(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における喘息の長期の疾患修飾するための反復投与用の有効量の非コンジュゲート型免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含む組成物を含む治療剤であって、ここで、ＩＳＳは少なくとも５回投与され、該長期の疾患修飾は、ＩＳＳの最終投与後、少なくとも３週間継続し、ＩＳＳは、５’−Ｎｘ（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙＮｗ（Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ２’Ｘ１’（ＣＧ）ｐ）ｚを含み、式中、ｘ＝０〜２、ｙ＝１〜２、ｗ＝０、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜５であり、Ｘ１及びＸ１’Ｘ２及びＸ２’は自己相補的であり、（ＴＣＧ（Ｎｑ））ｙ配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基であるり、ここで、前記治療剤は、上位及び／又は下位気管への送達に使用するためのものである、上記治療剤。
【請求項２】
反復投与が週１回を基本として行われる、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
長期の疾患修飾が、個体におけるＴｈ２反応の低下である、請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
個体におけるＴｈ２反応の低下が、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３からなる群から選択されるサイトカインのいずれか１つの低下である、請求項３に記載の治療剤。
【請求項５】
長期の疾患修飾が、ＩＳＳの最終投与後、少なくとも１３週間継続する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項６】
治療が、喘息の長期の疾患修飾をもたらし、ここで、喘息がアレルギー喘息である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
ＩＳＳが、少なくとも８回投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
反復投与が１４日毎に行われる、請求項１に記載の治療剤。
【請求項９】
個体におけるＴｈ２反応の低下が、好酸球の気道への浸潤の低下である、請求項３に記載の治療剤。
【請求項１０】
長期の疾患修飾が、ＩＳＳの最終投与後、少なくとも８週間継続する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項１１】
ＩＳＳが、リン酸連結を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００６年１１月９日に出願された、特許仮出願第60/865,089号の優先権の恩恵を主張するものであり、この出願の開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、長期の疾患修飾をもたらす１種又は複数の免疫刺激配列（「ＩＳＳ」）の反復投与を使用することによる、喘息の治療法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
感染症又は他の抗原チャレンジにより生じた免疫反応の種類は、一般に、その反応に関与したヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のサブセットにより識別することができる。Ｔｈ１サブセットは、遅延型過敏症及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化のような、古典的細胞−媒介機能に寄与するのに対し、Ｔｈ２サブセットは、Ｂ細胞活性化のヘルパーとしてより効果的に機能する。抗原に対する免疫反応の種類は一般に、抗原に反応する細胞により産生されたサイトカインにより影響を受ける。Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞により分泌されたサイトカイン類の差は、これらの２種のサブセットの生物学的機能の差を反映していると考えられる。例えば、Romagnaniの論文、(2000) Ann. Allergy Asthema Immunol, 85:9-18を参照のこと。
【０００４】
Ｔｈ１サブセットは、ウイルス感染症、細胞内病原体、及び腫瘍細胞に対する反応に特に適しており、その理由は、これはＩＬ−２及びＩＦＮ−γを分泌し、これらはＣＴＬを活性化するからである。Ｔｈ２サブセットは、自由生活の細菌及び蠕虫の寄生に対する反応により適しており、かつアレルギー反応を媒介することがあり、その理由は、ＩＬ−４及びＩＬ−５は、各々、ＩｇＥ産生及び好酸球活性化を誘導することがわかっているからである。一般にＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞は、異なるパターンのサイトカインを分泌し、その１方の反応型は、他方の反応型の活性を変調することができる。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスにおけるシフトは、例えば、あるいは、増大したＣＴＬ反応のようなアレルギー反応を生じ得る。
【０００５】
哺乳類において、Ｔｈ１型免疫反応を、ある種のＩＳＳの投与により誘導することができることがかなりの期間認められている。これらのＩＳＳは、頻繁にＣＧを含む免疫刺激配列（「ＩＳＳ」）と称される配列を含む。例えば、ＰＣＴ公開WO 98/55495、WO 97/28259、米国特許第6,194,388号；第6,207,646号、及び第6,498,148号；並びに、Kriegらの論文、(1995) Nature, 374:546-49を参照のこと。結核及びマラリアなどの多くの感染症に関して、Ｔｈ２型反応は、感染に対しほとんど保護的価値はない。タンパク質−ベースのワクチンは典型的には、高力価の中和抗体を特徴とする、重大な細胞媒介型免疫を伴わない、Ｔｈ２型免疫反応を誘導する。更に一部の型の抗体反応は、ある種の適応症には不適切であり、最も注目されるのはＩｇＥ抗体反応がアナフィラキシーショックを生じ得るアレルギーにおいてである。
【０００６】
脊椎動物において、顆粒球（好酸球、好塩基球、好中球及びマスト細胞）による内皮細胞接着には、ロイコトリエン、主要塩基性タンパク質及びヒスタミンのような、炎症メディエーターの放出が続く。易罹患性個体において生じる炎症は、罹患した個体の組織を損傷し得る。
【０００７】
最も一般的な病的炎症状態は喘息であり、これは、好酸球の呼吸気道への顕著な浸潤、それに続く炎症が誘導した組織損傷を特徴としている。そのような状態の慣習的な治療は、典型的には内皮への顆粒球接着後に放出された炎症メディエーターの活性の阻害に向けられる（例えば、罹患組織へのコルチコイド組成物の送達による）。炎症を誘導する抗原のアイデンティティがわかっている場合、更なる抗原チャレンジに対する免疫保護の一部を、免疫処置により提供することができる。しかし標準的(canonical)免疫処置は、中和抗体の産生を刺激するには有効であるが、より長期の細胞免疫は効果的に刺激しない。更に抗原免疫処置は、ＩＬ−４及びＩＬ−５の個々の産生を刺激する。ＩＬ−５は、内皮への顆粒球接着を促すのに対し、ＩＬ−４は、アナフィラキシーのリスクのあるＩｇＥアイソタイプへの免疫グロブリンクラススイッチを誘導する。
【０００８】
アレルギー喘息に関して、アレルギー喘息のマウスモデルにおけるＩＳＳによる前治療は、アレルゲンが誘導した気道好酸球増加症及び気道応答性亢進を阻害することが示されている。Broideら、(1998) J. Immunol. 161:7054。この阻害は、同じく気道内のＴｈ２型サイトカインレベルのＩＳＳが誘導したダウンレギュレーションに相関することも示されている。Hesselら、(2005) J. Exp. Med., 202(11):1563。しかしこれらの研究では、ＩＳＳ治療はアレルゲンチャレンジ前に短期間与えられたので、これはＩＳＳ治療の直接作用に焦点を当てている。一方でＩＳＳによる長期治療の作用は、依然不明部分が多い。加えて長期恩恵をもたらす喘息の治療は、いずれもよく特徴付けられていない。本明細書において開示された本発明は、前述のことに対処するのに有用な内容を提供する。
【０００９】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の簡単な概要
本発明は、ＩＳＳの有効量の反復投与を個体へ投与することによる、それを必要とする個体における喘息の治療法を提供する。一実施態様において、ＩＳＳは、少なくとも３回投与される。別の実施態様において、この反復投与は、週１回を基本として行われる。別の実施態様において、本方法は、喘息の長期の疾患修飾を生じる。別の実施態様において、この長期の疾患修飾は、個体におけるＴｈ２反応の低下である。別の実施態様において、この個体におけるＴｈ２反応の低下は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３からなる群より選択されるサイトカインのいずれかひとつの低下である。別の実施態様において、本長期の疾患修飾は、ＩＳＳの最終投与後、少なくとも１３週間継続する。別の実施態様において、本方法は、喘息の長期の疾患修飾を生じ、ここで喘息はアレルギー喘息である。別の実施態様において、ＩＳＳは、１０１８  ＩＳＳ、ＣｐＧ含有−ＩＳＳ、及びキメラ免疫調節化合物からなる群より選択される。別の実施態様において、ＩＳＳは、１０１８  ＩＳＳである。別の実施態様において、ＩＳＳは、偶発的(adventitious)アレルゲンの存在下で投与される。別の実施態様において、偶発的アレルゲンはブタクサである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、感作したマウスを、ブタクサで鼻腔内チャレンジした場合の、Ｔｈ２型気道炎症反応の発生に関し重要な６種の遺伝子ＩＳＳの結果を示すグラフである。データは、遺伝子／ユビキチン比として表した。
【図２】図２は、１０１８  ＩＳＳでの前処置による、ＧＯＢ−５及びＣ２に関するＴｈ２遺伝子誘導の阻害を示すグラフである。データは、遺伝子／ユビキチン比として表した。
【図３】図３は、ＢＡＬ液中に検出されたＴｈ２型サイトカインＩＬ−４及びＩＬ−１３のレベルを示すグラフである。２個のアスタリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１を示す。１個のアスタリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０５を示す。
【図４】図４は、ＢＡＬ液中に検出されたＴｈ２型サイトカインＩＬ−１０及びＴｈ１型サイトカインＩＮＦ−γのレベルを示すグラフである。２個のアスタリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１を示す。
【図５】図５は、ＢＡＬ液中に検出された好酸球の絶対数を示すグラフである。２個のアスタリスクは、統計学的有意性ｐ＜０．０１を示す。
【図６】図６は、１０１８  ＩＳＳの反復投与により処置されたマウスの洗浄液（ＢＡＬ液）中で測定されたＴｈ２型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３のレベルを示すグラフである。
【図７】図７は、１０１８  ＩＳＳ又はＴＯＬＡＭＢＡの反復投与により処置されたマウスの洗浄液（ＢＡＬ液）中で測定されたＴｈ２型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３のレベルを示すグラフである。
【図８】図８は、ブタクサが誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる長期鼻腔内処置の作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書において本発明は、免疫刺激配列（ＩＳＳ）の有効量を反復投与で個体へ投与することによる、個体における喘息の治療法を提供する。本発明のひとつの態様において、長期の疾患修飾は、ＩＳＳの反復投与を用いて付与することができる。長期の疾患修飾は、個体におけるＴｈ２反応の抑制を含む。場合によっては、この抑制は、Ｔｈ２反応の阻害である。
【００１３】
一般的方法
本発明の実践は、別に記さない限りは、当該分野の技術の範囲内である、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の通常の技術を利用するであろう。そのような技術は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第二版(Sambrookら、1989)及び「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第三版(Sambrook及びRussel、2001)(本明細書ではまとめて及び個別に「Sambrook」と称す)；「Oliconucleotide Synthesis」(M. J. Gait編集、1984)；「Animal Cell Culture」(R.I. Freshney編集、1987)；「Handbook of Experimental Immunology」(D. M. Weir 及びCC. Blackwell編集)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J. M. Miller及びM. P. Calos編集、1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M. Ausubelら編集、1987、2001までの補遺を含む)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」(Mullisら編集、1994)；「Current Protocols in Immunology」(J.E. Coliganら編集、1991)；「The Immunoassay Handbook」(D. Wild編集、Stockton Press NY, 1994)；「Bioconjugate Techniques」(Greg T. Hermanson編集、Academic Press, 1996)；「Methods of Immunological Analysis」(R. Masseyeff、W.H. Albert、及びN. A. Staines編集、Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993)、Harlow及びLane(1988)、「Antibody, A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Publications, NY、並びに、Harlow及びLane(1999)、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press, コールドスプリングハーバー, NY(本明細書ではまとめて及び個別に「Harlow及びLane」と称す)、Beaucageら編集、「Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry」(John Wiley & Sons, Inc., NY, 2000)；並びに、Agrawal編集、「Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties」(Humana Press Inc., NJ, 1993)などの文献に、十分に説明されている。
【００１４】
定義
本明細書において使用される用語「アレルゲン」は、被験者への曝露時に、アレルギー反応を誘発する、分子、通常はタンパク質の抗原又は抗原性部分をいう。典型的には本被験者は、例えば、膨疹及び発赤試験又は当該技術分野において公知の任意の方法により示されるように、アレルゲンに対しアレルギー性である。分子への曝露時に、例え被験者の極小さいサブセットがアレルギー性免疫反応（例えばＩｇＥ）を示したとしても、その分子は、アレルゲンと称される。アレルゲンは、季節に応じて、わずかに少量又は大量に環境中に存在することができる。アレルゲンの例は、下記表１に列記している。
【００１５】
「個体」は、マウスのような脊椎動物であり、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、ヒト、霊長類、家畜、スポーツ用動物、齧歯類及びペットを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
物質の「有効量」とは、臨床の結果を含む、有益な又は所望の結果を実行するために十分な量であり、従って「有効量」は、それが適応される状況に応じて決まる。抗原の同時投与を伴う又は伴わないのいずれかで、免疫反応を変調する組成物を投与する状況において、ＩＳＳ（及び適用可能である場合は抗原）の有効量は、抗原が単独で投与された場合に得られる免疫反応と比べ、そのような変調を実現するのに十分な量である。有効量は、Ｔｈ２免疫反応の抑制及び／又は阻害のような、疾患修飾の長期の恩恵をもたらすことができる。有効量は、１回又は複数回投与で投与することができる。
【００１７】
本明細書において使用されかつ当該技術分野において周知である「治療」とは、臨床の結果を含む、有益な又は所望の結果を得る方法である。本発明の目的に関して、有益な又は所望の臨床の結果とは、１種又は複数の症状の軽減もしくは改善、疾患範囲の縮小、疾患の安定化した（すなわち増悪しない）状態、疾患進行の遅延もしくは鈍化、及び／又は病態の改善もしくは緩和を含むが、これらに限定されるものではない。「治療」は、治療を受けない場合に期待される生存と比べた場合の、生存の延長も意味する。
【００１８】
本明細書において使用される用語「長期の疾患修飾」は、ＩＳＳ最終投与量の投与後少なくとも３週間の期間、好ましくは少なくとも８週間の期間、最も好ましくは少なくとも１２週間の期間にわたる１種又は複数の喘息症状の軽減又は消失をいう。喘息の症状は、気管支過敏症、好酸球の気道への浸潤、気道における粘液産生、気道におけるＴｈ２サイトカイン、気道リモデリング、即時型喘息反応（アレルゲン曝露直後の気道収縮）、及び遅発型喘息反応（アレルゲン曝露の数時間後の気道収縮）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
ＩＳＳの生物学的作用
ＩＳＳの反復投与を使用することにより、長期の疾患修飾を喘息の個体へもたらすことができることはわかっている。本実施例は、この知見のいくつかの例証を提供する。実施例１は、ＩＳＳのひとつの型、例えば１０１８  ＩＳＳの直接作用は、アレルギー喘息のマウスモデルにおいて、約１週間持続することを明らかにする。実施例２及び３は、Ｔｈ２反応を、１０１８  ＩＳＳが少なくとも８週間複数回投与された個体において抑制することができることを例示している。Ｔｈ２抑制の長期作用は、少なくとも１３週間持続することができる。従って一態様において、本発明は、ＩＳＳの有効量を少なくとも８週間個体へ投与することにより、長期の喘息の治療を提供する。この治療の長期作用は、少なくとも１３週間持続することができる。本発明は、少なくとも１３、１５、１７、１９、２１又は２５週間持続する長期の疾患修飾をもたらすために、少なくとも８週間のＩＳＳの反復投与を用いることにより、喘息を有する個体に、長期の恩恵を提供する方法を企図している。
【００２０】
機能的に、ＩＳＳは、個体における細胞性及び体液性免疫反応、特にリンパ球増殖及び個々の単球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるサイトカイン（インターフェロン又はＩＦＮを含む）の放出を増強する。インビボにおける合成ＩＳＳによる免疫刺激は、個々のリンパ球の、例えばＩＳＳ、ＩＳＳオリゴヌクレオチドコンジュゲート、及びＩＳＳ含む組み換え発現ベクターとの接触により行われる。例えば、米国特許第6,610,661号及びWO 97/28259を参照のこと。従って未変性の微生物ＩＳＳは、感染症に反応するよう個体の免疫系を刺激するが、これらのＩＳＳの合成アナログは、微生物抗原に対するのみではなく、アレルゲン及び他の物質にも対する個体の免疫反応の変調のために治療的に有用である。
【００２１】
ＩＳＳ組成物
本発明の方法は、任意の型のＩＳＳを使用することにより実践することができる。一実施態様において、１０１８  ＩＳＳが使用される。１０１８  ＩＳＳの構造は、複数の化学論文に加え特許において公開されている。例えば、Hesselらの論文、(2005) J. Exp. Med., 202(ll):1563を参照のこと。一般に１０１８  ＩＳＳは、（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’）（配列番号：１）である。別の実施態様において、１種又は複数のＣｐＧモチーフ（複数）含有−ＩＳＳを使用することができる。例えば米国特許公開第2006/0058254号又はWO 2004/058179を参照のこと。別の実施態様において、１種又は複数のキメラ免疫調節化合物（「ＣＩＣ」）を使用することができる。例えば、米国特許公開第2004/0132677号を参照のこと。
【００２２】
本発明に従い、ＩＳＳは、少なくとも１個のＣＧジヌクレオチドを含む、長さが少なくとも８個の塩基のパリンドローム配列（すなわちパリンドローム）を少なくとも１個含む。ＩＳＳは、そのポリヌクレオチドの５’末端又はその近傍に少なくとも１個のＴＣＧトリヌクレオチド配列も含む（すなわち、５’−ＴＣＧ）。場合によっては、このパリンドローム配列及び５’−ＴＣＧは、ＩＳＳ内の０、１又は２個の塩基により隔てられている。場合によっては、このパリンドローム配列は、５’−ＴＣＧの全て又は一部を含む。
【００２３】
ＩＳＳは、当該技術分野において説明されており、かつそれらの活性は、例えばサイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖などの、免疫反応の様々な態様を示す標準アッセイを用い、容易に同定され得る。例えばWO 97/28259；WO 98/16247；WO 99/11275；Kriegら、(1995) Nature 374:546-549；Yamamotoら、(1992a)；Ballasら、(1996)；Klinmanら、(1997)；Satoら、(1996)；Pisetsky、(1996a)；Shimadaら、(1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816；Cowderyら、(1996) J. Immunol. 156:4570-4575；Romanら、(1997)；Lipfordら、(1997a)；WO 98/55495及びWO 00/61151を参照のこと。従ってこれら及び他の方法は、免疫調節ＩＳＳを同定、試験及び／又は確認するために使用することができる。
【００２４】
ＩＳＳは、長さが１０個の塩基又は塩基対より長い、好ましくは１５個の塩基又は塩基対よりも長い、より好ましくは２０個の塩基又は塩基対よりも長いものであることができる。本明細書に説明された式に関して、任意の及び全てのパラメータは独立して選択されることが理解される。例えば、ｘ＝０〜２である場合、ｙは、ｘの値（又は式中のいずれか他の選択可能なパラメータ）とは無関係に独立して選択されてよい。
【００２５】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、（ａ）少なくとも２個のＣＧジヌクレオチドを含む、少なくとも８塩基長のパリンドローム配列であり、ここでＣＧジヌクレオチドは、０、１、２、３、４又は５個の塩基により互いに隔てられているもの、並びに、（ｂ）ポリヌクレオチドの５’末端から塩基０、１、２又は３個に位置した（ＴＣＧ）y配列であり、ここでｙは１又は２であり、及び（ＴＣＧ）y配列の３’末端は、０、１又は２個の塩基によりパリンドローム配列の５’末端から隔てられているもの：を含む。一部の実施態様において、（ｂ）の（ＴＣＧ）y配列のＣＧジヌクレオチドは、（ａ）のパリンドローム配列の少なくとも２個のＣＧジヌクレオチドのひとつとみなしてよい。一部の実施態様において、本パリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドは、１、３又は４個の塩基により互いに隔てられている。本発明の一部のＩＳＳにおいて、本出願の本段又は別所において説明されたかどうかにかかわらず、本パリンドローム配列は、２／３未満のＧ及びＣの塩基組成を有する。一部の実施態様において、本パリンドローム配列は、１／３よりも大きいＡ及びＴの塩基組成を有する。
【００２６】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、（ａ）少なくとも２個のＣＧジヌクレオチドを含む、長さが少なくとも８個の塩基のパリンドローム配列であり、ここでＣＧジヌクレオチドは、０、１、２、３、４又は５個の塩基により互いに隔てられているもの、並びに、（ｂ）ポリヌクレオチドの５’末端から塩基０、１、２又は３個に位置した（ＴＣＧ）y配列であり、ここでｙは１又は２であり、このパリンドローム配列は、（ＴＣＧ）y配列の全て又は一部を含み、及び（ｂ）の（ＴＣＧ）y配列のＣＧジヌクレオチドは、（ａ）のパリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドのひとつとみなしてよいもの：を含む。好ましくは一部の実施態様において、本パリンドローム配列のＣＧジヌクレオチドは、１、３又は４個の塩基により互いに隔てられている。
【００２７】
従って一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：２）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）P）配列を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1ＣＧＸ1’（ＣＧ）P）配列の５’側Ｘ1である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））（配列番号：３）y配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1は、Ａ又はＴのいずれかである。
【００２８】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）z（配列番号：４）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：５）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：５）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’ＣＣＧ）P）（配列番号：５）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。ｗ＝−３であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から三番目（すなわち最後から三番目）、末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＸ31’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：５）配列の５’側Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3は各々、Ａ又はＴのいずれかである。一部の実施態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3の少なくとも２つは、Ａ又はＴのいずれかである。
【００２９】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：６）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、Ｘ3及びＸ3’、並びにＸ4及びＸ4’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、１０塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：８）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号：７）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：８）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。ｗ＝−３であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から三番目（すなわち最後から三番目）、末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＣＧＸ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：８）配列の５’側Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4の少なくとも３つは、Ａ又はＴのいずれかである。一部の実施態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、及びＸ4の少なくとも２つは、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３０】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：９）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）P）配列の第一の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1ＣＧＣＧＸ1’（ＣＧ）P）配列の５’側Ｘ1である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。
【００３１】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号：１０）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−２、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）P）配列の第一の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ）を含む。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、ＣＧであり、及び第一の（ＣＧＸ1Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）P）配列の５’側ＣＧである。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。
【００３２】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）z（配列番号：１１）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、１０塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１３）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’）（配列番号：１２）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１３）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ3Ｘ3’ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１３）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、ｐ＝１である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3は各々、Ａ又はＴのいずれかである。一部の実施態様において、ｐ＝０である場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3の少なくとも２つは、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３３】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：１４）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）z（配列番号：２８）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられる。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、Ｘ1及びＸ2は各々、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３４】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：１５）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、Ｘ3及びＸ3’、Ｘ4及びＸ4’、並びにＸ5及びＸ5’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、１２塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１７）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号：１６）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１７）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１７）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。ｗ＝−３であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から三番目（すなわち最後から三番目）、末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＣＧＸ5’Ｘ4’Ｘ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１７）配列の５’側Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、及びＸ5の少なくとも３つは、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３５】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：１８）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（ＸIＸ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１９）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１９）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2ＣＧＣＧＸ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：１９）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、Ｘ1及びＸ2は各々、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３６】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）z（配列番号：２０）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−３、−２、−１、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、Ｘ2及びＸ2’、並びにＸ3及びＸ3’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、１０塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：２２）配列の第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’）（配列番号：２１）を含む。ｗ＝−１であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の３’側塩基は、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）p）（配列番号：２２）配列の５’側Ｘ1である。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：２２）配列の５’側Ｘ1及びＸ2である。ｗ＝−３であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から三番目（すなわち最後から三番目）、末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、各々、第一の（Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＣＧＣＧＸ3’Ｘ2’Ｘ1’（ＣＧ）P）（配列番号：２２）配列の５’側Ｘ1、Ｘ2及びＸ3である。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、ｐ＝１の場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3は、各々、Ａ又はＴのいずれかである。一部の実施態様において、ｐ＝０の場合、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3の少なくとも２つは、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３７】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、式：５’−Ｎx（ＴＣＧ（Ｎq））yＮw（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）p）z（配列番号：２３）の配列を含んでよく、ここでＮはヌクレオシドであり、ｘ＝０〜３、ｙ＝１〜４、ｗ＝−２、０、１又は２、ｐ＝０又は１、ｑ＝０、１又は２、及びｚ＝１〜２０であり、ここでＸ1及びＸ1’、並びにＸ2及びＸ2’は、自己相補的であり、並びにここで（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の５’側Ｔは、該ポリヌクレオチドの５’末端から０〜３個の塩基である。ＩＳＳは、８塩基長又はそれよりも大きいパリンドローム配列を更に含み、ここでこのパリンドローム配列は、少なくとも１個の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）P）（配列番号：２４）配列の第一の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ）を含む。ｗ＝−２であるＩＳＳにおいて、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の末位から二番目（すなわち最後から二番目）及び最終（すなわち最後）の３’側塩基は、ＣＧであり、及び第一の（ＣＧＸ1Ｘ2Ｘ2’Ｘ1’ＣＧ（ＣＧ）P）（配列番号：２４）配列の５’側ＣＧである。一部の実施態様において、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列は、０、１又は２個の塩基により、このパリンドローム配列から隔てられている。別の実施態様において、本パリンドローム配列は、（ＴＣＧ（Ｎq））y（配列番号：３）配列の全て又は一部を含む。一部の実施態様において、Ｘ1及びＸ2は、各々、Ａ又はＴのいずれかである。
【００３８】
ｙ＝２又はそれよりも大きいような本明細書に説明された任意のモチーフを含むＩＳＳに関して、（ＴＣＧ（Ｎq））のｙ個反復の各々における（Ｎq）は、独立して選択される。例えば、ｙ＝２のＩＳＳにおいて、第一のＴＣＧ（Ｎq）は、Ｎ＝Ａ及びｑ＝１を有し、第二のＴＣＧ（Ｎq）は、ｑ＝０を有してよく、この場合ＩＳＳのこの部分は、．．．ＴＣＧＡＴＣＧ．．．である。一部の実施態様における本明細書に説明された任意のモチーフを含むＩＳＳの一部の実施態様において、ｘは好ましくは０又は１である。本明細書に説明された任意のモチーフを含むＩＳＳの一部の実施態様において、ｙは好ましくは１又は２である。本明細書に説明された任意のモチーフを含むＩＳＳの一部の実施態様において、ｗは好ましくは０である。本明細書に説明された任意のモチーフを含むＩＳＳの一部の実施態様において、ｚは好ましくは１、２、３、４、５、６、７又は８である。
【００３９】
前述のように、これらのＩＳＳは、少なくとも８塩基長のパリンドローム配列を少なくとも１個含む。一部の実施態様において、ＩＳＳは、少なくとも下記の長さ（塩基で）のパリンドローム配列を少なくとも１個含む：１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０。一部の実施態様において、本パリンドローム配列は、ＩＳＳにおいて少なくとも１回反復される。一部の実施態様において、本パリンドローム配列は、もしあれば、（ＴＣＧ（Ｎq））y配列の５’側の塩基も含む。
【００４０】
前述の教示に従い使用することができる具体的ＩＳＳの非限定的例は、米国特許公開第2006/0058254号、同じく米国特許公開第2004/0132677号に開示されている。
【００４１】
ＩＳＳへの修飾
ＩＳＳは、修飾を含んでよい。ＩＳＳの修飾は、当該技術分野において公知のいずれかを含むが、３’ＯＨ基又は５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾に限定されない。修飾された塩基（類）が、ワトソン−クリック塩基対を通じてその天然の相補体と同じ特異性を維持する（例えばＩＳＳのパリンドローム部分は依然自己相補的である）限りは、修飾された塩基は、ＩＳＳのパリンドローム配列に含まれてよい。
【００４２】
ＩＳＳは、天然の又は修飾された非天然の塩基を含んでよく、かつ修飾された糖、リン酸、及び／又は末端を含んでよい。例えばリン酸修飾は、ホスホジエステル連結に加え、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート（架橋又は非架橋）、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートを含むが、これらに限定されるものではなく、並びに任意の組み合わせで使用されてよい。他の非リン酸連結も使用することができる。一部の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格のみを含む。一部の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格のみを含む。一部の実施態様において、ＩＳＳは、ホスホジエステルとホスホロチオエート連結の組み合わせのような、リン酸骨格中のリン酸連結の組み合わせを含んでよい。
【００４３】
当該技術分野において公知の糖修飾、例えば２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ並びに本明細書において説明されたその他のものなども作製し、かつ任意のリン酸修飾と組み合わせることができる。塩基修飾の例は、電子求引性部分の、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６（例えば５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）並びにＩＳＳのウラシルのＣ−５及び／又はＣ−６（例えば５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシル）への追加を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、WO 99/62923を参照のこと。ＩＳＳのパリンドローム配列における塩基修飾の使用は、ワトソン−クリック塩基対に関与した塩基の自己相補能を妨害してはならない。しかしパリンドローム配列の外側の修飾された塩基は、この制限を伴わずに使用することができる。
【００４４】
加えて、骨格リン酸基修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びホスホロジチオエートのヌクレオチド間連結）は、ＩＳＳに免疫調節活性を付与し、かつそれらのインビボにおける安定性を増強し、それらを特に治療的適用において有用にすることができる。特に有用なリン酸基修飾は、ＩＳＳオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート型又はホスホロジチオエート型への転換である。それらの可能性のある免疫調節特性に加え、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートは、それらの未修飾のオリゴヌクレオチド対応物よりも、インビボにおける分解に対しより抵抗性であり、本発明のＩＳＳを、個体により利用可能とする。
【００４５】
ＩＳＳの合成及びスクリーニング
ＩＳＳは、酵素的方法、化学的方法、及び比較的大きいオリゴヌクレオチド配列の分解を含むが、これらに限定されるものではない、当該技術分野において周知の技術及び核酸合成装置を用いて合成することができる。例えば、Ausubelら(1987)及びSambrookら(1989)の論文を参照のこと。酵素的に集成する場合は、個々のユニットを、例えばＴ４ ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼなどのリガーゼにより、連結することができる。例えば米国特許第5,124,246号を参照のこと。オリゴヌクレオチド分解は、米国特許第4,650,675号に例示されているように、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼへの曝露により達成することができる。
【００４６】
ＩＳＳは、通常のポリヌクレオチド単離手順を用いて単離することもできる。このような手順は、共有されたヌクレオチド配列を検出するためのゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーのプローブハイブリダイゼーション、共有された構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、及び特定の未変性の配列のポリメラーゼ連鎖反応による合成を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
環状ＩＳＳは、単離し、組み換え法により合成するか、又は化学的に合成することができる。環状ＩＳＳが単離又は組み換え法により得られる場合、ＩＳＳは好ましくはプラスミドであろう。比較的小さい環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に説明された任意の方法を用いて行うことができる。例えばGaoら、(1995) Nucleic Acids Res. 23:2025-2029；及び、Wangら、(1994) Nucleic Acids Res. 22:2326-2333を参照のこと。
【００４８】
ほとんどのＩＳＳの二重鎖（すなわち二本鎖）型及びヘアピン型は、動的平衡にあり、ヘアピン型は一般に、低いポリヌクレオチド濃度及び高温において好ましい。共有的鎖間又は鎖内架橋は、各々、熱−、イオン−、ｐＨ−、及び濃度−が誘導した高次構造の変化に対し、二重鎖又はヘアピンの安定性を増大する。化学架橋は、ポリヌクレオチドを、物理化学的及び生物学的特徴決定のために、二重鎖又はヘアピン型のいずれかに固定するために使用することができる。高次構造的に均質でありかつそれらの最も活性型（二重鎖又はヘアピン型のいずれか）に固定された架橋したＩＳＳは、それらの未架橋の対応物よりもより活性がある可能性がある。従って本発明の一部のＩＳＳは、共有的鎖間及び／又は鎖内架橋を含む。
【００４９】
二重鎖ＤＮＡを化学的に架橋する様々な方法が、当該技術分野において公知である。架橋したポリヌクレオチド生成物が所望の免疫調節活性を有する限りは、任意の架橋法を使用することができる。
【００５０】
ひとつの方法は、二重鎖又はヘアピンの末端で、例えば、２個の反対の(opposing)チミジンの間に、ジスルフィド橋を生じる。この架橋法に関して、関心対象のオリゴヌクレオチド（類）は、５’−ＤＭＴ−Ｎ３−（ｔＢｕ−ＳＳ−エチル）チミジン−３’−ホスホロアミダイト（“Ｔ＊”）により合成される。ジスルフィド橋を形成するために、混合されたジスルフィド結合が還元され、オリゴヌクレオチドは精製され、これらの鎖はハイブリダイズされ、かつこれらの化合物は空気酸化され、ヘアピン型の場合は鎖内架橋を、又は二重鎖型の場合は鎖間架橋を形成する。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは最初にハイブリダイズされ、その後還元、精製及び空気酸化されてもよい。このような方法及び他の方法は、例えば、Glickら、(1991) J. Org. Chem. 56:6746-6747；Glickら、(1992) J. Am. Chem. Soc. 114:5447-5448；Goodwinら、(1994) Tetrahedron Letters 35:1647-1650；Wangら、(1995) J. Am. Chem. Soc. 117:2981-2991；Osborneら、(1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 6:2339-2342、及びOsborneら、(1996) J. Am. Chem. Soc. 118:11993-12003に説明されている。
【００５１】
別の架橋法は、二重鎖又はヘアピン構造内のオフセット(offset)残基間にジスルフィド橋を形成する。この架橋法に関して、関心対象のオリゴヌクレオチド(類)は、交換可能なヌクレオシド(例えばGlen Researchから市販されている)により合成される。この方法は、例えば、Ａ−Ａジスルフィド又はＣ−Ａジスルフィド橋を使用し、かつ他の塩基を介した連結も可能である。ジスルフィド−修飾されたポリヌクレオチドを形成するために、交換可能なヌクレオシドを含むポリヌクレオチドは、シスタミン（又は他のジスルフィド−含有アミン）と反応する。ジスルフィド橋を形成するために、混合されたジスルフィド結合は還元され、オリゴヌクレオチドが精製され、鎖がハイブリダイズされ、かつこれらの化合物は空気酸化され、ヘアピン型の場合は鎖内架橋を、又は二重鎖型の場合は鎖間架橋を形成する。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは最初にハイブリダイズされ、その後還元、精製及び空気酸化されてもよい。このような方法及び他の方法は、例えば、Glickら、(1991) J. Org. Chem. 56:6746-6747；Glickら、(1992) J. Am. Chem. Soc. 114:5447-5448；Goodwinら、(1994) Tetrahedron Letters 35:1647-1650；Wangら、(1995) J. Am. Chem. Soc. 117:2981-2991；Osborneら、(1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 6:2339-2342、及びOsborneら、(1996) J. Am. Chem. Soc. 118:11993-12003に説明されている。
【００５２】
別の架橋法は、二重鎖又はヘアピン構造内のオフセット残基間にジスルフィド橋を形成する。この架橋法に関して、関心対象のオリゴヌクレオチド（類）は、交換可能なヌクレオシド(例えばGlen Researchから市販されている)により合成される。この方法は、例えば、Ａ−Ａジスルフィド又はＣ−Ａジスルフィド橋を使用し、かつ他の塩基を介した連結も可能である。ジスルフィド−修飾されたポリヌクレオチドを形成するために、交換可能なヌクレオシドを含むポリヌクレオチドは、シスタミン（又は他のジスルフィド−含有アミン）と反応する。ジスルフィド橋を形成するために、混合されたジスルフィド結合は還元され、オリゴヌクレオチドが精製され、鎖がハイブリダイズされ、かつこれらの化合物は空気酸化され、ヘアピン型の場合は鎖内架橋を、又は二重鎖型の場合は鎖間架橋を形成する。あるいは、これらのオリゴヌクレオチドは最初にハイブリダイズされ、その後還元、精製及び空気酸化されてもよい。このような方法は、例えば、Ferentzら、(1991) J. Am. Chem. Soc. 113:4000-4002、及びFerentzら、(1993) J. Am. Chem. Soc. 115:9006-9014に説明されている。
【００５３】
ポリヌクレオチド及び修飾されたポリヌクレオチドを作製する技術は、当該技術分野において公知である。ホスホジエステル連結を含む天然のＤＮＡ又はＲＮＡは一般に、適切なヌクレオシドホスホロアミダイトの、３’−末端が固相支持体に結合した成長するオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基への連続結合、それに続く中間体亜リン酸トリエステルのリン酸トリエステルへの酸化により、合成される。一旦所望のポリヌクレオチド配列が合成されると、このポリヌクレオチドは、支持体から除去され、リン酸トリエステル基は、リン酸ジエステルへと脱保護され、かつヌクレオシド塩基は、水性アンモニア又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Beaucageの「Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties」(Agrawal編集)、Humana Press社, Totowa, NJ(1993)中の「Oligodeoxyribonucleotide Synthesis」；Warnerら、(1984) DNA 3:401、及び米国特許第4,458,066号を参照のこと。
【００５４】
本ＩＳＳは、リン酸−修飾したポリヌクレオチドも含むことができ、その一部はポリヌクレオチドを安定化することが知られている。従って一部の実施態様は、安定化されたＩＳＳを含む。修飾されたリン酸連結又は非リン酸連結を含むポリヌクレオチドの合成も、当該技術分野において公知である。総説に関しては、Matteucciの「Oligonucleotides as Therapeutic Agents」(1997) (DJ. Chadwick及びG. Cardew編集)John Wiley and Sons社, ニューヨーク, NY中の「Oligonucleotide Analogs: an Overview」を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド内の糖又は糖アナログ部分に結合することができるリン誘導体（又は修飾されたリン酸基）は、一リン酸エステル、二リン酸エステル、三リン酸エステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートなどであることができる。前記リン酸アナログの調製、及びそれらのヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへの組み込みそれ自身も公知であり、かつ本明細書において詳細に説明する必要はない。Peyrottesら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:1841-1848；Chaturvediら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:2318-2323；及び、Schultzら、(1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973を参照のこと。例えば、ホスホロチオエートリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程を硫化工程と交換すること以外は、天然のオリゴヌクレオチドについて先に説明されたものに類似している(Zon、「Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties」(Agrawal編集)、Humana Press社(1993)中の「Oligonucleotide Phosphorotihoates」, 165-190頁,)。同様に他のリン酸アナログの合成、例えばホスホトリエステル(Millerら、(1971) JACS 93:6657-6665)、非架橋ホスホロアミデート(Jagerら、(1988) Biochem. 27:7247-7246)、Ｎ３’からＰ５’ホスホロアミデート(Nelsonら、(1997) JOC 62:7278-7287)及びホスホロジチオエート(米国特許第5,453,496号)なども、説明されている。他の非-リンベースの修飾されたオリゴヌクレオチドも使用することができる(Stirchakら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:6129-6141)。ホスホロチオエート骨格を持つポリヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を持つものよりも、より免疫原性であることができ、かつ宿主への注入後の分解に対しより抵抗性であるように見える。Braunら、(1988) J. Immunol. 141:2084-2089；及び、Latimerら、(1995) Mol. Immunol. 32:1057-1064。
【００５５】
本発明において使用されるＩＳＳは、１個又は複数のリボヌクレオチド（唯一又は主たる糖成分としてリボースを含む）、デオキシリボヌクレオチド（主たる糖成分としてデオキシリボースを含む）を含むことができるか、又は当該技術分野において公知であるように、修飾された糖又は糖アナログをＩＳＳへ組み込むことができる。従って糖成分は、リボース及びデオキシリボースに加え、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「アナログ」シクロペンチル基であることができる。糖は、ピラノシル型又はフラノシル型であることができる。ＩＳＳにおいて、糖成分は好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース又は２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、並びに糖は、各複素環塩基へ、α又はβアノマー配置のいずれかで結合することができる。糖修飾は、２’−アルコキシ−ＲＮＡアナログ、２’−アミノ−ＲＮＡアナログ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、ＩＳＳの糖修飾は、２’−Ｏ−メチル−ウリジン及び２’−Ｏ−メチル−シチジンを含むが、これらに限定されるものではない。これらの糖又は糖アナログ及びそのような糖又はアナログが複素環塩基（核酸塩基）に結合されている各「ヌクレオシド」の調製は、それ自身公知であり、そのような調製がいずれかの具体例に関連する場合を除いて、ここで説明は不要である。糖修飾を行い、及びＩＳＳの調製におけるいずれかのリン酸修飾と組み合わせてもよい。
【００５６】
ＩＳＳに組み込まれる複素環塩基又は核酸塩基は、天然の主要なプリン及びピリミジン塩基（すなわち、前述のウラシル、チミン、シトシン、アデニン及びグアニン）に加え、該主要塩基の天然の及び合成の修飾であることができる。従ってＩＳＳは、２’−デオキシウリジン及び／又は２−アミノ−２’−デオキシアデノシンを含んでよい。
【００５７】
当業者は、様々な複素環塩基及び様々な糖成分（及び糖アナログ）を含む、多数の「合成」非天然のヌクレオシドを、当該技術分野において利用可能であること、及び本発明の他の基準を満足する限りは、ＩＳＳは、天然の核酸の主要な５種の塩基成分以外の１種又は複数の複素環塩基を含むことができることを理解するであろう。しかし好ましくは、ＩＳＳの複素環塩基は、ウラシル−５−イル基、シトシン−５−イル基、アデニン−７−イル基、アデニン−８−イル基、グアニン−７−イル基、グアニン−８−イル基、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル基、２−アミノ−４−オキソピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル基、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含むが、これらに限定されるものではなく、ここでプリンは、ＩＳＳの糖成分へは９−位で、ピリミジンは１−位で、ピロロピリミジンは７−位で、及びピラゾロピリミジンは１−位で結合される。
【００５８】
ＩＳＳは、少なくとも１個の修飾された塩基を含んでよい。本明細書において使用される用語「修飾された塩基」は、「塩基アナログ」と同義であり、例えば「修飾されたシトシン」は「シトシンアナログ」と同義である。同様に「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書においてヌクレオシド又はヌクレオチド「アナログ」と同義であると定義される。塩基修飾の例は、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引性部分の付加を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくはこの電子求引性部分は、ハロゲンである。このような修飾されたシトシンは、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシ尿素、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、ウラシル、及びいずれか他のピリミジンアナログ又は修飾されたピリミジンを含むが、これらに限定されるものではない。他の塩基修飾の例は、ＩＳＳのウラシルのＣ−５及び／又はＣ−６への電子求引性部分の付加を含むが、これらに限定されるものではない。好ましくはこの電子求引性部分は、ハロゲンである。このような修飾されたウラシルは、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、及び５−ヨードウラシルを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５９】
塩基修飾の他の例は、１個又は複数のチオール基の塩基への付加を含み、これは２−アミノ−アデニン、６−チオ−グアニン、２−チオ−チミン、４−チオ−チミン、５−プロピニル−ウラシル、及び４−チオ−ウラシルを含むが、これらに限定されるものではない。塩基修飾の他の例は、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン及び５−ヒドロキシシトシンを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、Kandimallaら、(2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813を参照のこと。
【００６０】
塩基−修飾されたヌクレオシドの調製、及び該塩基−修飾されたヌクレオシドを前駆体として使用する修飾されたオリゴヌクレオチドの合成は、米国特許第4,910,300号、第4,948,882号、及び第5,093,232号に開示されている。これらの塩基−修飾されたヌクレオシドは、それらをオリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかの位置へ化学合成により組み込むことができるようにデザインされている。オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかの位置に存在するこのような塩基−修飾されたヌクレオシドは、ペプチド又は他の抗原の結合部位として利用することができる。それらの糖成分が修飾されたヌクレオシドが説明されており(米国特許第4,849,513号；第5,015,733号；第5,118,800号；及び、第5,118,802号を含むが、これらに限定されるものではない）、かつ同様に使用することができる。
【００６１】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、ほぼ以下の長さのいずれかよりも短い（塩基又は塩基対で）：１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０。一部の実施態様において、ＩＳＳは、ほぼ以下の長さのいずれかよりも長い（塩基又は塩基対で）：１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００。あるいは、本ＩＳＳは、１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０の上限、及び１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００から独立して選択された下限を有し、ここで下限は上限未満であるようなサイズ範囲のいずれかであることができる。一部の実施態様において、ＩＳＳは、塩基長が約２００以下であることが好ましい。
【００６２】
あるいは、ＩＳＳは、核酸ハイブリダイゼーションのような、当該技術分野において周知の技術を用い、微生物種（特にミコバクテリア）から単離されてよい。好ましくはそのような単離されたＩＳＳは、実質的に純粋な状態、すなわちリポ多糖のような内在性夾雑物を含まないようになるまで精製されるであろう。比較的大きいポリヌクレオチドの一部として単離されたＩＳＳは、エンドヌクレアーゼ消化によるなどの周知の技術により、所望の長さまで切断することができる。当業者は、本発明において使用する可能性のあるＩＳＳを得るためにポリヌクレオチドを単離、精製、及び消化するのに適した技術を熟知しているか、又は容易に確認することができるであろう。
【００６３】
特定のオリゴヌクレオチドが、本発明において有用なＩＳＳ特性を有することの確認は、以下に説明されたようにＩＳＳがサイトカイン分泌に影響を及ぼすかどうかを評価することにより得ることができる。そのような評価を行う上で有用なインビトロ技術の詳細は、本実施例に示されており；当業者は、本明細書に記されたパラメータに沿ってサイトカイン分泌を測定する他の方法も知っているか、又は容易に確認することができるであろう。
【００６４】
ＩＳＳと共に投与されてよい抗原
任意の抗原を、ＩＳＳと同時投与するか、並びに／又はＩＳＳ及び抗原を含有する組成物（及びこれらの組成物の調製品）において使用してよい。
【００６５】
一部の実施態様において、本抗原はアレルゲンである。組み換えアレルゲンの例を、表１に提示している。多くのアレルゲンの調製品が、当該技術分野において周知であり、これはブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ(Amb a I)(Rafnarら、(1991) J. Biol. Chem. 266:1229-1236)、草アレルゲンLol p1(Tamboriniら、(1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894)、主要なイエダニアレルゲンDer pI及びDer PII(Chuaら、(1988) J. Exp. Med. 167:175-182；Chuaら、(1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129)、家猫アレルゲンFel dI(Rogers ら、(1993) Mol. Immunol. 30:559-568)、シラカバ花粉Bet vl(Breitenederら、(1989) EMBO J. 8:1935-1938)、日本スギアレルゲンCry j1及びCry j2(Kingetsuら、(2000) Immunology 99:625-629)、及び他の樹木花粉由来のタンパク質抗原(Elsayedら、(1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31)の調製品を含むが、これらに限定されるものではない。示されたように、カバ、ヒノキ及び日本スギを含む、樹木由来のアレルゲンが公知である。インビボ投与のための草花粉からのタンパク質抗原の調製品が、報告されている。
【００６６】
一部の実施態様において、アレルゲンは、食品アレルゲンであり、これはピーナッツアレルゲン、例えばAra hI(Stanleyら、(1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409:213-216)；クルミアレルゲン、例えばJug rI(Tueberら、(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101:807-814)；ブラジルナッツアレルゲン、例えばアルブミン(Pastorelloら、(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102:1021-1027)；shrISSアレルゲン、例えばPen aI(Reeseら、(1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113:240-242)；卵アレルゲン、例えばオボムコイド(Crookeら、(1997) J. Immunol. 159:2026-2032)；牛乳アレルゲン、例えばウシβ-ラクトグロビン(Selotら、(1999) Clin. Exp. Allergy 29:1055-1063)；魚アレルゲン、例えばパルブアルブミン(Van Doら、(1999) Scand. J. Immunol. 50:619-625；Gallandら、(1998) J. Chromatogr. B. Biomed. ScL Appl. 706:63-71)を含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様において、アレルゲンは、ラテックスアレルゲンであり、これはHev b 7(Sowkaら、(1998) Eur. J. Biochem. 255:213-219)を含むが、これに限定されるものではない。表１は、使用することができるアレルゲン例の一覧を示している。
【００６７】
【表１Ａ】
0006023142.tif 000002
【００６８】
【表１Ｂ】
0006023142.tif 000003
【００６９】
【表１Ｃ】
0006023142.tif 000004
【００７０】
【表１Ｄ】
0006023142.tif 000005
【００７１】
一部の実施態様において、本抗原は、原虫、細菌、真菌（単細胞及び多細胞を含む）、及びウイルス感染物質を含む感染物質に由来する。好適なウイルス抗原の例は、本明細書に説明されており、かつ当該技術分野において公知である。細菌は、インフルエンザ菌、結核菌及び百日咳菌を含む。原虫感染物質は、マラリア原虫、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及びシストソマ種を含む。真菌は、カンジダ・アルビカンスを含む。
【００７２】
一部の実施態様において、本抗原は、ウイルス抗原である。ウイルスポリペプチド抗原は、ＨＩＶタンパク質、例えばＨＩＶ ｇａｇタンパク質（膜アンカー（ＭＡ）タンパク質、コアキャプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオキャプシド（ＮＣ）タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオキャプシド（ＮＰ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅタンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原などを含むが、これらに限定されるものではない。インフルエンザワクチンを考察する参考文献は、Scherle及びGerhard、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4446-4450；Scherle及びGerhard、(1986) J. Exp. Med. 164:1114-1128；Granoffら、(1993) Vaccine 11:S46-51；Kodihalliら、(1997) J. Virol. 71:3391-3396；Ahmeidaら、(1993) Vaccine 11:1302-1309；Chenら、(1999) Vaccine 17:653-659；Govorkova及びSmirnov、(1997) Acta Virol. (1997) 41:251-257；Koideら、(1995) Vaccine 13:3-5；Mbawuikeら、(1994) Vaccine 12:1340-1348；Tamuraら、(1994) Vaccine 12:310-316；Tamuraら、(1992) Eur. J. Immunol. 22:477-481；Hirabayashiら、(1990) Vaccine 8:595-599がある。他の抗原ポリペプチドの例は、群-又は亜群特異的抗原であり、これはアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス及びポックスウイルスを含むが、これらに限定されるものではない、多くの感染物質について公知である。
【００７３】
当該技術分野において、多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が公知であり、かつ利用可能であり；他のものを、従来の技術を用い同定することができる。腫瘍形成に対する免疫処置又は存在する腫瘍の治療のための免疫調節ペプチドは、腫瘍細胞（生存又は放射線照射した）、腫瘍細胞抽出物、又は腫瘍抗原のタンパク質サブユニット、例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｍａｒｔ１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）、ムチン（ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びチロシナーゼなどを含むことができる。免疫ベースの避妊のためのワクチンは、ＩＳＳと共に投与される精子タンパク質を含むことにより作製することができる。Leaら、(1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263。
【００７４】
弱毒化され失活されたウイルスは、抗原としてここで使用するのに適している。これらのウイルスの調製品は、当該技術分野において周知であり、かつ多くが市販されている(例えば「医家向け医薬品便覧(PDR)」(1998)、第52版、Medical Economics Company, Inc.を参照のこと)。例えば、ポリオウイルスは、IPOL（登録商標）(Pasteur Merieux Connaught)及びORIMUNE（登録商標）(Lederle Laboratories)として、A型肝炎ウイルスはVAQTA（登録商標）(Merck)として、麻疹ウイルスはATTENUVAX（登録商標）(Merck)として、ムンプスウイルスはMUMPSVAX（登録商標）(Merck)として、及び風疹ウイルスはMERUVAX（登録商標）II(Merck)として入手可能である。加えて、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、単純ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及び非ヒトパピローマウイルス及び遅発性脳ウイルスなどの弱毒化され失活されたウイルスは、ペプチド抗原を提供することができる。一部の実施態様において、この抗原は、ワクシニア、アデノウイルス、及びカナリアポックスなどのウイルスベクターを含む。
【００７５】
抗原は、それらの給源から、当該技術分野において公知の精製技術を用い、単離されるか、もしくはより好都合なことに組み換え法を用いて作出されてよい。抗原性ペプチドは、精製された未変性のペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化又は失活されたウイルス、細胞、微生物、又はそのようなペプチドの断片を含むことができる。免疫調節ペプチドは、未変性であるか、又は化学合成もしくは酵素合成することができる。当該技術分野において公知の化学合成法のいずれかが適している。液相ペプチド合成を用い、中サイズのペプチドを構築するか、又はペプチドを化学構築するために、固相合成を使用することができる。Athertonら、(1981) Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362:833-839。タンパク質分解酵素も、アミノ酸を組み合わせ、ペプチドを作出するために利用することができる。Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc.。あるいは、ペプチドは、細胞の生化学的機構を使用することによるか、又は生物給源からの単離により、得ることができる。組み換えＤＮＡ技術をペプチドの生成に使用することができる。Hamesら、(1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press。ペプチドは、アフィニティクロマトグラフィーのような標準技術を用い単離することもできる。
【００７６】
好ましくは、抗原は、ペプチド、脂質（例えばコレステロールを除くステロール、脂肪酸及びリン脂質）、インフルエンザ菌ワクチンで使用されるもののような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、化学的及び酵素的方法を用いる単離及び合成を含む、当該技術分野において公知のいくつかの方法により得ることができる。場合によっては、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質などについて、分子の抗原性部分が市販されている。
【００７７】
本組成物及びこの組成物を使用する方法において有用なウイルス抗原の例は、ＨＩＶ抗原を含むが、これらに限定されるものではない。このような抗原は、非限定的にｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１を含むＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含むが、これらに限定されるものではない。ＨＩＶ遺伝子及び抗原の多くの配列が公知である。例えば、Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Databaseは、ＨＩＶのヌクレオチド及びアミノ酸の配列を収集し、監督し及び注釈している。このデータベースは、インターネットでアクセス可能であり、毎年刊行されており、Human Retroviruses and AIDS Compendiumを参照のこと(例えば2000年版)。
【００７８】
感染物質由来の抗原は、例えば、未変性のウイルス又は細菌抽出物から、感染物質に感染した細胞から、精製されたポリペプチドから、組み換えにより作出されたポリペプチドから及び／又は合成ペプチドとして、当該技術分野において公知の方法を用い、得ることができる。
【００７９】
ＩＳＳ−抗原
ＩＳＳは、抗原と共に使用される場合、多くの方法で抗原と共に投与されてよい。一部の実施態様において、ＩＳＳ及び抗原は、互いに空間的に近接して、又は混合物として（すなわち溶液中）、投与されてよい。以下に説明するように、空間的近接は、コンジュゲート（連結）、封入、プラットホームへの固定(affixation)又は表面への吸着を含む、多くの方法で実現され得る。一般にかつ最も好ましくは、ＩＳＳ及び抗原は、ＩＳＳ及び抗原の混合物としての投与と比べ、生じる免疫反応を増強するのに有効な距離で、近接して会合されている。
【００８０】
一部の実施態様において、ＩＳＳは、抗原とコンジュゲートされている。ＩＳＳ部分は、共有的及び／又は非共有的相互作用を含む、様々な方法で、コンジュゲートの抗原部分と結合することができる。
【００８１】
これらの部分間の連結は、ＩＳＳの３’又は５’末端で、又はＩＳＳの内部位置の好適に修飾された塩基で、作製することができる。抗原がペプチドでありかつ好適な反応基（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含む場合、これはシトシン残基のＮ4アミノ基と直接反応することができる。ＩＳＳのシトシン残基の数及び位置に応じ、１個又は複数の残基での特異的結合を実現することができる。
【００８２】
あるいは、当該技術分野において公知であるように、修飾されたオリゴヌクレオシドを、ＩＳＳのいずれかの末端、又は内部位置に組み込むことができる。これらは、ブロックされた官能基を含むことができ、これはブロックされた場合、関心対象の抗原上に存在するか又は付着することができる様々な官能基と反応性である。
【００８３】
抗原がペプチド又はポリペプチドである場合、コンジュゲートのこの部分は、固形支持体化学によりＩＳＳの３’−末端に結合することができる。例えばＩＳＳ部分は、支持体上で予め合成されたポリペプチド部分へ追加することができる。Haralambidisら、(1990a) Nucleic Acids Res. 18:493-499；及び、Haralambidisら、(1990b) Nucleic Acids Res. 18:501-505。あるいはＩＳＳは、３’−末端から伸びる切断可能なリンカーを介して固形支持体に結合されるように、合成することができる。ＩＳＳの支持体からの化学切断時に、末端チオール基はそのオリゴヌクレオチドの３’−末端に残留する(Zuckermannら、(1987) Nucleic Acids Res. 15:5305-5321；及び、Coreyら、(1987) Science 238:1401-1403)か、又は末端アミノ基がオリゴヌクレオチドの３’−末端に残留する(Nelsonら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:1781-1794)。アミノ−修飾されたＩＳＳのペプチドのアミノ基へのコンジュゲートは、Benoitらの論文((1987) Neuromethods 6:43-72)に説明されたように行うことができる。チオール−修飾されたＩＳＳのペプチドのカルボキシル基へのコンジュゲートは、Sinahらの論文((1991) Oligonucleotide Analogues: A Practical Approach, IRL Press)に説明されたように行うことができる。付属したマレイミドを保持するオリゴヌクレオチドの、ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖への結合も説明されている。Tungら、(1991) Bioconjug. Chem. 2:464-465。
【００８４】
本コンジュゲートのペプチド又はポリペプチド部分は、オリゴヌクレオチドの合成時にオリゴヌクレオチドへ組み込まれたアミン、チオール、又はカルボキシル基を介して、ＩＳＳの５’−末端へ結合することができる。好ましくはオリゴヌクレオチドが固相支持体へ固定される間に、一端に保護されたアミン、チオール、又はカルボキシル、及び他端にホスホラミダイトを含む連結基が、５’−ヒドロキシルへ共有結合される。脱保護に続き、アミン、チオール及びカルボキシル官能性を用い、このオリゴヌクレオチドをペプチドへ共有結合することができる。Benoitら、(1987)；及び、Sinahら、(1991)。
【００８５】
ＩＳＳ−抗原コンジュゲートは、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び／又はファンデルワールス引力のような、非共有的相互作用によっても形成することができる。
【００８６】
非共有的に連結されたコンジュゲートは、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような、非共有相互作用を含むことができる。ビオチニル基は、例えばＩＳＳの修飾された塩基に結合することができる。Rogetら、(1989) Nucleic Acids Res. 17:7643-7651。ストレプトアビジン部分のペプチド部分への組み込みは、ストレプトアビジンコンジュゲートされたペプチドとビオチン化されたオリゴヌクレオチドの非共有的に結合した複合体の形成を可能にする。
【００８７】
非共有的会合は、ＩＳＳ及び荷電アミノ酸などの抗原内の残基が関与しているイオン相互作用によるか、又はオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用し得る荷電残基を含むリンカー部分の使用によっても生じることができる。例えば非共有的コンジュゲートは、一般に負帯電したＩＳＳと、正帯電したペプチドのアミノ酸残基、例えばポリリシン、ポリアルギニン及びポリヒスチジン残基の間で起こり得る。
【００８８】
ＩＳＳと抗原の間の非共有的コンジュゲートは、それらの天然のリガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して起こり得る。例えば、そのようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子及び抗−ＤＮＡ抗体において認めることができる。
【００８９】
ＩＳＳの脂質への連結は、標準法を用いて行うことができる。これらの方法は、オリゴヌクレオチド−リン脂質コンジュゲートの合成(Yanagawaら、(1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19:189-192)、オリゴヌクレオチド−脂肪酸コンジュゲートの合成(Grabarekら、(1990) Anal. Biochem. 185:131-135；及び、Starosら、(1986) Anal. Biochem. 156:220-222)、及びオリゴヌクレオチド−ステロールコンジュゲートの合成(Boujradら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728-5731)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
オリゴヌクレオチドのオリゴ糖への連結は、標準の公知の方法を用いて形成することができる。これらの方法は、オリゴ糖が免疫グロブリンの一部であるオリゴヌクレオチド−オリゴ糖コンジュゲートの合成を含むが、これらに限定されるものではない。O’Shannessyら、(1985) J. Applied Biochem. 7:347-355。
【００９１】
環状ＩＳＳのペプチド又は抗原への連結は、いくつかの方法で形成することができる。環状ＩＳＳが組み換え法又は化学法を用いて合成される場合、修飾されたヌクレオシドが適している。Ruth、(1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press。その後標準の連結技術を用い、環状ＩＳＳを、抗原又は他のペプチドへ結合することができる。Goodchild、(1990) Bioconjug. Chem. 1:165。環状ISSが組み換え法又は化学法を用いて単離又は合成される場合、この連結は、化学的活性化、又は光活性化、抗原又は他のペプチドへ組み込まれた反応基（例えばカルベン、ラジカル）により形成することができる。
【００９２】
ペプチド及び他の分子をオリゴヌクレオチドに結合する追加の方法は、米国特許第5,391,723号；Kessler、(1992) 「Nonradioactive labeling methods for nucleic acids」、Kricka(編集) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press；及び、Geogheganら、(1992) Bioconjug. Chem. 3:138-146に説明されている。
【００９３】
ＩＳＳは、別の方法で抗原（類）に近接して会合されてもよい。一部の実施態様において、ＩＳＳ及び抗原は、封入により近接して会合される。別の実施態様において、ＩＳＳ及び抗原は、プラットホーム分子へ連結することにより近接して会合される。「プラットホーム分子」（「プラットホーム」とも称される）とは、ＩＳＳ及び抗原（類）の結合を可能にする部位を含む分子である。別の実施態様において、ＩＳＳ及び抗原は、表面、好ましくはキャリア粒子への吸着により、近接して会合される。
【００９４】
一部の実施態様において、本発明の方法は、その複合体が標的に利用可能となるまで、ＩＳＳ及び第一の抗原の近接会合を維持することができる封入物質（又はそのような封入剤を含有する組成物）を利用する。好ましくはＩＳＳ、抗原及び封入剤を含有する組成物は、アジュバント水中油型エマルション、微粒子及び／又はリポソームの形である。より好ましくはＩＳＳ−免疫調節分子を封入しているアジュバント水中油型エマルション、微粒子及び／又はリポソームは、約０．０４μｍ〜約１００μｍのサイズの粒子形であり、好ましくは以下の範囲のいずれかである：約０．１μｍ〜約２０μｍ；約０．１５μｍ〜約１０μｍ；約０．０５μｍ〜約１．００μｍ；約０．０５μｍ〜約０．５μｍ。
【００９５】
ミクロスフェアのようなコロイド分散系、ビーズ、巨大分子複合体、ナノカプセル並びに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームのような脂質−ベースのシステムは、ＩＳＳ−含有組成物の効果的封入を提供することができる。
【００９６】
本封入組成物は更に、多種多様な成分のいずれかを含有する。これらは、明礬、脂質、リン脂質、脂質膜構造（ＬＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び他のポリマー、例えばポリペプチド、糖ペプチド、及び多糖などを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
封入成分に好適なポリペプチドは、当該技術分野において公知のいずれかを含み、脂肪酸結合タンパク質を含むが、これに限定されるものではない。修飾されたポリペプチドは、非限定的にグリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化及びヒドロキシル化を含む、様々な修飾のいずれかを含む。本明細書において使用される好適なポリペプチドは、ＩＳＳ−含有組成物の免疫調節活性を保存するように、ＩＳＳ−含有組成物を保護するものである。結合タンパク質の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び大豆アルブミンなどのアルブミンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
他の好適なポリマーは、医薬分野において公知のものであり、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、及び多糖などの天然のポリマー、並びに合成ポリマーを含むが、これらに限定されるものではない。天然のポリマーの例は、タンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン及び脂質である。追加のポリマーは、合成ポリマーであることができる。本発明における使用に適した合成ポリマーの例は、ポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、例えばポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタン及びポリホスファゼンを含むが、これらに限定されるものではない。合成ポリマーは更に、直鎖又は分枝鎖の、置換又は非置換の、ホモポリマー、２種以上の異なる合成モノマーのコポリマー、又はブロックコポリマーであることもできる。
【００９９】
本発明の封入組成物において使用するためのＰＥＧは、化学物質供給業者から購入するか、又は当業者に公知の技術を用い合成するかのいずれかである。
【０１００】
本明細書において使用される用語「ＬＭＳ」は、極性脂質の極性ヘッド基が境界面の水相に面するように並び、膜構造を形成している、層状脂質粒子を意味する。ＬＭＳの例は、リポソーム、ミセル、渦巻状（すなわち一般に円柱状リポソーム）、マイクロエマルジョン、単層ベシクル、多重層ベシクルなどである。
【０１０１】
好ましい本発明のコロイド状分散系はリポソームである。リポソーム−封入された抗原で免疫処置したマウスにおいて、リポソームは、抗原に対するＴｈ１−型免疫反応を増強するように見える。Aramakiら、(1995) Vaccine 13:1809-1814。本明細書において使用される「リポソーム」又は「脂質ベシクル」は、少なくとも１つ及び可能ならば１つよりも多い二層脂質膜により結合された小型ベシクルである。リポソームは、非限定的に音波処理、押出、又は脂質−界面活性剤複合体からの界面活性剤の除去をを含む、当該技術分野において公知の技術のいずれかにより、リン脂質、糖脂質、脂質、コレステロールなどのステロイド、関連分子、又はそれらの組み合わせから人工的に作製される。リポソームは任意に、組織標的化成分などの追加成分も含むことができる。「脂質膜」又は「脂質二層」は、専ら脂質からなる必要はないが、膜の全体構造が、疎水性コアをはさむ２個の親水性表面のシートであることを条件として、非限定的にコレステロール及び他のステロイド、脂溶性化学物質、任意の長さのタンパク質、及び他の両媒性分子を含む、いずれか好適な他の成分を追加的に含むことができることは理解される。膜構造に関する全般的考察については、「The Encyclopedia of Molecular Biology」J. Kendrew (1994)を参照のこと。好適な脂質に関しては、例えばLasic、(1993)「Liposomes: from Physics to Applications」 Elsevier, アムステルダムを参照のこと。
【０１０２】
ＩＳＳ−含有組成物を含むリポソームの調製プロセスは、当該技術分野において公知である。脂質ベシクルは、当該技術分野において公知の好適な技術のいずれかにより調製することができる。方法は、マイクロ封入、マイクロフルイダイゼーション、ＬＬＣ法、エタノール注入、フレオン注入、「バブル」法、界面活性剤透析、水和、音波処理、及び逆相蒸発を含むが、これらに限定されるものではない。Watweらの論文((1995) Curr. Sci. 68:715-724)において検証されている。最も望ましい特性を伴うベシクルを提供するために、技術を組み合わせてもよい。
【０１０３】
本発明は、組織又は細胞標的化成分を含むＬＭＳの使用を包含している。このような標的化成分とは、完全な(intact)動物、臓器又は細胞培養物へ投与される場合、ある組織又は細胞部位で、他の組織又は細胞部位よりも優先して、それが蓄積することを増強するLMSの成分である。標的化成分は一般に、リポソームの外側からアクセス可能であり、従って好ましくは外側表面に結合されているか、もしくは脂質二層の外側に挿入されているかのいずれかである。標的化成分はとりわけ、前述の任意の分子に結合した、ペプチド、巨大なペプチドの領域、細胞表面分子もしくはマーカーに特異的な抗体、又はそれらの抗原結合断片、核酸、糖質、複合糖質の領域、特別な脂質、又は小型分子、例えば薬物、ホルモンもしくはハプテンなどであることができる。細胞型−特異的細胞表面マーカーに特異性を有する抗体は、当該技術分野において公知であり、かつ当該技術分野において公知の方法により容易に調製される。
【０１０４】
ＬＭＳは、治療的処置が方向付けられる任意の細胞型、例えば免疫反応を変調するか及び／又はこれに参画することができる細胞型を標的化することができる。このような標的細胞及び臓器は、ＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹状細胞及びリンパ球、リンパ系構造、例えばリンパ節及び脾臓、並びに非リンパ系構造、特に樹状細胞が認められるものを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
本発明のＬＭＳ組成物は、追加的に界面活性剤を含有することができる。界面活性剤は、陽イオン性、陰イオン性、両性イオン性、又は非イオン性であることができる。使用することができる界面活性剤のひとつの種類は、非イオン性界面活性剤であり；特に好ましいのは、水溶性のものである。
【０１０６】
ＩＳＳ及び抗原が、プラットホーム分子への連結により近接して会合されているような実施態様において、プラットホームは、タンパク質性又は非タンパク質性（すなわち有機物）であってよい。タンパク質性プラットホームの例は、アルブミン、γグロブリン、免疫グロブリン（ＩｇＧ）及びオボアルブミンを含むが、これらに限定されるものではない。Borelら、(1990) Immunol. Methods 126:159-168；Dumasら、(1995) Arch. Dematol. Res. 287:123-128；Borelら、(1995) Int. Arch. Allelgy Immunol. 107:264-267；Borelら、(1996) Ann. N.Y. Acad. Sci. 778:80-87。プラットホームは、ＩＳＳ及び抗原の両方への結合に対応するために、多価である（すなわち、１個よりも多い結合部位又は連結部位を含む）。従ってプラットホームは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上の結合部位又は連結部位を含んでよい。高分子プラットホームの別の例は、デキストラン、ポリアクリルアミド、フィコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、及びポリＤ−グルタミン酸／Ｄ−リシンである。
【０１０７】
プラットホーム分子使用の原理は、当該技術分野において周知である。一般にプラットホームは、ＩＳＳ及び抗原の好適な結合部位を含むか、又は含むように誘導される。加えて又は代わりに、ＩＳＳ及び／又は抗原は、適切な連結基を提供するように誘導される。例えば単純なプラットホームは、ペプチドのような二官能性リンカー（すなわち２個の結合部位を有する）である。更なる例は以下に考察する。
【０１０８】
プラットホーム分子は、生物学的に安定化されてよく、すなわちこれらは治療的有効性をもたらすために、数時間から数日から数ヶ月のインビボ排泄半減期を示し、並びに定義された組成物の合成短鎖で構成されることが好ましい。これらは一般に、分子量約２００〜約１，０００，０００の範囲、好ましくは以下の範囲のいずれかを有する：約２００〜約５００，０００；約２００〜約２００，０００；約２００〜約５０，０００（又は未満、例えば３０，０００）。結合価のある(valency)プラットホーム分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；好ましくは分子量約２００〜約８０００を有する）、ポリ−Ｄ−リシン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−リシン（３：２の比）などのポリマーである（又はポリマーで構成される）。使用することができる他の分子は、アルブミン及びＩｇＧである。
【０１０９】
本発明における使用に適した他のプラットホーム分子は、米国特許第5,552,391号に開示された、化学的に規定された、非高分子の結合価のあるプラットホーム分子である。本発明における使用に適した他の均質な化学的に規定された結合価のあるプラットホーム分子は、誘導された２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤＡ）及びメチレングリコール（ＴＥＧ）である。
【０１１０】
追加の好適な結合価のあるプラットホーム分子は、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノβシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリスリトール、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン(Cyclam)及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン(Cyclen)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
一般にこれらのプラットホームは、標準の化学合成技術により作製される。ＰＥＧは、誘導されかつ多価とされなければならず、このことは標準技術を用いて実現される。コンジュゲート合成に適しているいくつかの物質、例えばＰＥＧ、アルブミン、及びＩｇＧは、市販されている。
【０１１２】
ＩＳＳ及び抗原のプラットホーム分子へのコンジュゲートは、多くの方法で実行することができ、典型的には１個又は複数の架橋剤並びに抗原及びＩＳＳプラットホーム及びプラットホーム分子上の官能基が関与している。プラットホーム及びＩＳＳ及び抗原は、適切な連結基を有さなければならない。連結基は、標準合成化学技術を用いて、プラットホームへ追加される。連結基は、標準固相合成技術又は組み換え技術のいずれかを用いて、ポリペプチド抗原及びＩＳＳへ添加されてよい。組み換えアプローチは、リンカーを結合するためには翻訳後修飾が必要であり、そのような方法は当該技術分野において公知である。
【０１１３】
例として、ポリペプチドは、ポリペプチドのプラットホームへの結合部位として働くアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基などの官能基を含む、アミノ酸側鎖部分を含む。ポリペプチドが既にこれらの基を含まない場合は、そのような官能基を有する残基をポリペプチドへ付加してよい。このような残基は、固相合成技術又は組み換え技術により組み込むことができ、これらは両方ともペプチド合成技術分野において周知である。ポリペプチドが、炭水化物側鎖（類）を有する場合（又は抗原が炭水化物である場合）、官能性アミノ、スルフヒドリル及び／又はアルデヒド基を、従来の化学によりそこに組み込んでよい。例えば第１級アミノ基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での酸化された糖のエチレンジアミンとの反応により組み込むことができ、スルフヒドリルは、システアミンジヒドロクロリドの反応、それに続く標準ジスルフィド還元剤による還元により導入することができ、アルデヒド基は、過ヨウ素酸酸化後に生成することができる。同様の様式で、プラットホーム分子が、既に適切な官能基を有さない場合は、これが官能基を含むように誘導することもできる。
【０１１４】
様々な長さの親水性リンカーが、ＩＳＳ及び抗原のプラットホーム分子への接続に有用である。好適なリンカーは、エチレングリコール直鎖オリゴマー又はポリマーを含む。このようなリンカーは、式Ｒ1Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ2Ｒ2を有するリンカー（式中、ｎ＝０〜２００、ｍ＝１又は２、Ｒ1＝Ｈ又はトリチルなどの保護基、Ｒ2＝Ｈ又はアルキル又はアリール）、例えば４−ニトロフェニルエステルを含む。これらのリンカーは、チオエーテルを介し、ハロアセチル(haloaceyl)、マレイミドなどのようなチオール反応基を含む分子の、アミド結合によるアミノ基を含む第二の分子への接続に有用である。これらのリンカーは、付着順序に関して柔軟であり、すなわちこのチオエーテルは最初又は最後に形成させることができる。
【０１１５】
ＩＳＳ及び抗原が表面上の吸着により近接して会合されている実施態様において、この表面は、無機コア又は有機コアのいずれかにより作製された担体粒子（例えばナノ粒子）の形であってよい。このようなナノ粒子の例は、ナノ結晶粒子、アルキルシアノアクリレートの重合により作製されたナノ粒子、及びマロン酸メチリデンの重合により作製されたナノ粒子を含むが、これらに限定されるものではない。ＩＳＳ及び抗原が吸着することができる追加の表面は、活性炭素粒子及びタンパク質−セラミックナノ粒子を含むが、これらに限定されるものではない。担体粒子の他の例が、本明細書に提示されている。
【０１１６】
吸着された分子を細胞へ送達する目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドの表面への吸着は、当該技術分野において周知である。例えば、Douglasら、(1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3:233-261；Hagiwaraら、(1987) In Vivo 1:241-252；Bousquetら、(1999) Pharm. Res. 16:141-147；及び、Kossovskyら、米国特許第5,460,831号を参照のこと。この吸着媒表面を含む物質は生分解性であることが好ましい。ＩＳＳ及び／又は抗原の表面への吸着は、イオン性及び／又は疎水性相互作用を含む、非共有的相互作用により生じてよい。
【０１１７】
一般に、ナノ粒子などの担体の特徴、例えば表面電荷、粒子サイズ及び分子量などは、重合条件、モノマー濃度及び重合過程での安定化剤の存在によって決まる(Douglasら、1987)。ＩＳＳ及び／又は抗原の吸着を可能に又は増強するために、担体粒子の表面は、例えば表面コーティングにより修飾されてよい。吸着されたＩＳＳ及び／又は抗原を伴う担体粒子は更に、他の物質でコーティングされてよい。このような他の物質の添加は、本明細書に説明されたように、例えば一旦被験者へ投与された粒子の半減期を延長するか、及び／又は粒子を特定の細胞型又は組織へ標的化することができる。
【０１１８】
ＩＳＳ及び抗原が吸着され得るナノ結晶表面が説明されている（例えば米国特許第5,460,831号を参照）。ナノ結晶コア粒子（直径１μｍ以下）は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び／又は他の医薬品の吸着を促進する表面エネルギー修飾層により、コーティングされている。米国特許第5,460,831号に開示されたように、例えばコア粒子は、オリゴヌクレオチドの吸着を促進する表面でコーティングされ、引き続き、例えば脂質−抗原混合物の形の、抗原調製品でコーティングされている。このようなナノ粒子は、ＩＳＳ内層及び抗原外層を保持する、ナノメーターサイズの、典型的には０．１μｍの桁の粒子の自己集成型複合体である。
【０１１９】
別の吸着性表面は、アルキルシアノアクリレートの重合により作製されたナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン重合プロセスにより、酸性化された水性媒体中で重合することができる。重合条件によって、この小型粒子は、２０〜３０００ｎｍの範囲のサイズを有する傾向があり、特定の表面特性及び特定の表面電荷を伴うナノ粒子を作製することが可能である(Douglasら、1987)。例えばオリゴヌクレオチドは、テトラフェニルホスホニウムクロリドなどの疎水性陽イオン又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドなどの第４級アンモニウム塩の存在下で、ポリイソブチル−及びポリイソヘキシルシアノアクリレートナノ粒子へ吸着されてよい。これらのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの吸着は、核酸鎖の負帯電したリン酸基と疎水性陽イオンの間のイオン対形成により媒介されるように見える。例えば、Lambertら、(1998) Biochimie 80:969-976；Chavanyら、(1994) Pharm. Res. 11:1370-1378；Chavanyら、(1992) Pharm. Res. 9:441-449を参照のこと。ポリペプチドは、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子に吸着されてもよい。例えば、Douglasら、1987；Schroederら、(1998) Peptides 19:777-780を参照のこと。
【０１２０】
別の吸着性表面は、マロン酸メチリデンの重合により作製されたナノ粒子である。例えば、Bousquetらの論文(1999)に説明されているような、ポリ（マロン酸メチリデン２．１．２）ナノ粒子に吸着されたポリペプチドは、最初に静電力により吸着され、引き続き疎水力により安定化されるように見える。
【０１２１】
ＩＳＳ／ＭＣ複合体
ＩＳＳは、ＩＳＳ／マイクロキャリア（ＩＳＳ／ＭＣ）複合体の形で投与されてよい。従って本発明は、ＩＳＳ／ＭＣ複合体を含有する組成物を提供する。
【０１２２】
本発明に有用なマイクロキャリアは、サイズが約１５０、１２０又は１００μｍ未満であり、より一般的にはサイズが約５０〜６０μｍ未満、好ましくはサイズが約１０μｍ未満であり、及び純水に不溶性である。本発明において使用されるマイクロキャリアは、生分解性が好ましいが、非生分解性マイクロキャリアも適用可能である。マイクロキャリアは、「ビーズ」又は他の粒子のように通常固相であるが、生分解性ポリマー又は油状物を含む水中油型エマルションのような液相マイクロキャリアも企図される。マイクロキャリアとしての使用に適用可能な多種多様な生分解性及び非生分解性材料が、当該技術分野において公知である。
【０１２３】
本発明の組成物又は方法において使用するためのマイクロキャリアは一般に、サイズが約１０μｍ未満（例えば、約１０μｍ未満の平均直径を有するか、又は粒子の少なくとも約９７％が１０μｍの篩のフィルターを通過する）であり、かつナノキャリア（すなわちサイズが約１μｍ未満のキャリア）を含む。好ましくは、上限が約９、７、５、２、もしくは１μｍ又は９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、もしくは１００ｎｍ、かつ下限が約４、２、もしくは１μｍ、又は約８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５、もしくは１０ｎｍから独立して選択され、ここで下限は上限未満であるサイズを有するマイクロキャリアが選択される。一部の実施態様において、本マイクロキャリアは、サイズ約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍ、又は約０．９〜１．６μｍを有する。ある好ましい実施態様において、マイクロキャリアは、サイズ約１０ｎｍ〜約５μｍ、又は約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ又は約４．５μｍを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい実施態様は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ又は約２００ｎｍのナノキャリアを含む。
【０１２４】
固相生分解性マイクロキャリアは、以下を含むが、これらに限定されるものではない、生分解性ポリマーから製造することができる：生分解性ポリエステル、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、及びそれらのコポリマー（ブロックコポリマーを含む）、加えてポリ（乳酸）及びポリ（エチレングリコール）のブロックコポリマー；ポリオルトエステル、例えば３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカンベースのポリマー(DETOSU)；ポリアンヒドリド、例えばセバシン酸などの比較的親水性のモノマーをベースにしたポリ（アンヒドリド）ポリマー；ポリイミド無水物、例えばグリシン又はアラニンなどのアミノ酸を組み込んでいるセバシン酸−由来のモノマー（すなわちアミノ−末端窒素を介したイミド結合によりセバシン酸に連結した）をベースにしたポリ無水物ポリマー；ポリエステル無水物；ポリホスファゼン、特にカルボン酸基の発生を通じてポリマー骨格の分解を触媒することができる加水分解−感受性エステル基を含むポリ（ホスファゼン）(Schachtら、(1996) Biotechnol. Bioeng. 1996:102)；並びに、ポリアミド、例えばポリ（乳酸−コ−リシン）。
【０１２５】
マイクロキャリアを製造するのに適した多種多様な非生分解性材料も公知であり、これはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、ラテックス、金、及び強磁性体又は常磁性体材料を含むが、これらに限定されるものではない。ある実施態様は、金、ラテックス、及び／又は磁気ビーズを除外する。ある実施態様において、マイクロキャリアは、第二の材料（例えばポリスチレン）により封入された第一の材料（例えば磁気材料）で製造される。
【０１２６】
固相ミクロスフェアは、当該技術分野において公知の技術を用いて調製される。例えばこれらは、エマルション−溶媒抽出／蒸発技術により調製することができる。一般にこの技術において、ポリ無水物(polyanhydrate)、ポリ（アルキル−α−シアノアクリレート）及びポリ（α−ヒドロキシエステル）、例えばポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）及びポリ（カプロラクトン）などの生分解性ポリマーが、塩化メチレンなどの好適な有機溶媒に溶解され、エマルション分散相（ＤＰ）を構成する。ＤＰは、高速ホモジナイゼーションにより、溶解した界面活性剤、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有する過剰量の水性連続相（ＣＰ）へ、乳化される。ＣＰ中の界面活性剤は、個別のかつ適切なサイズのエマルション液滴の形成を確実にする。その後有機溶媒が、ＣＰへ抽出され、引き続きシステムの温度を上昇することにより、蒸発される。その後固形微粒子が、遠心分離又は濾過により分離され、例えば凍結乾燥又は真空適用により、乾燥され、その後４℃で貯蔵される。
【０１２７】
乾燥ミクロスフェアの平均サイズ、サイズ分布及び表面電荷などの物理化学的特徴を決定することができる。サイズ特徴は、例えば動的光散乱技術により決定され、及び表面電荷は、ζ電位測定により決定された。
【０１２８】
液相マイクロキャリアは、リポソーム、ミセル、油滴、及び生分解性ポリマー又は油分を取り込んでいる他の脂質又は油ベースの粒子を含む。ある実施態様において、生分解性ポリマーは界面活性剤である。別の実施態様において、液相マイクロキャリアは、スクアレン又は植物油などの生分解性油分を内包しているので、生分解性である。ひとつの好ましい液相マイクロキャリアは、水中油型エマルション内の油滴である。好ましくは、マイクロキャリアとして使用される水中油型エマルションは、スクアレンのような生分解性置換基を含む。
【０１２９】
ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、マイクロキャリアの表面に結合したＩＳＳ（すなわち、ＩＳＳはＭＣ内に封入されていない）を含み、並びに好ましくは各マイクロキャリアに結合した複数のＩＳＳ分子を含む。ある実施態様において、様々なＩＳＳの混合物が、マイクロキャリアと複合されてよく、その結果このマイクロキャリアは、１種よりも多いＩＳＳ種に結合されている。このＩＳＳとＭＣの間の結合は、共有的又は非−共有的であってよい。当業者に理解されるように、ＩＳＳは、修飾されるか又は誘導されてよく、かつマイクロキャリアの組成物は、ＩＳＳ／ＭＣ複合体形成に望ましい結合の所望の型に適合するように選択及び／又は修飾されてよい。
【０１３０】
共有的に結合されたＩＳＳ／ＭＣ複合体は、当該技術分野において公知の共有的架橋技術を用いて連結されてよい。典型的には、ＩＳＳ部分は、そこでＩＳＳ部分がマイクロキャリアに連結され得る部位を提供するために、付加的部分（例えば遊離アミン基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基）の組み込み、又は修飾された（例えばホスホロチオエート）ヌクレオチド塩基の組み込みのいずれかにより修飾されるであろう。本複合体のＩＳＳ部分とＭＣ部分の間の連結は、ＩＳＳの３’又は５’末端で、又はＩＳＳの内部位置の適宜修飾された塩基で行うことができる。本マイクロキャリアは一般に、それを介して共有的連結が形成される部分を取り込むためにも修飾されるが、マイクロキャリア上に通常存在する官能基も利用することができる。ＩＳＳ／ＭＣは、ＩＳＳをマイクロキャリアと共に、共有的複合体の形成を可能にする条件（例えば、架橋剤の存在下、又はＩＳＳとの共有結合を形成する活性化された部分を含む活性化されたマイクロキャリアの使用により）下でインキュベーションすることにより形成される。
【０１３１】
多種多様な架橋技術が、当該技術分野において公知であり、かつアミノ基、カルボキシル基及びスルフヒドリル基と反応性の架橋剤を含む。当業者に明らかであるように、橋かけ剤(crosslinking agent)及び架橋プロトコールの選択は、ＩＳＳ及びマイクロキャリアの立体配置、更にはＩＳＳ／ＭＣ複合体の望ましい最終的な立体配置によって決まるであろう。この架橋剤は、ホモ二官能性又はヘテロ二官能性のいずれかであってよい。ホモ二官能性架橋剤が使用される場合、この架橋剤は、ＩＳＳ及びＭＣ上の同じ部分を利用する（例えば、アルデヒド架橋剤は、ＩＳＳ及びＭＣの両方とも１個又は複数の遊離アミンを有するＩＳＳ及びＭＣを共有的に連結するために使用される）。ヘテロ二官能性架橋剤は、ＩＳＳ及びＭＣ上の異なる部分を利用し（例えば、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ＩＳＳ上の遊離スルフヒドリル及びＭＣ上の遊離アミンを共有的に連結するために使用される）、及びマイクロキャリア間結合の形成を最小化することが好ましい。ほとんどの場合において、マイクロキャリア上の第一の架橋部分とＩＳＳ上の第二の架橋部分を介して架橋することが好ましく、そこでは第二の架橋部分は、マイクロキャリア上には存在しない。ＩＳＳ／ＭＣ複合体を作製するひとつの好ましい方法は、ヘテロ二官能性架橋剤とのインキュベーションによる、マイクロキャリアの「活性化」、その後のＩＳＳ及び活性化されたＭＣの反応に適した条件下でのインキュベーションによる、ＩＳＳ／ＭＣ複合体形成によるものである。この架橋剤は、これらの反応性部分の間に「スペーサー」アームを組み込むことができるか、又は架橋剤内のふたつの反応性部分は直接連結されてよい。
【０１３２】
ひとつの好ましい実施態様において、ＩＳＳ部分は、マイクロキャリアへの架橋のための少なくとも１個の遊離スルフヒドリル基（例えば、５’−チオール修飾された塩基又はリンカーにより提供される）を含むのに対し、マイクロキャリアは、遊離アミン基を含む。これら２種の基と反応性のヘテロ二官能性架橋剤（例えば、マレイミド基及びＮＨＳ−エステルを含む架橋剤）、例えばスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシラートなどを使用し、ＭＣを活性化し、その後ＩＳＳを共有的に架橋し、ＩＳＳ／ＭＣ複合体を形成する。
【０１３３】
非−共有的ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、結合対がＩＳＳ及びＭＣを連結する場合に通常であるように、イオン（静電気）結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス引力、又は２種もしくはそれよりも多い異なる相互作用の組み合わせを含む、任意の非−共有的結合又は相互作用により連結されてよい。
【０１３４】
好ましい非−共有的ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、典型的には、疎水性又は静電気（イオン）相互作用、又はそれらの組み合わせにより複合される（例えば、ＩＳＳと結合対に使用されるＭＣに結合したポリヌクレオチドの間の塩基対形成による）。ポリヌクレオチドの骨格の親水性の性質のために、複合体形成を疎水性相互作用に頼るＩＳＳ／ＭＣ複合体は一般に、その複合体のＩＳＳ部分に高度に疎水性部分を組み込むための修飾が必要である。好ましくはこの疎水性部分は、生体適合性で、非免疫原性であり、かつ該組成物が意図される個体にとって天然である（例えば、哺乳類、特にヒトにおいて認められる）。好ましい疎水性部分の例は、脂質、ステロイド、コレステロールなどのステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をＩＳＳに連結する方法は、当然ＩＳＳの立体配置及びその疎水性部分の同一性に左右されるであろう。この疎水性部分は、ＩＳＳ内の任意の都合のよい部位に、好ましくは５’又は３’末端のいずれかに付加されてよく；コレステロール部分のＩＳＳへの付加の場合、コレステロール部分はＩＳＳの５’末端に、通常の化学反応を用いて付加されることが好ましい（例えば、Godardら、(1995) Eur. J. Biochem. 232:404-410を参照）。好ましくは、疎水結合により連結されたＩＳＳ／ＭＣ複合体で使用するためのマイクロキャリアは、油滴又は疎水性ポリマーなどの、疎水性物質から製造されるが、疎水性部分を組み込むように修飾された親水性物質を更に利用することができる。マイクロキャリアが、リポソーム又は管腔を備える他の液相マイクロキャリアである場合、ＭＣ調製プロセス時のＩＳＳの封入を避けるために、ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、ＭＣの調製後に、ＩＳＳ及びＭＣを混合することにより、形成される。
【０１３５】
静電気結合により結合された非−共有的ＩＳＳ／ＭＣ複合体は典型的には、高度に負帯電したポリヌクレオチド骨格を利用する。従って非−共有的に結合したＩＳＳ／ＭＣ複合体で使用するマイクロキャリアは一般に、生理的ｐＨ（例えば約ｐＨ６．８〜７．４）で、正帯電（陽イオン）している。このマイクロキャリアは、固有の正電荷を有してよいが、通常正電荷を有さない化合物から作製されたマイクロキャリアは、正帯電（陽イオン）し始めるように誘導又はそうでなければ修飾されてよい。例えばマイクロキャリアの作製に使用されるポリマーは、第１級アミンのような正帯電した基を付加するように誘導される。あるいは正帯電した化合物は、製造時にマイクロキャリアの配合物中に取り込まれてよい（例えば、正帯電した界面活性剤を、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）コポリマーの製造時に使用し、得られるマイクロキャリア粒子に正電荷を付与することができる）。
【０１３６】
本明細書に説明されたように、陽イオンミクロスフェアを調製するためには、陽イオン脂質又はポリマー、例えば１，２−ジオレオイル−１，２，３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）又はポリリシンなどが、これらの相中のそれらの溶解度に従い、ＤＰ又はＣＰのいずれかに添加される。
【０１３７】
本明細書に説明されたように、ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、ポリヌクレオチド及び該粒子の、好ましくは水性混合物中でのインキュベーションにより、陽イオンミクロスフェア上に吸着することにより予備形成することができる。このようなインキュベーションは、周囲温度（室温）（例えばほぼ２０℃）又は冷蔵庫（例えば４℃）内を含む、いずれか望ましい条件下で行うことができる。陽イオンミクロスフェア及びポリヌクレオチドは比較的迅速に会合するので、このインキュベーションは、５、１０、１５分間又はそれよりも長くなど任意の都合の良い時間、一晩又はそれよりも長いインキュベーションを含んでよい。例えばＩＳＳは、ポリヌクレオチド及び該粒子の４℃での一晩の水性インキュベーションにより、陽イオンミクロスフェア上に吸着することができる。しかし陽イオンミクロスフェア及びポリヌクレオチドは自発的に会合するので、ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、このポリヌクレオチド及びＭＣのｓＩＳＳｌｅ同時投与によって形成され得る。ミクロスフェアは、サイズ及びポリヌクレオチド会合前後の表面電荷により特徴付けることができる。選択されたバッチはその後、例えば、本明細書に説明されたような確立されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及びマウス脾細胞のアッセイなどで、好適な対照に対する活性について評価されてよい。これらの配合物は、好適な動物モデルにおいて評価することもできる。
【０１３８】
ヌクレオチド塩基対形成により連結された非−共有的ＩＳＳ／ＭＣ複合体は、通常の方法を用いて作製することができる。一般に塩基−対形成されたＩＳＳ／ＭＣ複合体は、ＩＳＳと少なくとも部分的に相補的である結合した、好ましくは共有結合したポリヌクレオチド（「捕獲ポリヌクレオチド」）を含むマイクロキャリアを使用し、作出される。ＩＳＳと捕獲ヌクレオチドの間の相補性のセグメントは、好ましくは少なくとも６、８、１０又は１５個の隣接(contiguous)塩基対、より好ましくは少なくとも２０個の隣接塩基対である。この捕獲ヌクレオチドは、当該技術分野において公知の任意の方法によりＭＣに結合されてよく、及び好ましくは５’又は３’末端でＩＳＳに共有的に結合される。
【０１３９】
他の実施態様において、ＩＳＳ／ＭＣ複合体中のＩＳＳ及びＭＣを連結するために、結合対を使用することができる。この結合対は、受容体及びリガンド、抗体及び抗原（もしくはエピトープ）、又は高親和性（例えば、Ｋｄが約１０〜８未満）で結合する任意の他の結合対であってよい。好ましい結合対のひとつの型は、ビオチン及びストレプトアビジン又はビオチン及びアビジンであり、これは非常に緊密な複合体を形成する。ＩＳＳ／ＭＣ複合体結合を媒介する結合対を使用する場合、ＩＳＳは、その結合対の一員との典型的には共有的連結により誘導され、かつＭＣは、その結合対の他方の一員により誘導される。これら２種の誘導された化合物の混合物は、ＩＳＳ／ＭＣ複合体形成を生じる。
【０１４０】
多くのＩＳＳ／ＭＣ複合体の実施態様は、抗原を含まず、ある実施態様は、ＩＳＳ／ＭＣ複合体療法の目的である疾患又は障害に関連した抗原（類）を排除する。更なる実施態様において、ＩＳＳは、１種又は複数の抗原分子にも結合している。抗原は、例えばＷＯ ９８／１６２４７に開示されたような、共有的及び／又は非共有的相互作用を含む様々な方法で、ＩＳＳ／ＭＣ複合体のＩＳＳ部分に結合することができる。あるいは、抗原は、マイクロキャリアに連結されてもよい。ＩＳＳへ結合した抗原を含むＩＳＳ／ＭＣ複合体内の抗原とＩＳＳの間の連結は、本明細書に説明された技術及び当該技術分野において公知の技術により作製することができ、これは直接の共有的連結、架橋剤部分（これはスペーサーアームを含んでよい）を介した共有的コンジュゲート、特異的結合対（例えばビオチン及びアビジン）を介した非共有的コンジュゲート、並びに静電気又は疎水結合を介した非共有的コンジュゲートを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４１】
陽イオン縮合剤及び安定化剤を伴うＩＳＳ複合体
ＩＳＳは、レシピエントにおける免疫反応を変調するために、陽イオン縮合剤、ＩＳＳ、及び安定化剤を含有する組成物（すなわちＣＩＳ組成物）として投与されてよい。米国特許出願第６０／４０２，９６８号を参照のこと。一部の実施態様において、ＣＩＳ組成物は、抗原及び／又は脂肪酸も含有してよい。
【０１４２】
本発明のＣＩＳ組成物は、典型的には粒子形状である。当業者に明らかであるように、本発明のＣＩＳ粒子状組成物は、様々なサイズの粒子の集団からなるであろう。この自然に生じる変動性のために、本発明の組成物中の粒子の「サイズ」は、直径のある範囲で又は最大もしくは最小として説明され得る。粒子は、粒子の少なくとも９５％（質量で）が特定された寸法に合致する場合には、特定のサイズであると考えられる（例えば粒子の少なくとも９７％が、直径２０μｍ未満である場合、その組成物は直径２０μｍ未満の粒子からなると考えられる）。粒子は、濾過（例えば、カットオフサイズよりも大きい粒子を捕獲するための「デプス」フィルターの使用）、動的光散乱、ＴＥＭ（特に凍結割断処理との組み合わせ）及びＳＥＭを含む電子顕微鏡などを含む、当該技術分野において公知の簡便な方法により測定されてよい。
【０１４３】
好ましくは、本発明のＣＩＳ組成物は、直径約５０μｍ未満、より好ましくは直径約２０μｍ未満である粒子を含むが、一部の実施態様において、これらの粒子は、直径約３、２又は１μｍ未満であろう。好ましい粒子サイズ範囲は、直径約０．０１μｍ〜５０μｍ、０．０２〜２０μｍ、０．０５〜５μｍ、及び０．０５〜３μｍである。
【０１４４】
ＣＩＳ組成物の成分は、組成物中に様々な比／量で存在してよいが、安定化剤（類）並びに脂肪酸及び抗原などの任意の成分の量は、比較的不変であり続け、安定化剤は一般に約０．１％〜０．５％（ｖ／ｖ）を変動し、脂肪酸は約０〜０．５％を変動し、及び抗原濃度は約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１〜約１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１０〜５０μｇ／ｍＬを変動することが企図されている。ＩＳＳ及び陽イオン縮合剤の量及び比は、本発明の組成物においてより大きい変動範囲に供される。ＩＳＳの量は、ＩＳＳの分子量の関数としてある程度変動し、一般に約５０μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約１００μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの範囲である。陽イオン縮合剤は、一般にＩＳＳよりも過剰（質量に関して）で存在し、一般に約１：２（ＩＳＳ：陽イオン縮合剤）〜約１：６、より好ましくは約２：５〜１：５である。
【０１４５】
ＣＩＳ組成物の粒子サイズは、多くの変数の関数である。本組成物中の粒子のサイズ分布は、陽イオン縮合剤のＩＳＳに対する比を変更することにより、変調することができる。例えば、例証的＋ＩＳＳ／０．４％Ｔｗｅｅｎ８５／０．４％オレイン酸塩／ポリミキシンＢ組成物において、陽イオン縮合剤のＩＳＳに対する比を変更することにより、平均粒子サイズを陽イオン縮合剤：ＩＭＣ＝１での約１．５μｍから、陽イオン縮合剤：ＩＳＳ＝１０での約４５μｍまで変更することができる。
【０１４６】
ある実施態様において、ＣＩＳ組成物は、陽イオン縮合剤、ＩＳＳ及び非イオン性界面活性剤である安定化剤を含有する。他の実施態様において、本組成物は、膜破壊性陽イオンリポペプチド（好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンＢ）、ＩＳＳ及び安定化剤を含有する。一部の実施態様において、安定化剤は、血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。実施態様のこのクラスの例証的組成物は、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ ８０又はＴｗｅｅｎ ８５を安定化剤として使用し、オレイン酸塩を任意の追加の安定化剤として使用する。
【０１４７】
一部の実施態様において、ＣＩＳ組成物は、免疫調節粒子を含有し、ここでこれらの粒子は、陽イオン縮合剤、ＩＳＳ及び非イオン性界面活性剤である安定化剤を一緒にするプロセスにより作製される。他の実施態様において、本発明の組成物は、免疫調節粒子を含み、ここでこれらの粒子は、膜破壊性陽イオンリポペプチド（好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンＢ）、ＩＳＳ及び安定化剤を一緒にするプロセスにより形成される。一部の実施態様において、安定化剤は、血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０１４８】
一部の実施態様において、ＣＩＳ組成物は、免疫調節粒子を含有し、ここでこれらの粒子は、ＩＳＳ及び非イオン性界面活性剤である安定化剤を一緒にし、これによりＩＳＳ／安定化剤混合物を形成し、及び陽イオン縮合剤をＩＳＳ／安定化剤と一緒にするプロセスにより形成される。他の実施態様において、本発明の組成物は、免疫調節粒子を含有し、ここでこれらの粒子は、ＩＳＳ及び安定化剤を一緒にし、これによりＩＳＳ／安定化剤混合物を形成し、並びに膜破壊性陽イオンリポペプチド（好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンＢ）をＩＳＳ／安定化剤混合物と一緒にするプロセスにより形成される。一部の実施態様において、安定化剤は、血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０１４９】
一部の実施態様において、ＣＩＳ組成物は、免疫調節粒子を含有し、ここでこれらの粒子は、陽イオン縮合剤、ＩＳＳ及び非イオン性界面活性剤である安定化剤を含有する。他の実施態様において、本発明の組成物は、免疫調節粒子を含有し、ここでこれらの粒子は、膜破壊性陽イオンリポペプチド（好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンＢ）、ＩＳＳ及び安定化剤を含有する。一部の実施態様において、安定化剤は、血清タンパク質ではない（特にウシ血清タンパク質ではない）。
【０１５０】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を使用する方法において有用な陽イオン縮合剤は、生理的ｐＨ（すなわちｐＨ約７．０〜約７．５）で正帯電している分子である。好ましくは、本発明において使用される陽イオン縮合剤は、両性イオン性ではなく、及びポリ陽イオン、すなわち１個の分子につき１個よりも多い正電荷を有するものである。本発明において有用な陽イオン縮合剤は、親水性又は両親媒性ポリ陽イオンを含む。
【０１５１】
好ましい陽イオン縮合剤は、以下を含む：（ａ）膜破壊性陽イオンリポペプチドであり、ポリミキシンＡ、ポリミキシンＢ（ポリミキシンＢ1及びポリミキシンＢ2を含む）、ポリミキシンＣ、ポリミキシンＤ、ポリミキシンＥ（コリスチンとしても公知）、ポリミキシンＫ、ポリミキシンＭ、ポリミキシンＰ、ポリミキシンＳ及びポリミキシンＴを含むポリミキシン類、サークリンＡ、サークリンＢ、サークリンＣ、サークリンＤ、サークリンＥ及びサークリンＦを含むサークリン類、オクタペプチン、アンホテリシンＢを含むアンホテリシン類、並びにオクタノイル−ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ（配列番号：２５）及びアシルＫＡＬＡ（オクタノイル−ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＥＡＣＥＡ（配列番号：２６））を含むアシル化されたペプチドを含むが、これらに限定されるものではないもの；（ｂ）膜破壊性陽イオンペプチドであり、ポリミキシンＢノナペプチド、セクロピンＡ、セクロピンＢ及びセクロピンＰ１を含むセクロピン類、ＫＦＦＫＦＦＫＦＦ（配列番号：２５）及びＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ）（配列番号：２７）を含むが、これらに限定されるものではないもの；（Ｃ）単鎖陽イオン界面活性剤であり、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ベンジル−ジメチル−アンモニウムブロミド（ＢＤＡＢ）、ＣｐｙｒＢ（セチル−ピリジニウムブロミド）、ＣｉｍＢ（セチルイミダゾリウムブロミド）、及び非限定的にポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むポリ陽イオンポリマーを含むが、これらに限定されるものではないもの。ある実施態様において、陽イオン縮合剤は、膜破壊性陽イオンリポペプチド、好ましくはポリミキシン、より好ましくはポリミキシンＢである。一部の実施態様において、陽イオン縮合剤は、脂肪酸エステル（すなわち脂質）及び二本鎖陽イオン界面活性剤を除外してよい。
【０１５２】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を使用する方法において有用な安定化剤は、水中に懸濁可能であり、かつ水の表面張力を低下するものを含むが、水溶性及び／又は水に完全に混和性である安定化剤が好ましい。タンパク質（好ましくは親水性タンパク質）、非イオン性界面活性剤、ポリマー性界面活性剤（例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン）、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤及び脂肪酸を含む、安定化剤の多くのクラスが、本発明の組成物及び方法において有用であるが、ある実施態様において、血清タンパク質（特にウシ血清タンパク質）、脂肪酸、及び／又はイオン性界面活性剤は、この安定化剤の定義から除外されてよい。
【０１５３】
任意のタンパク質は、本発明の安定化剤として使用することができる。一部の実施態様において、安定化剤は、抗原として意図されないタンパク質であり（下記考察を参照）；これらの実施態様において、このタンパク質は、本組成物の意図されたレシピエントと同じ種に由来することが好ましい（例えば組成物のヒトにおける使用が意図される場合、安定化剤として使用されるタンパク質はヒトタンパク質であることが好ましい）。血清アルブミンは、そのような実施態様において安定化剤として有用な例証的タンパク質である。他の実施態様において、抗原は、安定化剤として利用され、この場合この抗原は、意図されたレシピエントと合致する種である必要はないが、一般にはこの種でないことが好ましい。本発明の組成物及び方法において有用な抗原は、以下に明らかにされている。
【０１５４】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を使用する方法に有用な非イオン性界面活性剤は、グルカミド、例えばデシルジメチルホスフィンオキシド(APO-10)及びジメチルドデシルホスフィンオキシド(APO-12)、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド(MEGA-8)、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド(MEGA-9)及びデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド(MEGA-10)など、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤で、ポリオキシエチレン（１０）ドデシルエステル(ゲナポールC100)、ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテル(BRIJ（登録商標）30)、ポリオキシエチレン（９）ラウリルエーテル(LUBROL（登録商標）PX)、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル(BRIJ（登録商標）35)、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル(BRIJ（登録商標）52)、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル(BRIJ（登録商標）56)、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル(BRIJ（登録商標）58)、ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル(BRIJ（登録商標）72)、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル(BRIJ（登録商標）76)、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル(BRIJ（登録商標）78)、ポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル(BRIJ（登録商標）700)、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル(BRIJ（登録商標）92)、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル(BRIJ（登録商標）97)、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル(BRIJ（登録商標）98)、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）8(ゲナポール80)、プルロニック（登録商標）F-68、プルロニック（登録商標）F-127、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）9（Thesit)、ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル(TRITON（登録商標）X-100)、ポリオキシエチレン（８）イソオクチルフェニルエーテル(TRITON（登録商標）X-114)、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート(TWEEN（登録商標）20)、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート(TWEEN（登録商標）40)、ポリエチレングリコールソルビタンモノステアレート(TWEEN（登録商標）60)、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート(TWEEN（登録商標）65)、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート(TWEEN（登録商標）80)、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート(TWEEN（登録商標）85)、ポロキサマー188、及びポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル(Nonidet NP40)など、アルキルマルトシド界面活性剤であり、シクロヘキシル−ｎ−エチル−β−Ｄ−マルトシド、シクロヘキシル−ｎ−ヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、及びシクロヘキシル−ｎ−メチル−β−Ｄ−マルトシドを含むもの、ｎ−デカノイルショ糖、グルコピラノシドであり、メチル６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−ａ−Ｄ−グルコピラノシド(HECAMEG)、及びアルキルグルコピラノシド、例えばｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、及びｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含むもの、アルキルチオグルコピラノシドであり、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシドを含むもの、アルキルマルトピラノシドであり、ｎ−���シル−β−Ｄ−マルトピラノシド及びｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトピラノシドを含むもの、ｎ−デシル−β−Ｄ−チオマルトシド、ジギトニン、ｎ−ドデカノイルショ糖、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ヘプタン１，２，３−トリオール、ｎ−オクタノイル−β−Ｄ−グルコシルアミン(NOGA)、ｎ−オクタノイルショ糖、ポロキサマー（ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、例えばポロキサマー188及びポロキサマー407など、並びにスルホベタイン類であり、SB-10、SB-12、及びSB-14を含むもの、並びにｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシドを含む。好ましい安定化剤は、ポリオキシエチレンエーテル界面活性剤、特にポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエートである。
【０１５５】
ＣＩＳ組成物及びＣＩＳ組成物を使用する方法において有用な陰イオン性界面活性剤は、カプリル酸及びそれらの塩、ケノデオキシコール酸及びそれらの塩、コール酸及びそれらの塩、デカンスルホン酸及びそれらの塩、デオキシコール酸及びそれらの塩、グリコデオキシコール酸及びそれらの塩、ラウロイルサルコシン及びそれらの塩、ｎ−ドデシル硫酸及びそれらの塩（ナトリウム塩及びリチウム塩を含む）、タウロケノデオキシコール酸及びそれらの塩、タウロコール酸及びそれらの塩、タウロデヒドロコール酸及びそれらの塩、タウロデオキシコール酸及びそれらの塩、タウロリソコール酸及びそれらの塩、並びにタウロウルソデオキシコール酸及びそれらの塩を含む。
【０１５６】
陽イオン性界面活性剤は、セチルピリジニウム及びそれらの塩、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を含むセチルトリメチルアンモニウム及びそれらの塩、臭化ドデシルトリメチルアンモニウムを含むドデシルトリメチルアンモニウム及びそれらの塩、アルキルアンモニウムイミダゾリン、第４級イミダゾリン、及び臭化テトラデシルトリメチルアンモニウムを含むテトラデシルトリメチルアンモニウム及びそれらの塩である。
【０１５７】
安定化剤としての使用のために選択された界面活性剤は、油／水型乳化性界面活性剤と考えられるものが好ましい。油／水型乳化性界面活性剤は、当該技術分野において公知であり、一般に疎水／親水バランス（ＨＬＢ）値が約８〜約１８であることで特徴付けられる。好ましくは、特定の組成物に組み込まれた界面活性剤は、ＨＬＢ値約１０〜約１６、より好ましくは約１１〜約１５を有する（例えば、ポリエチレングリコールソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ＝１５．４；ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル、ＨＬＢ＝１３．５；ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート、ＨＬＢ＝１１）。
【０１５８】
ある実施態様において、ＣＩＳ組成物は、追加成分として、１種又は複数の脂肪酸、又はそれらの塩も含んでよい。安定化剤成分として脂肪酸及び本組成物の追加成分として脂肪酸を使用するこれらの実施態様において、安定化剤として使用される脂肪酸は、「追加」成分として使用される脂肪酸とは異なるであろう。本発明のＣＩＳ組成物において有用な脂肪酸は、サイズが４〜３０個の炭素原子の範囲であり、不飽和（例えばステアリン酸）、単不飽和（例えばオレイン酸）、又は多不飽和（例えばリノール酸）であってよいが、単不飽和及び多不飽和脂肪酸が一般に好ましい。
【０１５９】
一部の実施態様において、本ＣＩＳ組成物は、炭素鎖の長さが少なくとも約４、５、６、８、１０、１５、１８、又は２０個の炭素原子及び約３０、２５、２０、１９、１５又は１０個未満の炭素原子を有する脂肪酸を組み込むであろう。従って一部の実施態様において、本発明において利用される脂肪酸は、長さが約４〜３０、５〜２５、１０〜２０、又は１５〜２０個の範囲の炭素原子の炭素鎖を有することができる。
【０１６０】
ＣＩＳ組成物において有用な脂肪酸は、アラキドン酸、デカン酸、ドコサン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサン酸、ヘンエイコサン酸、ヘプタデカン酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ラウリン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸、ノナデカン酸、ノナン酸、オクタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ペンタデカン酸、ステアリン酸、テトラコサン酸、トリコサン酸、トリデカン酸、及びウンデカン酸を含むが、これらに限定されるものではない。ＣＩＳ組成物において使用するのに好ましい脂肪酸は、オレイン酸、パルミトレイン酸、及びリノール酸を含む。
【０１６１】
本発明のある実施態様において、抗原は、ＣＩＳ組成物へ組み込まれるか、又はＣＩＳ組成物と組み合わせて混合される。抗原を組み込んでいるそれらのＣＩＳ組成物は、特定の組成物それ自身へ抗原を組み込むか、又は特定の組成物が懸濁されている溶液中に溶解もしくは懸濁されてよい。任意の抗原が、本発明のＣＩＳ組成物へ、組み込まれるか、又はこれと同時投与されてよい。
【０１６２】
ＩＳＳの送達
一実施態様において、ＩＳＳは、それ自身個体へ送達される。別の実施態様において、ＩＳＳは、１種又は複数の抗原と共に送達される。一実施態様において、抗原は、ＩＳＳとコンジュゲートとして同時投与される。別の実施態様において、抗原は、個別のビヒクル中で、ＩＳＳと共に投与される。抗原の投与は、ＩＳＳと同時期又は同時であることができる。下記ＩＳＳの送達の考察も同じく、ＩＳＳを伴う抗原の送達を企図している。
【０１６３】
ＩＳＳは、プラスミド、コスミド、ウイルス又はレトロウイルスなどの送達ベクターに取り込まれてよく、これは次にサイトカイン、ホルモン及び抗原などの治療的に恩恵のあるポリペプチドをコードしてよい。このようなベクターへのＩＳＳの取り込みは、それらの活性に有害な影響を及ぼさない。
【０１６４】
コロイド状分散システムを、ＩＳＳの、鼻腔粘膜などの炎症組織への標的化された送達に使用してよい。コロイド状分散システムは、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルション、ミセル、混合型ミセル及びリポソームを含む脂質−ベースのシステムを含む。一実施態様において、本発明のコロイド状システムは、リポソームである。
【０１６５】
リポソームは、インビトロ及びインビボにおける送達ビヒクルとして有用である人工膜ベシクルである。サイズが０．２〜４．０μｍの範囲である大型単層ベシクル（ＬＵＶ）は、大型高分子を含む水性緩衝液の実質的割合を封入することができることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷のビリオンは、水性の内部内に封入することができ、かつ生物学的活性型で細胞へ送達される(Fraleyら、Trends Biochem. Sci, 6:77 , 1981)。リポソームは、哺乳類細胞に加え、植物細胞、酵母細胞及び細菌細胞へポリヌクレオチドを送達するために使用される。リポソームが効果的遺伝子導入ビヒクルであるためには、下記の特徴が存在しなければならない：（１）高い効率でアンチセンスポリヌクレオチドをコードしているが、それらの生物活性は損なわない遺伝子の封入；（２）標的細胞への、非−標的細胞と比べ優先的かつ実質的な結合；（３）ベシクルの水性内容物の、標的細胞の細胞質への高効率での送達；並びに、（４）遺伝情報の正確かつ効果的な発現(Manninoら、Biotechniques, 6:682, 1988)。
【０１６６】
本リポソームの組成物は、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に高い相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在により左右される。
【０１６７】
リポソーム製造に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドなどのホスファチジル化合物を含む。特に有用なものは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここでその脂質部分は、１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、かつ飽和されている。例証的リン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【０１６８】
リポソームの標的化は、解剖学的(anatomical)要因及び機械的要因を基に分類することができる。解剖学的分類は、例えば、臓器特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性などの選択性のレベルを基にしている。機械的標的化は、受動的又は能動的であるかどうかを基に識別することができる。受動標的化は、リポソームが、洞様毛細血管を含む臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布する自然の傾向を利用する。他方で能動標的化は、リポソームの、モノクローナル抗体、糖質、糖脂質、もしくはタンパク質などの特異的リガンドへの結合によるか、又は天然の局在化部位以外の臓器及び細胞型への標的化を実現するための、リポソームの組成もしくはサイズの変化による、リポソームの変更に関与している。
【０１６９】
標的化された送達システムの表面は、様々な方法で修飾されてよい。リポソームの標的化された送達システムの場合、標的化リガンドをリポソーム二層との安定した会合状態に維持するために、脂質基は、リポソームの脂質二層へ組み込まれ得る。様々な周知の連結基を、脂質鎖の標的化リガンドへの連結に使用することができる(例えば、Yanagawaら、Nuc.Acids Symp.Ser., 19:189 (1988)；Grabarekら、Anal. Biochem., 185:131 (1990)；Starosら、Anal.Biochem., 156:220 (1986)；及び、Boujradら、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:5728 (1993)を参照のこと）。ＩＳＳの標的化された送達は、ＩＳＳの、ウイルス及び非ウイルス組み換え発現ベクターの表面への、抗原もしくは他のリガンドへの、モノクローナル抗体への、又は望ましい結合特異性を有する任意の分子へのコンジュゲートによっても実現され得る。
【０１７０】
当業者は、オリゴヌクレオチド−ペプチドコンジュゲートを調製するのに有用な方法を熟知しているか、又は容易に決定することができるであろう。コンジュゲートは、ＩＳＳの末端又は内部位置の好適に修飾された塩基で（例えばシトシンもしくはウラシル）のいずれかで達成され得る。参考までに、オリゴヌクレオチドをＩｇのタンパク質及びオリゴ糖部分にコンジュゲートする方法は、公知である（例えば、O’Shannessyら、J. Applied Biochem., 7:347 (1985)、別の有用な参考文献である「Kessler：Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acids」、Kricka(編集)、Nonisotopic DNA Probe Techniques(Acad. Press, 1992)を参照のこと)。
【０１７１】
ペプチド薬の本発明のＩＳＳとの同時投与は、組み換え発現ベクターにより送達可能な治療的に有益な任意のタンパク質をコードしている組み換え発現ベクター（プラスミド、コスミド、ウイルス又はレトロウイルス）への、ｃｉｓ又はｔｒａｎｓでのＩＳＳの取り込みによっても実現することができる。本発明を実践する上で使用するためのＩＳＳの発現ベクターへの取り込みが望ましい場合、そのような取り込みは、当業者には詳細な説明を必要としない通常の技術を用いて実現され得る。しかし検証のために、当業者は、Ausubelの「Current Protocols in Molecular Biology」(前掲)を参照することを欲するものである。
【０１７２】
簡単に述べると、組み換え発現ベクター（任意のタンパク質をコードせず、ＩＳＳの担体として使用されるものを含む）の構築は、標準ライゲーション技術を使用する。構築されたベクター内の正確な配列を確認する分析のために、このライゲーション混合物を使用し、個々の細胞を形質転換し、成功した形質転換体を、適宜抗生物質耐性について選択することができる。この形質転換体由来のベクターは、例えば、Messingらの方法(Nucleic Acids Res., 9:309, 1981)、Maxamらの方法(Methods in Enzymology, 65:499,1980)、又は当業者に公知の他の好適な方法により、調製、制限による分析、及び／又は配列決定される。切断された断片のサイズ分離は、例えば、Maniatisらにより説明されている(Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982)ような、通常のゲル電気泳動を用いて行われる。
【０１７３】
個々の細胞は、発現ベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、又は遺伝子を増幅するのに適するように改変された通常の栄養培地において培養されてよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現について選択された個々の細胞と共に先に使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１７４】
組み換え発現ベクターが、本発明のＩＳＳの担体として利用される場合、プラスミド及びコスミドが、それらは病原性を持たないので特に好ましい。しかしプラスミド及びコスミドは、ウイルスよりもより迅速に、インビボにおいて分解に供され、従って全身投与された遺伝子治療ベクターにより発揮されるＩＳＳ免疫刺激活性を実質的に阻害するのに適量のＩＳＳを送達することができない。このウイルスベクターの代わりの、アデノ随伴ウイルスは、低病原性という利点を有する。アデノ随伴ウイルスの外来遺伝子を挿入する能力の相対的な低さは、本発明のＩＳＳが合成され得るサイズは相対的に小さいために、この状況において問題はないであろう。
【０１７５】
本発明に利用することができる他のウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア又はレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、海洋生物(marine)、鳥又はヒトのＨＩＶレトロウイルスの誘導体が好ましい。１個の外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例は、以下を含むが、これらに限定されるものではない：モロニーマウス(marine)白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス(marine)肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス(marine)乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多くの追加のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を取り込むことができる。これらのベクターは全て、選択マーカーの遺伝子を導入又は取り込み、その結果導入された細胞を同定又は作製することができる。
【０１７６】
組み換えレトロウイルスは欠損性であるので、感染性ベクター粒子を作出するためには、これらを補助する必要がある。この補助は、例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下で、レトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードしているプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することにより提供され得る。これらのプラスミドは、キャプシド形成に関するＲＮＡ転写産物を認識するためのパッケージング機構が可能であるヌクレオチド配列を喪失している。パッケージングシグナルの欠損を有するヘルパー細胞株は、例えばＴ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２を含むが、これらに限定されるものではない。これらの細胞株は、ゲノムがパッケージされていないので、空のビリオンを作出する。レトロウイルスベクターが、パッケージングシグナルは無傷であるが構造遺伝子は関心対象の他の遺伝子と交換されているそのようなヘルパー細胞に導入される場合、このベクターはパッケージングされ、かつベクタービリオンが作出されることができる。例えば１種又は複数の関心対象の配列を、特異的標的細胞上の受容体のリガンドをコードしている別の遺伝子と共に、ウイルスベクターへ挿入することにより、このベクターは、標的特異性となることができる。レトロウイルスベクターは、例えば糖質、糖脂質、又はタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを挿入することにより、標的特異性とすることができる。好ましい標的化は、レトロウイルスベクターを標的とするために抗体を用いることにより達成される。当業者は、ＩＳＳを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするために、レトロウイルスゲノムに挿入することができる特異的ポリヌクレオチド配列を、知っているか、又は過度な実験を行うことなく容易に解明することができるであろう。
【０１７７】
ＩＳＳの医薬組成物
ＩＳＳがベクター又は他の送達システムを使用せずに送達される場合、ＩＳＳは、医薬として許容し得る組成物中に調製されるであろう。本発明のＩＳＳと共に使用するための好ましい医薬として許容し得る担体は、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液及び乳液を含んでよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、乳液又は懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒体を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム液、デキストロース加リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液又は不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、体液及び栄養素補充液、電解質補充液（デキストロース加リンゲル液をベースにしたものなど）などを含む。例えば抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性気体などの保存剤及び他の添加剤も、存在してよい。ＩＳＳ組成物は、本発明に従い引き続き再構成及び使用するために当該技術分野において周知の手段を用いて凍結乾燥されてもよい。
【０１７８】
吸収促進剤、界面活性剤及び化学性刺激物（例えば、ケラチン分解性物質）は、ＩＳＳ組成物の標的組織への透過を増強することができる。有機物及びペプチド−ベースの薬物の経粘膜送達を成功させるために使用される吸収プロモーター及び界面活性剤に関する一般原理について考察する参考文献については、Chienの著書「Novel Drug Delivery Systems」、第4章(Marcel Dekker, 1992)を参照のこと。
【０１７９】
好適な経鼻吸収促進剤の例は、特にChienの前掲の著書の第５章表２及び３に記されており；マイルダー物質(milder agent)が好ましい。経粘膜／経鼻送達のために本発明の方法で使用するのに適した作用物質も、Chienらの著書「Nasal Drug Delivery」の「Treatise on Controlled Drug Delivery」第9章及びその表3-4B(Marcel Dekker, 1992)に説明されている。皮膚を通じた薬物の吸収を増強することがわかっている好適な物質は、Sloanの著書「Use of Solubility Parameters from-Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes」第5章の「Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery」(Marcel Dekker, 1992)、及びその著書の別所に説明されている。
【０１８０】
ＩＳＳの個体への投与の方法及び経路
本発明のＩＳＳは、薬物送達に適したいずれか利用可能な方法及び経路を用い、個体へ投与される。一実施態様において、抗原を伴う又は伴わないＩＳＳは、当業者に公知の任意の送達手段により、上位及び／又は下位気管へ送達される。ＩＳＳのひとつの好ましい送達方法は、本実施例に説明されたような、鼻腔内送達である。別の好ましいＩＳＳ送達方法は、吸入である。他の投与法は、エクスビボ法（例えば、ＩＳＳと共にインキュベーション又はトランスフェクションされた細胞の送達）に加え、全身的もしくは局所的経路である。当業者は、ＩＳＳを個体へ方向付ける送達の方法及び経路は、ＩＳＳのインビボにおける分解を避けなければならないことを理解するであろう。
【０１８１】
ひとつの態様において、本発明は、環境中に自然に存在する抗原（すなわち「偶発的」抗原）と一緒の、ＩＳＳの投与法を提供する。偶発的アレルゲンは、季節を通じてレベルが変動するアレルゲンであることができる。季節性アレルゲンの存在は、例えば天気サービス会社からの天気予報、テレビ、ラジオもしくは新聞により放送されるニュース報道、公的機関の記録(institutional record)、及び個人的な調査などの様々な給源を使用することにより、確認することができる。偶発的抗原の例は、ブタクサ、例えばブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ(Amb a I)がある。他の非限定的偶発的抗原の例は、草アレルゲンLol p1(Tamboriniら、(1997) Eur. J. Biochem. 249:886-894)、主要なイエダニアレルゲンDer pI及びDer PII(Chuaら、(1988) J. Exp. Med. 167:175-182；Chuaら、(1990) Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91:124-129)、家猫アレルゲンFel dI(Rogers ら、(1993) Mol. Immunol. 30:559-568)、シラカバ花粉Bet vl(Breitenederら、(1989) EMBO J. 8:1935-1938)、日本スギアレルゲンCry j1及びCry j2(Kingetsuら、(2000) Immunology 99:625-629)、及び他の樹木花粉由来のタンパク質抗原(Elsayedら、(1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204:17-31)がある。示されたように、カバ、ヒノキ及び日本スギを含む、樹木由来のアレルゲンが公知である。インビボ投与のための草花粉からのタンパク質抗原の調製が、報告されている。使用することができる他の抗原は、先に表1に説明している。
【０１８２】
多くの外在性抗原の個体への侵入点は、皮膚又は粘膜を通じてである。従って皮膚（例えば表皮及び皮下の状態）又は粘膜（例えば呼吸器、眼、舌又は生殖器の状態）を標的とする送達の方法及び経路は、特に有用であろう。当業者は、皮膚及び粘膜への薬物送達の手段を熟知しているか、又は容易に確認することができる。しかし検証のために、本発明において有用な例証的薬物送達の方法及び経路を、以下に簡単に説明する。
【０１８３】
鼻腔内投与手段は、喘息（例えばアレルギー喘息）、呼吸器炎症、特に鼻孔から気管又は気管支へ伝達された抗原により媒介された炎症などの呼吸器の問題に対処するのに、特に有用である。このような手段は、本発明のポリヌクレオチド組成物のエアロゾル懸濁液の吸入を含む。ポリヌクレオチド組成物を鼻粘膜、気管及び気管支に送達するのに適したネブライザー装置は、当該技術分野において周知であり、従って本明細書においては詳細に説明しない。鼻腔内薬物送達に関する全般的総説については、当業者は、Chienの著書「Novel Drug Delivery Systems」の第5章(Marcel Dekker, 1992)を参考にすることが望まれる。
【０１８４】
投与の皮膚経路に加え、皮下注射は、皮膚のアレルギー反応及び炎症に対処するのに有用である。皮膚への薬物送達の手段の例は、好適な医薬調製品の外用塗布、経皮伝達、注射及び表皮投与である。
【０１８５】
経皮伝達に関して、吸収促進剤又はイオントフォレシスが、好適な方法である。そのような方法に関する総説については、当業者は、Chienの前掲の著書の第７章を参考にすることが望まれる。イオントフォレシスによる伝達は、電気パルスにより、無傷の皮膚を通して、数日又はそれよりも長い期間、それらの製品を連続して送達する、市販の「貼付剤」を用いて実現することができる。この方法の使用は、医薬組成物の比較的高い濃度での制御された伝達を可能にし、組み合わせ薬の注入をもたらし、かつ吸収促進剤の同時使用を可能にする。
【０１８６】
本方法において使用するための例証的貼付剤製品は、General Medical社(ロスアンジェルス、カリフォルニア州)の製品で商標LECTRO PATCHである。この製品は、貯蔵庫の電極を、中性ｐＨに電気的に維持し、かつ異なる濃度の用量を提供するか、連続して投与するか及び／又は定期的に投与するように適合することができる。この貼付剤の調製及び使用は、LECTRO PATCH製品に添付されている、製造業者の印刷された指示に従い行われるべきであり；これらの指示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８７】
表皮投与は本質的に、この刺激物に対する免疫反応を誘起するのに十分な、表皮の最も外側層の力学的又は化学的刺激に関与している。表皮投与において使用するための装置の例は、皮膚へとタイン(tyne)上にコーティングされたＩＳＳを引っ掻くために使用することができる複数の非常に狭い直径の短いタインを利用する。Pasteur Merieux社(リヨン、仏国)により製造されたMONO-VACC旧ツベルクリン試験に含まれるこの装置は、ＩＳＳの表皮投与における使用に適している。この装置の使用は、該装置製品と共に含まれた製造業者の書面による指示に従い；使用及び投与に関するこれらの指示は、本装置の通常の使用を例示するために参照により本明細書に組み入れられる。同じく本実施態様において使用される同様の装置が、アレルギー試験を実行するために現在使用されている。
【０１８８】
全身投与は、医薬調製品の侵襲性又は全身に吸収される外用投与に関連している。外用塗布に加え、静脈内及び筋肉内注射が、薬物の全身投与のための一般的手段の例である。
【０１８９】
ＩＳＳの投薬パラメータ
本発明のＩＳＳの特別な利点は、低用量であっても、抗炎症活性及び／又は免疫療法活性を発揮するそれらの能力である。使用される用量は、達成されるべき臨床目標に応じて変動するが、好適な用量範囲は、長期の疾患修飾を得るために有効な量であるものである。一実施態様において、長期疾患の実施態様は、下記の喘息の症状のいずれかひとつを軽減する：気管支過敏症、気道への好酸球浸潤、気道内の粘液分泌、気道内のＴｈ２サイトカイン、気道リモデリング、即時型喘息反応（アレルゲン曝露直後の気道収縮）、及び遅発型喘息反応（アレルゲン曝露の数時間後の気道収縮）。
【０１９０】
一態様において、ＩＳＳは、少なくとも週３回の投与量で投与される。投与されるべきＩＳＳの用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。一実施態様において、投与されるべき用量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。別の実施態様において、投与されるべきＩＳＳの用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。別の実施態様において、ＩＳＳの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２回投与量が、長期の疾患修飾を実現するために、個体へ投与される。
【０１９１】
ＩＳＳは、ある期間にわたり複数回投与される。用量投与の間の間隔は、１週間に１回である。別の場合は、用量投与の間のわずかに短い期間が使用され、例えば、用量投与の間は３、４、５又は６日であってよい。別の代替場合において、より長い期間が、用量投与の間に経過し、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日毎であってよい。更に別の代替の場合において、ＩＳＳは、２．５週、３週、又は４週毎の反復用量で投与されてよい。一実施態様において、ＩＳＳは、少なくとも３回の毎週の投与量で、１回投与量につき約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇで投与される。別の実施態様において、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２回のＩＳＳ投与量が、長期作用を実現するために、個体へ投与される。
【０１９２】
更に別の態様において、ＩＳＳは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、並びに長期の疾患修飾をもたらすために、これらの用量の間を約３、４、５又は６日あけて、少なくとも３回投与量が、個体に投与される。別の実施態様において、ＩＳＳは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、並びに長期の疾患修飾をもたらすために、これらの用量の間を約８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日あけて、少なくとも３回投与量が個体に投与される。別の実施態様において、ＩＳＳは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、並びに長期の疾患修飾をもたらすために、これらの用量の間を約２．５週間、３週間又は４週間あけて、少なくとも３回投与量が、個体に投与される。一実施態様において、長期作用を実現するために、ＩＳＳの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２回の投与量が、これらの用量の間が約３〜約１４日の範囲の間隔で個体に投与される。別の実施態様において、ＩＳＳの少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２回の投与量が、長期作用を実現するために、これらの用量の間が約２．５週間、３週間又は４週間の範囲の間隔で、個体に投与される。別の実施態様において、これらのＩＳＳ投与量は、およそ１週間に１回で投与される。当業者は、実施例において例証されるように、Ｔｈ２サイトカインレベルを測定することにより、投与量の範囲を調節することができるであろう。本開示に提示された内容及び出願時に一般に公知であるものを鑑み、臨床技術分野の業者は、本発明のＩＳＳの投与に関する好適なパラメータを熟知しているか、又は容易に確認することができるであろう。
【０１９３】
これに関して、本発明のＩＳＳの抗炎症活性及び免疫治療的活性は、本質的に投与量−依存型であることは注意されなければならない。従ってＩＳＳの効能を２倍だけ増強するためには、各単回投与量は、濃度で倍加されなければならない。臨床的には、低用量（例えば約０．０１ｍｇ／ｋｇ）のＩＳＳを投与することが勧告され、この用量は望ましい治療上の目的に到達するために必要に応じて増加される。現在の試験を基に、ＩＳＳは、これらの用量レベルでの毒性はほとんど又は全くないと考えられる。
【０１９４】
本発明の方法の実践において使用するためのキット
本発明は、先に説明された方法で使用するために、キットも提供する。このようなキットは、以下のいずれか又は全てを備えてよい：ＩＳＳ（コンジュゲート型又は非コンジュゲート型）；医薬として許容し得る担体（ＩＳＳと予備混合されてよい）、又は凍結乾燥されたＩＳＳを再構成するための懸濁液基剤；追加の医薬品；ＩＳＳを個体へ送達するために使用される、ＩＳＳ及び追加の医薬品の各々のための滅菌バイアル、又はそれらの混合物のための単独のバイアル、装置；治療された個体において求める免疫調節作用が達成されたことの兆候を検出するためのアッセイ試薬、ＩＳＳをどのように、いつ投与するかの指示書、並びに好適なアッセイ装置。
【０１９５】
本発明の実践を例示する実施例を、以下に記す。これらの実施例は、単に参照を目的とするものであり、本発明の限定するために構築されるものではない。
【実施例】
【０１９６】
実施例
実施例１：ブタクサ−誘導したアレルギー喘息に関するマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる鼻腔内治療後のＴｈ２−型遺伝子誘導の阻害
本実験の目的のひとつは、ブタクサ−感作され及びチャレンジされたマウスにおけるアレルゲン−誘導したＴｈ２−遺伝子誘導の阻害に対する、鼻腔内１０１８  ＩＳＳ治療の作用の持続期間を調べることであった。評価した遺伝子は、様々なＴｈ２−サイトカイン、ケモカイン、及び気道炎症に関与した様々な他の分子を含んだ。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ミョウバン上のブタクサで、−２１日目及び−１４日目に腹腔内感作した。様々な時点で（−７日目から０日目と３時間の範囲）、マウス群を、軽い麻酔下で、１０１８  ＩＳＳ又は食塩水により鼻腔内処置した。０日目に、全ての群に、ブタクサ又は食塩水のいずれかを鼻腔内チャレンジした。チャレンジの６時間後、肺を摘出し、液体窒素で瞬時に凍結した。総ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに転換した。ｍＲＮＡの発現を、肺ｃＤＮＡ試料において、リアルタイム定量的ＰＣＲを用いて測定した。
【０１９７】
使用した材料は、以下であった：１０１８(ロット番号AGU-003、Dynavax社)、ブタクサ(花粉ロット#16、24QQ 56-9FD-3、2003年1月17日抽出、Dynavax社)、パイロジェンフリー食塩水(Sigma社)。使用した方法は、以下であった：試験は、Charles River社(ホリスター、CA)から入手した６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。全部で９０匹のマウスを、ミョウバン上のブタクサ１０μｇで、−２１日目及び−１４日目に腹腔内感作した。−７日目以降開始し、５匹のマウスの群は、軽いイソフロライン(isofloraine)麻酔下で、下記のスケジュールに従い、パイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）又は１０１８  ＩＳＳ（２０μｇ／５０μｌ食塩水）により、鼻腔内処置した。
【０１９８】
【表２】
0006023142.tif 000006
【０１９９】
０日目に、全てのマウスに、ブタクサ（５μｇ／５０μｌ食塩水）又は食塩水（５０μｌ）のいずれかを鼻腔内チャレンジした。チャレンジの６時間後、肺を摘出し、液体窒素で瞬時に凍結し、−８０℃で後に使用するために貯蔵した。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット(Qiagen社、バレンシア、CA)を用い単離した。ＲＮＡ試料を、ＤＮＡｓｅ−処置し(Roche Diagnostics社、マンハイム、独国)、Superscript II Rnase H逆転写酵素(Invitrogen社、ロックビル、MD)を先に公開された方法(Scheerensら、Eur. J. of Immunology 2001, 31:1465-74)に従い使用し、ｃＤＮＡに転換した。
【０２００】
各ｃＤＮＡ試料において、様々な遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイム定量的ＰＣＲ(ABI Prism 5700、Perkin Elmer Applied Biosystems社)及びSYBRグリーン(Qiagen社、バレンシア、CA)を用いて測定した。検出に使用したセンス及びアンチセンスプライマーは、当研究室で開発し、Ｔｈ２−サイトカイン、ケモカイン、及び気道炎症に関連した様々な他の分子に対するプライマーセットを含んだ。関心対象の遺伝子に加え、各試料中の、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定した（この場合ユビキチン）。１試料あたりのＲＮＡ量を補正した後、全てのデータを、ハウスキーピング遺伝子の発現に対して計算した（遺伝子／ユビキチン比として表した）。
【０２０１】
結果：図１において、Ｔｈ２−型気道炎症反応の発生に必須の６種の遺伝子を示し、データは遺伝子／ユビキチン比として表している。このデータは、感作されたマウスにおけるブタクサによる鼻腔内チャレンジは、食塩水−チャレンジしたマウスと比べた場合に、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３などのＴｈ２−遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをアップレギュレーションしたことを明らかにしている（ブタクサ−チャレンジしたマウスは、灰色棒のＲＷ／ＲＷ／食塩水で示し、食塩水−チャレンジしたマウスは、白色棒のＲＷ／食塩水／食塩水で示した）。加えて、ケモカインＴＡＲＣ、ＭＤＣ及びエオタキシンのｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＷ／ＲＷ／食塩水マウスにおいて、アレルゲンチャレンジ後にアップレギュレーションされた。対照的に、１０１８  ＩＳＳで前処置されたマウスにおいて（黒色棒のＲＷ／ＲＷ／１０１８として示す）、様々なサイトカイン及びケモカインの発現レベルのブタクサ−誘導したアップレギュレーションは、しかし、１０１８  ＩＳＳ前処置が−１日目もしくは−３日目、又は一部の遺伝子については−５日目に与えられた場合にのみ、阻害された。
【０２０２】
図２において、ＧＯＢ−５及びＣ２に関する遺伝子／ユビキチン比が示されている。ＧＯＢ−５及びＣ２（ＦＩＺＺ−１としても公知）は両方とも、ＩＬ−４により気道において誘導されることがわかっている遺伝子である。本発明者らのデータから、ブタクサによるチャレンジは、両方の遺伝子のアップレギュレーションに繋がったことは明らかである。対照的に、ブタクサによるチャレンジの数日前に与えられた１０１８  ＩＳＳによる前処置は、Ｔｈ２−型気道炎症に関連したこれらのｍＲＮＡの発現を阻害した。ＧＯＢ−５に関して、１０１８  ＩＳＳ処置は、−１日目又は−３日目に投与された場合に有効である。Ｃ２に関して、１０１８  ＩＳＳ処置は、−３日目又は−５日目に投与された場合に有効である。
【０２０３】
アレルギー喘息のマウスモデルにおけるＩＳＳによる前処置は、アレルゲン−誘導した気道好酸球増加症及び気道過敏症を阻害することが公表されている(Broideら、J. Immunol, 161:7054, 1998)。本発明者らは、この阻害は、気道におけるＩＳＳ−誘導したＴｈ２及びＴｈ２−依存型遺伝子発現レベルのダウンレギュレーションと相関することを示した(Hesselら、(2005) J. Exp. Med., 202(11):1563)。
【０２０４】
ここで本発明者らは、気道におけるアレルゲン−誘導したＴｈ２反応のＩＳＳ−媒介した阻害の期間を決定した。この有効性のウインドウを確立する方法として、本発明者らは、感作したマウスにおけるアレルゲンチャレンジ後のＴｈ２−型気道炎症の発症に必須の又は発症に密に関連している気道における一連の遺伝子の発現を測定した。本発明者らのデータは、アレルゲンチャレンジの１〜３日前に与えられた１０１８  ＩＳＳは、これらの遺伝子の大部分を阻害することができ、このことは気道におけるＴｈ２反応の大きな減少を招いたことを明らかにしている。本発明者らは、１０１８  ＩＳＳがアレルゲンチャレンジから更に離れて投与される（すなわち−３日目よりも早く）場合、Ｔｈ２又はＴｈ２−依存型の遺伝子発現をダウンレギュレーションすることができないことを認めた。
【０２０５】
従って、ＩＳＳ処置の気道Ｔｈ２反応に対する直接作用を研究することを求める場合、アレルゲンチャレンジ前１〜３日以内に前処置することが推奨されるのに対し、ＩＳＳの疾患修飾に対する長期作用を研究することに関心がある場合は、直接のＩＳＳ作用が存在しないことを確実にするために、ＩＳＳ処置後少なくとも１週間は待つことが推奨される。
【０２０６】
実施例２：ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる長期鼻腔内処置の作用
本実験セットの目的のひとつは、ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおいて、１０１８  ＩＳＳによる長期鼻腔内処置が、疾患修飾につながるかどうかを調べることである。ブタクサ−感作しかつチャレンジしたマウスにおける、１０１８  ＩＳＳでの毎週１回の鼻腔内処置の長期作用を調べた。
【０２０７】
マウスは、鼻腔内低投与量のブタクサで、感作し、引き続き週１回を基本にチャレンジした。同じく週１回を基本に、マウスを、食塩水又は１０１８  ＩＳＳのいずれかで、鼻腔内処置した。この実験過程のいくつかの時点で、マウスを、２週間の休薬期間のために、別にした。この休薬期間は、１０１８  ＩＳＳ処置の直接作用を減弱することを確実にするためであった。この２週間の終わりに、これらのマウスを、高投与量のブタクサで再チャレンジし、このアレルゲンチャレンジに対する反応を、気道内のＴｈ２及びＴｈ１サイトカイン量を測定することにより、及び気道の好酸球浸潤の量を決定することにより、評価した。
【０２０８】
より詳細には、使用した物質は以下であった：１０１８(ロット番号AGU-003, Dynavax社)；ブタクサ(花粉ロット#16、24QQ 56-9FD-3、2003年1月17日抽出、Dynavax社)；パイロジェンフリー食塩水(Sigma社)。使用した方法は、以下であった：試験は、Charles River社(ホリスター、CA)から入手した６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。マウスを、ミョウバン上のブタクサ１５μｇで、０日目及び７日目に腹腔内感作した。１４日目以降開始し、マウスは、軽いイソフロライン麻酔下で、ブタクサ０．５μｇ又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）により、週１回を基本で鼻腔内チャレンジした。同時に、マウスは、１０１８  ＩＳＳ（２０μｇ／５０μｌ食塩水）又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）で、鼻腔内経路を介して、週１回で処置した。抗原チャレンジ及びＩＳＳ処置の１、２、６及び１０週間後、マウスは、２週間の休薬期間のために別にし、その後ブタクサ５μｇで鼻腔内再チャレンジした。２４時間後、肺を洗浄し、その洗浄液中のサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、及びＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ検出レベルは、各々、８、８、８、及び２３ｐｇ／ｍｌであった。洗浄液は、遠心し、回収した細胞を、トリパンブルーを用いてカウントした。残存する細胞を用い、サイトスピン(cytospin)を調製し、ライト・ギムザ染色により染色した。分画的細胞カウントを行い、好酸球の数を各サイトスピンについて決定した。
【０２０９】
図３及び４において、洗浄液（ＢＡＬ液）中で測定されたＴｈ２−型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０のレベルは、ｐｇ／ｍｌで示されている。加えて図４において、Ｔｈ１−型サイトカインＩＦＮ−γが示されている。これらの結果は、感作されたマウスにおける週１回のブタクサによるチャレンジは、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０に加え、高い数の好酸球（図５に示された）を伴い、気道における頑固なＴｈ２炎症に繋がったことを示している。これらの高レベルのＴｈ２サイトカイン及び好酸球は、ブタクサで感作したマウスを、食塩水でのみチャレンジした場合には存在しなかった。マウスをブタクサでチャレンジし、同時に１０１８  ＩＳＳで処置した場合、食塩水又はＩＳＳで処置したブタクサ−チャレンジしたマウスを比較すると、ＩＳＳ処置の１、２、又は６週間後に有意差は認められなかった。しかし、１０１８  ＩＳＳ処置の１０週間後、Ｔｈ２サイトカインレベルに加え好酸球数は、有意に減少し（ＩＬ−１３：＊ ｐ＜０．０５；ＩＬ−４、ＩＬ−１０、及び好酸球：＊＊ ｐ＜０．０１）、これはＴｈ２炎症がこれらのマウスにおいて阻害されたことを示している。更に、これらのデータは、ＩＦＮ−γのレベルの増加は、１０１８  ＩＳＳで処置したマウスにおいて測定したいずれの時点においても誘導されないことを示し、これは、１０１８  ＩＳＳによる１０週間の処置は、気道における顕性のＴｈ１−型反応を誘導しなかったことを示している。
【０２１０】
本実験において説明された本発明者らの実験データは、ＩＳＳ処置は、疾患修飾、すなわちアレルゲンに対するＴｈ２反応の阻害に繋がらなかったが、これは、他方で、気道における顕性のＴｈ１反応の発生を随伴しなかったことを明らかにした。実施例１において、本発明者らは、１０１８  ＩＳＳの気道におけるＴｈ２反応に対する直接作用は、１週間未満続いたことを決定した。従って本実施例において、全てのマウスは、それらの最後のＩＳＳ処置後、少なくとも２週間休薬し、その後アレルゲンで再チャレンジした。従って認められたいずれの作用も、ＩＳＳ処置の直接作用に起因しなかった。アレルゲンによる再チャレンジに対する反応は、気道が依然アレルゲンチャレンジに対する反応でＴｈ２炎症を発症しているかどうか、又はこれらはアレルゲンチャレンジに対し不応性(refractory)となり始めているかどうかを決定するためであった。本発明者らのデータは、本疾患の修飾作用を実現するためには、少なくとも１０週間の鼻腔内１０１８  ＩＳＳ処置が必要であることを示した。
【０２１１】
実施例３：ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる長期鼻腔内処置の作用
本実験セットは、ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおいて、１０１８  ＩＳＳによる長期鼻腔内処置が、疾患修飾をもたらしたかどうかを調べ、１０１８  ＩＳＳ処置を停止し、アレルゲン曝露を継続した後、この疾患修飾が維持されるかどうかを評価するために行った。
【０２１２】
マウスは、鼻腔内低投与量のブタクサで、感作し、引き続き週１回を基本にチャレンジした。同じく週１回を基本に、マウスを、食塩水又は１０１８  ＩＳＳのいずれかで、鼻腔内処置した。この実験過程のいくつかの時点で、マウスを、２週間の休薬期間のために、別にした。この休薬期間は、１０１８  ＩＳＳ処置の直接作用を減弱することを確実にするためであった。この２週間の終わりに、これらのマウスを、高投与量のブタクサで再チャレンジし、このアレルゲンチャレンジに対する反応を、気道内のＴｈ２及びＴｈ１サイトカイン量を測定することにより評価した。本試験に含まれた実験群は、以下であった：
【０２１３】
【表３】
0006023142.tif 000007
【０２１４】
１２週間のＩＳＳ処置及び合計２５週間のアレルゲンチャレンジを受け取るマウスの目的は、ＩＳＳ−誘導した疾患修飾が、連続したアレルゲン曝露の存在下で長期間持続したかどうかを評価するためであった。
【０２１５】
より詳細には、使用した物質は以下であった：１０１８(ロット番号AGU-003, Dynavax社)；ブタクサ(花粉ロット#01/26/05、Dynavax社)；パイロジェンフリー食塩水(Sigma社)。試験は、Charles River社(ホリスター、CA)から入手した６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。マウスを、ミョウバン上のブタクサ１５μｇで、０日目及び７日目に腹腔内感作した。１４日目以降開始し、マウスは、軽いイソフロライン麻酔下で、ブタクサ０．５μｇ又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）により、週１回を基本で鼻腔内チャレンジした。同時に、マウスは、１０１８  ＩＳＳ（２０μｇ／５０μｌ食塩水）又はTOLAMBA（２０μｇ／５０μｌ食塩水）又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）で、鼻腔内経路を介して、週１回で処置した。抗原チャレンジ及びＩＳＳ処置の１、８、１２、１６及び２５週間後、マウスは、２週間の休薬期間のために別にし、その後ブタクサ５μｇで鼻腔内再−チャレンジした。２４時間後、肺を洗浄し、その洗浄液中のサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２１６】
結果：図６に示したように、洗浄液（ＢＡＬ液）中で測定されたＴｈ２−型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＬ−１０のレベルは、ｐｇ／ｍｌで示されている。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、及びＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡの検出レベルは、各々、８、８、８、８、及び２３ｐｇ／ｍｌであった。加えてＴｈ１−型サイトカインＩＦＮ−γを測定したが、検出レベルを上回るＩＦＮ−γの誘導はいずれの処置群においても測定されなかった。本発明者らの結果は、感作されたマウスにおける週１回のブタクサによるチャレンジは、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１０を伴い、気道における頑固なＴｈ２炎症に繋がったことを示している。マウスをブタクサでチャレンジし、同時に１０１８  ＩＳＳで処置した場合、食塩水又はＩＳＳで処置したブタクサ−チャレンジしたマウスを比較すると、ＩＳＳ処置の１週間後に有意差は認められなかった。しかし１０１８  ＩＳＳ処置の８、１２、１６及び２５週間後、Ｔｈ２サイトカインレベルは、有意に減少し、これは、アレルゲン−誘導したＴｈ２炎症は１０１８  ＩＳＳ−処置したマウスにおいて阻害されたことを示している。検出可能なレベルのＩＦＮ−γは１０１８  ＩＳＳで処置したマウスにおいて測定したいずれの時点においても誘導されないという知見は、２５週間の１０１８  ＩＳＳ処置は、気道における顕性のＴｈ１−型反応を誘導しなかったことを示している。１２週間１０１８  ＩＳＳで処置し、引き続き更に１３週間アレルゲンチャレンジを受けることを継続した群において、Ｔｈ２反応は阻害され続け、このことは、１０１８  ＩＳＳにより誘導された疾患修飾は、長期間持続することを示している。
【０２１７】
実施例２において、本発明者らは、１０週間のＩＳＳ処置は、疾患修飾、すなわちアレルゲンに対するＴｈ２反応の阻害に繋がるが、これは、気道における顕性のＴｈ１反応の発生を随伴しなかったことを明らかにした。ここで説明された実験は、この発見を、疾患修飾は８週間の１０１８  ＩＳＳ処置後に事実上既に達成されており、この疾患修飾は、アレルゲン曝露が更に１３週間継続された場合にさえ持続するという知見に拡大している。
【０２１８】
実施例４：ＩＳＳ−コンジュゲート
１０１８  ＩＳＳ及びＡｍｂ ａ Ｉにコンジュゲートされた１０１８  ＩＳＳ(TOLAMBAとして公知のコンジュゲート）の両方を使用した以外は、前記実施例３に類似した方法を用いた。図７は、鼻腔内経路を介して週１回を基本で２５週間１０１８  ＩＳＳの２０μｇ、又は鼻腔内経路を介して週１回を基本で２５週間TOLAMBAの２０μｇにより処置したマウスにおける、Ｔｈ２−型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１３の測定の結果を示すグラフである。Ｔｈ２抑制は、ＩＳＳ−コンジュゲートを使用した場合にも認められた。
【０２１９】
実施例５：ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる長期間鼻腔内処置の作用及びＩＦＮ−γの役割
本実験は、ブタクサ−誘導したアレルギー喘息のマウスモデルにおける１０１８  ＩＳＳによる長期間鼻腔内処置により誘導された疾患修飾の維持が、サイトカインＩＦＮ−γにより媒介されるかどうかを調べるために行った。
【０２２０】
マウスは、鼻腔内低投与量のブタクサで、感作し、引き続き週１回を基本にチャレンジした。同じく週１回を基本に、マウスを、食塩水又は１０１８  ＩＳＳのいずれかで、鼻腔内処置した。この実験過程のいくつかの時点で、マウスを、２週間の休薬期間のために、別にした。この休薬期間は、１０１８  ＩＳＳ処置の直接作用を減弱することを確実にするためであった。２週間の終わりに、これらのマウスを、高投与量のブタクサで再チャレンジし、このアレルゲンチャレンジに対する反応を、気道内のＴｈ２及びＴｈ１サイトカインの量を測定することにより評価した。本試験に含まれた実験群は、以下であった：
【０２２１】
【表４】
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【０２２２】
１３週間のＩＳＳ処置及び合計１７週間のアレルゲンチャレンジを受け取るマウスの目的は、ＩＳＳ−誘導した疾患修飾が、連続したアレルゲン曝露の存在下で長期間持続したかどうかを評価するためであった。抗体処置を受け取る群（対照又は抗−ＩＦＮ−γ抗体のいずれか）の目的は、ＩＦＮ−γはＩＳＳ−誘導した疾患修飾の維持に必要かどうかを評価するためであった。
【０２２３】
より詳細には、使用した物質は以下であった：１０１８  ＩＳＳ(ロット番号AGU-003, Dynavax社)；ブタクサ(花粉ロット#01/26/05、Dynavax社)；パイロジェンフリー食塩水(Sigma社)。試験は、Charles River社(ホリスター、CA)から入手した６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスで行った。マウスを、ミョウバン上のブタクサ１５μｇで、０日目及び７日目に腹腔内感作した。１４日目以降開始し、マウスは、軽いイソフロライン麻酔下で、ブタクサ０．５μｇ又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）により、週１回を基本で鼻腔内チャレンジした。同時に、マウスは、１０１８  ＩＳＳ（２０μｇ／５０μｌ食塩水）又はパイロジェンフリー食塩水（５０μｌ）で、鼻腔内経路を介して、週１回で処置した。いくつかの群においては、マウスは、アイソタイプ対照抗体（クローンGL113)又はＩＦＮ−γに対する抗体(クローンXMGl.2)(２００μｌ中２ｍｇ、週１回）により、１３〜１７週目の間、腹腔内処置した。抗原チャレンジ及びＩＳＳ処置の１、３、８、１３及び１７週後、マウスは、２週間の休薬期間のために別にし、その後ブタクサ５μｇで鼻腔内再−チャレンジした。２４時間後、肺を洗浄し、その洗浄液中のサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０２２４】
結果：図８において、洗浄液（ＢＡＬ液）中で測定されたＴｈ２−型サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１３及びＩＬ−５のレベルは、ｐｇ／ｍｌで示されている。ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、及びＩＦＮ−γＥＬＩＳＡの検出レベルは、各々、１６、１６、３１、及び１６ｐｇ／ｍｌであった。加えてＴｈ１−型サイトカインＩＦＮ−γを測定したが、検出レベルを上回るＩＦＮ−γの誘導はいずれの処置群においても測定されなかった。本発明者らの結果は、感作されたマウスにおける週１回のブタクサによるチャレンジは、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びＩＬ−５を伴い、気道における頑固なＴｈ２炎症に繋がったことを示している。マウスをブタクサでチャレンジし、同時に１０１８  ＩＳＳで処置した場合、食塩水又はＩＳＳで処置したブタクサ−チャレンジしたマウスを比較すると、ＩＳＳ処置の１又は３週間後にＩＬ−４及びＩＬ−５において有意差は認められなかった。ＩＬ−１３レベルは、ＩＳＳ−処置及びブタクサ−チャレンジしたマウスにおいて、ＩＳＳ処置の１又は３週間後に、有意に阻害された。しかし１０１８  ＩＳＳ処置の８、１３、及び１７週間後、３種のＴｈ２サイトカインレベルは全て有意に減少し、これは、アレルゲン−誘導したＴｈ２炎症は１０１８  ＩＳＳ−処置したマウスにおいて阻害されたことを示している。検出可能なレベルのＩＦＮ−γは１０１８  ＩＳＳで処置したマウスにおいて測定したいずれの時点においても誘導されないという知見は、１７週間の１０１８  ＩＳＳ処置は、気道における顕性のＴｈ１−型反応を誘導しなかったことを示している。１３週間１０１８  ＩＳＳで処置し、引き続き更に４週間アレルゲンチャレンジを受けることを継続した群において、Ｔｈ２反応は阻害され続け、このことは、１０１８  ＩＳＳにより誘導された疾患修飾は、長期間持続することを示している。１３週間１０１８  ＩＳＳで処置し、引き続きアレルゲン曝露を継続し、対照又は抗−ＩＦＮ−γ抗体のいずれかで処置した群において、Ｔｈ２反応は同じく阻害され続け、このことは、ＩＦＮ−γは疾患修飾の維持に必要でないことを示している。
【０２２５】
実施例２において、本発明者らは、１０週間のＩＳＳ処置は、疾患修飾、すなわちアレルゲンに対するＴｈ２反応の阻害に繋がったが、これは、気道における顕性のＴｈ１反応の発生を随伴しなかったことを明らかにした。実施例３において、本発明者らは、疾患修飾は８週間の１０１８  ＩＳＳ処置後既に達成されており、この疾患修飾は、アレルゲン曝露が更に１３週間継続された場合にさえ持続することを明らかにした。本実験は、疾患修飾は８週間の１０１８  ＩＳＳ処置後に達成されているという知見を反復し、ＩＦＮ−γはこの疾患修飾の維持に必要ではないという知見に拡大している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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