(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に共有結合したシチジン−一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）の製造方法であって、該方法が、以下：
（ｉ）該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；
（ii）該陰イオン交換媒体から該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを溶出することにより、該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む溶出画分を生成すること；及び
（iii）該溶出画分を脱塩すること
を含み、
ここで、該方法は、工程（ｉ）の前の限外濾過を含まず、
これによって、該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡが生成され、
ここで、工程（ii）で、重炭酸緩衝液を用いる該陰イオン交換媒体からの溶出が、３０ｍＭ未満の重炭酸緩衝液による溶出、次いで、３０ｍＭの重炭酸緩衝液による１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡの溶出、次いで３０ｍＭより高い重炭酸緩衝液による溶出を用いて行われる、方法。
【請求項２】
該反応混合物が、５mS/cm未満の塩導電率を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該陰イオン交換媒体が、第４級アンモニウム樹脂及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂から選択されるメンバーである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
該陰イオン交換媒体が、第４級アンモニウム樹脂の重炭酸塩型である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該陰イオン交換媒体が、Ｑ−セファロース樹脂である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
該脱塩が、膜濾過を用いて達成される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
該膜濾過が、接線流濾過（ＴＦＦ）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該膜濾過が、該溶出画分の容量を減少させる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該膜濾過により、該膜濾過前の塩導電率に比較して該溶出画分の該塩導電率が低下する、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
該溶出画分の該低下した塩導電率が、１０μS/cm〜２００μS/cmの間である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該溶出画分の該低下した塩導電率が、５０μS/cm未満である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｉ）の前に、更に
（iv）該混合物の容量を減少させること
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
該減少が、回転蒸発を利用して達成される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
更に
（ｖ）該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む該溶出画分を凍結乾燥又は噴霧乾燥に付すこと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡが、直鎖状又は分岐状ポリ（エチレングリコール）残基に共有結合したシチジン−モノホスホ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
該分岐ポリ（エチレングリコール）残基が、グリセロール基本骨格を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡが、下記：
【化２２】
0005876649.tif 000035
［式中、
各ｎは、２００〜５００から独立に選択される整数であり；
各Ｑは、Ｈ、負電荷及び塩の対イオンから独立に選択されるメンバーであり；そして
各Ｑ１は、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルから独立に選択されるメンバーである］から選択されるメンバーである、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
該方法が、８０％〜１００％（w/w）の間の純度で該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを与える、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
該方法が、５０％〜９０％（w/w）の全収率で該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを与える、請求項１〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉ）の前に、更に
（vii）第１級アミノ基を含むＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを、活性化１０〜４０ｋＤａのＰＥＧ残基と、該ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンのアミノ基と該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧ残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること
を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧ残基が、ｐ−ニトロフェニルカーボネート残基を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンと該ＰＥＧ試薬とが、８．０〜８．８の間のｐＨを有する水性溶媒の存在下で接触する、請求項２０又は２１記載の方法。
【請求項２３】
該ＰＥＧ試薬が、ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカーボネートである、請求項２０〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したシチジン−一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）の製造方法であって、該ＰＥＧが、少なくとも１つの直鎖状又は分岐状の１０〜４０ｋＤａのＰＥＧ残基を含み、該方法が、以下：
（ｉ）第１級アミノ基を含むＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを、ｐ−ニトロフェニルカーボネート残基を含む活性化１０〜４０ｋＤａのＰＥＧ残基と、該ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンの該アミノ基と該ＰＥＧ残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること（ここで、該接触は、８．０〜８．８の間のｐＨを有する水性溶媒の存在下で行われ、これによって、該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む反応混合物を生成する）；
（ii）該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む該反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；
（iii）該陰イオン交換媒体から該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを溶出して、該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡを含む溶出画分を生成すること；
（iv）膜濾過を用いて該溶出画分を脱塩すること；及び
（ｖ）該溶出画分から水を除去すること
を含み、
ここで、該方法は、工程（ｉ）の前の限外濾過を含まず、
これによって、該１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡが生成され、
ここで、工程（ii）で、重炭酸緩衝液を用いる該陰イオン交換媒体からの溶出が、３０ｍＭ未満の重炭酸緩衝液による溶出、次いで、３０ｍＭの重炭酸緩衝液による１０〜４０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したＣＭＰ−ＳＡの溶出、次いで３０ｍＭより高い重炭酸緩衝液による溶出を用いて行われる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下で米国仮特許出願第60/943,527号（2007年6月12日出願）、米国仮特許出願第60/968,274号（2007年8月27日出願）、及び米国仮特許出願第60/970,247号（2007年9月5日出願）に対して優先権を主張するが、これらは各々その全体が全ての目的に対して引用例として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、糖残基がポリマー修飾基により修飾されている、糖ヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
酵素触媒反応（例えば、グリコシルトランスフェラーゼを用いる）及び／又は他の合成方法を介して製造されるヌクレオチド糖は、所望の化合物だけでなく、未反応糖、塩、ピルビン酸、リン酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、タンパク質などのような混入物をも包含する、複雑な混合物の形でしばしば得られる。これらの混入物の存在は、多くの下流の用途には望ましくない。副産物は、１種以上のクロマトグラフィー精製工程を用いて典型的には除去される。一般的なクロマトグラフィー法は、逆相クロマトグラフィーである。しかし、逆相クロマトグラフィーは、分離媒体が高価であり、そして充填済みカラムの供給が限られているため、しばしば大規模利用が実現できない。更に、逆相クロマトグラフィーでは、最適な分離及び分割のために典型的には有機溶媒が必要である。ヌクレオチド糖の製造及び複雑な反応混合物からのその単離に有用な、費用効率及び時間効率の高い製造法及び精製方法に対するニーズが存在している。本発明は、このニーズ及び他のニーズに対処する。
【０００４】
発明の要約
本発明は、ポリマー修飾基により修飾されている、ヌクレオチド糖の製造方法（例えば、大規模製造法）を提供する。典型的な修飾基は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）残基のような、ポリ（アルキレンオキシド）残基から選択される、少なくとも１つのポリマー残基を包含する。詳細には、本発明は、修飾シチジン−一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）の製造方法を提供する。本発明の方法を用いて製造することができる、典型的な修飾ヌクレオチド糖は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaを包含する（典型的なＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類については図２を参照のこと）。
【０００５】
修飾ヌクレオチド糖は、例えば、複合糖質化（glycoconjugation）（例えば、糖ＰＥＧ化（GlycoPEGylation））プロセスにおいて使用される。修飾ヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類）の種々の合成方法が報告されている。例えば、2002年10月9日出願のWO 2003/31464、2004年4月9日出願のWO 2004/99231及び2006年11月3日出願のWO 2007/056191を参照のこと（これらの開示は、全ての目的にその全体が引用例として本明細書に取り込まれる）。
【０００６】
修飾ヌクレオチド糖は、反応性官能基（例えば、アミノ基）を取り込んでいるヌクレオチド糖誘導体を、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）カーボネートのような反応性ポリマー試薬と反応させることにより調製することができる。例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaなど）は、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン（ＧＳＣ）を、ｐ−ニトロフェニルカーボネート残基を取り込んでいるＰＥＧ試薬と反応させることにより調製することができる。本実施態様の典型的な合成経路は、図２に略述されている。予期しないことに、本発明者らは、水性溶媒系中の約８．０と約８．８の間のｐＨ範囲が、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）カーボネート（例えば、ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル）とヌクレオチド糖誘導体（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）との間のカップリング反応中には決定的であることを発見した。最適化ｐＨ範囲は、反応相手の加水分解による副産物の生成を大きく減少させ、そして最終生成物の収量及び純度を有意に増大させる。
【０００７】
本発明では、既知の方法に比較するとき、少ない製造工程を含み、純度及び全収率が改善された修飾ヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）を提供するプロセスを記述する。典型的なプロセスは、（ａ）例えば、ＰＥＧベースの不純物を除去するのに有用な、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）を組み込む。陰イオン交換クロマトグラフィーの次に（ｂ）接線流濾過（ＴＦＦ）のような、膜濾過（即ち、限外濾過）を用いる部分精製生成物溶液の脱塩が続く。本発明の代表的なプロセスは図１に図解される。一例を挙げれば、ＴＦＦ工程では、精製される修飾ヌクレオチド糖の分子量よりも有意に小さい分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を持つ膜を用いる。例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaには、約１０kDaと約１kDaの間の分子量カットオフの膜が使用される。本改良プロセスは、陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過（例えば、ＴＦＦ）を必要としない。代わりに、粗反応混合物の容量は、反応混合物中に存在する溶媒（例えば、ＴＨＦ）の一部を留去することにより減少させることができる。一例を挙げれば、留去は、回転蒸発を利用して達成される。次いで容量減少した混合物は、粒子を除去するために、例えば、０．２２μmフィルターにより濾過することができ、次に混合物を陰イオン交換クロマトグラフィーに付す。一例を挙げれば、本発明の方法により製造した修飾ヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類）は、約９０％（w/w）を超える純度及び約６０〜約８０％の間の単離収率で得られる。
【０００８】
種々の例では、本発明は、ポリマー修飾基に共有結合した修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法であって、このポリマー修飾基が、少なくとも１つの直鎖状又は分岐状ポリ（アルキレンオキシド）残基を包含する方法を提供する。本方法は、以下を包含する：（ｉ）修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；（ii）陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出することにより、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること；及び（iii）溶出画分を脱塩すること。本方法は、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過（例えば、ＴＦＦ）を包含しない。
【０００９】
特定の例では、本発明の方法は以下を包含する：（ｉ）第１級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、ｐ−ニトロフェニルカーボネートを取り込んでいる活性化ポリ（アルキレンオキシド）残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ（アルキレンオキシド）残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること。この接触は、約８．０〜約８．８の間のｐＨを有する水性溶媒の存在下で行われる。修飾ヌクレオチド糖を包含する反応混合物が生成する。本方法は更に以下を包含する：（ii）反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；及び（iii）陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出して、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること。本方法は更に以下を包含することができる：（iv）膜濾過を用いて溶出画分を脱塩すること；及び（ｖ）溶出画分から水を除去すること。本方法は、好ましくは工程（ｉ）の前の限外濾過を包含しない。
【００１０】
本発明は更に、本発明の方法により製造される修飾ヌクレオチド糖を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の典型的な製造方法の略図である。
【図２】図２は、直鎖状（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa）及び分岐状（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−グリセロール−４０kDa）ＰＥＧ残基を取り込んでいるＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の典型的な合成方法を略述する合成スキームである。図２において、ｎは、１〜２５００から選択される整数である。
【図３】図３は、ヌクレオチド糖誘導体（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）及びＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート試薬（例えば、ｍＰＥＧ−ｐＮＦ）を含むカップリング反応を用いるヌクレオチド糖ＰＥＧ類（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類）の合成中に生成する副産物を要約する略図である。不純物のｍＰＥＧ−ＯＨ及びｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）は、ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートの加水分解中に生成しうる。ＣＭＰは、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン及び／又はＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの加水分解を介して生成しうる。ＳＡ−ＰＥＧは、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの加水分解により生成しうる。図３において、ｎは、１〜２５００から選択される整数である。
【図４】図４は、Q Sepharose Big Beadsクロマトグラフィーカラム及び実施例２．２に記載された段階的重炭酸ナトリウム溶出プロトコール（５mM  ＮａＨＣＯ３を０．６ＣＶで；３０mMを３ＣＶで；及び１Ｍを７ＣＶで）を利用する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaの精製中に得られる陰イオン交換クロマトグラムである。保持時間は以下であった：ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa（５５分）；ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa（６３分）；ＣＭＰ及びＣＭＰ−ＳＡ−Ｇｌｙ（ＧＳＣ、１１０分）並びにｐ−ニトロフェノール（１８０分）。
【図５】図５は、Q Sepharose Big Beadsクロマトグラフィーカラム及び実施例７に記載された重炭酸ナトリウム勾配溶出（０〜３０mMを３ＣＶで；３０mMを２ＣＶで；３０mM〜２８０mMを５ＣＶで；及び１Ｍを１０ＣＶで）を利用する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaの精製中に得られる陰イオン交換クロマトグラムである。
【図６】図６は、Q Sepharose Big Beadsクロマトグラフィーカラム及び実施例２．３に記載された重炭酸ナトリウム段階的溶出プロトコール（２mM  ＮａＨＣＯ３を１ＣＶで；３０mMを３ＣＶで；及び１Ｍを７ＣＶで）を利用する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaの精製中に得られる陰イオン交換クロマトグラムである。保持時間は以下であった：ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa（５５分）；ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa（７５分）；ＣＭＰ及びＣＭＰ−ＳＡ−Ｇｌｙ（１２０分）並びにｐ−ニトロフェノール（２００分）。
【図７】図７は、Q Sepharose Big Beadsクロマトグラフィーカラム及び実施例２．４に記載された重炭酸ナトリウム段階的溶出プロトコール（２mMを１ＣＶで；及び３０mMを３ＣＶで）を利用する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDaの精製中に得られる陰イオン交換クロマトグラムである。
【図８】図８は、Q Sepharose Big Beadsクロマトグラフィーカラム及び実施例７に記載された重炭酸ナトリウム溶出（２mM  ＮａＨＣＯ３を４ＣＶで）を利用する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDaの精製中に得られる陰イオン交換クロマトグラムである。
【００１２】
発明の詳細な説明
Ｉ．  略語
ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＰＧ、ポリ（プロピレングリコール）；Ａｒａ、アラビノシル；Ｆｒｕ、フルクトシル；Ｆｕｃ、フコシル；Ｇａｌ、ガラクトシル；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミニル；Ｇｌｃ、グルコシル；ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミニル；Ｍａｎ、マンノシル；ＭａｎＡｃ、酢酸マンノサミニル；Ｘｙｌ、キシロシル；及びＮｅｕＡｃ、シアリル（Ｎ−アセチルノイラミニル）；Ｍ６Ｐ、マンノース−６−リン酸；ＢＥＶＳ、バキュロウイルス発現ベクター系；ＣＶ、カラム容量；ＮＴＵ、比濁計濁度単位；ｖｖｍ、容量／容量／分；ＡＣＮ、アセトニトリル；ｍｃＬ、マイクロリットル；ＲＯ、逆浸透。
【００１３】
II．  定義
特に断りない限り、本明細書に使用される全ての技術及び科学用語は一般に、本発明が属する分野の当業者が普通に理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書において使用される命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学及び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。核酸及びペプチド合成には、標準手法が利用される。手法及び手順は、一般には当該分野における従来法及び種々の一般参考文献にしたがい実行され（一般的には、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと、これは引用例として本明細書に取り込まれる）、そしてこれらは本文書の至るところに提供されている。本明細書において使用される命名法、並びに分析化学、及び後述の有機合成法における実験手順は、当該分野において周知であり、かつ普通に利用されるものである。化学合成及び化学分析には、標準手法、又はその変法が使用される。
【００１４】
「ヌクレオチド糖」という用語は、「糖ヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、シアル酸のような別の糖残基に共有結合したヌクレオチドのことをいう。このヌクレオチド糖は、場合により、直鎖状又は分岐状ＰＥＧ残基のようなポリマー修飾基により共有結合で修飾される。
【００１５】
本発明のヌクレオチド糖の「糖残基」は、天然及び非天然のフラノース及びヘキサノースの両方から選択される。非天然糖類は、場合により、環上にアルキル化又はアシル化ヒドロキシル及び／又はアミン残基、例えば、エーテル、エステル及びアミド置換基を包含する。他の非天然糖類は、そのような置換基が天然糖類には存在しない環上の位置に、Ｈ、ヒドロキシル、エーテル、エステル又はアミド置換基を包含する。あるいは、この炭水化物は、その名称が由来する炭水化物に見い出されるであろう置換基を欠いている（例えば、デオキシ糖）。更なる典型的な非天然糖は、酸化（例えば、オン酸（-onic）及びウロン酸（-uronic acids））及び還元（糖アルコール）炭水化物を包含する。糖残基は、単糖類、オリゴ糖類又は多糖類であってよい。
【００１６】
本発明に有用な典型的な天然糖は、グルコース、ガラクトース、フコース、マンノース、キシラノース、リボース、Ｎ−アセチルグルコース（ＧｌｃＮＡｃ）、シアル酸及びＮ−アセチルガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）を包含する。
【００１７】
同様に、ヌクレオシドは天然及び非天然ヌクレオシドの両方から選択することができる。本発明に有用な典型的な天然ヌクレオシドは、シトシン、チミン、グアニン、アデニン及びウラシルを包含する。種々の非天然ヌクレオシド類及びその製造方法が当該分野において知られている。
【００１８】
「シアル酸」という用語は、カルボキシル化９炭糖のファミリーの任意のメンバーのことをいう。シアル酸ファミリーの最もありふれたメンバーは、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノヌロピラノース−１−オン酸（しばしばＮｅｕ５Ａｃ、ＮｅｕＡｃ、ＮＡＮ又はＮＡＮＡと略される））である。このファミリーの第２のメンバーは、Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ又はＮｅｕＧｃ）であるが、ここでＮｅｕＡｃのＮ−アセチル基はヒドロキシル化されている。第３のシアル酸ファミリーメンバーは、２−ケト−３−デオキシ−ノヌロソン酸（ＫＤＮ）である（Nadano et al., (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)）。また、９−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アシル−Ｎｅｕ５Ａｃ（９−Ｏ−ラクチル−Ｎｅｕ５Ａｃ又は９−Ｏ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃなど）、９−デオキシ−９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ及び９−アジド−９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃのような、９−置換シアル酸が含まれる。シアル酸ファミリーの総説については、例えば、Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))を参照のこと。シアル化方法におけるシアル酸化合物の合成及び使用は、国際出願WO 92/16640（1992年10月1日公開）に開示されている。
【００１９】
「陰イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、充填カラムを伴う手順、並びに陰イオン交換膜を伴う手順を包含する。「陰イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、陰イオン交換能を有する任意の混合モード媒体を用いて実行されるクロマトグラフィーを包含する。
【００２０】
「水性溶媒」という用語は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％又は少なくとも約８０％の水（v/v）を組み込んでいる溶媒を記述している。この水性溶媒は、場合により、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール又はブタノール）、ＴＨＦ及び他の脂肪族又は環状エーテル類のような、水混和性有機溶媒を包含することができる。
【００２１】
「ポリマー修飾基」という用語は、本発明のヌクレオチド糖に結合している任意のポリマーのことをいう。このポリマー修飾基は、水溶性であっても、又は本質的に水不溶性であってもよい。本発明に有用な典型的な水溶性ポリマーは、ＰＥＧ、ｍ−ＰＥＧ及び他の官能基化ＰＥＧ残基、ｍ−ＰＰＧ、ＰＰＧ、ポリシアル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリシン、ポリエチレンイミン及び生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリセリド）を包含する。
【００２２】
「水溶性」という用語は、ある検出可能な程度の水への溶解度を有する残基のことをいう。水溶解度を検出及び／又は定量するための方法は、当該分野において周知である。典型的な水溶性ポリマーは、ペプチド、糖類、ポリ（エーテル）、ポリ（アミン）、ポリ（カルボン酸）などを包含する。ペプチドは、混合配列を有しても、又は単一アミノ酸からなってもよい（例えば、ポリ（リシン））。典型的な多糖類は、ポリ（シアル酸）である。典型的なポリ（エーテル）は、ポリ（エチレングリコール）、例えば、ｍ−ＰＥＧである。ポリ（エチレンイミン）は、典型的なポリアミンであり、そしてポリ（アクリル酸）は、代表的なポリ（カルボン酸）である。
【００２３】
水溶性ポリマーのポリマー基本骨格は、ポリ（エチレングリコール）（即ち、ＰＥＧ）であってよい。しかし、当然のことながら、他の関連ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適しており、そしてＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、この点で包括的であり、かつ排他的ではないことが意図される。「ＰＥＧ」という用語は、アルコキシＰＥＧ、二官能性ＰＥＧ、多腕ＰＥＧ、フォーク型ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、ペンダントＰＥＧ（即ち、ポリマー基本骨格に１つ以上の官能基ペンダントを有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）、又は分解性結合部を有するＰＥＧを包含する、そのいずれかの型のポリ（エチレングリコール）を包含する。
【００２４】
ポリマー基本骨格は、直鎖状又は分岐状であってよい。分岐ポリマー基本骨格は、当該分野において一般に知られている。典型的には、分岐ポリマーは、中心枝コア残基及び中心枝コアに結合している複数の直鎖状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは普通、グリセロール、ペンタエリトリトール及びソルビトールのような種々のポリオールへの、エチレンオキシドの付加により調製することができる分岐型として使用される。中心枝残基はまた、リシンのような幾つかのアミノ酸から誘導することができる。分岐ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（ここで、Ｒは、グリセロール又はペンタエリトリトールのようなコア残基を表し、そしてｍは、腕の数を表す）のような一般型として表すことができる。米国特許第5,932,462号（引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる）に記載されるような、多腕ＰＥＧ分子もまた、ポリマー基本骨格として使用することができる。
【００２５】
多数の他のポリマーもまた、本発明に適している。非ペプチドで水溶性であり、２〜約３００個の末端を持つポリマー基本骨格は、本発明において特に有用である。適切なポリマーの例は、特に限定されないが、他のポリ（アルキレングリコール）［ポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど］、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）［米国特許第5,629,384号（引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる）に記載されている］、並びにこれらのコポリマー、ターポリマー、及び混合物を包含する。ポリマー基本骨格の各鎖の分子量は変化させることができるが、典型的には約１００Da〜約１００，０００Da、しばしば約６，０００Da〜約８０，０００Daの範囲である。
【００２６】
「供給溶液」とは、精製すべき化合物を含有する任意の溶液のことをいう。例えば、ある反応混合物は、本発明の方法を用いてそこから所望の反応生成物が精製される供給溶液として使用することができる。
【００２７】
置換基が、左から右へ書かれるその従来の化学式により特定される場合には、これらは、右から左へその構造を書くことによって生じるであろう、化学的に同一の置換基を等しく包含する（例えば、−ＣＨ２Ｏ−とは、−ＯＣＨ２−のことも言うものとする）。
【００２８】
「アルキル」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に断りない限り、直鎖若しくは分岐鎖、又は環状（即ち、シクロアルキル）炭化水素基、あるいはその組合せを意味し、そしてこれは、完全に飽和であるか、一価不飽和又は多価不飽和であってよく、かつ指定される数の炭素原子を有する（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１〜１０個の炭素を意味する）、二価（例えば、アルキレン）及び多価基を包含することができる。飽和炭化水素基の例は、特に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルの同族体及び異性体などのような基を包含する。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例は、特に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル、並びに高級同族体及び異性体を包含する。「アルキル」という用語はまた、特に断りない限り、「ヘテロアルキル」のような、更に詳細には以下に定義されるアルキルの誘導体を包含する意味である。炭化水素基に限られたアルキル基は、「ホモアルキル」と呼ばれる。
【００２９】
「アルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に限定されないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を典型例とする、アルカンから誘導される二価基を意味し、そして更に「ヘテロアルキレン」として後述される基を包含する。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有するが、１０個又はそれより少ない炭素原子を有する基が本発明では好ましい。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般には８個又はそれより少ない炭素原子を有する短鎖アルキル又はアルキレン基である。
【００３０】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、その従来の意味で使用され、そしてそれぞれ酸素原子、アミノ基、又は硫黄原子を介して、分子の残りの部分に結合したアルキル基のことをいう。
【００３１】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体で又は別の用語との組合せで、特に断りない限り、提示数の炭素原子、並びにＯ、Ｎ、Ｓｉ及びＳよりなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子よりなる（ここで、窒素及び硫黄原子は、場合により酸化されていてもよく、そして窒素ヘテロ原子は、場合により４級化されていてもよい）、安定な直鎖若しくは分岐鎖、又は環状炭化水素基、あるいはこれらの組合せを意味する。ヘテロ原子のＯ、Ｎ及びＳ並びにＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、又はアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置されていてもよい。例としては、特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３を包含する。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３のように、最大２個までのヘテロ原子が連続してもよい。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−を典型例とする、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基では、ヘテロ原子はまた、鎖末端のいずれか又は両方を占めることができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。更に、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基では、この連結基の式が書かれる向きによって連結基の幾何学配置を意味するものではない。例えば、式：−ＣＯ２Ｒ’は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’と−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’の両方を表す。
【００３２】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で又は他の用語との組合せで、特に断りない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状版を表す。更に、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子は、その複素環が分子の残りの部分に結合している位置を占めることができる。シクロアルキルの例は、特に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどを包含する。ヘテロシクロアルキルの例は、特に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどを包含する。
【００３３】
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、それ自体で又は別の置換基の一部として、特に断りない限り、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素原子を意味する。更に、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキル及びポリハロアルキルを包含する意味である。例えば、「ハロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル」という用語は、特に限定されないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを包含する意味である。
【００３４】
「アリール」という用語は、特に断りない限り、単環、又は縮合しているか若しくは共有結合している多環（好ましくは１〜３つの環）であってよい、多価不飽和の芳香族置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉ及びＢから選択される１個〜４個のヘテロ原子を含有する（ここで、窒素及び硫黄原子は、場合により酸化されており、そして窒素原子は、場合により４級化されている）、アリール基（又は環）のことをいう。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子によって分子の残りの部分に結合してもよい。アリール及びヘテロアリール基の非限定例は、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、及び６−キノリルを包含する。上記アリール及びヘテロアリール環系の各々の置換基は、後述の許容しうる置換基の群から選択される。
【００３５】
簡潔さのために、他の用語と組合せて使用されるとき（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）「アリール」という用語は、上記と同義のアリール及びヘテロアリール環の両方を包含する。即ち、「アリールアルキル」という用語は、アリール基が、アルキル基［炭素原子（例えば、メチレン基）が、例えば、酸素原子により置換されているアルキル基を包含する（例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなど）］に結合している基（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を包含する意味である。
【００３６】
上記用語の各々（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」）は、特に断りない限り指示基の置換及び非置換型の両方を包含する意味である。各タイプの基に好ましい置換基は後述される。
【００３７】
アルキル及びヘテロアルキル基（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を包含する）の置換基は、総称的に「アルキル基置換基」と呼ばれ、そしてこれらは、特に限定されないが、ゼロから（２ｍ’＋１）の範囲の数（ここで、ｍ’は、このような基中の炭素原子の総数である）の、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２から選択される、１種以上の種々の基であってよい。Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''は、各々好ましくは独立に、水素、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換アリール、例えば、１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基、又はアリールアルキル基を意味する。本発明の化合物が、例えば、２つ以上のＲ基を包含するとき、Ｒ基の各々は、各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''基が２つ以上存在するときと同様に、独立に選択される。Ｒ’及びＲ”が、同じ窒素原子に結合しているとき、これらは、この窒素原子と一緒になって、５員、６員、又は７員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ”は、特に限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを包含する意味である。上記置換基の考察から、当業者であれば、「アルキル」という用語は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３）及びアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）のような、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を包含する意味であることを理解するだろう。
【００３８】
アルキル基について記述された置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基の置換基は、総称的に「アリール基置換基」と呼ばれる。この置換基は、例えば、ゼロから芳香環系上のオープン原子価の総数の範囲の数の、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ”Ｒ'''、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ'''、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”Ｒ'''）＝ＮＲ''''、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ”）＝ＮＲ'''、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルから選択される（ここで、Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''は、好ましくは独立に、水素、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール及び置換又は非置換ヘテロアリールから選択される）。本発明の化合物が、例えば、２つ以上のＲ基を包含するとき、Ｒ基の各々は、各Ｒ’、Ｒ”、Ｒ'''及びＲ''''基が２つ以上存在するときと同様に、独立に選択される。
【００３９】
アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の２つの置換基は、場合により式：−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（ここで、Ｔ及びＵは、独立に−ＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−又は単結合であり、そしてｑは、０〜３の整数である）の置換基で置換されていてもよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の２つの置換基は、場合により式：−Ａ−（ＣＨ２）ｒ−Ｂ−（ここで、Ａ及びＢは、独立に−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−又は単結合であり、そしてｒは、１〜４の整数である）の置換基で置換されていてもよい。そうして生成する新しい環の１つの単結合は、場合により二重結合で置換されていてもよい。あるいは、アリール又はヘテロアリール環の隣接原子上の２つの置換基は、場合により式：−（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ”Ｒ'''）ｄ−（ここで、ｓ及びｄは、独立に０〜３の整数であり、そしてＸは、−Ｏ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、又は−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基で置換されていてもよい。置換基のＲ、Ｒ’、Ｒ”及びＲ'''は、好ましくは水素又は置換若しくは非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキルから独立に選択される。
【００４０】
本明細書において使用されるとき、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）及びホウ素（Ｂ）を包含する。
【００４１】
「Ｒ」という記号は、置換基を表す一般的略語である。典型的な置換基は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、及び置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基を包含する。
【００４２】
本明細書に記載される全てのオリゴ糖は、非還元糖に対する名称又は略語（即ち、Ｇａｌ）、続いてグリコシド結合の立体配置（α又はβ）、環結合（１又は２）、結合に関与する還元糖の環位置（２、３、４、６又は８）、及び次に還元糖の名称又は略語（即ち、ＧｌｃＮＡｃ）により記述される。それぞれの糖は好ましくはピラノースである。標準的な糖鎖生物学の命名法の総説については、Essentials of Glycobiology Varki et al. eds. CSHL Press (1999)を参照のこと。
【００４３】
オリゴ糖は、還元末端の糖が実際に還元糖であろうとなかろうと、還元末端及び非還元末端を有するものと考えられる。一般に認められた命名法により、オリゴ糖は、本明細書において非還元末端を左側に還元末端を右側に描かれる。
【００４４】
本明細書において使用されるとき、「修飾糖」という用語は、本発明のプロセスにおいてペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基に酵素的に付加された、天然又は非天然の炭水化物のことをいう。修飾糖は、特に限定されないが、糖ヌクレオチド（一、二、及び三リン酸）、活性化糖（例えば、ハロゲン化グリコシル、メシル酸グリコシル）及び活性化もされずヌクレオチドでもない糖を包含する、幾つかの酵素基質から選択される。「修飾糖」は、「修飾基」で共有結合により官能基化される。有用な修飾基は、特に限定されないが、ＰＥＧ残基、治療薬残基、診断薬残基、生体分子などを包含する。修飾基は、好ましくは天然、即ち非修飾炭水化物ではない。修飾基による官能基化の部位は、「修飾糖」が酵素的にペプチドに付加するのを妨げないように選択される。
【００４５】
「複合糖質化」という用語は、本明細書において使用されるとき、本発明の方法により調製される、ポリペプチド、例えば、エリトロポエチンペプチドのアミノ酸又はグリコシル残基への修飾糖種の酵素介在結合のことをいう。「複合糖質化」の下位には、修飾糖の修飾基が、ポリ（エチレングリコール）、そのアルキル誘導体（例えば、ｍ−ＰＥＧ）又は反応性誘導体（例えば、Ｈ２Ｎ−ＰＥＧ、ＨＯＯＣ−ＰＥＧ）である「糖ＰＥＧ化」がある。
【００４６】
「大規模」及び「工業的規模」という用語は、互換的に使用され、そして少なくとも約２５０mg、少なくとも約５００mg、少なくとも約１グラム、少なくとも約２グラム、少なくとも約５ｇ、少なくとも約１０ｇ、少なくとも約２０ｇ、少なくとも約３０ｇ、少なくとも約５０又は少なくとも約１００ｇのヌクレオチド糖を単一サイクルの完了時に製造する、反応サイクル又はプロセスのことをいう。１つの実施態様において、本発明は、キログラムスケール（例えば、合成／精製１回あたり、少なくとも約１kg、少なくとも約１．５kg、少なくとも約２kg、又は少なくとも約３kgの精製糖ヌクレオチド）で高度の純度までヌクレオチド糖を調製するのに適した、大規模製造法を提供する。
【００４７】
「単離された」又は「精製された」という用語は、本発明のヌクレオチド糖又は修飾ヌクレオチド糖に関するとき、このような物質が、これを製造するために使用される成分を本質的に含まないことを意味する。「単離された」、「純粋な」又は「精製された」は、互換的に使用される。純度は、任意の当該分野で認められた分析法（例えば、銀染色ゲル上のバンド強度、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ、又は類似手段）により決定することができる。一例を挙げれば、純度は、目的のヌクレオチド糖の量と、試料中に存在する他の成分全部の量との比（w/w）として決定される。例えば、試料中のヌクレオチド糖の濃度は、ヌクレオチド糖標準物質と組合せた分析用クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて決定してもよい。
【００４８】
典型的には、本発明の方法を用いて単離されるヌクレオチド糖は、ある範囲として表されるレベルの純度を有する。糖ヌクレオチドの純度の範囲の下端は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％又は約８０％であり、そして純度の範囲の上端は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約９５％超である。
【００４９】
ヌクレオチド糖が約９０％よりも純粋であるとき、その純度もまた、好ましくはある範囲として表される。この純度の範囲の下端は、約９０％、約９２％、約９４％、約９６％又は約９８％である。この純度の範囲の上端は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約１００％純度（w/w）である。
【００５０】
「ヌクレオチド糖回収率」、「収率」又は「反応収率」は、典型的には特定の製造工程（又は一連の工程）後の回収ヌクレオチド糖の量と、その製造工程に入ったヌクレオチド糖の量との間の範囲として表される。例えば、本発明の方法のヌクレオチド糖の回収率は、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％又は約９０％である。別の例では、本発明の方法のヌクレオチド糖回収率は、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％又は約９８％超である。
【００５１】
「ローディング液（loading buffer）」という用語は、その中で精製されるペプチドが精製装置、例えば、クロマトグラフィーカラム又はフィルターカートリッジに加えられる緩衝液のことをいう。典型的には、ローディング液は、不要な不純物からの目的のペプチドの分離が達成できるように選択される。例えば、ペプチドをヒドロキシアパタイト（ＨＡ）又はフルオロアパタイトカラム上で精製するとき、ローディング液のｐＨ及びローディング液中の塩濃度は、ペプチドが最初はカラム上に保持され、一方ある種の不純物が流出液中に見い出されるように選択することができる。
【００５２】
「制限液（limit buffer）」とも呼ばれる「溶離液（elution buffer）」という用語は、典型的にはそれ以前に加えた精製装置（例えば、クロマトグラフィーカラム又はフィルターカートリッジ）からペプチドを除去（溶出）するために使用される緩衝液のことをいう。典型的には、ローディング液は、不要な不純物からの目的のペプチドの分離が達成できるように選択される。しばしば溶離液中の特定の塩（例えば、ＮａＣｌ）の濃度は、溶出進行中に変化させる（勾配）。この勾配は連続的又は段階的であってよい。
【００５３】
「室温」又は「周囲温度」という用語は、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃又は少なくとも約２５℃の温度のことをいう。典型的には、室温は約２０℃と約２５℃の間である。
【００５４】
III.  方法
本発明は、ヌクレオチド糖の製造方法（例えば、大規模製造法）を提供する。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖はポリマー修飾基で修飾される（修飾ヌクレオチド糖）。典型的なポリマー修飾基は本明細書において開示される。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、ポリ（アルキレンオキシド）残基から選択される少なくとも１つのポリマー残基を包含する。典型的なポリ（アルキレンオキシド）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）残基を包含する。
【００５５】
一例を挙げれば、本発明は、修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法を提供する。修飾ヌクレオチド糖では、糖残基がポリマー修飾基に共有結合しており、そしてこのポリマー修飾基は、少なくとも１つの直鎖状又は分岐状ポリ（アルキレンオキシド）残基を包含する。典型的な方法は、以下を包含する：（ｉ）修飾ヌクレオチド糖を含む反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；（ii）陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出することにより、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること；及び（iii）溶出画分を脱塩すること。予期しないことに、本発明者らは、本発明のプロセスにより、このプロセスが陰イオン交換クロマトグラフィーの前の限外濾過を包含せず、そして反応混合物が最初に陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理される（例えば、溶媒及び粒子の除去により反応混合物を調整後）ときでさえ、高純度及び高い全収率で修飾ヌクレオチド糖が得られることを発見した。よって一例を挙げれば、本方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、即ち、工程（ｉ）の前の限外濾過（例えば、ＴＦＦ）を包含しない。
【００５６】
典型的な実施態様において、上記方法は、更に以下を包含することができる：（iv）反応混合物の容量を減少させること。一例を挙げれば、反応混合物の容量は、少なくとも溶媒の一部（例えば、回転蒸発を介して）の留去（例えば、減圧下）により減少する。一例を挙げれば、反応混合物は、減圧下での留去によって本質的に除去されるか又は部分的に除去される有機溶媒（例えば、ＴＨＦ）を包含する。上記方法は、更に以下を包含してもよい（例えば、反応混合物の容量の減少後）：（ｖ）反応混合物を濾過すること（例えば、粒子を除去するために）。典型例では、反応混合物は、０．２２μmフィルターにより濾過する。「濾過」という用語は、この文脈において「限外濾過」を包含しない。陰イオン交換クロマトグラフィーのために反応混合物を前処理するのに有用な他の適切なフィルターは、本明細書に記載される。特定の例では、反応混合物の容量を最初に減少させ、生じる混合物を濾過に付し、次いで濾液を陰イオン交換媒体と接触させる。
【００５７】
上記実施態様のいずれかによる一例を挙げれば、本方法は、例えば、工程（iii）の後に更に以下を包含することができる：（ｖ）溶出画分から水を除去すること。一例を挙げれば、溶出画分を凍結乾燥又は噴霧乾燥に付すことにより水を除去する。典型的には、これらの手順により、残留含水量が、例えば、約１０％（w/w）未満、約５％（w/w）未満、約４％（w/w）未満、約３％（w/w）未満、約２％（w/w）未満又は約１％（w/w）未満である、本質的に乾燥生成物が得られる。
【００５８】
特定の例では、本発明は、ポリマー修飾基がヌクレオチド糖に共有結合している、修飾ヌクレオチド糖を包含する組成物の製造方法を提供する。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、少なくとも１つの直鎖状又は分岐状ポリ（アルキレンオキシド）残基を包含する。この方法は、以下を包含する：（ｉ）第１級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、ｐ−ニトロフェニルカーボネートを取り込んでいる活性化ポリ（アルキレンオキシド）残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ（アルキレンオキシド）残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させること。この接触は、約８．０〜約８．８の間のｐＨを有する水性溶媒の存在下で行われる。こうして修飾ヌクレオチド糖を包含する反応混合物が生成する。本方法は更に以下を包含することができる：（ii）反応混合物を陰イオン交換媒体と接触させること；及び（iii）陰イオン交換媒体から修飾ヌクレオチド糖を溶出して、修飾ヌクレオチド糖を含有する溶出画分を生成すること。本方法は更に以下を包含することができる：（iv）膜濾過を用いて溶出画分を脱塩すること；及び（ｖ）溶出画分から水を除去すること（例えば、場合により添加剤の存在下での凍結乾燥又は噴霧乾燥を介して）。本方法は、好ましくは工程（ｉ）の前の限外濾過を包含しない。
【００５９】
上記実施態様のいずれかにおいて有用な典型的なポリマー修飾基は、本明細書の以下に開示される。一例を挙げれば、ポリマー修飾基は、ポリ（アルキレンオキシド）残基から選択される、少なくとも１つのポリマー残基を包含する。典型的なポリ（アルキレンオキシド）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）を包含する。一例を挙げれば、ＰＥＧ修飾基は、約５kDaと約６００kDaの間、約５kDaと約５００kDaの間、約５kDaと約４００kDaの間、約１０kDaと約４００kDaの間、約１０kDaと約３００kDaの間、約１０kDaと約２００kDaの間又は約１０kDaと約１００kDaの間の分子量を有する。特定の例では、ＰＥＧ残基は、約１０kDaと約８０kDaの間、約１０kDaと約６０kDaの間又は約１０kDaと約４０kDaの間の分子量を有する。一例を挙げれば、ポリマー修飾基が分岐しており、そして少なくとも２つのポリマー残基（例えば、２つのＰＥＧ残基）に共有結合したグリセロール基本骨格を包含する。
【００６０】
ヌクレオチド糖
上記実施態様のいずれかのヌクレオチド糖又は修飾ヌクレオチド糖は、リン酸残基（一リン酸、二リン酸、三リン酸及びポリリン酸残基から選択される）に共有結合したヌクレオシド残基、及びそのリン酸残基に共有結合した更なる糖残基を包含する。ヌクレオチド糖のヌクレオシド残基は、アデノシン、グアノシン、５−メチルウリジン、ウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、及びデオキシシチジンを包含する、任意のヌクレオシド又はデオキシヌクレオシドであってよい。更に別のヌクレオシド残基は、本明細書に記載される。本発明の方法は、ヌクレオチドが種々のリン酸化状態にある、ヌクレオチド糖を製造するのに有用である。したがって、ヌクレオチド糖の典型的なヌクレオチドは、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＡＭＰ、ｃＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＧＭＰ、ｃＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ及びＴＴＰ、更にはこれらや修飾ヌクレオチドを包含する他のヌクレオチドのデオキシ型を包含する。
【００６１】
ヌクレオチド糖の糖残基は、単糖及びオリゴ糖を包含する、任意のグリコシル残基であってよい。典型的な糖残基は、シアル酸、グルコース、ＧｌｃＮＡｃ、マンノース、フコース、ガラクトース、ＧａｌＮＡｃ及びこれらの組合せを包含する。「グリコシル残基」又は「糖残基」という用語は、「グリコシル擬態残基」を包含する。
【００６２】
典型的なヌクレオチド糖は、ＣＭＰ−ＳＡ、ＣＤＰ−ＳＡ、ＣＴＰ−ＳＡ、ＡＭＰ−ＳＡ、ｃＡＭＰ−ＳＡ、ＡＤＰ−ＳＡ、ＡＴＰ−ＳＡ、ＵＭＰ−ＳＡ、ＵＤＰ−ＳＡ、ＵＴＰ−ＳＡ、ＧＭＰ−ＳＡ、ｃＧＭＰ−ＳＡ、ＧＤＰ−ＳＡ、ＧＴＰ−ＳＡ、ＴＭＰ−ＳＡ、ＴＤＰ−ＳＡ及びＴＴＰ−ＳＡ、ＣＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＣＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＣＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＡＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｃＡＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＡＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＡＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ｃＧＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＧＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＴＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＴＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ及びＴＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰ−Ｇａｌ、ＣＤＰ−Ｇａｌ、ＣＴＰ−Ｇａｌ、ＡＭＰ−Ｇａｌ、ｃＡＭＰ−Ｇａｌ、ＡＤＰ−Ｇａｌ、ＡＴＰ−Ｇａｌ、ＵＭＰ−Ｇａｌ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＵＴＰ−Ｇａｌ、ＧＭＰ−Ｇａｌ、ｃＧＭＰ−Ｇａｌ、ＧＤＰ−Ｇａｌ、ＧＴＰ−Ｇａｌ、ＴＭＰ−Ｇａｌ、ＴＤＰ−Ｇａｌ及びＴＴＰ−Ｇａｌ、ＣＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＴＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＡＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ｃＡＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＡＴＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＴＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ｃＧＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＧＴＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＴＭＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＴＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びＴＴＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＣＭＰ−Ｇｌｃ、ＣＤＰ−Ｇｌｃ、ＣＴＰ−Ｇｌｃ、ＡＭＰ−Ｇｌｃ、ｃＡＭＰ−Ｇｌｃ、ＡＤＰ−Ｇｌｃ、ＡＴＰ−Ｇｌｃ、ＵＭＰ−Ｇｌｃ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ、ＵＴＰ−Ｇｌｃ、ＧＭＰ−Ｇｌｃ、ｃＧＭＰ−Ｇｌｃ、ＧＤＰ−Ｇｌｃ、ＧＴＰ−Ｇｌｃ、ＴＭＰ−Ｇｌｃ、ＴＤＰ−Ｇｌｃ及びＴＴＰ−Ｇｌｃ、ＣＭＰ−フコース、ＣＤＰ−フコース、ＣＴＰ−フコース、ＡＭＰ−フコース、ｃＡＭＰ−フコース、ＡＤＰ−フコース、ＡＴＰ−フコース、ＵＭＰ−フコース、ＵＤＰ−フコース、ＵＴＰ−フコース、ＧＭＰ−フコース、ｃＧＭＰ−フコース、ＧＤＰ−フコース、ＧＴＰ−フコース、ＴＭＰ−フコース、ＴＤＰ−フコース及びＴＴＰ−フコース、ＣＭＰ−Ｍａｎ、ＣＤＰ−Ｍａｎ、ＣＴＰ−Ｍａｎ、ＡＭＰ−Ｍａｎ、ｃＡＭＰ−Ｍａｎ、ＡＤＰ−Ｍａｎ、ＡＴＰ−Ｍａｎ、ＵＭＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−Ｍａｎ、ＵＴＰ−Ｍａｎ、ＧＭＰ−Ｍａｎ、ｃＧＭＰ−Ｍａｎ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＧＴＰ−Ｍａｎ、ＴＭＰ−Ｍａｎ、ＴＤＰ−Ｍａｎ及びＴＴＰ−Ｍａｎ、並びにこれらのデオキシ種を包含する。上記ヌクレオチド糖はいずれも、本発明の方法により製造される修飾ヌクレオチド糖の一部となりうる。好ましい実施態様において、これらの修飾ヌクレオチド糖中のポリマー修飾基（例えば、直鎖状又は分岐状ＰＥＧ残基）は、場合によりリンカー残基を介して、ヌクレオチド糖の糖残基に共有結合している。
【００６３】
本発明の方法を用いて製造することができる典型的な修飾ヌクレオチド糖は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−ＳＡ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−ＳＡ−ＰＥＧ、ＣＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−Ｇａｌ−ＰＥＧ、ＣＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−ＧａｌＮＡｃ−ＰＥＧ、ＣＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−Ｇｌｃ−ＰＥＧ、ＣＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ＣＤＰ−フコース−ＰＥＧ、ＣＴＰ−フコース−ＰＥＧ、ＡＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ＡＤＰ−フコース−ＰＥＧ、ＡＴＰ−フコース−ＰＥＧ、ＵＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ＵＤＰ−フコース−ＰＥＧ、ＵＴＰ−フコース−ＰＥＧ、ＧＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ＧＤＰ−フコース−ＰＥＧ、ＧＴＰ−フコース−ＰＥＧ、ＴＭＰ−フコース−ＰＥＧ、ＴＤＰ−フコース−ＰＥＧ及びＴＴＰ−フコース−ＰＥＧ、ＣＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＣＤＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＣＴＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＡＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ｃＡＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＡＤＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＡＴＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＵＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＵＤＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＵＴＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＧＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ｃＧＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＧＤＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＧＴＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＴＭＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、ＴＤＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ及びＴＴＰ−Ｍａｎ−ＰＥＧ、並びにこれらのデオキシ種を包含する。上記ＰＥＧ残基のいずれも、ＰＰＧ残基のような別のポリマー残基で置換することができる。
【００６４】
一例を挙げれば、本発明の糖ヌクレオチド又は修飾糖ヌクレオチドは、ヌクレオチドとしてシチジンを、そして糖残基としてシアル酸を包含する。特定の例では、糖ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド糖は、シチジン−モノホスホ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）を包含する。別の例では、ヌクレオチド糖はＣＭＰ−ＳＡである。更に別の例では、修飾ヌクレオチド糖は、直鎖状又は分岐状ＰＥＧ残基に共有結合したＣＭＰ−ＳＡ（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）である。
【００６５】
一例を挙げれば、上記実施態様のいずれかのヌクレオチド糖は、下記：
【００６６】
【化１】
0005876649.tif 000002
［式中、各ｎは、１〜２５００から独立に選択される整数である］から選択されるメンバーである。一例を挙げれば、ｎは、約１００〜約１０００、約１００〜約８００、約１００〜約６００、約１００〜約５００から選択される。各Ｑは、Ｈ、負電荷及び塩の対イオン（例えば、Ｎａ、Ｋ）から独立に選択されるメンバーである。各Ｑ１は、Ｈ、及びＣ１−Ｃ６アルキル［メチル、エチル、プロピル（例えば、ｎ−プロピル、イソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル）、ペンチル及びヘキシルなど］から独立に選択されるメンバーである。
【００６７】
上記方法のいずれかの典型的な実施態様において、陰イオン交換媒体は、第４級アンモニウム樹脂及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）樹脂から選択される。別の例では、陰イオン交換媒体は、セファロース樹脂（例えば、Ｑ−セファロース）である。その他の陰イオン交換媒体は本明細書に記載されるが、その各々は本発明の方法において同等に有用である。一例を挙げれば、陰イオン交換媒体は、対イオンとして重炭酸イオンを包含する、第４級アンモニウム樹脂である。例えば、この第４級アンモニウム樹脂は、使用の前に重炭酸緩衝液（例えば、ＮａＨＣＯ３）で処理する。
【００６８】
別の例では、ヌクレオチド糖は、重炭酸緩衝液を用いて陰イオン交換媒体から溶出する。例えば、ヌクレオチド糖は、溶出緩衝液中の重炭酸濃度が約０mMから約１Ｍ重炭酸（例えば、ＮａＨＣＯ３）まで上昇する、段階的溶出プロトコール又は勾配を用いて溶出する。典型的には、ＰＥＧ修飾ヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）は、修飾ヌクレオチド糖を生成するのに利用されるカップリング反応のよくある副産物である、対応する修飾糖（例えば、ＳＡ−ＰＥＧ）に近接して溶出する。予期しないことに、本発明者らは、ヌクレオチド糖が、低濃度の重炭酸又は緩徐な勾配（約０．０１mM〜約３０mMの間の重炭酸を含む）を用いて対応する修飾糖から分離できることを発見した。よって一例を挙げれば、ヌクレオチド糖は、約０．０１mM〜５０mMの間、約０．０１mM〜３０mMの間、約０．０１mM〜２０mMの間又は約０．０１mM〜１０mMの間の重炭酸濃度を包含する重炭酸緩衝液を用いて陰イオン交換媒体から溶出する。反応混合物の他の混入物（例えば、ヌクレオシド、非修飾ヌクレオチド糖）は、典型的には約３０又は５０mMより高い重炭酸濃度で溶出する。
【００６９】
別の典型的な実施態様において、陰イオン交換カラムに装填した（即ち、陰イオン交換媒体と接触させた）反応混合物（陰イオン交換供給溶液）は、約１０mS/cm未満、約８mS/cm未満、約６mS/cm未満、約５mS/cm未満、約４mS/cm未満、約３mS/cm未満又は約２mS/cm未満の塩導電率を有する。一例を挙げれば、陰イオン交換カラムに装填した反応混合物は、約１mS/cm未満、約０．８、０．６、０．４又は０．２mS/cm未満の塩導電率を有する。反応混合物の塩導電率は、陰イオン交換クロマトグラフィーの前に、例えば、反応混合物を水で希釈することにより調整できる。
【００７０】
上記実施態様のいずれかの一例を挙げれば、工程（iii）の脱塩は、限外濾過のように膜濾過を用いて達成される。例えば、脱塩は、接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて達成される。脱塩に有用な限外濾過膜は当該分野において知られている。典型的な膜は本明細書に記載される。一例を挙げれば、この限外濾過膜は、ヌクレオチド糖の分子量より小さいＭＷＣＯを有する。よって、ヌクレオチド糖は膜により保持されるが、一方塩イオンは膜フィルターを通り抜けることができる。例えば、ヌクレオチド糖溶液の脱塩に使用される限外濾過膜は、約１００kDa未満、約８０kDa未満、約６０kDa未満、約４０kDa未満又は約２０kDa未満の分子量カットオフを有する。特定の例では、限外濾過膜は、約１０kDa未満の分子量カットオフを有する。約１０kDa〜６０kDaの間のＰＥＧ残基を持つＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類を脱塩するのに使用される限外濾過膜は、典型的には約１kDa〜約５kDaの間の分子量カットオフを有する。
【００７１】
一例を挙げれば、上記の脱塩工程（例えば、限外濾過のような膜濾過を含む）により、膜濾過前の塩導電率に比較してヌクレオチド糖溶液（例えば、溶出画分）の塩導電率は低下する。例えば、膜濾過後の低下した溶出画分の塩導電率は、約１μS/cm〜約１０００μS/cmの間である。特定の例では、膜濾過後の溶出画分の塩導電率は、約１μS/cm〜約６００μS/cmの間、約１μS/cm〜約４００μS/cmの間、約１μS/cm〜約２００μS/cmの間、約１０μS/cm〜約１００μS/cmの間、約１０μS/cm〜約８０μS/cmの間、約１０μS/cm〜約６０μS/cmの間、約１０μS/cm〜約４０μS/cmの間、約１０μS/cm〜約２０μS/cmの間又は約１μS/cm〜約１０μS/cmの間である。好ましい例では、膜濾過中の塩導電率は、約４００μS/cm未満、約３００μS/cm未満、約２００μS/cm未満、約１００μS/cm未満、約８０μS/cm未満、約６０μS/cm未満、約５０μS/cm未満、約４０μS/cm未満、約３０μS/cm未満、約２０μS/cm未満、約１０μS/cm未満、約８μS/cm未満、約６μS/cm未満、約４μS/cm未満、約２μS/cm未満又は約１μS/cm未満まで低下する。
【００７２】
一例を挙げれば、溶出画分又は精製修飾ヌクレオチド糖溶液の最終容量を減少させるために限外濾過（例えば、ＴＦＦ）が利用される。
【００７３】
特定の例では、本発明は、修飾シチジン−一リン酸−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）ヌクレオチドの製造方法を提供する。本発明の方法を用いて製造することができる、典型的な修飾ヌクレオチド糖は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaを包含する。典型的な修飾ヌクレオチド糖類（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）は図２に示される。
【００７４】
上記実施態様のいずれかの一例を挙げれば、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ）は、少なくとも約５０％（w/w）、少なくとも約６０％（w/w）、少なくとも約７０％（w/w）、少なくとも約８０％（w/w）、少なくとも約８５％（w/w）、少なくとも約９０％（w/w）又は少なくとも約９５％（w/w）の純度を有する。特定の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約５０％〜約１００％（w/w）の間、約６０％〜約１００％（w/w）の間、約８０％〜約１００％（w/w）の間又は約９０％〜約１００％（w/w）の間の純度を有する。別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約９６％〜約１００％（w/w）の間、約９７％〜約１００％（w/w）の間、約９８％〜約１００％（w/w）の間又は約９９％〜約１００％（w/w）の間の純度を有する。
【００７５】
１つの実施態様において、本発明の製造法は、他の反応成分からヌクレオチド糖を精製するために利用される。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の場合には、反応混合物は、例えば、ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートの加水分解中に生成する、例えば、ｍＰＥＧ−ＯＨ及びｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）を含有しうる。この反応混合物は更に、例えば、ＣＭＰ−ＳＡグリシン及び／又はＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの加水分解を介して生成する、ＣＭＰを包含することができる。反応混合物は更に、例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの加水分解により生成する、ＳＡ−ＰＥＧ、更には塩類を包含することができる（図３）。
【００７６】
１つの実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満のＣＭＰ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満又は約０．２％未満のＣＭＰ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを提供する。
【００７７】
別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満のＳＡ−ＰＥＧ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満又は約０．２％未満のＳＡ−ＰＥＧ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを提供する。
【００７８】
別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満のｍＰＥＧ−ＯＨ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満又は約０．２％未満のｍＰＥＧ−ＯＨ（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを提供する。
【００７９】
別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満のｐ−ニトロフェノール（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満又は約０．２％未満のｐ−ニトロフェノール（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを提供する。
【００８０】
別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満のｐ−ニトロフェノール（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物を提供する。別の実施態様において、本発明の方法は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧに比較して約０．９％未満、約０．８％未満、約０．７％未満、約０．６％未満、約０．５％未満、約０．４％未満、約０．３％未満又は約０．２％未満のｐ−ニトロフェノール（w/w）を包含する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを提供する。
【００８１】
上記実施態様のいずれかによる別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の総収率で得られる。特定の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約５０％〜約１００％の間、約６０％〜約９５％の間、約８０％〜約９５％の間又は約９０％〜約９５％の間の総収率で得られる。別の例では、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、約４０％〜約９０％の間、約５０％〜約９０％の間、約６０％〜約９０％の間、約７０％〜約９０％の間、約８０％〜約９０％の間、約８５％〜約９０％（w/w）の間又は約８５％〜約９５％の間の総収率で得られる。
【００８２】
典型的な実施態様において、本発明の方法により精製された修飾ヌクレオチド糖は、１種以上のポリマー、例えば、分岐ポリマーに結合した糖、活性化糖又はヌクレオチド糖を包含する。典型的なポリマーは、水溶性及び水不溶性種の両方を包含する。
【００８３】
典型的な修飾ヌクレオチド糖は、ヌクレオチド糖の糖残基内の任意の位置でポリマー修飾基で置換されている。典型的な実施態様において、糖は、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４又はＣ−５の１箇所以上が、リンカー又はリンカーにより結合されたポリマー修飾基で置換されている。別の実施態様において、本発明は、Ｃ−１、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５又はＣ−６の１箇所以上が、リンカー又はリンカーにより糖に結合した修飾基で置換されているピラノースを提供する。好ましくは、リンカー及び／又は修飾基は、糖の炭素から、酸素、窒素又は硫黄ペンダントに直接結合している。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様において、ポリマーリンカー又は修飾基は、生じる複合体が、修飾糖残基を別の種、例えば、ペプチド、グリコペプチド、脂質、糖脂質などに連結するために使用される酵素の基質として機能するように選択される位置に付加される。典型的な酵素は、当該分野において知られており、そしてグリコシルトランスフェラーゼ（シアリルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコシルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトシルトランスフェラーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼなど）を包含する。典型的な本発明の糖ヌクレオチド及び活性化糖複合体はまた、加水分解活性よりも合成活性を持つように修飾された変異体グリコシダーゼ及び変異体グリコセラミダーゼのための基質をも包含する。
【００８５】
典型的な実施態様において、本発明の方法により精製されるヌクレオチド糖は、下記式（Ｉ）及び（II）：
【００８６】
【化２】
0005876649.tif 000003
から選択される式を有する。式（Ｉ）及び（II）において、Ｒ１は、Ｈ、ＣＨ２ＯＲ７、ＣＯＯＲ７又はＯＲ７であり、そしてここで、Ｒ７は、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル又は置換若しくは非置換ヘテロアルキルを表す。Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ又はヌクレオチドを包含する残基である。本実施態様の典型的なＲ２種は、下記式：
【００８７】
【化３】
0005876649.tif 000004
［式中、Ｘ１は、Ｏ又はＮＨを表し、そしてＲ８は、ヌクレオシドである］を有する。
【００８８】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ６’という記号は、Ｈ、置換又は非置換アルキル、ＯＲ９、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ１０を表す。ｄという指数は、０又は１である。Ｒ９及びＲ１０は、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル又はシアル酸から独立に選択される。Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ６’の少なくとも１つは、リンカー又はリンカー−修飾基、例えば、ＰＥＧを包含する。典型的な実施態様において、Ｒ６及びＲ６’は、これらが結合している炭素と一緒に、シアル酸の側鎖の構成要素である。更に別の典型的な実施態様において、この側鎖は、Ｃ−６、Ｃ−７又はＣ−９の１箇所以上が、リンカー又はリンカー−修飾残基で修飾されている。
【００８９】
典型的な実施態様において、リンカーアームは、ｗが０であるとき後述の構造を有し、そしてｗが０より大きいとき、修飾基が下記式：
【００９０】
【化４】
0005876649.tif 000005
［式中、Ｒ１１は、ポリマー残基であり、そしてＬは、結合及び連結基から選択され、そしてｗは、１〜６、好ましくは１〜３そして更に好ましくは１〜２の整数である］で示されるリンカーによって糖コアに繋がっている。
【００９１】
Ｌが、結合であるとき、これはＲ１１の前駆体上の反応性官能基とＬの前駆体上の相補的反応性の反応性官能基との間に形成される。本明細書に説明されるように、適切な反応性官能基を持つ前駆体の選択及び調製は当業者の能力の及ぶ範囲内である。更に、前駆体の化合は、当該分野において周知の化学により進行する。
【００９２】
典型的な実施態様において、Ｌは、アミノ酸、アミノ酸擬態物質、又は小ペプチド（例えば、１〜４個のアミノ酸残基）から生成する連結基であり、修飾糖を与える。別の実施態様において、修飾基はリンカーにより結合している（例えば、ポリマー修飾残基は置換アルキルリンカーにより結合している）。リンカーは、アミノ酸のアミン残基及びカルボン酸（又は反応性誘導体、例えば、活性エステル、酸ハロゲン化物など）と、Ｌ及びＲ１１への前駆体上の相補的反応性の基との反応により生成する。複合体の要素は、本質的に任意の便利な順序で複合体化することができる。例えば、Ｌへの前駆体は、糖類コア上に配置して、次にＲ１１の前駆体及びＬを複合体化することができる。あるいは、Ｌ上に反応性官能基を有するＲ１１−Ｌカセットを調製し、次いでこの種の上の相補的反応性の反応性官能基により糖類に連結することができる。
【００９３】
典型的な実施態様において、リンカー及び／又は修飾残基は、Ｒ３及び／又はＲ６である。別の典型的な実施態様において、Ｒ３及び／又はＲ６は、ポリマー修飾残基と、ポリマー残基を分子の残りの部分に繋げるリンカーＬの両方を包含する。別の典型的な実施態様において、修飾残基はＲ３である。更に別の典型的な実施態様において、Ｒ３は、修飾基と、修飾基を分子の残りの部分に繋げるリンカーＬの両方を包含する。糖がシアル酸である、また別の典型的な実施態様において、リンカー及び／又は修飾基は、Ｒ５にあるか、又はシアル酸側鎖、例えば、Ｃ−９の位置に結合している。
【００９４】
典型的な実施態様において、本発明は、水溶性又は水不溶性ポリマーのような直鎖状ポリマーの間に生成する、糖若しくは活性化糖複合体、又はヌクレオチド糖複合体の精製方法を提供する。これらの複合体において、ポリマーは、糖、活性化糖又は糖ヌクレオチドに結合している。本明細書に考察されるように、ポリマーは、直接か又はリンカーを介するかのいずれかで糖残基に連結されている。
【００９５】
本実施態様による典型的な化合物は、式（Ｉ）又は（II）の構造を有するが、ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５又はＲ６の少なくとも１つは、下記式：
【００９６】
【化５】
0005876649.tif 000006
を有する。Ｒ１１は、存在するか又は存在しない。本実施態様において、典型的なリンカーは、天然又は非天然アミノ酸、アミノ酸類縁体若しくはアミノ酸擬態物質、又は１種以上のこのような種から生成する小ペプチドに由来する。例えば、本発明の方法により精製される化合物に見い出される、ある分岐ポリマーは、下記式：
【００９７】
【化６】
0005876649.tif 000007
を有する。
【００９８】
Ｘａは、分岐ポリマー修飾残基の前駆体上の反応性官能基と、糖残基、又はリンカーへの前駆体との反応により生成する、連結残基である。例えば、Ｘ３’が、カルボン酸であるとき、これを活性化して、アミノ−糖類（例えば、ＧａｌＮＨ２、ＧｌｃＮＨ２、ＭａｎＮＨ２など）からのアミン基ペンダントに直接結合することができる。更なる典型的な反応性官能基及び活性化前駆体は本明細書に後述される。ｃという指数は、１〜１０の整数を表す。他の記号は、上述のものと同じ同一性を持つ。
【００９９】
別の典型的な実施態様において、Ｘａは、別のリンカーと一緒に形成される連結残基である：
【０１００】
【化７】
0005876649.tif 000008
［式中、Ｘｂは、連結残基であり、かつＸａのために説明された基から独立に選択され、そしてＬ１は、結合、置換若しくは非置換アルキル又は置換若しくは非置換ヘテロアルキルである］。
【０１０１】
Ｘａ及びＸｂに典型的な種は、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、及びＯＣ（Ｏ）ＮＨを包含する。
【０１０２】
本実施態様による別の例は、下記式：
【０１０３】
【化８】
0005876649.tif 000009
［式中、ｓは、０〜２０の整数であり、そしてＣ（Ｏ）Ｒ１１は、存在するか又は存在せず、そして存在するとき、Ｒ１１は、修飾基である］を有する。
【０１０４】
修飾基がＰＥＧ残基であるとき、このＰＥＧ残基は、本発明において有用な、任意の分子量、例えば、２kDa、５kDa、１０kDa、２０kDa、３０kDa及び４０kDaを有することができる。
【０１０５】
典型的なヌクレオシドは、ＡＭＰ、ＵＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＴＭＰ、ＡＤＰ、ＵＤＰ、ＧＤＰ、ＣＤＰ、ＴＤＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを包含する。
【０１０６】
好ましい実施態様において、本発明の方法により精製される糖は、リンカー基で修飾されたシアル酸を包含する。このような修飾に好ましい部位は、Ｒ５、Ｒ６又はＲ６’である。よって好ましい実施態様において、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方はリンカーを含む。典型的なリンカーは、グリシルリンカーである。
【０１０７】
別の好ましい実施態様において、本明細書に説明される方法により精製されるヌクレオチド糖は、下記式：
【０１０８】
【化９】
0005876649.tif 000010
［式中、基は、上述のとおりであり、そしてＲ１１は、存在するか又は存在しない修飾基である］を有する。
【０１０９】
１つの実施態様において、修飾シアル酸（ヌクレオチド糖誘導体）は、下記構造を有する：
【０１１０】
【化１０】
0005876649.tif 000011
【０１１１】
更に別の実施態様において、修飾基は、リンカーによりシアル酸に結合している。この記述による典型的な種は、リンカーの第１級アミノ基により結合している修飾基を包含する。典型的な修飾基は、ポリ（エチレングリコール）及びポリ（プロピレングリコール）のような、水溶性ポリマーである。
【０１１２】
別の実施態様において、本発明の方法により製造されるヌクレオチド糖は、下記式：
【０１１３】
【化１１】
0005876649.tif 000012
［式中、下記式：
【０１１４】
【化１２】
0005876649.tif 000013
で示される基は、リンカー−修飾基である］を有する。ｓという指数は、１〜２０から選択される整数である。ｆという指数は、１〜２５００から選択される整数である。Ｑは、Ｈ及び置換又は非置換Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択されるメンバーである。
【０１１５】
本発明の修飾ヌクレオチド糖において修飾基として包含される典型的なＰＥＧ残基は、特に限定されないが、下記式：
【０１１６】
【化１３】
0005876649.tif 000014
［式中、Ｌａは、結合、置換又は非置換アルキル及び置換又は非置換ヘテロアルキルから選択されるリンカーである］で示される基を包含する。Ｘ５、Ｒ１６及びＲ１７という記号は、ポリマー残基及び非反応性基を独立に表す。Ｘ２及びＸ４は、ポリマー残基のＲ１６及びＲ１７をＣに結合する、選択結合断片を独立に表す。ｍ及びｎという指数は、０〜５０００から独立に選択される整数である。
【０１１７】
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、Ａ１０及びＡ１１という記号は、Ｈ、置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換ヘテロアルキル、置換若しくは非置換シクロアルキル、置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、−ＮＡ１２Ａ１３、−ＯＡ１２又は−ＳｉＡ１２Ａ１３を独立に表す。Ａ１２及びＡ１３は、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換ヘテロアルキル、置換又は非置換シクロアルキル、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル、置換又は非置換アリール、及び置換又は非置換ヘテロアリールから独立に選択されるメンバーである。
【０１１８】
Ｘ２及びＸ４の典型的な結合断片は、ＣＨ２、Ｓ、ＳＣ（Ｏ）ＮＨ、ＨＮＣ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）Ｏ、Ｏ、ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、（Ｏ）ＣＮＨ及びＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、及びＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２Ｓ、（ＣＨ２）ａＯ、（ＣＨ２）ａＳ又は（ＣＨ２）ａＹ’−ＰＥＧ又は（ＣＨ２）ａＹ’−ＰＥＧ［ここで、Ｙ’は、Ｓ又はＯであり、そしてａは、１〜５０の整数である］を包含する。
【０１１９】
典型的な実施態様において、ポリマー修飾基は、下記式：
【０１２０】
【化１４】
0005876649.tif 000015
で示される構造を有する。
【０１２１】
上記式の別の典型的な実施態様において、ポリマー修飾基は、下記式：
【０１２２】
【化１５】
0005876649.tif 000016
で示される構造を有する。典型的な実施態様において、Ａ１及びＡ２は、各々−ＯＨ及び−ＯＣＨ３から選択されるメンバーである。
【０１２３】
本実施態様による典型的なリンカー−ポリマー修飾基は、下記式：
【０１２４】
【化１６】
0005876649.tif 000017
で示される基を包含する。
【０１２５】
本発明において有用な直鎖状及び分岐状ポリマー、例えば、ＰＥＧの更に別の特定の実施態様は、下記式：
【０１２６】
【化１７】
0005876649.tif 000018
で示されるものを包含し、そして下記式：
【０１２７】
【化１８】
0005876649.tif 000019
で示されるような、これらの種の炭酸及び活性エステルは、直鎖状及び分岐状ポリマー種、これらの種のリンカーアーム複合体並びにこれらの化合物と糖及びヌクレオチド糖との間の複合体を生成するのに使用することができる。
【０１２８】
本明細書に説明される化合物の調製に有用な直鎖状ＰＥＧ類を活性化するのに適切な、他の典型的な活性化基又は脱離基は、特に限定されないが、下記式：
【０１２９】
【化１９】
0005876649.tif 000020
で示される種を包含する。ポリマー修飾残基への前駆体上の選択された残基に適切な活性化基を選択することは、十分に当業者の能力の及ぶ範囲内である。
【０１３０】
これらや他の種で活性化されるＰＥＧ分子、及び活性化ＰＥＧ類の製造方法は、WO 04/083259に説明されている。
【０１３１】
典型的な実施態様において、分岐ポリマーは、システイン、セリン、リシン、ジ−又はトリ−リシンコアに基づくＰＥＧである。よって、更に別の典型的な分岐ＰＥＧは、下記式：
【０１３２】
【化２０】
0005876649.tif 000021
で示されるものを包含する。
【０１３３】
また別の実施態様において、分岐ＰＥＧ残基は、トリ−リシンペプチドに基づく。このトリ−リシンは、モノ−、ジ−、トリ−、又はテトラ−ＰＥＧ化することができる。本実施態様による典型的な種は、下記式：
【０１３４】
【化２１】
0005876649.tif 000022
［式中、ｅ、ｆ及びｆ’は、１〜２５００から独立に選択される整数であり；そしてｑ、ｑ’及びｑ”は、１〜２０から独立に選択される整数である］を有する。
【０１３５】
本発明の典型的な実施態様において、ＰＥＧは、ｍ−ＰＥＧ（５kDa、１０kDa、又は２０kDa）である。典型的な分岐ＰＥＧ種は、セリン−又はシステイン−（ｍ−ＰＥＧ）２（ここで、ｍ−ＰＥＧは、２０kDa  ｍ−ＰＥＧである）である。
【０１３６】
当業者には明らかになるように、本発明に有用な分岐ポリマーは、上述のテーマに沿った変種を包含する。例えば、上記のジ−リシン−ＰＥＧ複合体は、３つのポリマーサブユニット（三番目は上記構造中に非修飾として示されるα−アミンに結合している）を包含することができる。同様に、３又は４つのポリマーサブユニットで官能基化されたトリ−リシンの使用は本発明の範囲に含まれる。
【０１３７】
当業者であれば、分岐ポリマーのｍ−ＰＥＧアームの１つ以上を、様々な末端、例えば、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２、Ｃ２−Ｃ１０−アルキルなどを持つＰＥＧ残基により置換できることは正しく理解するだろう。更に、上記構造は、α−炭素原子と側鎖の官能基との間のアルキルリンカーの挿入（又は炭素原子の脱離）により容易に修飾される。即ち、「ホモ」誘導体及び高級同族体、更には低級同族体は、本発明において有用な分岐ＰＥＧ類のコアの範囲に含まれる。
【０１３８】
典型的な実施態様において、Ｌａは、リンカーアーム、例えば、グリシルリンカーの遊離アミン残基に、アミン、アミド又はウレタン結合により結合している。
【０１３９】
別の典型的な実施態様において、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。分岐ＰＥＧ種と同様に、直鎖状ＰＥＧは、リンカーアームのアミン残基に、アミン、アミド又はウレタン連鎖により結合することができる。
【０１４０】
本発明の好ましい実施態様において、上述の糖類は、そのヌクレオシド類縁体、リンカーアームを包含する誘導体、修飾基が糖類の糖残基に直接又はリンカーにより結合した類似体、及びこれらのモチーフ各々のヌクレオチド付加物に変換される。
【０１４１】
修飾ヌクレオチド糖の生成
上記実施態様のいずれかによる別の例では、本方法は更に以下を包含する：（vi）修飾ヌクレオチド糖を生成すること。一例を挙げれば、修飾ヌクレオチド糖は、反応性官能基（例えば、第１級アミノ基）を包含するヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリマー試薬、例えば、活性化ポリ（アルキレンオキシド）試薬と接触させることにより生成する。このポリマー試薬は、活性化エステル残基（例えば、ＮＨＳ−エステル）、酸塩化物基又は活性化カーボネート（例えば、ｐ−ニトロフェニルカーボネート）残基を組み込むことにより活性化することができる。典型的な活性化ポリマー試薬は、ｐ−ニトロフェニル残基を包含する。当業者であれば、２つの反応相手を複合体化するのに適切な任意のカップリング反応を利用して、ヌクレオチド糖を修飾基に共有結合させることができることは正しく理解するだろう。「ヌクレオチド糖誘導体」という用語は、ポリマー修飾基上の別の反応性官能基との共有結合を形成するのに有用な反応性官能基を取り込んでいる、任意のヌクレオチド糖である。典型的な反応性官能基基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びスルフヒドリル基のような求核性基を包含する。典型的な求電子性反応性官能基は、活性化エステル、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、酸塩化物などを包含する。
【０１４２】
一例を挙げれば、修飾ヌクレオチド糖は、第１級アミノ基を包含するヌクレオチド糖誘導体を、活性化ポリ（アルキレンオキシド）残基と、ヌクレオチド糖誘導体のアミノ基とポリ（アルキレンオキシド）残基との間に共有結合を生成させるのに十分な条件下で接触させることにより生成する。一例を挙げれば、ヌクレオチド糖誘導体は、グリシン残基に共有結合したヌクレオチド糖である。別の例では、ヌクレオチド糖誘導体は、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＡＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＵＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＧＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＴＭＰ−ＳＡ−グリシン、ＡＤＰ−ＳＡ−グリシン、ＵＤＰ−ＳＡ−グリシン、ＧＤＰ−ＳＡ−グリシン、ＣＤＰ−ＳＡ−グリシン、ＴＤＰ−ＳＡ−グリシン、ＡＴＰ−ＳＡ−グリシン、ＵＴＰ−ＳＡ−グリシン、ＧＴＰ−ＳＡ−グリシン、ＣＴＰ−ＳＡ−グリシン、ＴＴＰ−ＳＡ−グリシン、ｃＡＭＰ−ＳＡ−グリシン及びｃＧＭＰ−ＳＡ−グリシンから選択されるが、ここでシアル酸残基（ＳＡ）は、場合により別の糖残基（例えば、Ｇｌｃ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、フコース、マンノース、キシロース）で置換されているか、かつ／又はグリシン残基は、場合により別のリンカー残基で置換されて反応性官能基を与える。
【０１４３】
一例を挙げれば、本発明の方法に使用されるヌクレオチド糖誘導体は、ヌクレオチド及び糖から、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、シアリルトランスフェラーゼ）のような酵素の存在下で酵素的に合成される。ヌクレオチド糖誘導体の典型的な合成及び精製方法、並びに典型的な酵素は、11月3日出願のWO 2007/056191に開示されており、この開示はその全体が本明細書に取り込まれる。
【０１４４】
上記実施態様のいずれかによる一例を挙げれば、第１級アミノ基、及びｐ−ニトロフェニルカーボネート残基を包含する活性化ポリマー残基（例えば、ポリ（エチレングリコール）−ｐ−ニトロフェニルカーボネート）を包含する、ヌクレオチド糖誘導体は、約８．０〜９．０の間、８．０〜約８．９の間又は約８．０〜約８．８の間のｐＨを有する水性溶媒の存在下で接触させる。
【０１４５】
予期しないことに、本発明者らは、水性溶媒系中の約８．０〜約８．８の間のｐＨ範囲が、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル）のようなｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）カーボネート残基を包含する活性化ポリマー修飾基と、ヌクレオチド糖誘導体（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）との間のカップリング反応進行中に決定的であることを発見した。最適化ｐＨ範囲（ｐＨ７．０以上）では、反応相手及び生成物の加水分解による副産物の生成が大きく減少し、そして最終生成物の収率及び純度が有意に増大する。例えば、ｐＨ７．０未満では、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧは加水分解により分解して、ＣＭＰ、シアル酸−グリシン及びシアル酸−ＰＥＧが生成した。典型的な分解産物は図３に示される。反応混合物の約８．０〜約８．８の間の初期ｐＨ（例えば、約８．６〜約８．７）が、最高変換収率を達成するのに決定的であった。本プロセスを通じての最適ｐＨ範囲は、約８．０〜約８．８の間であった。ｐＨが８．０未満に落ちると、本反応は劇的に進行が遅くなり変換収率が悪化した。
【０１４６】
例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa）は、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン（ＧＳＣ）を、ｐ−ニトロフェニルカーボネート残基を取り込んでいるＰＥＧ試薬（例えば、直鎖状又は分岐状の１０kDa、２０kDa、４０kDa、６０kDa、８０kDa、１００kDa分子量のＰＥＧ試薬）と反応させることにより調製することができる。本実施態様による典型的な合成経路は図２に略述される。本発明は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧが既知プロセスよりも高い純度及び良好な全収率で得られる改善法を提供する。
【０１４７】
陰イオン交換クロマトグラフィー
典型的な実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する試料を、ヌクレオチド糖がカラムから溶出するであろう濃度未満の塩濃度を含むローディング液に入れて陰イオン交換体に装填する。一例を挙げれば、緩衝液のｐＨは、ヌクレオチド糖が陰イオン交換媒体上に保持されるように選択する。緩衝液のｐＨを変化させると、ヌクレオチド糖の電荷が変わり、そしてｐＨ値を低下させると、陰イオン交換体での保持時間が短くなる。あるいは、陰イオン交換条件は、不純物を優先的に結合するように選択し、一方精製ペプチドは流出液中に見い出される。
【０１４８】
カラムは、非結合物質及び／又は樹脂に弱く結合している物質を除去するために、数カラム容量（ＣＶ）の緩衝液で洗浄することができる。次に、例えば、従来法による重炭酸勾配を用いて、カラムから画分を溶出させる。溶液中の塩は、カラムへの結合においてヌクレオチド糖と競合し、そしてヌクレオチド糖が放出される。イオン相互作用が弱い成分は、イオン相互作用が強い成分よりも低い塩濃度で溶出する。試料画分をカラムから採取する。高レベルの所望のヌクレオチド糖及び低レベルの不純物を含有する画分を集めるか、又は別々に処理する。
【０１４９】
陰イオン交換媒体は当業者には知られている。典型的な陰イオン交換媒体は、例えば、Protein Purification Methods, A Practical Approach, Ed. Harris ELV, Angal S, IRL Press Oxford, England (1989); Protein Purification, Ed. Janson JC, Ryden L, VCH-Verlag, Weinheim, Germany (1989); Process Scale Bioseparations for the Biopharmaceutical Industry, Ed. Shukla AA, Etzel MR, Gadam S, CRC Press Taylor & Francis Group (2007), pages 188-196; Protein Purification Handbook, GE Healthcare 2007 (18-1132-29)及びProtein Purification, Principles, High Resolution Methods and Applications (2nd Edition 1998), Ed. Janson J-C and Ryden Lに記載されているが、これらの開示は、引用例としてその全体が本明細書に取り込まれる。本発明の典型的な陰イオン交換体は、第４級アンモニウム樹脂及びＤＥＡＥ樹脂から選択される。１つの実施態様において、陰イオン交換体は第４級アンモニウム樹脂（例えば、Mustang Qイオン交換膜、Pall Corporation）である。他の有用な樹脂は、QXL、Capto及びBigBeads樹脂を包含する。一例を挙げれば、陰イオン交換体はSartobind Qである。
【０１５０】
典型的な陰イオン交換媒体及び典型的な製造法が以下に要約される：
GE Healthcare:
Q-Sepharose FF
Q-Sepharose BB
Q-Sepharose XL
Q-Sepharose HP
Mini Q
Mono Q
Mono P
DEAE Sepharose FF
Source 15Q
Source 3OQ
Capto Q
ANX Sepharose 4 FF (high sub)
Streamline DEAE
Streamline QXL
Applied Biosystems:
Poros HQ 10及び20μmセルフパック（self pack）
Poros HQ 20及び50μmバルク媒体
Poros PI 20及び50μm
Poros D 50μm
Tosohaas:
Toyopearl DEAE 650S, M及びC
Super Q 650
QAE 550C
Pall Corporation:
DEAE Hyper D
Q Ceramic Hyper D
Mustang Q膜吸収体
Merck KGgA:
Fractogel DMAE
FractoPrep DEAE
Fractoprep TMAE
Fractogel EMD DEAE
Fractogel EMD TMAE
Sartorious:
Sartobind Q膜吸収体
【０１５１】
本発明の方法において使用される陰イオン交換体は、場合により、クロマトグラフィー樹脂又は支持体よりはむしろ膜吸着体である。この膜吸着体は、場合により使い捨てできる。
【０１５２】
脱塩
１つの実施態様において、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物は、陰イオン交換クロマトグラフィーの後に脱塩する。
【０１５３】
ヌクレオチド糖溶液の脱塩は、膜が目的のヌクレオチド糖よりも小さいＭＷＣＯを有する膜フィルターを用いて達成される。ヌクレオチド糖は保持液（retentate）中に見い出され、そして最適な緩衝液（例えば、水）中に再構成される。ヌクレオチド糖の脱塩に使用される膜のＭＷＣＯは、膜の細孔によるヌクレオチド糖の漏出を回避するために比較的小さくなければならない。例えば、限外濾過膜のＭＷＣＯは、約１kDa〜１０kDaの間である（例えば、約５kDaの細孔径）。
【０１５４】
１つの実施態様において、ヌクレオチド糖の脱塩は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）を用いて達成される。この手法では、サイズに基づいて分子を分離する。典型的には、高分子量成分は、そのサイズによってビーズ細孔に入れないため、低分子よりも容易にカラムを移動できる。したがって、低分子量成分は、カラムを通り抜けるのに時間がかかる。即ち、不要な塩のような低分子量物質は、目的のヌクレオチド糖から分離することができる。
【０１５５】
典型的な実施態様において、カラム材料は、デキストラン、アガロース、及びポリアクリルアミドゲル（ここで、ゲルは、様々な粒子径を特徴とする）から選択される。別の典型的な実施態様において、この材料は、硬質、親水性サイズ排除材料から選択される。本発明の典型的なゲル濾過樹脂は、Sepharose G-25樹脂（GE Healthcare）である。
【０１５６】
典型的な実施態様において、脱塩は、陰イオン交換クロマトグラフィー後（例えば、Q-Sepharoseクロマトグラフィー後）に実行される。
【０１５７】
本発明の方法によりヌクレオチド糖を精製するために、所望の炭水化物を、炭水化物を精製すべき溶液の不要な成分（混入物）から分離するのに適切な膜が選択される。膜の選択における目的は、特定の応用のために、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、膜組成、透過率、及び阻止特性、即ち、他の種、例えば、塩や他の一般に小さいか又は反対に荷電した分子は通り抜けられるが、特定の分子は保持する膜の全能力を最適化することである。成分ｉの保持パーセント（Ｒｉ）は、式：Ｒｉ＝（１−Ｃｉｐ／Ｃｉｒ）×１００％［式中、Ｃｉｐは、透過液中の成分ｉの濃度であり、そしてＣｉｒは、保持液中の成分ｉの濃度である（両方とも重量パーセントで表される）］により与えられる。ある成分の保持パーセントはまた、保持特性又は膜阻止係数とも呼ばれる。
【０１５８】
典型的な実施態様において、目的のヌクレオチド糖の除去比が、そこからの分離が望まれる化合物の除去比に比較して高い膜が選ばれる。ある膜が、第１の化合物に対する除去比が、第２の化合物に比較して高いならば、その膜を通り抜ける透過溶液中の第１の化合物の濃度は、第２の化合物の濃度に比較して減少している。逆に、保持液中では第１の化合物の濃度は、第２の化合物の濃度に比較して増大している。ある膜が、ある化合物を阻止しないならば、透過液及び阻止部分の両方でその化合物の濃度は、供給溶液中と同じで本質的に変わらない。また、透過液中のある化合物の濃度が、供給溶液中のその化合物の濃度より大きくなるならば、膜が、その化合物に対する負の除去率を持つことも可能である。膜技術の一般的な総説は、"Membranes and Membrane Separation Processes," in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (VCH, 1990)に見い出される；また、Noble and Stern, Membrane Separations Technology: Principles and Applications (Elsevier, 1995)も参照のこと。
【０１５９】
出発点として、一般には、供給流中に存在する不要な化合物は膜を通り抜けられるが、所望の化合物を保持することが期待される、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ、しばしば膜細孔径に関連する）を有する膜を選択する。所望のＭＷＣＯは、一般に精製される化合物の分子量よりも小さく、そして典型的には、精製される化合物を含有する溶液から除去すべき不要な混入物の分子量より大きい。例えば、２００Daの分子量を有する化合物を精製するには、ＭＷＣＯが約２００Daより小さい膜を選ぶであろう。例えば、１００DaのＭＷＣＯを持つ膜もまた適切な候補であろう。本発明に利用できる膜は、ある程度そのＭＷＣＯに基づいて、所望の分離法に応じて、限外濾過（ＵＦ）膜、ナノ濾過（ＮＦ）膜、又は逆浸透（ＲＯ）膜として分類される。本発明の目的には、ＵＦ、ＮＦ、及びＲＯ膜が、Pure Water Handbook, Osmonics, Inc.（Minnetonka MN）に定義されるように分類される。ＲＯ膜は、典型的には約２００Daより小さい表示ＭＷＣＯを有しており大部分のイオンを阻止し、ＮＦ膜は、一般に約１５０Da〜約５kDaの間の表示ＭＷＣＯを有し、そしてＵＦ膜は、一般に約１kDa〜約３００kDa（このようなＭＷＣＯ範囲は糖類様の分子を想定する）の間の表示ＭＷＣＯを有する。ヌクレオチド糖ＰＥＧ複合体を精製するのに有用な本発明の好ましい限外濾過膜は、１９Kdの分子量カットオフを有する。
【０１６０】
特定の分離法に適切な膜を選ぶのに考えられる第２のパラメーターは、膜のポリマータイプである。本発明に有用な典型的な膜は、無機、有機、又は無機と有機との混合であろうと従来の膜材料から製造される。典型的な無機材料は、ガラス、セラミック、サーメット、金属などを包含する。ＵＦ帯域に好ましいセラミック膜は、例えば、Asaedaらの米国特許第4,692,354号、Alaryらの第4,562,021号などに記載されるように製造することができる。ＮＦ及びＲＯ応用に好ましい有機材料は、典型的には、等方性であろうと、異方性であろうと、繊維の内腔（bore）側又は外殻（shell）側のいずれかに薄層又は「皮膚」を持つポリマーである。繊維に好ましい材料は、米国特許第4,230,463号、4,806,244号及び4,259,183号に開示されるような、ポリアミド、ポリベンズアミド、ポリスルホン（特に、スルホン化ポリスルホン及びスルホン化ポリエーテルスルホンを包含する）、ポリスチレン（アクリロニトリル−スチレン、ブタジエン−スチレン及びスチレン−ビニルベンジルハロゲン化物コポリマーのようなスチレン含有コポリマーを包含する）、ポリカーボネート、セルロースポリマー（酢酸セルロースを包含する）、ポリプロピレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール、フルオロカーボンなどである。ＮＦ及びＲＯ膜は、ポリマー識別層に加えて、しばしば多孔性支持基板よりなる。
【０１６１】
適切な膜組成を選択する際に特に重要なのは、膜表面電荷である。要求されるＭＷＣＯ範囲内で、その炭水化物のイオン電荷及び混入物の電荷に適切な表面電荷を有する膜が選択される。特定の膜のＭＷＣＯは一般に不変であるが、供給溶液のｐＨを変化させると、膜表面電荷を変えることによって膜の分離特性に影響を及ぼすことができる。例えば、中性ｐＨで正味の負の表面電荷を有する膜は、単に溶液のｐＨを下げることにより正味の中性電荷を有するように調整することができる。溶液ｐＨの調整の更に別の効果は、混入物上及び目的の炭水化物上のイオン電荷を調節することである。したがって、適切な膜のポリマータイプ及びｐＨを選ぶことにより、混入物と膜の両方が中性で、混入物の通過を促進するシステムを得ることができる。例えば、中性ｐＨで混入物が負に荷電しているならば、混入物をプロトン化するために供給溶液のｐＨを下げることがしばしば望まれる。例えば、溶液のｐＨを少なくとも約３まで、好ましくは少なくとも約４まで、更に好ましくは少なくとも約５まで、そして更に好ましくは少なくとも約６まで下げることにより、リン酸陰イオンがプロトン化して膜を通過できるため、リン酸の除去が促進される。陰イオン性炭水化物の精製には、ｐＨは、一般に約ｐＨ１〜約ｐＨ７の間、好ましくは約３〜約７の間、そして更に好ましくは約４〜約６の間である。反対に、混入物が正の表面電荷を有するならば、約ｐＨ７〜約ｐＨ１４の間に供給溶液のｐＨを調整することができる。例えば、アミノ基（−ＮＨ３＋）を有する混入物を含有する溶液のｐＨを上げると、アミノ基が中性になり、よってその膜の通過を促進する。即ち、本発明の１つの態様は、膜と接触する溶液のｐＨを調整することにより分離を調節することを伴う；これにより混入物のイオン電荷を変化させ、また膜の表面電荷に影響を及ぼすことによって、所望の炭水化物の精製を促進することができる。当然、膜への損傷を回避するため、特定の膜の許容しうるｐＨ範囲に関しては、製造業者の取扱説明書に従う必要がある。
【０１６２】
幾つかの応用には、混合物は先ず、あるｐＨでナノ濾過又は逆浸透に付し、次に目的のヌクレオチド糖を含有する保持液を様々なｐＨに調整して、更なる一連の膜精製に付す。例えば、ｐＨ３、好ましくは少なくとも約４、更に好ましくは少なくとも約５、そして更に好ましくは少なくとも約６での、Osmonics MX07膜（約５００DaのＭＷＣＯを有するナノ濾過膜）による、シアリル乳糖を合成するために使用される反応混合物の濾過では、シアリル乳糖は保持して、大部分のリン酸、ピルビン酸、塩及びマンガンを溶液から除去するが、また少量のＧｌｃＮＡｃ、乳糖、及びシアル酸も除去する。保持液のｐＨを約７、例えば７．４に調整後、更なるMX07膜による再循環によって、大部分の残存リン酸、全てのピルビン酸、全ての乳糖、少量のシアル酸、及び相当量の残存マンガンが除去される。
【０１６３】
ヌクレオチド糖を、所望のオリゴ糖又はヌクレオチド糖を合成するのに使用される酵素のようなタンパク質を含有する混合物から精製しようとするならば、精製手順の第１工程としてタンパク質を除去することが、しばしば望まれる。タンパク質よりも小さいヌクレオチド糖では、この分離は、溶液から除去すべきタンパク質又は他の高分子の分子量よりも小さいが、精製されるオリゴ糖の分子量より大きいＭＷＣＯを有する膜を選ぶことにより達成される（即ち、この場合の阻止率は、所望の糖類よりもタンパク質に対して高い）。よってＭＷＣＯよりも大きい分子量を有するタンパク質及び他の高分子は、この膜によって阻止されるが、一方ヌクレオチド糖は膜を通り抜ける。反対に、オリゴ糖又はヌクレオチド糖を、そのオリゴ糖又はヌクレオチド糖よりも小さいタンパク質から精製しようとするならば、そのタンパク質の分子量よりも大きいが、そのオリゴ糖又はヌクレオチド糖の分子量より小さいＭＷＣＯを有する膜を使用する。一般に、炭水化物からのタンパク質の分離には、普通には限外濾過（ＵＦ）膜と呼ばれる膜を利用する。本発明の方法に使用するのに適したＵＦ膜は、Millipore Corp.（Bedford, MA）、Osmonics, Inc.（Minnetonka, MN）、Filmtec（Minneapolis, MN）、UOP、Desalination Systems、Advanced Membrane Technologies、及びNittoを含む、幾つかの製造業者から入手できる。
【０１６４】
本発明はまた、ナノ濾過（ＮＦ）又は逆浸透（ＲＯ）膜を用いることにより、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物から塩及び他の低分子量成分を除去する方法を提供する。ナノ濾過膜は、分離が分子量とイオン電荷の両方に基づく種類の膜である。これらの膜は、膜を通り抜ける種のサイズに関して、典型的には逆浸透と限外濾過膜との間に位置する。ナノ濾過膜は、膨潤ポリマーネットワークの連鎖の間に典型的にはミクロ細孔又は開口部を有する。非イオン化分子の分子量カットオフは、典型的には１００〜２０，０００ダルトンの範囲にある。同じ分子量のイオンでは、膜除去（保持）は、電荷密度の増大のため、特定の膜で０、１、２、３などのイオン電荷に対して累進的に増大する（例えば、Eriksson, P., "Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration," Environmental Progress, 7:58-59 (1988)を参照のこと）。ナノ濾過はまた、Chemical Engineering Progress, pp. 68-74 (March 1994), Rautenbach et al., Desalination 77:73 (1990)、及びUSPN 4,806,244に記述されている。典型的な応用では、目的のヌクレオチド糖は、ナノ濾過膜に保持され、そして混入塩及び他の不要な成分は通り抜ける。本発明の方法に有用なナノ濾過膜は、典型的には約４０％〜約１００％、好ましくは約７０％〜約１００％、更に好ましくは約９０％〜約１００％の目的のヌクレオチド糖に対する保持特性を有する。本発明に使用されるナノ濾過膜は、従来のナノフィルター膜のいずれか１つであってもよいが、ポリアミド膜が特に適している。特に、Millipore Corp.（Bedford, MA）、Osmonics, Inc.（Minnetonka, MN）、Filmtec、UOP、Advanced Membrane Technologies、Desalination Systems、及びNittoを包含する幾つかの製造業者は、本発明の方法に使用するのに適切なナノ濾過膜を流通させている。例えば、適切な膜は、とりわけOsmonics MX07、YK、GH(G-10)、GE(G-5)、及びHL膜を包含する。
【０１６５】
逆浸透（ＲＯ）膜もまた、選択分子を保持しながら、種々の水性溶質を通り抜けさせる。一般に、浸透とは、純粋な液体（通常は水）が溶液（通常は糖又は塩及び水）へと半透膜を通り抜ける、溶液を希釈するため、及び２種の液体間の浸透平衡を達成するためのプロセスのことをいう。対照的に、逆浸透は、膜系への外部圧力の付加により、膜系の食塩水又は糖溶液区画から純水区画へと通り抜ける水分子により逆の流れが生じる、圧力による膜プロセスである。半透性で非多孔性のＲＯ膜は、水に溶解した物質の浸透圧より高い圧力で膜に送り込まれる水供給を必要とする。ＲＯ膜は、低分子量分子（＜２００ダルトン）及びイオンをも水から有効に除去することができる。好ましくは、逆浸透膜は、約４０％〜約１００％、好ましくは約７０％〜約１００％、そして更に好ましくは約９０％〜約１００％の目的のヌクレオチド糖の保持特性を有する。適切なＲＯ膜は、特に限定されないが、とりわけFilmtec BW-30、Filmtec SW-30、Filmtec SW-30HR、UOPのＲＯ膜、DesalのＲＯ膜、OsmonicsのＲＯ膜、Advanced Membrane TechnologiesのＲＯ膜、及びNittoのＲＯ膜を包含する。適切なＲＯ膜の一例は、Milliporeカタログ番号CDRN500 60（Millipore Corp., Bedford MA）である。
【０１６６】
本発明に使用される膜は、既知の膜構成物のいずれに利用してもよい。例えば、この膜は、扁平状、プレート・フレーム状、管状、らせん巻き状、中空糸状などであってよい。好ましい実施態様において、この膜はらせん巻き状である。この膜は、直交流又は深層配置のいずれかを包含する、任意の適切な配置で利用することができる。本発明の限外濾過、ナノ濾過及び逆浸透精製に好ましい「直交流」濾過では、「供給」又は目的の炭水化物を精製すべき溶液は、膜表面に平行するか又は正接するかのいずれかで膜チャネルを流れて、保持液（再循環液又は濃縮液とも呼ばれる）流と透過液流とに分離する。効率的な膜を維持するために、供給流は、膜に阻止された蓄積粒子を洗い流すための剪断力及び／又は乱流を生み出すよう、膜表面に平行に十分に高速で流すべきである。よって直交流濾過は、３本の流れ：供給液、透過液及び保持液を必要とする。対照的に、「全量」又は「深層」フィルターには、２つの流れ：供給液及び濾液（又は透過液）しかない。全ての粒子と膜に阻止された大分子を保持する再循環液又は保持液流は、再循環液流が生成する膜モジュールに全部を再循環することができるか、又は部分的にこの系から除去することができる。本発明の方法が、例えば、ヌクレオチド糖を低分子量成分から精製するために使用されるとき、所望のヌクレオチド糖は、保持液流（又は深層フィルターでは供給液流）に含有され、一方透過液流は、除去された混入物を含有する。
【０１６７】
本発明の精製方法は、濾過が実施される、圧力、流量、及び温度を調整することにより更に最適化できる。ＵＦ、ＮＦ、及びＲＯは、一般に、膜を通り抜ける溶液の浸透圧に打ち勝つための大気圧を超える圧力上昇を必要とする。最大及び推奨操作圧力に関しては膜の製造業者の取扱説明書に従うことができるが、漸増調整を行うことにより更なる最適化が可能である。例えば、ＵＦの推奨圧力は、一般に約２５〜約１００psiの間であり、ＮＦでは約５０psi〜約１５００psiの間、そしてＲＯでは約１００〜約１５００psiの間であろう。濃縮液（供給溶液）及び透過液の両方の流量もまた、望まれる精製を最適化するために調整することができる。再び、特定の膜の製造業者の推奨値が、漸増調整を行う最適化プロセスを開始する出発点として役立つ。濃縮液に典型的な流量（Ｐｃ）は、約１〜約１５ガロン／分（GPM）の間であり、更に好ましくは約３〜約７GPMの間であろう。透過液では、約０．０５GPM〜約１０GPMの間の流量（Ｐｆ）が典型的であり、約０．２〜約１GPMの間の流量が好ましい。精製が実施される温度もまた、精製の効率及び速度に影響を及ぼしうる。約０〜約１００℃の間の温度が典型的であり、約２０〜４０℃の間の温度が大部分の応用に好ましい。高温になると、一部の膜では、膜の細孔径が上昇するため、精製を最適化するために調整することができる追加のパラメーターを提供することになる。
【０１６８】
好ましい実施態様において、濾過は、流量、圧力、温度、及び精製に影響を及ぼしうる他のパラメーターを自動制御するための手段を提供する、膜精製機で実行される。例えば、Osmonics 213T膜精製機は、上記の他の会社が製造した機器と同様に、本発明の方法に使用するのに適している。
【０１６９】
膜は、使用後又は膜の透過性減退後、容易に洗浄することができる。洗浄は、水又は苛性溶液で濯ぐことにより、必要に応じてわずかに高温で実施することができる。流れに少量の酵素が含有されるならば、少量の界面活性剤、例えば、ULTRASILの存在下で濯ぐのが有効である。また、より高価なナノ濾過膜を保護するためにプレフィルター（１００〜２００μm）を使用することができる。他の洗浄剤は、必要に応じて使用することができる。洗浄方法の選択は、洗浄される膜に依存し、そして膜の製造業者の取扱説明書を参考にすべきである。洗浄は、前進流フラッシング又は逆進流フラッシングにより達成することができる。
【０１７０】
本発明の精製方法は、単独で、又は他の炭水化物の精製方法と組合せて使用することができる。例えば、目的のヌクレオチド糖を含有する混合物から特定のイオンを除去するために、ナノ濾過／逆浸透の前又は後に、あるいは濾過の前後両方に、イオン交換樹脂を使用することができる。イオン交換は、第１巡目のナノ濾過又は逆浸透後に残る、リン酸のようなイオン及びヌクレオチドを除去するには特に望ましい。上述のようなシアリル乳糖合成の場合には、これは、例えば、AG1X-8（酢酸塩型、BioRad；他のイオン交換樹脂については、例えば、BioRadカタログを参照のこと）のような陰イオン交換樹脂を、約ｐＨ３又はそれ以下の保持液に、リン酸濃度が必要なだけ低下するまで加えることにより達成できる。このプロセスでは、酢酸が放出されるため、イオン交換の次に、ナノ濾過又は逆浸透系による更なる精製を行おうとするだろう。例えば、透過液の導電率が低くかつ安定化するまで、Osmonics MX07又は類似の膜によりｐＨ３又はそれ以下の溶液を循環することができる。次にこの溶液のｐＨは、約７、例えば、７．４までＮａＯＨで上げることができ、そしてこの溶液は、残存酢酸ナトリウム及び塩を除去するために同じ膜により再循環させることができる。陽イオンは同様に除去することができる；例えば、Ｍｎ２＋を除去するために、AG50WX8(H+)（BioRad）のような酸性イオン交換樹脂を使用することができる。
【０１７１】
濾過
１つの実施態様において、合成後、ヌクレオチド糖溶液は、場合により濾過によって清澄にする。このヌクレオチド糖溶液は、混入塩及び他の不要な混入物がこのヌクレオチド糖溶液から除去される、膜フィルター（例えば、袋状フィルター）に通す。この清澄化工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。好ましい実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に清澄にする。ヌクレオチド糖溶液は、１回以上清澄にしてもよい。
【０１７２】
一例を挙げれば、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を用いて精製する。中空糸濾過により、例えば、ヌクレオチド糖の酵素調製により導入されたタンパク質を除去する。中空糸膜は、酵素調製からのタンパク質を保持するが、一方ヌクレオチド糖溶液には膜を通り抜けさせる。典型的な実施態様において、この中空糸膜は、接線濾過スキッド（tangential filtration skid）を持つ中空糸膜を含む。中空糸濾過工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に中空糸濾過を受ける。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に中空糸濾過を受ける。ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を利用して１回以上濾過してもよい。
【０１７３】
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液はナノ濾過を用いて精製する。ナノ濾過により、塩及び他の低分子量成分を混合物から除去する。ナノ濾過膜は、分子量及びイオン電荷に基づいて分子を分離する。非イオン化分子の分子量カットオフは、典型的には１００〜２０，０００ダルトンの範囲にある。典型的な応用において、目的の糖類はナノ濾過膜に保持され、混入塩及び他の不要な成分は通り抜ける。ナノ濾過工程は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過を最初に、そして次にナノ濾過を受ける。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、最初にナノ濾過を、そして次に中空糸濾過を受ける。別の方法では、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過又はナノ濾過のいずれかを用いて精製することができる。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後にナノ濾過を受ける。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後にナノ濾過を受ける。ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過を利用して１回以上濾過してもよい。ナノ濾過後、精製されたヌクレオチド糖溶液は、一般に保存されるか、又は更なる精製を受けてもよい。
【０１７４】
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、場合により脱色（例えば、溶液を活性炭に通すことによる）してもよい。好ましい実施態様において、脱色は、ヌクレオチド糖溶液を、クロマトグラフィーシステムに取り付けた活性炭のプレ充填カラムに通すことを伴う。脱色は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に脱色する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に脱色する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に脱色する。ヌクレオチド糖溶液は１回以上脱色してもよい。
【０１７５】
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターを用いて精製する。荷電深層媒体フィルターにより、例えば、エンドトキシンをヌクレオチド糖溶液から除去する。エンドトキシンは、細菌の細胞壁外側の病原体中に見い出されたリポ多糖類のような毒性の天然化合物である。荷電深層媒体フィルターによる精製は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、脱色後に濾過する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に荷電深層媒体フィルターにより精製する。ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターを用いて１回以上濾過してもよい。
【０１７６】
別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、滅菌フィルターを用いて精製する。滅菌フィルターにより、混入塩及び他の不要な混入物をヌクレオチド糖溶液から除去する。更に好ましい実施態様において、滅菌フィルターは、最終濾過及び保存のためにバッグマニホールド方式で予め包装及び滅菌化される。滅菌フィルターによる精製は、プロセスの任意の工程に組み込むことができる。１つの実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、荷電深層媒体フィルターによる精製後に滅菌フィルターにより濾過する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、脱色後に滅菌フィルターにより精製する。更に別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ナノ濾過後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、中空糸濾過後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、清澄化後に滅菌フィルターにより精製する。別の実施態様において、ヌクレオチド糖溶液は、ヌクレオチド糖の合成後に滅菌フィルターにより精製する。ヌクレオチド糖溶液は、滅菌フィルターを用いて１回以上濾過してもよい。
【０１７７】
以下の実施例は、例証の目的にのみ提示されるものであり、本発明を限定するものでも定義するものでもない。以下の実施例は、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の製造方法を記述している。この焦点は説明の明瞭さのためであり、本プロセスを限定するものと解釈すべきでない。当業者であれば、記述されるプロセスが、それぞれＣＭＰ及びシアル酸以外のヌクレオチド及び糖残基を包含する、修飾ヌクレオチド糖にも等しく応用されることは正しく理解するところであろう。
【発明を実施するための形態】
【０１７８】
実施例
一般：
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類（例えば、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa）の生産のための従来の製造方法では、逆相クロマトグラフィー（例えば、Ｃ−４樹脂）を利用した。典型的な既知の方法は、塩基加水分解、次にＴＦＦ、次にｐＨ中和、次に逆相クロマトグラフィー、次に脱塩、次に溶媒除去（例えば、回転蒸発）及び凍結乾燥を包含する。このプロセスは、主に逆相クロマトグラフィー工程に関連する限界（例えば、樹脂の高コスト、工業的規模のプレ充填Ｃ−４カラムの入手可能性、有機溶媒使用の必要性）のため、更にはこのアプローチは全ての反応混入物を完全に分離することができないために、大規模な応用（kg量の生産）には適していないことが分かった。したがって、上記欠点に対処するために、特に単位操作の数を減らすために、代わりの合理化された製造法を開発した。
【０１７９】
典型的な改良法を図１に示す。１つの実施態様において、本改良法は、５種の単位操作しか含まない。これらは、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを生成するためのカップリング（ＰＥＧ化）反応、本質的にＴＨＦを除去するための回転蒸発、陰イオン交換クロマトグラフィー（精製工程）、ＴＦＦを使用する脱塩／濃縮／ダイアフィルトレーション、及び固体生成物を生成するための凍結乾燥を包含する。凍結乾燥を除いて各工程は、プロセスの成績を改善するために最適化されており、このためＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類が高純度で得られる。
【０１８０】
カップリング反応の変換収率は、ＰＥＧのサイズにより６７〜９９％の範囲であった。ＡＥＸクロマトグラフィーのこの工程の収率は９５〜９９％の範囲であり、そしてＴＦＦ工程は９０〜９５％の範囲であり、カップリング反応に由来する全ての混入物（ＳＡ−ＰＥＧを包含する）を本質的に除去する。結合反応、回転蒸発、イオン交換、ＴＦＦ及び凍結乾燥の単位操作の生成物の総回収率は、約６５〜７７％の間であった。新しいプロセスによって製造されるＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類は、約９０と９５％の間の純度であった。最終生成物の１Ｈ−ＮＭＲ分析では、ＳＡ−ＰＥＧ不純物の存在は示されなかった。ＩＣＰ分析では、生成物が二ナトリウム塩型であり、別のナトリウム塩は含まないことを示した。
【０１８１】
方法と材料
Q-Sepharose Big BeadsはGE Healthcareから得た。ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンナトリウム塩はAMRIから得た。１０kDa  ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートはDow Chemical Companyから得た。４０kDa  ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートはNOFから得た。
【０１８２】
一般には以下の装置を使用した：蠕動ポンプ（Cole-Palmer、Masterflex L/Sデジタルスタンダードドライブ、easy-load IIポンプヘッド）；蠕動ポンプ（Cole-Palmer、Masterflex L/Sデジタル標準ドライブ、easy-load Iポンプヘッド）；ＦＰＬＣ（GE Healthcare、AEKTA FPLC）；ＨＰＬＣポンプＡ及びＢ（Dynamax、SD-1）；ＨＰＬＣ検出器（Dynamax、UV-C）；ＨＰＬＣ検出器（Varian、ProStarモデル３４０）；ＥＬＳ検出器（S.E.D.E.R.E. France、Sedex 55）、凍結乾燥機（VirTis、6K Benchtop）；イオン交換カラム（４Ｌ）（Sepracor SA、285530、１８０×３００mm）；イオン交換カラム（１２mL）（Biovalve, Inc.、Omnifit、006CC-10-50-AF、１０×２５０mm）；イオン交換カラム（２Ｌ）（GE Healthcare、BPG 100/500カラム、18-1103-01）；イオン交換カラム（１００mL）（GE Healthcare, XK26/40、18-8768-01）；導電率計（Fisher Thermo Electron Corporation、Accumet Basic AB30、Orion 4 star）；ｐＨ計（Orionモデル250A0；容積式ポンプ（Teknoflow Inc.、Labtop (300/350)）；Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース（Millipore、P2PLACV01；１kDa再生セルロース膜；０．１m2；Ｖスクリーン）；Pellicon 2 Standard 3K膜、再生セルロース（Millipore、P2PLBCV01；３kDa再生セルロース膜；０．１m2；Ｖスクリーン）；Pellicon 2 Standard 5K膜、再生セルロース（Millipore、P2C005C01；５kDa再生セルロース膜；０．１m2；Ｃスクリーン）；Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース（Millipore、P2PLACC01；１kDa再生セルロース膜；０．１m2；Ｃスクリーン）；Pellicon 2 Standard 1K膜、再生セルロース（Millipore、P2PLACV05；１kDa再生セルロース膜；０．５m2；Ｖスクリーン）。
【０１８３】
ＮＷＰ＝標準化透水性；ＧＳＣ＝ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン；ＰＳＣ＝ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa
【０１８４】
１Ｈ−ＮＭＲ（５００MHz、８００ＭＨｚ）スペクトルはＤ２Ｏで記録した。化学シフトは、水ピークに対してppmで表す。
【０１８５】
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類を含有する混合物を逆相ＨＰＬＣを利用して分析した（例えば、純度及び回収率測定）。典型的な方法を以下に示す：Chromolith Performance RP18カラム（VWR又はPhenomonex）をBeckman  ＨＰＬＣシステムに取り付けた。オートサンプラー（１０℃）を介して、３５℃に維持したカラムに試料を注入した。カラムを流量５．０mL/分で以下の勾配条件で溶出した（溶離液Ａ：２０mMリン酸カリウム、１mM  ＴＡＢＨＳ、ｐＨ＝６．２；溶離液Ｂ：１００％アセトニトリル）：０．５％  Ｂを２分、次に連続直線勾配で２分で２０％  Ｂまで、８分で４０％  Ｂまで、最後に４０％  Ｂで均一濃度溶出を７分間。カラムを０．５％  Ｂで３分間再平衡化して、総分析時間は２２分間であった。溶出したピークを２７１nmで検出した。ＧＳＣ及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa（AMRI）を、保持時間及び較正標準物質として使用した。ＧＳＣ標準物質（AMRI）を使用して、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa濃度を算出するための標準曲線を確定した。これらの標準物質の純度は定量的ＮＭＲ分析により測定した。
【０１８６】
精製及び脱塩したＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ試料のナトリウム含量は、誘導結合プラズマ分析（ＩＣＰ）により測定した。
【０１８７】
実施例１
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の調製
１．１．  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaの調製
シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−グリシルシアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）二ナトリウム塩（１．２３g、７３．５重量％純度、１．３４mmol）を、１Ｌの１ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水（８０mL）に溶解した。この無色溶液のｐＨは１０．４８であった。無水ＴＨＦを加え（３２０mL）、５００mMリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ４．６）５．５mLを滴下により加えてｐＨを８．６に調整した。次にこの反応溶液に１０kDa  ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（２０ｇ、２．０mmol、１．５当量）を一度に加えた。ＰＥＧ試薬が溶解後、溶液のｐＨは８．７であった。この黄色の溶液を２０℃で２１時間撹拌した。次に０．１Ｍ  ＮａＯＨ（４．０mL）を加えて、反応混合物のｐＨを７．８から８．５に調整した。この反応混合物は更に３時間撹拌し、ＴＨＦは、ロータリーエバポレーターを使用した減圧下で３０℃での蒸発により除去した。採取した液体の容量が３２０mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水（４００mL）で希釈し、この溶液を０．２２ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の濾液の最終容量は６８４mLであり、導電率は０．９７mS/cmであった。ＨＰＬＣにより測定した変換収率は８２％であった（表１、バッチ９）。
【０１８８】
１．２．  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaの調製
シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−グリシルシアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）二ナトリウム塩（０．６１g、７３．５重量％、０．６５６mmol）を、５００mLの１ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水（４０mL）に溶解した。この無色溶液のｐＨは１０．５であった。この撹拌溶液に無水ＴＨＦ（１６０mL）を加え、５００mMリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ４．６）２．０mLを滴下により加えてｐＨを（１１．２から）８．５に調整した。この反応溶液に２０kDa  ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（２０．０ｇ、１．０mmol、１．５当量）を一度に加えた。ＰＥＧが溶解後、溶液のｐＨは８．６であった。この黄色の混合物を２０℃で２１時間撹拌した。反応混合物のｐＨをＮａＯＨ（１．０Ｎ、２．０mL）で８．５に調整し、反応混合物を更に１８時間撹拌した。ＴＨＦは、減圧を利用した３５℃でロータリーエバポレーターでの回転蒸発により除去した。採取した液体の容量が１６０mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水（３００mL）で希釈し、溶液を０．２２ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットで真空を利用して濾過することにより不溶性物質をどれも除去した。黄色の溶液の最終容量は４７６mLであり、導電率はｐＨ７．２１で０．７２５mS/cmであった。ＨＰＬＣにより測定した変換収率は８７％であった（表５、例２）。
【０１８９】
１．３．  ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの調製
シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−グリシルシアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）二ナトリウム塩（３６８mg、７３．５重量％純度、０．４０mmol）を、５００mLの１ツ口丸底フラスコ中のMilli Q水４０mLに溶解した。この撹拌溶液に無水ＴＨＦ（１６０mL）を加えた。５００mMリン酸一ナトリウム溶液（ｐＨ４．６）２．０mLを滴下により加えて、この混合物のｐＨを１１．５から８．６に注意深く調整した。この反応混合物に４０kDa  ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート（２０．９６ｇ、９０％活性化、０．４４mmol、１．１当量）を一度に加えた。２０時間後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液１．４mLを加えて、反応混合物のｐＨを８．３１から８．８２に調整した。更に２２時間後、０．１Ｎ  ＮａＯＨ約０．８mLを加えることにより、混合物のｐＨを８．５２から８．８９にした。更に２４時間後（総反応時間６６時間）、減圧下でロータリーエバポレーターを使用して３５℃未満の水浴温度を利用してＴＨＦを除去した。採取した液体の容量が１６０mLを超えたとき、蒸発を停止した。生じた黄色の溶液をMilli Q水６００mLで希釈し、真空ポンプで０．２２ミクロンの1L Nalgeneフィルターユニットにより濾過した。フィルターをMilli Q水約５０mLで濯いだ。黄色の濾液の最終容量は６７８mLであり、導電率はｐＨ７．２５で０．４０mS/cmであった。変換収率はＨＰＬＣにより５７％であった（表６、実施例５）。反応混合物を２つの等量（３３５mL）に分けた。一方を後述のように精製した。
【０１９０】
実施例２
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の陰イオン交換クロマトグラフィー
２．１．  Q-Sepharose Big Bead樹脂のカラム充填手順（２Ｌスケール）
製造業者の取扱説明書に従ってカラムを調製した。代表的な手順を以下に記載する。
【０１９１】
空のGE BPG 100/500クロマトグラフィーカラムを、清浄度及び構造的完全性について検査した。底フリット（frit）を水で湿らせた。カラムの出口に栓をして、カラムの底に水１〜２cmを注いだ。２０％エタノール中のQ-Sepharose Big Beads樹脂スラリー（約３．２Ｌ、６５％）を再懸濁して均一性を確認した。空気の閉じ込めを防ぐため、樹脂スラリーをカラムの内側に沿ってゆっくり注ぎ入れた。樹脂スラリーをカラムに移した後、２０％エタノールを含有する噴射瓶を使用してカラムの内側を濯いだ。樹脂を約３０分間沈降させて、樹脂の高さが、所望の高さ２５cmより約３〜５cm高いことを確認した（必要であれば更に樹脂を加える）。フローアダプターは、水で満たして、カラムに入れた。フローアダプターと液体との間に空気が入らないように注意した。カラムの出口を開き、フローアダプターがベッド上に静かにおさまるように落として調整した。入口をDynamax SD-1  ＨＰＬＣポンプに連結した。ポンプを開始させ、目標の流量２００mL/分までゆっくり上げていった（流量は、２分間の維持時間で数回上昇変化させて上げることができる）。ベッドが完全に固まってから、ポンプのスイッチを切った。フローアダプターをそれ以上進まないような抵抗があるまで、ベッド上に下げて調整した。カラムの出口を閉じた。樹脂の高さに印をした（２５．４cm）。使用可能な状態で、カラムをまず脱気ＲＯ水４Ｌで洗浄することにより、樹脂スラリーから２０％エタノールを除去した。ここにＮａＯＨ（２ＣＶ、１００mL/分で、４０分の滞留時間）を充填してカラムを消毒し、水酸化物型の樹脂を作成し、ＲＯ水（２ＣＶ、２００mL/分で）で洗浄し、次に１Ｍ重炭酸ナトリウム（３ＣＶ、２００mL/分）を充填して、上述のように重炭酸対イオン型を作成した。
【０１９２】
２．２．  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂（塩化物型；１０cm  ＩＤ×２６cm）２．０Ｌを充填し、２１４nm及び２７１nmの両方で読むことができるＵＶ検出器を備えたDynamax SD-1  ＨＰＬＣシステムに連結した。カラムを脱気水２ＣＶ（４Ｌ）により１００mL/分（７６cm/時）で洗浄することにより、２０％エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを１Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ、４Ｌ、１００mL/分、７６cm/時）で洗浄することにより消毒し、次にＲＯ水（２ＣＶ、４Ｌ、２００mL/分、１３０cm/時）で洗浄し、続いて１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１３０cm/時）で洗浄し、最後にＲＯ水（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１３０cm/時）で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦１０microS/cm（ｐＨ４．５〜６）であった。
【０１９３】
実施例１．１の水性ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa反応混合物（６８４mL、ｐＨ７．２７、導電率０．９７mS/cm）を、流量６５mL/分（５０cm/時）でカラムに装填した。装填が完了後、全ての非結合不純物がカラムから洗浄されＵＶシグナル（２７１及び２１４nm）がベースラインに戻るまで、カラムをＲＯ水４Ｌ（２ＣＶ）により流量１３０mL/分（１００cm/時）で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を得た。図４に示すように５mM  ＮａＨＣＯ３  １．２Ｌ（０．６ＣＶ）を用いて流量１３０mL/分（１００cm/時）で、まずＳＡ−ＰＥＧ不純物（保持時間５５分）をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、３０mM  ＮａＨＣＯ３  ６Ｌ（３ＣＶ）により流量１００cm/時で生成物（保持時間６３分）を溶出した。次に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  １４Ｌ（７ＣＶ）を使用して過剰のＣＭＰ−ＳＡ−グリシン及び他の反応副産物をカラムから溶出した後、カラムを再生した。カラム溶出を２１４nm及び２７１nmの両方でＵＶを使用してモニターし、適切な画分を手動で採取した（図４）。ＳＡ−ＰＥＧ不純物ピークの溶出後、ＵＶ２７１の読み値がベースラインを超えたときに生成物の分画を開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した。生成物含有画分（画分１、２．０Ｌ）を２つの部分に分けた。約５００mLを使用して接線流濾過（Tangential Flow Filtration；ＴＦＦ）工程を最適化し、一方残りの１．５Ｌは後述の最適化ＴＦＦ法により処理した。
【０１９４】
２．３．  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂（塩化物型；１０cm  ＩＤ×２６cm）２．０Ｌを充填し、２１４nm及び２７１nmの両方で読むことができるＵＶ検出器を備えたDynamax SD-1  ＨＰＬＣシステムに連結した。カラムを脱気水２ＣＶ（４Ｌ）により１００mL/分（７６cm/時）で洗浄することにより、２０％エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを１Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ、４Ｌ、１００mL/分、７６cm/時）で洗浄することにより消毒し、次にＲＯ水（２ＣＶ、４Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）で洗浄し、続いて１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）及びＲＯ水（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦１０microS/cm（ｐＨ４．５〜６）であった。
【０１９５】
実施例１．２のＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa反応混合物（４７６mL、ｐＨ７．２１、導電率０．７２５mS/cm）を流量６５mL/分（５０cm/時）で、調製したカラムに装填した。装填が完了後、全ての非結合不純物がカラムから洗浄され、ＵＶシグナル（２１７及び２７１nm）がベースラインに戻るまで、カラムをＲＯ水４Ｌ（２ＣＶ）により流量１３０mL/分（１００cm/時）で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を溶出した。図６に示すように２mM  ＮａＨＣＯ３  ２．０Ｌ（１．０ＣＶ）を用いて流量１３０mL/分（１００cm/時）で、まずＳＡ−ＰＥＧ不純物（保持時間５５分）をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、３０mM  ＮａＨＣＯ３  ６Ｌ（３ＣＶ）により流量１３０mL/分（１００cm/時）で生成物（保持時間７５分）を溶出した。次に１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  １４Ｌ（７ＣＶ）を使用して、過剰のＣＭＰ−ＳＡ−グリシン及び他の反応副産物をカラムから溶出した後、カラムを再生した。カラム溶出を２１４nm及び２７１nmの両方でＵＶ吸収によりモニターし、適切な画分を採取した（図６）。ＳＡ−ＰＥＧ不純物ピークの溶出後、ＵＶ２７１の読み値がベースラインを超えたときに生成物の分画を開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した。生成物含有画分（画分１、２．０Ｌ）を次の工程に使用した。
【０１９６】
２．４．  ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaのQ-Sepharose Big Beads精製
BPG 100/500カラムに、上述のようにQ-Sepharose Big Beads陰イオン交換樹脂（塩化物型；１０cm  ＩＤ×２５．５cm）２．０Ｌを充填し、２１４nm及び２７１nmの両方で読むことができるＵＶ検出器を備えたDynamax SD-1  ＨＰＬＣシステムに連結した。カラムを脱気水２ＣＶ（４Ｌ）により１００mL/分（７６cm/時）で洗浄することにより、２０％エタノール充填溶液を除去した。次にカラムを１Ｍ  ＮａＯＨ（２ＣＶ、４Ｌ、１００mL/分、７６cm/時）で洗浄することにより消毒し、次にＲＯ水（２ＣＶ、４Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）、続いて１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）及びＲＯ水（３ＣＶ、６Ｌ、２００mL/分、１５３cm/時）で洗浄することにより重炭酸塩型に変換した。完了したとき、カラム流出液の導電率は≦１０microS/cm（ｐＨ４．５〜６）であった。
【０１９７】
実施例１．３の反応混合物（３３５mL、ｐＨ７．２５、導電率０．４０mS/cm）を流量４０mL/分（３０．６cm/時）で、調製したカラムに装填した。装填が完了後、容器を水約５００mLで濯ぎ、この溶液をカラムに装填した。次に全ての非結合不純物がカラムから洗浄され、ＵＶシグナル（２１７及び２７１nm）がベースラインに戻るまで、カラムをＲＯ水４Ｌ（２ＣＶ）により流量２００mL/分（１５３cm/時）で洗浄した。段階溶出を利用して生成物を溶出した。図７に示すように２mM  ＮａＨＣＯ３  ２．０Ｌ（１．０ＣＶ）を用いて流量２００mL/分（１５３cm/時）で、まずＳＡ−ＰＥＧ不純物（保持時間４４分）をカラムから溶出した。次に溶離緩衝液濃度を上げ、２０mM  ＮａＨＣＯ３  ６Ｌ（３ＣＶ）により流量２００mL/分（１５３cm/時）で生成物（保持時間４７分）を溶出した。カラム溶出を２１４nm及び２７１nmの両方でＵＶ吸収によりモニターし、適切な画分を採取した（図７）。生成物ピーク最大の吸収の２０％までＵＶ２７１読み値が上昇したとき（ＳＡ−ＰＥＧ不純物ショルダーの除去を可能にする）生成物の分画を開始し、主要な生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した。生成物含有画分をプールして（４．０５Ｌ、ｐＨ＝７．４、１２１８microS/cm）、次の工程に使用した。
【０１９８】
実施例３
限外濾過を利用する脱塩
３．１．  ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−１０kDa生成物プールの接線流濾過（ＴＦＦ）
実施例２．２のQ-Sepharose Big Beadsプール１．５Ｌを、後述の表１に要約したプロセスパラメーターを利用して接線流濾過（ＴＦＦ）により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、３つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター（PLAC-V 1kDa再生セルロース膜；スクリーンタイプ：Ｖ；０．１m2）を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ（L/S 24）で連結した。生成物水溶液約５００mLを５００mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中１４〜１６℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をＴＦＦシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り１Ｌ（これも氷浴を使用して冷却した）を、別のシリコーンチューブ（L/S 25）を介して第２のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第２のポンプの移送流量は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、ＴＦＦプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は２５０mLのメスシリンダー中に画分として採取し、採取した溶液各２５０mLを保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は１２００mL/分に設定し、保持液バルブはこのプロセスの間中一定のＴＭＰ（〜２２psi）を維持するように調整した。透過溶液を容量２５０mL毎にサンプリングし、ｐＨ及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液１．５Ｌが総量約５００mLに濃縮されたら、PETG保持液瓶に冷却ＲＯ水を加えて一定容量を維持した。透過溶液を５００mL毎に連続的にサンプリングした。透過液の容量が〜２０００mLに達し、透過溶液の導電率が４７microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶（１Ｌ）に移した。次いでＲＯ水（１５０mL）を保持液PETG瓶に加え、ＴＦＦシステム中を５分間再循環させた。こうしてシステム中の残りの生成物を除去した。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaのＴＦＦ工程総回収率は、ＨＰＬＣ分析に基づき９０％であった（表２）。再び合わせた保持溶液（４８８mL、ｐＨ＝７．３１、１３８microS/cm）を凍結乾燥すると、白色の固体７．１５ｇ（プロセス総収率６６％）が得られたが、これは現行分析法で８７％の純度であった（表３）。凍結乾燥生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０１９９】
【表１】
0005876649.tif 000023
【０２００】
【表２】
0005876649.tif 000024
【０２０１】
表２では、初期供給溶液の濃縮及び脱塩後に、保持液容量を測定した。保持液温度は、濃縮工程の開始時に測定した初期保持液温度、及びダイアフィルトレーション工程の最後の最終保持液温度である。保持液ｐＨは、第１の保持液（濃縮及びダイアフィルトレーション後）をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。保持液の導電率は、第１の保持液（濃縮及びダイアフィルトレーション後）をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。生成物総回収率は、最終の合わせた保持液（濃縮、ダイアフィルトレーション及びシステム洗浄後）中の生成物の量と比較したシステム供給溶液中の生成物の総量に基づいて決定した。
【０２０２】
【表３】
0005876649.tif 000025
【０２０３】
表３では、乾燥重量は凍結乾燥後の固体重量である。純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した凍結乾燥生成物中の生成物の量を、凍結乾燥試料中の固体の総量で割って求めた（生成物の分子量として、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaには１０，６００ダルトン、又はＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaには２０，６００ダルトンを仮定した）。製造プロセス（反応、溶媒留去、ＡＥＸ精製、濃縮／ダイアフィルトレーション、及び凍結乾燥工程）の総回収率は、得られた生成物のモル数をカップリング反応で使用した制限試薬（ＣＭＰ−ＳＡ−Ｇｌｙ）のモル数で割った比に、処理した生成物プールの割合を掛けたもの×１００％に基づいて算出した。
【０２０４】
３．２．  ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−２０kDa生成物プールの接線流濾過
実施例２．３のQ-Sepharose Big Beads生成物プール（２．０Ｌ）を、上記の表１に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプは、３つのMillipore 1kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター（PLAC-V 1kDa再生セルロース膜；スクリーンタイプ：Ｖ；０．１m2）を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ（L/S 24）を用いて連結した。生成物水溶液約５００mLを５００mLのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒を使用して溶液を撹拌し、温度をモニターし、このプロセスの間中４℃に維持した。供給ライン及び保持液ラインの両方をＴＦＦシステム上のPETG瓶の中に入れた。溶液の残り１．５Ｌ（これも氷浴を使用して冷却した）を、別のシリコーンチューブ（L/S 25）を介して第２のMasterflex蠕動ポンプを使用してPETG瓶に供給した。第２のポンプの移送流量は、供給PETG瓶中で一定容量を維持するために、ＴＦＦプロセスの透過液流量と等しくなるように設定した。透過溶液は５００mLのメスシリンダーを使用して５００mL画分として採取し、保存瓶に移した。蠕動ポンプの初期流量は１２００mL/分に設定し、次いで保持液バルブは、このプロセスの間中一定のＴＭＰ（〜２２psi）を維持するように調整した。処理中、透過溶液を採取５００mL毎にサンプリングし、ｐＨ及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。供給される生成物溶液の元々の容量（２．０Ｌ）が総容量約５００mLに濃縮されたら、保持溶液をダイアフィルトレーションした。ＴＦＦシステムに連結したPETG保持液瓶に冷却ＲＯ水（４℃）を、ダイアフィルトレーション中一定容量を維持する速度で加えた。透過溶液を５００mL毎に連続的にサンプリングし、導電率及びｐＨを記録した。透過液の容量が〜２０００mLに達し、透過溶液の導電率が５６microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶（１Ｌ）に移した。ＲＯ水（１５０mL）を供給PETG瓶に加え、ＴＦＦシステム中を５分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaのＴＦＦ工程総回収率は、ＨＰＬＣ分析で測定すると１１２％であった（表３）。合わせた保持溶液（５３０mL、ｐＨ＝７．８１、１１０microS/cm）を凍結乾燥することにより、１０．５２ｇ（総プロセス収率７７％）を白色の固体として得たが、これは現行分析法で９６％の純度であった（表３）。凍結乾燥生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０２０５】
３．３．  ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa生成物プールの接線流濾過
実施例２．４のQ-Sepharose Big Beads生成物プール（４．０５Ｌ）を、後述の表４に要約したプロセスパラメーターを使用して接線流濾過（ＴＦＦ）により脱塩した。Masterflex L/S蠕動ポンプ（ＴＦＦポンプ）は、２つのMillipore 1kDa Pellicon 2再生セルロース膜；スクリーンタイプ：Ｖ；０．５m2を取り付けたMillipore Pellicon-2 Holderに、シリコーンチューブ（L/S 35）を介して連結した。生成物水溶液約１Ｌを１ＬのPETG瓶に移し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌し、全プロセスの間中温度をモニターした。残りの生成物溶液を氷浴で冷却し、この溶液をシリコーンチューブ（L/S 25）を介して第２のMasterflex蠕動ポンプによりPETG瓶に供給した。第２ポンプの移送速度は、PETG瓶中で一定容量を維持するために、透過液流量と等しくなるように設定した。供給ライン及び保持液ラインの両方をＴＦＦシステム上のPETG瓶に入れた。透過溶液は１．０Ｌのメスシリンダー中に１．０Ｌ画分として集め、保存瓶に移した。ＴＦＦ蠕動ポンプの初期流量を２．４Ｌ/分に設定し、このプロセスの間中一定のＴＭＰ（〜２０psi）を維持するように保持液バルブを調整した。採取した溶液１．０Ｌ毎に透過液をサンプリングし、ｐＨ及び導電率を記録した。透過液流量も手動で記録した。元々の生成物溶液４．０Ｌが総容量約１．０Ｌに濃縮されたら、保持液をダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの間、一定容量を維持する速度で、冷却ＲＯ水（４℃）をPETG保持液瓶に加えた。透過溶液を１．０Ｌ毎に連続的にサンプリングした。透過溶液の総容量が〜４．０Ｌに達し、透過溶液の導電率が５６microS/cmに落ちたら、移送ポンプを止めた。次に保持溶液を別のPETG瓶（２Ｌ）に移した。ＲＯ水（３５０mL）をPETG保持液瓶に加え、ＴＦＦシステム中を５分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaのＴＦＦ工程総回収率は、最終保持液プール及び元々のイオン交換プールのＨＰＬＣ分析に基づき９３％であった（表５、プロセス＃１）。最終ＴＦＦ生成物溶液（１０６０mL、ｐＨ７．６０、６６microS/cm）を凍結乾燥することにより、５．８２ｇ（総プロセス収率６７％）の白色の固体を、ＨＰＬＣによる純度９２％で得た（表６、プロセス１）。凍結乾燥生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。
【０２０６】
【表４】
0005876649.tif 000026
【０２０７】
【表５】
0005876649.tif 000027
【０２０８】
表５では、初期供給溶液の濃縮及び脱塩後に保持液容量を測定した。システムの初期保持液温度は、濃縮工程の開始時に測定した。最終保持液温度はダイアフィルトレーション工程の最後に測定した。保持液のｐＨは、第１の保持液（濃縮及びダイアフィルトレーション後）をシステム洗浄保持液と合わせた後に測定した。保持液の導電率は、第１の保持液（濃縮及びダイアフィルトレーション後）とシステム洗浄保持液とを合わせた後に測定した。生成物回収率は、出発ＩＥＸプールの生成物（ＲＰ−ＨＰＬＣ濃度×容量）に対する最終ＴＦＦ保持液プール中の生成物（ＲＰ−ＨＰＬＣ濃度×容量）の比から算出した。
【０２０９】
【表６】
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【０２１０】
表６では、生成物質量はＴＦＦ保持液プールのＲＰ−ＨＰＬＣ濃度値及び容量から算出した。純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して決定し、ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの質量についての製造業者（NOF）の分析証明書のｍＰＥＧ分子量（４３，３４７ダルトン）を使用して算出した。総回収率は、得られた生成物のモル数（乾燥重量から）を反応における制限試薬のモル数で割った比に、処理した生成物プールの割合を掛けたもの×１００％に基づいて、反応、クロマトグラフィー及びＴＦＦをプロセスを合わせたものについて算出した。
【０２１１】
実施例４
限外濾過を利用する追加の脱塩実験
４．１．  ５kDa膜を使用するＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの脱塩
Masterflex L/S蠕動ポンプは、１つのMillipore 5kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター（PLCC 5kDa再生セルロース膜；スクリーンタイプ：Ｃ；０．１m2）を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ（L/S 15、#96400-15）を介して連結した。システムを２Ｌの水により１０００mL/分でフラッシュした。次に水（２Ｌ）を１０００mL/分でシステム内を再循環させ、透過液約５００mLを２０psiのＴＭＰで採取した。保持液の導電率は、３microS/cmと測定した。標準化透水性（ＮＷＰ）は、〜１．４L/時/m2/psiと測定した。ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa（４．０ｇ）を、５００mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水２００mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方をPETG瓶に入れた。この溶液を５００mL/分で５分間システム中を再循環させた。次にポンプ速度を１０００mL/分に上げ、保持液圧力を１３psiに調整し、これにより供給圧力２５psi及びＴＭＰ  １９psiが得られた。このプロセスの間、ＴＭＰを一定に維持した。透過液を１００mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第２の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液６００mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の１００mL画分の導電率は１２microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間１５〜１６℃であった。平均透過液流量は２８．６mL/分であり、計算された流量は１７．２L/時/m2であった。標準化した透過液速度は０．９０L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水１００mLを５分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。最終の合わせた保持溶液（〜３５０mL、ｐＨ６．６、３３microS/cm）を凍結乾燥することにより、白色の固体３．９２ｇを９８％の回収率で得た（表７）。
【０２１２】
４．２．  ３kDa膜を使用するＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの脱塩
Masterflex L/S蠕動ポンプは、１つのMillipore 3kDa Pellicon 2 "MINI"フィルター（PLCC 3kDa再生セルロース膜；スクリーンタイプ：Ｃ；０．１m2）を取り付けたMillipore Pellicon-2 Mini Holderに、シリコーンチューブ（L/S 15、#96400-15）を介して連結した。システムを水２Ｌにより１０００mL/分でフラッシュした。次に水２Ｌを１０００mL/分でシステムに再循環させ、透過液約５００mLを２０psiのＴＭＰで採取した。保持液の導電率は、５microS/cmと測定した。標準化透水性（ＮＷＰ）は、〜０．７５L/時/m2/psiと測定した。ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa（４．０ｇ）を、５００mLのプラスチック瓶中の冷却Milli Q水２００mLに溶解し、これを氷浴に浸した。磁気撹拌棒により溶液を撹拌した。供給ライン及び保持液ラインの両方を瓶に入れた。この溶液をシステム中に５００mL/分で５分間再循環させた。次にポンプ速度を１０００mL/分に上げ、保持液圧力を２０psiに調整し、これにより供給圧力２０psi及びＴＭＰ  ２０psiが得られた。本プロセスの間、ＴＭＰは一定に維持した。透過液を１００mL画分として採取し、各画分の対応する時間及び保持液の温度を記録した。第２の蠕動ポンプを使用して冷却Milli Q水を送ることにより、保持液瓶中の一定容量を維持した。透過液６００mLが採取されたら、透析工程を完了した。最終の１００mL画分の導電率は３４microS/cmであった。保持液の温度は、本プロセスの間１３〜１５℃であった。平均透過液流量は１６．７mL/分であり、計算された流量は１０．０L/時/m2であり、標準化した透過液速度は０．５０L/時/m2/psiであった。保持液を別の瓶に移し、システムに水１００mLを５分間再循環させた。次に元々の保持溶液と洗浄保持溶液とを合わせた。合わせた保持溶液（〜３００mL、ｐＨ７．４、５６microS/cm）を凍結乾燥することにより、白色の固体３．８６ｇを９５％の回収率で得た（表７）。
【０２１３】
【表７】
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【０２１４】
表７では、温度は、ダイアフィルトレーションプロセスの間中システムの保持液温度範囲である。導電率は、第１の保持液（ダイアフィルトレーション後）とシステムの洗浄保持液とを合わせた後の保持液で測定した。生成物の回収率は、凍結乾燥ＴＦＦ生成物の質量対ＴＦＦの元々の溶液（４ｇ）を調製するのに使用したＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧの質量の比から算出した。
【０２１５】
実施例５
カップリング（ＰＥＧ化）反応の最適化
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaを生成するのに使用したカップリング反応を最適化することにより、変換収率を改善し、反応中のプロセス操作を単純化した（表８）。最高の変換収率を得るのに、わずかにモル過剰のｍＰＥＧ−ｐＮＰ試薬（１．２〜１．５モル当量）が必要であった。反応は、ＴＨＦ／水（４／１）中で３．４〜３．７mMのＣＭＰ−ＳＡ−グリシン濃度及び５０〜５５mg/mLのｍＰＥＧ−ｐＮＰ濃度で行った。
【０２１６】
【表８】
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【０２１７】
表８では、ＰＥＧ−ｐＮＰは１０kDa−ＰＥＧ−ｐＮＰ（仮定ＭＷ：１０，０００ダルトン、１００％活性化を仮定）であり、緩衝液は、反応のｐＨを維持するのに加えられるリン酸緩衝液（０．５Ｍ）の量であり、ｐＨは、カップリング反応中に観測されるｐＨ範囲である。カップリング反応完了後のＰＳＣ対ＧＳＣの量比はＨＰＬＣを利用して測定した。全ての計算は、二ナトリウム塩（ＭＷ＝６７３）としてのＧＳＣ（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン）について純度７３．５％の乾燥重量純度を使用し、１０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰについて１０，０００ダルトン、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaについて１０，７００ダルトンの分子量を仮定する。全ての反応は約１９〜約２０℃の間で実行した。各反応物に加えられるＧＳＣの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。Ｒｋｔ時間は総反応時間である。反応終了後のＰＳＣ濃度は、ＨＰＬＣにより測定した。変換収率はＰＳＣ量（ＨＰＬＣ）対ＧＳＣ量（使用量）の比に基づいた。反応１〜４は、較正標準物質としてＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaを使用してＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。反応５〜１０は、較正標準物質としてＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを使用した。
【０２１８】
データは、最高の変換収率を達成するのに、反応混合物の初期ｐＨ８．６〜８．７が決定的であることを示す（表８）。このプロセスを通して最適ｐＨ範囲は約８．０と８．８の間であった。ｐＨが８．０より低くなると、反応は劇的に遅くなり変換収率が低くなった。ｐＨが７．０より低いと、このような条件下では加水分解のためにＣＭＰ−ＳＡ−グリシン及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧが分解することにより、ＣＭＰ、シアル酸−グリシン及びシアル酸−ＰＥＧが生成するため、ｐＨがこれより低くならないように注意した（図３）。ｐＨが８．８より高いと、１０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰ試薬は急速に加水分解して、変換収率が低くなった（図１、表８：反応１及び２）。いくつかのＣＭＰ−ＳＡ−グリシン試薬は残存ＮａＯＨ（この試薬のナトリウム塩型を確保するため）を含有し、これが水に溶解するとｐＨ＞１０で溶液を生成した。したがってカップリング反応の確立における第１段階は、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンの水への溶解であり、これには、ｍＰＥＧ−ｐＮＰを加える前に、ｐＨを約８．６に下げるための緩衝液（リン酸ナトリウム、ｐＨ４．６）の添加が必要であった。ｐＨ調整後、ｍＰＥＧ−ｐＮＰを反応混合物に加え、この反応混合物を周囲温度（約１９〜２０℃）で維持した。反応が進行すると、加えたリン酸緩衝液がｐＨ８．０より低くなることを防ぎ、酸性種のｐ−ニトロフェノールが生成した。しかしｐＨが８．０より下がった場合、水酸化ナトリウム（０．１Ｎ）を使用することによりｐＨを８．６に上げた。
【０２１９】
反応混合物の粘度のために、安定なｐＨ読み値を達成することは時に困難であり、特に大きなＰＥＧ類が関与する反応の場合はそうであった。より大きなＰＥＧ類（２０kDa及びグリセロール−４０kDa）については、より高濃度のｍＰＥＧ−ｐＮＰを使用することにより収率を上昇させた。ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン濃度が３．３で、反応混合物１mL当たりｍＰＥＧ−ｐＮＰ  １００mgの濃度を使用した（表９と１０）。より高濃度のＰＥＧを使用した場合、変換収率は約１０％上昇した（表１０、反応１〜４）。
【０２２０】
カップリング反応は、完了するまで約２４〜約７２時間を必要とした。反応はＲＰ−ＨＰＬＣを利用してモニターした。ある反応条件（特により大きなＰＥＧ分子が関与するもの）では、約４８〜約７２時間もの長い反応時間が必要であった。
【０２２１】
異なる比のカップリング試薬（ＧＳＣ及び４０kDa−グリセロール−ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネート）を使用しても、変換収率に有意な差は観察されなかった。表１０は、１．４モル当量ＧＳＣ／１モル当量活性化ＰＥＧによる反応が、１．１モル当量活性化ＰＥＧ／モル当量ＧＳＣを含有する反応と、その他は同じ条件下で同じ結果を与えることを示す（反応２及び３）。大過剰の４０kDa−グリセロール−ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートを使用して変換収率を上げることができるかも知れないが、プロセスの経済学としてあまり好ましくない。
【０２２２】
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa及びＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaを製造するためのＰＥＧ化反応も、１００％水中で実行した（ＴＨＦ無し）（表９）。最初は、ＴＨＦの非存在下では反応プロセスがより迅速に進行し、プロセス自体が単位操作としての回転蒸発を必要としないであろうと推定された。結果は、水性反応が可能であることを示す。しかし２０kDa反応については、充分なｐＨモニタリング及び０．１Ｎ  ＮａＯＨによるｐＨ調整が、特に反応の最初の数時間には必要であった。その結果、有意な時間節約は観察されなかった。更に１００％水を使用してＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaを製造した場合、グリセロール−ｍＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニルカーボネートは容易に溶解しなかった。これは、反応の速度と変換収率に影響を与えた。溶媒として水のみを使用してＰＥＧ化最適化プロセスの一環として、異なる緩衝液も検討した。しかし重炭酸ナトリウム緩衝液（１０mM、ｐＨ８．１）及びホウ酸ナトリウム緩衝液（１０mM、ｐＨ８．６）の両方ともが、低い変換収率を与えた（表１０）。
【０２２３】
【表９】
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【０２２４】
表９では、ＧＳＣはＣＭＰ−ＳＡ−グリシンであり、ＰＳＣはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaである。全ての計算は、二ナトリウム塩（６７３ダルトン）としてのＧＳＣについて純度７３．５％（ＨＰＬＣ）の乾燥重量純度を使用し、２０kDa  ｍＰＥＧ−ｐＮＰについて分子量２０，０００ダルトン及び１００％活性化を、そしてＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaについて分子量２０，７００ダルトンを仮定する。各反応に加えられるＧＳＣの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。「緩衝液」は、反応のｐＨを維持するために加えられたリン酸緩衝液（０．５Ｍ）の量を示す。「ｐＨ範囲」は、カップリング反応の間に観測されたｐＨ範囲を示す。「Ｒｋｔ時間」は総反応時間である。ＰＳＣ対ＧＳＣの量比は、カップリング反応完了後にＨＰＬＣにより測定した。ＰＳＣの濃度は、反応終了後にＨＰＬＣにより測定した。変換収率は、ＨＰＬＣにより測定したＰＳＣ対ＧＳＣの量比に基づく。
【０２２５】
【表１０】
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【０２２６】
表１０では、ＧＳＣはＣＭＰ−ＳＡ−グリシンであり、ＰＳＣはＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDaである。全ての計算は、二ナトリウム塩（６７３ダルトン）としてのＧＳＣについて純度７３．５％の乾燥重量純度を使用し、４０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰ（９０％活性化）について分子量４２，８４３ダルトンを、そしてＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaについて分子量４０，７００ダルトンを仮定する。各反応に加えられるＧＳＣの質量及びモル数は、実際の試薬の純度について補正した。「緩衝液」は、反応のｐＨを維持するために加えられたリン酸緩衝液（０．５Ｍ）の量を示す。「ｐＨ範囲」は、カップリング反応の間に観測されたｐＨ範囲を示す。「Ｒｋｔ時間」は総反応時間である。ＰＳＣ対ＧＳＣの量比は、カップリング反応終了後にＨＰＬＣにより測定した。ＰＳＣの濃度は、反応終了後にＨＰＬＣにより測定した。変換収率は、ＨＰＬＣにより測定したＰＳＣ対ＧＳＣの量比に基づく。反応８及び９は、リン酸ナトリウム緩衝液の代わりに１０mMホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．６）１０mLを使用して実行した。
【０２２７】
実施例６
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の典型的な製造プロセス
６．１．  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaの典型的な製造プロセス
ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを水及びＴＨＦ（１部対４部）に３．４mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでｐＨ８．６に調整し、次に１０kDa  ｍＰＥＧ−ｐＮＰ試薬を加えた（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンの実際のモル数に対して１．５モル当量）。ｐＨを８．６に維持しながら、この反応物を室温で２０〜４８時間撹拌した。反応は、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターし、完了後、反応混合物を回転蒸発により濃縮してＴＨＦを除去した。濃縮した水性反応混合物を水（４００mL）で、元々の反応物容量の１．７倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定すると、１microS/cm未満であった。この生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム（樹脂ベッド高さを少なくとも１０cmにして、樹脂１リットル当たりＰＥＧ試薬１０ｇ）に流量５０cm/時で装填した。非結合物質は、水２ＣＶでカラムから洗浄した。ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa不純物は、５mM  ＮａＨＣＯ３（０．６ＣＶ）により流量１００cm/時で、カラムから溶出した。３０mM  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ）によりこれも流量１００cm/時で、純粋な生成物ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaを溶出した。図４に示すように、生成物の分画は、ＵＶ２７１読み値がＳＡ−ＰＥＧ不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した。プールした生成物を４℃に冷却し、１kDa再生セルロース膜を使用する接線流濾過システムを利用して３倍濃縮した（生成物濃度が約１４g/Lまで）。４℃の水（４保持液容量）による保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。次に精製したＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
【０２２８】
６．２．  典型的なＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaの製造プロセス
ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを水及びＴＨＦ（１部対４部）に３．３mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでｐＨ８．６に調整し、２０kDa  ｍＰＥＧ−ｐＮＰ試薬（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンの実際のモル数に対して１．５モル当量）を加えた。ｐＨを８．６に維持しながら、反応物を室温で２０〜４８時間撹拌した。反応は、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してＴＨＦを除去した。濃縮した水性反応混合物を水（３００mL）で、元々の総反応物容量の２．４倍の最終容量まで希釈した。導電率を測定し、０．８microS/cm未満であることを確認した。希釈生成物溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム（樹脂ベッド高さを少なくとも１０cmにして、樹脂１リットル当たりＰＥＧ試薬１０ｇ）に流量５０cm/時で装填した。非結合物質は、水２ＣＶでカラムから洗浄した。ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa不純物は、２mM  ＮａＨＣＯ３（１ＣＶ）により流量１００cm/時でカラムから溶出した。純粋な生成物は、３０mM  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ）によりこれも流量１００cm/時で溶出した（図６）。生成物の分画は、ＵＶ２７１読み値がＳＡ−ＰＥＧ不純物ピークの後にベースラインを超えて上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した。プールした生成物を４℃に冷却し、１kDa再生セルロース膜を含有する接線流濾過システムを利用して４倍濃縮した（生成物濃度が約２１g/Lまで）。４℃の水（４保持液容量）での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
【０２２９】
６．３．  典型的なＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの製造プロセス
ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを水及びＴＨＦ（１部対４部）に２mMの濃度で溶解した。この溶液をリン酸ナトリウムでｐＨ８．６に調整し、４０kDa  ｍＰＥＧ−ｐＮＰ試薬（ＣＭＰ−ＳＡ−グリシンの実際のモル数に対して１．１モル当量）を加えた。ｐＨを８．６に維持しながら、反応物を室温で６０〜６６時間撹拌した。反応は、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターし、反応が完了したとき、反応混合物を回転蒸発により濃縮してＴＨＦを除去した。濃縮した水性反応混合物を水（６００mL）で希釈することにより、容量を元々の総反応物容量の３．４倍まで、かつ導電率を０．５microS/cm未満まで調整した。生成物の希薄溶液をQ-Sepharose Big Beadsカラム（樹脂ベッド高さを少なくとも１０cmにして、樹脂１リットル当たりＰＥＧ試薬５ｇ）に流量３０cm/時で装填した。非結合物質は、水２ＣＶでカラムから洗浄した。ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa不純物は、２mM  ＮａＨＣＯ３（１ＣＶ）により流量１５０cm/時でカラムから溶出した。純粋なＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaは、３０mM  ＮａＨＣＯ３（３ＣＶ）によりこれも１５０cm/時で溶出した（図７）。生成物の分画は、ＵＶ２７１読み値が生成物ピーク最大吸収の２０％（ＳＡ−ＰＥＧ不純物ショルダーの除去を可能にする）まで上昇したときに開始し、生成物ピークの立下り側でピーク最大値の約５％のときに終了した（図７）。プールした生成物を４℃に冷却し、１kDa再生セルロース膜を含有した接線流濾過システムを利用して４倍濃縮した（生成物濃度が約６g/Lまで）。システムが必要とする大きなワーキング容量のために、更なる濃縮は制限された。４℃の水（４保持液容量）での保持液のダイアフィルトレーションを利用して塩を除去し、透過液の導電率が供給水の導電率に近づくまで続けた。精製したＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa溶液を凍結し、凍結乾燥した。
【０２３０】
実施例７
陰イオン交換条件の最適化
GE HealthcareからのQ-Sepharose Big Beads樹脂は、低コストの高い結合能力、高い線流速及び第４級アミンイオン結合官能基を有するため、これをＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類の精製のための樹脂として選択した。異なる対イオン型（塩化物、水酸化物、リン酸及び重炭酸イオンを包含する）の樹脂を、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類を結合するその能力について検討した。恐らくは試薬−樹脂イオン相互作用を妨害する試薬上の大きなＰＥＧ残基のために、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類はこの樹脂に対する結合親和力は低かった。その結果、装填溶液の導電率は１mS/cm未満であるように選んだ。
【０２３１】
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類は塩化物型の樹脂には結合しないが、水酸化物、リン酸塩及び重炭酸塩型には結合した（表１１）。塩化ナトリウムを使用してＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを溶出すると、ＳＡ−ＰＥＧの分離度が達成できず、溶液のｐＨが強い塩基性になるため、水酸化物型の樹脂は処理に使用できなかった。ｐＨの上昇はＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧの分解を引き起こした（表１１）。リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５又はｐＨ８．０）を使用してリン酸塩型の樹脂から生成物を溶出すると、混入物の分離度が悪かった（表１１）。
【０２３２】
溶離緩衝液としての重炭酸ナトリウムにより重炭酸塩型のQ-Sepharose Big Bead樹脂から生成物を溶出したときのみ、供給溶液中の多くの関連混入物（ＣＭＰ、ＳＡ−ＰＥＧ及びＣＭＰ−ＳＡ−グリシンを包含する）が分離された（図５）。反応又は製造プロセス中に生成する可能性のあるＳＡ−ＰＥＧからＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ類を選択的に溶出するのに、ＮａＨＣＯ３緩勾配又は小段階溶出法が必要であった。ＳＡ−ＰＥＧ及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧを溶出するのに、導電率のほんの小段階の上昇が必要なだけであった（＜３０mM  ＮａＨＣＯ３、＜２．７mS/cm）。しかし他の結合反応成分（ＣＭＰ、ＣＭＰ−ＳＡ−グリシン、ｐ−ニトロフェノール）は全て、はるかに高濃度のＮａＨＣＯ３を使用したときのみ溶出された。
【０２３３】
【表１１】
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【０２３４】
表１１では、濃縮及び希釈されたカップリング反応混合物溶液の導電率は＜１．０mS/cmであった。分離は、他の関連混入物（例えば、ＣＭＰ、ＧＳＣ、ＳＡ−ＰＥＧ、ＰＥＧ及びｐ−ニトロフェノール）からのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa生成物の分離を示す。ＰＥＧ及びｐ−ニトロフェノールは、樹脂が塩化物イオン型であるときを除いて、全ての方法により生成物から容易に分離された。ｐＨ８．０のリン酸塩緩衝液もまた、同じ溶出法により検討した。ｐＨ７．５のリン酸塩緩衝液について見られるものと同様の結果を観測した。
【０２３５】
段階溶出の最適化
ＨＣＯ３−型のQ-Sepharose Big Beads樹脂を使用して、ＮａＨＣＯ３緩衝液を用いる段階溶出条件をＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物について注意深く最適化した。早期に溶出するＳＡ−ＰＥＧ不純物ピークと生成物との分離を最大にした。水から低濃度ＮａＨＣＯ３（３０mM、１０mM、５mM）への小段階を、表１２に記載のようにＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaについて調べた。５mM  ＮａＨＣＯ３までの初期段階を用いて、ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaと生成物との間でベースライン分離を達成した。生成物はまた５mMのＮａＨＣＯ３濃度でも溶出したが、生成物ピークの溶出プロフィールは非常に広かった。したがって５mMで０．６ＣＶ後、勾配を直ちに３０mM  ＮａＨＣＯ３まで段階上昇させた。図３に示すように、純粋なＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaは、ｐＨ８．３〜８．６で約１．５ＣＶで効率的に採取した。より強く結合したＣＭＰ、ＣＭＰ−ＳＡ−Ｇｌｙ及びｐ−ニトロフェノール不純物は、１Ｍ  ＮａＨＣＯ３への段階溶出により溶出した。ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaピークも採取し、脱塩（Ｇ−２５カラムで、記載していない）して凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲによる固体の分析により、その構造を確認した。
【０２３６】
ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaとＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa生成物との間で同じベースライン分離を達成するために、２mM  ＮａＨＣＯ３への初期段階溶出が必要であった（図６）。生成物もまた２mM  ＮａＨＣＯ３で溶出し始めた。非常に広い溶出生成物ピークを避けるために、２mM重炭酸ナトリウムでわずか１ＣＶの後に、勾配を３０mM  ＮａＨＣＯ３に段階上昇させた。純粋な生成物は、ｐＨ７．８で約１．５ＣＶで採取した（図５）。ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaピークも採取し、脱塩（Ｇ−２５カラム、記載していない）して凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲによる固体の分析により、その構造を確認した。
【０２３７】
【表１２】
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【０２３８】
表１２では、Q Big Beadsカラムは、実験１〜６についてはGE XK-26（２．６cm×１８．８cm、１００mL）の重炭酸イオン型で、実験７についてはGE BPG 100/500カラム（１０cm×２６cm、２Ｌ）重炭酸塩型である。ＰＥＧ装填量は、原料反応物中に使用した１０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰ質量（グラム）をカラムに装填した最終反応物容量液を乗じて、カラム容量（リットル）で割って計算した。
【０２３９】
ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaは、Q-Sepharose Big Beads樹脂に非常に弱く結合した。生成物とＳＡ−ＰＥＧ副産物は両方とも、２mM  ＮａＨＣＯ３への段階溶出を利用して溶出した。ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDa不純物は、生成物ピークの先端の非常に小さいショルダーとして部分的に分離された（図８）。ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaを２mM重炭酸ナトリウムを使用して採取すると、広い溶出ピーク（３ＣＶ）を採取した。この溶出ピークのｐＨはわずかに６．５であり、これが生成物の分解を引き起こした。
【０２４０】
したがって、ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDaは、２mM重炭酸ナトリウム（１ＣＶ）による段階溶出を利用して溶出した。次に図７に示すように生成物を迅速に溶出するために、３０mM  ＮａＨＣＯ３による段階溶出を上昇させることにより、生成物を溶出した。これらの条件を利用して、ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa生成物は、ｐＨ７．４で２ＣＶでカラムから採取した。更なるｐＨ調整は必要なかった。図５で観察された異常な形のピークは、１０kDa生成物で行ったように（図４）、２mM  ＮａＨＣＯ３段階を完全な１カラム容量（ＣＶ）溶出から０．５ＣＶに短縮することにより防止できた。この単位操作のプロセス段階回収率は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定すると９５を超えることが決定的に判った（図７）。ＳＡ−ＰＥＧ−４０kDaピークも採取して凍結乾燥した。１Ｈ−ＮＭＲによる固体の分析により、その構造を確認した。
【０２４１】
プロセスパラメーター  ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa及び２０kDa生成物の回転蒸発した反応混合物は、導電率がそれぞれ１及び０．８mS/cm未満に低下するまで好ましくは希釈した。更に、生成物の完全な捕捉を確保するために、溶液のｐＨは、好ましくは７．１〜７．６の間とした。この希釈溶液は、ＡＥＸ樹脂１リットル当たりの、反応に使用した活性化ｍＰＥＧ−ｐＮＰ出発試薬１０ｇに対応する濃度でＡＥＸカラムに装填した。ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDa生成物（２２ｇ  ｍＰＥＧ−ｐＮＰ／Ｌ樹脂）には、より高い生成物カラム装填量を使用することができたが、ＳＡ−ＰＥＧとＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaとの分離は消失した（表１１）。
【０２４２】
回転蒸発したＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa反応混合物の導電率を、水希釈により好ましくは０．５mS/cm未満に低下させた。更に、溶液のｐＨは、生成物の完全な捕捉を確保するために、好ましくは７．１〜７．６の間とした。小規模の装填試験による、反応に使用した４０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰ出発試薬各５グラムについてQ-Sepharose Big Beads樹脂約１リットルが必要であることが判った。即ち４０kDa−ｍＰＥＧ−ｐＮＰ２０ｇで始めたＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa反応生成物を捕捉するには、４Ｌのカラムで充分なはずである。これは、これらの溶出条件を利用するＡＥＸ樹脂についての最大装填能力の約７０％である。カラムベッドの高さが１５〜２８cmの間であるカラムを有するクロマトグラフィーの性能に、差は観察されなかった。
【０２４３】
濃縮し希釈した反応混合物を、１５〜５０cm/時の線流速（２Ｌカラム上で２０〜６５mL/分に対応する）でＡＥＸカラムに装填した。全ての場合に、カラムへの装填溶液の滞留時間は約１５分であった。２ＬのＡＥＸカラムを用いて、３つ全てのＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物について１００〜１５０cm/時（２Ｌカラムの１３０〜２００mL/分）の洗浄及び溶出流量を使用した。したがって、反応混合物装填及び生成物溶出を包含する総単位操作時間は、１．５時間未満であった（図３、５及び７）。最大２００cm/時までのより速い溶出流量を使用しても、ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaとＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDa生成物の間の分離の消失は観察されなかった。
【０２４４】
実施例８
限外濾過／ダイアフィルトレーション脱塩工程（ＴＦＦ）の最適化
限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＴＦＦ）を利用してＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧイオン交換溶出プールを濃縮及び脱塩した。ＴＦＦシステムは、Millipore Pellicon-2フラットシート膜（１kDa  ＭＷＣＯ；再生セルロース膜）を使用して、供給溶液を脱塩し、生成物を保持した。
【０２４５】
典型的な接線流濾過プロセス
ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaイオン交換生成物プール（１５００mL、図４）及びＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaイオン交換生成物プール（図６）の両方とも、蠕動ポンプを使用して、３×０．１m2膜（表１）を有するPellicon 2 "MINI"システムを利用して脱塩した。約２２psiの膜貫通圧力を利用したが、これは約３．７LMHの流量を発生させた。
【０２４６】
ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDa（図７）のＡＥＸ溶出プールからの大きな溶出容量のために、２×０．５m2膜を使用して溶出プールを脱塩した（表４）。このシステムのために蠕動ポンプを使用したが、これはＴＭＰが２０psiで３LMHの流量速度を発生させた。処理の間、氷浴中でQ-Sepharose Big Beads溶出生成物プールを冷却することにより、ポンプから発生する熱の結果としてのＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaの分解を防いだ。
【０２４７】
MINIシステムで処理した保持溶液は、それぞれ１４．３g/Lと２１g/Lの生成物濃度に対応する５００mL（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaについては３倍、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaについては４倍）に濃縮した。いずれの透過液試料についても生成物の分解は観察されなかった（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。０．５m2システムの大きなシステム維持容量（２つの膜カートリッジについて約４００mL）のために、達成できる最小保持液容量はわずかに１Ｌ（４〜６倍濃縮）であった。生じた生成物濃度は約５g/Lと非常に薄く、これはより小さい２０kDa生成物について達成された２０g/Lよりはるかに低かった。
【０２４８】
濃縮後、保持液は、４ダイアフィルトレーション容量の冷却水を使用して一定容量でそれぞれダイアフィルトレーションをした（１０及び２０kDa生成物については２Ｌ；４０kDa生成物については４Ｌ）。濃縮及びダイアフィルトレーションプロセスの間中、透過液試料を採取して、ｐＨ及び導電率を記録した。透過溶液の導電率がダイアフィルトレーションに使用した水の導電率（＜５０microS/cm）に近づいたら、ダイアフィルトレーションは完了した。
表８：
【０２４９】
最終のダイアフィルトレーション保持液プールは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析し、凍結乾燥することにより、約３日間にわたって白色の粉末を得た。最終の凍結乾燥ＴＦＦ生成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣ及びＮＭＲにより分析することにより、生成物の回収率（９０〜９５％）及び純度（＞９０％、表２、３、５及び６）を求めた。反応、回転蒸発、イオン交換、ＴＦＦ単位操作及び凍結乾燥を合わせたものの総生成物回収率は、６５〜７７％であった。１Ｈ−ＮＭＲにより、各生成物の構造を確認し、ＩＣＰ試験により、各生成物の構造が二ナトリウム型であることが判った。ＩＣＰ試験はまた、他のナトリウム塩が存在しないことを示した。
【０２５０】
純度及び総収率の計算は、製造業者が報告する、ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ生成物の各々を製造するのに使用されたｍＰＥＧの推定平均質量に基づく（ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−１０kDaでは１０，７００；ＣＭＰ−ＳＡ−ＰＥＧ−２０kDaでは２０，７００；ＣＭＰ−ＳＡ−グリセロール−ＰＥＧ−４０kDaでは４３，３４７）。生成物の分子量の過小評価は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる生成物含量の過小報告をもたらすため、生成物の純度の過小評価となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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