(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
0006038933.tif 000004
（式中、
「ｎ」は１〜４の整数であり、
Ｒ１およびＲ３は、同一または異なる、直鎖状または分岐状の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であり、かつ
Ｒ２は、水素、直鎖状または分岐状の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒａ基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｒａ基であり、式中、Ｒａは、直鎖状または分岐状の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基である）
の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含んでなる局所投与のための医薬ゲル組成物であって、
前記化合物が、粘膜炎の治療および／または予防のため、２．５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度であり、かつ
前記ゲル組成物が、粘膜の表面への局所投与のための組成物である、組成物。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ３は、同一または異なる、（Ｃ１−Ｃ２）アルキル基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ３がメチル基である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ｎが１である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
Ｒ２が水素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
化合物がメラトニンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
化合物の濃度が３％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
粘膜炎が放射線療法および／または化学療法によって引き起こされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
粘膜炎が口腔、咽頭、食道、胃または腸粘膜炎である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
粘膜炎が口腔粘膜炎である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
粘膜炎がヒト粘膜炎である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
組成物が、少なくとも１種類の薬学上許容可能な賦形剤またはアジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
組成物が、ゲル化剤を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ゲル化剤が、ポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマー、セルロースおよびグアーガムを含んでなるリストから選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
組成物が、少なくとも１種類の防腐剤をさらに含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
組成物が、酸化防止剤をさらに含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
組成物が、薬学上許容可能なキャリアをさらに含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン）またはその誘導体を２．５％〜５％重量／容量（ｗ／ｖ）の濃度で含んでなる組成物の粘膜炎を治療および／または予防するための医薬組成物の調製のための使用に関する。粘膜炎は、放射線療法および／または化学療法によって起こりやすい。従って、本発明は、医学の分野に含まれる可能性がある。
【発明の背景】
【０００２】
技術の状態
放射線療法もしくは化学療法、または両者の結合による悪性腫瘍の治療はますます効果的になっては来ているが、短期および長期副作用を伴っている。これらの副作用には、口腔粘膜の機能および健全に関する傷害がある。結果としては、重篤な潰瘍形成（粘膜炎）および口の真菌による重複感染（カンジダ症、鵞口瘡）が挙げられる。この疾患によって誘発されるこれらの合併症とその治療は、嚥下の際の苦痛、嚥下困難、栄養失調、化学療法による投薬での遅延、放射線療法計画における中断、腫瘍学的治療の有効性の喪失、長期間にわたる入院日数、費用の嵩み、および幾人かの患者では、潜在的に致命的な感染症（敗血症）を伴う。
【０００３】
粘膜炎は、口から肛門までの全消化管を冒す炎症性反応であり、化学療法および／または放射線療法および骨髄移植の主要な有害効果の一つである。粘膜炎は、コルチコイド、免疫抑制薬（アザチオプリン、シクロスポリンＡ）、口内乾燥症誘発薬、抗不安剤、抗鬱剤、抗ヒスタミン剤、交感神経刺激剤、抗パーキンソン病薬、抗精神病剤、歯肉治療剤、ヒダントインまたは広範囲抗生物質のような化学薬剤によっても引き起こされる可能性がある。
【０００４】
電離放射線によって誘発される口腔粘膜炎（または口内炎）（放射線誘発口腔粘膜炎）や化学療法剤によって誘発される口腔粘膜炎（または口内炎）は、現在、癌患者の治療における主要な問題の一つである。化学療法および／または放射線療法を受けている患者の４０％および骨髄移植患者の７６％までは、口部に問題を示し、最もよく見られる口部の問題は、粘膜炎、局所感染症、痛みおよび出血である。頭部および頸部癌患者の９７％はある程度の粘膜炎を示し、長期間の分割放射線療法を受けた患者の１００％も粘膜炎を示す（Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003,66:253-262）。電離放射線によって引き起こされる損傷は、直接的および間接的機構によるものである。直接的効果はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）における放射線の突然変異誘発作用によるものであり、間接的機構（このような機構の約７０％）は水分子に対する放射線の効果によりフリーラジカルの形成を引き起こすものである（Trotti A et al. Radiotherapy and Oncology 2003,66:253-262）。
【０００５】
世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、粘膜炎は、総体的症状に基づいて様々な等級に分類される。等級０：正常；等級１：全身性紅斑、粘膜はピンク色で痛みがなく、唾液は十分であり、声は正常；等級２：紅斑、余り広範囲でない潰瘍、固形物を飲み込むことはできる；等級３：紅斑、水腫または広範囲の潰瘍、患者は痛みを伴ってしか液体を飲み込むことができず、話しは困難である；等級４：極めて広範囲の潰瘍、歯肉からの出血、感染症、唾液なし、極めて強烈な痛み、経腸または非経口的サポート。
【０００６】
粘膜炎は、粘膜下組織で起こって上皮へと進行する一連の生物学的事象の結果として起こり、種々の病因を有する粘膜炎に共通している。放射線療法および化学療法では、第一相で、反応性酸素種（ＲＯＳ）とＤＮＡの損傷が増加することが報告されている。核因子κ−Ｂ（ＮＦ−κＢ）のような転写因子が活性化される。インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）などの炎症誘発性サイトカインの産生が増加し、アポトーシスや細胞損傷を引き起こす。この炎症性反応は、粘膜に損傷を生じ、その結果潰瘍を発症する。これらの細胞は微生物によってコロニー形成し、総ての組織損傷の原因であるサイトカインを更に産生するマクロファージが活性化される。この全プロセスにおいて、炎症プロセスおよび細胞損傷の増加に寄与するフリーラジカルが大幅に増加する。第二相では、放射線療法および／または化学療法が上皮細胞の複製を阻害し、細胞再生を減少させる。第三相では、微生物のコロニー形成と潰瘍化表面が増加し続け、全身感染症の発症が促進される（Volpato LE et al. Mol Cancer Ther 2007,6:3122-3130）。粘膜炎は、既知の抗炎症剤による治療に応答しない炎症性症状である。粘膜炎は、インフラマソーム経路のような炎症性プロセスの残りとは異なる生化学的機構が介在する可能性があるプロセスである（Escames G, et al. Hum Genet, July 2011, DOI 10.1007/s00439-011-1057）。現在のところ、粘膜炎を完全に逆転させまたは粘膜炎の発生を完全に防止する治療法はない。
【０００７】
今日まで、粘膜炎の治療および予防のため多種多様な治療法が用いられてきたが、完全な粘膜炎の逆転させる結果を示すことはなかったのであり、例えば、アシクロビル、ベンジダミン、β−カロテン、リン酸カルシウムを用いる治療、アロプリノール、アロエベラ、クロルヘキシジン、カモミール、エトポシド、フォリン酸、グルタミン、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ナイスタチン、ミソニダゾール、ポビドン、ピロカルピン、ヘマトトキシフィリン、プレドニゾンまたはスクラルファートを用いるすすぎが報告されている（Worthington HV et al. Cochrane Database Syst Rev. October 2007,17;(4) DOI: 10.1002/14651858.CD000978.pub3; Clarkson JE et al., Cochrane Database Syst Rev. August 2010,4;(8)), DOI: 10.1002/14651858.CD001973.pub4.）。
【０００８】
従って、粘膜炎、特に放射線療法および／または化学療法を受けている患者での粘膜炎を完全に逆転させかつ予防することができる手段が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
発明の説明
本発明は、粘膜炎の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための２．５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度でメラトニンまたはその誘導体を含んでなる組成物の使用を記載する。
【００１０】
放射線療法または化学療法によって引き起こされる損傷から口腔粘膜を保護するインビボでの結果が示される。本発明の組成物は、口腔粘膜並びに胃腸粘膜の保護に有用である。本発明は、本発明の組成物で記載されているより低濃度では粘膜炎を完全に元に戻させることができず、一方、３％（ｗ／ｖ）以上の濃度は、電離放射線によって引き起こされる粘膜炎を治療し、完全に元に戻させることができることを明らかにする。様々な投与経路の結果が示され、局所経路は、口腔粘膜炎に対して最善の保護を提供する経路である。
【００１１】
記載されていることに基づけば、本発明は、粘膜炎の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための２．５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度でメラトニンまたはその誘導体を含んでなる組成物の使用に関する。これ以後、それは、「本発明の組成物」と呼ぶことにする。
【００１２】
「２．５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度」とは、最終組成物１００ｍｌ中にメラトニンまたはその誘導体２．５〜５ｇを含んでなる組成物と理解される。「ｗ／ｖ」という略号は、重量／容量または質量／容量（ｍ／ｖ）を表す。
【００１３】
好ましい実施態様は、メラトニンまたはその誘導体の濃度が３％（ｗ／ｖ）である場合の使用に関する。従って、前記の好ましい組成物は、組成物の総容量１００ｍｌ中にメラトニンまたはその誘導体３ｇを含んでなる組成物を表す。これ以後、この組成物は、「本発明の好ましい組成物」と呼ぶことにする。
【００１４】
粘膜炎の治療および／または予防のための医薬組成物の調製に有用な一般式Ｉに含まれる任意の化合物並びに薬学上許容可能なその塩、溶媒和物またはプロドラッグは、「メラトニンまたはその誘導体」と理解される。
【００１５】
一般式Ｉの化合物は、
【化１】
0006038933.tif 000002
（式中、
「ｎ」は、１〜４の整数であり、
Ｒ１およびＲ３は、同一または異なる直鎖状または分岐状の（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基であり、および
Ｒ２は、水素、直鎖状または分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒａ基または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−Ｒａ基であって、Ｒａが直鎖状または分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル基であるものである）
を表す。
【００１６】
本発明において、「アルキル」という用語は、１〜４個の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の脂肪族鎖、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、第三ブチル、第二ブチル、ｎ−ペンチルなどを表す。アルキル基は、好ましくは１〜２個の炭素原子を有する。より好ましくは、それはメチル基である。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様では、Ｒ１およびＲ３はメチル基である。より好ましくは、ｎは１であり、さらにより好ましくは、Ｒ２は水素である。
【００１８】
「メラトニン」という用語は、Ｎ−アセチル−５−メトキシ−トリプタミンを表し、文献ではメラトニン（melatonin）、メラトニン（melatonine）、メラトール、メルビン（melovine）、サーカディン（circadin）、レグリン（regulin）、アセタミド、Ｎ−アセチル−メトキシ−トリプタミン、５−メトキシ−Ｎ−アセチルトリプタミン、Ｎ−［２−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］アセタミドまたはＮ−［２−（５−メトキシインドール−３−イル）エチル］アセタミドとも呼ばれ、または一般式（Ｉ）化合物においてＲ１およびＲ３がメチル基であるときには、ｎは１であり、Ｒ２は水素である。メラトニンのＣＡＳ登録番号は、７３−３１−４である。
【００１９】
メラトニンは、ヒトなどの動物において松果体（上生体）によって、および例えば、胃腸管、網膜、リンパ球および骨髄細胞のような他の器官によって生理学的に産生される内在性神経ホルモンである。
【００２０】
メラトニンは、ヒトなどの動物においてセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン、５−ＨＴ）から産生され、セロトニンはまたアミノ酸トリプトファンに由来する。従って、本発明は、メラトニン前駆体（５−ＨＴ、トリプトファンまたはＮ−アセチルセロトニンまたはＮＡＳのような中間代謝物）のいずれかを、粘膜炎の治療および／または予防のための医薬組成物を調製するための本発明に記載の濃度で人体においてメラトニンに転換されるのに十分な濃度で含んでなる組成物の使用にも関する。
【００２１】
従って、本発明は、当業者に知られている化学的方法によって、例えば、水または有機溶媒中またはこれらの混合物中における酸との反応によって産生することができるメラトニンまたはその誘導体の薬学上許容可能な塩にも関する。エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルを、有機溶媒として用いることができる。酸付加塩の例としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような無機酸付加塩、および例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩のような有機酸付加塩が挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いられる「プロドラッグ」という用語は、化学的誘導、例えば、付加的化学基の置換または付加を受け、溶解度またはバイオアベイラビリティーのようなその物理化学的特性のいずれかを変更する化学化合物を表すが、元の分子の技術的特徴を変更しない。プロドラッグは、例えば、エステル、エーテルまたはアミド誘導体であることができる。バイオアベイラビリティーは、特定の生物学的区画におけるその利用可能性を表す。
【００２３】
本発明によれば、「溶媒和物」という用語は、非共有結合によって結合した別の分子、例えば、極性溶媒を有するメラトニンの誘導体であると理解されなければならない。このような溶媒和物の例としては、水和物およびアルコラート、例えば、メタノラートが挙げられる。
【００２４】
塩、溶媒和物およびプロドラッグは、当該技術水準で知られている手段によって調製することができる。薬学上許容可能でない塩、溶媒和物またはプロドラッグも、薬学上許容可能な塩、溶媒和物またはプロドラッグの調製に用いることができるので、本発明の範囲内にある。
【００２５】
本発明の組成物または本発明の好ましい組成物は、本発明の組成物に記載したのと同等の濃度でメラトニンと同等の生物学的機能を有するものを含んでなる組成物を表すこともできる。
【００２６】
本明細書で用いられる「同等の生物学的機能を有するもの」または「生物学的に同等な変異体」という用語は、記載された分子に関して僅かの変化しか示すことができず、前記分子に対して任意の技術的効果の追加に寄与する前記変化のない記載された分子と同じ機能を有する分子を表す。従って、本発明は、同じ機能を有しかつメラトニンに対して任意の技術的効果の追加に寄与する変化のない僅かな変化を示すメラトニン変異体に関する。
【００２７】
「同等の濃度」とは、本発明の組成物によって本発明に記載されているのと同じ効果を生じるメラトニンの同等な生物学的機能を有するものに必要な濃度と理解される。
【００２８】
メラトニンは、植物でも生産される。例えば、藻類、食用植物、穀類、果実、種子、根、茎、葉および薬草には、メラトニンの存在が記載されている（Paredes SD et al. J Exp Bot 20089,60(1):57-69）。メラトニンは、例えば、ココア、ブドウ、トマト、茶、緑茶、藻類、穀類およびオリーブに含まれていることが記載されている。本発明の組成物のメラトニンの供給源は、植物供給源であることができる。植物供給源からのメラトニン（植物メラトニンとしても知られている）は、そのような目的に当業者に知られている任意の方法によって得ることができる。
【００２９】
本発明の組成物に用いられるメラトニンの供給源は、合成的なものであることもできる。メラトニンは、そのような目的に当業者に知られている手法によって化学的に合成することができる。
【００３０】
「医薬組成物」または「医薬品」という用語は、ヒトまたは動物の疾患を予防し、診断し、緩和し、治療しまたは治すために用いられる任意の物質を表す。本発明に関しては、それは、粘膜炎を治療しおよび／または予防することができる組成物を表す。
【００３１】
本発明において、「治療しおよび／または予防する」とは、治療的および予防的処置または予防的手段の両方を表す。治療を行うことができる状況としては、既に変化を伴った状況並びに変化が防止されている状況が挙げられる。「変化」とは、本明細書に記載されているように、本発明の組成物を用いる治療から利益を得る任意の状態である。
【００３２】
本明細書で用いられる「粘膜炎」という用語は、主として胃腸管の粘膜、すなわち、口腔、咽頭、食道、胃および腸粘膜の炎症を生じる疾患を表し、粘膜の健全と機能に衝撃を与え、そこに潰瘍形成と感染症を生じる可能性があることを特徴とする。粘膜炎は、様々な病因、中でも放射線療法治療、化学療法治療、骨髄移植または薬剤を用いる治療によって引き起こされる可能性がある。
【００３３】
好ましい実施態様は、粘膜炎が放射線療法および／または化学療法によって引き起こされる場合における使用に関する。
【００３４】
放射線療法は、例えばγ線およびα粒子を両方とも包含するｘ線または放射能のような、物質をイオン化することができる電離放射線の使用に基づく治療と理解される。本発明は、癌治療に用いられかつ粘膜炎を生じる当業者に知られている任意の治療を包含する電離放射線を用いる治療に関する。
【００３５】
化学療法は、腫瘍成長阻害を引き起こしかつ粘膜炎を生じる当業者に知られている任意の治療を包含する薬剤の投与に基づく治療と理解される。例えば、化学薬剤は、メトトレキサート、プロカルバジン、チオグアニン、メルカプトプリン、シタラビン、フルオロウラシル、フロクスウリジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトラマイシン、ブレオマイシン、アスパラギナーゼまたはイリノテカンを表すことができる。
【００３６】
もう一つの好ましい実施態様は、粘膜炎が口腔、咽頭、食道、胃または腸粘膜炎である場合の使用に関する。もう一つの好ましい実施態様は、粘膜炎が口腔粘膜炎である場合の使用に関する。
【００３７】
もう一つの好ましい実施態様は、粘膜炎がヒトで起こる場合の使用に関する。
【００３８】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物が少なくとも１種類の薬学上許容可能な賦形剤またはアジュバントをさらに含んでなる場合の使用に関する。
【００３９】
「賦形剤」という用語は、本発明の医薬組成物または医薬品の吸収を補助し、前記医薬組成物を安定化し、またはその組成物にコンシステンシーを与えまたはそれをさらに味をよくする風味を提供する意味においてその調製で補助する物質を表す。従って、賦形剤は、例えば、澱粉、砂糖またはセルロースのような成分を一緒に保持する機能、甘み付けの機能、色素として作用する機能、医薬品を例えば、空気および／または湿気から隔離するような医薬品を保護する機能、例えば、第二リン酸カルシウムのような丸薬、カプセルまたは任意の他の提示形態の充填剤としての機能、成分の溶解および腸におけるその吸収を促進する崩壊機能を有することができ、この段落に記載されていない他の種類の賦形剤を除外しない。例えば、シナモン、レモン、オレンジ、マンダリンまたはバニラエッセンスのようなエッセンスを添加して、本発明の組成物が心地よい風味を有するようにすることができる。
【００４０】
「アジュバント」という用語は、薬剤物質の応答を高める任意の物質を表す。本発明において、前記用語は、本発明の組成物の効果を高める任意の物質を表し、それは、当業者に知られている任意のアジュバントを表すことができる。
【００４１】
「薬学上許容可能な」という用語は、化合物を投与する生物を損傷しないようにすることができかつ評価される問題の化合物を表す。
【００４２】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物がゲル化剤をさらに含んでなる場合の使用に関する。ゲル化剤は、好ましくはポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマー、セルロースおよびグアーガムを含んでなるリストから選択される。それは、好ましくはポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマーを表す。本明細書に記載されていることに基づけば、もう一つの好ましい実施態様は、組成物がゲル（または「ヒドロゲル」とも呼ばれる）である場合の使用に関する。
【００４３】
「ゲル化剤」という用語は、ゲル、すなわち、ゲル化剤によって形成される三次元ネットワークを形成し、一般に液相を含む物質を表す。用いることができるゲル化剤は、当業者に知られており医薬組成物を調製するためのものであることができる。例えば、ポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマー以外に、ポロキサマーコポリマー（またはポロキサマー）、例えば、プルロニック（Pluronic）（商標）Ｆ１２７（ＣＡＳ登録番号９００３−１１−６）またはプルロニック（商標）Ｆ１２７ＮＦなどのプルロニック（商標）と呼ばれる薬剤を用いることができる。
【００４４】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物が少なくとも１種類の防腐剤をさらに含んでなる場合の使用に関する。
【００４５】
防腐剤は、微生物汚染を抑制することにより医薬品の特性を保持する物質として理解され、防腐剤は、イオン性または非イオン性防腐剤であることができる。用いられる防腐剤は、毒性がなく、化学的に安定であり、メラトニンと適合性である。当該技術水準において知られている防腐剤は、防腐剤として用いることができ、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸、ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、エチルパラベンまたはブチルパラベンを用いることができる。「微生物」とは、本発明の組成物において成長し、増殖することができる任意の細胞、例えば、細菌、真菌および酵母として理解される。
【００４６】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物が酸化防止剤をさらに含んでなる場合の使用に関する。
【００４７】
「酸化防止剤」という用語は、酸化を遅らせまたは防止することができる物質を表す。当該技術水準で知られている酸化防止剤は、酸化防止剤として用いることができ、例えば、トコフェロール、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、ブチルヒドロキシアニソール、クエン酸、ビタミンＡまたはビタミンＥを用いることができる。
【００４８】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物が少なくとももう一つの薬剤物質をさらに含んでなる場合の使用に関する。
【００４９】
本明細書で用いられる「薬剤物質」、「活性物質」、「医薬活性物質」、「活性成分」または「医薬活性成分」という用語は、疾患の診断、治癒、緩和、治療または予防に対して薬理活性または別の異なる効果を潜在的に提供してもよく、またはヒトまたは他の動物の身体の構造または機能に影響を及ぼしてもよい任意の成分を表す。例えば、アロプリノールを用いることができる。
【００５０】
もう一つの好ましい実施態様は、組成物が薬学上許容可能なキャリアをさらに含んでなる場合の使用に関する。
【００５１】
「薬学上許容可能なキャリア」または薬理学上許容可能なキャリアは、医薬剤形の調製に用いられる薬学分野で知られている物質または物質の組合せを表し、固形物、液体、溶媒または界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアは不活性物質でありあるいは本発明の化合物のいずれかと同様の作用を有することができる。キャリアの機能は、本発明の発現生成物並びに他の化合物の結合を促進し、より良好な投薬および投与を可能にし、医薬組成物にコンシステンシーと形態を与えることである。提示形態が液体であるときには、キャリアは希釈剤である。本発明で用いることができる薬学上許容可能なキャリアは、当業者に知られているもの、例えば、リソソーム、ミリカプセル、マイクロカプセル、ナノカプセル、スポンジ、ミリスフェア、マイクロスフェア、ナノスフェア、ミリ粒子、マイクロ粒子およびナノ粒子であることができる。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、当該技術水準で知られている様々な形態で投与する目的で処方することができる。このような処方物は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトに局所、口腔、非経口、腹腔内、静脈内、皮内、病巣内、動脈内、筋肉内、鼻内または皮下経路などこれらに限定されない様々な経路を通して投与することができる。
【００５３】
本明細書の記載に基づき、もう一つの好ましい実施態様は、組成物が局所、口腔、腹腔内、皮内または皮下投与に好適な投薬形態である場合の使用に関する。さらにより好ましい実施態様は、組成物が局所投与に好適な投薬形態である場合の使用に関する。
【００５４】
本発明における「局所投与」という用語は、組成物を粘膜の表面に投与することを表す。投与は、消化管の任意の部分の粘膜、好ましくは口腔粘膜で行うことができる。本発明の組成物の投与は、数分間の口腔すすぎにより口腔粘膜に含浸させることにより行うことができ、次いで全胃腸粘膜に含浸させかつ接触させるために摂取することができる。
【００５５】
局所投与の場合には、本発明の組成物で用いることができる処方物としては、下記のもの：水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、乳液、ローション、ゲル、ポマード、香油、フォーム、ボディオイル、石鹸、バー、ペンシル、吸入器、クリーム、塗布剤、軟膏、血清およびムースを挙げることができる。組成物は、ヒドロゲル、ワイプ、パッチおよびフェイスマスクからなる群から選択される固形支持体に組込むこともできる。
【００５６】
治療上有効量を得るための用量は、例えば、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトの年齢、体重、性別または耐性などの様々な要因によって変化する。本明細書で用いられる意味においては、「治療上有効量」という表現は、所望な効果を生じる組成物の薬学上有効量を表し、通常はとりわけ前記医薬組成物および求める治療効果の典型的特徴によって決定される。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様は、投与される一日用量が３７．５ｍｇ〜７５ｍｇである場合の使用に関する。さらにより好ましい実施態様は、投与される一日用量が４５ｍｇである場合の使用に関する。さらにより好ましい実施態様は、１５ｍｇの投薬計画の用量を１日３回投与する場合の使用に関する。
【００５８】
本明細書の記載および特許請求の範囲において、「含んでなる」という用語およびその変異形は、他の技術的特徴、付加物、成分または段階を除外しようとするものではない。当業者にとって、本発明の他の目的、利点および特徴は、一部は記載からおよび一部は本発明の実施から推定される。下記の実施例および図面は、実例として提供され、本発明を制限しようとするものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ラット舌ホモジネートにおける酸化的ストレスレベル。対照ラット、放射線照射ラットおよび口腔で局所経路によって１％、３％または５％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラットにおける脂質過酸化（ＬＰＯ）インデックスの結果を示す。対照群（Ｃ）；放射線照射群（ＩＲ）；１％、３％または５％メラトニンゲルを投与した放射線照射群（ＩＲ＋メラトニン）。ＭＤＡ、マロニルジアルデヒド；４−ＨＤＡ、ヒドロキシアルケナール；Ｃに関して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図２】ラット舌ミトコンドリアにおける酸化的ストレスレベル。対照ラット、放射線照射ラットおよび口腔で局所経路によって１％、３％または５％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラットにおける脂質過酸化（ＬＰＯ）インデックスの結果を示す。対照群（Ｃ）；放射線照射群（ＩＲ）；１％、３％または５％メラトニンゲルを投与した放射線照射群（ＩＲ＋メラトニン）。ＭＤＡ、マロニルジアルデヒド；４−ＨＤＡ、ヒドロキシアルケナール；Ｃに関して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図３】ラット舌におけるグルタチオンレベル。対照ラット、放射線照射ラットおよび口腔で局所経路によって１％、３％または５％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラットにおけるグルタチオンレベルの結果を示す。Ａ，還元グルタチオンレベル（ＧＳＨ）；Ｂ，酸化体（ＧＳＳＧ）；Ｃ，総グルタチオン（ＧＴ）；Ｄ，対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、および１％、３％および５％メラトニンを投与したラット（ＩＲ＋メラトニン）の舌ミトコンドリアにおける（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）比。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図４】ラット舌ミトコンドリアにおけるグルタチオンペルオキシダーゼおよびグルタチオンレダクターゼの活性。Ａ，グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）；およびＢ，グルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）の対照ラット、放射線照射ラットおよび１％、３％または５％メラトニンゲルを投与した放射線照射ラットにおける活性の結果を示す。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、および口腔で局所経路によって１％、３％または５％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラット。Ｃに関して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図５】本発明の組成物を投与した後のラット舌の肉眼的外観。対照ラット、放射線照射ラット、および口腔で局所経路によって１％、３％または５％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラットの舌の肉眼的観察結果を示す。対照ラット、放射線照射ラット（ＩＲ）、および１％、３％および５％メラトニンゲルを投与した放射線照射ラット（それぞれ、ＩＲ＋１％ＭＴ；ＩＲ＋３％ＭＴおよびＩＲ＋５％ＭＴ）。
【図６】ラット舌におけるグルタチオンレベルに関する局所投与と腹腔内投与の比較。対照ラット、放射線照射ラットおよび局所経路による３％（ｗ／ｖ）メラトニンまたは腹腔内（ｉ．ｐ．）経路による３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した放射線照射ラットにおけるグルタチオンレベルの結果を示す。ラット舌ミトコンドリアにおけるＡ，還元グルタチオンレベル（ＧＳＨ）；Ｂ，酸化グルタチオンレベル（ＧＳＳＧ）；Ｃ，総グルタチオンレベル（ＧＴ）；およびＤ，ＧＳＳＧ／ＧＳＨ比。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与したラット（ＩＲ＋３％）、およびｉ．ｐ．経路によりメラトニンを投与したラット（ＩＲ＋ＩＰ）。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃ｐ＜０．０１および＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図７】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌におけるＧＰｘの活性および発現。Ａ，ＧＰｘ活性；Ｂ，ＧＰｘのウェスタンブロットデンシトメトリー分析。Ｃ，対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、口腔での局所経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した（ＩＲ＋３％）およびｉ．ｐ．経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した（ＩＲ＋ＩＰ）ラットの舌ミトコンドリアにおけるＧＰｘのウェスタンブロット画像。Ｃに関して＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．０５；ＩＲに関して＃＃ｐ＜０．０１および＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図８】口腔で局所経路によってメラトニンゲルおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌におけるＧＲｄの活性および発現。Ａ，ＧＲｄ活性；Ｂ，ＧＲｄのウェスタンブロットデンシトメトリー分析およびＣ，対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、口腔での局所経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した（ＩＲ＋３％）およびｉ．ｐ．経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した（ＩＲ＋ＩＰ）ラットの舌ミトコンドリアにおけるＧＰｄのウェスタンブロット画像。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃ｐ＜０．０５および＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図９】口腔で局所経路によってメラトニンゲルおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットの舌ミトコンドリアにおけるミトコンドリア呼吸鎖複合体ＣＩ、ＣＩＩ、ＣＩＩＩおよびＣＩＶの活性。Ａ，複合体Ｉ；Ｂ，複合体ＩＩ；Ｃ，複合体ＩＩＩ；Ｄ，複合体ＩＶ。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、口腔で局所経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した（ＩＲ＋３％）およびｉ．ｐ．経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した（ＩＲ＋ＩＰ）ラット。Ｃに関して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃ｐ＜０．０５および＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図１０】３％メラトニンゲルおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットにおけるウェスタンブロット法による舌のミトコンドリア呼吸鎖複合体ＣＩ、ＣＩＩＩ、ＣＩＶおよびＣＶの発現。Ａ，複合体Ｉ、Ｂ，複合体ＩＩＩ、Ｃ，複合体ＩＶ、Ｄ，複合体Ｖに対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー。Ｅ．複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶに対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、口腔で局所経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した（ＩＲ＋３％）およびｉ．ｐ．経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した（ＩＲ＋ＩＰ）ラット。Ｃに関して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃ｐ＜０．０５および＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図１１】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌ミトコンドリアにおけるメラトニンレベル。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、口腔で局所経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した放射線照射ラット（ＩＲ＋３％  ａＭＴ）およびｉ．ｐ．経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した放射線照射ラット（ＩＲ＋ＩＰ）。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図１２】本発明の組成物を腹腔内経路によって投与した後のラット舌の肉眼的外観。腹腔内経路によって３％（ｗ／ｖ）メラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌の肉眼的結果を示す。
【図１３】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌ホモジネートにおけるウェスタンブロット法によるＰＧＣ−１α、ＮＲＦ１およびＴＦＡＭの発現。Ａ，ＰＧＣ−１α、Ｂ，ＮＲＦ１、Ｃ，ＴＦＡＭに対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー；Ｄ，ＰＧＣ−１α、ＮＲＦ１およびＴＦＡＭに対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与した（＋３％  ａＭＴ）およびメラトニンをｉ．ｐ．経路によって投与した（＋ＩＰ  ａＭＴ）ラット。Ｃに関して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１。
【図１４】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌におけるウェスタンブロット法によるＮＦκＢの発現。Ａ，サイトゾルのＮＦκＢに対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー；Ｂ，核のＮＦκＢ；Ｃ，サイトゾルのＮＦκＢおよび核のＮＦκＢに対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与した（＋３％  ａＭＴ）およびメラトニンをｉ．ｐ．経路によって投与した（＋ＩＰ  ａＭＴ）ラット。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊ｐ＜０．０１；ＩＲに関して＃＃ｐ＜０．０１。
【図１５】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌ホモジネートにおけるウェスタンブロット法によるＮＬＲＰ３、ＡＳＣおよびカスパーゼ１の発現。Ａ，ＮＬＲＰ３、Ｂ，ＡＳＣ、Ｃ，カスパーゼ１（ｃａｓｐ．１）に対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー；Ｄ，ＮＬＲＰ３、ＡＳＣおよびカスパーゼ１に対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与した（＋３％  ａＭＴ）およびｉ．ｐ．経路によってメラトニンを投与した（＋ＩＰ  ａＭＴ）ラット。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１；ＩＲに関して＃ｐ＜０．０５。
【図１６】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌ホモジネートでのウェスタンブロット法によるＩＬ−１およびＴＮＦ−αの発現。Ａ，ＩＬ−１、Ｂ，ＴＮＦ−αに対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー；Ｃ，ＩＬ−１およびＴＮＦ−αに対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与した（＋３％  ａＭＴ）およびメラトニンをｉ．ｐ．経路によって投与した（＋ＩＰ  ａＭＴ）ラット。Ｃに関して＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５；ＩＲに関して＃＃ｐ＜０．０１および＃ｐ＜０．０５。
【図１７】口腔で局所経路によってメラトニンゲルを投与したおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与した放射線照射ラットのラット舌ホモジネートにおけるウェスタンブロット法によるＰ５３、ＢａｘおよびＢｃｌ２の発現。Ａ，Ｐ５３、Ｂ，Ｂａｘ、Ｃ，Ｂｃｌ２に対応するウェスタンブロットバンドデンシトメトリー；Ｄ，Ｂａｘ／Ｂｃｌ２比；Ｅ，Ｐ５３、ＢａｘおよびＢｃｌ２に対応するウェスタンブロット画像。対照ラット（Ｃ）、放射線照射ラット（ＩＲ）、３％メラトニンゲルを投与した（＋３％  ａＭＴ）およびメラトニンをｉ．ｐ．経路によって投与した（＋ＩＰ  ａＭＴ）ラット。Ｃに関して＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１および＊ｐ＜０．０５；ＩＲに関して＃＃＃ｐ＜０．００１および＃＃ｐ＜０．０１。
【００６０】
発明の実施態様の例
この特許資料で提供される下記の具体例は、本発明の性質を例示するのに役立つ。これらの例は、説明の目的のためにのみ含まれるのであり、本明細書で主張される発明に対する制限と解釈してはならない。従って、下記の例は、その出願の分野を制限することなく発明を説明する。
【００６１】
本発明を、本発明者らによって行われる試験によって説明し、粘膜炎におけるメラトニンゲルの有用性を明らかに示し、様々な濃度での結果を示す。
【００６２】
Ａ．材料および方法
本発明の組成物を、実験で用いる動物に様々な投与経路によって投与し、ヒト患者による実験も行った。
【００６３】
口腔での局所投与のため、用いた組成物は、１％、３％または５％メラトニン（それぞれ、組成物の最終容積１００ｍｌ中メラトニン１、３または５ｇ）を含んでなり、２０％ポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマーをゲル化物質として用いたヒドロゲル（ゲル）であった。プルロニック（商標）Ｆ１２７（ポロキサマー）を、ポリエチレンとポリプロピレンとのコポリマーとして用いた。０．３％安息香酸ナトリウムを、防腐剤として用いた。０．５％スイートオレンジエッセンスを用いた。用いた総ての成分は、ＦＡＧＯＮ  ＩＢＥＲＩＣＡ，Ｓ．Ａ．Ｕ．から得た。照合番号：メラトニン、３３４５７−２７；プルロニック（商標）Ｆ１２７、３３３５３−ＳＰ；安息香酸ナトリウム、３１３６０−１２；オレンジエッセンス、３０６２０−０８。メラトニンの化学構造を、下記に示す。
【化２】
0006038933.tif 000003
【００６４】
実験に用いた動物は、体重が２８０ｇのラットであり、グラナダ大学の生物医学研究センターの実験放射線装置で制御条件下にて電離放射線に暴露した。動物を、５０グレイ（Ｇｙ）の完全露出に暴露した。毎日使用した照射線量は、１００．７５ｃＧｙ／分、２１０キロボルト（ｋＶ）および１２ミリアンペア（ｍＡ）で投与した１０Ｇｙであり、動物は線源から４０ｃｍ離して置いた。
【００６５】
様々な処方物を、下記のようにして動物に投与した。局所投与は、放射線照射前に、もう一つは後に口腔に投与し、連続投与は８時間毎に２１日間行った。動物を、メラトニンを投与しなかった放射線照射動物で最高等級の粘膜炎が観察された放射線照射開始から２１日後に屠殺した。実験に用いた動物で用いた処方物は、下記の通りであった：１％、３％または５％メラトニンを含むプルロニックＦ−１２７ゲル（それぞれ、１、３または５ｇのメラトニン／１００ｍｌゲル）、毎回５００μｌの容量を１日３回口腔に局所投与し、総量を１．５ｍｌ／日とした。口腔での局所投与は、動物が口腔に投与したゲルを摂取することを意味する。
【００６６】
実験は、動物に３％（ｗ／ｖ）ヒドロゲルで用いたのと同じメラトニン濃度を腹腔内経路によって投与することによっても行い、血漿メラトニンが粘膜炎を減少させることができるかまたは前記分子を局所経路によって投与する必要があるかを検討した。非経口経路には、溶液の総容積に対して測定した７０％ｖ／ｖ（容積／容積）の等張生理食塩水と３０％ｖ／ｖのプロピレングリコールとを含んでなる等張溶液を用いた。メラトニン４５ｍｇの１日用量を、２１日間注射した。放射線照射開始から２１日後に口腔で局所経路によって投与されるメラトニンゲルを投与した動物と同様に、動物を屠殺した。
【００６７】
放射線療法を受けた頭部および頸部の癌患者における３％（ｗ／ｖ）メラトニン組成物の保護機能も評価した。検討は、二重盲験（３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルを投与した５名の患者およびメラトニンを含まないゲルを投与した５名の患者）であった。患者に、前記ゲル５００マイクロリットルで口腔すすぎを１日３回行い、すなわち、患者は、総量が４５ｍｇ／日のメラトニンを１５ｍｇ、１日３回の投薬計画に分配して投与された。患者は、メラトニンを含むゲルを口腔に２分間保持した後、ゲルが胃腸粘膜全体に含浸するように摂取した。２週間評価は、口内炎の客観的等級を決定するための計画通院で行った（ＷＨＯによるＲＴＯＧ（腫瘍放射線治療グループ）客観的毒性尺度）：等級０〜４。
【００６８】
Ｂ．評価パラメーター
Ｂ．１．酸化的損傷のマーカー
−細胞膜および細胞内膜（ＬＰＯ）の酸化の評価
遊離酸素ラジカルが細胞損傷を生じることができる極めて重要な機構は、細胞およびミトコンドリア膜両方の脂質過酸化による。脂質過酸化は、ポリ不飽和脂肪酸に対するフリーラジカルの作用によって起こる。細胞膜構造におけるこれらの変化は、その物理化学特性を変化させ、透過性を増加させかつ機能を漸進的に喪失することにより、結果として細胞死へと至る可能性がある。膜の脂質過酸化度の測定は、常に酸化的ストレスインジケーターとして極めて重要なパラメーターであると考えられてきた。脂質過酸化（ＬＰＯ）インデックスは、試料に含まれるマロニルジアルデヒドと４−ヒドロキシアルケナール（ＭＤＡ＋４−ＨＤＡ）を定量することによって提供され、これらはポリ不飽和脂肪酸と関連エステルから誘導される過酸化物の分解による重要な生成物である。マロニルジアルデヒドと４−ヒドロキシアルケナールの濃度並びにヒドロペルオキシドの濃度は、脂質過酸化に対する好適なインデックスを提供する。
【００６９】
Ｂ．２．酸化防止剤防御の評価
細胞の酸化防止剤系には、生理学的条件で細胞中のフリーラジカルの解毒に関与する酵素の群があり、これらの酵素は本質的に
−グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）：この酵素は、補助因子として還元グルタチオンを用い、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を除去する。
−グルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）：この酵素は、グルタチオンペルオキシダーゼ活性によって生成した酸化型グルタチオンを還元型グルタチオンに再変換する。
【００７０】
酸化型グルタチオンを還元型グルタチオンで割ることによって商として得られる比（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）も、酸化還元状態の評価に重要な比である。
【００７１】
Ｂ．３．ミトコンドリア活性のマーカーの評価
フリーラジカルの産生増加に伴うミトコンドリア機能不全は、細胞死の原因である。従って、呼吸鎖輸送複合体（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ）の活性および複合体の発現の測定は、ミトコンドリア損傷の程度を知る上で基本的なことである。
【００７２】
Ｂ．４．ミトコンドリアおよび酸化的ストレス：インフラマソーム活性化：
活性酸素種（ＲＯＳ）の生成は、放射線照射によって損傷したミトコンドリアで増加し、ミトコンドリア成分の酸化的変化とミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＴＰ）の開口を引き起こす。ミトコンドリア膜透過性は、アポトーシスまたは壊死で終了するプログラム細胞死経路の活性化における不可逆点を表す（Schroder K, et al. Cell. 2010; 140:821-832; LatzE, Curr. Opin. Immunol, 2010; 22: 28-33. Epub 2010）。
【００７３】
最近の研究は、ミトコンドリアが先天性免疫応答をも調節することを示している（Kastner DL, et al. Eur J Immunol. 2010;40:611-615）。ミトコンドリアに生じるフリーラジカルは、細胞炎症機構、具体的にはＮＬＲＰ３（ＮＯＤ様受容体ファミリー、ピリンドメイン含有３）のようないわゆるインフラマソームの活性化の原因である（Zhou R, et al. Nature 2011;469:221-226）。ＮＬＲＰ３は、免疫メッセンジャーＩＬ−１βの産生および炎症に介在するタンパク質複合体である。
【００７４】
ストレスの増加の結果として細胞損傷を引き起こす病原体または分子など多種多様の要因が、先天性免疫応答を活性化することができる。ＮＬＲＰ３が活性化されると、それは、ＮＬＲＰ３、アダプター分子ＡＳＣ（カスパーゼ動因ドメインを含むアポトーシス関連シミ様タンパク質）並びにプロカスパーゼ−１からなるマルチタンパク質複合体を形成する。細胞ストレス状況では、ＮＬＲＰ３はＡＳＣタンパク質とカスパーゼ−１を活性化するプロカスパーゼ１を動員し、炎症誘発性サイトカインの活性化などの一連の細胞内反応を引き起こす。
【００７５】
Ｂ．５．炎症応答およびＮＦ−κＢ
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）経路は、炎症応答にも関与している。インフラマソームとの差は、ＮＦ−κＢ経路が、膜上でトール様受容体（ＴＬＲ）を介して活性化され、一方インフラマソームはサイトゾル性ＮＯＤ様受容体（ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン様受容体）（ＮＬＲ）を介して活性化されることである。
【００７６】
ＮＬＲ．ＮＦ−κＢおよびＮＬＲＰ３は、一緒に働いてＩＬ−１βのような炎症誘発性サイトカインを活性化する。平行して、このサイトカインはミトコンドリア損傷を誘発し、ＲＯＳ産生を増加させ、ＲＯＳはミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）およびＭＴＰ開口における損傷を誘発し、アポトーシスを引き起こす。
【００７７】
さらに、ＮＦ−κＢは、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）および血管接着分子（ＶＣＡＭ−１）のような炎症応答に関わる多種多様な遺伝子の発現を活性化する。従って、放射線照射は、アポトーシスに寄与し、従って、粘膜炎の開始に寄与する炎症誘発性分子の増加を引き起こす。
【００７８】
Ｂ．６．アポトーシスの機構：
アポトーシスを調節するタンパク質は、Ｂｃｌ２（Ｂ細胞リンパ腫２）のような抗アポトーシス性タンパク質およびＢａｘのようなアポトーシス促進性タンパク質に分類される。従って、Ｂａｘ／Ｂｃｌ２比は、アポトーシスのレベルを直接反映するので、極めて重要な比である。タンパク質ｐ５３は、ＤＮＡ修復酵素を活性化して、検出される損傷を治療する。ＤＮＡの損傷が修復不能である場合には、異常ＤＮＡを含む細胞の増殖を防止するために、アポトーシスに入ることは防御の最終機構である。ｐ５３は、ＢＡＸのようなアポトーシス促進性遺伝子の発現を活性化する。
【００７９】
従って、ミトコンドリアＲＯＳの産生増加、ｍｔＤＮＡの損傷およびＭＴＰ開口の結果は、炎症プロセスの保持を伴うので、インフラマソームを標的とする治療は、放射線療法によって誘発される粘膜炎で起こるような抗炎症剤に応答しない炎症性疾患における新たな治療法を用いるための経路であることができる。
【実施例】
【００８０】
Ｃ．実施例１：ラット舌で得られた結果
Ｃ．１−  口腔で局所経路による１％、３％および５％（ｗ／ｖ）ゲル中のメラトニンの使用
放射線によって引き起こされる酸化的ストレスは、細胞膜の損傷を引き起こし、これは、膜脂質の酸化の増加が対照に対して５０％を上回ることによって表される（図１、ｐ＜０．００１）。この損傷は、放射線がこれらの組織を傷つけて粘膜炎を引き起こすことを示している。３％メラトニンは放射線療法の影響を完全に逆転させるが、１％メラトニンはＬＰＯレベルを部分的に逆転させるだけである。３％を上回るメラトニン濃度、例えば５％のようなメラトニン濃度を用いるときには、酸化的ストレスの中和において３％濃度と同じ効果を有する（図１）。
【００８１】
放射線照射はまた、ミトコンドリアをひどく損傷し、これはミトコンドリア膜におけるＬＰＯの増加によって反映される（図２）。このミトコンドリア損傷は、細胞死を引き起こす（Acuna-Castroviejo et al. Curr Top Med Chem 2010,11(2):221-240）。放射線照射ラットにメラトニンを投与すると、メラトニンの強力な酸化防止効果が３％で投与するときに観察され、ミトコンドリアにおける放射線療法の影響を完全に逆転する（ｐ＜０．００１）。これらの効果を発揮することができる現在存在する分子は知られていない。しかしながら、１％メラトニンを投与するときには、それはミトコンドリアにおける放射線照射によって引き起こされる酸化的損傷を中和する効果は実質的にない。５％メラトニン濃度を用いるときには、それは、ミトコンドリアの酸化的ストレスの中和において３％濃度と同じ効果を有する。
【００８２】
放射線照射は、ＧＳＨレベルの極めて有意な減少も引き起こすが（ｐ＜０．００１）（図３Ａ）、同時にＧＳＳＧレベル（ｐ＜０．００１）は舌ミトコンドリアで増加し（図３Ｂ）、総グルタチオン（ＧＳＨ＋ＧＳＳＧ）の増加を引き起こす（図３Ｃ）。これらの変化は、ミトコンドリアの酸化的ストレスのかなりの増加を反映しており、放射線照射によって引き起こされる有害効果を反映している。細胞内の、およびこの場合にはミトコンドリア内の酸化的ストレスの最良のインデックスであるＧＳＳ／ＧＳＨ比の増加（ｐ＜０．００１）（図３Ｄ）は、このような放射線照射の有害効果を支持している。一方、１％メラトニンの投与では、ＧＳＨレベルを増加させることはできず（図３Ａ）かつＧＳＳＧレベルを減少させることはできず（図３Ｂ）、またＧＳＳＧ／ＧＳＨ比を正常化することもできず（図３Ｄ）、従って、酸化的ストレスを中和することはできない。５％メラトニン濃度を用いると、ミトコンドリアの酸化的ストレスの中和において３％濃度と同じ効果を有することが観察され、いずれの場合にも放射線照射の効果を完全に逆転する。
【００８３】
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を測定すると（図４Ａ）、産生した過酸化物の増加に対する応答として放射線照射によって引き起こされる活性の増加が観察される。３％メラトニンゲルの投与は、放射線照射の効果を部分的に中和する。５％メラトニンは、３％濃度と同じ効果を有するが、１％濃度は効果を持たない。
【００８４】
グルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）の活性を測定すると（図４Ｂ）、５％メラトニンは３％濃度と同じ効果を有するが、１％濃度は効果を持たないことが同様に観察される。ミトコンドリアＧＲｄは、酸化的ストレスによって容易に阻害される酵素であり、結果としてその活性は放射線照射によって有意に減少し（図４Ｂ、ｐ＜０．００１）、組成物の効果は３％および５％のいずれのメラトニンの投与によっても中和される（ｐ＜０．００１）。
【００８５】
メラトニンのこれらの作用の重要性は、前記の生化学的変化に加えて、ミトコンドリアの酸化的ストレスの減少が粘膜炎の完全な防止を引き起こし、他の種類の病変は治療を受けたラットでは見られないという事実に基づいている（図５）。１％メラトニンゲルが投与された動物の画像は、前記濃度では効果が見られなかったので含まれていない。
【００８６】
従って、粘膜炎の治療のための最少有効用量は、１日３回投与されるゲルにおける３％メラトニン濃度に相当し（それぞれの投与に５００μｌ）、メラトニンの１日用量は４５ｍｇとなる。
【００８７】
Ｃ．２−  ３％（ｗ／ｖ）メラトニンゲルの投与と非経口経路による同じメラトニン濃度の投与との比較
粘膜炎を逆転させるための最も好適な投与経路を決定するために、口腔で局所経路による３％メラトニンゲルの投与と腹腔内経路（ｉ．ｐ．）によるメラトニンの投与を、同一用量（１日４５ｍｇ）で比較した。
【００８８】
ゲルと共に投与したメラトニンと非経口経路によるメラトニンの投与との効果は、幾つかの重要な局面において異なっており、例えば、ＧＳＨ回復およびＧＳＳＧ減少におけるｉ．ｐ．投与の効力が低めであり、ＧＳＳＧ／ＧＳＨ比は高めを維持しており、ゲルを投与した後よりもミトコンドリア内の酸化的ストレスが高くなることを示している（図６）。図６では、３％ゲルおよび腹腔内経路によってメラトニンを投与したラットのラット舌におけるグルタチオンレベルを比較している。
【００８９】
ミトコンドリアグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）に関して（図７）、これらの結果は、放射線照射により産生した過酸化物の増加に対する応答として、酵素の活性（図７Ａ）および発現（図７Ｂおよび７Ｃ）の増加を示している。タンパク質発現の検討は、ウェスタンブロット法によって行い（７Ｃ）、タンパク質の量の増加はこれらのウェスタンブロット法のデンシトメトリー分析で観察され（図７Ｂ）、前記酵素の発現が放射線照射により増加することを示している。メラトニンの局所投与および腹腔内投与は、いずれも放射線照射の効果を部分的に中和する。
【００９０】
ミトコンドリアグルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）は、完全に異なる経路をたどる（図８）。それは酸化的ストレスによって容易に阻害される酵素であり、結果として、その活性（図８Ａ）および発現（図８Ｂおよび８Ｃ）は、放射線照射により有意に減少する。タンパク質発現の検討は、ウェスタンブロット法によって行い（８Ｃ）、放射線照射によるタンパク質の量の減少はこれらのウェスタンブロット法のデンシトメトリー分析で観察され（図８Ｂ）、前記酵素の発現が阻害されることを示している。ＧＲｄの活性および発現を回復するためのメラトニンゲルの有意な効果が観察されるが、メラトニンの腹腔内投与は酵素を回復させることはできない。ＧＲｄが阻害されたままであれば、ミトコンドリアは酸化的損傷を中和することができず、細胞死を促進する。
【００９１】
放射線照射は、ミトコンドリアの電子伝達系複合体であって、基本的に複合体Ｉ、ＩＩおよびＩＶの阻害を引き起こす（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｄ）。複合体ＩＩＩでは、有意な変化は観察されない（図９Ｃ）。呼吸鎖複合体が損傷すると、一層多くのフリーラジカルが生成し、呼吸鎖効率が減少し、ＡＴＰの産生は一層少なく、アポトーシス因子が活性化され、アポトーシスが増加する。メラトニンゲルは、複合体の活性回復に非経口投与より効率的であり、対照値を上回って活性を増加させる（図９）。
【００９２】
活性と共に起こるように、放射線照射は呼吸鎖複合体の発現も阻害し、複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの発現の阻害は極めて重要である（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄおよび１０Ｅ）。ウェスタンブロット法による検討は、複合体Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶのタンパク質の量の減少を示し、これらの複合体の合成における放射線照射による減少を示している。メラトニンゲルは、複合体の発現回復において非経口投与よりも遥かに効率的である。非経口投与では、複合体ＶまたはＡＴＰ合成に関与する酵素であるＡＴＰシンターゼの発現を完全に回復することができないこともさらに観察することができる（図１０Ｄ）。複合体Ｖが阻害されると、ＡＴＰ合成はなく、従って、細胞はアポトーシスまたは壊死によって死滅するので、このデータは極めて関連性が高い（Escames G, et al. Hum Genet, July, 2011, DOI 10.1007/s00439-011-1057）。３％ゲル組成物は、示された結果によれば、呼吸鎖複合体の発現の再活性化において非経口経路より有意に良好である。
【００９３】
放射線照射は、舌における内在性メラトニンレベルを抑制することが分かった。前記レベルは、口腔で局所経路による本発明の組成物投与により回復し、局所的酸化防止作用を促進する。しかしながら、このようなレベルは、舌ではメラトニンの非経口投与によっては回復しない（図１１）。これらの結果は、局所投与がメラトニンの非経口投与より一層有効である理由を説明している。
【００９４】
投与経路によるメラトニンの作用に関するこれらの効率の差は、肉眼的病変の分析により明らかに観察される（図５および１２）。実際に、メラトニンの非経口投与では、放射線照射後の舌の病変を回復することはできないが、口腔での局所投与では、舌の形態学的外観を完全に正常化する。
【００９５】
Ｃ．３−  インフラマソーム活性化、炎症応答およびアポトーシスの機構についてのデータ
ＰＧＣ１α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γコアクチベーター１−α）、ＮＲＦ１（核呼吸因子１）およびＴＦＡＭ（転写因子Ａ、ミトコンドリア）を測定することによってミトコンドリアバイオジェネシスを測定すると、放射線照射がＰＧＣ１αを阻害したが、ミトコンドリア損傷を埋め合わせるためのＮＲＦ１およびＴＦＡＭの増加はないことが観察された（図１３）。
【００９６】
放射線照射はＮＦκＢの活性化を増加させ、核およびサイトゾルの両方におけるレベルを増加させ（図１４Ａおよび図１４Ｂ）、またインフラマソーム経路が活性化されて、ＮＬＲＰ３、ＡＳＣおよびカスパーゼ−１を増加させる（図１５）ことが見出されている。ＮＦκＢ経路およびインフラマソーム経路の活性化の結果として、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１およびＴＮＦ−αが増加する（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【００９７】
ミトコンドリア損傷は、アポトーシス促進性タンパク質ｐ５３（図１７Ａ）およびＢａｘ（図１７Ｂ）の増加並びにＢｃｌ２のような抗アポトーシス性タンパク質の減少（図１７Ｃ）により、アポトーシスの増加をも伴う。従って、Ｂａｘ／Ｂｃｌ２比およびｐ５３が増加し（図１７Ｄ）、アポトーシスの有意な増加を示している。
【００９８】
ミトコンドリア損傷、インフラマソーム活性化および放射線によって誘発される粘膜炎の直接的関係が明らかにされたのは、これが最初である。
【００９９】
次いで、３％メラトニンゲルの投与は酸化的ストレスを中和し、酸化防止酵素の活性および発現を増加させ、ミトコンドリア機能を増加させ、フリーラジカルの産生を減少させてＮＦκＢ（図１４Ａおよび１４Ｂ）およびインフラマソーム（図１５）の活性を減少させる。
【０１００】
従って、３％メラトニンゲルは、有意にアポトーシスを阻害し（図１７Ｄ）、ｐ５３およびＢａｘのようなアポトーシス誘導タンパク質を減少させ（図１７Ａおよび１７Ｂ）、Ｂｃｌ２のような抗アポトーシス性タンパク質の発現を増加させる（図１７Ｃ）。
【０１０１】
さらに、３％メラトニンゲルは、ミトコンドリアバイオジェネシスを増加させ、放射線照射によって阻害されるＰＧＣ１αを増加させる。
【０１０２】
これは総て、細胞生存の増加を引き起こす。さらに、メラトニンレベルは口腔での局所経路によるゲルの投与によって回復し、局所的酸化防止作用を促進する。
【０１０３】
しかしながら、これらのレベルは、舌ではメラトニンの非経口投与によって回復しない。これらの結果は、局所投与がメラトニンの非経口投与より一層効率的であることを説明している。
【０１０４】
組織学も、肉眼的病変を示している。ヘマトキシリン・エオシン染色を用いて、検討を行った組織における組織学的病変の存在を決定した。マッソン・ゴールドナーのトリクローム染色（ＴＲＩ）は、赤色に染色される筋肉組織を緑色に染色される結合組織から区別することができた。
【０１０５】
治療を行っていない対照動物では、舌の組織学的構造に変化は見られない。粘膜の多重層化された角化上皮は、背面帯では糸状乳頭の存在がまた腹面帯ではその非存在が保たれている。結合組織の小さな層と幾つかの管によって形成される粘膜固有層および粘膜下組織は、粘膜の下にある。次いで、様々な方向に向き、束の間に少量の結合組織を有する筋肉の層が見出される。この結合組織がほとんどないことはＴＲＩ染色によって明らかに示されており、緑色染色の存在は、舌筋肉間では少ない。
【０１０６】
放射線照射動物では、筋肉繊維の間でそれらを分離している結合組織の増加がある（繊維症）。血管鬱血および管の数の有意な増加（脈管形成）も見られる。対照動物で観察されたのとは異なり、この場合には緑色染色された繊維症が一層多く見られる。これは、特に繊維が横方向に切断された筋肉層で観察される。
【０１０７】
メラトニンを投与した動物では、放射線照射動物の舌で観察したものと比較して、舌の繊維症および筋肉繊維間の脈管形成の減少が観察される。この繊維状結合組織の減少は、ＴＲＩ法によって最も良好に示され、それは緑色に染色され、赤色に染色される筋肉繊維と完全に識別されるからである。両治療間の差に関しては、３％メラトニンゲルは、非経口投与より良好に作用し、繊維症がずっと少ないからである。
【０１０８】
放射線照射のこれら総ての効果は、電子顕微鏡法によって観察することができるミトコンドリア損傷を生じる。放射線照射動物では、フリーラジカルおよび炎症応答の増加を引き起こすミトコンドリア空胞形成並びに内容物が失われた壊れたミトコンドリアを観察することができる。
【０１０９】
ゲルを投与した動物では、壊れたミトコンドリアは観察されず、空胞は消失する。しかしながら、壊れたミトコンドリアは、未治療動物と同様にメラトニンを非経口経路で投与したラットで観察される。
【０１１０】
従って、メラトニンは放射線療法を施した胃腸粘膜を保護し、前記の放射線によって引き起こされた病変、例えば粘膜炎を予防し、前記病変を治癒することができ、局所経路による投与が非経口投与より効率的であることを、初めて明らかにした。メラトニンのこれらの作用の重要性は、ミトコンドリア損傷の減少に基づいており、これが粘膜炎を完全に予防し、治療を受けたラットには肉眼的レベルまたは微視的レベルにおいて病変は全く観察されない。
【０１１１】
Ｄ−実施例２：ヒトで得られた結果：
３％メラトニンゲルを投与された患者は、放射線療法に一層よく耐え、オピオイドの投与を必要としなかった。これらの患者は経鼻胃管を必要とせず、入院はせず、治療を中断する必要はなかった。メラトニンを投与されない患者は総て強オピオイドを必要とし、彼らは総て最高等級の放射線皮膚炎を引き起こした。幾人かは、入院し、治療を中断しなければならなかった。
【０１１２】
Ｅ−本発明の実施例の結論：
１％メラトニンを含んでなる医薬組成物は、放射線療法によって引き起こされる粘膜炎を逆転させない。しかしながら、３％メラトニンを含んでなる医薬組成物は、５％メラトニンを含んでなる組成物によって起こるのと同様に、放射線療法によって引き起こされる粘膜炎を完全に逆転させる。これらの結果は、放射線療法によって引き起こされる粘膜炎の副作用の治療における３％〜５％メラトニンを含んでなる組成物の有用性を明らかにしている。
【０１１３】
本明細書に示される結果は、粘膜炎にはミトコンドリア損傷があり、従って、この治療の成功は、粘膜に含浸して、ミトコンドリア損傷を逆転させるメラトニンゲルの口腔投与に基づいていることを明らかにしている。任意の他の種類のメラトニン投与は、恐らくは、メラトニンが速やかに吸収され、半減期が非常に短く（３０分間）、口腔および胃腸管のいずれにおいても粘膜では十分な治療レベルに達しないという事実により、粘膜炎に明らかな効果を持たない。しかしながら、プルロニックＦ−１２７および３％以上の濃度のメラトニンゲルを含んでなる本発明の組成物は、粘膜に含浸して、有効な局所濃度に達し、メラトニンがミトコンドリアに入り、胃腸管全体にその効果を発揮することができる。
【０１１４】
従って、放射線療法期間中に放射線によって引き起こされるひどい損傷から皮膚および粘膜を保護するのに好適な用量のメラトニンを含む口腔で局所投与用のこれらの医薬処方物は、臨床上極めて重要である。メラトニンの非経口投与は全く利益がないが、粘膜炎の治療および／または予防のための口腔での局所投与については、長期間の非経口投与はこれらの患者にとって心理的に苦痛であるが、ゲルの局所投与は遥かに快適であるという付加価値を有することが見出された。
【０１１５】
ミトコンドリアは細胞生存に重要な役割を果たしており、ミトコンドリア機能不全は、粘膜炎の生理病理学にかなり関与していることが、本明細書において初めて明らかにされた（結果参照）。ミトコンドリア機能不全は、粘膜炎の悪化と相関している。粘膜炎に罹っているラットの舌ミトコンドリアでは、生体エネルギー論的機能不全に加えて、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）が増加し、グルタチオンレダクターゼ（ＧＲｄ）が減少し、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）／還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（ＧＳＳＧ／ＧＳＨ）比が増加することが初めて見出された。後者は、細胞内およびミトコンドリア内の酸化的ストレスの正確なマーカーである。
【０１１６】
本発明は、本発明の組成物に含まれる濃度のメラトニンが粘膜炎におけるミトコンドリア酸化的ストレスを完全に減少させ、ミトコンドリア酸化防止酵素、主としてＧＲｄの活性を増加させることを明らかにしている。同時に、粘膜炎では阻害されている呼吸鎖複合体の活性および発現が増加する。本発明の組成物は、低濃度の組成物では有していない酸化防止および抗炎症効果を有する。３〜５％（最終組成物１００ｍｌ中メラトニン３〜５ｇ）のメラトニンの局所および口腔投与により、電離放射線によって損傷を受けた粘膜の細胞機能の損傷が防止される。
【０１１７】
さらに、メラトニンゲルによる口腔での局所投与は、非経口投与より粘膜炎に効率的であり、好適な処方物において、口腔への投与は、口腔（および拡大すれば、胃腸管）で一層長時間より高いメラトニンレベルが保持されるという事実による可能性があり、これにより局所的酸化防止および抗炎症作用および基本的にミトコンドリア内部の作用が促進され、組織損傷、従って粘膜炎の開始が防止される。従って、口腔での３％〜５％メラトニンの局所投与により、これらの病状における強力な防御組織が提供される。本発明の組成物は、放射線療法を受けた胃腸粘膜を保護し、前記放射線によって引き起こされる粘膜炎のような病変を予防し、前記病変を治療できることが明らかになった。得られた結果は、化学療法に外挿することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図５】
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【図７Ｃ】
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【図８Ｃ】
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【図１０Ｅ】
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【図１２】
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