(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、アンジオゲニン、アンジオポエチン‐２、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、レプチン、血小板由来増殖因子‐ＢＢ、及び胎盤増殖因子からなる群から選択される１つ以上の血管新生因子の送達による虚血性損傷の修復に使用するための組成物であって、前記組成物が、細胞の集団を含み；ここで、前記細胞が、前記血管新生因子を産生し；さらにここで、前記細胞が、以下：
（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、
（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び
（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養すること
により得られる、組成物。
【請求項２】
前記虚血性損傷の修復が、血管新生の促進、内皮細胞死の阻止、内皮細胞生存の向上、内皮細胞増殖の刺激、血管分岐の促進、及び１つ以上の血管新生因子の供給からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記虚血性損傷が、中枢神経系で生じる、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記虚血性損傷が、脳で生じる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
さらに血管新生促進剤を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記血管新生促進剤が、ポリペプチドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記血管新生促進剤が、核酸である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記血管新生促進タンパク質が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記転写因子が、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに脳卒中の処置に使用するための、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５９１，４８６号、２０１２年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／６３７，７４０号、２０１２年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７０９，６１９号（当該明細書及び図面は、すべての目的のためにそれらの全体について参照により本明細書中に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府支援に関する陳述
適用なし。
【０００３】
本願発明は、例えば、脳卒中などの虚血性イベントの処置のための血管新生及び血管発生の分野に関する。また、本願発明は、幹細胞及び遺伝子操作による幹細胞由来の細胞の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
安定脳卒中において、血流の回復は、脳における栄養供給を回復するために必須である。長期の虚血後の血管損傷を修復するために、少なくとも２つの連続的なステップが必要である。第１ステップは、内皮細胞（ＥＣ）の血管新生発芽である；このプロセスは、内皮細胞の初期増殖及び周囲の細胞外マトリックスのリモデリングを伴う。ＥＣのＶＥＧＦ介在増殖及びマトリックスメタロプロテイナーゼは、血管新生発芽の主要構成要素の１つである。第２ステップは、血管安定化；若い血管を包むために血管平滑筋細胞の動員に依存するプロセスである。単球及び周皮細胞はまた、血管安定化、適切な動脈性因子及び細胞外マトリックスタンパク質の産生に関与する。平滑筋細胞及び周皮細胞による血管安定化を欠くときは、新生の血管系の退行が生じ得る。
【０００５】
骨髄間質細胞（ＭＳＣ、また間葉系幹細胞として知られている）は、大脳動脈閉塞及び外傷性脳損傷後の血管再生を促進することが示されている（Ｏｍｏｒｉら（２００８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ.１２３６：３０・３８；Ｏｎｄａら（２００８）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２８：３２９・３４０；Ｐａｖｌｉｃｈｅｎｋｏら（２００８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２３３：２０３・２１３；Ｘｉｏｎｇら（２００９）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１２６３：１８３・１９１）。ＳＢ６２３細胞は、骨髄間質細胞の誘導体であり、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むベクターで骨髄間質細胞をトランスフェクトすることにより得られる。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号及びＤｅｚａｗａら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１３：１７０１‐１７１０を参照のこと。ＳＢ６２３細胞は、実験的な脳卒中モデルにおいて機能的改善を生じさせる。例えば、米国特許第８，０９２，７９２号及びＹａｓｕｈａｒａら（２００９）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １８：１５０１‐１５１４を参照のこと。ＳＢ６２３細胞のセクレトームは、親ＭＳＣのものに匹敵するが、特定の栄養因子の異なるレベルが、ＳＢ６２３細胞と比較して、ＭＳＣによって分泌されることが観察される。例えば、Ｔａｔｅら（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１９：９７３‐９８４；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号を参照のこと。さらに、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞間で異なる発現レベルである多くの因子が、血管再生に関与することが報告されている。
【０００６】
脳卒中は、合衆国における成人の身体障害の主な原因であり、そして世界中の死亡原因の第２位であるので、脳における脳卒中誘発虚血性損傷領域への血液供給を回復し、そして当該領域のかん流を促進するための処置の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列でトランスフェクトされた間葉系幹細胞の子孫（すなわち、ＳＢ６２３細胞）が、血管新生を促進する因子を合成しそして分泌することができる驚くべき特性を有することを見出した。血管新生、すなわち、新たな血管の形成は、脳損傷及び疾患における内因性の修復プロセスの重要な部分であるので、この発見は、脳卒中などの血管障害の新たな処置方法を提供する。
【０００８】
従って、本開示は、とりわけ、以下を提供する。
１．対象における血管新生を増大させるための方法であって、前記方法が、前記対象にＳＢ６２３細胞の集団を投与することを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【０００９】
２．前記血管新生の増大が中枢神経系で生じる、実施態様１に記載の方法。
【００１０】
３．前記血管新生の増大が脳で生じる、実施態様２に記載の方法。
【００１１】
４．対象における虚血性損傷を修復するための方法であって、前記方法が、前記対象にＳＢ６２３細胞の集団を投与することを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００１２】
５．前記虚血性損傷が中枢神経系で生じる、実施態様４に記載の方法。
【００１３】
６．前記虚血性損傷が脳で生じる、実施態様５に記載の方法。
【００１４】
７．前記虚血性損傷が脳卒中に起因する、実施態様６に記載の方法。
【００１５】
８．内皮細胞の生存を高めるための方法であって、前記方法が、前記内皮細胞とＳＢ６２３細胞の集団とを接触させることを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００１６】
９．前記方法が内皮細胞の死を阻止する、実施態様８に記載の方法。
【００１７】
１０．前記内皮細胞が対象内にある、実施態様８又は９に記載の方法。
【００１８】
１１．前記内皮細胞が前記対象の中枢神経系にある、実施態様１０に記載の方法。
【００１９】
１２．前記内皮細胞が前記対象の脳内にある、実施態様１１に記載の方法。
【００２０】
１３．内皮細胞の増殖を刺激するための方法であって、前記方法が、前記内皮細胞とＳＢ６２３細胞の集団とを接触させることを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２１】
１４．前記内皮細胞が対象内にある、実施態様１３に記載の方法。
【００２２】
１５．前記内皮細胞が前記対象の中枢神経系にある、実施態様１４に記載の方法。
【００２３】
１６．前記内皮細胞が前記対象の脳内にある、実施態様１５に記載の方法。
【００２４】
１７．血管の分岐を促進するための方法であって、前記方法が、前記血管とＳＢ６２３細胞の集団とを接触させることを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００２５】
１８．前記血管が対象内にある、実施態様１７に記載の方法。
【００２６】
１９．前記血管が前記対象の中枢神経系にある、実施態様１８に記載の方法。
【００２７】
２０．前記血管が前記対象の脳内にある、実施態様１９に記載の方法。
【００２８】
２１．対象における血管新生を増大するための方法であって、前記方法が、前記対象に、以下：
（１）ＳＢ６２３細胞の集団；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られ；及び
（２）血管新生促進剤
を投与することを含む、方法。
【００２９】
２２．前記血管新生の増大が前記中枢神経系で生じる、実施態様２１に記載の方法。
【００３０】
２３．前記血管新生の増大が前記脳内で生じる、実施態様２２に記載の方法。
【００３１】
２４．前記血管新生促進剤が核酸である、実施態様２１に記載の方法。
【００３２】
２５．前記血管新生促進剤がポリペプチドである、実施態様２１に記載の方法。
【００３３】
２６．前記ポリペプチドが血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、実施態様２５に記載の方法。
【００３４】
２７．前記血管新生促進タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、実施態様２６に記載の方法。
【００３５】
２８．前記転写因子がＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、実施態様２７に記載の方法。
【００３６】
２９．対象における虚血性損傷を修復するための方法であって、前記方法が、前記対象に、以下：
（１）ＳＢ６２３細胞の集団；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られ；及び
（２）血管新生促進剤
を投与することを含む、方法。
【００３７】
３０．前記虚血性損傷が中枢神経系で生じる、実施態様２９に記載の方法。
【００３８】
３１．前記虚血性損傷が脳内で生じる、実施態様３０に記載の方法。
【００３９】
３２．前記虚血性損傷が脳卒中に起因する、実施態様３１に記載の方法。
【００４０】
３３．前記血管新生促進剤が核酸である、実施態様２９に記載の方法。
【００４１】
３４．前記血管新生促進剤がポリペプチドである、実施態様２９に記載の方法。
【００４２】
３５．前記ポリペプチドが血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、実施態様３４に記載の方法。
【００４３】
３６．前記血管新生促進タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、実施態様３５に記載の方法。
【００４４】
３７．前記転写因子が前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、実施態様３６に記載の方法。
【００４５】
３８．対象における脳卒中を処置するための方法であって、前記方法が、前記対象に、以下：
（１）ＳＢ６２３細胞の集団；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られ；及び
（２）血管新生促進剤
を投与することを含む、方法。
【００４６】
３９．前記血管新生促進剤が核酸である、実施態様３８に記載の方法。
【００４７】
４０．前記血管新生促進剤がポリペプチドである、実施態様３８に記載の方法。
【００４８】
４１．前記ポリペプチドが血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、実施態様４０に記載の方法。
【００４９】
４２．前記血管新生促進タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、実施態様４１に記載の方法。
【００５０】
４３．前記転写因子が前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、実施態様４２に記載の方法。
【００５１】
４４．前記ＳＢ６２３細胞と伴に血管新生促進剤を投与することをさらに含む、実施態様８、９又は１３に記載の方法。
【００５２】
４５．前記内皮細胞が対象内にある、実施態様４４に記載の方法。
【００５３】
４６．前記内皮細胞が前記対象の中枢神経系にある、実施態様４５に記載の方法。
【００５４】
４７．前記内皮細胞が前記対象の脳内にある、実施態様４６に記載の方法。
【００５５】
４８．前記血管新生促進剤が核酸である、実施態様４４に記載の方法。
【００５６】
４９．前記血管新生促進剤がポリペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【００５７】
５０．前記ポリペプチドが血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、実施態様４９に記載の方法。
【００５８】
５１．前記血管新生促進タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、実施態様５０に記載の方法。
【００５９】
５２．前記転写因子が前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、実施態様５１に記載の方法。
【００６０】
５３．前記ＳＢ６２３細胞と伴に血管新生促進剤を投与することをさらに含む、実施態様１７に記載の方法。
【００６１】
５４．前記血管が対象内にある、実施態様５３に記載の方法。
【００６２】
５５．前記血管が前記対象の中枢神経系にある、実施態様５４に記載の方法。
【００６３】
５６．前記血管が前記対象の脳内にある、実施態様５５に記載の方法。
【００６４】
５７．前記血管新生促進剤が核酸である、実施態様５３に記載の方法。
【００６５】
５８．前記血管新生促進剤がポリペプチドである、実施態様５３に記載の方法。
【００６６】
５９．前記ポリペプチドが血管新生促進タンパク質の発現を活性化する転写因子である、実施態様５８に記載の方法。
６０．前記血管新生促進タンパク質が血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である、実施態様５９に記載の方法。
【００６７】
６１．前記転写因子が前記ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する非天然型ジンクフィンガータンパク質である、実施態様６０に記載の方法。
【００６８】
６２．対象に血管新生因子を提供するための方法であって、ここで、前記方法が、前記対象にＳＢ６２３細胞の集団を投与することを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００６９】
６３．前記対象が虚血性障害に罹患している、実施態様６２に記載の方法。
【００７０】
６４．前記対象が中枢神経系の疾患又は障害に罹患している、実施態様６３に記載の方法。
【００７１】
６５．前記栄養因子が、アンジオゲニン、アンジオポエチン‐２、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子、肝細胞増殖因子、レプチン、血小板由来増殖因子‐ＢＢ、胎盤増殖因子、及び血管内皮細胞増殖因子からなる群から１つ以上選択される、実施態様６２に記載の方法。
【００７２】
６６．前記栄養因子が血管内皮細胞増殖因子である、実施態様６５に記載の方法。
【００７３】
６７．対象に血管内皮細胞増殖因子を提供するための方法であって、ここで、前記方法が、前記対象にＳＢ６２３細胞の集団を投与することを含み；ここで、前記ＳＢ６２３細胞が、（ａ）間葉系幹細胞の培養物を準備し、（ｂ）ステップ（ａ）の細胞培養物と、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチド、ここで前記ポリヌクレオチドがＮｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない、を接触させ、（ｃ）ステップ（ｂ）のポリヌクレオチドを含む細胞を選択し、及び（ｄ）ステップ（ｃ）の選択した細胞を、選択なしでさらに培養することにより得られる、方法。
【００７４】
６８．前記対象が虚血性障害である、実施態様６７に記載の方法。
【００７５】
６９．前記対象が中枢神経系の疾患又は障害に罹患している、実施態様６８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、血清及び増殖因子が欠乏しているＨＵＶＥＣの培養物におけるヨウ化プロピジウムに透過性の細胞画分の測定を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＭＳＣ由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。値は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の３つの独立したドナーに関する平均±ＳＤを示す（*は、対象群と比較したｐ＜０．０５を示す）。
【図２】図２は、血清及び増殖因子を欠乏させたＨＵＶＥＣの培養物において、Ｂｃｌ‐２を発現する細胞画分の測定を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＭＳＣ由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。結果は、フルオレセインコンジュゲート抗‐Ｂｃｌ‐２抗体で染色された細胞の蛍光を測定し、そしてフルオレセインコンジュゲートＩｇＧに供された細胞の蛍光を差し引くことにより得た。値は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の３つの独立したドナーに関する平均±ＳＤを示す（*は、対照群と比較したｐ＜０．０５を示す）。
【図３】図３は、血清及び増殖因子を欠乏させたＨＵＶＥＣの培養物におけるＫｉ６７を発現する細胞画分の測定を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＭＳＣ由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、７日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。結果は、フルオレセインコンジュゲート抗‐Ｋｉ６７抗体で染色された細胞の蛍光を測定し、そしてフルオレセインコンジュゲートＩｇＧに供された細胞の蛍光を差し引くことにより得た。値は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の３つの独立したドナーに関する平均±ＳＤを示す（*は、対照群と比較したｐ＜０．０５を示す）。
【図４】図４は、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞由来の馴化培地において１６時間培養後のＨＵＶＥＣの位相差顕微鏡の顕微鏡写真を示す。左端の写真は、ＭＳＣ由来の馴化培地において培養した細胞を示し、中央の写真は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地において培養した細胞を示し、そして右端の写真は、馴化培地を添加しない市販の培地において培養した細胞を示す。
【図５】図５は、ＨＵＶＥＣによる管形成への馴化培地の影響の測定を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＭＳＣ由来の馴化培地の存在下、１６時間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、１６時間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。値は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の３つの独立したドナーに関する平均±ＳＥＭを示す。
【図６】図６は、非馴化培地（図６Ａ）、ＭＳＣ馴化培地（図６Ｂ）、又はＳＢ６２３細胞馴化培地（図６Ｃ）における１０日間の培養後の大動脈輪の写真を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、大動脈輪アッセイにおける血管発芽及び分岐の測定を示す。図７Ａは、新しい血管及び新しい血管における分岐点の総数を示す。３対のバーのそれぞれについて、左側のバーは、新しい血管形成の測定を示し、そして右側のバーは、血管分岐の測定を示す。左端のバーの対（「対象」）は、対照大動脈輪から得られた結果を示し、中央のバーの対（「ＭＳＣ ＣＭ」）は、ＭＳＣ馴化培地において１０日間培養した大動脈輪から得られた結果を示し、そして右端のバーの対（「ＳＢ６２３ ＣＭ」）は、ＳＢ６２３細胞馴化培地において１０日間培養した大動脈輪から得られた結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、大動脈輪アッセイにおける血管発芽及び分岐の測定を示す。図７Ｂは、対照大動脈輪（左側のバー）、ＭＳＣ馴化培地において１０日間培養した輪（中央のバー）及びＳＢ６２３細胞馴化培地において１０日間培養した輪（右側のバー）に関する新しい血管への分岐点の割合を示す。値は、７つのドナー対に関して、平均±ＳＥＭを示す（*は、対照群と比較してｐ＜０．０５を示す）。
【図８】図８は、ＭＳＣ（ライトバー）及びＳＢ６２３細胞（ダークバー）由来の馴化培地における４つの異なる栄養因子のレベルを示す。タンパク質レベルは、ピコグラム／ｍｌ（馴化培地あたり１０6細胞）として示す。図に示したように、４人のヒトドナーからのＭＳＣ由来の馴化培地（及びそれら由来のＳＢ６２３細胞）を試験した。アンジオゲニン、アンジオポエチン‐２、ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子（ＨＢ‐ＥＧＦ）、及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）のレベルを示す。
【図９】図９は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞由来の馴化培地における１０個の異なるサイトカインのレベルを示す。馴化培地の産生のための細胞は、図に示すように、４つの異なるドナー（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）から得た。当該図は、試験した他の栄養因子のレベルと比較した、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞によって産生される膨大な量のＶＥＧＦを明らかにする。略語を、表１の凡例（実施例６）において示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＳＢ６２３細胞馴化培地によって高められたＨＵＶＥＣ生存能力の改善に対するＶＥＧＦ受容体阻害物質の影響を示す。図１０Ａは、血清及び増殖因子を欠失したＨＵＶＥＣの培養物におけるヨウ化プロピジウムに透過性の細胞画分を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、５日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地及び５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下、５日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。結果は、２つのドナーからの平均である（「*」は、対照培地に対して、ｐ＜０．０５を示し、「＃」は、ＳＢ６２３細胞馴化培地及びＳＵ５４１６に供した培地に対して、ｐ＜０．０５を示す）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＳＢ６２３細胞馴化培地によって高められたＨＵＶＥＣ生存能力の改善に対するＶＥＧＦ受容体阻害物質の影響を示す。図１０Ｂは、血清及び増殖因子を欠乏したＨＵＶＥＣの培養物においてＢｃｌ‐２を発現する細胞画分の測定を示す。左端のバーは、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下、５日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバーは、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地及び５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下、５日間培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。結果は、２連のドナーからの平均であり、フルオレセインコンジュゲート抗‐Ｂｃｌ‐２抗体で染色した細胞の蛍光を測定し、そしてフルオレセインコンジュゲートＩｇＧに供した細胞の蛍光を差し引くことにより得た。
【図１１】図１１は、ＶＥＧＦＲ２阻害物質ＳＵ５４１６の存在下及び不存在下、ＳＢ６２３細胞馴化培地に供したＨＵＶＥＣ培養物、及びＣＭの不存在下で培養した対照細胞におけるＫｉ６７を発現する細胞画分の測定を示す。左端のバー（クリアー）は、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバー（ブラック）は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下で培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバー（グレイ）は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地及び５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下で培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。値は、ＳＢ６２３細胞の２つの独立したドナーに関する平均±ＳＥＭを示す（「*」は、陰性対照培養物（馴化培地なし）に対する、ｐ＜０．０５を示し；「＃」は、ＳＵ５４１６処理培養物に対する、ｐ＜０．０５を示す）。
【図１２】図１２は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞馴化培地によって高められたＨＵＶＥＣによる管形成の促進に対するＶＥＧＦ受容体阻害物質の影響を示す。上列は、阻害物質の不存在下で培養した細胞を示す。上列の左端（「陰性（ｎｅｇ）」）は、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地において１６時間培養後の対照ＨＵＶＥＣの位相差顕微鏡写真を示す。左から２番目のパネル（「＋１０ｎｇ ＶＥＧＦ」）は、１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを添加したＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地において１６時間培養後のＨＵＶＥＣの位相差顕微鏡写真を示す。左から３番目のパネル（「＋ＭＳＣ‐ＣＭ」）は、ＭＳＣ馴化培地において１６時間培養した後のＨＵＶＥＣの位相差顕微鏡写真を示す。右端のパネル（「＋ＳＢ６２３‐ＣＭ」）は、ＳＢ６２３細胞馴化培地において１６時間培養した後のＨＵＶＥＣの位相差顕微鏡写真を示す。下列のパネルは、上列と同じ条件下でのＨＵＶＥＣの顕微鏡写真を示すが、５０ｎＭのＳＵ５４１６の添加を伴う。
【図１３】図１３は、ＶＥＧＦＲ２阻害物質ＳＵ５４１６の存在下及び不存在下でのＳＢ６２３細胞馴化培地に供したＨＵＶＥＣ、及びＣＭの不存在下で培養した対照細胞による管形成の定量化を示す。それぞれの時点に関して、左端のバー（クリアー）は、対照血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣから得られた結果を示し、中央のバー（ブラック）は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下で培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示し、そして右端のバー（グレイ）は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地及び５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下で培養した血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣの結果を示す。値は、ＳＢ６２３細胞の３つの独立したドナーに関する平均±ＳＥＭを示す（「＊」は、陰性対照培養物（馴化培地なし）に対する、ｐ＜０．０５を示し、「＃」は、ＳＵ５４１６‐処理培養物に対する、ｐ＜０．０５を示す）。
【図１４】図１４は、大動脈輪アッセイにおけるＳＢ６２３細胞馴化培地によって高められた血管伸長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）及び分岐の促進に対するＶＥＧＦ受容体阻害物質の影響を示す。上列において、左パネルは、ＯｐｔｉＭＥＭ培地において、ＲＧＦベースメントゲル上で１０日間培養後の大動脈輪の顕微鏡写真を示す（「陰性対照」）。中央のパネルは、ＳＢ６２３細胞馴化培地において１０日間培養後の大動脈輪の顕微鏡写真を示す（「＋ＳＢ６２３‐ＣＭ」）。右パネルは、５０ｎＭのＳＵ５４１６を含むＳＢ６２３細胞馴化培地において１０日間培養後の大動脈輪の顕微鏡写真を示す（「＋ＳＢ６２３‐ＣＭ＋ＳＵ５４１６」）。それぞれの顕微鏡写真の特定領域の拡大を、下列に示す。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
本明細書は、血管新生の調節のための新規方法及び組成物を開示する。特に、ＳＢ６２３細胞（Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むベクターでトランスフェクトしたＭＳＣ由来の子孫細胞）によって分泌された因子が、血清及び増殖因子欠乏条件下、インビトロにおいて内皮細胞の生存及び増殖を促進し、そしてヒト臍帯静脈内皮細胞による管形成を刺激する。また、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地が、齧歯類の大動脈輪アッセイにおいて、内皮発芽及び分岐を促進する。
【００７８】
本開示の実施は、特に断らない限り、細胞生物学、毒物学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組換えＤＮＡの分野及び当該技術分野の手法の範囲内である関連分野における標準的な方法及び従来の技術を利用する。そのような技術は、文献に記載されており、それによって当業者に利用可能である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，”５th ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００８；Ｖｏｅｔ，Ｄ．ら、“Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｌｉｆｅ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ，”３rd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”３rd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期的更新；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．I．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”４th ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００；及び“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”シリーズ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと。
【００７９】
本開示のために、「血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」は、新たな血管系（例えば、血管；例えば、静脈、動脈、小静脈、細動脈、毛細血管）の形成を意味する。血管新生は、既存の血管から新たな血管の発芽、及び／又は血管の分岐によって生じる。血管新生は、また、マトリックスリモデリング及び細胞動員の付随するプロセス（例えば、平滑筋細胞、単球及び／又は周皮細胞の動員）を含む。
【００８０】
「ＭＳＣ」は、骨髄から得られた付着性、非造血幹細胞を意味する。これらの細胞は、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、骨髄付着間質細胞、骨髄付着幹細胞、及び骨髄間質細胞として多様に知られている。
【００８１】
脳卒中
「脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）」は、脳における血流の機能障害に起因する状態に与えられる名称である。そのような脳血管の機能障害は、例えば、頭蓋内出血、又は脳における血流の悪化若しくは閉塞（すなわち、脳虚血）に起因し得る。虚血性閉塞は、血栓症（すなわち、頭蓋血管又は脳に供給する血管におけるその位置での凝血塊の形成）又は脳塞栓（すなわち、脳中の部位への凝血塊の移動）に起因し得る。虚血又は出血性脳卒中に起因する損傷は、通常、神経機能の機能障害につながる。異なる種類の脳卒中、及びそれらの特徴に関するさらなる情報は、共有する米国特許第８，０９２，７９２号に見られ；その開示は、異なる種類の脳卒中及びそれらの特徴を記載する目的で本明細書にその全体が参照として組み込まれる。
【００８２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
本開示は、対象における虚血性障害の部位にＳＢ６２３細胞を移植することにより血管新生を促進するための方法に関する。ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣにおいてＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインを発現することによって、骨髄付着間質細胞、また間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として知られる、から得られる。ＭＳＣは、骨髄から付着細胞（すなわち、組織培養プラスチックに付着する細胞）を選択することにより得られる。
【００８３】
ＭＳＣの例示的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００３０９０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：７１‐７４及びＪｉａｎｇ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１８：４１‐４９において提供される。ＭＳＣの単離及び精製方法は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３‐１４７及びＤｅｚａｗａら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１７７１‐１７７６において見られる。ヒトＭＳＣは、市販され（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）又はドナー、例えば、骨髄吸引、その後付着性骨髄細胞の選択によりドナーから得られる。例えば、国際公開第２００５／１００５５２号を参照のこと。
【００８４】
ＭＳＣは、臍帯血から単離し得る。例えば、Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉら（２００１）Ｂｌｏｏｄ９８：２３９６‐２４０２；Ｅｒｉｃｅｓら（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０９：２３５‐２４２及びＨｏｕら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７８：２５６‐２６１を参照のこと。
【００８５】
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン
Ｎｏｔｃｈタンパク質は、すべての後生動物で見られる、細胞内シグナル伝達を通じて細胞分化に影響を及ぼす膜貫通受容体である。Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインのＮｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ（Ｄｅｌｔａ）、セレート（Ｓｅｒｒａｔｅ）、ジャグド（Ｊａｇｇｅｄ））との接触は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の２つのタンパク質分解切断をもたらし、その２番目は、γ‐セクレターゼにより触媒され、そして細胞質中にＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を放出する。マウスＮｏｔｃｈタンパク質において、この切断は、アミノ酸ｇｌｙ １７４３及びｖａｌ １７４４の間で起こる。ＮＩＣＤは、核に移行し、そこで転写因子として働き、さらなる転写調節タンパク質（例えば、ＭＡＭ、ヒストンアセチラーゼ）を動員して、様々な標的遺伝子（例えば、Ｈｅｓ１）の転写抑制を緩和する。
【００８６】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関してさらなる詳細及び情報が、例えば、Ａｒｔａｖａｎｉｓ・Ｔｓａｋｏｎａｓら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８： ２２５‐２３２； Ｍｕｍｍ及びＫｏｐａｎ （２０００） Ｄｅｖｅｌｏｐ. Ｂｉｏｌ．２２８：１５１‐１６５並びにＥｈｅｂａｕｅｒら（２００６）Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２００６（３６４），ｃｍ７．［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｔｋｅ．３６４２００６ｃｍ７］において見出される。
【００８７】
細胞培養及びトランスフェクション
細胞培養のための標準的な方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ “Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，”Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ, Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００５を参照のこと。
【００８８】
外来性ＤＮＡの細胞への導入方法（すなわち、トランスフェクション）はまた、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，“Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ, Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期更新を参照のこと。
【００８９】
ＳＢ６２３細胞
ＳＢ６２３細胞の調製のための１つの実施態様において、ＭＳＣの培養物は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させ（例えば、トランスフェクションにより）；続いて薬剤選択によりトランスフェクトした細胞を濃縮し、そしてさらに培養する。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）；及び国際公開第２００９／０２３２５１号（２００９年２月１９日）を参照し；それらすべての開示は、間葉系幹細胞の単離及び間葉系幹細胞のＳＢ６２３細胞（それらの文書において「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」及び「神経再生細胞（ｎｅｕｒａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」を意味する）への変換を記載する目的のために、それらの全体について、参照により組み込まれる。
【００９０】
これらの方法において、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を使用し得、そしてトランスフェクトされた細胞の選択及び濃縮のための任意の方法を使用し得る。例えば、特定の実施態様において、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含み、また、薬剤耐性マーカー（例えば、Ｇ４１８に対する耐性）をコードする配列を含むベクターでトランスフェクトされる。さらなる実施態様において、２つのベクター（Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むものと薬剤耐性マーカーをコードする配列を含むもの）が、ＭＳＣのトランスフェクションのために使用される。これらの実施態様において、選択は、ベクター（１つ又は複数）での細胞培養物のトランスフェクション後、細胞培養物に、ベクターを含まない細胞ではなくベクターを含む不十分な細胞を殺すために十分な量の選択薬剤（例えば、Ｇ４１８）を添加することにより、達成される。選択の非存在は、前記選択薬剤の除去又はベクターを含まない細胞を殺さないレベルへのその濃縮の減少を必要とする。続く選択により（例えば、７日間）、選択薬剤は除去され、そして細胞はさらに培養される（例えば、２代継代）。
【００９１】
ＳＢ６２３細胞の調製は、従って、ＭＳＣにおける外来性Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの一時的な発現を含む。この目的を達成するために、ＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むベクターでトランスフェクトされ得、ここで、前記配列は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない。すべてのそのような配列は、周知であり、そして当業者にすぐに入手可能である。例えば、Ｄｅｌ Ａｍｏら（１９９３）Ｄｅｎｏｍｉｃｓ １５：２５９‐２６４は、マウスＮｏｔｃｈタンパク質の完全なアミノ酸配列を示し；さらにＭｕｍｍ及びＫｏｐａｎ（２０００）Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：１５１‐１６５は、細胞内ドメインを放出するいわゆるＳ３切断部位を取り囲む、Ｎｏｔｃｈタンパク質由来のアミノ酸配列を提供する。総合すれば、これらの参考文献は、当業者に、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長ではないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含むありとあらゆるペプチド提供し；従って、また当業者に、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むすべてのポリヌクレオチドを提供する。先行文献（Ｄｅｌ Ａｍｏ及びＭｕｍｍ）は、それぞれ、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長のアミノ酸配列及びＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列を開示する目的のために、それらの全体について参照により組み込まれる。
【００９２】
同様の情報が、ラット、ゼノパス、ショウジョウバエ、及びヒトを含むさらなる種由来のＮｏｔｃｈタンパク質及び核酸に関して利用できる。例えば、Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒら（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３：１９９‐２０５；Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：３８２‐３８６；ＮＣＢＩ 参照配列番号ＮＭ＿０１７１６７（及びその中に引用された参考文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ４６５３１（及びその中に引用された参考文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ０１７０５（及びその中に引用された参考文献）；及びＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ４０７３３（及びその中に引用された参考文献）を参照のこと。先行文献は、多数の異なる種における、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長のアミノ酸配列及びＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列を開示する目的のためにそれらの全体について参照により組み込まれる。
【００９３】
さらなる実施態様において、ＳＢ６２３細胞は、ＭＳＣ内に、ＭＳＣが外来性Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメインを発現しないようなＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含む核酸を導入することにより調製される。それは、例えば、ＭＳＣを、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むベクターでトランスフェクトすることによって達成し得、ここで、前記配列は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の全長をコードしない。
【００９４】
ＳＢ６２３細胞の調製、及び本明細書で開示される方法において使用され得るＳＢ６２３細胞と同様の特徴を有する細胞の製造方法についてのさらなる詳細は、米国特許第７，６８２，８２５号；及び米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）及び２０１１／０２２９４４２号（２０１１年９月２２日）に見られ；これらの開示は、ＳＢ６２３細胞の調製のさらなる詳細及び代替方法を提供し、そしてＳＢ６２３細胞と同様の特徴を有する細胞を調製するための方法を提供する目的のために本明細書に参照として組み込まれる。また、Ｄｅｚａｗａら（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１７０１‐１７１０を参照のこと。
【００９５】
用途
本明細書で開示されるように、本発明者等は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインが一時的に発現した間葉系幹細胞の子孫（すなわち、ＳＢ６２３細胞）が血管新生活性を有し；及び前記細胞が血管新生因子を合成しそして分泌することを見出した。従って、ＳＢ６２３細胞の移植は、治療的有用性が、対象において血管新生を増加することにより達成され得る障害の処置のために有用である。そのような障害は、限定されないが、脳虚血（例えば、脳卒中）、心虚血（例えば、虚血性心疾患）、腸の虚血（例えば、虚血性大腸炎、腸間膜虚血）、四肢の虚血、皮膚の虚血、虚血性眼症候群（例えば、網膜虚血）及び脳性まひが挙げられる。
【００９６】
従って、本明細書に記載されたようにＳＢ６２３細胞は、血管新生の刺激に関連する多くの方法に使用し得る。これらは、限定されないが、従前の段落で述べたいずれかの障害の処置、血管新生の増大、虚血性損傷の修復、内皮細胞の死の阻止、内皮細胞の生存の向上、内皮細胞の増殖の刺激、及び／又は血管の分岐の促進が挙げられる。
【００９７】
そのような方法は、インビトロ又は対象において実施し得る。対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。本明細書で開示したようなＳＢ６２３細胞による血管新生の刺激、及びそのような刺激に付随する効果は、例えば、中枢神経系（例えば、脳内）において生じ得る。
【００９８】
ＳＢ６２３細胞の移植は、また、対象に、１つ以上の血管新生栄養因子を供給するための方法において使用され得る。そのような因子は、限定されないが、アンジオゲニン、アンジオポエチン‐２、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子、肝細胞増殖因子、レプチン、血小板由来増殖因子‐ＢＢ、胎盤増殖因子、及び血管内皮細胞増殖因子が挙げられる。
【００９９】
さらなる実施態様において、ＳＢ６２３細胞は、対象における血管新生を増大するための併用療法において、第２の血管新生促進剤と組み合わせて使用し得る。前記併用療法は、上記のすべての目的のために使用し得る。第２の血管新生促進剤は、例えば、低分子薬剤、核酸又はポリペプチド（例えば、抗体、転写因子）であり得る。例示的な核酸は、血管新生タンパク質の発現を活性化し及び／又は抗血管新生タンパク質の発現を阻止する、三重鎖形成性核酸、リボザイム及びｓｉＲＮＡである。例示的な抗体は、血管新生タンパク質（又は他の血管新生剤）に結合し及び／又は血管新生タンパク質（又は他の血管新生剤）の活性を阻害する抗体である。例示的な転写因子は、１つ以上の抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害するもの、及び１つ以上の血管新生促進タンパク質の転写を活性化するものである。抗血管新生及び血管新生促進タンパク質は、当該技術分野において知られている。例示的な抗血管新生タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）が挙げられる。例示的な血管新生促進タンパク質は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
【０１００】
特定の実施態様において、上記のような転写因子は、非天然型（人工）転写因子である。そのような非天然型転写因子の例は、標的遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ遺伝子）の転写を調節する細胞クロマチン中のＤＮＡ配列に結合するために改変された非天然型ジンクフィンガータンパク質である。前記改変ジンクフィンガー転写因子は、当該技術分野において知られるように、改変ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインに加えて、転写調節ドメイン（例えば、転写活性化ドメイン又は転写抑制ドメイン）を含む。
【０１０１】
選択したＤＮＡ配列に結合するための、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを改変するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：１３５‐１４１；Ｐａｂｏら（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３‐３４０；Ｉｓａｌａｎら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６‐６６０；Ｓｅｇａｌら（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２‐６３７；Ｃｈｏｏら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１‐４１６を参照のこと。ジンクフィンガー結合ドメインは、天然型ジンクフィンガータンパク質と比較して、新たな結合特異性を有するように改変される。改変方法は、限定されないが、合理的設計及び様々な種類の実験に基づいた選択方法が挙げられる。合理的な設計は、例えば、トリプレット（又はクアドラプレット）ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、ここで、それぞれのトリプレット又はクアドラプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレット又はクアドラプレット配列を結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と関連する。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；６，４５３，２４２号；６，５３４，２６１号；６，６１０，５１２号；６，７４６，８３８号；６，８６６，９９７号；７，０６７，６１７号；米国特許出願公開第２００２／０１６５３５６号；２００４／０１９７８９２号；２００７／０１５４９８９号；２００７／０２１３２６９号；及び国際公開第９８／５３０５９号及び２００３／０１６４９６号を参照のこと。
【０１０２】
ファージディスプレイ、相互作用トラップ、ハイブリッド選択及びツーハイブリッド系を含む、例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；５，９２５，５２３号；６，００７，９８８号；６，０１３，４５３号；６，１４０，４６６号；６，２００，７５９号；６，２４２，５６８号；６，４１０，２４８号；６，７３３，９７０号；６，７９０，９４１号；７，０２９，８４７号及び７，２９７，４９１号、及び米国特許出願公開第２００７／０００９９４８号及び２００７／０００９９６２号；国際公開第９８／３７１８６号；国際公開０１／６０９７０号及び英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。
【０１０３】
ジンクフィンガードメインのための結合特異性の増強は、例えば、米国特許第６，７９４，１３６号（２００４年９月２１日）に記載されている。フィンガー間リンカー配列に関して、ジンクフィンガー改変のさらなる態様は、米国特許第６，４７９，６２６号及び米国特許出願公開第２００３／０１１９０２３号に開示される。また、Ｍｏｏｒｅら（２００１ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１４３２‐１４３６；Ｍｏｏｒｅら（２０００ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１４３７‐１４４１及び国際公開第０１／５３４８０号を参照のこと。
【０１０４】
転写活性化及び抑制ドメインは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：６３０（１９９５）を参照のこと。例示的な転写活性化ドメインは、ｐ６５、ＶＰ１６及びＶＰ６４が挙げられる。例示的な転写抑制ドメインは、ＫＲＡＢ、ＫＡＰ‐１、ＭＡＤ、ＦＫＨＲ、ＥＲＤ及びＳＩＤが挙げられる。核ホルモン受容体由来の機能ドメインは、リガンドの存在に依存して、活性化因子又は抑制因子のいずれかとして働く。また、米国特許第７，９８５，８８７号を参照のこと。
【０１０５】
製剤、キット及び投与経路
本明細書に開示されるように、ＳＢ６２３細胞を含む治療用組成物が、また、提供される。そのような組成物は、典型的にＳＢ６２３細胞及び医薬的に許容される担体を含む。追加の活性化合物が、また、ＳＢ６２３細胞組成物中に組み込み得る（下記参照）。
【０１０６】
本明細書に開示された治療用組成物は、とりわけ、対象における脳卒中又は他の虚血性障害の発症後、血管新生を刺激するために有用である。従って、ＳＢ６２３細胞を含む組成物の「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、血管新生を刺激する任意の量であり得る。体重、投与経路、疾患の重症度などに依存して、例えば、投与量は、約１００；５００；１，０００；２，５００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；５００，０００；１，０００，０００；５，０００，０００〜１０，０００，０００細胞以上（又はそれらの間の任意の整数値）で変化し得、例えば、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、１月に２回、１月に１回の投与頻度であり得る。
【０１０７】
様々な医薬組成物及びそれらの調製及び使用のための技術は、本開示に照らして、当業者に知られている。適切な薬理的な組成物の詳細なリスト及びそれらの投与のための技術に関して、テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．１９８５；Ｂｒｕｎｔｏｎら、“Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ，２００５；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ｅｄｓ．），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，” Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５；及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ｅｄｓ．），“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００８を参照してもよい。
【０１０８】
本明細書に記載された細胞は、移植のための生理学的に適合性の担体中に懸濁し得る。本明細書で使用される場合、用語「生理学的に適合性の担体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」は、ＳＢ６２３細胞と適合し、製剤の任意の他の成分と適合し、そしてそのレシピエントに有害でない担体を意味する。当業者は、生理学的に適合性の担体に精通している。適切な担体の例は、細胞培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液＋／−グルコース（ＨＢＳＳ）、及び複数の電解質溶液、例えば、Ｐｌａｓｍａ‐Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる。
【０１０９】
患者に投与するＳＢ６２３細胞懸濁液の用量は、移植部位、治療目標及び溶液中の細胞数に依存して変化する。典型的には、患者に投与する細胞の量は、治療有効量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」又は「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、特定の疾患の処置を達成するために、すなわち障害に関連する症状の量及び重症度の減少を生み出すために、必要とされる移植される細胞数を意味する。例えば、脳卒中の場合、ＳＢ６２３細胞の治療有効量の移植は、例えば、虚血によって損傷された領域において、新たな血管の増殖、血管の発芽及び血管の分岐をもたらす。治療有効量は、虚血性損傷の種類及び程度で変化し、そしてまた、対象の全身の状態に依存して変化し得る。
【０１１０】
開示した治療用組成物は、医薬的に許容される材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体又は固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料、すなわち、担体をさらに含み得る。これらの担体は、例えば、体内で、ＳＢ６２３細胞を安定させ及び／又はＳＢ６２３細胞の生存を容易にすることができる。それぞれの担体は、製剤の他の成分に適合し、そして対象に有害でない意味において「許容される（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」べきである。医薬的に許容される担体として役に立つことができる材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント粉末；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に使用される他の無毒性適合物質が挙げられる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤がまた、組成物中に存在し得る。
【０１１１】
例示的な製剤は、限定されないが、非経口投与、例えば、肺内、静脈内、動脈内、眼内、頭蓋内、硬膜下（ｓｕｂ‐ｍｅｎｉｎｇｉａｌ）又は皮下投与に適切なもの、ミセル、リポソーム又は薬物放出カプセル（徐放のために設計された生体適合性コーティング中に組み込まれた活性薬剤）中に封入された製剤；摂取可能な製剤；局所使用のための製剤、例えば、点眼薬、クリーム、軟膏及びゲル；並びに他の製剤、例えば、吸入、エアロゾル及びスプレーが挙げられる。開示の組成物の投与量は、処置の必要性の程度及び重症度、投与された組成物の活性、対象の全体的な健康状態、及び当業者に周知の他の考慮に従って変化する。
【０１１２】
さらなる実施態様において、本明細書に記載される組成物は、虚血損傷部位に局所的に送達される。局所送達は、非全身的に組成物を送達することを可能にし、それによって、全身送達と比較して、体に対する組成物の負担を軽減する。そのような局所送達は、例えば、頭蓋内注射によって、又は様々な医療的な埋め込み装置、限定されないが、ステント及びカテーテルの使用を通じて達成でき、又は吸入、静脈切開術、若しくは手術によって達成できる。コーティング、移植、包埋方法、並びに医療装置、例えばステント及びカテーテルに所望する薬剤を取り付ける他の方法は、当該技術分野において確立され、そして本明細書において熟慮される。
【０１１３】
本開示の他の態様は、対象に、任意により他の治療剤と組み合わせたＳＢ６２３細胞の投与を実施するためのキットに関する。１つの実施態様において、キットは、医薬担体、任意により、例えば、血管新生促進剤（以下を参照）において処方され、必要に応じて、１つ以上の個別の医薬調合物において処方された、ＳＢ６２３細胞の組成物を含む。
【０１１４】
併用療法
特定の実施態様において、ＳＢ６２３細胞組成物は、例えば、脳卒中を処置するための、血管新生を刺激する物質（「血管新生促進剤（ｐｒｏ‐ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔｓ）」を含む他の組成物と組み合わせて使用し得る。組成物は、任意の順序で連続して又は同時に投与し得る。従って、本明細書で開示される通り、治療用組成物は、ＳＢ６２３細胞及び血管新生促進剤の両方を含み得る。さらなる実施態様において、１つがＳＢ６２３細胞を含みそしてもう１つが血管新生促進剤を含む、個別の治療用組成物は、個別に又は一緒に、対象に投与し得る。
【０１１５】
特定の実施態様において、血管新生促進剤は、タンパク質（例えば、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、形質転換成長因子α、肝細胞増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、ソニック ヘッジホッグ、ＭＡＧＰ‐２、ＨＩＦ‐１、ＰＲ‐３９、ＲＴＥＦ‐１、ｃ‐Ｍｙｃ、ＴＦＩＩ、Ｅｇｒ‐１、ＥＴＳ‐１）又はそのようなタンパク質をコードする核酸である。例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４：７８１‐７８９を参照のこと。他の実施態様において、血管新生促進剤は、血管新生の阻害物質をコードする核酸を標的とする、小ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）又はリボザイムであり得る。さらなる実施態様において、血管新生促進剤は、血管新生促進を阻害するタンパク質の発現を調節するＤＮＡ配列に結合する三重鎖形成性核酸であり得、例えば、当該タンパク質をコードする遺伝子の転写を阻止する。
【０１１６】
さらなる実施態様において、血管新生促進剤は、血管新生促進分子（例えば、タンパク質）の発現を活性化する転写因子である。血管新生促進タンパク質の発現を調節する天然型の転写因子（例えば、ＨＩＦ‐１α）は、公知である。さらに、合成転写調節タンパク質は、遺伝子工学によって構築し得る。例えば、目的の配列に結合する、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計方法、及びそのようなジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと転写活性化及び抑制ドメインを融合するための方法は、記載されている。例えば、米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，７８５，６１３号；６，７９４，１３６号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；７，１７７，７６６号；７，２２０，７１９号；及び７，７８８，０４４号を参照のこと。これらの方法は、血管新生促進タンパク質をコードする任意の遺伝子の転写を活性化する非天然型タンパク質を合成するために使用され得る。また、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子の合成ジンクフィンガー転写活性化因子は、記載されている。例えば、米国特許第７，０２６，４６２号；７，０６７，３１７号；７，５６０，４４０号；７，６０５，１４０号；及び８，０７１，５６４号を参照のこと。従って、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を活性化する、非天然型（すなわち、合成）ジンクフィンガータンパク質は、例えば、脳卒中の処置において、血管新生を促進するために、ＳＢ６２３細胞と組み合わせて使用し得る。
【０１１７】
さらなる実施態様において、抗血管新生促進分子の転写を阻害する、天然又は合成転写調節タンパク質（例えば、合成ジンクフィンガー転写調節タンパク質）は、血管新生促進剤として使用し得る。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：馴化培地
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を、記載のように得て及び／又は調製した。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年３月２３日）及び米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）、２０１０／０３１０５２９号（２０１０年１２月９日）、２０１１／０２２９４４２号（２０１１年９月２２日）、及び２０１１／０３０６１３７号（２０１１年１２月１５日）を参照し；これらの開示は、ＳＢ６２３細胞（これらの文献において、「神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」及び「神経再生細胞（ｎｅｕｒａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）」として様々に称される）の調製を記載する目的のために、それらの全体について、参照により組み込まれる。細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、２ｍＭのＬ‐グルタミン及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ（両方））を補った、α‐ＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を含む成長培地で培養した。ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞は、フローサイトメトリーで測定した通り、典型的に、ＣＤ２９、ＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、そしてＣＤ３１、ＣＤ３４、又はＣＤ４５を発現していなかった。
【０１１９】
本明細書に記載される実験で使用するために、同じヒトドナー由来の凍結ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を解凍し、成長培地に再播種し、そして約１週間回復させた。馴化培地を得るために、細胞を、約９０％コンフルエンス（〜１５，０００細胞／ｃｍ2）まで増殖させ、プレートを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、そして培地を、次にＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で置換し、同じ細胞密度を維持した。馴化培地を、７２時間後に採取した。馴化培地の凍結サンプルを、使用前に３７℃にゆっくりと加温した。
【０１２０】
実施例２：ＨＵＶＥＣ生存に対するＳＢ６２３細胞分泌因子の影響
脳虚血は、患部への栄養供給の損失をもたらし得る。ＳＢ６２３細胞及びＭＳＣ由来の可溶性因子が、栄養欠乏内皮細胞に対する回復効果を有するかどうかを決定するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、血清及び増殖因子欠乏培地において、２４時間培養し、次に、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞由来の馴化培地（ＣＭ）に供した。対照培地は、ＣＭを添加しない、血清及び増殖因子欠乏培地のままである。ＨＵＶＥＣの生存率及び増殖能力を、その後、評価した。
【０１２１】
これらの実験のために、ヒト臍帯静脈内皮細胞を、２回通過させ、次に７．５×１０5細胞を、０．１％のゼラチンでコーティングした、Ｔ‐７５フラスコで、ＥＢＭ‐２／ＥＣＧＳ培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ‐２／Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ；Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において播種し、そして２４時間培養した。ＨＵＶＥＣ単層を、温かいＰＢＳで２回洗浄し、そして１２ｍｌの新鮮なＥＢＭ‐２培地で、３７℃、５％のＣＯ2で、一晩インキュベートした。ＣＭの影響を、それぞれのフラスコ由来の６ｍｌの培地を取り出し、そしてそれを、６ｍｌの新鮮なＯｐｔｉＭＥＭ（対照）、６ｍｌのＭＳＣ馴化培地、又は６ｍｌのＳＢ６２３細胞馴化培地（実施例１に記載のように調製した馴化培地）と置換することにより、その後、評価した。７日後、非付着及び付着細胞を採取し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして次の染色分析のために３つの画分に分けた（ＰＬ、Ｂｃｌ‐２及びＫｉ６７）。
【０１２２】
死んだ細胞は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に透過性であるので、細胞死を定量化するために、細胞を、ＰＩで染色した。細胞を、５μｇ／ｍｌのＰＩで、３０分間室温で染色し、そしてフローサイトメトリー収集及び分析を、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｐｒｏｇｒａｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のＦＬ‐２対数チャンバーを使用して行った。本アッセイについて、３人の異なるヒトドナーペアを試験した。結果を、図１に示す。栄養欠乏培地で７日間保持した対照ＨＵＶＥＣ培養物において、細胞の７０％超が、ヨウ化プロピジウム染色に関して陽性であった。ＳＢ６２３又はＭＳＣ馴化培地のいずれかの添加は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合を有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
【０１２３】
これらの結果は、ＭＳＣ馴化培地及びＳＢ６２３細胞馴化培地の両方が、血清及び増殖因子欠乏により生じる内皮細胞の死を有意に減少させる（すなわち、ヨウ化プロピジウム陽性ＨＵＶＥＣの数を減少させる）ことを示す。
【０１２４】
Ｂｃｌ‐２は、もともと、特定のＢ細胞リンパ腫において過剰発現されるものとして同定された抗‐アポトーシスタンパク質である。従って、Ｂｃｌ‐２タンパク質を発現している細胞画分を、血清／増殖因子欠乏ＨＵＶＥＣにおいて、それらのアポトーシスの可能性の指標として測定した。Ｂｃｌ‐２測定のために、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そして０．１％のトリトン‐Ｘ１００で１時間、透過処理した。透過処理後、細胞を、氷上で、フルオレセインコンジュゲート抗‐Ｂｃｌ‐２で、１時間、染色し、次に、サンプルを、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ‐１チャンネル上で、洗浄、収集、及び分析した。フルオレセインコンジュゲートＩｇＧに供した細胞を、陰性対照として使用した。これらのアッセイのために、３人の異なるヒトドナーペアを試験した。
【０１２５】
図２において示された結果は、ＭＳＣ馴化培地又はＳＢ６２３細胞馴化培地のいずれかの存在が、血清欠乏内皮細胞の培養物において、Ｂｃｌ‐２陽性細胞画分を有意に増加したことを示す。
【０１２６】
ＮＳＣ又はＳＢ６２３細胞由来の馴化培地が、死細胞（ＰＩ‐陽性）の数を減少させ、そして抗‐アポトーシスＢｃｌ‐２タンパク質を発現する細胞の数を増加させたことは、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の両方が、内皮細胞の生存を高める因子を分泌したことを示す。
【０１２７】
実施例３：ＨＵＶＥＣ増殖に対するＳＢ６２３細胞分泌因子の影響
Ｋｉ６７は、細胞周期のＧ０（静止）期から出た細胞において存在するタンパク質であり；従って、Ｋｉ６７のレベルは、細胞増殖の尺度として使用し得る。Ｋｉ６７タンパク質を発現する細胞画分を、血清及び増殖因子を欠乏させたＨＵＶＥＣにおいて測定し、その後、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞のいずれか由来の馴化培地で培養した。
【０１２８】
Ｋｉ６７測定のために、実施例２に記載のように、ＨＵＶＥＣを培養し、そしてＣＭに供した。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、そして０．１％のトリトン‐Ｘ１００で１時間、透過処理した。透過処理後、細胞を、氷上で、フルオレセインコンジュゲート抗‐Ｋｉ６７抗体で１時間染色し、その後、サンプルを、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのＦＬ‐１チャンネル上で、洗浄、収集、及び分析した。フルオレセインコンジュゲートＩｇＧに供した細胞を、陰性対照として使用した。これらの分析のために、３人の異なるヒトドナーペアを試験した。
【０１２９】
図３は、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞のいずれか由来の馴化培地の存在下で、欠乏ＨＵＶＥＣの培養物が、馴化培地に供していない対照ＨＵＶＥＣと比較して、増加したＫｉ６７を発現する細胞画分をもたらすことを示す。ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞由来の馴化培地が、増殖に関連するＫｉ６７タンパク質を発現する細胞の数を増加させたことは、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞が、内皮細胞増殖を高める因子を分泌することを示す。
【０１３０】
本実施例及び従前の実施例で示した結果は、これらの内皮細胞を、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞馴化培地で、７日間培養した場合、非馴化培地における培養物と比較して、ＨＵＶＥＣの生存及び増殖の有意な増加を明らかにした（ｐ＜０．０５）。
【０１３１】
実施例４：内皮細胞による管形成に対するＳＢ６２３細胞分泌因子の影響
ＨＵＶＥＣ管形成アッセイを、血管形成を刺激する因子を詳しく述べるためにＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の能力を試験するために用いた。例えば、ＥＪ Ｓｍｉｔｈ ＆ ＣＡ Ｓｔａｔｉｏｎ，“Ｔｕｂｕｌｅ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ，”ｉｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙｓ‐Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ａｐｐｒａｉｓａｌ ｏｆ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｂｉｃｋｎｅｌｌ， ｅｄｓ．）．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．,Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ，ｐｐ.６５‐８７，２００６；及びＧｏｏｄｗｉｎ（２００７）Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．７４：１７２‐１８３を参照のこと。
【０１３２】
ＨＵＶＥＣを、ＥＢＭ‐２／ＥＣＧＳ培地に５回通し、次に、１×１０５細胞／ｍｌの密度で、α‐ＭＥＭ／０．５％ ＦＢＳ／２ｍＭ グルタミン／ペニシリン‐ストレプトマイシンに移した。２４時間後、ＨＵＶＥＣを、０．２５％のトリプシン‐ＥＤＴＡを使用して採取し、洗浄し、そして１×１０５細胞／ｍｌの密度で、α‐ＭＥＭ／２ｍＭ グルタミン／ペニシリン‐ストレプトマイシンに再懸濁した。７５μｌのＨＵＶＥＣと７５μｌのＭＳＣ又はＳＢ６２３馴化培地（実施例１）のいずれか、又は７５μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地（陰性対照）の混合物を、各ウェルに、５０μｌのＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＧＦ）‐ベースメントゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加することにより前処理した、９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、そしてプレートを、３７℃で４５分間、インキュベートした。本アッセイのために、ＭＳＣを、３人の異なるヒトドナーから取得し、そしてそれぞれのドナー由来のＭＳＣの一部をＳＢ６２３細胞に変換した。
【０１３３】
１６時間後、培養物を、位相差顕微鏡及び写真により観察した。完全な管（接触している細胞により形成）の数を、群を知らされていない実験者によって定量化した。３人のドナーのいずれかからの結果を示す写真を、図４に示す。図５にまとめた、３人すべてのドナー由来のＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を使用するアッセイの結果は、管形成が、ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞のいずれか由来の馴化培地によって強力に高められることを示す。従って、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞は、血管形成を促進する因子を分泌する。
【０１３４】
実施例５：血管伸長及び分岐に対するＳＢ６２３細胞分泌因子の影響
虚血損傷後の血管系の回復は、残存している内皮細胞が、それらの移動及び浸潤を促進するシグナルを受け取る必要がある。そのようなシグナルは、とりわけ、血管平滑筋細胞、単球及び／又はマクロファージから生じ得る。血管発芽及び分岐に関わる因子の分泌を試験するために、大動脈輪アッセイを使用した。例えば、Ｎｉｃｏｓｉａ ＆ Ｏｔｔｉｎｅｔｔｉ（１９９０）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：１１５‐１２２及びＮｉｃｏｓｉａ（２００９）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１３：４１１３‐４１３６を参照のこと。
【０１３５】
大動脈輪の調製のために、スプラーグ‐ドーリ（Ｓｐｒａｇｕｅ‐Ｄａｗｌｅｙ）ラットの成獣を、解剖の前に安楽死させた。大動脈の両端を鉗子で止め、それを除去し、そして氷冷α‐ＭＥＭ／ペニシリン‐ストレプトマイシン培地に、外脂肪層を除去する前に、移した。脂肪不含大動脈を、１．０ｍｍの厚さの輪に分ける前に、氷冷ＥＢＭ‐２／ペニシリン‐ストレプトマイシン培地で２回洗浄した。大動脈輪をその後、ＥＢＭ‐２／ペニシリン‐ストレプトマイシン培地を含むプレートに移し、そして３７℃、５％のＣＯ2で、６日間インキュベートし、３日目に培地を新鮮なＥＢＭ‐２／ペニシリン‐ストレプトマイシン培地と置換して、すべての内因性のラット血管新生因子を欠乏させた。その時点で、培地を、α‐ＭＥＭ／ペニシリン‐ストレプトマイシン培地で置換し、そして培養を、２４時間続けた。
【０１３６】
大動脈輪アッセイの０日目（培養開始後７日）、５０μｌのＲｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＲＧＦ）ベースメントゲルを、２４ウェルプレートの各ウェルに堆積させた。各大動脈輪を、各ゲルコーティングされたウェルの真ん中に置き、そして追加の２５μｌのＲＧＦベースメントゲルを重ねた。ゲルの凝固のために、３７℃／５％ ＣＯ2で、３０分間放置後、５００μｌのα‐ＭＥＭ／２ｍＭグルタミン／ペニシリン‐ストレプトマイシンを、各ウェルに添加し、そしてインキュベーションを、さらに３０分間続けた。その後、５００μｌのＭＳＣ又はＳＢ６２３由来馴化培地（実施例１）のいずれかを添加した。陰性対照として、５００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地を、馴化培地の代わりに使用した。
【０１３７】
ＭＳＣ及びＳＢ６２３由来因子の血管新生活性を評価するために、位相差写真を、１０日目に撮影し、そして結果を、群を知らされていない実験者によって、血管伸長及び分岐を数えることにより定量した。新たな血管の増殖を、輪から伸長する血管の数を測定することにより定量し；血管分岐を、大動脈輪から伸長する血管に存在する分岐点の数を測定することにより定量した。
【０１３８】
１０日目のサンプル由来の代表的な結果を、図６に示し、そして１０日目の培養物の７組由来の結果を、図７にまとめそして定量する。図７Ａは、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の両方に由来する馴化培地が、対照大動脈輪と比較して、新たに発芽した血管の数及び分岐の程度の増加を刺激したことを示す。さらに、血管分岐の有意な増加を、ＭＳＣ馴化培地において培養した輪（図６Ｂ、図７Ａ）、又は非馴化培地において培養した輪（図６Ａ、図７Ａ）のいずれかと比較して、ＳＢ６２３細胞馴化培地において培養した輪（図６Ｃ、図７Ａ）で観察した。これらの結果は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞が、血管発芽及び血管分岐を促進する因子を分泌することを示す。特に、ＳＢ６２３細胞は、大幅に血管分岐を促進する因子を分泌する（図７Ｂ参照）。
【０１３９】
前述の実施例で示したデータは、ＳＢ６２３細胞分泌可溶性因子が、血管新生のいくつかの側面を促進し、そして損傷した脳における回復に寄与することを示す。
【０１４０】
実施例６：統計
各実験（３〜４ウェル／群）について、平均値を、（１）各細胞種の処理条件（ＭＳＣ又はＳＢ６２３細胞由来の馴化培地；試験したヒトドナーあたり１つの値）及び（２）非処理群（試験の各回に１つの値）について得た。統計比較（ＳｉｇｍａＳｔａｔ，ＳｙｓｔａｔＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）について、これらの値のそれぞれを使用し、そして比較を、以下の群（１）対照（非馴化培地；ｎ＝３）、（２）ＭＳＣ馴化培地（ｎ＝３〜５）；及び（３）ＳＢ６２３細胞馴化培地（３〜５）の間で、一元配置分散分析法（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。追加のペアワイズ比較を、Ｔｕｋｅｙ法を使用して行った。０．０５のα値を、平均が有意に異なるかどうかを決定するために使用した。
【０１４１】
実施例７：ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞によって分泌された血管新生因子の同定
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞における、特定のサイトカイン及び栄養因子のレベルを測定した。馴化培地を得るために、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞を、増殖培地中で、９０％コンフルエンスまで（〜１５，０００細胞／ｃｍ2）培養し、その時点で培地を除去し、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、そしてＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加して、〜１５０，０００細胞／ｍｌの濃度を得た。馴化培地を、７２時間後、回収し、そして取扱説明書に従って、Ｑｕａｎｔｉｂｏｄｙ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓａｙ １（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を使用してアッセイした。ＭＳＣの各ソースについて、細胞の一部を、ＭＳＣとして直接培養し、そして一部を、ＳＢ６２３細胞に変換した。従って、特定のドナー由来のＭＳＣの培養物及びこれらのＭＳＣから作成されたＳＢ６２３細胞の培養物を、対応「ドナーペア（ｄｏｎｏｒ ｐａｉｒ）」として称する。本実験において、４つのドナーペアをアッセイした。タンパク質の濃度として表した濃度を、馴化培地を採取した時、培養物中に存在する細胞の数を標準化した。図８は、ドナーによる、アンジオゲニン、ＡＮＧ‐２、ＨＢ‐ＥＧＦ及びＰＩＧＦについての結果を示す。図９は、またドナーによる、これらの４つの因子、及び他の６つについての結果を示し、そしてＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞によって産生された大量のＶＥＧＦを強調する。
【０１４２】
表１は、１０個の試験した因子について、４つのドナーペアの間で平均したタンパク質レベルを示す。分泌される栄養因子のレベルは、異なるドナーの間で変化したが（例えば、図８及び９に示すように）、４つの因子のレベル（アンジオゲニン、アンジオポエチン‐２、ＨＢ‐ＥＧＦ及びＰＩＧＦ）は、一貫してＭＳＣとＳＢ６２３細胞の間で異なった。アンジオゲニン、ＡＮＧ‐２、及びＨＢ‐ＥＧＦは、ＳＢ６２３細胞によってより高発現されたが、ＰＩＧＦのより高い濃度が、ＭＳＣによって産生された。
【０１４３】
【表１】
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【０１４４】
略語は以下の通りである。ＡＮＧ‐２：アンジオポエチン‐２；ＥＧＦ：上皮増殖因子；ｂＦＧＦ：塩基性線維芽細胞増殖因子／線維芽細胞増殖因子２；ＨＢ‐ＥＧＦ：ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子ＨＧＦ：肝細胞増殖因子；ＰＤＧＦ‐ＢＢ：血小板由来増殖因子‐ＢＢ；ＰＩＧＦ：胎盤増殖因子；ＶＥＧＦ：血管内皮細胞増殖因子。数字は、ｐｇ／ｍｌ／１０6細胞として表されたサイトカインレベルを意味する。「ＡＶＧ」は、馴化培地が得られた、ＭＳＣの４つのソース及びＳＢ６２３細胞の４つのソースからの平均値を意味する。「ＳＤ」は、標準偏差を意味する。「‐」は、たとえあったとしても、レベルが、アッセイにおける検出限界未満であったことを示す。「Ｎ／Ａ」は、「非適用（ｎｏｔ ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）」を示す。
【０１４５】
実施例８：ＨＵＶＥＣ生存率及び増殖に対するＶＥＧＦシグナル伝達阻害の影響
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞の両方によって分泌される大量のＶＥＧＦを考慮して、ＭＳＣ及びＳＢ６２３馴化培地の血管新生促進活性に対するＶＥＧＦの寄与を、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤を使用して試験した。ＳＵ５４１６（ＶＥＧＦＲ２キナーゼ阻害剤ＩＩＩ，ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）は、ＶＥＧＦ受容体２（Ｆｌｋ‐１）、より少ない程度に、ＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ‐１）及び他の受容体チロシンキナーゼによる下流シグナル伝達を阻止して、それによって、血管新生を阻害する。
【０１４６】
ＨＵＶＥＣ生存率アッセイ（ヨウ化プロピジウムの取り込み及びＢｃｌ‐２発現）を、５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下及び不存在下で、ＳＢ６２３細胞馴化培地の２つのバッチについて、細胞を、アッセイ前に７日間の代わりに５日間培養したことを除いて、実施例２に記載のように実施した。阻害剤を、ＣＭの添加３０分前に、培養物に添加した。より高い濃度のＳＵ５４１６は、ＶＥＧＦＲ２よりも他の受容体チロシンキナーゼを阻害し得るので、本ＳＵ５４２６濃度を、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達（しかしながら、例えば、ＰＤＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、又はＦｌｔ３によっては伝達されない）を阻害するように選択した。図１０Ａ及び１０Ｂに示した結果は、ＨＵＶＥＣがＳＢ６２３馴化培地及びＳＵ５４１６中で培養された場合の方が、それらが、ＳＢ６２３細胞馴化培地単独で培養された場合よりも、より細胞が、ＰＩを取り込み（図１０Ａ）、そして細胞が、より少ない抗‐アポトーシスタンパク質を発現する（図１０Ｂ）ことを示す。従って、ＶＥＧＦ受容体活性の阻害は、ＨＵＶＥＣの生存率に対するＳＢ６２３細胞馴化培地の好影響を部分的に低減し、これらの効果におけるＶＥＧＦタンパク質の役割を示す。
【０１４７】
ＳＢ６２３細胞因子によるＨＵＶＥＣ増殖の刺激に対するＶＥＧＦ受容体阻害剤の影響をまた評価した。Ｋｉ６７の発現に関するアッセイを、５０ｎＭのＳＵ５４１６を、馴化培地の添加３０分前に培地に添加し、そして細胞を、アッセイ前に７日間の代わりに５日間培養したことを除いて、実施例３に記載のように実施した。図１１に示され及び２つのドナーから平均された結果は、ＳＢ６２３細胞由来の馴化培地の存在下で観察されたＨＵＶＥＣ増殖の増大を、ＶＥＧＦＲ２の阻害によって部分的に逆転したことを示す。
【０１４８】
これらの結果は、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞馴化培地の生存促進及び増殖促進活性において、他のＳＢ６２３細胞由来因子に加えて、ＶＥＧＦの役割を指摘する。
【０１４９】
実施例９：ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成に対するＶＥＧＦシグナル伝達阻害剤の影響
ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞由来の馴化培地を伴うＨＵＶＥＣ管形成アッセイを、ＶＥＧＦ２受容体阻害剤ＳＵ５４１６の存在下及び不存在下で、実施例４に記載のように行った。馴化培地の不存在下で培養した細胞を、陰性対照として使用し；そしてＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した細胞を、陽性対照として使用した。図１２に示される結果は、ＶＥＧＦ、ＭＳＣ馴化培地及びＳＢ６２３細胞馴化培地のすべてが、管形成を促進したが、一方、ＶＥＧＦ２阻害剤ＳＵ５４１６は、これらの薬剤すべてによる管形成の刺激を低減したことを示す。
【０１５０】
管形成の定量を、播種後１６及び４０時間で、ＳＵ５４１６の存在下及び不存在下で、ＳＢ６２３細胞馴化培地に供したＨＵＶＥＣについて、実施例４に記載のように実施した。図１３に示される結果は、両時点において、ＶＥＧＦＲ２の阻害が、管形成に対するＣＭの好影響を完全に逆転することを示す。
【０１５１】
実施例１０：大動脈輪アッセイにおける血管伸長及び分岐に対するＶＥＧＦシグナル伝達阻害の影響
大動脈輪血管新生アッセイを、５０ｎＭのＳＵ５４１６の存在下及び不存在下で、ＳＢ６２３細胞馴化培地の１つのバッチにおいて、実施例５に記載のように実施した。阻害剤を、ＣＭの添加３０分前に培養物に添加し、そして輪を、培養１０日後にアッセイした。結果は、ＳＢ６２３細胞馴化培地における大動脈輪の培養物に由来する血管伸長及び分岐（図１４、左及び中央パネルの比較）が、ＶＥＧＦ受容体阻害剤ＳＵ５４１の存在下（図１４、中央及び右のパネルの比較）で低減したことを示す。これらの結果は、ＳＢ６２３細胞馴化培地の血管新生促進活性におけるＶＥＧＦの役割についてさらなる証拠を提供する。
【０１５２】
ＶＥＧＦ受容体阻害剤を使用して得られた結果（上記）は、これらのプロセス（特に、管形成、血管伸長及び血管分岐）に対するＶＥＧＦの重要性を確信した一方で、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞馴化培地の血管新生促進活性におけるさらなる因子（ＶＥＧＦ以外）の関与を除外しない。
【図４】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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