(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目のヒスチジンに相当するヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる群から選択される何れかのアミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなり、かつ、前記野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、ニストースの生成量に対するケストースの生成量の割合（ケストースの量／ニストースの量）が大きい活性を有する改良型β−フルクトフラノシダーゼ。
【請求項２】
下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼ；
（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）からなる群から選択される何れかのアミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記野生型β−フルクトフラノシダーゼと比較して、ニストースの生成量に対するケストースの生成量の割合（ケストースの量／ニストースの量）が大きい活性を有するアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体。
【請求項７】
宿主が大腸菌である、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項６または請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼに関し、特に、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、オリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体および改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−フルクトフラノシダーゼは、末端にフルクトース残基を含む糖質のフルクトースを認識して、加水分解する酵素である。β−フルクトフラノシダーゼの中には、加水分解活性に加えて、加水分解によって生じたフルクトースを基質に転移させるフルクトース転移活性を有するものも存在する。そのようなβ−フルクトフラノシダーゼによれば、スクロースを基質として、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖であるケストースを生成することができる。【０００３】
ケストースの中でも１−ケストースは、スクロース（砂糖）と似た甘味質であり、砂糖の三分の一程度の甘さを生じる一方で、砂糖の約半分のカロリーであること、摂取しても血糖値を上昇させにくいこと、アレルギー抑制機能を奏すること（特許文献１）などから、有用なオリゴ糖であることが知られている。１−ケストースを生成するβ−フルクトフラノシダーゼとしては、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のβ−フルクトフラノシダーゼおよびそのアミノ酸配列にアミノ酸変異を導入した変異体のβ−フルクトフラノシダーゼが開示されている（特許文献２）。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１６２１４７号公報
【特許文献２】特許第３６２８３３６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
スクロースを基質とし、β−フルクトフラノシダーゼを用いてケストースを製造する際には、通常、副生成物として４糖のニストースが生成する。ニストースはクロマトグラフィーにおいてケストースとの分離が困難であり、クロマトグラフィーによる分離精製工程を経ても反応液中に残存し易い。また、液中に存在する一定量以上のニストースは、晶析工程でのケストースの結晶化を阻害する。これらのことから、高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造するためには、ニストースの生成を低減させることが必要である。【０００６】
また、反応液中に残存した基質のスクロースも、クロマトグラフィーによるケストースの分離精製工程においてケストースの回収率を低下させる要因であり、スクロースを特異的に分解して単糖にすることにより、当該回収率を上げることができる。このことから、クロマトグラフィーによる分離精製工程を効率化して高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造するためには、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを特異的に分解することが必要である。【０００７】
以上のことから、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成できるβ−フルクトフラノシダーゼや、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを分解できるβ−フルクトフラノシダーゼが求められている。【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β−フルクトフラノシダーゼ、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含む組換えベクター、当該ＤＮＡまたは当該組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体および改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成できること、および、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できることを見出し、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。【００１０】
（１）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで前記配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。【００１１】
（２）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。【００１２】
（３）本発明に係るポリペプチドは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む。【００１３】
（４）本発明に係るＤＮＡは、（１）または（２）に記載の改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードする。【００１４】
（５）本発明に係る組換えベクターは、（４）に記載のＤＮＡを含む。【００１５】
（６）本発明に係る形質転換体は、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる、形質転換体である。【００１６】
（７）本発明に係る形質転換体において、（４）に記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組換えベクターを導入する宿主は大腸菌であってもよい。【００１７】
（８）本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法は、（６）または（７）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼや本発明に係る形質転換体によれば、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、ケストースの分解を抑制しつつスクロースを分解することができ、その結果、クロマトグラフィーによる分離精製工程を効率化して高純度のケストース溶液を製造し、ケストース結晶を効率的に製造することができる。また、本発明に係るポリペプチドや本発明に係るＤＮＡ、本発明に係る組換えベクター、本発明に係る形質転換体、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法によれば、ニストースの生成を抑制しつつケストースを生成し、また、ケストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法について詳細に説明する。
【００２０】
本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいい、「改良型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、１または２以上のアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいう。
【００２１】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの一態様は、配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントで配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる。
【００２２】
ここで、「タンパク質構成アミノ酸」とは、下記の表１に掲げるものをいう（生化学事典第４版；東京化学同人社発行、第５７頁、２００７年１２月）。これらのうち、本発明に係る「ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸」として、好ましくはヒスチジン（Ｈ）以外の塩基性アミノ酸、酸性アミノ酸、脂肪族アミノ酸およびヒドロキシアミノ酸を、より好ましくはアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を挙げることができる。
【００２３】
【表１】
0006023392.tif 000002
【００２４】
配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列とそれ以外のアミノ酸配列との同一性は、常法に従って確認することができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて確認することができる。なお、「同一性」とは一致性を指し、「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」と交換可能に用いられる。
【００２５】
配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加することにより得ることができる。また、常法に従い、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＰＲＦ）、ＧｅｎＰｅｐｔ（ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ）などのアミノ酸配列データベースから、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）などのプログラムを用いて配列番号２のアミノ酸配列とのホモロジー検索をすることにより得ることができる。
【００２６】
配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列は、細菌や酵母、カビ、植物などのいずれの生物に由来するβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列でもよい。配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列として、具体的には、例えば、配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性(以下、「所定の同一性」という場合がある。)が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列や、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１５０７３０５８．１；所定の同一性９９％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｎｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２３９４４１２０．１；所定の同一性９７％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｎｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０５０３３９５．１；所定の同一性９６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＴＭＷ２．７６７由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４４．１；所定の同一性９６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４５．１；所定の同一性９１％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２６１９９９３９．１；所定の同一性６８％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１０６６６４３５．１；所定の同一性６８％）、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｓ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＢＡＡ９３７２０．１；所定の同一性６７％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｍｏｒｂｉｆｅｒ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００８８５１８９８．１；所定の同一性６６％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＴＭＷ２．１１９１由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＣＣＧ４７８４６．１；所定の同一性６５％）、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０１１２５２４４２．１；所定の同一性６３％）などを挙げることができる。
【００２７】
ここで、本発明において「配列番号２のアミノ酸配列において、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が５０％未満とならない範囲で１または複数個のアミノ酸を欠失、置換、挿入または付加したアミノ酸配列」という場合の、欠失、置換、挿入または付加するアミノ酸の個数は、例えば、１〜２００個、１〜１８０個、１〜１６０個、１〜１４０個、１〜１２０個、１〜１００個、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜４０個、よりさらに好ましくは１〜３０個を挙げることができる。
【００２８】
また、本発明に係る「配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列」において、同一性の値は、５０％以上を挙げることができるほか、例えば、５５％以上、６０％以上、６５％以上、６８％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上などを挙げることができる。
【００２９】
アラインメントは、「シーケンスアラインメント」や「アライメント」と呼ばれる場合があるが、同義である。本発明において、アラインメントは常法に従って行うことができ、例えば、ＦＡＳＴＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ／ｔｏｏｌｓ／ｆａｓｔａ／）、Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.)、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｔｅｒａｔｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）、ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｊａ／）などのプログラムを用いて行うことができる。
【００３０】
次に、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのもう一つの態様は、下記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなる；
（ａ）配列番号２に示す野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）をヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入したアミノ酸配列、
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するアミノ酸配列。
【００３１】
上記（ｂ）の「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、１〜３０個、１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、よりさらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、野生型β−フルクトフラノシダーゼに比べ、以下（ｉ）や（ｉｉ）の特徴を有する；（ｉ）ケストースを生成することができ、かつ、ニストースが生成する量あるいは割合が小さい、（ｉｉ）酵素反応時間が長時間の場合において、ケストースやニストースなどのオリゴ糖の分解量が小さく、かつ、スクロースを分解することができる。すなわち、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、（ｉ）の特徴によれば、ケストース生成酵素として用いることができ、（ｉｉ）の特徴によれば、スクロース分解酵素として用いることができる。
【００３３】
なお、本発明において、オリゴ糖は、３〜十数個程度の単糖が結合してなる糖をいい、「少糖」、「寡糖」と交換可能に用いられる。
【００３４】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼは、常法に従って得ることができ、そのような方法としては、例えば、化学合成する方法や、遺伝子組換え技術による方法を挙げることができる。化学合成する方法では、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列情報に基づいて、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法に従って本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを合成することができる他、各種の市販のペプチド合成機を利用して合成することもできる。
【００３５】
また、遺伝子組換え技術による方法では、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを好適な発現系にて発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。すなわち、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。あるいは、後述する実施例１に示すように、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを、適当なベクターに挿入して組換えベクターを得た後、その組換えベクターを適当な宿主に導入して形質転換体を得る。そして、得られた形質転換体を培養して改良型β−フルクトフラノシダーゼを発現させることにより、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができる。
【００３６】
ここで、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡは、その塩基酸配列情報に基づいて、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて合成することができるほか、野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡや改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得ることができる。
【００３７】
例えば、アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得る場合は、後述する実施例１に示すように、まず、導入するアミノ酸変異をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、野生型β−フルクトフラノシダーゼまたは当該アミノ酸変異を導入していない改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、当該アミノ酸変異を導入したアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００３８】
また、上記（ｂ）の、アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸変異が導入されたアミノ酸を除く１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなる改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡもまた、ＰＣＲにより得ることができる。すなわち、まず、アミノ酸配列（ａ）において、アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加された箇所に相当するアミノ酸配列をコードするＤＮＡプライマーを設計し、そのＤＮＡプライマーを用いて、アミノ酸配列（ａ）をコードするＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、当該アミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加がされたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを得ることができる。
【００３９】
本発明において、あるタンパク質がβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有するか否かは、常法に従い確認することができ、例えば、後述する実施例２（１）に示すように、当該タンパク質をスクロースを含む反応液中でインキュベートし、または当該タンパク質を発現させた形質転換体をスクロースを含む反応液中で培養した後、その反応液の含有物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などにより確認する。その結果、グルコースやフルクトースなどのβ−フルクトフラノシダーゼの加水分解活性により生じた物質や、ケストースやニストースなどのβ−フルクトフラノシダーゼのフルクトース転移活性により生じた物質の存在が確認されれば、当該タンパク質はβ−フルクトフラノシダーゼ活性を有すると判断することができる。
【００４０】
また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。なお、本発明に係るポリペプチドにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４１】
本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列を含む限り、その配列長は特に限定されず、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のみからなるものでもよく、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に、１もしくは複数個のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるものでもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼを得る方法と同様の方法により得ることができる。
【００４２】
次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼおよびポリペプチドと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４３】
また、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。なお、本発明に係る組換えベクターにおいて、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチドおよびＤＮＡと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４４】
本発明に係る組換えベクターは、例えば、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡをベクターに挿入することにより得ることができる。ＤＮＡのベクターへの挿入は、常法に従って行うことができ、例えば、ＤＮＡと線状化したベクターのＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより行うことができる。ここで、ベクターとしては、例えば、ファージベクターやプラスミドベクター、コスミド、ファージミドなどを挙げることができ、宿主や操作性などに応じて適宜選択することができる。また、本発明に係る組換えベクターは、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡのほかに、薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求マーカー遺伝子などの形質転換体の選択マーカー遺伝子、改良型β−フルクトフラノシダーゼの発現に必要なプロモーター、転写開始信号、リボゾーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号や翻訳調節信号などを含むものであってもよい。
【００４５】
また、本発明は、形質転換体も提供する。なお、本発明に係る形質転換体において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡおよび組換えベクターと同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４６】
本発明に係る形質転換体は、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡまたは本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを宿主に導入して得られる。ここで、宿主としては、例えば、大腸菌や枯草菌などの細菌、酵母、糸状菌などを挙げることができ、組換えベクターの種類や操作性などに応じて適宜選択することができる。ＤＮＡや組換えベクターの宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、プラスミドを用いた組換えベクターを大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。また、宿主の染色体に直接目的のＤＮＡを導入するには、相同組換え法などを用いることができる。
【００４７】
次に、本発明は、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法を提供する。本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法は、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程を有する。なお、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクターおよび形質転換体と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００４８】
本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する工程において、改良型β−フルクトフラノシダーゼを取得する方法は、形質転換体の態様などに応じて適宜選択することができる。具体的には、形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得してもよく、培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製して取得してもよい。
【００４９】
形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得する方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の細胞表面あるいは細胞内部に発現されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して形質転換体を回収し、これをそのまま改良型βフルクトフラノシダーゼとして取得する方法や、回収した形質転換体を破砕して、これを改良型β−フルクトフラノシダーゼとして取得する方法を挙げることができる。
【００５０】
培養物から改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製する方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の外部に分泌されるようにＤＮＡあるいは組換えベクターを設計した場合は、培養物を遠心分離に供して培養上清を回収することにより改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製することができる。また、改良型β−フルクトフラノシダーゼが形質転換体の内部に発現される場合は、培養物を遠心分離に供して沈殿させた形質転換体を回収し、これを、緩衝液中に懸濁、凍結融解、超音波処理または磨砕するなどして形質転換体を破砕した後、遠心分離に供して上清を回収することにより改良型β−フルクトフラノシダーゼを精製することができる。その他、精製する方法としては、培養物を熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などに供する方法を挙げることができる。
【００５１】
最後に、本発明は、ケストースの製造方法を提供する。本発明に係るケストースの製造方法は、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、本発明に係る形質転換体または本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる工程を有する。なお、本発明に係るケストースの製造方法において、上述した本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体および改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法と同じまたは相当する構成については、再度の説明を省略する。
【００５２】
なお、ケストースは、通常、スクロースにフルクトースが結合して生成し、フルクトースが結合する位置により、１−ケストース、６−ケストースおよびネオケストースの３種類が生じうる。すなわち、１−ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成し、６−ケストースはフルクトースがスクロース中のフルクトース単位にβ（２→６）結合して生成し、ネオケストースはフルクトースがスクロース中のグルコース単位にβ（２→６）結合して生成する。また、ニストースは、フルクトースが１−ケストース中のフルクトース単位にβ（２→１）結合して生成する４糖である。
【００５３】
本発明における「ケストース」とは、１分子のグルコースと２分子のフルクトースとが結合した３糖を意味し、１−ケストース、６−ケストースおよびネオケストースを包含する。
【００５４】
本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼとスクロースとを接触させる方法としては、例えば、改良型β−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置する方法を挙げることができる。また、本発明に係る形質転換体とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、宿主が大腸菌の場合は、本発明に係る形質転換体をスクロースを含む溶液に添加し、５０℃で数日間振盪培養する方法を挙げることができる。
【００５５】
また、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係る形質転換体を培養して得られる培養物をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。ここで、培養物は、破砕、磨砕、緩衝液への懸濁、凍結融解、超音波処理、遠心分離、熱処理、塩沈澱、溶媒沈澱、透析、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの何らかの処理に供したものでもよく、処理に供していないものでもよい。
【００５６】
本発明に係るケストースの製造方法には、本発明に係るケストースの製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、クロマトグラフィーによるケストースの分離工程や煎糖などの結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
【００５７】
以下、本発明に係る改良型β−フルクトフラノシダーゼ、ポリペプチド、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、改良型β−フルクトフラノシダーゼの製造方法およびケストースの製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００５８】
＜実施例１＞ 改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）の野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７２８１７７４；配列番号２）のうち、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）またはセリン（Ｓ）に置換するアミノ酸変異（以下、それぞれのアミノ酸変異を「Ｈ３２１Ｒ」「Ｈ３２１Ｋ」「Ｈ３２１Ｅ」「Ｈ３２１Ｇ」「Ｈ３２１Ｓ」と略記する。）を導入したアミノ酸配列からなる変異体のβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これらを改良型β−フルクトフラノシダーゼとした。具体的な手順を以下に示す。【００５９】
（１）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（ＮＣＢＩ_ＧＩ：４５９０１８８７７；配列番号１）を基に、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを設計し、下記の条件でポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１とした。【００６０】
《Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で１分３０秒を１サイクルとして４５サイクル。【００６１】
（２）Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、これをＤＮＡ断片２とした。また、ＤＮＡ断片２について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。【００６２】
《ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号７）
リバースプライマー（下線はＢｇｌＩＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
反応条件；９５℃で１０秒、６０℃で２０秒および６８℃で２分を１サイクルとして３０サイクル。【００６３】
続いて、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）を消化した後、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて、添付の使用書に従いＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターとした。その後、下記の条件でＰＣＲを行うことによりｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片３とした。【００６４】
《ｐＣＤＦ−ＰｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ−３’(配列番号９)
リバースプライマー；５’− ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ−３‘(配列番号１０)
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ(東洋紡社)
反応条件；９８℃で１０秒、６８℃で２分２５秒を１サイクルとして２５サイクル。【００６５】
次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片３を連結することにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをｔｈａｉ組換えベクターとした。【００６６】
（３）改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターを鋳型として、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」、「Ｈ３２１Ｅ」、「Ｈ３２１Ｇ」および「Ｈ３２１Ｓ」を導入した改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅した。【００６７】
《改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡ増幅用ＰＣＲの条件》
「Ｈ３２１Ｒ」
フォワードプライマー；５’−ＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１１）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＮＥＯ
反応条件；９８℃で１０秒、５８℃で３０秒および６８℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
「Ｈ３２１Ｋ」
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
「Ｈ３２１Ｅ」
フォワードプライマー；５’−ＧＡＡＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１４）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
「Ｈ３２１Ｇ」
フォワードプライマー；５’−ＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１５）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。
「Ｈ３２１Ｓ」
フォワードプライマー；５’−ＴＣＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣ−３’（配列番号１６）
リバースプライマー；５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＡＴＡＧＧＴＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲ用酵素；ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ
反応条件；９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および７２℃で３分を１サイクルとして２５サイクル。【００６８】
得られたＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃で１時間消化した後、アガロースゲル電気泳動に供してゲルを切り出して、ＤＮＡ断片を精製した。これに、Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈｖｅｒ．２（東洋紡社）およびＴ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡社）を加えて１６℃で１時間静置することによりＤＮＡ断片のセルフライゲーションを行い、改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成した。「Ｈ３２１Ｒ」、「Ｈ３２１Ｋ」、「Ｈ３２１Ｅ」、「Ｈ３２１Ｇ」および「Ｈ３２１Ｓ」を導入した改良型β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを、それぞれｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターとした。【００６９】
（４）形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例１（２）のｔｈａｉ組換えベクターならびに本実施例１（３）のｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（コスモバイオ社）に導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｒｐｍで２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｒｐｍで２４時間振盪培養した。その後、培養物を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を集菌した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。【００７０】
Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水  ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース  ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、２．５Ｍ  ＭｇＣｌ２  ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水  ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１  ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２  ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３  １００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。【００７１】
＜実施例２＞ 改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価；アミノ酸変異の検討
（１）β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応
３０（ｗ／ｗ）％のスクロースを含む０．０４Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を調製し、これを３０％スクロース溶液とした。実施例１（４）の組換え大腸菌の集菌体０．５ｍＬを用意し、湿重量を測定した。ここに、３０％スクロース溶液３５０μＬを加えて懸濁した後、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪することによりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、これを反応液とした。【００７２】
（２）酵素反応生成物の確認
続いて、反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる各糖（単糖；フルクトース、単糖；グルコース、２糖；スクロース、３糖；ケストース、４糖；ニストースおよびその他の糖）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。また、ケストースおよびニストースの量は、酵素反応開始時の反応液に含まれていたスクロースの質量にケストースおよびニストースのそれぞれの割合を乗じて算出した。その結果を表２に示す。
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２(８.０φ×３００ｍｍ)  ２本
移動相；水
流速  ；１．０ｍＬ／ｍｉｎ
注入量；２０μＬ
温度  ；５０℃
検出  ；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率）【００７３】
【表２】
0006023392.tif 000003
【００７４】
表２に示すように、ｔｈａｉ組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液のいずれにおいても、ケストースの存在が確認された。    【００７５】
そして、ニストースの量は、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では８．８ｍｇであったのに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ、２．８ｍｇ、１．７ｍｇ、０．２ｍｇ、０．１ｍｇおよび０．９ｍｇであった。また、ニストースの割合は、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では７．４％であったのに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、それぞれ、２．３％、１．４％、０．２％、０．１％および０．７％であった。【００７６】
すなわち、ｔｈａｉ組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液のいずれにおいてもケストースが生成する一方で、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、ニストースの量および割合が顕著に低下した。【００７７】
これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつ、ケストースなどの有用なオリゴ糖を生成できることが明らかになった。【００７８】
＜実施例３＞ 改良型β−フルクトフラノシダーゼの評価；長時間反応時の検討
実施例１（４）の組換え大腸菌のうち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌およびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌を用いて、実施例２（１）に記載の方法によりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、実施例２（２）に記載の方法により酵素反応生成物の確認を行った。ただし、酵素反応の時間は２０時間に代えて９６時間とし、酵素反応生成物の確認は１６、２０、２４、４８、７２および９６時間において行った。その結果を表３に示す。【００７９】
【表３】
0006023392.tif 000004
【００８０】
表３に示すように、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が８．７ｍｇから５．６ｍｇ、ケストースの量が１７．５ｍｇから１０．３ｍｇと顕著に小さくなった。
これに対して、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が２．８ｍｇから１．７ｍｇ、ケストースの量が８．６ｍｇから７．２ｍｇと僅かに小さくなった。
また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が１．８ｍｇから１．４ｍｇ、ケストースの量が１１．１ｍｇから８．８ｍｇと僅かに小さくなった。
また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．１ｍｇから１．１ｍｇ、ケストースの量が６．４ｍｇから９．７ｍｇと大きくなった。
また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．１ｍｇから０．２ｍｇ、ケストースの量が３．２ｍｇから４．３ｍｇと大きくなった。
また、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応の時間が１６時間から９６時間へと長くなるにつれて、ニストースの量が０．８ｍｇから１．５ｍｇ、ケストースの量が８．５ｍｇから９．６ｍｇと大きくなった。【００８１】
すなわち、酵素反応の時間が長くなるに伴い、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースが顕著に減少したのに対してｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースがほとんど減少しなかった。このことから、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｇ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液では、酵素反応により生成したケストースやニストースの分解が顕著に抑制されたことが明らかになった。【００８２】
その一方で、酵素反応の時間が９６時間において、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とで、スクロースの割合はほとんど変わらなかった。すなわち、ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｒ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｋ）組換えベクター、ｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｅ）組換えベクターおよびｔｈａｉ（Ｈ３２１Ｓ）組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液とで、スクロースに対する分解活性はほぼ同等であることが明らかになった。【００８３】
これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に対して、Ｎ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ケストースやニストースなどのオリゴ糖の分解を抑制しつつ、スクロースを分解できることが明らかになった。【００８４】
＜実施例４＞Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと相同なβ−フルクトフラノシダーゼにおける改良型β−フルクトフラノシダーゼの作成と評価
Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼと６８％の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼとして、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ａｃｅｔｉ（ＮＢＲＣ１４８１８）のβ−フルクトフラノシダーゼ（ＮＣＢＩ ＷＰ＿０２６１９９９３９．１）を抽出し、これを評価対象酵素とした。評価対象酵素について、実施例１（１）〜（４）に記載の方法に準じて、野生型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターおよび改良型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌を得た。なお、評価対象酵素のアミノ酸配列において、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末端から３２１番目のヒスチジン（Ｈ）に相当する箇所は、ＣｌｕｓｔａｌＷ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）を用いてアラインメントを行うことにより特定した。【００８５】
続いて、実施例３に記載の方法によりβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応および酵素反応生成物の確認を行った。その結果、改良型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液において、野生型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液と比較して、ニストースの量および割合が低かった。また、酵素反応の時間が長くなるに伴い、野生型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースが顕著に減少したのに対して、改良型β−フルクトフラノシダーゼが挿入された組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液ではニストースやケストースがほとんど減少しなかった。【００８６】
これらの結果から、Ｇ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）と５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列に対して、アラインメントでＧ．ｔｈａｉ由来野生型β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から３２１番目の位置に相当するヒスチジン（Ｈ）を、ヒスチジン（Ｈ）以外のタンパク質構成アミノ酸に置換するアミノ酸変異を導入することにより、ニストースの生成を抑制しつつケストースなどの有用なオリゴ糖を生成し、また、オリゴ糖の分解を抑制しつつスクロースを分解できる改良型β−フルクトフラノシダーゼを得ることができることが明らかになった。
【配列表】
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