(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を産生する方法であって、前記方法が、
発酵油脂産生工程において、発酵油脂産生および細胞外酵素産生に適切な条件下で、発酵油脂および細胞外酵素の両方を産生することのできる微生物を培養し、そして前記微生物によって発酵油脂および酵素を産生する工程、
酵素調製物としての、または酵素源としての使用のために、発酵油脂および細胞外酵素を含む微生物培養物を得、そして、上澄みからの富化されたタンパク質画分の少なくとも一部を回収する工程、および
微生物細胞から発酵油脂を回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記微生物培養物もしくはその一部または前記上澄みもしくはその一部が、工程に再循環される請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程から遊離されるプロセス水が、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水と比較して、少なくとも５％少ないタンパク質を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記工程から遊離されるプロセス水が、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水と比較して、少なくとも１０％少ないタンパク質を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記微生物培養物の水相または上澄みが濃縮される請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
酵素産生が、微生物培養物中に酵素誘導物質を添加することによって開始および／または維持されるか、または、酵素産生が構成的に起こる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、炭素源としてポリマーバイオマスを含む培地上で培養される請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーバイオマスが、リグノセルロースまたはその画分である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記酵素が、ヒドロラーゼ、酸化還元酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼもしくはリガーゼまたはそれらの任意の混合物を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素がグリコシド結合を加水分解する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、真菌または酵母である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記真菌が、アスペルギルス、トリコデルマ、リゾプスおよびフミコーラの群より選択される属に属している真菌である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記真菌が、アスペルギルス属に属する真菌である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記酵母が、クリプトコッカス属に属する酵母である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
産生された前記酵素が同じまたは別の工業的工程において使用される請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素を産生するための方法に関する。とりわけ、本発明は発酵油脂（single cell oil）工程において酵素を産生するための方法および酵素を同じまたは他の工程で利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の微生物は、細胞内トリアシルグリセロール、発酵油脂を、適切な生理学的条件下蓄積することができる。この特性は、例えば化粧品および栄養的利用などの専門的な使用および付加価値の高い製品を主な目的として、発酵油脂を産生するために利用されてきた。現在まで、これらの目的のための発酵油脂の必要性は、低いかまたは中程度規模の製造工程であって、工程の経済性および製品の供給可能性が重要な役割を占めていない工程によって満たされてきた。
【０００３】
現在、輸送燃料の前駆体としての、化石原料の代替としての非化石原材料の使用に対する興味が高まっている。主要な課題は、発酵油脂の製造が大規模な水性の微生物工程に典型的な課題が避けられ得るように大きな規模で行われなければならないことであるように思われる。特徴的には発酵油脂製造工程は、大きなエネルギーインプットを必要とし、そして、大量の水性の副流および単細胞残渣（single cell debris）を製造する。したがって、超大規模な水性の微生物工程のための現在の技術は、経済的に実行可能であるとは思えず、かつ、環境問題に関するいくつかの問題を含んでいる。
【０００４】
炭水化物は地球上のバイオマスのもっとも豊富な単一の貯蔵物であり、そしてこれゆえ、大規模な発酵油脂製造のための唯一の現実的な基質である。リグノセルロースは、地球上で最も豊富な炭水化物源である。しかしながら、リグノセルロースまたは他の成分のバイオ材料は、それらを微生物にとって栄養素としておよび発酵油脂の供給源として利用可能にさせるために幅広い工程を必要とする。リグノセルロースバイオマスの処理に付随して、例えばリグニンなどの非発酵性の副流が生じるであろう。一方、発酵油脂製造工程それ自身が、かなりの量の栄養素を依然として含んでいる細胞マスおよび副流をもたらす。
【０００５】
様々な発酵工程の副供給流の再利用および全体の工程の経済性の改善が、先行技術におけるいくつかの刊行物に提案されてきている。発酵油脂製造の量的に最大の副流は、発酵排水および細胞からオイルを除去した後に残存する細胞残渣である。特許文献１は、ストラメノパイル界の微生物を増殖させることによる従属栄養発酵による生物学的オイルの製造を開示している。該刊行物は、脱脂されたバイオマスまたは加水分解されたバイオマスを微生物の培養のために使用される培地へリサイクルすることを提案している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／００６４５６７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
先行技術において直面する課題への解決法を提供することが本発明の１つの目的である。特には、本発明は発酵油脂の大規模製造において直面する課題への技術的に有用な解決法を提供することを目的とする。
【０００８】
特に、大規模な発酵油脂製造の経済性を向上させることが可能である解決法を提供することが本発明の１つの目的である。
【０００９】
大規模な発酵油脂製造によって引き起こされる環境的負荷を低減することができる解決法を提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１０】
本発明は、輸送用バイオ燃料の製造に関する問題を解決することを特に目的とする。
【００１１】
これらの目的を達成するために、本発明は、独立クレームに挙げられている特性によって特徴づけられる。他のクレームは発明のより好ましい実施態様を示している。
【００１２】
本発明による方法は、発酵油脂製造工程の副供給流が顕著な量の栄養素を含んでおり、例えばオイル産生微生物などの微生物のための炭素源として役立ち得るという発見に基づく。
【００１３】
驚くべきことに、発酵油脂製造工程の副供給流がまた、顕著な量のタンパク質、とりわけ酵素を含んでいることが発見された。したがって、微生物培養物またはその画分は酵素源として、または酵素調製物として、または酵素調製物の成分として使用され得る。
【００１４】
ある態様において、本発明は、発酵油脂（脂質）および酵素の両方を産生することのできる微生物を、脂質産生に適切かつ酵素産生に適切な条件下で培養することを含む、酵素を産生するための方法を提供し、そして、発酵油脂（脂質）および酵素が前記酵素によって産生される。
【００１５】
本発明の一実施態様において、微生物細胞および使用済み培養培地を含む微生物培養物は回収される。
【００１６】
本発明の別の実施態様において、上澄みおよび／または微生物細胞は微生物培養物から分離され、そして上澄みおよび／または細胞は回収される。
【００１７】
さらに本発明の別の実施態様において、タンパク質画分は微生物培養物中または上澄み中で富化され、そして、富化されたタンパク質画分が回収される。これは、例えば、微生物培養物または上澄みの水相（培養ブロース）を濃縮することなどによって達成され得る。
【００１８】
さらに本発明の別の実施態様において、微生物によって産生された細胞内酵素は、細胞の自己消化または誘発される溶解によって細胞から回収される。細胞から遊離された酵素は上澄みから採取され得る。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、酵素は上澄みから回収される。培養培地に分泌されるまたは細胞溶解によって遊離される酵素は、細胞外であり、そして上澄みから回収され得る。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様によれば、培養培地は、固体または半固体であり、そして酵素は水相へと導入され、そこから回収される。
【００２１】
本発明の様々な実施態様において、酵素は微生物培養物またはその画分から触媒的に活性な形で回収される。
【００２２】
本発明の一実施態様において、微生物培養物または触媒的に活性な酵素を含む液相は、同じバイオ技術的工程へと導入されるか、または、例えばポリマーバイオマスなどの、前記工程において使用されるフィードストックが、前記酵素を用いて前処理される。
【００２３】
本発明の別の実施態様において、微生物培養物または触媒的に活性な酵素を含む液相は、別の工程へと導入されるか、または、例えばポリマーバイオマスなどの、前記工程において使用されるフィードストックが前処理される。
【００２４】
本発明のさらなる一実施態様において、微生物培養物または微生物によって産生された酵素を含む液相は、酵素を産生することのできない微生物を使用するバイオ技術的工程へと導入されるか、または、例えばポリマーバイオマスなどの、前記工程において使用されるフィードストックが前処理される。
【００２５】
同じまたは別の工程は好ましくは発酵油脂産生工程である。
【００２６】
本発明の一実施態様によれば、工程は、フィードストックとしてポリマーバイオマスおよび／または例えばリグノセルロースなどのポリマー糖を使用する工程である。
【００２７】
別の実施態様において、タンパク質に富んだ、微生物培養物または上澄みの画分は、別の工業的工程へ導入されるか、または、別の工業的工程へと供給されるフィードストックを処理するために使用される。
【００２８】
別の実施態様において、タンパク質に富んだ、微生物培養物または上澄みの画分は、別のバイオ技術的工程へ導入されるか、または、別のバイオ技術的工程へと供給される例えばポリマーバイオマスおよび／またはポリマー糖などのフィードストックを処理するために使用される。
【００２９】
本発明のさらなる一実施態様において、微生物培養物中または上澄み中のタンパク質画分は、富化され、回収され、そして任意には精製され、安定化され、乾燥されおよび／または製剤化され、そして酵素調製物としてまたは様々な適用における酵素源として使用される。
【００３０】
本発明のさらなる一実施態様において、酵素は細胞内であり、そして、細胞から得られる。細胞内酵素は、回収され、そして任意には富化され、精製され、分離され、安定化され、乾燥されおよび／または製剤化される。
【００３１】
発酵油脂および酵素の産生における主な有利点は、発酵油脂産生のコスト効率および工程の副流と関連付けられる環境因子が大規模な発酵油脂製造との関連において考慮されることである。さらにまた、統合された工程はポリマーバイオマスのより効率的な利用をもたらし、一方、水性の発酵工程に典型的な副流の生物学的酸素必要量を減少させる。
【００３２】
本発明は、いくつかの経済的および環境的な有利点を提供する：
−リグノセルロース系材料または他のポリマー炭水化物バイオマスを含む材料の処理に関するエネルギーコストが、市販の酵素ならびに熱機械的および化学的処理の代わりに発酵油脂工程それ自身からの酵素を使用することによって低減される。
−発酵油脂産生発酵からの液体の残余物からの酵素タンパク質の除去は、発酵油脂産生から遊離される発酵液の生物学的酸素消費量を減少させる。
−細胞物質の除去の後、実質的に細胞を含まない発酵廃棄溶液は、再使用により適切である。
−発酵油脂工程の炭素バランスは、工程流において生物学的負荷を引き起こす代わりに、酵素タンパク質が減少し、または、発酵廃液から除去され、触媒的目的のために再使用され、または発酵油脂産生工程もしくは別の工業的もしくはとりわけバイオ技術的工程において栄養素として使用される場合に改善される。
−発酵溶液から回収される酵素は、微生物のポリマー化合物または微生物の構成成分の加水分解のために使用され得る。
−本発明の方法は、公知のおよび試験されたユニット操作ならびに工業的に応用可能な微生物種によって実行され得る。
−本発明は発酵油脂産生のためのリグノセルロース系材料の経済的および技術的有用性に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】工程スキームを示す図である。
【図２】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図３】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図４】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図５】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図６】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【図７】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【図８】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図９】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１０】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１１】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１２】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１３】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示す図である。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【図１４】加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【図１５】加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示す図である。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養物ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書において、「発酵油脂産生工程（a single cell oil production process）」とは、脂質合成微生物の生成またはその生成を可能にし、そして脂質を産生するおよび／または蓄える（store）（蓄積する（accumulate））ための生物マス（organism mass）を得ることを可能にする工程、液相から細胞を回収する工程、および細胞から脂質を抽出または回収する工程を含む工程を指す。本明細書中で後に開示されるように、様々な微生物群、例えばバクテリア、古細菌、真菌（糸状菌類）、酵母、および藻類などが発酵油脂産生微生物である。
【００３５】
本明細書中に記載されるように、本発明は、好ましくは脂質および酵素の両方を産生することが可能な微生物を使用する。本明細書のいくつかの実施態様において「微生物（a microorganism）」とは、２つまたはそれ以上の微生物を指す。ある実施態様では、酵素は１つの微生物によって産生され、そして発酵油脂（脂質）は別の微生物によって産生される。
【００３６】
用語「発酵油脂（single cell oil）」は、脂肪性物質であって、その分子が一般的に、脂肪族炭化水素鎖を部分的に含み、非極性有機溶媒に溶解するが水には溶解しにくい物質を意味する。発酵油脂は生体細胞における巨大分子の不可欠な一群である。発酵油脂としては例えば、脂質、脂肪、ワックス、ろうエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪酸エステル、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、および、トリアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはモノアシルグリセロールなどのアシルグリセロールが挙げられる。
【００３７】
本発明における好ましい発酵油脂は、脂質、脂肪、ワックス、アシルグリセロールおよび脂肪酸ならびにその誘導体、特にはトリアシルグリセロールおよびろうエステルである。
【００３８】
本発明と関連して、「脂質（lipid）」は発酵油脂の同義語として使用される。
【００３９】
本発明の一態様において、脂質および酵素の両方を産生することが可能な微生物が、発酵油脂産生工程において脂質産生および酵素産生に適切な条件下で培養されることを含む、酵素を産生するための方法が提供される。微生物は脂質および酵素を産生することができる。発酵油脂（脂質）が微生物細胞および微生物培養物および／または培養培地またはその一部から回収されるか、または、微生物培養物および／または培養培地の様々な画分が酵素調製物としてまたは酵素源として使用される。
【００４０】
本発明の一実施態様において、微生物細胞および使用済み培養培地を含む微生物培養物の少なくとも一部が、酵素調製物としてまたは酵素源として使用される。
【００４１】
本発明の一実施態様において、微生物培養物もしくはその一部または上澄みもしくはその一部が、発酵油脂工程において再循環される。典型的には、１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％、いくつかの実施態様では３０〜７０％、いくつかの実施態様では４０〜６０％、いくつかの実施態様では２０〜５０％の微生物培養物または上澄みが工程中で再循環され、好ましくは発酵油脂産生工程にまたはフィードストックの処理に戻されて再循環される。
【００４２】
別の実施態様において、上澄みおよび／または微生物細胞は、微生物培養物から分離され、そして、酵素調製物としてまたは酵素源として使用される。
【００４３】
上澄みとは実質的に細胞を含まない画分を表わしており、使用済み培養培地または培養物ブロースを含む。上澄みはまた、「発酵液（fermentation liquid）」または「液相（a liquid phase）」とも称され得る。
【００４４】
上澄みおよび細胞が完全に分離される必要はない。いくつかの実施態様において、上澄みは、１％〜５０％の元々の微生物培養物の細胞を含む。いくつかの実施態様において、上澄みは、５％〜４０％の、いくつかの実施態様では５〜３０％の、いくつかの実施態様では１０〜４０％、または２０〜３０％、または４０〜５０％の元々の微生物培養物の細胞を含む。
【００４５】
いくつかの実施態様において、細胞画分は、１％〜５０％の元々の微生物培養物の細胞を含む。いくつかの実施態様において、細胞画分はは、５％〜４０％の、いくつかの実施態様では５〜３０％の、いくつかの実施態様では１０〜４０％、または２０〜３０％、または４０〜５０％の元々の微生物培養物の細胞を含む。
【００４６】
上澄みおよび細胞の分離は、酵素の触媒活性を維持する任意の適切な方法によって行われ得る。
【００４７】
酵素の回収のための好ましい方法は、それによって微生物培養物、上澄みまたはそれらの任意の組み合わせが、当業者によって、その触媒活性を維持しながらの酵素の回収を達成するために処理され得るような方法である。
【００４８】
酵素は、微生物培養物、使用済み培養培地、上澄みおよび微生物細胞から、任意の公知のおよび適切な方法で、または将来において開発される任意の適切な方法で行われ得る。それによって所望の酵素活性を有する酵素を画分に分離し得るような方法についても同様のことが適用される。
【００４９】
それによって触媒的に活性な酵素（または複数の酵素）を含む、微生物培養物または上澄みまたは富化されたタンパク質画分が回収されるような方法は、それらの分子サイズ、イオン性の挙動、水への溶解度、種々の溶質の溶解性、または緩衝因子もしくは表面活性因子もしくは表面−活性化合物もしくは塩を含む溶質混合物中の溶解度に依存し得る。
【００５０】
酵素は、例えば遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーションまたは沈降などを含むがこれらに限定されるわけではない、様々な方法によって培養培地から回収され得る。
【００５１】
必要であれば、酵素は、クロマトグラフィー、電気泳動法、種々の溶解性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出などを含むがこれらに限定されるわけではない、様々な方法によって精製または単離されてもよい。
【００５２】
酵素は、例えば塩、糖、またはグリセロールなどによって安定化されてもよい。
【００５３】
さらに、酵素は、所望の適用のために製剤化されてもよい。
【００５４】
対応する方法は、微生物細胞から酵素を回収する際に適用されることも可能である。
【００５５】
一実施態様において、タンパク質画分は、微生物細胞から回収される。回収は酵素の触媒活性を維持する任意の適切な方法によって行われ得る。
【００５６】
「脂質回収（lipid recovery）」とは、そこで脂質（細胞内脂質）が、機械的、化学的、生化学的、熱機械的または自己触媒的な方法によって、または、これらの方法の組み合わせによって、微生物細胞から回収される工程を指す。
【００５７】
発酵油脂とは典型的には、微生物によって細胞内で合成された細胞内脂質、細胞によって分泌された脂質、そして細胞の構造的部分内、例えば膜系中などに存在する脂質を表わす。特定の場合においては、発酵油脂は、培養のあいだまたは培養後に細胞から培養培地中に分泌されるまたは遊離されるような細胞外であってもよい。
【００５８】
「残渣細胞マス（residual cell mass）」とは、細胞内脂質および／または細胞内酵素の回収のために処理される微生物を含む、固体、半固体または流動物質の画分を表わす。
【００５９】
「脂質含有単細胞マス（lipid-containing single-cell mass）」とは、独立栄養的に、従属栄養的におよび／または混合栄養的に形成される、微生物の乾燥物量の少なくとも３％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％（ｗ／ｗ）またはそれ以上の脂質量を有する単細胞マスおよび細胞の菌糸体を表わしている。
【００６０】
本明細書中に開示されるように得られる酵素調製物は、微生物培養物または上澄みまたは触媒的に活性な酵素を含む富化されたタンパク質画分である。典型的には、酵素調製物は、発酵油脂産生工程のプロセス水（水相、培養物ブロース、上澄み）、または、プロセス水（水相、培養物ブロース、上澄み）由来の富化されたタンパク質画分である。富化は、生物学的に活性な形でタンパク質を富化または濃縮するために使用される任意の適切な方法によって行われ得る。
【００６１】
本発明の一実施態様において、培養培地は、固体または半固体であり、そして酵素は回収前に水相へと導入される。
【００６２】
「タンパク質画分の富化（enrichiing a protein fraction）」とは、本明細書において、発酵油脂産生工程の任意の画分からのタンパク質を富化し、かつ、タンパク質の触媒活性を維持する任意の方法を指す。より具体的には、方法は、発酵油脂産生工程からの微生物培養物または上澄みの液相を、液相中のタンパク質を富化する少なくとも１つの方法によって処理することを含む。本発明のいくつかの実施態様において、富化工程は必ずしも必要ではない。
【００６３】
いくつかの実施態様において、タンパク質画分は、元々の液相と比較して、少なくとも１０％、典型的には少なくとも２０％、様々な実施態様では少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％富化される。適切な方法の例としては、タンパク質のイオン特性、分子サイズ、溶解度、表面活性特性または疎水性相互作用に基づく方法が挙げられる。好ましくは、酵素画分の回収は、温度が７０℃またはそれより低い温度である条件下で行われる。
【００６４】
本発明の一実施態様において、タンパク質画分は、微生物培養物の水相中で、または上澄み中で富化される。富化は、例えば微生物培養物または上澄みの水相を濃縮することなどによって容易に行われ得る。
【００６５】
本発明の一実施態様において、微生物培養物の水相中または上澄み中のタンパク質画分は、容積当たりの酵素活性および／または総タンパク質当たりの酵素活性として計算して、少なくとも１倍（１×）、典型的には少なくとも２倍（２×）、好ましくは少なくとも３倍（３×）富化される。いくつかの実施態様において、微生物培養物の水相中または上澄み中のタンパク質画分は、容積当たりのおよび／または総タンパク質当たりの酵素活性として計算して、少なくとも５倍、いくつかの実施態様においては少なくとも１０×、または２０×、または３０×、または４０×、または５０×、または６０×、または７０×、または８０×、または９０×、または１００×富化される。
【００６６】
本発明の好ましい実施態様によれば、酵素は上澄みから回収される。「細胞外酵素（extracellular enzymes）」は、培養培地中へと分泌された、または細胞から培養培地へと細胞分解によって遊離された酵素である。細胞外酵素は、上澄みから回収され得る。
【００６７】
発酵油脂工程から遊離される「プロセス水（process water）」とは本明細書において酵素回収後に工程から遊離される水を意味している。プロセス水の一部は工程へと還流されてもよく、そしてプロセス水の一部は別の工程へと循環されてもまたは導かれてもよく、そして一部は環境に放出されてもよい。プロセス水はまた、環境に放出される前に、排水処理工程へと導かれ得る。
【００６８】
本発明の一実施態様において、典型的には１０％〜９０％、好ましくは２０％〜８０％、いいくつかの実施態様においては３０％〜７０％、いくつかの実施態様においては４０％〜６０％、いくつかの実施態様においては２０％〜５０％のプロセス水が工程中に再循環され、好ましくは発酵油脂産生工程へとまたはフィードストックの処理へと還流される。
【００６９】
本発明の一実施態様において、工程から放出されるプロセス水は、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水よりも、少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、典型的には少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％より少ないタンパク質を含む。
【００７０】
本発明の一実施態様において、工程から放出されるプロセス水は、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水の生物学的酸素要求量と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、典型的には少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％より低い生物学的酸素要求量を有する。
【００７１】
本発明の一実施態様において、酵素は細胞内であり、そして、微生物細胞から得られる。
【００７２】
本発明の一実施態様において、酵素回収後の細胞残渣は、細胞からの酵素回収なしの発酵油脂工程の細胞残渣よりも、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％より少ないタンパク質を含む。
【００７３】
いくつかの実施態様において、酵素回収後の細胞残渣は、細胞からの酵素回収なしの発酵油脂工程の細胞残渣よりも、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％より少ないタンパク質を含む。
【００７４】
本発明の一実施態様において、酵素産生および発酵油脂産生は同時に、または、任意の順序で逐次的におこる。典型的には、酵素産生がより早く開始される。産生された酵素は、培養培地中のポリマーバイオマスを分解し、それにより、微生物の増殖のための成分を産生する。
【００７５】
本明細書中において「酵素（enzyme）」とは、任意の酵素を指し、そしていかなる特定の酵素または酵素群に限定されない。一実施態様において酵素とは炭水化物およびタンパク質の複合体への影響を有する酵素を指す。「酵素」とは好ましくは、ヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．ｘ．ｘ．）、酸化還元酵素（ＥＣ  １．ｘ．ｘ．）、リアーゼ（ＥＣ  ４．ｘ．ｘ．）、イソメラーゼ（ＥＣ  ５．ｘ．ｘ．）、トランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．ｘ．ｘ．）およびリガーゼ（ＥＣ  ６．ｘ．ｘ．）を指す。最初の数字は酵素群を意味し、最初のｘは結合の型を意味し、そして二番目のｘは特定の反応を指している。
【００７６】
本発明において「酵素」とは、とりわけ炭水化物、タンパク質および脂質の複合体を分解することのできる細胞外酵素を意味する。より具体的には、酵素は反応性生物の官能基に水を導入し、そしてそれによってグリコシド、ペプチド、エステル、またはエーテル結合、または、窒素と炭素との、または窒素と酸素とのあいだの結合を分解する加水分解酵素である。酵素は、好ましくはセルラーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、アラビナーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フォスフォリパーゼ、イソメラーゼまたはエステラーゼである。本発明における加水分解酵素とは、加水分解反応を行うことができる酵素、すなわち水に官能基を移すことが可能である酵素を指す。好ましくは、酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼまたはマンナーゼの群より選択される。
【００７７】
いくつかの実施態様において、酵素は、酸化還元反応を触媒する酸化還元酵素、基の付加または除去を触媒して二重結合を形成するリアーゼ、基の分子内転位を触媒するイソメラーゼまたはＡＴＰ加水分解を使って２つの基質の連結を触媒するリガーゼである。
【００７８】
「セルラーゼ（cellulase）」または「セルロース分解性の酵素（cellulolytic enzyme）」とは、主に、例えば糸状菌類または酵母などの真菌、バクテリア、植物などによって、またはセルロースの加水分解（セルロース分解とも称される）を触媒する動物によって産生される酵素の群を意味する。いくつかの異なる種類のセルラーゼが公知であり、それらは構造的におよび反応機構的に異なっている。セルラーゼの概要としては、触媒される反応のタイプにしたがって、エンドセルラーゼ、エキソセルラーゼ、セルビアーゼ、またはベータグルコシダーゼ、酸化セルラーゼ、およびセルロースホスホリラーゼなどが挙げられる。これらの酵素は、例えば以下のＥＣ番号のもとに見出すことができる：ＥＣ  ３．２．１．４、ＥＣ  ３．２．１．９１、ＥＣ  ３．２．１．２１。
【００７９】
「ヘミセルラーゼ（hemicellulase）」とは、主に、例えば糸状菌類または酵母などの真菌、バクテリア、植物などによって、またはヘミセルロースの加水分解を触媒する動物によって産生される酵素の群を意味する。例えば、キシランの加水分解に関与する酵素としては、エンドキシラーゼ、アセチル−キシランエステラーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよびβ−キシロシダーゼが挙げられる。加えて、ガラクトグルコマンナンの加水分解に関与する酵素としては、エンドマンナーゼ、アセチル−マンナンエステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−マンノシダーゼが挙げられる。加えて、アラビノガラクタンの加水分解に関与する酵素としては、β−ガラクトシダーゼおよびエンド−α−Ｌ−アラビナーゼが挙げられる。これらの酵素は例えば以下のＥＣ番号のもとに見出すことができる：EC 3.2.1.8, EC 3.2.1.37, EC 3.2.1.55, EC 3.2.1.99, EC 3.2.1.139, EC 3.2.1.78, EC 3.2.1.25, EC 3.2.1.22, EC 3.2.1.21, EC 3.2.1.89, EC 3.1.1.72, EC 3.1.1.6, EC 3.1.1.73。
【００８０】
「ヘミセルロース（hemicellulose）」とは、植物細胞のセルロース繊維を他の炭水化物（例えばペクチンなど）とともに取り巻いている、リグノセルロース系材料中に見出される炭水化物複合体の群を意味する。ヘミセルロースの構成成分は、植物の種類に依存する。ヘミセルロースの最も一般的な種類としては、キシラン、グルコノキシラン、グルコマンナン、ガラクトグルコマンナン、アラビノキシラン、キシログルカンおよびアラビノガラクタンが挙げられる。
【００８１】
微生物培養培地中に補充される栄養素とは、微生物の増殖および／または脂質の産生を可能にする、または増殖および脂質産生を促進する化合物および成分のことを指す。これらは典型的には、炭素、窒素およびリンの様々なソース、無機塩および微量元素を含む。培養培地は、炭水化物、好ましくはヘキソース糖、ペントース糖、これらのどちらか一つもしくは両方を含む炭水化物を含む天然のもしくは人工の画分、または、セルロース、でんぷん、非でんぷん性多糖類、キチン、リグノセスロースを含む画分で補充され得る。培養培地中の栄養素の補充は不可欠であるとは限らないが、特定の場合には望ましいであろう。
【００８２】
脂質の産生のために適切な培養条件とは、脂質の生成および／または蓄積が、培養培地の成分、培養条件、外部因子またはその両方に反応して起こる条件を指す。
【００８３】
酵素の産生のために適切な培養条件とは、そこで酵素の形成および蓄積が、培養培地の成分、培養条件、外部因子またはその両方に反応して起こることを指す。
【００８４】
本発明の実施態様において、酵素産生は、微生物培養物中に酵素誘導物質を添加することによって開始および／または維持される。一般的にこれは、産生される酵素の量を増大させる結果となる。特に、連続的な培養において、誘導物質の量を細胞外酵素の産生を維持するために十分なレベルに維持することは重要である。
【００８５】
本明細書中で記載される酵素は、誘導性でも、また、構成性でもあり得る。
【００８６】
酵素誘導（酵素の誘導性）とは誘導性因子の存在による酵素のデノボ合成の増加を指す。
【００８７】
本発明の好ましい実施態様によれば、例えば糖などの細胞外のポリマーまたはオリゴマー化合物を、例えば炭素および／またはエネルギー源など栄養素として使用することのできる微生物が、これらの化合物を含むポリマーバイオマスを含む培養培地上で培養される。微生物は脂質および酵素を産生できる。
【００８８】
「培養培地（a cultivation medium）」とは、本明細書において微生物を培養するために使用される培地を意味する。培養培地は、本明細書において例えば、ポリマー糖などの少なくとも部分的はポリマーであるかまたはオリゴマーである化合物を含むポリマーバイオマスを含む。培養培地は、無機物、微量栄養素、主要栄養素および緩衝剤で補充されてもよい。
【００８９】
本発明のいくつかの実施態様における好ましいフィードストックは、リグノセルロース、セルロース、ヘミセルロースまたはリグニン、または、単独でまたは組み合わせでのリグノセルロースでんぷんの他の成分を含むポリマーバイオマス、または、酵素の糖ポリマーへのアクセスを改善するために化学的もしくは物理的に、またはそれらの組み合わせによって処理されたバイオマスである。
【００９０】
前処理されたバイオマスとは、例えばヘキソースおよび／またはペントース糖またはそれらの誘導体を含むバイオマスである。バイオマスは、酵素処理の前または後に、化学的、物理的、熱機械的または生物学的方法によって、またはそれらの任意の組み合わせによって処理され、その後発酵油脂産生のために使用されてもよい。
【００９１】
「ポリマーバイオマス（polymeric biomass）」とは、天然の有機材料または種々の化学的または物理的方法によってまたはそれらの組み合わせによって処理された有機材料を指す。本明細書において、ポリマーバイオマスは例えば、発酵油脂工程などのバイオ技術的工程におけるフィードストックとして使用されるバイオマスを意味する。ポリマーバイオマスはまた、工業的製品、または、例えばヘミセルロースまたはセルロースを含む画分、でんぷん、でんぷんを含むバイオマス、非でんぷん性多糖類、キチン、ポリガラクツロン酸、ペクチン、タンパク質、微生物、または微生物の残渣などの、工業的工程の副供給流であってもよい。
【００９２】
本発明の一実施態様において、バイオマスは、例えば酵母、バクテリア、カビまたは藻類などの微生物またはそれらの成分またはこれらの微生物を含む工業的工程の副供給流である。
【００９３】
より具体的には、本発明において、発酵油脂産生工程は、例えば加水分解酵素などの酵素の産生または促進された産生を誘導し得ることが見出された。
【００９４】
本発明の一実施態様において、ポリマーバイオマスは、工程において得られた酵素によって処理され、そして、生成物はモノマー、ダイマー、オリゴマーの炭水化物および／または酵素産生を誘導するまたは維持する未分解の成分を含む。
【００９５】
リグノセルロース系材料（lignocellulosic material）」または「リグノセルロース系バイオマス（lignocellulosic biomass）」とは、セルロース、ヘミセルロース、および／またはリグニンまたはそれらの任意の画分からなるバイオマスを意味する。リグノセルロース系材料としては、木本植物または非木本植物の、草木植物またはセルロースおよび／またはヘミセルロースを含む他の材料などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。材料は、農業残渣（例えば麦わら、稲わら、まぐさ、さや、トウモロコシ茎葉、さとうきびバガス）、専用のエネルギー作物（例えばスイッチグラス、ススキ、リードカナリーグラス、ヤナギ、ホテイアオイなど）、木材材料または残渣（例えばヘミセルロース、亜硫酸パルプ廃液、屑繊維および／または一次汚泥などの、製材所およびパルプおよび／または製紙工場残渣または画分を含む）、コケまたは泥炭、微生物または都市紙くずであり得る。また、低リグニン含有材料である、例えば大型藻類または微細藻類バイオマスなどの材料もまた使用され得る。加えて、材料は産業活動からのヘミセルロースまたはセルロース画分であってもよい。本発明は任意の種類のセルロース画分を利用することができる。異なる起源、植物種または工業的工程由来の原材料、または、例えばヘミセルロースおよび／またはセルロースなどの原材料の特定の画分がともに混合され、そして、本発明によるバイオプロセスのための原材料として使用され得る。
【００９６】
「糖化（saccharification）」とは、ポリマー糖の、糖オリゴマーおよび単量体への加水分解を指す。糖化は典型的には、ポリマー糖を加水分解することのできる酵素の使用によって達成される。
【００９７】
「炭水化物（carbohydrates）」とは、アルデヒド、酸またはケト基、およびこれらに加えていくつかの水酸基が組入れられた有機分子を表わす。したがって、炭化水素の範囲としては、例えば単糖類、オリゴ糖、糖、セルロース、ヘミセルロース、でんぷんおよび非でんぷん性多糖類などの用語によって開示される化合物を含む。
【００９８】
「セルロース（cellulose）」とは、β−１−４グルコース結合によって形成されるポリマーからなる一次構造を有する、長鎖の多糖類である。
【００９９】
「でんぷん（starch）」とは、主としてα−１−４およびα−１−６グルコースユニットからなる長鎖の多糖類である。
【０１００】
単糖類は、炭水化物（Ｃ−Ｈ2Ｏ）nの単量体ユニットであり、典型的には３〜９の炭素原子からなり、そして１つまたはそれ以上の炭素原子において立体化学的不一致点をもつ。これらは、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フラクトースなどの、６つの炭素原子を有するヘキソース、および、例えばキシロース、リボースおよびアラビノースなどの、５つの炭素原子を有するペントースで示される。
【０１０１】
セルロースは通常、実際上水に溶解しない。セルラーゼとしては、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼが挙げられる。例えば、主にセルロースのアモルファスな部分に作用するエンドグルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）はセルロースの巨大分子の内部結合をランダムにアタックする。エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９１）はセルロース鎖の端部をアタックし、一度に主に１つのセロビオースユニットを加水分解する。エキソグルカナーゼはまた、結晶性セルロースポリマーを加水分解することもできる。最後に、セロビオースのグルコースモノマーへの加水分解がβ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２１）によって行われる。
【０１０２】
ヘミセルロースを加水分解することのできる酵素は、例えばエンドキシラナーゼ、エンドアラビナーゼおよびエンドマンナナーゼである。エンド−ヘミセルラーゼ作用の後に、オリゴマーをアタックするヘミセルラーゼは、例えばβ−キシロシダーゼ、β−アラビノシダーゼ、β−マンノシダーゼおよびβ−グルコシダーゼなどである。オリゴマー中の残余の側鎖結合は、例えばα−グルクロニダーゼ、α−アラビノダーゼおよびα−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素によって分解され得る。アセチル成分は、エステラーゼによって除去され得る。
【０１０３】
さらに、リグニンの酵素的加水分解は、リグニンペロキシダーゼ（ＬｉＰ  ＥＣ  １．１１．１．１４）、マンガネーゼ−依存性ペロキシダーゼ（ＭｎＰ  ＥＣ  １．１１．１．１３）およびラッカーゼ（ＥＣ  １．１０．３．２）などの酸化酵素の活性を必要とする。化学構造およびリグニンのセルロースおよびヘミセルロースへの付加が、リグニンの量よりもより重要である。
【０１０４】
副流または副流画分は、細胞の産生、酵素の産生、発酵油脂の産生、細胞の回収またはオイルの抽出、細胞内酵素の回収から遊離される任意の水溶液または上澄み、および、不定に分解されたおよびそのままの細胞（すなわち残余の細胞マスまたは細胞懸濁液または細胞マス）の脂質抽出後混合物を意味する。
【０１０５】
本明細書において記載されるように発酵油脂産生工程は、連続的、回分または流加回分工程または発酵油脂産生を目的として組み合わされた任意の他の工程であり得る。
【０１０６】
発酵油脂産生工程は、遊離水の量が少ないか、または産生が固体または半固体表面上で行われる反応器中でもまた行われ得る。水に溶解しない細胞マスまたは他のバイオマスは、酵素を溶解可能な形状で得るために水溶液を用いて抽出され得る。
【０１０７】
酵素は、微生物培養物、上澄みおよび微生物細胞から、任意の公知かつ適切な方法で、または将来において開発される任意の適切な方法で行われ得る。それによって所望の酵素活性を有する酵素に画分が分離され得るような方法についても同様のことが適用される。
【０１０８】
それによって触媒的に活性な酵素（または複数の酵素）を含む、微生物培養物または上澄みまたは富化されたタンパク質画分が回収されるような方法は、それらの分子サイズ、イオン性の挙動、水への溶解度、種々の溶質の溶解性、または緩衝因子もしくは表面活性因子もしくは表面−活性化合物もしくは塩を含む溶質混合物の溶解度に依存する。
【０１０９】
脂質産生が可能である微生物は、本明細書において、例えば脂質を産生することのできるバクテリア、古細菌、藻類または真菌、典型的には糸状菌類または酵母などの微生物を指す。
【０１１０】
「油性生物（oleaginous organisms）」とは、本明細書において、適切であるかまたは最適化されている培養条件で培養される場合に、そのバイオマスの少なくとも１５％（ｗ／ｗ）を脂質として蓄積する微生物を指す。
【０１１１】
「脂質および酵素の両方を産生することのできる微生物（A microorganism capable of producing both lipids and enzymes）」とは、典型的には、真菌、特には糸状菌類（カビ）または酵母、微細藻類またはバクテリアである。脂質産生カビ、二形性真菌および糸状菌類としては例えば、アブシディア（Absidia）、アスペルギルス（Aspergillus）、ブラケスレア（Blakeslea）、ケタマカビ（Chaetomium）、クラドスポリウム（Cladosporium）、麦角菌（Claviceps）、クラドスポリジウム（Clodosporidium）、クスダマカビ（Cunninghamella）、エメリセラ（Emericella）、ハエカビ（Entomophthora）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、グロムス（Glomus）、フミコーラ（Humicola）、ケカビ（Mucor）、クサレケカビ（Mortierella）、ペシロマイセス（Paecilomyces）、アオカビ（Penicillium）、プッキア（Puccia）、フハイカビ（Pythium）、クモノスカビ（Rhizopus）、ミズカビ（Saprolegnia）、トリコデルマ（Trichoderma）、黒穂菌（Ustilago）およびジゴリンクス（Zygorhynchus）の属であるもの、例えばアブシディア  スピノサ（Absidia spinosa）の属のカビなど、例えばＡ．フィシェリ（A. ficheri）、Ａ．フラブス（A. flavus）、Ａ．ニデュランス（A. nidulans）、Ａ．ニガー（A. niger）、Ａ．オクラセウス（A. ochraceus）、Ａ．オリザエ（A. oryzae）、Ａ．ソーヤ（A. sojae）およびＡ．テレウス（A. terreus）などのアスペルギルス、ブラケスレア  トリスポラ（Blakeslea trispora）、ケトミウム  グロボーサム（Chaetomium globosum）、クラドスポリジウム  ハーバルム（Cladosporidium herbarum）、クラビセプス  プルプレア（Claviceps purpurea）、例えばＣ．エチヌラータ（C. echinulata）、Ｃ．ジャポニカ（C. japonica）およびＣ．エレガンス（C. elegans）などのクスダマカビの属のカビ、、エントモフトラ  コロナタ（Entomophthora coronata）、フザリウム  ブルギゲヌム（Fusarium bulbigenum）、フザリウム  グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム種、ジベレラ  フジクロイ（Gibberella fujikuroi）、グロムス  カレドニウス（Glomus caledonius）、フミコーラ  ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、フミコーラ  グリセア（Humicola grisea）、例えばＭ．シルシネロイデス（M. circinelloides）、Ｍ．プランビアス（M. plumbeus）およびＭ．ロウクスィー（M. rouxii）などのケカビ属のカビ、例えばＭ．イザベリナ（M. isabellina）、Ｍ．アルピナ（M. alpina）およびＭ．ラマニアナ（M. ramanniana）などのクサレケカビ属のカビ、例えばＰ．ジャバニカム（P. javanicum）、Ｐ．リラキヌム（P. lilacinum）、Ｐ．スピナロサム（P. spinulosum）およびＰ．ソッピ（P. soppii）などのアオカビ属のカビ、パエシロマイセス  ライラキナス（Paecilomyces lilacinus）、プッキア  コロナタ（Puccia coronata）、ピシウム  ウルティマム（Pythium ultimum）、ピシウム  イレグラレ（Pythium irregulare）、リゾプス  アリツス（Rhizopus arrhizus）、リゾプス  デレマ（Rhizopus delemar）、リゾプス  オリザエ（Rhizopus oryzae）、ウスティラゴ  ゼアー（Ustilago zeae）、トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）、ジゴリンクス  モエレーリ（Zygorhynchus moelleri）、および、マルブランケア  プルケラ（Malbranchea pulchella）、ミロテシウム種（Myrothecium sp.）、スクレロチウム  バタチコラ（Sclerotium bataticola）、ペリキュラリア  プラティコラ（Pellicularia practicola）、スファセロテカ  レイリアナ（Sphacelothea reiliana）、ティロポスポリジウム  エーレンベルギー（Tyloposporidium ehren bergii）、アクルヤ  アメリカーナ（Achyla americana）、レピスタ  ヌダ（Lepista nuda）、チレチア・コントロベルサ（Tilletia controversa）、クロナルティウム  フシホルメ（Cronartium fusiform）が含まれる。
【０１１２】
本発明において、接合菌門（Zycomycota）または子嚢菌門（Ascomycota）であるカビを使用することが有用である。アスペルギルス、リゾプス、ケカビまたはクサレケカビ属のカビを使用することが特に有用である。
【０１１３】
本発明の別の実施態様において、これらに限られるわけではないが、例えば、ストレプトマイセス（Streptomyces）、アクチノマイセス（Actinomyces）、アルスロバクター（Arthrobacter）、ノカルディア（Nocardia）、ロードコッカス（Rhodococcus）またはバチラス（Bacillus）などの属のバクテリアが使用され得る。
【０１１４】
本発明のさらに別の実施態様において、これらに限られるわけではないが、クリプトコッカス（Cryptococcus）、トリコスポロン（Trichosporon）、アピオトリカム（Apiotrichum）、ハンゼヌラ（Hansenula）、リポマイセス（Lipomyces）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、カンジダ（Candida）、ヤロウイア（Yarrowia）、ロドトルラ（Rhodotorula）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces）、スポリディオボラス（Sporidiobolus）、トリコスポロン（Trichosporon）、トルロプシス（Torulopsis）、ウォルトマイセス（Waltomyces）、エンドミコプシス（Endomycopsis）、ガラクトマイセス（Galactomyces）、ピキア（Pichia）または例えばクリプトコッカス  アルビダス（Cryptococcus albidus）、Ｃ．テリコラス（C. terricolus）などのクリプトコッカス（Cryptococcus）、トリコスポロン  クタネウム（Trichosporon cutaneum）、リポマイセス  スターケイ（Lipomyces starkeyi）、Ｌ．リポフェラ（L. lipofera）、ロドスポリジウム  トルロイデス（Rohodosporidium toruloides）、カンジダ  クルバータ（Candida curvata）、ヤロウイア  リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ロドトルラ  グルチニス（Rhodotorula glutinis）、カンジダ  ｓｐ．１０７（Candida sp. 107）、リポマイセス  ｓｐ．３３（Lipomyces sp. 33）、ロドトルラ  グラシリス（Rhodotorula gracilis）、トリコスポロン  プルランス（Trichosporon pullulans）またはＴ．フェルメンタス（T. fermentans）の属の酵母が使用され得る。
【０１１５】
好ましい微生物は、真菌、より好ましくはアスペルギルス（Aspergillus）、トリコデルマ（Trichoderma）、リゾプス（Rhizopus）およびフミコーラ（Humicola）の群、または、酵母クリプトコッカス（Cryptococcus）より選択される属に属する。より好ましくは、微生物は、アスペルギルス属に属する。
【０１１６】
ヘミセルロース中のポリマー糖を利用することができるように遺伝子組み換えされている油性生物もまた、本発明の一部分である。さらに、脂質の産生が向上するように遺伝子組み換えされた、セルロースおよびヘミセルロース中のポリマー糖を利用することのできる生物もまた、本発明に含まれる。
【０１１７】
本発明の一実施態様において、酵素調製物は、加水分解酵素を産生することのできない微生物を使用するバイオ技術工程へと導入される。別の実施態様において、前記工程において使用されるバイオマスは、好ましくは触媒的に活性な加水分解酵素（または複数の酵素）を含む上澄みまたはタンパク質画分である、酵素調製物で前処理される。バイオ技術工程は典型的には、例えば酵母、バクテリア、藻類、古細菌、糸状菌類（カビ）またはそれらの成分などの微生物を使用する。
【０１１８】
生物学的に活性なタンパク質の除去の後、発酵液は、別のバイオ技術工程へと導入されるか、もしくは、同じ工程へ戻されてリサイクルされるか、または、それは環境へ放出されてもよく、もしくは、廃棄水処理工程へと導かれてもよい。発酵液は、そのまま使用されてもよく、または、使用の前もしくは環境への放出の前に、微生物的、化学的および／または物理的に処理されてもよい。
【０１１９】
本発明の好ましい実施態様によると、プロセス水、残余のバイオマスおよび酵素は、残余のバイオマスが回収された酵素で処理され、そして、その結果得られるバイオマスおよびプロセス水が同じまたはその後の発酵油脂産生工程へと導入されるような方法で工程内で再循環される。
【０１２０】
本明細書中で記載されるように、本発明の工程によって製造される、実質的にタンパク質を含まない水は他の工程、応用、環境へと導入される。他の使用の前に、例えば有機物、無機塩または非タンパク質ベースの成分が除去または水中で減少されてもよい。
【０１２１】
本発明の一実施態様において、ポリマーバイオマスまたはポリマー糖は、バイオマスの酵素分解生成物が、発酵性炭水化物および好ましくはまたオリゴマー炭水化物を含むような方法で、本明細書中に記載されるように回収される酵素で処理され、新規の発酵工程に導入された際に細胞外酵素産生をもたらし、かつ維持する。
【０１２２】
本発明において回収される酵素画分または酵素は、リグノセルロースを例えばセルロース、ヘミセルロースまたはリグニン画分などの副画分へと加水分解するために使用され得る。
【０１２３】
本発明の好ましい実施態様において、脂質、タンパク質、とりわけ加水分解酵素が本発明において回収される。
【０１２４】
ある態様において、本発明はまた、本発明の様々な実施態様による工程によって得られる酵素調製物を提供する。酵素調製物は典型的には、微生物培養物の水相中または上澄み中のタンパク質画分を含み、そして、容積当たりおよび／または乾燥総タンパク質当たりの酵素活性として計算して、少なくとも１倍（１×）、好ましくは少なくとも２倍（２×）、より好ましくは少なくとも３倍（３×）富化される。
【０１２５】
本発明のいくつかの実施態様において、酵素調製物は、微生物培養物からまたは上澄みから、容積当たりおよび／または総タンパク質当たりの酵素活性として計算して、少なくとも５倍、いくつかの実施態様においては少なくとも１０×、または２０×、または３０×、または４０×、または５０×、または６０×、または７０×、または８０×、または９０×、または１００×富化され得る。
【０１２６】
ある態様において、本発明はまた、本発明の様々な実施態様によって産生される酵素または酵素調製物の、別の工業的工程における、または、同じもしくは別の発酵油脂産生工程における、または前記工程におけるフィードストックとして使用されるポリマーバイオマスを処理するための使用を提供する。
【０１２７】
ある態様において、本発明はまた、本発明の様々な実施態様によって産生される脂質の使用、または、バイオ燃料の成分として、またはバイオ燃料製造のための出発物質としての脂質の使用を提供する。
【０１２８】
本発明の好ましい実施態様によれば、本明細書において記載されるように産生される脂質は、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼル、ガソリン、もしくはジェット燃料として使用される。
【０１２９】
脂質からのバイオ燃料産生
「バイオ燃料（biofuel）」は、主にバイオマスまたはバイオ廃棄物由来の固体、液体、ガス状の燃料を意味し、有史以前の植物および動物の有機遺物由来である化石燃料とは異なる。
【０１３０】
ＥＵ指令（directive）２００３／３０／ＥＵに従えば、「バイオディーゼル（biodiesel）」は植物油または動物油から製造されるメチルエステルであって、バイオ燃料として使用されるディーゼル品質のものを意味する。より広義には、バイオディーゼルは、ディーゼル品質の、植物油または動物油由来の、例えばメチル、エチルまたはプロピルエステルなどの、長鎖アルキルエステルを意味する。バイオディーゼルは微生物脂質からもまた製造されることができ、ここで微生物脂質は、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。
【０１３１】
「再生可能ディーゼル（renewable diesel）」とは、動物、植物もしくは微生物起源の脂質またはそれらの混合物の水素処理によって製造される燃料を意味し、ここで微生物脂質は、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。再生可能ディーゼルはまた、ガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成によりバイオマスに由来するワックスから製造され得る。任意には、水素処理に加えて、異性化または他の処理工程が行われてもよい。再生可能ディーゼル製造方法はまた、ジェット燃料および／またはガソリンの製造に使用され得る。再生可能ディーゼルの製造は、欧州特許第１３９６５３１号明細書、欧州特許第１３９８３６４号明細書、欧州特許第１７４１７６７号明細書および欧州特許第１７４１７６８号明細書の特許文献に記載されている。
【０１３２】
バイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルは、化石燃料と混合されてもよい。適切な添加物、例えば防腐剤および酸化防止剤などが燃料製品に添加されてもよい。
【０１３３】
「潤滑剤（lubricant）」とは、例えばグリース、脂質またはオイルなどの、可動部への表面コーティングとして適用された場合に摩擦を減少させる物質を意味する。潤滑剤の他の２つの主な機能は、熱の除去および不純物を溶解させることである。潤滑剤の適用の例としては例えば、内燃エンジン内におけるエンジンオイルとしての使用、燃料中への添加物、例えばポンプおよび油圧装置などのオイル駆動機器における使用、または、種々のタイプの軸受部における使用などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。典型的には潤滑剤は、７５〜１００％のベースオイルを含み、そして、残りは添加物である。適切な添加物としては例えば、界面活性剤、貯蔵安定剤、酸化防止剤、腐食防止剤、曇り防止剤、抗乳化剤、消泡剤、共溶媒および潤滑性添加物（例えば米国特許第７，６９１，７９２号明細書などを参照のこと）が挙げられる。潤滑剤のためのベースオイルは鉱物油、植物油、動物油起源、または、バクテリア、真菌（酵母またはカビ）、藻類または別の微生物起源であり得る。ベースオイルはまた、バイオマスに由来するワックスからガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成により生じ得る。粘度指数がベースオイルを特徴付けるために使用される。典型的には高い粘度指数が好ましい。
【０１３４】
本発明において記載される方法を用いて産生される脂質は、バイオディーゼル、再生可能ディーゼル、ジェット燃料またはガソリンの製造のためのフィードストックとして使用され得る。バイオディーゼルは脂肪酸メチルエステルからなり、そして、典型的にはエステル交換によって製造される。エステル交換において、アシルグリセロールは長鎖脂肪酸アルキル（メチル、エチルまたはプロピル）エステルへと変換される。再生可能なディーゼルとは、脂質の水素処理（水素脱酸素化、水素化または水素化処理）によって製造される燃料を意味する。水素処理において、アシルグリセロールは対応するアルカン（パラフィン）へと変換される。アルカン（パラフィン）はさらに異性化によってまたは他の代替の工程によって修飾され得る。再生可能なディーゼルの製造工程はジェット燃料および／またはガソリンを製造するためにもまた使用され得る。加えて、脂質のクラッキングがバイオ燃料を製造するために行われてもよい。さらに、脂質は特定の適用においては直接的にバイオ燃料として使用され得る。
【０１３５】
本方法によって産生される脂質は、潤滑剤（潤滑油）のためのベースオイルとして、または潤滑剤のためのベースオイルの製造のための出発材料として使用され得る。
【０１３６】
用語「アシルグリセロール」とは、グリセロールおよび脂肪酸のエステルを意味する。アシルグリセロールは天然に脂肪および脂肪油として存在する。アシルグリセロールの例としては例えば、トリアシルグリセロール（ＴＡＧｓ、トリグリセリド）、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）およびモノアシルグリセロール（モノグリセリド）が挙げられる。
【０１３７】
オイルの回収
脂質を含む微生物は、例えばろ過または傾斜法などを用いることによってなど、任意の公知の方法によって、培養培地から分離され得る。代わりに、大容積容量の産業規模の工業用遠心分離器を用いた遠心分離が、所望の製品を分離するために使用されてもよい。
【０１３８】
本発明の様々な実施態様において、オイル、またはオイルのための前駆物質は、細胞バイオマスまたは培養物ブロースから、当該技術において公知のまたは将来において開発される、任意の方法を用いて回収され得る。このような方法としては有機溶媒を用いた抽出などが挙げられるがこれに限定されるわけではない。本発明の様々な実施態様において、微生物細胞は、オイルおよび他の成分の分離を促進するために破砕されてもよい。例えば超音波処理、浸透圧ショック、機械的せん断力、コールドプレス、熱衝撃、酵素触媒のまたは自立の自己消化などの、細胞破砕のための公知の任意の方法が使用され得る。
【０１３９】
オイルが抽出された細胞残渣は、例えば燃焼される、もしくは嫌気性分解方法で処理されるなど、エネルギー産生に使用されるか、または、動物試料として利用され得る。オイルが抽出された細胞残渣または細胞残渣の画分はまた、栄養源として使用されるべくバイオプロセスへとリサイクルされてもよい。
【０１４０】
脂質および酵素の回収に加えて、他の経済的に利用可能な成分または発酵油脂工程の副供給流からの成分を回収することも本発明の範囲内である。
【０１４１】
本発明の一実施態様が図１に示される。
【０１４２】
ポリマーバイオマスは、機械的、熱機械的、化学的に、またこれらの方法の組み合わせによって前処理され得る。
【０１４３】
処理された材料は酵素処理へと導入される。酵素は、少なくとも部分的に画分から、典型的には発酵油脂産生工程のプロセス水に由来する。酵素処理の後、任意には物理的または化学的処理またはその組み合わせが続く。これらの処理および酵素処理は、１またはそれ以上の回数繰り返されてもよい。
【０１４４】
処理されたバイオマスは、発酵油脂産生工程へと導入され、微生物が脂質を産生することを可能にする。
【０１４５】
細胞および固相は、液相（上澄み）から分離される。高分子成分は、実質的な酵素活性量を維持するような方法を用いて液相から回収される。酵素的に活性な成分は、発酵油脂産生工程において使用されるバイオマスを処理するために導入され得るが、または、発酵油脂産生工程に導入されてもよい。任意には、酵素調製物は、酵素的に活性な成分から調製されてもよく、そしてしたがって、得られた酵素量生物は販売されるかまたは他の工程で使用されてもよい。放出される水は、任意には発酵油脂産生工程へ、または他の使用のために導入されるか、または、システムから放出されてもよい。
【０１４６】
発酵油脂産生工程から遊離される固形物画分は、好ましい成分、とくには脂質、いくつかの実施態様においてはまた酵素を分離および回収するために処理される。
【０１４７】
要約すると、本発明の様々な実施態様が、１〜２２の番号を付された以下の項を用いて以下に開示される。
【０１４８】
項
１．酵素を産生する方法であって、前記方法が、
−発酵油脂産生工程において、発酵油脂産生および酵素産生に適切な条件下で、発酵油脂および酵素の両方を産生することのできる微生物を培養し、そして前記微生物によって発酵油脂および酵素を産生する工程、
−酵素調製物としての、または酵素源としての使用のために、発酵油脂および酵素を含む微生物培養物を得、そして、少なくとも一部の（ｉ）微生物培養物、（ｉｉ）微生物培養物から分離された上澄みおよび／または微生物細胞、（ｉｉｉ）上澄みからの富化されたタンパク質画分、および／または（ｉｖ）細胞からのタンパク質画分を回収する工程、および
−微生物細胞から発酵油脂を回収する工程
を含む方法。
【０１４９】
２．前記酵素が細胞外であり、そして、上澄みから回収可能である項１記載の方法。
【０１５０】
３．培養培地が固体または半固体であり、そして、前記酵素が回収される前に水相へと導かれる項１または２記載の方法。
【０１５１】
４．前記微生物培養物もしくはその一部または前記上澄みもしくはその一部が、工程に再循環される項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１５２】
５．プロセスから遊離されるプロセス水が、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％より少ないタンパク質を含む項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１５３】
６．プロセスから遊離されるプロセス水が、酵素回収なしの発酵油脂工程のプロセス水の生物学的酸素要求量と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％より低い生物学的酸素要求量を含む項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０１５４】
７．前記微生物培養物の水相または上澄みが濃縮される項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１５５】
８．前記酵素が細胞内であり、そして微生物細胞から得られ得る項１記載の方法。
【０１５６】
９．酵素回収後の細胞残渣が、細胞からの酵素回収なしの発酵油脂工程の細胞残渣と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも１０％より少ないタンパク質を含む項８記載の方法。
【０１５７】
１０．酵素産生が、微生物培養物中に酵素誘導物質を添加することによって開始および／または維持されるか、または、酵素産生が構成的に起こる項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１５８】
１１．酵素産生および発酵油脂産生が、同時に、または、任意の順序で逐次的に起こる項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１５９】
１２．前記微生物が、炭素源として例えばリグノセルロースまたはその画分などのポリマーバイオマスを含む培地上で培養される項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１６０】
１３．前記酵素が、ヒドロラーゼ、酸化還元酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼもしくはリガーゼまたはそれらの任意の混合物を含む項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１６１】
１４．前記酵素がグリコシド結合を加水分解する項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【０１６２】
１５．前記微生物が、真菌または酵母、好ましくはアスペルギルス、トリコデルマ、リゾプスおよびフミコーラの群より選択される属に属している真菌、または、クリプトコッカス属に属する酵母、より好ましくはアスペルギルス属である真菌である項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１６３】
１６．項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得られる酵素調製物。
【０１６４】
１７．前記微生物培養物の水相中または上澄み中のタンパク質画分が、富化され、および任意には、精製され、安定化され、乾燥されおよび／または製剤化される項１６記載の酵素調製物。
【０１６５】
１８．項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により産生される酵素または項１６もしくは１７記載の酵素調製物の、同じまたは別の工業的工程における使用。
【０１６６】
１９．項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により産生される酵素または項１６もしくは１７記載の酵素調製物の、バイオ燃料、バイオ燃料の成分としての、またはバイオ燃料製造のための出発物質としての使用。
【０１６７】
２０．前記バイオ燃料が、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼル、ガソリンおよび／またはジェット燃料である項１９記載の使用。
【０１６８】
本発明を説明することが以下の実施例の目的であって、本発明を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６９】
脂肪産生糸状菌の培養からの使用済み培養物ブロースにおける酵素活性が、基質として純粋なセルロースおよびキシランを用いた加水分解試験によって測定された。
【０１７０】
方法
糖の規定：
溶液の糖濃度を規定するために、溶液は、適切な希釈液とされ、ＨＰＬＣ分析に先立ち、０．２μｍを通してろ過された。
【０１７１】
糖の規定のために使用されたカラムは、鉛型のＳｈｏｄｅｘ  Ｓｕｇａｒ  ＳＰ０８１０  イオン交換体（固定相）であった。カラム寸法は、８．０ｍｍ（ＩＤ）×３００ｍｍであった。溶出液は水（流量０．６ｍＬ／分）であり、カラム温度は６０℃であった。検出器はＲＩ  Ｓｈｉｍａｔｚｕ  ＲＩＤ  １０Ａであり、ポンプはＡ６、およびオートサンプラーはＳｈｉｍａｔｚｕ  ＳＩＬ  ２０Ａであった。結果の処理はＣｌａｓｓ−ＶＰソフトウェアを用いて行われた。
【０１７２】
脂肪酸分析：
サンプルの脂肪酸成分がＳｕｕｔａｒｉら（１９９０）によって記載される方法で測定された。サンプル中の脂質は、初めに遊離脂肪酸へと加水分解され、そのナトリウム塩へとケン化され、そしてその後、メチルエステルへとメチル化された。脂肪酸メチルエステルはガスクロマトグラフィーを用いて分析された。
【０１７３】
タンパク質濃度分析：
培養物ブロースのタンパク質濃度が、Ｗｈａｔｍａｎ３ろ紙を通してブロースをろ過した後に分析された。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（ブラッドフォード法に基づく）によって分析された。
【０１７４】
加水分解試験：
使用済み培養物ブロースは、加水分解試験前にＷｈａｔｍａｎ３ろ紙を通してろ過された。
【０１７５】
キシラーゼ活性は、以下のように測定された。１００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコが反応容器として使用された。それを基質としての２０ｍＬの１％カバ材キシラン（Ｓｉｇｍａ）のリン酸緩衝溶液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）、１０ｍＬのろ過した培養物ブロースおよび２０ｍＬのリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）で満たした。加水分解反応が、５０℃の攪拌（１４０ｒｐｍ）水浴中で行われた。１ｍＬのサンプルが培養物ブロースの添加のすぐ後、１、３、５、２１／２３時間後に反応容器から採取された。加水分解反応は、１ｍＬのサンプルにおいて、１．３３Ｍの硫酸５０μＬの添加によってｐＨを低下されることにより停止された。試料は、ＨＰＬＣ分析に適合するように塩およびポリマー糖除去のために処理された。遊離された糖が、マンニトールを基準としてＨＰＬＣによって（糖の規定を参照のこと）分析された。
【０１７６】
セルラーゼ活性は、キシランの代わりにセルロース基質として１ｇのＷｈａｔｍａｎろ紙を用いて測定された。反応容積は、基質として同じサイズの円である（直径約５ｍｍ）１ｇのＷｈａｔｍａｎろ紙、１０ｍＬのろ過された培養物ブロースおよび４０ｍＬのリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ５）を含む５０ｍＬであった。実験はまたキシランを用いても行われた。
【０１７７】
微生物株：
脂質産生微生物は、通常、例えばＡＴＣＣ、ＤＳＭなどの複数の公認の微生物培養物（株）保存機関によって一般に公開されている。本発明の様々な実施態様が、以下の実施例において、以下の微生物株を使用することにより議論される。アスペルギルス  オリザエ（Aspergillus oryzae）  ＤＳＭ  １８６１、アスペルギルス  オリザエ（Aspergillus oryzae）  ＤＳＭ  １８６４、アスペルギルス  テレウス（Aspergillus terreus）  ＤＳＭ  １９５８。
【０１７８】
実施例１
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのヘミセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  オリザエの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０１７９】
アスペルギルス  オリザエは、炭素源として、精製カバ材キシラン（Ｓｉｇｍａ）、加圧熱水抽出によって抽出されたトウヒ（spruce）およびカバ材ヘミセルロースを用いてフラスコ培養された。培養は、５０ｍＬの培養培地を含む２５０ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ中で行われた。増殖培地のベースは、水１リットル当たり１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4および０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを含み、そして、炭素源、酵母エキスおよび任意には補助材料で補充された。培養培地は、１％（ｗ／ｗ）の真菌胞子を含む懸濁液で播種され、そして、培養物は２８℃の温度でインキュベートされた。
【０１８０】
精製キシランの場合、培養ベースは１リットル当たり４０ｇの精製カバ材キシラン（Ｓｉｇｍａ）および１ｇの酵母エキスで補充された。２つ組みの培養物が６日間オービタルシェーカー（１６０ｒｐｍ）中でインキュベートされた。
【０１８１】
トウヒおよびカバ材ヘミセルロースの場合、培養ベースは１リットル当たり４４ｇの熱水抽出によって製造された乾燥トウヒまたはカバ材ヘミセルロース、０．５ｇの酵母エキスおよび真菌の菌糸体のため機械的サポートを付与するための２ｇのセルロースで補充された。３つ組みの培養物が７日間オービタルシェーカー（１８０ｒｐｍ）中でインキュベートされた。
【０１８２】
インキュベーションの後、培養ブロースは、Ｗｈａｔｍａｎ３ろ紙を通してろ過された。タンパク質濃度および酵素活性が、ろ液から測定された。残余分は蒸留水で洗浄され、そして乾燥された。バイオマス濃度および脂質含有量が乾燥された試料から測定された。
【０１８３】
精製キシラン上での６日間の培養後、Ａ．オリザエ真菌は、１６ｇ／Ｌのバイオマス（乾燥重量）を産生し、そして、バイオマスは１０．５％の脂質／乾燥重量を含んでいた。水で抽出されたカバ材ヘミセルロース上で培養されたアスペルギルス  オリザエは、７日間のインキュベーションのあいだで１４ｇ／Ｌの乾燥バイオマスを産生した。菌糸体、残余のヘミセルロースおよびセルロースを含むバイオマスは、８．９％の脂質／乾燥重量（培養培地１リットル当たり１．２６の脂質に相等）を含んでいた。トウヒヘミセルロース上では、３．７％の脂質／乾燥重量を含む８．７ｇ／Ｌの乾燥バイオマスが産生されており、脂質産生のためには、カバ材キシランおよびヘミセルロースの両方が、トウヒヘミセルロースと比べより優れていた。
【０１８４】
培養ブロースのタンパク質濃度は、トウヒおよびカバ材ヘミセルロース培養物において０．０６および０．０２ｍｇ／ｍＬであり、そして、カバ材キシラン培養物において０．０５ｍｇ／ｍＬであった。
【０１８５】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりおよび反応中の１ミリグラムのタンパク質当たりの、キシランの加水分解試験から遊離されたキシロースが、時間の関数として図２および３に示されている。図２は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図３は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。
【０１８６】
トウヒヘミセルロース培養物からの培養ブロース１ミリリットルは、２１時間の培養で１．２ｍｇのキシロースおよび２０．１ｍｇ／ｍｇタンパク質を遊離した。カバ材ヘミセルロース培養物からの培養ブロース１ミリリットルは、２１時間の培養で５．２ｍｇのキシロースおよび２３４．６ｍｇ／ｍｇタンパク質を遊離した。カバ材キシラン培養物からの培養ブロース１ミリリットルは、２３時間の培養で５．０ｍｇのキシロースおよび１０１．４ｍｇ／ｍｇタンパク質を遊離した。
【０１８７】
ヘミセルロースまたはキシランを炭素源とするアスペルギルス  オリザエ培養物からの培養物ブロースは、顕著なキシラナーゼ活性を示した。セルロース加水分解試験において遊離のグルコースが全く検出されなかったことから、培養ブロースは、検出可能なセルラーゼ活性を有さなかった。
【０１８８】
実施例２
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  オリザエの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０１８９】
アスペルギルス  オリザエは、種々のセルロースをベースとするリグノセルロース材料上で、脂質産生のため培養された。増殖培地のベースは、水１リットル当たり４０ｇの炭素源としてのリグノセルロース材料、０．５ｇの酵母エキス、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4および０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏを含み、そして、窒素源および微量金属で補充された。
【０１９０】
実施例１〜４は、フラスコ培養で行われた。実施例１〜３において、培地ベースは、１リットル当たり３ｇのＮａＮＯ3および０．０２ｇのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏで補充され、そして、実施例４では培地ベースは、１リットル当たり１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4で補充された。５０〜１００ｍＬの培養培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中での培養が同時に行われた。培養培地は、１％（ｗ／ｗ）のアスペルギルス  オリザエの胞子を含む懸濁液で播種された。培養物は６日間オービタルシェーカー（１６０ｒｐｍ）中、２８℃の温度でインキュベートされた。
【０１９１】
実施例５〜６は、バイオリアクター発酵として行われた。
【０１９２】
実施例５において、増殖培地ベースは、１リットル当たり、１．４６ｇのペプトン、０．０００１５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００１ｇのＣｕＣｌ・２Ｈ2Ｏおよび０．００６２５ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏで補充された。炭素源はセルロースであり、培養液に最終濃度が５０ｇ／Ｌとなるように添加された。培養培地は、４８時間前培養されたアスペルギルス  オリザエ懸濁液５０ｍＬを用いて播種された。発酵は、１Ｌの培養培地容量で、０．８Ｌ／分のエアレーションおよび３５０〜４５０ｒｐｍの攪拌下で２８℃の温度で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。酵素活性が１８８時間のインキュベーション後に測定された。
【０１９３】
実施例６において、培養培地ベースは、増殖培地ベース１リットル当たり、６．５ｇのペプトン、０．０００１５ｇのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０００１ｇのＣｕＣｌ・２Ｈ2Ｏおよび０．００６２５ｇのＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏで補充された。炭素源はセルロースであり、培養液に最終濃度が５５ｇ／Ｌとなるように添加された。播種のために、胞子を形成しているＡ．オリザエの２つのＰＤＡペトリプレート培養上に計２４ｍＬの滅菌水を適用することによって胞子懸濁液が調製された。胞子はスプレッダを用いて懸濁され、１Ｌの培養培地が懸濁液を用いて播種された。発酵は、０．６Ｌ／分のエアレーションおよび３５０〜４５０ｒｐｍの攪拌下で２８℃の温度で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。酵素活性が２３３時間のインキュベーション後に測定された。
【０１９４】
培養物ブロースが分離され、タンパク質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。
【０１９５】
【表１】
0005844383.tif 000002
1  繊維原材料：リサイクル繊維
2  カバ材硫酸塩パルプ（Birch sulphate pulp）、さらし（bleached）、ヘミセルロース約１０％。
3  限外ろ過（攪拌式セル（stirred ultrafiltration cell）Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８２００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）中の１００００Ｄａフィルター in an Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ８２００ stirred ultrafiltration cell from Millipore）により３倍濃縮されたブロース
【０１９６】
実施例６において、脂質含有量は４％であると測定された。
【０１９７】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として４〜７に示されている。図４は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図５は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図６は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。図７は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。
【０１９８】
全ての６つの試験された培養物からの培養物ブロースは、顕著なキシラナーゼ活性を示した。６つの培養物ブロースのうち３つだけがセルラーゼ活性を示しており、特定の条件においてこれらの酵素を産生する弱い能力を示している。
【０１９９】
本実施例は、アスペルギルス  オリザエがリグノセルロース分解性の酵素を培養ブロースへ産生できることを示している。本実施例は、Ａ．オリザエがキシランおよびセルロース両方の分解活性を有していることを示す。
【０２００】
実施例３
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのヘミセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  テレウスの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０２０１】
アスペルギルス  テレウスは、バイオリアクター中２リットルの容積で、炭素基質として麦わらヘミセルロース上で、脂質産生のため培養された。培養培地は、５０ｍＬの酵母ニトロゲンベース、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含（Ｄｉｆｃｏ）の１０倍ストック溶液を２Ｌの水に懸濁したものからなり、１リットル当たり、１．０ｇの酵母エキス、１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏおよび２ｇのセルロースで補充された。培養培地は、２４時間前培養されたＡ．テレウス培養物１５０ｍＬを用いて播種された。発酵は、３．０Ｌ／分のエアレーションおよび２００〜４３０ｒｐｍの攪拌下で３５℃の温度で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。培養のあいだ、ヘミセルロース溶液が発酵槽へと供給された。酵素活性が１６５時間のインキュベーション後に測定された。
【０２０２】
培養物ブロースが分離され、そして、１００００Ｄａフィルターを有するアミコン攪拌式セル（Millipore）中で限外ろ過により部分的に濃縮された。タンパク質濃度ならびに脂質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。
【０２０３】
真菌の菌糸体、残余のヘミセルロースおよびセルロースを含むバイオマス中の脂質含有量は、乾燥重量当たり１５％であった。タンパク質濃度は、非濃縮の培養ブロース中で０．７２ｍｇ／ｍＬであり、濃縮されたブロース中で２．１５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２０４】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として図８〜１１に示されている。
【０２０５】
図８は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図９は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１０は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。図１１は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【０２０６】
本実施例は、アスペルギルス  テレウスが、細胞内脂質と培養ブロースへの細胞外加水分解酵素との両方を産生できることを示している。本実施例は、Ａ．テレウスが、キシランおよびセルロース分解活性の両方を有する酵素を産生し、そして増殖培地中に分泌することを示す。これらの酵素は、分離され、濃縮され、そして、リグノセルロース材料の加水分解に使用され得る。
【０２０７】
実施例４
本実施例は、脂質産生のための炭素源としてのヘミセルロースベース材料を用いたアスペルギルス  オリザエの培養のあいだに培養物ブロース中に形成される酵素活性を示している。
【０２０８】
アスペルギルス  オリザエは、バイオリアクター中バイオリアクター中２リットルの容積で、炭素基質として麦わらヘミセルロース上で、脂質産生のため培養された。培養培地は、５０ｍＬの酵母ニトロゲンベース、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含（Ｄｉｆｃｏ）の１０倍ストック溶液を２Ｌの水に懸濁したものからなり、１リットル当たり、１．０ｇの酵母エキス、１ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇのＫ2ＨＰＯ4、１ｇのＫＨ2ＰＯ4および０．２ｇのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏで補充された。
【０２０９】
培養培地は、７２時間前培養されたＡ．オリザエ培養物２００ｍＬを用いて播種された。発酵は、３．０Ｌ／分のエアレーションおよび２００〜４１０ｒｐｍの攪拌下で３０℃の温度で、２Ｌの培養培地容積中で行われた。培養液のｐＨは５．７であり、培養のあいだ、３Ｍ  ＮａＯＨを用いて調整された。培養のあいだ、ヘミセルロース溶液が発酵槽へと供給された。酵素活性が１４４時間のインキュベーション後に測定された。
【０２１０】
培養物ブロースが分離され、そして、タンパク質濃度ならびに脂質濃度ならびにキシラーゼおよびセルラーゼ活性が、上述されるようにアッセイされた。真菌の菌糸体および残余のヘミセルロースを含むバイオマス中の脂質含有量は、乾燥重量当たり２１％であった。タンパク質濃度は、非濃縮の培養ブロース中で０．６１ｍｇ／ｍＬであり、濃縮されたブロース中で１．６５ｍｇ／ｍＬであった。
【０２１１】
１ミリリットルの培養物ブロース当たりのミリグラム単位の、および１ミリグラムのタンパク質当たりのミリグラム単位としての加水分解試験のあいだに遊離された糖が、時間の関数として図１２〜１５に示されている。図１２は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１３は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのキシロースを示している。基質としては、２００ｍｇのカバ材キシランが使用された。図１４は、加水分解試験中に遊離された、培養物ブロースの容積当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。図１５は、加水分解試験中に遊離された、タンパク質当たりのグルコースを示している。基質としては、１ｇのセルロースが使用された。使用された培養ブロース由来のヘミセルロースから、多少のキシロースが遊離された。
【０２１２】
本実施例は、アスペルギルス  オリザエが、脂質、および、副生成物として、リグノセルロース材料の加水分解に使用され得る、加水分解活性を有する培養ブロースを産生し得ることを示している。
【０２１３】
参考文献
Suutari M, Liukkonen K, Laakso S. 1990. Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids. Journal of General Microbiology 136: 1469-1474.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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