(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質が結合するアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）マトリックスを使用して、精製された抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質を産生する方法であって、
（ａ）前記抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質を含む混合物を前記ＡＣマトリックス上に負荷すること、および
（ｂ）前記ＡＣマトリックスから前記抗体、抗体断片またはＦｃ融合タンパク質を溶出する前に、１種または複数の洗浄液で前記ＡＣマトリックスを洗浄すること（ここで、前記洗浄液の少なくとも１種が（ｉ）０．０５〜０．８５Ｍの範囲の濃度のアルギニンおよび（ｉｉ）０．７５〜１．５Ｍの濃度範囲の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の両方を含み、８．５〜９．５の範囲のｐＨを有する）、
を含み、
前記ＡＣマトリックスがプロテインＡカラムである、方法。
【請求項２】
前記洗浄が前記ＡＣマトリックスから不純物を除去する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルギニンが０．２５Ｍの濃度である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルギニンがアルギニン−ＨＣｌである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記塩化ナトリウムが１Ｍの濃度である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄のｐＨが９．０である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記不純物が高分子量（ＨＭＷ）種を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記不純物が宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルギニンが０．１〜０．５Ｍの範囲の濃度であり、前記塩化ナトリウムが０．７５〜１．２５Ｍの範囲の濃度である、請求項１、２、４および６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
アフィニティークロマトグラフィーにより、ゲル基質のような固相中の標的に対象のタンパク質が選択的に結合することに基づき、細胞採取のように分子混合物から対象のタンパク質を精製できる。この固相成分は通常はカラムに形成され、対象のタンパク質を含む混合物をそれに通す。この最初の手順である捕捉手順において、対象のタンパク質は固相中の標的に特異的に結合し、混合物中の他の成分はカラムを通って流れる。しかし、高分子量種（ＨＭＷｓ）、低分子量種（ＬＭＷｓ）及びホスト細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）を含む混合物内のある成分は、不純物として対象のタンパク質と共にカラム内に保持される。そのため通常は１回以上の洗浄手順を行い、対象のタンパク質を固相に結合させたまま、洗浄溶液を１回以上カラムに用いてこれらの不純物を除去する。最後に、洗浄手順により不純物を除去した後、溶離手順によりカラムから対象のタンパク質を回収し、ここでは固相標的への対象のタンパク質の結合を分裂させる溶離溶液をカラムに用いて対象のタンパク質を溶離液中に回収する。従って、対象のタンパク質の精製におけるアフィニティークロマトグラフィーの有効性の大部分は、固相標的への対象のタンパク質の結合を分裂させずにまたは不要な影響を与えずに、不純物（例えばＨＭＷｓ、ＬＭＷｓ、ＨＣＰｓ）を有効に除去できる洗浄条件を識別することにかかっている。
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーの特に有用な種類は、抗体及びＦｃ融合タンパク質のような免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質の精製用のプロテインＡクロマトグラフィーである。以下の１つを含む洗浄溶液を含む様々な洗浄溶液がプロテインＡカラムから不純物を除去することについて述べられており、疎水性電解液（例えばｐＨ５．０〜７．０のテトラメチルアンモニウムクロリド、テトラエチルアンモニウムクロリド、テトラプロピルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウム）、溶媒（例えば５〜２０％イソプロパノールまたはポリプロピレン／ヘキシレングリコール）、尿素（例えば濃度１〜４Ｍ）、洗剤（例えば０．１〜１％Ｔｗｅｅｎ２０またはＴｗｅｅｎ８０）、ポリマー（例えばＰＥＧ４００またはＰＥＧ８０００のような５〜１５％ポリエチレングリコール）または濃度０．８〜２．０Ｍ、ｐＨ５．０〜７．０のＴｒｉｓ、ＨＣｌ、酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩緩衝剤のような高濃度緩衝溶液である（例えばＳｈｕｋｌａ．Ａ．Ａ  ａｎｄ  Ｈｉｎｃｋｌｅｙ．Ｐ（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２４：１１１５−１１２１、Ｂｌａｎｋによる米国特許第６，１２７，５２６号及び第６，３３３，３９８号、及びＢｒｅｅｃｅらによる米国特許第６，８７０，０３４号を参照）。しかしこれらの化学薬品の多くには、この限りではないが有毒性、腐食性、可燃性、不安定性、有害廃棄物としての高価な処分及び／または洗浄手順中に汚染物質を除去する効率の悪さを含む１つ以上の不便さがある。
【０００３】
単独でまたは洗剤（例えばＴｗｅｅｎ２０）、溶媒（例えばヘキシレングリコール）またはポリマー（例えばポリエチレングリコール）のどれかと組み合わせて塩（塩化ナトリウムのような）を含むプロテインＡクロマトグラフィー洗浄緩衝剤について述べられている（Ｂｒｅｅｃｅらによる米国特許第６，８７０，０３４号）。
【０００４】
Ｂａｒｒｏｎらは、ｐＨ５．０〜７．５のリン酸塩／酢酸塩緩衝剤中に０．５〜２．０Ｍアルギニン（任意選択で、ｐＨ５．０の１Ｍアルギニン、０．１Ｍリン酸塩／酢酸塩緩衝剤）を含むプロテインＡクロマトグラフィー用の中間体洗浄溶液について述べている。このアルギニン洗浄手順はＨＣＰ汚染物質を除去することを報告されている。著者らは、ｐＨ５．０〜７．５の０．５〜２．０Ｍの塩化ナトリウムを含む中間体洗浄溶液も試験したが、ＮａＣｌ洗浄はＨＣＰにおける有意な減少を示さないことを報告した（Ｂａｒｒｏｎら，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  Ｐｕｒｉｔｙ  ｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍｅｄｉａ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｗａｓｈ  Ｓｔｅｐ”，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｉｏｒａｒｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ＩＰＣＯＭ／００１２７３１９）。
【０００５】
Ｓｕｎらはまた、プロテインＡカラムのようなアフィニティークロマトグラフィーカラムを濃度０．１〜２．０Ｍ及びｐＨ４．５〜８．０でアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む洗浄緩衝剤を用いて洗浄することについても述べている（米国特許出願公開第２００８００６４８６０号及び第２００８００６４８６１号、ＰＣＴ公報第ＷＯ２００８／０３１０２０号）。
【０００６】
アルギニンはアフィニティークロマトグラフィーカラム及び他の種類の精製カラムからタンパク質を溶離するためにも使用されてきた。例として、Ａｒａｋａｗａらは、ｐＨ４．１〜５．０で０．５〜２．０Ｍアルギニンを含む溶離緩衝剤を使用しプロテインＡカラムから抗体を溶離させる方法を述べている（Ａｒａｋａｗａら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３６：２４４−２４８、Ｔｓｕｍａｔｏ，Ｋら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：１３０１−１３０８、米国特許出願公開第２００５０１７６１０９号）。更に、Ｅｊｉｍａらによる米国特許第７，５０１，４９５号は、アルギニン塩酸塩を含む展開溶液を使用することによりゲルろ過カラムからタンパク質を溶離させる方法について述べている。Ｇｈｏｓｅらは溶離液としてアルギニン勾配を用い非誘導体化シリカから対象のタンパク質を溶離させる方法を述べている（Ｇｈｏｓｅ，Ｓ．ら（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：４１３−４２３）。Ｃｏｆｆｍａｎらによる米国特許出願公開第２００３００５０４５０号は、分子及びタンパク質Ａを含むＦｃの錯体から分子を含むＦｃを分離する方法を述べており、ここでＦｃ／プロテインＡ錯体は疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）に適用され、カラムはアルギニンを含む緩衝剤で洗浄される。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用の効果的で強力な洗浄溶液を、この溶液を使用する洗浄方法と共に提供する。この洗浄溶液は溶離手順に先立ち洗浄手順で用いられ、その使用により、親和性基質から溶離された対象のタンパク質を高収率、高濃度で得られ、基質に用いられた出発材料から高分子量種（ＨＭＷｓ）及びホスト細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）を効果的に除去できる。この洗浄溶液の特徴はアルギニン（またはアルギニン誘導体）及び非緩衝塩の両方が存在することである。好ましくは、洗浄溶液は８．０を越える高ｐＨである。アルギニン（またはアルギニン誘導体）及び非緩衝塩の組み合わせは、アルギニンまたは塩のどちらかのみが含まれる洗浄溶液よりかなり多くの不純物を除去し、回収された対象のタンパク質の高い濃度に相関する鋭い溶離液ピークが得られる。
【０００８】
従って一形態において、本発明は対象のタンパク質が結合するアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）基質を用いて対象の精製タンパク質を生産する方法を提供し、この方法は、ＡＣ基質から対象のタンパク質を溶離させる前に、（ｉ）アルギニンまたはアルギニン誘導体及び（ｉｉ）非緩衝塩を含む１種以上の洗浄溶液でＡＣ基質を洗浄することを含む。好ましくは、１種以上の洗浄溶液で洗浄する前に対象のタンパク質をＡＣ基質に付加し、１種以上の洗浄溶液で洗浄後対象のタンパク質をＡＣ基質から溶離させ、特にＡＣ基質から不純物を除去する。
【０００９】
好ましい実施形態では、ＡＣ基質はプロテインＡカラムである。様々な他の形態では、ＡＣ基質は例えば、プロテインＧカラム、プロテインＡ／Ｇカラム、プロテインＬカラム、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、カルモジュリン樹脂カラム、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）カラム、麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合するカラム、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）と結合するカラム及びＳｔｒｅｐ−ＴａｇIIと結合するカラムから選択される。好ましい実施形態では、対象のタンパク質はプロテインＡカラムのようなＡＣ基質に結合する抗体または抗体切片であり、ここで述べられた親和性基質に結合する他のタンパク質も本発明の方法による精製に適している。
【００１０】
好ましい実施形態では、１種以上の洗浄溶液はアルギニン−ＨＣｌを含み、好ましくは濃度が０．０５〜２．０Ｍの範囲、より好ましくは０．０５〜０．８５Ｍの範囲、最も好ましくは０．１〜０．５Ｍの範囲にある。好ましい実施形態では、アルギニン−ＨＣｌは０．１Ｍまたは約０．１Ｍの濃度、０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍあるいは０．５Ｍまたは約０．５Ｍで存在する。他の実施形態では、１種以上の洗浄溶液は、アセチルアルギニン、Ｎ−アルファ−ブチロイル−アルギニン、アルマチン、アルギニン酸及びＮ−アルファ−ピバロイルアルギニンからなる群から選択された誘導体のようなアルギニン誘導体を含む。アルギニンまたはアルギニン誘導体はＬ−アルギニンを含むことが好ましいが、Ｄ−アルギニンも含まれる。
【００１１】
好ましい実施形態では、１種以上の洗浄溶液中の非緩衝塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）であり、好ましくは濃度が０．１〜２．０Ｍの範囲にある。好ましい実施形態では、ＮａＣｌは０．７５Ｍまたは約０．７５Ｍの濃度、１．０Ｍまたは約１．０Ｍあるいは１．２５Ｍまたは約１．２５Ｍで存在する。他の実施形態では、１種以上の洗浄溶液中の非緩衝塩は塩化カリウム、塩化カルシウム及び塩化マグネシウムから成る群から選択される。
【００１２】
特定の実施形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨは８．０より大きく、好ましくは少なくとも８．１であり、より好ましくは少なくとも８．５、少なくとも８．９である。一態様では、１種以上の洗浄溶液のｐＨは８．１〜９．５の範囲にある。別の形態では、１種以上のｐＨは８．５〜９．５の範囲にある。別の形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨは約９．０である。別の形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨは９．０である。
【００１３】
ここに述べられたアルギニン及び非緩衝塩の洗浄組み合わせは、両方の成分を含む単一の洗浄溶液で用いられることが好ましい（すなわち、ＡＣ基質は（ｉ）アルギニンまたはアルギニン誘導体及び（ｉｉ）非緩衝塩の両方を含む１種の洗浄溶液で洗浄される）。代わりに、一方はアルギニンまたはアルギニン誘導体を含み（好ましくはｐＨが８．０より大きい）、他方は非緩衝塩を含む２種の洗浄溶液を二段階の洗浄で使用できる。従って、洗浄方法の別の形態では、ＡＣ基質は一次洗浄溶液及び二次洗浄溶液の２種の洗浄溶液で洗浄される。一形態では、一次洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を含み、二次洗浄溶液は非緩衝塩を含む。別の形態では、一次洗浄溶液は非緩衝塩を含み、二次洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。
【００１４】
本発明の洗浄方法は、高分子量（ＨＭＷ）種及びホスト細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）を含む様々な不純物を除去する際に有効である。
【００１５】
別の形態では、本発明はプロテインＡカラムを使用して精製抗体または抗体切片を生産する方法を提供し、この方法は、（ａ）抗体または抗体切片を含む混合物をプロテインＡカラムに付加し、（ｂ）（ｉ）濃度が０．０５〜２．０Ｍ（より好ましくは０．０５〜０．８５Ｍ、最も好ましくは０．１〜０．５Ｍ）の範囲にあるアルギニン−ＨＣｌ及び濃度が０．１〜２．０Ｍの範囲にある塩化ナトリウムを含む洗浄溶液でプロテインＡカラムを洗浄し、洗浄溶液はタンパク質Ａカラムから不純物を除去し、（ｃ）プロテインＡカラムから抗体または抗体切片を溶離させることを含み、アルギニン−ＨＣｌは０．１Ｍまたは約０．１Ｍ、０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍあるいは０．５Ｍまたは約０．５Ｍの濃度で存在する。特別な形態では、ＮａＣｌは０．７５Ｍまたは約０．７５Ｍ、１．０Ｍまたは約１．０Ｍあるいは１．２５Ｍまたは約１．２５Ｍの濃度で存在する。様々な形態では、洗浄溶液のｐＨは８．０より大きく、好ましくは少なくとも８．１であり、より好ましくは少なくとも８．５であり、より好ましくは９．０であり、８．１〜９．５または８．５〜９．５の範囲にある。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明は、プロテインＡクロマトグラフィーのようなアフィニティークロマトグラフィー用の新しい洗浄溶液を提供し、これは不純物を除去するため対象のタンパク質の溶離に先立ちカラムに適用される。新しい洗浄溶液は、アルギニンまたはアルギニン誘導体及び非緩衝塩を含む。通常、洗浄溶液は水溶液である。
【００１７】
ここで用いられている「非緩衝塩」という用語は、酸または塩基を添加した際、適用条件下（高ｐＨ値のような）洗浄溶液（または複数の洗浄溶液）のｐＨを保持することに実質上寄与しないような種類でそのような濃度にある洗浄溶液中に存在する塩を指す。通常、非緩衝塩イオン性塩である。非緩衝塩は、ＣｌまたはＢｒ（より好ましくはＣｌ）を含む塩を含むハロゲン塩、特にＮａ、Ｋ、Ｃａ及びＭｇ（より好ましくはＮａまたはＫ）を含むアルカリ金属またはアルカリ土類金属を含むハロゲン塩を含む。「非緩衝塩」という用語は、適用条件下で洗浄溶液（または複数の洗浄溶液）のｐＨを保持することに実質上寄与する酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びＴｒｉｓのような緩衝塩を含まない。好ましい形態では、非緩衝塩はハロゲン（例えば、ＣｌまたはＢｒ）の塩である。好ましい形態では、非緩衝塩はナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）またはマグネシウム（Ｍｇ）を含むハロゲン塩であり、ナトリウム（Ｎａ）またはカリウム（Ｋ）がより好ましい。また別の形態では、非緩衝塩はＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２及びＭｇＣｌ２から成る群から選択される。特に好ましい形態では、非緩衝塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。通常、非緩衝塩は少なくとも１Ｍの「高」濃度で使用される。他の適した濃度及び濃度範囲については更に以下で述べる。
【００１８】
洗浄成分のこの新しい組み合わせは、収率に影響を与えずに一般に使用される手順よりかなり多くの不純物を除去する。更に、この洗浄条件により溶離物中の対象のタンパク質の高い濃度に相関する鋭い溶離液ピークが得られ、更なる下流の精製工程の性能を向上させることに有利である。
【００１９】
ホスト細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）及び高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）種のような生成物に関連する不純物を含む不純物を効率的に除去することは、対象のタンパク質の下流処理中の重要な因子である。アフィニティークロマトグラフィーはしばしば対象のタンパク質（例えば抗体）の多段階精製工程の第１段階として使用され、アフィニティークロマトグラフィーの後の対象のタンパク質の純度は、後に続く精製手順の種類及び数に著しく影響を与える。アフィニティークロマトグラフィーの別の重要な役割は生成物を濃縮することであり、これにより後に続く精製手順において使用されるカラムが比較的小さくなり、費用が安くなる。そのため、アフィニティークロマトグラフィー手順の間の不純物の除去を最適化することが特に重要である。
【００２０】
通常ｐＨ３〜４の低ｐＨ条件は、親和性基質から結合した対象のタンパク質を溶離し、するための必要条件であり、凝集を引き起こすかもしれない欠点を有する。以前は、ｐＨ５〜５．５のあまり厳しくない条件は、対象のタンパク質と親和性基質間の相互作用を保ち、カラムから非特異的に結合された不純物を洗浄するために使用されてきた。しかし、特に高付加密度で作業する場合、これらの条件で対象のタンパク質が部分的に溶離するため、対象のタンパク質の収率はしばしば低減する。従って好ましい形態では、本発明により提供される洗浄溶液は８．０より高い高ｐＨで有利に機能し、不純物を除去できるが、親和力基質への対象のタンパク質の結合は保つ。
【００２１】
本発明により提供されるアフィニティークロマトグラフィー用の新しい洗浄溶液は、好ましくは高ｐＨで機能する、アルギニン（またはアルギニン誘導体）及び非緩衝塩の混合物に基づく。不純物の広い生物物理学的多様性が一般の収穫物または細胞抽出物に存在するため、クロマトグラフィー媒体の固相及び／または対象の結合されたタンパク質との相互作用が非常に多様な様式となる。水素結合、静電相互作用、疎水性及びファンデルワールス力または相互作用のこれらの型の組み合わせのような２つの分子間の非共有分子間相互作用により、不純物が多少強くつながれる。そのため、不純物を除去するためのいくつかの異なる機構の組み合わせが、不純物を除去するための単一の機構に基づく手段よりかなり有効なようである。
【００２２】
本発明の分析データに基づき、洗浄溶液中の非緩衝塩の効果に関して、対象のタンパク質と親和性基質の配位子間の高い親和力相互作用は、高い非緩衝塩濃度での洗浄により切断されず、固定配位子または結合された対象のタンパク質のどちらかの上の荷電残留物に非特異的につながれた荷電汚染物質は効率的に除去される。従って、機構に拘束されることは意図しないが、洗浄溶液に使用される非緩衝塩は、アフィニティークロマトグラフィー基質の１種以上の成分（例えば、前記基質の樹脂などの化学的支持体、前記基質に固定されたアフィニティー配位子、及び/又は前記マトリックス上に固定された前記リガンドに結合した対象となる標的）上の荷電残留物に非特異的につながれた荷電汚染物質（不純物）間のイオン性相互作用を切断する能力を有するが、固定配位子に結合された標的の特異的な結合を分裂しない。
【００２３】
洗浄溶液中のアルギニンの効果に関して、アルギニンはある沈殿したタンパク質を安定化できること（Ｕｍｅｔｓｕ，Ｍ．ら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２８：１８９−１９７；Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｋ．ら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１２：１３８３−１３８６）、凝集体の形成を減少させること（Ｅｊｉｍａ，Ｄ．ら（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．１０９４：４９−５５）が報告されている。機構に拘束されることを意図しないが、タンパク質凝集体の減少は、アルギニンと相互作用するタンパク質上の疎水性部分のマスキングから起きる。この相互作用は、アルギニン上のグアニジウム基とタンパク質上のトリプトファン基間に生じるまたはアルギニンのクラスター化により疎水性部分の形成から生じる、またはそのような効果の組み合わせである。
【００２４】
洗浄溶液中の８．０より高いｐＨ値を用いることに関して、塩基性ｐＨはＨＣＰｓ及びＨＭＷｓを部分的に変性させるが、単量体抗体を含む安定なタンパク質はこれらの条件で影響を受けない。機構に拘束されることは意図しないが、汚染物質タンパク質の変性は構造におけるわずかな変化として現れ、それは非特異的結合を弱めるために十分である。そのため、結合されたまたは親和性基質の固体支持体との相互作用を不安定にすることにより、対象のタンパク質洗浄溶液の高いｐＨは不純物の除去を高めるために有益である。
【００２５】
従って、一形態では、本発明は対象のタンパク質が結合されるアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）基質を使用して精製タンパク質を生産する方法を提供し、この方法はＡＣ基質から対象のタンパク質を溶離させる前にＡＣ基質を１種以上の洗浄溶液で洗浄することを含み、洗浄溶液は（ｉ）アルギニンまたはアルギニン誘導体及び（ｉｉ）非緩衝塩を含む。
【００２６】
ここで用いられている「アフィニティークロマトグラフィー基質」または「ＡＣ基質」という用語は固相媒体、通常はゲルまたは樹脂を指すものであり、それにより受容体と配位子、酵素と基体または抗原と抗体間のような対象のタンパク質とＡＣ基質間の非常に特異的な結合相互作用に基づいて生化学的混合物が分離される。そのため、緩衝剤条件に依存し、固相媒体は対象のタンパク質が可逆的に付着できる標的を含む。ＡＣ基質を含む固定または固相媒体の例として、アガロースビード（市販のＳｅｐｈａｒｏｓｅ基質のような）のようなゲル基質及び多孔性ガラスビード（市販のＰｒｏＳｅｐ基質のような）のようなガラス基質を含むが、この限りでない。
【００２７】
対象のタンパク質のＡＣ基質への結合は通常、カラムクロマトグラフィーによりなされる。つまり、ＡＣ基質はカラムに形成され、対象のタンパク質を含む生化学的基質をカラムに流し、１種以上の洗浄溶液をカラムに流すことによりカラムを洗浄し、溶離緩衝剤をカラムに流すことによりカラムから対象のタンパク質を溶離する。
【００２８】
代わりに、対象のタンパク質のＡＣ基質への結合はバッチ処理によりなされ、そこで対象のタンパク質を含む生化学的混合物を容器中でＡＣ基質と定温放置して対象のタンパク質をＡＣ基質に結合させ、固相媒体を容器から除去し（例として遠心分離による）、固相媒体を洗浄して不純物を除去し、再度回収し（例として遠心分離による）対象のタンパク質を固相媒体から溶離させる。
【００２９】
また別の実施形態では、バッチ処理及びカラムクロマトグラフィーの組み合わせが用いられる。例として、対象のタンパク質のＡＣ基質への最初の結合はバッチ処理によりなされ、その後固相媒体をカラムに充填し、カラムを洗浄しカラムから対象のタンパク質を溶離させる。
【００３０】
特別な固相基質の性質、特に固相に付着された標的の結合特性は、固相基質を用いて精製されるタンパク質の種類を決定する。例えば、本発明の好ましい実施形態では、ＡＣ基質はプロテインＡカラムであり、これは固相に付着される標的として細菌細胞壁タンパク質であるプロテインＡを含み、ある免疫グロブリンのＦｃ領域内のＣＨ２及びＣＨ３域と特異的に結合する。プロテインＡの結合特性は当技術分野で確立されている。従って、本発明の好ましい形態では、対象のタンパク質（精製される）はＦｃ領域を含む抗体または抗体切片である。さらに、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製できる補足のタンパク質はＦｃ融合タンパク質を含む。タンパク質がプロテインＡ基質に特異的に結合できる場合に限り、本発明の方法に従って精製できる。
【００３１】
様々なプロテインＡ樹脂は当技術分野でよく知られており、本発明における使用に適している。市販のプロテインＡ樹脂の例として、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＸｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、ｒｍｐＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ及びｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ（全てＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手できる）；ＰｒｏＳｅｐ  Ａ  、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ  Ｕｌｔｒａ及びＰｒｏＳｅｐ−Ｖａ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（全てＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手できる）；Ｐｏｒｏｓ  Ａ及びＭａｂｃａｐｔｕｒｅ  Ａ（両方ともＰｏｒｏｓから入手できる）；ＩＰＡ−３００、ＩＰＡ−４００及びＩＰＡ−５００（全てＲｅｐｌｉＧｅｎ  Ｃｏｒｐ．から入手できる）；Ａｆｆｉｇｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びＡｆｆｉｐｒｅｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（両方ともＢｉｏ−Ｒａｄから入手できる）、ＭＡＢｓｏｒｂｅｎｔ  ＡＩＰ及びＭＡＢｓｏｒｂｅｎｔＡ２Ｐ（両方ともＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｌｔｄ．から入手できる）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  Ｆ  （Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販）；Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ及びＰｒｏｔｅｉｎＡｇａｒｏｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（両社ともＰＩＥＲＣＥから市販）；Ａ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ３００及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｕｌｔｒａｆｌｏｗ（両方ともＳｔｅｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓから入手できる）が挙げられるがこの限りではない。
【００３２】
プロテインＡクロマトグラフィーに加えて、本発明の洗浄方法は他のアフィニティークロマトグラフィー系に用いられる。例として、他の実施形態では、ＡＣ基質はプロテインＧカラム、プロテインＡ／ＧカラムまたはプロテインＬカラムであり、その各々は当技術分野で確立された結合特性を有する免疫グロブリン結合細菌タンパク質でもある。そのため、プロテインＧ基質、プロテインＡ／Ｇ基質またはプロテインＬ基質であるＡＣ基質はＦｃ領域及びＦｃ領域タンパク質を含む抗体、抗体切片を精製するために使用できる。
【００３３】
AC 基質の他の無限定な例、及び精製時に有効なタンパク質種は次を含む：固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（ヒスチジン−標識付けタンパク質のような金属イオンに対する親和力を有するタンパク質の精製用）、カルモジュリン樹脂カラム（カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）で標識付けされたタンパク質の精製用）、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒCｅｌ（登録商標）カラム（免疫グロブリンと選択的に結合するセルロース基質）、麦芽糖結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合するカラム（ＭＢＰで標識付けされたタンパク質と選択的に結合するＤｅｘｔｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂のような）、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）と結合するカラム（ＧＳＴで標識付けされたタンパク質と選択的に結合するＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）樹脂のような）及びＳｔｒｅｐ−ＴａｇIIと結合するカラム（Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇIIで標識付けされたタンパク質と選択的に結合するＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂のような）。更に、免疫親和性基質は固相に固定される標的としての抗体を含み、固相に固定される抗体に特異的に結合する対象の抗原を精製するために使用される。
【００３４】
関心のある本発明は、特にプロテインＡクロマトグラフィーを使用する抗体の精製に関して述べられ、タンパク質が特にＡＣ基質に選択的に結合することを当業界でよく知られている場合に限り、タンパク質は本明細書に述べられた洗浄方法を用いて精製される。
【００３５】
本発明の洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む。本発明に用いられるアルギニンは、天然アミノ酸アルギニン（例えばＬ−アルギニン）、Ｄ−アルギニンまたはアルギニン誘導体である。アルギニン誘導体の例として、アセチルアルギニン及びＮ−アルファ−ブチロイル−アルギニンのようなアシル化アルギニン、アグマチン、アルギニン酸及びＮ−アルファ−ピバロイルアルギニンを含むがこの限りではない。アルギニンまたはアルギニン誘導体は酸付加塩の形態で用いてもよい。酸付加塩を形成できる酸の例は、塩酸等を含む。
【００３６】
洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体濃度は通常、０．０５Ｍと２．０Ｍの間であり（例えば、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．１５Ｍ、１．２０Ｍ、１．２５Ｍ、１．３０Ｍ、１．３５Ｍ、１．４０Ｍ、１．４５Ｍ、１．５Ｍ、１．５５Ｍ、１．６Ｍ、１．６５Ｍ、１．７Ｍ、１．７５Ｍ、１．８Ｍ、１．８５Ｍ、１．９Ｍ、１．９５Ｍまたは２．０Ｍ）、特に好ましくは０．０５Ｍと０．８５Ｍの間であり（これは２０℃におけるアルギニンの上限溶解度である）（例えば、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍまたは０．８５Ｍ）、最も好ましくは０．１Ｍと０．５Ｍの間である（例えば、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍまたは０．５Ｍ）。様々な形態では、アルギニンまたはアルギニン誘導体濃度は例えば、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍまたは０．８Ｍであるか、あるいは０．１Ｍと０．５Ｍとの間の範囲である。ある実施形態では、洗浄溶液中のアルギニンまたはアルギニン誘導体濃度は０．２５Ｍまたはそれ以上である。特別な実施形態では、アルギニンは０．１Ｍまたは約０．１Ｍ、０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍあるいは０．５Ｍまたは約０．５Ｍの濃度で存在する。
【００３７】
本発明の洗浄溶液はまた上に述べたように非緩衝塩を含み、不純物と親和性基質の１種以上の成分間のイオン性相互作用を分裂させるために十分な種類でそのような濃度である。好ましい実施形態では、非緩衝塩はハロゲン塩である。特に好ましい実施形態では、非緩衝塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である。他の実施形態では、非緩衝塩は例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）または塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）である。洗浄溶液中の非緩衝塩濃度は通常、０．１Ｍと２．０Ｍの間であり（例えば、０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．２５Ｍ、０．３Ｍ、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．１５Ｍ、１．２０Ｍ、１．２５Ｍ、１．３０Ｍ、１．３５Ｍ、１．４０Ｍ、１．４５Ｍ、１．５Ｍ、１．５５Ｍ、１．６Ｍ、１．６５Ｍ、１．７Ｍ、１．７５Ｍ、１．８Ｍ、１．８５Ｍ、１．９Ｍ、１．９５Ｍまたは２．０Ｍ）、または０．５Ｍと１．５Ｍの間であり（例えば、０．５Ｍ、０．５５Ｍ、０．６Ｍ、０．６５Ｍ、０．７Ｍ、０．７５Ｍ、０．８Ｍ、０．８５Ｍ、０．９Ｍ、０．９５Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．１５Ｍ、１．２Ｍ、１．２５Ｍ、１．３Ｍ、１．３５Ｍ、１．４Ｍ、１．４５Ｍまたは１．５Ｍ）、または１Ｍと２Ｍの間である（例えば、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．１５Ｍ、１．２Ｍ、１．２５Ｍ、１．３Ｍ、１．３５Ｍ、１．４Ｍ、１．４５Ｍ、１．５Ｍ、１．５５Ｍ、１．６Ｍ、１．６５Ｍ、１．７Ｍ、１．７５Ｍ、１．８Ｍ、１．８５Ｍ、１．９Ｍ、１．９５Ｍまたは２Ｍ）。ある実施形態では、戦場溶液中の非緩衝塩の濃度は１Ｍ以上である。特別な実施形態では、洗浄溶液中の非緩衝塩濃度は０．７５Ｍまたは約０．７５Ｍ、１．０Ｍまたは約１．０Ｍあるいは１．２５Ｍまたは約１．２５Ｍの濃度で存在する。
【００３８】
本発明の洗浄溶液のｐＨは通常、８．０より高いが、低いｐＨも本発明の洗浄溶液の使用に適している。特別な実施形態では、ｐＨは８．０より高く、好ましくは少なくとも８．１、より好ましくは少なくとも８．５または８．９である。一実施形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨが８．１〜９．５の範囲にある。別の実施形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨが８．５〜９．５の範囲にある。別の実施形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨが約９．０である。別の実施形態では、１種以上の洗浄溶液のｐＨが９．０である。代わりに、精製される対象のタンパク質に依り、低いｐＨ値、例えばｐＨ５．０〜８．０の範囲にあるｐＨまたは７．５または７．０または６．５または５．０のｐＨを使用できる。精製されるタンパク質の特性に依り、普通の当業者は洗浄溶液の適切なｐＨ値を選択できる。従って、洗浄溶液（複数の洗浄溶液）はｐＨを調節する及び／または保持するため１種以上の緩衝剤を含む。洗浄溶液（複数の洗浄溶液）に含まれる通常の緩衝剤の例は、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、ビス−Ｔｒｉｓ、ビス−Ｔｒｉｓプロパン、ヒスチジン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、ギ酸塩、酢酸塩、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、クエン酸塩、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸）、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）、ＴＥＳ（２−｛［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、カコジル酸塩（ジメチルアルシン酸）及びＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩溶液）を含むがこの限りではない。
【００３９】
本明細書で述べられているアルギニン及び非緩衝塩洗浄溶液の組み合わせは、両方の成分を含む単一の洗浄溶液で用いられることが好ましい。代わりに、一方がアルギニンまたはアルギニン誘導体を含み（好ましくは高ｐＨで）他方が非緩衝塩を含む２種の洗浄溶液も連続洗浄で使用できる。従って、洗浄方法の別の実施形態では、対象のタンパク質を溶離させる前に、一次洗浄溶液及び二次洗浄溶液の２種の洗浄溶液で洗浄する。一実施形態では、一次洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体を含み（８．０より高いｐＨが好ましい）、二次洗浄溶液は非緩衝塩を含む。別の実施形態では、一次洗浄溶液は非緩衝塩を含み、二次洗浄溶液はアルギニンまたはアルギニン誘導体（８．０より高いｐＨが好ましい）を含む。適したアルギニン誘導体及び非緩衝塩の例は、洗浄溶液の好ましい濃度、濃度範囲及びｐＨ条件と共に前述の通りである。
【００４０】
本発明の洗浄方法は、高分子量（ＨＭＷ）種及びホスト細胞タンパク質（ＨＣＰｓ）を含む様々な不純物を除去することに有効である。実施形態で詳しく述べたように、本発明の洗浄溶液は溶離液中のＨＭＷ種及びＨＣＰｓの両方を減らすことに有効であり、溶離液中の対象のタンパク質の収率割合は高く溶離液中の対象のタンパク質の濃度は高い。例として、様々な実施形態では、本明細書で述べた洗浄方法を用いると対象のタンパク質の収率割合は９５％より高い、より好ましくは９６％より高い、更により好ましくは９７％より高くなる。溶離液中のＨＭＷ種の減少に関して、溶離液中％ＨＭＷと表され、様々な実施形態では、本明細書で述べた洗浄方法を用いると溶離液中の％ＨＭＷは１０％未満または５％未満または２．０％未満または１％未満または０．５％未満となる。溶離液中のＨＣＰｓの減少に関して、対数減少値（ＬＲＶ）と表され、様々な実施形態では、本明細書で述べた洗浄方法を用いるとＨＣＰｓに関するＬＲＶは少なくとも１．１または少なくとも１．３または少なくとも１．５または少なくとも２．０または少なくとも２．３または少なくとも２．５または少なくとも２．７となる。
【００４１】
本発明はアフィニティークロマトグラフィー中の洗浄手順に関して本明細書で述べているが、アフィニティークロマトグラフィー基質から対象のタンパク質を精製するため洗浄手順の前後両方で補足の手順を行うことは普通の当業者に明白である。例えば、洗浄手順に先立ち、本発明の方法は平衡化手順及び付加または捕捉手順を含み、平衡化手順でアフィニティークロマトグラフィー基質を付加緩衝剤で平衡化し、付加または捕捉手順で対象のタンパク質を含む生化学的混合物（例えば細胞採取物）をＡＣ基質に適用する。平衡化及び付加緩衝剤に適した条件は、ＡＣ基質及び精製される対象のタンパク質の性質に依って変わり、普通の当業者は当技術分野で確立された方法及び情報を用いそのような条件をたやすく決定できる。プロテインＡカラム上の抗体の精製について平衡化及び付加緩衝剤の例は、実施例１および２に示すがこの限りではない。更に、上述した洗浄手順（または複数の洗浄手順）の後、本発明の方法は一般の洗浄溶液を用いる１種以上の追加の洗浄手順（または複数の洗浄手順）及び／または溶離手順を含み、溶離手順では、アフィニティークロマトグラフィー基質に溶離緩衝剤を用いて基質から対象のタンパク質を溶離させる。溶離緩衝剤の適した条件は、ＡＣ基質及び精製される対象のタンパク質の性質に依り変わり、普通の当業者は当技術分野で確立された方法及び情報を用いてそのような条件をたやすく決定できる。通常、ＡＣ基質からの対象のタンパク質の溶離は酸性ｐＨで行われる。プロテインＡカラム上の抗体を精製するための溶離緩衝剤の例は、実施例１及び２に示すがこの限りではない。
【００４２】
別の態様では、本発明は、抗体のプロテインＡ精製中に抗体含有混合物から不純物を除去する好ましい方法を提供する。従って、本発明はプロテインＡカラムを用いて精製された抗体または抗体切片を生産する方法を提供し、この方法は、
ａ）抗体または抗体切片から成る混合物をプロテインＡカラムに負荷し
ｂ）（ｉ）０．０５〜２．０Ｍの範囲（より好ましくは０．０５〜０．８５Ｍの範囲、最も好ましくは０．１〜０．５Ｍの範囲）にある濃度のアルギニン−ＨＣｌ及び（ｉｉ）０．１〜２．０Ｍの範囲にある濃度の塩化ナトリウムから成る洗浄溶液でプロテインＡカラムを洗浄し、ここで洗浄溶液はプロテインＡカラムから不純物を除去し
ｃ）抗体または抗体切片をプロテインＡカラムから溶離させる
ことから成る。好ましくは、洗浄溶液は８．０より高いｐＨにある。アルギニン−ＨＣｌの好ましい濃度及び濃度範囲は前述の通りである。例として、好ましい実施形態では、アルギニン−ＨＣｌは約０．２５Ｍの濃度または０．２５Ｍの濃度にある。塩化ナトリウムの好ましい濃度及び濃度範囲は上述の通りである。例として、好ましい実施形態では、塩化ナトリウムは約１Ｍの濃度または１Ｍの濃度にある。好ましいｐＨ及びｐＨ範囲は上述の通りである。例として、一実施形態では、洗浄溶液のｐＨは８．１〜９．５の範囲にある。別の実施形態では、洗浄溶液のｐＨは８．５またはそれより高い。別の実施形態では、洗浄溶液のｐＨは９．０である。
【００４３】
本発明は更に以下の実施形態により説明され、これらを更に制限するものとして解釈するべきでない。本出願に引用された全ての参照、特許及び公開特許出願は全体として特に本明細書に援用される。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
実施例
実施例１：アルギニン／非緩衝塩洗浄液と他の洗浄液との比較
本実施例では、アフィニティークロマトグラフィー中に抗体含有液から不純物を除去するための様々な洗浄液の有効性を比較する。より詳細には、３種の洗浄液（１種目はｐＨ５．０でアルギニンおよび非緩衝塩を含まず、２種目はｐＨ７．０で非緩衝塩を含むがアルギニンを含まず、３種目はｐＨ９．０で非緩衝塩とアルギニンの両方を含む）を比較する。
【００４５】
分かりやすく説明すると、１．５から２．５ｇ／Ｌの抗体を含む哺乳動物細胞培養の上清を深層濾過によって回収し、ＡＬＣカラム、特にプロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、以下の表１に記載の条件に従って精製する。
【表１】
0005909450.tif 000002
【００４６】
平衡化したカラムに清澄化した回収物を負荷し、以下の表２に記載の洗浄液１で一次洗浄し、続いて洗浄液２（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．０）で二次洗浄し、次に低ｐＨで溶出する。この溶出液を、分析ＡＬＣによりその抗体濃度を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＨＭＷ／ＬＭＷを、および同じ細胞株で作成された酵素結合免疫吸着測定法によりＨＣＰ含量を分析する。一次洗浄用に比較する様々な洗浄液を以下の表２に示す。
【表２】
0005909450.tif 000003
【００４７】
表２に示す３種の異なる洗浄液を使用した、４種の異なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のプロテインＡ精製の収率を以下の表３に示す。
【表３】
0005909450.tif 000004
【００４８】
表３は、Ｗ１−Ａ５（非緩衝塩またはアルギニンを含まない、ｐＨ５．０）またはＷ２−Ｎ７（非緩衝塩を含むがアルギニンを含まない、ｐＨ７．０）のどちらかを用いた洗浄は、精製される抗体によって回収される抗体量が変動する結果となることを示す。より詳細には、Ｗ１−Ａ５を用いた洗浄では８１から９６％の間で変動する収率となり、Ｗ２−Ｎ７を用いた洗浄では９２から１０１％の間で変動する収率となる。これに対して、ｐＨ９．０で非緩衝塩とアルギニンの両方を含むＷ３−Ａｒｇ／Ｎ９を用いた洗浄は、精製された４種全ての抗体に関して９６％を超え、一貫して高収率になる。
【００４９】
表２に示す３種の異なる洗浄液を使用した、４種の異なるｍＡｂのプロテインＡ精製後の溶出液濃度（ｇ／Ｌ）を以下の表４に示す。
【表４】
0005909450.tif 000005
【００５０】
表４は、溶出液濃度もまたＡＬＣ中に用いられる洗浄バッファーに影響されることを示す。４種のｍＡｂ（ｍＡｂＱｇ、ＢｙおよびＶａ）のうちの３種に関して、Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９を用いた洗浄は、Ｗ１−Ａ５またはＷ２−Ｎ７を用いた洗浄よりも高い溶出液濃度となる。４種の抗体に対する平均溶出液濃度は、Ｗ１−Ａ５洗浄後（１７．１ｇ／Ｌ）が最も低く、続いてＷ２−Ｎ７洗浄（１７．３ｇ／Ｌ）であり、Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９を用いた洗浄後（２１．７ｇ／Ｌ）が最も高い。
【００５１】
表２に示す３種の異なる洗浄液を使用した、４種の異なるｍＡｂのプロテインＡ精製後の溶出液中における宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の減少を表５に示す。ＨＣＰの減少は、細胞回収物中の値に対する対数減少値（ＬＲＶ）として表される。
【表５】
0005909450.tif 000006
【００５２】
不純物除去に関しては、表５のデータに基づいて、３種の洗浄バッファー間に明確な順位を定めることができる。最も低いＨＣＰの減少は低ｐＨ洗浄であるＷ１−Ａ５で得られ、続いて塩洗浄であるＷ２−Ｎ７を用いた洗浄であり、最も高い除去係数は、ｐＨ９．０のアルギニン−ＮａＣｌを組合せたバッファー（Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９）を用いることで得られる。除去の対数オーダーで表すと、Ｗ１−Ａ５を用いた洗浄後に平均１．４ｌｏｇが得られ、Ｗ２−Ｎ７では１．５５ｌｏｇであり、Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９では２．２ｌｏｇという最も高い除去が達成される。
【００５３】
表２に示す３種の異なる洗浄液を使用した、４種の異なるｍＡｂのプロテインＡ精製後の溶出液中の高分子（ＨＭＷ）種のレベルを以下の表６に示す。溶出液中のＨＭＷ種のレベルは、溶出液中の総タンパク質のパーセント（％）として表す。
【表６】
0005909450.tif 000007
【００５４】
表６は、ＨＭＷ種のレベルは４種の異なるｍＡｂの間で非常に不均一であり、ＨＭＷの除去はｍＡｂ依存的であることを示す。全体的に見て、Ｗ１−Ａ５洗浄液は最も有効でない洗浄液である。より良い結果がＷ２−Ｎ７洗浄液で得られ、ＡＬＣ溶出液中の最も低いＨＭＷの値が、Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９洗浄液で一貫して見出される。Ｗ１−Ａ５洗浄に対してＷ３−Ａｒｇ／Ｎ９洗浄を比較すると、３種のｍＡｂ（ｍＡｂＱｇ、ＢｙおよびＶａ）は、２．６から５．９倍のＨＭＷの減少に対応するが、ｍＡｂ−Ｂｐは、ごくわずかな減少しか示さなかった。
【００５５】
上の表３〜６に概説した実験に関する結果のまとめを以下の表７に示す。陰をつけた行には、回収物の組成を表す。
【表７】
0005909450.tif 000008
【００５６】
実施例２：様々なアルギニン／塩洗浄液の比較
本実施例では、アフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）中に不純物を除去するための、異なったｐＨ値で異なった量の非緩衝塩および／またはアルギニンを含むさらなる洗浄液の有効性を比較する。本実施例で使用するクロマトグラフィーの条件は、以下の表８に記載の通りである。
【表８】
0005909450.tif 000009
【００５７】
本実施例で比較する洗浄液を以下の表９に記載する。
【表９】
0005909450.tif 000010
【００５８】
表９に示す４種の洗浄液によって、低非緩衝塩洗浄液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含むＷ４−０．１５ＭＮ７）と高非緩衝塩洗浄液（１ＭのＮａＣｌを含むＷ２−Ｎ７）の直接的な比較、ならびにｐＨ８．０でアルギニンだけを含む洗浄液（Ｗ５−Ａｒｇ８）と塩基性ｐＨで非緩衝塩とアルギニンの組合せを含む洗浄液（Ｗ６−Ａｒｇ／Ｎ８）の比較が可能になる。
【００５９】
表９に示す４種の異なる洗浄液ならびにアルギニン単独の洗浄（Ｗ５−Ａｒｇ８）と高塩単独の洗浄（Ｗ２−Ｎ７）の組合せを使用した、ｍＡｂ−Ｂｙの精製に対する収率、溶出液中のＨＭＷ種のパーセントおよびＨＣＰの減少（ＬＲＶとして表される）を以下の表１０に示す。
【表１０】
0005909450.tif 000011
【００６０】
表１０は、抗体の収率は全ての洗浄条件に対して９７％を上回ったままであることを示す。さらに、ＨＭＷとＨＣＰの両方の不純物の除去に最も有効な洗浄液は、塩基性ｐＨでアルギニンと高非緩衝塩の両方を含む洗浄液（Ｗ６−Ａｒｇ／Ｎ８）、または塩基性ｐＨでアルギニンを含む洗浄液（Ｗ５−Ａｒｇ８）と高非緩衝塩洗浄液（Ｗ２−Ｎ７）の併用である。
【００６１】
ある程度生理的な洗浄液であるＷ４−０．１５ＭＮ７を用いた洗浄は、カラムに負荷した出発材料と比較して、ＨＣＰを６４分の１（１．８ｌｏｇ）に減少させる。これとは対照的に、ｐＨ８で非緩衝塩−アルギニンの組合せ（Ｗ６−Ａｒｇ／Ｎ８）を用いた洗浄は、４９８分の１（２．７ｌｏｇ）に減少させる。
【００６２】
ＨＭＷの減少は、同様の傾向を取る。ｐＨ７．０で２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む洗浄液（Ｗ４−０．１５ＭＮ７）を用いた洗浄は、溶出液中に１．６％のＨＭＷをもたらすのに対して、非緩衝塩−アルギニンの組合せ（Ｗ６−Ａｒｇ／Ｎ８）を用いた洗浄は、この値を５分の１以下に減少させる。
【００６３】
実施例３：洗浄液における塩基性ｐＨと生理的ｐＨとの比較
本実施例では、ＨＣＰおよびＨＭＷの除去に対する洗浄液のパラメータとしてのｐＨの分析を行い、塩基性ｐＨ条件の優位性を示す。実施例２の表８に記載の条件を使用したアフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）を、わずかに異なるレベルのＨＭＷおよびＨＣＰを用いて、ｍＡｂ−Ｖａの細胞回収物に対して行う。
【００６４】
本実施例で比較する洗浄液を以下の表１１に記載する。
【表１１】
0005909450.tif 000012
【００６５】
表１１に示す３種の異なる洗浄液を使用した、ｍＡｂ−Ｖａの精製に対する収率、溶出液中のＨＭＷ種のパーセントおよびＨＣＰの減少（ＬＲＶとして表される）を以下の表１２に示す。
【表１２】
0005909450.tif 000013
【００６６】
高非緩衝塩単独の洗浄液であるＷ２−Ｎ７を基準のコントロール洗浄に供して、ほぼ生理的なｐＨ７．０（洗浄液Ｗ６−Ａｒｇ／Ｎ７）および塩基性のｐＨ８．９（洗浄液Ｗ３ｂ−Ａｒｇ／Ｎ８．９）で、アルギニン／非緩衝塩の組合せのＨＣＰ／ＨＭＷ除去能力を確かめる。低い方のｐＨ（ｐＨ７．０）と比較すると、高い方のｐＨ（ｐＨ８．９）において、１．６から１．４％というわずかであるが注目すべきＨＭＷレベルの減少が観察される。ＨＣＰ除去への効果はさらに明らかである。ここでは、低い方のｐＨの洗浄（ｐＨ７．０）がＨＣＰを１．４８ｌｏｇ減少させるのに対して、高い方のｐＨの洗浄（ｐＨ８．９）は、この値を１．６１ｌｏｇ減少させる。このことは、不純物除去能力における高いｐＨの洗浄の優位性を強調するものである。
【００６７】
実施例４：アルギニン／塩洗浄液と他の洗浄液との比較
本実施例では、Ｔｗｅｅｎ８０、アルギニン以外のアミノ酸または高濃度のトリスを含む他の洗浄液を、アルギニン／非緩衝塩洗浄液と比較する。本実施例では、ＨＣＰおよびＨＭＷの除去に対する洗浄液のパラメータとしてのｐＨの分析を行い、塩基性ｐＨ条件が優位であること示す。実施例１の表１に記載の条件を使用したアフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）を、わずかに異なるレベルのＨＭＷおよびＨＣＰを用いて、ｍＡｂ−Ｖａの細胞回収物に対して行う。
【００６８】
本実施例で比較する洗浄液を以下の表１３に記載する。
【表１３】
0005909450.tif 000014
【００６９】
表１３に示す６種の異なる洗浄液を使用した、ｍＡｂ−Ｖａの精製に対する収率、溶出液中のＨＭＷ種のパーセントおよびＨＣＰの減少（ＬＲＶとして表される）を以下の表１４に示す。
【表１４】
0005909450.tif 000015
【００７０】
表１４は、高非緩衝塩単独（Ｗ２−Ｎ７）、Ｔｗｅｅｎ８０（Ｗ７−Ｎ７−Ｔ８０）、グリシン等の他のアミノ酸（Ｗ８−Ｎ７−０．１ＭＧ）または高濃度のトリス（Ｗ９−０．５Ｍトリス８．９ＬＷ）を含む他の洗浄液と比較して、高ｐＨのアルギニン／非緩衝塩洗浄液（Ｗ３ｂ−Ａｒｇ／Ｎ８．９）は、ＨＭＷとＨＣＰの両方を除去することにおいて最も有効な洗浄液であることを示す。
【００７１】
実施例５：高ｐＨのアルギニン／非緩衝洗浄液と低ｐＨおよび高ｐＨの塩単独との比較
本実施例では、高ｐＨのアルギニン／非緩衝塩洗浄液の有効性を、高ｐＨおよび低ｐＨの非緩衝塩液と比較する。詳細に述べると、以下の条件、つまり（１）低ｐＨ（すなわち７．０）の非緩衝塩洗浄液、（２）高ｐＨ（すなわち９．０）の非緩衝塩洗浄液および（３）高ｐＨ（すなわち９．０）でアルギニンと組合せた非緩衝塩洗浄液を評価および比較する。さらに、ＨＭＷ、ＬＭＷおよびＨＣＰの除去に対するアルギニンの効果を分析し、塩基性ｐＨ条件でアルギニンと組合せた非緩衝塩液の使用が特に有効で有益であることを示す。本実施例で比較する洗浄液を以下の表１５に記載する。
【表１５】
0005909450.tif 000016
【００７２】
以下の表１６で詳細に説明するように、実施例１の表１に記載の条件を使用するアフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）を、最小限の変動で異なるレベルのＨＭＷおよびＨＣＰを用いて、ｍＡｂ−Ｂｙの細胞回収物に対して行う。
【表１６】
0005909450.tif 000017
【００７３】
表１５に示す３種の異なる洗浄液を使用して、（１）ＳＥＣ由来抗体の濃度（ｇ／Ｌ）、（２）ＨＭＷ種およびＬＭＷ種のパーセント、（３）ｎｇ／ｍｇモノクローナル抗体で表されるＨＣＰレベルおよび（４）ＡＬＣ溶出液中のＡＬＣ由来収率というパラメータを、ｍＡｂ−Ｂｙの精製に対して測定した。以下の表１７にその結果を示す。
【表１７】
0005909450.tif 000018
【００７４】
詳細に述べると、非緩衝塩単独を含む他の洗浄液（Ｗ２−Ｎ７およびＷ１０−Ｎ９）と比較した場合、それらのｐＨに関係なく、９．０という高ｐＨのアルギニン／非緩衝塩洗浄液（Ｗ３−Ａｒｇ／Ｎ９）がＨＭＷ、ＬＭＷおよびＨＣＰの除去に最も有効な洗浄液であることを表１７は示す。特に、ｐＨが７（Ｗ２−Ｎ７）またはｐＨが９（Ｗ１０−Ｎ９）の非緩衝塩単独を用いた洗浄と比較して、ｐＨが９．０のアルギニン／非緩衝塩洗浄液を用いた洗浄は、ＨＣＰを少なくとも３分の１、およびＬＭＷを少なくとも４分の１減少させた。
【００７５】
実施例６：アルギニン／塩洗浄液に対するアルギニンおよびＮａＣｌの濃度範囲ならびにｐＨ範囲の比較
本実施例では、さらなるアルギニンおよび非緩衝塩の濃度ならびにｐＨ洗浄条件について、アフィニティー液体クロマトグラフィー（ＡＬＣ）中に不純物を除去することに対するそれらの有効性を決定づけるために検討する。本実施例で比較する洗浄液を以下の表１８に記載する。
【表１８】
0005909450.tif 000019
【００７６】
以下の表１９で詳細に説明するように、最小限の変動でわずかに異なるレベルのＨＭＷおよびＨＣＰを用いて、ｍＡｂ−Ｂｙの細胞回収物に対してＡＬＣを行う（実施例１の表１に記載の条件下で）。
【表１９】
0005909450.tif 000020
【００７７】
（１）ＳＥＣ由来抗体の濃度（ｇ／Ｌ）、（２）ＨＭＷ種およびＬＭＷ種のパーセント（％）、（３）ｎｇ／ｍｇモノクローナル抗体で表されるＨＣＰレベルおよび（４）ＡＬＣ溶出液中のＡＬＣ由来収率というパラメータを、表１８に示す２種の異なった洗浄液のいずれかを使用したｍＡｂ−Ｂｙの精製後に測定した。これらの結果を以下の表２０に示す。
【表２０】
0005909450.tif 000021
【００７８】
表２０に示すデータは、アフィニティー液体クロマトグラフィー用の使用に関して、高ｐＨのアルギニン／非緩衝塩洗浄液の有効性を強調するものである。（１）ｐＨが８．５でアルギニンおよび低い方の濃度の非緩衝塩（０．７５ＭのＮａＣｌ）、（２）ｐＨが９．５でアルギニンおよび高い方の濃度の非緩衝塩（１．２５ＭのＮａＣｌ）または（３）低（例えば１００ｍＭ）または高（例えば５００ｍＭ）濃度のアルギニンのどちらかを用いた洗浄は、収率を損なうことなくＨＣＰを顕著に減少させる（平均で＞２ｌｏｇの減少）。
本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］  目的タンパク質が結合するアフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）マトリックスを使用して、精製された目的タンパク質を産生する方法であって、前記ＡＣマトリックスから前記目的タンパク質を溶出する前に、（ｉ）アルギニンまたはアルギニン誘導体および（ｉｉ）非緩衝塩を含む１種または複数の洗浄液で前記ＡＣマトリックスを洗浄することを含む方法。
［２］  （ｉ）アルギニンまたはアルギニン誘導体および（ｉｉ）非緩衝塩の両方を含む１種の洗浄液で前記ＡＣマトリックスが洗浄される、上記［１］に記載の方法。
［３］  前記洗浄液がアルギニン−ＨＣｌを含む、上記［２］に記載の方法。
［４］  前記非緩衝塩が塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）である、上記［２］に記載の方法。
［５］  前記ＡＣマトリックスが一次洗浄液および二次洗浄液の２種の洗浄液で洗浄され、ここで、
（ａ）一次洗浄液がアルギニンまたはアルギニン誘導体を含み、二次洗浄液が非緩衝塩を含む、または
（ｂ）一次洗浄液が非緩衝塩を含み、二次洗浄液がアルギニンまたはアルギニン誘導体を含む、
上記［１］に記載の方法。
［６］  前記目的タンパク質が前記プロテインＡカラムに結合する抗体または抗体断片である、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  前記１種または複数の洗浄液が前記ＡＣマトリックスから不純物を除去する、上記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］  プロテインＡカラムを使用して、精製された抗体または抗体断片を産生する方法であって、
ａ）抗体または抗体断片を含む混合物を前記プロテインＡカラムに負荷すること、
ｂ）（ｉ）０．０５〜０．８５Ｍの範囲の濃度のアルギニン−ＨＣｌおよび（ｉｉ）０．１〜２．０Ｍの範囲の濃度の塩化ナトリウムを含む洗浄液で前記プロテインＡカラムを洗浄し、前記洗浄液が、前記プロテインＡカラムから不純物を除去すること、およびｃ）前記プロテインＡカラムから前記抗体または抗体断片を溶出すること
を含む方法。
［９］  前記アルギニン−ＨＣｌが０．２５Ｍまたは約０．２５Ｍの濃度である、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  前記塩化ナトリウムが１Ｍまたは約１Ｍの濃度である、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］  前記１種または複数の洗浄液のｐＨが８．０より高い、上記［１］から［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］  前記１種または複数の洗浄液のｐＨが約８．５〜９．５の範囲である、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］  もう１つの洗浄液のｐＨが９．０である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］  前記不純物が高分子（ＨＭＷ）種を含む、上記［７］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］  前記不純物が宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む、上記［７］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。