(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に、配列番号19若しくは22のヌクレオチド9405位から9998位までに記載の配列を有する長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド1203位からヌクレオチド2819位までに記載の配列を有するgag核酸ドメイン、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド2820位からヌクレオチド6358位までに記載の配列を有するpol核酸ドメイン及び
配列番号19若しくは22のヌクレオチド6359位からヌクレオチド8323位までに記載の配列を有するenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位(IRES)及びRNAポリメラーゼIIIプロモーターを含むカセットであって、3'LTRの5'側、及びレトロウイルスエンベロープをコードするenv核酸ドメインの3'側に位置するカセット;並びに
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列を含み、
前記カセットは配列番号21のIRESカセットと比べて、カセットのいずれかの側の直接反復を欠き、6継代培養後に、配列番号21を含むベクター(pACE)と比較してより高い複製能力を維持する、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項２】
前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列が、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３】
前記MLVが両種性MLVである、請求項1又は2に記載のレトロウイルス。
【請求項４】
前記レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項５】
前記標的細胞が、細胞増殖性障害を有する細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項６】
前記標的細胞が新生物細胞である、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項７】
前記細胞増殖性障害が、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、脳腫瘍、頭頚部癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌及び卵巣癌、関節リウマチ又は他の自己免疫疾患からなる群から選択される、請求項5に記載のレトロウイルス。
【請求項８】
前記プロモーター配列が増殖調節遺伝子に関連する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項９】
前記プロモーター配列が組織特異プロモーター配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１０】
前記組織特異プロモーター配列が少なくとも一つのアンドロゲン応答エレメント(ARE)を含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
【請求項１１】
前記アンドロゲン応答エレメントがプロバシンプロモーターに由来する、請求項10に記載のレトロウイルス。
【請求項１２】
前記組織特異プロモーター配列がプロバシンプロモーターを含む、請求項9に記載のレトロウイルス。
【請求項１３】
前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド582位までに記載の配列を有するCMVプロモーターを含み、一つ又は複数の核酸塩基に対する改変を含んでもよく、転写を誘導し開始することができる、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１４】
前記プロモーターが、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド582位までに記載の配列を含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１５】
前記プロモーターがCMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１６】
前記CMV-R-U5ドメインが、MLV R-U5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターを含む、請求項15に記載のレトロウイルス。
【請求項１７】
前記CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドが、配列番号19、20若しくは22のヌクレオチド1位からヌクレオチド1202位までに記載の配列、又は配列番号19、20若しくは22に記載の配列に対し少なくとも95%同一である配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する、請求項16に記載のレトロウイルス。
【請求項１８】
前記gagポリヌクレオチドがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドのpolドメインがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２０】
前記3'LTRがガンマレトロウイルスに由来する、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２１】
前記3'LTRがU3-R-U5ドメインを含む、請求項20に記載のレトロウイルス。
【請求項２２】
前記異種核酸配列が生体応答調節因子をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２３】
前記生体応答調節因子が免疫増強サイトカインを含む、請求項22に記載のレトロウイルス。
【請求項２４】
前記免疫増強サイトカインが、インターロイキン1〜15、インターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)からなる群から選択される、請求項23に記載のレトロウイルス。
【請求項２５】
前記免疫増強サイトカインがインターフェロンである、請求項23に記載のレトロウイルス。
【請求項２６】
前記インターフェロンがガンマインターフェロンである、請求項25に記載のレトロウイルス。
【請求項２７】
前記異種核酸が、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換するポリペプチドをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項２８】
無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する前記ポリペプチドが、チミジンキナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP)又はシトシンデアミナーゼである、請求項27に記載のレトロウイルス。
【請求項２９】
前記異種核酸配列がターゲッティング部分をコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３０】
前記ターゲッティング部分が癌抗原を含む、請求項29に記載のレトロウイルス。
【請求項３１】
前記異種核酸配列が結合ドメインをコードする、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３２】
前記結合ドメインが受容体ドメイン、抗体又は抗体断片を含む、請求項31に記載のレトロウイルス。
【請求項３３】
前記異種核酸配列が抑制性ポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載のレトロウイルス。
【請求項３４】
前記抑制性ポリヌクレオチドがRNAi又はsiRNA配列を含む、請求項33に記載のレトロウイルス。
【請求項３５】
細胞増殖性障害の治療における使用のための組成物であって、請求項1に記載のレトロウイルスを含み、前記異種核酸配列は新生物細胞の増殖を阻害する治療的タンパク質をコードする、組成物。
【請求項３６】
前記治療的タンパク質が、非細胞毒性薬物を細胞毒性薬物に変換するポリペプチドを含む、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ポリペプチドがシトシンデアミナーゼ活性を有する、請求項36に記載の組成物。
【請求項３８】
前記非細胞毒性薬物が5-フルオロシトシンである、請求項36に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞増殖性障害の治療における使用のための組成物であって、請求項1に記載のレトロウイルス、及び抗癌剤又は化学療法剤を含む組成物。
【請求項４０】
前記抗癌剤が、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、AE-941、VEGF Trap、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、INGN-241、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Panzem NCD、2-メトキシエストラジオール、AEE-788、AG-013958、ベバシラニブナトリウム、AMG-706、アクシチニブ、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184及びZK-304709からなる群から選択される、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
レトロウイルスGAGタンパク質;
レトロウイルスPOLタンパク質;
レトロウイルスエンベロープ;
レトロウイルスポリヌクレオチドであって、前記レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に、配列番号19若しくは22のヌクレオチド9405位から9998位までに記載の配列を有する長末端反復(LTR)配列、前記レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド1203位からヌクレオチド2819位までに記載の配列を有するgag核酸ドメイン、
配列番号19若しくは22のヌクレオチド2820位からヌクレオチド6358位までに記載の配列を有するpol核酸ドメイン及び
配列番号19若しくは22のヌクレオチド6359位からヌクレオチド8323位までに記載の配列を有するenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;
polIIIプロモーター及びsiRNA又はshRNAを含むカセット、
標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、
を含み、前記カセットは配列番号21のIRESカセットと比べて、カセットのいずれかの側の直接反復を欠き、該ベクターは、細胞中で少なくとも6継代の間少なくとも90%安定である、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)。
【請求項４２】
前記ベクターが、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたIRESカセットをさらに含む、請求項41に記載のベクター。
【請求項４３】
前記IRESカセットがenv遺伝子のすぐ3'側に位置する、請求項42に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願への相互参照)
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、2008年9月26日に出願の米国特許仮出願第61/100,666号、2008年12月8日に出願の米国特許仮出願第61/120,618号及び2009年6月13日に出願の米国特許仮出願第61/186,823号への優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、細胞増殖を治療するための、複製適合性レトロウイルスベクターに関連する。本開示は、異種核酸の送達及び発現のためのそのような複製適合性レトロウイルスベクターの使用にさらに関連する。
【背景技術】
【０００３】
細胞及び被験体へ遺伝子及び異種核酸を送達する有効な方法は、科学の発達並びに疾患及び障害の可能な治療法のための研究者の目標であった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、レトロウイルスGAGタンパク質;レトロウイルスPOLタンパク質;レトロウイルスエンベロープ;レトロウイルスポリヌクレオチドであって、該レトロウイルスポリヌクレオチド配列の3'末端に長末端反復(LTR)配列、該レトロウイルスポリヌクレオチドの5'末端に哺乳動物細胞での発現に適するプロモーター配列、gag核酸ドメイン、pol核酸ドメイン及びenv核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド;異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位(IRES)を含むカセットであって、3'LTRの5'側、及びレトロウイルスエンベロープをコードするenv核酸ドメインの3'側に位置するカセット;並びに、標的細胞での逆転写、パッケージング及び組込みのために必要なシス作用性配列、を含み、6継代培養後に、pACEベクター(配列番号21)と比較してより高い複製能力を維持する、組換え複製適合性レトロウイルス(RCR)を提供する。一実施形態では、レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス(MLV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)、ネコ白血病ウイルス(FeLV)又はテナガザル白血病ウイルス(GALV)に由来する。別の実施形態では、MLVは両種性（amphotropic）MLVである。さらに別の実施形態では、レトロウイルスは、オンコレトロウイルス又はガンマレトロウイルスである。さらに別の実施形態では、標的細胞は、細胞増殖性障害を有する細胞である。細胞増殖性障害は、以下に限定されないが、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌、脳腫瘍、頭頚部癌、膵臓癌、黒色腫、胃癌及び卵巣癌、関節リウマチ及び他の自己免疫疾患からなる群から選択することができる。一実施形態では、プロモーターは、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド約582位までに記載の配列を有するCMVプロモーターを含み、一つ又は複数の核酸塩基への改変を含むことができ、これは転写を誘導し開始することができる。さらなる実施形態では、プロモーターは、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド約582位までに記載の配列を含む。さらなる実施形態では、プロモーターはCMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、CMV-R-U5ドメインは、MLV R-U5領域に連結されたヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターを含む。さらに別の実施形態では、CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドは、配列番号19、20若しくは22のヌクレオチド約1位からヌクレオチド約1202位までに記載の配列、又は配列番号19、20若しくは22に記載の配列に少なくとも95%同一である配列を含み、該ポリヌクレオチドは、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する。別の実施形態では、ポリヌクレオチドのgag及びpolは、オンコレトロウイルス又はガンマレトロウイルスに由来する。gag核酸ドメインは、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約1203からヌクレオチド約2819までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%の同一性を有する配列を含むことができる。polドメインは、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約2820からヌクレオチド約6358までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.9%の同一性を有する配列を含むことができる。一実施形態では、envドメインは、両種性envタンパク質をコードする。envドメインは、配列番号19若しくは22のヌ���レオチド番号約6359からヌクレオチド約8323までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%の同一性を有する配列を含むことができる。ベクターのIRESドメインは任意のIRESでもよいが、一実施形態では、IRESは脳心筋炎ウイルスに由来する。さらなる実施形態では、IRESは、配列番号19若しくは22のヌクレオチド番号約8327からヌクレオチド約8876までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99%の同一性を有する配列を含む。
【０００５】
ベクターは、任意の数の異なる異種ポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、異種ポリヌクレオチドは、サイトカイン、siRNA、miRNA又はRNAi分子、ターゲッティング配列、結合ドメイン、細胞傷害遺伝子、単鎖抗体又はそれらの任意の組合せを含むことができる。異種ポリヌクレオチドがsiRNA、miRNA又はRNAiなどの非翻訳RNAに対するものである場合、IRESは必要ないが、別の翻訳される遺伝子RNAのために含まれてもよく、任意の種類のレトロウイルスを用いることができる。さらなる実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号3、5、11、13、15又は17に記載の配列を有するポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、異種配列は、配列番号4に記載の配列を含むポリペプチドをコードする。異種核酸はヒトコドン最適化され、配列番号4に記載のポリペプチドをコードする。さらなる実施形態では、異種核酸は、配列番号19又は22のヌクレオチド番号約8877から約9353までに記載の配列を含む。一実施形態では、3'LTRは、オンコレトロウイルス又はガンマレトロウイルスに由来する。さらなる実施形態では、3'LTRはU3-R-U5ドメインを含む。さらなる実施形態では、3'LTRは、配列番号19のヌクレオチド約9405位から約9998位までに記載の配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99.5%同一である配列を含む。
【０００６】
本開示は、配列番号19、20又は22に記載の配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本開示は、5'から3'方向に、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターとMLV R-U5領域とのCMV-R-U5融合体;逆転写酵素のプライマー結合部位PBS;5'スプライス部位;Ψパッケージングシグナル;MLV群特異抗原をコードするgagコード配列;MLVポリメラーゼポリプロテインをコードするpolコード配列;3'スプライス部位;MLV株4070Aのエンベロープタンパク質をコードする4070A envコード配列;脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位(IRES);改変シトシンデアミナーゼコード配列;ポリプリン領域;及びU3-R-U5 MLVの長末端反復配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本開示は、細胞増殖性障害を有する被験体を治療する方法であって、該被験体を、シトシンデアミナーゼ活性を有する本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドが発現されるような条件下で接触させるステップ、及び該被験体を5-フルオロシトシンと接触させるステップを含む方法を提供する。
【０００９】
本開示は、被験体で細胞増殖性障害を治療する方法であって、該被験体を本開示のレトロウイルスと接触させるステップを含み、異種核酸配列は、新生物細胞の増殖を阻害する治療タンパク質をコードする、方法も提供する。一実施形態では、レトロウイルスは、配列番号4、12、14、16又は18に記載の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１０】
本開示の一つ又は複数の実施形態の詳細を、添付図面及び下記の説明で示す。他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面から、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列（配列番号31〜40）を示す図である。
【図１−２】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列を示す図である。
【図１−３】図1A〜Cは野生型酵母シトシンデアミナーゼ(配列番号2)及び本開示のシトシンデアミナーゼ(配列番号4)のアライメント並びに本開示の他の配列を示す図である。
【図２】元の野生型CDと比較して、改変ベクターがより効果的であることを示す細胞死滅データのグラフである。新しい改変骨格(T5.0007)が古い骨格(pACE-CD)よりも死滅においてより効果的であることもグラフは示している。様々なベクター構築物及びそれらの名前をまとめた表も示す。
【図３−１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−１９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２７】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２８】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−２９】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３０】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３１】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３２】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３３】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３４】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３５】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図３−３６】図3A〜Fは、(A)本開示の組換えレトロウイルスベクターの概略図;(B)本開示のポリヌクレオチドのプラスミド地図;(C及びD)本開示のポリヌクレオチドの配列(配列番号19);種々のフォーマットでのpAC-yCD2のベクターコード領域;(E)pACE-emdGFP及びpAC3-emdGFP間の変化を示す図;（F)pAC3-yCD2の図及び配列を示す図である。
【図４】野生型yCDタンパク質と比較して、感染U-87細胞において、より高レベルのyCD2タンパク質が観察されることを示す図である。
【図５】PCR増幅を使用した評価で、12サイクルのウイルス継代後に本開示のベクターが遺伝的に安定であることを示す図である。pACE-CDベクター(Kasahara et al.)と比較して、本開示のベクターがより長期の継代後により安定であることも図は示す。特に、pAC3-CDがpACE-CDよりも安定であり、これは、変更した骨格がベクターをより安定にしたことを示す。さらに、pACE-yCD1(T5.0001)及び-yCD2(T5-0002)がpAC-yCDよりもはるかに安定であり、これは、導入遺伝子のコード配列へのわずかなサイレントな変更が安定性に対して非常に大きな影響を与え、優れた特性をもたらすことができることを示す。T5.0003は安定性が最も低く、T5.0004及びT5.0005は、マウス腫瘍において有効性を示したpACE-CD(W.Wang et al.Hum Gene Ther 14:117 2003,Tai et al.Mol Ther 12:842 2005)とほとんど同等であるように思われる。
【図６−１】(A)細胞死滅アッセイ;及び(B)異なるベクターを感染させた細胞のシトシンデアミナーゼの比活性を示す。(A)は、漸増レベルの5-FCにU87感染細胞を曝露した場合、シトシンデアミナーゼ及び本開示のベクターが元のpACE-CDと少なくとも同等に感染細胞を死滅させ、おそらく元のpACE-CDよりも感染細胞をより死滅させることを示す。
【図６−２】(A)細胞死滅アッセイ;及び(B)異なるベクターを感染させた細胞のシトシンデアミナーゼの比活性を示す。(B)は、pACE-CD(T5.0000)と比較して、本開示のCD(T5.0007、T5.0001及びT5.0002)の比活性が全て増加し、T5.0000<T5.0007<T5.0001<T5.0002の順であることを示す。
【図７】本開示のCDベクターでin vivo処理し、4サイクルの5-FCで処理したマウスから移植したU-87腫瘍が薬物に対してなお感受性があることを示す。
【図８】脳腫瘍のマウスモデルに対するカプラン-マイヤー生存分析の投薬情報及び治療効果を示す。
【図９】同系のマウスモデルにおけるカプラン-マイヤー生存分析での投薬情報及び治療効果を示す。
【図１０−１】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−２】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−３】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１０−４】図10A〜Dは、CD、OPRT及びUPRT活性を有するポリペプチドを含む本開示の様々な実施形態を作製するためのスキームである。
【図１１】Aは、pAC3-miR128-1、pAC3-miR-128-2、及びpAC3-H1-shRNAmiR128と各々命名されたヒト一次前駆体miR-128-1、ヒト一次前駆体miR-128-2及びヒトH1プロモーターに連結したヒト前駆体miR-128のポリヌクレオチド配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3骨格の概略ベクター地図である。Bは、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128と命名された、ヒトH1プロモーターに連結したヒト前駆体miR-128のポリヌクレオチド配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2骨格の概略ベクター地図である。
【図１２】Aは、qPCRによって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080におけるmiR-128含有ベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及び、pAC3-H1-shRNAmiR128)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、qPCRによって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおけるmiR-128含有ベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及び、pAC3-H1-shRNAmiR128)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。
【図１３】miR-128含有ベクターで形質導入した細胞の成熟型miR-128発現の相対定量化を示す
【図１４】miR-128含有ベクターで形質導入した細胞のBmi-1遺伝子発現の相対定量化を示す。
【図１５】pAC3-emd-142-3pTと命名され、1コピーの142-3pT標的配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-emd、及びpAC3-emd-142-3pT4Xと命名され、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-emdの概略ベクター地図である。
【図１６】pAC3-yCD2-142-3pTと命名され、1コピーの142-3pT標的配列を含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2、及びpAC3-yCD2-142-3pT4Xと命名され、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むMLVレトロウイルスベクターpAC3-yCD2の概略ベクター地図である。
【図１７】Aは、qPCRによって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080における142-3pT含有ベクター(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)並びにそれらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト線維肉腫細胞HT1080におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図１８】Aは、qPCRによって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおける142-3pT含有ベクター(pAC3-emd-142-3pT、pAC3-emd-142-3pT4X、pAC3-yCD2-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)並びにそれらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)の複製速度の比較を示す。ウイルス複製中に、qPCRから得られた1/C(t)値 対 様々な時点をプロットすることによってグラフを作成した。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト神経膠腫細胞U87-MGにおけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図１９】ベクター拡散の際の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、マウス及びヒト造血細胞におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd)の複製速度を示す。
【図２０】複製速度の比較を示し、Aは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー法によって解析した、マウスT-リンパ球EL4におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。Bは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒトT-リンパ球SUP-T1におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。Cは、ベクター拡散中の様々な時点でGFP発現についてフローサイトメトリー解析によって解析した、ヒト単球U937におけるGFP含有ベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度の比較を示す。
【図２１】21A及び21Bは、Toca 511及びガドリニウムの腫瘍内CED注射の間に、患犬から得られたMRI画像の静止画像である。画像の左側にある大きな腫瘍が脳の両側を圧迫し、正中線構造を右側に移動させていることに注意されたい。白い領域は、ガドリニウム-Toca 511注射である。図21Bは、腫瘍内の二つのカテーテルの留置を示す。
【図２２】pAC3骨格内に、各々ヒトIFN-γ(hIFNg)及びマウスIFN-γ(mIFNg)をコードするMLVレトロウイルスベクターの概略ベクター地図である。
【図２３】pAC3-mIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080のRNAレベルにおけるmIFN-γ発現を示す図である。発現をRT-PCRによって検出している。
【図２４】pAC3-hIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080から分泌したhIFN-γタンパク質の発現を示すグラフである。
【図２５】pAC3-mIFNgベクターで感染させたヒト線維肉腫細胞株HT1080から分泌したmIFN-γタンパク質の発現を示すグラフである。
【図２６】ヌードマウスモデルへのAC3-GFPベクターの腫瘍内又は静脈内送達後のU87細胞におけるGFP発現のフローサイトメトリー解析を示す。GFP陽性パーセントについて、細胞をフローサイトメトリーにより測定する。未処理のヌードマウス脳から単離した細胞、組織培養由来のU87細胞、又はAC3-GFP(V)を用いて感染多重度1でin vitroで形質導入したU87細胞を対照とする。実施例27(GFPベクターのiv注射)より。
【図２７】U87単離細胞におけるGFPシグナルの分布を測定するために、実施例27(GFPベクターのiv注射)の第一、第三、及び第五群においてヒストグラム解析も行った結果のグラフを示す。GFP発現は、ベクター処理14日後のマウス脳から単離したU87腫瘍細胞に由来する。
【図２８】pAC3骨格内にヒトIL-2をコードするMLVレトロウイルスベクターの概略ベクター地図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
様々な図における同様の参照記号は、同様の要素を示す。
【００１３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いるように、単数形「a」、「and」及び「the」は、文脈上明らかに別の指示がない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「細胞」と呼ぶ場合は複数のそのような細胞を含み、「剤」と呼ぶ場合は、当業者に公知である一つ又は複数の剤への言及を含む、などである。
【００１４】
さらに、「又は」の使用は、特に明記しない限り「及び/又は」を意味する。同様に、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(include)」、「含む(includes)」及び「含む(including)」は互換性があり、限定するものではない。
【００１５】
様々な実施形態の記載が用語「含む(comprising)」を使用する場合、当業者は、一部の特定の例では、実施形態を、言語「から本質的になる」又は「からなる」を使って代わりに記載することができることがさらに理解されよう。
【００１６】
特に定義されていない場合は、本明細書で用いるすべての専門用語及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似又は同等の方法及び材料を開示されている方法及び組成物の実施で用いることができるが、例示的な方法、装置及び材料を本明細書で記載する。
【００１７】
ベクター、プロモーターの使用及び多くの他の関連する話題を含む、本明細書で有用な分子生物学的技術を記載する一般教科書には、Berger及びKimmel、Guide to Molecular Cloning Techniques、Methods in Enzymology第152巻(Academic Press, Inc.、San Diego, Calif.)(「Berger」);Sambrookら、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor, N.Y.、1989年(「Sambrook」)及びCurrent Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.及びJohn Wiley & Sons, Inc.間の共同事業(1999年まで増補された)(「Ausubel」)が含まれる。例えば本開示の相同核酸の生成のために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅及び他のRNAポリメラーゼ媒介技術(例えば、NASBA)を含むin vitro増幅方法を当業者に指導するのに十分なプロトコルの例は、Berger、Sambrook及びAusubel、並びにMullisら(1987年)米国特許第4,683,202号;Innisら編、(1990年)PCRプロトコル:A Guide to Methods and Applications (Academic Press Inc. San Diego, Calif.)(「Innis」);Arnheim及びLevinson (1990年10月1日) C&EN 36〜47;The Journal Of NIH Research (1991年) 3巻: 81〜94頁;Kwohら(1989年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86巻: 1173頁;Guatelliら(1990年) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87巻: 1874頁;Lomellら(1989年) J. Clin. Chem 35巻: 1826頁;Landegrenら(1988年) Science 241巻: 1077〜1080頁;Van Brunt (1990年) Biotechnology 8巻: 291〜294頁;Wu及びWallace (1989年) Gene 4巻:560頁;Barringerら(1990年) Gene 89巻:117頁;並びにSooknanan及びMalek (1995年) Biotechnology 13巻: 563〜564頁に見られる。in vitroで増幅された核酸をクローニングするための改善された方法は、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載されている。PCRによって大きな核酸を増幅するための改善された方法は、Chengら(1994年) Nature 369巻:684〜685頁及びその中の引用文献に要約され、そこでは、最高40kbのPCRアンプリコンが生成される。当業者は、逆転写酵素及びポリメラーゼを用いて、本質的にいかなるRNAも、制限消化、PCR拡張及び配列決定に適する二本鎖DNAに変換することができることを理解する。例えば、すべて前掲のAusubel、Sambrook及びBergerを参照。
【００１８】
本文全体で述べられる刊行物は、本出願の出願日の前に、それらの開示のためにだけ提供される。本明細書のいずれも、先行開示のために発明者がそのような開示に先願権を有しないことを認めるものと解釈されてはならない。
【００１９】
本開示は、細胞又は被験体への遺伝子又はタンパク質の送達に有用な方法及び組成物を提供する。そのような方法及び組成物は、癌並びに他の細胞増殖性疾患及び障害を含む、被験体での様々な疾患及び障害を治療するのに用いることができる。本開示は、遺伝子送達のための複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。
【００２０】
用語「ベクター」、「ベクター構築物」及び「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現(例えば、転写及び翻訳)を促進するために、DNA又はRNA配列(例えば外来遺伝子)を宿主細胞に導入することができる運搬体を意味する。ベクターは一般的に伝播性因子のDNAを含み、その中に、タンパク質をコードする外来性DNAが、制限酵素技術によって挿入される。ベクターの一般的な型は「プラスミド」であり、それは一般に、追加の(外来の)DNAを容易に受け入れることができ、適する宿主細胞に容易に導入することができる二本鎖DNAの自立型分子である。プラスミド及び真菌のベクターを含む多数のベクターが、様々な真核生物及び原核生物の宿主での複製及び/又は発現について記載されている。それには限定されない例には、本明細書で開示若しくは引用されるか、さもなければ関連技術分野の技術者に公知である方法を用いる、pKKプラスミド(Clonetech)、pUCプラスミド、pETプラスミド(Novagen, Inc.、Madison, Wis.)、pRSET若しくはpREPプラスミド(Invitrogen、San Diego, Calif.)、又はpMALプラスミド(New England Biolabs、Beverly, Mass.)、及び多くの適当な宿主細胞が含まれる。組換えクローニングベクターは、クローニング又は発現のための一つ又は複数の複製系、宿主での選択のための一つ又は複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、及び一つ又は複数の発現カセットをしばしば含む。
【００２１】
用語「発現する」及び「発現」は、遺伝子又はDNA配列内の情報を顕在化することを可能にするか又はそうさせること、例えば、対応する遺伝子又はDNA配列の転写及び翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を生成することを意味する。DNA配列は細胞内で、又はそれによって発現され、タンパク質などの「発現産物」を形成する。発現産物自体、例えば生じるタンパク質が、細胞によって「発現される」と言うこともできる。例えば、それが外来若しくは天然のプロモーターの制御下において外来宿主細胞で、又は外来プロモーターの制御下において天然宿主細胞で発現又は生成される場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチドは組換えによって発現される。
【００２２】
本開示は、例えばシトシンデアミナーゼ若しくはその突然変異体、miRNA若しくはsiRNA、サイトカイン、抗体結合ドメインなどをコードする、細胞又は被験体に送達できる異種ポリヌクレオチドを含む複製適合性ウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、ヘルペスベクター、レトロウイルスベクター(レンチウイルスベクターを含む)、ラブドウイルスベクター、例えば水疱性口内炎ウイルスベクター、レオウイルスベクター、セネカバレーウイルスベクター、ポックスウイルスベクター(動物ポックス若しくはワクシニア由来のベクターを含む)、パルボウイルスベクター(AAVベクターを含む)、アルファウイルスベクター、又は当業者に公知である他のウイルスベクターであってもよい(例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Concepts in Genetic Medicine、Boro Dropulic及びBarrie Carter編、Wiley、2008年、Hoboken, NJ.;The Development of Human Gene Therapy、Theodore Friedmann編、Cold Springs Harbor Laboratory Press、Cold springs Harbor, New York、1999年;Gene and Cell Therapy、Nancy Smyth Templeton編、Marcel Dekker Inc.、New York, New York、2000年並びにGene Therapy: Therapeutic Mechanism and Strategies、Nancy Smyth Templetone及びDanilo D Lasic編、Marcel Dekker, Inc.、New York, New York、2000も参照)。
【００２３】
一実施形態では、ウイルスベクターは、複製中の哺乳動物細胞に感染することだけができる複製適合性レトロウイルスベクターであってもよい。一実施形態では、複製適合性レトロウイルスベクターは、例えばシトシンデアミナーゼ、miRNA、siRNA、サイトカイン、受容体、抗体などをコードする異種ポリヌクレオチドの5'側に内部リボソーム侵入部位(IRES)を含む。異種ポリヌクレオチドがsiRNA、miRNA又はRNAiなどの非翻訳RNAをコードする場合、IRESは必要ないが、別の翻訳される遺伝子のために含まれてもよく、任意の種類のレトロウイルス(下記参照)を用いることができる。一実施形態では、該ポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターのENVポリヌクレオチドの3'側にある。
【００２４】
他の実施形態では、本開示の複製適合性レトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。宿主細胞には、真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞又は動物細胞が含まれる。宿主細胞には、細菌細胞などの原核細胞も含まれる。
【００２５】
本明細書で提供されるベクター(例えば複製適合性レトロウイルスベクター)で形質導入される(形質転換又はトランスフェクトされる)人工の宿主細胞も提供される。人工の宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、又はコードポリヌクレオチドを増幅するために適宜改変された、従来の栄養培地で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で前に用いられたものであり、それらは、当業者に、及び本明細書の引用文献、例えば、Sambrook、Ausubel及びBerger、並びに、例えば、Freshney (1994年) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、第3版(Wiley-Liss、New York)及びその中の引用文献で明らかである。
【００２６】
適当な発現宿主の例には、以下が含まれる。大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの細菌細胞;出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)及びアカパンカビ(Neurospora crassa)などの真菌細胞;ショウジョウバエ(Drosophila)及びスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)などの昆虫細胞;CHO、COS、BHK、HEK 293 br Bowes黒色腫などの哺乳動物細胞;又は植物細胞若しくは外植片など。一般的に、ヒト細胞又は細胞系が用いられるが、配列決定、増幅及びクローニングの目的のために、本開示のベクター及びポリヌクレオチドを非ヒト宿主細胞にクローニングすることが望ましいかもしれない。
【００２７】
本開示は、先のレトロウイルスベクターと比較して安定性の増加した複製適合性レトロウイルスベクターも提供する。感染及び複製の際のそのような増加した安定性は、細胞増殖性障害の治療にとって重要である。形質導入効率、導入遺伝子安定性及び標的選択性の組合せが、複製適合性レトロウイルスによって提供される。本組成物及び方法は、挿入断片の安定性を提供し、導入遺伝子の転写活性及びコードされるポリペプチドの翻訳達成可能性を維持する。
【００２８】
本開示は、改変レトロウイルスベクターを提供する。改変レトロウイルスベクターは、レトロウイルス科のメンバーから誘導することができる。レトロウイルス科は、以下の3個の群からなる。ヒトフォーミーウイルス(HFV)などのスプマウイルス(又はフォーミーウイルス);レンチウイルス、並びにヒツジのビスナウイルス;及び腫瘍ウイルス(この群のすべてのウイルスが発癌性であるというわけではない)。用語「レンチウイルス」は、逆転写酵素を含むウイルスの属を記載する、その従来の意味で用いられる。レンチウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)1型及び2型(HIV-1及びHIV-2)並びにサル免疫不全ウイルス(SIV)を含む「免疫不全ウイルス」が含まれる。歴史的に腫瘍ウイルスは、ウイルス成熟の際に電顕下で観察される粒子形態に基づいて、A群、B群、C群及びD群にさらに細分類されている。A型粒子は、感染細胞の細胞質で見られるB型及びD型ウイルスの未熟粒子を表す。これらの粒子は、感染性でない。B型粒子は、細胞質内A型粒子を包み込むことによって原形質膜から成熟ビリオンとして出芽する。膜において、それらは75nmの環状コアを有し、そこから長い糖タンパク質スパイクが突き出る。出芽後に、B型粒子は、偏在する電子密度の高いコアを含む。プロトタイプB型ウイルスは、マウス乳癌ウイルス(MMTV)である。C型ウイルスに感染した細胞では、いかなる細胞質内粒子も観察することができない。代わりに、成熟粒子は、三日月形の「C」形の凝縮物を通じて細胞表面から直接に出芽し、それは次にそれ自体が閉じ、原形質膜によって包まれる。エンベロープ糖タンパク質スパイクは、均一に高電子密度のコアと一緒に見ることができる。出芽は、表面原形質膜から、又は直接に細胞内液胞中へと起こることができる。C型ウイルスは最も一般的に研究されており、トリ及びマウス白血病ウイルス(MLV)の多くを含む。ウシ白血病ウイルス(BLV)並びにヒトT細胞白血病ウイルスI型及びII型(HTLV-I/II)は、細胞表面からのそれらの出芽形態のために、同様にC型粒子と分類される。しかし、それらは正六角形の形態も有し、マウス白血病ウイルス(MLV)などのプロトタイプC型ウイルスよりも複雑なゲノム構造を有する。D型粒子は、それらが感染細胞の細胞質中で、細胞表面から出芽する環様
構造を示すが、ビリオンが短い表面糖タンパク質スパイクを組み込むという点で、B型粒子に似ている。高電子密度コアも、粒子の中に偏在する。メイソンファイザーサルウイルス(MPMV)は、プロトタイプD型ウイルスである。
【００２９】
レトロウイルスは様々な方法で分類されてきたが、この10年で命名法は標準化された(その開示が参照により本明細書に組み込まれる、ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/のワールドワイドウェブ(www)上のICTVdB-汎用ウイルスデータベース、v 4、及びテキストブック「レトロウイルス」Coffin、Hughs及びVarmus編、Cold Spring Harbor Press 1997年を参照)。一実施形態では、複製適合性レトロウイルスベクターは、オルトレトロウイルス又はより一般的にガンマレトロウイルスのベクターを含みうる。
【００３０】
レトロウイルスは、それらが遺伝物質を複製する方法によって定義される。複製の際、RNAはDNAに変換される。細胞の感染の後、逆転写として知られる分子過程によって、ウイルス粒子中で運ばれるRNAの2つの分子からDNAの二本鎖分子が生成される。DNA形態はプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに共有結合的に組み込まれ、そこから、細胞性因子及び/又はウイルスの因子助けによってウイルスRNAが発現される。発現されたウイルスRNAは粒子にパッケージングされ、感染性のビリオンとして放出される。
【００３１】
レトロウイルス粒子は、2個の同一のRNA分子で構成される。各野生型ゲノムは、正のセンス一本鎖RNA分子を有し、それは、5'末端がキャップされ、3'テールがポリアデニル化されている。二倍体のウイルス粒子は、gagタンパク質の「コア」構造内でgagタンパク質、ウイルス酵素(pol遺伝子産物)及び宿主tRNA分子と複合体を形成した2本のRNA鎖を含む。このキャプシドを囲んで保護するのは、宿主細胞膜に由来し、ウイルスエンベロープ(env)タンパク質を含む、脂質二重層である。envタンパク質はウイルスの細胞受容体に結合し、その粒子は、一般的に受容体依存性エンドサイトーシス及び/又は膜融合を通じて宿主細胞に入る。
【００３２】
外側のエンベロープを脱殻した後、ウイルスRNAは逆転写によってDNAに複製される。これは、pol領域によってコードされる逆転写酵素によって触媒され、ビリオンにパッケージングされる宿主細胞tRNAを、DNA合成のためのプライマーとして用いる。この方法では、RNAゲノムは、より複雑なDNAゲノムに変換される。
【００３３】
逆転写によって生成される二本鎖線状DNAは、核内で環化必要があっても、又はなくてもよい。今では、プロウイルスはいずれかの末端に、長末端反復配列(LTR)として知られる2本の同一の反復配列を有する。2本のLTR配列の末端は、組込みを触媒するpol生成物-インテグラーゼタンパク質-によって認識される部位を生成し、その結果プロウイルスは、LTRの末端から2塩基対(bp)にて宿主DNAに常に結合する。細胞性配列の複製は、両LTRの末端で見られ、転移性遺伝エレメントの組込みパターンを想起させる。組込みは、標的細胞ゲノム内で本質的に無作為に起こると考えられる。しかし、長末端反復配列を改変することによって、レトロウイルスゲノムの組込みを調節することが可能である。
【００３４】
組み込まれたウイルスDNAの転写、RNAスプライシング及び翻訳は、宿主細胞のタンパク質によって媒介される。様々にスプライスされた転写産物が生成される。ヒトレトロウイルスの場合、遺伝子発現を調節するのに、HIV-1/2及びHTLV-I/IIウイルスタンパク質も用いられる。細胞性因子及びウイルス因子間の相互作用は、ウイルス潜在及びウイルス遺伝子がその中で発現される一時的配列の制御下にある要因である。
【００３５】
レトロウイルスは、水平及び垂直に伝播することができる。レトロウイルスの効率的な感染伝播は、ウイルスエンベロープタンパク質を特異的に認識する受容体の標的細胞上での発現を必要とするが、ウイルスは、低い効率の受容体非依存性非特異的侵入経路を用いることもできる。さらに、標的細胞種は、ウイルスが結合及び侵入した後の複製サイクルのすべての段階をサポートすることができなければならない。ウイルスゲノムが宿主の生殖細胞系に組み込まれるとき、垂直感染が起こる。その後プロウイルスは、それが細胞の遺伝子であるかのように、代々引き継がれる。したがって、しばしば潜在性のままであるが、宿主が適当な作用因子に曝露されると活性化され得る、内因性プロウイルスが確立される。
【００３６】
上記のように、組み込まれたDNA中間体は、プロウイルスと呼ばれる。以前の遺伝子治療又は遺伝子送達系は、適当なヘルパーウイルスの存在下で、又は汚染性ヘルパーウイルスの同時生成なしでキャプシド形成を可能にする適当な配列を含む細胞系で、プロウイルスの転写及び感染性ウイルスへのアセンブリーを必要とする方法及びレトロウイルスを用いる。下記のように、キャプシド形成のための配列がゲノムで提供され、したがって遺伝子送達又は療法のための複製適合性レトロウイルスベクターを提供するので、本開示の組換えレトロウイルスの生成のためにヘルパーウイルスを必要としない。
【００３７】
既存の複製適合性レトロウイルスベクターも、水平又は垂直感染の際、及び複製の間に、感染細胞又は宿主細胞から失われる傾向がある。これは、反復配列を含むか又はポリメラーゼの効率を低減させる余分なヌクレオチド配列の存在に、一部起因するかもしれない。
【００３８】
本開示のレトロウイルスゲノム及びプロウイルスDNAは、少なくとも3個の遺伝子、gag、pol及びenvを有し、これらの遺伝子には、1又は2個の長末端反復配列(LTR)が隣接することができ、又はプロウイルスでは、psiなどのシス作用性配列を含む2個の長末端反復配列(LTR)が隣接する。gag遺伝子は、内部構造(マトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシド)タンパク質をコードし;pol遺伝子は、RNA指向性DNAポリメラーゼ(逆転写酵素)、プロテアーゼ及びインテグラーゼをコードし;env遺伝子は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質をコードする。5'及び/又は3'のLTRは、ビリオンRNAの転写及びポリアデニル化を促進する役目を果たす。LTRは、ウイルス複製に必要な他のすべてのシス作用性配列を含む。レンチウイルスは、vif、vpr、tat、rev、vpu、nef及びvpxを含む追加の遺伝子を有する(HIV-1、HIV-2及び/又はSIVにおいて)。
【００３９】
ゲノムの逆転写に必要な配列(tRNAプライマー結合部位)、及び粒子へのウイルスRNAの効率的なキャプシド形成のために必要な配列(Psi部位)が、5'LTRに隣接する。キャプシド形成(又は感染性ビリオンへのレトロウイルスRNAのパッケージング)のために必要な配列がウイルスゲノムから欠落している場合、その結果は、ゲノムウイルスRNAのキャプシド形成を妨げるシス欠損である。この型の改変ベクターは、以前の遺伝子送達系(すなわち、ビリオンのキャプシド形成のために必要とされるエレメントを欠く系)で一般的に用いられてきたものである。
【００４０】
第一の実施形態では、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞又は細胞増殖性障害を有する細胞に感染することができる、組換えレトロウイルスを提供する。本開示の組換え複製適合性レトロウイルスは、ビリオン内に封入される内部リボソーム侵入部位(IRES)の後に、ウイルスのGAG、ウイルスのPOL、ウイルスのENV、異種ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
句「非分裂性」細胞は、有糸分裂を経ない細胞を指す。非分裂細胞は、その細胞が活発に分裂していない限り、細胞周期中の任意の時点(例えば、G0/G1、G1/S、G2/M)でブロックすることができる。ex vivo感染のために、分裂細胞は、照射、アフィディコリン(aphidocolin)処理、血清飢餓及び接触阻害を含む、当業者により用いられる標準技術によって、細胞分裂をブロックするために処理することができる。しかし、多くの細胞がすでに停止しているので(例えば、幹細胞)、ex vivo感染はしばしば細胞をブロックすることなく実施されることを理解すべきである。例えば、組換えレンチウイルスベクターは、細胞分裂をブロックするために用いられる機構又は細胞がブロックされる細胞周期内の時点に関係なく、任意の非分裂細胞に感染することができる。体内の既存の非分裂細胞の例には、ニューロン、筋肉、肝臓、皮膚、心臓、肺及び骨髄の細胞、及びそれらの誘導体が含まれる。分裂細胞のために、オンコレトロウイルスベクターを用いることができる。
【００４２】
「分裂」細胞は、活発な有糸分裂又は減数分裂を経る細胞を意味する。そのような分裂細胞には、幹細胞、皮膚細胞(例えば、線維芽細胞及びケラチノサイト)、配偶子、及び当技術分野で公知である他の分裂細胞が含まれる。特に興味があり、用語分裂細胞に包含されるものは、新生物細胞などの細胞増殖性障害を有する細胞である。用語「細胞増殖性障害」は、異常な数の細胞を特徴とする状態を指す。この状態は、肥大性(組織の中で細胞集団の過成長をもたらす細胞の継続的増殖)及び発育不全(組織中の細胞の不足若しくは欠乏)細胞増殖の両方、又は体の領域への細胞の過剰の流入若しくは移動を含むことができる。細胞集団は必ずしも形質転換細胞、腫瘍形成細胞又は悪性細胞であるわけではなく、正常細胞も含むことができる。細胞増殖性障害には、結合組織の過成長に関連する障害、例えば強皮症、関節炎及び肝硬変を含む様々な線維症状態が含まれる。細胞増殖性障害には、頭頸部癌などの新生物障害が含まれる。頭頸部癌には、例えば、口、食道、咽喉、喉頭、甲状腺、舌、唇、唾液腺、鼻、副鼻腔、鼻咽頭の癌腫、上鼻腔及び副鼻腔腫瘍、感覚神経芽腫、扁平上皮細胞癌、悪性黒色腫、副鼻腔(sinonasal)未分化癌腫(SNUC)、脳(グリア芽細胞腫を含む)又は血液の新生物が含まれるであろう。子宮頸部リンパ節、喉頭前リンパ節、肺食道近傍リンパ節及び顎下リンパ節を含む局所リンパ節の癌腫も含まれる(Harrison's Principles of Internal Medicine、Isselbacherら編、McGraw-Hill, Inc.、第13版、1850〜1853頁、1994年)。他の癌型には、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、尿路癌、子宮癌リンパ腫、口腔癌、膵臓癌、白血病、黒色腫、胃癌、皮膚癌及び卵巣癌が含まれるが、これらに限定されない。細胞増殖性疾患には、免疫系の不適当な細胞増殖をしばしば特徴とする、関節リウマチ(O'Dell NEJM 350巻:2591頁 2004年)及び他の自己免疫障害(MackayらNEJM 345巻:340頁 2001年)も含まれる。
【００４３】
異種核酸配列は、IRESに作動可能に連結される。本明細書で用いるように、用語「異種」核酸配列又は導入遺伝子は、(i)野生型レトロウイルスに通常は存在しない配列、(ii)他の種に由来する配列、又は(iii)同じ種に由来する場合、それが、その原形からかなり改変されてもよいことを指す。或いは、細胞で通常発現されない未改変の核酸配列は、異種核酸配列である。
【００４４】
本開示のレトロウイルスベクターの使用目的によって、任意の数の異種ポリヌクレオチド又は核酸配列をレトロウイルスベクターに挿入することができる。例えば、in vitro試験のために、抗生物質耐性及び蛍光分子(例えば、GFP)を含め、通常用いられるマーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を用いることができる。任意の所望のポリペプチド配列をコードする追加のポリヌクレオチド配列を、本開示のベクターに挿入することもできる。異種核酸配列のin vivo送達を目指す場合、治療的及び非治療的な配列の両方を用いることができる。例えば、異種配列は、細胞増殖性障害又は他の遺伝子関連疾患若しくは障害に関連する特定の遺伝子を目的とするアンチセンス分子(miRNA、siRNA)又はリボザイムを含む治療的分子をコードすることができ、異種配列は、自殺遺伝子(例えば、改変された又は未改変のHSV-tk又はPNP又はシトシンデアミナーゼ)、増殖因子又は治療タンパク質(例えば、第IX因子、IL2など)であることができる。本開示に適用できる他の治療タンパク質は、当技術分野で容易に特定される。
【００４５】
一実施形態では、ベクター中の異種ポリヌクレオチドは、ヒト細胞での発現のために最適化されたシトシンデアミナーゼを含む。さらなる実施形態では、シトシンデアミナーゼは、ヒトコドン最適化された配列を含み、野生型シトシンデアミナーゼと比較してシトシンデアミナーゼの安定性(例えば、分解の低減又は熱安定性の増加)を高める突然変異を含む。さらに別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、UPRT又はOPRT活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたシトシンデアミナーゼ(ヒトコドン最適化されたか又は最適化されておらず、突然変異を起こしたか又は突然変異を起こしていない)を含む融合構築物をコードする。別の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、本開示のCDポリヌクレオチド(例えば、配列番号3、5、11、13、15又は17)を含む。
【００４６】
別の実施形態では、複製適合性レトロウイルスベクターは、シトシンデアミナーゼ(本明細書に記載のもの)を含むポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むことができ、さらに、ウイルスプロモーターからの一次転写産物の一部として、又は細胞型若しくは組織特異的であってもよいプロモーターに連結されたmiRNA又はsiRNA分子を含む、ポリヌクレオチドを含むことができる。
【００４７】
MicroRNA(miRNA)は、小さな非コードRNAである。それらは、コード遺伝子若しくは非コード遺伝子のイントロン、非コード遺伝子のエクソン、又は遺伝子間領域内に位置する。miRNA遺伝子は、一次前駆体miRNA(pri-miRNA)と呼ばれる前駆体ポリヌクレオチドを生成するRNAポリメラーゼIIによって転写される。核内のpri-miRNAはリボヌクレアーゼDroshaによって処理され、短いヘアピン構造を形成するmiRNA前駆体(pre-miRNA)を生成する。その後、pre-miRNAはExportin 5を通して細胞血漿に輸送され、Dicerと呼ばれる別のリボヌクレアーゼによってさらに処理され、活性のある成熟miRNAを生成する。
【００４８】
成熟miRNAは、長さが約21ヌクレオチドである。それは、標的遺伝子のmRNAの3'非翻訳領域に結合し、タンパク質翻訳の抑制又はmRNAの分解によってタンパク質発現を抑制することによって、機能を発揮する。miRNAは、発生、細胞増殖、分化及び癌進行を含む生物学的過程に関与する。miRNAプロファイリングの研究は、一部のmiRNA発現が組織特異的であるか、又は特定の組織で濃縮されることを示す。例えば、miR-142-3p、miR-181及びmiR-223の発現は、ヒト及びマウス造血組織で濃縮されることが証明されている(Baskervilleら、2005年RNA 11巻、241〜247頁;Chenら、2004年Science 303巻、83〜86頁)。
【００４９】
一部のmiRNAは、いくつかの腫瘍で上方制御(発癌性miRNA)又は下方制御(リプレッサー)されることが観察されている(Spizzoら、2009年Cell 137巻、586e1)。例えば、miR-21は、グリア芽細胞腫、乳房、肺、前立腺、結腸、胃、食道及び子宮頸の癌、子宮平滑筋肉腫、DLBCL、頭頸部癌で過剰発現される。対照的に、let-7のメンバーは、グリア芽細胞腫、肺、乳房、胃、卵巣、前立腺、及び結腸の癌で下方制御されることが報告されている。癌でのmiRNA発現のホメオスタシスの再確立は、癌進行を阻害又は逆転させるのに不可欠な機構である。
【００５０】
癌でmiRNAによって調節される生活機能の結果として、可能な治療的手法の開発の焦点は、発癌性miRNAのアンチセンス媒介抑制(アンチゴマー)に向けられた。しかし、miRNA置換は、等しく有効な戦略になり得るであろう。この手法では、治療的に最も有用なmiRNAは、腫瘍では低レベルで発現されるが、正常組織では高レベルで発現される（すなわち許容される）ものである。
【００５１】
癌で下方制御されるmiRNAは、抗癌剤として有用であるかもしれない。例には、mir-128-1、let-7、miR-26、miR-124及びmiR-137が含まれる(Esquela-Kerscherら、2008年Cell Cycle 7巻、759〜764頁;Kumarら、2008年Proc Natl Acad Sci USA 105巻、3903〜3908頁;Kotaら、2009年Cell 137巻、1005〜1017頁;Silberら、2008年BMC Medicine 6巻:14 1〜17頁)。miR-128発現は、中枢神経系で高められることが報告され、グリア芽細胞腫では下方制御されることが観察されている(Sempereら、2004年Genome Biology 5巻:R13.5〜11;Godlewskiら、2008年Cancer Res 68巻: (22号) 9125〜9130頁)。miR-128は、2個の異なる遺伝子、miR-128-1及びmiR-128-2によってコードされる。両方とも、同一の成熟配列に処理される。Bmi-1及びE2F3aは、miR-128の直接の標的であることが報告されている(Godlewskiら、2008年Cancer Res 68巻: (22号) 9125〜9130頁;Zhangら、2009年J. Mol Med 87巻:43〜51頁)。さらに、Bmi-1発現は、神経膠腫、マントル細胞リンパ腫、非小細胞肺癌B細胞非ホジキンリンパ腫、乳癌、結腸直腸癌及び前立腺癌を含め、様々なヒトの癌で上方制御されることが観察されている。さらに、ニューロン幹細胞並びに神経膠腫中の「幹様」細胞集団を含む、多様な組織からの幹細胞の自己複製のためにBmi-1が必要とされることが証明されている。
【００５２】
細胞機能のmiRNA媒介抑制の可能性を示すいくつかのin vitro実証があるが、他の分子でそうであるように、これらをオリゴヌクレオチドとして、又はウイルスベクターで、in vivo効果を有するのに必要なくらい効率的に送達するのは困難であった(例えば、LiらCell Cycle 5巻:2103〜2109頁 2006年)。複製不能ベクターは、いかなる場合も、腫瘍のかなりの部分への治療的遺伝子の送達を達成するのに十分に効率的ではないようである。しかし、miRNA型の剤を送達するために複製可能なベクターを用いる方法を知ることも簡単ではない。特に、追加のRNA配列を複製適合性レトロウイルスのRNAゲノムにどのように組み込み、複製効率を維持し、追加物をゲノムに安定して組み込んでおくべきかは明白でない。
【００５３】
CMV又はLTRなどのポリメラーゼIIプロモーターによってpri-mi RNAを安定して発現させるために、複製欠陥のあるレトロウイルス及びレンチウイルスベクターが用いられ、成熟したmiRNAの生成を実証した。しかし、これらのベクターは、ベクターを複製するために必要とされているように、レトロウイルス又はレンチウイルスの全生活環を複数回経る必要はない。ゲノムは、単純な侵入、組込み及び転写よりも多くの事象を受け入れることができなければならない。miRNAを発現させるためのRNAベースのウイルスの使用に関連する懸念には、以下のものが含まれる。(1) RNAプロセシングの際の転写後段階でのウイルスRNAゲノムの完全性、(2)複製の際の挿入したカセットの安定性、及び(3)成熟miRNAを生成するLTRプロモーターから転写されるウイルスRNAの一部としてのpri-miRNAの適切なプロセシング。
【００５４】
したがって、複製不能レトロウイルス及びレンチウイルスベクターでのU6及びH1プロモーターなどのIII型RNAポリメラーゼIIIプロモーターの組込みは、短いヘアピン構造のRNAを生成する機能的な小さな干渉RNA(siRNA)を発現させるために、広く用いられている(Bromberg-Whiteら、2004年J Virol 78巻:9号、4914〜4916頁;Slivaら、2006年Virology 351巻、218〜225頁;Hagaら、2006年、Transplant Proc 38巻(10号):3184〜8頁)。ループ配列は、長さが21〜22ヌクレオチドである成熟siRNAを生成するDicerによって切断される。標的遺伝子の発現を下方制御するために、shRNAを細胞内で安定して発現させることができる。しかし、組換え複製適合性レトロウイルスベクターへのそのようなカセットの組込み、成熟miRNAを生成するためのDicerによる発現及びプロセシングは、まだ問題が残されている。一実施形態では、本発明は、一次前駆体miRNAの異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。
【００５５】
さらなる実施形態では、一次前駆体miRNAは、ヒト起源である。別の実施形態では、一次前駆体RNA配列は、env遺伝子の下流にある。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、env遺伝子の下流のヒト一次前駆体miR-128-2(配列番号32)の異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。癌で下方制御されるmiRNAを、治療的遺伝子送達のためのベクターに組み込むことができる。例えば、let-7、miR-26、miR-124及びmiR-137 (Esquela-Kerscherら、2008年Cell Cycle 7巻、759〜764頁;Kumarら、2008年Proc Natl Acad Sci USA 105巻、3903〜3908頁;Kotaら、2009年Cell 137巻、1005〜1017頁;Silberら、2008年BMC Medicine 6巻:14 1〜17頁)。
【００５７】
さらに別の実施形態では、本発明は、短いヘアピン構造のヒトpre-miR-128の異種ポリヌクレオチド配列をenv遺伝子の下流のヒトH1プロモーター(配列番号33及び配列番号34)に連結したものを含む、組換え複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。癌で下方制御されるmiRNAを、治療的遺伝子送達のためのベクターに組み込むことができる。例えば、let-7、miR-26、miR-124及びmiR-137 (Esquela-Kerscherら、2008年Cell Cycle 7巻、759〜764頁;Kumarら、2008年Proc Natl Acad Sci USA 105巻、3903〜3908頁;Kotaら、2009年Cell 137巻、1005〜1017頁;Silberら、2008年BMC Medicine 6巻:14 1〜17頁)。
【００５８】
アンチセンス核酸は、特異的mRNA分子の少なくとも一部に相補的であるDNA又はRNA分子である(Weintraub、Scientific American、262巻:40頁、1990年)。細胞では、アンチセンス核酸は対応するmRNAとハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるmRNAを翻訳しないので、アンチセンス核酸はmRNAの翻訳を妨害する。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましいが、その理由は、それらが容易に合成され、標的細胞に導入される場合、より大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が低いからである。遺伝子のin vitro翻訳を抑制するアンチセンス方法の使用は、当技術分野で周知である(Marcus-Sakura、Anal. Biochem.、172巻:289頁、1988年)。
【００５９】
アンチセンス核酸は、アルツハイマー病で蓄積するアミロイド前駆体タンパク質などの、突然変異体タンパク質又は優性活性遺伝子産物の発現をブロックするために用いることができる。そのような方法は、ハンチントン病、遺伝性パーキンソン症候群及び他の疾患の治療のためにも有用である。細胞増殖性障害に関連する遺伝子のブロッキングが、特に興味がある。アンチセンス核酸は、毒性に関連するタンパク質の発現の抑制のためにも有用である。
【００６０】
転写を遅れさせるオリゴヌクレオチドの使用は、オリゴマーが二重らせんDNAに巻きついて三本鎖らせんを形成するので、トリプレックス戦略として知られる。したがって、これらのトリプレックス化合物は、選択された遺伝子上の特異部位を認識するように設計することができる(Maherら、Antisense Res. and Dev.、1巻(3号):227頁、1991年;Helene, C.、Anticancer Drug Design、6巻(6号):569頁、1991年)。
【００６１】
リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼに類似した方法で他の一本鎖RNAを特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列の改変を通して、RNA分子中の特定のヌクレオチド配列を認識してそれを切断する分子を工作することが可能である(Cech、J. Amer. Med. Assn.、260巻:3030頁、1988年)。この手法の主要な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAだけが不活性化されることである。
【００６２】
本明細書で用いるように、用語「RNA干渉」(RNAi)は、短い干渉核酸(siRNA又はmicroRNA(miRNA))によって媒介される配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す。用語「RNA干渉を媒介することができる因子」は、siRNA、並びに細胞中で転写されるとsiRNAをコードする、DNA及びRNAベクターを指す。用語siRNA又はmiRNAは、配列特異的なRNA干渉を媒介することができる任意の核酸分子、例えば短い干渉性RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、micro-RNA(miRNA)、短いヘアピンRNA(shRNA)、短い干渉性オリゴヌクレオチド、短い干渉性核酸、短い干渉性改変オリゴヌクレオチド、化学改変siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)、その他を包含するものとする。
【００６３】
ヘアピン二重鎖のステム長を設計するのに適する範囲には、20〜30ヌクレオチド、30〜50ヌクレオチド、50〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチド、150〜200ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜500ヌクレオチド、500〜600ヌクレオチド及び600〜700ヌクレオチドの茎長が含まれる。ヘアピン二重鎖のループ長を設計するのに適する範囲には、4〜25ヌクレオチド、25〜50ヌクレオチド、又は、ヘア二重鎖のそのステム長がかなりのものである場合それ以上のループ長が含まれる。特定の文脈では、21ヌクレオチドよりも長い二重領域を有するヘアピン構造は、ループの配列及び長さに関係なく、有効なsiRNA誘導性のサイレンシングを促進することができる。
【００６４】
本開示の複製性レトロウイルスベクターは、腫瘍細胞を含む罹患細胞の増殖又は生存を支配する鍵となる遺伝子の発現をスイッチオフ又は低下させる人工のsiRNA又はmiRNAを発現させることによって、疾患を治療するために用いることができる(Dennis、Nature、418巻:122頁2002年)。そのような標的には、DNA修復の中心的酵素であって、それなしでは細胞増殖が大幅に制限されるRad 51のような遺伝子が含まれる。他の標的には、細胞増殖を調節するシグナル伝達経路の分子の多くが含まれる(Marquez & McCaffrey Hum Gene Ther. 19巻:27頁2008年)。siRNA又はmiRNAを、本開示の同じか又は異なるレトロウイルスベクターからの細胞傷害遺伝子の発現と組み合わせることができる。適する細胞傷害遺伝子の例は、本開示のシトシンデアミナーゼ又は改変シトシンデアミナーゼを含む。
【００６５】
使用時、レトロウイルスベクター(複数可)は、腫瘍又は他の標的組織を通して複製され、増殖阻害が起こる前にウイルスは先ず宿主ゲノムに組み込まれ、その細胞の増殖が阻害される後にウイルスを作り続ける。機能的miRNA又はsiRNA配列を選択する方法は、当技術分野で公知である。有効なsiRNA又はmiRNA配列の設計での一般の重要な特徴は、通常、「標的外」影響を回避することである。しかし、細胞は最終的に死に至ると予想されるので、本開示のものなどの腫瘍細胞に非常に特異的である複製ベクターの使用については、これらの副作用はあまり重要でない。本開示のレトロウイルスベクターは、対応するタンパク質が重要な標的でない他の種からの細胞を用いて作製することができる。そのような細胞には、イヌ細胞系又はニワトリ細胞系が含まれる。或いは、効率的な一時的トランスフェクションを可能にするヒト293由来細胞又は他の細胞系への一時的トランスフェクションによって、ウイルスは作製される。この使用のために、ウイルスはIRESを利用する必要はなく、siRNA又はmiRNA配列は、ウイルスゲノム上の好都合の部位に簡単に挿入することができる。この部位は、複製レトロウイルスのエンベロープの下流及び3'LTRの上流の領域を含む。或いは、一般的に3'エンベロープ遺伝子の下流に、polIII転写単位を適当なsiRNA又はmiRNAとウイルスゲノムに挿入することができる。標的遺伝子の効率的な下方制御又は複数の遺伝子の下方制御を確保するために、いくつかの異なるsiRNA又はmiRNA配列を挿入することができる。適する配列及び標的は、当業者に公知であるソースから得ることができる。例えば、
・The MIT/ICBP siRNA Database http:(//)web.mit.edu/sirna/-「The MIT [Massachusetts Institute of Technology]/ICBP [Integrative Cancer Biology Program] siRNAデータベースは、これらの実験的に検証された試薬の目録を作り、その情報をMITコミュニティの内外の他の研究者に利用可能にする、大学規模の努力である。(Massachusetts Institute of Technology)。
【００６６】
・RNAi Central-http:(//)katahdin.cshl.org:9331/RNAi_web/scripts/main2.pl siRNA及びshRNA設計ツールを含む、RNAi資源。(Hannon Lab、Cold Spring Harbor Laboratory)
・The RNAi Web-http:(//)www.rnaiweb.com/一般資源。
【００６７】
・siDIRECT-http:(//)genomics.jp/sidirect/哺乳動物のRNA干渉のためのオンライン標的特異的siRNA設計プログラム。(University of Tokyo、Japan)。
【００６８】
・siRNA Database-様々な生物体にわたるすべての既知mRNA配列に対するsiRNA標的を含む、包括的なsiRNAデータベース。(Protein Loungeシステムズバイオロジーウェブサイトの一部)
・RNA干渉研究のためのsiRNAデータベース及び資源http:(//)www.rnainterference.org/
・siRNA Selector-http:(//)bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm.熱力学パラメータ(Khvorovaら、2003年、Schwarzら、2003年)及びDharmacon(Reynoldsら、2004年)によって開発された配列関連の決定因子に基づいてsiRNA機能を評価するために、規則のセットを用いた。特異性は、UniGeneデータベースに対してBLASTを用いて測定される。(Wistar Institute)
・siRNA Target Finder http:(//)www(.)ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html (Ambion)。
【００６９】
本開示の複製性レトロウイルスは、発現が特定の細胞型に限定され、ベクターの複製がそれらの細胞型でかなり抑制されるように、天然に存在するsiRNAの標的を発現することもできる。マウス白血病ウイルスに基づく組換え複製適合性レトロウイルスベクターの生成は、高レベルの形質導入を可能にし、したがって高効率のin vivo遺伝子送達を可能にする。複製適合性レトロウイルスベクターを用いることの一つの主要な懸念は、前に報告されているウイルスの無制御の拡散である(Donahueら、J. Exp Med. 1992年、176巻:1124〜1135頁;Calmesら、Blood 2005年、106巻: 2530〜2533頁;Seggewissら、Blood 2006年、107巻: 3865〜3867頁)。ウイルスの性質のため、ウイルスの拡散はリンパ細胞で最初に達成され、その後末梢組織に広がることができる。抗腫瘍目的のために、あるレベルで自然に複製している体内の一部の正常細胞は、造血細胞、腸管内壁の細胞及び一部の内皮細胞である。これらは、したがって、循環中のウイルスが生産的に感染することができる可能性のある部位である。一般に、これは望ましくないであろう。このような細胞のいかなる迷走感染も、天然に存在するmiRNA又はmiRNAの組合せのための標的をこれらの細胞型に含めることによって抑制することができる。免疫応答を抑制するためにmiRNA標的を用いることの若干の実行可能性が、すでに示されている。(BrownらNat Biotechnol. 2007年25巻:1457〜67頁)。これらの標的は、天然に存在するmiRNA配列への相同的一致を有する、小さなRNA配列である。これらの配列は、所望の型の細胞以外で、一般にベクター生存性へのかなり有害な結果なしで、本発明のベクターの任意の好都合な部位に挿入することができる。ベクターは、本明細書に記載のように作製及び使用することができる。
【００７０】
一実施形態では、本発明は、IRESに連結されているyCD2又はGFPなどの導入遺伝子の下流の単一コピーのmiR-142-3p標的配列(142-3pT、配列番号35)を含む、組換え複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。特異的組織又は細胞型の方法でウイルス拡散を制限するために、miR181及びmiR-223に加えて、他の組織又は細胞濃縮miRNAの標的配列をベクターに組み込むことができる。例えば、miR-133及びmiR206の発現は、筋細胞で高度に濃縮される(Kellyら、2008年Nature Medicine 14巻:11号1278〜1283頁)。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、IRESに連結されているyCD2又はGFPなどの導入遺伝子の下流の142-3pTの4コピー(配列番号36)を含む、組換え複製適合性レトロウイルスベクターを提供する。特異的組織又は細胞型の方法でウイルス拡散を制限するために、miR181及びmiR-223に加えて、他の組織又は細胞濃縮miRNAの標的配列をベクターに組み込むことができる。例えば、miR-133及びmiR206の発現は、筋細胞で高度に濃縮される。本発明は、単一の、複数の又は組合せのmiRNAの標的配列の柔軟性を提供し、それによって、in vitro及びin vivo(例えば造血細胞及び/又は筋細胞)で組織特異的及び/又は細胞特異的方法で無制御のウイルス拡散の制限を提供する(Kellyら、2008年、Nature Medicine 14巻:11号1278〜1283頁)。
【００７２】
miRNA標的は、導入遺伝子の3'側であるが3'LTRの前に、又はIRESの上流であるがエンベロープの3'末端の後に挿入することができる。一般に、標的はタンパク質コード配列に挿入されないであろう。
【００７３】
さらに他の実施形態では、異種ポリヌクレオチドは、インターロイキン、インターフェロンγなどのサイトカインを含むことができる。本開示のレトロウイルスベクターから発現させることのできるサイトカインには、それらに限定されないが、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20及びIL-21、抗CD40、CD40L、IFN-γ及びTNF-α、TNF-αの溶解性形態、リンフォトキシン-α(LT-α、別名TNF-β)、LT-β(複合ヘテロトリマーLT-α2-βで見出される)、OPGL、FasL、CD27L、CD30L、CD40L、4-1BBL、DcR3、OX40L、TNF-γ(国際公開第96/14328号)、AIM-I(国際公開第97/33899号)、エンドカイン-α(国際公開第98/07880号)、OPG、及びニュートロカイン-α(国際公開第98/18921号、OX40及び神経成長因子(NGF)、並びにFas、CD30、CD27、CD40及び4-IBBの溶解性形態、TR2(国際公開第96/34095号)、DR3(国際公開第97/33904号)、DR4(国際公開第98/32856号)、TR5(国際公開第98/30693号)、TRANK、TR9(国際公開第98/56892号)、TR10(国際公開第98/54202号)、312C2(国際公開第98/06842号)、及びTR12、並びにCD154、CD70及びCD153の溶解性形態が含まれる。一部の実施形態では、特に細胞系からのタンパク質生成のために、血管形成タンパク質が有用なことがある。そのような血管形成因子には、それらに限定されないが、神経膠腫由来増殖因子(GDGF)、血小板由来増殖因子A(PDGF-A)、血小板由来増殖因子B(PDGF-B)、胎盤増殖因子(PIGF)、胎盤増殖因子2(PIGF-2)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、血管内皮増殖因子2(VEGF-2)、血管内皮増殖因子B(VEGF-3)、血管内皮増殖因子B-186(VEGF-B186)、血管内皮増殖因子D(VEGF-D)、血管内皮増殖因子D(VEGF-D)及び血管内皮増殖因子E(VEGF-E)が含まれる。線維芽細胞増殖因子は、本開示のベクターによって送達することができ、その例には、それらに限定されないが、FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14及びFGF-15が含まれる。造血増殖因子は、本開示のベクターを用いて送達することができ、そのような増殖因子には、それらに限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)(サルグラモスチム)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)(フィルグラスチム)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、CSF-1)エリスロポイエチン(エポエチンアルファ)、幹細胞因子(SCF、c-kitリガンド、steel因子)、巨核球コロニー刺激因子、PIXY321(GMCSF/IL-3)融合タンパク質などが含まれる。
【００７４】
一般に、本開示の組換えウイルスは、核酸配列を標的細胞に移すことができる。
【００７５】
用語「調節核酸配列」は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、エンハンサーなどを総称し、それらが協働して、レシピエント細胞でコード配列の複製、転写及び翻訳を可能にする。選択されるコード配列の複製、転写及び翻訳が適当な宿主細胞において可能である限り、これらの調節配列のすべてが必ずしも存在する必要があるわけではない。当業者は、公開データベース及び資料から調節核酸配列を容易に同定することができる。さらに、当業者は、例えばin vivo、ex vivo又はin vitroで、使用目的に適用できる調節配列を同定することができる。
【００７６】
内部リボソーム侵入部位(「IRES」)は、IRESの通常は3'側のコード配列の翻訳の際、リボソームの侵入又は保持を促進する核酸セグメントを指す。一部の実施形態では、IRESはスプライス受容体/供与体部位を含むことができるが、好ましいIRESはスプライス受容体/供与体部位を欠く。通常、メッセンジャーRNAへのリボソームの侵入は、すべての真核生物mRNAの5'末端に位置するキャップを通して起こる。しかし、この普遍的規則の例外がある。一部のウイルスmRNAでのキャップの非存在は、これらのRNAの内部部位でのリボソームの侵入を許す、代替構造の存在を示唆する。今まで、それらの機能のためにIRESと命名されたこれらの構造のいくつかが、特にポリオウイルス(Pelletierら、1988年、Mol. Cell. Biol.、8巻、1103〜1112頁)及びEMCVウイルス(脳心筋炎ウイルス(Jangら、J. Virol.、1988年、62巻、2636〜2643頁))などのピコルナウイルスのものなどの、キャップのないウイルスmRNAの5'非コード領域で同定されている。本開示は、複製適合性レトロウイルスベクターとの関連でのIRESの使用を提供する。
【００７７】
用語「プロモーター領域」は本明細書で通常の意味で用いられ、DNA調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、そこで、調節配列は、RNAポリメラーゼに結合して下流(3'方向)コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。調節配列は、所望の遺伝子配列に同種又は異種であってもよい。例えば、上に述べたようなウイルス又は哺乳動物のプロモーターを含む、広範囲のプロモーターを利用することができる。
【００７８】
異種核酸配列は、一般的にウイルスLTRプロモーター-エンハンサーシグナル又は内部プロモーターの制御下にあり、レトロウイルスLTRの中に保持されたシグナルは、宿主細胞ゲノムへのベクターの効率的な組込みをもたらすことがまだできる。したがって、本開示の組換えレトロウイルスベクター、所望の配列、遺伝子及び/又は遺伝子断片は、いくつかの部位に、及び異なる調節配列の下で挿入することができる。例えば、挿入のための部位は、ウイルスエンハンサー/プロモーターに近位の部位(すなわち、5'LTR作動遺伝子座)であることができる。或いは、所望の配列は、調節配列に遠位の部位(例えば、env遺伝子の3'側のIRES配列)に挿入することができ、又は、2個以上の異種配列が存在する場合、一つの異種配列は第一の調節領域の制御下に、第二の異種配列は第二の調節領域の制御下にあってもよい。他の遠位部位にはウイルスプロモーター配列が含まれ、そこでは、SV40若しくはCMV、又は内部リボソーム侵入部位(IRES)を用いることができるので、所望の一つ又は複数の配列の発現は、プロモーター近位のシストロン、内部異種プロモーターのスプライシングによる。
【００７９】
一実施形態では、本開示のレトロウイルスゲノムは、所望の/異種のポリヌクレオチドの挿入のためにIRESの下流にクローニング部位を含むIRESを含む。一実施形態では、IRESは、レトロウイルスベクターのenv遺伝子の3'側であるが、所望の異種ポリヌクレオチドの5'側に位置する。したがって、所望のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを、IRESに作動可能に連結することができる。
【００８０】
別の実施形態では、ターゲッティングポリヌクレオチド配列は、本開示の組換えレトロウイルスベクターの一部として含まれる。ターゲッティングポリヌクレオチド配列は、ターゲッティングリガンド(例えば、ヘレグリンなどのペプチドホルモン、単鎖抗体、受容体若しくは受容体のリガンド)、組織特異的若しくは細胞型特異的調節エレメント(例えば、組織特異的若しくは細胞型特異的プロモーター若しくはエンハンサー)、又はターゲッティングリガンド及び組織特異的/細胞型特異的調節エレメントの組合せである。好ましくは、ターゲッティングリガンドはレトロウイルスのenvタンパク質に作動可能に連結され、キメラレトロウイルスenvタンパク質を形成する。ウイルスGAG、ウイルスPOL及びウイルスENVタンパク質は、任意の適するレトロウイルスに由来する(例えば、MLV又はレンチウイルス由来する)ことができる。別の実施形態では、ウイルスENVタンパク質は、非レトロウイルスに由来する(例えば、CMV又はVSV)。
【００８１】
一実施形態では、本開示の組換えレトロウイルスは、レトロウイルスベクターの組換えゲノムが、標的の非分裂細胞、標的の分裂細胞、又は細胞増殖性障害を有する標的細胞に送達されるように、ウイルスが特定の細胞型(例えば、平滑筋細胞、肝細胞、腎細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、間葉性幹細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、上皮細胞、腸の細胞、乳腺細胞、新生物細胞、グリオーマ細胞、ニューロン細胞及び当技術分野で公知である他のもの)を標的にするような方法で遺伝子改変される。
【００８２】
一実施形態では、レトロウイルスベクターは、細胞の外表面に分子を有する細胞に結合することによって細胞を標的にする。レトロウイルスを標的にするこの方法は、レトロウイルス表面のターゲッティングリガンドと相互作用する受容体又は結合分子を有する細胞又は組織をウイルスの標的にするのに役立つために、レトロウイルスの外被上でのターゲッティングリガンドの発現を利用する。ウイルスが細胞に感染した後、ウイルスは細胞内にその核酸を注入し、レトロウイルス遺伝物質は宿主細胞ゲノムと一体化することができる。
【００８３】
別の実施形態では、下でより完全に記載するように、調節エレメントを活発に利用する標的細胞でウイルスゲノムの発現及び転写を促進するために、ターゲッティングは、細胞特異的又は組織特異的調節エレメントを用いる。移されたレトロウイルス遺伝物質は、次に宿主細胞の中でタンパク質に転写、翻訳される。ターゲッティング調節エレメントは、一般的に5'及び/又は3'LTRに連結し、キメラLTRを形成する。
【００８４】
本開示のウイルスベクターに目的の異種ポリヌクレオチドを、例えば特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と一緒に挿入することによって、今や、ベクターは標的特異的である。ウイルスベクターは、例えば糖、糖脂質又はタンパク質を結合させることによって、標的特異的にすることができる。ターゲッティングは、ウイルスベクターを標的にする抗体を用いて達成することができる。当業者は、目的の核酸配列を含むウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするためにウイルスエンベロープに結合させることができるウイルスゲノム又はタンパク質に挿入することができる、特異的ポリヌクレオチド配列を知っているか、又は容易に確認することができる。
【００８５】
したがって、本開示は、一実施形態では、ターゲッティングポリペプチドに作動可能に連結されたレトロウイルスENVタンパク質を含む、キメラenvタンパク質を含む。ターゲッティングポリペプチドは、細胞特異的受容体分子、細胞特異的受容体のリガンド、細胞特異的抗原エピトープに対する抗体若しくは抗体断片、又は標的細胞と結合若しくは相互作用することができる、当技術分野で容易に同定される他の任意のリガンドであってもよい。ターゲッティングポリペプチド又は分子の例には、リンカーとしてビオチン-ストレプトアビジンを用いる二価抗体(Etienne-Julanら、J. Of General Virol.、73巻、3251〜3255頁(1992年);Rouxら、Proc. Natl. Acad. Sci USA 86巻、9079〜9083頁(1989年))、そのエンベロープにハプテンに対する単鎖抗体可変領域をコードする配列を含む組換えウイルス(Russellら、Nucleic Acids Research、21巻、1081〜1085頁(1993年))、レトロウイルスエンベロープへのペプチドホルモンリガンドのクローニング(Kasaharaら、Science、266巻、1373〜1376頁(1994年))、キメラEPO/env構築物(Kasaharaら、1994年)、低比重リポタンパク質(LDL)受容体を発現するHeLa細胞の特異的感染をもたらす、同種指向性MLVエンベロープのLDL受容体に対する単鎖抗体(Somiaら、Proc. Natl. Acad. Sci USA、92巻、7570〜7574頁(1995年))が含まれ、同様に、ALVの宿主域はインテグリンリガンドの組込みによって変化させることができ、これで、ラットグリア芽細胞腫細胞に特異的に感染するためにウイルスが種を交雑することが可能になり(Valsesia-Wittmannら、J. Virol. 68巻、4609〜4619頁(1994年))、またDornberg及び共同研究者(Chu及びDornburg、J. Virol 69巻、2659〜2663頁(1995年))は、腫瘍マーカーに対する単鎖抗体を含むエンベロープを用いて、脾臓壊死ウイルス(SNV)、トリレトロウイルスの組織特異的ターゲッティングを報告している。
【００８６】
本開示は、標的細胞に感染することができる組換えレトロウイルスを生成する方法であって、適する宿主細胞を以下のもの、すなわちウイルスgag、ウイルスpol及びウイルスenvをコードするポリヌクレオチド配列、並びに調節核酸配列に作動可能に連結された異種ポリヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトすることと、組換えウイルスを回収することとを含む方法を提供する。
【００８７】
本開示のレトロウイルス及び方法は、ビリオンを増殖及び生成するために、ヘルパーウイルス又は追加の核酸配列若しくはタンパク質を必要としない、複製適合性レトロウイルスを提供する。例えば、本開示のレトロウイルスの核酸配列は、例えば、上記のようにそれぞれ基特異的抗原及び逆転写酵素(並びに、成熟及び逆転写のために必要なインテグラーゼ及びプロテアーゼ酵素)をコードする。ウイルスのgag及びpolは、レンチウイルス、例えばHIV又は腫瘍ウイルス又はガンマレトロウイルス、例えばMoMLVに由来することができる。さらに、本開示のレトロウイルスの核酸ゲノムは、ウイルスエンベロープ(ENV)タンパク質をコードする配列を含む。env遺伝子は、任意のレトロウイルスに由来することができる。envは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にする両種性エンベロープタンパク質であってもよく、又は、マウス及びラットの細胞だけを形質導入することができる同種指向性エンベロープタンパク質であってもよい。さらに、エンベロープタンパク質と、特定の細胞型の受容体へのターゲッティングのための抗体又は特定のリガンドとの結合によって、組換えウイルスを標的にすることが望ましいことがある。上記のように、レトロウイルスベクターは、例えば糖脂質又はタンパク質を挿入することによって、標的特異的にすることができる。ターゲッティングは、特定の細胞型(例えば、特定の組織で見られる細胞型又は癌細胞型)の上の抗原をレトロウイルスベクターの標的にするための抗体を用いてしばしば達成される。当業者は、過度な実験なしで、特異的標的へのレトロウイルスベクターの送達を達成する特異的方法を知るか、又は容易に確認することができる。一実施形態では、env遺伝子は、レトロウイルス以外に由来する(例えば、CMV又はVSV)。レトロウイルス由来のenv遺伝子の例には、それらに限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMuLV)、ハーベイマウス肉腫ウイルス(HaMuSV)、マウス乳癌ウイルス(MuMTV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)及びラウス肉腫ウイルス(RSV)が含まれる。他のenv遺伝子、例えば水疱性口内炎ウイルス(VSV)(プロテインG)、サイトメガロウイルスエンベロープ(CMV)又はインフルエンザウイルス血球
凝集素(HA)を用いることもできる。
【００８８】
一実施形態では、レトロウイルスゲノムは、オンコレトロウイルス、より特定すると、哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。「由来する」は、親ポリヌクレオチド配列が、天然に存在する配列の挿入又は除去によって改変されている、野生型腫瘍ウイルスであることを意味する(例えば、IRESの挿入、目的のポリペプチド又は抑制性核酸をコードする異種ポリヌクレオチドの挿入、野生型プロモーターに代えての異なるレトロウイルス又はウイルス由来のより有効なプロモーターのスワッピング、など)。
【００８９】
欠陥があって、感染性ベクター粒子を生成するために助けを必要とする、当技術分野で標準の方法によって生成される組換えレトロウイルスと異なり、本開示は、複製適合性なレトロウイルスを提供する。
【００９０】
別の実施形態では、本開示は、調節配列を用いて標的に向けられる、レトロウイルスベクターを提供する。特異的細胞集団の遺伝子配列の発現を標的にするために、細胞特異的又は組織特異的調節配列(例えば、プロモーター)を利用することができる。本開示に適する哺乳動物及びウイルスのプロモーターは、本明細書のほかで記載される。したがって、一実施形態では、本開示は、レトロウイルスゲノムの5'末端に組織特異的プロモーターエレメントを有するレトロウイルスを提供する。一般的に、組織特異的調節エレメント/配列は、例えば新生物細胞に対する細胞特異的又は組織特異的プロモーター及びエンハンサー(例えば、腫瘍細胞特異的エンハンサー及びプロモーター)並びに誘導可能なプロモーター(例えば、テトラサイクリン)を含む、レトロウイルスゲノムのLTRのU3領域にある。
【００９１】
本開示の転写調節配列は、超抗原、サイトカイン又はケモカインをコードする遺伝子に自然に関連している、天然に存在する転写調節配列を含むこともできる。
【００９２】
一部の状況では、発現を調節することが望ましいことがある。例えば、所望の発現レベルによって異なる活性力価を有する異なるウイルスプロモーターを利用してもよい。哺乳動物の細胞では、強い転写活性を提供するために、CMV前初期プロモーターがしばしば用いられる。導入遺伝子のより低い発現レベルが所望の場合、より非力であるCMVプロモーターの改変バージョンも用いられている。造血細胞で導入遺伝子の発現が所望の場合、MLV又はMMTV由来のLTRなどのレトロウイルスプロモーターを用いることができる。用いることができる他のウイルスプロモーターには、SV40、RSV LTR、HIV-1及びHIV-2 LTR、アデノウイルスプロモーター、例えばE1A、E2A又はMLP領域由来のもの、AAV LTR、カリフラワーモザイクウイルス、HSV-TK及びトリ肉腫ウイルスが含まれる。
【００９３】
同様に、非標的組織に対する潜在毒性又は望ましくない影響を低減させるために、特異的組織又は細胞で転写を達成するために組織特異的又は組織選択的なプロモーターを用いることができる。例えば、前立腺での遺伝子発現を標的にするために、PSA、プロバシン、前立腺酸性フォスファターゼ又は前立腺特異的腺性カリクレイン(hK2)などのプロモーターを用いることができる。乳清アクセサリータンパク質(WAP)を、乳房組織発現のために用いることができる(Andresら、PNAS 84巻:1299〜1303頁、1987年)。用いることができる他のプロモーター/調節ドメインを、表1に示す。
【００９４】
「組織特異的調節エレメント」は、他の組織型ではほとんど「サイレント」のままであるが、一組織で遺伝子の転写を誘起することができる調節エレメント(例えば、プロモーター)である。しかし、組織特異的プロモーターは、それらがサイレントである組織で、検出可能な量の「バックグラウンド」又は「基底」活性を有することができることは理解される。プロモーターが標的組織で選択的に活性化される程度は、選択性比率(標的組織での活性/対照組織での活性)で表すことができる。この点に関しては、本開示の実施で有用な組織特異的プロモーターは、一般的に約5よりも大きな選択性比率を有する。好ましくは、選択性比率は、約15よりも大きい。
【００９５】
特定の適用では、本開示の組換え複製適合性レトロウイルス(RRCR)を投与した後、指定された時間に転写を活性化することが望ましいことがある。このことは、ホルモン又はサイトカインで調節可能であるプロモーターで実行することができる。例えば、特定のステロイドが生成されるか又は送られる、適用が生殖腺組織である治療適用では、アンドロゲン又はエストロゲンによって調節されるプロモーターの使用が有利であるかもしれない。ホルモンにより調節可能であるそのようなプロモーターには、MMTV、MT-1、エクジソン及びRuBiscoが含まれる。甲状腺、下垂体及び副腎ホルモンに応答性であるものなどの、ホルモンによって調節される他のプロモーターを用いることができる。用いることができるであろうサイトカイン及び炎症性タンパク質に応答性のプロモーターには、K及びTキニノーゲン(Kageyamaら、1987年)、c-fos、TNF-α、C反応性タンパク質(Arconeら、1988年)、ハプトグロビン(Olivieroら、1987年)、血清アミロイドA2、C/EBPα、IL-1、IL-6(Poli及びCortese、1989年)、補体C3(Wilsonら、1990年)、IL-8、α-1酸性糖タンパク(Prowse及びBaumann、1988年)、α-1アンチトリプシン(antitypsin)、リポタンパク質リパーゼ(Zechnerら、1988年)、アンギオテンシノーゲン(Ronら、1990年)、フィブリノーゲン、c-jun(ホルボールエステル、TNF-α、UV照射、レチノイン酸及び過酸化水素によって誘導可能)、コラゲナーゼ(ホルボールエステル及びレチノイン酸によって誘導される)、メタロチオネイン(重金属及びグルココルチコイドによって誘導可能)、ストロメライシン(ホルボールエステル、インターロイキン1及びEGFによって誘導可能)、α-2マクログロブリン並びにα-1抗キモトリプシンが含まれる。腫瘍細胞で遺伝子発現を調節するために、オステオカルシン、低酸素応答性エレメント(HRE)、MAGE-4、CEA、アルファフェトプロテイン、GRP78/BiP及びチロシナーゼなどの腫瘍特異的プロモーターを用いることもできる。
【００９６】
さらに、このプロモーターリストは網羅的又は限定的とみなすべきではなく、当業者は、本明細書で開示されるプロモーター及び方法と一緒に用いることができる他のプロモーターについて知っているであろう。
【表１】
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【００９７】
特定のプロモーターは、単一の組織型に活性が制限されないとはいえ、それらが一群の組織で活性であり、別の群では活性がより低いか又はサイレントであることができるという点で選択性を示すことができることがさらに理解される。そのようなプロモーターは「組織特異的」とも言われ、本開示での使用が企図される。例えば、様々な中枢神経系(CNS)ニューロンで活性であるプロモーターは、脳のいくつかの異なる領域のいずれかに影響することができる脳卒中による損傷からの保護において、治療的に有用であることがある。したがって、本開示で用いられる組織特異的調節エレメントは、異種タンパク質の調節への適用可能性に加えて、本レトロウイルスベクターでのターゲッティングポリヌクレオチド配列としての適用可能性を有する。
【００９８】
さらに別の実施形態では、本開示は、組換えレトロウイルス由来構築物を含むプラスミドを提供する。プラスミドは、NIH 3T3又は他の組織培養細胞などの標的細胞又は細胞培養に直接導入することができる。生じた細胞は、培地にレトロウイルスベクターを放出する。
【００９９】
本開示は、5'から3'方向に、転写を開始するために有用なプロモーター又は調節領域;psiパッケージングシグナル;gagコード核酸配列、polコード核酸配列;envコード核酸配列;内部リボソーム侵入部位核酸配列;マーカー、治療用又は診断用のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド;及びLTR核酸配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。本明細書のほかで記載のように、及び以下の通りに、本開示のポリヌクレオチド構築物(例えば、組換え複製適合性レトロウイルスポリヌクレオチド)の様々なセグメントが、部分的には所望の宿主細胞、発現のタイミング又は量、及び異種ポリヌクレオチドに依存して遺伝子工学的に作製される。本開示の複製適合性レトロウイルス構築物は、当業者が個々に改変することができるいくつかのドメインに分割することができる。
【０１００】
例えば、プロモーターは、配列番号19、20又は22のヌクレオチド1位からヌクレオチド約582位までに記載の配列を有するCMVプロモーターを含むことができ、また、改変されたプロモーターが転写を誘導及び開始することができる限り、一つ又は複数の(例えば、2〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜50、50〜100個又はそれ以上の)核酸塩基に改変を含むことができる。一実施形態では、プロモーター又は調節領域は、CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドを含む。CMV-R-U5ドメインは、MLV R-U5領域に対し、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターを含む。一実施形態では、CMV-R-U5ドメインポリヌクレオチドは、配列番号19、20若しくは22のヌクレオチド約1位からヌクレオチド約1202位までに記載の配列、又は配列番号19、20若しくは22に記載の配列に少なくとも95%同一である配列を含み、前記ポリヌクレオチドは、作動可能にそれに連結された核酸分子の転写を促進する。ポリヌクレオチドのgagドメインは、任意数のレトロウイルスに由来することができるが、一般的には、オンコレトロウイルス、より詳細には哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。一実施形態では、gagドメインは、ヌクレオチド番号約1203位からヌクレオチド約2819位までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%(小数点以下一桁(10th)に丸めた)の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのpolドメインは、任意数のレトロウイルスに由来することができるが、一般的には、オンコレトロウイルス、より詳細には哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来する。一実施形態では、polドメインは、ヌクレオチド番号約2820からヌクレオチド約6358までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.9%(小数点以下一桁(10th)に丸めた)の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのenvドメインは、任意数のレトロウイルスに由来することができるが、一般的には、オンコレトロウイルス又はガンマレトロウイルス、より詳細には哺乳動物のオンコレトロウイルス又はガンマレトロウイルスに由来する。一部の実施形態では、envコードドメインは、両種性envドメインを含む。一実施形態では、envドメインは、ヌクレオチド番号約6359からヌクレオチド約8323までの配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%、99%若しくは99.8%(小数点以下一桁(10th)に丸めた)の同一性を有する配列を含む。ポリヌクレオチドのIRESドメインは、任意数の内部リボソーム侵入部位から得ることができる。一実施形態では、IRESは脳心筋炎ウイルスに由来する。一実施形態では、IRESドメインは、ヌクレオチド番号約8327からヌクレオチド約8876までの配列、又は、そのドメインがリボソームの侵入を可能にする限り、それに対して少なくとも95%、98%若しくは99%(小数点以下一桁(10th)に丸めた)の同一性を有する配列を含む。異種ドメインは、本開示のシトシンデアミナーゼを含むことができる。一実施形態では、CDポリヌクレオチドは、ヒトコドン最適化された配列を含む。さらに別の実施形態では、CDポリヌクレオチドは、シトシンデアミナーゼを有する突然変異体ポリペプチドをコードし、そこにおいて、突然変異は融点(Tm)を10℃上昇させる熱安定化の増大を付与し、より広い温度範囲での持続的反応速度活性及びタンパク質の蓄積レベルの増加を可能にする。一実施形態では、シト��ンデアミナーゼは、配列番号19又は22のヌクレオチド番号約8877から約9353までに記載の配列を含む。異種ドメインには、ポリプリンに富むドメインが続くことができる。3'LTRは、任意数のレトロウイルス、一般的にオンコレトロウイルス、好ましくは哺乳動物のオンコレトロウイルスに由来することができる。一実施形態では、3'LTRは、U3-R-U5ドメインを含む。さらに別の実施形態では、LTRは、配列番号19若しくは22のヌクレオチド約9405位から約9998位までに記載の配列、又はそれに対して少なくとも95%、98%又は99.5%(小数点以下一桁に四捨五入)同一である配列を含む。
【０１０１】
本開示は、5'から3'方向に、CMV-R-U5、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期プロモーターとMLV R-U5領域との融合体;PBS、逆転写酵素のためのプライマー結合部位;5'スプライス部位;Ψパッケージングシグナル;gag、MLV群特異抗原のためのORF;pol、MLVポリメラーゼポリプロテインのためのORF;3'スプライス部位;4070A env、MLV株4070Aのエンベロープタンパク質のためのORF;IRES、脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム侵入部位;改変シトシンデアミナーゼ(熱安定化及びコドン最適化された);PPT、ポリプリン領域;並びにU3-R-U5、MLV長末端反復配列を含む組換えレトロウイルスベクターも提供する。この構造は、図3でさらに表される。
【０１０２】
本開示は、配列番号19、20又は22に記載の配列を含むレトロウイルスベクターも提供する。
【０１０３】
レトロウイルスベクターは、いくつかの細胞増殖性疾患及び障害を含む広範囲の疾患及び障害を治療するために用いることができる(例えば、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第4,405,712号及び第4,650,764号;Friedmann、1989年、Science、244巻:1275〜1281頁;Mulligan、1993年、Science、260巻:926〜932頁、R. Crystal、1995年、Science、270巻:404〜410頁を参照、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、The Development of Human Gene Therapy、Theodore Friedmann編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、1999年。ISBN 0-87969-528-5も参照)。
【０１０４】
本開示は、細胞増殖性障害の治療のための遺伝子治療も提供する。そのような療法は、増殖性障害を有する被験体の細胞への、適当な治療的ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス、リボザイム、自殺遺伝子、siRNA)の導入によって、その治療効果を達成するであろう。ポリヌクレオチド構築物の送達は、特にそれがMLVに基づく場合、分裂細胞に感染することができる本開示の組換えレトロウイルスベクターを用いて達成することができる。
【０１０５】
さらに、本明細書に記載の治療法(例えば、遺伝子治療又は遺伝子送達法)は、in vivo又はex vivoで実施することができる。遺伝子治療の前に、例えば外科的に又は放射線によって、腫瘍の大半を除去することが好ましいことがある。一部の態様では、レトロウイルス療法の前後に、手術、化学療法又は放射線療法がきてもよい。
【０１０６】
したがって、本開示は、非分裂細胞、分裂細胞又は新生物細胞に感染することができる、組換えレトロウイルスを提供し、そこにおいて、組換えレトロウイルスは、ウイルスGAG;ウイルスPOL;ウイルスENV;IRESに作動可能に連結された異種核酸;並びにパッケージング、逆転写及び組込みのために必要なシス作用性核酸配列を含む。組換えレトロウイルスは、HIVなどのレンチウイルスであってもよく、又は腫瘍ウイルスであってもよい。組換えレトロウイルスを生成する方法について上に記載のように、本開示の組換えレトロウイルスは、VPR、VIF、NEF、VPX、TAT、REV及びVPUタンパク質の少なくとも一つをさらに含むことができる。特定の理論に束縛されることを欲しないが、これらの遺伝子/タンパク質生成物の一つ又は複数が、生成される組換えレトロウイルス(例えば、NEF)のウイルス力価の増加に重要であるか、又はビリオンの感染及びパッケージングに必要かもしれないと考えられている。
【０１０７】
本開示は、特定の核酸(例えば、異種配列)の発現を提供するために、標的細胞への核酸移入の方法も提供する。したがって、別の実施形態では、本開示は、標的細胞での異種核酸の導入及び発現のための方法であって、標的細胞を本開示の組換えウイルスに感染させ、標的細胞で異種核酸を発現させることを含む方法を提供する。上記のように、標的細胞は、それらがレトロウイルスによる感染が可能である限り、当業者によって認識される分裂細胞型、非分裂細胞型、新生物細胞型、不死化細胞型、改変細胞型及び他の細胞型を含む、任意の細胞型であってもよい。
【０１０８】
本開示の方法による核酸配列(例えば、異種核酸配列)の導入によって細胞で遺伝子の発現を調節することが望ましいことがあり、そこにおいて、核酸配列は、例えばアンチセンス又はリボザイム分子を生成する。用語「調節する」は、それが過剰発現されるときは遺伝子の発現の抑制を、又はそれが過小発現されるときは発現の増強を想定する。細胞増殖性障害が遺伝子の発現に関連する場合、翻訳レベルで遺伝子の発現に干渉する核酸配列を用いることができる。この手法は、アンチセンス核酸若しくはトリプレックス剤でそのmRNAをマスキングすることによって、又はリボザイムでそれを切断することによって、特異的mRNAの転写又は翻訳をブロックするために、例えばアンチセンス核酸、リボザイム又はトリプレックス剤を利用する。
【０１０９】
生体応答調節因子(例えば、サイトカイン)をコードする核酸を細胞又は被験体に導入することが望ましいことがある。このカテゴリーには、「インターロイキン」と分類されるいくつかのサイトカインをコードする核酸を含む、免疫賦活剤が含まれる。これらには、例えば、インターロイキン1〜15、並びに本明細書のほかで記載される他の応答調節剤及び因子が含まれる。必ずしも同じ機構によって働くわけではないが、インターフェロン、特にガンマインターフェロン、腫瘍壊死因子(TNF)及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)もこのカテゴリーに含まれる。他のポリペプチドには、例えば血管形成因子及び抗血管形成因子が含まれる。酵素欠乏症又は免疫欠乏を治療するために、そのような核酸を骨髄細胞又はマクロファージに送達することが望ましいことがある。増殖因子、毒性ペプチド、リガンド、受容体又は他の生理的に重要なタンパク質をコードする核酸を、特異的標的細胞に導入することもできる。
【０１１０】
本開示は、薬剤特異的ターゲッティング及び効果を促進する異種ポリヌクレオチドの送達のために用いることができる。例えば、EGF受容体ファミリーのメンバーHER2(例えば配列番号23及び24を参照)は、薬剤トラスツズマブ(Herceptin(商標)、Genentech)の結合の標的である。トラスツズマブは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)の媒介物質である。活性は、1+及び非発現細胞よりも、免疫組織化学により2+及び3+レベルの過剰発現のHER2発現細胞を優先的に標的にする(Herceptin処方情報、Crommelin 2002年)。低HER2腫瘍におけるHER2又は末端切断HER2(細胞外及び膜貫通ドメインだけを発現する)を発現するベクターの導入によるHER2の発現の増強は、ADCCの最適な誘発を促進すること、及び臨床使用で観察されるHER2抵抗性の急速な発達を克服することができる。
【０１１１】
yCD2(配列番号19の約8877位から9353位までを含む)によるHER2の細胞内ドメインの置換は、HER2の細胞表面発現及びyCD2のサイトゾル局在化を可能にする。HER2の細胞外ドメイン(ECD)及び膜貫通ドメイン(TM)(配列番号23の約175位〜2200位の約2026bp)は、PCRによって増幅(Yamamotoら、Nature 319巻:230〜234頁(1986年);Chenら、Canc. Res.、58巻:1965〜1971頁、1998頁)するか、又は化学的に合成(BioBasic Inc.、Markham、Ontario, Canada)して、ベクターpAC3-yCD2(配列番号19)のIRESとyCD2遺伝子との間に挿入することができる(例えば、配列番号19のヌクレオチド約8876位〜8877位)。或いは、yCD遺伝子を切り出し、HER2ポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドで置換することができる。ECDのHerceptin結合ドメインIV及びTMドメイン(1910〜2200位の約290bp)だけを有するさらなる末端切断型HER2を上のように増幅するか又は化学的に合成して、用いることができる(Landgraf 2007年;Garrettら、J. of Immunol.、178巻:7120〜7131頁、2007年)。ドメインIV及びTMに融合されている、本来のシグナルペプチドを有するこの末端切断型(175〜237位の約69bp)のさらなる改変体を上のように化学的に合成し、用いることができる。生じたウイルスは、トラスツズマブと、又はトラスツズマブ及び5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。
【０１１２】
或いは、HER2及び上記の改変体は、異なるENV遺伝子又は他の適当な表面タンパク質を含む別々のベクターで発現させることができる。このベクターは、目的のエンベロープ及び遺伝子をコードする複製適合性(Loggら、J.Mol Biol. 369巻:1214頁2007年)又は複製不能な「第一世代」レトロウイルスベクターであることができる(Emiら、J.Virol 65巻:1202頁1991年)。後者の場合、既存のウイルス感染は、任意の既感染細胞からの「複製不能」ベクターの感染性拡散を可能にする、相補的gag及びpolを提供する。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu 2000年、Baumら、Mol. Therapy、13巻(6号):1050〜1063頁、2006年)。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号19のGAG及びPOL及びyCD2遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-gの異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはHER2、HER2 ECDTM、HER2 ECDIVTM若しくはHER2 SECDIVTMに作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【０１１３】
VSVG偽型ウイルス及び両種性レトロウイルスによる細胞の混合感染は、他のエンベロープタンパク質によるキャプシドに包まれた一ウイルスのゲノムを運ぶ、後代ビリオンの生成をもたらす。同じことは、レトロウイルス粒子を偽型化する他のエンベロープについても言える。例えば、上のように導かれたレトロウイルスによる感染は、感染細胞でyCD2及びHER2(又は変異体)をコードすることができる後代ビリオンの生成をもたらす。生じたウイルスは、トラスツズマブと、又はトラスツズマブ及び5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。
【０１１４】
近年では、ガンマレトロウイルス、XMRVがヒトの前立腺癌に関連付けられ、そのウイルスは前立腺組織での複製に強い好みを示す(R.Schlabergら、PNAS 106巻:16351〜16356頁2009年)。ウイルスは、異種指向性MLVに非常に類似して見える。本発明の一実施形態では、治療的遺伝子(シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、他のプロドラッグ活性化遺伝子、インターフェロン、IL-2、IL-12、他のサイトカイン、p53、他の癌抑制遺伝子、抗癌性miRNAなど)、並びにXMRV gag及びgag-pol機能によって相補することができるエンベロープ遺伝子、例えば両種性エンベロープ、GALVエンベロープ、VSVgタンパク質エンベロープ又は当業者に公知である他のエンベロープの両方を運ぶ複製不能レトロウイルスベクターが提供される。複製不能ベクターポリヌクレオチドは、非ウイルス性若しくは物理的送達系;アデノウイルスベクターなどの異種ウイルス性送達系の一つを用いてDNA又はRNA分子として、又は製造されたレトロウイルス粒子として、患者又は動物の前立腺癌に送達される。送達されると、複製不能ベクターは、XMRVによる相補によって拡散され、XMRV相補が利用できない場合には、XMRV感染の境界に到達するまで、隣接細胞の感染が起こる。その後、治療的遺伝子は、XMRV感染領域だけでその影響を及ぼすことができる(例えばプロドラッグの投与後)。本発明の複製可能なレトロウイルスベクターを用いて、同じ救出効果を達成することができる。この戦略(治療的遺伝子を有する相補的複製不能ベクター)は、任意のレトロウイルス疾患(HIV感染、HTLV1感染、他の癌関連レトロウイルス)で、又は任意のウイルス性若しくはウイルス関連の疾患(子宮頸癌でのHPV感染並びにHPV E6及びE7の発現、EBV関連のリンパ腫又は癌腫など)で用いることができる。
【０１１５】
トラスツズマブ抵抗性の発達の別の態様は、トラスツズマブの活性のために必要な細胞内シグナル伝達への干渉に関する。抵抗性細胞はPTENの減少及びp27kip1の発現低下を示す(Fujita、Brit J. Cancer、94巻:247頁、2006年;Luら、Journal of the National Cancer Institute、93巻(24号): 1852〜1857頁、2001年;Kuteら、Cytometry Part A 57A:86〜93頁、2004年)。例えば、PTENをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)は、組換えで生成するか又は化学的に合成し(BioBasic Inc.、Markham、Canada)、ベクターpAC3-yCD2(配列番号19若しくは22)のyCD2ポリヌクレオチドの後に直接に、又は前述の通りにリンカー配列で、又はyCD2の置換として作動可能に挿入することができる。さらなる例では、PTENをコードするポリヌクレオチドを上のように合成し、前述の通りIRESとyCD2配列との間に、又はリンカーで挿入することができる。
【０１１６】
或いは、PTENは、異なるENV遺伝子又は他の適当な表面タンパク質を含む別々のベクターで発現させることができる。このベクターは、目的ののエンベロープ及び遺伝子をコードする、複製適合性(Loggら、J.Mol Biol. 369巻:1214頁2007年)又は複製不能な「第一世代の」レトロウイルスベクターであることができる(Emiら、J.Virol 65巻:1202頁1991年)。後者の場合、既存のウイルス感染は、任意の既感染細胞からの「複製不能」ベクターの感染性拡散を可能にする、相補的gag及びpolを提供する。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu、Rev Med Virol. 2000年、Baum、Mol. Ther. 13巻(6号):1050〜1063頁、2006年)。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号19のGAG及びPOL及びyCD2遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-gの異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはPTENに作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【０１１７】
VSVG偽型化ウイルス及び両種性レトロウイルスによる細胞の混合感染は、他のエンベロープタンパク質によるキャプシドに包まれた一ウイルスのゲノムを運ぶ、後代ビリオンの生成をもたらす(Emi、1991年)。同じことは、レトロウイルス粒子を偽型化する他のエンベロープについても言える。例えば、上のように導かれたレトロウイルスによる感染は、感染細胞でyCD2及びPTEN(又は変異体)又はPTEN単独をコードすることができる後代ビリオンの生成をもたらす。生じたウイルスは、トラスツズマブと、又はトラスツズマブ及び5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。
【０１１８】
同様に、p27kip1をコードするポリヌクレオチド(配列番号28及び27)を化学的に合成し(BioBasic Inc.、Markham、Canada)、ベクターpAC3-yCD2(配列番号19)のyCD2遺伝子の後に直接に、又はリンカー配列で作動可能に挿入することができる。さらなる例では、p27kip1をコードするポリヌクレオチドを上のように合成し、前述の通りIRESとyCD2配列との間に、若しくはリンカーで、又はyCD2遺伝子の代わりに挿入することができる。
【０１１９】
或いは、p27kip1は、異なるENV遺伝子又は他の適当な表面タンパク質を含む別々のベクターで発現させることができる。このベクターは、目的のエンベロープ及び遺伝子をコードする、複製適合性(CR. Loggら、J.Mol Biol. 369巻:1214頁2007年)又は複製不能な「第一世代の」レトロウイルスベクターであることができる(Emiら、J.Virol 65巻:1202頁1991年)。後者の場合、既存のウイルス感染は、任意の既感染細胞からの「複製不能」ベクターの感染性拡散を可能にする、相補的gag及びpolを提供する。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu 2000年、Baum 2006年、上記)。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号19のGAG及びPOL及びyCD2遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-gの異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはp27kip1に作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【０１２０】
VSVG偽型化ウイルス及び両種性レトロウイルスによる細胞の混合感染は、他のエンベロープタンパク質によるキャプシドに包まれた一ウイルスのゲノムを運ぶ、後代ビリオンの生成をもたらす(Emi、1991年)。同じことは、レトロウイルス粒子を偽型化する他のエンベロープについても言える。例えば、配列番号19及び22の両方から上のように導かれたレトロウイルスによる感染は、感染細胞でyCD2及びp27kip1(又は変異体)をコードすることができる後代ビリオンの生成をもたらす。生じたウイルスは、トラスツズマブと、又はトラスツズマブ及び5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。
【０１２１】
別の例では、CD20は、薬剤リツキシマブ(Rituxan(商標)、Genentech)の結合の標的である。リツキシマブは、補体依存性細胞傷害(CDC)及びADCCの媒介物質である。フローサイトメトリーによるより高い平均蛍光強度を有する細胞は、リツキシマブに対して増強された感度を示す(van Meertenら、Clin Cancer Res 2006年;12巻(13号):4027〜4035頁、2006年)。低CD20のB細胞におけるCD20を発現するベクターの導入によるCD20の発現の増強は、ADCCの最適な誘発を促進することができる。
【０１２２】
例えば、CD20をコードするポリヌクレオチド(配列番号30及び29)を化学的に合成し(BioBasic Inc.、Markham、Canada)、ベクターpAC3-yCD2(-2)(配列番号19若しくは22)のyCD2遺伝子の後に直接に、又は前述の通りにリンカー配列で、又はyCD2遺伝子の置換として作動可能に挿入することができる。さらなる例では、CD20をコードするポリヌクレオチドを上のように合成し、前述の通りIRESとyCD2配列との間に、又はリンカーで挿入することができる。さらなる代替形態として、Psi1及びNot1消化によるCD遺伝子の切除の後、CD20配列をpAC3-yCD2ベクターに挿入することができる。
【０１２３】
さらなる例では、CD20をコードするポリヌクレオチド(配列番号30及び29)を化学的に合成し(BioBasic Inc.、Markham、Canada)、非両種性ENV遺伝子又は他の適当な表面タンパク質を含むベクターに挿入することができる(Tedderら、PNAS、85巻:208〜212頁、1988年)。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu、2000年、Baum、2006年)。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号19のGAG及びPOL及びyCD2遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-gの異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはCD20に作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【０１２４】
VSVG偽型化ウイルス及び両種性レトロウイルスによる細胞の混合感染は、他のエンベロープタンパク質によるキャプシドに包まれた一ウイルスのゲノムを運ぶ、後代ビリオンの生成をもたらす(Emi、1991年)。同じことは、レトロウイルス粒子を偽型化する他のエンベロープについても言える。例えば、配列番号19又は22の両方から上のように導かれたレトロウイルスによる感染は、感染細胞でyCD2及びCD20をコードすることができる後代ビリオンの生成をもたらす。生じたウイルスは、Rituxan及び/又は5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。同様に、CD20マーカーだけをコードするベクターによる腫瘍の感染は、Rituxanの使用によって腫瘍を治療できるようにし得る。
【０１２５】
ピリミジン同化に関与する酵素及びコファクターのレベルは、制限的であってもよい。OPRT、チミジンキナーゼ(TK)、ウリジンモノリン酸キナーゼ及びピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの発現は、感受性系統と比較して5-FU抵抗性癌細胞で低い(Wangら、Cancer Res.、64巻:8167〜8176頁、2004年)。大きな集団解析は、酵素レベルと疾患予後との相関関係を示す(Fukuiら、Int'l. J. OF Mol. Med.、22巻:709〜716頁、2008年)。フルオロピリミジン薬剤の活性、したがって治療指数を高めるために、CD及び他のピリミジン同化酵素(PAE)の同時発現を活用することができる。
【０１２６】
ベクターを含むyCD2/PAEの遺伝的安定性をさらに増加させるために(例えば図5参照)、酵素をコードする遺伝子を、配列全体を通してランダムな突然変異で化学的に合成することができる。これらの突然変異は本質的にランダムであり得るか、各アミノ酸について揺らぎの位置の突然変異だけからなることができる。突然変異配列のライブラリーは、プラスミドのライブラリーを作製するために前に配列番号11及び13について記載したように、yCD2遺伝子の下流に又はそれに代えて挿入され、次に、293T細胞又は同等物の一時的トランスフェクションによって感染性粒子のライブラリーを生成するためにそれを用いることができる。融合ポリペプチドをコードするレトロウイルスに感受性細胞を感染させ、適当な化学物質で選択することができる。
【０１２７】
DNAシャフリング又は「分子育種」は、遺伝情報のシャフリングを可能にし、所望の特性を有する組換え体をもたらす。DNAシャフリングを用いて、異なるタンパク質及び酵素が改善された(Stemmer 1994年、Proc Natl Acad Sci USA 91巻(22号): 10747〜51頁;Stemmer 1994年、Nature 370巻(6488号):389〜91頁)。遺伝子組換えは、多くのウイルスの進化を推進する主要な力である。レトロウイルスでは、二つの同時パッケージングされたレトロウイルスゲノムの間の組換えが、1複製サイクルにつき40%の高い率で起こることができる。各複製サイクルでの高率の組換えは、遺伝情報の速やかなシャフリングを可能にし、短時間の間に新型の突然変異及び表現型を有する組換え体をもたらす。例えば、六つのマウス白血病ウイルス由来の組換え同種指向性エンベロープ配列のライブラリーを含むレトロウイルスの分子育種は、新しい向性を有するウイルスクローンをもたらした。同法を用いて、改善された安定性及びプロセシング収率を有するいくつかのウイルスクローンが選択された(Soongら、2000年Nat Genet 25巻(4号):436〜9頁;Powellら、2000年Nat Biotechnol 18巻(12号):1279〜82頁)。
【０１２８】
本発明に組み込まれるポリヌクレオチド配列は時々不安定であり、ウイルスゲノムからのポリヌクレオチド配列の経時的欠失をもたらす。これの基礎はあまり理解されていないが、それは明らかに配列依存性である。異種ポリヌクレオチド配列の中で最適な組換えを獲得した組換えウイルスクローンを選択するための本発明を用いる分子育種が、より大きなベクター安定性を有するウイルスクローンを選択するために使用される。
【０１２９】
例えば、HSV-TKコード配列は、一部の状況では望ましいほど安定ではない。大きなベクター安定性を有する組換えベクターを選択するために、HSV-TKの変質されたコード配列のプールを含む組換えレトロウイルスベクターの分子育種が実施される。ランダムに突然変異を起こすヘルペスチミジンキナーゼ(TK)が、化学的に合成される(Bio Basic Inc、Markham, Canada)。合成配列は、配列番号19のyCD2配列の3'側に挿入されるか、又はCD2遺伝子の切除後にpAC3-yCD2ベクター骨格に単独で挿入される。レトロウイルスベクター混合物は、前述の通りにパッケージングされる。マウス線維芽細胞LMTK細胞又はヒト143Tk細胞にベクターを感染させ、HAT培地中でTK活性について選択する(Hillerら、Mol. Cell Biol. 8巻(8号):3298〜3302頁(1988年)。HAT培地で同じく選択される新しいLMTK細胞/143Tk細胞への抵抗性細胞の上清の連続継代は、TKを発現する安定ベクターの選択をもたらす。突然変異分析のための標準のPCRに基づく技術によってTK+抵抗性細胞を単離し、TK配列を回収することができる(Cowellら、CDNA Library Protocols、Humana Press発行、1996年)。この方法では、レトロウイルスベクター構築物の機能的タンパク質の発現及びゲノム安定性の両方について配列が選択される。類似した戦略は、UPRT(配列番号11、13)、OPRT(配列番号15、17)(Olahら、Cancer Res. 40巻:2869〜2875頁、1980年及びSuttle、Somatic Cell & Mol. Genet.、15巻(5号):435〜443頁、1989年)及び関心の他の遺伝子のために使用されてもよい。さらに、連続継代をIRES-挿入断片遺伝子全域にわたってPCRによって完全長挿入断片についてスクリーニングした後、選択不能遺伝子及びゲノムDNAのために連続継代戦略を用いることができる(図5を参照)。完全長挿入断片を精製し、クローニングでウイルスベクターに戻し、次に再試験することができる。最も安定な遺伝子を選択するために、この手順を数サイクル実施することができる。この戦略は、腫瘍の有無に関係なく動物で、さらに患者組織でも継代のために用いることもできる。
【０１３０】
或いは、OPRT、UPRT、TK又は他のPAEは、異なるenv遺伝子又は他の適当な表面糖タンパク質を含む別々のベクターで発現させることができる。このベクターは、目的のエンベロープ及び遺伝子をコードする、複製適合性(Loggら、J.Mol Biol. 369巻:1214頁2007年)又は複製不能な「第一世代の」レトロウイルスベクターであることができる(Emiら、J.Virol 65巻:1202頁1991年)。後者の場合、既存のウイルス感染は、任意の既感染細胞からの「複製不能」ベクターの感染性拡散を可能にする、相補的gag及びpolを提供する。代わりのENV及び糖タンパク質には、ヒト細胞に感染することができる異種指向性及び多種指向性のENV並びに糖タンパク質、例えばMLVのNZB株由来のENV配列並びにMCF、VSV、GALV及び他のウイルス由来の糖タンパク質が含まれる(Palu 2000年、Baum 2006年、上記)。例えば、ポリヌクレオチドは、GAG及びPOL遺伝子が欠失し、ENVはNZB MLV又はVSV-g由来の異種指向性ENVドメインに対応し、IRES又はRSVなどのプロモーターはOPRT、UPRT、TK又は他のPAE遺伝子に作動可能に直接連結された配列を含むことができる。
【０１３１】
VSV-g偽型化ウイルス及び両種性レトロウイルスによる細胞の混合感染は、他のエンベロープタンパク質によるキャプシドに包まれた一ウイルスのゲノムを運ぶ、後代ビリオンの生成をもたらす(Emiら、J. Virol. 65巻:1202頁、1991年)。同じことは、レトロウイルス粒子を偽型化する他のエンベロープについても言える。例えば、配列番号19及び22の両方から上のように導かれたレトロウイルスによる感染は、感染細胞でyCD2及びOPRTをコードすることができる後代ビリオンの生成をもたらす。生じたウイルスは、5-FCと併用して被験体で細胞増殖性障害を治療するために用いることができる。
【０１３２】
本開示の組換えレトロウイルスは、例えばニューロン障害の治療のために用いることができ、外因性遺伝子、例えば、受容体をコードする遺伝子又はリガンドをコードする遺伝子を任意選択で含むことができる。そのような受容体には、上に述べたように、ドーパミン、GABA、アドレナリン、ノルアドレナリン、セロトニン、グルタミン酸、アセチルコリン及び他の神経ペプチドに応答する受容体が含まれる。ニューロン障害で治療効果を提供することができるリガンドの例には、ドーパミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、γアミノ酪酸及びセロトニンが含まれる。感染した供与体細胞による分泌の後の必要とされるリガンドの拡散及び取込みは、目的の神経細胞がそのような遺伝子産物の生成に欠陥のある障害で有益となろう。神経栄養因子、例えば神経成長因子(NGF)を分泌するように遺伝子改変された細胞は、治療なしでは死に至るかもしれないコリン作動性ニューロンの変性を予防するために用いられるかもしれない。
【０１３３】
或いは、細胞は、基底神経節の障害、例えばパーキンソン病の被験体に移植され、ドーパミンの前駆体L-DOPAをコードする外因性遺伝子を含むように改変することができる。パーキンソン病は、それらの主要な標的器官として基底神経節を有する、中脳黒質中のドーパミンニューロンの減少を特徴とする。
【０１３４】
本開示の方法によって同様に治療することができる他のニューロン障害には、アルツハイマー病、ハンチントン病、脳卒中によるニューロン損傷及び脊髄損傷が含まれる。アルツハイマー病は、基底前脳のコリン作動性ニューロンの変性を特徴とする。これらのニューロンの神経伝達物質はアセチルコリンであり、それはそれらの生存のために必要である。これらのニューロンの生存を促進するであろう因子のための外因性遺伝子を含んでいる、本開示の組換えレトロウイルスに感染したコリン作動性細胞の移植は、記載のように本開示の方法によって達成することができる。脳卒中の後に、海馬のCA1の細胞の選択的減少、並びに皮質細胞の減少があり、それらは、これらの患者で認知機能及び記憶喪失の基礎をなすことができる。CA1細胞死を担う分子が同定されると、それらはこの開示の方法によって抑制することができる。例えば、アンチセンス配列、又はアンタゴニストをコードする遺伝子をニューロン細胞に移し、脳の海馬領域に移植することができる。
【０１３５】
タンパク質生成物の欠損による疾患については、遺伝子導入は、補充療法のために、並びにアンチセンス突然変異を用いて疾患の動物モデルを作製するために、正常な遺伝子を患部組織に導入することができよう。例えば、筋肉又は肝細胞の感染のために、第IX因子をコードする核酸をレトロウイルスに挿入することが望ましいことがある。
【０１３６】
本開示は、細胞増殖性又は免疫性の障害の治療のための遺伝子治療も提供する。そのような療法は、アンチセンス又はドミナントネガティブをコードするポリヌクレオチドを、増殖性障害を有する細胞に導入することによってその治療効果を達成するであろうが、そこにおいて、ポリヌクレオチドは、細胞増殖性障害に関連する遺伝子に結合して、その翻訳又は発現を阻止する。細胞増殖性障害を治療又は調節するのに有用な異種核酸(例えば、アンチセンスポリヌクレオチド)の送達は、本開示の組換えレトロウイルスベクターを用いて達成することができる。別の実施形態では、細胞増殖性障害は、本開示のCDポリヌクレオチドを導入し、ポリヌクレオチドを発現させてシトシンデアミナーゼ活性を含むポリペプチドを生成し、細胞を、5-FUの細胞毒性量を生成する量及び時間で、5-フルオロシトシンと接触させることによって治療される。
【０１３７】
完全寛解から一時的な寛解、及び再発が予想される長期生存までの、様々な程度の奏効を有するいくつかの化学療法剤が現在市販されている。市販されている癌治療薬のいくつかは、腫瘍の血管形成特性を標的にする。本組成物は腫瘍の血管形成を標的にし、腫瘍又は癌への血液供給及び栄養を削減し、それによって腫瘍を減少させて被験体の生命を長くすることを目指す。VEGFは、腫瘍増殖で一役担うことが知られている血管形成因子である。したがって、VEGFのアンタゴニストは、抗癌剤として開発されている。
【０１３８】
ヒトVEGFは、正常及び悪性の血管系で新血管形成を媒介する。それは、ほとんどの悪性腫瘍で過剰発現され、高レベルは、多くで転移及び不良予後のより大きな危険と相関している。VEGFが血管形成のin vitroモデルでその受容体と相互作用する場合、内皮細胞増殖及び新しい血管形成が起こる。動物モデルでは、VEGFは、血管内皮細胞増殖/移動を誘発し、新しく形成された血管の生存を持続させ、血管透過性を増強することが証明されている。
【０１３９】
VEGFアンタゴニスト剤は、VEGFシグナル伝達経路を標的にするか、又は負に調節するものである。例には、VEGF阻害剤(例えば、VEGFに例えば結合することにより(例えば、ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標))若しくはラニビズマブ(LUCENTIS(登録商標))などの抗VEGF抗体、又はペガプタニブ、NEOVASTAT(登録商標)、AE-941、VEGF Trap及びPI-88などの他の阻害剤)VEGFを直接に阻害する剤(例えば、VEGF-A、-B、-C若しくは-D))、VEGF発現の調節因子(例えば、INGN-241、経口テトラチオモリブデート、2-メトキシエストラジオール、2-メトキシエストラジオールナノクリスタル分散剤、ベバシラニブナトリウム、PTC-299、Veglin)、VEGF受容体の阻害剤(例えば、KDR若しくはVEGF受容体III(Flt4)、例えば抗KDR抗体、VEGFR2抗体、例えばCDP-791、IMC-1121B、VEGFR2遮断薬、例えばCT-322)、VEGFR発現の調節因子(例えば、VEGFR1発現調節因子Sirna-027)又はVEGF受容体の下流シグナル伝達の阻害剤が含まれる。本明細書に記載される一部の態様では、VEGFアンタゴニスト剤は、ベバシズマブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ソラフェニブ、スニチニブ、AE-941、VEGF Trap、パゾパニブ、バンデタニブ、バタラニブ、セジラニブ、フェンレチニド、スクアラミン、INGN-241、経口テトラチオモリブデート、テトラチオモリブデート、Panzem NCD、2-メトキシエストラジオール、AEE-788、AG-013958、ベバシラニブナトリウム、AMG-706、アキシチニブ、BIBF-1120、CDP-791、CP-547632、PI-88、SU-14813、SU-6668、XL-647、XL-999、IMC-1121B、ABT-869、BAY-57-9352、BAY-73-4506、BMS-582664、CEP-7055、CHIR-265、CT-322、CX-3542、E-7080、ENMD-1198、OSI-930、PTC-299、Sirna-027、TKI-258、Veglin、XL-184又はZK-304709である。
【０１４０】
ベバシズマブ(AVASTATIN(登録商標))(rhuMAb-VEGF)(抗VEGFモノクローナル抗体)は、血管内皮増殖因子(VEGF)に対する組換えヒト/マウスキメラモノクローナル抗体である。それは、マウス抗VEGFモノクローナル抗体のVEGF結合残基を、ヒト免疫グロブリン1(IgG1)(Prod Info Avastin、2004年)のフレームワーク領域に導入することによって調製される。アミノ酸配列のわずか7%がマウス抗体に由来し、93%がIgG1由来である。ベバシズマブは、二つのヒトVEGF受容体型(flt-1及びflk-1)の結合部位の認識を通じて、すべてのヒトVEGF型に結合して中和する。動物モデルでは、抗体は、VEGFによって誘導される血管形成を阻害することによって、確立された腫瘍を安定させるか、又は腫瘍増殖を抑制することが示されている。
【０１４１】
ベバシズマブの薬物動態は、0.3mg/kg以上の用量の後、線形である(Anon、2002年)。進行癌患者(n=25)において、0.3、1、3及び10mg/kgでの90分静脈注入の後、ベバシズマブのピーク血清濃度は、それぞれ5〜9mcg/mL、21〜39mcg/mL、52〜92mcg/mL及び186〜294mcg/mLの範囲であった。わずかな蓄積が反復投与(毎週)で観察されたが、これは重大ではなく、薬物動態は線形のままであった。ベバシズマブの定常状態のレベルは、毎週、2週間ごと又は3週間ごとの1〜20mg/kgの100日後に得られた。
【０１４２】
ベバシズマブの推奨用量は、疾患の進行が弱まるまでの2週間ごとの、5ミリグラム/キログラムの30分間静注である。ベバシズマブは、化学療法の後に続くべきである。単剤ベバシズマブの効力は、確立されていない。ベバシズマブ(ゲムシタビン及びドセタキセルと同時投与されてもよく、又は化学療法の前後1週間以内に投与されてもよい)は、約1mg/kg〜約15mg/kg、好ましくは約5mg/kgで静脈内投与される。
【０１４３】
本開示の方法及び組成物は、ベバシズマブによる療法を含む併用療法において有用である。本明細書に記載のように、治療薬(例えば、細胞傷害遺伝子)を含む本開示の複製適合性レトロウイルス(RCR)は、細胞増殖性障害の治療において有用である。本開示のRCRの利点には、複製中の細胞や癌細胞に感染するその能力が含まれる。ベクターの導入遺伝子が細胞傷害遺伝子(例えば、非細胞傷害物質を細胞傷害物質に変換するポリペプチドをコードする遺伝子)を含む場合、癌細胞を死滅させる能力が提供される。
【０１４４】
本開示は、癌及び新生物などの細胞増殖性障害を治療するための方法であって、本開示のRCRベクターの投与に続いて、化学療法剤又は抗癌剤で治療することを含む方法を提供する。一態様では、化学療法薬又は抗癌剤の投与より前に、RCRの感染及び複製を可能にする時間、RCRベクターが被験体に投与される。被験体は次に、癌細胞の増殖を減少させるか、それらを死滅させるための時間及び投薬量で、化学療法剤又は抗癌剤で治療される。一態様では、化学療法薬又は抗癌剤による治療が、癌/腫瘍を減少させるが死滅させない場合(例えば、部分寛解又は一時的寛解)、RCR由来の細胞傷害遺伝子(例えば、シトシンデアミナーゼ)を発現する細胞で毒性治療薬に変換される非毒性治療薬(例えば、5-FC)で被験体を次に治療することができる。そのような方法を用いて、本開示のRCXRベクターは腫瘍細胞の複製過程の間に拡散され、そのような細胞は抗癌剤又は化学療法剤による治療によって次に殺すことができ、本明細書に記載のRCR治療法を用いてさらなる殺滅を起こすことができる。
【０１４５】
本開示のさらに別の実施形態では、異種遺伝子は、標的抗原(例えば、癌抗原)のコード配列を含むことができる。この実施形態では、細胞増殖性障害を含む細胞を、標的抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含むRCRに感染させて、標的抗原の発現(例えば、癌抗原の過剰発現)を提供する。標的抗原と特異的に相互作用するターゲッティングコグネート(cognate)部分を含む抗癌剤が、次に被験体に投与される。ターゲッティングコグネート部分は、細胞傷害剤に作動可能に連結されてもよく、又はそれ自身が抗癌剤であってもよい。したがって、ターゲッティング抗原コード配列を含むRCRに感染する癌細胞は、癌細胞上での標的の発現を増加させ、細胞傷害剤ターゲッティングの効率/効力の増加をもたらす。
【０１４６】
免疫系の細胞間の相互作用のブロッキングは、活性化又は抑制のかなりの免疫学的影響を及ぼすことが示されている(Waldmann Annu Rev Med. 57巻:65頁2006年)。例えば、T細胞の活性化を調節する、CTLA-4(CD 152)及びB7.1(CD80)の相互作用の遮断は、おそらくこの抑制性相互作用をブロックすることによって、免疫刺激を引き起こすことが示されている(PeggsらCurr. Opin. Immunol. 18巻:206頁、2006年)。この遮断は、CTLA-4に対する抗体によって、又は溶解性のB7.1によって潜在的に達成することができる。この種の分子の全身投与は、最低でも有害な副作用、又は一CD28アゴニストの場合は死さえもたらすことがある、望ましくない全体的影響を及ぼすことができる(Suntharalingamら、NEJM 355巻1018頁2006年)。Pfizerは抗癌試薬としてそのような抗CTLA-4遮断抗体の一つ(CP-675,206)を開発しているが、重大な副作用のために開発を最近中止した。細胞外空間に放出されるそのような分子をコードする複製適合性ベクターに感染した後の腫瘍からの、局所環境に放出される遮断分子の局所送達は、局所的に免疫調節を提供し、これらの重大な副作用を回避し得る。遮断分子は、抗体、単鎖抗体、天然リガンドの溶解性バージョン、又はそのような受容体に結合する他のペプチドである。
【０１４７】
さらに別の実施形態では、本開示のRCRは、コグネート(cognate)抗原又はリガンドと特異的に相互作用する結合ドメイン(例えば、抗体、抗体断片、抗体ドメイン又は受容体リガンド)を含むコード配列を含むことができる。次に、癌細胞又は新生物細胞などの細胞増殖性障害を含む被験体で細胞に感染させるために、結合ドメインのコード配列を含むRCRを用いることができる。感染細胞は、結合ドメイン又は抗体を次に発現する。作動可能に細胞傷害剤に連結されているか、又はそれ自体細胞傷害性である抗原又はコグネートを、次に被験体に投与することができる。細胞傷害性コグネートは、結合ドメインを発現する感染細胞を次に選択的に死滅させる。或いは、結合ドメイン自体が抗癌剤であってもよい。
【０１４８】
本明細書で用いるように、用語「抗体」は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。例えば、抗体は、重(H)鎖可変領域(本明細書でVHと省略する)及び軽(L)鎖可変領域(本明細書でVLと省略する)を含むことができる。別の例では、抗体は二つの重(H)鎖可変領域及び二つの軽(L)鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、完全抗体だけでなく、抗体の抗原結合性断片(例えば、単鎖抗体、Fab断片、F(ab') 2、Fd断片、Fv断片及びdAb断片)を包含する。
【０１４９】
VH及びVL領域は、より保存されている「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域が間にある、「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができる。フレームワーク領域及びCDRの範囲は、正確に定義されている(Kabat、E. A.ら、(1991年) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication No. 91-3242、及びChothia, C.ら(1987年) J. Mol. Biol. 196巻:901〜917頁を参照)。本明細書では、Kabat定義が用いられる。各VH及びVLは、一般的に三つのCDR及び四つのFRで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。
【０１５０】
「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変ドメイン又は定常ドメイン由来のドメインを指す。免疫グロブリンドメインは、約7個のβ鎖及び保存されたジスルフィド結合で形成される2個のβシートを一般に含む(例えば、A. F. Williams及びA. N. Barclay 1988年Ann. Rev Immunol. 6巻:381〜405頁を参照)。可変免疫グロブリンの超可変ループの正規構造は、Chothiaら(1992年)J. Mol. Biol. 227巻:799〜817頁;Tomlinsonら(1992年)J. Mol. Biol. 227巻:776〜798頁、及びTomlinsonら(1995年)EMBO J. 14巻(18号):4628〜38頁に記載のように、その配列から推測することができる。
【０１５１】
本明細書で用いるように、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、その配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべて又は一部を含むことができる。例えば、その配列は一つ、二つ又はそれ以上のN末端又はC末端のアミノ酸、内部アミノ酸を省略することができ、一つ又は複数の挿入又は追加の末端アミノ酸を含むことができ、或いは他の変更を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と結合して標的結合構造(又は「抗原結合部位」)、例えばTie1と相互作用する構造、例えばTie1に結合するか又はそれを阻害する構造を形成することができる。
【０１５２】
抗体のVH又はVL鎖は、それによって重鎖又は軽鎖免疫グロブリンをそれぞれ形成するために、重鎖又は軽鎖の定常領域のすべて又は一部をさらに含むことができる。一実施形態では、抗体は、二つの重鎖免疫グロブリン及び二つの軽鎖免疫グロブリンの四量体であり、そこで、重鎖及び軽鎖免疫グロブリンは、例えばジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、三つのドメイン、CH1、CH2及びCH3を含む。軽鎖定常領域は、CLドメインを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第一成分(Clq)を含む宿主組織又は因子への抗体の結合を一般に媒介する。用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン型IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(並びにそれらのサブタイプ)を含む。免疫グロブリンの軽鎖は、κ型又はλ型であることができる。一実施形態では、抗体はグリコシル化される。抗体は、抗体依存性細胞傷害性及び/又は補体媒介性細胞傷害性について機能的であることができる。
【０１５３】
用語「単一特異的抗体」は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す抗体を指す。この用語は、例えば均質の単離細胞の集団からの単一の分子種として生成される抗体を指す、「モノクローナル抗体」を含む。「モノクローナル抗体組成物」は、抗体の単一の分子種を含む組成物中の抗体又はその断片の調製物を指す。一実施形態では、モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞によって生成される。一つ又は複数のモノクローナル抗体種を組み合わせることができる。
【０１５４】
抗体の一つ又は複数の領域は、ヒト由来(human)又は事実上ヒト由来であってもよい。例えば、可変領域の一つ又は複数は、ヒト由来又は事実上ヒト由来であってもよい。例えば、CDRの一つ又は複数は、ヒト由来のもの、例えばHC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3であることができる。軽鎖CDRの各々は、ヒト由来であってもよい。HC CDR3はヒト由来であってもよい。フレームワーク領域の一つ又は複数は、ヒト由来のもの、例えばHC又はLCのFR1、FR2、FR3及びFR4であることができる。一実施形態では、すべてのフレームワーク領域はヒト由来であり、例えばヒト体細胞性細胞、例えば免疫グロブリンを生成する造血細胞又は非造血細胞に由来する。一実施形態では、ヒト配列は生殖細胞系配列であり、例えば生殖細胞系核酸によってコードされる。定常領域の一つ又は複数は、ヒト由来又は事実上ヒト由来であってもよい。別の実施形態では、フレームワーク領域(例えば、総合的にFR1、FR2及びFR3、又は総合的にFR1、FR2、FR3及びFR4)又は抗体全体の少なくとも70、75、80、85、90、92、95又は98%は、ヒト由来又は事実上ヒト由来であってもよい。例えば、総合的にFR1、FR2及びFR3は、軽鎖又は重鎖の配列をコードする遺伝子座のヒト生殖細胞系Vセグメントによってコードされるヒト配列と、少なくとも70、75、80、85、90、92、95、98又は99%同一であってもよい。
【０１５５】
抗体のすべて又は一部は、免疫グロブリン遺伝子又はそのセグメントによってコードされてもよい。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α(IgA1及びIgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。完全長免疫グロブリン軽鎖(約25Kd又は214アミノ酸)は、NH2末端の可変領域遺伝子(約110アミノ酸)及びCOOH末端のκ又はλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長免疫グロブリン重鎖(約50Kd又は446アミノ酸)は、可変領域遺伝子(約116アミノ酸)及び他の前記定常領域遺伝子の一つ、例えばγ(約330アミノ酸をコードする)によって同様にコードされる。軽鎖は、軽鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドを指す。重鎖は、重鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドを指す。
【０１５６】
本明細書で用いるように、完全長抗体の「抗原結合性断片」(又は単に「抗体部分」又は「断片」)という用語は、被験体の標的に特異的に結合する能力を保持する完全長抗体の一つ又は複数の断片を指す。完全長抗体の「抗原結合性断片」という用語に含まれる結合性断片の例には、(i) Fab断片、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価の断片;(ii) F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのFab断片を含む二価の断片;(iii) VH及びCH1ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一の腕のVL及びVHドメインからなるFv断片、(v) VHドメインからなるdAb断片(Wardら、(1989年)Nature 341巻:544〜546頁);並びに(vi)機能性を保持する単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の二つのドメイン、VL及びVHは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を用いることによって、VL及びVH領域が対になって単鎖Fv(scFv)として知られる一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによってそれらを結合することができる。例えば、Birdら(1988年) Science 242巻:423〜426頁及びHustonら(1988年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85巻:5879〜5883頁を参照。
【０１５７】
抗体断片は、当業者に公知である従来の技術を含む任意の適当な技術を用いて得ることができる。用語「単一特異的抗体」は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す抗体を指す。この用語は、「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」を含み、それは、本明細書で用いるように単一の分子組成の抗体又はその断片の調製物を指す。本明細書で用いるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス(例えば、IgM又はIgG1)を指す。
【０１５８】
本開示は、細胞増殖性障害を有する被験体を治療する方法を提供する。被験体は任意の哺乳動物であることができ、好ましくはヒトである。被験体を、本開示の組換え複製適合性レトロウイルスベクターと接触させる。接触させることは、in vivoであっても又はex vivoであってもよい。本開示のレトロウイルスベクターを投与する方法は当技術分野で公知であり、例には、全身投与、局所投与、腹腔内投与、筋内投与、脳内、脳脊髄、並びに腫瘍又は細胞増殖性障害の部位への直接投与が含まれる。他の投与経路は、当技術分野で公知である。
【０１５９】
したがって、本開示は、細胞増殖性障害を治療するために有用な様々な医薬組成物を含む。本開示による医薬組成物は、本開示による細胞増殖性障害の治療又は調節で有用な異種ポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを、担体、賦形剤及び添加剤又は補助剤を用いて被験体への投与に適する形にすることによって調製される。頻繁に用いられる担体又は補助剤には、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他の糖、タルク、ミルクタンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、動植物油、ポリエチレングリコール並びに溶媒、例えば無菌水、アルコール、グリセロール及び多価アルコールが含まれる。静脈内媒体には、液体及び栄養素補液が含まれる。保存剤には、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガスが含まれる。例えば、その内容は参照により本明細書に組み込まれる、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、Easton: Mack Publishing Co.、1405〜1412頁、1461〜1487頁(1975年)及びThe National Formulary XIV.、第14版、Washington: American Pharmaceutical Association (1975年)に記載されるように、他の薬学的に許容される担体には、塩、保存剤、緩衝剤などを含む水溶液、非毒性賦形剤が含まれる。医薬組成物の様々な成分のpH及び正確な濃度は、当技術分野で常用される技術によって調節される。Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis for Therapeutics (第7版)を参照。
【０１６０】
例えば、限定するためではないが、細胞増殖性障害の治療で有用なレトロウイルスベクターは、両種性ENVタンパク質、GAG及びPOLタンパク質、U3領域レトロウイルスゲノムのプロモーター配列、並びに複製、パッケージング及び標的細胞へのレトロウイルスゲノムの組込みのために必要なすべてのシス作用性配列を含む。
【０１６１】
以下の例は、本開示を例示するためのものであり、限定するものではない。そのような例は用いることができるであろうものを代表するが、当業者に公知である他の手順を代わりに利用することができる。
【実施例】
【０１６２】
実施例１：  pACE-GFPemdからpAC3-GFPemdへのベクター骨格の改変、及びGFPに代わるシトシンデアミナーゼ遺伝子配列の挿入
pACE-GFPemdプラスミドの以前の骨格(米国特許第6,899,871号、Wang et al. Hum Gene Ther 14:117 2003)を、図3Eに示す三つの方法で改変した。改変を、PCRによるオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発(Logg et al.,J.Mol Biol 369:1214,2007;“Molecular Biology and Biotechnology" Eds. J M. Walker,R.Rapley,Royal Society of Chemistry,London UK,2000も参照されたい)によって行った。以下の改変を行った。1)両種性env遺伝子の3'末端のp15領域の核酸配列は、元は同種指向性エンベロープに由来した  -この配列を、4070A両種性エンベロープ由来の対応する配列に置換した。;二つの構築物におけるコード化エンベロープアミノ酸は同一である。2)PstI1部位の挿入により、選択した導入遺伝子の挿入がより容易になるようにIRES配列の3'末端を改変し、またIRES導入遺伝子部位の一方の末端にある小さな不完全反復配列を除去した。3)3'LTRの下流にある残りのウイルス配列を除去した。得られたプラスミドはpACE-emdGFP(別名pACE-GFP、pACE-eGFP及びT5.0006)であり、シトシンデアミナーゼ及び変異体をコードするベクターの基礎として使用した。最初に、コード配列カセットを挿入するための二つの方法を使用した。第一の方法は、ATG開始コドンのすぐ上流に配列5'TTATAAT3'（配列番号７３）をもたらし、第二の方法は配列5'TTATAA3'（配列番号７４）をもたらした。第二の方法はより単純であり、ベクター並びに合成シトシンデアミナーゼ遺伝子中でシンプルにPstI1及びNot1で酵素切断し、その後再びライゲーションを行う。シトシンデアミナーゼ挿入断片を有するベクターを、CDopt(CD1)及びCDopt+3pt(CD2)(図2参照)コード配列を用いる両方の方法により作製し、実施例3に記載したように、293T細胞の一過性トランスフェクションによって感染性ウイルス調製物を作製した。その後、MOI 0.1で、U87細胞を培養液中で感染させ、これらの細胞を100%感染するまで増殖させた。100%感染した細胞の細胞抽出物を、実施例6に記載したようにしてシトシンデアミナーゼ活性についてアッセイしたところ、この酵素の比活性は、いずれか一方の上流配列を有する点以外は同一である構築物と同等であることが判明した。したがって、図2の表において、pACE-eGFP(T5.0006)及びpACE-yCD(T5.0007)は第一の上流配列を有するが、さらに試験した他の全ての構築物は第二の上流配列を有する。その後、異なる遺伝子挿入断片を有するベクターを、単純なPStI1及びNot 1切断を用いて通常法で構築した。
【０１６３】
最初にトランスフェクトした複製適合性レトロウイルスのベクター構築物の概略図について、以下の図3Aを参照されたい。CMVはヒトCMV前初期プロモーターであり、U3、R及びU5はウイルスの長末端反復配列(LTR)の対応する領域である。gag、pol及びenvは、ウイルスタンパク質コード領域である。図3B及び3Dは本開示のプラスミド構造及び配列を示す。
【０１６４】
Tai et al., Mol.Ther.12:842,2005のベクターと比較して、本開示のベクターは多数の違いを示す。Tai et al.のベクターは、3'LTRの下流の約70bpのMLV配列を除去するように改変されている。エンベロープのClaI部位の下流のDNA配列を両種性エンベロープ配列に変更した。この変更はエンベロープのアミノ酸配列を変更しない。さらに、IRES-CDカセットのいずれの側の小さなリピートも除去し、相同組換えによる不安定性を回避した。これらの変更は、予想外に、宿主細胞内における複製及び継代中のベクター安定性の増加ももたらした(図5)。
【０１６５】
処理細胞における逆転写及び第一の組込み事象後、DNAプロウイルス及びその結果生じた子孫レトロウイルスは、一方の末端にMLV由来の従来的LTR構造を有することが理解されよう。多重感染サイクル後、この配置は安定であることが証明されている(以下の図5参照)。
【０１６６】
実施例２：  野生型酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子に対する遺伝的増強
2セットの変更を行った:(1)酵母シトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を増加させるため、三つのアミノ酸を変更する三つの位置変異(A23L、I140L及びV108I)並びに(2)アミノ酸配列をさらに変更することなく、ヒト細胞内でのタンパク質翻訳効率を改善するために、ヒトコドン使用配列(codon usage sequences)を増強する追加の遺伝子配列改変。
【０１６７】
CDの配列設計には、CD最適化、CD-UPRT(+/-リンカー)及びCD-OPRTアーゼ(+/-リンカー)が含まれた。最終的なシトシンデアミナーゼコード配列は、PSI1/Not1カセットに基づく戦略のために、5'末端にPSI1部位(全長)、及び3'末端にNot1部位とポリAテールを含み得る。配列カセットを商業メーカー(BioBasic Inc.,Markham,Ontario,Canada)に注文し、且つそこから提供された。
【０１６８】
酵母シトシンデアミナーゼを含む以下の配列を、クローニング、最適化及び突然変異のために用いた(ボックス中の核酸は、その後のクローニング法において使用する制限部位-Psi1及びNot1を含む)：
0005992548.tif 000003
（配列番号４３）
【０１６９】
以下の表に、作製された遺伝子及び得られたプラスミドベクター並びにそれらの名前をまとめる。
【表２】
0005992548.tif 000004
【０１７０】
Kasahara et al.によって記載された複製適合性(competent)レトロウイルスベクターpACE-CD(米国特許第6,899,871、この開示は本明細書に組み込まれる)を、追加の改変の基礎として使用した。本明細書記載の改変型酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子を発現するようにベクター(pAC3-yCD)を改変し、構築物中で使用した。最初にトランスフェクトした複製適合性レトロウイルスのベクター構築物の概略図については、下記の図3Aを参照されたい。CMVはヒトCMV前初期プロモーターであり、U3、R及びU5はウイルスの長末端反復配列(LTR)の対応する領域である。gag、pol及びenvは、ウイルスタンパク質コード領域である。図3B及び3Dに本開示のプラスミド構造及び配列を示す。
【０１７１】
受託業者(Bio Basic Inc.,Markham,Ontario,Canada)で遺伝子を合成した後、それらをpAC3ベクター骨格のPsi1-Not1部位に挿入した(図3)。Psi1及びNot1を用いてpAC3-eGFPプラスミドを切断し、プラスミド及びレトロウイルス骨格をコードする大きな(約11kb)断片を精製することによって、プラスミド骨格を通常法で作製した。
【０１７２】
A.ヒト化コドン最適化CD遺伝子(CDopt、別名CD1、T5.0001)
Conrad et al.及び国際公開第99/60008号のヒトコドン最適化シトシンデアミナーゼを比較すると、両方において全91個のコドンが最適化され、36個のコドンが同一であり、47個のコドンが三番目の塩基対変更を有し(全て同じアミノ酸をコードする)、並びに9個のコドンが異なった(しかし、それらは同じアミノ酸をコードした)ことが示される。9個コドンのうち異なったのは以下である:
AGC(Ser)がTCC(Ser)に、
CGT(Arg)がAGG(Arg)に、
CCA(Pro)がCCT(Pro)に変化。
【０１７３】
全ては同等のGC含量を有し、同じアミノ酸をコードする。上記の天然の酵母遺伝子配列を別々にコドン最適化し、以下のCD遺伝子(CD1)を得、IRESを有する複製適合性レトロウイルス(RCR)をコードするpAC3プラスミドベクターに挿入した場合はそれをT5.0001と呼んだ：
0005992548.tif 000005
（配列番号４４）
【０１７４】
B.熱安定化CD遺伝子
シトシンデアミナーゼの安定性の増加のために、追加の改変を行った。三つのアミノ酸を変更して酵母のシトシンデアミナーゼタンパク質の熱安定性を増加させる三つの位置変異(A23L、I140L及びV108I)を含むように、野生型酵母シトシンデアミナーゼ遺伝子の遺伝子増強を行った。
【０１７５】
本開示のシトシンデアミナーゼポリペプチド遺伝子の作製において、以下のプライマー対を用いた。
【０１７６】
部位特異的突然変異誘発プライマー:センスプライマー:5'-tcgaggatatcggcgagtgaaacccgttattctttttggc-3'(配列番号45):
アンチセンスプライマー:5'-gccaaaaagaataacgggtttcactcgccgatatcctcga-3'(配列番号46)
センスプライマー:5'tcggcgagtgatccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgcctccggcggcggcgccaacccgttatt-3'(配列番号47)
アンチセンスプライマー:5'-aataacgggttggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggaggcgccgccgccggatcactcgccga-3'(配列番号48)
天然酵母CDタンパク質の安定性を増加させるために、このタンパク質に三つのアミノ酸置換を遺伝子工学処理で行った。これらの置換は単独で行うか、あるいはヒトコドン最適化と組み合わせて行った。
【０１７７】
三つのアミノ酸置換は、A23L、V108I、I140Lである。これらの置換をコードする配列を以下に示す：
0005992548.tif 000006
【０１７８】
コード化ポリペプチドは以下の配列を含む(置換したアミノ酸を下線で示す):
0005992548.tif 000007
【０１７９】
優先コドンを利用する三つのアミノ酸置換A23L/V108I/I140Lを組み込み、配列全体に対して優先ヒトコドン使用を利用する最終構築物設計(この遺伝子をCDopt+3pt[別名CD2](配列番号49):
0005992548.tif 000008
並びに、IRESを有するRCRをコードするpAC3プラスミドベクターに挿入した時のT5.0002。下線のコドンは、アミノ酸置換に対する優先コドンを示す。
【０１８０】
タンパク質翻訳配列アラインメントは優先コドン変更を示し、アミノ酸置換は所望のタンパク質構造をもたらす。
【０１８１】
CD最適化配列設計(ヒトコドンの優先+3つのアミノ酸置換)
0005992548.tif 000009
（配列番号50）
【０１８２】
C.CD-UPRT融合遺伝子(pAC3プラスミドRCRベクター中のCDopt+3pt-UPRT、[別名CDopt-UPRT及びCD2-UPRT]、T5.0003)の構築  図10Aで説明するスキームIを使用してCD最適化-UPRT配列を作製するため、UPRTポリペプチドに連結した上記のCDポリペプチドを含む融合構築物も作製した。以下のプライマーを用いて、CDとUPRTとの間の終止-開始コドンを除去した。
【表３】
0005992548.tif 000010
【０１８３】
得られた融合ポリヌクレオチドは1296bpを有し、直下に示す配列を含む：
0005992548.tif 000011
（配列番号５５）
【０１８４】
D.CD-リンカーUPRT融合遺伝子(CDopt+3pt-LINK-UPRT [別名CDopt-LINKER-UPRT及びCD2-L-UPRT]の構築
図10Bに示すスキームIIを使用してCD最適化-リンカー-UPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとUPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4（配列番号５６）ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。以下のプライマーを用いて、リンカーを挿入した。
【表４】
0005992548.tif 000012
【０１８５】
得られた構築物はサイズ:1356bp及び直下の配列を有する：
0005992548.tif 000013
（配列番号５９）
【０１８６】
E.CD-OPRT融合遺伝子(CDopt+3pt-OPRT [別名CDopt-OPRT及びCD2-OPRT]、pAC3プラスミドRCRベクターに挿入した場合T5.0004)の構築
図10Cに示すスキームIIIを用いてCD最適化-OPRTアーゼ(CDヒト化+3pt変異+ヒトのOPRTアーゼ機能ドメイン)を作製するために、OPRTポリペプチドに連結した上記のCDポリペプチドを含む融合構築物も作製した。
【０１８７】
得られた構築物は1269塩基対のサイズ及び直下の配列を含む：
0005992548.tif 000014
（配列番号６０）
【０１８８】
F.CD-リンカー-OPRT融合遺伝子(CDopt+3pt-LINK-OPRT、[別名CDopt-LINKER-OPRT及びCD2-L-OPRT]、pAC3プラスミドRCRベクター中ではT5.0005)の構築
図10Dに示すスキームIVを用いてCD最適化-リンカー-OPRT配列を作製するために、CDポリペプチドとOPRTポリペプチドとの間にインフレームでリンカー(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)4（配列番号５６）ドメインをクローニングすることによって、融合構築物も作製した。
【０１８９】
得られた構築物は1329塩基対のサイズ及び直下の配列を含む：
0005992548.tif 000015
（配列番号６１）
【０１９０】
野生型yCDタンパク質と比較して、感染U-87細胞において、より高い安定性について3つの変異を用いて最適化したより高レベルのヒトコドンが観察されたことを図4は示す。
【０１９１】
実施例３：  一過性トランスフェクションによるベクター産生
ベクターは多くの方法で作製できるが、第一のステップは細胞にDNAベクターを導入して感染粒子の産生を可能にすることであり、これは、その後、細胞の上清から回収することができる。一度感染粒子を作製すれば、当業者は他の作製法を実行することができる。293T細胞の一過性トランスフェクションによりベクター粒子を作製した(Pear et al.Proc Natl Acad Sci U S A.90:8392〜8396 1993)。
【０１９２】
293T細胞を解凍して培養し、その後、DMEM高グルコース培地(Hyclone# 30081,500mL)をFBS(Hyclone# SH30070,50mL)、L-グルタミン(Cellgro# 25-005-CI,5mL)、NEAA(Hyclone #SH30238,5mL)、及びペニシリン-ストレプトマイシン(Penicillin-strep)(Cellgro# 30-002-CI,5mL)と混合することによって調製したDMEM培地15mLを含むT-75フラスコ内で2回継代した。このフラスコを37℃、5%CO2でインキュベートした。その後、1.8×106細胞/T-25(又は7.2×104細胞/cm2)の細胞密度で、各々5mLの培地を含む六つのT-25に第三継代細胞を播いた。T-25に播いた1日後、プロメガ社のリン酸カルシウムトランスフェクションキット(Cat# E1200)を用いて、ウイルスベクターを発現するT5.0002プラスミドで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの18時間後、1セットのフラスコ(各セット3フラスコ)中の培地を、10mMのNaBを含む新鮮培地と交換した。第二のセットのフラスコ中の培地は交換せず、対照(NaBゼロ)とした。NaB処理の8時間後、全フラスコ中の培地を、NaBを含まない新鮮培地と交換した。次の日まで(22時間)、両セットのフラスコの発現を継続させた。両セットのフラスコの上清を回収し、qPCRによりそれらの力価をアッセイし、形質導入単位(TU)/mlで表した(実施例4参照)。
【０１９３】
力価の結果を以下の表に示す。
【表５】
0005992548.tif 000016
【０１９４】
その後のベクター調製物をこの方法で、酪酸ナトリウムなしで生成した。他のベクタープラスミド(表2)を同じ方法で用いて、1E5 TU/ml〜1E7 TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製した。必要であれば、下記のように、かかる物質をさらに精製・濃縮することができる。米国特許第5,792,643号;T.Rodriguez et al.J Gene Med 9:233 2007;米国特許出願第61218063号も参照されたい。
【０１９５】
本開示の特定の実施形態において、投与量を脳重量グラム数により計算した。かかる実施形態において、処置の方法に有用な本開示の複製適合性レトロウイルスベクターの投与量を、脳重量1gについて104〜106 TUの範囲に定めることができる。
【０１９６】
実施例４：  定量PCR力価測定アッセイ
機能的なベクターの濃度、又は力価を定量PCR(qPCR)に基づく方法を用いて決定する。この方法において、形質導入可能な宿主細胞系(例えば、PC-3ヒト前立腺ガン細胞、ATCC Cat# CRL-1435)を標準量のベクターで感染させ、形質導入後の宿主細胞内に存在する得られたプロウイルス量を測定することによって、ベクターを力価測定する。細胞及びベクターを標準的な培養条件下(37℃、5%CO2)、24時間インキュベートし、完全感染を可能にさせた後、ベクターの複製を停止するために抗レトロウイルスAZTを添加した。次に、細胞を培養皿から回収し、ゲノムDNA(gDNA)をインビトロジェン社のPurelink gDNA精製キットを用いて精製し、RNase/DNase不含滅菌水を用いて精製カラムから溶出する。分光光度計でA260/A280吸光度比を測定し、試料の濃度及び相対純度を決定する。qPCRのためのインプットDNAが全解析試料に対して一定になるように、RNase/DNase不含水を追加して、所与のセットのgDNA調製物のうち一番低い濃度にgDNA濃度を標準化する。エチジウムブロマイド染色された0.8%アガロースゲルにて、一定分量の各試料の電気泳動を行うことにより、ゲノムDNAの純度をさらに評価する。試料のA260/A280吸光度が1.8〜2.0の範囲であり、gDNAが単一バンドを示す場合、その試料をベクターのプロウイルスコピー数についてのqPCR解析に使用する。プロウイルス(逆転写されたベクターDNA及び宿主gDNAに組み込まれたベクターDNA)のLTR領域を調べるプライマーを用いてqPCRを行い、既知量のベクターを用いて既知数の細胞に形質導入した時に起こった形質導入事象の総数を推定する。試料として既知のコピー数の標的含有プラスミドを利用し、それを107から10コピーに段階希釈し、同一のqPCR条件下で測定した標準曲線から、反応あたりの形質導入事象の数を計算する。(以前に決定された濃度から)どれくらいのゲノム当量を各qPCR反応に使用したのか、どれくらいの形質導入事象が反応あたりに起こったのかを知るために、形質導入時に存在した細胞の総数に基づいて生じた形質導入事象の総数を決定する。この値は、最初の形質導入中に細胞を含む培地で希釈した後のベクターの力価である。補正した力価を
計算するために、力価量で割った培養液の体積及び力価量を掛け合わせることによって希釈を訂正する。これらの実験を複製培養中に行い、各条件に対して3連の測定を用いてqPCRにより解析し、平均力価並びにそれに関連する標準偏差及び変動係数を決定する。
【０１９７】
実施例５：  ベクター試験
効果的なベクター構築物及びそれらに由来する感染粒子であるためには、以下が必要である:1)ウイルスの良好な力価を一過性トランスフェクションにより達成する(実施例3及び4参照);2)複数継代において安定性である;3)5-FCの存在下で、効率的に細胞を死滅させる;及び4)標的細胞の感染において酵素活性を示す。実施例3は、有用な力価をこれらのベクターから得ることができることを示す。
【０１９８】
ウイルスベクターの遺伝的安定性
安定性を証明するために、以下の実験を行った。最初に、約106の未処理のU-87細胞をMOI 0.01でウイルスベクターに感染させ、完全に感染するまで増殖させ、1サイクルの感染を完了した。その後、上清を未感染細胞に再継代し、このサイクルを繰り返す。この実験において、2連の試験で、12サイクルを完了した(図5は各2連の試験の一方を示し、2連の試験の他方において同じ結果を得た)。導入遺伝子挿入部位の近傍のMLV特異的プライマーを用いる、感染細胞由来の組み込まれたプロウイルスのPCR増幅により、yCD2又は他の導入遺伝子配列の遺伝的安定性を評価する。全長の増幅産物よりも小さいバンドが現れることは、ベクターの不安定性を示す。図5は、本開示のベクター(T5.0007-改変ベクター及びCD異種ポリヌクレオチドを含む)がpACE-CDよりも回数の多い継代に対して安定性を維持することを示す。さらに、T5.0003は多少安定性が低いが、T5.0004及びT5はpACE-CDとほとんど同じ安定性であると思われる。pACE-CDはマウス腫瘍研究において用いられてきており、マウスモデルにおいて良好な抗腫瘍効果を示す。しかし、特に、複数サイクルの5-FC処理を必要とする場合、より安定なウイルスゲノムは、動物及びヒトの治療においてはるかに効力があり長持ちする。T5.0001及びT5.0002の両方がT5.0007よりも顕著に安定であることは、タンパク質コード配列内のサイレント変化又は点変異をもたらす小さな変化が、より安定なベクターゲノムと共に予期せぬ優れた特性をもたらすことができることを示す。
【０１９９】
細胞死滅実験
Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)は、増殖アッセイにおいて生存可能な細胞数を決定する比色法である。細胞増殖の速度を決定するため、並びに5-フルオロシトシン(5-FC)及び5-フルオロウラシル(5-FU)に対する様々な細胞株の用量反応を測定するために、このアッセイを使用した。
【０２００】
ベクターで100%感染させた細胞を、96-ウェルプレートに、1000細胞/ウェルの割合で播いた。様々な濃度の5-FC(対照には5-FU)で処理した後、これらの細胞を8日間にわたってモニターした。これらの細胞増殖の解析を、プロメガ社のCell Titer 96 AQueous One Solution reagent(MTS)を利用して2日おきに評価した。簡単に説明すると、(メーカーに推奨されるように)MTS20μlを培地100μlと混合し、96-ウェルプレートの試料に加えた。試料を60分間、37℃/5%CO2インキュベーターの中でインキュベートした。その後、プレートリーダーで、490nm波長における吸光度測定を行った。その後、プレートを廃棄した。
【０２０１】
AC3-yCD2(ベクター)又はAC3-yCD(ベクター)のいずれかを感染させたU-87細胞に5-FC力価測定を行うことにより、yCD2タンパク質を発現する細胞内のシトシンデアミナーゼが、野生型yCDタンパク質を発現する細胞のシトシンデアミナーゼと少なくとも同程度の活性があることを証明する実験結果を図6Aは示す。簡単に説明すると、AC3-yCD(野生型CD)ベクター又はAC3-yCD2(熱安定化及びコドン最適化)ベクターのいずれかを用いた感染多重度0.1(すなわち100%感染)の感染の5日後のU-87細胞を、8日間、漸増量の5-FCに曝露し、又は陽性対照では0.1mMの5-FUに曝露した。8日目に、MTSアッセイ(プロメガ社のCell Titer 96 AQUEOUS One Solution Proliferation Assay)を用いて、細胞培養物を生存能力について評価した。漸増投与量での5-FC処理において、二つのレトロウイルスベクターのデータは同程度の死滅を示す。
【０２０２】
RG2細胞(ATCC Cat# CRL-2433)を用いた同様のin vitro細胞培養実験において、RG2細胞株を五つの異なるベクター(pACE-CD、T5.0001、T5.0002、T5.0004、及びT5.0007)で形質導入した。その後、漸増濃度の5-FC(対照には5-FU)に、8日間曝露し、上記のようにモニターした。結果を図2に示す。野生型-酵母シトシンデアミナーゼ(pACE-yCD)を除いて、0.01mMの濃度は、試験した全ベクターを通して完全な死滅を誘導するのに十分であった。野生型-酵母シトシンデアミナーゼは感受性が低く、完全な死滅には1.0mMの5-FCを必要とした。
【０２０３】
CD発現アッセイ
U87細胞を感染多重度(MOI)0.1で形質導入し、5日間培養し、ウイルスを拡散させ、形質導入5日後の細胞を回収した。その後、5分間、800×gの遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットから吸引により上清を取り除き、リン酸緩衝食塩水(PBS)5mLで洗浄し、再び5分間、800×gで遠心分離をした。得られた細胞ペレットに1.5mLのPBSを加え、ピペッティングにより再懸濁し、-20℃の冷凍庫で保管した。細胞を凍結/溶解法により溶解させた。前もって再懸濁した細胞を室温で溶解させ、ピペッティングし、プロテアーゼ阻害剤混合液と混合し、再び-20℃で凍結させた。酵素アッセイの前に、試料を再び室温で溶解し、ピペッティングした。その後、5分間、卓上用遠心機の14,000rpmにおいて、懸濁液を遠心分離した。ペレットから上清をデカントして取り、新しいエッペンドルフ試験管に入れ、氷上に置いた。
【０２０４】
yCD酵素活性を、HPLCアッセイを用いて評価した。フォトアレイ検出器及び自動注入器と直列に連結したShimadzu LC20ATユニットを用いて、HPLCアッセイを行った。固相は、5μmの球形サイズ及び4.0×250mmのカラム寸法を有するHypersil BDS C18 HPLCカラムであった。移動相は、0.01%の3級-ブチルアンモニウム過塩素酸及び5%メタノールを含む50mMのリン酸アンモニウム、pH2.1であった;このシステムを22℃で平衡化した。全試薬はACSグレードであり、溶媒はHPLCグレードであった。最終濃度0.125mg/mLの5FC(1mM)を有するPBS溶液800μLからなる反応混合液を作製し、1.5mLのオートサンプラーバイアルに入れた。その後、各細胞溶解物200uLを加えることにより、反応を開始した。反応/オートサンプラーバイアルをオートサンプラーに設置し、5uLの反応混合液を注入した。各反応バイアルから5uL分量を回収し、HPLCカラムで解析することで、定期的にタイムポイントを取った。5FCから5FUへの変換速度は、ピーク面積を、前もって作成した5FUの標準曲線からの既知量と比較することによって計算した。産生した5FU(nmol)量をその対応する時間間隔に対してプロットすることによって、5FCから5FUへの変換速度を得る。細胞試料のタンパク質濃度を得て、変換速度(nmol/分)をアッセイで用いたタンパク質の量(mg)で除算することによって、細胞溶解物試料の比活性を計算した。図6Bは、MOI 0.1における形質導入5日後の様々なベクターの比活性を示す。組織培養細胞内のシトシンデアミナーゼの比活性に関して、pACE-yCD(T5.0000)<pAC3-yCD1(T5.0001)<pAC3-CD2(T5.0002)であることをデータは示す。
【０２０５】
実施例６：  ベクターの精製及び濃度
293T細胞の一過性トランスフェクションにより、本開示のベクターを作製し(実施例3)、その後、細胞上清の回収、濾過、ベンゾナーゼ処理、膜分離/濃縮及び透析を行った。さらに、当業者に知られたクロマトグラフィーカラムステップを含んでもよい(例えば、米国特許第5,792,643号;T.Rodriguez et al.J Gene Med 9:233 2007;米国特許出願第61218063号参照)。臨床物質は、無菌性、マイコプラズマ及びエンドトキシン、並びに産物特有の効力、強度、及び同一性試験などの標準試験に基づいて発売される。標的細胞に組み込まれたウイルスベクターDNAのPCR定量化により、形質導入単位(TU)として力価を決定する(実施例4)。最終産物が、無菌注射剤として、等張トリス-ショ糖緩衝液で調製した109TU/mlまでの力価を有することを目的とする。
【０２０６】
一般に、ベクターロットの強度を正確に且つ精密に決定するために、定量PCRに基づく力価アッセイが発展してきた(実施例4で概括的に述べた)。アッセイ手順の詳細は以下のステップからなる:
形質導入
PC-3細胞株由来の安定なヒト前立腺腺ガンを用いて、12-ウェル型プレートの中で形質導入を行う。各試験試料について、力価が決定していないベクター調製物の3種類の希釈を用いて、3ウェルずつPC-3細胞を形質導入する。形質導入24時間後に、アジドチミジン(AZT)を用いてウイルス複製を停止する。細胞をさらに24〜64時間維持し、その後回収し、ゲノムDNA精製を行う。
【０２０７】
ゲノムDNA調製
キアゲン社のDNeasy DNA Minikitsを用いて、メーカーの手順書に従い、形質導入して回収した細胞からゲノムDNAを調製する。UV/vis分光光度法を用いる直接的吸光度測定により、DNAの濃度及び質を評価し、A260及びA260/A280比を決定する。
【０２０８】
リアルタイム定量PCR
バイオラッド社のCFX96リアルタイムPCR装置又はそれと同等の物を用いて定量PCRを行う。CMV/Psiプラスミドプロモーターに対する、組み込まれた又はプロ-レトロウイルスのU3/Psiパッケージングを増幅するように設計したTaqManプローブと併用して、特異的DNAオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、各試験試料中に存在するプロベクターのコピー数を測定する。コピー数標準曲線と比較して、ベクターの力価を表す。ベクターコピー数標準曲線を作成するために、プロ-レトロウイルスU3/Psi配列を含む固有のプラスミドをPC-3細胞のゲノムDNAに添加する。希釈ごとに複数の反応を用いて、複数の希釈物中の形質導入ゲノム数を計算することにより、ベクター試験試料の力価を得る。
【０２０９】
各力価の評価に対して、鋳型を含まない対照(プラスミド又はゲノムDNAを除く全構成要素を含むウェル)及び陰性対照(非形質導入PC-3細胞の等量のゲノムDNAを含む全構成要素)を3通りずつ用意する。1ミリリットルあたりの形質導入単位(TU/mL)で力価の値を表す。
【０２１０】
本開示のベクターの効力は、標的細胞におけるベクターの複製及び生じたシトシンデアミナーゼ(CD)活性の両方によって決まる。したがって、効力アッセイは、組織培養中の前もって感染をさせていない細胞株においてベクター感染が蔓延する時間と共に、CD活性の増加を測定する。UV検出と共に逆相HPLC分離を用いて、5-フルオロシトシン(5-FC)から5-フルオロウラシル(5-FU)の変換をモニターすることにより、感染の初期、中期及び後期の形質導入細胞における移行yCD2タンパク質の酵素活性をこのアッセイは測定する。感染期間中のCD活性の増加は、時間に対する感染細胞の割合の関数であり、TOCA511ベクターの複製能を示す。タンパク質1mgあたりのCD単位(比活性、SA)における5-FCから5-FUへの変換速度に基づくCD活性を、各時点について測定する。その後、SAの増加を時間ともにプロットし、培養中のウイルス複製の結果としての形質導入細胞の割合の増加、及び結果として得られるCD活性の移行の両方に反映する。複数のアッセイ及びベクターロットの蓄積したデータを用いて、製品発売のために、CDのSAのこの増加について適切な仕様を決定した。このアッセイは、MOI約0.1における最初の感染後1、3及び5日目の時点並びに非感染対照を含む。
【０２１１】
後期の感染細胞(5日目時点)のCD活性をロット間で比較し、同一性試験としてのこの活性の使用を評価した。このアッセイは以下のステップを含む:
形質導入
U87細胞を用いて、複数ウェル型プレートの中で形質導入を行う。各形質導入について、適切な3種類の希釈を用いて、各々3通りで行う。形質導入0、1、3及び5日後に細胞を回収する。
【０２１２】
CD反応の設定
細胞を溶解し、基準としてBSAを用い、BCAタンパク質アッセイを用いて、全タンパク質濃度を決定する。yCD2酵素アッセイについて、37℃で1〜2時間にわたり5-FU形成速度が直線のままであるように、適切な量の細胞溶解物を5-FCを含む緩衝液に加える。反応混合物の最終体積は100μLである。2時間後、トリクロロ酢酸の添加により酵素反応を停止し、少しボルテックスをし、次のHPLC解析の準備をする。非形質導入細胞の細胞溶解物を陰性対照として用いる一方で、100%感染細胞の試料を用いる同様のアッセイを陽性対照として用いる。
【０２１３】
HPLC解析
室温で5分間、微量遠心機を用いて、停止した反応混合物を12,000rpmで遠心分離する。その後ペレットから上清をデカントして取り、さらに微粒子を除去するために0.2μフィルターに通過させ、pH約4.0のリン酸緩衝液を含む水溶性の移動相を備える前もって平衡化した逆相HPLCカラムに注入する。基質消費及び産物形成の両方をモニターするために、260nm及び280nmでクロマトグラムを行う。既知の基質又は産物の濃度から計算した、前もって作成した標準曲線と比較することにより、GraphPadのグラフ作成及び解析機能を用いて、基質又は産物のいずれかの濃度を決定する。1〜2時間にわたって生成した5-FU量を用いて、CDの活性単位(CD活性の1単位を、1分あたりの1nmolの5-FU形成として定義する)を決定し、この数字をアッセイに使用した(細胞溶解物の)タンパク質の量で割ることにより比活性を計算する。
【０２１４】
実施例７：  CTLA-4(CD 152)に対する一本鎖抗体をコードするベクターの構築及び使用
一本鎖抗体は、所望の効果を有する既知の全抗体配列に由来する。かかる配列は入手可能である(例えば、WO2006048749、米国特許公開第2006/165706号、米国特許第7,034,121号、Genbankアクセッション番号DJ437648、CS441506、CS441500、CS441494、CS441488、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる)。当業者に知られた一般的に使用されている方法(例えば、Gilliland et al.“Rapid and reliable cloning of antibody variable regions and generation of recombinant single chain antibody fragments."Tissue Antigens 47,1〜20,1996参照)により、かかる従来の抗体遺伝子配列を一本鎖抗体(scFv)配列に変換する。CTLA-4に対するファージの一本鎖抗体も、ファージ-scFvライブラリーから直接スクリーニングすることにより入手可能であり、本発明の複製型レトロウイルスベクター(Pistillo et al. Tissue Antigens 55:229 2000)に挿入するために直接使用することができる。どれくらい配列が由来するかに関わらず、scFvは一般に約700〜900塩基対の長さであり、前記のように、5'末端にあるPsi1部位及び3'末端の互換性のあるNot1部位を用いて、商業メーカー(BioBasic)が合成する。その後、yCD2配列の除去後、Psi1-Not1部位において、pAC3-yCD2の複製型レトロウイルス骨格にこの配列を挿入する。記載したようにベクターを産生し、力価を測定し、必要であれば上記のようにさらに精製する。ヒト及びマウスCTLA4は配列において非常に相同性があり、当業者に周知のCT26/Balb/cモデル及びs91マウス黒色腫モデルなどの適切な同系の免疫応答性マウスモデル(例えば、Hodge et al J.Immunol.174:5994 2005参照)において、本発明の複製型レトロウイルスを最初に試験する。1つ又は複数の以下のもの:腫瘍増殖の調節;毒性の欠失;抗腫瘍反応の発生;全身性免疫を示す遠隔病巣の縮小により結果を測定する。マウスに103〜107TUの範囲で投与する。患者には、腫瘍への病巣内注射により投与する、又は血液循環への投与によりこのベクターを投与し、その後、腫瘍にウイルスを運ぶ。105〜1011 TUの範囲で投与する。
【０２１５】
実施例８：  マウス黒色腫モデルにおける、抗CD152一本鎖抗体発現ベクターを用いた抗黒色腫有効性試験
目的
皮下黒色腫を保有するDBA/2マウス(Cloudman S91)における腫瘍内(IT)注射により送達する時、分化クラスター152(CD152)配列(pAC3-αCD152)とも称される、細胞毒性T-リンパ球抗原4(CTLA-4)に対して作られる一本鎖抗体を保有する、新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの黒色腫増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
【０２１６】
マウス
メスのDBA/2マウス(約8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
【０２１７】
細胞
Cloudman S91細胞(ATCC, Manassas VA)は、DBA/2マウスに由来する自然発生黒色腫である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。S91細胞(100μL中1E6)を、DBA/2マウスの右わき腹に注射する。
【０２１８】
ベクター
一過性トランスフェクションにより(又はHT1080細胞内の産生細胞株から、米国特許出願参照)、約7E6TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約7E5 TU/マウスとなる総投与量/マウスを50〜100μLの体積でITにより、また100μLの体積でIVによりベクターを投与する。αCD152を発現するベクターをToca  αCD152とする。
【０２１９】
腫瘍移植及びベクター注射
メスDBA/2(55匹のマウス、9〜10週齢)の5群にS91黒色腫細胞を皮下に移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca  αCD152ベクターの腫瘍内(IT)注射(第三群)、又はToca  αCD152ベクターの静脈内注射(第四群)を(S91腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第五群のマウスには腫瘍が移植されておらず、Toca  αCD152のみ静脈内注射する。
【０２２０】
データ解析
最初に到達した方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を行う。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。処理中のαCD152発現に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
【０２２１】
結果
対照と比較して、ITのMLVの複製によるαCD152の送達は統計的に有意な増殖遅延を示す。対照と比較して、静脈内のMLVの複製によるαCD152の送達は統計的に有意な増殖遅延を示し、DBA/2-Cloudman S91マウス黒色腫モデルの黒色腫量を抑制する。
【０２２２】
さらなる動物試験を以下のように行った:
実施例９：  ACE-yCD2ウイルスベクターは、ヌードマウスでの頭蓋内ヒト異種移植片(U87)において治療効果がある。
【０２２３】
U87ヒト神経膠腫細胞株を用いて頭蓋内異種移植モデルを確立し、ヌードマウス宿主におけるRCRベクターの拡散及び体内分布並びにRCR-ベクター介在型シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療有効性を調べた。
【０２２４】
気候順化後、マウスを無作為に八つの治療群(下記の群参照)のうちの一つに割り当てた。0日目に、1×105のU87投与細胞/マウスの割合で七つの群に右線条体への頭蓋内投与を行った。第八群のマウスには腫瘍の移植を行わなかった。5日目に、製剤バッファーのみ、又は9×105/5ul、9×104/5ul、若しくは9×103/5ulのRCRベクターをマウスに注射した。ベクターを注射していないマウス、9×105/5ul若しくは9×103/5ulのベクターを注射したマウスを無作為化し、19日目から、単一IP注射として5-FC(500mg/kg/日)を投与したか、又は5-FCを投与しなかった。中間用量のベクターを注射したマウス全てに5-FCを投与した(すなわち、この用量については対照群と分けない)。5-FC投与を7日間連続して毎日続け、その後15日間は処置をしなかった。薬物と休息のサイクルを最高で4サイクル繰り返した。第八群を除いて各群から10匹を、生存分析カテゴリーに無作為に割り当てた。予定したスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺した。
【表６】
0005992548.tif 000017
【０２２５】
静脈内投与は尾静脈への注射により行った。腹腔内投与は、膀胱を避けることに注意をして腹部への注射により行った。頭蓋内注射のために、マウスをイソフルランで麻酔し、平滑な耳の柵を備える定位固定装置に置いた。手術部位を準備するために、皮膚を剪毛し、ベタジン(betadine)を使用して頭皮を処置した。この動物を熱パッド上に置き、無菌条件下でメスを使い、皮膚を貫いて正中切開を行った。切開部位における皮膚の退縮及び筋膜の反射は、頭蓋の可視化を可能にさせる。3.5mmの突起を備える蓋を取り付けた3mmの突起を備えるガイドカニューレを、頭蓋内の小さな穿頭孔を通して挿入し、頭蓋に歯科用セメント及び三つの小さなネジを取り付ける。セメントが固まった後、皮膚を縫合して閉じる。突起の定位座標は、AP=0.5〜1.0mm、ML=1.8〜2.0mm、DV=3.0mmである。一群の被験動物の正確な定位座標は、染料を注射しその位置を決定することによるパイロット実験(2〜3匹の動物)において決める。麻酔回復の間、これらの動物をモニターする。鎮痛剤のブプレノルフィンを、本手順の終了前に皮下(SC)に投与し、その後、最高3日間、約12時間ごとにブプレノルフィン投与する。動物を毎日モニターする。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mmの突起を備える注射カニューレを通して、細胞又はベクターを頭蓋内に注入した。ハミルトン注射器及び柔軟性のある管を取り付けた注射器ポンプを用いて速度を制御した。細胞注射に関しては、1μLの細胞を1分あたり0.2μLの流速(合計5分)で送達した。ベクター注射に関しては、5μLのベクターを1分あたり0.33μLの流速(合計15分)で送達した。
【０２２６】
ベクターをマウスに送達し、脳重量1gあたりの形質導入単位(TU)として計算した。かかる計算を用いて、ヒトを含む他の動物に対する用量換算を計算することができる。図8はこのマウスモデルにおけるベクター投与に対する効果を示す。
【０２２７】
実施例１０：  AC3-yCD2(V)は、脳腫瘍の同系マウスモデルにおいて治療効果がある。
【０２２８】
同系の動物モデルにおける本開示の方法及び組成物を証明する追加実験を行った。
【０２２９】
同系のBALB/cマウスのCT26結腸直腸ガン細胞株を用いた頭蓋内移植モデルを確立し、RCRベクターの拡散及び体内分布並びにRCRベクター介在型シトシンデアミナーゼ自殺遺伝子治療の治療有効性及びその免疫学的影響を調べた。
【０２３０】
本研究には129匹の動物(0匹のオス、119匹のメス及び10匹の予備動物(contingency animal)(10匹のメス))が含まれた。気候順化後、マウスを八つの処置群(下記の群参照)の一つに無作為に割り当てた。0日目に、1×104 CT26投与細胞/マウスの右線条体への頭蓋内投与を七つの群に行った。第八群のマウスには腫瘍を移植しなかった。4日目に、製剤バッファーのみ、又は9×105/5ul、9×104/5ul、若しくは9×103/5ulのベクターをマウスに注射した。ベクターを注射していないマウス、9×105/5ul若しくは9×103/5ulのベクターを注射したマウスを無作為化し、13日目から、IP注射により5-FC(500mg/kg/BID)を投与したか、又は5-FCを投与しなかった。中間用量のベクターを投与したマウスに5-FCを投与した(すなわち、この用量については対照群と分けない)。5-FC投与を7日間連続して毎日続け、その後10日間は処置をしなかった。薬物と休息のサイクルを最高で4サイクル繰り返した。第八群を除いて各群から10匹を、生存分析カテゴリーに無作為に割り当てた。予定したスケジュールに従って、残りのマウスを屠殺した。
【０２３１】
未処置のセンチネルマウス(sentinel mice)を屠殺予定動物と一緒に飼育し、同時点で屠殺し、脱殻を経たベクター伝達を評価した。
【表７】
0005992548.tif 000018
【０２３２】
静脈内投与は尾静脈への注射により行った。腹腔内投与は、膀胱を避けることに注意をして腹部への注射により行った。頭蓋内注射のために、右線条体に移植し、3.7mmの突起を備える蓋を取り付けた3.2mmの突起を備えるガイドカニューレを有するマウスを用いた。突起の定位座標は、(十字縫合から)AP=0.5〜1.0mm、ML=1.8〜2.0mm、DV=3.2mmである。ガイドカニューレを通して挿入した3.7mmの突起を備える注射カニューレにより、細胞又はベクターを頭蓋内に注入した。ハミルトン注射器及び柔軟性のある管を取り付けた注射器ポンプを用いて速度を制御した。
【０２３３】
細胞注射に関しては、細胞1μLを1分あたり0.2μLの流速(合計5分)で送達した。ベクター注射に関しては、ベクター5μLを1分あたり0.33μLの流速(合計15分)で送達した。
【０２３４】
ベクターをマウスに送達し、脳重量1gあたりの形質導入単位(TU)として計算した。かかる計算を用いて、ヒトを含む他の動物に対する用量変換を計算することができる。図9は、ベクターを頭蓋内に送達する場合のこのマウスモデルにおけるベクター投与に対する効果を示す。
【０２３５】
実施例１１：  miR-128-1及びmiR128-2を発現するRCRベクターの構築並びに試験
A.ヒトpri-miRNA-128-1異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの構築
miR-128-1を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-1は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。pri-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、pEP-mir-128-1発現ベクター(Cell BioLabs Inc.)の製品シートから入手した(配列番号31)。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有するpri-miR-128-1のDNA配列を合成し、続いて上記のMluI及びNotI消化pAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-miR-128-1は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコードし、非コードpri-miR-128-1配列を有する(図11)。
【０２３６】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45mフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２３７】
B.ヒトpri-miRNA-128-2異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの構築
miR-128-2を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-2は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクター内のpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。pri-miR-128-2のポリヌクレオチドDNA配列を、pri-miR128-2を発現するLenti-miR-128-2発現ベクター(System Biosciences)の配列解析から得た(配列番号32)。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有するpri-miR-128-2のDNA配列を合成し、続いて上記のMluI及びNotI消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-miR-128-1は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコードし、非コードpri-miR-128-2配列を有する(図1)。
【０２３８】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２３９】
C.ヒトH1プロモーター及びヒトpre-miRNA-128-異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの構築
miR-128-2を発現する複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-miR-128-2は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-miR-128-1ベクター内のpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのMluI及びNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離し、IRES-yCD2ポリヌクレオチド配列を除去した。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列をpSilencer 3.1 H1 hygro発現ベクター(Ambion)の製品情報から得、低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、http://www.mirbase.org/から得た。2本鎖DNA断片の5'末端にMluI制限酵素部位及び3'末端にNotI制限酵素部位を有する、ヒトH1プロモーターに連結したpre-miR128-1のDNA配列(配列番号33)を合成し、続いて上記のMluI及びNotIで消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-H1-shRNAmiR128は、三つの遺伝子:gag、pol、及びenvをコート化し、並びに非コードの低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1配列を有する(図11)。
【０２４０】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45mフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２４１】
D.qPCRアッセイによる組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度解析
現在、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度を求めるために少なくとも二つの一般的な方法がある:(1)フローサイトメトリー解析による、GFPタンパク質を発現するベクターを用いたGFP発現解析、及び(2)形質導入細胞を培養した培地から回収したベクターストックの逆転写酵素活性を測定することによる逆転写酵素アッセイ。力価が各々過大評価及び過小評価されたRNA及び導入遺伝子発現によって得られる力価と比較すると、形質導入細胞のDNA解析により評価した力価は、最も信頼性のある推定の機能的力価をもたらす(Sastry et al.,2002 Gene Therapy 9,1155〜1162)。ウイルス拡散の複製速度は、そのウイルスゲノムの、組み込まれたプロウイルスDNAが、そのウイルス配列に特異的なプライマーを用いて、培養中に試験するqPCRにより検出できる形質導入細胞集団の割合と相関する。複製速度の比較を行う場合、本アッセイは、試験する同じベクター内で及び様々なベクター間で、全ての時点の等量のインプットゲノムDNAを必要とする。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、複製速度グラフを作成した。図12A及び図12Bは、様々な組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度の比較を示す。様々なベクター間で、複製速度におけるわずかな違いを明らかにする上で本アッセイは敏感である。
【０２４２】
E.miR-128を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの培養中の複製速度試験
本発明のpri-miR-128-1、pri-miR-128-2及びH1-pre-miR-128-1配列各々の組込みが正常に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させた。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代した。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収した。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定量のゲノムDNAを作製した。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度を作成した。対照のMLVウイルスと比較して、試験をした全ベクターが同様の速度で複製したことを図12A及び図12Bは示す。
【０２４３】
E.miR-128を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターで形質導入した細胞の成熟miR-128の発現試験
miR-128を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターで形質導入した細胞のmiR-128発現を確かめるために、最大の感染力に達した(図12A及び12B)感染9日後の細胞を増殖させ回収して、成熟miRNA発現の検出のために全RNAを抽出した。非形質導入細胞と比較して、pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における成熟miR-128の過剰発現を、Taqman microRNAアッセイの結果は示した(図13)。両細胞株において、pAC3-miR-128-1及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクターで形質導入した細胞は、pAC3-miR-128-2ベクターで形質導入した細胞よりも高レベルの成熟miR-128を発現した。
【０２４４】
F.miR-12の標的関与を証明するための、miR-128を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターで形質導入した細胞におけるBmi-1発現試験
グリア芽腫を含む様々なヒトのガンにおいて、Bmi-1発現は上方制御されることが観察され、miR-128の標的であることが示された。miR-128の標的関与を確かめるために、pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入した細胞におけるBmi-1発現をqRT-PCRによって検出した。pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2及びpAC3-H1-shRNAmiR128ベクター各々で形質導入したU87-MG細胞は、非形質導入細胞よりもより低レベルのBmi-1を発現したが、HT1080細胞においては、形質導入及び非形質導入細胞間で顕著な違いは観察されなかったことを図14は示す。このデータは中枢神経系において、miR-128が重要な機能的役割を担うという考えを支持する。
【０２４５】
実施例１２：  IRES、yCD2、ヒトH1プロモーター及びヒトpre-miR128-1の異種ポリヌクレオチド配列を含む組換え複製適合性レトロウイルスベクターの構築並びに試験
A.構築
複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128は、実施形態の一つに記載したpAC3-yCD2骨格に由来する。pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128ベクター内のpAC3-yCD2骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離する。ヒトH1プロモーターのポリヌクレオチドDNA配列をpSilencer 3.1 H1 hygro発現ベクター(Ambion)の製品情報から得、低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1のポリヌクレオチドDNA配列を、http://www.mirbase.org/から得る。2本鎖DNA断片の両末端にNotI制限酵素部位を有する、ヒトH1プロモーターに連結したpre-miR128-1のDNA配列(配列番号34)を合成し、続いて上記のNotIで消化したpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-H1-shRNAmiR128は、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード低分子ヘアピン構造化pre-miR-128-1配列を有する(図11)。
【０２４６】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製する。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換する。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存する。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させる。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害する。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出する。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定する。
【０２４７】
B.組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128の培養中の複製速度試験
本発明のH1-pre-miR-128-1の組込みが正常に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させる。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代する。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収する。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定量のゲノムDNAを作製する。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度論を作成する。対照のMLVウイルスと比較して、ベクターが同様の速度で複製することを結果は示す。
【０２４８】
C.組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞の成熟miR-128の発現試験
組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞のmiR-128の発現を確かめるために、最大の感染力に達する感染9日後の細胞を増殖させ回収し、成熟miRNA発現の検出のために全RNAを抽出する。非形質導入細胞と比較して、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における成熟miR-128の過剰発現を、Taqman microRNAアッセイの結果は示す。
【０２４９】
D.miR-128の標的関与を証明するための、組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞のBmi-1発現試験
グリア芽腫を含む様々なヒトのガンにおいて、Bmi-1発現は上方制御されることが観察され、miR-128の標的であることが示された。miR-128の標的関与を確かめるために、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞におけるBmi-1発現をqRT-PCRによって検出する。pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したU87-MG細胞は、非形質導入細胞よりもより低レベルのBmi-1を発現するが、HT1080細胞においては、形質導入及び非形質導入細胞間で顕著な違いは観察されなかったことを結果は示す。このデータは中枢神経系において、miR-128が重要な機能的役割を担うという考えを支持する。
【０２５０】
E.免疫ブロットによる、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞におけるyCD2発現試験
組換え複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入した細胞におけるyCD2発現を確かめるために、最大の感染力に達する感染9日後の細胞を増殖させ回収し、yCD2発現の検出のために全タンパク質を抽出する。pAC3-yCD2形質導入細胞と比較して、pAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128で形質導入したHT1080及びU87-MG細胞の両方における正常なyCD2発現を免疫ブロットの結果は示す。
【０２５１】
実施例１３：  miR-128を含む組換えレトロウイルスベクターの培養中のベクター安定性試験
miR-128を含む組換えレトロウイルスベクター(pAC3-miR-128-1、pAC3-miR-128-2、pAC3-H1-shRNAmiR128及びpAC3-yCD2-H1-shRNAmiR128)の多重連続感染サイクルを試験し、ベクターの安定性を評価する。最初に、HT1080及びU87-MG細胞を低いMOIにおいてベクターで感染し、培養液中に拡散させる。各感染サイクルのベクターストックを回収、濾過、希釈し、新鮮な細胞に感染させる。各感染サイクルの最後に、env遺伝子の3'及び3'LTRのベクター上流にある非翻訳領域の3'に結合するプライマーを用いる標準的なPCRによって導入遺伝子安定性を評価するために、細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出する。試験する全ベクターが少なくとも8〜20サイクルにわたって安定な状態であることを結果は示す。
【０２５２】
実施例１４：  マウス/ヒト異種移植モデルにおけるmiRNA発現ベクターを用いた抗腫瘍有効性研究
目的
ヒト神経膠腫異種移植片を有するヌードマウスに、三つの用量レベルのToca 511で頭蓋内(IC)注射により送達する時、miR128配列を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクター(AC3-miR128-1(V);AC3-miR128-2(V);AC3-miR128-3(V)の生存に対する効果を評価することが本研究の目的である。
【０２５３】
マウス
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(約8週齢)をハーラン社(Indianapolis IN)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。右線条体に移植する、3.5mmの突起を含む蓋を取り付けた3.0mmの突起を備える留置ガイドカニューレの外科的留置をマウスに行う。定位座標は、(十字縫合から)AP=+0.5mm、ML=-1.8mmである。
【０２５４】
細胞
U-87 MG細胞(ATCC, Manassas VA)は、44歳の白人女性の悪性神経膠腫に由来する。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mm突起を有する注射カニューレにより、U-87 MG細胞(1μL中に1E5)を1分あたり0.2μLでICに注入する(5分、その後5分間の保持が続く)。
【０２５５】
ベクター調製物を、一過性トランスフェクションにより(又は産生細胞株から、仮出願参照)作製し、全てのベクターは約5E6 TU/mlの力価を有する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlの力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約2.5E4 TU/マウスの最小総投与量/マウスで、5μL以下の体積でベクターをIC投与する。
【０２５６】
腫瘍移植及びベクター注射
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(65匹、9〜10週齢)の6群にU-87腫瘍細胞をICに移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター(AC3-GFP(V)、第二群)で(U-87細胞の増殖率に応じて4〜7日目に)ICに投与し、又はAC3-miR128-1(V);AC3-miR128-2(V);AC3-miR128-3(V)(第三〜五群)でICに投与する。第六群のマウスには腫瘍又はベクターを移植しなかった。
【０２５７】
データ解析
第一〜第六群の各10匹のマウスにおいて60日目まで生存分析を実行し、カプラン-マイヤープロットのようにプロットする。ログランク検定により生存曲線を比較する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全分析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。
【０２５８】
このヒト神経膠腫異種移植モデルにおいて、対照ベクター又はビヒクルのみを用いた処理と比較して、ベクターを用いた処理の結果は統計的に有意な生存効果を示す。
【０２５９】
実施例１５：  マウス/ヒト異種移植モデルにおけるyCD2及びmiRNAの発現ベクターを用いた抗腫瘍有効性研究
濃縮したヒト神経膠腫異種移植片のような「幹細胞」を有するヌードマウスに、三つの用量レベルで頭蓋内(IC)注射により送達する時、AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V)と命名した、yCD2及びmiR-128を発現する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの生存に対する効果を評価することが本研究の目的である。
【０２６０】
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(約8週齢)をハーラン社(Indianapolis IN)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。右線条体に移植する、3.5mmの突起を含む蓋を取り付けた3.0mmの突起を備える留置ガイドカニューレの外科的留置をマウスに行う。定位座標は、(十字縫合から)AP=+0.5mm、ML=-1.8mmである。
【０２６１】
初期のヒト神経膠腫(Dr.Carol Kruse,Burnham Biomedical Res Inst,San Diego,CA)の最初の継代を、EGF、bFGF及びB27補充の無血清培地で培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mm突起を有する注射カニューレにより、1μL中約1000細胞を1分あたり0.2μLでICに注入する(5分、その後5分間の保持が続く)。
【０２６２】
ベクター調製物を、一過性トランスフェクションにより(又は産生細胞株から、仮出願参照)作製し、全てのベクターは約5E6 TU/mlの力価を有する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlの力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約2.5E4 TU/マウスの最小総投与量/マウスで、5μL以下の体積でICにベクターを投与する。
【０２６３】
腫瘍移植及びベクター注射
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(66匹、9〜10週齢)の6群に「幹様」細胞をICに移植し(0日目)、その後、第一群:ビヒクル;第二群:対照ベクターAC3-GFP(V);第三群:TOCA511;第四群:AC3-yH1-shRNAmiR128(V);第五群:AC3-yCD2-H1-shRNAmiR128(V)を細胞の増殖率に応じて腫瘍移植7〜14日後にICに投与する;並びに第六群は腫瘍又はベクターを移植しない未処理マウスである。
【０２６４】
データ解析
第一〜第五群の各10匹のマウスにおいて60日目まで生存分析を実行し、カプラン-マイヤープロットのようにプロットする。ログランク検定により生存曲線を比較する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全分析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。
【０２６５】
結果
このヒト神経膠腫異種移植モデルにおいて、対照ベクター又はビヒクルのみを用いた処理と比較して、ベクターを用いた処理の結果は統計的に有意な生存効果を示す。
【０２６６】
実施例１６：  miR標的配列を用いたベクターの構築
A.GFPを発現し、1コピーの142-3p標的配列を含む複製適合性レトロウイルスベクターの構築
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-emd-142-3pTは、上記のpAC3-emd骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-emd-142-3pTベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-emdプラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。miR142-3pTの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pの標的配列(配列番号35)を合成し、続いてpAC3-emdプラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pTは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びemdをコードし、非コード142-3pT配列を有する(図15)。
【０２６７】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２６８】
B.yCD2を発現し、1コピーの142-3p標的配列を含む複製適合性レトロウイルスベクターの構築
yCD2をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-142-3pTは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-yCD2-142-3pTベクターのpAC3-yCD2骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。miR142-3pTの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pの標的配列(配列番号35)を合成し、pAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-yCD2-142-3pTは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード142-3pT配列を有する(図16)。
【０２６９】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２７０】
C.GFPを発現し、4コピーの142-3p標的配列を含む複製適合性レトロウイルスベクターの構築
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-emd-142-3pT4Xは、上記のpAC3-emd骨格に由来した(現在存在する特許)。pAC3-emd-142-3pT4XベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-emdプラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。四つのタンデムリピートのmiR142-3pT4Xの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3p4Xの標的配列(配列番号36)を合成し、続いてpAC3-emdプラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pT4Xは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びyCD2をコードし、非コード142-3pT4X配列を有する(図15)。
【０２７１】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを用いて、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２７２】
D.yCD2を発現し、4コピーの142-3p標的配列を含む複製適合性レトロウイルスベクターの構築
GFPをコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-yCD2-142-3pT4Xは、上記のpAC3-emd骨格に由来した。pAC3-yCD2-142-3pT4XベクターのpAC3-emd骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのNotIでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。四つのタンデムリピートのmiR142-3pT4Xの完全相補性標的配列を既刊文献(Brown et al.,2006 Nature Medicine 12:5 585〜591)から得た。2本鎖DNA断片の各末端に存在するNotI制限酵素部位を有するmiR-142-3pT4Xの標的配列(配列番号36)を合成し、続いてpAC3-yCD2プラスミドDNA中の対応する部位に挿入した。142-3pT4X挿入断片の方向を、配列解析により確かめた。得られた構築物pAC3-emd-142-3pT4Xは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びemdをコードし、非コード142-3pT4X配列を有する(図16)。
【０２７３】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２７４】
実施例１７：  qPCRアッセイによる組換えレトロウイルスベクターの複製速度のグラフ作成
現在、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度を求めるために少なくとも二つの一般的な方法がある:(1)フローサイトメトリー解析による、GFPタンパク質を発現するベクターを用いたGFP発現解析、及び(2)形質導入細胞を培養した培地から回収したベクターストックの逆転写酵素活性を測定することによる逆転写酵素アッセイ。力価が各々過大推定及び過小推定されたRNA及び導入遺伝子発現によって得られる力価と比較すると、形質導入細胞のDNA解析により評価した力価は、最も信頼性のある推定の機能的力価をもたらす(Sastry et al.,2002 Gene Therapy 9,1155-1162)。ウイルス拡散の複製速度は、そのウイルスゲノムの、組み込まれたプロウイルスDNAが、そのウイルス配列に特異的なプライマーを用いて、培養中に試験するqPCRにより検出できる形質導入細胞集団の割合と相関する。複製速度の比較を行う場合、本アッセイは、試験する同じベクター内で及び様々なベクター間で、全ての時点において等量のインプットゲノムDNAを必要とする。1/C(t)値対複数の時点をプロットすることによって、複製速度グラフを作成した。図17A及び図17Aは、組換え複製適合性レトロウイルスベクターの複製速度の比較を示す。様々なベクター間で、複製速度におけるわずかな違いを明らかにする上で本アッセイは敏感である。
【０２７５】
実施例１８：  複製速度試験
非造血性ヒト細胞株における142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクター
本発明の142-3pT配列の組込みベクターがそれらの親ベクターと同様に複製することを確かめるために、上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積の各ベクターストックを用いて、新鮮な線維肉腫細胞HT1080及びヒト神経膠腫細胞U87-MGの各々にMOI 0.1で感染させた。形質導入細胞を、感染3、6及び9日後に継代した。各時点において、qPCR用のゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収した。ゲノムDNAを希釈し、qPCRの等量のインプットゲノムのために同じ濃度を有する一定分量のゲノムDNAを作製した。
【０２７６】
1/C(t)値 対 複数の時点をプロットすることによって、各ベクターの複製速度を作成した。試験した全ベクターが、それらの親ベクター(pAC3-emd及びpAC3-yCD2)と比較して、同様の速度で複製したことを図17A及び図18Aは示す。GFPタンパク質を発現するベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の複製速度も、フローサイトメトリー解析により評価した。pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターが、それらの親ベクターpAC3-emdと同様の速度で複製したことを図17及び18は示す。
【０２７７】
A.ヒト及びマウス造血細胞における、142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの複製速度試験
マウス及びヒトの成熟miR-142-3p配列が同一であるので、マウス及びヒトmiR-142-3pに特異的なプライマーセットを用いるTaqman microRNAアッセイにより、マウスT-リンパ球細胞株EL4、ヒトT-リンパ球細胞株SUP-T1及びヒト単球細胞株U937において、成熟miR-142-3pの発現を最初に確かめた。最初の感染がMOI 2である全三つの細胞株において、GFPを発現する組換えレトロウイルスベクター(pAC3-emd)の複製速度を試験した。感染28日後までにウイルス拡散が各々細胞集団の65%及び95%に達した時、ヒトT-リンパ球及び単球(SUP-T1及びU937)において、pAC3-emdベクターが効率よく複製したことを図19は示す。試験した時間枠の間、EL4細胞におけるベクター拡散は、5%未満のままであった。
【０２７８】
実施例１８：  ヒト及びマウス造血細胞における142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターのベクター拡散試験
GFPを発現する組換えレトロウイルスベクターのGFP発現抑制に対するmiR-142-3pの機能的効果をフローサイトメトリー解析により試験した。上記の一過性トランスフェクションから回収した計算した体積のpAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターストックを用いて、新鮮なEL4、SUP-T1及びU937細胞をMOI 2で感染させた。フローサイトメトリー解析によるGFP発現解析のために、感染6、12及び18日後に一部の細胞を回収した。それらの親ベクターpAC3-emdと比較して、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターで形質導入したEL4細胞において、GFP発現をバックグラウンドレベルにまで抑性したことを図20Aは示す。試験した時間枠内において、GFP抑性は持続した。それらの親ベクターpAC3-emdと比較して、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xベクターで形質導入した各々SUP-T1及びU937細胞におけるGFP発現の顕著な抑性を、図20B及び図20Cは示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3p発現は、142-3pT配列を含む組換えレトロウイルスベクターで形質導入した細胞において、GFP発現を効果的に抑性することを結果は裏付ける。U937細胞において、4コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X)は、1コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X)よりもGFP発現抑制により効果的であり得ることを結果は示唆した。
【０２７９】
実施例１９：  ウイルスRNAゲノム試験
上記のGFP発現抑制に対するmiR-142-3pTの機能的効果は、翻訳レベルにおけるGFP発現の直接的抑性に起因するのか、あるいは転写後レベルのウイルスゲノムの分解に起因するのかは不明である。実験の最後の時点において、標準的な分子生物学的方法を用いる全RNA抽出のために、一部の細胞を回収する。逆転写ウイルスRNAに由来するcDNAに特異的なプライマー(例えば、polプライマーセット及びenv2プライマーセット)を用いてqRT-PCRを行い、形質導入細胞のウイルス量を評価する。各々pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xで形質導入した細胞のウイルス量は、pAC3-emdベクターで形質導入した細胞よりも顕著に低いことを結果は示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3pは、転写後レベルにおいてウイルスRNAゲノムを効果的に分解し、したがって、マウス及びヒト造血細胞におけるベクター拡散を制限するという考えを結果は支持する。
【０２８０】
実施例２０：  qPCRによる組み込まれたプロウイルスDNA試験
上記のGFP発現抑制に対するmiR-142-3pTの機能的効果は、翻訳レベルにおけるGFP発現の直接的抑性に起因するのか、あるいはウイルスゲノムの分解及びプロウイルスDNAの組込みに起因するのかは不明である。実験の最後の時点において、標準的な分子生物学的方法を用いるゲノムDNA抽出のために、一部の細胞を回収する。組み込まれたプロウイルスDNAに特異的なプライマーを用いてqPCRを行い、1細胞あたりの組み込まれたプロウイルスDNAのコピー数を評価する。各々pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4Xで形質導入した細胞の細胞あたりのコピー数は、pAC3-emdベクターで形質導入した細胞よりも顕著に低いことを結果は示す。マウス及びヒト造血細胞におけるmiR-142-3pは、転写後レベルにおいてウイルスRNAゲノムを効果的に分解し、したがって、マウス及びヒト造血細胞におけるベクター拡散を制限するという考えを結果は支持する。
【０２８１】
実施例２１：  142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの培養中のベクター安定性試験
142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの多重連続感染サイクルを試験し、ベクターの安定性を評価する。最初に、HT1080及びU87-MG細胞を低いMOIにおいてベクターに感染させ、培養液中に拡散させる。各感染サイクルのベクターストックを回収、濾過、及び希釈し、新鮮な細胞に感染させる。env遺伝子の3'及びIRESに連結した異種ポリヌクレオチド配列のベクター下流にある非翻訳領域の3'に結合するプライマーを用いる標準的なPCRによって導入遺伝子安定性を評価するために、各感染サイクルの最後に細胞を回収し、ゲノムDNAを抽出する。1コピーの142-3pTを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-yCD2-142-3pT)は少なくとも10〜20サイクルにわたって安定な状態であるが、142-3pTの四つのタンデムリピートを含むベクター(pAC3-emd-142-3pT4X及びpAC3-yCD2-142-3pT4X)は、初期の感染サイクルにおいて、142-3pT配列の欠損を示し得る。
【０２８２】
実施例２２：  in vivoにおける、142-3pTを含む組換えレトロウイルスベクターの制御されたベクター拡散試験
下記の実施例27と同じ設計でこの実験を行う。移植したU87異種移植片を有する8週齢のBalb/Cマウスへの組換えレトロウイルスベクター(pAC3-emd、pAC3-emd-142-3pT及びpAC3-emd-142-3pT4X)の静脈内注射により、造血細胞におけるベクター拡散を制限するmiR-142-3pの機能的効果をin vivoで試験する。各ベクターに対して、1つの時点(例えば、ウイルスベクター投与30日、60日及び90日後)をそれぞれ代表する3群のマウスがある。各ベクターストックの1E4〜1E7TU用量を全動物に静脈内注射により投与する。各時点の動物を屠殺し、脾臓、リンパ節及び骨髄及び腫瘍を摘出する。回収した亜集団細胞(例えば、CD4+、CD8+など)のGFP発現をフローサイトメトリー解析により解析する。重複実験において、各時点の動物を屠殺し、組織(例えば、肝臓、腎臓、脾臓、腫瘍など)をゲノムDNA抽出のために回収する。qPCRを行い、回収した組織中の組み込まれたプロウイルスDNAの存在を評価する。142-3pTを含むベクターのベクター拡散は造血組織において顕著に減少することを結果は示し、これらの組織におけるベクター複製の減少を示す。同時に、GFP及びPCRシグナルが腫瘍においてなお観察されることは、miR標的配列はリンパ組織における拡散を抑制するが、腫瘍組織における拡散をなお可能にさせることを示す。
【０２８３】
実施例２３：  自発性で、再発性の悪性神経膠腫を患い、T5.0002ベクターと5-FCで処置した患犬における延命
完全な外科的切除の3か月後に再発性の退形成乏突起神経膠腫が現れるオスの35kgのボクサーイヌを、マンニトール及びスクロース、1mg/mlのHAS、0.1mg/mlのアスコルビン酸で等張にした等張Tris/NaCl、pH7.2で精製及び製剤化したT5.0002ウイルス(米国特許第5,792,643号;T.Rodriugez et al. J Gene Med 9:233 2007;米国特許出願第61218063号参照)で5-FCと併用して処置した。腫瘍は約13cm3であり、主要側脳室圧迫及び顕著な正中線偏位を引き起こした(図1参照)。大きいサイズの腫瘍であるため、対流増加送達(CED)を用いて、二つの別のカテーテル(400μL及び480μL)を通してToca 511を注射した。投与したToca 511の全用量は、約4.1×106TU/脳gであった。ProHance(登録商標)(ガドテリドール)をToca 511に加え、注射し、MRIによる送達の視覚化を可能にした。ベクターの分布量は、腫瘍体積の約10〜12%と推定された。
【０２８４】
図21A及び21Bは、Toca 511及びガドリニウムの腫瘍内CED注射の間、患犬から得たMRI画像の静止画像である。画像の左側にある大きな腫瘍が脳の両側を圧迫し、正中線構造を右側に移動させていることに注意されたい。白い領域は、ガドリニウム-Toca 511注射である。図21Bは、腫瘍内の二つのカテーテルの留置を示す。
【０２８５】
Toca 511を8日間拡散させた。経口により、5日間、毎日3回の食事と共に130mg/kg/日の分割用量の5-FCでイヌを処置した。さらに2日間、用量を160mg/kg/日まで増加させた(5-FCについて合計7日)。追跡MRIでは、腫瘍サイズに変化はなく、腫瘍の内部領域にいくつかの変化の可能性を示した。ウイルス拡散21日後、2番目のサイクルの5-FCを160mg/kg/日(分割、食事と共に1日3回)のより高い用量で開始した。発疹の発生のため、投与5日後に薬物を停止した。
【０２８６】
5-FCの第一の治療単位の2週間後及び5-FCの第二の治療単位の2週間後(治療開始後7週)に行ったMRIは、腫瘍体積がプラトーになり、腫瘍増殖率は減少したことを示す。ベクター注射13週後、このイヌはより機敏で活発になり、臨床的に安定な状態であった。記載している現在で、イヌは生存している。このイヌの推測寿命は、ベクターの最初の注射の時点で、わずか3〜4週であった。この患犬におけるToca 511/5-FC併用有効性は、担当獣医によって最初に推定された生存よりも3〜4倍長い生存によって示される。
【０２８７】
実施例２４：  γインターフェロンベクターの構築
A.ヒトIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターの構築及び試験
ヒトIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-hIFNgは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-hIFNgベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。ヒトIFN-γ遺伝子のcDNA配列を同定し、異なるアクセッション番号(AM903379、BC070256、及びNM000619)から得た三つの配列間で確かめた。配列アラインメントはこの三つの間で同一の配列を示した。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するヒトIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号38)を合成し、続いてpAC3骨格内の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-hIFNgは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びヒトIFN-γをコードする(図22)。
【０２８８】
FUGENE HDトランスフェクション試薬を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAをHT1080細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション48時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。未希釈ベクターストックの特定量を用いて、75%集密度の新鮮なHT1080に感染させた。感染4日及び5日後に、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２８９】
最初に、ヒトIFN-γの発現をRNAレベルで試験した。標準的なRNA抽出法を用いて、二次感染の感染5日後のHT1080形質導入細胞から全RNAを抽出した。RT-PCRを行い、ヒトIFN-γの発現を検出した。cDNAを作製するためにRT反応で50ngの全RNAを使用した。その後に、RT反応物の1/10体積を、ヒトIFN-γに特異的なPCRプライマーセットを用いるPCRに使用した。ヒトIFN-γがpAC3-hIFNgベクターで感染させたHT1080細胞内で発現することをRT-PCRの結果は示した。
【０２９０】
ヒトIFN-γ分泌タンパク質の発現を、標準的なELISAにより試験した。タンパク質濃度及び希釈係数間で直線的な範囲を得るために、感染4日及び5日後に回収したベクターストックをELISAアッセイにおいて段階希釈した。ヒトIFN-γタンパク質が、感染4日後の細胞よりも感染5日後のHT1080細胞により、より高い濃度で分泌されることを結果は示した(図24)。感染5日後の細胞は、約325〜355pg/mLのヒトIFN-γタンパク質を分泌した。
【０２９１】
B.マウスIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターの構築及び試験
マウスIFN-γ遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-mIFNgは、上記のpAC3-yCD2骨格に由来した。pAC3-mIFNgベクターのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。マウスIFN-γ遺伝子のcDNA配列を同定し、異なるアクセッション番号(BC119063、BC119065及びNM008337)から得た三つの配列間で確かめた。配列アラインメントがこの三つの間で同一配列を示した。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するマウスIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号39)を合成し、pAC3骨格内の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-mIFNgは、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びマウスIFN-γをコードする(図22)。
【０２９２】
FUGENE HDトランスフェクション試薬を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAをHT1080細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製した。トランスフェクション48時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45mフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。未希釈ベクターストックの特定体積を用いて、75%集密度の新鮮なHT1080に感染させた。感染4日及び5日後に、ベクターを含む上清を回収し、0.45mフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０２９３】
最初に、マウスIFN-γの発現をRNAレベルで試験した。標準的なRNA抽出法を用いて、二次感染の感染5日後のHT1080形質導入細胞から全RNAを抽出した。RT-PCRを行い、マウスIFN-γの発現を検出した。cDNAを作製するためにRT反応で50ngの全RNAを使用した。その後に、RT反応物の1/10体積を、マウスIFN-γに特異的なPCRプライマーセットを用いるPCRに使用した(図23)。マウスIFN-γがpAC3-mIFNgベクターで感染させたHT1080細胞内で発現することをRT-PCRの結果は示した。
【０２９４】
ヒトIFN-γ分泌タンパク質の発現を、標準的なELISAにより試験した。タンパク質濃度及び希釈係数間で線形の範囲を得るために、感染4日及び5日後に回収したベクターストックをELISAアッセイにおいて段階希釈した。マウスIFN-γタンパク質が、感染4日後の細胞よりも感染5日後のHT1080細胞により、より高い濃度で分泌されることを結果は示した(図25)。感染5日後の細胞は、約33〜42ng/mLのマウスIFN-γタンパク質を分泌した。
【０２９５】
実施例２５：  マウス皮下腫瘍モデルにおける、γインターフェロンを発現するベクターを用いる抗腫瘍有効性試験
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)に腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの腫瘍増殖に対する効果を評価することが本研究の目的である。
【０２９６】
マウス
メスのBALB/cマウス(8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
【０２９７】
細胞
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
【０２９８】
ベクター
一過性トランスフェクションにより(又は、最初のトランスフェクション由来の感染ウイルスを用いた第二細胞株の感染後の産生細胞株から;米国特許出願第61218063号)、約3E6 TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。γインターフェロンは種交差反応性が低く、異種細胞株の使用が産生細胞に対するγインターフェロンの阻害作用を防ぐことから、高い力価の物質を得るために、イヌのCF2細胞株を産生のために選択する。本明細書に記載したように、ベクターを精製し、濃縮する。約3E3、3E4及び3E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL体積でベクターをIT投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca 621とする。
【０２９９】
腫瘍移植及びベクター注射
メスBALB/c(99匹のマウス、9〜10週齢)の9群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca 621ベクターのIT注射(第三〜五群)、又はToca 621ベクターの静脈内注射(第六〜八群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第九群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
【０３００】
データ解析
最初に到達する方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。Toca 621投与に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
【０３０１】
結果
経時的な腫瘍サイズの測定結果は、対照ベクター又はビヒクルを注射した動物における腫瘍と比較して、γIFNを発現するベクターで処理した腫瘍増殖では統計的に有意な違いがあることを示す。
【０３０２】
実施例２６：  マウス皮下腫瘍モデルにおける、γインターフェロンを発現するベクターを用いる抗腫瘍有効性試験
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)における腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウスγインターフェロン配列(pAC3-mIFNg)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの腫瘍増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
【０３０３】
マウス
メスのBALB/cマウス(8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
【０３０４】
細胞
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
【０３０５】
ベクター
一過性トランスフェクションにより(又は、最初のトランスフェクション由来の感染ウイルスを用いた第二細胞株の感染後の産生細胞株から;米国特許出願第61218063号)、約3E6TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。γインターフェロンは種交差反応性が低く、異種細胞株の使用が産生細胞に対するγインターフェロンの阻害作用を防ぐことから、高い力価の物質を得るために、イヌのCF2細胞株を産生のために選択する。本明細書に記載したように、ベクターを精製し、濃縮する。約3E3、3E4及び3E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL体積でベクターをIT投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca 621とする。
【０３０６】
腫瘍移植及びベクター注射
メスBALB/c(99匹のマウス、9〜10週齢)の9群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、溶媒(第一群)、対照ベクター[AC3-GFP(V)(第二群)、Toca 621ベクターのIT注射(第三〜五群)、又はToca 621ベクターの静脈内注射(第六〜八群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第九群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
【０３０７】
データ解析
最初に到達する方に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。Toca 621投与に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
【０３０８】
結果
経時的な腫瘍サイズの測定結果は、対照ベクター又はビヒクルを注射した動物における腫瘍と比較して、γIFNを発現するベクターで処理した腫瘍増殖では統計的に有意な違いがあることを示す。
【０３０９】
実施例２７：  複製レトロウイルスベクターを用いた静脈内遺伝子送達
目的
マーカーの緑色蛍光タンパク質を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクター(AC3-GFP(V))の、ヌードマウスの脳に移植したU87神経膠腫への静脈内送達の有効性を評価することが本研究の目的である。
【０３１０】
マウス
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nu(ヌード)マウス(約8週齢)をハーラン社(Indianapolis IN)から購入した。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させた。右線条体に移植する、3.5mmの突起を含む蓋を取り付けた3.0mmの突起を備える留置ガイドカニューレの外科的留置をマウスに行った。定位座標は、(十字縫合から)AP=+0.5mm、ML=-1.8mmである。
【０３１１】
細胞
U-87 MG細胞(ATCC, Manassas VA)は、44歳の白人女性の悪性神経膠腫に由来する。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養した。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。ガイドカニューレを通して挿入した3.5mm突起を有する注射カニューレにより、U-87 MG細胞(1μL中に1E5)を1分あたり0.2μLで頭蓋(IC)に注入した(5分、その後5分間の保持が続く)。
【０３１２】
ベクター
ベクター調製物を、一過性トランスフェクションにより作製し、全てのベクターは約2.8E7 TU/mlの力価を有した。約1.4E45 TU/マウスの最小総用量/マウスで、5μL以下の量で腫瘍内に(IT)ベクターを投与した。静脈内注射を2.8E6/100μLで尾静脈に行った。
【０３１３】
腫瘍移植及びベクター注射
メスの胸腺欠損nude-Foxn1^nuマウス(16匹、9〜10週齢)の5群にU-87腫瘍細胞をICに移植し(0日目)、その後、ビヒクルIV(第一群)、ベクターIV(第二群)で(U-87細胞の増殖率に応じて4〜7日目に)IT又はIVに、血液脳関門破壊物質バルデナフィル及びベクターでITに(第三群)、バルデナフィル及びベクターでITに(第四群)、又はベクターでITに(第五群)投与した。ベクター注射14日後、マウスを屠殺し、腫瘍を単離し、GFP発現について解析した。
【０３１４】
データ解析
マウスから単離しバラバラにした腫瘍のU87細胞を、第二〜五群のGFP陽性パーセントについて、フローサイトメトリーにより解析した(図26)。単離したU87細胞のGFPシグナルの分布を測定するために、第一、第三、及び第五群においてヒストグラム解析も行った(図27)。
【０３１５】
結果
GFPの静脈内送達は、ヌードマウスの頭蓋内に移植したU87神経膠腫細胞の腫瘍内注射と同等に効果的であった。
【０３１６】
実施例２８：  ヒトIL-2遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターの構築
ヒトIL2遺伝子をコードする複製適合性レトロウイルスベクターpAC3-hIL2は、pAC3-yCD2骨格に由来する。pAC3-hIL2ベクターコード化プラスミドDNAのpAC3骨格を、pAC3-yCD2プラスミドDNAのPsi I及びNot Iでのエンドヌクレアーゼ消化により単離した。ヒトIFN-γ遺伝子のcDNA配列を、異なるアクセッション番号(BC066255及びBC066257)から得た配列を用いて同定し、確かめた。二つの配列アラインメントは同一配列を明らかにした。DNA断片の各末端に存在するPsi I及びNot I制限酵素部位を有するヒトIFN-γのオープンリーディングフレーム(配列番号40)を合成し、続いてpAC3骨格の対応する部位に挿入した。得られた構築物pAC3-hIL2は、四つの遺伝子:gag、pol、env、及びヒトIL2をコードする(図28)。
【０３１７】
リン酸カルシウム法を用いて、ベクターコード化プラスミドDNAを293T細胞に一過性にトランスフェクションすることにより、ベクターストックを作製する。トランスフェクション18時間後、培養液を新鮮培地と交換した。培地交換24時間後、ベクターを含む上清を回収し、0.45μmフィルターで濾過し、すぐに使用するか又は後の使用のために-80℃で、一定分量で保存した。20μLの回収したベクターストックを使用して、ヒト前立腺ガン細胞PC3に感染させた。感染24時間後、AZTを細胞に加え、さらなるウイルス複製を阻害した。感染48時間後、感染させたPC3細胞のゲノムDNAを力価アッセイのために抽出した。ベクターストックの力価を、既知のコピー数の標準物を用いたqPCRにより決定した。
【０３１８】
最初に、ヒトIL-2の発現をRNAレベルで試験する。標準的なRNA抽出法を用いて、感染5日後のCF2TH及びHT1080形質導入細胞から全RNAを抽出する。RT-PCRを行い、ヒトIL-2の発現を検出した。cDNAを作製するためにRT反応で50ngの全RNAを使用した。その後に、RT反応物の1/10体積を、ヒトIL-2に特異的なPCRプライマーセットを用いるPCRに使用した。ヒトIL-2がpAC3-hIL2ベクターで形質導入したHT1080細胞内で発現することをRT-PCRの結果は示す。
【０３１９】
ヒトIL-2分泌タンパク質の発現を、標準的なELISAにより試験した。タンパク質濃度及び希釈係数間で線形の範囲を得るために、感染5日後に回収したベクターストックをELISAアッセイにおいて段階希釈した。ヒトIL-2タンパク質が、感染5日後のHT1080細胞によりも、CF2TH細胞により、より高い濃度で分泌されることを結果は示した。
【０３２０】
実施例２９：  マウス皮下腫瘍モデルにおける、インターロイキン2を発現するベクターを用いる抗腫瘍有効性試験
目的
皮下結腸ガンを保有するBALB/cマウス(CT26.WT)における腫瘍内(IT)注射により送達する場合の、マウス白血球指向性ホルモンインターロイキン2(IL-2)配列(pAC3-mIL2)を保有する新規MLVに基づく複製適合性レトロウイルスベクターの、腫瘍増殖における効果を評価することが本研究の目的である。
【０３２１】
マウス
メスのBALB/cマウス(約8週齢)をジャクソン研究所(Bar Harbor,ME)から購入する。到着後試験の開始前の7日間、マウスを気候順化させる。
【０３２２】
細胞
CT26.WT細胞(ATCC, Manassas VA)は、N-ニトロソ-N-メチルウレタン(NNMU)で誘導される未分化結腸ガンの細胞株である。10%ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、及びグルタマックス(Hyclone,Logan UT、及びInvitrogen,San Diego CA)を含むダルベッコ改変イーグル培地で細胞を培養する。移植のために細胞をPBS(Hyclone,Logan UT)で再懸濁する。CT26.WT細胞(100μL中2E5)を、BALB/cマウスの右わき腹に注射する。
【０３２３】
ベクター
一過性トランスフェクションにより(又は産生細胞株から;仮出願参照)、約6E6 TU/mlの力価を有するベクター調製物を作製する。最初の研究については、ベクターをさらに精製又は濃縮をしない。全用量反応曲線を得るための以後の実験のために、約10E8/mlと期待される力価を有する高い力価の精製物質を準備する。約6E5 TU/マウスの総用量/マウスで、100μL量でITにベクターを投与する。γインターフェロンを発現するベクターをToca IL2とする。
【０３２４】
腫瘍移植及びベクター注射
メスBALB/c(55匹のマウス、9〜10週齢)の5群にCT26.WT腫瘍細胞を皮下移植し(0日目)、その後、ビヒクル(第一群)、対照ベクターAC3-GFP(V)(第二群)、Toca IL2ベクターのIT注射(第三群)、又はToca IL2ベクターの静脈内注射(第四群)を(CT26腫瘍の増殖率に応じて4〜7日目に;約50〜100mm3)投与する。第五群のマウスには腫瘍を移植せず、ベクターのみ静脈内注射する。
【０３２５】
データ解析
最初の状態に基づいて2000mm3又は60日目まで腫瘍増殖解析を実行する。各群の10匹のマウスの腫瘍サイズを時間と共にプロットする。分散分析(ANOVA)を用いて統計的有意性を決定する。Prism 5統計ソフトウェア(GraphPad Software)又はそれと同等の物を用いて実行する全解析において、P値<0.05を統計的に有意であるとみなす。治療中のIL-2発現に対する任意の有害事象を評価するために、生存中の観察も行う。
【０３２６】
結果
MLVを複製させることによるIL-2の送達は、BALB/c CT26マウスモデルの腫瘍量を減少させ、場合によっては除去する。
【０３２７】
本開示の多くの実施形態を記載した。しかしながら、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更形態が行われ得ると理解されよう。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１−１】
0005992548.tif 000019
【図１−２】
0005992548.tif 000020
【図１−３】
0005992548.tif 000021
【図２】
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【図３−１】
0005992548.tif 000023
【図３−２】
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【図３−３】
0005992548.tif 000025
【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図３−１４】
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【図３−１５】
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【図３−１６】
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【図３−１７】
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【図３−１８】
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【図３−１９】
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【図３−２０】
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【図３−２１】
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【図３−２２】
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【図３−２３】
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【図３−２４】
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【図３−２５】
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【図３−２６】
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【図３−２７】
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【図３−２８】
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【図３−２９】
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【図３−３０】
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【図３−３１】
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【図３−３２】
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【図３−３３】
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【図３−３４】
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【図３−３５】
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【図３−３６】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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