(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’の方向に、第１のインスレーター配列、タンデムに６回反復される環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子および第２のインスレーター配列を含むｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
第１のインスレーター配列が、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ−高感受性領域（ＨＳ４）および末端逆位配列（ＩＴＲ）からなる群より選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
第２のインスレーター配列が、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、ＨＳ４およびＩＴＲからなる群より選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
第１のインスレーター配列が、前記第２のインスレーター配列と同じである、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
プロモーターが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの最小プロモーター（ＨＳＶ  ＴＫ  ｍｉｎ）である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
生物発光レポーターが、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群より選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
導入遺伝子が配列番号１８を含む、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項８】
導入遺伝子が配列番号１９を含む、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９】
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片。
【請求項１１】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物中の生物発光の量を測定する工程；
（ｂ）トランスジェニック非ヒト動物に試験薬剤を投与する工程；
（ｃ）試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点でトランスジェニック非ヒト動物の生物発光の量を測定する工程；
（ｄ）（ａ）において測定した生物発光の量と（ｃ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｃ）と比較した（ａ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【請求項１２】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から組織切片を調製する工程；
（ｂ）組織切片中の生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）組織切片に試験薬剤を投与する工程；
（ｄ）試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で組織切片の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）において測定した生物発光の量と（ｄ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【請求項１３】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を調製する工程；
（ｂ）細胞中の生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）細胞に試験薬剤を投与する工程；
（ｄ）試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で細胞の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）において測定した生物発光の量と（ｄ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【請求項１４】
非ヒト動物におけるＧＰＣＲ機能をモニタリングする方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、タンデムに６回反復されるｃＡＭＰ応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子および第２のインスレーター配列を含むｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；（ｂ）非ヒト動物からの生物発光をモニタリングする工程；および
（ｃ）該生物発光をＧＰＣＲ機能と相関させる工程；
を含む、上記方法。
【請求項１５】
ＧＰＣＲ機能のモニタリングにおいて使用するための非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、タンデムに６回反復されるｃＡＭＰ応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子および第２のインスレ
ーター配列を含むｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；（ｂ）（ａ）のトランスジェニック非ヒト動物における生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）ＧＰＣＲリガンドを該トランスジェニック非ヒト動物に投与する工程；
（ｄ）ＧＰＣＲリガンドの投与後に、１またはそれより多い時点でトランスジェニック非ヒト動物の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）で測定した生物発光の量と（ｄ）で測定した生物発光の量を比較する工程；を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、ＧＰＣＲ機能をモニタリングするのに用いるための非ヒトトランスジェニック動物を同定する、上記方法。
【請求項１６】
該ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子および該第１および第２の隣接するインスレーター配列を含む導入遺伝子構築物が、隣接するインスレーター配列をもたないｈＧＨ機能エレメントを含むＣＲＥ含有導入遺伝子構築物と比べて、より多くのｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子の発現を示すトランスジェニック初代動物を作成する、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１７】
５’から３’の方向に、第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子および第２のインスレーター配列を含むｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子構築物を含む、トランスジェニック非ヒト動物であって、ここで第１のインスレーター配列と第２のインスレーター配列とは異なっており、そして応答配列が配列番号６または１１のいずれかの核酸配列を含むｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）である、上記トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１８】
配列番号６または１１のいずれかの核酸配列を含む導入遺伝子構築物を含むｃＡＭＰ誘導性導入遺伝子構築物を含む遺伝子を有する、トランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的には導入遺伝子構築物、導入遺伝子構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物、該導入遺伝子構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物の作製方法およびそれを用いる方法に関する。本発明の実施態様は、リガンドをＧＰＣＲレセプターに結合した後に、経路変更に応答する生物発光導入遺伝子レポーターシステムを含むトランスジェニックモデルを用いて、全身の動物、組織切片、またはネイティブ細胞中で非侵襲的にＧＰＣＲリガンドを試験する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物開発においては、５つの化合物中の１つのみが米国食品医薬品局の承認（ＦＤＡ）を通過しており、損耗率が高い（非特許文献１）。さらに、投資が劇的に増加したにもかかわらず、新薬の導入率は過去３０年にわたりほぼ一定であり、結局年ごとに新薬種でわずか２〜３の進歩が市場にでるだけである（非特許文献２）。
【０００３】
薬物開発の最初のステージで適用される分子イメージングおよび機能イメージングは、生物活性の証明を提供し、その企図される標的に対する効果を有する推定薬物（ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｄｒｕｇ）を確認することができる。従って、分子イメージング技術への投資は薬物開発を推し進めるとかなり期待される（非特許文献３）。従来の情報を超える分子イメージング技術の利点は、その技術がインビボでの生物学的プロセスを研究するための十分な空間および時間的分解能により無処置固体（ｉｎｔａｃｔ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）に実施され得ることである。さらに、異なる時点における同一の生物学的モデルの反復性があり、非観血的で、均一かつ比較的自動化された研究を可能とするため、長期的研究の検出力を増加させ、必要とされる動物の数を減少させることができ、結果的に薬物開発のコストを低減させることができる。
【０００４】
分子イメージング
分子イメージングとは、生きている製物中の細胞内および細胞小器官における特異的な分子プロセスの評価における画像処理技術を利用し、統合するための、様々な学問分野（細胞および分子生物学、化学、医学、薬理学、物理学、生物情報科学および光学）からのアプローチの集合のことを言う（非特許文献４）。
【０００５】
遺伝子工学の出現は、創薬パイプラインなどを含む応用科学へ大きな変更をもたらしている。同じように、動物イメージング手段の開発および利用は、前臨床試験のための新しい集団を提供している（非特許文献５）。動物モデルは、リアルタイムで生理学的な事象を定量化するのが困難であるため、従来的にわずらわしいものであった。この困難を克服するために、長年にわたり磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）や陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）のような新しい画像処理法が開発されてきた。さらに最近では、ルシフェラーゼ、ホタルの発光酵素のインビボでの発光をベースにした生物発光イメージングが非侵襲的な検出のために用いられている。
【０００６】
分子イメージング：生物発光
インビボでの生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、細胞または組織からの発光の検出にも続いている高感度なツールである。レポーター遺伝子技術の有用性は、インビボイメージング法を通して生きている動物中の特定の細胞および生物学的プロセスを分析することを可能にする。生物発光、つまり生きている生物による可視光の酵素生成は、多くの非哺乳動物種における天然に存在する現象である（非特許文献６）。ルシフェラーゼは、光の甲子を放出する基質の酸化を触媒する酵素である（非特許文献７）。北アメリカホタルからの生物発光は最も広く研究されている。このホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ）の発現は、基質Ｄ−ルシフェリンを、５６２ｎｍの緑色発光を生じる非反応性のオキシルシフェリンに変換する酵素であるルシフェラーゼを生成する。哺乳動物の組織は自然に生物発光を発しないため、画像処理が非常に小さなバックグラウンド信号を発生することができるのでインビボＢＬＩはかなり魅力的である。ＢＬＩは、恒常的に光レポーターを駆動する選択遺伝子プロモーターの制御下で、生物発光レポーター遺伝子からなる発現カセットを有する細胞または組織の遺伝子操作を必要とする（図３）。光の産生を誘導するために、ルシフェリンなどの基質が脳室内（ｉｃｖ）、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）または皮下（ｓｑ）注射により投与される。
【０００７】
ルシフェラーゼによって放出される光は、数ミリメートルから数センチメートルの深さに浸透することができる。しかし、光子の強度は、組織の深さの各センチメートルに対して１０倍減衰する（非特許文献８）。高感度な光検出装置を、インビボで生物発光を検出するために用いる必要がある。この検出器は、単位面積当たりに発光される光子数を測定する。４００〜１０００ｎｍの波長での低レベルの光は、シリコンウエハーを打ち、電子に変換する電荷結合素子カメラで検出することができる（非特許文献９）。このソフトウエアは、電子信号を二次元画像に変換することができる。このソフトウエアはまた、放出される光の強度（検出器を打つ放出光子の数）の定量化と、これらの数値の疑似グラフィックまたはグレースケールイメージへの変換が可能である（図２Ａおよび２Ｂ）。実際のデータは光子で測定されるが、疑似グラフィックは、迅速な視覚的解釈を可能にする。目的の領域内の定量的な測定は、より微妙な差異の場合必要となり得る。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラの使用により熱雑音を低減し、遮光用の箱を用いるとルシフェラーゼ産生光が最適に可視化および定量化することを可能にする（非特許文献１０）。発光シグナルの解剖学的位置についてのオートグラフやレントゲン写真のような別のタイプの画像に重ねてルシフェラーゼイメージを持っておくことは有用である（図２Ｂ）。このソフトフエアは、視覚化と解釈のために画像を重ね合わせる。動物の遺伝子操作と分子イメージング技術を組み合わせることによって、生きている動物中の特定の分子プロセスにおける動的研究を行うことが可能となる。このアプローチは、前臨床試験のプロトコルに影響を与え、それにより医学の全ての局面を広く変更する可能性がある（非特許文献１１）。
【０００８】
Ｇ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）−創薬ターゲットとしてのＧＰＣＲ
ＧＰＣＲは、その共有される位置構造にも続いて１００以上のサブファミリーに分類されている細胞表面受容体の大きなスーパーファミリーを構成し；ＧＰＣＲはまた、７回膜貫通（７ＴＭ）受容体とも呼ばれている。ＧＰＣＲは、製薬業界の中で最も頻繁に扱われる創薬ターゲットである。全ての市販処方薬のうちの約３０％がＧＰＣＲを標的化しており、このタンパク質ファミリーを最も成功したターゲット類としている（非特許文献１２）。ＧＰＣＲとそれらの細胞外リガンドとの相互作用は、治療薬の干渉の魅力的な点であることが証明されている。このため、製薬業界は、これらのリガンド−ＧＰＣＲ相互作用を調査するために生化学的創薬アッセイを開発した。活性化ＧＰＣＲとヘテロトリマーＧ−タンパク質との相互作用は、いくつかの下流エフェクターとの相互作用を可能にするグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）により、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）の交換を触媒する（非特許文献１３）。下流のシグナル伝達は、目的のＧＰＣＲに好ましいＧαアイソフォームに依存している。Ｇαi/0およびＧ−αsのファミリーの代表が主にアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性を調節する一方、Ｇαq/11ファミリーのタンパク質がホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を刺激する。目的のＧＰＣＲがＰＬＣを経由して信号を発する場合、その後のＧＰＣＲの活性化を測定するために最も広く適用されたレポーターベースの技術は、Ｃａ+2感受性発蛍光団を用いた蛍光形式（非特許文献１４）またはエクオリンと化学発光基質を用いた発光形式（非特許文献１５）のいずれかで測定されるカルシウム（Ｃａ+2）放出アッセイである。目的のＧＰＣＲがＡＣを経由して信号を発する場合、その後の細胞質環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）含有量は、種々の検出技術を用いて検出され得る（非特許文献１６）。
【０００９】
ＧＰＣＲレポーターベースのアッセイは、現在の創薬プログラムにおいて広範囲に用いられている。一般的に、ＧＰＣＲレポーターは、特定のＧＰＣＲを活性化するかまたは調節するリガンドまたは化合物を同定するために、大きな製薬ライブラリのインビトロでのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）をサポートするための細胞ベースのシステムに導入されている。第二の継続した細胞ベースのアッセイは、特定のＧＰＣＲに対するＨＴＳで同定された全ての「ヒット」を確認および洗練する；しかし再び、これらのアッセイは形質転換された細胞型中にクローン化されたＧＰＣＲを導入する組み換えＤＮＡ法に依存している。形質転換された細胞型は、大きなスクリーニングプログラムをサポートする優れた増殖能を有しているが、これらはしばしば異常な遺伝的および機能的特性を示し、結果としてＨＴＳから推定される「ヒット」の有意な消耗がこれらのパラダイムを用いて検出される。
【００１０】
数年にわたり、生物発光ベースのレポーター遺伝子アッセイは、ＧＰＣＲの機能的活性を測定するために用いられてきた（非特許文献１７）。このアッセイ形式は、生物発光の読み出しの低いシグナルバックグラウンドおよび、ＧＰＣＲの活性化と累積レポーター遺伝子発現との間の信号増幅工程のおかげで非常に感受性が高い。
【００１１】
レポーター遺伝子のプロモーター中のｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）は、Ｇタンパク質依存性のシグナル伝達の特異的なモニタリングを可能にする。リガンドがＧＰＣＲに結合すると、それは付随Ｇタンパク質の活性化を可能にする、ＧＰＣＲの立体構造変化を引き起こす。酵素アデニル酸シクラーゼは、Ｇタンパク質によって調節され得る細胞のタンパク質である。アデニル酸シクラーゼ活性は、活性化Ｇタンパク質のサブユニットに結合すると活性化されるかまたは抑制されるかのいずれかである。シグナル伝達は、Ｇタンパク質のタイプに依存している。アデニル酸シクラーゼは、細胞中のｃＡＭＰ産生を増加させるかまたは減少させるかのいずれかの役割を果たしている。このｃＡＭＰ産生は、細胞代謝におけるセカンドメッセンジャーであり、またプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のアロステリック活性化因子である。ｃＡＭＰが存在しない場合、ＰＫＡ複合体は不活性である。ｃＡＭＰは、ＰＫＡの調節サブユニットに結合すると、それらのコンフォメーションは変更され、プロテインキナーゼＡを活性化し、さらなる生物学的効果を可能にする調節サブユニットの解離を引き起こす。次いで、ＰＫＡが転写因子ＣＲＥＢをリン酸化し活性化する。ＣＲＥＢは、ｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）と呼ばれる特定のＤＮＡ配列に結合することによって転写を増加または減少させ、それによりルシフェラーゼレポーター遺伝子のような特定の遺伝子を発現する。
【００１２】
ＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子は、ｃＡＭＰ細胞内シグナル伝達経路を通して直接的にかまたはＰＬＣを通して間接的にかのいずれかで３つの主要なＧＰＣＲ全てのアッセイを活性化するように設計されている。任意の１つの細胞型は、それらの細胞表面上に多くの異なるタイプのＧＰＣＲを含んでいるため（従って全ての細胞は、細胞内で同時に生じるＧ−αq/11、Ｇ−αi/0およびＧ−αsを経由するＧＰＣＲシグナル伝達を有している）、従来の知識は、ＣｒｅＬｕｃのような導入遺伝子が任意のひとつの特定ＧＰＣＲリガンドを識別するのに十分特異的であることはありそうもないということを示唆している。しかし、本発明者らは、本明細書中でＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子がＧＰＣＲリガンドを識別することができることを示している。本発明者らは、細胞内のルシフェラーゼレポーター、組織切片、または全体の動物の生物発光シグナルがホルスコリンによって増加されること、およびＧｓ、ＧｑまたはＧｉのリガンドによって調節されることを予測している。表１は、ＧＰＣＲリガンドに結合する際に、ＣｒｅＬｕｃレポーターシステム上でＧＰＣＲの活性化／抑制が起こるという予測された効果を示している。さらに、本発明者らは、新規のＣｒｅＬｕｃレポーターシステムがＧＰＣＲリガンドの異なるクラスを識別し、そのようなレポーターシステムは、細胞、組織切片および全体の動物中で用いられるときに新規のＧＰＣＲリガンドを同定するために適用可能であるというデータを示している。
【００１３】
【表１】
0005944833.tif 000002
【００１４】
ＧＰＣＲバイオイメージングレポータートランスジェニックモデル
現在の創薬パラダイムにおける潜在的な薬物候補の顕著な消耗は、細胞ベースのレポーターアッセイからインビボモデルへの相転移においておきている。多くのインビボモデルは、特定のヒト疾患の全てまたは一部を反復することが可能である。これらのモデルにおけるリード化合物を証明することは、新しい化学ＧＰＣＲ薬の進行に重要なマイルストーンである。動物疾患モデルは、通常それらの表現型および、疾患転帰の変更に及ぼす候補化合物の影響の正確なアッセイの開発を可能にするために、多数の動物と時間を必要とする。インビトロでの試験後の、複雑なシステムでの薬物候補を試験する次のレベルは、疾患状態のインビボ試験またはインビボモデルを用いており、これらは機械ベースである。誘導された疾患転帰を変更する失敗はあまり理解されないが、いまだに薬物開発のパイプラインにおいて候補化合物の大きな損耗率を生じている。
【００１５】
ＧＰＣＲリガンド結合を含むトランスジェニックモデルおよび活性化レポーターアッセイは、ＧＰＣＲの現在の薬物開発パラダイムの大幅な改善となる。例えば、本発明の実施態様は、ＧＰＣＲリガンド薬物開発を大幅に促進する、全身の動物、組織、または細胞における分子イメージングと組み合わせた、ルシフェラーゼレポーター（ＣｒｅＬｕｃ）をベースにしたｃＡＭＰレポーターアッセイを含む導入遺伝子を記載している（非特許文献１８；非特許文献１９）。本明細書中に記載されるように、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の実施態様は、以下の非限定的な利点を提供する：
【００１６】
1.組織や細胞ベースのアッセイはトランスジェニックインビボモデルアッセイと同じレポーターシステムを持っているため。複雑な無処置の生物学的システムの未知数の数を減らす。
2.非侵襲的な画像処理は、同じ動物において、経時的アッセイにおけるリガンドや化合物活性の定量分析を可能にする。
3.非侵襲的な画像処理は、研究あたりの動物の数を減らし、各動物が自身のコントロールになることによって、より大きな検出力につながる。ここで、コントロールとは時間ゼロにおいてアッセイされる動物である。
4.トランスジェニック動物は、インビトロまたはエキソビボでなされる並行アッセイをサポートするための細胞および組織の供給源になる。
5.トランスジェニック動物のアッセイは、ネイティブ細胞型におけるリガンド活性のアッセイをサポートし、リガンドのより現実的なプロファイルを導く。
6.トランスジェニック動物は、ＧＰＣＲリガンドの約力学および薬物動態の同時評価を可能にする。
7.トランスジェニック動物は、器官レベルまたは全身の動物レベルいずれかで、組織および細胞型の特異性の同時識別を可能にする。
8.トランスジェニック動物は、新規のシグナル伝達経路および特定のリガンドへのそれらの応答を明らかにするための、他の遺伝的に改変されたモデルとの交配を可能にする。
【００１７】
異なるレポーターを用いて遺伝子操作された多くのトランスジェニック動物は、以下のような分子プロセスの研究に用いられている：薬物代謝（非特許文献２０）、遺伝毒性（非特許文献２１）および毒性化合物の効果（非特許文献２２）。それらの設計目的を達成するために、分子イメージング研究に適切なＧＰＣＲレポーター動物は、研究下にあるリガンドまたは化合物の生体内分布における広範で鋭いインビボアッセイをサポートするための大きなウインドウの生物発光検出、ならびに全ての細胞型における発現の両方を可能にするように配置されるいくつかのエレメントを組み込む必要がある。
【００１８】
遺伝子発現に関与するメカニズムの複雑さと多様性により、研究者らは、完全に予測可能な方法でトランスジェニック動物中における発現の全てのケースにおいて有能な遺伝子を構築することができない（非特許文献２３：非特許文献２４；非特許文献２５）。大規模な試行錯誤を通してのみ、導入遺伝子構造の独特の組み合わせを、ＧＰＣＲレポーターのバイオイメージングの必要に応じて、モデルデザインの目的に到達させることができる。
【００１９】
組換え細胞アッセイに対する、トランスジェニックＧＰＣＲレポーターの有用性
スクリーニング技術が、個々のＧＰＣＲの振る舞いを理解するポイントまで進むと、スイッチをオンオフするというよりもむしろ、これらの受容体が情報のマイクロプロセッサのように作用することが明らかである。このことは、機能の選択性の現象を導入しており、それにより特定のリガンドは所定の受容体によって媒介されるシグナル伝達機構の一部分のみを開始することによって、薬物開発の新たな地平を切り開く。任意の薬理学的レポーターアッセイにおける非常に高い要求を置く医薬品化学を導くために、これらの複雑なシステムにおいて新規のＧＰＣＲリガンドの関係を発見し、薬物の効果を定量化する必要がある。この概念は、組換え細胞ベースのスクリーニングアッセイから全体のシステムのアッセイへ戻る原動力となる。ネイティブ細胞環境中で特定のＧＰＣＲまたはＧＰＣＲのセットによってリガンドの活性をプロファイリングし、重要なクラスの薬学的に重要な受容体に対する新しい薬物を同定するための成功率を向上させることが期待される（非特許文献２６）。生物発光ＧＰＣＲレポーター導入遺伝子を含む動物モデルは、無処置の生物学的に複雑なシステム中でＧＰＣＲリガンド活性を定義する非常に望ましい分子イメージングストラテジーであり、ヒトの疾患と戦うための薬物開発を向上させる目的を有している。
【００２０】
ＣＲＥ／ＣＲＥＢの活性化は、多くの可変的な生物学的プロセスに関与しており、ＣＲＥ／ＣＲＥＢレポーター発現系を用いることによるＣＲＥの活性化の研究に大きな関心がある。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）は、受容体の活性化とひき続くタンパク質キナーゼの活性化後の、細胞内シグナル伝達におけるセカンドメッセンジャーであり、よって多くの生物学的プロセスの調節に関与している。ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）は、ｃＡＭＰによって活性化されたキナーゼによってリン酸化され、多くの遺伝子のプロモーター領域中のｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）に結合して転写を活性化させる（非特許文献２７）。β−ガラクトシダーゼ発現を駆動する最小単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーターを持つ６つのタンデムＣＲＥを保持するトランスジェニックマウスを用いて、慢性的な抗うつ薬治療に応答する脳スライス中のＣＲＥ媒介性遺伝子発現が研究された（非特許文献２８）。同様に、チミジンキナーゼプロモーターに融合するラットソマトスタチン遺伝子プロモーターＣＲＥの４つのコピー、およびルシフェラーゼ遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを用いて、組織学的脳スライスまたはホモジネート中のＣＲＥ活性化が研究された（非特許文献２９）。しかしながら、これまでの研究は、適切な動物モデルを見つけるために多くのトランスジェニック系統をスクリーニングする必要性によって、妨げられてきた。さらに、適切な系統が確認された後、比較的低いレポーター発現レベルでは、レポーター遺伝子を測定するためにトランスジェニック動物を安楽死させる必要があり、多くの動物を１つの実験系に用いる必要がある。
【００２１】
本発明の実施態様は、インスレーター配列、応答配列、プロモーターエレメント、レポーター遺伝子および機能エレメントを含む導入遺伝子の開発である。この導入遺伝子は、その早い速度での組込みと高いレベルでのレポーター発現によって、迅速に非ヒト動物中に導入することができ、それによりインビボ（すなわち生きている動物中）、インサイチュ（例えば、脳スライス、無処置の固体）またはインビトロ（例えば、トランスジェニック動物から培養された初代細胞、組織ホモジネート）でのエレメント活性の調節を研究するためのモデルとして、トランスジェニック動物を容易に開発することができる。
【００２２】
本発明の実施態様は、インビボで細胞内ｃＡＭＰレベルの調節を通してＧＰＣＲリガンド活性を定量化するモデルとしてトランスジェニック非ヒト動物中で用いられるＣＲＥ  Ｌｕｃレポーターシステムを含む導入遺伝子である。非限定的な例として、本発明者らは、一般的なｃＡＭＰ調節因子を用いて、単離された初代細胞中および全身の動物中の生物発光によるルシフェラーゼレポーターの変化を示している。別の実施態様において、このレポーターの活性化はエキソビボでのルシフェラーゼアッセイを用いて組織抽出物中でアッセイされ確認されている。ＣＲＥ  Ｌｕｃ導入遺伝子の応答は、複数のマウス系統において記録されており、単一または複数の組織活性化プロファイルを示している。さらに非限定的な例として、本発明者らは、特定のＧＰＣＲリガンドが全身の動物、組織スライス、および初代細胞中のＣＲＥ  Ｌｕｃ導入遺伝子を活性化することを実証した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】ＤｉＭａｓｉ、ＪＡ、ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｅ  ｃｏｎ  ２２，１５１−１８５、２００３
【非特許文献２】Ｌｉｎｄｓａｙ  ＭＡ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２、８３１−８３８、２００３
【非特許文献３】Ｒｕｄｉｎ  Ｍ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ  ｖｏｌ  ６２
【非特許文献４】Ｍａｓｓｏｕｄ  Ｔ．Ｆ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：５４５−５８０、２００３
【非特許文献５】Ｍａｇｇｉｅ  Ａ．ａｎｄ  Ｃｉａｎａ  Ｐ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．４、２４９−２５５、２００５
【非特許文献６】Ｃｏｎｔａｇ、Ｃ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３、１９９５
【非特許文献７】Ｇｒｅｅｒ  Ｌ．Ｆ．、ＩＩＩ、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １７：４３−７４、２００２
【非特許文献８】Ｃｏｎｔａｇ、Ｃ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３、１９９５
【非特許文献９】Ｓｐｉｂｅｙ  ＣＰ  ｅｔ  ａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２：８２９−８３６、２００１
【非特許文献１０】Ｃｏｎｔａｇ  Ｃ．Ｈ．ａｎｄ  Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｍ．Ｈ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４：２３５−２６０、２００２
【非特許文献１１】Ｍａｇｇｉｅ  Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ．Ｓｃｉ  ２５、３３７−３４２、２００４
【非特許文献１２】Ｊａｃｏｂｙ、Ｅ；Ｃｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１：７６１−７８２、２００６
【非特許文献１３】Ｃａｂｒｅｒａ−Ｖｅｒａ  Ｔ．Ｍ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２４：７６５−７８１、２００３
【非特許文献１４】Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１４：１２５−１３３、１９９９
【非特許文献１５】Ｄｕｐｒｉｅｚ  Ｖ．Ｊ．、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ８：３１９−３３０、２００２
【非特許文献１６】Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｄ．Ａｓｓａｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：２９１−３０３、２００３
【非特許文献１７】Ｈｉｌｌ、Ｓ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１：５２６−５３２、２００１
【非特許文献１８】Ｂｈａｕｍｉｋ、Ｓ．ａｎｄ  Ｇａｍｂｈｉｒ、Ｓ．Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：３７７−３８２  ２００２
【非特許文献１９】Ｈａｓａｎ  Ｍ．Ｔ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２９：１１６−１２２、２００１
【非特許文献２０】Ｚｈａｎｇ  Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：１０５４−１０６４、２００３
【非特許文献２１】Ｇｏｓｓｅｎ  Ｊ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７９７１−７９７５、１９８９
【非特許文献２２】Ｓａｃｃｏ  Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３９２−１３９７、１９９７
【非特許文献２３】Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ｃ．Ａ．（ｅｄ．）１９９４．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
【非特許文献２４】Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｄｏ、Ｃａｌｉｆ．
【非特許文献２５】Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｏｂｌ、Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓ  ｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓ  ｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ
【非特許文献２６】Ｋｅｎａｋｉｎ  ＴＰ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．８，６１７−６２５、２００９
【非特許文献２７】Ｓｈａｙｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６８：８２１−８６１、１９９９
【非特許文献２８】Ｔｈｏｍｅ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：４０３０−４０３６、２０００
【非特許文献２９】Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、Ｍａｙ  ９；２（５）：ｅ４３１、２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
概して、本発明は、導入遺伝子構築物、導入遺伝子構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物、該導入遺伝子構築物を含むトランスジェニック非ヒト動物の作製方法およびそれを用いる方法を提供する。本発明の実施態様は、ＣＲＥ  Ｌｕｃレポーターシステムを含む導入遺伝子構築物を提供する。本発明の実施態様は、非ヒト動物中への、ＣＲＥ  Ｌｕｃレポーターシステムを含む導入遺伝子構築物の導入である。
【００２５】
ｃＡＭＰ変調は、ＧＰＣＲのための主要な活性化経路であるため、本発明は全身の動物、組織切片、または細胞中で、レポーター遺伝子（このレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼによるルシフェリンの代謝など測定可能な生物発光シグナルを提供する）の活性化を通してリガンドまたは化合物によるＧＰＣＲの活性化を定量化するためのプラットフォームとしての役目を担う。本発明は、細胞ベースのアッセイから全身の動物まで、リガンドまたは化合物のような新規に発見された薬物成分（ｎｅｗ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の移行を向上させるためのツールを供給する。本発明の実施態様は、ネイティブ細胞中で同じレポーターシステムを用いることで、バイオアベイラビリティーデータを同時に提供しながら、新規のＧＰＣＲリガンドの損耗率を低減する。
【００２６】
本発明の実施態様は、第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００２７】
本発明の実施態様は、前記第１のインスレーター配列が、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ−高感受性領域（ＨＳ４）および末端逆位配列（ＩＴＲ）からなる群より選択される、トランスジェニック非ヒト動物である。本発明のさらなる実施態様は、前記第２のインスレーター配列が、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）、ＨＳ４およびＩＴＲからなる群より選択される、トランスジェニック非ヒト動物である。本発明のさらなる実施態様は、前記第１のインスレーター配列が、前記第２のインスレーター配列と同じである、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００２８】
本発明の実施態様は、前記応答配列が、ｃＡＭＰ  応答配列（ＣＲＥ）、アクチベータータンパク質１（ＡＳＰ１）、グルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）、熱ショック応答配列（ＨＳＥ）、血清応答配列（ＳＲＥ）、甲状腺ホルモン応答配列（ＴＲＥ）およびエストロゲン応答配列（ＥＲＥ）からなる群より選択される、トランスジェニック非ヒト動物である。本発明のさらなる実施態様は、前記応答配列がタンデムに２〜２４回反復されている、トランスジェニック非ヒト動物である。本発明のさらなる実施態様は、前記応答配列がタンデムに６回反復されている、トランスジェニック非ヒト動物である。本発明のさらなる実施態様は、前記応答配列がＣＲＥであり、さらにこのＣＲＥ応答配列がシングルエレメントであるかまたは２〜２４回反復されていてもよい、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００２９】
本発明の実施態様は、前記プロモーターが単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの最小ポロモーター（ＨＳＶ  ＴＫ  ｍｉｎ）である、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００３０】
本発明の実施態様は、生物発光レポーターが、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）からなる群より選択される、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物である。
【００３１】
本発明の実施態様は、前記機能エレメントがヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子である、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物である。
【００３２】
本発明の実施態様は、前記導入遺伝子が配列番号１８を含む、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００３３】
本発明の実施態様は、前記導入遺伝子が配列番号１９を含む、トランスジェニック非ヒト動物である。
【００３４】
本発明の実施態様は、前記トランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞であるかまたは請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片である。
【００３５】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物中の生物発光の量を測定する工程；
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト動物に試験薬剤を投与する工程；
（ｃ）該試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で該トランスジェニック非ヒト動物の生物発光の量を測定する工程；
（ｄ）（ａ）において測定した生物発光の量と（ｃ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｃ）と比較した（ａ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【００３６】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から組織切片を調製する工程；
（ｂ）該組織切片中の生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）該組織切片に試験薬剤を投与する工程；
（ｄ）該試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で該組織切片の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）において測定した生物発光の量と（ｄ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【００３７】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）リガンドを同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を調製する工程；
（ｂ）該細胞中の生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）該細胞に試験薬剤を投与する工程；
（ｄ）該試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で該細胞の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）において測定した生物発光の量と（ｄ）において測定した生物発光の量とを比較する工程；
を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、試験薬剤をＧＰＣＲリガンドとして同定する、上記方法。
【００３８】
本発明の実施態様は、非ヒト動物におけるＧＰＣＲ機能をモニタリングする方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；
（ｂ）該非ヒト動物からの生物発光をモニタリングする工程；および
（ｃ）該生物発光をＧＰＣＲ機能と相関させる工程；
を含む、上記方法。
【００３９】
本発明の実施態様は、非ヒト動物におけるＧＰＣＲ機能をモニタリングする方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；
（ｂ）該非ヒト動物からのルシフェラーゼをモニタリングする工程；および
（ｃ）該生物発光をＧＰＣＲ機能と相関させる工程；
を含む、上記方法。
【００４０】
本発明の実施態様は、非ヒト動物におけるＧＰＣＲ機能をモニタリングする方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；
（ｂ）疾患状態の状況を模倣するために非ヒト動物を操作する工程；
（ｃ）該非ヒト動物からの生物発光をモニタリングする工程；および
（ｃ）該生物発光をＧＰＣＲ機能と相関させる工程；
を含む、上記方法。
【００４１】
本発明の実施態様は、非ヒト動物におけるＧＰＣＲ機能をモニタリングする方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；
（ｂ）疾患状態の状況を模倣するために非ヒト動物を操作する工程；
（ｃ）該非ヒト動物からのルシフェラーゼをモニタリングする工程；および
（ｃ）該生物発光をＧＰＣＲ機能と相関させる工程；
を含む、上記方法。
【００４２】
本発明の実施態様は、ＧＰＣＲ機能のモニタリングにおいて使用するための非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、以下：
（ａ）第１のインスレーター配列、応答配列、プロモーター、生物発光レポーター、機能エレメントおよび第２のインスレーター配列（ｉｎｓｕｌａｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む導入遺伝子を発現させるために、非ヒト動物を遺伝子導入により改変する工程；
（ｂ）（ａ）のトランスジェニック非ヒト動物における生物発光の量を測定する工程；
（ｃ）ＧＰＣＲリガンドを該トランスジェニック非ヒト動物に投与する工程；
（ｄ）該ＧＰＣＲリガンドの投与後に、１またはそれより多い時点で該トランスジェニック非ヒト動物の生物発光の量を測定する工程；および
（ｅ）（ｂ）で測定した生物発光の量と（ｄ）で測定した生物発光の量を比較する工程；を含み、ここで（ｄ）と比較した（ｂ）の生物発光の量の差が、ＧＰＣＲ機能をモニタリングするのに用いるための非ヒトトランスジェニック動物を同定する、上記方法。
【００４３】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されるトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を準備する工程；（ｂ）該細胞中の生物発光の量を測定する工程；（ｃ）試験薬剤を該細胞に投与する工程；（ｄ）試験薬剤の投与後に、１またはそれより多い時点で該細胞中の生物発光の量を測定する工程；（ｅ）（ｂ）において測定した生物発光の量と（ｄ）において測定した生物発光の量とを比較する工程であって、ここで（ｂ）と（ｄ）を比較した場合の生物発光の量の差異は、ＧＰＣＲリガンドとして試験薬剤を同定している、工程。
【００４４】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）コントロールを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、コントロールを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００４５】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）コントロールを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、コントロールを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００４６】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）一般的なｃＡＭＰモジュレーターを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、一般的なｃＡＭＰを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００４７】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）コントロールを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、コントロールを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００４８】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）一般的なｃＡＭＰモジュレーターを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、一般的なｃＡＭＰモジュレーターを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００４９】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）細胞刺激因子を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、細胞刺激因子を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００５０】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された細胞を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）細胞刺激因子を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）一般的なｃＡＭＰモジュレーターを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｅ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、細胞刺激因子および一般的なｃＡＭＰモジュレーターを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と細胞刺激因子および一般的なｃＡＭＰモジュレーターならびに試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００５１】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）細胞刺激因子を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、細胞刺激因子を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【００５２】
本発明の実施態様は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を調節する化合物を同定する方法であって、該方法は以下の工程を包含する；（ａ）本明細書中に開示されているトランスジェニック非ヒト動物から単離された組織切片を１つ以上のレセプタクル中に供給する工程；（ｂ）細胞刺激因子を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｃ）一般的なｃＡＭＰモジュレーターを１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｄ）試験薬剤を１つ以上のレセプタクルに投与する工程；（ｅ）該レセプタクル中のルシフェラーゼの量を測定する工程であって、細胞刺激因子および一般的なｃＡＭＰモジュレーターを含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量と細胞刺激因子および一般的なｃＡＭＰモジュレーターならびに試験薬剤を含むレセプタクル中で測定されたルシフェラーゼの量とを比較した場合の差異は、ＧＰＣＲを調節する化合物を示している。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＣｒｅＬｕｃバイオイメージングマウスモデルを示している。この図は、３つのタイプのＧＰＣＲ（Ｇｉ、ＧｓおよびＧｑ）全てがｃＡＭＰ経路を経由して直接的にかまたはＰＬＣ経路を経由して間接的にかのいずれかによる、ＣＲＥ  Ｌｕｃレポーター導入遺伝子の細胞内活性化を示している（パネルＡ）。ホルスコリン誘導に応答するルシフェラーゼレポーターの生物発光における変化を３つのタイプのＧＰＣＲについて示している（パネルＢ）。ホルスコリンは、ＧｓおよびＧｑシグナルを増加、すなわちＣｒｅＬｕｃ生物発光を増加させる一方、Ｇｉ誘導はそのレポーターからのシグナルを減少させる。ＧαｓはＡＣの直接的な刺激によってｃＡＭＰ依存性経路を活性化し、ＧαｓはｃＡＭＰの生成を阻害し、そしてＧαｑは２つのセカンドメッセンジャーＩＰ３およびＤＡＧの発生をもたらすＰＬＣを刺激する。略号：α、Ｇタンパク質のαサブユニット；β、Ｇタンパク質のβサブユニット；γ、Ｇタンパク質のγサブユニット；ＡＣ、アデニル酸シクラーゼ；ＰＬＣ、ホスホリパーゼＣ；ＰＫＡ、プロテインキナーゼＡ；ＰＫＣ、プロテインキナーゼＣ；ＤＡＧ、ジアシルグリセロール；ＩＰ３、イノシトール三リン酸；Ｃａ+2、カルシウム；ＣａＭＫ、カルシウム／カルモジュリンプロテインキナーゼ；ｃＡＭＰ、環状アデノシン一リン酸；ＣＲＥ、ｃＡＭＰ応答配列；ＣＲＥＢ、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質。
【図２Ａ】リアルタイムのインビボ生物発光イメージングを示し、そのシステムを用いるメリットを記載している。コンピュータ分析システムを備えるこのＩＶＩＳ１００（Ｘｅｎｏｇｅｎ）バイオイメージング装置は、生物発光レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼによって発せられた光を利用してリアルタイムのインビボイメージングを可能にする。このソフトウエアは、シグナルの数量化を非観血的かつ長期的にサポートする。リアルタイムのインビボイメージングは、従来のインビボでの化合物試験に対して多くの利点を有する。従来の動物試験は、複数の治療点で個々のマウスが必要となる一方、バイオイメージングモデルを利用した研究では、同じ動物を複数の時点でサンプリングし、複数の治療のために再利用することができる。この図に示されるように、０時間、２時間、４時間および８時間の時間経過は、現在の方法論を用いると２４匹の動物（各時点あたりｎ＝６）が必要であるにもかかわらず、バイオイメージング技術を用いると必要とされるのは６匹の動物のみである。これは、以下を含むいくつかの利点をもたらす：より多くの化合物が効果について試験されることを可能にするのに必要な試験動物はより少ないので、よりハイスループットである；時間的および空間的データが同じ動物から採取することができるので、データの内容および質がより高い；および統計的誤差が減少し、個々の化合物についてなされる決定の質が向上する。
【図２Ｂ】ＣｒｅＬｕｃトランスジェニックマウスにおける化合物誘導の典型的な視覚イメージを示している。イソプロテレノール（右パネル）の投与は、基底レベル（左パネル）と比較してＣＲＥ  Ｌｕｃレポーターの脊髄の発現を増加させる。この生物発光検出は、グレースケールでの疑似表現として動物の白色光画像に視覚的に表わされる。
【図３】発現を高めるために複数のＤＮＡエレメントを含んでいる導入遺伝子構造の模式図を示している。この模式的な導入遺伝子構造は、以下のエレメントを含んでいる：位置に依存しない発現を産生するためのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）としてこの図に示されているインスレーター配列；６回反復されたＣＲＥ−ｃＡＭＰ（６×ＣＲＥ）によって表わされる応答配列；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの最小プロモーター（ＨＳＶ  ＴＫ  ｍｉｎ）として示されるプロモーターエレメント；哺乳動物発現に最適化されたルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ２）によって表わされるレポーターエレメント；および遺伝子発現を増強するためにポリＡ末端を有するヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ  ｐｏｌｙ  Ａ）によって表わされる機能エレメント。
【図４】ＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子ベクターのインビトロでの検証である。３０、１００、または１９９ｎｇのＤＮＡでのハイブリッドまたは合成（シンセ）ベクターを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ  ＃１１６６８−０１９）を用いてＣＨＯ細胞（ウミシイタケルシフェラーゼポジティブコントロールベクターと一緒に）にトランスフェクションした。２日後、その細胞を３μＭのフォスルコリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ  ＃Ｆ６８８６）を用いて４時間刺激し、その後Ｄｕａｌ  Ｇｌｏ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃  Ｅ２９２０）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、両方のベクターでルシフェラーゼシグナルの用量依存性の増加を示している。より高いレベルの誘導がハイブリッドベクターで達成された。
【図５Ａ】正常マウスにおけるｃＡＭＰレベルのＰＤＦ阻害剤の効果を示している（Ｃｈｅｎｇ  ＪＢ、ＪＰＥＴ、２８０、６２１−６２６からの再現）。Ｂａｌｂ／ｃマウスにｘ軸上に列挙されているビヒクルまたは薬物を服用させ、２０分後にその血液を採取してｃＡＭＰラジオイムノアッセイによりｃＡＭＰをアッセイした。ＣＰ−８０、６３３とロリプラムの両方が１０ｍｇ／ｋｇでの血漿ｃＡＭＰレベルを大幅に増加させた。
【図５Ｂ】血漿中のｃＡＭＰのインビボ刺激を示している。ＦＶＢ／Ｔａｃメスにビヒクル（１％  ＤＭＳＯ）または薬物をｉ．ｐ．で服用させ、３０分後血液サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ、  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ｃａｔ＃９００−１６３）によってｃＡＭＰをアッセイした。用いた薬物は以下のとおりである：５ｍｇ／ｋｇ  ホルスコリン（Ｆ）（Ｓｉｇｍａ  Ｆ６８８６）、５ｍｇ／ｋｇ  水溶性ホルスコリン（Ｈ2０Ｆ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ３４４２７３）、１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム（Ｒ）（Ｓｉｇｍａ  Ｒ６５２０）またはホルスコリンプラスロリプラム（Ｆ／Ｒ）の組み合わせのいずれか。統計的に有意な増加である１４倍が、ｔ−検定によって決定されるロリプラムと組み合わせた水溶性ホルスコリンの処理で観察された。ホルスコリンがアデニル酸シクラーゼを活性化することによってｃＡＭＰレベルを増加させる一方、ロリプラムのようなＰＤＥ４の阻害剤はｃＡＭＰの加水分解を防止することによって血漿内ｃＡＭＰを上げる。ロリプラムと水溶性ホルスコリンの組み合わせは、インビボでｃＡＭＰレベルを１４倍増加させる。この組み合わせは、バイオイメージングによる初代のスクリーニングのための誘導の大きなウインドウを提供するために用いられ、代表的な研究を図６に示す。
【図６】ＣｒｅＬｕｃレポーターマウスモデルの初代の誘導と系統の選択の結果を示している。複数のトランスジェニック系統を、インビボでのホルスコリンとロリプラムによるルシフェラーゼ誘導のためにスクリーニングし、その後組織を単離してルシフェラーゼ酵素についてアッセイした。トランスジェニックマウスを投薬前（基底発現レベル）でバイオイメージングし、その後同じマウスにｉ．ｐ．で１０ｍｇ／ｋｇのロリプラムおよび５ｍｇ／ｋｇの水溶性ホルスコリンを投与し、投薬の４時間後にバイオイメージングした（誘導された発現）。Ａ（亜系統番号９０）：ホルスコリン／ロリプラム投与は、肺および他の組織においてＣｒｅＬｕｃレポーター遺伝子の基底発現を増加させた；Ｂ（亜系統番号２１９）基底発現の誘導は、主に腸内である；Ｃ（亜系統番号４４）：検出されない基底発現およびレポーターは、脳および他の組織に誘導される；Ｄ（亜系統番号２８）：胸腺および肝臓で増加される検出されない基底発現；Ｅ（亜系統番号１８７）：脳および脊髄で誘導される検出されない基底発現。ランダムに統合された導入遺伝子について予想されるように、基底発現、組織分布、および誘導に対する応答において、系統間にばらつきがあった。２０系統は、１つ以上の組織で５倍より大きい誘導を持つことが同定された。組織プロファイルの変化は、その単一の組織（すなわち、肺、肝臓、脳）が、バックグランド組織の応答のないイメージングを可能にする一方、複数の組織は、広範な化合物の応答プロファイルが作成されることを可能にする。
【図７】インビボまたはエキソビボでのＣｒｅＬｕｃスクリーニングアッセイの一般的な概略図を示している。
【図８Ａ】ＣｒｅＬｕｃマウス（系統１８７）由来の全脳スライスにおける発光に対するイソプロテレノール（ＩＳＯ）およびＡＭＮ０８２（ＡＭＮ）の効果を示している。
【図８Ｂ】時間の経過とともに、ＣｒｅＬｕｃマウス（系統４４）由来の全脳スライスにおける発光に対するホルスコリンの効果を示している。時間は、分単位でＸ軸上に示されている。５０ｕＭのホルスコリンまたはビヒクル（ＤＭＳＯ）を、下のパネルの矢印でマークされた時間＝２８８０で加えた。
【図９】ＣｒｅＬｕｃマウス由来の初代神経細胞の単離および化合物処理を表わす模式図を示している。
【図１０】β−アドレナリン受容体（ＡＤβＲ）の活性化とＤ１ドーパミン受容体（ＤＲＤ１）の活性化を介したＧｓの変調を示している。ニューロンを、系統１８７  Ｅ１８胚の皮質から単離した。培養３日目、試験化合物にホルスコリン５μＭ（Ｆ）、ロリプラム１０μＭ（Ｒ）、ホルスコリンとロリプラム（Ｆ／Ｒ）をイソプロテレノールと組み合わせて１０μＭ、イソプロテレノールとロリプラムを組み合わせて（Ｉ／Ｒ）；ＳＫＦ８２９５８を１０μＭおよびＳＫＦ８２９５８とロリプラムを組み合わせて（Ｓ／Ｒ）を加えた。データは、秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１１】初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼ発現に対する、プロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）２（ＰＲＯＫ２）ペプチドの効果を示している。初代皮質ニューロンを、系統１８７（脳および脊髄中にルシフェラーゼを誘導できる）Ｅ１８上から採取した。このアッセイを培養３日目に４時間または８時間実行した。このＰＲＯＫ２ペプチドは、１ｎＭおよび１００ｎＭで水溶液として加えられる。データは、秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）として示されている。
【図１２】異なるＣｒｅＬｕｃ系統由来の初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼ発現に対するプロキネチシン（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ）２（ＰＲＯＫ２）ペプチドの効果を示している。初代皮質ニューロンを、Ｅ１８で４つの異なるＣｒｅＬｕｃ系統から採取した。このアッセイを、培養３日目に１ｎＭまたは１００ｎＭのＰＲＯＫ２ペプチドいずれかを用いて、４時間後および２４時間後の２つの時点においてトリプリケートで実行した。そのアッセイにはＢｒｉｇｈｔＧｌｏを用い、ＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは、秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１３Ａ】初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼ発現に対するｍＧｌｕＲ７アゴニスト、ＡＭＮ０８２の効果を示している。皮質ニューロンは、Ｅ１８胚（系統１８７）から採取した。このアッセイを培養３日目に実行した。ホルスコリンは１０μＭで用いた。このアゴニスト、ＡＭＮ０８２を１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１μＭのホルスコリンと組み合わせて用いた。このアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔで４時間および８時間で読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１３Ｂ】初代皮質ニューロンにおけるＧｉ活性を調節する能力について未知の化合物をスクリーニングした結果を示している。皮質ニューロンは、Ｅ１８胚（系統１８７）から採取した。このアッセイを培養３日目に実行した。ホルスコリンは１０μＭで用いた。ＡＭＮ０８２または未知の化合物Ａ、ＢまたはＣを異なる濃度のホルスコリンと組み合わせて試験紙、ＥＣ５０値を算出した。このアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔで、４時間で読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１４】初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼ発現に対するｍＧｌｕＲ７アゴニスト、ＡＭＮ０８２の効果を示している。初代皮質ニューロンは、系統１８７由来のＥ１８胚から単離した。このアッセイを培養７日目に６時間、トリプリケートで実行した。ＡＭＮ０８２の濃度曲線は、５０μＭのホルスコリンおｙぼい１０μＭのロリプラムと組み合わせて実行した。このアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１５Ａ】ＣＢ１アゴニスト、ＣＰ５５，９４０によって異なるＣｒｅＬｕｃ系統由来の初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼ発現のＧｉ調節を示している。初代皮質ニューロンは、Ｅ１８で４つの異なるＣｒｅＬｕｃ系統から採取した。このアッセイは培養３日目に実行した。ＣＢ１アゴニストを１０μＭ、ホルスコリンを５μＭおよびロリプラムを１０μＭで用いた。４時間および２４時間の２つの時点で実行した。次いでブライトグロルシフェラーゼアッセイ基質を添加し、そのアッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔルミノメーターで読み取った。データはトリプリケートの平均値で示されている。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１５Ｂ】ＣＢ１アゴニスト、ＣＰ５５，９４０によるＣｒｅＬｕｃマウス由来の初代皮質ニューロンにおけるルシフェラーゼのＧｉ調節を示している。皮質ニューロンは、Ｅ１８胚（系統１８７）から単離した。このアッセイは培養３日目に実行した。ホルスコリン（Ｆ）およびロリプラム（Ｒ）を１０μＭで用いた。アゴニストを１０μＭ、１μＭ、および１００ｎＭの濃度で加えた。このアッセイを、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔにおいて８時間で読み取った。データは、秒足りのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１６】ホルスコリンおよびロリプラム、ならびにＧｓアゴニストであるＤＲＤ１およびＡＤβＲによる、ＣｒｅＬｕｃ線条体ニューロンにおける誘導されたルシフェラーゼ発現を示している。線条体ニューロンは、Ｅ１４胚（系統１８７）から単離した。このアッセイは、培養４日目に実行した。ホルスコリン（Ｆ）を５μＭ、ロリプラム（Ｒ）を１０μＭで用いた。Ｇｓアゴニストであるイソプロテレノール（ｉｓｏ）、ドーパミン（ｄｏｐａ）およびＳＫＦ８２９５８（ｃｈｌｏｒｏ）を１０μＭ、３μＭ、および１μＭで用いた。このアッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔルミノメーターおよびブライトグロルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて５時間で読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１７】ＣｒｅＬｕｃマウスから単離された全脾細胞プレップ中のルシフェラーゼ発現に対する、ホルスコリン（Ｆ）およびロリプラム（Ｒ）のような一般的なｃＡＭＰ誘導因子、ならびにＧｓアゴニストの影響を示している。系統６４の脾細胞を抗ＣＤ３交代（ＣＤ）で２４時間刺激し、他の半分は未処理とした（ｕｎｓｔｉｍ）。２４時間で化合物をプレートに加え、さらに４時間経過させた。ホルスコリンおよびロリプラムの同時処理（Ｆ／Ｒ）は、５ｕＭのホルスコリンおよび１０ｕＭのロリプラムであった。用いたＧｓアゴニストは以下のとおりである：ＥＰ２アゴニストとしてＥＸ０００００１７３Ａ（１７３Ａ）、ＤＰ１アゴニストとしてＢＷ２４５ＣおよびＡＤβＲアゴニストとしてイソプロテレノール。全てのＧｓアゴニストを１０ｕＭで用いた。このアッセイをトリプリケートで実行した。４時間後、１００ｕｌのＢｒｉｇｈｔＧｌｏを加え、このアッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔルミノメーターで読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図１８】ＣｒｅＬｕｃマウスの５つの異なるサブラインから単離されたＴ細胞中のロリプラムおよびホルスコリンによる、一般的なｃＡＭＰの効果を示している。この細胞を抗ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）で刺激した。１８時間後、１０μＭのロリプラムおよび５μＭのホルスコリンをプレートに加え、さらに４時間経過させた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏを加え、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは上のパネルでは発光（秒あたりのカウント数）で示され、下のパネルでは培地に対しての増加の倍率として示している。
【図１９】ＣｒｅＬｕｃマウス（系統６４）から単離された抗ＣＤ刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のルシフェラーゼレベルに対するＧｓアゴニストの効果を示している。この細胞（１ウエルあたり１．５ｘ１０5）を９６ウエルの白色不透明プレート上にプレーティングし、抗ＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）で刺激した。２４時間後、化合物を加えさらに４時間経過させた。ＧｓアゴニストであるＢＷ２４５Ｃ、ＥＸ０００００１７３Ａ（１７３４Ａ）およびイソプロテレノール（ｉｓｏ）は、全て１０μＭで用いた。ホルスコリン（Ｆ）を５ｕＭ、ロリプラム（Ｒ）を１０ｕＭで加えた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏを加え、このアッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。
【図２０】ＣｒｅＬｕｃマウスの２つの異なるサブラインから単離されたＢ細胞中の、ロリプラムおよびホルスコリンにる一般的なｃＡＭＰ活性化の効果を示している。細胞を９６ウエルの白色不透明プレート上に、１ウエルあたり２．０ｘ１０5でプレートし、１０ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激した。１８時間後、１０μＭのロリプラムおよび５μＭのホルスコリンをそのプレートに加え、さらに４時間経過させた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏを加え、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは発光（秒あたりのカウント数）およびコントロールのみ培地に対する増加の倍率として示している。
【図２１】ＣｒｅＬｕｃマウス（系統から単離されたＬＰＳ刺激されたＢ２２０＋Ｂ細胞中のルシフェラーゼレベルに対するＧｓアゴニストの効果を示している。この細胞を９６ウエルの白色不透明プレート上に１ウエルあたり２．０ｘ１０5プレートし、その後１０ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）で刺激した。２４時間後、化合物を加えさらに４時間経過させた。ＧｓアゴニストであるＢＷ２４５Ｃ、ＥＸ０００００１７３Ａ（１７３４Ａ）およびイソプロテレノール（ｉｓｏ）は１０μＭで用いた。ホルスコリン（Ｆ）を５ｕＭ、ロリプラム（Ｒ）を１０ｕＭ加えた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を加え、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示している。
【図２２】一般的なｃＡＭＰアクチベーターであるホルスコリン（Ｆ）およびロリプラム（Ｒ）、ならびにＤＰレセプターのアゴニストであるＢＷ２４５Ｃによる、単離されたミクログリア（系統６４）中の誘導されたルシフェラーゼ発現を示している。初代ミクログリアをＰ２マウス由来の皮質から単利し、ポリ−Ｄ−リシンコーティングしたプレート上に９６ウエル形式でプレートした。細胞は、未処理のままかまたは１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２時間刺激したものかのいずれかである。次いで化合物を加え４時間経過させ、その後Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏアッセイを実行した。用いた化合物は、５μＭのホルスコリン、１０μＭのロリプラムもしくはその２つの組み合わせ、またはＤＰ１レセプターのＧｓアゴニスト、ＢＷ２４５Ｃを１０μＭであった。データは秒あたりのカウント数で示されている。
【図２３】ＣｒｅＬｕｃマウス（系統１８７）の脳および脊髄におけるルシフェラーゼ発現の誘導に対する髄腔内注射されたホルスコリン（Ｆ）およびロリプラム（Ｒ）の効果を示している。１グループあたりＮ＝３〜４のマウスで、３ヶ月齢の雄。グループＡ：ＤＭＳＯコントロール、グループＢ：１ｕｇホルスコリン／１０ｕｇロリプラム、グループＣ：１０ｕｇホルスコリン／１０ｕｇロリプラム、グループＤ：４０ｕｇホルスコリン／１０ｕｇロリプラム。この動物に、髄腔内注射により腰部に１匹のマウスあたり５μｌの量で投薬した。これらを投薬後４時間で画像処理した。脊髄および脳の両方のデータは、平均ピーク輝度、平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。
【図２４】ＣｒｅＬｕｃマウスの脳および脊髄中のルシフェラーゼ発現に対するＥＰアゴニスト、ＥＸ０００００１７３Ａの効果を示している。マウス（系統１８７）をビヒクル（５％  ＤＭＳＯ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ８０、ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇ  ＥＸ０００００１７３Ａのいずれかを用いてｉ．ｐ．注射した。動物を投薬４時間後にバイオイメージングした。データは平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。
【図２５】ＣｒｅＬｕｃマウス中のルシフェラーゼ発現に対するＥＰ２アゴニスト、ＥＸ０００００１７３Ａの効果を示している。マウスに、ビヒクルコントロールまたは用量を変化させたＥＰ２アゴニストＥＸ００００１７３Ａのいずれかを投薬した。マウスに髄腔内注射（１匹のマウスあたり５μｌ）により投薬し、ＩＶＩＳ  ｂｉｏｉｍａｇｅｒで４時間後にバイオイメージングした。データは５匹のマウスの平均値として、平均ピーク輝度、平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。
【図２６】ＣｒｅＬｕｃマウスにおけるアドレナリン受容体β３（Ａｄｒｂ３）アゴニスト、ＣＬ３１６，２４３（１  ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）による異なる組織中のルシフェラーゼの誘導を示している。このルシフェラーゼアッセイは、組織ホモジネートで実施した。
【図２７Ａ】ＣｒｅＬｕｃマウスの系統１１（ｎ＝２）および系統１１５（ｎ＝３）におけるＡｄｒｂ３アゴニスト、ＣＬ３１６，２４３（１  ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）によるルシフェラーゼの誘導を示している。処理前および処理後４〜５時間でＢＬＩを撮影した。組織ホモジネート中のルシフェラーゼ活性は、画像の下に示されている。
【図２７Ｂ】ＣｒｅＬｕｃマウスの系統３１（ｎ＝２）および系統１７５（ｎ＝３）におけるＡｄｒｂ３アゴニスト、ＣＬ３１６，２４３（１  ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）によるルシフェラーゼの誘導を示している。処理前および処理後４〜５時間でＢＬＩを撮影した。組織ホモジネート中のルシフェラーゼ活性は、画像の下に示されている。
【図２８】ＣｒｅＬｕｃマウスの３つの独立した系統における、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト、ＡＶＥ００１０によるルシフェラーゼレセプターの誘導を示している。ベースラインの画像は１日目に得られた。２日目、マウスをＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）で処理し、４時間後に画像処理した。ベースラインに対する誘導の倍率が下部に示されている。
【図２９】ＣｒｅＬｕｃマウスの３つの独立した系統における、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト、ＡＶＥ００１０によるルシフェラーゼレセプターの誘導を示している。マウスをＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）で４時間処理した。８つの異なる組織中のルシフェラーゼ活性を測定した。
【図３０】ＡＶＥ００１０によるＣｒｅＬｕｃの誘導におけるβ細胞毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の効果を示している。雄のＣｒｅＬｕｃマウス（系統１１）を、ＡＶＥ００１０を０．１  ｍｇ／ｋｇ与える前（「非誘導」；上パネル）およびｓｃで与えた後（「ＡＶＥ００１０による誘導」中パネル）に画像処理した。全てのマウスは、ＡＶＥ００１０に応答していた（中パネル）。次いで、この動物をビヒクル（コントロール）またはＳＴＺ（２００ｍｐｋ、ｉｐ）で処理した。４日後、これらをＡＶＥ００１０での処理後再び画像処理した（下パネル）。
【図３１】ＡＶＥ００１０によるＣｒｅＬｕｃの誘導がβ細胞特異的な可能性があることを示している。動物を図３０に記載されたように処理した。血中グルコース濃度を、非絶食マウスの尾静脈ニッキングによって測定した。グルコース濃度は、Ｂａｙｅｒのグルコースメーターで読み取った。グルコース濃度はｍｇグルコース／ｍｌとして示される。誘導の倍率は、ベースラインの信号  対  ＡＶＥ１０を投与したルシフェラーゼバイオイメージングレベルである。血中グルコース濃度（ＢＧ）は、ＳＴＺによる増加した（左上パネル）。非絶食ＢＧレベルは、ＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）によって低減された。図３０に示されるＢＬＩデータを定量した。
【図３２】ＮＯＤ  ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスへのＣｒｅＬｕｃ骨髄移植を示している。骨髄細胞は、系統４４のヘテロ接合体と系統６４のホモ接合体から採取した。その後、この細胞を、１匹のマウスあたり１００万、または５００万個の細胞で、照射ＮＳＧマウスに細胞の尾静脈注射により移植した。系統４４：マウス１および２は、５００万、マウス３および４が１００万の細胞を受けた；系統６４：マウス１が５００万個の細胞、マウス２、３および４が１００万個の細胞を受けた。（ＣｒｅＬｕｃ系統あたり４匹のＮＳＧマウス）。動物を、４週間（データは示さず）でバイオイメージングし、再度８週間（データは示されている）でバイオイメージングした。画像処理の前に、系統６４のマウスを５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンおよび１０ｍｇ／ｋｇのロリプラムで５時間誘導した。
【図３３】マウス胚線維芽細胞中のルシフェラーゼ発現に対する、ホルスコリン、ロリプラムおよびイソプロテレノールの効果を示している。マウス胚線維芽細胞は、６つの独立したＣｒｅＬｕｃ系統由来のＥ１２胚から、１ウエルあたり２０，０００細胞プレーティングして培養した。試験した化合物としては、１０μＭ  ホルスコリン（Ｆ）、５μＭ  ロリプラム（Ｒ）および１０μＭ  イソプロテレノール（ｉｓｏ）が挙げられる。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）として示されている。
【図３４】ＣｒｅＬｕｃマウス（系統１８７）中のルシフェラーゼレベルに対するザイモサン処理の効果を示している。治療群の動物に、疼痛反応を誘導するためにザイモサン（ｚｙｍｏ）によって両方の後部足に皮下注射した。これらの動物を４日間毎日バイオイメージングした（ｄ１、ｄ２、ｄ３およびｄ４と表記）。
【図３５】心筋細胞中のルシフェラーゼレベルに対するホルスコリンおよびロリプラムおよびイソプロテレノールの効果を示している。心筋細胞は、Ｐ３の子犬（系統２２９）から単離した。この細胞を９６ウエルプレートで培養した。試験した化合物としては、１０μＭ  ホルスコリン（Ｆ）、５μＭ  ロリプラム（Ｒ）および１０μＭ  イソプロテレノール（ｉｓｏ）が挙げられる。データは秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）として示されている。
【００５４】
発明の詳細な説明
他に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、一般的に本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるもとの同じ意味を持っている。
【００５５】
本明細書中で引用した各文献、特許出願、特許および他の参考文献は、それが本発明の開示に反しない限り、その全体が参照により援用される。
【００５６】
ここで、本明細書中および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形の「ａ」「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００５７】
さらに、本発明によると、当該分野の技術の範囲内で、従来の分子生物学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は、文献に十分に説明されている例えば、以下を参照のこと：Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ｈｅｒｅｉｎ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９”）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ、ｅｄｓ．（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００５８】
「試験薬」は、化合物または化学化合物のような任意の物質（例えば、有機化学物質、無機化学物質）、生物学的化合物または生物学的物質（例えば、交代および抗原認識フラグメントおよび構築物、核酸（例えばＲＮＡｉ））などの任意の物質を含む。試験薬は、一緒に適用される単一薬剤または複数薬剤を包含する。
【００５９】
本明細書中で用いられる場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、非限定的な例は哺乳動物であるが、その動物の細胞の１つ以上が本明細書中に定義されるような遺伝的改変を含んでいる。さらに非限定的な例として、ラットまたはマウスのようなげっ歯類が挙げられる。他のトランスジェニック動物の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。トランスジェニック動物の選択は、組織を横切るためにレポーターから光を発生させて、検出が可能な表面まで到達させる能力によってのみ限定される。
【００６０】
本明細書中で用いられる場合、「遺伝子組み換え」は、ヒト以外の動物の遺伝子配列における１またはそれより多い変更である。非限定的な例は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入遺伝子の挿入である。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、用語「導入遺伝子」は、発現を増強するためにプロモーター、レポーター遺伝子、ポリアデニル化シグナルおよび他のエレメントを含む外因性ＤＮＡのことをいう（インスレーター、イントロン）。この外因性ＤＮＡは、１つの細胞の胚のゲノム中に組み込まれ、そこからトランスジェニックが発達し、その導入遺伝子はその成熟動物のゲノム中に留まる。この組み込まれた導入遺伝子ＤＮＡは、卵またはマウスのゲノム中に単一でかまたは複数で生じ得、またその導入遺伝子の単一〜複数（数百）のタンデムコピーが各ゲノム位置に組み込まれ得る。
【００６２】
用語「一般的なｃＡＭＰモジュレーター」は、ｃＡＭＰレベルを増加または維持することのできる、化学化合物（例えば、有機化学物質、無機化学物質）、生物学的化合物または生物学的材料（例えば、フラグメントおよび構築物を認識する抗体および抗原）、核酸（例えばＲＮＡｉ）などを言う。非限定的な例としては、ホルスコリンおよびロリプラムが挙げられる。一般的なｃＡＭＰモジュレーターは、単一のｃＡＭＰモジュレーターまたは一緒に適用される複数のｃＡＭＰモジュレーターを包含する。
【００６３】
用語「細胞刺激因子」とは、細胞を活性化し得るかまたは細胞をより活性化した状態にすることのできる、化学化合物（例えば、有機化学物質、無機化学物質）、生物学的化合物または生物学的材料（例えば、フラグメントおよび構築物を認識する抗体および抗原）、核酸（例えばＲＮＡｉ）などを言う。非限定的な例としては、リポポリサッカライドおよび抗ＣＤ３が挙げられる。
【００６４】
本発明の実施態様は、コントロールを使用する。コントロールは、当業者に周知の用語である。適切なコントロールは利用されるアッセイパラメーターまたは調査中の実験の問題に依存する場合がある。典型的には、コントロールは、そのコントロールが、試験薬剤または化合物を溶解するのに用いられているのと同じ緩衝液または溶媒であるビヒクルコントロールである。非限定的な例として、化合物を溶解するのにリン酸緩衝生理食塩水が用いられている場合、ビヒクルコントロールはリン酸緩衝生理食塩水である。同様に、ＤＭＳＯが試験薬剤を溶解するのに用いられている場合、コントロールはＤＭＳＯである。しばしば、化合物を試験するために１種より多い希釈剤が用いられるために、実験またはアッセイごとに１種より多いコントロールを使用する必要がある。
【００６５】
本明細書中で用いられる場合、「ルシフェラーゼ」は、ルシフェラーゼ酵素活性だけでなく、ルシフェラーゼタンパク質の実際の量も言及する。
【００６６】
本発明に従って、トランスジェニック非ヒト動物を作製するために、当業者に公知の従来の技術を使用することができる。例えば、Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ｃ．Ａ．（ｅｄ．）１９９４。トランスジェニック動物技術：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｄｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｏｂｌ、Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．．ａｎｄ  Ｎａｇｙ  Ａ、Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、Ｖｉｎｔｅｒｓｔｅｎ、Ｋ、Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｒ  ２００３。マウス胚の操作；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００６７】
導入遺伝子エレメント
本発明の実施態様は、導入遺伝子に関連している。この導入遺伝子は、インスレーター配列、応答配列、プロモーターエレメント、レポーターエレメントおよび機能エレメントを含み得る。
【００６８】
応答配列は、細胞内でホルモン、酵素、または他の重要なシグナル伝達タンパク質のような細胞のシグナルに応答するパリンドロームＤＮＡ配列である。応答配列の非限定的な例としては、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ応答配列）、エストロゲン応答配列および表２に列挙される他のものが挙げられる。応答配列は、単一のＤＮＡ配列またはタンデムリピートとして、導入遺伝子中に組み込まれ得る。例えば、４回または６回反復されるＣＲＥ応答配列が、導入遺伝子構築物中で用いられ、インビトロで検証されている（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｐ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３；１８４６６−１８４７２、１９８８；Ｏｅｔｊｅｎ  Ｅ  ＪＢＣ  ２６９；２７０３６−２７０４４、１９９４）。Ｃｒｅ応答配列もまた、インビボで比較されており、多量体における増加は、ｃＡＭＰ経路のアクチベーターに対する転写応答の増加と相関している（Ｍｏｎｔｏｌｉｕ、Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２；４２４４、１９９５；Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ、ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ、Ｍａｙ  ９；２（５）：ｅ４３１、２００７）。本発明の実施態様は、単一の配列としてかまたは複数のタンデムリピート（例えばＣＲＥのタンデム６回反復（６×ＣＲＥ））としてのいずれかの任意の公知の応答配列を利用することができる。
【００６９】
【表２】
0005944833.tif 000003
【００７０】
ＤＮプロモーターエレメントは、特定の遺伝子の転写を促進するＤＮＡの領域である。プロモーターは、通常、同じ鎖および上流（センス鎖の５‘領域に向かって）上で、それらが制御する遺伝子の近くに位置している。プロモーターは、特定のＤＮＡ配列および応答配列（ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼを補充するタンパク質（転写因子と呼ばれる）の結合部位を提供する）を含んでいる。ＤＮプロモーターは、その大きさおよび時間と空間内の特定の遺伝子の発現の調節に寄与する内部構造が非常に可変的である。プロモーターエレメントの非限定的な例において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの最小プロモーター（ＨＳＶ  ＴＫ  ｍｉｎ）は、全ての細胞型におけるレポーター遺伝子の発現を可能にするように設計されている。その中核的な発現エレメントのみが保持され、インビトロまたはインビボのいずれかでのユビキタス発現を付与する（Ｐａｒｋ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、１２：１１４７−１１４９、１９９４）。本発明の実施態様は、任意の公知のプロモーターエレメントを利用することができる。非限定的な例として、任意の公知のプロモーターエレメントは、そのプロモーターエレメントがＣＲＥ  ｃｉｓ活性応答配列と組み合わせられる場合に、ｃＡＭＰ経路の変調に応答するレポーターの遺伝子発現を可能にするように用いられる。
【００７１】
ＣＲＥのような応答配列およびプロモーターエレメントであるＨＳＶ  ＴＫ  ｍｉｎはサイズが小さいので、位置の影響に非常に敏感であり、乏しい発現につながるレポーターエレメントの転写を調節するこれらのエレメントを含む導入遺伝子プロモーターは、特にインビボで低いリガンド濃度でリガンドに応答する。従って、本発明の実施態様は、全ての細胞区画を通して機能している導入遺伝子の高レベルでの発現および広い分布を達成するために、追加のエレメントを導入遺伝子に加えることを包含する。これらのエレメントには、インスレーター配列および機能エレメントを含む（Ｓｕｎ  Ｆ．Ｌ  ａｎｄ  Ｅｌｇｉｎ  Ｓ．Ｃ、Ｃｅｌｌ  ９９：４５９−４６２、１９９９）。
【００７２】
本発明の実施態様は、導入遺伝子内の機能エレメントまたは機能増強エレメントを利用する。機能エレメントの非限定的な例は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子である。ＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子において用いられるｈＧＨ配列は、
バイオイメージングモデルの設計目標を達成するために、インスレーター配列に寄与し、相互作用するいくつかの設計エレメントを含んでいる。このｈＧＨ配列は、全てのｈＧＨゲノム構造を含んでいるため、いくつかの重要なエレメントを提供するが、タンパク質中には転写も翻訳もされない。機能する導入遺伝子の産生を向上するためのｈＧＨ配列の重要な影響は、１９９０年以来、いくつかのトランスじぇニックモデルについて実証されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ＬＡ、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：７４−７６、１９９０）。その重要性の比較分析は存在しないが、ｈＧＨ構造は、いくつかの重要で、重要な意味をもつＤＮＡエレメントを含んでいる：
ａ．  イントロンスプライシング：最初に転写されたｍＲＮＡは、イントロン配列とエキソン配列の両方を含んでおり、核から書き出されてさらに処理され、イントロン配列が取り除かれてエキソン配列のみを含む成熟ｍＲＮＡを生じる。このトランスポートおよびトリミングのプロセスは、成熟ｍＲＮＡ鎖をタンパク質の最終的な生産のためのさらなる翻訳機構に接続させる。導入遺伝子のｃＤＮＡ構造中にイントロンを含むことは、導入遺伝子のｃＤＮＡの発現レベルを向上させることが示されている（Ｐａｌｍｉｔｅｒ、Ｒ．Ｄ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４７８−４８２、１９８８）。
ｂ．  無処置の３’ＵＴＲを持つゲノム構造：本発明の実施態様において、導入遺伝子中のｈＧＨ配列は、高いレベルでのｍＲＮＡ安定性、およびそれによる高いレベルでの遺伝子発現を付与する、無処置の３’ＵＴＲを含んでいる。
ｃ．  ポリＡ（ＰＡ＋）構造を有するゲノム構造：このｈＧＨ配列は、天然の３’ＵＴＲに埋め込まれたそのネイティブＰＡ＋構造を含んでいる。一般的にＰＡ＋シグナルは、ウイルス配列（ＳＶ４０、ＲＳＶなど）由来であり、無関係の３’ＵＴＲの末端に加えられた最小構造である。本発明の実施態様において、天然のＰＡ＋シグナルを有する全体の３’ＵＴＲ構造は、完全ｈＧＨ遺伝子のさらに広いゲノムのコンテキストに保存される。
【００７３】
インスレーター配列は、位置に依存する発現を産生するＤＮＡの配列である（Ｇｉｒａｌｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：７５１−
７５５、２００３）。インスレーター配列は、グロブリン遺伝子座について１９８０年に記載され（Ｓｕｎ  Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｌｇｉｎ、Ｓ．Ｃ．、Ｃｅｌｌ  ９９；４５９−４６２、１９９９）、バイオイメージングのためのモデル設計目標をサポートするために選択された組織中で、適切な応答性トランスジェニック発現を得る機会を増やすことが報告された（Ｐｉｎｋｅｒｔ、Ｃ．Ａ．（ｅｄ．）１９９４．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．；Ｍｏｎａｓｔｅｒｓｋｙ  Ｇ．Ｍ．ａｎｄ  Ｒｏｂｌ、Ｊ．Ｍ．（ｅｄ．）（１９９５）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ａｎｉｍａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ．ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ）。インスレーターは、遺伝子発現に寛容なオープンクロマチンドメインを作成し、遠位のサイレンサー／エンハンサー配列の影響に対して、ならびにアセチル化およびメチル化事象に対しての障壁を構成するＤＮＡエレメントである。これらは、バイオイメージングで検出可能なレベルで発現されるレポーター遺伝子を持つ独立したトランスジェニック初代系統の数を大幅に増やさねばならない。インスレーター配列は、一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、４０〜７０％までクローンを発現するルシフェラーゼの数を増やし、結果的にＥＲＥ−ｌｕｃｉ  導入遺伝子中のルシフェラーゼ発現の誘導能を高めることが示されている（Ｏｔｔｏｂｒｉｎｉ  Ｌ．、  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏ  ２４６、６９−７５）。しかしながら、導入遺伝子レポーター発現に対するインスレーターの適用を全面的に検討すると、実用面において、インスレーターを利用することは依然として困難であるという結論に至る。それらの作用メカニズムは部分的にしか知られておらず、その効果は完全に予測可能ではない。インスレーター配列の非限定的な例は、表３に挙げられている。
【００７４】
【表３】
0005944833.tif 000004
【００７５】
Ｃｒｅ−Ｌｕｃ導入遺伝子の実施態様において、インスレーター配列の封入は、バイオイメージングによって検出される機能的レポーターを持つ系統の作製頻度を明らかに増加させた。ＣｒｅＬｕｃトランス得ニック系統におけるルシフェラーゼ発現へのインスレーター配列の寄与の分析については、ＶＩ章の「実施例」以下を参照のこと。
【００７６】
本発明の実施態様は、レポーターエレメントまたは遺伝子を含む導入遺伝子に関する。レポーター遺伝子は、検出可能な遺伝子産物を発現する任意の遺伝子を含み、ＲＮＡまたはタンパク質であり得る。多くのレポーター遺伝子は当該分野で公知であり、限定するわけではないが、β−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。別の実施態様において、導入遺伝子は、生物発光レポーター遺伝子を含む。多くの生物発光レポーター遺伝子は当該分野で公知であり、ルシフェラーゼを含むがこれに限定されない。ルシフェラーゼの供給源は多く存在し、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の実施態様は、例えばルシフェラーゼのような任意の公知の生物発光レポーターを利用し得る。他のレポーターエレメントの非限定的な例は、表５に示される。
【００７７】
【表４】
0005944833.tif 000005
【００７８】
本発明の他の実施態様用は、ルシフェラーゼ酵素の改変バージョン、異なる種由来のルシフェラーゼ酵素、または適切な基板と共に提供される場合、動物組織を横切ることのできる光を産生し得る他のタンパク質、もしくは動物組織を横切ることのできる光を発することのできる任意の酵素を組み込むことができる。本発明のレポータータンパク質は、信号の減衰量が、発された光の波長および発光細胞を取り巻く組織特性に依存するという事実によってのみ限定される。一般的に青緑光（４００〜５９０ｎｍ）は、強く減衰される一方、近赤外光（５９０〜８００ｎｍ）は、はるかに減衰が少ない。ルシフェラーゼの多くのタイプは、青〜黄緑の波長で発光し、その発光スペクトルは広く、組織に非常に深く浸透する赤色波長（＞６００ｎｍ）で有意な発光が存在しているようである。マウスなどの小型ゲッ歯類では、このことが動物全体を通してのシグナルの検出を可能にする。
【００７９】
インビボでの光検出の限界は、生物発光レポーターのタイプ、動物の周囲の生理学および発光源の深さに依存する。通常、動物の生物発光細胞は、細胞の数および場所により、高感度ＣＣＤカメラを用いて、１〜３ｃｍの深さで観察することができる。それらが組織をとおして伝播するときの光子の散乱は、動物表面上で検出された画像の空間分解能を制限する。一般的に、表面におけるスポットサイズや解像度は、表面化の光源の深さにほぼ等しい。物理ベースの拡散モデルを用いて、ミリメートルレベルでアプローチする空間解像度の改善を達成することができる。冷却した科学グレードのＣＣＤアレイを用いると、シグナル検出の限界は、画像が撮影された後のＣＣＤ画素数（これは、ピクセルあたりのいくつかの光子のオーダーである）の読み取りと関連した読み出しノイズによって決定される（Ｈｏｎｉｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２３９−２４９、２００１）。毛皮、皮膚、あるいは動物上の汚染物質の燐光に起因して、動物から発せられるさらなるバックグラウンド光もあり得る。通常、バックグラウンド光は低レベルであり、深く低レベルな生物発光供給源の画像に有害な影響を及ぼすのみである。しかしながら、バックグランド光は、適切な光学フィルターの使用により、排除することができる。
【００８０】
本発明の実施態様は、ＩＶＩＳ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、８６０  Ａｔｌａｎｔｉｃ  Ａｖｅｎｕｅ、Ａｌａｍｅｄａ、Ｃａｌｉｆ．９４５０１、ＵＳＡ）などのＣＣＤカメラを利用する。このＩＶＩＳ．ＲＴＭ．Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍは、高感度ＣＣＤカメラ、入射光を最小にするための暗い画像処理チャンバー、および結果を定量化し分析するための特殊なソフトウエアを備えている。ＩＶＩＳは、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標である。しかしながら、このような生物発光画像処理システムはどれも本発明に適用可能である。
【００８１】
リアルタイムのインビボイメージングは、生物発光レポーター遺伝子定量化を非侵襲的に（すなわち動物を安楽死させる必要がない）、かつ長期的に（すなわち長い時間経過にわたり、連続的または反復して測定することができる）可能にする。リアルタイムのインビボイメージングは、従来のプロトコルに比べ、必要な試験動物がより少なく（例えば、特定の時間の間同じ動物を用いることができるため）、より少ない時間でよい（例えば、取り扱う必要のある動物の数がより少ないため）、より多くの化合物を効率よく試験することができる。リアルタイムのインビボイメージングは、多くの理由により、より高いデータ内容およびより高いデータ品質を提供する。例えば、時間的および空間的データは同じ動物から集めることができ、データを時間のかかる組織学的評価を必要とせずに集めることができる。データ品質が高いほど、統計誤差を減少させ、試験化合物の評価と意思決定の質を向上させる。
【００８２】
本発明の実施態様は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）法で用いる。ＨＴＳは、疾患の病態の生物学的メカニズムや側面をモデル化するために設計されたアッセイにおける何千もの異なる化合物の自動化された同時試験である。１またはそれより多い化合物（例えば複数の化合物）は、例えば、１つのバッチで同時に試験することができる、１実施態様において、用語「ＨＴＳスクリーニング法」は、任意の読み出しに影響を及ぼす１つの化合物または複数の化合物の能力を試験するアッセイを意味する。
【００８３】
細胞培養およびサンプル操作のための、液体取扱システム、蛍光読み取り装置またはシンチレーションカウンターのような分析装置およびロボットは当該分野でよく知られている。ロボットのような機械的システムや「チェリーピッキング」デバイスは、当業者に利用可能である。市販のプレートリーダーは、従来の９６ウエルプレートや３８４ウエルプレートを分析するのに利用可能である。単一のサンプル、複数のサンプル、またはプレートサンプルのリーダーは、所定のウエルを分析し、生データのレポートを作成するのに利用可能である。この生データは種々の方法で変換され提示することができる。
【００８４】
本発明の実施態様は、細胞、組織切片または培養培地のような他の材料を受けることのできる容器の配列を含む。容器の配列は、本発明の範囲内で、細胞または組織切片を保持するのに適切な少なくとも１つ以上の容器から任意の数の容器であり得る。例としては、フラスコ、培養皿、１．５ｍｌチューブのようなチューブ、１２ウエルプレート、９６ウエルプレート、３８４ウエルプレートおよび４０００ほどレセプタクルを有する小型のマイクロタイタープレート（米国特許出願２００５０２５５５８０号）が挙げられるが、これらに限定されない。容器の配列は、保護カバーを追加するような修正が可能であり、それにより汚染物質の混入や内容物の蒸発を防止することができる。
【００８５】
これらの容器のさらなる特徴は、容器が分析（非限定的な例として、分光分析、シンチレーション計数、および蛍光測定を含む）を可能にすることができることである。しかしながら、さらなる分析のために修正可能な適切な容器に移すことができることを考えると、本発明の範囲内で用いられ得る容器は限定されない。非限定的な例は、この方法を変更することであり、例えばこの方法が、第２の容器の配列を提供することをさらに包含し、ここで、細胞を溶解させる工程は、さらに細胞片から上清を分離する工程を包含し、次の工程は、この第２の容器の配列の少なくとも１つが分離した上清のサンプルを含むようにＤＮＡフラグメント中にインターカレートし得る検出可能な化合物を加える工程をさらに包含する。
【００８６】
本発明のさらなる局面および詳細は、以下の実施例から明らかであり、これらは例示することを意図しているのであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意味しない。
【００８７】
動物を含む全ての実験的な操作は事前に検討された連邦政府のガイドラインとプロトコルに従って実施し、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓのサイト、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認されている。
【実施例】
【００８８】
Ｉ．ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍのベクター骨格（図３）
デスティネーションベクターｐＤｅｓｔ２ＸＭＡＲＳを、ＭｕｌｔｉＳｉｔｅ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ  ＃１２５３７−１００）での使用に特異的に設計しクローニングした。ベクター中に挿入された全てのエレメントをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニングまたは合成的に生成した。全てのＰＣＲクローニング工程について、フラグメントを、ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭＩｘ  Ｈｉ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ  ＃  １０７９０−０２０）およびフラグメント特異的プライマーの使用を通して、特定されたベクターから増幅した。次いで。このＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニングによってｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした。ＴＯＰＯクローニングは、ＴａｑまたはＰｆｕポリメーラーゼのいずれかによって増幅されたＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡリガーゼを必要とせずに特定のベクター中にクローニングする、分子生物学的手法である。
【００８９】
はじめに、インスレーター配列をベクターｐＣｐＧ−ＬａｃＺ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ｃａｔ  ＃ｐｃｐｇ−ｌａｃｚ）からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローニングし、配列を検証した後、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ｃａｔ＃Ｎ３０５１Ｓ）の制限部位にサブクローニングした。このインスレーター配列を、統合部位依存の位置効果に起因する導入遺伝子の発現におけるばらつきを低減するために使用した。
【００９０】
フラグメントをクローニングするのに用いたＰＣＲプライマーは以下のとおりである：ａ．ヒトＩＦＮ−ベータＭＡＲプライマー配列（プライマーは、サブクローニングのためのＥｃｏＲＶ部位を有する）
配列番号１、ＩＦＮ  順方向プライマー：
５’−GGGGGATATCAGTCAATATGTTCACCCCA−３’
配列番号２、ＩＦＮ  逆方向プライマー：
５’−GGGGGATATCCTACTGTTTTAATTAAGC−３’
ｂ．ヒトβ−グロビンＭＡＲプライマー配列
配列番号３、β−グロビン順方向プライマー：
５’−AAGGATCCTTAATTAAAATTATCTCTAAGGC−３’
配列番号４、β−グロビン逆方向プライマー：
５’−GGATCCCTGCAGGAATTCCTTTTAAT−３’
【００９１】
β−グロビンＰＣＲフラグメントを、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃Ｋ２０３０−０１）を用いてｔｏｐｏクローニングした。配列を確認した後、そのフラグメントをＢａｍＨＩで切り出し、その後ｐＮＥＢ１９３（βｇｌｏＭＡＲ−ｐＮＥＢ１９３）のＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。ＩＦＮ−βＰＣＲフラグメントもまた、ｐＣＲ２．１でｔｏｐｏクローニングし、シーケンスし、その後ＥｃｏＲｖで切り出して、βｇｌｏＭＡＲ−ｐＮＥＢ１９３（２ＸＭＡＲＳ−ｐＮＥＢ１９３）のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングした。最後のゲートウエイデスティネーションベクター（Ｇａｔｅｗａｙ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）については、ＸｂａＩ末端を含むリンカーおよび内部ＥｃｏＲＶ部位を２ＸＭＡＲｓ−ｐＮＥＢ１９３のＸｂａＩ部位にサブクローニングした。平滑末端化したゲートウエイコンバージョンカセット（Ｇａｔｅｗａｙ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）、ＲｆＡを２ＸＭＡＲｓ−ｐＮＥＢ１９３（２ＸＭＡＲＳｐＤｅｓｔ）のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。最後のベクトル、２ＸＭＡＲＳｐＤｅｓｔが導入遺伝子を作製するために用いられる最後のデスティネーションベクターであった。
【００９２】
配列番号５
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGGCGCGCCGGGATCCTTAATTAAAATTATCTCTAAGGCATGTGAACTGGCTGTCTTGGTTTTCATCTGTACTTCATCTGCTACCTCTGTGACCTGAAACATATTTATAATTCCATTAAGCTGTGCATATGATAGATTTATCATATGTATTTTCCTTAAAGGATTTTTGTAAGAACTAATTGAATTGATACCTGTAAAGTCTTTATCACACTACCCAATAAATAATAAATCTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTTCTATAAATATGTACCAGTTTTATTGTTTTTAGTGGTAGTGATTTTATTCTCTTTCTATATATATACACACACATGTGTGCATTCATAAATATATACAATTTTTATGAATAAAAAATTATTAGCAATCAATATTGAAAACCACTGATTTTTGTTTATGTGAGCAAACAGCAGATTAAAAGGAATTCCTGCAGGATCCTTAATTAAGTTCTAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTCACTATGGCGGCCGCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGATTTTGAGTTAGGATCCGTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTCCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAAACGCGTGGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGATAACAGTATGCGTATTTGCGCGCTGATTTTTGCGGTATAAGAATATATACTGATATGTATACCCGAAGTATGTCAAAAAGAGGTATGCTATGAAGCAGCGTATTACAGTGACAGT
TGACAGCGACAGCTATCAGTTGCTCAAGGCATATATGATGTCAATATCTCCGGTCTGGTAAGCACAACCATGCAGAATGAAGCCCGTCGTCTGCGTGCCGAACGCTGGAAAGCGGAAAATCAGGAAGGGATGGCTGAGGTCGCCCGGTTTATTGAAATGAACGGCTCTTTTGCTGACGAGAACAGGGGCTGGTGAAATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCTCCCTTATACACAGCCAGTCTGCAGGTCGACCATAGTGACTGGATATGTTGTGTTTTACAGTATTATGTAGTCTGTTTTTTATGCAAAATCTAATTTAATATATTGATATTTATATCATTTTACGTTTCTCGTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCTAGACTAGAGTCATCAGTCAATATGTTCACCCCAAAAAAGCTGTTTGTTAACTTGTCAACCTCATTCTAAAATGTATATAGAAGCCCAAAAGACAATAACAAAAATATTCTTGTAGAACAAAATGGGAAAGAATGTTCCACTAAATATCAAGATTTAGAGCAAAGCATGAGATGTGTGGGGATAGACAGTGAGGCTGATAAAATAGAGTAGAGCTCAGAAACAGACCCATTGATATATGTAAGTGACCTATGAAAAAAATATGGCATTTTACAATGGGAAAATGATGATCTTTTTCTTTTTTAGAAAAACAGGGAAATATATTTATATGTAAAAAATAAAAGGGAACCCATATGTCATACCATACACACAAAAAAATTCCAGTGAATTATAAGTCTAAATGGAGAAGGCAAAACTTTAAATCTTTTAGAAAATAATATAGAAGCATGCCATCAAGACTTCAGTGTAGAGAAAAATTTCTTATGACTCAAAGTCCTAACCACAAAGAAAAGATTGTTAATTAGATTGCATGAATATTAAGACTTATTTTTAAAATTAAAAAACCATTAAGAAAAGTCAGGCCATAGAATGACAGAAAATATTTGCAACACCCCAGTAAAGAGAATTGTAATATGCAGATTATAAAAAGAAGTCTTACAAATCAGTAAAAAATAAAACTAGACAAAAATTTGAACAGATGAAAGAGAAACTCTAAATAATCATTACACATGAGAAACTCAATCTCAGAAATCAGAGAACTATCATTGCATATACACTAAATTAGAGAAATATTAAAAGGCTAAGTAACATCTGTGGCTTAATTAAAACAGTAGGATGACTGTTTAAACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
【００９３】
ＩＩ．導入遺伝子コンポーネント
Ａ．ＣＲＥ：
２つの異なる６×ＣＲＥエレメントを導入遺伝子の作製に用いた。最初は、ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡで合成して作製された合成ＣＲＥエレメント（「合成」と記されている）である。この合成配列は４フラグメントのＧａｔｅｗａｙクローニングのためのａｔｔＬ１およびａｔｔＲ５部位を有している。
【００９４】
異なるベクターから６×ＣＲＥをＰＣＲクローニングして出す複数の試みがなされた；しかし、これは、ＣＲＥの中ほどにあるヘアピン構造が原因で不可能であった。次いで、このフラグメントを合成によってクローニングした。用いられた第２の６×ＣＲＥエレメントは、クローンテックベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｖｅｃｔｏｒ）（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ、ｃａｔ＃ＰＴ３３３６−５）からＣＲＥエレメントをＰＣＲクローニングすることによって作製されたハイブリッドバージョンである。クローンテックは、このベクター中には２つのＣＲＥが存在していると主張しているが、配列分析では、実際には３つ存在していることが示された。２つの異なるＰＣＲ反応をフラグメントのクローニングに用いた。ゲートウエイのクローニング用のＡｔｔ部位と同様にＥｃｏＲ１部位をプライマー中に導入し、２つのフラグメントが一緒に「接着される」ことができるようにして、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｇａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ  Ｐ１−Ｐ５ｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ  ＃１２５３７−１００）中に再結合させた。
【００９５】
１．合成ＣＲＥエレメント
配列番号６：
5’AAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTACTGTCGACAATTGCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGATTGACGTCAATGGGGTGTCTGAAAGACGTCACAGTATGACCCGGGCTCGAGCCTCCTTGGCTGACGTCAGAGAGAGAGGCCGGCCCCTTACGTCAGAGGCGAGAATTCGACAACTTTGTATACAAAAGTTGAACGAGAAACGTAAAATGATATAAATATCAATATATTAAATTAGATTTTGCATAAAAAACAGACTACATAATACTGTAAAACACAACATATCCAGTCACTATG3’
【００９６】
２．ハイブリッドＣＲＥ：標準的なクローニング、３×ＣＲＥを含むＣｌｏｎｔｅｃｈ  ｐＣｒｅＬｕｃ  ｖｅｃｔｏｒからＣＲＥエレメントをＰＣＲ増幅し、ＰＣＲプライマーは一端にＥｃｏＲ１制限部位を有しており（ＣＲＥ３Ｘ−Ｂ、ＣＲＥ３Ｘ−Ｃ）、ａｔｔ部位は、ゲートウエイのａｔｔＢ１またはａｔｔＢ５ｒのいずれかがもう一方の末端でクローニングされている（ＣＲＥ３Ｘ−Ａ、ＣＲＥ３Ｘ−Ｄ）。次いで、これらの２つのフラグメントを組み合わせて６×ＣＲＥの１つのフラグメントを作成した。このフラグメントは、Ｇａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ  Ｐ１−Ｐ５ｒ  ｖｅｃｔｏｒ中に組み換えされる。
【００９７】
配列番号７：ＣＲＥ  順方向プライマー  Ａ
５’−GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGCACCAGACAGTGA−３’
配列番号８：ＣＲＥ  逆方向プライマー  Ｂ
５’−GGGAATTCGTTCTCCCATTGACGTCA−３’
配列番号９：ＣＲＥ  順方向プライマー  Ｃ
５’−GGGAATTCGCACCAGACAGTGACGTC−３’
配列番号１０：ＣＲＥ  逆方向プライマー  Ｄ
５’−GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGTTCTCCCATTGACGTCA−３’
配列番号１１：ハイブリッドＣＲＥ配列：
GCTTAGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACGAATTCGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACA
【００９８】
Ｂ．ヒト成長ホルモン  ポリＡテール：
ヒト成長ホルモン  ポリＡテールを、ベクターｐＯＧＨ（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ、Ｃａｔ  ＃  ４０−２２０５）からＰＣＲクローニングした。プライマー配列は、Ｇａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ  Ｐ３−Ｐ２  ｖｅｃｔｏｒ中への組み換え用に、順方向プライマー上にａｔｔＢ３部位、逆方向プライマー上にａｔｔＢ２部位を有している。
【００９９】
配列番号１２：ｈＧＨ  順方向プライマー：
５’−GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGATCCCAAGGCCCAACTCC−3’
配列番号１３：ｈＧＨ  逆方向プライマー
５’−GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAACAGGCATCTACT−3’
【０１００】
Ｃ．ＨＳＶ  ＴＫ最小プロモーター：
ＨＳＶ  ＴＫ最小プロモーターを、「６６１  ＣｒｅＬｕｃ」と呼ばれるインハウスベクター（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ  ｖｅｃｔｏｒ）からＰＣＲクローニングした。プライマー配列は、Ｇａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ  Ｐ５−Ｐ４  ｖｅｃｔｏｒ中への組み換え用に、順方向プライマー上にａｔｔＢ５部位を有し、逆方向プライマー上にａｔｔＢ４部位を有している。
【０１０１】
配列番号１４：ＴＫ  順方向プライマー
５’−GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGTGGAACACGCAGATGCAGT−３’
【０１０２】
配列番号１５：ＴＫ  逆方向プライマー
５’−GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGGATCTGCGGCACGCT−３’
【０１０３】
Ｄ．ルシフェラーゼ  ｃＤＮＡ：
ルシフェラーゼｃＤＮＡを、ベクターｐＧＬ４．１０（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ    Ｃａｔ  ＃Ｅ６６５１）からＰＣＲクローニングした。Ｌｕｃプライマー配列は、Ｇａｔｅｗａｙ  ｐＤＯＮＲ  Ｐ４ｒ−Ｐ３ｒ  ｖｅｃｔｏｒ中への組み換え用に、順方向プライマー上にａｔｔＢ４ｒ部位を有し、逆方向プライマー上にａｔｔＢ３ｒ部位を有している。
【０１０４】
配列番号１６：ｌｕｃｉ  順方向プライマー
５’GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGATGGAAGATGCCAAAAACA３’
【０１０５】
配列番号１７：ｌｕｃｉ  逆方向プライマー
５’GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTTTACACGGCGATCTTGCC３’
【０１０６】
ＩＩＩ．最終的なベクターの構築
導入遺伝子の４つのコンポーネント、ＣＲＥ（合成バージョンまたはハイブリッドバージョンのいずれか）、ＨＳＶＴＫ  ｍｉｎ、ルシフェラーゼ  ｃＤＮＡ、およびｐＤＯＮＲベクター中のｈＧＨポリＡテールを、標準的なＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎプロトコルに従ってｐＤｅｓｔ２ＸＭＡＲｓデスティネーションベクターと共に組み換えを行った。その後これら２つの導入遺伝子をシーケンスし、ＣＨＯＫ１中にトランスフェクトして、機能について試験した。図５に示されように、どちらの導入遺伝子も、インビトロで機能する。図５は、ホルスコリン誘導によるＣｒｅＬｕｃベクターのインビトロ分析を示している。
【０１０７】
ＩＶ．トランスジェニックマウスの作製
Ａ．導入遺伝子の準備
導入遺伝子構築物の質は、アリコートをアガロースゲル（電気泳動）にかけることにより検証および確認した。劣化（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）のトレースは観察されなかった。最終的に、診断用のＸｈｏＩおよびＰｖｕＩＩおよびＰｓｔＩ制限酵素を用いた切断解析により、予測された制限プロファイルが得られた。次いで、この導入遺伝子プラスミドをＡｃｃ６５ＩおよびＰｍｅＩで消化して、導入遺伝子を含むフラグメントをアガロースゲル上での消化を実行することにより、ベクター骨格から単離した。その後、この導入遺伝子フラグメントをゲルから切り出し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ  ｃａｔ＃２８７０６）で精製し、希釈して、受精卵中に注入した。単離した導入遺伝子の純度および濃度はアガロースゲル電気泳動により検査した。
【０１０８】
配列番号１８：ＣｒｅＬｕｃ  合成導入遺伝子（Ａｃｃ６５Ｉ／ＰｍｅＩ  消化、５５５０ｂｐ）
5’GTACCCGGGGGCGCGCCGGGATCCTTAATTAAAATTATCTCTAAGGCATGTGAACTGGCTGTCTTGGTTTTCATCTGTACTTCATCTGCTACCTCTGTGACCTGAAACATATTTATAATTCCATTAAGCTGTGCATATGATAGATTTATCATATGTATTTTCCTTAAAGGATTTTTGTAAGAACTAATTGAATTGATACCTGTAAAGTCTTTATCACACTACCCAATAAATAATAAATCTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTTCTATAAATATGTACCAGTTTTATTGTTTTTAGTGGTAGTGATTTTATTCTCTTTCTATATATATACACACACATGTGTGCATTCATAAATATATACAATTTTTATGAATAAAAAATTATTAGCAATCAATATTGAAAACCACTGATTTTTGTTTATGTGAGCAAACAGCAGATTAAAAGGAATTCCTGCAGGATCCTTAATTAAGTTCTAGATCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTACTGTCGACAATTGCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGATTGACGTCAATGGGGTGTCTGAAAGACGTCACAGTATGACCCGGGCTCGAGCCTCCTTGGCTGACGTCAGAGAGAGAGGCCGGCCCCTTACGTCAGAGGCGAGAATTCGACAACTTTGTATACAAAAGTTGTGGAACACGCAGATGCAGTCGGGGCGGCGCGGTCCCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAACAGCGTCAACAGCGTGCCGCAGATCCACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGCTATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTAGCTGCAATGGCTACAGGTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCACTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGTGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGTATTTGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGACTTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGAAAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCG
TAGACCTTGGTGGGCGGTCCTTCTCCTAGGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCGTGAGTGGATGCCTTCTCCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAGAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGGTGAGGGTGGCGCCAGGGGTCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTAGAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCAGGCCCTGACCCAAGAGAACTCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCCAGGCCTTTCTCTACACCCTGAAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAACAGTACCCAAGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGCGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTAAAATAACTATACCAGCAGGAGGACGTCCAGACACAGCATAGGCTACCTGGCCATGCCCAACCGGTGGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGCGTTGGGTCCACTCAGTAGATGCCTGTTGTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGATCTAGACTAGAGTCATCAGTCAATATGTTCACCCCAAAAAAGCTGTTTGTTAACTTGTCAACCTCATTCTAAAATGTATATAGAAGCCCAAAAGACAATAACAAAAATATTCTTGTAGAACAAAATGGGAAAGAATGTTCCACTAAATATCAAGATTTAGAGCAAAGCATGAGATGTGTGGGGATAGACAGTGAGGCTGATAAAATAGAGTAGAGCTCAGAAACAGACCCATTGATATATGTAAGTGACCTATGAAAAAAATATGGCATTTTACAATGGGAAAATGATGATCTTTTTCTTTTTTAGAAAAACAGGGAAATATATTTATATGTAAAAAATAAAAGGGAACCCATATGTCATACCATACACACAAAAAAATTCCAGTGAATTATAAGTCTAAATGGAGAAGGCAAAACTTTAAATCTTTTAGAAAATAATATAGAAGCATGCCATCAAGACTTCAGTGTAGAGAAAAATTTCTTATGACTCAAAGTCCTAACCACAAAGAAAAGATTGTTAATTAGATTGCATGAATATTAAGACTTATTTTTAAAATTAAAAAACCATTAAGAAAAGTCAGGCCATAGAATGACAGAAAATATTTGCAACACCCCAGTAAAGAGAATTGTAATATGCAGATTATAAAAAGAAGTCTTACAAATCAGTAAAAAATAAAACTAGACAAAAATTTGAACAGATGAAAGAGAAACTCTAAATAATCATTACACATGAGAAACTCAATCTCAGAAATCAGAGAACTATCATTGCATATACACTAAATTAGAGAAATATTAAAAGGCTAAGTAACATCTGTGGCTTAATTAAAACAGTAGGATGACTGTTT 3’
【０１０９】
配列番号１９：ＣｒｅＬｕｃ  ハイブリッド導入遺伝子配列（Ａｃｃ６５Ｉ／ＰｍｅＩ  消化、５５６２ｂｐ）
5’GTACCCGGGGGCGCGCCGGGATCCTTAATTAAAATTATCTCTAAGGCATGTGAACTGGCTGTCTTGGTTTTCATCTGTACTTCATCTGCTACCTCTGTGACCTGAAACATATTTATAATTCCATTAAGCTGTGCATATGATAGATTTATCATATGTATTTTCCTTAAAGGATTTTTGTAAGAACTAATTGAATTGATACCTGTAAAGTCTTTATCACACTACCCAATAAATAATAAATCTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTTCTATAAATATGTACCAGTTTTATTGTTTTTAGTGGTAGTGATTTTATTCTCTTTCTATATATATACACACACATGTGTGCATTCATAAATATATACAATTTTTATGAATAAAAAATTATTAGCAATCAATATTGAAAACCACTGATTTTTGTTTATGTGAGCAAACAGCAGATTAAAAGGAATTCCTGCAGGATCCTTAATTAAGTTCTAGATCCAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACGAATTCGCACCAGACAGTGACGTCAGCTGCCAGATCCCATGGCCGTCATACTGTGACGTCTTTCAGACACCCCATTGACGTCAATGGGAGAACACAACTTTGTATACAAAAGTTGTGGAACACGCAGATGCAGTCGGGGCGGCGCGGTCCCAGGTCCACTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAGCGACCCTGCAGCGACCCGCTTAACAGCGTCAACAGCGTGCCGCAGATCCACCCAACTTTTCTATACAAAGTTGCTATGGAAGATGCCAAAAACATTAAGAAGGGCCCAGCGCCATTCTACCCACTCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCTGCACAAAGCCATGAAGCGCTACGCCCTGGTGCCCGGCACCATCGCCTTTACCGACGCACATATCGAGGTGGACATTACCTACGCCGAGTACTTCGAGATGAGCGTTCGGCTGGCAGAAGCTATGAAGCGCTATGGGCTGAATACAAACCATCGGATCGTGGTGTGCAGCGAGAATAGCTTGCAGTTCTTCATGCCCGTGTTGGGTGCCCTGTTCATCGGTGTGGCTGTGGCCCCAGCTAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGGGCATCAGCCAGCCCACCGTCGTATTCGTGAGCAAGAAAGGGCTGCAAAAGATCCTCAACGTGCAAAAGAAGCTACCGATCATACAAAAGATCATCATCATGGATAGCAAGACCGACTACCAGGGCTTCCAAAGCATGTACACCTTCGTGACTTCCCATTTGCCACCCGGCTTCAACGAGTACGACTTCGTGCCCGAGAGCTTCGACCGGGACAAAACCATCGCCCTGATCATGAACAGTAGTGGCAGTACCGGATTGCCCAAGGGCGTAGCCCTACCGCACCGCACCGCTTGTGTCCGATTCAGTCATGCCCGCGACCCCATCTTCGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCTATCCTCAGCGTGGTGCCATTTCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACGCTGGGCTACTTGATCTGCGGCTTTCGGGTCGTGCTCATGTACCGCTTCGAGGAGGAGCTATTCTTGCGCAGCTTGCAAGACTATAAGATTCAATCTGCCCTGCTGGTGCCCACACTATTTAGCTTCTTCGCTAAGAGCACTCTCATCGACAAGTACGACCTAAGCAACTTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCTCAGCAAGGAGGTAGGTGAGGCCGTGGCCAAACGCTTCCACCTACCAGGCATCCGCCAGGGCTACGGCCTGACAGAAACAACCAGCGCCATTCTGATCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCTGGCGCAGTAGGCAAGGTGGTGCCCTTCTTCGAGGCTAAGGTGGTGGACTTGGACACCGGTAAGACACTGGGTGTGAACCAGCGCGGCGAGCTGTGCGTCCGTGGCCCCATGATCATGAGCGGCTACGTTAACAACCCCGAGGCTACAAACGCTCTCATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCGCCTACTGGGACGAGGACGAGCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGAGCCTGATCAAATACAAGGGCTACCAGGTAGCCCCAGCCGAACTGGAGAGCATCCTGCTGCAACACCCCAACATCTTCGACGCCGGGGTCGCCGGCCTGCCCGACGACGATGCCGGCGAGCTGCCCGCCGCAGTCGTCGTGCTGGAACACGGTAAAACCATGACCGAGAAGGAGATCGTGGACTATGTGGCCAGCCAGGTTACAACCGCCAAGAAGCTGCGCGGTGGTGTTGTGTTCGTGGACGAGGTGCCTAAAGGACTGACCGGCAAGTTGGACGCCCGCAAGATCCGCGAGATTCTCATTAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGATCGCCGTGTAAACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTGATCCCAAGGCCCAACTCCCCGAACCACTCAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCTAGCTGCAATGGCTACAGGTAAGCGCCCCTAAAATCCCTTTGGGCACAATGTGTCCTGAGGGGAGAGGCAGCGACCTGTAGATGGGACGGGGGCACTAACCCTCAGGTTTGGGGCTTCTGAATGTGAGTATCGCCATGTAAGCCCAGTATTTGGCCAATCTCAGAAAGCTCCTGGTCCCTGGAGGGATGGAGAGAGAAAAACAAACAGCTCCTGGAGCAGGGAGAGTGCTGGCCTCTTGCTCTCCGGCTCCCTCTGTTGCCCTCTGGTTTCTCCCCAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTTGTAAGCTCTTGGGGAATGGGTGCGCATCAGGGGTGGCAGGAAGGGGTGACTTTCCCCCGCTGGGAAATAAGAGGAGGAGACTAAGGAGCTCAGGGTTTTTCCCGAAGCGAAAATGCAGGCAGATGAGCACACGCTGAGTGAGGTTCCCAGAAAAGTAACAATGGGAGCTGGTCTCCAGCGTAGACCTTGGTGGGCGGTCCTTCTCCTAGGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCGTGAGTGGATGCCTTCTCCCCAGGCGGGGATGGGGGAGACCTGTAGTCAGAGCCCCCGGGCAGCACAGCCAATGCCCGTCCTTCCCCTGCAGAACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCCTAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGGTGAGGGTGGCGCCAGGGGTCCCCAATCCTGGAGCCCCACTGACTTTGAGAGCTGTGTTAGAGAAACACTGCTGCCCTCTTTTTAGCAGTCAGGCCCTGACCCAAGAGAACTCACCTTATTCTTCATTTCCCCTCGTGAATCCTCCAGGCCTTTCTCTACACCCTGAAGGGGAGGGAGGAAAATGAATGAATGAGAAAGGGAGGGAACAGTACCCAAGCGCTTGGCCTCTCCTTCTCTTCCTTCACTTTGCAGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGACTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCACTACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCCTGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAGCTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGCGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTTTAAAATAACTATACCAGCAGGAGGACGTCCAGACACAGCATAGGCTACCTGGCCATGCCCAACCGGTGGGACATTTGAGTTGTTTGCTTGGCACTGTCCTCTCATGCGTTGGGTCCACTCAGTAGATGCCTGTTGTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGATCTAGACTAGAGTCATCAGTCAATATGTTCACCCCAAAAAAGCTGTTTGTTAACTTGTCAACCTCATTCTAAAATGTATATAGAAGCCCAAAAGACAATAACAAAAATATTCTTGTAGAACAAAATGGGAAAGAATGTTCCACTAAATATCAAGATTTAGAGCAAAGCATGAGATGTGTGGGGATAGACAGTGAGGCTGATAAAATAGAGTAGAGCTCAGAAACAGACCCATTGATATATGTAAGTGACCTATGAAAAAAATATGGCATTTTACAATGGGAAAATGATGATCTTTTTCTTTTTTAGAAAAACAGGGAAATATATTTATATGTAAAAAATAAAAGGGAACCCATATGTCATACCATACACACAAAAAAATTCCAGTGAATTATAAGTCTAAATGGAGAAGGCAAAACTTTAAATCTTTTAGAAAATAATATAGAAGCATGCCATCAAGACTTCAGTGTAGAGAAAAATTTCTTATGACTCAAAGTCCTAACCACAAAGAAAAGATTGTTAATTAGATTGCATGAATATTAAGACTTATTTTTAAAATTAAAAAACCATTAAGAAAAGTCAGGCCATAGAATGACAGAAAATATTTGCAACACCCCAGTAAAGAGAATTGTAATATGCAGATTATAAAAAGAAGTCTTACAAATCAGTAAAAAATAAAACTAGACAAAAATTTGAACAGATGAAAGAGAAACTCTAAATAATCATTACACATGAGAAACTCAATCTCAGAAATCAGAGAACTATCATTGCATATACACTAAATTAGAGAAATATTAAAAGGCTAAGTAACATCTGTGGCTTAATTAAAACAGTAGGATGACTGTTT
【０１１０】
Ｂ．初代の作製：
これらの導入遺伝子をＦＶＢ／Ｔａｃｏｎｉｃ単細胞胚の前核に別々にマイクロインジェクションした。トランスジェニック（Ｔｇ）動物を作製するための一般的なストラテジーはよく記載されており、当業者に公知である。
【０１１１】
ＰＣＲ遺伝子型判定ストラテジーを用いて、トランスジェニックポジティブ初代マウスを、尾部生検および遺伝子型用のＰＣＲを介して出生後すぐに同定した。選択されたプライマー対は、導入遺伝子配列内に短いＤＮＡ配列の増幅を可能にし、特定の４０５−ｂｐ  ＰＣＲ産物を得ることができる。ＰＣＲ反応ミックスは、ＭｇＣｌ２（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ  ｃａｔ  ＃２０１２０５）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．４ｕＭ  プライマー、０．５単位のＴａｑポリメラーゼを含む１×Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ緩衝液である。サイクリング条件は以下の通りである：９４℃で１サイクル；９４℃で５分、３５サイクル；５７℃で４５秒；７２℃で４５秒；７２℃で１分、１サイクル；５分。
【０１１２】
遺伝子型判定プライマーは以下の通りである：
配列番号２０：Ｌｕｃ２−順方向プライマー：
５’−GAAGATGCCAAAAACATTAAGAAG−３’ 
配列番号２１：Ｌｕｃ２−逆方向プライマー：
５’−GATCTTTTGCAGCCCTTTCT −３’
【０１１３】
合成ＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子については、（１８１出生したうち）３９の導入遺伝子ポジティブ初代、ハイブリッドＣｒｅＬｕｃ導入遺伝子については、（２４４出生したうち）７３の導入遺伝子ポジティブが生成された。このトランスジェニックマウス系統は、ＣｒｅＬｕｃと省略される。
【０１１４】
Ｖ．初代発現分析：
図５Ａは、正常マウスにおける血漿ｃＡＭＰレベルに対する異なるホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）インヒビターの効果の比較である（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ、ＪＰＥＴ、２８０（２）：６２１−６２６、１９９７からの再現）。これらのマウスを、４匹の動物群で化合物またはビヒクル（ＶＥＨ）をｐ．ｏ．投与した。２０分後、血液を採取し、ｃＡＭＰ測定のために処理した。この発行された実験に基づき、ｃＡＭＰレベルを増加させるその能力およびそのアベイラビリティについてのＣｒｅＬｕｃ初代をスクリーニングするために、ホルスコリンと共にロリプラムを一般的な誘導因子として選択した。一緒に投与する場合、これらの２つの化合物の付加的な効果により、動物中のルシフェラーゼレベルを調べるときの誘導の大きいウインドウを提供される。
【０１１５】
図５Ｂは、ホルスコリン（Ｆ）、ロリプラム（）またはホルスコリンとロリプラムの組み合わせ（Ｆ／Ｒ）による種々の処理後の、野生型マウス中の血漿レベルのｃＡＭＰアッセイである。２月齢のＦＶＢ／Ｔａｃ雌を、以下のうちの１つと共にｉ．ｐ．投与した：グループ：ビヒクルコントロール、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた１％ジメチルスルホキシド  （ＤＭＳＯ）、グループＢ：５ｍｇ／ｋｇ  ホルスコリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ、ｃａｔ＃Ｆ６８８６）、およびグループＣ：１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ＃  Ｒ６５２０）、グループＤ：５ｍｇ／ｋｇ  ホルスコリン＋１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム、グループＥ：５ｍｇ／ｋｇ  水溶性ホルスコリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ  ｃａｔ＃３４４２７３）、およびグループＦ：５ｍｇ／ｋｇ  水溶性ホルスコリン＋１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム。グループＧは、処理を受けていない。ビヒクルのみと比較して、ロリプラムおよび／またはホルスコリンは、循環しているｃＡＭＰレベルの上昇において、統計的に有意であった。ホルスコリンのみでは、ビヒクルコントロールに対して循環しているｃＡＭＰを有意に上昇させなかった。水溶性ホルスコリン（Ｈ２ＯＦ）とロリプラムとの組み合わせは、ｃＡＭＰ血漿レベルにおいて最も大きい上昇を示し、この処理がインビボでの導入遺伝子の発現のためにＣｒｅＬｕｃ初代をスクリーニングするために最適であった。
【０１１６】
全ての初代（表５〜８に列挙している初代および図６に示されている代表的な初代）を、１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ＃  Ｒ６５２０）と５ｍｇ／ｋｇ  水溶性ホルスコリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ  ｃａｔ＃３４４２７３）との組み合わせをマウスにｉ．ｐ．投与することによって、導入遺伝子発現について試験した。４時間後、これらのマウスをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ｓｙｓｔｅｍを用いてバイオイメージングした。これらのマウスを、イソフルラン、および２５０ｍｇ／ｋｇ  ルシフェリンをｓ．ｃ．注射することにより麻酔した。３９の導入遺伝子ポジティブな合成ＣｒｅＬｕｃのうち、３４（または８７％）が発現ポジティブであった。発現は任意の組織のルシフェラーゼレベルがシステムのバックグラウンドレベルを超えたとき、ポジティブであると考えられた。
【０１１７】
ＣｒｅＬｕｃマウスの異なる独立した系統のバイオイメージングによってアッセイされた種々のホルスコリン  ロリプラム応答プロファイルを、図６に示している。誘導されていない状態において、本発明者らは、系統９０および２１９に図示されているような検出可能な基底バイオイメージングシグナルか、または系統４４、２８、および１８７に図示されているような基底活性がないかのいずれかを確認した。ホルスコリン  ロリプラム誘導後、ＣｒｅＬｕｃレポーター誘導のバイオイメージングパターンは、単一または複数の組織中に生じ、それは、各独立したＣｒｅＬｕｃ系統で独特であった。多くのＣｒｅＬｕｃ系統は、治療に関連する領域中に検出可能なルシフェラーゼビオイメージを発現する組織を１以上有していた。
【０１１８】
基底と、ホルスコリン  ロリプラム誘導の両方での初代中のＣｒｅＬｕｃ発現のバイオイメージングスクリーニング後、１またはそれより多い組織（脳内で２×）中で５×バイオイメージング誘導のフィルターウインドウを満たすＣｒｅＬｕｃ系統を、組織抽出物中のルシフェラーゼ酵素の誘導されたレベルをアッセイすることによってより詳細に分析した。
【０１１９】
組織発現分析のために、動物を、ベースラインシグナル用に未処理のままかまたは４時間誘導した。誘導のために、動物に、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１４０４０）に溶解させた５ｍｇ／ｋｇ  ホルスコリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ  ｃａｔ＃３４４２７３）と１０ｍｇ／ｋｇ  ロリプラム（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ＃  Ｒ６５２０）ｗｉｔｈ  １％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ＃Ｄ２６５０）の組み合わせをｉ．ｐ．投与した。数時間後、これらの動物をＣＯ２で屠殺し、種々の器官を取り除いてドライアイスで凍らせた。ルシフェラーゼアッセイのために、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ１５００）を用いた。これらの組織を、１ｍｌの細胞培養溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ１５３１）中でホモジネートさせ、５分間氷上でインキュベーションし、その後５分間遠心分離で回転させた。２０μｌの上清を製造業者の指示書によりアッセイ中で用いた。これらのサンプルのタンパク質濃度をＤＣタンパク質アッセイキット（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ｃａｔ＃５００−０１１１）を用いて測定した。データは表５〜８に示しており、誘導倍率として表わしている（誘導されたＲＬＵ／ｕｇタンパク質を、基底ＲＬＵ／ｕｇタンパク質で割ったもの）。誘導されたＲＬＵは、誘導された組織サンプルのＲＬＵ／ｕｇタンパク質である。
【０１２０】
【表５】
0005944833.tif 000006
【０１２１】
【表６】
0005944833.tif 000007
【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
【表８】
0005944833.tif 000009
【０１２４】
各系統におけるＣｒｅＬｕｃ発現の詳細なレベルは、標的組織中で最も高い発現レベルを持つ最適の系統の選択、および独特な単一または複数のパターンの発現を有する系統の選択を可能にする。この酵素アッセイはまた、ＣｒｅＬｕｃ発現が特定の組織と明らかに関連していたことを保証した。一般的に、導入遺伝子中にデザインされた場合、大部分の系統を横切ってすべての組織の近くにルシフェラーゼ発現を観察した。重要な医薬関連標的組織（脳、膵臓、肺、脾臓）由来のトップの３〜５系統を、ＧＰＣＲリガンドを用いたさらなる参照化合物応答プリファイリングのために選択した。
【０１２５】
ＶＩ．発現レベルにおけるインスレーター配列の効果の分析
表９において、インスレーター配列を加えることの影響は、１１の異なる導入遺伝子を通じて比較され、２２５の独立したトランスジェニック系統を含んでいる。機能的なトランスジェニック系統の生産は、典型的には１０〜３０％の範囲である（本発明者らの研究室から採取した過去のデータ）。表９において、ｈＧＨ小遺伝子または機能的エンハンサーの封入により、１１のうち１０の導入遺伝子および１９０系統が、この範囲の上限での発現レベルを獲得した（機能的系統の平均数は３７または３２．７％）。重要なことに、インスレーター配列の封入は、この発現頻度を２倍以上に増やし、１１２系統については７８％が機能的レポーターを発現している。導入遺伝子の比較および多様性両方についてのサンプルサイズは、ゲノム中の導入遺伝子のランダムな組み込みにより、正常な生物学的変動を克服するのに十分な大きさである。
【０１２６】
トランスジェニックバイオイメージングレポーター系統の作製は、低頻度で高い損耗率のプロセスである。多くの独立した初代系統（５０〜１００）が、レポーター用に所望される検出レベルを備える系統を得るため、および薬物候補のスクリーニング用に適切な標的組織の広範な選択肢において発現されるレポーターを持つために必要とされる。一般的には、薬物スクリーニング用途には５％以下の系統で十分であるため、レポーターを含む導入遺伝子は、作製された各トランスジェニック系統中の発現を最大化させるために多くのエレメントを含める必要がある。他の発現エンハンサー（ｈＧＨ小遺伝子）に結合しているインスレーター配列は、導入遺伝子を発現するトランスジェニック系統の大部分を得ることが実証されており、薬物開発に適用可能な発現パターンを持つトランスジェニック系統を見つける鍵である（リガンドのレセプターへの結合の際のシグナルの低下を検出するための種々のＧＰＣＲシグナル伝達経路については特に）。
【０１２７】
【表９】
0005944833.tif 000010
【０１２８】
材料の寄託：
マウス胚線維芽細胞の調製：妊娠した雌から、１２日目の胚を取り出した。この胚をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１４０４０）を含む１０ｃｍの皿に入れた子宮の中から解剖した。次いで、それをＰＢＳの新しい皿に移した。その胚を鉗子で裂いて、心臓および肝臓を取り除いた。次いで、組織切片を２〜３ｍｌの冷０．２５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃２５２００）中で４℃にて一晩インキュベーションした。次の日、そのトリプシンの大部分を吸引し、組織ペレットを３７℃で３０分間インキュベーションした。２〜３ｍｌの培地、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１１９６５）、５％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１６１４０）、１％のペン連鎖球菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃  １５１４０）を加え、組織の残りの塊を壊すために上下にピペッティングした。次いで細胞懸濁液をＴ７５組織培養フラスコにプレーティングした。細胞を３継体培養し、その後１ｍｌのバイアル中で、バイアルあたり１〜２百万細胞、凍結培地、１５％の熱不活性化ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１６１４０）、５％  ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ｃａｔ＃Ｄ２６５０）、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１１９６５）中で、凍結させた。
【０１２９】
以下の材料をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）：に寄託した：
【表１０】
0005944833.tif 000011
【０１３０】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその下の条例（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ））の規定の下でなされた。これにより、寄託日より３０年間、その寄託の生存培養物の維持が保証される。この寄託は、ブダペスト条約の下、ＡＴＣＣによって利用可能とされており、ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ  ＵＳ  Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの契約下にある。この契約は、関連する米国特許の公開の際、または任意の米国特許出願もしくは外国特許出願の一般への公開（いずれか早いほう）の際に、一般に対して寄託の培養物の子孫の永続的かつ無制限なアベイラビリティを保証し、かつその全体に対して米国の特許商標庁長官によって決定される子孫のアベイラビリティを保証する。
【０１３１】
本出願の指定代理人は、寄託においてそれらの材料の培養物が、適切な条件下で培養された場合に死ぬかまたは紛失されるかまたは破壊された場合に、それらの材料が速やかに同一の別のもので置き換えられることに合意した。寄託された材料のアベイラビリティーは、その特許法に従って、あらゆる政府の権限下で付与される権利に違反して本発明を実施するためのライセンスとして解釈されるべきではない。
【０１３２】
ＶＩＩ．いンビボおよびエキソビボスクリーニングアッセイ
図７は、インビボまたはエキソビボいずれかのＣｒｅＬｕｃスクリーニングアッセイの流れを表わすことによって本発明の実施態様を示している。インビボアッセイについては、動物にルシフェリンのみを投与し、その後ＩＶＩＳ  ｂｉｏｉｍａｇｅｒでバイオイメージングして、ベースライン信号を得た。その後これらの動物に化合物を投与して、設定した時点で再びバイオイメージングし、ルシフェラーゼシグナルに対する化合物の影響を調べた。データは、ベースラインの信号に対する誘導された信号の誘導倍率として分析することができる。エキソビボアッセイについては、マウスに化合物またはビヒクルのいずれかを投与し、その後設定した時点において組織を採取し、凍結させた。次いで、その組織をホモジネートし、Ｐｒｏｍｅｇａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃Ｅ１５００）のようなルシフェラーゼアッセイをその組織抽出物に対して実行し、Ｔｏｐｃｏｕｎｔのようなルミノメーターでそのアッセイを読み取った。データは、化合物群に対してビヒクルを比較する、μｇタンパク質あたりの相対光として分析することができる。
【０１３３】
本発明のさらなる局面および詳細は、以下の実施例から明らかとなり、これらは例示することを意図しているのであって、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意味しない。
【０１３４】
Ａ．全脳スライス実験
ＣｒｅＬｕｃマウスにおける発光に及ぼす化合物の影響を示すために、全脳スライスを用いた（図８Ａ、８Ｂ）。一般的には、ＣｒｅＬｕｃマウスから脳を採取し、ミクロトームでスライス状にカットするかまたは種々の小領域を解剖して取り出し、ミクロトームでスライスすることもできる。その後これらのスライスをホルスコリンとロリプラム、またはＧＰＣＲ特異的化合物のような異なる化合物と共にインキュベーションすることができる。次いで、ルシフェラーゼレベルをＩＶＩＳ  ｂｉｏｉｍａｇｅｒまたはカルーセルを備える光電子増倍管で測定し、定量的経時測定を行うことができる。
【０１３５】
ＣｒｅＬｕｃマウス（系統１８７）の海馬領域からの脳スライスを１ｕＭのイソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ＃５６２７）と共に２日間インキュベーションした。イソプロテレノール（ＩＳＯ）は、ｃＡＭＰ経路を活性化するＧｓアゴニストであり（経路の概略は図１を参照のこと）、ＣｒｅＬｕｃマウス中でルシフェラーゼ発現レベルを誘導する（図８Ａ、下パネル）。従って、ＧｉアゴニストのようなＧＰＣＲ特異的化合物のスクリーニングを可能にするルシフェラーゼシグナルウインドウを増加させるためにイソプロテレノールを用いた。ＡＭＮ０８２（ＡＭＮ、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．２３８５）は、ｍＧｌｕＲ７アゴニストであり、ｍＧｌｕＲ７は、Ｇｉに結合しているレセプターである。脳スライスを、１ｕＭ  ＡＭＮ０８２と組み合わせた１ｕＭ  ＩＳＯで処理した場合、ルシフェラーゼシグナルは、ＩＳＯのみでの処理と比較して減少した。
【０１３６】
化合物の活性はまた、生育できる脳スライス中で時間をかけて定量することができ、またルシフェラーゼ発現は、バイオイメージャーによって可視化することができる。図８Ｂにおいて、ＣｒｅＬｕｃマウス（系統４４）からの脳スライスは、ホルスコリンに反応した。ホルスコリンはｃＡＭＰの一般的なアクチベーターである。５０ｕＭのホルスコリンでの脳スライスの処理（矢印は、ホルスコリンをスライスに加えた時間をマークしている）により、ビヒクルと比較して時間依存的に誘導を引き起こした。
【０１３７】
Ｂ．インビトロ細胞培養実験
１．初代皮質ニューロン
ＣｒｅＬｕｃモデルからの初代神経細胞の単離および化合物処理についてのワークフローの一般的な概略図を図９に示している。皮質や他の脳の小領域を胚（通常は胎齢（Ｅ）１７または１８であるが、早ければＥ１４も）から取り除いた。その後、個々のニューロンを単離し、９６ウエルのアッセイプレート上にプレーティングした。アッセイは、トリプリケートまたは４通り（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）のいずれかで実行した。アッセイは、標的ＧＰＣＲの発現レベルに依存して、培養物中で７日または１０日まで培養した。その後、化合物をそのプレートに加え、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ  ＃  Ｅ２６１０）をプレートに加えて、ＴｏｐＣｏｕｎｔまたは他のルミノメーターでアッセイを実行した。
【０１３８】
ａ）βアドレナリン受容体（ＡＤ(Ｒ）およびＤ１ドーパミン受容体（ＤＲＤ１）を介したＧｓの調節
ＣｒｅＬｕｃマウスからの初代細胞培養物を、Ｇｓ共役型レセプターを調節し得る化合物をスクリーニングするために用いることができる。ニューロンを系統１８７のＥ１８胚の皮質から単離した。系統１８７は、全組織ルシフェラーゼアッセイによって脳と脊髄両方におけるルシフェラーゼの誘導性レベルを有することが示されている（以下の文章；図２４を参照のこと）。このアッセイを培養３日目にトリプリケートで実行した。ホルスコリンを５μＭ、ロリプラムを１０μＭ、および、Ｇｓアゴニスト、ＡＤβＲ−イソプロテレノール；およびドーパミン−ＳＫＦ８２９５８（ＭＦＧ、Ｃａｔ＃  Ｃ１３０）を１０μＭで用いた。４時間でＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏを加え、Ｔｏｐｃｏｕｎｔでアッセイを実行した。ホルスコリンは、ｃＡＭＰの一般的なアクチベーターである。ロリプラムはｃＡＭＰを活性化しないが、かわりにロリプラムはｃＡＭＰの分解をブロックし、それによりｃＡＭＰレベルを安定化させる。ホルスコリンとロリプラムは、ルシフェラーゼ発現を増加させるように相乗的に作用する。１００倍を超える誘導が、ホルスコリンとロリプラムの組み合わせで観察された。増加したｌｕｃｉレベルは、ＤＭＳＯコントロールに対して、ＡＤβＲアゴニストイソプロテレノールで見られた（１１倍）。一方、Ｄ１  ＤＲアゴニスト、ＳＫＦ８２９５８は、ルシフェラーゼレベルを有意に増加させず、ロリプラム単独と比較する場合に、ＳＫＦ８２９５８をロリプラムと組み合わせて投与した場合、２倍の誘導が観察された。従って、系統１８７は、その化合物がＧｓ共役レセプターを調節し得るかどうかを判断するために化合物をスクリーニングするおに有用なモデルである。
【０１３９】
ｂ）Ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ  ２受容体（ＰＲＯＫ２Ｒ）を介したＧｑ調節
ＣｒｅＬｕｃマウスからの初代細胞培養物を、Ｇｓ共役受容体を調節し得る化合物をスクリーニングするために用いることができる。従って、このＰＲＯＫ２Ｒは、ＰＲＯＫ２Ｒのアゴニストであるｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃｉｎ  ２（ＰＲＯＫ２）を、ＣｒｅＬｕｃマウスがＧｑ調節に応答するかどうかを確認するために用いた。Ｇｑは、ｃＡＭＰをバイパスするが、ＣＲＥＢを活性化するためにＰＬＣ経路を利用している（図１の経路図を参照のこと）。初代皮質ニューロンを、Ｅ１８の系統１８７（脳および脊髄中に誘導可能なルシフェラーゼを有していることが示されている−以下の文章および図２４を参照のこと）から採取した。このアッセイは、４時間、または８時間培養で３日目に実行した。ＰＲＯＫ２ペプチド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃１００−４６）を１ｎＭおよび１００ｎＭの水溶液として加えた。ルシフェラーゼシグナル用にＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏを用い、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで実行した。コントロールのみの培地に対して、ルシフェラーゼレベルの非常に有意な増加が両方の時点で、ＰＲＯＫ２の両方の濃度について観察された。従って、ＣｒｅＬｕｃマウスは、Ｇｑ共役受容体を調節する化合物をスクリーニングするために用いることができる。
【０１４０】
異なるＣｒｅＬｕｃ系統由来の初代皮質ニューロン中のルシフェラーゼ発現におけるＰＲＯＫ２ペプチドの効果を調べた。初代皮質ニューロンを４つの異なるＣｒｅＬｕｃ系統からＥ１８で採取した。系統は、全脳抽出物中で誘導可能なルシフェラーゼレベルを決定した以前の実験に基づいて選択した（データは示さず）。このアッセイを４時間および２４時間の２つの時点で、１ｎＭまたは１００ｎＭいずれかのＰＲＯＫ２ペプチドを含む培養物中で３日目にトリプリケートで実行した。このアッセイにはＢｒｉｇｈｔＧｌｏを使用し、ＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。ルシフェラーゼレベルにおける統計的に有意な増加が、系統２１９および１７５の両方の時点および両方の濃度において観察された。全ての系統がある程度ＰＲＯＫ２リガンドに対応しているとしても、ルシフェラーゼ発現レベルの差異は、導入遺伝子の組込みにおける差異に起因し得る。
【０１４１】
ｃ）ｍＧｌｕＲ７受容体を介したＧｉ調節
ＣｒｅＬｕｃマウス由来の初代細胞培養物を、Ｇｉ共役受容体を調節し得る化合物をスクリーニングするために用いることができる。図１３Ａは、初代皮質ニューロン中のルシフェラーゼ発現におけるｍＧｌｕＲ７アゴニスト、ＡＭＮ０８２の効果を示している。皮質ニューロンをＥ１８胚（系統１８７）より採取した。このアッセイは、培養３日目に実行した。ホルスコリンを１０μＭで用いてＧｉ活性を検出するのに用いるより大きいシグナルウインドウを得た。このｍＧｌｕＲ７アゴニスト、ＡＭＮ０８２は、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび１μＭのホルスコリンと組み合わせて用いた。このアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔで、４時間および８時間で読み取った。ホルスコリンのみに対して、ルシフェラーゼレベルの有意な減少が両時点の１００ｎＭおよび１μＭのＡＭＮ０８２で観察された。このＣｒｅＬｕｃマウスは、Ｇｑ共役受容体を調節する化合物をスクリーニングするために用いることができる。例えば、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と記される「未知の」化合物を内部コントロールとしてＡＭＮ０８２を用いて初代皮質ニューロン培養物中でスクリーニングし、任意の化合物がＧｉ調節能を示すかどうか決定する（図１３Ｂ）。化合物Ａは、ＥＣ５０＝１．７３５ｅ−０７を持つ公知のｍＧｌｕＲ７アゴニストＡＭＮ０８２と比較すると、算出値ＥＣ５＝１．５２９ｅ−０６の活性化合物であると考えられるが、一方化合物Ｂは、非特異的化合物であると考えられ、また化合物Ｃは不活性である。
【０１４２】
ＣｒｅＬｕｃマウス由来の初代細胞培養物を用いるＧｉ共役受容体を調節する能力についての化合物のスクリーニングは、上記に示したように、ホルスコリンのようなｃＡＭＰ刺激因子の存在中でなされ得る。しかしながら、シグナルウインドウを増加させるためにも、ロリプラム（ｃＡＭＰの分解をブロックする）をホルスコリンと組み合わせて用いた。初代皮質ニューロンは、誘導可能な能および脊髄発現を有していると以前に判断された系統１８７由来のＥ１８胚から単離した。アッセイは、トリプリケートで、６時間培養で７日目に実行した。ＡＭＮ０８２の１０μＭから１ｎＭまでの用量曲線は、５０μＭのホルスコリンと１０μＭのロリプラムとを組み合わせて実行した。このアッセイは、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで読み取った。ルシフェラーゼレベルの統計的に有意な減少であるｐ＜０．０００５（ホルスコリンおよびロリプラムコントロールに対して５９〜６１％）は、１μＭ、１００ｎＭおよび１ｎＭで見られた。
【０１４３】
ＣＢ１アゴニスト、ＣＰ５５，９４０による、異なるＣｒｅＬｕｃ系統由来の初代皮質ニューロン中のルシフェラーゼ発現のＧｉ調節を、ホルスコリンおよびロリプラムの存在下で実施した（図１５）。初代皮質ニューロンは、系統６９、１８７、１７５および２１９のＥ１８から採取した。用いられた全ての系統は、全脳組織抽出物中で誘導可能なルシフェラーゼ発現を有していると以前に判断されたものである（データは示さず）。このアッセイは、３日培養で実施した。ＣＢ１アゴニストは、１０μＭで、ホルスコリンは５μＭ、ロリプラムは１０μＭで用いた。４時間と２４時間の２つの時点で実行した。次いで、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質を加え、このアッセイをＴｏｐｃｏｕｎｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで読み取った。このアッセイはトリプリケートで実行した。データはトリプリケートの平均で示されている。データは、秒あたりのカウント数（ｃｐｓ）で示されている。ルシフェラーゼのシグナルの減少は、ＣＢ１アゴニストを添加した両方の時点で４つ全ての系統において観察された。応答レベルのわずかな差異は、導入遺伝子の組み込みに起因し得るが、全ての系統がＧｉ調節に応答性であり、Ｇｉ活性のスクリーニング化合物に修正可能であった。
【０１４４】
ＣＢ１アゴニスト、ＣＰ５５，９４０による、ＣｒｅＬｕｃマウス由来の初代皮質ニューロン中のルシフェラーゼのＧｉ調節は、用量依存的であった（図１５Ｂ）。皮質ニューロンは、Ｅ１８胚から単離下。このアッセイは培養３日目に実行した。ホルスコリンおよびロリプラムを１０μＭで用いた。アゴニストを１０μＭ、１μＭおよび１００ｎＭの濃度で加えた。このアッセイは、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を備えるＴｏｐＣｏｕｎｔで、８時間で読み取った。ルシフェラーゼレベルの有意な減少（ホルスコリンおよびロリプラム単独に対して、アゴニストにホルスコリンとロリプラムを加えたもの）は、３つ全ての濃度で観察された。
【０１４５】
２．初代線条体ニューロン
ＣｒｅＬｕｃマウスから誘導された任意の細胞培養物は、ＧＰＣＲを調節する能力について化合物をスクリーニングするために用いることができる。ホルスコリンおよびロリプラム、ならびにＤＲＤ１およびＡＤβＲのＧｓアゴニストによって、ＣｒｅＬｕｃ線条体ニューロン中でルシフェラーゼ発現を誘導した（図１６）。線条体ニューロンは、Ｅ１４胚（系統１８７）から単離した。このアッセイは培養４日目に実行した。ホルスコリンを５μＭ、ロリプラムを１０μＭで用いた。Ｇｓアゴニスト（イソプロテレノールはＡＤＲβにおいてアゴニストであり、ドーパミンおよびＳＫＦ８２９５８は、Ｄ１ＤＲにおいてアゴニストである）を１０μＭ、３μＭおよび１μＭで用いた。このアッセイは、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒおよびＢｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏ  ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて５時間で読み取った。２８倍の非常に有意な増加が、ホルスコリンとロリプラムの組み合わせで処理された細胞中で観察された。有意な増加はまた、１０μＭのドーパミンで２．７倍、イソプロテレノールの３つ全ての濃度で観察された。下がｔｔえ、導入遺伝子は、皮質ニューロンだけでなく線条体においても機能的である（図１０を参照のこと）。
【０１４６】
３．全脾細胞
ＣｒｅＬｕｃマウス（系統６４）から単離した全脾細胞プレップを用いて、ホルスコリンおよびロリプラムのような一般的なｃＡＭＰ誘導因子、ならびいルシフェラーゼ発現におけるＧｓアゴニストの効果を示した（図１６）。脾臓は、１×ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１４０２５）の動物から採取した。次いで、この細胞を、５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１４１９０）中で、５ｍｌシリンジの先端を用いて脾臓カプセルを機械的に破壊することにより単離した。次いで、この細胞懸濁液を７０ｕｍのストレーナーを通過させて５０ｍｌのコニカルチューブ中に入れた。その後細胞を８００ｒｐｍで回転させ、５ｍｌの１Ｘ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃５５５８９９）中に再懸濁させて室温で６分間インキュベーションした。次いで細胞に、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１１８７５）、１０％  ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１６０００）、１％  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃１５０７０）および０．１％  β−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ｃａｔ＃２１９８５）からなる２８ｍｌの培地を加えることによって洗浄した。細胞を２×１０6／ｍｌまで希釈し、９６ウエルの白色不透明プレートにプレートあたり１００ｕｌの細胞をプレーティングした。これらの細胞の半分を抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ＃５５３０５８）で２４時間刺激し、残りの半分は処理しなかった。２４時間でそのプレートに化合物を加え、さらに４時間放置した。一般的な誘導因子としては、ロリプラム（Ｓｉｇｍａ  Ｒ６５２０）、ホルスコリン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ６８８６）が挙げられる。用いられたＧｓアゴニストは以下のとおりである：ＥＸ０００００１７３Ａ（１７３Ａ；インハウスで合成された）は、Ｇｓ結合プロスタグランジンＥ２（ＥＰ２）受容体でのアゴニストである；ＢＷ２４５Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ｂ９３０５）は、Ｇｓ結合プロスタグランジンＤ２受容体（ＤＰ１）のアゴニストであり、イソプロテレノール（Ｓｉｇｍａ  Ｉ５６２７）は、Ｇｓ結合βアドレナリン受容体（ＡＤβＲ）でのアゴニストである。このアッセイは、トリプリケートで実行した。４時間後、１００μｌのＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を加え、アッセイはＴｏｐＣｏｕｎｔ  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  で読み取った。ＤＭＳＯに対して１４倍の増加がロリプラムおよびホルスコリンの存在下でのＣＤ３刺激された細胞中で観察された。統計的に有意な増加（ｔ−検定による）もまた、ＤＭＳＯのみのコントロールに対して３つ全てのＧｓアゴニストで観察された。この実験により、導入遺伝子は、全脾細胞集団において機能的であることが示された。この実験において用いられた調製物は、細胞の混合された集合である、全脾細胞調製物であった。以下に記載される実験は、Ｔ細胞およびＢ細胞のような亜集団におけるルシフェラーゼ発現レベルを調��ている。
【０１４７】
４．単離Ｔ細胞
５つの異なるサブ系統のＣｒｅＬｕｃマウスから単離したＴ細胞中の、ロリプラムおよびホルスコリンによる一般的なｃＡＭＰ活性化の効果を研究した（図１８）。全脾細胞集団を上に記載したような機械的な破壊により準備した。次いで、ＣＤ４＋細胞をＭＡＣＳ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ｃａｔ＃１３０−０４９−２０１）を用いて単離した。次いで、これらの細胞をウエルあたり１．５ｘ１０5個、９６ウエルの白色不透明プレートにプレーティングし、抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５３０５８）で刺激した。１８時間後、１０μＭのロリプラ  （Ｓｉｇｍａ  Ｒ６５２０）および５μＭのホルスコリン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ６８８６）をプレートに加え、さらに４時間置いた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を加え、アッセイはＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは発光（秒あたりのカウント数）、および培地のみのコントロールに対する増加倍率として示される。ルシフェラーゼの発現における増加は試験された全ての系統で観察され、系統６４が最も高い誘導レベルを提供し、ｃＡＭＰがＣｒｅＬｕｃマウス中の一般的なモジュレーターによって活性化されていることを実証している。
【０１４８】
ＣｒｅＬｕｃマウス（系統６４）から単離された抗ＣＤ３刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のルシフェラーゼレベルに対する異なるＧｓアゴニストの効果を研究した（図１９）。全脾細胞集団を機械的な破壊によって準備した。次いで、ＣＤ４＋細胞をＭＡＣＳ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ｃａｔ＃１３０−０４９−２０１）によって単離下。これらの細胞をウエルあたり１．５ｘ１０5個、９６ウエルの白色不透明プレートにプレーティングし、抗ＣＤ３抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ｃａｔ＃５５３０５８）で刺激した。２４時間後、化合物を加え、さらに４時間置いた。ＤＰ（ＢＷ２４５Ｃ）、ＥＰ２（ＥＸ０００００１７３Ａ）およびＡＤβＲ（イソプロテレノール）のＧｓアゴニストを全て１０μＭで、ホルスコリンを５μＭで、およびロリプラムを１０μＭで用いた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を加え、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。ホルスコリンおよびロリプラムで処理した細胞において、２５倍の増加が観察された。ＢＷ２４５Ｃは３倍、１７３Ａは２倍、イソプロテレノールは５倍という非常に有意な増加が３つ全てのＧｓアゴニストで観察された。導入遺伝子は、特異的ＧｓアゴニストだけでなくｃＡＭＰ経路の一般的なモジュレーターとして応答性であった。
【０１４９】
５．単離Ｂ細胞
ＣｒｅＬｕｃマウスの２つの異なるサブ系統から単離したＢ細胞中の、ロリプラムおよびホルスコリンによる一般ｔ系なｃＡＭＰ活性化の効果を調べた（図２０）。全脾細胞集団を上記のように機械的に破壊した。次いで、Ｂ２２０＋細胞を、Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ｃａｔ＃  １３０−０４９−５０１）を備えるＭＡＣＳ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎを用いて単離した。その後これらの細胞を９６ウエルの白色不透明プレート上にウエルあたり２．０ｘ１０5個プレーティングし、１０ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ｌ−２６３０）で刺激した。１８時間後、１０μＭのロリプラム（Ｓｉｇｍａ  Ｒ６５２０）および５μＭのホルスコリン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ６８８６）をそのプレートに加え、さらに４時間置いた。ＢｒｉｇｈｔＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ｃａｔ＃Ｅ２６１０）を加え、アッセイをＴｏｐＣｏｕｎｔで読み取った。データは発光（秒あたりのカウント数）および培地のみのコントロールに対する増加倍率として示される。ルシフェラーゼ発現の増加は、系統６４では観察されたが、系統２２９では観察されなかった。
【０１５０】
６．ミクログリア
一般的なｃＡＭＰアクチベーターであるホルスコリンおよびロリプラム、ＤＰ受容体のアゴニストであるＢＷ２４５Ｃによる、ＣｒｅＬｕｃマウスから単離されたミクログリア中のルシフェラーゼ発現の誘導を調べた（図２２）。初代ミクログリアは、ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ＃  １１９９５）、１０％  ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ＃  １６１４０）および１％  ペニシリン−ストレプトマイシン１００Ｘ（ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ＃  １５１４０）からなる培地中でＰ２マウス（系統６４）由来の皮質から単離した。細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコーティングプレート上に９６ウエル形式でプレーティングした。細胞は未処理のままか１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで２時間刺激したかのいずれかである。次いで化合物を加え、さらに４時間置いた後、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏアッセイを実行した。使用した化合物は、５μＭのホルスコリン、１０μＭのロリプラム、もしくはこれら２つの組み合わせ、またはＤＰ１受容体のＧｓアゴニストＢＷ２４５Ｃを１０μＭである。非刺激条件下では、ミクログリアは一般的なｃＡＭＰモジュレーターおよびＤＰ受容体の特異的Ｇｓアゴニストに対して非応答性であった。しかしながら、ミクログリアをＬＰＳで刺激した場合、それらの細胞はホルスコリンおよびＢＷ２４５Ｃに対して応答性となった。
【０１５１】
７．マウス胚線維芽細胞
マウス胚線維芽細胞中のルシフェラーゼ発現におけるホルスコリン、ロリプラム、およびイソプロテレノールの効果を調査した（図３３）。マウス胚線維芽細胞は、６つの独立したＣｒｅＬｕｃ系統のＥ１２胚から培養した。細胞をウエルあたり２０，０００細胞プレーティングした。試験した化合物としては、１０μＭのホルスコリン、５μＭのロリプラムおよび１０μＭのイソプロテレノール（ＡＤβＲアゴニスト）が挙げられる。ホルスコリンとロリプラムの組み合わせに応じて、有意な増加が全ての系統で観察された。有意な増加はまた、イソプロテレノールに応じて、３つの系統で観察された。
【０１５２】
７．心筋細胞
心筋細胞中のルシフェラーゼレベルにおける、ホルスコリンおよびロリプラムおよびイソプロテレノールの効果を研究した（図３５）。心筋細胞は、系統２２９由来のＰ３仔より単離した。細胞を９６ウエルプレートで培養した。試験した化合物としては、１０μＭのホルスコリン、５μＭのロリプラムおよび１０μＭのイソプロテレノール（ＡＤβＲアゴニスト）が挙げられる。ロリプラムとホルスコリンの組み合わせにより、ルシフェラーゼレベルの有意な増加（２５倍）が観察され、アゴニストのイソプロテレノールでもまた有意な増加（２倍）が観察された。
【０１５３】
Ｂ．インビボおよびエキソビボ試験
１．一般的なｃＡＭＰモジュレーターの効果
ルシフェラーゼ発現の誘導に対する髄腔内注射されたホルスコリンおよびロリプラムの効果を、系統１８７のＣｒｅＬｕｃマウスの脳および脊髄において研究した（図２３）。選択されたマウスの系統は、脳と脊髄の両方において導入遺伝子の発現を有していることが以前に判定されている（データは示さず）。このアッセイ用に選択されたマウスの系統（系統１８７）は、脳と脊髄の両方において誘導可能なレベルのルシフェラーゼを有している。グループあたりＮ＝３〜４のマウス、４つの処理群、３月齢の雄。グループＡ：ＤＭＳＯコントロール、グループＢ：１μｇホルスコリン／１０μｇロリプラム、グループＣ：１０μｇホルスコリン／１０μｇロリプラム、グループＤ：４０μｇホルスコリン／１０μｇロリプラム。この動物に、髄腔内注射により腰部に１匹のマウスあたり５μｌの量で投薬した。これらを投薬後４時間で画像処理した。脊髄および脳の両方のデータは、平均ピーク輝度、平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。統計的に有意な増加が脊髄中で観察され、脳内におけるルシフェラーゼシグナルの有意な増加は、ホルスコリンの最も高い濃度においてみられただけであった。一般的なモジュレーターまたはｃＡＭＰが脊髄中に注射された場合、脊髄中で導入遺伝子の局所的な発現の増加があり、脳においてはより低い応答が観察された。
【０１５４】
２．Ｇｓアゴニストの効果
ＣｒｅＬｕｃマウスの脳および脊髄中のルシフェラーゼ発現に対するＥＰアゴニスト、ＥＸ０００００１７３Ａの効果を研究した（図２４）。系統１８７由来の５月齢の雄マウス（ｎ＝５）に、ビヒクル（５％  ＤＭＳＯ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ８０、ＰＢＳ）または１０ｍｇ／ｋｇ  ＥＸ０００００１７３Ａのいずれかを用いてｉ．ｐ．注射した。動物を投薬４時間後にバイオイメージングした。データは平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。脳と脊髄の両方において、アゴニスト処理による統計的に有意な増加がみられた。従って、ｉ．ｐ．投与されたＧｓアゴニストは、導入遺伝子を活性化した。
【０１５５】
さらに、ＣｒｅＬｕｃマウス中のルシフェラーゼ発現に対するＥＰ２アゴニスト、ＥＸ０００００１７３Ａの効果は用量反応性であった（図２５）。系統１８７は、この系統が脳と脊髄の両方において高く誘導可能な発現を有しているために選択した。このアッセイは、５つの群の６週齢のマウス（ｎ＝５）で構成されている。マウスに、ビヒクルコントロール（Ｄ−ＰＢＳ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｃａｔ＃１４０４０）または用量を変化させたＥＰ２アゴニストＥＸ００００１７３Ａ（１．５ｎｍｏｌ、５ｎｍｏｌ、１５ｎｍｏｌおよび５０ｎｍｏｌ）のいずれかを投薬した。マウスに髄腔内注射（１匹のマウスあたり５μｌ）により投薬し、ＩＶＩＳ  ｂｉｏｉｍａｇｅｒで４時間後にバイオイメージングした。データは５匹のマウスの平均値として、平均ピーク輝度、平方センチメートル毎秒あたりの光子として示されている。アゴニスト処理による統計的に有意な（ｔ−検定）増加が、脊髄中の３つの濃度で観察されたが、脳内では観察されなかった。脳内の増加（有意ではない）は、髄腔内注射で予測されたような最も高い濃度で観察されたのみであった。
【０１５６】
図２６は、ＣｒｅＬｕｃマウスにおけるアドレナリン受容体β３（Ａｄｒｂ３）アゴニスト、ＣＬ３１６，２４３（１  ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）による異なる組織中のルシフェラーゼの誘導を示している。このルシフェラーゼアッセイは、組織ホモジネートで実施した。スクリーニングした１２の独立したトランスジェニック系統の中で、７系統が脂肪組織と胚において１０倍以上の誘導を示した。４系統はバイオイメージングによって目視可能な誘導を示した（図２７Ａおよび２７Ｂを参照）。
【０１５７】
３．ＧｓアゴニストＡＶＥ００１０の特異的効果
導入遺伝子の活性化は、ＣｒｅＬｕｃマウスの３つの独立した系統において健空された、グルカゴン用ペプチド１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）アゴニストによるルシフェラーゼレポーターの誘導によって例示されるように、組織特異的受容体の活性化と共局在する（図２８）。ＧＬＰ−１Ｒは、Ｇｓ結合されている。ベースラインの画像は、１日目に得られた。２日目、マウスをＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）で処理し、４時間後に画像処理した。ベースラインに対する誘導倍率が下部に示されている。予想どおりＧＬＰ−１Ｒ受容体は、主に脾臓組織中で発現されているので、脾臓中で観察された導入遺伝子活性化の強い誘導が存在した。８つの異なる組織中のルシフェラーゼ活性を、系統１１、１６および９０について測定し（図２９）、その後ＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）で４時間処理した。組織ホモジネート中のルシフェラーゼ活性により、ルシフェラーゼの脾臓特異的誘導が確認された。ＡＶＥ００１０の活性は、ＧＬＰ−１Ｒが異なる組織タイプで見出されても、脾臓に限定されている。
【０１５８】
ＡＶＥ００１０によるＣｒｅＬｕｃの誘導は、β細胞媒介である可能性が高い。ＡＶＥ００１０によるＣＲＥ−Ｌｕｃの誘導におけるβ細胞毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の効果を調査した（図３０）。雄のＣｒｅＬｕｃマウス（系統１１）を、ＡＶＥ００１０を０．１  ｍｇ／ｋｇ処理の前および処理後に画像処理した。全てのマウスは、ＡＶＥ００１０に応答していた（中パネル）。次いで、この動物をビヒクル（コントロール）またはＳＴＺ（２００ｍｐｋ、ｉｐ）で処理した。４日後、これらをＡＶＥ００１０での処理後再び画像処理した。ビヒクル群と比較すると、ＳＴＺ群は、ルシフェラーゼ誘導が減少していた。
【０１５９】
ＡＶＥ００１０によるＣｒｅＬｕｃの誘導は、β細胞特異的である可能性がある（図３１）。動物を図３０に記載されたように処理した。血中グルコース濃度を、非絶食マウスの尾静脈ニッキングによって測定した。グルコース濃度は、Ｂａｙｅｒのグルコースメーターで読み取った。グルコース濃度はｍｇグルコース／ｍｌとして示される。誘導の倍率は、ベースラインの信号  対  ＡＶＥ１０を投与したルシフェラーゼバイオイメージングレベルである。血中グルコース濃度（ＢＧ）は、ＳＴＺによる増加した（左上パネル）。非絶食ＢＧレベルは、ＡＶＥ００１０（０．１  ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）によって低減された。図３０に示されるＢＬＩデータを定量した。
【０１６０】
４．骨髄移植
ＣｒｅＬｕｃ骨髄移植を、ＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ガンマ（ＮＧＳ）マウスを用いて実施した（図３２）。ＮＳＤマウスは、成熟Ｔ細胞およびＢ細胞、機能的なナチュラルキラー細胞を欠損した免疫無防備状態のマウスであり、造血細胞の移植を可能にする差異と下院シグナル伝達を欠損している。骨髄細胞は、系統４４（高い基底ルシフェラーゼレベルを有している；データは示さず）のヘテロ接合体と系統６４（誘導可能なルシフェラーゼレベルを有している）のホモ接合体から採取した。その後、この細胞を、１匹のマウスあたり１００万、または５００万個の細胞で、照射ＮＳＧマウスに細胞の尾静脈注射により移植した。系統４４については、マウス１および２は５００万、マウス３および４が１００万の細胞を受けた。系統６４について：マウス１が５００万個の細胞、マウス２、３および４が１００万個の細胞を受けた。（ＣｒｅＬｕｃ系統あたり４匹のＮＳＧマウス）。動物を、４週間（データは示さず）でバイオイメージングし、再度８週間（データは示されている）でバイオイメージングした。画像処理の前に、系統６４のマウスを５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンおよび１０ｍｇ／ｋｇのロリプラムで５時間誘導した。バイオイメージング写真は、８週の時点のものを示している。系統４４の骨髄細胞を移植したＮＳＧマウスにおけるルシフェラーゼレベルは、ＣｒｅＬｕｃ系統４４で見られた画像を模倣しており、間接、脊髄、頭部および胸骨において発現が観察された。誘導可能なルシフェラーゼ発現は、系統６４の骨髄細胞を移植したＮＳＧマウスの脾臓で観察された。
【０１６１】
４．動物モデル
ＣｒｅＬｕｃマウスは、疾患または疾患状態の局面の動物モデルを研究するのに用いることができる。さらに、このＣｒｅＬｕｃマウスは、ＣｒｅＬｕｃマウスにおいて誘導される疾患または疾患の局面を調節することができる化合物をスクリーニングするために用いることができる。例えば、ＣｒｅＬｕｃ系統１８７におけるルシフェラーゼレベルに対するザイモサン処理の効果を研究した（図３４）。治療群のＣｒｅＬｕｃマウス（系統１８７）に、疼痛反応を誘導するためにザイモサンによって両方の後部足に皮下注射した。これらの動物を４日間毎日バイオイメージングした。ルシフェラーゼ発現の統計的に有意な増加は、全ての時点において、ザイモサンに反応して動物の足で観察された。ザイモサンは、炎症反応を強く活性化する酵母細胞壁成分である。従って、ＣｒｅＬｕｃマウスは、同じ動物において炎症反応を経時的にモニタリングできるツールである。また、ザイモサン処理した動物を用いて、ザイモサンによって誘導される炎症を逆にするかまたは悪化させる試験化合物の能力を評価するためのスクリーニングツールとして用いることができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図３１】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【配列表】
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