(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法に対する反応を予測する方法であって、
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法の前に対象から得られた生物学的試料を用意するステップと、
生物学的試料中の、ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＩＦＮＧ、ＫＤＲ（可溶性ＶＥＧＦＲ２）、ＦＬＴ４（可溶性ＶＥＧＦＲ３）、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡＢ、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＦＧＦ２、及びＩＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップと、
を含み、
ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＩＦＮＧ、若しくは可溶性ＫＤＲ（可溶性ＶＥＧＦＲ２）の濃度が対照と比較して低下していること、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＰＤＧＦＡＢ、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＦＬＴ４（可溶性ＶＥＧＦＲ３）、若しくはＦＧＦ２の濃度が対照と比較して上昇していることにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法に反応することが予測される方法。
【請求項２】
少なくとも２つの遺伝子の濃度を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つの遺伝子が、
（ｉ）ＶＥＧＦＡ、ＡＮＧＰＴ２、及びＣＳＦ３、又は
（ｉｉ）ＩＬ１３、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ４
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法に対する反応を予測する方法であって、
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法の後で対象から得られた生物学的試料を用意するステップと、
生物学的試料中の、ＡＮＧＰＴ２及びＩＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップと、
を含み、
ＡＮＧＰＴ２又はＩＬ１３の濃度が対照と比較して低下していることにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を投与する療法に反応することが予測される方法。
【請求項５】
甲状腺癌が、分化型甲状腺癌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
分化型甲状腺癌が甲状腺濾胞癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分化型甲状腺癌が甲状腺乳頭癌である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩がレンバチニブメシル酸塩である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
対象がヒトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、全体として、バイオマーカー並びに甲状腺癌及び腎臓癌に関する。
【発明の背景】
【０００２】
多数のキナーゼ阻害剤が、抗腫瘍剤として開発されている。例えば、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）などの受容体チロシンキナーゼに対する阻害活性を有する化合物群は、血管新生を阻害することが知られており、新たなクラスの抗腫瘍剤とみなされている。レンバチニブメシル酸塩（また、Ｅ７０８０としても知られている）は、ＶＥＧＦＲ１〜３、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１〜４、ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ受容体（ＲＥＴ）、ＫＩＴ、及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を標的とする経口チロシンキナーゼ阻害剤である。レンバチニブメシル酸塩についての第Ｉ相の臨床研究では、治療に対する反応が、甲状腺癌、腎臓癌、子宮内膜癌のほか、黒色腫においても認められた。
【０００３】
残念ながら、大半の抗腫瘍治療は、重篤な悪心、嘔吐、又は重度の疲労など、好ましくない副作用を伴う。また、抗腫瘍治療が成功しながら、それらを施された全ての患者において有意義な臨床反応をもたらすわけではなく、その結果として、有効でない治療に伴う、好ましくない副作用、遅延、及び費用がもたらされる。したがって、投与前に抗腫瘍剤に対する対象の反応を予測するために用い得るバイオマーカーの必要性は大きい。加えて、抗腫瘍剤を含む療法が有効であるのかどうかを評価するために用い得るバイオマーカーを有することも有用である。
【発明の概要】
【０００４】
本出願は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する甲状腺癌対象又は腎臓癌対象の反応性を予測するバイオマーカーの同定に少なくとも部分的に基づく。１つ又は複数の遺伝子における突然変異の存在は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性の有用な予測因子である。例えば、遺伝子ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＶＨＬ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、及びＭＥＴのうちの１つ又は複数における（１つ又は複数の）突然変異は、所与の甲状腺癌対象又は腎臓癌対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することの指標である。加えて、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法による治療前及び治療後におけるサイログロブリンレベルの比も、分化型甲状腺癌を有する対象が、レンバチニブ化合物による継続療法に反応する可能性を決定するのに有用である。さらにまた、治療前若しくは治療後における特定のタンパク質（例えば、表３に列挙されるタンパク質）の発現レベル、又は治療後／治療前の対照と比較した発現レベル比も、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性の有用な予測因子であり得る。また、これらの２つのクラスのバイオマーカー（突然変異及び血中バイオマーカー）又は３つのクラスのバイオマーカー（突然変異、サイログロブリン、及び血中バイオマーカー）の組合せも、甲状腺癌又は腎臓癌を有する対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応する可能性についてのなおより明確な予測をもたらし得る。
【０００５】
本出願はまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療を、甲状腺癌又は腎臓癌を有する対象に継続すべきかどうかについて評価する方法も提供する。療法による治療前及び／又は治療後における特定のタンパク質（例えば、表３に列挙されるタンパク質）のレベルが低いこと又は高いことは、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療を継続するべきかどうかを評価するのに有用であり得る。例えば、（レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療後／治療前の）サイログロブリンレベルの比が、このような療法に反応しないことが知られる患者の試料に由来する対照の比と比較して低いことは、被験対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む継続療法から利益を得るかどうかを評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ／ａｓｓｅｓｓ）のに有用であり得る。
【０００６】
したがって、本明細書で記載されるバイオマーカー及び組成物は、例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療から利益を得る可能性がある、甲状腺癌又は腎臓癌を有する患者又は患者の亜集団を同定すること、及び／又はこれらを選択することにおいて有用である。加えて、本明細書で記載される方法は、例えば、甲状腺癌又は腎臓癌を患うか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象に適切な治療法（例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法）を選択するのに有用である。方法はまた、医療ケア従事者が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を継続するべきか、療法を変更して異なる治療を用いるべきかを決定することも可能とする。
【０００７】
一態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応を予測する方法を提供する。方法は、対象から得られた生物学的試料を用意するステップと、生物学的試料中の、ＲＡＳ、ＶＨＬ、及びＢＲＡＦからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における突然変異の存在を検出するステップとを伴う。少なくとも１つの遺伝子における突然変異の存在により、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが予測される。一実施形態では、ＲＡＳは、ＫＲＡＳ又はＮＲＡＳである。一実施形態では、少なくとも１つの遺伝子における突然変異は、表１に列挙される突然変異である。別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子における突然変異は、表２に列挙される突然変異である。別の実施形態では、ＲＡＳにおける突然変異は、ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ、及びＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒからなる群から選択される。別の実施形態では、この態様の方法は、生物学的試料中の、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、及びＭＥＴからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における突然変異の存在を検出するステップをさらに伴い、ＲＡＳの突然変異及びＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、及びＭＥＴのうちの少なくとも１つにおける突然変異の存在により、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することがなおより明確に予測される。一実施形態では、方法は、ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＦＬＴ４、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ４からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定するステップをさらに含む。
【０００８】
第２の態様では、本出願は、分化型甲状腺癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応を予測する別の方法を提供する。この方法はまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の継続投与の利益を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ／ａｓｓｅｓｓ）ためにも用いることができる。方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の前に対象から得られた第１の血液試料を用意するステップと、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した後で対象から得られた第２の血液試料を用意するステップと、第１の血液試料及び第２の血液試料中のサイログロブリンの濃度を測定するステップと、サイログロブリンの濃度比（第２／第１）を計算するステップとを伴う。血液試料中のサイログロブリンの濃度比が対照と比較して低下していると、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが予測され、血液試料中のサイログロブリンの濃度比が対照と比較して上昇していると、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に、血液試料中のサイログロブリンの濃度比が対照と比較して低下した対象ほど有効には反応しないことが予測される。一実施形態では、第２の血液試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した１週間〜９カ月後に対象から得られる。別の実施形態では、第２の血液試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した２週間〜９カ月後に対象から得られる。別の実施形態では、第２の血液試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した４週間〜６カ月後に対象から得られる。さらなる実施形態では、第２の血液試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した４日〜２週間後に対象から得られる。
【０００９】
第３の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応を予測する別の方法を提供する。この方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の前に対象から得られた生物学的試料を用意するステップと、生物学的試料中の、ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＩＦＮＧ、ＫＤＲ（可溶性ＶＥＧＦＲ２）、ＦＬＴ４（可溶性ＶＥＧＦＲ３）、ＩＬ６、ＰＤＧＦＡＢ、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＦＧＦ２、及びＩＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップとを伴う。ＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＩＦＮＧ、又は可溶性ＫＤＲ（可溶性ＶＥＧＦＲ２）の濃度が対照と比較して低下すること、及び／又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＰＤＧＦＡＢ、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＦＬＴ４（可溶性ＶＥＧＦＲ３）、若しくはＦＧＦ２の濃度が対照と比較して上昇することにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが示される。一実施形態では、少なくとも２つの遺伝子の濃度を測定する。一実施形態では、２つの遺伝子は、ＶＥＧＦＡ、ＡＮＧＰＴ２、及びＣＳＦ３、又はＩＬ１３、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ４からなる群から選択される。別の実施形態では、少なくとも３つの遺伝子の濃度を測定する。さらに別の実施形態では、少なくとも４つの遺伝子の濃度を測定する。
【００１０】
第４の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応を予測する別の方法を提供する。この方法また、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の継続投与の利益を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ／ａｓｓｅｓｓ）ためにも用いることができる。方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した後で対象から得られた生物学的試料を用意するステップと、生物学的試料中の、ＡＮＧＰＴ２、ＩＬ１３、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ６、ＰＧＦ、ＩＬ１０、ＣＸＣＬ１２、及びＣＣＬ５からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップとを伴う。ＡＮＧＰＴ２、ＩＬ１３、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ６、又はＰＧＦの濃度が対照と比較して低下すること、及びＩＬ１０、ＣＸＣＬ１２、又はＣＣＬ５の濃度が対照と比較して上昇することにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが示される。一実施形態では、試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した約１５日後に得られる。一実施形態では、試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した約２９日後に、又は各治療サイクル（１サイクル当たり４週間）のいずれの１日目にも得られる。
【００１１】
第４の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応を予測する別の方法を提供する。この方法はまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の継続投与の利益を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ／ａｓｓｅｓｓ）ためにも用いることができる。方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法の前に対象から得られた第１の生物学的試料を用意するステップと、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した後で対象から得られた第２の生物学的試料を用意するステップと、第１及び第２の生物学的試料中の、ＣＣＬ５、ＦＬＴ３ＬＧ、ＩＬ１２（ｐ４０）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＣＳＦ２、ＦＬＴ１、ＴＥＫ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ６、ＣＳＦ３、ＦＩＧＦ、ＩＬ１ＲＮ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ａ、ＴＧＦＡ、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＬ１０、及びＦＧＦ２からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を測定するステップと、タンパク質の濃度比（第２／第１）を計算するステップとを伴う。ＣＣＬ５、ＦＬＴ３ＬＧ、ＩＬ１２（ｐ４０）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＣＳＦ３、ＦＬＴ１、ＴＥＫ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦＡ、又はＩＬ６の濃度比が対照と比較して低下すること、及びＣＳＦ２、ＦＩＧＦ、ＩＬ１ＲＮ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ａ、ＴＧＦＡ、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＩＬ１０、又はＦＧＦ２の濃度比が対照と比較して上昇することにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが予測される。一実施形態では、試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した約１５日後に得られる。一実施形態では、試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を開始した約２９日後に得られるか、又は各治療サイクル（１サイクル当たり４週間）のいずれの１日目にも得られる。
【００１２】
第５の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量のレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を投与するステップを包含し、対象が、この療法に対する反応性と関連する突然変異を有する対象、及び／又はこの療法に対する反応性と関連するバイオマーカーのレベルを発現しているか若しくはバイオマーカーの発現比を有している対象、及び／又は、甲状腺癌の場合、この療法に対する反応性と関連するサイログロブリンの発現比を有している対象として同定される方法を提供する。
【００１３】
第６の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の反応性を予測する方法を提供する。方法は、ＮＲＡＳの突然変異状態及び対象から得られた（１つ又は複数の）生物学的試料中の治療前のＡＮＧＰＴ２濃度を評価するステップを伴う。一実施形態では、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙されるＮＲＡＳの突然変異）の存在と、以下の予測式：（０．０００７５１）×（Ａｎｇ２）＋（２．６９）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（３．９２）＜０．７１６［式中、関数Ｄは、詳細な説明の節で定義される］へと代入したときにこの式を満たすＡＮＧＰＴ２の濃度とにより、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応性である対象が、これらのバイオマーカーのうちのいずれかを個別に示す対象よりなお明確に予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００１４】
第７の態様では、本開示は、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象の反応性を予測する方法を提供する。方法は、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳの突然変異状態及び対象から得られた（１つ又は複数の）生物学的試料中の治療前のＡＮＧＰＴ２濃度を評価するステップを伴う。一実施形態では、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙されるＮＲＡＳの突然変異又はＫＲＡＳの突然変異）の存在と、以下の予測式：（０．０００８６９）×（ＡＮＧ２９０）＋（２．１６）×Ｄ（ＫＲＡＳＮＲＡＳ，ＷＴ）−（２．２４）＜０．５０８へと代入したときにこの式を満たすＡＮＧＰＴ２の濃度とにより、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応性である対象が、これらのバイオマーカーのうちのいずれかを個別に示す対象よりなお明確に予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００１５】
以下の実施形態は、上記の態様全てに想定される。一実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩は、レンバチニブメシル酸塩である。一実施形態では、甲状腺癌は、分化型甲状腺癌である。別の実施形態では、甲状腺癌は、甲状腺髄様癌である。一実施形態では、甲状腺癌は、甲状腺乳頭癌である。別の実施形態では、甲状腺癌は、甲状腺濾胞癌である。別の実施形態では、甲状腺癌は、ヒュルトレ細胞甲状腺癌である。特定の実施形態では、甲状腺癌は、放射性ヨウ素不応性進行性分化型甲状腺癌である。一実施形態では、腎臓癌は、腎細胞癌である。特定の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、生物学的試料は、血液試料、循環腫瘍細胞、循環ＤＮＡ、血漿試料、血清試料、尿試料、甲状腺試料、甲状腺結節試料、腎臓試料、及び腫瘍試料からなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、検査結果を対象の医療ケア提供者に伝えるステップをさらに包含する。特定の実施形態では、方法は、対象の医療記録を修正して、対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応する可能性が高いか、又はその可能性が高くないかを示すステップをさらに包含する。具体的な実施形態では、記録は、コンピュータで読み取り可能な媒体上でなされる。特定の実施形態では、バイオマーカーの発現プロファイルにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが予測される場合は、方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を対象に処方するステップをさらに包含する。一部の実施形態では、方法は、対象にレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法を投与するステップをさらに包含する。一部の実施形態では、方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む治療から利益を得る癌を有するか又は発症する危険性がある対象を選択するステップをさらに含む。
【００１６】
別段に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験では、本明細書で記載される方法及び材料と類似又は同等の方法及び材料も用いることができるが、以下では例示的な方法及び材料について記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。不一致の場合は、定義を含めて本出願が優先される。材料、方法、及び例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＮＲＡＳ単独における突然変異又はＮＲＡＳ若しくはＫＲＡＳにおける突然変異を伴う患者の無増悪生存（ＰＦＳ）についての概略図である。ログランク検定による解析は、ＮＲＡＳ単独における突然変異、又はＮＲＡＳ若しくはＫＲＡＳにおける突然変異を伴う患者が、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳについて野生型である患者より良好なＰＦＳを示すことを裏付けた。
【図２】Ｅ７０８０による治療後におけるサイログロブリンレベルの変化についての概略図である。「ＰＲ」とは、Ｅ７０８０療法に対して部分寛解を示す患者群における中央値を指す。「その他」とは、Ｅ７０８０療法後において疾患の安定、又は疾患の進行を示す患者群における中央値を指す。
【詳細な説明】
【００１８】
本開示は、甲状腺癌対象又は腎臓癌対象（ヒト患者など）の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応を予測するための方法及び組成物を提供する。本開示は、甲状腺癌（例えば、分化型甲状腺癌）又は腎臓癌（例えば、腎細胞癌）を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象に、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を投与することが有効である可能性が高いのか、有効でない可能性が高いのかを同定するための予測バイオマーカー（例えば、タンパク質の発現レベル及び／又は遺伝子の突然変異）を提供する。加えて、本開示は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法による甲状腺癌対象又は腎臓癌対象の継続治療を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ／ａｓｓｅｓｓ）ために有用なバイオマーカーを提供する。本明細書で記載されるバイオマーカー、組成物、及び方法は、甲状腺癌又は腎臓癌を患う対象に適切な治療法（例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による療法）を選択するのに有用である。さらに、本出願は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法並びに治療法から利益を得る可能性がある、甲状腺癌又は腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある患者を選択する方法も提供する。
【００１９】
定義
「循環腫瘍細胞」という用語（ＣＴＣ）は、原発性腫瘍から脱離して血流中を循環する細胞を指す。ＣＴＣは、異なる組織におけるさらなる腫瘍のその後における増殖（転移）の原因を構成し得る（Ｋｉｔａｇｏら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、５５（４）：７５７−７６４（２００９））。
【００２０】
「循環ＤＮＡ」という用語は、癌患者の血漿又は血清において増大した量で存在するＤＮＡを指す。癌患者は、健常対照より循環ＤＮＡレベルが高い（Ｌｅｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、３７：６４６〜６５０（１９７７）；Ｃｈｕａｎｇら、Ｈｅａｄ  ＆  Ｎｅｃｋ、２２９〜２３４（２０１０））。
【００２１】
「発現レベルの減少／低下」という用語は、発現レベルが対照における発現レベルより低いことを意味する。
【００２２】
「発現レベルの上昇」という用語は、発現レベルが対照における発現レベルより高いことを意味する。
【００２３】
「レンバチニブ」という用語は、４−（３−クロロ−４（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）−７−メトキシ−６−キノリンカルボキシアミドを指す。この化合物は、米国特許第７，２５３，２８６号の実施例３６８（カラム２７０を参照されたい）において開示されている。米国特許第７，２５３，２８６号は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。レンバチニブメシル酸塩はまた、Ｅ７０８０とも称する。
【００２４】
本明細書では、「核酸」という用語と「ポリヌクレオチド」という用語とが、互換的に用いられ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び核酸類似体を含有するＤＮＡ（又はＲＮＡ）を含めたＲＮＡ及びＤＮＡの両方を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得る。核酸は、二本鎖の場合もあり、一本鎖の場合もある（すなわち、センス鎖の場合もあり、アンチセンス鎖の場合もある）。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーのほか、核酸類似体が含まれる。
【００２５】
「薬学的に許容される塩」という用語は、塩の種類について特に限定しない。このような塩の例には、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩などの無機酸付加塩；酢酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、及びトリフルオロ酢酸塩などの有機カルボン酸付加塩；メタンスルホン酸塩、ヒドロキシメタンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、及びタウリン塩などの有機スルホン酸付加塩；トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチルアミノ）メタン塩、及びフェネチルベンジルアミン塩などのアミン付加塩；並びにアルギニン塩、リシン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、及びグルタミン酸塩などのアミノ酸付加塩が含まれるがこれらに限定されない。一実施形態では、薬学的に許容される塩は、メタンスルホン酸塩（「メシル酸塩」）である。４−（３−クロロ−４−（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）−７−メトキシ−６−キノリンカルボキシアミドのメタンスルホン酸塩形態（すなわち、メシル酸塩）は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６１２，２０８号において開示されている。
【００２６】
本明細書では、「ポリペプチド」と「タンパク質」とが互換的に用いられ、長さ又は翻訳後修飾に関わらず、ペプチド結合された任意のアミノ酸鎖を意味する。典型的に、調製物中の全タンパク質のうちの重量で少なくとも６０％、例えば、試料中の全タンパク質のうちの６０％を構成する場合、本明細書で記載されるポリペプチドは「単離」されている。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチドは、調製物中の全タンパク質のうちの重量で少なくとも７５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％からなる。
【００２７】
「療法に反応する／療法に反応性の」という用語は、療法を投与される対象が、施される療法に対して肯定的な反応を示すことを意味する。このような肯定的な反応の非限定的な例は、腫瘍サイズの縮減、腫瘍転移の軽減、又は治療後における生存期間の延長である。
【００２８】
「対象」という用語は、ヒト、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、ヒヒ、サル、マウス、ラット、ブタ、ウマ、イヌ、及びウシが含まれるがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。
【００２９】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応性と関連する突然変異
ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＶＨＬ、又はＢＲＡＦなど、特定の遺伝子における突然変異により、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性が予測される。それぞれの遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列上のこのような突然変異の非限定的な例を、表１及び２に列挙する。
【００３０】
【表１−１】
0006038128.tif 000002
【表１−２】
0006038128.tif 000003
【００３１】
【表２】
0006038128.tif 000004
【００３２】
表１及び／又は表２に列挙される突然変異のうちの任意の１つ又は複数が対象において存在することにより、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。本明細書では、簡略のため、表１及び表２に由来する、本発明において用いるのに適するあらゆる可能な突然変異の組合せが明示的に列挙されるわけではない。にもかかわらず、あらゆるこのような組合せが考慮され、本発明の範囲内にあることを理解されたい。対象は、単一の突然変異（例えば、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ）を有する場合もあり、同じ遺伝子における複数の突然変異（例えば、ＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ及びＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）を有する場合もあり；複数の遺伝子における単一の突然変異を有する場合もあり（例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、及びＶＨＬ  Ｐ８１Ｓ）；複数の遺伝子における複数の突然変異（例えば、ＮＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ）を有する場合もあり；特定の遺伝子における単一の突然変異と他の遺伝子における複数の突然変異との組合せ（例えば、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ；ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ、ＮＲＡＳ  Ｇ１３Ｖ；ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ、ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ；及びＶＨＬ  Ｐ８１Ｓ）を有する場合もある。表１又は表２に列挙される１つの突然変異だけでも、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測するのに有用である。特定の実施形態では、（１つ又は複数の）突然変異は、ＮＲＡＳに存在する。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測するＮＲＡＳにおける突然変異の非限定的な例は、ＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｐ及びＮＲＡＳ  Ｑ６１Ｒである。他の実施形態では、（１つ又は複数の）突然変異は、ＮＲＡＳ及び／又はＫＲＡＳに存在する。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測するＫＲＡＳにおける突然変異の非限定的な例は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ及びＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｒである。他の実施形態では、（１つ又は複数の）突然変異は、ＮＲＡＳ及び／又はＫＲＡＳ及び／又はＶＨＬに存在する。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測するＶＨＬにおける突然変異の非限定的な例は、Ｐ８１Ｓである。さらに他の実施形態では、（１つ又は複数の）突然変異は、ＮＲＡＳ及び／又はＫＲＡＳ及び／又はＢＲＡＦに存在する。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測するＢＲＡＦにおける突然変異の非限定的な例は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅである。他の実施形態では、（１つ又は複数の）突然変異は、ＮＲＡＳ及び／又はＫＲＡＳ及び／又はＢＲＡＦ及び／又はＶＨＬに存在する。
【００３３】
また、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＶＨＬ、及び／若しくはＢＲＡＦ以外の遺伝子、又はこれらに加えた遺伝子における１つ又は複数の突然変異によっても、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測することができる。このような遺伝子の非限定的な例には、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、及びＭＥＴが含まれる。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性を予測し得る遺伝子における突然変異の非限定的な例には、ＥＲＢＢ２  Ｓ７７９＿Ｐ７８０ｉｎｓＶＧＳ、ＰＴＥＮ  Ｎ３２３ｆｓ＊２、及びＭＥＴ  Ｔ１０１０Ｉ．Ｔ９９２Ｉが含まれる。
【００３４】
一実施形態では、対象は、甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌又は甲状腺濾胞癌などの分化型甲状腺癌）を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性を示す。別の実施形態では、対象は、腎臓癌（例えば、腎細胞癌）を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性を示す。
【００３５】
対象から得られた生物学的試料から単離される核酸は、表１及び／又は表２に列挙される突然変異のうちの１つ又は複数の存在について解析することができる。当技術分野では、核酸における突然変異を同定する方法がよく知られている。対象が、対象とする遺伝子のうちのいずれかにおいて突然変異を有するかどうかを評価する１つの方法は、実施例１で記載する方法、とりわけ、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ製のオンコカルタ（ＯｎｃｏＣａｒｔａ）（商標）突然変異パネルの使用である。対象とする遺伝子又は核酸が突然変異を含有するかどうかを決定する他の非限定的な方法には、サンガー配列決定法（鎖終結法）、大規模並列処理特徴配列決定法（ＭＰＳＳ）、ポロニー配列決定法、４５４パイロシークエンス法、イルミナシークエンス法、ＳＯＬｉＤ配列決定法、イオン半導体配列決定法、ＤＮＡナノボール配列決定法、並びに電気化学アレイチップ及びフェロセン化ナフタレンジイミド（ＦＮＤ）を使用する同時多重突然変異検出（ＳＭＭＤ）システム（Ｗａｋａｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３２（１８）：ｅ１４１（２００４）を参照されたい）が含まれる。
【００３６】
また、対象とするタンパク質を対象に由来する生物学的試料から単離し、上記で開示した突然変異など、突然変異の存在について解析することもできる。当技術分野では、タンパク質を配列決定する方法がよく知られている。このような方法の非限定的な例には、質量分析及びエドマン分解反応が含まれる。タンパク質の配列決定は、全タンパク質解析又は酵素的に生成させたペプチドの質量分析による解析のいずれかの形態で実行することができる（Ｃｈａｉｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１４（５７９６）：６５〜６（２００６）を参照されたい）。衝突誘起解離（ＣＩＤ）（４）などのタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、タンパク質又はペプチドを配列決定する重要な技法である。この方法では、イオン供給源を介して発生させた気相のペプチド／タンパク質イオンが、希ガス原子との多発的衝突により内部加熱される。これにより、Ｃ−Ｎ結合によるペプチド骨格のフラグメント化がもたらされる結果として、一連のフラグメントイオンが発生する。配列情報は、一連のフラグメントイオンから読み取ることができる。
【００３７】
解析のための核酸又はタンパク質を得るために用いられる生物学的試料には、血液試料、血漿試料、血清試料、循環腫瘍細胞、循環ＤＮＡ、尿試料、甲状腺組織試料、甲状腺結節試料、腎臓組織試料、又は腫瘍試料が含まれるがこれらに限定されない。
【００３８】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応性についてのバイオマーカーとしてのサイログロブリン
上記の突然変異バイオマーカーに加えて、サイログロブリンもまた、有効なバイオマーカーとして用いることができる。サイログロブリンは、甲状腺コロイドにおいて見出される主要なタンパク質であり、甲状腺ホルモンのプロホルモン及び貯蔵部位の両方としての甲状腺の生理、機能にとっての中心である。サイログロブリンの発現レベルを用いて、対象（例えば、分化型甲状腺癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象）が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応する可能性が高いのか、その可能性がそれほど高くないのかを決定することができる。加えて、サイログロブリンの発現レベルはまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を既に投与されている対象に療法を継続させるのか、療法を終了させるのかを評価する（ａｓｓｅｓｓ又はｅｖａｌｕａｔｅ）ためにも用いることができる。
【００３９】
対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対して有効に反応するかどうかを評価するか、又はこの療法による継続治療を評価するために、以下の方法を使用することができる。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）の投与前及び投与後のいずれにおいても、対象から生物学的試料（例えば、血液試料、血清試料、又は血漿試料）を得る。２つの試料中のサイログロブリンの発現レベルの比（レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩の投与後におけるサイログロブリンの濃度／レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩の投与前におけるサイログロブリンの濃度）を計算する。被験対象に由来する試料の比が、対照の場合より小さければ、対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応する可能性が高いと決定されるのに対し、被験対象に由来する試料の比が、対照の比より大きいか又はこれとほぼ同じ（少なくとも９０％であるが１００％未満）であれば、対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応する可能性がそれほど高くないと決定される。対象が治療に反応すると予測される場合は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による療法を継続することが推奨される。上記のアッセイにおける「対照」という用語は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による治療前及び治療後において、被験試料の供給源と同じ供給源（例えば、血液試料、血清試料、又は血漿試料）から得られた試料であって、被験試料と同じ時点又は実質的に同じ時点において、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応しなかった（１つ又は複数の）対象である対照の（１つ又は複数の）対象から採取された試料を意味する。「対照」という用語は、過去に（療法による治療前及び治療後に）得られ、治療反応性が予測される対象から採取される被験試料との将来の比較のための基準として用いられる試料を包含する。例えば、「対照」は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応しなかった１例又は複数例の対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療前及び治療後におけるサイログロブリン発現を解析することによりあらかじめ確立することができる。次いで、このあらかじめ確立された基準比（療法に反応しなかった複数の対象から測定された平均の比の場合もあり、中央値の比の場合もある）を、被験試料と比較される「対照」比として用いることができる。
【００４０】
或いは、「対照」は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応した１例又は複数例の対象におけるサイログロブリン発現を解析することによりあらかじめ確立することもできる。次いで、このあらかじめ確立された基準比（療法に反応した複数の対象から測定された平均の比の場合もあり、中央値の比の場合もある）を、被験試料と比較される「対照」比として用いることができる。このような比較では、サイログロブリンレベルの比が、あらかじめ確立された基準比と同等であるか又はこれより小さければ、例えば、これより小さいか、これと同じであるか、又はこれとほぼ同じ（少なくとも９０％であるが１００％未満）であれば、対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。
【００４１】
上記の方法では、第１の生物学的試料を、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療前の任意の時点において採取することができる。例えば、第１の生物学的試料は、療法を開始する数分間、数時間、数日間、数週間、又は数カ月前に採取することもでき、療法の開始と実質的に同時に採取することもできる。また、第２の生物学的試料も、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療を開始した後の任意の時点において対象から採取することができる。例えば、第２の生物学的試料は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による治療の数分間、数時間、数日間、数週間、又は数カ月後に採取することができる。第２の生物学的試料を採取する時点の非限定的な例には、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による治療を開始して１週間〜９カ月、２週間〜９カ月、３週間〜９カ月後、４週間〜９カ月後、１日〜２週間後、２日〜２週間後、３日〜２週間後、４日〜２週間後、５日〜２週間後、６日〜２週間後、１週間〜２週間後、１週間〜３週間後、１週間〜４週間後、及び１週間〜５週間後が含まれる。
【００４２】
サイログロブリンレベルは、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することにより決定することができる。当技術分野では、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定する方法がよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ編（１９８９）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｇｕｉｄｅ」、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５２７９（型番：１７０−９７９９）を参照されたい）。
【００４３】
特定の実施形態では、対象は、療法による治療後において部分寛解を示す場合に、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応することが決定される。「部分寛解」とは、ベースライン最長径（ＬＤ）和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも３０％の減少を意味する。一部の実施形態では、対象は、療法による治療後において腫瘍退縮を示す場合に、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応することが決定される。「腫瘍退縮」（ＴＳ）とは、ベースライン直径和を基準として、標的病変の直径和の百分率変化を意味する。他の実施形態では、対象は、無増悪生存を示す場合に、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応することが決定される。「無増悪生存」（ＰＦＳ）とは、治療の開始日から疾患の進行（ＰＤ）状態に入る前の最終日までの期間を指す。ＰＤとは、治療を開始してから記録された最小のＬＤ和、又は１つ若しくは複数の新たな病変が出現してから記録された最小のＬＤ和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも２０％の増大を意味する。
【００４４】
治療後におけるサイログロブリンレベルの治療前のレベルからの、対照（例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対して反応しない対象から得られた、治療前及び治療後における試料）と比較した大幅な低下により、分化型甲状腺癌患者における、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法による部分寛解が予測される。
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法による治療の約２８日（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４日）後におけるサイログロブリンレベルの低下により、分化型甲状腺癌患者における無増悪生存が予測される。
【００４５】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法による治療の約５６日後、約８４日後、約１１２日後、及び約１４０日後におけるサイログロブリンレベルの低下により、分化型甲状腺癌患者における腫瘍退縮が予測される。
【００４６】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対する反応性についてのバイオマーカーとしてのサイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子
それらの発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベル）がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性を予測するのに有用な、多数の遺伝子が同定されている。Ｇｅｎｅ  ＩＤ、関連するＵＲＬ、タンパク質ＩＤ、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号により同定されるこれらの遺伝子を表３に列挙する。
【００４７】
【表３−１】
0006038128.tif 000005
【表３−２】
0006038128.tif 000006
【００４８】
表３に列挙される特定の遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現）レベルが低ければ（対照と比較して）、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが示される／予測される。例えば、療法による治療前の対象から得られた生物学的試料中のＡＮＧＰＴ２、ＶＥＧＦＡ、ＩＦＮＧ、及びＫＤＲの濃度が低ければ（対照と比較して）、所与の対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。ここで、「対照」という用語は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応しないことが知られている対象から得られた試料（同じ組織に由来する）を包含する。「対照」という用語はまた、過去において得られ、治療反応性が予測される対象から採取された被験試料に対する将来の比較のための基準として用いられる試料も包含する。例えば、特定の細胞型又は組織における特定の遺伝子の「対照」の発現レベルは、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応しなかった１例又は複数例の対象における遺伝子発現を解析することによりあらかじめ確立することができる。次いで、このあらかじめ確立された基準値（療法に反応した複数の対象から測定された平均又は中央値の発現レベルであり得る）を、被験試料と比較される「対照」の発現レベルに用いることができる。或いは、特定の細胞型又は組織における特定の遺伝子の「対照」の発現レベルは、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応した１例又は複数例の対象における遺伝子発現を解析することによりあらかじめ確立することができる。次いで、このあらかじめ確立された基準値（療法に反応した複数の対象から測定された平均又は中央値の発現レベルであり得る）を、被験試料と比較される「対照」の発現レベルに用いることができる。このような比較では、解析される遺伝子の発現レベルが、あらかじめ確立された基準と同等であるか又はこれより低ければ、例えば、これより低いか、これと同じであるか、又はこれとほぼ同じ（少なくとも８５％であるが１００％未満）であれば、対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。
【００４９】
表３に列挙される特定の遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現）レベルが高ければ（対照と比較して）、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。例えば、療法による治療前の対象から得られた生物学的試料中のＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦ２、ＣＳＦ３、ＩＬ６、ＩＬ１３、ＦＬＴ４、ＣＣＬ３、及びＣＣＬ４の濃度が高ければ（対照と比較して）、所与の対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。ここで、「対照」という用語は、特定の細胞型又は組織における特定の遺伝子の「対照」の発現レベルが、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応した１例又は複数例の対象における遺伝子発現を解析することによりあらかじめ確立することができる場合、解析される遺伝子の発現レベルが、あらかじめ確立された基準と同等であるか又はこれより高ければ、例えば、これより高いか、これと同じであるか、又はこれとほぼ同じ（少なくとも８５％であるが１００％未満）であれば、対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測されることを除き、上記の段落で記載した「対照」という用語と同一である。
【００５０】
また、短い期間にわたり対象にレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を投与して、投与される療法が対象に有効であるかどうかを決定すべきことも想定される。療法の有効性の決定は、治療後の異なる時点におけるこれらの対象から得られた生物学的試料中の特定の遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現）レベルに基づき行う。これらの遺伝子の発現レベルに基づき、対象が継続治療に反応するかどうかを予測することができる。したがって、これらの方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）の投与を継続することが妥当であるかどうかを評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ又はｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）のに有用である。例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後に、特定の遺伝子、例えば、ＡＮＧＰＴ２及び／又はＩＬ１３の濃度が（対照と比較して）低ければ、レンバチニブ化合物による継続療法時に対象が有益な臨床転帰（例えば、腫瘍反応及び／又は腫瘍退縮）を示すことが予測される。同様にまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後に、特定の遺伝子、例えば、ＩＬ１０及び／又はＣＸＣＬ１２の濃度が（対照と比較して）高ければ、レンバチニブ化合物による継続療法時に対象が有益な臨床転帰（例えば、腫瘍反応及び／又は腫瘍退縮）を示すことが予測される。
【００５１】
加えて、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後において、特定の遺伝子、例えば、ＶＥＧＦＲ、ＩＬ６、及び／又はＰＧＦの濃度が（対照と比較して）低ければ、レンバチニブ化合物による継続療法時に対象が有益な臨床転帰（例えば、腫瘍反応及び／又は腫瘍退縮）を示すことが予測される。また、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後において、特定の遺伝子、例えば、ＣＣＬ５の濃度が（対照と比較して）高ければ、レンバチニブ化合物による継続療法時に対象が有益な臨床転帰（例えば、腫瘍反応及び／又は腫瘍退縮）を示すことが予測される。
【００５２】
また、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による治療後における特定の遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現）レベルを、治療前のレベルで除した比（対照と比較）も、レンバチニブ化合物による継続療法時に対象が有益な臨床転帰（例えば、最良総合効果、腫瘍退縮、無増悪生存）を示すかどうかを予測するのに有用である。例えば、特定の遺伝子、例えば、ＣＣＬ５、ＦＬＴ３ＬＧ、ＩＬ１２（ｐ４０）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＣＳＦ３、ＦＬＴ１、ＴＥＫ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦＡ、又はＩＬ６の発現レベル比が対照と比較して低下していれば、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが示される。加えて、特定の遺伝子、例えば、ＣＳＦ２、ＦＩＧＦ、ＩＬ１ＲＮ、ＣＣＬ１１、ＩＬ１Ａ、ＴＧＦＡ、ＰＧＦ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＩＬ１０、又はＦＧＦ２の濃度比が対照と比較して上昇していれば、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応することが予測される。
【００５３】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＣＣＬ５、ＦＬＴ３ＬＧの発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が（対照と比較して）低下していれば、対象が無増悪生存を示すことが示される。
【００５４】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＣＳＦ３又はＦＧＦ２の発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が（対照と比較して）上昇していれば、対象が腫瘍反応を示すことが示される。
【００５５】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＣＳＦ３、ＩＬ１０、又はＦＧＦ２の発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が（対照と比較して）上昇していれば、対象が腫瘍退縮を示すことが示される。
【００５６】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５日〜約１８日後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＦＩＧＦ、ＩＬＩＲＮ、ＰＤＧＦＡＢ、又はＩＬ１０の発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が（対照と比較して）上昇していれば、対象が無増悪生存を示すことが示される。
【００５７】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＦＬＴ３ＬＧ、ＩＬ１２、ＥＧＦ、ＰＤＧＦＢＢ、ＰＤＧＦＡＡ、ＣＳＦ３、又はＦＬＴ１の発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が低下していれば、対象が無増悪生存を示すことが示される。
【００５８】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＣＣＬ１１の発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が上昇していれば、対象が腫瘍反応を呈示することが示される。
【００５９】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＩＬ１Ａ又はＴＧＦＡの発現レベルと、この療法の開始前における同じ遺伝子の発現レベルとの比が上昇していれば、対象が腫瘍退縮を呈示することが示される。
【００６０】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＦＬＴ１、ＴＥＫ、ＶＥＧＦＲ、又はＩＬ６の発現レベルと、この療法を開始して約５日〜約１８日後における同じ遺伝子の発現レベルとの比が低下していれば、対象が腫瘍退縮を呈示することが示される。
【００６１】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＴＥＫ、ＨＧＦ、又はＶＥＧＦＲの発現レベルと、この療法を開始して約５日〜約１８日後における同じ遺伝子の発現レベルとの比が低下していれば、対象が最良総合効果を示すことが示される。
【００６２】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を開始して約５週間（例えば、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間）後における発現に基づく特定の遺伝子、例えば、ＰＧＦの発現レベルと、この療法を開始して約５日〜約１８日後における同じ遺伝子の発現レベルとの比が上昇していれば、対象が腫瘍退縮を呈示することが示されるのに対し、同じ条件下における、例えば、ＦＧＦ２の比が上昇していれば、対象が腫瘍反応を呈示することが予測される。
【００６３】
上記で観察された無増悪生存は、例えば、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間、１２カ月間、１３カ月間、１４カ月間、１５カ月間、１６カ月間、１７カ月間、１８カ月間、１９カ月間、２０カ月間、２１カ月間、２２カ月間、２３カ月間、又は２４カ月間の場合もあり、約４カ月間、約５カ月間、約６カ月間、約７カ月間、約８カ月間、約９カ月間、約１０カ月間、約１１カ月間、約１２カ月間、約１３カ月間、約１４カ月間、約１５カ月間、約１５カ月間、約１７カ月間、約１８カ月間、約１９カ月間、約２０カ月間、約２１カ月間、約２２カ月間、約２３カ月間、又は約２４カ月間の場合もある。
【００６４】
比が上昇しているか低下しているかを決定する際は、対照と比較する。ここで、「対照」という用語は、被験試料の供給源と同じ供給源（例えば、血液試料、血清試料、又は血漿試料）から得られ、被験試料と同じ時点又は実質的に同じ時点において、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に対して反応しなかった（１つ又は複数の）対象から採取される試料を包含する。「対照」という用語は、過去において（療法による治療前及び治療後において）得られた試料であって、治療反応性が予測される対象から採取される被験試料との将来の比較のための基準として用いられる試料を包含する。例えば、「対照」は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応しなかった１例又は複数例の対象における、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療前、及び治療後の対象とする遺伝子のあらかじめ確立された発現比であり得る。次いで、このあらかじめ確立された基準比（療法に反応しなかった複数の対象から測定された平均の比の場合もあり、中央値の比の場合もある）を、被験試料と比較される「対照」比として用いることができる。
【００６５】
或いは、「対照」は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療に反応した１例又は複数例の対象における対象とする遺伝子の発現を解析することにより、あらかじめ確立することもできる。次いで、このあらかじめ確立された基準比（療法に反応した複数の対象から測定された平均の比の場合もあり、中央値の比の場合もある）を、被験試料と比較される「対照」比として用いることができる。このような比較では、遺伝子の発現レベル比が、あらかじめ確立された基準比と同等である、例えば、これと同じであるか、又はこれとほぼ同じ（少なくとも９０％であるが１００％未満）であれば、対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応することが予測される。
【００６６】
組合せ法
上記のバイオマーカーのうちのいずれかを組み合わせて評価して、対象がレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法の継続投与に反応するかどうか、又はこれから利益を得るかどうかを決定する。例えば、突然変異バイオマーカーのうちの任意の１つ又は複数を、サイログロブリンの発現比、及び／又はサイトカイン、ケモカイン、若しくは血管新生因子の発現レベル若しくは発現比、及び／又は組織学的解析と組み合わせて評価することができる。ある場合には、（１つ又は複数の）突然変異バイオマーカーを、組織学的解析と組み合わせて評価する。他の場合には、（１つ又は複数の）突然変異バイオマーカーを、サイログロブリンの発現比と組み合わせて評価する。ある場合には、（１つ又は複数の）突然変異バイオマーカーを、１つ又は複数のサイトカイン、ケモカイン、又は血管新生因子の発現レベル又は発現比と組み合わせて評価する。一実施形態では、ＮＲＡＳの突然変異状態を、対象から得られた生物学的試料中で評価し、治療前のＡＮＧＰＴ２濃度と組み合わせて考慮する。別の実施形態では、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳの突然変異状態を、対象から得られた生物学的試料中で評価し、治療前のＡＮＧＰＴ２濃度と組み合わせて考慮する。このような組合せによるバイオマーカー解析は、個別のバイオマーカーを研究するよりさらに明確な予測値をもたらし、例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性を予測するのに有用である。
【００６７】
統計学的解析は、組み合わせて用いる場合、どのマーカーが個別のマーカーより良好に所望の臨床転帰と関連するのかを決定するのに用いることができる。本出願の実施例４では、このような解析の非限定的な例を呈示する。
【００６８】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法の開始前における（「治療前の」）ＶＥＧＦＡの発現レベルとＡＮＧＰＴ２の発現レベルとの組合せは、療法反応についての、これらの個別の血中バイオマーカーの各々より良好な予測因子であり得る。例えば、対象における治療前のＶＥＧＦＡ及びＡＮＧＰＴ２の濃度が、以下の予測式：
（０．０００２６１）×（Ａｎｇ２）＋（０．００１２６）×（ＶＥＧＦＡ１００）−（１．０９）＜−０．２４
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が−０．２４未満（例えば、−１．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を施された後でこれらの因子の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。別の例として述べると、対象における治療前のＶＥＧＦＡ、ＡＮＧＰＴ２、及びＧＣＳＦの濃度が、以下の予測式：
（０．０００５９１）×（ＡＮＧ２９０）＋（−０．０１７８）×（ＧＣＳＦ）＋（０．００１４２）×（ＶＥＧＦＡ１００）−（−０．６７１）＜０．６５１
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．６５１未満となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を施された後で、治療前のこれらの因子の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００６９】
さらなる例として述べると、対象における治療前のＩＬ１３及びＭＩＰ１ａの濃度が、以下の予測式：
（−０．０４５９）×（ＩＬ１３）＋（０．０４５９）×（ＭＩＰ１ａ）−（０．０３９５）＜０．２６８
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．２６８未満となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を施された後でこれらの因子の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７０】
さらなる例として述べると、対象における治療前のＩＬ１３、ＭＩＰ１ａ、及びＭＩＰ１ｂの濃度が、以下の予測式：
（−０．０３５３）×（ＩＬ１３）＋（０．０７１３）×（ＭＩＰ１ａ）＋（−０．０１５４）×（ＭＩＰ１ｂ）−（０．１８８）＜０．２２２
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．２２２未満となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を施された後で、治療前のこれらの因子の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７１】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法の開始前における（「治療前の」）ＶＥＧＦＲの（１つ又は複数の）突然変異及び発現レベルとＭＩＰ１ｂの（１つ又は複数の）突然変異及び発現レベルとの組合せは、これらの個別の突然変異及び血中バイオマーカーの各々より良好な療法反応についての予測因子であり得る。例えば、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＶＥＧＦＡ及びＭＩＰ１ｂの濃度が、以下の予測式：
（−０．０２５）×（ＭＩＰ１ｂ）＋（−０．００６１６）×（ＶＥＧＦＡ１００）＋（３．３２）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（−０．５２）＜１．８１
（式中、関数Ｄ（ｇ，ｓ）は、（１つ又は複数の）遺伝子の突然変異状態ｇが状態ｓであるときは１であり、ｇがｓでないときは０である。状態は、「ＷＴ」（野生型）の場合もあり、「ＭＵ」（突然変異）の場合もある。複数遺伝子の場合、突然変異状態は、１つ又は複数の遺伝子が突然変異を有する場合は「ＭＵ」であり、「ＷＴ」は、全ての遺伝子が野生型である場合に限られる）
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が１．８１未満（例えば、１．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳを有し、その治療前のＶＥＧＦＡ及びＭＩＰ１ｂの濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７２】
別の例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ｂ、及びｓＶＥＧＦＲ３の濃度が、以下の予測式：
（−０．０４９４）×（ＭＩＰ１ｂ）＋（−０．０００４７２）×（ｓＶＥＧＦＲ３）＋（−０．０１１９）×（ＶＥＧＦＡ１００）＋（４．６６）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（−５．９）＜３．５５
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が３．５５未満（例えば、３．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳを有し、その治療前のＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ｂ、及びｓＶＥＧＦＲ３の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７３】
さらなる例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ｂ、ｓＶＥＧＦＲ３、及びＡｎｇ２の濃度が、以下の予測式：
（０．００１４８）×（Ａｎｇ２）＋（−０．０６０６）×（ＭＩＰ１ｂ）＋（−０．０００９１７）×（ｓＶＥＧＦＲ３）＋（−０．０１７７）×（ＶＥＧＦＡ１００）＋（６．５８）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（−５．７８）＜３．９７
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が３．９７未満（例えば、３．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳを有し、その治療前のＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ｂ、ｓＶＥＧＦＲ３、及びＡｎｇ２の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７４】
さらなる例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＡｎｇ２の濃度が、以下の予測式：
（０．０００７５１）×（Ａｎｇ２）＋（２．６９）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（３．９２）＜０．７１６
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．７１６未満（例えば、０．５）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳを有し、その治療前のＡｎｇ２の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７５】
さらなる例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＡＮＧ２（９０）の濃度が、以下の予測式：
（０．０００９７２）×（ＡＮＧ２９０）＋（２．７５）×Ｄ（ＮＲＡＳ，ＷＴ）−（２．９６）＜０．６３３
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．６３３未満（例えば、０．５）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳを有し、その治療前のＡＮＧ２（９０）の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７６】
別の例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＡＮＧ２（９０）の濃度が、以下の予測式：
（０．０００８６９）×（ＡＮＧ２９０）＋（２．１６）×Ｄ（ＫＲＡＳＮＲＡＳ，ＷＴ）−（２．２４）＜０．５０８
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が０．５０８未満（例えば、０．４）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳ又は野生型ＫＲＡＳを有し、その治療前のＡＮＧ２（９０）の濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７７】
別の例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＢＲＡＦにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＭＩＰ１ａの濃度が、以下の予測式：
（−０．０２８１）×（ＭＩＰ１ａ）＋（２．１９）×Ｄ（ＢＲＡＦＫＲＡＳＮＲＡＳ，ＷＴ）−（−０．４１）＜−０．０３４８
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が−０．０３４８未満（例えば、−１．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳ又は野生型ＫＲＡＳ又は野生型ＢＲＡＦを有し、その治療前のＭＩＰ１ａの濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７８】
別の例として述べると、対象に由来する試料が、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＢＲＡＦにおける突然変異（例えば、表１又は２に列挙される突然変異のうちの１つ）を有し、対象における治療前のＩＬ６、ＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ａ、及びＭＩＰ１ｂの濃度が、以下の予測式：
（０．１２６）×（ＩＬ６）＋（−０．１９３）×（ＭＩＰ１ａ）＋（−０．０７７５）×（ＭＩＰ１ｂ）＋（−０．０５１４）×（ＶＥＧＦＡ１００）＋（７．９４）×Ｄ（ＢＲＡＦＫＲＡＳＮＲＡＳ，ＷＴ）−（−１４．４）＜４．６９
へと代入したときにこの式を成り立たせる場合（すなわち、値が４．６９未満（例えば、３．０）となる場合）、この対象は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により、野生型ＮＲＡＳ又は野生型ＫＲＡＳ又は野生型ＢＲＡＦを有し、その治療前のＩＬ６、ＶＥＧＦＡ、ＭＩＰ１ａ、及びＭＩＰ１ｂの濃度がこの式を満たさない対象より良好な臨床転帰（例えば、無増悪生存）を示すと予測される（異なる試料集団を解析する場合は、式中の傾き、切片、及びカットオフ値を異なる形で最適化させることができる）。
【００７９】
生物学的試料
本明細書で記載される方法に適する生物学的試料には、核酸（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）又はタンパク質など、対象とする解析物である生体分子を包含する、任意の生物学的流体、細胞、組織、又はこれらの画分が含まれる。生物学的試料は、例えば、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）から得られた検体の場合もあり、このような対象に由来する場合もある。例えば、試料は、生検により得られる組織切片の場合もあり、組織培養物中に置くか、又はこれに適応させた細胞の場合もある。生物学的試料はまた、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、痰、脳脊髄液、涙液、又は粘液の場合もあり、基質（例えば、ガラス、ポリマー、紙）へと吸収させた試料などの生物学的流体の場合もある。生物学的試料にはまた、甲状腺組織試料、腎臓組織試料、腫瘍試料、循環腫瘍細胞、及び循環ＤＮＡも含まれ得る。具体的な実施形態では、生物学的試料は、腫瘍又は前癌性病変を含有することが疑われる対象の領域から得られた（１つ又は複数の）腫瘍細胞又は（１つ又は複数の）細胞である。例えば、生物学的試料は、甲状腺腫瘍試料の場合もあり、腎臓腫瘍試料の場合もある。所望の場合、生物学的試料は、特定の細胞型を含有する画分へとさらに画分化することができる。例えば、血液試料は、血清へと画分化することもでき、赤血球又は白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））など、特定の血液細胞型を含有する画分へと画分化することもできる。所望の場合、試料は、組織試料と体液試料との組合せなど、対象に由来する試料の組合せであり得る。
【００８０】
生物学的試料は、対象、例えば、癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある対象から得ることができる。特定の実施形態では、対象は甲状腺癌を有する。一部の実施形態では、対象は分化型甲状腺癌（例えば、甲状腺乳頭癌、甲状腺濾胞癌）を有する。他の実施形態では、対象は甲状腺髄様癌を有する。特定の実施形態では、対象は腎臓癌を有する。一部の実施形態では、対象は腎細胞癌を有する。例示的な方法には、例えば、静脈切開手順、スワブ（例えば、口腔内スワブ）手順、又は微細針吸引生検手順が含まれるが、生物学的試料を得るために適する任意の方法を使用することができる。微細針吸引を施しやすい組織の非限定的な例には、リンパ節、肺、甲状腺、乳房、皮膚、及び肝臓が含まれる。試料はまた、例えば、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）又はレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））により収集することもできる。
【００８１】
当業者には、試料を得る方法及び／又はこれを保管する方法であって、試料中の分子（例えば、核酸又はタンパク質）の活性又は完全性を保全する方法がよく知られている。例えば、生物学的試料は、試料中の分子（例えば、核酸又はタンパク質）を変化から保全するか又は試料中の分子の変化を最小化する、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、及びホスファターゼ阻害剤を含めた、適切な緩衝剤及び／又は阻害剤など、１つ又は複数のさらなる薬剤とさらに接触させることができる。このような阻害剤には、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などのキレート化剤、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパインなどのプロテアーゼ阻害剤、及びリン酸、フッ化ナトリウム、バナジウム酸などのホスファターゼ阻害剤が含まれる。当業者には、分子を単離するのに適切な緩衝剤及び条件がよく知られており、例えば、特徴づけられる試料中の分子の種類に応じて変化させることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、（補遺４７）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｔｉｅｔｚ、「Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｂｕｒｔｉｓ及びＡｓｈｗｏｏｄ編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、（１９９９）を参照されたい）。また、試料を処理して、干渉物質を消失させるか又はこれらの存在を最小化することもできる。例えば、生物学的試料を画分化又は精製して、対象でない１つ又は複数の物質を除去することができる。生物学的試料を画分化又は精製する方法には、液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ除外クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法が含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
本明細書で記載される方法で用いられる試料は、多様な物理的状態に置くことができる。例えば、試料は、液体の場合もあり、固体の場合もあり、液体中に溶解させることもでき、懸濁させることもでき、エマルジョン又はゲル中に存在させることもでき、物質へと吸収させることもできる。
【００８３】
バイオマーカーの発現の評価
遺伝子の発現は、例えば、標的遺伝子のタンパク質又はｍＲＮＡへの発現として検出することができる。すなわち、遺伝子の存在又は発現レベル（量）は、遺伝子のｍＲＮＡ若しくはタンパク質への発現を検出すること、及び／又はその発現レベルを測定することにより決定することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現を、表３に示される遺伝子などの遺伝子によりコードされるタンパク質の活性として検出することができる。
【００８４】
遺伝子のｍＲＮＡへの発現レベルを検出及び／又は測定するのに適する多様な方法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット解析又はドットブロット解析、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ；例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）、又は核酸アレイ（例えば、オリゴヌクレオチドアレイ又は遺伝子チップ）解析を用いて決定することができる。このような方法の詳細は、以下、及び、例えば、それらの各々の開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、１、２、及び３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、１９８９年１１月；Ｇｉｂｓｏｎら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６（１０）：９９５〜１００１；並びにＺｈａｎｇら（２００５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、３９（８）：２７７７〜２７８５；米国特許出願公開第２００４０８６９１５号；欧州特許出願公開第０５４３９４２号；及び米国特許第７，１０１，６６３号において記載されている。
【００８５】
一例では、全ｍＲＮＡを生物学的試料から単離し、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけて、ｍＲＮＡをサイズで分離することにより、生物学的試料中の１つ又は複数の個別のｍＲＮＡ集団の存在又は量を決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）及び米国特許第６，８１２，３４１号を参照されたい）。次いで、サイズで分離されたｍＲＮＡを、ニトロセルロース膜などの固体支持体に移す（例えば、拡散により）。次いで、対象とするｍＲＮＡ配列と相補的な、１つ又は複数の検出可能に標識したポリヌクレオチドプローブであって、それらの対応するｍＲＮＡ集団に結合し、したがって、これらを検出可能とするプローブを用いて、生物学的試料中の１つ又は複数のｍＲＮＡ集団の存在又は量を決定することができる。検出可能な標識には、例えば、蛍光標識（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、又はフィコエリトリン）、発光標識（例えば、ユーロピウム、テルビウム、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ製のキュードット（Ｑｄｏｔ）（商標）ナノ粒子）、放射性標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐ、又は３Ｈ）、及び酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンステラーゼ）標識が含まれる。
【００８６】
別の例では、核酸（又はオリゴヌクレオチド）アレイ（例えば、以下の「アレイ及びキット」の下に記載されているアレイ）を用いて、生物学的試料中の個別のｍＲＮＡ（例えば、表３に示される１つ又は複数の遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ）集団の存在又は量を決定することができる。例えば、生物学的試料から単離されたｍＲＮＡは、例えば、ランダムヘキサマー又はオリゴ（ｄＴ）プライマーを介する第１鎖の合成を伴うＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。単位複製配列は、短いセグメントへと断片化することができる。ＲＴ−ＰＣＲステップを用いて、単位複製配列を検出可能に標識することもでき、場合によって、単位複製配列を、ＲＴ−ＰＣＲステップの後で検出可能に標識することもできる。例えば、検出可能な標識は、多様で適切な技法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照されたい）のうちのいずれかを用いて、単位複製配列に酵素的に（例えば、ニック翻訳又はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどのキナーゼを介して）結合させることもでき、単位複製配列に化学的に結合させることもできる。次いで、検出可能に標識した単位複製配列を、各セットが対応する単位複製配列に特異的な（及びこれに結合することが可能な）ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）プローブのうちの１つ又は複数を含有し、各々が異なる単位複製配列に対応する多くのプローブセットを含有する複数のポリヌクレオチドプローブセットと接触させる。一般に、プローブセットは固体支持体へと結合させ、固体支持体上の各プローブセットの位置は、あらかじめ決定されている。検出可能に標識された単位複製配列のプローブセットの対応するプローブへの結合は、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡの存在又は量を示す。核酸アレイを用いてｍＲＮＡの発現を検出するさらなる方法は、例えば、それらの各々の開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４４５，９３４号；同第６，０２７，８８０号；同第６，０５７，１００号；同第６，１５６，５０１号；同第６，２６１，７７６号；及び同第６，５７６，４２４号において記載されている。
【００８７】
検出可能な標識を検出及び／又は定量化する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素により触媒される反応産物（検出可能な標識が酵素である場合；上記を参照されたい）は、限定なしに述べると、蛍光反応産物、発光反応産物、又は放射性反応産物の場合もあり、可視光又は紫外光を吸収する場合もある。このような検出可能な標識を検出するのに適する検出器の例には、限定なしに述べると、Ｘ線フィルム、放射能カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、比色計、蛍光光度計、照度計、及び濃度計が含まれる。
【００８８】
遺伝子の発現はまた、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出及び／又は測定することにより決定することもできる。当技術分野では、タンパク質の発現を決定する方法がよく知られている。一般に用いられる方法は、対象とする標的タンパク質に特異的な抗体の使用を伴う。例えば、タンパク質の発現を決定する方法には、ウェスタンブロット解析若しくはドットブロット解析、免疫組織化学（例えば、定量的免疫組織化学）、免疫細胞化学、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定スポット法（ＥＬＩＳＰＯＴ；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ら編（１９９５）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、又は抗体アレイ解析（それらの各々の開示が参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許出願公開第２００３００１３２０８号及び同第２００４１７１０６８号を参照されたい）が含まれるがこれらに限定されない。タンパク質の発現を検出する上記の方法及びさらなる方法のうちの多くについてのさらなる記載は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）において見出すことができる。
【００８９】
一例では、遺伝子のタンパク質への発現の存在又は量（例えば、表３に示される遺伝子）は、ウェスタンブロット法を用いて決定することができる。例えば、溶解物は、生物学的試料から調製する場合もあり、生物学的試料自体の場合もあり、レムリ緩衝液と接触させて、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけることもできる。次いで、サイズで分離された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分解されたタンパク質を、フィルター膜（例えば、ニトロセルロース）へと移し、対象とするタンパク質に特異的な、検出可能に標識された抗体を用いる免疫ブロット法にかけた。結合した、検出可能に標識された抗体の存在又は量は、生物学的試料中のタンパク質の存在又は量を示す。
【００９０】
別の例では、遺伝子（例えば、表３に示される遺伝子）のタンパク質への発現を検出及び／又は測定するのにイムノアッセイを用いることができる。上記の通り、検出を目的として、検出部分（例えば、蛍光剤又は酵素）を保有する抗体によりイムノアッセイを実施することができる。生物学的試料に由来するタンパク質は、固相マトリックス（例えば、マルチウェルアッセイプレート、ニトロセルロース、アガロース、セファロース、コード粒子、又は磁気ビーズ）へと直接結合させることもでき、特異的結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン又はストレプトアビジン）であって、特異的結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン又はビオチン）に結合すると固相マトリックスへと接合される第１のメンバーに結合させることもできる。このような固相マトリックスへの接合は、タンパク質を、検出抗体と接触させる前に、生物学的試料の他の干渉成分又は非関与成分から精製することを可能とし、また、その後の結合しなかった抗体の洗浄も可能とする。上記の通り、ここで、結合した、検出可能に標識された抗体の存在又は量は、生物学的試料中のタンパク質の存在又は量を示す。
【００９１】
抗体の形態について特に制約はなく、本開示は、ポリクローナル抗体のほか、モノクローナル抗体も包含する。ウサギなどの動物を本発明のタンパク質で免疫化することにより得られる抗血清のほか、また、全てのクラスのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、ヒト抗体、及び遺伝子組換えにより生成させたヒト化抗体も包含される。
【００９２】
完全タンパク質又はその部分ペプチドは、免疫化のための抗原として用いることができる。タンパク質の部分ペプチド、例えば、タンパク質のアミノ（Ｎ）末端断片及びカルボキシ（Ｃ）末端断片を施すことができる。
【００９３】
対象とするタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を、既知の発現ベクターへと挿入し、標準的な方法を用いて、宿主細胞を本明細書で記載されるベクターで形質転換することにより、所望のタンパク質又はその断片を宿主細胞の外部又は内部から収集する。このタンパク質は、感作抗原として用いることができる。また、タンパク質を発現させる細胞、細胞溶解物、又は本発明の化学合成されたタンパク質も、感作抗原として用いることができる。
【００９４】
感作抗原により免疫化される哺乳動物は制約されないが、細胞融合で用いられる親細胞との適合性を考慮することにより動物を選択することが好ましい。一般に、ネズミ目、ウサギ目、又はサル目に属する動物を用いる。用い得るネズミ目に属する動物の例には、例えば、マウス、ラット、及びハムスターが含まれる。用い得るウサギ目に属する動物の例には、例えば、ウサギが含まれる。用い得るサル目に属する動物の例には、例えば、サルが含まれる。用いられるサルの例には、狭鼻下目（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒ、及びチンパンジーが含まれる。
【００９５】
感作抗原で動物を免疫化するには、よく知られている方法を用いることができる。例えば、感作抗原を、哺乳動物へと腹腔内注射又は皮下注射する。とりわけ、感作抗原は、生理食塩液中、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中などで適切に希釈し、懸濁させ、所望の場合は、適量の一般的なアジュバント、例えば、フロイントの完全アジュバントと共に混合する。次いで、溶液を乳化させ、哺乳動物へと注射する。その後、フロイントの不完全アジュバントと共に適切に混合した感作抗原を、好ましくは４〜２１日ごとに複数回にわたり施す。動物を感作抗原で免疫化する場合はまた、適切な担体も用いることができる。免疫化の後、血清抗体レベルの上昇を、通常の方法により検出する。
【００９６】
本開示のタンパク質に対するポリクローナル抗体は、以下の通りに調製することができる。所望の血清抗体レベルに達したことを検証した後で、抗原で感作した哺乳動物から血液を抜き取った。従来の方法を用いてこの血液から血清を単離する。ポリクローナル抗体を含有する血清は、ポリクローナル抗体として用いることもでき、必要に応じて、ポリクローナル抗体を含有する画分を血清からさらに単離することもできる。例えば、とりわけ本発明のタンパク質を認識する抗体の画分は、タンパク質が連結されるアフィニティーカラムを用いることにより調製することができる。次いで、免疫グロブリンＧ又はＭを調製するために、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いることによりこの画分をさらに精製する。
【００９７】
モノクローナル抗体を得るためには、上記の抗原で感作した哺乳動物において所望の血清抗体レベルが達せられたことを検証した後で、この哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に用いる。この目的では、脾臓細胞が好ましい免疫細胞であるということができる。上記の免疫細胞と融合させる親細胞としては、哺乳動物の骨髄腫細胞を用いることが好ましい。より好まくは、薬剤により融合細胞を識別するのに用い得る特色を獲得した骨髄腫細胞を親細胞として用いる。
【００９８】
上記の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、既知の方法、例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（Ｇａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３〜４６、１９８１）による方法に従い実施することができる。
【００９９】
細胞融合から得られたハイブリドーマは、標準的な選択培地、例えば、ＨＡＴ培養培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有する培地）中で細胞を培養することにより選択する。このＨＡＴ培地中の培養は、目的のハイブリドーマ以外の細胞（融合しなかった細胞）が死滅するのに十分な期間、通常は数日〜数週間にわたり継続する。次いで、通常の限界希釈法を実行し、目的の抗体をもたらすハイブリドーマをスクリーニング及びクローニングする。
【０１００】
ヒト以外の動物を抗原で免疫化することによりハイブリドーマを得る上記の方法以外に、ヒトリンパ球を感作し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ヒトリンパ球をＥＢウイルス、タンパク質、タンパク質を発現させる細胞、又はこれらの溶解物で感染させ、感作されたリンパ球を、恒久的な細胞分裂能を有する、ヒトに由来する骨髄腫細胞、例えば、Ｕ２６６細胞と融合させる方法によっても、タンパク質に結合する活性を有する目的のヒト抗体を生成させるハイブリドーマを得ることができる。
【０１０１】
ハイブリドーマをマウスの腹腔内に移植し、腹水を抽出することにより得られたモノクローナル抗体は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本開示のタンパク質が連結されたアフィニティーカラムなどにより精製することができる。
【０１０２】
モノクローナル抗体はまた、遺伝子操作法（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．Ａ．Ｋ．及びＬａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．、「ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」、ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤにより英国で刊行（１９９０）を参照されたい）を用いることにより生成させた組換え抗体としても得ることができる。コードＤＮＡを、ハイブリドーマ又は抗体生成用感作リンパ球などの免疫細胞からクローニングし、適切なベクターへと組み込み、このベクターを宿主へと導入して抗体を生成させることにより、組換え抗体を生成させる。本開示は、このような組換え抗体も包摂する。
【０１０３】
１つ又は複数のバイオマーカーによりコードされるタンパク質に特異的な抗体又は抗体断片はまた、ファージディスプレイなど、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法によっても生成させることができる。
【０１０４】
さらに、本開示の抗体は、本発明のバイオマーカーによりコードされるタンパク質に結合する限りにおいて、抗体断片の場合もあり、修飾抗体の場合もある。例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はＨ鎖によるＦｖとＬ鎖によるＦｖとをリンカーにより適切に連結した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３、（１９８８））を抗体断片として施すことができる。とりわけ、抗体断片は、抗体を酵素、例えば、パパイン又はペプシンで処理することにより生成させる。或いは、抗体断片は、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターへと導入し、このベクターを適切な宿主細胞において発現させることによって生成させることもできる（例えば、Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：２９６８〜２９７６、１９９４；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４７６〜４９６、１９８９；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４９７〜５１５、１９８９；Ｌａｍｏｙｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：６５２〜６６３、１９８６；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：６６３〜６６９、１９８６；Ｂｉｒｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９：１３２〜１３７、１９９１を参照されたい）。
【０１０５】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、蛍光物質、放射性物質、及び発光物質など、多様な分子へと結合させることができる。このような部分を抗体に結合する方法は既に確立されており、当技術分野で常套的である（例えば、米国特許第５，０５７，３１３号及び同第５，１５６，８４０号を参照されたい）。
【０１０６】
抗体の抗原結合活性をアッセイする方法の例には、例えば、吸光度の測定、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び／又は免疫蛍光法が含まれる。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合は、本発明のバイオマーカーによりコードされるタンパク質を、本開示の抗体でコーティングしたプレートへと添加し、次いで、抗体試料、例えば、抗体生成細胞の培養物上清、又は精製された抗体を添加する。次いで、一次抗体を認識する二次抗体であって、アルカリホスファターゼ及びこのような酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベート及び洗浄し、ｐ−ニトロフェニルホスフェートなどの酵素基質を添加した後で、吸光度を測定して、抗原結合活性を評価する。タンパク質、タンパク質断片、例えば、Ｃ末端を含む断片、又はＮ末端を含む断片を用いることができる。本発明の抗体の活性を評価するには、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることができる。
【０１０７】
これらの方法を用いることにより、本発明の抗体と、本発明のタンパク質を含有することが推定される試料と接触させ、上述の抗体とタンパク質との間で形成される免疫複合体を検出又はアッセイすることにより、本発明のバイオマーカーによりコードされるタンパク質を検出又はアッセイする。
【０１０８】
例えば、これらに限定されないが、安定的な同位元素で標識した内部基準物質と組み合わせた多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ベースの手法などの質量分析ベースの定量化アッセイ法は、タンパク質を定量的に測定するためのイムノアッセイの代替法である。これらの手法は、抗体の使用を要求せず、このため、解析は、費用効率的及び時間効率的な形で実施することができる（例えば、Ａｄｄｏｎａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２７：６３３〜６４１、２００９；Ｋｕｚｙｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８：１８６０〜１８７７、２００９；Ｐａｕｌｏｖｉｃｈら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．、２：１３８６〜１４０２、２００８を参照されたい）。加えて、ＭＲＭは、優れたマルチプレックス処理能をもたらし、多数のタンパク質の同時並行的な定量化を可能とする。これらの方法の基本理論は、十分に確立されており、低分子の薬物代謝及び薬物動態解析で広く用いられている。
【０１０９】
場合によって、遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現）を検出又は測定する方法は、複数試料の迅速な調製、処理、及び解析を可能とするフォーマットでも実施することができる。これは、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェル又は３８６ウェル）の場合もあり、アレイ（例えば、核酸チップ又はタンパク質チップ）の場合もある。多様な試薬の原液は、手作業で供給することもでき、ロボット操作で供給することもでき、その後の試料調製（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、標識化、又は細胞の固定）、ピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベート処理（例えば、ハイブリダイゼーション）、試料のリードアウト、データの収集（光学データ）、及び／又は解析（コンピュータ支援の画像解析）は、アッセイから発生したシグナルを検出することが可能な市販の解析ソフトウェア、ロボット装置、及び検出測定装置を用いてロボット操作で行うことができる。このような検出器の例には、分光光度計、照度計、蛍光光度計、及び放射性同位元素の崩壊を測定するデバイスが含まれるがこれらに限定されない。例示的なハイスループットの細胞ベースアッセイ（例えば、細胞における標的タンパク質の存在又はレベルを検出するアッセイ）では、アレイスキャン（ＡｒｒａｙＳｃａｎ）（登録商標）ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒ法、又はキネティックスキャン（ＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ）（登録商標）ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒ法（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ、ＰＡ）を用い得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、２つの遺伝子、３つの遺伝子、４つの遺伝子、５つの遺伝子、６つの遺伝子、７つの遺伝子、８つの遺伝子、９つの遺伝子、１０の遺伝子、１１の遺伝子、１２の遺伝子、１３の遺伝子、１４の遺伝子、１５の遺伝子、１６の遺伝子、１７の遺伝子、１８の遺伝子、１９の遺伝子、２０の遺伝子、２１の遺伝子、２２の遺伝子、２３の遺伝子、少なくとも２４の遺伝子、少なくとも２５以上の遺伝子、又は少なくとも２つの遺伝子、少なくとも３つの遺伝子、少なくとも４つの遺伝子、少なくとも５つの遺伝子、少なくとも６つの遺伝子、少なくとも７つの遺伝子、少なくとも８つの遺伝子、少なくとも９つの遺伝子、少なくとも１０の遺伝子、少なくとも１１の遺伝子、少なくとも１２の遺伝子、少なくとも１３の遺伝子、少なくとも１４の遺伝子、少なくとも１５の遺伝子、少なくとも１６の遺伝子、少なくとも１７の遺伝子、少なくとも１８の遺伝子、少なくとも１９の遺伝子、少なくとも２０の遺伝子、少なくとも２１の遺伝子、少なくとも２２の遺伝子、少なくとも２３の遺伝子、少なくとも２４の遺伝子、又は少なくとも２５以上の遺伝子の発現レベルを評価及び／又は測定することができる。
【０１１１】
表３に示される遺伝子のうちの１つ又は複数の存在又は発現レベルを検出する一助とするために、遺伝子の核酸配列の任意の部分を、例えば、ハイブリダイゼーション用のポリヌクレオチドプローブ又はポリヌクレオチドプライマー（例えば、増幅又は逆転写のための）として用いることができる。プローブ及びプライマーは、生物学的試料に由来するＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はこれらの断片に対する特異的なハイブリダイゼーションをもたらすのに十分な長さのオリゴヌクレオチドであり得る。特定の適用に応じて、ハイブリダイゼーション条件の変化を使用して、標的配列に対するプローブ又はプライマーの選択性の程度の変化を達成することができる。プライマー及びプローブは、検出を容易とする試薬（例えば、蛍光標識、化学標識（例えば、米国特許第４，５８２，７８９号及び同第４，５６３，４１７号を参照されたい）、又は塩基の修飾）で検出可能に標識することができる。
【０１１２】
標準的なストリンジェンシーの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）及びＨａｙｍｅｓら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）により記載されている。核酸分子がプライマー又はプローブとして用いられるためには、使用される特定のハイブリダイゼーション条件（例えば、溶媒及び塩濃度）下において安定的な二本鎖構造を形成することを可能とするのに十分な程度に配列が相補的でありさえすればよい。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションを用いて、２つの核酸配列の間の相同性を評価することができる。本明細書で記載される核酸配列又はその断片は、標準的なハイブリダイゼーション法に従うハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。対象とするプローブ（例えば、本明細書で記載されるヌクレオチド配列又はその相補体の部分を含有するプローブ）の、被験供給源に由来するＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はこれらの断片とのハイブリダイゼーションは、プローブに対応するＤＮＡ又はＲＮＡが被験供給源に存在することの現れである。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に知られており、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１〜６．３．６、１９９１において見出すことができる。中程度のハイブリダイゼーション条件は、２倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、３０℃でのハイブリダイゼーション後における、１倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、５０℃での洗浄として規定される。高度に厳密な条件は、６倍濃度のＳＳＣ中、４５℃でのハイブリダイゼーション後における、０．２倍濃度のＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中、６５℃での洗浄として規定される。
【０１１４】
プライマーは、多様なＰＣＲ型の方法において用いることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞内ＲＮＡに由来する配列を含め、ＤＮＡ及びＲＮＡに由来する特異的な配列を増幅することができる。ＰＣＲプライマーは、増幅の対象となる領域を挟むようにデザインされる。プライマーは、増幅されるヌクレオチド配列内の、５’端近傍に位置する場合もあり、３’端近傍に位置する場合もあり、いずれかの場所に位置する場合もある。単位複製配列の長さは、実験目的により決定される。ｑＰＣＲでは、標的の長さが１００ｂｐに近く、標準的なＰＣＲでは、標的の長さが５００ｂｐほどである。一般に、対象とする領域の端部又はそれらを越えた領域に由来する配列情報を使用して、増幅される鋳型の対向鎖と配列が同一であるか又は類似するオリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。ＰＣＲプライマーは、単一の核酸分子として化学合成することもでき（例えば、ホスホロアミダイト法を用いる、３’〜５’方向における自動式ＤＮＡ合成を用いて）、一連のオリゴヌクレオチドとして化学合成することもできる。例えば、所望の配列を含有し、オリゴヌクレオチド対がアニールするときに二重鎖が形成されるように、各対が相補性の短い（例えば、約１５ヌクレオチド）セグメントを含有する長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、１００ヌクレオチド超）の１つ又は複数の対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドを伸長させる結果として、オリゴヌクレオチド対１つ当たり１つずつの二本鎖核酸分子がもたらされる。
【０１１５】
加えて、核酸配列又はこれらの断片（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）は、遺伝子発現を検出及び／又は定量化するための核酸アレイ（以下の「アレイ」の下に記載されている核酸アレイなど）においても用いることができる。
【０１１６】
カットオフ値
上記で言及した通り、本明細書で記載される方法は、１つ又は複数の遺伝子（例えば、表３に示される１つ又は複数の遺伝子）の発現レベル（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベル）を評価するステップを伴うことが可能であり、遺伝子のうちの１つ又は複数の発現レベルにより、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む治療に対する対象の反応が予測される。「評価すること」は、例えば、被験生物学的試料中の１つ又は複数の遺伝子の発現を、特定の（１つ又は複数の）対象とする遺伝子の既知の発現レベル又は対照の発現レベル（例えば、基準の生物学的試料中の発現レベル）と比較することを包含し得る。例えば、被験生物学的試料中の１つ又は複数の遺伝子の発現レベルは、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応したか、又はこれに反応しなかった対象における対応する発現レベルと比較することもでき、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応したか、又はこれに反応しなかった、同じ種の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５、３０、３５、又は４０以上）の対象の平均又は中央値の発現レベルと比較することもできる。評価することはまた、１つ又は複数の遺伝子（例えば、表３に示される１つ又は複数の遺伝子）の発現レベルが、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性を予測するものとしてあらかじめ決定された値の範囲内に収まるかどうかを決定することも包含し得る。一部の実施形態では、評価することが、１つ又は複数の遺伝子（例えば、表３に示される１つ又は複数の遺伝子）の発現が、あらかじめ決定されたカットオフ値を上回るのか、下回るのかを決定することの場合もあり、これを包含する場合もある。カットオフ値は典型的に、遺伝子の発現レベルであって、それを上回るか又は下回れば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性が予測されると考えられる遺伝子の発現レベルであるか、又はこの遺伝子の発現レベルの別の遺伝子の発現レベルとの比である。こうして、本明細書で記載される方法（及び組成物）に従い、遺伝子（例えば、表３に示される遺伝子）の基準発現レベルが、カットオフ値であって、それを上回るか又は下回れば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応性が予測されるカットオフ値として同定されている。一部のカットオフ値は、臨床的相関がカットオフのいずれの側の値の範囲にもわたってやはり有意性を維持し得る点で絶対的なものではないが、特定の試料種類の遺伝子の発現レベルに最適のカットオフ値を選択する（例えば、Ｈスコアを変化させながら）ことは可能である。本明細書で記載される方法において用いるために決定されるカットオフ値は、例えば、公表された発現レベルの範囲と比較し得るが、用いられる方法及び患者集団に対して個別化することもできる。最適のカットオフ値の改良は、用いられる統計学的方法の洗練、並びに異なる遺伝子及び試料種類の基準レベル値を決定するために用いられる試料の数及び供給源に応じて決定し得ることが理解される。したがって、確立されたカットオフ値は、定期的な再評価又は方法若しくは集団分布の変化に基づき、上方に調整することもでき、下方に調整することもできる。
【０１１７】
１つ又は複数の遺伝子の基準発現レベルは、多様な方法により決定することができる。基準レベルは、例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に反応性であるか、又はレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に対して反応しない対象（例えば、患者）の集団における対象とする遺伝子の発現レベルを比較することにより決定することができる。これは、例えば、患者コホートの全体がグラフ表示されるヒストグラム解析であって、第１の軸が遺伝子の発現レベルを表し、第２の軸がコホートにおける対象の数であり、その試料が所与の量において１つ又は複数の発現レベルを含有するコホートにおける対象の数を表すヒストグラム解析により達成することができる。次いで、これらの個別の群を最もよく識別する量に基づき、遺伝子の基準発現レベルを決定することができる。基準レベルは、あらゆる対象に同等に適用可能な単一の数の場合もあり、対象の特定の亜集団に応じて変化する場合もある。例えば、老齢の対象は、同じ代謝性障害について、若齢の対象とは異なる基準レベルを有し得る。加えて、疾患が進行した（例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療可能な疾患のより進行した形態を伴う）対象も、疾患の軽度の形態を伴う対象とは異なる基準値を有し得る。
【０１１８】
反応プロファイルの作成
本明細書で記載される方法はまた、レンバチニブ（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による療法に対する対象の反応プロファイルを作成するためにも用いることができる。プロファイルは、表１及び２に列挙される突然変異など、突然変異のうちの１つ又は複数が、対象に由来する試料中に存在するかどうかを示す情報；並びに／或いは１つ若しくは複数の遺伝子（例えば、表３に示される１つ又は複数の遺伝子）の発現レベル；及び／又は対象の試料（例えば、血漿、血清）中の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩による治療後／治療前におけるサイログロブリンの発現比；及び／又は任意の腫瘍についての組織学的解析（例えば、甲状腺癌がＦＴＣであるのか、ＰＴＣであるのか）を示す情報を包含し得る。レンバチニブ療法に対する反応プロファイルは、１つ若しくは複数のさらなる遺伝子及び／又は他のプロテオミクスによるマーカー、血清マーカー、若しくは臨床マーカーの発現レベルも包含し得る。本明細書で記載される反応プロファイルは、表３に列挙される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、又は少なくとも２５の遺伝子の発現又は発現レベルについての情報を含有し得る。本明細書で記載される反応プロファイルはまた、以下の遺伝子：ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＶＨＬ、ＢＲＡＦ、ＥＲＢＢ２、ＰＴＥＮ、及びＭＥＴのうちの任意の１つ又は複数における突然変異（存在する場合）の存在、及びこれらにおける（１つ又は複数の）突然変異の性質についての情報も含有する。結果として得られる情報（レンバチニブ療法に対する反応プロファイル）は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む治療に対する対象（例えば、ヒト患者）の反応を予測するのに用いることができる。加えて、例えば、障害の生理学的症状又は行動学的症状が明らかであろうとなかろうと、遺伝子（例えば、表３に示される遺伝子のうちの１つ又は複数）のうちの１つ若しくは複数の発現レベル、突然変異、サイログロブリンレベル、及び／又は検討された組織学的データは、このような反応又は障害を示し得るので、反応プロファイルは、多様な療法及び／又は多様な疾患状態に対する対象の反応を予測するのにも用いることができる。
【０１１９】
レンバチニブ（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に対する反応プロファイルは、電子形式（例えば、コンピュータ又は他の電子（ＤＶＤ、ＣＤ、又はフロッピーディスクなど、コンピュータ読み取り可能な）媒体上に保存した患者の電子記録）の場合もあり、書面形式の場合もあることが理解される。レンバチニブ（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に対する反応プロファイルはまた、複数例の（例えば、２例、３例、４例、５例、１０例、２０例、３０例、５０例、又は１００例以上の）対象（例えば、ヒト患者）の情報も包含し得る。このような多重対象反応プロファイルは、例えば、対象コホートの特定の特徴についての解析（例えば、統計学的解析）において用いることができる。
【０１２０】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応性は、複数のやり方で分類することができ、分類は、対象の疾患（例えば、甲状腺癌、腎臓癌、又はレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法により治療可能な他の任意の疾患）、疾患の重症度、及び対象が投与される特定の薬物に依存する。最も単純な意味において、反応性とは、疾患状態の、治療前と比較した任意の軽減であり、非反応性とは、疾患状態の、治療前と比較した変化の欠如である。癌を伴う対象（例えば、ヒト）の反応性は、これらに限定されないが、腫瘍サイズ、臨床利益（ＣＢ）、全生存（ＯＳ）、無増悪生存（ＰＦＳ）、疾患コントロール率（ＤＣＲ）、反応までの時間（ＴＴＲ）、腫瘍退縮（ＴＳ）、又は腫瘍反応（ＴＲ）などの目的となる多数の臨床指標のうちの１つ又は複数に基づき分類することができる。
【０１２１】
「臨床利益」とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）；又は６カ月以上の無増悪生存（ＰＦＳ）を伴う疾患の安定（ＳＤ）のうちの１つを示すことを指す。「完全寛解」とは、全ての標的病変の完全消失を意味する。「部分寛解」とは、ベースライン最長径（ＬＤ）和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも３０％の減少を意味する。「疾患の進行」（ＰＤ）とは、治療を開始してから記録された最小のＬＤ和、又は１つ若しくは複数の新たな病変が出現してから記録された最小のＬＤ和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも２０％の増大を意味する。「疾患の安定」とは、治療を開始してからの最小のＬＤ和を基準として、ＰＲと見なされる標的病変の十分な退縮でもなく、疾患の進行（ＰＤ）と見なされる十分な増大でもないことを意味する。
【０１２２】
「全生存」（ＯＳ）とは、無作為化から任意の原因による死亡までの期間として定義される。「無作為化」とは、患者の療法計画を決定するときに患者を被験群又は対照群へと無作為化することを意味する。
「無増悪生存」（ＰＦＳ）とは、治療の開始日からＰＤ状態に入る前の最終日までの期間を指す。
「疾患コントロール率」（ＤＣＲ）とは、７週間にわたるＣＲ又はＰＲ又はＳＤとして定義される。
「反応までの時間」（ＴＴＲ）とは、治療の開始日から奏効（ＣＲ又はＰＲ）の基準が最初に満たされる日までの期間として定義される。
「腫瘍退縮」（ＴＳ）とは、ベースライン直径和を基準として、標的病変の直径和の百分率変化を意味する。
「腫瘍反応」（ＴＲ）は、「部分寛解」（ＰＲ）を示す対象を、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）を示す対象と比較する。
【０１２３】
治療法
本明細書で開示される方法は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に対する反応性についての対象の評価を可能とする。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応する可能性が高い対象には、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を投与することができる。
【０１２４】
本開示の方法はまた、対象の、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療から利益を得る可能性が高い対象群、及びレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療から利益を得る可能性がそれほど高くない対象群への分類も可能とする。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療について考慮されている対象のプールからこのような対象を選択する能力は、有効な治療に有益である。
【０１２５】
本開示の方法はまた、短い期間にわたりこの療法を投与し、治療後における、又は治療前と対比した治療後における、上記のバイオマーカーのうちの１つ又は複数の発現プロファイルに基づき、この療法が患者に利益をもたらす可能性は高いのか、その可能性はあまり高くないのかを決定した後で、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療を継続するのかどうかを決定するためにも用いることができる。
【０１２６】
レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）は、血管新生を阻害することにより、多様な腫瘍の異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示す。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による治療について考慮される対象には、甲状腺癌又は腎臓癌（例えば、腎細胞癌）を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い対象が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２７】
一実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、甲状腺癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。甲状腺癌とは、甲状腺内に位置する癌性の腫瘍又は増殖である。甲状腺癌は、最も一般的な内分泌癌であり、近年において発症率を増大させている少数の癌のうちの１つである。甲状腺癌は、小児から老齢者まで全ての年齢群において生じる。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙは、２０１０年に米国で約４４，６７０例の甲状腺癌の新たな症例が認められたと推定している。これらの新たな症例のうち、約３３，９３０例が女性であり、約１０，７４０は男性であった。２０１０年には、約１，６９０名（女性９６０名及び男性７３０名）が甲状腺癌で死亡した。多くの患者、とりわけ、甲状腺癌の早期段階にある患者は、症状を感じない。しかし、癌が進行するにつれ、症状には、頸部前面におけるしこり又は結節、嗄声又は発話困難、リンパ節の腫脹、嚥下又は呼吸の困難、及び咽喉又は頸部における疼痛が含まれ得る。甲状腺癌には複数の種類：乳頭癌、濾胞癌、髄様癌、未分化癌、及び変異型がある。乳頭癌は、全ての甲状腺癌のうちの約８５％を占める最も一般的な種類であり、通常出産年齢の女性が罹患する。乳頭癌は、ゆっくりと拡大し、危険性が最も小さい種類の甲状腺癌である。濾胞癌は、全症例のうちの約１０％を占め、再発及び拡大する可能性が高い。髄様癌は、通常甲状腺内に存在する甲状腺以外の細胞による癌である。この甲状腺癌の形態は、家族において生じる傾向がある。髄様癌は、他の種類の甲状腺癌とは異なる治療を要求する。未分化癌（また、巨細胞紡錘形細胞癌とも称する）は、甲状腺癌の最も危険な形態である。未分化癌は、まれであり、放射性ヨウ素療法に反応しない。未分化癌は、急速に拡大し、気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ（ｔｒａｃｈｅａ））など、近傍の構造に浸潤し、呼吸困難を引き起こす。変異型には、高細胞型、島状型、円柱細胞型、及びヒュルトレ細胞型が含まれる。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を用いて、上記の甲状腺癌のうちのいずれかを有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い対象を治療することができる。特定の実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、分化型甲状腺癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。他の実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、甲状腺髄様癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。一実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、甲状腺乳頭癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。別の実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、甲状腺濾胞癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。別の実施形態��は、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、甲状腺ヒュルトレ細胞癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。
【０１２８】
一実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、腎臓癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。腎臓癌は、通常腎臓に由来する癌として定義される。腎臓内のそれらの場所を反映する、２つの最も一般的な種類の腎臓癌は、腎細胞癌（ＲＣＣ、また、副腎腫としても知られている）及び腎盂の尿路上皮細胞癌（ＵＣＣ）である。他の、それほど一般的でない種類の腎臓癌には、扁平上皮細胞癌、傍糸球体細胞腫瘍（腎腫）、血管筋脂肪腫、腎好酸性顆粒細胞腫、ベリーニ管癌、腎明細胞肉腫、中胚葉性腎腫、ウィルムス腫瘍、及び上皮間質混合型腫瘍が含まれる。ＲＣＣとは、血液を濾過し、老廃物を除去する腎臓における極細管である、近位尿細管の内壁に由来する腎臓癌である。ＲＣＣとは、成人で最も一般的な種類の腎臓癌であり、症例の約８０％を占めている。ＲＣＣはまた、全ての泌尿生殖器腫瘍のうちで最も致死的であることも知られている。初期治療は、根治的腎摘出術又は腎部分切除術であることが最も一般的であり、なおも根治治療の主柱である。腫瘍が腎実質に限定される場合、５年間の生存率は６０〜７０％であるが、転移が拡大した場合、これは大幅に低下する。ＲＣＣは、放射線療法及び化学療法に対して抵抗性であるが、一部の症例は、免疫療法に反応する。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を用いて、上記の腎臓癌のうちのいずれかを有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い対象を治療することができる。特定の実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療される対象は、腎細胞癌を有するか、有することが疑われるか、又は発症する可能性が高い。
【０１２９】
対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応する可能性が高ければ（突然変異性バイオマーカーの存在及び／又は上記のバイオマーカーの発現レベル／比に基づき）、有効量のレンバチニブ化合物（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を対象に投与することができる。化合物の有効量は、例えば、患者の特徴（年齢、性別、体重、人種など）、疾患の進行、及び既往の薬物への曝露を考慮に入れる医療ケア従事者により適切に決定され得る。対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩を含む療法に反応する可能性がそれほど高くなければ、場合によって、レンバチニブを含まない療法を対象に投与するもできる。これらの療法には、放射性ヨウ素、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ソラフェニブ、ドセタキセル、トラスツマブ、インターロイキン２、インターフェロン、エベロリムス、スニチニブ、パゾパニブ、バンデタニブ、及び「標準ケア」治療（すなわち、医療ケア従事者により決定されるか、又は、治験薬及び治験化学療法など、臨床研究で指定される、現行の標準ケア）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３０】
全ての年齢の対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療可能な障害に罹患し得る。したがって、本明細書で記載される方法において用いられる生物学的試料は、小児、若年者、又はレンバチニブ若しくはその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療可能な疾患（例えば、甲状腺乳頭癌、腎細胞癌）を有するか、若しくは有することが疑われる成人などの成人を含めた任意の年齢の対象（例えば、ヒト）から得ることができる。
【０１３１】
方法はまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）により治療可能な癌を発症する危険性がある個体に適用することもできる。このような個体には、（ｉ）このような障害の家族歴（遺伝的素因）、又は（ｉｉ）このような障害を発症する１つ若しくは複数の危険因子を有する個体が含まれる。
【０１３２】
対象が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）に反応する可能性が高いのか、その可能性がそれほど高くないのかに基づき対象を分類又は選択した後、医療従事者（例えば、医師）は、適切な治療法を対象に投与することができる。当技術分野では、レンバチニブ療法を投与する方法がよく知られている。
【０１３３】
本明細書で記載される任意の療法（例えば、レンバチニブを含む療法又はレンバチニブを含まない療法）は、１つ又は複数のさらなる治療剤を包含し得ることが理解される。すなわち、本明細書で記載される任意の療法は、これらに限定されないが、ドキソルビシン、カルボプラチン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、トラスツマブ、インターロイキン２、インターフェロン、及びエベロリムスなどの１つ又は複数のさらなる治療剤と共投与する（組み合わせて投与する）ことができる。さらに、本明細書で記載される任意の療法は、例えば、疼痛、悪心、及び／又はレンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法の１つ若しくは複数の副作用を治療するための１つ又は複数の薬剤も包含し得る。
【０１３４】
組合せ療法（例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法と１つ又は複数のさらなる治療剤との共投与）は、例えば、同時的な場合もあり、逐次的な場合もある。例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）と１つ又は複数のさらなる治療剤とを同時に投与することもでき、レンバチニブ化合物（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を第１の期間に投与し、１つ又は複数のさらなる治療剤を第２の期間に投与することもできる。一部の実施形態では、１つ又は複数のさらなる治療剤を第１の期間に投与し、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を第２の期間に投与することもできる。
【０１３５】
レンバチニブ（例えば、レンバチニブメシル酸塩）による療法に反応することが予測される対象が、１つ又は複数のレンバチニブ以外の療法を既に投与されている場合、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法は、既に投与された療法又は現在投与されている療法を置換することもでき、これを増強することもできる。例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法で治療したら、１つのレンバチニブ以外の療法の投与を中止又は減量する、例えば、低レベルで投与することができる。レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法を投与しながら、かつての療法の投与を維持することもできる。一部の実施形態では、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法のレベルが治療効果をもたらすのに十分なレベルに達するまで、かつての療法を維持することができる。
【０１３６】
アレイ
本明細書で開示される核酸バイオマーカーを包含する核酸アレイは、例えば、遺伝子発現の検出及び／又は遺伝子発現レベルの測定に有用である。アレイはまた、例えば、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する対象の反応を予測するにも有用であり、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法から利益を得る対象を同定するにも有用であり、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法から利益を得る可能性が高くない対象を、他の癌療法へと誘導するにも有用である。
【０１３７】
アレイとは、秩序だった試料の配列であって、既知のＤＮＡ試料と未知のＤＮＡ試料とのマッチングが塩基の対合規則（例えば、アデノシンはチミン又はウラシルと対合し、グアノシンはシトシンと対合する）に基づいてなされる配列である。典型的なマイクロアレイ実験は、ｍＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はその断片の、それが由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ又はｄｅｒｉｖｅｄ）ＤＮＡ鋳型とのハイブリダイゼーションを伴う。アレイを構築するには、多くのＤＮＡ試料が用いられる。アレイ実験では、マイクロプレート又は標準的なブロット膜など、一般的なアッセイ系を用いる。試料スポットのサイズは、典型的に直径２００ミクロン未満であり、アレイは通常、数千個のスポットを含有する。スポットされたプローブとして既知の数千個の試料（内容が既知である）を、基質（例えば、顕微鏡用のスライドガラス、シリコンチップ、ナイロン膜）へと固定化する。スポットは、ＤＮＡの場合もあり、ｃＤＮＡの場合もあり、オリゴヌクレオチドの場合もある。これらを用いて、未知の配列の相補的な結合を決定し、したがって、遺伝子発現及び遺伝子発見のための並行解析を可能とする。単一のＤＮＡチップによる実験で、数千の遺伝子についての情報を同時にもたらし得る。アレイ上の各スポットの位置を、遺伝子を同定するために用いるので、支持体上のプローブの秩序だった配列は重要である。アレイ上の各位置に結合したｍＲＮＡの量は、アレイ上に包含される多様な遺伝子の発現レベルを示す。多くのＤＮＡ試料を含有するアレイを用いて、アレイ上の各位置に結合したｍＲＮＡの量を測定することにより、単一の実験において、数百又は数千の遺伝子の発現レベルを決定することができる。コンピュータの支援により、マイクロアレイ上のスポットに結合したｍＲＮＡの量を正確に測定することができ、細胞における遺伝子発現のプロファイルを作成することができる。
【０１３８】
一般に用いられる２つの主要なＤＮＡマイクロアレイプラットフォームは、ｃＤＮＡマイクロアレイ及びオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。ｃＤＮＡマイクロアレイが、ＰＣＲ（Ｓｃｈｅｎａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４６７−４７０（１９９５））などの酵素反応を介して生成する長鎖の二本鎖ＤＮＡ分子により作製されるのに対し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイは、ロボット操作による沈着又はｉｎ  ｓｉｔｕにおける基質上の合成を介してスポットされたオリゴヌクレオチドプローブを使用する（Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４、１６７５−１６８０（１９９６））。
【０１３９】
キット
本出願はまた、キットも提供する。一部の実施形態では、キットは、表３のバイオマーカーのうちのいずれかを同定又は検出するのに用い得るプローブを包含する。一部の実施形態では、キットは、表１及び／又は表２に列挙される突然変異のうちのいずれかを含有する領域を増幅するために用い得るプライマーを包含する。一部の実施形態では、キットは、本明細書で記載される核酸アレイのうちのいずれかを包含する。特定の実施形態では、キットは、サイログロブリンを検出するか、或いは表３のバイオマーカーのうちのいずれか又はそれらの発現若しくは発現レベルを検出するのに用い得る抗体を包含する。一部の実施形態では、キットは、表３のバイオマーカーのうちのいずれか又はそれらの発現若しくは発現レベルを同定又は検出するのに用い得るプローブ及び抗体を包含する。場合によって、キットは、生物学的試料中の１つ又は複数の遺伝子のレベルを検出及び／又は測定するための指示書も含有し得る。
【０１４０】
場合によって、キットは、例えば、対照の生物学的試料、又は対照の標識した単位複製配列セットであって、アレイの核酸プローブにより認識される、既知量の１つ若しくは複数の単位複製配列を含有する、対照の単位複製配列セットも包含し得る。場合によっては、対照が、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法に対する反応を予測する１つ又は複数の遺伝子の発現レベルの範囲を含有する添付文書（例えば、紙の添付文書又はＣＤ、ＤＶＤ、若しくはフロッピーディスクなどの電子媒体）でもあり得る。
【０１４１】
一部の実施形態では、キットは、生物学的試料を処理するための１つ又は複数の試薬を包含し得る。例えば、キットは、タンパク質を生物学的試料から単離するための試薬、並びに／又は生物学的試料中のタンパク質の存在及び／若しくは量を検出するための試薬（例えば、検出アッセイの対象であるタンパク質に結合する抗体、及び／又はタンパク質に結合する抗体に結合する抗体）を包含し得る。
【０１４２】
一部の実施形態では、キットは、結果、例えば、マイクロアレイ解析の結果又は発現プロファイルの結果を解析するためのソフトウェアパッケージを包含し得る。
【０１４３】
キットはまた、本明細書で記載される遺伝子のうちのいずれかの、タンパク質への発現を検出するための１つ又は複数の抗体も包含する。例えば、キットは、表３に示される遺伝子のうちのいずれかによりコードされる１つ又は複数のタンパク質に特異的に結合することが可能な複数の抗体、並びに、場合によって、１つ若しくは複数のタンパク質を検出するための指示書、及び／又は複数の抗体のうちの少なくとも１つに結合することが可能な、検出可能に標識された抗体を含む検出抗体も包含し得る（又は場合によってはこれらからなり得る）。一部の実施形態では、キットは、表３に示される遺伝子によりコードされる１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のタンパク質を認識する抗体を包含し得る。
【０１４４】
場合によって、本明細書で記載されるキットはまた、レンバチニブ又はその薬学的に許容される塩（例えば、レンバチニブメシル酸塩）を含む療法であって、アレイを介して検出可能な１つ又は複数の遺伝子の発現レベルにより、対象がそれに反応することが予測される療法を投与するための指示書も包含する。
【０１４５】
以下は、本発明の実施例である。これらは、いかなる形であれ、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１４６】
実施例１：Ｅ７０８０を含む療法に対する反応性についての予測バイオマーカーとしての突然変異状態
目的：Ｅ７０８０（レンバチニブ）による第ＩＩ相研究で治療された分化型甲状腺癌患者において、腫瘍反応及び疾患安定化の長期化が観察された。この実験は、３つの反応基準：最良総合効果、腫瘍退縮、及び無増悪生存を用いて、対象がＥ７０８０による治療に対して反応するかどうかを予測するのに有用なアミノ酸の突然変異を同定することを指向した。
【０１４７】
材料及び方法：組織試料は、患者がＥ７０８０を含む任意の療法を施される前の手術時に得、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織のためのプロトコールにより日常通りに処理した。用いるプロトコールには、治験審査委員会の承認を得、各対象からは説明同意文書を得た。組織が入手可能な２７例の患者に由来する腫瘍組織試料を、突然変異解析に用いた。ＤＮＡは、試験に参加する患者から収集したＦＦＰＥ腫瘍ブロックから単離した。ゲノムＤＮＡは、脱パラフィン化及びわずかな改変を伴うＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを介して、１０ミクロンの染色していない切片２〜５例から抽出した。突然変異を検出するには、シーケノム（ＳＥＱＵＥＮＯＭ）（登録商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）プラットフォーム、並びにオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０、及びオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０を用いた（ｗｗｗ．Ｓｅｑｕｅｎｏｍ．ｃｏｍ／Ｆｉｌｅｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃ−Ａｎａｌｙｓｉｓ−−−Ｇｒａｐｈｉｃｓ／Ａｌｌ−Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−−−ＰＤＦｓ／ＡｓｓａｙＥｘｐｌｏｒｅｒ２０１０＿１１１０−Ｗｅｂ／を参照されたい）。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ製のオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌｓとは、突然変異の効率的なスクリーニングのためにあらかじめデザインされてあらかじめ検証されたアッセイのセットである。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０の遺伝子及び突然変異の数（カッコ内）は、ＡＢＬ１（１４）；ＡＫＴ１（７）；ＡＫＴ２（２）；ＢＲＡＦ（２５）；ＣＤＫ４（２）；ＥＧＦＲ（４０）；ＥＲＢＢ２（９）；ＦＧＦＲ１（２）；ＦＧＲＦ３（７）；ＦＬＴ３（３）；ＨＲＡＳ（１０）；ＪＡＫ２（１）；ＫＩＴ（３２）；ＫＲＡＳ（１６）；ＭＥＴ（５）；ＮＲＡＳ（１９）；ＰＤＧＦＲＡ（１１）；ＰＩＫ３ＣＡ（１４）；及びＲＥＴ（６）である。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０の遺伝子及び突然変異の数（カッコ内）は、ＡＢＬ１（２）ＡＫＴ１（１）；ＡＰＣ（１２）；ＢＲＡＦ（１９）；ＣＤＫＮ２Ａ（７）；ＣＳＦ１Ｒ（６）；ＣＴＴＮＢ１（２８）；ＥＧＦＲ（３２）；ＥＲＢＢ２（２）；ＦＬＴ３（３）；ＨＲＡＳ（２）；ＪＡＫ３（３）；ＫＩＴ（３）；ＫＲＡＳ（５）；ＭＥＴ（６）；ＭＬＨ１（１）；ＭＹＣ（６）；ＰＤＧＦＲＡ（１１）；ＰＩＫ３ＣＡ（４）；ＰＴＥＮ（１４）；ＲＢ１（１１）；ＲＥＴ（１３）；ＳＲＣ（１）；ＳＴＫ１１（１２）；Ｐ５３（７）；及びＶＨ１（７）である。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０の遺伝子及び突然変異の数（カッコ内）は、ＡＢＬ１（２）ＡＫＴ１（１）；ＡＰＣ（１２）；ＢＲＡＦ（１９）；ＣＤＫＮ２Ａ（７）；ＣＳＦ１Ｒ（６）；ＣＴＴＮＢ１（２８）；ＥＧＦＲ（３２）；ＥＲＢＢ２（２）；ＦＬＴ３（３）；ＨＲＡＳ（２）；ＪＡＫ３（３）；ＫＩＴ（３）；ＫＲＡＳ（５）；ＭＥＴ（６）；ＭＬＨ１（１）；ＭＹＣ（６）；ＰＤＧＦＲＡ（１１）；ＰＩＫ３ＣＡ（４）；ＰＴＥＮ（１４）；ＲＢ１（１１）；ＲＥＴ（１３）；ＳＲＣ（１）；ＳＴＫ１１（１２）；Ｐ５３（７）；及びＶＨ１（７）である。
【０１４８】
オンコカルタ（商標）ＰＣＲプライマープールを用いてＤＮＡを増幅し、組み込まれなかったヌクレオチドは、エビ  アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）により不活化し、突然変異のすぐの隣接部でハイブリダイズする伸長プライマー、及び特製のヌクレオチドの組合せを用いて、単一塩基による伸長反応を実施した。カチオン交換樹脂を添加することにより塩を除去した。マルチプレックス反応をＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐＩＩへとスポットし、突然変異が存在する場合は、これを、Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（シーケノム（登録商標）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分解した。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０（シーケノム（登録商標）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、２４のプライマー対のプール及び２４の伸長プライマーのプールからなり、１９遺伝子における２２５の突然変異を検出する能力を有する。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０は、２４のプライマー対のプール及び２４の伸長プライマーのプールからなり、２６遺伝子における２１８の突然変異を検出する能力を有する。各プールは、ＰＣＲ反応における５〜９ずつのプライマー対からなる。オンコカルタパネルでは、単一型及び複合型と称する２つの種類のアッセイがデザインされている。単一型アッセイとは、単一のアッセイによりそのコドンにおけるアミノ酸の変化を検出することが可能なアッセイである。複合型アッセイとは、コドンの変化又は欠失及び挿入を同定するために複数のアッセイを要求するアッセイであり、したがって、複数の異なるアミノ酸の置換又は欠失を検出することが可能である。複合型アッセイの例には、コドン１２内の２つの異なるヌクレオチド位置を探査し、コドン１２における全てのアミノ酸変化を併せて同定する、ＫＲＡＳ＿１アッセイ及びＫＲＡＳ＿２アッセイの使用が含まれる。ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ突然変異では、ＧＧＴ（グリシン）コドンを有する野生型の対立遺伝子に対して、突然変異体の対立遺伝子が、コドンＣＧＴ（アルギニン）を有する。このため、コドン１２の１番目のヌクレオチドは、「Ｃ」であることが必要であり、２番目のヌクレオチドは、「Ｇ」であることが必要である。ＫＲＡＳ＿２アッセイは、どのヌクレオチドがコドン１２の１番目のヌクレオチドへと組み込まれるのかを明らかにし、ＫＲＡＳ＿１アッセイは、２番目のヌクレオチドについてのアッセイである。併せて、これらの２つのアッセイに由来するデータはＧ１２Ｒ置換を検出する。ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異（ＧＴＧからＧＡＧへの突然変異）では、ＢＲＡＦ＿１６アッセイ（コドン６００の１番目のヌクレオチドについてのアッセイ）により「Ｇ」を同定し、ＢＲＡＦ＿１５（２番目のヌクレオチドについてのアッセイ）により「Ａ」を同定する。ＶＨＬ  Ｐ８１Ｓ突然変異では、突然変異体の対立遺伝子が、ＴＣＧ（セリン）を有するのに対し、野生型の対立遺伝子は、ＣＣＧ（プロリン）を有する。ＶＨＬ＿４９８は、どのヌクレオチドがコドン８１の１番目のヌクレオチドへと組み込まれるのかを明らかにする。ＫＲＡＳ  Ｑ６１Ｒ突然変異では、ＫＲＡＳ＿７アッセイでコドンの２番目の位置におけるヌクレオチド変化を検討すること��より、突然変異体の対立遺伝子（ＣＧＡ、アルギニン）を、野生型の対立遺伝子（ＣＡＡ、グルタミン）から識別する。ＮＲＡＳコドン６１の場合、３つの突然変異であるＱ６１Ｌ（ＣＡＡからＣＴＡへ）、Ｑ６１Ｒ（ＣＡＡからＣＧＡへ）、及びＱ６１Ｐ（ＣＡＡからＣＣＡへ）が知られている。ＮＲＡＳ＿６アッセイでは、コドンの２番目の位置におけるヌクレオチド変化が検出される。オンコカルタ（商標）には、ＥＧＦＲ遺伝子内の挿入及び欠失を探査する、なお複合度の高いアッセイもまた包含される。
【０１４９】
データ解析は、データパターン及び生スペクトルの視覚化を容易とする、ＭａｓｓＡｒｒａｙ  Ｔｙｐｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（シーケノム（登録商標））を用いて実施した。Ｏｎｃｏによる突然変異報告に由来する全ての突然変異を手作業で点検して、塩ピーク又は他のバックグラウンドピークから「真の」突然変異体ピークを同定した。
患者がＥ７０８０を服用する期間は、評価及び追跡を容易とするために、異なるサイクルへと人為的に分割した。患者には、２８日のサイクルにおいて毎日１回、経口、２４ｍｇの用量でＥ７０８０を施した。解析を目的として、９カ月後及び１４カ月後の最小限の追跡時に、臨床転帰の評価を実施した。Ｅ７０８０の甲状腺癌試験では、各サイクルが２８日間（４週間）で、このため、１〜２８日目がサイクル１であり；２９日目がサイクル２の１日目であり；５７日目がサイクル３の１日目である。サイクル１の１日目及び８日目、サイクル２の１日目、及びサイクル３の１日目における薬物動態（ＰＫ）解析のために血液試料を収集した。患者１人当たり合計９例ずつの試料を、以下の通りに収集した：サイクル１の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前、並びにＥ７０８０の初回投与の０．５時間後及び２時間後（投与後）；サイクル１の８日目：Ｅ７０８０を投与する直前；サイクル２の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前、並びにＥ７０８０の初回投与の０．５時間後及び２時間後（投与後）；サイクル３の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前及び投与の２時間後。無増悪生存を解析するために、ＰＫパラメータをコックス比例ハザードモデルにおける共変量として用いる。
【０１５０】
反応の３つの基準：最良総合効果、腫瘍退縮、及び無増悪生存について、以下に定義する。
「最良総合効果」（ＢＯＲ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）のうちの１つを示すことを指す。
「臨床利益」（ＣＢ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）；又は６カ月間以上の無増悪生存（ＰＦＳ）を伴う疾患の安定（ＳＤ）のうちの１つを示すことを指す。
「完全寛解」とは、全ての標的病変の完全消失を意味する。
「部分寛解」とは、ベースライン最長径（ＬＤ）和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも３０％の減少を意味する。
「疾患の進行」（ＰＤ）とは、治療を開始してから記録された最小のＬＤ和、又は１つ若しくは複数の新たな病変が出現してから記録された最小のＬＤ和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも２０％の増大を意味する。
「疾患の安定」とは、治療を開始してからの最小のＬＤ和を基準として、ＰＲと見なされる標的病変の十分な退縮でもなく、疾患の進行（ＰＤ）と見なされる十分な増大でもないことを意味する。
「無増悪生存」（ＰＦＳ）とは、治療の開始日からＰＤ状態に入る前の最終日までの期間を指す。
「腫瘍退縮」（ＴＳ）とは、ベースライン直径和を基準として、標的病変の直径和の百分率変化を意味する。
【０１５１】
結果：オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０突然変異パネル及びオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０突然変異パネルを用いて、３３の遺伝子中の、のべ４４３の突然変異について調べ、本発明者らが検討した対象２３例中１６例において突然変異を見出した。オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０を用いて患者２７例に由来する２３の患者試料を解析し、オンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０も用いてこれらを解析した。１０の遺伝子中に１２の突然変異を同定したが、これらを表４に列挙する。７例の患者は、全ての被験遺伝子について野生型であった。
【０１５２】
【表４】
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【０１５３】
ＢＲＡＦのジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（登録商標）受託番号はＮＭ＿００４３３３．３であり；ＮＲＡＳのジェンバンク（登録商標）受託番号はＮＭ＿００２５２４．２であり；ＫＲＡＳのジェンバンク（登録商標）受託番号はＮＭ＿０３３３６０．２（変異体Ａ）及びＮＭ＿００４９８５．３（変異体Ｂ）であり；ＶＨＬのジェンバンク（登録商標）受託番号はＮＭ＿０００５５１．２（変異体１）及びＮＭ＿１９８１５６．１（変異体２）である。
【０１５４】
表５に示す通り、その腫瘍が、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＶＨＬ−１遺伝子のうちのいずれかにおいて突然変異を有する患者では、最良総合効果が有意に良好であった（フィッシャーの正確検定）。例えば、ＮＲＡＳの突然変異又はＫＲＡＳの突然変異を伴う患者８例中８例が部分寛解（ＰＲ）を示したのに対し、ＮＲＡＳ及びＫＲＡＳにおける突然変異を伴わない患者でＰＲを示したのは、１４例中５例だけであった。
【０１５５】
【表５】
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【０１５６】
ＮＲＡＳ；ＮＲＡＳ若しくはＫＲＡＳ；又はＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、若しくはＮＲＡＳにおいて突然変異を伴う患者は、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＢＲＡＦについて野生型の患者と比較して、腫瘍退縮の百分率変化として示される腫瘍サイズの縮減が大きかった（表６を参照されたい）。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
まず、ログランク検定を実施し、次いで、共変量を伴うか又は伴わないコックス比例ハザードモデルを用いて、治療された患者の遺伝子突然変異の無増悪生存との関連を解析した。用いられた共変量は、以下のＰＫパラメータ：サイクル１の１日目のＣｍａｘ（サイクル１の１日目の投与２時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ１）；サイクル１の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（サイクル１の８日目の投与前におけるＥ７０８０濃度：ＭＩＮ１）；サイクル２の１日目のＣｍａｘ（サイクル２の１日目の投与２時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ２）；サイクル２の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（サイクル２の１日目の投与前におけるＥ７０８０濃度：ＭＩＮ２）である。ログランク検定は、ＮＲＡＳにおける突然変異単独、又はＮＲＡＳ若しくはＫＲＡＳにおける突然変異を伴う患者が、ＮＲＡＳ又はＫＲＡＳについて野生型の患者より良好な無増悪生存を示すことを裏付けた（図１）。また、コックス比例ハザードモデルは、サイクル１の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（ＭＩＮ１）を共変量とするコックス比例ハザード検定に基づき、野生型を１とし、突然変異を０とし、０未満の係数では突然変異のときのハザードを小さくすることから、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＶＨＬにおける突然変異、及びＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＢＲＡＦにおける突然変異を伴う患者が、突然変異を有さない患者より良好な無増悪生存を示すことも裏付けた（表７を参照されたい）。
【０１５９】
【表７】
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【０１６０】
結論：甲状腺腫瘍におけるＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、及びＶＨＬのうちのいずれか１つ又はこれらの組合せなど、少数の遺伝子セットにおける突然変異は、甲状腺癌を提示するか、有することが疑われるか、又は発症する危険性がある患者の、Ｅ７０８０を含む療法に対する臨床反応を予測するのに有用である。
【０１６１】
実施例２：甲状腺腫瘍におけるＥ７０８０を含む療法のバイオマーカーとしてのサイログロブリン
目的：この実験は、臨床反応の３つの基準：腫瘍反応、腫瘍退縮、及び無増悪生存を用いて、サイログロブリンレベルの変化により、患者がＥ７０８０による治療に反応するかどうかが予測されるかどうかを決定することを指向した。
【０１６２】
材料及び方法：全てのサイクルの１日目の７２時間前以内に、サイログロブリンアッセイのための血清を収集した。２４ｍｇのＥ７０８０を、２８日間のサイクルにおいて毎日継続的に経口投与した。患者５８例に由来する血清試料をサイログロブリンの測定に用いた。６ｍＬの血液を、レッドトップの試験管へと引き入れ、室温で少なくとも３０分間にわたり凝固させた。試料収集後６０分間以内に、２０〜２５℃、１０００×ｇで１５分間にわたり試験管を遠心分離した。ペレットを攪乱せずに上清を吸い上げ、血清フィルターを伴う試料用試験管へと入れ、収集日に試験にかけるために、凍結させて中央研究室へと送付した。サイログロブリンレベルは、標準的な操作手順に従う固相の化学発光免疫測定アッセイ（ＩＭＭＵＬＩＴＥ  ２０００  Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）により検出した。略述すると、抗サイログロブリン抗体でコーティングしたビーズにより血清サイログロブリンを捕捉し、アルカリホスファターゼに連結した抗サイログロブリン抗体を用いてこれを検出した。血清サイログロブリンレベルは、凍結乾燥させたサイログロブリンにより作成した検量線から計算した。アッセイ用に凍結させて保管したところ、血清サイログロブリンは、最長２カ月間にわたり安定であった。このアッセイの感度は、０．２ｎｇ／ｍｌであった。
【０１６３】
結果：５８例の患者試料から、治療前及び治療後における最大で５０例の血液試料をこれらの解析に用いた。Ｅ７０８０による治療を開始して２９日後に、サイログロブリンレベルの劇的な変化が観察された。サイログロブリンレベルは、Ｅ７０８０による治療の４８日後（２サイクル以内）に有意に低下し、この低下はサイクル８まで持続した。
【０１６４】
Ｅ７０８０による部分寛解（ＰＲ）を示す患者群におけるサイログロブリンレベルの変化は、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）を有する患者群におけるサイログロブリンレベルの変化より有意に小さかった（マンホイットニーのＵ検定：図２；白丸：ＰＲ群の中央値、黒丸：その他（ＳＤ又はＰＤ）の中央値；及び表８の上方）。サイログロブリンレベルの変化はまた、サイクル２の完了後（治療の５６日後）における腫瘍退縮とも関連した（スピアマンの順位相関検定：表８の中央）。コックス比例ハザード検定により、患者の無増悪生存が、Ｅ７０８０による治療の２８日後におけるサイログロブリンレベルの変化と関連することが裏付けられたことから、大幅な低下はＰＦＳの延長を予測することが示される（表８の下方）。
【０１６５】
【表８】
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【０１６６】
結論：Ｅ７０８０療法後におけるサイログロブリンレベルの変化は、腫瘍反応、腫瘍サイズの縮減、及び無増悪生存と関連し、Ｅ７０８０による治療の４週間後までの臨床反応を予測するのに用いることができる。したがって、サイログロブリンレベルは、Ｅ７０８０を含む療法を継続すべきかどうかを評価する一助となる。
【０１６７】
実施例３：Ｅ７０８０の予測バイオマーカー及び反応バイオマーカーとしてのサイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子（血中バイオマーカー）
目的：血管新生は、ＶＥＧＦ受容体及びＦＧＦ受容体など、複数の増殖因子受容体を介するシグナル伝達により制御される。ＶＥＧＦ受容体によるシグナル伝達はまた、免疫細胞機能とも関連する。この解析の目的は、臨床試験のＥ７０８０による治療前及び治療後の両方において患者から得られる血清試料中のサイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子（本明細書では、まとめて「血中バイオマーカー」と称する）を測定し、患者がＥ７０８０による治療に反応するかどうかを予測するのに用い得る血中バイオマーカーを同定することであった。これらの解析では、３つの反応基準、すなわち：腫瘍反応、腫瘍退縮の％、及び無増悪生存を使用した。
「腫瘍反応」（ＴＲ）は、「部分寛解」（ＰＲ）を示す対象を、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）を示す対象と比較する。
【０１６８】
材料及び方法：患者にＥ７０８０を、２８日間のサイクルにより毎日１回経口、２４ｍｇの用量で施した。血清試料は、サイクル１の１日目（治療前）、サイクル１の８日目、及びサイクル２の８日目（すなわち、治療の３６日後）に収集した。７．５ｍＬの血液をステンレス鋼製の血清用試験管（ＳＳＴ）へと引き入れ、室温で少なくとも３０分間にわたり凝固させた。試料収集後６０分間以内に、２０〜２５℃、１４００×ｇで１０分間にわたり試験管を遠心分離した。ペレットを攪乱せずに上清を吸い上げ、血清を混合し、２つの試料用試験管へと分割し、解析のためのさらなる治療まで直立の位置で凍結させて（−７０℃）保管した。５８例の患者に由来する血清試料を血中バイオマーカー解析に用いた。この解析では、サイクル１の１日目（ベースライン）、サイクル１の８日目、及びサイクル２の８日目に由来する血清を用いた。無増悪生存の共変量との関連又は非関連を解析した。用いられた共変量は、以下のＰＫパラメータ：サイクル１の１日目のＣｍａｘ（サイクル１の１日目の投与２時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ１）；サイクル１の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（サイクル１の８日目の投与前におけるＥ７０８０濃度：ＭＩＮ１）；サイクル２の１日目のＣｍａｘ（サイクル２の１日目の投与２時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ２）；サイクル２の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（サイクル２の１日目の投与前におけるＥ７０８０濃度：ＭＩＮ２）である。血清試料は、同じ対象に由来する全ての時点が同じ日にアッセイされるバッチフォーマットで調べた。アッセイ日には、試料を−８０℃から取り出して、融解させ、室温に到達させた。製造元の指示書に従い、以下の市販のアッセイキット：Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｉｅ−２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＴＥ２００）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＡＮＧ１０）、Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦ２３  ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ  ＳＤＦ−１ａ  ＥＬＩＳＡ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＡＮＧ２０）、Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ型番：ＨＳＣＲ−３２Ｋ；ｓＶＥＧＦＲ１、ｓＶＥＧＦＲ２、及びｓＶＥＧＦＲ３に限る）、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ型番：ＭＰＸＨＣＹＴＯ−６０Ｋ；ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、及びＶＥＧＦに限る）、及びＨｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＴｒｕＰＬＥＸ型番：ＡＭ１０００９６；ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ４、ＶＥＧＦＤ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＬＴ３ＬＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＰＧＦ、及びＶＥＧＦＡ）を用いて、血清試料について調べた。
【０１６９】
ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ５．２  ソフトウェアを伴うＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＵＶｍａｘ  ｋｉｎｅｔｉｃ  マイクロプレートリーダーを用いて、ＥＬＩＳＡプレートを測定した。マルチプレックスアッセイは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  ４．１  ソフトウェアを伴うＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを用いて実施した。最終タンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）は、各アッセイの検量線から計算した。アッセイに応じて、試験前に血清試料をアッセイ緩衝液中で希釈しておくことができる。これらの場合は、タンパク質濃度に希釈倍率を乗じる。
【０１７０】
結果及び考察：５８例の患者試料に由来する、治療前及び治療後における２７〜４９例の血液試料を解析に用いた。５０のアッセイにおいて調べた４６因子中２３因子のレベルの有意な変化を、Ｅ７０８０により治療された患者に由来する血清中で、サイクル１の８日目及び／又はサイクル２の８日目の両方又は一方において、治療前のレベル（サイクル１の１日目（ベースライン））と比較して観察した（表９）。
【０１７１】
【表９−１】
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【表９−２】
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【０１７２】
次に、これらの因子の発現レベルの変化が、臨床転帰と関連するかどうかを評価した（腫瘍反応；ＰＲ及びその他（ＳＤ又はＰＤ）、腫瘍退縮、並びにＰＦＳ）。
【０１７３】
【表１０】
0006038128.tif 000014
【０１７４】
５つのアッセイのＥ７０８０による治療前又は治療の１週間後若しくは５週間後における４つの因子（ＩＦＮ−ｇ、ＡＮＧ−２、ＳＤＦ−１ａ、及びＩＬ−６）の中央値濃度は、Ｅ７０８０による治療に反応した患者（ＰＲ群）における場合が、「その他」群（ＳＤ又はＰＤを示す患者）における場合と比較して有意に異なった（表１０：マン−ホイットニーのＵ検定）。例えば、治療前のＩＦＮ−ｇ濃度及びＡＮＧ−２濃度が、ＳＤ又はＰＤを示した患者において見られるＩＦＮ−ｇ濃度及びＡＮＧ−２濃度より有意に低かったことから、Ｅ７０８０による治療を開始する前のＩＦＮ−ｇ濃度及びＡＮＧ−２濃度が低ければ、Ｅ７０８０に対する有益な腫瘍反応が予測されることが示される。ＰＲ群では、３つの因子（ＦＧＦ２、エオタキシン、ＩＰ−１０）の発現レベルが、サイクル１の８日目又はサイクル２の８日目に上昇したのに対し、「その他」群では、これらの３つの因子の発現レベルが低下した。興味深いことに、ＧＭ−ＣＳＦの発現レベルは、サイクル２の８日目のその他の群だけにおいて、サイクル１の１日目又はサイクル１の８日目と比較して低下した。加えて、サイクル２の８日目のＰＲ群では、Ｔｉｅ−２、ＨＧＦ、及びＶＥＧＦのサイクル１の８日目と比較した発現レベルが、「その他」群より有意に低下した。これらの結果は、血中バイオマーカーの発現レベルの変化が、Ｅ７０８０を含む療法に対する腫瘍反応と関連し、これを予測し得ることを裏付けた。
【０１７５】
次に、腫瘍退縮と関連する因子を探索した（ピアソンの相関係数検定：表１１）。
【表１１】
0006038128.tif 000015
【０１７６】
５つのアッセイにおける４つの因子（ＡＮＧ−２、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ｓＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦ）の濃度は、治療前の腫瘍退縮と有意に関連した。これらの研究は、これらの４つの因子の濃度の低下が、腫瘍退縮の増大を予測し得る一方で、ＰＤＧＦ−ＡＢの濃度の上昇も、腫瘍退縮の増大を予測し得ることを示した。Ｅ７０８０による治療の１週間又は５週間後の４つのアッセイにおける３つの因子（ＩＬ−１３、ＰＧＦ、及びＶＥＧＦ）の濃度は、腫瘍退縮と有意に関連した。これらの研究は、これらのＩＬ−１３、ＰＧＦ、及びＶＥＧＦの濃度の低下が、表示される時点における腫瘍退縮の増大を予測し得ることを示した。Ｅ７０８０による治療の１週間又は５週間後の３つのアッセイにおける３つの因子（ＩＬ−１０、ＳＤＦ１ａ、及びＲＡＮＴＥＳ）の濃度の上昇により、腫瘍退縮の増大が予測される。サイクル１の８日目におけるＦＧＦ２、ＩＬ１０、ＧＭＣＳＦの発現レベルの、サイクル１の１日目と比較した上昇（比の増大を示す）は、腫瘍退縮と有意に関連したが、これにより腫瘍退縮の増大が予測される。サイクル２の８日目における、ＩＬ１ａ及びＴＧＦａの比の、サイクル１の１日目と比較した増大により、腫瘍退縮の増大が予測される。サイクル２の８日目における４つの因子（ＩＬ−６、Ｔｉｅ−２、ｓＶＥＧＦＲ１、及びＶＥＧＦ）の発現比の、サイクル１の８日目と比較した減少は、腫瘍退縮の増大と関連した。サイクル２の８日目におけるＰＧＦの発現比の、サイクル１の８日目と比較した減少は、腫瘍退縮の増大と関連した。
【０１７７】
コックス比例ハザードモデルを実施して、因子の濃度又は比（発現レベルの変化）により無増悪生存を予測する血中バイオマーカーを同定した。薬物動態（ＰＫ）パラメータを、コックス比例ハザードモデルにおける共変量として用いた。サイクル１の１日目にＡＮＧ−２及びＶＥＧＦの濃度が低いか、又はサイクル２の８日目におけるＩＬ−１２（ｐ４０）の、サイクル１の１日目と比較した比が減少することは、ＰＦＳの延長と有意に関連したことから、これらの因子を、Ｅ７０８０療法に対する反応を予測するためのバイオマーカーとして用い得ることが示される（表１２）。ＰＫパラメータを伴うコックス比例ハザードモデルは、治療前において７つの因子（ＧＣＳＦ、ＭＩＰ１ｂ、ＦＧＦ２、ＭＩＰ１ａ、ＩＬ６、ＩＬ１３、及びｓＶＥＧＦＲ３）の濃度が高ければ、ＰＦＳの延長が予測され得る一方で、治療前においてＡＮＧ−２の濃度が低くても、ＰＦＳの延長が予測され得ることを裏付けた。ＰＫパラメータを伴うコックス比例ハザードモデルは、７つの因子（ＦＬＴ３ＬＧ、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＣＳＦ、ｓＶＥＧＦＲ１、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＡ）の比が小さければ、良好なＰＦＳが予測されるが、４つの因子（ＶＥＧＦＤ、ＩＬ１０、ＩＬ１ＲＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ）の比が高くても良好なＰＦＳが予測されることを裏付けた。
【０１７８】
【表１２】
0006038128.tif 000016
【０１７９】
結論：サイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子の濃度及び発現レベルの変化は、腫瘍反応、腫瘍退縮、及び無増悪生存と関連し、Ｅ７０８０による治療に対する臨床反応を予測するのに用いることができる。
【０１８０】
実施例４：臨床転帰を予測するために２つ又は３つ以上の因子を組み合わせてバイオマーカーを開発するための多変量解析
目的：この解析の目的は、突然変異、サイログロブリン、血中バイオマーカーなどの因子の組合せであって、単一の因子より良好に無増悪生存（ＰＦＳ）などの臨床転帰と関連する組合せを同定し、これらの臨床転帰を予測することであった。
【０１８１】
材料及び方法：全ての因子（すなわち、突然変異、サイログロブリン、サイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子）は、対象とする独立変数として、すなわち、バイオマーカー候補物質として用いた。ＰＦＳは、従属変数、すなわち、この解析における臨床転帰のうちの１つとして用いた。第１に、全ての因子を、単一の因子を伴うコックス比例ハザードモデルにより計算したｐ値に従いスクリーニングした。第２に、スクリーニングされた因子の全ての組合せを、コックス比例ハザードモデルで調べて、因子の全ての組合せにおいて有意な因子を見出した。全ての因子が有意な組合せを、さらなる解析のために選択した。それらの係数により定義される因子の組合せについてのハザード関数は、この解析から得られた。モデルにハザードの閾値を与えれば、患者を２つの群に割り当て得るように、各患者は、各モデルの彼／彼女自身のハザード値を有する。患者を群分けした後で、無増悪生存についてのログランク検定を実施して、２つの群（低ハザード群及び高ハザード群）間における生存曲線の差違を検定した。因子の組合せの各モデルについて最良のハザード閾値は、閾値をくまなく調べてログランク検定のｐ値を計算し、ｐ値から構築された滑らかな曲線を最小化する閾値を見出すことにより同定したが、これは、Ｕ．Ａｂｅｌ、Ｊ．Ｂｅｒｇｅｒ、及びＨ．Ｗｉｅｂｅｌｔ、「ＣＲＩＴＬＥＶＥＬ：Ａｎ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎｆ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２３（３）：１５４〜６（１９８４）において記載されている手法と同様であった。モデルの最良の閾値は、患者を高ハザード群と低ハザード群とに分割する。それらのハザード値が、閾値より小さい場合、患者は、ＰＦＳが延長されると予測される。
【０１８２】
結果及び考察：治療前にＰＦＳを予測するためのバイオマーカーを見出すために、本発明者らは、治療前に入手可能なデータを解析した。コックス比例ハザードモデルは、２つのバイオマーカー群による４種類の組合せを示した。１つの群は、ＡＮＧ−２、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦであり、別の群は、ＩＬ１３、ＭＩＰ１ａ、及びＭＩＰ１ｂである。予測モデルにより決定されたハザード比は、ＶＥＧＦとＡＮＧ−２との組合せ（ハザード比＝０．３８６）により、ＰＦＳが各単一の因子（ＶＥＧＦ；０．５５２、ＡＮＧ−２；ハザード比＝０．５４５）より良好に予測されることを示した。ＧＣＳＦをＶＥＧＦ及びＡＮＧ−２に追加しても、ハザード比（０．４１３）のさらなる減少がもたらされることはなかった。ＩＬ１３とＭＩＰ１ａとの組合せは、本発明者らの予測モデルにおいて小さなハザード比（１．０×１０−９）を示したが、ＭＩＰ１ｂを追加してもハザード比にさらに影響を及ぼすことはなかった（表１３）。
【０１８３】
【表１３】
0006038128.tif 000017
【０１８４】
次に、本発明者らは、遺伝子突然変異と血中バイオマーカーとの組合せにより、遺伝子突然変異単独の場合より良好にＰＦＳが予測されるかどうかを検討した。コックス比例ハザードモデルは、
群（１）：ＮＲＡＳの突然変異（ｍｕ）に
ａ．ＡＮＧ−２を加えること；
ｂ．ＶＥＧＦ、ＭＩＰ１ｂを加えること；
ｃ．ＶＥＧＦ、ＭＩＰ１ｂ、ｓＶＥＧＦＲ３を加えること；
ｄ．ＮＲＡＳのｍｕにＡＮＧ−２、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ１ｂ、ｓＶＥＧＦＲ３を加えること；
群（２）：ＮＲＡＳのｍｕ又はＫＲＡＳのｍｕにＡＮＧ−２を加えること；及び
群（３）：ＮＲＡＳのｍｕ又はＫＲＡＳのｍｕ又はＶＨＬのｍｕに
ａ．ＭＩＰ１ａを加えること；
ｂ．ＩＬ６、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂを加えること
など、３つの遺伝子突然変異間の組合せによる３つの群を示した（表１４）。
【０１８５】
例えば、予測モデルにより決定されたハザード比は、ＮＲＡＳのｍｕとＡＮＧ−２との組合せ（ハザード比＝０．０８５）により、ＰＦＳが突然変異単独（ＮＲＡＳ；ハザード比＝０．１２４）より良好に予測されることを示した。また、ＮＲＡＳのｍｕ又はＫＲＡＳのｍｕ及びＡＮＧ−２のうちのいずれかの組合せ（ハザード比＝０．０８３）でも、突然変異だけ（ＫＲＡＳのｍｕ又はＮＲＡＳのｍｕ；ハザード比＝０．２０５）よりハザード比が小さかった。ＢＲＡＦのｍｕ又はＮＲＡＳのｍｕ又はＫＲＡＳのｍｕ及びＩＬ６、ＶＥＧＦ、ＭＩＰ１ａ、ＭＩＰ１ｂのうちのいずれかによる組合せ（ハザード比＝１．９×１０−１０）でも、突然変異だけ（ハザード比＝０．０８６）よりハザード比が小さかった（表１４）。
【０１８６】
【表１４】
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【０１８７】
結論：コックス比例ハザードモデルを用いてそれらの組合せを決定した後の予測モデルに基づくと、遺伝子突然変異若しくは血中バイオマーカーによるバイオマーカーの組合せ、又は血中バイオマーカー間の組合せにより、単一のバイオマーカーより良好にＰＦＳが予測された。この解析により見出されたバイオマーカーの組合せは、Ｅ７０８０によるＰＦＳ及びＥ７０８０による治療に対する反応などの臨床転帰を予測するのに用いることができる。
【０１８８】
実施例５：Ｅ７０８０を含む療法単独又はエベロリムスと組み合わせたＥ７０８０に対するＲＣＣ患者の反応性についての予測バイオマーカーとしての突然変異状態
目的：第ＩＩ相研究で、Ｅ７０８０（レンバチニブのメタンスルホン酸塩）単独又はエベロリムスと組み合わせたＥ７０８０を治療された腎細胞癌患者（ＲＣＣ）における腫瘍反応及び疾患安定化の長期化が観察される。この実験は、３つの反応基準：最良総合効果、腫瘍退縮、及び無増悪生存を用いて、ＲＣＣ対象がＥ７０８０による治療に対して反応するか、反応しないかを予測するのに有用なアミノ酸の突然変異を同定することを指向する。
【０１８９】
材料及び方法：組織試料は、患者がＥ７０８０を含む任意の療法を施される前の手術時に得、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織のためのプロトコールにより日常通りに処理した。用いるプロトコールには、治験審査委員会の承認を得、各対象からは説明同意文書を得る。組織が入手可能なＸ例の患者に由来する腫瘍組織試料を、突然変異解析に用いる。ＤＮＡは、試験に参加する患者から収集したＦＦＰＥ腫瘍ブロックから単離する。ゲノムＤＮＡは、脱パラフィン化及びわずかな改変を伴うＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを介して、１０ミクロンの染色していない切片２〜５例から抽出する。突然変異を検出するには、実施例１に記載したシーケノム（登録商標）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）プラットフォーム、並びにオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ１．０、及びオンコカルタ（商標）Ｐａｎｅｌ  ｖ３．０などの配列決定法、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、又は古典的なサンガー配列決定法などの半導体による配列決定法を用いる。
【０１９０】
患者がＥ７０８０を服用する期間は、評価及び追跡を容易とするために、異なるサイクルへと人為的に分割する。患者には、２８日間のサイクルにおいて毎日１回、経口、２４ｍｇの用量、単独又はエベロリムスとの組合せ（Ｅ７０８０及び／又はエベロリムス）でＥ７０８０を施す。Ｅ７０８０の腎細胞癌試験では、各サイクルが２８日間（４週間）で、１〜２８日目がサイクル１であり；２９日目がサイクル２の１日目であり；５７日目がサイクル３の１日目である。サイクル１の１日目、サイクル２の１日目、及びサイクル３の１日目における薬物動態（ＰＫ）解析のために血液試料を収集した。患者１人当たり合計６例ずつの試料を、以下の通りに収集した：サイクル１の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前、及びＥ７０８０の初回投与の２〜８時間後（投与後）；サイクル２の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前、及びＥ７０８０の初回投与の２〜８時間後（投与後）；サイクル３の１日目：Ｅ７０８０を投与する直前、及びＥ７０８０の初回投与の２〜８時間後（投与後）。無増悪生存を解析するために、ＰＫパラメータをコックス比例ハザードモデルにおける共変量として用いる。
【０１９１】
４つの反応基準：最良総合効果、腫瘍反応、腫瘍退縮、及び無増悪生存を以下に定義する。
「最良総合効果」（ＢＯＲ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）のうちの１つを有することを指し、ＢＯＲの遺伝子突然変異との関連は、フィッシャーの正確検定により解析する。
「臨床利益」（ＣＢ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）；又は６カ月以上の無増悪生存（ＰＦＳ）を伴う疾患の安定（ＳＤ）のうちの１つを示すことを指す。
「完全寛解」とは、全ての標的病変の完全消失を意味する。
「部分寛解」とは、ベースライン最長径（ＬＤ）和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも３０％の減少を意味する。
「疾患の進行」（ＰＤ）とは、治療を開始してから記録された最小のＬＤ和、又は１つ若しくは複数の新たな病変が出現してから記録された最小のＬＤ和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも２０％の増大を意味する。
「疾患の安定」とは、治療を開始してからの最小のＬＤ和を基準として、ＰＲと見なされる標的病変の十分な退縮でもなく、疾患の進行（ＰＤ）と見なされる十分な増大でもないことを意味する。
「無増悪生存」（ＰＦＳ）とは、治療の開始日からＰＤ状態に入る前の最終日までの期間を指し、遺伝子突然変異のＰＦＳとの相関は、ログランク検定及びコックス比例ハザードモデルにより解析する。
「腫瘍退縮」（ＴＳ）とは、ベースライン直径和を基準として、標的病変の直径和の百分率変化を意味し、遺伝子突然変異のＴＳとの相関は、ピアソンの積率相関係数検定及びスピアマンの順位相関係数検定により解析する。
「腫瘍反応」（ＴＲ）は、「部分寛解」（ＰＲ）を示す対象を、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）を示す対象と比較するものであり、突然変異解析のためのものではなく、ＴＧ及び血中バイオマーカーのためのものである。
【０１９２】
実施例６：ＲＣＣ対象におけるＥ７０８０単独又はエベロリムスと組み合わせたＥ７０８０についての予測バイオマーカー及び反応バイオマーカーとしての血中バイオマーカー
目的：この解析の目的は、臨床試験のＥ７０８０及び／又はエベロリムスによる治療前及び治療後の両方において患者から得られた血液試料中のサイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子（本明細書では、まとめて「血中バイオマーカー」と称する）を測定し、腎細胞癌患者がＥ７０８０による治療に反応するのか、反応しないのかを予測するのに用い得る血中バイオマーカーを同定することである。これらの解析のために、４つの反応基準、すなわち：最良総合効果、腫瘍反応、腫瘍退縮の％、及び無増悪生存を使用する。
【０１９３】
材料及び方法：患者にＥ７０８０単独又はエベロリムスと組み合わせたＥ７０８０を、２８日間のサイクルにより毎日１回経口、２４ｍｇの用量で施す。血清試料は、サイクル１の１日目（治療前）、サイクル１の１５日目、及びその後の各サイクルの１日目の投与直前、並びに患者が治療を休止する期間に収集する。７．５ｍＬの血液をステンレス鋼製の血清用試験管（ＳＳＴ）へと引き入れ、室温で少なくとも３０分間にわたり凝固させる。試料収集後６０分間以内に、２０〜２５℃、１４００×ｇで１０分間にわたり試験管を遠心分離する。ペレットを攪乱せずに上清を吸い上げ、血清を混合し、２つの試料用試験管へと分割し、解析のためのさらなる治療まで直立の位置で凍結させて（−７０℃）保管する。患者に由来する血清試料を血中バイオマーカー解析に用いる。この解析では、サイクル１の１日目（ベースライン）、サイクル１の１５日目に由来する血清、その後の各サイクルの１日目の投与前の試料、及び患者が治療を休止するときの血清試料を用いる。無増悪生存の共変量との関連又は非関連を解析する。用いられる共変量は、以下のＰＫパラメータ：サイクル１の１日目のＣｍａｘ（サイクル１の１日目の投与２時間〜８時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ１）；サイクル２の１日目のＣｍａｘ（サイクル２の１日目の投与２時間〜８時間後におけるＥ７０８０濃度：ＭＡＸ２）；サイクル２の１日目のＣｔｒｏｕｇｈ（サイクル２の１日目の投与前におけるＥ７０８０濃度：ＭＩＮ２）である。血清試料は、同じ対象に由来する全ての時点が同じ日にアッセイされるバッチフォーマットで調べる。アッセイ日には、試料を−８０℃から取り出して、融解させ、室温に到達させる。製造元の指示書に従い、以下の市販のアッセイキット：Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｉｅ−２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＴＥ２００）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＡＮＧ１０）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ型番：ＤＡＮＧ２０）、Ｈｕｍａｎ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ型番：ＨＳＣＲ−３２Ｋ；ｓＶＥＧＦＲ１、ｓＶＥＧＦＲ２、及びｓＶＥＧＦＲ３に限る）、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ／Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ  Ｉ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ型番：ＭＰＸＨＣＹＴＯ−６０Ｋ；ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＥＧＦ、エオタキシン、ＦＧＦ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、及びＶＥＧＦに限る）、及びＨｕｍａｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（Ｏｒｉｇｅｎｅ  ＴｒｕＰＬＥＸ型番：ＡＭ１０００９６；ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＦＧＦ４、ＶＥＧＦＤ、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＦＬＴ３ＬＧ、ＡＮＧＰＴ２、ＰＧＦ、及びＶＥＧＦＡ）を用いて��血清試料について調べる。
【０１９４】
ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ５．２  ソフトウェアを伴うＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＵＶｍａｘ  ｋｉｎｅｔｉｃ  マイクロプレートリーダーを用いて、ＥＬＩＳＡプレートを測定する。マルチプレックスアッセイは、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ  ４．１  ソフトウェアを伴うＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムを用いて実施する。最終タンパク質濃度（ｐｇ／ｍＬ）は、各アッセイの検量線から計算する。アッセイに応じて、試験前に血清試料をアッセイ緩衝液中で希釈しておくことができる。これらの場合は、タンパク質濃度に希釈倍率を乗じる。
【０１９５】
４つの反応基準：最良総合効果、腫瘍反応、腫瘍退縮、及び無増悪生存を以下に定義し、表示される方法により解析する。
「最良総合効果」（ＢＯＲ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）のうちの１つを有することを指し、ＢＯＲの遺伝子突然変異との関連は、フィッシャーの正確検定により解析する。
「臨床利益」（ＣＢ）とは、以下の状態：完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）；又は６カ月以上の無増悪生存（ＰＦＳ）を伴う疾患の安定（ＳＤ）のうちの１つを示すことを指し、ＣＢの遺伝子突然変異との関連は、スチューデントのｔ検定及びマン−ホイットニーのＵ検定により解析する。
「完全寛解」とは、全ての標的病変の完全消失を意味する。
「部分寛解」とは、ベースライン最長径（ＬＤ）和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも３０％の減少を意味する。
「疾患の進行」（ＰＤ）とは、治療を開始してから記録された最小のＬＤ和、又は１つ若しくは複数の新たな病変が出現してから記録された最小のＬＤ和を基準として、標的病変のＬＤ和の少なくとも２０％の増大を意味する。
「疾患の安定」とは、治療を開始してからの最小のＬＤ和を基準として、ＰＲと見なされる標的病変の十分な退縮でもなく、疾患の進行（ＰＤ）と見なされる十分な増大でもないことを意味する。
「無増悪生存」（ＰＦＳ）とは、治療の開始日からＰＤ状態に入る前の最終日までの期間を指し、遺伝子突然変異のＰＦＳとの相関は、ログランク検定及びコックス比例ハザードモデルにより解析する。
「腫瘍退縮」（ＴＳ）とは、ベースライン直径和を基準として、標的病変の直径和の百分率変化を意味し、遺伝子突然変異のＴＳとの相関は、ピアソンの積率相関係数検定及びスピアマンの順位相関係数検定により解析する。
「腫瘍反応」（ＴＲ）は、「部分寛解」（ＰＲ）を示す対象を、疾患の安定（ＳＤ）又は疾患の進行（ＰＤ）を示す対象と比較するものであり、血中バイオマーカーの関連をスチューデントのｔ検定及びマン−ホイットニーのＵ検定により解析する。
【０１９６】
実施例７：ＲＣＣ患者における臨床転帰を予測するために２つ又は３つ以上の因子を組み合わせてバイオマーカーを開発するための多変量解析
目的：この解析の目的は、突然変異、並びにサイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子のレベル又は発現比などの因子の組合せであって、単一の因子より良好に無増悪生存（ＰＦＳ）と関連する組合せを同定し、ＲＣＣ患者におけるＰＦＳ及びＴＳなどの臨床転帰を予測することである。
【０１９７】
材料及び方法：全ての因子（すなわち、突然変異、サイトカイン、ケモカイン、及び血管新生因子）は、対象とする独立変数として、すなわち、バイオマーカー候補物質として用いる。ＰＦＳは、従属変数、すなわち、この解析における臨床転帰として用いる。第１に、全ての因子を、単一の因子を伴うコックス比例ハザードモデルにより計算したｐ値に従いスクリーニングする。第２に、スクリーニングされた因子の全ての組合せを、コックス比例ハザードモデルにより調べて、因子の全ての組合せにおいて有意な因子を見出す。全ての因子が有意な組合せを、さらなる解析のために選択する。それらの係数により定義される因子の組合せについてのハザード関数は、この解析から得られる。モデルにハザードの閾値を与えれば、患者を２つの群に割り当て得るように、各患者は、各モデルの彼／彼女自身のハザード値を有する。患者を群分けした後で、無増悪生存についてのログランク検定を実施して、２つの群（低ハザード群及び高ハザード群）間における生存曲線の差違を検定する。因子の組合せの各モデルについて最良のハザード閾値は、閾値をくまなく調べてログランク検定のｐ値を計算し、ｐ値から構築された滑らかな曲線を最小化する閾値を見出すことにより同定するが、これは、Ｕ．Ａｂｅｌ、Ｊ．Ｂｅｒｇｅｒ、及びＨ．Ｗｉｅｂｅｌｔ、「ＣＲＩＴＬＥＶＥＬ：Ａｎ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎｆ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２３（３）：１５４〜６（１９８４）において記載されている手法に類似する。モデルの最良の閾値は、患者を高ハザード群と低ハザード群とに分割する。ＰＦＳ延長についての患者予測の基準は、この閾値より低いハザード関数により計算されるハザード値として定義される。
【０１９８】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前出の記載は、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、これを限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、付属の特許請求の範囲により規定されている。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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