(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座において生殖系列改変を含むトランスジェニックマウスであって、該改変は：
（ａ）該内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座において内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードしている核酸配列を欠失すること；および
（ｂ）（ａ）の内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むこと；
を含み、
ここで、該マウスは、該内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座においてインタクトな内因性ＩｇＭ定常領域遺伝子を含み、そしてここで、該マウスは、ＩｇＧ重鎖抗体を発現し、かつ、該ＩｇＧ重鎖抗体をその血清中へと分泌し、該ＩｇＧ重鎖抗体は、（ｉ）（ａ）の内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子に由来し、かつＣＨ１ドメインを欠いたＩｇＧ定常ドメインに融合されたヒト可変ドメインを含んでおり、かつ（ｉｉ）同系の軽鎖を欠いている、マウス。
【請求項２】
前記ＩｇＧ定常領域遺伝子が、ＩｇＧ１定常領域遺伝子、ＩｇＧ２ｂ定常領域遺伝子、ＩｇＧ２ａ定常領域遺伝子、およびその組合せからなる群より選択される、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記ＩｇＧ定常領域遺伝子がＩｇＧ１定常領域遺伝子である、請求項２に記載のマウス。
【請求項４】
前記マウスが、
ａ）野生型ＩｇＧ３タンパク質；
ｂ）野生型ＩｇＧ２ａタンパク質；および
ｃ）野生型ＩｇＧ２ｂタンパク質
をさらに発現することを特徴とする、請求項３に記載のマウス。
【請求項５】
前記マウスが、
ｅ）野生型ＩｇＭタンパク質；
ｆ）野生型ＩｇＤタンパク質；
ｇ）野生型ＩｇＡタンパク質；および
ｈ）野生型ＩｇＥタンパク質
を発現することをさらに特徴とする、請求項４に記載のマウス。
【請求項６】
前記ＩｇＧ定常ドメインが前記ＣＨ１ドメインを完全に欠いていることを特徴とする、請求項１に記載のマウス。
【請求項７】
前記ＩｇＧ重鎖抗体が前記ヒト可変ドメイン、ＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項８】
前記マウスが、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座を含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項９】
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座が、κ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項８に記載のマウス。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座が、λ軽鎖遺伝子の遺伝子座である、請求項８に記載のマウス。
【請求項１１】
前記マウスが、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、および混合型１２９×Ｃ５７ＢＬ／６系統からなる群より選択される系統由来である、請求項１に記載のマウス。
【請求項１２】
前記マウスが５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６である、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
請求項１に記載のマウスの単離された細胞であって、該細胞は、
（ａ）内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座において内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードしている核酸配列を欠失しており；および
（ｂ）（ａ）の内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、
改変された内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座を含み、
ここで、該細胞は、該内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座においてインタクトな内因性ＩｇＭ定常領域遺伝子を含む、単離された細胞。
【請求項１４】
単離されたマウス胚性幹（ＥＳ）細胞であって、該細胞は、
（ａ）内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座において内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子のＣＨ１ドメインをコードしている核酸配列を欠失しており；および
（ｂ）（ａ）の内因性ＩｇＧ定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む、
改変された内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座を含み、
ここで、該細胞は、該内因性重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座においてインタクトな内因性ＩｇＭ定常領域遺伝子を含む、単離されたマウスＥＳ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、重鎖抗体が作製される遺伝子改変された非ヒト動物、特に、免疫グロブリンγ（ＩｇＧ）遺伝子のＣＨ１ドメイン（またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域）をコードしている配列内にヌクレオチド配列の欠失を含むが、機能性ＣＨ１ドメインを欠いていないＩｇＭを発現できる遺伝子改変された動物、特に、野生型ＩｇＭ分子（すなわち、ＣＨ１ドメインを有する）の作製能を有するが、機能性ＣＨ１ドメイン（またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域）が欠如している重鎖ＩｇＧ抗体が作製されるマウスである。
【背景技術】
【０００２】
背景
ほとんどの動物では、正常な免疫グロブリン重鎖は、その同系の（ｃｏｇｎａｔｅ）軽鎖とカップリングされている場合でのみ良好に発現される。ヒトでは、重鎖可変部、ＣＨ１、または重鎖可変部とＣＨ１ドメインの配列を欠いている機能不全性の重鎖によって症状発現する重鎖病で孤立重鎖が見られる。軽鎖が欠如している重鎖は、特定の種の魚類お
よびラクダに見られる。かかる重鎖は、機能性ＣＨ１ドメインを欠いており、重鎖可変ドメインにおいて非ヒト特徴を有する。ラクダまたは特定の種の魚類に見られるＶＨＨドメインを模倣するラクダ化遺伝子を発現するようにマウスを改変することにより（一部において、ＩｇＭおよびＩｇＧ  ＣＨ１ドメインを除去し、重鎖可変領域をラクダおよび／または特定の種の魚類のものと類似するように適合させることにより）、ラクダ化抗体を作製する試みがなされている。しかしながら、ラクダ化抗体では、非ラクダ動物において免疫応答が誘導されることが予測される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
当該技術分野において、非ラクダ類ＶＨドメインを有する重鎖抗体が作製される遺伝子改変された非ヒト動物の必要性が存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
遺伝子改変された細胞、非ヒト胚、非ヒト動物ならびにそれらを作製および使用するための方法および組成物を提供する。ここで、該動物は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）において機能性ＣＨ１配列を欠くように遺伝子改変され、任意選択で、該改変ＩｇＧにおいて機能性ＩｇＧヒンジ領域を欠くように改変され、ここで、該細胞、胚および動物には機能性ＩｇＭ  ＣＨ１配列が含まれている。一部の態様では、該マウスは、内因性マウス免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントの１つ以上または全部の、１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。一部の態様では、内因性マウスＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの全部が、１つ以上のヒトＶ、１つ以上のヒトＤおよび１つ以上のヒトＪ遺伝子セグメントで置き換えられている。
【０００５】
一態様において、遺伝子改変がＩｇＧ定常領域をコードしているヌクレオチド配列の改変を含み、該改変によってＩｇＧ定常領域のＣＨ１ドメインの機能喪失がもたらされる、遺伝子改変マウスを提供する。一実施形態において、該機能喪失改変は、ＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列の欠失、またはＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列内の欠失である。
【０００６】
一実施形態において、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびその組合せから選択される。一実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１である。一実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂである。
【０００７】
一実施形態において、該改変は、さらに、ＣＨ１改変を含むＩｇＧのヒンジ領域のヌクレオチド配列の欠失を含む。
【０００８】
一実施形態において、遺伝子改変マウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、および１２９×Ｃ５７ＢＬ／６混合型から選択される。具体的な一実施形態では、該マウスは５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６である。
【０００９】
一実施形態において、遺伝子改変マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６参照）からなる群より選択される１２９系統である。一実施形態では、遺伝子改変マウスはＣ５７ＢＬ系統であり、具体的な一実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／Ｇｒ
Ｆａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、Ｃ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。具体的な一実施形態では、遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統の混合型である。別の具体的な実施形態では、該マウスは、前述の１２９系統の混合型、または前述のＢＬ／６系統の混合型である。具体的な一実施形態では、該混合型の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。
【００１０】
一実施形態において、該マウスは、該改変ＩｇＧ定常領域配列に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていない内因性マウス重鎖免疫グロブリン可変領域（ｍＶＲ）遺伝子セグメントを含むものである。一実施形態では、該１つ以上のｍＶＲ遺伝子セグメントは、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＨ７、ＶＨ１４およびその組合せから選択されるマウスＶＨ遺伝子ファミリーに由来するものである。一実施形態では、該１つ以上のｍＶＲ遺伝子セグメントは、ｍＶＨ  １−２６、１−４２、１−５０、１−５８、１−７２、３−６、５−６、７−１、１４−２およびその組合せから選択される。
【００１１】
一実施形態において、該マウスは、機能性ＣＨ１領域を欠いているＩｇＧ重鎖のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３をコードしている再構成遺伝子を含むものであり、該ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は各々、独立して、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＨ７およびＶＨ１４遺伝子ファミリーから選択されるｍＶＨ生殖系列配列に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。一実施形態において、ｍＶＨ生殖系列配列は、１−２６、１−４２、１−５０、１−５８、１−７２、３−６、５−６、７−１、および１４−２配列から選択される。
【００１２】
一実施形態において、該マウスは、ＤＨ１−１、２−１４、３−１、３−２、３−３、４−１およびその組合せから選択されるＤＨ遺伝子セグメントに由来するＣＤＲ３を含むものである。一実施形態において、該マウスＣＤＲ３は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３またはＪＨ４であるＪＨにコードされた配列を含む。
【００１３】
一実施形態において、該マウスは、ＤＨ１−１、２−１４、３−１、３−２、３−３、４−１、およびＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３またはＪＨ４の再構成体に由来するＣＤＲ３をコードしている再構成抗体配列を含むものである。
【００１４】
一実施形態において、該マウスは、機能性ＣＨ１領域を欠いているＩｇＧ重鎖のＦＲ４をコードしている再構成遺伝子を含むものであり、該ＦＲ４は、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３またはＪＨ４とのＤＨ１−１、２−１４、３−１、３−２、３−３または４−１の再構成体にコードされたＦＲ４と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００１５】
一実施形態において、該マウスは、再構成されていないヒト重鎖免疫グロブリン可変領域（ｈＶＲ）遺伝子セグメントを、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座に含むものである。一実施形態では、該マウスは、該改変ＩｇＧ定常領域配列に作動可能に連結された再構成されていないｈＶＲ遺伝子セグメントを、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座に含むものである。一実施形態において、ｈＶＲ遺伝子セグメントは、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４およびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するものである。一実施形態において、１つ以上のｈＶＲ遺伝子セグメントが、１−２、１−８、１−１８、１−４６、１−６９、３−２１、３−７２および４−５９から選択される。具体的な一実施形態では、１つ以上のｈＶＲ遺伝子セグメントが、１−８、１−１８および１−６９から選択される。
【００１６】
一実施形態において、マウス重鎖Ｖ遺伝子セグメントの全部または実質的に全部が、１つ以上のヒト重鎖Ｖ遺伝子セグメントで置き換えられている。一実施形態では、マウス重鎖ＶおよびＤ遺伝子セグメントの全部が、１つ以上のヒト重鎖ＶおよびＤ遺伝子セグメントで置き換えられている。一実施形態では、マウス重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの全部が、１つ以上のヒト重鎖（ｃａｈｉｎ）Ｖ、１つ以上のヒト重鎖Ｄおよび１つ以上のヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントで置き換えられている。このような実施形態において、ヒト重鎖Ｖおよび／またはＤおよび／またはＪ遺伝子セグメントは、マウス内因性重鎖の遺伝子座に存在し、マウス定常領域遺伝子（１つもしくは複数）または改変マウス定常領域遺伝子（１つもしくは複数）に作動可能に連結される。
【００１７】
一実施形態において、該マウスは、機能性ＣＨ１領域を欠いているＩｇＧ重鎖のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列をコードしており、かつ１−８、１−１８または１−６９ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントのヒト生殖系列ヌクレオチド配列由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むものであり；ここで、改変マウスのＦＲ１＋ＦＲ２＋ＦＲ３配列は、マウスおよびヒト配列のＣＤＲの配列に関係なく、記載のヒト生殖系列配列と最適にアラインメントされる（すなわち、該ＦＲは、比較対象のいずれのＣＤＲのアミノ酸の実体も考慮せずに最適にアラインメントされる）。具体的な実施形態では、該ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、１−８、１−１８または１−６９遺伝子セグメントである重鎖可変領域遺伝子セグメントのＦＲ１＋ＦＲ２＋ＦＲ３のヒト生殖系列ヌクレオチド配列と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００１８】
一実施形態において、該マウスは、さらに、ヒトＤ６−１９／Ｊ６再構成、Ｄ６−７／Ｊ４再構成、Ｄ４−４／Ｊ４再構成、Ｄ６−６／Ｊ２再構成、Ｄ３−１６／Ｊ６再構成、Ｄ６−６／Ｊ４再構成、およびＤ１−７／Ｊ４再構成によって形成されたＦＲ４と少なくとも８０％同一であるＦＲ４を含むものである。具体的な実施形態では、該ＦＲ４は、前述のＤ／Ｊ再構成によって形成されたＦＲ４と約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【００１９】
一実施形態において、該マウスは、アミノ酸配列において１個以下、２個以下、３個以下、４個以下または５個以下のアミノ酸が、Ｖ１−８、Ｖ１−１８およびＶ１−６９から選択されるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの生殖系列配列にコードされたＦＲ１と異なるＦＲ１をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。具体的な一実施形態では、該ＦＲ１をコードしているヌクレオチド配列は、機能性ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ定常領域をコードしている配列に作動可能に連結された再構成された配列である。
【００２０】
一実施形態において、該マウスは、アミノ酸配列において１個以下、２個以下、３個以下、４個以下または５個以下のアミノ酸が、Ｖ１−８、Ｖ１−１８およびＶ１−６９から選択されるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの生殖系列配列にコードされたＦＲ２と異なるＦＲ２をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。具体的な一実施形態では、該ＦＲ２をコードしているヌクレオチド配列は、機能性ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ定常領域をコードしている配列に作動可能に連結された再構成された配列である。
【００２１】
一実施形態において、該マウスは、アミノ酸配列において１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下または１１個以下のアミノ酸が、Ｖ１−８、Ｖ１−１８およびＶ１−６９から選択されるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの生殖系列配列にコードされたＦＲ３と異なるＦＲ３をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。具体的な一実施形態では、該ＦＲ３をコードしているヌクレオチド配列は、機能性ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ定常領域をコードしている配列に作動可能に連結された再構成された配列である。
【００２２】
一実施形態において、該マウスは、アミノ酸配列において１個以下、２個以下または３個以下のアミノ酸が、ヒトＤ６−１９／Ｊ６、Ｄ６−７／Ｊ４、Ｄ４−４／Ｊ４、Ｄ６−６／Ｊ２、Ｄ３−１６／Ｊ６、Ｄ６−６／Ｊ４、およびＤ１−７／Ｊ４の再構成体にコードされたＦＲ４のアミノ酸配列と異なるＦＲ４をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。具体的な一実施形態では、該ＦＲ４をコードしているヌクレオチド配列は、機能性ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ定常領域をコードしている配列に作動可能に連結された再構成された配列である。
【００２３】
一実施形態において、該マウスは、ヒト重鎖Ｄ領域遺伝子セグメント（ｈＤＨ）に由来する重鎖ＣＤＲ３をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。一実施形態において、ｈＤＨは、Ｄ１−７、Ｄ３−１６、Ｄ４−４、Ｄ６−６、Ｄ６−７およびＤ６−１９から選択される。
【００２４】
一実施形態において、該マウスは、ヒト重鎖接合遺伝子セグメント（ＪＨ）に由来する重鎖ＣＤＲ３をコードしているヌクレオチド配列を含むものである。具体的な一実施形態では、ＪＨはＪ２、Ｊ４およびＪ６から選択される。
【００２５】
一実施形態において、該マウスは、ヒトＤＨとヒトＪＨの再構成に由来するヌクレオチド配列にコードされた重鎖ＣＤＲ３を含むものである。具体的な一実施形態では、該ＣＤＲ３は、Ｄ１−７／Ｊ４、Ｄ３−１６／Ｊ６、Ｄ４−４／Ｊ４、Ｄ６−６／Ｊ２、Ｄ６−６／Ｊ４、Ｄ６−７／Ｊ４、またはＤ６−１９／Ｊ６再構成に由来するものである。
【００２６】
一実施形態において、該マウスは、内因性ｍＶＲ遺伝子セグメントのｈＶＲ遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。具体的な一実施形態では、該ｍＶＲ遺伝子セグメントのｈＶＲ遺伝子セグメントでの置き換えは、改変された重鎖定常領域と同じ対立遺伝子におけるものである。別の具体的な実施形態では、該ｍＶＲ遺伝子セグメントのｈＶＲ遺伝子セグメントでの置き換えは、改変された重鎖定常領域と異なる対立遺伝子におけるものである。
【００２７】
一実施形態において、ｍＶＲ遺伝子セグメントの９０〜１００％が、少なくとも１つのｈＶＲ遺伝子セグメントで置き換えられている。具体的な一実施形態では、内因性ｍＶＲ遺伝子セグメントの全部または実質的に全部が、少なくとも１つのｈＶＲ遺伝子セグメントで置き換えられている。一実施形態において、該置き換えは、少なくとも１８個、少なくとも３９個、または少なくとも８０個もしくは８１個のｈＶＲ遺伝子セグメントによるものである。一実施形態において、該置き換えは、少なくとも１２個の機能性ｈＶＲ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能性ｈＶＲ遺伝子セグメント、または少なくとも４３個の機能性ｈＶＲ遺伝子セグメントによるものである。
【００２８】
一実施形態において、遺伝子改変マウスは、少なくとも１つの再構成されていないｈＶＲ遺伝子セグメント、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤセグメント、少なくとも１つの再構成されていないヒトＪセグメント、および少なくとも１つのヒト重鎖定常配列を含む導入遺伝子を含むものである。一実施形態において、内因性マウス重鎖可変領域およびκ軽鎖可変領域の遺伝子座は機能的にサイレンシングされている。具体的な一実施形態では、該マウスは、トランススイッチ（ｔｒａｎｓ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）能を有し、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているマウスＩｇＧ配列が隣接するヒト重鎖可変ドメインを含み、任意選択で、機能性ＣＨ１ドメインを欠いている該ＩｇＧのヒンジ領域を欠いているキメラヒト／マウス抗体を生成することができる。具体的な一実施形態では、該導入遺伝子は、さらに、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ配列を含み、任意選択で、機能性ＣＨ１ドメインを有するＩｇＭを含むものである。さらなる具体的な一実施形態では、Ｉ
ｇＧ配列はヒンジ領域を欠いている。
【００２９】
一実施形態において、該マウスは第１の重鎖可変領域の対立遺伝子と第２の重鎖可変領域の対立遺伝子を含むものであり、第１対立遺伝子と第２対立遺伝子はどちらも同じマウス系統由来のものである。一実施形態では、第１対立遺伝子は第１のマウス系統に由来し、第２対立遺伝子は第２のマウス系統に由来する。一実施形態において、第１および第２対立遺伝子のうち一方の対立遺伝子は、ｍＶＲの少なくとも１つのｈＶＲでの置き換えを含む。別の実施形態では、両方の対立遺伝子がｍＶＲの少なくとも１つの（ｏｎ）ｈＶＲでの置き換えを含む。
【００３０】
一態様において、ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭが発現され、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧが発現されるか、または機能性ＣＨ１ドメインを欠いているとともに機能性ヒンジ領域も欠いているＩｇＧが発現される遺伝子改変マウスを提供する。
【００３１】
一実施形態において、ＩｇＧはＩｇＧ１である。
【００３２】
一実施形態において、該マウスでは、改変ＩｇＧ１ならびに野生型ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂである４種類のＩｇＧが発現される。別の実施形態では、該マウスでは、改変ＩｇＧ１および野生型ＩｇＧ３である２種類以下のＩｇＧが発現される。具体的な一実施形態では、該マウスでは、野生型ＩｇＭ、野生型ＩｇＤ、野生型ＩｇＧ３、改変ＩｇＧ１、野生型ＩｇＧ２ａ、野生型ＩｇＧ２ｂ、野生型ＩｇＡ、および野生型ＩｇＥである重鎖アイソタイプが発現される。別の具体的な実施形態では、該マウスでは、野生型ＩｇＭ、野生型ＩｇＤ、野生型ＩｇＧ３、改変ＩｇＧ１、野生型ＩｇＡ、および野生型ＩｇＥである重鎖アイソタイプが発現される。種々の（ｖａｒｉｏｓｕ）実施形態において、ＩｇＧ１の改変は、ＣＨ１ドメインの欠失、および任意選択でヒンジ領域の欠失を含む。
【００３３】
一実施形態において、該マウスは、１２９、Ｃ５６ＢＬ／６、混合型１２９×Ｃ５７ＢＬ／６から選択される系統に由来するものである。
【００３４】
一態様において、本質的に二量体重鎖からなる重鎖抗体が発現されるマウスを提供し、ここで、該重鎖は、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能性ＣＨ１ドメインと機能性ヒンジ領域の両方を欠いており、また、該重鎖は、生殖系列可変領域遺伝子にコードされた哺乳動物の重鎖可変ドメインと同一でない配列を含む哺乳動物の重鎖可変ドメインを含むものであり、また、該重鎖は、ヒトまたはマウスのＣＨ２ドメインとヒトまたはマウスのＣＨ３ドメインを含むものであり、該マウスでは、野生型ヒトまたはマウスＩｇＭが発現される。
【００３５】
一実施形態において、該マウスは、機能性免疫グロブリン軽鎖の遺伝子の遺伝子座を含むものである。
【００３６】
一実施形態において、哺乳動物の重鎖可変ドメインは、ヒトまたはマウス重鎖可変ドメインである。
【００３７】
一実施形態において、重鎖抗体は、本質的に、機能性ＣＨ１ドメインを欠いており、機能性ヒンジ領域を欠いている二量体重鎖からなり、ここで、該重鎖は、少なくとも１つの体細胞変異を含むヒト可変ドメインを含み、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。具体的な一実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、独立してマウスドメインおよびヒトドメインから選択される。具体的な一実施形態では、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの両方がヒトのものであり；別の実施形態では、ＣＨ２ドメインとＣＨ３
ドメインの両方がマウスのものである。
【００３８】
一態様において、非ラクダ類可変ドメインとＣＨ１ドメインを欠いている重鎖定常領域とを含む重鎖を含む重鎖抗体を提供する。
【００３９】
一実施形態において、重鎖抗体は、さらにヒンジ領域を欠いている。
【００４０】
一実施形態において、重鎖抗体は、本質的にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる定常領域を含む。別の実施形態では、重鎖抗体は、本質的にＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインからなる定常領域を含む。
【００４１】
一実施形態において、非ラクダ類可変ドメインは、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むマウスまたは遺伝子改変マウス由来のＢ細胞のＩｇＭまたはＩｇＧをコードしているヌクレオチド配列から得られる体細胞変異を有するヒトまたはマウス重鎖可変ドメインである。具体的な一実施形態では、該マウスは、ヒト化重鎖可変領域遺伝子セグメントを含むものである。別の実施形態では、該マウスは、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメント遺伝子座の、少なくとも１つのヒト可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。別の実施形態では、該マウスは、内因性マウス重鎖の遺伝子座の、少なくとも１つのヒト可変遺伝子セグメント、少なくとも１つのヒトＤ遺伝子セグメント、および少なくとも１つのヒトＪ遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。具体的な一実施形態では、内因性マウス免疫グロブリン可変領域遺伝子座は、全部または実質的に全部が、複数のヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントを含むヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子座で置き換えられている。
【００４２】
一実施形態において、非ラクダ類可変ドメインはヒトまたはマウス可変ドメインである。別の実施形態では、非ラクダ類可変ドメインは、１つ以上のラクダ化改変を含むヒトまたはマウス可変ドメインである。具体的な一実施形態では、ラクダ化改変は、Ｌ１１Ｓ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５Ｃ、Ｌ４５Ｒ、およびＷ４７Ｇ（カバトによる番号付け）から選択される。具体的な一実施形態では、ラクダ化改変はＶ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、およびＬ４５Ｃから選択される。具体的な一実施形態では、重鎖可変ドメインは、２つのシステインを含む相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むものである。
【００４３】
一実施形態において、重鎖抗体は、第１の重鎖可変ドメインを含む第１の重鎖と、第２の重鎖可変ドメインを含む第２の重鎖の二量体で構成されており、第１および第２の重鎖は各々、ＣＨ１ドメインを欠いている（またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いている）。一実施形態において、該二量体の第１の重鎖のヒト可変ドメインは第１のエピトープに結合し、該二量体の第２の重鎖のヒト可変ドメインは第２のエピトープに結合し、第１および第２のエピトープは同一でない。具体的な一実施形態では、第１および第２の重鎖の重鎖可変ドメインは、本明細書に記載のヒト重鎖可変ドメインおよび／またはヒト重鎖ＦＲ領域を含む。
【００４４】
一態様において、遺伝子改変された非ヒト細胞を提供し、ここで、該遺伝子改変はＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失を含み、該細胞は機能性ＩｇＭを発現する。具体的な一実施形態では、該細胞は、ＣＨ１ドメインをコードしている配列を含むＩｇＭ遺伝子を含む。
【００４５】
一実施形態において、該細胞は、非ヒトＥＳ細胞、多能性細胞および全能細胞から選択される。具体的な一実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞から選択される。
【００４６】
一態様において、遺伝子改変された非ヒト胚を提供し、ここで、該遺伝子改変は本明細
書に記載の改変を含む。一実施形態では、該遺伝子改変はＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失を含み、該非ヒト胚は機能性ＩｇＭを発現する。具体的な一実施形態では、該非ヒト胚は、ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭ遺伝子を含む。
【００４７】
一実施形態において、非ヒト胚はマウス胚またはラット胚である。
【００４８】
一態様において、ドナー細胞を含む非ヒト胚を提供し、ここで、該ドナー細胞は遺伝子改変されており、該遺伝子改変は本明細書に記載の改変である。一実施形態では、該遺伝子改変はＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失を含み、該細胞は、ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭ遺伝子を含む。
【００４９】
一実施形態において、非ヒト胚はマウス胚またはラット胚であり、ドナー細胞は、それぞれ、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞である。
【００５０】
一態様において、（ａ）５’側の第１の配列に相同であり、ＩｇＧ  ＣＨ１領域の開始部に直接隣接しているマウス相同性アーム；（ｂ）マーカーまたは薬物選択カセット；および（ｃ）３’側の第２の配列に相同であり、ＩｇＧ  ＣＨ１領域の終結部に直接隣接している相同性アーム、あるいは３’側の第２の配列に相同であり、ＩｇＧヒンジ領域の終結部に直接隣接している相同性アームを含むＤＮＡ構築物を提供する。
【００５１】
一態様において、（ａ）ＩｇＧにおいて機能性ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＩｇＧにおいて機能性ＣＨ１ドメインを欠いており、機能性ヒンジ領域を欠いている本明細書に記載の非ヒト動物を免疫化すること、ここで、該マウスでは、機能性ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭが発現される；（ｂ）該非ヒト動物で抗体が作製されるのに充分な条件下で該非ヒト動物を維持すること；（ｃ）機能性ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能性ヒンジ領域を欠いている、該マウスによって作製される抗体を同定すること；および（ｄ）該マウスから該抗体、該抗体が作製される細胞、または該抗体の配列をコードしているヌクレオチド配列を単離することを含む、ＣＨ１ドメインを欠いている抗体の作製方法を提供する。
【００５２】
一実施形態において、該非ヒト動物は機能性免疫グロブリン軽鎖の遺伝子の遺伝子座を含む。
【００５３】
一態様において、重鎖抗体を作製する遺伝子改変マウスを対象抗原で免疫化すること、該マウスに免疫応答を生じさせること、該マウスのＢ細胞においてコードされた該マウスのマウスＶＨ領域を同定すること、ここで、該Ｂ細胞は該対象抗原に特異的に結合する、および該ＶＨ領域をヒト化することを含む、マウス重鎖抗体のヒト化方法を提供する。
【００５４】
一実施形態において、重鎖抗体を作製する遺伝子改変マウスは本明細書に記載のマウスである。一実施形態において、該マウスは、インタクトなＩｇＭ遺伝子を含み、ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジドメインを欠いているＩｇＧ遺伝子を含む重鎖定常遺伝子座に作動可能に連結された少なくとも１つのｍＶＲ遺伝子セグメントを含むものである。一実施形態において、ＩｇＧ遺伝子はＩｇＧ１遺伝子である。一実施形態において、ＩｇＧ遺伝子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３およびその組合せから選択される。
【００５５】
一実施形態において、該方法は、さらに、ヒト化ＶＨ領域をコードしているヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のヌクレオチド配列上にクローニングすることを含む。
【００５６】
一実施形態において、該マウスｍＶＲ遺伝子セグメントは、ＶＨ１およびＶＨ１４から選択されるマウスＶＨ遺伝子ファミリーに由来するものであり、ヒト化は、ＶＨ１またはＶＨ１４のマウスフレームワークの、ヒトＶＨ１遺伝子由来フレームワークでの置き換えを含む。一実施形態において、ヒトＶＨ１遺伝子は、１−２、１−３、１−８、１−１７、１−１８、１−２４、１−４５、１−４６、１−５８、および１−６９から選択される。具体的な実施形態では、該ｍＶＲ遺伝子が１−５８遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−１８遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が１−２６遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−２遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が１−５０遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−４６遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が１−１７遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−２遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が１−４２遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−２遺伝子である；該ｍＶＲが１４−１遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−２遺伝子である；または該ｍＶＲが１４−２遺伝子であり、該ヒト遺伝子が１−２遺伝子である。
【００５７】
一実施形態において、該ｍＶＲ遺伝子セグメントは、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ１０、ＶＨ１１およびＶＨ１３遺伝子から選択されるマウスＶＨ遺伝子に由来するものであり、ヒト化は、マウスフレームワークの、ヒトＶＨ３遺伝子由来フレームワークでの置き換えを含む。一実施形態において、ヒトＶＨ３遺伝子は、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−１６、３−２０、３−２１、３−２３、３−３０、３−３３、３−３５、３−３８、３−４３、３−４８、３−４９、３−５３、３−６４、３−６６、３−７２、３−７３および３−７４から選択される。具体的な一実施形態では、該ｍＶＲ遺伝子が７−１遺伝子であり、該ヒト遺伝子が３−７２遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が３−６遺伝子であり、該ヒト遺伝子が４−５９遺伝子である；該ｍＶＲ遺伝子が５−６遺伝子であり、該ヒト遺伝子が３−２１遺伝子である。
【００５８】
一実施形態において、該ｍＶＲ遺伝子セグメントは、ＶＨ３およびＶＨ１２から選択されるマウスＶＨ遺伝子ファミリーに由来するものであり、ヒト化は、マウスフレームワークの、ヒトＶＨ４遺伝子由来フレームワークでの置き換えを含む。一実施形態において、ヒトＶＨ４遺伝子は、４−４、４−２８、４−３１、４−３４、４−３９、４−５９および４−６１から選択される。
【００５９】
一実施形態において、該ｍＶＲ遺伝子セグメントはマウスＶＨ４遺伝子ファミリーに由来するものであり、ヒト化は、マウスＶＨ４フレームワークの、ヒトＶＨ６遺伝子由来フレームワークでの置き換えを含む。一実施形態において、ヒトＶＨ６遺伝子は６−１である。
【００６０】
一実施形態において、該ｍＶＲ遺伝子セグメントはマウスＶＨ９遺伝子ファミリーに由来するものであり、ヒト化は、マウスＶＨ９フレームワークの、ヒトＶＨ７ファミリーのヒトＶＨ遺伝子由来フレームワークでの置き換えを含む。一実施形態において、ヒトＶＨ遺伝子は７−４−１および７−８１から選択される。
【００６１】
一実施形態において、ヒト化は、さらに、マウスＣＤＲ内に、該マウスＣＤＲがより密接にヒトＣＤＲに対応するように１つ以上の保存的もしくは非保存的置換、１つ以上の欠失および／または１つ以上の挿入を行なうことを含む。
【００６２】
一実施形態において、ヒト化は、さらに、ヒトフレームワーク内に、該ヒトフレームワークがより密接にマウスフレームワークに対応するように、１つ以上の保存的もしくは非保存的置換、１つ以上の欠失および／または１つ以上の挿入行なうことを含む。
【００６３】
一態様において、機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む遺伝子改変マウスを提供し、ここで、該マウスでは、軽鎖を欠いており、ＣＨ１領域を欠いているか、またはＣＨ１領
域とヒンジ領域を欠いている重鎖抗体が発現される。
【００６４】
一実施形態において、該マウスは、ＣＨ１領域をコードしている配列を欠いているか、またはヒンジとＣＨ１領域をコードしている配列を欠いている免疫グロブリン遺伝子を含むものである。一実施形態において、該配列を欠いている免疫グロブリン遺伝子は１つ以上の重鎖定常遺伝子である。具体的な一実施形態では、該配列を欠いている免疫グロブリン遺伝子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３遺伝子から選択される。具体的な一実施形態では、該マウスは、ＣＨ１領域、および／またはヒンジ領域、および／またはＣＨ１領域とヒンジ領域を有するＩｇＭ遺伝子を含むものである。
【００６５】
一実施形態において、該抗体は抗原に応答して発現され、該抗体は該抗原に特異的に結合する。
【００６６】
一実施形態において、該抗体はマウスＶＨドメインを含む。具体的な一実施形態では、該マウスＶＨドメインは、１−２６、１−４２、１−５０、１−５８、１−７２、３−６、５−６、７−１、１４−１および１４−２から選択されるマウスＶＨ遺伝子セグメントを含む。
【００６７】
一実施形態において、該抗体はヒトＶＨドメインを含む。具体的な一実施形態では、ヒトＶＨドメインは、１−２、１−１８、１−４６、３−２１、３−７２および４−５９から選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する配列を含む。
【００６８】
一態様において、本質的に、各々ＣＨ１ドメインを欠いている２つのＩｇＧ１重鎖からなる結合タンパク質を発現する遺伝子改変マウスを提供し、ここで、該マウスではＣＨ１領域を含むＩｇＭが発現され、該マウスはそのゲノムから、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡを発現できない。
【００６９】
一実施形態において、各々ＣＨ１ドメインを欠いている免疫グロブリン重鎖は、本質的に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ヒトまたはマウス重鎖免疫グロブリン可変領域、任意選択でヒンジ領域、マウスＣＨ２領域、およびマウスＣＨ３領域からなる。具体的な一実施形態では、該重鎖免疫グロブリン可変領域はヒト可変領域であり、ヒンジ領域が存在しており、該マウスは機能性免疫グロブリン軽鎖の遺伝子の遺伝子座を含む。
【００７０】
一態様において、軽鎖を欠いており、ＣＨ１領域を完全に、または一部欠いている重鎖抗体を発現するマウスを提供し、ここで、該マウスでは、Ｂ細胞上にＢ細胞受容体が発現され、その表面上の該Ｂ細胞受容体は、免疫グロブリンヒンジ領域に直接融合された、またはＣＨ２領域に直接融合された免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む結合分子をディスプレイする。該結合分子はＣＨ１領域を欠いている。一実施形態において、該結合分子はＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。
【００７１】
一態様において、マウスを対象抗原で免疫化すること（ここで、該マウスは、ＣＨ１領域をコードしている配列を欠いているＩｇＧ遺伝子を含むものであり、該マウスはインタクトなＩｇＭ定常領域遺伝子を含む）、該マウスに該対象抗原に対する免疫応答を生じさせること、および該マウスから、該対象抗原を特異的に認識する細胞またはタンパク質を単離すること（ここで、該細胞またはタンパク質は、ＣＨ１ドメインを欠いており、同系の軽鎖を欠いており、該対象抗原に特異的に結合する重鎖抗体を含む）を含む、重鎖抗体の作製方法を提供する。
【００７２】
一実施形態において、該マウスは、機能性軽鎖遺伝子を含むものである。一実施形態において、該マウスは、λ、κおよびその組合せから選択される機能性軽鎖遺伝子を含むも
のである。
【００７３】
一実施形態において、該マウスは、マウス重鎖Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの全部または実質的に全部の、１つ以上のヒトＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントでの置き換えを含むものである。
【００７４】
一実施形態において、ＣＨ１をコードしている配列を欠いているＩｇＧ遺伝子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびその組合せから選択される。
【００７５】
一実施形態において、ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ遺伝子はＩｇＧ１であり、該マウスは、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはその組合せをコードしている遺伝子を欠いている。一実施形態では、ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ遺伝子はＩｇＧ２ａであり、該マウスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはその組合せをコードしている遺伝子を欠いている。一実施形態では、ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ遺伝子はＩｇＧ２ｂであり、該マウスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、またはその組合せをコードしている遺伝子を欠いている。一実施形態では、ＣＨ１配列を欠いているＩｇＧ遺伝子はＩｇＧ３であり、該マウスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはその組合せをコードしている遺伝子を欠いている。
【００７６】
一実施形態において、該マウスは、表面上にＢ細胞受容体を有するＢ細胞を含むものであり、該Ｂ細胞受容体は、対象抗原に結合する再構成重鎖ＶＤＪを含み、また、該Ｂ細胞受容体は、ＣＨ１領域を含むＩｇＭを含み、該ＩｇＭは軽鎖を含む。一実施形態において、該軽鎖はＶＪが再構成されている。具体的な一実施形態では、該軽鎖は、対象抗原に結合する再構成重鎖ＶＤＪと同系のκ軽鎖またはλ軽鎖である。
【００７７】
一態様において、本発明によるマウスにおいて作製されるマウス重鎖抗体、ヒト重鎖抗体、またはキメラヒト／マウス重鎖抗体を提供する。
【００７８】
一態様において、本発明によるマウスにおいて作製される重鎖可変領域ヌクレオチド配列またはその断片を用いて作製されるマウス重鎖抗体、ヒト重鎖抗体、キメラヒト／マウス重鎖抗体、またはヒト化重鎖抗体を提供する。
【００７９】
他の実施形態を記載するが、当業者には、以下の詳細説明を検討すると自明となろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
生殖系列遺伝子改変を含むマウスであって、該生殖系列遺伝子改変は、ＩｇＧのＣＨ１をコードしているヌクレオチド配列の欠失を含み、該マウスは、
ＣＨ１ドメインを含むＩｇＭを発現し、
ＣＨ１ドメインおよび軽鎖を欠いているＩｇＧ抗体を血清中で発現し、かつ
ＣＨ１ドメインをコードしている配列を含むＩｇＧ  ｍＲＮＡを発現できない、
マウス。
（項目２）
前記ＣＨ１をコードしている前記ヌクレオチド配列の前記欠失が、ＩｇＧ１遺伝子内に存在している、項目１に記載のマウス。
（項目３）
機能性免疫グロブリン軽鎖遺伝子の遺伝子座を含む、項目１に記載のマウス。
（項目４）
軽鎖を欠いている前記ＩｇＧ抗体が、ヒト可変ドメインと、ＣＨ１ドメインを欠いているマウス定常ドメインとを含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目５）
軽鎖を欠いている前記ＩｇＧ抗体が、マウス可変ドメインと、ＣＨ１ドメインを欠いているマウス定常ドメインとを含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目６）
ＩｇＧ２ａ遺伝子の欠失を含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目７）
ＩｇＧ２ｂ遺伝子の欠失を含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目８）
ＩｇＧ２ａ遺伝子の欠失およびＩｇＧ２ｂ遺伝子の欠失を含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目９）
ＩｇＧ２ａ遺伝子の欠失およびＩｇＧ２ｂ遺伝子の欠失を含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１０）
１つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１１）
前記１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントがヒトＶＨ１ファミリー遺伝子セグメントである、項目１０に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１２）
前記ＶＨ１ファミリー遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ遺伝子セグメント１−８、１−１８、および１−６９のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３遺伝子セグメントと少なくとも９０％同一であるＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３領域を含む、項目１１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１３）
さらに、ヒトＤ遺伝子セグメントおよびヒトＪ遺伝子セグメントを含む、項目１１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１４）
項目１１に記載の遺伝子改変マウスであって、該マウスが、ＦＲ４をコードしている再構成免疫グロブリン遺伝子を含み、該ＦＲ４が、ヒトＤ１−７／Ｊ４、Ｄ３−１６／Ｊ６、Ｄ４−４／Ｊ４、Ｄ６−６／Ｊ４、Ｄ６−６／Ｊ２、Ｄ６−７／Ｊ４、またはＤ６−１９／Ｊ６によってコードされたＦＲ４と少なくとも９０％同一である、遺伝子改変マウス。
（項目１５）
１つ以上の内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの１つ以上のラクダ化ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む、項目１に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１６）
マウスにおいて体細胞変異重鎖抗体を作製するための方法であって、該方法は、
ａ．マウスを抗原で免疫化する工程であって、ここで、該マウスは、再構成されていないヒトまたはマウス重鎖免疫グロブリンの可変領域遺伝子セグメントを含み、機能性ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインをコードする少なくとも１つの対立遺伝子のヌクレオチド配列を欠いており、かつＣＨ１ドメインを含むＩｇＭを発現する、工程；
ｂ．該マウスを、該抗原に対する免疫応答が起こるのに充分な条件下で維持する工程；および
ｃ．該マウスから体細胞変異重鎖抗体を単離する工程であって、ここで、該体細胞変異重鎖抗体は、該ヒトまたはマウス重鎖免疫グロブリンの可変領域遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含み、かつ該抗原に特異的に結合する、工程
を含む、方法。
（項目１７）
Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの全部または実質的に全部の１つ以上のヒトＶ、ヒトＤおよびヒトＪ遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変マウスであって、該１つ
以上のヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントは、内因性マウス遺伝子座でマウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座に作動可能に連結されており、該マウス重鎖定常領域遺伝子の遺伝子座は、完全長ＩｇＭ遺伝子、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびその組合せから選択されるＩｇＧ遺伝子内のＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列内に欠失を含むＩｇＧ遺伝子を含み、該マウスは、ＣＨ１領域を有するＩｇＭを含むＢ細胞受容体を発現し、該ＩｇＭは、同系のλまたはκ軽鎖と会合している重鎖を含む、遺伝子改変マウス。
（項目１８）
前記１つ以上のヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが、ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４およびその組合せから選択される可変領域ファミリー由来のヒト遺伝子セグメントを含む、項目１７に記載の遺伝子改変マウス。
（項目１９）
前記１つ以上のヒト遺伝子セグメントが、１−２、１−８、１−１８、１−４６、１−６９、３−２１、３−７２、４−５９およびその組合せから選択される、項目１８に記載の遺伝子改変マウス。
（項目２０）
前記１つ以上のヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントが、Ｄ１−７、Ｄ３−１６、Ｄ４−４、Ｄ６−６、Ｄ６−７、Ｄ６−１９、Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４およびその組合せを含む、項目１８に記載の遺伝子改変マウス。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、マウスの野生型ＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１，上部）（ＣＨ１遺伝子セグメントと融合されたＪＨ領域遺伝子セグメント、続いて、ヒンジ領域、ＣＨ２遺伝子セグメント、およびＣＨ３遺伝子セグメントを示す）；ＣＨ１ドメインが欠失している構築物で標的化されるＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１，中央）；ならびにＣＨ１ドメインとヒンジ領域の両方が欠失している構築物で標的化されるＩｇＧ１遺伝子座（ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ，下部）を示す。
【図２】図２は、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ１が発現される遺伝子改変された遺伝子座を作製するためのマウスＩｇＧ１遺伝子の標的化を示す。
【図３】図３は、ＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１が発現される遺伝子改変された遺伝子座を作製するためのマウスＩｇＧ１遺伝子の標的化を示す。
【図４】図４は、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ１が発現され、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ２ａは発現されない遺伝子改変された遺伝子座を作製するためのマウス重鎖定常領域遺伝子座の標的化を示す。
【図５】図５は、ＣＨ１ドメインが欠失しており、ヒンジ領域が欠失しており、ＩｇＧ２ｂ遺伝子とＩｇＧ２ａ遺伝子が欠失している構築物で標的化されるマウス重鎖定常領域を示す。
【図６】図６は、ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１を有する遺伝子改変マウスの重鎖定常領域（上部）、およびＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１を有し、また、ＩｇＧ２ａ遺伝子を欠いており、ＩｇＧ２ｂ遺伝子を欠いている遺伝子改変マウスの重鎖定常領域（下部）を示す。
【図７】図７は、独立して、対照（マウスＦｃとのサイトカインエクトドメイン融合体）、ＣＨ１ドメインを欠いているキメラ（ヒトＶＲ）／（マウスＦｃ）重鎖抗体（ｈＶＲ−ｍＦｃΔＣＨ１）、ＣＨ１ドメインを欠いているラクダ化キメラ（ヒトＶＲ）／（マウスＦｃ）重鎖抗体（ｈＶＲ＊−ｍＦｃΔＣＨ１）、キメラ（ヒトＶＲ）／（マウスＦｃ）重鎖抗体（ｈＶＲ−ｍＦｃ）、ラクダ化キメラ（ヒトＶＲ）／（マウスＦｃ）重鎖抗体（ｈＶＲ＊−ｍＦｃ）（ＣＨ１ドメインを有するｍＦｃ（ｍＦｃ）またはＣＨ１ドメインを有しないｍＦｃ（ｍＦｃΔＣＨ１））を発現するように操作されたＣＨＯ細胞由来のＣＨＯ細胞上清みのウエスタンブロットを示す。
【図８】図８は、野生型マウス（左）およびＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いている（ヘテロ接合性）遺伝子改変マウス（右）由来のマウス血清の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウエスタンブロットの画像を示す（抗マウスＩｇＧを用いてブロット）；該重鎖の模式図も示しており、これらは分子量マーカー位置としてのものである。
【図９】図９は、野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いている４匹の遺伝子改変マウス（ホモ接合性；それぞれ、ＨＯ  １、ＨＯ  ２、ＨＯ  ３、ＨＯ  ４と表記）由来のマウス血清の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからのウエスタンブロットの画像を示す（抗マウスＩｇＧを用いてブロット）；各マウス（ＷＴまたはＨＯ）を２つのレーンで表示し、各動物について血清の１：５および１：１０の希釈物に対応するレーンの上部に角括弧を示している（各々、左から右に連続するレーン）。
【図１０】図１０は、正常なＩｇＧ１抗体（左）およびＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いている重鎖抗体の模式図を示す。
【図１１】図１１は、野生型マウス（ＷＴ）およびＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１を含む遺伝子改変マウス（ＨＯ；ＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いている重鎖抗体が発現されるホモ接合性マウス）のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂの別々の血清免疫グロブリンアッセイを示す。対照はプールされたヒト血清である。
【図１２】図１２は、ＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジ領域配列が欠如している改変内因性マウス重鎖の遺伝子座に、マウス重鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｔｙｅ）のＲＮＡから増幅させた１１個の独立したＲＴ−ＰＣＲクローンのタンパク質の配列を示す。Ｂ１＝配列番号：１９；Ｂ２＝配列番号：２１；Ｂ３＝配列番号：２３；Ｂ５＝配列番号：２５；Ｄ２＝配列番号：２７；Ｄ５＝配列番号：２９；Ｄ６＝配列番号：３１；Ｅ２＝配列番号：３３；Ｅ８＝配列番号：３５；Ｅ１０＝配列番号：３７；Ｆ６＝配列番号：３９。小文字の塩基は、組換えの間の変異および／またはＮ付加のいずれかにより生じた非生殖系列の塩基を示す。点は、フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列の上部に表記）の適正なアラインメントのための配列内の人為的ギャップを表す。内因性ＩｇＧ１のＣＨ２領域（ＣＨ２）である定常領域由来の最初の９個のアミノ酸を各クローンについて示す。
【図１３】図１３は、ＩｇＧ１  ＣＨ１領域配列が欠如している改変内因性マウス重鎖の遺伝子座にヒト重鎖遺伝子配列を有するマウスの脾細胞のＲＮＡから増幅させた７つの独立したＲＴ−ＰＣＲクローンのタンパク質の配列を示す。Ａ８＝配列番号：５１；Ｃ２＝配列番号：５３；Ｄ９＝配列番号：５５；Ｃ４＝配列番号：５７；Ｈ８＝配列番号：５９；Ａ５＝配列番号：６１；Ａ２＝配列番号：６３。小文字の塩基は、組換え時の変異および／またはＮ付加のいずれかにより生じた非生殖系列の塩基を示す。点は、フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）（配列の上部に表記）の適正なアラインメントのための配列内の人為的ギャップを表す。１３個のアミノ酸の内因性ＩｇＧ１のヒンジ領域（ＨＩＮＧＥ）である定常領域の最初の７個のアミノ酸を各クローンについて示す。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
詳細説明
本発明は記載の特定の方法および実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は種々であり得る。本明細書で用いる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定を意図するものでない。
【００８２】
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技
術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料を以下に記載する。本明細書において挙げた刊行物はすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
ＣＨ１ドメインおよび抗体の生成
ＣＨ１ドメインを欠いている抗体、例えば、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を欠いている抗体を作製する遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。該遺伝子改変された非ヒト動物は、機能性免疫グロブリン重鎖ドメイン（ＣＨ１ドメイン）、例えば、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインの欠如を含む遺伝子改変を含むものであり、一部の実施形態では、機能性ＣＨ１ドメインを欠いている該免疫グロブリン重鎖においてヒンジ領域の欠失を含むさらなる改変を含むものであり、該非ヒト動物は機能性ＩｇＭを発現する。他の改変としては、ＩｇＧ１およびＩｇＭ以外のアイソタイプを非機能性にすること、例えば、ＩｇＤ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＡおよびＩｇＥに対して遺伝子における欠失、または遺伝子の欠失を行なうことが挙げられる。また、遺伝子改変された非ヒト胚、細胞、ならびに非ヒト動物、非ヒト胚および細胞を作製するための標的化構築物も提供する。
【００８４】
重鎖抗体（すなわち、軽鎖を欠いている抗体）を作製し得る遺伝子改変細胞を作製する取組みでは、他の種、例えば、ラクダ類および特定の魚類における重鎖抗体の模倣に重点が置かれている。このアプローチは、マウスＥＳ細胞を遺伝子改変してＩｇＭおよびＩｇＧの免疫グロブリン定常領域遺伝子においてＣＨ１ドメインを欠失させるため、また、ラクダ類またはラクダ化ＥＳ細胞に重鎖可変領域（すなわち、ＶＨＨまたはＶＨＨ様）を導入するために使用されている。ＩｇＭおよびＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失は、おそらく、遺伝子改変された遺伝子座からのラクダ化抗体の形成と競合する内因性の天然抗体の形成を抑制するために行なわれる。ＶＨＨ遺伝子セグメントの付加は、おそらく、ＣＨ１欠失との組合せで重鎖抗体の形成を模倣させるために行なわれる。かかる動物由来の重鎖抗体はＶＨＨ遺伝子セグメントを含む。インビトロ試験により、非ラクダ類ＶＨドメインは、ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖内に存在している場合では、発現可能な重鎖抗体を必ずしも満足に形成しないことが示されているため、ＶＨＨ遺伝子セグメントは、おそらく、重鎖抗体の適正な発現に必要であると考えられている。
【００８５】
しかしながら、ラクダ類（および一部の軟骨魚類）では、ＣＨ１ドメインまたはＣＨ１様ドメインを含む遺伝子が存在している。ＣＨ１ドメインを欠いているＶＨＨ含有抗体は、ＲＮＡのスプライシングによって、またはＣＨ１領域をコードしているであろうＤＮＡ配列の再構成によって生じると考えられている。したがって、ラクダ類であっても、ＣＨ１領域をコードしているＤＮＡ配列は保持される。ヒトは（ある状況下において）、ＣＨ１領域を完全に、または一部欠いている重鎖抗体を作製することがあり得るため（例えば、ヒト重鎖病において）、一連の所与の状況下において、非ラクダ類（マウスなど）においてＣＨ１領域を欠いている重鎖が形成されるようにすることが可能であり得る。このアプローチは、ＣＨの生殖系列構造の破壊に依存するのではなく、動物の軽鎖の遺伝子座を非機能性にすることに依存するものである。このアプローチでは、非機能性の軽鎖の遺伝子座があると、発現に同系の軽鎖を必要とする重鎖（例えば、ＣＨ１領域を有する完全長重鎖）は、κまたはλ軽鎖いずれかを欠くため作製されず、そのため、軽鎖なしで発現および分泌され得る重鎖（すなわち、ＣＨ１領域を欠いている重鎖）のみが発現および分泌されると仮定している。該アプローチは、再構成されて機能性軽鎖遺伝子が形成され得る機能性κまたはλ遺伝子セグメントがないこと、およびなんら機能性の再構成軽鎖遺伝子がないことに依存するものであり、したがって、両方の生殖系列軽鎖の遺伝子座の機能性を破壊するために遺伝子操作（例えば、ノックアウト）が必要とされる。該アプローチは「天然の」プロセスに依存するものであるため内因性ＣＨ１ヌクレオチド配列の使用が不要となり、ＣＨ１サイレンシングの「天然の」プロセスはクラススイッチにおいて起こる
ものである。機能性軽鎖遺伝子を含む動物ではいずれも、かかるプロセスの使用の可能性は全くないようである。さらに、「天然の」プロセスには、大量の正常なＲＮＡ（すなわち、ＣＨ１領域をコードしている領域を含むＲＮＡ）の合成が含まれることは明らかである。
【００８６】
免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（および任意選択でヒンジ領域）を欠いている抗体、例えば重鎖抗体、および例えば、ＶＨドメイン（例えば、マウスまたはヒトＶＨドメイン）を含む抗体を作製するマウスを作製するための組成物および方法を提供する。該方法は、内因性非ＩｇＭ  ＣＨ１領域を選択的に非機能性にすること（例えば、ＣＨ１ドメインの配列の欠失により）、および再構成されていない内因性マウス可変領域（ｍＶＲ）遺伝子セグメントまたは再構成されていないヒト可変領域（ｈＶＲ）遺伝子セグメントのいずれかを内因性マウス可変領域遺伝子座において使用し、マウスにおいてキメラヒト／マウス抗体を作製することを含む。ＣＨ１ドメインの欠失は１つ以上のＩｇＧ遺伝子において行なわれるが、ＩｇＭ遺伝子には行なわない。該アプローチでは、１つ以上のＩｇＧ  ＣＨ１ドメインを選択的に非機能性にするが、機能性ＩｇＭはそのままにしておく。１つ以上のＩｇＧ  ＣＨ１ドメインの欠失に加え、さらなる実施形態は、ＣＨ１ドメインが欠失されているか、または非機能性にされたＩｇＧ（１つまたは複数）のヒンジ領域の欠失、または該領域を非機能性にすることを提供する。
【００８７】
遺伝子改変された非ヒト動物のすべてのＩｇアイソタイプが非機能性ＣＨ１またはＣＨ１ドメイン（および任意選択でヒンジ）の欠失を示すとは限らないため、ＩｇＧ  ＣＨ１欠失アプローチでは、動物における天然のＢ細胞発生における比較的保存的な破壊が使用される。したがって、ＣＨ１改変はＩｇＭ分子では起こらず、したがって、機能性ＣＨ１を有するＩｇＭに依存するＢ細胞発生の初期の段階に影響を及ぼさない。ＩｇＭは改変されないため、ＩｇＧのＣＨ１ドメイン（および任意選択でＩｇＧのヒンジ領域）の１つ以上の欠失を有するが、ＩｇＭのＣＨ１ドメインは有しない動物では、ＩｇＧの状況の可変ドメインの提示前に、クローン選択段階において、可変領域の満足できる大量のレパートリーがプロセッシングされ得るはずである。したがって、種々の実施形態において、重鎖抗体における使用に利用可能な多様な可変領域に対する遺伝子改変（１つまたは複数）の有害な影響（あれば）によって、ＩｇＧに関連する選択に利用可能な可変領域のプールは、マイナスの影響を受けないはずである。さらに、生殖系列において非機能性にする（例えば、欠失される）ＣＨ１配列がＩｇＧ１である場合、マウスは、ＣＨ１ドメインをコードするＲＮＡの作製能を欠いている。
【００８８】
非ヒト動物を遺伝子改変して１つ以上のＩｇＧアイソタイプのＣＨ１ドメインまたはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を非機能性にすると、ＶＨ領域の完全なまたは実質的に完全なレパートリーから、重鎖抗体において発現する適当なＶＨ領域を選択し得るマウスがもたらされ得る。ＩｇＧアイソタイプを選択的に改変すると（ＩｇＭはしない）、ＣＨ１ドメインを欠くため、またはＩｇＭのＣＨ１ドメインを欠くため、選択に残るＶＨ領域の数が減少する可能性が回避される。したがって、ＶＨ領域のより完全なレパートリーが、ＩｇＧ（ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いている）の状況での選択に利用可能になる。したがって、本発明による遺伝子改変マウスにおけるＶＨドメインの選択は、例えば、ＩｇＭ構造の改変によるものである初期のＩｇＭ依存性Ｂ細胞発生のハードルの克服が、どのＶＨドメインによって補助され得るかに依存するものでない。そうではなく、初期のＩｇＭ依存性段階は通常どおりに起こるはずであり、ＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインを欠いており、ヒンジ領域を欠いているＩｇＧの状況で発現するための好適性に関する選択に利用可能な重鎖の大きなレパートリーがもたらされる。
【００８９】
したがって、種々の実施形態において、本発明による遺伝子改変マウスでは機能性Ｉｇ
Ｍの発現が維持されるはずであり、これにより、より自然なクローン選択プロセスの機会がもたらされるはずである。例えば、機能性ＩｇＭ（例えば、ＣＨ１ドメインを欠いていないＩｇＭ）がある場合、サロゲート軽鎖と同系の軽鎖の両方がＩｇＭのＣＨ１ドメインを介して結合することができ、初期のＢ細胞発生における選択プロセスに関与することができる。本発明による遺伝子改変マウスでは、ＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチが最初の選択段階であり、ここでは、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能性ＣＨ１ドメインと機能性ヒンジを欠いている定常ドメインの状況で発現され得る重鎖可変ドメインの任意の選択がみられると考えられる。
【００９０】
Ｂ細胞発生におけるＩｇＭ
ラクダ類、特定の魚類および病的状態における観察結果により、ある状況下では、同系の軽鎖の非存在下において、重鎖定常領域のＣＨ１ドメインを欠いている抗体が発現され得ることが示されているが、抗体産生Ｂ細胞の正常な発生には、一般的にＣＨ１ドメインの存在が必要とされる。ＩｇＭを含む重鎖アイソタイプにはすべてＣＨ１ドメインが含まれている。サロゲート軽鎖および同系の軽鎖はともに、ＩｇＭの状況の重鎖のＣＨ１ドメインを介して所与の重鎖と相互作用すると考えられる。重鎖抗体の発生が構造の完全性またはＩｇＭアイソタイプ重鎖の機能性に依存する範囲では、ＩｇＭの構造の完全性または機能の破壊は望ましくないであろう。
【００９１】
抗体の正常な発生には、抗体が、機能性で有用な抗体の残存および最終的な発現をもたらす数多くの複雑な選択スキームを経て残存することが必要とされる。抗体構造の破壊は、該構造破壊によって抗体が１つ以上の自然な抗体選択スキームの充足に対して有効に競合して進化する能力の消失がもたらされる程度まで、抗体の残存および最終的な発現に有害であると示されることがあり得る。
【００９２】
抗体発生の初期では、抗体重鎖は、さまざまな選択スキームを経て自然選択により適当な重鎖がさらなる選択を受けて最終的に機能性の親和性成熟抗体が形成される選択プロセスを受ける。前駆Ｂ細胞（またはプロＢ細胞）内で組換えを受けた重鎖遺伝子セグメントから発現された抗体重鎖は、正常に、ＩｇＭアイソタイプにおいて、プロＢ細胞の表面上への提示のためにサロゲート軽鎖と対を形成し、プレＢ細胞受容体またはプレＢＣＲと称される構造（これは、他の共受容体を含む）を形成する。プレＢＣＲが該細胞表面上に提示されたら、プレＢＣＲは、その複合体の適切な形成を該細胞にシグナル伝達し、該細胞に対して、重鎖がこの初期の選択段階を通過したことを有効に指示すると考えられる。したがって、該細胞には、重鎖がさらなる選択を受けるかもしれないことが情報伝達される。重鎖が、ＩｇＭおよびサロゲート軽鎖の状況において提示された場合にプレＢＣＲの形成に有害な欠陥を含む場合、該細胞はアポトーシスを受ける。該細胞がアポトーシスを受けると、重鎖の重鎖可変領域の有用性、または多様性に対する寄与が失われる。したがって、抗体選択の非常に初期の段階では、ＩｇＭアイソタイプの状況で重鎖とともにサロゲート軽鎖の提示が必要とされる。サロゲート軽鎖はＩｇＭと、少なくとも一部においてＩｇＭのＣＨ１ドメインを介して相互作用すると考えられる。この初期の接合部（例えば、非機能性ＣＨ１ドメイン）における抗体構造の機能不全または破壊により、クローン選択機能不全、重鎖を発現するプロＢ細胞の減少、および有用な抗体において特定の重鎖可変ドメインが使用される可能の低下がもたらされ得る。
【００９３】
プレＢＣＲを有する細胞がこの選択段階を経たら、次の選択段階で、重鎖は同系の軽鎖と対合することが必要とされる（例えば、マウスおよびヒトのκまたはλのいずれか）。対合した重鎖／同系の軽鎖構造は、細胞、ここでは、ＩｇＭのＣＨ１ドメインを通してＩｇＭアイソタイプの状況において、ナイーブなプレＢ細胞の表面上に再度提示される。この表面上の複合体により、機能性の膜結合型Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）がもたらされる。このＢＣＲは、細胞に、該重鎖がさらなる選択に適していること、および該細胞は、今度は
、この特定の軽鎖を発現するように拘束され得、さらなるＢ細胞成熟段階（例えば、親和性成熟およびクラススイッチ）に進み得ることをシグナル伝達すると考えられる。重鎖が、ＩｇＭおよびその同系の軽鎖の状況で提示された場合にＢＣＲの形成に対して有害な欠陥を含む場合、該細胞はアポトーシスを受ける。該細胞がアポトーシスを受けると、該重鎖の重鎖可変領域の有用性または多様性に対する寄与が失われる。したがって、抗体選択の非常に初期の段階では、重鎖とともにＩｇＭアイソタイプの状況のサロゲート軽鎖の提示が必要とされる。この場合も、この初期の接合部の抗体構造（例えば、非機能性ＣＨ１ドメイン）の欠損または破壊により、クローン選択の失敗および該重鎖を発現するプレＢ細胞の付随的な減少がもたらされることがあり得る。
【００９４】
ここまで選択に残ったら、ＩｇＭの状況においてその同系の軽鎖と対合している該重鎖を提示しているプレＢ細胞は、次いで成熟プロセスを受け、該プロセスにより、最終的にクラススイッチ、および該重鎖と同系の軽鎖がＩｇＧアイソタイプの状況でＢ細胞表面上に提示されるさらなる選択機構がもたらされる。ＣＨ１ドメインを欠いている、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ重鎖の選択（あれば）が起こっているとしたら、この段階かもしれない。本発明による動物では、重鎖可変領域の通常のレパートリーが、可変ドメインが残ってＣＨ１ドメインを欠いているか、またはＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ重鎖に発現され得るかどうかに基づいた選択に利用可能であり得ると考えられる。対照的に、ＩｇＭが障害されたマウスは、障害ＩｇＭの状況で選択に残り得る可変領域のみがクラススイッチに利用可能となり得るため、おそらく、重鎖可変領域の完全なレパートリーを提示しない。
【００９５】
したがって、機能性ＩｇＭを欠いている動物では、そうでない場合は適当な重鎖可変遺伝子セグメントの再構成後にＢ細胞集団を作製する能力の著しい低下が起こり得る。かかる場合では、豊富な供給量の重鎖可変領域が利用可能である（すなわち、動物は再構成され得る適当な数の重鎖可変領域遺伝子セグメントを有する）場合であっても、選択プロセス中の該重鎖の残存を抑制するＩｇＭの欠陥のため、望ましい度合の多様性を示す満足なＢ細胞集団が形成されないことがあり得る。
【００９６】
機能性ＩｇＭ遺伝子での重鎖抗体の生成
対象免疫原で非ヒト動物を免疫化することによる抗体の作製に充分な多様性をもたらすために、Ｂ細胞発生中に提示されたときにＩｇＭの状況で有効に選択に残り得る適当な数の再構成された重鎖可変領域が維持されていることが望ましい。したがって、免疫グロブリン重鎖に非機能性ＣＨ１ドメインまたは非機能性ＣＨ１ドメインと非機能性ヒンジ領域を含む遺伝子改変された非ヒト動物は、両方のＩｇＭ対立遺伝子にＣＨ１欠失を含むべきではない。
【００９７】
一部の実施形態では、遺伝子改変された動物において重鎖抗体を作製するためにすべてのＩｇアイソタイプのＣＨ１ドメインを欠失させることは望ましくない。したがって、ＩｇＧのＣＨ１ドメインまたはその断片をコードしているヌクレオチド配列を無効にする、欠失させる、あるいは非機能性にする（一部の実施形態では、ＩｇＧのヒンジ領域も無効にする、欠失させる、あるいは非機能性にする）が、他のアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ）では機能性ＣＨ１ドメインが保持されるようにすることにより、遺伝子改変された非ヒト動物において重鎖抗体を作製するための方法および組成物を提供する。他のアイソタイプのＣＨ１ドメイン（選択された１つ以上のＩｇＧ  ＣＨ１ドメイン以外）の機能性により、重鎖可変ドメインが非ＩｇＧアイソタイプの状況（例えば、ＩｇＭアイソタイプ）で提示される発生段階が破壊されない、または実質的に破壊されないＢ細胞発生プロセスがもたらされると考えられる。したがって、例えば、Ｂ細胞発生中でのＩｇＭ依存性段階の破壊は比較的最小限になる。本発明（これは特許請求の範囲に記載）に関して制限するものでないが、本発明者らは、ＩｇＭの状況の重鎖可変ドメインの提示と関連している初期
の選択段階の破壊を最小限にすると、残ってＩｇＧアイソタイプへのクラススイッチを受け、機能性ＣＨ１ドメインを欠いている、または機能性ＣＨ１ドメインを欠いており、機能性ヒンジ領域を欠いているＩｇＧの状況での選択を受ける重鎖可変領域を有する細胞がより多くもたらされることを提案する。
【００９８】
したがって、遺伝子改変された非ヒト動物を、該動物を作製するための方法および組成物とともに提供し、ここで、該遺伝子改変により、ＩｇＭドメインでないＩｇドメインにおいて機能性ＣＨ１ドメインを欠くことになる（さらなる実施形態では機能性ヒンジ領域を欠くことになる）。種々の実施形態において、ＣＨ１またはＣＨ１とヒンジ領域（あるいはその実質的に機能性の部分）をコードしている配列が遺伝子改変された動物のゲノムにおいて欠失している。遺伝子改変された非ヒト動物は、重鎖抗体（すなわち、軽鎖を欠いている抗体）、例えば、完全ヒト抗体（ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むように遺伝子改変されたマウスにおいて）ならびにキメラヒト／マウス抗体（例えば、ヒト可変領域遺伝子セグメント、Ｄ領域およびＪ領域を含むように遺伝子改変されたマウスにおいて、あるいは機能性ＣＨ１ドメインを欠いているか、または機能性ＣＨ１ドメインを欠いており、機能性ヒンジ領域を欠いている遺伝子改変ＩｇＧアイソタイプにトランススイッチされ得るヒト導入遺伝子を有するマウスにおいて）の作製において有用である。
【００９９】
重鎖抗体
抗体はヒト治療薬として有用である。また、重鎖抗体、すなわち、軽鎖を欠いている抗体もヒト治療薬として有用である。重鎖抗体は軽鎖を欠いているため小型になり、したがって、軽鎖を含む抗体よりも良好な組織浸透を示すが、従来の抗体と比較すると類似した、またはより有利な薬物動態プロフィールを有し、類似したエフェクター機能が保持されていることが予測される。また、重鎖抗体は小型になるため、所与の容量でより高い用量での投与が可能になる。よく使用される抗体投与方法は皮下注射であり、所与の投薬量の抗体に対する投与容量の低減により、患者に有益性がもたらされ、大容量の皮下注射による合併症および痛みが回避され得る。
【０１００】
重鎖抗体の別の利点は、単一の治療薬において、２種類の異なるエピトープに対する特異性を有する重鎖をヘテロ二量体化することにより二重特異性抗体を作製できることである。重鎖抗体は軽鎖を欠いていることから、いずれかの重鎖の結合親和性または特異性を妨げないだけでなく、二重特異性抗体の適当な発現を可能にし得る共通する軽鎖を操作する必要がないため、二重特異性抗体の作製に特に適している。
【０１０１】
本発明の遺伝子改変された動物を用いて多種多様な重鎖抗体が作製され得る。本明細書に記載の遺伝子改変は、例えば、任意の適当なマウス系統において行なわれ得る。マウス系統は、選択される重鎖抗体の作製に適した任意の遺伝的背景を有するものであり得る。具体的な実施形態が包含される数例の遺伝的背景を以下に示す。
【０１０２】
遺伝子改変された動物は、本発明に従う遺伝子改変と、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子座と置き換えられた１つ以上の再構成されていないヒト可変領域遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないＤ領域遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないＪ領域遺伝子セグメントとを含むマウスであり得る。かかるマウスでは、ヒト化可変領域遺伝子座が、内因性マウス定常ドメイン配列の上流に再構成された可変領域遺伝子が形成されるように組み換えられ得る（この場合、該免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つ以上が本明細書に記載のようにして改変される）。したがって、該マウスではキメラヒト可変／マウス定常重鎖抗体が作製され得る。対象免疫原に曝露されると、該マウスでは、親和性成熟し、該対象免疫原のエピトープに特異的に結合し得る本発明による重鎖抗体が生成され得る。
【０１０３】
遺伝子改変された動物は、再構成されていない内因性マウス可変領域遺伝子セグメント、再構成されていない内因性マウスＤ領域遺伝子セグメント、および再構成されていない内因性マウスＪ領域遺伝子セグメントを含む内因性マウス可変領域を含むマウスであってもよく、ここで、該マウスは、本明細書に記載のマウス重鎖定常領域の遺伝子改変を含むものである。したがって、該マウスではマウス重鎖抗体が作製され得る。対象免疫原に曝露されると、該マウスでは、親和性成熟し、該対象免疫原のエピトープに特異的に結合し得る本発明による重鎖抗体が生成され得る。
【０１０４】
遺伝子改変された動物は、再構成されていないヒト可変領域遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＤ遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪ遺伝子セグメント、ミュー遺伝子、ならびにトランススイッチを可能にする配列を含むヒト導入遺伝子を含むマウスであってもよい。該マウスは、さらに、本明細書に記載のマウス重鎖定常領域の改変を含むものであってもよい。したがって、該マウスでは、完全ヒトＩｇＭ抗体、およびトランススイッチによりキメラヒト可変／マウス定常抗体が作製され得、ここで、該定常ドメインは、本明細書に記載の遺伝子改変を含む。対象免疫原に曝露されると、該マウスでは、親和性成熟し、該対象免疫原のエピトープに特異的に結合し得る本発明による重鎖抗体が生成され得る。
【０１０５】
重鎖抗体のインビトロ発現
本発明者らは、通常のヒトまたはマウス重鎖可変領域（ｈＶＲまたはｍＶＲ）が、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧの状況のインビトロ系において発現され得ることを確立した。本発明者らは、野生型マウスＩｇＭを有するマウスの再構成されていないｈＶＲミニ遺伝子座からｈＶＲを発現させた。発現されたｈＶＲはＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ２ｂ上にクローニングされ（その結果、ｈＶＲ−ＩｇＧ２ｂΔＣＨ１が発現される）、ｈＶＲ−ＩｇＧ２ｂΔＣＨ１構築物で一過的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞によって分泌され、野生型ＩｇＭを有するマウスにおいて選択されたｈＶＲは、機能性ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧにスイッチされると、すなわち、重鎖抗体として細胞によって発現され分泌され得ることが有効に確立された。
【０１０６】
本発明者らは、ＣＨ１ドメインを欠いており、ｈＶＲまたはヒトラクダ化ＶＲ（ｈＶＲ＊）を有する重鎖をＣＨＯ細胞において発現させるためのインビトロ系を構築した。ＶＲは、内因性マウス重鎖の遺伝子座のヒト重鎖可変領域ミニ遺伝子座（３つのヒトＶ領域遺伝子セグメント６−１、１−２および１−３、すべてのヒトＤＨ遺伝子セグメント、ならびにすべてのヒトＪＨ遺伝子セグメントを有する）での置き換えを含むＲＡＧマウスから得た。内因性マウス免疫グロブリンのκおよびλ軽鎖の遺伝子座はインタクトで機能性であった。
【０１０７】
キメラ重鎖（ｈＶＲ−ｍＦｃ）およびラクダ化重鎖（ｈＶＲ＊−ｍＦｃ）の構築物を、ＣＨＯ細胞内での発現のために、上記のミニ遺伝子座を有するマウスから得たＶＲ配列を用いて作製した。キメラ重鎖は、キメラ重鎖（ｈＶＲ−ｍＦｃ）とマウス軽鎖を含む機能性抗体が形成される該マウスにおけるＢ細胞発生中の通常のＶ−Ｄ−Ｊ組換えの産物であった。ｈＶＲ−ｍＦｃおよびｈＶＲ＊−ｍＦｃの構築物は、ＣＨ１ドメインを有するものとＣＨ１ドメインを欠いているものの両方を作製した。
【０１０８】
ＣＨＯ細胞内でのｈＶＲ−ｍＦｃおよびｈｃＶＲ−ｍＦｃの構築物の一過性トランスフェクションにより、ＣＨ１ドメインがないと、ｈＶＲおよびｈＶＲ＊を有する重鎖が発現され、上清み中で可溶性のままであることが示された。ＣＨ１ドメインが存在する場合は、ｈＶＲまたはｈＶＲ＊のいずれかを含む重鎖は上清み中に発現されなかった。この観察結果により、かかる重鎖抗体は、ＣＨ１ドメインを欠いている重鎖抗体においてラクダ類ＶＨＨドメインを使用することなく、例えば、ヒトまたはマウスＶＨドメインを用いて作
製され得ることが示唆された。
【０１０９】
ヒト化重鎖抗体
本発明の重鎖抗体のヒト化型を生成させるためには、該改変についてホモ接合性である動物を抗原で免疫化し、動物の特異的免疫応答が確立されたら、該免疫化動物の脾臓の細胞を適当な不死細胞（例えば、骨髄腫細胞）と融合させてハイブリドーマ細胞を得る。あるいはまた、該免疫化動物のＢ細胞から直接抗体を得てもよい。ハイブリドーマ細胞（または例えば、単離したＢ細胞）由来の上清みを、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体の存在についてスクリーニングし、抗原に特異的な抗体が所望の特徴に基づいて選択され得る。
【０１１０】
重鎖可変領域（ＶＨ）核酸はハイブリドーマおよび／またはＢ細胞から、当該技術分野において知られた標準的な分子生物学的手法を用いて単離され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら
１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら
１９９５．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）。ＶＨ核酸配列が決定されたら、推定アミノ酸配列を得、他のヒトＶＨ配列と比較し、類似した配列を有する一群の関連するＶＨ配列を同定することができる。関連するＶＨ配列は、当業者に利用可能な抗体データベース、例えば、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））を用いて得ることができる。この比較は、目によって、あるいはまた電子的にアラインメントプログラム（例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ）の使用によってのいずれかでなされる配列のアラインメントによって行なわれ得る。この比較において、相補性決定領域（ＣＤＲ）とフレームワーク領域（ＦＲ）が特定される。ＣＤＲおよびＦＲ残基は、標準的な配列規定（例えば、Ｋａｂａｔら  １９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ，１９８７．Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）に従って決定される。当業者には、場合によっては免疫グロブリン重鎖のＣＤＲ領域およびＦＲ領域の配列の番号付けおよび決定の方法に不一致が存在することがあり得ることは認識されよう。かかる場合では、構造による定義が好ましいが、配列定義法によって同定される残基を、重鎖配列の比較に基づいてどのフレームワーク残基を置き換えるかを決定するのに重要なＦＲ残基とみなす。
【０１１１】
アラインメントされたら、ＶＨ配列内の置換可能な位置を特定する。単離されたＶＨ配列内のある位置のアミノ酸の正体がその他のヒトＶＨ配列と比較したときに異なる場合、該位置を、単離されたＶＨ配列の該位置での置換の好適性について評価する。したがって、単離されたＶＨ配列において、比較対象のその他の関連ヒトＶＨ配列（１つまたは複数）と異なる任意の位置が、その他の関連ヒトＶＨ配列の１つまたはいずれかに見られる対応する位置のアミノ酸と置換され得る位置として潜在的に役立ち得る。その他の関連ヒトＶＨ配列と同一性を共有する位置、すなわち、可変性が示されない位置は、置換可能でない位置と判定される。種々の実施形態において、上記の方法を用いてコンセンサスヒト重鎖抗体配列が得られる。
【０１１２】
本明細書に記載の目的のためのヒト化重鎖抗体は、所定の抗原に対する結合能を有し、ヒトＦＲアミノ酸配列と比べて実質的に類似したまたは同一のアミノ酸配列を有するＦＲ領域と、非ヒトＣＤＲアミノ酸配列と実質的に類似したまたは同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲとを含む免疫グロブリン重鎖のアミノ酸配列バリアントまたはその断片である。一般に、ヒト化重鎖抗体は、非ヒト供給源に由来する１つ以上のアミノ酸残基を有する。かかる残基は、典型的には重鎖可変ドメイン由来のものである。さらに、このような残基
は、関連する特徴、例えば、親和性および／または特異性ならびに抗体機能と関連している他の望ましい生物学的活性などを有するものであり得る。
【０１１３】
種々の実施形態において、ヒト化重鎖抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒトＶＨドメインのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒトＶＨドメイン配列のものである少なくとも１つ、他の実施形態では、少なくとも２つのＶＨドメインの実質的に全部を含むものである。ヒト化重鎖抗体は、一実施形態では、少なくともＣＨ１ドメインを欠いている、一実施形態では、ヒトＦｃのヒンジ領域も欠いている特殊な免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）を含む。一実施形態では、重鎖抗体は、軽鎖を含まず、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖定常領域のＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一実施形態において、重鎖抗体の定常領域には、ＩｇＧ重鎖Ｆｃのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域が含まれている。一実施形態において、重鎖抗体の定常領域にはＩｇＭのＣＨ１領域が含まれている。
【０１１４】
ヒト化重鎖抗体は、任意のクラスのＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される。種々の実施形態において、定常領域は、１つより多くのクラスのＩｇＧに由来する配列を含むものであり得、所望のエフェクター機能を最適化するための具体的な定常領域の選択は、当該技術分野の通常の技能の範囲内である。
【０１１５】
一般に、ヒト化重鎖抗体の重鎖ＦＲおよび重鎖ＣＤＲ領域は、親配列に厳密に対応している必要はなく、例えば、非ヒト重鎖ＣＤＲまたはヒト重鎖ＦＲは、少なくとも１つの残基の置換、挿入または欠失によって、所与の部位の重鎖ＣＤＲまたは重鎖ＦＲ残基がヒト重鎖ＦＲ配列または非ヒト重鎖ＣＤＲ配列のいずれにも対応しないように変えられ得る。しかしながら、かかる変異は広範性でない。一実施形態ではヒト化重鎖抗体残基の少なくとも７５％が親の重鎖ＦＲおよび重鎖ＣＤＲ配列のものに対応し、別の実施形態では９０％、別の実施形態では９５％より多くが対応する。
【０１１６】
本明細書に開示したヒト化重鎖抗体は、一実施形態において、親配列および種々の概念的ヒト化コンポジット配列をインシリコで、当業者に利用可能であり知られているコンピュータプログラムを用いて解析する方法によって調製される。ヒト化型を作製するため、および／または例えば免疫原性、親和性などの特徴を変更するための配列改変は、当該技術分野において知られた方法を用いて行なわれる（例えば、ＵＳ５，５６５，３３２  Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら；ＵＳ５，６３９，６４１  Ｐｅｄｅｒｓｅｎら；ＵＳ５，７６６，８８６  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら；ＵＳ５，８５９，２０５  Ａｄａｉｒら；ＵＳ６，０５４，２９７  Ｃａｒｔｅｒら；ＵＳ６，４０７，２１３  Ｃａｒｔｅｒら；ＵＳ６，６３９，０５５  Ｃａｒｔｅｒら；ＵＳ６，８４９，４２５  Ｈｕｓｅら；ＵＳ６，８８１，５５７  Ｆｏｏｔｅ；ＵＳ７，０９８，００６  Ｇｏｒｍａｎら；ＵＳ７，１７５，９９６  Ｗａｔｋｉｎｓら；ＵＳ７，２３５，６４３  Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら；ＵＳ７，３９３，６４８  Ｒｏｔｈｅｒら；ＵＳ７，４６２，６９７  Ｃｏｕｔｏら）。
【０１１７】
種々の実施形態において、親重鎖抗体のバリアントを作製するための親重鎖抗体配列に対する所望の置換は、一実施形態では、親重鎖抗体の抗原結合活性が維持されるもの、または別の実施形態では、該活性が増大するものである。一般に、親重鎖抗体の重鎖抗体のバリアントは、特定の抗原に対する親重鎖抗体の結合親和性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％（例えば、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％または少なくとも１０，０００％まで）である抗原結合親和性を有する。一部の実施形態では、バリアント重鎖抗体は、親重鎖抗体と比較すると単一の置換を含むものである。しかしながら、他の実施形態では、親重鎖抗体配列と比べていくつかのアミノ酸
、例えば、約５個までまたは１０個までまたはそれより多くまでが置換されており、これらは、所与の位置において同一性を共有している他のヒト重鎖配列に由来するものである。置換は、一実施形態では、保存的であり（すなわち、置き換えられる残基と類似した特性を共有しているアミノ酸）、別の実施形態では、非保存的である（すなわち、置き換えられる残基と異なる特性を共有しているアミノ酸）。種々の実施形態において、得られたバリアント重鎖抗体を試験し、所望の結合親和性および／または特異性が、置き換えられた残基によって有意に低下していないことを確認する。一部の実施形態では、異なるヒト重鎖配列由来のアミノ酸の置換によって改善されたバリアント重鎖抗体が生成される。
【０１１８】
天然に存在している重鎖抗体（例えば、ラクダ類に見られる）は、従来の抗体分子（すなわち、２つの重鎖と２つの軽鎖）の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との境界部に対応する位置に独特なアミノ酸残基を含むことが示されている。このような境界部の残基は、従来の抗体において、互いに対する２つの鎖の近接性または向きに影響を及ぼすことが知られている。このような天然の重鎖抗体は、軽鎖可変領域の非存在と相関している残基の置き換えを含むことが知られているが、該抗体は、従来の抗体と比較すると、配列内の他の位置に、特徴的な免疫グロブリンのフォールディングを保存するための残基を保持している。天然の重鎖抗体に見られる置換は、Ｌ１１Ｓ、Ｖ３７Ｆ、Ｇ４４Ｅ、Ｌ４５ＲまたはＬ４５Ｃ、Ｗ４７Ｇおよび重鎖可変領域のＣＤＲ１とＣＤＲ３との間のジスルフィド結合に寄与するさらなるシステイン残基である。一部の実施形態では、本発明の重鎖抗体は、これらの位置に親抗体の残基が保持されたものであり得る。他の実施形態では、親抗体は、これらの位置に、天然の重鎖抗体の残基と関連している変異を示すものであり得る。一部の実施形態において、単離されたＶＨ配列に由来するヒト化重鎖抗体を本明細書に記載の遺伝子改変マウスから作製する際に、これらの位置の少なくとも１つに、または一実施形態ではこれらの位置の全部に親重鎖抗体に見られるものと同じ残基が保持されているのが望ましい場合があり得る。種々の実施形態において、当業者には、このような境界部の残基は、本明細書に記載の遺伝子改変マウスによって作製される重鎖抗体における鎖間相互作用に関与していることが合理的に予測されないことが理解されよう。
【０１１９】
遺伝子改変動物の作製
重鎖抗体が発現される動物を作製するための遺伝子改変は、実例としての該マウスを使用することにより簡便に示される。本発明による遺伝子改変マウスはさまざまな様式で作製され得、その具体的な実施形態を以下に論考する。
【０１２０】
ＩｇＧ１遺伝子座の模式図（一定の縮尺でない）を図１（上部）に示し、ＩｇＧ１遺伝子座におけるＣＨドメインの配置を示す。図示のように、ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびにヒンジ領域は、スイッチ領域の下流の容易に識別可能なヌクレオチド範囲に存在している。
【０１２１】
ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列を欠いているがヒンジ領域を含む遺伝子改変マウスは、任意の当該技術分野において知られた方法によって作製され得る。例えば、ＩｇＧ１遺伝子をＣＨ１ドメインを欠いているがヒンジを含む切断型ＩｇＧ１で置き換える標的化ベクターが作製され得る。図２は、内因性ＣＨ１ドメインの上流の配列、続いて、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、薬物選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）、およびＩｇＧ１膜貫通ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む５’側（ゲノムＩｇＧ１遺伝子の転写の方向に対して）の相同性アームと、膜貫通ドメインに対して３’側の配列を含む３’側の相同性アームを有する標的化構築物によって標的化されるマウスゲノム（上部）を示す。該遺伝子座において相同組換えが起こり、薬物選択カセットが除去されると（例えば、Ｃｒｅ処理によって）、内因性ＩｇＧ１は、ＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ１で置き換えられる（図２の下部；ｌｏｘ部位は図示せず）。図１（ＩｇＧ１ΔＣＨ１，中央）は、得
られた遺伝子座の構造を示し、該遺伝子座により、ヒンジ配列と融合されたＪ領域配列を有するＩｇＧ１が発現される。
【０１２２】
ＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをコードしているヌクレオチド配列を欠いており、ヒンジ領域をコードしているヌクレオチド配列を欠いている遺伝子改変マウスは、任意の当該技術分野において知られた方法によって作製され得る。例えば、ＩｇＧ１遺伝子をＣＨ１ドメインをコードしている配列を欠いており、ヒンジ領域をコードしている配列を欠いている切断型ＩｇＧ１で置き換える標的化ベクターが作製され得る。図３は、内因性ＣＨ１ドメインの上流の配列、続いて、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、薬物選択カセット（例えば、ｌｏｘｅｄ耐性遺伝子）、およびＩｇＧ１膜貫通ドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む５’側（ゲノムＩｇＧ１遺伝子の転写の方向に対して）の相同性アームと、膜貫通ドメインに対して３’側の配列を含む３’側の相同性アームを有する標的化構築物によって標的化されるマウスゲノム（上部）を示す。該遺伝子座において相同組換えが起こり、薬物選択カセットが除去されると（例えば、Ｃｒｅ処理によって）、内因性ＩｇＧ１遺伝子は、ＣＨ１ドメインをコードしている配列を欠いているＩｇＧ１遺伝子で置き換えられる（図３の下部；ｌｏｘ部位は図示せず）。図１（ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ，下部）は、得られた遺伝子座の構造を示し、該遺伝子座により、ＣＨ２ドメインと融合されたＪ領域配列を有するＩｇＧ１が発現される。
【０１２３】
ＩｇＧ１  ＣＨ１配列を欠いている（ＩｇＧ１ΔＣＨ１）、またはＩｇＧ１  ＣＨ１配列を欠いており、ヒンジを欠いている（ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ）遺伝子改変マウスを、該改変ＩｇＧ１アイソタイプの使用に好都合となるように、１つ以上の他のＩｇＧアイソタイプを欠失させることにより、例えば、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ａをコードしている配列を欠失させること、または機能的に無効にすることによりさらに改変してもよい。例えば、内因性ヒンジ領域配列の上流（または内因性ＣＨ１ドメイン配列の上流）の配列、ＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、薬物選択カセットをコードしている配列、続いて、ＩｇＧ１膜貫通ドメイン、続いて所望により別の薬物選択カセットをコードしている配列を含む５’側の相同性アームを有する標的化構築物を作製する。該遺伝子座において相同組換えが起こり、薬物選択カセット（１つまたは複数）が除去されると（例えば、Ｃｒｅ処理によって）、内因性の重鎖定常遺伝子座は、２つだけのＩｇＧ遺伝子：内因性ＩｇＧ３と、ＩｇＧ１ΔＣＨ１（図４，下部参照；レコンビナーゼ部位（１つもしくは複数）は図示せず；図６，下部参照）またはＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ（図５，下部参照；レコンビナーゼ部位（１つもしくは複数）は図示せず；図６，下部参照）とを含む。
【０１２４】
ＩｇＧ１ΔＣＨ１−ΔヒンジまたはＩｇＧ１ΔＣＨ１ΔＩｇＧ２ａΔＩｇＧ２ｂ対立遺伝子を有する遺伝子改変マウスにおいて発現されるＩｇＧ１は、図１０の右パネルに示すような構造を有する、すなわち、ＶＨドメインはＣＨ２ドメインと融合されている。図１０の左パネルは、比較のため、野生型ＩｇＧ１抗体を示し、そのＣＨ１ドメインが、ヒンジ領域によってＣＨ２ドメインに連結され、ジスルフィド結合によって軽鎖定常ドメインＣＬに連結されていることを示す。対照的に、遺伝子改変マウスによって作製される抗体は、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを欠いており、したがって、ＣＬドメインを完全に欠いている。
【０１２５】
上記および他の遺伝子改変マウスは、適当な標的化構築物を適当なマウスＥＳ細胞内に導入することにより作製され（１回以上の独立した標的化にて）、該標的化構築物のマーカーまたは選択カセットを含む陽性クローンを確認し、増殖させる。次いで、該クローンを宿主胚において、キメラマウスまたは完全ＥＳ細胞由来マウスの作製に適した条件下でドナーＥＳ細胞として使用する。該マーカーまたは選択カセットは、ＥＳ細胞の段階またはキメラもしくはＥＳ細胞由来マウスにおいてのいずれかで、例えば、ｌｏｘｅｄカセットを用い、Ｃｒｅ含有系統と交配することにより、またはＥＳ細胞にＣｒｅ発現ベクター
をエレクトロポレーションすることにより、任意選択で除去してもよい。
【０１２６】
ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ対立遺伝子（ヘテロ接合性）を有する遺伝子改変マウスを本発明の一実施形態に従って作製した。血清を該マウスから単離し、抗マウスＩｇＧ１抗体を用いてウエスタン様式（還元条件）でブロットし、重鎖を検出した。野生型ＩｇＧ１重鎖のサイズに対応するバンドが示された野生型マウスとは対照的に、ＩｇＧ１ΔＣＨ１−Δヒンジ対立遺伝子を含むように遺伝子改変されたマウスでは、ＶＨ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインからなる重鎖抗体の予測サイズを有する抗マウスＩｇＧ１抗体と反応する重鎖も発現された（図８参照）。
【実施例】
【０１２７】
実施例
実施例１：重鎖抗体のインビトロ発現
分子生物学的手法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら  １９８２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）を用いてヒト可変領域とマウスＩｇＧ２ｂ（ｍＩｇＧ２ｂ）定常領域と融合させ、キメラ重鎖構築物を作製した。各構築物のヒト可変遺伝子セグメントは、両方のエキソン（すなわち、リーダー配列＋成熟配列）、（内因性マウス免疫グロブリン重鎖の遺伝子座の３つのｈＶＲ遺伝子セグメントでの置き換えを含むナイーブＲＡＧマウスから単離されたＩｇＭのｈＶＲから同定）、全ｈＤＨ遺伝子セグメント、および全ｈＪＨ遺伝子セグメントを含む完全長ヒト可変遺伝子セグメントとした。ＩｇＭ抗体の軽鎖はマウス軽鎖とした。
【０１２８】
ｍＩｇＧ２ｂ配列のうち２つの型；ＣＨ１ドメインを有するものと、有しないものを使用した。また、いくつかの他の構築物も作製して、トランスフェクションおよび発現の対照として供した。第１の対照構築物は、マウスＩｇＧ２ａ（ｍＩｇＧ２ａ）定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと融合されたサイトカイン受容体を用いて作製した（対照Ｉ）。他の２つの対照は、マウスＲＯＲシグナル配列を、ＣＨ１ドメインを有する、または有しないマウスＩｇＧ２ａ配列と融合させることにより構築した（それぞれ、対照ＩＩおよびＩＩＩ）。
【０１２９】
また、各ヒト可変領域のラクダ化型もＰＣＲ部位特異的変異誘発手法を用いて作製した（例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら  １９７８．Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ａｔ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３（１８）：６５５１−６０参照）。各可変領域に対して２組の特異的プライマーセットを用いてヒト可変領域配列内に特異的変異を作出し、ラクダ様特徴を含むヒト可変領域配列を得た。該可変領域の５’側の半分を含む産物の増幅にはプライマーＬ１（配列番号：１）およびＨＨ１．２  ｍｕｔ  ＢＯＴ（配列番号：２）を使用し、一方、該可変領域の３’側の半分の増幅には、プライマーＨＨ１．２  ｍｕｔ  ＴＯＰ（配列番号：３）およびｍ１８．３．１（配列番号：４）を使用した。これらの産物を精製して一緒に混合し、プライマーＬ１およびｍ１８．３．１を用いた第３のＰＣＲ反応のための鋳型として供した。得られたラクダ化ヒト可変領域のＰＣＲ産物をクローニングし、精製し、配列決定することによって確認した。
【０１３０】
後で付着末端でのライゲーションによって一体にすることが可能となるように制限酵素部位を含むプライマーを使用し、ヒト可変領域（ラクダ化および非ラクダ化）と定常領域を増幅させることにより、完全長重鎖構築物（可変および定常）を作製した。すべての完全長重鎖構築物を発現ベクター内にクローニングし、精製し、再度配列決定することによって確認した。表１は、各構築物に関する各重鎖構築物、その配列番号および簡単な説明を示す。
【０１３１】
【表１】
0005909449.tif 000002
キメラ重鎖構築物で、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を一過的にトランスフェクトさせ、免疫グロブリン軽鎖の非存在下における発現を解析した。上清みおよび細胞溶解物をウエスタンブロットによって調べ、重鎖の存在を検出した（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｅｓｃｅｎｃｅ）により）。キメラ重鎖構築物はすべて、独立して６回、一過的にトランスフェクトさせた。トランスフェクションの代表的なウエスタンブロットを図７に示す。
【０１３２】
すべてのキメラ重鎖構築物（ＣＨ１ドメインを含むもの、および含まないもの）ならびに対照構築物が細胞溶解物中に検出された。ＣＨ１ドメインを欠いている構築物のみ、上清み中に観察された（図７，左）。また、対照Ｉおよび対照ＩＩＩ（ＣＨ１ドメインを欠いているマウスＦｃタンパク質）も検出された（図７）が、ＣＨ１ドメインを含むマウスＦｃタンパク質は検出されなかった。ＣＨ１ドメインを含む非ラクダ化およびラクダ化の重鎖構築物はどちらも、いずれもトランスフェクションでも上清み中には検出されなかった（図７，右）。しかしながら、ＣＨ１ドメインを欠いている非ラクダ化およびラクダ化ヒト重鎖構築物はどちらも、すべてのトランスフェクションで上清み中に検出された。総合すると、この結果により、ＣＨ１ドメインを欠いているｈＶＲ（通常またはラクダ化）は、免疫グロブリン軽鎖の非存在下において、一過的にトランスフェクトさせたＣＨＯ細胞で発現され、分泌され得るが、ＣＨ１ドメインを含むｈＶＲ（通常またはラクダ化）は、軽鎖の非存在下では分泌され得ないことが確立される。
【０１３３】
実施例２：マウス重鎖ＩｇＧ１定常領域の改変
Ａ．マウスＩｇＧ１−ＣＨ１−ヒンジ標的化ベクター（図３）の調製
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（後述）のＥＳ細胞由来のＣ５７ＢＬ／６対立遺伝子に対して、マウスＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ１とヒンジ領域の欠失を導入するための標的化構築物を構築した。
【０１３４】
標的化構築物を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９参照）を用いて作製して、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＢＭＱ  ７０ｐ０８を改変した。ＢＭＱ  ７０ｐ０８  ＢＡＣ  ＤＮＡは、ＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ１とヒンジ領域は欠失されるがＩｇＧ１遺伝子の残部（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３および膜貫通エキソン）はインタクトな
ままとなるように改変した。
【０１３５】
簡単には、上流および下流の相同性アームを、それぞれ、プライマーｍ１０２（配列番号：１３）とｍ１０４（配列番号：１４）およびｍ１００（配列番号：１５）とｍ９９（配列番号：１６）を用いて作製した。この相同性アームを使用し、ＩｇＧ１の定常ドメインのＣＨ１とヒンジ領域は欠失しているがＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ２、ＣＨ３および膜貫通領域は保持されたカセットを作製した（例えば、図３参照）。標的化構築物には、ｌｏｘｅｄハイグロマイシン耐性遺伝子をＩｇＧ１遺伝子のＣＨ３と膜貫通ドメインエキソンの間の位置に含めた。ＣＨ１およびヒンジエキソンの上流の遺伝子（例えば、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＭ）ならびにＩｇＧ１膜貫通エキソンの下流の遺伝子（例えば、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２１、ＩｇＥ、ＩｇＡなど）は、標的化構築物で改変されなかった。すべての定常ドメインのスイッチ領域は、標的化構築物で改変されなかった。該欠失前後のヌクレオチド配列には、以下のもの（これは、該欠失点に存在するスプライスアクセプター配列を示す）：ＴＧＡＣＡＧＴＧＴＡ  ＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡ  ＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧ  Ｔ（ＡＧ）ＴＣＣＣＡＧＡ  ＡＧＴＡＴＣＡＴＣ（配列番号：１７）を含めた。この欠失配列はスプライスアクセプター（上記の括弧内に記載のＡＧ）を含み、スプライスアクセプターの５’側はプレＣＨ１配列であり、スプライスアクセプターの３’側はＣＨ２エキソン配列である。
【０１３６】
Ｂ．マウスＩｇＧ１−ＣＨ１標的化ベクター（図２）の調製
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（後述）のＥＳ細胞由来の１２９／ＳｖＥｖＴａｃ対立遺伝子に対してマウスＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ１の欠失を導入するための第２の標的化構築物を、この実施例のセクションＡに記載のものと同様の様式で構築した。
【０１３７】
標的化構築物を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９参照）を用いて作製して、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）ＢＭＱ  ７０ｐ０８を改変した。ＢＭＱ  ７０ｐ０８  ＢＡＣ  ＤＮＡは、ＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ１領域は欠失されるがＩｇＧ１遺伝子の残部（例えば、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および膜貫通エキソン；図２参照）はインタクトなままとなるように改変した。
【０１３８】
第２の標的化構築物の相同性アームは、ＣＨ１−ヒンジ標的化ベクター（この実施例のセクションＡにおいて上記）の場合と同じものとした。この相同性アームを使用し、ＩｇＧ１定常ドメインのＣＨ１領域は欠失しているがＩｇＧ１定常ドメインのヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および膜貫通領域は保持されたカセットを作製した（例えば、図２参照）。標的化構築物には、ｌｏｘｅｄハイグロマイシン耐性遺伝子をＩｇＧ１遺伝子のＣＨ３と膜貫通ドメインエキソンの間の位置に含めた。ＣＨ１エキソンの上流の遺伝子（例えば、ＩｇＧ３、ＩｇＤ、ＩｇＭ）およびＩｇＧ１膜貫通エキソンの下流の遺伝子（例えば、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２１、ＩｇＥ、ＩｇＡなど）は、標的化構築物で改変されなかった。すべての定常ドメインのスイッチ領域は、標的化構築物で改変されなかった。該欠失前後のヌクレオチド配列には、以下のもの（これは、該欠失点に存在するスプライスアクセプター配列を示す）：ＴＧＡＣＡＧＴＧＴＡ  ＡＴＣＡＣＡＴＡＴＡ  ＣＴＴＴＴＴＣＴＴＧ  Ｔ（ＡＧ）ＴＧＣＣＣＡＧ  ＧＧＡＴＴＧＴＧＧＴ  ＴＧＴＡＡＧＣＣＴＴ  ＧＣＡＴＡＴＧＴＡＣ  ＡＧＧＴＡＡＧＴＣＡ  ＧＴＡＧＧＣＣＴＴＴ  ＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣ  Ｃ（配列番号：６４）を含めた。この欠失配列はスプライスアクセプター（上記の括弧内に記載のＡＧ）を含み、スプライスアクセプターの５’側はプレＣＨ１配列であり、スプライ
スアクセプターの３’側はヒンジエキソン配列である。
【０１３９】
実施例３：ＥＳ細胞におけるマウス重鎖定常領域の改変
Ａ．ＩｇＧ１−ＣＨ１−ヒンジ標的化ベクターでのマウスＥＳ細胞の標的化
マウスＥＳ細胞を、上記の標的化構築物（すなわち、ＩｇＧ１遺伝子のＣＨ１とヒンジ領域の欠失を導入する標的化構築物）で標的化した。ＥＳ細胞はＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来のものとした。このマウスは、１２９系統とＣ５７ＢＬ／６系統の５０／５０混合型であり、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントの再構成されていないヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変を有する。Ｃ５７ＢＬ／６との交配に使用した１２９系統は、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントのヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む系統である。
【０１４０】
ヘテロ接合性ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、１２９系統由来の一組の内因性マウス重鎖定常領域遺伝子を一方の対立遺伝子に、およびＣ５７ＢＬ／６系統由来の一組の内因性マウス重鎖定常領域遺伝子を他方の対立遺伝子に有する。１２９重鎖の対立遺伝子は、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち、内因性マウス遺伝子座）が置き換えられたヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントである重鎖可変領域遺伝子セグメントの遺伝子座と隣接している。ＢＬ／６重鎖の対立遺伝子は、野生型マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントと隣接している。また、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは野生型内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子も有する。したがって、１２９対立遺伝子を、ＩｇＧ、Ｄ、ＥまたはＡのＣＨ１欠失を含む構築物で標的化することにより、キメラヒト／マウス重鎖抗体が生成され得、一方、Ｃ５７ＢＬ／６対立遺伝子を同様の構築物で標的化することにより、ＣＨ１ドメインを欠き、ヒンジを欠いている完全マウス重鎖抗体が生成され得る。
【０１４１】
上記のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来のＥＳ細胞を、実施例２のセクションＡの線状化した標的化ベクターでエレクトロポレーションし、ハイグロマイシン耐性遺伝子の存在により選択した。
【０１４２】
Ｂ．ＩｇＧ１−ＣＨ１標的化ベクターでのマウスＥＳ細胞の標的化
同様の様式で、マウスＥＳ細胞を、実施例２のセクションＢ（図２も参照のこと）に記載のＣＨ１標的化構築物で標的化した。ＥＳ細胞はＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ系統とＣ５７ＢＬ／６系統の５０／５０混合型であり、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントの再構成されていないヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む遺伝子改変を有するマウス）由来のものとした。Ｃ５７ＢＬ／６との交配に使用した１２９／ＳｖＥｖＴａｃ系統は、マウス重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントのヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子セグメントでの置き換えを含む系統である。
【０１４３】
ヘテロ接合性ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、１２９／ＳｖＥｖＴａｃ系統由来の一組の内因性マウス重鎖定常領域遺伝子を一方の対立遺伝子に、およびＣ５７ＢＬ／６系統由来の一組の内因性マウス重鎖定常領域遺伝子を他方の対立遺伝子に有する。１２９／ＳｖＥｖＴａｃ重鎖の対立遺伝子は、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子セグメント（すなわち、内因性マウス遺伝子座）が置き換えられたヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントである重鎖可変領域遺伝子セグメントの遺伝子座と隣接している。ＢＬ／６重鎖の対立遺伝子は、野生型マウス重鎖可変領域遺伝子セグメントと隣接している。また、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは野生型内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子も有する。したがって、１２９／ＳｖＥｖＴａｃ対立遺伝子を、ＩｇＧ、Ｄ、ＥまたはＡのＣＨ１欠失を含む構築物で標的化することにより、キメラヒト／マウス重鎖抗体が生成され得
、一方、Ｃ５７ＢＬ／６対立遺伝子を同様の構築物で標的化することにより、ＣＨ１ドメインを欠き、ヒンジを欠いている完全マウス重鎖抗体が生成され得る。
【０１４４】
上記のＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来のＥＳ細胞を、実施例２のセクションＢに記載の線状化した標的化ベクターでエレクトロポレーションし、ハイグロマイシン耐性遺伝子の存在により選択した。
【０１４５】
実施例４：改変ＩｇＧ１定常領域を有するマウスの作製
Ａ．ＩｇＧ１−ＣＨ１−ヒンジ欠失を有するマウス
上記の標的とされるＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、８細胞期のマウス胚にＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）での方法によって導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９参照）。標的とされるＣ５７ＢＬ／６  ＩｇＧ１対立遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウス）を、欠失しているヒンジおよびＣＨ１領域の上流および下流に位置する配列の存在を検出する変形型の対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，上掲）を用いて遺伝子型分類することにより確認した。
【０１４６】
ＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジの欠失（Ｃ５７ＢＬ／６対立遺伝子内、すなわち、マウス対立遺伝子内）について遺伝子型分類されたマウスを、ＩｇＧ１  ＣＨ３エキソンの下流でＩｇＧ１膜貫通エキソンの上流のｌｏｘｅｄ  ｈｙｇカセット（標的化構築物（例えば、図３参照）によって導入）を除去するために、Ｃｒｅ  ｄｅｌｅｔｅｒマウス系統（例えば、国際特許出願公開公報番号ＷＯ２００９／１１４４００参照）と交配した。幼獣を遺伝子型分類し、ＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジの欠失についてヘテロ接合性の幼獣を選択し、Ｃ５７ＢＬ／６対立遺伝子から発現されたＩｇＧ１重鎖を幼獣の血清中において調べた。
【０１４７】
Ｂ．ＩｇＧ１−ＣＨ１欠失を有するマウス
同様の様式で、ＩｇＧ１  ＣＨ１領域の欠失を有する標的とされるＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、８細胞期のマウス胚にＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）での方法によって導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９参照）。標的とされる１２９ＳｖＥｖ／Ｔａｃ対立遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０マウス）を、欠失しているＣＨ１領域の上流および下流に位置する配列の存在を検出する変形型の対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，上掲）を用いて遺伝子型分類することにより確認した。
【０１４８】
ＩｇＧ１  ＣＨ１欠失（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ対立遺伝子内、すなわち、ヒト対立遺伝子内）について遺伝子型分類されたマウスを、ＩｇＧ１  ＣＨ３エキソンの下流でＩｇＧ１膜貫通エキソンの上流のｌｏｘｅｄ  ｈｙｇカセット（標的化構築物（例えば、図２参照）によって導入）を除去するために、Ｃｒｅ  ｄｅｌｅｔｅｒマウス系統（例えば、国際特許出願公開公報番号ＷＯ２００９／１１４４００参照）と交配した。幼獣を遺伝子型分類し、ＩｇＧ１  ＣＨ１欠失についてホモ接合性の幼獣を選択し、改変ＩｇＧ１重鎖の発現を調べた。
【０１４９】
実施例５：改変ＩｇＧ１遺伝子を有するマウス由来の重鎖抗体
Ａ．ＩｇＧ１−ΔＣＨ１−Δヒンジマウス
ＣＨ１とヒンジの欠失を含むと上記で確認されたマウス幼獣と野生型幼獣を交配し、交配マウス由来の血清をウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのＩｇＧを、抗ｍＩｇＧ１抗体を用いて同定した。簡単には、マウス血清の１０μＬの１：１００希釈物を還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥに使用し、ゲルをＰＶＤＦ膜に移した。ブロットを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む５％脱脂乳含有Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ；Ｓｉｇｍａ）で一晩ブロックし、ＴＢＳＴで４回洗浄し（１回あたり５分間の洗浄）、次いで、一次抗体（ＨＲＰにコンジュゲートさせたヤギ抗ｍＩｇＧ１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（１％脱脂乳含有ＴＢＳＴ中で１：１，０００に希釈）に室温で２時間曝露した。ブロットを６回洗浄した（１回あたり５分間の洗浄）。ブロットを５分間、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させ、次いでフィルムに１分間露光した。
【０１５０】
標的とされるドナーＥＳ細胞から得られたＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）（５０％野生型ＢＬ／６；５０％ΔＣＨ１−ΔヒンジＢＬ／６）由来の血清では、混合バンド：約５７．５ｋＤ（野生型ＩｇＧの予測サイズ）のバンド１つ、および約４５ｋＤ（ＣＨ１ドメインとヒンジを欠いているＩｇＧの予測サイズ）にバンド１つが示された（図８）。この結果は、野生型ＢＬ／６対立遺伝子由来の通常のマウス重鎖と、そのΔＣＨ１−ΔヒンジＢＬ／６対立遺伝子由来のΔＣＨ１／Δヒンジマウス重鎖が発現されるＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）と整合している。この結果により、機能性ＩｇＭ遺伝子およびＣＨ１ドメインとヒンジドメインを欠いているＩｇＧ遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、血清中において重鎖抗体を発現できることが確立される。
【０１５１】
Ｂ．ＩｇＧ１−ΔＣＨ１マウス
同様の様式で、ＣＨ１欠失についてホモ接合性のマウス幼獣と野生型幼獣を交配した。交配マウス由来の血漿および血清（５匹のホモ接合型；２匹の野生型について）をウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのＩｇＧを、抗ｍＩｇＧ１抗体を用いて同定した（上記のとおりに）。ＩｇＧ１−ΔＣＨ１欠失についてホモ接合性のマウス由来の血清および血漿のウエスタンブロットでは、混合物バンド：約４５ｋＤ（ＣＨ１ドメインを欠いている一本鎖ＩｇＧ１の予測サイズ）のバンド１つ、および約７５ｋＤ（ＣＨ１ドメインを欠いている二量体ＩｇＧの予測サイズ）にバンド１つが示された（データ表示せず）。この結果は、一方または両方いずれかの重鎖の遺伝子座に由来するＩｇＧ１−ΔＣＨ１重鎖が発現されるホモ接合性のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）と整合している。この結果により、機能性ＩｇＭ遺伝子とＣＨ１ドメインを欠いているＩｇＧ遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、該動物の免疫系の末梢リンパ球画分において重鎖抗体を発現できることが確立される。
【０１５２】
実施例６：ＩｇＧ１−ＣＨ１−ヒンジ欠失についてホモ接合性のマウスの特性評価
ＣＨ１−ヒンジ欠失についてヘテロ接合性のＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）同士を交配し、該欠失についてホモ接合性のマウスを得た。４匹のマウス幼獣が、ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−Δヒンジについてホモ接合性であると確認された。これらの４匹のマウスと野生型マウスを交配し、交配マウス由来の血清を、ウエスタンブロッティングのために調製し、血清中に発現されたいずれかのＩｇＧを、抗ｍＩｇＧ１抗体を用いて同定した（上記のとおりに）。図９は、この実験で使用したＰＶＤＦ膜から発色させたフィルムを示す。血清を１：５および１：１０に希釈し、１０μＬの各希釈物を各マウスに対して並列でゲルに負荷した。ゲル画像の上部において、レーンに各マウスならびにＩｇＧ１（１）およびＩｇＧ２ａ（２ａ）対照の表示をしている。
【０１５３】
野生型マウス由来の血清では、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む通常の抗体（およそ１５０ｋＤ）が発現されるという野生型マウスについて予測されたパターンが示された。４匹すべてのマウス（ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−Δヒンジについてホモ接合性）では各々、混合バンド：約１５０ｋＤ（ＩｇＧ１以外の野生型ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３）の予測サイズ）のバンド１つ、および約４５ｋＤ（ＣＨ１ドメインとヒンジを欠いているＩｇＧの予測サイズ）にバンド１つが示された（図９）。この結果は、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いており、軽鎖を欠いているＩｇＧ１重鎖抗体が発現されるマウスと整合している。この結果により、さらに、機能性ＩｇＭ遺伝子およびＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、血清中において重鎖抗体を発現できることが確立される。
【０１５４】
別の実験において、ＩｇＧの血清中発現を、ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−Δヒンジについてホモ接合性のマウスでＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定した。簡単には、ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のいずれかに特異的な抗体を別々に希釈し、１００μｌ／ウェルをプレート上に、２μｇ／ｍＬ（１×ＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中）でコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ；Ｓｉｇｍａ）で４回洗浄した。４回目の洗浄後、プレートを２５０μＬ／ウェルの５％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍａ）でブロックし、室温で１時間インキュベートした。血清および標準を、４００ｎｇ／ｍＬ（ｍＩｇＧ１）または６００ｎｇ／ｍＬ（ｍＩｇＧ２ｂ）の開始濃度で、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴ中でプレートの下方に向かって（上から下に）連続希釈した（希釈係数は０．３１６）。ブロックした後、プレートを再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。４回目の洗浄後、１００μＬの血清または標準をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。洗浄後、１００μＬのビオチン化検出抗体（１０ｎｇ／ｍＬのラット抗ｍＩｇＧ１または２５０ｎｇ／ｍＬの抗ｍＩｇＧ２ｂ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、上記のようにして再度洗浄した。洗浄後、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジンにコンジュゲートさせたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ−ＳＡ）の１：２０，０００希釈物（ＰＢＳＴ中）をプレートに添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄した後、基質ＡおよびＢ（ＢＤ  ＯＰＴＥＩＡ（商標）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の１００μＬ／ウェルの１：１希釈物を添加し、プレートを暗所に維持した。反応液を暗所内で発色させ、所望により１Ｎリン酸を用いて停止させた（およそ１５分間）。停止させた反応液の読み出しを、４５０ｎｍの吸光波長（１．０秒／読み出し）でＷａｌｌａｃ  １４２０  Ｗｏｒｋ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＶＩＣＴＯＲ（商標）  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにおいて行ない、結果をグラフにプロットした（図１１）。
【０１５５】
野生型マウス由来の血清では、通常レベルのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｂが示された。ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−Δヒンジについてホモ接合性のマウスは、末梢において、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ１を発現できた（血清；図１１の左側）。さらに、他のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２ｂ）の血清レベルは、野生型レベルより著しくは低減しなかった（図１１の右側）。この結果により、さらに、機能性ＩｇＭ遺伝子およびＣＨ１ドメインとヒンジ領域を欠いているＩｇＧ遺伝子を有する遺伝子改変マウスは、血清中に検出され得る改変ＩｇＧ１アイソタイプ（すなわち、ＣＨ１ドメインとヒンジを欠いている）を発現できることが確立される。
【０１５６】
実施例７：ＩｇＧ１改変マウスにおけるＶ−Ｄ−Ｊ再構成の解析
Ａ．ＩｇＧ１−ＣＨ１−ヒンジ欠失についてホモ接合性のマウス
ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−Δヒンジについてホモ接合性のマウス改変を、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え
および重鎖遺伝子の使用について、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した。
【０１５７】
簡単には、脾臓を収集し、滅菌使い捨てバッグ内で１０ｍＬの５％ＨＩ−ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）を灌流させた。次いで、１つの脾臓を含む各バッグをＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（商標）（Ｓｅｗａｒｄ）内に入れ、ミディアム設定で３０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズした脾臓を０．７μｍセルストレーナーを用いて濾過し、次いで、遠心分離機を用いてペレット化し（１０００ｒｐｍで１０分間）、赤血球（ＲＢＣ）をＢＤ  ＰＨＡＲＭ  ＬＹＳＥ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で３分間溶解させた。脾細胞をＲＰＭＩ−１６４０で希釈し、再度遠心分離した後、１ｍＬのＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁させた。ＲＮＡは、ペレット化した脾細胞から当該技術分野において知られた標準的な手法を用いて単離した。
【０１５８】
ＲＴ−ＰＣＲは脾細胞ＲＮＡに対して、マウス重鎖可変領域（ＶＨ）遺伝子セグメント（Ｎｏｖａｇｅｎ）に特異的な一組の縮重プライマー、およびマウスＩｇＧ１  ＣＨ２プライマー（ＣＧＡＴＧＧＧＧＧＣ  ＡＧＧＧＡＡＡＧＣＴ  ＧＣＡＣ；配列番号：４０）を用いて行なった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、Ｍ１３フォワード（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣ  ＧＧＣＣＡＧ；配列番号：４１）およびＭ１３リバース（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ  ＣＴＡＴＧＡＣ；配列番号：４２）プライマー（ベクター配列内クローニング部位にフランキングする位置に配置）を用いて配列決定した。１９個のクローンを配列決定し、重鎖遺伝子の使用およびＩｇＧ１定常領域の再構成ＶＨとＣＨ２の接合部の配列を決定した（表２）。
【０１５９】
【表２−１】
0005909449.tif 000003
【０１６０】
【表２−２】
0005909449.tif 000004
図１２は、１９個のＲＴ−ＰＣＲクローンのうち１１個の、ＩｇＧ１定常領域のＣＨ２に対して再構成されたＶＨドメインの配列アラインメントを示す。図１２に示した配列は、異なるマウス重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびにＣＨ１とヒンジ領域が欠如しているマウスＩｇＧ１が関与する独特な再構成を示す。内因性ＩｇＧ１定常領域遺伝子のＣＨ１とヒンジ領域の欠失についてホモ接合性のマウスは、ＣＨ１とヒンジ領域が欠如しているマウスＩｇＧ１定常領域由来のＣＨ２−ＣＨ３領域に作動可能に連結されたマウスＶＨドメインを含む重鎖の産生能を有し、ＣＨ１とヒンジ領域が欠如しており、軽鎖を欠いているマウスＩｇＧ１重鎖を発現するＢ細胞の生成能を有した（図８および９）。このような再構成は、該改変遺伝子座により、このようなマウスにおいて、多数の個々のＢ細胞内でマウス重鎖遺伝子セグメントが独立して再構成され得、通常ラクダに見られるものと類似した重鎖抗体が生成されたことを示す。さらに、この実施例は、内因性ＩｇＧ１のＣＨ１とヒンジ領域の欠失により、該遺伝子座が作動不可能にならなかった、または該改変ＩｇＧ１定常領域が関与する組換えは抑制されなかったことを示す。このようなマウスでは、Ｂ細胞発生になんら検出可能な欠陥を有することなく内因性レパートリーの一部として、ＣＨ１とヒンジ領域が欠如しているＩｇＧ１を含む機能性の重鎖抗体が作製された。
【０１６１】
Ｂ．ＩｇＧ１−ＣＨ１欠失についてホモ接合性のマウス
同様の様式で、ＩｇＧ１  ΔＣＨ１改変についてホモ接合性のマウスを、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびヒト重鎖遺伝子の使用について、脾細胞から単離されたＲＮＡを用いて逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって解析した。
【０１６２】
簡単には、脾臓を２匹のホモ接合性ＩｇＧ１−ΔＣＨ１マウスから、この実施例のセクションＡにおいて上記のようにして単離した。ＣＤ１９＋  Ｂ細胞を、磁気細胞分取（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてプールされた脾細胞から単離した。分取したＣＤ１９＋  Ｂ細胞から、Ｑｉａｇｅｎ  ＡＬＬＰＲＥＰ（商標）  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）  ＩＩＩ逆転写酵素およびＯｌｉｇｏ（ｄＴ）２０プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。次いで、このｃＤＮＡを、ヒト重鎖可変リーダー配列に結合するように設計された３’マウスＩｇＧ１ヒンジ特異的プライマーおよび５’縮重プライマーを用いて行なうＰＣＲ用の鋳型として使用した（表３）。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（商標）  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを用いて配列決定した（この実施例のセクションＡにおいて上記のとおりに）。
【０１６３】
【表３】
0005909449.tif 000005
ＩｇＧ１  ΔＣＨ１についてホモ接合性のマウスにおける重鎖遺伝子の使用を決定するため、２８個のＲＴ−ＰＣＲクローンを配列決定した。これらのクローンにおいて、ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントの７つの独特な再構成が観察された（表４）。
【０１６４】
【表４】
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図１３は、表４に示した７つの再構成の、ＩｇＧ１定常領域のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３に対して再構成されたＶＨドメインの配列アラインメントを示す。図１３に示す配列は、異なるヒト重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントおよびＣＨ１領域が欠如しているマウスＩｇＧ１が関与する独特な再構成を示す。内因性ＩｇＧ１定常領域遺伝子のＣＨ１領域の欠失についてホモ接合性のマウスは、ＣＨ１が欠如しているマウスＩｇＧ１定常領域由来のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域に作動可能に連結されたヒトＶＨドメインを含む重鎖の産生能を有し、ＣＨ１領域が欠如しており、軽鎖を欠いているマウスＩｇＧ１重鎖を発現するＢ細胞の生成能を有した（データ表示せず）。このような再構成は、改変遺伝子座（ＩｇＧ１  ΔＣＨ１−ΔヒンジおよびＩｇＧ１  ΔＣＨ１）の一方または両方いずれかにより、このようなマウスにおいて、多数の個々のＢ細胞内で重鎖遺伝子セグメント（マウスおよびヒト）が独立して再構成され得、通常ラクダに見られるものと類似した重鎖抗体が生成されたことを示す。さらに、この実施例は、内因性ＩｇＧ１  ＣＨ１の欠失により、該遺伝子座が作動不可能にならなかった、またはヒト重鎖Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントならびに改変マウスＩｇＧ１定常領域が関与する組換えは抑制されなかったことを示す。このようなマウスでは、Ｂ細胞発生になんら検出可能な欠陥を有することなく内因性レパートリーの一部として、ヒト重鎖ＶドメインおよびＣＨ１が欠如しているマウスＩｇＧ１を含む機能性の重鎖抗体が作製された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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