(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハス胚芽抽出物を含有することを特徴とするヒアルロン酸産生促進剤（ただし、飲食品の用途を除く）。
【請求項２】
ハス胚芽抽出物を含有することを特徴とするＩＩ型コラーゲン産生促進剤（ただし、変形性関節症による炎症改善の用途、及び飲食品の用途を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節機能改善剤及び飲食品に関する。具体的には、ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用を有する関節機能改善剤、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生量を高めることができるヒアルロン酸産生促進剤、ＩＩ型コラーゲン産生促進剤、ＴＮＦ−α産生抑制剤、並びにこれらを含有する飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節の表面を覆っている軟骨や滑膜組織から分泌される滑液（関節液）は、関節の荷重の衝撃を和らげたり、関節の動きを滑らかにしたりする機能を果たしていることが知られている。前記滑液の主成分であるヒアルロン酸は、関節をスムーズに動かすための潤滑剤及びクッションの役割を果たしている。
前記滑液中のヒアルロン酸濃度は、正常な人の場合には、約３．４ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬであるが、変形性関節症の場合には前記濃度が約３０％〜５０％低下することが知られている。そして、滑液中のヒアルロン酸量の減少又はその粘性の低下によって、軟骨の摩耗、関節痛、運動障害といった症状が現れる。
【０００３】
上記疾患において、潤滑機能の改善、関節軟骨の被覆（保護）、痛みの抑制及び病的関節液の改善若しくは正常化のために、関節液中のヒアルロン酸量を増加させることが考えられる。例えば、慢性関節リウマチ患者にヒアルロン酸ナトリウムの関節注入療法を行うと上記症状の改善が認められることが報告されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、上記疾患の治療は長期にわたり、しかも医師の処方を必要とする。また、ヒト細胞のヒアルロン酸を産生する薬剤としては、インシュリン様成長因子−１、上皮成長因子（非特許文献２参照）及びインターロイキン−１（非特許文献３参照）等のサイトカイン、或いはフォルボールエステル（非特許文献４参照）などが知られているが、いずれも医薬品や飲食品等として簡便にかつ安心して使用することができるものではない。
【０００５】
また、関節の骨と骨とが接する面には粘弾性に富んだ関節軟骨が存在しており、関節を保護すると共に関節面を滑らかにして関節の動きを円滑にしている。前記関節軟骨が激しい運動や加齢に伴ってすり減ると、変形性関節症に移行しやすいことが知られている。前記関節軟骨は自己修復能が乏しく自然には治癒し難いという問題がある。
そこで、関節軟骨の創傷治癒及び健康な関節の維持のためには、軟骨前駆細胞の軟骨細胞への分化誘導及び軟骨の主要構成成分であるＩＩ型コラーゲンの産生促進作用を有することが求められる。
【０００６】
また、関節機能が低下し、関節炎が発生している場合、マクロファージが活性化されてＴＮＦ−αなどのサイトカインを盛んに産生することが知られている。前記サイトカインにより、好中球及び単球の誘導と、マクロファージ自身やヘルパーＴ４細胞の活性化とが加速されると、炎症が拡大しパンヌス（炎症を生じた滑膜の表層細胞が増殖して、それが絨毯状に広がって軟骨や骨に浸潤している状態）が形成される。前記パンヌスや軟骨がＴＮＦ−αの刺激を受けることで細胞外マトリックス蛋白分解酵素（ＭＭＰ−３）が産生され、軟骨や骨を破壊する結果、関節の変形などの症状を引き起こすと考えられている。このような炎症のスパイラルに入り込むことを防ぐため、マクロファージにおけるサイトカインの産生を抑制することが求められる。
【０００７】
したがって、生体内において滑膜細胞によるヒアルロン酸産生量を高め、産生されたヒアルロン酸が関節に補充されること、軟骨前駆細胞から軟骨細胞への分化誘導によるＩＩ型コラーゲンの産生を促進すること、及びマクロファージにおけるサイトカインの産生を抑制することにより軟骨の破壊を抑制することによって変形性関節症に対して効果を発揮する、つまり、関節のスムーズな動きを維持し、関節の変形を防ぎ、変形性関節症による痛み、運動障害などへの予防及び改善効果を有する簡便で安全性の高い素材が待ち望まれている。
【０００８】
一方、ハスは古来よりその実が食されて或いは漢方薬として服用されており、その安全性が確立されている。
このハスを用いたものとして、例えば、ハスの種子の胚芽を水や水混和性の有機溶媒などを用いて抽出された抽出物が血圧降下作用を有すること（特許文献１参照）、同じくハスの胚芽から抽出された抽出物が高血圧症などの循環器疾患や気管支喘息などの呼吸器疾患、不眠症などの中枢神経疾患などに作用を有すること（特許文献２参照）、同じくハスの胚芽から抽出された抽出物が皮膚の老化防止作用を有すること（特許文献３参照）、更には、同じくハスの胚芽から抽出された抽出物が皮膚の表皮層の新陳代謝を促す作用を有すること（特許文献４参照）がそれぞれ開示されている。
【０００９】
しかしながら、ハス（種子）の胚芽については、上記作用効果が知られているだけであり、ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用、関節機能改善作用などについては知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭６３−６６１２６号公報
【特許文献２】特開昭６４−９０１２９号公報
【特許文献３】特開２００２−２９９８０号公報
【特許文献４】特開２００２−６８９９３号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「炎症」、日本炎症学会、１１巻、１６頁、１９９１年
【非特許文献２】“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ”、１０１４、ｐ．３０５（１９８９）
【非特許文献３】「日本産科婦人科学会」雑誌、４１巻、１９４３頁、１９８９年
【非特許文献４】“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、ｖｏｌ．１４８、ｐ．３７７（１９８３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生量を高めること、軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲンの産生量を高めること、及びマクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生量を低減することにより、変形性関節症等による関節の機能障害を改善することができる安全性の高い新規な関節機能改善剤、並びに飲食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、古来より食され、或いは漢方薬として使用されており、その安全性が確立されているハスの実の一部であるハス胚芽を用いて抽出されたハス胚芽抽出物が、ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用、及びＴＮＦ−α産生抑制作用を有することを知見した。
【００１４】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ハス胚芽抽出物を含有することを特徴とする関節機能改善剤である。
＜２＞  関節機能改善剤が、ヒアルロン酸産生促進剤、ＩＩ型コラーゲン産生促進剤、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制剤のいずれかである前記＜１＞に記載の関節機能改善剤である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の関節機能改善剤を含有することを特徴とする飲食品である。
＜４＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の関節機能改善剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生量を高めること、軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲンの産生量を高めること、及びマクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生量を低減することにより、変形性関節症等による関節の機能障害を改善することができる安全性の高い新規な関節機能改善剤、並びに飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、参考例１におけるコラーゲン産生促進作用を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２におけるコラーゲン産生促進作用を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３におけるコラーゲン産生促進作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（関節機能改善剤）
本発明の関節機能改善剤は、ハス胚芽抽出物を含有してなり、必要に応じて更にその他の成分を含有してなる。また、前記関節機能改善剤は、ヒアルロン酸産生促進剤、ＩＩ型コラーゲン産生促進剤、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制剤のいずれかであり得る。なお、本発明にいうヒアルロン酸産生促進剤とは、上記したように滑膜細胞におけるヒアルロン酸の産生を促進する作用を有するものであって、後述する実施例の試験法にて作用を確認することができる物質を意味する。また、前記ＩＩ型コラーゲン産生促進剤とは、軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲンの産生を促進する作用を有するものであり、前記ＴＮＦ−α産生抑制剤とは、マクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生を抑制する作用を有するものである。また、前記関節機能改善剤は、前記ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用及びＴＮＦ−α産生抑制作用の少なくともいずれかを有する。
【００１８】
本発明においては、スイレン科ハス属のハス(Ｎｅｌｕｍｂｏ ｎｕｃｉｆｅｒａ  Ｇａｅｒｔｎ．)の種子中にある胚（胚芽）が用いられる。胚芽は、通常緑色で棒状をしており、採取した種子から取り出し、生のまま或いは直ちに乾燥したものが好適に用いられる。
【００１９】
ハス胚芽抽出物は、この胚芽を水や各種の有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール等の低級脂肪族アルコール、アセトン、１，３−ブチレングリコール等の極性溶媒のほかクロロホルム、酢酸エチル等の中間性溶媒又はこれらの混合物、更には水とこれらの有機溶媒との混合抽出溶媒を用いて抽出することにより得られるものである。
【００２０】
抽出に際してはハス種子より得られた胚芽をそのまま用いることもできるが、抽出効率を高めるため、予め粉砕して用いるのが好ましい。また、ヘキサンなどの非水系溶媒（非極性溶媒）を用いて予め脱脂処理しておくと、不純物含量が少なくなり、より効果の高い抽出物が得られる。
【００２１】
前記抽出は、室温ないし加熱下において、抽出溶媒に応じて任意の装置を用いて行うことができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に粉砕したハス胚芽を投入し、ときどき撹拌しながら可溶性成分を溶出させる。その後、ろ過して抽出残渣を除去し、抽出液を得ることができる。このとき用いる溶媒量は、概ねハス胚芽に対して質量比で、１：５〜１：２０となるように用いるのがよい。
【００２２】
こうして得られた抽出物（液）は、そのまま関節機能改善剤として用いることもできるが、これらの剤の作用を妨げない範囲で、抽出液を濃縮した濃縮液や更に濃縮したエキス状物あるいは抽出溶媒等を留去した乾燥物として提供することもできる。
【００２３】
また、ハス胚芽の抽出物は特有のにおいと味を有するので、その作用を低下させない程度に脱臭や脱色等を目的として精製を行うのが好ましい。もちろん、その使用目的等に応じて、例えば、本発明に係る飲食品に含有させる場合には、大量に使用するものではないため、そのまま使用しても実用上差し支えない。
【００２４】
更に、本発明の関節機能改善剤には、必要に応じて上記抽出物に、保存やその取り扱いを容易にすべく、ショ糖や乳糖などの各種糖類、たんぱく質やデンプンなどの賦形剤、その他の任意の助剤を用いてもよい。また、適宜、製剤化して提供することも可能であって、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状など任意の剤形として提供することも可能である。
【００２５】
＜用法＞
本発明の関節機能改善剤は、滑膜細胞によるヒアルロン酸産生量を高め、産生されたヒアルロン酸が関節に補充されることによって変形性関節症に対して効果を発揮するヒアルロン酸産生促進剤として適用できる。また、本発明の関節機能改善剤は、軟骨前駆細胞の軟骨細胞への分化を誘導し、軟骨の主要構成成分であるＩＩ型コラーゲンの産生量を高め、関節軟骨の創傷治癒及び健康な関節の維持に効果を発揮するＩＩ型コラーゲン産生促進剤として適用できる。また、本発明の関節機能改善剤は、マクロファージにおけるサイトカインの産生を抑制することにより軟骨の破壊を抑制し、炎症を抑制する効果を有するＴＮＦ−α産生抑制剤として適用できる。したがって、本発明のヒアルロン酸産生促進剤、ＩＩ型コラーゲン産生促進剤及びＴＮＦ−α産生抑制剤は、関節のスムーズな動きを維持し、関節の変形を防ぎ、変形性関節症による痛み、運動障害などへの予防及び改善効果を有する人体に安全な関節機能改善剤として用いることができる。その形態としては、飲食品又は皮膚外用剤に配合して用いたり、医薬製剤として投与したりすることができる。また、これらの剤は、ヒトだけでなく動物にも適用することができる。
【００２６】
前記関節機能改善剤を皮膚外用剤に配合する場合、ハス胚芽抽出物の配合量（乾燥質量）としては、外用剤全量中、０．０００１質量％〜７０質量％が好ましく、０．００１質量％〜３０質量％がより好ましい。
【００２７】
前記関節機能改善剤を皮膚外用剤に適用する場合、上記成分に加えて、更に必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば、酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２８】
更に、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属イオン封鎖剤、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン等の防腐剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸又はその誘導体、甘草抽出物、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸若しくはその誘導体又はその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。
【００２９】
また、前記皮膚外用剤は、外皮に適用される化粧料、医薬部外品等、特に好適には化粧料に広く適用することが可能であり、その剤型も、皮膚に適用できるものであればいずれでもよく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、化粧水、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。
【００３０】
使用形態も任意であり、例えば、化粧水、乳液、クリーム、パック等のフェーシャル化粧料、ファンデーション、口紅、アイシャドウ等のメーキャップ化粧料、芳香化粧料、浴用剤等に用いることができる。
【００３１】
また、トイレタリー製品として、例えば、ボディーソープ、石けん等の形態に広く適用可能である。更に、医薬部外品であれば、各種の軟膏剤等の形態に広く適用が可能である。そして、これらの剤型及び形態に、本発明の関節機能改善剤の採り得る形態が限定されるものではない。
【００３２】
本発明の関節機能改善剤を医薬製剤として用いる場合、該製剤は経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、又は注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの医薬製剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等の賦形剤などを適宜使用してもよい。
【００３３】
（飲食品）
本発明の関節機能改善剤は、任意の飲食品に添加することにより、あるいはこれらを主成分とした栄養補助食品などとして、経口的に活用することができる。
前記飲食品としては、特に制限はなく、例えば、各種の清涼飲料水、果汁飲料、和洋菓子、乳製品その他の畜産加工品、果実加工品、野菜加工品、穀物の加工品、水産加工品、調味料、ビタミンなどを主成分としたいわゆる各種の健康食品など数多くの飲食品が挙げられる。また、栄養補助食品としては、例えば、液剤の形態のもの又は錠剤などの形態のものとして提供することもできる。この場合の添加率は、添加対象である飲食品の一般的な摂取量を考慮して、液状、固形状など抽出物の形態によっても異なるが、概ね通常成人１日当たりのハス胚芽抽出物摂取量として約１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、原料であるハス胚芽乾燥物に換算して、概ね３ｍｇ〜６，０００ｍｇになるように添加するのが適当である。
【００３４】
なお、本発明の飲食品には、ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用、及びＴＮＦ−α産生抑制作用を妨げない限り、飲食品の製造に通常用いられる各種原材料を用いることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００３６】
（実施例１：ヒアルロン酸産生促進作用の評価）
ハス胚芽抽出物について、ヒト滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生促進作用に関する試験を行った。具体的には、まず、慢性関節リウマチ患者由来のヒト滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ）をヒト滑膜細胞増殖培地（Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＥＬＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．製）を用いて７日間培養した。なお、培養装置としては、三洋電機株式会社製ＣＯ２インキュベーターを用い、培養条件としては、ＣＯ２濃度５％、インキュベーション温度３７℃とした。
その後、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液を用いて、３分間トリプシン処理を行い、細胞を回収した。
次いで、回収した細胞を１．２５×１０５ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度になるように１質量％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有ヒト細胞滑膜細胞増殖培地（Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＥＬＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＩＮＣ．製）で希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、２４時間培養した。培養後、１質量％ＦＢＳ含有ヒト細胞滑膜細胞増殖培地で溶解したハス胚芽抽出物を各ウェルに１００μＬずつ添加し、２４時間培養した。
【００３７】
なお、前記ハス胚芽抽出物としては、ハス胚芽エキスパウダーＭＦ（丸善製薬株式会社製）を用いた。ハス胚芽抽出物の濃度としては、培地中の最終濃度が２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ及び４００μｇ／ｍＬの３種類について試験を行った。
次いで、培養後、各ウェルの培地中のヒアルロン酸量をヒアルロン酸結合タンパク質（ＨＡＢＰ）を用いたサンドイッチ法により測定した。具体的には、培養上清をＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ）にて１１倍希釈後、ＨＡＢＰプレートにアプライした。室温で２時間放置後、ＷａｓｈｉｎｇＢｕｆｆｅｒ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｄＨ２Ｏ）にて洗浄後、Ｂ−ＨＡＢＰ溶液（生化学バイオビジネス株式会社製）を１００μＬ添加し、１時間反応させた。その後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）で発色した後、４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。ヒアルロン酸量は、各ウェルから得られた試料について測定された吸光度を標準となるサンプルの検量線から換算した。結果を表１に示す。
ヒアルロン酸産生促進率の計算方法は、以下のとおりである。
ヒアルロン酸産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ  ×  １００
ただし、Ａは、ハス胚芽抽出物を添加した場合のヒアルロン酸量、Ｂは、ハス胚芽抽出物を添加しなかった場合のヒアルロン酸量を、それぞれ表す。
【００３８】
前記試験の対照試験として、慢性関節リウマチ患者由来のヒト滑膜細胞（ＨＦＬＳ−ＲＡ）を新生児皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ、ＲＩＫＥＮ  ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ）に変更し、培地をヒト滑膜細胞増殖培地から線維芽細胞増殖培地Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ａｌｐｈａ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製）に変更した以外は、上記の方法と同様にして、新生児皮膚線維芽細胞におけるハス胚芽抽出物のヒアルロン酸産生促進作用を調べた。結果を表１に示す。
【００３９】
【表１】
0005992691.tif 000002
表１から、ハス胚芽抽出物は、ヒト滑膜細胞に対する優れたヒアルロン酸産生促進作用を有することが分かった。また、ハス胚芽抽出物は、新生児皮膚線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用を有さないことから、前記作用は滑膜細胞に特異的であることが分かった。
【００４０】
（ＩＩ型コラーゲン産生促進作用の評価：参考例１、並びに実施例２及び３）
被験試料として、ハス胚芽エキスパウダーＭＦ（丸善製薬株式会社製）を用い、軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲン産生促進作用を特開２０１０−１８９３１５号公報及び特開２０１１−２１３６９４号公報に記載の方法に従い、以下のようにして試験した。なお、本試験に用いる軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５は、コンフルエントになった後に軟骨細胞へ分化する細胞であり、未分化時にはＩ型コラーゲンを産生し、分化時にＩＩ型コラーゲンを産生するという特性が知られている（“Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、ｖｏｌ．１３３、Ｎｏ．２、ｐ．４５７（１９９６）参照）。そこで、培養条件を変更し、未分化時と分化時における被験試料の作用を確認する試験を実施した。
【００４１】
（参考例１）
マウス由来軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５（理研バイオリソースセンターから入手）を、５質量％のＦＢＳを含有するダルベッコＭＥＭ／ハムＦ−１２培地（質量比１：１、日水製薬株式会社製）を用いて前培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように５質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ／ハムＦ−１２培地で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、１日間培養した。培養終了後、培地を取り除き、０．１質量％ＢＳＡ含有ダルベッコＭＥＭ／ハムＦ−１２培地（ＦＢＳを含まない）で溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、３日間培養した。培養終了後、培地を取り除き、細胞をプレートに固定させウェル中のコラーゲンをシリウスレッド（和光純薬工業株式会社製）、非コラーゲンタンパク質をファストグリーン（和光純薬工業株式会社製）によって染色した。染色後、メタノールと１ＮのＮａＯＨとの混合液（質量比１：１）で抽出した後、波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に非コラーゲンタンパク質量として波長６０５ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差からコラーゲン量を算出した。
なお、コラーゲン産生促進率の計算方法は以下の通りである。
コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ：被験試料添加時のコラーゲン産生量
Ｂ：被験試料無添加時（陰性対照）のコラーゲン産生量
【００４２】
なお、被験試料を添加しない陰性対照及びハス胚芽エキスパウダーＭＦを添加した細胞は未分化であることを顕微鏡観察により確認した。したがって、この試験はＩ型コラーゲンの産生促進作用の評価に相当する。また、分化誘導させた陽性対照として、ハス胚芽エキスパウダーＭＦに代えてアスコルビン酸リン酸マグネシウムを用い、同様に評価した。結果を表２及び図１に示す。
【００４３】
【表２】
0005992691.tif 000003
【００４４】
表２及び図１から、未分化の軟骨前駆細胞においてはハス胚芽エキスパウダーＭＦにはコラーゲン産生促進作用が認められなかった。したがって、Ｉ型コラーゲン産生促進作用は有さないと考えられる。
【００４５】
（実施例２）
参考例１において、被験試料添加後の培養時間を３日間から１４日間に変更した以外は、参考例１と同様にして、コラーゲン産生促進率を評価した。結果を表３及び図２に示す。なお、試料を添加しない陰性対照細胞は未分化であることを顕微鏡観察により確認した。また、ハス胚芽エキスパウダーＭＦを添加した細胞では、一部の細胞において軟骨細胞に分化していることを顕微鏡観察により確認した。また、分化誘導させた陽性対照として、ハス胚芽エキスパウダーＭＦに代えてアスコルビン酸リン酸マグネシウムを用い、同様に評価した。
【００４６】
【表３】
0005992691.tif 000004
【００４７】
表３及び図２から、ハス胚芽エキスパウダーＭＦにおいてコラーゲン産生促進作用が認められた。実施例２では、Ｉ型及びＩＩ型のどちらのコラーゲン産生促進能も検出されると考えられるが、参考例１の結果と合わせて考えると、ハス胚芽エキスパウダーＭＦは分化を誘導することでＩＩ型コラーゲンの産生を促進していると考えられる。
【００４８】
（実施例３）
参考例１において、細胞の培養条件を以下のように変更した以外は、参考例１と同様にして、細胞を固定し、染色して、コラーゲン産生促進率を算出した。結果を表４及び図３に示す。なお、本実施例における培養条件は、アスコルビン酸リン酸マグネシウムにより軟骨前駆細胞を軟骨細胞に分化させる条件であり、分化していることを顕微鏡観察により確認した。
＜培養条件＞
マウス由来軟骨前駆細胞ＡＴＤＣ５（理研バイオリソースセンターから入手）を、５質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ／ハムＦ−１２培地を用いて前培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度になるように分化誘導培地〔５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸リン酸マグネシウムを添加したα−ＭＥＭ培地（日水製薬株式会社製、ＦＢＳを含まない）〕で希釈した後、２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬずつ播種し、７日間培養した。培養終了後、培地を取り除き、０．１質量％ＢＳＡ含有ＭＥＭ／ハムＦ−１２培地（ＦＢＳを含まない）で溶解した被験試料を各ウェルに５００μＬ添加し、１日間培養した。
【００４９】
【表４】
0005992691.tif 000005
【００５０】
表４及び図３から、ハス胚芽エキスパウダーＭＦによるコラーゲン産生促進作用が認められた。したがって、ハス胚芽エキスパウダーＭＦは、分化した軟骨細胞に対するＩＩ型コラーゲン産生促進作用を有すると考えられる。
【００５１】
参考例１、並びに実施例２及び３の結果から、ハス胚芽抽出物はＩＩ型コラーゲンの産生促進作用を有すると考えられる。また、実施例２から、未分化の軟骨前駆細胞を分化に誘導することでＩＩ型コラーゲンの産生を促進すること、実施例３から、分化した軟骨細胞のＩＩ型コラーゲンの産生を促進することが示唆された。したがって、ハス胚芽抽出物は軟骨の損傷治療及び健康な軟骨を維持する作用を有すると考えられる。
【００５２】
（参考例４：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用の評価）
被験試料としてハス胚芽エキスパウダーＭＦ（丸善製薬株式会社製）を用い、下記の試験方法により腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）産生抑制作用を試験した。
【００５３】
マウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７、大日本製薬株式会社製）を１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭ（日水製薬株式会社製）を用いて培養した後、セルスクレーパーにより細胞を回収した。回収した細胞を１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるように１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで希釈した後、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間培養した。培養終了後、培地を取り除き、終濃度２％のＤＭＳＯを含む１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭで溶解した被験試料を各ウェルに１００μＬ添加し、終濃度１μｇ／ｍＬで１０質量％ＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解したリポポリサッカライド（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ
０１１１；Ｂ４、ＤＩＦＣＯ社製）を１００μＬ加え、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した。培養終了後、各ウェルの培養上清中のＴＮＦ−α量を下記のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
一次抗体であるラット抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．製）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）で２．５μｇ／ｍＬとなるように溶解し、その溶液１００μＬを９６ウェルマイクロプレートに加え、一晩、４℃でコーティングした。次いで、洗浄液（０．０５質量％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液）で各ウェルを洗浄後、１質量％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキングを行った。
洗浄液によって各ウェルを洗浄後、試験培地で培養上清を希釈し、その１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で１２０分間インキュベートした。各ウェルを洗浄した後、二次抗体として、０．３質量％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液に２．５μｇ／ｍＬの濃度で溶解させたウサギ抗マウスＴＮＦ−αポリクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．製）１００μＬを加え、３７℃で６０分間インキュベートしてから洗浄した。
次いで、１，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ  Ｉｎｃ．製）を１００μＬ加え、３７℃で６０分間インキュベートした。各ウェルを洗浄した後、発色用緩衝液（２０ｍＭ硫酸マグネシウム含有トリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００ｍＬにｐ−ニトロフェニルリン酸５０ｍｇを溶解してなる基質溶液１５０μＬをウェルに添加し、３７℃で２０分間〜３０分間酵素反応を行って発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定し、リコビナントマウスＴＮＦ−α（Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．製）標準液より作成した標準曲線から、培養上清中のＴＮＦ−α量（ｐｇ／ｍＬ）を求めた。
ＴＮＦ−α産生抑制率は、下記式により算出した。
ＴＮＦ−α産生抑制率（％）＝｛（Ｂ−Ａ）／Ｂ｝×１００・・・（式）
Ａ：被験試料添加時のＴＮＦ−α量
Ｂ：被験試料無添加時（コントロール）のＴＮＦ−α量
【００５４】
なお、被験試料の濃度を２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬとして上記ＴＮＦ−α産生抑制率の測定を行い、これらのＴＮＦ−α産生抑制率から、内挿法により、ＴＮＦ−α産生抑制率が５０％になる被験試料濃度ＩＣ５０（μｇ／ｍＬ）を求めた。結果を表５に示す。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
表５から、ハス胚芽抽出物はＴＮＦ−αの産生抑制作用を有することが示された。したがって、ハス胚芽抽出物はマクロファージにおけるサイトカインの産生を抑制することにより軟骨の破壊を抑制し、関節炎を抑制すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の関節機能改善剤によれば、ヒアルロン酸産生促進作用、ＩＩ型コラーゲン産生促進作用及びＴＮＦ−α産生抑制作用により、変形性関節症等による関節の機能障害を改善することができ、安全性の高い新規な関節機能改善剤として適用できる。また、滑膜細胞におけるヒアルロン酸産生量を高められるため、ヒアルロン酸産生促進剤として適用できる。また、軟骨細胞におけるＩＩ型コラーゲンの産生量を高められるため、ＩＩ型コラーゲン産生促進剤として適用できる。また、マクロファージにおけるＴＮＦ−αの産生量を低減できるため、ＴＮＦ−α産生抑制剤として適用できる。また、前記関節機能改善剤を任意の飲食品に添加することにより、又はこれらを主成分とした栄養補助食品などとして変形性関節症の症状緩和に貢献できる。具体的には、関節のスムーズな動きを維持し、関節の変形を防ぎ、変形性関節症による痛み、運動障害などへの予防及び改善に貢献できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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