(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体の精製方法であって、
ａ．モノクローナル抗体を含有するサンプルを準備し、
ｂ．該サンプルを捕捉アフィニティクロマトグラフィー樹脂により処理して、該モノクローナル抗体を含む第１溶出液を得、
ｃ．第１溶出液中のウイルスを不活性化させて、該モノクローナル抗体を含む不活性化溶出液を得、
ｄ．該不活性化溶出液を少なくとも１つのデプスフィルターにより処理して、該モノクローナル抗体を含む濾過溶出液を得、および
ｅ．該濾過溶出液を少なくとも１つのイオン交換膜により処理して、該モノクローナル抗体を含む第２溶出液を得ること
を含み、第２溶出液は、セラミックハイドロキシアパタイトを用いてさらに精製されない、前記精製方法。
【請求項２】
デプス濾過工程およびイオン交換膜工程をフィルター列において行う、請求項１記載の方法。
【請求項３】
捕捉アフィニティクロマトグラフィー樹脂が、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、プロテインＡ／Ｇ樹脂およびプロテインＬ樹脂からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、細胞培養である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
捕捉アフィニティクロマトグラフィー樹脂により処理する前に、サンプルを清澄化する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
遠心分離、精密濾過、限外濾過、デプス濾過、滅菌濾過および界面活性剤での処理からなる群から選択される清澄化方法により、サンプルを清澄化する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ウイルス不活性化が、酸、界面活性剤、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ照射線および熱での処理からなる群から選択される方法を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ウイルス不活性化が、第１溶出液のｐＨを３〜４のｐＨに低下させることを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ウイルス不活性化中に、第１溶出液を３０〜９０分間インキュベートする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
デプス濾過工程の前に、不活性化溶出液をｐＨ５〜１０に調節する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
デプス濾過工程が、少なくとも１つのデプスフィルターでの濾過を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
デプス濾過工程が、直列または並列に配置された少なくとも２つのデプスフィルターでの濾過を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
デプス濾過工程の後、カプセル滅菌濾過工程を行う、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
イオン交換膜が、Ｑ膜を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
Ｑ膜工程をフロースルー形態で行う、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
イオン交換膜工程の後、カプセル滅菌濾過工程を行う、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
不活性化溶出液を１つのデプスフィルターにより処理し、濾過溶出液を直列のイオン交換膜により処理する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
第２溶出液を更に、追加的クロマトグラフィー工程に付す、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
追加的クロマトグラフィー工程が、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
第２溶出液を更に、ナノ濾過工程に付す、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
第２溶出液を更に、限外濾過およびダイアフィルトレーション工程に付す、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
モノクローナル抗体の精製方法であって、
ａ．モノクローナル抗体を含有するサンプルを準備し、
ｂ．該サンプルを清澄化して清澄化サンプルを得、
ｃ．該清澄化サンプルを捕捉アフィニティクロマトグラフィー樹脂により処理して、該モノクローナル抗体を含む第１溶出液を得、
ｄ．第１溶出液中のウイルスを不活性化させて、該モノクローナル抗体を含む不活性化溶出液を得、
ｅ．該不活性化溶出液を少なくとも１つのデプスフィルターにより処理して、該モノクローナル抗体を含む濾過溶出液を得、
ｆ．該濾過溶出液を少なくとも１つのイオン交換膜により処理して、該モノクローナル抗体を含む第２溶出液を得、
ｇ．該第２溶出液を追加的クロマトグラフィー樹脂により処理して、該モノクローナル抗体を含む第３溶出液を得、
ｈ．該第３溶出液をナノ濾過に付して、該モノクローナル抗体を含むナノ濾過溶出液を得、および
ｉ．該ナノ濾過溶出液を限外濾過およびダイアフィルトレーションに付すこと
を含み、第２溶出液又は第３溶出液がセラミックハイドロキシアパタイトを用いてさらに精製されない、前記精製方法。
【請求項２３】
追加的クロマトグラフィー樹脂が、陽イオン交換樹脂を含む、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的には、タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大規模なタンパク質精製の経済的側面は、特に治療用抗体の場合には重要である。なぜなら、抗体は市販の治療用生物製剤の大きな割合を占めるからである。例えば、モノクローナル抗体は、その治療的重要性に加えて、診断分野においても重要な手段である。多数のモノクローナル抗体が開発されており、多数の疾患の診断、妊娠の診断および薬物試験に使用されている。
【０００３】
典型的な精製方法は、純度、収率および処理量の要件を満足させるために、複数のクロマトグラフィー工程を含む。該工程は、典型的に、捕捉、中間精製または純化および最終純化を含む。アフィニティクロマトグラフィー（プロテインＡまたはＧ）またはイオン交換クロマトグラフィーが、しばしば、捕捉工程として用いられる。伝統的には、該捕捉工程の後、適度な純度およびウイルス除去を保証するために、少なくとも２つの他の中間精製または純化クロマトグラフィー工程を行う。該中間精製または純化工程は、典型的に、とりわけ、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用により達成される。伝統的な方法においては、最終純化工程はイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーにより達成されうる。これらの工程は、産物流および細胞培養からの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、浸出プロテインＡ、凝集物、断片、ウイルスおよび他の小分子不純物を含む、プロセス化関連および産物関連不純物を除去する。
【発明の概要】
【０００４】
簡潔には、本発明は、１つの実施形態において、タンパク質を含有するサンプルを準備し、該サンプルを捕捉クロマトグラフィー樹脂でプロセス化して、該タンパク質を含む第１溶出液を得、第１溶出液中のウイルスを不活性化させて、該タンパク質を含む不活性化溶出液を得、該不活性化溶出液を少なくとも１つのデプスフィルターでプロセス化して、該タンパク質を含む濾過溶出液を得、該濾過溶出液を少なくとも１つのイオン交換膜でプロセス化して、該タンパク質を含む第２溶出液を得る、タンパク質の精製方法に関する。
【０００５】
更に、本発明は、１つの実施形態において、タンパク質を含有するサンプルを準備し、該サンプルを清澄化して清澄化サンプルを得、該清澄化サンプルを捕捉クロマトグラフィー樹脂でプロセス化して、該タンパク質を含む第１溶出液を得、第１溶出液中のウイルスを不活性化させて、該タンパク質を含む不活性化溶出液を得、該不活性化溶出液を少なくとも１つのデプスフィルターでプロセス化して、該タンパク質を含む濾過溶出液を得、該濾過溶出液を、該デプスフィルターに連続的に合体している又は別々の工程で使用される少なくとも１つのイオン交換膜でプロセス化して、該タンパク質を含む第２溶出液を得、該第２溶出液を追加的なクロマトグラフィー樹脂でプロセス化して、該タンパク質を含む第３溶出液を得、該第３溶出液をナノ濾過に付して、該タンパク質を含むナノ濾過溶出液を得、該ナノ濾過溶出液を限外濾過およびナノ濾過またはダイアフィルトレーションに付すことを含む、タンパク質の精製方法に関する。
【０００６】
実施形態の詳細な説明
以下に本発明の実施形態を詳細に説明し、それらの１以上の実施例（具体例）を後記に記載する。各実施例は本発明の説明のために記載されており、本発明を限定するものではない。実際、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明において種々の修飾および変更が施されうることが、当業者に明らかであろう。例えば、１つの実施形態の一部として例示または記載されている特徴が別の実施形態で用いられて、更に別の実施形態を構成しうる。
【０００７】
したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲に含まれる修飾および変更を含むと意図される。本発明の他の目的、特徴および態様は以下の詳細の説明に開示されているか、または該説明から明らかである。本考察は典型的な実施形態の説明に過ぎず、本発明の、より広い態様を限定することを意図するものではない、と当業者により理解されるべきである。
【０００８】
１つの実施形態においては、本発明はタンパク質精製系および方法を含む。本精製系の実施形態に関する概要図を図１〜４に示す。
【０００９】
本発明の１つの実施形態においては、タンパク質を含有するサンプルを準備する。タンパク質を含有する任意のサンプルが本発明において使用されうる。タンパク質を含有する該サンプルは、例えば、細胞培養またはマウス腹水を含みうる。一例として、該タンパク質は撹拌したタンクバイオリアクター内のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現されうる。該タンパク質は、当技術分野で公知の任意のタンパク質またはその断片でありうる。種々の実施形態においては、該タンパク質は、融合タンパク質、例えばＦｃ−融合タンパク質である。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、該タンパク質は抗体である。特定の実施形態においては、該タンパク質はモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。幾つかの場合には、該タンパク質はヒトモノクローナル抗体でありうる。他の実施形態においては、該タンパク質は免疫グロブリンＧ抗体である。１つの実施形態においては、該タンパク質は修飾免疫グロブリンＧ抗体、ヒト化免疫グロブリンＧ抗体または組換え免疫グロブリンＧ抗体でありうる。特定の実施形態においては、該タンパク質はＩｇＧ１免疫グロブリンでありうる。該タンパク質は、ある実施形態においては、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のエピトープに特異的でありうる。該タンパク質は、もう１つの実施形態においては、ＩＬ−１３上の特有のエピトープに対する組換えヒト化中和モノクローナル抗体でありうる。
【００１１】
本発明の実施形態においては、該タンパク質を含有するサンプルは、まず、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて清澄化されうる（図１〜４、工程１）。該清澄化工程は該サンプルからの細胞、細胞残渣および幾つかの宿主細胞不純物を除去するためのものである。１つの実施形態においては、該サンプルは１以上の遠心分離工程により清澄化されうる。該サンプルの遠心分離は、当技術分野で公知のとおりに行われうる。例えば、該サンプルの遠心分離は、約１×１０−８ｍ／ｓの標準化ローディングおよび約５，０００×ｇ〜約１５，０００×ｇの重力を用いて行われうる。
【００１２】
もう１つの実施形態においては、該サンプルは１以上のデプス濾過工程により清澄化されうる。デプス濾過は、次第に減少する孔径を有する連続的に配置された一連のフィルターを使用して溶液から粒子を除去する方法を意味する。デプスフィルター三次元マトリックスは、該サンプルが通過する迷路状経路を生成する。デプスフィルターの主な保持メカニズムは、該マトリックスの深さ全体にわたるランダムな吸着および機械的捕捉に基づく。種々の実施形態においては、該フィルター膜またはシートは、巻かれた綿、ポリプロピレン、レーヨンセルロース、ガラス繊維、焼結金属、磁器、珪藻土または他の公知成分でありうる。ある実施形態においては、該デプスフィルター膜を含む組成物は、該フィルターがＤＮＡ、宿主細胞タンパク質または凝集物のような負荷電粒子を捕捉することを可能にするために、正電荷、すなわち、陽イオン電荷を付与するために化学的に処理されうる。
【００１３】
当業者に利用可能な任意のデプス濾過系がこの実施形態において使用されうる。特定の実施形態においては、該デプス濾過工程は、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）Ｐｏｄデプスフィルター系、Ｘ０ＨＣ媒体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）を使用して達成されうる。もう１つの実施形態においては、該デプス濾過工程は、Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ（商標）Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒ（３Ｍ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．から入手可能）を使用して達成されうる。
【００１４】
幾つかの実施形態においては、該デプスフィルター媒体は約０．１μｍ〜約８μｍの公称孔径を有する。他の実施形態においては、該デプスフィルター媒体は約２μｍ〜約５μｍの公称孔径を有しうる。特定の実施形態においては、該デプスフィルター媒体は約０．０１μｍ〜約１μｍの孔径を有しうる。更に他の実施形態においては、該デプスフィルター媒体は約１μｍを超える孔径を有しうる。他の実施形態においては、該デプスフィルター媒体は約１μｍ未満の孔径を有しうる。
【００１５】
幾つかの実施形態においては、該清澄化工程は、直列（連続的）に配置された２以上のデプスフィルターの使用を含みうる。それらのデプスフィルターは互いに同じ又は異なりうる。この実施形態においては、例えば、Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標）ｍｉｎｉ  Ｄ０ＨＣおよびＸ０ＨＣフィルターが直列に接続され、本発明の清澄化工程において使用されうるであろう。
【００１６】
もう１つの実施形態においては、該清澄化工程は３以上のデプスフィルターの使用を含みうる。１つの実施形態においては、該清澄化工程は、並列に配置された複数（例えば、１０）単位のデプスフィルターの使用を含みうる。この実施形態においては、複数単位のデプスフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｘ０ＨＣフィルターでありうる。
【００１７】
特定の実施形態においては、該清澄化工程は、遠心分離の利用、およびそれに続いて連続的に行われるＸ０ＨＣデプス濾過により達成されうる（図２〜４、工程１）。
【００１８】
もう１つの実施形態においては、該サンプルは接線流動濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）法による精密濾過または限外濾過膜により清澄化されうる。当技術分野で公知のいずれかのＴＦＦ清澄化法がこの実施形態で用いられうる。ＴＦＦは、圧力勾配により駆動されるクロスフロー形態の膜分離法を意味し、この場合、該膜は、粒子および／または溶質のサイズおよび構造に応じて液体混合物の成分を分画する。清澄化においては、選択された膜孔径は、膜表面上に細胞および細胞残渣を保持しながら、幾つかの成分が該細孔を水と共に通過することを可能にする。ＴＦＦ清澄化は、例えば０．１μｍまたは７５０ｋＤ分子量カットオフ、５〜４０ｐｓｉｇおよび約４℃〜約６℃の温度を用いて、ポリスルホン膜を使用して行われうる。
【００１９】
本発明の１つの実施形態においては、該清澄化工程は、サンプルを界面活性剤で処理することを含みうる。使用される界面活性剤は、タンパク質精製法において有用であることが知られているいずれかの界面活性剤でありうる。１つの実施形態においては、該界面活性剤は低レベルで該サンプルに適用され、ついで該サンプルは、包膜哺乳類ウイルスを不活性化させるのに十分な時間にわたってインキュベートされうる。１つの実施形態において適用される界面活性剤のレベルは約０〜約１％（ｖ／ｖ）でありうる。もう１つの実施形態においては、適用される界面活性剤のレベルは約０．０５％〜約０．７％（ｖ／ｖ）でありうる。更にもう１つの実施形態においては、適用される界面活性剤のレベルは約０．５％（ｖ／ｖ）でありうる。特定の実施形態においては、該界面活性剤はポリソルベート８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．から入手可能なＴｗｅｅｎ（登録商標）、またはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨから入手可能なＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）でありうる。
【００２０】
当技術分野で公知であるこれらの又は他の清澄化方法の組合せのいずれかが本発明の清澄化工程として使用されうる。
【００２１】
１つの実施形態においては、本発明の清澄化工程の後、該サンプルはクロマトグラフィー捕捉工程に付されうる（図１〜４、工程２を参照されたい）。該捕捉工程は、清澄化サンプル中に存在する他の不純物から標的タンパク質を分離するように設計される。しばしば、該捕捉工程は該サンプル中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡおよび内因性ウイルスまたはウイルス様粒子を減少させる。この実施形態において使用されるクロマトグラフィー技術は、捕捉工程として用いられることが当技術分野で公知のいずれかの技術でありうる。１つの実施形態においては、該サンプルは、捕捉工程として、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合形態クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィーに付されうる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態においては、該捕捉工程としてアフィニティクロマトグラフィーが用いられうる。アフィニティクロマトグラフィーは分子間の特異的結合相互作用を利用する。特定のリガンドが固体支持体に化学的に固定化または「カップリング」される。該サンプルが樹脂を通過すると、該リガンドに対する特異的結合アフィニティを有する、該サンプル中のタンパク質が結合する。ついで、他のサンプル成分が洗い落とされた後、該結合タンパク質が該固定化リガンドから除去され溶出されて、元のサンプルからのその精製がもたらされる。
【００２３】
本発明のこの実施形態においては、該アフィニティクロマトグラフィー捕捉工程は、抗原と抗体との相互作用、酵素と基質との相互作用、または受容体とリガンドとの相互作用を含みうる。本発明の特定の実施形態においては、該アフィニティクロマトグラフィー捕捉工程はプロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、プロテインＡ／ＧクロマトグラフィーまたはプロテインＬクロマトグラフィーを含みうる。
【００２４】
ある実施形態においては、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは本発明の捕捉工程において用いられうる（図２〜４、工程２を参照されたい）。プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーは、多数のクラスの免疫グロブリンの非抗原結合部分への特異的結合を示す細菌タンパク質であるプロテインＡの使用を含む。使用されるプロテインＡ樹脂はいずれかのプロテインＡ樹脂でありうる。１つの実施形態においては、プロテインＡ樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）系列の樹脂から選択されうる。もう１つの実施形態においては、プロテインＡ樹脂は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ樹脂でありうる。当技術分野で利用可能ないずれかのカラムがこの工程において使用されうる。特定の実施形態においては、該カラムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂、またはＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ樹脂が充填されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なカラム（例えば、Ｑｕｉｃｋｓｃａｌｅカラム）が充填されたカラムでありうる。
【００２５】
プロテインＡアフィニティがクロマトグラフィー工程として用いられる場合、該カラムは約３５ｃｍの内径および２０ｃｍのカラム長を有しうる。他の実施形態においては、該カラム長は約５ｃｍ〜約３５ｃｍでありうる。更にもう１つの実施形態においては、該カラム長は約１０ｃｍ〜約２０ｃｍでありうる。更にもう１つの実施形態においては、該カラム長は５ｃｍ以上でありうる。１つの実施形態においては、該カラムの内径は約０．５ｃｍ〜約１００または２００ｃｍでありうる。もう１つの実施形態においては、該カラムの内径は約１０ｃｍ〜約５０ｃｍでありうる。更にもう１つの実施形態においては、該カラムの内径は１５ｃｍ以上でありうる。
【００２６】
該カラムを通過する該サンプルの流動、洗浄および溶出を含む該クロマトグラフィー捕捉工程に用いられる具体的な方法は、使用される具体的なカラムおよび樹脂に左右され、典型的には、製造業者により提供されるか、または当技術分野で公知である。本明細書中で用いる「プロセス化（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）」なる語は、サンプルをクロマトグラフィーカラム、樹脂、膜、フィルターまたは他の構造体内に流動または通過させる方法を意味することがあり、各構造体を通過する連続的流動、および各構造体間で中断または停止される流動を含むものとする。
【００２７】
該クロマトグラフィー捕捉工程の後、該溶出液は組合せプロセス化工程に付されうる。この組合せ工程は、１つの実施形態においては、ウイルス不活性化、およびそれに続く、１以上のデプスフィルターおよびイオン交換膜に通過させるプロセス化を含む（図１〜４、工程３を参照されたい）。１つの実施形態においては、該デプス濾過およびイオン交換膜は直列のフィルター列として設計されうる。
【００２８】
１つの実施形態においては、該ウイルス不活性化工程は低ｐＨウイルス不活性化を含みうる。１つの態様においては、低ｐＨウイルス不活性化のための目標範囲の最終溶出液プールにおける更なるｐＨ調節を行うことなく、溶出のための低ｐＨでの高濃度のグリシンバッファーの使用が行われうる。あるいは、酢酸バッファーまたはクエン酸バッファーが溶出に使用され、ついで該溶出液プールは、低ｐＨウイルス不活性化のための、より適切なｐＨ範囲へと滴定されうる。１つの実施形態においては、該ｐＨは約２．５〜約４である。もう１つの実施形態においては、該ｐＨは約３〜約４である。
【００２９】
１つの実施形態においては、該溶出液プールのｐＨが低下したら、該プールは約１５〜約９０分間の時間にわたってインキュベートされる。特定の実施形態においては、該低ｐＨウイルス不活性化工程は、約３．５のｐＨを得るための０．５Ｍ  リン酸の滴下により達成されうる。ついで該サンプルは、約６０分〜９０分の時間にわたってインキュベートされうる。
【００３０】
該低ｐＨウイルス不活性化工程の後、該不活性化溶出液プールはより高いｐＨへと中和されうる。１つの実施形態においては、その中和された、より高いｐＨは、約５〜約１０のｐＨでありうる。もう１つの実施形態においては、その中和された、より高いｐＨは、約８〜約１０のｐＨでありうる。更にもう１つの実施形態においては、その中和された、より高いｐＨは、約６〜約１０のｐＨでありうる。更にもう１つの実施形態においては、その中和された、より高いｐＨは、約６〜約８のｐＨでありうる。更にもう１つの実施形態においては、その中和された、より高いｐＨは、約８．０のｐＨでありうる。
【００３１】
１つの実施形態においては、該ｐＨ中和は、３．０Ｍ  トロラミン（ｔｒｏｌａｍｉｎｅ）または当技術分野で公知の別のバッファーを使用して達成されうる。ついで該不活性化溶出液プールの伝導率が精製水または脱イオン化水で調節されうる。１つの実施形態においては、該不活性化溶出液プールの伝導率は約０．５〜約５０ｍＳ／ｃｍに調節されうる。もう１つの実施形態においては、該不活性化溶出液プールの伝導率は約４〜約６ｍＳ／ｃｍに調節されうる。特定の実施形態においては、該不活性化溶出液プールの伝導率は約５．０ｍＳ／ｃｍに調節されうる。
【００３２】
代替的実施形態においては、該組合せプロセス化工程のウイルス不活性化態様は、当技術分野で公知の他の方法を用いて行われうる。例えば、該ウイルス不活性化工程は、種々の実施形態においては、酸、界面活性剤、溶媒、化学物質、核酸架橋剤、紫外線、ガンマ線照射、熱、またはこの目的に有用であることが当技術分野で公知のいずれかの他の方法での処理を含みうる。
【００３３】
ウイルス不活性化および中和の後、該不活性化溶出液プールは、フィルター列として又は直列に設けられた、前記で十分に記載されている１以上のデプスフィルター、および１以上のイオン交換膜、疎水性膜または混合形態の膜によりプロセス化されうる。
【００３４】
該組合せ工程のデプス濾過態様は１以上のタイプのデプスフィルターを含みうる。１つの実施形態においては、該組合せ工程のデプス濾過態様は２以上の単位のデプスフィルターを含みうる。これらのデプスフィルターは、１つの実施形態においては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｘ０ＨＣフィルターでありうる。使用されるフィルターのタイプおよび数の選択は、プロセス化されるサンプルの体積に左右される、と当業者は認識するであろう。
【００３５】
該組合せ工程のイオン交換態様は、当技術分野で公知のいずれかのイオン交換法でありうる。１つの実施形態においては、この工程は膜クロマトグラフィーカプセルを含む。１つの実施形態においては、Ｃｈｒｏｍａｓｏｒｂ（商標）  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｒが使用されうる。
【００３６】
特定の実施形態においては、該工程のクロマトグラフィー態様はＱ膜クロマトグラフィーカプセルを含む。１つの実施形態においては、Ｑ膜クロマトグラフィーカプセルは、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ膜クロマトグラフィーカプセル（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）またはＳａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）  Ｑ  （ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）を含みうる。１つの実施形態においては、Ｑ膜クロマトグラフィーカプセルはフロースルー形態で実施される。
【００３７】
該デプスフィルターおよびイオン交換膜工程のそれぞれの後、１つの実施形態においては、カプセル濾過工程が行われうる。例えば、該カプセル濾過工程は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨから入手可能なＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２フィルターを含みうる。
【００３８】
該組合せプロセス化工程の後、該サンプルは中間／最終純化工程（図１〜４、工程４）に付されうる。この工程は、１つの実施形態においては、追加的なクロマトグラフィー工程を含みうる。当技術分野で公知のいずれかの形態のクロマトグラフィーが許容されうる。例えば、１つの実施形態においては、該中間／最終純化工程は混合形態（マルチモードとしても公知である）クロマトグラフィー工程を含みうる（図３、工程４）。本発明で用いられる混合形態クロマトグラフィー工程は、当技術分野で公知のいずれかの混合形態クロマトグラフィー法を用いうる。混合形態クロマトグラフィーは、タンパク質または他の溶質を吸着させるために複数の化学的メカニズムを利用する樹脂、モノリスまたは膜形態の固相クロマトグラフィー支持体の使用を含む。本発明において有用な例には、以下のメカニズムの２以上の組合せを用いるクロマトグラフィー支持体が含まれるが、これらに限定されるものではない：陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、親硫黄性相互作用、水素結合、π−π結合および金属アフィニティ。特定の実施形態においては、該混合形態クロマトグラフィー法は以下の組合せである：（１）陰イオン交換および疎水性相互作用技術、（２）陽イオン交換および疎水性相互作用技術、ならびに／または（３）静電的および疎水性相互作用技術。
【００３９】
１つの実施形態においては、該混合形態クロマトグラフィー工程は、例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＣａｐｔｏ（登録商標）付着カラムおよび樹脂のようなカラムおよび樹脂を使用することにより達成されうる。Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラムは、捕捉後のモノクローナル抗体の中間的精製および純化のためのマルチモード媒体である。特定の実施形態においては、該混合形態クロマトグラフィー工程はフロースルー形態で行われうる。他の実施形態においては、該混合形態クロマトグラフィー工程は結合−溶出形態で行われうる。
【００４０】
他の実施形態においては、該混合形態クロマトグラフィー工程は、以下の系の１以上を用いることにより達成されうる：Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）、ＨＥＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＭＢＩ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）、ＣＦＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｆｌｕｏｒｏａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）、ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）および／またはＡＢｘ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒから入手可能）。該混合形態クロマトグラフィー工程に用いられる具体的な方法は、使用される具体的なカラムおよび樹脂に左右されることがあり、典型的には、該製造業者により供給され、または当技術分野で公知である。
【００４１】
もう１つの実施形態においては、該中間／最終純化工程は陽イオン交換クロマトグラフィーを含みうる（図４、工程４）。本発明で用いられる陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、当技術分野で公知のいずれかの陽イオン交換クロマトグラフィー法を用いうる。１つの実施形態においては、該陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が充填されたカラムを使用することにより達成されうる。特定の実施形態においては、該陽イオン交換クロマトグラフィー工程は結合−溶出形態で実施されうる。
【００４２】
該方法において使用される各カラムは、最大の処理能力および利益をもたらすのに十分な程度に大きいものでありうる。例えば、ある実施形態においては、各カラムは、約１Ｌ〜約１５００Ｌ、約１Ｌ〜約１０００Ｌ、約１Ｌ〜約５００Ｌ、または約１Ｌ〜約２５０Ｌの内部体積を示しうる。幾つかの実施形態においては、該混合形態または陽イオン交換カラムは約１ｃｍの内径および約７ｃｍのカラム長を有しうる。他の実施形態においては、該混合形態または陽イオン交換カラムの内径は約０．１ｃｍ〜約１００ｃｍ、０．１〜５０ｃｍ、０．１ｃｍ〜約１０ｃｍ、約０．５ｃｍ〜約５ｃｍ、約０．５ｃｍ〜約１．５ｃｍであることが可能であり、あるいは約１ｃｍであることが可能である。１つの実施形態においては、該混合形態または陽イオン交換カラムのカラム長は約１〜約５０ｃｍ、約１〜約２０ｃｍ、約５〜約１０ｃｍであることが可能であり、あるいは約７ｃｍであることが可能である。
【００４３】
幾つかの実施形態においては、本発明の系は、高い滴定濃度、例えば、約５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２．５ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約２０ｇ／Ｌ、約２５ｇ／Ｌの濃度、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの濃度、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌの濃度、約５ｇ／Ｌ〜約１２．５ｇ／Ｌの濃度、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌの濃度、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの濃度、約５ｇ／Ｌ〜約５５ｇ／Ｌの濃度、または約５ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの濃度を扱うことが可能である。例えば、該系の幾つかは、高い抗体濃度を扱うことが可能であり、同時に、１時間当たり約２００Ｌ〜約２０００Ｌの培養物、１時間当たり約４００Ｌ〜約２０００Ｌの培養物、１時間当たり約６００Ｌ〜約１５００Ｌの培養物、１時間当たり約８００Ｌ〜約１２００Ｌの培養物、または１時間当たり約１５００Ｌを超える培養物をプロセス化することが可能である。
【００４４】
１つの実施形態においては、該中間／最終純化工程は１以上の膜吸着材またはモノリスにより達成されうる。膜吸着材は、同等の樹脂上のものに類似した官能基で誘導体化された薄い合成微孔性またはマクロポーラス膜である。膜吸着材は、重力により膜を通過移動する流体相内で少なくとも１つの物質と相互作用しうる官能基、リガンド、編込み繊維または反応物を、それらの表面上に含有する。該膜は、典型的に、比較的小さなカートリッジ内で５〜１５層の深さに積層されていて、同様の出力を有するカラムより遥かに小さなフットプリントを与える。この場合に使用される膜吸着材は膜イオン交換体、混合形態リガンド膜および／または疎水性膜でありうる。
【００４５】
１つの実施形態においては、使用される膜吸着材は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｒでありうる。ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂ（商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｄｓｏｒｂｅｒは、ＭＡｂおよびタンパク質の精製のための、ＨＣＰ、ＤＮＡ、内毒素およびウイルスを含む微量不純物の除去のために設計された膜に基づく陰イオン交換体である。使用されうる他の膜吸着材には、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｃ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｄ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）Ｐｈｅｎｙｌ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）ＩＤＡ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｍ  ＢＢＩ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨから入手可能）、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）または当技術分野で公知のいずれかの他の膜吸着材が含まれる。
【００４６】
前記のとおり、本発明の中間／最終純化工程においてモノリスが使用されうる。モノリスは、制御される特定のサイズの、遮られておらず相互連結されたチャネルの、一体型多孔性構造体である。サンプルは対流によりモノリスを介して輸送されて、移動相と固定相との間の高速質量移動をもたらす。その結果、クロマトグラフィー特性は非流動依存的である。また、モノリスは、高い流量であっても低い背圧を示して、精製時間を有意に減少させる。１つの実施形態においては、該モノリスはイオン交換または混合形態リガンド系モノリスでありうる。１つの態様においては、使用されるモノリスには、ＣＩＭ（登録商標）モノリス（ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから入手可能）、ＵＮＯ（登録商標）モノリス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）またはＰｒｏＳｗｉｆｔ（登録商標）もしくはＩｏｎＳｗｉｆｔ（商標）モノリス（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）が含まれうる。
【００４７】
更にもう１つの実施形態においては、該中間／最終純化工程は、膜吸着材、モノリスまたは混合形態カラムを使用する代わりに追加的なデプス濾過工程により達成されうる。この実施形態においては、中間／最終純化に使用されるデプス濾過はＣＵＮＯ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（登録商標）デプスフィルターでありうる。この実施形態においては、該デプスフィルターは中間／最終純化およびウイルス除去の目的を果たしうる。
【００４８】
特定の実施形態においては、該中間／最終純化工程は疎水性相互作用クロマトグラフィー工程でありうる（図２、工程４）。１つの実施形態においては、この工程は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ疎水性相互作用樹脂およびＣｈｒｏｍａｆｌｏｗ（登録商標）Ａｃｒｙｌｉｃクロマトグラフィーカラム（それぞれ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能）を使用することが可能である。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ樹脂は、３４μｍの平均粒径を有する強固な高度に架橋されたビーズ化アガロースである。最小化されたイオン特性を有する疎水性媒体を与える化学的に安定な非荷電エーテル結合により、官能基がマトリックスに結合している。この実施形態においては、該サンプルは、該カラムへのローディングの前に、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）カプセルフィルターにより濾過されうる。
【００４９】
該中間／最終純化工程において疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる場合、該カラムの内径は約１０〜１００ｃｍでありうる。特定の実施形態においては、該内径は約６０ｃｍでありうる。該カラムの高さは、１つの実施形態においては、約１０〜２０ｃｍでありうる。１つの実施形態においては、該カラムの高さは約１５ｃｍである。
【００５０】
該中間／最終純化クロマトグラフィー工程の後、溶出液プールはナノ濾過工程に付されうる（図１〜４、工程５を参照されたい）。１つの実施形態においては、該ナノ濾過工程は１以上のナノフィルターまたはウイルスフィルターにより達成される。該フィルターは、この目的に有用であることが当技術分野で公知のいずれかのものであることが可能であり、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）またはＭｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）フィルターまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）またはＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを包含しうる。特定の実施形態においては、該ナノ濾過工程は、プレフィルターとナノフィルターまたはウイルスフィルターとを含むフィルター列により達成されうる。一例として、該フィルター列は、並列の、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨから入手可能な２つの２０インチＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶフィルターのための保護フィルターとしての、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能な２つのＰａｌｌ  ０．１５ｍ２  ０．１μｍ  Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標）ＩＩ  ＰＶＤＦカプセルフィルターを含みうる。もう１つの例においては、該フィルター列は、１つの（０．１７ｍ２）０．１μｍ  Ｍａｘｉｃａｐ（登録商標）プレフィルターおよび２つの２０インチＶｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶフィルター（共に、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨから入手可能）を含みうる。フィルターのタイプおよび数の選択は、プロセス化されるサンプルの体積に左右される、と当業者は理解するであろう。
【００５１】
図１〜４の工程６に示されているとおり、該ナノ濾過工程の後、瓶詰前に標的化薬物濃度およびバッファー条件を得るために、場合により、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）が行われうる。１つの実施形態においては、これはフィルターの使用により達成されうる。該フィルターは、この目的に有用であることが当技術分野で公知のいずれかのものであることが可能であり、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）またはＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）フィルターを包含しうる。特定の実施形態においては、該ＵＦ／ＤＦは、それぞれ３０ｋＤの分子量カットオフおよび２．５ｍ２の表面積を有する３つのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２  Ｂｉｏｍａｘ  ＵＦ  Ｍｏｄｕｌｅｓ、ならびに場合によっては、それらに続く、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２，８００滅菌カプセルフィルターでの濾過により達成されうる。該ナノフィルターおよびＵＦ／ＤＦ工程は、瓶詰のために許容される精製タンパク質を与えることが当技術分野で公知のいずれかの方法と組合され、または該方法により置換されうる（図１〜４、工程７）。瓶詰前に、該サンプルは、１つの実施形態においては、Ｍｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）２００  ０．２２μｍフィルターを介して、予め滅菌された発熱物質非含有ポリエチレンテレフタラートグリコール（ＰＥＴＧ）容器内に送り出されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は該方法の１つの実施形態の概要図を示す。
【図２】図２は該方法のもう１つの実施形態の概要図を示す。
【図３】図３は該方法の更にもう１つの実施形態の概要図を示す。
【図４】図４は該方法の更にもう１つの実施形態の概要図を示す。
【図５】図５は２８０ｎｍにおけるＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＰｌｕｓプロテインＡ捕捉クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
【図６】図６は３０２ｎｍにおけるＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＰｌｕｓプロテインＡ捕捉クロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。
【図７】図７は２８０ｎｍにおけるＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰクロマトグラフィープロファイルを示す。
【図８】図８は３０２ｎｍにおけるＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰクロマトグラフィープロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下の実施例は本発明の種々の実施形態を記載している。本明細書または本明細書に開示されている本発明の実施を考慮することにより、本発明における特許請求の範囲内の他の実施形態が当業者に明らかであろう。本明細書は、該実施例と共に、専ら例示に過ぎないとみなされ、本発明の範囲および精神は、該実施例に続く特許請求の範囲により定められると意図される。
【実施例】
【００５４】
［実施例１]
一般的に言えば、タンパク質サンプル（ＭＡｂ  Ａ）を一連の回収、捕捉および精製工程により細胞培養上清から精製した。該初期回収工程は遠心分離およびデプス濾過を含むものであった。該捕捉工程はプロテインＡクロマトグラフィーならびにそれに続くウイルス不活性化、デプス濾過およびＭｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ膜クロマトグラフィーを含むものであった。該精密精製工程は疎水性相互作用クロマトグラフィー、ナノ濾過および限外濾過／ダイアフィルトレーションを含むものであった。ついで最終産物を濾過し、瓶詰し、凍結させた。該回収および捕捉操作は、室温で行った。該精密精製工程は、特に示されていない限り、１７±２℃で行った。３つのバッチの３０００Ｌの、ＭＡｂ  Ａのバイオリアクター回収物を、この方法により精製した。
【００５５】
初期回収
製造用バイオリアクタータンクから細胞および細胞残渣を除去するために、遠心分離およびデプス濾過による初期回収を用いた。Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ  ＢＴＵＸ  ５１０遠心機をこのプロセス工程に使用した。３０００Ｌの製造用バイオリアクターを、連続的流動ディスク・スタック遠心機への供給タンクとして使用した。該遠心機を、約５２００ｒｐｍで２８Ｌ／分の供給速度で運転した。遠心分離された回収物を次いで、１０個の１．１ｍ２  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｘ０ＨＣ媒体Ｐｏｄ単位からなるフィルター列に通過させた。該バイオリアクターの内容物をデプスフィルターに付した後、該フィルター列を次いで、２００ｋｇの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、次いで空気ブローに付して残存濾液を除去した。該回収物の遠心分離および濾過を単一単位の操作で行った。該濾液を３０００Ｌの回収タンク内に集め、４〜１２℃に冷却し、５日間まで維持した。１つの実施においては、該遠心機を使用せず、その代わりに一連のＰｏｄフィルターを使用して該物質をプロセス化した。合計１５個のＤ０ＨＣフィルターおよび１０個のＸ０ＨＣフィルターを使用して、約３０００Ｌの回収物を清澄化した。この場合もまた、ついで該フィルター列を２００ｋｇの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、ついで空気ブローに付して残存濾液を除去した。該デプスフィルターのみを使用した場合の清澄化収率は、遠心機およびデプスフィルターの両方を使用した場合に類似していた。総合すると、平均回収工程収率は９１％であり、平均回収濃度は１．８５ｇ／Ｌであった。回収物の遠心分離および濾過操作の結果を表１に要約する。
【００５６】
【表１】
0006023715.tif 000002
【００５７】
プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー
該清澄化回収物から該タンパク質を捕捉し、プロセス化関連不純物の量を減少させるために、プロテインＡクロマトグラフィーを用いた。ＰｒｏＳｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＱｕｉｃｋｓｃａｌｅクロマトグラフィーカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をこのプロセス化工程に使用した。該プロテインＡ捕捉カラムは３５ｃｍの直径および２０ｃｍの標的高（カラム床体積１９．２Ｌ）を有していた。該カラムにおけるＭＡｂ  Ａのローディング限界はプロテインＡ樹脂１リットル当たりサンプル４２グラムであった。各バッチに関して７サイクルを完了した。該工程は室温で行い、３６ｇ／Ｌまでは７２０ｃｍ／時、３９ｇ／Ｌまでは４８０ｃｍ／時、そして４２ｇ／Ｌまでは２４０ｃｍ／時の３段階直線速度ローディングを用いた。該カラムを２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）で平衡化し、清澄化回収物をローディングした。
【００５８】
ローディング後、該カラムをベースライン吸光度（Ａ２８０）まで平衡化バッファーで洗浄した。プロセス化関連不純物の量を減少させるために、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム／クエン酸、０．５Ｍ  塩化ナトリウム（ｐＨ６．０）の第２の洗浄を行った。平衡化バッファーの第３の洗浄を行うことにより、光学濃度（ＯＤ）、ｐＨおよび伝導率がベースラインに戻った。該産物を０．１Ｍ  酢酸（ｐＨ３．５）で該カラムから溶出した。１ｃｍの光路長における２８０ｎｍでの前部の１  ＯＤから尾部の１  ＯＤまで、該溶出液を集めた。各細胞培養バッチに関して、該カラムを更に６回循環（サイクル）させて、予想される約５５００ｇの粗タンパク質をプロセス化した。各サイクル間で、該カラムを０．２Ｍ  酢酸で再生させた。該溶出液プールを５日間維持し、４〜１２℃に冷却した後、低ｐＨウイルス不活性化工程に進めた。
【００５９】
プロテインＡ捕捉工程の実施データおよび収率を表２に示す。平均カラムローディング量は、各バッチの第７サイクル（これは、残存ロード容量を用いて部分的にローディングされた）以外は、サイクル当たり樹脂１Ｌ当たりタンパク質約４２ｇであった。プロテインＡ捕捉工程の平均収率は９０％であった。捕捉カラム操作は、溶出クロマトグラフィープロファイルに関して一貫していた。重ね合せを図５および図６に示す。
【００６０】
【表２】
0006023715.tif 000003
【００６１】
ウイルス不活性化、デプス濾過およびＱ膜クロマトグラフィー
存在しうる外来性ウイルスを不活性化するために、プロテインＡ溶出液プールを低ｐＨに付した。該工程は、室温で行った。該低ｐＨ不活性化工程は、該溶出液プールのｐＨを０．５Ｍ  リン酸で３．５±０．１（２５℃で測定）に調節することにより行った。６０〜９０分間の維持時間の後、該不活性化物質を、３．０Ｍ  トロラミンを使用してｐＨ８．０±０．１（２５℃で測定）に中和し、５．０±０．５ｍＳ／ｃｍの伝導率になるまで精製水で希釈した。中和後、該ｐＨ不活性化物質をフィルター列に通過させて、保持タンクに入れた。該フィルター列は２つの成分からなるものであった。第１成分は６個の１．１ｍ２  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｘ０ＨＣ媒体Ｐｏｄ単位からなり、第２成分は７８０ｍＬ  Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑクロマトグラフィーカプセルであった。該Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑカプセルへの平均ローディングはＱカプセル１ｍＬ当たりタンパク質６．３ｇであった。デプス濾過後、そして再び、Ｑ膜プロセス化の後、該サンプルをＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ２０インチ（０．４５μｍ＋０．２μｍ）カプセルフィルターに通過流動させた。該供給タンクの内容物を濾過した後、該フィルター列を次いで、約１００ｋｇの２５ｍＭ  トロラミンおよび４０ｍＭ  塩化ナトリウムで洗浄した。該流出液を２２℃以下で１日間まで維持した。他の場合には、該流出液を８℃以下に冷却し、３日間まで維持した後、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰクロマトグラフィー工程に進めた。
【００６２】
該低ｐＨ不活性化および濾過操作の結果を表３に要約する。Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑカプセルへの平均ローディングはＱカプセル１ｍＬ当たりタンパク質６．３ｇ（Ｑカプセル１ｍＬ当たりタンパク質４０９ｍＬと等価）であった。それらの３つの実施は９６％の平均工程収率を示した。
【００６３】
【表３】
0006023715.tif 000004
【００６４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
該Ｑ膜流出液中に存在しうるプロセス化関連不純物および凝集した抗体の量を減少させるために、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰクロマトグラフィーを用いた。この純化工程の前に、該Ｑ膜流出液を、１．０Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１８ｍＭ  硫酸ナトリウムの標的濃度を含むように２．２Ｍ  硫酸アンモニウムおよび４０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈し、ついでＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  １０インチ（０．４５μｍ＋０．２μｍ）カプセルフィルターで濾過した後、該カラム上にローディングした。
【００６５】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ疎水性相互作用樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＣｈｒｏｍａｆｌｏｗ（登録商標）Ａｃｒｙｌｉｃクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をこのプロセス化工程に使用した。該フェニルカラムは６０ｃｍの直径および１５±１ｃｍ（カラム床体積４２．４Ｌ）の標的高を有していた。該カラムにおけるローディング限界はＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ樹脂１リットル当たりサンプル４０グラムであった。該工程は１７±２℃および７５ｃｍ／時の流速で行った。第１サイクルの開始前に、必要に応じて、該ローディング物質を１７±２℃に加温した。該カラムを水で前洗浄し、１．０Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１８ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で平衡化した。平衡化後、該カラムに希釈したフェニルローディング物をローディングした。ローディング後、該カラムをベースライン吸光度（Ａ２８０）まで、それぞれ、１．１Ｍ  硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、ならびにそれに続く０．９５Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１７ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で洗浄した。該産物を、３７．５ｃｍ／時の低下した流速で、０．５５Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で、該カラムから可搬性タンク内に溶出した。１ｃｍの光路長における２８０ｎｍでの前部の５  ＯＤから尾部の１  ＯＤまで、溶出液を集めた。各細胞培養バッチに関して、該カラムを更に２回循環（サイクル）させて、予想される約４７００ｇのタンパク質サンプルをプロセス化した。各サイクル間で、該カラムを注射用水（ＷＦＩ）で再生させた。該溶出液を２２℃以下で１日間維持した。所望により、該溶出液を８℃以下に冷却し、ナノ濾過工程に進める前に１０日間まで維持することが可能である。フェニルカラム操作は、溶出クロマトグラフィープロファイルに関して一貫していた。重ね合せを図７および図８に示す。
【００６６】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰクロマトグラフィーの実施データおよび収率を表４に詳細に示す。平均カラムローディング量はサイクル当たり樹脂１Ｌ当たりタンパク質約３６ｇであった。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）工程の平均収率は８９％であった。
【００６７】
【表４】
0006023715.tif 000005
【００６８】
ナノ濾過
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ精製物質中に潜在的に存在しうる直径２０ｎｍ以上の外来性ウイルスを除去するために、ナノ濾過を用いた。該ナノ濾過フィルター列は、並列の、２つの２０インチＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶフィルター（合計２．８ｍ２の公称フィルター面積）または２つの２０インチ  Ｐａｌｌ  ＤＶ２０フィルターのための保護フィルターとしての２つのＰａｌｌ  ０．１５ｍ２  ０．１μｍ  Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標）ＩＩ  ＰＶＤＦカプセルフィルター（合計０．３ｍ２の公称フィルター面積）を含むものであった。該工程は１０〜１４℃で行った。該濾過をモニターするために、プレフィルターの上流および各ナノフィルターハウジングの上流に圧力計を設置した。該濾過中、圧力を３２ｐｓｉｇ以下に維持した。Ｐｈｅｎｙｌ溶出液の全てが濾過された後、該フィルター列を２５ｋｇの１５ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ６．０）で洗浄して、該フィルターハウジング内に保持されている可能性のあるタンパク質サンプルを回収した。各細胞培養バッチに関して、１つのナノ濾過を行った。該濾液を１日間まで２２℃以下に維持し、または８℃以下に冷却し、製剤化工程に進める前に１０日間まで維持した。
【００６９】
該ナノ濾過操作の平均収率は９９％であった。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓフィルターの平均フィルターローディングは１実施当たり１３０Ｌ／ｍ２（１実施当たり１４１３ｇ／ｍ２と等価）であった。ＤＶ２０ローディングは１実施当たり６１Ｌ／ｍ２（１実施当たり６９３ｇ／ｍ２と等価）であった。濾液体積、濾液濃度および収量に基づけば、濾過操作は一貫していた。操作および収量を表５に詳細に示す。
【００７０】
【表５】
0006023715.tif 000006
【００７１】
製剤化（限外濾過およびダイアフィルトレーション）
ウイルス濾液の各ロットを濃縮し、限外濾過およびダイアフィルトレーションにより製剤化した。３０ｋＤの分子量カットオフおよび２．５ｍ２の表面積（合計７．５ｍ２の公称フィルター面積）をそれぞれが有する３つのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２  Ｂｉｏｍａｘ  ＵＦ  Ｍｏｄｕｌｅを、該製剤化操作の最初の部分に使用した。該工程は１０〜１４℃で行った。該ウイルス濾液を、まず、限外濾過により７０ｇ／Ｌの目標値まで濃縮した。次に、少なくとも８容量の１９ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ５．６）での連続的ダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、薬物を１９５ｇ／Ｌの目標値まで更に濃縮した。ついで産物を該限外濾過系から排出させ、該濾過系を約８ｋｇの１９ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ５．６）で洗浄して、該系内に保持された産物を回収した。該濃縮物および洗液を合わせて、１３０〜１５０ｇ／Ｌの目標濃度を有するダイアフィルトレーションサンプルを得た。ついで該製剤化濃縮物をＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２，８００無菌カプセルフィルターを介して保持タンク内に濾過した。該濾液を２２℃以下で７日間まで維持した後、最終瓶詰工程に進めた。
【００７２】
該製剤化操作の平均収率は９９％であった。最終濃縮液体積、濃度および収率に基づけば、製剤化操作は一貫していた（表６を参照されたい）。
【００７３】
【表６】
0006023715.tif 000007
【００７４】
濾過、瓶詰および凍結
瓶詰操作を２〜８℃の流動フード内で行った。該サンプルをＭｉｌｌｉｐａｋ（登録商標）２００  ０．２２μｍフィルターを介して、予め滅菌された発熱物質非含有ポリエチレンテレフタラートグリコール容器内に送り出した。２Ｌボトル当たり約１．６Ｌが充填された。該瓶詰操作の終了から３時間以内に、ラベルが付された該充填ボトルを−８０℃で凍結させた。
【００７５】
該最終瓶詰操作の平均収率は９９％であった。タンパク質濃度、タンパク質量および最終収率に基づけば、該瓶詰操作は一貫していた（表７を参照されたい）。
【００７６】
【表７】
0006023715.tif 000008
【００７７】
収率の要約
各プロセス化工程からの収率を表８に示す。リアクター最終量および瓶詰バルク薬物質量を、総収率を計算するために用いた。平均計算総収率は６０％であった。プロセス化間（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ）サンプリングに関する補正を行った場合には、平均計算総収率は６８％であった。
【００７８】
【表８】
0006023715.tif 000009
【００７９】
製品の質
最終バルク薬物質を品質特性の全項目に関して試験した。総合すると、最終薬物のそれらの３つのバッチは、試験した全ての特性に関して一貫しており、仕様の範囲内であった（表９を参照されたい）。
【００８０】
【表９】
0006023715.tif 000010
【００８１】
［実施例２］
この実施例においては、実施例１に記載されているのに非常に類似したタンパク質精製方法を、ＭＡｂ  Ｂを精製するために行った。それらの２つの方法における相違は本明細書に記載されている。該方法の態様が詳細に記載されていない場合、それは、実施例１に記載されているとおりである。
【００８２】
初期回収
遠心分離およびデプス濾過を初期回収工程として用いた。該遠心分離法は、実施例１に記載されているのと同じであった。ついで該遠心分離回収物を、１０個の１．１ｍ２  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｘ０ＨＣ媒体Ｐｏｄ単位からなるフィルター列に通過させた。ついで該サンプルを直列の３個の３０インチＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ０．４５／０．２μｍフィルターで濾過した。該サンプルを濾過した後、それを２００ｋｇの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  塩化ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄し、ついで空気ブローに付して残存濾液を除去した。該回収物の遠心分離および濾過は、単一単位操作として行った。該濾液を３０００Ｌの回収タンク内に集め、４〜１２℃に冷却し、５日間まで維持した。
【００８３】
プロテインＡ捕捉クロマトグラフィー
実施例２のプロテインＡ捕捉工程は、実施例１に記載されているものに実質的に類似していた。該カラムのローディング限界はプロテインＡ樹脂１リットル当たりＭＡｂ  Ｂ  ４３グラムであった。各バッチに関して８〜９サイクルを完了した。該工程は室温で行い、３０ｇ／Ｌまでは６００ｃｍ／時および４３ｇ／Ｌまでは４００ｃｍ／時の２工程直線速度ローディングを用いた。各サイクルの再生のために０．１５Ｍ  リン酸（ｐＨ１．５）を使用した。５サイクルごとに、および該方法の終了時に、洗浄のために６Ｍ  尿素を使用した。５０ｍＭ  Ｎａ酢酸（ｐＨ５）、２％ベンジルアルコールを殺菌および保存のために使用した。
【００８４】
ウイルス不活性化、デプス濾過およびＱ膜クロマトグラフィー
該方法における次の工程は、ウイルス不活性化、デプス濾過およびクロマトグラフィーを含む組合せ工程である。この工程においては、実施例１に記載されているのと同様にして、低ｐＨ不活性化を行った。不活性化後、８．８ｍ２  Ｘ０ＨＣ  Ｐｏｄおよびそれに続く２個の７８０ｍＬ  Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ膜吸着材（これらは並列に設置されていた）に該サンプルを通過流動させた。該Ｑ膜吸着材を通過する流速は１０ＣＶ／分であった。デプス濾過後、そして再びＱ膜プロセス化後、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２  ３０インチ（０．４５μｍ＋０．２μｍ）カプセルフィルターに該サンプルを通過流動させた。
【００８５】
疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ疎水性相互作用樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＣｈｒｏｍａｆｌｏｗ（登録商標）Ａｃｒｙｌｉｃクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をこのプロセス化工程に使用した。該フェニルカラムは８０ｃｍの直径および１５±１ｃｍの標的高を有していた。この純化工程の前に、該Ｑ膜流出液を、１．１Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１１ｍＭ  リン酸ナトリウムの目標濃度を得るために２．２Ｍ  硫酸アンモニウムおよび４０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で希釈し、ついでＳａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２（０．４５μｍ＋０．２μｍ）カプセルフィルターで濾過した後、該カラム上にローディングした。該カラムを水で前洗浄し、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液中の１．１Ｍ  硫酸アンモニウムで平衡化した。平衡化後、該カラムに希釈したフェニルローディング物を７５ｃｍ／時の流速でローディングした。ローディング後、該カラムをベースライン吸光度（Ａ２８０）まで１．４Ｍ  硫酸アンモニウムおよび２５ｍＭ  リン酸ナトリウムで洗浄した。該産物を、３７．５ｃｍ／時の低下した流速で、０．６２５Ｍ  硫酸アンモニウムおよび１１ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で、該カラムから溶出した。１ｃｍの光路長における２８０ｎｍでの前部の１  ＯＤから尾部の１  ＯＤまで、溶出液を集めた。該カラムで２サイクルにわたって該サンプルをプロセス化した。該カラムのローディング限界はＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ樹脂の１リットル当たりサンプル６４グラムであった。
【００８６】
ナノ濾過
該ナノ濾過フィルター列は、並列の２個の２０インチＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶフィルター（合計２．８ｍ２の公称フィルター面積）のためのプレフィルターとしてＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ０．１μｍ  Ｍａｘｉｃａｐ（登録商標）フィルターを含むものであった。該濾過中、圧力を３４ｐｓｉｇ以下に維持した。
【００８７】
製剤化（限外濾過およびダイアフィルトレーション）
ウイルス濾液の各ロットを濃縮し、限外濾過およびダイアフィルトレーションにより製剤化した。３０ｋＤの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２  Ｂｉｏｍａｘ  ＵＦ  Ｍｏｄｕｌｅ（合計膜面積１０ｍ２）を、該製剤化操作の最初の部分に使用した。該ウイルス濾液を、まず、限外濾過により５０ｇ／Ｌの目標値まで濃縮した。次に、少なくとも８容量の２３ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ５．６）での連続的ダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、薬物を１８０ｇ／Ｌの目標値まで更に濃縮した。ついで産物を該限外濾過系から排出させ、該濾過系を約６〜８ｋｇの１５ｍＭ  ヒスチジン（ｐＨ５．６）で洗浄して、該系内に保持された産物を回収した。該濃縮物および洗液を合わせて、１２０〜１６０ｇ／Ｌの目標濃度を有するダイアフィルトレーションサンプルを得た。
【００８８】
濾過、瓶詰および凍結を、実施例１に記載されているとおりに行った。
【００８９】
ＭＡｂ  Ｂに関する精製収率および最終製品品質を表１０および表１１に要約する。６９％の平均総精製収率で４個のバッチが成功裏に実施された。全バッチの最終バルク薬物における不純物のレベルは比較しうるものであり、製品品質仕様を満たしていた。
【００９０】
【表１０】
0006023715.tif 000011
【００９１】
【表１１】
0006023715.tif 000012
【００９２】
［実施例３］
この実施例においては、実験室規模でＭＡｂ  Ａを精製するために、もう１つのタンパク質精製方法を行った。実施例１に記載されている第３バッチ実施からのＸ０ＨＣ濾液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）溶液を加えることによりｐＨ８．１に調節し、１Ｍ  ＮａＣｌを加えることにより伝導率を９ｍＳ／ｃｍに調節した。ついで約２７０ｍＬの調節濾液を並列の３個の０．１８ｍｌ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ膜吸着材装置に通過流動させた。該Ｑ膜フロースループールの伝導率を、１Ｍ  ＮａＣｌを加えることにより９ｍＳ／ｃｍに更に調節し、ついで０．２２μｍでの濾過を行った。ついでこの調節プールを５ｍＬの前充填Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラムに３分の滞留時間流速で通過流動させた。Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラム上のローディングレベルは２２１ｍｇ／ｍｌであり、供給ローディング後、２０ＣＶの平衡化バッファーでの洗浄を行った。ＵＶ２８０測定に基づいて、産物ローディング中の２００ｍＡＵからバッファー洗浄中の２００ｍＡＵまで、該産物プールを集めた。該実験は室温で行った。Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着産物プールの濃度および体積を測定して工程収率を計算し、ＳＥＣを用いて凝集物／単量体に関して、そして社内ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＣＰおよびプロテインＡレベルに関して、該プールを分析した。
【００９３】
該実験室規模Ｑ膜フロースルーは９３〜９７％の工程収率を示し、Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラム純化工程は８９％の工程収率を与えた。したがって、最終純化のためにＣａｐｔｏ（登録商標）付着を使用した総プロセス化収率は、実施例１に示したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰを使用した場合に類似している。また、表１２に示すとおり、Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着精製後の産物プールの品質も製品仕様を満たした。
【００９４】
【表１２】
0006023715.tif 000013
【００９５】
［実施例４］
この実施例においては、実験室規模でＭＡｂ  Ｂを精製するために、実施例３に記載されているものに類似したタンパク質精製方法を行った。実施例２に記載されている第２バッチ実施からのＱ膜フロースループールを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）を加えることによりｐＨ８．１に調節し、１Ｍ  ＮａＣｌを加えることにより伝導率を６ｍＳ／ｃｍに調節した後、０．２２μｍ膜での濾過を行った。ついでこの調節プールを５ｍＬの前充填Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラムに３分の滞留時間流速で通過流動させた。Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラム上のローディングレベルは２５６ｍｇ／ｍｌであり、供給ローディング後、２０ＣＶの平衡化バッファーでの洗浄を行った。ＵＶ２８０測定に基づいて、産物ローディング中の２００ｍＡＵからバッファー洗浄中の２００ｍＡＵまで、該産物プールを集めた。該実験は室温で行った。Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着産物プールの濃度および体積を測定して工程収率を計算し、ＳＥＣを用いて凝集物／単量体に関して、そして社内ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＣＰおよびプロテインＡレベルに関して、該プールを分析した。
【００９６】
該Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着カラム純化工程は９１．６％の工程収率を与え、これは、実施例２に示したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ結合−溶出工程に類似したものである。また、表１３に要約するとおり、Ｃａｐｔｏ（登録商標）付着精製後の産物プールの品質は製品仕様を満たした。
【００９７】
【表１３】
0006023715.tif 000014
【００９８】
［実施例５］
この実施例においては、実験室規模でＭＡｂ  Ｂを精製するために、実施例４に記載されているものに類似したタンパク質精製方法を行った。実施例２に記載されている第２バッチ実施からのＸ０ＨＣ濾液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）を加えることによりｐＨ６．５に調節し、１Ｍ  ＮａＣｌを加えることにより伝導率を６ｍＳ／ｃｍに調節した後、０．２２μｍ膜での濾過を行った。ついでこの調節プールを５ｍＬの前充填ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）カラムに３分の滞留時間流速で通過流動させた。２回の実施を行った。該ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）カラム上のローディングレベルはそれぞれ１０４および２３５ｍｇ／ｍｌであり、各供給ローディング後、２０ＣＶの平衡化バッファーでの洗浄を行った。ＵＶ２８０測定に基づいて、産物ローディング中の２００ｍＡＵからバッファー洗浄中の２００ｍＡＵまで、該産物プールを集めた。該実験は室温で行った。該ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）産物プールの濃度および体積を測定して工程収率を計算し、ＳＥＣを用いて凝集物／単量体に関して、そして社内ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＣＰおよびプロテインＡレベルに関して、該プールを分析した。
【００９９】
この実験の供給物は約９８．１％  単量体（１．７％  凝集物）、７ｎｇ／ｍｇ  ＨＣＰを含有し、２３．６ｎｇ／ｍｇ  プロテインＡが添加された。該ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）樹脂の性能を表１４に要約する。より高いローディングレベル（２３５ｍｇ／ｍｌ）での収率は９２％であり、これは、実施例２に示したＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ純化工程の場合に匹敵するものであった。また、ＰＰＡ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（商標）精製後の産物プールの品質は製品仕様を満たした。この実施のためのローディングはＱ膜に付されなかったため、Ｘ０ＨＣ濾過とＰＰＡハイパーセル純化工程との間にＱ膜が使用されると製品品質は更に改良されると予想される。
【０１００】
【表１４】
0006023715.tif 000015
【０１０１】
［実施例６]
この実施例においては、実験室規模でＭＡｂ  Ｂを精製するために、もう１つのタンパク質精製方法を行った。実施例２に記載されているプロテインＡ溶出液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）溶液を加えることによりｐＨ５に調節し、１Ｍ  ＮａＣｌを加えることにより伝導率を８ｍＳ／ｃｍに調節した後、０．２２μｍでの濾過を行った。ついでこの調節プールを８ｍＬのＰｏｒｏｓ  ＸＳ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）陽イオン交換カラムに４分の滞留時間流速で通過流動させた。ローディング前に、該カラムを０．１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５）バッファーで平衡化した。７２ｍｇ／ｍｌ  ＭＡｂ  Ｂをローディングした後、該カラムを平衡化バッファーで洗浄し、ついで５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、２２０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５）バッファーで溶出した。ＵＶ２８０測定に基づいて、２００ｍＡＵから２００ｍＡＵまで、該溶出液を集めた。該実験は室温で行った。該Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ（登録商標）産物プールの濃度および体積を測定して工程収率を計算し、ＳＥＣを用いて凝集物／単量体に関して、そして社内ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＣＰおよびプロテインＡレベルに関して、該プールを分析した。
【０１０２】
表１５はこの純化工程の精製性能を要約する。ほぼ１００％の工程収率が得られ、不純物のレベルの全ては製品仕様の範囲内である。この実施のためのローディングはＸ０ＨＣ  ＰＯＤおよびＱ膜純化工程に付されなかったため、これらの工程が組込まれると製品品質は更に改良されると予想される。
【０１０３】
【表１５】
0006023715.tif 000016
【０１０４】
［実施例７］
この実施例においては、実験室規模でＭＡｂ  Ｃを精製するために、もう１つのタンパク質精製方法を行った。実施例１に記載した低ｐＨウイルス不活性化に付したＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＯＤデプス濾過物質を、該溶液に２Ｍ  酢酸を加えることによりｐＨ５に調節し、水で希釈することにより伝導率を５ｍＳ／ｃｍに調節した後、０．２２μｍでの濾過を行った。ついで、これらのプロセス化不純物を除去するこのクロマトグラフィー樹脂の能力を調べるために、この調節物質に追加量のプロテインＡおよび宿主細胞タンパク質を添加した。該添加物質を４．９ｍＬのＰｏｒｏｓ  ＸＳ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）陽イオン交換カラムに２．９分の滞留時間流速で通過流動させた。ローディング前に、該カラムを０．１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５）バッファーで平衡化した。６８ｍｇ／ｍｌ  ＭＡｂ  Ｃでローディングした後、該カラムを平衡化バッファーで洗浄し、ついで３８０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５）バッファーで溶出した。ＵＶ２８０測定に基づいて、２００ｍＡＵから４００ｍＡＵまで、該溶出液を集めた。該実験は室温で行った。該Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ（登録商標）産物プールの濃度および体積を測定して工程収率を計算し、ＳＥＣを用いて凝集物／単量体に関して、そして社内ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＨＣＰおよびプロテインＡレベルに関して、該プールを分析した。
【０１０５】
表１６は該精製性能を要約する。９３％の工程収率が得られ、不純物のレベルの全ては製品仕様の範囲内である。
【０１０６】
【表１６】
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【０１０７】
全ての論文、刊行物、特許、特許出願、発表、テキスト、報告、原稿、パンフレット、本、インターネット投稿、雑誌記事および／または定期刊行物（これらに限定されるものではない）を含む、本明細書中に引用されている全ての参考文献の全体を、参照により本明細書に組み入れることとする。本明細書における参考文献の考察は、それらの著者によりなされている主張を単に要約することを意図したものであり、いずれかの参考文献が先行技術を構成することを自認するものではない。本出願人は、引用参考文献の正確さ及び関連性に異議を申し立てる権利を保有する。
【０１０８】
添付の特許請求の範囲に、より厳密に記載されている、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対するこれらの及び他の修飾および変更が当業者により実施されうる。また、種々の実施形態の態様は全体的または部分的に交換されうると理解されるべきである。更に、前記の説明は単なる例示に過ぎず、添付の特許請求の範囲に更に詳細に記載されている本発明を限定するものではない、と当業者は理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲は、それに含まれる形態の説明に限定されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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