(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物癌患者(乳癌患者を除く)において腹水形成を低下させるための薬物の調製における、抗IL-1α抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2006年5月22日に出願された同時係属中の仮出願第60/802,166号の恩典を主張し、その仮出願は参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、一般的に、隣接組織構造に侵入し、重要な器官の生理機能を乱すことにより殺す。転移の過程は、原発腫瘍病巣の脱分化と同時であることが見出されている。腫瘍脱分化の結果として生じるのが腫瘍不均一性である。脱分化、不均一性、および転移の3つが合わさると、致死性の組み合わせとなる。癌がいったん、転移性および不均一性の両方になると、完全な抗腫瘍処置の望みは薄い。転移性腫瘍のいくつかの共通の要素、すなわち、大多数の不均一な腫瘍中で増殖および脱分化の間保持される重大な特徴、転移の過程に内在するために起源または向性に関わらず事実上すべての腫瘍細胞に存在する特徴を同定することが長年望まれている。そのような重大な要素を同定することを用いて、進行した播種性疾患を処置するという考えは、実際に根拠をもつ可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１Ａ】抗IL-1α抗体での処置後のヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける腫瘍応答を示すグラフ。マウスを、マウス抗ヒト抗IL-1aモノクローナル抗体（mahIL-1α）、またはハムスター抗マウスIL-1aモノクローナル抗体(hamIL-1α)、または両方(mahIL-1α＋hamIL-1α)のいずれかで処置する。マウスに週2回、各抗体の5mg/kg用量を与えることを、異種移植の日(1日目腫瘍)または転移性疾患の確立後に(樹立した腫瘍)に開始した。かなりの腫瘍量を有し、かつ明らかに不快状態にある時、マウスを屠殺する。図1A、前立腺腫瘍、1日目。
【図１Ｂ】抗IL-1α抗体での処置後のヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける腫瘍応答を示すグラフ。マウスを、マウス抗ヒト抗IL-1aモノクローナル抗体（mahIL-1α）、またはハムスター抗マウスIL-1aモノクローナル抗体(hamIL-1α)、または両方(mahIL-1α＋hamIL-1α)のいずれかで処置する。マウスに週2回、各抗体の5mg/kg用量を与えることを、異種移植の日(1日目腫瘍)または転移性疾患の確立後に(樹立した腫瘍)に開始した。かなりの腫瘍量を有し、かつ明らかに不快状態にある時、マウスを屠殺する。図1B、乳房腫瘍、1日目。
【図１Ｃ】抗IL-1α抗体での処置後のヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける腫瘍応答を示すグラフ。マウスを、マウス抗ヒト抗IL-1aモノクローナル抗体（mahIL-1α）、またはハムスター抗マウスIL-1aモノクローナル抗体(hamIL-1α)、または両方(mahIL-1α＋hamIL-1α)のいずれかで処置する。マウスに週2回、各抗体の5mg/kg用量を与えることを、異種移植の日(1日目腫瘍)または転移性疾患の確立後に(樹立した腫瘍)に開始した。かなりの腫瘍量を有し、かつ明らかに不快状態にある時、マウスを屠殺する。図1C、樹立前立腺腫瘍。
【図１Ｄ】抗IL-1α抗体での処置後のヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにおける腫瘍応答を示すグラフ。マウスを、マウス抗ヒト抗IL-1aモノクローナル抗体（mahIL-1α）、またはハムスター抗マウスIL-1aモノクローナル抗体(hamIL-1α)、または両方(mahIL-1α＋hamIL-1α)のいずれかで処置する。マウスに週2回、各抗体の5mg/kg用量を与えることを、異種移植の日(1日目腫瘍)または転移性疾患の確立後に(樹立した腫瘍)に開始した。かなりの腫瘍量を有し、かつ明らかに不快状態にある時、マウスを屠殺する。図1D、樹立した乳房腫瘍。
【図２】alum中のIL-1α-PPD結合体を3回皮下注射した後のC57BL/6マウスにおける56日目の抗IL-1α自己抗体形成(◆)。alum中のPPDのみで免疫された対照マウス(■)。
【図３】EL-4細胞の抗体依存性補体媒介性死滅。EL-4細胞を、マウス抗マウスIL-1αポリクローナル抗血清の段階希釈溶液と共にインキュベートした。生細胞に対する殺害された細胞の比率は、血清濃度に比例する。ヒト抗マウスIL-1αモノクローナル抗体を、陽性対照として用いた。未処置マウス血清とのインキュベーション、または培地単独とのインキュベーションは、2つの陰性対照として役割を果たした。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
発明の詳細な説明
抗体を用いたIL-1αのターゲッティングは、癌処置として用いることができる。特に、抗IL-1α抗体は、腫瘍転移における腫瘍由来のIL-1αが果たす生理学的役割の妨害を通して、腫瘍の転移能を阻害することができる。さらに、IL-1αは腫瘍により発現されるため、IL-1αを標的にする抗体は、抗体に方向づけられる細胞傷害性(一般的にADCCと呼ばれる)を通じて直接的な腫瘍細胞傷害性を引き起こすことができる。
【０００５】
インターロイキン-1α(IL-1α)が癌治療の標的であり得ることは全く予想外なことである。これを理解するためには、いわゆるインターロイキン-1系の歴史の簡単な概説を必要とする。IL-1系は、IL-1α、インターロイキン-1β(IL-1β)、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1ra)、およびインターロイキン-1受容体1(IL-1R1)を含む。IL-1αおよびIL-1βの発見からほぼ30年後、その2つの遺伝子産物の別々の生物学的役割を区別することにおいてほとんど進展が見られていない。これらの2つのサイトカインの独立した生物学的機能が解明できないことは、何十年もの間、IL-1αおよび/またはIL-1βを集合的に指す名称になっているインターロイキン-1へだけの科学文献における共通参照が証明している。これらの2つのサイトカインを区別できなかったというこの失敗は、以下のIL-1αとIL-1βのかなり明らかな違い、すわなち、それらは有意なタンパク質配列相同性を共有せず；それらは異なる転写制御下にあり、結果として、発現の時間的および空間的分離を生じ；それらは、別々の、個々に複雑な翻訳後プロセシング機構を通して独立的に制御され；それらは固有かつ別々の翻訳後修飾を受け；かつ、それらは異なる組織分布を有し、異なる刺激に応答して上方制御される、ということを考えれば、奇妙と言うくらい類がない。さらに、IL-1αは、脂質尾部を介して膜に固定され、レクチン様結合活性を有するが、IL-1βは分泌タンパク質である。
【０００６】
これらのサイトカイン間の違いを考えれば、なぜIL-1αおよびIL-1βがインターロイキン-1と集合的に呼ばれなければならなかったのかは、理解する価値がある。まず、初期の仮説は、その2つの遺伝子産物は単一の生物活性のみを示すこと、またはおそらくより細かいことを言えば、IL-1αはほとんど顕著な生物学的機能をもたないということであった。このIL-1αを無視するということは、そのサイトカインについて既知の分泌機構がない、膜での組込みを可能にする膜貫通配列がない、および分泌小胞への転位置のためのコードされたシグナル配列がないという事実から生じた。IL-1αは、細胞質に含まれると考えられ、細胞内シグナル伝達分子としての役割から、真のサイトカインとしての関連性はほとんどないことが示唆された。他方、翻訳後プロセシングおよび分泌経路は、IL-1βについてすぐに確立された。実際、いわゆるインターロイキン-1系におけるIL-1αの唯一の関連性は、それがIL-1受容体-1を通してシグナル伝達を誘導することが示されたことであると思われ、このことから、IL-1αおよびIL-1βに応答してシグナル伝達が誘導されることが見出された。分泌の機構が存在しなかったため、IL-1αは、それが死細胞の細胞質から放出された時のみ生理学的役割を果たすと仮定された。しかし、ほとんどいかなる環境下でも血清または組織中に有意なレベルのIL-1αを見出せなかったことで、IL-1αが重要である可能性が過小評価されるように思われた。
【０００７】
従って、抗IL-1α抗体での動物の処置により侵攻型の癌から動物を保護できることは、全く予想外である。同様に、抗IL-1α抗体価を誘導するための動物の免疫化により、腫瘍から動物を保護することができる。作用機構はまだ明らかではなく、宿主の腫瘍IL-1α産生促進の中和、腫瘍IL-1α産生の中和、または抗体に方向づけられる細胞傷害性(ADCC)もしくは抗体に方向づけられる補体媒介性の死滅(ADCK)による、直接的な腫瘍の細胞傷害性の1つまたは複数の組み合わせを含む可能性がある。
【０００８】
本発明に従って処置され得る患者には、ヒト、およびコンパニオン・アニマル、実験動物、動物モデルなど(例えば、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ)の非ヒト哺乳動物の両方が挙げられる。
【０００９】
本明細書に用いられる場合、「抗体」には、完全なポリクローナルまたはモノクローナル免疫グロブリン分子；単量体および二量体のFab、F(ab')2、scFV、ならびにFvなどの免疫グロブリン断片；ならびにダイアボディ(diabody)、ミニボディ(minibody)、カッパーボディ(Kappa body)、ジャヌシン(Janusin)などの非天然分子などが挙げられる。本発明の治療方法に有用な抗体は、IL-1α結合部位を含み、IL-1αに特異的に結合する。本明細書に用いられる場合、「IL-1α結合部位」には、抗体の可変部に天然で存在するIL-1α結合部位が挙げられる。IL-1α結合部位にはまた、1個〜15個(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、または15個)の保存的アミノ酸置換によって天然のIL-1α結合部位と異なり、かつIL-1αへ特異的に結合する結合部位も挙げられる。典型的には、IL-1αへ特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイに用いられる場合、非IL-1α抗原により与えられる検出シグナルより少なくとも10倍、20倍、または100倍高い検出シグナルを与える。好ましくは、IL-1αへ特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイで他のタンパク質を検出せず、かつIL-1αを溶液から免疫沈降させることができる。
【００１０】
ポリクローナル抗体は、周知の方法を用いて適当な宿主をIL-1αで免疫することにより得ることができる。しかしながら、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体(例えば、完全長、scFv、Fv)は、培養中の連続細胞系による抗体分子の産生を与える任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術には、限定されるわけではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術、およびEBVハイブリドーマ技術が挙げられる。Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995; Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983;およびShimamoto et al., Biologicals, 2005 Sep;33(3):169-74参照。一本鎖抗体は、ランダムコンビナトリアルライブラリーからのチェイン・シャフリング(chain shuffling)によって作製することができる。Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985。
【００１１】
一本鎖抗体はまた、鋳型としてハイブリドーマcDNAを用いるPCRなどのDNA増幅方法を用いて構築することができる。一本鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であり得、二価または四価であり得る。四価の二重特異性一本鎖抗体の構築は当技術分野において周知である。一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を、手動または自動ヌクレオチド合成を用いて構築し、標準組換えDNA方法を用いて発現構築物へクローニングし、細胞へ導入してコード配列を発現させることができる。あるいは、一本鎖抗体は、例えば、繊維状ファージテクノロジーを用いて、直接作製することができる。Burton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991; Verhaar et al., Int. J. Cancer 61, 497-501, 1995。
【００１２】
本発明に有用なIL-1α抗体は、その抗体を発現する任意の細胞から精製することができ、その細胞には、抗体をコードする核酸分子でトランスフェクションされている宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は、抗体の発現に適した条件下で培養される。適当な宿主細胞および培養条件は、当技術分野において公知の幅広い種類から選択できる。
【００１３】
精製抗体は、特定のタンパク質、糖質、または脂質などの、細胞内で抗体と通常会合する他の化合物から分離される。精製方法には、限定されるわけではないが、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および分取ゲル電気泳動が挙げられる。精製抗体の調製物は、少なくとも80%純粋であり；好ましくは、調製物は、90%、95%、または99%純粋である。調製物の純度は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野において公知の任意の手段により評価することができる。本発明の精製抗体の調製物は、IL-1αへ特異的に結合する抗体の種類を複数含むことができる。
【００１４】
しかしながら、調製された完全長ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を、標準技術を用いて切断し、FabまたはF(ab')2などの機能的抗体断片を得ることができる。Cheung et al., Protein Expr. Purif. 32, 135-40, 2003参照。WO 94/13804およびHolliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-48, 1993に記載された「ダイアボディ」；Martin et al., EMBO J. 13, 5303-09, 1994に記載された「ミニボディ」；Ill et al., Protein Eng. 10, 949-57, 1997に記載された「カッパーボディ」；ならびにTraunecker et al., EMBO J. 10, 3655 3659, 1991およびTraunecker et al., Int. J. Cancer Suppl. 7, 51-52, 1992に記載された「ジャヌシン」(二重特異性一本鎖分子)などの、免疫グロブリンに由来し、かつ多価および多重特異性である結合タンパク質を調製することができる。
【００１５】
本発明に有用な任意のIL-1α抗体はまた、固相技術を用いる直接的なペプチド合成によるなど、そのアミノ酸配列を合成する化学的方法を用いて作製することができる(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-54, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-04, 1995)。タンパク質合成は、手動技術を用いるかまたは自動化により、実施することができる。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いて達成することができる。任意で、抗体の断片を別々に合成し、化学的方法を用いて組み合わせて、完全長分子を生成させてもよい。新しく合成された分子は、分取高速液体クロマトグラフィーによって実質的に精製することができる(例えば、Creighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983)。合成ポリペプチドの組成物は、アミノ酸分析またはシーケンシング(例えば、エドマン分解を用いる)によって確認することができる。
【００１６】
当業者は、公知の注射可能な生理学的に許容される滅菌溶液を用いて、本発明の抗体を含む適切な薬学的組成物を調製することができる。生理食塩水または対応する血漿タンパク質溶液などの水性等張液は、容易に入手可能であり、非経口的な注射または注入用のすぐ使用できる溶液を調製するのに用いることができる。薬学的組成物は、使用前に公知の注射剤で元に戻すことができる凍結乾燥物または乾燥調製物として保存することができる。薬学的組成物には、公知の担体物質または/および添加剤(例えば、血清アルブミン、デキストロース、亜硫酸水素ナトリウム、EDTAなど)を追加することができる。本発明の薬学的組成物は、典型的には、不活性希釈剤などの薬学的に許容される媒体を含む。
【００１７】
本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の様々な経路によって投与することができる。全身適用については、静脈内、血管内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経口、結節内、または髄腔内経路を用いることができる。より局所的な適用については、皮下に、皮内に、心臓内に、葉内に、髄内に、肺内に、または処置される組織の中もしくは近くへ直接的に、実施することができる。処置の望ましい期間および有効性に応じて、組成物は、例えば、数日間、数週間、または数ヶ月間、毎日を基本として、1回または数回、および様々な用量で、投与してもよい。
【００１８】
用量は、患者の年齢、健康状態、性別 および疾患の程度に依存するものであり、患者の体重の0.25mg/kgから約50mg/kgまで様々であり得る。処置できる癌には、限定されるわけではないが、血液癌(例えば、白血病、リンパ腫)および固形組織(例えば、膀胱、骨、脳、乳房、頸部、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、膵臓、前立腺、胃)の癌が挙げられる。
【００１９】
一つの態様において、患者を、IL-1α抗体を誘導するためにIL-1αに対して免疫する。当技術分野において公知の任意の免疫化方法を用いて、所望の抗体応答を達成することができる(下記参照)。一般的に、組換えIL-1αについては、アジュバントを含む処方を用いて、免疫化を達成することができる。IL-1αをコードする核酸配列を用いて、免疫するのに用いられうる組換えウイルスもしくは生物体を作製することができる。または組換えIL-1αを、免疫刺激性複合体として働くウイルス様粒子へ化学的に連結することができる。
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【００２０】
本開示に引用されたすべての特許、特許出願、および参考文献は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。上記開示は、一般的に本発明を記載する。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができ、その実施例については、例証のみを目的として提供し、本発明の範囲を限定することを意図しない。
[請求項101]
癌を処置する方法であって、それを必要としている哺乳動物患者に抗IL-1α抗体の治療的有効量を投与する段階を含む、方法。
[請求項102]
患者がヒトである、請求項101記載の方法。
[請求項103]
患者が、マウス、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、およびヒツジからなる群より選択される、請求項記載の方法。
[請求項104]
癌が転移性である、請求項101記載の方法。
[請求項105]
癌が乳癌または前立腺癌である、請求項101記載の方法。
[請求項106]
抗体がポリクローナル抗体である、請求項101記載の方法。
[請求項107]
抗体がモノクローナル抗体である、請求項101記載の方法。
[請求項108]
抗体が、Fab、F(ab')2、scFv、Fv、ダイアボディ(diabody)、ミニボディ(minibody)、カッパーボディ(Kappa body)、およびジャヌシン(Janusin)からなる群より選択される、請求項101記載の方法。
[請求項109]
癌を処置する方法であって、それを必要としている哺乳動物患者をIL-1αで免疫し、それにより患者がIL-1α自己抗体を産生する段階を含む、方法。
[請求項110]
患者がヒトである、請求項109記載の方法。
【実施例】
【００２１】
実施例1
動物および腫瘍細胞
データについては、無胸腺nu/nuマウス(週齢8〜10週間、NCI, Frederick, MD)を用いて作製する。マウスに、200μlのDMEMに懸濁した5×106個の腫瘍細胞を脇腹に皮下注射する。本発明者らは、IL-1αが腫瘍細胞生存能力の一般的機構を与えていると予想していたため、本発明者らは、抗IL-1αでの阻害について数個の腫瘍細胞系を試験し、IL-1αを発現することが以前に示されている、乳房系統(MDA-MB-436またはMDA-MB-231、Nozaki et al. Biochem Biophy Res Comm 275, 60-62 (2000))または前立腺系統(PC-3、Chung et al. The Prostate 38:199-207 (1999); Singer CF et al. Clin Cancer Res. 2003 Oct 15;9(13):4877-83)のいずれか由来の腫瘍細胞を動物に注射した。
【００２２】
腫瘍IL-1α産生に拮抗するように、マウス抗ヒトIL-1α抗体をマウスに注射する。マウスは、5mg/kg IgG1モノクローナル抗体(クローン364-3B3-14, BioLegend)または5mg/kg IgG2aモノクローナル抗体(クローン1F3B3, ProMab)のいずれかを受け、腫瘍移植の日に、または少なくとも約3mm3の原発腫瘍病巣の徴候後に開始して、週2回、腹腔内に投与される。2つの他の群のマウスは、IgG1モノクローナル抗体またはIgG2aモノクローナル抗体、加えて、内因性IL-1α産生を中和するために5mg/kgの抗マウス抗IL-1αモノクローナル抗体(ハムスター抗マウスIL-1αは、BD PharMingen(San Diego, Calif)から購入される)を受ける。
【００２３】
動物は、腫瘍量過剰により人道的見地からより早く屠殺しない限り、56日間、生かしておく。毎週、動物の体重を記録し、観察可能な腫瘍容積を測定する。明らかな腫瘍に関連した病的状態(体重減少、嗜眠)がある場合、動物を屠殺する。マウスは、CO2チャンバーを用いて屠殺する。腹腔および腹膜腔、ならびに肝臓、リンパ節、脾臓、および肺を含む主要器官の精密検査後、別々に、転移を採取し、保存する。凝集した腫瘤を計算する。生存率および腫瘍量の結果は、平均+/-SEとして表す。
【００２４】
実施例2
免疫組織化学
周囲組織と共に切除された転移性腫瘍検体を、組織学的分析のためにいくつかの動物から採取する。ホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍調製物を屠殺時に作製する。組織学的分析については、抗マウスIL-1α抗体および抗ヒトIL-1α抗体の両方を用いて実施し、さらに、抗VEGF染色、抗ICAM-1染色、抗E-セレクチン染色、および抗VCAM染色も実施する。
【００２５】
実施例3
PCR
RNAを、腫瘍細胞系のそれぞれから、および樹立され、皮下に移植された腫瘍を有するマウスから採取された腫瘍生検から、抽出する。細胞を、IL-1α転写産物についてRT-PCRを用いて分析する。IL-1α転写産物が腫瘍細胞由来であるかまたは内因的な産生に由来するものか否かという混乱が、腫瘍生検試料においてないように、ヒトIL-1αを特異的に同定するようにプライマーを設計する。加えて、浸潤性白血球から、または腫瘍微小環境の周囲組織から産生された可能性がある内因性IL-1αを同定するために、IL-1αマウス特異的プライマーを設計する。どちらの供給源由来のIL-1αも好ましい腫瘍微小環境を作り出すのに重要である可能性があるためである。
【００２６】
全RNAを、Trizol(Gibco/BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA)を用いて、製造会社による指示通りに腫瘍試料から単離する。混入DNAを、RNアーゼを含まないDNアーゼを用いて除去する。1μgのDNアーゼで処理された全RNA(または陰性対照としての水)を、1μgオリゴdTプライマーと、95℃で3分、その後、68℃で10分、インキュベートする。Lee et al.(Journal of Orthopaedic Research, 21(2003)62-72)の方法に従って、8μlの5×緩衝液、4μl DTT(0.1M)、2μlのdNTP(10mM)、1μl RNアーゼ阻害剤、および1μlsuperscript逆転写酵素を各反応に加える。
【００２７】
実施例4
aIL-1α抗体による転移発生率の低下
樹立した転移性腫瘍を有するnu/nuマウスを、PBS、5mg/kgのmahIL-1α b、または5mg/kgのhamIL-1α bと共に5mg/kgのhamIL-1α bの腹腔内注射で週2回、処置する。担癌マウスの2つの群を用い、それらには、5×106個のMDA-MB-436腫瘍細胞またはPC-3腫瘍細胞を皮下注射した。抗体の週2回の投与を、腫瘍細胞の皮下注射の日かまたは3mm3の腫瘍増殖後のいずれかに開始する。表1参照。
【００２８】
（表１）実験計画および動物の数の記載
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【００２９】
目に見える腫瘍コロニーを、屠殺時に器官上で数える。表面肝臓転移の数を、腫瘍病巣を可視化する組織検査により測定する。横隔膜、腸壁および腹膜壁、ならびにリンパ節上の転移性病巣の数を同様の様式で測定する。
【００３０】
乳房腫瘍モデルにおいて、目に見えるリンパ節、肺、および肝臓の転移は、mahIL-1αでの処置によるか、またはmahIL-1α b＋hamIL-1α bでの組み合わせ処置によるかのいずれかで低下している。抗IL-1α処置マウスの10%のみが腹水を形成したのと対照的に、対照処置マウスの100パーセントが、腹水症を発症した。前立腺腫瘍モデルに関して同様に観察し、mahIL-1αか、またはmahIL-1α b＋hamIL-1α bのいずれかを受けたマウスは、転移性腫瘍量が低下していた。乳房腫瘍モデルおよび前立腺腫瘍モデルの両方において、hamIL-1α bを投与されたマウスは、屠殺時点で、明らかな転移の低下を示さなかった。表2参照。
【００３１】
（表２）aIL-1α抗体での処置による異種移植腫瘍の制御
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【００３２】
すべてのPBS処置マウスを50日目までに屠殺するが、aIL-1α処置マウスは、60日後、乳房異種移植腫瘍または前立腺異種移植腫瘍によって死んではいない。IL-1αを発現する腫瘍に由来するIL-1α、または内因的(主に白血球)に由来するIL-1αを標的にするaIL-1α処置は、乳房異種移植癌または前立腺異種移植癌のいずれかを有するマウスにおいて転移性腫瘍量を低下させる。腫瘍が発現したIL-1αを標的にするaIL-1α処置は、統計学的により強力な抗腫瘍効果を生じるが、抗腫瘍aIL-1α抗体および抗内因性aIL-1α抗体の組み合わせ処置は、乳房腫瘍または前立腺腫瘍のいずれかを有するnu/nuマウスにおいて、転移性腫瘍の増殖をほとんど完全に遮断する。図1参照。
【００３３】
mahIL-1α、またはhamIL-1α、またはその2つの抗体の組み合わせのいずれかを受けた動物は、疾患の臨床経過の重症度が低下している。すべての対照動物は、最終的には瀕死状態を示し、研究の終了前に屠殺を必要とする。対照的に、mahIL-1α＋hamIL-1αを受けた動物は、外観上ごく普通であり、身繕いが良く、活動的であり、苦痛の徴候を示さず、正常な成長および体重増加を示し、かつすべて実験期間中生存している。しかしながら、抗体の組み合わせを受けたマウスについて、器官を注意深く死後調査した後、観察可能な転移性病巣が明らかとなる。このことは、処置を開始する前に、樹立した転移性腫瘍を有する動物において特に顕著である。樹立した転移性病巣が発生して初めて処置を受けるマウスは、すべての樹立した病巣をその後に除去することはできないと思われる。しかしながら、これらの処置されたマウスにおける転移性病巣は、明らかに停止している。
【００３４】
この効果は、乳房腫瘍または前立腺腫瘍をマウスに接種し、検出可能な転移性疾患の時点で動物を屠殺した後に、分析することができる。このことは、動物が処置を受けた場合と同じ疾患経過である。転移性病巣の存在量およびサイズは、mahIL-1α＋hamIL-1α組み合わせを受けた動物において死後に観察されるものよりも、これらのマウスにおいて著しく大きい。抗体処置は、確立した転移性疾患の退行を生じると思われる。
【００３５】
腫瘍接種後の1日目に開始する抗体注射を受ける、mahIL-1α＋hamIL-1α処置マウスは、転移の発生をほとんど完全に免れている。乳房腫瘍群または前立腺腫瘍群のそれぞれにおける1匹の動物(17%)のみが、転移性病巣を発生している。
【００３６】
異種移植されたヒト腫瘍を、腫瘍転移のヌードマウスモデルに用いる。ヒトIL-1αを発現するヒト腫瘍を用いることで、本発明者らは、腫瘍上に発現したヒトIL-1α；白血球上に発現したマウスIL-1α(簡単にするために本発明者らは内因性IL-1α産生と呼ぶものとする)のいずれかを標的にすることにより；または2つの異なる抗体を投与して、同時に内因性IL-1αおよび腫瘍由来のIL-1αの両方を標的にすることにより、マウスを処置しようと試みることが可能になる。これによって、本発明者らは、内因的に産生されるIL-1α(白血球浸潤から、または腫瘍微小環境の組織から発現した)の役割から、腫瘍由来のIL-1αの転移における役割をいくらか切り離し始めることが可能となる。
【００３７】
どちらの供給源のIL-1αに対して方向づけられた抗体でもそれぞれ、マウスの生存率を向上させることから、結果は、内因性IL-1αおよび腫瘍由来のIL-1αの両方が腫瘍転移に役割を果たしていることを示唆する。しかしながら、内因性IL-1αに対して方向づけられた抗体は、腫瘍由来のIL-1αを標的にする抗体と比較して、長期延命効果を与える点においてかなり効果が低く、マウスを転移から保護しない。明らかに、これらのモデルにおいて転移を促進するためには、腫瘍自体からのIL-1α発現で十分である。
【００３８】
腫瘍によって発現したIL-1αに対して方向づけられた抗体は、強力な抗腫瘍効果を生じる。抗腫瘍IL-1α抗体を受けた動物における強い抗腫瘍効果は、腫瘍転移においてIL-1αを生理学的に遮断することを含むように思われるが、抗体の直接的な殺腫瘍性作用も含む可能性がある。補体結合および抗体に方向づけられる細胞傷害性(ADCC)を効率的に誘導する抗体サブクラスであるIgG1抗体を用いて腫瘍が発現したIL-1αを標的にすることは、ヌードマウスモデルにおいてIL-1αを発現する腫瘍に対してかなりの殺腫瘍性作用を示すと本発明者らは予想する。しかしながら、腫瘍由来のIL-1αに対して方向づけられた抗体の抗腫瘍効果がもっぱらADCCまたは他の細胞傷害性機構によって作用するならば、その2つの抗体での相乗効果への見込みはないと考えられる。内因性IL-1αに対して方向づけられた抗体が生存に影響を及ぼすことも期待できないと考えられる。ところが、内因性IL-1αに対して方向づけられた抗体で処置された動物に、ささやかではあるが、一貫した延命効果が見られる。hamIL-1α抗体で抗内因性IL-1αを標的にすることから見られる延命効果は、ヒトIL-1αとのhamIL-1α交差反応性の結果であり、それにより腫瘍を直接ターゲットする、という可能性がある。本発明者らは、抗マウスIL-1α抗体の交差反応性を調べ、延命効果が、腫瘍が発現したIL-1αとのその抗体の交差反応性の直接的結果であって、腫瘍のADCC、腫瘍のIL-1α産生の生理学的なIL-1α遮断、または両方を誘導するかどうかを評価した。その抗体に関して明らかな交差反応性はない。さらに、hamIL-1α抗体は、マウスFc受容体を効率的には結合せず、効果的なADCC応答を誘導する可能性は低いと考えられる。
【００３９】
ヌードマウスの異種移植モデルにおいて内因性IL-1αおよび腫瘍が発現したIL-1αを区別して標的にした結果から、本発明者らは、IL-1αを生理学的に遮断することが腫瘍の致死性を低下させることができると結論づける。内因性IL-1αおよび腫瘍由来のIL-1αの両方に向けられる抗IL-1α抗体の組み合わせについての延命効果の相乗効果により、このモデルにおいて、腫瘍が供給源のIL-1αおよび内因的な供給源のIL-1αの両方が腫瘍転移に重要であるという有力な証拠が提供される。これらの結果はまた、IL-1αが腫瘍と宿主の間の動的相互作用に生理学的な役割を果たすことを示唆する他の報告；およびIL-1α発現が腫瘍の転移能を増強することができるという他の報告に有利となる手掛かりを与えている。
【００４０】
モノクローナル抗体を用いて、腫瘍細胞によるIL-1α産生を標的にすることは、生存を延ばしかつ転移性の腫瘍量を低減する効果的な手段である。IL-1αを発現する腫瘍の抗体ターゲティングは、ヒト疾患設定において潜在的な治療的価値があると考えられ、疾患の初期または進行期のどちらの多数の型の癌にでも効果的な治療標的を表す可能性がある。
【００４１】
分析された人の20%もの人は、血清にIL-1α中和自己抗体が存在すると他の所で報告されている。さらに、これらの人々は、長期に渡る観察期間中、健康であると報告されている。同様に、IL-1αノックアウトマウスは、明らかな表現型がない(Horai et al. J. Exp. Med. 1998 187:1463-1475)。最後に、動物をIL-1αで単純かつ効率的に免疫して、サイトカインに対する強力な中和抗体応答を誘導できることが他の所(Svenson et al.)で報告されている。これらの知見は、中和自己抗体を誘導するためのIL-1αでの免疫化などの能動免疫療法もまた、IL-1αを発現するヒト癌を処置する効果的な手段であることを示唆する。
【００４２】
実施例5
材料および方法
ELISAによる抗IL-1α抗体価の測定
ヒトIL-1αまたはマウスIL-1αをそれぞれ、96ウェルELISAプレート上で一晩、1ウェルあたり100μlの容量で0.5μg/mlを用いてインキュベートする。その後、プレートを、リン酸緩衝食塩水(PBS)＋0.05%Tween 20で4回洗浄し、次に、PBS＋0.05%Tween 20中に1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むブロッキング溶液で飽和させる。1ウェルあたり、このブロッキング緩衝液の200μlを、室温で1〜2時間用いる。その後、プレートを再び、PBS＋0.05%Tween 20(PBST)で4回洗浄する。その後、100mlの段階希釈した血清試料(PBST＋1%BSA中1:2希釈溶液)を加え、室温で1時間、または4℃で一晩、インキュベートする。その後、プレートを再び、PBSTで4回洗浄する。その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合型抗Fc抗体を二次抗体として加える(1%BSAを含むPBST中に1:2000希釈、1ウェルあたり100μl、1時間、室温)。ヒト：400μl PBST＋1%BSA中、0.2μlヤギ抗ヒトIgG-HRP。マウス：0.5μl HRPヤギ抗マウスIgG(H+L)。その後、プレートを再び、PBSTで4回洗浄する。ABTS緩衝液(3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸、SigmaカタログNo. A-1888、150mg、0.1Mクエン酸、Fisher anhydrous、カタログNo. A-940、500ml、NaOHペレットでpHを4.35に調整、1バイアルあたり11mlで分注し、-20℃、40%SDS(200ml dd H2O中、80g SDS)で保存、200ml DMF(N,N-ジメチルホルムアミド)を加える)で発色反応を行う。100μlのABTS緩衝液を各ウェルに加える。良好なコントラストが見えた時、100μlの2%シュウ酸溶液を加えることにより反応を停止する。その後、最適な濃度を、ELISAリーダーを用いて405nmの波長で測定する。
【００４３】
腫瘍負荷中の動物のモニタリング
以下のスコアリングシステムを用いて、外観、食物および水の摂取量、自然な行動、ならびに挑発された行動をモニターすることにより、動物の健康状態を記録した。スコア0：正常から偏差なし；スコア1：正常から軽度の偏差；スコア2：正常から中等度の偏差；スコア3：正常から大幅な偏差。3が複数スコアリングされた場合、15を最大スコアとして、追加の1をそれぞれに与える。スコア0〜3：正常。スコア4〜7：注意深くモニターする。スコア8〜15：動物は苦しんでいる。動物は安楽死させる。動物が15%を超える体重減少がある、または体温が3.0℃より大きく下がっている時もまた、動物を安楽死させた。
【００４４】
腫瘍細胞系
EL-4細胞については、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas VA, USA)から入手した。EL-4は、9,10-ジメチル-1,2-ベンゾアントラセンによりC57BL/6マウスに誘発されたリンパ腫から樹立した。1.5g/L重炭酸ナトリウムおよび4.5g/Lグルコースを90%；ウシ胎児血清を10%含むように調整された4mM L-グルタミンを含むダルベッコの(Dulbecco's)改変イーグル培地で細胞を培養した。
【００４５】
PC-3細胞については、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas VA, USA)から入手した。PC-3細胞系は、62歳の男性カフカス人由来の悪性度IV前立腺癌の骨転移から創始された。1.5g/L重炭酸ナトリウムを90%；ウシ胎児血清を10%含むように調整された2mM L-グルタミンを含むHamのF12K培地を用いて、細胞系を増殖させた。
【００４６】
PPDと結合したIL-1αおよびIL-1bでのマウスの免疫化
IL-1αおよびIL-1βについては、eBioscience(San Diego, CA)から入手した。PPDは、Statens Serum Institute(Copenhagen, Denmark)から入手した。結合の方法については、Svenson et al.(Svenson M. 2000)を改良した。IL-1αまたはIL-1bを、0.41(w/w)の比率でPPDと、0.1%グルタルアルデヒドの存在下で、4℃48hインキュベートした(IL-1/PPD=0.41)。対照として、IL-1αまたはIL-1βを含まずに、PPDを並行して処理した。その後、結合体をAl(OH)3(Rehydragel; Reheis Chemical, Dublin, Ireland)に、最終容量で1.5% Al(OH)3であるように吸着させた。Alumとのインキュベーションは、室温で90分であった。その後、粒子を0.9% NaClで洗浄し、Al(OH)3へIL-1αの70%が吸着した(125I-IL-1αを用いるパイロットスタディで見出された)と仮定して、それを0.9% NaCl中に11μg IL-1α/100μl懸濁液で再懸濁した。IL-1β結合体を、同じ方法で調製した。対照懸濁液については、IL-1α-PPD結合体中のPPDの量と一致するように同様に希釈した。結合体を、使用するまで4℃で保存した。
【００４７】
実施例6
C57BL/6マウスにおける抗IL-1α抗体応答の発生
しかしながら、免疫系は、サイトカインなどの自己タンパク質に対して寛容であるため、そのような能動的ワクチン接種は自己寛容を打破しなければならない。たいていの自己タンパク質の場合、免疫寛容は、胸腺におけるネガティブセレクションの結果として特異的T細胞の欠如により引き起こされる。その一方、潜在的な自己反応性B細胞が通常存在する。IL-1αのような自己タンパク質を単独で注射した場合、これらのB細胞は、T細胞の助けが欠如しているために応答しない。自己抗原IL-1αに対しPPDなどの外来タンパク質を結合させると、T細胞がPPDを認識するので、B細胞刺激のためのT細胞の助けが得られ、その結果として、IL-1αおよびPPDに対する刺激されたB細胞の抗体産生がもたらされる。それゆえ、本発明者らは、IL-1β特異的B細胞のための有効なT細胞の助けを確実にするために、alum中のIL-1α-PPD結合体をマウスにワクチン接種した。抗体価をELISAによって測定した。5匹のマウスの群は、グルタルアルデヒドを伴うインキュベーション段階を用いて10μg-PPDに結合した15μgの組換えIL-1αでの皮下免疫化を受けた。その後、IL-1α-PPD結合体をalumに吸着させる。マウスは、2週間の時間間隔で3回、そのような皮下免疫化を受けた。
【００４８】
免疫されたマウスは、高力価の抗IL-1α抗体を生じたが、alum中のPPDで免疫された対照マウスは、検出可能な抗体価を誘導できなかった(図2)。抗IL-1α抗体の誘導は、少なくとも2回の注射を必要とした。alum中の組換えIL-1α-PPD結合体を1回のみ注射した後では、抗体応答は血清中に検出されなかった。しかし、alum中の組換えIL-1α-PPD結合体を3回注射した後、すべてのワクチン接種されたマウスは抗IL-1α抗体を産生した。
【００４９】
実施例7
IL-1αに対する能動免疫化による、EL-4を用いた腫瘍負荷からのマウスの保護
C57BL/6マウスを、0日目、14日目、および28日目に、首領域での皮下投与によるalum中の10μg PPDと結合した15μgマウスIL-1αの3回の注射によって、能動免疫した。注射容量は100μlであり、水酸化アルミニウムの量はおよそ1mgであった。対照マウスを同様に、ただし、同じ量のPPDおよび水酸化アルミニウムを含むがIL-1αを含まない調製物で処置した。ELISAにより抗IL1α抗体応答の形成を確認するために、0日目、28日目、42日目、および56日目に尾の静脈から血液を試料採取した。最初の免疫化後56日目に、すべてのマウスに、1,000個のEL-4リンパ腫細胞の接種を行った。その後、次の4週間の間、毎日、マウスを観察した。病気の徴候の最初の発生時点で、腫瘍増殖および転移の巨視的ならびに組織学的定量化のためにマウスを安楽死させた。
【００５０】
腫瘍負荷から30日以内に、対照マウスは、内臓における、播種性の肉眼で見える転移によって証明されたように、腫瘍進行による病気の徴候を示した。対照的に、IL-1αに対して能動免疫されたマウスのいずれも、疾患の臨床的徴候を示さなかった。
【００５１】
実施例8
IL-1αに対する受動免疫化による、マウスリンパ腫EL-4からの保護
C57BL/6マウスを、alum中のIL-1α-PPD結合体を3回皮下注射することで、IL-1αに対して能動免疫した。56日後、それらの血清を収集し、抗IL-1α自己抗体価の発生をELISAにより確認した。そのような血清の200μlを週齢6週間のC57BL/6マウスへ受動転移した(passively transfer)。これらの受動血清転移(passive serum transfer)を毎週、繰り返した。対照C57BL/6マウスに、週1回の間隔で未処置C57BL/6マウス由来の200μlの血清を転移させた。最初の血清転移と共に、すべてのマウスに1,000個のEL-4リンパ腫細胞の接種を行った。その後、次の4週間の間、毎日、マウスを観察した。病気の徴候の最初の発生時点で、腫瘍増殖および転移の巨視的ならびに組織学的定量化のためにマウスを安楽死させた。
【００５２】
30日以内に、対照マウスは、内臓における播種性の肉眼で見える転移から証明されたように、腫瘍によって死んだ。対照的に、ポリクローナル抗IL-1α抗血清での受動血清転移を受けたマウスのいずれも、疾患の臨床的徴候を示さなかった。
【００５３】
実施例9
IL-1αに対する受動免疫化によるPC-3異種移植腫瘍からのSCIDマウスの保護
C57BL/6マウスを、alum中のIL-1α-PPD結合体を3回皮下注射することでIL-1αに対して能動免疫した。56日後、それらの血清を収集し、抗IL-1α自己抗体価の発生をELISAにより確認した。そのような血清の200μlを週齢6週間の雌SCIDマウスへ受動転移した。これらの受動血清転移を毎週繰り返した。対照SCIDマウスに、週1回の間隔で未処置C57BL/6マウス由来の200μlの血清を転移させた。最初の血清転移と共に、すべてのマウスに、脇腹へ107個のPC-3細胞の皮下接種を行った。触知可能な腫瘍を有するマウスを毎週同定した。
【００５４】
30日以内に、対照マウスは、接種の部位に触知可能な腫瘍を発生したが、ポリクローナル抗IL-1α抗血清の受動血清転移を受けたマウスのいずれも触知可能な腫瘍を発生しなかった。
【００５５】
実施例10
ADCK - 抗体依存性補体媒介性死滅(Antibody dependent complement mediated killing)
C57BL/6マウスを、alum中のIL-1α-PPD結合体を3回皮下注射することで、IL-1aに対して能動免疫した。56日後、それらの血清を収集し、抗IL-1α自己抗体価の発生をELISAにより確認した。血清を熱不活性化した。50μlのEL-4細胞懸濁液を96ウェルプレートへ蒔いた。これらのウェルのそれぞれへ、熱不活性化した血清を1:2に段階希釈した溶液の15μlを加えた。その後、プレートを37℃で20分間インキュベートした。その後、25mlのマウス血清を各ウェルへ加えた。37℃でさらに5hインキュベートした後、ウェルを写真に撮り、その後死細胞と生きている細胞を区別するためにトリパンブルーを用いて、計数板内で細胞を数えた。
【００５６】
ポリクローナルマウス抗マウスIL-1α抗血清は、濃度依存性様式でEL-4腫瘍細胞の補体依存性死滅を媒介した。図3参照。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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