(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２型糖尿病を検出する方法であって、
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の配列番号１、配列番号２もしくは配列番号３の６１番目の塩基に相当する一塩基多型またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６の６１番目の塩基に相当する一塩基多型を解析すること、および
該解析結果に基づいて、
配列番号１の６１番目の塩基に相当する塩基がＧの場合；
配列番号２の６１番目の塩基に相当する塩基がＴの場合； 
配列番号３の６１番目の塩基に相当する塩基がＣの場合；
配列番号４の６１番目の塩基に相当する塩基がＡの場合；
配列番号５の６１番目の塩基に相当する塩基がＧの場合；または、
配列番号６の６１番目の塩基に相当する塩基がＣの場合、
２型糖尿病の発症の危険性が高い、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いと判定されることにより２型糖尿病を検出することを含む、方法。
【請求項２】
２型糖尿病を検出するためのプローブであって、
配列番号１、２、３、４、５もしくは６において６１番目の塩基を含む１０以上の連続する塩基配列、または、その相補配列を含む、プローブ。
【請求項３】
２型糖尿病を検出するためのプライマーであって、
配列番号１、２、３、４、５または６の６１番目の塩基を含む領域を増幅することができる、プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全世界でおよそ３億人がＴ２Ｄに罹患しており、日本を含めて、多くの国々において、Ｔ２Ｄの罹患率の増加が重大な関心である。多くの遺伝的要因および環境的要因が、Ｔ２Ｄの病因に複雑に関与すると考えられるが、疾患の発症および進行の正確な機序は、完全には解明されていない。
ヨーロッパ人集団で行われたゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）により、ゲノムワイド水準の有意差を示す、２６のＴ２Ｄ感受性遺伝子座が同定されている。近年、日本人集団においても２つのＧＷＡＳの結果が同時に報告された。これらの解析規模は比較的小さく、一方の研究では、１８７人のＴ２Ｄに罹患した人（症例）、および７５２人の罹患していない対照において、８２，３４３のＳＮＰマーカーを(非特許文献１)、もう一方の研究では、１９４人の症例および１，５５８人の対照において、２０７，０９７のＳＮＰマーカーを解析している(非特許文献２)。両方のＧＷＡＳは、同じＴ２Ｄ感受性遺伝子座（ＫＣＮＱ１内）を同定し、さらに、この結果は、東アジア人集団およびヨーロッパ人集団においても確認された（非特許文献１および非特許文献２）。Ｔ２Ｄの臨床像は、人種により様々であるが、ゲノムワイド水準を示すリスク遺伝子座が異なる人種間でどの程度異なっているかは、殆ど明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Nat. Genet. 40, 1092-1097 (2008)
【非特許文献２】Nat. Genet. 40, 1098-1102 (2008)
【発明の概要】
【０００４】
本発明の目的は、２型糖尿病の発症の危険性、またはその発症の存在の有無を検出する方法を提供することである。
【０００５】
本発明の発明者らは、上述の課題を解決するために重点的に検討した。その結果、本発明の発明者らは、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の一塩基多型が、２型糖尿病に関連することを見出し、これによって、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の一態様は、次に示すことを含む、２型糖尿病を検出する方法である：
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の一塩基多型を解析すること、および
この解析結果に基づいて、２型糖尿病を検出すること。
本発明の別の態様は、上述する方法であって、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の一塩基多型が、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の６１番目の塩基に相当する塩基の多型、または、該塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型である、方法である。
本発明の別の態様は、上述する方法であって、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の一塩基多型が、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６の６１番目の塩基に相当する塩基の多型、または、該塩基と連鎖不平衡にある塩基の多型である、方法である。
本発明の別の態様は、２型糖尿病を検出するためのプローブであって、配列番号１、２、３、４、５もしくは６において６１番目の塩基を含む１０以上の連続する塩基配列、またはその相補配列を含む、プローブである。
本発明の別の態様は、２型糖尿病を検出するためのプライマーであって、配列番号１、２、３、４、５または６の６１番目の塩基を含む領域を増幅することができる、プライマーである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、ＧＷＡＳのスキームである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜１＞本発明の検出方法
本発明の方法は、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座において、２型糖尿病に関連する一塩基多型を解析し、この解析結果に基づいて２型糖尿病を検出することを含む。本発明において、「検出」という用語には、２型糖尿病の発症の危険性の検出、および、発症の存在の有無の検出が含まれる。
【０００９】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座としては、ヒト３番染色体上のＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座が好ましい。例えば、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座は、全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)（ＮＣＢＩ）のデータベースの登録番号ＮＴ_０２２５１７．１８で登録された配列を含む、遺伝子座であってもよい。
Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座としては、ヒト１５番染色体上のＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座が好ましい。例えば、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座は、ＮＣＢＩのデータベースの登録番号ＮＴ_０１０１９４．１７で登録された配列を含む、遺伝子座であってもよい。
さらに、遺伝子において人種差等があり、置換、欠失等が、２型糖尿病に関連する塩基以外の塩基に生じ得るので、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座およびＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座は、上述の配列を含む遺伝子に限定されない。
【００１０】
ＵＢＥ２Ｅ２に関する例示的な情報を以下に示す。
ＵＢＥ２Ｅ２  ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｅ ２（ＵＢＣ４／５ホモログ、酵母）［ヒト］
ゲノム  ＮＴ_０２２５１７．１８ ２３１８４７８３．．２３５７２２９５
ｍＲＮＡ ＮＰ_６８９８６６．１
【００１１】
Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座は、Ｃ２ＣＤ４ＡとＣ２ＣＤ４Ｂとを含む。
Ｃ２ＣＤ４Ａに関する例示的な情報を以下に示す。
Ｃ２ＣＤ４Ａ ４Ａを含むＣ２カルシウム依存性ドメイン(C2CD4A C2 calcium-dependent domain containing 4A)［ヒト］
ゲノム  ＮＴ_０１０１９４．１７ ３３１４９７３２．．３３１５３６７２
ｍＲＮＡ ＮＰ_９９７２０５．２
【００１２】
Ｃ２ＣＤ４Ｂに関する例示的な情報を以下に示す。
Ｃ２ＣＤ４Ｂ ４Ｂを含むＣ２カルシウム依存性ドメイン(C2CD4B C2 calcium-dependent domain containing 4B)［ヒト］
ゲノム  ＮＴ_０１０１９４．１７ ３３２４６２９３．．３３２４８０３８、相補鎖
ｍＲＮＡ  ＮＰ_００１００７５９６．２
【００１３】
２型糖尿病に関連するＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の一塩基多型は、特に限定されない。また、その例には、配列番号１の６１番目の塩基に相当する塩基の多型（ｒｓ６７８０５６９）、配列番号２の６１番目の多型（ｒｓ９８１２０５６）、および配列番号３の６１番目の多型（ｒｓ７６１２４６３）が含まれる。
【００１４】
ｒｓ６７８０５６９  NT_022517.18：g．23138484  G（リスクアレル）＞A
配列番号１
TCGATTAGCA TGTAATGATT TTGACATTGG CAGGGTGATA AAAGGGAGAA TTGAGAGTAT
R
GAGGGAAGAA AATAAATGCA AGGAGGGAGA AAAAAGAGGA AATAAACAAC AAAGGAAGGA
【００１５】
ｒｓ９８１２０５６  NT_022517.18：g．23144024  T （リスクアレル）＞C
配列番号２
CAAACCACCC GTCGACTGAC AAATTTAGAT AAGCAAATGT GGTACGGACA CATAGCGAAA
Y
ATTATCTGAC CATAAAAAGG AGTGGAGTGC TGATAAACAC TACAACATGG ATAGACCTTG
【００１６】
ｒｓ７６１２４６３  NT_022517.18：g．23276450  C（リスクアレル）＞A
配列番号３
TTAAAATTAC TTTCTAAAGC CAATCATTCT GCCTAATACA GGGTCTTCAT TTATTTTTAG
M
TACCTGAAAC TGAGTCTAAA ACCACTTCTC TCTACTTCCT CTTGTCTTTT TCATTTAAAC
【００１７】
２型糖尿病に関連するＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の一塩基多型は、特に限定されない。また、その例には、配列番号４の６１番目の塩基に相当する塩基の多型（ｒｓ７１７２４３２）、配列番号５の６１番目の多型（ｒｓ１４３６９５３）、および配列番号６の６１番目の多型（ｒｓ１３７０１７６）が含まれる。
【００１８】
ｒｓ７１７２４３２  NT_010194.17：g．33186946  A（リスクアレル）＞G
配列番号４
GCTGGGCTAC CTCCTTTGGG AGATAGGTTC TGCCCTGTCA CTGTCTACAA AATTGTTAAT
R
TTCCCAAAGA AACTGTCTGG GCCCCCAAGC CCTCTTTTAA GCCAGGAATT GTGACATTTT
【００１９】
ｒｓ１４３６９５３  NT_010194.17：g．33204571  C（リスクアレル）＞T
配列番号５
GGGCAATTCG GCTGTGGATC CAAATATGTA CACTCCACTC AGCAAAGTGA AACTCCAAAG
R
CAGCCAAGGT ATTTATTACC TGTTGTTACC AGAGCACATC CCTTGGCGTT TTACACCCCA
配列番号５では、ＳＮＰをＲ（Ｇ（リスクアレル）＞Ａ）と示すように、アンチセンス鎖の配列を示す。
【００２０】
ｒｓ１３７０１７６  NT_010194.17：g．33187791  G（リスクアレル）＞A
配列番号６
TGGGCCCTCT ACAGCTGTCT TGGGGCTAAA GGGAAGAAGA GGAAATGACA CCTCTGCTGG
Y
GGAATTATAG CCTGCCAGAG TTGGAAAGGA CCTCAGAGAT GATCACTCAA GCCCACCCCC
配列番号６では、ＳＮＰをＹ（Ｃ（リスクアレル）＞Ｔ）と示すように、アンチセンス鎖の配列を示す。
【００２１】
「〜に相当する」という表現は、ヒトＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座上の上述の配列を含む領域中の該当塩基を意味する。上述の配列が、人種の相違等によって、ＳＮＰ以外の位置で若干変更されても、その該当塩基を解析することも含まれる。
【００２２】
２型糖尿病は、上述の塩基多型を単独で、またはこれらの組合せを解析することによって、検出することができる。さらに、上述の一塩基多型と連鎖不平衡（ｒ２＞０．５、好ましくはｒ２＞０．８）にある多型に関して、２型糖尿病を検出することができる。
【００２３】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の配列は、そのセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに関して解析することができる。
【００２４】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の遺伝的多型の解析に使用する試料には、尿および血液等の体液、粘液細胞等の細胞、ならびに頭髪等の体毛が含まれるが、これらに限定されない。遺伝的多型の解析において、これらの試料は直接使用することができるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法によって単離し、これを用いて解析することが好ましい。
【００２５】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の遺伝的多型の解析は、遺伝的多型を解析するための従来の方法によって行うことができる。解析の例には、シークエンス解析、ＰＣＲ、およびハイブリダイゼーションが含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
シークエンスは、従来の方法によって行うことができる。具体的には、多型部位から５’側数十塩基に配置されるプライマーを使用して、シークエンス反応を行う。かかる解析結果から、該当する位置における塩基の種類を決定することができる。シークエンスを行う場合、多型塩基を含む断片を、ＰＣＲ等によって増幅することが好ましい。
【００２７】
さらに、ＰＣＲにおける増幅の有無を検出することによって、解析することができる。例えば、多型部位を含む領域に相当する配列、およびそれぞれの多型塩基に相当する配列を有した、プライマーを用意し、次いで、これらをＰＣＲに使用し、その後、増幅産物の有無を検出して、多型塩基の種類を決定する。
または、増幅産物の有無は、ＬＡＭＰ法（日本国特許第３３１３３５８号）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ法；日本国特許２８４３５８６号）、およびＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号）を用いて決定してもよい。また、一本鎖増幅法等の他の方法のいずれかを使用してもよい。
【００２８】
さらに、多型部位を含むＤＮＡ断片を増幅してもよく、また、増幅産物を電気泳動して、移動度の相違に基づいて、塩基の種類を決定してもよい。かかる方法の例には、一本鎖高次構造多型（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）(Genomics.1992 Jan 1; 12(1): 139-146)が含まれる。具体的には、まず、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座またはＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、次いで、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。その後、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、次いで、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の相違に基づいて、塩基の種類を決定することができる。
【００２９】
さらに、多型塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による消化の有無によって解析することができる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素によって消化する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、これによって、検出されたＤＮＡ断片の大きさに基づいて、塩基の種類を決定することができる。
【００３０】
上述の方法によって解析された多型に基づいて、２型糖尿病を検出することができる。
例えば、ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の配列番号１の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＧである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子
型が、ＧＧ対立遺伝子またはＡＧ対立遺伝子である場合、ＡＡ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３１】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の配列番号２の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＴである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子型が、ＴＴ対立遺伝子またはＴＣ対立遺伝子である場合、ＣＣ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３２】
ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座の配列番号３の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＣである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子型が、ＣＣ対立遺伝子またはＣＡ対立遺伝子である場合、ＡＡ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３３】
Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の配列番号４の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＡである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子型が、ＡＡ対立遺伝子またはＡＧ対立遺伝子である場合、ＧＧ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３４】
Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の配列番号５の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＧである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子型が、ＧＧ対立遺伝子またはＧＡ対立遺伝子である場合、ＡＡ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３５】
Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座の配列番号６の６１番目の塩基に相当する塩基に基づいて、２型糖尿病を検出する場合には、塩基がＣである場合、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。さらに、対立遺伝子の多型を考慮することによって、２型糖尿病を検出することができる。例えば、遺伝子型が、ＣＣ対立遺伝子またはＣＴ対立遺伝子である場合、ＴＴ対立遺伝子と比較して、２型糖尿病の発症の危険性が高いか、または、２型糖尿病に罹患する可能性が高いことが示される。
【００３６】
＜２＞本発明の検出試薬
本発明では、２型糖尿病を検出するためのプライマーおよびプローブ等の検出試薬を提供する。プローブの例には、配列番号１、２、３、４、５もしくは６において６１番目の塩基を含む連続する配列、またはその相補配列を含む、プローブが含まれる。
さらに、プライマーの例には、配列番号１、２、３、４、５または６の６１番目の塩基の多型を識別することができるプライマー、例えば、配列番号１、２、３、４、５または６の６１番目の塩基を含む領域を増幅することができるプライマーが含まれる。プライマーは、多型部位を含む領域（好ましくは、５０から１，０００塩基の長さを有する領域）
の両側で設計された、１組の順方向プライマーと逆方向プライマーであってもよい。さらに、シークエンス解析または一本鎖増幅に使用する場合、プライマーの例は、上述の多型塩基の５’側領域、好ましくは、多型部位から３０から１００塩基上流の領域の配列を有するプライマー、または、上述の多型塩基から３’側の領域に相補的な配列を有するプライマー、好ましくは、３０から１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーであってもよい。ＰＣＲにおける増幅の有無に基づいて多型を決定するのに使用するプライマーには、配列番号１、２、３、４、５または６において連続する配列を含み、上述の多型塩基を３’側に含むプライマー、および、配列番号１、２、３、４、５または６において連続する配列の相補配列を含み、上述の多型塩基に相補的な塩基を３’側に含むプライマーが含まれる。
かかるプライマーおよびプローブの長さは、特に限定されず、例えば、１０から１００塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが好ましく、１５から５０塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドがより好ましく、また、２０から３５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドがより好ましい。さらに、本発明の検出試薬は、これらのプライマーおよびプローブの他に、ＰＣＲポリメラーゼおよびバッファーをさらに含むものであってもよい。
【００３７】
２型糖尿病を検出する他の方法は、ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂの発現レベル（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を解析すること、および、この解析結果に基づいて２型糖尿病を検出することを含む。２型糖尿病ではない対照と比較して、発現レベルが試験対象において変化する場合、対象が、２型糖尿病の発症の高い危険性を有するか、または、２型糖尿病に罹患する可能性があることを示す。ここで、「発現の変化」という用語の意味には、発現の低下ならびに発現の増強が含まれる。
【００３８】
＜３＞スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、次に示すステップを含む、２型糖尿病の治療法をスクリーニングするための方法である：ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂを含むスクリーニング系に、医薬候補物質を加えること；ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂの活性を測定すること；ならびに、活性を変化させる物質を選択すること。
【００３９】
本発明の他のスクリーニング方法は、次に示すステップを含む、２型糖尿病の治療薬をスクリーニングするための方法である：ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂを発現する培養細胞等のスクリーニング系に医薬候補物質を加えること；ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂの発現レベル（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を測定すること；および、発現レベルを変化させる物質を選択すること。
【００４０】
医薬候補物質は、特に限定されず、低分子合成化合物または天然源由来の化合物であってもよい。さらに、医薬候補物質はペプチドであってもよい。個々の試験物質、またはこれらの物質を含む化合物ライブラリーを、スクリーニングに使用してもよい。これらの候補物質のうち、ＵＢＥ２Ｅ２またはＣ２ＣＤ４Ａおよび／またはＣ２ＣＤ４Ｂの活性または発現レベルを変化させる物質が、２型糖尿病の治療薬として選択される。ここで、「変化させる」という用語の意味には、活性（または発現）を低下させることと、活性（または発現レベル）を増強させることが含まれる。
【実施例】
【００４１】
本発明を、以下の実施例によって説明するが、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
【００４２】
我々は、３段階の日本人集団におけるＴ２ＤのＧＷＡＳを行い、さらに別の集団において検証を行った（図１）。まず、イルミナ・ヒューマン・ハップ６１０−クァド(Illumin
a HumanHap610-Quad)、および５５０Ｋビーズチップ(BeadChip)をそれぞれ使用して、バイオバンクジャパン(BioBank Japan) (//biobankjp.org/)から収集した、４，８７８人のＴ２Ｄに罹患した人（ここで、この群を症例１と称する）、および３，３４５人の対照（対照１と称する）の遺伝子型を解析した。主成分解析（principal component analysis）を最初に行った結果、過去の報告と同様に(Am. J. Hum. Genet. 83, 445-456 (2008))、日本人集団では、本土および琉球の２つの主なクラスターが存在した。そこで、第１段階のゲノムスキャンでは、Ｔ２Ｄとの関連解析のために、本土クラスターに属する７，５４１人（４，４７０人の症例および３，０７１人の対照）を選択した（図１）。我々は、相加的関連モデルを用いたアーミテージトレンド検定により、４５９，３５９個の良好に判定されたＳＮＰの遺伝子型頻度を比較した（ゲノムインフレーションスコア(genomic inflation score)λ＝１．１０、レファレンスλ１，０００＝１．０３）(Nat. Genet. 36, 388-393 (2004))。その結果、１６のゲノムワイド水準（Ｐ＜５×１０−８）の関連を示す、ＫＣＮＱ１内の１個のＳＮＰを同定した。
【００４３】
我々は、さらに関連解析のP値が最も小さい上位１００個のＳＮＰを第２段階で解析した。これらのＳＮＰは６１個の別々の遺伝子座に存在していた。これら１００個のＳＮＰをＴ２Ｄに罹患した２，８８６人（症例２と称する）、および３，０８７人の対照（対照２と称する）を用いて解析し、９８個のＳＮＰについて良好なデータを得た。第１段階と第２段階の統合解析の結果、これらのＳＮＰのうちの２０個が、Ｔ２Ｄと１６のゲノムワイド水準の関連（Ｐ＜５×１０−８）を示した。これらのうち、１８個のＳＮＰは、ＫＣＮＱ１、ＣＤＫＡＬ１、ＣＤＫＮ２Ｂ、およびＴＣＦ７Ｌ２に存在していた。ＫＣＮＱ１遺伝子座およびＣＤＫＡＬ１遺伝子座は、ヨーロッパ系および日本人集団において、Ｔ２Ｄとゲノムワイド水準の関連を有することが既に報告されている。加えて、過去に報告されていない３番染色体上のＵＢＥ２Ｅ２内に位置する２個のＳＮＰを同定した（表１）。この２つのＳＮＰはＫＣＮＱ１内の ＳＮＰと比較して、効果サイズは弱いものの（オッズ比（ＯＲ）＝１．２１）、リスクアレル頻度はより高いものであった。さらに我々は、ゲノムワイド水準には達していないが境界線上の関連（Ｐ＜１×１０−７として定義）を有する、３個のＳＮＰ（ＵＢＥ２Ｅ２内に１個、および、１５番染色体上のＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ内に２個）を同定した。
【００４４】
そこで、我々は、これらの過去に報告されていない２つの遺伝子座（ＵＢＥ２Ｅ２およびＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ）に注目した。ＵＢＥ２Ｅ２遺伝子座内の４個のＳＮＰのうち、ｒｓ６７８０５６９およびｒｓ９８１２０５６は、絶対連鎖不平衡（ＬＤ）（ｒ２＝１）にあったが、他のＳＮＰは、相互に中程度のＬＤにあった（ｒ２＝０．１０−０．４８）。Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子座における３個のＳＮＰ（ｒｓ７１７２４３２、ｒｓ１４３６９５３、およびｒｓ１３７０１７６）は、相互に高いＬＤにあった（ｒ２＝０．６２−０．８０）。
【００４５】
これらの２つの新規遺伝子座と2型糖尿病との関連を確認するために、我々は、第３の日本人集団（第３段階、３，６２２人のＴ２Ｄ症例、および２，３５６人の対照）を用いて新規２領域内のSNPを解析した（図１）。その結果、第３段階の追加によりＴ２Ｄとこれらの遺伝子座の関連はさらに強力なものとなった（ＵＢＥ２Ｅ２：ｒｓ６７８０５６９、Ｐ＝４．３７×１０−９；ｒｓ７６１２４６３、Ｐ＝２．２７×１０−９；ｒｓ９８１２０５６、Ｐ＝１．８３×１０−８；表２；Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ：ｒｓ７１７２４３２、Ｐ＝３．６６×１０−９；ｒｓ１４３６９５３、Ｐ＝２．１９×１０−８；表３）。この関連は、第１段階のＧＷＡＳの際のゲノムインフレーションスコア（λ＝１．１０）によって補正したＰ値を用いた場合においても、ゲノムワイド水準の有意性を示した（ＵＢＥ２Ｅ２：ｒｓ７６１２４６３、Ｐ＝２．１０×１０−８；Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ：ｒｓ７１７２４３２、Ｐ＝４．８８×１０−８）。
【００４６】
さらに我々は、３つの東アジア人の集団（４，１８４人のＴ２Ｄ症例、および４，１５４人の対照）、ならびに２つのヨーロッパ人の集団（６，９８０人のＴ２Ｄ症例、および８，６１５人の対照）を用いて、上記２遺伝子座をさらに検証した（図１）。両遺伝子座と2型糖尿病との関連は、これらの３つの東アジア人の集団で再現され（ＵＢＥ２Ｅ２のｒｓ７６１２４６３、Ｐ＝３．０６×１０−２、表２；Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂのｒｓ７１７２４３２、Ｐ＝１．２６×１０−２；表３）、３つの日本人集団および３つの東アジア人集団のすべての結果を統合すると、Ｔ２Ｄとこれらの遺伝子座の関連はさらに強くなった（ＵＢＥ２Ｅ２のｒｓ７６１２４６３、P＝９．１６×１０−１０、ＯＲ＝１．１５、９５％ＣＩ １．１０−１．２１；Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂのｒｓ７１７２４３２、Ｐ＝２．６１×１０−１０、ＯＲ＝１．１２、９５％ＣＩ １．０８−１．１６）。ヨーロッパ人の集団においては、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂと2型糖尿病との関連は再現され（ｒｓ７１７２４３２、Ｐ＝６．３６×１０−５）、すべての集団の結果を統合すると関連はさらに強力となった（Ｐ＝８．７８×１０−１４）。一方、今回解析したヨーロッパ人集団ではＴ２ＤとＵＢＥ２Ｅ２内のＳＮＰとの関連は認められなかった（Ｐ＞０．０５；表２）。
【００４７】
【表１】
0005904501.tif 000002
【００４８】
【表２−１】
0005904501.tif 000003
【００４９】
【表２−２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
３ｐ２４．２に位置するＵＢＥ２Ｅ２は、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｅ２をコードし(Cytogenet. Cell Genet. 78, 107-111 (1997))、ヒトの膵臓、肝臓、筋肉、および脂肪組織、ならびに培養インスリン分泌細胞系に発現することが報告されている。特に、膵臓β細胞の小胞体のストレスを増加させる条件下で、正常なインスリン生合成、分泌、およびシグナリングを維持する際に、ユビキチンプロテアソーム系が、極めて重要な役割を果たすことが報告されている(Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, E1-E10 (2009))。複数の報告は、薬理学的阻害剤によるプロテアソーム阻害が、プロインスリン生合成(J. Biol. Chem. 280, 15727-15734 (2005))、インスリン分泌に関与する分子の活性(J. Biol. Chem. 281, 13015-13020 (2006))、およびグルコースの刺激によるインスリン分泌（Diabetes 55, 1223-1231 (2006)、ならびにDiabetologia 28, 412-419 (1985)）を低減させることを示すが、他の研究者は、プロテアソーム阻害剤が、単離されたラット膵島の急性グルコース誘導性インスリン分泌を増強することを報告している(Gene 342, 85-95 (2004))。これらの報告は共に、ユビキチン−プロテアソーム系が、インスリン分泌に重要な役割を果たすことを示唆した。空腹時血漿グルコースおよびインスリン値が測定されている、第３段階（図１）の８７２人の対照のうち、ｒｓ７６１２４６３のリスクアレルを有する群（ＣＣ＋ＣＡ；ｎ＝８４６）は、リスクアレルを持たない群（ＡＡ；ｎ＝２６）よりも、β細胞機能の指標であるＨＯＭＡ−β(Diabetologia 28, 412-419 (1985))が有意に低く（Ｐ＝０．０１６３；９０．８±３９．０と比較して７３．７±３６．１）、このことから、このリスクアレルがインスリン分泌の低減に関与する事が示唆された。
【００５２】
また、我々は、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ4Ｂ遺伝子座の周辺で４００ｋｂ以内のＳＮＰの関連性についても検討し、この領域中の感受性遺伝子座が、Ｃ２ＣＤ４ＡとＣ２ＣＤ４Ｂの間に存在する事を見出した（データは示さない）。ＮＬＦ１−２（核局在因子をコードする）、またはＦＡＭ１４８Ａ−Ｂ（１４８の配列類似性を有するファミリーをコードする）としても知られている、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ（４を含むＣ２カルシウム依存症ドメイン（C2 calcium-dependent domain containing 4)をコードする）は、１５ｑ２２．２に位置し、細胞構造を制御する遺伝子の調節能を有する核内因子をコードする(Gene 342, 85-95 (2004))。しかしながら、Ｃ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂがコードするタン
パク質の機能的役割は十分に解明されていない。またＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂ遺伝子発現は、ヒトの膵臓、肝臓、筋肉、および脂肪組織、ならびに培養インスリン分泌細胞系で認められ、炎症誘発サイトカインによる処理によって増加することが報告されている(Gene 342, 85-95 (2004))が、Ｔ２Ｄ疾患感受性の付与におけるＣ２ＣＤ４Ａ−Ｃ２ＣＤ４Ｂの関与を示す証拠は、これまで報告されていない。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の方法によれば、２型糖尿病を検出することができ、これは、診断等の分野において有用である。さらに、本発明のスクリーニング方法によれば、２型糖尿病のための新規薬剤を得ることができ、これは、医療分野等において有用である。
【００５４】
本発明は、その好ましい実施態様によって詳細に説明されているが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、等価物を使用することができることが当業者に明らかである。前述の各文書、ならびに米国特許出願第６１／３７９，４８９号は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれる。 
【図１】
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