(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水生生物を含む液体を硝化する方法であって、細菌組成物を水生生物を含む液体に導入することを含み、ここで該細菌組成物がアンモニア酸化細菌としてニトロソモナス  ユートロファ（Nitrosomonas eutropha）及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi）を含み、そして水生生物を含む液体の温度が１０℃又はそれ未満であり、そして前記細菌組成物が、アンモニア及び亜硝酸塩を連続期間にわたり酸化する、前記方法。
【請求項２】
アンモニア、亜硝酸塩又はそれらの組み合わせを含む液体中で水生生物を救出する方法であって、細菌組成物を、水生生物を含む液体に導入することを含み、ここで当該液体の温度が、１０℃又はそれ未満であり、ここで当該細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソモナス  ユートロファ（Nitrosomonas eutropha）及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi）を含み、そして導入すると、当該細菌組成物が当該液体中に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を連続期間にわたり酸化する、前記方法。
【請求項３】
前記細菌組成物が、１５００リットルの液体あたり１〜１６リットルの細菌組成物の割合で液体に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液体が、塩水、淡水、又はそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体が、塩水、淡水、又はそれらの組み合わせである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記液体の温度が、５℃又はそれ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記液体の温度が、５℃又はそれ未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＨが６．８〜８．５である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｐＨが６．８〜８．５である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
液体が、少なくとも４０％の酸素飽和を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
液体が、少なくとも４０％の酸素飽和を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１の緩衝化合物を液体に添加する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１の緩衝化合物を液体に添加する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソコッカス及び亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソコッカス及び亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
水性生物環境においてアンモニア及び亜硝酸塩のレベルを制御することを含む、水生生物リソース方法。
【請求項１７】
アンモニウム及び亜硝酸塩のレベルを制御する工程が、環境に細菌組成物を導入することを含み、ここで当該細菌組成物が、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
水生生物を含む液体を硝化する方法であって、細菌組成物を該水生生物を含む液体に接触させることを含み、ここで当該細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソモナス  ユートロファ（Nitrosomonas eutropha）及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi）を含み、前記水生生物を含む液体の温度が、１０度又はそれ未満であり、そして細菌組成物が１週間又はそれより長い連続期間にわたりアンモニア及び亜硝酸塩を酸化する、前記方法。
【請求項１９】
前記連続期間が１週間又はそれより長い期間である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記連続期間が１日である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年８月１８日に出願された３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９の米国仮出願番号６１／３７４，８８１の利益を主張し、その内容は本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、一般的に、水生生物の治療、救助又は保護において有用な方法に関する。より具体的に、本開示は、水生生物の環境において有害な成分のレベルを維持または調節するために、硝化細菌組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
水生動物は、主要な食物供給源として役立ち、そして科学的探究において重要な役割を果たす。水生動物は、通常、輸送のあいだ生存状態で維持しなければならず、それにより水生動物を、捕えた状態で所定の期間生存させるための有効な手段に対する必要性が生じる。海産物などの水生動物の輸送システムは、通常、冷淡水または海水を充填したタンクを有するコンテナからなる。長距離にわたる水生動物の輸送は、大変な難関となる。なぜなら、貯蔵水が窒素廃棄物で汚染される一方で、酸素含量が減少するからである。アンモニアと亜硝酸塩（nitrite）は、有機物質の分解（たとえば、糞便物質）及び過剰な食餌により生成されうる。温度、ｐＨ及び酸素レベルは、アンモニアの生成にも影響する。天然細菌が（つまり、貯蔵コンテナやタンク内に）存在しない場合には、高いアンモニアレベルは、毒性条件を作り出し、血中ｐＨを増加させ、血中における酸素伝達率（oxygen conductivity）を低下させ、エラの健康に影響を及ぼし、そして水生生物の致死率を増加させる。こうして、水生生物を含んでいる液体を硝化する経済的に実行可能な手段に対する必要性のみならず、特に冷温条件下で長期間の生存を必要とする生きた水生生物の輸送及び貯蔵の経済的に実行可能な手段に対する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、１の態様として、細菌組成物を液体に導入することを含む水生生物含有液体の硝化方法を提供する。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。液体の温度は、１０℃又はそれ未満である。
【０００５】
１の態様では、本開示は、液体において亜硝酸塩又はアンモニアレベルを維持する方法であって、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む細菌組成物を、液体に導入することを含み、液体の温度が１０℃又はそれ未満である、方法を提供する。
【０００６】
別の態様では、本開示は、アンモニア含有又は亜硝酸塩含有液体において水生生物を保護するための方法であって、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む細菌組成物の存在下で水生生物を貯蔵することを含む、方法に関する。
【０００７】
１の態様では、本開示は、アンモニア、亜硝酸塩、又はそれらの組み合わせを含む液体において、細菌組成物を液体に導入することにより、水生生物を救うための方法を提供する。細菌組成物液体は、アンモニア酸化細菌及び硝酸酸化細菌を含む。導入した際に、細菌組成物は、即座に液体中に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を酸化し始める。
【０００８】
別の態様では、本開示は、水生生物を液体含有タンクに導入し、そして細菌組成物を液体に導入することを含む、液体含有タンク中で生きた水生生物を輸送する方法を提供する。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。液体の温度は、液体の凍結温度であるか、又はそれより高い。
【０００９】
さらに別の態様では、本開示は、水生生物環境において、アンモニウム及び亜硝酸塩のレベルを調節することを含む、水生生物のリソース方法（a process of aquatic organism resourcing）を提供する。
【００１０】
さらに別の態様では、本開示は、治療を必要とする水生生物を治療する方法であって、水生生物を伴う液体を、有効量の細菌組成物と接触させることを含み、ここで細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含み、そしてここで液体の温度は、１０℃又はそれ未満である、方法に関する。液体の適切な温度の非限定的な例は、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃若しくは１℃、又はそれら未満である。さらなる適切な温度として、１〜１０℃、１〜５℃、又は１〜３℃の液温が挙げられる。実施態様において、細菌組成物は、０．２５〜２５ｍｇのＮ−ＮＨ3／Ｌ／ｈｒを取り除くことができる量で液体に加えられる。実施態様では、液体に添加されたアンモニア酸化細菌の量は、０．２５〜２５ｍｇのＮ−ＮＨ3／Ｌ／ｈｒを除去するために十分な量である。実施態様では、液体に加えられる亜硝酸酸化細菌は、０．２５〜２５ｍｇのＮ−ＮＨ3／Ｌ／ｈｒを除去するために十分な量である。実施態様では、細菌組成物は、アンモニア酸化細菌として、ニトロソモナス  ユートロファ（Nitrosomonas eutropha)及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi)を含む。実施態様では、細菌組成物は、ニトロバクター  ウィノグラドスキーと組み合わされたニトロソモナス  ユートロファを含む。実施態様では、細菌組成物は、亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスと組み合わされたアンモニア酸化細菌としてニトロソコッカスを含む。
【００１１】
本発明の開示は、本明細書に記載された態様及び実施態様の組み合わせを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
「水生生物」という用語は、海産魚、甲殻類、及びすべての水生動物、例えば非限定的に海水魚、淡水魚、甲殻類、軟体動物、及びは虫類を含むが、これらに限られるものではない。水生生物としては、商業的に重要な動物、例えば非限定的に、エビ、ウナギ、ロブスター、牡蠣、二枚貝、及び餌魚（bait fish）も含む。
【００１３】
本明細書に記載される方法における細菌組成物は、アンモニア及び亜硝酸塩の両者の毒性を低減し、廃棄物又はスラッジの蓄積を低減し、過剰の栄養物を除去し、過剰量の水生生物の餌及び廃棄物などの有機化合物を分解し、そして水の透明度を高めることにより、環境的に安全な様式で水生生物の健常な環境を促進することができる。細菌組成物は、有害なアンモニアをまず亜硝酸塩に変換し、次に無害の硝酸塩へと変換することにより共同して作用する少なくとも２の硝化細菌の組み合わせを使用する。アンモニアと亜硝酸塩のレベルが高くなるにつれて、細菌組成物は、有効な硝化を可能にする割合で増殖できる。細菌組成物を水生生物環境に導入する前の水生生物による食物消費レベルをよそに、本明細書に記載された細菌組成物は、さらにアンモニア及び亜硝酸塩をさらに酸化することができる。
【００１４】
水生生物含有液体を硝化する方法が提供される。１の実施態様では、水生生物含有液体を硝化する方法は、細菌組成物を液体に導入するステップを含む。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。細菌組成物は，アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。細菌組成物は、液体の温度が１０℃又はそれ未満である場合に、液体中に存在しうるアンモニア及び亜硝酸塩を酸化することができる。適切な液温の非限定的な例として、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃若しくは１℃、又はそれ未満の温度を含む。実施態様では、液体の温度は、１〜１０℃、１〜５℃、又は１〜３℃である。細菌組成物の適切な組み合わせの非限定的な例として、ニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi)と組み合わされたニトロソモナス  ユートロファ（Nitromonas eutropha)、及びニトロコッカスと組み合わされたニトロソコッカスが挙げられる。
【００１５】
１の実施態様では、液体中における亜硝酸塩又はアンモニアレベルが維持され、温度が１０℃又はそれ未満にされる。この方法は、アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌とを含む細菌組成物を液体に導入する工程を含む。この方法の１の実施態様では、液体は、少なくとも１の水生生物を含む。実施態様では、液体は、多数の生物、例えば２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上、例えば２０、３０、４０、５０、又はそれより多くの生物を含む。
【００１６】
アンモニア含有又は亜硝酸塩含有液体中の水生生物を、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む細菌組成物の存在下で水生生物を保護する工程を含む方法に従って保護することができる。
【００１７】
汚染された保護条件の結果として苦しんでいるか、又は１又は複数の身体的損傷の徴候を示している水生生物は、細菌組成物を、水生生物を含む液体へと導入することを含む方法により、アンモニア含有又は亜硝酸塩含有液体中で救うことができる。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。導入すると、細菌組成物は、即効性又は実質的に即効性の様式で、液体中に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を酸化し始め、硝化からの迅速な回復を提供し、それにより死亡や水生生物の健康に対する永続的な身体的損傷を防ぐことができる。実施態様では、細菌組成物は、１〜１０時間などの期間の後、液体に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を酸化し始める。実施態様では、細菌組成物は、５、６、７、８、９又は１０時間などの期間の後に液体中に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を酸化し始める。
【００１８】
液体含有タンク中で生きた水生生物を輸送する方法も提供される。この方法は、水生生物を液体含有タンクに導入し、そして細菌組成物を液体に導入するステップを含む。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。液体温度は、液体の凝固点又はそれより高く維持される。１の実施態様では、液体の標準的な凝固点を低下させるための成分、例えば非限定的にエタノール、炭酸水素ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウムマグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、及び塩化ナトリウムを含む。
【００１９】
水生生物のリソース方法が提供される。この方法は、水生生物環境中でアンモニウム及び亜硝酸塩のレベルを調節することを含む。実施態様では、アンモニア及び亜硝酸塩は、pH７．０〜８．５において、０〜１０ｐｐｍのＮ−ＮＨ3に維持又は調節される。実施態様では、アンモニウム及び亜硝酸塩は、ｐＨ７．０〜８．５で、１〜１０ｐｐｍのＮ−ＮＨ3に維持又は調節される。実施態様では、アンモニウム及び亜硝酸塩は、ｐＨ７．０〜８．５で、１〜１０ｐｐｍのＮ−ＮＨ3に維持又は調節される。実施態様では、アンモニウム及び亜硝酸塩は、ｐＨ７．０〜８．５で１〜５ｐｐｍのＮ−ＮＨ3に維持又は調節される。実施態様では、アンモニウム及び亜硝酸塩は、ｐＨ７．０〜８．５で、１〜３ｐｐｍに維持又は調節される。１の実施態様では、アンモニウム及び亜硝酸塩のレベルの調節は、細菌組成物を環境に導入することにより達成される。細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む。この方法は、制御条件下で水生生物を飼育し、養殖し、又は維持するための水産養殖、海洋養殖、又はアクアポニクスプログラムにおけるリソース管理の一部として統合されうる。
【００２０】
本発明により提供される方法における細菌組成物は、少なくとも１のアンモニア酸化細菌と、少なくとも１の亜硝酸酸化細菌の組み合わせを含む。適切なアンモニア酸化細菌は、非限定的に、ニトロソコッカス、ニトロソモナス  ユートロファ、及びそれらの組み合わせを含む。適切な亜硝酸酸化細菌は、非限定的にニトロバクター  ウィノグラドスキー、ニトロコッカス、及びそれらの組み合わせを含む。
【００２１】
１の実施態様では、細菌組成物は、ニトロソコッカスをアンモニア酸化細菌として、及びニトロコッカスを亜硝酸酸化細菌として含む。好ましい実施態様では、細菌組成物は、ニトロソモナス・ユートロファを、アンモニア酸化細菌として、及びニトロバクター・ウィノグラドスキーを亜硝酸酸化細菌として含む組み合わせを含む。アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌は、共に互いに組み合わせて、又は他の細菌（例えば、バチルス（Bacillus）、例えば市販のPrawn Bac PB-628 (Novozymes Biologicals)、エンテロバクター（Enterobacter)又はシュードモナス(Pseudomonas)と組み合わせて、使用されてもよい。
【００２２】
細菌組成物は、液体、凍結乾燥粉末、又はバイオフィルム（例えば、ブラン上又はコーングルテン上）として剤形されてもよい。好ましい実施態様では、細菌組成物は、即時使用液体として剤形される。１の実施態様では、アンモニア酸化細菌を、０．０１〜２０ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒのＮＨ3酸化速度になるように植菌する。好ましい実施態様では、アンモニア酸化細菌を、０．３〜６ｍｇ  Ｎ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒのＮＨ3酸化速度になるように植菌する。１の実施態様では、亜硝酸酸化細菌を、０．００３〜６ｍｇのＮ−ＮＯ2/Ｌ/ｈｒのＮＯ2酸化速度になるように亜硝酸酸化細菌を植菌する。好ましい実施態様では、亜硝酸酸化細菌を０．０１〜３ｍｇのＮ-ＮＯ2/Ｌ/ｈｒのＮＯ2酸化速度になるように植菌する。
【００２３】
細菌組成物を、本技術分野に既知の方法によりバッチ培養で培養してもよい（例えば、, H Koops, U Purkhold, A Pommerening-Roser, G Timmermann, and M Wagner, "The Lithoautotrophic Ammonia-Oxidizing Bacteria," in M. Dworkin et al., eds., The Prokaryotes: An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community, 3rd edition, release 3.13, 2004, Springer-Verlag, New Yorkを参照のこと）。
【００２４】
水生生物含有液体を硝化する条件下では、本開示の細菌組成物は、処理される液体１５００リットルあたり１６リットルの初期速度で液体に加えられる、硝化組み合わせ濃縮物でありうる。本開示の濃縮物は、処理される液体１５００リットルあたり８リットルの初期速度で液体に加えられる。１の実施態様では、本開示の細菌組み合わせの維持用量は、場合により、例えば２週間ごとに、処理される液体の１５００リットルあたり２リットルの速度で液体に加えられうる。好ましい実施態様では、本開示の細菌組み合わせの維持用量が、場合により、例えば２週間ごとに、処理される液体の１５００リットルあたり１リットルの速度で液体に加えられる。
【００２５】
水生生物リソースの条件下で、本開示の細菌組成物は、処理される液体の１５００リットルあたり２４リットルの初期速度で液体に加えられる硝化組み合わせ濃縮物であり得る。好ましい実施態様では、本開示の濃縮物は、処理される液体の１５００リットルあたり１２リットルの初期速度で液体に加えられる。１の実施態様では、本開示の細菌組み合わせの維持用量は、場合により、処理される液体の１５００リットルあたり１２リットルの速度で加えられうる。好ましい実施態様では、本開示の細菌組み合わせの維持用量は、場合により、処理される液体の１５００リットルあたり１．５リットルの速度で液体に加えられる。
【００２６】
１の実施態様では、本開示の細菌組成物が導入される液体は淡水である。別の実施態様では、液体は塩水である。代わりの実施態様では、液体は、淡水と塩水の組み合わせである。水生生物は、タンク又はコンテナ内に維持される液体中に格納される。適切なタンク又はコンテナの非限定的な例は、デンマークのAqualife of Hoersholmから市販されている。
【００２７】
本明細書中に提供される方法は、１０℃又はそれ未満の温度で維持される液体中で水生生物を治療、救助、維持又は保護を可能にする。別の実施態様では、本明細書に提供される方法は、５℃又はそれ未満の温度に維持される液体中で、水生生物を治療、救助、維持又は保護することを可能にする。さらに別の実施態様では、本明細書に提供される方法は、４℃又はそれ未満の温度で維持される液体中で、水生生物を治療、救助、維持、又は保護することを可能にする。
【００２８】
実施態様では、本開示は、治療を必要とする水生生物を治療する方法であって、水生生物が入っている液体を、有効量の細菌組成物と接触させることを含み、ここで細菌組成物はアンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含み、そして液体の温度は１０℃又はそれ未満である方法に関する。実施態様では、細菌組成物の有効量は、有益効果に十分な量である。有益効果の非限定的な例として、バイオマスの品質の改善、非毒性条件の作出、血液ｐＨの低下、血中の酸素伝達率の増加、エラ健康の改善、及び水生生物の死亡率の低下が挙げられる。有益な効果は、バイオマスや、バイオマスが含まれている水の外観の改善によっても観察することができる。実施態様では、細菌組成物は、０．２５〜２５ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒで除去することができる量を液体に加えられる。実施態様では、細菌組成物は、１〜１０ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒで除去することができる量を液体に加える。実施態様では、液体に加えられたアンモニア酸化細菌の量は、０．２５〜２５ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒで除去するために十分な量である。実施態様では、液体に加えられる亜硝酸酸化細菌の量は、０．２５〜２５ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒを除去するために十分な量である。実施態様では、細菌組成物は、アンモニア酸化細菌として、ニトロソモナス  ユートロファ（Nitrosomonas eutropha)及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター  ウィノグラドスキー（Nitrobacter winogradskyi)を含む。実施態様では、細菌組成物は、ニトロバクター  ウィノグラドスキーと組み合わせたニトロソモナス  ユートロファを含む。実施態様では、細菌組成物は、亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスと組み合わせたアンモニア酸化細菌としてニトロソコッカスを含む。
【００２９】
実施態様では、本明細書に提供される方法は、さらに少なくとも１４日間の連続期間にわたり、液体中に存在するアンモニウム又は亜硝酸塩を酸化することにより、液体中における水生生物の治療、救助、維持、又は保護をさらに可能にする。好ましい実施態様では、連続期間は、少なくとも２８日である。特に好ましい実施態様では、連続期間は、少なくとも４５日である。実施態様では、連続期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間又はそれより長く、１ヶ月又はそれより長く、２ヶ月又はそれより長く、３ヶ月又はそれより長い期間である。
【００３０】
１の実施態様では、少なくとも１の緩衝化合物が、液体のｐＨ及びアルカリ度を安定させるために加えられる。好ましい実施態様では、少なくとも１の緩衝化合物はＮａＨＣＯ３、Ｋ2ＣＯ3、又はそれらの組み合わせである。液体のｐＨは、約６．８〜約８．５の範囲で、２０〜２００ｐｐｍのアルカリ度で維持される。好ましい実施態様では、液体のｐＨは、約７．２〜約８．２の範囲で、５０〜１５０ｐｐｍのアルカリ度で維持される。特に好ましい実施態様では、液体のｐＨは、約７．８で、１００ｐｐｍのアルカリ度で示される。
【００３１】
１の実施態様では、本明細書に記載される方法は、タンク又はコンテナ内で行われてもよい。タンク又はコンテナ内のトート（totes）、ボックス(boxes)、タブ(tabs)、又は他の装置は、水生生物を含むか又は維持するために使用されてもよい。タンク又はコンテナ内の温度は、好ましくは一定に維持される。タンク又はコンテナは、タンク又はコンテナの内部又は外部のいずれかにおいて、液体の温度を維持する様々な手段、例えば断熱層、及び場合により熱交換機を備えてもよい。タンク又はコンテナは、その底部に、１又はそれより多くの排液部及び１又はそれより多くの回収容器を、好ましくはコンテナの下側に取り付けてもよい。コンテナから容器へと液体を回収/送り出すための手段と場合により組み合わされた任意の既知の排液部が使用されてもよい。
【００３２】
１の実施態様では、タンク又はコンテナは、場合により、少なくとも１のバイオフィルターを備える。バイオフィルターは、有害なアンモニアを無害の亜硝酸塩に変換し、それにより閉ループ系を可能にすることによって、水交換を少なくするか又はなくすために機能する。使用されるバイオフィルターのタイプは、例えば、水及びプラスチックバイフィルタービーズを含む拡張可能な培地フィルターであってもよく、そして本明細書に記載される細菌組成物を植菌されてもよい。
【００３３】
タンク又はコンテナは、慣用の手段、例えばパドルホイールやジェットポンプなどによって通気されてもよい。１の実施態様では、酸素飽和は、約７０％〜約１００％のレベルで維持される。特に好ましい実施態様では、酸素飽和は、約１００％のレベルで維持される。別の実施態様では、水生生物が保護されるタンク又はコンテナは、液体濾過システム（例えば、フィルターチューブ）（Aqualife of hoersholm, Denmark から市販）を備えていてもよい。
【００３４】
タンク又はコンテナは、温度、湿度、圧力、アンモニア、二酸化炭素、ｐＨ、又は水生生物の保護に必要と認められる任意の他のパラメーターについてのプローブ/センサーを備えてもよい。ある適用に必要とされるならば、タンク又はコンテナは、さらにバイオ−リザーバタンク、１又は複数のタンパク質スキマー、１又は複数の回転ドラムフィルター、液体を排出し、そしてリサイクルするための任意の付随配管（例えばバルブ）、紫外線ユニット、及びタンクに戻される水の毒性を処理するためのオゾンユニットを含むことができる。当業者に知られている他の成分は、コンテナに加えられてもよい。シクロヘキシイミドなどの抗菌剤が、アメーバなどの原生生物の生育を防止するために液体に加えられてもよい。
【００３５】
以下の実施例は、例示の目的で含められており、そして開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００３６】
実証実施例１
本実験は、４℃でタンク中におけるアンモニアレベルを制御する細菌の能力を実証するために行われた。１.５００リットルの容量と、冷蔵、通気、及び水循環のシステムを有する海水タンク（Aqualife of Hoersholm, Denmarkから市販)を用いた。
【００３７】
２つの対照群のタンク（Ａ群；タンク１及びタンク２）、及び２つの実験群のタンク（Ｂ群；タンク１及びタンク２）を準備し、その内容物を表１に要約した。
【００３８】
【表１】
0005876487.tif 000002
【００３９】
各タンクを、およそ１.１００リットルの淡水で満たし、そして温度を４℃まで冷却した。１００％酸素飽和で、ｐＨを７．８に維持した。ニトロソモナス・ユートロファ（Nitrosomonas eutropha)（平均アンモニア酸化細菌（ＡＯＢ）活性、１５００ｍｇＮＨ3/Ｌ/Ｈｒ）及びニトロバクター・ウィノグラドスキー（Nitrosomonas winogradskyi)（亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）活性、１２３８ｍｇＮＯ2/Ｌ/Ｈｒ）を調製し、そしてＢ群（処理タンク）の各タンクに加えた。Ｂ群（処理タンク）中の２つのタンクを、２００ｇのＮａＨＣＯ3で処理し、そして１２ｇのＫ2ＣＯ3で処理した。次に、バイオマス（ウナギ）を各タンクに加えた（表１参照）。アンモニウム、硝酸、及び亜硝酸塩のレベルを通常のインターバルで計測した。各タンクについての実験結果を表２〜５に記載した。
【００４０】
【表２】
0005876487.tif 000003
【００４１】
【表３】
0005876487.tif 000004
【００４２】
【表４】
0005876487.tif 000005
【００４３】
【表５】
0005876487.tif 000006
【００４４】
対照群（Ａ群）のタンク１では、ウナギは、中程度のストレスのサインを示し、そして何匹かは１３日目に死亡した。ウナギは、刺激された場合に、ゆっくりした動きを示した。水は、脂っこい感じとなり、そして濁った。実験を１３日目に終了した。対照群（Ａ群）のタンク２では、ウナギは、エラが赤くなり、そして行動や動きが遅くなるという形態で、明らかなストレスのサインを示した。数匹の死亡が記録され、そして水が脂っこい感じを有しそして濁ったと報告された。実験を１３日目で終了した。
【００４５】
実験群（Ｂ群）のタンク１では、ウナギはストレスのサインを示さず、そして２２日目まで死亡しなかった。水は、非常に透明（crystal clear）と報告され、そしてウナギは刺激を与えた際に十分に活動的であった。実験群（Ｂ群）のタンク２では、ウナギは、ストレスのサインを示さず、かつ死亡しなかった。水は非常に透明（crystal clear)と報告され、そしてウナギは刺激されたときに十分に活動的であった。実験を１３日目に結論を出した。これらの結果により、低温での硝化細菌の適用が、適用がない場合に致死的又は有害なレベルのアンモニア及び亜硝酸塩を蓄積する条件下で、水生生物の命を保護することができることが示された。
【００４６】
予言的実施例１
液体をいれたタンク又はコンテナに低温に維持された様々なバイオマスソースを、本開示にしたがった組み合わせで処理する。組み合わせを、水生生物、例えば貝類、海水魚、淡水魚、甲殻類、軟体動物、又はは虫類などを治療、維持、保護、又は救助するために加えられる。
【００４７】
予言的実施例２
アンモニア酸化細菌としてニトロソコッカスと、亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスの組み合わせを、実証実施例１に記載される方法に従い液体をいれたタンク又はコンテナに低温で維持された様々なバイオマスソースを治療するために用いる。組み合わせを、水生生物、例えば貝類、海水魚、淡水魚、甲殻類、軟体動物又はは虫類を維持、保護、又は救助するために加える。
【００４８】
予言的実施例３
液体を入れたタンク又はコンテナ内に低温で維持された様々なバイオマスソースを、実証的実施例１に記載される方法に従い組み合わせで処理する。組み合わせを、少なくとも３０日の期間にわたり液体中に存在する水生生物を維持又は予防するために加えられる。水生生物は、非限定的に貝類、海水魚、淡水魚、甲殻類、軟体動物又はは虫類を含む。
【００４９】
予言的実施例４
液体を入れたタンク又はコンテナに維持された様々なバイオマスソースを、本開示にしたがった組み合わせで処理してもよい。しかしながら、温度は、最初の温度３２℃から途中の温度１℃まで１１日間の期間にわたり連続的に低下させる。途中の温度１℃に達したときに、温度を試験期間の残りの１１日間にわたって３２℃へと連続的に上昇させる。温度変化が生じているあいだに、水生生物を維持又は保護するために組み合わせを加える。水生生物としては、貝類、海水魚、淡水魚、甲殻類、軟体動物、又はは虫類が挙げられるがそれらに限定されるものではない。
【００５０】
実証的実施例２
ニトロソモナス  ユートロファとニトロバクター・ウィノグラドスキーによる冷温硝化
３の再現試験チューブを有する３つの群を含む試験設定を準備した。各試験チューブは、１００ｍｌの３５ｐｐｔ塩水、ｐＨ８．０及びアルカリ度＞１００ｐｐｍで準備した。溶存酸素を、通気を用いることによりすべての実験で、＞４．０ｐｐｍに維持した。温度制御水浴を、＋/−０．１℃の正確性を与える温度制御に用いた。
【００５１】
全ての群に対して実験の最初の日に、２０ｐｐｍのアンモニアを加える。次に、ニトロソモナス  ユートロファ（平均アンモニア酸化細菌（ＡＯＢ）活性：１５００ｍｇＮ−ＮＨ3／Ｌ／ｈｒ）及びニトロバクター・ウィノグラドスキー（亜硝酸酸化細菌（ＮＯＢ）活性：１２３８Ｎ−ＮＯ2/Ｌ/ｈｒ）を含む、４０００ｐｐｍの硝化組み合わせを、実験の０日目に処理チューブに加えた。
【００５２】
実験のあいだ、通常のアンモニア読み取り値を測定した（表６）。
【００５３】
【表６】
0005876487.tif 000007
【００５４】
高レベルのアンモニアを含む水溶液が冷温で処理されうるということがこの実験により示された。
【００５５】
実証的実施例３
ニトロソコッカス及びニトロコッカスによる冷却硝化
３の再現試験チューブを有する３つの群を含む試験設定を、実証実施例２に記載されるのと同様に準備した。次に、同様のアンモニア及び亜硝酸酸化率レベルを有するニトロソコッカスとニトロコッカスを含む、４０００ｐｐｍの硝化組み合わせを、実験の０日目に処理チューブに加えた。
【００５６】
実験のあいだ通常のアンモニア読み取り値を測定した（表７）。
【００５７】
【表７】
0005876487.tif 000008
【００５８】
本発明は、以下の番号をつけた段落により記載される。
【００５９】
１．水生生物含有液体を硝化する方法であって、細菌組成物を液体に導入することを含み、当該細菌組成物が、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含み、そして液体の温度が、１０℃か又はそれ未満である、前記方法。
【００６０】
２．液体の温度が１０℃又はそれ未満である液体中の亜硝酸塩又はアンモニアレベルを維持又は低下させる方法であって、液体にアンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌とを含む細菌組成物を液体に導入することを含む、前記方法。
【００６１】
３．前記液体が、さらに少なくとも１の水生生物を含む項目２に記載の方法。
【００６２】
４．アンモニア含有又は亜硝酸塩含有液体中において水生生物を保護するための方法であって、アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌を含む細菌組成物の存在下で、水生生物を保護するを含む、前記方法。
【００６３】
５．アンモニア、亜硝酸塩、又はそれらの組み合わせを含む液体中で水生生物を救出する方法であって、細菌組成物を液体に導入することを含み、ここで当該細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含み、そして導入すると、細菌組成物は、液体中に存在する任意のアンモニア又は亜硝酸塩を酸化し始める、前記方法。
【００６４】
６．液体の温度が１０℃又はそれ以下である、項目５に記載の方法。
【００６５】
７．液体を入れたタンク中で生きた水生生物を輸送する方法であって、
水生生物を気体を入れたタンクに導入し；そして
細菌組成物を液体に導入する
を含み、ここで細菌組成物は、アンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含み、そして液体の温度は液体の凝固点であるか又はそれより高い、前記方法。
【００６６】
８．前記液体の標準凝固点を低下させる成分を液体中に含む、項目７に記載の方法。
【００６７】
９．前記タンクが、水生生物を含むか又は維持する手段、所望の温度を維持する手段、及び通気のための手段を含む、項目７に記載の方法。
【００６８】
１０．前記タンクが、さらにバイオフィルムを含む、項目９に記載の方法。
【００６９】
１１．前記細菌組成物が、液体１５００リットルあたり、１〜１６リットルの細菌組成物の割合で、細菌組成物を液体に導入する、項目１、２、又は７のいずれかに記載の方法。
【００７０】
１２．前記細菌組成物が、５０〜２０００ｍｇのＮ−ＮＨ3／Ｌ／Ｈｒのアンモニア酸化能力を有する、項目１に記載の方法。
【００７１】
１３．前記液体が、塩水、炭水、又はそれらの組み合わせである、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７２】
１４．前記液体の温度が、５℃であるか、又はそれ未満である、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７３】
１５．前記液体の温度が、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃、又は１℃であるか又はそれ未満である、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７４】
１６．液体の温度が、１〜１０℃、１〜５℃、又は１〜３℃である、項目１、２、４、５、又は７のいずれかに記載の方法。
【００７５】
１７．液体のｐＨが、６．８〜８．５である、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７６】
１８．液体が少なくとも４０％の酸素飽和度を示す、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７７】
１９．少なくとも１の緩衝化合物を液体に添加する工程をさらに含む、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００７８】
２０．少なくとも１の緩衝化合物が、ＮａＨＣＯ３、Ｋ2ＣＯ3、又はそれらの組み合わせである、項目１９に記載の方法。
【００７９】
２１．前記水生生物が、少なくとも１４日間液体中に維持される、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００８０】
２１．前記細菌組成物が、アンモニア酸化細菌として、ニトロソモナス・ユートロファ及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター・ウィノグラドスキーを含む、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００８１】
２２．前記細菌組成物がアンモニア酸化細菌としてニトロソコッカス及び亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスを含む、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００８２】
２３．前記細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソコッカス及び亜硝酸酸化細菌としてニトロコッカスを含む、項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の方法。
【００８３】
２４．項目１、２、４、５又は７のいずれかに記載の液体。
【００８４】
２５．水生生物の環境中でアンモニウム及び亜硝酸塩のレベルを制御することを含む、水生生物のリソース方法。
【００８５】
２６．アンモニア及び亜硝酸塩のレベルの制御工程が、細菌組成物を環境に導入することを含み、ここで当該細菌組成物がアンモニア酸化細菌及び亜硝酸酸化細菌を含む、項目２５に記載の方法。
【００８６】
２７．前記細菌組成物が、アンモニア酸化細菌としてニトロソモナス・ユートロファ及び亜硝酸酸化細菌としてニトロバクター・ウィノグラドスキーを含む、項目２６に記載の方法。
【００８７】
２８．治療を必要とする水生生物を治療する方法であって、その中に水生生物をいれた液体を、有効量の細菌組成物と接触させることを含み、ここで細菌組成物が、アンモニア酸化細菌と亜硝酸酸化細菌を含み、そして液温が１０℃又はそれ未満である、前記方法。
【００８８】
２９．液体の温度が、９℃、８℃、７℃、６℃、５℃、４℃、３℃、２℃又は１℃であるか又はそれ皆である、項目２８に記載の方法。
【００８９】
３０．液体の温度が、１〜１０℃、１〜５℃、又は１〜３℃である、項目２８に記載の方法。
【００９０】
３１．液体に加えられた細菌組成物が、０．２５〜２５ｍｇのＮ−ＮＨ3／Ｌ／ｈｒを除去できる、項目２８に記載の方法。
【００９１】
３２．液体に加えられたアンモニア酸化細菌の量が、少なくとも０．２５Ｎ−ＮＨ3/Ｌ／ｈｒを除去できる、項目２８に記載の方法。
【００９２】
３３．液体に加えられる亜硝酸酸化細菌の量が、少なくとも０．２５ｍｇＮ−ＮＨ3/Ｌ/ｈｒを除去できる、項目２８に記載の方法。
【００９３】
様々な変更が本明細書に開示される実施態様に加えることができるてんについて理解されたい。したがって、上の記載は、限定的に解釈すべきではないが、単に実施態様説明として解釈すべきである。当業者は、本明細書に添付された特許請求項の範囲及び精神の範囲内の他の変更を想像するであろう。