(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、炎症性免疫応答の持続時間または重篤度を低減する炎症性疾患の治療薬の製造のためのカルボキシル化された粒子（生物活性薬剤を含む粒子を除く）の使用であって、
前記粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まない、
使用。
【請求項２】
前記カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子、ポリスチレン粒子、またはダイヤモンド粒子である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記カルボキシル化された粒子の直径は、０．１μｍ〜１０μｍ、０．３μｍ〜５μｍ、０．５μｍ〜３μｍ、０．５μｍ〜１μｍ、または０．５μｍである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記対象は、多発性硬化症、強皮症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫心筋炎、またはクローン病といった、自己免疫障害を有するか、虚血再潅流傷害、アテローム性動脈硬化症を有するか、心筋梗塞に罹患しているか、移植受容者であるか、乾癬もしくは皮膚炎を有するか、または湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、もしくは皮膚過敏といった、アレルギー性疾患に罹患する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記炎症性疾患の治療薬は、経口的に、経鼻的に、静脈内に、筋肉内に、経眼的に、経皮的に、または皮下に投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
対象において、ウイルスまたは細菌感染を処理するウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬の製造のためのカルボキシル化された粒子（生物活性薬剤を含む粒子を除く）の使用であって、
前記粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まない、
使用。
【請求項７】
前記カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子、ポリスチレン粒子、またはダイヤモンド粒子である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記カルボキシル化された粒子の直径は、０．１μｍ〜１０μｍ、０．３μｍ〜５μｍ、０．５μｍ〜３μｍ、０．５μｍ〜１μｍ、または０．５μｍである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記ウイルス感染は、西ナイルウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、レトロウイルス感染、パピローマウイルス感染、パラミクソウイルス感染、およびパラインフルエンザウイルス感染から成る群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
前記ウイルス感染は、前記対象の中枢神経系に感染するか、またはウイルス脳炎もしくはウイルス髄膜炎を引き起こす、請求項６に記載の使用。
【請求項１１】
前記細菌感染は、前記対象の中枢神経系に感染するか、または細菌性脳炎もしくは細菌性髄膜炎を引き起こす、請求項６に記載の使用。
【請求項１２】
前記ウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬は、経口的に、経鼻的に、静脈内に、筋肉内に、経眼的に、経皮的に、または皮下に投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項１３】
カルボキシル化された粒子（生物活性薬剤を含む粒子を除く）を含む、炎症性疾患の治療薬であって、前記粒子は、付着抗原性ペプチド部分を含まない、炎症性疾患の治療薬。
【請求項１４】
前記カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子、ポリスチレン粒子、またはダイヤモンド粒子である、請求項１３に記載の炎症性疾患の治療薬。
【請求項１５】
当該炎症性疾患の治療薬は、それを必要とする対象において、炎症性免疫応答を改善する、請求項１３に記載の炎症性疾患の治療薬。
【請求項１６】
前記カルボキシル化された粒子の直径は、０．１μｍ〜１０μｍ、０．３μｍ〜５μｍ、０．５μｍ〜３μｍ、０．５μｍ〜１μｍ、または０．５μｍである、請求項１３に記載の炎症性疾患の治療薬。
【請求項１７】
カルボキシル化された粒子（生物活性薬剤を含む粒子を除く）を含む、ウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬であって、前記粒子は、付着抗原性ペプチド部分を含まない、ウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬。
【請求項１８】
前記カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子、ポリスチレン粒子、またはダイヤモンド粒子である、請求項１７に記載のウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬。
【請求項１９】
当該ウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬は、それを必要とする対象において、炎症性免疫応答を改善する、請求項１７に記載のウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬。
【請求項２０】
前記カルボキシル化された粒子の直径は、０．１μｍ〜１０μｍ、０．３μｍ〜５μｍ、０．５μｍ〜３μｍ、０．５μｍ〜１μｍ、または０．５μｍである、請求項１７に記載のウイルスまたは細菌感染疾患の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、双方とも２０１１年１１月１２日出願の米国仮出願第６１／４１３，０１６号および第６１／４１３，０１８号への優先権を主張し、これらの双方は、それらの全体として、本明細書において参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
炎症性疾患および障害は、異常またはそうでなければ無秩序な炎症性応答が、疾患の病因または重篤度の一因となる状態である。例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、および糖尿病といった自己免疫疾患、結核、および種々の形態の髄膜炎、および西ナイルウイルス脳炎を含む脳炎といった、感染症が挙げられ、他の障害としては、アテローム性動脈硬化症および虚血再潅流が挙げられる。
【０００３】
これらの疾患の多くは、組織損傷または他の傷害の部位における、単核細胞浸潤によって特徴付けられる。これらの浸潤において観察されている単核細胞の例としては、リンパ球、特に、Ｔリンパ球、ならびに単球、マクロファージ、樹枝状細胞、ミクログリア細胞、および他のものといった、単核食細胞系の細胞（ＭＰＳ細胞）が挙げられる。
【０００４】
単核細胞浸潤物において観察される細胞の多くは、これらの異常な炎症性応答における役割を果たすという疑いが持たれている。例えば、多発性硬化症といった疾患において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、病理学的自己免疫応答における中心的役割を果たすことが知られている。Ｔ細胞活性化におけるより早い時点で、樹枝状細胞および他のＭＰＳ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を担い得る。ＭＰＳ細胞はまた、少なくとも一部の炎症性疾患において、かかる細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の非存在下において、これを行うことが可能であるかどうかは明白ではないが、貪食を通じて、炎症の一因となる可能性がある。
【０００５】
末梢血液単球は、ある細胞表面分子の発現の有無に従って、２つの群のうちの１つに分類され得る。具体的に、ヒト「常在単球」または「成熟単球」は、ＣＤ１４ｌｏＣＤ１６＋表現型を有することが理解される（マウス対照物は、ＣＸ３ＣＲ１ｈｉＣＣＲ２−Ｇｒ１−である）。別の細胞群である「炎症性単球」または「未成熟単球」は、ＣＤ１４＋ＣＤ１６−表現型を有することが理解される（マウス対照物は、ＣＸ３ＣＲ１ｌｏＣＣＲ２＋Ｇｒ１＋である）。（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００３  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９：７１−８２）
【０００６】
重要なことに、後者は、それらが、骨髄由来の末梢血液細胞から炎症組織に遊走することが観察されるという意味で、「炎症性」であると理解される一方で、これらの細胞は、直接、または他の細胞の作用を通じてのいずれかで、炎症を引き起こすことは示されていない。さらに、これらの細胞が分化する時に形成され得る種々のＭＰＳ細胞もまた、炎症を引き起こすことは示されていない。
【０００７】
望ましくない免疫応答と関連付けられる障害における、一般的な長期免疫抑制のための従来の臨床的戦略は、広く作用する免疫抑制薬物、例えば、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ＦＫ５０６（タクロリムス）、およびコルチコステロイドといった、シグナル１遮断薬の長期投与に基づく。これらの薬物の高用量の長期使用は、毒性の副作用を有する可能性がある。さらに、これらの薬物に寛容であることが可能であるそれらの患者においてさえ、生涯にわたる免疫抑制薬物療法が必要になると、腫瘍、深刻な感染、腎毒性、および代謝障害を含む、重篤な副作用の著しいリスクを伴う。
【０００８】
抗原またはペプチドの細胞結合を含む、抗原特異的寛容を誘導する方法が開発されている。例えば、一方法において、ペプチド誘導細胞結合寛容は、末梢血液細胞の収集、分離、および無菌状態下での、疾患特異的自己抗原およびエチレンカルボジイミド（ＥＣＤＩ）結合試薬による処理、ならびにドナー／患者へのその後の再注入を含む。このプロセスは、費用がかかり、熟練した専門家によって、厳密に監視された状態の下で行われなければならず、この手技を行うことができる施設の数が限定されている。ドナー細胞タイプとしての赤血球の使用は、同種異系ドナーを含むように潜在的な源を拡大し、このため、源細胞の供給を劇的に増加させ、輸血が認められる任意の状況へのこの療法の送達を潜在的に拡大する。これらの手法には、源細胞の供給、およびドナー細胞への免疫応答を最小化するための組織タイプ適合の必要性の点で、有意な制限がある。加えて、ＥＤＣＩを介して自己抗原を結合するための細胞の局所的処理は、重大な品質管理問題を提示する。さらに、これらの手法はまた、免疫寛容が求められる病理学的抗原の少なくとも何らかの知識を必要とする。
【０００９】
最近、源細胞の供給に対する要件を排除し、先行手法の組織タイピング要件を回避する、ペプチド結合粒子が説明されている。その全体として本明細書において参照することにより組み込まれる、国際公開第ＷＯ２０１０／０８５５０９号を参照されたい。しかしながら、これらの手法は、依然として、抗原特異的免疫寛容に依存する。
【００１０】
特異的抗原／エピトープは、ヒト疾患において一般的に知られていないため、抗原特異的寛容は、一般的に理想的ではない。さらに、抗原は、抗原特異的手法が有効であるために、対象によって異なる可能性があり、したがって、各個々の患者が認識するであろう抗原はどれかを判定する必要性があるか、または投与前に、可能なペプチドのライブラリを粒子に結合することを必要とするであろう。これらのペプチドの合成および個々の結合は、双方とも、時間がかかり、かつ高価である。したがって、これらの問題の双方を解決し、それによって、組織適合細胞の源に対する必要性を排除し、同時に、大きなペプチドパネルを合成および結合させる必要性を排除する、療法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、修飾された粒子が、単独で、即ち、それに結合されるペプチドを伴わずに、それを必要とする患者において、炎症性免疫応答を改善する上で有効であるという驚くべき所見に関与する。驚くべきことに、炎症性免疫応答を減退させ、炎症性疾患を処理するために必要なのは、ペプチド（複数を含む）をそれに結合させることを必要としない、カルボキシル化された粒子の投与である。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、カルボキシル化された粒子を含む薬学的組成物を提供する。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まない。一部の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリスチレン粒子である。他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ダイヤモンド粒子である。さらに他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子である。
【００１３】
一実施形態において、カルボキシル化された粒子を含有する薬学的組成物は、それを必要とする対象に投与される時、免疫寛容を誘導する。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子を含有する薬学的組成物は、それを必要とする対象に投与される時、炎症性免疫応答を改善する。
【００１４】
一実施形態において、本発明の薬学的製剤を成すカルボキシル化された粒子は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有する。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。なおさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。さらにさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍの直径を有する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、対象において、炎症性免疫応答の持続時間または重篤度を低減する方法を提供し、対象に、カルボキシル化された粒子を含む薬学的組成物を投与することを含む。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まない。一部の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリスチレン粒子である。他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ダイヤモンド粒子である。さらに他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子である。
【００１６】
一実施形態において、本発明の方法は、それを必要とする対象に投与される時、免疫寛容を誘導する。さらなる実施形態において、方法は、それを必要とする対象に投与される時、炎症性免疫応答を改善する。
【００１７】
一実施形態において、本発明の方法は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有するものを含むカルボキシル化された粒子を利用する。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。なおさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。さらにさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍの直径を有する。
【００１８】
一実施形態において、対象は、自己免疫障害を有する。さらなる実施形態において、自己免疫障害は、多発性硬化症、強皮症、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、レイノー症候群、シェーグレン症候群、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫心筋炎、またはクローン病である。特定の実施形態において、自己免疫疾患は、多発性硬化症である。
【００１９】
別の実施形態において、対象は、アレルギー性疾患を有する。さらなる実施形態において、アレルギー性疾患は、湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、または皮膚過敏である。
【００２０】
別の実施形態において、対象は、移植レシピエントである。さらに別の実施形態において、対象は、心筋梗塞に罹患している。さらに別の実施形態において、患者は、虚血再潅流を有する。さらに別の実施形態において、患者は、アテローム性動脈硬化症を有する。
【００２１】
一実施形態において、方法は、カルボキシル化された粒子を、任意の好適な手段によって、投与することを含む。一実施形態において、組成物は、経口的に、経鼻的に、静脈内に、筋肉内に、経眼的に、経皮的に、または皮下に投与される。特定の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、経鼻的に投与される。さらに別の実施形態において、粒子は、静脈内に投与される。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、対象において、細菌またはウイルス感染を処理する方法を提供し、対象に、カルボキシル化された粒子を含む薬学的組成物を投与することを含む。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まない。一部の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリスチレン粒子である。他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ダイヤモンド粒子である。さらに他の実施形態において、カルボキシル化された粒子は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）粒子である。
【００２３】
一実施形態において、本発明の方法は、細菌またはウイルス感染を有する対象に投与される時、免疫寛容を誘導する。さらなる実施形態において、方法は、細菌またはウイルス感染を有する対象に投与される時、炎症性免疫応答を改善する、または減退させる。
【００２４】
一実施形態において、本発明の細菌またはウイルス感染を処理する方法は、約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有するカルボキシル化された粒子を利用する。さらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。なおさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。さらにさらなる実施形態において、カルボキシル化された粒子は、約０．５μｍの直径を有する。
【００２５】
一実施形態において、対象は、ウイルス感染を有する。さらなる実施形態において、ウイルス感染は、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス、インフルエンザ感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、またはパラインフルエンザウイルス感染である。さらなる実施形態において、ウイルス感染は、前記対象の中枢神経系に感染する。さらにさらなる実施形態において、ウイルス感染は、ウイルス脳炎またはウイルス髄膜炎を引き起こす。
【００２６】
一実施形態において、対象は、細菌感染を有する。さらなる実施形態において、細菌感染は、前記対象の中枢神経系に感染する。さらにさらなる実施形態において、細菌感染は、敗血症、細菌性脳炎、または細菌性髄膜炎を引き起こす。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】（Ａ）ＷＮＶによる高用量または低用量感染後のマウスの生存率（％）；（Ｂ）ＷＮＶによるマウスの高用量感染と関連付けられる体重減少；（Ｃ）感染に屈するマウスの脳におけるウイルス力価；（Ｄ）感染後０〜７日目の高および低用量ＷＮＶに感染させたマウスにおける体重減少；（Ｅ）感染後７日目の高および低用量ＷＮＶに感染させたマウスの脳におけるウイルス力価、ならびに７日目の体重減少の割合（％）とウイルス力価との間の相関；（Ｆ）体重減少の割合（％）と、高および低用量ＷＮＶによる感染後７日目のマウスの脳におけるＣＤ４５＋白血球の存在との間の相関；（Ｇ）脳におけるウイルス力価と、高および低用量ＷＮＶによる感染後７日目のマウスの脳におけるＣＤ４５＋白血球の存在との間の相関；（Ｈ）体重減少の割合（％）と、高および低用量ＷＮＶによる感染後７日目のマウスの脳におけるＣＤ４５ｈｉマクロファージの存在との間の相関を示す。
【図２】体重減少の割合（％）と、（Ａ）ＣＤ４５ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋移入ミクログリア；（Ｃ）ＣＤ３＋Ｔ細胞；（Ｄ）ＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６Ｇ＋好中球、および（Ｅ）ＮＫ１．１＋ＣＤ１１ｂｌｏ／−ナチュラルキラー細胞の存在との間の相関を示す一方で、ＣＤ４５ｌｏ常在ミクログリア（Ｂ）の数は、高用量または低用量ＷＮＶによる感染後７日目で未変化のままであった；（Ｆ）は、体重減少と、低用量ＷＮＶに感染させたマウスの殺処理時の脳におけるウイルス力価との間の相関を示し、（Ｇ）低用量ＷＮＶに感染させたマウスにおける、白血球浸潤と、体重減少の割合（％）との間の相関を示し、（Ｈ）は、低用量ＷＮＶ感染後、ウイルス力価と、白血球浸潤との間に相関が無かったことを示す。
【図３】（Ａ）は、高用量ＷＮＶによる感染後６日目の、ＰＢＳ中のカルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理されたマウスの長期生存を示し、（Ｂ）は、感染後６日目に開始した、低用量ＷＮＶに感染させたマウスを、カルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理することが、マウスの生存を延長するのに無効であることを示し、（Ｃ）感染後６日目に開始した、低用量ＷＮＶに感染させたマウスを、カルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理することが、対照マウスと比較して、マウスにおける体重減少を阻止するのに無効であることを示し、（Ｄ）低用量ＷＮＶに感染させたマウスの処理が、体重減少してから、ビーズをマウスに投与する時、マウスの生存を延長するのに有効であることを示す。（Ｅ〜Ｇ）は、感染後２０日目までのこれらのマウスにおいて記録された体重減少を示す。
【図４】（Ａ〜Ｄ）は、マウスにおける体重減少後の、低用量ＷＮＶに感染させたマウスを、カルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理する例であり、（Ａ〜Ｂ）のマウスのみが、５日間のビーズ処理を必要とし、体重は安定したままであり、それらは、さらなるビーズ処理をせずに生存し続けるが、（Ｃ〜Ｄ）のマウスは、ビーズ処理が５日目後に中止される時、再び体重が減少し始め、そのため、体重が再安定化するまで処理を再開し、（Ｅ）は、感染後９日目の低用量ＷＮＶに感染させたマウスの脳へのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージの浸潤を示し、体重減少したか、もしくは体重減少しなかったかのいずれかであり、感染後８日目にＰＢＳもしくはカルボキシル化されたビーズのいずれかで処理された；（Ｆ）は、感染後９日目のＷＮＶに感染させたマウスの脳に浸潤することが見出された細胞のタイプのグラフ表示であり、体重が減少したか、もしくは体重が減少しなかったかのいずれかであり、かつ感染後８日目にＰＢＳもしくはカルボキシル化されたビーズのいずれかで処理された。
【図５】（Ａ）ＷＮＶによる低用量感染後、カルボキシル化されたポリスチレンビーズ、裸ポリスチレンビーズ、またはＰＢＳで処理したマウスの生存の相違；（Ｂ）は、ＷＮＶによる低用量感染後、カルボキシル化されたビーズ、裸ビーズ、またはＰＢＳで処理したマウスの体重減少率（％）の相違を示し、（Ｃ、Ｄ）は、ＷＮＶによる低用量感染後のマウスにおける、カルボキシル化されたビーズ処理と、裸ビーズ処理との間の体重減少率（％）の相違を示し、（Ｅ、Ｏ）は、０日目に高用量ＷＮＶ、および６日目にＦＩＴＣ−カルボキシル化されたビーズ、ＦＩＴＣ−裸ビーズ、またはＰＢＳに感染させたマウスにおける、７日目のＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたビーズまたは裸ビーズの局所化を示す。（Ｅ〜Ｇ）は、３匹の別個のＰＢＳで処理したマウスからの血液であり、（Ｈ〜Ｊ）は、３匹の別個の裸ポリスチレンビーズで処理したマウスからの血液であり、（Ｌ〜Ｎ）は、３匹の別個のカルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理したマウスからの血液であり、カルボキシル化されたビーズよりも、プレーンなビーズのより多くが、血液中に留まることを示す。
【図６】（Ａ〜Ｃ）図Ｅ〜Ｏのように感染および処理したマウスの脳における、ＦＩＴＣに共役したポリスチレンビーズの浸潤の欠如；（Ｄ〜Ｅ）は、図５（Ｅ〜Ｏ）のようにカルボキシル化されたポリスチレンビーズまたは裸ポリスチレンビーズで処理した、ＷＮＶに感染させたマウスの脳への、種々の白血球、マクロファージ、およびミクログリアの浸潤の低減を示す。
【図７】（Ａ）ＣＤ１１ｂ＋（Ｃ、Ｇ）、ＣＤ１１ｃ＋（Ｄ、Ｈ）、Ｌｙ６ｃ＋（Ｅ、Ｉ）細胞内のＣＤ４５＋白血球（Ａ、Ｂ、Ｆ）との、脾臓における、ＦＩＴＣに共役したポリスチレンカルボキシル化されたビーズ、およびＦＩＴＣに共役した裸ポリスチレンビーズの会合；（Ｊ〜Ｒ）は、ＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたビーズ、およびＦＩＴＣに共役した裸ビーズを取り込む、細胞のタイプを示す。
【図８】ＦＩＴＣに共役したポリスチレンカルボキシル化されたビーズ、またはＦＩＴＣに共役した裸ポリスチレンビーズの、高用量ＷＮＶによる感染後、脾臓において、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−単球（Ａ）、およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋（Ｂ）、またはＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋（Ｃ）樹枝状細胞によって、取り込まれる、およびその数を増加させる、能力を示す。
【図９】（Ａ〜Ｄ）ＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたポリスチレンビーズ、またはＦＩＴＣに共役した裸ポリスチレンビーズの、高用量ＷＮＶによる感染後、脾臓において、ＣＤ１９＋Ｂ細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞サブセットによって、取り込まれる、およびその数を増加させる、能力を示す。
【図１０】（Ａ〜Ｌ）ＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたポリスチレンビーズ、またはＦＩＴＣに共役した裸ポリスチレンビーズの、高用量ＷＮＶによる感染後、肝臓における、具体的に、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−単球（Ｊ）およびＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋（Ｋ）またはＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋（Ｌ）樹枝状細胞内のＣＤ１１ｂ＋（Ｃ、Ｇ）、ＣＤ１１ｃ＋（Ｄ、Ｈ）、およびＬｙ６ｃ＋（Ｅ、Ｉ）細胞によって、取り込まれる能力を示す。
【図１１】（Ａ〜Ｇ）ＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたポリスチレンビーズ、またはＦＩＴＣに共役した裸ポリスチレンビーズの、高用量ＷＮＶによる感染後、骨髄における、ＣＤ１１ｂ＋、（Ｃ、Ｆ）、ＣＤ１１ｃ＋およびＬｙ６Ｃ＋（Ｄ、Ｇ）細胞によって、取り込まれる能力を示す。
【図１２】（Ａ）異なるサイズの高用量または低用量のカルボキシル化されたポリスチレンビーズで処理した、低用量ＷＮＶに感染させたマウスの生存率（％）；（Ｂ）は、ＦＩＴＣに共役したカルボキシル化されたビーズ、裸ＦＩＴＣに共役したビーズ、カルボキシル化されたＰＬＧＡ球体、または裸ＰＬＧＡ球体で処理した、低用量のＷＮＶに感染させたマウスの生存率（％）を示す；（Ｃ）は、低用量のＷＮＶに感染させ、カルボキシル化されたＦＩＴＣ−ビーズ、カルボキシル化された−ＦＩＴＣ  ＰＬＧＡ球体、またはカルボキシル化されたナノダイヤモンドで処理したマウスの脳における、種々の単球集団の浸潤／活性化を示す。
【図１３】高または低用量のＷＮＶに感染させた野生型およびＴ細胞欠損マウスにおける、（Ａ）生存率（％）、および（Ｂ）体重減少；（Ｃ）高または低用量のＷＮＶに感染させた野生型およびＴ細胞欠損マウスの脳における、体重減少とウイルス力価との間の相関；感染後８日目の、高用量のＷＮＶに感染させた野生型およびＴ細胞欠損マウスの脳における、（Ｄ）体重減少、および（Ｅ）免疫細胞浸潤；高または低用量のＷＮＶに感染させ、有意な体重減少後、カルボキシル化されたビーズまたはＰＢＳで処理した、野生型およびＴ細胞欠損マウスの（Ｆ）生存率（％）、および（Ｇ）体重減少を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明者らは、驚くべきことに、あるサイズのカルボキシル化されたポリスチレン、ＰＬＧＡ、またはダイヤモンド粒子といった、カルボキシル化された粒子が対象に投与される時、炎症性免疫応答が改善されるということを見出した。さらに、本発明者らはまた、驚くべきことに、これらの同じカルボキシル化された粒子が、活性ウイルスまたは細菌感染、特に、中枢神経系に感染するものを有する対象に投与される時、これらの感染の症状の劇的な減少につながり、生存を延長したということを見出した。したがって、これらの粒子は、自己免疫疾患といった過度の炎症性免疫応答によって特徴付けられる任意の疾患または状態の処理、ならびに細菌およびウイルス感染の処理において有用であり得る。
【００２９】
「粒子」は、本明細書において使用される際、任意の非組織由来の微小な組成物を指し、それは、球体または球体状の実在物またはビーズであり得る。「粒子」という用語、および「ビーズ」という用語は、同義的に使用することができる。さらに、「粒子」という用語は、ビーズおよび球体を包含するために使用することができる。
【００３０】
「カルボキシル化された粒子」または「カルボキシル化されたビーズ」または「カルボキシル化された球体」は、その表面上にカルボキシル基を含有するように修飾されている、任意の粒子を含む。一部の実施形態において、カルボキシル基の付加は、例えば、ＭＡＲＣＯといったスカベンジャ受容体との相互作用を通じて、循環からの粒子の食細胞／単球摂取を増強する。
【００３１】
「抗原性部分」は、本明細書において使用される際、任意の部分、例えば、宿主の免疫系によって認識されるペプチドを指す。抗原性部分の例としては、自己抗原および／または細菌もしくはウイルスタンパク質、ペプチドまたは構成要素が挙げられるが、これらに限定されない。理論に束縛されることなく、カルボキシル化されたビーズ自体は、免疫系によって認識され得る一方で、それに付着されるものを何も有しないカルボキシル化されたビーズは、本発明の目的上、「抗原性部分」と見なされない。
【００３２】
「裸ビーズ」または「裸粒子」または「裸球体」は、本明細書において使用される際、カルボキシル化されていない、ビーズ、粒子、または球体を指す。
【００３３】
粒子は、任意の粒子形状または配座を有することができる。しかしながら、一部の実施形態において、生体内で凝集する可能性がより低い粒子を使用することが好ましい。これらの実施形態内の粒子の例は、球体形状を有するものである。
【００３４】
各粒子は、サイズが均一である必要はないが、粒子は、一般的に、抗原提示細胞または他のＭＰＳ細胞における貪食の誘因となるのに十分なサイズでなければならない。好ましくは、粒子は、溶解度を増強し、生体内凝集によって引き起こされる可能な合併症を回避し、飲作用を促進するために、サイズがミクロスケールまたはナノスケールである。粒子サイズは、間質腔からリンパ球成熟の領域への摂取に対する要因であり得る。約０．１μｍ〜約１０μｍの直径を有する粒子は、貪食の誘因となることが可能である。このため、一実施形態において、粒子は、これらの限界内の直径を有する。別の実施形態において、粒子は、約０．３μｍ〜約５μｍの直径を有する。さらに別の実施形態において、粒子は、約０．５μｍ〜約３μｍの直径を有する。好ましい実施形態において、粒子は、約０．５μｍのサイズを有する。組成物における粒子は、均一な直径である必要はない。一例として、薬学的製剤は、複数の粒子を含有することができ、これらのうち、約０．５μｍであるものもある一方、約１．０μｍであるものもある。これらの所与の範囲内の粒子サイズのいかなる混合物も有用であろう。
【００３５】
一部の実施形態に おいて、粒子は、非金属である。これらの実施形態において、粒子は、ポリマーから形成することができる。好ましい実施形態において、粒子は、個体内で生分解性である。本実施形態において、粒子は、個体内で粒子が蓄積されることなく、複数回投与にわたって、個体に提供することができる。好適な粒子の例としては、ポリスチレン粒子、ＰＬＧＡ粒子、およびダイヤモンド粒子が挙げられる。
【００３６】
好ましくは、粒子表面は、非特異的または望ましくない生物学的相互作用を最小化する材料から成る。粒子表面と間質との間の相互作用は、リンパ摂取における役割を果たす要因であり得る。粒子表面は、非特異的相互作用を阻止するまたは減少させるように、材料でコーティングすることができる。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（ポリ（エチレングリコール）−ｂｌ−ポリ（プロピレングリコール）−ｂｌ−ポリ（エチレングリコール）のコポリマーを含む）といった、そのコポリマーといった、親水性層で、粒子をコーティングすることによる、立体安定化は、皮下注射後の改善されたリンパ摂取によって実証されるように、間質のタンパク質との非特異的相互作用を低減することができる。これらの事実の全てが、リンパ摂取に関して、粒子の物理的特性の有意性を指摘する。生分解性ポリマーは、ポリマーおよび／または粒子および／または層の全てまたは一部を作製するために使用することができる。生分解性ポリマーは、例えば、溶液中の水と反応する官能基の結果によって、分解を受け得る。「分解」という用語は、本明細書において使用される際、分子量の低減、または疎水性基の親水性基への変換のいずれかによって、可溶性になることを指す。エステル基を有するポリマー、例えば、ポリラクチドおよびポリグリコライドは、一般的に、自発的加水分解に供される。
【００３７】
本発明の粒子はまた、追加の構成要素を含有することができる。例えば、担体は、担体に組み込まれるまたは共役される造影剤を有することができる。現在商業的に入手可能である造影剤を有する担体ナノ球体の例は、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ｓｉｇｈｔナノ球体である。量子ドット（ＱＤ）として知られる、無機量子を閉じ込めた発光ナノ結晶が、ＦＲＥＴの適用における理想的なドナーとして浮上しており、それらの高い量子収量および調整可能なサイズ依存性のストークスシフトが、単一の紫外波長で励起される時、異なるサイズが、青から赤外まで放出することを可能にする（Ｂｒｕｃｈｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９８，  ２８１，  ２０１３、Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，  Ｃ．  Ｍ  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ２００３，  ４２，  ５７９６、Ｗａｇｇｏｎｅｒ，  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９９５，  ２４６，  ３６２、Ｂｒｕｓ，  Ｌ．  Ｅ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  １９９３，  ７９，  ５５６６）。デンドリマーとして知られるポリマーの部類に基づく、ハイブリッド有機／無機量子ドットといった量子ドットは、生物学的標識化、撮像、および光学的バイオセンシング系において使用することができる（Ｌｅｍｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０００，  １２２，  １２８８６）。無機量子ドットの従来の合成と異なり、これらのハイブリッド量子ドットナノ粒子の合成は、高い温度、または高度に毒性の不安定な試薬を必要としない（Ｅｔｉｅｎｎｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  Ｌｅｔｔ．  ８７，  １８１９１３，  ２００５）。
【００３８】
粒子は、広範な材料から形成することができる。粒子は、好ましくは、生物学的使用に好適な材料から成る。例えば、粒子は、ガラス、シリカ、ヒドロキシカルボン酸のポリエステル、ジカルボン酸のポリ無水物、またはヒドロキシカルボン酸およびジカルボン酸のコポリマーから成ってもよい。より一般的には、担体粒子は、直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線状もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、またはアルコキシヒドロキシ酸のポリエステル、あるいは直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換、飽和もしくは不飽和、線状もしくは架橋された、アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アルケニル、アラルケニル、ヘテロアリール、またはアルコキシジカルボン酸のポリ無水物から成ってもよい。さらに、担体粒子は、量子ドットとすることができるか、または量子ドットポリスチレン粒子といった量子ドットから成ることができる（Ｊｏｕｍａａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２２：１８１０−６）。エステルおよび無水物結合の混合物を含む担体粒子（例えば、グリコール酸およびセバシン酸のコポリマー）もまた、採用することができる。例えば、担体粒子は、ポリグリコール酸ポリマー（ＰＧＡ）、ポリ乳酸ポリマー（ＰＬＡ）、ポリセバシン酸ポリマー（ＰＳＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−セバシン）酸コポリマー（ＰＬＳＡ）、ポリ（グリコール−コ−セバシン）酸コポリマー（ＰＧＳＡ）等を含む、材料を含むことができる。本発明において有用な他の生体適合性、生分解性ポリマーとしては、カプロラクトン、カーボネイト、アミド、アミノ酸、オルソエステル、アセタール、シアノアクリレート、および分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマー、ならびに直鎖もしくは分岐、置換もしくは非置換アルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、または芳香族ヒドロキシ−もしくはジ−カルボン酸とのこれらのコポリマーが挙げられる。加えて、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、およびシステイン、またはそれらのエナンチオマーといった、反応側鎖基を有する、生物学的に重要なアミノ酸は、抗原ペプチドおよびタンパク質または共役部分に共役するための反応基を提供するように、上記材料のうちのいずれかとのコポリマーに含めることができる。本発明に好適な生分解性材料としては、ダイヤモンド、ＰＬＡ、ＰＧＡ、およびＰＬＧＡポリマーが挙げられる。生体適合性であるが、非生分解性である材料もまた、本発明の担体粒子において使用することができる。例えば、アクリレート、エチレン酢酸ビニル、アシル置換酢酸セルロース、非分解性ウレタン、スチレン、塩化ビニル、フッ化ビニル、ビニルイミダゾール、クロロスルホン化オレフィン、酸化エチレン、ビニルアルコール、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌ．）、およびナイロンの非生分解性ポリマーを採用することができる。
【００３９】
現在商業的に入手可能である、好適なビーズとしては、ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．）といったポリスチレンビーズが挙げられる。
【００４０】
物理的特性もまた、未成熟リンパ球を有する領域における摂取および保持後のナノ粒子の有用性に関係する。これらには、剛性またはゴム性といった、機械的特性が含まれる。一部の実施形態は、最近、全身（しかしながら、標的または免疫ではない）送達のために開発および特徴付けされているＰＰＳ−ＰＥＧ系におけるように、上層、例えば、ＰＥＧにおけるような親水性上層を有する、ゴム状コア、例えば、ポリ（プロピレンスルフィド）（ＰＰＳ）コアに基づく。ゴム状コアは、ポリスチレンまたは金属ナノ粒子系におけるような、実質的に剛性のコアとは対照的である。ゴム状という用語は、天然または合成ゴムに加え、ある弾性材料を指し、ゴム状とは、ポリマーの技術分野の当業者にはよく知られた用語である。例えば、架橋されたＰＰＳは、疎水性ゴム状コアを形成するために使用することができる。ＰＰＳは、酸化状態下で、ポリスルホキシドおよび最終的にはポリスルホンに分解し、疎水性ゴムから親水性、水溶性ポリマーに転移する、ポリマーである。他の硫化物ポリマーを使用のために適合させることができ、硫化物ポリマーという用語は、ポリマーの骨格に硫黄を有するポリマーを指す。使用することができる他のゴム状ポリマーは、約３７℃未満である水和状態下のガラス転移温度を有するポリエステルである。疎水性コアは、コアおよび上層が入り混じる傾向がなく、それにより、上層が、コアから離れて立体的に拡大する傾向があるため、親水性上層とともに有利に使用することができる。コアは、その上に層を有する粒子を指す。層は、コアの少なくとも一部分を被覆する材料を指す。層は、吸着または共有結合されてもよい。粒子またはコアは、中実または中空であってもよい。ゴム状疎水性コアは、ゴム状疎水性コアを有する粒子によって、疎水性薬物のより高い充填を行うことができるという点において、結晶性またはガラス状（ポリスチレンの場合のような）コアといった剛性疎水性コアよりも有利である。
【００４１】
別の物理的特性は、表面の親水性である。親水性材料は、それが架橋されていない時、１リットルあたり少なくとも１グラムの水における溶解度を有し得る。親水性ポリマーを有する粒子の立体安定化は、非特異的相互作用を低減することによって、間質からの摂取を改善することができるが、しかしながら、粒子の増加したステルス性質が、未成熟リンパ球を有する領域における食細胞による内在化を低減する可能性もある。これらの拮抗する特性のバランスを取る課題に遭遇しているが、しかしながら、本出願は、リンパ節におけるＤＣおよび他のＡＰＣへの効果的なリンパ送達のためのナノ粒子の創出を立証する。一部の実施形態は、親水性構成要素、例えば、親水性材料の層を含む。好適な親水性材料の例は、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、ポリサッカリド、ポリアクリル酸、およびポリエーテルのうちの１つ以上である。層におけるポリマーの分子量は、生体内で有用な程度の立体障害を提供するように、例えば、約１，０００から約１００，０００、またはさらにそれ以上に調節することができ、当業者は、明示的に記載される範囲内の範囲および値の全て、例えば、１０，０００〜５０，０００が、企図されることを直ちに理解するであろう。
【００４２】
ナノ粒子は、さらなる反応のための官能基を組み込むことができる。さらなる反応のための官能基としては、求電子剤または求核剤が挙げられ、これらは、他の分子と反応するのに好都合である。求核剤の例は、第１級アミン、チオール、およびヒドロキシルである。求電子剤の例は、スクシンイミジルエステル、アルデヒド、イソシアネート、およびマレイミドである。
【００４３】
本発明の粒子は、それを必要とする対象において、炎症性免疫応答を減退させる、またはそれを必要とする対象において、細菌もしくはウイルス感染を処理するのに有効ないかなる用量にも与えることができる。ある実施形態において、約１０２から約１０２０の粒子が、個体に提供される。さらなる実施形態において、約１０３から約１０１５の粒子が提供される。なおさらなる実施形態において、約１０６から約１０１２の粒子が提供される。さらにさらなる実施形態において、約１０８から約１０１０の粒子が提供される。一実施形態において、好ましい用量は、０．１％固体／ｍｌである。したがって、０．５μｍのビーズに関して、好ましい用量は、およそ４×１０９のビーズであり、０．０５μｍのビーズに関して、好ましい用量は、およそ４×１０１２のビーズであり、３μｍのビーズに関して、好ましい用量は、２×１０７のビーズである。しかしながら、処理されるべき特定の状態の処理において有効であるいかなる用量も、本発明によって包含される。
【００４４】
本発明は、自己免疫疾患、移植拒絶、およびアレルギー性反応といった、免疫関連障害の処理に有用である。免疫寛容を誘導するための合成、生体適合性粒子系の置換は、製造の容易性、治療剤の広い利用可能性につながり、試料間の均一性を増加させ、潜在的な処理部位の数を増加させ、担体細胞へのアレルギー性応答に対する潜在性を劇的に低減する可能性がある。
【００４５】
本明細書において使用される際、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介および／またはＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞毒性が挙げられる。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化、例えば、抗体産生（体液性応答）、およびサイトカイン反応性細胞、例えば、マクロファージの活性化によって間接的に影響される免疫応答を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞ならびにＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞）といったリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹枝状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞といったプロフェッショナル抗原提示細胞、およびケラチノサイト、内皮細胞、星状膠細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞といった非プロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球といった骨髄性細胞が挙げられる。一部の実施形態において、本発明の修飾された粒子は、炎症部位への炎症性細胞の移動を低減するのに効果的である。
【００４６】
本明細書において使用される際、「アネルギー」、「寛容」、または「抗原特異的寛容」という用語は、Ｔ細胞受容体媒介刺激に対する、Ｔ細胞の不感受性を指す。かかる不感受性は、一般的に、抗原特異的であり、抗原性ペプチドへの曝露が中止した後、存続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギーは、サイトカイン産生、例えば、ＩＬ−２の欠如によって特徴付けられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第２のシグナル（共刺激シグナル）の非存在において、第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３媒介シグナル）を受容する時に、生じる。これらの状態下では、同じ抗原への細胞の再曝露（再曝露が共刺激分子の存在下で生じたとしても）は、サイトカインを産生することができず、その後、増殖することができないことをもたらす。このため、サイトカインを産生することができないことは、増殖を阻止する。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養される場合、増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーはまた、ＥＬＩＳＡによって、またはインジケータ細胞株を使用した増殖アッセイによって測定される、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によって観察することができる。代替的に、レポータ遺伝子構築物を使用することができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサの制御下で異種のプロモータによって、またはエンハンサにおいて見出すことができるＡＰＩ配列のマルチマーによって誘導される、ＤＬ−２遺伝子転写を開始することができない（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２５７：１１３４）。
【００４７】
本明細書において使用される際、「免疫学的寛容」という用語は、ある割合の処理対象において実施される方法を指し、非処理対象と比較して、ａ）特異的な免疫学的応答（抗原特異的エフェクタＴリンパ球、Ｂリンパ球、抗体、またはそれらの同等物によって、少なくとも部分的に媒介されると考えられる）のレベルが減少する；ｂ）特異的な免疫学的応答の開始もしくは進行が遅延する；またはｃ）特異的な免疫学的応答の開始もしくは進行のリスクが低減する。「特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、他と比較して、ある抗原に対して優先的に惹起される時に生じる。「非特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、炎症性免疫応答につながる抗原に対して無差別に惹起される時に生じる。「擬似特異的な」免疫学的寛容は、免疫学的寛容が、防御免疫応答につながる他のものではなく、病原性免疫応答につながる抗原に対して、半差別的に惹起される時に生じる。
【００４８】
寛容原性活性に対する代理は、粒子が、標的部位における適切なサイトカインの産生を刺激する能力である。標的部位においてＴサプレッサ細胞によって放出される免疫調整サイトカインは、ＴＧＦ−βであると考えられる（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２１，  １９９２）。寛容中に産生され得る他の要因は、サイトカインＩＬ−４およびＩＬ−１０、ならびにメディエータＰＧＥである。対照的に、活発な免疫破壊を受ける組織におけるリンパ球は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＦＮγといった、サイトカインを分泌する。したがって、修飾された粒子の有効性は、適切なタイプのサイトカインを刺激するその能力を測定することによって評価することができる。
【００４９】
これを考慮して、修飾された粒子、有効な粘膜結合構成要素、有効な組み合わせ、または粘膜投与の有効な形態およびスケジュールに関する、迅速なスクリーニング試験を、動物モデル系を使用して行うことができる。動物は、粘膜表面を、試験粒子組成物で処理し、ある時期に、疾患を引き起こす抗原もしくは感染体の投与でチャレンジする。脾臓細胞を単離し、約５０μｇ／ｍＬの濃度の疾患を引き起こす抗原または感染体に由来する抗原の存在下で生体外で培養する。培地へのサイトカイン分泌は、標準的なイムノアッセイによって定量化することができる。
【００５０】
粒子が細胞の活性を抑制する能力は、修飾された粒子で免疫化した動物から単離される細胞を使用して、または疾患を引き起こす抗原もしくはウイルス抗原標的抗原に応答する細胞株を創出することによって判定することができる（Ｂｅｎ−Ｎｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１：１９５，  １９８１）。この実験の一変形例において、サプレッサ細胞集団は、増殖を阻止するように、軽く照射され（約１０００から１２５０ｒａｄ）、サプレッサは、レスポンダ細胞とともに共培養され、次いで、トリチウム化チミジン組み込み（またはＭＴＴ）を使用して、レスポンダの増殖活性を定量化する。別の変形例において、サプレッサ細胞集団およびレスポンダ細胞集団は、デュアルチャンバトランスウェル培養系（Ｃｏｓｔａｒ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）の上および低レベルにおいて培養され、これは、集団が、ポリカーボネート膜によって分離され、相互に１ｍｍ以内で共インキュベートすることを可能にする（国際公開第ＷＯ９３／１６７２４号）。この手法においては、レスポンダの増殖活性が別個に測定することができるため、サプレッサ細胞集団の照射は不要である。
【００５１】
特異的疾患の処理のための組成物および投与形態の有効性もまた、対応する動物疾患モデルにおいて詳述され得る。採用されているモデルについて、適切に、疾患の循環する生化学的および免疫学的ホールマーク、罹患組織の免疫組織学、ならびに肉眼的な臨床的特性のレベルで、疾患の症状を減退または遅延するための処理の能力を監視する。試験に使用することができる動物モデルの非限定的な例は、以下の項に挙げられる。
【００５２】
本発明は、ＴＨ１応答、ＴＨ２応答、ＴＨ１７応答、またはこれらの応答の組み合わせを調節することによる、寛容の調節を企図する。ＴＨ１応答の調節は、例えば、インターフェロン−ガンマの発現の変化を包含する。ＴＨ２応答の調節は、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の任意の組み合わせの発現の変化を包含する。典型的に、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも１つの発現の増加（減少）を含み、より典型的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも２つの発現の増加を含み、最も典型的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、またはＩＬ−１３のうちの少なくとも３つの増加を含む一方、理想的には、ＴＨ２応答の増加（減少）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の全ての発現の増加（減少）を含む。ＴＨ１７の調節は、例えば、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２３の発現の変化を包含し、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２のレベルに影響する。
【００５３】
自己抗原および自己免疫疾患に対する寛容は、胸腺における自己反応性Ｔ細胞の負の選択、および胸腺での除去を回避し末梢中で見出されるそれらの自己反応性Ｔ細胞に対する末梢寛容の機構を含む、様々な機構によって、達成される。末梢Ｔ細胞寛容を提供する機構の例としては、自己抗原の「無視」、自己抗原に対するアネルギーまたは不応答性、サイトカイン免疫偏向、および自己反応性Ｔ細胞の活性化誘導細胞死が挙げられる。加えて、制御性Ｔ細胞は、末梢寛容の媒介に関与することが示されている。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：１１−１９、Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １８２：５８−６７を参照されたい。一部の状況において、自己抗原に対する末梢寛容は失われ（または破壊され）、自己免疫応答が生じる。例えば、ＥＡＥの動物モデルにおいて、ＴＬＲ自然免疫受容体を通じた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化は、自己寛容を破壊し、ＥＡＥの誘導をもたらすことを示された（Ｗａｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１３：９９０−９９７）。
【００５４】
したがって、一部の実施形態において、本発明は、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、および／またはＴＬＲ７／８／９依存性細胞刺激を抑制または低減しつつ、抗原提示を増加させるための方法を提供する。本明細書において説明されるように、特定の修飾された粒子の投与は、免疫刺激ポリヌクレオチドと関連付けられるＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、および／またはＴＬＲ７／８／９依存性細胞応答を抑制しつつ、ＤＣまたはＡＰＣによる抗原提示をもたらす。かかる抑制は、１つ以上のＴＬＲ関連サイトカインのレベルの減少を含み得る。
【００５５】
上で述べられるように、本発明は、Ｍａｃ−１およびＬＦＡ−１媒介障害の処理に有用な生物学的特性を有する、新規の化合物を提供する。
【００５６】
したがって、本発明の別の態様において、カルボキシル化された粒子を含み、任意に、薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物が提供される。ある実施形態において、これらの組成物は、任意に、１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。代替的に、本発明の修飾された粒子は、それを必要とする患者に、１つ以上の他の治療剤の投与と組み合わせて、投与することができる。例えば、本発明の化合物との共同投与、または薬学的組成物への包含のための追加の治療剤は、承認された抗炎症剤であってもよいか、またはそれは、最終的には、無制御な炎症性免疫応答、または細菌もしくはウイルス感染によって特徴付けられる任意の障害の処理に対して承認を得る、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（米国食品医薬品局）において承認段階にあるいくつかの薬剤のうちのいずれであってもよい。本発明の修飾された粒子のうちのいくつかは、処理のために自由形態で、または適切な場合、その薬学的に許容可能な誘導体として、存在することができるということもまた、理解されよう。
【００５７】
本発明の薬学的組成物は、本明細書において使用される際、所望される特定の用量形態に適した、いずれかおよび全ての溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散液、または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、潤滑剤等を含む、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８０）は、薬学的組成物を製剤化する上で使用される種々の担体、およびその調製のための既知の技術を開示する。任意の従来の担体媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を産生するか、またはそうでなければ、薬学的組成物の任意の他の構成要素（複数を含む）と有害に相互作用することによって、本発明の化合物と適合性が無い場合を除き、その使用は、本発明の範囲内にあることが企図される。薬学的に許容可能な担体として機能することができる材料の一部の例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースといった糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンといったデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびセルロースアセテートといった、セルロースおよびその誘導体；粉末化トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬ワックスといった賦形剤；ピーナッツ油、綿実油；サフラワー油、ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油および大豆油といった油；プロピレングリコールといったグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルといったエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムといった緩衝剤；アルギン酸；ピロゲン不含水；等張生理食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝剤溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムといった他の非毒性、適合性潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されず、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、および芳香剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、製剤者の判断に従って、組成物に存在することができる。
【００５８】
経口投与のための液体用量形態としては、薬学的に許容可能なエマルション、ミクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。活性化合物に加えて、液体用量形態は、例えば、水または他の溶媒、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実、ラッカセイ、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物といった、可溶化剤および乳化剤といった、当該技術分野において一般的に使用される、不活性の希釈剤を含有することができる。不活性の希釈剤に加え、経口組成物はまた、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤、甘味剤、着香剤、ならびに芳香剤といった、アジュバントを含むことができる。
【００５９】
注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性もしくは油性懸濁液は、好適な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、既知の技術に従って製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルションであってもよい。採用することができる許容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の固定油が、溶媒または懸濁媒体として、従来、採用される。この目的上、合成モノまたはジグリセリドを含む、いかなる無菌性の固定油も、採用することができる。加えて、オレイン酸といった脂肪酸が、注射剤の調製において使用される。
【００６０】
注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルタを通じた濾過によって、または使用前に、無菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散させることができる、無菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【００６１】
薬物の効果を延長するために、しばしば、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を減速させることが望ましい。これは、液体懸濁液、または難水溶性の結晶性もしくは非晶質材料の使用によって達成することができる。次いで、薬物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、同様に、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。代替的に、非経口的に投与された薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクルに薬物を溶解または懸濁することによって達成される。注射可能なデポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコライドといった生分解性ポリマーに、薬物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率、および採用される特定のポリマーの性質に依存して、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、（ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポーの注射可能な製剤はまた、身体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルションに、薬物を封入することによって、調製することができる。
【００６２】
経口投与のための固体用量形態としては、カプセル、錠剤、ピル、粉末、および顆粒が挙げられる。かかる固体用量形態において、修飾された粒子は、少なくとも１つの不活性の、薬学的に許容可能な、クエン酸ナトリウムもしくは第二リン酸カルシウムといった、賦形剤または担体、ならびに／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸といった、充填剤もしくは増量剤、ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアといった、結合剤、ｃ）グリセロールといった、保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、あるケイ酸塩シリカ、および炭酸ナトリウムといった、崩壊剤、ｅ）パラフィンといった、溶液遅延剤、ｆ）第４級アンモニウム化合物といった、吸収促進剤、ｇ）例えば、セチルアルコール、およびモノステアリン酸グリセロールといった、湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土といった吸収剤、ならびにｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物といった、潤滑剤と、混合される。カプセル、錠剤、およびピルの場合、用量形態はまた、緩衝剤を含むことができる。
【００６３】
同様のタイプの固体組成物もまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等といった、賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルに、充填剤として採用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒の固体用量形態は、薬学的製剤化の技術分野において公知の、腸溶性コーティングおよび他のコーティングといった、コーティングおよびシェルを伴って、調製することができる。それらは、任意に、乳白剤を含有することができ、それらが、活性成分（複数を含む）のみを、または優先的に、腸管のある部分において、任意に、遅延様態で放出する、組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等といった、賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルに、充填剤として採用することができる。
【００６４】
修飾された粒子はまた、上に記載される１つ以上の賦形剤とともに、マイクロカプセル化された形態とすることができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル、および顆粒の固体用量形態は、薬学的製剤化の技術分野において公知の、腸溶性コーティング、放出制御コーティング、および他のコーティングといった、コーティングおよびシェルを伴って、調製することができる。かかる固体用量形態において、活性化合物は、スクロース、ラクトース、およびデンプンといった、少なくとも１つの不活性の希釈剤と混和することができる。かかる用量形態はまた、通常の実践におけるように、不活性の希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースといった、錠剤化潤滑剤および他の錠剤化助剤を含むことができる。カプセル、錠剤、およびピルの場合、用量形態はまた、緩衝剤を含むことができる。それらは、任意に、乳白剤を含有することができ、それらが、修飾された粒子のみを、または優先的に、腸管のある部分において、任意に、遅延様態で放出する、組成物とすることもできる。使用することができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【００６５】
本発明は、本発明の修飾された粒子の薬学的に許容可能な局所製剤を包含する。「薬学的に許容可能な局所製剤」という用語は、本明細書において使用される際、表皮への製剤の塗布によって、本発明の修飾された微粒子の皮内投与に対して薬学的に許容可能である、任意の製剤を意味する。本発明のある実施形態において、局所製剤は、担体系を含む。薬学的に有効な担体としては、溶媒（例えば、アルコール、ポリアルコール、水）、クリーム、ローション、軟膏、油、硬膏、リポソーム、粉末、エマルション、マイクロエマルション、および緩衝溶液（例えば、低張もしくは緩衝生理食塩水）、または局所的に投与する医薬に関して、当該技術分野において既知の任意の他の担体が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知の担体のより完全なリストは、当該技術分野において標準である参考文献の本文、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８０  ａｎｄ  １７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５，  ｂｏｔｈ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．によって提供されており、この開示は、それらの全体として、参照することにより、本明細書に組み込まれる。ある他の実施形態において、本発明の局所製剤は、賦形剤を含むことができる。当該技術分野において既知のいかなる薬学的に許容可能な賦形剤も、本発明の薬学的に許容可能な局所製剤を調製するために使用することができる。本発明の局所製剤に含むことができる賦形剤の例としては、防腐剤、抗酸化剤、保湿剤、皮膚軟化剤、緩衝剤、可溶化剤、他の浸透剤、皮膚保護剤、界面活性剤、および推進剤、ならびに／または修飾された粒子と組み合わせて使用される追加の治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適な防腐剤としては、アルコール、第４級アミン、有機酸、パラベン、およびフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。好適な抗酸化剤としては、アスコルビン酸およびそのエステル、重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、トコフェロール、およびＥＤＴＡのようなキレート剤、ならびにクエン酸が挙げられるが、これらに限定されない。好適な保湿剤としては、グリセリン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、尿素、およびプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明との使用に好適な緩衝剤としては、クエン酸、塩酸、および乳酸緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適な可溶化剤としては、第４級塩化アンモニウム、シクロデキストリン、安息香酸ベンジル、レシチン、およびポリソルベートが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の局所製剤において使用することができる好適な皮膚保護剤としては、ビタミンＥ油、アラトイン（ａｌｌａｔｏｉｎ）、ジメチコーン、グリセリン、ワセリン、および酸化亜鉛が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
ある実施形態において、本発明の薬学的に許容可能な局所製剤は、少なくとも、本発明の修飾された粒子、および浸透増強剤を含む。局所製剤の選択は、処理されるべき状態、本発明の化合物および存在する他の賦形剤の物理化学的特徴、製剤におけるそれらの安定性、利用可能な製造機器、ならびに費用制約を含む、いくつかの要因に依存するであろう。本明細書において使用される際、「浸透増強剤」という用語は、好ましくは、全身吸収をほとんど、もしくは全く伴わずに、薬理学的に活性な化合物を、角質層を通って、表皮または真皮に輸送することが可能な薬剤を意味する。多様な化合物が、皮膚を通じた薬物の浸透速度を増強する上でのそれらの有効性に関して、評価されている。例えば、種々の皮膚浸透エンハンサの使用および試験を調査する、Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ，  Ｍａｉｂａｃｈ  Ｈ．  Ｉ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．  Ｅ．（ｅｄｓ．），  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌａ．（１９９５）、ならびにＢｕｙｕｋｔｉｍｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅａｎｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｐｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇｏｓｈ  Ｔ．  Ｋ．，  Ｐｆｉｓｔｅｒ  Ｗ．  Ｒ．，  Ｙｕｍ  Ｓ．  Ｉ．（Ｅｄｓ．），  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，  Ｉｌｌ．（１９９７）を参照されたい。ある例示的な実施形態において、本発明との使用のための浸透剤としては、トリグリセリド（例えば、大豆油）、アロエ組成物（例えば、アロエベラゲル）、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、オクトリフェニル（ｏｃｔｏｌｙｐｈｅｎｙｌ）ポリエチレングリコール、オレイン酸、ポリエチレングリコール４００、プロピレングリコール、Ｎ−デシルメチルスルホキシド、脂肪酸エステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル、ラウリン酸メチル、モノオレイン酸グリセロール、およびプロピレングリコールモノオレエート）、ならびにＮ−メチルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
ある実施形態において、組成物は、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、またはパッチの形態とすることができる。ある例示的な実施形態において、本発明に従う組成物の製剤は、クリームであり、これは、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、パルミート−オレイン酸、セチルもしくはオレイルアルコール（ステアリン酸が特に好ましい）といった、飽和もしくは不飽和脂肪酸をさらに含有することができる。本発明のクリームはまた、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシ−４０−ステアラートを含有することができる。ある実施形態において、活性構成要素は、無菌状態下で、薬学的に許容可能な担体、および、必要とされ得る際、任意の必要とされる防腐剤または緩衝剤と、混和される。眼科製剤、点耳剤、および点眼剤もまた、本発明の範囲内にあるとして企図される。さらに、本発明は、身体への化合物の制御された送達を提供する付加的利点を有する、経皮パッチの使用を企図する。かかる用量形態は、適切な媒体に化合物を溶解または分散することによって作製される。上で述べられるように、浸透増強剤もまた、皮膚にわたる化合物の流動を増加させるために使用することができる。速度は、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリクスもしくはゲルに化合物を分散することのいずれかによって、制御することができる。
【００６８】
修飾された粒子は、エアロゾルによって投与することができる。これは、修飾された粒子を含有する、水性エアロゾル、リポソーム調製物、または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フッ化炭素推進剤）懸濁液が使用され得る。
【００６９】
通常、水性エアロゾルは、薬剤の水溶液または懸濁液を、従来の薬学的に許容可能な担体および安定剤とともに製剤化することによって作製される。担体および安定剤は、特定の化合物の要件によって変化するが、典型的に、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、もしくはポリエチレングリコール）、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンといったアミノ酸のような、無害タンパク質、緩衝剤、塩、糖、または糖アルコールが挙げられる。エアロゾルは、一般的に、等張溶液から調製される。
【００７０】
本発明の修飾された粒子および薬学的組成物は、組み合わせ療法において、製剤化および採用することができる、即ち、化合物および薬学的組成物は、１つ以上の他の所望の治療剤または医学的手技とともに製剤化することができる、またはそれと同時に、その前に、もしくはその後に投与することができるということもまた、理解されよう。組み合わせレジメンにおいて採用するための、療法（治療剤もしくは手技）の特定の組み合わせは、所望の治療剤および／または手技、ならびに達成されるべき所望の治療効果の適合性を考慮に入れる。採用される療法は、同じ障害に対して所望の効果を達成することができるか（例えば、本発明の化合物は、別の抗炎症剤と同時に投与することができる）、または異なる効果を達成することができる（例えば、任意の有害効果の制御）ということもまた、理解されよう。
【００７１】
ある実施形態において、本発明の修飾された粒子を含有する薬学的組成物は、１つ以上の追加の治療的に活性な成分（例えば、抗炎症および／または緩和）をさらに含むことができる。本発明の目的上、「緩和」という用語は、疾患の症状および／または治療レジメンの副作用の軽減に焦点を当てるが、治癒的ではない、処理を指す。例えば、緩和処理は、鎮痛剤、嘔吐抑制剤、および抗病薬を包含する。
【００７２】
本発明は、個体、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトにおいて、免疫応答を調整する方法を提供し、個体に、本明細書において説明される修飾された粒子を投与することを含む。本発明によって提供される免疫調整の方法は、免疫刺激ポリペプチド、またはウイルスもしくは細菌構成要素によって刺激される免疫応答を含むが、これらに限定されない、自然免疫応答または適応免疫応答を抑制および／または阻害するものを含む。
【００７３】
修飾された粒子は、免疫応答を調整するのに十分な量で投与される。本明細書において説明されるように、免疫応答の調整は、体液性および／または細胞性であり得、当該技術分野における、および本明細書において説明される、標準的技術を使用して測定される。
【００７４】
ある実施形態において、個体は、アレルギー性疾患または状態、アレルギーおよび喘息といった、望ましくない免疫活性化と関連付けられる障害に罹患する。アレルギー性疾患または喘息を有する個体は、既存のアレルギー性疾患または喘息の認識可能な症状を有する個体である。
【００７５】
ある実施形態において、個体は、アテローム性動脈硬化症、虚血再潅流傷害、および心筋梗塞といった、望ましくない免疫活性化と関連付けられる障害に罹患する。
【００７６】
ある実施形態において、個体は、自己免疫疾患および炎症性疾患といった、望ましくない免疫活性化と関連付けられる障害に罹患する。自己免疫疾患または炎症性疾患を有する個体は、既存の自己免疫疾患または炎症性疾患の認識可能な症状を有する個体である。
【００７７】
自己免疫疾患は、臓器特異的および全身性という、２つの大きなカテゴリに分類することができる。自己免疫疾患としては、これらに限定することなく、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、早発閉経といった免疫媒介不妊症、強皮症、シェーグレン病、白斑、脱毛症（禿頭症）、多腺性不全、グレーブス病、甲状腺機能低下症、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と関連付けられるものを含む自己免疫肝炎、下垂体機能低下症、移植片対宿主疾患（ＧｖＨＤ）、心筋炎、アジソン病、自己免疫皮膚疾患、ブドウ膜炎、悪性貧血、ならびに副甲状腺機能低下症が挙げられ得る。
【００７８】
自己免疫疾患としてはまた、これらに限定することなく、橋本甲状腺炎、Ｉ型およびＩＩ型自己免疫多腺性症候群、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ病、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、妊娠性類天疱瘡、瘢痕性類天疱瘡、本態性混合型クリオグロブリン血症、小児慢性水疱性疾患、溶血性貧血、プラーク減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、自己免疫好中球減少症、重症筋無力症、イートン・ランバート筋無力症症候群、スティフマン症候群、急性播種性脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、伝導ブロックを伴う多巣性運動ニューロパチー、単クローングロブリン血症を伴う慢性ニューロパチー、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、小脳変性症、脳脊髄炎、網膜症、原発性胆管硬化症、硬化性胆管炎、グルテン過敏性腸疾患、強直性脊椎炎、反応性関節炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、混合性結合組織疾患、ベチェット症候群、乾癬、結節性多発動脈炎、アレルギー性脈管炎および肉芽腫症（チャーグ・ストラウス病）、多発性血管炎重複症候群、過敏性血管炎、ウェーゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、高安動脈炎、川崎病、中枢神経系の孤立性血管炎、閉塞性血栓血管炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、ならびに寒冷症が挙げられ得る。これらの状態は、医学的技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  １４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｆａｕｃｉ  Ａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  １９９８において説明される。
【００７９】
自己免疫疾患の研究のための動物モデルは、当該技術分野において既知である。例えば、ヒト自己免疫疾患に最も類似すると考えられる動物モデルには、高い発生率の特定の疾患を自発的に発症する動物株が含まれる。かかるモデルの例としては、１型糖尿病に類似の疾患を発症する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、ならびにＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄハイブリッド、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ、およびＢＸＳＢマウスといった、狼瘡様疾患になりやすい動物が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患が誘導されている動物モデルとしては、多発性硬化症に対するモデルである実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、関節リウマチに対するモデルであるコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）、およびブドウ膜炎に対するモデルである実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患に対する動物モデルはまた、遺伝子操作によっても創出されており、例えば、炎症性腸疾患に対するＩＬ−２／ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＳＬＥに対するＦａｓまたはＦａｓリガンドノックアウト、および関節リウマチに対するＩＬ−１受容体拮抗薬ノックアウトが挙げられる。
【００８０】
ある実施形態において、個体は、細菌またはウイルス感染に罹患する。細菌またはウイルス感染を有する個体は、既存の細菌またはウイルス感染の認識可能な症状を有する個体である。
【００８１】
本発明の修飾された粒子で処理可能なウイルス感染の非限定的なリストには、ヘルペスウイルス感染、肝炎ウイルス感染、西ナイルウイルス感染、フラビウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染、パピローマウイルス感染、パラミクソウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、およびレトロウイルス感染が含まれる。好ましいウイルスは、対象の中枢神経系に感染するそれらのウイルスである。最も好ましいウイルスは、脳炎または髄膜炎を引き起こすものである。
【００８２】
本発明の修飾された粒子で処理可能な細菌感染の非限定的なリストには、ブドウ球菌感染、連鎖球菌感染、マイコバクテリア感染、バチルス感染、サルモネラ感染、ビブリオ感染、スピロヘータ感染、およびナイセリア感染が含まれる。対象の中枢神経系に感染する細菌が好ましい。脳炎または髄膜炎を引き起こす細菌が、最も好ましい。
【００８３】
一部の実施形態において、本発明は、疾患の開始前の本発明の組成物の使用に関する。他の実施形態において、本発明は、疾患の進行を阻害するための本発明の組成物の使用に関する。一部の実施形態において、本発明は、対象における疾患の改善に関する。対象における疾患の改善とは、対象における疾患の処理、予防、または抑制を意味する。
【００８４】
一部の実施形態において、本発明は、疾患の再発の予防に関する。例えば、望ましくない免疫応答は、ペプチドの１つの領域（抗原決定基といった）において生じ得る。望ましくない免疫応答と関連付けられる疾患の再発は、ペプチドの異なる領域において免疫応答攻撃を受けることによって生じ得る。本発明のカルボキシル化された粒子は、付着ペプチドまたは抗原性部分を含まないため、粒子は、複数のエピトープに対して有効であろう。ＭＳおよび他のＴＨ１／１７媒介自己免疫疾患を含む、一部の免疫応答障害におけるＴ細胞応答は、動的であり得、再発寛解型および／または慢性進行性疾患の経過中に進展し得る。疾患が進行するにつれて、標的が変化する可能性があるため、Ｔ細胞レパートリの動的性質は、ある疾患の処理に対する影響を有する。これまで、疾患の進行を予測するために、応答のパターンの既存の知識が必要であった。本発明は、動的に変化する疾患の効果である、「エピトープスプレッディング」の機能を阻止することができる、組成物を提供する。再発に対する既知のモデルは、多発性硬化症（ＭＳ）に対するモデルとしての、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）への免疫反応である。初期免疫応答は、ＰＬＰ１３９−１５１への応答によって生じ得る。その後の疾患の開始は、ＰＬＰ１５１−１７１への再発免疫応答によって生じ得る。
【００８５】
本発明のある実施形態は、望ましくない過敏性に関する病理学的状態の処理に関する。過敏性は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ型のうちのいずれかであり得る。即時型（Ｉ型）過敏性。投与の頻度は、典型的に、アレルゲン曝露のタイミングに対応する。好適な動物モデルは、当該技術分野において既知である（例えば、Ｇｕｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．  １４６：３６９，  １９９２、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３９，  ２０５５，  １９９６、および国際公開第ＷＯ９６／３５４１８号）。
【００８６】
本発明の他の実施形態は、移植に関する。これは、ドナー個体からレシピエント個体への組織試料または移植片の移動を指し、組織によって提供される生理学的機能を回復させるために、組織を必要とするヒトレシピエントにおいて、頻繁に実施される。移植される組織には、腎臓、肝臓、心臓、肺といった全臓器；植皮および目の角膜といった臓器構成要素；ならびに骨髄細胞、および骨髄または循環血液から選択および拡大される細胞の培養物といった、細胞懸濁液、ならびに全血輸血が含まれる（が、これらに限定されない）。
【００８７】
任意の移植の重大な潜在的な合併症は、宿主レシピエントと移植された組織との間の抗原性相違から生じる。相違の性質および程度に依存して、宿主による移植片の、もしくは移植片による宿主の免疫学的攻撃のリスクが存在し得るか、またはその双方が生じ得る。リスクの程度は、同様の表現型を有する同様に処理された対象の集団における応答パターンを追跡すること、および十分に許容された臨床的手技に従って、種々の可能な寄与因子を相関させることによって、判定される。免疫学的攻撃は、既存の免疫学的応答（事前形成された抗体といった）、または移植の頃に開始されるもの（ＴＨ細胞の生成といった）の結果であり得る。抗体、Ｔヘルパー（ＴＨ）細胞、または細胞毒性Ｔ（Ｔｃ）細胞は、相互との、ならびに種々のエフェクタ分子および細胞との任意の組み合わせにおいて関与し得る。しかしながら、免疫応答に関与する抗原は、一般的に不明であり、したがって、抗原特異的療法を設計する、または抗原特異的寛容を誘導する上での難題を提起する。付着ペプチドまたは抗原は、寛容を誘導する、または炎症性免疫応答を改善する上で、粒子を有効なものとするために、修飾された粒子に共役される必要がないため、本発明の修飾された粒子は、臓器の拒絶を予防する上で特に有用である。
【００８８】
本発明のある実施形態は、レシピエントによる組織移植片の拒絶につながる、宿主対移植片疾患のリスクの減少に関する。処理は、超急性、急性、または慢性拒絶応答の効果を予防または低減するために実施することができる。処理は、移植片が取り付けられる時に、寛容が整った状態となるように、移植の十分にずっと前に優先的に開始されるが、これが可能ではない場合、処理は、移植と同時に、またはその後に開始することができる。開始の時間にかかわらず、処理は、一般的に、移植後の少なくとも最初の１ヶ月間は、一定の間隔で継続する。移植片の十分な順応が生じる場合、追跡の投薬は必要ない場合があるが、移植片の拒絶または炎症のいずれかの証拠が存在する場合、再開することができる。当然のことながら、本発明の寛容化手技は、さらにより低いレベルのリスクを達成するように、他の形態の免疫抑制と組み合わせることができる。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は、本発明の利点および特性をさらに例解するために提供されるが、本開示の範囲を限定することは意図されない。
【００９０】
材料および方法
ウイルス繁殖
【００９１】
以前に説明されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０３  ：１０１９，  ２００７）、西ナイルウイルス（Ｓａｒａｆｅｎｄ株）は、新生仔マウスの脳に由来し、細胞あたり５つのプラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染の多重度において、コンフルエントなベロ細胞単層に感染するように使用した。細胞を、３７℃で４０時間、ウイルスとともにインキュベートし、その後、それらを、凍結した。次いで、フラスコを解凍し、ウイルスに富んだ上清を遠心分離によって清澄し、その後、アリコートを、使用するまで−７０℃で保存した。
【００９２】
マウスおよび感染
【００９３】
８から１２週齢のメスＣ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２）およびコンジェニックＢ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１）マウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。Ｃ５７ＢＬ／６−７．２ｆｍｓ−ＥＧＦＰトランスジェニック（ＣＤ４５．２）マウスは、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。全ての手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの許可を得て実施した。全ての動物は、ヘパフィルタトップケージにおいて、クラスＩＩの生体有害状態下で飼育した。食餌および水は、自由裁量で提供した。
【００９４】
高用量鼻腔内感染は、無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）中の６×１０４ＰＦＵのＷＮＶを用いて、以前に説明されるように行った。低用量感染に関しては、マウスに、６×１０３ＰＦＵのＷＮＶを接種した。擬似感染は、マウスに無菌ＰＢＳのみを接種することによって行った（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０３：１０１９，  ２００７、Ｗａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１：８６０，  ２００７）。
【００９５】
マウスは、感染後、１日２回計量した。マウスは、４０ｍｌの氷冷ＰＢＳを使用した心臓潅流によって、麻酔下で殺処理した。組織学に関して、マウスは、ＰＢＳ中の２０ｍｌの４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）でさらに潅流された。
【００９６】
ウイルス力価を判定するためのプラークアッセイ
【００９７】
組織試料における生ウイルスの力価を判定するために、ウイルス感受性のＢＨＫ細胞（Ｇｕｎａ  Ｋａｐｕｒｉａｈ，  Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｔｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，  Ｃａｎｂｅｒｒａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａの好意により提供）を使用したプラークアッセイを採用した。以前に説明されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０３：１０１９，  ２００７）、組織試料は、動物から切除され、パワーホモジナイザ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅａｒｏｒ，  Ｂｉｏｓｐｅｃ，  Ｂａｒｔｌｅｓ，  ＯＫ，  ＵＳＡ）で解離した。簡潔に述べると、清澄されたホモジネートの５倍希釈物を、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０培地（ＲＰＭＩ；ＣＳＬ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において調製し、６ウェルプレート（２ｍＬのＲＰＭＩに終夜播種された１×１０６細胞）において、コンフルエントなＢＨＫ細胞に感染させるために使用した。
【００９８】
細胞を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、接種材料を、吸引によって除去した。ウェルを、２Ｘ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）中の３ｍｌの１．５％（ｗ／ｖ）低温ゲル化Ａｇａｒｏｓｅ  ＩＩ（Ａｍｒｅｓｃｏ，  Ｓｏｌｏｎ，  ＯＨ，  ＵＳＡ）で上塗りした。細胞を、３７℃でさらに３日間インキュベートし、その後、それらを、アガロースプラグ除去前に、２時間、３ｍｌの１０％  ホルマリン（Ｃｏ．）で固定した。２０％メタノール（Ｆｒｏｎｉｎｅ，  Ｒｉｖｅｒｓｔｏｎｅ，  ＮＳＷ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中の３％クリスタルバイオレット（Ｈｏｐｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｅｓｓｅｘ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）染料溶液を使用して、固定された細胞を染色した。プラークは、コロニー計数器（ＩＵＬ  Ｓ．  Ａ．，  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，  Ｓｐａｉｎ）を使用して計数し、１グラム（組織）あたりの最終ＰＦＵを、プラークの数、接種材料の体積、および試料希釈を因数分解することによって判定した。
【００９９】
キメラマウスの生成
【０１００】
以前に説明されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０３：１０１９，  ２００７）、６から８週齢のＢ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１）マウスを、９５０ｒａｄの１線量で照射した。１２時間後、マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６−７．２ｆｍｓ−ＥＧＦＰドナーからの１０７の骨髄細胞で再構成した。マウスには、照射後、１０日間、飲料水中にスルファメトキサゾール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を与えた。マウスを、上で説明されるように、照射の６週後に、ＷＮＶに感染させた。キメラ化は、フローサイトメトリを使用してチェックし、以前に実証されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  １０３：１０１９，  ２００７）、常にドナー起源の９６〜９９％であることが見出された。
【０１０１】
ビーズの静脈内注射
【０１０２】
０．５、０．０５、および３μｍのＦＩＴＣまたはＢｒｉｇｈｔ  Ｂｌｕｅ（ＢＢ）Ｆｌｏｕｒｅｓｂｒｉｔｅの裸およびカルボキシル化されたポリスチレンビーズは、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ，  ＵＳＡから入手した。ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）の裸およびカルボキシル化されたビーズは、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｘ，  ＭＡ，  ＵＳＡから入手した。
【０１０３】
ビーズを無菌ＰＢＳ中に希釈し、３００μｌを、感染させた、または擬似感染させたマウスの尾静脈に、静脈内注射した。高用量の生存研究（６×１０４ＰＦＵのＷＮＶ鼻腔内）に関して、マウスには、感染後６日目から開始した、毎日１用量のビーズを与えた。必要とされる場合、マウスには、体重が再安定化するまで、毎日、さらなる注射を与えた。低用量の生存研究（６×１０３ＰＦＵのＷＮＶ鼻腔内）に関して、マウスには、感染後６日目から、または有意な体重減少が記録された時（総体重の４〜６％）のいずれかに、ビーズを注射した。マウスには、５日間、または体重が再安定化するまで、３００ｕｌのビーズを１日１回注射した。組織収集に関して、６×１０４または６×１０３で感染させたマウスに、感染後６日目、または有意な体重減少が記録された時のいずれかに、３００μｌのビーズを注射し、必要とされる時に抜粋した。臓器は、以下で説明されるように、免疫組織化学、フローサイトメトリ、プラークアッセイ、およびサイトカイン分析に関して採取された。
【０１０４】
免疫組織学
【０１０５】
蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）は、Ｃ５７ＢＬ／６およびｃＦＭＳ−ＥＧＦＰ（Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐ３ｂ／ＢｏｙＪへ）キメラから収集された、脳、脾臓、肝臓、肺、および腎臓において行った。灌流後、臓器を、４時間、４℃の４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次いで、Ｏｐｔｉｍｕｍ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＯＣＴ；Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ，  Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）中で凍結する前に、３０％スクロース中に終夜浸漬した。８ミクロンの組織切片を、クリオスタット・ミクロトーム上で切断し、空気乾燥させた。蛍光ＩＨＣは、製造元の取扱説明書に従って使用される、チラミドベースの増幅系（ＴＳＡ  ｋｉｔ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）の付加を伴って、以前に説明されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２９：２３１９，  ２００７）実施した。組織切片は、視覚化の前に、ＤＡＰＩ−ａｎｔｉ  ｆａｄｅ（Ｖｅｃｔｏｒ）で対比染色した。
【０１０６】
顕微鏡および画像取得
【０１０７】
画像は、ＤＰ−７０カメラおよびＤＰマネージャ２．２．１ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，  Ｊａｐａｎ）上で取得した。
【０１０８】
脳および肝臓からの白血球の単離
【０１０９】
以前に説明されるように（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２９：２３１９，  ２００７）、白血球は、デオキシ−リボヌクレアーゼ（０．００５ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびコラゲナーゼＩＶ（０．０５ｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＰＢＳ中で、３７℃で６０分間、脳を消化することによって、ＰＢＳ灌流マウスの脳から得た。消化を、１０％ＦＣＳで停止させ、ホモジネートを、７０μｍナイロン細胞濾し器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）に通過させた。３４０ｘｇでの１０分の遠心分離後に得たペレットを、３０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｎｏｒｗａｙ）中に再懸濁し、８０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ上で層にした。白血球を、室温で２５分間の１１４０ｘｇでの遠心分離後、３０％／８０％界面から収集した。同じプロトコルをまた、白血球を肝臓から得て、処理前に組織を計量するために、使用する。
【０１１０】
脾臓、血液、および骨髄からの白血球の単離
【０１１１】
フローサイトメトリ分析のために、右大腿を切除し、骨髄細胞を、ＰＢＳ充填注射器を使用して洗い流した。骨髄前駆体の単離のために、少なくとも４匹のマウスからの大腿および脛骨を利用した。洗い流しの後に達成された細胞懸濁液を、７０μｍの細胞濾し器を通して濾過し、３４０ｇで５分間遠心分離した。得られたペレット中の赤血球を、３４０ｘｇでの５分間の遠心分離の前に、ＮＨ４Ｃｌベースの赤血球溶解緩衝剤（ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（商標）；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で溶解した。末梢血液の場合、血液は、心穿刺を介して収集し、クエン酸緩衝剤（ｍＭｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｒｉｃｈ）に直ちに移した。得られた懸濁液を、７０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ上で層にし、ブレーキはオフにして、室温で２０分間、１１４０ｘｇで遠心分離した。界面を収集し、細胞を一度、ＰＢＳで洗浄し、３４０ｘｇで遠心分離した。脾臓の白血球の単離のために、脾臓を、７０７０μｍの細胞濾し器に通過させ、３４０ｇで５分間、遠心分離した。得られたペレット中の赤血球を、３４０ｘｇでの５分間の遠心分離の前に、ＮＨ４Ｃｌベースの赤血球溶解緩衝剤（ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（商標）；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で溶解した。
【０１１２】
フローサイトメトリ
【０１１３】
脳、肝臓、血液、および骨髄から（上で説明されるように）収集された細胞をＰＢＳで洗浄し、抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で遮断した。生存細胞は、トリパンブルー排除法を使用して計数し、これは、通常、＞９５％の細胞生存能力を示した。
【０１１４】
細胞表面分子発現を測定し、細胞分別を、アルゴンイオンおよびＨｅＮｅレーザを具備する、ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で行った。生存集団は、前方および側方散乱によってゲートし、識別された蛍光集団を、その後の前方ゲートによって判定した。分別は、関心対象の集団を識別する特定の蛍光および散乱パラメータを使用して、行った。分別の厳密性は、骨髄集団に対して＞９８％純度を達成するための純度に設定した。
【０１１５】
取得したＦＡＣＳデータファイルは、フローサイトメトリプログラムである、Ｆｌｏｗ  Ｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）を使用して分析した。関心対象の細胞集団の定量化は、分析時のフローサイトメトリの割合（％）、および各臓器からの絶対細胞数に基づいて計算した。
【０１１６】
養子移入
【０１１７】
Ｌｙ６Ｃｈｉ／ｃＦＭＳ−ＥＧＦＰ＋／ＣＤ１１ｂ＋およびＬｙ６Ｃｌｏ／Ｃｆｍｓ−ＥＧＦＰ＋／ＣＤ１１ｂ＋集団の双方を、６日目の鼻腔内にＷＮＶに感染させたマウスから分類した。Ｌｙ６ＣｈｉＢＭは、１０ｍＭのｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅ（ＣＭＴＭＲ［５−（および−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン）−混合異性体；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。分別された細胞を遠心分離し、１０μＭのＣＭＴＭＲを含有する１ｍｌのＰＢＳですすいだ。反応を１０％のＦＣＳで停止する前に、細胞を、１０分間染色した。細胞を５０ｍｌのＰＢＳで少なくとも３回洗浄した。次いで、標識されたＣＭＴＭＲ  Ｌｙ６ＣｈｉＢＭ細胞を、１：１でＬｙ６Ｃｌｏ細胞と混合し、これを、ＣＭＴＭＲの添加を除き、Ｌｙ６Ｃｈｉ集団と同様に処理した。合計２×１０６のＢＭ細胞を、６．５日目のＷＮＶに感染させた、または擬似感染させたＬｙ５．１−Ｃ５７ＢＬ／６コンジェニックマウスのいずれかに静脈注射した。この直後に、３００ｕｌのＢＢポリスチレンビーズの静脈内注射を行った。１２時間後、脳、脾臓、および肝臓を、上で説明されるように採取した。ドナー細胞の存在は、ｃＦＭＳ−ＥＧＦＰおよびＣＭＴＭＲ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｋｅｒ  ｏｒａｎｇｅの双方を使用して、フローサイトメトリを使用して調査した。
【０１１８】
多重ＥＬＩＳＡ
【０１１９】
多重化されたプレートＥＬＩＳＡは、製造元の取扱説明書（Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌｏｇａｎ，  Ｕｔａｈ，  ＵＳＡ）に従って実施した。簡潔に述べると、脳、脾臓、および肝臓組織は、ＰＢＳ中で均質化し、１０００ｘｇのスピンによって清澄し、アッセイが実施されるまで、−２０℃で保管した。血清試料もまた使用した。解凍された試料および標準物を、提供された緩衝剤中で希釈し、各々の３０μｌを、特定の可溶性タンパク質に対する捕捉抗体を各々含有する１６のスポットを含有する各ウェルにプレートした。次いで、プレートを、１２０ｒ．ｐ．ｍ．の軌道振盪器上で、１時間、インキュベートした。プレートを３回洗浄し、検出抗体の３０μｌを、各ウェルに添加し、さらに１時間インキュベートした。３回洗浄した後、ストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰを添加し、さらに１５分間インキュベートした。次いで、プレートを６回洗浄し、基質混合物を添加した。プレートをＣＣＤ撮像器（Ｋｏｄａｋ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ，  ＵＳＡ）上で直ちに読み取った。プレート画像は、Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｑ−ｖｉｅｗソフトウェア（Ｑｕａｎｓｙｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０１２０】
実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）の誘導および評価
【０１２１】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｇのＭＯＧペプチド（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；Ａｕｓｐｅｐ，  Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，  Ｖｉｃｔｏｒｉａ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａ；＞９５％ＨＰＬＣ精製）、および２ｍｇ／ｍＬのヒト型結核菌（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄのアジュバントを含有するエマルションを皮下注射した。２日後、マウスに、感染後、５００μｌの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を投与した。マウスを、疾患進行に関して監視し、以下のスケールで等級分けした：１、尻尾のひきずりおよび／または１本の後肢の弱化；２、２本以上の肢の弱化、歩行障害；３、１本の肢におけるまひ；４、２本以上の肢におけるまひ、失禁；５、瀕死。
【０１２２】
チオグリコレート誘導される腹膜炎の誘導
【０１２３】
腹膜炎の誘導は、ＰＢＳ中に溶解された１ｍｌのチオグリコレート（４％（ｗ／ｖ）；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｒｉｃｈ）の注射によって実施した。頸椎脱臼によって殺処理されたマウスにおいて、腹腔内洗浄を実施した。簡潔に述べると、５ｍｌの腹膜洗浄緩衝剤（ＰＬＢ；ヘパリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を９．９単位／ｍｌ含む０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｆｒｏｎｉｎｅ）を含有するＰＢＳ）を、腹膜に注射した。ＰＬＢを１０ｍｌの注射器に吸引する前に、腹膜をやさしくマッサージした。このプロセスを、２回繰り返した。次いで、洗浄液をＰＬＢ中の５０ｍｌに上昇させ、５分間３４０ｘｇでスピンした。細胞は、上で説明されるように、フローサイトメトリのために調製された。
【０１２４】
統計
【０１２５】
グラフを作成し、コンピュータ化された統計的分析をＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＩｎＳｔａｔにおいて、それぞれ実施した（双方のプログラムは、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡより）。データに依存して、不対両側Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定、またはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを実施し、Ｐ＜０．０５が、有意と見なされた。
体重減少、浸潤、およびウイルス力価といったパラメータ間の相関分析に関して、二次多項式（Ｙ＝Ａ＋Ｂ＊Ｘ＋Ｃ＊Ｘ＾２）とともに非線形回帰（曲線適合）を使用した。
【０１２６】
（実施例１）
ＷＮＶ脳炎の高および低用量モデルの特徴付け
【０１２７】
６×１０４のＰＦＵのＷＮＶ鼻腔内投与によるＣ５７ＢＬ／６マウスの高用量感染は、感染後７日目において、１００％の死亡率をもたらす（図１Ａ）。循環Ｌｙ６ｃｈｉ単球前駆体に由来することを、我々が先で示した、マクロファージおよび移入ミクログリア（Ｇｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２９：２３１９，  ２００７）は、感染後５日目からＷＮＶに感染させた脳を浸潤する。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および好中球もまた、この時点から中枢神経系に進入し、浸潤のピークは、感染後７日目に見られる（図１Ｆ〜Ｈ、図２Ａ〜Ｄ）。脳ウイルス力価もまた、感染後５日目から指数関数的に増加し、感染後７日目に高いレベルに達し（図１Ｃ）、感染したマウスの体重は、感染後５日目から死亡するまで、有意に減少する（図１Ｂ）。
【０１２８】
１０倍少ないウイルス、即ち、６×１０３のＰＦＵの鼻腔内投与によるマウスの接種は、亜致死的転帰をもたらす。独立した実験と比較した時、４０〜６０％の範囲である、いくらかの変動性が生じるが（図１Ａ）、しかしながら、体重減少の割合（％）と、ウイルス力価／浸潤との間の強い相関が、一貫して示された（図１Ｂ〜Ｈ、図２Ａ〜Ｅ）。マウスの体重の毎日の監視は、個体における感染の転帰を予測するための信頼性のある方法であることが証明されており、感染から生存するために、マウスが介入を必要とする時を示す（図１Ｂ）。
【０１２９】
６×１０３のＷＮＶによる接種後、体重が減少しないマウスは、感染に屈せず、６×１０４によるその後の再感染に免疫がある（図１Ａ〜Ｂ）。これらのマウスは、体重減少を含む、初期感染または高用量の再感染後の病気のいかなる症状も示さない。反対に、擬似感染させた対照の正常な変動（通常、２４時間の期間において体重の＞４％）と比較して、有意な量の体重が減少するマウスは、死亡が生じる前の典型的に２〜３日間、体重が減少し続ける。脳炎のこのモデルにおいて、感染に屈する大半のマウスは、感染後６〜１１日目の間に体重が減少し始め、感染後１６日目前に死亡が生じる。これらのマウスは、ＴＯＤにおいて、脳における高いウイルス力価を示し、６×１０４に感染させた７日目のマウスに相当する（図１Ｃ）。
【０１３０】
６×１０４および６×１０３に感染させたマウスの脳における白血球浸潤を比較するフローサイトメトリは、感染後７日目の体重減少の割合（％）が、全白血球（図１Ｆ）、マクロファージ（図１Ｈ）、移入ミクログリア（図２Ａ）、Ｔ細胞（図２Ｃ）、およびＮＫ細胞（図２Ｅ）の浸潤と強く相関することを明らかにし、一部の相関が、体重減少と好中球移入との間で示された（２Ｄ）。驚くべきことではないが、この集団は、脳の常在ミクログリアを主に含んでいるため、ＣＤ４５ｌｏミクログリアの数は、全てのマウスにおいて比較的未変化のままであった（図２Ｂ）。
【０１３１】
低用量の感染モデルをさらに調査するために、６×１０３に感染させたマウスを毎日計量し、０〜１４日目に殺処理し、脳を、フローサイトメトリおよびプラークアッセイのために採取した。一部の相関が、殺処理時の体重減少の割合（％）と、ウイルス力価（図２Ｆ）、または白血球浸潤（図２Ｇ）との間に示された。しかしながら、ウイルス力価と白血球浸潤との間の比較は、一部のマウスが、有意な浸潤を伴わずに高いウイルス力価を有したこと（図２Ｈ）、ならびに、これらのマウスのうち、有意な量の体重を減少したものもあった一方で、減少しなかったものもあった（図２Ｆ）ということを明らかにした。マウスは、脳におけるウイルス力価を判定するために殺処理されなければならないため、有意な体重減少または白血球浸潤を伴わずに、脳においてウイルスを有するこれらのマウスが、体重減少もしくは浸潤を示すことなくウイルスを一掃するかどうか、または見られる高いウイルス力価が、脳の浸潤／体重減少に先行するかどうかは、不明確である。
【０１３２】
（実施例２）
カルボキシル化されたビーズ処理は、ＷＮＶ脳炎の高および低用量モデルにおける生存を有意に改善する
【０１３３】
蛍光ビーズは、疾患の種々の生体内モデルにおける、単球サブセットの移動を追跡するために、文献内で頻繁に使用されている。しかしながら、これらの研究は、これらの理論的に「不活性の」ビーズが、単球機能に、および結果として、疾患の転帰に及ぼし得る、潜在的な影響を見逃す。
【０１３４】
ＷＮＶ感染中の単球を追跡する試行において、我々は、裸、およびカルボキシル化されたポリスチレンビーズの双方を使用し、疾患の経過における予想外の改変を見出した。以下のデータは、裸およびカルボキシル化されたポリスチレンビーズの双方が、免疫細胞による脳の浸潤を有意に低減し、感染したマウスの長期生存を促進するということを明らかにする。
【０１３５】
静脈内投与の感染後６日目における、３００μｌのＰＢＳ中の４．４１×１０９の０．５μｍのカルボキシル化されたポリスチレンビーズによる、６×１０４のＷＮＶに感染させたマウスの注射は、この疾患の致死的モデルにおいて、マウスの１０％の長期生存をもたらした（図３Ａ）。生存転帰が改善され得るかどうかを確かめるために、我々はまた、感染後６日目に、より低い用量の６×１０３に感染させたマウスに、この同じ濃度のビーズを注射した。しかしながら、この戦略は、ＰＢＳで処理した対照と比較した際、処理されたマウスの生存を低減した（図３Ｂ）。これらの結果は、ビーズが、治療的に、即ち、我々が、高いウイルス力価および白血球集団による脳の浸潤を示す（図１、２を参照されたい）ことを示した、マウスが最初に有意な体重減少を示す時に、投与される必要があるということを強調する。
【０１３６】
したがって、我々は、低用量感染モデルにおけるビーズ投与に、治療的手法を採用した。マウスは毎日計量し（図３Ｅ〜Ｇ）、４．４１×１０９のカルボキシル化されたポリスチレンビーズは、有意な体重減少が２４時間の期間内に検出された場合（通常、擬似感染させた対照の正常な変動と比較した際、総体重の＞４％）、投与した。この戦略を使用して、我々は、通常、体重が減少し続け、介入無しでは死亡するであろうマウスの生存を、６０％（独立した実験において４０〜８０％）増加させることができた（図３Ｄ）。予想されたとおり、体重が減少し、ＰＢＳで処理された、全てのマウスは、体重が減少し続け、２〜４日後に死亡した（図３Ｅ、Ｇ）。いずれの時においても有意な量の体重が減少しなかったマウスは、ＰＢＳに感染させた対照と同様の体重の安定性を示した（図３Ｅ〜Ｆ）。
【０１３７】
マウスは、有意な体重減少の初期検出後、連続５日間、カルボキシル化されたビーズで処理した。一部のマウスにおいて、５日間のビーズ処理は十分であり、体重は、ビーズ注射を中止した後、安定化したままであり、これらのマウスは、さらなる介入無しで、感染から生存し続けた（図４Ａ〜Ｂ）。しかしながら、一部のマウスは、５日目でビーズ処理を中止した後、再び体重が減少し始め、そのため、体重が再び安定化するまで処理を再開し、これらのマウスもまた、長期生存した（図４Ｃ〜Ｄ）。
【０１３８】
フローサイトメトリは、有意な体重減少が感染後８日目に検出された時、カルボキシル化されたポリスチレンビーズまたはＰＢＳのいずれかで処理された、６×１０３のＷＮＶに感染させたマウスの脳において、感染後９日目に行った。体重が減少しなかったマウスもまた、実験のための対照として、８日目にビーズまたはＰＢＳで処理した。図４Ｄ〜Ｌに示されるように、感染後８日目には体重が減少しなかったが、ビーズ（図４Ｈ〜Ｉ）またはＰＢＳで処理された（図４Ｄ〜Ｅ）マウスは、単球由来のマクロファージもしくは移入ミクログリア、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または好中球による脳の浸潤は示さず、単離された主要な集団は、ＣＤ４５ｌｏ／ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋常在ミクログリアであった。感染後８日目に体重が減少し、ＰＢＳで処理されたマウスにおいて、脳の大規模な浸潤が、感染後９日目に顕著であり（図４Ｆ〜Ｇ）、主要な集団は、ＣＤ４５ｈｉ炎症性単球由来マクロファージ（図４Ｌ）であった。しかしながら、感染後８日目に体重が減少し、ビーズで処理されたマウスにおいて、有意な浸潤物が依然として存在したが、ＰＢＳで処理したマウスと比較して大幅に低減された（図４Ｊ〜Ｌ）。体重減少後、ビーズまたはＰＢＳで処理された、１０３に感染させたマウスのフローサイトメトリは、マウスが、感染後６〜１４日目にわたって、ビーズで処理される時に、浸潤の低減が生じるということを示すために、繰り返される必要がある。
【０１３９】
（実施例３）
ビーズのカルボキシル化は、ＷＮＶに感染させたマウスにおける生存の有意な改善および白血球集団の変化に重要である
【０１４０】
調査のこの段階において、ビーズのカルボキシル化が、生存に見られる改善、および脳への白血球移動の低減に重要であるかどうかは不明確であった。６×１０３のＷＮＶに感染させたマウスに、有意な体重減少が記録された時に、３００μｌのＰＢＳ中の４．４１×１０９の０．５μｍの裸もしくはカルボキシル化されたビーズ、またはＰＢＳのみを静脈内に注射した。カルボキシル化されたビーズを注射したマウスは、６０％の生存の有意な改善を示したが、裸ビーズで処理したマウスは、２５％のはるかに小さい改善を示した（図５Ａ）。体重が減少しなかったマウスは、処理されず、介入無しで感染から生存したが、体重が減少し、ＰＢＳで処理されたマウスは、全て、感染後１４日目までに死亡した（図５Ｂ〜Ｄ）。体重減少は、これらのマウスにおいて、感染後２０日目まで監視した。有意な量の体重が減少しなかったマウスは、ＰＢＳに感染させた対照と同様のパターンの安定性を示した（データは図示せず）が、カルボキシル化された、または裸ビーズ（図５Ｂ〜Ｃ）のいずれかで処理されたマウスは、最終的に安定化し、生存したか、または体重が減少し続け、２〜４日後に死亡した。体重が減少し、ＰＢＳで処理された全てのマウス（Ｂ、Ｄ）は、体重が減少し続け、２〜５日後に死亡した。
【０１４１】
白血球集団の変化を調査し、どの細胞が、カルボキシル化された、または裸ビーズのいずれかと会合して見出され得るかを判定するために、フローサイトメトリを、６×１０４のＰＦＵのＷＮＶに感染させたマウスにおいて行った。マウスに、感染後６日目に、３００ｕｌのＰＢＳ中で送達される４．４１×１０９の０．５μｍのカルボキシル化されたＦＩＴＣビーズもしくは裸ＦＩＴＣビーズ、またはＰＢＳのみを、注射した。マウスを感染後７日目に殺処理し、血液、脳、骨髄、肝臓、および脾臓を、フローサイトメトリのために収集した。
【０１４２】
「遊離」ビーズ、ならびにＣＤ４５＋白血球と会合するビーズは、フローサイトメトリ（Ｅｘ／Ｅｍ  Ｍａｘ  ４４１／４８６ｎｍ）によって検出され得る。予想されたとおり、ビーズは、ＰＢＳで処理した対照の血液においては検出することができなかった（図５Ｅ〜Ｇ）が、裸（図５Ｈ〜Ｊ）およびカルボキシル化された（図Ｌ〜Ｍ）ビーズで処理されたマウスにおいて見ることができた。ビーズは、それらがカルボキシル化された時に、より効果的に一掃されると考えられ、循環に留まったままのもののうち、多くは、主に「遊離」であった裸ビーズ（図５Ｋ）と比較して、ＣＤ４５＋白血球（図５Ｏ）と会合した。このデータは、そのうちの一部が、注射後２４時間に、循環において依然として「遊離」のままである、裸ビーズと比較した際、カルボキシル化が何らかの形で、白血球による循環からのビーズの摂取を促進するということを示唆する。
【０１４３】
脳のフローサイトメトリは、カルボキシル化された、または裸ビーズのいずれかで処理されたマウスの脳における、白血球集団の低減における、いくらかの有意な相違を明らかにした。カルボキシル化された、または裸ビーズは、感染後７日目、処理後１日目における脳において検出することができず（図６Ａ〜Ｃ）、これは、ビーズを取り込む細胞が、感染した中枢神経系に進入しなかったということを示唆する。裸およびカルボキシル化されたビーズで処理したマウスの両方の脳における白血球の総数、ならびに総マクロファージおよびミクログリア集団は、ＰＢＳで処理した対照と比較した際、有意に低減した（図６Ｄ）。しかしながら、カルボキシル化されたビーズのみが、これらのマウスの脳におけるＴ細胞およびＮＫ細胞の数を低減した。マクロファージのＬｙ６ｃｈｉおよびＬｙ６ｃｌｏ／ｉｎｔ集団の双方は、双方のビーズ処理によって有意に低減され、Ｌｙ６ｃ−細胞の小集団において、変化は見られなかった。ＣＤ４５ｉｎｔ活性化ミクログリアに関して、Ｌｙ６ｃｈｉサブセットの低減は、カルボキシル化されたビーズ処理のみで見られたが、Ｌｙ６ｃｌｏ／ｉｎｔおよびＬｙ６ｃ−サブセットの低減は、双方のビーズ処理で見られた。Ｌｙ６ｃｈｉＣＤ４５ｌｏ静止ミクログリアの小サブセットにおいて、変化は見られなかったが、しかしながら、双方のビーズ処理が、Ｌｙ６ｃｌｏ／ｉｎｔおよびＬｙ６ｃ−サブセットを有意に低減した。
【０１４４】
脾臓のフローサイトメトリは、処理間の集団における、いくらかの興味深い相違を伴って、多くのビーズが、この臓器における白血球によって取り込まれたということを明らかにした。図７Ａ〜Ｉに示されるように、ビーズ＋細胞は、主に、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、およびＬｙ６ｃ＋であった。
【０１４５】
さらなる分析は、関心対象の３つの主要なサブセット−ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ−単球（図７Ｊ、Ｍ、Ｐ）、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋「骨髄性」樹枝状細胞、主にＬｙ６ｃｌｏ／−（図７Ｋ、Ｎ、Ｑ）、およびＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞、主にＬｙ６ｃｌｏ／−（図７Ｌ、Ｏ、Ｒ）が、脾臓においてビーズを取り込むことが見出されたことを示した。
【０１４６】
これらの３つの集団の細胞の増加はまた、カルボキシル化されたビーズで処理したマウスの脾臓においても明らかであった。ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ−単球の合計、ならびにＬｙ６ｃｉｎｔ／ｈｉ、ビーズ＋Ｌｙ６ｃｉｎｔ／ｈｉ、およびビーズ−Ｌｙ６ｃｉｎｔ／ｈｉサブセットの合計の増加は、カルボキシル化されたで処理したマウスにおいて見出された（図８Ａ）。Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ、ビーズ＋Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ、およびビーズ−Ｌｙ６ｃ−／ｌｏの合計もまた、カルボキシル化されたビーズ処理で増加することが見出された。これらのデータは、単球が、カルボキシル化されたビーズ処理の結果として、脾臓に移動し得、ビーズ＋だけでなく、ビーズ−細胞もまた、動員されるということを示唆する。
【０１４７】
脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞のうち、Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ集団は、双方のタイプのビーズを取り込むことが見出された（図８Ｂ）。しかしながら、カルボキシル化されたビーズのみが、脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞の総数、およびこれらのうち、Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ集団を増加させた。ビーズ−Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ樹枝状細胞の増加は無かったため、ビーズ＋Ｌｙ６ｃ−／ｌｏ樹枝状細胞のみが、カルボキシル化されたビーズの摂取後、脾臓に移動することが明らかである。これらの細胞が、実際、循環におけるビーズを取り込むＬｙ６ｃｈｉ炎症性単球に由来し、脳への移動の代わりに脾臓に逸れ、そこで、それらが樹枝状細胞に分化する際、Ｌｙ６ｃ発現を下方制御し、ＣＤ１１ｃ発現を上方制御するということが可能である。
【０１４８】
脾臓におけるＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞集団のうち、Ｌｙ６ｃｌｏ／−細胞が、双方のビーズタイプを取り込んだ（図８Ｃ）。カルボキシル化されたビーズ処理では、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞集団の総数、より具体的には、Ｌｙ６ｃｌｏ／−細胞の増加が見られた。この集団のビーズ＋およびビーズ−細胞の双方において増加が見られ、ビーズ＋だけでなく、ビーズ−細胞もまた、脾臓において増加することを示唆する。この集団は、脾臓の常在ＤＣ、末梢から動員される非骨髄性ＤＣから成り得るか、または、潜在的にビーズを取り込み、ＣＤ１１ｂおよびＬｙ６ｃを下方制御し、ＣＤ１１ｃ発現を上方制御した炎症性単球からも成り得る。
【０１４９】
ビーズはまた、脾臓においてわずかな割合（％）のＢ細胞と会合することが見出されたが、しかしながら、カルボキシル化されたビーズのみが、脾臓におけるＢ細胞の数を有意に増加させた（図９Ａ〜Ｄ）。脾臓において見られた他の有意な増加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のみであった一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および好中球の数は、未変化のままであった。
【０１５０】
ビーズはまた、主にＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、およびＬｙ６ｃ発現細胞と会合して、肝臓において検出され得る（図１０Ａ〜Ｉ）。脾臓に関して、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ−単球（図１０Ｊ）、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋（図１０Ｋ）、およびＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋（図１０Ｌ）樹枝状細胞は、肝臓においてビーズを取り込むことが見出された。しかしながら、肝臓のいかなる白血球集団においても有意な増加または減少は無かった。少数のビーズはまた、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｌｙ６ｃ＋白血球の小集団で、骨髄において検出された（図１１Ａ〜Ｇ）。しかしながら、骨髄のいかなる白血球集団においても、有意な増加または減少は無かった。
【０１５１】
（実施例４）
６×１０３のＷＮＶに感染させたマウスに、有意な体重減少が記録された時、３００μｌのＰＢＳ中の０．５、０．０５、もしくは３μｍのカルボキシル化されたポリスチレンビーズの低用量の０．１％もしくは高用量の０．５％ビーズ、またはＰＢＳのみを、静脈内注射した。低用量の０．５、０．０５、もしくは３μｍで処理されたマウスは、およそ４０〜５０％の生存における同様の改善を示した（図１２Ａ）。しかしながら、マウスの高用量処理は、２０％のはるかに小さな改善を伴って、生存に対しては有害であると考えられた。高用量のビーズで処理された有意な数のマウスが、病気の非定型的症状を示し、数日間にわたる重要な臓器におけるかかる高用量のビーズの増大は、マウスに対して有害であったということが推測され得る。この経時変化は、他のより低用量のビーズを含む潜在性を伴って、繰り返されるであろう。フローサイトメトリもまた、異なるサイズのビーズで感染後６日目に処理された、６×１０４のＷＮＶに感染させたマウスにおいて行われるであろう。
【０１５２】
これらのデータは、カルボキシル化されたポリスチレンビーズが、生体内で崩壊しない可能性があり、このため、限られた治療的適用性を有する可能性があるという事実を浮き彫りにする。したがって、我々は、カルボキシル化された、または裸のいずれかである（しかしながら、裸球体もまた、少量のカルボキシル基を含有する）、０．５μｍの生分解性ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）球体を得た。６×１０３のＷＮＶに感染させたマウスに、有意な体重減少が検出された時、４．４１×１０９の０．５μｍの裸もしくはカルボキシル化されたポリスチレンビーズ、またはＰＬＧＡ球体を注射した。図１２Ｂにおいて見ることができるように、これまで、ＰＬＧＡ裸およびカルボキシル化された球体は、生存において、カルボキシル化されたポリスチレンビーズと同様の改善を示した。
【０１５３】
感染後６日目に注射されたカルボキシル化されたＰＬＧＡ球体が、６×１０４のＷＮＶに感染させたマウスにおける７日目の脳の浸潤を低減したかどうかを確認するために、我々は、静脈内送達される４．４１×１０９の粒子によるマウスのＰＢＳ、０．５μｍのカルボキシル化されたビーズ、０．５μｍのカルボキシル化されたＰＬＧＡ球体、および０．５μｍのカルボキシル化されたダイヤモンド粒子処理を比較した。脳、血液、脾臓、および肝臓を、フローサイトメトリのために処理した。この実験の分析は、継続中であるが、しかしながら、これらのマウスの脳の予備分析は、３つ全ての粒子が、免疫細胞による脳の浸潤の低減に成功するということを示す（図１２Ｃ）。脾臓における総白血球の増加もまた観察され、我々が、カルボキシル化されたビーズで処理されたマウスにおいて見た結果と一致する。
【０１５４】
（実施例５）
Ｔ細胞欠損マウスにおけるビーズ処理
【０１５５】
Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）およびＲＡＧ（Ｔ細胞欠損）マウスを、６×１０４または６×１０３のＰＦＵのＷＮＶに感染させた。高用量の６×１０４に感染させたＷＴマウスは、感染後７日目に１００％の死亡率を示した一方、同じ用量に感染させたＲＡＧマウスは、感染後８日目に死亡し始め、一部のマウスは感染後１３日目まで生きた。より低い用量の６×１０３に感染させたＷＴマウスは、感染後８日目までに６０％の死亡率を示したが、この時点後、４０％の長期生存を示した。この同じ用量に感染させたＲＡＧマウスは、感染後１４日目まで死亡し始めなかったが、しかしながら、１６日目までに、全てのＲＡＧマウスが死亡した（図１３Ａ〜Ｂ）。これらのデータは、Ｔ細胞欠損マウスがＲＡＧSよりも長く生存するため、ＷＮＶ脳炎の免疫病理学において、Ｔ細胞に対する直接的もしくは間接的役割のいずれかを示唆する。しかしながら、低用量に感染させたＲＡＧマウスの全ては、疾患に屈するが、ＷＴマウスのうちの４０％は、免疫でもって生存するため、Ｔ細胞が、ウイルス感染を制御するために重要であるという点もまた浮き彫りにする。
【０１５６】
これらのマウスの体重減少は毎日記録され、体重減少が、ＲＡＧＳおよびＷＴマウスの双方において、死亡に先行するということが示された（図１３Ｂ）。しかしながら、ＷＴのみが、初期の体重減少後、最大２〜３日間生きる一方、ＲＡＧＳは、体重減少が始まった後、５日まで生き得るということが観察された。６×１０４または６×１０３のいずれかに感染させたＲＡＧおよびＷＴマウスから採取される脳のプラークアッセイは、体重減少の割合（％）が、ウイルス力価と強く相関するということを明らかにした（図１２Ｃ）。一般的に、ＲＡＧマウスは、ＷＴマウスよりも、死亡時に大きな体重減少、および高いウイルス力価を示した。これは、直接的に、Ｔ細胞無しでウイルスを制御することができないという結果とは対照的に、それらが、初期の体重減少後、ＷＴマウスよりも長く生存することができ、このため、ウイルスが脳において増加し続け、マウスが死亡時まで体重を減少し続けたという事実に起因し得ると考えられる。この仮説は、７日目のＷＴおよび７日目／８日目のＲＡＧマウス脳が比較された、脳のフローサイトメトリによって裏付けられる（図１３Ｄ〜Ｅ）。ＲＡＧマウスは、マクロファージ、ミクログリア、Ｔ細胞（それらが欠損している際）、および好中球による脳の浸潤の有意な低減を示し、これは、感染後７日目〜８日目に増加しない。これは、免疫病理学がこれらの動物の死亡に対する主要な一因である場合、なぜこれらの動物が、初期の体重減少後、ＷＴマウスよりも長く生存するかを説明し得る。
【０１５７】
ＲＡＧおよびＷＴマウスはまた、Ｔ細胞の非存在下でのカルボキシル化されたビーズの有効性を試験するために、６×１０３のＰＦＵのＷＮＶに感染させ、毎日計量した。有意な体重減少（２４時間内に＞４％）後、マウスを、３００ｕｌの体積で静脈内送達される、４．４１×１０９のカルボキシル化されたビーズまたはＰＢＳで処理した。ビーズ注射によるＲＡＧマウスの生存の有意な改善は無かった（図１２Ｆ）。ＲＡＧマウスは、ビーズまたはＰＢＳ注射後、体重が減少し続け、２〜５日後に死亡した（図１２Ｇ）。この実験は、結果を確認するために、再び繰り返される必要がある。
【０１５８】
（実施例６）
ＥＡＥにおけるビーズ処理
【０１５９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＭＯＧおよびＣＦＡアジュバントでプライムされる。疾患の症状の発症時、歩行、姿勢、および他の活動における変化によって判定される際、カルボキシル化された粒子は、８時間毎、１６時間毎、毎日、または４８時間毎のいずれかに、静脈内投与される。疾患の重篤度は、疾患スコアの変化によって判定される。粒子の注入は、脳への単球の遊走、およびその後のＴ細胞プライミングを阻止し、疾患スコアの有意な低減をもたらす。
【０１６０】
（実施例７）
アテローム性動脈硬化症および新生内膜平滑筋細胞増殖におけるビーズ処理
【０１６１】
ＡＰＯ／Ｅ欠損マウスに、高脂肪食を給餌する。４週齢から、カルボキシル化された粒子を、８時間毎、１６時間毎、２４時間毎、４８時間毎、７２時間毎、週に１回、または月に１回、静脈内投与する。疾患の重篤度は、動脈組織学における変化によって判定される。粒子の注入は、動脈壁への単球の遊走を阻止し、平滑筋増殖および血管内膜のプラーク形成を推進するのに重要な、その後の免疫後遺症を阻止する。
【０１６２】
本発明の具体的な実施形態を説明および例解してきたが、かかる実施形態は、本発明の例解に過ぎず、添付の請求項に従って解釈される本発明を限定するとして見なされるべきではない。
【０１６３】
本明細書において引用される全ての特許、出願、および他の参照文献は、それらの全体として参照することにより組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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