(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1のアミノ酸配列を有するイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)を活性成分として含み、該IDSのアミノ酸配列中の59番目のシステイン残基が平均76％以上のモル比でホルミルグリシン（FGly）に変換されており、前記IDSがマンノース-6-リン酸(M6P)をIDS1モルにつき2.3〜3.5モルの量で含有することを特徴とする、ハンター症候群処置用組成物。
【請求項２】
配列番号1のアミノ酸配列を有するイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)がマンノース-6-リン酸(M6P)をIDS1モルにつき2.5〜3.0モルの量で含有する、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
請求項1または2に記載の組成物を含む、ハンター症候群処置用製剤。
【請求項４】
医薬上許容される担体と、
緩衝剤、糖質、安定剤、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤、アジュバント、懸濁化剤、増粘剤、および保存剤からなる群より選択される物質と
を含む、請求項3に記載の製剤。
【請求項５】
（1）配列番号1で表されるイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)をコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を加水分解物の存在下で無血清培養し、培養物を得ること；および
（2）培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、前記カチオン交換クロマトグラフィーは、pH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる、ハンター症候群処置用組成物の調製方法。
【請求項６】
（1）配列番号1で表されるイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)をコードする遺伝子を担持する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して組換え細胞株を得ること；
（2）無血清培地中、加水分解物の存在下で該組換え細胞株を培養し、培養物を得ること；
（3）アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって該培養物からIDSを精製すること、および
（4）精製されたIDSを医薬上許容される担体と組み合わせること
を含み、前記カチオン交換クロマトグラフィーは、pH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる、ハンター症候群処置用組成物の調製方法。
【請求項７】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
疎水性クロマトグラフィーがpH5.0〜7.0の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
【請求項９】
アフィニティークロマトグラフィーがpH6.0〜8.0の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１０】
アニオン交換クロマトグラフィーがpH5.5〜7.5の溶出緩衝液を使って行われる、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１１】
3.0〜4.0のpHでウイルスを不活化することをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
【請求項１２】
請求項5または6に記載の方法に従って調製された組成物を製剤化することを含む、ハンター症候群処置用製剤の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（以下「IDS」という）を含むハンター症候群処置用組成物、それを含む製剤、およびそれを調製するための方法に関する。
【０００２】
より具体的に述べると、本発明のハンター症候群処置用組成物は、活性成分として、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するIDSであって、配列番号1のIDSアミノ酸配列中の59番目のシステイン残基が、65％以上のモル比で、好ましくは75％以上のモル比で、さらに好ましくは80％以上のモル比で、ホルミルグリシン（FGly：2-アミノ-3-オキソプロピオン酸）に変換(convert)されているものを含む。加えて、本ハンター症候群処置用組成物に含有されるIDSは、マンノース-6-リン酸を、IDS1モルにつき2.0〜4.0モルの量で、好ましくは2.3〜3.5モルの量で、さらに好ましくは2.5〜3.0モルの量で含有する。
【０００３】
本発明のハンター症候群処置用組成物を調製するための方法は、
（1）配列番号1で表されるIDSをコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を培養し、培養物を得ること；および
（2）培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、組換え細胞株が加水分解物の存在下で培養され、カチオン交換クロマトグラフィーがpH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われることを特徴とする。
【０００４】
IDSを含む治療組成物およびそれを含む製剤は、安全性および薬効の面で従来の製品に対して利点を有するので、ハンター症候群の処置に、効果的に使用することができる。
【背景技術】
【０００５】
ハンター症候群、別名ムコ多糖症II型は、IDSの欠損ゆえに、グリコサミノグリカン（GAG）とも呼ばれているムコ多糖が正しく分解されることなく体内に蓄積するリソソーム蓄積症（LSD）である。GAGが身体の細胞全体に蓄積し続けるにつれて、ハンター症候群の様々な徴候がより明白になる。ハンター症候群を有する一部の人々の身体的症状発現には特徴的顔貌および大頭が含まれる。ハンター症候群の症状のうち代表的なものは、肝腫大または脾腫による腹部腫脹、難聴、心臓弁膜症、閉塞性気道疾患および睡眠時無呼吸である。また、ハンター症候群では大関節が冒される場合もあり、それが関節硬直および運動制限につながる。ハンター症候群のいくつかの症例では、中枢神経系関与が発育遅延および神経系障害をもたらす。ハンター症候群は162,000人に1人の割合で起こることが知られており、染色体X連鎖劣性遺伝の形態をとる遺伝障害であることから、患者だけでなく家族にも大きな苦悩を与える。
【０００６】
そこで、ハンター症候群の処置については、骨髄移植、酵素補充、および遺伝子治療を含むさまざまな試みがなされてきた。骨髄移植は症状の大半を止めることができるが、全ての患者にHLA（ヒト白血球抗原）適合者を見つけることは困難である。さらに、骨髄移植は、HLAが不適合である場合に患者の生命が高い危険にさらされるなど、いくつかの有害作用を伴う大外科手術である。ハンター症候群の遺伝子治療では、アデノウイルスもしくはレトロウイルスなどのウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを利用して、正常なIDS遺伝子が体内に送達される。しかし遺伝子治療は今なお実験的技法であり、臨床応用はされていない。ハンター症候群の酵素補充処置について言えば、この処置は体外で生産されたIDSを投与するものであり、単純であるという利点を有する。しかし、酵素補充は絶え間なく行わなければならず、それが高い費用を招く。組換えDNA技術を使って生産されるエラプレース（Elaprase（登録商標））（Shire Pharmaceuticals Group）が、ハンター症候群の酵素補充処置としてFDAに承認された。しかし、この薬は極めて高価であり、効果と安全性に乏しいという欠点がある。
【０００７】
上述のように、ハンター症候群の治療法は種々開発されたが、今なお、高い治療効力を高い安全性と共に示す新しい治療法および薬剤が、差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、従来技術において直面した課題を克服すること、そして、改良された培養および精製プロセスによって生産される、高い治療効力および安全性を保証する組換えIDSを活性成分として含むハンター症候群治療用組成物、ならびにそれを含む製剤を提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、ハンター症候群処置用組成物およびそれを含む製剤を調製するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために、本発明は、活性成分として、配列番号1によって表されるアミノ酸配列を有する組換えIDSであって、59番目のシステイン残基が、65％以上のモル比で、好ましくは75％以上のモル比で、さらに好ましくは80％以上のモル比で、ホルミルグリシン（FGly）に変換されているものを含む、ハンター症候群治療用組成物を提供する。
【００１１】
IDSは、本明細書においてはイズロン酸-2-スルファターゼまたはI2Sともいい、ヒトの肝臓、腎臓または胎盤から単離、精製された場合は、56kDaの分子サイズを有する（Bielicki, J.ら (1990) Biochem. J., 271:75-86）。IDSは550アミノ酸の単量体タンパク質として発現し、25アミノ酸のシグナルペプチドの切断後に、525アミノ酸の成熟活性タンパク質として培地中に分泌される。IDSの分子量はグリコシル化によって変動し、エンドグリコシダーゼFによる処理後は、SDS-PAGEによる測定で約60〜90kDaの範囲にあることがわかっている。
【００１２】
IDSは2つのジスルフィド結合と8つのN結合型グリコシル化部位とを含有し、翻訳後修飾を経た後に糖タンパク質として生産され、この際、真核生物では、N-結合型グリコシル化部位が複合型、混合型および高マンノース型オリゴ糖鎖によって占められる。IDSは、ひとたび培養培地中に分泌されれば、典型的な単離および精製プロセスを経た後に、薬として使用することができる。IDSは、例えばIDS遺伝子の組み換え、形質転換（例えば使用した細胞株）、培養および精製技法を含むさまざまな因子に依存して、さまざまなグリコシル化パターンを有する糖タンパク質の形態をとりうる。
【００１３】
本発明では、マンノース-6-リン酸（M6P）の含量と、Cys-59のFGlyへの変換率(conversion ratio)とが、IDSの治療効力および安全性に大きな影響を有することを開示する。マンノース-6-リン酸（M6P）残基の存在は細胞表面上のM6P受容体への本酵素の特異的結合を可能にし、それが、酵素の細胞内在化、リソソームのターゲティング、そしてそれに続く、蓄積したGAGの異化をもたらす。IDSの生物学的活性は、保存されたシステイン（59番目）のホルミルグリシンへのポスト修飾にも依存する。
【００１４】
別段の言明がない限り、本明細書において使用する用語「IDS」は、糖質が結合しているIDSタンパク質、すなわちグリコシル化IDSを意味する。本発明のIDSは、好ましくは、配列番号1のアミノ酸配列を有するが、それに限定されるわけではない。配列番号1のアミノ酸配列の一部のアミノ酸残基に挿入、欠失および置換などの変異が起こっているアミノ酸配列であっても、そのIDSが所望の活性を保持しうる限り、いずれも本発明の範囲に包含されることは、当技術分野における通常の知識を有する者（以下、「当業者」という）にとっては明白なはずである。
【００１５】
本明細書において、IDSの「グリコシル化パターン」という用語は、結果として生じるIDSの8つのグリコシル化部位に結合しているオリゴ糖のプロファイル（例えばグリコシル化部位およびオリゴ糖の種類）を指す。
【００１６】
一実施形態において、本発明のハンター症候群治療用組成物に含有されるIDSは、既知のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列（配列番号1）を有するが、上述のように、グリコシル化パターンと59番目のシステインのホルミルグリシンへの変換率とが異なっている（実施例1-5および1-6参照）。
【００１７】
すなわち、本発明のハンター症候群治療用組成物に使用されるIDSは、配列番号1のアミノ酸配列を有し、59番目のシステインが、65％以上のモル比で、好ましくは75％以上のモル比で、さらに好ましくは80％以上のモル比で、ホルミルグリシン（FGly）に変換されているのに対し、エラプレースにおける変換率はおよそ50％である（Genet Med 2006:8(8):465-473）。ホルミルグリシンは、基質を分解するIDSの能力、すなわちIDSの活性に、深く関与することが知られている。したがって、本発明の組成物と従来の薬剤エラプレースとは異なるので、本発明の組成物および製剤は、IDSのアミノ酸配列の59番目におけるシトシンからホルミルグリシンへの変換率が高いために、ハンター症候群に対して、従来の薬剤エラプレースよりも高い治療効力を発揮することができる。
【００１８】
加えて、本発明のハンター症候群治療用の組成物または製剤に使用されるIDSは、マンノース-6-リン酸を、IDS1モルにつき2.0〜4.0モルの量で、好ましくは2.3〜3.5モルの量で、さらに好ましくは2.5〜3.0モルの量で含有する。M6Pは、IDSの細胞内在化とそれに続く細胞内リソソームへのターゲティングとに重要な役割を果たす。したがって、M6P含量が高いIDSを含む本発明の組成物は、受容体を介したこの酵素の取り込み機序およびリソソームへのターゲティング、そしてそれによる、蓄積したGAGの効果的な異化の性能が高いことを保証する。
【００１９】
本発明のIDSを含むハンター症候群治療用製剤は、本発明の組成物を医薬上許容される担体と共に適切な形態に製剤化することによって調製することができる。
【００２０】
本明細書において使用する用語「医薬上許容される」担体とは、活性成分のための無毒性で生理学的に適合する媒体であって、動物が摂取するのに適しており、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激性、アレルギー応答などを伴わないものを指す。
【００２１】
本発明の組成物は、採用した投与経路に応じて、適切な媒体とともに製剤化することができる。本発明の製剤は、経口投与または非経口投与することができるが、これらに限るわけではない。非経口投与の場合、経皮、鼻腔内、腹腔内、筋肉内、皮下または静脈内経路から選択される経路を採用することができる。
【００２２】
経口投与用には、医薬組成物を適切な経口媒体と組み合わせて、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁剤およびオブラート剤（wafers）に、当技術分野で知られている方法を使って製剤化することができる。製剤化に有用な適切な媒体の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトールおよびマルチトールなどの糖類、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、およびバレイショデンプンなどのデンプン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース、ならびにゼラチンおよびポリビニルピロリドンなどの充填剤が挙げられる。場合により、製剤はさらに、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を含みうる。加えて、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、および保存剤を、さらに使用することができる。
【００２３】
また、本発明の組成物は、非経口媒体と組み合わせて、注射可能調製物、経皮調製物または鼻腔内吸入薬などの非経口剤形に、当技術分野において周知の方法を使って製剤化することもできる。注射に使用する場合、製剤は、滅菌され、細菌および真菌などの微生物による汚染から防護されていなければならない。注射に適した媒体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの組み合わせ、および/または植物油含有溶媒もしくは分散媒などを挙げることができるが、これらに限るわけではない。より好ましくは、媒体は等張液、例えばハンクス溶液、リンゲル液、トリエタノールアミン含有PBS（リン酸緩衝食塩水）または注射用滅菌水、10％エタノール、40％プロピレングリコールおよび5％デキストロースなどであることができる。注射可能調製物を微生物汚染から防護するために、注射可能調製物は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの抗微生物剤および抗真菌剤を、さらに含んでもよい。また、注射可能調製物はさらに、ほとんどの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張化剤を含みうる。これらの製剤は、医薬分野では周知の文書（Remington's Pharmaceutical Science、第15版、1975、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン）に開示されている。吸入薬については、本発明の製剤を、圧縮パックまたは噴霧機から、適切な噴射剤、例えばジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または適切なガスを使って、エアロゾルスプレーの形態で都合よく送達することができる。圧縮エアロゾルの場合は、用量の単位サイズを、計量された量を送達するためのバルブによって決定することができる。例えば、吸入器または噴霧器に使用するためのゼラチンカプセルおよびカートリッジであって、本化合物とこれらの系に適した粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンなどとの粉末混合物を含有するものを、製剤化することができる。
【００２４】
他の適切な医薬媒体は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（第19版、Mack Publishing Company、ペンシルベニア州イーストン、1995）に記載されている。
【００２５】
そのうえ、本発明の製剤は、1つ以上の緩衝液（例えば食塩水またはPBS）、糖質（例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、安定剤（亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸）、酸化防止剤、静菌剤、キレート剤（例えばEDTAまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、懸濁化剤、増粘剤および/または保存剤（塩化ベンザルコニウム、メチル-またはプロピル-パラベンおよびクロロブタノール）を、さらに含みうる。
【００２６】
また、本発明の組成物は、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速放出、持続放出または遅延放出を可能にする剤形へと製剤化することもできる。こうして調製された製剤の有効量は、経口、 経皮、皮下、静脈内および筋肉内経路を含むさまざまな経路によって投与することができる。本明細書において使用する用語「有効量」は、患者に投与した時に診断効果または治療効果が起こるのを追跡できるようなIDSの量を指す。本発明の製剤の用量は、投与の経路、処置すべき対象のタイプ、処置すべき疾患のタイプ、投与経路、疾病の重症度、および患者の年齢、性別、体重、状態、および健康状況を含むさまざまな因子に依存して変動しうる。本発明のIDSを含む製剤は、1回の投薬につき、0.1〜10mg/kgの用量で、好ましくは0.5〜1.0mg/kgの用量で、使用することができる。
【００２７】
本発明の治療組成物を調製するための方法は、
（1）配列番号1で表されるIDSをコードする遺伝子で形質転換された組換え細胞株を培養し、培養物を得ること；および
（2）培養物をアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製すること
を含み、ここで、組換え細胞株は加水分解物の存在下で培養され、カチオン交換クロマトグラフィーはpH4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる。
【００２８】
より具体的には、本発明の治療組成物を調製するための方法は、
（1）IDS遺伝子を担持する発現ベクターで宿主細胞を形質転換して組換え細胞株を得ること；
（2）無血清培地中、加水分解物の存在下で組換え細胞株を培養し、培養物を得ること；
（3）アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによって培養物からIDSを精製すること、ただし該カチオン交換クロマトグラフィーはpHが4.0〜6.0の範囲にある溶出緩衝液を使って行われる；および
（4）精製されたIDSを医薬上許容される担体と組み合わせること
を含む。
【００２９】
本方法において、ステップ（1）は、IDS遺伝子を担持する発現ベクターを宿主細胞中に導入することによって、組換え細胞株を樹立することに向けられる。IDSのアミノ酸配列およびIDSをコードする遺伝子は、当技術分野において知られている。配列番号1のアミノ酸配列を有するIDSをコードする遺伝子は好ましいが、これは、限定的な例として掲載されているわけではない。本発明が生じさせようとしているIDSの活性をそのアミノ酸配列が保持しているのであれば、配列番号1のアミノ酸配列上の一部のアミノ酸が挿入、欠失、および/または置換によって変異していても、その遺伝子は本発明において使用することができる。遺伝子を担持する発現ベクターは、当技術分野において知られている典型的な方法を使って構築することができる。また、発現ベクターは、遺伝子の導入を同定することを可能にするマーカー遺伝子を含有することができる。マーカー遺伝子の例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dhfr）が挙げられるが、これに限るわけではない。好ましいのはpJK-dhfr-Or2-IDSベクター（図2）である。
【００３０】
ステップ（1）に利用することができる宿主細胞として動物細胞を挙げることができ、その例には、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞7（COS7）、およびNSO細胞などがあり、CHO細胞は好ましいが、これらに限るわけではない。CHO細胞株は、その高い細胞成長速度および生産性、遺伝子操作の容易さ、大規模懸濁培養における迅速な増殖、および無タンパク質培地への高い適応ゆえに、生物医学的製品の生産に最も広く使用されているものの一つである。ステップ（1）における形質転換は、当技術分野において知られているプロトコールに従って行うことができる。
【００３１】
本方法において、ステップ（2）は、IDS発現ベクターを内包する組換え細胞株を無血清培地中で培養することに向けられる。培養は宿主細胞の種類に最適化された培地および条件下で行うことができる。好ましいのは無血清培地である。血清（例えばウシ血清）を含まないため、そのような培地では、血清に関連する副作用またはリスクを誘導する可能性を回避することができる。
【００３２】
本発明の一実施形態では、IDS発現ベクターで形質転換された組換え細胞株の培養をさらにスケールアップすることができる。例えば、本発明の組換え細胞株を振とうフラスコで培養し、次にバイオリアクターにおいて、数百〜数千リットルまでスケールアップすることができる。培養ステップは、ホルミルグリシン含量の決定に重大な影響を有する加水分解物の存在下で行われる。好ましくは、0.1〜10.0g/Lの最終濃度を形成するような量で、加水分解物を加える。本発明において有用な加水分解物は、動物質または植物質を加水分解することによって得られるものであり得る。より具体的には、加水分解物は、ダイズ、ジャガイモ、小麦胚芽、および酵母からなる（ただしこれらに限るわけではない）群から選択される少なくとも一つを加水分解することによって得ることができる。
【００３３】
本方法において、ステップ（3）は、アニオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーによる、細胞培養物からのIDSの精製に向けられる。
【００３４】
好ましくは、上記4つのクロマトグラフィープロセスを、上記の順に行うことができる。ただし、必要であれば順序を変更しうることは、当業者には自明なはずである。クロマトグラフィープロセスの順序と共に、樹脂および溶出緩衝液のpH値も、IDSのグリコシル化パターンおよびホルミルグリシン含量を決定するのに重要である。
【００３５】
アニオン交換クロマトグラフィーは、細胞培養物から色素およびさまざまな不純物を除去することを目的としており、Qセファロース（Q Sepharose（登録商標））樹脂を充填したカラムで、pHが5.5〜7.5の溶出緩衝液を使って行われる。
【００３６】
疎水性クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィー後に残っている色素および不純物を除去することを目的とする。これは、フェニルセファロース（phenyl Sepharose（登録商標））樹脂を充填したカラムで、pHが5.0〜7.0の溶出緩衝液を使って行われる。
【００３７】
カチオン交換クロマトグラフィーは、高いホルミルグリシン含量を選択し、残留不純物を除去することを目的とする。これは、カチオン交換樹脂を充填したカラムで、pHが4.0〜6.0の溶出緩衝液を使って行われる。本発明において有用なカチオン交換樹脂の例としては、CMセファロースファストフロー（CM Sepharose Fast Flow）、SPセファロースファストフロー（SP Sepharose Fast Flow）、Sセファロースファストフロー（S Sepharose Fast Flow）およびカプト（Capto）MMC（いずれもGE Healthcare製）を挙げることができるが、これらに限るわけではない。好ましくは、溶出緩衝液のpHは4.0〜6.0の範囲にある。
【００３８】
アフィニティークロマトグラフィーは、カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用したグリセロールを除去し、溶出物の体積を減縮することを目的とする。これは、ブルーセファロース（Blue Sepharose（商標））樹脂を充填したカラムで、pHが6.0〜8.0である溶出緩衝液を使って行われる。
【００３９】
各タイプのクロマトグラフィーの条件を、当業者は、最適に変更することができる。具体的なクロマトグラフィー条件については、後述の実施例1-5を参照することができる。
【００４０】
活性成分としてIDSを含む組成物を調製するための本発明の方法は、組成物中に組み込まれているかもしれないウイルスを不活化することを、さらに含みうる。不活化は、さまざまな方法で行うことができ、好ましくは培養物を、前もって定められた時間、pH3.0〜4.0で、または高pH条件下に、保持することによって行うことができる。不活化プロセスは、精製プロセス中に、好ましくはクロマトグラフィー中に、さらに好ましくは疎水性クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとの間に、達成することができる。
【００４１】
クロマトグラフィープロセス後に、こうして得られた活性画分を濃縮し、ろ過することで、医薬組成物の活性成分として使用することができるIDSを得ることができる。
【００４２】
本組成物を医薬上許容される担体と混合し、適切な剤形に製剤化することができる。
【００４３】
本発明の方法に従って調製されたIDSを含む組成物は、従来のIDS組成物に対して次に挙げる利点を有する：1）ホルミルグリシン含量が高いために高い薬効を発揮し、2）リソソーム内に蓄積したGAGをより効果的に異化することができ、3）動物由来の血清を含まないので安全であり、そして 4）その純度が99.9％以上であることから、安全かつ有効である。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の組換えIDSを含む組成物およびそれを含む製剤は、従来の薬剤エラプレースに対して、薬効および安全性において優れており、したがって、ハンター症候群の治療に効果的に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】IDS発現ベクターを構築するために使用したpJK-dhfr-IDS-S1ベクターを構築するためのスキームを図解した図である。
【図２】図1のpJK-dhfr-IDS-S1からIDS発現ベクターpJK-dhfr-Or2-IDSを構築するためのスキームを図解した図である。
【図３】形質転換CHO-DG44からのIDSの単離および精製を図解したフローチャートである。
【図４】N端配列を分析するためのIDSのSDS-PAGEの結果を表す写真である。ここでは、マーカーをレーンMで、グリコシル化IDSをレーン1で、PNGase Fをレーン2で、そして脱グリコシル化IDSをレーン3で泳動した。
【図５】IDSのアミノ酸配列を分析するプロセスを図解したフローチャートである。
【図６】MALDI-MS/MSおよびLC-ESI-MS/MSによって分析した本発明のIDSのアミノ酸配列を表す図である。
【図７】IDSにおけるジスルフィド結合の位置を表す非還元および還元IDS試料のRP-HPLCクロマトグラムである。
【図８】MALDI-MSによって分析した本発明のIDSにおけるジスルフィド結合の位置を表す図である。
【図９】MALDI-MS/MSによって分析した本発明のIDSにおけるジスルフィド結合の位置を表す図である。
【図１０】MALDI-MS/MSによって得られた本発明のIDSにおけるジスルフィド結合の位置を示す図である。
【図１１】本発明のIDSのグリコシル化を調べるためにさまざまなグリコシドヒドロラーゼ酵素による処理後にSDS-PAGEによって泳動したIDSを表す写真である。
【図１２】本発明のIDSにおけるマンノース-6-リン酸の含量を表すHPAEC-PADクロマトグラムである。
【図１３】本発明のIDSの純度を表すサイズ排除クロマトグラムである。
【図１４】天然基質に対する本発明のIDSの触媒活性を表すイオンクロマトグラムである。
【図１５】正常線維芽細胞に加えられたIDSの量に対するIDSの細胞取り込み量の比を表すラインウィーバー-バーク・プロットである。
【図１６】正常ヒト線維芽細胞およびハンター症候群を患う患者の細胞に内在化された本発明のIDSの量を表すグラフである。
【図１７】本発明のIDSにおけるホルミルグリシン含量を表す図である。
【図１８】カチオン交換クロマトグラフィーの前および後の本発明のIDSのIEF（等電点電気泳動）点を表す図である。ここでは、MをMレーンで、カチオン交換クロマトグラフィーにローディングする試料をレーン1で、カチオン交換クロマトグラフィーの溶出物をレーン2で、カチオン交換クロマトグラフィー後の再生溶液をレーン3で泳動する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の実施例によって、本発明をより良く理解することができるが、これらの実施例は本発明を例示するために記載するのであり、これらを本発明の限定であると解釈してはならない。
【実施例】
【００４７】
［実施例1：IDSの調製］
＜1-1＞遺伝子の取得
既述のとおり［S.Beckebaumら, Immunology, 2003, 109:487-495］、末梢血単核球（PBMC）をヒト血液から単離した。既述のプロトコール［M. J. Hollandら, Clin. Exp. Immunol., 1996, 105:429-435］に従って、PBMCから全RNAを抽出した。全RNAからcDNAライブラリーを構築するために、一本鎖合成キット（Boehringer Mannheim）を利用し、オリゴ-(dT)プライマーを使って、一本鎖cDNAを合成した。これに関連して、1μgの全RNAを含有するエッペンドルフチューブにDEPC処理蒸留水を加えて、最終体積が12.5μlになるようにした。次に、そのチューブに1μgの20pmolオリゴ(dT)プライマーを加えてから、70℃で2分間インキュベートし、冷却した。この反応混合物に、4μgの反応緩衝液、1μgのdNTP、1μgのRNase阻害剤、および1μgの逆転写酵素を加え、次に、それらを42℃で1時間反応させて、一本鎖cDNAを合成した。cDNAをテンプレートとし、配列番号2〜4のプライマーの存在下でPCRを行うことにより、ヒトIDS遺伝子を増幅した。ここでは、遺伝子クローニングにおいて使用するための制限酵素認識部位を含有するように、各プライマーを設計した。
【００４８】
＜1-2＞発現ベクターの構築
A．pJK-dhfr-IDS-S1ベクターの構築
非コード配列として、抗体の軽鎖シグナル配列（ヒトIgG軽鎖の一部に由来）を、実施例＜1-1＞によって取得したIDS遺伝子の5'端に、PCR前に導入した。それによって得られたPCR産物を電気泳動によりゲル上で泳動した後、ゲル抽出キットを使ってヒトIDS遺伝子を単離した。単離されたIDS遺伝子およびpJK-dhfr-Or2ベクター（Aprogen）をEcoRVおよびApaIで消化し、16℃で20時間、互いにライゲートした。こうして構築された組換えベクターを大腸菌（E. coli）（DH5α）に形質転換し、次にそれを、50μg/mLアンピシリンを含有するLBプレート上に拡げ、終夜インキュベートした。プレート上で成長したコロニーを選択し、そこからプラスミドを単離するために培養した（図1）。
【００４９】
B．組換えヒトIDS発現プラスミドの構築
上で構築したプラスミドの非コード配列をシグナル配列に変えるために、組換えヒトIDSをpJK-dhfr-or2ベクターにサブクローニングした。この目的のために、pJK-dhfr-IDS-S1ベクターをEcoRVおよびApaIで消化することで部分IDS遺伝子（1233bp）を得て、次にそれを、前もって同じ制限酵素で処理しておいたpJK-dhfr-Or2ベクターに挿入することにより、pJK-dhfr-IDS-S2ベクターを構築した。非コード配列およびシグナル配列を5'端に導入するために、pJK-dhfr-IDS-S1ベクターをテンプレートとするPCRに、IDS N1フォワードプライマー（配列番号5）およびIDS4リバースプライマー（配列番号7）を使用した。PCRは、94℃で5分間から開始した後、94℃で1分、55℃で30秒および72℃で40秒を30サイクル行い、72℃で10分間の伸長によって締めくくった。
【００５０】
このPCR増幅により、448bpである部分IDS遺伝子を得た。この遺伝子をテンプレートとして使用して、IDS N2フォワードプライマー（配列番号6）およびIDS4リバースプライマー（配列番号7）の存在下、上記と同じ条件で、再びPCRを行った。これにより476bp長のDNAフラグメントが合成された。
【００５１】
次に、pJK-dhfr-IDS-S2ベクターおよび組換えヒトIDS遺伝子フラグメント（476bp）をEcoRVで別々に消化した。消化物を電気泳動により、ゲル上で分離することで、ベクターと476bp長のIDSフラグメントとを得た。これらのベクターおよびインサートを、T4 DNAリガーゼの存在下、16℃で12時間ライゲートすることで、pJK-dhfr-Or2-IDSプラスミドを構築した。これらの手順を図2に図解する。
【００５２】
IDS発現プラスミドの構築を確認するために、DH5をpJK-dhfr-Or2-IDSで形質転換し、アンピシリン（50μg/mL）を含有するLBプレート上で24時間培養した。こうして形成されたコロニーから、プラスミドを単離し、消化することで、インサートのサイズを測定した。また、T7プライマー（配列番号8）を使って塩基配列決定も行った。
【００５３】
＜1-3＞組換えヒトIDS発現株の選択
A．CHO-DG44のトランスフェクション
本発明のIDSを発現させるための宿主細胞としてCHO-DG44を使用した。変異型チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-DG44は、DHFR酵素をコードする内在性dhfr（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）遺伝子に関して、二重欠失を持っている。DHFR酵素は、葉酸がジヒドロ葉酸（FH2）を経由して核酸のデノボ合成に関与するテトラヒドロ葉酸（FH4）へと変換される過程に関与する。細胞におけるdhfrのレベルはMTXの濃度に依存する。DHFRの基質である葉酸に構造が類似しているMTXは、ジヒドロ葉酸レダクターゼとの結合に関して葉酸と競合するので、MTXの存在下では大半のジヒドロ葉酸レダクターゼがその活性を失う。したがって、もし細胞が十分な量のdhfrを増幅しなければ、細胞は、その生命に必要な核酸を合成することができないので、死んでしまう。これに対して増幅が十分であれば、dhfrが比較的豊富に存在するので、細胞は高濃度のMTX下でも生き残ることができる。この系は、dhfr遺伝子を、したがって目的の構造遺伝子を、増幅することができるトランスフェクト細胞株を選択するために、動物細胞に応用することができる。
【００５４】
この目的のために、実施例1-2で構築したIDS発現ベクターpJK-dhfr-Or2-IDSに、dhfr遺伝子を増幅可能マーカーとして導入し、MTXおよびdhfr遺伝子を使って、遺伝子増幅を行った。
【００５５】
これに関連して、DG44細胞株（コロンビア大学Chaisin博士から入手）を10mLのDMEM/F12（ヌクレオチドおよびヌクレオシドならびに10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したもの）に懸濁し、1000rpmで5分間の遠沈によって収穫した。細胞を、T-175フラスコ中の培養培地50mLに接種し、5±1％CO2のインキュベーター中、37±1℃でインキュベートした。トランスフェクションの前日に、DG44細胞用の培養培地をT-175フラスコから除去し、細胞をPBSで2回洗浄し、トリプシン処理によって剥離させた。次に、それらを5×105細胞の密度でT-25フラスコに播種し、5±1％CO2インキュベーター中、37±1℃で24時間インキュベートした。細菌および真菌汚染を光学顕微鏡下で調べると同時に、PCR-ELISAを行って、細胞がマイコプラズマに汚染されていないかどうかを調べた。
【００５６】
リポフェクタミン（Lipofectamine）キットを使って、無菌DG-44細胞に、実施例1-2で構築したIDS発現ベクターpJK-dhfr-Or2-IDSをトランスフェクトした。これに関連して、5μgの発現ベクターおよび50μgのリポフェクタミンを、800μgのOpti-MEM Iに個別に希釈し、起泡しないように注意深く混合し、室温で15分間放置した。その間に、DG44細胞を滅菌PBSで1回、Opti-MEM Iで3回洗浄した。そのDG44細胞にDNA-リポフェクタミン混合物を注意深く加え、次に6.4mLのOpti-MEMを加えてから、5±1％CO2インキュベーター中、37±1℃で、5時間インキュベートした。その後、細胞膜の回復と細胞の成長を促進するために、8mLのDMEM/F12および1.6mLのFBSを補充した培地で、さらに48時間、インキュベーションを行った。
【００５７】
B．ジェネティシン(G418)耐性細胞株の選択
培養細胞を0.25％トリプシンで剥離させ、計数し、1ウェルにつき100μgのMEM-アルファ培地（10％透析FBSおよび550μg/mL G418を補充）が入っている96穴プレートに、5×103細胞/ウェルの密度で播種した。翌日、同じ培地を100μg/ウェルの量で加え、細胞を2〜3週間培養してコロニーを形成させた。細胞が50％コンフルエントまで成長した時に、培地を新鮮なものに置き換えた。3日間の維持後に、酵素分析のために培養培地を収集した。
【００５８】
3日ごとに培地を200μgの新鮮培地に置き換えた。培養後3〜4日目に、光学顕微鏡で観察すると、非トランスフェクト細胞、すなわちジェネティシンに対して耐性でない細胞は、96穴プレートの底から剥離し始めた。選択したクローンを、逐次的に96穴プレートから24穴プレート、6穴プレートおよび100mmディッシュへと順に移しながら、培養した。細胞が100mmディッシュで80〜90％コンフルエントまで成長した時に、再び発現レベルを測定した。細胞を0.25％トリプシンで剥離させ、計数し、6穴プレートに5×105細胞/ウェル/3mLの密度でプレーティングし、3日間維持し、計数した。タンパク質の発現レベルを定量的に分析した。分析結果に従って、15個のクローンを選択した。
【００５９】
C．高い発現能を有するIDS発現株の選択
選択した15個のクローンを、MTXの濃度を増加させて培養することにより、IDSが増幅される細胞株を選択した。
【００６０】
ここでは、1×106細胞/100mmディッシュ/10mLのMTX含有培地という密度で、細胞を接種し、80〜90％コンフルエントまで培養した。細胞培養物の体積の10分の1を100mmディッシュ/10mLに再び接種した。この継代培養プロセスを2回繰り返した。増加したMTX濃度に細胞が十分に適応するように、細胞を少なくとも3回は継代させた。MTXの濃度は、最初の3日間の分析を行った後に選択したクローンの5nMから、20nMまで増加させた。各ステップにおいて、増加したMTX濃度に適応したクローンを3日間培養して、細胞成長速度を測定した。IDS発現レベルを測定して、IDS遺伝子の増幅が起こる細胞株、すなわち組換えIDSが高い比率で発現する細胞株を選択した。選択した細胞株のうち、以降の実験ではNI4を使用した。これが最も高い発現レベルを有していたからである。
【００６１】
D．限界希釈法による単一株の選択
株NI4は他の株と混じった状態になっている可能性があった。そこでこの株を単一株に分離した。20nM MTXに耐えるN14クローンを、所望の細胞株が選択されるように、限界希釈法によってサブクローニングした。
【００６２】
まず、NI4を、96穴プレート中のIMDM培地（Gibco BRL、カタログ番号12200）に0.5細胞/ウェルの密度で接種し、3日ごとに培地を補充しながら培養した。3日目に、プレートを顕微鏡下で観察して、1ウェルにつき2つ以上のコロニーが形成されているウェルを排除した。1ウェルにつきコロニーが1つだけ形成されていたウェルを選択して、培養を続けた。15日間の培養後に、細胞を96穴プレートに継代培養し、細胞が90％コンフルエントまで成長した時に、培地を新たに補充した。
【００６３】
N14株から合計263個の単一株が同定された。それらのうち、S46株は最も高いIDS活性を有することが見出され、これをNI4-S46と名づけた。
【００６４】
＜1-4＞細胞培養
A．振とうフラスコ培養
本発明のIDSを生産するためにNI4-S46株を大規模に培養した。この株を、125mL培養フラスコ中のEX-cell302無血清培地（グルタミン、デキストラン硫酸、およびプルロニック（pluronic）F-68を含有）に接種し、5±1％CO2インキュベーター中、37±1℃で培養した。次に細胞を、2〜3日ごとに、振とうフラスコを使って、1：5〜1：8の比率で継代した。継代時に、培養体積をおよそ2,400mLまで徐々に増加させた。多くの振とうフラスコで、細胞を、発酵槽への接種に十分なレベルまで培養した。
【００６５】
B．30L発酵槽における培養（作業体積20L）
振とうフラスコにおける細胞の密度が1.3×106細胞/mLに到達した時に、それらを30L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、10％以上の溶存酸素含量、37±1℃の培養温度、および7.0±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞試料を採取して、顕微鏡下で観察した。細胞培養物を調べて、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析した。分析結果に基づいて、細胞が十分に成長したと判断された時に、細胞を150L発酵槽に接種した。
【００６６】
C．150L発酵槽における培養（作業体積100L）
30L発酵槽における細胞が0.9×106細胞/mL以上の密度に到達した時に、それらを150L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、10％以上の溶存酸素含量、37±1℃の培養温度、および7.0±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞試料を採取して、顕微鏡下で観察した。細胞培養を調べて、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析した。分析結果に基づいて、細胞が十分に成長したと判断された時に、細胞を650L発酵槽に接種した。
【００６７】
D．650L発酵槽における培養（作業体積500L）
150L発酵槽における細胞が0.9×106細胞/mL以上の密度に到達した時に、それらを650L発酵槽に接種した。細胞培養中は、培養条件を、3日間は、10％以上の溶存酸素含量、34±1℃の培養温度、および6.9±0.2のpHに維持し、次に、32±1℃の培養温度および6.9±0.2のpHに維持した。必要であれば、細胞数、細胞生存率、pH、グルコース濃度およびグルタミン濃度を分析するために、細胞試料を採取し、顕微鏡下で観察した。分析結果に応じて、細胞成長を継続させるために、グルコース濃度およびグルタミン濃度を調節した。発酵中は、ホルミルグリシン変換を増加させるために加水分解物を加えた。
【００６８】
＜1-5＞IDSの精製
次に挙げる一連の4つのクロマトグラフィープロセスを使ってIDSを細胞培養物から単離した。
【００６９】
A．培養培地の収穫およびろ過
650L発酵槽への接種の10日後、細胞生存率が80〜85％の範囲にとどまっている時に、培養を停止した。ミリポア（Millipore）PODフィルターシステムおよびD0HCフィルター（ミリポア）を使って、0.9バール以下の圧力で、細胞を培養物から収穫した。細胞を除去した後、上清をプレフィルター（ミリポア、0.5＋0.2μm）および0.45＋0.2μmフィルターでろ過し、使い捨て滅菌ビニルバッグに回収した。収穫した培養物溶液を2〜8℃で貯蔵した。
【００７０】
B．濃縮およびダイアフィルトレーション
Aで回収したろ液を、限外濾過システム（タンジェンシャルフロー濾過膜システム）を使って約10倍濃縮した。限外濾過システムの内部に取り付けた膜（カットオフ：30K、Pall）を流量20〜25L/分のWFI（注射用水）で洗浄してから、20mMリン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素ナトリウム七水和物）を含有する緩衝液（pH7.0〜8.0）で平衡化した。平衡化後に、膜を通過しなかった画分を回収しながら、ろ液を膜に給送した。回収された体積がろ液の初期体積の約1/10になったら、濃縮作業を停止した。濃縮物の体積の3〜4倍の体積で緩衝液を連続的に交換した。電導度およびpHが基準内に入ったら、このプロセスを停止した［基準−電導度：＝5.0mS/cm、pH7.0〜8.0］。
【００７１】
C．アニオン交換クロマトグラフィー
Bで回収された濃縮物から色素およびさまざまな不純物を除去するために、Qセファロース樹脂（GE Healthcare）を充填したカラム（GE Healthcare）で、アニオン交換クロマトグラフィーを行った。20mMリン酸ナトリウム（リン酸二水素ナトリウム一水和物およびリン酸水素ナトリウム七水和物）を含有する平衡緩衝液（pH7.0〜8.0）でカラムを平衡化した。Bで得た濃縮物を0.45＋0.2μmフィルター（Sartorius）でろ過し、平衡化したカラムに、100〜120cm/時間の流速でローディングした。ローディングが完了した後、カラムをまず平衡緩衝液で洗浄し、次に、塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液（pH5.5〜7.5）で洗浄した。次に、塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液（pH5.5〜7.5）で、標的タンパク質を溶出させた。
【００７２】
D．疎水性クロマトグラフィー
アニオン交換クロマトグラフィー後に残っている色素および不純物を除去するために、フェニルセファロース樹脂（GE Healthcare）を充填したカラム（GE Healthcare）で、疎水性クロマトグラフィーを行った。塩化ナトリウムを含有する平衡緩衝液（pH5.0〜7.0）でカラムを平衡化した。Cで得た溶出物を0.45＋0.2μmフィルター（Sartorius）でろ過し、平衡化したカラムに、70〜100cm/時間の流速でローディングした。ローディングが完了した後、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。次に、グリセロールを含有する溶出緩衝液（pH5.0〜7.0）で、標的タンパク質を溶出させた。
【００７３】
E．低pHによるウイルスの不活化
宿主細胞または実行したプロセスで使用した何らかの材料に由来しうるウイルスを低pH条件によって不活化した。これに関連して、Dで得た溶出物をpH3.0〜4.0に2時間維持し、その酸性度は25％酢酸で調節した。その後、次のプロセスに使用するために、0.5M水酸化ナトリウムを使って溶出物のpHを4.0〜5.0に増加させた。低pHによる不活化は12±2℃で行った。
【００７４】
F．カチオン交換クロマトグラフィー
IDSはオリゴ糖を伴う糖タンパク質であり、グリカン鎖の末端にあるシアル酸の含量に応じて異なる等電点を有する異性体として存在する。負電荷を有するオリゴ糖として、シアル酸は、カチオン交換樹脂への結合の度合いに関して、シアル酸の含量に応じた相違を示す。この特徴づけを使って、高いシアル酸含量と共に高い活性（高いホルミルグリシン含量）を示すIDSを得るために、そして他の不純物［製品不純物（凝集IDS、加工IDS）、プロセス不純物（宿主細胞タンパク質）］を除去するために、カチオン交換クロマトグラフィーを行った。詳しく述べると、カチオン交換カプト（Capto（商標））MMC樹脂（GE Healthcare）を充填したカラムを、グリセロール添加平衡緩衝液（pH4.0〜5.0）で平衡化した。Eで得た不活化溶出物を0.45＋0.2μmフィルター（Sartorius）でろ過し、平衡化したカラムに、100〜120cm/時間の流速でローディングした。次に、カラムを平衡緩衝液で洗浄してから、グリセロール添加溶出緩衝液（pH4.0〜6.0）で溶出させることで、高いシアル酸含量（等電点3.5以下）、高い活性（ホルミルグリシン含量：80±15％）および高い純度（SE-HPLC、98％以上）を有するIDSを得た。
【００７５】
G．アフィニティークロマトグラフィー
カチオン交換クロマトグラフィーにおいて使用したグリセロールを除去するため、および溶出物の体積を減少させるために、アフィニティークロマトグラフィー（ブルーセファロース、GE Healthcare）を行った。Fで得た溶出物を0.45＋0.2μmフィルター（Sartorius）でろ過し、グリセロール添加平衡緩衝液（pH4.5〜5.5）で前もって平衡化しておいたブルーセファロース樹脂充填カラム（GE Healthcare）に100〜120cm/時間の流速でローディングした。ローディングの完了後に、洗浄緩衝液（pH4.5〜5.5）でカラムを洗浄し、標的タンパク質を溶出緩衝液（pH6.0〜8.0）で溶出させた。
【００７６】
H．濃縮および緩衝液交換
限外濾過システム（タンジェンシャルフロー濾過膜システム）を使って、Gで得た溶出物のタンパク質濃度を調節すると共に、精製タンパク質の緩衝液を製剤緩衝液と交換した。限外濾過システムの内部に取り付けた膜（カットオフ：10K、Pall）を流量450〜650mL/分のWFI（注射用水）で洗浄してから、ポリソルベート20を含まない製剤緩衝液（2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム七水和物、8g/L塩化ナトリウム、pH6.0〜7.0）で平衡化し、次いで、標的タンパク質を濃縮した。濃縮物の体積の3〜4倍の体積で緩衝液を連続的に交換した。電導度およびpHが基準内に入ったら、このプロセスを停止した［基準−電導度：15.0±3.0mS/cm、pH6.0〜7.0］。濃縮溶液の含量を4.0±0.5mg/mLに調節する。
【００７７】
I．ナノろ過
宿主細胞または使用した材料のいずれかから由来しているかもしれないウイルスを除去するために、ナノフィルター（NFP、ミリポア）を使ってナノろ過を行った。フィルターの完全性試験は、ナノフィルターを注射用水で洗浄した後に行う。完全性試験に合格したら、ポリソルベート20を含まない1Lの製剤緩衝液（2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム、8g/L塩化ナトリウム、pH6.0〜7.0）で、ナノフィルターを平衡化した。平衡化の完了後に、Hで得た濃縮物を約2バールの圧力でフィルターに通すことで、ナノろ液を生成した。ろ過が完了した後に、フィルターを製剤緩衝液で洗浄した（後洗浄溶液）。ナノろ過溶液と後洗浄溶液とを合わせた後に、タンパク質含量を測定する。
【００７８】
J．原薬
Iで得たろ液のタンパク質濃度を、ポリソルベート20を含まない製剤緩衝液で調節した。ポリソルベートの添加後に、溶液を0.2μmフィルターでろ過することで、原薬を生成した。原薬を小分けし、使用時まで超低温フリーザー（-70±10℃）で貯蔵した。
【００７９】
K．薬物製品（充填、ラベリング、包装）
超低温フリーザーに貯蔵した原料を28±1℃に維持した水槽で融解し、製剤緩衝液（2.25g/Lリン酸二水素ナトリウム一水和物、0.99g/Lリン酸水素ナトリウム七水和物、8g/L塩化ナトリウム、0.23g/Lポリソルベート20、pH6.0〜7.0）を使って、約2.05±0.2mg/mLのタンパク質濃度に希釈した。その後、その希釈溶液を0.2μmフィルターでろ過することで、最終バルク溶液を生成した。自動充填を使って、この最終バルク溶液を、およそ3.3gずつ、6mLバイアルに充填した。バイアル検査試験に合格したら、バイアルを包装することで、薬物製品を生産した。
【００８０】
株培養から最終製品生産までの手順を図3に図解する。
【００８１】
［比較例1：エラプレースの調製］
市販の組換えIDSであるエラプレース（登録商標）を比較例として使用した。
【００８２】
［実験例1：本発明IDSの構造解析および特徴づけ］
＜1-1＞アミノ酸配列決定−内部配列決定
脱グリコシル化IDSをSDS-PAGEによって分離してから、ゲル切り出しを行った。次に、さまざまなエンドプロテイナーゼ（トリプシン、キモトリプシン、AspN、キモトリプシン/トリプシン、AspN/トリプシン、GluC、およびGluC/トリプシン）による処理で生じた消化産物を、MALDI-MS/MSおよびLC-ESI-MS/MSを使って分析した（図5）。結果として合計525アミノ酸の配列が同定された。アミノ酸配列はヒトIDSの理論的配列と一致した（図6）。
【００８３】
＜1-2＞ジスルフィド結合解析
ポリペプチドにおいて、ジスルフィド結合は、通常、システイン残基の2つのSH基のカップリングによって生じる共有結合であり、タンパク質の高次構造の安定化に重要な役割を果たす。理論上、IDSの525アミノ酸は6つのシステイン残基を含有し、そのうちの4つがジスルフィド結合を形成する。この例では、IDSのジスルフィド結合を担うシステイン残基の位置を同定した。まず、糖の干渉を排除するために、IDSをPNGase Fで処理することによって脱グリコシル化した。ジスルフィド結合の形成に参加しないシステイン残基が妨害因子として作用するのを防ぐために、4-ビニルピリジンを使ってIDSを非還元試料に変換することで、SH基がS-S結合をランダムに形成しないようにした。一方、ジスルフィド結合をDTTによって切断した後に、4-ビニルピリジンでブロッキングすることで、還元試料を得た。実験例1-3の結果に基づいて選択したトリプシンおよびAspNを非還元試料および還元試料に適用した。こうして得たペプチドフラグメントをRP-HPLCで分離した。非還元試料には見つかるが還元試料には見つからないピークを識別するために、非還元試料および還元試料のRP-HPLCクロマトグラムを比較した（図7）。
【００８４】
より正確な分析のために、識別されるピークの画分のサイズを、エンドプロテイナーゼによる追加処理で縮小し、ジスルフィド結合含有ピークをMALDI-MSを使って分析した（図8）。
【００８５】
525個のIDSアミノ酸残基のうちジスルフィド結合を形成するシステイン残基の位置を調べるために、ジスルフィド結合を含むピークをMALDI-MS/MSで再び配列分析した（図9）。図10に示すように、ジスルフィド結合は、C146-C159間およびC397-C407間に形成されることが観察された。
【００８６】
＜1-3＞ホルミルグリシン含量の分析
IDSは、共にグリコサミノグリカン（GAG）の一種であるヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸を分解する。この分解活性は、活性部位にある59番目のシステイン残基（Cys59）が翻訳後修飾によってホルミルグリシン（FGly）に変換されるまで獲得されない。そこで、Cys59のFGlyへの翻訳後修飾を調べることによって、IDSの分解活性を分析した。この分析には、MS（質量分析）に基づく定量的分析法であるAQUA（絶対定量（absolute quantification））を使用し、ここでは、放射標識合成基質（AQUAペプチド）を試料にスパイクした。Cys59位におけるホルミルグリシンを定量的に分析するために、AQUAペプチドの段階希釈液を試料にスパイクし、検量線を引いた。FGly型ペプチドとCys型ペプチドとの比を、LC-ESI-MS分析によって測定し、AQUA検量線に適用することで、ホルミルグリシンの含量を計算した。
【００８７】
この分析により、Cys59のFGlyへの変換は80±15％の比率であると決定された。市販の薬剤エラプレースではCys50のFGlyへの変換率が約50％であることを考慮すると（Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007；Genet Med 2006:8(8):465-473）、本発明のIDSを含む治療組成物および本組成物を使って調製される製剤は、エラプレースと比較して、はるかに高い治療活性を有すると予想される。
【００８８】
＜1-4＞グリコシル化パターンの同定
本発明のIDSがグリコシル化されているかどうかを調べ、グリコシル化されているのであれば、そのグリコシル化パターンを同定するためのアッセイを行った。この目的のために、IDSをさまざまなグリコシドヒドロラーゼ酵素で処理し、その消化産物をSDS-PAGEで分離し、それらの移動度パターンを分析した。
【００８９】
詳しく述べると、IDS試料を、以下の4つのグリコシドヒドロラーゼ酵素の組み合わせで消化し、SDS-PAGEで分離した。
［表1］糖切断酵素の性質
【表１】
0005844459.tif 000002
【００９０】
図11からわかるように、本発明のIDSはPNGase FおよびEndo Hによって切断されたが、O-グリコシダーゼでは切断されなかった。これは本発明のIDSがN-グリコシル化タンパク質であることを示している。また、IDSはPNGase Fでは完全に切断されたが、Endo Hで処理した場合には、そのサイズ減少はわずかだった。PNGase Fが3つのパターンの全てのグリコシル化部位に作用するのに対し、Endo Hは、高マンノース型および混合型のグリコシル化部位に作用する。総合すると、これらの結果は、IDSが、複合型、高マンノース型および混合型という3つのグリコシル化パターンを含有することを示している。
【００９１】
＜1-5＞マンノース-6-リン酸含量の分析
細胞上のM6P受容体に結合することで、マンノース-6-リン酸（M6P）は、IDSが細胞内に内在化されることを、したがってリソソーム中のヘパラン硫酸またはデルマタン硫酸を加水分解することを可能にする。この例では、IDSをトリフルオロ酢酸（TFA）で酸加水分解し、HPAEC-PAD（Bio-LC）にかけることで、マンノース-6-リン酸を定量的に分析した。
【００９２】
IDSを6.75M TFAで加水分解し、液体クロマトグラフィー（高速アニオン交換クロマトグラフィー-パルスアンペロメトリック検出； HPAEC-PAD）を使って、加水分解物を分析した。濃度が既にわかっているM6Pを同じ条件下で分析し、M6Pと糖タンパク質とのモル比を、面積の比較によって得た。分析は三重に行った。M6P標準物質およびIDSのM6P組成物のクロマトグラムを図12に示し、M6Pのモル比を下記表2に要約する。
［表2］マンノース-6-リン酸含量に関する分析結果
【表２】
0005844459.tif 000003
【００９３】
表2のデータから理解されるように、IDS1モルにつきおよそ3モルのM6Pが存在する。これらの結果から、本発明のIDSを含む治療組成物および本組成物を使って調製される製剤は、リソソーム中に蓄積したGAGを異化する能力が高いと推論される。
【００９４】
＜1-6＞質量分析
MALDI-TOF-MSを使ってグリコシル化IDSおよび脱グリコシル化IDSの質量を測定した。PNGase Fによるグリコシル化IDSの処理は脱グリコシル化IDSを与えた。MALDI-TOF-MSは、遅延引き出しレーザー脱離質量分析計と接続したVoyager-DE PRO Biospectrometry（Applied Biosystems、米国）を使って行った。計器はウシ血清アルブミンおよびIgG1を使って標準化した。分析結果を下記表3に要約する。
［表3］IDSのMALDI-TOF-MS分析結果
【表３】
0005844459.tif 000004
【００９５】
表3のデータから明らかなように、分子サイズは、グリコシル化IDSについては77,244Da、脱グリコシル化IDSについては59,399Daであり、これは、アミノ酸配列に基づいて計算される59,298Daという分子量に類似している。
【００９６】
＜1-7＞純度測定
サイズ排除クロマトグラフィーを使ってIDSの純度を測定した。サイズ排除クロマトグラフィーは、溶解状態の分子が相対的分子量および形状によって分離されるクロマトグラフィー法である。サイズ排除クロマトグラフィーでは、カラムの孔径より大きいタンパク質は、その細孔系に入り込むことができず、カラムを直ちに素通りする。続いて、より小さい分子量またはサイズを有する分析物が、遅れて溶出する。このクロマトグラフィーには、2487 UV/VIS検出器（Waters、米国ウィスコンシン州）と接続したAlliance 2695 HPLCシステム（Waters、米国ウィスコンシン州）を使用した。タンパク質を214nmで検出し、Empower 2ソフトウェアを使って分析した。TSK SWXLガードカラムと連結したTSK G3000SWXLカラム(東ソー、日本）に分析物をローディングした。IDSを、製剤緩衝液に1.0mg/mLの濃度まで希釈してから、10μmの体積でカラムにローディングした。それらを移動相（20mMリン酸ナトリウム緩衝液、200mM NaCl、pH7.0）と共に0.5mL/分の流量で60分間流した。
【００９７】
分析結果を図13に示す。図からわかるようにIDS単量体はおよそ16.4分の保持時間を有し、100％の純度で溶出した。
【００９８】
＜1-8＞合成基質を使った活性測定
IDSと合成基質（4-メチルウンベリフェリル-L-イズロニド-2-硫酸Na2（MU-IdoA-2S））との4時間の反応により、硫酸部分が放出される（一次反応）。一次反応後に、LEBT（ウシ精巣から精製されたリソソーム酵素）の添加によって、基質4-メチルウンベリフェリル-L-イズロニド（一次反応において硫酸部分の放出後に残る反応物）との二次酵素反応が誘導されて、L-イズロニド部分から4-メチルウンベリフェリル部分が分離する。残った4-メチルウンベリフェリルは蛍光原性であるので、蛍光（励起355nm/蛍光460nm）の強さを測定することによって、IDSの活性を評価した。本発明のIDSは比活性が19〜55nmol/分/μgの範囲にあることがわかった。この活性は、IDSにおける59番目のシステイン残基の翻訳後修飾の結果として、ホルミルグリシンが酵素の活性部位に存在することを示している。
【００９９】
＜1-9＞天然基質を使った活性測定
IDSが天然基質と反応するかどうかを決定するために、IDSとの反応によって基質（ヘパリン二糖）から放出される硫酸イオンを測定した。反応混合物をイオンカラム（バイダック（Vydac）302IC）にローディングし、0.49g/Lフタル酸の移動相と共に、2ml/分の流量で流し、その間に、遊離の硫酸イオンをネガティブモードで290nmにおいて検出した。図14に示すように、IDSは、ヘパリン二糖から硫酸イオンを加水分解することが確認された。これは、IDSが、インビボでデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸のO結合型硫酸を分解する能力を有することを示している。
【０１００】
＜1-10＞インビボ細胞取り込み活性
正常な線維芽細胞およびハンター症候群患者細胞を使ってIDSの細胞内在化活性を測定した。これに関連して、正常な線維芽細胞およびハンター症候群患者細胞（韓国ソウルのSamsung Medical Centerから入手）を、5％CO2インキュベーター中、さまざまな濃度のIDSと共に、37℃で20時間インキュベートしながら、培養し、細胞に内在化させた。収穫後に、細胞を溶解し、細胞に内在化されたIDSのレベルを、溶解物において決定した。
【０１０１】
内在化されたIDSと正常線維芽細胞に加えたIDSとの濃度比に基づいて、ミカエリス-メンテン・グラフおよびラインウィーバー‐バーク・プロットを作成し、そこからKuptake（反応速度が、飽和基質濃度で達成される最大値の半分になるIDS濃度）を計算した。Kuptakeは18.0nM以下と計算された。これは、IDSのM6Pが細胞表面上のM6P受容体に結合することによって、IDSが細胞に内在化されることを示している（図15）。
【０１０２】
また、ハンター症候群患者細胞および正常ヒト線維芽細胞におけるIDSの細胞取り込みおよび活性を分析した。IDSの取り込みおよび活性はどちらの細胞でも増加していたことから、本発明のIDSは、より効率よく細胞に内在化されることが実証された（図16）。
【０１０３】
［実験例2：IDSの効果に関する臨床分析］
ハンター症候群を有する31人の患者を3つの群に分け、本発明のIDSを投与し、ハンター症候群に関連するパラメータについて分析した。市販のハンター症候群治療剤であるエラプレース（登録商標）を陽性対照として使用した。
【０１０４】
＜2-1＞尿GAGレベルの変化（妥当性試験の主要評価項目）
3つのハンター症候群患者群にエラプレース（0.5mg/kg）および本発明のIDS（0.5mg/kgおよび1.0mg/kg）を24週間投与し、尿GAG（グリコサミノグリカン）レベルを、先に報告されているように測定した（Conn. Tissue Res. Vol.28, pp317-324, 1990；Ann. Clin. Biochem. Vol.31, pp147-152, 1994）。測定値を下記表4に要約する。
［表4］IDS投与による尿GAGレベルの変化
【表４】
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【０１０５】
表4に示すように、ハンター症候群患者では、尿GAGレベルがエラプレースの注射後に18.7％減少したが、本発明のIDSの注射後は同じ用量で29.5％減少した。加えて、1.0mg/kgの用量で注射すると、本発明のIDSは尿GAGレベルを41.1％も減少させた。これらの結果は、本発明のIDSが、GAGの蓄積の結果として引き起こされる疾患であるハンター症候群の治療に有効であることを実証している。
【０１０６】
＜2-2＞6-MWT（6分間歩行テスト）変化（妥当性試験の副次的評価項目）
ハンター症候群患者にエラプレースおよび本発明のIDSを24週間投与した後、患者が6分間に歩く距離をAM.J. Respir. Crit. Care. Med., Vol.166, pp 111-117, 2002に記載の方法に従って測定した。結果を下記表5に記載する。
［表5］6-MWT試験結果
【表５】
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【０１０７】
表5に示すように、6-WMT変化は、エラプレースを投与した患者では1.3％だけだったが、同じ用量の本発明IDSを投与した患者では18.2％まで増加した。ハンター症候群患者は拘縮ゆえの歩行困難を有する。しかし本発明のIDSはその症状を改善することができ、したがってハンター症候群の処置に有効である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号1：IDSアミノ酸配列
配列番号2：IDS-1フォワードプライマー配列
配列番号3：IDS-2フォワードプライマー配列
配列番号4：IDS-3リバースプライマー配列
配列番号5：IDS-N1フォワードプライマー配列
配列番号6：IDS-N2フォワードプライマー配列
配列番号7：IDS-4リバースプライマー配列
配列番号8：T7フォワードプライマー配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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