(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式の化合物:
0005876075.tif 000136
式中、
Yは、-(CH2)3-であり;
R1は、-(C1〜6)アルキル; あるいはフェニルが非置換であるか、または以下より独立して選択される置換基で最大4回置換されている-(CH2)m-フェニルであり:
-NO2、
-CN、もしくは
ハロゲン;
R2は、水素;
フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-NH-C(Ph)3;
-(CH2)k-C(O)-NH2;
-(CH2)k-フェニル; あるいは
-(C1〜6)アルキルであり;
R3は、フェニル基が以下より独立して選択される置換基でさらに置換されている-NH-フェニルであり:
-(CH2)-OH; もしくは
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル);
kは1、2、3、4、5または6であり;
mは1、2、3または4であり; かつ
nは0または1である。
【請求項２】
式(Ia)に示す立体配座を有する、請求項1記載の化合物:
0005876075.tif 000137
【請求項３】
R3が、フェニル基が-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル)でさらに置換されている-NH-フェニルであり;
nが0であり;かつ
Y、R2、R1およびkが、それぞれ上記請求項1に記載の定義に同じ意味を有する、
請求項1または2記載の化合物。
【請求項４】
下記式の化合物:
0005876075.tif 000138
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
Y、n、R1およびkは、それぞれ上記請求項1に記載の定義に同じ意味を有し;かつ
生物活性物質は、タンパク質またはペプチドである。
【請求項５】
式(IIa)に示す立体配座を有する、請求項4記載の化合物:
0005876075.tif 000139
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
Y、n、R1およびkは、それぞれ上記請求項1に記載の定義に同じ意味を有し;かつ
生物活性物質は、タンパク質またはペプチドである。
【請求項６】
請求項4または5記載の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
生物活性物質のインビボ送達のための薬剤の調製における、請求項4または5記載の化合物の使用。
【請求項８】
生物活性物質のインビボ送達のための薬剤の調製における、請求項4または5記載の化合物の使用であって、化合物が送達用ポリマーと同時送達され、前記送達用ポリマーが、それぞれ天然物もしくは合成化合物であるペプチド、多糖、または核酸である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、ペプチドおよびタンパク質などの生物活性物質の送達に有用な新規小分子複合体に関する。生細胞中への核酸および他の実質的に細胞膜不透過性の化合物の送達は、細胞の複雑な膜系によって非常に制限される。
【背景技術】
【０００２】
核酸などの生物活性物質をインビボで送達するために使用された1つの手段は、生物活性物質を標的化小分子、または脂質もしくはステロールなどの疎水性分子のいずれかに結合させることであった。これらの複合体について何らかの送達および活性が観察されたが、これらの方法について所要である生物活性物質の用量が禁制的に多かったことから、多くの場合、インビボでの望まれない毒性効果が生じた。生物活性物質に結合可能であって該生物活性物質の細胞中への送達の成功を媒介可能である小分子化合物が本明細書において提供される。驚くべきことに、本明細書において提供される新規化合物を使用する場合、送達の成功には著しく減少した用量の生物活性物質で今や十分であることがわかった。したがって、新規化合物は、インビボでの毒性が相当に制限された、生物活性物質の送達のための強力な手段を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、本発明は下記式の化合物に関する:
0005876075.tif 000002
式中、
Yは、-(CH2)3-または-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-より選択されるリンカー基であり;
R1は、-(C1〜6)アルキル;
-(CH2)-ナフチル; あるいは
フェニルが非置換であるか、または以下より独立して選択される置換基で最大4回置換されている-(CH2)m-フェニルであり:
-NO2、
-CN、
ハロゲン、
-O-(CH2)-フェニル、
-O-(C1〜6)アルキルもしくは
-C(O)-NH2;
R2は、水素;
フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3;
-(CH2)k-C(O)-NH2;
-(CH2)k-フェニル;
非置換であるかまたは-S-CH3で1回置換されている-(C1〜6)アルキルであり;
R3は、フェニル基が以下より独立して選択される置換基でさらに置換されている-NH-フェニルであり:
-(CH2)-OH; もしくは
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル);
kは1、2、3、4、5、6であり;
mは1、2、3または4であり;
nは0または1であり;かつ
pは1〜20の整数である。
【０００４】
別の態様では、式(I)の化合物は、式(Ia)に示す特定の立体配座を有する:
0005876075.tif 000003
式中、すべての置換基R1、R2、R3およびYならびに変数k、m、nおよびpは上記に示す意味を有する。
【０００５】
さらに別の態様では、本発明は、Yが-(CH2)3-であり; かつ残りすべての置換基が上記に示す意味を有する式(I)または(Ia)の化合物に関する。
【０００６】
さらに別の態様では、本発明は、Yが-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-であり; すべての置換基が上記に示す意味を有する式(I)または(Ia)の化合物に関する。
【０００７】
さらに別の態様では、
Yが、-(CH2)3-であり;
R2が、フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3であり;
R3が、フェニル基が-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル)でさらに置換されている-NH-フェニルであり;
nが0であり;かつ
R1およびkが上記に示す意味を有する
式(I)または(Ia)の化合物が提供される。
【０００８】
さらに別の態様では、
Yが、-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-であり;
R2が、フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3であり;
R3が、フェニル基が-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル)でさらに置換されている-NH-フェニルであり;
nが0であり;かつ
R1、kおよびpが上記に示す意味を有する
式(I)または(Ia)の化合物が提供される。
【０００９】
本明細書において使用される「(C1〜6)アルキル」という用語は、1個〜6個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和炭化水素を意味する。好ましいC1〜6アルキル基としてはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、2-ブチルなどが挙げられる。
【００１０】
本明細書において使用される「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
【００１１】
本発明の化合物は、有機化学または薬化学の当業者に公知の方法を使用して一般に得ることができる。より特定には、化合物(A)を出発原料として使用して、Yが-(CH2)3-であり、n＝0である式(Ia)の化合物を得ることができる。
0005876075.tif 000004
【００１２】
特に、(A)の合成は国際公開公報第2001/070415号に記載されている。
【００１３】
式(A)の化合物をヒューニッヒ塩基および酢酸エチル(AcOET)の存在下でさらに反応させた後、THF中ジヒドロフラン-2,5-ジオンを加えることで式(B)の化合物を得る。
0005876075.tif 000005
【００１４】
式(B)の化合物を式(C)のアミンとさらに反応させることで式(Ia)の化合物を得る。
0005876075.tif 000006
【００１５】
式(I)または(Ia)の化合物は、それらが共有結合する核酸、ペプチドまたはタンパク質などの生物活性物質上のリガンドとして有用である。好ましくは、共有結合は、生物活性物質中の一級アミン基などの好適な官能基と上記定義のR3の-O-C(O)-O-部分中の活性化カルボニル基との反応によって作り出される。したがって、式(I)または(Ia)の化合物と生物活性物質とを含む複合体が本明細書において提供される。
【００１６】
本明細書において使用される「生物活性物質」という用語は、鳥類、およびヒトを含む哺乳動物を含むがそれに限定されない動物にインビボで投与される際に生物学的効果を引き起こす、小分子、ペプチド(例えば細胞浸透性ペプチド)、タンパク質、炭水化物(単糖、オリゴ糖および多糖を含む)、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドもしくはタンパク質、またはタンパク質に結合した小分子、糖タンパク質、ステロイド、核酸(任意の形態のcDNAを含むDNAもしくはRNAまたはその断片)、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNAおよびsiRNAを含む)、遺伝子、脂質、ホルモン、あるいはそれらの組み合わせを含む、無機分子または有機分子を意味する。好ましくは、前記生物活性物質はペプチドまたは核酸である。本明細書において使用される好ましい核酸はsiRNAである。
【００１７】
生物活性物質に共有結合した本化合物を含む複合体は、単独での該生物活性物質に比べて、細胞に取り込まれる能力の改善を示す。複合体が細胞中に送達されてリソソームに輸送される時点で、対応する生物活性物質は酵素的開裂によって放出される。この開裂は、式(I)または(Ia)の化合物に存在する好ましくはα-またはβ-(フェニル)アラニンおよびリジンの配列からなるジ-ペプチドモチーフが複合体に組み込まれる際に行われることが好ましい(スキーム1参照)。最も好ましくは、siRNAについてスキーム2に例示するように、複合体は、ジ-ペプチドモチーフと、ジ-ペプチドモチーフのアミド結合C末端が開裂する時点で自発的に断片化するp-アミノベンジルカルバメートスペーサー(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855)などのスペーサーとを含有する。したがって、式(I)または(Ia)の化合物を含む複合体はジペプチド含有コレステロール複合体とも呼ばれる。本発明のジペプチド含有コレステロール複合体からの生物活性物質の酵素的開裂は、細胞の生来のプロテアーゼによって触媒される。式(I)または(Ia)の化合物に存在するジ-ペプチドモチーフを開裂させることができる生来のプロテアーゼの一例はカテプシンBである。カテプシンBは、哺乳動物細胞のリソソームに位置する公知の遍在性のシステインプロテアーゼである(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855; J. Med. Chem. 2005, 48, 1344; Nat. Biotechnology 2003, 21, 778)。したがって、先に記載のジ-ペプチドモチーフはカテプシン開裂性ジペプチドモチーフとも呼ばれる。
【００１８】
したがって、本発明はまた、生物活性物質の細胞中への送達のための方法であって、該生物活性物質が引き続き複合体から開裂することで治療活性を明らかにしうる方法を提供する。
【００１９】
0005876075.tif 000007
【００２０】
本発明のさらなる態様では、生物活性化合物、好ましくはsiRNAまたはペプチド部分に共有結合した、式(I)または(Ia)の化合物の複合体が提供される。好ましくは、前記ペプチド部分は、細胞浸透性ペプチドまたは両親媒性ペプチドのような、膜攪乱性を示すペプチドである。
【００２１】
生物活性物質に共有結合した式(I)または(Ia)の複合体が、本明細書においてそれぞれ式(II)または(IIa)と称される。
【００２２】
したがって、さらなる態様では、本発明は下記式の化合物を提供する:
0005876075.tif 000008
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
R1およびkは、式(I)について上記に示す意味を有し;かつ
生物活性物質は、核酸、タンパク質またはペプチドである。
【００２３】
より具体的な態様では、本発明は下記式の化合物を提供する:
0005876075.tif 000009
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
R1およびkは、式(I)について上記に示す意味を有し;かつ
生物活性物質は、核酸、タンパク質またはペプチドである。
【００２４】
好ましい態様では、式(II)または(IIa)中の生物活性物質は核酸、最も好ましくはsiRNAである。
【００２５】
別の好ましい態様では、式(II)または(IIa)中の生物活性物質はタンパク質またはペプチドである。
【００２６】
式(II)または(IIa)の化合物は治療における有用な特性を有しうる。したがって、さらなる態様では、医薬として使用される式(II)または(IIa)の化合物が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様は、生物活性物質に共有結合した式(I)または(Ia)の化合物の複合体を含む薬学的組成物である。
【００２８】
本発明のさらに別の態様では、式(IIa)の化合物を薬学的に許容される賦形剤と共に含む薬学的組成物が提供される。
【００２９】
以下の態様は、siRNAに共有結合した式(I)または(Ia)の化合物の複合体、したがって、生物活性物質がsiRNAである式(II)または(IIa)の化合物について例示される。これらの態様がペプチドおよびタンパク質などの他の生物活性物質にも適用可能であることが理解されよう。
【００３０】
siRNAの式(I)または(Ia)の化合物への共有結合は、siRNA中の好適な求核性基、すなわち一級アミン基と式(I)または(Ia)の該化合物のR3中の活性化-C(O)-基との反応を介して実現される。以下のスキーム2に示すように、その-C(O)-基の活性化はp-ニトロフェノキシカーボネートによって得られる。
0005876075.tif 000010
【００３１】
例えば、p-ニトロフェニル活性化カーボネートとヘキシルアミノリンカーを備えたsiRNAとを反応させてカルバメート結合を発生させることでsiRNA複合体を得ることができる。やはりスキーム2に示すように、siRNAが細胞内に取り込まれてリソソームに形質移入される時点で、生物活性物質がsiRNAである式(II)または(IIa)の化合物がプロテアーゼ活性によって開裂して、siRNAが放出される。式(II)または(IIa)の化合物の複合体のコレステロール部分は、全身投与がインビボで遺伝子サイレンシングを可能にするようにsiRNAのPK特性を改変する。
0005876075.tif 000011
【００３２】
一態様では、生物活性物質がsiRNAである式(II)または(IIa)の化合物を送達用ポリマーと共に投与する。送達用ポリマーは、細胞膜を破壊する手段を与え、エンドソーム放出を媒介する。別の態様では、前記送達用ポリマーおよび本発明のsiRNA複合体は共有結合しておらず、別々に合成されており、別々の容器で供給してもよく、単一の容器で供給してもよい。siRNAなどのオリゴヌクレオチドの送達用ポリマーは当技術分野において周知である。例えば、Rozemaらは米国特許出願公開第20040162260号において、膜活性ポリアミンの膜破壊活性を可逆的に制御する手段を示した。可逆的制御は、標的細胞のエンドソームに対する活性を制限することで毒性を制限する手段を与えた。彼らの方法は、ポリアミン上のアミンと2-プロピオン酸-3-メチルマレイン酸無水物との反応に依存した。この改変は、一級アミンのカルボキシル含有基への変換を介してポリカチオンをポリアニオンに変換し、ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害した。核酸と送達用媒体との同時送達を可能にするために、核酸を送達用ポリマーに共有結合させた。米国仮特許出願第61/307490号には新世代の送達用ポリマーが記載されている。その仮出願では、アミン含有モノマー、低級疎水性モノマーおよび高級疎水性モノマーのランダム重合によって形成される両親媒性三元共重合体を含む膜活性ポリアミンが提供される。この新世代の送達用ポリマーは、ポリヌクレオチドおよびポリマーを共有結合または電荷-電荷相互作用のいずれかによって結合させることの必要性を除去した。
【００３３】
本発明のsiRNA複合体との同時投与に使用される送達用ポリマーの非限定的な例としては、膜活性ポリアミンおよびポリ(ビニルエーテル)(PBAVE)、Dynamic PolyConjugates(DPC; Rozema et al. 2007)ならびに米国仮特許出願第61/307490号に開示の改良型DPCがある。
【００３４】
さらなる態様では、機能的インビボ送達のための新たな化学的siRNA修飾パターンが提供される。この新たな化学物質siRNA修飾パターンは、相対的に強力なエンドソーム/リソソーム保持を示す送達用媒体で特に有用である。
【００３５】
DNAse IIなどのエンドソーム/リソソーム局在化ヌクレアーゼによる分解に対するsiRNA安定化が標的ノックダウンを強力に向上させることがわかった。そのような安定化は、細胞RNAi機構が位置する細胞質中に放出されるsiRNAの量に直接影響しうる。細胞質中の利用可能なsiRNA部分のみがRNAi効果の引き金を引く。
【００３６】
siRNAは、薬物動態特性が低いことに加えて、保護的送達用媒体なしで循環中にそのまま投与される際に生物学的環境中のヌクレアーゼに影響されやすい。したがって、多くのsiRNAは細胞外の組織および血流中で、または細胞内への取り込み後に速やかに分解する(エンドソーム)。
【００３７】
エンドソーム/リソソーム区画に局在化する1つの公知のヌクレアーゼはDNase IIである。この酵素はpH 6〜6.5未満で活性であり、エンドソーム/リソソーム区画の酸性化環境に存在する条件を反映するpH範囲4.5〜5で最大活性を示す。DNase IIによって誘導される以下のRNA分解経路がインビトロで同定された。本発明において開示する:
A. 少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドを含有するRNA鎖が環状五価リン中間体を介して速やかに分解することで、5'-開裂生成物において2'-3'環状リン酸が生じる。五価中間体の形成は、2'-デオキシ、2'-O-メチル(2'-OMe)または2'-デオキシ-2'-フルオロ(2'-F)ヌクレオチドなどの2'-OH基を欠くヌクレオチドによって阻害することができる。
B. さらに、RNAは、5'-末端ヌクレオチドに対する2'-修飾とは無関係の5'-エキソヌクレアーゼ経路において分解する。この分解経路は、例えばコレステロール、アミノアルキルリンカー、または第1のヌクレオチド間結合におけるホスホチオエートのような5'-末端非ヌクレオチド部分によって阻害することができる。
C. また、5'-リン酸は、エキソヌクレアーゼ開裂動態を保護および減速させるが、この経路を完全に遮断することはできない。これはほぼ間違いなく、ホスファターゼ、または安定性アッセイに使用されるDNase II酵素調製物の固有のホスファターゼ活性による、5'-リン酸の開裂が理由である。
D. 最善の保護は、鎖内に2'-OHヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドであって、ホスホロチオエート(PTO)結合により第2のヌクレオチドに接続される5'-末端の2'-OMeヌクレオチドで出発するオリゴヌクレオチドによって実現された。他の末端非2'-OHヌクレオチドも5'-エキソ分解に対して保護するが、2'-OMe修飾に比べてその程度は低い。
【００３８】
したがって、本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチドが修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖とを備え、
wが独立して5'-リン酸もしくは5'-ホスホチオエートまたはHであり、
Z1が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
Z2が独立して2'-デオキシヌクレオシドまたは2'-フルオロ修飾ヌクレオシドであり、
Z3が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
naが8〜23であり、かつnsが8〜25である
設計を使用する際に、siRNAを著しく安定化することができることを発見した。
【００３９】
好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは、修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖とを備え、Z1は2'-フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsは上記に示す意味を有する。
【００４０】
好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは、修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖とを備え、Z3は2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsは上記に示す意味を有する。
【００４１】
好ましい一態様では、オリゴヌクレオチドは、修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖とを備え、Z1は2'-フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2'デオキシ-ヌクレオシドであり、Z3は2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-フルオロ-修飾ヌクレオシドまたは2デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsは上記に示す意味を有する。
【００４２】
新規修飾パターンを有するオリゴヌクレオチドの核酸配列中のヌクレオシドは、5'-3'リン酸ジエステルまたは5'-3'ホスホロチオエートのいずれかにより結合させることができる。
【００４３】
本明細書において使用される「アンチ-センス」鎖とは、標的mRNAに相補的であって、siRNAをほどく時点でmRNAに結合する、siRNA鎖のことである。
【００４４】
新規修飾パターンを含む前記siRNAのセンス鎖はアンチセンス鎖に相補的である。
【００４５】
Rozemaらが例示したように(Dynamic PolyConjugates (DPC; Rozema et al. 2007)、新規修飾パターンを含む前記siRNAは、送達用ポリマーに共有結合する際に特に有益であることが証明された。本発明に概説されるsiRNA修飾戦略を使用することで、効果の効力および持続時間を著しく高めることができる。
【００４６】
別の態様では、新規修飾パターンを含む前記siRNAは、コレステロールまたは本明細書において提供される式(I)および(Ia)の化合物などの、siRNAの薬物動態特性を改変する小分子に結合される際に特に有用である。一態様では、オリゴヌクレオチドが以下の修飾パターン、すなわち修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-を有するセンス鎖とを有し、かつ置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、小分子とオリゴヌクレオチドとの複合体が提供される。一態様では、前記小分子はコレステロールである。別の態様では、前記小分子は、式(II)または(IIa)の化合物を生じさせる式(I)または(Ia)の化合物である。
【００４７】
好ましくは、前記siRNA複合体を送達用ポリマーと同時投与する。好適な送達用ポリマーは先に記載されている。
【００４８】
一態様では、新規修飾パターンを含む前記siRNAは、複合体を細胞中に内在化する特定の受容体に結合することが知られるリガンドに結合される際に特に有用である。特に、肝細胞上で発現するアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)が、循環からの脱シアル化タンパク質のクリアランス(エンドサイトーシスおよびリソソーム分解)を可能にする周知の受容体である。N-アセチル-D-ガラクトサミンが、特にそれが多価で提示される場合およびガラクトース残基が適切な間隔で配置される場合に、この受容体に対する高い結合親和性を示すことがわかった(J Biol Bhem, 2001, 276, 37577)。生物活性物質の受容体媒介性エンドサイトーシスにこの高能力の受容体を利用するために、以下に示す合成リガンドを、新規修飾パターンを含むsiRNAに共有結合するように調製した。この種類のエンドサイトーシスが内在化物質のリソソーム分解を導くことから、リソソーム中で安定であるようにsiRNAを調製しなければならず、これは上記で概説した新規修飾パターンによって今や解決される。
【００４９】
ASGPRのリガンドはアミド結合を介して生物活性物質に結合する。アミド結合の形成はNHS化学構造の支援によって確立することができる。結合反応に使用されるリガンドを以下に示す(式III)。siRNAについて(式IVに)示すように、ASGPRとの相互作用のためには、O-アセテート基を除去する必要がある。
0005876075.tif 000012
0005876075.tif 000013
【００５０】
本発明の一態様では、オリゴヌクレオチドが以下の修飾パターン、すなわち修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-を有するセンス鎖とを有し、かつ置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、式IVの化合物とオリゴヌクレオチドとの複合体が提供される。前記複合体はGalNAcパルミトイル複合体とも呼ばれる。好ましくは、前記GalNAcパルミトイル複合体を送達用ポリマーと同時投与する。好適な送達用ポリマーは先に記載されている。
【００５１】
これらの修飾パターンについて、開裂性リンカーが、安定に結合した小分子リガンドに比べて有利であることが証明された。ありうる開裂性リンカーとしては、スキーム1に例示されるジ-ペプチドモチーフ、または2'-OH含有ヌクレオチドを含む開裂性RNAリンカーがある。先に記載の新規修飾パターンを有するsiRNA(完全2'-修飾siRNA)に関しては、開裂性RNAリンカーが特に有用である。
【００５２】
原則として、ヌクレアーゼ開裂部位は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかにおいて少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドを含有する3'-または5'-オーバーハングによって導入することができる。最終活性siRNA種は細胞内ヌクレアーゼ処理によって発生する。また、塩基対領域内の2'-OHヌクレオチドが実行する規定の開裂部位の使用も可能である。これは、反対側の鎖に相補的な少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドを使用して、または少なくとも1個のミスマッチ2'-OHヌクレオチドの導入もしくは少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドを含有するヘアピン/バルジの導入によって行うことができる。
【００５３】
他の開裂性リンカー化学構造とは対照的に、2'-OHヌクレオチドの導入による規定の開裂部位の使用は、より汎用的な結合アプローチを導く。3'および/もしくは5'-末端または二本鎖構造内のいずれかにおけるsiRNAの一方または両方の鎖上に選択的開裂部位を導入することで、多重結合が可能になる。
【００５４】
したがって、一態様では、
a) 小分子が、1〜10個、好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個の2'OH-ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーを含み;
b) オリゴヌクレオチドが以下の修飾パターン、すなわち修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と修飾パターン5'-(Z3)ns-を有するセンス鎖とを有し、置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有し;かつ
c) オリゴヌクレオチドが小分子のヌクレオチドリンカーに共有結合している、
小分子とオリゴヌクレオチドとの複合体が提供される。
【００５５】
ヌクレオチドリンカーが、複合体のエンドソームへの内在化後にDNAse IIなどの細胞内ヌクレアーゼによって開裂することで、siRNAが放出される。
【００５６】
好ましくは、前記複合体を送達用ポリマーと同時投与する。好適な送達用ポリマーは先に記載されている。
【００５７】
本発明の別の態様では、式(V)の化合物が提供される。この化合物は、コレステロール部分と1〜10個、好ましくは1〜5個、最も好ましくは1〜3個の2'OH-ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーとを含む。このヌクレオチドリンカーは、siRNAなどのオリゴヌクレオチドを式(V)の化合物に共有結合させるために有用である。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは上記で概説した新規修飾パターンを有する。したがって、別の態様では、オリゴヌクレオチドが式(V)の化合物のヌクレオチドリンカーに共有結合している、式(V)の化合物とオリゴヌクレオチドとの複合体が提供される。
【００５８】
ヌクレオチドリンカーが、式(V)の化合物とオリゴヌクレオチドとの複合体のエンドソーム中への内在化後にDNAse IIなどの細胞内ヌクレアーゼによって開裂することで、siRNAが放出される。
0005876075.tif 000014
【００５９】
好ましくは、式(V)の化合物とオリゴヌクレオチドとの前記複合体を送達用ポリマーと同時投与する。好適な送達用ポリマーは先に記載されている。
【００６０】
別の態様では、前記送達用ポリマーおよび本発明の式(V)の化合物とオリゴヌクレオチドとの複合体は共有結合しておらず、別々に合成されており、別々の容器で供給してもよく、単一の容器で供給してもよい。
【００６１】
定義
本明細書において使用される「小分子」という用語は、モル当たり10,000グラム未満、任意でモル当たり5,000グラム未満、任意でモル当たり2,000グラム未満の分子量を一般に有する、合成されるかまたは自然状態で見られる有機分子または無機分子を意味する。
【００６２】
本明細書において使用される「ペプチド」という用語は、1つのD-またはL-アミノ酸のα-カルボキシル基と別のD-またはL-アミノ酸のα-アミノ基との間のアミド結合形成によって生成される任意のポリマー化合物を意味する。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、約50個を超える残基の特定の配列のポリペプチドを意味する。
【００６３】
本明細書において使用される「ジ-ペプチドモチーフ」という用語は、第1のアミノ酸のD-もしくはL-αアミノ基またはβアミノ基のいずれかと第2のD-もしくはL-アミノ酸のα-カルボキシル基とによって形成されるアミド結合を含む任意のモチーフを意味する。
【００６４】
本明細書において使用される「アミノ酸」という用語は、アミン官能基とカルボキシル官能基との両方を含有する任意の分子を意味する。したがって、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸および合成アミノ酸をいずれも意味する。本発明において使用される任意の天然アミノ酸を本明細書においてはそれらの一般的略語で呼ぶ。
【００６５】
本明細書において使用される「リガンド」という用語は、生物活性物質に共有結合または他のやり方で化学結合することが可能な部分を意味する。本発明の文脈での「リガンド」という用語は、生物活性物質に共有結合している式(I)または(Ia)の化合物であることが好ましい。
【００６６】
本明細書において使用される「生物活性物質」という用語は、鳥類、およびヒトを含む哺乳動物を含むがそれに限定されない動物にインビボで投与される際に生物学的効果を引き起こす、小分子、ペプチド(例えば細胞浸透性ペプチド)、タンパク質、炭水化物(単糖、オリゴ糖および多糖を含む)、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドもしくはタンパク質、またはタンパク質に結合した小分子、糖タンパク質、ステロイド、核酸(任意の形態のcDNAを含むDNAもしくはRNAまたはその断片)、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNAおよびsiRNAを含む)、遺伝子、脂質、ホルモン、あるいはそれらの組み合わせを含む、無機分子または有機分子を意味する。好ましくは、前記生物活性物質はペプチドまたは核酸である。本明細書において使用される好ましい核酸はsiRNAである。
【００６７】
本明細書において使用される「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成されるオリゴマーまたはポリマー、あるいは、2つの天然核酸と類似して配列特異的に天然核酸とハイブリッド形成可能な、例えばワトソン・クリック型塩基対相互作用に関与可能な、合成的に生成される化合物(例えば米国特許第5,948,902号および当該特許において引用される参考文献に記載のPNA)を意味する。非天然核酸は、ペプチド核酸(PNA)、トレオース核酸(TNA)、ロックド核酸(LNA)またはグリセリン核酸(GNA)のような、自然状態で生じない核酸塩基配列を含有するオリゴマーまたはポリマー、あるいは、天然の核酸塩基、糖または糖間結合の機能的等価物を含有する種である。この用語は、天然核酸の核酸塩基アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)を含有するオリゴマー、ならびに塩基類似体または修飾核酸塩基を含有するオリゴマーを含む。核酸は、ウイルス、細菌および真核生物のDNAおよびRNAなどの種々の天然源に由来しうる。他の核酸は、合成源に由来しうるものであり、研究試薬、診断薬、または潜在的および確定的な治療薬としての使用のために製造されている複数のオリゴヌクレオチドのいずれかを含みうる。この用語は、一本鎖核酸または二本鎖核酸で構成されるオリゴマーを含む。
【００６８】
本明細書において使用される「2'-修飾」という用語は、2'-OH基がH、F、O-CH3、または当技術分野において公知の他の置換基で置き換えられた天然核酸塩基で構成されるβ-D-リボヌクレオシドまたはβ-D-リボヌクレオチドを意味する。
【００６９】
本明細書において使用される「2'-OH-ヌクレオチド」という用語は、2'-OH基を有する天然核酸塩基で構成されるβ-D-リボヌクレオチドを意味する。
【００７０】
本明細書において使用される「5'-リン酸」という用語は式-O-P(=O)(OH)OHを意味する。別の局面では、リン酸は、1個のOまたはOH基がSで置き換えられるように修飾され、本明細書において「5'-ホスホチオエート」と呼ばれる。
【００７１】
本明細書において使用される「ホスホロチオエート」という用語は、1個の非架橋酸素が硫黄で置き換えられたヌクレオチド間結合を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される「送達用ポリマー」という用語は、生物活性物質の機能的送達に好適なポリマーを意味する。本発明の文脈では、送達用ポリマーは、本明細書に記載の化合物に結合された生物活性物質に共有結合しているかまたはそれと同時投与され、細胞中への内在化およびエンドソーム中への取り込み後にエンドソーム脱出を媒介する。この文脈での「ポリマー」という用語は、互いに共有結合している同一でも異なっていてもよい2個以上のモノマー単位で構成され、したがってホモポリマーでもヘテロポリマーでもよい、任意の化合物を意味する。代表的ポリマーとしてはペプチド、多糖、核酸などが挙げられ、ポリマーは天然でも合成でもよい。送達用ポリマーの非限定的な例は、例えばINTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICAL RESEARCH AND DEVELOPMENT, October - 2010 / Volume - 2 / Issue - 8 / Article No -2に概説されている。核酸の送達に有用な送達用ポリマーの非限定的な例は、いずれも参照により包含される、欧州特許出願第10165502.5号および第10191030.5号、PCT公開WO 2008/0022309号ならびに米国仮出願第61/307490号、ならびにこれらに引用されている参考文献に開示されている。
【００７３】
本明細書において使用される「薬学的組成物」は、本発明の複合体、薬学的担体または希釈剤、および製剤に必要な任意の他の媒体または薬剤を含む。
【００７４】
本明細書において使用される「薬学的担体」は、生理学的に適合性のあるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与(例えば注射または注入による)に好適である。
【００７５】
本発明の複合体は、当技術分野において公知の種々の方法によって投与することができる。当業者が理解するように、投与経路および/または投与様式は所望の結果に応じて変動する。特定の投与経路で本発明の複合体を投与するには、複合体をその不活性化を防ぐ材料でコーティングするかまたは複合体をそれと同時投与することが必要なことがある。例えば、複合体を適切な担体または希釈剤中で対象に投与することがある。薬学的に許容される希釈剤としては食塩水および緩衝水溶液が挙げられる。薬学的担体としては、滅菌水溶液または水性分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性な物質用のそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において公知である。
【００７６】
本明細書において使用される「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が挙げられるがそれに限定されない。
【００７７】
これらの担体は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、前述の滅菌手順と各種の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの包含との両方によって確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含むことが望ましいこともある。さらに、注射用の薬学的形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらすことができる。
【００７８】
選択される投与経路にかかわらず、好適な水和形で使用可能な本発明の複合体、および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知である通常の方法によって薬学的に許容される剤形に調剤される。
【００７９】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬量レベルは、患者に対して毒性であることなく、所望の特定患者に対する治療応答、所望の組成および所望の投与様式を実現するために有効な有効成分の量を得るように変動しうる。選択される投薬量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、使用される特定の組成物との組み合わせで使用される他の薬物、化合物および/または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身的健康および前病歴、ならびに医学分野において周知である同様の要因を含む種々の薬物動態学的要因に依存する。
【００８０】
薬学的組成物は、シリンジによって送達可能である程度に滅菌および流動性でなければならない。担体は、水以外に等張緩衝食塩水であることが好ましい。
【００８１】
適当な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。
[本発明1001]
下記式の化合物:
0005876075.tif 000015
式中、
Yは、-(CH2)3-または-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-より選択されるリンカー基であり;
R1は、-(C1〜6)アルキル;
-(CH2)-ナフチル; あるいは
フェニルが非置換であるか、または以下より独立して選択される置換基で最大4回置換されている-(CH2)m-フェニルであり:
-NO2、
-CN、
ハロゲン、
-O-(CH2)-フェニル、
-O-(C1〜6)アルキルもしくは
-C(O)-NH2;
R2は、水素;
フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3;
-(CH2)k-C(O)-NH2;
-(CH2)k-フェニル;
非置換であるかまたは-S-CH3で1回置換されている-(C1〜6)アルキルであり;
R3は、フェニル基が以下より独立して選択される置換基でさらに置換されている-NH-フェニルであり:
-(CH2)-OH; もしくは
-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル);
kは1、2、3、4、5、6であり;
mは1、2、3または4であり;
nは0または1であり;かつ
pは1〜20の整数である。
[本発明1002]
式(Ia)に示す立体配座を有する、本発明1001の化合物:
0005876075.tif 000016
。
[本発明1003]
Yが-(CH2)3-である、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1004]
Yが-(CH2)3-であり;
R2が、フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3であり;
R3が、フェニル基が-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル)でさらに置換されている-NH-フェニルであり;
nが0であり;かつ
R1およびkが上記に示す意味を有する、
本発明1003の化合物。
[本発明1005]
Yが-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-である、本発明1001または1002の化合物。
[本発明1006]
Yが-C(O)-N-(CH2-CH2-O)p-CH2-CH2-であり;
R2が、フェニル環が非置換であるかまたは-O-(C1〜4)アルキルで独立して置換されている-(CH2)k-N-C(Ph)3であり;
R3が、フェニル基が-(CH2)-O-C(O)-O-(4-ニトロ-フェニル)でさらに置換されている-NH-フェニルであり;
nが0であり;かつ
R1、kおよびpが上記に示す意味を有する、
本発明1005の化合物。
[本発明1007]
生物活性化合物のリガンドとしての本発明1001〜1006のいずれかの化合物の使用であって、前記リガンドが前記生物活性化合物に共有結合している、使用。
[本発明1008]
前記生物活性化合物がペプチドである、本発明1007の使用。
[本発明1009]
前記生物活性化合物が核酸である、本発明1007の使用。
[本発明1010]
下記式の化合物:
0005876075.tif 000017
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
R1およびkは、式(I)について上記に示す意味を有し;かつ
生物活性物質は、核酸、タンパク質またはペプチドである。
[本発明1011]
式(IIa)に示す立体配座を有する、本発明1010の化合物:
0005876075.tif 000018
式中、
Raは、-(CH2)k-NH2であり;
R1およびkは、式(I)について上記に示す意味を有し;かつ
生物活性物質は、核酸、タンパク質またはペプチドである。
[本発明1012]
生物活性化合物がタンパク質またはペプチドである、本発明1010または1011の化合物。
[本発明1013]
生物活性化合物が核酸である、本発明1010または1011の化合物。
[本発明1014]
前記核酸が、
修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と
修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖と
を含むオリゴヌクレオチドであり、
ここで、wが独立して5'-リン酸もしくは5'-ホスホチオエートまたはHであり、
Z1が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
Z2が独立して2'-デオキシヌクレオシドまたは2'-フルオロ修飾ヌクレオシドであり、
Z3が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
naが8〜23であり、かつnsが8〜25である、
本発明1013の化合物。
[本発明1015]
前記核酸がsiRNAである、本発明1013または1014の化合物。
[本発明1016]
前記核酸が送達用ポリマーに共有結合している、本発明1013〜1015のいずれかの化合物。
[本発明1017]
本発明1010〜1016のいずれかの化合物を含む、薬学的組成物。
[本発明1018]
生物活性化合物のインビボ送達のための本発明1010〜1016のいずれかの化合物の使用。
[本発明1019]
生物活性化合物のインビボ送達のための本発明1010〜1015のいずれかの化合物の使用であって、複合体が送達用ポリマーと同時送達される、使用。
[本発明1020]
修飾パターン5'-(w)-(Z1)-(Z2)-(Z3)na-3'を有するアンチセンス鎖と
修飾パターン5'-(Z3)ns-3'を有するセンス鎖と
を含むオリゴヌクレオチドであって、
ここで、wが独立して5'-リン酸もしくは5'-ホスホチオエートまたはHであり、
Z1が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
Z2が独立して2'-デオキシヌクレオシドまたは2'-フルオロ修飾ヌクレオシドであり、
Z3が独立して2'-修飾ヌクレオシドであり、
naが8〜23であり、かつnsが8〜25である、
オリゴヌクレオチド。
[本発明1021]
Z1が2'-フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、本発明1020のオリゴヌクレオチド。
[本発明1022]
Z3が2'-O-メチル修飾ヌクレオシド、2'-フルオロ修飾ヌクレオシドまたは2デオキシ-ヌクレオシドであり、かつ残りすべての置換基ならびに変数naおよびnsが上記に示す意味を有する、本発明1020または1021のオリゴヌクレオチド。
[本発明1023]
送達用ポリマーに共有結合している、本発明1020〜1023のいずれかのオリゴヌクレオチド。
[本発明1024]
本発明1020〜1023のいずれかのオリゴヌクレオチドとコレステロールとを含む、複合体。
[本発明1025]
本発明1020〜1023のいずれかのオリゴヌクレオチドと下記式の化合物とを含む、複合体:
0005876075.tif 000019
。
[本発明1026]
小分子と本発明1020〜1023のいずれかのオリゴヌクレオチドとの複合体であって、前記小分子が、1〜10個の2'OH-ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーを含み、かつ前記オリゴヌクレオチドが、前記小分子の前記ヌクレオチドリンカーに共有結合している、複合体。
[本発明1027]
前記小分子がコレステロールまたは下記式の化合物である、本発明1026の複合体:
0005876075.tif 000020
式中、Rは、1〜10個の2'OH-ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカーである。
[本発明1028]
本発明1020〜1023のいずれかのオリゴヌクレオチドまたは本発明1024〜1027のいずれかの複合体を含む、薬学的組成物。
[本発明1029]
本質的に上記の通りである、化合物、使用および方法。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】式(I)または(Ia)の化合物を含むsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与を示す。
【図２】式(I)または(Ia)の化合物を含むsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与を示す。
【図３】式(I)または(Ia)の化合物を含むsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与を示す。
【図４】式(I)または(Ia)の化合物を含むsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与を示す。
【図５】図5aは、完全2'-修飾siRNAによるアンチセンス鎖媒介遺伝子サイレンシングを示す。COS7細胞を3nMのEGFP指向性siRNAおよびpsiCHECK2-ATと同時形質移入した。siRNAのノックダウン活性を、レポーター構築物からウミシイタケ対ホタルのルシフェラーゼ活性を測定することで評価した。無修飾(2-19-2)基準siRNAのノックダウン活性によってsiRNAを選別した。図5bは、完全2'-修飾siRNAによるセンス鎖媒介遺伝子サイレンシングを示す。COS7細胞を3nMのEGFP指向性siRNAおよびpsiCHECK2-STと同時形質移入した。siRNAのノックダウン活性を、レポーター構築物からルシフェラーゼ発現を測定することで評価した。無修飾(2-19-2)基準siRNAのノックダウン活性によってsiRNAを選別した。
【図６】図6aは、送達用ポリマーに共有結合した各種2'-修飾siRNAの静脈内注射時の非ヒト霊長類における血清FVII活性の減少を示す。図6bは、送達用ポリマーに共有結合した2'-修飾siRNAでの処置時の非ヒト霊長類におけるプロトロンビン時間の展開を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００８４】
実施例1
工程1
3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ]-プロピルアミン
0005876075.tif 000021
標記アミンをそのニトリル前駆体から文献のプロトコール[Lollo et al, WO2001/070415]に従って調製した。
【００８５】
工程2
N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ]-プロピル}-スクシナミン酸
0005876075.tif 000022
2L丸底フラスコ中で3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロパン-1-アミン(21.15g、47.7mmol、当量: 1.00)およびヒューニッヒ塩基(12.3g、16.6ml、95.3mmol、当量: 2.00)とAcOEt(845ml)とを組み合わせて無色溶液を得た。THF(42ml)中ジヒドロフラン-2,5-ジオン(4.77g、47.7mmol、当量: 1.00)を加え、反応混合物を周囲温度で終夜攪拌して白色懸濁液を得た。すべての揮発物を減圧除去し、残渣をCH2Cl2に溶解させ、有機層をNH4Clおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をCH3CN/H2Oに溶解させ、凍結乾燥させて標記化合物29.8gを綿毛状粉末として得た。
MS (ISP): (M-H) 542.5。
【００８６】
工程3
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-3-(4-ニトロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000023
10mL丸底フラスコ中で、上記で調製した4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタン酸(106mg、184μmol、当量: 1.00)、(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)ヘキサンアミド(132mg、184μmol、当量: 1.00)、HOAt(25.0mg、184μmol、当量: 1.00)およびEDC塩酸塩(35.3mg、184μmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(1.8ml)中で一緒に混合して黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(47.5mg、64.2μl、368μmol、当量: 2.00)を加え、反応液を周囲温度で終夜攪拌した。TLCは出発原料の消費を示した。すべての揮発物を減圧除去し、粗生成物をCH2Cl2中SiO2/7% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物128mgを明黄色固体として生成した。
MS: 予測質量: 1240.7552、実測質量: 1240.7518。
【００８７】
工程4
0005876075.tif 000024
10mL丸底フラスコ中で、上記で調製したN1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-3-(4-ニトロフェニル)-1-オキソプロパン-2-イル)スクシンアミド(126mg、101μmol、当量: 1.00)およびヒューニッヒ塩基(39.3mg、53.2μl、304μmol、当量: 3.00)とCH2Cl2(1.4ml)およびDMF(1.0ml)とを組み合わせて黄色懸濁液を得て、ビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(46.3mg、152μmol、当量: 1.50)を加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。ジエチルエーテル約10mlによるトリチュレーション後、標記生成物99mgをオフホワイトの固体として得た。
MS: 予測質量: 1405.7614、実測質量: 1405.7518。
【００８８】
工程3に必要なジペプチドビルディングブロックを以下のように調製した。
【００８９】
工程a
(S)-2-[(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-3-(4-ニトロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸
0005876075.tif 000025
25mL丸底フラスコ中で、(S)-2-アミノ-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル-アミノ)ヘキサン酸(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869、968mg、2.31mmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(20ml)に溶解させて明黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(897mg、1.21ml、6.94mmol、当量: 3.00)およびトリメチルクロロシラン(528mg、621μl、4.86mmol、当量: 2.10)を加え、反応混合物を15分間攪拌した。
【００９０】
第2の50mL丸底フラスコ中で、(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-ニトロフェニル)プロパン酸(1g、2.31mmol、当量: 1.00)をDMF(20ml)に溶解させて無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(359mg、485μl、2.78mmol、当量: 1.20)およびTPTU[125700-71-2](687mg、2.31mmol、当量: 1.00)を加え、反応混合物を20分間攪拌した。対応するシリルエステルモノシリルアミンを含有する第1のフラスコからの溶液を加え、反応液をさらに3時間攪拌した。混合物を砕氷/NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO2/10% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物1.38gを褐色泡状物として得た。
MS (ISP): (M+H) 833.5, (M+Na) 855.4。
【００９１】
工程b
[(S)-1-((S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-5-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ペンチルカルバモイル)-2-(4-ニトロ-フェニル)-エチル]-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル
0005876075.tif 000026
250mLナシ型フラスコ中で、上記で合成した(S)-2-((S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-ニトロフェニル)プロパンアミド)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサン酸(1.38g、1.66mmol、当量: 1.00)、(4-アミノフェニル)メタノール(204mg、1.66mmol、当量: 1.00)、HOAt(226mg、1.66mmol、当量: 1.00)およびEDC塩酸塩(318mg、1.66mmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(16.6ml)に溶解させて黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(428mg、579μl、3.31mmol、当量: 2.00)を加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷/NH4Cl(pH約7)上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をジエチルエーテル(1x50mL)でトリチュレートし、得られた固体を濾去し、乾燥させて標記化合物1.214gを明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 938.7。
【００９２】
工程c
(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(4-ニトロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド
0005876075.tif 000027
50mL丸底フラスコ中で、上記で調製した[(S)-1-((S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-5-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ペンチルカルバモイル)-2-(4-ニトロ-フェニル)-エチル]-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル(1.214g、1.29mmol、当量: 1.001)とTHF(19ml)とを組み合わせて褐色溶液を得た。0℃でジエチルアミン(1.77g、2.49ml、24.2mmol、当量: 18.70)を加えた。反応液を周囲温度で3時間攪拌し、その時点でMSは出発原料の消失を示した。すべての揮発物を減圧蒸発させた後、CH2Cl2中SiO2/0.1% NEt3→CH2Cl2中10% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィー、続いてCH2Cl2中SiO2/5% MeOH/0.1% NEt3の第2のフラッシュクロマトグラフィーを行って標記化合物502mgを明褐色泡状物として得た。
MS: 予測質量: 715.337、実測質量: 715.3362。
【００９３】
実施例2
O-ベンジル-N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-チロシル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000028
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(4-ベンジルオキシ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-(ベンジルオキシ)フェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1466.8182、実測質量: 1466.8136。
【００９４】
実施例3
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-4-シアノ-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000029
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(4-シアノ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-シアノフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1385.7716、実測質量: 1385.7696。
【００９５】
実施例4
3,4-ジクロロ-N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000030
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(3,4-ジクロロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(3,4-ジクロロフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1428.6984、実測質量: 1428.695。
【００９６】
実施例5
4-クロロ-N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000031
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-クロロフェニル)プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)-カルボニルアミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1394.7373、実測質量: 1394.7342。
【００９７】
実施例6
4-{[(2S)-2-{[(2S)-2-[(4-{[3-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-[(2R)-6-メチルヘプタン-2-イル]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル}オキシ)プロピル]アミノ}-4-オキソブタノイル)アミノ]-3-(ナフタレン-1-イル)プロパノイル]アミノ}-6-{[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]アミノ}ヘキサノイル]アミノ}ベンジル 4-ニトロフェニル カーボネート(好ましくない名称)
0005876075.tif 000032
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-2-アミノ-3-ナフタレン-1-イル-プロピオニルアミノ)-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(ナフタレン-1-イル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1410.792、実測質量: 1410.7918。
【００９８】
実施例7
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-4-フルオロ-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000033
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(4-フルオロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)-ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-フルオロフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1378.7669、実測質量: 1378.7609。
【００９９】
実施例8
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-2-フルオロ-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000034
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(2-フルオロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)-ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(2-フルオロフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1378.7669、実測質量: 1378.7689。
【０１００】
実施例9
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-3-フルオロ-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000035
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-[(S)-2-アミノ-3-(3-フルオロ-フェニル)-プロピオニルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)-ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(3-フルオロフェニル)プロパン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1378.7669、実測質量: 1378.7659。
【０１０１】
実施例10
工程1
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-4-オキソブタン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000036
10mL丸底フラスコ中で、上記で調製した4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタン酸(109mg、188μmol、当量: 1.00)、(S)-2-[(S)-3-アミノ-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド(132mg、188μmol、当量: 1.00)、HOAt(25.6mg、188μmol、当量: 1.00)およびEDC塩酸塩(36.1mg、188μmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(2ml)中で一緒に混合して黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(48.7mg、64.1μl、377μmol、当量: 2.00)を加え、反応液を周囲温度で終夜攪拌した。TLCは出発原料の消費を示した。すべての揮発物を減圧除去し、粗生成物をCH2Cl2中SiO2/5% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物197mgをオフホワイトの固体として生成した。
MS: 予測質量: 1227.7763、実測質量: 1227.7714。
【０１０２】
工程2
4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)-4-(4-フルオロフェニル)ブタンアミド)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)ヘキサンアミド)-ベンジル 4-ニトロフェニル カーボネート
0005876075.tif 000037
10mL丸底フラスコ中で、上記で調製したN1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(4-フルオロフェニル)-4-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-4-オキソブタン-2-イル)スクシンアミド(196mg、160μmol、当量: 1.00)およびヒューニッヒ塩基(61.9mg、81.4μl、479μmol、当量: 3.00)とCH2Cl2(1.6ml)およびDMF(0.8ml)とを組み合わせて黄色懸濁液を得て、ビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(72.8mg、239μmol、当量: 1.50)を加え、反応を周囲温度で終夜進行させた。混合物を砕氷/NH4Cl(pH約6)上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。AcOEt/ヘプタンでのトリチュレーション後、標記化合物123mgを明黄色固体として得た。
MS: 予測質量: 1392.7825、実測質量: 1392.7819。
【０１０３】
工程1に必要なジペプチドビルディングブロックを以下のように調製した。
【０１０４】
工程a
(S)-2-[(S)-3-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸
0005876075.tif 000038
25mL丸底フラスコ中で、(S)-2-アミノ-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル-アミノ)ヘキサン酸(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869、1040mg、2.48mmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(12.5ml)に溶解させて淡黄色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(961mg、1.27ml、7.44mmol、当量: 3.00)およびトリメチルクロロシラン(566mg、621μl、5.21mmol、当量: 2.10)を加え、反応混合物を周囲温度で20分間攪拌した。
【０１０５】
第2の50mL丸底フラスコ中で、(S)-3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル-アミノ)-4-(4-フルオロフェニル)ブタン酸(1040mg、2.48mmol、当量: 1.00)をDMF(12.5ml)に溶解させて無色溶液を得た。ヒューニッヒ塩基(385mg、506μl、2.98mmol、当量: 1.20)およびTPTU[125700-71-2](737mg、2.48mmol、当量: 1.00)を加え、反応混合物を15分間攪拌した。対応するシリルエステルモノシリルアミンを含有する第1のフラスコからの溶液を加え、反応液を周囲温度でさらに3時間攪拌した。混合物を砕氷/NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO2/5% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物2.10gを黄色泡状物として得た。
MS (ISP): (M+H) 820.6。
【０１０６】
工程b
{(S)-2-(4-フルオロ-フェニル)-1-[((S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-5-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ペンチルカルバモイル)-メチル]-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル
0005876075.tif 000039
250mLナシ型フラスコ中で、上記で合成した{(S)-2-(4-フルオロ-フェニル)-1-[((S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-5-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ペンチルカルバモイル)-メチル]-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル(2.10g、2.56mmol、当量: 1.00)、(4-アミノフェニル)メタノール(315mg、2.55mmol、当量: 1.00)、HOAt(349mg、2.56mmol、当量: 1.00)およびEDC塩酸塩(491mg、2.56mmol、当量: 1.00)をCH2Cl2(12.5ml)に溶解させた。ヒューニッヒ塩基(662mg、871μl、5.21mmol、当量: 2.00)を加え、反応を終夜進行させた。混合物を砕氷/NH4Cl(pH約7)上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗生成物をジエチルエーテル(1x50ml)でトリチュレートし、得られた固体を濾去し、乾燥させて標記化合物0.796gを明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 925.6。
【０１０７】
工程c
(S)-2-[(S)-3-アミノ-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド
0005876075.tif 000040
50mL丸底フラスコ中で、上記で調製した{(S)-2-(4-フルオロ-フェニル)-1-[((S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-5-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ペンチルカルバモイル)-メチル]-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル(793mg、857 mol、当量: 1.001)とTHF(12ml)とを組み合わせて褐色溶液を得た。0℃でジエチルアミン(1.13g、1.59ml、15.4mmol、当量: 18)を加えた。反応液を周囲温度で終夜攪拌した。混合物を砕氷/NH4Cl(pH約7)上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。CH2Cl2中SiO2/10% MeOH/0.1% NEt3のフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物500mgをオフホワイトの固体として得た。
MS: 予測質量: 702.3581、実測質量: 702.3578。
【０１０８】
実施例11
4-((S)-2-((S)-3-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)-4-フェニルブタンアミド)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)ヘキサンアミド)ベンジル 4-ニトロフェニル カーボネート
0005876075.tif 000041
実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-3-アミノ-4-フェニルブタンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドを(S)-2-[(S)-3-アミノ-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-4-フェニルブタン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1374.792、実測質量: 1374.7877。
【０１０９】
実施例12
4-({N~2~-[(3S)-4-(4-クロロフェニル)-3-{[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]アミノ}ブタノイル]-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-L-リジル}アミノ)ベンジル 4-ニトロフェニル カーボネート
0005876075.tif 000042
実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-3-アミノ-4-(4-クロロフェニル)ブタンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)ヘキサンアミドを(S)-2-[(S)-3-アミノ-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-4-(4-クロロフェニル)-ブタン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS (ISP): (M+H) 1409.9。
【０１１０】
実施例13
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-O-メチル-L-チロシル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000043
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-メトキシフェニル)プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)ヘキサンアミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-3-(4-メトキシフェニル)プロパン酸から実施例1の上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS (ISP): (M+H) 1391.9。
【０１１１】
実施例14
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-D-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-D-リジンアミド
0005876075.tif 000044
実施例1に類似して、但し工程3においてカップリングパートナーとして(R)-2-((R)-2-アミノ-3-フェニル-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-ヘキサンアミドを(S)-2-((S)-2-アミノ-3-(4-ニトロフェニル)-プロパンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドの代わりに使用して調製した。このビルディングブロックは(R)-2-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-6-アミノヘキサン酸および(R)-2-アミノ-6-((4-メトキシフェニル)-ジフェニルメチルアミノ)ヘキサン酸(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 885-869を参照)から上記工程a]〜c]に記載のように合成した。
MS: 予測質量: 1360.7763、実測質量: 1360.7774。
【０１１２】
実施例15
4-({N~2~-[(3S)-3-{[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]アミノ}-4-(4-シアノフェニル)ブタノイル]-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-L-リジル}アミノ)ベンジル 4-ニトロフェニル カーボネート
0005876075.tif 000045
実施例10に類似して、但し工程1においてカップリングパートナーとして(S)-2-((S)-3-アミノ-4-(4-シアノフェニル)ブタンアミド)-N-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニル-メチルアミノ)ヘキサンアミドを(S)-2-[(S)-3-アミノ-4-(4-フルオロ-フェニル)-ブチリルアミノ]-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドの代わりに使用して調製した。前者は(S)-3-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニルアミノ)-4-(4-シアノフェニル)ブタン酸から上記工程a]〜c]に記載のように調製した。
MS: 予測質量: 1399.7872、実測質量: 1399.7857。
【０１１３】
実施例16
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000046
【０１１４】
工程1
(S)-2-((S)-2-アミノ-3-フェニル-プロピオニルアミノ)-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸 (4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド
0005876075.tif 000047
ビルディングブロック(S)-2-((S)-2-アミノ-3-フェニル-プロピオニルアミノ)-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸 (4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミドはBioconjugate Chem., Vol. 13, No.4, 2002, 855-869に記載の手順に類似して調製した。
MS (ISP): (M+H) 671.5
【０１１５】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-6-((4-メトキシフェニル)ジフェニルメチルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000048
N-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ]-プロピル}-スクシナミン酸(実施例1、工程2を参照)(426mg、0.784mmol、当量: 1.00)およびヒューニッヒ塩基(304mg、411μl、2.35mmol、当量: 3)のDMF(10ml)溶液にTPTU[125700-71-2](233mg、784μmol、当量: 1.00)を加えた。3分後、(S)-2-((S)-2-アミノ-3-フェニル-プロピオニルアミノ)-6-{[(4-メトキシ-フェニル)-ジフェニル-メチル]-アミノ}-ヘキサン酸 (4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド(工程1)を加えた。t=1時間でのTLCは、反応が完了したことを示した。溶媒を減圧除去した。残りの残渣を酢酸エチル中に取り込み、NaHCO3半飽和溶液(1X)、フタル酸水素カリウム溶液0.05M(2X)、水(1X)およびブライン(1X)で抽出した。有機抽出物をMgSO4で乾燥させ、減圧濃縮した。粗材料をフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記生成物(682mg、513μmol)を明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 1196.8
【０１１６】
工程3
上記アルコール(718mg、600μmol、当量: 1.00)およびビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(548mg、1.8mmol、当量: 3)のTHF(20ml)溶液にヒューニッヒ塩基(465mg、629μl、3.6mmol、当量: 6)を加えた。黄色溶液を室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧除去した。残りの残基をジエチルエーテルでトリチュレートした。固体を濾取し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて標記化合物(800mg、529μmol)を明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 1361.9
【０１１７】
実施例17
工程1
(S)-2-[(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-3-フェニル-プロピオニルアミノ]-ヘキサン酸
0005876075.tif 000049
市販のL-Fmoc-Phe-OSu(0.969g、2.00mmol、当量: 1.00)を1,2-ジメトキシエタンと水との1:1 v/v混合物(17ml)に懸濁させ、0℃でL-ノルロイシン(0.275g、2.10mmol、当量: 1.05)およびNaHCO3(0.185g、2.20mmol、当量: 1.10)で処理した。冷却浴を取り外し、反応を周囲温度で14時間進行させた。混合物を砕氷/クエン酸(pH約3)上に注ぎ、酢酸エチルで2回抽出し、H2Oおよびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、蒸発乾固させた。SiO2/AcOEtのフラッシュクロマトグラフィーによって標記化合物0.870mgを白色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 501.2。
【０１１８】
工程2
{(S)-1-[(S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-ペンチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル
0005876075.tif 000050
ナシ型フラスコ中で、上記で合成した(S)-2-[(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ-カルボニルアミノ)-3-フェニル-プロピオニルアミノ]-ヘキサン酸(10.72g、21mmol、当量: 1.00)、(4-アミノフェニル)メタノール(2.717g、22mmol、当量: 1.03)および2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン(EEDQ)(7.994g、32mmol、当量: 1.50)をCH2Cl2(320ml)に溶解させ、Arバルーン下で終夜攪拌した。混合物を砕氷/NH4Cl上に注ぎ、AcOEtで2回抽出し、H2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、体積を約300mlに減少させた。析出物を濾去し、乾燥させて標記化合物5.25gを明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 606.3。
【０１１９】
工程3
(S)-2-((S)-2-アミノ-3-フェニル-プロピオニルアミノ)-ヘキサン酸(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-アミド
0005876075.tif 000051
丸底フラスコ中で、上記で調製した{(S)-1-[(S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-ペンチルカルバモイル]-2-フェニル-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル(4.738g、7.822mmol、当量: 1.0)をCH2Cl2(28ml)に溶解させた。0℃でジエチルアミン(28ml、19.80g、271mmol、当量: 35)を加え、反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。すべての揮発物を減圧蒸発させた後、SiO2/CH2Cl2/10% MeOHのフラッシュクロマトグラフィー、続いてAcOEtからの結晶化により標記化合物2.116gを明褐色結晶として得た。
MS (ISP): (M+H) 384.2。
【０１２０】
工程4
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-1-オキソヘキサン-2-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000052
実施例16、工程2に類似して調製した。
MS (ISP): (M+H) 909.7 (M+Na) 931.8。
【０１２１】
工程5
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-ノルロイシンアミド
0005876075.tif 000053
実施例16、工程3に類似して調製した。
MS 予測質量: 1073.6453、実測質量1073.642
【０１２２】
実施例18
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-アラニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]グリシンアミド
0005876075.tif 000054
【０１２３】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000055
2-クロロトリチルクロリド樹脂(Novabiochem 01-64-0114、100〜200メッシュ)、1%DVB(18g、21.6mmol、当量: 1.00)をDCM/DMF=1/1(300mL)中で10分間膨潤させた。樹脂を排水し、FMOC-4-アミノベンジルアルコール(14.9g、43.2mmol、当量: 2)およびピリジン(6.83g、6.99ml、86.4mmol、当量: 4)のDCM/DMF=1/1(300mL)溶液を加えた。混合物を終夜振盪した。樹脂を排水し、10%ヒューニッヒ塩基のメタノール溶液(300mL)で封鎖した。樹脂をDMFおよびDCMで洗浄し、HVで終夜乾燥させて樹脂21.7gを得た。負荷を決定した結果、0.41mmoL/gであった。
【０１２４】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(2-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-2-オキソエチルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000056
工程1の樹脂(1g、410μmol、当量: 1.00)をDMF(2X)で予め洗浄し、ピペリジン/DMF=1/4(10mL)で5分間および10分間処理した。樹脂をDMFおよびIPA(3X10mL)で交互に洗浄した。Fmoc-Gly-OH(488mg、1.64mmol、当量: 4)、TPTU(487mg、1.64mmol、当量: 4)およびヒューニッヒ塩基(636mg、859μl、4.92mmol、当量: 12)のDMF(10mL)溶液を5分間攪拌した後、樹脂と共に1時間振盪した。樹脂をDMFおよびイソプロピルアルコール(3X)で交互に洗浄した。
【０１２５】
以下のFmoc開裂および引き続くFmoc-Ala-OH(511mg、1.64mmol、当量: 4)とN-{3-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ]-プロピル}-スクシナミン酸(実施例1、工程2)(892mg、1.64mmol、当量: 4)とのカップリングを適宜行った。乾燥ペプチド樹脂をTFA 1%/DCM(2X20mL)中で約2X30分間攪拌した。反応混合物を濾過し、樹脂をDCMで洗浄した。濾液をプールし、溶媒を減圧蒸発させた。粗材料をジエチルエーテル(2x)でトリチュレートした。フラッシュクロマトグラフィーで精製後、生成物(84mg、97.3μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 776.5452、実測質量776.5455
【０１２６】
工程3
上記で調製したアルコールN1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(2-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-2-オキソエチルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)スクシンアミド[RO5545270](70mg、90.1μmol、当量: 1.00)およびビス(4-ニトロフェニル)カーボネート(137mg、450μmol、当量: 5)をアルゴン下、室温でDMF(4ml)に溶解させ、ヒューニッヒ塩基(34.9mg、47.2μl、270μmol、当量: 3)で処理し、混合物を終夜反応させた。溶媒を減圧除去した。得られた固体をジエチルエーテルでトリチュレートした。固体を濾取し、ジエチルエーテルで洗浄した。生成物を減圧乾燥させて標記化合物(84mg、80.2μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 941.5514、実測質量941.5518
【０１２７】
実施例19
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-ロイシル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-メチオニンアミド
0005876075.tif 000057
【０１２８】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000058
実施例18、工程1に類似して調製した。
【０１２９】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-4-(メチルチオ)-1-オキソブタン-2-イルアミノ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000059
Fmoc-Met-OH(609mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Leu-OH(580mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１３０】
生成物(208mg、210μmol)を明黄色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 893.6183
【０１３１】
工程3は実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、標記化合物(161mg、137μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 1057.6174、実測質量1057.6184
【０１３２】
実施例20
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-ロイシル-N~1~-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-アスパルトアミド
0005876075.tif 000060
【０１３３】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000061
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１３４】
工程2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)-4-メチルペンタンアミド)-N1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)スクシンアミド
0005876075.tif 000062
Fmoc-Asn-OH(581mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Leu-OH(580mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１３５】
生成物(87mg、89.4μmol)を明黄色固体として得た。
MS 予測質量: 875.6136、実測質量875.6133
【０１３６】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、標記化合物(87mg、89.4μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 1040.6198、実測質量1040.6188
【０１３７】
実施例21
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-アラニル-N~1~-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-アスパルトアミド
0005876075.tif 000063
【０１３８】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000064
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１３９】
工程2
(S)-2-((S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)プロパンアミド)-N1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)スクシンアミド
0005876075.tif 000065
Fmoc-Asn-OH(581mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Ala-OH(511mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１４０】
生成物(140mg、159μmol)を明黄色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 834.8 (M+Na) 856.7
【０１４１】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それ(169mg、152μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 998.5729、実測質量998.5739
【０１４２】
実施例22
N~2~-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-アスパラギニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]グリシンアミド
0005876075.tif 000066
【０１４３】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000067
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１４４】
工程2
(S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)-N1-(2-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-2-オキソエチル)スクシンアミド
0005876075.tif 000068
Fmoc-Gly-OH(488mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Asn-OH(581mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１４５】
生成物(140mg、162μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 819.551、実測質量819.5503
【０１４６】
工程3
実施例18、工程3に類似して標記化合物(176mg、161μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 984.5572、実測質量984.5489
【０１４７】
実施例23
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]グリシンアミド
0005876075.tif 000069
【０１４８】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000070
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１４９】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(2-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-2-オキソエチルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000071
Fmoc-Gly-OH(488mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Phe-OH(635mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１５０】
生成物(259mg、288μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 852.5765、実測質量852.5754
【０１５１】
工程3
実施例18、工程3に類似して標記化合物(280mg、247μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 1017.5827、実測質量1017.5775
【０１５２】
実施例24
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-ロイシル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]グリシンアミド
0005876075.tif 000072
【０１５３】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000073
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１５４】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-(2-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-2-オキソエチルアミノ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000074
Fmoc-Gly-OH(488mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Leu-OH(580mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１５５】
生成物(240mg、278μmol)を明黄色固体として得た。
MS 予測質量: 818.5921、実測質量818.5921
【０１５６】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それ(194mg、177μmol)を明黄色固体として得た。
MS 予測質量: 983.5983 実測質量983.6004
【０１５７】
実施例25
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-ロイシル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-フェニルアラニンアミド
0005876075.tif 000075
【０１５８】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000076
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１５９】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000077
Fmoc-Phe-OH(635mg、1.64mmol、当量: 4)およびFmoc-Leu-OH(580mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として使用して実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１６０】
生成物(153mg、151μmol)を明黄色固体として得た。
MS 予測質量: 908.6391 実測質量908.637
【０１６１】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それ(117mg、98μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 1073.6453 実測質量1073.646
【０１６２】
実施例26
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-フェニルアラニンアミド
0005876075.tif 000078
【０１６３】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000079
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１６４】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イルアミノ)-1-オキソ-3-フェニルプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000080
Fmoc-Phe-OH(635mg、1.64mmol、当量: 4)をアミノ酸として用いて実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１６５】
生成物(240mg、204μmol)を明黄色固体として得た。
MS 予測質量: 942.6234 実測質量942.6218
【０１６６】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それ(190mg、154μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 1107.6296 実測質量1107.6287
【０１６７】
実施例27
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-ロイシル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-ロイシンアミド
0005876075.tif 000081
【０１６８】
工程1
2-クロロトリチル樹脂へのFMOC-4-アミノベンジルアルコールの添加
0005876075.tif 000082
実施例18、工程1に類似して行った。
【０１６９】
工程2
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イルアミノ)-4-メチル-1-オキソペンタン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000083
Fmoc-Leu-OH(1.59g、4.5mmol、当量: 3)をアミノ酸として用いて実施例18、工程2に類似して調製した。
【０１７０】
生成物(254mg、284μmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 874.6547 実測質量874.6527
【０１７１】
工程3
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体(178mg、168μmol)として得た。
MS 予測質量: 1039.6609 実測質量1039.6588
【０１７２】
実施例28
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-アラニル-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-アラニンアミド
0005876075.tif 000084
【０１７３】
工程1
{(S)-1-[(S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-エチルカルバモイル]-エチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル
0005876075.tif 000085
Fmoc-Ala-Ala-OH(1g、2.61mmol、当量: 1.00)および(4-アミノフェニル)メタノール(483mg、3.92mmol、当量: 1.5)のTHF(20ml)溶液をEEDQ(970mg、3.92mmol、当量: 1.5)で処理した。溶液を室温で終夜攪拌した。混合物を10% 2-プロパノール/酢酸エチル(100mL)で希釈し、溶液をKHSO4 5%/K2SO4 10%(2X)、水(1X)およびブライン(1X)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、減圧蒸発させた。残渣をジエチルエーテル中で数分間超音波処理し、固体を濾取して生成物(1.27g、1.2mmol)を明褐色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 488.3
【０１７４】
工程2
(S)-2-アミノ-N-[(S)-1-(4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-エチル]-プロピオンアミド
0005876075.tif 000086
化合物を実施例1、工程cに類似して調製して生成物(245mg、877μmol)を明黄色固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 266.3, (M+Na) 288.2 (2M+H) 531.3
【０１７５】
工程3
N1-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピル)-N4-((S)-1-((S)-1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イルアミノ)-1-オキソプロパン-2-イル)スクシンアミド
0005876075.tif 000087
実施例16、工程2に類似して化合物(165mg、198μmol)を明褐色固体として調製した。
MS 予測質量: 790.5608、実測質量790.5587
【０１７６】
工程4
標記化合物を実施例18、工程3に類似して調製した。シリカゲル上での精製後、それを白色固体(99mg、98.4μmol)として得た。
MS 予測質量: 955.567、実測質量955.5651
【０１７７】
実施例29
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-イソロイシル-N~1~-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-アスパルトアミド
0005876075.tif 000088
【０１７８】
工程1
(S)-2-[(2S,3S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-3-メチル-ペンタノイルアミノ]-スクシナミン酸
0005876075.tif 000089
2-クロロトリチルクロリド樹脂(5g、7.5mmol、当量: 1.00)をDCM中で膨潤させた後、Fmoc-Asn(Trt)-OH(8.95g、15.0mmol、当量: 2)およびヒューニッヒ塩基(3.88g、5.1ml、30.0mmol、当量: 4)のDCM溶液で終夜処理した。樹脂をDCMで洗浄し、10%ヒューニッヒ塩基のメタノール溶液で封鎖した。標準的固相ペプチド合成に従ってFmoc-Ile-OH(5.3g、15.0mmol、当量: 2)とTPTU(4.46g、15.0mmol、当量: 2)およびヒューニッヒ塩基(3.88g、5.1ml、30.0mmol、当量: 4)とをカップリングした。樹脂から生成物をTFA/水/トリイソプロピルシランのカクテル(95/2.5/2.5 v/v/v)によって室温で2時間かけて開裂させた。樹脂を濾過し、濾液を少量に減圧濃縮した。ジエチルエーテルでのトリチュレーション後、生成物を濾過し、減圧乾燥させて生成物(2.85g、5.79mmol)を白色固体として得た。
MS 予測質量: 467.2056、実測質量467.2056
【０１７９】
工程2
{(1S,2S)-1-[2-カルバモイル-1-((S)-4-ヒドロキシメチル-フェニルカルバモイル)-エチルカルバモイル]-2-メチル-ブチル}-カルバミン酸9H-フルオレン-9-イルメチルエステル
0005876075.tif 000090
実施例28、工程1に類似して化合物(620mg、336μmol)を明黄色固体として調製した。
【０１８０】
工程3
(S)-2-((2S,3S)-2-アミノ-3-メチル-ペンタノイルアミノ)-N*1*-(4-ヒドロキシメチル-フェニル)-スクシンアミド
0005876075.tif 000091
実施例1、工程cに類似して化合物(100mg、228μmol)を明黄色固体として調製した。
【０１８１】
工程4
(S)-2-((2S,3S)-2-(4-(3-((3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-((R)-6-メチルヘプタン-2-イル)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシ)プロピルアミノ)-4-オキソブタンアミド)-3-メチルペンタンアミド)-N1-(4-(ヒドロキシメチル)フェニル)スクシンアミド
0005876075.tif 000092
実施例16、工程2に類似して化合物(89mg、91.4μmol)を明黄色固体として調製した。
【０１８２】
工程5
実施例18、工程3に類似して上記工程の化合物を反応させて標記化合物を得た。シリカゲル上での精製後、それ(42mg、36.3μmol)を明褐色固体として得た。
MS 予測質量: 1040.6198、実測質量1040.6177
【０１８３】
実施例30
N-[4-({3-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]プロピル}アミノ)-4-オキソブタノイル]-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-D-リジンアミド
0005876075.tif 000093
Fmoc-D-Lys(Boc)-OHで出発して実施例16、工程1に類似して化合物(158mg、116μmol)を明褐色固体として調製した。
MS (ISP): (M+H) 1362.8 (M+Na) 1383.8
【０１８４】
実施例31
N-{15-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-4,15-ジオキソ-8,11-ジオキサ-5,14-ジアザペンタデカン-1-オイル}-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000094
合成の工程2においてコレステロール-オリゴ-PEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。
MS (ISP): (M+H) 1479.8
【０１８５】
工程2に必要なコレステロール-PEG中間体N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシカルボニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エチル]-スクシナミン酸を以下のように調製した。
【０１８６】
工程a
{2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-エチル}-カルバミン酸(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルエステル
0005876075.tif 000095
2,2'-(エチレンジオキシ)ビス-(エチルアミン)(495mg、3.34mmol)のジクロロメタン75mL溶液にコレステリルクロロホルメート(1g、2.23mmol)のジクロロメタン25mL溶液を攪拌下で滴下した。反応液を室温で終夜攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、水で抽出した。有機抽出物を無水MgSO4二水和物で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。アミノ改質シリカゲル(溶離液: MeCl2→MeCl2/MeOH=975:25 v/v)上での精製後、生成物(615mg)を白色ワックス状固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 561.5
【０１８７】
工程b
N-[2-(2-{2-[(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-((R)-1,5-ジメチル-ヘキシル)-10,13-ジメチル-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イルオキシカルボニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エチル]-スクシナミン酸
0005876075.tif 000096
工程aのアミン(480mg、0.856mmol)およびトリエチルアミン(0.13mL、0.94mmol)をジクロロメタン5mLに溶解させた。無水コハク酸(90mg、0.9mmol)を加えた後、溶液を室温で終夜攪拌した。TLCチェックは何らかの出発原料を依然として示した。さらに無水コハク酸(20mg、0.2mmol)を加えた。反応液を室温でさらに3時間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、5%KHSO4/10%K2SO4混合物で洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4二水和物で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させて所望の酸(490mg、0.667mmol)を得た。
MS (ISP): (M+H) 661.5
【０１８８】
実施例32
N-{30-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-4,30-ジオキソ-8,11,14,17,20,23,26-ヘプタオキサ-5,29-ジアザトリアコンタン-1-オイル}-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000097
合成の工程2においてコレステロール-PEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。
MS (ISP): (M+H) 1699.9
【０１８９】
工程2に必要なコレステロール-PEG中間体1-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-1,27-ジオキソ-5,8,11,14,17,20,23-ヘプタオキサ-2,26-ジアザトリアコンタン-30-酸を以下のように調製した。
【０１９０】
工程a
tert-ブチル [25-({(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-ジメチル-17-[(2R)-6-メチルヘプタン-2-イル]-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-テトラデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-3-イル}オキシ)-25-オキソ-3,6,9,12,15,18,21-ヘプタオキサ-24-アザペンタコサ-1-イル]カルバメート
0005876075.tif 000098
コレステリルクロロホルメート(476mg、1.06mmol)およびトリエチルアミン(155uL、1.113mmol)をジクロロメタン5mLに溶解させた。次に、ジクロロメタン1mLに溶解したα-アミノ-ω-boc-アミノ-オクタ(エチレングリコール)(497mg、1.06mmol)の溶液を加えた。溶液を室温で終夜攪拌し、ジクロロメタンで希釈し、KHSO4 5%/K2SO4 10%水性混合物で希釈した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、減圧蒸発させた。シリカゲル(溶離液: MeCl2/MeOH=975:25→95:5 v/v)上で精製後、生成物(530mg、0.571mmol)を無色油状物として得た。
MS (ISP): (M+NH4) 898.7
【０１９１】
工程b
1-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-1,27-ジオキソ-5,8,11,14,17,20,23-ヘプタオキサ-2,26-ジアザトリアコンタン-30-酸
0005876075.tif 000099
上記Boc誘導体(450mg、0.511mmol)をジオキサン中HCl 4M(10.2mL、40.9mmol)に溶解させた。溶液を室温で40分間攪拌した。溶媒を減圧除去し、残りの白色固体をジクロロメタン5mLに溶解させ、トリエチルアミン(32uL、0.229mmol)および無水コハク酸(11.5mg、0.114mmol)で終夜処理した。さらに無水コハク酸(11mg、0.11mmol、0.2当量)を加え、60分後に反応液をジクロロメタンで希釈し、KHSO4 5%/K2SO4 10%緩衝液で洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて所望の生成物390mgを得た。
MS (ISP): (M+H) 881.7
【０１９２】
実施例33
N-{66-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-4,66-ジオキソ-8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62-ノナデカオキサ-5,65-ジアザヘキサヘキサコンタン-1-オイル}-L-フェニルアラニル-N~6~-[(4-メトキシフェニル)(ジフェニル)メチル]-N-[4-({[(4-ニトロフェノキシ)カルボニル]オキシ}メチル)フェニル]-L-リジンアミド
0005876075.tif 000100
合成の工程2においてコレステロール-PEG誘導体を使用して実施例16に類似して標記化合物を調製した。
MS (ISP): (M+H) 2228.1
【０１９３】
工程2に必要なコレステロール-PEG中間体1-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-1,63-ジオキソ-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-ノナデカオキサ-2,62-ジアザヘキサヘキサコンタン-66-酸を以下のように調製した。
【０１９４】
工程a
(3β)-コレスタ-5-エン-3-イル (59-アミノ-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57ノナデカオキサノナペンタコンタ-1-イル)カルバメート
0005876075.tif 000101
α,ω-ビス-アミノ20(エチレングリコール)(538mg、0.6mmol)およびトリエチルアミン(92uL、0.66mmol)を乾燥ジクロロメタン15mLに溶解させた。コレステリルクロロホルメート(270mg、0.6mmol)の乾燥ジクロロメタン2mL溶液を室温で滴下した。溶液を終夜攪拌した後、少量に減圧濃縮し、シリカゲル(溶離液: MeCl2/MeOH=95:5→9:4→4:1 v/v)上で直接精製して生成物(350mg、0.254mmol)をワックス状固体として得た。
MS (ISP): (M+H) 1309.9
【０１９５】
工程b
1-[(3β)-コレスタ-5-エン-3-イルオキシ]-1,63-ジオキソ-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59-ノナデカオキサ-2,62-ジアザヘキサヘキサコンタン-66-酸
0005876075.tif 000102
工程aのアミン(329mg、0.251mmol)、無水コハク酸(26.4mg、0.264mmol)およびトリエチルアミン(40uL、0.286mmol)を乾燥ジクロロメタン5mLに溶解させた。さらにトリエチルアミン(40uL、0.286mmol)を加えた後、溶液(pH＞8)を室温で終夜攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、KHSO4 5%/K2SO4 10%水性混合物で2回洗浄した。有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて生成物(260mg、0.175mmol)を無色ワックス状固体として得た。
MS (ISP): (M+NH4) 1408.9
【０１９６】
実施例34:RNA複合体の調製のための一般的手順
材料
ジメチルスルホキシド(DMSO)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)および酢酸ナトリウム溶液(3M、pH 5.2)をSigma Aldrich Chemie GmbH(ドイツTraufkirchen)から購入した。
【０１９７】
RP-HPLC用の酢酸トリエチルアンモニウム(TEAA)(2.0M、pH 7.0)およびアセトニトリル(ACN、HPLC品質)をBiosolve(オランダValkenswaard)から購入した。
【０１９８】
エタノール(EtOH、試薬グレード)をMerck(ドイツ・ダルムシュタット)から購入した。Optilab HF(Membra Pure、ドイツ)システムからの精製水を使用した。
【０１９９】
Resource RPC 3mLカラム(10x0.64cm; 粒径15μm)をGE Healthcare(ドイツ・フライブルク)から購入した。
【０２００】
HPLC精製はAKTA Explorer 100システム(GE Healthcare)を使用して実現した。
【０２０１】
アミノ修飾RNAの合成
センス鎖の5'-末端においてヘキシルアミノリンカーを備えたRNAを、1215μmolスケールでの固相上でAKTA Oligopilot 100(ドイツ・フライブルク、GE Healthcare)および固体支持体としての細孔制御ガラス(米国ペンシルベニア州アストン、Prime Synthesis)を使用して標準的ホスホラミダイト化学作用によって生成した。2'-O-メチルヌクレオチドを含有するRNAを、対応するホスホラミダイトである2'-O-メチルホスホラミダイトおよびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト(ドイツ・ハンブルク、Sigma-Aldrich、SAFC)を使用して作成した。開裂および脱保護ならびに精製を、当技術分野で公知の方法(Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84)によって実現した。
【０２０２】
アミノ修飾RNAをアニオン交換HPLCによって特性決定し(純度: 96.1%)、独自性をESI-MSによって確認した([M+H]1+計算値: 6937.4; [M+H]1+実測値: 6939.0)。
【０２０３】
配列: 
0005876075.tif 000103
; u、c: 対応するRNAヌクレオチドの2'-O-メチルヌクレオチド、s: ホスホロチオエート。
【０２０４】
一般的な実験的結合手順
実施例1〜33の標記化合物を以下の手順に従ってアミノ修飾RNA経由でカップリングした。
【０２０５】
5'-末端においてC-6アミノリンカーを備えたRNA(16.5mg、1当量)をDMSO 500μLおよび水150μLに溶解させる。DMSO 1mLに溶解したp-ニトロフェニルカーボネート誘導体(10当量)、続いてDIPEA 8μLを加える。反応混合物を暗室中35℃で振盪し、RP-HPLC(Resource RPC 3mL、緩衝液: A: 水中0.1M TEAA、B: 95% ACN中0.1M TEAA、勾配: 20 CV中3% B→100% B)を使用してモニタリングする。反応が完了に至る時点で、EtOH中酢酸ナトリウム(3M)を使用してRNA複合体を-20℃で析出させる。ジペプチドモチーフ中にMMT保護基を欠く例では、先に記載の条件を使用して対応する複合体を精製する。純粋な画分をプールし、材料を酢酸ナトリウム/EtOHによって析出させて所望のRNA複合体を得る。
【０２０６】
ジペプチド配列中にMMT保護基を含有するRNA複合体を、以下に示す手順に従ってさらに処理する。
【０２０７】
MMT開裂の一般的手順
粗RNA複合体ペレットを水500μLおよび酢酸ナトリウム緩衝液(3M、pH 5.2または0.1M、pH 4.0)1.5mLに溶解させる。溶液を30℃で2日間振盪する。反応混合物をRP-HPLC(Resource RPC 3mL、緩衝液: A: 水中0.1M TEAA、B: 95% ACN中0.1M TEAA、勾配: 20 CV中3% B→100% B)を使用してモニタリングする。MMT保護基の開裂完了後、すぐ上で言及した条件を使用してRNA複合体を直接精製する。純粋な画分をプールし、所望の複合体を酢酸ナトリウム/EtOHによって析出させる。
【０２０８】
対照として、ジペプチドモチーフを欠くRNA複合体を合成した。この目的でコレステロールを文献記載のリンカー経由で5'-末端に結合させた(Nature Biotech, 2007, 25, 1149)。この複合体を「非開裂性」と呼ぶ。
【０２０９】
すべてのRNA複合体を純度についてRP HPLCで分析し、独自性をESI MS(ネガティブモード)で確認した。簡潔に言えば、XBridge C18カラム(2.5x50mm、粒径2.5μm、ドイツEschborn、Waters)を備えたDionex Ultimateシステム(ドイツIdstein、Dionex)上にてカラム温度65℃でRP-HPLCを行った。1%メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)および16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95%メタノール中のそれらを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った(30分で1% B→18% B)。UV検出を260nmで記録した。質量分析では、マイクロスプレー源およびイオントラップ検出器を備えたThermoFinnigan LCQ DecaXP ESI-MSシステムをHPLCシステムにオンラインで組み合わせた。
【０２１０】
式(IIa)の特定の化合物の例を表1に開示する。得られた化合物を「ジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体」と呼び、特定のジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体をさらに「標記化合物実施例X-(NHC6)-(siRNA配列)」および「実施例Xの標記化合物を有するsiRNA」と呼ぶ。
【０２１１】
siRNA調製
アンチセンス配列: 
0005876075.tif 000104
u、c: 対応するRNAヌクレオチドの2'-O-メチルヌクレオチド、s: ホスホロチオエート。
【０２１２】
アポリポタンパク質B mRNAに対して指向するジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を、アニーリング緩衝液(20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8; 100mM塩化ナトリウム)中の相補鎖の等モル溶液を混合することで作成し、水浴中、80〜85℃で3分間加熱し、3〜4時間かけて室温に冷却した。二本鎖形成を天然ゲル電気泳動によって確認した。
【０２１３】
すべての調製したジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を表2に列挙する。
【０２１４】
（表１）ジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体(5'-3')および分析データ
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。(NHC6)は、センス鎖の5'-末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。
0005876075.tif 000105
【０２１５】
（表２）ジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体
最後の項目(SEQ ID NO対266/154)は、ジ-ペプチドモチーフを欠くsiRNA複合体を表す。キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。(NHC6)は、センス鎖の5'-末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。
0005876075.tif 000106
0005876075.tif 000107
【０２１６】
実施例35:インビボ実験
ジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体および送達用ポリマーのインビボでの同時投与
6〜8週齢マウス(C57BL/6またはICR系統、各約18〜20g)をHarlan Sprague Dawley(インディアナ州インディアナポリス)から得た。マウスを注射前に少なくとも2日間収容した。給餌はHarlan Tekladげっ歯類用食餌(ウィスコンシン州マジソン、Harlan)によって自由に行った。
【０２１７】
マウス(群当たりn=3)に送達用ポリマーの0.2mL溶液とジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体0.2mlとの混合物を注射した。別途明記しない限り、注射量は送達用ポリマー15mg/kg、ジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体0.1mg/kgとした。溶液を尾静脈への注入により注射した。注射48時間後の血清ApoBレベルを等張グルコース処理動物に対して以下の手順に従って測定した。
【０２１８】
血清ApoBレベル決定
マウスを顎下出血による血清採取前に4時間絶食させた。血清ApoBタンパク質レベルを標準的サンドイッチELISA法で決定した。簡潔に言えば、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体(Biodesign International)をそれぞれ捕捉抗体および検出抗体として使用した。その後、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma)をApoB/抗体複合体に結合するように適用した。次にテトラメチル-ベンジジン(TMB、Sigma)比色展開の吸光度をTecan Safire2(欧州オーストリア)マイクロプレートリーダーによって450nmで測定した。
【０２１９】
図1において、各種のジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体を、コレステロールに結合されているが本節で先に詳述した開裂性モチーフを欠く同一のsiRNAに対して評価した。このsiRNA複合体(SEQ ID NO対266/154、「非開裂性対照」)の血清ApoBレベルに対する効果を1に設定することで、ジ-ペプチド含有複合体の影響を非開裂性対照に対して評価した。最初に使用したPhe-Lysモチーフ(実施例16の標記化合物を有するsiRNA)を対応するD-アミノ酸(実施例14の標記化合物を有するsiRNA)で置換するか、または単にLysを非天然鏡像異性体(実施例30の標記化合物を有するsiRNA)で置き換えることで、非開裂性対照siRNA以下のApoB減少が生じた。LysをGly(実施例23の標記化合物を有するsiRNA)で置き換えるかまたはPheをp-メトキシフェニルアラニン(実施例13の標記化合物を有するsiRNA)で置き換えることで、実施例16の標記化合物を有するsiRNAに比べて効力が減少した。他のジ-ペプチドモチーフ含有siRNA複合体は、当初のPhe-Lys含有複合体と同程度に有効であることが示された。
【０２２０】
図2は、Phe-Lysモチーフからなる実施例16の標記化合物を有するsiRNAに比べて同程度に有効であったかまたは向上した有効性を示したジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体をまとめて示す。これらすべての複合体は「非開裂性」コレステロールsiRNA複合体SEQ ID NO対266/154に比べて著しく活性が高かった。最も高能力のジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体は、フッ素修飾フェニル環をPhy-Lysモチーフ中に有していたか(実施例8の標記化合物を有するsiRNA、実施例9の標記化合物を有するsiRNA)、またはβ-フェニルアラニンで置換されたフェニルアラニンを有していたか(実施例11の標記化合物を有するsiRNA)もしくはその誘導体で置換されたフェニルアラニンを有していた(実施例10の標記化合物を有するsiRNA)。
【０２２１】
D-アミノ酸からなるジ-ペプチドモチーフを有するジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体が非開裂性対照複合体と同等に機能することから、他のジ-ペプチド配列がプロテアーゼ活性によってインビボで実際に開裂すると考えられる。しかし、異なるアミノ酸およびその誘導体の広範な受容を考慮すれば、文献に示唆されるように、2つ以上の酵素が開裂反応に関与している可能性が高い(Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855)。
【０２２２】
図3に示すように、siRNAと小分子リガンドコレステロールとの間にカテプシン開裂性ジ-ペプチドモチーフ(この場合はPhe-Lys、実施例16の標記化合物を有するsiRNA)を組み込むことで、ストレートなコレステロールsiRNA複合体(SEQ ID NO対266/154)に比べてsiRNA複合体の効力が増強される。さらに、PEGに基づくリンカーによってコレステロールリガンドをジ-ペプチドモチーフから間隔を空けて配置することで、PEGリンカーの長さに比例して効力が減弱される。
【０２２３】
図4ではポリマー用量を15mg/kgで一定に保持した。siRNA用量を滴定し、血清ApoB含有量に対する効果を測定した。Phe-Lys(F-K)モチーフを含有するジ-ペプチド含有コレステロールsiRNA複合体は、ジ-ペプチド配列を欠く対照複合体に比べて著しく強力であった。
【０２２４】
実施例36:2'-修飾オリゴリボヌクレオチド合成
オリゴリボヌクレオチドを固相上でホスホラミダイト技術に従って合成した。スケールに応じてABI 394シンセサイザー(Applied Biosystems)またはAKTA oligopilot 100(ドイツ・フライブルク、GE Healthcare)のいずれかを使用した。細孔制御ガラスでできた固体支持体(CPG、520Å、負荷75μmol/g、米国ペンシルベニア州アストンのPrime Synthesisから得た)上で合成を行った。すべての2'-修飾RNAホスホラミダイトおよび補助試薬をSAFC(ドイツ・ハンブルク)から購入した。具体的には、以下の2'-O-メチルホスホラミダイトを使用した: (5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-メチル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-N4-(アセチル)-2'-O-メチル-シチジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-メチル-グアノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-メチル-ウリジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト。2'-デオキシ-2'-フルオロ-ホスホラミダイトは2'-O-メチルRNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル(100mM)に溶解させ、モレキュラーシーブ(3Å)を加えた。5'-リン酸を作成するために、Glen Research(米国バージニア州スターリング)からの2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトを使用した。オリゴマーの5'-末端においてC-6アミノリンカーを導入するために、Thermo Fisher Scientific(米国ウィスコンシン州ミルウォーキー)からの6-(トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイトを使用した。5'-修飾を合成サイクルの改変なしに導入した。5-エチルチオテトラゾール(ETT、アセトニトリル中500mM)をアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3-((ジメチルアミノ-メチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-3-チオン(DDTT、米国カリフォルニア州オーシャンサイドのAM Chemicalsから得た)の無水アセトニトリル/ピリジン(1:1 v/v)中50mM溶液を使用した。
【０２２５】
実施例37:支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護
固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、濃アンモニア水(Aldrich)によって40℃で18時間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな管に移し、CPGをアンモニア水で洗浄した。一緒にした溶液を蒸発させ、固体残渣を緩衝液A(以下参照)中で再構成した。
【０２２６】
実施例38:オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴマーを、Source Q15(GE Helthcare)で充填したカラムおよびAKTA Explorerシステム(GE Helthcare)を使用してアニオン交換HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM過塩素酸ナトリウム、20mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)(スイスBuchs、Fluka)であり、20%アセトニトリルを含有し、緩衝液Bは500mM過塩素酸ナトリウムを除けば緩衝液Aと同一であった。32個のカラム体積(CV)内の22%B〜42%Bの勾配を使用した。280nmでのUVトレースを記録した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。最後にペレットを70%エタノールで洗浄した。
【０２２７】
実施例39:siRNAを発生させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルRNA溶液を組み合わせることで相補鎖を混合した。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8)で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。
【０２２８】
実施例40:2'-OH残基を欠くsiRNAのインビトロ活性
2'-OH残基を欠くsiRNAが強力なインビトロノックダウン活性を示すか否かを調査するために、本発明者らは、異なる2'-修飾化学構造を有するEGFP mRNA標的化siRNAのパネルを検査した(SEQ ID対31/32〜149/150、例については表3を参照)。siRNAをセンス活性およびアンチセンス活性についてDual-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)によってCOS7細胞(ドイツ・ブラウンシュヴァイク、DSMZ、カタログ番号ACC-60)中でpsiCHECK2ベクター(Promega)を使用してスクリーニングした。センス鎖およびアンチセンス鎖が与えるサイレンシング活性を扱うために、本発明者らは、別々のpsiCHECK2構築物としての対応する各19mer標的部位配列(アンチセンス活性についてpsiCHECK2-AT、センス活性についてpsiCHECK2-ST)を、合成ウミシイタケルシフェラーゼの翻訳終止コドンに対して3'に位置する多重クローニング領域内にクローニングした。Lipofectamine 2000(ドイツ・カールスルーエ、Invitrogen GmbH、カタログ番号11668-019)を使用することで、COS7細胞をベクター構築物、およびクローニング標的部位に相補的な対応するsiRNA 3nMと同時形質移入した。siRNA媒介サイレンシングの成功は、形質移入の24時間後、ホタルルシフェラーゼレベルに対して正規化されるウミシイタケルシフェラーゼの活性を介して、形質移入効率を考慮するように決定した(アンチセンス活性については図5a、センス活性については図5bを参照)。
【０２２９】
（表３）2'-修飾に依存するインビトロノックダウン活性の決定に使用される例示的siRNA配列および化学修飾
本研究において使用される基準二本鎖、および対応する修飾変異体の選択例。XfはヌクレオチドXの2'-フルオロ修飾を示し、小文字は2'-O-メチル修飾を示し、強調文字はDNAヌクレオチドを示し、すべての他の大文字はリボヌクレオチドを示す。文字「p」は5'-リン酸を示す。
0005876075.tif 000108
【０２３０】
5つの最も強力な修飾siRNA(≧60%ノックダウン)が2'-フルオロ/2'-O-メチル(2'F/2'-OMe)の交互パターンで設計されていることがわかった。検査したすべての2'F/2'-OMe変異体においてウミシイタケルシフェラーゼ活性が欠けているかまたは最小限であることが示すように、この化学構造は、アンチセンス活性を与えたが、対応するセンス鎖の活性を完全に除去した。
【０２３１】
本発明者らは、そのような2'F/2'-OMeパターンがsiRNAの所期のアンチセンス鎖活性を促進する一方、センス鎖に由来する望まれない非特異的な効果が完全に抑制されると結論づけた。2'O-指向性の核酸分解性開裂に対する保護の必要性に対処するこの設計は、siRNAに特に好ましい。
【０２３２】
実施例41:インビトロアッセイによるDNAse II感受性部位の検出
イオン対(IP)逆相(RP)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)とエレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析(MS)との組み合わせ、またはアニオン交換(AEX)-HPLCに基づく方法を確立することで、選択される一本鎖および二本鎖RNAのインビトロ安定性を検査した。
【０２３３】
方法の説明
安定性分析のために、一本鎖または二本鎖RNAの10μM溶液を、DNase II(ウシ脾臓由来、タイプV、Sigma Aldrich)0.8または8単位を含有する5mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.5)中にて37℃でインキュベートした。100mM酢酸トリエチルアンモニウム塩(TEAA)溶液を加えて、pHを7に変化させて、DNase II酵素を不活性化することで、インキュベーション反応を停止させた。LC/MSとUV検出との組み合わせ、またはAEX-HPLCとUV検出との組み合わせのいずれかで分析を行った。260nmでのUV検出トレースを定量分析に使用し、MSデータをRNA配列内の開裂部位同定に役立てた。
A. Waters XBridge C18カラム(2.5x50mm、粒径2.5μm)をカラム温度65℃で使用してIP-RP-HPLCを行った。1%メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)および16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95%メタノール中の組成Aを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った。1% B→18% Bの30分での勾配を使用した。
B. Dionex DNA Pac200カラム(4x250mm)上にて50℃で、10% ACNを含有するpH=11の20mMリン酸緩衝液を使用してAEX-HPLCを行った。溶離液Bは、溶離液A中に1M NaBrを含有した。25→62% Bの18分での勾配を使用した。
【０２３４】
（表４）二本鎖および残りの無傷鎖をDNase IIに対するそれらの安定性について評価した
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、「f」が続く大文字A、C、G、Uは2'-フルオロヌクレオチドを示す。小文字「p」は5'-リン酸を示す。(invdT)は逆位デオキシチミジン(3'-3'-結合)を表す。ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。dTはデオキシチミジンとする。(NHC6)は、センス鎖の5'-末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。
0005876075.tif 000109
【０２３５】
結語
A. 少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドを含有するRNA鎖(例えばSEQ ID NO対157/158の両方の鎖)が環状五価中間体を介して速やかに分解することで、5'-開裂生成物において2'-3'環状リン酸が生じる。五価中間体の形成は、例えば2'-デオキシ、2'-OMeまたは2'-Fのような2'-OH基を欠くヌクレオチドを使用して阻害することができる。
B. さらに、RNAは、5'-末端ヌクレオチドに対する2'-修飾とは無関係の5'-エキソヌクレアーゼ経路を介して分解する。この分解経路は、例えばC6-アミノリンカー(例えばSEQ ID NO対160/159中のSEQ ID NO 160もしくはSEQ ID NO対165/166中のSEQ ID NO 165)または第1のヌクレオチド間結合におけるホスホロチオエート(例えばSEQ ID NO対160/159中のSEQ ID NO 160)のような5'-末端非ヌクレオチド部分を使用して阻害することができる。
C. 5'-リン酸基は、エキソヌクレアーゼ開裂動態を減速させるが、この末端(例えばSEQ ID NO対160/159中のSEQ ID NO 160)において出発する分解を完全に遮断することはできない。これはほぼ間違いなく、ホスファターゼ、またはDNase II酵素の固有のホスファターゼ活性のいずれかによる、5'-リン酸の開裂が理由である。
D. RNA鎖の最善の保護は、鎖内に2'-OHヌクレオチドを含有しないオリゴヌクレオチドであって、ホスホロチオエート結合により第2のヌクレオチドに接続される5'-末端の2'-OMeヌクレオチド(例えばSEQ ID NO対173/174中のSEQ ID NO 173)で出発するオリゴヌクレオチドによって実現された。他の末端非2'-OHヌクレオチドも5'-エキソ分解に対して保護するが、2'-OMe修飾に比べてその程度は低い(表9参照)。
【０２３６】
実施例42:2'-OH残基を欠くsiRNAのインビボノックダウン活性
DPC-GalNacと同時投与される因子VII(FVII)標的化siRNA(SEQ ID NO対179/166および180/168、表5参照)を注射したマウスを用いてインビボ実験を行った。
【０２３７】
（表５ａ）インビボ実験用のsiRNAの配列
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、「f」が続く大文字A、C、G、Uは2'-フルオロヌクレオチドを示す。小文字「p」は5'-リン酸を示す。(invdT)は逆位デオキシチミジン(3'-3'-結合)を表す。ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。dTはデオキシチミジンとする。(NHC6)は、センス鎖の5'-末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。GalNAcは式(IV)の構造を意味する。
0005876075.tif 000110
【０２３８】
センス鎖およびアンチセンス鎖上に2'-OMe/2'-Fの交互パターンを有するFVII siRNAを、アンチセンス上に5'末端2'-OMeヌクレオチドとし、センス鎖上に5'-末端2'-F鎖として作成した。両方の鎖を3'-末端オーバーハングにおけるinv(dT)で保護する。アンチセンス鎖は、siRNAの活性を維持するための5'-リン酸基を有していた。アシアロ糖タンパク質受容体による肝細胞への標的化のために、センス鎖をその5'末端においてGalNAc-パルミトイル構築物に結合させた。マウスにおいてsiRNA(2.5mg/kg)をGalNAc標的化PBAVE(15mg/kg)と同時投与した。
【０２３９】
肝ホモジネートからQuantiGene 1.0分岐DNA(bDNA)アッセイキット(米国カリフォルニア州フレモント、Panomics、カタログ番号: QG0004)を使用してFVII mRNA測定を行った。
【０２４０】
剖検において肝組織1〜2gを液体窒素中でスナップ凍結させた。凍結組織をドライアイス上で乳鉢および乳棒によって粉末化した。組織15〜25mgを冷却1.5mL反応管に移し、MilliQ水中に予め希釈した1:3溶解混合物1mLおよびプロテイナーゼK(50μg/μL)3.3μLを加え、組織を出力30〜50%で数秒間の超音波処理(ドイツ・ベルリン、Bandelin、HD2070)によって溶解させた。溶解液を分析まで-80℃で保存した。mRNA分析のために、溶解液を解凍し、プロテイナーゼKと共に65℃でのサーモミキサー(ドイツ・ハンブルク、Eppendorf、Thermomixer comfort)中、1000rpmで15分間消化した。FVIIおよびGAPDH mRNAレベルを、QuantiGene 1.0 bDNAアッセイキット試薬を製造者の推奨に従って使用して決定した。FVII mRNA発現を溶解液20μLおよびマウスFVIIプローブセットによって分析した。GAPDH mRNA発現を溶解液40μL、およびマウスと交差反応することがわかったドブネズミプローブセット(プローブセットの配列は上記参照)によって分析した。アッセイ読み取りとして、アッセイの終わりの化学発光シグナルをVictor 2 Lightルミネセンスカウンター(ドイツ・ヴィースバーデン、Perkin Elmer)中で相対光単位(RLU)として測定した。FVII mRNAのシグナルを同一の溶解液からのGAPDH mRNAのシグナルで割った。値は、GAPDHに対して正規化されたFVII mRNA発現として報告する。
【０２４１】
結果は、SEQ ID NO対179/166の投与の48時間後において79%のFVII mRNAノックダウンを示す。対照的に、表5に示すように、2'-OHヌクレオチドを有するsiRNA SEQ ID NO対180/168は著しいノックダウンを示さなかった(＜25%)。
【０２４２】
（表５ｂ）インビボノックダウン研究の結果
0005876075.tif 000111
【０２４３】
実施例43:2'-OH残基を欠くsiRNAの組織分布
肝組織試料中のsiRNA濃度を、国際公開公報第2010043512号に記載の特許保護されたオリゴヌクレオチド検出方法を使用して決定した。簡潔に言えば、siRNA定量化は、siRNA二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な蛍光(Atto-425)標識PNAプローブ( 
0005876075.tif 000112
、韓国Panagene Incから得た)のハイブリッド形成とそれに続くAEX-HPLCに基づく分離とに基づく。定量化は、インビボ実験において使用した2つのFVII siRNA(実施例42参照)の希釈系列から作成した外部検量線に対する蛍光検出によって行った。血漿試料では0.2〜2μL、組織では約1mgのアリコートをHPLCシステムに注入した。
【０２４４】
2'-OHヌクレオチドを欠く安定化siRNAの肝組織分析は、ug/g範囲での肝臓中の無傷アンチセンス鎖の高濃度を示したが、約95%が5'-脱リン酸化不活性型で存在した(表IR.04参照)。末端2'-OMeヌクレオチドを有する得られたRNAは、ホスホキナーゼhClp1によって細胞質内で再リン酸化される傾向がない(以下参照)。対照的に、2'-OH含有siRNAのアンチセンス鎖は投薬後の最初の6時間以内に組織中で完全に分解した。
【０２４５】
（表６）2'-OHヌクレオチドを含有しない安定化siRNAの肝組織分析
0005876075.tif 000113
*BDL＝検出限界未満
【０２４６】
実施例44:最適化された5'-末端を有するsiRNAのインビトロノックダウン活性
アンチセンスの5'-末端において細胞内で(再)リン酸化されることでRNAiコンピテント種を生じさせることが可能なsiRNAを同定するために、FVII siRNAのさらなるインビトロスクリーンを行った。このスクリーンからのすべてのsiRNAを表7に示す。2'-OMe/2'-Fの交互修飾パターンは、アンチセンス鎖の5'-末端における最初2個のヌクレオチドにおける各種修飾を除けば、第一世代設計(2'-OH残基なし)と同一であった。アンチセンス鎖の2個の5'-末端ヌクレオチドは、さらなる5'-リン酸または5'-ホスホチオエートありまたはなしの各種組み合わせにおける2'-Fまたは2'-デオキシ修飾ヌクレオチドとして作成された。すべてのsiRNAを、ノックダウン活性についてマウス初代培養肝細胞の形質移入(ウェル当たり細胞30000個; 96ウェルプレートフォーマット)後にLipofectamine 2000を製造者の説明書に従って使用して用量反応(4倍希釈で24nM〜0.00037nM)でスクリーニングした。2つのsiRNAはIC50値に関して親二本鎖(SEQ ID NO対182/168)と同程度に活性であり(同程度に活性なsiRNA: SEQ ID NO対181/186および181/185)、1つは5'-末端2'-Fおよびリン酸基を有し、1つは2個の5'-末端2'-デオキシヌクレオチドおよび5'-ホスホロチオエートを有していた(IC50値については表7を参照)。これらはいずれも、第1の動物実験において使用した末端2'-OMeヌクレオチドを有するsiRNA(SEQ ID NO対181/166)に比べて約5〜6倍活性が高い。
【０２４７】
（表７）IC50値
0005876075.tif 000114
【０２４８】
実施例45:最適化された5'-末端を有するsiRNAのインビトロ5'-リン酸化
表7に列挙した5'-リン酸または5'-ホスホロチオエートを有さないすべてのsiRNAを、リン酸化についてHeLa S100細胞抽出物中でhClp1によって評価した。
【０２４９】
WeitzerおよびMartinez(S. Weitzer and J. Martinez. hClp1: a novel kinase revitalizes RNA metabolism. Cell Cycle 6 (17):2133-2137, 2007)に記載のようにS100 HeLa抽出物から5'-リン酸化を分析した。5mM ATPを含有するS100 HeLa抽出物中での1μM siRNAのインキュベーションの直後に、溶液をIP-RP-HPLCまたはAEX-HPLCのいずれかによって試料溶液5μLの注入による変性条件下で分析した。
A. Waters XBridge C18カラム(2.5x50mm、粒径2.5μm)をカラム温度65℃で使用してIP-RP-HPLCを行った。1%メタノール中の100mMヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)および16mMトリエチルアミンを溶離液Aとして、95%メタノール中の組成Aを溶離液Bとして使用して勾配溶離を行った。1% B→18% Bの30分での勾配を使用した。
B. Dionex DNA Pac200カラム(4x250mm)上にて50℃で、10% ACNを含有するpH=11の20mMリン酸緩衝液を使用してAEX-HPLCを行った。溶離液Bは、溶離液A中に1M NaBrを含有した。25→62% Bの18分での勾配を使用した。
【０２５０】
5'-リン酸化比をsiRNAの各鎖について260nmでのUVトレースから以下の等式(PAはピーク面積)を使用して計算する。
%(5'-リン酸化)＝100*PA[5'-リン酸化鎖]/(PA[5'-リン酸化鎖]＋PA[親鎖])
【０２５１】
表8は、2'-OMeヌクレオチドが5'-末端に位置しない場合(SEQ ID NO対181/196およびSEQ ID NO対181/195)、siRNAのアンチセンス鎖を5'-リン酸化することができないことを示す。対照的に、2'-F、2'-デオキシまたは2'-OHヌクレオチドが5'-末端において組み込まれている場合(SEQ ID NO対181/195、SEQ ID NO対181/192、SEQ ID NO対181/197、SEQ ID NO対181/199およびSEQ ID NO対182/168)、アンチセンス鎖は5'-リン酸化されやすい。インビトロアッセイにおいて親SEQ ID NO対182/168と同程度に活性であった2つのsiRNA(SEQ ID NO対181/186および181/185)は、合成的に導入された5'-リン酸/5'-PTO基がインビボで例えばホスファターゼによって開裂する時点で5'-リン酸化されやすい。
【０２５２】
（表８）S100 HeLa細胞抽出物中での4時間のインキュベーション後の5'-リン酸化鎖の割合
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、「f」が続く大文字A、C、G、Uは2'-フルオロヌクレオチドを示す。(invdT)は逆位デオキシチミジン(3'-3'-結合)を表す。ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。dTはデオキシチミジンとする。
0005876075.tif 000115
【０２５３】
実施例46:最適化された5'末端を有するsiRNAのインビトロDNAse II安定性
すべてのアンチセンス鎖を実施例41に記載のようにDNAse II安定性についてスクリーニングした。親二本鎖と同程度に活性であったsiRNAに存在する2つのアンチセンス鎖(SEQ ID NO 186およびSEQ ID NO対185、1つは5'-末端2'-Fおよびリン酸基を有し、1つは2個の5'-末端2'-デオキシヌクレオチドおよび5'-ホスホロチオエートを有する)は、DNAse II開裂IIに対して安定である(20時間のインキュベーション後に無傷鎖は70%超)。
【０２５４】
（表９）20時間のインキュベーション後のDNase IIに対するsiRNAのインビトロ安定性
0005876075.tif 000116
【０２５５】
実施例47:最適化された5'末端を有するsiRNAのインビボノックダウン活性
最適化された5'-末端によるインビトロでの向上がインビボ状況に移転されるか否かを評価するために、本発明者らは、選択されたsiRNAのGalNAc-パルミトイル複合体によるさらなるマウス実験を行った(表10参照)。第1のマウス実験(本特許出願の実施例42)について記載の理想的条件下でSiRNAを投与した。
【０２５６】
FVIIレベルの測定のために、マウスからの血漿試料を、標準的手順に従って顎下出血によって0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤(1体積)を収容する微量遠心管中に血液(9体積)を採取することで調製した。血漿中のFVII活性を発色合成基質法によってBIOPHEN VIIキット(オハイオ州メーソン、Hyphen BioMed/Aniara)を製造者の推奨に従って使用して測定した。比色展開の吸光度を、405nmでTecan Safire2マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０２５７】
調査されたsiRNAは、インビトロスクリーニング結果と完全に一致して、インビボ活性の向上を示した。血清中のFVII活性の減少は、投薬48時間後の両siRNAでは80%超であり、これに比べて第一世代DNasaII安定siRNA設計を使用した場合では49%であった(表10参照)。この結果は、合成的に作成された5'-リン酸または5'-ホスホチオエート基をホスファターゼがインビボで開裂させる場合の、有効にリン酸化可能なアンチセンス鎖上の5'-末端ヌクレオチドの重要性を明らかに強調する。最初の設計において使用されている、または古典的なsiRNAとのインビトロ比較に基づいてより強力なsiRNA設計として文献(Allerson et al. J. Med Chem. 2005, 48, 901-904)に記載されている5'-末端2'-OMeヌクレオチドの場合、インビボでの合成リン酸の開裂は対応するsiRNAの効力の強力な減少を導く。
【０２５８】
（表１０）最適化された5'末端を有するsiRNAのインビボノックダウン活性
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、「f」が続く大文字A、C、G、Uは2'-フルオロヌクレオチドを示す。小文字「p」は5'-リン酸を示す。(invdT)は逆位デオキシチミジン(3'-3'-結合)を表す。ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。(NHC6)は、センス鎖の5'-末端において組み込まれたアミノヘキシルリンカーとする。GalNAcは式(IV)の構造を意味する。
0005876075.tif 000117
【０２５９】
実施例48:最適化された3'末端を有するsiRNAのインビトロノックダウン活性
DNase IIに対して安定なsiRNAの活性をさらに増大させるために、3'-オーバーハングのSAR研究を行った。センス鎖またはアンチセンス鎖3'-オーバーセンス上のinvdT、dTinvdTまたはdTsdTの各種組み合わせをAha1およびEGFP標的化siRNA(それぞれ表11および表12を参照)に適用し、最も強力なsiRNAにおける両3'末端の組成について対で比較した。すべてのsiRNAを、ノックダウン活性についてマウス初代培養肝細胞の形質移入(細胞30000個/ウェル; 96ウェルプレートフォーマット)後にLipofectamine 2000を製造者の説明書に従って使用して用量反応(4倍希釈で24nM〜0.00037nM)でスクリーニングした。
【０２６０】
（表１１）異なる3'-末端を有するEGFP標的化siRNAのインビトロノックダウン活性
0005876075.tif 000118
【０２６１】
（表１２）異なる3'-末端を有するAha1標的化siRNAのインビトロノックダウン活性
0005876075.tif 000119
【０２６２】
アンチセンス鎖上に2個のヌクレオチドdTsdTオーバーハングを有するsiRNAが、(センス鎖が同一であったが)アンチセンスの3'-末端において単一のinvdTオーバーハングを有するsiRNAよりも常に優れて機能することがわかった。3'オーバーハングとしての単一のinvdTオーバーハングで修飾されたセンス鎖を有する組み合わせがさらに有益であった。
【０２６３】
実施例49:非ヒト霊長類におけるsiRNAのインビボノックダウン活性
DPCの調製および投薬
ポリマー「149 RAFT」をジスルフィド結合を通じて指示されたsiRNA標的化凝固因子VII(siF7)に4:1重量:重量比(ポリマー:siRNA)で共有結合させた後、ポリマー-siRNA複合体をCDM-PEG:CDM-NAGの2:1重量:重量混合物によって7x重量:重量比(CDM:ポリマー)で修飾することで、DPCを調製した。カニクイザルにDPC 1mg/kg(ポリマー重量)および指示されたsiRNA 0.25mg/kgを投薬した。1匹の動物は、siF7 SEQ ID NO対151/152を含有するDPCを受け取り、2匹の動物は、siF7 SEQ ID NO対253/254を含有するDPC、#1および#2を受け取り、2匹の動物は、SEQ ID NO対251/255を含有するDPC、#1および#2を受け取った。F7値を2つの投薬前値の平均に正規化した。SEQ ID NO対253/254またはSEQ ID NO対251/255を含有するDPCを受け取った動物は、SEQ ID NO対251/252を受け取った動物よりも大きなF7ノックダウンレベルおよび長いPTを有した。
【０２６４】
DPC注射手順
各注射手順において、ケタミン(最大7mg/kg)とデクスメデトミジン(最大0.03mg/kg)との組み合わせを含有する筋肉内注射液を動物に投与し、手術室に移動させた。手術室において、動物を水ジャケット付きの加熱パッド上に置き、注射部位を剪毛し、消毒薬で準備した。静脈内カテーテル(20〜22ゲージ)を体静脈(橈側皮静脈または小伏在静脈)に挿入し、DPC溶液を1〜2分かけてゆっくりと注入した(2ml/kg)。パルスオキシメーターを使用して注射手順の途中および直後の心拍数および酸素飽和度をモニタリングした。各注射手順を行うには約20分を要した。注射後、カテーテルを除去し、静脈穿刺部位に緩やかな圧力を加えた。動物をケージに戻し、逆転薬アチパメゾール(アンチセダン(antisedan))の筋肉内注射液(0.10〜0.15mg/kg)を投与した。正常な活動を回復するまで動物をモニタリングした。
【０２６５】
採血手順
遺伝子阻害(F7活性、凝固時間)、血液化学値、および肝損傷マーカー(CBC、化学パネル、ALT、サイトカイン、補体)の測定用に血液試料(1〜5ml)を得た。これらの採血手順において、ケタミン(最大7mg/kg)とデクスメデトミジン(最大0.03mg/kg)との組み合わせを含有する筋肉内注射液を動物に投与した。鎮静させた時点で、動物を携帯式手術台に移動させ、22ゲージ針およびシリンジを使用して大腿静脈から血液を採取した。採血直後に、圧力を静脈穿刺部位に加え、血液を分割して各血液検査に適した試料管に入れた。次に動物に逆転薬アチパメゾール(アンチセダン)の筋肉内注射液(0.10〜0.15mg/kg)を投与し、ケージに戻した。任意の30日の期間において全血液量の20%以下を抜き取った(推定血液量＝60ml/kg)。各採血手順を行うには約10分を要した。
【０２６６】
因子VII(F7)活性測定
非ヒト霊長類からの血液試料を、血清分離管を全血で満たして血液を室温で少なくとも20分間凝固させることで調製した。凝固後、血液管を9000rpmで3分間遠心分離し、アリコートしてエッペンドルフ管に入れ、アッセイするまで-20℃で保管した。血清中のF7活性を発色合成基質法によってBIOPHEN VIIキット(オハイオ州メーソン、Hyphen BioMed/Aniara)を製造者の推奨に従って使用して測定した。比色展開の吸光度を、405nmでTecan Safire2マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
【０２６７】
凝固検査(プロトロンビン時間、部分プロトロンビン時間およびフィブリノーゲン)
非ヒト霊長類からの血液試料を、クエン酸ナトリウム管(BD Vacutainer)を全血で完全に満たし、緩やかに混合して血餅形成を防ぐことで調製した。管を1時間以内に臨床試験室に運び、凝固アッセイを採取時間から4時間以内に行った。
【０２６８】
（表１３）NHP実験に使用されるFVII siRNA
キー: 小文字a、c、g、uは2'-O-メチルヌクレオチドとし、「f」が続く大文字A、C、G、Uは2'-フルオロヌクレオチドを示す。小文字「p」は5'-リン酸を示す。(invdT)は逆位デオキシチミジン(3'-3'-結合)を表す。ホスホロチオエート結合は小文字「s」で記号化する。dTはデオキシチミジンとする。
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【０２６９】
両鎖上の単一のヌクレオチド(invdT)-3'-オーバーハングをセンス鎖上の3'-(invdT)オーバーハングおよびアンチセンス鎖上のdTsdTオーバーハングを有する非対称siRNA設計に変化させるが、それ以外は修飾パターンを一定にすることは、非ヒト霊長類におけるより顕著な血清FVII減少、およびこの効果の著しく長い持続時間を導く(図6a参照)。この観察は、予測される生物学的結果、すなわち、因子7減少の程度に対応するプロトロンビン時間に対するより顕著な効果によって裏付けられる(図6b参照)。
【０２７０】
実施例50:開裂性RNAリンカーを有するsiRNAのインビボノックダウン活性
表14では、血清中のFVIIタンパク質阻害に基づくインビボ有効性を、マウスにおける同一の配列構成内でコレステロールまたはGalNAc-パルミトイルsiRNA複合体を使用して比較した。インビボ実験を実施例42に記載のように行った。FVII阻害は、2'-OHヌクレオチドを含有しないコレステロール結合siRNAでは、GalNAc-パルミトイル結合対応物に比べて強力に減少していた(SEQ ID NO対179/166 vs. 179/190、SEQ ID NO対257/264 vs. SEQ ID NO対179/262、SEQ ID NO対257/263 vs. SEQ ID NO対179/163およびSEQ ID NO対257/166 vs. SEQ ID NO対179/166)。対照的に、2'-OH含有siRNAでは、コレステロール複合体はGalNAc-パルミトイル誘導体に比べて高いFVII阻害を導いた(SEQ ID NO対180/168 vs. SEQ ID NO対258/168)。
【０２７１】
記載されるインビボ実験に使用される小分子リガンドGalNAc-パルミトイルおよびコレステロールは、センス鎖の5'-末端への非開裂性リンカーを介してsiRNAに接続される。センス鎖が2'-OHヌクレオチドを示す場合、リガンドはヌクレアーゼ(例えばエンドソームまたはリソソーム区画内のDNase II)によって依然として開裂可能である。開裂反応は遊離siRNAを放出し、次に遊離siRNAは送達用ポリマーのエンドソーム攪乱活性によって細胞質中に放出される。
【０２７２】
センス鎖中に2'-OHヌクレオチドを欠くsiRNAでは、リガンドの開裂の引き金を引く酵素機構(ヌクレアーゼ/プロテアーゼ/エステラーゼなど)または化学機構がないことから、リガンドは二本鎖に安定して接続される。したがって、完全に安定なコレステロール結合siRNAは、親油性コレステロールリガンドの膜相互作用が理由で、細胞膜に捕捉されうる。細胞質中へのsiRNAの有効な放出には、組織中の高濃度のsiRNAであっても十分ではない。対照的に、比較的親油性が低いGalNAc-パルミトイル結合siRNAは、細胞膜との比較的顕著ではない相互作用が理由で、細胞質中に放出されうる。このため、安定な非開裂性のGalNAc-パルミトイルsiRNA複合体が、同一のsiRNAに結合されるコレステロールに比べて有効である。
【０２７３】
開裂性リンカー構築物を開発することは、安定に結合したコレステロールsiRNAの膜捕捉に関する問題を回避するために役立つであろう。ジスルフィドリンカー化学構造の使用は、規定の開裂部位を導入するための魅力的な可能性として記載されているが、開裂は細胞内の特定の小器官の還元環境におそらくは限定されている(PNAS, 2006, 103, 13872)。エンドソーム/リソソーム区画において開裂が遅いことが予測されることから、コレステロール-ジスルフィド結合siRNAの大部分は、非開裂性コレステロール複合体について記載のように、依然として膜に捕捉されうる。
【０２７４】
（表１４）
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【０２７５】
十分に確立されたジスルフィド開裂性リンカー化学構造以外の別の可能性としては、特定の位置で2'-OHヌクレオチドを使用することによる規定の開裂部位の発生がある。選択的位置での2'-OHヌクレオチドの導入は、RNA鎖からの複合体の開裂を実現するための新たなアプローチである。2'-OHヌクレオチドは、少なくとも1個の2'-OHヌクレオチドをRNA鎖の3'-または5'-末端において有する一本鎖オーバーハングを加えること、またはsiRNAの二本鎖領域内で2'-OHヌクレオチドを使用することによって実現することができる。エンドソーム/リソソームに存在するヌクレアーゼの酵素活性は、この位置において選択的に開裂を行う。第1の設計では、コレステロールを、3個の2'-OHヌクレオチド(AUC)を含有する一本鎖オーバーハングを介して5'-末端においてセンス鎖に接続した。
【０２７６】
各種の開裂性リンカー化学構造を比較するコレステロール結合siRNAを表15に示す。すべてのsiRNAは同一の配列構成を有しており、リンカー化学構造のみが改変された。コレステロールを、3個の2'-OHヌクレオチド(AUC)で構成される一本鎖オーバーハングを介して5'-末端においてセンス鎖に接続した。送達用ポリマーと同時投与した際に、このsiRNA(SEQ ID NO対260/263)は、マウスにおける血清中のFVIIの77%下方制御を導いたが、これに比べて、安定結合コレステロールを有する同一のsiRNA(SEQ ID NO対257/263)を使用した場合、下方制御はわずか60%であった。式Iaのリンカーを介してセンス鎖5'-末端に結合されたコレステロールを有する同一のsiRNA(SEQ ID NO対261/263)は、血清中のFVII活性の93%減少を導いた。すべての結果は、マウスにおける送達用ポリマー15mg/kgとコレステロール結合siRNA 2.5mg/kgとの同時投与によって実現された。
【０２７７】
（表１５）コレステロール結合siRNAの各種のリンカー化学構造のインビボ比較
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【０２７８】
これらの結果は、開裂性リンカーの使用が、2'-OHヌクレオチドを含有しないsiRNAのインビボでの効力を向上させることを示す。開裂性リンカーは、2'-OH含有ヌクレオチド、ジ-ペプチド開裂モチーフ、またはジスルフィドリンカー化学構造のいずれかで構成されうる。すべての開裂性リンカー構築物は、コレステロール結合siRNAと緩徐エンドソーム放出送達用ポリマーとの同時投与設定においてインビボでの効力を向上させる。
【０２７９】
実施例51:開裂性リンカーを有するsiRNAのインビトロ血清安定性
開裂性リンカーの安定性をインビトロ安定性アッセイにおいて評価した。コレステロール結合センス鎖を90%マウス血清中、37℃にて様々な時点でインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)含有緩衝液中にプロテイナーゼKを加えることでインキュベーション反応を停止させた。処理は、RNA鎖の完全性に干渉することなくすべてのタンパク質および酵素を分解した。この溶液25μLを、260nmでのUV検出器に接続されたAEX-HPLCシステム上に直接注入した。AEX-HPLCを、Dionex DNA Pac200カラム(4x250mm)上で75℃にて、50% ACNを含有するpH＝8の20mM Tris緩衝液を使用して行った。溶離液B中の800mM NaBrが溶離液塩として役立つ。25→62% Bの18分での勾配を使用した。
【０２８０】
コレステロール含有一本鎖RNAは、260nmでブロードなピークとしてHPLCカラムから溶離する。コレステロールの開裂後、鋭い対称ピークがより短い保持時間で観察される。コレステロールの開裂速度を下記等式によって決定した(PA＝ピーク面積)。
%(遊離RNA)＝100*PA[遊離RNA]/(PA[遊離RNA]＋PA[コレステロール結合RNA])
【０２８１】
インビトロでは、3ntヌクレオチド(AUC)-オーバーハングが90%マウス血清中にて1時間未満で定量的に開裂することが示された。オーバーハング中の2個のピリミジンヌクレオチドに対して3'側で開裂が生じることで、2つの別々の開裂代謝物が得られる(代謝物のピーク面積をデータ評価用にまとめて示した)。対照的に、式1aのジ-ペプチド含有リンカー、ジスルフィド結合コレステロールおよび安定結合コレステロールは、マウス血清中で完全に安定である。
【０２８２】
実施例52:開裂性リンカーを有するsiRNAの組織分布
肝組織試料中のsiRNA濃度を、国際公開公報第2010043512号に記載の特許保護されたオリゴヌクレオチド検出方法を使用して決定した。簡潔に言えば、siRNA定量化は、siRNA二本鎖のセンス鎖に相補的な蛍光(Atto-425)標識PNAプローブ( 
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、韓国Panagene Incから得た)のハイブリッド形成とそれに続くAEX-HPLCに基づく分離とに基づく。定量化は、インビボ実験において使用した2つのFVII siRNA(実施例42参照)の希釈系列から作成した外部検量線に対する蛍光検出によって行った。血漿試料では0.2〜2μL、組織では約1mgのアリコートをHPLCシステムに注入した。
【０２８３】
肝組織分析からの結果を表16に示す。siRNA含有量を分析した際に、肝組織中に存在するセンス鎖が、ジ-ペプチドリンカーモチーフ、または無修飾リンカー配列AUCを有する3nt 5'-オーバーハングのいずれかを使用する場合にコレステロールから定量的に開裂することがわかった。対照的に、肝臓中に存在するジスルフィド結合siRNAのわずか15%が投薬後の最初の48時間以内にコレステロールから開裂し、安定結合コレステロールは全くsiRNAから開裂しない。
【０２８４】
肝組織中の無コレステロールsiRNAの絶対量を比較した際に、ジスルフィドリンカーとRNA AUCリンカーとで同様の量が観察され、これは投薬48時間後の同等のFVII血清活性とよく相関していた。ジ-ペプチド結合コレステロールsiRNAによって達成される比較的低いFVII活性は、開裂無コレステロールsiRNAの比較的大きな絶対量と完全に相関している。
【０２８５】
肝臓内に送達される、センス鎖上に(AUC)リンカーを備えたコレステロールsiRNA複合体の全量は、安定結合またはジスルフィド結合コレステロールに比べて約6倍少なく、ジ-ペプチド結合コレステロールsiRNAに比べて約3倍少ない。組織中での存在の減少は、マウス血清とのインビトロインキュベーションにおいて示されるように、AUCリンカーが細胞内ヌクレアーゼの基質であるだけでなく、循環中に存在するヌクレアーゼの基質でもあるという事実に起因しうる。既に循環中にあるsiRNAからコレステロールリガンドが開裂する場合、得られたsiRNAは腎クリアランスを起こしやすく、組織中への送達なしに尿中に速やかに排出される。
【０２８６】
（表１６）
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【０２８７】
以下の表では、実施例において使用されるsiRNAをまとめて示す。
【０２８８】
（表１７）コア配列
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【０２８９】
（表１８）コア配列および修飾配列のマッピング
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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