(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結または凍結乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存するための方法であって、(a) アルミニウム塩アジュバント；
(b) N,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩；ならびに
(c) 1種以上の糖、
を含む水性懸濁液または溶液を凍結または凍結乾燥することを含む、前記方法。
【請求項２】
水性懸濁液または溶液が少なくとも1種の抗原をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルミニウム塩アジュバントがリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抗原またはそれぞれの抗原がアジュバント上に吸着されて提供される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
N,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩の濃度が少なくとも0.1Mである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
(i)1種の糖が用いられるか；または
(ii)1種の糖が用いられ、且つ(a)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.5Mもしくは0.01〜0.2Mであり、且つN,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩の濃度が0.2〜5Mであるか、または(b)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.5Mもしくは0.01〜0.2Mであり、且つN,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩の濃度が0.2〜2Mであるか、または(c)糖がマンニトールであり、マンニトールの濃度が0.2〜0.8Mであり、且つN,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩の濃度が0.5〜1Mであるか、または(d)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.7Mもしくは0.01〜0.6Mもしくは0.01〜0.5Mである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
(i)2種以上の糖が用いられるか；
または(ii)2種以上の糖が用いられ、且つ(a)スクロースが別の糖と共に存在し、他の糖がラフィノース、スタキオースもしくは糖アルコールであるか、または(b)スクロースが別の糖と共に存在し、他の糖がラフィノースである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
懸濁液または溶液を(a)凍結乾燥し、または(b)凍結乾燥して不定形の固体マトリックスを形成させる、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
乾燥した不定形の固体マトリックスを形成させ、該固体マトリックスを密封されたバイアル、アンプルまたはシリンジ中の粉末の形態で提供する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において、前記方法により得られるケーキを粉砕して粉末を形成させ、該粉末を密封されたバイアル、アンプルもしくはシリンジ中で提供する、方法。
【請求項１１】
凍結または凍結乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存するための、(i)N,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩および(ii)1種以上の糖を含む賦形剤の使用。
【請求項１２】
アルミニウム塩アジュバント；
1種以上の抗原；
N,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩；および
1種以上の糖、
を含むワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、凍結または乾燥中、典型的には、アルミニウム塩アジュバントおよび1種以上のワクチン抗原を含むワクチン調製物の凍結または乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルミニウム塩アジュバントは、現在最も広く用いられているヒト用および動物用ワクチンのためのアジュバントである。アルミニウムアジュバント化合物としては、リン酸アルミニウム(AlPO4)および水酸化アルミニウム(Al(OH)3)などのアルミニウム塩が挙げられ、ワクチンアジュバントの分野では一般に「ミョウバン」と呼ばれる。十分な免疫原性を提供するためには、抗原がアジュバントの表面上に吸着されなければならないと考えられる。ミョウバンアジュバントは免疫系の刺激原として作用し、ならびに投与部位での抗原の蓄積(例えば、注射による)を提供することによって、抗原の段階的、連続的な放出を提供し、抗体産生を刺激すると考えられる。アルミニウムアジュバントは、その天然の形態ではゲルとして一般に知られ、水性媒体中では粒子状懸濁液である。
【０００３】
ミョウバンアジュバント化ワクチンの保存および輸送は問題が多い。凍結-乾燥(凍結乾燥)は、様々なタンパク質調製物の長期安定性を改善するためによく用いられる方法である。にもかかわらず、アルミニウム塩アジュバントを含有する市販のワクチン組成物は、アジュバント構造に対する損傷を引き起こすことなく凍結-乾燥することができない。凍結-乾燥は、アジュバントのゲル構造の崩壊を引き起こし、水中への再懸濁の際にアジュバント塩の凝集および沈降をもたらす。その効果は、ワクチンの免疫原性を有意に低下させることである。
【０００４】
WO 01/93829は、
(a) 抗原が吸着した0.1〜0.95重量％のアルミニウム塩またはカルシウム塩アジュバント；
(b) 0.5〜6重量％の糖；
(c) 0.1〜2重量％のアミノ酸またはその塩；および
(d) 0.02〜1重量％のコロイド物質、
を含む水性溶液を噴霧-乾燥または噴霧凍結-乾燥することを含むアジュバント化ワクチンを調製する方法を記載している。
【０００５】
WO 2008/118691は、(a) 少なくとも1種のアルミニウム塩アジュバント、少なくとも1種のバッファー系、少なくとも1種のガラス形成剤および少なくとも1種の抗原を混合して、液体ワクチン製剤を作製すること；(b) 液体ワクチン製剤を凍結させて、凍結ワクチン製剤を作製すること；ならびに(c) 凍結ワクチン製剤を凍結乾燥させて、乾燥ワクチン組成物を作製することを含む、免疫学的に活性なアジュバントに結合した乾燥ワクチン組成物を調製する方法を記載している。ガラス形成剤は、好ましくはトレハロースである。
【発明の概要】
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの存在下でアジュバントを凍結または乾燥、特に、凍結乾燥することにより、アルミニウム塩アジュバントに対する構造的損傷を低減することができることを見出した。1種以上の糖のさらなる存在は、凍結または乾燥中のアジュバントに対する構造的損傷のさらなる低減を誘導することができる。
【０００７】
従って、本発明は、
(a) アルミニウム塩アジュバント；
(b) 式(I)：
【化１】
0006023696.tif 000002
【０００８】
(式中、
-  R1は水素もしくはC1〜6アルキルであり；および
-  R4は水素であり；または
-  R1およびR4はそれらが結合した原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し；
-  R2は水素、C1〜6アルキルもしくは-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3であり；および
-  R3はC1〜6アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；または式(II)：
【化２】
0006023696.tif 000003
【０００９】
(式中、
-  Xは-S(O)2-もしくは-S+(Rc)-であり；
-  RaおよびRbは独立にC1〜6アルキルであり；および
-  Rcはカルボン酸陰イオンおよびアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；ならびに
(c) 必要に応じて、1種以上の糖、
を含む水性懸濁液または溶液を凍結または乾燥することを含む、凍結または乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存する方法を提供する。
【００１０】
本発明はまた、
-  凍結または乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存するための、(i)本発明の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび(ii)必要に応じて、1種以上の糖を含む賦形剤の使用；
-  アルミニウム塩アジュバント；1種以上の抗原；本発明の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；および必要に応じて、1種以上の糖を含むワクチン組成物；
-  本発明の方法により得られるワクチン組成物；ならびに
-  ワクチン組成物のための再懸濁剤としての、(i)本発明の式(I)もしくは(II)の化合物または生理学的に許容し得るその塩もしくはエステルおよび(ii)必要に応じて、1種以上の糖を含む賦形剤の使用、
も提供する。
【００１１】
凍結された、または乾燥されたワクチン組成物は、好適な保存を容易にし、該組成物の貯蔵期間を最大化する。この組成物を長期間にわたって積み重ねて保存することができる。かくして、ワクチンの免疫原性、効能および有効性を維持することができる。式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび任意選択の糖は、凍結防止剤として作用し、凍結中に遭遇するストレスに対してアルミニウム塩アジュバントを保護し、凍結-乾燥中にリオプロテクタント(lyoprotectant)としても作用する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】水酸化アルミニウムゲルを凍結した後に参考例においてアジュバントを顕微鏡的に分析した結果を示す図である。パネルAは通常の損傷していない構造の例を示し、パネルBは水酸化アルミニウムアジュバントの凍結後の凝集した結晶構造を示す。
【図２】実施例1における様々な濃度のスクロースおよびジメチルグリシン(DMG)の存在下での水酸化アルミニウムゲルの凍結後のアジュバント凝集アッセイの結果を示す図である。
【図３】凝集アッセイを用いて評価された、スクロースおよび／またはトリメチルグリシン(TMG)を含有する実施例2に記載の製剤における凍結-解凍後のアジュバント(Al(OH)3)の回復を示す図である。
【図４】凝集アッセイにより評価された、スクロースおよび／またはS-メチル-L-メチオニン(SMM)もしくはメチルスルホニルメタン(MSM)を含有する実施例2に記載の製剤における凍結-解凍後のアジュバント(Al(OH)3)の回復を示す図である。
【図５】実施例3における様々な濃度のスクロースおよびジメチルグリシン(DMG)、トリメチルグリシン(TMG)、S-メチルメチオニン(SMM)またはサルコシンの存在下での水酸化アルミニウムゲルの凍結-乾燥後のアジュバント凝集アッセイの結果を示す図である。
【図６】対照と比較した実施例6のアジュバントに結合したBSAの割合(％)を示す図である。
【図７】実施例6のアジュバントに結合したBSAの濃度を示す図である。
【図８】実施例7からのドットブロットの結果を示す図である。図8Aは4℃で保存した表19に記載のサンプルのドットブロットを示す図である。図8Bは、-80℃で保存した表19に記載のサンプルのドットブロットを示す図である。
【図９】実施例7からのさらなるドットブロットの結果を示す図である。図9Aは4℃で保存した表20に記載のサンプルのドットブロットを示す図である。図9Bは-80℃で保存した表20に記載のサンプルのドットブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
概要
本発明は、凍結または乾燥、特に、凍結乾燥された場合の、アルミニウム塩ワクチンアジュバントに対する構造的損傷の低減および／または防止に関する。そのような構造的損傷は、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび必要に応じて(ii)1種以上の糖の存在下でアジュバントを凍結または乾燥することにより低減または防止される。
【００１４】
典型的には、少なくとも1種の抗原が吸着されたアルミニウム塩アジュバントを、水性溶液中で式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルと接触させる。次いで、1種以上の糖が存在してもよい、得られる水性組成物を凍結または乾燥する。抗原が存在する場合、前記方法は、アルミニウム塩アジュバントおよび少なくとも1種の抗原を含むワクチン組成物を調製する方法である。アルミニウムアジュバントを含むワクチン調製物を、患者にワクチン調製物を投与する前に、それぞれ凍結または乾燥した後に解凍または再構成させることができる。
【００１５】
本発明は、凍結または乾燥工程中にアルミニウムアジュバントの構造および機能を保存することができる。結果として、凍結または乾燥後のアルミニウムアジュバント化ワクチンの免疫原性を維持することができる。
【００１６】
アルミニウム塩アジュバント
アジュバントとしての使用にとって好適な任意の種類のアルミニウム塩を本発明において用いることができる。アルミニウム塩は、水酸化アルミニウム(Al(OH)3)、リン酸アルミニウム(AlPO4)、塩酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、アンモニウムミョウバン、カリウムミョウバンまたはケイ酸アルミニウムであってよい。好ましくは、用いられるアルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムである。最も好ましくは、アルミニウム塩アジュバントは、水酸化アルミニウム(Al(OH)3)である。
【００１７】
典型的には、アルミニウム塩アジュバントは、アルミニウム塩から作られた水和ゲルの形態を取り、この水和ゲルは水性媒体中では粒子状懸濁液である。アルミニウム塩アジュバントの調製は当業者にはよく知られている。例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムアジュバントは、一般に、当業者には公知のように、アルミニウムイオン(典型的には、硫酸塩または塩化物として)の水性溶液を明確に定義され、制御された化学的環境中でアルカリ条件に曝露することにより調製される。そのような方法を用いて、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム水和ゲルを調製することができる。
【００１８】
抗原
本発明における使用にとって好適な抗原は、ワクチンの任意の免疫原性成分を含む。かくして、抗原は、タンパク質、細菌特異的タンパク質、ムコタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、リポタンパク質、多糖、ペプチドグリカン、核タンパク質または融合タンパク質であってよい。
【００１９】
抗原は、微生物(細菌、ウイルスもしくは真菌など)、原生動物、腫瘍、悪性細胞、植物、動物、ヒト、またはアレルゲンから誘導されたものであってもよい。一実施形態においては、抗原は、タンパク質であるが、全ウイルスまたはビリオンを含まない。
【００２０】
抗原は、例えば、組換えDNA技術を用いて誘導された合成のものであってもよい。抗原は、病原体関連抗原、腫瘍関連抗原、アレルギー関連抗原、神経欠損関連抗原、心血管疾患抗原、慢性関節リウマチ関連抗原などの疾患関連抗原であってもよい。抗原は、不活化または弱毒化／解毒化された毒素(トキソイド)であってもよい。
【００２１】
特に、ワクチン免疫原が誘導される病原体としては、ヒトパピローマウイルス(HPV)、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス(A、BおよびC型)、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、腸ウイルス、アストロウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT細胞リンパ腫I型ウイルス(HTLV-I)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、サルモネラ(Salmonella)菌、ナイセリア(Neisseria)菌、ボレリア(Borrelia)菌、クラミジア(Chlamydia)菌、クロストリジウム菌(Clostridium)、例えば、C.ディフィシレ(C.difficile)およびC.テタニ(C.tetani)、ボルデテラ菌、例えば、ボルデテラ・ペルツシス(Bordetella pertussis)、コリネバクテリア菌(Corynebacterium)、例えば、C.ジフテリア(diptheriae)、プラスモジウム菌(Plasmodium)、コキソプラズマ菌(Coxoplasma)、肺炎球菌(Pneumococcus)、髄膜炎菌(Meningococcus)、クリプトコッカス菌(Cryptococcus)、連鎖球菌(Streptococcus)、ビブリオコレラ菌(Vibriocholerae)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、ヘモフィルス菌(Haemophilus)、バチルス菌(Bacillus)、例えば、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)(炭疽菌)、大腸菌(Escherichia)、カンジダ菌(Candida)、アスペルギルス菌(Aspergillus)、エントアメーバ(Entamoeba)、ジアルジア(Giardia)およびトリパノソーマ(Trypanosoma)が挙げられる。
【００２２】
前記ワクチンをさらに用いて、いくつかの動物疾患に対して好適な免疫応答を刺激することができる。従って、ワクチン抗原は、手足口病ウイルス(血清型O、A、C、SAT-1、SAT-2、SAT-3およびAsia-1など)、コロナウイルス、ブルータングウイルス、ネコ白血病ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ヘンドラおよびニパウイルス、ペスチウイルス、例えば、牛ウイルス性下痢ウイルスおよびイヌパルボウイルスから誘導されてもよい。
【００２３】
腫瘍関連抗原としては、例えば、メラノーマ関連抗原、乳癌関連抗原、結腸直腸関連抗原または前立腺癌関連抗原が挙げられる。
【００２４】
アレルゲン関連抗原としては、ワクチンを投与する個体におけるアレルギー反応の抑制を刺激するためのワクチンにおける使用にとって好適な任意のアレルゲン抗原が挙げられる(例えば、花粉、イエダニ、昆虫、食物アレルゲン、ホコリ、毒物、毒素、毒および寄生虫から誘導された抗原)。
【００２５】
式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル
式(I)および(II)の化合物は、その生理学的に許容し得る塩またはエステルとして存在してもよい。
【００２６】
塩は、典型的には、生理学的に許容し得る酸との塩であり、かくして、塩酸もしくは硫酸などの無機酸またはクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデリン酸、フマル酸もしくはメタンスルホン酸などの有機酸を用いて形成されたものが挙げられる。塩酸塩が好ましい。
【００２７】
エステルは、典型的には、C1〜6アルキルエステル、好ましくは、C1〜4アルキルエステルである。従って、エステルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはtert-ブチルエステルであってよい。エチルエステルが好ましい。
【００２８】
本明細書で用いられるC1〜6アルキル基は、好ましくは、C1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびtert-ブチルから選択される。メチルおよびエチルが特に好ましい。
【００２９】
疑いを避けるために、式(I)および式(II)の化合物の定義は、カルボン酸陰イオンがプロトン化されて-COOHを与え、アンモニウムまたはスルホニウム陽イオンが製薬上許容し得る陰イオンと結合した化合物も含む。さらに、疑いを避けるために、上記で定義された化合物を、任意の互変異性形態または鏡像異性形態で用いてもよい。
【００３０】
式(I)の化合物
典型的には、R1は水素またはC1〜6アルキルであり、R4は水素である。典型的には、R2は水素またはC1〜6アルキルである。好ましくは、R1は水素またはC1〜6アルキルであり、R4は水素であり、R2は水素またはC1〜6アルキルである。
【００３１】
好ましくは、式(I)の化合物は、N-C1〜6アルキル-、N,N-ジ(C1〜6アルキル)-もしくはN,N,N-トリ(C1〜6アルキル)-グリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである。アルキル基は、典型的には、C1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルおよびtert-ブチルから選択される。メチルおよびエチルが特に好ましい。
【００３２】
式(I)の好ましい化合物は、N-メチルグリシン、N,N-ジメチルグリシンもしくはN,N,N-トリメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである。N-メチル-グリシンは、サルコシンとも呼ばれる。N,N-ジメチルグリシンは、ジメチルグリシン(DMG)または2-(ジメチルアミノ)-酢酸とも呼ばれる。N,N,N-トリメチルグリシンは、トリメチルグリシン(TMG)とも呼ばれる。
【００３３】
あるいは、式(I)の化合物は、典型的には、式(IA)のグリシン誘導体またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル：
【化３】
0006023696.tif 000004
【００３４】
(式中、R5およびR6は独立にC1〜6アルキル、例えば、メチルまたはエチルなどのC1〜4アルキルであり；R7はC1〜6アルキル、例えば、メチルもしくはエチルなどのC1〜4アルキル、または-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3である)
である。式(IA)の好ましい化合物は、トリメチルグリシン(TMG)およびコカミドプロピルベタイン(CAPB)またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである。
【００３５】
あるいは、式(I)の化合物は、典型的には、式(IB)のプロリン誘導体またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル：
【化４】
0006023696.tif 000005
【００３６】
(式中、R8およびR9は独立にC1〜6アルキル、例えば、メチルまたはエチルなどのC1〜4アルキルである)
である。好ましくは、式(IB)の化合物は、S-プロリン誘導体である。好ましくは、R8およびR9は両方ともメチルである；この化合物は、プロリンベタインとして知られる。S-プロリンベタインまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルが特に好ましい：
【化５】
0006023696.tif 000006
【００３７】
式(IA)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルが好ましい。
【００３８】
最も好ましくは、式(I)の化合物は、N,N-ジメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである。
【００３９】
式(II)の化合物
典型的には、カルボン酸とRcのアミン置換基とを、Rcアルキル部分の同じ炭素原子に結合させる。典型的には、RcはC2〜4またはC2〜3アルキル部分である。
【００４０】
式(II)の化合物は、典型的には、式(IIA)のスルホン化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル：
【化６】
0006023696.tif 000007
【００４１】
(式中、RcおよびRdは独立にC1〜6アルキル、例えば、メチルまたはエチルなどのC1〜4アルキルである)
である。好ましいスルホン化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、これはジメチルスルホン(DMSO2)としても知られる。
【００４２】
式(II)の化合物は、典型的には、式(IIB)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル：
【化７】
0006023696.tif 000008
【００４３】
(式中、ReおよびRfは独立にC1〜6アルキル、例えば、メチルまたはエチルなどのC1〜4アルキルであり、Rgはカルボン酸陰イオンおよびアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキル、例えば、メチルまたはエチルなどのC1〜4アルキルである)
である。式(IIB)の好ましい化合物は、S-メチル-L-メチオニン(SMM)またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである。
【００４４】
糖
本発明における使用にとって好適な糖としては、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒド、ラクトース、アラビノースおよびマルトースなどの還元糖；ならびに好ましくは、スクロースおよびラフィノースなどの非還元糖が挙げられる。糖は、単糖、二糖、三糖、または他のオリゴ糖であってよい。用語「糖」は、糖アルコールを含む。
【００４５】
ガラクトースおよびマンノースなどの単糖；スクロース、ラクトースおよびマルトースなどの二糖；ラフィノースなどの三糖ならびにスタキオースなどの四糖が想定される。トレハロース、ウンベリフェロース、ベルバスコース、イソマルトース、セロビオース、マルツロース、ツラノース、メレジトースおよびメリビオースも本発明における使用にとって好適である。好適な糖アルコールはマンニトールである。
【００４６】
2種以上の糖が存在してもよい。2、3または4種の糖を用いることができる。1種以上の糖が凍結または凍結乾燥される水性懸濁液中に存在する場合、好ましくは、スクロースまたはスクロースとラフィノースが存在する。スクロースはグルコースとフルクトースとの二糖である。ラフィノースはガラクトース、フルクトースおよびグルコースから構成される三糖である。
【００４７】
凍結または乾燥される水性懸濁液
凍結または乾燥される水性懸濁液または溶液を、アルミニウム塩アジュバントと、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの水性溶液とを混合することにより調製することができる。式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルは特に、ジメチルグリシン、S-メチル-L-メチオニン、メチルスルホニルメタン、サルコシンおよびトリメチルグリシンから選択してもよく、例えば、ジメチルグリシン、S-メチル-L-メチオニン、メチルスルホニルメタンまたはトリメチルグリシンであってよい。任意の好適な水性溶液を用いることができる。溶液を緩衝化してもよい。溶液は、HEPES溶液、トリス緩衝化溶液、リン酸緩衝化溶液または純水溶液であってもよい。
【００４８】
必要に応じて、1種以上の糖を水性溶液中に溶解した後、アジュバントと混合する。あるいは、糖を、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの水性溶液中でアジュバントの懸濁液と混合することができる。
【００４９】
存在する場合、一般に抗原を、アジュバントと、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルとの混合の前にアジュバント上に吸着させる。アジュバントを、水和ゲルの形態で調製し、抗原を水和ゲル中に吸着させることができる。抗原吸着を、当業者にはよく知られた技術を用いて実行することができる。例えば、特定のタンパク質抗原については、アジュバントと抗原とが反対の電荷を有するpH間隔で吸着を最良に実行し、静電気引力および吸着を容易にすることができる。特定の抗原-アジュバント組合せのためのタンパク質吸着は、抗原の性質および化学的環境(pH、イオン強度、界面活性剤の存在など)に依存する。
【００５０】
凍結させる水性懸濁液または溶液中の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよびそれぞれの糖の濃度を、日常的な実験により決定することができる。かくして、最適化された濃度を選択することができる。式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルは、糖と相乗的に作用して、安定性を改善することができる。
【００５１】
水性懸濁液または溶液中の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、典型的には、0.001M以上の範囲、好ましくは、0.01M以上の範囲およびより好ましくは、0.1M以上の範囲、例えば、0.1M〜5.0Mにある。用いられる特定の濃度は、存在する場合、抗原の性質；用いられる式(I)もしくは(II)の特定の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；1種以上の糖が用いられるかどうかと、その場合の糖の同一性；および採用される特定の凍結または乾燥手順などのいくつかの因子に依存する。かくして、
-  式(I)の化合物または式(IA)もしくは式(IB)の化合物、例えば、TMG、またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、好ましくは、0.01M〜5M、0.1M〜5M、0.2M〜5.0Mまたは0.1M〜1Mである。
【００５２】
-  Xが-S(O)2-である式(II)の化合物または式(IIA)の化合物、例えば、MSM、またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、好ましくは、0.01M〜4M、0.05M〜2Mまたは0.07M〜1Mまたはさらには0.53Mまでである。
【００５３】
-  XがS+(Rc)-である式(II)の化合物または式(IIB)の化合物、例えば、S-メチル-L-メチオニン、またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、好ましくは、0.01M〜5M、0.1M〜5M、0.2M〜3Mまたは0.1M〜1Mである。
【００５４】
-  N,N-ジ(C1〜6アルキル)-、N,N,N-トリ(C1〜6アルキル)-、もしくはN-C1〜6アルキル-グリシンである式(I)の化合物、例えば、N,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン、もしくはN-メチルグリシン、またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、典型的には、0.01M以上および好ましくは0.1M以上、例えば、0.1M〜5.0M、0.33M〜5.0M、0.5M〜4Mまたは0.5M〜3Mである。
【００５５】
-  N,N-ジメチルグリシン(DMG)である式(I)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度は、典型的には、0.01M以上、好ましくは、0.1M以上、例えば、0.1M〜5.0M、0.33M〜5.0M、0.5M〜4Mまたは0.5M〜3Mである。1種以上の糖が存在する場合、より少ないDMGまたはDMG塩またはエステルを用いることができる。
【００５６】
1種以上の糖を用いる場合、凍結または乾燥させる水性懸濁液または溶液中の糖の濃度または糖の合計濃度は、典型的には、1M以下または0.7M以下、例えば、0.5M以下または0.29M以下である。10% w/vのスクロース溶液は、0.29Mのスクロース濃度を有する。糖濃度または合計濃度は、0.1 mM、0.5 mM、0.073Mまたは0.146Mまで下げてもよい。
【００５７】
式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルがDMGまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである場合、凍結または乾燥のための水性懸濁液または溶液中の糖の濃度は、糖が存在する場合、典型的には、1M以下または0.7M以下、例えば、0.5M以下または0.29M以下である。10% w/vのスクロース溶液は、0.29Mのスクロース濃度を有する。好ましくは、スクロースもしくはラフィノースなどの糖の濃度、または2種以上の糖が存在する場合、糖の合計濃度は0.5M以下、0.2M以下、0.1M以下もしくは10mM以下である。存在する場合の糖の最少濃度または、2種以上の糖が存在する場合の糖の最少合計濃度は、0.01M、0.1Mまたは0.2Mであってよい。かくして、糖濃度、例えば、スクロースもしくはラフィノースの濃度、または2種以上の糖が存在する場合の合計濃度は、0.01M〜0.7M、0.029M〜0.5M、0.058M〜0.3Mまたは0.1M〜0.3Mであってよい。糖がスクロースである場合、スクロースの濃度は、好ましくは0.01〜0.2Mであり、DMGまたはその塩もしくはエステルの濃度は、好ましくは0.2〜2Mである。
【００５８】
用いられる特定の濃度は、抗原の性質、用いられる特定の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび採用される特定の凍結または乾燥手順などのいくつかの因子に依存する。糖の濃度または合計濃度は、0.1mM〜0.7M、5mM〜0.7M、0.073M〜0.5M、または0.146M〜0.389Mであってよい。
【００５９】
糖がマンニトールである場合、マンニトール濃度は、典型的には0.2〜1Mまたは0.2〜0.8Mであり、好ましくは0.25〜0.6Mまたは0.4〜0.8M、例えば、0.5〜0.6Mである。
【００６０】
式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの最も効果的な濃度は、用いられる特定の種類の化合物、それが糖と共に用いられるかどうか、および用いられるアルミニウム塩アジュバントの種類、例えば、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバントが用いられるかどうかに依存する。式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルと、糖との混合物を用いて、本発明者らはより低濃度の各成分を用いて、各成分を別々に用いる場合に得られるものと同じレベルのアジュバントの保護を達成することができることを証明した。
【００６１】
糖の高濃縮溶液は、そのような濃縮された糖を含有するワクチン調製物を患者に注射した場合に部位特異的反応を与えることが知られている。従って、本発明は、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルと組合せた場合により低濃度の糖を用いることができるという利点を有する。結果として、そのようなワクチン調製物を再構成させるか、または解凍する場合、糖の濃度が低下し、部位特異的反応の可能性が最小化される。
【００６２】
凍結／乾燥
凍結
凍結は、任意の好適な方法により行われる。かくして、凍結は、液体窒素もしくは液体窒素蒸気中に浸すこと、-4℃〜-80℃の温度の冷凍庫に入れること、またはドライアイスとアルコール凍結浴槽を用いることにより実行することができる。大気圧で、-4℃以下、-10℃以下、-15℃以下、-20℃以下、-25℃以下などの温度を用いることができる。
【００６３】
乾燥
典型的には、乾燥は凍結-乾燥、真空乾燥、噴霧-乾燥、噴霧凍結-乾燥または流動床乾燥により達成される。凍結-乾燥が好ましい。材料中の水を減少させ、材料をバイアル中に密封することにより、材料を容易に保存、輸送し、後にその元々の形態に再構成させることができる。乾燥条件を日常的な実験により好適に最適化することができる。
【００６４】
乾燥時に、ウイルス粒子を含む組成物が形成される。かくして、ウイルス粒子を含むマトリックスが作製される。この組成物は、典型的には不定形の固体である。かくして、一般に固体マトリックス、一般的には不定形固体マトリックスが形成される。「不定形」とは、構造がなく、観察可能な規則的または反復的な分子組織を持たないことを意味する(すなわち、非結晶質)。乾燥手順を行って、例えば、凍結-乾燥により不定形ケーキを形成させることができる。
【００６５】
凍結-乾燥
凍結-乾燥を標準的な手順に従って実行することができる。3つの主な段階がある：凍結、一次乾燥および二次乾燥である。凍結は、典型的には凍結-乾燥装置を用いて実施される。この工程では、生物材料を、材料の固相と液相が同時に存在することができる最も低い温度であるその共晶点より下に冷却することが重要である。これにより、確実にその後の工程において融解よりもむしろ昇華が起こる。あるいは、不定形材料は共晶点を有さないが、一次および二次乾燥中のメルトバックまたは崩壊を防止するように生成物を下に維持する必要がある臨界点を有する。
【００６６】
一次乾燥中に、十分な熱を供給して水が昇華できるようにしながら、好適なレベルの真空の適用により圧力を制御する。材料中の水の少なくとも50％、典型的には60〜70％がこの段階で昇華する。一次乾燥は、高熱が生物材料の構造を分解するか、または変化させ過ぎないようにゆっくりであってよい。冷却コンデンサーチャンバおよび／または平板コンデンサーは、水蒸気が再凝固により捕捉される表面を提供する。
【００６７】
二次乾燥プロセスにおいては、さらに熱を加えることにより水和反応の水を除去する。典型的には、圧力も低下させてさらなる乾燥を促進する。凍結-乾燥プロセスの完了後、密封前に真空を窒素などの不活性気体で破壊するか、または材料を真空下で密封することができる。
【００６８】
真空乾燥
特定の実施形態においては、乾燥を約1300Paの真空乾燥を用いて実行する。しかしながら、真空乾燥は本発明にとって必須ではなく、他の実施形態においては、ウイルス粒子と接触させた保存混合物を回転させる(すなわち、回転式乾燥)か、または凍結-乾燥する(以下でさらに説明する)。有利には、本発明の方法は、ウイルス粒子を含有する保存混合物を真空にかけることをさらに含む。便利には、真空を20,000Pa以下、好ましくは、10,000Pa以下の圧力で適用する。有利には、真空を、少なくとも10時間、好ましくは16時間以上の期間適用する。当業者には公知のように、真空適用の期間はサンプルのサイズ、用いられる装置および他のパラメーターに依存する。
【００６９】
噴霧-乾燥および噴霧凍結-乾燥
別の実施形態においては、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を噴霧-乾燥または噴霧凍結-乾燥することにより達成される。これらの技術は当業者にはよく知られており、気体、例えば、空気、無酸素気体もしくは窒素、または噴霧凍結-乾燥の場合、液体窒素により液体供給物を乾燥させる方法を含む。液体供給物を液滴のスプレー中で霧化させる。次いで、乾燥チャンバ中の気体または液体窒素との接触により、液滴を乾燥させる。
【００７０】
流動床乾燥
さらなる実施形態においては、乾燥は、本発明の保存混合物と混合されたウイルス粒子を流動床乾燥することにより達成される。この技術は当業者にはよく知られており、典型的には流動状態を作る制御された速度条件下で生成物層に気体(例えば、空気)を通過させることを含む。この技術は、粒子状生成物材料の乾燥、冷却、凝集、顆粒化および被覆の段階を含んでもよい。
【００７１】
流動化気体により、および／または流動層に浸した他の加熱表面(例えば、パネルもしくはチューブ)により、熱を供給することができる。冷却は、冷却気体および／または流動層に浸した冷却表面を用いて達成することができる。凝集および顆粒化の工程は当業者にはよく知られており、達成しようとする生成物の特性に応じて様々な方法で実施することができる。粉末、顆粒または錠剤などの粒子状生成物の被覆は、制御された条件下で流動化された粒子上に液体を噴霧することにより達成することができる。
【００７２】
凍結または乾燥により生成される組成物は、典型的には低い残留水分含量を有する固体マトリックスである。冷蔵温度よりも高い温度、例えば、4℃〜56℃以上、または冷蔵温度よりも低い温度、例えば、0℃〜-70℃以下でワクチン活性の長期保存を提供する残留水分含量のレベルが達成される。かくして、本発明に従って生成される組成物は、5重量％以下、2重量％以下または1重量％以下の残留水分含量を有してもよい。典型的には、前記組成物は0.1〜5％または0.5〜5％の残留水分含量を有する。
【００７３】
前記組成物を乾燥粉末形態で取得することができる。乾燥、例えば、凍結-乾燥工程の結果得られるケーキを、粉末形態に粉砕することができる。かくして、本発明による固体組成物は、自由流動粒子の形態を取ってもよい。固体組成物は、典型的には密封されたバイアル、アンプルまたはシリンジ中の粉末として提供される。吸入用の場合、粉末を乾燥粉末吸入器中で提供することができる。あるいは、固体マトリックスをパッチとして提供することができる。粉末を錠剤形態に圧縮してもよい。
【００７４】
前記組成物は、アルミニウム塩アジュバント；1種以上の抗原；式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；および必要に応じて、1種以上の糖からなるか、または本質的にそれらからなってもよい。
【００７５】
本発明の組成物の使用
凍結または乾燥ワクチン組成物は、患者に投与する前に液体形態(水性溶液)に変換される。凍結組成物を解凍し、必要に応じて、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または注射用の水で希釈する。乾燥組成物を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水または注射用の水により水性溶液として再構成させる。次いで、得られる水性溶液を、ワクチン接種を必要とする患者に、例えば、注射によって投与することができる。
【００７６】
式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび必要に応じて、1種以上の糖は、典型的には、例えば、それを患者に投与する前に液体形態(水性溶液)に変換する場合、ワクチン組成物のための再懸濁剤として作用する。
【００７７】
凍結または乾燥の有害な効果に対する保護
天然形態にあるアルミニウム塩アジュバントは、通常、水性媒体中の粒子状懸濁液であるゲルの形態にある。凍結または乾燥は、沈降した固体化合物の対応する沈降率の増加およびより緊密な充填に伴う粒径の増加を特徴とする構造的変化を引き起こすことが多い。しかしながら、本発明を用いて、凍結または凍結-乾燥の結果としての粒径の増加、沈降した固体の沈降率の増加および／またはより緊密な充填の形態にある損傷を低減することができる。
【００７８】
沈降した固体化合物の対応する沈降率の増加およびより緊密な充填に伴う粒径の増加の形態にある構造的損傷を、実施例1に記載のアジュバント凝集アッセイを用いて評価することができる。凍結または凍結-乾燥の前後でのアルミニウムアジュバントの物理化学的特性を評価するための他の分析方法を用いることもできる。例えば、アルミニウムゲル粒子の粒径分布を、レーザー回折分析、X線回折または赤外分光分析を用いて取得することができる。顕微鏡観察を用いて構造的変化を可視化することもできる。
いくつかの実施形態を以下に示す。
項１
凍結または乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存するための方法であって、
(a) アルミニウム塩アジュバント；
(b) 式(I)：
【化８】
0006023696.tif 000009
(式中、
R1は水素もしくはC1〜6アルキルであり；および
R4は水素であり；または
R1およびR4はそれらが結合した原子と一緒になって、ピロリジン環を形成し；
R2は水素、C1〜6アルキルもしくは-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3であり；および
R3はC1〜6アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；または
式(II)：
【化９】
0006023696.tif 000010
(式中、
Xは-S(O)2-もしくは-S+(Rc)-であり；
RaおよびRbは独立にC1〜6アルキルであり；および
Rcはカルボン酸陰イオンおよびアミン(-NH2)部分で置換されたC1〜6アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；ならびに
(c) 必要に応じて、1種以上の糖、
を含む水性懸濁液または溶液を凍結または乾燥することを含む、前記方法。
項２
水性懸濁液または溶液が凍結または凍結乾燥される、項１に記載の方法。
項３
水性懸濁液または溶液が少なくとも1種の抗原をさらに含む、項１または２に記載の方法。
項４
式(I)の化合物が式(IA)：
【化１０】
0006023696.tif 000011
(式中、R5およびR6は独立にC1〜4アルキルであり；R7はC1〜4アルキルまたは-(CH2)2〜5NHC(O)(CH2)5〜15CH3である)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルであるか；
式(I)の化合物が式(IB)：
【化１１】
0006023696.tif 000012
(式中、R8およびR9は独立にC1〜4アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルであるか；
式(II)の化合物が式(IIA)：
【化１２】
0006023696.tif 000013
(式中、RcおよびRdは独立にC1〜4アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルであるか；または
式(II)の化合物が式(IIB)：
【化１３】
0006023696.tif 000014
(式中、ReおよびRfは独立にC1〜4アルキルであり、Rgはカルボン酸陰イオンおよびアミン部分で置換されたC1〜4アルキルである)
の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである、
項１または２に記載の方法。
項５
式(I)の化合物がN,N-ジ(C1〜6アルキル)-、N,N,N-トリ(C1〜6アルキル)-、もしくはN-C1〜6アルキル-グリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
項６
式(I)の化合物がN,N-ジメチルグリシン、N,N,N-トリメチルグリシン、もしくはN-メチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである、項５に記載の方法。
項７
式(I)の化合物がN,N-ジメチルグリシンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである、項６に記載の方法。
項８
式(I)または(II)の化合物がジメチルスルホン、トリメチルグリシン、コカミドプロピルベタイン、プロリンベタインもしくはS-メチル-L-メチオニンまたはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルである、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
項９
アルミニウム塩アジュバントがリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
項１０
抗原またはそれぞれの抗原がアジュバント上に吸着されて提供される、項３〜９のいずれか１項に記載の方法。
項１１
式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度が少なくとも0.1Mである、項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
項１２
1種の糖が用いられる、項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
項１３
(a)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.5Mもしくは0.01〜0.2Mであり、且つ式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度が0.2〜5Mであるか、または(b)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.5Mもしくは0.01〜0.2Mであり、且つ式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度が0.2〜2Mであるか、または(c)糖がマンニトールであり、マンニトールの濃度が0.2〜0.8Mであり、且つ式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度が0.5〜1Mであるか、または(d)糖がスクロースであり、スクロースの濃度が0.01〜0.7Mもしくは0.01〜0.6Mもしくは0.01〜0.5Mである、項１に記載の方法。
項１４
2種以上の糖が用いられる、項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
項１５
(a)スクロースが別の糖と共に存在し、他の糖がラフィノース、スタキオースもしくは糖アルコールであるか、または(b)スクロースが別の糖と共に存在し、他の糖がラフィノースである、項１４に記載の方法。
項１６
糖が存在せず、式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルの濃度が0.3M〜5Mである、項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
項１７
懸濁液または溶液を凍結乾燥する、項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
項１８
懸濁液または溶液を凍結乾燥して、不定形の固体マトリックスを形成させる、項１７に記載の方法。
項１９
乾燥した不定形の固体マトリックスを形成させ、該固体マトリックスを密封されたバイアル、アンプルまたはシリンジ中の粉末の形態で提供する、項１８に記載の方法。
項２０
(a)得られるケーキを粉砕して粉末を形成させ、該粉末を密封されたバイアル、アンプルもしくはシリンジ中で提供するか、または(b)固体マトリックスが錠剤もしくはカプセルの一部を形成する、項１７に記載の方法。
項２１
凍結または乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを保存するための、(i)項１または４〜８のいずれか１項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび(ii)必要に応じて1種以上の糖を含む賦形剤の使用。
項２２
項１または９に記載のアルミニウム塩アジュバント；
1種以上の抗原；
項１または４〜８のいずれか１項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステル；および
必要に応じて、1種以上の糖、
を含むワクチン組成物。
項２３
項３〜２０のいずれか１項に記載の方法によって得られるワクチン組成物。
項２４
ワクチン組成物のための再懸濁剤としての、(i)項１または４〜８のいずれか１項に記載の式(I)もしくは(II)の化合物またはその生理学的に許容し得る塩もしくはエステルおよび(ii)必要に応じて1種以上の糖を含む賦形剤の使用。
項２５
ワクチン組成物が項２２に記載のものであるか、または項３〜２０のいずれか１項に記載の方法によって得られるものである、項２４に記載の使用。
【００７９】
(実施例)
以下の実施例は、本発明を例示するものである。参考例も提供する。
【００８０】
参考例
アジュバント
水酸化アルミニウムゲル(Al(OH)3)を、13 mg/mlの溶液(pH 6.8)としてSigma(A8222)から取得した。
【００８１】
アジュバントの凍結
アジュバントを実験室冷凍庫に入れ、そこで-20℃で一晩静置することにより凍結させた。次いで、それを解凍し、室温(約20℃)に平衡化させた。
【００８２】
顕微鏡分析
アジュバントを、100倍の倍率で顕微鏡的に試験した。水酸化アルミニウムの通常の損傷していない不定形構造および凍結後の損傷した凝集した結晶構造の例を、図1に示す。写真Aは、損傷していないアジュバントの均等に分布した粒子状懸濁液を示し、写真Bはそれと比較した、凍結により損傷したアジュバントに典型的な大きく凝集した平たい結晶構造の形成を示す。
【実施例１】
【００８３】
方法
水酸化アルミニウムアジュバントを、pH 6.8の13 mg/mlの溶液としてSigma(A8222)から取得した。最初に、50μl容量の水酸化アルミニウムを、96穴平底マイクロプレートのウェル中、100μl容量のスクロースおよび／またはDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に希釈した賦形剤に添加した。さらなる賦形剤はDMGであった。凍結する前のDMGおよびスクロースの最終濃度の一覧を、以下の表1に見出すことができる。
【００８４】
アジュバントを-20℃で凍結した。約18時間後、Al(OH)3を含有するサンプルを解凍し、以下に記載のアジュバント凝集アッセイを用いて記載のように沈降レベルについて評価した。
【表１】
0006023696.tif 000015
【００８５】
アジュバント凝集アッセイ
各ウェルからサンプルを100μlマイクロピペット中に取り、室温で1時間、再安定化させた後、ピペット中の溶液の全高の割合(％)として沈降したゲルの高さを測定することにより、凝集量を評価した。ピペット中の溶液の全高の割合(％)としての沈降したゲルの高さを、％ゲル容量として表した。％ゲル容量が大きいほど、アジュバントはより構造的に無傷である。
【００８６】
結果および考察
これらの試験から得られた結果を、図2に2つの形態で示す。第1に、単純なXY散乱プロットを示し、これを3Dシートプロットにより補完する。
【００８７】
DMGまたはスクロースの非存在下では、測定されたアジュバントの回収率は30％に過ぎなかったが、これはアジュバント構造の非常に有意な喪失が凍結解凍中に起こったことを示唆している(約70％の喪失)。製剤中のスクロース濃度を増加させることにより、試験した最も高い濃度で最大約70％までアジュバントの回収率が増加した(234 mM、約8% w/v)。
【００８８】
DMG濃度のみを増加させることにより、アジュバントの回収率が増加した。DMGのみを用いた場合、良好な用量依存的応答が観察され、ほぼ100％の回収率を達成することができた。
【００８９】
DMGとスクロースの両方を用いるアジュバントの同時製剤化により、ほぼ100％の回収率を達成するのに必要なDMGの量が有意に減少した。
【実施例２】
【００９０】
方法
水酸化アルミニウムアジュバントを、pH 6.8の13 mg/mlの溶液としてSigma(A8222)から取得した。最初に、50μl容量の水酸化アルミニウムアジュバントを、96穴平底マイクロプレートのウェル中、100μl容量のスクロースおよび／またはDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に希釈したさらなる賦形剤に添加した。さらなる賦形剤はS-メチル-L-メチオニン、MSMおよびTMGであった。アジュバントを-20℃で凍結した。凍結する前のスクロースおよびさらなる賦形剤の最終濃度の一覧を、以下の表2に見出すことができる。
【００９１】
約18時間後、Al(OH)3を含有するサンプルを解凍し、実施例1に記載のアジュバント凝集アッセイを用いて記載のように沈降レベルについて評価した。
【表２】
0006023696.tif 000016
0006023696.tif 000017
【００９２】
結果および考察
これらの試験から得られた結果を、図3および4に2つの形態で示す。最初に単純なXY散乱プロットを示し、これを3Dシートプロットにより補完する。
【００９３】
スクロースとさらなる賦形剤の両方の非存在下では、測定されたアジュバントの回収率は30％に過ぎなかったが、これはアジュバント構造の非常に有意な喪失が凍結解凍中に起こったことを示唆している(約70％の喪失)。製剤中のスクロース濃度を増加させることにより、試験した最も高い濃度で最大約70％までアジュバントの回収率が増加した(234 mM、約8% w/v)。
【００９４】
さらなる賦形剤(TMGおよびS-メチル-L-メチオニン)の濃度のみを増加させることにより、アジュバントの回収率が増加した。これらの場合の各々において、さらなる賦形剤のみを用いた場合、良好な用量依存的応答が観察され、ほぼ100％の回収率を達成することができた。
【００９５】
スクロースとさらなる賦形剤の一つ(TMGまたはS-メチル-L-メチオニン)の両方を用いるアジュバントの同時製剤化により、ほぼ100％の回収率を達成するのに必要なさらなる賦形剤の量が有意に減少した。
【実施例３】
【００９６】
方法
水酸化アルミニウムアジュバントを、pH 6.8の13 mg/mlの溶液としてSigma(A8222)から取得した。アジュバントの容量を遠心分離してペレットを形成させた後、40 mM HEPES + 25 mM NaCl、pH 7.9中で(2回)洗浄し、元の容量の半分の中に再懸濁したところ、約26 mg/mlの溶液が得られた。各バイアル中に、75μlの26 mg/mlアジュバント溶液および225μlの関連賦形剤(添加されるアジュバント容量を構成する濃度に調整)を添加して好適な濃度に等しくなるようにしたところ、6.5 mg/mlの最終アジュバント濃度を含有する各バイアルが得られた。賦形剤の最終濃度の一覧を以下の表4に記載する。
【００９７】
VirTis Advantage凍結乾燥機により、以下の表3に示される乾燥周期を用いて、約3日間続けてサンプルを凍結乾燥した。Thermo Savant VLPポンプ(Thermofisher, UK)を用いて最初は300 mTorrで、真空を適用する前に2時間、-40℃でサンプルを凍結した。棚温度および真空をプロセスを通じて調整し、コンデンサーを-80℃に維持した。サンプルを栓で塞ぐまで工程11を延長した後、真空を開放した。
【００９８】
一次乾燥段階において、棚温度を-45℃まで低下させた。二次乾燥段階は、乾燥が完了するまで温度を30℃に上昇させる一連の保持工程を含んでいた。プローブは棚温度とコンデンサー温度とを記録した。
【表３】
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【００９９】
アジュバント凝集アッセイ
凍結-乾燥アジュバントを含有するバイアルを、300μlの精製水中で再構成し、ボルテックスした。各ウェルからサンプルを100μlのマイクロピペット中に取り、室温で90分間再安定化させた後、ピペット中の溶液の全高の割合(％)として沈降したゲルの高さを測定することにより、凝集量を評価した。ピペット中の溶液の全高の割合(％)としての沈降したゲルの高さを、％ゲル容量として表した。％ゲル容量が大きいほど、アジュバントはより構造的に無傷である。
【表４】
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【０１００】
結果および考察
結果を、上記の表4に記載し、図5に図示する。これらのものは、ある濃度範囲の(i)DMG、TMG、S-メチルメチオニンまたはサルコシン、および(ii)スクロースの存在下、凍結-乾燥アジュバント溶液上でアジュバント構造を維持することができることを確認するものである。一般に、ケーキの品質は、より低濃度のさらなる賦形剤およびより高濃度のスクロースについてより良好である。
【実施例４】
【０１０１】
材料および装置
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方法
300μlの凍結乾燥バイアル1個あたり75μlのアジュバントを添加したことを考慮して(1/4容量、従って、さらに25％濃縮)、以下の賦形剤ミックスを、10 mlのマスターミックスとしてHEPESバッファー中で作製した。
【表５】
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【０１０２】
上記のように、各バイアルに、75μlの26 mg/ml水酸化アルミニウムアジュバント(13 mg/ml水酸化アルミニウムゲルを遠心分離し、元の容量の半分にペレットを再懸濁することにより調製した)および225μlの好適な賦形剤ミックスを添加した。次いで、以下の表6に示される乾燥周期を用いて、VirTis Advantage凍結乾燥機に入れる前にバイアルを閉栓した。
【表６】
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【０１０３】
凍結乾燥した後、バイアルを真空下で閉栓し、フタを付け、写真を撮った。アジュバントの凝集を実施例3に記載のように評価した。
【０１０４】
結果および考察
結果を以下の表7〜10に記載する。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１０５】
これらの結果は、DMG、TMG、SMMおよびサルコシンの存在により、アジュバント保護を減少させることなく糖の濃度を低下させることができることを示している。これは、アジュバント安定化における賦形剤の明確な役割を証明している。
【実施例５】
【０１０６】
材料および装置
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方法
300μlの凍結乾燥バイアル1個あたり75μlのアジュバントを添加したことを考慮して(1/4容量、従って、さらに25％濃縮)、以下の賦形剤ミックスを、10 mlのマスターミックス中、HEPESバッファー中で作製した。
【表１１】
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【０１０７】
上記のように、各バイアルに、75μlの26 mg/ml水酸化アルミニウムアジュバント(13 mg/ml水酸化アルミニウムゲルを遠心分離し、元の容量の半分にペレットを再懸濁することにより調製した)および225μlの好適な賦形剤ミックスを添加した。次いで、凍結乾燥機に入れる前にバイアルを閉栓し、以下の表12に示される乾燥周期で運転した。
【表１２】
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【０１０８】
凍結乾燥した後、バイアルを真空下で閉栓し、フタを付け、写真を撮った。アジュバントの凝集を実施例3に記載のように評価した。
【０１０９】
結果および考察
結果を以下の表13および14に記載する。
【表１３】
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【表１４】
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【０１１０】
これらの結果は、DMG、TMG、およびSMMの存在により、アジュバント保護を減少させることなく糖の濃度を低下させることができることを示している。これは、アジュバント安定化における賦形剤の明確な役割を証明している。
【実施例６】
【０１１１】
序論
ウシ血清アルブミン(BSA)は、例えば、アジュバント上へのタンパク質吸着を測定しようとする実験におけるモデルとして一般的に用いられる。
【０１１２】
材料および装置
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タンパク質吸着
Alhydrogel(2％保存液(w/v)で供給される)を、BSAを含有するPBSに添加して、0.52％のAlhydrogelおよび200μg/mlのBSAの濃度を有する10 ml最終容量に等しくなるようにした。タンパク質吸着工程を、室温で緩やかに振とうした後、+4℃に一晩入れることによりインキュベートした。
【０１１３】
以下の賦形剤ミックスを5 ml容量で調製した：
-  1.315 M (24%)マンニトール
-  1.315 M (24%) + 1.6 M DMG
-  1.315 M (24%) + 1.6 M TMG
-  1.315 M (24%) + 1.6 M SMM
-  1.096 M (20 %)マンニトール + 1.2 M DMG
-  1.096 M (20 %) + 1.2 M TMG
-  1.096 M (20 %) + 1.2 M SMM
-  0.877 M (16 %)マンニトール + 0.8 M DMG
-  0.877 M (16 %) + 0.8 M TMG
-  0.877 M (16 %) + 0.8 M SMM
-  PBS。
【０１１４】
アジュバント-賦形剤の処理
アジュバントを1:1の比(2 ml + 2 ml)の賦形剤濃度で混合して、半分の濃度の上記賦形剤、0.26％Alhydrogelおよび100μg/ml BSAを作製した。これを+4℃で12時間インキュベートした後、300μl容量に分割し、(a)凍結(-80℃)、(b)以下の表15に記載のように凍結乾燥、または(c)液体として+4℃で保持した。
【０１１５】
タンパク質アッセイのためのブランクとしてタンパク質を含有させない等量のブランクを、考察されるように作製および処理した。
【表１５】
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【０１１６】
凍結乾燥した後、バイアルを真空下で閉栓し、フタを付け、写真を撮り、ケーキをケーキ品質に関して実施例3に記載のようにスコア化した。
【０１１７】
次いで、液体バイアル、凍結バイアルおよび凍結乾燥バイアルを室温に置いて平衡化／解凍すると同時に、凍結乾燥バイアルを300μlの精製水中で再構成させ、完全な再構成が観察されるまでボルテックスした。
【０１１８】
300μl容量の各々をマイクロ遠心管上で1分間パルスしてアジュバントを沈降させ、上清を廃棄し、ペレットを等量のPBS中に再懸濁した。この手順を3回繰り返して、アジュバントから残留する賦形剤を完全に除去した。
【０１１９】
タンパク質アッセイ(Bradford)
各々の賦形剤混合物を2回の対応ブランク(すなわち、タンパク質なし)と共に2回泳動した。液体サンプル、凍結乾燥サンプルおよび凍結サンプルを別々のプレート上で泳動した。タンパク質濃度を標準化するために、各プレートを200μg/mlのBSAから開始して6.25μg/mlまで段階的に希釈した標準曲線を用いて泳動した。50μl容量のアジュバントサンプルを各ウェルに添加した後、125μlのBradford溶液(室温で平衡化させた)を添加した。プレートをプレートリーダーに移し、プレート振とうモード(アジュバントを懸濁液中で保持するため)に5分間設定した後、各プレートを595 nmの吸光度で読み取った。
【０１２０】
結果
各プレートについて、標準曲線を作製し(ブランクを差し引いた)、これらの標準曲線(y = mx + cの式を用いる)を用いて、アジュバントサンプルのタンパク質濃度を確認すると共に、その対応するブランクも差し引いた。データをアジュバントサンプルの総タンパク質濃度／mlとして、およびまたPBS対照の割合(％)としてプロットした。
【０１２１】
その結果を以下の表16〜18ならびに図6および7に記載する。
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【０１２２】
考察
これらのマンニトールならびにDMG、TMGおよびSMM濃度により、アジュバント構造の完全に近い構造的保存が得られた。
【０１２３】
総タンパク質の結果は、アジュバントに吸着されたBSAレベルは、マンニトール-賦形剤範囲間で同等であり、実際にマンニトールのみ(0.66M/12%)およびPBSと同等であることを示している。これは、予め吸着させたAlhydrogelに導入した場合、賦形剤によって引き起こされるタンパク質の溶出がなかったことを示唆している。これはPBSおよびマンニトールの場合も同じであった。液体保持、凍結乾燥および凍結-解凍の出来事は溶出を増幅しなかった。
【０１２４】
この実験は、アジュバントの構造が凍結乾燥中に保存される条件下でも依然としてタンパク質がアジュバントに吸着されることを示している。
【実施例７】
【０１２５】
序論
この実験は、マンニトール基剤と、アジュバント構造を保護することが以前に示されたレベルのDMG、TMGおよびSMMとを比較するものである。それは、両方の保存方法において抗体の活性を精査するためのドットブロットを用いて、ミョウバン抗体を4℃で保持した場合と、それを凍結-解凍した場合の両方においてミョウバンに結合した抗体の抗原性を比較するものである。
【０１２６】
材料
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方法
ミョウバン上に吸着されたマウス抗体を凍結解凍し、様々な賦形剤の存在下、4℃で保持した。マウス抗体がその抗原性を保持しているかどうかを見るためにドットブロットを用いてこれをアッセイした。
【０１２７】
2％Alhydrogel溶液をPBSで0.52％に希釈し、マウス抗体を添加して200μg/mlの濃度にした。これを室温で1時間、撹拌しながら混合した後、4℃で一晩静置した。次いで、ミョウバン-抗体溶液を賦形剤溶液で1:1に希釈して、以下に列挙される最終賦形剤濃度を得た：
-  0.657M マンニトール
-  0.657M マンニトール + 0.8M DMG
-  0.657M マンニトール + 0.8M TMG
-  0.657M マンニトール + 0.8M SMM
-  PBS。
【０１２８】
次いで、これらの溶液を2つのアリコートに分割した。各賦形剤の1つを4℃で保持し、他のものを必要になるまで-80℃で保存した。
【０１２９】
保持されたマウス抗体活性のドットブロット
ニトロセルロース膜を必要な大きさに切断し、2μlのサンプルをドットとして印加した。これを乾燥させた後、振とう器上、室温で1時間、10 ml PBS L 0.05% Tween 20 + 5%ミルク中でインキュベートした。次いで、この溶液を除去した後、膜を、PBS + 0.05% Tween 20 + 5%ミルク中で1:5000に希釈された10 mlの抗マウスHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)中、振とう器上で室温で1時間インキュベートした。次いで、膜をPBS + 0.05% Tween 20で10分間、3回洗浄した。膜をティッシュペーパー上にブロットして過剰のバッファーを除去した後、10 mlのTMB(テトラメチルベンズイジン)を5分間膜上に載せた。次いで、TMBを叩いて除去し、ブロットの色を走査した。
【０１３０】
結果
図8(表19は図8で試験したサンプルのレイアウトを示す)は、液体(図8A)と凍結-解凍(図8B)サンプルの両方において、抗体を含有しない全てのサンプルが予想通り陰性であり、抗体のみの陽性対照が強い陽性であることを示している。液体サンプルにおいて、全てのドットは同じ希釈率では類似している。凍結サンプルは、特に賦形剤中のサンプルとPBS対照サンプルとの間であまり一致しない。PBSサンプルは様々な賦形剤中のサンプルよりも1:500の希釈率ではより弱い。
【０１３１】
図9(表20は図9で試験したサンプルのレイアウトを示す)は、これと一致する結果を示す。賦形剤のみの対照を含む、抗体を含まない全ての陰性対照は陰性であり、これは賦形剤がアッセイを妨げていないことを示す。PBSサンプルは、特に1:300および1:500の賦形剤中のサンプルと比較した場合、凍結した場合の液体サンプルよりもこの場合もやはり弱い。
【表１９】
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【表２０】
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【０１３２】
結論
両セットの結果は、凍結させた場合の賦形剤を含有するサンプルと比較したPBSのみのサンプルに関するより弱い陽性の結果を示す。これは、賦形剤が、抗体がその抗原性をより効率的に保持しているため、サンプルを凍結-解凍する場合のミョウバンのみを含む抗体と比較した場合、ミョウバンを含む抗体に対する保護を提供することを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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