(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４〜９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４、配列番号５、配列番号７、および配列番号９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号４、配列番号７、および配列番号９からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドが、そのＮ末端、Ｃ末端、またはそれらの両方を介して、自己集合可能なタンパク質に融合しているポリペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載の単離されたポリペプチドが、そのＮ末端、Ｃ末端、またはそれらの両方を介して、自己集合可能なタンパク質に融合しているポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項９】
プロモータに作動可能に連結された請求項８に記載の単離核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項５または７に記載のポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）感染症の治療薬の製造における、請求項５または７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
ＲＳＶ感染症の発症を制限するための医薬の製造における、請求項５または７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１４】
対象個体において免疫応答を引き起こすための医薬の製造における、請求項５または７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１５】
（ａ）請求項５または７に記載のポリペプチドをコードする単離核酸、プロモータに作動可能に連結された前記単離核酸を含む組換え発現ベクター、および前記組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞のうち少なくともいずれかと、
（ｂ）薬学的に許容可能な担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
対象個体におけるＲＳＶを原因とする疾患のモニタリング、およびＲＳＶワクチンによる免疫に対する対象個体の応答のモニタリングのうち少なくともいずれか一方を行うための方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１に記載の医薬組成物を、対象個体由来の体液と接触させるステップと、対象個体の体液中のＲＳＶ結合抗体を検出するステップとを含む方法。
【請求項１７】
体液は血清または全血を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＳＶ結合抗体を検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１に記載の医薬組成物を、ＲＳＶ結合抗体の候補を含む組成物と、ＲＳＶ抗体が前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物に結合するのに適した条件下で生体外において接触させるステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドまたは前記医薬組成物とのＲＳＶ抗体複合体を検出するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
ＲＳＶ抗体を単離するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＲＳＶ抗体を生産する方法であって、
（ａ）非ヒト対象個体に、抗体応答を引き起こすのに有効な量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１１に記載の医薬組成物を投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒト対象個体によって産生された抗体を単離するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド、ならびに呼吸器多核体ウイルス感染症の治療および制限における該ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は、全世界的に幼児のウイルスを原因とする死亡の主要原因であり、かつ高齢者および免疫不全者においても疾患を引き起こす。ＲＳＶ感染症を予防するための現行の方法は、ＦＤＡに認可されたＲＳＶ表面上のＦタンパク質に結合するヒト化モノクローナル抗体であるパリビズマブ（Ｐａｌｉ）を用いた受動免疫法である。ＲＳＶ感染症の予防には有効であるが、Ｐａｌｉ治療は世界規模では経済的または論理的に実現不可能である。
【発明の概要】
【０００３】
第１の態様では、本発明は、配列番号１〜９のうちいずれかのアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、例えば本発明の方法において使用することができるポリペプチドを提供する。
【０００４】
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを含むウイルス様粒子を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸、プロモータに作動可能に連結された本発明の単離核酸を含む組換え発現ベクター、および、本発明の組換え発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【０００５】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドおよびウイルス様粒子のうち少なくともいずれか一方と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、ＲＳＶ感染症を治療する方法であって、ＲＳＶに感染した対象個体に、該感染症を治療するのに有効な量の本発明のポリペプチド、ウイルス様粒子、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、ＲＳＶ感染症の発症を制限する方法であって、ＲＳＶ感染症のリスクを有する対象個体に、ＲＳＶ感染症の発症を制限するのに有効な量の本発明のポリペプチド、ウイルス様粒子、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００７】
さらに別の態様では、本発明は、対象個体において免疫応答を引き起こす方法であって、該対象個体に、免疫応答を引き起こすのに有効な量の本発明のポリペプチド、ウイルス様粒子、または医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明の単離核酸、組換え発現ベクター、および組換え宿主細胞のうち少なくともいずれかと；
（ｂ）薬学的に許容可能な担体と
を含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、対象個体におけるＲＳＶを原因とする疾患のモニタリング、およびＲＳＶワクチンによる免疫に対する対象個体の応答のモニタリングのうち少なくともいずれか一方を行うための方法であって、本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または医薬組成物を、対象個体由来の体液と接触させるステップと、対象個体の体液中のＲＳＶ結合抗体を検出するステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＳＶ結合抗体を検出する方法であって、
（ａ）本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物を、ＲＳＶ結合抗体の候補を含む組成物と、ＲＳＶ抗体がポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物に結合するのに適した条件下で接触させるステップと、
（ｂ）ポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物とのＲＳＶ抗体複合体を検出するステップと
を含む方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ＲＳＶ抗体を生産する方法であって、
（ａ）対象個体に、抗体応答を引き起こすのに有効な量の本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、および組成物のうち少なくともいずれかを投与するステップと、
（ｂ）対象個体によって産生された抗体を単離するステップと
を含む方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ポリペプチドスカフォールド（scaffold）を設計するためのコンピュータ計算方法であって、
（ａ）フォールディング核として使用されるべきポリペプチド構造モチーフを定義するステップと、
（ｂ）（ｉ）該ポリペプチド構造モチーフとの適合性を有するポリペプチドスカフォールドについての標的三次元トポロジー、および（ｂ）該ポリペプチド構造モチーフに置き換えられるべき該標的三次元トポロジーの領域、を定義するステップと、
（ｃ）該ポリペプチド構造モチーフの原子座標の終点から延長ポリペプチド鎖を成長させるステップと、
（ｄ）該ポリペプチド構造モチーフの主鎖二面角を固定状態に維持しながら延長ポリペプチド鎖をフォールディングするステップと、
（ｅ）標的三次元トポロジーに対するポリペプチド主鎖の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）のユーザ定義の閾値を満たすフォールディングされたポリペプチド鎖を、対象とするポリペプチドスカフォールドとして同定するステップと、
を含む方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、コンピュータデバイスに本発明のコンピュータ計算方法を実行させるための命令一式を含む、非一時的な機械可読記憶媒体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】コンピュータ計算手順フォールド・フロム・ループス（Fold From Loops）の大要を示す図。この手順は、フォールディング核として使用されて該手順全体にわたり固定された主鎖立体配座に維持されることになる機能部位（例えば図中のヘリックス状ヘアピンなど）を用いる。標的トポロジーが供給され、距離制約は（任意選択で）フォールディング軌道を誘導するための標的トポロジー構造から得られる。フォールディング核からポリペプチド鎖が延長され、次いで該ポリペプチド鎖がフォールディングされる。作られたモデルが根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）のカットオフ値（例えば５Å）よりも標的トポロジーから離れる場合、そのモデルは廃棄される。そうでない場合、該モデルは設計および全原子最適化のサイクルに入る。図は、合理的選択として３サイクルの反復的設計および最適化を示しているが、サイクル数はユーザの自由裁量で選択されることになっている。
【図２】モタビズマブ（Ｍｏｔａ）を、ＲＳＶＦタンパク質由来のモタビズマブのペプチドエピトープとの複合体として示す図。Ａ）複合体の側面図。Ｂ）複合体の背面図。Ｃ）複合体の境界面上の側鎖が棒で表されている。
【図３】様々なスカフォールドおよび標的トポロジーとして使用されたタンパク質（Ｔ９３）の配列の配列アラインメントを示す図。スカフォールドにおいて意図的に標的トポロジーと同じであるように維持された表面により、多数の部位における類似性が与えられた。
【図４】サイズ排除クロマトグラフィーおよび静的光散乱法によるスカフォールドのオリゴマー状態の特性解析を示す図。すべての分子が単一の単分散化学種を示し、モノマー化学種について予想される分子量（およそ１５ｋＤａ）に近い分子量を有していた。サイズ排除由来のＵＶシグナルは全グラフの上方のトレースであり、光散乱シグナルは下方のトレースである。
【図５】ＦＦＬ設計物の二次構造および熱安定性の円偏光二色性分析を示す図。設計物の波長スキャン（左列）はヘリックス状タンパク質に典型的な２つの極小を示す。熱変性曲線（右列）は、ほとんどの設計物について協調的アンフォールディングを示し、またＦＦＬ＿００５が９５℃まで融解しないことを示している。ＦＦＬ＿００５の高い安定性は９５℃での波長スキャンによって例証される（左列）。融解温度は表１に示されている。
【図６】ＳＰＲにより測定されたモタビズマブに対するスカフォールドの結合を示す図。スカフォールドはｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）チップにカップリングされ、モタビズマブはアナライトとして使用された。データおよび速度論的フィットの両方が示されている。速度論的フィットパラメータは表１に示されている。
【図７】ＳＰＲにより測定されたＦＦＬ＿００１のＭｏｔａ結合特異性を示す図。Ｍｏｔａ  ＩｇＧはリガンドであり、センサチップ上の抗ヒトＩｇＧによって捕捉され、ＦＦＬ＿００１およびＦＦＬ＿００１のエピトープ点突然変異体（ＦＦＬ＿００１＿Ｋ８２Ｅ）は濃度２２μＭにおけるアナライトであった。ＦＦＬ＿００１とＭｏｔａとの間の相互作用は点突然変異によって排除された。
【図８】野生型（左）およびリジン官能化型（右）のＨｅｐＢｃＡｇ粒子のネガティブ染色ＴＥＭを示す図。スケールバーは５０ｎＭである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
引用された参照文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。本願においては、別途記載のない限り、利用される技法はいくつかのよく知られた参照文献、例えば
サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年、Ｄ．ゲッデル（D. Goeddel）編、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」第１８５巻、「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press）、１９９１年、Ｍ．Ｐ．ドイツァー（M.P. Deutshcer）編、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）」、「タンパク質精製の手引き（Guide to Protein Purification）」、アカデミックプレス社（Academic Press, Inc.）、１９９０年；イニス（Innis）ら、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用の手引き（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）」、米国カリフォルニア州サンディエゴ、アカデミックプレス（Academic Press）、１９９０年、Ｒ．Ｉ．フレシュニー（R.I. Freshney）、「動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）」、第２版、米国ニューヨーク州ニューヨーク、リス社（Liss, Inc.）、１９８７年、Ｅ．Ｊ．マレー（E.J. Murray）編、「遺伝子の導入および発現プロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）」、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（The Humana Press Inc.）、第１０９〜１２８ページ、ならびにアンビオン（Ambion）１９９８年カタログ（米国テキサス州オースティン、アンビオン）、のうちいずれかに見られるものである。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、アミノ酸残基は以下すなわち：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）、のように略される。
【００１７】
本明細書中で使用されるように、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、複数の指示物を含む。本明細書中で使用される「および、ならびに（and）」は、明示的にそうでないことが定められた場合を除き、「または、もしくは（or）」と互換的に使用される。
【００１８】
本発明の任意の態様のすべての実施形態は、文脈が明らかにそうでないことを述べていない限り、組み合わせて使用されうる。
第１の態様において、本発明は、下記すなわち：
（−／Ｇ）（−／Ｓ）（Ｍ／Ｌ／Ｒ／Ｆ）ＳＤ（Ｒ／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ｌ）（Ｒ／Ｍ）ＫＤ（Ｌ／Ａ／Ｖ）Ｅ（Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄ）Ｒ（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ａ）ＤＫ（Ｌ／Ｆ／Ａ）（Ｌ／Ｖ／Ｆ／Ｍ）ＥＡ（Ａ／Ｖ／Ｆ／Ｉ／Ｌ）ＫＮＫ（Ｅ／Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｗ／Ｖ）ＤＫ（Ｆ／Ｍ／Ｅ／Ｉ／Ｖ）ＫＡＡ（Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｉ）ＲＫ（Ｒ／Ｅ／Ｇ／Ｄ／Ｑ）（Ｇ／Ｄ／Ｐ／Ｗ／Ｅ／Ｑ）（Ｑ／Ｉ／Ｐ／Ｋ／Ｆ）（Ｒ／Ｑ／Ｋ／Ｓ／Ｇ／Ｈ）ＥＥＲ（Ｍ／Ｋ／Ｒ／Ａ）ＫＤ（Ｗ／Ｌ／Ｍ／Ｋ）（Ａ／Ｍ／Ｋ／Ｆ）Ｋ（Ｉ／Ｆ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｄ）（Ａ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｌ）Ｒ（Ｄ／Ｋ／Ｅ／Ｙ）Ｅ（Ｆ／Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ／Ｌ）ＥＱ（Ｆ／Ｌ／Ａ／Ｖ／Ｍ）Ｒ（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ｖ／Ｍ／Ｉ）ＲＮ（Ｆ／Ｒ／Ｖ／Ｉ／Ａ／Ｙ）（Ｌ／Ｅ／Ａ）（Ｓ）（Ｅ）（Ａ／Ｌ）（Ｌ）（Ｓ）Ｋ（Ｉ）（Ｎ）Ｄ（Ｙ／Ｍ／Ｌ）（Ｐ）Ｉ（Ｔ）（Ｎ）（Ｄ）（Ｄ／Ｑ／Ｋ）（Ｋ）（Ｋ）（Ｌ）（Ｔ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ａ）（Ｓ）（Ｎ）（Ｄ／Ｋ）（Ａ／Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｌ／Ｉ）Ｋ（Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｅ／Ｒ／Ｌ）（Ｄ／Ａ／Ｖ／Ｍ）（Ａ）（Ｅ／Ｉ／Ｒ）（Ｖ／Ａ／Ｍ／Ｌ）（Ａ／Ｅ／Ｋ／Ｆ／Ｍ／Ｗ）ＫＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｅ（Ａ／Ｌ）（Ｆ／Ｍ／Ｌ／Ｅ／Ｉ）（Ｋ／Ａ／Ｖ／Ｍ／Ｉ／Ｌ）ＡＤ（Ａ／Ｖ／Ｉ）Ｅ（Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｋ／Ｉ／Ａ）（Ａ／Ｍ／Ｋ／Ｌ／Ｗ）（Ａ／Ｆ／Ｖ／Ｋ）ＴＱ（−／Ｇ）（−／Ｓ）（−／Ｗ）（配列番号１）
のアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列で構成されている単離ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明者らは、パリビズマブまたはモタビズマブと同様の特異性を備えた中和抗体を誘発するために本発明のポリペプチドを設計した。パリビズマブは、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）の表面糖タンパク質Ｆの抗原部位Ａ（「部位ＩＩ」とも呼ばれる）に結合することによりＲＳＶを強力に中和する、ＦＤＡに認可された治療抗体である。モタビズマブはパリビズマブの親和性成熟型バリアントである。したがって、パリビズマブ（Ｐａｌｉ）またはモタビズマブ（Ｍｏｔａ）に類似したＲＳＶ中和抗体を誘発するワクチンは、ＲＳウイルス感染に対する防御をなすために望ましい。ＰａｌｉおよびＭｏｔａはＲＳＶのＦタンパク質上の立体配座依存的エピトープに結合する。本明細書中に開示されるように、本発明者らは、エピトープの立体配座の安定化および免疫系への提示のためのタンパク質スカフォールドをデノボ（de novo）設計するためのコンピュータ計算方法を開発した。この方法は、本発明のポリペプチドを設計するためにＭｏｔａエピトープに適用され、該ポリペプチドは、モノマーであり、熱安定性が高く、かつＭｏｔａへの結合親和性が極めて高いことが示され、このことは、該ポリペプチドが、結晶構造解析によって確認されるように、所望のエピトープ立体配座を安定化することに成功したことを示している。本発明者らは、この属（genus）の範囲内にあるポリペプチドがＲＳＶに対する中和抗体を誘発することができることも実証した。
【００２０】
カッコはポリペプチド中の可変部位を表し、その部位における代替として挙げられたアミノ酸残基と共に示されている。
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは下記すなわち：
（−／Ｇ）（−／Ｓ）（Ｍ／Ｌ／Ｒ／Ｆ）ＳＤ（Ｒ／Ａ／Ｉ／Ｍ／Ｖ）ＲＫＤ（Ｌ／Ａ／Ｖ）Ｅ（Ｅ／Ｒ／Ｋ／Ｄ）Ｒ（Ｌ／Ｆ／Ｉ／Ａ）ＤＫ（Ｌ／Ｆ／Ａ）（Ｌ／Ｖ／Ｆ）ＥＡ（Ａ／Ｖ／Ｆ／Ｌ）ＫＮＫ（Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｖ）ＤＫ（Ｆ／Ｍ／Ｅ／Ｉ）ＫＡＡ（Ｍ／Ｌ／Ｆ／Ｉ）ＲＫ（Ｒ／Ｅ／Ｇ／Ｄ）（Ｇ／Ｄ／Ｐ／Ｗ／Ｑ）（Ｑ／Ｉ／Ｐ／Ｆ）（Ｒ／Ｑ／Ｋ／Ｓ／Ｈ）ＥＥＲ（Ｍ／Ｋ／Ｒ／Ａ）ＫＤ（Ｗ／Ｌ／Ｍ／Ｋ）（Ａ／Ｍ／Ｋ／Ｆ）Ｋ（Ｉ／Ｆ／Ｌ／Ｅ／Ｋ／Ｄ）（Ａ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ｌ）Ｒ（Ｄ／Ｋ／Ｙ／Ｅ）Ｅ（Ｆ／Ｖ／Ａ／Ｒ／Ｍ）ＥＱ（Ｆ／Ｌ／Ａ／Ｖ／Ｍ）Ｒ（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ｖ／Ｍ／Ｉ）ＲＮ（Ｆ／Ｒ／Ｖ／Ｉ／Ｙ）（Ｌ／Ｅ／Ａ）ＳＥ（Ａ／Ｌ）ＬＳＫＩＮＤ（Ｙ／Ｍ／Ｌ）ＰＩＴＮＤ（Ｄ／Ｑ／Ｋ）ＫＫＬ（Ｔ／Ｉ／Ｍ／Ｖ／Ａ）ＳＮＤ（Ｔ／Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｌ／Ｉ）Ｋ（Ｆ／Ｙ／Ｋ／Ｅ／Ｌ）（Ｄ／Ａ／Ｖ／Ｍ）Ａ（Ｅ／Ｉ／Ｒ）（Ｖ／Ａ／Ｍ／Ｌ）（Ｅ／Ｋ／Ｆ／Ｗ）ＫＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｅ（Ａ／Ｌ）（Ｆ／Ｍ／Ｌ／Ｅ／Ｉ）（Ｋ／Ａ／Ｖ／Ｍ／Ｌ）ＡＤ（Ａ／Ｖ／Ｉ）Ｅ（Ｅ／Ｒ／Ｄ／Ｋ／Ｉ／Ａ）（Ａ／Ｍ／Ｋ／Ｌ／Ｗ）（Ａ／Ｆ／Ｖ）ＴＱ（−／Ｇ）（−／Ｓ）（−／Ｗ）（配列番号２）
のアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列で構成されている。
【００２１】
後述の実施例において実証されるように、この属のポリペプチドは最良の範囲の活性を実証するポリペプチド中に存在するポリペプチドである。
さらなる好ましい実施形態では、ポリペプチドは下記すなわち：
（−／Ｇ）（−／Ｓ）（Ｍ／Ｌ／Ｒ／Ｆ）ＳＤ（Ｉ／Ｍ）ＲＫＤ（Ｌ／Ａ）Ｅ（Ｅ／Ｒ／Ｄ）Ｒ（Ｆ／Ａ）ＤＫ（Ｌ／Ｆ／Ａ）（Ｖ／Ｆ）ＥＡ（Ａ／Ｖ／Ｌ）ＫＮＫ（Ｌ／Ｆ／Ｗ）ＤＫ（Ｆ／Ｍ／Ｉ）ＫＡＡ（Ｌ／Ｆ／Ｉ）ＲＫ（Ｅ／Ｇ／Ｄ）（Ｇ／Ｄ／Ｗ／Ｑ）（Ｑ／Ｉ／Ｐ／Ｆ）（Ｑ／Ｋ／Ｓ／Ｈ）ＥＥＲ（Ｍ／Ｒ／Ａ）ＫＤ（Ｗ／Ｌ／Ｍ）（Ｍ／Ｋ／Ｆ）Ｋ（Ｆ／Ｌ／Ｋ／Ｄ）（Ａ／Ｍ／Ｌ）Ｒ（Ｙ／Ｋ）Ｅ（Ｖ／Ａ／Ｍ）ＥＱ（Ｌ／Ａ／Ｍ）Ｒ（Ｋ／Ｒ）Ａ（Ｖ／Ｍ／Ｉ）ＲＮ（Ｆ／Ｒ／Ｉ／Ｙ）（Ｌ／Ｅ／Ａ）ＳＥ（Ａ／Ｌ）ＬＳＫＩＮＤ（Ｍ／Ｌ）ＰＩＴＮＤ（Ｄ／Ｑ）ＫＫＬ（Ｉ／Ｍ／Ａ）ＳＮＤ（Ｌ／Ｖ／Ｉ）（Ｋ／Ｌ／Ｉ）Ｋ（Ｆ／Ｙ／Ｅ／Ｌ）（Ｄ／Ａ／Ｖ／Ｍ）Ａ（Ｅ／Ｉ／Ｒ）（Ｖ／Ａ／Ｌ）（Ｅ／Ｆ／Ｗ）ＫＫ（Ｌ／Ｉ）ＥＡ（Ｍ／Ｌ／Ｉ）（Ｋ／Ａ／Ｍ／Ｌ）ＡＤ（Ａ／Ｖ／Ｉ）Ｅ（Ｒ／Ｄ／Ｉ／Ａ）（Ｍ／Ｋ／Ｌ／Ｗ）（Ａ／Ｆ／Ｖ）ＴＱ（−／Ｇ）（−／Ｓ）（−／Ｗ）（配列番号３）
のアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列で構成されている。
【００２２】
この属のポリペプチドは、ＲＳＶに対する中和抗体を誘発するとして本発明者らにより例証されたポリペプチドである。
さらなる好ましい実施形態では、ポリペプチドは、
＞ＦＦＬ＿００１
ＧＳＲＳＤＭＲＫＤＡＥＲＲＦＤＫＦＶＥＡＡＫＮＫＦＤＫＦＫＡＡＬＲＫＧＤＩＫＥＥＲＲＫＤＭＫＫＬＡＲＫＥＡＥＱＡＲＲＡＶＲＮＲＬＳＥＬＬＳＫＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＮＤＶＬＫＦＡＡＥＡＥＫＫＩＥＡＬＡＡＤＡＥＤＫＦＴＱＧＳＷ（配列番号４）；
＞ＦＦＬ＿００２
ＧＳＬＳＤＶＲＫＤＶＥＫＲＩＤＫＡＬＥＡＦＫＮＫＭＤＫＥＫＡＡＦＲＫＤＰＰＳＥＥＲＲＫＤＫＫＫＥＦＲＥＥＲＥＱＶＲＫＡＩＲＮＶＬＳＥＡＬＳＫＩＮＤＬＰＩＴＮＤＫＫＫＬＶＳＮＤＶＩＫＫＶＡＥＭＫＫＫＶＥＬＥＶＡＤＶＥＫＫＶＴＱＧＳＷ（配列番号５）；
＞ＦＦＬ＿００４
ＧＳＭＳＤＡＲＫＤＬＥＥＲＬＤＫＬＬＥＡＡＫＮＫＭＤＫＦＫＡＡＭＲＫＲＧＱＲＥＥＲＫＫＤＷＡＫＩＶＲＤＥＦＥＱＦＲＫＡＶＲＮＦＬＳＥＡＬＳＫＩＮＤＹＰＩＴＮＤＤＫＫＬＴＳＮＤＴＫＫＦＡＡＥＶＥＫＫＬＥＡＦＫＡＤＶＥＥＡＡＴＱ（配列番号６）；
＞ＦＦＬ＿００５
ＧＳＭＳＤＩＲＫＤＬＥＥＲＦＤＫＬＶＥＡＬＫＮＫＶＤＫＭＫＡＡＦＲＫＤＱＦＨＥＥＲＭＫＤＷＦＫＤＬＲＫＥＶＥＱＭＲＲＡＶＲＮＹＡＳＥＡＬＳＫＩＮＤＬＰＩＴＮＤＤＫＫＬＡＳＮＤＶＬＫＬＶＡＥＶＷＫＫＬＥＡＩＬＡＤＶＥＡＷＦＴＱ（配列番号７）；
＞ＦＦＬ＿００６
ＧＳＦＳＤＩＲＫＤＡＥＤＲＡＤＫＡＦＥＡＡＫＮＫＦＤＫＩＫＡＡＩＲＫＤＷＰＳＥＥＲＡＫＤＬＭＫＫＡＲＹＥＭＥＱＡＲＲＡＩＲＮＩＥＳＥＡＬＳＫＩＮＤＬＰＩＴＮＤＱＫＫＬＡＳＮＤＩＩＫＥＭＡＲＬＦＫＫＬＥＡＬＭＡＤＩＥＩＬＶＴＱ（配列番号８）；
および＞ＦＦＬ＿００７
ＧＳＬＳＤＩＲＫＤＡＥＲＲＦＤＫＬＶＥＡＶＫＮＫＬＤＫＭＫＡＡＬＲＫＥＧＱＱＥＥＲＭＫＤＬＭＫＦＭＲＫＥＶＥＱＬＲＫＡＭＲＮＦＬＳＥＡＬＳＫＩＮＤＭＰＩＴＮＤＤＫＫＬＩＳＮＤＬＫＫＹＤＡＩＡＥＫＫＬＥＡＭＫＡＤＶＥＲＭＡＴＱＧＳＷ（配列番号９）
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むかまたは該アミノ酸配列で構成されている。
【００２３】
これらのポリペプチドの各々は、後述の実施例において、モノマーであり、熱安定性が高く、かつＭｏｔａへの極めて高い結合親和性を有することが実証され、このことは該ポリペプチドが所望のエピトープ立体配座の安定化に成功したことを示している。また、これらのポリペプチドの多くはＲＳＶに対する中和抗体を誘発することが示された。
【００２４】
さらなる好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４（ＦＦＬ＿００１）、配列番号５（ＦＦＬ＿００２）、配列番号７（ＦＦＬ＿００５）、配列番号８（ＦＦＬ＿００６）、および配列番号９（ＦＦＬ＿００７）からなる群から選択された配列を含むかまたは該配列で構成される。より好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４（ＦＦＬ＿００１）、配列番号５（ＦＦＬ＿００２）、配列番号７（ＦＦＬ＿００５）、および配列番号９（ＦＦＬ＿００７）からなる群から選択された配列を含むかまたは該配列で構成される。より好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４（ＦＦＬ＿００１）、配列番号７（ＦＦＬ＿００５）、および配列番号９（ＦＦＬ＿００７）からなる群から選択された配列を含むかまたは該配列で構成される。
【００２５】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、リストに記載された配列の任意の再表面形成（resurfaced）型を含み、コレイア（Correia）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol Biol）、２０１１年または再表面形成（resurfacing）の概念のあらゆる関連出願に記載されている再表面形成を指している。
【００２６】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、１つ以上のジスルフィド結合を加えることにより得られた、リストに記載された配列の任意のバリアントを含む。
本明細書中に開示されるように、本発明者らは、エピトープの立体配座の安定化および免疫系への提示のためのタンパク質スカフォールドを設計するためのコンピュータ計算方法を開発した。この方法はＭｏｔａエピトープに適用されて本発明のポリペプチドが設計され、該ポリペプチドは、モノマーであり、熱安定性が高く、かつＭｏｔａへの結合親和性が極めて高いことが示される。
【００２７】
本願全体にわたって使用されるように、用語「ポリペプチド」は、サブユニットのアミノ酸の配列を指す該用語の最も広い意味で使用される。本発明のポリペプチドは、Ｌ‐アミノ酸、Ｄ‐アミノ酸（生体内（in vivo）のＬ‐アミノ酸特異的プロテアーゼに対して抵抗性である）、またはＤ‐アミノ酸とＬ‐アミノ酸との組み合わせを含むことができる。本明細書中に記載されるポリペプチドは、化学合成されてもよいし、組換え発現されてもよい。ポリペプチドは、ポリペプチド精製を容易にするペプチドタグや所望の免疫応答を増強するためのＴヘルプエピトープのような、任意の所望の用途で使用するための任意の適切なリンカーなどを含有することができる。例えば、下記に議論される例示のポリペプチドのうち２つは、これらのポリペプチドが他に「Ｗ」残基を含まないことからタンパク質濃度の決定を容易にするＣ末端「ＧＳＷ」を備えている。
【００２８】
ポリペプチドは、例えばＰＥＧ化（PEGylation）、ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ（登録商標）、グリコシル化などによってｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期延長を促進する他の化合物に連結されてもよいし、Ｆｃ融合体として生産されても、脱免疫（deimmunized）バリアントとして生産されてもよい。当業者には理解されるように、そのような連結は共有結合であっても非共有結合であってもよい。
【００２９】
さらなる実施形態では、本発明の任意の実施形態のポリペプチドは、検出可能な構成部分または治療薬のようなタグをさらに含むことができる。タグは、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、静電気結合、組換え融合および立体配座的結合を含むがこれらに限定されない共有結合により、ポリペプチドに連結されうる。別例として、タグは、１つ以上の連結化合物によりポリペプチドに連結されてもよい。ポリペプチドにタグをコンジュゲートするための技術は当業者には周知である。検出可能なタグを含むポリペプチドは、例えば、該ポリペプチド中に存在するエピトープに特異的なＢ細胞を単離するためのプローブとして使用されうる。しかしながら、タグは、その他の検出および分析目的のうち少なくともいずれか一方のためにも使用されうる。任意の適切な検出タグ、例えば、限定するものではないが、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが使用されうる。使用されるタグは、使用される特定の検出／分析の技術および／または方法、例えばフローサイトメトリー検出、レーザー走査型サイトメトリー検出、蛍光免疫測定法、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ（例えば中和アッセイ）、ウエスタンブロッティングの適用などに応じて変わることになろう。本発明のポリペプチドが、フローサイトメトリー検出、レーザー走査型サイトメトリー検出、または蛍光免疫測定法に使用される場合、タグは例えばフルオロフォアを含むことができる。本発明のポリペプチドを蛍光標識するために有用な種々のフルオロフォアが当業者に良く知られている。ポリペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでの診断用途に使用される場合、タグは、例えば、ガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸のような磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）造影剤を含むこともできるし、超音波造影剤に、もしくはＸ線造影剤に、または放射性同位体標識によってもよい。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、ウイルス様粒子のような粒子に結合するためのリンカー（例えばシステインまたはリジンのようなアミノ酸リンカーを含むがこれらに限定はされない）のようなタグをさらに含むこともできる。別の例として、本発明のポリペプチドは、ＥＬＩＳＡのためにマイクロタイタープレートの表面に有用なように取り付け可能である。本発明のポリペプチドは、以降の実施例に記載されているように、精製を容易にするためにマーカー配列に融合されてもよい。実施例としては、限定するものではないが、ヘキサヒスチジンタグ、ｍｙｃタグまたはフラグタグが挙げられる。
【００３１】
別の実施形態では、複数のポリペプチドが複合されてデンドリマーとされてもよい。デンドリマーは、三次元の高次オリゴマーおよび／またはポリマー化合物であって、典型的にはコア分子もしくは指定の開始剤上で該オリゴマーおよび／またはポリマーを付加して外側表面を提供する反復した連続反応によって形成される化合物である。適切なデンドリマーには、限定するものではないが「スターバースト」デンドリマーおよび様々なデンドリマーポリカチオンが挙げられる。デンドリマーの調製および使用のための方法は当業者によく知られている。
【００３２】
別の実施形態では、ポリペプチドは、該ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方を介してオリゴマー化ドメインに（組換えによる手段もしくは化学的手段により）融合されてもよい。任意の適切なオリゴマー化ドメインが使用可能である。１つの非限定的な実施形態では、ポリペプチドは、三量体を形成するＧＣＮ４バリアントに融合される（従って、融合ポリペプチドの三量体または六量体が提示されることが考えられる）。別の非限定的な実施形態では、ポリペプチドは、三量体を形成するフィブリチン（fibritin）のフォルドン（foldon）ドメインに融合される。他の非限定的な実施形態では、オリゴマー化ドメインは、集合して、例えば（非ウイルスの）ルマジンシンターゼタンパク質から作られる粒子や（非ウイルスの）フェリチンまたはフェリチン様タンパク質から作られる粒子を含むがこれらに限定されない粒子を形成する任意のタンパク質であってもよい。
【００３３】
別の実施形態では、ポリペプチドは、リポソームに化学的にコンジュゲートされてもよい。１つの非限定的な実施形態では、リポソームは、反応性基を担持するようにＰＥＧ基が官能化されたＰＥＧ化脂質を一部含有しており、ポリペプチドはＰＥＧ上の該反応性基に化学的に連結される。別の非限定的な実施形態では、さらなる免疫刺激性の化合物がリポソーム内の脂質層中またはその内側に含まれる。別の非限定的な実施形態では、特定の細胞を標的とする分子、例えば、限定するものではないが樹状細胞の表面上のタンパク質に結合する分子が、リポソームの表面に含まれている。
【００３４】
別の実施形態では、免疫系へのポリペプチドの提示をさらに増強するために、複数（すなわち２以上、好ましくは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、９０個またはそれ以上のコピー数）のポリペプチドがウイルス様粒子（ＶＬＰ）の中に存在していてもよい。本明細書中で使用されるように、「ウイルス様粒子」とは、少なくとも１つの属性の点ではウイルスに類似しているが感染性であることは実証されていない構造物を指す。本発明で用いるウイルス様粒子は、該ウイルス様粒子のタンパク質をコードしている遺伝子情報を担持していない。一般に、ウイルス様粒子はウイルスゲノムを欠き、したがって非感染性である。加えて、ウイルス様粒子は異種発現によって多量に生産可能である場合が多く、かつ容易に精製されうる。好ましい実施形態では、ＶＬＰは、自然発生的な自己集合を生じうるウイルスタンパク質を含み、そのようなウイルスタンパク質には、例えば、限定するものではないが、アデノ随伴ウイルスの組換えタンパク質、ロタウイルス、ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、アルファウイルスの組換えタンパク質、口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、レトロウイルスの組換えタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、タバコモザイクウイルスの組換えタンパク質、フロックハウスウイルスの組換えタンパク質、およびヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質、ならびにＱβバクテリオファージ粒子が含まれる。１つの好ましい実施形態では、ウイルスタンパク質はＢ型肝炎コア抗原粒子を含む。別の実施形態では、ＶＬＰは脂質エンベロープウイルスに由来し、脂質および任意の適切なウイルスタンパク質、例えば、限定するものではないが、チクングンヤウイルス由来のタンパク質、またはＢ型肝炎表面抗原タンパク質を含む。組換え生産型ＶＬＰを生産して特性解析する方法は、米国特許出願公開第２０１１０２３６４０８号明細書に概説されるように、いくつかのウイルス由来のＶＬＰについて記載されている；米国特許第７，２２９，６２４号明細書も参照のこと。以降の実施例に記載されるように、Ｂ型肝炎（ＨｅｐＢ）コア抗原粒子上にコンジュゲートされたおよそ７５コピーのＦＦＬ＿００１ポリペプチド（配列番号４）を用いたＶＬＰに関連する免疫は、該ポリペプチドへの免疫応答の増大をもたらす。
【００３５】
本明細書中に議論されるように、本発明のＶＬＰはＲＳＶ感染の治療または制限のためのワクチン剤または抗原調合物として使用可能である。いくつかの実施形態では、ＶＬＰは、ＲＳＶＦタンパク質またはＲＳＶＧタンパク質由来の他のエピトープを提示する他のスカフォールドをさらに含むこともできる。他の実施形態では、ＶＬＰは、さらなるＲＳＶタンパク質、例えばＭ、Ｎ、ＧおよびＳＨのうち少なくともいずれかに由来するエピトープを提示するスカフォールドをさらに含むこともできる。
【００３６】
別の実施形態では、ポリペプチドは、合成ポリマー、脂質ミセルまたは金属のような非天然のコア粒子上に存在していてもよい。そのようなコア粒子は、対象個体に送達して免疫応答の増強をもたらすための本発明の複数のポリペプチドの組織化に使用することができる。例を挙げると、合成ポリマーまたは金属のコア粒子は、複数のペプチドループが取り付けられたカリックスアレーン有機スカフォールドの、「抗体模倣体（antibody mimic）」の作出における使用を開示する米国特許第５，７７０，３８０号明細書に記載されており、また米国特許第５，３３４，３９４号明細書は、金属またはセラミックスを含む種々様々の無機質材料からなる、ウイルスのおとりとして使用されるナノ結晶粒子について述べている。本実施形態において好ましい金属には、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀、白金が挙げられる。本実施形態において好ましいセラミックス材料には、二酸化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズが挙げられる。本実施形態のコア粒子は炭素（ダイヤモンド）を含む有機材料から作られてもよい。好ましいポリマーには、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースが挙げられる。この種のナノ結晶粒子については、酸化スズ、二酸化チタンまたは炭素（ダイヤモンド）から作られた粒子が特に好ましい。脂質ミセルは、当分野で周知の任意の手段によって調製可能である。米国特許第７，２２９，６２４号明細書および本明細書中に開示された参照文献を参照されたい。
【００３７】
第２の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。該単離核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡを含むことができる。本明細書中で使用されるように、「単離核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中において通常その周囲にある核酸配列から取り出された核酸である。そのような単離核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および精製のうち少なくともいずれか一方を容易にするのに有用な追加の配列を含むことができ、そのような追加の配列には、例えば、限定するものではないが、ｐｏｌｙＡ配列、修飾コザック配列、ならびに、エピトープタグ、移出シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および原形質膜局在シグナルをコードする配列が含まれる。本明細書中の教示に基づけば、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードすることになるかは当業者には明白であろう。
【００３８】
第３の態様では、本発明は、適切な制御配列に作動可能に連結された本発明の任意の態様の単離核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」には、核酸コード領域または遺伝子を該遺伝子産物の発現を達成することができる任意の制御配列に作動可能に連結するベクターが含まれる。本発明の核酸配列に作動可能に連結される「制御配列」は、該核酸分子の発現を達成することができる核酸配列である。制御配列は、該制御配列が核酸配列の発現を導くように機能する限り、該核酸配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列がプロモータ配列と核酸配列との間に存在することが可能であり、その場合も該プロモータ配列はコード配列に「作動可能に連結された」とみなすことができる。他のそのような制御配列には、限定するものではないが、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられる。そのような発現ベクターは当分野において既知の任意の種類のものであってよく、例えば、限定するものではないが、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが挙げられる。開示された核酸配列の発現を哺乳類の系において駆動するために使用される制御配列は、構成的（様々なプロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦプロモータによって駆動される）であってもよいし、誘導型（例えばいくつかの誘導プロモータのうち任意のもの、例えば、限定するものではないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性のプロモータによって駆動される）であってもよい。原核細胞のトランスフェクションに使用される発現ベクターの構築は当分野においてよく知られており、よって標準的技法により達成可能である。（例えば、サムブルック（Sambrook）、フリッチェ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年；Ｅ．Ｊ．マレー（E.J. Murray）編、「遺伝子の導入および発現プロトコール（Gene Transfer and Expression Protocols）」、米国ニュージャージー州クリフトン、ヒューマナ出版社（The Humana Press Inc.）、第１０９〜１２８ページ、ならびにアンビオン（Ambion）１９９８年カタログ（米国テキサス州オースティン、アンビオン）を参照）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込みにより、宿主生物体内において複製可能でなければならない。好ましい実施形態では、発現ベクターはプラスミドを含む。しかしながら、本発明は、ウイルスベクターのような同等の機能を果たす他の発現ベクターを含むことも意図されている。
【００３９】
第４の態様では、本発明は、本明細書中に開示された組換え発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を提供し、該宿主細胞は原核細胞であってもよいし真核細胞であってもよい。細胞は、一過性にトランスフェクションされることも、安定的にトランスフェクションされることも可能である。原核細胞および真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、当分野で既知の任意の技術、例えば、限定するものではないが、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションによって行うことができる。（例えば、サムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、１９８９年；Ｒ．Ｉ．フレシュニー（R.I. Freshney）、「動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique）」、第２版、米国ニューヨーク州ニューヨーク、リス社（Liss, Inc.）、１９８７年を参照のこと）。本発明のポリペプチドを生産する方法は本発明の補足部分である。該方法は、（ａ）本発明のこの態様の宿主を、該ポリペプチドの発現を助長する条件下で培養するステップと、（ｂ）任意選択で、発現されたポリペプチドを回収するステップとを含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物から回収可能であるが、培地から回収されることが好ましい。無細胞抽出物または培地からポリペプチドを回収する方法は、当業者によく知られている。
【００４０】
第５の態様では、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド、ＶＬＰ、核酸、組換え発現ベクター、または宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物（ワクチンなど）を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、下記に記載された本発明の方法において使用されうる。該医薬組成物は、本発明のポリペプチドに加えて、（ａ）リオプロテクタント；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤：（ｄ）等張化剤；（ｅ）安定化剤；（ｆ）防腐剤および（ｇ）バッファーのうち少なくともいずれかを含むことができる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物中のバッファーは、トリスバッファー、ヒスチジンバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファーまたは酢酸バッファーである。医薬組成物は、リオプロテクタント、例えばショ糖、ソルビトールまたはトレハロースを含むこともできる。ある実施形態では、該医薬組成物は、防腐剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、フェノール、ｍ‐クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ‐クレゾール、ｐ‐クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびこれらの種々の混合物を含む。他の実施形態では、該医薬組成物は、グリシンのような増量剤を含む。さらに他の実施形態では、該医薬組成物は、界面活性剤、例えばポリソルベート‐２０、ポリソルベート‐４０、ポリソルベート‐６０、ポリソルベート‐６５、ポリソルベート‐８０、ポリソルベート‐８５、ポロキサマー‐１８８、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミタート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリラウレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタントリオレエート、またはこれらの組み合わせを含む。医薬組成物はさらに、等張化剤、例えば調合物をヒト血液とほぼ等張または等浸透圧にする化合物も含むことができる。典型的な等張化剤には、ショ糖、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。他の実施形態では、医薬組成物はさらに、安定化剤、例えば、対象とするタンパク質と組み合わされたときに、凍結乾燥形態または液体形態における該対象タンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に防止または低減する分子を含む。典型的な安定化剤には、ショ糖、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。
【００４２】
ポリペプチドは医薬組成物中の唯一の活性物質であってもよいし、該組成物が、意図される用途に適した１つ以上の他の物質、例えば、限定するものではないが、免疫系を広く刺激しかつ免疫応答を全体的に高めるアジュバントを、さらに含むこともできる。任意の適切なアジュバントが使用可能である。用語「アジュバント」は、抗原への免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。典型的なアジュバントには、限定するものではないが、Ａｄｊｕ‐Ｐｈｏｓ（登録商標）、Ａｄｊｕｍｅｒ（商標）、アルブミン‐ヘパリン微粒子、藻類グルカン（Algal Glucan）、アルガミュリン（Algammulin）、アラム（Alum）、抗原調合物（Antigen Formulation）、ＡＳ‐２アジュバント、自己由来樹状細胞、自己由来ＰＢＭＣ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（商標）、Ｂ７‐２、ＢＡＫ、ＢＡＹ  Ｒ１００５、ブピバカイン、ブピバカイン‐ＨＣｌ、ＢＷＺＬ、カルシトリオール、リン酸カルシウムゲル（Calcium Phosphate Gel）、ＣＣＲ５ペプチド、ＣＦＡ、コレラホロトキシン（ＣＴ）およびコレラトキシンＢサブユニット（ＣＴＢ）、コレラトキシンＡ１サブユニット‐プロテインＡ  Ｄフラグメント融合タンパク質、ＣｐＧ、ＣＲＬ１００５、サイトカイン含有リポソーム、Ｄ‐Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ、ＤＤＡ、ＤＨＥＡ、ジフテリアトキソイド、ＤＬ‐ＰＧＬ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／アラム複合体（DOC/Alum Complex）、鶏痘、フロイント完全アジュバント、γイヌリン、Ｇｅｒｂｕ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（登録商標）、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＧＭＤＰ、ｈＧＭ‐ＣＳＦ、ｈＩＬ‐１２（Ｎ２２２Ｌ）、ｈＴＮＦ‐α、ＩＦＡ、ｐｃＤＮＡ３中のＩＦＮγ、ＩＬ‐１２  ＤＮＡ、ＩＬ‐１２プラスミド、ＩＬ‐１２／ＧＭＣＳＦプラスミド（サイクス（Sykes））、ｐｃＤＮＡ３中のＩＬ‐２、ＩＬ‐２／Ｉｇプラスミド、ＩＬ‐２／Ｉｇタンパク質、ＩＬ‐４、ｐｃＤＮＡ３中のＩＬ‐４、イミキモド、ＩｍｍＴｈｅｒ（商標）、共刺激分子に対する抗体を含有しているイムノリポソーム、インターフェロンγ、インターロイキン１β、インターロイキン１２、インターロイキン２、インターロイキン７、ＩＳＣＯＭ（ｓ）（商標）、Ｉｓｃｏｐｒｅｐ７．０．３（商標）、キーホールリンペットヘモシアニン、脂質系アジュバント、リポソーム、ロキソリビン（Loxoribine）、ＬＴ（Ｒ１９２Ｇ）、ＬＴ‐ＯＡすなわちＬＴ経口アジュバント、ＬＴ‐Ｒ１９２Ｇ、ＬＴＫ６３、ＬＴＫ７２、ＭＦ５９、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ７２０、ＭＰＬ（商標）、ＭＰＬ‐ＳＥ、ＭＴＰ‐ＰＥ、ＭＴＰ‐ＰＥリポソーム、ムラメチド、Ｍｕｒａｐａｌｍｉｔｉｎｅ、ＮＡＧＯ、ｎＣＴ天然コレラトキシン、非イオン性界面活性剤ベシクル、コレラトキシンの非毒性突然変異体Ｅ１１２ＫであるｍＣＴ‐Ｅ１１２Ｋ、ｐ‐ヒドロキシ安息香酸メチルエステル、ｐＣＩＬ‐１０、ｐＣＩＬ１２、ｐＣＭＶｍＣＡＴ１、ｐＣＭＶＮ、ペプトマーＮＰ（Peptomer-NP）、プルーラン（Pleuran）、ＰＬＧ、ＰＬＧＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ１２１、ＰＭＭＡ、ＰＯＤＤＳ（商標）、ポリｒＡ：ポリｒＵ、ポリソルベート８０、プロテインコクリエート（Protein Cochleates）、ＱＳ‐２１、クアドリ（Quadri）Ａサポニン、Ｑｕｉ���‐Ａ（登録商標）、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（登録商標）ＨＰＡ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（登録商標）ＬＶ、ＲＩＢＩ（登録商標）、Ｒｉｂｉｌｉｋｅアジュバントシステム（ＭＰＬ、ＴＭＤ、ＣＷＳ）、Ｓ‐２８４６３、ＳＡＦ‐１、スクラボ・ペプチド（Sclavo peptide）、センダイプロテオリポソーム（Sendai Proteoliposome）、センダイ含有脂質マトリックス（Sendai-containing Lipid Matrix）、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｓｐｅｃｏｌ（登録商標）、スクアラン１、スクワレン２、ステアリルチロシン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）、トレオニルムラミルジペプチド（ＴＭＤＰ）、Ｔｙ粒子、およびウォルター・リード・リポソーム、が挙げられる。アジュバントの選択は、ワクチン接種を受ける対象個体に応じて変化する。好ましくは、薬学的に許容可能なアジュバントが使用される。
【００４３】
該ポリペプチドを含む組成物は、任意の標準的な形態、例えば水溶液または凍結乾燥された固形物として保管可能である。そのような組成物は、細胞または対象個体へ投与される場合は一般に滅菌状態である。水溶液の滅菌は、濾過滅菌メンブレンによる濾過によって容易に行われる。組成物が凍結乾燥形態で保管される場合、組成物は凍結乾燥および再構成の前に濾過されてもよいし後で濾過されてもよい。
【００４４】
第６の態様では、本発明は、ＲＳＶ感染症の治療および制限のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、ＲＳＶ感染症の治療および制限のうち少なくともいずれか一方を行うために、投与を必要とする対象個体に、治療上有効な量の本発明の１つ以上のポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドのコンジュゲート物、該ポリペプチドのＶＬＰ、または該ポリペプチドの医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、該方法は、ＲＳＶ感染しているかまたはＲＳＶ感染症のリスクを有する個体において免疫応答を誘発することを含み、免疫応答を引き起こすために、投与を必要とする対象個体に、治療上有効な量の本発明の１つ以上のポリペプチド、該ポリペプチドの塩、該ポリペプチドのコンジュゲート物、該ポリペプチドのＶＬＰ、または該ポリペプチドの医薬組成物を投与するステップを含む。
【００４５】
「呼吸器多核体ウイルス」および「ＲＳＶ」は、特に小児において呼吸器疾患を引き起こすパラミクソウイルス科の一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスを指す。
該方法がＲＳＶ感染を治療することからなる場合、１つ以上のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物は、ＲＳＶに既に感染している対象個体、またはＲＳＶに感染しているであろうことを示す症状（例えば、限定するものではないが、下気道感染、上気道感染、細気管支炎、肺炎、発熱、気力低下、食欲減退、反復性喘鳴、および喘息）を患っている対象個体に投与される。本明細書中で使用されるように、「治療する」または「治療」とは、下記すなわち：（ａ）対象個体におけるＲＳＶ力価の低減；（ｂ）対象個体におけるＲＳＶ力価の何らかの増大の制限；（ｃ）ＲＳＶ症状の重症度の低減；（ｄ）感染後のＲＳＶ症状の発症の制限または予防；（ｅ）ＲＳＶ症状の悪化の抑制；（ｆ）以前にＲＳＶ感染の症状を示した対象個体におけるＲＳＶ症状の再発の制限または予防、のうち１つ以上を達成することを意味する。一実施形態の方法では、ポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物は、既に存在している感染症の改善および新たなＲＳＶウイルスによる感染症の予防の提供のうち少なくともいずれか一方を行うために、「治療ワクチン」として使用される。
【００４６】
該方法がＲＳＶ感染症を制限することからなる場合、１つ以上のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物は、感染しているか否か不明であるがＲＳＶに曝露したリスクを有しうる対象個体に予防的に投与される。本明細書中で使用されるように、「制限」とは、ＲＳＶ感染症のリスクを有する対象個体のＲＳＶ感染を制限することを意味する。特に高いリスクを有するグループには、１８歳未満の小児（特に３歳以下の幼児）、６５歳を超える成人、および任意の種類の免疫不全に罹患している人が含まれる。この方法では、ポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物はワクチンとして使用される。
【００４７】
本明細書中で使用されるように、「治療上有効な量」とはＲＳＶ感染症の治療および制限のうち少なくともいずれか一方を行うために有効なポリペプチドの量を指す。ポリペプチドは、一般的には上記に開示されたもののような医薬組成物として製剤化され、任意の適切な経路を介して、例えば経口的に、parentally、吸入スプレーにより、経直腸的に、または局所的に、従来の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する投与単位製剤として投与されうる。本明細書中で使用される非経口という用語には、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸内、点滴技法または腹腔内が含まれる。ポリペプチド組成物は、ミクロスフェア、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、または適切な組織（例えば血液）中に導入されるその他の微小粒子送達システムもしくは徐放性製剤を介して投与されてもよい。投与レジメンは望ましい最適な応答（例えば治療的応答または予防的応答）を提供するために調節されうる。適切な用量域は、例えば、体重１ｋｇ当たり０．１ｕｇ〜１００ｍｇであってよく；別例として、適切な用量域は体重１ｋｇ当たり０．５ｕｇ〜５０ｍｇ；１ｕｇ〜２５ｍｇ、または５ｕｇ〜１０ｍｇであってよい。ポリペプチドは単回のボーラス投与で送達されてもよいし、主治医の決定により２回以上（例えば２、３、４、５回またはそれ以上）投与されてもよい。
【００４８】
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、以降の実施例で実証されるように、ＲＳＶの感染力を中和する。様々な実施形態において、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドの非存在下でのＲＳＶによる宿主細胞の感染と比較して、ＲＳＶが宿主細胞に感染するのを少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％予防する。中和は当分野において標準的な技法を使用して測定可能である。
【００４９】
別の態様では、本発明は、
（ａ）本発明の単離核酸、組換え発現ベクター、および組換え宿主細胞のうち少なくともいずれかと；
（ｂ）薬学的に許容可能な担体と
を含む医薬組成物を提供する。この態様では、本発明の核酸、発現ベクター、および宿主細胞は、対象個体において、コードされたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで発現することによりコードされたポリペプチドに対する免疫応答を誘発するための、ポリヌクレオチド系免疫原性組成物として使用することができる。ポリヌクレオチドを動物に投与するための様々な方法が利用可能である。動物に特定のポリヌクレオチドを導入するのに適した方法の選択は、当分野の技術の範囲内にある。本発明のポリヌクレオチドは、当分野で既知の他の方法、例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈澱法、リポフェクション（リソソーム融合）、またはＤＮＡベクタートランスポーターによっても対象個体に導入可能である（例えば、ウー（Wu）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.）、１９９２年、第２６７巻、ｐ．９６３〜９６７を参照のこと）。
【００５０】
本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物に対する免疫応答は、対象個体に本発明の免疫原性組成物を１回以上接種することによって引き起こされうる。初回接種は「一次接種」と呼ばれ、その後の免疫処置は「ブースター接種」と呼ばれる。ブースター接種は一般に免疫応答を増強し、少なくとも１回のブースター接種を含む免疫処置レジメンが好ましい。本発明の任意のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物が初回免疫またはブースター免疫に使用されうる。選択されたワクチン接種パラメータ、例えば製剤、用量、レジメンなどの妥当性は、対象個体から血清のアリコートを採取して免疫処置プログラムの経過中に抗体力価をアッセイすることにより判定可能である。別例として、Ｔ細胞集団が従来の方法によってモニタリングされてもよい。加えて、対象個体の臨床症状が、期待される効果、例えばＲＳＶ感染症の制限、病状の改善（例えばウイルス負荷の低減）などについてモニタリングされてもよい。そのようなモニタリングによりワクチン接種が不十分であることが示された場合、対象個体に追加用量の組成物がブースター接種されてもよく、またワクチン接種パラメータが、免疫応答を強化すると予想される様式に修正されてもよい。従って、例えば、ポリペプチド、ＶＬＰ、もしくは組成物、およびアジュバントのうち少なくともいずれかの用量が増加されてもよいし、投与経路が変更されてもよい。
【００５１】
さらなる態様では、本発明は、対象個体においてＲＳＶにより引き起こされた疾患をモニタリングするか、またはＲＳＶワクチンによる免疫に対する対象個体の応答をモニタリングするための方法であって、本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または医薬組成物を対象個体由来の体液と接触させるステップと、対象個体の体液中のＲＳＶ結合抗体を検出するステップとを含む方法を提供する。「ＲＳＶにより引き起こされた疾患」とは、ＲＳＶによって直接または間接的に引き起こされた任意の疾患を意図している。該方法は、本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物を、ある量の対象個体由来の体液（血清、全血など）と接触させるステップと；対象個体の体液中のＲＳＶ結合抗体を検出するステップとを含む。ＲＳＶ結合抗体の検出は、対象個体におけるＲＳＶ疾患のモニタリングを可能にする。加えて、ＲＳＶ結合抗体の検出は、ＲＳＶワクチンによる免疫に対する対象個体の応答のモニタリングも可能にする。さらに別の方法では、ＲＳＶ結合抗体の力価が決定される。任意の適切な検出アッセイ、例えば、限定するものではないが、均一系および不均一系の免疫学的測定法であって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学的検査、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥおよびウエスタンブロット解析などが使用可能である。該方法は溶液中で行われてもよいし、本発明のポリペプチドを、担体または基材、例えば微量定量プレート（例えばＥＬＩＳＡ用）、メンブレンおよびビーズなどに結合または付着させてもよい。担体または基材は、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロン（登録商標）などで作製されうる。そのような支持体の表面は、一面に均質であっても、多孔性であってもよく、かつ任意の好都合な形状のものであってよい。この態様で使用される本発明のポリペプチドは、所与のアッセイに適した任意の検出技法に有用なタグを提供するために、上記に開示されるようなコンジュゲートを含むこともできる。
【００５２】
さらに別の態様では、本発明は、ＲＳＶ結合抗体を検出する方法であって、
（ａ）本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物を、ＲＳＶ結合抗体の候補を含む組成物と、ＲＳＶ抗体がポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物に結合するのに適した条件下で接触させるステップと；
（ｂ）ポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物とのＲＳＶ抗体複合体を検出するステップと、を含む方法を提供する。この態様では、該方法は、ＲＳＶ結合抗体の候補が本発明のポリペプチド中に存在するＲＳＶ  Ｆエピトープを認識するか否かを決定するために実施される。任意の適切な組成物、例えば、限定するものではないが、適切な対象個体（ＲＳＶに感染した人など）由来の体液試料（血清、全血など）、ナイーブライブラリ、修飾ライブラリ、および、ＲＳＶ特異的免疫応答を示すヒト提供者から直接作製されたライブラリが使用されうる。アッセイは、ポリペプチドに対する抗体の結合を促進するのに適した条件下で実施され、そのような条件は本明細書中の教示に基づいて当業者により決定されうる。任意の適切な検出アッセイ、例えば、限定するものではないが、均一系および不均一系の免疫学的測定法であって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光検査法、免疫組織化学的検査、ＦＡＣＳ、ＢＩＡＣＯＲＥおよびウエスタンブロット解析などが使用可能である。該方法は溶液中で行われてもよいし、本発明のポリペプチドを、担体または基材、例えば微量定量プレート（例えばＥＬＩＳＡ用）、メンブレンおよびビーズなどに結合または付着させてもよい。担体または基材は、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖類、ナイロン、ニトロセルロース、またはテフロン（登録商標）などで作製されうる。そのような支持体の表面は、一面に均質であっても、多孔性であってもよく、かつ任意の好都合な形状のものであってよい。この態様で使用される本発明のポリペプチドは、所与のアッセイに適した任意の検出技法に有用なタグを提供するために、上記に開示されるようなコンジュゲートを含むこともできる。さらなる実施形態では、ＲＳＶ  Ｆ結合抗体は標準的な手順を用いて単離される。１つの実施形態では、該方法は、当分野における標準的な技法を使用した蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によるポリペプチド特異的な記憶Ｂ細胞の単離を含むこともできる（例えば、サイエンス（Science）のDOI:10.1126/science.1187659を参照のこと）。
【００５３】
別の態様では、本発明は、ＲＳＶ抗体を生産する方法であって、
（ａ）抗体応答を引き起こすのに有効な量の本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、および組成物のうち少なくともいずれかを対象個体に投与するステップと；
（ｂ）対象個体によって産生された抗体を単離するステップと
を含む方法を提供する。本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを認識する抗体を生成するためにも使用されうる。該方法は、本発明のポリペプチド、ＶＬＰ、または組成物を対象個体に投与するステップを含む。そのような抗体は、例えば、ＲＳＶ研究に使用することができる。この実施形態に使用される対象個体は、抗体生産のために一般に使用される対象個体、例えば、限定するものではないが、哺乳動物、例えばげっ歯動物、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどである。生成される抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであってよい。ポリクローナル抗体は、適切な動物（例えばマウスまたはウサギ）に抗原ポリペプチドを注射（例えば皮下注射または筋肉内注射）することにより産生される。その後、抗体は該動物から採取された血液試料から得られる。ポリクローナル抗体を生産するために使用される技術は、広く文献に記載されている。対象個体によって産生されたポリクローナル抗体は、例えば、該抗体を産生させたポリペプチドを基材に結合させ、その基材に該抗体を結合させ、さらにその基材から溶出させることにより、さらに精製可能である。当業者であれば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および濃縮のうち少なくともいずれか一方のための様々な標準的技法について精通しているであろう。モノクローナル抗体は当分野で既知の技法を使用して生成されてもよい。
【００５４】
第７の態様では、本発明は、ポリペプチドスカフォールドを設計するためのコンピュータ計算方法を提供する。その方法は：
（ａ）フォールディング核として使用されるべきポリペプチド構造モチーフを定義するステップと、
（ｂ）（ｉ）該ポリペプチド構造モチーフとの適合性を有するポリペプチドスカフォールド用の標的三次元トポロジー、および（ｉｉ）該ポリペプチド構造モチーフに置き換えられるべき該標的三次元トポロジーの領域、を定義するステップと、
（ｃ）該ポリペプチド構造モチーフの原子座標の終点から延長ポリペプチド鎖を成長させるステップと、
（ｄ）該ポリペプチド構造モチーフの主鎖二面角を固定状態に維持しながら延長ポリペプチド鎖をフォールディングするステップと、
（ｅ）標的三次元トポロジーに対するポリペプチド主鎖の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）のユーザ定義の閾値を満たすフォールディングされたポリペプチド鎖を、対象とするポリペプチドスカフォールドとして同定するステップと
を含みうる。
【００５５】
開示されたコンピュータ計算方法は、任意の適切なコンピュータデバイス、例えば、限定するものではないが、サーバコンピュータ、パーソナルコンピュータ、およびモバイルコンピュータのうち少なくともいずれかによって実行されうる。
【００５６】
開示されたコンピュータ計算方法によって設計されたポリペプチドスカフォールドは、例えば、エピトープの立体配座の安定化および免疫系への提示を促進するために使用されうる。この方法論（本明細書中ではフォールド・フロム・ループス（Fold From Loops（ＦＦＬ））と呼ばれる）の出発点は、タンパク質への機能性付与を担う構造モチーフおよび該機能性モチーフ周辺でフォールディングされるべき標的トポロジーである（図１）。ＦＦＬ手法の実際的な取り組みは２点すなわち：（１）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのフォールディング段階により、機能性モチーフの正確な立体配座を安定させるためのスカフォールド全体の構造および配列の最適化が可能となること；ならびに（２）標的トポロジーについて、該戦略が天然に存在するフォールディング構造または自然界で未だ確認されていないフォールディング構造のいずれをも利用することができること、である。該方法は、以下により詳細に議論されるように、ＲＳＶ広域中和エピトープ周辺の３ヘリックス束トポロジーをフォールディングかつ設計するために適用されてもよい。
【００５７】
ポリペプチド構造モチーフは、任意の機能性ポリペプチドセグメントまたはドメイン、例えば、タンパク質結合部位、酵素活性部位、小分子結合部位、ＤＮＡもしくはＲＮＡ結合部位などであってよいが、これらに限定されない。同様に、該構造モチーフは、フォールディング核として使用される連続的構造モチーフ（単一のアミノ酸セグメント）であってもよいし、特定の三次元形状で提示される複数（すなわち２つ以上）の不連続セグメントを含むこともできる。
【００５８】
フォールディング核として使用されるべきポリペプチド構造モチーフを定義するステップの特徴は、様々な形態をとりうる。一例において、コンピュータデバイスは、ユーザにより入力されたデータ、ローカルデータ保存記憶装置および遠隔データ保存記憶装置のうち少なくともいずれかから取得されたデータ、および、別のコンピュータデバイスから受信されたデータのうち少なくともいずれかに基づいて、ポリペプチド構造モチーフを定義することができる。その他の例も同様に可能である。
【００５９】
ポリペプチド構造モチーフとの適合性を有するポリペプチドスカフォールド用の標的三次元トポロジー、およびポリペプチド構造モチーフに置き換えられるべき標的三次元トポロジーの領域を定義するステップの特徴も、様々な形態をとりうる。一例において、コンピュータデバイスは、ユーザにより入力されたデータ、ローカルデータ保存記憶装置および遠隔データ保存記憶装置のうち少なくともいずれかから取得されたデータ、および、別のコンピュータデバイスから受信されたデータのうち少なくともいずれかに基づいて、標的三次元トポロジーおよび置き換えられるべき領域を定義することができる。同じく、標的三次元トポロジーの基になるデータは様々な形態をとりうる。例えば、このデータは、意図される用途について任意の適切な特徴、例えば、限定するものではないが、（ｉ）原子座標に関する構造モチーフとの既存の三次元的類似性、（ｉｉ）二次構造に関する構造モチーフとの既存の類似性、および／または（ｉｉｉ）同様の距離だけ隔てられるように意図された、モチーフの終点間の距離およびトポロジー中の残基間の距離の比較、を示すことができる。その他の例も同様に可能である。
【００６０】
コンピュータデバイスはさらに、標的三次元トポロジーを定義する際に様々な制約を考慮に入れることができる。例えば、コンピュータデバイスは、既知構造のタンパク質またはモデル由来の構造フラグメントを考慮することができ、その構造フラグメントは主鎖二面角情報を含み、かつ配列および二次構造のうち少なくともいずれかの類似性に基づき標的トポロジーと一致するものとして選択される。特に、コンピュータデバイスは、これらのフラグメントに含まれた一組の二面角をポリペプチド鎖に無作為に適用することができる。別の例として、コンピュータデバイスは、低解像度または高解像度の三次元構造から収集された距離の制約を使用して、特定の残基対の間の距離が対応する標的トポロジーの距離±ユーザ定義の標準偏差以内にないポリペプチド立体配座にエネルギー的なペナルティを課すことにより、ＦＦＬフォールディング段階を誘導することができる。その他の例も同様に可能である。
【００６１】
ポリペプチド構造モチーフによって置き換えられるべき標的三次元トポロジーの定義された領域は、様々な形態をとることができる。１つの実施形態では、該領域は連続的な構造モチーフ（単一のアミノ酸セグメント）である。別の実施形態では、領域は複数（すなわち２つ以上）の不連続なセグメントを含む。
【００６２】
１つの実施形態では、該方法は、延長ポリペプチド鎖を成長させるステップの前に標的三次元トポロジー由来の１つ以上の制約を決定するステップをさらに含む。上記の制約は様々な形態をとることが可能であり、例えば、限定するものではないが、Ｃα距離の制約、Ｃαもしくは他の座標に関する角度もしくは二面角についての制約、トポロジーを安定化するのに重要であると思われるジスルフィド結合もしくは金属結合部位に基づいた幾何学的制約、特定の二次構造要素間の相互作用についての制約（例えば、トポロジーがいくつかのヘリックスを有する場合の、どのヘリックスが他のどのヘリックスと対になるべきかについての制約、および、トポロジーにβシートが存在する場合の、どのβストランドがβシート中の他のどのβストランドと対になるべきかについての制約）、および、どの残基を埋没させるべきで、かつどれを露出させるべきかについての（例えば、フォールディング中の近接Ｃβの数を概算することによるか、またはより正確には溶媒露出面積（accessible surface area）による）制約のうち少なくともいずれかである。１つの実施形態では、制約は標的三次元トポロジーからのＣα距離の制約を決定することを含むことができる。１つの非限定的な例では、配列上の離隔が６より大きな残基のＣα原子の間の距離は、結合部位が挿入されることになる範囲の外側で収集される。
【００６３】
ポリペプチド構造モチーフの原子座標の終点から延長ポリペプチド鎖を成長させるステップの特徴は、さらに様々な形態をとりうる。例えば、コンピュータデバイスは、ポリペプチド構造モチーフの主鎖の座標を「フォールディング核」としての役割を果たすように使用して、延長される鎖を最初に該モチーフの終点から成長させ、その後フォールディングさせてもよい。この点で、該モチーフの正確な主鎖原子座標は、該方法全体を通じて保存されることが好ましい。コンピュータデバイスはさらに、Ｃα距離を抽出するためのテンプレートとして標的三次元トポロジーを使用し、その後フォールディング段階を誘導するための制約として該Ｃα距離を使用することもできる。１つの非限定的な実施形態では、コンピュータデバイスは、結合部位原子座標の終点から延長ポリペプチド鎖を成長させ、その結果として、ポリペプチド構造モチーフが該モチーフの元の主鎖二面角を含有するが残りのすべての残基が延長された立体配座にある、セントロイド構造がもたらされてもよい。その他の例も同様に可能である。
【００６４】
ポリペプチド構造モチーフの主鎖二面角を固定状態に維持しながら延長ポリペプチド鎖をフォールディングするステップの特徴も、様々な形態をとりうる。特に、コンピュータデバイスは、この特徴を実行するために、任意の適切なフォールディングプロトコール、例えば、限定するものではないが、ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）ソフトウェア・パッケージにおいて利用可能なプロトコールを使用することができる（ブラッドリー  Ｐ（Bradley P）、ベイカー  Ｄ（Baker D）、プロテイン（Proteins.）、２００６年１２月１日、第６５巻、第４号、ｐ．９２２‐９；シモンス  ＫＴ（Simons KT）、クーパーバーグ  Ｃ（Kooperberg C）、ホアン  Ｅ（Huang E）、ベイカー  Ｄ（Baker D.）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J Mol Biol.）、１９９７年４月２５日、第２６８巻、第１号、ｐ．２０９‐２５；ロール  ＣＡ（Rohl CA）、シュトラウス  ＣＥ（Strauss CE）、ミスラ  ＫＭ（Misura KM）、ベイカー  Ｄ（Baker D）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymol.）、２００４年、第３８３巻、ｐ．６６‐９３）。例えば、コンピュータデバイスは、低解像度エネルギー関数によって評価された低エネルギー立体配座を探索するために、フラグメント挿入に依存するＲＯＳＥＴＴＡ（商標）のａｂｉｎｉｔｉｏプロトコールを使用することができる。任意選択で、コンピュータデバイスは、距離の制約に基づいたフォールディングプロトコールを使用することもできる。ＦＦＬプロトコールについては、既存のタンパク質由来の構造フラグメントが、配列相同性および二次構造予測によって選択された。ＦＦＬの低解像度モデルに割り当てられる配列は、標的トポロジーおよび入力された構造モチーフから得られた。
【００６５】
延長ポリペプチド鎖をフォールディングする間、コンピュータデバイスは、構造モチーフの主鎖二面角を「フォールディング核」として作用させるために固定状態に保持する。標的トポロジーから収集されたＣα距離は、立体配座サンプリングに制約を与えるために使用することができるが、Ｃα距離に基づいた制約は、例えば、ガウスのペナルティ関数（Gaussian penalty function）においてより大きな標準偏差を可能にすることにより、緩めることができる。
【００６６】
該方法は２つ以上の不連続なセグメントを備えた不連続の構造モチーフと共に使用可能であるので、ポリペプチド構造モチーフ内の主鎖二面角を固定することに加えて、該方法は、構造モチーフ内のセグメントの空間的配置を固定することをさらに含むこともできる。
【００６７】
標的三次元トポロジーに対するポリペプチド主鎖の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）のユーザ定義の閾値を満たす延長ポリペプチド鎖を、対象とするポリペプチドスカフォールドとして同定するステップの特徴も、様々な形態をとりうる。例えば、コンピュータデバイスは、標的トポロジーに対するユーザ定義の閾値未満の主鎖ｒｍｓｄを備えた構造を同定することが可能であり、その後の全原子の設計段階のために選択されうる。この点で、ユーザ定義の閾値は例えば５オングストロームであってよい。その他の例も同様に可能である。
【００６８】
好ましい実施形態では、該方法は、構造モチーフ内の元の側鎖立体配座を回復させるステップと、反復的なフォールディング設計を数サイクル（少なくとも１、３、４、５、６、７、８、９、１０サイクルまたはそれ以上）実施するステップとをさらに含む。この実施形態では、構造モチーフの元の側鎖立体配座のうち一部または全部が回復され、数回の反復的設計および全原子最適化の全体にわたって固定状態に保持される。構造モチーフ上のいくつかの部位は残基を他のアミノ酸に変更することが許容されうる。例えば、１つの実施形態では、構造モチーフ上の部位は、元の側鎖が機能に直接寄与しない（例えば、抗体または小分子またはＤＮＡもしくはＲＮＡなどの結合パートナーと直接接触せず、かつ化学反応を触媒しない）場合、また、その部位の他の側鎖がフォールディングされたスカフォールドの他の部分と直接接触可能であり、その意味で構造モチーフの立体配座安定化およびスカフォールドの熱安定性に寄与しうる場合に、残基を２０種のアミノ酸のうちの任意のものに変更することが許容されるであろう。フォールディング段階で生成されたモデルは、典型的には、構造全体にわたる局所的な主鎖最適化と対をなす数回の配列設計に供される。一般的でありかつタンパク質設計分野の当業者に良く知られているように、構造モチーフの外側の残基は２０種のアミノ酸のうちいずれにも変更が許容されるが、ユーザはある部位について許容されるアミノ酸を制限することもできる。例えば、設計されるタンパク質について細胞外環境のような酸化環境での使用が意図される場合、ユーザはシステイン残基の包含を不可とすることに決めてもよい。１つの実施形態では、ＦＦＬ設計法のユーザは、全原子設計がいくつ作出されるべきかを決定することができる。例えば、合理的な数は１００００であるが、より少数または多数の設計が適切な場合もある。該方法は、１つ以上のスコアフィルタ（例えば、全原子スコア、パッキング、埋没した不飽和の極性原子または他のフィルタなど）を使用するステップと、手動の検証のための望ましい（例えば、指定された基準に基づいた）設計を選択するステップとをさらに含みうる。検証のための設計の数はユーザが決定することができる。例えば、ユーザは５０個の設計を検証することができるが、当業者であれば、ユーザによって検証される設計の数は５０個より少なくても多くてもよいことを認識するであろう。
【００６９】
別の実施形態では、該方法はさらに、１つ以上の構造上の特徴、例えば、必ずしも限定するものではないが、ＲＯＳＥＴＴＡ（商標）エネルギー、ラマチャンドラン・スコア、埋没した不飽和の主鎖原子の数、およびコアパッキングによる設計をフィルタリングするステップも含むことができる。この実施形態では、設計されたモデル（典型的には１００００）の最終的なプールは上記の構造上の基準によってフィルタリングおよびランク付けされる。
【００７０】
さらに別の実施形態では、該方法は、最初のトポロジーの表面残基（標的結合部位ではない）を、例えば、疎水性残基のクラスターが存在する場合に該クラスターを除去するために再設計するステップをさらに含むことができる。該方法はさらに、タンパク質コアの選択部位の構造を、例えば、過剰に存在する残基の変異、パッキングの改善、および、埋没した極性アミノ酸の除去のうち少なくともいずれかを行うために再設計するステップをさらに含むこともできる。１つの実施形態では、再設計ステップの後に全原子の最適化ステップが行われうる。いくつかの実施形態では、該方法は、エネルギー、パッキングおよび目視による検証に基づいて追加のフィルタリングステップを含むことができる。該方法は、異なるポリペプチド設計の間にアミノ酸部位の類似性を与えることができる、構造モチーフの外側のスカフォールド表面上のアミノ酸のうち一部または全部を標的トポロジーと同じように維持するステップを、さらに含むことができる。
【００７１】
さらに別の実施形態では、該方法は、定義されたポリペプチド構造モチーフ、定義された標的三次元トポロジー、定義された標的三次元トポロジーの領域、同定された延長ポリペプチド鎖、１つ以上の制約、および本明細書中で議論された他の特徴のいずれかのうち少なくともいずれかを表すデータを格納するステップをさらに含むことができる。さらに、該方法は、定義されたポリペプチド構造モチーフ、定義された標的三次元トポロジー、定義された標的三次元トポロジーの領域、および同定がなされたフォールディングされたポリペプチド鎖のうち少なくともいずれかを表すデータを表示するステップを含むことができる。さらになお、該方法は、別のコンピュータデバイスに、定義されたポリペプチド構造モチーフ、定義された標的三次元トポロジー、定義された標的三次元トポロジーの領域、および同定がなされたフォールディングされたポリペプチド鎖のうち少なくともいずれかを表すデータを送信するステップを含むことができる。
【００７２】
開示された方法を実行するコンピュータデバイスは様々な形態をとることができる。典型的なコンピュータデバイスには、ユーザインタフェース、通信インタフェース、プロセッサ、およびデータ保存記憶装置であっていずれもシステムバス、ネットワーク、または他の接続機構を介して相互に連結されたものが含まれうる。コンピュータデバイスは同様に他の構成要素も含みうる。
【００７３】
ユーザインタフェースは、ユーザのコンピュータデバイスとの対話を容易にするように構成されうる。そのため、ユーザインタフェースは、ユーザとの対話を容易にする様々な構成要素への接続性を備えるかまたは提供することができる。例えば、ユーザインタフェースは、例えばキーボード、マウス、タッチスクリーン、およびマイクロホンのうち少なくともいずれかのような入力構成要素への接続性を備えるかまたは提供することができる。別の例として、ユーザインタフェースは、例えば表示スクリーンおよびスピーカーのうち少なくともいずれか一方のような出力構成要素への接続性を備えるかまたは提供することもできる。さらに別の例として、ユーザインタフェースは、アナログ・デジタル（Ａ‐Ｄ）またはデジタル・アナログ（Ｄ‐Ａ）回路構成のような信号処理構成要素を備えてもよい。他の構成も同様に可能である。
【００７４】
通信インタフェースは別のコンピュータデバイスとの通信を容易にするように構成されうる。この通信を容易にするために、通信インタフェースは様々な形態をとりうる。例えば、通信インタフェースは、イーサネット（登録商標）・インターフェース、シリアルバス・インタフェース（例えばＦｉｒｅｗｉｒｅ、ＵＳＢ  ２．０など）、所望のプロトコールを与える無線通信を容易にするようになされたチップセットおよびアンテナ、および、別のコンピュータデバイスとの有線通信および無線通信のうち少なくともいずれか一方を提供する任意の他のインタフェースのうち少なくともいずれかの形態をとることができる。通信インタフェースはさらに、異なる種類のインタフェースの組み合わせを含むこともできる。他の構成も同様に可能である。
【００７５】
プロセッサは、１つ以上のプロセッサ構成要素、例えば汎用プロセッサ（例えばマイクロプロセッサ）、特定用途向きプロセッサ（例えばＡＳＩＣまたはＤＳＰ）、プログラマブルロジックデバイス（例えばＦＰＧＡ）、または現在既知もしくは将来開発される他のプロセッサ構成要素などを含むことができる。次に、データ保存記憶装置は、１つ以上の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体、例えば揮発性データ記憶媒体（例えば、ＲＡＭ）レジスタ、およびキャッシュのうち少なくともいずれか）、または不揮発性データ記憶媒体（例えば、ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、フラッシュメモリ、光記憶装置デバイス、およびフロッピーディスクのうち少なくともいずれか）を含むことができる。いくつかの記憶媒体は、全体または一部がプロセッサと一体化していてもよい。さらに、いくつかの記憶媒体は、コンピュータデバイスへの外付け式および着脱式のうち少なくともいずれか一方であってよく、その場合、そのような記憶媒体は、様々な様式で（例えば周辺装置インタフェースおよび通信インタフェースのうち少なくともいずれか一方を介して）コンピュータデバイスと連動することができる。データ保存記憶装置は（ｉ）プログラム論理および（ｉｉ）プログラムデータを含有し、これらはデータ保存記憶装置内に別々に維持されてもよいし、一緒に維持されてもよい。
【００７６】
プログラム論理は、好ましくは、開示されたポリペプチドスカフォールド設計方法に従って機能を実行するための、プロセッサのような処理装置により実行可能であり、かつ／または説明可能である機械語命令を含む。次に、プログラムデータは、開示されたポリペプチドスカフォールド設計方法に関連してプロセッサにより使用されうるデータ、例えば、定義されたポリペプチド構造モチーフ、定義された標的三次元トポロジー、定義された標的三次元トポロジーの領域、同定がなされたフォールディングされたポリペプチド鎖、１つ以上の制約、およびユーザ定義の閾値のうち少なくともいずれかを表すデータを含有することができる。
【００７７】
該方法は、最初のトポロジーの表面残基（標的結合部位ではない）を、例えば、疎水性残基のクラスターが存在する場合に該クラスターを除去するために再設計するステップをさらに含むことができる。該方法はさらに、タンパク質コア中の選択部位の構造を、例えば、過剰に存在する残基の変異、パッキングの改善、および、埋没した極性アミノ酸の除去のうち少なくともいずれかを行うために再設計するステップをさらに含むこともできる。１つの実施形態では、再設計ステップの後に全原子の最適化ステップが行われうる。いくつかの実施形態では、該方法は、エネルギー、パッキングおよび目視による検証に基づいて追加のフィルタリングステップを含むことができる。
【００７８】
別の態様では、本発明は、コンピュータデバイスに本発明のコンピュータ計算方法を実行させるための命令一式を含む、非一時的な機械可読記憶媒体を提供する。この態様では、本発明は、ポリペプチドスカフォールドを設計するための自動化されたコンピュータ計算方法のステップをプロセッサに実行させるための命令を含む、機械可読記憶媒体を提供する。本明細書中で使用されるように、用語「コンピュータ可読記憶媒体」には、磁気ディスク、光ディスク、有機メモリ、およびＣＰＵにより読取可能な任意の他の揮発性（例えばランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」））または不揮発性（例えば読み出し専用メモリ（「ＲＯＭ」））の大容量記憶システムが含まれる。コンピュータ可読媒体には、協調型（cooperating）または相互接続型（interconnected）のコンピュータ可読媒体が含まれ、該媒体は該処理システムにのみ存在してもよいし、該処理システムに対してローカル接続な場合も遠隔接続な場合もある多数の相互接続型処理システムの中に分布してもよい。
【００７９】
本明細書中で引用された参照文献はすべて、参照により組込まれる。本開示の態様は、必要な場合には、本開示のさらに別の実施形態を提供するために、上記参照文献および出願のシステム、機能および概念を使用するための修正がなされることも可能である。上記およびその他の変更は、詳細な説明を考慮して本開示に対して行うことができる。
【００８０】
本開示の実施形態についての説明は、網羅的であることも、本開示内容を開示された正確な形態に限定するようにも意図されない。本開示の特定の実施形態、および本開示の実施例は、例示目的で本明細書中に記載されているが、当業者であれば認識するように、様々な等価な修正が本開示の範囲内で可能である。
【００８１】
先述の実施形態のうちいずれの特定の要素も、組み合わされてもよいし、または他の実施形態の要素の代替とされてもよい。更に、本開示のある実施形態に伴う利点はこれらの実施形態に関連して記載されているが、他の実施形態がそのような利点を示すことも可能であり、また本開示の範囲内にあるためにすべての実施形態が必ずそのような利点を示す必要があるとも限らない。
【００８２】
実施例１
フォールド・フロム・ループス（Fold From Loops）
ＦＦＬプロトコールはＲＯＳＥＴＴＡ（商標）ソフトウェア・パッケージに実装された。ＦＦＬプロトコールは、始動時の入力として構造モチーフおよびフォールディングされるべき標的トポロジーのｐｄｂファイルを必要とする（図１）。ここでは、入力された構造モチーフは、モタビズマブのＦａｂ部分との複合体で結晶化されたＲＳＶペプチド‐エピトープであった（ＰＤＢｉｄ  ３ＩＸＴ）。３ヘリックス束の標的トポロジーは、次の基準すなわち：ヘリックス束にヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフが存在すること；テンプレートの標的トポロジーとして使用されるタンパク質の熱安定性が高いこと、に基づいて選択された。ＦＦＬプロトコールは２つの主要な段階すなわち：Ｉ）大規模な立体配座サンプリングを用いる低解像度段階と、ＩＩ）配列設計および限定された立体配座サンプリングの反復を用いる全原子の段階とに分けられる。
【００８３】
低解像度の立体配座サンプリング
延長ポリペプチド鎖を入力モチーフの終点に付加し、残基の総数をテンプレートトポロジーの残基総数と一致させた。入力モチーフが挿入されるトポロジーの残基はループ・ファイルを通じて定義され、入力モチーフの位置から、付加するポリペプチド鎖の長さが決定された。この低解像度段階では、ポリペプチド鎖の表現は粗雑であり、主鎖の原子のみが明示的に表現され、側鎖は球体として表現された。
【００８４】
この段階で行われた立体配座サンプリングは、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ａｂｉｎｉｔｉｏ型プロトコールで実施された。ａｂｉｎｉｔｉｏプロトコールは、一連の大量の既知タンパク質構造から抽出されたフラグメントの挿入を利用する。使用されたフラグメントは、提供された配列およびその二次構造予測によってフラグメント・ライブラリーを構築するプログラムＮＮＭＡＫＥ（商標）を用いて収集された。ここで記載される設計作業については、フラグメントはテンプレートの配列に由来するものであった。
【００８５】
任意選択で、フォールディング軌道を標的トポロジーの軌道に類似した構造物となるようにバイアスするために、標的トポロジーからＣα制約が抽出され［ロール（Rohl）ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、２００４年、第３８３巻］、スコアリング項（scoring term）として全体的なスコアリング関数（scoring function）に組み込まれた。距離制約を組み込むＲｏｓｅｔｔａ（商標）フォールディングプロトコールは、ロール（Rohl）らによって既に説明されている。残基間の距離は、配列上の離隔が６より大きい場合、ならびにいずれの残基も５残基上流および下流を含む機能部位の範囲の外側にある場合に、収集された。ここで記載された設計については、テンプレートのタンパク質から抽出された各Ｃα‐Ｃα距離について３Åの標準偏差が許容された。
【００８６】
一般に、サンプリング段階全体を通じて入力モチーフの主鎖二面角には手を付けなかったが、それにもかかわらず、アルゴリズム実装は該モチーフの終点を移動可能なものとして設定することを許容する。入力モチーフ内の上記自由度を許容するべき論理的根拠は、入力モチーフと残りのタンパク質との間の円滑な構造変換に有利に働くということである。
【００８７】
全原子の配列設計および構造最適化
大きな立体配座空間が調査される低解像度段階の後、生成されたモデルは、天然のトポロジーの座標に対する該モデルのＲＭＳＤに従ってフィルタリングされた。ここでは、５ÅのＲＭＳＤ閾値が使用されて、標的トポロジーと構造的に近いモデルが配列設計段階に移され、モデルが規定の閾値を上回る場合、該モデルは自動的に廃棄された。入力モチーフ由来の元の側鎖立体配座が回復され、全原子段階の全体にわたって固定された。
【００８８】
初期設定により、配列設計段階では、入力された機能モチーフを除いたモデルのすべての残基において１９個のアミノ酸（システインは除外）が許容された。システインの除外は必須ではない。一般に、ジスルフィド結合が設計されている場合を除いてシステインは免疫原の設計には使用されないが、これは、免疫原が酸化性の細胞外環境を対象としており、従って細胞外環境において対をなしていないシステインは他のシステインと対をなすことによりジスルフィドを形成しやすいからである。細胞内での適用に関するタンパク質設計については、対をなしていないシステインは完全に許容可能である。この段階でも、特定の残基部位において許容されるアミノ酸が何であるかをより詳細に管理するために追加のオプションが行われた。ここで説明されたＦＦＬ設計では、入力モチーフのいくつかの部位は抗体接触面の一部ではなく、したがってタンパク質コアの一部を構成したが、いくつかのシミュレーションでは、この接触をなさない側鎖については変更が許容された。
【００８９】
配列設計の各ステップの後、局所の立体配座空間の調査を確実に行いながら全原子の精密化（緩和（relax））のステップが実施された。この緩和プロトコールは、小さな主鎖の摂動と、側鎖の再パッキングと、エネルギーの最小化とを１ラウンドとした数ラウンドで構成されている。
【００９０】
反復的な配列設計および構造の最小化のサイクルは、３回繰り返された。サイクル数はユーザにより調整可能である。
設計の選択
品質フィルタ
典型的には１０，０００個の設計物が各ＦＦＬの実行によって生成され、適用される最初のフィルタはＲｏｓｅｔｔａ（商標）全原子エネルギーに基づき、ＲｏｓｅｔｔａＥｎｅｒｇｙ（商標）による最良の５０個の設計についてさらに検討がなされた。次に、最良の構造的特徴を備えた設計物を選択するために複合フィルタが適用された。検討された構造的特徴は、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）において実装されるようなラマチャンドラン・スコア；水素結合に関与しない埋没した極性原子の数；および、ＲｏｓｅｔｔａＨｏｌｅｓ（商標）アルゴリズムによるコアパッキング判定であった。この３つの特徴による上位２５個以内の設計モデルが次の段階に移行された。
【００９１】
いくつかの設計は、モデルの幾何学的特性、特にヘリックスの屈曲角度に基づいて選択された。ヘリックス束を構成する各ヘリックスの屈曲角度の統計量は、ソフトウェアＨｅｌａｎａｌ（商標）を用いて収集された。最も小さい平均屈曲角度を備えた束が次の段階のために選択された。
【００９２】
ＦＦＬ後の設計
Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数の長期にわたり認識されてきた問題点は、周知のとおり溶媒に曝露される残基を正確に設計する能力がないことであり、考えられる原因の１つは適切な静電学的パラメータ化の不在に関係している。この既知の問題点を回避するために、ＦＦＬ後の設計の第１のステップでは、溶媒に曝露される部位にテンプレートトポロジーとして使用されるタンパク質の残基と同一の残基を定めた。
【００９３】
次に、手動設計および全原子精密化のステップが、コアパッキングの瑕疵を修正してコアから極性アミノ酸を取り除くために使用された。手動設計は、設計物のコア内における極性残基（特にヒスチジン）の存在；ならびに、テンプレートトポロジーと比較してアラニンが過剰でありかつバリンが不足している自動段階直後の設計を修正するために実施される。アラニンの高頻出は、所定の主鎖二面角におけるあるアミノ酸を見出す確率を表すエネルギー項（ラマチャンドラン項（Ramachandran term））に関係している可能性がある。多くがヘリックス状であるＦＦＬタンパク質を前提とすると、ラマチャンドラン項はアラニンの存在を好み、バリンまたはβ分岐側鎖を備えたアミノ酸の存在を嫌うことになる。別の潜在的な有力要因は、部位によってはアラニンより大きなアミノ酸に適合することを許容できない可能性のあるヘリックスの基端側の配置構成である。
【００９４】
反復的な設計手順の性質を考慮すると、生成されるモデルはコア内の突然変異に対して極めて許容度が低かった。従って、手動の設計段階では、突然変異により立体化学的衝突が導入され、全原子のエネルギーの正確な評価には精密化ステップが必要であった。精密化は実施された手動の突然変異に対するフィルタリングステップとしての役割も果たした。その理由は、所与の１つまたは一連の突然変異が、局所のヘリックス構造に大きな歪みを引き起こすことなく全原子のエネルギーが著しく回復する場合にのみ許容されたためである。実験的特性解析のために選択された設計物のうち１つ（ＦＦＬ＿００１）は、コア内で実施される手動の変更を伴わない純粋なＦＦＬ設計物であった。このポリペプチドは熱力学的に安定であり、対象とする抗体に高い親和性で結合した。
【００９５】
実験的特性解析のために選択された設計物は、相互に比較すると６〜４８個の突然変異がある点で異なっていた。元のテンプレートの配列と比較すると、設計物は５１〜５９個の突然変異を示した。ＦＦＬ設計物および元のテンプレートの配列の配列アラインメントを図３に示す。
【００９６】
設計されたモデル内の主鎖ｒｍｓｄは０．５３〜３．０６Åであり、設計物を当初のテンプレートの座標と比較した場合は１．８３〜２．９１であった。
設計の最小化
ＦＦＬ設計物の大きさをさらに縮小するために、ｍｏｔａエピトープと接触しないタンパク質セグメントが除去された。
【００９７】
実験方法
発現および精製
非標識タンパク質
スカフォールド構築物をコードするＤＮＡセグメントは、コドン使用を最適化してＲＮＡ構造物（コドン・デバイス（Codon Devices）、ジェンスクリプト社（Genscript Corp.））を用いて合成され、ｐＥＴ２９（イー・エム・ディー・バイオサイエンシズ（EMD Biosciences））にサブクローニングされ、ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ（商標）大腸菌（インビトロジェン（Invitrogen））の形質転換に用いられた。単一コロニーは、１０ｍＬのルリア・ブロス（ＬＢ）＋カナマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）中にて３７℃で一晩増殖させた。このスタータカルチャーが１ＬのＬＢ＋カナマイシンへと拡大され、３７℃でインキュベートされた。細胞が対数増殖期に達した時、２５０μＭのＩＰＴＧを培養物に添加してタンパク質発現を誘導し、次いで細胞を１２℃で一晩インキュベートした。その後、培養物をペレット化してスタートバッファー（１６０ｍＭイミダゾール、４Ｍ塩化ナトリウム、１６０ｍＭリン酸ナトリウム）中に再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤タブレット（ノバジェン（Novagen））を添加して該細胞懸濁液を−２０℃で冷凍した。
【００９８】
細胞懸濁液を解凍し、細胞を溶解するために１０ｍｌの１０×Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）（ノバジェン（Novagen））、５０μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼおよび１．７μＬのｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（ノバジェン（Novagen））を添加した。次いで該細胞懸濁液をオービタルシェーカーで２０分間穏やかに転倒混和した。溶解された細胞をペレット化し、上清を０．２２μｍのフィルタ（ミリポア（Millipore））を通してろ過した。上清を、５ｍＬのＮｉ＋＋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ジー・イー・ヘルスケア（GE Healthcare））とともに４℃で１時間転倒混和した。樹脂を３０ｍＬの洗浄バッファー（５０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１６０ｍＭリン酸ナトリウム）で３回洗浄し、２０ｍＬの溶出バッファー（２５０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭリン酸ナトリウム）で溶出させた。対象とする構築物を含有するフラクションを合わせ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５  １６／６０（ジー・イー・ヘルスケア（GE Healthcare））における分離用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によりＨＢＳ中で室温にてさらに精製した。収集されたフラクションを４〜１２％ＳＤＳ変性ゲル（インビトロジェン（Invitrogen））で分析し、陽性のフラクションを合わせて限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）、バイオエクスプレス（Bioexpress））により濃縮した。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収シグナルを測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標））し、理論上の吸光係数から計算することによりタンパク質濃度が決定された。迅速かつ正確なタンパク質定量を容易にするために、一次配列中にトリプトファンを含まないすべての設計物にＧＳＷ配列が付加された。
【００９９】
低エンドトキシンタンパク質
免疫研究用の低エンドトキシンのタンパク質を調製するために、細菌のペレットを界面活性剤バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．５ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１１４）中に別途再懸濁し、また別途Ｎｉ＋＋樹脂を、１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１１４で最初に洗浄した。
【０１００】
Ｎ１５標識タンパク質
ＦＦＬ＿００１、ＦＦＬ＿００５、ＦＦＬ＿００６およびＦＦＬ＿００７のアイソトープ標識試料を、１ｇ／Ｌの１５Ｎ塩化アンモニウムを補足したＭＯＰＳ最小培地で増殖させた。このスタータカルチャーは１ＬのＭＯＰＳに拡大され、３７℃で一晩インキュベートされた。増殖を継続するために３ｍｌの４０％  １５Ｎグルコースを添加し、ＯＤλ＝６００に到達した時、タンパク質発現を誘導するために２５０μＭのＩＰＴＧを培養物に添加し、次いで細胞を１６℃で一晩インキュベートした。
【０１０１】
光散乱法
精製されたタンパク質の単分散度および分子量を、静的光散乱デバイス（ｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ（登録商標）、ワイアット（Wyatt））にインライン接続されたＨＰＬＣ（アジレント（Agilent）、１２００系）よってさらに測定した。１００μｌの１〜２ｍｇ／ｍＬタンパク質試料が使用され、収集データはＡＳＴＲＡ（商標）ソフトウェア（ワイアット（Wyatt））で解析した。
【０１０２】
円偏光二色性
溶液の熱安定性（Ｔｍ）は、アビブ（Aviv）６２Ａ  ＤＳ分光計における円偏光二色性（ＣＤ）によって測定された。１５〜２５μＭのタンパク質の遠紫外線波長スキャン（１９０〜２６０ｎｍ）が、１ｍｍ路程のキュベットで収集された。温度により誘発されたタンパク質変性が、２１０ｎｍにおける楕円率の変化により追跡測定された。実験は１〜９９度の温度範囲にわたって３分おきに２℃刻みで実施され、得られたデータは平均残基楕円率に変換されて二状態モデルにフィッティングされた。
【０１０３】
ＮＭＲ
ＮＭＲ試料は、２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、および９０％Ｈ２Ｏ／１０％Ｄ２Ｏ中に５００ｕＭの濃度で調製された。ＦＦＬ＿００１、ＦＦＬ＿００５、ＦＦＬ＿００６およびＦＦＬ＿００７のＨＳＱＣスペクトルは、アクティブシールドされたｚ‐グラジエント三重共鳴ｃｒｙｏ‐ｐｒｏｂｅが装備されたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ（商標）６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器で記録された。スペクトルはすべて２５℃で記録された。スペクトルは、ＮＭＲＰｉｐｅ（商標）およびＮＭＲＶｉｅｗ（商標）を使用して処理された（１、２）。
【０１０４】
表面プラズモン共鳴
実験はすべて、送液バッファーとしてＨＢＳＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）サーファクタントＰ２０（Surfactant P20））（ジー・イー・ヘルスケア（GE Healthcare））を用いて２５℃でＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（ジー・イー・ヘルスケア（GE Healthcare））において実行された。結合解析については、２００〜５００レスポンスユニット（response unit：ＲＵ）のモタビズマブＩｇＧが、アミンで連結された８０００〜９０００ＲＵのマウス抗ヒトＩｇＧ（ヒト抗体捕捉キット（Human Antibody Capture kit）、ジー・イー・ヘルスケア（GE Healthcare））を含有するＣＭ５センサチップ上に捕捉された。この表面上に、様々なタンパク質濃度の試料が流速５０〜１００μｌ／分にて二連で注入された。必要に応じ、流速１０μｌ／分での３Ｍ  ＭｇＣｌ２の２回の６０秒間注入により、表面の再生が実施された。１つのフローセルは抗ヒトＩｇＧのみを含み、そのアナライトとの相互作用がリファレンスとして使用された。別法として、エピトープがセンサチップにアミンでカップリングされ、Ｍｏｔａ  Ｆａｂが上述と同じ流速で注入される別の様式が使用された。
【０１０５】
データの準備および解析は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０（バイオロジック・ソフトウェア（BioLogic Software））を使用して実施された。動態解析については、バイオセンサ・データは、マストランスポートリミテーション影響下の単純な二分子結合モデル：
【０１０６】
【数１】
0006023061.tif 000002
（上記式中、Ａ０は注入されたアナライトを表す）に対してグローバルフィッティングされた。
【０１０７】
実施例１の結果
モタビズマブに結合したＲＳＶ  Ｆの部位Ａペプチドの構造を、スカフォールディング（scaffolding）のための標的結合部位として使用した。（図２）このペプチド構造（ＰＤＢＩＤ：３ＩＸＴのＰ鎖）はヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフであり、このことは、本発明者らが３ヘリックス束を上記スカフォールドの標的トポロジーとして選択するように導いた。ＰＤＢＩＤ：３ＬＨＰ（Ｓ鎖）の構造が特定の３ヘリックス束として選択された。ＦＦＬ設計の手順の詳細は表１に示されている。ＦＦＬシミュレーションに使用される種々のパラメータおよびフィルタリング基準が概説されている。手動での介入段階も、実施されるコア突然変異の数、設計物の初期のＲｏｓｅｔｔａエネルギーならびに突然変異および全原子精密化ステップ後のＲｏｓｅｔｔａエネルギーに関連して概説されている。
【０１０８】
【表１】
0006023061.tif 000003
７個のスカフォールドがフォールド・フロム・ループス（Fold From Loops）法を使用して設計され（表２）、該スカフォールドの配列は、３ＬＨＰ由来のテンプレートの３ヘリックス束「Ｔ９３」の配列と共に図３に示されている。
【０１０９】
【表２】
0006023061.tif 000004
設計された配列は互いに８〜４２個の突然変異で異なっている。コンピュータ計算モデルの構造多様性は互いに０．５３Å〜３．０６Åの間で異なっている。
【０１１０】
発現および溶解度を評価するために、組換えタンパク質を大腸菌で発現させた。これら７個の設計バリアントは可溶性であり、金属親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ＋＋）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）のステップを通じて精製可能であり、発現収量は３〜５ｍｇ  Ｌ−１の範囲であった。溶液中でのオリゴマー化状態を評価するために、７個の可溶性設計物をＳＥＣおよび静的光散乱法によって解析した（図４）。６個の設計物は単分散であり、モノマータンパク質に相当するみかけの分子量を示す（約１５ｋＤａ）。設計された分子のフォールディングおよび熱安定性を評価するために、本発明者らは円偏光二色性分光法（ＣＤ）を実施した（図５）。６個のモノマー設計物は、適切にフォールディングされたヘリックス状タンパク質の典型的なＣＤスペクトルを示した。温度誘発性の変性の後のＣＤから、設計物の安定性が４８℃から１００℃超まで及ぶことが示された（表３）。機能部位（ｍｏｔａエピトープ）が忠実に再形成されたか否かを試験するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験によって結合親和性が評価された（図６）。結合定数（ＫＤ）は３０〜６５２ｐＭの範囲内であった。（表３を参照）スカフォールドはｂｉａｃｏｒｅチップにカップリングされ、モタビズマブがアナライトとして使用された。結合相互作用は、ＲＳＶに関して同じ効果を有することが以前に報告されているエピトープ領域（Ｋ２８Ｅ）の点突然変異によって容易に阻止され、したがって、結合特異性がエピトープを対象にしていることが示された（図７）。
【０１１１】
最良のＦＦＬ設計物により示された親和性は、ペプチドエピトープについて過去に公表されたＫＤ（２００ｎＭ）をおよそ７０００倍上回る向上に相当する。最近では、他の異種スカフォールドにＲＳＶエピトープを移植するため側鎖グラフト戦略が利用された（マクレラン（McLellan）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）、２０１１年、第４０９巻、ｐ．８５３−８６６）。その研究では、親和性の最も高い設計物はｍｏｔａ抗体に対して６０ｎＭのＫＤを示した。したがって、ＦＦＬ設計物は、マクレランらの結果をおよそ２０００倍上回るＫＤを有していた。
【０１１２】
設計された分子の溶液挙動および構造特性のオルトゴナル（orthogonal）な特性解析を得るために、１５Ｎ‐１Ｈ異核種単一量子コヒーレンス（ＨＳＱＣ）スペクトルが収集された。これらのスペクトルは、明確に画成された球状の折りたたみ構造（図示せず）を備えたタンパク質に典型的な良好なピーク分散を示した。本発明者らのコンピュータ計算設計の精度をさらに評価するために、ＦＦＬ＿００５のＸ線構造が解明された。コンピュータ計算モデルおよびＦＦＬ＿００５の結晶構造（図示せず）はほぼ一致しており（主鎖原子に関して１．７Å  ｒｍｓｄ）、所望の構造モチーフおよび三次元構造を備えたポリペプチドを設計するためのコンピュータ計算方法の妥当性を実証していた。更に、ＦＦＬ＿００５の結晶構造内のＭｏｔａエピトープの立体配座は、０．５Åのｒｍｓｄを備えたＰＤＢ：３ｉｘｔ由来のＭｏｔａ結合ペプチドの立体配座と一致し、ＦＦＬ法がフォールディング核として使用される構造モチーフの立体配座を安定化することができるという主張が支持された。
【０１１３】
これらの研究は、分子の機能部分と熱力学的安定性とを同時に最適化するためにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのフォールディングプロセスと配列設計とをカップリングすることによる、新規な機能タンパク質作出の成功を実証している。記載されたコンピュータ計算戦略は一般的であって融通性を有し、よって標的トポロジーが天然に存在するタンパク質であることは必要とされず、簡単に算出できるトポロジーを機能性タンパク質の設計に使用することも可能となっている。機能部位の構造の複雑さに関して、ＦＦＬアルゴリズムは、天然に存在するタンパク質の機能部位において通常必要とされる複数の主鎖セグメントによって構成された非連続的モチーフを処理するように適合されている。これらの結果は、機能タンパク質のコンピュータ設計および既存のタンパク質構造の潜在的テンプレートとしての使用について幅広い影響力を有する。
【０１１４】
【表３】
0006023061.tif 000005
実施例２
エピトープに対する免疫応答を向上させるために、ＦＦＬ＿００１スカフォールドはＨｅｐＢｃＡｇ粒子の表面にコンジュゲートされた。該スカフォールドは、スカフォールド中のエピトープに対向する端部に遺伝子工学的に導入されたシステインと、ＨｅｐＢｃＡｇの主要な免疫優性領域の先端上に遺伝子工学的に導入されたリジンとの間のヘテロ二機能性の架橋剤を介してコンジュゲートされた。これにより、該スカフォールドは、エピトープがコンジュゲート粒子の径方向に外側の面に露出するように配向された。
【０１１５】
細菌における高発現をもたらし、かつ２４０個のＨｅｐＢｃＡｇモノマーを備えた大きなＴ＝４粒子を優勢とする構築物であるＨＢｃＡｇ残基１〜１４９由来の粒子（ズロトニック（Zlotnick）ら、１９９６年；ウィン（Wynne）ら、１９９９年）が、大腸菌で発現されて標準的なショ糖勾配法によって精製された。モノマーのＦＦＬ免疫原の化学的カップリングについては、純粋なリジンで官能化されたＨＢｃＡｇ（１‐１４９）粒子が、標準的な技法を使用して発現および精製され、その技法ではリジン残基がサブユニットごとの免疫優性スパイクの先端に遺伝子工学的に導入された。ＨＢｃＡｇ（１‐１４９）のＷＴ粒子およびリジン官能化粒子はいずれも普通サイズ（３０ｎｍ）であった。（図８）
ＦＦＬ＿００１スカフォールドおよびＨｅｐＢｃＡＧのコンジュゲーションは、１０％ショ糖および１％ＣＨＡＰＳを使用して標準的な条件下で実行され、その結果、ショ糖勾配超遠心分離の精製フラクションについて行われたＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの密度計測分析によれば、各ＨｅｐＢ粒子におよそ７５個のＦＦＬ＿００１スカフォールドが取り付けられた。該ＦＦＬ＿００１コンジュゲート粒子へのＭｏｔａの結合については、Ｍｏｔａ  ＩｇＧをセンサチップ上に捕捉し、次いでＭｏｔａ  ＩｇＧでコーティングされた表面にＦＦＬ＿００１粒子を結合させることによるＳＰＲで評価され、続いてＭｏｔａ  Ｆａｂをアナライトとして使用し、Ｍｏｔａ‐ＩｇＧに捕捉されたＦＦＬ＿００１粒子へのＭｏｔａ  Ｆａｂの結合の動態を評価した。このようにして、ＦＦＬ＿００１コンジュゲート粒子がＦＦＬ＿００１モノマーと同様の高い親和性でＭｏｔａに結合することが確認された（データは示さない）。
【０１１６】
表４は、ＦＦＬスカフォールドモノマーおよびＦＦＬ＿００１コンジュゲートＨｅｐＢｃＡｇ粒子を用いたマカク免疫実験の結果を概括している。免疫原は、「００１」、「００５」および「００７」とラベルされたスカフォールドモノマー、ならびに「００１‐粒子」とラベルされたＦＦＬ＿００１コンジュゲートＨｅｐＢｃＡｇ粒子であった。アカゲザル（１つの免疫原当たり４頭）は、筋肉内経路で０、１および２か月の時点で免疫された。動物には、Ａｄｊｕｐｌｅｘ（商標）アジュバントと混合された全体積１ｍＬの抗原を、両腕に０．５ｍＬずつ注入した。初回の免疫処置は合計２００ｕｇのスカフォールドを含み、その後の免疫処置は合計１００ｕｇのスカフォールドを含んでいた。「ナイーブ」血清は、初回免疫前の第０日に各動物から採取された。「Ｉｍｍ３」血清は、３回目の免疫処置の２週間後に各動物から採取された。「ナイーブ」および「Ｉｍｍ３」のいずれの血清も、１：２０に希釈されて標準的なプラーク減少アッセイで中和について評価された。試料はそれぞれ二連で実施された（２回の個々の実施についての計数値は「ナイーブ１」、「ナイーブ２」、「Ｉｍｍ３＿１」および「Ｉｍｍ３＿２」として示されている）。平均プラーク計数値「ナイーブ＿ａｖｅ」および「Ｉｍｍ３＿ａｖｅ」は２回の実施から計算された。プラーク減少率（％）は、（ナイーブ＿ａｖｅ−Ｉｍｍ３＿ａｖｅ）／ナイーブ＿ａｖｅとして算出された。血清は組換えＲＳＶＦタンパク質へのＥＬＩＳＡ反応性についても試験された。各動物についてのエンドポイント力価が示されている。プラーク減少率（％）の数値はＥＬＩＳＡ力価との緩やかな直線相関を示し、ピアソンの係数は０．５８である。
【０１１７】
これらのデータは、ＦＦＬスカフォールドモノマーまたはＨｅｐＢｃＡｇ粒子上に提示されたＦＦＬスカフォールドを用いたマカクの免疫がＲＳＶＦ結合抗体およびＲＳＶ中和抗体の産生をもたらしうることを実証している。中和率（％）（プラーク減少率（％））は、粒子に提示されたスカフォールドについては８８％、モノマースカフォールドについては７２％であった。ＶＬＰに提示されたスカフォールドについての平均プラーク減少率（％）は５１±２５％であり、これはいずれのモノマー試料の平均よりも高かった（モノマー試料についての最も高いプラーク減少率（％）はＦＦＬ＿００１モノマーの３３±１１％である）。粒子‐００１をモノマー‐００１と比較した平均プラーク減少率（％）の差は統計的に有意ではなかった。平均ＲＳＶＦ  ＥＬＩＳＡ力価も、最も高い力価のモノマー試料（ＦＦＬ＿００１について７９０００±６６０００）と比較して粒子‐００１試料（９４０００±２００００）は高かったが、これもその差は統計的に有意ではなかった。
【０１１８】
【表４】
0006023061.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006023061.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図８】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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