(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経保護のための医薬組成物であって、
以下の式Ｉ
式Ｉ
【化１】
0005904997.tif 000010
（式中、Ｒは、未置換であるか又はハロゲン原子、ハロアルキル基、ニトロ基、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ3、アルキル基及びアルコキシ基からなる群より選択される少なくとも１種により置換された炭素原子数７ないし１５のアリールアルキル基を表し；
Ｙは、Ｏを表し；
Ｒ1はＨ又は炭素原子数１ないし３のアルキル基を表し；
Ｒ2は、Ｈ又はハロゲン原子を表し；
Ａは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択され；
Ｂは、Ｃ又はＮを表し;
Ｚは、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ3Ｒ4を表し；
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ、Ｈ又は炭素原子数１ないし５のアルキル基を表し；
ｍは、０ないし４の範囲における整数を表し；及び
ｎは、０ないし５の範囲における整数を表す。）により表される化合物、その医薬的に許容される塩、異性体、溶媒和物若しくは水和物又はそれらの任意の組み合わせ並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
【請求項２】
脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、
以下の式Ｉ
式Ｉ
【化２】
0005904997.tif 000011
（式中、Ｒは、未置換であるか又はハロゲン原子、ハロアルキル基、ニトロ基、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ3、アルキル基及びアルコキシ基からなる群より選択される少なくとも１種により置換された炭素原子数７ないし１５のアリールアルキル基を表し；
Ｙは、Ｏを表し；
Ｒ1はＨ又は炭素原子数１ないし３のアルキル基を表し；
Ｒ2は、Ｈ又はハロゲン原子を表し；
Ａは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択され；
Ｂは、Ｃ又はＮを表し;
Ｚは、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ3Ｒ4を表し；
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ、Ｈ又は炭素原子数１ないし５のアルキル基を表し；
ｍは、０ないし４の範囲における整数を表し；及び
ｎは、０ないし５の範囲における整数を表す。）により表される化合物、その医薬的に許容される塩、異性体、溶媒和物若しくは水和物又はそれらの任意の組み合わせ並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物。
【請求項３】
前記式Ｉにより表される化合物は、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソチアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−［１，２，４］チアジアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−２−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−ブロモ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメチル−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（１−フェニル−エトキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，６−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，３−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３，４−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，４，６−トリフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，６−ジクロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，５−ジクロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−クロロ−５−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−ニトロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
４−［４−（５−カルバモイルオキシメチル−イソキサゾール−３−イル）−フェノキシメチル］−安息香酸メチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−メチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−メチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−メトキシ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
３−［４−（３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−イソプロピル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、及び
カルバミン酸３−［４−（４−第三ブチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステルからなる群より選択される請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記式Ｉにより表される化合物は、
式ＩＩ
式ＩＩ
【化３】
0005904997.tif 000012
で表される化合物である請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
神経保護のための又は脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患を治療するための薬剤の製造における請求項１又は２で規定される医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、韓国特許庁において２０１０年５月３日に提出された、韓国特許出願第１０−２０１０−００４１４３６号の利益を請求するが、その開示の全てが参照としてここに組み込まれる。
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）のアポトーシスは、神経発生のような正常な生理的機能において又は疾患のような病的過程において誘導され得る。神経細胞の発生過程の間、過剰な神経細胞が、シナプス前部とシナプス後部の間の最適で正確な連結のために、アポトーシスを介して除去される（Ｎｅｕｒｏｎ，４０巻：４０１−４１３頁（２００３年）；Ｎｅｕｒｏｎ，２０巻：６３３−６４７頁（１９９８年））。神経細胞の広範なアポトーシスは、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病及びパーキンソン病、脳卒中及び外傷のような神経変性疾患において観察される。これらの疾患の直接の原因は未だ見出されていないが、しかしながら、これはアポトーシスと関係するものであり、アポトーシスは、酸化的ストレス、カルシウム恒常性の異常調節、ミトコンドリアの機能障害、活性酸素種の発生、興奮毒性、カスパーゼ活性及び栄養不足（ｔｒｏｐｈｉｃ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）のような種々の要因により影響を受ける（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻：１２０−１３０頁（２０００年），Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，２４巻：６７５−６８２頁（２００２年））。
【０００３】
パーキンソン病において、ミトコンドリアの機能障害が、カルシウムの分泌及び活性酸素種の発生を増加し、それにより、酸化的ストレスを誘導して抗酸化系の活性を低減することが報告されている。更に、グルタミン酸塩による興奮毒性とパーキンソン病の間の関連性に関する報告が存在する（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，２４巻：６７５−６８２頁（２００２年））。
【０００４】
アルツハイマー病において、神経細胞のアポトーシスが、酸化的ストレス、イオン恒常性の異常調節、成長因子遮断、アミロイドＡβの蓄積、代謝障害、ミトコンドリアの機能障害、ＤＮＡ損傷及びタンパク質凝集と関連することが報告されている（Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７巻：２７８−２９４頁（２００６年）；Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，２巻：２７０−２７８頁（２００３年））。
【０００５】
近年、種々な機構により誘導されるアポトーシスから神経細胞を保護するために使用される神経保護薬の種々のタイプが提案されている（Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，２４巻：６７５−６８２頁（２００２年））。神経保護薬の例は、抗酸化剤、イオンキレート剤、遊離ラジカル捕捉剤、神経栄養因子、興奮性アミノ酸拮抗剤、生体エネルギー補助食品、免疫抑制剤及びタンパク質の凝集又は蓄積を防止する処方を含む。しかし、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を効果的に阻害する薬剤は、未だ市販で入手可能ではなく、よって、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物を開発することに対する要求が依然として存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｅｕｒｏｎ，４０巻：４０１−４１３頁（２００３年）
【非特許文献２】Ｎｅｕｒｏｎ，２０巻：６３３−６４７頁（１９９８年）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻：１２０−１３０頁（２０００年）
【非特許文献４】Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ，２４巻：６７５−６８２頁（２００２年）
【非特許文献５】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，７巻：２７８−２９４頁（２００６年）
【非特許文献６】Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，２巻：２７０−２７８頁（２００３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
技術的課題
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物を提供する。
本発明はまた、神経保護又は神経回復のための医薬組成物も提供する。
更なる観点が付随する本明細書中に部分的に記述されているが、部分的に、本明細書から明らかであるか又は提示された態様の実施により教示され得る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
課題の解決
本発明は、添付の図面を参照して詳細に説明される。
本発明は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するための医薬組成物であって、以下の式Ｉにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、神経保護のための医薬組成物であって、以下の式Ｉにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
【００１０】
本発明はまた、神経回復のための医薬組成物であって、以下の式Ｉにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
【００１１】
本発明はまた、神経変性疾患又は虚血−若しくは再灌流−関連疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、以下の式Ｉにより表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
【００１２】
本発明はまた、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のための医薬組成物であって、該組成物は、
以下の式Ｉ
式Ｉ
【化１】
0005904997.tif 000002
（式中、Ｒは、置換されているか又は未置換の炭素原子数１ないし１５のアリールアルキル基、置換されているか又は未置換の炭素原子数１ないし１０のヘテロアリールアルキル基及び置換されているか又は未置換の直鎖の炭素原子数１ないし１０のアルキル基からなる群より選択され；
Ｙは、Ｏ及び−Ｎ−Ｒ1からなる群より選択され；
Ｒ1はＨ及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数１ないし３のアルキル基からなる群より選択される少なくとも１種を表し；
Ｒ2は、Ｈ及びハロゲン原子からなる群より選択され；
Ａは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群より選択され；
Ｂは、Ｃ又はＮを表し;
Ｚは、置換されているか又は未置換の複素環基、カーバメート基、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ3Ｒ4、ＮＨ2、ＮＲ5Ｒ6、ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2及び−ＮＣ（＝Ｏ）ＮＨ2からなる群より選択され；
Ｒ3及びＲ4は、それぞれ独立して、Ｈ；未置換であるか又はＮＨ2及びＮＲ7Ｒ8からなる群より選択される少なくとも１種で置換された炭素原子数１ないし５のアルキル基；未置換であるか又は炭素原子数１ないし３のアルキル基で置換された複素環からなる群より選択されるか、又は、Ｒ3及びＲ4は一緒になって、未置換であるか又は炭素原子数１ないし３のアルキル基で置換された５−又は７−員の複素環を形成し；
Ｒ5及びＲ6は、それぞれ独立して、Ｈ；炭素原子数２ないし３のアルケニル基；炭素原子数２ないし３のアルキニル基；及び直鎖又は分岐鎖の、未置換であるか又は−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、炭素原子数１ないし３のアルコキシ基及びカーバメート基からなる群より選択される少なくとも１種で置換された炭素原子数１ないし７のアルキル基からなる群より選択されるか、又は、Ｒ5及びＲ6は一緒になって、置換されているか又は未置換の脂肪族環状アミン又は芳香族環状アミンを形成し；
Ｒ7及びＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ及び直鎖又は分岐鎖の炭素原子数１ないし３のアルキル基からなる群より選択される少なくとも１種を表し；
ｍは、０ないし４の範囲における整数を表し；及び
ｎは、０ないし５の範囲における整数を表す。）により表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量並びに医薬的に許容されるキャリアを含む組成物も提供する。
【００１３】
本医薬組成物は、式Ｉで表される置換アゾール誘導体、その医薬的に許容される塩、該置換アゾール誘導体の異性体、該置換アゾール誘導体の溶媒和物及びそれらの組み合わせからなる群より選択される化合物の治療有効量を含み得る。
【００１４】
ここで使用される用語“治療（treatment）”とは、神経細胞のアポトーシス又は神経変性により発生する疾患、障害又は状態を有していると診断されたことはないが、このような疾患、障害、又は状態にかかりやすい傾向のある動物において、疾患、障害又は状態が発生されることの予防、前記疾患、障害又は状態の抑制、即ち、発展の抑制及び前記疾患、障害又は状態の軽減、即ち、疾患、障害又は状態の退行の原因を含むと解釈すべきである。従って、ここで使用される用語“治療学的有効量（therapeuticallyeffectiveamount）”は、前記した薬理学的効果を達成するのに使用された十分な量を言及する。
【００１５】
式Ｉで表される置換アゾール誘導体は、本発明に関係する技術において、化合物合成の分野に関する当業者により、既知の化合物又はこれらから容易に製造できる化合物を用いて製造し得る。従って、以降に記載される式Ｉで表される置換アゾール誘導体の製造方法は、説明のみを目的とする例示的な態様であり、必要ならば、単位操作の順序は選択的に変えられ得るものであるが、発明の範囲を制限するものではない。
【００１６】
スキーム１：アゾールの合成
【化２】
0005904997.tif 000003
Ｒは、ベンジル基であり得、及びＲ2、Ｚ、Ｂ、ｍ及びｎは、上記で定義された通りであり得る。アゾールの一般的な合成法は、オキシム（ＩＩ）が、出発物質であるアルデヒド（Ｉ）から製造され、製造されたオキシム化合物が、ＮａＯＣｌの存在においてアルキン又はニトリルと［３＋２］環化付加に付されて、アゾール化合物（ＩＩＩ又はＩＶ）が得られ、及び所望の官能基がその後、アゾール化合物中に導入されて最終化合物（Ｖ）が得られるような手順において達成され得る。
【００１７】
スキーム２：チアゾールの合成
【化３】
0005904997.tif 000004
Ｒは、ベンジル基であり得、及びＲ2、Ｚ、Ｂ及びｍは、上記で定義された通りであり得る。チアゾールの一般的な合成法は、オキサチアゾロン（ＶＩＩ）が、出発物質であるアミド（ＶＩ）から製造され、製造された化合物が、ＮａＯＣｌの存在においてアルキン又はニトリルと［３＋２］環化付加に付されて、チアゾール化合物（ＶＩＩＩ）が得られ、及び該地アゾール化合物は還元され（ＩＸ）及び所望の官能基が、その中に導入されて最終化合物（Ｘ）が得られるような手順において達成され得る。
【００１８】
スキーム３
【化４】
0005904997.tif 000005
Ｒ、Ｒ2、Ｚ、Ａ、ｍ及びＢは、上記で定義された通りである。最終化合物（ＸＩＩＩ）の一般的な合成法は、ヒドロキシフェニル誘導体（ＸＩＩ）が、出発物質である化合物（ＸＩ）の脱ベンジル化反応により製造され、及び所望の官能基がその中に導入されて、最終化合物（ＸＩＩＩ）が得られるような手順において達成され得る。
【００１９】
スキーム４
【化５】
0005904997.tif 000006
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、Ｚ、Ａ、ｍ及びＢは、上記で定義された通りである。最終化合物（ＸＶＩ）の一般的な合成法は、アミノフェニル誘導体（ＸＶ）が、出発物質であるニトロフェニル誘導体（ＸＩＶ）の還元により合成され、及び該合成された化合物がその後、所望のアルデヒドと還元的アミノ化に付されて、最終化合物（ＸＶＩ）が得られるような手順において達成され得る。
【００２０】
アゾール誘導体は、式Ｉで示されるアゾール誘導体に加えて、その医薬的に許容される塩、即ち、酸又は塩基の付加塩、及びその立体化学異性体を含み、該塩は、望ましくない効果を伴うことなく、それをもって投与された対象において本発明化合物の活性を維持するあらゆる塩であり得る。そのような塩は、無機塩又は有機塩であり得る。該塩の例は、酢酸、硝酸、アスパラギン酸、スルホン酸、硫酸、マレイン酸、グルタミン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、フタル酸、タンニン酸、酒石酸、臭化水素酸、プロピオン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ステアリン酸、エシレート（ｅｓｉｌａｔｅ）、乳酸、重炭酸、重硫酸、重酒石酸、シュウ酸、酪酸、エデト酸カルシウム、カムシル酸、炭酸、クロロ安息香酸、クエン酸、エデト酸、トルエンスルホン酸、エジシル酸、エシル酸、フマル酸、グルセプト酸、パモ酸、グルコン酸、グリコリルアルサニル酸、メチルクエン酸、ポリガラクツロン酸、ヘキシルレゾルシノン酸、マロン酸、ヒドラバミン酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシナフトエ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、マンデル酸、エストル酸、粘液酸、ナプシル酸、ムコネッキ酸、p-ニトロメタンスルホン酸、ヘキサミン酸、パントテン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、サリチル酸、スルファミン酸、スルファニル酸、メタンスルホン酸及びテオクリン酸を含む。また、前記塩基性塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウム塩のような、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン及びヒドラバミン塩のような有機塩基の塩並びにアルギニン及びリジンのようなアミノ酸を有する塩を含む。それと同時に、塩の形態は適当な塩基又は酸で処理することによって、遊離形態に転換され得る。ここで使用される用語“付加塩”は式Ｉで表される置換アゾール誘導体又はその塩が形成し得る溶媒和物を含む。該溶媒和物は、水和物又はアルコール和物であり得る。
【００２１】
ここで使用される用語“式Ｉで表される置換アゾール誘導体の立体化学異性体”は、式Ｉで表される置換アゾール誘導体が有し得る全ての可能な形態を言及する。他に指定又は
言及が無い限り、式Ｉで表される置換アゾール誘導体の化学名は、基本分子構造の全てのジアステレオマー及びエナンチオマーを含む、全ての可能な立体化学異性体の混合物を示す。特に、各不斉中心は、Ｒ−又はＳ−配置の何れかを、及び、２価の環状（部分）飽和基上の置換基は、シス−又はトランス−配置を有し得る。二重結合を有する化合物は、Ｅ−又はＺ−立体化学を有し得る。式Ｉで表される置換アゾール誘導体の全ての立体化学異性体は、本発明の範囲内に含まれ得ることが意図される。
【００２２】
上記の式Ｉの定義に従って、置換アゾール誘導体の例は、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−［１，２，４］オキサジアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソチアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−［１，２，４］チアジアゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−２−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−クロロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−ブロモ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３−フルオロ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメチル−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（１−フェニル−エトキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，６−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，３−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３，４−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，４，６−トリフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−クロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，６−ジクロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２，５−ジクロロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−クロロ−５−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−ニトロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
４−［４−（５−カルバモイルオキシメチル−イソキサゾール−３−イル）−フェノキシメチル］−安息香酸メチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−メチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（２−メチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（３−メトキシ−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
３−［４−（３−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、
カルバミン酸３−［４−（４−イソプロピル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステル、及び
カルバミン酸３−［４−（４−第三ブチル−ベンジルオキシ）−フェニル］−イソキサゾール−５−イルメチルエステルを含み得る。
これらの置換アゾール誘導体の製造方法は、本願の発明者により提出された韓国特許出願第２００９−１５８５６号中に開示されているが、その開示の全てが参照としてここに組み込まれる。
【００２３】
本発明の態様に従って、式Ｉで表される置換アゾール誘導体は、以下の式ＩＩ
式ＩＩ
【化６】
0005904997.tif 000007
で表される、カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル（ＣＢＩ）であり得る。
【００２４】
一方、本発明の態様に従う医薬組成物は、医薬的に許容されるキャリアを含み得る。
一般的に配合物中に使用される、本医薬組成物における医薬的に許容されるキャリアは、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラル油などを含むが、これらに限定されない。本医薬組成物は
更に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤及び保存剤を含み得る。好適な医薬的に許容されるキャリア及び配合物は、Remington's Pharmaceutical Sciences (第１９版, 1995年）に開示されている。
【００２５】
本発明の１態様に従う医薬組成物は、経口で又は非経口的に投与され得る。非経口投与は、静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、内皮投与、局所投与、経鼻投与、肺内投与及び直腸投与を含み得る。経口投与のため、消化を防止するために、医薬組成物から形成される活性薬物は、被覆され得るか又は医薬組成物は製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、活性物質を標的細胞に移動させることが可能なデバイスにより投与され得る。
【００２６】
本発明の１態様に従う医薬組成物の好適な投与量は、多くの因子、例えば、製剤化方法、投与方法、患者の年齢、体重、性別、病状、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応選択性に依存し、所望する治療又は予防に有効である該医薬組成物の投与量は、通常の技術を有する医者により容易に決定及び処方し得る。
該医薬組成物は、本技術分野における周知の方法により、医薬的に許容されるキャリア及び／又は添加剤を用いて製剤化されて、単回投与形態に製造されるか又は多回投与容器中に収められる。その際、製剤は、油又は水性媒体の溶液、懸濁液又は乳化溶液、抽出物、粉末、顆粒、錠剤又はカプセルであり得、更に、分散剤又は安定化剤を含み得る。加えて、該医薬組成物は、個別の薬剤として又は他の薬剤と共に投与され得、従来の薬剤と連続して又は同時に投与され得る。
【００２７】
該医薬組成物は、神経細胞の死滅又は神経変性を阻害するために使用される。
ここで使用される用語“神経細胞”とは、は一つの細胞体（cell body）、細胞体から押し出された突起の一つ、即ち、軸索又は神経突起及びいくつかの樹上突起からなる動物細胞を言及し、該神経細胞の例は、感覚ニューロン、運動ニューロン及び介在ニューロンを含み得る。加えて、前記神経細胞は、中枢神経系、脳、脳幹、脊髄及び中枢神経系と末梢神経系のシナプス領域、神経支持細胞、グリア細胞及びシュワン細胞を構成する神経細胞を含み得る。
ここで使用される用語“神経細胞の死滅（death of neuron）”は、アポトーシス（apoptosis）による神経細胞の死滅を含むものと解釈される。加えて、ここで使用される用語“神経変性（neurodegeneration）”は、神経細胞の死滅を含む神経細胞の構造又は機能の段階的な変性を意味する。
【００２８】
神経細胞のアポトーシス又は神経変性が、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病のような種々の脳疾患を引き起こすという事実は、本技術分野において周知であり、これらの疾患の予防又は治療のために神経細胞のアポトーシスの機構に関する研究が実施されてきた。Nature Reviews Molecular Cell Biology 1巻、120-130頁 (2000年）及びJournal of Cellular and Molecular Medicine, 12巻、2263-2280頁 (2008年）は、神経細胞のアポトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、虚血、脳卒中及び硬化症のような種々の疾患の原因であること、並びに酸化的ストレス及びミトコンドリアの機能障害を引き起こす神経細胞のアポトーシスの機構に関する研究を通して、神経変性性疾患の予防又は治療の方法が見出されたことを開示している。従って、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を抑制する効果を有する化合物を含む医薬組成物が、上記した疾患の予防又は治療のために使用し得ることは、医薬分野の当業者により明確に理解される。
【００２９】
本発明の１態様に従う医薬組成物は、神経保護のために使用し得る。
ここで使用される用語“神経保護（neuroprotection）”は、アポトーシス又は変性から神経細胞を保護する神経系内の機構を意味し、特に、神経傷害を減少、抑制又は緩和する効果を意味し、また同様に、神経傷害により損傷された神経組織内の神経細胞を保護、
回復又は再生する効果も意味する。加えて、用語“神経保護”は、本発明に関係する当業者により一般的に使用される標準用語である（Neuro Report, 9巻、3955-3959頁(1998年）; Chen, J-F., J. Neurosci., 21巻、RC143頁(2001年））。
【００３０】
ここで使用される用語“神経細胞の保護（protection of neuron cell）”は、神経外傷を減少又は改善する機構或いは神経外傷により損傷された神経細胞を保護又は回復する機構を意味する。加えて、ここで使用される用語“神経外傷（nervous insult）”は、種々の因子（例えば、代謝因子、毒性因子、神経毒性因子及び化学的因子）により引き起こされた神経細胞又は神経組織の損傷を意味する。神経外傷の例は、酸化的ストレス、カルシウム恒常性の異常調節、ミトコンドリアの機能障害、興奮毒性、カスパーゼ活性及び栄養不足を含み得る（Nature Reviews Molecular Cell Biology 1巻、120-130頁(2000年）,
Neurotoxicology and Teratology 24巻、675-682頁(2002年））。該医薬組成物は、これらの種々の神経外傷による神経細胞のアポトーシス又は神経変性を抑制する効果又は該神経外傷から神経細胞を保護する効果を有する。例えば、上記した神経外傷の中で、酸化的ストレは神経細胞のアポトーシス又は変性と関連し、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患（demyelinating diseases）、糖尿病性多発神経障害（diabetic polyneuropathy）、ダウン症候群、ＨＩＶ神経障害、ハンチントン病、多系統萎縮症（multiple system atrophy）、パーキンソン病、脳卒中及び虚血再潅流損傷、タウオパチー(tauopathy）及び外傷性脳損傷（reactive oxygen species）のような種々の疾患を引き起こし得る。
【００３１】
一方、活性酸素種に対する抗酸化酵素の活性の増加が、神経保護の機構の一つであることもまた既知である（Free radical Biology & Medicine, 33巻(2号）、182-191頁(2002年））。従って、該医薬組成物は、活性酸素種の減少を誘導することにより酸化的ストレスを抑制し、それにより神経細胞のアポトーシスを妨げ、よって上記の種々の疾患の予防又は治療のために使用し得る。
従って、該医薬組成物は、神経保護的治療剤として使用し得るが、それは、脳又は脊髄が、虚血、発作、痙攣又は外傷により損傷されることを防止することを意図する医薬品又は化学品である。
【００３２】
本発明の１態様に従う医薬組成物は、神経回復のために使用し得る。
ここで使用される用語“神経回復”は、神経細胞から新しいシナプス連結の形成を促進することにより損傷された神経系を回復することを言及する。該神経回復は損傷された神経細胞にり引き起こされた機能不全の修復を意味し得る。例えば、該神経回復は、周囲の細胞との伝達のための神経細胞からの神経突起の形成及び成長を意味するか又はスパイン（spine）の数を増加することを意味する。
神経系の種々の疾患が神経回復により予防又は治療し得るという事実は本技術分野において周知である。Neurotoxicity Research, 2巻、71-84頁(2000年）は、神経回復において使用される医薬品により、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症及びアルツハイマー病のような特定の疾患の予防又は治療の可能性を開示しており、国際公開第０７／０２２１８２号は、ハンチントン病等のような疾患が、中枢神経系の神経回復により治療され得ることを開示している。
前記のように、神経細胞のアポトーシス又は神経変性は、種々の神経外傷により引き起こされ及び種々の神経変性性疾患に関連するため、本発明の１態様に従う医薬組成物は、種々の神経外傷を阻害することにより該神経変性性疾患を予防又は治療する効果を有し得る。
【００３３】
本発明の１態様に従う医薬組成物は、神経変性性疾患又は虚血若しくは再潅流に関連する疾患の予防又は治療のために使用し得る。
該医薬組成物により治療し得る神経変性性疾患の例は、認知症、ハンチントン病、パー
キンソン病及び筋萎縮性側索硬化症を含み得るが、これらに制限されない。加えて、該医薬組成物により治療し得る、虚血若しくは再潅流に関連する疾患の例は、虚血性脳卒中、一過性虚血発作、心筋虚血、筋虚血及び脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血を含み得るが、これらに制限されない。
【００３４】
本発明の１態様に従う医薬組成物は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択される疾患の予防又は治療のために使用し得る。
【００３５】
本発明の１態様に従って、神経細胞のアポトーシス又は神経変性に関係する疾患を治療する方法であって、該方法は、対象を該医薬組成物と接触させることを含む方法が提供される。
該方法は、対象を該医薬組成物と接触させることを含む、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害する方法を含み得る。
該疾患は、脳卒中、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ピック病、クロイツフェルト・ヤコブ病、パーキンソン−ＡＬＳ−認知症症候群、ウィルソン病、多発性硬化症、進行性核上まひ、神経障害痛に関連する双極性障害、大脳皮質基底核変性症、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、認知症、筋萎縮性側索硬化症、網膜疾患、てんかん、卒中、一過性脳虚血発作、心筋虚血、筋虚血、脳に対する血流の延長停止に関する手術法により生じる虚血、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素症及び鬱病からなる群より選択され得る。
【００３６】
該接触方法は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で遂行でき、接触方法が、生体内で遂行される場合、該方法は該医薬組成物を対象に投与することを含み得る。
該対象は、細胞、組織、器官又は個体であり得る。加えて、該投与方法は、該医薬組成物を好適な緩衝剤中に溶解し、その後、結果として生じた溶液を、細胞、組織又は器官と直接接触させるか又は個体に非経口投与することにより達成され得る。上記の治療方法において使用される医薬組成物及び投与方法の詳細な記載は、既に上記で提供されており、よって、それは過度な複雑性を避けるために、ここでは提供されない。
該医薬組成物が投与される対象は、全ての動物を含み得る。例えば、該動物はヒト、犬、猫、又はマウスであり得る。
【００３７】
本発明の１つ以上の態様が、以下の実施例を参照して更に詳細に記載される。これらの実施例は、単に説明を目的とするだけのものであり、本発明の１つ以上の態様の範囲を制限することを意図するものではない。
【００３８】
図面の簡単な説明
本発明の上記の及び他の特性と利点は、添付図面を参照してその例示的な態様を詳細に記載することにより、更に明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導サルのパーキンソン病の程度を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導サルの内側線条体及び尾側線条体にドーパミン輸送体が存在しているか否かを示す顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの尾懸垂試験結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの線条体内のドーパミン濃度を示したグラフである。
【図５】図５は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの黒質の神経細胞の減少の程度を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の１態様に従う、抗体としてチロシンヒドロキシラーゼを用いる免疫組織化学染色及びクレシル・バイオレット染色により観察される、ＣＢＩが投与された６−ＯＨＤＡ−誘導ラットの黒質緻密部の神経細胞の減少の程度を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたマロネート−誘導マウスの線条体が損傷から回復されるか否かを示す写真である。
【図８】図８は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたマロネート−誘導マウスの損傷した線条体の回復の程度を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞のアポトーシスの程度を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＢｃｌ−２のｍＲＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＢｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質の量の測定結果を示す写真である。
【図１２】図１２は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＢＤＮＦのｍＲＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＧＤＮＦのｍＲＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩで処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のＮＧＦのｍＲＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたマウスのＮＧＦのｍＲＮＡ量の測定結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のミトコンドリアの膜電位を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中の細胞質シトクロムｃの量の測定結果を示す写真である。
【図１８】図１８は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中のカスパーゼ３の活性の測定結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中の活性酸素種の顕微鏡写真である。
【図２０】図２０は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中に存在する活性酸素種を示すグラフである。
【図２１】図２１は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩ及びＭＰＰ+で処理されたＭＡＯ−Ｂ欠損ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞中の、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性の測定結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたマウスの線条体及び黒質中のカタラーゼ、ＳＯＤ及びＧＰｘの活性の測定結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの神経突起であるか否かを示す顕微鏡写真及び分析グラフである。
【図２４】図２４は、本発明の１態様に従う、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスのスパインであるか否かを示す顕微鏡写真及び分析グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
以下、一つ以上の具体例を実施例を通してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、一つ以上の具体例を例示的に説明するためのものであり、発明の範囲がこれらの実施例に制限されるものではない。この関連で、本態様は異なる形態を有し得るものであり、ここに示した記載に限定されるように解釈されるべきではない。従って、該態様は、図を参照することにより、本明細書の観点を説明するためだけに以下に記載されるものである。
【実施例】
【００４１】
実施例１：カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル（式ＩＩ）
式ＩＩ
【化７】
0005904997.tif 000008
１．１．  ４−ベンジルオキシ−ベンズアルデヒドオキシムの合成
４−ベンジルオキシベンズアルデヒド４．２４ｇ（２０ｍｍｏｌ）をエタノール及び水（３：１  １００ｍＬ）の０．２Ｍ混合液に溶解し、続いて撹拌した。ここにＮＨ2ＯＨ−ＨＣｌ  ２．７８ｇ（４０ｍｍｏｌ）及び酢酸ナトリウム２．４６ｇ（30ｍｍｏｌ）を加え、室温で約３０分間撹拌した。続いて、液体クロマトグラフィーにより反応の終結を確認し、水及びエタノールを減圧蒸留して、淡黄色の固体化合物を得た。この淡黄色の固体化合物を水と酢酸エチルで３回抽出し、有機溶媒層を減圧下で乾燥して粗生成物を得、その後、該粗生成物をヘキサン／酢酸エチル（１０：１）で精製して、白色の固体化合物を得た。得られた固体はさらに精製することなく、次の反応に用いた。
【００４２】
１．２．  ［３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イル］−メタノールの合成
４−ベンジルオキシ−ベンズアルデヒドオキシム２．２７ｇ（１０ｍｍｏｌ；９２％純度）を塩化メチレン４０ｍＬ（０．２５Ｍ）に溶解し、その後、結果として生じた溶液に、プロパルギルアルコール１．７７ｍＬ（３０ｍｍｏｌ）を加えた。その後、結果として生じた溶液に、１０％ＮａＯＣｌ  １３．７ｍＬ（２０ｍｍｏｌ）を滴下漏斗を用いて０℃で非常にゆっくり滴下した。ＮａＯＣｌの添加が終了した後、結果として生じた溶液を、温度をゆっくり室温まで昇温しながら約５時間撹拌した。続いて、液体クロマトグラフィーにより反応の終結を確認し、結果として生じた物を減圧蒸留に付して塩化メチレンを蒸発し、残余物に水２００ｍＬを加え、得られた固体をろ過した。ろ過された化合物を大量の水で洗浄し、ジエチルエーテルで洗浄して固体化合物を得た。得られた固体化合物を酢酸エチル／ヘキサン（１：２）で精製して、白色の固体の［３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソオキサゾール−５−イル］−メタノールを得た（収量：２．５ｇ）。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，２００ＭＨｚ）δ７．７（ｄ，２Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），７．１（ｄ，２Ｈ），６．５（ｓ，１Ｈ），５．１（ｓ，２Ｈ），４．８（ｓ，２Ｈ）
【００４３】
１．３．  カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステルの合成
２５０ｍＬフラスコに入れた、ＴＨＦ（５０ｍＬ、０.２Ｍ）及び［３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イル］−メタノール（２．８１３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロスルホニルイソシアネート１．０４ｍＬ（１２ｍｍｏｌ）を−７８℃でゆっくり加えた。続いて、液体クロマトグラフィーにより出発物質が完全に除去されたことを確認した後、水を結果として生じた反応溶液に加えた。１時間後、生じた溶液を減圧蒸留に付して、そこからＴＨＦを蒸発し、結果として生じた物に水１００ｍＬを加え、得られた固体をろ過した。ろ過された固体は水１００ｍＬと酢酸エチル／ヘキサン（１：２）溶液で、それぞれ洗浄し、乾燥して、粗生成物３．４ｇを得た（純度：９５．９％）。該粗生成物を１％メタノールを含む酢酸エチル／ヘキサン／塩化メチレン（１：４：１）溶液で精製して、カルバミン酸３−（４−ベンジルオキシ−フェニル）−イソキサゾール−５−イルメチルエステル（ＣＢＩ）２．７４３ｇを９９％の純度で得た。
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3，２００ＭＨｚ）δ７．７（ｄ，２Ｈ），７．４（ｍ，４Ｈ），７．１（ｄ，２Ｈ），６．６（ｓ，１Ｈ），５．２（ｓ，２Ｈ），５．１（ｓ，２Ｈ），４．８（ｂｒｓ，２Ｈ）
【００４４】
実施例２：ＭＰＴＰ−誘導サルを使用することによるＣＢＩの神経保護効果の確認
１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）は、パーキンソン病患者で観察されるものと類似した臨床的、生化学的及び病理的特徴を誘導すると報告されており、齧歯類及び霊長類のパーキンソン病のための動物モデルを作製するのに広範に使用される神経毒素として既知である（J. Neural Transm., 103巻、987-1041頁(1996年); Neurotoxicol. Teratol. 24巻、607-620頁(2002年)）。ＭＰＴＰは、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ｂにより１−メチル−４−フェニル-ピリジニウム（ＭＰＰ+）に転換され、ＭＰＰ+はドーパミン輸送体（ＤＡＴ）に高い親和性を有し、ミトコンドリアの機能障害及び酸化的ストレスを誘導し、結果としてドーパミンの生成を誘導するドーパミン性ニューロンのアポトーシスを生じる（J. Neurochem., 61巻、1191-1206頁(1993年); J. Neural Transm., 103巻、987-1041頁(1996年); Mov. Disord., 13巻、35-38頁(1998年); Restor. Neurol. Neurosci., 16巻、135-142頁(2000年)）。
実験モデルとして、マカクザル（ｎ＝３５、３ないし４歳）を使用した。該マカクザルサルを３群に分け、各群に０．２ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを静脈注射により投与した（１日１回、毎日、パーキンソン疾患スコアが８に達するまで又は１４日間）。１４日間の投与終了翌日、それぞれ３群に賦形剤（対照群）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリン（米国特許第５，４５７，１３３号に開示されたＲ（＋）−Ｎ−プロパルギル−１−アミノインダン  ラサギリンの製造方法を用いて製造された）を４週間経口投与し、パーキンソン疾患スコアの変化を測定した。加えて、ドーパミン作動薬としてのＣＢＩの効果を確認するために、ＭＰＴＰ−誘導サルモデルから内側線条体及び尾側線条体に存在するドーパミン輸送体をドーパミン輸送体結合分析（dopamine transporter binding assay）に付した。
【００４５】
実施例２−１：パーキンソン病の程度の測定
パーキンソン病の程度は、４つの基準：ａ）可動範囲、ｂ）運動機能低下、ｃ）姿勢異常の程度及びｄ）震えに基づいて、サルの各群のビデオ撮影された行動を分析することにより測定された。パーキンソン疾患スコアは、（４−可動範囲）＋運動機能低下＋姿勢異常の程度＋震えの和により評価された。従って、総合的なパーキンソン疾患スコアの最大値は１０となる。該パーキンソン疾患スコアは２時間にわたって３０分毎に１０分間測定された。即ち、最も高いパーキンソン疾患スコアの最大値は４０である。一方、４つの基準に基づいて遂行される評価方法は以下の通りであり、以下に示す評価スコアは、観察期間を通して観察された代表的な行動を示す：
ａ）可動範囲のスコア：０＝動きなし；１＝頭だけ動く；２＝観察時間の３０％以上を、運動なしに、頭、手足及び／又は胴体を動かす；３＝観察時間の３０％以下を歩く／歩るか、ケージの壁を登る；４＝観察時間の３０％以上を歩く／歩くか、ケージの壁を登る
。
ｂ）運動機能低下のスコア：０＝正常な動きの速度及び正常な動きの開始；１＝動きが若干遅くなる；２＝中程度の遅い動き、動きを開始して維持することが難しい、体が明確に固まる；３＝運動不能、体が持続的に固まり、結果として動けない。
ｃ）姿勢異常の程度のスコア：０＝正常、姿勢が正しい、頭を持ち上げられる、正常なバランス；１＝曲がった胴体、頭を持ち上げられる；２＝曲がった胴体、首及び頭を持ち上げることができない、バランスを失う。
ｄ）震えのスコア：０＝ない；１＝あり。
パーキンソン病の程度の測定結果として、ＣＢＩが投与されたサル群が、パーキンソン病の治療に使用される薬物として既知のラサギリンが投与されたサル群に比して、パーキンソン病の程度が顕著に低くなっていることが確認された（図１参照）。
【００４６】
実施例２−２：ドーパミン輸送体結合の分析
脳を各サル群から摘出し、脳幹をそこから分離し、その後大脳半球を正中線に沿って二等分した。組織を−４５℃でイソペンタン中に浸漬し、急速に冷凍し、その後−８０℃で貯蔵した。大脳半球の冠状切片を、−１７℃において低温保持装置中で２０μｍの厚さで製作し、その後解凍した。解凍された生成物をゼラチンでコートされたスライド上に載置し、スライド上で乾燥し、その後−８０℃で貯蔵した。
ドーパミン輸送体結合のために、［125Ｉ］−（Ｅ）−Ｎ−（３−ヨードプロ−２−フェニル）−２βカルボキシメチル−３β（４'−メチルフェニル）−ノルトロパン（ＰＥ２Ｉ）の放射性元素を用いる標識化が、ドーパミン神経末端を確認するために使用される慣用の方法に従ってスタンニル（stannyl）前駆体から遂行された（D. Guilloteau等, 1998年）。結果として生じた物を精製して、２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌの活性を有する、［125Ｉ］ＰＥ２Ｉの輸送体が添加されない形態（no-carrier-addedform）を得た。関連技術で開示された方法を使用することにより、大脳半球の冠状切片を、ｐＨ７．４のホスフェート緩衝液（ＮａＨ2ＰＯ4  １０．１４ｍＭ、ＮａＣｌ  １３７ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4  １．７６ｍＭ）中の１００ｐＭ［125Ｉ］ＰＥ２Ｉを用いて、９０分間２５℃で培養した（S. Chalon等, 1999年; E. Bezard等, 2001年）。隣接した切片を１００のコカイン（Sigma, St Louis, MO）の存在下で培養して、非特異的結合を確認した。培養後、切片を４℃で２０分間、ホスフェート緩衝液で２回洗浄し、４℃で蒸留水で１秒間濯いだ。得られた切片を室温で乾燥し、その後Ｘ線カセット中の調整にされた［125Ｉ］−マイクロスケール（Amersham）と一緒に、β放射能−敏感性フィルム（Hyperfilm s max, Amersham, Buckingamshire, UK）に３日間露出して、所望の領域に結合された放射能を測定した。
図２で示されるように、ＣＢＩが投与されたサル群は、それらの中央線条体及び尾側線条体中に多数のドーパミン輸送体を提示し、ＣＢＩと同量のラサギリンが投与されたサル群により提示されたものより顕著に多い量のドーパミン輸送体を提示した。この結果は、ＣＢＩがドーパミン性ニューロンのアポトーシスを效果的に阻害し、それにより、ＭＰＴＰによるドーパミン輸送体の損失が、対照群又はラサギリンが投与されたサル群よりも相対的に少ないことを示す。この結果から、ＣＢＩが、パーキンソン病の進行を阻害することを含む、神経保護を実行できることが確認された。
【００４７】
実施例３：ＭＰＴＰ−誘導マウスモデルを用いるＣＢＩの神経保護効果
実験モデルとして、Ｃ５７ＢＬ/６マウス（ｎ＝９４、８週齢；雄性）を使用した（亜株：C57BL/6NCrljBgi, ORIENT BIO INC.）。該マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを腹腔内注射により１日１回、４日間投与し、最終投与日から４日後に、該マウスを３群に分け、賦形剤（対照群）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリンに、それぞれ１日１回、１０日間経口投与した。最終投与翌日、尻尾懸垂テスト（ＴＳＴ）を各群に行い、線条体（striatum）と黒質脳組織を各群のマウスから摘出し、それにより線条体におけるドーパミン及びその代謝産物の濃度及び黒質（substantia nigra）における神経細
胞の減少の程度を測定した。
【００４８】
実施例３−１：尻尾懸垂テストによるマウスの行動分析
ＭＰＴＰ及び薬物投与による行動損失の誘発の程度を測定するために、尻尾懸垂テストを行った。ＴＳＴは、前記の化合物をそれぞれ３群に投与した７日後に、幅１ｃｍの円形ステンレス棒を３５ｃｍ高さにある左右が黒色の木材で遮蔽された幅１６ｃｍ、高さ４０ｃｍのケージに固定するという方法で遂行された。マウスの運動時間を秒単位で６分間測定し、それにより該化合物の効能を評価した。
ＴＳＴ分析の結果として、ＭＰＴＰが投与されたマウス群は有意な行動損失を示したものの、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウス群は正常マウスと同じ程度の行動を示し、ラサギリンが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウス群と比べて優れた行動回復能力を示すことが確認された（図３参照）。
【００４９】
実施例３−２：線条体内のドーパミン及びその代謝産物の量の測定
上記のＭＰＴＰ及び化合物の投与に従って線条体内のドーパミン及びそのドーパミン代謝産物の量の変化を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した。上記の化合物をそれぞれ３群に投与した７日後、各群のマウスを頚椎脱臼により犠牲し、直ちに脳組織を摘出した。該脳組織から線条体を採取し、０．５ｍＬのＨＰＬＣ分析希釈液（０.１Ｍの過塩素酸、０.１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を線条体に添加し、その後、超音波処理装置を使用して組織ホモジネートを調製した。該ホモジネートを１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をニトロセルロース膜ろ紙（０．２μｍ、ミリポア）でろ過した。ＨＰＬＣ分析のために、ＨＲ−８０カラム（８０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径：３μｍ、ＥＳＡ、ＵＳＡ）を使用し、移動相（０．０７Ｍ  リン酸二水素ナトリウム、１ｍＭ  オクタスルホン酸ナトリウム、０.１μｍ  ＥＤＴＡ、５％アセトニトリル、ｐＨ３．２）の流速を０．７ｍＬ／分に保持し、電気化学検出器（Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩＩ、ＥＳＡ、ＵＳＡ）の電極電位はＥ１＝−１００ｍＶ、Ｅ２＝３５０ｍＶとした。
実験を通して線条体内のドーパミン濃度を分析した結果として、ラサギリンが投与されたマウス群は正常マウスに比べて約４０％のドーパミン濃度の回復を示したが、一方、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウス群は正常マウスに比べて約７０％のドーパミン濃度の回復を示したことが確認された（図４参照）。
【００５０】
実施例３−３：チロシンヒドロキシラーゼの抗体を用いる免疫組織化学染色
上記の化合物の投与に従う線条体及び黒質中のチロシンヒドロキシラーゼ（tyrosine hydroxylase）に対する抗体の発現における変化を、免疫組織化学染色により測定した。各群のマウスをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、該マウスの胸廓を開け、心臓内へ２００ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を潅流し、それにより血管内の血液を除去した。血液を十分に除去した後、２５０−３００ｍＬの４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ固定液を心臓内へ潅流し、脳を摘出し、該脳を２４時間冷蔵条件でパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ固定液で後固定（postfixation）に付した。続いて、該脳組織をＰＢＳで十分に洗浄して固定液を除去し、凍結の間の氷の結晶（ice crystal）の生成を防止するために、得られた脳組織を３０％スクロース溶液中に収納し、それが沈むまでその中に貯蔵した。得られた組織を凍結用包埋剤（OCT compound）で包埋し、−４０℃で冷凍し、クリオスタット（Ｃｒｙｏｓｔａｔ）（Reichert Frigocut model 2000）を使用して、線条体と黒質を含む中脳領域の連続冠状切片を、厚さ４０μｍで製作した。該冠状切片を３０分間３％Ｈ2Ｏ2／ＰＢＳ中に維持し、その後３０分間０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び３％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍ  ＰＢＳ中に維持された。ドーパミンを含む細胞を選択的に染色するために、該切片を室温で一夜、１次抗体としての抗−マウスモノクロナールＴＨ（Chemicon International, Temecula, CA; 1:500）と反応させ、ビオチン化されたヤギ−抗−マウスＩｇＧ（Vector Lab, Burlingame, CA, 1:200）を２次抗体として使用した。続いて、アビジン−ビオチン結合を、Ｖｅｃｔａｓｔａ
ｉｎ  ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Vector Lab, Burlingame, CA）を使用して誘導し、該組織において、３，４−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して顕色を遂行した。得られた組織をＰＢＳに入れ、スライドガラス上に載せ、得られたものを乾燥し、その後、カバーガラスでカバーした。得られたものにおける中脳領域の黒質を、２００倍の倍率で、デジタルカメラ付き顕微鏡（オリンパス BX-60, オリンパス光学, 東京, 日本）を使用して観察し、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体に陽性反応を示す細胞を観察し、記録し、Graph pad Prism 4 programを用いて統計分析（一元配置分散分析（One-way ANOVA））を実施した。
上記のように、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いる免疫組織化学染色により、黒質中の神経細胞における減少の程度を分析した結果として、ＣＢＩが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの群は、ラサギリンが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの群と同程度の黒質中の神経細胞の減少の程度を示した（図５参照）。この結果から、ＣＢＩがドーパミン作動薬として機能し、それにより神経保護の遂行が可能となり、ドーパミン作動薬として従来既知であるラサギリンより優れた効果を有することが確認された。
【００５１】
実施例４：６−ＯＨＤＡ−誘導ラットモデルを用いることによるＣＢＩの神経保護効果の確認
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）は、ヒドロキシルラジカルの生成を増加させ、それにより黒質及び線条体の神経細胞の変性を誘導する神経毒素として既知である。ヒドロキシルラジカルは、神経細胞の末端部分を迅速に破壊（J. Neural. Transm., 103:987-1041(1996); J. Neurosci., 19:1284-1293(1999)）し、それにより黒質緻密部（ＳＮｐｃ）中の細胞の漸進的な損失を引き起こし、そのような損失は、初期のパーキンソン病患者において観察される黒質及び線条体の漸進的な変性と類似することが知られている（Brain Res., 26巻、301-307頁(1991年); Neurosci., 59巻、401-415頁(1994年); Neurosci., 67巻、631-647頁(1995年);  Neurosci., 72巻、641-653頁(1996年)）。
実験モデルとして、ORIENT BIO INC.により供給されたウィスターラット（賦形剤及びＣＢＩ  ｎ＝７、ラサギリン  ｎ＝６；６週齢；２０匹の雄性ラット）を用いた。２０μｇ／μＬの６−ＯＨＤＡを含む溶液３μＬの片側注射を、各ラットの線条体（位置：前面−１．０ｍｍ、背面−３．０ｍｍ、後腹部面−５．０ｍｍ）において行い、それにより線条体内の神経細胞の変性を誘導した。ラットを３群に分け、賦形剤（対照群）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリンを、６−ＯＨＤＡ投与１時間前及び１日おきに１回で６週間、それぞれ３群に経口投与した。最終投与日から４週、５週及び６週後に、アポモルヒネ−誘導回転試験を各群において行った。アポモルヒネ−誘導回転試験は、各群のラットに０．５ｍｇ／ｋｇのアポモルヒネを腹腔内注射により投与し、各群のラットを回転チャンバーに置き、その回転動作を４５分間記録し、それにより各群のラットの１分当りの回転数を測定してその平均値を決定するという方法で遂行した。加えて、アポモルヒネ−誘導回転試験を遂行した後、最終投与日から６週間後、各群のラットを犠牲し、それにより黒質緻密部の神経細胞における減少の程度を、チロシンヒドロキシラーゼに対する抗体を用いる免疫組織化学染色及びクレシル・バイオレット染色を使用して確認した。上記の実施例３−３に記載されたようにして、黒質を含む中脳領域の連続冠状切片を製作し、該切片をＰＢＳに入れ、得られた切片をシランでコートされたスライドガラスに装着して乾燥し、該スライドガラスをキシレン、１００％アルコール、９５％アルコール、７０％アルコール及び蒸留水中に、それぞれ５分、２分、１分、１分及び２分間入れた。続いて、得られたスライドガラスを１％クレシル・バイオレット溶液に５分間浸漬し、蒸留水、７０％アルコール、９５％アルコール、１００％アルコール及びキシレンで、それぞれ２分、１分、１分、２分及び５分間洗浄し、該スライドガラスをカバーガラスでカバーし、デジタルカメラ付き顕微鏡（オリンパス BX-60, オリンパス光学, 東京, 日本）を用いて観察した。中脳領域の黒質を２００倍の倍率で観察し、クレシル・バイオレットに対して陽性反応を示す細胞を観察して記録し、その後Graph pad Prism 4 programを用いて統計分析（一元配置分散分析（One-way ANOVA））を行った。
図６に示されるように、ＣＢＩが投与された６−ＯＨＤＡ−誘導ラットの群は神経細胞の減少において顕著に減少された程度を示し、ラサギリンが投与された６−ＯＨＤＡ−誘導ラットの群に対して優れた効果を有することが確認された。
【００５２】
実施例５：マロネート−誘導マウスモデルを用いることによるＣＢＩの神経保護効果の確認
マロネートは、ミトコンドリアの酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼの可逆的な阻害剤であり、ミトコンドリアの電子伝達系を抑制して興奮毒性ニューロンの変性を誘導するか、または線条体からのドーパミン放出を増加させて、線条体の損失を引き起こすことが知られている。ミトコンドリアにおける生体エネルギー欠乏は、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病及び筋萎縮性側索硬化症のような種々の神経変性性疾患の病理現象と関連しており（Ann. Neurol., 58巻、495-505頁(2005年); Nat. Rev. Neurosci., 7巻、278-294頁(2006年)）、動物の線条体中へのマロネートの注入は、局所虚血やハンチントン病において観察されるものと類似した損失を引き起こす（Experimental Neurology, 178巻、301-305頁(2002年)）。これは、神経細胞の幾つかの群に代謝ストレスを引き起こし、結果として黒質ドーパミン細胞及び線条体の両方の細胞体のドーパミン量が減少する（J. Neurochem., 61巻、1147-1150頁(1993年); Brain Res., 773巻、223-226頁(1997年); Neuroscience, 96巻、309-316頁(2000年)）。
実験モデルとして、ＩＣＲマウス（ｎ＝３４、１０週齢；雄性）を用いた。各マウスにエクテシン５ｍＬ／ｋｇを腹腔内注射で投与して麻酔し、定位装置の二つの水平調節器を両方の外耳道から０ｍｍに固定し、該定位装置中でマウスの頭蓋骨を穿孔した。対照群として０．２ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸を用い、マロネート２．４ｕｍｏｌｅ／２を病変群及び化合物処理群へ、右側線条体（ブレグマ）から、前（ＡＰ）へ０．５ｍｍ、横（ＭＬ）へ１．２ｍｍ、硬膜から下（ＤＶ）へ３．１ｍｍにおいて、１μＬ／分の速度でハミルトン注射器（１０μＬ、２６Ｇ針）を用いて注入した。マロネートが投与された群を２群に分け、０．５ｍＬ／ｋｇの賦形剤（ｎ＝１２）及び５ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ（ｎ＝１４）を、それぞれ２群へ手術２時間前に腹腔内注射により投与し、再度、手術後１時間、1日、２日及び３日、即ち、全部で５回投与した。マロネートをマウスの線条体に注入し、該マウスを３日後に犠牲し、該マウスの脳を摘出して切片を製作した。その後、該切片を、２，３,５−トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）で染色した。
図７及び図８で示されるように、ＣＢＩがマロネートにより誘導された線条体中の神経細胞のアポトーシスを抑制し、それにより線条体の損傷された領域が顕著に減少することが確認された。従って、該結果は、ＣＢＩがミトコンドリアの損傷により引き起こされる神経細胞のアポトーシスを緩和することを示す。
【００５３】
実施例６：神経細胞の抗−アポトーシスによるＣＢＩの神経保護効果の確認
脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスにより特徴付けられ（The New England Journal of Medicine, 348巻、1365頁(2003年)）、慢性の神経変性性疾患は幾つかの内的又は外的因子によるアポトーシス経路の誘導により引き起こされることが知られている。神経細胞のアポトーシスにおいて引き起こされる生化学的、分子生物学的変化を説明するために、神経細胞のアポトーシスの幾つかの段階において多角的な機構を示す物質又は神経保護薬物の治療を捜す取り組みが行われてきた（CNS drugs, 19巻、723頁(2005年); Nat. Rev. Neurosci., 7巻295頁(2006年)）。
図６ないし１０を参照して、ＣＢＩが幾つかの内的又は外的因子により引き起こされる神経細胞のアポトーシスを阻害し、それにより神経変性性疾患において治療効果を示すことが確認される。
この態様において、ＭＡＯ−Ｂ欠損のヒト神経芽腫（neuroblastoma）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（韓国細胞株銀行）を用いた。該ヒト神経芽腫細胞のアポトーシスは血清飢餓（serum starvation）によって誘発された。正常培地中で培養されたＭＡＯ−Ｂ欠損のヒト神経
芽腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を６−ウェルプレートに１．８×１０5細胞数／ウェルの濃度で分注し、１日間培養した後、該培地を、ＣＢＩ（０．１、１及び１０）を含む無血清培地、ラサギリン（０．１、１及び１０）を含む無血清培地又は前記ＣＢＩ又はラサギリンをいずれも含まない無血清培地に交替し、該細胞を更に３７℃で４８時間５％のＣＯ2中で培養した。続いて、神経細胞のアポトーシスを引き起こさなかった対照群と比較して、死滅細胞の数を百分率で示した。
図９で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞にＣＢＩが投与されたとき、神経細胞のアポトーシスの程度が減少したことが確認された。特に、アポトーシスが誘発された神経細胞に１０のＣＢＩが投与されたとき、アポトーシスが誘発された神経細胞に１０のラサギリンが投与された場合よりも、神経細胞のアポトーシスのより高い減少の程度、即ち、約３３％の減少の程度を示すことが確認された。
一方、アポトーシスを媒介又は阻害するための方法において、種々の情報伝達タンパク質が含まれ、その代表的な例は、Ｂｃｌ−２遺伝子ファミリータンパク質である（Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 37巻、179-190頁(2005年); J. Cell Mol. Med.,
7巻、249-257頁(2003年); Genes and Development, 13巻、1899-1911頁(1999年)）。従って、前記のように、０．１、１及び１０のＣＢＩ又は０．１、１及び１０のラサギリンをそれぞれアポトーシスが誘発された細胞へ添加し、得られた細胞を更に３７℃で２４時間５％のＣＯ2中で培養し、ｍＲＮＡを該培養細胞から抽出するか、又は細胞抽出物をそこから得て、それによりＢｃｌ−２ｍＲＮＡの量及びＢｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬタンパク質の量を測定した。Ｂｃｌ−２ｍＲＮＡの量は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定し、Ｂｃｌ−２とＢｃｌ−ｘＬタンパク質量はウェスタンブロット法にり測定した。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の総ＲＮＡを、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を無血精培地で２４時間、ＣＢＩ又はラサギリンで処理した後、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉＫｉｔ（Qiagen）を用いて抽出した。２μｇの総ＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Applied  Biosystems）を用いて逆転写し、Ｂｃｌ−２に対するＴａｑＭａｎプローブ（Applied Biosystems,USA）でリアルタイムＰＣＲ（(Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR SYSTEM）を行った。内部対照として、１８Ｓ
ＲＮＡに対するｍＲＮＡを増幅した。標的遺伝子のｍＲＮＡ水準の相対的な定量はｄｄＣｔ方法（Takekawa, 1998）により決定した。
ウェスタンブロット法のために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．４、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で溶解し、その後、遠心分離して細胞抽出物を得た。続いて、該細胞抽出物を定量化し、同量の細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷し、電気泳動した後、該ゲルをニトロセルロース膜に移し、該膜を、それぞれ、本技術分野において周知の方法を用いることにより１：５０００に希釈された、Ｂｃｌ−２に対する抗体（Cat#: 2872, Cell Signaling, USA）及びＢｃｌ−ｘＬに対する抗体（Cat#: 2762, Cell Signaling, USA）を用いてブロットし、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬタンパク質の発現量を、ＥＣＬキット（Amersham Pharmacia）を用いて確認した。対照群としては、β−アクチンに対する抗体（(Cat#: A2228, Sigma, USA）を対照として使用し、β−アクチンタンパク質の発現量を確認した。
図１０及び図１１で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞にＣＢＩが投与された場合、抗−アポトーシスの機能を有するＢｃｌ−２のｍＲＮＡの量は、対照よりも１．５ないし２倍多く、Ｂｃｌ−２タンパク質の量もまた、対照よりも１．５ないし２倍多いことが確認された。加えて、別の抗−アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−ｘＬの量もまた、対照よりも多いことが確認された。該結果から、ＣＢＩが神経細胞のアポトーシスを阻害する効果を有し、これにより神経保護効果を有することが確認された。
【００５４】
実施例７：神経栄養因子の発現誘導によるＣＢＩの神経保護効果の確認
神経栄養因子は、神経細胞の発達、再生、治癒において重要な役割を果すタンパク質で、神経栄養因子の例は、脳−由来神経栄養因子（（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄
養因子（ＧＤＮＦ）及び神経成長因子（ＮＧＦ）を含む。該神経栄養因子の誘導は、神経細胞のアポトーシスの阻害を可能とする（Nature medicine, 15巻、331-337頁(2009年); Brain Research Bulletin, 57巻、817-822頁(2002年); The Journal of Neuroscience, 21巻、8108-8118頁(2001年); The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 322巻、59-69頁(2007年); TRENDS in Pharmacological Sciences, 27巻、619-625頁(2006年)）。
実施例６と同様の方法を用いることにより、０．１、１及び１０のＣＢＩ又は０．１、１及び１０のラサギリンを、それぞれ、アポトーシスが誘発された細胞に添加し、得られた細胞を、更に３７℃で２４時間５％のＣＯ2中で培養し、該培養細胞からｍＲＮＡを抽出し、それにより、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びＮＧＦのｍＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
図１２ないし図１４で示されるように、アポトーシスが誘発された神経細胞をＣＢＩで処理した場合、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ及びＮＧＦのｍＲＮＡ量は、それぞれ、対照よりも１．５ないし２倍、４ないし８倍及び２ないし２．５倍多いことが確認された。
加えて、神経栄養因子がＣＢＩの処理により誘導されるか否かをｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１２、８週齢の雄性、ORIENT BIO INC.）を使用した。該マウスを３群（各群ｎ＝４）に分け、賦形剤（対照）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリンに、神経毒素の処理を行うことなく、それぞれ３群に１日に１回、８日間経口投与し、最終投与翌日に、各群のマウスから線条体及び黒質組織を摘出した。摘出された組織の細胞からｍＲＮＡを抽出し、それにより、ＮＧＦのｍＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
図１５で示されるように、マウス群がＣＢＩで処理された場合、線条体中のＮＧＦのｍＲＮＡ量が、他のマウス群よりも、約１．７倍ないし２．５倍多いことが確認された。特に、マウス群がＣＢＩで処理された場合、線条体中のＮＧＦの発現が、ラサギリンで処理されたマウス群においてより、顕著に高いことが確認された。該結果は、ＣＢＩが神経細胞の神経栄養因子の発現を誘導し、それにより神経細胞のアポトーシスを阻害し得ることを示す。
【００５５】
実施例８：神経細胞中のミトコンドリアの機能向上によるＣＢＩの神経保護効果の確認
この態様において、ＭＡＯ−Ｂ欠損ヒト神経芽種ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（韓国細胞株銀行）を用いた。該細胞を３７℃で２４時間、５％のＣＯ2でＤＭＥＭ培地中で培養した。培養された細胞を５群に分け、各群に２ｍＭの１−メチル−４−フェニルピリジニウム（ＭＰＰ+）を添加し、該５群の３群に、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ及び５０ｎＭのＣＢＩで処理し、他の２群の一方を１０ｎＭのラサギリンで処理し、ＣＢＩ又はラサギリンで処理された４群を、更に３７℃で２４時間、５％のＣＯ2中で培養した。そこへＭＰＰ+だけが添加された１群を上記と同じ条件で培養した。続いて、製造業者のプロトコルに従って、ＭｉｔｏＰＴｔｍキット（Immunochemistry Technology社）を用いて、ミトコンドリアの膜電位（transmembrane potential）を決定した。ミトコンドリアの膜電位は蛍光プレートリーダー（Tecan社, Austria）を用いて確認した。ミトコンドリアの膜電位が低い場合、緑色蛍光を表示し、一方、それが高い場合、赤色蛍光を表示する。よって、ＲＦＵ値（赤色蛍光値／緑色蛍光値）を該結果から決定し、該結果を図１６に示した。
ＭＰＰ+は、ミトコンドリアの膜電位を下げ、それによりミトコンドリア膜の不安定性を誘導する。ミトコンドリア膜の透過性上昇（membrane permeabilization）は、アポトーシスの過程において必須であり、よって、ミトコンドリア膜の安定性は、抗−アポトーシスの機構となり得る（Brain Res. Rev., 29巻、1-25頁(1999年)）。図１６で示されるように、神経細胞にＭＰＰ+が添加された場合、ミトコンドリアの膜電位は、ＣＢＩの処理により濃度依存的に安定化され、ミトコンドリアの膜電位の安定化効果は、ＣＢＩと同じ濃度のラサギリンで処理された神経細胞の群においてより、約２倍以上高いことが確認された。
上記のように、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、ア
ルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスにより特徴付けられ（The New England Journal of Medicine, 348巻、1365頁(2003年)）、神経細胞のアポトーシスは幾つかの内的又は外的因子によるアポトーシス経路の誘導により引き起こされる。加えて、ミトコンドリアの膜の安定性は、抗−アポトーシスの機構であり、神経細胞のアポトーシスがＢｃｌ−２又はＢｃｌ−ｘＬタンパク質により阻害され、ミトコンドリア膜が該タンパク質により安定化されることは既知である。（Biochem Biophys Res Commun., 304巻(3号)、433-435頁(2003年); N Engl J Med., 348巻(14号)、1365-1375頁(2003年); Brain Res Rev., 29巻(1号)、1-25頁(1999年); Journal of
Neurological Sciences, 283巻、240-320頁(2009年)）。従って、該結果は、ＣＢＩがミトコンドリアの膜電位を安定化し、それにより上記の神経変性性疾患を予防又は治療し得ることを示す。
加えて、アポトーシスは、ミトコンドリアからシトクロムｃの放出及びカスパーゼ３の活性化の機構により引き起こされることが知られている（The New England journal of Medicine, 348巻、1365-1375頁(2003年)）。ＣＢＩの処理によるミトコンドリアの膜電位の安定性が神経細胞の抗−アポトーシスと関連するか否かを確認するために、細胞抽出物を細胞群から得、それにより、細胞質内のシトクロムｃの量及びカスパーゼ３の活性を測定した。
【００５６】
実施例８−１：シトクロムｃの放出の測定
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実施例７に記載したのと同様の条件下で培養し、その後、ＰＢＳで洗浄した。高浸透圧緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Roche）を添加し、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を得られた溶液の１００μＬで処理し、その後、均一に懸濁した。得られたものを氷上に３０分間放置し、その後、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。続いて、該上清の同量をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷した後、電気泳動し、該ゲルをニトロセルロース膜に移し、該膜を、本技術分野において周知の方法を用い、１：２０００に希釈されたシトクロムｃ（Santacruz, sc13156）を使用してブロットし、シトクロムｃの発現をＥＣＬキット（Amersham Pharmacia）を用いて評価した。
図１７で示されるように、神経細胞にＭＰＰ+が添加された場合、細胞質内のシトクロムｃの量がＣＢＩの処理により減少し、ミトコンドリアから放出されたシトクロムｃの量が、ＣＢＩと同量のラサギリンで処理されたＭＰＰ+が添加された神経細胞の場合よりも少ないことが確認された。
【００５７】
実施例８−２：カスパーゼ３／７の活性の測定
上記と同様の条件下、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を５×１０5細胞数／ウェルの濃度で、９６ウェル−プレート中で培養し、該細胞を２ｍＭのＭＰＰ+及びＣＢＩ（１、５、１０及び５０ｎＭ）又はラサギリン（５０ｎＭ）で処理し、得られた細胞を２４時間培養した。続いて、１００μＬのＡｐｏ−ＯＮＥカスパーセ３／７試薬（Promega, G7790）をそこへ添加して一緒に混合し、得られたものを更に４時間培養した。培養終了後、蛍光プレートリーダー（GeminiXPS, Molecular Devices）を使用することにより、励起（excitation）波長４９５ｎｍ及び発光（emission）波長５２１ｎｍで蛍光を測定した。図１８で示されるように、カスパーゼ３の活性がラサギリンで処理された細胞の場合と同様に、ＣＢＩの処理により減少されたことが確認された。
実施例８の結果から、ＣＢＩが神経細胞中のミトコンドリア膜を安定化し、それによりミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を防止し、従ってカスパーゼ３の活性を減少し、それにより細胞のアポトーシスを阻害することが確認された。
上記したように、脳卒中、脳損傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病及びパーキンソン病のような多くの神経変性性疾患は、神経細胞のアポトーシスのより特徴付けられ、よって、該結果は、ＣＢＩが神経細胞のアポトーシスを阻
害し、それにより前記神経変性性疾患を予防又は治療し得ることを示す。
【００５８】
実施例９：神経細胞の活性酸素種を阻害することによるＣＢＩの神経保護効果の確認
この態様において、ＭＡＯ−Ｂ欠損ヒト神経芽種ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（韓国細胞株銀行）を用いた。該細胞を３７℃で２４時間、５％のＣＯ2でＤＭＥＭ培地中において培養した。培養された細胞を３群に分け、各群に２ｍＭのＭＰＰ+を添加し、該３群のうちの１群を５０ｎＭのＣＢＩで処理し、他の２群の一方を５０ｎＭのラサギリンで処理し、該３群を更に、３７℃で２４時間、５％のＣＯ2で培養した。そこにＭＰＰ+だけが添加された群を、前記と同じ条件下で培養した。続いて、該細胞を、活性酸素種を検出可能な蛍光染料である２，７−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ）で染色し、その後、共焦点顕微鏡（株式会社ニコン、日本）を用いて観察した。
図１９及び図２０で示されるように、神経細胞にＭＰＰ+が添加された場合、活性酸素種は、ＣＢＩと同じ濃度のラサギリンで処理されたＭＰＰ+が添加された神経細胞の場合と同様に、ＣＢＩの処理により顕著に減少した。
細胞中の活性酸素種の発生及び増加は、アポトーシスを誘導することが知られており、よって、上記の結果から、ＣＢＩが活性酸素種の減少を誘導し、それによりアポトーシスを阻害することが確認された。このような酸化的ストレスは、神経細胞のアポトーシス又は神経変性性疾患と関連する種々の疾患、例えば、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患（demyelinating diseases）、糖尿病性多発神経障害（diabetic polyneuropathy）,ダウン症候群、ＨＩＶ神経障害、ハンチントン病、多系統萎縮症（multiple system atrophy）、パーキンソン病、脳卒中及び虚血再潅流損傷、タウオパシー（tauopathy）及び外傷性脳損傷を引き起こすことが知られており（Free radical Biology & Medicine, 33(2):182-191(2002)）、よって、該結果は、ＣＢＩが活性酸性種の減少を誘導し、それにより酸化的ストレスを阻害し、従って神経細胞のアポトーシスを防止し、よって種々の神経変性性疾患の予防又は治療のために使用されることを示す。
【００５９】
実施例１０：抗酸化酵素の活性増加によるＣＢＩの神経保護効果の確認
この態様において、ＭＡＯ−Ｂ欠損ヒト神経芽種ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（韓国細胞株銀行）を用いた。該ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１．８×１０5細胞数／ウェルの濃度で６−ウェルプレート中に分注し、その後、３７℃で２４時間５％のＣＯ2で培養した。得られた細胞を３群に分け、各群に２ｍＭのＭＰＰ+を添加し、該３群のうちの２群をそれぞれ０．１で処理し、得られたものを更に３７℃で２４時間、５％のＣＯ2で培養した。ＭＰＰ+で処理されなかった対照群を上記と同様の条件下で培養した。続いて、細胞抽出物を該細胞から得、これにより抗酸化酵素、即ち、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を測定した。
図２１で示されるように、ＭＰＰ+が添加された神経細胞は、ＭＰＰ+が添加されなかった細胞群に比べて、カタラーゼ及びＧＰｘの活性が減少する傾向を示し、ＣＢＩで処理されたＭＰＰ+が添加された神経細胞は、抗酸化酵素の減少された活性において増加を示した。特に、ＧＰｘの活性が対照においてよりも約２．５倍ないし４倍高かったことが確認された。
加えて、抗酸化酵素の活性がＣＢＩの処理により増加するか否かをｉｎ  ｖｉｖｏで確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１２）、８ないし９週齢の雄性）を用いた（ORIENT BIO INC.）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを３群（各群ｎ＝４）に分け、賦形剤（対照）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリンを、それぞれ３群に、神経毒素の処理することなく、８日間経口投与し、最終投与翌日に、各群のマウスから線条体及び黒質組織を摘出した。細胞抽出物を該組織の細胞から得、これにより、カタラーゼ、ＳＯＤ及びＧＰｘの活性を測定した。
図２２で示されるように、ＣＢＩが投与されたマウスの群において、ＳＯＤの活性における顕著な変化はなかったが、しかし、カタラーゼの活性は線条体において約１３％上昇し、ＧＰｘの活性は黒質において約２８％上昇した。
細胞中の活性酸素種の発生及び増加は、アポトーシスを誘導することが知られており、また、抗酸化酵素は該活性酸素種を分解することが知られており、よって、該結果から、ＣＢＩが神経細胞中の抗酸化酵素の活性、特に、黒質中のＧＰｘの活性を増加し、それにより、活性酸素種の減少を誘導し、従ってアポトーシスを阻害できることが確認された。加えて、該結果は、ＣＢＩが活性酸性種の減少を誘導し、それにより酸化的ストレスを阻害して神経細胞のアポトーシスを防止し、よって上記の種々の疾患の予防又は治療のために使用し得ることを示す。
【００６０】
実施例１１：ＣＢＩの神経細胞回復効果の確認
実験モデルとして、Ｃ５７ＢＬ/６マウス（ｎ＝８／群（計４群）、８週齢；雄性）を用いた（亜株: C57BL/6NCrljBgi, ORIENT BIO INC.より入手可能）。３０ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを該マウスに腹腔内注射により１日１回、４日間投与し、最終投与日から４日後、該マウスを３群（ｎ＝４）に分け、賦形剤（対照）、１ｍｇ／ｋｇのＣＢＩ及び１ｍｇ／ｋｇのラサギリンをそれぞれ、該３群に１日１回、１０日間経口投与した。最終投与翌日に、線条体及び黒質組織を各群のマウスから摘出した。該組織中の神経突起の数及び神経細胞当たりのスパイン（spine）の数が増加するか否かを観察するために、ビブラトーム（vibratome）を用いて線条体又は黒質を含む２００μＭの厚さの冠状スライスを製作した。各群のマウスを犠牲し、各群から脳を摘出し、その後、カルボゲン（carbogen）（５％ＣＯ2及び９５％Ｏ2）でバブルリングされた冷たい高濃度のスクロース解剖緩衝液（８７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、１．２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  デキストロース、及び７５ｍＭ  スクロース）中に置いた。ビブラトームを遂行する間、スライスチャンバーをカルボゲン化されたスクロース解剖緩衝液で均一に満たした。スライス工程が完了した後、全スライスをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ溶液中４％のパラホルムアルデヒドで固定した。固定された脳スライスを、１．５％アガロース（ＰＢＳ中）ブロック上に置いた。その写真をＺｅｉｓｓ  ＬＳＭイメージブラウザソフトウェア（Carl Zeiss Microimaging, Germany, version 4.0 SP2）を用い、共焦点蛍光顕微鏡（ZEISS LSM 510 META）を使用して得た。
図２３及び図２４で示されるように、ＭＰＴＰ−誘導マウスがＣＢＩで処理された場合、神経突起の数が増加し、スパインの数もまた正常細胞の水準まで回復した。特に、ラサギリンが投与されたＭＰＴＰ−誘導マウスの群の場合、スパインの数の増加は観察されたが、しかし、神経突起における増加は統計的有意性を示さなかった。該結果から、ＣＢＩがアポトーシスを阻害し、同様に、神経可塑性（neural plasticity）を促進する効果も有することが確認された。
【００６１】
実施例１２：ＣＢＩの投与及びＣＢＩを含む錠剤の製造（予想）
本発明に従う医薬組成物は、神経細胞のアポトーシス又は神経変性を阻害するか、又は神経保護若しくは神経回復において使用される。該医薬組成物の臨床的に好適な投与量（経口投与）は、成人において２５ｍｇないし１００ｍｇである。
該投与量に基づいて、以下の表１で示された成分を含む錠剤を、通常的な方法を使用して製造した。賦形剤としてアビセル（Avicel）１０２（微細結晶形セルロース）を使用した。
【表１】
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該成分の好適な投与量は、体重６０ｋｇの成人のために、１日当り該成分を含む錠剤１個又は２個である。
本発明の１つ以上の態様に従って、医薬組成物は神経細胞のアポトーシス又は神経変性と関連する疾患を效果的に予防又は治療し得る。
本発明は、その例示的な態様を参照して具体的に示され及び記載されているが、以下の請求項により定義される本発明の精神及び範囲から逸脱すること無く、様々な変更及び修正がなされ得ることは当業者により理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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