(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に対する特異的な免疫応答を抑制するための医薬組成物であって、
Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃに共有結合した抗原を含み、
前記Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃに共有結合した抗原が、抗原に特異的なＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞の分化を促進することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記抗原は、表１に記載された抗原からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子免疫学の分野に属し、より具体的には、望ましくない免疫反応を患っている患者の治療の分野に属する。本発明は、望ましくない免疫反応を治療するための方法に関し、免疫応答を抑制するための手段および方法を提供する。本発明は、特に、調節性Ｔ細胞と、免疫療法において、同じものを長期にわたり、培養増殖させ、活性化させて使用する方法と、自己免疫応答、アレルギーおよび炎症性疾患の抑制のための方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫抑制細胞は、癌の進行に影響を与えると長い間考えられてきた（Dye et al., J. Exp. Med. 154:1033-1042 (1981)）。実際には、調節性Ｔ細胞による積極的抑制は、外来性抗原および自己抗原に対するＴ細胞応答の下方調節において重要な役割を果たしている。
【０００３】
Ｔ細胞は、遺伝子再構成の結果として生じる特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）を有するリンパ球の１種である。Ｔ細胞は、遺伝子発現の個々のパターンによって認識可能なＴ細胞の異なる集団の分化によって遂行される多様な役割を有する。いくつかの主要なＴ細胞の集団は、ＴＣＲ−[アルファ]／[ベータ]、およびＴＣＲ[ガンマ]／[デルタ]のような受容体の発現と、一定のナチュラルキラー細胞とに基づいて識別される。他のＴ細胞集団は、表面分子と、そこから分泌されるサイトカインとによって定義される。
【０００４】
たとえば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４細胞）は、サイトカインを分泌し、Ｂ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞を補助し、生存させ、エフェクター機能を実行する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）は、一般にＣＤ８細胞であり、それらは、感染細胞または腫瘍細胞のような標的細胞を殺すために特化されている。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞の１種であるが、ＴＣＲを有さず、寿命がより短い。しかしながら、それらはＴ細胞といくつかの機能を共有し、サイトカインを分泌していくつかの種類の標的細胞を殺すことができる。
【０００５】
ヒトおよびマウスの末梢血は、Ｔ細胞調節性表現型（「Ｔｒｅｇ」）、すなわちＣＤ４およびＣＤ２５抗原の両者に陽性（すなわち、ＣＤ２５にも明らかに陽性であるＣＤ４陽性Ｔ細胞）を示すＴ細胞リンパ球の小集団を含む。まずマウスで特徴を述べると、それらはリンパ節および脾臓のＣＤ４−陽性Ｔ細胞数の６〜１０％を占め、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性細胞のこの数は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のわずか約５〜１０％、またはＣＤ４−陽性Ｔ細胞の２〜７％に相当する。ただし、あるドナーは、ＣＤ４−陽性およびＣＤ２５−陽性細胞のより異なった数を示す。ヒト末梢血ＰＢＭＣｓの約１〜２％は、ＣＤ４陽性（ＣＤ４−陽性）およびＣＤ２５に明らかに陽性（ＣＤ２５−陽性）な細胞である。
【０００６】
Ｔｒｅｇ細胞には、いくつかの集団が存在する（Bluestone et al., Nature Rev. Immunol. 3:253 (2003)）。調節性細胞の１集団は、胸腺において発生する。胸腺に由来するＴｒｅｇ細胞は、細胞間接着を含むサイトカイン非依存性機構によって機能する（Shevach, Nature Rev. Immunol 2:389 (2002)）。それらは、自己寛容の誘導および維持と、自己免疫の抑制とに必須である（Shevach, Annu. Rev. Immunol. 18:423-449 (2000); Stephens et al., 2001; Turns et al., 2001; Thornton et al., 1998; Salomon et al., Immunity 12:431-440 (2000); Sakaguchi et al., Immunol. Rev. 182:18-32 (2001))。
【０００７】
これらの専門的調節性細胞は、胸腺の排除を逃れた、または胸腺外抗原を認識する自己反応性Ｔ細胞の活性化および増殖を抑制するので、それらは恒常性および免疫調節のために重要であるだけではなく、自己免疫の発生から宿主を保護するために重要である（Suri-Payer et al., J. Immunol. 157:1799-1805 (1996); Asano et al., J. Exp. Med. 184:387-396 (1996); Bonomo et al., J. Immunol. 154:6602-6611 (1995); Willerford et al., Immunity 3:521-530 (1995); Takahashi et al., Int. Immunol. 10:1969-1980 (1998); Salomon et al., Immunity 12:431-440 (2000); Read et al., J. Exp. Med. 192:295-302 (2000)）。よって、免疫調節性ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞は、多くの場合「専門的免疫抑制細胞」と称される。
【０００８】
しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞は、成熟した、末梢ＣＤ４−陽性Ｔ細胞の活性化によっても生じる。いくつかの研究は、末梢由来のＴｒｅｇ細胞が、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−[ベータ]）およびＩＬ−１０のような免疫抑制性サイトカインを産生することによってそれらの阻害活性を調節することを示した（Kingsley et al., J. Immunol. 168:1080 (2002); Nakamura et al., J. Exp. Med. 194:629-644 (2001)）。抗原特異的な活性化の後、これらのＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４−陽性またはＣＤ２５−陽性のどちらのＴ細胞の増殖でも非特異的に抑制することができる（低用量で固定化された共培養抑制因子分析に基づく抗ＣＤ３モノクローナル抗体のＦＡＣＳソーティングによって示された（Baecher-Allan et al., J. Immunol. 167(3):1245-1253 (2001)）。
【０００９】
いくつかの研究では、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性細胞が、自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養したときにＴ細胞の抗ＣＤ３刺激を阻害することができることを示したが、直接的な接触によってのみであった（Stephens et al., Eur. J. Immunol. 31:1247-1254 (2001); Taams et al., Eur. J. Immunol. 31:1122-1131 (2001); Thornton et al., J. Exp. Med. 188:287-296 (1998))。しかしながら、マウスにおけるこの阻害作用は、固定化抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／ＣＤ２８による直接のＴ細胞刺激を克服することができなかった（Thornton et al., 1998）。以前の報告では、調節性細胞の直接培養は一般的に抑制効果を調節するために不十分であるので、末梢血から単離されたヒトＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞は、それらの抑制特性を明らかにするために、予め活性化される必要があった（Dieckmann et al., J. Exp. Med. 193:1303-1310 (2001)）。
【００１０】
他の研究では、ヒトＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞の阻害特性は活性化に依存するが、抗原非特異的であることが見出され（Jonuleit et al., J. Exp. Med. 193:1285-1294 (2001); Levings et al., J. Exp. Med. 193(11):1295-1302 (2001); Yamagiwa et al., J. Immunol. 166:7282-7289 (2001))、細胞傷害性のＴリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）の細胞内ストアの恒常的発現が示された（Jonuleit et al., 2001; Read et al., J. Exp. Med. 192:295-302 (2000); Yamagiwa et al., 2001; Takahashi et al., J. Exp. Med. 192:303-310 (2000)）。さらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）調節性刺激の後、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞は、同種抗原および分裂促進物質によって活性化されるナイーブＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陰性Ｔ細胞の活性化を抑制する（Jonuleit et al., 2001）。
【００１１】
マウスおよびヒトの両者のＴｒｅｇ細胞はＣＴＬＡ−４を発現するが、寛容誘導におけるＣＴＬＡ−４の役割と、調節性ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞に阻害機能を付与するその能力とについては意見が分かれている。ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２としても知られる）は、ＣＤ２８のホモログであり、ＣＤ８０およびＣＤ８６リガンドの受容体である。ＣＴＬＡ−４は、抗原およびＴＣＲ依存的にＴ細胞応答を阻害する。ＣＴＬＡ−４の機能を損なわせたＴ細胞は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生が促進された。これに対して、促進されたＣＴＬＡ−４機能は、インビトロおよびインビボの両者において、サイトカイン分泌の阻害、および細胞周期進行の障害を導く。マウスにおいて、ＣＴＬＡ−４はＴｒｅｇ細胞の抑制機能のために必要とされず、ヒトにおけるその要件とは対照的である。
【００１２】
最近の研究では、Ｔｒｅｇ細胞がインビボで大規模に増殖することが示された（Tang, J. Immunol. 171:3348 (2003))が、他の研究ではマウスにおける癌治療ワクチン接種の有効性はＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞を除去することによって促進することができることが示唆された（Sutmuller et al., J. Exp. Med. 194:823-832 (2001)）。また、いくつかの研究は、調節細胞の欠乏が他の非応答性動物において腫瘍特異的免疫応答を増加させ、腫瘍の根絶を導くことを示した（Onizuka et al., Cancer Res. 59:3128-3133 (1999); Shimizu et al., J. Immunol. 163:5211-5218 (1999))。新生児胸腺摘出によってＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞を欠損した感受性マウス系統は、１０〜１４日齢でＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞の注入によって防ぐことができる幅広い臓器特異的な自己免疫を発生させることが示された（Suri-Payer et al., J. Immunol. 160:1212-1218 (1998))。その研究は、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞が自己抗原特異的Ｔ細胞クローンによって誘導される自己免疫を阻害することができることも見出した。報告によると、ヌードマウスへのＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陰性Ｔ細胞の移入は、ＣＤ２５−陽性細胞を最初に欠損したリンパ球を使用するＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞の同時移入によって抑制することができる自己免疫疾患を引き起こす（Sakaguchi et al., J. Immunol. 155:1151-1164 (1995)）。
【００１３】
そして、転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）は、天然に生じるＴｒｅｇの生成および機能に関する。ＦｏｘＰ３遺伝子の変異によってＦｏｘＰ３タンパク質が欠失されたマウスは、重篤な自己免疫症候群および消耗性疾患を発病する（いわゆる「ふけ症」マウス。Brunkow et al., Nat Genet. 27:68-73, 2001）。この将来性のある発見は、ヒトのＸ連鎖免疫調節異常（Ｘ連鎖免疫調節異常多発性内分泌障害腸症候群）の原因がＦｏｘＰ３遺伝子における変異にあるとすることを可能とした（Bennett et al. Nat Genet. 27: 20-21; 2001）。また、後者の研究は、いくつかの適応性Ｔｒｅｇ集団におけるＦｏｘＰ３の存在を示した。
【００１４】
しかしながら、データは、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性細胞の役割が、自己寛容と自己免疫の予防とに限定されるものではないことも示している。アロ反応性または移植におけるＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞の役割に焦点を当てた研究はほとんどないが、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞は、インビトロおよびインビボの両方で、同種移植の拒絶反応を抑制することが報告されている（Hara et al., J. Immunol. 166:3789-3796 (2001); Taylor et al., J. Exp. Med. 193:1311-1318 (2001))。ヒトＴ細胞増殖の同種異系刺激はＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞によっても防がれる（Yamagiwa et al., 2001）が、Wood研究室は、アロ抗原が直接的でなく間接的なアロ認識経路によって提示されたときのみ、ＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性Ｔ細胞が混合リンパ球応答（ＭＬＲ）を抑制することを示した（Hara et al., 2001）。選別されたＣＤ４−陽性ＣＤ２５−陽性細胞は専門的なＡＰＣを高度に欠いているので、直接の抗原提示は、調節性Ｔ細胞と抗−ＣＤ３／２８刺激応答Ｔ細胞の間とで生じるようである。
【００１５】
Ｔｒｅｇ細胞の不在、またはＴｒｅｇ細胞の欠乏は、１型糖尿病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、甲状腺炎、多発性硬化症および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫の発症を引き起こすことが示されている。さらに、上記の疾患は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の養子移入によって回復に向かわせることができる。また、自己免疫におけるＴ細胞調節は、調節性Ｔ細胞数の欠乏に加え、エフェクターＴ細胞を阻害するＴｒｅｇの機能の欠損によって機能しなくなることが示された。Ｔｒｅｇ細胞の数および機能の低下が疾患に寄与すること、ならびにこれらの低下に対する治療がこれらの疾患を予防し、治療する可能性を有することは明らかである。動物における研究は、炎症部位におけるＴｒｅｇ細胞数の増加が自己免疫における治療である可能性が高いことを示唆している。このことは、インビトロで増殖された自家移植Ｔｒｅｇの養子移入によって、またはＴｒｅｇ細胞の増殖、生存および誘導を促進する薬剤を使用することによって引き起こすことができる。Ｔｒｅｇの細胞数および機能に影響を与える要因は、現時点では明確に特定されておらず、当該要因の特定は自己免疫疾患の処置にとって重要であろう。
【００１６】
ＤＣのような抗原提示細胞は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＴｒｅｇのような、Ｔ細胞の異なる系統にナイーブＣＤ４Ｔ細胞を分化させる能力で知られている。最近の研究では、腸のＤＣ、特に粘膜固有層のＣＤ１０３＋ＤＣｓが、ＴＧＦ−βと連動するレチノイン酸（ＲＡ）の分泌によって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇへの変換を促進できることが示されている。ＤＣは、ＤＣにおいて酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の誘導を引き起こすＴｒｅｇ上のＣＴＬＡ−４によって結合されるＣＤ８０／８６のような様々な受容体を発現する。ＩＤＯは、トリプトファンを、エフェクターＴ細胞を抑制するプロアポトーシス代謝物に変換する。一方、Ｔｒｅｇ上のＬＡＧ３によるＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩの会合は、ＡＰＣの成熟を抑制し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を低下させる。これらの知見は、ＤＣがＣＤ４Ｔ細胞をＴｒｅｇに分化させる可能性があることを示している。しかしながら、その機構と、ＣＤ４ナイーブＴ細胞をＴｒｅｇに分化させるように指示するためにＤＣに達するシグナルとについては、依然としてほとんど知られていない。
【００１７】
自己免疫疾患または炎症性疾患を患っている患者は、Ｔｒｅｇの数または機能が向上される治療から大きな利益を得るであろう。
【００１８】
出願人は、ＤＣによる特異的なグリコシル化抗原の取り込みがＴｒｅｇの数および機能を調節することを証明した。このことは、望ましくない免疫反応の治療のための新しい機会を開き、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療のための新しい方法および手段をもたらす。
【発明の概要】
【００１９】
発明者は、自己および非自己抗原上のシアル酸が寛容の誘導に重要な役割を果たしていることを見出した。発明者は、モデル系として、周知な卵白アルブミン（ＯＶＡ）に対する食物アレルギーを調査した。卵白アルブミンは、鶏卵の主要なアレルゲンである。ヒトにおいて、ＯＶＡに対するＣＤ４Ｔ細胞応答が検出された（Heine et al, Currebt Allergy and Asthma reports 6, 145-152, 2006）。マウスにおける応答を調べるために、全てのＣＤ４Ｔ細胞上にＯＶＡ特異的ＴＣＲを発現する、Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス（ＯＴ−ＩＩトランスジェニックマウス）が作製された。これらのマウスは広く用いられている。
【００２０】
したがって、発明者は、Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃを有するモデル抗原ＯＶＡを改変し、ｓｉａ−アルファ２，３−ＯＶＡを作製し、ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化における機能的影響と、ｓｉａ−２，３−ＯＶＡ装填ＤＣを使用する共培養における分化とを評価した。
【００２１】
そのようなｓｉａアルファ２，３−結合抗原は、免疫応答を抑制することができ、したがって、卵白アルブミンに対するアレルギー患者における免疫応答の抑制に有効に使用することができることが立証された。
【００２２】
したがって、より一般的な概念において、本発明は、治療を必要とする患者における免疫応答の抑制に使用するためのｓｉａアルファ２，３−結合抗原に関する。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
シアル酸は、哺乳動物細胞の表面上の最も一般的な末端単糖である。哺乳類の最も一般的なシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。ヒトは、Ｎｅｕ５ＡｃからＮｅｕ５Ｇｃへの変換に関する酵素をコードする遺伝子における不可逆変異によってＮｅｕ５Ｇｃを合成することができない。シアル酸は、基礎となる糖鎖にα２，３−，α２，６−，α２，８−結合されてもよい。多くの場合、シアル酸は、タンパク質および脂質に付着したオリゴ糖鎖を露出した面の外端に見出される。この末端位置において、それらはシアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）のようなレクチンのリガンドとして機能する。
【００２４】
発明者は、ＯＶＡへのアルファ−ｓｉａ−２，３の結合（これ以後、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３と称する）が、ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答にインビトロで本質的に影響を与えるかどうかを評価することから始めた。ここで、ナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ２５−Ｔ細胞を、ＯＴ−ＩＩマウスから単離し、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３または天然ＯＶＡを装填されたＢＭＤＣと共に４時間共培養した。６日後、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞の分化を、ＦｏｘＰ３または細胞内ＩＦＮγを染色することによって分析した。発明者は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣによって刺激したとき、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞に変換されたことを認めた（図１Ａ、上部パネル）。
【００２５】
天然ＯＶＡを装填されたＤＣは、Ｔ細胞のＴｒｅｇへの分化を刺激しなかった。これに対して、ＩＦＮγ染色によって示されるように（図１Ａ、下部パネル）、これらのＴ細胞はエフェクターＴ細胞に変換された。このことは、これらの培養上清を調べるときに確認された（図１Ｂ、上部パネル）。また、これらの培養においてＴ細胞エフェクターサイトカインであるＴＮＦαおよびＩＬ−６が高水準で検出された。これとは対照的に、これらはＯＶＡ−ｓｉａ−２，３ＤＣによって刺激されたＴ細胞の培養において事実上存在しなかった。ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの生成は、Ｔｈ１７の生成に密接に関連しているので、発明者は上清中におけるＩＬ１７Ａを分析することによってＴｈ１７細胞の存在を評価した。ＩＬ１７Ａは、ＯＶＡ−ｓｉａ２，３ＤＣ−Ｔ細胞の共培養の上清中でほとんど検出されなかった。
【００２６】
さらに、発明者は、ナイーブＴ細胞が、Ｔｈ１−またはＴｈ２−促進刺激の存在下において、ＯＶＡ−ＤＣよりもＯＶＡ−ｓｉａ２，３−ＤＣによって刺激されたとき、Ｔｈ１エフェクターサイトカインであるＩＦＮγおよびＴＮＦαの量が有意に低いままであることを認めた（図１Ｃ）。Ｔｈ１７分化促進剤のプロスタグランジン（ＰＧＮ）の存在下でのみ、高水準のＩＬ１７ＡがＯＶＡ−ｓｉａ−２，３−ＤＣの存する培養で検出された。ＩＬ１０は、ＤＣ−Ｔ細胞の共培養においてほとんど検出されなかった（データは示されていない）。
【００２７】
同時に、これらのデータは、ＤＣに装填されたＯＶＡ−ｓｉａ２，３によるナイーブＣＤ４Ｔ細胞の刺激が、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の新たな生成を促進することを示している。さらに、Ｔｈ１またはＴｈ１７分化促進環境下でさえ、エフェクターＴ細胞の生成は妨げられる。しかしながら、Ｔｈ１７に優位に傾く環境においてナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣによって刺激されたとき、より多くのＩＬ１７Ａ分泌Ｔ細胞が現れる。
【００２８】
コントロールとして、以下の実験を行った。エフェクターＴ細胞の不在下において、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣでナイーブＣＤ４−Ｔ細胞を刺激した後におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の生成は、理論的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子においてＤＣによって提示された抗原の減少の結果である可能性があった。これに対処するために、発明者は、蛍光標識されたＯＶＡ−ｓｉａ−２，３と共にＢＭＤＣを培養し、異なる時点において、結合および摂取の両者を評価した。図２Ａおよび図２Ｂから、ｓｉａ−２，３によるＯＶＡの修飾は、修飾されていないＯＶＡに比べて有意に良好なＢＭＤＣによる結合および摂取をもたらすことが明らかである。したがって、ＢＭＤＣによるＯＶＡ−ｓｉａ−２，３の取り込みが増加する。
【００２９】
この増加した摂取にもかかわらず、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３は内在化によって急速に劣化する可能性がある。この可能性を除外するために、発明者は、続いて、精製されたＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用する抗原提示アッセイにおいて、これらの抗原を装填されたＤＣを用いた。天然ＯＶＡは、有意なＴ細胞増殖によって示されるように、ＭＨＣクラスＩＩ分子において良好に提示される（図２Ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、高用量のシアル酸結合型ＯＶＡを用いたときに有意に異なるのみであった。天然ＯＶＡまたはｓｉａ−２，３−ＯＶＡを装填されたＤＣによって誘導されるＣＤ４Ｔ細胞の増殖において、低用量では有意差は検出されなかった。これらのデータは、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３−ＯＶＡが、天然ＯＶＡと同様の処理および提示経路に入ることを示す可能性がある。
【００３０】
抗原摂取および提示におけるデータを鑑みて、発明者は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３の摂取がシグナルカスケードを引き起こし、ＤＣ表現型の調節をもたらすとの仮説を立てた。したがって、発明者は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３と共に６時間培養後のＢＭＤＣにおける共刺激分子の転写産物の発現を調べ、それを、培地のみで培養された天然ＯＶＡまたはＢＭＤＣと共に培養されたＢＭＤＣにおける発現と比較した。図３Ａから、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現は、有意ではないが、天然ＯＶＡと共に培養されたＢＭＤＣよりもＯＶＡ−ｓｉａ−２，３と共に培養されたＢＭＤＣにおいて低いことが明らかである。同様のデータは、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩについて得られた（データは示されていない）。さらに、寛容に関する分子は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＢＭＤＣによって、顕著にまたは高度には発現されなかった。その上、ＰＤ−Ｌ２の発現は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＢＤＭＣにおいて低下したようである。
【００３１】
サイトカインｍＲＮＡ発現の分析は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣにおけるＩＬ１βの有意に低い発現を明らかにした（図３Ｂ）。これに対して、ＩＬ２３を生じるためのＩＬ１２のｐ４０サブユニットに結合することができるＩＬ２３ｐ１９の発現は、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣにおいて有意に上昇した。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ１０またはＴＧＦｂをコードするｍＲＮＡの試験では有意差は認められなかった（図３Ｂ）。
【００３２】
同時にこれらのデータは、追加の刺激の非存在下におけるＯＶＡ−ｓｉａ−２，３の摂取が、周知の寛容マーカーの発現をもたらさないことを示している。したがって、発明者は、ＤＣによって摂取されたｓｉａ−２，３修飾抗原がナイーブＣＤ４Ｔ細胞のＴｒｅｇへの分化を調節することを示した。発明者のデータは、このことが抗原提示の低下の結果ではなく、多量の抗原が摂取されたとき、非修飾抗原またはｓｉａ−２，６修飾抗原と同様であったことを示している。発明者は、ｓｉａ−２，３の摂取がＤＣの寛容表現型を改変することができるかどうかを分析したが、ＣＤ８０／ＣＤ８６、ＣＤ４０またはＭＨＣクラスＩＩの発現において全く大きな変化を見出さなかった。発明者は、共刺激分子ＰＤＬ−２の発現が、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を摂取したＤＣにおいて、天然ＯＶＡと比較して低いことを認めた。ＤＣによるサイトカイン産生の分析において、発明者は、炎症性サイトカインプロファイル（ＩＦＮγ、ＩＬ−６およびＴＮＦα）が、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３摂取後のＤＣによって低下することを認めた。このことは、抗炎症効果を示す。抗炎症性サイトカインプロファイルの分析において、発明者はＴＧＦｂの産生がほとんど向上せず、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７Ａの変化がないことを認めた。
【００３３】
抗原のアルファ２，３シアリル化が抗原に特異的なＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞の分化を促進するとの発明者の知見は、その機構と、ＣＤ４ナイーブＴ細胞のＴｒｅｇへの分化を誘導するためにＤＣに到達するシグナルとがどのようなものであるかを明らかにするものである。また、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療の全く新しい領域を開拓するものである。したがって、本発明は、治療を必要とする患者における免疫応答の抑制に使用するためのｓｉａアルファ２，３−結合抗原に関する。
【００３４】
用語ｓｉａ−アルファ２，３結合抗原は、タンパク質、ポリペプチド、脂質などの抗原であって、シアル酸Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃに共有結合され、ｓｉａ−アルファ２，３−結合抗原を生じる抗原を表す。
【００３５】
そのような抗原は、多発性硬化症、関節リウマチ、１型糖尿病、胃炎および炎症性腸疾患などの自己免疫疾患の治療のために効果的に使用することができる。また、それは、乾癬、アレルギー、アルツハイマー病、パーキンソン病および移植のような炎症性疾患の治療に使用することができる。
【００３６】
他の実施形態において、本発明は、治療を必要とする患者における免疫応答を抑制するための方法であって、ｓｉａｌアルファ２，３修飾抗原が前記患者に投与される方法に関する。
【００３７】
疾患特異的抗原がシアリル化され、患者に投与されるとき、免疫応答がさらに抑制されると想定されてもよい。したがって、本発明は、治療を必要とする患者における免疫応答の抑制に使用するためのｓｉａアルファ２，３−結合抗原であって、疾患特異的である抗原に関する。本発明に係る方法において良好に作用する疾患特異的抗原のいくつかの例は、表１に記載されている。
【００３８】
【表１】
0005992918.tif 000002
【００３９】
この方法において、当業者は、タンパク質もしくはペプチド、またはナノ粒子もしくはカプセル化粒子のような、疾患に関連する特異的抗原を修飾し、抗炎症プログラムを開始させるために、ＤＣのようなＡＰＣにエクスビボまたはインビボにおいて指示を与えることができる糖鎖構造としてアルファ２，３シアル酸を用いて、炎症を抑制し、疾患を回復させるＴｒｅｇの誘導を促進させるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣによるナイーブＣＤ４Ｔ細胞の刺激は、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の新たな生成をもたらし、エフェクターＴ細胞の形成を抑制する。図１Ａにおいて、未成熟ＢＭＤＣを５０μｇ／ｍｌのＯＶＡまたはＯＶＡ−ｓｉａ−２，３と共に４時間培養した。よく洗浄した後、ナイーブＯＶＡ特異的ＣＤ４Ｔ細胞を１：１０の割合で添加した。培養の６日目に細胞を採取し、固定化し、透過処理し、ＣＤ４およびＦｏｘＰ３について染色（上部パネル）、またはＰＭＡ／イオノマイシン／ブレフェルジンＡで６時間刺激した後、ＣＤ４およびＩＦＮγについて染色した（下部パネル）。結果は、５つの独立した実験を代表するものである。図１Ｂにおいて、これらの培養の上清について、エフェクターＴ細胞のサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６およびＩｌ１７Ａ）、ならびに抗炎症性サイトカインＩＬ１０の存在を調べた。図１Ｃにおいて、ＣｐＧまたはＰＧＮがＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣを含む共培養に添加されたときもエフェクターＴ細胞サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの量は減少した。ＰＧＮの存在下でのみ、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を装填されたＤＣはＴｈ１７分化を促進させる。図示された結果は、４つの独立した実験を代表するものである。
【図２】ＤＣによる結合および摂取の増加にもかかわらず、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３のＭＨＣクラスＩＩ提示は増加しない。ＯＶＡ−ｎｅｏ−糖結合ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を、ＢＭＤＣによる結合および摂取を評価するために蛍光標識した。図２Ａにおいて、新たな糖タンパク質の結合を評価するために、１０５ＢＭＤＣを５０μｇ／ｍｌの抗原と共に４℃で３０分間培養した。結合を天然ＯＶＡと比較した。ＣＴＲＬは、ネガティブコントロールとして用いられた培地のみで培養した細胞を示す。結合をフローサイトメトリーによって評価した。代表的なＦＡＣＳプロットが示される。図２Ｂにおいて、ＢＭＤＣを５０μｇ／ｍｌの抗原と共に３７℃で培養することによって摂取を測定した。抗原の摂取を、フローサイトメトリーを用いて指示された時点で測定し、ＭＦＩとして表した。３つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験が示される。図２Ｃにおいて、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３の増加した摂取が、ＭＨＣクラスＩＩの提示も増加させるかどうかを調べるために、発明者は、指示濃度のＯＶＡ−ｓｉａ−２，３または天然ＯＶＡを加えた２．５×１０４ＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣと精製されたＯＶＡ−特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞とを共培養した。３日間の培養期間の最後の１６時間の間に３Ｈ−チミジンを添加することによって増殖を測定した。
【図３】ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３との培養後、ＢＭＤＣにおける免疫寛容誘発の兆候の誘導はない。ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３とのＢＭＤＣの培養が、ＢＭＤＣにおける免疫寛容誘発表現型を誘導するかどうかを調べるために、発明者は１０５のＢＭＤＣを５０μｇ／ｍｌの抗原と共に培養した。これを、天然ＯＶＡとＢＭＤＣとの培養によって誘導される表現型と比較した。６時間後、ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、（Ａ）共刺激マーカーおよび（Ｂ）サイトカインの発現を調べた。３つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験が示される。Ｐ値＜０．０５は、天然ＯＶＡに対する反応と有意に異なると考えられる。
【図４】ｓｉａ−ＯＶＡ−２，３を装填されたエクスビボで単離された脾臓ＤＣによるナイーブＣＤ４Ｔ細胞の刺激は、抑制特性を有するＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の新規生成をもたらす。エクスビボで単離されたＣＤ１１ｃ＋脾臓ＤＣを、５０μｇ／ｍｌのＳｉａ−ＯＶＡまたは天然ＯＶＡと共に４時間培養した。よく洗浄した後、ナイーブＯＶＡ特異的ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋Ｔ細胞を１：１０の割合で添加した。培養の６日目において、細胞を採取し、固定し、透過処理し、ＣＤ４およびＦｏｘＰ３について染色（Ａ）、またはＰＭＡ／イオノマイシン／ブレフェルジンＡで刺激した６時間後、ＣＤ４およびＩＦＮγについて染色（Ｂ）した。培養上清について、エフェクターサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６）および抗炎症性サイトカインＩＬ１０の存在を調べた（Ｄ）。また、これらのＴ細胞を、天然ＣＦＳＥ標識ＯＴ−ＩＩＴ細胞と、ＯＶＡを装填されたＤＣとの共培養に添加することによって、潜在的な抑制特性を評価することができた。フローサイトメトリーを用いて４日後にレスポンダーＴ細胞の増殖を分析した（Ｃ）。結果は、２つの独立した実験を代表するものである。
【図５】炎症後刺激の存在下でさえ、シアリル化抗原の摂取は免疫寛容誘発ＤＣをもたらす。エクスビボで単離された脾臓ＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ存在下において、５０ｕｇ／ｍｌのＳｉａ−ＯＶＡと共に培養した。４時間後、細胞をよく洗浄し、ナイーブＯＶＡ特異的ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４＋Ｔ細胞を１：１０の割合で添加した。培養後６日目に、細胞を採取し、固定し、透過処理し、ＣＤ４およびＦｏｘＰ３について染色（Ａ、上部パネル）、またはＰＭＡ／イオノマイシン／ブレフェルジンＡの刺激の６時間後、ＣＤ４およびエフェクターサイトカインＩＦＮγについて染色した（Ａ、下部パネル）。また、エフェクターサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ６）の存在について培養上清を分析した（Ｂ）。
【図６】Ｓｉａ−ＯＶＡの静脈内注射におけるＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の新規誘導。図６Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＦＳＥ標識されたＯＴ−ＩＩ細胞を移入し、１日後、ＰＢＳと共に、ＯＶＡまたはＳｉａ−ＯＶＡを静脈に注射し、脾臓（左）およびリンパ節（右）におけるＣＦＳＥの希釈のための、（Ｔｇ  Ｔ細胞受容体に基づいて特定された）ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の分析したものである。図６Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ、ＯＶＡまたはＳｉａ−ＯＶＡを皮下注射した１日後、ＣＦＳＥ標識されたＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞を移植し、脾臓（左）およびリンパ節（右）の分析したものである。また、Ｓｉａ−ＯＶＡがインビボにおいて免疫寛容誘発特性を有するか否かを調べるために、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＯＴ−ＩＩ細胞を用いて養子移入されたＣ５７ＢＬ／６マウスに１００ｕｇのＳｉａ−ＯＶＡを静脈内（Ａ）、または皮下（Ｂ）に注入した。これを、１００ｕｇのＯＶＡの注入と比較した。コントロールマウスはＰＢＳを与えられ、４日後、脾臓および腋窩および鼠径部リンパ節を単離し、単一細胞懸濁液をＴｇ  ＴＣＲ（Ｖａｌｆａ２、Ｖａｌｆａ５）、ＣＤ４について染色し、Ｔｇ  ＣＤ４  Ｔ細胞のＣＦＳＥ希釈を分析した。また、細胞はＦｏｘＰ３について共染色され（固定および透過処理後）、ＦｏｘＰ３＋ＣＦＳＥ＋  ＴＣＲ  Ｔｇ  Ｔ細胞の量を抗原の静脈注射後に測定した（Ｃ）。養子移入されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団は、９９％のＣＤ２５−Ｔ細胞を含んでおり、天然に生じるＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇが全く変換されなかったことを示した（Ｄ）。２つの独立した実験のうち、１つの代表的な実験が示されている。Ｐ値＜０．０５は、天然ＯＶＡと有意に異なると考えられる。
【図７】Ｓｉａ−ＯＶＡの注射は、インビボにおけるエフェクター細胞の生成を抑制する。インビボにおけるＳｉａ−ＯＶＡの誘発する寛容の強度を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１００ｕｇのＳｉａ−ＯＶＡを静脈内注射し、コントロールマウスに１００ｕｇの天然ＯＶＡを注射した。一週間後、マウスを２００ｕｇのＯＶＡ／２５ｕｇの抗ＣＤ４０と、５０ｕｇのポリＩ：Ｃとの注入によって感作させた。さらに一週間後、マウスを屠殺し、脾臓を単離し、固定、透過ならびにＣＤ４およびＦｏｘＰ３について染色した後、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在を評価し（Ａ．左パネル）、またはＲＮＡ単離後ＲＴ−ＰＣＲによってＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の存在を評価した（Ａ、右パネル）。また、脾細胞をブレフェルジンＡの存在下でＯＶＡ２５７−２６４を用いて５時間再刺激し、細胞を採取し、固定し、透過処理し、ＣＤ４およびＩＦＮγについて染色した（Ｂ、左パネル）。また、培養上清におけるＩＦＮγの存在をＥＬＩＳＡによって分析した（Ｂ、右パネル）。次に、脾臓細胞をＯＶＡ２６５−２７９で２４時間再刺激し、最後の６時間の間ブレフェルジンＡを存在させた。細胞を採取し、固定し、透過処理し、ＣＤ４およびＩＦＮγ（Ｃ）、またはＣＤ４およびＩＬ１０（Ｄ、左パネル）について染色した。培養上清におけるＩＬ１０の存在もＥＬＩＳＡによって分析され、培養中にブレフェルジンＡが含まれなかった（Ｄ、右パネル）。３つの独立した実験のうち１つの代表的な実験が示されている。反応を無処置の天然マウスと比較した。Ｐ値＜０．０５は、天然ＯＶＡ対する反応と有意に異なると考えられた。
【図８】Ｓｉａ−ＯＶＡを装填されたＤＣ上におけるＣＤ４０の低発現。ＢＭＤＣを、Ｓｉａ−ＯＶＡまたは天然ＯＶＡと共にＬＰＳの非存在下または存在下で培養した。コントロールＤＣを培地またはＬＰＳと共に培養した。２４時間後、細胞を抗ＣＤ４０およびＣＤ１１ｃ抗体で染色し、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ上のＣＤ４０の発現についてフローサイトメトリーを用いて分析した。
【実施例】
【００４１】
実施例１：マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをチャールスリバーから購入し、８〜１２週齢で用いた。ＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲトランスジェニックマウスを、特定の病原体を含まない条件下において発明者の動物施設で飼育した。全ての実験は、ＶＵｍｃの動物実験委員会によって承認された。
【００４２】
実施例２：骨髄由来ＤＣ
以前にＬｕｔｚによって記載された方法を少し改変してＢＭＤＣを培養した（Lutz et. al. J.I. Methods 223, 77-92, 1999）。マウスの大腿骨および脛骨を除去し、両端を切断し、骨髄をイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ; Gibco, CA, USA）で洗い流した。得られた骨髄懸濁液を、単一細胞懸濁液を得るために１００μｍのガーゼを通した。洗浄後、１００ｍｍディシュ（Greiner Bio-One, Alphen aan de Rijn, The Netherlands）あたり２×１０６細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン（BioWhittaker, Walkersville, MD)、および５０μＭ  β−メルカプトエタノール（Merck, Damstadt, Germany)（＝ＩＭＤＭｃ）を補充し、３０ｎｇ／ｍｌのリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ（ｒｍＧＭ−ＣＳＦ）を含む１０ｍｌのＩＭＤＭ中に播種した。２日目に、３０ｎｇ／ｍｌ  ｒｍＧＭ−ＣＳＦを含む１０ｍｌの培地を添加した。５日目に、別の３０ｎｇ／ｍｌ ｒｍＧＭ−ＣＳＦを各プレートに添加した。６日目以降から、非接着ＤＣを回収し、その後の実験に用いた。
【００４３】
実施例３：抗体
非結合マウス抗鶏卵アルブミン（ＯＶＡ）抗体（ＯＶＡ−１４）をシグマアルドリッチから購入した。用いたＦＩＴＣ−標識抗体は、抗ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）および抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）である。
【００４４】
ＰＥ標識抗体は、抗ＩＬ−４（クローン１１Ｂ１１）、抗ＩＬ−１７（クローンｅＢｉｏＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）、抗ＣＤ４０（クローンＭＲ１）、抗ＣＤ８０（クローン１６−１０−Ａ１）、抗ＣＤ８６（クローンＧＬ−１）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（クローン？）、用いたＡＰＣ標識抗体は、抗ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、抗ＩＦＮγ（クローンＸＭＧ１．２）、および抗ＦｏｘＰ３（クローンＦＪＫ−１６ｓ）である。全ての抗体は、ｅ−バイオサイエンス（Belgium）またはＢＤバイオサイエンス（Belgium）から購入した。
【００４５】
本研究において用いた二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧおよびヤギ抗マウスＩｇＧであった（Jackson, West grove, PA, USA）。
【００４６】
実施例４：ｓｉａ−２，３−ＯＶＡの生成
３’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ、Dextra labs, UK）を卵白アルブミン（Calbiochem, Darmstadt, Germany）に結合させ、二官能性架橋剤（４−Ｎ−マレイミドフェニル酪酸ヒドラジド、ＭＰＢＨ、Pierce, Rockford, USA）を用いてＯＶＡ−ｓｉａ−２，３を作製した。つまり、還元的アミノ化によって、リンカのヒドラジド部分は炭水化物の還元末端に共有結合される。ここで、混合物を７０℃で２時間培養した。室温に冷却後、１ｍｌの氷冷イソプロパノール（ＨＰＣグレード；Riedel de Haan, Seelze, Germany）を添加し、混合物をさらに1時間、−２０℃で培養した。続いて、沈殿した誘導体化炭水化物をペレット化し、１ｍＭのＨＣｌ中に溶解した。卵白アルブミンを１：１０のモル比（ＯＶＡ：炭水化物）で誘導体化炭水化物に添加し、結合を４℃で一晩行った。新規の複合糖質を、ＰＤ−１０脱塩カラム（Pierce, Rockford, USA）を用いて反応の還元剤から分離した。ＯＶＡの濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（Pierce, Rockford, Ill.）を用いて測定した。潜在的なエンドトキシン混入を、発色ＬＡＬエンドトキシンアッセイキット（fabrikant）を用いて測定した。ＯＶＡ−ｓｉａ２，３および天然ＯＶＡの両者は、全くエンドトキシンを欠いていた（補足図１Ａ）。
【００４７】
また、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）標識（Thermo Scientific, Rockford, USA）を、ＯＶＡまたはＯＶＡ−ｓｉａ−２，３に共有結合させた（Ｄｙｌｉｇｈｔ−５４９−ＯＶＡ）。遊離標識は、ＰＤ−１０カラム（Pierce）を用いて除去した。
【００４８】
ＯＶＡ上のｓｉａ−２，３の提示をＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔には、ＯＶＡ−ｓｉａ−２，３をＥＬＩＳＡプレート（NUNC Maxisorb, Roskilde, Denmark）に直接コートし、植物レクチンであるイヌエンジュ（ＭＡＡ、Vector Laboratories Inc）の結合を｛Ｓｉｎｇｈ，２０１０  ９０／ｉｄ｝に記載されたように測定した。データは、補足図１Ｂに示されている。
【００４９】
実施例５：結合／摂取アッセイ
５×１０４ＢＭＤＣを９６ウェル丸底プレートで培養し、Ｄｙｌｉｇｈｔ５４９標識抗原（３０μｇ／ｍｌ）を添加した。細胞を抗原と共に３０分間４℃で培養し、結合を測定し、３７℃で１時間、２時間および４時間培養し結合／摂取を測定した。
【００５０】
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ−制限された抗原提示アッセイ
ＢＭＤＣ（２．５×１０４／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート中の抗原の指示濃度で４時間培養した。洗浄後、５×１０４の精製されたＯＶＡ特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかを各ウェルに添加した。ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、それぞれＯＴ−ＩまたはＯＴ−ＩＩマウスのリンパ組織から単離した。簡潔には、リンパ節および脾臓を回収し、１００μｍのガーゼを通し、脾臓およびリンパ節を濾過することによって単一細胞懸濁液を得た。赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液において培養することによって希釈し、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＤｙｎａｌマウスＣＤ４またはＣＤ８陰性単離キット（Invitrogen, CA, USA）を用いて、製造者の手順に従って単一細胞懸濁液から単離した。増殖を[３Ｈ]−チミジンの取り込みによって評価した。[３Ｈ]−チミジン（１μＣｉ／ウェル；Amersham Biosciences, NJ, USA）を、３日間の培養における最後の１６時間の間に添加した。細胞をフィルター上に採取し、[３Ｈ]−チミジンの取り込みを、Wallacマイクロベータカウンター（Perkin-Elmer, USA）を用いて評価した。
【００５１】
実施例６：インビトロにおけるＣＤ４＋Ｔヘルパー分化アッセイ
１０４のＢＭＤＣを９６ウェル丸底プレートにおいて３０μｇ／ｍｌの新規複合糖質または天然ＯＶＡと共に培養した。洗浄後、５×１０４の精製されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ２５−Ｔ細胞をＯＴ−ＩＩマウスから単離し、各ウェルに添加した。２日目に、１０ＩＵ  ｒｍＩＬ−２を添加した。７日目に、ＦｏｘＰ３の発現を、ＦｏｘＰ３染色キット（e-Bioscience）を用いて分析した。また、ＩＦＮｇ＋、ＩＬ４＋、またはＩＬ１７Ａ＋Ｔ細胞の発生頻度を細胞内染色によって測定した。ここで、ブレフェルジンＡ（Sigma）の存在下で６時間の間、Ｔ細胞をＰＭＡおよびイオノマイシン（１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ；Sigma）で活性化した。細胞をＣＤ４について共染色し、ＦＡＣＳキャリバーを用いて分析した。
【００５２】
実施例７：ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲ
ｍＲＮＡキャプチャーキット（Roche, Basel, Switzerland）を用いて、ストレプトアビジン被覆チューブ内においてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを捕捉することによってｍＲＮＡを単離した。製造業者のガイドラインに従って逆転写システムキット（Promega, WI, USA）を用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Applied Biosystems）においてＳＹＢＲグリーン法を用いて行った。
【００５３】
実施例８：Ｔｒｅｇ誘導のインビトロ分析
エクスビボで単離された脾臓ＤＣのインビトロにおけるＳｉａ−ＯＶＡの装填は、ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴｒｅｇ系統への分化を誘導する免疫寛容誘発性ＤＣの生成をもたらす。
【００５４】
１０４のＢＭＤＣを、３０μｇ／ｍｌのＳｉａ−ＯＶＡ、または天然ＯＶＡと共に９６ウェル丸底プレート中で４時間培養した。洗浄後、ＯＴ−ＩＩ  Ｔｇマウスの二次リンパ組織から単離された、５×１０４の精製されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ２５−Ｔ細胞を、各ウェルに添加した。２日目、１０ＩＵ  ｒｍＩＬ−２を添加した。７日目に、ＦｏｘＰ３の発現を、ＦｏｘＰ３染色キット（e-Bioscience）を用いて分析した。また、ＩＦＮγ＋、ＩＬ４＋およびＩＬ１７Ａ＋Ｔ細胞の発現頻度を細胞内染色によって測定した。ここで、Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡ（シグマ社）の存在下で、ＰＭＡおよびイオノマイシン（１００ｎｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ；Sigma）で６時間活性化させた。細胞を、ＣＤ４について共染色し、ＦＡＣＳキャリバーを用いて分析した。
【００５５】
また、発明者は、エクスビボで単離され、Ｓｉａ−ＯＶＡを装填された脾臓ＤＣと共にナイーブなＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を培養すると、天然ＯＶＡを装填されたＤＣと比べてＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成を増加させることを認めた（図４Ａ）。ＩＦＮγ産生Ｔ細胞は、ほとんど検出されなかった（図４Ｂ）。ＩＬ４−、ＩＬ１７−産生Ｔ細胞のどちらも、ＳＩＡ−ＯＶＡまたは天然ＯＶＡ装填ＤＣによって刺激されたＴ細胞において検出されなかった（図示せず）。
【００５６】
誘導されたＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞は、それらの抑制能力について試験された。ここで、それらはナイーブＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩレスポンダーＴ細胞およびＯＶＡ装填ＤＣの共培養物に添加された。レスポンダーＴ細胞をＣＦＳＥで標識することによって、それらの増殖をフローサイトメトリーによって分析することができる。Ｓｉａ−ＯＶＡを装填されたＤＣによって刺激されたＴ細胞のみがレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制した（図４Ｃ）。ＯＶＡ装填ＤＣまたはナイーブＴ細胞によって刺激されたＴ細胞は、レスポンダーＴ細胞の増殖に影響を及ぼさなかった。
【００５７】
ＳＩＡ−ＯＶＡ摂取によるＤＣ調節の強さ（ひいては継続的な免疫応答を有する患者におけるシアリル化抗原を投与の妥当性）を評価するために、発明者は、ＬＰＳの存在下（１００ｎｇ／ｍｌ）において、エクスビボで単離された脾臓ＤＣにＳｉａ−ＯＶＡを装填した。この環境においても、ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の生成が検出された。さらに、ＯＶＡ−ＬＰＳ装填ＤＣはＯＶＡ−反応性Ｔ細胞においてＩＦＮγ産生を誘導したが、このことはＳｉａ−ＯＶＡ−ＬＰＳを装填されたＤＣとの培養においては認められなかった（図５Ａ）。培養上清の分析は、Ｔ細胞およびＤＣ−ＯＶＡ−ＬＰＳからの培養上清よりも減少したＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＩＬ６濃度を示した（図５Ｂ）。
【００５８】
実施例９：インビボ実験
インビボにおいて寛容を誘導するためのシアリル化抗原の有効性を、異なるモデルで分析した。
【００５９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＣＦＳＥで標識されたＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩＴ細胞を養子移入した。１日後、マウスに１００μｇのＯＶＡ−ＳＩＡまたは天然ＯＶＡを静脈注射または皮下注射し、３日後、リンパ組織を、移入されたＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖について分析した。コントロールマウスは、移入されたＣＤ４Ｔ細胞の増殖を導かないＰＢＳを与えた（図６Ａ）。発明者は、注射の用いられた部位（静脈内または皮下）にかかわりなく、ＯＶＡの注入が大規模な増殖を導くこと（図６Ａ）を認めた。しかしながら、静脈内へのＳｉａ−ＯＶＡの注入は、移入されたＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞増殖の低下をもたらした。増殖の低下は、全身（脾臓およびリンパ節）において認められた。Ｓｉａ−ＯＶＡの皮下注射は、ＯＶＡと比較して、流入領域リンパ節においてＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の増殖に対する顕著な効果を示さなかった（図６Ｂ）。移入されたＯＴ−ＩＩ細胞の表現型を分析した際、発明者は、Ｓｉａ−ＯＶＡを注入したマウスのみにおいて、Ｔ細胞がＦｏｘＰ３に陽性であることを認めた（図６Ｃ）。注入されたＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞はＣＤ２５−ＣＤ４＋Ｔ細胞であったので、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋の欠陥は天然にＴｒｅｇを生じ、これらのデータはＳｉａ−ＯＶＡの注入がＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの新規誘導をもたらすことを示している（図６Ｄ）。
【００６０】
さらに、これらのデータは、シアル酸の受容体が特に脾臓のＤＣなどの抗原提示細胞上に主に存在することを示唆している。
【００６１】
Ｓｉａ−ＯＶＡの静脈内注入は、インビボでのＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞生成においてこのような顕著な効果を有したので、発明者は、これらの細胞がエフェクターＴ細胞の生成を抑制することができるかどうかを評価した。ここで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫前にＳｉａ−ＯＶＡで処理した。この群をＯＶＡで処理したマウスと比較した。一週間後に、マウスを２５μｇのａＣＤ４０およびポリＩ：Ｃと混合された１００μｇのＯＶＡの静脈注入によって免疫した。免疫の一週間後、脾臓を採取し、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現頻度をフローサイトメトリーによって分析した。ナイーブコントロールマウスと比較して、Ｓｉａ−ＯＶＡの脾臓で検出されたＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の割合において有意な増加があったが、ナイーブＯＶＡ処置マウスでは増加しなかった。この割合は、天然ＯＶＡ処置マウスの脾臓において検出された割合（図７Ａ左パネル）よりも有意に高く、総脾臓細胞においてＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図７Ａ右パネル）。
【００６２】
また、ＣＤ８およびＣＤ４エフェクターＴ細胞の存在を、ＯＶＡペプチド（それぞれＯＶＡ２５７−２６４およびＯＶＡ２６５−２７９）を用いたインビトロ再刺激、および細胞内サイトカイン染色によって測定した。ＩＦＮγ産生ＣＤ８Ｔ細胞の割合は、ＯＶＡ処置されたマウスと比較して、Ｓｉａ−ＯＶＡ処置されたマウスにおいて有意に減少した（図７Ｂ、左）。このことは、パラレル培養の上清におけるＩＦＮγ量を測定するときに確認された（図７Ｂ、右）。ＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮｇ産生の分析は、有意差を示さなかった（図７Ｃ）。このことは、誘導されたＴｒｅｇがＩＦＮγをよく産生するという事実によるものであるかもしれない（たとえば、Ｔｒ１細胞）。ここで、これらのＩＬ１０およびＩＦＮγを産生するＴｒｅｇをＩＦＮγ産生エフェクターＴ細胞から区別するために、ＩＬ１０について刺激分析を将来実施するべきである。
【００６３】
ＩＬ１０産生ＣＤ４Ｔ細胞の分析は、ＳＩＡ−ＯＶＡ処置マウスの脾臓におけるＩＬ１０分泌Ｔ細胞の割合を有意に増加させることを示した。しかしながら、これは、天然ＯＶＡ処置マウスの脾臓で見られた割合と有意差はなかった（図７Ｄ、左）。一晩培養後、脾細胞の上清を分析するとき、これらのデータを確認した（図７Ｄ、右）。
【００６４】
さらに、発明者の実験は、発明者がインビトロにおいてＳＩＡ−ＯＶＡを装填されたＤＣをＣ５７ＢＬ／６マウスに注入し、続いてＯＶＡ＋ＣｐＧを抗原投与したとき、発明者がＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの強い誘導とエフェクターＣＤ４Ｔ細胞誘導の減少とを認めたことを明確に示している。このことは、インビボにおける寛容の誘導が、ＤＣによって調節されることを明らかに示している。
【００６５】
実施例１０：ＤＣの調節
発明者は、Ｓｉａ−ＯＶＡの摂取後にＤＣの表現型を分析し、それを天然ＯＶＡ摂取ＤＣの表現型と比較した。このことを、ＬＰＳの不在下および存在下の両者で行った。ＯＶＡを装填されたＤＣと比較すると、ＣＤ４０は、Ｓｉａ−ＯＶＡ装填ＤＣ上に一貫して少ないことが示された。
【００６６】
Ｓｉａ−ＯＶＡを装填されたＤＣによる寛容誘導の基本的な機構におけるより多くの知見を得るために、発明者はマイクロアレイ解析を行った。ここで、ＤＣを５０μｇ／ｍｌのＳｉａ−ＯＶＡまたは天然ＯＶＡと培養し、１時間および６時間の培養後、ＤＣを回収し、ヌクレオスピンキットを用いてＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅ処理を用いてゲノムＤＮＡを除去した。ＲＮＡの品質および完全性は、サービスＸＳ（Leiden）によって確認した。良い品質のものに基づいて、ＲＮＡを増幅し、標識し、ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（MouseWG-6 V2、Illumina）上にハイブリダイズさせた。発明者は、Ｓｉａ−ＯＶＡ  ＤＣとＯＶＡ−ＤＣとの標準化された遺伝子発現を比較した。全ての試料は表２に示されるように１０倍以上の差（より多いまたはより少ない）を示している。最も興味深い遺伝子は、ＡＩＲＥ（Ｓｉａ−ＯＶＡ  ＤＣにおいて高い）と、Ｉ型ＩＦＮ経路を作動させる遺伝子であると考えられる。両者は、寛容に関連しており、お互いに関係しているようである。
【００６７】
【表２−１】
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【００６８】
【表２−２】
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【００６９】
【表２−３】
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【００７０】
【表２−４】
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【００７１】
【表２−５】
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【００７２】
【表２−６】
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【００７３】
【表２−７】
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【００７４】
【表２−８】
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【００７５】
【表２−９】
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【００７６】
【表２−１０】
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【００７７】
【表２−１１】
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【００７８】
【表２−１２】
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【００７９】
【表２−１３】
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【図１Ａ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ｂ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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