(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を精製する方法であって、
前記ＦＳＨを含有する液体を、
−  陰イオン交換クロマトグラフィ、
−  疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−  色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記３つのクロマトグラフィは前記記載の順序で実施され、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない方法。
【請求項２】
前記陰イオン交換クロマトグラフィは、−Ｎ＋（ＣＨ３）３官能基を有する強陰イオン交換樹脂または、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分を含む強陰イオン交換樹脂、第四級アンモニウム（Ｑ）部分を含む強陰イオン交換樹脂、もしくは、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基を含む強陰イオン交換樹脂を使用して行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィは、フェニル基またはブチル基で誘導体化された架橋アガロースビーズから成る樹脂または、フェニルセファロース（登録商標）、ブチルセファロース（登録商標）、プロピルセファロース（登録商標）、オクチルセファロース（登録商標）、オクチル基で誘導体化された架橋アガロースビーズ、ＳＯＵＲＣＥ  １５（登録商標）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｍｅｔｈｙｌ、ｔ−ブチルＨＩＣ支持体、プロピルリガンドまたはフェニルリガンドを備えたＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）ＨＩＣ樹脂、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
６ＦＦ（登録商標）からなる群から選択される樹脂を使用して行なわれる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記色素アフィニティークロマトグラフィは、任意のマトリックスに共有結合されたリガンドとしてシバクロンブルー３Ｇを用いて行なわれる請求項１〜３のいずれか一項に記載
の方法。
【請求項５】
クロマトグラフィは、溶出液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ／塩化ナトリウム緩衝液を使用して７．０〜９．０の間の範囲のｐＨで行なわれる請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
陽イオン交換クロマトグラフィをさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記陽イオン交換クロマトグラフィが、膜に固定された強酸性の陽イオン交換体スルホン酸または、Ｓ樹脂、硫酸塩誘導体を有する樹脂、ＣＭ（カルボキシメチル）樹脂、もしくは、カルボキシル基誘導体化されたイオンを有する樹脂で行なわれる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程が、
ａ）陰イオン交換クロマトグラフィ、
ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィ、
ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィ、および
ｄ）陽イオン交換クロマトグラフィ
の順に行われる請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
さらなる陰イオン交換クロマトグラフィを含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換クロマトグラフィは、−Ｎ＋（ＣＨ３）３官能基を有する強陰イオン交換樹脂または、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分を含む強陰イオン交換樹脂、第四級アンモニウム（Ｑ）部分を含む強陰イオン交換樹脂、もしくは、トリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基を含む強陰イオン交換樹脂を使用して行なわれる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィは、溶出液としてＴｒｉｓ−ＨＣｌ／塩化ナトリウム緩衝液を使用して７．０〜９．０の間の範囲のｐＨで行なわれる請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程が、
ａ）第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、
ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィ、
ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィ、
ｄ）任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、および
ｅ）第２の陰イオン交換クロマトグラフィ
の順に行われる請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
サイズ排除クロマトグラフィをさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
サイズ排除クロマトグラフィは、架橋アガロースとデキストランからなる球状複合体のマトリックスを使用して行なわれる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程が、
ａ）第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、
ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィ、
ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィ、
ｄ）任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、
ｅ）任意選択の第２の陰イオン交換クロマトグラフィ、および
ｆ）サイズ排除クロマトグラフィ
の順に行われる請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程が、
ａ）第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、
ｂ）疎水性相互作用クロマトグラフィ、
ｃ）色素アフィニティークロマトグラフィ、
ｄ）膜陽イオン交換、
ｅ）第２の陰イオン交換クロマトグラフィ、および
ｆ）サイズ排除クロマトグラフィ
の順に行われる請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
１または複数の限外ろ過工程およびナノろ過工程の少なくとも一方をさらに含む請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
金属イオンアフィニティークロマトグラフィは行なわれない請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
免疫親和性クロマトグラフィは行なわれない請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＳＨは配列番号１のαサブユニットと配列番号２のβサブユニットとを有する請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）を含む医薬組成物の製造方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の精製方法によって前記ＦＳＨを得る工程を含む、方法。
【請求項２２】
組換えヒト卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の製造方法であって、
ａ）ヒトＦＳＨのα鎖とβ鎖をコードする１または複数の組換え核酸分子から、組換えヒトＦＳＨを生産するＣＨＯ細胞クローンを生成する工程、
ｂ）前記ＣＨＯ宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、および
ｃ）請求項１〜２０のいずれか一項に記載の精製方法によって、前記宿主細胞から前記組換えヒトＦＳＨを精製する工程、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または組換えＦＳＨ変異型を精製する方法に関する。方法は、組換えＦＳＨまたは組換えＦＳＨ変異型を含有する液体を、陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、および色素アフィニティークロマトグラフィにかけることを含み、これらのクロマトグラフィはどの順序で行ってもよく、該方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。この精製方法により、所望の程度の純度を有する高収率の組換えＦＳＨが得られる。得られたＦＳＨは、ＦＳＨ調製物が有用な治療剤と見なされる疾患ならびに医学適応の予防および治療に特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は下垂体前葉の性腺刺激細胞により生成され、血中へ放出される。ＦＳＨは、雌での卵成熟の制御、および雄での精子形成の制御の際に黄体形成ホルモン（ＬＨ）と共に作用する。ＦＳＨとＬＨはいずれも、別々の遺伝子によりコードされた２つの非共有結合により結合されたα鎖とβ鎖から成るヘテロダイマー糖タンパク質のファミリーに属している。α鎖とβはいずれも糖化すなわちグリコシル化されている。α−サブユニットは９２個のアミノ酸残基から成り、β−サブユニットは１１１個のアミノ酸残基から成り、その各々は２つの潜在的なアスパラギンに結合されるグリコシル化部位を有する。
【０００３】
ヒトＦＳＨは、無排卵女性の治療に、多卵胞発達（過剰排卵）の刺激のために、およ
びＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＧＩＦＴまたはＣＩＦＴ等の受胎支援の準備に使用されている。さらに、ヒトＦＳＨは、ＦＳＨ生産が低いか無い女性での卵胞成熟の刺激や、先天性または後天性の低ゴナドトロピン性性機能低下症の男性での精子形成の刺激のために使用されている。
【０００４】
排卵誘発の一般的な治療計画では、患者は約６日ら約１２日までの期間の間、毎日ＦＨＳまたは変異型（約７５〜４５０ＩＵ  ＦＳＨ／日）を注射で毎日投与される。卵巣過剰刺激の抑制のための一般的な治療計画では、患者は約６日ら約１２日までの期間の間、ＦＳＨまたは変異型（約１５０〜６００ＩＵ  ＦＳＨ／日）を注射で毎日投与される。
【０００５】
精子形成刺激の場合、１５０ＩＵ  ＦＳＨを一週間に３回と、２，５００ＩＵ  ｈＣＧを一週間に２回との組み合わせが、低ゴナドトロピン性性機能不全に罹患している男性の精子数の改善の達成に成功している。
【０００６】
１９８０年代までは、ヒトＦＳＨの主な供給源は、出産適齢期の女性の尿から単離された尿由来のＦＳＨであった。さらに精製された形式の高純度の尿由来 ＦＳＨが１９９０
年代に導入され、遂には１９９８年以来、組換えＦＳＨが開発され広く使用されるようになった。組換えＤＮＡ技術の到来で、α鎖およびβ鎖 をコードする核酸配列でトランス
フェクトした細胞培養物でヒトＦＳＨを生産することが可能となった。α鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列と、組換え ＦＳＨの生産方法が例えば特許文献１〜３に開示され
ている。
【０００７】
現在、ドイツの市場にはＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）および Ｐｕｒｅｇｏｎ（登録商
標）という２つの市販の組換えヒトＦＳＨ製品があり、これらはいずれもヒト野生型α鎖およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させることにより生産されている。
受胎障害の治療におけるＦＳＨの重要性のために、高純度で比活性の高い組換えＦＳＨを提供することが望ましい。ＦＳＨ治療には注射が繰り返し要求される。高度に精製されＦＳＨ製剤は皮下投与が可能であり、これは患者による自己投与を許容し、それにより、患者の便宜および遵守を増大させることが可能である。
【０００８】
Ares Trading S.A.の特許文献４は、組換えＦＳＨを精製する方法であって、１）色素
アフィニティークロマトグラフィ、２）疎水性相互作用クロマトグラフィ、および３）逆相クロマトグラフィからなる工程を含む方法について記載している。さらに、特許文献４は、ＦＳＨを１）陰イオン交換クロマトグラフィ、２）色素アフィニティークロマトグラフィ、３）疎水性相互作用クロマトグラフィ、４）逆相クロマトグラフィ、および５）陰イオン交換クロマトグラフィにかける工程を含むＦＳＨの精製方法を開示している。
【０００９】
Ares Trading S.A.の特許文献５は、組換えヒトＦＳＨの精製方法であって、（１）イ
オン交換クロマトグラフィ、（２）固定化金属イオンクロマトグラフィ、および（３）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）からなる工程を含む方法に関する。
【００１０】
Ares Trading S.A.の特許文献６は、ＦＳＨの精製方法であって、色素アフィニティー
クロマトグラフィ、弱陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、および強陰イオン交換クロマトグラフィからなるクロマトグラフィ工程を含む方法について記載している。これらのクロマトグラフィ工程はどの順序で実行されてもよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第８８／ｌ０２７０号
【特許文献２】国際公開第８６／０４５８９号
【特許文献３】欧州出願出願公開第０ ７３５ １３９号
【特許文献４】国際公開第２００６／０５１０７０Ａ１号
【特許文献５】国際公開第２００５／０６３８１１Ａ１号
【特許文献６】国際公開第２００７／０６５９１８Ａ２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
組換えＦＳＨおよびＦＳＨ変異型を精製する新しい方法が絶えず必要とされている。特に、逆相クロマトグラフィ工程の使用を回避する精製方法が必要とされている。さらに、免疫親和性クロマトグラフィに依存せず、このコスト集約的な工程なしで行なうことが可能な精製方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、上記のおよび更なる課題は独立請求項の特徴により解決される。有利な実施形態は従属請求項に定義される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的は、組換えＦＳＨまたは組換えＦＳＨ変異型を精製する新規かつ有利な方法を提供することにある。
第１態様では、本発明は、組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または組換えＦＳＨ変異型を精製する方法であって、
前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記３つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない方法を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、上記の異なるクロマトグラフィの工程は以下の順に行なわれる：（１）陰イオン交換クロマトグラフィ、（２）疎水性相互作用クロマトグラフィおよび（３）色素アフィニティークロマトグラフィ。陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）は、サンプル中のタンパク質と、樹脂に固定化された電荷との間の電荷と電荷の相互作用に基づいている。陰イオン交換クロマトグラフィでは、タンパク質の結合イオンは陰性であり、固定化される官能基は陽性である。一般的に使用される陰イオン交換樹脂はＱ樹脂、第四級アミンおよびＤＥＡＥ樹脂（ジエチルアミノエタン）である。しかしながら、一般に、陰イオン交換クロマトグラフィ工程は、すべての一般的な市販の陰イオン交換樹脂または膜で行なうことが可能である。陰イオン交換樹脂は、予め液体を注入されたカラムの形で使用されてもよい。代わりに、カラムは自己調製されてもよい。通常のカラム以外のカラムの容量および形状に関する制限は特に無い。当業者には、使用される陰イオン交換樹脂の量が、細胞培養液または捕捉工程でカラムに適用される他の流体（例えば先のクロマトグラフィ工程の溶出液）の全タンパク質含有量に依存して決まることが理解される。
【００１６】
本発明の目的で使用可能な典型的な強陰イオン交換樹脂は、以下のような官能基を含む：
第四級アミノエチル（ＱＡＥ）部分  例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ（ドイツ所在のＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から入手可能）、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ  ＱＡＥ（セルロースの第四級アミノエチル誘導体、アメリカ合衆国ペンシルバニア所在のＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能）等を含む樹脂、
第四級アンモニウム（Ｑ）部分  例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ドイツ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（ドイツ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）、Ｍａｃｒｏ  Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ（アメリカ合衆国カリフォルニア州Ｂｉｏ−ｒａｄ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ（ドイツ所在のＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ（アメリカ合衆国カリフォルニア州Ｂｉｏ−ｒａｄから入手可能）およびトリメチルアンモニウムエチル（ＴＭＡＥ）基を含む樹脂、例えばＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（ドイツ所在のＭｅｒｃｋから入手可能）を含む樹脂。
【００１７】
陰イオン交換クロマトグラフィは好ましくは、−Ｎ+（ＣＨ3）3官能基を有する強陰イ
オン交換樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる強陰イオン交換クロマトグラフィである。
【００１８】
本発明の目的で使用することが可能な強陰イオン交換樹脂の好ましい例は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとして当該技術分野で周知の強陰イオン交換体樹脂および第四級アンモニウム基（Ｑ）部分を有する他の樹脂である。
【００１９】
強陰イオン交換体であるＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑの特性は以下の通りである：
官能基          −Ｎ+（ＣＨ3）3
総イオン容量  １２０μｅｑ／ｍｌ
動的容量
１５０ｃｍ／時  １８０ｍｇ／ｍｌ
６００ｃｍ／時  １２５ｍｇ／ｍｌ
送出する対イオン  Ｃｌ-
平均粒径  １２０μｍ
推奨される線形流速範囲
５０−１２００ｃｍ／時
化学安定性
２，０００時間まで  １．０Ｍ  ＮａＯＨ（２０℃）
２００時間まで  １．０Ｍ  ＨＣｌ（２０℃）
体積変化
体積変化率
ｐＨ４−１０    ＜５％
０．  ０１−１．０Ｍ  ＮａＣｌ  ＜５％
ｐＨ安定性  １−１４
強陰イオン交換体Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰの特性は以下の通りである：
イオン容量  ０．１４−０．２０  ｍｍｏｌ  Ｃｌ-／ｍｌ
動的容量  ７０ｍｇ  ＢＳＡ／ｍｌ  媒体
記録流速  ３０−１５０ｃｍ／時
動作中の充填ベッドに対する最大圧力  ３バール（４２ｐｓｉ、０．３ＭＰａ）
ＨｉＬｏａｄカラムハードウェア圧力限界  ５バール（７３ｐｓｉ、０．５ＭＰａ）
平均粒径  ３４μｍ  
排除限界（Ｍｒ）  約４×１０6球状タンパク質
マトリックス  架橋アガロース、６％
ｐＨ安定性  ２−１２（動作期間および長期間）
１−１４（短期間）
化学安定性  一般に用いられているすべての緩衝液において安定
官能基としてジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）に基づくもののような弱陰イオン交換樹脂の使用は回避することが望ましい。
【００２０】
陰イオン交換クロマトグラフィの工程は、穏やかにアルカリ性のｐＨ、例えば７．０または７．０周辺から９．０にまたは９．０周辺、もしくは、７．５または７．５周辺から８．５または８．５周辺のｐＨを有する緩衝液を使用して好ましくは行なわれる。適切な緩衝液には例えば、ホウ酸緩衝液、トリエタノールアミン／イミノ二酢酸Ｔｒｉｓ、酢酸アンモニウム、トリシン、ビシン、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳが含まれる。トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液の使用が好ましい。陰イオン交換樹脂からの溶出は、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加を通じて移動相の伝達率を増加させることにより通常達成される。
【００２１】
本発明の方法の疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）は、（逆相樹脂のはるかに強い疎水性の表面と比較して）比較的穏やかに疎水性の表面を有するＨＩＣ樹脂を使用して行なうことが可能である。疎水性の表面性質を有するタンパク質は、エーテル基、フェニル基、ブチル基またはヘキシル基を一般に有する樹脂に引きつけられる。
【００２２】
ＨＩＣは、すべての通常市販されているＨＩＣ樹脂で行なうことが可能である。本発明の目的で使用することが可能なＨＩＣ樹脂には、ブチル、フェニル、プロピル、またはオクチルセファロース、ＳＯＵＲＣＥ  １５（すべて、ドイツ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｍｅｔｈｙｌまたはｔ−ブチルＨＩＣ支持体（ドイツ所在のＢｉｏ−ｒａｄ）またはプロピルリガンドまたはフェニルリガンドを備えたＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ（ドイツ所在のＭｅｒｃｋ  ＡＧ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＩＣ樹脂（例えばＴｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｂｕｔｙｌ  ６５０Ｍ）および同様のＨＩＣ樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）等のマトリックスを含む。
【００２３】
好ましい実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィは、フェニル基、ブチル基ま
たはオクチル基で誘導体化された架橋アガロースビーズから成る樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）の特性が以下に与えられる。
【００２４】
リガンド密度
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ｌｏｗ  ｓｕｂ）  ２５μｍｏｌ／ｍｌ  媒体
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）  ４０μｍｏｌ／ｍｌ  媒体
結合量
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ｌｏｗ  ｓｕｂ）  １０ｍｇ  ＩｇＧ／ｍｌ  媒体、２４ｍｇ  ＨＳＡ／ｍｌ  媒体  
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）  ３０ｍｇ  ＩｇＧ／ｍｌ  媒体、３６ｍｇ  ＨＳＡ／ｍｌ  媒体
圧力／フロー仕様  ２００−４００ｃｍ／時、１バール  ＸＫ  ５０／６０カラム、ベッド高さ  ２５ｃｍ
ｐＨ安定性  ２−１４（短期間）、３−１３（長期間）
化学安定性  通常の緩衝液、カオトロピック剤、界面活性剤、および極性有機溶媒において安定
平均粒径  ９０μｍ
保存  ２０％  エタノール
保存温度  ４℃から３０℃まで
ＨＩＣ樹脂での結合は、塩（例えばＮａＣｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4またはＮａ2ＳＯ4）の
添加を通じて得られた高い伝導率を備えた緩衝液で達成される。ＨＩＣ工程における溶出は、５または５周辺から９または９周辺、より好ましくは６または６周辺から８または８周辺、最も好ましくは７または７周辺から８または８周辺のｐＨを有する緩衝液を用いて、移動相の伝導率を減少させる（つまり塩濃度を低下させる）ことにより通常実行される。
【００２５】
平衡化緩衝液、洗浄緩衝液および溶出緩衝液は、ＨＩＣに通常使用される緩衝液の種類をすべて含んでもよい。したがって、緩衝剤はリン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたは他の緩衝剤を含む。さらに、緩衝液は、緩衝液が平衡化、洗浄、または溶出に使用されるかどうかに基づいて、０．５ｍＭから３Ｍの間のＮａＣｌ、ＫＣｌまたは他の適切な塩類を含んでもよい。平衡化緩衝液および洗浄緩衝液は、溶出緩衝液よりも高い濃度の前記塩類を含む。
【００２６】
ＨＩＣ工程における特に好ましい緩衝液は、塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液である。
本発明の方法の色素アフィニティークロマトグラフィは、固定化リガンドとして当業者に周知の色素化合物すなわちシバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａを有する樹脂を使用して行なうことが可能である。用語「固定化」は、当業者によく理解されている用語であって、リガンドが樹脂に化学的に結合されるという意味でリガンドが誘導体化されることを意味する。
好ましい実施形態では、色素アフィニティークロマトグラフィは、任意のマトリックス（例えばアガロースマトリックス）に共有結合されたリガンドとしてのシバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａを用いて行なわれる。好ましくは、色素アフィニティークロマトグラフィは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ドイツ所在のＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）として周知の樹脂を使用して行なわれる。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦの技術特性は以下に与えられる：
リガンド  シバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａ
リガンドカップリング方法  トリアジンカップリング
結合量  ＞１８ｍｇヒト血清アルブミン／ｍｌ  媒体
リガンド密度  約７μｍｏｌ  シバクロンブルー／ｍｌ  媒体
マトリックス  高度に架橋されたアガロース、６％
平均粒径  ９０μｍ
ｐＨ安定性  ４−１２（長期間）、３−１３（短期間）
保存  ２０％  エタノール、０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０
保存温度  ４℃から３０℃まで
化学安定性  ７０％  エタノール、６Ｍ  塩酸グアニジン、８Ｍ  尿素で４０℃にて７日間において安定
本発明の方法の色素アフィニティークロマトグラフィは、同様の特性を有する代替樹脂で行なわれてもよいことが理解される。代替樹脂の例には以下のものが含まれる：Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＡＦ−ｂｌｕｅ−ＨＣ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｂｌｕｅ  Ｃｅｌｌｔｈｒｕ  ＢｉｇＢｅａｄ（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ社）、ＳｗｅｌｌＧｅｌ  Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ社）、Ｃｉｂａｃｈｒｏｍｅ  ｂｌｕｅ  ３ＧＡ−アガロース  １００（Ｓｉｇｍａ社）、ＡｆｆｉＧｅｌ−Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  ｂｌｕｅカートリッジ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）、シバクロンブルー３ＧＡ（Ｓｉｇｍａ社）。
【００２７】
固定化色素アフィニティークロマトグラフィの工程における溶出は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液またはリン酸緩衝液を使用して好ましくは実行される。最も好ましいのは塩化ナトリウムを含むＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液である。溶出液のｐＨは好ましくは７または７周辺から９または９周辺であり、最も好ましくはｐＨは７と８の間の範囲にある。
【００２８】
別の態様では、本発明による組換えＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を精製する方法は、  前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、および
さらに陽イオン交換クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記４つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
【００２９】
１実施形態では、工程は、（１）陰イオン交換クロマトグラフィ、（２）疎水性相互作用クロマトグラフィ、（３）色素アフィニティークロマトグラフィおよび（４）陽イオン交換クロマトグラフィの順に行なわれる。
【００３０】
陽イオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＣ）は、サンプル中のタンパク質と、樹脂に固定化された電荷との間の電荷と電荷の相互作用に基づいている。陽イオン交換クロマトグラフィでは、タンパク質の結合イオンは陽性であり、固定化される官能基は陰性である。一般的に使用される陽イオン交換樹脂はＳ樹脂、硫酸塩誘導体およびＣＭ（カルボキシメチル）樹脂、カルボキシル基誘導体化されたイオンである。
【００３１】
しかしながら、一般に、陽イオン交換クロマトグラフィ工程は、すべての一般的な市販の陽イオン交換樹脂または膜で行なうことが可能である。陽イオン交換樹脂は、官能基（例えばスルホン酸）が固定された、予め液体を注入されたカラムまたは膜の形で使用されてもよい。代わりに、カラムは自己調製されていてもよい。通常のカラム以外のカラムの容量および形状に関する制限は特に無い。当業者には、使用される陽イオン交換樹脂の量が、細胞培養液または他の流体（例えば先のクロマトグラフィ工程の溶出液）の全タンパ
ク質含有量に依存して決まることが理解される。
【００３２】
本発明の目的で使用可能な典型的な陽イオン交換樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社およびイオンクロマトグラフィの付属品およびカラムの他の製造業者から入手可能である。一般に、ＣＥＣは４と７の間のｐＨ値の緩衝液を使用して行なわれる。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明の方法の陽イオン交換工程は膜陽イオン交換として行なわれる。好ましくは、陽イオン交換工程は、膜に固定された強酸性の陽イオン交換体であるスルホン酸または同様の特性を有する交換体を用いて行なわれる。
本発明の陽イオン交換工程に使用される適切な膜吸着体は、当該技術分野で周知であり、いくつかの供給業者から入手可能である。例えば、本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィは再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なうことが可能である。有用な膜吸着体の例は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により販売されているＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体である。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体の技術的なデータは以下に与えられる。
名称  Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ  ＳｉｎｇｌｅＳｅｐ（登録商標）（強酸陽イオン交換体Ｓ）リガンド  スルホン酸（Ｒ−ＣＨ2−ＳＯ3-）
静的結合量 ≧０．８ｍｇ／ｃｍ2  （２９ｍｇ／ｍｌ）ウシ血清アルブミンおよび鶏卵リゾチームで測定
イオン交換能  ４−６μｅｑ／ｃｍ2
膜
基材  安定化強化セルロース
膜厚  ２７５μｍ
公称孔径  ＞３μｍ
カプセル
設計  円筒状、公称の層数：１５
ベッド高さ：４ｍｍ
材料カプセル  ポリプロピレン（ＦＤＡ）
最大圧力  ０．４  ＭＰａ（４バール、５８ｐｓｉ）
ｐＨ安定性  ３−１４（短期間）
保存  １回使用後、廃棄
化学安定性  １Ｍ  ＮａＯＨ（２０℃で３０−６０分）、８Ｍ  尿素、８Ｍ  塩酸グアニジン、エタノール、アセトンおよび１００％  アセトニトリルにおいて、クロマトグラフィで一般に用いられているすべての緩衝液において安定。酸化剤はなし。
【００３４】
ＣＥＣ工程は製造業者のプロトコルに従って行なうことが可能である。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液はｐＨ７．０で使用することが可能である。
ＣＥＣ工程、好ましくは陽イオン細胞膜吸着体工程は、処理時間を短く維持しつつすべての分子の大きさの宿主細胞タンパク質を除去することが分かった。ＦＳＨはｐＨ７．０では吸着体に結合しないため、約９５％という収率は非常に有利である。
【００３５】
一般に、クロマトグラフィ膜の形の陽イオン交換クロマトグラフィは、組換えＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の精製に非常に有用であることが分かった。したがって、別の態様では、本発明は、ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を精製する方法における陽イオン膜吸着体の使用に関する。好ましい実施形態では、陽イオン膜吸着体は、再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する、陽イオン交換体吸着体、好ましくは強い陽イオン交換吸着体である。
別の態様では、本発明による組換えＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を精製する方法は、  前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、
−任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、および
さらなる陰イオン交換クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記クロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
【００３６】
１実施形態では、工程は、第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、色素アフィニティークロマトグラフィ、任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、および第２の陰イオン交換クロマトグラフィの順に行なわれる。
【００３７】
第２の陰イオン交換クロマトグラフィは、第１の陰イオン交換クロマトグラフィに関連して上述した典型的な陰イオン交換樹脂を使用して行なうことが可能である。また、第２の陰イオン交換クロマトグラフィは好ましくは、−Ｎ+（ＣＨ3）3官能基を有する強い陰
イオン交換樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる強陰イオン交換クロマトグラフィである。本発明の目的で使用可能な強陰イオン交換樹脂の好ましい例は、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  ＱおよびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとして当該技術分野で周知の第四級アンモニウム強陰イオン交換体樹脂、ならびに第四級アンモニウム基（Ｑ）部分を有する他の樹脂である。強陰イオン交換体ＵＮＯｓｐｈｅｒｅＱおよびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰの特性は、第１の陰イオン交換クロマトグラフィに関して与えた通りである。第２の陰イオン交換クロマトグラフィ工程でも、官能基としてジメチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）またはジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥ）に基づくもの等の弱陰イオン交換樹脂の使用を避けるのが好ましい。
【００３８】
陰イオン交換クロマトグラフィの工程は、穏やかにアルカリ性のｐＨ、例えば７．０またはその周辺から９．０またはその周辺、もしくは７．５またはその周辺から８．５またはその周辺のｐＨを有する緩衝液を使用して好ましくは行なわれる。適切な緩衝液には例えば、ホウ酸緩衝液、トリエタノールアミン／イミノ二酢酸Ｔｒｉｓ、酢酸アンモニウム、トリシン、ビシン、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳが含まれる。トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液の使用が好ましい。陰イオン交換樹脂からの溶出は、塩、好ましくは塩化ナトリウムの添加を通じて移動相の伝達率を増加させることにより通常達成される。
【００３９】
１実施形態では、第２の陰イオン交換クロマトグラフィは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／塩化ナトリウム緩衝液を使用して７．０から９．０の間の範囲のｐＨで行われる。
別の態様では、本発明による組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または組換えＦＳＨ変異型を精製する方法は、前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、および
−色素アフィニティークロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記３つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まず、
前記方法は、サイズ排除クロマトグラフィをさらに含む。
【００４０】
別の態様では、本発明による組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）または組換えＦＳＨ変異型を精製する方法は、前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、
−陰イオン交換クロマトグラフィ、
−疎水性相互作用クロマトグラフィ、
−色素アフィニティークロマトグラフィ、
−任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、
−任意選択のさらなる陰イオン交換クロマトグラフィ、および
−サイズ排除クロマトグラフィ
にかける工程を含み、
前記６つのクロマトグラフィはどの順序で行なってもよく、
前記方法は、弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも含まない。
【００４１】
１実施形態では、工程は以下の順に行なわれる：陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、色素アフィニティークロマトグラフィ、任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、任意選択のさらなる陰イオン交換クロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィ。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は以下の順に以下の工程を含む：第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、色素アフィニティークロマトグラフィ、任意選択の陽イオン交換クロマトグラフィ、任意選択の第２の陰イオン交換クロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィ。
【００４３】
ゲルろ過クロマトグラフィとしても知られているサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）は、粒子（例えばタンパク質および他の生体分子）がそれらのサイズに基づいて分離されるクロマトグラフ法である。ＳＥＣのための典型的なゲル媒体はポリアクリルアミド、デキストラン、アガロースまたはそれらの混合物である。ＳＥＣマトリックスはクロマトグラフィの付属品およびカラムの様々な製造業者（例えばＴｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ社またはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）から入手可能である。
【００４４】
サイズ排除クロマトグラフィは、架橋アガロースおよびデキストランからなる球状複合体のマトリックスを使用して好ましくは行なわれる。
有用なサイズ排除クロマトグラフィマトリックスの例は、例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能な、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇとして当該技術分野で周知のマトリックスである。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇカラムは、サイズによるタンパク質、ペプチドおよび他の生体分子の高分解能の分離を可能にする。一般に、サイズ排除カラムは精製手順における研摩工程にとって理想的である。
【００４５】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇマトリックスの技術的詳細は以下の通りである：
排除限界（Ｍr）  １×１０5 球状タンパク質
分離範囲（Ｍr）  ３０００−７００００  球状タンパク質
マトリックス    架橋アガロースとデキストランからなる球状複合体
平均粒径        ３４μｍ
化学安定性      すべての一般的な緩衝液において安定：
１Ｍ  酢酸、８Ｍ  尿素、６Ｍ  塩酸グアニジン、３０％  イソプロピルアルコール、７０％  エタノール、１Ｍ  ＮａＯＨ（定置洗浄用）
ｐＨ安定性        ３−１２（動作時間および長期間）および１−１４（短期間）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）  １０×３００  ＧＬカラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ）＊
ベッド寸法        １０×３００ｍｍ
推奨サンプル体積  ２５−２５０μｌ
ベッド体積        ２４ｍｌ
最大圧力          １８バール（２６１ｐｓｉ、１．８ＭＰａ）
最大流速（２５℃の水）  １．５ｍｌ／分
理論段          ＞３０  ０００ｍ-1
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標） ＰＣ  ３．２／３０カラム
ベッド寸法      ３．２×３００ｍｍ
ベッド体積      ２．４ｍｌ
推奨サンプル体積  ２−２５μｌ
最大圧力        ２４バール（３４８ｐｓｉ、２．４ＭＰａ）
最大流速（２５℃の水）  ０．１００ｍｌ／分
理論段          ＞３０  ０００ｍ-1 
保存            ２０％  エタノール
保存温度        ４℃から３０℃まで
ＳＥＣ工程は製造業者のプロトコルに従って行なうことが可能である。例えば、リン酸ナトリウム緩衝液はｐＨ６〜８、好ましくは約ｐＨ７．０で使用することが可能である。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は以下の順に以下の工程を含む：第１の陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、色素アフィニティークロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、第２の陰イオン交換クロマトグラフィ、およびサイズ排除クロマトグラフィ。
【００４７】
好ましい実施形態では、本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィ工程は、膜陽イオン交換として行なわれる。好ましくは、陽イオン交換工程は、膜に固定された強酸性の陽イオン交換体であるスルホン酸または同様の特性を有する交換体を用いて行なわれる。
【００４８】
さらに、本発明の方法は、１または複数の限外ろ過およびナノろ過のうちの少なくとも一方の工程を含む。限外ろ過（ＵＦ）は、静水圧が半透膜に対して液体を押しやる膜ろ過の形式である。浮遊物質と高分子量の溶質が保持される一方、水と低分子量の溶質が膜を通過する。限外ろ過は、巨大分子の溶液（特にタンパク溶液）を精製および濃縮するためのよく用いられている分離方法である。限外ろ過はナノろ過と似ているが、保持する分子のサイズの点で異なっている。本発明の構成では、１０ｋＤａの分子量カットオフ値が好まれる（１０ｋＤａ  ＵＦ）。ＵＦ膜は、希釈および再濃縮を繰り返すかまたは連続させるかによって溶液から塩類および他の小型種を除去するのにも使用可能である。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、精製工程は、１または複数の限外ろ過、透析ろ過、およびナノろ過のうちの少なくとも一つの工程を含む。これらのろ過工程は、市販のろ過装置（例えばＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社またはＳａｒｔｏｒｉｕｓ社から入手可能なもの）を使用して行なうことが可能である。
【００５０】
限外ろ過は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により販売されているＳａｒｔｏｃｏｎカセットおよびＳａｒｔｏｃｏｎスライスカセットを使用して好ましくは行なわれる。
膜                    ポリエーテルスルホン（ＰＥＳＵ）またはＨｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）
分子量カットオフ値    １０ｋＤ
フィルタ面積          ０．０２〜０．７ｍ2
供給圧                ４バール（５８ｐｓｉ）最大
ｐＨ安定性            １−１４
動作温度              ２０℃において最大５０℃
洗浄                  １Ｍ  ＮａＯＨ、４０℃
消毒                  １Ｍ  ＮａＯＨ、４０−５０℃、３０分
保存                  ０．１Ｍ  ＮａＯＨ
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により販売されている交差流カセットに使用されているポリエーテルスルホン膜（ＰＥＳＵ）は、広範ｐＨと温度範囲を特徴とする安定な膜ポリマーである。
【００５１】
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により販売されているＨｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）限外ろ過カセットも使用することが可能である。Ｈｙｄｒｏｓａｒｔは生物工学の用途のために最適化された安定したセルロース膜である。Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ限外ろ過膜およびカセットは、以下の公称分子量カットオフ値で入手可能である：２ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤおよび３０ｋＤ。
【００５２】
好ましい実施形態では、精製方法はナノろ過工程を含む。ナノろ過は任意の有用なナノフィルタ装置を使用して行なってもよい。ナノろ過は好ましくは、Ｐｌａｎｏｖａフィルタ（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉメディカル会社から入手可能）を使用して行なわれる。
【００５３】
Ｐｌａｎｏｖａフィルタは生物医薬品等の生物治療薬製品の製造中にウイルスを除去するために設計されている。Ｐｌａｎｏｖａフィルタは、狭い孔分布の天然の親水性銅アンモニア再生セルロースから構成された、中空の繊維からなる微小孔のある膜に基づく。Ｐｌａｎｏｖａフィルタは、４つの平均孔径が１５ｎｍ、１９ｎｍ、３５ｎｍおよび７２ｎｍ（それぞれＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎ、２ＯＮ、３５Ｎ、および７５Ｎ）の使い捨ての内蔵モジュールとして入手可能である。本発明の処理ではで、Ｐｌａｎｏｖａ  １５Ｎフィルタ（つまり１５ｎｍの平均孔径を有するフィルタ）を使用することが好ましい。フィルタは供給業者のプロトコルに従って使用される。
【００５４】
本発明によるＦＳＨの精製方法は、金属イオン親和性クロマトグラフィを含まないことが好ましい。
さらに、本発明の方法は、免疫親和性クロマトグラフィがないことが好ましい。免疫親和性クロマトグラフィ工程のないＦＳＨの精製により、抗体の調製から生じる不純物または病原体がＦＳＨ化合物と干渉する可能性が無くなる。
【００５５】
別の実施形態では、本発明は、組換えＦＳＨまたは組換えＦＳＨ変異型を精製する方法であって、前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を、膜陽イオン交換体にかける工程を含む方法に関する。
【００５６】
好ましい実施形態では、膜陽イオン交換体は、膜に固定された強酸性の陽イオン交換体スルホン酸または同様の特性を有する交換体である。
本発明の方法に使用される適切な膜吸着体が、当該技術分野で周知であると共に、いくつかの供給業者から入手可能である。例えば、本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィは、再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なうことが可能である。有用な膜吸着体の例は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社により販売されているＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓ膜吸着体である。その技術的詳細は上述した。
【００５７】
別の実施形態では、前記ＦＳＨを含有する液体を膜陽イオン交換体へかける工程を含む組換えＦＳＨまたは組換えＦＳＨ変異型を精製する方法は、さらに疎水性相互作用クロマトグラフィを含む。
【００５８】
本発明の方法の疎水性相互作用クロマトグラフィは、上述の組換えＦＳＨまたは組換えＦＳＨ変異型を精製する方法に関連して説明したように行うことが可能であり、該方法は、前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型を含有する液体を陰イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、および色素アフィニティークロマトグラフィにかける工程を含み、それらのクロマトグラフィはどの順で行なってもよく、
前記方法は弱陰イオン交換クロマトグラフィも逆相クロマトグラフィも、それらの好ましい実施形態も含まない。
【００５９】
好ましい実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィは、フェニル基またはブチル基で誘導体化された架橋アガロースビーズから成る樹脂または同様の特性を有する樹脂を使用して行なわれる。
【００６０】
別段の定めがなければ、以下の定義は、本発明を説明するために使用される種々の用語の意味および範囲を例証および定義するように意図される。
用語「ＦＳＨ」は、組換え技術により生産されてもよいし、閉経後の女性の尿等のヒ
トの供給源から分離されてもよい、ヒトＦＳＨすなわち「ｈＦＳＨ」を含む がこれに限
定されない全長成熟タンパク質としての卵胞刺激ホルモンポリペプチドのことを指す。  ヒト糖タンパク質のタンパク質配列およびヒトＦＳＨβサブ ユニットのタンパク質配列
は、科学論文および特許文献（例えば国際公開第２００４／０８７２１３号参照）から当業者には知られている。
【００６１】
本明細書に添付されるように、ヒトＦＳＨのα鎖のアミノ酸配列は配列番号１で示さ
れ、ヒトＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列は配列番号２で示される。これらのア ミノ酸配列
は、ＥＭＢＬデータベースでアクセッション番号Ｊ００１５２およびＮＣＢＩデータベースでアクセッション番号ＮＭ０００５１０でそれぞれ寄託されたヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖野生型アミノ酸配列に相当する。
【００６２】
ヒトＦＳＨをコードする野生型核酸配列は、配列番号３（＝α鎖）および配列番号４（＝β鎖）で示される。
組換えＦＳＨは、ヒトで天然に見出される野生型核酸配列によってコードされてもよいし、またはその発現が野生型アミノ酸配列（つまりヒトで天然に見出される野生型タンパク質配列）を有するＦＳＨになる変更された核酸配列によってコードされてもよい。
【００６３】
ヒトＦＳＨをコードする核酸配列は、例えば、ヒトＦＳＨのα鎖およびβ鎖をコード
する核酸配列の一方又は両方を、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞でのコドン使用に適合させて、かかる宿主細胞での組換えＦＳＨの発現レベルおよび収率を増加させるように変更されてもよい。
【００６４】
ヒトＦＳＨをコードし、ＣＨＯ細胞でのコドン利用に関して修飾された核酸配列の例
が、国際公開第２００９／０００９１３号に記載されている。ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号５で示される核酸配列のコード領域であり（配列番号５において、コード領域はヌクレオチド５６から開始し、ヌクレオチド４４２まで延びる）、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする修飾核酸配列は、配列番号６で示される核酸配列のコード領域である（配列番号６で、コード領域 はヌクレオチド１９から開始し、ヌクレオチド
３６６まで延びる）。ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする第１の修飾核酸配列と、ヒトＦＳＨのα鎖をコードする第２ の修飾核酸配列とを有する組換え核酸分子を備えたＣＨＯ細胞
系を、２００７年３月２８日に寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８３３の下、ブラウンシュベイク （Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）所在のドイツ細胞バンク（ＤＳＭＺ）に寄託した。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明のＦＳＨ液体製剤は、ＣＨＯ細胞でのコドン利用に関してヒトＦＳＨのβ鎖とα鎖の両方について修飾されたＦＳＨ核酸配列から組換え遺伝子発現によって得られた組換えヒト野生型ＦＳＨを含む。別の好ましい実施形態では、組換えＦＳＨは国際公開第２００９／０００９１３号に開示されたＦＳＨ核酸配列からの発現により得られる。
【００６６】
「ＦＳＨ変異型」という表現は、ヒトＦＳＨとアミノ酸配列、グリコシル化パターン
、またはサブユニット間結合が異なるが、ＦＳＨ活性は示す分子を包含する ことを意味
する。例にはＣＴＰ−ＦＳＨが含まれ、これはLaPoIt et al. (1992）Endocrinology, 131, 2514-2520またはKlein et al. (2003）Human Reprod., 18, 50-56に記載されているような、野生型αサブユニットと、ｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβサブユニットのＣ末端に融合されたハイブリッド βサブユニットとから成る長時間作用性修飾組
換えＦＳＨである。単一鎖ＣＴＰ−ＦＳＨも含まれるが、これはｈＣＧのカルボキシ末端ペプチドがＦＳＨのβサ ブユニットのＣ末端に融合されたKlein et al. (2002）Fertility & Sterility, 77, 1248-1255に記載された単一鎖分子である。ＦＳＨ変異型の他の例
には、国際公開第０１／５８４９３号に開示されるようなα鎖およびβ鎖の少なくと も
一方に追加のグリコシル化部位組み込まれたＦＳＨ分子や、国際公開第９８／５８９５７号に開示されるようなサブユニット間Ｓ−Ｓ結合を有するＦＳＨ分子 が含まれる。国際
公開第２００４／０８７２１３号には、βサブユニットのカルボキシ末端の欠失が特徴であるＦＳＨ変異型の他の例が開示されている。ＦＳＨ 変異型の他の例には、追加のグリ
コシル化部位を導入するか天然のグリコシル化部位を削除するようにタンパク質のアミノ酸配列を変化させることにより、野生型のＦＳＨと比較してグリコシル化の程度を変更させたＦＳＨ分子が含まれる。
【００６７】
さらに、本発明のＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、化学的部分により修飾されたＦＳＨ分子であってもよい。そのようなＦＳＨ結合体は、例えばポリアルキルエングリコール（例、ＰＥＧ）、ヒドロキシアルキルスターチ（例、ＨＥＳ）または他のポリマー部分を備えてもよい。
【００６８】
ＦＳＨヘテロダイマーまたはＦＳＨ変異型ヘテロダイマーは、任意の適切な方法により、例えば組換えにより、場合に応じて天然供給源からの単離または精製により、または化学合成により、もしくはそれらの任意の組み合わせにより、生産することが可能である。
【００６９】
用語「組換え」の使用は、組換えＤＮＡ技術の使用を通じて生産されるＦＳＨまたは
ＦＳＨ変異型の調製を指す（例えば国際公開第８５／０１９５８号参照）。 ＦＳＨのゲ
ノムおよび相補的ＤＮＡクローンの配列がいくつかの種のαサブユニットとβサブユニットについて知られている。組換え技術を使用した組換え ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の種
々の生産方法が先行技術に記載されており、例えば欧州特許出願出願公開第０ ７１１ ８９４号および欧州特許出願出願公開第０ ４８７ ５１２号を参照されたい。
【００７０】
好ましくは、本発明により精製されたＦＳＨは、配列番号１のαサブユニットおよび配列番号２のβサブユニットを有している。
別の態様では、本発明は、本発明による精製方法によって得られた、精製されたＦＳＨまたはＦＳＨ変異型タンパク質に関する。
【００７１】
本発明はさらに、本発明の方法を使用して精製されたＦＳＨまたはＦＳＨ変異型と、医薬として許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物は防腐剤を含み、複数回投与に使用可能である。好ましい医薬組成物は国際出願出願番号第ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５１４５１号に記載されている。
【００７２】
さらに、本発明は、本発明の方法を使用して精製されたＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の使用、または受胎障害の治療のための前記ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型と医薬として許容される賦形剤との組み合わせを含む医薬組成物の使用にも関する。
【００７３】
組換えヒトＦＳＨは、本発明の方法によって、宿主細胞の培養上清から精製される。組換えヒトＦＳＨまたはＦＳＨ変異型は、国際公開第２００９／０００９１３号に記載されているように好ましくは生産される。
【００７４】
最も好ましくは、ＦＳＨは組み換え技術により生産されたヒトＦＳＨであり、特に好ましくは、配列番号３および４（＝野生型の核酸配列）または配列番号５および６（＝コドン最適化された核酸配列）のいずれかでコードされたＦＳＨのヒト糖タンパク質αサブユニットおよびβサブユニットをコードするＤＮＡを含む１つまたは複数のベクターでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞で生産されたヒトＦＳＨである。αサブユニットおよびβサブユニットをコードするＤＮＡは同じベクター上に存在してもよいし、異なるベクター上に存在してもよい。
【００７５】
組換えＦＳＨは、その尿相当物に勝るいくつかの長所を有する。組換え細胞を使用した培養および単離技術により、バッチの一貫性が可能となる。対照的に、 尿ＦＳＨは、サ
ブユニットの純度、グリコシル化パターン、シアリル化および酸化等の特性がバッチによって大幅に変わる。組換えＦＳＨではバッチごとの一貫 性と純度が大きいため、かかる
ホルモンは容易に等電点電気泳動（ＩＥＦ）等の技術を使用して容易に識別および定量化することが可能である。組換えＦＳＨの 識別および定量化が可能となるその容易さによ
り、バイオアッセイにより充填せずにホルモンの質量で（fill-by-mass）ガラス瓶に充填することが 可能となる。
【００７６】
用語「ＦＳＨ活性」は、Ｓｔｅｅｌｍａｎ−Ｐｏｈｌｅｙアッセイ（Steelman et al. (1953）Endocrinology 53, 604-616）における卵巣重量増加や女性患者における卵胞成長のようなＦＳＨに関連する生体応答を誘発するＦＳＨ製剤の能力を指す。女性患者における卵胞成長は、例えば刺激の８日目の平均直径が約１６ｍｍの卵胞の数に関して、超音波により評価することが可能である。生物活性はＦＳＨについて認められている基準に関して評価される。
【００７７】
組換えＦＳＨの比インビボ生物活性は、通常約８，０００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク
質〜約１６，０００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク質の範囲である。例えば、市販製品であ
るＰｕｒｅｇｏｎ（Ｏｒｇａｎｏｎ社）中の組換えヒトＦＳＨは、約１０，０００ＩＵ 
ＦＳＨ／ｍｇタンパク質の特異的生物活性を有し、Ｓｅｒｏｎｏ社のＧｏｎａｌ−ｆの場合、組換えヒトＦＳＨの生物活性は約１３，６００ＩＵ ＦＳＨ／ｍｇタンパク質である
。
【００７８】
ＦＳＨ活性はＦＳＨおよび他の性腺刺激ホルモンに関する公知の方法により決定可能である。かかる方法には例えば酵素免疫活性分析（ＥＩＡ）またはレポーター遺伝子分析が含まれる。生物活性は、尿由来のＦＳＨに対する欧州薬局方第５版に記載されているバイオアッセイにより通常決定される。その際、生物活性 は、胎盤性性腺刺激ホルモンで処
理された未熟ラットの卵巣を拡大させるＦＳＨ効果と、標準品の同じ効果とを比較することにより推定される。
【００７９】
ＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の生物活性は、所与の条件下で、胎盤性性腺刺激ホルモンで処理された未成熟ラットの卵巣拡大の効果を、国際基準の調製物または国際単位で補正された参照調製物（ヨーロッパ薬局方第５版）の同じ効果と比較することにより評価可能である。
【００８０】
インビトロでのＦＳＨ活性の測定はAlbanese et. al. (1994）Mol. Cell Endcrinol. 101:211-219に記載されている。
本発明の方法で得られるＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の純度は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは９９％よりも大きい。純度の程度はＨＰＬＣ分析により決定可能である。そのような分析を行なうための適切な材料およびプロトコルをＶｙｄａｃまたはＴＯＳＨＯ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ等の供給業者から得ることが可能である。
【００８１】
以下の実施例を、本発明の精製方法をさらに詳しく例証するためにのみ提供する。本発明の範囲は以下の実施例から成るのみであると解釈されないものとする。
実施例
実施例１
実施例１
組換え技術による組換えヒトＦＳＨの調製
組換えヒトＦＳＨは、トランスフェクトされたＣＨＯ宿主細胞中で標準的方法により生産さ れる。かかる方法は、ヒトＦＳＨのα鎖とβ鎖をコードする１または複数の組換え核
酸分子から、組換えヒトＦＳＨを生産するＣＨＯ細胞クローンを生成し、かつ宿主細胞を適切な条件で培養することを含む。次に組換えヒトＦＳＨは、本発明に従って細胞培養物からを精製される。
【００８２】
好ましい実施形態では、組換えヒトＦＳＨは国際公開第２００９／０００９１３号に記載されているように生産される。
実施例２
細胞培養物からのＦＳＨの精製
精製スキームは以下の通りである：
陰イオン交換クロマトグラフィ工程
↓
ＨＩＣ工程
↓
色素アフィニティー工程
↓
ウイルス不活性化
↓
１０ｋＤａ  ＵＦ／ＤＦ
↓
陽イオン膜吸着体
↓
陰イオン交換クロマトグラフィ工程
↓
１０ｋＤａ  ＵＦ
↓
サイズ排除クロマトグラフィ工程
↓
ナノろ過
発酵期間は２８日とし、発酵体積は３０Ｌとした。収穫物は０．２２μｍでろ過し、逆浸透水で３．５倍で希釈した。
【００８３】
陰イオン交換クロマトグラフィ（ＡＥＣ）工程：
希釈した細胞培養物の上清収穫物を、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑとして当該技術分野で知られている第四級アンモニウム基の強陰イオン交換樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィにかけた。このマトリックスはＢｉｏＲａｄから入手可能である。
【００８４】
５０のｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）の３カラム体積（ＣＶ）を平衡化に使用した。カラムに収穫物（逆浸透水で１：３．５に希釈、収穫物の力価は約１．８μｇ  ＦＳＨ／ｍＬ）を載せ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ  ７．６（５ＣＶ）でその後洗浄した。その後、カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６
（５ＣＶ）で洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６（８ＣＶ）を使用して溶出した。この工程の収率は９０％以上であった。
【００８５】
ＨＩＣ工程：
ＨＩＣを、フェニル基で誘導化した架橋アガロースビーズから成る樹脂を使用して実行した。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）は、アガロースに基づく高度に架橋された誘導体である。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦは物理的および化学的に安定しており、高い流量と樹脂寿命の増大を許容する。この樹脂の技術的詳細については上述した。
【００８６】
８つのＡＥＣ溶出液をプールし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４．５ＮａＣｌ、ｐＨ７．６で３倍で希釈した。ＨＩＣカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６（４ＣＶ）で平衡化し、１：３で希釈したＡＥＣ溶出液を載せた。その後、カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６（３ＣＶ）を使用して洗浄し、また５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．８Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６（５ＣＶ）を使用して洗浄した。１．８Ｍ  ＮａＣｌの洗浄緩衝液は、検知可能なＦＳＨの損失のない良好なクリアランス力を有することが判明した。その後、タンパク質を５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．８Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６（６ＣＶ）で溶出した。
【００８７】
ＨＩＣ工程のＦＳＨ収率は９５％よりも高く、カラムにかけている間の有意な損失はなく、全タンパク質のクリアランス力は約１０倍(factor 10)と良好であった。これらのデ
ータは、この開発されたＨＩＣ工程が、合理的な収率と産物品質とを伴う非常に効率的な精製工程であることを示している。
【００８８】
色素アフィニティークロマトグラフィ工程：
ブルー  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）を、色素アフィニティークロマトグラフィ工程に使用した。ＨＩＣ溶出液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６で４倍で希釈した。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６（３ＣＶ）を使用して平衡化し、１：４の希釈ＨＩＣ溶出液を載せた。次にカラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．６（３ＣＶ）で洗浄し、ＦＳＨタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６（６ＣＶ）で溶出した。
【００８９】
アフィニティークロマトグラフィに続いて、溶出液を１５％の２−プロパノールで２時間インキュベートすることにより、ウイルス不活性化工程を行なった。この目的で、色素アフィニティークロマトグラフィ溶出液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３０％  ２−プロパノール、ｐＨ７．６で２倍に希釈し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５％  ２−プロパノール、２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．６とした。２時間のインキュベート後、ウイルスを不活性化した色素アフィニティークロマトグラフィ溶出液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．０で２倍に希釈した。
【００９０】
１０ｋＤａ  ＵＦ／ＤＦ：
限外および透析ろ過を、標準プロトコルに従って通常通りに行った。有用なＵＦ／ＤＦ装置は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｃｏｎ限外ろ過／透析ろ過カセット（ポリエーテルスルホン（ＰＥＳＵ）、１０ｋＤ）である（フィルタ面積：１４，０００ｃｍ2
、ＵＦ係数：１３−２０、ＤＦ係数：８−１０、装填量（load）：０．１〜０．５ｍｇ  ＦＳＨ／ｃｍ2）。ＵＦ／ＤＦ装置による透析ろ過を、限外ろ過（濃縮）係数１３〜２０
および透析ろ過係数８〜１０で一般に実行した。
【００９１】
ウイルスを不活性化した色素アフィニティークロマトグラフィ溶出液を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０）で透析ろ過し、陽イオン膜吸
着体に直接載せた。
【００９２】
陽イオン膜吸着体工程：
本発明の方法の陽イオン交換クロマトグラフィを、再生セルロースから作られ、かつセルロース骨格上に形成されたスルホン酸のクロマトグラフィマトリックスを有する膜を使用して行なった。そのような膜吸着体は、Sartobind S膜吸着体の商標名でＳａｒｔｏｒ
ｉｕｓ社から入手可能である。Sartobind S膜吸着体は、リガンドが固定化されたいくつ
かの膜層を備えたカプセルである。この膜吸着体は、処理時間が短く、かつ緩衝液の体積が小さいという利点を有する。使い捨ての考え方であるため、確認にかかるコストと時間は無視できる。
【００９３】
膜吸着体を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０（２００ｍＬ）で平衡化し、１０ｋＤａ
ＵＦ／ＤＦ保持液（約１００ｍＬ）を載せた。その後、吸着体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０（２００ｍＬ）で洗浄した。
【００９４】
膜吸着体を通過させる処理は、処理時間を短縮する流過モードである。さらに、次の処理工程（陰イオン交換クロマトグラフィ）に関する装填の調整は不要である。流過における生成物の収率は非常に良好であった。異なる緩衝系でｐＨ値６．０、６．５および７．０でSartobind Sモジュールで処理する間に、実質上、生成物の損失は無かった。
【００９５】
陽イオン膜吸着体工程はＨＣＰ（宿主細胞タンパク質）のクリアランスに非常に有利である。精製されるＦＳＨは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝系のｐＨ  ７．０では吸着体に結合しないため、９０〜９５％という収率は非常に有利である。
【００９６】
陰イオン交換クロマトグラフィ工程：
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰとして当該技術分野で知られている第四級アンモニウム基の強陰イオン交換樹脂を用いて、第２の陰イオン交換クロマトグラフィを行なった。この樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能である。
【００９７】
ＡＥＣカラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０（３ＣＶ）で平衡化した。膜吸着体を流過させたプールをカラムに載せ（３ＣＶ）、カラムを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．０（２ＣＶ）でまず洗浄し、次に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
８．５（３ＣＶ）で洗浄し、最後に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．５（５ＣＶ）で洗浄した。その後、ＦＳＨを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８．５（６ＣＶ）で溶出した。
【００９８】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ溶出液は、ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）に匹敵する非常に高い純度を有する。
１０ｋＤａ  ＵＦ：
１０ｋＤａ限外ろ過を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製のＳａｒｔｏｃｏｎ限外ろ過カセット（ＰＥＳＵ、１０ｋＤ）（フィルタ面積：３，０００ｃｍ2、ＵＦ係数：１０−２０、装
填量（load）：０．２〜１．０ｍｇ  ＦＳＨ／ｃｍ2）を使用して、標準プロトコルに従
って行った。限外ろ過は通常、１０〜３０の限外ろ過（濃縮）係数で一般に実行した。
【００９９】
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）工程：
サイズ排除クロマトグラフィはＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から入手可能）を使用して行なった。カラムを５０ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ4、ｐＨ７．
０（２ＣＶ）を使用して平衡化した。１０ｋＤａ  ＵＦh保持液をカラム（０．０２５Ｃ
Ｖ）に載せ、その後、カラムを５０ｍＭ  Ｎａ−ＰＯ4、ｐＨ７．０（２ＣＶ）で洗浄し
た。
【０１００】
ＳＥＣ溶出液は、商品ＧＯＮＡＬ−ｆ（登録商標）と同じ範囲で高い純度を有する。
ナノろ過：
最後に、ＳＥＣ溶出液をＡｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ社により販売されているＰｌａｎｏｖａ  １５Ｎフィルタ（平均孔径１５ｎｍ）を使用してナノろ過した。目標装填最大値は２．５ｍＬ／ｃｍ2とした。ろ過は供給業者のプロトコルに従って行なっ
た。
【０１０１】
精製されたＦＳＨの純度を、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。得られたＦＳＨの純度および特定された不純物は以下の通りであった：
ＳＥ−ＨＰＬＣ  （二量体およびより高い分子量の関連物質）＜１％
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元）（コロイド法）  純度  ＞９７％
ＨＣＰ（汎用）＜  １０ｐｐｍ
ＤＮＡ  ＜  ０．００６ｐｇ／ＩＵ  ＦＳＨ
組換えヒトＦＳＨの生物活性は少なくとも約１０，０００ＩＵ／ｍｇと決定された。好ましくは、組換えヒトＦＳＨまたはＦＳＨ変異型の生物活性は約１０，０００ＩＵ／ｍｇから約１７，０００ＩＵ／ｍｇまでの範囲であり、より好ましくは、生物活性は少なくとも約１２，０００ＩＵ／ｍｇであり、最も好ましくは、生物活性は少なくとも約１５，０００ＩＵ／ｍｇである。
配列表：
配列番号１：ヒトＦＳＨのα鎖のアミノ酸配列
配列番号２：ヒトＦＳＨのβ鎖のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＦＳＨのα鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号４：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードする野生型の核酸配列
配列番号５：ヒトＦＳＨのβ鎖をコードするコドン最適化した核酸配列
配列番号６：ヒトＦＳＨのα鎖を子オードするコドン最適化した核酸配列
【配列表】
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