(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物イムノアッセイにおける白血球からの干渉を低減する方法であって、
白血球を含有する生体試料を、生体試料中の前記白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、前記白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、
磁気犠牲ビーズを電気化学的免疫センサーと実質的に接触させないで磁気的に保持するステップと
を含み、
該磁気犠牲ビーズが、生体試料中の白血球以上で、試料中に存在する白血球を実質的に隔離するのに十分な量存在する、
上記方法。
【請求項２】
血液試料中で分析物サンドイッチイムノアッセイを実施する方法であって、
検査カートリッジ中の保持チャンバー内に、白血球を含有する血液試料を導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、
生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、
血液試料を導管内に移動させるステップであって、導管の少なくとも一部に局在化した磁場が、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、
血液試料を電気化学的免疫センサーと接触させることによって、固定化捕捉抗体、試料分析物、及びシグナル抗体を含むサンドイッチを形成するステップと、
任意選択により、電気化学的免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、
シグナル抗体によってもたらされるシグナルに基づいて分析物の存在を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項３】
試料分析物が、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、クレアチンキナーゼＭＢ、プロカルシトニン、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビン、ＰＳＡ、Ｄ−二量体、ＣＲＰ、ＨＣＧ、ＮＧＡＬ、ミエロペルオキシダーゼ、及びＴＳＨからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
固定化捕捉抗体がアッセイビーズに付着され、アッセイビーズが電流測定用電極に付着される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
血液試料中で分析物競合イムノアッセイを実施する方法であって、
検査カートリッジ中の保持チャンバー内に、白血球を含有する血液試料を導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、
標識分析物を用いて血液試料を改質するステップと、
生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、
導管の少なくとも一部に局在化した磁場を印加することによって、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが電気化学的免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、
血液試料を電気化学的免疫センサーと接触させることによって、競合的な比の結合試料分析物と結合標識分析物を形成するステップと、
任意選択により、電気化学的免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、
結合標識分析物によってもたらされるシグナルによって求められる競合的な比に基づいて、分析物の存在を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項６】
免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、
免疫センサーを、標識分析物と反応することができる試薬と接触させることによって、血液試料中の試料分析物の存在に逆に関連する、免疫センサーにおけるシグナルを生成するステップと
をさらに含む、請求項２または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料分析物が、ジゴキシン、フェノバルビタール、フェニトイン、テオフィリン、バルプロ酸、及びバンコマイシンからなる群から選択される、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標識分析物が、フルオレセイン、フェロセン、及びｐ−アミノフェノールからなる群から選択される標識で標識される、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料または血液試料が全血試料である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料または血液試料が抗凝固剤を用いて改質される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
磁気犠牲ビーズが、スチレン−アクリル酸コポリマーでコーティングされた磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）コアを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
磁気犠牲ビーズが、非ヒトＩｇＧ又はその断片でコーティングされた磁気ビーズを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
磁気犠牲ビーズが、３μｍ〜５μｍの平均粒径を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
磁気犠牲ビーズが、１つ又は複数の可溶性乾燥試薬コーティング中にある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
全血試料中で分析物イムノアッセイを実施するためのキットであって、
磁場によって可動性であり；全血試料中の白血球以上で、試料中に存在する白血球を実質的に隔離するのに十分な量存在する；
白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズと、
磁気犠牲ビーズを保持するための磁石と、
電気化学的免疫センサーとを含み、
全血試料中の白血球は、前記磁気犠牲ビーズに結合可能であり、磁場は、前記磁気犠牲ビーズの少なくとも一部を、前記電気化学的免疫センサーと接触させないで保持することができる上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１０年６月１４日に出願された米国出願第１２／８１５，１３２号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、イムノアッセイによって血液試料中の分析物の存在又は濃度を求めるためのデバイス及び方法において、バフィーコート成分、特に白血球からの干渉を低減又は排除することに関する。特に、本発明は、オプソニン化された磁気犠牲ビーズ（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｂｅａｄ）及び同様にオプソニン化された磁気エレメントを用いて、血液試料を改質する（ａｍｅｎｄ）することによって、白血球免疫センサー干渉を低減又は排除することに関する。
【背景技術】
【０００３】
対象とする分析物についての実験室イムノアッセイ試験の多数は、とりわけ、診断、スクリーニング、疾患の病期分類、法医学的分析、妊娠検査、及び薬物検査のために生体試料に対して実施される。妊娠検査などのいくつかの定性的検査は、患者が家庭で使用するための単純なキットに変えられている一方で、定量的検査の大部分は、洗練された機器を使用して、実験室設定下で、訓練された技術者の専門知識を依然として必要とする。実験室検査は、分析の費用を増やし、患者が結果を受領することを遅らせる。例えば、心筋梗塞及び心不全を示すマーカーの分析などの多くの状況において、この遅延は、患者の状態又は予後に有害となり得る。これらの状況及び同様の極めて重要な状況において、そのような分析を、ポイントオブケアで、正確に、安価に、且つ遅延を最小にして実施することが有利である。
【０００４】
多くの型のイムノアッセイデバイス及びプロセスが説明されている。例えば、血液の試料中の分析物を首尾よく測定するための１つの使い捨て検出デバイスが、米国特許第５，０９６，６６９号においてＬａｕｋｓによって開示されている。例えば、凝固時間などの特徴を首尾よく測定するための他のデバイスが、米国特許第５，６２８，９６１号及び同第５，４４７，４４０号において、Ｄａｖｉｓらによって開示されている。これらのデバイスは、時間の関数として血液の試料中の分析物濃度及び粘度変化を測定する目的のために、読取装置及びこの読取装置に適合するカートリッジを使用する。米国特許第５，０９６，６６９号、同第５，６２８，９６１号、及び同第５，４４７，４４０号の全体の内容及び開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００５】
Ｍｉｌｌｅｒらの米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号（「’１６４出願」）は、免疫参照電極（ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を有するイムノアッセイデバイスを記載し、Ｍｉｌｌｅｒらの米国特許第７，６８２，８３３号は、試料閉じ込めが改善されたイムノアッセイデバイスを記載し、Ｅｍｅｒｓｏｎ  Ｃａｍｐｂｅｌｌらの米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号は、多重ハイブリッドイムノアッセイを記載し、Ｄａｖｉｓらの米国特許第７，４１９，８２１号は、分析物測定及びイムノアッセイのための装置及び方法を記載しており、これらのそれぞれは、共同所有されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０００６】
サンドイッチ型イムノアッセイとも呼ばれる非競合２サイトイムノアッセイは、生物学的検査試料中の分析物濃度を求めるのにしばしば使用され、例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．によって、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）イムノアッセイシステムとして開発されたポイントオブケア分析物検出システムにおいて使用される。一般的な２サイト酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）では、１つの抗体が、固体支持体に結合されることによって、固定化抗体又は捕捉抗体を形成し、第２の抗体が、酵素などのシグナル生成試薬とコンジュゲート又は結合されることによって、シグナル抗体又は標識抗体を形成する。測定される分析物を含有する試料と反応すると、分析物は、固定化抗体とシグナル抗体の間で「サンドイッチされた」状態になる。試料及び任意の非特異的に結合した試薬を洗い流した後、固体支持体上に残っているシグナル抗体の量が測定され、これは、試料中の分析物の量に比例するはずである。
【０００７】
分析物の結合が、電極に隣接する電気活性種の活性の変化を直接又は間接的に引き起こす電気化学的検出も、イムノアッセイに適用されている。電気化学的イムノアッセイの概説については、Ｌａｕｒｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７３巻、「電気イムノアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３９、３４０、３４６〜３４８（１９８１）を参照されたい。
【０００８】
電気化学的免疫センサーでは、分析物がその同族抗体に結合することにより、電極における電気活性種の活性の変化が生じ、これは、適当な電気化学的な電位で釣り合うことによって、電気活性種の酸化又は還元を引き起こす。これらの条件を満たすための多くの構成又は機構が存在する。例えば、電気活性種は、分析物に直接結合することができ、又は抗体は、電気不活性な基質から電気活性種を生成し、若しくは電気活性な基質を破壊する酵素に共有結合することができる。電気化学的免疫センサーの概説については、Ｍ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ（１９８７）、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３１６：１３５〜１４２を参照されたい。
【０００９】
示差電流（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ）測定の概念は、電気化学の技術分野で周知である。例えば、共同所有のＣｏｚｚｅｔｔｅらの、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，１１２，４５５号を参照されたい。示差電流（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ）センサー組合せのバージョンは、Ｃｏｚｚｅｔｔｅらの、共同所有の米国特許第５，０６３，０８１号（「’０８１特許」）に開示されており、これも、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。’０８１特許はまた、電気化学的センサーのために選択透過性層を使用すること、及び生理活性分子を固定化するために膜形成ラテックスを使用することを開示している。センサーの製造においてポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を使用することは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＤａｖｉｓらの米国特許第６，０３０，８２７号に記載されている。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｖｉｋｈｏｌｍらの米国特許出願公開第２００３／００５９９５４号は、表面上の抗体同士間のギャップ内で、生体忌避（ｂｉｏｒｅｐｅｌｌａｎｔ）又は生体分子忌避コーティング、例えば、ＰＶＡを有する表面に直接結合した抗体を教示している。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎらの米国特許第５，６５６，５０４号は、抗体が上に固定された固相、例えば、ＰＶＡを教示しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、Ｄａｖｉｓらの米国特許第６，０３０，８２７号及び同第６，３７９，８８３号は、ＰＶＡ層をパターン形成するための方法を教示しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００１０】
イムノアッセイが様々な形態の干渉に感受性であることは、当技術分野で周知である。共同所有の、係属中の米国出願第１２／４１１，３２５号（「’３２５出願」）は、例えば、ＩｇＧ試薬カクテル中にＩｇＭを含めることによって、異好性抗体からの干渉を改善することに対処している。’３２５出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００１１】
イムノアッセイ技術は、ポイントオブケア検査市場への参入にますます適応しているので、検査媒質としての全血の使用は、主要な検査室検査において一般に使用される血漿及び血清と比べて増大している。全血が分析される場合、アッセイ媒質中に赤血球及びバフィーコート成分が存在する。バフィーコートは、血液が遠心分離されるとき、赤血球の上に形成する白血球及び血小板の層であることを、当業者は分かっている。
【００１２】
ある特定のアッセイにおいて、様々なアッセイコンポーネント、例えば、ビーズ及び電極表面を、白血球に関して有効にオプソニン化することができることが見出されている。例えば、電極表面に関して、Ｈｉｌｌら（ＦＥＢＳ１９１、２５７〜２６３、１９８５）は、スーパーオキシドイオンの電気化学的検出に基づいて、ヒト好中球の呼吸性バーストを観察する目的のために、ヒトＩｇＧを用いてマイクロボルタンメトリー電極をオプソニン化した。
【００１３】
上記に参照された米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号（「’１６４出願」）は、電気化学的免疫センサー、全血と血漿の間のバイアスを論じ、トロポニンなどのマーカーについてのイムノアッセイは一般に、血漿値又は血清値として測定及び報告されることを示している。’１６４出願は、これらの免疫センサーが全血を分析するために使用される場合、補正係数、又はバイアスを排除するための手段が使用される必要があることを教示している。’１６４出願は、バフィーコートの成分に関連する全血の電気化学的イムノアッセイにおけるバイアス、及びまた、試料同士間のヘマトクリット変動に関連するバイアスを含めた、ある特定の態様のこのバイアスを排除することができることをさらに教示している。
【００１４】
’１６４出願において示されているように、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（又は白血球（ｗｈｉｔｅ  ｃｅｌｌ））干渉は、分析物抗体、例えば、トロポニン抗体でコーティングされたビーズを有する免疫センサー上で起こり、対照実験では、この正のバイアスは、血漿試料中、及びバフィーコートが除去された血液試料中では存在しないことが示されている。したがって、白血球は、免疫センサーに貼り付き、酵素標識抗体の非特異的結合を促進することができ、これは、洗浄ステップ後でさえ結合したままであると思われる。’１６４出願では、ビーズ調製の間に少量の抗体をヒト血清アルブミンに添加することによって、このバイアスを部分的に排除することができることが示された。その結果として、試料が改変されたビーズと接触する場合、試料に由来するアルブミンは、ビーズを急速にコーティングし、ビーズが天然アルブミンの層でコーティングされると、白血球は、このビーズをオプソニン化された表面として認識しないはずである。
【００１５】
’１６４出願は、バイアスが、血液試料の塩濃度を、約１４０ｍＭの通常のナトリウムイオン濃度から約２００ｍＭ超に、好ましくは約２３０ｍＭに増大させることによって排除される、白血球干渉問題に対する追加の解決策を記載している。干渉の低減を説明する機構は、塩が、白血球の浸透圧減少を引き起こすことである可能性がある。この解釈は、開示される免疫センサーと相互作用する、白血球の能力の減退と一致する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上記文献にもかかわらず、少なくとも以下の分野のイムノアッセイおける白血球活性の改善効果（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）のために、プロセスを改善する（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）必要が残っている：最も特に、ポイントオブケア検査との関連で、免疫センサー干渉；電気化学的イムノアッセイ；免疫参照センサーと併せた免疫センサーの使用；全血イムノアッセイ；使い捨てカートリッジベースのイムノアッセイ；１回の洗浄ステップのみを伴う、非連続イムノアッセイ；及び乾燥試薬コーティング。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、分析物イムノアッセイにおける白血球干渉を低減又は排除すること、並びに、キット、デバイス、並びにそのようなキット及びデバイスを使用するための方法を対象とする。
【００１８】
第１の実施形態では、本発明は、分析物イムノアッセイにおける白血球からの干渉を低減する方法であって、白血球を含有する生体試料、例えば、血液試料を、生体試料中の前記白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、前記白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、磁気犠牲ビーズを免疫センサーと実質的に接触させないで磁気的に保持するステップとを含む方法を対象とする。任意選択により、磁気犠牲ビーズは、スチレン−アクリル酸コポリマーでコーティングされた磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）コア、又は非ヒトＩｇＧ若しくはその断片でコーティングされた磁気ビーズを含む。磁気犠牲ビーズは、０．０１μｍ〜２０μｍ、例えば、０．１μｍ〜５μｍ、又は３μｍ〜５μｍの平均粒径を有することが好ましい。任意選択により、磁気犠牲ビーズは、イムノアッセイカートリッジ内で、１つ又は複数の可溶性乾燥試薬コーティング中にある。磁石は、永久磁石であっても電磁石であってもよく、イムノアッセイカートリッジ内に配置されていても、イムノアッセイカートリッジ用読取装置内に配置されていてもよい。好適な態様では、磁気犠牲ビーズの少なくとも５０重量％、例えば、少なくとも７５重量％は、免疫センサーと接触しないで保持される。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、血液試料中の分析物サンドイッチイムノアッセイを実施する方法であって、白血球を含有する血液試料を検査カートリッジ内の保持チャンバー中に導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、血液試料を導管中に移動させるステップであって、導管の少なくとも一部に局在化した磁場が、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、血液試料を免疫センサーと接触させることによって、固定化捕捉抗体、試料分析物、及びシグナル抗体を含むサンドイッチを形成するステップと、任意選択により免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、シグナル抗体によってもたらされるシグナルに基づいて分析物の存在を検出するステップとを含む方法に対するものある。任意選択により、この方法は、免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、免疫センサーを、前記シグナル抗体と反応することができる試薬と接触させることによって、血液試料中の試料分析物の存在に関連する、免疫センサーにおけるシグナルを生成するステップとをさらに含む。分析物は、任意選択により、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＢＮＰ、クレアチンキナーゼＭＢ、プロカルシトニン、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビンなどと、臨床診断において使用される他のサンドイッチアッセイ、例えば、ＰＳＡ、Ｄ−二量体、ＣＲＰ、ＨＣＧ、ＮＧＡＬ、ミエロペルオキシダーゼ、及びＴＳＨからなる群から選択される。固定化捕捉抗体は、電流測定用電極、電位差測定用電極、電気伝導度測定用電極、光導波路、表面プラズモン共鳴センサー、音波センサー、及び圧電センサーからなる群から選択されるセンサーに付着されることが好ましい。固定化捕捉抗体は、アッセイビーズに付着させることができ、アッセイビーズは、電流測定用電極に付着される。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、血液試料中の分析物競合イムノアッセイを実施する方法であって、白血球を含有する血液試料を検査カートリッジ内の保持チャンバー中に導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、標識分析物を用いて血液試料を改質するステップと、生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、導管の少なくとも一部に局在化した磁場を印加することによって、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、血液試料を免疫センサーと接触させることによって、競合的な比の結合試料分析物と結合標識分析物を形成するステップと、任意選択により、免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、結合標識分析物によってもたらされるシグナルによって求められる競合的な比に基づいて、分析物の存在を検出するステップとを含む方法に対するものである。このプロセスは、任意選択により免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、免疫センサーを、標識分析物と反応することができる試薬と接触させることによって、血液試料中の試料分析物の存在に逆に関連する、免疫性センサーにおけるシグナルを生成するステップとをさらに含む。試料分析物は、任意選択により、ジゴキシン、フェノバルビタール、フェニトイン、テオフィリン、バルプロ酸、及びバンコマイシンからなる群から選択される。標識分析物は、任意選択により、放射標識、酵素、発色団、フルオロフォア、化学発光種、イオノフォア、及び電気活性種からなる群から選択される標識で標識される。例えば、標識分析物は、フルオレセイン、フェロセン、及びｐ−アミノフェノールからなる群から選択される標識で標識することができる。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、血液試料中に存在する疑いのある試料分析物についての競合イムノアッセイを実施するためのカートリッジであって、血液試料を受け入れるための試料入口と、計量された試料を形成するために血液試料を計量するための計量チャンバーと、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズ及び標識分析物を含む１つ又は複数の乾燥試薬コーティング層と、試料分析物及び標識分析物に対する固定化抗体を含む電極と、計量された試料及び標識分析物を電極に移動させるための１つ又は複数のポンピングエレメントとを備えるカートリッジに対するものである。カートリッジは、磁気犠牲ビーズを適所配置するための磁石をさらに備えることができる。或いは、磁石は、カートリッジではなく、読取デバイス内に配置することができる。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、血液試料中に存在する疑いのある試料分析物についての非競合イムノアッセイを実施するためのカートリッジであって、血液試料を受け入れるための試料入口と、計量された試料を形成するために血液試料を計量するための計量チャンバーと、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズ及び分析物に対するシグナル抗体を含む１つ又は複数の乾燥試薬コーティング層と、試料分析物に対する固定化抗体を含む電極と、計量された試料を電極に移動させるための１つ又は複数のポンピングエレメントとを備えるカートリッジに対するものである。カートリッジは、磁気犠牲ビーズを適所配置するための磁石をさらに備えることができる。或いは、磁石は、カートリッジではなく、読取デバイス内に配置することができる。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、全血試料中で分析物イムノアッセイを実施するためのキットであって、磁場によって可動性である、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズと、任意選択により、磁気犠牲ビーズを保持するための磁石と、免疫センサーとを含み、全血試料中の白血球は、前記磁気犠牲ビーズに結合可能であり、磁場は、前記磁気犠牲ビーズの少なくとも一部を、前記免疫センサーと接触させないで保持することができるキットに対するものである。イムノアッセイは、サンドイッチアッセイ又は競合アッセイとすることができる。
【００２４】
本発明のこれら及び他の目的、特徴、及び利点は、具体的な実施形態の以下の詳細な説明に記載され、以下の図面に例示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジカバーの等尺上面図である。
【００２６】
【図２】本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジカバーの等尺下面図である。
【００２７】
【図３】本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジ用テープガスケットの構成の上面図である。
【００２８】
【図４】本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジベースの等尺上面図である。
【００２９】
【図５】本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジの構成の概略図である。
【００３０】
【図６】本発明の一実施形態による乾燥試薬で流体を改質するための場所を含む、免疫センサーカートリッジ内の流体及び空気の経路の概略図である。
【００３１】
【図７】本発明の一実施形態による免疫センサーカートリッジ用電気伝導度測定電極及び免疫センサー電極のためのマスク設計の上面図である。
【００３２】
【図８】白血球についてオプソニン化された犠牲ビーズ（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｂｅａｄ）を含んだ電気化学的免疫センサーの稼動の原理を例示する図である。
【００３３】
【図９】（Ａ）正の傾きの出力シグナルを有する、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）カートリッジについての予期されない波形を示す図である。  （Ｂ）負の傾きの出力シグナルを有する、ＢＮＰカートリッジについての予期されない波形を示す図である。  （Ｃ）低分析物濃度についてゼロ付近の傾きを有する通常の応答を示す図である。  （Ｄ）測定が酵素限界ではなく、基質限界となり得る高分析物濃度でのみ、負の傾きが予期されることを例示する図である。
【００３４】
【図１０】（Ａ）通常の試料に対する洗浄ステップの間の酸化的電極パルシング（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｐｕｌｓｉｎｇ）の効果を示す図である。  （Ｂ）異常なバフィー試料に対する洗浄ステップの間の酸化的電極パルシングの効果を示す図である。
【００３５】
【図１１】電気活性種の酵素再生の略図である。
【００３６】
【図１２】好適な実施形態の免疫センサーカートリッジの上面図である。
【００３７】
【図１３】免疫センサーカートリッジの好適な実施形態の流体工学の概略図である。
【００３８】
【図１４】（Ａ）試料中の犠牲ビーズの不在下で、高バフィー試料中のＢＮＰをアッセイした後の免疫センサーの顕微鏡写真を示す図である。  （Ｂ）試料中の犠牲ビーズの存在下で、高バフィー試料中のＢＮＰをアッセイした後の免疫センサーの顕微鏡写真を示す図である。
【００３９】
【図１５】閉じた位置での、試料流入ポートを閉じるためのスライド可能な密封エレメントを有する、本発明の一実施形態のカートリッジデバイスを例示する図である。
【００４０】
【図１６】開いた位置での、試料流入ポートを閉じるためのスライド可能な密封エレメントを有する、本発明の一実施形態のカートリッジデバイスを例示する図である。
【００４１】
【図１７】（Ａ）分析する間に起こるシグナル生成反応である、電気活性なｐ−アミノフェノールを生成するためのアルカリホスファターゼによる基質の切断を例示する図である。  （Ｂ）分析する間に起こるシグナル生成反応である、ｐ−アミノフェノールの酸化を例示する図である。
【００４２】
【図１８】試薬中に犠牲微粒子（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）が組み込まれた（サブロット２及びサブロット３）、並びに組み込まれていない（サブロット１）、高バフィー試料（左パネル）並びに通常の全血試料（右パネル）中の、免疫センサーの傾きに対する効果についてのグラフによるデータを示す図である。
【００４３】
【図１９】（Ａ）図１４（Ａ）中の関連した免疫センサー顕微鏡写真についての分析器の波形を示す図である。  （Ｂ）図１４（Ｂ）中の関連した免疫センサー顕微鏡写真についての分析器の波形を示す図である。
【００４４】
【図２０】電流波形に対する、不満足な洗浄（センサー構造内の試料流体を分析流体と置換することができないこと）の作用を例示する図である。
【００４５】
【図２１】本発明の一実施形態による、磁気犠牲ビーズを用いて改質することができる競合イムノアッセイを例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
白血球についてオプソニン化された犠牲ビーズを用いて血液試料を改質すると、イムノアッセイにおける白血球干渉が低減されることが最近発見された。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願第１２／６２０，１７９号及び同第１２／６２０，２３０号を参照されたい。本発明は、イムノアッセイにおいて白血球が存在することによって引き起こされる干渉を低減又は排除するための磁気犠牲ビーズの使用に関する。特に、本発明は、分析物イムノアッセイにおける白血球からの干渉を低減する方法であって、白血球を含有する生体試料を、生体試料中の前記白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、前記白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、磁気犠牲ビーズを免疫センサーと実質的に接触させないで磁気的に保持するステップとを含む方法を対象とする。このようにして、磁気犠牲ビーズに結合される白血球は、免疫センサーと接触することが防止され、それによって白血球干渉が低減又は排除される。本明細書で使用する場合、用語「磁気」は、犠牲ビーズを記述するのに使用される場合、ビーズが磁場による移動に感受性であり、又はそれ自体で磁場を作り出すことを意味する。
【００４７】
図８は、分析物、例えば、ＢＮＰ及びＴｎＩなどの心臓機能のマーカーの存在及び量を判定し、白血球干渉を低減するためのオプソニン化された磁気犠牲ビーズを使用するための電流測定イムノアッセイの原理を例示する。流体試料、例えば、血液試料が、イムノアッセイカートリッジ中に導入され、コーティングされた乾燥試薬で改質される。乾燥試薬は、磁気犠牲ビーズ１０２を含み、これは、試料中に溶解すると、試料中に含有している場合のある白血球１０３に選択的に結合する。犠牲ビーズが白血球に結合する機会を有した後、磁場が印加されることによって、ビーズが免疫センサーと実質的に接触しない領域に保持され、それによって免疫センサーにおける白血球干渉が低減又は排除される。
【００４８】
このように、好適な実施形態では、本発明は、以下の分野の１つ又は複数において使用される：最も特に、ポイントオブケア検査との関連で、免疫センサー；電気化学的イムノアッセイ；免疫参照センサーと併せた免疫センサー；全血イムノアッセイ；使い捨てカートリッジベースのイムノアッセイ；１回の洗浄ステップのみを伴う、非連続イムノアッセイ；及び乾燥試薬コーティング。特に、上記に参照された米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号（「’１６４出願」）は、抗ヒト血清の添加、免疫センサー上へのアルブミン抗体のコーティング、及びアッセイ媒質への塩の添加に基づく白血球に関連した、ある特定の干渉に対処している一方で、本明細書は、白血球に関連したバイアスの追加の源を開示し、干渉を低減するための新規解決策を提供する。当業者によって理解されるように、本明細書で開示される一般的な概念は、多くのイムノアッセイ法及びプラットフォームに適用可能である。
【００４９】
このように、好適な実施形態では、本発明は、以下の分野の１つ又は複数において使用される：最も特に、ポイントオブケア検査との関連で、免疫センサー；電気化学的イムノアッセイ；免疫参照センサーと併せた免疫センサー；全血イムノアッセイ；使い捨てカートリッジベースのイムノアッセイ；１回の洗浄ステップのみを伴う、非連続イムノアッセイ；及び乾燥試薬コーティング。特に、上記に参照された米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号（「’１６４出願」）は、抗ヒト血清の添加、免疫センサー上へのアルブミン抗体のコーティング、及びアッセイ媒質への塩の添加に基づく白血球に関連した、ある特定の干渉に対処している一方で、本明細書は、白血球に関連したバイアスの追加の源を開示し、干渉を低減するための新規解決策を提供する。当業者によって理解されるように、本明細書で開示される一般的な概念は、多くのイムノアッセイ法及びプラットフォームに適用可能である。
【００５０】
本発明は、分析物センサーのアレイ、及び免疫センサー又は分析物アレイに改質された試料を順次提示するための手段を有するカートリッジを使用して、分析物の迅速なインサイツ判定を可能にする。好適な実施形態では、本発明は、１９９２年３月１７日に発行されたＬａｕｋｓらの米国特許第５，０９６，６６９号（上記に参照されている）、又は２００８年９月２日に発行されたＤａｖｉｓらの米国特許第７，４１９，８２１号（上記に参照されている）に開示されたものなどの、読取デバイスを用いて稼動されるように設計されたカートリッジで使用される。これらの特許の両方は、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。本発明は、この脈絡において最良に理解される。その結果として、ポイントオブケアイムノアッセイシステムを稼動するのに適したデバイス及び方法が最初に記載され、続いて全血イムノアッセイにおける白血球干渉をさらに低減又は排除するのに、システムを最良に適応させることができる方法が記載される。
【００５１】
様々な実施形態では、本発明は、電極表面における、又は電極表面付近でのサンドイッチの形成に基づくヘテロジニアス電気化学的イムノアッセイにおいて使用される。しかし、他の実施形態では、本発明は、他の形態のイムノアッセイに対するものである。例えば、本発明の磁気犠牲ビーズは、ヘテロジニアス又はホモジニアスビーズベースアッセイにおいて、並びに非競合（サンドイッチ）イムノアッセイ又は競合イムノアッセイにおいて使用することができる。この脈絡において、用語「ヘテロジニアス」及び「ホモジニアス」は、捕捉ステップを指す。したがって、ホモジニアスアッセイについては、捕捉ステップは、流体媒質中で起こる一方で、ヘテロジニアスアッセイでは、捕捉ステップは、巨視的な表面上、例えば、センサー表面上で起こる（競合又は非競合様式で）。これらの例のそれぞれにおいて、アッセイビーズは、アッセイが血液試料中で実施される場合、白血球による攻撃に感受性となる。競合アッセイ及び非競合アッセイにおいて、この作用は、白血球についてオプソニン化された磁気犠牲ビーズを添加することによって低減することができる。
【００５２】
図２１に例示されたヘテロジニアス競合アッセイは、試料中に存在する（未標識）分析物が、固体表面、例えば、センサーエレメント上の結合部位を、標識分析物と競合する。対象とする分析物を含有する疑いのある試料（試料分析物）は、標識にコンジュゲートされた同じ分析物、すなわち、標識分析物を含むある量の試薬で改質される。標識は、色素、又は酵素、例えば、ＡＬＰなどの任意のシグナル生成成分とすることができる。いくつかの例示的な実施形態では、標識分析物は、放射標識、酵素、発色団、フルオロフォア、化学発光種、イオノフォア、及び電気活性種からなる群から選択される標識で標識することができる。別の実施形態では、標識分析物は、フルオレセイン、フェロセン（任意選択によりカルボキシル化フェロセン、又はジカルボキシル化フェロセン、又はアミノフェロセン）、及びｐ−アミノフェノールからなる群から選択される標識で標識される。
【００５３】
競合アッセイによって一般に同定並びに／又は測定される分析物には、治療剤、例えば、ジゴキシン、テオフィリンなど、及び生物マーカー、例えば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、他にまたフェノバルビタール、フェニトイン、バルプロ酸、及びバンコマイシンなどが含まれる。好適な実施形態では、試料分析物は、ジゴキシン、フェノバルビタール、フェニトイン、テオフィリン、バルプロ酸、及びバンコマイシンからなる群から選択される。本発明の一実施形態では、改質された試料は、対象とする分析物に対する抗体が固定化された固体表面と接触させられる。試料が運ぶ分析物と標識分析物は、この固体表面で結合を競合し、その結果、標識分析物の量、及びしたがって、標識分析物から生成されるシグナルの量は、元の試料中の分析物の濃度に反比例する。センサー表面から非特異的に結合した物質を洗浄した後、標識の量が測定される。酵素標識の場合、これは、酵素に適当な基質を供給すること、及び（例えば、電気化学的又は光学的に）生成物を検出することを伴う。ヘテロジニアス競合イムノアッセイにおいて使用される場合、血液試料は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズ（例えば、ＩｇＧコート磁気微粒子）を用いて、固体表面、すなわち、センサーと接触させる前に、改質されることが好ましい。
【００５４】
Ｉ．カートリッジ
様々な実施形態では、本発明は、試料中の分析物の存在又は量を判定するために液体試料を処理するためのカートリッジ及び方法に関する。デバイスは、例えば、１つの試料で満たされ、検査のために１回使用され、次いで廃棄される使い捨てカートリッジであることが好ましい。図面を参照すると、本発明のカートリッジは、カバー（図１及び２に示される実施形態）、ベース（図４に示される実施形態）、ベースとカバーの間に配置された薄膜接着性ガスケット（図３に示される実施形態）、及び永久磁石又は電磁石を含む磁石領域（図５及び６に示される実施形態）を備える。
【００５５】
磁場は、実際の免疫センサーから離れた、カートリッジの領域内で生成されるべきである。磁石領域は、例えば、免疫センサーから数ミリメートル（例えば、１〜２５ｍｍ又は１〜１０ｍｍ）に直接隣接しても、試料流入ポートと免疫センサーの間の任意の他の位置にあってもよい。センサーの上流でビーズを磁気的に捕捉することが好ましいが、捕捉は任意選択により下流であってもよい。重要な特徴は、捕捉が、免疫センサーが稼動する導管の範囲から離れて局在化していることである。磁石は、カートリッジ内の永続的治具とすることができ、又は別の実施形態では、稼動するためにカートリッジが接続する機器（読取装置）内に備えられていてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、カートリッジは、磁気犠牲ビーズを含むが、磁場生成エレメントをまったく含まない場合がある。
【００５６】
図１を参照すると、カバー１は、剛性の物質、好ましくはプラスチックでできており、ひびが入ることなく、可動性のヒンジ領域５、９、１０で繰り返し変形することができる。カバーは、可動性ヒンジ９によってカバーの本体に取り付けられた蓋２を備える。稼動中、試料を試料保持チャンバー３４内に導入した後、蓋は、試料流入ポート４の入口上に固定され、試料の漏れを防止することができ、蓋は、フック３によって所定の位置に保持される。カバーは、２つのパドル６、７をさらに備え、これらは、カバーの本体に対して移動することができ、可動性のヒンジ領域５、１０によって本体に取り付けられている。ポンプ手段によって操作されるとき、パドル６は、薄膜ガスケット２１によって覆われた、空洞４３を備える空気ブラダー（ａｉｒ  ｂｌａｄｄｅｒ）に力をかけることによって、カートリッジの導管内の流体を移動させる。第２のポンプ手段によって操作されるとき、パドル７は、ガスケット２１に力をかけ、これは、その中に切られたスリット２２のために変形することができる。カートリッジは、読取装置内に挿入するように適応されており、したがって、この目的のために複数の機械的及び電気的接続を有する。本発明の他の実施形態では、カートリッジを手動で操作することが可能である。
【００５７】
読取装置内にカートリッジを挿入すると、ガスケットは、空洞４２内に位置した、分析／洗浄液（「流体」）約１３０μＬで満たされた流体の入ったホイルパック上に圧力を伝達し、スパイク３８上でパッケージを破裂させ、ベース内の短い、横断する導管を介してセンサーの導管に接続された導管３９内に流体を排出する。分析流体は、最初に分析導管の前部を満たし、キャピラリーストップとして作用するテープガスケット中の小さい開口部上に流体を押しつける。カートリッジに施される分析器の機構の他の動作は、分析導管内の制御された位置で、１つ又は複数のセグメント、例えば、空気セグメントを分析流体中に投入するのに使用される。これらのセグメントは、最少の流体を用いてセンサー表面及び周囲の導管の洗浄を補助するのに使用される。
【００５８】
本発明のある特定の実施形態では、カバーは、薄い柔軟膜８によって覆われた穴をさらに備える。稼動中、膜にかけられる圧力は、ガスケット中の小さい穴２８を通して、導管２０内に１つ又は複数の空気セグメントを排出する。
【００５９】
図２を参照すると、ベースの下方の表面は、第２の導管１１、及び第１の導管１５をさらに備える。第２の導管１１は狭窄部１２を含み、これは、流体の流れに抵抗をもたらすことによって流量を制御する。任意選択のコーティング１３、１４は、疎水性表面を与え、これらは、ガスケットの穴３１、３２と一緒に、第２及び第１の導管１１、１５の間の流量を制御する。ベース内の陥凹１７は、導管３４内の空気をガスケット中の穴２７を通して導管３４に送るための経路を提供する。
【００６０】
図３を参照すると、薄膜ガスケット２１は、ベース及びカバー内の導管同士間の流体の移動を促進し、必要な場合、圧力下でガスケットを変形させるための様々な穴及びスリットを備える。したがって、穴２４は、流体が導管１１から廃棄物チャンバー４４内に流れるのを可能にし、穴２５は、導管３４と１５の間にキャピラリーストップを備え、穴２６は、陥凹１８と導管４０の間で空気が流れるのを可能にし、穴２７は、陥凹１７と導管３４の間に空気の移動をもたらし、穴２８は、流体が導管１９から、任意選択の閉鎖可能な（ｃｌｏｓｅａｂｌｅ）バルブ４１を介して廃棄物チャンバー４４に流れるのを可能にする。穴３０及び３３は、それぞれカッタウェイ３５及び３７内に収容された複数の電極が、導管１５内で流体に接触するのを可能にする。特定の実施形態では、カッタウェイ３７は、接地電極、及び／又は対参照電極を収容し、カッタウェイ３５は、少なくとも１つの分析物センサー、及び任意選択により電気伝導度測定センサーを収容する。図３において、テープ２１は、機器が、バーブ３８上のエレメント４２内のカリブラントポーチ（ｃａｌｉｂｒａｎｔ  ｐｏｕｃｈ）を破裂させるために下向きの力をかけるとき、３つの切れ目２２によって囲まれたテープが変形するのを可能にするための２２におけるスリットである。このテープはまた、２３において切れ目であり、これは、機器が下向きの力を与えるとき、テープがエレメント４３内に下向きに曲がるのを可能にし、チャンバー４３から空気を排出し、導管１５を通してセンサーに試料流体を移動させる。図３中のエレメント２９は、テープ内の開口部として作用し、カバー（図２）内の領域を、ベース（図４）と接続している。
【００６１】
図４において、導管３４は、組み立てられたカートリッジ内で、試料流入ポート４を第１の導管１１に接続する試料保持チャンバーである。カッタウェイ３５は、任意選択の１つ又は複数の電気伝導度測定センサーと一緒に、１つ若しくは複数の分析物センサー、又は分析物応答性表面を収容する。カッタウェイ３７は、電気化学的センサーのための戻り電流経路として必要な場合、接地電極を収容し、任意選択の電気伝導度測定センサーを収容することもできる。カッタウェイ３６は、ガスケットの穴３１と３２の間の流体経路を提供し、その結果流体は、第１と第２の導管の間を通過することができる。陥凹４２は、読取装置内に挿入された後にパドル７上にかけられる圧力のために、スパイク３８によって穴を開けられる組み立てられたカートリッジ内に、流体を含むパッケージ、例えば、破裂可能なポーチを収容する。穴を開けられたパッケージからの流体は、３９で第２の導管内に流れる。空気ブラダーは陥凹４３を備え、これは、ガスケット２１によってその上面で密封される。空気ブラダーは、ポンプ手段の一実施形態であり、パドル６にかけられる圧力によって作動し、これは、導管４０内の空気を移動させ、それによって、試料を試料チャンバー３４から第１の導管１５内に移動させる。
【００６２】
カートリッジのある特定の実施形態では、試料セグメントを計量するための手段は、ベースのプラスチック部分に提供される。試料セグメントのサイズは、ベース内のコンパートメントのサイズ、並びにキャピラリーストップ及びテープガスケット中の空気パイプ穴の位置によって制御される。この体積は、０．００１〜１０００μＬ、例えば、１〜５００μＬ及び２〜２００μＬに容易に変更することができる。試料サイズのこの範囲のさらなる拡大は、本発明の脈絡の範囲内で可能である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、流体は、試料がセンサー導管１９に差し出される前に、試薬（例えば、磁気犠牲ビーズ、非磁気犠牲ビーズ、可溶性分子、ＩｇＭ若しくはその断片、又はこれらの組合せ）を改質するのに使用することができる分析前用導管１１を通して、試料中に押し出される。或いは、改質試薬は、部分１６を越えて部分１５内に位置することができる。分析前用導管を通して試料を押し出すことはまた、ダイヤフラムポンプパドル７に張力を導入する機能を果たし、これは、流体移動の始動に対するその応答性を改善する。このカートリッジが稼動するシステムは、一般に、試料が、所定の期間、例えば、１〜３０分間、試薬と接触したままになることを可能にする。
【００６４】
空気が、ブラダーから試料保持チャンバー（ガスケットの穴２７）に入る位置、及びキャピラリーストップ２５は、試料保持チャンバーの所定の体積を一緒に画定する。パドル６が押し下げられるとき、この体積に対応する量の試料が第１の導管内に移動する。この配置は、計量された量の未計量試料をカートリッジの導管内に送るための計量手段の１つの可能な実施形態である。
【００６５】
本発明のある特定の実施形態によれば、分析物の定量化が要求される場合、計量はいくつかのアッセイで有利である。図４において、カートリッジの外表面の汚染を防止するために、導管から排出される試料及び／又は流体のための廃棄物チャンバー４４が提供される。廃棄物チャンバーを外部の大気に接続する排出口４５も提供される。本発明のカートリッジの１つの望ましい特徴は、生体試料が装填されると、オペレーター又は試料に接触する他のものを伴わずに、分析を完了し、カートリッジを廃棄することができることである。
【００６６】
図５は、本発明の一実施形態によるカートリッジ及びそのコンポーネントの概略図であり、５１〜５７及び６５は、試料又は流体を改質するための乾燥試薬で任意選択によりコーティングすることができる、導管及び試料チャンバーの一部である。生体試料又は流体は、乾燥試薬の上を少なくとも１回通過することによって、乾燥試薬を溶解させる。試料を改質するのに使用される試薬は、以下のうちの１つ又は複数を含むことができる。白血球に対してオプソニン化された本発明の磁気犠牲ビーズ、非磁気犠牲ビーズ、抗体−酵素コンジュゲート（シグナル抗体）、１つ若しくは複数の白血球試薬（ｌｅｕｋｏｃｉｄａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ＩｇＭ及び／若しくはその断片、ＩｇＧ及び／若しくはその断片、並びに／又はアッセイ化合物の間で特異的若しくは非特異的な結合反応を防止する他の遮断剤。一実施形態では、試薬は、磁気犠牲ビーズ及び非磁気犠牲ビーズの両方を含む。可溶性でないが、カートリッジの内表面にアッセイ成分が非特異的に吸着するのを防止するのに役立つ表面コーティングも、ある特定の実施形態において利用することができる。
【００６７】
図５及び６において、このデバイスは、磁石領域６５を含み、これは、例えば、免疫センサーの上流で、磁気犠牲ビーズ及び任意の付随した結合した白血球を、免疫センサーと実質的に接触させないで保持するための磁石を含む。磁石領域６５は、例えば、磁石領域６５の表面の上又は下でカートリッジに組み込まれた永久磁石又は電磁石を含むことができる。いくつかの実施形態では、磁石は、導管の指定されたゾーンに隣接した機器内に配置される。他の実施形態では、磁石は、カートリッジ本体中に埋め込まれる。図５に示した好適な実施形態では、磁石は、試料保持チャンバーとセンサー領域の間の領域内のカートリッジ本体中に配置される。
【００６８】
特定の実施形態及び図５において、閉鎖可能なバルブが、第１の導管と廃棄物チャンバーの間に提供される。一実施形態では、このバルブ５８は、不浸透性物質でコーティングされた、乾燥スポンジ物質を含む。稼動中、スポンジ物質が試料又は流体と接触すると、スポンジが膨潤することによって、空洞４１（図４）を塞ぎ、それによって廃棄物チャンバー４４（図４）への液体のさらなる流れが実質的に遮断される。濡れたバルブは、第１の導管と廃棄物チャンバーの間の空気の流れも遮断し、これにより、試料チャンバーに接続された第１のポンプ手段が、第２の導管内の流体を移動させ、第２の導管から第１の導管へと流体を移動させることが可能になる。
【００６９】
図６は、本発明の一実施形態の免疫センサーカートリッジの概略の構成を例示し、この構成において、３つのポンプ６１〜６３が提供されている。これらのポンプは、特定の実施形態の観点から記載されているが、ポンプ６１〜６３のそれぞれの機能を実施することができる任意のポンピングデバイスを、本発明の範囲内で使用することができることが容易に理解されるであろう。したがって、ポンプ１の６１は、試料保持チャンバーから第１の導管内に試料を移動させることができるべきであり、ポンプ２の６２は、第２の導管内の流体を移動させることができるべきであり、ポンプ３の６３は、少なくとも１つのセグメントを第２の導管内に挿入することができるべきである。本願に想定される他のタイプのポンプとして、それだけに限らないが、圧力が空気袋にかけられる気圧力学手段と接触している空気袋、可動性ダイヤフラム、ピストンとシリンダー、電磁ポンプ、及び音波ポンプが挙げられる。ポンプ３の６３を参照すると、用語「ポンプ」は、１つ又は複数のセグメントが第２の導管内に挿入されるすべてのデバイス及び方法、例えば、空気袋から空気を移動させるための気圧力学手段、溶解するとガスを生じる乾燥化学物質、又は電流源に作動可能に接続された複数の電気分解電極などを含む。特定の実施形態では、セグメントは、１つを超える空気ブラダー又はチャンバーを有することができる機械的なセグメント生成ダイヤフラムを使用して生成される。示したように、ウェル８は、１つの開口部を有し、これは、内側のダイヤフラムポンプとセグメントが注入される、流体が満たされた導管２０とを接続する。ダイヤフラムは、複数のセグメントを生成するために区分することができ、それぞれのセグメントは、流体で満たされた導管内の特定の位置に注入される。図６において、エレメント６５は、磁石領域を示し、エレメント６４は、免疫センサーが、捕捉反応を実施することによって、固定化抗体、分析物、及びシグナル抗体を含むサンドイッチを形成する領域を示す。
【００７０】
本発明の代替の実施形態では、空気セグメントは、受動的な機能を使用して注入される。カートリッジのベース内のウェルは、テープガスケットによって密封される。ウェルを覆うテープガスケットは、いずれかの端部に２つの小さい穴を有する。一方の穴は開いているが、他方は、流体と接触すると湿るフィルター物質で覆われている。このウェルは、目の粗い親水性物質、例えば、セルロース繊維フィルター、紙フィルター、又はガラス繊維フィルターなどで満たされている。この親水性物質は、キャピラリー作用を介してベースのウェル内に液体を引き込み、先にウェル内にあった空気を移動させる。空気は、テープガスケット中の開口部を通じて排出され、体積が、ウェルの体積及び目の粗い親水性物質の空隙体積によって決定されるセグメントを作り出す。ベース内のウェルへの入口の一方を覆うのに使用されるフィルターは、流体がウェルを満たす速度を計測し、それによってセグメントが、カバー内の導管中に注入される速度を制御するように選択することができる。この受動的な機能は、任意の数の制御されたセグメントが、流体経路内の特定の位置に注入されることを可能にし、最小の空間で済む。
【００７１】
上述したように、本発明のカートリッジは、好ましくは計量手段を含み、これにより、未計量体積の試料を導入することが可能になり、この手段から、計量された量が、カートリッジ及びその付随した読取装置によって処理される。したがって、医師又はオペレーターは、測定前に試料の体積を手動で測定することから解放され、それによって時間、努力を節約し、精度及び再現性を増大させる。計量手段は、一実施形態では、キャピラリーストップを境界とし、長さに沿って空気流入ポイントを有する長い試料チャンバーを備える。空気流入ポイントでかけられる空気圧により、計量された体積の試料が、キャピラリーストップを通過させられる。計量される体積は、空気流入ポイントとキャピラリーストップの間の試料チャンバーの体積によって予め設定される。
【００７２】
カートリッジは、気密様式で試料ポートを密封するための閉鎖デバイスを有することができる。この閉鎖デバイスは、好ましくは、カートリッジの本体に対してスライド可能であり、ポートの領域内に位置した過剰の試料を追い出すせん断作用をもたらすことができ、それによって流入ポートとキャピラリーストップの間の保持チャンバー中の試料部分を確実に密封する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，６８２，８３３号を参照されたい。一実施形態では、カートリッジは、例えば、過剰の流体試料を試料流れ口から追い出し、内部流体試料保持チャンバー内の、ある体積の流体試料を密封し、流体試料が内部キャピラリーストップを尚早に突き破るのを抑制する様式で、カートリッジの表面上で密封エレメントをスライド可能なように動かすことによって密封することができる。このスライド可能な閉鎖デバイスによって得られる密封は、非可逆性であることが好ましく、過剰の血液がカートリッジ内に貯まることを防止し、その理由は、閉鎖デバイスは、血液がカートリッジに入る流れ口の面内を移動し、流入ポートの面より下の血液を密封するせん断作用をもたらし、それによって、過剰の血液、すなわち、流れ口の面より上の血液を流入ポートから離し、任意選択により廃棄物チャンバーに移すためである。
【００７３】
本発明の一実施形態の例示的な閉鎖デバイスは、図１に示されており、カバー１の一体化したエレメント２、３、４、及び９を備える。この実施形態では、閉鎖デバイス２は、フック３がパチンと閉まって試料流入ポート４を遮断するまでヒンジの周りを回転する。図１のカバー１の一体化したエレメント２、３、４、及び９を備える閉鎖デバイスの代替案が、図１５及び１６中に、別個のスライド可能なエレメント２００として示されている。図１５及び１６は、別個のスライド可能な閉鎖エレメント２００とともに、図３に示された介在する接着性層２１を伴った、図４中の底部と同様の底部に取り付けられた図１のカバーの改良版を備えるカートリッジデバイスを示す。図１６は、開いた位置での閉鎖デバイス２００を示し、この場合、試料流入ポート４は、試料、例えば、血液を受け入れることができる。図１５は、閉じた位置での閉鎖デバイス２００を示し、この場合、これは、気密様式で試料流入ポートを密封する。稼動中、試料、例えば、血液が流入ポートに添加され、保持チャンバー３４に入った後、エレメント２００は、開いた位置から閉じた位置に手動で動かされる。示した実施形態では、流入ポートの領域内のいずれの過剰の血液も、オーバーフローチャンバー２０１、又は隣接する保持領域若しくは空洞に移動される。このチャンバー又は領域は、過剰の試料、例えば、血液を保持するための流体吸収パッド又は物質を含むことができる。
【００７４】
試料流入ポート４は、図１６に示したような円形、又は楕円形である流れ口とすることができ、流れ口の直径は一般に、０．２〜５ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍの範囲内であり、又は楕円形の周囲長が１〜１５ｍｍである。流れ口の周囲の領域は、適用される試料の液滴形状を制御することによって、流入ポート中への流入を促進するために、疎水性又は親水性であるように選択することができる。図１５及び１６に示された閉鎖デバイスの１つの利点は、これは、試料が保持チャンバー３４の端部のキャピラリーストップエレメント２５を越えて押されるのを防止することである。キャピラリーストップを越えて少量の試料、例えば血液が存在することは、分析物のバルク濃度を測定する検査に有意でなく、したがって、試料体積に依存しない。しかし、試料の計量が一般に有利であるイムノアッセイ用途について、密封エレメントは、デバイスの計量精度を改善し、分析器により試料がカートリッジ導管内に動かされるとき、試料のアッセイされるセグメントが免疫センサーに対して適切に配置されるのを確実にする。
【００７５】
稼動中、試料、例えば、血液がカートリッジに添加されるとき、これは、キャピラリーストップへと移動する。したがって、キャピラリーストップから試料流入ポートまでの領域、すなわち、保持チャンバー３４が試料を含むとき、アッセイに十分な試料が存在する。保持チャンバーを満たすプロセスの間、一部の試料が、流入ポートの流れ口の面の上に残る場合がある。密封エレメントが、開いた位置から閉じた位置に移動されるとき、流入ポートの上にあるいずれの試料も、閉鎖の動作の際に追加の試料を取り込むことなくせん断されて除かれ、それによって試料がキャピラリーストップ２５を越えて移動しないことを確実にする。好適な実施形態では、密封エレメント２００は、図３のテープガスケット２１の表面の上の数千分の１インチ以内に配置される。流入ポートは、密封エレメントが、ロック機構２１２及び２１３に噛み合うとき、２００の表面が接着性テープガスケットまで引き続いて低下することによって密封される。テープは、本質的に非圧縮性であり、流れ口の直径は小さいので、ユーザーによって密封エレメントにかけられるいずれの不意の圧力も、キャピラリーストップを越えて試料を移動させることにならない。
【００７６】
数滴の試料を分析する、ある特定のカートリッジの実施形態では、気泡は、アッセイに影響し得るので、保持チャンバー内でまったく形成しないことが望ましい。したがって、１滴を超える試料、例えば、血液を、気泡を中に閉じ込めることなく保持チャンバー３４内に導入するための信頼できる手段が開発された。本発明の一実施形態によると、試料流入ポートは、コロナ及び／又は試薬カクテルを用いて保持チャンバーを最初に処理することによって、次の液滴が、取り込まれた気泡を保持チャンバー３４内に形成させることなく、複数の液滴の試料を受け入れるように設計する。
【００７７】
使い捨て医療用デバイスにコロナ処理を使用することは、当技術分野で周知であり、実質的に任意の物質、例えば、金属化表面、ホイル、紙、板紙原料、又はプラスチック、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ビニル、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、及びポリエリレンテレフタレート（ＰＥＴ）などの表面活性を増大させる有効な方法である。このコロナ処理は、これらの物質をインク、コーティング、及び接着剤に対してより受容性にする。実際には、処理されている物質は、放電、又は「コロナ」に曝される。放電範囲内の酸素分子が壊れて原子になり、処理されている物質中の分子に結合し、化学的に活性化された表面をもたらす。コロナ処理のための適当な装置は市販されている（例えば、Ｃｏｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ）。プロセス変数は周知であり、例えば、物質を処理するのに必要とされるパワー量、物質速度、幅、処理される面の数、及びコロナ処理に対する特定の物質の応答性が含まれる。一般的なコロナ処理設備の場所は、プリント、コーティング、又はラミネートプロセスとインラインである。別の一般的な設置は、インフレーションフィルム又はキャストフィルム押出機の直接上であり、その理由は、新鮮な物質は、コロナ処理に対して相対的により受容性であるためである。
【００７８】
本発明のカートリッジは、試料及び第２の流体が、アッセイシーケンスの間の異なる時間にセンサーアレイに接触することができるという利点を有する。試料及び第２の流体はまた、それぞれの導管内に乾燥コーティングとして最初に存在する他の試薬又は化合物を用いて独立して改質することができる。カートリッジ内の液体の制御された動きはさらに、試料又は流体が導管の新しい領域に移されるときはいつでも、１つを超える物質が各液体中に改質されるのを可能にする。このようにして、各流体への複数の改質のための対応がなされ、実施することができる自動化されたアッセイの複雑性を大いに拡張し、したがって、本発明の有用性を増強する。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態では、カートリッジは使い捨てである。使い捨てカートリッジでは、含まれる液体の量は、費用及びサイズを最小限にするために、少なく維持されることが好ましい。本発明では、導管内のセグメントは、少なくとも１回すすがれるセンサーアレイ上のセグメント又は他の領域の空気−液体界面を通過させることによって、導管の掃除及びすすぎを補助するのに使用することもできる。より多い量の流体による連続的なすすぎと比較して、より少ない流体を使用するより効率的なすすぎが本方法によって実現されることが見出された。
【００８０】
導管内の制約は、本発明におけるいくつかの目的を果たす。一実施形態では、試料保持チャンバーと第１の導管の間に位置したキャピラリーストップは、十分な圧力がかけられることによって、キャピラリーストップの抵抗を克服するまで、保持チャンバー内の試料が移動するのを防止することによって、保持チャンバー内で試料計量を促進するのに使用される。別の実施形態では、第２の導管内の制約は、流体が狭窄部に到達するとき、廃棄物チャンバーに向かう代替経路に沿って洗浄流体をそらすのに使用される。ガスケット中の小さい穴が、疎水性コーティングと一緒に提供されることによって、十分な圧力がかけられるまで、第１の導管から第２の導管までの流れを防止する。本発明の導管内及び導管同士間の液体の流れを制御する機能は、本明細書で一括して「バルブ」と呼ばれる。
【００８１】
本発明の一実施形態は、分析物センサー又は分析物センサーのアレイを含む第１の導管に試料保持チャンバーが接続された使い捨てカートリッジを提供する。流体をある程度含む第２の導管は、第１の導管に接続され、第２の導管内の流体中に空気セグメントを導入することによって、これを区分することができる。ポンプ手段が第１の導管内の試料を移動させるのに提供され、これは、流体を第２の導管から第１の導管へと移動させる。したがって、１つ又は複数のセンサーは、試料に最初に接触し、次いで第２の流体に接触することができる。
【００８２】
別の実施形態では、カートリッジは、第１の導管と廃棄物チャンバーの間に位置した閉鎖可能なバルブを含む。この実施形態は、第１の導管に接続された唯一のポンプ手段を使用して、第２の導管から第１の導管への流体の移動を可能にする。この実施形態はさらに、本発明のカートリッジの導管を効率的に洗浄することを可能にし、これは、小さい使い捨てカートリッジの重要な機能である。稼動中、試料は移動されてセンサーに接触し、次いで閉鎖可能なバルブを通じて廃棄物チャンバーへと移動される。濡れると、閉鎖可能なバルブは、廃棄物チャンバーへの開口部を密封し、気密シールをもたらし、これは、第１の導管に接続されたポンプ手段のみを使用して、第２の導管内の流体が引き込まれてセンサーに接触するのを可能にする。この実施形態では、閉鎖可能なバルブは、流体がこのようにして移動するのを可能にし、廃棄物チャンバーから第１の導管に空気が入るのを防止する。
【００８３】
別の実施形態では、閉鎖可能なバルブ、及び導管中にセグメントを導入するための手段の両方が提供される。この実施形態は、多くの利点、その中でも、センサー又はセンサーのアレイ上で区分された流体を往復運動させる能力を有する。したがって、第１のセグメント又は一連のセグメントがセンサーをすすぐのに使用され、次いで新鮮なセグメントが、測定を行うためにこれを差し替える。１つのポンプ手段（第１の導管に接続された）だけが必要とされる。
【００８４】
ＩＩ．シグナル生成反応
上述したように、非競合（サンドイッチ）イムノアッセイ形式は、最も広く使用されるイムノアッセイ法であり、分析デバイス、例えば、本発明のカートリッジにおいて好適な形式である。この実施形態では、１つの抗体（固定化抗体）が固体支持体又は免疫センサーに結合され、第２の抗体（シグナル抗体）が、酵素、例えば、アルカリホスファターゼなどのシグナル生成試薬にコンジュゲート／結合される。
【００８５】
簡単に言えば、図１７は、分析の間に起こるシグナル生成反応を例示し、図１７（Ａ）は、電気活性なｐ−アミノフェノールを生成するためのアルカリホスファターゼによる基質の切断を示し、図１７（Ｂ）は、ｐ−アミノフェノールの酸化を示す。図１７（Ａ）中の反応は、センサー構造の上側層で起こり、一方、図１７（Ｂ）中の反応は、金電極表面において起こる。図１７（Ａ）中の挿入図は、アルカリホスファターゼで触媒される加水分解のｐＨ依存性を例示する。中央の図解は、試料に曝す前の免疫センサー構造の全体的な特徴を表す。
【００８６】
シグナル生成試薬（例えば、非競合アッセイのためのシグナル抗体、又は競合アッセイのための標識分析物）は、以下に記載されるように、分析デバイス中の乾燥試薬コーティングの一部とすることができ、好ましくは、試料が免疫センサーに到達する前に生体試料中に溶解する。非競合アッセイについて、試料及び非特異的に結合した試薬を洗い流した後、固体支持体上に残っているシグナル生成試薬（例えば、シグナル抗体）の量は、試料中の分析物の量に、原理上は比例するはずである。上記に論じた競合アッセイについて、試料及び非特異的に結合した試薬を洗い流した後、固体支持体上に残っているシグナル生成試薬（例えば、標識分析物）の量は、試料中の分析物の量に、原理上は反比例するはずである。しかし、これらのアッセイ構成の１つの制限は、試料中に存在する白血球によって引き起こされる干渉（単数又は複数）に対する感受性である。
【００８７】
代替の実施形態では、抗体又は他の分析物結合分子にコンジュゲートした酵素は、ウレアーゼであり、基質は尿素である。アンモニウム感受性電極を使用することによって、尿素の加水分解で生成されるアンモニウムイオンが、この実施形態では検出される。アンモニウム特異的電極は、当業者に周知である。例えば、適当な、微細加工されたアンモニウムイオン選択的電極は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，２００，０５１号に開示されている。基質と反応してイオンを生じる他の酵素は、それとともに使用される他のイオンセンサーと同様に、当技術分野で公知である。例えば、アルカリホスファターゼ基質から生成されるリン酸は、リン酸イオン選択的な電極において検出することができる。
【００８８】
ＩＩＩ．磁気犠牲ビーズ
本発明の様々な実施形態では、生体試料、例えば、血液試料は、白血球に対して特異的にオプソニン化された「犠牲」磁気ビーズ又は「デコイ（ｄｅｃｏｙ）」磁気ビーズを用いて改質される。好適な実施形態では、磁気犠牲ビーズは、試料と均質に混合されている。他の実施形態では、磁気犠牲ビーズは、試料とあまり均質に混合されていない場合があるが、目的は、可能な限り多くの白血球を捕捉することである。磁気犠牲ビーズを利用すると、試料が免疫センサーに到達する前に、生体試料から白血球を実質的に除去することが可能になる。
【００８９】
例えば、一実施形態では、上述したサンドイッチアッセイプロセスと同様に、磁気犠牲ビーズは、カートリッジの保持チャンバー内の生体試料、例えば、血液と、及び任意選択により、酵素標識された第２の抗体とも混合される。次いで試料は、混合を促進するために、任意選択により保持チャンバー内で往復され、その間に、白血球がオプソニン化された磁気ビーズと付随した状態になる。混合は、所定の期間、例えば、アッセイサイクルの最初の１〜５分間行うことができる。アッセイの次ステップでは、試料は、導管を通じて免疫センサーに移動される。先に述べたように、免疫センサーは、分析物についての捕捉抗体を有する。免疫センサーに対して保持チャンバーに近位の導管の領域において、磁気ビーズは磁石領域に入り、そこでの印加磁場は、流体から犠牲ビーズの大部分、好ましくは実質的にすべて、例えば、少なくとも５０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８５重量％、又は少なくとも９０重量％を保持し、磁石領域（一般的に導管）の壁にこれらを有効に固定するのに十分である。本質的には、カートリッジ内のポンプが始動され、試料を、導管を通じて前進させる際、磁気犠牲ビーズは、気圧による力に抵抗し、磁石によって印加された磁場のために磁石領域内に残ることができる。試料の残りの部分は、免疫センサー領域へと進み続ける。免疫センサー上でサンドイッチが形成された後（ヘテロジニアス非競合的実施形態について）、血液試料は、好ましくは廃棄物チャンバーへと洗浄され、標識と反応する試薬、例えば、ＡＬＰが添加される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、磁場は、導管の指定されたゾーンに隣接した機器内の永久磁石又は電磁石によって生成することができる。他の実施形態では、磁石は、カートリッジ本体中に埋め込まれる。本発明で利用される磁石は、当技術分野で公知の任意の形状、サイズ、及び磁性物質のものとすることができる。図５に示した好適な実施形態では、磁石は、試料保持チャンバーとセンサー領域の間の磁石領域６５内のカートリッジ本体中に配置される。すべてのこのような実施形態において、磁石と磁気犠牲ビーズの相互作用により、試料中の白血球の実質的な部分が、導管の免疫センサー領域に到達するのが防止される。この脈絡において、用語「実質的な」「実質的に」は、５０重量％より多い量を意味する。
【００９１】
磁気犠牲ビーズは、本発明のデバイス中、又はこのデバイスと合わせて利用される磁石、例えば、永久磁石又は電磁石に敏感な、当技術分野で公知の任意の物質を含むことができる。本発明のいくつかの実施形態では、犠牲ビーズは、好ましくはコーティング材で完全又は部分的にコーティングされた磁気コアを含む。磁気コアは、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｎｉの１つ又は複数、これらの元素の１つ又は複数を含む金属、これらの元素の秩序合金、これらの元素を含む結晶、フェライトなどの磁性酸化物構造、及びこれらの組合せを含むことができる。他の実施形態では、磁気コアは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、又は式Ｍｅ１−ｘＯＦｅ３＋ｘＯ３（式中、Ｍｅは、例えば、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｍｇ、若しくはＺｎ、又はこれらの物質の組合せであり、ｘは、０．０１〜９９の範囲である）によって与えられる二価の金属フェライトを含むことができる。
【００９２】
コーティングに適した物質として、合成ポリマー及び生体高分子、コポリマー、並びにポリマーブレンド、並びに無機材料が挙げられる。ポリマー物質として、アクリレート、シロキサン、スチレン、アセテート、アルキレングリコール、アルキレン、アルキレンオキシド、パリレン、乳酸、及びグリコール酸のポリマーの様々な組合せを挙げることができる。無機コーティング材として、金属、金属合金、及びセラミックの任意の組合せを挙げることができる。セラミック材料の例として、ヒドロキシアパタイト、炭化ケイ素、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、フェライト、ホスホネート、及び元素の周期律表のＩＶ族元素の酸化物を挙げることができる。本発明の好適な実施形態では、磁気ビーズは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）を含み、カルボキシル基で修飾された表面をもたらすために、スチレン−アクリル酸コポリマーでコーティングされている。
【００９３】
本発明の他の実施形態では、磁気犠牲ビーズは、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、及びデキストランからなる群から選択される材料で形成された非磁気基質ビーズを含み、その上に磁気コーティングが施されている。
【００９４】
原理上は、磁気犠牲ビーズの分散性の要求を考慮して、白血球についてオプソニン化され得る任意の正確なサイズの磁気ビーズを本発明において利用することができる。いくつかの例示的な実施形態では、磁気犠牲ビーズの平均粒径は、０．０１〜２０μｍ、例えば、０．１〜１０μｍ、１〜５μｍ、又は３〜５μｍの範囲となり得る。本明細書で使用する場合、用語「平均粒径」は、当技術分野で周知の方法によって求められる場合の、粒子の平均最長寸法、例えば、球状粒子の直径を指す。磁気犠牲ビーズの粒径分布は、単峰性であることが好ましいが、多峰性分布も、本発明によって使用することができる。
【００９５】
球状磁気ビーズを使用することが好適であるが、他の実施形態では、他のビーズ形状及び構造、例えば、楕円形、亜球状、円柱状、及び他の不規則な形状をした粒子も、本明細書で使用及び定義される用語「ビーズ」並びに用語「微粒子」の意味の範囲内である。
【００９６】
表面コーティングが、アッセイされる試料に曝された後にオプソニン化され、又はオプソニン化可能（ｏｐｓｏｎｉｚａｂｌｅ）にされるように、磁気ビーズを、様々な表面コーティング材料を用いてコーティングすることができる。いくつかの実施形態では、磁気犠牲ビーズは、動物種から単離された非ヒトＩｇＧ（ＩｇＧクラスの免疫グロブリン）又はその断片でコーティングされる。本明細書で使用する場合、用語「断片」は、指定された分子に由来する任意のエピトープ担持断片を指す。したがって、ＩｇＧ断片は、例えば、エピトープ担持Ｆ（ａｂ’）２断片若しくはＦａｂ断片、又はＦｃ断片を含むことができる。さらに、「ＩｇＧ又はその断片」という語句は、ＩｇＧ単独、ＩｇＧ断片単独（すなわち、ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、及び／若しくはＦｃ断片の１つ若しくは複数）、又はＩｇＧとＩｇＧ断片の組合せを意味する。本発明の好適な実施形態では、ヤギＩｇＧ又はヒツジＩｇＧでコーティングされた粒子が使用されるが、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧなどの他のＩｇＧ源も使用することができる。
【００９７】
個々のモノマーが、Ｆ（ａｂ’）２領域に結合されたＦｃ領域から形成され、その結果として２つのＦａｂ領域を含む全ＩｇＧ分子を使用して磁気犠牲ビーズをコーティングすることに加えて、又はその代わりに、上記に定義したＩｇＧの断片を使用することも可能である。ＩｇＧ断片化は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、及び／又はＦｃ断片のいくつかの組合せを作り出すために、ジスルフィド結合の還元（−Ｓ−Ｓ−から−ＳＨ  ＨＳ−）、及び酵素のペプチン又はパパイン消化の組合せを使用して、様々に実現することができる。これらの断片は、別個に使用するためにクロマトグラフィーによって分離し、又は組合せで使用することができる。例えば、遮断部位がＦｃ断片上にある場合、これは、全ＩｇＧ分子の代わりに使用することができる。同じことが、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片にも当てはまる。
【００９８】
相対的により小さい犠牲ビーズ、例えば、ＩｇＧでコーティングされた０．２μｍ未満の平均粒径を有するものを使用することができるが、ＩｇＧでコーティングされた磁気犠牲ビーズの平均粒径は、３〜５μｍの範囲内であることが好ましい。
【００９９】
本発明の磁気ビーズは、例えば、血液収集デバイスの一体部分、又は標準的なマニュアル添加ステップなどとして、カートリッジに導入する前に生体試料に添加することができることを当業者は理解するであろう。しかし、ユーザーの利便性のため、及び高品質なアッセイを保証するために、磁気ビーズは、検査デバイス内に含められることが好ましい。
【０１００】
一実施形態では、磁気犠牲ビーズは、乾燥試薬コーティング中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、カートリッジ筐体の少なくとも一部を、非ヒトＩｇＧでコーティングされた磁気犠牲ビーズを含むことができる乾燥試薬を用いてコーティングすることができる。重要な特徴は、乾燥試薬が、試料中に溶解し、白血球を結合に引きつけることができることである。これは一般に、試料中で、潜在的に干渉性の白血球を隔離するのに十分である。  
ある特定の実施形態では、磁気犠牲ビーズは、シグナル生成試薬（例えば、非競合アッセイのためのシグナル抗体、又は競合アッセイのための標識分析物）を含有する、同じ乾燥試薬コーティング中に組み込まれる。したがって、本発明の一実施形態では、分析デバイスは、（ａ）白血球の作用を改善するのに適した成分、例えば、ＩｇＧ若しくはその断片でコーティングされた磁気犠牲ビーズ、及び／又は（ｂ）シグナル抗体若しくは標識分析物などのシグナル生成試薬のいずれか、又は両方を含む乾燥試薬コーティングを含む。
【０１０１】
本発明は、生体試料中の標的分析物についてのイムノアッセイを実施する方法も対象とする。一実施形態では、この方法は、検査カートリッジ中の保持チャンバー内に、白血球を含有する血液試料を導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、血液試料を導管内に移動させるステップと、導管の少なくとも一部に局在化した磁場を印加することによって、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、血液試料を免疫センサーと接触させることによって、固定化捕捉抗体、試料分析物、及び標識シグナル抗体を含むサンドイッチを形成するステップと、免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、免疫センサーを、前記標識シグナル抗体と反応することができる試薬と接触させることによって、血液試料中の試料分析物の存在に関連する、免疫性センサーにおけるシグナルを生成するステップとを含む分析物サンドイッチイムノアッセイを実施することを含む。
【０１０２】
この同じ一般的な手法は、競合イムノアッセイにも適している。サンドイッチアッセイについて上述した実質的に同じカートリッジ形式では、白血球は、免疫センサーにおいて（ヘテロジニアス競合アッセイについて）、又は可動性粒子上で（ホモジニアス競合アッセイについて）起こる分析物と標識分析物の競合的結合の前に、磁気手段によって試料から実質的に除去される。
【０１０３】
ヘテロジニアス競合分析物イムノアッセイを実施することの詳細は、検査カートリッジ中の保持チャンバー内に、白血球を含有する血液試料を導入するステップであって、保持チャンバーの一部は、白血球に対してオプソニン化された磁気犠牲ビーズでコーティングされているステップと、生体試料中の白血球の少なくとも一部を磁気犠牲ビーズに結合させるのに十分な条件下で、血液試料を磁気犠牲ビーズと接触させるステップと、血液試料を導管内に移動させるステップと、導管の少なくとも一部に局在化した磁場を印加することによって、磁気犠牲ビーズを導管の壁の少なくとも一部に引き寄せ、保持し、それによって、磁気犠牲ビーズが免疫センサーと接触するのを実質的に防止するステップと、血液試料を免疫センサーと接触させることによって、競合的な比の結合試料分析物と結合標識分析物を形成するステップと、免疫センサーから血液試料を洗浄するステップと、免疫センサーを、標識分析物と反応することができる試薬と接触させることによって、血液試料中の試料分析物の存在に逆に関連する、免疫性センサーにおけるシグナルを生成するステップとを含む。
【０１０４】
ＩＶ．添加剤
本発明のいくつかの実施形態では、添加剤を、カートリッジ内に含め、又はアッセイとともに使用することができる。ある特定の実施形態では、抗凝固剤を添加することができる。例えば、いくつかの実施形態では、試料が、ヘパリン化された管内に収集されなかった、又はヘパリン化された管内で適切に混合されなかった場合に、性能を改善するためにヘパリンを添加することができる。新鮮なヘパリン化されていない血液が、カートリッジのアッセイサイクルの間、一般に２〜２０分の範囲内で、凝血しないままであるように、十分な量のヘパリンが添加される。他の実施形態では、イムノアッセイの分野で公知の異好性抗体問題に対処するためにヤギＩｇＧ及びマウスＩｇＧを添加することができる。さらに他の実施形態では、プロクリン、ＤＥＡＥ−デキストラン、ｔｒｉｓ緩衝液、及びラクチトールのうちの１つ又は複数を、試薬安定剤として添加することができる。他の実施形態では、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０としても知られるポリソルベート２０などの界面活性剤を添加することによって、タンパク質が、カートリッジに好適な物質であるプラスチックに結合するのを低減することができる。界面活性剤の添加はまた、試薬がプラスチック表面を均等にコーティングするのを促進し、糖（例えば、ラクチトール）の結晶化を最小限にする。本発明の他の実施形態では、抗菌剤又は殺生物剤（例えば、アジ化ナトリウム）を添加することによって、細菌増殖を阻害することができる。
【０１０５】
Ｖ．プリントカクテル（ｐｒｉｎｔ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）の調製及びプリント
磁気ビーズ／微粒子は、様々な形態で市販されている。磁気コアは、磁性物質又は超常磁性物質とすることができる。一般的に、コアは、ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、又はバイオポリマー、例えば、デンプン若しくは同様の炭水化物でコーティングされる。磁気ビーズ配合物の商業的供給源には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ａｄｅｍｔｅｃｈ（Ｐｅｓｓａｃ、ＦＲ）、及びＣｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ（Ｂｅｒｌｉｎ）が含まれる。これらの製品の多くは、微粒子上に抗体、例えばＩｇＧを固定化するのに使用することができる表面機能化を組み込んでおり、例えば、−カルボキシル、−アミノ、又はストレプトアビジンで修飾された磁気ビーズである。磁気ビーズ配合物は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、ＵＫ）によって供給されるものなどの、例えば、ラクチトールとＤＥＡＥ−デキストランの混合物中の懸濁液として、デバイスの適当な領域内に堆積させることができる。溶媒、通常、水が蒸発すると、ガラス状の堆積物が生じ、この中でビーズが固定化される。ラクチトール／ＤＥＡＥ−デキストランは、微粒子が、試料に接触すると溶解する、機械的及び生化学的に安定な状態でデバイス内に局在化することを可能にする。
【０１０６】
好適な実施形態では、ベースプリントカクテルは、１リットル（Ｌ）のバッチについて以下のように調製される。タンパク質安定化溶液（ＰＳＳ、ＡＥＴ  Ｌｔｄ．、５０％の固体、１００．０ｇ）が、塩化ナトリウム（８．００ｇ）及びアジ化ナトリウム（０．５００ｇ）の水溶液２００〜２５０ｍＬに添加され、得られた溶液は、１Ｌ容のフラスコに移される。マウスＩｇＧの溶液は、マウスＩｇＧ（０．９ｇ）を脱イオン水７５ｍＬに添加することによって調製され、溶解が完全になるまで１５〜６０分間撹拌される。ヤギＩｇＧの同様に濃縮された溶液も同一の様式で調製され、両溶液は、１．２μＭのフィルターを通して濾過される。マウスＩｇＭは、供給者（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から液体として得られる。３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）原液のそれぞれのタンパク質濃度は、２８０ｎｍで、分光光度法で測定される。マウスＩｇＧ（０．７５ｇ）、ヤギＩｇＧ（０．７５ｇ）、及びマウスＩｇＭ（２５ｍｇ）を提供するのに必要とされるこれらのＩｇ溶液の質量が計算され、これらの量がプリント溶液（ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に添加される。ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ−デキストラン）の溶液は、ＤＥＡＥ−デキストラン（２．５ｇ）を脱イオン水５０〜１００ｍＬに添加し、３０分間撹拌することによって調製される。このＤＥＡＥ−デキストラン溶液は、プリント溶液に添加される。これに、ナトリウムヘパリン（１０，０００ＩＵ／ｍＬ、３．００ｍＬ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（３．００ｇ）、及びローダミンの５％（重量／体積）の水溶液（２００μＬ）が添加される。得られた溶液は、脱イオン水で１．０００Ｌに希釈され、使用されるまでフリーザー又は冷蔵庫内で貯蔵される。白血球干渉を低減又は排除するためのＩｇＧでコーティングされた磁気ビーズは（任意選択によりＩｇＧでコーティングされた非磁気ビーズと組み合わせて）、最終的な希釈の前、又は検査デバイス、例えば、図１〜６に示されたタイプのいずれかのカートリッジ内への堆積の直前に添加することができる。
【０１０７】
本発明の様々な実施形態では、カートリッジコンポーネント上に乾燥試薬コーティングを形成するために、プリントカクテル及び同様の流体をプリントするステップは、好ましくは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｃｏｚｚｅｔｔｅらの米国特許第５，５５４，３３９号（「’３３９特許」）に開示されているように、自動化され、コンポーネントを整列させるためのカメラ及びコンピューターシステムを含むマイクロディスペンシングシステムに基づく。’３３９特許において、ウエハーチャックは、プラスチックカートリッジのベースをディスペンシングヘッドに送るためのトラックに取り替えられる。トラックは、所定の配向でベースをヘッドに差し出すことによって、一貫した位置での分注を保証する。
【０１０８】
ＶＩ．収集及び分析
本発明の様々な実施形態によれば、血液試料は、試料収集デバイス、例えば、キャピラリー、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）、又はシリンジなどを使用して得られる。一実施形態では、磁気犠牲ビーズは、試料収集デバイス、例えば、キャピラリー、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）、又はシリンジ内に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、磁気犠牲ビーズコーティングは、収集デバイスの内壁上に形成することができる。
【０１０９】
ＶＩＩ．免疫センサーの実施形態、及びそれに関係した方法
本発明は、イムノアッセイシステムに広く適用可能であるが、上記に引用された共同所有の係属中及び発行済み特許に記載されているように、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）イムノアッセイシステム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  米国）との関連で最良に理解される。その全体が参照により本明細書に組み込まれている、２００９年１２月１８日に出願された、「Ｆｏｌｄａｂｌｅ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｈｏｕｓｉｎｇｓ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」という表題の米国特許出願第６１／２８８，１８９号も参照されたい。
【０１１０】
様々な実施形態では、このシステムは、アッセイの間に起こる非特異的結合（ＮＳＢ）の程度を評価する目的で、免疫参照センサー（例えば、上記に参照した、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｉｌｌｅｒらの米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号を参照されたい）を使用する。いくつかの場合、ＮＳＢは、不十分な洗浄、又は干渉の存在のために発生し得る。アッセイからの正味のシグナルは、免疫参照センサーから生じる非特異的シグナルを減じることによって補正された、分析物免疫センサーから生じる特異的シグナルを含む。免疫参照センサーにおけるシグナルの量は、品質管理アルゴリズムによって定義される限界に支配される。免疫センサーは、心血管マーカー、例えば、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びｐｒｏＢＮＰなどの分析物を検出するのを対象とすることが好ましい。
【０１１１】
本発明の実施形態は、ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）イムノアッセイ形式の、白血球によって引き起こされる干渉に対する耐性を改善する。これらの実施形態では、生体試料は、白血球干渉を低減又は排除するために、本発明の磁気犠牲ビーズで改質される。そのような実施形態は、細胞が分析媒質中に存在する場合、標準的なＥＬＩＳＡ形式にも同様に適用可能である。
【０１１２】
従来のサンドイッチアッセイは、白血球レベルが高い生体試料について誤った結果を生じる場合がある一方で、先のｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）システムアッセイは、システムが、偽シグナルを検出し、エラーコードでユーザーに警告し、結果が表示されることを抑制するアルゴリズムを含むので、これらの試料について、不正確な結果を報告しなかった。これは、信頼できるポイントオブケア検査のための品質システムの一実施形態であり、ここでは分析システムの品質及び完全性が維持される。
【０１１３】
本発明の要旨に関して、ある特定のイムノアッセイ検査カートリッジ、特に脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）カートリッジが、以前に知られていない干渉機構から生じる予期しない正及び負の傾きをした波形を示すことが発見された。例えば、それぞれ図９（Ａ）及び（Ｂ）を参照されたい。これにより、洗浄ステップの間に電極を正電位にパルシングする効果についての実験に基づいて、干渉の機構に関する仮説が導かれた。図９（Ｃ）及び（Ｄ）に示したように、理論に基づいて予期される通常の免疫センサー応答は、低分析物濃度でゼロ付近の傾きを有し、測定が酵素限界ではなく、基質限界となり得る高分析物濃度でのみ、負の傾きが予期される。
【０１１４】
動的な（非定常状態）電流測定シグナルを引き起こすいくつかの潜在的な機構が存在する。動的な電極活性（有効電極面積の変化）はありそうになく、その理由は、電極は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）層上の固定化されたアッセイビーズ（微粒子）の存在のために、形成されるエレメントから隔離されており、そのどちらも血漿試料中でこの効果を示さないためである。動的な層厚、例えば、流体との接触に応じた上記コンポーネントの膨張又は縮小はありそうになく、その理由は、正及び負の傾きの両方を誘発する現象の原動力がまったく存在しないためである。酵素の動的なカバー率（例えば、ＡＬＰ、酵素の表面濃度の変化）は除外され、その理由は、薄層形式において、測定の時間スケールにわたって、センサーから酵素（例えば、ＡＬＰ）が拡散することは可能でないためである。酵素基質、例えば、パラ−アミノフェノールホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）の電極表面への動的な輸送は、相対的に小さく、拡散が相対的に容易である（Ｄ≒５×１０−６ｃｍ２／ｓ）分子のサイズを考慮するとありそうにない。したがって、消去プロセスによって、且つ理論に束縛されることを望むわけではなく、動的なＡＬＰ活性が、動的なセンサーシグナルの最も可能性のある原因と考えられたので、この機構を評価するためにさらなる調査を行った。ＡＬＰによるｐ−ＡＰＰの加水分解は、ｐＨ依存性であり、最適条件は、ｐＨ１０付近である。いくつかの実施形態では、カートリッジ内で、９．２の作業ｐＨが使用され、その理由は、このわずかに低いｐＨ値が免疫複合体の安定性を保証するためである。さらに、電極におけるパラ−アミノフェノール（ｐ−ＡＰ）の酸化は、ｐＨ依存性であり、ｐＨの低下１当たり約＋５９ｍＶシフトすることが予期され、すなわち、より低いｐＨで、反応は、より強く推進されなければならず、すなわち、印加電位の上昇が必要とされる。
【０１１５】
プリント層の浸透性が、干渉成分との相互作用のために、センサー構造内の試料流体（ｐＨ７．４）が洗浄ステップの間に分析流体（ｐＨ９．２）と完全に置換することができない程度により低くなることになった実施形態では、これは、特に、分析流体の流入箇所から最も遠い領域で起こる電極反応について、準最適な検出ステップのｐＨをもたらす。この流体置換の障害は、経時的に緩和するｐＨ勾配を作り出す。酵素反応及び電極反応の相対速度が変化するので、観察されるシグナルも変化することになる。この技術的な評価は、これが正及び負の傾きのシグナルの両方を説明するという相当な利点を有する。例えば、図９（Ａ）及び（Ｂ）を参照されたい。
【０１１６】
観察される干渉が、プリント層の「詰まり」又は「ファウリング」による不完全な洗浄ステップと関連するという概念は、洗浄ステップの間に、極端な電位までパルスを印加することによって、例えば、酸化電位までパルスを印加することによってさらに評価された。正の傾きの波形は、不活性な遮断されたセンサーによって引き起こされる場合があり、分析ステップの前に電極を浄化するために、パルシングを使用することができることが期待された。通常の試料における洗浄ステップの間に酸化パルスを印加しても、観察されるシグナルに対して、及び引き続く分析において効果はまったくないことが観察された。図１０（Ａ）を参照されたい。しかし、異常な高バフィー試料の場合では、パルシングの効果は、大きくて動的なシグナルであり、さらに、これらのシグナルは、分析物の濃度を考慮して予期されるより大きかった。図１０（Ｂ）を参照されたい。
【０１１７】
これらの２つの場合における酸化電位パルスに対する応答の差異は、センサー構造内の流体が実際に異なることを実証した。期待されたように、正しい応答は、センサー上に所望の分析流体が存在したことから生じ、一方、異常な応答は、センサー構造上の流体が、血漿、又は血漿と分析流体の組合せであったために生じた。応答の差異は、以下のように理解することができる：酸化パルスは、Ｈ２Ｏ→１／２Ｏ２＋２Ｈ＋＋２ｅ−によって、酸素を発生させ、ｐＨを低下させる。
【０１１８】
ｐＨ９．２に緩衝された分析流体を含有するセンサー構造の場合では、電極で発生するプロトンは、緩衝液（分析流体中１００ｍＭの炭酸塩）の存在下で急速に消費された。しかし、分析流体によって得られる緩衝作用の非存在下で、プロトンは電極領域内で残り続け、酸性流体のプルームをもたらした。この酸性プルームは、ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）のパラ−アミノフェノール（ｐ−ＡＰ）への酸触媒加水分解をもたらし、期待されるより大きいシグナルを生成した。具体的には、異常波形は、ｐ−ＡＰＰに対する酵素、例えば、ＡＬＰの酵素作用、及びまた、非酵素的な酸触媒加水分解によって生成されたｐ−ＡＰから生じた。
【０１１９】
酸触媒加水分解反応は、ｐＡＰＰについては、アミノ基が、低ｐＨでプロトン化されるようにプロトン化されない限り、有意に起こらないことが注目される。これは、反応がパラ位において強い電子吸引性置換基を必要とするためである（例えば、Ｂａｒｎａｒｄら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６６）、２２７〜２３５を参照）。当技術分野で知られているように、−ＮＨ２置換基は著しく電子供与性であるが、プロトン化すると、−ＮＨ３＋置換基は非常に電子求引性になる（−ＮＯ２よりさえも電子吸引性になる；例えば、Ｈａｍｍｅｔのパラ−ρ値は、−ＮＨ２について−０．６６、−ＮＨ３＋について１．７０である）。
【０１２０】
これらの実験は、観察される干渉を「高バフィー」試料と関係づけ、「富化されたバフィーコート」とともに全血試料を流すことによって意図的に引き出すことができた。この用語は、血液試料が遠心分離されるとき、血漿−赤血球境界で形成する白血球と血小板の層に与えられる。白血球、及び潜在的に血小板をファウリング作用物質として関係させるさらなる証拠が、顕微鏡写真の図１４（Ａ）（犠牲ビーズ又は白血球試薬を使用しないアッセイ）、及び図１４（Ｂ）（非磁気犠牲ビーズを使用した後のアッセイ）に示されている。比較のために、血液試料と接触させる前の無垢の免疫センサーが、図１７に例示されている。免疫センサーが位置する範囲から離れて磁気ビーズが局在化し得るという視覚的な確認をもたらす、同様の結果が得られた。
【０１２１】
図１４（Ａ）は、１０分のセンサーインキュベーション時間とともに、標準的な測定サイクルを使用して高バフィー試料（１μＬ当たり約１０５個の白血球）に曝されたセンサーを示す。試料は、オプソニン化された犠牲ビーズに曝されなかった。アッセイビーズでコーティングされたセンサー表面の一部は、細胞の接着層で覆われていることが明らかであり、これは、洗浄ステップによって容易に除去されなかった。
【０１２２】
対照的に、図１４（Ｂ）は、１０分のセンサーインキュベーション時間とともに、標準的な測定サイクルを使用して高バフィー試料（１μＬ当たり約１０５個の白血球）に曝されたセンサーを示す。しかし、図１４（Ａ）に示したアッセイと対照的に、図１４（Ｂ）に示した試料は、オプソニン化された（ＩｇＧでコーティングされた）（非磁気）犠牲ビーズに曝された。アッセイビーズでコーティングされたセンサー表面の一部は、洗浄ステップ後に図１４（Ａ）と比較した場合、接着細胞が著しく少なかったことが明らかである。
【０１２３】
ＩｇＧはオプソニンとして作用し、オプソニンは、例えば、白血球による食作用について病原体をマーキングすることができる物質である。ＩｇＧは一般に、共同所有された、係属中の米国出願第１２／４１１，３２５号に記載された異好性抗体干渉を管理するために、イムノアッセイに添加され、本明細書に記載されるＢＮＰカートリッジ中の固定化されたアッセイビーズ（微粒子）上に存在する。その結果として、ＩｇＧのこの源（イムノアッセイデバイス中に存在する場合）、又は血液試料中に天然に存在するＩｇＧは、白血球に対してセンサー表面を望ましくなくオプソニン化するように作用する場合がある可能性がある。さらに、アッセイビーズは、食作用の天然の標的である生体細胞（細菌）とサイズが同様であるので、アッセイビーズ上のＩｇＧの蓄積は、これらのビーズ上の白血球の蓄積を望ましくなく促進していることが考えられる。これは、高白血球数を有する試料、及びおそらく、活性化された免疫状態を有する試料において観察される干渉と一致する。本発明は、ＩｇＧでコーティングされた犠牲磁気ビーズを用いた試料の改質が、センサー上の主要な免疫試薬から白血球活性をそらすように白血球活性を減少させるための手段をもたらす、この白血球干渉に対する解決策を提供する。
【０１２４】
本発明のいくつかの実施形態では、ＩｇＧでコーティングされた固定化されたアッセイビーズ（微粒子）の調製は、ＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）中でのカルボキシル化ポリスチレン固定化微粒子上へのＩｇＧの吸着、その後のＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の存在下での架橋を伴う。しかし、固定化されたアッセイビーズは、当技術分野で公知の任意の適当な物質を含むことができる。
【０１２５】
次に、固定化されたアッセイビーズ（微粒子）を形成するための限定されない一方法が説明される。１つの手順では、未処理の固定化微粒子は、その基質（水中１０％の微粒子、Ｓｅｒａｄｙｎ）から、１８，０００ＲＣＦ（相対遠心力）で２０分間遠心分離することによってペレット化され、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液中で、１００〜２００ｍｇ／ｍＬの微粒子の濃度に再懸濁される。次いで、２５ｍＭのＭＥＳ緩衝液中に溶解したＩｇＧが、微粒子の重量の約１〜５％に等しい量で添加される。冷蔵庫内で１５〜２０分、転頭運動させた後、微粒子は、１３００ＲＣＦで２０分間遠心分離することによってペレット化され、新鮮なＭＥＳ緩衝液中で、７５ｍｇ／ｍＬの濃度に再懸濁される。ＩｇＧが微粒子上に吸収されたことを確認するために、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって、遠心分離からの上澄みが、タンパク質含量についてアッセイされる（１ｍＬ当たり１ｍｇのタンパク質当たり１．４ＡＵの有効吸光係数）。新たに調製されたＥＤＡＣ架橋剤（ＭＥＳ緩衝液中１０ｍＭ）が再懸濁された微粒子に添加されて、約２〜４ｍＭの最終濃度にされる。次いでこの混合物は、冷蔵庫内で１２０±１５分間、転頭運動によって撹拌される。次いで微粒子は、１３００ＲＣＦで２０分間遠心分離することによって再びペレット化し、１／５ＰＰＳ（リン酸緩衝食塩水）中に再懸濁し、冷蔵庫内で１５〜３０分間、転頭運動させることができる。最後の遠心分離の後、ＰＢＳ＋０．０５％のアジ化ナトリウム、又は１：１の１／５ＰＰＢ：ＰＳＳ（１／５ＰＰＢは、４部の水で希釈されたＰＢＳである、ＰＳＳ＝タンパク質安定化溶液、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｏｎｙｐｏｏｌ、英国）中で、１０％の固体の濃度に、微粒子を再懸濁することができる。得られる配合物を、アリコートし、好ましくは−６０℃で凍結貯蔵することができる。このプロセスによって形成されたＰＢＳ中に懸濁された微粒子及び（非磁気）犠牲ビーズが、本明細書に記載される実験において使用され、血液試料中に直接投与された。
【０１２６】
上述したある特定のアッセイは、固定化されたアッセイビーズ（微粒子）に結合した固定化された第１の抗体を使用し、このビーズは、さらには、電極が下にある多孔質層に結合しているが、この第１の抗体は、電極若しくは任意の他の表面上に直接固定化し、又は可溶性ビーズ上に固定化することができる。
【０１２７】
本明細書に記載される実験において使用するために記載される、富化された、又は高いバフィー全血試料（ＥＢＳ）の例示的な調製方法は、以下の通りであった。好ましい手順では、新鮮な全血がドナーから抜き取られて２つの６ｍＬのＥＤＴＡ抗凝固処理Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｓ（登録商標）中に入れられ、２０００ＲＣＦ（標準的な回転子）で１０分間遠心分離された。ＢＮＰ「陽性」試料が望まれた場合、管は、遠心分離の前にＢＮＰ抗原でスパイクされた。血漿／バフィーコート／赤血球界面の上の最後の１ミリメートルを除く血漿のすべてが引き出され、確保された。次いで二面間の領域が、ピペッターを使用して（可能な限り多くのバフィーコート層を取り出す意図で）引き出され、確保された。赤血球が取り出され、確保された。バフィーコート物質を血漿画分及び赤血球画分のより少ない部分と再び合わせることによって、通常の試料ヘマトクリット、例えば、３５〜５５ｗｔ．％を保持しながら、高バフィー血液試料を作り出すことが可能であった。同様に、存在するバフィー物質（白血球及び血小板）が少ない、又は本質的にまったくない試料を作り出すことができる。
【０１２８】
実験において、ＢＮＰ検査カートリッジを、（ｉ）高バフィー試料、（ｉｉ）実行する直前に、ＰＢＳ中、ＩｇＧ（μＰ−ＩｇＧ）でコーティングされた１０重量パーセントの微粒子の１０容量パーセントの懸濁液で処理された高バフィー試料、（ｉｉｉ）高ヘマトクリット無白血球試料、及び（ｉｖ）低ヘマトクリット無白血球試料を用いて試験した。
【０１２９】
図１８は、電気化学的免疫センサーのシグナルの傾きに対する白血球干渉の作用、及び傾きに対する（非磁気）犠牲ビーズ処理の効果を例示するグラフデータを含む。右パネル及び左パネル中に例示されているのは、通常の全血試料（右パネル）、及び高バフィー血液試料（富化された白血球、高バフィー、左パネル）についての、正味のシグナル（ｘ軸）の関数としてプロットされたセンサー傾き（ｙ軸）である。左パネルは、犠牲ビーズの非存在下で（サブロット１）、高バフィー試料中で観察されるシグナルの傾きの相当なばらつきを例示する。このばらつきは、非磁気犠牲ビーズの存在下で（サブロット２及びサブロット３）実質的に改善された。最小のシグナルの傾きのばらつきが、犠牲ビーズを含む、及び含まない両方の通常の全血試料（右パネル）において観察された。本発明による磁気犠牲ビーズを使用することによって、同じ又はより良好な結果が実現されるはずである。
【０１３０】
アッセイ後のセンサーの顕微鏡検査により、高バフィー（ＨＢ）中で実行されたチップ上に厚い堆積物が存在し、ＨＢ／μＰ−ＩｇＧ中で実行された試料上に堆積物が存在しないことが明らかになった。免疫センサーの顕微鏡写真は、図１４（Ａ）及び１４（Ｂ）に示され、その関連する分析器の波形が、それぞれ図１９（Ａ）及び（Ｂ）に例示されている。図１７に例示されたような、血液試料と接触する前の無垢の免疫センサーと、犠牲ビーズで処理された血液と接触した後の免疫センサー（図１４（Ｂ））との比較から、視覚的に著しい改善、すなわち、図１４（Ａ）と比較した接着白血球の低減があることが明らかである。多くの観察に基づくと、この視覚的な改善は、免疫センサーの性能の実際の改善と直接相関する。やはり、本発明による磁気犠牲微粒子（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を使用することによって、同じ又はより良好な結果が得られるはずである。
【０１３１】
追加の実験により、干渉現象は、血漿単独中、又は血小板を含有するが、白血球を含有しない試料中で起こらず、しかし、高バフィーレベルを含有する試料中のみで起こることが示された。さらに、ＩｇＧでコーティングされたより小さいビーズ、例えば、平均粒径が０．２μｍ未満のものは、センサーの傾きに対して、より大きい粒子が有するのと同じ干渉低減又は排除効果を有さない。まとめると、実験データは、白血球が、センサーの浸透性が洗浄サイクル中でより低くなる現象の主原因であり、このイムノアッセイ干渉は、アッセイ媒質にＩｇＧでコーティングされた犠牲粒子を添加することによって改善することができるという結論を支持する。
【０１３２】
本発明の免疫センサーの好適な実施形態のウエハーレベルの微細加工は、以下の通りである。図７は、１つの基板上のいくつかの電極のためのマスク設計を例示する。マスキング及びエッチング技法によって、独立した電極及びリードを堆積することができる。したがって、複数の免疫センサー、９４及び９６、並びに電気伝導度測定センサー、９０及び９２が、読取装置への電気的接続を行うための、そのそれぞれの接続パッド９１、９３、９５、及び９７と一緒に、低コストでコンパクトな範囲に提供される。原理上は、それぞれが異なる分析物に感受性であり、又は対照センサー若しくは参照免疫センサーとして作用するセンサーの非常に大きいアレイをこのようにしてアセンブルすることができる。
【０１３３】
本発明の特定の実施形態では、免疫センサーは、以下のように作製することができる。シリコンウエハーを熱酸化することによって、厚さ約１ミクロンの絶縁酸化物層が形成される。チタン／タングステン層が、１００〜１０００オングストロームの間の好ましい厚さまで、酸化物層上にスパッタされ、その後、最も好ましくは８００オングストロームの厚さである金の層がスパッタされる。次に、フォトレジストがウエハー上にスピニングされ、乾燥され、適切にベーキングされる。次いで、図７中に例示したものに対応するマスクなどのコンタクトマスクを使用して、表面が露光される。潜像が現像され、ウエハーが金エッチャントに曝される。パターン形成された金層が感光性ポリイミドでコーティングされ、適切にベーキングされ、コンタクトマスクを使用して露光され、現像され、Ｏ２プラズマ中で浄化され、好ましくは３５０℃で５時間イミド化される。抵抗性加熱素子として作用するために、ウエハーの裏面の任意選択のメタライゼーションを実施することができ、この場合、免疫センサーは、サーモスタットで調節された形式で使用されるべきである。次いで表面が、抗体でコーティングされたビーズでプリントされる。好ましくは体積が約２０ｎＬであり、脱イオン水中、１％の固体含量を含む液滴がセンサー領域上に堆積され、空気乾燥によって、定位置で乾燥される。任意選択により、抗体安定化試薬（ＳｕｒＭｏｄｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｄｅｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ、米国、又はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ、Ｐｏｎｔｙｐｏｏｌ、英国によって供給された）が、センサー上にオーバーコートされる。
【０１３４】
粒子の乾燥は、基質を含有する試料又は流体中に溶解するのを防止する様式で、粒子を表面に接着させる。この方法は、センサーチップを大量に製造するのに適した、信頼でき、再現可能な固定化プロセスを提供する。
【０１３５】
図７に示されるように、ベース電極９４は、１５μｍの中心上に、７μｍの金ディスクの正方形アレイを備える。アレイは、直径が約６００μｍの円形領域を覆い、Ｓｉ／ＳｉＯ２／ＴｉＷ／Ａｕを含む一連の層でできた基板上に、厚さ０．３５μｍのポリイミドの薄層を光パターン形成することによって実現される。７μｍの微小電極のアレイは、電気活性種の高収集効率をもたらし、露出した金属の電気容量に関連する任意の電気化学的バックグラウンド電流からの寄与が低減される。金属上にポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）層を含めることにより、バックグラウンド電流の低減が著しく増強される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、多孔質ＰＶＡ層は、ウエハー上の微小電極の上に、ＰＶＡとスチルビゾニウム（ｓｔｉｌｂｉｚｏｎｉｕｍ）光活性架橋剤の水性混合物をスピンコーティングすることによって調製される。スピンコーティング混合物は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を任意選択により含む。次いでウエハーは、光パターン形成されることによって、アレイの上及び周囲の領域のみを覆い、好ましくは、約０．６μｍの厚さを有する。
【０１３７】
示差測定法の一般的な概念は、電気化学分野及びセンシング分野において公知である。電気化学的免疫センシングシステムにおいて干渉シグナルを低減するための新規手段が、これから説明される。これは、電流測定電気化学的センサーの組について記載されるが、これは、電位差測定センサー、電界効果トランジスタセンサー、及び電気伝導度測定センサーを含むがこれらに限定されない、他の電気化学的センシングシステムにおいても等しく有用なものである。本発明の実施形態は、光学センサー、例えば、エバネッセント波センサー、及び光導波路、並びに音波センシング及び温度測定センシングを含む他のタイプのセンシングなどにも適用可能である。したがって、本発明の様々な実施形態によれば、固定化抗体は、電流測定用電極、電位差測定用電極、電気伝導度測定用電極、光導波路、表面プラズモン共鳴センサー、音波センサー、及び圧電センサーからなる群から選択されるセンサーに付着させることができる。
【０１３８】
理想的には、非競合アッセイの実施形態では、免疫センサー（ＩＳ）からのシグナルは、固定化抗体（Ａｂ１）、分析物、及び標識されたシグナル抗体（Ａｂ２）を含むサンドイッチの構造からもっぱら由来し、スキーム（１）で以下に示されるように、標識（例えば、酵素）は基質（Ｓ）と反応することによって、検出可能な生成物（Ｐ）を形成する。
表面−Ａｂ１−分析物−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （１）
【０１３９】
スキーム（２）及び（３）で以下に示されるように、シグナル抗体（Ａｂ２）の一部は、表面に非特異的に結合する場合があり、洗浄ステップの間に、免疫センサーの領域（最大約１００ミクロン離れた）から完全に洗い流されない場合があり、それによって表面−Ａｂｌ−分析物−Ａｂ２−酵素イムノアッセイサンドイッチ構造の機能ではない、検出される生成物全体の一部を生じ、それによって干渉シグナルを作り出すことが知られている。
表面−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （２）
表面−分析物−Ａｂ２−酵素；酵素＋Ｓ→Ｐ    （３）
【０１４０】
上記に示したように、免疫参照センサー（ＩＲＳ）として作用し、主免疫センサー上で起こるのと同じ（又は予想通りに関係した）程度の非特異的結合（ＮＳＢ）を与える第２の免疫センサーを、カートリッジ内に任意選択により配置することができる。位一実施形態では、干渉は、この免疫参照センサーのシグナルを、主免疫センサーのシグナルから減じることによって低減することができ、すなわち、以下のスキーム（４）に示されるように、シグナルのＮＳＢ成分が除去され、アッセイの性能を改善する。別の実施形態では、補正は、追加のオフセット値の減算又は加算を任意選択により含んでもよい。
補正されたシグナル＝ＩＳ−ＩＲＳ    （４）
【０１４１】
本発明の好適な実施形態では、参照免疫センサーは、免疫−参照センサーとも呼ばれ、すべての重要な点（例えば、寸法、多孔質スクリーニング層、ラテックス粒子コーティング、及び金属電極組成）において、分析物（例えば、ｃＴｎＩ）についての捕捉抗体が、高濃度で、試料（通常試料及び病理学的試料の両方）中に天然に存在する血漿タンパク質に対する抗体と置換されていることを除いて、主な免疫センサーと同じである。免疫センサー及び参照免疫センサーは、図７に示されるように、シリコンチップ上に、それぞれ隣接する構造９４及び９６として作製することができる。好適な実施形態が、トロポニンＩ及び脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）アッセイについて記載されているが、この構造は、例えば、トロポニンＴ、クレアチンキナーゼＭＢ、プロカルシトニン、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ミオグロビンなどを含めた他の心臓マーカーアッセイ、並びに臨床診断において使用される他のサンドイッチアッセイ、例えば、ＰＳＡ、Ｄ−二量体、ＣＲＰ、ＨＣＧ、ＮＧＡＬ、ミエロペルオキシダーゼ及びＴＳＨにも有用である。
【０１４２】
血漿タンパク質に結合する適当な抗体の例には、ヒト血清アルブミン、フィブリノーゲン、及びＩｇＧ  ｆｃ領域に対する抗体が含まれ、ヒト血清アルブミンが好適である。しかし、適切な抗体が入手可能である場合、約１００ｎｇ／ｍＬ超の濃度で発生する任意の天然タンパク質又は血液成分を使用することができる。ただし、タンパク質は、分析物アッセイを実施するのに必要な時間に対して急速にセンサーをコーティングするのに十分な量で存在するべきである。好適な実施形態では、タンパク質は、血液試料と接触して約１００秒以内に、参照免疫センサー上の利用可能な抗体の５０％超に結合するのに十分な濃度で血液試料中に存在する。一般に、第２の固定化抗体は、約１×１０−７〜約１×１０−１５Ｍの親和定数を有する。例えば、血液試料中のアルブミンのモル濃度が約１×１０−４Ｍと高いために、約１×１０−１０Ｍの親和定数を有するアルブミンに対する抗体が好適である。
【０１４３】
本発明の様々な実施形態によれば、試料に由来する天然アルブミンによって覆われた表面を提供することにより、存在し得る他のタンパク質及び細胞物質の結合が著しく低減される。この方法は、ＮＳＢを最小限にするために従来の遮断剤を使用する従来のイムノアッセイより一般に優れており、その理由は、これらの作用剤は、一般にドライダウンされ、使用するまで数カ月間又は数年間安定なままでなければならず、この時間の間にこれらは劣化する場合があり、望まれるより粘着性の表面を作り出し、古くなるとともに上昇するＮＳＢをもたらすためである。対照的に、本発明の実施形態では、使用時に新鮮な表面が提供される。
【０１４４】
ＮＳＢの作用を低減するために示差測定法を実施するための、参照免疫センサーを伴ったＢＮＰ用免疫センサーの一実施形態が、以下のように記載される。一実施形態では、抗ＢＮＰ及び抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でコーティングされた、カルボキシレート修飾ラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、米国、又はＳｅｒａｄｙｎ  Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ、米国によって供給されている）を含むアッセイビーズ（微粒子）は、ともに同じ方法で調製される。アッセイビーズは、遠心分離によって最初に緩衝液交換され、その後抗体が添加され、これは、ビーズ上に受動的に吸着させられる。次いでアッセイビーズ上のカルボキシル基は、ｐＨ６．２のＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）中で、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（ＥＤＡＣ）で活性化されることによって、抗体にアミド結合を形成する。いずれのビーズ凝集物も遠心分離によって除去され、完成したビーズは凍結して貯蔵される。
【０１４５】
別の実施形態では、抗ＨＳＡ抗体について、ビーズを飽和被覆すると、ビーズ質量が約７％増加する。さらに別の実施形態では、コーティングされたビーズは、抗ＨＳＡ  ７ｍｇ及びビーズ１００ｍｇを含む混合物から、共有結合を使用して調製される。この配合物を使用して、脱イオン水中に約１％の固体を含む約０．４ｎＬの液滴が、光パターン形成された多孔質ＰＶＡ選択透過性層カバーセンサー９６上に微量分注され（上で参照され、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５５４，３３９号の方法及び装置を使用して）、乾燥される。乾燥した粒子は多孔質層に接着し、血液試料又は洗浄流体中にこれらが溶解するのを実質的に防止する。
【０１４６】
本発明の一実施形態では、ＢＮＰ抗体について、ビーズ表面を飽和被覆すると、ビーズの質量が約１０％増加する。したがって、抗ＢＮＰ  １０ｍｇをカップリング試薬とともにビーズ１００ｍｇに添加することによって、飽和被覆が実現された。次いでこれらのビーズは、センサー９４上に微量分注された。
【０１４７】
さらに別の実施形態では、免疫センサー９４は、血漿タンパク質抗体、例えば、抗ＨＳＡ、及び分析物抗体、例えば、抗ＢＮＰの両方を有するアッセイビーズでコーティングされる。抗ＢＮＰで飽和コーティングされたビーズ１００ｍｇ当たり抗ＨＳＡ約２ｍｇ以下で作製されたビーズは、免疫センサーにおいて優れたＮＳＢ特性を示した。利用可能な分析物（抗原）を捕捉するのに、ビーズ上に十分な抗ＢＮＰが存在するので、トロポニンアッセイの勾配（シグナル対分析物濃度）は、実質的に影響されないことが見出された。様々な抗体についてのビーズの飽和濃度、及び標的分析物に対する抗体のみを含むビーズを有する免疫センサーの勾配を求めることによって、抗体の組合せの適切な比を、所与の分析物及び血漿タンパク質の両方に対する抗体を有するビーズについて求めることができる。
【０１４８】
参照免疫センサーを有する免疫センサーの重要な態様は、血漿タンパク質、好ましくはＨＳＡ／抗ＨＳＡの組合せの層によって作り出される表面の「ヒト化」である。この表面「ヒト化」は、ビーズの、抗体−酵素コンジュゲートのＮＳＢへの傾向を少なくし、ビーズばらつきを低減するように思われる。理論によって束縛されることなく、センサーが試料によって覆われるにつれて、抗ＨＳＡ表面のために、これらは天然アルブミンで急速にコーティングされると思われる。これは、製造中にドライダウンされ、一般に長い期間貯蔵された後に再水和される従来の遮断物質と比較して優れた結果を与える。センサー表面を「ヒト化する」ことの別の利点は、これが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及び他の異好性抗体の干渉に対する耐性の追加の機序をもたらすことである。ＨＡＭＡのイムノアッセイに対する効果は周知である。
【０１４９】
別の実施形態では、免疫参照センサーは本発明のデバイス及び方法において使用され、分析サイクルの間に得られる洗浄効率をモニターする。上述したように、バックグラウンドノイズの１つの源は、依然として溶液中にある、又はセンサー上に非特異的に吸収され、洗浄ステップによって除去されない少量の酵素コンジュゲートである。本発明のこの態様は、本明細書に述べられているように、空気セグメントを導入することによって、小体積の洗浄流体を使用して、効率的な洗浄ステップを実施することに関する。
【０１５０】
電流測定の電気化学的システムである好適な実施形態を稼動する際、ＡＬＰの活性から生じる、免疫センサー９４及び免疫参照センサー９６におけるｐ−アミノフェノールの酸化に関連する電流が、分析器によって記録される。免疫センサー及び免疫参照センサーにおける電位は、銀−塩化銀参照電極に対して同じ値に保たれる。干渉の効果を除去するために、分析器は、上記式（４）に従って、免疫センサーのシグナルから免疫参照センサーのシグナルを減じる。２つのセンサーの間に特徴的な一定のオフセットが存在する場合、この値も減じられる。免疫参照センサーが、免疫センサーとすべて同じ非特異的特性を有することは必要でなく、免疫参照センサーがアッセイの洗浄部分及びＮＳＢ部分の両方において一貫して比例していることのみが必要である。一実施形態では、分析器に組み込まれたアルゴリズムは、２つのセンサー間の任意の他の本質的に一定の差異を捕らえることができる。
【０１５１】
免疫センサー単独ではなく、免疫センサーと免疫参照センサーの示差的組合せの使用は、アッセイに以下の改善をもたらす。好適な実施形態では、カートリッジの設計により、約１０μＬの血液試料中に溶解した約４０〜５０億の酵素コンジュゲート分子を生じる乾燥試薬が提供される。結合ステップ及び洗浄ステップの最後で、センサーにおける酵素分子の数は、約７０，０００である。好適な実施形態を用いた実験では、非特異的に結合したバックグラウンドとして、免疫センサー及び参照免疫センサー上に、平均で約２００，０００（±約１５０，０００）の酵素分子が存在した。免疫参照センサーを用いた示差測定法を使用して、不確定度の約６５％が除去され、アッセイの性能を著しく改善した。他の実施形態は、他の程度の改善を有することができるが、アッセイ性能の全体的な改善のための根本的なことが残っている。
【０１５２】
任意選択の免疫参照センサーの追加の用途は、例えば、不適切に抗凝固性の試料などの異常な試料状態を検出することであり、これは、導管全体にわたって物質を堆積させ、免疫センサー及び免疫参照センサーの両方で、測定される電流を増大させる。この作用は、非特異的に吸着された酵素、及び測定ステップの間に、センサー上の洗浄流体の薄層中に残っている酵素の両方に関連する。
【０１５３】
任意選択の免疫参照センサーの別の用途は、洗浄効率についてシグナルを補正することである。ある特定の実施形態では、免疫センサーにおけるシグナルのレベルは、洗浄の程度に依存する。例えば、より多くの流体／空気セグメントの移行を用いたより長い洗浄は、特異的に結合したコンジュゲートの一部が洗い流されるために、より低いシグナルレベルを与える場合がある。これは、相対的に小さい作用、例えば、５％未満である場合があるが、補正は、アッセイの全体的な性能を改善することができる。補正は、センサーにおける相対的なシグナルに基づいて、又は空気セグメント／流体の移行を検出し、その数を計数するためのセンサーとして作用する、センサーに隣接する導管内に配置された伝導率センサーとともに実現することができる。これは、分析器に組み込まれたアルゴリズム補正手段のためのインプットを提供する。
【０１５４】
内因性タンパク質、例えば、ＨＳＡを用いた参照免疫センサーの別の実施形態では、外因性タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する抗体でコーティングされた免疫参照センサーを有することによって同じ目的を実現することが可能である。この場合、センサーに接触させる前に、追加の試薬として提供される、試料中のＢＳＡの一部を溶解させるステップが必要である。この溶解ステップは、カートリッジの試料保持チャンバー内、又は外部収集デバイス、例えば、ＢＳＡでコーティングされたシリンジ内で、乾燥試薬としてＢＳＡを用いて行うことができる。この手法は、ある特定の利点を提供し、例えば、表面電荷、特異的な表面基、グリコシル化の程度などについてタンパク質を選択することができる。これらの特性は、内因性タンパク質の利用可能な選択肢中に必ずしも存在しなくてもよい。
【０１５５】
塩に加えて、他の試薬もイムノアッセイにおける全血精度（ｗｈｏｌｅ−ｂｌｏｏｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を改善することができる。これらの試薬は、迅速な溶解を促進するように血液試料に差し出されるべきである。いくつかの実施形態では、血液保持チャンバー（又は別の導管）の壁上にコーティングされる、セルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びゼラチン（又はこれらの混合物）を含めた支持基質は、例えば、１５秒未満以内に９０％超完了する迅速な溶解を促進する。
【０１５６】
別の実施形態では、分析物測定は、分析物センサーをコーティングする液体の薄膜中で実施される。そのような薄膜判定は、電流測定で実施されることが好ましい。このカートリッジは、試料がバルブを通じて追い出されるとき密封される閉鎖バルブ、及び導管内の換気口であって、少なくとも１つの空気セグメントが測定流体中に引き続いて導入されることを可能にし、それによって、試料がセンサーからすすがれる効率を増大させ、さらに、測定前にセンサーから実質的にすべての液体を除去することを可能にし、なおさらに、精度を改善し、再現性を内部チェックするために、センサー全体に新鮮な液体のセグメントが運ばれるのを可能にすることによって、連続した、繰り返しの測定を可能にする換気口の両方を有することにおいて、前述の実施形態と異なる。
【０１５７】
非競合アッセイの実施形態では、上記に論じたように、低濃度の免疫活性分析物を検出するための分析スキームは、酵素標識抗体／分析物／表面結合抗体「サンドイッチ」複合体の形成に依拠する。試料中の分析物の濃度は、酵素の比例した表面濃度に変換される。酵素は、基質を検出可能な生成物に変換することによって、分析物の化学的なシグナルを増幅することができる。例えば、アルカリホスファターゼが酵素である場合、１個の酵素分子は、１分当たり約９０００の検出可能な分子を生成することができ、電気活性種がアルカリホスファターゼの代わりに抗体に結合されるスキームと比較して、分析物の検出性が数桁改善される。
【０１５８】
免疫センサーの実施形態では、センサーを最初に試料と、次いで、センサーからの応答を記録する前に洗浄流体と接触させるのが有利である。いくつかの特定の実施形態では、白血球干渉を低減するために、ＩｇＧコート微粒子を用いて改質されることに加えて、試料は、改質された試料がセンサーと接触する前に、試料内の対象とする分析物に結合する抗体−酵素コンジュゲート（シグナル抗体）を用いて改質される。試料中の結合反応により、分析物／抗体−酵素複合体が生成される。センサーは、電極表面付近に付着される分析物に対する固定化抗体を含む。センサーに接触すると、分析物／抗体−酵素複合体は、電極表面付近で固体化抗体に結合する。この時点で、可能な限り多くの非結合抗体−酵素コンジュゲートを電極の近傍から除去することによって、センサーからのバックグラウンドシグナルを最小にすることが有利である。抗体−酵素複合体の酵素は、有利には、流体中に供給される基質を変換することによって、電気化学的に活性な種を生成することができる。この活性種は電極付近で生成され、適当な電位が印加されるとき、電極での酸化還元反応から電流をもたらす（電流測定動作）。或いは、電気活性種がイオンである場合、これは、電位差測定で測定することができる。電流測定では、電位は、測定の間固定するか、又は所定の波形に従って変更することができる。例えば、サイクリックボルタンメトリーの周知技法において使用されるように、限度間で電位をスイープするのに三角波を使用することができる。或いは、矩形波などのデジタル技法を使用することによって、電極に隣接する電気活性種の検出の感度を改善することができる。電流又は電圧測定から、試料中の分析物の量又は存在が計算される。これら及び他の分析的電気化学的方法は、当技術分野で周知である。
【０１５９】
カートリッジが免疫センサーを含む実施形態では、免疫センサーは、有利には、非反応性金属、例えば、金、白金、又はイリジウムなどのベースセンサー、及び微粒子、例えば、ラテックスビーズに付着された生理活性層を重ね合わされた多孔質選択透過性層から微細加工される。微粒子は、電極表面を覆う多孔質層上に分配され、接着した、多孔質生理活性層を形成する。生理活性層は、対象とする分析物に特異的に結合する特性、又は分析物が存在するとき、検出可能な変化を現す特性を有し、分析物に対する固定化抗体であることが最も好ましい。
【０１６０】
ＩＸ．白血球干渉を低減又は排除するためのデバイス、キット、及び方法
本発明は、サンドイッチイムノアッセイ及び競合イムノアッセイの両方に適用可能である。サンドイッチアッセイの実施形態では、試料は、標的分析物に対する固定化された第１の抗体を含む免疫センサー、及び前記標的分析物に対する標識された第２の抗体と接触する。競合アッセイの実施形態では、試料は、前記標的分析物に対する固定化された第１の抗体を含む免疫センサー、及び標的分析物と結合を競合する標識された標的分析物と接触する。一般的な分析物として、それだけに限らないが、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＢＮＰ、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰ、ＨＣＧ、ＴＳＨ、ＮＧＡＬ、ジゴキシン、テオフィリン、及びフェニトインなどが挙げられる。
【０１６１】
本発明のいくつかの実施形態では、試料、例えば、全血試料が最初に収集され、次いで磁気犠牲ビーズを含む乾燥試薬を試料中に溶解させることによって改質される。ある特定の実施形態では、試料中の白血球に対して過剰のビーズを供給するように、十分な犠牲ビーズが利用される。これは、試料１μｌ当たり少なくとも５μｇ、例えば、試料１μｌ当たり少なくとも１０μｇ、又は試料１μｌ当たり少なくとも１５μｇの溶解した犠牲ビーズ濃度を有する試料を生じ、この濃度は、試料中のあらゆる白血球を実質的に連結するのに十分である。範囲に関して、乾燥試薬は、試料１μｌ当たり約５μｇ〜約４０μｇのビーズ、好ましくは、試料１μｌ当たり約１０〜約２０μｇのビーズの犠牲ビーズ濃度を与えるように試料中に溶解することが好ましい。ビーズのサイズに応じて、これは、試料１μｌ当たり少なくとも約１０４個のビーズ、試料１μｌ当たり少なくとも約１０５個のビーズ、又は試料１μｌ当たりおよそ約１０５〜約１０６個のビーズに相当する。したがって、いくつかの好適な実施形態では、犠牲ビーズが、試料１μｌ当たり少なくとも１０４個のビーズ、例えば、試料１μｌ当たり少なくとも約１０５個のビーズ、又は試料１μｌ当たり約１０５〜約１０６個のビーズの溶解した犠牲ビーズ濃度をもたらすのに十分な量で存在する。このステップが完了すると、改質された試料に対してイムノアッセイ、例えば、電気化学的イムノアッセイを実施することによって、分析物の濃度を求めることが可能である。
【０１６２】
乾燥試薬の溶解、及びサンドイッチ形成ステップは、同時に、又は段階的な様式で行うことができる。本発明の方法の実施形態は、心血管マーカー、例えば、ＴｎＩ、ＴｎＴ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及びｐｒｏＢＮＰである分析物を主に対象とするが、他のマーカー、例えば、β−ＨＣＧ、ＴＳＨ、ミエロペルオキシダーゼ、ミオグロビン、Ｄ−二量体、ＣＲＰ、ＮＧＡＬ、及びＰＳＡなどにも使用することができる。白血球の大部分が検出ステップの前に隔離されることを保証するために、試料改質ステップは、約１分〜約３０分の範囲内の選択された所定の期間のものであることが好ましい。
【０１６３】
好適な実施形態では、この方法は、免疫センサー、導管、試料流入ポート、及び試料保持チャンバーを備え、これらのエレメントの少なくとも１つの少なくとも一部が、乾燥試薬でコーティングされているカートリッジ内で実施される。乾燥試薬は、白血球干渉を低減するための磁気犠牲ビーズ、白血球試薬、緩衝液、塩、界面活性剤、安定化剤、単純炭水化物、複合炭水化物、及び様々な組合せのうちの１つ又は複数を含むことができる。さらに、乾燥試薬は、分析物に対する酵素−標識抗体（シグナル抗体）も含むことができる。
【０１６４】
アッセイステップの前に、カートリッジの表面、例えば、カートリッジの導管上に、任意の付随した白血球とともに、且つ免疫センサーと実質的に接触させないで磁気犠牲ビーズを保持するために、磁場が磁気犠牲ビーズに印加される。
【０１６５】
実際のアッセイステップでは、好適な実施形態において、固定化抗体とシグナル抗体の間でサンドイッチが形成されたら、試料媒質を引き続いて廃棄物チャンバーへと洗浄し、その後、酵素と反応して電気化学的検出可能な生成物を形成することができる基質にこのサンドイッチを曝す。好適な形式は、電気化学的酵素結合免疫吸着アッセイである。
【０１６６】
本発明のある特定の実施形態は、磁気犠牲ビーズを含む、イムノアッセイを実施するためのキットを対象とする。このキット又は方法は、白血球を含有する任意の試料、例えば、全血に適用可能であり、抗凝固剤、例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン、フッ化物、シトレートなどで改質された血液試料とすることができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、磁気犠牲ビーズは、第１の容器又は位置において生体試料、例えば血液を改質するのに使用され、次いで試料が、捕捉抗体及びシグナル抗体を有する第２の容器又は位置に送られる。他の実施形態では、磁気犠牲ビーズは、溶液中に含められ、生体試料と混合され、得られる改質された試料は、分析デバイス中に導入される。例えば、血液試料を磁気犠牲ビーズと混合することによって、改質された試料を形成することができ、次いでこれは、カートリッジ中に導入される。ある特定の実施形態では、分析デバイス、例えば、カートリッジは、磁気犠牲ビーズを含む液体を含むポーチを含み、これは、デバイス中で生体試料と混合され、次いで概ね本明細書に記載されるように処理されることによって分析物検出のためのアッセイ、例えば、サンドイッチアッセイを形成することができる。
【０１６８】
他の実施形態では、磁気犠牲ビーズを含む第１の液体を、液体生体試料、例えば血液と混合するのに、エレクトロウェッティングが使用される。そのような一実施形態では、液滴を操作するための装置が提供される場合がある。この装置は、例えば、すべての導電性エレメントが、液滴が操作される１つの表面上に含まれる、片面の電極設計を有することができる。他の実施形態では、操作される液滴を入れる目的のために、第１の表面と平行に追加の表面が提供される。液滴は、エレクトロウェッティングに基づく技法を実施することによって操作され、この技法において、第１の表面上に含まれ、又はこの表面中に埋め込まれた電極が、制御された様式で順次電圧を印加され、電圧を切られる。装置は、２つの液滴を一緒に合わせ、混合すること、１つの液滴を２つ以上の液滴に分割すること、流れから個々に制御可能な液滴を形成することによって連続する液体の流れを試料採取すること、及び所望の混合比を得るために液滴を繰り返して二成分混合又はデジタル混合することを含めた、いくつかの液滴操作プロセスを可能にすることができる。このようにして、磁気犠牲ビーズ、及び任意選択により１つ又は複数の白血球試薬を含む第１の液体の液滴は、液体生体試料、例えば、血液を慎重に且つ制御可能に合わせ、混合することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｐａｍｕｌａらの米国特許第６，９１１，１３２号を参照されたい。
【０１６９】
さらに、当技術分野で公知の現在のイムノアッセイ形式を、例えば、試料前処理ステップにおいてビーズを添加することによって、本発明の磁気犠牲ビーズを含むように改変することができる。この前処理は、血液収集デバイス内、別個の容器内に犠牲ビーズを組み込むことによって達成することができ、又はデバイスの検査サイクル内で犠牲ビーズを組み入れることによって、分析（イムノアッセイ）デバイス自体で行うことができる。
【０１７０】
本発明を脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）検査カートリッジとの関連で説明してきたが、これは、白血球が存在し、干渉の原因となり得る任意のイムノアッセイに同様に適用可能である。同様に、この方法又はキットは、ＢＮＰに限定されず、それだけに限らないが、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、ｃＴｎＩ、ＴｎＴ、ＨＣＧ、ＴＳＨ、ＰＳＡ、Ｄ−二量体、ＣＲＰ、ミオグロビン、ＮＧＡＬ、ＣＫＭＢ、ミエロペルオキシダーゼ、及びガレクチン−３を含めて、任意のイムノアッセイに適応させることができる。さらに、この方法及びキットは、磁気犠牲ビーズが、マウス、ヤギ、ウシ、及びルピナスを含めた任意の非ヒトＩｇＧ又はその断片でコーティングされた、或いは犠牲ビーズが、活性化されたヒトＩｇＧ又はその断片でコーティングされたアッセイに適用可能である。磁気犠牲ビーズは、タンパク質、細菌、ウイルス、及び生体異物から選択される物質若しくはこれらの断片でコーティングされた基質ビーズを含むことができ、又は任意選択により基質ビーズを用いずに、休止中の、若しくはさもなければ安定化された細菌性細胞、胞子、若しくはこれらの断片、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって得ることができる。
【０１７１】
本発明のキット又は方法は、可溶性乾燥試薬の形態である第２の標識抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、可溶性乾燥試薬は、可溶性乾燥試薬の一部として、又は様々な成分が別個の乾燥試薬の位置内にある場合、１つ若しくは複数の白血球試薬、及び／又はオプソニン化された犠牲ビーズを含む。白血球試薬の考察については、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、同時係属中の米国特許出願第１２／７７１，６３４号を参照されたい。固定化抗体及び標識抗体はともに、モノクローナル、ポリクローナル、これらの断片、及びこれらの組合せとすることができることに注意されたい。さらに、第２の抗体は、放射標識、酵素、発色団、フルオロフォア、化学発光種、及びイムノアッセイの分野で公知の他のものを含めた様々な標識で標識することができる。第２の抗体が酵素で標識される場合、この酵素は、ＡＬＰ、西洋わさびペルオキシダーゼ、又はグルコースオキシダーゼであることが好ましい。
【０１７２】
この方法又はキットが非競合イムノアッセイを実施するために使用される場合、（ｉ）分析物を含有する疑いのある血液試料を、白血球についてオプソニン化された磁気犠牲ビーズを含む試薬と混合するステップ、（ｉｉ）磁気犠牲ビーズを白血球に結合させるステップ、（ｉｉｉ）ビーズ及び任意の付随した白血球を磁場領域内に磁気的に保持するステップ、（ｉｖ）血液試料を、分析物に対する固定化された第１の抗体と混合し、固定化抗体と前記分析物の間で複合体を形成するステップ、（ｖ）血液試料を、標識された第２の抗体と混合することによって、前記分析物と前記固定化抗体を含む複合体を形成するステップを含む一連の混合ステップが存在する場合がある。これらの混合ステップは、同時に、又は指定された順序で実施することができることに注意されたい。例えば、ステップ（ｉｖ）及び（ｖ）を同時に行うことができ、又はステップ（ｉ）及び（ｖ）をステップ（ｉｖ）の前に実施することができる。最終ステップにおいて、固定化された第１の抗体、分析物、及び標識された第２の抗体の間で形成された複合体の量の判定がある。
【実施例】
【０１７３】
本発明は、以下の非限定的な予言的な例を考慮して、より良好に理解されるであろう。
【０１７４】
（例１）
一実施形態では、未計量の流体試料が、試料流入ポート４を通じて、カートリッジの試料保持チャンバー３４中に導入される。キャピラリーストップ２５は、この段階で試料が導管１５へと通過するのを防止し、保持チャンバー３４は、試料で満たされる。蓋２又はエレメント２００は、カートリッジから試料が漏れるのを防止するために閉じられている。次いでカートリッジは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８２１，３９９号に開示されているものなどの、読取装置内に挿入される。読取装置内にカートリッジを挿入することにより、４２に位置した流体を含むパッケージに、このパッケージがスパイク３８に対して押されたとき、穴を開ける機構が作動する。それによって流体は、第２の導管内に排出され、３９、２０、１２及び１１に順に到達する。１２における狭窄部は、流体のさらなる移動を防止し、その理由は、流体が第２の導管部分１１を介して廃棄物チャンバー４４内に流れることによって、残留する静水圧が放散されるためである。第２のステップでは、ポンプ手段を稼動することにより、空気ブラダー４３に圧力をかけ、導管４０を通じ、カッタウェイ１７及び１８を通じて、導管３４内に所定の位置２７で空気を押し込む。キャピラリーストップ２５及び位置２７は、元の試料の計量された部分を区切る。試料が試料保持チャンバー３４内にある間、試料は、チャンバーの内表面上の、磁気犠牲ビーズ、及び任意選択により非磁気犠牲ビーズ、及び／又は１つ若しくは複数の白血球試薬、及び任意の他の所望の物質を含む乾燥試薬コーティングで改質される。次いで試料の計量された部分は、空気ブラダー４３内で生じる空気圧によって、キャピラリーストップを通じて排出される。試料は、例えば、保持チャンバー３４及び／又は導管１５内で、試料中に含まれる白血球が、磁気犠牲ビーズに結合するのを可能にするのに十分な（任意選択により、試料の往復で促進された）条件下で、磁気犠牲ビーズと混合させられることが好ましい。次いで、磁場が試料に印加されることによって、導管の表面上に、且つ免疫センサーと実質的に接触しないで、磁気犠牲ビーズが保持される。試料は次いで通り、カッタウェイ３５内に位置した１つ又は複数の分析物センサーに接触する。
【０１７５】
カットアウト３５内に位置した免疫センサーを使用する実施形態では、試料は、センサーに到達する前に、例えば、酵素−抗体コンジュゲート（シグナル抗体）によって改質される。分析物がセンサーに効率的に結合するのを促進するために、分析物を含有する試料は、任意選択により、往復性の動きでセンサー上を繰り返して通される。好ましくは、約０．２と２Ｈｚの間の往復振動数が使用され、最も好ましくは０．７Ｈｚである。こうして、シグナル抗体に付随するシグナル酵素は、試料中に存在する分析物の量に比例して、電流測定電極表面のごく近くに運ばれる。
【０１７６】
分析物／酵素−抗体コンジュゲート複合体が免疫センサーに結合する機会が提供された後、試料は、空気ブラダー４３にかけられるさらなる圧力によって排出され、試料は廃棄物チャンバー４４に進む。次に洗浄ステップにより、非特異的に結合した酵素−コンジュゲート及び犠牲ビーズが、センサーチャンバーから除去される。第２の導管における流体は、ポンプ手段４３によって移動されてセンサーと接触する。分析流体は、第１の空気セグメントが伝導率センサーで検出されるまで、徐々に引き寄せられる。
【０１７７】
１つ又は複数の空気セグメントは、それだけに限らないが、（１）受動的な手段、（２）空気がフラップ又はバルブを通じて導管内に引き寄せられるポンプを使用する、導管内の圧力の一過性の低下を含めた能動的な手段、又は（３）導管内で流体と接触するとガスを遊離する、導管内に予め配置された化合物であって、カーボネート、ビカーボネートなどを挙げることができる化合物を溶解させることによるものを含めた、任意の適当な手段によって導管内に作製することができる。このセグメントは、試料が混入した流体を導管１５から一掃することにおいて極めて有効である。センサー領域をすすぐ効率は、説明したように、１つ又は複数の空気セグメントを第２の導管中に導入することによって大いに増強される。空気セグメントの先頭縁部及び／又は後縁部は、センサー上を１回又は複数回通過することによって、試料から堆積する場合のある異質の物質をすすぎ、再懸濁する。異質の物質には、特異的に結合した分析物又は分析物／抗体−酵素コンジュゲート複合体以外の任意の物質が含まれる。しかし、すすぎが、それほど長引かず、又はセンサーからの、特異的に結合した分析物若しくは分析物／抗体−酵素コンジュゲート複合体の解離を促進するほど活発であることは、本発明の目的である。
【０１７８】
流体中に空気セグメントを導入することの第２の利点は、流体を区分することである。例えば、流体の第１のセグメントが、センサーをすすぐのに使用された後、次いで第２のセグメントは、２つのセグメントの混合を最小にして、センサー上に配置される。この機能は、非結合の抗体−酵素コンジュゲートをより効率的に除去することによって、センサーからのバックグラウンドシグナルをさらに低減する。先端洗浄（ｆｒｏｎｔ  ｅｄｇｅ  ｗａｓｈｉｎｇ）の後、分析流体は、第１の空気セグメントが伝導率センサーにおいて検出されるまで徐々に引き寄せられる。このセグメントは、第１の分析流体試料と混合された、試料が混入した流体を一掃することにおいて極めて有効である。測定のために、流体の新しい部分がセンサー上に配置され、操作のモードに適切な場合、電流又は電位が時間の関数として記録される。
【０１７９】
（例２）
次に図１２を参照すると、免疫センサーカートリッジの上面図が示されている。カートリッジ１５０は、好ましくはプラスチックで構築されたベース及び頂部部分を備える。２つの部分は、薄い接着性ガスケット又は薄い柔軟な膜によって接続されている。先の実施形態と同様に、組み立てられたカートリッジは、試料保持チャンバー１５１を備え、この中に、対象とする分析物を含有する試料が、試料入口１６７を介して導入される。試料は、オプソニン化された磁気犠牲ビーズで改質され、センサーチップ１５３に送達される前に、磁石１６８が使用されることによって、試料に由来する標的物質（例えば、白血球）が積まれたビーズが保持される。試料の計量された部分は、カートリッジの２つの部分を接続するガスケット又は膜中に、０．０１２インチ（０．３ｍｍ）のレーザーカットされた穴によって好ましくは形成されたキャピラリーストップ１５２と、試料ダイヤフラム１５６上を押しつけるパドルなどのポンプ手段の作用によって空気が導入される試料保持チャンバー内の所定箇所に位置した流入点１５５との合わせた作用によって、以前と同様に試料導管１５４（第１の導管）を介してセンサーチップ１５３に送達される。結合することが可能になるようにセンサーと接触した後、試料は、排出口１５７に移動され、この排出口はウィッキング材を含み、これは、試料を吸収し、それによって、液体又は空気のさらなる通過に対して排出口を閉じて密封する。ウィッキング材は、綿繊維物質、セルロース物質、又は孔を有する他の親水性物質であることが好ましい。この物質は、以下に記載される試料ダイヤフラム作動手段を引き続いて引っ込めることと釣り合った時間内でバルブが閉じ、その結果試料が、センサーチップの領域内に引き続いて引き戻されないほど十分に吸収性である（すなわち十分なウィッキング速度を有する）ことが、本願において重要である。
【０１８０】
示した特定の実施形態と同様に、一端で排出口１５９に、他端で、排出口１５７とセンサーチップ１５３の間に位置した試料導管のある箇所１６０の試料導管に接続された洗浄導管（第２の導管）１５８が提供される。読取装置内にカートリッジを挿入すると、流体は、導管１５８に導入される。好ましくは、流体は、ホイルポーチ（ｆｏｉｌ  ｐｏｕｃｈ）１６１内に最初に存在し、これは、作動手段によりポーチに圧力がかけられるとき、ピンによって穴を開けられる。ガスケット１６３中の小さい開口部を介して流体を導管１５４に接続する短い導管１６２も提供される。第２のキャピラリーストップは、流体がキャピラリーストップ１６０に到達するのを最初に防止し、その結果、流体は導管１５８内に保持される。
【０１８１】
排出口１５７が閉じられた後、ポンプが作動され、導管１５４内に圧力低下を作り出す。振動することによって断続的な空気のストリームをもたらす、ガスケット又は膜中にカットされた小さいフラップを好ましくは備える換気口１６４は、空気が第２の排出口１６５を介して導管１５８に入るための手段を提供する。第２の排出口１６５も、湿ったとき排出口を閉じることができるウィッキング材を好ましくは含み、これは、必要に応じて、試料ダイヤフラム１５６を引き続いてへこませることによって排出口１６５を閉じることを可能にする。試料ダイヤフラム１５６の作動と同時に、流体は、導管１５８からキャピラリーストップ１６０を通じて導管１５４に引き寄せられる。流体の流れが排出口１６４に入る空気によって妨害されるので、少なくとも１つの空気セグメント（セグメント又はセグメントのストリーム）が導入される。
【０１８２】
試料ダイヤフラム１５６がさらに引っ込むと、少なくとも１つの空気セグメントを含有する液体が引き戻され、センサーチップ１５３の感知表面を横切る。液体内に空気−液体の境界が存在することにより、残っている試料を除去するためのセンサーチップ表面のすすぎが増強される。好ましくは、試料ダイヤフラム１５６の運動は、分析物センサーに隣接するセンサーチップ内に収容された伝導率電極から受信されるシグナルと連動して制御される。このようにして、センサー上の液体の存在が検出され、別個のステップにおける流体の動きによって、複数の読み取りを実施することができる。
【０１８３】
流体の薄膜が、センサー、接地チップ１６５、及びセンサーと接地電極の間の導管１５４の壁の接触部分を覆うときのみ、分析物測定を実施することが、この実施形態では有利である。適当な膜は、センサーの隣に位置した電気伝導度測定センサーが、バルクの流体は、導管１５４のその領域内にもはや存在しないことを示すまで、試料ダイヤフラム１５６を操作することにより、流体を引き抜くことによって得られる。測定は、非常に低い（ｎＡ）電流で実施することができ、（バルクの流体と比較して）接地チップとセンサーチップの間の薄膜の抵抗を増大させることによって生じる電位降下は、重要でないことが判明した。
【０１８４】
接地チップ１６５は、銀／塩化銀であることが好ましい。二酸化ケイ素の表面などのより親水性の領域が点在した銀／塩化銀の小さい領域として接地チップをパターン形成するのに、相対的に疎水性の塩化銀表面上に容易に形成する空気セグメントを回避することが有利である。したがって、好適な接地電極構成は、高密度に配置され、二酸化ケイ素が点在した銀／塩化銀の正方形のアレイを含む。銀／塩化銀の領域がある程度くぼんでいる場合、意図していないセグメントを回避することにさらなる利点が存在する。
【０１８５】
次に図１３を参照すると、免疫センサーカートリッジの好適な実施形態の流体工学の概略図が示されている。領域Ｒ１〜Ｒ８は、特定の運転機能に関連する導管の特定の領域を表す。したがって、Ｒ１は試料保持チャンバーを表し、Ｒ２は試料導管を表し、それによって白血球を含む試料の計量された部分が捕捉領域に移される。試料は、Ｒ１又はＲ２の壁上にコーティングされた物質、例えば、オプソニン化された磁気犠牲ビーズで改質することができる。上記に論じたように、ビーズは、白血球についてオプソニン化されており、試料中に溶解すると結合することが好ましい。磁石領域６５において、磁石が使用されることによって、磁気ビーズ及び試料に由来する付随した白血球が、免疫センサーと実質的に接触しないで磁気的に保持される。Ｒ３は、電気伝導度測定センサー及び分析物センサーを収容する捕捉領域を表す。Ｒ４及びＲ５は、第１の導管の部分を表し、これらは、導管壁上にコーティングされた物質で流体をさらに改質するのに任意選択により使用され、それによってより複雑なアッセイスキームが実現され、Ｒ６は、第２の導管の部分を表し、カートリッジが読取装置内に挿入されると、その中に流体が導入される。Ｒ７は、キャピラリーストップ１６０と１６６の間に配置された導管の部分を備え、その中でさらなる改質を行うことができる。Ｒ８は、箇所１６０と排出口１５７の間に配置された導管１５４の部分を表し、これは、その中に含まれる液体を改質するのにさらに使用することができる。
【０１８６】
本発明の実施形態は、遠心分離又は濾過によって残留白血球を除去する意図にもかかわらず、残留白血球が存在し得る試料、例えば、血漿に適用可能である。ある特定の実施形態は、例えば、緩衝液を用いて希釈された場合のある試料にも適用可能である。さらに、本発明は一般に、試料中に乾燥試薬を溶解させることによって試料を改質することを対象とするが、分析の間、又は試料収集の間に、試薬、例えば、磁気犠牲ビーズを液体として試料に添加することも、他の実施形態では実用的である。したがって、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって、もっぱら限定されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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