(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）該重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）該軽鎖可変領域が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｂ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｂ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）該重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｆ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｇ）該軽鎖可変領域が配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｈ）該抗体がヒト化されている、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｉ）該軽鎖可変領域が配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｈ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、（ｉ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｋ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、（ｉ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｌ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域をさらに含む、（ｋ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｍ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域をさらに含む、（ｌ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｎ）該単離された抗体が配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、（ｈ）の単離された抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む組成物。
【請求項２】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記毒素がサポリンである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ヒトＦＺＤ１０に結合する、前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｄ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体からなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）それぞれ配列番号９、１１および１２またはそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
を含むヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項１０】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体からなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記毒素がサポリンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
ＦＺＤ１０発現と関連する疾患を有する患者を処置するための、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＦＺＤ１０発現と関連するがんの転移を処置するまたは予防するための、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記がんが、滑膜肉腫、結腸直腸癌、および胃癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
非がん細胞と比べた場合にＷｎｔ／Ｆｚｄシグナル伝達経路においてＦＺＤ１０タンパク質を過剰発現しているがん細胞の増殖または生存を阻害するための、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
ＦＺＤ１０タンパク質を発現している細胞においてカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害するための、請求項１または請求項９に記載の組成物。
【請求項２０】
ＦＺＤ１０過剰発現細胞の（ｉ）生存、（ｉｉ）複製、（ｉｉｉ）分化および（ｉｖ）上皮細胞−間葉細胞移行のうちの少なくとも１つを変化させるための組成物であって、抗ＦＺＤ１０抗体を含み、該組成物は、該細胞と、該細胞への該抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させられることを特徴とし、該抗ＦＺＤ１０抗体が、
（１）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（２）配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
からなる群から選択される組成物。
【請求項２１】
ＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害するための組成物であって、抗ＦＺＤ１０抗体を含み、該組成物は、養子試験宿主への単離されたＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞の移植前に、移植中にまたは移植後に、該腫瘍細胞と、該細胞への該抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させられることを特徴とし、
該養子試験宿主において確立される腫瘍組織のレベルが、該ＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞が該抗ＦＺＤ１０抗体に接触させることなく移植される養子対照宿主において確立される腫瘍組織のレベルと比べて減少し、
該抗ＦＺＤ１０抗体が
（１）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号９、１１および１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（２）配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号２、配列番号３または配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
からなる群から選択される組成物。
【請求項２２】
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が抗増殖剤に抵抗性である、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記細胞が、少なくとも第１の薬剤および第２の薬剤に接触させられることを特徴とし、該第１および第２の薬剤の各々がそれぞれ、少なくとも１つのＷｎｔリガンドと該Ｗｎｔリガンドに対する第１および第２の受容体との間の特異的相互作用を障害し、前記第１の薬剤が前記抗ＦＺＤ１０抗体を含み、該第１の受容体がＦＺＤ１０を含む、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記第２の薬剤が、１つまたは複数の（ｉ）Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−４、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ４、ｓＦＲＰ−５、ＷＩＦ−１；Ｎｏｒｒｉｎ；Ｒ−スポンジン；およびＤｋｋＬ１から選択されるＷｎｔリガンドと、（ｉｉ）ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＭｕＳＫおよびグリピカンから選択される該Ｗｎｔリガンドに対する１つまたは複数の第２の受容体との間の特異的相互作用を障害する１つまたは複数の薬剤を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
（１）の抗ＦＺＤ１０抗体が、
（ａ）前記重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）該重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｆ）該軽鎖可変領域が配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｇ）該抗体がヒト化されている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｈ）該抗体が単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーからなる群から選択される、（１）または（ｇ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｉ）該抗体がＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｊ）該抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｋ）該抗体が完全抗体である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｌ）該抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｍ）該毒素がサポリンである、（ｌ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｎ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｏ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｎ）の単離された抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項２６】
（２）の抗ＦＺＤ１０抗体が、
（ａ）前記重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体、
（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｄ）該軽鎖可変領域が配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｃ）の単離された抗体、
（ｅ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｆ）該軽鎖可変領域が配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体、
（ｇ）該抗体が単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーからなる群から選択される、（２）の単離された抗体、
（ｈ）該抗体がＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（２）の単離された抗体、
（ｉ）該抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、（２）の単離された抗体、
（ｊ）該抗体が完全抗体である、（２）の単離された抗体、
（ｋ）該抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、（２）の単離された抗体、
（ｌ）該毒素がサポリンである、（ｋ）の単離された抗体、
（ｍ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（２）の単離された抗体、ならびに
（ｎ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｍ）の単離された抗体
からなる群から選択される、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗増殖剤が化学療法剤および電離放射線の供給源から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が、結腸がん細胞、乳がん細胞、皮膚がん細胞および造血がん細胞からなる群から選択される、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞ががん幹細胞である、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記がん幹細胞（ＣＳＣ）が、急性骨髄性白血病ＣＳＣ、乳ＣＳＣ、髄芽腫ＣＳＣ、神経膠芽腫ＣＳＣ、頭頸部扁平上皮癌ＣＳＣ、結腸ＣＳＣ、黒色腫ＣＳＣ、前立腺ＣＳＣ、膵臓ＣＳＣ、非小細胞肺ＣＳＣ、肝細胞ＣＳＣ、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣ、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣおよび骨髄腫ＣＳＣからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
（ｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の成長、ならびに（ｉｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の発生のうちの少なくとも１つを変化させるまたは阻害するステップを含む、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が、肝細胞癌細胞、奇形癌細胞、乳がん細胞、非小細胞肺がん細胞、悪性黒色腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、滑膜癌細胞、結腸直腸癌細胞、結腸腺癌細胞、および胃腺癌細胞からなる群から選択される、請求項２０または請求項２１のどちらかに記載の組成物。
【請求項３３】
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な部分とコンジュゲートしている、請求項１または請求項９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体またはその抗原結合断片がヒト化されている、請求項９に記載の組成物。
【請求項３５】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記抗体が、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項３４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願と関連する配列表は、紙原稿ではなく、テキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、９８００８７＿４０４ＰＣ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは、約３５ＫＢであり、２０１２年８月９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
【０００２】
背景
技術分野
本明細書で開示されている発明の実施形態は一般に、抗ＦＺＤ１０抗体、および抗ＦＺＤ１０抗体を使用する方法に関する。特に、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体および方法は、種々のがんなどのＦＺＤ１０の発現（典型的には過剰発現）と関連する疾患の処置、および抗ＦＺＤ１０抗体の単独または他の薬剤と組み合わせての投与を含む処置レジメンの同定に有用である。さらに、その方法は、組織再生および移植ならびにがんに治療的な含意のある胚性幹細胞、多能性幹細胞およびがん幹細胞などの幹細胞の成長および分化を制御するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ抗原は、生物学的シグナル伝達を媒介し、特異的遺伝子発現の選択的上方制御因子として作用する分泌分子であるＷｎｔタンパク質リガンドに対する結合部位を有するＧタンパク質共役受容体様細胞表面受容体のファミリーである。ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＷｎｔファミリーの受容体−リガンド対のメンバーは、胚発生を制御し、細胞増殖においておよび胚形成中の細胞の最終運命を決定するのにも役割を果たし得る。大半のｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体はβカテニンまたは「カノニカル」Ｗｎｔシグナル伝達経路と機能的に共役しており、この経路ではＷｎｔリガンドが細胞表面ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体に結合すると、順次に、細胞質ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質が活性化され、細胞内ＧＳＫ−３キナーゼが阻害され、βカテニンが核に集積し、核内のβカテニンとＴＣＦまたはＬＥＦ転写因子の相互作用を通じてＷｎｔ標的遺伝子が転写活性化される。タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびカルシウムフラックスを伴う他のＷｎｔシグナル伝達経路が一部のＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＷｎｔファミリーメンバーについて記載されてきたが、これらの経路全てが異なる経路を表しているのかまたはこれらの経路のうちのある１つもしくは複数がカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路と一体化している可能性があるのかどうかはまだ明白ではない。
【０００４】
ヒトゲノムデータベースでは現在まで１９のＷｎｔおよび１０のＦｒｉｚｚｌｅｄ（ＦｚまたはＦＺＤ）遺伝子が同定されている（非特許文献１（Venterら、Science  ２９１巻：１３０４〜１３５１頁（２００１年）））。５つの分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ型も存在する。それぞれのＦｚ遺伝子は、大きなＮ末端細胞外部分、７つの推定膜貫通ドメインおよび細胞質側尾部を有する膜内在性タンパク質をコードする（非特許文献２（Wangら、J.  Biol.  Chem.  ２７１巻、４４６８〜４４７６頁（１９９６年））；非特許文献３（Vinsonら、Nature  (London)  ３３８巻、２６３〜２６４頁（１９８９年）））。細胞外部分のＮＨ２末端近傍には、ＦＺファミリーの他のメンバー間でよく保存されているシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）がある（非特許文献２（Wangら、J.  Biol.  Chem.  ２７１巻、４４６８〜４４７６頁（１９９６年）））。ＣＲＤは、１０の不変のシステインを含めて、１１０のアミノ酸残基で構成されており、Ｗｎｔリガンドに対する推定結合部位である（非特許文献４（Bhanotら、Nature  (London)  ３８２巻、２２５〜２３０頁（１９９６年）））。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体は細胞膜において二量体化することができ、二量体化はＷｎｔ／βカテニン経路の活性化と相関している（非特許文献５（Carronら、Journal  of  Cell  Science、１１６巻：２５４１〜２５５０頁（２００３年）））。
【０００５】
ヒトＦｚ遺伝子ファミリーメンバーであるＦｒｉｚｚｌｅｄ−１０（ＦＺＤ１０）は、クローニングされ特徴付けられている（非特許文献６（Koikeら、Biochem  Biophys  Res  Commun.  ２６２巻（１号）：３９〜４３頁（１９９９年）））。ＦＺＤ１０ヌクレオチド配列の解析により、ヒトＦＺＤ１０遺伝子が、アミノ末端システインリッチドメインおよびカルボキシ末端Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘｘｘ−Ｖａｌモチーフを含めて、５８１アミノ酸の７回膜貫通型受容体をコードすることが明らかにされた。ＦＺＤ１０コードｍＲＮＡ（４．０ｋｂ）は、胎盤、胎児腎臓、胎児肺および脳において検出された。成人脳では、ＦＺＤ１０  ｍＲＮＡは小脳において豊富であった。ＦＺＤ１０遺伝子は、ヒト染色体１２ｑ２４．３３にマッピングされた。ＦＺＤ１０はＦｒｉｚｚｌｅｄ−９（ＦＺＤ９）と６５．７％アミノ酸同一性を共有している。ＦＺＤ１０およびＦＺＤ９は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ遺伝子間でサブファミリーを構成している。ＦＺＤ１０は、Ｗｎｔリガンドタンパク質であるＷＮＴ７ａおよびＷＮＴ７ｂに対する受容体である。マウスとヒトのＦＺＤ１０間には９３％の同一性がある。ヒトＦＺＤ１０（ＦＺ１０、ＣＤ３５０、ＦｚＥ７、ｈＦＺ１０、ｆｒｉｚｚｌｅｄ相同体１０、ＦＺ−１０としても知られる）アミノ酸配列は配列番号２８に記載されている。
【０００６】
正常組織では、ＦＺＤ１０タンパク質の発現レベルは、重要臓器では非常に低いまたは存在せず（例えば、従来の手段では検出可能ではない）、胃および結腸の表在粘膜では、腎臓の近位尿細管および遠位尿細管では、子宮内膜間質ではならびに胎盤では低レベルで存在する。しかし、容易に検出可能なＦＺＤ１０発現は、滑膜肉腫（９２％；非特許文献７（Nagayamaら、２００２年  Cancer  Res.  ６２巻：５８５９頁））、胃癌（４０％；非特許文献８（Kirikoshiら、２００１年  Int.  J.  Oncol.  １９巻：７６７頁））および結腸直腸癌（２５％；非特許文献９（Nagayamaら、２００９年  Cancer  Sci.  １００巻：４０５頁））などの種々のがんにおいて明らかにされてきた。ＦＺＤ１０発現の特異的ｓｉＲＮＡノックダウンによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで滑膜肉腫細胞成長が阻害され、ポリクローナル抗ＦＺＤ１０抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＺＤ１０過剰発現滑膜肉腫細胞に対して抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）として媒介し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは滑膜肉腫異種移植片腫瘍成長を阻害することが明らかにされた（非特許文献１０（Nagayamaら、２００５年  Oncogene  ２４巻：６２０１頁））。放射標識された抗ＦＺＤ１０モノクローナル抗体は抗原担持腫瘍細胞により内部に取り入れられｉｎ  ｖｉｖｏにおいて滑膜肉腫異種移植片腫瘍成長を劇的に抑制した（非特許文献１１（Fukukawaら、２００８年  Cancer  Sci.  ９９巻：４３７頁））。
【０００７】
このように、Ｗｎｔ−ＦＺＤ経路は多くのがんにおいて活性化されているが、ＦＺＤ受容体はまだ治療標的として効果的に開発されていない。明らかに、臨床開発を受け入れられる抗ＦＺＤ１０モノクローナル抗体の必要性が存在する。本明細書に記載される発明の実施形態はこの必要性に取り組み、他の関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Venterら、Science  ２９１巻：１３０４〜１３５１頁（２００１年）
【非特許文献２】Wangら、J.  Biol.  Chem.  ２７１巻、４４６８〜４４７６頁（１９９６年）
【非特許文献３】Vinsonら、Nature  (London)  ３３８巻、２６３〜２６４頁（１９８９年）
【非特許文献４】Bhanotら、Nature  (London)  ３８２巻、２２５〜２３０頁（１９９６年）
【非特許文献５】Carronら、Journal  of  Cell  Science、１１６巻：２５４１〜２５５０頁（２００３年）
【非特許文献６】Koikeら、Biochem  Biophys  Res  Commun.  ２６２巻（１号）：３９〜４３頁（１９９９年）
【非特許文献７】Nagayamaら、２００２年  Cancer  Res.  ６２巻：５８５９頁
【非特許文献８】Kirikoshiら、２００１年  Int.  J.  Oncol.  １９巻：７６７頁
【非特許文献９】Nagayamaら、２００９年  Cancer  Sci.  １００巻：４０５頁
【非特許文献１０】Nagayamaら、２００５年  Oncogene  ２４巻：６２０１頁
【非特許文献１１】Fukukawaら、２００８年  Cancer  Sci.  ９９巻：４３７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示に従ったある特定の実施形態では、ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を含み、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む組成物が提供される。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、前記抗体はそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、かつ前記抗体の重鎖可変領域は配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片は、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、かつ配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片はヒト化されている。一実施形態では、本明細書に記載されるヒト化抗体は配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００１２】
一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む。一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含み、配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域をさらに含む。
【００１３】
一実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、または配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含み、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるヒト化抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
【００１４】
一実施形態では、ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有し、配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、または配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有し、配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、または配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有し、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をさらに含む。
【００１５】
別の実施形態では、ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、単離された抗体は配列番号２を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、単離された抗体は配列番号３を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。一実施形態では、単離された抗体は配列番号４を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１０への結合について本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体と競合する単離された抗体が提供される。一実施形態では、単離された抗体はＦＺＤ１０に結合し、抗体は０．２２ｎＭ以下のＫＤでＦＺＤ１０に結合する。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１０に結合する本明細書に記載される抗体は、単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体またはミニボディーである。他の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片はＦａｂまたはＦａｂ’断片である。別の実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片でありまたは完全抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）でもよい。ある特定の実施形態では、抗体は薬物または毒素とコンジュゲートしている。例示的毒素には、サポリンが挙げられるが、これに限定されない。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に記載される単離された抗体またはその抗原結合断片は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得るように修飾されている。他の実施形態では、生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の本明細書に記載される単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片のうちの１つまたは複数を含む組成物が提供される。
【００１８】
別の実施形態では、ＦＺＤ１０発現と関連する疾患を有する患者を処置するための方法であって、生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の本明細書に記載される１つまたは複数の単離された抗体またはその抗原結合断片を含む組成物を患者に投与し、それによってＦＺＤ１０発現と関連する疾患を処置するステップを含む方法が提供される。一実施形態では、ＦＺＤ１０発現と関連するがんの転移を処置するまたは予防するための方法であって、生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の本明細書に記載される単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片のうちの１つまたは複数を含む組成物を、がんを有する患者に投与し、それによってＦＺＤ１０発現と関連するがんの転移を処置するまたは予防するステップを含む方法が提供される。これに関連する例示的がんには、滑膜肉腫、結腸直腸癌および胃癌が挙げられる。
【００１９】
別の実施形態は、非がん細胞と比べた場合にＷｎｔ／Ｆｚｄシグナル伝達経路においてＦＺＤ１０タンパク質を過剰発現しているがん細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、がん細胞を、生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の本明細書に記載される１つまたは複数の単離された抗体またはその抗原結合断片を含む組成物に接触させるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、ＦＺＤ１０タンパク質を発現している細胞においてカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害する方法であって、細胞を本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片に接触させるステップを含む方法が提供される。
【００２０】
本明細書に記載される本発明のある特定の実施形態に従えば、ＦＺＤ１０過剰発現細胞の（ｉ）生存、（ｉｉ）複製、（ｉｉｉ）分化および（ｉｖ）上皮細胞−間葉細胞移行のうちの少なくとも１つを変化させる（例えば、一部の実施形態において阻害するステップを含む、統計学的に有意な方法で増大させるまたは減少させる）ための方法であって、細胞を抗ＦＺＤ１０抗体に、細胞への抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップを含み、抗ＦＺＤ１０抗体が（１）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、単離された抗体またはその抗原結合断片、（２）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片、（３）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに（４）ＦＺＤ１０への結合について（１）、（２）または（３）の抗体と競合する単離された抗体から選択される方法が提供される。
【００２１】
ある特定の他の実施形態では、ＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害するための方法であって、単離されたＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞を抗ＦＺＤ１０抗体に、細胞への抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップを含み、接触させる前記ステップが養子試験宿主への腫瘍細胞の移植前に、移植中にまたは移植後に行われ、養子試験宿主において確立される腫瘍組織のレベルが、ＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞が抗ＦＺＤ１０抗体と接触させずに移植される養子対照宿主において確立される腫瘍組織のレベルと比べて減少し、抗ＦＺＤ１０抗体が（１）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号９、１１および１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片、（２）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片、（３）ヒトＦＺＤ１０に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変ドメインを含む単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに（４）ＦＺＤ１０への結合について（１）、（２）または（３）の抗体と競合する単離された抗体から選択される方法が提供される。
【００２２】
上記方法のある特定のさらなる実施形態では、ＦＺＤ１０過剰発現細胞は抗増殖剤に実質的に抵抗性である。ある特定の実施形態では、前記方法は、前記細胞を少なくとも第１の薬剤および第２の薬剤に接触させるステップを含み、前記第１および第２の薬剤の各々がそれぞれ、少なくとも１つのＷｎｔリガンドと前記Ｗｎｔリガンドに対する第１および第２の受容体間の特異的相互作用を実質的に障害し、前記第１の薬剤が抗ＦＺＤ１０抗体を含み、前記第１の受容体がＦＺＤ１０を含む。さらなる実施形態では、前記第２の薬剤は、１つまたは複数の（ｉ）Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−４、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ４、ｓＦＲＰ−５、ＷＩＦ−１；Ｎｏｒｒｉｎ；Ｒ−スポンジン；およびＤｋｋＬ１から選択されるＷｎｔリガンドと、（ｉｉ）ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＭｕＳＫおよびグリピカンから選択されるＷｎｔリガンドに対する１つまたは複数の第２の受容体との間の特異的相互作用を実質的に障害する１つまたは複数の薬剤を含む。
【００２３】
上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、（１）の抗ＦＺＤ１０抗体は、（ａ）重鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｂ）軽鎖可変ドメインが配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｃ）重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｄ）重鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｆ）軽鎖可変ドメインが配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｇ）ヒト化されている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｈ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーから選択される、（１）または（ｇ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｉ）ＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｊ）Ｆ（ａｂ’）２断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｋ）完全抗体である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｌ）薬物または毒素とコンジュゲートしている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｍ）毒素がサポリンである、（ｌ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｎ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに（ｏ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｎ）の単離された抗体またはその抗原結合断片から選択される。
【００２４】
上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、（２）の抗ＦＺＤ１０抗体は、（ａ）重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、（ｂ）軽鎖可変ドメインが配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体、（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、（ｄ）軽鎖可変ドメインが配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｃ）の単離された抗体、（ｅ）重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、（ｆ）軽鎖可変ドメインが配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体、（ｇ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーから選択される、（２）の単離された抗体、（ｈ）ＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（２）の単離された抗体、（ｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片である、（２）の単離された抗体、（ｊ）完全抗体である、（２）の単離された抗体、（ｋ）薬物または毒素とコンジュゲートしている、（２）の単離された抗体、（ｌ）毒素がサポリンである、（ｋ）の単離された抗体、（ｍ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（２）の単離された抗体、ならびに（ｎ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｍ）の単離された抗体から選択される。
【００２５】
上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、（３）の抗ＦＺＤ１０抗体は、（ａ）軽鎖可変ドメインが配列番号２を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、（ｂ）軽鎖可変ドメインが配列番号３を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、（ｃ）軽鎖可変ドメインが配列番号４を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、（ｄ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーから選択される、（３）の単離された抗体、（ｅ）ＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（３）の単離された抗体、（ｆ）Ｆ（ａｂ’）２断片である、（３）の単離された抗体、（ｇ）完全抗体である、（３）の単離された抗体、（ｈ）薬物または毒素とコンジュゲートしている、（３）の単離された抗体、（ｉ）毒素がサポリンである、（ｈ）の単離された抗体、（ｊ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（３）の単離された抗体、ならびに（ｋ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｊ）の単離された抗体から選択される。
【００２６】
上記方法のある特定のさらなる実施形態では、抗増殖剤は化学療法剤および電離放射線の供給源から選択される。上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、ＦＺＤ１０過剰発現細胞は、結腸がん細胞、乳がん細胞、皮膚がん細胞および造血がん細胞から選択される。上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、ＦＺＤ１０過剰発現細胞はがん幹細胞である。ある特定のさらなる実施形態では、がん幹細胞（ＣＳＣ）は、急性骨髄性白血病ＣＳＣ、乳ＣＳＣ、髄芽腫ＣＳＣ、神経膠芽腫ＣＳＣ、頭頸部扁平上皮癌ＣＳＣ、結腸ＣＳＣ、黒色腫ＣＳＣ、前立腺ＣＳＣ、膵臓ＣＳＣ、非小細胞肺ＣＳＣ、肝細胞ＣＳＣ、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣ、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣおよび骨髄腫ＣＳＣから選択される。上記方法のある特定のさらなる実施形態では、前記方法は、（ｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の成長、ならびに（ｉｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の発生のうちの少なくとも１つを変化させるまたは阻害するステップを含む。
【００２７】
上記方法のある特定の他のさらなる実施形態では、ＦＺＤ１０過剰発現細胞は、肝細胞癌細胞、奇形癌細胞、乳がん細胞、非小細胞肺がん細胞、悪性黒色腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、滑膜癌細胞、結腸直腸癌細胞、結腸腺癌細胞および胃腺癌細胞から選択される。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
（ａ）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）該重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）該軽鎖可変領域が配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｂ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｂ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）該重鎖可変領域がそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｆ）該重鎖可変領域が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｇ）該軽鎖可変領域が配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｈ）該抗体がヒト化されている、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｉ）該軽鎖可変ドメインが配列番号３７に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｈ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｊ）配列番号３９のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（ｉ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｋ）配列番号３９に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（ｉ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｌ）配列番号３６に記載されるアミノ酸配列を含むヒトラムダ軽鎖定常領域をさらに含む、（ｋ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｍ）配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１定常領域をさらに含む、（ｌ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｎ）該単離された抗体が配列番号２９に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖および配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、（ｈ）の単離された抗体またはその抗原結合断片
から選択される単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む組成物。
（項目２）
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体、またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体から選択される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記毒素がサポリンである、項目３に記載の組成物。
（項目５）
ヒトＦＺＤ１０に結合する前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片が配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｄ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｂ）配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目５に記載の組成物。
（項目８）
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体から選択される、項目５に記載の組成物。
（項目９）
（ａ）配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変領域を含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、（ｂ）該軽鎖可変領域が配列番号２を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、（ａ）の単離された抗体、（ｃ）該軽鎖可変領域が配列番号３を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、（ａ）の単離された抗体、および（ｄ）該軽鎖可変領域が配列番号４を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む、（ａ）の単離された抗体、から選択される単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む組成物。
（項目１０）
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が、（ａ）単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体またはミニボディー、（ｂ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片、（ｃ）完全抗体、（ｄ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む抗体、および（ｅ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている（ｄ）の抗体から選択される、項目９に記載の組成物。
（項目１１）
前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、項目９に記載の組成物。
（項目１２）
前記毒素がサポリンである、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
（ｉ）ＦＺＤ１０への結合について項目１に記載の抗体と競合する抗体、および（ｉｉ）ＦＺＤ１０に結合する抗体であって、０．２２ｎＭ以下のＫＤでＦＺＤ１０に結合する抗体、から選択される、単離された抗体。
（項目１４）
生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む、項目１に記載の組成物。
（項目１５）
生理学的に許容されるキャリアおよび治療有効量の前記単離された抗ＦＺＤ１０抗体を含む、項目９に記載の組成物。
（項目１６）
ＦＺＤ１０発現と関連する疾患を有する患者を処置するための方法であって、項目１４または項目１５のどちらかに記載の組成物を該患者に投与し、それによってＦＺＤ１０発現と関連する該疾患を処置するステップを含む方法。
（項目１７）
ＦＺＤ１０発現と関連するがんの転移を処置するまたは予防するための方法であって、項目１４または項目１５のどちらかに記載の組成物を、該がんを有する患者に投与し、それによってＦＺＤ１０発現と関連する該がんの転移を処置するまたは予防するステップを含む方法。
（項目１８）
前記がんが、滑膜肉腫、結腸直腸癌、および胃癌からなる群から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
非がん細胞と比べた場合にＷｎｔ／Ｆｚｄシグナル伝達経路においてＦＺＤ１０タンパク質を過剰発現しているがん細胞の増殖または生存を阻害する方法であって、該がん細胞を項目１４または項目１５のどちらかに記載の組成物に接触させるステップを含む方法。
（項目２０）
ＦＺＤ１０タンパク質を発現している細胞においてカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害する方法であって、該細胞を項目１または項目９のどちらかに記載の組成物に接触させるステップを含む方法。
（項目２１）
ＦＺＤ１０過剰発現細胞の（ｉ）生存、（ｉｉ）複製、（ｉｉｉ）分化および（ｉｖ）上皮細胞−間葉細胞移行のうちの少なくとも１つを変化させるための方法であって、該細胞を抗ＦＺＤ１０抗体に、該細胞への該抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップを含み、該抗ＦＺＤ１０抗体が、
（１）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号９、１１、１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１、１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（２）配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（３）配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（４）ＦＺＤ１０への結合について（１）、（２）または（３）の抗体と競合する単離された抗体
からなる群から選択される方法。
（項目２２）
ＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害するための方法であって、
単離されたＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞を抗ＦＺＤ１０抗体に、該細胞への該抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップ
を含み、接触させる該ステップが、養子試験宿主への前記腫瘍細胞の移植前に、移植中にまたは移植後に行われ、
該養子試験宿主において確立される腫瘍組織のレベルが、該ＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞が該抗ＦＺＤ１０抗体に接触させることなく移植される養子対照宿主において確立される腫瘍組織のレベルと比べて減少し、
該抗ＦＺＤ１０抗体が
（１）それぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびにそれぞれ配列番号９、１１および１２、またはそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（２）配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、
（３）配列番号２、３および４に記載されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む軽鎖可変ドメインを含み、ヒトＦＺＤ１０に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（４）ＦＺＤ１０への結合について（１）、（２）または（３）の抗体と競合する単離された抗体
からなる群から選択される方法。
（項目２３）
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が抗増殖剤に実質的に抵抗性である、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目２４）
前記細胞を少なくとも第１の薬剤および第２の薬剤に接触させるステップを含み、該第１および第２の薬剤の各々がそれぞれ、少なくとも１つのＷｎｔリガンドと該Ｗｎｔリガンドに対する第１および第２の受容体との間の特異的相互作用を実質的に障害し、前記第１の薬剤が前記抗ＦＺＤ１０抗体を含み、該第１の受容体がＦＺＤ１０を含む、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目２５）
前記第２の薬剤が、１つまたは複数の（ｉ）Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２、Ｄｋｋ−４、ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ４、ｓＦＲＰ−５、ＷＩＦ−１；Ｎｏｒｒｉｎ；Ｒ−スポンジン；およびＤｋｋＬ１から選択されるＷｎｔリガンドと、（ｉｉ）ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＭｕＳＫおよびグリピカンから選択される該Ｗｎｔリガンドに対する１つまたは複数の第２の受容体との間の特異的相互作用を実質的に障害する１つまたは複数の薬剤を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
（１）の抗ＦＺＤ１０抗体が、
（ａ）前記重鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号９、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｂ）該軽鎖可変ドメインが配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｃ）該重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｄ）該重鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号５、６および７に記載されるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変ドメインがそれぞれ配列番号１０、１１および１２に記載されるＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｅ）該重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｆ）該軽鎖可変ドメインが配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｄ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｇ）該抗体がヒト化されている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｈ）該抗体が単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーからなる群から選択される、（１）または（ｇ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｉ）該抗体がＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｊ）該抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｋ）該抗体が完全抗体である、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｌ）該抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｍ）該毒素がサポリンである、（ｌ）の単離された抗体またはその抗原結合断片、
（ｎ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（１）の単離された抗体またはその抗原結合断片、ならびに
（ｏ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｎ）の単離された抗体またはその抗原結合断片
からなる群から選択される、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目２７）
（２）の抗ＦＺＤ１０抗体が、
（ａ）前記重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号３に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｂ）該軽鎖可変ドメインが配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む、（ａ）の単離された抗体、
（ｃ）配列番号４に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｄ）該軽鎖可変ドメインが配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｃ）の単離された抗体、
（ｅ）該重鎖可変ドメインが配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含み、配列番号２に記載されるアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをさらに含む、（２）の単離された抗体、
（ｆ）該軽鎖可変ドメインが配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む、（ｅ）の単離された抗体、
（ｇ）該抗体が単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーからなる群から選択される、（２）の単離された抗体、
（ｈ）該抗体がＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（２）の単離された抗体、
（ｉ）該抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、（２）の単離された抗体、
（ｊ）該抗体が完全抗体である、（２）の単離された抗体、
（ｋ）該抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、（２）の単離された抗体、
（ｌ）該毒素がサポリンである、（ｋ）の単離された抗体、
（ｍ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（２）の単離された抗体、ならびに
（ｎ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｍ）の単離された抗体
からなる群から選択される、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目２８）
（３）の抗ＦＺＤ１０抗体が、
（ａ）前記軽鎖可変ドメインが配列番号２を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、
（ｂ）該軽鎖可変ドメインが配列番号３を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、
（ｃ）該軽鎖可変ドメインが配列番号４を含み、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインをさらに含む、（３）の単離された抗体、
（ｄ）該抗体が単鎖抗体、ＳｃＦｖ、ヒンジ領域を欠く一価抗体およびミニボディーからなる群から選択される、（３）の単離された抗体、
（ｅ）該抗体がＦａｂまたはＦａｂ’断片である、（３）の単離された抗体、
（ｆ）該抗体がＦ（ａｂ’）２断片である、（３）の単離された抗体、
（ｇ）該抗体が完全抗体である、（３）の単離された抗体、
（ｈ）該抗体が薬物または毒素とコンジュゲートしている、（３）の単離された抗体、
（ｉ）該毒素がサポリンである、（ｈ）の単離された抗体、
（ｊ）ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む、（３）の単離された抗体、ならびに
（ｋ）該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが、該ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインが修飾されていない抗体と比べた場合に増強されたＡＤＣＣ活性を有する修飾された抗体を得られるように修飾されている、（ｊ）の単離された抗体
からなる群から選択される、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目２９）
前記抗増殖剤が化学療法剤および電離放射線の供給源から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目３０）
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が、結腸がん細胞、乳がん細胞、皮膚がん細胞および造血がん細胞からなる群から選択される、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目３１）
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞ががん幹細胞である、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目３２）
前記がん幹細胞（ＣＳＣ）が、急性骨髄性白血病ＣＳＣ、乳ＣＳＣ、髄芽腫ＣＳＣ、神経膠芽腫ＣＳＣ、頭頸部扁平上皮癌ＣＳＣ、結腸ＣＳＣ、黒色腫ＣＳＣ、前立腺ＣＳＣ、膵臓ＣＳＣ、非小細胞肺ＣＳＣ、肝細胞ＣＳＣ、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣ、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病ＣＳＣおよび骨髄腫ＣＳＣからなる群から選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
（ｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の成長、ならびに（ｉｉ）がん組織、神経組織、間葉組織および造血組織のうちの１つまたは複数の発生のうちの少なくとも１つを変化させるまたは阻害するステップを含む、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
（項目３４）
前記ＦＺＤ１０過剰発現細胞が、肝細胞癌細胞、奇形癌細胞、乳がん細胞、非小細胞肺がん細胞、悪性黒色腫細胞、ウィルムス腫瘍細胞、滑膜癌細胞、結腸直腸癌細胞、結腸腺癌細胞、および胃腺癌細胞からなる群から選択される、項目２１または項目２２のどちらかに記載の方法。
【００２８】
以下の詳細な説明および付属の図面を参照すれば、本明細書で記載される本発明のこれらの態様および実施形態ならびに他の態様および実施形態は明らかとなろう。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、各々が個別に組み込まれたと仮定した場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、刊行物の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、本発明の態様および実施形態を改変することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＤＴＬａｃＯ細胞を使用するＦＺＤ１０抗体選択および成熟過程の概略図である。
【図２】図２は、アフィニティー成熟過程中の高アフィニティー抗ＦＺＤ１０抗体後代クローンを求める選択戦略を示す一連のドットプロットである。
【図３】図３、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＦＺＤ１０を発現している滑膜肉腫細胞への高アフィニティー抗ＦＺＤ１０抗体結合を示すヒストグラムである。前記ヒストグラムは、関連する親クローンにより産生される抗体と比べた場合の、２つの後代クローンにより産生される抗ＦＺＤ１０抗体による結合を示している。パネルＡ：親抗体Ｂ９Ａ５；パネルＢ：４０ｎＭのＫＤを有する後代クローンＢ９Ｌ３２．２；パネルＣ：０．２２ｎＭのＫＤを有する後代クローンＢ９Ｌ９．３。
【図４】図４は、親ＤＴＬａｃＯ生殖系列配列に対する親Ｂ９Ａ５抗ＦＺＤ１０抗体ならびに２つの後代クローン、Ｂ９Ｌ３２．２およびＢ９Ｌ９．３の重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列のアライメントである。３つの抗体全てがＢ９で示される共通重鎖ＶＤＪを共有するが、それぞれがＡ５、Ｌ９．３およびＬ３２．２で示される異なる軽鎖ＶＪを有している。相補性決定領域（ＣＤＲ）は下線が施されている。重鎖可変領域アミノ酸配列は以下：ＤＴＬａｃＯ＝配列番号１３；Ｂ９＝配列番号１、の通りである。軽鎖可変領域アミノ酸配列は以下：ＤＴＬａｃＯ＝配列番号１７；Ａ５＝配列番号２：Ｌ９．３＝配列番号３；およびＬ３２．２＝配列番号４、の通りである。
【図５】図５、パネルＡおよびＢは、抗ＦＺＤ１０  Ｂ９Ｌ９．３ｍＡｂ−サポリンコンジュゲートがＦＺＤ１０を発現している細胞には致死性であったことを示している。パネルＡは、漸増濃度のコンジュゲートされた抗体への曝露に続く細胞生存率を示すグラフである。パネルＢは、無関係な抗体特異性のアイソタイプがマッチした対照ｍＡｂサポリンコンジュゲート（左）に曝露された細胞と比べた、Ｂ９Ｌ９．３ｍＡｂサポリンコンジュゲート（右）に曝露された細胞を示す顕微鏡写真である。
【図６】図６は、Ｂ９Ｌ９．３抗ＦＺＤ１０ｍＡｂがＡＤＣＣにより２つの滑膜肉腫細胞系を死滅させたことを実証する細胞溶解曲線を示す。さらに、最適化されたＦｃドメインを有するＢ９Ｌ９．３抗ＦＺＤ１０ｍＡｂは、死滅化の増強を実証した。
【図７Ａ】図７Ａは、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路に対する抗ＦＺＤ１０抗体の効果を試験するためのＴＯＰ／ＦＯＰｆｌａｓｈルシフェラーゼレポーター系を使用する実験戦略を示している。
【図７Ｂ】図７Ｂは、Ｂ９Ｌ９．３抗体がカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路を効果的に阻害したことを実証する実験結果を示す。
【図８】図８は、ヒト化Ｂ９Ｌ９．３重鎖可変領域アミノ酸配列および軽鎖可変領域アミノ酸配列（それぞれ配列番号３９および３７）と、対応するニワトリ前駆体配列（配列番号１および３）ならびにヒトＶλおよびＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス配列（配列番号３８および４０）とのアライメントを示す。配列付番方式はＫａｂａｔ（１９９１年）に従っている。ＣＤＲは下線が施されている。アステリスクは、アライメントにおけるギャップを示している。ニワトリ残基がフレームワーク配列において保持されていたバーニアゾーン位置は、二重下線により示されている。ｈＢ９Ｌ９．３ＨおよびｈＢ９Ｌ９．３Ｌは、それぞれＢ９Ｌ９．３  ＶＨおよびＶＬのヒト化バージョンを示している。ＨＩＩＩ：ヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス配列。ＬＩＩＩ：ヒトＶλサブグループＩＩＩコンセンサス配列。
【図９】図９は、Ｂ９Ｌ９．３およびヒト化Ｂ９Ｌ９．３抗体ｈＢ９Ｌ９．３に対する結合アフィニティーのグラフを示す。アフィニティーは、ＳＹＯ−１細胞での組換え抗体の飽和結合反応速度を測定することにより決定された。
【図１０】図１０は、ヒト化Ｂ９Ｌ９．３（ｈＢ９Ｌ９．３）抗体がキメラＢ９Ｌ９．３抗体と同程度に効果的にカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路を阻害したことを実証する実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＢ９重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号２は、Ｂ９Ａ５（親）抗ＦＺＤ１０抗体のＡ５軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号３は、Ｂ９Ｌ９．３抗ＦＺＤ１０抗体のＬ９．３軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号４は、Ｂ９Ｌ３２．２抗ＦＺＤ１０抗体のＬ３２．２軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号５は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＢ９  ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号６は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＢ９  ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号７は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＢ９  ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号８は、Ｂ９Ａ５親抗ＦＺＤ１０抗体のＡ５  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列、ならびにまた親ＤＴＬａｃＯ  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号９は、Ｂ９Ｌ９．３抗ＦＺＤ１０抗体のＬ９．３  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号１０は、Ｂ９Ｌ３２．２抗ＦＺＤ１０抗体のＬ３２．２  ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号１１は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＡ５、Ｌ９．３およびＬ３２．２  ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号１２は、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＡ５、Ｌ９．３およびＬ３２．２  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、ならびにまた親ＤＴＬａｃＯ  ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号１３は、親ＤＴＬａｃＯ重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号１４は、親ＤＴＬａｃＯのＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１５は、親ＤＴＬａｃＯのＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１６は、親ＤＴＬａｃＯのＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１７は、親ＤＴＬａｃＯの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１８は、親ＤＴＬａｃＯのＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１９は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、Ｂ９Ａ５（親）、Ｂ９Ｌ９．３およびＢ９Ｌ３２．２（後代）、抗ＦＺＤ１０抗体のＢ９重鎖可変領域をコードする。
【００４９】
配列番号２０は、配列番号２（Ｂ９Ａ５抗体のＡ５軽鎖可変領域）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００５０】
配列番号２１は、配列番号３（Ｂ９Ｌ９．３抗体のＬ９．３軽鎖可変領域）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００５１】
配列番号２２は、配列番号４（Ｂ９Ｌ３２．２抗体のＬ３２．２軽鎖可変領域）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００５２】
配列番号２３は、親ＤＴＬａｃＯ重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００５３】
配列番号２４は、親ＤＴＬａｃＯ軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００５４】
配列番号２５、２６および２７はリンカーのアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号２８は、ヒトＦＺＤ１０アミノ酸配列を示す。
【００５６】
配列番号２９は、ヒトＩｇラムダ定常領域を含む、ヒト化Ｌ９．３軽鎖のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号３０は、ヒト化Ｌ９．３軽鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）をコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
配列番号３１は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含む、ヒト化Ｂ９重鎖のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号３２は、ヒト化Ｂ９重鎖のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）をコードするポリヌクレオチドである。
【００６０】
配列番号３３は、ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００６１】
配列番号３４は、ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号３５は、ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【００６３】
配列番号３６は、ヒトラムダ軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号３７は、ヒト化Ｌ９．３軽鎖ＶＪ領域のアミノ酸配列である。
【００６５】
配列番号３８は、ＣＤＲが「Ｘ」で示されるヒトＶλサブグループＩＩＩコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３９は、ヒト化Ｂ９重鎖ＶＤＪ領域のアミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号４０は、ＣＤＲが「Ｘ」で示されるヒトＶＨサブグループＩＩＩコンセンサス配列のアミノ酸配列である。
【００６８】
詳細な説明
本発明の実施形態は、ＦＺＤ１０、Ｗｎｔファミリー受容体タンパク質（例えば、配列番号２８）に結合する抗体に関する。特に、本明細書に記載される抗体は予想外に高アフィニティーでＦＺＤ１０に特異的に結合し、ある特定の実施形態では、異常なまたは変化したＦＺＤ１０発現、および特にＦＺＤ１０過剰発現（例えば、正常な細胞もしくは無病細胞においておよび／または正常な細胞もしくは無病細胞上で検出可能である発現のレベルよりも大きさにおいてより大きなレベルで検出可能なＦＺＤ１０発現）と関連する疾患などの、ＦＺＤ１０発現と関連する疾患の処置に治療的有用性を有する。そのような疾患には様々な形態のがんが含まれ、制限なく、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）ならびに他のがんが含まれる。例示的抗体またはその抗原結合断片またはその相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号１〜１２に記載されており、配列番号１９〜２２に記載されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００６９】
本発明のある特定の実施形態は、ＦＺＤ１０、Ｗｎｔファミリー受容体タンパク質（例えば、配列番号２８）に結合して、ＦＺＤ１０過剰発現細胞のまたは胚性幹細胞もしくはその後代などのＦＺＤ１０＋幹細胞の生存、複製、分化または脱分化（例えば、上皮細胞−間葉細胞移行）を変化させる（例えば、一部の実施形態において阻害するステップを含む、統計学的に有意な方法で増大させるまたは減少させる）および／あるいはＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害する抗体を使用する方法に関する。本明細書に記載される方法は、種々のがんなどのＦＺＤ１０の発現（典型的には過剰発現）と関連する疾患の処置におよび抗ＦＺＤ１０抗体単独でのまたは他の薬剤と組み合わせての投与を含む処置レジメンの同定に有用である。本抗ＦＺＤ１０抗体が、例えば、抗ＦＺＤ１０抗体誘導の前にまたはその後でそのような細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで導入することにより胚性幹細胞またはその後代などのＦＺＤ１０＋幹細胞の発生に有利に影響を及ぼして、心筋細胞へと発生して梗塞により損傷を受けた心筋の修復をもたらす、あるいは内皮細胞および／または平滑筋細胞へと発生して循環器疾患もしくはがんもしくは他の関連状態において脈管修復をもたらし得る方法も本明細書に記載されている。例示的抗ＦＺＤ１０抗体またはその抗原結合断片またはその相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、配列番号１〜１２に記載されており、配列番号２０〜２３に記載されるポリヌクレオチド配列によりコードされている。
【００７０】
ある特定の実施形態ではおよび非限定的理論に従えば、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせてがん幹細胞（ＣＳＣ）に接触させて腫瘍増殖を阻害しえる。さらに非限定的理論に従えば、がん幹細胞は、充実性腫瘍の細胞または新しい腫瘍の形成を開始する能力およびがんを養子宿主に移す能力により特徴付けられる造血がんの細胞であってもよい。（Parkら、２００９年  Molec.  Therap.  １７巻：２１９頁）。例えば、特定種類のドナー腫瘍由来のヒトＣＳＣの細胞表面マーカー表現型は、細胞表面マーカー発現に基づいて単離された候補ＣＳＣの異種移植片を免疫不全マウスに移植し、ドナー腫瘍と同じ種類のレシピエント腫瘍の確立および成長が起こるかどうかを決定することにより決定しえる。同上文献。「単離された」細胞は、その細胞が本来存在していた自然環境から取り出された細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持され、成長しまたは産生されたそのような細胞の後代である。
【００７１】
新しい腫瘍を開始する、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの累代移植を介して新しい腫瘍を開始する単離された腫瘍細胞の能力は、多種多様なモデル系について裏付けられてきた。例えば、Parkら、２００９年Molec.  Therap.  １７巻：２１９頁；  Curtinら、２０１０年Oncotarget  １巻：５６３頁；  De  Almeidaら、２００７年Canc.  Res.  ６７巻：５３７１頁；  Ettenbergら、２０１０年Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA  １０７巻：１５４７３頁；  Fukukawaら、２００９年Oncogene  ２８巻：１１１０頁；Fukukawaら、２００８年Canc.  Sci.  ９９巻：４３２頁；  Heら、２００４年Neoplasia  ６巻：７頁；  Huら、２００９年Canc.  Res.  ６９巻：６９５１頁；  Nagayamaら、２００９年Canc.  Sci.  １００巻：４０５頁；  Hagayamaら、２００５年Oncogene  ２４巻：６２０１頁；  Nagayamaら、２００２年Canc.  Res.  ６２巻：５８５９頁；  Podeら、２０１１年Oncogene  ３０巻：１６６４頁；  Youら、２００４年Canc.  Res.  ６４巻：５６３８５頁などを参照されたい。
【００７２】
これらのおよび関連する系では、移植された腫瘍細胞（複数の腫瘍細胞を含む腫瘍断片を含む）は、該移植された細胞が複製して、測定可能な成長を統計学的に有意な方法で検出することができる腫瘍を生じるのが観察される場合は養子宿主（例えば、レシピエント多細胞生物、好ましくは脊椎動物、さらに好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等のような哺乳動物）において腫瘍を確立すると見なしえる。典型的には、養子宿主における腫瘍は、養子移入細胞が得られた腫瘍に表現型で類似する。確立した充実性腫瘍は、多くの場合、細胞表面マーカー発現、細胞骨格成分発現および組織化、形態、血管網および／または基底膜の存在ならびに他の特長などの特徴的表現型を示す場合がある。
【００７３】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害するための方法であって、単離されたＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞を本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体に、該抗体の該細胞への特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップを含み、接触させるステップが養子試験宿主（例えば、抗ＦＺＤ１０抗体も受け入れる宿主生物）への腫瘍細胞の移植前に、移植中にまたは移植後に行われ、養子試験宿主において確立される腫瘍組織のレベルが、ＦＺＤ１０過剰発現腫瘍細胞が抗ＦＺＤ１０抗体に接触されることなく移植される養子対照宿主において確立される腫瘍組織のレベルと比べて減少している方法を提供する。
【００７４】
したがって、本明細書に記載される実施形態のうちのいくつかに従えば、これらおよび／または関連する系を使用して、ＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖の、抗ＦＺＤ１０抗体による阻害を決定するまたはＦＺＤ１０過剰発現細胞の生存、複製、分化および／もしくは脱分化（例えば、上皮細胞−間葉細胞移行）の抗ＦＺＤ１０抗体による阻害を決定する方法が明確に想定されている。
【００７５】
本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、第１のＷｎｔリガンド（例えば、ＷＮＴ７ａおよび／またはＷＮＴ７ｂ）と該Ｗｎｔリガンドに対する第１の受容体（例えば、ＦＺＤ１０）との間の特異的相互作用を実質的に障害する第１の薬剤として単独で使用しえる。さらにまたは代わりに、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、１つまたは複数のさらなる薬剤と組み合わせて使用しえる。ある特定のそのような実施形態では、さらなる薬剤（複数可）は、少なくとも１つの第２のＷｎｔリガンド（例えば、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２またはＤｋｋ−４などのＤＫＫファミリーメンバー；ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ４またはｓＦＲＰ−５などの分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）；Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）；Ｎｏｒｒｉｎ；Ｒ−スポンジン；ＤｋｋＬ１；等）と該Ｗｎｔリガンドに対する第２の受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＭｕＳＫおよびグリピカン３などのグリピカン；例えば、Schulte  ２０１０年  Pharmacol.  Rev.  ６２巻：６３２頁；  RaoおよびKuehl、２０１０年Circ.  Res.  １０６巻：１７９８頁；  Filmusら、２００８年Genome  Biol.  ９巻：２２４頁；  ChienおよびMoon、２００７年Front.  Biosci.  １２巻：４４８頁を参照されたい；表１も参照されたい）との間の特異的相互作用を実質的に障害する第２の薬剤を含みうる。そのような第２のＷｎｔリガンドと該Ｗｎｔリガンドに対するそのような第２の受容体との間の特異的相互作用を実質的に障害する（例えば、少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセントまたはそれよりも多くの統計学的に有意な方法で阻害する）そのような第２の薬剤の非限定的例は表１に提示されており、遺伝子ノックアウトモデルは、例えば、確立したｓｉＲＮＡ技術を使用して、関連遺伝子発現の抑制のための標的を同定すると理解される（例えば、Wangら、２０１１年  Mini  Rev.  Med.  Chem.１１巻：１１４頁；  Petroccaら、２０１１年  J.  Clin.  Oncol.  ２９巻：７４７頁；  Shiら、２０１１年  Expert  Opin.  Biol.  Ther.  １１巻：５頁；  Nijweningら、２０１０年  IDrugs  １３巻：７７２頁）。
【００７６】
【表１−１】
0005944994.tif 000002
【表１−２】
0005944994.tif 000003
【表１−３】
0005944994.tif 000004
【００７７】
したがって、本明細書で開示されているある特定の実施形態は、ＦＺＤ１０過剰発現細胞の生存、複製、分化および上皮細胞−間葉細胞移行のうちの少なくとも１つを変化させる（例えば、統計学的に有意な方法で増大させるまたは減少させるおよび一部の実施形態では阻害する）ための方法であって、該細胞を本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体に、該細胞への該抗体の特異的結合に十分な条件下でかつそれに十分な時間接触させるステップを含む方法を想定している。細胞生存、複製、分化および上皮細胞−間葉細胞移行を決定するための基準は公知であり、当業者であれば十分に理解している。細胞分裂、細胞生存、アポトーシス、増殖および分化と関連している経路を含む、生物学的シグナル伝達のための経路は、ある特定の例では「生物学的シグナル伝達経路」または「誘導性シグナル伝達経路」と称されることもあり、細胞におけるこれらのおよび類似する過程の制御に関与している細胞分子成分および細胞外分子成分間での一時的もしくは安定な会合または相互作用を含むことがある。対象の特定の経路（複数可）に応じて、そのような経路（複数可）の誘導を決定するための１つまたは複数の適切なパラメータは、当技術分野で認められた基準に基づいて選択してもよい。
【００７８】
例えば、細胞複製または増殖に関連するシグナル伝達経路では、例えば、増殖中の細胞によるトリチウム標識チミジンの細胞ＤＮＡへの取り込み、細胞呼吸活動の検出可能な（例えば、蛍光光度または比色）指示薬（例えば、代謝的活性細胞におけるテトラゾリウム塩（黄色）３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）のホルマザン色素（紫色）への変換）のモニタリング、または細胞数計測などを含む、複製または増殖を定量化するための種々の周知の方法が利用可能である。
【００７９】
同様に、細胞生物学技術では、顕微鏡的技法、生化学的技法、分光光度的技法、分光学的技法、光散乱技法、フローサイトメトリー技法および細胞蛍光を含む細胞数計測技法または他の技法（例えば、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）などの生体染色色素、ヨウ化プロピジウムなどのＤＮＡ結合フルオロフォア、代謝指示薬、等）による生存能決定を含む多数の公知の方法のうちのいずれかにより細胞生存を評価するための、ならびにアポトーシス（例えば、アネキシンＶ結合、ＤＮＡ断片化アッセイ、カスパーゼ活性化、マーカー解析、例えば、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、等）を決定するための複数の技法が公知である。
【００８０】
他のシグナル伝達経路は、特定の細胞表現型、例えば、遺伝子発現の特定の誘導（例えば、転写産物もしくは翻訳産物として、またはそのような産物のバイオアッセイにより、または細胞質因子の核局在化として検出可能である）、細胞内メディエーター（例えば、活性化キナーゼもしくはホスファターゼ、環状ヌクレオチドのもしくは生理学的に活性なイオン種の変化したレベル、１つもしくは複数の特定のリン酸化基質のリン酸化の程度の変化したレベル、等）の変化した（例えば、統計学的に有意な増大または減少）レベル、変化した細胞周期プロファイル、または変化した細胞形態などに関連しているため、本明細書に提供される特定の刺激に対する細胞応答性を容易に同定して、特定の細胞が生存、複製、分化または脱分化イベントを起こしているまたは起こしたかどうかを決定することができる（例えば、上皮細胞−間葉細胞移行；例えば、Hlubekら、２００７年  Front.  Biosci.  １２巻：４５８頁を参照されたい）。
【００８１】
被験体における悪性状態の存在は、当技術分野では公知であり、それについての診断および分類の基準が確立している、例えば、新形成細胞、腫瘍細胞、非接触阻害されたまたは腫瘍形成的に形質転換した細胞など（例えば、黒色腫、癌、例えば、腺癌、扁平上皮癌、小細胞癌、燕麦細胞癌等、肉腫、例えば、軟骨肉腫、骨肉腫等）を含む被験体における形成異常細胞、がん性細胞および／または形質転換細胞の存在を指している（例えば、HanahanおよびWeinberg、２０１１年Cell  １４４巻：６４６頁；  HanahanおよびWeinberg  ２０００年Cell  １００巻：５７頁；  Cavalloら、２０１１年Canc.  Immunol.  Immunother.  ６０巻：３１９頁；  Kyrigideisら、２０１０年J.  Carcinog.  ９巻：３頁）。本発明により想定されている好ましい実施形態では、例えば、そのようながん細胞は、急性骨髄性白血病、乳がん、髄芽腫、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、結腸がん、黒色腫、前立腺がん、膵臓がん、非小細胞肺がん、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞リンパ芽球性白血病、骨髄腫、肝細胞癌、奇形癌、ウィルムス腫瘍、滑膜癌、結腸直腸癌、結腸腺癌または胃腺癌の細胞であり得、それには、これらの種類のがんのいずれも開始することができ、逐次的に移植することができるがん幹細胞が含まれる（例えば、Parkら  ２００９年  Molec.  Therap.  １７巻：２１９頁を参照されたい）。
【００８２】
ある特定の想定された実施形態に従えば、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０ｍＡｂは、異なる特殊化した免疫機能を有する免疫エフェクター細胞を、多種多様な細胞表面抗原のその差次的発現に基づいて互いに区別することができることが周知である、治療的状況において望ましい免疫エフェクター細胞機能（複数可）を有利に動員することができる。免疫エフェクター細胞には、天然にまたは遺伝子操作の結果としてそのような能力を有する細胞を含めて、免疫系機能の構成要素である活性を直接媒介することができる任意の細胞が挙げられる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞は、一般に「Ｆｃ受容体」（ＦｃＲ）と称されるクラスの受容体を含む、免疫グロブリン定常領域に対する受容体などの免疫グロブリンに対する細胞表面受容体を含む。限定されたサブセットの免疫グロブリン重鎖アイソタイプと相互作用する特定の能力もしくはＦｃドメインと様々なアフィニティーで相互作用する特定の能力を有し、かつ／またはある特定の条件下、限定されたサブセットの免疫エフェクター細胞上で発現されることがあるＦｃＲを含む、多数のＦｃＲが構造的および／または機能的に特徴付けられており、当技術分野では周知である（例えば、Kijimoto-Ochichaiら、２００２年  Cell  Mol.  Life  Sci.  ５９巻：６４８頁；  Davisら、２００２年Curr.  Top.  Microbiol.  Immunol.  ２６６巻：８５頁；  Pawankar、２００１年Curr.  Opin.  Allerg.  Clin.  Immunol.  １巻：３頁；  Radaevら、２００２年Mol.  Immunol.  ３８巻：１０７３頁；  Wurzburgら、２００２年Mol.  Immunol.  ３８巻：１０６３頁；  Sulicaら、２００１年Int.  Rev.  Immunol.  ２０巻：３７１頁；  Underhillら、２００２年Ann.  Rev.  Immunol.  ２０巻：８２５頁；  Coggeshall、２００２年Curr.  Dir.  Autoimm.  ５巻：１頁；  Mimuraら、２００１年Adv.  Exp.  Med.  Biol.  ４９５巻：４９頁；  Baumannら、２００１年Adv.  Exp.  Med.  Biol.  ４９５巻：２１９頁；  Santosoら、２００１年Ital.  Heart  J.  ２巻：８１１頁；  Novakら、２００１年Curr.  Opin.  Immunol.  １３巻：７２１頁；  Fossatiら、２００１年Eur.  J.  Clin.  Invest.  ３１巻：８２１頁）。
【００８４】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介することができる細胞は、本発明に従えば免疫エフェクター細胞の好ましい例である。他の好ましい例には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびアレルギー応答機構を備えた細胞などの顆粒球細胞が挙げられる。したがって、免疫エフェクター細胞には、骨髄系統およびリンパ系統内の分化の様々な段階の細胞を含み、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好塩基球、好酸球、マスト細胞、血小板、赤血球ならびに前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）、前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（例えば、造血幹細胞）、静止状態の、活性化されたおよび成熟型のそのような細胞などの、１つまたは複数種類の機能的細胞表面ＦｃＲを発現し得る（しかし、その必要はない）造血起源の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の免疫エフェクター細胞として、免疫機能を媒介することができる非造血起源の細胞、例えば、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、破骨細胞、上皮細胞および他の細胞を挙げることができる。免疫エフェクター細胞として、細胞毒性もしくは細胞増殖抑制性イベントまたはエンドサイトーシスイベント、食作用イベントもしくは飲作用イベントを媒介する、あるいはアポトーシスの誘導をもたらす、あるいは微生物免疫または微生物感染の中和をもたらす細胞、あるいはアレルギー反応、炎症反応、過敏反応および／または自己免疫反応を媒介する細胞も挙げられ得る。
【００８５】
抗体およびその抗原結合断片
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域（本明細書ではまた、可変ドメインとも称する）内に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子である。本明細書で用いられる通り、用語「抗体」は、無傷のポリクローナル抗体または無傷のモノクローナル抗体だけでなく、また、これらの断片（単一可変領域抗体（ｄＡｂ）、または他の公知の抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）など、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、これらの合成改変体、天然に存在する改変体、必要とされる特異性を有する抗原結合断片を伴う抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性を有する抗原結合部位または抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む他の任意の操作もしくは修飾された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。遺伝子融合により構築される「ダイアボディー」、多価断片、または多重特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年）も、本明細書で想定される特定の形態の抗体である。本明細書にはまた、ＣＨ３ドメインへと接合されたｓｃＦｖを含むミニボディーも包含される（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年）；例えば、Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻、４２３〜４２６頁、１９８８年；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８５巻、５８７９〜５８８３頁、１９８８年；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻、６４４４〜６４４８頁、１９９３年；Ｙ．  Ｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４巻、１２３９〜１２４５頁、１９９６年；Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５６巻、３０５５〜３０６１頁、１９９６年も参照されたい）。ナノボディーおよびマキシボディー（ｍａｘｉｂｏｄｙ）もまた意図される（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号；米国特許第６，８３８，２５４号；ＷＯ０６／０７９３７２；ＷＯ２０１０／０３７４０２を参照されたい）。
【００８６】
本明細書で用いられる「抗原結合断片」という用語は、対象の抗原に結合する免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド断片を指し、この抗原は、本明細書に記載される特に好ましい実施形態では、ＦＺＤ１０受容体に結合する。この点で、本明細書で記載される抗体の抗原結合断片は、ＦＺＤ１０に結合する抗体に由来する、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列の１、２、３、４、５、または６つ全てのＣＤＲを含みうる。本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体の抗原結合断片は、ＦＺＤ１０への結合が可能である。ある特定の実施形態では、抗原結合断片または抗原結合断片を含む抗体が、ＦＺＤ１０を発現させる標的細胞の死滅化を媒介する。他の実施形態では、抗原結合断片の結合が、ＦＺＤ１０リガンド（例えば、Ｗｎｔタンパク質）のＦＺＤ１０受容体への結合を防止または阻害し、さもなければリガンドの受容体への結合から結果として生じる生物学的応答を遮断する。ある特定の実施形態では、抗原結合断片が、ヒトＦＺＤ１０に特異的に結合し、かつ／またはその生物学的活性を阻害もしくはモジュレートする。
【００８７】
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤による結合が可能であり、加えて、動物において、この抗原のエピトープへの結合が可能な抗体を産生するのに用いることが可能な分子または分子の部分を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有しうる。
【００８８】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体への特異的結合が可能である、任意の決定基、好ましくはポリペプチド決定基を包含する。エピトープとは、抗体が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基に、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニルなど、分子の化学的に活性な表面の組み分け（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）が含まれ、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特徴および／または特定の電荷特徴を有しうる。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。抗体は、ある実施形態によれば、抗体−抗原結合についての平衡解離定数が１０−６Ｍ未満もしくはそれに等しいか、または１０−７Ｍ未満もしくはそれに等しいか、１０−８Ｍ未満もしくはそれに等しい場合に、特異的に抗原に結合するといわれることができる。一部の実施形態では、平衡解離定数が１０−９Ｍ未満もしくはそれに等しい場合もあり、１０−１０Ｍ未満もしくはそれに等しい場合もある。
【００８９】
タンパク質分解酵素であるパパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片であって、これらのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）の各々が、無傷の抗原結合部位を包含する共有結合的ヘテロ二量体を含む、いくつかの断片をもたらす。酵素であるペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかの断片であって、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片を含めた、いくつかの断片をもたらすことが可能である。本発明のある特定の実施形態に従って用いられるＦｖ断片は、ＩｇＭの優先的なタンパク質分解的切断により産生させうるが、まれな場合には、ＩｇＧ免疫グロブリン分子またはＩｇＡ免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断により産生させることもできる。しかし、Ｆｖ断片は、より一般的には、当技術分野において公知の組換え法を用いて誘導される。Ｆｖ断片は、天然抗体分子の抗原認識能および抗原結合能の大半を保持する抗原結合部位を含めた、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を包含する（Ｉｎｂａｒら（１９７２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、６９巻：２６５９〜２６６２頁；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５巻：２７０６〜２７１０頁；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９巻：４０９１〜４０９６頁）。
【００９０】
ある特定の実施形態では、単鎖Ｆｖ抗体またはｓｃＦＶ抗体が想定される。例えば、カッパボディー（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．、１０巻：９４９〜５７頁（１９９７年））；ミニボディー（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１３巻：５３０５〜９頁（１９９４年）；ダイアボディー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ、９０巻：６４４４〜８頁（１９９３年））；またはヤヌシン（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ、１０巻：３６５５〜５９頁（１９９１年）、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．、７巻：５１〜５２頁（１９９２年））は、所望の特異性を有する抗体の選択について本出願の教示に従い、標準的な分子生物学法を用いて調製することができる。さらに他の実施形態では、本開示のリガンドを包含する二重特異性抗体またはキメラ抗体を作製することができる。例えば、キメラ抗体が、異なる抗体に由来するＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を含みうるのに対し、１つの結合ドメインを介してＦＺＤ１０に特異的に結合し、第２の結合ドメインを介して第２の分子に特異的に結合する二重特異性抗体を生成させることができる。これらの抗体は、組換え分子生物学法を介して産生させることもでき、物理的に併せてコンジュゲートすることもできる。
【００９１】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドとは、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体であって、ペプチドをコードするリンカーにより連結されたＶＨ−コード遺伝子およびＶＬ−コード遺伝子を含めた遺伝子融合体から発現するヘテロ二量体である（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻（１６号）：５８７９〜５８８３頁）。天然では凝集した（しかし、化学的には分離される）軽ポリペプチド鎖および重ポリペプチド鎖を、抗体のＶ領域から、抗原結合部位の構造と実質的に類似した三次元構造へとフォールドするｓＦｖ分子へと転換するために、化学構造を識別する多数の方法が記載されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎらによる米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄｎｅｒらによる米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【００９２】
抗体のｄＡｂ断片は、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，  Ｅ．  Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４〜５４６頁（１９８９年））。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体（例えば、ＦＺＤ１０特異的抗体）は、ダイアボディーの形態である。ダイアボディーとは、各ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含むポリペプチドの多量体であって、２つのドメインが連結されている（例えば、ペプチドリンカーによって）が、互いと会合して抗原結合部位を形成することは可能でなく、抗原結合部位が、多量体内の一方のポリペプチドの第１のドメインの、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合により形成される多量体である（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００９４】
二重特異性抗体を用いる場合、これらは、多様なやり方（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４巻、４４６〜４４９頁（１９９３年））で製造しうる、例えば、化学的に調製されるか、またはハイブリッド体であるハイブリドーマから調製される、従来の二重特異性抗体の場合もあり、上記で言及した二重特異性抗体断片のうちのいずれかの場合もある。ダイアボディーおよびｓｃＦｖは、そのような抗体の投与を受ける被験体において、惹起された免疫応答（例えば、抗イディオタイプ反応）の可能性または重篤度を潜在的に低減する可変領域だけを用いて、Ｆｃ領域なしに構築することができる。
【００９５】
二重特異性完全抗体と対比される二重特異性ダイアボディーはまた、それらを容易に構築し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させうるため、特に有用でもありうる。適切な結合特異性を有するダイアボディー（および抗体断片など、他の多くのポリペプチド）は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いて、ライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディーの一方のアームを、例えば、抗原Ｘを指向する特異性により定常に保つ場合、他方のアームを変化させて適切な特異性を有する抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性完全抗体は、ＫＩＨ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作により作製することができる（Ｒｉｄｇｅｗａｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９巻、６１６〜６２１頁、１９９６年）。
【００９６】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供することができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）とは、ヒンジ領域を除去したＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照されたい；また、例えば、ＵＳ２００９０２２６４２１も参照されたい）。この所有権のある抗体技術は、現行の低分子抗体フォーマットより治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）が長いと予測される、安定的なより低分子の抗体フォーマットを創出する。ＩｇＧ４抗体は、不活性であり、したがって、免疫系とは相互作用しないと考えられる。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を消失させて、対応する無傷のＩｇＧ４と比べて顕著な安定性特性を有する半分子断片を得ることにより改変することができる（ＧｅｎＭａｂ、Ｕｔｒｅｃｈｔ）。ＩｇＧ４分子を二等分することにより、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）には、コグネイト抗原（例えば、疾患の標的）に結合しうる１つのエリアだけが残され、したがって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞における１つの部位だけに一価結合する。ある特定のがん細胞の表面抗原では、この一価結合は、同じ抗原特異性を有する二価抗体を用いるときに見られうるようながん細胞の成長を刺激しえず、よって、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来の抗体による処置に対して不応性でありうる一部の種類のがんのための処置の選択肢をもたらしうる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、普通のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズである。このようにサイズが小さいことは、より大型の充実性腫瘍にわたる分子のより良好な分布を可能とし、潜在的に有効性を増大させるので、一部の形態のがんを処置する場合に大きな有益性でありうる。
【００９７】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、ナノボディーの形態をとりうる。ナノボディーは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼ全ての原核生物宿主および真核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照されたい）、かび（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属）、および酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ属、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、またはＰｉｃｈｉａ属（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号を参照されたい））において効率的に産生される。産生工程は拡大可能であり、数キログラム分量のナノボディーが産生されている。ナノボディーは、保管寿命の長い、すぐに使用可能な液剤として製剤化することができる。Ｎａｎｏクローン法（例えば、ＷＯ０６／０７９３７２を参照されたい）とは、Ｂ細胞の自動式ハイスループット選択に基づき、所望の標的に対するナノボディーを生成させる所有権のある方法である。
【００９８】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体およびそれらの抗原結合断片は、ＣＤＲに対する支持体をもたらし、互いと比べたＣＤＲの空間関係を規定する、重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域（ＦＲ）のセットの間にそれぞれ置かれる、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲのセットを包含する。本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のうちの３つの超可変領域を指す。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域を、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と称する。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを包含する。本明細書では、単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを「分子的認識単位」と称する。多数の抗原−抗体複合体の結晶学的解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触であって、抗原との最も広範な接触が重鎖ＣＤＲ３との接触である、抗原との接触を形成することが裏付けられている。したがって、分子的認識単位は、抗原結合部位の特異性の主要な一因をなす。
【００９９】
本明細書で用いられる「ＦＲセット」という用語は、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを枠付ける４つの隣接アミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基は、結合した抗原に接触しうるが、ＦＲ、特に、ＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基は、Ｖ領域を抗原結合部位へとフォールドさせる主要な一因をなす。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基およびある特定の構造的特徴が極めて高度に保存される。この点で、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部のジスルフィドループを含有する。Ｖ領域が結合部位へとフォールドすると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出ループモチーフとして提示される。一般に、ＣＤＲループがある特定の「カノニカル」構造（ＣＤＲの正確なアミノ酸配列にかかわらず）へとフォールドする形状に影響を与える、ＦＲの保存された構造領域が存在することが認知されている。さらに、ある特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖との相互作用を安定化させる非共有結合的なドメイン間接触に関与することも公知である。
【０１００】
免疫グロブリン可変領域の構造および位置は、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、４版、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８７年、および現在ではインターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で入手可能なその改定版を参照することにより決定することができる。
【０１０１】
「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団をいい、ここで、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関係するアミノ酸（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸）で構成される。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一のエピトープを指向する。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、また、それらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）、それらの改変体、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープに結合する能力を有する抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む他の任意の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子も包含する。抗体の供給源または抗体が作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定することは意図しない。この用語は、完全な免疫グロブリンの他、上記の断片なども包含する。
【０１０２】
「ヒト化」抗体とは、一般に組換え法を用いて調製され、抗原結合部位がヒト以外の種に由来する免疫グロブリンに由来し、残りの免疫グロブリン分子の構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づくキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインへと融合させた完全可変領域を含む場合もあり、可変ドメインにおける適切なフレームワーク領域へと移植したＣＤＲだけを含む場合もある。エピトープ結合部位は、野生型の場合もあり、１つまたは複数のアミノ酸置換により修飾される場合もある。このキメラ構造は、ヒト個体における免疫原としての非ヒト起源の定常領域は消失させるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，  Ａ．  Ｆ．ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻：４２２０〜４２２４頁；Ｑｕｅｅｎら、ＰＮＡＳ（１９８８年）、８６巻：１００２９〜１００３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８年）、３３２巻：３２３〜３２７頁）。本発明のある特定の実施形態に従う例示的ヒト化抗体は、配列番号２９、３１、３７、３９に提供されるヒト化配列を含む。
【０１０３】
別の手法は、ヒト由来の定常領域をもたらすことだけでなく、また、それらをヒト形態に可能な限り酷似させて作り変えるように、可変領域の修飾にも同様に焦点を絞る。上記にも留意したように、重鎖および軽鎖両方の可変領域は、問題のエピトープに応じて変化し、結合能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、所与の種において比較的保存されてＣＤＲの足場をもたらすと推定される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に挟まれるＣＤＲを含有することが公知である。特定のエピトープに対する非ヒト抗体を調製する場合、非ヒト抗体に由来するＣＤＲを、改変されるヒト抗体に存在するＦＲに移植することにより、可変領域を「作り変える」または「ヒト化する」場合がある。この手法の多様な抗体への適用は、Ｓａｔｏ，  Ｋ．ら（１９９３年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５３巻：８５１〜８５６頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，  Ｌ．ら（１９８８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，  Ｍ．ら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，  Ｃ．  Ａ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４巻：７７３〜３７８３頁；Ｍａｅｄａ，  Ｈ．ら（１９９１年）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、２巻：１２４〜１３４頁；Ｇｏｒｍａｎ，  Ｓ．  Ｄ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁；Ｔｅｍｐｅｓｔ，  Ｐ．  Ｒ．ら（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：２６６〜２７１頁；Ｃｏ，  Ｍ．  Ｓ．ら（１９９１年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：２８６９〜２８７３頁；Ｃａｒｔｅｒ，  Ｐ．ら（１９９２年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜４２８９頁；およびＣｏ，  Ｍ．  Ｓ．ら（１９９２年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻：１１４９〜１１５４頁により報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体に由来する６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、１つまたは複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）であって、元の抗体に対して変化させたＣＤＲ、また、元の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれるＣＤＲを有する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、キメラ抗体でありうる。この点で、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分に作動可能に連結するか、または他の形で融合させた抗ＦＺＤ１０抗体の抗原結合断片で構成される。ある特定の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ヒト起源である。他の実施形態では、異種Ｆｃドメインは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含めた）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含めた）、およびＩｇＭを含めた親抗体とは異なるＩｇクラスに由来しうる。さらなる実施形態では、異種Ｆｃドメインは、異なるＩｇクラスのうちの１つまたは複数に由来するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインで構成されうる。ヒト化抗体について上記で言及した通り、キメラ抗体の抗ＦＺＤ１０抗原結合断片は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数（例えば、本明細書で記載される抗体の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ）だけを含む場合もあり、可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ、またはこれらの両方）の全体を含む場合もある。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１０結合抗体は、本明細書で記載される抗体のＣＤＲのうちの１つまたは複数を含む。この点で、場合によっては、所望の特異的結合をなお保持しながら、抗体のＶＨＣＤＲ３だけを移動させうることが示されている（Ｂａｒｂａｓら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：２５２９〜２５３３頁）。また、ＭｃＬａｎｅら、ＰＮＡＳ（１９９５年）、９２巻：５２１４〜５２１８頁、Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（１９９４年）、１１６巻：２１６１〜２１６２頁も参照されたい。
【０１０６】
Ｍａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９２年、１０巻：７７９〜７８３頁）は、抗体可変ドメインのレパートリーを作製する方法であって、可変ドメインの５’端を指向するかまたはこれに隣接するコンセンサスプライマーを、ヒトＶＨ遺伝子の第３のフレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に用いて、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを提供する方法について記載している。Ｍａｒｋｓらは、どのようにしてこのレパートリーを、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせうるかについてもさらに記載している。類似の技法を用いて、本明細書で記載されている抗体のＣＤＲ３に由来する配列を、ＣＤＲ３を欠くＶＨドメインまたはＶＬドメインのレパートリーと共にシャッフルし、シャッフルされた完全ＶＨドメインまたは完全ＶＬドメインを、コグネイトＶＬドメインまたはコグネイトＶＨドメインと組み合わせて、ＦＺＤ１０に結合する抗体またはその抗原結合断片をもたらすことができる。次いで、適した抗体またはそれらの抗原結合断片を選択しうるように、ＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムなど、適した宿主システムにおいてレパートリーを提示することができる。レパートリーは、少なくとも約１０４の個別のメンバーから、これを数桁上回る、例えば、約１０６〜１０８または１０１０以上のメンバーまでからなりうる。また、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ、１９９４年、３７０巻：３８９〜３９１頁）は、類似のシャッフリング法またはコンビナトリアル法も開示しており、この技法を、β−ラクタマーゼ遺伝子との関連で記載しているが、この手法を抗体の生成に用いうることを観察している。
【０１０７】
さらなる代替法は、１つまたは複数の選択されたＶＨ遺伝子および／またはＶＬ遺伝子に対するランダム変異誘発であって、可変ドメインの全体において変異を発生させる変異誘発を用いて、本明細書で記載される本発明の実施形態の１つまたは複数のＣＤＲに由来する配列を保有する新規のＶＨ領域またはＶＬ領域を生成させることである。このような技法は、エラープローンＰＣＲを用いたＧｒａｍら（１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９巻：３５７６〜３５８０頁）により記載されている。用いうる別の方法は、変異誘発をＶＨ遺伝子またはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域へと方向付けることである。このような技法は、Ｂａｒｂａｓら（１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３８０９〜３８１３頁）およびＳｃｈｉｅｒら（１９９６年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２６３巻：５５１〜５６７頁）により開示されている。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体の特異的ＶＨおよび／または特異的ＶＬを用いて、相補的な可変ドメインのライブラリーをスクリーニングして、ＦＺＤ１０に対するアフィニティーの増大など、所望の特性を伴う抗体を同定することができる。このような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）、１５０巻：８８０〜８８７頁；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１年）、３５２巻：６２４〜６２８頁に記載されている。
【０１０９】
また、他の方法を用いてＣＤＲを混合および適合させて、ＦＺＤ１０への結合などの所望の結合活性を有する抗体を同定することもできる。例えば、Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００年）、８３巻：２５２〜２６０頁は、マウスＶＬと、ＣＤＲ３およびＦＲ４をマウスＶＨから保持したヒトＶＨライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリーに対してスクリーニングして、抗原に結合する抗体を得た。Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．（２０００年）、２９６巻：８３３〜８４９頁は、マウス重鎖の全体とヒト軽鎖ライブラリーとを用いるスクリーニング工程について記載している。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３を保持したヒトＶＨライブラリーと組み合わせた。抗原に結合することが可能な抗体を得た。Ｒａｄｅｒら、ＰＮＡＳ（１９９８年）、９５巻：８９１０〜８９１５頁は、上記のＢｅｉｂｏｅｒらの工程と同様の工程について記載している。
【０１１０】
当技術分野では、記載したばかりのこれらの技法が、それら自体としては、そのようなものとして公知である。しかし、本開示に基づいて、当業者は、当技術分野の日常的な方法を用いて、本明細書で記載される本発明のいくつかの実施形態に従い、抗体またはそれらの抗原結合断片を得るのに、このような技法を用いることが可能である。
【０１１１】
本明細書ではまた、ＦＺＤ１０抗原に特異的な抗体または抗原結合ドメインを得る方法であって、本明細書で示されるＶＨドメインのアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸を付加、欠失、置換、または挿入することにより、このＶＨドメインのアミノ酸配列改変体であるＶＨドメインをもたらすステップを含む、方法も開示される。場合によっては、このようにしてもたらされたＶＨドメインは、１つまたは複数のＶＬドメインと組み合わされうる。次いで、ＶＨドメインまたは１つもしくは複数のＶＨ／ＶＬの組合せを調べて、ＦＺＤ１０の特異的結合メンバー、またはＦＺＤ１０に特異的であり、場合によって、１つもしくは複数の好ましい特性、好ましくは、ＦＺＤ１０を発現させる細胞に対する細胞傷害を媒介する能力もさらに伴う抗体の抗原結合ドメインを同定されうる。前記ＶＬドメインは、本明細書で実質的に示されるアミノ酸配列を有しうる。本明細書で開示されるＶＬドメインの１つまたは複数の配列改変体を、１つまたは複数のＶＨドメインと組み合わせる類似の方法も使用することができる。
【０１１２】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」（本明細書では互換的に用いられる）エピトープとは、当技術分野において十分に理解された用語であり、当技術分野ではまた、このような特異的な結合または優先的な結合を決定する方法も周知である。分子は、それが、特定の細胞または物質と、他の細胞または物質との場合より高頻度で、迅速に、長い持続期間にわたり、かつ／または大きなアフィニティーで反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈示するという。抗体は、それが、他の物質に結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続期間にわたり結合する場合、標的に「特異的に結合する」か、またはこれに「優先的に結合する」。例えば、ＦＺＤ１０エピトープに特異的または優先的に結合する抗体とは、１つのＦＺＤ１０エピトープに、他のＦＺＤ１０エピトープまたはＦＺＤ１０以外のエピトープに結合する場合より大きなアフィニティー、アビディティーで、容易に、かつ／または長い持続期間にわたり結合する抗体である。また、この定義を読み取ることにより、例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合もあり、結合しない場合もあることも理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を要求するわけではない（排他的結合を包含しうるが）。一般に、結合に対する言及は、優先的結合を意味するが、必ずしもそうであるわけではない。
【０１１３】
免疫的結合とは一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的である抗原との間で、例えば、例示として述べるものであり、限定として述べるものではないが、静電引力もしくは静電斥力、イオン性引力もしくはイオン性斥力、親水性引力もしくは親水性斥力、および／または疎水性引力もしくは疎水性斥力、立体的な強制力（ｓｔｅｒｉｃ  ｆｏｒｃｅ）、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果として生じる種類の非共有結合的相互作用を指す。免疫的結合による相互作用の強度またはアフィニティーは、この相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、より低値のＫｄがより大きなアフィニティーを表す。選択したポリペプチドの免疫的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。このような一方法は、抗原結合部位／抗原の複合体形成および解離の速度を測定するステップを伴い、この速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用のアフィニティー、およびいずれの方向の速度にも等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。こうして、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）のいずれも、濃度ならびに実際の会合速度および解離速度を計算することにより決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、アフィニティーと関連しない全てのパラメータの解消を可能とし、したがって、解離定数Ｋｄと等しい。一般に、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５９巻：４３９〜４７３頁を参照されたい。
【０１１４】
免疫的に活性であるかまたは「免疫的活性を維持する」エピトープに言及する場合の「免疫的に活性な」という用語は、抗体（例えば、抗ＦＺＤ１０抗体）が、異なる条件下で、例えば、エピトープを還元条件および変性条件にかけた後でエピトープに結合する能力を指す。
【０１１５】
本出願のある特定の好ましい実施形態に従う抗体またはその抗原結合断片は、本明細書で記載される任意の抗体であって、（ｉ）抗原に特異的に結合し、かつ、（ｉｉ）本明細書で開示されるＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含むか、または本明細書で開示されるＶＨ  ＣＤＲ３、もしくはこれらのうちのいずれかの改変体を含む抗体と、ＦＺＤ１０への結合について競合する抗体またはその抗原結合断片でありうる。結合メンバー間の競合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、かつ／または特定のレポーター分子であって、他のタグ付けされない結合メンバー（複数可）の存在下において検出され、同じエピトープもしくは重複エピトープに結合する特異的結合メンバーの同定を可能としうるレポーター分子を１つの結合メンバーへとタグ付けすることにより、簡単にアッセイすることができる。
【０１１６】
したがって、本明細書では、本明細書の実施例に記載される抗体（例えば、クローンＢ９Ｌ９．３、Ｂ９Ｌ９．３２．２）など、本明細書で記載される、ＦＺＤ１０に結合する抗体と、競合する抗体の抗原結合部位を含む特異的な抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【０１１７】
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域よりも配列多様性が少なく、重要な生化学イベントを誘発する多数の天然のタンパク質への結合を担う。ヒトでは、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を包含する）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を包含する）、およびＩｇＭを含めた、抗体の５つの異なるクラスが存在する。Ｖ領域にも微妙な差違が存在しうるが、これらの抗体クラスの間の識別特徴はそれらの定常領域である。
【０１１８】
抗体のＦｃ領域は、多数のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と称する一連の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、ＩｇのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、ならびにＣＨ２へと通じるＮ末端のヒンジを含む。ＩｇＧクラスのＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞性アームとの間のコミュニケーションを媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含めたＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含めた）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含めた）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めたＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含めた）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含めた）を含めたＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）を包含する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内の一部のシグナル伝達イベントを媒介しうる細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞を含めた多様な免疫細胞において発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、これらのエフェクター細胞は、抗原が結合した部位へと動員され、この結果として典型的に、細胞内ではシグナル伝達イベントがもたらされ、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞の活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性の攻撃など、その後の重要な免疫応答がもたらされる。
【０１１９】
細胞傷害エフェクター機能および食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的とする細胞を破壊する強力な機構である。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と称する（Ｒａｇｈａｖａｎら、１９９６年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ、１２巻：１８１〜２２０頁；Ｇｈｅｔｉｅら、２０００年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８巻：７３９〜７６６頁；Ｒａｖｅｔｃｈら、２００１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９巻：２７５〜２９０頁）。ＦｃγＲを発現させる非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応を、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）と称する。全てのＦｃγＲは、Ｆｃ上の同じ領域である、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端および上流のヒンジに結合する。この相互作用は、構造的に十分特徴付けられており（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２００１年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３０９巻：７３７〜７４９頁）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃのいくつかの構造が解明されている（ｐｄｂ受託コード：１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ、４０６巻：２６７〜２７３頁）（ｐｄｂ受託コード：１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖら、２００１年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７６巻：１６４６９〜１６４７７頁）。
【０１２０】
異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲに対して異なるアフィニティーを有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の場合より実質的に良好に、ＦｃγＲ受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ、８２巻：５７〜６５頁）。全てのＦｃγＲは、ＩｇＧ  Ｆｃの同じ領域に結合するが、アフィニティーが異なる：高アフィニティーで結合するＦｃγＲＩのＩｇＧ１に対するＫｄが１０−８Ｍ−１であるのに対し、低アフィニティーの受容体であるＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは一般に、それぞれ、１０−６および１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外ドメインとＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインとは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは、細胞内のシグナル伝達ドメインを有さない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａが、免疫複合体によりトリガーされる活性化の正の制御因子であり、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内のドメインを有することを特徴とするのに対し、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、したがって、阻害性である。したがって、前者を活性化受容体と称し、ＦｃγＲＩＩｂを、阻害性受容体と称する。異なる免疫細胞ではまた、受容体の発現パターンおよび発現レベルも異なる。複雑性のさらに別のレベルは、ヒトプロテオームにおける多数のＦｃγＲ多型の存在である。臨床的な重要性を伴う特に関与性の多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプに対する場合より大きなアフィニティーでＶ１５８アロタイプに結合する。このアフィニティーの差違、ならびに、おそらくはＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対するその効果は、抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標））の有効性の重大な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを伴う患者は、リツキシマブ処置に対する応答が良好であるが、低アフィニティーのＦ１５８アロタイプを伴う患者の応答は良好でない（Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。ヒトのうちの約１０〜２０％はＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合性であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合性であり、ヒトのうちの３５〜４５％はＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合性である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒら、１９９９年、Ｂｌｏｏｄ、９４巻：４２２０〜４２３２頁；Ｃａｒｔｒｏｎら、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻：７５４〜７５８頁）。したがって、ヒトのうちの８０〜９０％は応答が良好ではない、すなわち、少なくとも１つのＦ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子を有する。
【０１２１】
Ｆｃ領域はまた、補体カスケードの活性化にも関係する。古典的な補体経路では、Ｃ１が、そのＣ１ｑサブユニットにより、抗原（複数可）と複合体を形成したＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ断片に結合する。本発明のある特定の実施形態では、Ｆｃ領域に対する修飾が、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体の補体系を活性化する能力を変化させる（増強または減殺する）修飾を含む（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号を参照されたい）。補体の活性化を評価するためには、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．２０２巻：１６３頁（１９９６年）を参照されたい）。例えば、多様な濃度の（Ｆｃ）改変体ポリペプチドおよびヒト補体を、緩衝液で希釈することができる。（Ｆｃ）改変体抗体、希釈したヒト補体、および抗原（ＦＺＤ１０）を発現させる細胞の混合物を、平底の組織培養用９６ウェルプレートに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で２時間にわたりインキュベートさせて、補体媒介性細胞溶解を促進することができる。次いで、５０マイクロリットルのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で一晩にわたりインキュベートすることができる。吸光度は、励起を５３０ｎｍとし、発光を５９０ｎｍとする９６ウェル蛍光測定器を用いて測定することができる。結果は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表すことができる。試料濃度は、標準曲線から算出することができ、改変体でない抗体と比較した活性パーセントを、対象の改変体抗体について報告することができる。
【０１２２】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣの増強、または特定のＦｃγＲに対する結合アフィニティーの増強などの機能的特性を変化させた、修飾Ｆｃ領域を有する抗ＦＺＤ１０抗体を提供する。Ｆｃ領域の例示的な修飾には、例えば、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、２００７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６７巻：８８８２頁において記載される修飾が含まれる。本明細書で想定される他の修飾Ｆｃ領域は、例えば、発行された米国特許第７，３１７，０９１号；同第７，６５７，３８０号；同第７，６６２，９２５号；同第６，５３８，１２４号；同第６，５２８，６２４号；同第７，２９７，７７５号；同第７，３６４，７３１号；米国出願公開第ＵＳ２００９０９２５９９号；同第ＵＳ２００８０１３１４３５号；同第ＵＳ２００８０１３８３４４号；および国際出願公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号；同第ＷＯ２００４／０６３３５１号；同第ＷＯ２００６／０８８４９４号；同第ＷＯ２００７／０２４２４９号において記載されている。
【０１２３】
抗ＦＺＤ１０抗体の所望の機能的特性は、ＡＤＣＣアッセイ（実施例の節を参照されたい）、ＡＤＣＰアッセイ、アフィニティー／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴、競合的阻害アッセイ）、細胞傷害性アッセイ、細胞生存度アッセイ（例えば、Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ、ヨウ化プロピジウムなどの色素排除を用いるアッセイ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデル（例えば、細胞増殖および／またはコロニー形成アッセイ、アンカー形成依存性増殖アッセイ、標準的なヒト腫瘍異種移植モデル）を用いるがん細胞および／または腫瘍の成長阻害が含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知の多様な方法を用いて評価することができる（例えば、Ｃｕｌｐ  ＰＡら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１６巻（２号）：４９７〜５０８頁を参照されたい）。他のアッセイでは、本明細書で記載される抗体が、細胞増殖、細胞分化（例えば、幹細胞および前駆細胞の分化）、およびある特定の細胞型では、免疫制御機能など、通常のＦＺＤ１０を介する応答を遮断する能力を調べることができる。このようなアッセイは、当業者に公知の十分に確立されたプロトコール（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｉｎｃ．  ＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ編、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ、２００１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）を参照されたい）を用いて実施することもでき、市販のキットを用いて実施することもできる。
【０１２４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、ＦＺＤ１０受容体へのＷＮＴ７ａおよび／またはＷＮＴ７ｂ、またはＦＺＤ１０に対する他の任意のリガンドの結合をも遮断する。結合アッセイおよび競合阻害アッセイを使用して、本明細書に記載される抗体またはその改変体（ｖａｒｉａｎｔ）もしくは抗原結合断片の遮断活性を決定することができる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体はＦＺＤ１０に結合して、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路における下流シグナル伝達イベントを遮断するまたは阻害する。特定の実施形態では、抗ＦＺＤ１０抗体により与えられるＷｎｔシグナル伝達阻害のレベルは、本明細書に開示される抗ＦＺＤ１０抗体の非存在下でのＷｎｔシグナル伝達のレベルと比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂによるシグナル伝達のレベルにおける統計学的に有意な減少でありえる。
【０１２６】
したがって、本開示は、カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の構成要素をモジュレートする抗ＦＺＤ１０抗体を提供する。モジュレートするとは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素の活性、タンパク質レベル、遺伝子発現レベルまたはリン酸化状態を統計学的に有意な方法で（例えば、適切な対照を使用して測定した場合、統計学的に有意な方法で阻害することまたは統計学的に有意な方法で増大させること）変えることを意味する。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の構成要素には、ＬＲＰ（ＬＲＰ５、ＬＲＰ６などの低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）、アキシン、カゼインキナーゼ（ＣＫ１、ＣＫ２）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（Ｇｓｋ３ｂ）結合腫瘍タンパク質のＦｒａｔ／ＧＢＰファミリー、微小管アフィニティー制御キナーゼ（ＭＡＲＫ；ＰＡＲ−１）、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ｂ（ＧＳＫ−３ｂ）、大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ；ポリポーシス２．５の欠失（ＤＰ２．５）とも称される）、βカテニン、ＤＮＡ結合タンパク質（転写因子）の（Ｔ細胞因子）／ＬＥＦ−１（リンパ系エンハンサー因子１）ファミリー、βカテニン−ＴＣＦおよびβカテニン−ＴＣＦにより制御される遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。βカテニンは、活性型では、ＤＮＡ結合タンパク質のＴＣＦ／ＬＥＦ−１（リンパ系エンハンサー因子１）ファミリーに対する転写活性化因子である。ＴＣＦ応答性遺伝子の例にはｃ−ｍｙｃおよびサイクリンＤ１が挙げられる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素の調節は、前記経路の１つまたは複数の構成要素のリン酸化状態の調節を含み得る。ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１０受容体への本発明の抗ＦＺＤ１０抗体の結合により、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄのリン酸化の減少、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化の減少およびβカテニンのリン酸化の増加のうちの１つまたは複数が、統計学的に有意な方法で引き起こされ得る。
【０１２８】
抗体がＷｎｔシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは当技術分野では公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にＴＣＦ結合ドメインの複数のコピーを含有するＴＣＦ／Ｌｕｃレポーターベクターを利用する細胞ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、カノニカルＷｎｔシグナル伝達レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができる（Gazitら、１９９９年、Oncogene  １８巻；  ５９５９〜６６頁）。そのようなアッセイは、本明細書の実施例４においても記載されている。ＦＺＤ１０結合抗体が存在する１つまたは複数のＷｎｔ（例えば、トランスフェクト細胞により発現されるまたはＷｎｔ順化培池により提供されるＷｎｔ（複数可））の存在下でのＷｎｔシグナル伝達のレベルは、ＦＺＤ１０結合抗体が存在しないシグナル伝達のレベルと比較される。カノニカルＷｎｔシグナル伝達の阻害を評価するそのようなルシフェラーゼレポーターアッセイの使用の非限定的な特定の例は、本明細書の実施例に提供されている。ＴＣＦ／ｌｕｃレポーターアッセイに加えて、カノニカルＷｎｔシグナル伝達に対するＦＺＤ１０結合抗体の効果は、ｃ−ｍｙｃ（Heら、Science  ２８１巻：１５０９〜１２頁（１９９８年））、サイクリンＤ１（Tetsuら、Nature  ３９８巻：４２２〜６頁（１９９９年））および／またはフィブロネクチン（Gradlら、Mol.  Cell  Biol.  １９巻：５５７６〜８７頁（１９９９年））などのベータカテニン制御遺伝子の発現レベルに対する前記抗体の効果を測定することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達に対する本明細書に記載される抗体の効果は、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−１、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−２、Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−３、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６および／またはβカテニンのリン酸化状態に対する前記抗体の効果を測定することによっても評価することができる。他の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＦＺＤ結合抗体の効果は、Ｗｎｔシグネチャーにおける１つまたは複数の遺伝子の発現レベルに対するＦＺＤ結合抗体の効果を評価することにより決定される。カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の構成要素の調節を決定するための他のアッセイおよび市販のシステムは当業者には公知である。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合断片をコードする単離核酸、例えば、ＣＤＲまたはＶＨドメインもしくはＶＬドメインをコードする核酸をさらに提供する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。これらの実施形態および関連する実施形態は、本明細書で記載されるＦＺＤ１０に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを包含しうる。本明細書で用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、もしくは合成起源、またはこれらの一部の組合せであるポリヌクレオチドであって、その起源により、（１）その単離ポリヌクレオチドが天然において見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していないか、（２）天然では連結されないポリヌクレオチドに連結されているか、または（３）天然でより長大な配列の一部としては生じないポリヌクレオチドを意味するものとする。
【０１３０】
「作動可能に連結された」という用語は、この用語が適用される構成要素が、適した条件下でそれらがそれらの固有の機能を果たすことを可能とする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結された」転写制御配列は、タンパク質コード配列の発現を、制御配列の転写活性と適合可能な条件下で達成するように、タンパク質コード配列にライゲーションされる。
【０１３１】
本明細書で用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるかまたは作動可能に連結されるコード配列の発現、プロセシング、または細胞内局在化に影響を及ぼしうるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存しうる。具体的な実施形態では、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を包含しうる。他の具体的な実施形態では、真核生物の転写制御配列は、転写因子、転写エンハンサー配列、転写終結配列、およびポリアデニル化配列の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーターを包含しうる。ある特定の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を包含しうる。
【０１３２】
本明細書で言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドの場合もあり、デオキシリボヌクレオチドの場合もあり、ヌクレオチドのいずれかの種類の修飾形態の場合もある。前記修飾には、ブロモウリジンなどの塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、およびホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）などのヌクレオチド間連結修飾が含まれる。「ポリヌクレオチド」という用語は、特に、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【０１３３】
「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。「修飾ヌクレオチド」という用語は、糖基などが修飾または置換されたヌクレオチドを包含する。「オリゴヌクレオチド連結」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホルアミデートなどのオリゴヌクレオチド連結を包含する。例えば、それらの開示が任意の目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、１９８６年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１４巻：９０８１頁；Ｓｔｅｃら、１９８４年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０６巻：６０７７頁；Ｓｔｅｉｎら、１９８８年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻：３２０９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、６巻：５３９頁；Ｚｏｎら、１９９１年、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、８７〜１０８頁（Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃら、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、１９９０年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０巻：５４３頁を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能とする検出可能な標識を包含しうる。
【０１３４】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞へと導入するのに用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すのに用いられる。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に適し、挿入された異種核酸配列の発現を誘導し、かつ／または制御する核酸配列を含有するベクターを指す。発現には、転写、翻訳、および、イントロンが存在する場合は、ＲＮＡスプライシングなどの過程が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３５】
当業者が理解する通り、ポリヌクレオチドは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現させる、またはこれらを発現させるように適合させる場合もある、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミドによりコードされる配列、ならびにより小型の作出された遺伝子セグメントを包含しうる。このようなセグメントは、天然で単離される場合もあり、当業者が合成的に改変する場合もある。
【０１３６】
これもまた当業者が十分に理解する通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）の場合もあり、二本鎖の場合もあり、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分子の場合もあり、ＲＮＡ分子の場合もある。ＲＮＡ分子は、イントロンを含有し、ＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含しうる。本開示に従うポリヌクレオチドには、さらなるコード配列または非コード配列を存在させることもできるが存在させなくともよく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結することもできるが連結しなくともよい。ポリヌクレオチドは、天然配列を含む場合もあり、このような配列の改変体または誘導体をコードする配列を含む場合もある。
【０１３７】
したがって、これらの実施形態および関連する実施形態によれば、配列番号１９〜２２のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１９〜２２のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号１９〜２２のうちのいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体の一部または全部を含むポリヌクレオチドが提供される。ある特定の好ましい実施形態では、本明細書の別の個所で記載される通り、本明細書で示されるポリヌクレオチド配列が、ＦＺＤ１０に結合する抗体またはそれらの抗原結合断片をコードする。
【０１３８】
他の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド改変体が、本明細書の配列番号１９〜２２で開示される配列に対して実質的な同一性を有することが可能であり、例えば、本明細書で記載される方法（例えば、以下で記載される、標準的なパラメータを用いるＢＬＡＳＴ解析）を用い、本明細書で開示される配列など、基準のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む改変体でありうる。当業者は、これらの値を適切に調整して、コドンの縮重性、アミノ酸の類似性、リーディングフレームの位置決定などを考慮することにより、２つのヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の対応する同一性を決定しうることを認識するであろう。
【０１３９】
ポリヌクレオチド改変体は、好ましくは、改変体のポリヌクレオチドによりコードされる抗体の結合アフィニティーが、本明細書で具体的に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる抗体と比べて実質的に減殺されないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有することが典型的である。
【０１４０】
他のある特定の関連する実施形態では、ポリヌクレオチド断片が、本明細書で開示される配列のうちの１つまたは複数と同一であるかまたは相補的な、多様な長さの配列の連続的なストレッチを含むか、または本質的にこれらからなることが可能である。例えば、本明細書で開示される配列のうちの１つまたは複数のうちの少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００、４００、５００、または１０００以上の連続ヌクレオチド、ならびにこれらの間の全ての中間の長さを含むか、または本質的にこれらからなるポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」とは、２００〜５００；５００〜１，０００などを通した全ての整数を含め、５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など、引例値の間の任意の長さを意味することが容易に理解される。本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列は、一方または両方の末端において、天然配列において見出されないさらなるヌクレオチドにより伸長させることができる。このさらなる配列は、開示される配列のいずれかの末端または開示される配列の両方の末端における１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドからなる可能性がある。
【０１４１】
別の実施形態では、中程度〜高度なストリンジェンシーの条件下で、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列、またはその断片、もしくはその相補的配列にハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドが提供される。分子生物学の技術分野では、ハイブリダイゼーション法が周知である。例示を目的として述べると、本明細書で提供されるポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを調べるのに適する中程度にストリンジェントな条件には、５倍濃度のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液中の前洗浄；５０℃〜６０℃、５倍濃度のＳＳＣ中、一晩にわたるハイブリダイジングの後；０．１％のＳＤＳを含有する２倍濃度のＳＳＣ、０．５倍濃度のＳＳＣ、および０．２倍濃度のＳＳＣの各々による、６５℃で２０分間ずつ２回にわたる洗浄が含まれる。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションを実施する温度を変化させることなどにより容易に操作しうることを理解するであろう。例えば、別の実施形態では、適した高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、ハイブリダイゼーション温度を、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃へと上昇させることを例外として、上記の条件が含まれる。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド改変体、断片、およびハイブリダイズする配列が、ＦＺＤ１０に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、特に本明細書で示される抗体配列の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％でＦＺＤ１０に結合する抗体またはその抗原結合断片もしくはＣＤＲをコードする。さらなる実施形態では、このようなポリヌクレオチドが、本明細書で示される抗体より大きなアフィニティーでＦＺＤ１０に結合する、例えば、特に本明細書で示される抗体配列の、定量的に少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％で結合する、抗体またはその抗原結合断片もしくはＣＤＲをコードする。
【０１４３】
代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提供される改変体のＦＺＤ１０特異的抗体、例えば、本明細書で提供される抗原結合断片を有する抗体タンパク質）の三次元構造の決定は、選択された天然または非天然のアミノ酸による１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入を、このようにして導かれる構造的改変体が本明細書で開示される分子種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で事実上モデル化しうるように、日常的な方法を介して行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅら、１９９４年、Ｐｒｏｔ．  Ｓｃｉ．、３巻：２３７８頁；Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０９巻：１８６８〜１８７１頁（２００５年）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０巻：６３８頁（２００５年）；Ｄｉｅｔｚら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０３巻：１２４４頁（２００６年）；Ｄｏｄｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：１７６頁（２００７年）；Ｑｉａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４５０巻：２５９頁（２００７年）；Ｒａｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２７巻：１０１４〜１０１８頁（２０１０年）を参照されたい。本明細書で提供されるＦＺＤ１０特異的抗体およびそれらの抗原結合ドメインの合理的なデザインなど、これらの実施形態および関連する実施形態のために用いうるコンピュータアルゴリズムの一部のさらなる非限定的な例には、生体高分子系の高性能シミュレーションのためにデザインされた並列分子動力学コードであるＮＡＭＤ、ならびに３Ｄ画像およびビルトインスクリプト記述を用いて生体高分子系を表示、動画表示、および解析するための分子画像化プログラムであるＶＭＤが含まれる（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６巻：１７８１〜１８０２頁、２００５年；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、「ＶＭＤ  −  Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｇｒａｐｈｉｃｓ、１９９６年、１４巻、３３〜３８頁を参照されたい；また、ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／におけるＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイトも参照されたい）。当技術分野では、他の多くのコンピュータプログラムが公知であり、当業者に利用可能であり、エネルギーを最小化したコンフォメーションの空間充填モデル（ファンデルワールス半径）から原子の寸法を決定することを可能とする：異なる化学基に対する高アフィニティー領域を決定し、これにより、結合を増強しようとするＧＲＩＤ、数学的アライメントを計算するモンテカルロ探索、およびＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、４巻：１８７〜２１７頁）、ならびに力の場の計算および解析を評価するＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒら（１９８１年）、Ｊ．  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、１０６巻：７６５頁）（また、Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄら（１９９１年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６１巻：Ｃ３７６〜３８６頁；Ｌｙｂｒａｎｄ（１���９１年）、Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｅｌｇ．、４６巻：４９〜５４頁；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、８巻：６４０〜６４４頁；Ｂｕｒｂａｍら（１９９０年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、７巻：９９〜１１１頁；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５年）、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．、６１巻：１８５〜１９０頁；およびＫｉｎｉら（１９９１年）、Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．、９巻：４７５〜４８８頁も参照されたい）。また、Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製などの、多様で適切な計算用コンピュータプログラムも市販されている。
【０１４４】
本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたはそれらの断片は、コード配列それ自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなど、他のＤＮＡ配列と組み合わせることができ、その結果、その全体の長さが大幅に変化しうる。したがって、ほぼ任意の長さの核酸断片であって、全長が調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコールにおける使用により限定されることが好ましい核酸断片を用いうることが想定される。例えば、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（全ての中間の長さを含めた）である例示的なポリヌクレオチドセグメントは、有用であると想定される。
【０１４５】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、下記の通りに対応が最大となるようにアライメントしたときに、２つの配列におけるヌクレオチド配列が同じであれば、２つの配列を「同一である」という。２つの配列の間の比較は、典型的に、配列を比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたり比較して、局所的な配列類似性の領域を同定および比較することにより実施される。本明細書で用いられる「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続的な位置のセグメントであって、配列を、同数の連続的な位置を有する基準配列と、これら２つの配列を最適にアライメントした後で比較しうるセグメントを指す。
【０１４６】
比較のための最適の配列アライメントは、バイオインフォーマティックスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラムでデフォルトのパラメータを用いて実行することができる。このプログラムは、以下の参考文献において記載されているいくつかのアライメントスキームを具体化する：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（１９７８年）、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、補遺３巻、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁（１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．、ＣＡＢＩＯＳ、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、ＣＡＢＩＯＳ、４巻：１１〜１７頁（１９８８年）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．、Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁（１９７１年）；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．、４巻：４０６〜４２５頁（１９８７年）；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９７３年）；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁（１９８３年）。
【０１４７】
代替的に、比較のための最適の配列アライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁（１９８１年）による局所的な同一性アルゴリズムを介して実行することもでき、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁（１９７０年）による同一性アライメントのアルゴリズムを介して実行することもでき、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁（１９８８年）による類似性の検索法を介して実行することもでき、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩによるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実装により実行することもでき、目視により実行することもできる。
【０１４８】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するのに適するアルゴリズムの好ましい一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９７７年）、およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）において記載されている。例えば、本明細書で記載されるパラメータによりＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を用いて、２つ以上のポリヌクレオチド間における配列同一性のパーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公開されている。例示的な一例では、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチする残基対に対するリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて累積スコアを計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から分量Ｘだけ低下する場合；１つもしくは複数の負のスコアをもたらす残基アライメントが累積するために、累積スコアがゼロ以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁（１９８９年）を参照されたい）によるアライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、「配列同一性の百分率」は、最適にアライメントした２つの配列を、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって比較することにより決定し、ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列の最適のアライメントのための基準配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、両方の配列で同一な核酸塩基が生じてマッチした位置数をもたらす位置数を決定し、マッチした位置数を基準配列における位置の総数（すなわち、ウインドウのサイズ）で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率をもたらすことにより計算する。
【０１５０】
当業者は、遺伝子コードの縮重性の結果として、本明細書で記載される抗体をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを認識するであろう。これらのポリヌクレオチドのうちの一部は、ＦＺＤ１０に結合する抗体をコードする、本明細書で記載されるポリヌクレオチド配列など、天然のポリヌクレオチド配列または元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列と最小限の配列同一性を保有する。にもかかわらず、本開示では、コドン使用の差違に起因して変化するポリヌクレオチドが明示的に想定される。ある特定の実施形態では、哺乳動物における発現のためにコドンを最適化した配列が、特に想定される。
【０１５１】
したがって、本発明の別の実施形態では、本明細書で記載される抗体の改変体および／または誘導体を調製するために、部位特異的変異誘発などの変異誘発手法を使用することができる。この手法では、それらをコードする根底的なポリヌクレオチドの変異誘発を介して、ポリペプチド配列における特定の修飾を行うことができる。これらの技法は、配列改変体を調製して調べる簡便な手法、例えば、１つまたは複数のヌクレオチド配列の変更をポリヌクレオチド内に導入することにより、前出の検討事項のうちの１つまたは複数を組み込むことを提供する。
【０１５２】
部位特異的変異誘発は、特異的なオリゴヌクレオチド配列であって、所望の変異を有するＤＮＡ配列をコードする他、横断される欠失接合部の両側において安定的な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列の複雑性を有するプライマー配列をもたらすのに十分な数の隣接するヌクレオチドもコードするオリゴヌクレオチド配列の使用を介する変異体の産生を可能とする。選択したポリヌクレオチド配列における変異を使用して、ポリヌクレオチドそれ自体の特性を改善するか、変化させるか、低下させるか、修飾するか、もしくは他の形で変更することもでき、かつ／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、もしくは一次配列を変化させることもできる。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本発明者らは、開示されるポリヌクレオチド配列の変異誘発であって、抗体もしくはその抗原結合断片の結合アフィニティー、または特定のＦｃ領域のＡＤＣＣ機能、またはＦｃ領域の特定のＦｃγＲに対するアフィニティーなど、コードされるポリペプチドの１つまたは複数の特性を変化させる変異誘発を想定する。当技術分野では、部位特異的変異誘発法が周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を創出するのに広く用いられている。例えば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を変化させるのに用いられることが多い。このような実施形態では、典型的に約１４〜約２５ヌクレオチドくらいの長さを含むプライマーを使用し、配列接合部の両側において約５〜約１０残基を変化させる。
【０１５４】
当業者により認識される通り、部位特異的変異誘発法では、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用することが多かった。部位指向的変異誘発において有用な典型的ベクターには、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージは、市販品の入手が容易であり、当業者にはそれらの使用が一般に周知である。二本鎖プラスミドはまた、対象の遺伝子をプラスミドからファージへと導入するステップを排除する部位指向的変異誘発でも日常的に使用されている。
【０１５５】
一般に、本明細書に従う部位指向的変異誘発は、まず所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列内に包含する、一本鎖ベクターを得るか、または二本鎖ベクターの２つの鎖を溶融させて解離させることにより実施する。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般に合成により調製する。次いで、変異保有鎖の合成を完結させるために、このプライマーを、一本鎖ベクターとアニールさせ、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片などのＤＮＡ重合化酵素に供する。こうして、一方の鎖が元の非変異配列をコードし、第２の鎖が所望の変異を保有するヘテロ二重鎖が形成される。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などの適切な細胞を形質転換し、変異配列の構成を保有する組換えベクターを包含するクローンを選択する。
【０１５６】
部位指向的変異誘発を用いて選択されるペプチドをコードするＤＮＡセグメントの配列改変体を調製することにより、潜在的に有用な分子種を産生させる手段がもたらされるが、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を取得し得る他のやり方も存在するので、これは、限定的であることを意味するわけではない。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンなどの変異原性剤で処理して、配列改変体を得ることができる。これらの方法およびプロトコールに関する特定の詳細は、各々がその目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｏｙら、１９９４年；Ｓｅｇａｌ、１９７６年；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１年；Ｋｕｂｙ、１９９４年；ならびにＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２年の教示において見出される。
【０１５７】
本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、増幅など、特定の核酸分子の濃度のその初期濃度と比べた上昇、または検出可能なシグナル濃度の上昇を結果としてもたらす、鋳型依存的工程およびベクターを介する増殖を指す。本明細書で用いられる「オリゴヌクレオチド指向的変異誘発手順」という用語は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を伴う工程を指すことを意図する。鋳型依存的工程という用語は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成であって、核酸の新たに合成される鎖の配列が、相補的な塩基対合についての周知の規則（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７年を参照されたい）により規定される核酸合成を指す。典型的に、ベクターを介する方法は、核酸断片のＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターへの導入、ベクターのクローン増幅、および増幅された核酸断片の回収を伴う。このような方法の例は、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれる、米国特許第４，２３７，２２４号により提供されている。
【０１５８】
ポリペプチド改変体を産生させるための別の手法では、米国特許第５，８３７，４５８号において記載される、再帰的配列組換えを用いることができる。この手法では、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復的サイクルを実施して、例えば、結合アフィニティーを増大させた個別のポリヌクレオチドの改変体を「進化」させる。また、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態における構築物も提供する。
【０１５９】
ある特定の関連する実施形態に従い、本明細書で記載される１つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞と；任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨドメインもしくはＶＬドメイン、またはその抗原結合断片をコードする核酸と；コードされる産物を産生させる方法であって、それをコードする核酸からの発現を含む方法とが提供される。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより好都合に達成しうる。発現による産生の後、抗体またはその抗原結合断片は、任意の適した技法を用いて単離および／または精製し、次いで、所望の通りに用いることができる。
【０１６０】
本明細書で提供される抗体またはそれらの抗原結合断片、ならびにコード核酸分子およびベクターは、例えば、それらの天然の環境から、実質的に純粋または均一な形態で単離および／または精製することもでき、核酸の場合、所望の機能を伴うポリペプチドをコードする配列以外の起源の核酸または遺伝子を含まないかまたは実質的に含まずに単離および／または精製することもできる。核酸は、ＤＮＡを含む場合もあり、ＲＮＡを含む場合もあり、完全に合成する場合もあり、部分的に合成する場合もある。本明細書で示されるヌクレオチド配列に対する言及は、配列を指定したＤＮＡ分子を包含し、配列を指定したＲＮＡ分子を包含する（この場合、文脈により別段に要求されない限り、ＵをＴで置換する）。
【０１６１】
多様な異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングして発現させるための系が周知である。適した宿主細胞には、細菌系、哺乳動物細胞系、酵母系、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドを発現させるのに当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、および他の多くの細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０１６２】
当技術分野では、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体および抗原結合断片の発現が十分に確立されている。総説には、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ａ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：５４５〜５５１頁（１９９１年）を参照されたい。当業者にはまた、培養物中の真核細胞における発現も、抗体またはそれらの抗原結合断片を産生させるための選択肢として利用可能であり、近年の総説、例えば、Ｒｅｆ，  Ｍ．  Ｅ．（１９９３年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、４巻：５７３〜５７６頁；Ｔｒｉｌｌ，  Ｊ．  Ｊ．ら（１９９５年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、６巻：５５３〜５６０頁を参照されたい。
【０１６３】
必要に応じて、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含めた適切な調節配列を含有する適したベクターを選ぶまたは構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドの場合もあり、ウイルス、例えば、ファージの場合もあり、ファージミドの場合もある。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい；分子生物学の方法に関する以下で引用した追加の参考文献も参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列決定、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析において核酸を操作するための多くの公知の技法およびプロトコールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２年、またはこれに対するその後の改定版において詳細に記載されている。
【０１６４】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で記載される抗体のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を導入されたか、または導入された可能性がある細胞、および本明細書で記載される任意の抗体をコードする遺伝子など、選択された対象の遺伝子をさらに発現させるか、またはこれを発現させることが可能な細胞を指すのに用いられる。この用語は、選択された遺伝子が存在する限りにおいて、後代が形態または遺伝子組成において元の親細胞と同一の場合であれ、そうでない場合であれ、親細胞の後代を包含する。したがってまた、このような核酸を宿主細胞へと導入するステップを含む方法も想定される。導入では、任意の利用可能な技法を使用しうる。真核細胞の場合、適した技法には、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソームを介するトランスフェクション、およびレトロウイルスもしくは他のウイルス、例えば、ワクシニア、または、昆虫細胞の場合、バキュロウイルスを用いる形質導入が含まれうる。細菌細胞の場合、適した技法には、塩化カルシウムによる形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを用いるトランスフェクションが含まれうる。導入後、例えば、遺伝子を発現させるための条件下で宿主細胞を培養することにより、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能とすることができる。一実施形態では、核酸を、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に組み込む。組込みは、標準的な技法に従い、ゲノムとの組換えを促進する配列を包含することにより促進することができる。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、本発明はまた、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体など、特定のポリペプチドを発現させるために、上記で言明された構築物を発現系において用いるステップを含む方法も提供する。「形質導入」という用語は、１つの細菌から別の細菌への、通常はファージによる遺伝子の移入を指すのに用いられる。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移入も指す。「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡ取込みを指すのに用いられ、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「トランスフェクト」されている。当技術分野では、多数のトランスフェクション法が周知であり、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ、１３巻：１９７頁を参照されたい。このような技法は、１つまたは複数の外因性ＤＮＡ部分を適した宿主細胞へと導入するのに用いることができる。
【０１６６】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、細胞の遺伝子特徴の変更を指し、新規のＤＮＡを含有するように改変されたとき、細胞は形質転換されている。例えば、その天然状態から遺伝子的に改変される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入後において、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へと物理的に組み込まれることにより細胞のＤＮＡと組換わる場合もあり、複製されることなくエピソームエレメントとして一過性に維持される場合もあり、プラスミドとして独立に複製される場合もある。ＤＮＡが細胞分裂により複製される場合、細胞は安定的に形質転換されたと考えられる。核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などの生物学的物質との関連で用いられる場合の「天然に存在する」または「天然の」という用語は、天然において見出され、ヒトにより操作されていない物質を指す。同様に、本明細書で用いられる「天然に存在しない」または「非天然の」とは、天然において見出されないか、またはヒトにより構造的に修飾されるかもしくは合成された物質を指す。
【０１６７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」、ならびに「糖タンパク質」という用語は、互換的に用いられ、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。この用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の付加または欠失などの修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸鎖であって、各鎖が、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸を含み、前記ポリペプチドまたはタンパク質が、天然タンパク質、すなわち、天然に存在する細胞、および、特に非組換え細胞により産生されたタンパク質、または遺伝子操作された細胞もしくは組換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合により非共有結合的および／または共有結合的に併せて連結された複数の鎖を含むことが可能であり、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する分子を含みうるアミノ酸鎖を意味する。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に本開示のＦＺＤ１０に結合する抗体、または抗ＦＺＤ１０抗体の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、これらに対する付加、および／もしくはこれらに対する置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸鎖のうちの１つ（「単量体」と呼ばれる）を含む場合もあり、複数（「多量体」と呼ばれる）を含む場合もある。
【０１６８】
本明細書で言及されるタンパク質に関する「単離」という用語は、対象タンパク質が、（１）典型的には天然においてそれと共に見出される少なくとも数種の他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源に由来する他のタンパク質、例えば、同じ種に由来する他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種に由来する細胞を介して発現すること、（４）それが天然において会合するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質のうちの少なくとも約５０パーセントから分離されていること、（５）「単離タンパク質」が天然において会合するタンパク質の部分と会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）していないこと、（６）それが天然において会合しないポリペプチドと作動可能に会合（共有結合的相互作用を介する場合もあり、非共有結合的相互作用を介する場合もある）していること、または（７）天然において発生しないことを意味する。このような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡによりコードされる場合もあり、合成起源の場合もあり、これらの任意の組合せの場合もある。ある特定の実施形態では、単離タンパク質が、その天然の環境において見出されるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その使用（治療的使用、診断的使用、予防的使用、研究のための使用、または他の形の使用）に干渉するタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【０１６９】
「ポリペプチド断片」という用語は、単量体の場合もあり、多量体の場合もあるポリペプチドであって、天然に存在するポリペプチドまたは組換えにより産生させたポリペプチドのアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失もしくは置換を有するポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含みうる。ある特定の実施形態では、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることが認識される。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは抗原結合断片を含めた機能的ドメインを包含する。抗ＦＺＤ１０抗体の場合、有用な断片には、ＣＤＲ領域、特に、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の部分または２つのＣＤＲを含めたそのちょうどの可変領域などが含まれるがこれらに限定されない。
【０１７０】
ＦＺＤ１０特異的抗体を生成させる方法
本発明のある特定の実施形態に従う抗体は、ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いて生成させることができる。ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける抗体進化のために用いられてきた（Ｃｕｍｂｅｒｓ，  Ｓ．Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１１２９〜１１３４頁（２００２年）；Ｓｅｏ，  Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻、７３１〜７３５頁（２００５年））。ＤＴ４０細胞は、それぞれ、鋳型による変異および鋳型によらない変異を創出する、多様化の２つのはっきり異なる生理学的経路である、遺伝子転換および体細胞超変異を利用しうるので、膨大なＶ領域配列の潜在的多様性を駆使する（Ｍａｉｚｅｌｓ，  Ｎ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ、３９巻：２３〜４６頁（２００５年））。しかし実のところ、抗体進化のためのＤＴ４０細胞の有用性は、多様化が（他の形質転換されたＢ細胞系における場合と同様）生理学的速度の１％未満で生じるために、限定されている。多様化は、相同組換え経路を無効化することにより数倍加速化しうる（Ｃｕｍｂｅｒｓら、前出）が、このようにして操作された細胞は、効率的な遺伝子ターゲティングを実行する能力を失う。多様化はまた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡで細胞を処理することによっても加速化しうる（Ｓｅｏら、前出）が、結果として得られる変異は、もっぱら鋳型による変異であり、潜在的な多様性は制限され、必要とされるアフィニティーまたは特異性を有する抗体を産生させることはできない。
【０１７１】
本明細書で抗体を生成させるのに用いられるＤＴ４０細胞を改変して、さらなる遺伝子改変能、または遺伝子転換および体細胞超変異の両方が変異誘発に寄与する可能性を犠牲にすることなしに、Ｉｇ遺伝子の多様化速度を加速化する。これは、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子の多様化を、強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーター／リプレッサー制御ネットワークの制御下に置くことにより実現された。強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーターが約１００重合化した反復配列からなる多量体（ＰｏｌｙＬａｃＯ）を、相同遺伝子ターゲティングにより、再配列して発現させたＩｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の上流に挿入した。次いで、ラクトースリプレッサーのオペレーターＤＮＡに対する高アフィニティー（ＫＤ＝１０−１４Ｍ）を利用して、ラクトースリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）に融合させた制御因子を、ＬａｃＯ制御エレメントへとテザーして、多様化を制御することができる。ＰｏｌｙＬａｃＯがＩｇλだけに組み込まれたＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞は、任意の操作前の親ＤＴ４０細胞と比べて、Ｉｇ遺伝子の多様化速度の５倍の増大を呈示した（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））。多様化は、Ｉｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の両方を標的としたＰｏｌｙＬａｃＯを保有するように操作された細胞（「ＤＴＬａｃＯ」）においてさらに上昇した。
【０１７２】
重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有する、操作されたＤＴＬａｃＯ系を、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける抗体発見の出発点として用いることができる。例えば、実施例において記載される通り、１０７〜１０１０個のＤＴＬａｃＯ  ＬａｃＩ−ＨＰ１細胞による多様化集団から出発して、ＦＺＤ１０に結合する細胞を、ＦＺＤ１０を保有する固体のマトリックス（Ｄｙｎａｌ磁気ビーズ）における選択ラウンドおよびＦＡＣＳにより濃縮した。当業者により認識される通り、他の選択方法（例えば、ＦＺＤ１０に対する抗体の結合特異性に基づく）もまた用いることができる。次いで、本明細書で記載される標準的な技法を用いて、所望の結合特徴を有する組換えキメラモノクローナル抗体を生成させる。
【０１７３】
次いで、ある特定の実施形態（例えば、本明細書で記載される抗ＦＺＤ１０抗体の改変体を生成させるための実施形態；本明細書で記載される抗ＦＺＤ１０抗体の結合を遮断する抗体を生成させるための実施形態）では、パニングおよび細胞：標的細胞間結合が含まれるがこれらに限定されない多様なハイスループット手法のうちのいずれかを用いて、抗原特異的ＤＴＬａｃＯ細胞の選択について調べることができる。例えば、低い百分率でＦＺＤ１０特異的細胞を含有する多様なＤＴＬａｃＯ集団を、プラスチック製のマトリックスに結合させた、複数の可溶性抗原の標的アレイと共にインキュベートすることにより、パニングを実行することができる。パニングにより、ＦＺＤ１０特異的ＤＴＬａｃＯ細胞が著明に濃縮される。ＤＴＬａｃＯ：標的細胞による選択は、低百分率のＣＦＳＥ標識したＤＴＬａｃＯ  ＦＺＤ１０結合細胞または選択されていないＤＴＬａｃＯを含有した多様なＤＴＬａｃＯ集団を、対象の抗原を発現させる標的細胞、例えば、細胞表面において天然ＦＺＤ１０または組換えＦＺＤ１０を構成的または一過性に発現させるＦＺＤ１０発現細胞と共に共インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーにより、標的細胞へと結合したＤＴＬａｃＯ細胞を定量化することにより実行することができる。ＤＴＬａｃＯの標的細胞との相互作用は、はるかに小型の遊離ＤＴＬａｃＯ細胞に由来するシグナルが前方散乱に基づき消失するドットプロット上のＣＦＳＥ陽性イベントとして明らかである。
【０１７４】
ある特定の実施形態（例えば、本明細書で記載される抗ＦＺＤ１０抗体の結合を遮断する抗体を生成させるための実施形態）では、抗体を、ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３においてさらに記載されるのと同様に、特定のポリペプチドの多様性を生成させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いて調製することができる。特に、これらの適用は一般に、標的遺伝子の多様化の可逆的誘導を可能にする、本明細書の上記で記載したＤＴ４０細胞系など、改変Ｂ細胞に関する。例示的なＢ細胞はＤＴ４０  Ｂ細胞系であるが、ヒトＢ細胞を含めた他のＢ細胞の使用が想定される。ＤＴ４０とは、その培養中の重鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子および軽鎖免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子を、構成的に変異させることが公知のニワトリＢ細胞系である。他のＢ細胞と同様、この構成的な変異誘発は、Ｉｇ遺伝子のＶ領域を変異の標的とし、したがって、発現する抗体分子のＣＤＲを変異の標的とする。ＤＴ４０細胞における構成的な変異誘発は、各機能的Ｖ領域の上流に位置する一連の非機能的Ｖ遺伝子セグメント（Ｖ偽遺伝子；ΨＶ）をドナー配列として用いる遺伝子転換を介して起こる。ΨＶ領域の欠失は、多様化機構の切換えであって、遺伝子転換から、ヒトＢ細胞において一般に観察される機構である体細胞超変異への切換えを引き起こすことが既に示されている。ＤＴ４０はまた、特定の遺伝子を修飾するか、欠失させるか、もしくは挿入した改変細胞、または特定の対象の遺伝子が内因性遺伝子を置き換えた改変細胞、特に、内因性の再配列されたＩｇ遺伝子を置き換えた改変細胞の創出を可能とする効率的な相同組換えを支援することも示されている。
【０１７５】
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３において記載される系は、これらの特性および他の特性を利用して、標的配列を多様化するためのプラットフォームを創出している。より具体的に述べると、その最も広範な形態において、これらの文献では、標的遺伝子の多様化の可逆的誘導を可能にする改変Ｂ細胞が記載されている。細胞は、対象の標的遺伝子に作動可能に連結した「シス制御エレメント」を包含するように改変する。細胞は、「テザー因子（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）」に融合させた「多様化因子」を包含するようにさらに改変する。テザー因子の機能は、シス制御エレメントに結合し、これにより、多様化因子を標的遺伝子の発現を制御する領域へともたらすことである。多様化因子の役割は、標的配列の多様化（変異）を加速化または制御することである。標的遺伝子をＩｇ遺伝子座へと挿入してからは、多様化因子−テザー因子融合タンパク質を用いることにより、変異をそのコード領域へと標的化し、制御する。一般に、シス制御エレメントは、テザー因子の、シス制御エレメントへの、配列特異的な形での結合を可能とし、遺伝子（対象の遺伝子）の発現または多様化を制御する領域に位置付けられる任意のＤＮＡ配列でありうる。シス制御エレメントには、２０塩基対のＬａｃＯ結合部位による約１００の反復配列を含む重合化ラクトースオペレーター（ＰｏｌｙＬａｃＯ）が含まれる。シス制御エレメントは、Ｉｇλ軽鎖遺伝子座およびＩｇＨ遺伝子座のΨＶ領域内に位置付けられる。テザー因子には、高アフィニティーでＬａｃＯに結合するＬａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）が含まれる。シス制御エレメントのこの挿入は、改変ＤＴ４０細胞系における通常の鋳型による変異誘発（遺伝子転換）過程には影響を及ぼさない。
【０１７６】
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３による系の誘導性の側面は、テザー因子（ＬａｃＩ）−多様化因子融合タンパク質の発現およびＬａｃＩのＬａｃＯからの放出を引き起こす低分子である、ＩＰＴＧの使用を介して生じる。１０μＭという少量のＩＰＴＧを伴う改変ＤＴ４０細胞の培養物は、ＬａｃＩのＰｏｌｙＬａｃＯからの放出を引き起こし、細胞の増殖には影響を及ぼさない。多くの異なる多様化因子が想定され、これらには、クロマチン構造、転写活性化因子、および他の遺伝子制御因子、デアミナーゼ、ＤＮＡの修復および複製に関係するタンパク質、レソルバーゼおよびヘリカーゼ、細胞周期制御因子、核膜孔複合体タンパク質、およびユビキチン化に関係するタンパク質に影響を及ぼす因子が含まれる。異なるテザー因子−多様化因子構築物には、以下が含まれる：１）ＬａｃＩ−ＨＰ１：ヘテロクロマチンタンパク質であるＨＰ１は、近傍遺伝子のクロマチン構造の閉鎖を促進する。したがって、ＬａｃＩが改変ＤＴ４０細胞内のＰｏｌｙＬａｃＯに結合すると、テザーされたＨＰ１タンパク質は、ドナーΨＶ配列の、クロマチン解放状態からクロマチン複製阻害状態への転移を引き起こした。これは、ΨＶ領域の欠失と機能的に同等であり、下流のＩｇ  Ｖλ遺伝子座の鋳型による変異誘発から、この標的とされる領域の体細胞超変異への切換えも同様に結果としてもたらした。２）ＬａｃＩ−ＶＰ１６：ＶＰ１６とは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ複合体を動員することにより機能する強力な転写活性化因子である。ＬａｃＩ−ＶＰ１６融合体のＰｏｌｙＬａｃＯ経路への結合は、許容性のクロマチン構造および遺伝子転換により標的とされるＶλ領域の変異誘発の増大を結果としてもたらした。３）ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３：Ｎｕｐ１５３とは、核膜孔タンパク質であり、ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３融合タンパク質は、改変ＤＴ４０細胞内のＩｇＨ遺伝子座を核膜孔へとテザーするように機能した。Ｉｇ遺伝子の多様化は、核外搬出シグナルを保持する活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）により媒介されて核周縁部で始まることが示されているので、ＬａｃＩ−Ｎｕｐ１５３融合タンパク質のＰｏｌｙＬａｃＯ経路への結合の効果は、核膜孔に対する遺伝子の近接性を増大させることにより多様化を加速化することであった。記載された実験は、クローンの多様化速度が５．７倍加速化されることを示す。４）Ｅ４７−ＬａｃＩ：Ｅ４７とは、Ｅ２Ａのアイソフォームであり、リンパ球発生の多くの側面に対する制御因子である。このタンパク質は、それがクラススイッチ組換えならびにＡＩＤ遺伝子の発現を制御する活性化マウスＢ細胞において誘導される。Ｅ２Ａ遺伝子の不活化は、Ｉｇλ遺伝子の多様化を損なう。同様に、Ｅ４７の異所性発現は、Ｉｇλ遺伝子の多様化を促進する。したがって、Ｅ４７−ＬａｃＩ融合タンパク質の、改変ＤＴ４０細胞内のＰｏｌｙＬａｃＯシス制御エレメントへの結合は、標的とされる下流の遺伝子の多様化の増大を結果としてもたらした。５）ＨＩＲＡ−ＬａｃＩ：ＨＩＲＡとは、ヒストンのシャペロンである。その機能の１つは、Ｈ３．３ヒストン改変体を含有するヌクレオソームを組み立てることである。ＰｏｌｙＬａｃＯ改変ＤＴ��０細胞におけるＨＩＲＡ−ＬａｃＩ融合タンパク質の発現は、多様化を１１倍に増大させた。この加速化は、鋳型による変異（遺伝子転換）レベルの上昇に起因することが示された。
【０１７７】
ＷＯ２００９０２９３１５およびＵＳ２０１００９３０３３において記載される改変Ｂ細胞は、変異タンパク質を生成させるのに用いることができ、ある特定の実施形態では、例えば、本明細書で記載される抗体の、それらのコグネイト抗原への特異的結合を、競合的阻害を介して遮断する抗体など、抗ＦＺＤ１０抗体を生成させるのに用いることができる。
【０１７８】
ＦＺＤ１０機能のモジュレーター、アゴニスト、またはアンタゴニストである、本明細書で記載されるＦＺＤ１０結合抗体またはその抗原結合断片は、想定される実施形態内に明示的に包含される。これらのアゴニスト、アンタゴニスト、およびモジュレーターである抗体またはその抗原結合断片は、ＦＺＤ１０の抗原決定部位またはＦＺＤ１０のエピトープ断片もしくはエピトープ改変体のうちの１つまたは複数と相互作用する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＦＺＤ１０結合抗体は、ＦＺＤ１０の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）におけるエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書の抗体はｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーの他のメンバーとは交差反応しない（例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＦＺＤ９、ＦＺＤ８、ＦＺＤ７、ＦＺＤ６、ＦＺＤ５、ＦＺＤ４、ＦＺＤ３、ＦＺＤ２またはＦＺＤ１には結合しない）。他の実施形態では、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、１つまたは複数の他のｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリータンパク質と交差反応し得る。
【０１７９】
当業者により認識される通り、標準的な技術を含め、ＦＺＤ１０などの特定の抗原に結合する抗体を作製する多くの公知の方法が存在し、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年を参照されたい。一般に、本明細書で明示的に開示されるＦＺＤ１０結合抗体の、それらのコグネイト抗原への結合を特異的に遮断する抗体などの抗体は、本明細書で記載されるモノクローナル抗体の生成を含めた細胞培養法により産生させることもでき、組換え抗体の産生を可能とするための、抗体遺伝子の、適した細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主へのトランスフェクションを介して産生させることもできる。ある特定の実施形態では、ポリペプチド抗原を含む免疫原（例えば、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むヒトＦＺＤ１０タンパク質）を最初に、多種多様な哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）のうちのいずれかへと注射する。このステップでは、ポリペプチドが、修飾を伴わない免疫原として働きうる。代替的に、特に、比較的短いポリペプチドでは場合によって、ポリペプチドを、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどのキャリアタンパク質へと接合すると、優れた免疫応答を誘発することができる。免疫原は、好ましくは１回または複数回の追加の免疫化を組み込む所定のスケジュールに従い動物宿主へと注射し、動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体を、例えば、適した固体の支持体と共役させたポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製することができる。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１〜５１９頁、１９７６年による技法、およびこれに対する変法を用いて、対象の抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。略述すると、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、対象のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生させることが可能な不死化細胞系の調製を伴う。このような細胞系は、例えば、上記の通りに免疫化した動物から得られる脾臓細胞から産生させることができる。次いで、例えば、骨髄腫細胞の融合パートナー、好ましくは免疫化した動物と同系の融合パートナーと融合させることにより脾臓細胞を不死化させる。多様な融合法を使用することができる。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞を、非イオン性洗浄剤と数分間にわたり組み合わせ、次いで、ハイブリッド細胞の成長は支援するが、骨髄腫細胞の成長は支援しない選択培地上に低密度で播種する。好ましい選択法では、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な期間の後、通常は約１〜２週間後、ハイブリッド体のコロニーを観察する。単一のコロニーを選択し、それらの培養上清をポリペプチドに対する結合活性について調べる。反応性および特異性の高いハイブリドーマが好ましい。
【０１８１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマコロニーを成長させる上清から単離することができる。加えて、マウスなど、適した脊椎動物宿主の腹腔へのハイブリドーマ細胞系の注射など、収量を増強する多様な技法も用いることができる。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から採取することができる。クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出など、従来の技法により夾雑物を抗体から除去することができる。精製工程、例えば、アフィニティークロマトグラフィーステップでは、ポリペプチドを用いることができる。
【０１８２】
使用方法および医薬組成物
本明細書では、ＦＺＤ１０に結合する抗体を用いる処置方法が提供される。一実施形態では、本発明の抗体を、ＦＺＤ１０の不適切な発現と関連する疾患であって、本開示の文脈では、例えば、存在するタンパク質の量の変化（例えば、統計学的に有意な増大または減少）、もしくは変異体タンパク質の存在、またはこれらの両方に起因する、異常なＦＺＤ１０を特徴とする疾患および障害を包含することを意味する疾患を有する患者に投与する。過剰量は、ＦＺＤ１０の分子レベルにおける通常の検出可能な発現と比べた過剰発現、作用部位における通常の検出可能な出現と比べて長期にわたるかもしくは累積的な出現、または通常の検出可能な活性と比べた活性の増大（例えば、統計学的に有意な方法での増大）が含まれるがこれらに限定されない任意の原因に起因しうる。ＦＺＤ１０のこのような過剰量は、ＦＺＤ１０の正常な発現、出現、または活性と比べて測定することができ、前記測定は、本明細書で記載される抗体の開発および／または臨床試験において重要な役割を果たしうる。
【０１８３】
特に、本抗体は、ＦＺＤ１０の発現と関連する多様ながんの処置に有用である。例えば、本発明の一実施形態は、治療有効量の、本明細書で開示されるＦＺＤ１０特異的抗体をがん患者に投与することにより、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんを処置するための方法を提供する。投与後、統計学的に有意な方法で（すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べて）がんを阻害するか、がんの進行および／または転移を防止するかまたは遅延させる量を有効であると考える。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体はＦＺＤ１０に結合し、そのリガンドの結合およびそれに続くシグナル伝達イベントを遮断する。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＷＮＴ７ａおよびＷＮＴ７ｂなどのＦＺＤ１０に対するリガンドの異常な発現と関連する疾患の処置に有用である。
【０１８５】
別の実施形態は、治療有効量（例えば、投与後、統計学的に有意な方法で、すなわち、当業者に公知の適切な対照と比べてがんを阻害するか、がんの転移を防止するかまたは遅延させる量）の、本明細書で開示されるＦＺＤ１０特異的抗体をがん患者に投与することにより、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんの転移を防止するための方法を提供する。
【０１８６】
別の実施形態は、治療有効量の、本明細書で開示されるＦＺＤ１０特異的抗体をがん患者に投与することにより、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、黒色腫、唾液腺癌、乳がん、肝細胞癌、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ；腺癌および扁平上皮癌の両方）、腎臓がん、頭頸部がん、膀胱がん、子宮がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、および多形膠芽腫が含まれるがこれらに限定されないがんを防止するか、またはその発生の可能性を低減するための方法を提供する。
【０１８７】
別の実施形態は、カノニカルＷｎｔ経路を介するシグナル伝達を阻害するのに十分な量の本明細書に開示されるＦＺＤ１０特異的抗体にＦＺＤ１０を発現している細胞を接触させることにより、該細胞においてカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害するための方法を提供する。
【０１８８】
想定されるある特定の実施形態では、本明細書で開示されるＦＺＤ１０特異的抗体が、患者に投与される唯一の治療的に活性な薬剤である。代替的に、他のある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体を、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、抗炎症剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、または他の治療剤が含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与する。このような分子は、意図される目的に有効な量で組み合わせて存在させるのに適する。熟達した医療従事者は、本明細書で有用な他の治療剤の１つまたは複数の適切な用量を経験的に決定することができる。抗体は、１つまたは複数の他の処置レジメンと共に併用投与することができる。例えば、抗体は、化学療法、放射線療法、または化学療法および放射線療法の両方と共に患者に投与することができる。一実施形態では、抗体を、治療的利益をもたらすことが当技術分野で公知の１つまたは複数の他の抗体と共に投与することができる。
【０１８９】
ある特定の想定される実施形態では、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、１つまたは複数のさらなるＷＮＴ阻害剤（複数可）と同時にまたは順次におよび任意の順番でも投与することができる。Ｗｎｔシグナル伝達の公知のアンタゴニストには、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質（Ｄｋｋ−１、−２および−４）、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ；ｓＦＲＰ−１、２および５ならびにｓＦＲＰ−３および４）、Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）、Ｎｏｒｒｉｎ、Ｒ−スポンジン；およびＤＫＫＬ１が挙げられる。したがって、さらに上記のように、ある特定のそのような実施形態では、さらなる薬剤（複数可）は、少なくとも１つの第２のＷｎｔリガンド（例えば、Ｄｋｋ−１、Ｄｋｋ−２またはＤｋｋ−４などのＤＫＫファミリーメンバー；ｓＦＲＰ−１、ｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−３、ｓＦＲＰ４またはｓＦＲＰ−５などの分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）；Ｗｎｔ阻害因子１（ＷＩＦ−１）；Ｎｏｒｒｉｎ；Ｒ−スポンジン；ＤｋｋＬ１；等）と前記Ｗｎｔリガンドに対する第２の受容体（例えば、ＦＺＤ１、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ５、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＲＹＫ、ＭｕＳＫおよびグリピカン３などのグリピカン；例えば、Schulte  ２０１０年  Pharmacol.  Rev.  ６２巻：６３２頁；  RaoおよびKuehl、２０１０年Circ.  Res.  １０６巻：１７９８頁；  Filmusら、２００８年Genome  Biol.  ９巻：２２４頁；  ChienおよびMoon、２００７年Front.  Biosci.  １２巻：４４８頁を参照されたい；表１も参照されたい）との間の特異的相互作用を実質的に障害する第２の薬剤を含みうる。
【０１９０】
一実施形態では、本明細書で記載される抗体を化学療法剤と共に投与する。「化学療法剤」とは、がんの処置において有用な化合物を意味する。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのアルキルスルホナート；ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）、およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａｓ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）；フォリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフロルニチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モ���ダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェンメトラジン（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤であるＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；チミジル酸シンターゼ阻害剤（Ｔｏｍｕｄｅｘなど）；セリコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））またはＭＫ−０９６６（ＶＩＯＸＸ（登録商標））などのｃｏｘ−２阻害剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるがこれらに限定されない。また、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤、４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含めた抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体など、腫瘍に対するホルモンの作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【０１９１】
化学療法剤または他の細胞傷害剤は、プロドラッグとして投与することができる。本明細書で用いられる「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してより細胞傷害性ではなく、酵素的に活性化するか、または活性のより大きな親形態へと転換することが可能な、薬学的に活性な物質の前駆体形態または誘導体形態を意味する。例えば、Ｗｉｌｍａｎ、１９８６年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ、１４巻：３７５〜３８２頁；およびＳｔｅｌｌａら、「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔら（編）：２４７〜２６７頁、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年を参照されたい。本明細書で想定されるある特定の実施形態では、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体と共に用いうるプロドラッグに、活性のより大きな遊離細胞傷害性薬へと転換されうる、ホスフェートを含有するプロドラッグ、チオホスフェートを含有するプロドラッグ、スルフェートを含有するプロドラッグ、ペプチドを含有するプロドラッグ、Ｄ−アミノ酸で修飾されたプロドラッグ、グリコシル化されたプロドラッグ、ベータ−ラクタムを含有するプロドラッグ、場合によって置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または、場合によって置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンプロドラッグ、および他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれうるがこれらに限定されない。本ＦＺＤ１０特異的抗体と共に用いられるプロドラッグ形態へと誘導体化しうる細胞傷害性薬の例には、前述の化学療法剤のうちのいずれかが含まれるがこれらに限定されない。
【０１９２】
本ＦＺＤ１０特異的抗体は、他の処置レジメンと組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、抗体により処置される患者はまた、放射線療法も施されうる。放射線療法は、当技術分野で一般に使用され、当業者に公知のプロトコールに従い投与することができる。このような療法には、当技術分野で許容される放射性同位元素であるセシウム、イリジウム、ヨウ素、またはコバルトへの照射による曝露が含まれるがこれらに限定されない。放射線療法は、全身照射の場合もあり、肺、膀胱、または前立腺など、体内または体表における特定の部位または組織へと局所的に方向付ける場合もある。典型的に、放射線療法は、パルスで、約１〜２週間の期間にわたり投与する。しかし、放射線療法は、より長期間にわたり投与する場合もある。例えば、放射線療法は、頭頸部がんを有する患者に約６〜約７週間にわたり投与する場合もある。場合によって、放射線療法は、単回線量として投与する場合もあり、複数回の逐次線量として投与する場合もある。熟達した医療従事者は、本明細書で有用な放射線療法の１回または複数回の適切な線量を経験的に決定することができる。別の実施形態に従い、本ＦＺＤ１０特異的抗体および１つまたは複数の他の抗がん療法を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいてがん細胞を処置することができる。このようなｅｘ  ｖｉｖｏにおける処置は、骨髄移植において有用な場合があり、特に、自系骨髄移植において有用でありうることが想定される。例えば、がん細胞を含有する細胞または組織（複数可）の、抗体および上記の抗がん療法などの１つまたは複数の他の抗がん療法による処置を使用して、レシピエント患者における移植前のがん細胞を枯渇させるか、または実質的に枯渇させることができる。当然ながら、本明細書で記載される抗体を、手術などのさらに他の治療法と組み合わせて使用しうることが想定される。
【０１９３】
代替的な実施形態では、本明細書で記載される抗体を、サイトカインと共に投与することができる。本明細書で用いられる「サイトカイン」とは、１つの細胞集団により放出されるタンパク質であって、別の細胞に対して細胞間メディエーターとして作用するタンパク質についての総称的な用語を意味する。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび腫瘍壊死因子−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経増殖因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、およびインターフェロン−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含めた他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で用いられるサイトカインという用語は、天然の供給源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質、および天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物を包含する。
【０１９４】
本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を伴う投与には、他の多様な治療剤も用いることができる。一実施形態では、抗体を、抗炎症剤と共に投与する。抗炎症剤または抗炎症薬には、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含めた）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセンを含めた非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、免疫選択的抗炎症性誘導体（ｉｍＳＡＩＤＳ）（例えば、Ｂａｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００６年７月７日、１４０巻（３号）：１０１１〜２２頁；Ｍａｔｈｉｓｏｎら、ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００３年３月４日；４巻：３頁を参照されたい）、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミド、およびミコフェノール酸塩が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９５】
本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を伴う投与には、他の多様な治療剤も用いることができる。一実施形態では、抗体を、抗血管新生剤と共に投与する。本明細書で用いられる「抗血管新生剤」とは、血管の発生を遮断するか、またはこれにある程度干渉する化合物を意味する。例えば、抗血管新生因子は、低分子またはタンパク質、例えば、血管新生の促進に関係する増殖因子もしくは増殖因子受容体に結合する抗体またはサイトカインでありうる。本明細書で好ましい抗血管新生因子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。代替的な実施形態では、抗体を、適応免疫応答を誘導するかまたは増強する治療剤、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体と共に投与する。代替的な実施形態では、抗体をチロシンキナーゼ阻害剤と共に投与する。本明細書で用いられる「チロシンキナーゼ阻害剤」とは、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。このような阻害剤の例には、ＰＤ  １５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ＣＧＰ  ５９３２６、ＣＧＰ  ６０２６１、およびＣＧＰ  ６２７０６などのピロロピリミジン；ピラゾロピリミジンである４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するトリホスチン；ＰＤ−０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；アンチセンス分子（例えば、ＥｒｂＢをコードする核酸に結合するアンチセンス分子）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号）；トリホスチン（米国特許第５，８０４，３９６号）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ａ  Ｇ）；Ｃ１−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）などのｐａｎ−ＥｒｂＢ阻害剤；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ  ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；メシル酸イマチニブ（ＳＴ１５７１、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ  １６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；Ｃ１−１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；Ｓｅｍａｘｉｎｉｂ（Ｓｕｇｅｎ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ−７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ）；ＩＮＣ−１−Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；または以下の特許公開：米国特許第５，８０４，３９６号；ＰＣＴ  ＷＯ９９／０９０１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎｉｍｉｄ）；ＰＣＴ  ＷＯ９８／４３９６０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ）；ＰＣＴ  ＷＯ９７／３８９８３（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ  ＷＯ９９／０６３７８（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ  ＷＯ９９／０６３９６（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）；ＰＣＴ  ＷＯ９６／３０３４７（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ）；ＰＣＴ  ＷＯ９６／３３９７８（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＣＴ  ＷＯ９６／３３９７（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＣＴ  ＷＯ９６／３３９８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳ���（商標）、ＺＤ１８３９、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、およびＯＳＩ−７７４（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のうちのいずれかにおいて記載される阻害剤が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９６】
想定される別の実施形態では、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を、本明細書ではコンジュゲートと称する、別の治療用化合物とコンジュゲートすることもでき、これに作動可能に連結することもできる。コンジュゲートは、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、毒素、放射性同位元素、または他の治療的に活性な薬剤でありうる。化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、および他の治療剤については上記で記載したが、これらの前述の治療剤の全てを、抗体コンジュゲートとして用いることができる。
【０１９７】
代替的な実施形態では、抗体を、それらの断片および／または改変体を含めた、細菌起源、真菌起源、植物起源、または動物起源の低分子毒素および酵素的に活性な毒素が含まれるがこれらに限定されない毒素とコンジュゲートするか、またはこれに作動可能に連結する。低分子毒素には、サポリン（Ｋｕｒｏｄａら、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ、７０巻：１２８６〜１２９４頁（２０１０年）；Ｌｉｐら、２００７年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、４巻：２４１〜２５１頁；Ｑｕａｄｒｏｓら、２０１０年、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ、９巻（１１号）；３０３３〜４０頁；Ｐｏｌｉｔｏ  Ｌ．ら、２００９年、Ｂｒｉｔ．Ｊｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１４７巻、７１０〜７１８頁）、カリケアマイシン、マイタンシン（米国特許第５，２０８，０２０号）、トリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５が含まれるがこれらに限定されない。毒素には、ＲＮアーゼ、ゲロニン、エンジイン、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属外毒素（ＰＥ４０）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ毒素、およびヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
【０１９８】
ある特定の関連する実施形態では、抗体を、１つまたは複数のマイタンシン分子（例えば、抗体分子１つ当たり約１〜約１０のマイタンシン分子）とコンジュゲートされうる。例えば、マイタンシンを、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅへと転換することができ、これをＭａｙ−ＳＨ３へと還元して、修飾抗体と反応させ（Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁）て、マイタンシノイド−抗体コンジュゲートを生成させることができる。別の対象のコンジュゲートは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡの切断をもたらすことが可能である。また、カリケアマイシンの構造的類似体も用いることができる（Ｈｉｎｍａｎら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３巻：３３３６〜３３４２頁；Ｌｏｄｅら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５８巻：２９２５〜２９２８頁）（米国特許第５，７１４，５８６号；米国特許第５，７１２，３７４号；米国特許第５，２６４，５８６号；米国特許第５，７７３，００１号）。アウリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）など、ドラスタチン１０の類似体も、本明細書で開示される抗体またはその改変体のコンジュゲートとして用いることができる（Ｄｏｒｏｎｉｎａら、２００３年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２１巻（７号）：７７８〜８４頁；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ、１０２巻（４号）：１４５８〜６５頁）。酵素的に活性な有用な毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来する）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉのタンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれるがこれらに限定されない。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。本開示は、コンジュゲートまたは融合体を、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体と、核酸分解活性を伴う化合物、例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼとの間で形成させる実施形態もさらに想定する。
【０１９９】
代替的な実施形態では、本明細書で開示される抗体は、放射性同位元素にコンジュゲートするかまたはこれに作動可能に連結して、放射性コンジュゲートを形成することができる。放射性コンジュゲート抗体を産生させるには、多様な放射性同位元素が利用可能である。例には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれるがこれらに限定されない。
【０２００】
他のある特定の実施形態では、本明細書で記載される抗体を、細胞毒（例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤）、治療剤、または放射性元素（例えば、アルファ放射体、ガンマ放射体など）などの治療用部分とコンジュゲートすることができる。細胞毒または細胞傷害剤には、細胞に対して有害な任意の薬剤が含まれる。例には、パクリタキセル／パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または同族体が含まれる。１つの好ましい例となる細胞毒は、サポリン（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）である。治療剤には、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ；シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０１】
さらに、ある特定の実施形態では、ＦＺＤ１０特異的抗体（本明細書で提供される抗原結合断片など、その機能的断片を含めた）を、放射性金属イオンをコンジュゲートするのに有用な放射性物質または大環状キレート化剤などの治療用部分とコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態では、大環状キレート化剤が、リンカー分子を介して抗体へと付着されうる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、Ｄｅｎａｒｄｏら、１９９８年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４巻：２４８３〜９０頁；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９９９年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．、１０巻：５５３号；およびＺｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９９年、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．、２６巻：９４３〜５０頁において記載されている。
【０２０２】
さらに別の実施形態では、抗体を、腫瘍のプレターゲティングにおいて使用される「受容体」（ストレプトアビジンなど）であって、抗体−受容体コンジュゲートが患者に投与された後、清澄化剤（ｃｌｅａｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を用いて、結合しなかったコンジュゲートが循環から除去され、次いで、細胞傷害剤（例えば、放射性ヌクレオチド）とコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、アビジン）の投与が行われる受容体とコンジュゲートすることができる。代替的な実施形態では、抗体依存性酵素介在性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を使用するために、抗体を、酵素とコンジュゲートするか、またはこれに作動可能に連結する。ＡＤＥＰＴは、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル系化学療法剤；ＰＣＴ  ＷＯ８１／０１１４５を参照されたい）を、活性な抗がん薬へと転換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートすることにより用いることもでき、これに作動可能に連結することにより用いることもできる。例えば、ＰＣＴ  ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、それを活性のより大きな細胞傷害性形態へと転換するようなやり方でプロドラッグに作用することが可能な任意の酵素が含まれる。これらの実施形態および関連する実施形態による方法において有用な酵素には、ホスフェートを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェートを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗がん薬である５−フルオロウラシルへと転換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチドを含有するプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なセラチア菌プロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ、およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）などのプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸の置換基を含有するプロドラッグを転換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化されたプロドラッグを遊離薬物へと転換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｍｉｄａｓｅ）などの炭水化物切断酵素；α−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物へと転換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ；およびそれらのアミン窒素において、それぞれ、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物へと転換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれるがこれらに限定されない。代替的に、当技術分野ではまた「アブザイム」としても公知の酵素活性を伴う抗体を用いて、プロドラッグを遊離の活性薬物へと転換することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ、３２８巻：４５７〜４５８頁を参照されたい）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、アブザイムを腫瘍細胞集団へと送達するために調製することができる。
【０２０３】
また、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体の他の修飾も想定される。例えば、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの１つと連結することができる。別の実施形態では、抗体を、分化誘導剤または薬物、およびこれらの誘導体と共役させることができる。例となる薬物には、メトトレキサート、ならびにピリミジン類似体およびプリン類似体が含まれうるがこれらに限定されない。例となる分化誘導剤には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれうるがこれらに限定されない。
【０２０４】
本発明のある特定の実施形態では、多様なリンカーを用いて、抗体コンジュゲートを生成させることができる。本明細書では、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「テザー配列」、またはこれらの文法的同等物が、２つの分子を接続し、２つの分子を好ましい立体配置に置くように働くことが多い分子または分子群（単量体またはポリマーなど）を意味する。多数の戦略を用いて、分子を併せて共有結合的に連結することができる。これらには、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端とのポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介する結合、および化学架橋試薬を介する連結が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０５】
このような一実施形態では、リンカーが、組換え法またはペプチド合成により生成させるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特定の場合に適したリンカーの選択は、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが天然でオリゴマー化するのかどうか）、公知の場合は、接続されるＮ末端とＣ末端との距離、ならびに／またはタンパク質分解および酸化に対するリンカーの安定性が含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の多様なパラメータに依存しうる。さらに、リンカーは、可撓性をもたらすアミノ酸残基を含有しうる。したがって、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒのうちの１つまたは複数を主に包含しうる。リンカーペプチドは、２つの分子を、所望の活性を保持するように、互いに対して適正なコンフォメーションをとるようなやり方で連結するのに適当な長さを有するべきである。この目的に適する長さには、少なくとも１アミノ酸残基であり、かつ、３０アミノ酸残基以下である長さが含まれる。リンカーは、約１〜３０アミノ酸の長さであることが好ましく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０アミノ酸の長さのリンカーが好ましい。
【０２０６】
リンカーペプチドに包含させるのに選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性にそれほど干渉しない特性を呈示しうることが望ましい。したがって、リンカーペプチド全体で、ポリペプチドの活性と不整合であるか、または内部フォールディングに干渉するか、単量体のうちの１つまたは複数におけるアミノ酸残基であって、受容体の単量体ドメインの結合を大きく妨げるアミノ酸残基と結合または他の相互作用を形成する電荷を呈示すべきではない。有用なリンカーには、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２５）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２７）を含めた［配列中、ｎは、少なくとも１つの整数である］）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびＳｈａｋｅｒカリウムチャネルのためのテザーなどの他の可撓性リンカー、ならびに当業者により認識される多種多様な他の可撓性リンカーが含まれる。
【０２０７】
一部の実施形態では、グリシン−セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が、比較的構造化されておらず、したがって、構成要素間の中性のテザーとして働きうるので好ましい。第２に、セリンは親水性であり、したがって、球状のグリシン鎖となりうるポリマーを可溶化させることが可能である。第３に、同様な鎖が、単鎖抗体など、組換えタンパク質のサブユニットを接合するのに有効であることが示されている。適したリンカーはまた、２つのポリペプチド鎖の間のギャップを架橋しうる天然に存在するモチーフについての、公知の三次元構造のデータベースをスクリーニングすることによっても同定することができる。
【０２０８】
好ましい実施形態では、リンカーが、ヒト患者に投与するときに免疫原性ではない。したがって、リンカーは、それらが低免疫原性であるか、または免疫原性が低いと考えられるように選ぶことができる。例えば、ヒトにおいて天然で存在するリンカーを選ぶことができる。好ましい実施形態では、リンカーが、抗体のヒンジ領域の配列、すなわち、抗体のＦａｂ領域とＦｃ領域とを連結する配列を有するが、代替的に、リンカーは、ヒンジ領域の一部を含む配列または抗体のヒンジ領域と実質的に同様な配列も有する。適したリンカーを得る別のやり方は、単純なリンカー、例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号２６）を、ランダム変異誘発を介して最適化することによるやり方である。代替的に、適したポリペプチドリンカーを規定したら、さらなるリンカーポリペプチドを創出して、連結されるドメインとより最適な形で相互作用するアミノ酸を選択することができる。
【０２０９】
用いうる他の種類のリンカーには、人工のポリペプチドリンカーおよびインテインが含まれる。別の実施形態では、２つの分子を連結するようにジスルフィド結合をデザインする。別の実施形態では、リンカーが、化学架橋剤である。例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｌｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）が含まれるがこれらに限定されない多様な二官能性タンパク質の共役剤を用いることができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａら、１９７１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８号において記載される通りに、リシン抗毒素を調製することができる。
【０２１０】
化学リンカーは、同位元素のキレート化を可能にしうる。例えば、炭素１４標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体へとコンジュゲートするための例となるキレート化剤である（ＰＣＴ  ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい）。リンカーは、切断可能であり、細胞における細胞傷害性薬の放出を容易とする。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、１９９２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁）を用いることができる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーが含まれるがこれらに限定されない多様な非タンパク質性ポリマーをリンカーとして用いることができる、すなわち、本明細書で開示される抗体を融合パートナーへと連結するのに用いる場合もあり、抗体を所望のコンジュゲート部分へと連結して免疫コンジ
ュゲートを形成するのに用いる場合もある。
【０２１１】
当業者には、ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方である多様な二官能性または多官能性試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログにおいて記載される試薬など）をリンカー基として使用しうることが明らかであろう。共役は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化炭水化物残基を介して行うことができる。このような方法について記載する参考文献には、例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらによる米国特許第４，６７１，９５８号など、多数の参考文献が存在する。治療剤が免疫コンジュゲートの抗体部分から遊離するとより強力となる場合は、細胞へと内部移行されている間、または内部移行時に切断可能となるリンカー基を用いることが望ましい。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。細胞内のこれらのリンカー基からの薬剤放出の機構には、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒによる米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性の結合に対する照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらによる米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（例えば、Ｋｏｈｎらによる米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を介する加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらによる米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらによる米国特許第４，５６９，７８９号）が含まれる。
【０２１２】
２つ以上の薬剤を抗体と共役させることが所望されうる。一実施形態では、薬剤の複数の分子を、１つの抗体分子と共役させる。別の実施形態では、２つ以上の種類の薬剤を、１つの抗体と共役させることができる。具体的な実施形態にかかわらず、２つ以上の薬剤を伴う免疫コンジュゲートは、多様なやり方で調製することができる。例えば、２つ以上の薬剤を抗体分子へと直接共役させることもでき、複数の付着部位をもたらすリンカーを用いることもできる。代替的に、キャリアを用いることもできる。
【０２１３】
キャリアは、直接またはリンカー基を介する共有結合の形成を含め、多様なやり方で薬剤を保有しうる。適したキャリアには、アルブミンなどのタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらによる米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよびアミノデキストランなどの多糖（例えば、Ｓｈｉｈらによる米国特許第４，６９９，７８４号）が含まれる。キャリアはまた、非共有結合の形成またはリポソーム小胞内などのカプセル化によっても薬剤を保有しうる（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種による薬剤に特異的なキャリアには、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化化合物が含まれる。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成について開示している。放射性核種のキレートは、金属または金属酸化物である放射性核種に結合させるためのドナー原子としての窒素原子および硫黄原子を含有するキレート化化合物が含まれるキレート化化合物から形成することができる。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらによる米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化化合物およびそれらの合成について開示している。
【０２１４】
毒素または薬物などの治療剤は、抗体と直接的または間接的に（例えば、本明細書で開示されるリンカー基を介して）共役させる（例えば、共有結合形成させる）ことができる。例えば、一実施形態では、治療剤を、アビジン−ビオチン系または他の類似の系を介して間接的に共役させる。各々が他方と反応することが可能な置換基を所有する場合は、薬剤と抗体との直接的反応が可能である。例えば、一方におけるアミノ基またはスルフヒドリル基などの求核基は、他方における無水物または酸ハロゲン化物などのカルボニル含有基と反応することができる場合もあり、良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる場合もある。
【０２１５】
治療用部分を抗体とコンジュゲートする技法は周知であり、例えば、Ａｍｏｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、１９８５年、２４３〜５６頁、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、１９８７年、６２３〜５３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、１９８５年、４７５〜５０６頁；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｒｅｓｕｌｔｓ，  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、１９８５年、３０３〜１６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．６２巻：１１９〜５８頁、１９８２年を参照されたい。
【０２１６】
純粋形態または適切な医薬組成物中での、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体の投与は、類似の有用性を供給するのに許容される薬剤の投与方式のうちのいずれかを介して実行することができる。医薬組成物は、抗体または抗体を含有する組成物（例えば、ＦＺＤ１０特異的抗体−サポリン抗毒素などの免疫コンジュゲート）を、生理学的に許容される適切なキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることにより調製することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびエアゾール剤など、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態の調製物へと製剤化することができる。加えて、他の薬学的に活性な成分（本明細書の別の個所で記載される他の抗がん剤を含めた）、ならびに／または塩、緩衝剤、および安定化剤などの適した賦形剤を組成物内に存在させることもできるがそうしなくともよい。投与は、経口経路、非経口経路、経鼻経路、静脈内経路、皮内経路、皮下経路、または局所経路を含め、異なる多様な経路を介して達成することができる。好ましい投与方式は、処置または防止される状態の性質に依存する。投与後、がんを軽減するか、がんを阻害するか、がんの進行および／または転移を防止するかまたは遅延させる量を有効であると考える。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、投与される量が、生存可能な腫瘍の量の統計学的に有意な減少、例えば、腫瘍塊の少なくとも５０％の減少または走査寸法の変化（例えば、統計学的に有意な減少）により示される腫瘍の退縮を結果としてもたらすのに十分である。処置の正確な投与量および持続期間は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを用いて経験的に決定することもでき、当技術分野で公知のモデル系において組成物を調べ、そこから外挿することにより決定することもできる。また、対照臨床検査も実施することができる。投与量はまた、緩和させる状態の重症度によって変わりうる。医薬組成物は一般に、望ましくない副作用を最小化しながら、治療的に有用な効果を発揮するように製剤化および投与する。組成物は、一度に投与することもでき、時間間隔を置いて投与される多数回のより小用量へと分割することもできる。任意の特定の対象には、特定の投与量レジメンを、個別の必要に従い、経時的に調整することができる。
【０２１８】
ＦＺＤ１０特異的抗体を含有する組成物は、単独で投与することもでき、放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光力学療法など、他の公知のがん処置と組み合わせて投与することもできる。組成物はまた、細菌感染、特に、細胞内の細菌感染を処置するのに用いられる抗生物質と組み合わせても投与することができる。
【０２１９】
したがって、限定せずに述べると、これらの医薬組成物および類縁の医薬組成物を投与する典型的な経路には、経口経路、局所経路、経皮経路、吸入経路、非経口経路、舌下経路、口腔内経路、直腸内経路、膣内経路、および鼻内経路が含まれる。本明細書で用いられる非経口という用語には、皮下注射、静脈内注射法または静脈内注入法、筋肉内注射法または筋肉内注入法、胸骨内注射法または胸骨内注入法が含まれる。本発明のある特定の実施形態に従う医薬組成物は、組成物を患者へと投与したときに、その中に含有される活性成分が生体に利用可能になるように製剤化する。被験体または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投薬単位であって、例えば、錠剤が単一の投薬単位の場合もあり、エアゾール形態における本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体の容器が複数の投薬単位を保持する場合もある投薬単位の形態をとりうる。このような剤形を調製する実際の方法は当業者に公知であるか、または明らかであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００年）を参照されたい）。いずれにせよ、投与される組成物は、本明細書の教示に従う被験体の疾患または状態を処置するための治療有効量の本開示の抗体を含有する。
【０２２０】
医薬組成物は、固体形態の場合もあり、液体形態の場合もある。一実施形態では、組成物が、例えば、錠剤形態または粉末形態であるように、キャリア（複数可）は微粒子である。キャリア（複数可）は液体であることが可能であり、組成物は、例えば、経口油、注射液、または、例えば、吸入投与において有用なエアゾールでありうる。経口投与用に意図される場合、医薬組成物は、固体形態または液体形態であることが好ましく、半固体、半液体、懸濁液、およびゲル形態が、本明細書で固体または液体として考えられる形態内に包含される。
【０２２１】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物を、散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、チューインガム、ウェハーなどへと製剤化することができる。このような固体組成物は典型的に、１つまたは複数の不活性希釈剤または可食性キャリアを含有する。加えて、以下のうちの１つまたは複数を存在させることができる：カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｘなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料などの着香剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；および着色剤。医薬組成物が、カプセル形態、例えば、ゼラチンカプセル剤の場合、それは、上記の種類の物質に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体キャリアを含有しうる。
【０２２２】
医薬組成物は、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤でありうる。２つの例として、液体は、経口投与用の場合もあり、注射による送達用の場合もある。経口投与用が意図される場合、好ましい組成物は、本化合物に加えて、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１つまたは複数も含有する。注射により投与することが意図される組成物では、界面活性剤、防腐剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、および等張剤のうちの１つまたは複数が包含されうる。
【０２２３】
それらが溶液であれ、懸濁液であれ、他の同様の形態であれ、液体の医薬組成物は、以下のアジュバントのうちの１つまたは複数を包含しうる：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒もしくは懸濁媒として働きうる合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数の用量バイアル内に封入することができる。生理食塩水は、好ましいアジュバントである。注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
【０２２４】
非経口投与用または経口投与用を意図される液体の医薬組成物は、適した投与量が得られるように、本明細書で開示されるＦＺＤ１０特異的抗体の量を含有するべきである。典型的に、この量は、組成物中に少なくとも０．０１％の抗体である。経口投与用が意図される場合、この量は、組成物重量の０．１〜約７０％であるように変わりうる。ある特定の経口医薬組成物は、約４％〜約７５％の抗体を含有する。ある特定の実施形態では、非経口投薬単位が、希釈前の０．０１〜１０重量％の抗体を含有するように、本発明に従う医薬組成物および医薬調製物を調製する。
【０２２５】
医薬組成物は、局所投与用を意図することもでき、この場合、キャリアは、溶液基剤、エマルジョン基剤、軟膏基剤、またはゲル基剤を含むことが適切でありうる。基剤は、例えば、以下のうちの１つまたは複数を含みうる：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱油、水およびアルコールなどの希釈剤、ならびに乳化剤および安定化剤。増粘剤は、局所投与用の医薬組成物中に存在させることができる。経皮投与用を意図する場合、組成物は、経皮パッチを包含する場合もあり、イオン導入デバイスを包含する場合もある。医薬組成物は、例えば、直腸内で溶融して薬物を放出する、坐剤の形態での直腸内投与を意図する場合もある。直腸内投与用の組成物は、適した非刺激性賦形剤としての油性基剤を含有しうる。限定せずに述べると、このような基剤には、ラノリン、ココアバター、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０２２６】
医薬組成物は、固体または液体の投薬単位の物理的形態を改変する多様な物質を包含しうる。例えば、組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を包含しうる。コーティングシェルを形成する物質は、典型的に不活性であり、例えば、糖、セラック、および他の腸溶性のコーティング剤から選択することができる。代替的に、活性成分は、ゼラチンカプセル内に包み込むこともできる。固体形態または液体形態の医薬組成物は、本発明の抗体に結合し、これにより化合物の送達の一助となる薬剤を包含しうる。この能力において作用しうる適した薬剤には、他のモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１つもしくは複数のタンパク質、またはリポソームが含まれる。医薬組成物は、本質的にエアゾールとして投与しうる投薬単位からなる場合がある。エアゾールという用語は、コロイド状のもの〜加圧パッケージからなる系の範囲にわたる多様な系を指し示すのに用いられる。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスを介する場合もあり、活性成分を分注する適したポンプシステムを介する場合もある。活性成分（複数可）を送達するために、エアゾールは、単相系で送達することもでき、二相系で送達することもでき、三相系で送達することもできる。エアゾールの送達は、併せてキットを形成しうる、必要な容器、アクチベーター、バルブ、部分容器などを包含する。当業者は、必要以上の実験なしに、好ましいエアゾールを決定することができる。
【０２２７】
医薬組成物は、製薬技術分野で周知の方法により調製することができる。例えば、注射により投与することを意図される医薬組成物は、溶液を形成するように、本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体、ならびに場合によって、塩、緩衝剤、および／または安定化剤のうちの１つまたは複数を含む組成物を、滅菌蒸留水と組み合わせることにより調製することができる。界面活性剤を添加して、均一な溶液または懸濁液の形成を容易にすることができる。界面活性剤とは、水性送達系における抗体の溶解または均一な懸濁を容易にするように、抗体組成物と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０２２８】
組成物は、使用される特定の化合物（例えば、ＦＺＤ１０特異的抗体）の活性；化合物作用の代謝安定性および長さ；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別、および食事；投与方式および投与期間；排泄速度；薬物の組合せ；特定の障害または状態の重症度；ならびに療法を受ける被験体を含めた多様な因子に依存して変わる治療有効量で投与することができる。一般に、治療的に有効な毎日の用量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．０７ｍｇ）〜約１００ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７．０ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、好ましくは、治療有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、０．７ｍｇ）〜約５０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、３．５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）であり、より好ましくは、治療有効用量は、約１ｍｇ／ｋｇ（すなわち、７０ｍｇ）〜約２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、１．７５ｇ）（７０ｋｇの哺乳動物の場合）である。
【０２２９】
本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を含む組成物はまた、１つまたは複数の他の治療剤の投与と同時に投与することもでき、この前に投与することもでき、この後で投与することもできる。このような組合せ療法は、本発明の化合物および１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含有する単一の医薬投薬製剤の投与の他、本発明の抗体を含む組成物およびその固有の別個の医薬投薬製剤における各活性薬剤の投与も包含しうる。例えば、本明細書で記載される抗体および他の活性薬剤は、錠剤またはカプセル剤など、単一の経口投与組成物中で併せて患者に投与することもでき、各薬剤を別個の経口投薬製剤により投与することもできる。別個の投薬製剤を用いる場合、抗体および１つまたは複数のさらなる活性薬剤を含む組成物は、本質的に同時に、すなわち、共時的に投与することもでき、別個に時間をずらして、すなわち、逐次的、かつ、任意の順序で投与することもでき、組合せ療法は、これら全てのレジメンを包含することが理解される。
【０２３０】
本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を含む組成物は、がんなど、本明細書で記載される疾患に罹患する個体に投与することができる。ヒト疾患を処置するためにｉｎ  ｖｉｖｏで用いる場合は一般に、本明細書で記載される抗体を、投与前に医薬組成物へと組み込む。医薬組成物は、本明細書の別の個所で記載される通り、生理学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせた、本明細書で記載される抗体のうちの１つまたは複数を含む。医薬組成物を調製するには、有効量の１つまたは複数の化合物を、特定の投与方式に適することが当業者に公知である任意の医薬キャリア（複数可）または医薬賦形剤と混合する。医薬キャリアは、液体の場合もあり、半液体の場合もあり、固体の場合もある。非経口適用、皮内適用、皮下適用、または局所適用に用いられる溶液または懸濁液には、例えば、滅菌希釈剤（水など）、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗微生物剤（ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸および亜硫酸水素ナトリウムなど）；ならびにキレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝剤（酢酸塩、クエン酸塩、およびリン酸塩など）が含まれうる。静脈内投与する場合、適したキャリアには、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤を含有する溶液が含まれる。
【０２３１】
本明細書で記載されるＦＺＤ１０特異的抗体を含む組成物は、徐放製剤またはコーティングなど、体内からの急速な消失から抗体を保護するキャリアと共に調製することができる。このようなキャリアには、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系、ならびにエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、および当業者に公知の他のポリマーなどの生体分解性ポリマー、生体適合性ポリマーなどであるが
これらに限定されない、制御放出製剤が含まれる。
【０２３２】
本発明の様々な他の実施形態は、ＦＺＤ１０を発現している細胞または組織の存在を検出するための診断的適用に部分的に関する。したがって、本開示は、ＦＺＤ１０を発現している細胞または組織の検出などの、試料においてＦＺＤ１０を検出する方法を提供する。そのような方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、ホールマウントｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）、蛍光ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリー、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）および酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられるがこれらに限定されない、種々の公知の検出フォーマットにおいて適用することができる。
【０２３３】
ＩＳＨは、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖（すなわち、一次結合剤）を用いて、細胞もしくは組織の一部または切片（ｉｎ  ｓｉｔｕ）において、または組織が全く小さい場合は組織全体（ホールマウントＩＳＨ）において特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の位置を突き止める一種のハイブリダイゼーションである。当業者であれば、このＩＳＨは、一次結合剤として抗体を用いて組織切片においてタンパク質の位置を突き止める免疫組織化学とは異なっていることを認識するであろう。ＤＮＡ  ＩＳＨは、ゲノムＤＮＡ上で使用して、染色体の構造を決定することができる。蛍光ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）は、例えば、医学診断において使用して、染色体の完全性を評価することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学）は、組織切片またはホールマウント内でｍＲＮＡおよび他の転写物を測定し位置を突き止めるのに使用される。
【０２３４】
様々な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、直接的にまたは間接的に検出しうる検出可能な標識とコンジュゲートしている。これに関して、抗体「コンジュゲート」とは、検出可能な標識に共有結合している抗ＦＺＤ１０抗体を指す。本発明では、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、モノクローナル抗体、その抗原結合断片、および単鎖可変断片抗体またはエピトープタグ付き抗体などのその抗体誘導体は全て検出可能な標識に共有結合していてもよい。「直接的検出」では、１つの検出可能な抗体、すなわち、検出可能な一次抗体のみが使用される。したがって、直接的検出とは、検出可能な標識とコンジュゲートしている抗体それ自体が、第２の抗体（二次抗体）を加える必要なく検出されうることを意味する。
【０２３５】
「検出可能な標識」とは、試料における前記標識の存在および／または濃度を示す検出可能な（例えば、視覚的に、電子的にまたは他の方法で）シグナルを出すことができる分子または材料のことである。検出可能な標識は、抗体とコンジュゲートすると、これを使用して特異的抗体が向かう標的の位置を突き止めかつ／または定量化することができる。それによって、試料における標的の存在および／または濃度は、検出可能な標識から出るシグナルを検出することにより検出することができる。検出可能な標識は直接的にまたは間接的に検出することができ、異なる特異的抗体とコンジュゲートしたいくつかの異なる検出可能な標識を組み合わせて用いて１つまたは複数の標的を検出することができる。
【０２３６】
直接的に検出しうる検出可能な標識の例には、蛍光色素および放射性物質および金属粒子が挙げられる。これとは対照的に、間接的検出は、一次抗体の適用後に、１つまたは複数のさらなる抗体、すなわち、二次抗体の適用を必要とする。したがって、前記検出は、検出可能な一次抗体への二次抗体または結合剤の結合を検出することにより実施される。二次結合剤または二次抗体の添加を必要とする検出可能な一次結合剤または一次抗体の例には、酵素的検出可能な結合剤およびハプテン検出可能な結合剤または抗体が挙げられる。
【０２３７】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、第１の結合剤を含む核酸ポリマーとコンジュゲートしている（例えば、ＩＳＨ、ＷＩＳＨまたはＦＩＳＨ工程において）。他の実施形態では、検出可能な標識は第１の結合剤を含む抗体とコンジュゲートしている（例えば、ＩＨＣ工程において）。
【０２３８】
本開示の方法において使用される抗体とコンジュゲートしうる検出可能な標識の例には、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテン、および色素が挙げられる。
【０２３９】
蛍光標識の例には、５−（および６）−カルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（および６）−カルボキシアミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５などの色素、必要に応じて、ＡＭＣＡ、ＰｅｒＣＰを含む置換クマリン、Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）およびアロフィコエリトリン（ＡＰＣ）を含むフィコビリタンパク質、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｒｅｄ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびこれらの類似体、ならびにＲ−フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンのコンジュゲート、被覆ＣｄＳｅナノ微結晶のような半導体材料に基づく粒子などの無機蛍光標識が挙げられる。
【０２４０】
ポリマー粒子標識の例には、ポリスチレン、ＰＭＭＡまたはシリカのマイクロ粒子またはラテックス粒子が挙げられ、これらの粒子は蛍光色素、または色素、酵素もしくは基質を含有するポリマーミセルもしくはカプセルで包埋させることができる。
【０２４１】
金属粒子標識の例には、銀染色により変換することができる、金粒子および被覆金粒子が挙げられる。ハプテンの例には、ＤＮＰ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、およびジゴキシゲニンが挙げられる。酵素標識の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（acetylglucosamimidase）、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。西洋ワサビペルオキシダーゼに対する一般的に用いられる基質の例には、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル強化されたジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジンジヒドロクロリド（ＢＤＨＣ）、Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ試薬（ＨＹＲ）、Ｉｎｄｏｐｈａｎｅ  ｂｌｕｅ（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、α−ナフトールピロニン（α−ＮＰ）、ｏ−ジアニシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロライド（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド／フェロ−フェリシアン化物（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【０２４２】
アルカリホスファターゼに対する一般的に用いられる基質の例には、ナフトール−ＡＳ−Ｂ  １−ホスフェート／ファーストレッド（ｆａｓｔ  ｒｅｄ）  ＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスフェート／ファーストレッド  ＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート／−ファーストレッド  ＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスフェート／ファーストレッド  ＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスフェート／ニューフクシン（ｎｅｗ  ｆｕｓｃｈｉｎ）（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【０２４３】
発光標識の例には、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタンおよびピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例には、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射性標識の例には、ヨウ化物、コバルト、セレニウム、トリチウム、炭素、硫黄およびリンの放射性同位元素が挙げられる。
【０２４４】
検出可能な標識は、本明細書に記載される抗体にまたは対象の生物学的マーカー、例えば、抗体、核酸プローブ、もしくはポリマーに特異的に結合する他の任意の分子に連結させることができる。さらに、当業者であれば、検出可能な標識は、第２、および／または第３、および／または第４、および／または第５の結合剤または抗体などにもコンジュゲートすることができることは十分に理解されるであろう。さらに、当業者であれば、対象の生物学的マーカーを特徴付けるのに用いられるそれぞれのさらなる結合剤または抗体は、シグナル増幅ステップとして働きうることを十分に理解されるであろう。前記生物学的マーカーは、例えば、検出可能な物質が例えば色素、コロイド金粒子、発光試薬である光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法を使用して視覚的に検出されうる。生物学的マーカーに結合している視覚的に検出可能な物質は、分光光度計を用いても検出しうる。検出可能な物質が放射性同位元素である場合、検出は、視覚的にオートラジオグラフィーによっても、または非視覚的にシンチレーション計数器を用いても可能である。例えば、Larsson、１９８８年、Immunocytochemistry:  Theory  and  Practice、(CRC  Press、Boca  Raton、Fla.)；  Methods  in  Molecular  Biology、８０巻  １９９８年、John  D.  Pound（編）(Humana  Press、Totowa、N.J.)を参照されたい。
【０２４５】
ある特定の実施形態は、試料においてＦＺＤ１０またはＦＺＤ１０を発現している細胞もしくは組織を検出するためのキットであって、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含有するキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、バッファ、酵素、標識、基質、本発明の抗体が結合されているビーズまたは他の表面などならびに使用のための指示を含んでいてもよい。
【０２４６】
本明細書の全体において、文脈により別段に要求されない限り、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、言明された要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の包含は含意するが、他の任意の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の除外は含意しないと理解される。
【０２４７】
文脈により別段であることが明確に規定されない限り、本明細書で用いられる単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数態を包含する。したがって、例えば、「ある細胞」への言及は、単一の細胞の他、２つ以上の細胞も包含し、「ある薬剤」への言及は、１つの薬剤の他、２つの以上の薬剤も包含するなどである。
【０２４８】
別段に明示的に言明されない限り、本明細書に記載される各実施形態は、変更すべき部分を変更して、他の全ての実施形態にも適用されるものとする。
【０２４９】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技法を用いることができる。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様に従い実施することもでき、当技術分野において一般的に実現される通りに実施することもでき、本明細書で記載される通りに実施することもできる。これらの技法および手順ならびに関連する技法および手順は一般に、当技術分野において周知の従来の方法に従い、本明細書全体で引用されて論じられる、微生物学、分子生物学、生化学、分子遺伝学、細胞生物学、ウイルス学および免疫学の技法における、多様な一般的参考文献およびより特定の参考文献において記載される通りに実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、３版、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００８年７月更新）；  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；  Ｇｌｏｖｅｒ，  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  Ｉ  ＆  ＩＩ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡ，  １９８５）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａｄａ  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅｔｈａｎ  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、２００１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、ＮＹ）；Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｕｌｉｅ  Ｌｏｇａｎ，  Ｋｉｒｓｔｉｎ  ＥｄｗａｒｄｓおよびＮｉｃｋ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ編，  ２００９，  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｏｒｆｏｌｋ，  ＵＫ；  Ａｎａｎｄ，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）；  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  （Ｎ．  Ｇａｉｔ編，  １９８４）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編，  １９８５）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  （Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；  Ａ��ｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；  Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；  Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  （Ｊａｎｉｔｚ，  ２００８  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｐａｒｋ，  Ｅｄ．，３版，  ２０１０  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６）；  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．  Ｈ．  ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．  Ｐ．  Ｃａｌｏｓ編，１９８７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９９８）；  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．  Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣＣ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６）；  Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８８）；  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編，２００２）；  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編，２００６）；  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ：  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓｔａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編，２００６）；  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｋｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ編，２００６）；  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）  （Ｄａｒｗｉｎ  Ｊ．  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｄｏｎａｌｄ  Ｇ．  Ｐｈｉｎｎｅｙ，  ａｎｄ  Ｂｒｕｃｅ  Ａ．  Ｂｕｎｎｅｌｌ編，２００８）；  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃ���ｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ａ．  Ｋｌｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｒａｉｇ  Ｔ．  Ｊｏｒｄａｎ編，２００１）；  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ  Ｄ．  Ｂｕｎｔｉｎｇ編，２００８）  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ  Ｐ．  Ｗｅｉｎｅｒ編，２００８）を参照されたい。
【０２５０】
特定の定義を提供しない限り、本明細書で記載される分子生物学、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および製薬化学との関連で用いられる用語法ならびにこれらの実験室における手順および技法は、周知の手順および技法であり、当技術分野において一般的に用いられている。標準的な技法は、組換え技術、分子生物学法、微生物学法、化学合成、化学的分析、医薬の調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に用いることができる。
【０２５１】
文脈により別段に要求されない限り、本明細書および特許請求の範囲全体で、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変化形は、開放された包括的意味で、すなわち、「包含するが限定されない」として解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続くものは何でも包含しかつ典型的にはこれに限定されることを意味する。「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、前記語句の後に列挙された任意の要素をも包含し、前記列挙されている要素について本開示において明記されている活性または作用に干渉しないしそれに寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「基本的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、前記列挙された要素が必要とされているまたは必須であること、しかし他のどんな要素も必要とされず、前記要素が前記列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすか否かに応じて、存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示している。
【０２５２】
本明細書および添付されている特許請求の範囲では、単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別段に明確に指示されない限り、複数のリファレンスを包含する。本明細書で用いられている通り、特定の実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、数値に先行している場合、前記値プラスまたはマイナス５％、６％、７％、８％もしくは９％の範囲を示している。他の実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、数値に先行している場合、前記値プラスまたはマイナス１０％、１１％、１２％、１３％もしくは１４％の範囲を示している。さらに他の実施形態では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、数値に先行している場合、前記値プラスまたはマイナス１５％、１６％、１７％、１８％、１９％もしくは２０％の範囲を示している。
【０２５３】
「一実施形態（ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態（ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「態様（ａｎ  ａｓｐｅｃｔ）」への本明細書全体を通しての言及は、前記実施形態に関連して記載される特定の特長、構造または特徴は、本発明の少なくとも１つの実施形態に包含されていることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態では（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「実施形態では（ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、前記特定の特長、構造または特徴は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせてもよい。
【実施例】
【０２５４】
（実施例１）
ｅｘ  ｖｉｖｏにおける多様化系を用いるＦＺＤ１０特異的抗体の生成
【０２５５】
ＤＴ４０ニワトリＢ細胞リンパ腫系列は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける抗体進化の有望な出発点であることが示されている（Ｃｕｍｂｅｒｓ，  Ｓ．Ｊ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０巻、１１２９〜１１３４頁（２００２年）；Ｓｅｏ，  Ｈ．ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３巻、７３１〜７３５頁（２００５年））。ＤＴ４０細胞は、培養物中で頑健に増殖し、倍加時間が８〜１０時間であり（ヒトＢ細胞系の２０〜２４時間と比較して）、極めて効率的な相同遺伝子ターゲティングを支援する（Ｂｕｅｒｓｔｅｄｄｅ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ、９巻、９２１〜９２７頁（１９９０年））。ＤＴ４０細胞は、それぞれ、鋳型による変異および鋳型によらない変異を創出する、多様化の２つのはっきり異なる生理学的経路である、遺伝子転換および体細胞超変異を利用しうるので、膨大なＶ領域配列の潜在的多様性を駆使する（Ｍａｉｚｅｌｓ，  Ｎ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ、３９巻、２３〜４６頁（２００５年））。しかし実のところ、抗体進化のためのＤＴ４０細胞の有用性は、多様化が（他の形質転換されたＢ細胞系における場合と同様）生理学的速度の１％未満で生じるために限定されている。多様化は、相同組換え経路を無効化することにより数倍加速化しうる（Ｃｕｍｂｅｒｓ，  Ｓ．Ｊ．ら、前出）が、このようにして操作された細胞は、効率的な遺伝子ターゲティングを実行する能力を失っている。多様化はまた、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡで細胞を処置することによっても加速化しうる（Ｓｅｏら、前出）が、結果として得られる変異は、もっぱら鋳型による変異であり、潜在的な多様性は制限され、必要とされるアフィニティーまたは特異性を有する抗体を産生させることはできない。
【０２５６】
この実施例では、ＤＴ４０細胞を操作して、さらなる遺伝子改変能、または遺伝子転換および体細胞超変異の両方が変異誘発に寄与する可能性を犠牲にすることなしに、高度に多様な初代レパートリーを作製し、その細胞内のＩｇ遺伝子の多様化速度を加速化した。これは、Ｉｇ遺伝子の多様化を、強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーター／リプレッサー制御ネットワークの制御下に置くことにより実現された。ここで実証される通り、これらの操作された細胞は、多様化を加速するだけではなく、主要なレパートリーおよびアフィニティー／機能的抗体成熟から逸脱する変異を制御する多様化経路の実験的制御をも可能にした。
【０２５７】
強力なＥ．ｃｏｌｉラクトースオペレーターが約１００重合化した反復配列からなる多量体（ＰｏｌｙＬａｃＯ）を、相同遺伝子ターゲティングにより、再配列して発現させたＩｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の上流に挿入した。次いで、ラクトースリプレッサーのオペレーターＤＮＡに対する高アフィニティー（ｋＤ＝１０−１４Ｍ）を利用して、ラクトースリプレッサータンパク質（ＬａｃＩ）に融合させた制御因子を、ＬａｃＯ制御エレメントへとテザーして、多様化を制御することができる。ＰｏｌｙＬａｃＯがＩｇλだけに組み込まれたＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞は、任意の操作前の親ＤＴ４０細胞と比べて、Ｉｇ遺伝子の多様化速度の５倍の増大を呈示した（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））。多様化は、Ｉｇλ遺伝子およびＩｇＨ遺伝子の両方を標的としたＰｏｌｙＬａｃＯを保有するように操作された細胞（「ＤＴＬａｃＯ」）においてさらに上昇することが予測された。これは、ＬａｃＩ−ＨＰ１制御因子によるトランスフェクションの３週間後にｓＩｇＭ−細胞の割合をアッセイすることにより操作された候補系列について確認され、これにより、多様化速度が、親ＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ  ＬａｃＩ−ＨＰ１系列に特徴的な２．８％と比べて２．５〜９．２倍上昇したことが示された。加速化は、個別のトランスフェクタントの変動アッセイにより、１つの系列について再確認された。ｓＩｇＭ−細胞の百分率は、２．５％〜５２．５％の範囲であり、ＤＴＬａｃＯ細胞におけるメジアンは１３．０％であった。このメジアンは、ＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ  ＬａｃＩ−ＨＰ１トランスフェクタントにおける場合（２．８％）より４．７倍高く、ＤＴ４０親系列（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年））に匹敵する対照細胞（ＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ  ＧＦＰ−ＬａｃＩ）における場合（０．６％）より２１．７倍高い。この変動アッセイでは累積ｓＩｇＭ喪失改変体を測定する（Ｌｕｒｉａ，  Ｓ．Ｅ．およびＤｅｌｂｒｕｅｃｋ，  Ｍ．、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２８巻、４９２〜５１１頁（１９４３年））ために予測される通り、一部の個別のクローンは、メジアンと大幅に異なる多様化速度を呈示した。したがって、重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方をＰｏｌｙＬａｃＯエレメントの標的とすることにより、多様化は、ＤＴ４０親細胞系と比べて２１．７倍に加速化された。
【０２５８】
細胞表面受容体ＦＺＤ１０は、ＷＮＴ７ａおよびＷＮＴ７ｂに対するＧタンパク質共役受容体である。マウスのＦＺＤ１０ポリペプチドとヒトＦＺＤ１０ポリペプチドの間には９３％のアミノ酸配列同一性が存在する。正常組織では、このタンパク質の発現は生体臓器においては非常に低いかまたは存在せず、このタンパク質は胃および結腸の表在粘膜、腎臓の近位尿細管および遠位尿細管、子宮内膜間質ならびに胎盤では低レベルで存在する。このタンパク質は、滑膜肉腫（９２％；  Nagayamaら、２００２年  Cancer  Res.  ６２巻：５８５９頁）、胃癌（４０％；  Kirikoshiら、２００１年  Int.  J.  Oncol.  １９巻：７６７頁）および結腸直腸癌（２５％；  Nagayamaら、２００９年  Cancer  Sci.  １００巻：４０５頁）などの種々のがんにおいて発現されていることが明らかにされてきた。ＦＺＤ１０発現の特異的ｓｉＲＮＡノックダウンにより、結果としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで滑膜肉腫細胞成長が阻害され、ポリクローナル抗ＦＺＤ１０抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＦＺＤ１０過剰発現滑膜肉腫細胞に対してＡＤＣＣを媒介し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは滑膜肉腫異種移植片腫瘍成長を阻害することが示された（Nagayamaら、２００５年  Oncogene  ２４巻：６２０１頁）。放射標識された抗ＦＺＤ１０モノクローナル抗体は抗原担持腫瘍細胞により内部に取り入れられｉｎ  ｖｉｖｏにおいて滑膜肉腫異種移植片腫瘍成長を劇的に抑制した（Fukukawaら、２００８年  Cancer  Sci.  ９９巻：４３７頁）。
【０２５９】
重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子の両方においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有する、操作されたＤＴＬａｃＯ系は、様々なＬａｃｌ制御融合タンパク質でトランスフェクトされると、重鎖および軽鎖Ｖ領域を急速に多様化する能力を有した。次に、この多様なＤＴＬａｃＯ集団はｅｘ  ｖｉｖｏでの抗体発見のための出発点として用いられた。抗ＦＺＤ１０抗体選択および成熟戦略を示す概略図は図１に示されている。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に融合されたＦＺＤ１０の細胞外Ｎ末端ドメインを使用して、ＦＺＤ１０特異的結合ついてＤＴＬａｃＯ細胞を調べた。
【０２６０】
この実施例では、以下の方法を用いた。
【０２６１】
細胞の培養および遺伝子ターゲティング：別段に示さない限り、細胞系は、ＡＴＣＣから購入した。ＤＴ４０に由来する細胞系は、既に記載した通りに維持およびトランスフェクトし（Ｙａｂｕｋｉ，  Ｍ．、Ｆｕｊｉｉ，  Ｍ．Ｍ．、およびＭａｉｚｅｌｓ，  Ｎ．、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６巻、７３０〜７３６頁（２００５年））、他の細胞系は、元の供給源により指定される通りに維持およびトランスフェクトした。ＰｏｌｙＬａｃＯ制御エレメント（Ｒｏｂｉｎｅｔｔ，  Ｃ．Ｃ．ら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３５巻、１６８５〜１７００頁（１９９６年））は、ラクトースオペレーター（ＬａｃＯ）の約１００の反復配列からなり、再配列して発現させた軽鎖対立遺伝子においてＰｏｌｙＬａｃＯを保有するようにあらかじめ操作されたＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞の、再配列して発現させた重鎖対立遺伝子を標的とした（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．ら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ、５巻、ｅ２４６頁（２００７年）；Ｙａｂｕｋｉ，  Ｍ．、Ｏｒｄｉｎａｒｉｏ，  Ｅ．Ｃ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．、Ｆｕｊｉｉ，  Ｍ．Ｍ．、およびＭａｉｚｅｌｓ，  Ｎ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８２巻、４０８〜４１５頁（２００９年）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ｗ．Ｊ．、Ｂｅｄｎａｒｓｋｉ，  Ｄ．Ｗ．、およびＭａｉｚｅｌｓ，  Ｎ．、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、３巻、ｅ４０７５頁（２００８年））。遺伝子ターゲティングは、ターゲティング構築物であるｐＰｏｌｙＬａｃＯ−ΨＶＨを用いて記載される通りに（Ｙａｂｕｋｉら、前出）実行した。この構築物を生成させるため、ΨＶＨアレイに由来する４ｋｂの断片をＤＴ４０のゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ部位へとクローニングし、ＰｏｌｙＬａｃＯおよびヒスチジノール耐性マーカーの断片をΨＶＨ断片へと挿入した。構築物は、制限解析、ＰＣＲおよび部分的配列決定により検証し、反復配列の安定性を維持するために、組換え欠損Ｅ．ｃｏｌｉ株であるＳｔｂｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において増殖させた。ＤＴ４０  ＰｏｌｙＬａｃＯ−λＲ細胞のトランスフェクション後、ＰＣＲおよびサザンブロット法により安定なトランスフェクタントを選択およびスクリーニングした。Ｃｒｅリコンビナーゼの一過性発現によりｌｏｘＰに挟まれた選択マーカーを欠失させ、ＬａｃＩ−ＨＰ１を安定的にトランスフェクトした細胞において加速化される多様化について調べた（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００７年、前出）。ＬａｃＩ−ＨＰ１またはＥ４７−ＬａｃＩを安定的に発現させるＤＴＬａｃＯ細胞（Ｙａｂｕｋｉら、前出）を、抗原特異的系統の選択に用いた。
【０２６２】
抗原および抗原結合についての選択：初期選択は、多様化ＤＴＬａｃＯ集団を、抗原と複合体化させたビーズに結合させることにより実施し、その後、蛍光標識した可溶性抗原を用いるＦＡＣＳにより選択した（Ｃｕｍｂｅｒｓら、前出；およびＳｅｏら、前出）。ＦＺＤ１０を認識した細胞を選択するため、抗原は、ＤｙｎａｌプロテインＧ磁気ビーズに結合されるかまたはＰＥＣｙ５標識された抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）で検出される、組換えヒトＦＺＤ１０−Ｆｃ融合タンパク質とした。
【０２６３】
結合アッセイ、アフィニティーアッセイ、および機能性アッセイ：組換え抗体は、ＰＣＲで増幅したＶ領域を、２９３Ｆ細胞におけるヒトＩｇＧ１の発現を支援するベクターへとクローニングすることにより生成させた（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、２００７年、前出）。飽和結合反応速度は、ＦＺＤ１０特異的ＤＴＬａｃＯ細胞を、多様な濃度の蛍光標識した可溶性抗原で染色することにより、またはＦＺＤ１０でトランスフェクトした細胞または内因的にＦＺＤ１０を発現させるがん細胞系を、多様な濃度の組換えキメラ抗ＦＺＤ１０  ｍＡｂで染色することにより決定した。細胞表面におけるＦＺＤ１０結合をアッセイするため、細胞を、全て３ｐＭ〜８００ｎＭの濃度の、キメラｍＡｂクローンであるＢ９Ａ５（親）、Ｂ９ｌ３２．２およびＢ９Ｌ９．３（子孫）または二次抗体単独で染色し、免疫細胞蛍光測定法（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）により解析した。
【０２６４】
図１に示される抗体発見概略図では、親クローンのアフィニティーよりも大きなアフィニティーを有する多様化されたＤＴＬａｃＯクローンが同定された。所定のどのクローンでも上昇した表面ＩｇＭは、より高いアフィニティー結合を暗示することにより誤らせ得ることを念頭に置いて、親クローンよりも大きなアフィニティーを有するクローンを同定する戦略は、標識標的と抗ＩｇＭの二重染色を行い、出発親ＤＴＬａｃＯと比べて高い標的染色を有するクローンを選択することであり、より高い表面ＩｇＭ染色を有するクローンは避けられた。この選択戦略は図２に示されている。
【０２６５】
ＤＴＬａｃＯスクリーニングおよび選択戦略により、親クローンであるＢ９Ａ５、ならびに２つの高アフィニティー結合後代クローン、Ｂ９Ｌ３２．２およびＢ９Ｌ９．３が同定された。両方の後代クローンにより、ＦＺＤ１０＋滑膜肉腫細胞系であるＳＹＯ−１へのより高いアフィニティー結合が明らかにされた。ＳＹＯ−１細胞に結合するＢ９Ｌ３２．２およびＢ９Ｌ９．３のＫＤは、それぞれ４０ｎＭおよび０．２２ｎｍであった（図３を参照されたい）。
【０２６６】
Ｂ９Ａ５、Ｂ９Ｌ３２．２およびＢ９Ｌ９．３クローンは配列決定され、クローニングされて、さらなる機能的特徴付けのために使用されるキメラ抗体を生成させた。Ｂ９Ａ５の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号２に与えられている。Ｂ９Ｌ９．３の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号３に与えられている。Ｂ９Ｌ３２．２の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および配列番号４に与えられている。
【０２６７】
図４におけるＢ９親クローンおよび後代クローンの重鎖配列および軽鎖配列のアライメントにより、３つの抗体全てが同じ重鎖配列を有しているが、異なる軽鎖ＣＤＲ１領域配列を有していることが示された。
【０２６８】
（実施例２）
抗ＦＺＤ１０ｍＡｂ−毒素コンジュゲートはＦＺＤ１０を発現している細胞には致死性である
【０２６９】
リボソーム不活性化タンパク質であるサポリン（分子量３０ｋＤａ）は、内部移行される抗体により送達されると、腫瘍細胞には毒性である（例えば、Flavell、D.J.ら  British  J  Cancer  ８３巻、１７５５〜１７６１頁（２０００年）；  Yip、W.L.ら  Mol  Pharmaceutics  ４巻、２４１〜２５１頁（２００７年）；  Daniels、T.R.ら  Mol  Cancer  Ther  ６巻、２９９５〜３００８頁（２００７年）；  Kuroda、Kら  Prostate  ７０巻、１２８６〜１２９４頁（２０１０年）を参照されたい）。ストレプトアビジンとサポリンの化学的コンジュゲート（ストレプトアビジン−ＺＡＰ）は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入された。Ｂ９Ｌ９．３−サポリンコンジュゲートは以下の手順により生成された：Ｂ９Ｌ９．３は、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用い、製造業者の指示に従ってビオチン化された。ストレプトアビジン−ＺＡＰは、室温で３０分間、前記成分を１対１のモル比でインキュベートすることによりビオチン化Ｂ９Ｌ９．３に連結された。陰性のアイソタイプ対照として、ヒトＶＥＧＦＲ２に特異的なキメラ抗体は同様にストレプトアビジン−ＺＡＰとコンジュゲートされ、下に記載されるアッセイに適用された。
【０２７０】
Ｂ９Ｌ９．３−サポリンの、標的にされる毒性を試験するために、前記コンジュゲートは２９３−ＦＺＤ１０発現細胞に様々な濃度で添加され、細胞生存率が決定された。略述すると、細胞は９６ウェル組織培養プレートのそれぞれのウェルに播種された。一晩のインキュベーション後、細胞は培養培地で２度洗浄された。それに続いて、培養培地における様々な濃度のＢ９Ｌ９．３−サポリンまたはアイソタイプ対照は３通りのウェルに添加され、プレートは３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートされた。細胞生存の定量的評価では、ＭｕｌｔｉＴｏｘ  Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて相対的生存率がアッセイされた。図５に示される通りに、Ｂ９Ｌ９．３−サポリン結合体化抗体はＦＺＤ１０を発現している細胞を、０．８ｎＭのＩＣ５０で効果的に死滅させた。
【０２７１】
（実施例３）
抗ＦＺＤ１０ｍＡｂは腫瘍細胞をＡＤＣＣにより死滅させる
【０２７２】
さらなる実験により、Ｂ９Ｌ９．３  ＦＺＤ１０特異的抗体がＡＤＣＣを介してがん細胞を死滅させることが示された。２つの滑膜肉腫細胞系が試験された。ＳＹＯ−１細胞はＡｋｉｒａ  Ｋａｗａｉ博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）より寄贈された。Ｂ９Ｌ９．３を有する細胞を染色しフロー細胞蛍光光度法により検出することによって決定される場合、ＡＴＣＣから購入されたＳＷ９８２細胞集団の小サブセット（ＨＴＢ−９３）はＦＺＤ１０を発現した。ＦＺＤ１０＋集団はＦＡＣＳにより単離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、それに続く実験で用いられた。ＡＤＣＣをアッセイするため、図６に記されるＳＹＯ−１細胞およびＦＺＤ１０＋  ＳＷ９８２細胞は、指示された濃度のｍＡｂ  Ｂ９Ｌ９．３抗体またはアイソタイプ対照抗体と一緒にインキュベートされ、続いて全末梢血単核球と一緒にインキュベートされ（エフェクター対標的比  １５対１）、がん細胞からのＢＡＴＤＡ（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’２”−ターピリジン（ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ）−６，６”−ジカルボキシレート）放出（Ｄｅｌｆｉａ  ＥｕＴＤＡ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により特異的溶解百分率が決定された。前記抗体のＦｃ領域における２つのアミノ酸置換（Lazarら、２００６年．  PNAS  １０３巻：４００５頁を参照されたい）または５つのアミノ酸置換（Stavenhagenら、２００７年、Cancer  Res.  ６７巻：８８８２頁を参照されたい）のいずれかを有する前記抗体の２つの改変体がＡＤＣＣを増強することが見出された。
【０２７３】
（実施例４）
抗ＦＺＤ１０ｍＡｂ  Ｂ９Ｌ９．３はカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害する
【０２７４】
カノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達に対するＢ９Ｌ９．３  抗ＦＺＤ１０ｍＡｂの効果を決定する実験が行われた（例えば、Ｗｎｔ経路シグナル伝達の概説については、Katoh、２００７年  Stem  Cell  Rev.  ３巻：３０頁を参照されたい）。ＴＯＰ／ＦＯＰｆｌａｓｈルシフェラーゼシステムを用いる実験戦略は図７Ａに概要が述べられている。ＦＺＤ１０を安定的に発現している２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＦＺＤ１０リガンド、ＷＮＴ７ｂ、コレセプターＬＲＰ５、およびＴＯＰｆｌａｓｈまたはＦＯＰｆｌａｓｈ  ＴＣＦレポータープラスミド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のどちらかで一過性にトランスフェクトされた。次に、組換えｍＡｂが最終濃度２０μｇ／ｍＬまで添加された。３７℃で２４時間後、ルシフェラーゼ活性が、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３通りにアッセイされた。図７Ｂに示される通りに、ｍＡｂ  Ｂ９Ｌ９．３はカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を効果的に遮断した。
【０２７５】
（実施例５）
抗ＦＺＤ１０ｍＡｂ  Ｂ９Ｌ９．３のヒト化
Ｂ９Ｌ９．３キメラ抗体を、最初はマウス抗体のヒト化について記載され（Ｑｕｅｅｎ  Ｃら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（１９８９年）１２月、８６巻（２４号）：１００２９〜３３頁）、近年ではＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ（２００４年）ならびにＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ（２００８年）（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  Ｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００４年１２月、２９５巻（１〜２号）：９〜１９頁；Ａｌｍａｇｒｏ  ＪＣおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｊ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００８年）、１３巻：１６１９〜３３頁）により総説されているＣＤＲ移植手法を用いてヒト化した。
【０２７６】
コンセンサスのヒトフレームワーク配列を、Ｂ９Ｌ９．３のＶＨおよびＶＬの両方について選んだが、これらは、いずれの場合においても、対応するＢ９Ｌ９．３の可変領域配列に対する同一性レベルが最高の亜群コンセンサス配列であった。Ｂ９Ｌ９．３のＶＨをヒト化するため、ヒト亜群ＩＩＩ  ＶＨ配列のコンセンサス配列（Ｋａｂａｔ  ＥＡら（１９９１年））、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２）を、アクセプターフレームワーク配列として選んだ。Ｂ９Ｌ９．３のＶＬをヒト化するため、ヒト亜群ＩＩＩラムダ可変配列のコンセンサス配列（Ｋａｂａｔら、前出）を、アクセプターフレームワークとして選んだ。しかし、ＣＤＲのアクセプターフレームワークへの単純な移植は通常、リガンドに対するアフィニティーの低減を結果としてもたらし、フレームワーク配列内の１つまたは複数の残基を、元の抗体内のその位置において見出されるアミノ酸で置き換えることの所望性が示唆される。特に、抗原に接触するか、または近傍のＣＤＲ（「ベニヤ帯域」の残基）のコンフォメーションを変化させる可能性があるフレームワーク配列内の残基は、元の残基に戻してリガンドに対する完全なアフィニティーを保持することがしばしば有益でありうる（Ｆｏｏｔｅ，  ＪおよびＷｉｎｔｅｒ，  Ｇ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９２年）、２２４巻：４８７〜９９頁）。したがって、Ｂ９Ｌ９．３のベニヤ帯域の残基を含む全ての残基を、元のＢ９Ｌ９．３抗体中に見出される残基と同一にした。したがって、ヒト化ＶＨの４９、６７および９４位の各々におけるヒト残基を、Ｂ９Ｌ９．３中に見出される残基へと変更しながらまた、ヒト化ＶＬの４６、４７、６６、６９、および７１位でも、ヒトからニワトリへの同様の置換えを行った（Ｋａｂａｔによる番号付けシステム；Ｋａｂａｔら、前出）。
【０２７７】
ニワトリのラムダ軽鎖は、ヒトラムダ軽鎖の１位および２位において見出される２つのアミノ末端残基（Ｋａｂａｔによる番号付け）を逸失している。さらに、哺乳動物抗体における軽鎖のＮ末端は、Ｌ−ＣＤＲ１に近接する。したがって、ヒト化ＶＬのＮ末端におけるさらなる２つの残基が、立体障害を介して抗原の結合に干渉しうることが可能であると考えられた。したがって、これら２つのアミノ酸はヒト化軽鎖において欠失していた。表２に示される通り、その結果得られたヒト化抗体は元のキメラ抗体Ｂ９Ｌ９．３のアフィニティーに非常に近いアフィニティーを有していた（図９も参照されたい）。
【０２７８】
【表２】
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【０２７９】
カノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達を阻害するヒト化Ｂ９Ｌ９．３  ｍＡｂの能力は、キメラＢ９Ｌ９．３  ｍＡｂの能力と比較された。実験方法は、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ＳｙｓｔｅｍではなくＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定したこと以外は、実施例４に記載される通りであった。図１０に示される通り、ヒト化ｍＡｂは、カノニカルＷｎｔ経路を遮断する点ではそのキメラ前駆体と同程度の効果であった。
【０２８０】
Ｂ９Ｌ９．３のヒト化重鎖のポリヌクレオチド配列（リーダー配列を含む）は、配列番号３２に与えられており、配列番号３１に与えられる成熟アミノ酸配列をコードする。Ｂ９Ｌ９．３のヒト化軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３０に与えられており（リーダー配列を含む）、配列番号２９に与えられる成熟アミノ酸配列をコードする。ヒト化Ｂ９Ｌ９．３軽鎖のフレームワーク配列は９４％ヒトである。ヒト化Ｂ９Ｌ９．３重鎖のフレームワーク配列は９６％ヒトである（図８を参照されたい）。
【０２８１】
要約すれば、実施例１〜５に記載される実験からの結果により、抗ＦＺＤ１０  ｍＡｂがＤＴＬａｃＯ細胞において抗体アフィニティーおよび機能的成熟の劇的有効性を例証していることが実証された。前記工程により、細胞結合なしから２か月で０．２２ｎＭまでのアフィニティー成熟、治療抗体を生成するための他の公知の方法に勝る著しい改善；滑膜肉腫細胞系であるＳＹＯ−１およびＳＷ−９８２に結合するＢ９Ｌ９．３  ｍＡｂが可能になった。Ｂ９Ｌ９．３  ｍＡｂはＡＤＣＣによりおよび抗体−毒素コンジュゲートとして標的細胞を死滅させ、ｍＡｂ  Ｂ９Ｌ９．３はカノニカルＷｎｔ経路シグナル伝達も遮断した。さらなる実験により、Ｂ９Ｌ３２．２  ｍＡｂが滑膜肉腫細胞系であるＳＹＯ−１およびＳＷ−９８２にも結合することが示された。したがって、これらの抗体はＦＺＤ１０の異常発現と関連する疾患の処置のための治療的有用性を示した。
【０２８２】
（実施例６）
がんの抗ＦＺＤ１０媒介阻害
【０２８３】
本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体は、ＦＺＤ１０過剰発現細胞の生存、複製、分化、および脱分化（上皮細胞−間葉細胞移行）のうちの１つまたは複数を阻害する、かつ単離されたＦＺＤ１０過剰発現細胞による腫瘍増殖を阻害するその能力について、確立された方法に従って試験される。例えば、Parkら、２００９年  Molec.  Therap.  １７巻：２１９頁；  Curtinら、２０１０年Oncotarget  １巻：５６３頁；  De  Almeidaら、２００７年Canc.  Res.  ６７巻：５３７１頁；  Ettenbergら、２０１０年Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA  １０７巻：１５４７３頁；  Fukukawaら、２００９年Oncogene  ２８巻：１１１０頁；  Fukukawaら、２００８年Canc.  Sci.  ９９巻：４３２頁；  Heら、２００４年Neoplasia  ６巻：７頁；  Huら、２００９年Canc.  Res.  ６９巻：６９５１頁；  Nagayamaら、２００９年Canc.  Sci.  １００巻：４０５頁；  Hagayamaら、２００５年Oncogene  ２４巻：６２０１頁；  Nagayamaら、２００２年Canc.  Res.  ６２巻：５８５９頁；  Podeら、２０１１年Oncogene  ３０巻：１６６４頁；  Youら、２００４年Canc.  Res.  ６４巻：５６３８５頁を参照されたい。
【０２８４】
異種移植片モデルにおけるＦＺＤ１０＋細胞腫瘍増殖および細胞複製の阻害：典型的には、および用いられている特定のＦＺＤ１０過剰発現細胞に応じて、約１０２から１０７のＦＺＤ１０＋細胞の異種移植片が免疫無防備状態の養子宿主に導入され、抗ＦＺＤ１０抗体療法の効果が決定される。
【０２８５】
一例では、５×１０６のＳＹＯ−１ヒト滑膜肉腫ＦＺＤ１０＋細胞（Fukukawa  ２００８年；  Hanaokaら、２００９年  Ann.  Nucl.  Med.  ２３巻：４７９頁；  Kawaiら、２００４年Canc.  Lett.  ２０４巻：１０５頁）またはヒトＦＺＤ１０＋奇形腫細胞（ＰＡ−１、ＮＴｅｒａ−２、Ｔｅｒａ−２、De  Almeidaら、２００７年Canc.  Res.  ６７巻：５３７１頁；  Snowら、２００９年  BMC  Canc.  ９巻：３８３頁）またはＦＺＤ１０＋非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ、Guggerら、２００８年Dis.  Markers  ２４巻：４１頁）またはＦＺＤ１０＋結腸直腸がん細胞（ＳＷ４８０、Nagayamaら、２００９年Cancer  Sci.  １００巻：４０５頁）またはＦＺＤ１０＋胃がん細胞（ＴＭＫ１、ＭＫＮ７４、Kirikoshiら,  ２００１年Int.  J.  Oncol.  １９巻：７６７頁）は、皮下注射により免疫不全マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）に移植され、腫瘍直径は測量用キャリパーにより毎日測定され、測定値を用いて腫瘍容積を計算する（Nagayamaら、２００５年  Oncogene  ２４巻：６２０１頁）。
【０２８６】
確立した腫瘍（０．０１６〜１．３ｃｍ３の容積）を有する動物は、抗ＦＺＤ１０抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）、９０Ｙ−結合体化抗ＦＺＤ１０抗体、または無関係な結合特異性を有するアイソタイプがマッチした対照抗体（抗ＣＤ２０）の単回静脈内注射を受ける処置群に無作為に割り当てられる。動物の他の実験群は、非標識抗ＦＺＤ１０抗体および非標識抗ＬＲＰ６抗体を受ける（Ettenbergら、２０１０年  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA  １０７巻：１５４７３頁）。腫瘍容積に対する効果は、６０日間の腫瘍直径の毎日測定により決定される。
【０２８７】
ＦＺＤ１０＋細胞生存の阻害。ＦＺＤ１０＋細胞においてアポトーシスを誘導する本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体の能力は、基本的にはHeら（２００４年  Neoplasia  ６巻：７頁）、Pode-Shakkedら（２０１１年  Oncogene  ３０巻：１６６４頁）およびYouら（２００４年  Canc.  Res.  ６４巻：５３８５頁）により記載される手順を用いて試験される。試験細胞には、ＳＹＯ−１ヒト滑膜肉腫ＦＺＤ１０＋細胞（Fukukawa  ２００８年；  Hanaokaら、２００９年  Ann.  Nucl.  Med.  ２３巻：４７９頁；  Kawaiら、２００４年Canc.  Lett.  ２０４巻：１０５頁）、ヒトＦＺＤ１０＋奇形腫細胞（ＰＡ−１、ＮＴｅｒａ−２、Ｔｅｒａ−２、De  Almeidaら、２００７年Canc.  Res.  ６７巻：５３７１頁；  Snowら、２００９年  BMC  Canc.  ９巻：３８３頁）、ＦＺＤ１０＋非小細胞肺癌細胞（ＮＳＣＬＣ、Guggerら、２００８年Dis.  Markers  ２４巻：４１頁）、ＦＺＤ１０＋結腸直腸がん細胞（ＳＷ４８０、Nagayamaら、２００９年Cancer  Sci.  １００巻：４０５頁）およびＦＺＤ１０＋胃がん細胞（ＴＭＫ１、ＭＫＮ７４、Kirikoshiら、２００１年Int.  J.  Oncol.  １９巻：７６７頁）が挙げられる。試験条件には、ＦＺＤ１０＋細胞を抗ＦＺＤ１０抗体単独にまたは他のＷｎｔリガンド−受容体相互作用の阻害剤と組み合わせて接触させることが挙げられ（例えば、抗ＬＲＰ６；Ettenbergら、２０１０年）；対照条件には、前記細胞を無関係な特異性のアイソタイプがマッチした対照抗体または抗体なしで接触させることが挙げられる。
【０２８８】
脱分化／上皮−間葉移行：転写活性化因子であるベータカテニンは、上皮−間葉移行の脱分化プロセスを受けている腫瘍細胞の核内に蓄積する（ＥＭＴ；  Hlubekら、２００７年  Front.  Biosci.  １２巻：４５８頁）。ＦＺＤ１０＋細胞は本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体の非存在下または存在下でＷｎｔリガンドであるＷＮＴ７ａおよび／またはＷＮＴ７ｂに曝露され、細胞核へのベータカテニンの移動は多数の公知の方法のいずれによっても特徴付けられる（例えば、Uematsuら、２００３年  Canc.  Res.  ６３巻：４５４７頁による転写因子Ｔｃｆの活性化；またはｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤもしくはサバイビン転写の活性化、例えば、Curtinら、２０１０年  Oncotarget  １巻：５６３頁を参照されたい）。
【０２８９】
（実施例７）
前駆体細胞成長および分化に対する抗ＦＺＤ１０抗体媒介効果
【０２９０】
この実施例は、当技術分野で認められたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを含めた、胚性幹細胞および他の組織前駆体細胞において細胞成長および／または分化イベントを変化させる（例えば、統計学的に有意な方法で増大させるまたは減少させる）ための本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体の使用を記載する。組織再生および修復のためおよび組織または臓器移植のための方法を含めて、これらのおよび関連する方法は、ヒト組織成長および分化を制御することが望ましい状況において用途を見出す。
【０２９１】
手短な背景として、ＦＺＤ１０は、ヒトを含む種々の脊椎動物の胚生期に複数の発生中の組織において発現されるが、ＦＺＤ１０の発現は、出生後の生物における正常組織では高度に限定される。例えば、胎仔マウスでは、Ｆｚｄ１０は肢芽、ミュラー管、および神経管において発現される（Nunnallyら、２００４年  Dev.  Genes  Evol.  ２１４巻：１４４頁；  Kempら、２００７年  Dev.  Dynam.  ２３６巻：２０１１頁）。胎生期７日目、Ｆｚｄ１０は、原腸胚の原始線条において発現されるが、移動中の中胚葉では発現されておらず、中胚葉誘導における役割を示唆している（Kempら、２００７年）。マウスが成熟するにしたがって、発現は、出生後日数２０日から成体期まで、Ｆｚｄ１０は内包においてのみ見出されるまでは、極めて特定の神経構造に制限される（Yanら、２００９年  Gene  Expression  Patterns  ９巻：１７３頁）。子宮では、Ｆｚｄ１０は子宮内膜発生に関与しているようである（Hayashiら、２０１１年  Biol.  Reprod.  ８４巻：３０８頁）。
【０２９２】
ＦＺＤ１０の発生上の役割は非哺乳類脊椎動物においても観察され、この受容体の進化的保存に重要性を添えている。Ｆｚｄ１０は、胚性ニワトリ肢芽間葉において発現される（Kawakamiら、２０００年  Develop.  Growth  Differ.  ４２巻：５６１頁）。加えて、Ｆｚｄ１０は、発生中のトリの様々な頭蓋顔面構造において他のいくつかのＦｚｄとともに発現される（Geetha-Loganathanら、２００９年  Dev.  Dynam.  ２３８巻：１１５０頁）。クセノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）発生では、Ｆｚｄ１０は、一次感覚ニューロンが発生する背側神経外胚葉の領域において発生中のカエルで発現されている。Ｆｚｄ１０が過剰発現すると、その結果この野での感覚ニューロンの数が増加し、Ｆｚｄ１０ノックダウンは感覚ニューロンの発生を阻害し（Garcia-Moralesら、２００９年  Dev.  Biol.  ３３５巻：１４３頁）、神経発生におけるＦｚｄ１０の重要性が実証された。ゼブラフィッシュでは、Naseviciusら（２０００年  Mechs.  Develop.  ９２巻：３１１頁）は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｆｚｄ１０が後方尾、神経管背側（ｄｏｒｓａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ）、および脳において初期発生中に発現され、後期胚発生において発現は脳に限局されることを実証した。
【０２９３】
本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体による細胞成長および／または分化の変化（例えば、統計学的に有意な増大または減少）を評価するため、ヒト胚性幹細胞の分化は、記載される分化誘導方法を用いて、内皮細胞分化系列（例えば、Liら、２００９年  PLoS  One  ４巻（１２号）：ｅ８４４３頁）、平滑筋細胞分化系列（例えば、Xieら、２０１１年  Arterioscelr.  Thromb.  Vasc.  Biol.  ３１巻（７号）：１４８５頁；  Ramkisoensingら、２０１１年  PLoS  One  ６巻（９号）：ｅ２４１６４頁）、または心筋細胞分化系列（例えば、Caoら、２００８年  PLoS  One  ３巻（１０号）：ｅ３４７４頁）に沿って、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体の存在下または非存在下、選択的に達成される。内皮分化系列細胞分化の状況では、誘導されたＦＺＤ１０＋ヒト胚性幹細胞またはその後代による内皮細胞管形成の誘導の本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体による変化は、Huら（２００９年  Canc.  Res.  ６９巻：６９５１頁）に記載される方法に従って達成される。別々の研究で、ＦＺＤ１０＋ヒト胚性幹細胞またはその後代は、Huら（２００９年  Chin.  Med.  J.  (Engl)  １２２巻：５４８頁；  ２００９年  Clin.  Exp.  Pharmacol.  Physiol.  （２００９年１２月  電子出版）ＰＭＩＤ  ２００３９９１０）によりモデル化された方法に従って、導入され誘導されて心筋細胞へと発生し梗塞で損傷した心筋のｉｎ  ｖｉｖｏ修復をもたらす。
【０２９４】
予備研究では、誘導性分化を起こしている細胞によるＦＺＤ１０の発現は本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体を用いてモニターされ、免疫蛍光顕微鏡法およびフロー免疫細胞蛍光光度法（ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ）を含む免疫蛍光法により細胞表面発現をモニターする。発生時間にわたるＦＺＤ１０発現は、必要に応じて、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンイムノブロッティング、および／または本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体（例えば、本明細書に記載されるＢ９Ｌ９．３抗体）を用いた細胞の特異的抗体染色によってもモニターされる。
【０２９５】
次に、細胞成長および分化研究は、記載されている手順（Liら、２００９年；  Xieら、２０１１年；  Ramkisoensingら、２０１１年；  Caoら、２００８年）を修正して、ＦＺＤ１０発現の期間に先立っておよび／またはその間に細胞を飽和濃度未満のまたは飽和濃度の抗ＦＺＤ１０抗体（例えば、本明細書に記載されるＢ９Ｌ９．３抗体）に接触させるステップを包含することにより行われる。細胞成長および分化パラメータ（例えば、成長速度、分化率、および生存率）に対する抗ＦＺＤ１０抗体の効果はｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察され、無関係な結合特異性のアイソタイプがマッチした抗体で処置される対照群において行われる観察結果と比較される。
【０２９６】
例えば、ヒトＨ９胚性幹細胞（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）は、ｍＴｅＳＲＩ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）においてＭａｔｒｉｇｅｌ被覆表面上でLiら（２００９年）により記載される通りに成長し、分化は、細胞を塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した培地において超低付着培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に移して懸濁胚様体を形成させることにより誘導される。分化誘導後１２日目、細胞は１．５ｍｇ／ｍＬのＩ型ラット尾コラーゲンを含有する培地に懸濁され、３７℃で３０分間インキュベートされて、コラーゲンゲル重合を可能にし、三次元細胞外マトリックス培養物を得る。培養物に、ｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地を補充し、ここで胚様体出芽が起こり、ひき続いて３日間にわたり抗ＦＺＤ１０抗体の非存在下または存在下で培養を維持する。様々な時点で、マトリックス培養物の試料は、記載（Liら、２００９年）の通りにフロー免疫細胞蛍光光度法、ＤｉＩ−ａｃ−ＬＤＬ取り込み、およびＲＮＡ分析による前記細胞の（内皮）細胞表面マーカー発現表現型の特徴付けのために採取される。マトリックス培養細胞試料は、また記載（Liら、２００９年）の通りに免疫無防備状態（ＳＣＩＤ）試験マウスの皮膚にｉｎ  ｖｉｖｏでまたは直接心筋内注射により埋め込まれ、続いて記載（Liら、２００９年）の通りにｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよびコンダクタンス測定、および外植片の組織学的精密検査が行われる。胚性幹細胞培養物の成長速度、分化率、および生存率に対するならびに移植細胞に対する効果を含めて、抗ＦＺＤ１０抗体の効果が記述される。
【０２９７】
同様に、本明細書に記載される抗ＦＺＤ１０抗体（例えば、本明細書に記載されるＢ９Ｌ９．３抗体）にまたは無関係な結合特異性の対照のアイソタイプがマッチした抗体にｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで曝露される胚性幹細胞は、平滑筋細胞分化系列（例えば、Xieら、２０１１年  Arterioscelr.  Thromb.  Vasc.  Biol.  ３１巻（７号）：１４８５頁；  Ramkisoensingら、２０１１年  PLoS  One  ６巻（９号）：ｅ２４１６４頁）または心筋細胞分化系列（例えば、Caoら、２００８年  PLoS  One  ３巻（１０号）：ｅ３４７４頁）に沿って分化するよう誘導され、平滑筋細胞または心筋細胞の成長および分化マーカーなどの細胞成長速度、分化率、および生存率に対する前記抗体の効果はその中に記載されている確立した方法に従って決定される（例えば、Xieら、２０１１年  Arterioscelr.  Thromb.  Vasc.  Biol.  ３１巻（７号）：１４８５頁；  Ramkisoensingら、２０１１年  PLoS  One  ６巻（９号）：ｅ２４１６４頁；Caoら、２００８年  PLoS  One  ３巻（１０号）：ｅ３４７４頁）。例えば、Caoら（２００８年）により記載される電気生理学的特性、細胞質ゾルカルシウム陽イオン濃度、および移植特徴の測定値は、抗ＦＺＤ１０抗体（例えば、Ｂ９Ｌ９．３）に接触させる細胞および無関係な特異性のアイソタイプがマッチした対照抗体に接触させる細胞について比較される。
【０２９８】
上記の多様な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及されており、かつ／または出願データシートで列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。必要な場合は、多様な特許、出願、および、刊行物の概念を用いて、なおさらなる実施形態をもたらすために、実施形態の態様を改変することができる。
【０２９９】
上記の詳細な説明に照らして、実施形態にこれらの変更および他の変更を施すことができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、用いられる用語が、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲で開示される特定の実施形態へと限定するものとみなすべきではなく、このような特許請求の範囲が権利を付与される全範囲の同等物を伴う全ての可能な実施形態を包含するとみなすべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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