(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、１以上の生体試料に含まれる、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の定量方法。
（工程１）分析の対象とする１以上の生体試料、および、既知量の該アミノ基含有非ペプチド化合物を含有する内部標準試料を調製する工程；
（工程２）混合比の指標となる化合物として、該１以上の生体試料中および内部標準試料中には存在しないアミノ基含有非ペプチド化合物を、該１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに、既知の濃度となるように添加する工程；
（工程３）式（Ｉ）：
【化１】
0005958957.tif 000016
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す。）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いて、該１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに含まれる該アミノ基含有非ペプチド化合物および該混合比の指標となる化合物に質量差を与える工程；
（工程４）該１以上の生体試料および該内部標準試料からそれぞれ一定量をとり、それらを混合して混合液を調製する工程；
（工程５）該混合液を質量分析に供し、該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応し、かつ、互いに対して該質量差を有する２以上の質量スペクトル、および、該混合比の指標となる化合物に対応し、かつ、互いに対して該質量差を有する２以上の質量スペクトルを取得する工程；
（工程６）該１以上の生体試料のそれぞれに由来する該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応する各質量スペクトルと、該内部標準試料に由来する該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応する質量スペクトルとの強度の比に基づいて、該混合液中に含まれる、互いに質量差を有する該アミノ基含有非ペプチド化合物の量比を決定する工程；
（工程７）該混合比の指標となる化合物に対応する２以上の質量スペクトルの比較に基づいて試料の混合比を決定することにより、工程６で決定された量比に基づいて、該１以上の生体試料のそれぞれに含まれる該アミノ基含有非ペプチド化合物の絶対量を決定する工程。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項１記載の定量方法。
【請求項３】
前記工程５において取得される質量スペクトルが由来する、該標識化合物で標識されたアミノ基含有非ペプチド化合物および混合比の指標となる化合物の少なくともいずれかが、式（ＩＩ）：
【化２】
0005958957.tif 000017
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義を示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表される化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩である、請求項１記載の定量方法。
【請求項４】
前記組み合わせが５種以上の安定同位体を含む、請求項１記載の定量方法。
【請求項５】
前記アミノ基含有非ペプチド化合物が、生理活性アミンおよび／またはアミノ酸である、請求項１記載の定量方法。
【請求項６】
前記生理活性アミンがドーパミンである、請求項５記載の定量方法。
【請求項７】
質量分析が、ナノ液体クロマトグラフ質量分析装置によって為される、請求項１記載の定量方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の定量方法に用いるためのキットであって、式（Ｉ）：
【化３】
0005958957.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として含む、キット。
【請求項９】
式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
前記２種以上の安定同位体の組み合わせが、式（ＩＩＩ）：
【化４】
0005958957.tif 000019
（式中、黒丸で示された炭素原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）に示されるＰｙ０、Ｐｙ１、Ｐｙ２、Ｐｙ３、Ｐｙ４、Ｐｙ５、Ｐｙ６、Ｐｙ７およびＰｙ８からなる群から選択される２種以上の化合物またはそれらの塩を含む、請求項９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれるアミノ基含有非ペプチド化合物を定量する方法およびそのためのキット等に関する。より詳細には、本発明は、質量分析装置を用いて、分析の対象とする１以上の生体試料に対して、各試料に含まれる、生理活性アミンまたはアミノ酸などの分析の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物を多重定量する方法、および該方法を行うために用いられ得るキット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、アミノ酸の分析では、２０種以上の生体アミノ酸を１回の高速液体クロマトグラフィー（High performance liquid chromatography; ＨＰＬＣ）分析で相互分離した後でニンヒドリンと反応させ、その生成物の吸光度に基づいて、アミノ酸を定量する方法が一般的である。しかしながら、この方法は感度が低く、低濃度のアミノ酸の分析には適していない。
そのため、より高い感度を実現するために、蛍光標識の使用が提案されており、それにより、約１０倍以上の高感度化が実現されている。
さらに、それでも検出できない低濃度のアミノ酸に対しては、液体クロマト分離した後に質量分析装置を連結して検出する方法が採用されている。この場合、分離したアミノ酸をイオン化し易くするために、アミノ基と反応する試薬を用いてアミノ酸を誘導体化してから、それを液体クロマト分離および質量分析に供する方法が採用されてきた。しかしながら、この方法論に従った場合でも、従来の技術では高感度分析には限界があった。
【０００３】
ところで、本発明者らの一人は以前、下記式：
【０００４】
【化１】
0005958957.tif 000002
【０００５】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いてそれぞれの試料に含まれる同一タンパク質に質量差を与えることを含む、質量分析計を用いる２以上の試料にそれぞれ含まれる該タンパク質の定量方法を開発した（特許文献１）。該文献で開示された技術は、機能性、効率性、利便性、経済性等における従来技術の問題点により、タンパク質定量の現実の適用において存在していた困難を克服するものであった。
【０００６】
このようにタンパク質定量においては優れた技術が本発明者らの一人により提案されたが、上述のようにアミノ酸、あるいは生理活性アミン等のアミノ基含有非ペプチド化合物については、存在するニーズに耐え得る技術は存在しないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／１５６１３９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したような当該技術分野における現状から、生体試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物をより高感度に定量し得る方法が求められている。また、複数の生体試料を多重定量して、各試料中に存在する生理活性アミンやアミノ酸等を網羅的に分析できる方法を提供することは非常に有用である。本発明はそのような方法を提供する。本発明はまた、そのような方法を行うために使用され得るキット等も提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、更なる高感度化に対応するためにナノ液体クロマトグラフ質量分析システムを採用し、更に、分析の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物のイオン化効率を向上させるために、ｐＨ非依存的に正帯電するようなアミノ基反応試薬を用いて誘導体化を行い、かつ、複数試料を一括して分析するために、該試薬において、安定同位体の組み合わせを用いることで互いに対する質量差を与える方法論に想到した。当該方法論に従って分析を行うことで、生体試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物を高感度に検出し得るのみならず、複数試料を同時に定量して、各試料中に含まれるアミノ基含有非ペプチド化合物を網羅的に分析できることを見出した。また、生体試料中のアミノ基含有非ペプチド化合物を上記アミノ基反応試薬で標識すると、従来知られていた反応経路より予想される生成物に加えて、それとは異なる構造を有する生成物も得られることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて更に研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明はすなわち、以下を提供する。
［１］以下の工程を含む、１以上の生体試料に含まれる、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の定量方法。
（工程１）分析の対象とする１以上の生体試料、および、既知量の該アミノ基含有非ペプチド化合物を含有する内部標準試料を調製する工程；
（工程２）混合比の指標となる化合物として、該１以上の生体試料中および内部標準試料中には存在しないアミノ基含有非ペプチド化合物を、該１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに、既知の濃度となるように添加する工程；
（工程３）式（Ｉ）：
【００１１】
【化２】
0005958957.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として用いて、該１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに含まれる該アミノ基含有非ペプチド化合物および該混合比の指標となる化合物に質量差を与える工程；
（工程４）該１以上の生体試料および該内部標準試料からそれぞれ一定量をとり、それらを混合して混合液を調製する工程；
（工程５）該混合液を質量分析に供し、該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応し、かつ、互いに対して該質量差を有する２以上の質量スペクトル、および、該混合比の指標となる化合物に対応し、かつ、互いに対して該質量差を有する２以上の質量スペクトルを取得する工程；
（工程６）該１以上の生体試料のそれぞれに由来する該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応する各質量スペクトルと、該内部標準試料に由来する該アミノ基含有非ペプチド化合物に対応する質量スペクトルとの強度の比に基づいて、該混合液中に含まれる、互いに質量差を有する該アミノ基含有非ペプチド化合物の量比を決定する工程；
（工程７）該混合比の指標となる化合物に対応する２以上の質量スペクトルの比較に基づいて試料の混合比を決定することにより、工程６で決定された量比に基づいて、該１以上の生体試料のそれぞれに含まれる該アミノ基含有非ペプチド化合物の絶対量を決定する工程。
［２］式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、上記［１］記載の定量方法。
［３］前記工程５において取得される質量スペクトルが由来する、該標識化合物で標識されたアミノ基含有非ペプチド化合物および混合比の指標となる化合物の少なくともいずれかが、式（ＩＩ）：
【００１３】
【化３】
0005958957.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義を示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表される化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩である、上記［１］記載の定量方法。
［４］前記組み合わせが５種以上の安定同位体を含む、上記［１］記載の定量方法。
［５］前記アミノ基含有非ペプチド化合物が、生理活性アミンおよび／またはアミノ酸である、上記［１］記載の定量方法。
［６］前記生理活性アミンがドーパミンである、上記［５］記載の定量方法。
［７］質量分析が、ナノ液体クロマトグラフ質量分析装置によって為される、上記［１］記載の定量方法。
［８］１以上の生体試料に含まれる、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の定量用キットであって、式（Ｉ）：
【００１５】
【化４】
0005958957.tif 000005
【００１６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを標識化合物として含む、キット。
［９］式（Ｉ）の化合物が、２，４，６−トリメチルピリリウムである、上記［８］記載のキット。
［１０］前記２種以上の安定同位体の組み合わせが、式（ＩＩＩ）：
【００１７】
【化５】
0005958957.tif 000006
【００１８】
（式中、黒丸で示された炭素原子は、質量数１３の炭素原子を示す。）に示されるＰｙ０、Ｐｙ１、Ｐｙ２、Ｐｙ３、Ｐｙ４、Ｐｙ５、Ｐｙ６、Ｐｙ７およびＰｙ８からなる群から選択される２種以上の化合物またはそれらの塩を含む、上記［９］記載のキット。
［１１］式（ＩＩ）：
【００１９】
【化６】
0005958957.tif 000007
【００２０】
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表され、かつ式（ＩＩ）中のＲ以外の位置において質量数１３の炭素原子を少なくとも１つ有する化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩。
［１２］式（ＩＶ）：
【００２１】
【化７】
0005958957.tif 000008
【００２２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表され、かつ式（ＩＶ）中のＲ以外の位置において質量数１３の炭素原子を少なくとも１つ有する化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）またはその塩。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の定量方法を使用することにより、体液（血液、尿、髄液等）や生体組織（脳等）において低濃度（例：０．０１〜０．１ピコモル）で存在するアミノ基含有非ペプチド化合物（例：神経アミン等の生理活性アミンやアミノ酸、覚せい剤等）の存在量を定量することが可能となる。しかも、本発明の分析方法により、多数の生体試料（例：９試料）中の上記化合物を一斉に検出し、更にその構造を推定することも可能となる。
より具体的には例えば、本発明の分析方法により、脳内神経伝達アミン（例：Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、ヒスタミン等）またはアミノ酸（例：グルタミン酸、グリシン、アラニン、トリプトファン等）の分析による神経精神疾患および情動性障害の原因解明、血液、髄液、涙液中等の生理活性アミン、アミノ酸、覚せい剤および麻薬の分析による臨床医学および法医学検査、ならびに、微生物作用により生成されるアレルギー様食中毒の原因物質の不揮発性腐敗アミン（例：ヒスタミン、チラミン、スペルミジン、スペルミン、プトレシン、カダベリン等）の検出および定量による環境中または食品中のアミノ基含有非ペプチド化合物の分析において、高感度および高効率での多重定量が実現される。
本発明のキットおよび標識生成物は、本発明の定量方法を行うために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Ｐｙ化合物（Ｐｙ０〜Ｐｙ８）によるドーパミンの標識を示す模式図である。
【図２】種々のアミノ基含有非ペプチド化合物について、Ｐｙ化合物で標識された誘導体の化学式および分子量（Ｐｙ０で標識した場合の分子量で示している）等を示す図である。
【図３】マイクロＬＣ分離した質量M/z 258.1±0.1のイオンクロマトグラフを示す図である。
【図４】図３のイオンクロマトグラフにおける、１のピーク（生成物１）に対応するマススペクトルデータを示す図である。
【図５】図３のイオンクロマトグラフにおける、２のピーク（生成物２）に対応するマススペクトルデータを示す図である。
【図６−１】Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、ＧＡＢＡおよびヒスタミンのそれぞれについて、マイクロＬＣ分離でのイオンクロマトグラフを示す図である。
【図６−２】オルニチン、ドーパミン、ノルアドレナリン、Ｌ−ドーパおよびセロトニンのそれぞれについて、マイクロＬＣ分離でのイオンクロマトグラフを示す図である。
【図７】ナノＬＣ分離した質量M/z 258.1±0.1のイオンクロマトグラフを示す図である。
【図８】図７のイオンクロマトグラフ中の矢印部分（保持時間：３２．９分）の質量スペクトルを示す図である。
【図９】ナノＬＣ分離におけるM/z=244.1に対応する部分の質量スペクトルを示す図である。
【図１０】５種類のＰｙ化合物を用いたドーパミンの検出感度の確認実験において得られた質量スペクトルを示す図である。図中、１、２、３、４および５はそれぞれ、Ｐｙ０、Ｐｙ２、Ｐｙ４、Ｐｙ６およびＰｙ８で標識されたドーパミンに対応している。
【図１１】図１０における１〜５の質量スペクトルの強度を、対応する各々の試料中のドーパミンの初期量に対してプロットしたグラフを示す図である。
【図１２】ラット脳内のカテコラミンの定量実験における、各試料に対応する脳切片中の位置を示す図である。画像中に付した番号は、反応させたＰｙ試薬の種類に対応しており、０はＰｙ０、２はＰｙ２、４はＰｙ４、６はＰｙ６、８はＰｙ８に対応している。
【図１３】ラット脳内のカテコラミンの定量実験において得られたナノスペクトルデータを示す図である。用いた標識試薬とピークとの対応関係が矢印で示されている。
【図１４】図１３で得られたスペクトル強度に基づいて、脳の各部位のドーパミン量を算出した結果のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
（定量方法）
以下、本発明の定量方法を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の定量方法により、分析の対象とする１以上の生体試料に含まれる、測定対象のアミノ基含有非ペプチド化合物の絶対量を決定することができる。
分析の対象とされる生体試料の個数は、各生体試料に含まれる該アミノ基含有非ペプチド化合物を安定同位体の組み合わせによって標識して質量差を与えることができる限り、特に制限されない。例えば、後述する２，４，６−トリメチルピリリウムの安定同位体の組み合わせを標識化合物として利用する場合、内部標準試料として用いられる試料以外に最大８個の生体試料を一度に分析することができる。
さらに、本発明の定量方法では、生体試料中の測定対象のアミノ基含有非ペプチド化合物の絶対量が決定され得るため、同様の手順を繰り返すことにより、対象とする生体試料がどれだけ増えても分析を行うことが可能である。
【００２７】
分析の対象とされる生体試料の由来や種類は特に制限されず、分析の目的に応じて任意の由来および組織等から取得され得る。具体的には例えば、該生体試料としては、哺乳動物（例：ヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等）の種々の体液（例：血液、骨髄液、髄液、唾液、涙液、胃液、腹水、滲出液、羊膜液、膵液、胆汁など）、排泄物（例：尿、大便など）、および組織（例：脳、脊髄、眼球、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例：大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋など）含有試料などが例示されるがこれらに限定されない。
【００２８】
本明細書においてアミノ基含有非ペプチド化合物とは、分子内に１つ以上のアミノ基を有し、かつ、分子内にペプチド結合を有しない任意の化合物を意味し、ここでアミノ基とは、アンモニア、第一級アミン（すなわち、アンモニアの水素原子を任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で１つ置換した化合物）または第二級アミン（すなわち、アンモニアの水素原子を、それぞれ同一または異なる任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基で、２つ置換した化合物）から水素を除去した１価の官能基をいう。従って、アミノ基含有非ペプチド化合物は、ＮＨ３、ＮＨ２Ｒ、またはＮＨＲＲ’（式中、ＲおよびＲ’はそれぞれ同一または異なって、任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基をそれぞれ示す。）の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。但し、ＮＨＲＲ’の化学式を有する化合物については、本発明の方法で用いられる標識試薬とは反応しないか、もしくは極めて低反応性であると考えられる。それ故、本発明の方法の対象となるアミノ基含有非ペプチド化合物は、通常、ＮＨ２Ｒ（式中、Ｒは水素または任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）の化学式を有する非ペプチド性の化合物である。
測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の分子量は、本発明の定量方法を可能とする限り特に限定されないが、一般的には低分子量の化合物である。具体的な分子量としては１７〜１０００であり、好ましくは１７〜７００、より好ましくは１７〜５００である。測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物としては、例えば、生理活性アミン、アミノ酸、薬物、覚醒剤、麻薬、不揮発性腐敗アミン、および、それらの代謝物でアミノ基を保有する化合物等が挙げられる。一度の分析において、複数種類のアミノ基含有非ペプチド化合物を測定の対象とすることもできる。
【００２９】
アミノ基含有非ペプチド化合物のより具体的な例としては、以下に限定されないが、神経系に作用する生理活性アミン（例：Ｌ−ドーパ、ノルエピネフリン（ノルアドレナリン）、ドーパミン、トリプタミン、セロトニン、プトマイン、ヒスタミン、チラミン、タウリン等）、種々の生体アミノ酸（例：アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびそれらの修飾体（例：リン酸化体等）等）、薬物や麻薬（例：フェネチルアミン、アンフェタミン、カチン、カチノン、フェンテルミン、メスカリン、MDA、メトキシアンフェタミン、BDB、HMA、２C-B、DOB、DOM、DOET、MMDA、TMA、２C-I、２C-D、２C-N、２C-T-2、２C-T-7、DOI、DON、2,5-DMA、3,4−DMA等）、不揮発性腐敗アミン類（例：スペルミジン、スペルミン、プトレシン、カダベリン等）、ならびに、アミノ基を保有するそれらの代謝物等が挙げられる。
【００３０】
上記工程１では、分析の対象とする１以上の生体試料、および、既知量の該アミノ基含有非ペプチド化合物を含有する内部標準試料が調製される。
【００３１】
分析の対象とする生体試料は、上述したような由来や組織等から、自体公知の方法で採取され得る。次いで、固相抽出等の適当な手段を用いて、各生体試料において測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物を濃縮することが好ましい。該濃縮は例えば、以下の手順により行うことができる。すなわち、採取した生体試料のそれぞれにおいて、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物とタンパク質とを分離するために、酸抽出等の適当な手段により除タンパク質処理を行う。次いで、除タンパク質液体試料中の測定対象のアミノ基含有非ペプチド化合物を、それを選択的に捕捉する陽イオン交換樹脂を用いて捕捉する。次いで、非特異的に樹脂に吸着した酸性または中性の低分子物質をアルコールにより洗浄する。さらに、残存する樹脂結合陽イオンを塩酸等を用いて溶出し、その後塩酸を減圧除去する。このようにして、分析の対象とする生体試料が調製され得る。
【００３２】
一方、本明細書において内部標準試料とは、分析の対象とする試料と同様の処理に供せられる試料であって、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物を既知の濃度で含むことにより、分析の対象とする各試料に含まれる該化合物の絶対量を決定するために利用され得る試料をいう。
内部標準試料の調製は例えば、測定対象の化合物の市販品を０．０５ＭのＨＣｌに溶解することによって行うことができる。また、内部標準試料中に存在する、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の濃度は特に制限されないが、一般には、分析の対象とする試料中での該化合物の予想される濃度と近いことが好ましい。
【００３３】
上記工程２では、混合比の指標となる化合物が、該１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに、既知の濃度となるように添加される。本明細書で用いられる場合、「混合比の指標となる化合物」とは、各試料において既知の濃度で存在することにより、後の工程４において、上記の１以上の生体試料および内部標準試料から混合液を調製した際に、その混合比を決定するために利用できる化合物を意味する。詳細は後述するように、該混合比の決定は、該混合液中に存在する、各試料由来の混合比の指標となる化合物の量比の決定に基づいて行うことができる。そのため、混合比の指標となる化合物は、分析対象である１以上の生体試料中および内部標準試料中のいずれにも存在しないアミノ基含有非ペプチド化合物である必要がある。具体的には、混合比の指標となる化合物としては、ジヒドロキシベンジルアミン（ＤＨＢＡ）等が例示される。また、混合比の指標となる化合物の添加量は、その後の質量分析に支障を生じさせない限り特に制限されないが、例えば、各試料中の混合比の指標となる化合物の濃度が０．２〜１０ｐｍｏｌ、好ましくは０．５〜５ｐｍｏｌ、より好ましくは１〜３ｐｍｏｌとなるように添加される。また、好ましくは、該１以上の生体試料および内部標準試料のいずれにおいても等しい濃度となるように、混合比の指標となる化合物は添加される。
【００３４】
続いて上記工程３では、上記の１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに含まれる測定対象のアミノ基含有非ペプチド化合物および混合比の指標となる化合物が、アミノ基反応試薬で標識される。本発明の定量方法においては、式（Ｉ）：
【００３５】
【化８】
0005958957.tif 000009
【００３６】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す）
で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせが標識化合物として用いられる。
【００３７】
式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示す。Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、好ましくは水素、ハロゲン、または炭素数１〜６のアルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等）であり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキル（例えば、メチルまたはエチル）である。また、前記ハロゲンとしては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物の好ましい例としては、２，４，６−トリメチルピリリウム、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウムおよび２，６−ジエチル−４−メチルピリリウムなどが挙げられ、特に好ましくは、２，４，６−トリメチルピリリウムである。
【００３９】
本発明の定量方法において、式（Ｉ）の化合物は、通常、塩の形態で利用される。その場合、該塩は式（Ｉ）の化合物および任意の陰イオン原子または陰イオン分子からなる塩である。該陰イオン原子または陰イオン分子としては、ヘキサフルオロリン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、テトラフルオロホウ酸等の陰イオンが挙げられ、アミノ基含有非ペプチド化合物の標識反応を妨げない限り特にその種類は限定されないが、好ましくはテトラフルオロホウ酸の陰イオンである。
【００４０】
従って、好ましいアミノ基反応試薬の例としては、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸、２−エチル−４，６−ジメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸塩または２，６−ジエチル−４−メチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸などが挙げられ、特に好ましくは、２，４，６−トリメチルピリリウム・テトラフルオロホウ酸である。
【００４１】
上記工程３の標識は、安定同位体により互いに質量差を有する上記アミノ基反応試薬を用いることにより、分析の対象とする１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれに含まれる測定対象のアミノ基含有非ペプチド化合物および混合比の指標となる化合物に質量差を与えるものである。使用される安定同位体間の質量差は、質量分析計により質量差を与えられた同種のアミノ基含有非ペプチド化合物を分離することができる限り特に限定されない。質量差は１以上であり、場合により互いに２以上の質量差を有する安定同位体のみを選んで使用することもできる。質量差の上限も、アミノ基反応試薬が安定に存在し得る限り特に限定されず、通常は化合物間の質量差を１２Ｃと１３Ｃとの間の質量差により与えるので、質量差の上限はアミノ基反応試薬中に含まれる炭素原子の個数に等しい。
【００４２】
上述の通り、本発明の定量方法で用いられる式（Ｉ）の化合物の好ましいものとして、２，４，６−トリメチルピリリウムが挙げられる。２，４，６−トリメチルピリリウムは、下記式：
【００４３】
【化９】
0005958957.tif 000010
【００４４】
を有する化合物であり、８個の炭素原子を含む。本発明において標識化合物として用いられる安定同位体では、炭素同位体１３Ｃの個数は０〜８個のいずれであってもよく、また、１３Ｃの個数に応じて、その位置について特別の配慮が払われている。すなわち、１３Ｃの位置は１位の酸素と４位の炭素とを結ぶ直線に対して対称となるように配置されている。
【００４５】
本発明の定量方法で用いられるアミノ基反応試薬の特に好ましい例として、以下に示す、２，４，６−トリメチルピリリウムの質量差１毎の９種の安定同位体の組み合わせが挙げられる。
【００４６】
【化１０】
0005958957.tif 000011
【００４７】
（式中、黒丸で示された炭素原子は、質量数１３の炭素原子である。）以下、これらの化合物をＰｙ化合物と総称し、Ｐｙ化合物に含まれる各安定同位体を分子中の１３Ｃの個数に基づいて、Ｐｙ０、Ｐｙ１、Ｐｙ２、Ｐｙ３、Ｐｙ４、Ｐｙ５、Ｐｙ６、Ｐｙ７、Ｐｙ８と呼称する。例えば、上記Ｐｙ化合物のテトラフルオロホウ酸塩を本発明の定量方法では好適に用いることができる。また、上記９種の化合物から選択される、任意の２種以上（例：２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種）を組み合わせて本発明の定量方法に用いることができる。
【００４８】
上記アミノ基反応試薬は、例えば
1) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1112(1973);vol.49, p.121(1969). 
2) Balaban, A.T., Boulton A.J., Organic Synthesis, Coll., vol.5, p.1114(1973)
3) Ghiviriga I., Czerwinski E. W., Balaban A.T., Croatia Chemica Acta, vol.77(1-2), p.391-396 (2004)
等で教示されている方法に従って合成することが出来る。
【００４９】
上記Ｐｙ化合物での標識は以下のようにして行うことができる。すなわち、Ｐｙ化合物では９種類の安定同位体の組み合わせが存在するため、内部標準試料のために１種類の安定同位体を使用し、それ以外の８種類のいずれかを、分析の対象とする１〜８個の生体試料のために使用するように割り振る。異なる生体試料中に含まれるアミノ基含有非ペプチド化合物は、異なる質量を有する安定同位体で標識される。標識反応を行う前に、各生体試料を予め適当なｐＨ（例：ｐＨ８．５〜ｐＨ１１、好ましくはｐＨ９〜ｐＨ１０）に調整することが好ましい。次いで、各標識試薬を各試料に添加し、２５℃〜６０℃、例えば５０℃で適当な時間（例：１０分〜１８０分間、例えば３０分間）反応させる。反応が完了したら、例えば塩酸を添加して酸性条件として反応を停止させる。
【００５０】
Ｐｙ化合物は、以下の反応経路に従ってアミノ基含有非ペプチド化合物を標識する（例えば、C.Toma and Balaban A.T., Tetrahedron,Vol.22 suppliment No.7 p.9-22 (1966)を参照）。Ｐｙ化合物以外の上記式（Ｉ）に示される標識化合物についても、同様の経路に従ってアミノ基含有非ペプチド化合物を標識する。
【００５１】
【化１１】
0005958957.tif 000012
【００５２】
上記反応経路に示されるように、標識により、互いに分子量が異なる２種類の標識体（生成物１および生成物２）が生成する。生成物１と生成物２との存在割合は、対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の種類と反応条件に応じて変動する。これら２種類の標識体については後の液体クロマトグラフィー分析において容易に分離することができる。
【００５３】
具体例として、図１には、ドーパミンをＰｙ化合物で質量差を与えて標識した例が示されている。ドーパミンをＰｙ０、Ｐｙ１、Ｐｙ２、Ｐｙ３、Ｐｙ４、Ｐｙ５、Ｐｙ６、Ｐｙ７、Ｐｙ８化合物のそれぞれで標識した場合、Ｐｙ化合物が有する互いに対する質量差に基づいて、おおよその分子量として２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７のＰｙ標識ドーパミンが得られる。
また、図２には、いくつかのアミン類またはアミノ酸について、Ｐｙ化合物（具体的には、Ｐｙ０化合物）で標識した場合の誘導体の化学式および分子量が示されている。
【００５４】
続いて上記工程４では、互いに質量差を有するアミノ基反応試薬で標識された上記１以上の生体試料および内部標準試料のそれぞれから一定量を取り、それらを混合して混合液を調製する。混合液の調製に際して各試料から採取される量は等量であることが好ましいが、それに限定されない。また、必ずしも必要ではないが、混合液中に存在する過剰な標識試薬を除去してもよい。過剰な標識試薬の除去は、酢酸エチルなどを用いる有機溶媒抽出、または、陽イオン交換樹脂を用いて行うことができる。さらに、質量分析に供する前に、該混合液を濃縮することが好ましい。混合液の濃縮は、平衡化した陽イオン交換樹脂（Ｈ＋型）に混合液を付加し、水でよく洗浄してから、１％アンモニア水または０．１Ｍ塩酸により反応物を溶出する。溶出液は、減圧遠心濃縮器で適当な量まで濃縮することにより行うことができる。
【００５５】
上記工程５では、上記の手順に従って調製した混合液が質量分析に供される。質量分析は公知の方法に従って行うことができる。本発明の定量方法では任意の質量分析システムを用いることができるが、高感度での定量を可能とするために、ナノ液体クロマトグラフィー質量分析（ナノＬＣ／ＭＳ）システムを用いて分析することが好ましい。使用され得るナノＬＣ／ＭＳ装置としては、例えば、NanoFrontier eLD (日立ハイテクノロジーズ社製)等が挙げられる。質量分析は例えば、具体的には以下のようにして行うことができる。すなわち、分離用カラムとしてモノリス型のMonoCap for FastFlow (0.075mm IDx150mmL, Merck社)、トラップカラムとしてC18-Monolithトラップカラム（0.05mm IDx150mm L Hitachi）を用い、流量200nl/分、移動層としてA)ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：98：2）、B) ギ酸/水/アセトニトリル（0.1：2：98）からなるグラジエント溶出を行う（すなわち、A/B=98/2(0分)−50/50（50分）-0/100（50.1-70分）−98/2(70.1-90分)）。サンプル注入量は50nlとする。質量部設定：イオン化モードはナノESI(正イオン化)、スプレー電圧は1400V、検出器電圧は2150V、カウンター窒素ガス量は0.8L/分、スキャン範囲は50-1000 m/ｚとする。質量分析結果は、50分間記録する。
同位体標識によって、異なる試料由来の同種のアミノ基含有非ペプチド化合物は互いに異なる質量を持つため、質量分析により得られる質量スペクトルにおいては、異なる試料由来のアミノ基含有非ペプチド化合物は分離したピークとして現れる。そのようにして、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物に対応し、かつ、互いに対して、安定同位体間の質量差を有する異なる試料由来の２以上の質量スペクトル、および、混合比の指標となる化合物に対応し、かつ、互いに対して、安定同位体間の質量差を有する異なる試料由来の２以上の質量スペクトルが取得できる。以下、同一化合物に対応し、かつ、互いに対して安定同位体間の質量差を有する異なる試料由来の２以上の質量スペクトルを質量スペクトル群ともいう。上述したように、各化合物に対して互いに分子量と化学的特性が異なる２つの標識体（すなわち、上記の生成物１および生成物２）が得られるため、化合物毎に２種類の質量スペクトル群を得ることができる。以下の工程では、同一の質量スペクトル群に含まれる２以上の質量スペクトル間での強度の比較が行われることに留意されたい。アミノ基含有非ペプチド化合物の種類によって生成物１と生成物２の形成量は異なるので、スペクトル強度の高い方の生成物の質量スペクトル群内での強度比較を行なうことが好ましい。
【００５６】
上記の工程６および工程７では、上記のようにして取得された質量スペクトル群から、分析の対象とする各生体試料に含有される、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の絶対量が決定される。
【００５７】
先ず工程６では、測定の対象とするアミノ基含有非ペプチド化合物の各試料間での相対量が決定される。そのために、分析の対象とする生体試料のそれぞれについて、該試料に由来する該化合物に対応する質量スペクトルと、内部標準試料に由来する該化合物に対応する質量スペクトルとの強度の比を取得する。該強度の比は、質量分析に供した混合液中に含まれる、同位体標識により互いに質量差を有する該化合物の量比に対応している。従って、該強度の比に基づいて、該混合液中に含まれる、各試料由来の該化合物の量比を決定することができる。
【００５８】
続いて工程７において、上記混合液の調製における、分析の対象とする１以上の生体試料および内部標準試料の混合比が決定される。上述の通り、混合比の指標となる化合物は、混合前の各試料に既知の濃度となるように添加されているため、混合比の指標となる化合物に対応する質量スペクトル群に含まれる２以上の質量スペクトルの比較に基づいて、該混合比を決定することができる。さらに、該混合比と、上記工程６で決定された各試料由来の該化合物の量比とを利用することにより、分析の対象とする１以上の生体試料のそれぞれに含まれる該化合物の絶対量を決定することができる。
【００５９】
（定量用キット）
本発明はまた、上述したアミノ基含有非ペプチド化合物の定量方法に用いることができる試薬キットであって、標識化合物として式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の２種以上の安定同位体の組み合わせを含む、キット（以下、本発明のキットともいう）を提供する。式（Ｉ）で表される化合物またはその塩に関する定義、安定同位体や組み合わせの態様は上述の通りである。
【００６０】
本発明のキットは、前記安定同位体の組み合わせ以外に、１種以上の反応緩衝液、洗浄溶液、または本発明の標識試薬との組み合わせ使用に必要若しくは好適なその他の成分を含んでいても良い。本発明のキットはまた、任意でその使用説明書を含む。また、本発明のキットは、未反応成分除去試薬（洗浄試薬）、制限酵素、精製用カラム、精製用溶媒などを更に含んでいてもよい。
【００６１】
（標識生成物）
本発明は更に、下記式：
【００６２】
【化１２】
0005958957.tif 000013
【００６３】
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表され、かつ式中のＲ以外の位置において質量数１３の炭素原子を少なくとも１つ有する化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）（以下、化合物１ともいう）およびその塩、ならびに下記式：
【００６４】
【化１３】
0005958957.tif 000014
【００６５】
（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ同一または異なって、水素、ハロゲンまたはアルキルを示し、Ｒは任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）
で表され、かつ式中のＲ以外の位置において質量数１３の炭素原子を少なくとも１つ有する化合物（但し、ペプチド結合を有する化合物を除く。）（以下、化合物２ともいう）およびその塩を提供する（以下、これらの化合物を総称して、本発明の標識生成物ともいう）。本発明の標識生成物は、例えば、本発明の定量方法における内部標準試料（分析の対象とされるアミノ基含有非ペプチド化合物が１３Ｃを有する標識試薬で既に標識されている）の調製のために利用できる。
【００６６】
本発明の標識生成物は、例えば、本発明の定量方法で用いられる標識試薬（１３Ｃを有するものに限る）により、上で定義した所与のアミノ基含有非ペプチド化合物を標識することにより生成したものであってよい。すなわち、該標識試薬により上で定義したアミノ基含有非ペプチド化合物を標識することにより得られる化合物はいずれも本発明の標識生成物に包含される。
【００６７】
従って、化合物１または化合物２の式中のＲ１、Ｒ２およびＲ３の定義は、本発明の定量方法での標識化合物におけるＲ１、Ｒ２およびＲ３について上述したものと同じである。その組み合わせとしても該標識化合物におけるものと同様であり、例えば、化合物１においてＲ１、Ｒ２およびＲ３がいずれもメチル基である組み合わせ、化合物２においてＲ１およびＲ２がいずれもメチル基である組み合わせ等が例示される。
化合物１または化合物２の式中のＲについても、本発明の定量方法において上述した、ＮＨ２Ｒ（式中、Ｒは水素または任意に置換されていてもよい任意の炭化水素基を示す。）の化学式を有する任意のアミノ基含有非ペプチド化合物におけるＲと同じものであってよい。
化合物１または化合物２の塩は任意の塩であってよく、例えば、式（Ｉ）の化合物の塩として例示したもの（例えば、ヘキサフルオロリン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、テトラフルオロホウ酸塩等）、および硝酸塩、塩酸塩、硝酸塩、硫酸塩等である。
１３Ｃの個数は、１つ以上であり、かつ化合物１または化合物２の式中のＲ以外の位置にある炭素原子の総数以下である任意の個数である。１３Ｃの位置は、該標識試薬における１３Ｃの位置（上述）およびその標識反応（上述）に従って導出される位置である。
【００６８】
以下に実施例等を示して本発明の定量方法をより具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定されない。
【実施例】
【００６９】
実験例１：マイクロＬＣ／ＭＳによる、互いに質量差２を有する５種類のＰｙ化合物を用いたドーパミンの分析
10mMドーパミン標準液（0.05M塩酸溶液に溶解）1μlに50mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐH 10.0）を5μｌ、50 mM Py試薬（50mM Py0、Py2、Py4、Py6、Py8の等量混合液）を1μl、蒸留水3μlを加えて全量10μlとして50℃で30分間加熱保温した。終了後１M塩酸を2μl加えて酸性条件にしてから、その2μlをマイクロLC/MSに直接導入し、MS分析を行った。LC条件は逆相系のDevelosil C30-UG-3 2.0mmID x 150mm Lカラムを用い、流量を200μl/分に設定した。移動相はA液として0.1%ギ酸水溶液、B液として0.1%ギ酸含有アセトニトリルを用い、濃度勾配溶出法を採用し、A/B＝10/90（0分）−0/100（10〜20分）−10/90（20.1分）とした。カラム温度は40℃に設定した。MSの測定条件は、セミミクロ正イオン化ESIモードのイオン化モードを採用し、ネブライザーガス流速は3.0L/分、AUXガス流速は12.0L/分、ガス温度は600℃とした。スプレー印加電圧を3500Vとして、検出器の印加電圧は2200Vとした。質量スキャン範囲は50〜500の範囲とした。
図３は、LC分離した質量M/z 258.1±0.1のイオンクロマトグラフを示しており、2つのピークが観察される。これらが生成物１と生成物2に対応するが、溶出条件とピリジニウムイオンの特性からみて、5.6分のピーク1が生成物１に対応し、8.1分のピーク2がキシリジン型の生成物２と推定された。両者の質量は本来1だけ違うが、生成物２では[M+H]+となり生成物1と区別ができない。なお、ピーク1と2の量比は反応条件で変動することが分かっている。図４はピーク１、図５はピーク２の質量スペクトルを示している。いずれも、質量244.1から質量2違いの5本のピークが大体同じ強度で観察されることが分かる。
【００７０】
実験例２：アミン及びアミノ酸の複数成分の分析例
上記実験例１と同様に、ドーパミン以外のアミンやアミノ酸（図２）について、個々の10mM標準溶液をPy誘導体化してマイクロLC/MS分析を行ない、個々に分析した。各々の誘導体について、質量M/z値の示すイオンクロマトグラフを図６に示している。
10種類の物質とPy試薬は反応して誘導体を形成するが、実験例１と同じ条件では、生成物１および生成物２が生成することが図中の★印で示された。また、それらの溶出時間と生成量比は対象物質により異なること、および、物質相互の分離も可能であることが分かった。
【００７１】
実験例３：ナノＬＣ／ＭＳによる、互いに質量差２を有する５種類のＰｙ化合物を用いたドーパミンの分析
高感度分析のためにナノLC/MSを用いて、以下の通りに実験を行った。
10mM ドーパミン標準溶液（0.05M HCl）2μl、10mM DHBA(dihydroxybenzoic acid)2μl、50mM ナトリウムホウ酸緩衝液(pH10.0)10μｌ、25mM Py試薬（各25mM Py0、Py2、Py4、Py6、Py8の5種類の等量混合物）2μｌ、蒸留水4μｌで総量20μｌとして50℃で120分保温した。冷却後１M HClを2μｌ加えて、酸性にした反応液を0.05M HCl で希釈してマニュアルインジェクターでナノLC/MS分析に導入した。ナノLCの分析条件とMS計測の条件は前述と同じである。
図７に示されるように、ナノLC分離で32.9分に質量M/ｚ＝258.1の物質が溶出していた。その部分の質量スペクトルを図８に示した。Py試薬でラベルされたドーパミンに相当して、2Da毎に5本のピークが検出された。これらはPy0、Py2、Py4、Py6、Py8で標識されたドーパミンにそれぞれ対応する。
さらに、同じクロマトグラフィーで、ドーパミンとは異なった時間に溶出するM/z=244.1の位置の質量分析をした結果、図９に示したように、244.1078から２Da差で5本のスペクトル(黒矢先)が観察された。これが内部標準としてドーパミンとPy試薬の反応物の固相精製などの操作の回収率の補正に利用され得る。
【００７２】
実験例４：ドーパミンの検出感度の確認
ドーパミンを5本のチューブに5.0pmol 、1.25pmol、0.625pmol、0.3pmol、0.15pmolをとり、5% TCAで総量を8μlとした。2Mリン酸K緩衝液、pH 11を12μl加え、pH 10に保った。100mM Py試薬5種（Py0を5.0pmol、 Py2を1.25 pmol、Py4を0.625pmol、Py6を0.3pmol、Py8を0.15pmolに対応させる）を1μl加え、50℃で5分間保温した。反応は6M塩酸を4μl加え停止した。総量25μlとした。各反応チューブから20μlを採取し混合した。混合液100μlをPBA（phenylboronic acid）樹脂（MonoSpinPBAカラム：GLサイエンス）により処理し、カテコール基を持つPy誘導体化合物を精製した。即ち、PBAカラムを2％TFA(トリフルオロ酢酸)含有50%アセトニトリルにより活性化し、100mM リン酸カリウム緩衝液、pH8.0でよく洗浄する。上記混合液に等量の１Mリン酸カリウム緩衝液、pH 10を加えてよく攪拌したのち、このカラムに負荷した。アセトニトリルで2回、100mMリン酸カリウム、pH8.0でカラムを2回洗浄し30μlの2% TFA(トリフルオロ酢酸)含有50%アセトニトリルで溶出した。10μlまで濃縮し、その5μlを注入し、ナノLC/MSにより分析した。分析条件は前記と同じであった。
Py0と反応したドーパミン（Py0-dopamine）の質量は258.0879、Py2-dopamineは260.0943、Py4-dopamineは262.1008、Py6-dopamineは264.1090、Py8-dopamineは266.1128であり、丁度、質量差は2.0038〜2.0080の範囲にあり、Py試薬の質量差を反映したスペクトルを与えることが分かった（図１０）。このスペクトル強度をドーパミンの初期量に対してプロットすると直線関係が得られたことから（図１１）、0.15pmolのドーパミンが定量できることが判明した。
【００７３】
実施例１：ラット脳内のカテコラミンの定量
以下に、本発明の方法によりラット脳微少組織中のドーパミン定量を行った実施例を示す。
まずラット頭部にマイクロウェーブの照射（5kW，1,7秒）を行い（マイクロウェーブアプリケーター、室町機械）、固定を行った。脳摘出後、凍結ミクロトーム（CM3050S，ライカ）を用い40μm厚の脳組織切片を作成し、レーザーマイクロダイセクション（ASLMD、ライカ）により、一辺500μm四方、厚さ40μmの脳組織を得た。図１２には、脳の様々の部位から採取した試料の位置が脳切片の画像の中に白く表示されており、画像中に付した番号は、反応させたPy試薬の種類である（すなわち、0はPy0、2はPy2、4はPy4、6はPy6、8はPy8に対応している）。Py試薬の種類と、脳の部位との対応を以下の表１に示す。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
採取された各切片は、0.5mm四方で厚さ40μm、従って体積は0.01μlに相当する。
続いて、内部標準物質としてDHBAを各試料あたり2pmol添加し、さらに酸抽出法により除タンパク処理を行った。その後、Py化合物と試料中のドーパミンとを反応させ（反応条件は50℃, 5分）、塩酸添加により反応を停止させた。
次に、官能基にフェニルホウ酸（PBA）を持つカラム（MonoSpin PBA、GLサイエンス）により試料中のドーパミン−Py化合物の精製を行った。ドーパミン−Py化合物を含む試料にアルカリ溶液（りん酸水素二カリウム水溶液）を加えpH 8-9に調整した後、ドーパミン−Py化合物をPBAに結合させ、アセトニトリルおよび水で洗浄してから2%トリフルオロ酢酸含有50%アセトニトリル溶液でドーパミン−Py化合物を溶出した。発明を実施するための形態において上述したようにして、溶出液を減圧遠心濃縮機により濃縮した後、ナノLC/MSシステムにより分析を行った。得られたナノスペクトルデータを図１３に示している。
得られた強度から、各部位のドーパミンの量が算出されたものを図１４に示した。その結果、Py0を用いて線条体10nlの2枚分、計20nl中のドーパミンを測定したところ、およそ1.3pmolの値が得られた。Py2およびPy6を用いて線条体10nl中のドーパミンを測定したところ、およそ0.5pmolの値が、Py4を用いて脳梁10nl中のドーパミンを測定したところ、およそ0.2pmolの値が得られた。また、Py8を用いて大脳皮質10nl中のドーパミンを測定したところ、検出感度以下であった。
本結果より、MonoSpin PBAによるドーパミン−Py化合物の精製と本発明の方法であるPy試薬を用いた測定法を組み合わせることにより、脳組織10nl中のドーパミン濃度の測定が可能であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の定量方法を使用することにより、体液（血液、尿、髄液等）や生体組織（脳等）において低濃度（例：０．０１〜０．１ピコモル）で存在するアミノ基含有非ペプチド化合物（例：神経アミン等の生理活性アミンやアミノ酸、覚せい剤等）の存在量を定量することが可能となる。しかも、本発明の分析方法により、多数の生体試料（例：９試料）中の上記化合物を一斉に検出し、更にその構造を推定することも可能となる。
より具体的には例えば、本発明の分析方法により、脳内神経伝達アミン（例：Ｌ−ドーパ、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、ヒスタミン等）またはアミノ酸（例：グルタミン酸、グリシン、アラニン、トリプトファン等）の分析による神経精神疾患および情動性障害の原因解明、血液、髄液、涙液中などの生理活性アミン、アミノ酸、覚せい剤および麻薬の分析による臨床医学および法医学検査、ならびに、微生物作用により生成されるアレルギー様食中毒の原因物質の不揮発性腐敗アミン（例：ヒスタミン、チラミン、スペルミジン、スペルミン、プトレシン、カダベリンなど）の検出および定量による環境中または食品中のアミノ基含有非ペプチド化合物の分析において、高感度および高効率での多重定量が実現される。
本発明のキットおよび標識生成物は、本発明の定量方法を行うために有用である。
【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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