(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３またはそのＢ群類似体；
配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号７またはそのＢ群類似体；
配列番号９またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号７またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号１１またはその類似体；ならびに
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号７またはそのＢ群類似体および配列番号１１またはその類似体；
から選択されるイントロンのない核酸配列によってコードされる酵素の少なくとも１つの活性が、野生型と比べて低下していることを特徴とする、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞であって、
前記Ｂ群類似体とは、各配列番号に記載の配列と少なくとも９０％以上同一であって、かつ、各配列番号によってコードされる酵素の活性を有する酵素をコードする配列であり、
配列番号１又は配列番号３によってコードされる酵素に関する「酵素の活性」とは、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋Ｌ−グリシン＋Ｈ２Ｏ<=>テトラヒドロ葉酸＋Ｌ−セリンという反応を触媒する酵素活性であり、
配列番号５によってコードされる酵素に関する「酵素の活性」とは、Ｌ−セリン<=>ピルビン酸＋ＮＨ３という反応を触媒する酵素活性であり、
配列番号７によってコードされる酵素に関する「酵素の活性」とは、ＡＴＰ＋スフィンガニン<=>ＡＤＰ＋スフィンガニン１−ホスフェートという反応を触媒する酵素活性であり、
配列番号９によってコードされる酵素に関する「酵素の活性」とは、スフィンガニン
１−ホスフェート<=>ホスホエタノールアミン＋パルミトアルデヒドという反応を触媒する酵素活性であり、
配列番号１１の類似体とは、配列番号１１に記載の配列と少なくとも９０％以上同一であって、かつ、配列番号１１によってコードされる酵素をコードする配列である、細胞。
【請求項２】
請求項１において特定された核酸配列のいずれかを含む遺伝子を改変することによって、酵素活性の低下が達成され、改変が、
遺伝子への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点変異、ＲＮＡ干渉の影響への遺伝子の曝露、外来ＤＮＡによる遺伝子の一部の置換、および外来ＤＮＡによるプロモーター領域の置換を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞。
【請求項３】
外来ＤＮＡが選択マーカー遺伝子、または形跡を残さずに除去でき、かつ標的遺伝子に欠失を残す外来ＤＮＡであることを特徴とする、請求項２に記載のＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞。
【請求項４】
３−ケトスフィンガニンを生じるセリンとパルミトイル−ＣｏＡの反応を触媒する酵素、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、および配列番号１３および／または配列番号１５によってコードされる酵素からなる群から選択される酵素Ｅ１、ならびに
スフィンガニンからフィトスフィンゴシンへの反応を触媒する酵素、スフィンガニンＣ４−ヒドロキシラーゼ、および配列番号１７によってコードされる酵素からなる群から選択される酵素Ｅ２
から選択される酵素の内の少なくとも１つの酵素活性が、野生型と比べて上昇していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞。
【請求項５】
スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【請求項６】
Ｉ）Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞を提供する工程、ならびに
ＩＩ）請求項１において特定された核酸配列のいずれかを含む少なくとも１つの遺伝子を、外来ＤＮＡの遺伝子への挿入、選択マーカー遺伝子をコードする外来ＤＮＡの遺伝子への挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点変異、ＲＮＡ干渉の影響への遺伝子の曝露、外来ＤＮＡによる遺伝子の一部の置換、または外来ＤＮＡによる遺伝子のプロモーター領域の置換、によって改変する工程を含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞を作製する方法。
【請求項７】
ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞を、炭素源を含む培地と接触させる工程、ならびに
ｂ）細胞が炭素源からスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を産生するのを可能にする条件下で細胞を培養する工程
を含む、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造する方法。
【請求項８】
ｃ）産生されたスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を単離する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変されたＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞、その使用、ならびにスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９６０年代の初めから、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉは、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質の製造に使用されている。Ｗｉｃｋｅｒｈａｍら  １９６０、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８０、４８４〜９１を参照されたい。
【０００３】
野生型の株によるスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質の収率を改善することは、常に価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質に関して高い生産力を有する利用可能なＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞を作製することが、本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
驚くべきことに、本発明者らは、特定の酵素活性が低下している後述する細胞が、本発明の目的を達成できることを発見した。
【０００６】
したがって、本発明は、本発明の請求項１に記載のとおり、酵素の活性が野生型と比べて低下している遺伝子改変されたＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞を説明する。
【０００７】
本発明はさらに、前述の細胞の使用、ならびにスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造する方法にも関する。
【０００８】
本発明の１つの利点は、本発明による細胞が、高い細胞密度まで増殖できることである。
【０００９】
本発明の別の利点は、適切な栄養培地中で増殖させた場合、これらの細胞が、著しく増加した量（titre）のアセチル化スフィンゴイド塩基を産生することである。
【００１０】
本発明のさらなる利点は、元の遺伝子型への復帰変異を不可能にする、これらの株の高い遺伝的安定性である。さらに、この高い遺伝的安定性のおかげで、維持しなければならない選択圧がないため、抗生物質の非存在下で培養することが可能になる。
【００１１】
本発明のさらなる利点は、安価かつ再生可能な原料からの生物工学的で環境にやさしいスフィンゴイド塩基製造においてこれらの細胞を使用することが可能であることである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】遺伝子欠失カセットの設計原理
【図２】過剰発現カセットの設計原理
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、
Ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、
Ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１の配列のいずれかと少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列
からなる２つの群Ａ）およびＢ）から選択されるイントロンのない核酸配列によってコードされる酵素の内の少なくとも１つの活性が、野生型と比べて低下していることを特徴とする、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞に関する。
【００１４】
この文脈において、群Ａ）は、本発明による好ましい核酸配列群である。
【００１５】
本発明の文脈において、細胞の「野生型」とは、特定された配列番号の核酸によってコードされる酵素の活性に影響するエレメント（例えば、対応する酵素をコードする特定された核酸配列を含む遺伝子、または対応する遺伝子中に存在し、特定された核酸配列に機能的に連結されているプロモーター）を操作することによって本発明による細胞が進化する元となる親株を好ましくは意味する。
【００１６】
配列番号１もしくは配列番号３または配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列によってコードされる酵素に関連する「酵素の活性」という用語は、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸＋Ｌ−グリシン＋Ｈ２Ｏ<=>テトラヒドロ葉酸＋Ｌ−セリンという反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。この活性は、好ましくは、Ｓｃｈｌｕｐｅｎ、２００３において説明されている方法によって測定される。
【００１７】
配列番号５または配列番号５と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列によってコードされる酵素に関連する「酵素の活性」という用語は、Ｌ−セリン<=>ピルビン酸＋ＮＨ３という反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。
【００１８】
この活性は、好ましくは、ＲａｍｏｓおよびＷｉａｍｅ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２  Ａｐｒ；１２３（３）：５７１〜６において説明されている方法によって測定される。
【００１９】
配列番号７または配列番号７と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列によってコードされる酵素に関連する「酵素の活性」という用語は、ＡＴＰ＋スフィンガニン<=>ＡＤＰ＋スフィンガニン１−ホスフェートという反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。
【００２０】
この活性は、好ましくは、ＬａｎｔｅｒｍａｎおよびＳａｂａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９８  Ｊｕｎ  １；３３２（Ｐｔ２）：５２５〜３１において説明されている方法によって測定される。
【００２１】
配列番号９または配列番号９と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列によってコードされる酵素に関連する「酵素の活性」という用語は、スフィンガニン１−ホスフェート<=>ホスホエタノールアミン＋パルミトアルデヒドという反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。
【００２２】
この活性は、好ましくは、Ｖａｎ  ＶｅｌｄｈｏｖｅｎおよびＭａｎｎａｅｒｔｓ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１  Ｊｕｌ  ５；２６６（１９）：１２５０２〜７において説明されている方法によって測定される。
【００２３】
配列番号１１または配列番号１１と少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である配列によってコードされる酵素に関連する「酵素の活性」という用語は、当該酵素の発現速度のレベル、特に細胞内濃度を意味するものとして理解される。これは、後述する二次元ゲル技術またはウェスタンブロット法によって測定される。
【００２４】
「活性が野生型と比べて低下している」という表現は、好ましくは、野生型の活性を基準として、少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９９．９％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９９％、最も好ましくは少なくとも９９．９９９％低下している活性を意味する。
【００２５】
野生型と比べた本発明による細胞の特定の活性の低下は、例えば、培地、ガス供給、撹拌などが同一の条件下で増殖させた細胞、可能であれば同じ細胞数／濃度のものを使用することによって活性を測定する、前述の方法によって測定される。
【００２６】
提示する配列に関する「ヌクレオチド同一性」は、公知の方法の助けを借りて測定することができる。一般に、特殊な必要条件を考慮に入れる、アルゴリズムを含む特別なコンピュータープログラムが使用される。
【００２７】
同一性を測定する好ましい方法では、第一に、比較する配列間で最大一致を生じさせる。同一性を測定するためのコンピュータープログラムとしては、
−ＧＡＰ（Deveroy, J.ら、Nucleic Acid Research 12（1984）、387ページ、Genetics Computer Group University of Wisconsin, Medicine（Wi））ならびに
−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S.ら、Journal of Molecular Biology 215（1990）、403〜410ページ）を含むＧＣＧプログラムパッケージが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（NCBI）および他の供給者から得ることができる（BLASTマニュアル、Altschul S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda ND 22894；Altschul S.ら、上記参照）。
【００２８】
また、公知のスミス−ウォーターマンアルゴリズムも、ヌクレオチド同一性を測定するために使用され得る。
【００２９】
ＢＬＡＳＴＮプログラム（Altschul, S.ら、Journal of Molecular Biology 215（1990）、403〜410ページ）を用いる場合の「ヌクレオチド同一性」を測定するための好ましいパラメーターは、以下のとおりである：
予想閾値：１０
ワードサイズ：２８
マッチスコア：１
ミスマッチスコア：−２
ギャップコスト：線形。
【００３０】
上記のパラメーターが、ヌクレオチド配列比較における初期設定パラメーターである。
【００３１】
また、上記のパラメーターを用いてＧＡＰプログラムを使用することもできる。
【００３２】
上記のアルゴリズムに従う８０％の同一性が、本発明の文脈における８０％の同一性を意味する。より高い同一性にも同じことが当てはまる。
【００３３】
「イントロンのない核酸配列によってコードされる」という用語は、本明細書において提示する配列に関する配列比較では、比較される核酸配列から任意のイントロンが前もって取り除かれている必要があることをはっきりと述べている。
【００３４】
別段の記載がない限り、パーセンテージ（％）はすべて質量パーセンテージである。
【００３５】
本発明による好ましい細胞は、先に特定した核酸配列群Ａ）およびＢ）から選択される配列のいずれかを含む少なくとも１つの遺伝子を改変することによって、酵素活性の低下が達成され、この改変が、遺伝子への外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列中の点変異、およびＲＮＡ干渉の影響への遺伝子の曝露、または外来ＤＮＡによる遺伝子の一部、特にプロモーター領域の置換を含む群、好ましくはこれらからなる群から選択されることを特徴とする。
【００３６】
これに関連して、外来ＤＮＡは、遺伝子に対して（生物に対してではない）「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味すると理解される。すなわち、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉの内在性ＤＮＡ配列でさえ、これに関連して「外来ＤＮＡ」としての役割を果たし得る。
【００３７】
この文脈において、選択マーカー遺伝子の挿入によって遺伝子が破壊されること、すなわち外来ＤＮＡが選択マーカー遺伝子、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ  ｎａｔ１遺伝子をコードする配列を含むものであることが特に好ましく、例えばＳｃｈｏｒｓｃｈら、２００９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００９）、５５（４）、３８１〜３８９において説明されているように、この配列は、好ましくは、Ｐｉｃｈｉａ  ＰＤＡ１プロモーター配列およびＰｉｃｈｉａ  ＴＥＦターミネーター配列に挟まれており、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ  ｎａｔ１遺伝子をコードする配列は好ましくはＰ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ用にコドン最適化されており、前記挿入は好ましくは遺伝子座への相同組換えによって成された。
【００３８】
これに関連して、結果として遺伝子からその後に除去することを可能にするさらなる機能によって選択マーカー遺伝子を伸長させることが有利である場合がある。この除去は、例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系もしくはＦＲＴ（フリッパーゼ認識標的）系など生物にとって外来の組換え系またはその生物自身の相同組換え系によって達成され得る。
【００３９】
本発明によれば、イントロンのない以下の核酸配列：
配列番号１またはそのＢ群類似体；
配列番号３またはそのＢ群類似体；
配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号７またはそのＢ群類似体；
配列番号９またはそのＢ群類似体；
配列番号１１またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号７またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号１１またはそのＢ群類似体；
配列番号１またはそのＢ群類似体および配列番号３またはそのＢ群類似体および配列番号５またはそのＢ群類似体および配列番号７またはそのＢ群類似体および配列番号１１またはそのＢ群類似体；
によってコードされる酵素の活性が野生型と比べて低下している組合せを有する細胞が好ましい。
【００４０】
上記に挙げた組合せに関して、Ａ群のメンバーにコードされる酵素活性を低下させることが好ましい。
【００４１】
本発明による好ましい細胞は、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞が、Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｙ−１０３１Ｆ−６０−１０、ＷＯ９５／１２６８３の実施例において開示されているＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ株、およびＳｃｈｏｒｓｃｈら、２００９、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．５５、３８１〜９において説明されているＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ  ＣＳ．ＰＣΔＰｒｏ２株からなる群から選択される株に由来するということを特徴とする。
【００４２】
本発明による好ましい細胞は、
３−ケトスフィンガニンを生じるセリンとパルミトイル−ＣｏＡの反応を触媒する酵素Ｅ１、特にセリンパルミトイルトランスフェラーゼ、特に配列番号１３および／または配列番号１５によってコードされる酵素、
スフィンガニンからフィトスフィンゴシンへの反応を触媒する酵素Ｅ２、特にスフィンガニンＣ４−ヒドロキシラーゼ、特に配列番号１７によってコードされる酵素
から選択される酵素の内の少なくとも１つの酵素活性が、野生型と比べて上昇していることを特徴とする。
【００４３】
酵素Ｅ１に関連する「酵素の活性」という用語は、パルミトイル−ＣｏＡ＋Ｌ−セリン<=>ＣｏＡ＋３−デヒドロ−Ｄ−スフィンガニン＋ＣＯ２の反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。
【００４４】
この活性は、好ましくは、Ｚｗｅｅｒｉｎｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２  Ｄｅｃ  １５；２６７（３５）：２５０３２〜８において説明されている方法によって測定される。
【００４５】
酵素Ｅ２に関連する「酵素の活性」という用語は、スフィンガニン＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋＋Ｏ２<=>フィトスフィンゴシン＋ＮＡＤＰ＋＋Ｈ２Ｏの反応を触媒する酵素活性を意味するものとして常に理解される。
【００４６】
この活性は、好ましくは、Ｇｒｉｌｌｅｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｍａｙ  １；２７３（１８）：１１０６２〜８において説明されている方法によって測定される。
【００４７】
本発明の文脈において上記および下記の解説で使用される「上昇した酵素活性」という用語は、好ましくは、上昇した細胞内活性を意味するものとして理解される。
【００４８】
細胞における酵素活性の上昇に関する以下の解説は、酵素Ｅ１〜Ｅ２の活性の上昇と、適切な場合には活性を上昇させられる場合がある下記に特定する酵素すべてとの両方に当てはまる。
【００４９】
原則的には、酵素活性の上昇は、その酵素をコードする遺伝子配列のコピー数を増やすことによって、強力なプロモーターを使用することによって、遺伝子のコドン使用頻度を変更することによって、ｍＲＮＡもしくは酵素の半減期を様々な方法で延長することによって、遺伝子の発現調節を改変することによって、または活性の上昇した対応する酵素をコードする遺伝子もしくは対立遺伝子を使用することによって、および適切な場合にはこれらの手段を組み合わせることによって、達成することができる。本発明による遺伝子改変された細胞は、例えば、所望の遺伝子、この遺伝子またはその一部の対立遺伝子、およびこの遺伝子が発現されるのを可能にするプロモーターを含むベクターを用いて、形質転換、形質導入、接合、またはこれらの方法の組合せによって作製される。異種発現は、特に、細胞の染色体または染色体外で複製するベクター中に、遺伝子または対立遺伝子を組み込むことによって達成される。細胞中の酵素活性を上昇させるための選択肢の概要は、ＤＥ−Ａ−１００３１９９９においてピルビン酸カルボキシラーゼを例として示されている。ＤＥ−Ａ−１００３１９９９は参照により本明細書に組み入れられ、その開示内容は、細胞中の酵素活性を上昇させるための選択肢に関する本発明の開示内容の一部を成す。
【００５０】
以上に特定した酵素または遺伝子および以下に特定するすべての酵素または遺伝子の発現は、一次元および二次元のタンパク質ゲル分画を用い、続いて、適切な評価ソフトウェアを用いてゲル中のタンパク質濃度を光学的に同定することにより、検出可能である。
【００５１】
酵素活性の上昇が、対応する遺伝子の発現の増大にもっぱら基づいている場合、酵素活性の上昇は、野生型細胞と遺伝子改変された細胞の一次元または二次元のタンパク質分画を比較するだけで定量することができる。細菌の場合にタンパク質ゲルを調製し、タンパク質を同定する通例の方法は、Ｈｅｒｍａｎｎら（Electrophoresis、22:1712.23（2001））によって説明されている手順である。同様に、タンパク質濃度は、検出しようとするタンパク質に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrookら、Molecular Cloning: a laboratory manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. USA、1989）および濃度測定用の適切なソフトウェアを用いたその後の光学的評価（LohausおよびMeyer（1989） Biospektrum, 5:32-39; Lottspeich（1999）、Angewandte Chemie 111:2630-2647）によって分析することもできる。
【００５２】
本発明によれば、酵素Ｅ１の酵素活性が野生型と比べて上昇しており、イントロンのない以下の核酸配列：
配列番号１もしくはそのＢ群類似体、および配列番号３もしくはそのＢ群類似体、および配列番号５もしくはそのＢ群類似体の組合せ、
または配列番号１もしくはそのＢ群類似体、および配列番号３もしくはそのＢ群類似体、および配列番号５もしくはそのＢ群類似体、および配列番号７もしくはそのＢ群類似体、および配列番号１１もしくはそのＢ群類似体の組合せ、
によってコードされる酵素の活性が野生型と比べて低下している組合せを有する細胞が好ましい。
【００５３】
本発明によれば、酵素Ｅ１および酵素Ｅ２の酵素活性が野生型と比べて上昇しており、イントロンのない以下の核酸配列：
配列番号１またはそのＢ群類似体、および配列番号３またはそのＢ群類似体、および配列番号５またはそのＢ群類似体、および配列番号７またはそのＢ群類似体、および配列番号１１またはそのＢ群類似体、
によってコードされる酵素の活性が野生型と比べて低下している組合せを有する細胞が好ましい。
【００５４】
１つの変形実施形態において、本発明によるＰ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞は、ＷＯ２００６０４８４５８およびＷＯ２００７１３１７２０において説明されており、さらに、本発明による本発明の細胞に関連して前述した酵素活性が変化しているものなどである。
【００５５】
本発明の目的の達成へのさらなる貢献は、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造するために本発明による細胞を使用することによってなされる。
【００５６】
本発明の文脈における「スフィンゴイド塩基」という用語は、フィトスフィンゴシン、スフィンゴシン、スフィンガジエニン、６−ヒドロキシスフィンゴシン、およびスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）を、またアセチル化型、例えば、テトラアセチルフィトスフィンゴシン、トリアセチルフィトスフィンゴシン、ジアセチルフィトスフィンゴシン、Ｏ−アセチルフィトスフィンゴシン、トリアセチルスフィンガニン、ジアセチルスフィンガニン、Ｏ−アセチルスフィンガニン、トリアセチルスフィンゴシン、ジアセチルスフィンゴシン、Ｏ−アセチルスフィンゴシン、テトラアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、トリアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、ジアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、Ｏ−アセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、トリアセチルスフィンガジエニン、ジアセチルスフィンガジエニン、Ｏ−アセチルスフィンガジエニンなども意味するものとして理解される。
【００５７】
本発明の文脈における「スフィンゴ脂質」という用語は、アミド結合によって脂肪酸に共有結合的に連結しているスフィンゴイド塩基を含む化合物を意味するものとして理解される。脂肪酸は、飽和または一不飽和もしくは多価不飽和であってよい。脂肪酸側鎖の長さは様々でよい。また、脂肪酸側鎖は、ヒドロキシ基のような官能基を有していてもよい。スフィンゴ脂質としては、例えば、フィトセラミド、セラミド、およびジヒドロセラミド、ならびにより複雑なグルコシルセラミド（セレブロシド）およびイノシトールホスホリルセラミド、マンノシルイノシトールホスホリルセラミドおよびマンノシルジイノシトールホスホリルセラミドが挙げられる。また、本明細書におけるスフィンゴ脂質としては、アミド結合によってアセチル基に連結しているスフィンゴイド塩基、例えば、Ｎ−アセチルフィトスフィンゴシン、Ｎ−アセチルスフィンガニン、Ｎ−アセチルスフィンゴシン、Ｎ−アセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシンなども挙げられる。これらの化合物は、短鎖セラミドという用語によっても公知である。
【００５８】
フィトスフィンゴシン、スフィンゴシン、スフィンガジエニン、６−ヒドロキシスフィンゴシン、スフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）、テトラアセチルフィトスフィンゴシン（TAPS）、トリアセチルフィトスフィンゴシン、ジアセチルフィトスフィンゴシン、Ｏ−アセチルフィトスフィンゴシン、Ｎ−アセチルフィトスフィンゴシン、トリアセチルスフィンガニン（TriASa）、ジアセチルスフィンガニン、Ｏ−アセチルスフィンガニン、Ｎ−アセチルスフィンガニン、トリアセチルスフィンゴシン（TriASo）、ジアセチルスフィンゴシン、Ｏ−アセチルスフィンゴシン、Ｎ−アセチルスフィンゴシン、テトラアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、トリアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、ジアセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、Ｏ−アセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、Ｎ−アセチル−６−ヒドロキシスフィンゴシン、トリアセチルスフィンガジエニン、ジアセチルスフィンガジエニン、Ｏ−アセチルスフィンガジエニンからなる群から選択されるスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造するための本発明による細胞の使用は、特に有利である。テトラアセチルフィトスフィンゴシン（TAPS）を製造するための本発明による細胞の使用は、特に極めて好ましい。
【００５９】
本発明による好ましい使用は、本発明によれば、前述の本発明による好ましい細胞が使用されることを特徴とする。
【００６０】
前述のスフィンゴシンおよびスフィンガニン誘導体を製造するために特に使用されるＰ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞は、ＷＯ２００６０４８４５８およびＷＯ２００７１３１７２０において説明されており、さらに、本発明による本発明の細胞に関連して前述した酵素活性が変化しているものなどである。
【００６１】
本発明の目的を達成するためのさらなる貢献は、先に説明した本発明による細胞を作製する方法によってなされ、前記方法は
Ｉ）Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉｉ細胞を提供する工程、ならびに
ＩＩ）請求項１において特定された核酸配列群Ａ）およびＢ）から選択される配列のいずれかを含む少なくとも１つの遺伝子を、
外来ＤＮＡ、特に選択マーカー遺伝子をコードするＤＮＡ、好ましくは、形跡を残さずに除去でき、かつ標的遺伝子に欠失を残すものの、遺伝子への挿入、
遺伝子の少なくとも一部の欠失、
遺伝子配列中の点変異、
ＲＮＡ干渉の影響への遺伝子の曝露、および
外来ＤＮＡによる遺伝子の一部、特にプロモーター領域の置換
によって改変する工程
を含む。
【００６２】
本発明の目的を達成するためのさらなる貢献は、スフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を製造する方法によってなされ、前記方法は、
ａ）本発明による細胞を、炭素源を含む培地と接触させる工程、
ｂ）細胞が前記炭素源からスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を産生するのを可能にする条件下で細胞を培養する工程、ならびに
ｃ）任意に、産生されたスフィンゴイド塩基およびスフィンゴ脂質を単離する工程
を含む。
【００６３】
本発明による好ましい方法は、上記に特定した本発明による好ましい細胞を使用する。
【００６４】
使用され得る炭素源は、炭水化物、例えば、グルコース、フルクトース、グリセロール、スクロース、マルトース、モラセスなど、あるいはアルコール、例えばエタノールなど、および有機酸、例えば酢酸などである。使用され得る窒素源は、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、有機窒素化合物（酵母抽出物、麦芽エキス、ペプトン、コーンスティープリカーなど）である。無機化合物、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、亜鉛塩、鉄塩などもまた、使用され得る。
【００６５】
Ｐｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉの適切な培養条件は、例えばＷＯ２００６０４８４５８およびＷＯ２００７１３１７２０から、当業者には公知である。
【００６６】
本発明による方法は、テトラアセチルフィトスフィンゴシン（TAPS）を製造するのに特に適している。
【００６７】
下記に挙げる実施例は、一例として本発明を説明するが、実施例で特定する実施形態は、本発明を限定することを意図せず、本発明の使用範囲は、明細書全体および特許請求の範囲の結果として起こる。
【００６８】
以下の図面は実施例の一部分である。
【実施例】
【００６９】
遺伝子欠失カセットの構築
別段の記載がない限り、遺伝子欠失は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  １９８３、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１：２０２〜２１１において説明されている従来の「ワンステップ遺伝子置換」を用いて実施した。
【００７０】
欠失カセットをＰＣＲに基づいて増幅するための鋳型として使用されるプラスミドを最終的に生じるインビボクローニングによって、欠失カセットを構築した。次いで、特定の遺伝子を欠失させることを目的として、これらのＰＣＲ産物をＰ．ｃｉｆｅｒｒｉｉに形質転換した。
【００７１】
プラスミドｐ４２６ＨＸＴ７−６ＨＩＳ（Hamacherら、2000; Microbiology 148、2783-8）をシャトルベクターとして使用することによって、これらの欠失カセットを構築した。まず、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによってｐ４２６ＨＸＴ７−６ＨＩＳを切断して５．６９ｋｂのフラグメントを得、このフラグメントをその後のクローニング工程のための骨格として使用した。最初に、各Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ欠失カセットのために、次の３つの重複するＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって作製した：中央部分としての優性マーカーｃｌｏｎＮＡＴ（後で再び除去することができる）（nat1耐性カセット）（Schorschら、Curr Genet. 2009 Aug;55（4）:381-9を参照されたい）、欠失させようとするＯＲＦの５’−非翻訳領域（プロモーター領域、PR）に相当し、ｃｌｏｎＮＡＴマーカーフラグメントの初めの部分に重複部分がある、長さ約５００ｂｐの第２のフラグメント、および欠失させようとするＯＲＦの３’−非翻訳領域（ターミネーター領域、TR）に相当し、ｃｌｏｎＮＡＴマーカーフラグメントの末端に重複部分がある、長さ約５００ｂｐの第３のフラグメント。
【００７２】
各場合において、遺伝子に特異的なプライマーを用いて、野生型Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉゲノムＤＮＡから欠失させようとする遺伝子のプロモーター領域（PR）およびターミネーター領域（TR）をＰＣＲによって増幅させることによって、各欠失カセットを構築した。このために、ＰＲに対してプライマー対Ｐ１／Ｐ２を、ＴＲに対してプライマー対Ｐ３／Ｐ４を、各場合において使用した。これらのプライマーは、融合されるべきＤＮＡエレメントと重複する長さ約３０〜３５ｂｐの領域を５’末端に有するように選択した。
【００７３】
【表１】
0006023807.tif 000002
【００７４】
各場合において、プライマー対ＬＰＮＴＬ．ｆｗ（TGGCGCTTCGTACCACTGGGTAAC）およびＬＰＮＴＬ．ｒｖ（GAAATTAATACGACTCACTATAGG）を用い、プラスミドｐＣＳ．ＬｏｘＰ．ｎａｔ１（Schorschら、2009; Curr. Genet. 55、381-9）を鋳型として使用して、中央のフラグメント（nat1耐性カセット、配列番号１９）を増幅させた（プライマー配列はすべて、５’→３’の向きで示している）。
【００７５】
プライマー対Ｐ１／Ｐ２、Ｐ３／Ｐ４、およびＬＰＮＴＬ．ｆｗ／ＬＰＮＴＬ．ｒｖのＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いた消化によってあらかじめ線状化したプラスミドｐ４２６ＨＸＴ７−６ＨＩＳと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ２６株に形質転換した。ＰＣＲ産物および線状化ベクターは、相同組換えによってインビボで相互に結合し、それによって線状化ベクターが再び環状になり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で増殖できるようになった。
【００７６】
得られた形質転換体を、ｃｌｏｎＮＡＴを含むＹＥＰＤプレート上でマーカー遺伝子（nat1）を用いて選択し、それらのＤＮＡを単離し、大腸菌（E. coli）に形質転換し、それから再び単離したプラスミドを制限マッピングまたは配列決定によって検証した。別段の記載がない限り、プライマー対４２６Ｌ．ｆｗ（GCTTCCGGCTCCTATGTTG、配列番号２３）および４２６Ｒ．ｒｖ（ACCCTATGCGGTGTGAAATAC、配列番号２４）またはＨＸＴ７（GCCAATACTTCACAATGTTCGAATC、配列番号２５）およびＣＹＣ（CGTGAATGTAAGCGTGACATAAC、配列番号２６）を用いて欠失カセットを増幅させた。
【００７７】
明確化のために図１を参照されたい。
【００７８】
複数の遺伝子を連続的に欠失させるために、各欠失の後にマーカーレスキューを実施した。これは、既報のように（Schorschら、Curr Genet. 2009 Aug;55（4）:381-9）、プラスミドｐＣＳ．ｏｐｔ．Ｃｒｅ（配列番号２０）を用いた形質転換によって行った。これらの遺伝子欠失は、形質転換体のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ解析によって確認した。
【００７９】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１１の配列を有する遺伝子の個々の遺伝子欠失カセットを、下記の表に挙げるプライマーを用いて構築した。これらの各配列番号に関して、列記した最初の２つのプライマー（SH11およびSH12またはSH21およびSH22またはC1およびC2またはHXT7-LCB4.fwおよびLCB4.HXT7.rvまたはHXT7-DPL1.fwおよびDPL1.rv2またはORM-426L.fwおよびORM-LPNTL.rv）は、各場合においてＰＲの増幅のために使用し、列記した次の２つのプライマー（SH13およびSH14またはSH23およびSH24またはC3およびC4またはLCB4.rvおよびLCB4.fwまたはDPL1.fw2およびCYC-DPL1.rvまたはORM-LPNTL.fw2およびORM-426R.rv）は、ＴＲの増幅のために使用した。各場合において列記した最後の２つのプライマー（SHMT1.pop-in.fwおよびSHMT1.veri.rvまたはSHMT2.pop-in.fwおよびSHMT2.veri.rvまたはCHA1.pop-in.fwおよびCHA1.veri.rvまたはLCB4.pop-in.fwおよびLCB4.veri.rvまたはDPL1.pop-in.fwおよびDPL1.veri.rvまたはORM1.pop-in.fwおよびORM.veri.rv）は、組込みまたは野生型対立遺伝子を検出するために使用する。
【００８０】
【表２−１】
0006023807.tif 000003
【表２−２】
0006023807.tif 000004
【００８１】
過剰発現カセットの構築
欠失カセットのために使用した方法と基本的には同じようにして、過剰発現カセットを構築した。しかし、過剰発現カセットの場合、ＰｃＴＤＨ３プロモーターまたはＰｃＥＮＯ１プロモーターのフラグメントに相当する、付加的な第４のＰＣＲ産物を作製した（プロモーターフラグメント、PF）。その後、ｎａｔ１耐性カセット、およびこの場合において過剰発現させようとするＯＲＦの初めの部分と重複部分がある第３のＰＣＲフラグメントにインビボでこれを連結した（図２を参照されたい）。
【００８２】
配列番号１３の遺伝子産物を過剰発現させるために、Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉの天然のプロモーターをＰｃＥＮＯ１−５８４−１（配列番号２１）プロモーターフラグメントで置換した。一方、配列番号１５および配列番号１７の遺伝子産物を過剰発現させるためには、Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉの個々の天然のプロモーターをＰｃＴＤＨ３−４２０−１プロモーターフラグメント（配列番号２２）で置換した。
【００８３】
原則として、個々の過剰発現カセットを構築するために、３種の異なる遺伝子特異的プライマー対を使用した。これらのプライマーは、融合されるべきＤＮＡエレメントと重複する長さ約３０〜３５ｂｐの領域を５’末端に有するように選択した。
【００８４】
【表３】
0006023807.tif 000005
【００８５】
各場合において、プライマー対ＬＰＮＴＬ．ｆｗおよびＬＰＮＴＬ．ｒｖを用い、プラスミドｐＣＳ．ＬｏｘＰ．ｎａｔ１（Schorschら、2009; Curr. Genet. 55、381-9）を鋳型として使用して、ｎａｔ１耐性カセットを増幅させた。プライマー対Ｐ５／Ｐ６、Ｐ７／Ｐ８、Ｐ９／Ｐ１０、およびＬＰＮＴＬ．ｆｗ／ＬＰＮＴＬ．ｒｖのＰＣＲ産物を、ＨｐａＩおよびＮｇｏＭＩＶを用いた消化によってあらかじめ線状化したプラスミドｐ４２６ＨＸＴ７−６ＨＩＳと共に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｋ２６株に形質転換した。ＰＣＲ産物および線状化ベクターは、相同組換えによってインビボで相互に結合し、それによって線状化ベクターが再び環状になり、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で増殖できるようになった。得られた形質転換体を、ｃｌｏｎＮＡＴを含むＹＥＰＤプレート上でマーカー遺伝子（nat1）を用いて選択し、それらのＤＮＡを単離し、大腸菌に形質転換し、それから再び単離したプラスミドを制限マッピングまたは配列決定によって検証した。各場合においてプライマー対「４２６Ｌ．ｆｗおよび４２６Ｒ．ｒｖ」を用いて、過剰発現カセットを増幅させた。
【００８６】
明確化のための図２を参照されたい。
【００８７】
複数の遺伝子を組み合わせた過剰発現のために、または１つもしくは複数の遺伝子欠失を有する１つもしくは複数の標的遺伝子を組み合た過剰発現のために、各工程（標的遺伝子の欠失または過剰発現カセットの染色体組込み）の後にマーカーレスキューを実施した。これは、既報のように（Schorschら、Curr Genet. 2009 Aug;55（4）:381-9）、プラスミドｐＣＳ．ｏｐｔ．Ｃｒｅを用いた形質転換によって行った。過剰発現カセットの組込みは、形質転換体のゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ解析によって確認した。
【００８８】
配列番号１３、配列番号１５、および配列番号１７の配列によってコードされる酵素の個々の過剰発現カセットを、下記の表に挙げるプライマーを用いて構築した。これらの各配列番号に関して、列記した最初の２つのプライマー（LCB1.426L.fwおよびLCB1.LPNTL.rvまたはLCB2-426L.fwおよびLCB2-LPNTL.rvまたはSYR2oe.426LおよびSYR2oe.LPNTL.rv）は、各場合においてＰＲの増幅のために使用した。列記した次の２つのプライマー（P-ENO.LPNTL.fwおよびLCB1.P-ENO.rvまたはTDH3-LPNTL.fwおよびP-TDH3.rvまたはTDH3-LPNTL.fwおよびP-TDH3.rv）は、個々のＰｃＥＮＯ１−５８４−１またはＰｃＴＤＨ３−４２０−１プロモーターフラグメントの増幅のために使用した。列記した次の２つのプライマー（P-ENO.LCB1.fwおよびLCB1.426R.rvまたはLCB2.P-TDH3.fwおよびLCB2-426R.rvまたはSYR2oe.P-TDH3.fwおよびSYR2oe.426R）は、各場合において過剰発現させようとする標的遺伝子の５’−ＯＲＦフラグメントの増幅のために使用した。各場合において列記した最後の２つのプライマー（P-ENO.veri.rvおよびLCB1ue.veri.rvまたはP-TDH3.pop.fwおよびLCB2ue.veri.rvまたはP-TDH3.pop.fwおよびSYR2oe.veri.rv）は、組込みまたは野生型対立遺伝子を検出するために使用する。
【００８９】
【表４】
0006023807.tif 000006
【００９０】
遺伝子改変された株によるアセチル化スフィンゴイド塩基の産生
以下の遺伝子改変によって、アセチル化スフィンゴイド塩基の量(titre)の増加を達成した。
【００９１】
下記の表は、振盪フラスコ中で定常期まで増殖した後の、様々な組換えＰ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ株のアセチル化スフィンゴイド塩基（テトラアセチルフィトスフィンゴシン（TAPS）および任意選択によりトリアセチルスフィンガニン（TriASa））の量(titre)を示す。
【００９２】
詳細（使用した培地、増殖条件、抽出、ＨＰＬＣ解析による定量）は、Ｓｃｈｏｒｓｃｈら、Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２００９  Ａｕｇ；５５（４）：３８１〜９において説明されている。本出願で使用した株は、上記の参照文献において名付けられたＰｉｃｈｉａ  ｃｉｆｅｒｒｉ  ＣＳ．ＰＣΔＰｒｏ２に相当し、これは下記では短縮して「ＣＳ」とも呼んでいる。
【００９３】
最初に、様々な遺伝子の欠失がアセチル化スフィンゴイド塩基の産生に与える影響を調査した。これらの結果を下記の表に示す。個別には、特にＰｃＳＨＭ２の欠失がアセチル化スフィンゴイド塩基の産生を著しく増加させることが示された。この効果は、ＰｃＳＨＭ１欠失と組み合わせることによってさらに増大された。ＰｃＣＨＡ１をさらに欠失させることによって、さらなる増大が達成された。関連する遺伝子型がｃｈａ１  ｓｈｍ１  ｓｈｍ２であるこの株は、ＴＡＰＳ  ６４ｍｇ／ｇ（CDW）に加えてＴｒｉＡＳａ  ３ｍｇ／ｇ（CDW）と格段に多い量を産生した。
【００９４】
【表５】
0006023807.tif 000007
【００９５】
次に、酵素活性を増大させるための様々な遺伝子改変の影響を、ＣＳ．ＣＳＳ（cha1 shm1 shm2）株をバックグランドとして調査した。この目的のために、以下の遺伝子改変（個別と選択された組合せによるものと両方）をＣＳ．ＣＳＳ株において実施した：
ＰｃＬＣＢ４、配列番号７の欠失
ＰｃＤＰＬ１、配列番号９の欠失
ＰｃＯＲＭ１２、配列番号１１の欠失
ＰｃＬＣＢ１配列番号１３の過剰発現
ＰｃＬＣＢ２配列番号１５の過剰発現
ＰｃＳＹＲ２配列番号１７の過剰発現。
【００９６】
さらに、ＰｃＬＣＢ４およびＰｃＤＰＬ１の欠失の効果はまた、単独で、すなわちｃｈａ１  ｓｈｍ１  ｓｈｍ２遺伝子型と組み合わせずに検討した。
【００９７】
相加効果または相乗効果を達成するために、スフィンゴイド塩基産生を促進する多種多様な遺伝子改変を、単一の株において様々な方法で組み合わせた。この場合、次の遺伝子型の株が最良であることが判明した：
ｃｈａ１  ｓｈｍ１  ｓｈｍ２  ｌｃｂ４  ｏｒｍ１２  ＴＤＨ３ｐ：ＬＣＢ２  ＥＮＯ１ｐ：ＬＣＢ１  ＴＤＨ３ｐ：ＳＹＲ２。
【００９８】
参照株ＣＳはＴＡＰＳ  ２１ｍｇ／ｇ（CDW）しか産生しなかったのに対し、この株は、振盪フラスコ中でＴＡＰＳ  １９９ｍｇ／ｇ（CDW）（およびトリアセチルスフィンガニン（ＴｒｉＡＳａ）１２ｍｇ／ｇ（CDW））という量(titre)を産生した。
【００９９】
これらの結果を下記の表に示す。
【０１００】
【表６】
0006023807.tif 000008
【図１】
0006023807.tif 000009
【図２】
0006023807.tif 000010
【配列表】
0006023807000001.app