(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液上清、あるいは、菌体破砕物を分析することによりアザ糖が検出されるアザ糖を生産する微生物であって、
前記アザ糖が１−デオキシノジリマイシンであり、
前記微生物が、バチルス・アミロリクエファシエンスAS385（Bacillus amyloliquefaciens AS385）株（ＦＥＲＭ AＰ−２２０４９）である
アザ糖を生産する微生物。
【請求項２】
培養液上清、あるいは、菌体破砕物を分析することによりアザ糖が検出されるアザ糖を生産する微生物であって、
前記アザ糖が１−デオキシノジリマイシンであり、
前記微生物が、バチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）（ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０）株である
アザ糖を生産する微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大豆発酵食品として食経験のある食品から得られたBacillus属の微生物とその生産物の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
アザ糖（Azasugar）は、単糖の環内酸素原子をイミノ基で置換したイミノシクリトールの総称である。代表的なアザ糖としては、ノジリマイシン、マンノジリマイシン、ガラクトスタチンやそれらのデオキシ体が知られている。これらは、いずれもグルコシダーゼ、マンノシダーゼおよびガラクトシダーゼの阻害剤である。
【０００３】
特に、グルコシダーゼの阻害剤は２型糖尿病において食後高血糖改善薬として注目を集めている。これらは小腸粘膜刷子縁のα−グルコシダーゼに結合し小腸での糖質の分解、吸収を阻害、遅延することにより食後高血糖を抑えることができる。またいくつかの治療薬が認可され食後高血糖の改善薬としての位置づけが既に確立されている。
【０００４】
アザ糖は、桑（Ｍｏｒｕｓ  ａｌｂａ）、ツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）中に存在すること、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｕｂｒｕｔｉｌｕｓ、Ｓ．ｌａｖｅｎｄｕａｅ）、バチルス属の微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）による生産が推定されている。
【０００５】
また、豆チ（トウチ）、大徳寺納豆、浜納豆、清国醤などの食品がアザ糖を有効成分（関与成分）として血糖値を下げると言われている。
【０００６】
現在精力的に進められているのが桑を利用したものである。桑には強力なα−グルコシダーゼの阻害剤である１−デオキシノジリマイシンが含まれている。製品としては、桑葉を乾燥させ打錠にしたもの、桑葉を茶にしたものがある。特に根皮は古くから漢方薬として利用されている。また技術としては抽出物を利用するものなどがある。
【０００７】
１−デオキシノジリマイシンは試験管内の実験では非常に強力なα−グルコシダーゼの阻害を示すもののヒト試験において生体内では試験管内ほどの作用を示さないことも報告されている。また食後血糖値の降下という点においては高濃度で有意な差が示されているものの、長期投与においては効果的な結果がまだ得られていない。
【０００８】
一方、動物試験（ラット）においては効果的な結果が得られていることから、ヒトに投与することによって効果が期待できうる量の１−デオキシノジリマイシンをはじめとするアザ糖の効率的な生産方法が望まれる。
【０００９】
前述の桑葉を基にした生産物は天候、気温などの外的要因に影響に左右されることもあり、生育の時間が必要な他、葉を処理するにあたりいくつかの加工工程が必要になる。
【００１０】
微生物での発酵生産では人為的に生産をコントロールすることが可能であり、特に乾燥、濃縮においてはスプレードライなどの簡便な方法も利用できる。
【００１１】
放線菌、Bacillus属の細菌によるアザ糖の生産について、例は少ないもののいくつか報告されている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００８−２２２７０１号公報
【特許文献２】特開２００４−２９４３８４号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hardick D .J. et al:Tetrahedron  Ｖｏｌ４８，NO.３０、ｐｐ６２８５−６２９６（１９９２）
【非特許文献２】Hardick D .J. et al:Tetrahedron  Ｖｏｌ４９，NO.３０、ｐｐ６７０７−６７１６（１９９３）
【非特許文献３】Stein D.C. et al: Appl. Environ. Microbiol. Vol. 48, No. 2, pp. 280-284（1984）
【非特許文献４】Kojima M.:Journal of Fermentation and Bioengeneering Vol 79,No.4 pp391-394(1995)
【非特許文献５】Kimura T. et al :J. Agric. Food Chem., 52, 1415-1418 (2004)
【非特許文献６】Kimura T. et al: J. Agric. Food Chem., 55, 8928-8933 (2007)
【非特許文献７】Nakagawa K. et al：Anal. Biochem., 404, 217-222 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前述した特許文献１、非特許文献１〜４の報告の中には１−デオキシノジリマイシンをはじめとするアザ糖の存在が示されていない、または定量的に示されていないので、推定にすぎない。
【００１５】
本発明はアザ糖を含む食品、食品添加物、動物又は魚類用飼料および医薬品、化粧料等を提供することを最終目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
請求項１記載の発明は、
培養液上清、あるいは、菌体破砕物を分析することによりアザ糖が検出されるアザ糖を生産する微生物であって、
前記アザ糖が１−デオキシノジリマイシンであり、
前記微生物が、バチルス・アミロリクエファシエンスAS385（Bacillus amyloliquefaciens AS385）株（ＦＥＲＭ AＰ−２２０４９）である
アザ糖を生産する微生物
である。
【００１７】
請求項２記載の発明は、
培養液上清、あるいは、菌体破砕物を分析することによりアザ糖が検出されるアザ糖を生産する微生物であって、
前記アザ糖が１−デオキシノジリマイシンであり、
前記微生物が、バチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）（ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０）株である
アザ糖を生産する微生物
である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、食品、または経口摂取可能な食品、食品添加物などとして利用可能な、１−デオキシノジリマイシンをはじめとするアザ糖を生産出来る微生物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１の分離パターン（クロマトグラム）である。横軸は分析時間、縦軸は検出量を示す。
【図２】実施例２の分離パターン（クロマトグラム）である。横軸は分析時間、縦軸は検出量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１−デオキシノジリマイシンをはじめとするアザ糖を含む食品、食品添加物、動物又は魚類用飼料および医薬品、化粧料等を提供するという本発明の目的上、高い安全性が要である。本発明におけるアザ糖生産能を持つ微生物は、豆チ、大徳寺納豆、浜納豆、清国醤をはじめとする大豆発酵食品または、大豆由来原料を由来とする。これら食品は長い食経験を有することから、安全性については危惧するに及ばない。
【００２４】
本発明においては、これらの食品中から単離された微生物を用いアザ糖の発酵生産、含有食品、添加物、動物又は魚類用飼料および医薬品、化粧品の生産を行う。
【００２５】
本発明は、大豆発酵食品より分離されたバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens AS385）株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０４９）および、バチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）株（寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０）を利用し、大豆発酵食品または、大豆由来原料を主成分とする培地を利用した発酵生産物、食品、動物又は魚類用飼料および医薬品、化粧料等を生産するものである。
【００２６】
本発明の微生物の単離源としては、豆チ、大徳寺納豆、浜納豆、清国醤をはじめとする大豆発酵食品などを使用できる。これらに限定するものではないが、長期にわたり食経験がある物が良い。
【００２７】
これら発酵食品を滅菌水に懸濁し、懸濁液の一部を、LB培地、標準寒天培地などに塗沫し、培地を３７℃で培養、現れた集落から釣菌し候補株とする。
【００２８】
得られた候補株を液体培地にて培養し、その培養上清についてα−グルコシダーゼの阻害活性について評価を行う。培養液としては、アザ糖が生産されうる培地であれば何であっても良く、具体的には、大豆煮汁（Ｂｒｉｘ  ２％  ｐＨ７．３）を用いた培地やLB培地、２％大豆ペプトンなどが挙げられる。
【００２９】
培養は３７℃で３日間行い、１３０００rpmで５分間遠心分離を行ったあと、培養上清の一部を採取し、それを検体としてα−グルコシダーゼの阻害活性の測定を行う。
【００３０】
α−グルコシダーゼ阻害活性評価を行う際は酵素としてパン酵母、ラット小腸、ウサギ小腸などの由来の物を使用し、基質としてはｐ−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシド、スクロース、マルトースなどを用いる。反応停止にはトリス塩酸系緩衝液、炭酸塩緩衝液などを用いる。
【００３１】
本発明におけるα−グルコシダーゼとは糖のα−グリコシド結合を加水分解する反応を触媒する酵素のことである。よってα−グルコシダーゼ阻害活性とは、スクロース、マルトースを分解したときに生成する遊離のグルコース、フルクトースの量、合成基質ｐ−ニトロフェニル−α−D−グルコピラノシドにおいては遊離してくるｐ−ニトロフェノールの量を指標とし、検体溶液の添加反応時の生成量、または吸光度の増加を、検体溶液無添加反応時の生成量または吸光度の増加で割った値を阻害率とする。なお阻害率が５０％を示したときの酵素反応時における検体濃度をＩＣ５０値として定義し、これをα-グルコシダーゼ阻害活性の尺度とする。
【００３２】
α−グルコシダーゼ阻害活性の評価の良かった菌株について、再度培養し遠心分離後、培養上清を凍結乾燥した。
【００３３】
上述して得た検体を、特許文献２および非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７などに記載されている方法（例えば、試料を親水性相互液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）で分離し、１−デオキシノジリマイシンを光散乱検出器で検出する方法）によりアザ糖の検出と定量を行った。
【００３４】
このようにして、本発明者らは後述する実施例に準じてバチルス・アミロリクエファシエンスAS385株（Bacillus amyloliquefaciens AS385株）およびバチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）株を単離し、２０１０年１２月１６日に独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した。当該菌株はそれぞれＦＥＲＭ ＡＰ−２２０４９、ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０として寄託されている。
【００３５】
以下、実施例に基づき本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
スクリーニング
市販の納豆、浜納豆、稲藁、日本国内で輸入品の豆チおよび韓国国内の量販店で手に入れた清国醤を滅菌生理食塩水に懸濁した。懸濁液を培地1枚あたり100μｌ採取し、標準寒天培地上に塗沫、３７℃にて２４時間培養した。培養後、形成されたいくつかの集落より釣菌し取得菌株とした。それぞれ、５ｍｌの２％大豆ペプトンにて３７℃にて３日間振盪培養した。培養液を１３０００rpm、５分間遠心分離し、上清を採取し、試料とした。
【００３７】
培養上清を試料としてα−グルコシダーゼ阻害活性評価を行った。α−グルコシダーゼ阻害活性評価の方法は下記の通りである。
【００３８】
腸アセトンパウダー ラット由来（ＳＩＧＭＡ社）０.１２５ｇに５０ｍＭリン酸ナトリウム酸緩衝液／１００ｍMＮａＣｌ（ｐＨ７．０）５ｍＬを添加し、４℃にて２時間以上静置した。４℃１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を酵素液とした。基質溶液として１．０ｍＭｐ−ニトロフェニル−α−グルコピラノシド（５０ｍＭリン酸ナトリウム酸緩衝液／１００ｍMＮａＣｌ（ｐＨ７．０））、反応停止液として０．３Ｍ炭酸ナトリウム溶液を用いた。
【００３９】
検体液５０μｌに対して酵素液５０μｌを添加した。室温で１０分間プレインキュベートしたあと、基質溶液を１００μｌ添加した。１２０分間反応させ、反応停止液を１００μｌ添加した。酵素反応前に予め反応停止液を添加した物をブランクとし、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製：Ｍｏｄｅｌ５５０）にて被検溶液の４０５nmにおける吸光度を測定した。
【００４０】
以上の方法から得られた菌株を再度同様の方法で確認試験を行い再現性の得られた菌株について候補株とした。候補株のうち豆チから得られた菌株の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号２となった。この株はBacillus subtilisに分類されると結論づけ、この株をバチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）株と命名した。そして本菌株を用いて液体培養を行った。
【００４１】
次に５００ｍｌ容積の坂口フラスコにて、５０ｍｌの４％大豆ペプトン（DIFCO Select Soytone：Becton, Dickinson and Company）と２％の炭素源とした培地で候補株を７日間培養した。培養液を１日目、３日目、７日目で適量採取し、１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、上清を凍結乾燥し、試料とした。
【００４２】
試料に凍結乾燥前の上清と等量のエタノール：蒸留水（１：１、V/V）溶液を加え、を４５μｍポアサイズのＰＴＦＥメンブランで濾過し、そのうち１０μｌに濾液にアセトニトリル：蒸留水：蟻酸（50:49.9:0.1、V/V/V）を990μｌ加えた物を測定試料溶液とした。
【００４３】
１−デオキシノジリマイシンの定量およびアザ糖の検出は、HILIC-タンデム質量分析法（HILIC-MS/MS）法で行った。 ＨＰＬＣは、島津製作所社製（ポンプ：LC-20AD、カラム恒温槽：CTO-20A、オートサンプラー：SIL-20AC  ）を使用した。カラムは東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（２．０×１００ｍｍ）を用い、カラム温度４０℃、移動相はアセトニトリル（０．１％蟻酸を含む）と水（０．１％蟻酸を含む）、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのグラジエント展開で溶出した。質量分析計はエービーサイエックス社製ＡＰＩ３２００を使用した。桑葉１−デオキシノジリマイシン量は、１−デオキ シノジリマイシン標品を用いた検量線から算出した。
【００４４】
その結果、表１中に示す１−デオキシノジリマイシンの含有が培養上清中に確認された。また図１にクロマトグラムの例を示す。
【表１】
0005904522.tif 000002
【００４５】
以上のことよりバチルス・サブティリスB4（Bacillus subtilisB4）株がデオキシノジリマイシンを含むアザ糖の生産能を有すると結論づけ独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０）。
【実施例２】
【００４６】
日本全国より収拾された稲藁および、韓国国内の量販店で手に入れた清国醤を滅菌生理食塩水に懸濁した。懸濁液を培地1枚あたり１００μｌ採取し、標準寒天培地上に塗沫、３７℃にて２４時間培養した。培養後、形成されたいくつかの集落より釣菌し取得菌株とした。それぞれ、５ｍｌの２％大豆ペプトンにて３７℃にて３日間振盪培養した。培養液を１３０００rpm、５分間遠心分離し、上清を採取し、試料とした。
【００４７】
培養上清を試料としてα−グルコシダーゼ阻害活性評価を行った。α−グルコシダーゼ阻害活性評価の方法は実施例１と同様である。
【００４８】
得られた候補株をＬＢ液体培地で培養し、得られた培養液を滅菌水で１，０００倍に希釈したものを種菌液とした。大豆発酵食品は納豆と同様の工程で試作を行った。次に大豆発酵食品の試作方法を示す。
【００４９】
丸大豆をよく洗い、大豆重量の３倍量の水に一晩浸漬した。吸水した大豆の水を切り、１２１℃で５０分間オートクレーブして煮豆とした。この煮豆がさめてから種菌液を５０ｇあたり１ｍｌの割合で接種し、４０℃で１７時間発酵させた。その後４℃で３日間保存して熟成を行い、大豆発酵食品とした。得られた大豆発酵物を凍結乾燥し試料とした。
【００５０】
得られた試料を粉末化し、当該粉末５０ｍｇにエタノール：蒸留水（１：１、V/V）１ｍＬを加え、超音波洗浄機で１０分間抽出を行い、３０００rpmで遠心し、上清を０．４５μｍポアサイズのＲＣメンブレンフィルターで濾過し、濾液を測定試料溶液として、実施例１と同様に１−デオキシノジリマイシン含量を測定した。
【００５１】
１−デオキシノジリマイシンの定量およびアザ糖の検出は、実施例１同様HILIC-タンデム質量分析法で行った。
【００５２】
その結果、表２中に示す、１−デオキシノジリマイシンの含有が大豆発酵物中に確認された。また図２にクロマトグラムの例を示す。
【表２】
0005904522.tif 000003
【００５３】
これら候補株より、１−デオキシノジリマイシンの生産量が一番高かったAS385株候の１６ｓＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号１となった。この株はBacillus amyloliquefaciensに分類されると結論づけ、この株をバチルス・アミロリクエファシエンスAS385（Bacillus amyloliquefaciens AS385）株と命名し、デオキシノジリマイシンを含むアザ糖の生産能を有すると結論づけ独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託した（寄託番号：ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０４９）。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によりアザ糖を生産する微生物（Azasugar-Producible Bacteria）を提供することができる。
【００５５】
本発明の微生物を利用することにより、アザ糖の発酵生産が可能になる。本発明は、発酵食品、健康食品の原材料、動物又は魚類用飼料および医薬品、化粧料等に広く利用できる。
【受託番号】
【００５６】
ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０４９
ＦＥＲＭ ＡＰ−２２０５０
【図１】
0005904522.tif 000004
【図２】
0005904522.tif 000005
【配列表】
0005904522000001.app