(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルであって、カリウムイオンの含量が１０〜７００ｐｐｍであり、粒径５００μm以下の粉体を６２重量%以下含有し、かつ、ナトリウムイオンの含量が０．０１〜６．０ｐｐｍである血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル。
ＲＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−Ｈ    （１）
［式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、４〜５００の数を表す。］
【請求項２】
ｎが２０〜３００の数である請求項１に記載の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル。
【請求項３】
ナトリウムイオンの含量が５００ｐｐｍ以下であるアルカリ金属化合物（Ａ）の存在下で、メタノール、グリコール（Ｂ）又は（Ｂ）のモノメチルエーテルにエチレンオキサイドを付加反応させる工程を含む請求項１または２に記載の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエチレングリコールはその毒性が低いことから、種々の薬物の添加剤として利用されている。また、工程薬剤として血漿分画用としても利用されている。
血漿分画とは、多量の血漿成分から治療に有用なタンパク質を精製することである。血漿タンパクは１００種類以上のタンパク成分からなり、主な成分はアルブミン、グロブリン、各種血液凝固因子、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、プラスミノーゲン、プロトロンビン等である。血漿からこれらの血漿タンパク成分に分画する方法としては、コーンの低温エタノール分画法、硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法（以下、ＰＥＧ分画と略記）等が知られている。
この中のＰＥＧ分画に使用されるポリエチレングリコールは、通常、エチレングリコール、ジエチレングリコール及びトリエチレングリコール等の活性水素を２個以上有する化合物に、アルカリ触媒存在下でエチレンオキサイドを付加重合することにより製造される。そして、毒性の強いアルデヒドなどの副生物を抑制する観点から、蒸留した原料を使用する方法（特許文献１）や、遠心式薄膜分子蒸留機を使用し精製する方法（特許文献２）がなされてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００７−５１４０２８号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３２３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のポリエチレングリコールは、製造直後は、副生物は抑制されているものの、経時的にアルデヒド等のカルボニル化合物が発生し、血漿分画用として使用した場合、得られるタンパクに影響を与えることがあった。
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたものであり、経時的にアルデヒドなどのカルボニル化合物の発生を抑制し、優れた製品安定性を有する血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の目的を達成すべく検討を行った結果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、下記一般式（１）で表される血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルであって、カリウムイオンの含量が１０〜７００ｐｐｍであり、粒径５００μm以下の粉体を６２重量%以下含有し、かつ、ナトリウムイオンの含量が０．０１〜６．０ｐｐｍである血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルである。
ＲＯ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−Ｈ    （１）
[式中、Ｒは水素原子又はメチル基を表し、ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、４〜５００の数を表す。］
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールのモノメチルエーテル中の経時的なカルボニル化合物の発生を抑制することができ、血漿分画において本発明のポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールのモノメチルエーテルを使用した場合、得られるタンパク質の収率が向上するという効果を奏する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、一般式（１）で表されるポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールのモノメチルエーテルである。
一般式（１）におけるＲは、水素原子又はメチル基である。血漿分画能の観点から、水素原子であることが好ましい。本発明の一般式（１）におけるＲは、水素原子又はメチル基以外の場合、経時的なカルボニル化合物の発生量が多くなり、ｐＨ低下や血漿分画において得られるタンパク質へ影響を及ぼすという問題が生じる。
【０００８】
ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数を表し、４〜５００の数である。なお、ｎは整数であるとは限らず、少数の場合もある。ｎが４未満又は５００より大きい場合、血漿分画能が低下する。
【０００９】
一般式（１）におけるｎは、血漿分画能の観点から、好ましくは２０〜３００であり、更に好ましくは４５〜１８０である。
【００１０】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、経時安定性の観点から、カリウムイオンの含量が１０〜７００ｐｐｍであり、かつ、ナトリウムイオンの含量が０．０１〜６．０ｐｐｍである。カリウムイオンの含量が好ましくは１０〜６５０ｐｐｍであり、かつ、ナトリウムイオンの含量が０．０１〜５．０ｐｐｍであり、カリウムイオンの含量がさらに好ましくは１０〜１００ｐｐｍであり、かつ、ナトリウムイオンの含量が０．０１〜４．５ｐｐｍである。
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、ナトリウムイオンの含量が６．０ｐｐｍを超えると経時的なカルボニル化合物の発生量が多くなり、ｐＨ低下や血漿分画において得られるタンパク質へ影響を及ぼすという問題が生じ、また、カリウムイオンの含量が７００ｐｐｍを超えると、血漿分画能が低下する。
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルのナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンの含量は、アルカリ金属化合物（Ａ）の使用量及び／又はナトリウムイオンの含量が５００ｐｐｍ以下である（Ａ）を使用することにより調整することができる。例えば、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンの含量を減らす場合には、アルカリ金属化合物（Ａ）の使用量を減らす方法及び／又はナトリウムイオンの含量が好ましくは５００ｐｐｍ以下の（Ａ）を使用する方法等が挙げられる。
【００１１】
ナトリウムイオンの含量及びカリウムイオンの含量の測定方法としては、公知の方法、例えばイオンクロマトグラフィー法、原子吸光法、ICP発光分析法が利用できるが、分析の精度の観点から、ICP発光分析法が好ましい。
＜ICP発光分析法による血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテル中のナトリウムイオン及びカリウムイオン含量の測定方法＞
ICP発光分析法には、ICP発光分析装置（VARIAN社製、Vａｒｉａｎ７３０−ＥＳ）を用いて分析した。超純水で１０００倍に希釈した試料をＩＣＰ発光分析装置で定量した。測定波長は、ナトリウムが５８９．５９２ｎｍであり、カリウムが７６６．４９１ｎｍであった。この時、ナトリウム及びカリウムを超純水で、５０、１００、２００、５００ｐｐｂに希釈したものを検量線として用いた。
【００１２】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、重量平均分子量が、好ましくは２００〜２２，０００であり、更に好ましくは４００〜２０，０００である。
この測定法は、第１６改正日本薬局方「マクロゴール４０００」の平均分子量試験に準ずる。
【００１３】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、取り扱いの観点から、粒径５００μm以下の粉体を好ましくは６２重量%以下含有し、更に好ましくは６０重量％以下含有する。粒径の測定は、ＪＩＳ Ｚ８８１５−１９９４に準拠して測定され、例えば、内径１５０ｍｍ、深さ４５ｍｍのふるい｛目開き（μｍ）：７１０、５００、３００、１５０及び１０６｝を、目開きの狭いふるいを下にして重ね、一番上の最も目開きの広い７１０μｍのふるいの上に、測定試料５０ｇを入れ、ふるい振動機にて１０分間ふるい、各ふるいの上に残った測定試料の重量を測定し、最初の測定試料の重量に基づく各ふるいの上に残った測定試料の重量％を求めることによって測定することができる。
【００１４】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、経時安定性の観点から、ナトリウムイオンの含量が好ましくは５００ｐｐｍ以下であり、より好ましくは４００ｐｐｍ以下であるアルカリ金属化合物（Ａ）の存在下で、グリコール（Ｂ）にエチレンオキサイドを付加反応させる工程を含む方法により製造することができる。
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルのナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンの含量は、アルカリ金属化合物（Ａ）の使用量及び／又はナトリウムイオンの含量が５００ｐｐｍ以下である（Ａ）を使用することにより調整することができる。例えば、ナトリウムイオン及び／又はカリウムイオンの含量を減らす場合には、アルカリ金属化合物（Ａ）の使用量を減らす方法及び／又はナトリウムイオンの含量が好ましくは５００ｐｐｍ以下の（Ａ）を使用する方法等が挙げられる。
ナトリウムイオンの含量は、前記ICP発光分析法で測定することができる。
【００１５】
本発明の血漿分画用ポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは通常、以下の方法等で製造することができる。アルカリ金属化合物（Ａ）の存在下、メタノール又はグリコール（Ｂ）にエチレンオキサイドを反応温度９０〜１９０℃で開環付加反応した後、１３０℃〜１５０℃において、６．７ｋＰａ以下の減圧条件で５時間、脱エチレンオキサイド工程を行い、粗ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールのモノメチルエーテルを得ることができる。その後、ｐＨ調整を行うことでポリエチレングリコール又はポリエチレングリコールのモノメチルエーテルを製造する方法等が例示できる。
エチレンオキサイドの添加方法は特に限定されず、一度に全量を加えてもよいし、複数回に分割して添加してもよい。通常、開環付加反応における圧力は、安全性の観点から−０．１ＭＰａＧ〜０．５ＭＰａＧであることが好ましい。
【００１６】
アルカリ金属化合物（Ａ）としては、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、又はナトリウムメチラート等が挙げられる。これらは１種類でもよいし２種類以上を併用してもよい。開環付加反応を複数回に分けて行う場合は、反応ごとに異なる種類の化合物を使用してもよい。
これらのうち、アルカリ金属化合物（Ａ）としては、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウムが好ましい。
【００１７】
アルカリ金属化合物（Ａ）の使用量は、メタノール又はグリコール（Ｂ）１ｍｏｌに対して、好ましくは１〜１００ｍｍoｌであり、更に好ましくは１〜１０ｍｍoｌである。
【００１８】
グリコール（Ｂ）としては、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、これらのモノメチルエーテル及びこれらのエチレンオキサイド付加物からなる群から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
【００１９】
リン酸及び／又は有機酸（Ｃ１）としては、リン酸；有機カルボン酸［蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸等］が挙げられる。これらのうち、リン酸、シュウ酸又はクエン酸が好ましい。
ｐＨ調整剤（Ｃ）は、前記の（Ｃ１）を水で希釈してもよく、１０〜９５重量％に希釈したものが好ましい。
【００２０】
ｐＨ調整は、リン酸及び／又は有機酸（Ｃ１）を含有するｐＨ調整剤（Ｃ）を加え、中和後のポリエチレングリコール５重量％水溶液のｐＨが好ましくは５．５〜７．５であり、更に好ましくは６．５〜７．５である。
ｐＨはポリエチレングリコール５重量％水溶液を測定した。これは、日本薬局方「マクロゴール４０００」の規格に準ずる。
【００２１】
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
＜実施例１＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール２９７ｇ（２．８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が２７５ｐｐｍである水酸化カリウム０．０４ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１２５±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド１３８３ｇ（３１．４ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、１００±５℃に冷却し、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が２７５ｐｐｍである水酸化カリウム０．０８ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１２５±５℃、６．７ｋＫＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４ｍｏｌ）を１３５±５℃で開環付加反応させた後、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却した。冷却後、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のカリウムイオン含量は４２ｐｐｍ、ナトリウムイオン含量は０．０３ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２３】
＜実施例２＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール２９７ｇ（２．８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が３８２ｐｐｍである水酸化カリウム０．０４ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１４５±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド１３８３ｇ（３１．４ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８mol）、ナトリウムイオン含量が３８２ｐｐｍである水酸化カリウム０．０８ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１３０±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。更に１４５℃まで昇温後、エチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４mol）を１７０±５℃の温度で開環付加反応させた。６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却し、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のカリウムイオン含量は４２ｐｐｍ、ナトリウムイオン含量は０．０２ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２４】
＜実施例３＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール１４９ｇ（１．４ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が５７％である水酸化ナトリウム０．０１ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１４５±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド６９２ｇ（１５．７ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が３７６ｐｐｍである水酸化カリウム０．０８ｇ（１．４ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１３０±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。更に、エチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４ｍｏｌ）を１３５±５℃の温度で開環付加反応させた。６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却し、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のカリウムイオン含量は３９ｐｐｍ、ナトリウムイオン含量は１．８ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２５】
＜実施例４＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール２９７ｇ（２．８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が２９９ｐｐｍである水酸化カリウム０．０４ｇ（０．６３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１２５±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド１３８３ｇ（３１．４ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、１００±５℃に冷却し、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８ｍｏｌ）、ナトリウムイオン含量が２９９ｐｐｍである水酸化カリウム０．０４ｇ（０．７ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１２５±５℃、６．７ｋＫＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド３７３ｇ（８．５ｍｏｌ）を１３５±５℃で開環付加反応させた後、６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却した。冷却後、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝２２）のカリウムイオン含量は６０ｐｐｍ、ナトリウムイオン含量は０．１ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２６】
＜比較例１＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール１４９ｇ（１．４ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム０．０１ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１２５±５℃、６．７ＫＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド６９２ｇ（１５．７ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム０．０５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１３０±５℃、６．７ＫＰａ以下で減圧脱水した。更に、エチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４ｍｏｌ）を１３５±５℃の温度で開環付加反応させた。６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却し、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のナトリウムイオン含量は２５．７ｐｐｍであり、カリウムイオン含量は２ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２７】
＜比較例２＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール１４９ｇ（１．４ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム０．０１ｇ（０．２ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１４５±５℃、６．７ＫＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド６９２ｇ（１５．７ｍｏｌ）を開環付加反応させた後、６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム０．０５ｇ（１．３ｍｍｏｌ）を投入し、窒素置換後、１３０±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。更に１４５℃まで昇温し、エチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４ｍｏｌ）を１７０±５℃の温度で開環付加反応させた。６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却し、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のナトリウムイオン含量は２５．７ｐｐｍであり、カリウムイオン含量は２ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
【００２８】
＜比較例３＞
撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器にジエチレングリコール１４９ｇ（１．４mol）、ナトリウムイオン含量が０．２２％である水酸化カリウム０．０１ｇ（０．２mmol）を投入し、窒素置換後、１４５±５℃、６．７ＫＰａ以下で減圧脱水した。そこにエチレンオキサイド６９２ｇ（１５．７mol）を開環付加反応させた後、６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、粗ポリエチレングリコールを作製した。更に撹拌機、加熱冷却装置を備えた耐圧反応容器に粗ポリエチレングリコール２８５ｇ（０．４８mol）、ナトリウムイオン含量が０．２２％である水酸化カリウム０．０５ｇ（１．３mmol）を投入し、窒素置換後、１３０±５℃、６．７ｋＰａ以下で減圧脱水した。更に１４５℃まで昇温し、エチレンオキサイド１１２０ｇ（２５．４mol）を１７０±５℃の温度で開環付加反応させた。６．７ｋＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、６．７ＫＰａ以下で脱エチレンオキサイドを行い、８０℃に冷却し、９０重量％のリン酸水溶液を加え、８０±５℃で６０分間撹拌し中和した。取り出し、固化後、ミキサー粉砕を行い、７１０μｍの篩で分級した。得られたポリエチレングリコール（エチレンオキシドの平均付加モル数ｎ＝６７）のナトリウムイオン含量は７．７ｐｐｍであり、カリウムイオン含量は２ｐｐｍであった。このとき、粒径５００μｍ以下の粉体は、６０重量％であった。
＜血漿分画用ポリエチレングリコールの熱劣化処理方法＞
実施例１〜４、比較例１〜３で作製した血漿分画用ポリエチレングリコールをスターラーチップが入ったスクリュー管に２０ｇ入れて、７０℃に温調したウォーターバス中で、大気存在下で回転速度２５０ｒｐｍ、２３時間撹拌を行い熱劣化した血漿分画用ポリエチレングリコールを作製した。
【００２９】
製造直後及び熱劣化させた血漿分画用ポリエチレングリコールのカルボニル含量、ｐＨ及びアンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率は、以下の方法で測定し、その結果を表１及び表２に示す。
【００３０】
＜カルボニル含量測定＞
カルボニル含量は以下の測定法で行った。まず、試料２ｇをイオン交換水２ｍＬに溶かし、５０重量％試料溶液を作製した。２−ニトロフェニルヒドラジン（２−ＮＰＨ）塩酸塩０．０３８ｇを９９．５重量％エタノールで１０ｍＬとし２−ＮＰＨ塩酸塩溶液を作製した。チオ尿素０．２ｇを９９．５重量％エタノールで１０ｍＬとしチオ尿素溶液を作製した。ピリジン０．７ｍＬを９９．５重量％エタノールで１０ｍＬとしピリジン溶液を作製した。カルボジイミド（ＤＣＣ）０．５１６ｇを９９．５重量％エタノールで１０ｍＬとし０．２５Ｍ ＤＣＣ溶液を作製する。更に水酸化カリウム１ｇにイオン交換水１ｍＬを加え、メタノールで１０ｍＬとし、ＫＯＨ溶液を作製した。
２−ＮＰＨ塩酸塩溶液とチオ尿素溶液を５ｍＬずつ混合し、ＮＰＨ・チオ尿素混合溶液を作製した。上記の５０重量％試料溶液６０μＬ、ＮＰＨ・チオ尿素混合溶液１２０μＬ、ピリジン溶液６０μＬ更に０．２５Ｍ ＤＣＣ溶液６０μＬをサンプリングチューブ(MICRO TUBE製)に混合し、ボルテックスミキサーで撹拌後、振とう恒温水槽（タイテック株式会社製、TAIYO PERSONAL INCUBATOR）で３７℃、１時間振とうし、反応させた。反応後、ＫＯＨ溶液３０μＬ混合し、ボルテックスミキサーで撹拌後、更に振とう恒温水槽中で６０℃、１５分間振とうし、反応させた。
その後、５３０ｎｍの波長でプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ）を用い、吸光度測定を行い、カルボニル含量の定量を行った。この時、検量線には酢酸を用いた。
なお、血漿分画用ポリエチレングリコールの製造直後と熱劣化後においてカルボニル含量の差が低いほど、経時的なカルボニル化合物の発生を抑制していることを示す。
【００３１】
＜ｐＨ測定＞
ｐＨはポリエチレングリコール５重量％水溶液のｐＨを測定した。これは、日本薬局方「マクロゴール４０００」の規格に準ずる。
なお、血漿分画用ポリエチレングリコールの製造直後と熱劣化後において血漿分画用ポリエチレングリコール５重量％水溶液のｐＨの差が低いほど、製品安定性に優れていることを示す。
【００３２】
＜アンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率＞
アンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率（重量％）は以下の方法に準じて測定した。まず、希釈溶液にリン酸緩衝液（ライフテクノロジーズジャパン製、ＤＰＢＳ）を使用し、２２重量％試料溶液を作製した。アンチトロンビンＩＩＩ１０μLに２２重量％試料溶液を９０μL加え、サンプリングチューブに混合し、５℃で２時間静置した。アンチトロンビンＩＩＩの残存量の測定には、「ATＩＩＩキット  ベリクローム  ATＩＩＩ  オートB」（SIEMENS製）を使用した。吸光度測定にはプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ製、ＰｏｗｅｒＷａｖｅ  ＸＳ）を用いた。
試料溶液およびブランク（生理食塩水）それぞれ４μLと予め３７℃に加温していたトロンビン試液１２０μLを９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ製）に混和し、37℃で3分間反応させた。予め３７℃に加温していたトシル−グリシル−プロリル−アルギニル−５−アミノ−２−ニトロ安息香酸イロプロピルアミド試薬（基質試薬）（２０μL）を添加し、すばやく撹拌した後、３０秒以内に３７℃で４０７nmにおける初期吸光度を測定した。さらに６０秒後、１２０秒後の吸光度を測定して、1分あたりの吸光度変化率ΔA/分を求め、それをアンチトロンビンＩＩＩの残存量とした。式（２）によりアンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率を算出した。
アンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率（重量％）＝２日後に測定したアンチトロンビンＩＩＩ残存量／試料溶液とアンチトロンビンＩＩＩ配合直後のアンチトロンビンＩＩＩ残存量（２）
なお、血漿分画用ポリエチレングリコールの製造直後と熱劣化後において、アンチトロンビンＩＩＩの活性基準比率の差が低いほど、血漿分画用ポリエチレングリコールのアンチトロンビンＩＩＩに対する影響が低いことを示す。
【００３３】
表１及び表２から明らかなように、本発明で得られるポリエチレングリコールは、経時的なカルボニル化合物の発生を抑制し、かつ、血漿分画において得られるアンチトロンビンＩＩＩへの影響を与えにくいことがわかる。
【００３４】
【表１】
0006023766.tif 000002
【００３５】
【表２】
0006023766.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明で得られたポリエチレングリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルは、経時的なカルボニル化合物の発生が少なく、血漿分画において得られるタンパク質への影響を与えにくいことから、得られるタンパク質の収率向上が期待でき、血漿分画用等に使用されるポリエチレグリコール又は血漿分画用ポリエチレングリコールのモノメチルエーテルとして有用である。