(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、第１認識半部位を有する第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
を含む組換え単鎖メガヌクレアーゼであって、
前記第１および第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはポリペプチドリンカにより共有結合され、前記リンカは２５より大きく３１未満の残基を含む可撓性リンカであり、
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧユニットは、配列番号１の１５１〜１５３位からなる群から選択される位置に対応する残基で前記ポリペプチドリンカと共有的に結合し、
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧユニットは、配列番号１の７〜９位からなる群から選択される位置に対応する残基で前記ポリペプチドリンカと共有的に結合し、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識、切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項２】
配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、第１認識半部位を有する第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、第２認識半部位を有する第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと、
を含む組換え単鎖メガヌクレアーゼであって、
前記第１および第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはポリペプチドリンカにより共有結合され、
前記リンカはＮ末端からＣ末端まで、第１のループ、第１のαヘリックス、第１のターン、第２のαヘリックス、及び第２のループを含み、
前記第１ＬＡＧＬＩＤＡＤＧユニットは、配列番号１の１５２〜１６３位からなる群から選択される位置に対応する残基で前記ポリペプチドリンカと共有的に結合し、
前記第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧユニットは、配列番号１の１〜９位からなる群から選択される位置に対応する残基で前記ポリペプチドリンカと共有的に結合し、
前記第１及び第２ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは一緒に機能して、前記第１認識半部位及び前記第２認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ配列を、認識、切断することができる、組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項３】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインの少なくとも１つは、Y75, L75, C75, Y139, C46, A46, H75, R75, H46, K46, R46, K70, E70, E75, E46, D46, Q70, C70, L70, Q75, H139, Q46, G70, A70, S70, G46, T44, A44, V44, I44, L44, N44, D70, K44, R44, H70, D44, E44, C44, Q68, C24, E68, F68, K24, R24, M68, C68, L68, H68, Y68, K68, A26, Q77, E77, K26, R77, E26, S77, Q26, S26, E42, R42, K28, C28, Q42, M66, K66, Q40, E40, R28, R40, C40, I40, V40, C79, I79, V79, Q28, A40, A79, A28, H28, S40, S28, E38, K30, R30, K38, R38, E30, I38, L38, C38, H38, N38, Q30, F33, E33, D33, H33, L33, V33, I33, C33, R32, R33, E32, K32, L32, V32, A32, C32, D32, I32, N32, H32, Q32, およびT32からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１又は２記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項４】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットはそれぞれ、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項５】
前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの少なくとも一つは、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位を有し、
他の前記ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、少なくとも一つの塩基対の修飾が、配列番号７〜３０からなる群から選択される認識半部位と異なる認識半部位を有する、
請求項４に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項６】
前記リンカは、２３〜５６個の残基を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項７】
前記リンカを構成する前記残基の少なくとも５０％は極性非荷電残基である、請求項１記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項８】
前記極性非荷電残基がＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、及びＴｈｒからなる群から選択される、請求項７記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項９】
前記リンカがＧｌｙ−Ｓｅｒリンカである、請求項１記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１０】
前記リンカが（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＳ）ｎ、又は（ＳＧＧＳ）ｎの繰り返しを含む、請求項１記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１１】
真核細胞（但し、ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞細胞、ヒト胚性幹細胞を除く。）の染色体中に挿入された関心のある外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で製造する方法であって、
（ａ）（ｉ）メガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸配列と、（ｉｉ）前記関心のある配列を含む第２核酸配列と、を含む一つ以上の核酸を用いて、真核細胞にトランスフェクトすること、又は
（ｂ）メガヌクレアーゼタンパク質を真核細胞に導入すること、及び前記関心のある配列を含有する核酸を用いて前記真核細胞にトランスフェクトすること、を含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体内に切断部位が作られ、該切断部位で前記関心のある配列が前記染色体に挿入され、
前記メガヌクレアーゼは、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである、方法。
【請求項１２】
真核細胞（但し、ヒト配偶子、ヒト接合子、ヒト胚盤胞細胞、ヒト胚性幹細胞を除く。）の染色体中で標的配列を混乱させることによって遺伝子組換え真核細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で製造する方法であって、
メガヌクレアーゼをエンコードする核酸を用いて真核細胞にトランスフェクトすることを含み、
前記メガヌクレアーゼにより前記染色体中に切断部位を作り、該切断部位で前記標的配
列を非相同的末端結合によって混乱させ、
前記メガヌクレアーゼは請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼである、方法。
【請求項１３】
前記真核細胞が、非ヒト配偶子、非ヒト接合子、非ヒト胚盤胞細胞、非ヒト胚性幹細胞、およびプロトプラスト細胞からなる群から選択され、前記遺伝子組換え生物を製造するために、前記遺伝子組換え真核細胞を成長させる、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記非ヒト遺伝子組換え生物が植物であり、前記遺伝子組換え真核細胞がプロトプラストである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト遺伝子組換え生物が動物であり、前記遺伝子組換え真核細胞が非ヒト接合子又は非ヒト胚性幹細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【請求項１７】
真核生物宿主のウイルス性病原体感染又は真核生物宿主の原核細胞系病原体感染の治療に用いられる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換え単鎖メガヌクレアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に本発明は、異なる認識配列半部位に関して特異性を持つ一対の酵素サブユニットが単鎖ポリペプチドに結合され、非パリンドローム認識配列を持つ機能的へテロ二量体を形成する、合理的に設計された非天然由来のメガヌクレアーゼに関する。また本発明は、該メガヌクレアーゼを製造する方法、および該メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生物を製造する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム工学には、ゲノム内の特異的な遺伝子配列を挿入、欠失、置換およびその他操作する性能が必要とされ、数多くの治療的および生物工学的な用途がある。ゲノム修飾の効果的な手段の開発は、遺伝子治療、農業技術および合成生物学において大きな目的を残している（非特許文献１、２、３、）。ＤＮＡ配列を挿入または修飾する一般的な方法は、ゲノム標的に相同性のある配列に挟まれた遺伝子導入ＤＮＡ配列を導入することと、効果を挙げた相同組換え事象を選択またはスクリーニングすることとを含む。遺伝子導入ＤＮＡを用いる組換えが起こることはまれであるが、該組換えは、標的部位で、ゲノムＤＮＡ中の二本鎖切断端によって刺激される可能性がある。ＤＮＡ二本鎖切断端を作るために数多くの方法が使用されてきており、照射処理および化学処理が挙げられる。これらの方法は組換えを効率的に刺激するが、該二本鎖切断端はゲノム中に無作為に分散し、この状態は、変異原性および毒性が高い可能性がある。現在、染色体バックグラウンド内で固有の部位に対し遺伝子修飾を標的にすることができないことは、ゲノム工学の成功への大きな障害となっている。
【０００３】
この目的を達成するための一つの取組みとして、ゲノム内の単一部位のみに存在する十分に大きい配列に対して特異性のあるヌクレアーゼを使用して、標的遺伝子座中の二本鎖切断端で相同組換えを刺激することがある（たとえば、非特許文献１参照）。この方法の有効性は、遺伝子操作されたＺｎフィンガＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特異的ヌクレアーゼドメインとの間のキメラ融合を使用する種々の生物において実証されている（非特許文献４、５、６）。これらの人工的Ｚｎフィンガヌクレアーゼは、部位特異的組換えを刺激するが、ヌクレアーゼドメインの制御が十分でないことに起因して、残存非特異的切断活性を保持し、しばしば予想外の部位で切断する（非特許文献７）。このような予想外の切断により、処置された生物では、突然変異および毒性を起こす可能性がある（非特許文献１）。
【０００４】
植物および菌類のゲノム中に一般的に見出される１５−４０塩基対切断部位を認識する一群の天然由来のヌクレアーゼにより、低毒性のゲノム工学的代替物が提供されるかもしれない。そのような「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、グループＩ自己スプライシングイントロンおよびインテインのような寄生性ＤＮＡエレメントに会合していることが多い。これらは、染色体中で二本鎖切断端を生成することによって、宿主ゲノム中の特異的な位置で相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進し、これにより細胞内ＤＮＡ修復機構が動員される（非特許文献８）。メガヌクレアーゼは、一般的に、四つのファミリ、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリ、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリ、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリおよびＨＮＨファミリに分類される。これらのファミリは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。たとえば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリのメンバは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの一つまたは二つのコピーを有することを特徴とする（非特許文献９参照）。一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチ
ーフを持つＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（「モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」）は、ホモ二量体を形成し、一方二コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを持つメンバ（「ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」）は単量体として見出される。Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＩ−ＭｓｏＩのようなモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、パリンドローム性または擬似パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識、切断し、一方、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＡｎｉＩおよびＩ−ＤｍｏＩのようなジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼは、一般的に、非パリンドローム性であるＤＮＡ部位を認識する（非特許文献８）。
【０００５】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリからの天然メガヌクレアーゼは、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳類細胞およびマウスにおいて、部位特異的なゲノム修飾を効果的に促進するために使用されているが、この取組みは、メガヌクレアーゼ認識配列を保存する相同遺伝子の修飾（非特許文献１０）、または認識配列が導入されているプレエンジニアリングされたゲノムに対する修飾（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５）のいずれかに限定されている。
【０００６】
ヌクレアーゼ刺激遺伝子修飾の体系的実施には、ゲノム中の既存部位へのＤＮＡ破壊を標的にするようにカスタマイズされた特異性をもつ遺伝子操作された酵素を使用することが必要であり、したがって、医学または生物工学関連部位で遺伝子修飾を促進するために、メガヌクレアーゼを適用することは、大きな関心がもたれてきている（非特許文献１、１６、１７）。
【０００７】
Ｉ−ＣｒｅＩは、葉緑体染色体中の２２塩基対認識配列を認識および切断するＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリのメンバであり、メガヌクレアーゼ再設計用の魅力的な標的を提供する。野生型酵素は、各単量体が完全長認識配列において９塩基対と直接接触するホモ二量体である。遺伝的選択技術は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ切断部位の優先度を変更するために使用されてきた（非特許文献１６、１８、１９、２０、２１、２２、特許文献１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１）。つい最近では、哺乳類、酵母、植物、細菌およびウィルスのゲノム中の部位を始めとする多様なＤＮＡ部位を標的にするために、Ｉ−ＣｒｅＩおよび他のそのようなメガヌクレアーゼを包括的に再設計しうる、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法が記述された（特許文献１２）。
【０００８】
大部分の遺伝子工学的用途のために、Ｉ−ＣｒｅＩのようなモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを使用することの主な限界は、これらの酵素が、パリンドローム性ＤＮＡ認識部位を自然に標的にするという事実である。そのような冗長な（１０〜４０ｂｐ）パリンドローム性ＤＮＡ部位は、実際にはまれであり、関心のあるＤＮＡ部位において偶然に起こることは、到底不可能である。モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを持つ非パリンドロームＤＮＡ部位を標的にするために、二つの異なる半部位を認識し、ヘテロ二量体化し、所望の非パリンドローム部位を切断するメガヌクレアーゼを形成する一対の単量体を製造することができる。ヘテロ二量体化は、宿主細胞中で一対のメガヌクレアーゼ単量体を共発現することによって、またはインビトロで一対の精製ホモ二量体メガヌクレアーゼを混合し、該サブユニットをヘテロ二量体に再会合させることによって達成することができる（非特許文献２３、２４、特許文献１２、１３、１４、１５、１６）。どちらの取組みも２つの主要な限界を負う。すなわち、（１）これらは、所望のヘテロ二量体種を製造するために、２個のメガヌクレアーゼ遺伝子の発現が必要であること（これは、遺伝子送達およびインビボでの使用を複雑にする）および（２）その結果物は、約２５％の第１ホモ二量体、５０％のヘテロ二量体および２５％の第２ホモ二量体の混合物であるが、所望のものはヘテロ二量体のみであることである。この後者の限界は、特許文献１２、１７、１８、および非特許文献２５に記載されるように、二つのメガヌクレアーゼの二量体化境界面を遺伝子操作して、ホモ二量体化よりヘテロ二量体化を促進することによ
ってかなりの程度まで克服することができる。たとえそうであっても、二つのメガヌクレアーゼ遺伝子を発現しなければならず、ホモ二量体化が、完全に阻止されるわけではない。
【０００９】
一つ以上のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来する非パリンドローム認識部位を持つメガヌクレアーゼの形成への代替の取組みは、二つのメガヌクレアーゼに由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの融合を含む単鎖ポリペプチドの製造である。そのようなメガヌクレアーゼを製造するために二つの一般的方法を適用することができる。
【００１０】
第１の方法では、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの一つを、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって置き換えることができる。この取組みは、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ  Ｉ−ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットをＩ−ＣｒｅＩサブユニットに置き換えることによって実証された。（非特許文献１７、２６、特許文献１９）。結果物は、ハイブリッドＤＮＡ部位を認識および切断したハイブリッドＩ−ＤｍｏＩ／Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼであった。
【００１１】
第２の方法では、一対のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを、ペプチドリンカによって結合し、「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を作成することができる。そのようなＩ−ＣｒｅＩの単鎖誘導体を製造する１つの試みが報告されている（非特許文献１７、特許文献１９）。しかし、本明細書および非特許文献２５で検討するように、現在、この方法では、共有結合したＩ−ＣｒｅＩサブユニットが一緒に機能し、非パリンドローム認識部位を認識および切断する、単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼは製造されないことを示唆する証拠がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開公報第２００８／０１０００９号
【特許文献２】国際公開公報第２００７／０９３９１８号
【特許文献３】国際公開公報第２００７／０９３８３６号
【特許文献４】国際公開公報第２００６／０９７７８４号
【特許文献５】国際公開公報第２００８／０５９３１７号
【特許文献６】国際公開公報第２００８／０５９３８２号
【特許文献７】国際公開公報第２００８／１０２１９８号
【特許文献８】国際公開公報第２００７／０６０４９５号
【特許文献９】国際公開公報第２００７／０４９１５６号
【特許文献１０】国際公開公報第２００６／０９７８５３号
【特許文献１１】国際公開公報第２００４／０６７７３６号
【特許文献１２】国際公開公報第２００７／０４７８５９号
【特許文献１３】国際公開公報第２００６／０９７８５４号
【特許文献１４】国際公開公報第２００７／０５７７８１号
【特許文献１５】国際公開公報第２００７／０４９０９５号
【特許文献１６】国際公開公報第２００７／０３４２６２号
【特許文献１７】国際公開公報第２００８／０９３２４９号
【特許文献１８】国際公開公報第２００８／０９３１５２号
【特許文献１９】国際公開公報第２００３／０７８６１９号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献２】Ｔｚｆｉｒａら（２００５），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７−９
【非特許文献３】ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６−８３
【非特許文献４】Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４３８−４６
【非特許文献５】Ｗｒｉｇｈｔら（２００５），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５
【非特許文献６】Ｕｒｎｏｖら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ４３５：６４６−５１
【非特許文献７】Ｓｍｉｔｈら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９
【非特許文献８】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５
【非特許文献９】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４
【非特許文献１０】Ｍｏｎｎａｔら（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８−９３
【非特許文献１１】Ｒｏｕｅｔら（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６
【非特許文献１２】Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６−６５
【非特許文献１３】Ｐｕｃｈｔａら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：５０５５−６０
【非特許文献１４】Ｒｏｎｇら（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１
【非特許文献１５】Ｇｏｕｂｌｅら（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２
【非特許文献１６】Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１
【非特許文献１７】Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２
【非特許文献１８】Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８
【非特許文献１９】Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９
【非特許文献２０】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８
【非特許文献２１】Ｒｏｓｅｎら（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：４７９１−４８００
【非特許文献２２】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７）．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７１：４９−６５，
【非特許文献２３】Ｓｍｉｔｈら（２００６），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：１４９−１５７
【非特許文献２４】Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１７８−１８６
【非特許文献２５】Ｆａｊａｒｄｏ−Ｓａｎｃｈｅｚら（２００８）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６：２１６３−２１７３
【非特許文献２６】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１０：８９５−９０５
【非特許文献２７】Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６
【非特許文献２８】Ｐｒｉｅｔｏら（２００７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：３２６２−３２７１
【非特許文献２９】Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ２：４６９−４７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、当該分野では、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識および切断するために、Ｉ−ＣｒｅＩのようなモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ酵素に由来する単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼを製造する方法の必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、ペプチドリンカが二つの異種ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼサブユニットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」または「単鎖メガヌクレアーゼ」を形成し、少なくともＮ末端サブユニットはモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来し、およびサブユニットは一緒に機能して、二つのサブユニットの認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを切断する融合タンパク質の開発に、一部基づく。特に、本発明は、天然由来のメガヌクレアーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺伝子操作するために、使用することができる。また、本発明は、特に、遺伝子操作、遺伝子治療、病原性感染の治療ならびに診断および研究においてインビトロで使用するために、メガヌクレアーゼを利用して生物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配列の組換えを起こすことによって、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸および生物を製造する方法を提供する。
【００１６】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、一種以上のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来する一対の共有結合されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、一緒に機能して非パリンドローム認識部位を認識および切断するサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態では、該モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットは、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来する。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、Ｎ末端サブユニットはＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブユニットもＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来するが、Ｎ末端サブユニットは、Ｃ末端サブユニットとは異なる種の野生型メガヌクレアーゼに由来する、一対のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｎ末端サブユニットはＩ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩから選択される野生型メガヌクレアーゼに由来し、およびＣ末端サブユニットはＩ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＡｎｉＩから選択される野生型ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼからの単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する、一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【００１９】
野生型モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼとして、配列番号１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、配列番号２のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ、および配列番号３のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。野生型ジ−ＬＡＧ
ＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼとして、配列番号４のＩ−ＤｍｏＩメガヌクレアーゼ、配列番号５のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ、および配列番号６のＩ−ＡｎｉＩメガヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインとして、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１、配列番号２の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１〜１６２、および配列番号３の野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５〜２１０、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基９−９６、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基１０５〜１７８、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基３２〜１２３、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基１３４〜２２５、配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基４〜１２１、および配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基１３６〜２５４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとして、配列番号１の野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基９〜１５１、配列番号２の野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基１１〜１６２、および配列番号３の野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５５〜２１０、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基９〜９６、配列番号４の野生型Ｉ−ＤｍｏＩの残基１０５〜１７８、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基３２〜１２３、配列番号５の野生型Ｉ−ＳｃｅＩの残基１３４〜２２５、配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基４〜１２１、および配列番号６の野生型Ｉ−ＡｎｉＩの残基１３６〜２５４のいずれか一つと、少なくとも８５％の配列同一性、または８５％〜１００％の配列同一性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインを含有するサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
また、野生型ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとして、一つ以上のアミノ酸修飾が、国際公開公報第２００７／０４７８５９号に開示された、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計する方法に従って含有されている前記ポリペプチド配列のいずれかと、当該分野で公知の他の非天然由来のメガヌクレアーゼ変異体とを含むサブユニットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
ある実施形態では、本発明は、それぞれが配列番号７〜３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位を認識する天然由来のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する、一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、ＤＮＡ結合特異性に関して遺伝子操作された一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、それぞれが、少なくとも一つの塩基が、配列番号７〜３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位とは異なるＤＮＡ半部位を認識するサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は、一つのサブユニットは天然であり、配列番号７〜３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位を認識し、もう一つは、ＤＮＡ結合特異性に関して遺伝子操作され、少なくとも一つの塩基が、配列番号７〜３０から選択される野生型ＤＮＡ半部位とは異なるＤＮＡ部位を認識する一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合するポリペプチドリンカは、可撓性リンカである。特定の実施形態では、該リンカは、１５〜４０個の残基、２５〜３１個の残基、またはこれらの範囲の任意の数の残基を含有することができる。他の特定の実施形態では、リンカを形成する残基の少なくとも５０％または５０％〜１００％が、極性非荷電残基である。
【００２７】
他の実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合するポリペプチドリンカは、安定な二次構造を有する。特定の実施形態では、該安定な二次構造は、少なくとも二つのαへリックス構造を含む。他の特定の実施形態では、該安定な二次構造は、Ｎ末端からＣ末端までに、第１のループ、第１のαへリックス、第１のターン、第２のαへリックスおよび第２のループを含む。ある特定の実施形態では、該リンカは、２３〜５６個の残基、または該範囲内の任意の数の残基を含有することができる。
【００２８】
他の態様では、本発明は、本明細書で記載し、実施可能な単鎖メガヌクレアーゼを使用する種々の方法を提供する。これらの方法は、遺伝子組換え細胞および生物を製造すること、遺伝子治療によって疾患を治療すること、病原体感染を治療すること、および診断または研究のためのインビトロでの用途のために組換え単鎖メガヌクレアーゼを使用することを含む。
【００２９】
したがって、一態様では、本発明は、（ｉ）本発明のメガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を、細胞にトランスフェクトすることによって、染色体中に挿入された前記関心のある外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心のある配列を染色体に挿入する方法を提供する。
【００３０】
あるいは、他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を細胞に導入し、関心のある配列を含有する核酸を該細胞にトランスフェクトすることによって、染色体中に挿入された関心のある外因性配列を含有する遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中で切断部位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端結合のどちらかにより、関心のある配列を染色体に挿入する方法を提供する。
【００３１】
他の態様では、本発明は、染色体中の標的配列を混乱させ、本発明のメガヌクレアーゼをエンコードする核酸を細胞にトランスフェクトすることにより、遺伝子組換え真核細胞を製造する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部位で、非相同的末端結合により、標的配列を混乱させる方法を提供する。
【００３２】
他の態様では、本発明は、先に記載した方法に従って遺伝子組換え真核細胞を製造し、該遺伝子組換え真核細胞を成長させ、遺伝子組換え生物を製造することによって、遺伝子組換え生物を製造する方法を提供する。これらの実施形態では、真核細胞を、配偶子、接合子、胚盤胞細胞、胚性幹細胞およびプロトプラスト細胞から選択することができる。
【００３３】
他の態様では、本発明は、（ｉ）本発明のメガヌクレアーゼをエンコードする第１核酸配列および（ｉｉ）関心のある配列を含む第２核酸配列を含有する一つ以上の核酸を、真核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることで、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、関心のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合により染色体に挿入し、該関心のある配列の挿入により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供する。
【００３４】
あるいは他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼタンパク質を真核生物の少なくとも一つの細胞に導入し、関心のある配列を含む核酸を細胞にトランスフェクトすることで、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部位で、相同組換えまたは非相同的末端結合により関心のある配列を染色体に挿入し、該関心のある配列の挿入により疾患の遺伝
子治療がもたらされる方法を提供する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼをエンコードした核酸を真核生物の少なくとも一つの細胞にトランスフェクトすることにより、真核生物の染色体中の標的配列を混乱させて、真核生物において遺伝子治療により疾患を治療する方法であって、メガヌクレアーゼにより染色体中に切断部位を作り、該切断部で非相同的末端結合により標的配列を混乱させ、該標的配列の混乱により疾患の遺伝子治療がもたらされる方法を提供する。
【００３６】
他の態様では、本発明は、本発明のメガヌクレアーゼをエンコードした核酸を宿主の少なくとも一つの感染細胞にトランスフェクトすることにより、病原体のゲノム中の標的配列を混乱させて、真核生物宿主におけるウィルス性または原核細胞系病原体感染を治療する方法であって、メガヌクレアーゼによりゲノム中に切断部位を作り、（１）該切断部位での非相同的末端結合または（２）第２核酸を用いる相同組換えのいずれかにより標的配列を混乱させ、該標的配列の混乱により感染の治療がもたらされる方法を提供する。
【００３７】
これらおよび本発明の他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明に基づき、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明のリンカ（リンカ９）、および該ライナーによって結合されたエンドヌクレアーゼサブユニットのＮ末端およびＣ末端残基の一実施形態の構造成分の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．１  導入
本発明は、ペプチドリンカが二つの異種ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼサブユニットを共有結合で連結して「単鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」を形成し、該サブユニットは一緒に機能して、該二つのサブユニットの認識半部位のハイブリッドである非パリンドロームＤＮＡ認識部位に優先的に結合し、これを切断する融合タンパク質の開発に、一部基づく。特に、天然由来のメガヌクレアーゼが認識しない、非パリンドロームＤＮＡ配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを遺伝子操作するために、本発明を使用することができる。
【００４０】
この発見は、以下に詳細に記載するように、自然ではホモ二量体として機能するモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、単鎖メガヌクレアーゼに結合するために使用されている。さらに、本発明は、ＤＮＡ認識特異性に関して再設計されたモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを、二つのメガヌクレアーゼホモ二量体によって認識されるパリンドローム性部位のハイブリッドであるＤＮＡ配列を認識および切断する単鎖ヘテロ二量体に、結合するために使用されている。本発明は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを単鎖ポリペプチドに結合するための代表的なペプチドリンカ配列を提供する。本発明が、リンカ配列の一般的製造方法および異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットをつなぐための融合ポイントの一般的選択方法を提供し、機能的な、合理的に設計された単鎖メガヌクレアーゼを製造することは重要である。
【００４１】
また、本発明は、特に、遺伝子操作、遺伝子治療、病原性感染および癌の治療、ならびに診断および研究におけるインビトロでの使用のために、メガヌクレアーゼを利用して生物のゲノム内の限られた数の遺伝子座で所望の遺伝子配列の組換えを起こすことによって、前記メガヌクレアーゼを使用して組換え核酸、細胞および生物を製造する方法も提供する。
【００４２】
一般的事項として、本発明は、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットであって、Ｎ末端サブユニットは、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩまたはＩ−ＣｅｕＩ、あるいはこれらの変異体のような天然のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来し、Ｃ末端サブユニットは、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼか、あるいはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩまたはＩ−ＡｎｉＩのようなジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのドメインのうちの一つのいずれかに由来するサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼを生成する方法を提供する。該方法は、先に記載された方法（非特許文献１７、２６、特許文献１９）とは、Ｎ末端サブユニットがモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼに由来する組換え単鎖メガヌクレアーゼを製造するために、特異的な新規リンカ配列および融合ポイントの使用が必要である点で異なる。
【００４３】
以下に詳細に記載するように、組換え単鎖メガヌクレアーゼを製造する方法は、結合されるべき二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて特定された融合ポイントを使用することと、単鎖ポリペプチドに結合するために特定されたリンカ配列を使用することとを含む。さらに、本明細書では明記されていない融合ポイントを同定するため、および本明細書では明記されていない機能的リンカ配列を製造するために、一組の規則を規定する。
【００４４】
したがって、一態様では、本発明は、組換え単鎖ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを製造する方法を提供する。他の態様では、本発明は、これらの方法により得られる組換え単鎖メガヌクレアーゼを提供する。他の態様では、本発明は、細胞または生物のゲノム内の所望のＤＮＡ配列または遺伝子座がＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換またはその他の操作によって修飾されている組換え核酸、細胞および生物を製造するために、そのような単鎖メガヌクレアーゼを使用する方法を提供する。他の態様では、本発明は、病原体に特異的なまたは癌に特異的な認識配列を有する単鎖メガヌクレアーゼを使用して、病原体または癌細胞の生存率を下げる方法を提供する。
【００４５】
１．２  参考文献および定義
本明細書で記載されている特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を構築する。本明細書で挙げた、発行された米国特許、許可された出願、公開された米国およびＰＣＴ国際出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれ、具体的かつ個別に、参照により本発明に組み込まれると記載されているように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書で使用される用語「メガヌクレアーゼ」は、認識配列で二本鎖ＤＮＡを結合するエンドヌクレアーゼであって、長さが１２塩基対を超えるものをいう。天然由来のメガヌクレアーゼは、単量体（たとえば、Ｉ−ＳｃｅＩ）または二量体（たとえば、Ｉ−ＣｒｅＩ）である可能性がある。本明細書で使用される用語メガヌクレアーゼは、単量体メガヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、会合して二量体メガヌクレアーゼを形成する単量体、または本発明の組換え単鎖メガヌクレアーゼを指すために使用することができる。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義である。
【００４７】
本明細書で使用される用語「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、天然では二量体である、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼ、または天然では単量体である、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧを含有するメガヌクレアーゼを言う。この二つを区別する必要がある場合は、用語「モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書では、単一ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すために使用され、用語「ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書では、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有するメガヌクレアーゼを指すために使用される。
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含有し、酵素活性を有するジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つの構造ドメインのそれぞれ、およびモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの個々の単量体のそれぞれは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット、または単純に「サブユニット」と言うことができる。
【００４８】
ペプチド配列に関して、本明細書で使用される「終わり」はＣ末端を指し、「始まり」はＮ末端を指す。したがって、たとえば、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの始まり」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド配列中のＮ最末端アミノ酸を指し、一方、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの終わり」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むペプチド配列中のＣ最末端アミノ酸を指す。
【００４９】
本明細書で使用される用語「合理的に設計された」は、非天然由来のおよび／または遺伝子操作された、を意味する。本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型または天然由来のメガヌクレアーゼと、それらのアミノ酸配列または一次構造が異なり、それらの第二、第三、第四次構造も異なる場合もある。さらに、本発明の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型または天然由来のメガヌクレアーゼと、認識配列特異性および／または活性においても異なる。
【００５０】
タンパク質に関して、本明細書で使用される用語「組換え」は、タンパク質をエンコードする核酸、およびタンパク質を発現する細胞または生物に対する遺伝子操作技術の適用の結果、変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関し、用語「組換え」は、遺伝子操作技術の適用の結果、変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術として、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術、トランスフェクション、トランスフォーメーションおよび他の遺伝子転移技術、相同組換え、部位特異的変異誘発および遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定されない。この定義によれば、天然由来のタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニングおよび発現によって製造されたタンパク質は、組換えとみなされない。
【００５１】
組換えタンパク質に関し、本明細書で使用される用語「修飾」は、基準配列（たとえば、野生型）に対する組換え配列において、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換のいずれかを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される用語「遺伝子組換え」は、ゲノムＤＮＡ配列が、組換え技術によって計画的に修飾されている細胞または生物、またはこれらの原種が修飾されているものを指す。本明細書で使用される用語「遺伝子組換え」は、用語「遺伝子導入」を包含する。
【００５３】
本明細書で使用される用語「野生型」は、メガヌクレアーゼの任意の天然由来の形態を指す。用語「野生型」は、自然の酵素の最も一般的な対立遺伝子変異体を意味するのではなく、自然に見出される全ての対立遺伝子変異体を意味するものである。野生型メガヌクレアーゼは、組換えまたは非天然由来のメガヌクレアーゼとは区別される。
【００５４】
本明細書で使用される用語「認識配列半部位」、または単純に「半部位」は、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの単量体、またはジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの一つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子中の核酸配列を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される用語「認識配列」は、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ二量体またはジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のどちらかによって、結合および切断される半部位の一対を言う。二つの半部位は、酵素によって特異的に認識さ
れない塩基対によって分離されても、されなくてもよい。Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩの場合、各単量体の認識配列半部位は、９塩基対に広がり、二つの半部位は、酵素の結合により直接接触していないが、実際の切断部位（４塩基対オーバーハングを有する）を構築する四つの塩基対によって分離される。したがって、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ二量体の組合わされた認識配列は、通常、４塩基対切断部位の横に位置する、二つの９塩基対半部位を含む２２塩基対に広がる。ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体であるＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの場合、認識配列は、約１８ｂｐ非パリンドローム配列であり、特異的に認識されない中心塩基対は存在しない。慣例により、二本のストランドの一本を「センス」鎖といい、もう一本を「アンチセンス」鎖と言うが、どちらの鎖もタンパク質をエンコードしていなくてよい。
【００５６】
本明細書で使用される用語「特異性」は、認識配列と言われる塩基対の特定の配列のみで、または認識配列の特定の一組のみで、二本鎖ＤＮＡ分子を認識、切断する、メガヌクレアーゼの能力を意味する。認識配列の組みは、ある保存位置または配列モチーフを共有するが、一つ以上の位置で縮重していてもよい。高度に特異的なメガヌクレアーゼは、一つだけまたは非常に少ない数の認識配列を切断することができる。特異性は、実施例１で記載するような切断アッセイによって測定することができる。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、生理的条件下で、基準メガヌクレアーゼ（たとえば、野生型）によって、結合されるのではなく切断される認識配列を、結合し切断する場合、あるいは認識配列の切断速度が、標準メガヌクレアーゼに対して生理学的に相当な量（たとえば、少なくとも２倍、または２倍〜１０倍）によって増加または減少する場合、「変化した」特異性を有する。
【００５７】
本明細書で使用される用語「パリンドローム性」は、同一の半部位の逆方向反復を構成する認識配列を指す。しかし、パリンドローム性配列は、酵素の結合によって直接接触していない中心塩基対（たとえば、Ｉ−ＣｒｅＩ認識部位の四つの中心塩基対）に関して、パリンドローム性である必要はない。天然由来の二量体メガヌクレアーゼの場合、パリンドローム性ＤＮＡ配列は、二つの単量体が同一の半部位と接触しているホモ二量体によって認識される。
【００５８】
本明細書で使用される用語「擬似パリンドローム性」は、同一でないまたは不完全なパリンドローム性半部位の逆方向反復を構成する認識配列を指す。酵素の結合により直接接触していない中心塩基対の他に、擬似パリンドローム性配列は、二つの半部位のそれぞれにおいて、１〜３塩基対で、二つの認識半部位の間のパリンドローム性配列から逸脱する可能性がある。擬似パリンドローム性ＤＮＡ配列は、二つの同一の酵素単量体が僅かに異なる半部位に接触する野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼによって認識される天然ＤＮＡ部位に特有のものである。
【００５９】
本明細書で使用される用語「非パリンドローム」は、メガヌクレアーゼの二つの無関係な半部位で構成された認識配列を指す。この場合、非パリンドローム配列は、二つの半部位のそれぞれで、中心塩基対または４以上の塩基対のいずれかに関して、パリンドローム性である必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、高縮重モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（たとえば、Ｉ−ＣｅｕＩ）によって、または同一でない半部位を認識するモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のヘテロ二量体によって認識される。後者の場合、二つの異なるモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ単量体のヘテロ二量体は、これらが単鎖ポリペプチドに融合していてもしていなくても、各単量体によって認識される一つの半部位を含む認識配列を切断するので、非パリンドローム認識配列を「ハイブリッド配列」と言ってもよい。したがって、ヘテロ二量体認識配列は、二つのホモ二量体認識配列のハイブリッドである。
【００６０】
本明細書で使用される用語「リンカ」は、二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを単鎖ポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を言う。リンカは、天然のタンパク質中に見出される配列を有してもよいし、またはいかなる天然のタンパク質中にも見出されない人工的な配列であってもよい。リンカは、可撓性で二次構造が欠けていてもよいし、または生理的条件下で特異的な三次元構造を形成する傾向を有してもよい。
【００６１】
本明細書で使用される用語「融合ポイント」は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットとリンカとの間の接合点を指す。具体的には、「Ｎ末端融合ポイント」は、リンカ配列の前の、Ｎ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最終の（Ｃ最末端）アミノ酸であり、「Ｃ末端融合ポイント」は、リンカ配列の後の、Ｃ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの最初の（Ｎ最末端）アミノ酸である。
【００６２】
本明細書で使用される用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、リンカによって結合された、一対のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含むポリペプチドを指す。単鎖メガヌクレアーゼは、組織：Ｎ末端サブユニット−リンカ−Ｃ末端サブユニットを有する。単鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニットがモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼから由来していなければならない点において、天然のジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼと区別され、したがって、リンカは、Ｎ末端サブユニットに対して外因性でなければならない。
【００６３】
本明細書で使用される用語「相同組換え」は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列を用いて、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される自然の細胞内プロセスを指す（たとえば、非特許文献２７参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性の染色体配列であっても、または細胞に送達された外因性核酸であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、標的配列内の認識配列を切断するために使用され、標的配列に対し相同性を持つまたは実質的な配列類似性を持つ外因性核酸が細胞に送達され、相同組換えによって修復のためのテンプレートとして使用される。これによって、標的配列と大きく相違するかもしれない外因性核酸のＤＮＡ配列が、染色体の配列に導入される。相同組換えのプロセスは、主として、真核生物の生物において起こる。用語「相同性」は、本明細書では、「配列類似性」と同等のものとして使用され、血統または系統的な関連性による同一性は必要とされないものである。
【００６４】
本明細書で使用される用語「非相同的末端結合」は、二本鎖ＤＮＡ切断が二つの非相同性ＤＮＡセグメントの直接結合によって修復される、自然の細胞内プロセスを指す（たとえば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。非相同的末端結合によるＤＮＡ修復は、エラーを起こしがちで、しばしば、修復部位で非テンプレート付加またはＤＮＡ配列の欠失を起こす結果となる。したがって、ある実施形態では、非相同的末端結合によって、遺伝子を混乱させる（たとえば、塩基挿入、塩基欠失またはフレームシフト突然変異を導入することによって）ように標的配列内のメガヌクレアーゼ認識配列で、二本鎖切断端を製造するために、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを使用することができる。他の実施形態では、標的配列に対する相同性、または実質的な配列類似性を欠く外因性核酸を、非相同的末端結合によって、メガヌクレアーゼで刺激された二本鎖ＤＮＡ切断の部位で捕獲してもよい（たとえば、Ｓａｌｏｍｏｎら（１９９８），ＥＭＢＯＪ．１７：６０８６−６０９５参照）。非相同的末端結合のプロセスは、真核生物および細菌のような原核生物の両方において起こる。
【００６５】
本明細書で使用される用語「関心のある配列」は、タンパク質、ＲＮＡまたは調節エレメント（たとえば、エンハンサ、サイレンサまたはプロモータ配列）をコードする場合、メガヌクレアーゼタンパク質を使用して、ゲノムに挿入されうる、またはゲノムＤＮＡ配
列の置換えに使用されうる任意の核酸配列を意味する。関心のある配列は、該関心のある配列から発現されるタンパク質またはＲＮＡにタグをつけることを可能にする異種ＤＮＡ配列を有する可能性がある。たとえば、エピトープ（たとえば、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）または他のリガンド（たとえば、ポリ−Ｈｉｓ）（これらに限定されない）を始めとするタグで、タンパク質にタグをつけることができる。さらに、関心のある配列は、当該分野で公知の技術に従って融合タンパク質をエンコードすることができる（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  １９９９参照）。いくつかの実施形態では、関心のある配列は、切断用の組換えメガヌクレアーゼに認識されるＤＮＡ配列の横に配置されている。したがって、フランキング配列は切断され、関心のある配列が組換えメガヌクレアーゼによって切断されたゲノム認識配列へ正しく挿入される。いくつかの実施形態では、相同組換えにより標的配列が関心のある配列に効率的に置き換わるように、関心のある配列全体が、ゲノム中の標的配列に相同性があるか、あるいは実質的な配列類似性を有する。他の実施形態では、相同組換えによりゲノム内の関心のある配列が標的配列の遺伝子座で挿入されるように、関心のある配列は、標的配列と相同性であるか、あるいは実質的に配列類似性のあるＤＮＡ配列に挟まれている。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼが関心のある配列によって修飾された後、標的配列を切断できないように、関心のある配列は、メガヌクレアーゼ認識配列において、突然変異または他の修飾以外の標的配列に対し実質的に同一である。
【００６６】
アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して、本明細書で使用される用語「類似性百分率」および「配列類似性」は、整列アミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にし、配列アラインメントにおける、同一または類似する残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチド総数、およびギャップの存在および長さの関数である、配列のアラインメントに基づく二つの配列が類似する程度の測定値を言う。標準パラメータを使用して配列類似性を測定するために、種々のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが入手可能である。本明細書で使用される配列類似性は、どちらも、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より入手可能であり、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴｐプログラムおよび核酸配列用のＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２、Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３  ８９−３４０２）、Ｚｈａｎｇら（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（ｌ−２）：２０３−１４に記載されている。本明細書で使用される二つのアミノ酸配列の類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズム用の以下のパラメータ：語長＝３、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝−１１、ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝−１、およびスコアマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づくスコアである。本明細書で使用される二つの核酸配列の類似性百分率は、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズム用の以下のパラメータ：語長＝１１、ギャップ・オープニング・ペナルティ＝−５、ギャップ・エクステンション・ペナルティ＝−２、マッチリワード＝１、およびミスマッチペナルティ＝−３に基づくスコアである。
【００６７】
二つのタンパク質またはアミノ酸配列の修飾に関して、本明細書で使用される用語「に対応する」は、第１タンパク質の特定の修飾が、第２のタンパク質の修飾と同じアミノ酸残基の置換であり、二つのタンパク質を、標準配列アラインメント（たとえば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）に供した場合、第１タンパク質の修飾のアミノ酸の位置が、第２のタンパク質の修飾のアミノ酸位置に対応するまたは一致することを示すために使用される。したがって、もし、配列アラインメントにおいて残基ＸおよびＹが互いに対応す
れば、ＸおよびＹが異なる数であっても、第１タンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への修飾は、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への修飾に対応することになる。
【００６８】
本明細書で使用される変数に関する数字の範囲の記述は、本発明が、その範囲内の任意の値に等しい変数を用いて実施できることを伝えるものである。したがって、本質的に不連続な変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む数字の範囲内の任意の整数と同一でありうる。同様に、本質的に連続した変数に関して、該変数は、その範囲の終点を含む数字の範囲内の任意の実数値と同一でありうる。限定ではない、例示として、もし変数が本質的に不連続であれば、０と２との間の値を持つと記載された変数は、０、１または２の値をとることができ、変数が本質的に連続であれば、変数は、０．０、０．１、０．０１、０．００１、または≧０および≦２の他の任意の実数をとりうる。
【００６９】
他に特定の示唆がない限り、本明細書で使用される用語「または」は、「および／または」を含む意味で使用され、「どちらか／または」の意味は含まない。
【００７０】
２．ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
天然のモノ−およびジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの構造比較は、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのＮ末端サブユニットが、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ単量体より小さい傾向にあることを明らかにする。この結果は、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの場合、Ｎ末端サブユニットの終点（Ｃ末端）は、Ｃ末端サブユニットの始点（Ｎ末端）に非常に近いということである。これは、比較的短い（たとえば、５〜２０アミノ酸）リンカは、二つのサブユニットを結合するのに十分であることを意味する。モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの場合、一つの単量体のＣ末端は、一般的に、第２単量体のＮ末端から非常に遠い（Ｉ−ＣｒｅＩの場合、約４８Å）。したがって、一対のモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを単鎖ポリペプチドに融合するには、この距離に広がることができるより長い（たとえば、＞２０アミノ酸）ペプチドリンカが必要である。Ｎ末端サブユニットをＣ末端サブユニットの始点に空間的により近い点でトランケートする代替方法は、先に報告されている（非特許文献１７、特許文献１９）が、以下の実施例１に示すように、この方法では、どのような機能的へテロ二量体も殆ど製造されない。Ｉ−ＣｒｅＩに由来する機能的単鎖メガヌクレアーゼの製造に関する難しさについての広範な検討は、非特許文献２５に見出すことができる。
【００７１】
２．１  Ｉ−ＣｒｅＩに関する融合ポイント
野生型Ｉ−ＣｒｅＩ、またはそのＤＮＡ切断部位優先度に関して変更されたＩ−ＣｒｅＩの操作された変異体（「ＣＣＲ２」と示される、配列番号３１、特許文献１２参照）のどちらかを、天然Ｃ末端アミノ酸、Ｐｒｏ１６３の前で停止させた、一連のトランケーション変異体を作った（表１）。変異体ホモ二量体がＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、これを精製し、野生型認識配列（配列番号３４〜３５）またはＣＣＲ２認識配列（配列番号３２〜３３）のどちらかで培養して、切断活性の試験を行った。
【表１】
0006050861.tif 000002
【００７２】
野生型Ｉ−ＣｒｅＩは、残基１４８以上のＣ末端残基でトランケートされた場合は活性であるが、残基１４１以上のＮ末端残基でトランケートされた場合は不活性であることがわかった。したがって、野生型活性のためには、残基１４１から１４７の少なくともいくつかの残基、またはそれらの残基の保存的置換が必要である。同様に、ＣＣＲ２は、残基１５１以上のＣ末端残基でトランケートされた場合は活性であるが、残基１４８以上のＮ末端残基で停止された場合は不活性であることがわかった。したがって、ＣＣＲ２活性のためには、残基１４８から１５０の少なくともいくつかの残基、またはそれらの残基の保存的置換が必要である。野生型Ｉ−ＣｒｅＩと合理的に設計されたＣＣＲ２メガヌクレアーゼとの間の違いは、おそらく、未成熟Ｃ末端トランケーションによりさらなる不安定化に対してより敏感になるように、ＣＣＲ２メガヌクレアーゼの構造的安定性における減少によるものであろう。これらのトランケーションの結果は、Ｉ−ＣｒｅＩのＣ末端ループ（アミノ酸１３８−１４２）は、切断活性に必須であることが発見されたというＰｒｉｅｔｏらの刊行物（Ｐｒｉｅｔｏら（２００７），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３５：３２６２−３２７１）と一致する。まとめると、これらの結果は、Ｉ−ＣｒｅＩのＣ末端に近傍のいくつかの残基は、ＤＮＡ結合および／または触媒活性に必須であり、残基１４２のほぼ前のＩ−ＣｒｅＩサブユニットをトランケートする単鎖メガヌクレアーゼの製造方法（たとえば、Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）によって、両ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットが触媒的に活性な単鎖メガヌクレアーゼを得ることは見込みがないことを示す。
【００７３】
したがって、本発明によれば、位置１４２〜１５１の任意の位置、または残基１５１に対するＣ末端の任意の位置を含む、Ｎ末端融合ポイント（すなわち、Ｎ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットとリンカとの間）は、Ｎ末端サブユニットの残基１４２に対するＣ末端にあるべきである。Ｉ−ＣｒｅＩの残基１５４−１６３は、非構造的であり（Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ２：４６９−４７６）、したがって、これらの残基を含むことにより可撓性が増し、得られる単鎖メガヌクレアーゼの構造の不安定性もおそらく増すであろう。逆に、可撓性を少なくし、構造安定性を強めることが望ましいまたは必要
であると決めた場合は、残基１４２−１５３の融合ポイントを選択することができる。
【００７４】
単鎖メガヌクレアーゼのＣ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットがＩ−ＣｒｅＩに由来するという条件下で、リンカのＣ末端融合ポイントは、Ｉ−ＣｒｅＩ配列のＮ末端に向いている。残基７、８および９は、（１）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼファミリメンバの間に構造的に保存され、したがって、ヘテロ二量体の形成において、他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバとの大きな適合性を提供でき、（２）触媒機能に関与する保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むαへリックスを開始するという理由で、Ｉ−ＣｒｅＩ中のＣ末端融合ポイントとして特に関心がもたれる。しかし、残基１−６の任意の残基を含む残基７に対する融合ポイントＮ末端も、本発明に従って使用することができる。
【００７５】
以下のＩ−ＣｒｅＩ  Ｎ末端およびＣ末端融合ポイントは、さらなる実験のために選択したが、本発明の範囲を限定するように考えるべきではない。
【表２】
0006050861.tif 000003
【００７６】
２．２  Ｉ−ＣｒｅＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ用のリンカ
一対のＩ−ＣｒｅＩ単量体を単鎖ポリペプチドに結合する目的で、二つの一般的なクラスのリンカ、（１）二次構造を欠く非構造化リンカ、および（２）二次構造を有する構造化リンカについて考慮した。非構造化リンカの例は、当該分野で周知であり、ＧＩｙおよびＳｅｒ含有率が高い、または反復を含む人工配列が挙げられる。構造化リンカも当該分野で周知であり、タンパク質ホールディングの基本的な原理を使用して設計されたもの（たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：２１−３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  １９９８）が挙げられる。
【００７７】
「ＬＡＭｌ」（配列番号３６）および「ＬＡＭ２」（配列番号３７）と呼ばれる一対の合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ単量体を使用して、本発明を検証した。これらの合理的に設計されたエンドヌクレアーゼは、国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載された方法を使用して製造され、該公報で特徴付けられている。しかし、当業者には明らかであろうが、ＬＡＭ１およびＬＡＭ２単量体は、野生型モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット、Ｎ末端および／またはＣ−末端がトランケートされた野生型モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット、Ｎ末端および／またはＣ末端がトランケートされた野生型ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび先に記載した任意のものの合理的に設計された修飾形態を始めとする、使用することができる多くの単量体の単なる例示である。
【００７８】
単量体の一例であるＬＡＭ１は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩとは７つのアミノ酸が異なり、半部位：
５’−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣ−３’（配列番号３８）
３’−ＡＣＧＣＣＡＣＡＧ−５’（配列番号３９）
を認識する。したがって、ＬＡＭ１ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、
各Ｎは非拘束型である）：
５’−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＣＣＧＣＡ−３’（配列番号４０）
３’−ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＧＧＣＧＴ−５’（配列番号４１）
を認識する。
【００７９】
他の単量体の例示であるＬＡＭ２は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩとは５個のアミノ酸が異なり、半部位：
５’−ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号４２）
３’−ＧＴＣＣＧＡＣＡＧ−５’（配列番号４３）
を認識する。したがって、ＬＡＭ２ホモ二量体は、パリンドローム性認識配列（ここで、各Ｎは非拘束型である）：
５’−ＣＡＧＧＣＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４４）
３’−ＧＴＣＣＧＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ−５’（配列番号４５）
を認識する。
【００８０】
一つのＬＡＭ１単量体と一つのＬＡＭ２単量体とを含む（「ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体」）ヘテロ二量体は、そのため、ハイブリッド認識配列：
５’−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＮＮＮＮＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’（配列番号４０）
３’−ＡＣＧＣＣＡＣＡＧＮＮＮＮＣＴＧＴＣＧＧＡＣ−５’（配列番号４１）
を認識する。
【００８１】
２．２．１  単鎖メガヌクレアーゼ用の可撓性リンカ
種々の高可撓性ペプチドリンカは当該分野で公知であり、本発明に従って使用することができる。たとえば、限定ではないが、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ反復単位を含むペプチドリンカは、非構造的で、可撓性であることが知られている（Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  １９９８）。この組成および類似する組成を持つリンカは、たとえば、単鎖抗体（Ｍａｃｋら（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９２：７０２１−７０２５）、成長因子受容体（Ｕｅｄａら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４１：１５９−１７０）、酵素（Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓら（２００２），２６９：３５７０−３５７７）、およびＤＮＡ結合およびヌクレアーゼドメイン（Ｋｉｍら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１５６−１１６０）と一緒に、タンパク質ドメインを融合するために、しばしば使用される。
【００８２】
一般的事項として、可撓性リンカは、生理的条件下で安定な二次構造を形成しない任意のポリペプチド配列を含みうる。いくつかの実施形態では、リンカは、高い割合（たとえば、＞５０％、６０％、７０％、８０％または９０％、あるいは一般的には、５０％〜１００％）で、極性非荷電残基（すなわち、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧＩｎ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ）を含有する。さらに、いくつかの実施形態では、リンカは、大きな疎水性残基（すなわち、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ）を含有する割合が低い。リンカは、種々の長さの繰返し（たとえば、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ）、ランダム配列、またはこれらの二つの組合せを含んでもよい。
【００８３】
したがって、本発明に従って、Ｖａｌ−１５１またはＡｓｐ−１５３をＮ末端融合ポイントとして、およびＰｈｅ−９をＣ末端融合ポイントとして使用して、高可撓性ペプチドリンカがＮ末端（ＬＡＭ１）サブユニットをＣ末端（ＬＡＭ２）サブユニットに共有結合した一組の単鎖融合を、ＬＡＭ１とＬＡＭ２との間に製造した。単鎖タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉで発現し、これを精製し、一つのＬＡＭ１半部位と一つのＬＡＭ２半部位と（配列番号４６および４７）を含むハイブリッドＤＮＡ部位を切断する能力に関して、試験した。切断活性を、−：活性は検出不能、＋：最小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エ
ンドヌクレアーゼ精製前のＥ．ｃｏｌｉ中の二つの単量体の共発現により製造されたＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する活性の四点スケールで評価した。また、発現または精製中にリンカ領域がタンパク分解され、二つのサブユニットを遊離する程度を測定するＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても、該タンパク質を評価した。
【表３】
0006050861.tif 000004
【００８４】
結果は、表３中のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカのような可撓性リンカは、長さが正しければ、単鎖メガヌクレアーゼ製造に適することを示した（実施例２も参照）。たとえば、表３に関して、それぞれ合計２２個および２５個のアミノ酸を含むリンカ１および２を含有する単鎖メガヌクレアーゼは、試験された融合ポイントに関して、いかなる検出可能な切断活性も発揮しなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、これらのメガヌクレアーゼは未変化で、プロテアーゼによって分解されなかったことが示され、つまり、これらの単鎖メガヌクレアーゼは、構造的には安定であるが、機能的には、あまりに短すぎて個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに、ＤＮＡ結合および／または触媒作用のために必要な立体配座を適用できないリンカによって制約されているという結論に達した。それぞれ２８、２９、３０および２８個のアミノ酸を含むリンカ３、６、７および８は、全て、低い切断活性のレベルを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、それぞれ、少量（５％〜１０％）は、個々のサブユニットにタンパク分解されるが、一方、大部分は、完全長単鎖メガヌクレアーゼ（約４０キロダルトン）に対応する分子量を持つことが示された。３および８は、同じリンカ配列を有するが、Ｎ末端融合ポイントは、それぞれ、Ｖａｌ−１５１およびＡｓｐ−１５３であった。両単鎖メガヌクレアーゼは、同等の活性を示し、この場合、正確な融合ポイントは重大な意味を持つものではないことを示した。最後に、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した場合、それぞれ、３１個および３４個のアミノ酸を含むリンカ４および５からは、検出しうる単鎖メガヌクレアーゼが得られなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出されたように、これらのリンカは、個々のＬＡＭ１および／またはＬＡＭ２サブユニットに完全にタンパク分解され、したがって、これらのメガヌクレアーゼの切断活性は、これ以上調べなかった。
【００８５】
これらの結果により、本発明者らは、リンカの長さが、２５アミノ酸より長く３１アミ
ノ酸より短ければ、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカは、モノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼＩ−ＣｒｅＩおよび使用した特定の融合ポイントのＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに基づく単鎖メガヌクレアーゼの製造にふさわしいと結論付けた。これらの融合ポイントを持つＩ−ＣｒｅＩ系単鎖メガヌクレアーゼに関しては、より短いリンカは触媒作用を妨げるが、より長いリンカは、不安定で、プロテアーゼによってクリッピングする傾向がある。
【００８６】
ふさわしいリンカの長さにおける融合ポイントの変化の効果は、日常的な実験により経験的に測定することができおよび／またはタンパク質構造の三次元モデル化に基づいて予測することができる。融合ポイントはＮ末端またはＣ末端を移動させるので、融合ポイントに近いタンパク質の第二および第三次構造に依存して、他の融合ポイントにより近くに、あるいは該ポイントからより遠くに動きうるということは重要である。したがって、たとえば、Ｃ末端方向へ（たとえば、残基１５０から残基１５５へＮ末端融合ポイントを）動かすが、物理的にＣ末端融合ポイントに近いＮ末端融合ポイントとなる結果には必ずしもならない。なぜなら、たとえば、その領域内のＮ末端残基は、Ｃ末端融合ポイントに向かう、あるいは該ポイントから離れる方向を指す第二／第三次構造の一部であるかもしれないからである。したがって、Ｎ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かす、またはＣ末端融合ポイントをＮ末端またはＣ末端方向に動かすことによって、ふさわしいリンカ長さの範囲内で、より長いまたはより短いリンカに向かってシフトすることになる可能性がある。しかし、該シフトは、本明細書で報告されている実験例、日常の実験および／または三次元モデル化によって示されるように、簡単に測定される。
【００８７】
したがって、いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼ系の二つのＩ−ＣｒｅＩ
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットに関して、有用な可撓性リンカは、表３に示すように、２５残基を超え、３１残基未満（間の全ての値を含む）の長さを有する。しかし、他の実施形態では、リンカが広範囲にタンパク分解されず、単鎖メガヌクレアーゼが、本明細書に記載する簡単なアッセイによって測定されるＤＮＡ結合および切断活性を保持するという条件下で、有用な可撓性リンカは、異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットおよび／または異なる融合ポイントを使用して、１５を超えおよび４０未満の残基（間の全ての値を含む）の長さを有することができる。
【００８８】
２．２．２  単鎖メガヌクレアーゼ用に設計、構造化されたリンカ
長期間にわたって保存が十分安定でかつタンパク分解に対して十分な耐性がある、天然の二量体酵素に匹敵するヌクレアーゼ活性を持つ単鎖Ｉ−ＣｒｅＩ系メガヌクレアーゼを製造することを目的として、サブユニットを共有結合するために、安定な二次構造を有するリンカを使用することができる。タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）検索では、Ｉ−ＣｒｅＩ中で認識されたＮおよびＣ末端融合ポイント間の長い距離（約４８Å）にわたって広がるのに適したリンカを持つ、任意の構造的に特徴付けられたＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質は、明らかにされなかった。したがって、二つのサブユニットを結合するのに適した構造要素を持つことが期待される一組のリンカを製造するために、タンパク質構造を管理する公知の最初の原理（たとえば、ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：２１−３８、Ｆｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  １９９８）を使用した。具体的には、適切なリンカは、以下（Ｎ末端融合ポイントからＣ末端融合ポイントまでを挙げる）を含むと仮定した。
【００８９】
（１）ループ１．この構造要素は、Ｎ末端融合ポイントから始まり、それ自身の上でペプチド鎖の方向を逆転させる（１８０°ターン）。配列は、３〜８アミノ酸が可能であり、少なくとも一つのグリシン残基、いくつかの実施形態では、２〜３グリシンを含みうる。この構造要素は、「Ｃキャッピング」モチーフを導入することによって安定化すること
ができ、Ｉ−ＣｒｅＩのＣ末端αへリックスを終わらせ、後続のターンを開始する。へリックス・キャップ・モチーフは、普通、へリックスの最終ターン中の疎水性アミノ酸で始まるように記載される（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：２１−３８）。Ｃキャップは、表４に挙げる形態の任意のものをとることができる。
【表４】
0006050861.tif 000005
表中、ｈ＝疎水性アミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓ）、ｐ＝極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、ｎ＝β分岐していないアミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＰｒｏではない）、ｘ＝ｈまたはｐ基からの任意のアミノ酸、Ｇ＝グリシン、およびＰ＝プロリンである。Ｔｈｒは、その側鎖に、疎水性（メチル基）および極性（水酸基）官能基の両方を持つので、ｈ基およびｐ基の両方に現れることに注意すべきである。ハイフンは、αへリックスの末端を示し、ｈ１は、へリックスの最終ターンにおける疎水性アミノ酸（すなわち、Ｎ末端融合ポイントの前の疎水性アミノ酸、０〜４個のアミノ酸）である。Ｉ−ＣｒｅＩの場合、ｈ１は、普通、Ｖａｌ−１５１またはＬｅｕ−１５２である。したがって、モチーフ７の例は、配列：Ｖ１５１Ｌ１５２Ｄ１５３Ｓ−ＰＧＳＶである（たとえば、表６、リンカ９参照）。
【００９０】
（２）αへリックス１．ループ１の後、リンカ中のこの最初のαへリックスが、約３０Åの距離でタンパク質の外面上をＩ−ＣｒｅＩ中のＣ末端へリックス（アミノ酸１４４〜１５３）に対し逆平行に走るように設計される。このセグメントは、長さが１０−２０アミノ酸であるべきで、ＮおよびＣキャッピングモチーフ（下方）の外側にグリシンアミノ酸もプロリンアミノ酸も含むべきではなく、一つのへリックス面（疎水性面）はＮ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットの面に対して埋められ、一方他の面は溶剤に触れるように、３〜４アミノ酸周期性を持つ疎水性および極性アミノ酸が交互に並んでいる。たとえば、該へリックスは、形態：ｐｐｈｐｐｈｈｐｐｈｐｐ（ここで、ｐは任意の極性アミノ酸であり、ｈは任意の疎水性アミノ酸である）をとることができるが、配列：ＳＱＡＳＳＡＡＳＳＡＳＳのようなグリシンでもプロリンでもない（たとえば、表６、リンカ９参照）。ペプチド配列の螺旋性向を測定するために、複数のアルゴリズムが利用可能であり（たとえば、ＢＭＥＲＣ−ＰＳＡ，ｈｔｔｐ：／／ｂｍｅｒｃ−ｗｗｗ．ｂｕ．ｅｄｕ／ｐｓａ／、ＮＮＰＲＥＤＩＣＴ，ｈｔｔｐ：／／ａｌｅｘａｎｄｅｒ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／〜ｎｏｍｉ／ｎｎｐｒｅｄｉｃｔ．ｈｔｍｌ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｃｔｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｒｇ）、αヘリカル二次構造
への適用が期待できる適正な長さの配列を作るために、これらのどれでも使用することができる。あるいは、このへリックス配列は、既存の天然または設計されたタンパク質においてαヘリカル二次構造を適用することが知られているペプチド配列に由来しうる。そのようなペプチド配列の数多くの例が、タンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）にある。
【００９１】
さらに、その構造を安定化するために、Ｎキャッピングモチーフを持つαへリックスから開始することが望ましいこともある（ＡｕｒｏｒａおよびＲｏｓｅ（１９９８），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：２１−３８）。このモチーフは、ループ−αへリックス接合点に広がり、普通、表５に示される形態の一つを有する。
【表５】
0006050861.tif 000006
表中、記号は、先の表４と同じであり、ハイフンは、ループとへリックスとの間の接合点を表わす。モチーフ番号２の例は、配列：Ｌ−ＳＰＳＱＡである（たとえば、表６、リンカ９参照）。
【００９２】
（３）ターン１．αへリックス１の後、ペプチド鎖の全配向を、αへリックス１の配向に対して約９０°曲げるために、短い、可撓性ペプチド配列が導入される。この配列は、長さが３〜８アミノ酸であってもよく、１、またはいくつかの実施形態では、２〜３グリシンを含みうる。また、この配列は、αへリックス１を安定化し、ターンを開始するために、表４のモチーフの１つのようなＣキャップを含むこともできる。例示として、Ｃキャッピングモチーフ番号６に一致する配列：ＡＳＳＳ−ＰＧＳＧＩがある（たとえば、表６、リンカ９参照）。この場合、配列：ＡＳＳＳは、αへリックス１の最終ターンであり、一方配列：ＰＧＳＧＩはターン１である。
【００９３】
（４）αへリックス２．このヘリックスは、ターン１の後に続き、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット間の境界面に作られた溝中のＩ−ＣｒｅＩの面に存在するように設計される。この溝の面は、本質的に、Ｎ末端サブユニットのアミノ酸９４〜１００および１３４〜１３９、ならびにＣ末端サブユニットのアミノ酸４８〜６１を含む。
【００９４】
αへリックス２は、αへリックス１より短くなるように設計することができ、該へリックス（４〜１２個のアミノ酸）のターンを１〜３つ含むことができる。αへリックス２は、αへリックス１と同じ全アミノ酸組成を有することができ、表５のＮキャッピングモチーフの追加によって安定化することもできる。配列：Ｉ−ＳＥＡＬＲは、Ｎキャッピングモチーフ番号１と一致する例（たとえば、表６、リンカ９）である。リンカ９は、約二つのターンを作ることが予測される配列：ＳＥＡＬＲＡを含む、比較的短いαへリックス２
を取込む。異なるリンカαへリックス２配列に関する実験により、リンカのこの領域でのヘリカルレジスタの重要性が実証されている。グリシンアミノ酸を用いてαへリックス２の停止前の単一アミノ酸（たとえば、Ａ、リンカ１１）、二つのアミノ酸（たとえば、ＡＳ、リンカ１２）、あるいは三つのアミノ酸（たとえば、ＡＳＳ、リンカ１３）を付加することにより、不安定で、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製ですぐに析出する単鎖Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質（表６）となる可能性がある。対照的に、一つの追加の完全ターンを作り、ヘリカルレジスタをリンカ１のものに回復することが予測される、四つのアミノ酸（たとえば、ＡＳＳＡ、リンカ１４）の付加は、安定で活性である。
【００９５】
（５）ループ２．このループは、αへリックス２を停止し、Ｃ末端融合ポイントで、Ｃ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットと結合するために、ペプチド鎖をそれ自身の上で逆転させる。ループ１のように、この配列は、長さが３〜８アミノ酸とすることができ、一つ以上のグリシンを含みうる。また、αへリックス２を安定化するために、表４のＣキャッピングモチーフを含みうる。たとえば、リンカ９からの配列：ＡＬＲＡ−ＧＡは、Ｃキャッピングモチーフ番号１と一致する。さらに、このセグメントは、Ｃ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットのＮ末端αへリックス（アミノ酸７〜２０）上で、Ｎキャップを開始することができる。たとえば、リンカ９からの配列：Ｔ−ＫＳＫ７Ｅ８Ｆ９は、Ｎキャッピングモチーフ番号２と一致する。この場合、Ｃ末端融合ポイントはＬｙｓ−７である。他の場合、融合ポイントを第２サブユニット（たとえば、アミノ酸８または９）にさらに移動させることができ、場合によっては、１〜２アミノ酸をループ２に付加することで、Ｃ末端融合ポイントを移動させるように、ヘリカルレジスタの変化を補う。たとえば、以下の表６のリンカ１５〜２３は、Ｃ末端融合ポイントとしてＧｌｕ−８を有し、全て、リンカ１〜６に対しループ２内に追加のアミノ酸を有する。
【００９６】
先に記載した原理を使用して、表６に概要を述べたリンカの組を発現させた。ＬＡＭ１サブユニットとＬＡＭ２サブユニットとの間にリンカを取込む一組の単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを構築し、それぞれについて、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド認識配列に対する活性を試験した。全ての場合で、Ｎ末端融合ポイントはＬＡＭ１のＡｓｐ−１５３であり、Ｃ末端融合ポイントは、ＬＡＭ２のＬｙｓ−７またはＧｌｕ−８（「ＣＦＰ」カラム中で表示される）のどちらかであった。切断活性を、−：活性は検出不能、＋：最小活性、＋＋：中程度の活性、＋＋＋：エンドヌクレアーゼ精製前にＥ．ｃｏｌｉ中で二つの単量体を共発現することにより製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する活性の四点スケールで評価した。精製直後、単鎖メガヌクレアーゼを遠心（２１００ｇ１０分間）し、沈殿したタンパク質（構造不安定性を示す）をペレット化し、観測した沈殿物の量（ｐｐｔ）をスコア化した。−：沈殿なし、＋：僅かに沈殿、＋＋：有意に沈殿。有意な程度まで沈殿したタンパク質サンプルは、切断活性に関してアッセイできなかった。
【表６】
0006050861.tif 000007
【００９７】
単鎖メガヌクレアーゼでは、１１〜１３および２３（これらは調べなかった）以外のこれらのリンカのそれぞれは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で所望の分子量（約４０キロダルトン）の単一バンドとして走り、リンカ配列のタンパク質分解切断に対して抵抗性があることを示していた。少なくとも一つのケース（リンカ９）では、単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼを、切断活性の劣化または喪失のいかなる証拠もなしに、４℃で４週間を超えて保存することができた。さらに、数多くの単鎖ＬＡＭエンドヌクレアーゼ（９、１０および１４）は、精製ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵する効率で、ハイブリッドＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列を切断し、これらのリンカを使用してＩ−ＣｒｅＩサブユニットを融合することで、エンドヌクレアーゼ活性は大きく損なわれないことが示された（実施例２参照）。
【００９８】
精製ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体（これは、実際、ホモおよびヘテロ二量体の混合物）とは全く対照的に、表６のリンカを導入する単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼは、パリンドローム性配列のどれよりも、ハイブリッド部位をより高い効率で切断する（実施例２参照）。パリンドローム性配列は、普通、ハイブリッド部位に対して＜５％の効率で切断される。この予想外のパリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、（１）一対の異なる単鎖タンパク質からのＬＡＭ１またはＬＡＭ２サブユニットのホモ二量体化、（２）単鎖メガヌクレアーゼ内の単一サブユニット（ＬＡＭ１またはＬＡＭ２）によるパリンドローム性配列の両鎖の逐次ニッキング、または（３）単鎖メガヌクレアーゼをその個々のサブユニット
にタンパク質分解切断された後に形成される、僅かな量のホモ二量体ＬＡＭ１またはＬＡＭ２のためであろう（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果は、この後の説明をなさそうにするが）。単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、パリンドローム性ＤＮＡ部位に対するある活性を維持するが、該活性は、ハイブリッド部位のほうに非常に大きく偏り、この取組みは今ある方法を超えて、非常に大きな重要性を示す。
【００９９】
３．Ｉ−ＭｓｏＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｉ−ＭｓｏＩは、Ｉ−ＣｒｅＩに近い構造的同族体であり、このメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を再設計するために、類似の方法が存在している（国際公開公報第２００７／０４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ−ＭｓｏＩに直接適用することができる。Ｉ−ＭｓｏＩのアミノ酸Ｐｈｅ−１６０、Ｌｅｕ−１６１およびＬｙｓ−１６２は、それぞれ、Ｉ−ＣｒｅＩのＶａｌ−１５１、Ｌｅｕ−１５２およびＡｓｐ−１５３と、構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ酸を、Ｉ−ＭｓｏＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。さらに、Ｉ−ＭｓｏＩのＸ線結晶構造により、アミノ酸１６１〜１６６は、自然にＣ−キャップとして作用し、ペプチド鎖の方向を逆転するタンパク質のＣ末端でターンを開始することが明らかである。したがって、ループ１のＣキャップ部分を取除くために、リンカをそのＮ末端で縮められれば、Ｉｌｅ−６６を、Ｎ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ−ＭｓｏＩのＰｒｏ−９、Ｔｈｒ−１０およびＧｌｕ−１１は、それぞれ、Ｉ−ＣｒｅＩのＬｙｓ−７、Ｇｌｕ−８およびＰｈｅ−９と、構造的に相同性があり、Ｉ−ＭｓｏＩに関するＣ末端融合ポイントとして選択することができる（表７）。さらに、Ｉ−ＭｓｏＩの配列：Ｌ７Ｑ８Ｐ９Ｔ１０Ｅ１１Ａ１２は、天然Ｎ−キャップ（表５のモチーフ２）を形成するので、Ｌｅｕ−７を、融合ポイントとして挙げることができる。
【表７】
0006050861.tif 000008
【０１００】
表３または６中のリンカはどれも、単鎖Ｉ−ＭｓｏＩエンドヌクレアーゼの製造に使用することができる。たとえば、Ｌｙｓ−１６２およびＰｒｏ−９を融合ポイントとして使用して一対のＩ−ＭｓｏＩサブユニットを機能的単鎖メガヌクレアーゼに結合するために、表６のリンカ９を使用してもよい。一実施形態では、プロリンは構造的に制約されているので、Ｐｒｏ−９を異なるアミノ酸（たとえば、アラニンまたはグリシン）に変える。これは、Ｔｈｒ−１０をＣ末端融合ポイントとして選択すること、および表３または６に列挙されたリンカのＣ末端への付加的アミノ酸を付加することと類似している。たとえば、表８のリンカ２６および２７は、Ｃ末端での単一アミノ酸の付加を除いて表６のリンカ９と同一であり、Ｃ末端融合ポイントにおいてＰｒｏ−９（Ｉ−ＣｒｅＩ  Ｌｙｓ−７と構造的に相同性のある）からＴｈｒ−１０（Ｉ−ＣｒｅＩ  Ｇｌｕ−８に構造的に相同性のある）への変化する原因となる。
【０１０１】
別の実施形態では、実施例４に記載するように、Ｉ−１６６がＮ末端融合ポイントとして選択され、Ｌｅｕ−７がＣ末端融合ポイントとして選択される、表８のリンカ２８〜３０から選択されるリンカ配列を使用して、Ｉ−Ｍｓｏに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造を成功させることもできる。Ｉ−１６６がＮ末端融合ポイントとして選択されるので、ループ１のＣキャップ部分（表６の各リンカの最初の６個のアミノ酸に対応する）を移動させることができる。さらに、リンカ２８−３０のαへリックス１は、表６に挙げられるリンカに対して、へリックスの追加の１ターンに対応する３個のアミノ酸（ＡＡＳ、表８中の下線部）で延長される。リンカ２８−３０および特定の融合ポイントを使用して、一対のＩ−Ｍｓｏ−由来サブユニットを含む、プロテアーゼ−耐性型の高活性単鎖メガヌクレアーゼを製造することが可能である（実施例４参照）。
【表８】
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【０１０２】
４．Ｉ−ＣｅｕＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｉ−ＣｅｕＩは、Ｉ−ＣｒｅＩに構造的に近い同族体であり、このメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を再設計する類似の方法が存在している（国際公開公報第２００７／０４７８５９号）。先に挙げた単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法は、Ｉ−ＣｅｕＩに直接適用することができる。Ｉ−ＣｅｕＩのアミノ酸Ａｌａ−２１０、Ａｒｇ−２１１およびＡｓｎ−２１２は、それぞれ、Ｉ−ＣｒｅＩのＶａｌ−１５１、Ｌｅｕ−１５２およびＡｓｐ−１５３と構造的に相同性がある。したがって、これらのアミノ酸を、Ｉ−ＣｅｕＩ用のＮ末端融合ポイントとして選択することができる。Ｉ−ＣｅｕＩのＳｅｒ−５３、Ｇｌｕ−５４およびＳｅｒ−５５は、それぞれ、Ｉ−ＣｒｅＩのＬｙｓ−７、Ｇｌｕ−８およびＰｈｅ−９と構造的に相同性があり、Ｉ−ＣｅｕＩ用のＣ末端融合ポイントとして選択しうる（表９）。
【表９】
0006050861.tif 000010
【０１０３】
表３または６中のいずれのリンカも、単鎖Ｉ−ＣｅｕＩエンドヌクレアーゼの製造に効果的である可能性がある。たとえば、Ｉ−ＣｅｕＩサブユニットは、Ａｓｎ−２１２をＮ末端融合ポイントとして、Ｓｅｒ−５３をＣ末端融合ポイントとして使用して、表６のリンカ９によって結合しうる。
【０１０４】
Ｉ−ＣｅｕＩ用に選択されたＣ末端融合ポイントは、アミノ酸１〜５２をＣ末端Ｉ−ＣｅｕＩサブユニットから除去する結果となる。構造分析（Ｓｐｉｅｇｅｌら（２００６），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１４：８６９−８８０）は、これらのアミノ酸が、Ｉ−ＣｅｕＩの面に静止し、アミノ酸９４〜１２３により提供される疎水性表面積の相当量を埋める、構造ドメインを形成することを明らかにする。したがって、このＮ末端ドメインの除去により、単鎖メガヌクレアーゼ中のＣ末端Ｉ−ＣｅｕＩサブユニットが不安定化される可能性がある。この可能性を軽減するため、このＮ末端ドメインの除去によって、曝される疎水性アミノ酸を極性アミノ酸に突然変異させることができる（たとえば、β分岐状ではない疎水性アミノ酸をＳｅｒに突然変異させることができ、一方β分岐状の疎水性アミノ酸をＴｈｒに突然変異させることができる）。たとえば、Ｌｅｕ−１０１、Ｔｙｒ−１０２、Ｌｅｕ−１０５、Ａｌａ−１２１およびＬｅｕ−１２３をＳｅｒに突然変異させることができ、一方、Ｖａｌ−９５、Ｖａｌ−９８およびＩｌｅ−１１３をＴｈｒに突然変異させることができる。
【０１０５】
あるいは、Ｃ末端Ｉ−ＣｅｕＩサブユニットのＮ末端ドメインを、大部分、無処理のまま残し、トランケートされたリンカを介してＮ末端サブユニットに結合することができる。これは、Ｃ末端融合ポイントとしてＬｙｓ−７、Ｐｒｏ−８、Ｇｌｙ−９またはＧｌｕ−１０を使用して、達成することができる。該リンカは、その長さ（すなわち、（ＧＳＳ）４Ｇまたは（ＧＳＳ）５Ｇ）の約５０％までトランケートされた、可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカ（たとえば、表３のリンカ）でありえる。あるいは、該リンカは、ターン１内でトランケートされた表６のリンカのいずれであってもよい。したがって、例として、表６のリンカ９を使用して、単鎖Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼを以下の組成で作ることができる。
Ｎ末端サブユニットＮ２Ｉ２−ＳＬＰＧＳＶＧＧＬＳＰＳＱＡＳＳＡＡＳＳＡＳＳＳＰＧＳ−Ｇ９Ｃ末端サブユニット
【０１０６】
５．二種の異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバに由来する単鎖メガヌクレアーゼ
また、本発明により、サブユニットのそれぞれが異なる天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造も可能になる。本明細書で記載される「異なる」は、同じ天然ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリメンバに由来しないＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを言う。したがって、本明細書で使用されるように、同じファミリメンバから合
理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニット（たとえば、ＤＮＡ切断特異性に関して遺伝子操作されている、二つのＩ−ＣｒｅＩサブユニット）は、「異なる」とは考えない。具体的には、本発明は、異なるモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、またはジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの二つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインのどちらかに由来するＣ末端サブユニットに結合するモノ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（たとえば、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩまたはＩ−ＣｅｕＩ）に由来するＮ末端サブユニットを含む、単鎖メガヌクレアーゼの製造を可能にする。たとえば、ＤＮＡ認識部位特異性に関して合理的に設計されていても、されていなくてもよいＣ末端Ｉ−ＭｓｏＩサブユニットに結合するＮ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニット（これも、ＤＮＡ認識部位特異性に関して合理的に設計されていても、されていなくてもよい）を含む単鎖メガヌクレアーゼを製造することができる。
【０１０７】
Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩの場合、望ましい融合ポイントおよびリンカは先に記載した通りである。たとえば、単鎖Ｉ−ＣｒｅＩからＩ−ＭｓｏＩ融合は、Ｉ−ＣｒｅＩ  Ａｓｐ−１５３をＩ−ＭｓｏＩ  Ｔｈｒ−１０に結合するため、表６のリンカ９を使用して製造することができる。表９は、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩおよびＩ−ＡｎｉＩからの個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメイン用の可能性のあるＣ末端融合ポイントを列挙する。
【表１０】
0006050861.tif 000011
【０１０８】
表７、９および１０に列挙された融合ポイントは、問題になっているメガヌクレアーゼと、Ｉ−ＣｒｅＩ融合ポイントに構造的に相同性のあるアミノ酸位置が同定されたＩ−ＣｒｅＩとの間の構造比較に基づいている。また、融合ポイントは、Ｉ−ＣｒｅＩに対するタンパク質配列アラインメントを使用して、構造的に特徴付けられていないＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいても同定することができる。これは、保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの位置に基づき、任意のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットにおいて簡単に同定することができるＣ末端融合ポイントに特に当てはまることである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの始点の４〜６残基Ｎ末端であるアミノ酸は、許容可能なＣ末端融合ポイントである。
【０１０９】
異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼからのサブユニット間の二量体化の境界面は変化するので、該サブユニットは、単鎖ポリペプチドとして共有結合されたとしても、機能的「ヘテロ二量体」に会合しないかもしれない。会合を促進するために、二つのサブユニットの間の境界面を国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載するように、合理的に設計することができる。最も簡単には、これは、境界面残基を一つのサブユニットから他へ置換することを含む。たとえば、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＭｓｏＩは、本質的
に、Ｉ−ＣｒｅＩ  Ｇｌｕ−８（これは、Ｉ−ＭｓｏＩの相同位置におけるＴｈｒ、アミノ酸１０である）、およびＬｅｕ−１１（これは、Ｉ−ＭｓｏＩの相同位置におけるＡｌａ、アミノ酸１３である）での界面領域において相違する。したがって、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＭｓｏＩサブユニットは、Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットのＧｌｕ−８およびＬｅｕ−１１を、それぞれ、ＴｈｒおよびＡｌａに変えることによって、あるいはＩ−ＭｓｏＩサブユニットのＴｈｒ−１０およびＡｌａ−１３を、それぞれ、ＧｌｕおよびＬｅｕに変えることによって、効率的に相互作用させることができる。
【０１１０】
また、コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムのような技術も、サブユニット境界面を合理的に設計するために使用することができる。該方法は、当該分野で公知である。たとえば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらは、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインの間の境界面を再設計するために、コンピュータによるアルゴリズムを使用して、該二つが相互作用することを可能にした（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５）。これらの結果を考慮に入れれば、Ｉ−ＣｒｅＩに由来するＮ末端サブユニットと、Ｉ−ＤｍｏＩのＮ末端ＬＡＧＡＬＩＤＡＤＧドメインに由来するＣ末端サブユニットとを含む単鎖メガヌクレアーゼは、（１）表２のＩ−ＣｒｅＩ中のＮ末端融合ポイントを選択し、（２）表１０のＩ−ＤｍｏＩ中のＣ末端融合ポイントを選択し、（３）表６のリンカを選択し（または、規定される規則に基づいて類似するリンカを設計し）、および（４）Ｃｈｅｖａｌｉｅｒらが提案するように、突然変異Ｌ１１Ａ、Ｆ１６Ｉ、Ｋ９６ＮおよびＬ９７ＦをＩ−ＣｒｅＩサブユニットに、および突然変異Ｉ１９Ｗ、Ｈ５１ＦおよびＬ５５ＲをＩ−ＤｍｏＩサブユニットに取り込むことによって製造することができる。
【０１１１】
あるいは、定向進化のような実験的な方法を、二つの異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットの間の境界面を操作するために使用することができる。該方法は当該分野で公知である。たとえば、サブユニット境界面中の特異的なアミノ酸が無作為化された遺伝子ライブラリを作ることができ、該二つのサブユニット間の相互作用を可能にするライブラリメンバを、実験的にスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニング方法は、当該分野で公知であり（たとえば、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８）、そして酵母または細菌の細胞内でハイブリッドＤＮＡ部位を切断する、二つの異なるＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼの能力に関して、試験を行うことができる。
【０１１２】
６．変更されたＤＮＡ切断特異性、活性および／またはＤＮＡ結合親和性を持つ単鎖メガヌクレアーゼ
本発明は、種々の方法を使用して、ＤＮＡ切断特異性に関して遺伝子操作されている、個々のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを含む単鎖メガヌクレアーゼを製造するために使用することができる。該方法として、合理的な設計（たとえば、国際公開公報第２００７／０４７８５９号）、コンピュータを用いる設計（たとえば、Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６），Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９）、および遺伝子選択（Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１、Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９，Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８）が挙げられる。そのようなメガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼによって認識される部位とは異なるＤＮＡ部位に的を絞ることができる。また、本発明は、合理的に設計され、変更した活性（たとえば、国際公開公報第２００７／０４７８５９号、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００７），Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ３７１（１）：４９−６５）、または国際公開公報第２００７／０４７８５９号に記載されるようなＤＮＡ結合親和性を有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットを結合するためにも、使用することができる。
【０１１３】
７．組換え細胞および生物の製造方法
本発明の態様は、さらに、単鎖メガヌクレアーゼを使用して、組換え、遺伝子導入またはその他、遺伝子組換え細胞および生物を産生する方法も提供する。したがって、ある実施形態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二本鎖切断端を特異的に起こすように、組換え単鎖メガヌクレアーゼを成長させ、相同組換えにより関心のある配列を正確に挿入すること（複数を含む）を可能にする。他の実施形態では、細胞または生物のゲノムＤＮＡ中の単一部位または比較的少ない部位で、二本鎖切断端を特異的に起こすように、組換えメガヌクレアーゼを成長させ、（ａ）非相同的末端結合による関心のある配列の挿入を殆ど起こさせないようにすること、あるいは（ｂ）非相同的末端結合により標的配列を混乱することを可能にする。関心のある配列の相同組換えまたは非相同的末端結合に関して、本明細書で使用される用語「挿入」は、関心のある配列が染色体に組み込まれるように、関心のある配列を染色体に連結することを意味する。相同組換えの場合、本来のＤＮＡが、該ＤＮＡと同じ長さであるが、変更されたヌクレオチド配列を持つ外因性ＤＮＡによって置き換えられるように、挿入された配列は、内因性配列を置き換えることができる。あるいは、挿入された配列は、それが置き換える配列よりも多いまたは少ない塩基を含みうる。
【０１１４】
したがって、本発明のこの態様によれば、組換え生物として、コメ、コムギ、コーン（トウモロコシ）およびライムギのような単子葉植物種、およびマメ科植物（たとえば、インゲンマメ、ダイズ、レンズマメ、ピーナッツ、エンドウマメ）、アルファルファ、クローバ、タバコ、およびアラビドプシスのような双子葉植物種が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、組換え生物として、ヒトおよびヒトではない霊長類、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、トカゲ、サカナ、およびショウジョウバエ種のような昆虫を挙げることができるが、これらに限定されない。他の実施形態では、生物は、カンジダ、パンカビまたは酵母類のような真菌類である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、関心のある配列を、成熟組換え生物になりうる、または得られた遺伝子組換え生物がそのゲノム中に挿入された関心のある配列を持つ子孫を生じさせる生殖細胞または幹細胞のような細胞に導入することを含む。
【０１１６】
メガヌクレアーゼタンパク質は、細胞に送達され、ゲノムＤＮＡを切断することができ、これによって、当該分野で公知の種々の異なるメカニズムにより、該切断部位で、関心のある配列を相同組換えまたは非相同的末端結合させる。たとえば、組換えメガヌクレアーゼタンパク質は、マイクロインジェクションまたはリポソームトランスフェクション（たとえば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（これらに限定されない）を始めとする技術によって、細胞に導入することができる。リポソーム形成は、標的細胞を持つ脂質二重膜融合を促進するために使用することができ、これによって、その表面と会合しているリポソームまたはタンパク質の内容物を、細胞中に持ち込むことが可能になる。あるいは、酵素を融合し、細胞摂取を指示するＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質からの摂取ペプチドのような、適正な摂取ペプチドとすることができる（たとえば、Ｈｕｄｅｃｚら（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９−７３６参照）。
【０１１７】
あるいは、当該分野で公知の技術を使用して、メガヌクレアーゼタンパク質をエンコードする遺伝子配列をベクタに挿入し、真核細胞にトランスフェクトする（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ１  ９９９参照）。関心のある配列を、同じベクタ、異なるベクタに、または当該分野で公知の他の方法によって、導入することができる。
【０１１８】
ＤＮＡトランスフェクション用のベクタの限定ではない例示として、ウィルス性ベクタ、プラスミド、コスミドおよびＹＡＣベクタが挙げられる。ＤＮＡ配列のトランスフェクションは、当業者に公知の種々の方法によって達成することができる。たとえば、リポソームおよび免疫リポソームは、ＤＮＡ配列を細胞に送達するために使用される（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５−７６参照）。さらに、ベクタを細胞に導入するために、ウィルスを利用することができる（たとえば、米国特許第７，０３７，４９２号参照）。あるいは、トランスフェクション手法は、ベクタをネイキッドＤＮＡとして導入するように、利用することができる（たとえば、Ｒｕｉら（２００２），Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７１（１５）：１７７１−８参照）。
【０１１９】
核酸を細胞に送達する一般的方法として、（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍら（１９７３），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４（２）：５３６−５３９、Ｚａｔｌｏｕｋａｌら（１９９２），Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：１３６−１５３、（２）マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８０），Ｃｅｌｌ  ２２（２）：４７９−４８８）、エレクトロポレーション（Ｗｏｎｇら（１９８２），Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１０７（２）：５８４−５８７、Ｆｒｏｍｍら（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２（１７）：５８２４−５８２８、米国特許第５，３８４，２５３号）、およびバリスティックインジェクション（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら（１９９４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４３（Ａ）：３５３−３６５、Ｆｙｎａｎら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（２４）：１１４７８−１１４８２）のような物理的方法、（３）ウィルス性ベクタ（Ｃｌａｐｐ（１９９３），Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．２０（１）：１５５−１６８、Ｌｕら（１９９３），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８（６）：２０８９−２０９６、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ａｖｄ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：１９−２７、Ｅｇｌｉｔｉｓら（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６０８−６１４）、および（４）受容体介在性メカニズム（Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８（１９）：８８５０−８８５４、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９２），Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３（２）：１４７−１５４、Ｗａｇｎｅｒら（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１３）：６０９９−６１０３）が挙げられる。
【０１２０】
ある実施形態では、ゲノムに挿入された関心のある配列を含有する、遺伝子組換え植物を産生する。ある実施形態では、植物細胞に、組換えメガヌクレアーゼおよび関心のある配列に対応するＤＮＡ配列であって、メガヌクレアーゼ認識配列および／または標的配列に実質的に同一の配列によって挟まれていても、あるいは挟まれていなくてもよいＤＮＡ配列をトランスフェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。他の実施形態では、植物細胞に、切断により非相同的末端結合が促進され、認識配列を含有する標的配列を混乱させるような、組換えメガヌクレアーゼだけに対応するＤＮＡ配列をトランスフェクトすることによって、遺伝子組換え植物を産生する。そのような実施形態では、メガヌクレアーゼ配列は、宿主植物細胞においてメガヌクレアーゼの発現を可能にする調節配列のコントロール下にある。これらの調節配列として、ＮＯＳプロモータのような構成植物プロモータ、デキサメタゾン誘導性プロモータ（たとえば、Ｇｒｅｍｉｌｌｏｎら（２００４），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３７：２１８−２２８参照）のような化学的誘導性遺伝子プロモータ、およびＬＧＣ１プロモータ（たとえば、Ｓｉｎｇｈら（２００３），ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．５４２：４７−５２参照）のような植物組織特異的プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
植物細胞にＤＮＡを導入する適切な方法としては、ＤＮＡを細胞に導入することができる実質的にいかなる方法も挙げられ、たとえば、アグロバクテリウム感染、プロトプラストのＰＥＧ介在形質転換（Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈら（１９９３），Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１：４１５−４２８）、乾燥／抑制介在ＤＮＡ摂取、エレクトロポレーション、シリコンカーバイド繊維による攪拌、バリスティックインジェクション、または微粒子銃などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
他の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼを使用して遺伝子組換え動物を産生する。植物細胞と同様に、核酸配列を、生殖細胞または最終的に遺伝子導入生物になる細胞に導入する。いくつかの実施形態では、細胞は受精卵であり、外因性ＤＮＡ分子を受精卵の前核に注入することができる。次いで、マイクロインジェクトされた卵を、偽妊娠仮親の卵管に移し、成長させる。組換えメガヌクレアーゼは受精卵中で発現し（たとえば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのような、構成プロモータのコントロール下で）、ゲノム中の１個または数個の別々の部位への関心のある配列の相同組換えを容易にする。あるいは、Ｇｏｓｓｌｅｒら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９０６５  ９０６９によって記載されているように、遺伝子導入発生用の組換え胚幹（「ＥＳ」）細胞を利用することによって、遺伝子組換え動物を得ることができる。
【０１２３】
ある実施形態では、組換え哺乳類発現ベクタは、特定の細胞型において、核酸の組織特異的発現を優先的に導くことができる。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモータの限定ではない例示として、アルブミンプロモータ（肝臓特異的なもの、Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異的プロモータ（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８），Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモータ（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９），ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３），Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０、ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３），Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、神経特異的プロモータ（たとえば、神経フィラメントプロモータ、ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモータ（たとえば、乳漿プロモータ、米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許公報第０２６４１６６号）が挙げられる。また、発育的に調節されたプロモータも包含され、たとえば、マウスｈｏｘプロモータ（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）およびα胎児タンパク質プロモータ（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）がある。
【０１２４】
ある実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼに、ペプチドエピトープ（たとえば、ＨＡ、ＦＬＡＧまたはＭｙｃエピトープ）でタグを付け、発現レベルや局在化をモニターしてもよい。いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼは、核局在化シグナル（たとえば、ＳＶ４０からの核局在化シグナル）のようなサブ細胞局在化シグナル、あるいは葉緑体またはミトコンドリア局在化シグナルに融合してもよい。他の実施形態では、メガヌクレアーゼを、核外移行シグナルに融合し、これを細胞質に局在化してもよい。また、メガヌクレアーゼを、ＤＮＡ修復または相同組換えを刺激するタンパク質（たとえば、ｒｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５７またはＢＲＣＡ２）のような無関係のタンパク質またはタンパク質ドメインに融合してもよい。
【０１２５】
８．遺伝子治療の方法
本発明の態様は、遺伝子治療のために組換えメガヌクレアーゼを使用することを可能にする。本明細書で使用される「遺伝子治療」は、少なくとも一つの遺伝子または遺伝子調
節配列、たとえば、プロモータ、エンハンサまたはサイレンサの機能コピーを患者に導入し、その構造および／または機能に欠陥のある遺伝子または遺伝子調節領域を置き換えることを含む、治療的処置を意味する。また、用語「遺伝子治療」は、遺伝子の発現を減らすまたは消す、有害な遺伝子または調節エレメント（たとえば、癌遺伝子）に対してなされる修飾を指すこともできる。遺伝子治療は、先天的な状態、突然変異または患者の生涯にわたる特異的な遺伝子座に対する障害に起因する状態、または感染性生物に起因する状態を治療するために行うことができる。
【０１２６】
本発明のいくつかの態様では、遺伝子発現に影響を及ぼすゲノムの領域に外因性核酸配列を挿入することによって、機能障害性遺伝子を、置換えまたは無能にする。ある実施形態では、状態を緩和するように、組換えメガヌクレアーゼを、修飾されるべきゲノムの領域内の特定の配列に標的化する。配列は、エクソン、イントロン、プロモータまたは遺伝子の機能障害性発現を起こしている他の調節領域内の領域が可能である。本明細書で使用される用語「機能障害性発現」は、遺伝子産物をあまりにも少なく、遺伝子産物をあまりにも多く産生する細胞による、あるいは必要な機能のない、または必要以上の機能を持つ異なる機能を有する遺伝子産物を産生することによる、遺伝子産物の異常な発現を意味する。
【０１２７】
修飾領域に挿入された外因性核酸配列は、遺伝子を正常化する「修復された」配列を提供するために使用することができる。遺伝子修復は、正しい遺伝子配列を、再構築されるべき正しい機能を可能にする遺伝子に導入することによって、達成することができる。これらの実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、タンパク質の完全コード配列が可能であり、またはある実施形態では、修復されるべき領域だけを含む遺伝子のフラグメントが可能である。他の実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、異常な発現または調節を起こす突然変異が修復されているプロモータ配列または他の調節エレメントを含む。他の実施形態では、挿入されるべき核酸配列は、変異遺伝子中にはない適正な翻訳停止コドンを含有する。また、核酸配列は、適正な翻訳停止シグナルのない組換え遺伝子において、翻訳を停止するための配列を有することもできる。
【０１２８】
あるいは、核酸配列は、遺伝子の調節配列を混乱させることにより、または遺伝子機能を排除するサイレンサを提供することにより、遺伝子機能を一斉に除去することができる。いくつかの実施形態では、外因性核酸配列は、翻訳停止コドンを提供し、遺伝子産物の発現を阻止する。他の実施形態では、外因性核酸配列は、転写停止要素を提供し、完全長ＲＮＡ分子の発現を阻止する。さらに他の実施形態では、遺伝子機能を、塩基挿入、塩基欠失および／または非相同的末端結合によるフレームシフト突然変異を導入することによって、メガヌクレアーゼで直接混乱させる。
【０１２９】
多くの場合、正しい遺伝子配列を、標的細胞または疾患状態の原因である細胞集団に導くことが望ましい。そのような治療上の標的化は、健康な細胞が治療による標的となることを回避する。これにより、治療の効率は増加し、一方、治療による健康な細胞へ与える可能性のある潜在的な副作用は減少する。
【０１３０】
ゲノムに挿入されるべき組換えメガヌクレアーゼ遺伝子および関心のある配列を、関心のある細胞に送達することは、種々のメカニズムによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ウィルスの複製を阻止するために不活性化した、特別のウィルス性遺伝子を持つウィルスによって、核酸を細胞に送達する。したがって、標的細胞内のみへ送達および維持することができるが、標的細胞または組織内で複製する能力は保持しないように、ウィルスを変更することができる。一つ以上のＤＮＡ配列を、ベクタのように作用するウィルス性ゲノムを産生するように、変更されたウィルス性ゲノムに導入することができ、これを宿主ゲノムに挿入し次いでこれを発現させてもよいし、しなくてもよい。よ
り具体的には、ある実施形態は、ＭＦＧまたはｐＬＪベクタ（これらに限定されない）のようなレトロウィルス性ベクタを使用することを含む。ＭＦＧベクタは、ｐｏｌおよびｅｎｖタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列が欠失し、複製欠損になっている、単純化されたモロニーマウス白血病ウィルスベクタ（ＭｏＭＬＶ）である。また、ｐＬＪレトロウィルス性ベクタは、ＭｏＭＬＶの形態でもある（たとえば、Ｋｏｒｍａｎら（１９８７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：２１５０−２１５４参照）。他の実施形態では、組換えアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルスを、送達ベクタとして使用することができる。
【０１３１】
他の実施形態では、組換えメガヌクレアーゼタンパク質および／または組換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列の標的細胞への送達を、リポソームを使用することによって達成する。核酸および／またはタンパク質カーゴを含有するリポソームの製造は、当該分野で公知である（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５−７６参照）。免疫リポソームは、細胞関連抗原に対する抗体をリポソームに取込み、メガヌクレアーゼ用のＤＮＡ配列、またはメガヌクレアーゼそれ自体を特異的な細胞型に送達することができる（たとえば、Ｌａｓｉｃら（１９９５），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５−７６、Ｙｏｕｎｇら（２００５），Ｊ．Ｃａｌｉｆ．Ｄｅｎｔ．Ａｓｓｏｃ．３３（１２）：９６７−７１、Ｐｆｅｉｆｆｅｒら（２００６），Ｊ．Ｖａｃｅ．Ｓｕｒｇ．４３（５）：１０２１−７参照）。リポソーム製剤を製造し使用する方法は、当該分野において周知である（たとえば、米国特許第６，３１６，０２４号、米国特許第６，３７９，６９９号、米国特許第６，３８７，３９７号、米国特許第６，５１１，６７６号および米国特許第６，５９３，３０８号、およびこれらに挙げてある参考文献を参照）。いくつかの実施形態では、関心のある配列、および組換えメガヌクレアーゼタンパク質または組換えメガヌクレアーゼ遺伝子配列を送達するために、リポソームを使用する。
【０１３２】
９．病原体感染を治療する方法
また、本発明の態様は、病原体による感染を治療する方法も提供する。病原体生物として、単純ヘルペスウィルス１、単純ヘルペスウィルス２、ヒト免疫不全ウィルス１、ヒト免疫不全ウィルス２、痘瘡ウィルス、ポリオウィルス、エプスタイン・バー・ウィルス、およびヒトパピローマウィルス（これらに限定されない）のようなウィルス、およびバシラスアンスラシス、ヘモフィルス種、肺炎球菌種、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス種、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌およびマイコプラスマ結核病原体（これらに限定されない）のような細菌生物が挙げられる。また、病原体生物として、カンジダ、ブラストミセス、クリプトコッカスおよびヒストプラズマ種（これらに限定されない）のような真菌生物が挙げられる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼは、病原体ゲノム内の認識配列、たとえば、成長、複製、または病原体の毒性に必須の遺伝子または調節エレメントに、標的化されうる。ある実施形態では、認識配列は、細菌プラスミド中にあってもよい。病原体ゲノムにおける認識配列のメガヌクレアーゼ介在切断は、非相同的末端結合を刺激することによって、標的化された必須遺伝子内で、挿入、欠失またはフレームシフトの形態で、突然変異を刺激することができる。あるいは、細菌プラスミドの切断により、プラスミドとともにそこにエンコードされていた全ての遺伝子、たとえば、毒性遺伝子（たとえば、炭疽菌致死因子遺伝子）または抗生物質耐性遺伝子も消滅する結果となりうる。先に記載したように、メガヌクレアーゼを、当該分野で一般的な技術を使用して、タンパク質あるいは核酸の形態で、感染した患者、動物または植物に送達してもよい。ある実施形態では、メガヌクレアーゼ遺伝子を、病原体細菌に送達するバクテリオファージゲノムに取込んでもよい。
【０１３４】
また、本発明の態様は、ある形態の癌を処置するための治療を提供する。ヒトウィルス
は、しばしば、腫瘍形成（たとえば、エプスタイン・バー・ウィルスと上咽頭癌、ヒトパピローマウィルスと子宮頸癌）と関連するので、これらのウィルス性病原体の不活性化により、癌の発現および進行を阻止してもよい。あるいは、単鎖メガヌクレアーゼを使用して、これらの腫瘍関連ウィルスのゲノムに標的化された二本鎖切断端に対して、ＤＮＡ損傷応答経路によりアポトーシスを開始させるように使用してもよい。この方法では、ウィルス性ゲノムを内部に持つ腫瘍細胞に、アポトーシスを選択的に誘導することが可能であるかもしれない。
【０１３５】
１０．遺伝子型同定および病原体同定方法
また、本発明の態様は、インビトロでの分子生物学研究開発のためのツールも提供する。真核生物および原核細胞系生物から、プラスミド、ＰＣＲ産生物、ＢＡＣ配列、ＹＡＣ配列、ウィルスおよびゲノム配列のような核酸を、単離、クローニングおよび操作するために、部位特異的なエンドヌクレアーゼ（たとえば、制限酵素）を使用することは、当該分野ではよくあることである（たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  １９９９参照）。したがって、いくつかの実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、核酸配列をインビトロで操作するために使用する。たとえば、同じＤＮＡ分子内の一対の認識配列を認識する単鎖メガヌクレアーゼを、細菌プラスミド、ＢＡＣまたはＹＡＣへの連結のような後続の操作のために、介在ＤＮＡセグメントを単離するために使用することができる。
【０１３６】
他の態様では、本発明は、病原体遺伝子および生物を同定するツールを提供する。一実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、疾患を起こす対立遺伝子を健康な対立遺伝子から区別するために、疾患と相関関係がある多形性遺伝子領域に対応する認識部位を切断するのに使用することができる（たとえば、ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ−５０８対立遺伝子を認識する単鎖メガヌクレアーゼ、実施例４参照）。この実施形態では、ヒト患者または他の生物から単離されたＤＮＡ配列を、可能であれば追加の部位特異的なヌクレアーゼとともに、単鎖メガヌクレアーゼで消化し、得られたＤＮＡフラグメントパターンを、ゲル電気泳動法、キャピラリ電気泳動法、質量分析法、または当該分野で公知の他の方法によって分析する。この細分化パターンおよび、具体的には、単鎖メガヌクレアーゼによる切断の存在または不存在は、認識配列がゲノム中に存在するか否かを明らかにすることにより、生物の遺伝子型を示す。別の実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼを、病原体ウィルス、真菌または細菌のゲノム中の多形領域に対して標的化し、生物を同定するために使用する。この実施形態では、単鎖メガヌクレアーゼは、病原体に固有の認識配列を切断し（たとえば、バクテリア中の１６Ｓおよび２３Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子間のスペーサー領域、たとえば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｉｅｓｓｅｎら（１９９４），Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０：１１０３−１１０８参照）、ゲノムのエンドヌクレアーゼ消化後の他の密接に関連した生物から病原体を区別し、電気泳動、質量分析、または当該分野で公知の他の方法によるその後の細分化パターンの分析のために使用することができる。
【０１３７】
１１．カスタムＤＮＡ結合ドメインの製造方法
他の態様では、本発明は、エンドヌクレアーゼ切断活性のない単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を提供する。単鎖メガヌクレアーゼの触媒活性は、触媒作用（たとえば、Ｉ−ＣｒｅＩにおけるＱ４７のＥへの突然変異、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３：１４０１５−１４０２６参照）、Ｉ−ＳｃｅＩにおけるＤ４４またはＤ１４５のＮへの突然変異、Ｉ−ＣｅｕＩにおけるＥ６６のＱへの突然変異、Ｉ−ＭｓｏＩにおけるＤ２２のＮへの突然変異）に関与するアミノ酸に突然変異を起こすことによって、除去することができる。次いで、不活性化されたメガヌクレアーゼを、転写アクチベータ（たとえば、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインまたはＶＰ１６トランス活性化ドメイン）、転写抑制因子（たとえば、クルッペルタンパク質からのＫＲＡＢドメイン）、ＤＮＡメチラーゼドメイン（たとえば、Ｍ．ＣｖｉＰＩまたはＭ．ＳｓｓＩ）、またはヒスト
ンアセチル基転移酵素ドメイン（たとえば、ＨＤＡＣ１またはＨＤＡＣ２）（これらに限定されない）を始めとする他のタンパク質から効果ドメインに融合することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメイン、いわゆる操作されたＺｎフィンガドメイン、および効果ドメインを構成するキメラタンパク質は、当該分野で公知である（たとえば、Ｐａｐｗｏｒｔｈら（２００６），Ｇｅｎｅ  ３６６：２７−３８参照）。
【実施例】
【０１３８】
本発明を、以下の実施例によってされに説明するが、これらの実施例を、限定として解釈すべきではない。当業者は単なる日常の実験、本明細書に記載の特定の物質および手段と数多くの同等のものを使用することで、認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような同等のものとは、以下の実施例に続く、請求項の範囲に包含されるものである。実施例１では、先に記載した単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法（Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識するメガヌクレアーゼの製造としては十分ではないという証拠を示す。実施例２および３では、可撓性Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカ（実施例２）または設計された構造化リンカ（実施例３）を使用する、本明細書に記載された方法が、非パリンドロームＤＮＡ部位を認識する単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを製造するのに十分であるという証拠を示す。実施例２および３は、以下で、特にＩ−ＣｒｅＩに基づく単鎖メガヌクレアーゼについて記載するが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＡｎｉＩに由来するサブユニットで構成される単鎖メガヌクレアーゼおよび他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼも本明細書で記載されるのと同様に製造および使用することができる。
【実施例１】
【０１３９】
Ｅｐｉｎａｔらの方法の評価
【０１４０】
１．Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用する単鎖メガヌクレアーゼ
Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２および国際公開公報第２００３／０７８６１９号は、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造を報告する。具体的には、筆者らは、Ｉ−ＤｍｏＩに由来する１１アミノ酸ペプチドリンカ（Ｉ−ＤｍｏＩのアミノ酸９４〜１０４，配列：ＭＬＥＲＩＲＬＦＮＭＲ）を使用して、Ｎ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニット（Ｉ−ＣｒｅＩのアミノ酸１〜９３）をＣ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニット（アミノ酸８〜１６３）に結合した。このＮ末端サブユニット−リンカＣ末端サブユニットの特定の配置は、ジ−ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ  Ｉ−ＤｍｏＩメガヌクレアーゼのドメイン組織を最もよく模倣しているので、これを選択した。筆者らは、単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを実験的に評価し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩホモ二量体に対して有意に少ない割合でも、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列を効率的に切断することを見出した。
【０１４１】
該筆者らによって製造された融合タンパク質は、両方とも同じＤＮＡ半部位を認識する、二つの別の野生型サブユニットを含んでいたので、擬似パリンドローム性野生型ＤＮＡ部位を使用して、単鎖メガヌクレアーゼを試験する必要があった。したがって、前記筆者らは、観察された切断活性が、個々の単鎖メガヌクレアーゼによる切断ではなく、それぞれの一つのドメインが会合し、野生型ホモ二量体のように、効率的に挙動する機能的メガヌクレアーゼを形成する、二つの単鎖メガヌクレアーゼの分子間二量体による切断のためであるという可能性を取除くことはできなかった。事実、Ｎ末端Ｉ−ＣｒｅＩサブユニットの実質的な部分（アミノ酸９４〜１６３）は、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている単鎖メガヌクレアーゼの製造において、除去された。三次元Ｉ−ＣｒｅＩ結晶構造検査（Ｊｕｒｉｃａら（１９９８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２：４６９−４７６）により、このトランケーションにより、三つのαへリックスがＮ末端サブユニットの表面から除去され、
次いで、大部分の疎水性表面積が溶剤に曝されたことは明らかである。したがって、本発明者らは、Ｅｐｉｎａｔらの単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼからのＮ末端サブユニットは不安定で、不活性であり、観察されたＤＮＡ切断活性は、実際、二つの単鎖タンパク質からのＣ末端サブユニットの二量体化によるものであると仮定した。Ｅｐｉｎａｔらの方法の適用から生じるタンパク質安定性の問題は、Ｆａｊａｒｄｏ−Ｓａｎｃｈｅｚら（２００８），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３６：２１６３−２１７３でも検討されている。
【０１４２】
２．Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用した単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼの設計
Ｅｐｉｎａｔらによって報告されている単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの製造方法（Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２、国際公開公報第２００３／０７８６１９号）を、さらにはっきりと評価するために、ＮおよびＣ末端Ｉ−ＣｒｅＩドメインが異なるＤＮＡ半部位を認識する単鎖メガヌクレアーゼを製造した。Ｅｐｉｎａｔらが報告する方法を使用して、一つのＬＡＭ１ドメインと一つのＬＡＭ２ドメインとを含む、一対の単鎖メガヌクレアーゼを製造した。この「ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２」メガヌクレアーゼ（配列番号：４８）は、Ｎ末端ＬＡＭ１ドメインと、Ｃ末端ＬＡＭ２ドメインを含み、一方、「ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１」（配列番号：４９）は、Ｎ末端ＬＡＭ２ドメインとＣ末端ＬＡＭ１ドメインを含む。全体で、両単鎖メガヌクレアーゼは、Ｅｐｉｎａｔらによって報告されたものとは１１アミノ酸が異なり、全アミノ酸変化は、サブユニット相互作用に影響を及ぼすことが期待されない、ＤＮＡ認識に関与する酵素の領域内で起こる。
【０１４３】
３．単鎖メガヌクレアーゼの構成
ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２およびＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１を、Ｉ−ＤｍｏＩリンカ配列（ＭＬＥＲＩＲＬＦＮＭＲに翻訳する）を導入するプライマー、およびクローニング用の制限酵素部位を用い、既存のＬＡＭ１およびＬＡＭ２遺伝子のＰＣＲによって製造した。次いで、２個の該ＬＡＭサブユニットを、精製用完全長単鎖遺伝子（Ｎｏｖａｇｅｎ社，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の３’終点で融合された六ヒスチジンタグで、ｐＥＴ−２１ａベクタにクローン化した。全ての核酸配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（１２）：５４６３−７参照）を用いて確認した。
【０１４４】
以下の方法を使用して、ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼを発現させ、精製した。ｐＥＴ２１ａベクタにクローン化された構築物を、化学的に形質転換受容性のあるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換し、２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンの入った標準の２ｘＹＴプレートに播いた。一晩成長させた後、形質転換細菌コロニを、プレートからこすり落とし、５０ｍｌの２ＸＹＴブロスを接種するために使用した。細胞を振盪しながら３７℃で６００ｎｍの波長の吸光度が０．９になるまで成長させた。次いで、成長温度を３７℃から２２℃に下げた。タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加により誘発し、細胞を攪拌しながら２時間半培養した。次いで、細胞を６０００×ｇで１０分、遠心分離によってペレット化した。ペレットをボルテックス処理によって１ｍｌの結合緩衝液（２０ｍＭのトリ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁した。次いで、細胞を５０％電力で１２パルスの音波処理によって崩壊し、細胞の残骸を１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってペレット化した。細胞上澄みを４ｍｌの結合緩衝液で希釈し、２００μｌのニッケルを詰めた金属キレート・セファロース・カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に充填した。
【０１４５】
続いて、カラムを、４ｍｌの洗浄緩衝液（２０ｍＭのトリ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのイミダゾール）、および０．２ｍｌの溶離緩衝液（２０ｍＭのトリ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭのＮａＣｌ、４００ｍＭのイミダゾール）で
洗浄した。メガヌクレアーゼ酵素を、追加の０．６ｍｌ溶離緩衝液で溶離し、Ｖｉｖｏｓｐｉｎ使い捨て濃縮器（ＩＳＣ社，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）を使用して、５０〜１３０μｌに濃縮した。アッセイおよび保存のため、該酵素を、Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＳＡ緩衝液（２５ｍＭのトリ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＤＴＡ）に交換した。酵素濃度を、２３，５９０Ｍ−１ｃｍ−１の吸光係数を使用して、２８０ｎｍでの吸光度によって測定した。次いで、酵素の純度および分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により確かめた。
【０１４６】
４．切断アッセイ
先に記載したように精製した全ての酵素の活性を、メガヌクレアーゼ認識配列を含む直鎖二本鎖ＤＮＡ基質を用いる培養によってアッセイした。認識配列のセンスおよびアンチセンス鎖の両方に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニールし、ブラントエンド連結により、ｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａｌ部位にクローン化した。クローン化された結合部位の配列を、Ｓａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド配列決定によって確認した。全てのプラスミド基質を、メガヌクレアーゼ消化と同時にＸｍｎＩまたはＳｃａＩにより直線化した。酵素分解物は、５μｌの０．０５μＭのＤＮＡ基質、２．５μｌの５μＭ単鎖メガヌクレアーゼ、９．５μｌのＳＡ緩衝液、および０．５μｌのＸｍｎＩまたはＳｃａＩを含んでいた。分解物を３７℃で４時間培養した。分解を０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫおよび０．５％ＳＤＳを加えることによって停止し、分解物を３７℃で１時間培養した。分解物を１．５％アガロースで分析し、臭化エチジウム染色によって視覚化した。
５．結果
【０１４７】
Ｅｐｉｎａｔらの方法を使用して製造されたＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼを、ＬＡＭ１パリンドローム（配列番号：４０および４１）、ＬＡＭ２パリンドローム（配列番号：４４および４５）、またはＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位（配列番号：４６および４７）を含むＤＮＡ基質で培養した。ＬＡＭ１ｅｐＬＡＭ２単鎖メガヌクレアーゼは、主としてＬＡＭ２パリンドロームを切断することが確認され、一方ＬＡＭ２ｅｐＬＡＭ１単鎖メガヌクレアーゼは、主としてＬＡＭ１パリンドロームを切断することが見られた。どちらの単鎖メガヌクレアーゼも、ハイブリッド部位を有意な程度に切断しなかった。これらの結果は、Ｅｐｉｎａｔらの方法では、実際、非パリンドロームＤＮＡ配列を切断することができない単鎖メガヌクレアーゼを産生することを示唆している。両単鎖メガヌクレアーゼは、Ｃ末端サブユニットによって認識される半部位のパリンドロームに対応する認識配列を主として切断することが見られ、Ｎ末端サブユニットは不活性であることを示唆している。したがって、Ｅｐｉｎａｔらによって特徴付けられた活性メガヌクレアーゼ種は、本質的に、一対の単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニット間の二量体であるようである。あるいは、パリンドローム性ＤＮＡ部位の切断は、異なる単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＣ末端サブユニットによる逐次一本鎖ニッキングによるためかもしれない。どちらの場合も、Ｅｐｉｎａｔらによる主張とは対照的に、該方法では、実質的に機能的な単鎖Ｉ−ＣｒｅＩヘテロ二量体を産生せず、一般的に、非パリンドロームＤＮＡ部位の認識および切断に有用ではない。
【実施例２】
【０１４８】
可撓性Ｇｌｖ−Ｓｅｒリンカを用いて製造された単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ
【０１４９】
１．Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカを用いた単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼの設計
表３のリンカ３を使用して、設計されたＬＡＭ１およびＬＡＭ２エンドヌクレアーゼを融合し、単鎖ポリペプチドとした。Ｖａｌ−１５１をＮ末端融合ポイント（ＬＡＭ１サブユニットに対する）として使用し、一方Ｐｈｅ−９をＣ末端融合ポイント（ＬＡＭ２サブユニットに対する）として使用した。実施例１に記載したように、得られた単鎖メガヌク
レアーゼ、「ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２」（配列番号：５０）をｐＥＴ２１ａにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製した。
【０１５０】
２．結果
ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２の切断活性を、実施例１記載のものと同じＤＮＡ基質および培養条件を使用してアッセイした。ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼに関する結果とは対照的に、ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、主にハイブリッドＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列（配列番号：４６および４７）を切断することが見られた。切断の程度は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でＬＡＭ１およびＬＡＭ２単量体を共発現することによって製造したＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に比べて有意に減少した。同じ反応条件下で、ヘテロ二量体はＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列を完全に切断し、これは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカは、ある程度切断活性を弱めることを示唆する。それにもかかわらず、ＬＡＭ１ｇｓＬＡＭ２は、ハイブリッド部位に関し、パリンドローム性ＬＡＭ１またはＬＡＭ２部位よりも非常に強い優先度を示し、したがって、これは、特異性が活性より大きく重要である用途のために有用性がある。
【実施例３】
【０１５１】
構造化リンカを用いる単鎖Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ製造
【０１５２】
１．設計された、構造化リンカを用いる単鎖ＬＡＭメガヌクレアーゼの設計
表６のリンカ９を使用して、設計されたＬＡＭ１およびＬＡＭ２エンドヌクレアーゼを融合し、単鎖ポリペプチドとした。Ａｓｐ−１５３をＮ末端融合ポイント（ＬＡＭ１サブユニットに対する）として使用し、一方Ｌｙｓ−７をＣ末端融合ポイント（ＬＡＭ２サブユニットに対する）として使用した。実施例１に記載されるように、得られた単鎖メガヌクレアーゼ、「ＬＡＭ１ｄｅｓＬＡＭ２」（配列番号：５１）をｐＥＴ２１ａにクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製した。
【０１５３】
２．結果
ＬＡＭ１ｄｅｓＬＡＭ２の切断活性を、実施例１記載のものと同じＤＮＡ基質および培養条件を使用してアッセイした。ＬＡＭｅｐメガヌクレアーゼに関する結果とは対照的に、ＬＡＭｌｄｅｓＬＡＭ２は、主にハイブリッドＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列（配列番号：４６および４７）を切断することが見られた。切断の程度は、ＬＡＭ１およびＬＡＭ２単量体をＥ．ｃｏｌｉ中で共発現することによって製造されるＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体に匹敵している。これらの結果は、リンカ９のような設計された、構造化リンカは、切断活性を有意に妨げないことを示唆している。しかも、ＬＡＭ１ｄｅｓＬＡＭ２は、構造的に安定であり、ＳＡ緩衝液中４℃で保存した場合、触媒活性を＞３週間維持する。ＬＡＭ１ｄｅｓＬＡＭ２は、パリンドローム性ＬＡＭ１およびＬＡＭ２部位（配列番号：４０および４１および４４および４５）に対して最小限の活性を示し、本明細書で開示された方法により製造された機能的種は、主に単鎖ヘテロ二量体であることを示していることは重要である。
【実施例４】
【０１５４】
構造化リンカを用いて製造した単鎖Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ
【０１５５】
１．設計された、構造化リンカを用いる単鎖Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの設計
表８のリンカ３０を使用して、一対のＩ−ＭｓｏＩエンドヌクレアーゼサブユニット（ＤＮＡ切断特異性に関して非修飾である）を融合し、単鎖ポリペプチドとした。Ｉｌｅ−１６６をＮ末端融合ポイントとして使用し、一方Ｌｅｕ−７をＣ末端融合ポイントとして使用した。得られた単鎖メガヌクレアーゼ、「ＭＳＯｄｅｓＭＳＯ」（配列番号：５２）をＣ末端６ｘＨｉｓ−タグを持つｐＥＴ２１ａにクローン化し、精製を容易にした。次いで、実施例１に記載するように、該メガヌクレアーゼをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、精製
した。
【０１５６】
２．結果
実施例１で記載されるような培養条件下で、精製ＭＳＯｄｅｓＭＳＯの、野生型Ｉ−ＭｓｏＩ認識配列（配列番号：５３および配列番号：５４および５４）を内部に持つプラスミド基質を切断する能力をアッセイした。該酵素は、Ｉ−ＭｓｏＩホモ二量体（この場合、これは、ＭＳＯｄｅｓＭＳＯと同じ認識配列を認識および切断することが予測される）に匹敵する切断活性を有することが見出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＭＳＯｄｅｓＭＳＯは、約４０キロダルトンの見かけ上の分子量を有し、一対の共有結合されたＩ−ＭｓｏＩサブユニットで構成されるものと一致し、タンパク質分解産物は現れなかったことが明らかになった。これらの結果は、本発明が、安定で、高活性のＩ−ＭｓｏＩに由来する単鎖メガヌクレアーゼの製造に適していることを示している。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【図１】
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【配列表】
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