(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリシアル酸（ＰＳＡ）または修飾ＰＳＡ（ｍＰＳＡ）を、ＤＮＡ分解酵素の酸化した糖質部分に、一般式ＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎＯＮＨ２（ｎは１〜５０）により表されるアミノオキシリンカーを用いて結合体化させる方法であって、
該方法が、
ａ）水溶性ポリマーである該ＰＳＡまたはｍＰＳＡを酸化してアルデヒド基を形成させる工程；
ｂ）該アミノオキシリンカーを、酸化したＰＳＡまたはｍＰＳＡと反応させて、該アミノオキシリンカー化合物の末端の窒素原子に直接結合した化合物を合成する工程；
ｃ）該ＤＮＡ分解酵素を酸化し、アルデヒド基を形成させる工程；および
ｄ）工程ｂ）で合成された化合物を、工程ｃ）からの酸化したＤＮＡ分解酵素と反応させ、該ＤＮＡ分解酵素の該酸化した糖質部分の該アルデヒド部分と該工程ｂ）で合成された化合物の該アミノオキシリンカーのもう一方の末端の窒素原子との間でオキシム結合を形成させる工程
を含み、
ｍＰＳＡが、酸化または還元により末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分を含むＰＳＡである、方法。
【請求項２】
前記ＰＳＡまたはｍＰＳＡが、コロミン酸または修飾コロミン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＳＡまたはｍＰＳＡが、２〜５００のシアル酸単位を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｃ）における前記糖質部分の酸化が、前記ＤＮＡ分解酵素を過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）とインキュベートすることを含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）が、前記ＰＳＡまたはｍＰＳＡを酸化させて、該ＰＳＡまたはｍＰＳＡの末端単位にアルデヒド基を形成させる工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＮａＩＯ４を用いて、前記ＰＳＡまたはｍＰＳＡを酸化させる工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アニリンおよびアニリン誘導体より選択される求核触媒を含む緩衝液中で、前記酸化した糖質部分を、前記ＰＳＡまたはｍＰＳＡと接触させる工程を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記アミノオキシリンカーが、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンまたは３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
還元性化合物の存在下でインキュベートすることによって、結合体化したＤＮＡ分解酵素のオキシム結合を還元する工程をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記還元性化合物が、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）またはアスコルビン酸（ビタミンＣ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
一般式ＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎＯＮＨ２（ｎは１〜５０）で表されるアミノオキシリンカーの末端の一方の窒素原子が、酸化したＤＮＡ分解酵素中のアルデヒド基由来のカルボニル炭素原子との間でオキシム結合し、該アミノオキシリンカーの末端のもう一方の窒素原子が、酸化したＰＳＡ中のアルデヒド基由来のカルボニル炭素原子との間でオキシム結合してなる、結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性ポリマー（特に、ポリシアル酸）を糖質含有化合物（特に、血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質）に結合体化させるための材料および方法、ならびに得られた結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド薬物の（例えば、ＰＥＧ化またはポリシアル酸化による）結合は、血液循環中の分解からポリペプチド薬物を保護し、このようにそれらの薬力学的および薬物動態学プロファイルを改善させる（HarrisおよびChess, Nat Rev Drug Discov. 2003; 2: 214-21; S. Jain, D. Hreczuk-Hirst, P. LaingおよびG. Gregoriadis, Drug Delivery Systems and Sciences, 4 (No 1): 3-9, 2004.）。ＰＥＧ化プロセスにより、エチレングリコールの反復単位（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））をポリペプチド薬物に付着させる。ＰＥＧ分子は巨大な流体力学量（球状タンパク質の５〜１０倍量）を有し、高度な水溶性と水和性、非毒性、および非免疫原性であり、生体内から速やかに除去される。分子のＰＥＧ化は、薬物の酵素的分解に対する抵抗性の増大、インビボでの半減期の延長、投薬頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱安定性の増大、溶解性の増大、液体安定性の増大、および凝集の低減をもたらし得る。最初のＰＥＧ化薬物は１９９０年代初期にＦＤＡにより承認された。それ以来、ＦＤＡは経口、注射用および局所投与用の数々のＰＥＧ化薬物を承認している。
【０００３】
シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸ともよばれる）およびポリシアル酸は、動物組織、および、より少ない程度で、植物および真菌から酵母および細菌に及ぶ他種において、大部分は糖タンパク質やガングリオシドに広く分布していることがわかっている。
【０００４】
本明細書中で用いる略語である「ＰＳＡ」は、用語「ポリシアル酸」のことをいう。同様に、本明細書中で用いる「ｍＰＳＡ」は、用語「修飾ポリシアル酸」のことをいう。
【０００５】
ＰＳＡは、Ｎ−アセチルノイラミン酸のポリマー（通常、ホモポリマー）からなる。二級アミノ基は、通常、アセチル基を持つが、代わりにグリコリル基を持ってもよい。ヒドロキシル基の可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基、硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。
【０００６】
【化１】
0005909755.tif 000002
【０００７】
ＰＳＡおよびｍＰＳＡは、一般的には、２，８−または２，９−グリコシド結合、あるいはこれらの組み合わせ（例えば、２，８−および２，９−で交互に結合したもの）で連結されたＮ−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる線状ポリマーを含む。特に好ましいＰＳＡおよびｍＰＳＡでは、グリコシド結合がα−２，８である。そのようなＰＳＡおよびｍＰＳＡは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中では「ＣＡ」および「ｍＣＡ」という。典型的なＰＳＡおよびｍＰＳＡは、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも２０のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、ＰＳＡおよびｍＰＳＡは、５から５００のＮ−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは１０から３００のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。ＰＳＡおよびＣＡは、異なる糖部分を含むポリマーであり得る。ＰＳＡおよびＣＡは、コポリマーであり得る。ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは、Ｎ−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。ＰＳＡおよびＣＡは、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％のＮ−アセチルノイラミン酸部分を含む。
【０００８】
ＰＳＡおよびＣＡがＮ−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合（例えば、ｍＰＳＡおよびｍＣＡにおけるように）、これらの部分は、好ましくは、ポリマー鎖の一端または両端に位置している。例えば、そのような「他の」部分は、酸化または還元により末端Ｎ−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であり得る。
【０００９】
例えば、WO-A-0187922には、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、非還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位がアルデヒド基に変換されたｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。さらに、WO 2005/016974には、還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位が還元を受け、この還元末端Ｎ−アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それにより隣接ジオール基が形成され、それに伴い引き続き酸化され、隣接ジオール基をアルデヒド基に変換したｍＰＳＡおよびｍＣＡが記載されている。
【００１０】
シアル酸リッチの糖タンパク質は、ヒトおよび他の生物でセレクチンを結合する。それらは、ヒトのインフルエンザ感染に重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、マンノース結合レクチンから、宿主細胞または細菌の表面上のマンノース抗原を隠し得る。このことは、補体の活性化を妨げる。また、シアル酸は、最後から２番目の位置にあるガラクトース残基を隠し、肝実質細胞上のガラクトース受容体による、糖タンパク質の急速な排除を妨げる。
【００１１】
【化２】
0005909755.tif 000003
【００１２】
とりわけ、ＣＡは、Ｋ１抗原をもつ特定の大腸菌株により生産される。ＣＡは多くの生理機能を有する。それらは、薬物および化粧品の原材料として重要である。
【００１３】
ポリシアル酸化および非修飾のアスパラギナーゼを用いたインビボでの比較試験により、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させることが判明した（FernandesおよびGregoriadis, Biochimica Biophysica Acta 1341: 26-34, 1997）。
【００１４】
水溶性ポリマーと治療用タンパク質との間の共有結合の形成による結合体の調製は、様々な化学的方法によって実施され得る。ＰＳＡを治療用タンパク質へカップリングさせるための１つのアプローチは、上記タンパク質の糖質部分を介したポリマーの結合である。タンパク質中の糖質の隣接するヒドロキシル（ＯＨ）基は、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）で容易に酸化され得、活性アルデヒド基を形成する（RothfusおよびSmith, J Biol Chem 1963; 238: 1402-10; van LentenおよびAshwell, J Biol Chem 1971; 246: 1889-94）。その後、上記ポリマーは、例えば、活性ヒドラジド基を含有する試薬を用いて、糖質のアルデヒド基にカップリングされ得る（Wilchek MおよびBayer EA, Methods Enzymol 1987; 138: 429-42）。より最新の技術は、アルデヒドと反応してオキシム結合を形成させるアミノオキシ基を含む試薬の使用である（WO 96/40662, WO2008/025856）。
【００１５】
ＰＳＡの治療用タンパク質への結合体化を記載しているさらなる例が、US Publication No. 2009/0076237（ｒＦＶＩＩＩの酸化、ならびにその後のヒドラジド化学物質を用いた、ＰＳＡおよび他の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ＨＥＳ、デキストラン）へのカップリングが教示されている）、およびWO 2008/025856（種々の凝固因子（例えば、ｒＦＩＸ、ＦＶＩＩｌ、およびＦＶＩＩａ）の酸化、ならびにその後のポリマー（例えば、ＰＥＧ）へのカップリングが教示されている）に記載されている。
【００１６】
近年、シアル酸の穏やかな過ヨウ素酸酸化によりアルデヒドを生じさせ、引き続き触媒量のアニリン存在下で、アミノオキシ基含有試薬と反応させる工程を含む、改良された方法が記載された（Dirksen AおよびDawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; 19, 2543-8; およびZeng Yら、Nature Methods 2009; 6: 207-9）。アニリン触媒作用はオキシム結合を劇的に促進し、非常に低濃度の試薬の使用を可能にする。
【００１７】
水溶性ポリマーを治療用タンパク質へ結合体化させるのに利用できる方法があるにもかかわらず、様々な試薬に関するコストを最小限に抑えながら、化合物の薬力学的および／または薬物動態的特性を改善させる、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質以外の糖質含有化合物へ結合体化させるための材料および方法を開発する必要が残っている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、様々な試薬に関するコストを最小限に抑えながら、化合物の薬力学的および／または薬物動態的特性を改善させる、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質以外の糖質含有化合物へ結合体化させるための材料および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の１つの実施形態では、水溶性ポリマーを血液凝固タンパク質以外の糖質含有化合物の酸化した糖質部分に結合体化させる方法が提供され、上記方法は、上記酸化した糖質部分を上記水溶性ポリマーと、結合体化を可能とする条件下で接触させる工程を含み、上記水溶性ポリマーがアミノオキシ基を含み、上記酸化した糖質部分と上記水溶性ポリマー上の上記アミノオキシ基との間でオキシム結合が形成される、または、上記水溶性ポリマーがヒドラジド基を含み、上記酸化した糖質部分と上記水溶性ポリマー上の上記ヒドラジド基との間でヒドラゾン結合が形成される。上記化合物は、（１）血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質、（２）ガングリオシド、または（３）糖質基を含むドラッグデリバリーシステムであり得る。
【００２０】
上記糖質部分は、糖特異的酸化酵素（例えば、ガラクトースまたはグルコースオキシダーゼ）を用いて、または過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、および過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）より選択される酸化剤を含むバッファーとインキュベートすることによって、酸化され得る。
【００２１】
上記糖質部分は、シアル酸、マンノース、ガラクトース、またはグルコース残基にて酸化され得る。
【００２２】
本発明に用いられる水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分岐ＰＥＧ、ＰＥＧ誘導体、ＰＳＡ、ｍＰＳＡ、ＣＡ、ｍＣＡ、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、デキストリン、ポリオキサゾリン、糖質、ポリサッカリド、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン無水マレイン酸共重合体、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムリン酸（ＭＰＣ）であり得るが、これらに限定されない。
【００２３】
以下の実施例に示す本発明の特定の実施形態では、上記水溶性ポリマーが、ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧである。
【００２４】
以下の実施例に示す本発明のさらなる特定の実施形態では、上記水溶性ポリマーがポリシアル酸（ＰＳＡ）または修飾ＰＳＡ（ｍＰＳＡ）である。上記ＰＳＡまたはｍＰＳＡは、３５０Ｄａから１２０，０００Ｄａ、５００Ｄａから１００，０００Ｄａ、１０００Ｄａから８０，０００Ｄａ、１５００Ｄａから６０，０００Ｄａ、２，０００Ｄａから４５，０００Ｄａ、または３，０００Ｄａから３５，０００Ｄａの範囲の分子量を有し得る。
【００２５】
上記ＰＳＡまたはｍＰＳＡは、コロミン酸または修飾コロミン酸であり得る。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、上記ＰＳＡまたはｍＰＳＡは、約２〜５００または１０〜３００のシアル酸単位で構成される。さらに別の実施形態では、酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）である、上述の方法が提供される。
【００２７】
本発明の方法は、水溶性ポリマーを酸化させて、水溶性ポリマーの末端シアル酸単位にアルデヒド基を形成させる工程、および酸化した水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとを反応させる工程を含み得る。
【００２８】
本発明のさらに別の実施形態では、活性化アミノオキシリンカーと酸化した水溶性ポリマーとを反応させることによって水溶性ポリマーが調製される、上述の方法が提供され、上記リンカーは、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性リンカーである。上記ホモ二官能性リンカーは、一般式ＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎＯＮＨ２を有し得、ｎは１〜５０、好ましくは１〜１１、より好ましくは１〜６である。上記リンカーは、特に、次式の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー
【００２９】
【化３】
0005909755.tif 000004
【００３０】
および次式の３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンリンカー
【００３１】
【化４】
0005909755.tif 000005
【００３２】
より選択され得る。ＰＳＡまたはｍＰＳＡは、酸化剤とインキュベートすることによって酸化され、ＰＳＡの非還元末端で末端アルデヒド基を形成し得る。
【００３３】
本方法は、水溶性ポリマーを酸化させて、水溶性ポリマーの末端単位（例えば、ＰＳＡまたはｍＰＳＡの末端シアル酸単位）にアルデヒド基を形成させる工程、および酸化した水溶性ポリマーとアミノオキシリンカーとを反応させる工程を含み得る。さらにもう１つの実施形態では、上記アミノオキシリンカーが３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンである、上述の方法が提供される。関連する実施形態では、酸化剤はＮａＩＯ４である。
【００３４】
本発明の別の実施形態では、アニリンおよびアニリン誘導体からなる群より選択される求核触媒を含むバッファー中で、酸化した糖質部分と活性化された水溶性ポリマーとの接触が生じる、上述の方法が提供される。
【００３５】
ヒドラジド基は、酸化した水溶性ポリマーとヒドラジドリンカーとを反応させることによって、水溶性ポリマー上で形成され得る。上記ヒドラジドリンカーは、適宜、アジピン酸ジヒドラジドまたはヒドラジンであり得る。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態では、結合体化したタンパク質のオキシム結合またはヒドラゾン結合を還元する工程（例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）からなる群より選択される還元性化合物を含むバッファー中に、結合体化したタンパク質をインキュベートすることによって）をさらに含む、上述の方法が提供され得る。関連する実施形態では、上記還元性化合物がシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）である。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、上述のいずれかの方法で生産された、結合体化した糖タンパク質が提供される。本発明のさらに別の実施形態では、血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステムの結合体は、（ａ）上記糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステム、および、（ｂ）（ａ）の糖タンパク質に結合した少なくとも１のアミノオキシ水溶性ポリマーを含み、上記アミノオキシ水溶性ポリマーは、１以上の糖質部分を介して、上記糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステムに付着されている。本発明のさらに別の実施形態では、血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステムの結合体は、（ａ）上記糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステム、および、（ｂ）（ａ）の糖タンパク質に結合した少なくとも１のヒドラジド水溶性ポリマーを含み、上記ヒドラジド水溶性ポリマーは、１以上の糖質部分を介して、上記糖タンパク質、ガングリオシド、またはドラッグデリバリーシステムに付着されている。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、水溶性ジアミノキシリンカーである３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンおよび３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンの合成を示す。
【図２】図２は、アミノオキシ−ＰＳＡの調製を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
糖質含有化合物（例えば、血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質）の薬理学的および免疫学的特性は、水溶性ポリマー（特に、ＰＥＧまたはＰＳＡまたはｍＰＳＡ）との化学的な修飾および結合体化により改善され得る。上記の結果生じる結合体の特性は、一般的に、ポリマーの構造およびサイズに強く依存する。したがって、規定のおよび狭いサイズ分布を持つポリマーが通常好ましい。ＰＳＡおよびｍＰＳＡ（具体例で使用）は、狭いサイズ分布を持つ最終的なＰＳＡ調製物を生じるように、精製され得る。
【００４０】
糖タンパク質
本明細書中に記載されるように、本発明によって考慮される血液凝固タンパク質以外の糖タンパク質としては、サイトカイン、例えば、インターロイキン、α−、β−、およびγ−インターフェロン、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子を含む）、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＵＰ）、インスリン、植物タンパク質、例えば、レクチンおよびリシン、腫瘍壊死因子および関連対立因子、可溶型腫瘍壊死因子受容体、インターロイキン受容体および可溶型インターロイキン受容体、成長因子、組織成長因子、トランスフォーミング増殖因子、例えば、ＴＧＦαまたはＴＧＦβ、および上皮成長因子、ホルモン、ソマトメジン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、および免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ、モノクローナル抗体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血液凝固タンパク質以外の血液因子、ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＤＮＡ分解酵素、フェチュイン、それらの断片、および上記タンパク質またはその断片のいずれかを治療用糖タンパク質一般とともに含む任意の融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、糖タンパク質はＥＰＯである。さらなる実施形態では、糖タンパク質はガラクトシダーゼである。なおさらなる実施形態では、糖タンパク質はＤＮＡ分解酵素である。よりさらなる実施形態では、糖タンパク質はフェチュインである。最後に、なおよりさらなる実施形態では、糖タンパク質は顆粒球コロニー刺激因子である。
【００４１】
本明細書中で用いられるように、「生物学的に活性な誘導体」または「生物学的に活性な改変体」は、その分子の実質的に同じ機能的および／または生物学的な特性（例えば、結合特性）および／または同じ構造基盤（例えば、ペプチド骨格または基本ポリマー単位）を有する分子のいかなる誘導体または改変体も包含する。
【００４２】
「類似体」、「改変体」、または「誘導体」は、天然に存在する分子に対し、場合により程度は異なるが、実質的に構造が類似し、かつ同じ生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド改変体は、参照ポリペプチドと、実質的に類似の構造を共有し、かつ同じ生物学的活性を有するポリペプチドをいう。改変体または類似体は、類似体が由来する天然に存在するポリペプチドと比べて、アミノ酸配列の組成が異なる。これは、（i）ポリペプチドの１以上の末端および／または天然に存在するポリペプチド配列の１以上の内部領域での１以上のアミノ酸残基（例えば、フラグメント）の欠失、（ii）ポリペプチドの１以上の末端（典型的には、「付加」または「融合」）および／または上記天然に存在するポリペプチド配列の１以上の内部領域（典型的には、「挿入」）での１以上のアミノ酸残基の挿入または付加、または（iii）天然に存在するポリペプチド配列における１以上のアミノ酸の他のアミノ酸による置換を包含する１以上の変異に基づく。例として、「誘導体」は、例えば化学的に、修飾された参照ポリペプチドと同じまたは実質的に類似の構造を共有するポリペプチドをいう。
【００４３】
改変体または類似体のポリペプチドとしては挿入改変体が挙げられ、この改変体では、１以上のアミノ酸残基が本発明のタンパク質アミノ酸配列に付加されている。挿入は、タンパク質のいずれか一方または両方の末端に位置し得、および／またはタンパク質アミノ酸配列の内部領域内に配置され得る。挿入改変体は、いずれか一方または両方の末端に付加残基を持ち、例えば、融合タンパク質およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸ラベルを含むタンパク質を包含する。１つの局面では、タンパク質分子は、特にこの分子が細菌細胞（例えば大腸菌）で組換え発現される場合、必要に応じて、Ｎ末端のメチオニンを含む。
【００４４】
欠失改変体では、本明細書中に記載されるように、タンパク質またはポリペプチド内の１以上のアミノ酸残基が除去される。欠失は、タンパク質またはポリペプチドのいずれか一方または両方の末端で生じ得、および／またはタンパク質アミノ酸配列内の１以上の残基の除去を伴う。したがって、欠失改変体は、タンパク質またはポリペプチド配列のフラグメントを包含する。
【００４５】
置換改変体では、タンパク質またはポリペプチドの１以上のアミノ酸残基が除去され、代替の残基で置き換えられる。１つの局面では、置換は本質的に保存的であり、このタイプの保存的置換は当該技術分野で周知である。あるいは、本発明はまた、非保存的な置換も包含する。例示的な保存的置換はLehninger, [Biochemistry, 2nd Edition; Worth Publishers, Inc., New York (1975), pp.71-77］に記載されており、すぐ下に示される。
保存的置換
側鎖特性                                アミノ酸
非極性（疎水性）：
Ａ．脂肪族                              ＡＬＩＶＰ
Ｂ．芳香族                              ＦＷ
Ｃ．硫黄含有                            Ｍ
Ｄ．ボーダーライン                      Ｇ
非荷電極性：
Ａ．ヒドロキシル                        ＳＴＹ
Ｂ．アミド                              ＮＱ
Ｃ．スルフヒドリル                      Ｃ
Ｄ．ボーダーライン                      Ｇ
陽性荷電（塩基性）                      ＫＲＨ
陰性荷電（酸性）                        ＤＥ
【００４６】
あるいは、例示的な保存的置換をすぐ下に示す。
保存的置換ＩＩ
元の残基                                例示的置換
Ａｌａ（Ａ）                            Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
Ａｒｇ（Ｒ）                            Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ａｓｎ（Ｎ）                            Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ａｓｐ（Ｄ）                            Ｇｌｕ
Ｃｙｓ（Ｃ）                            Ｓｅｒ
Ｇｌｎ（Ｑ）                            Ａｓｎ
Ｇｌｕ（Ｅ）                            Ａｓｐ
Ｈｉｓ（Ｈ）                            Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
Ｉｌｅ（Ｉ）                            Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｅｕ（Ｌ）                            Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ
Ｌｙｓ（Ｋ）                            Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ
Ｍｅｔ（Ｍ）                            Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ（Ｆ）                            Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ
Ｐｒｏ（Ｐ）                            Ｇｌｙ
Ｓｅｒ（Ｓ）                            Ｔｈｒ
Ｔｈｒ（Ｔ）                            Ｓｅｒ
Ｔｒｐ（Ｗ）                            Ｔｙｒ
Ｔｙｒ（Ｙ）                            Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ
Ｖａｌ（Ｖ）                            Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ａｌａ
【００４７】
ガングリオシド
本発明の実施形態では、ガングリオシドが、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＳＡまたはｍＰＳＡ）に結合体化される。ガングリオシドは、細胞認識および細胞間コミュニケーションにおいて働き得る識別性表面マーカーを細胞に提供することが知られている。それらは治療剤として有用である。
【００４８】
本発明の結合体は、ガングリオシドおよび水溶性ポリマーを含み得、ガングリオシドは、１以上のシアル酸が糖鎖に結合したスフィンゴ糖脂質（セラミドおよびオリゴ糖）を含む。ガングリオシドは、分子に存在しているシアル酸単位の数に従って分類され得る。ガングリオシドの例は、ＧＭ１、ＧＭ２、およびＧＭ３（モノシアロ−ガングリオシド）、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＤ２、およびＧＤ３（ジシアロ−ガングリオシド）、ＧＴ１ｂ（トリシアロ−ガングリオシド）およびＧＱ１（テトラシアロ−ガングリオシド）である。
【００４９】
本発明での使用に関して、好ましいガングリオシドは、セラミドがグルコースに結合し、グルコースが第１のガラクトースに結合し、第１のガラクトースがＮ−アセチルガラクトサミンに結合し、Ｎ−アセチルガラクトサミンが第２のガラクトースに結合したものを含む。この第２のガラクトースは１つのシアル酸に結合し得る。上記第１のガラクトースは１、２、３、または４つのシアル酸に結合し得る。シアル酸は、モノマー（各ガラクトース分子に１つずつ）として、または第１のガラクトースにオリゴシアル酸（２〜４シアル酸）として結合し得る。
【００５０】
投与された場合、治療用ガングリオシドは長期間血液中を循環する必要がある。標的組織に対するそれらの作用がより効果的であるように、ガングリオシドは、例えば、本発明の方法によってポリシアル酸化され得る。
【００５１】
ドラッグデリバリーシステム
本発明のさらなる実施形態では、ドラッグデリバリーシステムが、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧまたはＰＳＡまたはｍＰＳＡ）に結合体化される。一般に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）は、付随する薬物の運命および効果を制御し得る分子または粒子物質である。ＤＤＳは、２つの一般的なタイプに分けられ得る。第１のタイプは、高分子（ＭＤＤＳ）、例えば、抗体、ネオ糖タンパク質、ならびに合成ポリマー（例えば、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリリジン、および重合アルキルシアノアクリレート）を含む。薬物と種々のタイプの高分子キャリアー（所望の部位にこの薬物をターゲティングするモノクローナル抗体を含む）との会合は、例えば、Gregoriadis Nature 265, 407-411 (1977)に記載されている。第２のタイプは、粒子ＤＤＳ（ＰＤＤＳ）であり、例えば、生分解性材料（例えば、アルブミン）または半生分解性材料（例えば、デキストランおよびアルキルシアノアクリレートポリマー）を含むナノ粒子もしくはマイクロ粒子を含み、あるいは非イオン系界面活性剤で形成される小胞またはリポソームを含む。その詳細は、例えば、Gregoriadis NIPS, 4, 146-151 (1989)を参照のこと。
【００５２】
薬物は、ＤＤＳに共有結合され得るか、またはＤＤＳ内に受動的に捕捉され得る。例えば、界面活性剤小胞またはリポソームを含むＰＤＤＳは、界面活性剤または脂質分子の層の適切な組み合わせから形成されることによって、親水性または疎水性の薬学的に活性な化合物を捕捉し得る。薬学的に活性な化合物は通常、例えば、当該活性な化合物がその機能を実行する前または後、体内で溶解され得るまたはされ得ない結合によって、ＭＤＤＳに共有結合されている。
【００５３】
上記ＭＤＤＳの多くは、標的細胞または組織によって、それらの表面上の受容体を通じて認識される内在性（例えば、抗体）または獲得性（例えば、ネオ糖タンパク質）の能力を有する。典型的には、そのようなＤＤＳは、注入時に標的によって特異的に取り込まれる。しかしながら、特異的取り込みは制限され、上記ＤＤＳの大部分は、他の（治療に）無関係な組織によって取り込まれる。この理由のため、抗体および他のＤＤＳタンパク質（標的の特異性を問わず）は、他のタンパク質と同様に、それらの生物学的寿命の終了で分解されなければならない。
【００５４】
高分子タイプのＭＤＤＳに用いられる合成ポリマーは、例えば、ポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）、ポリリジン、および重合アルキルシアノアクリレートである。これらは、細網内皮系（ＲＥＳ）または他の組織で適切なリソソーム酵素によって分解され得る。ある手段によって、例えば、ＲＥＳまたは他の組織によるＤＤＳの取り込みを減らすことによって、またはＲＥＳによって一度取り込まれたらリソソーム酵素による分解を減らすことによって、そのような生物分解性の高分子タイプのＤＤＳの分解速度を下げることが望ましい。
【００５５】
粒子ＤＤＳ（ＰＤＤＳ）は、通例、ＲＥＳによって循環から除去される。ＲＥＳに対するそれらの傾向のため、ＰＤＤＳは、しばしばこれらの組織への薬物の送達のために用いられる。しかしながら、ＰＤＤＳがＲＥＳ以外の組織に指向されることが、しばしば望ましい。本目的を達成するために、ＰＤＤＳのＲＥＳ妨害を遮断または遅延しなければならない。
【００５６】
本発明で用いるＤＤＳは、グリコンを初期に含まなくてよい。必要に応じて、グリコンをＤＤＳ構造に付加あるいはさもなければ組み込ませる。そのような場合の例は、マンノシル化またはガラクトシル化された脂質を組み込んだリポソームである。これらの糖リポソームは、マンノースまたはガラクトース受容体それぞれを発現する組織に、活性物をターゲティングする。
【００５７】
例えば、標的組織による取り込みが（肝実質細胞と同様に）より効果的であるように、ＤＤＳが長期間血液中で循環する必要がある場合、それらは、本発明の方法により、有利にポリシアル酸化される。
【００５８】
投与
１つの実施形態では、本発明の結合体化した化合物は、注射（例えば、静脈、筋肉内、あるいは腹腔内注射）によって投与され得る。その組成物は、治療、診断および／または同様の薬剤として有用であり得る。
【００５９】
本発明の結合体化した化合物を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、１つの局面では、上記組成物は、１以上の薬学的に受容可能なキャリアーを含む。用語「薬学的に」または「薬理学的に受容可能な」は、以下に記載されるように、安定であり、タンパク質分解（例えば、凝集および切断生成物）を妨げ、ならびに、さらに当該技術分野で周知の経路を用いて投与されたときにアレルギーまたはその他の副作用を生じない、分子物質および組成物をいう。「薬学的に受容可能なキャリアー」は、上記の薬剤を含めて、任意のかつ全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、アイソトニックおよび吸収遅延剤などを包含する。
【００６０】
本明細書中で用いられているように、「有効量」は、臨床的に定義された疾患を有する哺乳類を治療するために適する投与量を包含する。
【００６１】
上記組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーにより、膣内に、直腸内に、または頭蓋内注射により投与され得る。本願明細書中で用いられている用語「非経口的」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、および大槽内注射、または点滴法を包含する。静脈内、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼窩内、肺内注射および／または特定部位での外科移植による投与が、同様に考慮される。一般的に、組成物は、発熱因子、ならびにレシピエントに有害となり得る他の不純物を本質的に含まない。
【００６２】
組成物の単一または複数の投与が実施され得、投与レベルおよびパターンは、治療を行っている医師によって選択される。疾病の予防または治療のために、適切な投与量は、上記のように、治療される疾病のタイプ、疾病の重症度および経過、予防または治療のいずれの目的で薬物が投与されるか、以前の治療、患者の病歴および薬物に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存し得る。
【００６３】
本発明はまた、本明細書中に定義されたように、結合体化した化合物またはタンパク質の有効量を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、薬剤的に受容可能なキャリアー、希釈剤、塩、バッファー、または賦形剤をさらに含み得る。薬学的組成物は、臨床的に定義された疾患を治療するために用いられ得る。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥製品であり得る。薬学的組成物の溶液は、任意の適切な凍結乾燥プロセスに供され得る。
【００６４】
さらなる局面として、本発明は、本発明の組成物を含むキットを包含し、この組成物は、被験体への投与のためにその使用を容易にするようにパッケージングされている。１つの実施形態では、そのようなキットは、本明細書中に記載された化合物または組成物（例えば、結合体化したタンパク質を含む組成物）を含み、この化合物または組成物は、コンテナ、例えば、密閉された瓶または容器内にパッケージングされ、方法を実施する際の化合物または組成物の使用を記載するラベルが上記コンテナに貼り付けられるか、あるいはパッケージ内に含まれる。１つの実施形態では、上記キットは、結合体化したタンパク質を含む組成物を有する第１コンテナ、および上記第１コンテナ内の組成物に関して生理学的に受容可能な再構成溶液を有する第２コンテナを含む。１つの局面では、化合物または組成物は、単位投与形態でパッケージングされる。キットは、特定の投与経路に従って組成物を投与するために適切なデバイスをさらに含み得る。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用を記載したラベルを含む。
【００６５】
１つの実施形態では、誘導体は、本来の治療用化合物の完全な機能活性を保持し、本来の治療用化合物に比べて、延長されたインビボ半減期を提供する。別の実施形態では、誘導体は、本来の化合物に対して、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０パーセント（％）の生物学的活性を保持する。
【００６６】
シアル酸およびＰＳＡ
本明細書中で用いられるように、「シアル酸部分」は、シアル酸モノマーまたはポリマー（「ポリサッカリド」）を含み、これらは、水性の溶液または懸濁液に可溶であり、薬学的有効量でＰＳＡ−タンパク質結合体を投与した場合に哺乳類に対する負の影響（例えば、副作用）をほとんどまたは全く有さない。１つの局面では、ＰＳＡおよびｍＰＳＡは、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、または５００のシアル酸単位を有するものとして特徴付けられる。ある局面では、異なるシアル酸単位が、１つの鎖内で組み合わせられる。
【００６７】
本発明の１つの実施形態では、ＰＳＡまたはｍＰＳＡ化合物のシアル酸部分が高度に親水性であり、別の実施形態では、化合物全体が高度に親水性である。親水性は、主にシアル酸単位のペンダントカルボキシル基によって、ならびにヒドロキシル基によって、与えられる。サッカリド単位は、他の官能基（例えば、アミン、ヒドロキシルまたは硫酸基、あるいはそれらの組み合わせ）を含み得る。これらの基は、天然に存在するサッカリド化合物上に存在し得るか、または誘導体ポリサッカリド化合物に導入され得る。本発明の方法および結合体で用いられるＰＳＡおよびｍＰＳＡは、発明の背景において上述したように、さらに特徴付けられ得る。
【００６８】
天然に存在するポリマーＰＳＡは、広いサイズ分布（例えば、Sigma C-5762）および高い多分散度（ＰＤ）を示す多分散調製物として入手され得る。ポリサッカリドは、通常、エンドトキシンを共精製する固有の危険性を有する細菌で生産されるので、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、エンドトキシン含量増加の確率を高め得る。また１〜４のシアル酸単位を有する短いＰＳＡ分子が、合成的に調製され得（Kang SHら、Chem Commun. 2000; 227-8; Ress DKおよびLinhardt RJ, Current Organic Synthesis. 2004; 1: 31-46）、これにより、高いエンドトキシンレベルの危険性を最小化する。しかしながら、エンドトキシンフリーでもある、狭いサイズ分布および低い多分散度を有するＰＳＡ調製物が、今や製造され得る。１つの局面では、本発明について特に用いられるポリサッカリド化合物は、細菌によって生産されたものである。これらの天然に存在するポリサッカリドのいくつかは、糖脂質として知られている。１つの実施形態では、上記ポリサッカリド化合物は、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。
【００６９】
種々の実施形態では、上記化合物は、化学量論量（例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：７、１：８、１：９、または１：１０など）で、ＰＳＡまたはｍＰＳＡ化合物に結合されるか、または会合している。種々の実施形態では、１〜６、７〜１２、または１３〜２０のＰＳＡおよび／またはｍＰＳＡ単位が、上記化合物に結合されている。さらに他の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のＰＳＡおよび／またはｍＰＳＡ単位が、上記化合物に結合されている。
【００７０】
必要に応じて、上記化合物は修飾されて、グリコシル化部位（すなわち、本来のグリコシル化部位以外の部位）を導入する。そのような修飾は、当該技術分野で知られる標準の分子生物学的手法を用いて達成され得る。さらに、上記化合物は、１以上の糖質部分を介する結合体化前に、インビボまたはインビトロにてグリコシル化され得る。
【００７１】
アミノオキシ結合
本発明の１つの実施形態では、ヒドロキシルアミンまたはヒドロキシルアミン誘導体とアルデヒドとを（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化後に糖質部分上で）反応させて、オキシム基を形成することが、化合物の結合体の調製に適用される。例えば、まず、糖タンパク質を、酸化剤、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を用いて酸化する（Rothfus JAおよびSmith EL., J Biol Chem 1963, 238, 1402-10; ならびにVan Lenten LおよびAshwell G., J Biol Chem 1971, 246, 1889-94）。例えば糖タンパク質の過ヨウ素酸酸化は、１９２８年に記載された古典的なマラプラード反応に基づき、隣接ジオールを過ヨウ素酸で酸化し、活性アルデヒド基を形成する（Malaprade L., Analytical application, Bull Soc Chim France, 1928, 43, 683-96）。そのような酸化剤のさらなる例は、四酢酸鉛（Ｐｂ（ＯＡｃ）４）、酢酸マンガン（ＭｎＯ（Ａｃ）３）、酢酸コバルト（Ｃｏ（ＯＡｃ）２）、酢酸タリウム(ＴｌＯＡｃ）、硫酸セリウム(Ｃｅ（ＳＯ４）２）（ＵＳ４，３６７，３０９）、または過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）（Marko ら、J Am Chem Soc 1997, 119, 12661-2）である。「酸化剤」によって、生理的反応条件下、糖質中の隣接ジオールを酸化し、活性アルデヒドを生成し得る、穏やかな酸化化合物が意図される。
【００７２】
第２の工程は、アミノオキシ基を含むポリマーを酸化した糖質部分にカップリングし、オキシム結合を形成することである。本発明の１つの実施形態では、本工程は、求核触媒であるアニリンまたはアニリン誘導体の触媒量の存在下で実施され得る（Dirksen AおよびDawson PE, Bioconjugate Chem. 2008; Zeng Yら、Nature Methods 2009; 6: 207-9）。アニリン触媒はオキシム結合を劇的に加速し、試薬を非常に低い濃度で用いることを可能とする。本発明の別の実施形態では、オキシム結合は、ＮａＣＮＢＨ3で還元してアルコキシアミン結合を形成することによって、安定化される。
【００７３】
本発明の１つの実施形態では、ＰＳＡまたはｍＰＳＡをタンパク質に結合体化させる反応工程は、個別および順次、実施される（すなわち、出発物質（例えば、タンパク質、ポリマーなど）、試薬（例えば、酸化剤、アニリンなど）、および反応生成物（例えば、タンパク質上の酸化した糖質、活性化アミノオキシポリマーなど）は、個々の反応工程間で分けられている）。
【００７４】
アミノオキシ技術に関するさらなる情報は、以下の参考文献に見出され得、各参考文献は、それらの全体が援用されている：EP 1681303Al（ヒドロキシアルキルデンプン化（ＨＡＳｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン）；WO 2005/014024（オキシム結合基によって結合されたポリマーとタンパク質との結合体）；WO96/40662（アミノオキシ含有リンカー化合物および結合体におけるその適用）；WO 2008/025856（修飾タンパク質）； Peri Fら、Tetrahedron 1998, 54, 12269-78; Kubler-Kielb JおよびPozsgay V., J Org Chem 2005, 70, 6887-90; Lees Aら、Vaccine 2006, 24 (6), 716-29; ならびにHeredia KLら、Macromoecules 2007, 40 (14), 4772-9。
【００７５】
本発明の利点は、結合体の高い回収率、結合体化されていないタンパク質と比べて結合体化された糖タンパク質の活性の高い保持、および高い結合効率を含む。
【００７６】
本発明は、以下の実施例を参照することによって説明される。実施例１〜３、９および１１〜２７は、本発明の具体的な実施形態を示している。実施例４〜８および１０は、本発明の対応する結合体の調製に関連する参考例として含まれる。
【実施例】
【００７７】
（実施例１：ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２の調製）
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］２ＯＮＨ２
【００７８】
【化５】
0005909755.tif 000006
【００７９】
（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン）（２つの活性アミノオキシ基を含む）を、Boturynら（Tetrahedron 1997; 53: 5485-92）に従い、一級アミンの改変ガブリエル合成を用いる二工程有機反応で合成した。第１の工程では、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、１分子の２，２−クロロジエチルエーテルを２分子のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドと反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中、ヒドラジン分解によって生じた中間体から調製した。特に指定のない場合を除き、以下の実施例では、これをジアミノオキシリンカーという。
【００８０】
（実施例２：ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２の調製）
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２
【００８１】
【化６】
0005909755.tif 000007
【００８２】
（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）（２つの活性アミノオキシ基を含む）を、Boturynら（Tetrahedron 1997; 53: 5485-92）に従い、一級アミンの改変ガブリエル合成を用いる二工程有機反応で合成した。第１の工程では、ＤＭＦ中、１分子のビス−（２−（２−クロルエトキシ）−エチル）−エーテルを２分子のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドと反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中、ヒドラジン分解によって生じた中間体から調製した。
【００８３】
（実施例３:アミノオキシ−ＰＳＡの調製）
Serum Institute of India（Pune, India）から得た酸化したＰＳＡ（分子量１８．８ｋＤ）５００ｍｇを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）８ｍＬ中に溶解した。次に、３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン１００ｍｇを添加した。室温にて２時間振盪後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム４４ｍｇを添加した。４℃にてさらに４時間振盪後、この反応混合物をSlide-A-Lyzer（Pierce, Rockford, IL）透析カセット（３．５ｋＤ膜、再生セルロース）に注入し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して４日間透析した。この生成物を−８０℃にて凍結した。本手順に従ったアミノオキシ−ＰＳＡの調製を、図２に示す。
【００８４】
（実施例４：アミノオキシ−ＰＳＡのｒＦＩＸへのカップリングおよび結合体の精製）
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）６．３ｍＬ中に溶解したｒＦＩＸ  １２．６ｍｇに、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）２８９μＬを添加した。この混合物を、暗所下、４℃にて１時間振盪し、１Ｍグリセロール６．５μＬの添加によって、室温にて１５分間クエンチした。Vivaspin（Sartorius, Goettingen, Germany）濃縮器（３０ｋＤ膜、再生セルロース）を用いた限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）によって、低分子量の夾雑物を除去した。次に、アミノオキシ−ＰＳＡ  ４３ｍｇをＵＦ／ＤＦ保留物に添加し、この混合物を４℃にて１８時間振盪した。疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によって過剰なＰＳＡ試薬を除去した。冷却した反応混合物の電気伝導度を１８０ｍＳ／ｃｍに上げ、５ｍＬ HiTrap Butyl FF（GE Healthcare, Fairfield, CT）HICカラム（１．６×２．５ｃｍ）に注入した。このカラムは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３Ｍ塩化ナトリウム、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。結合体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ  塩化カルシウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４を用いて、流速５ｍＬ／分にて２．４カラムボリューム（ＣＶ）内に溶出させた。調製物を、総タンパク質量（ＢＣＡ）およびＦＩＸ発色活性を測定することによって解析評価した。ＰＳＡ−ｒＦＩＸ結合体について、８０．２ＩＵ／ｍｇタンパク質の比活性が求められた（本来のｒＦＩＸと比べて５６．４％）。本結果を表１にまとめる。
【００８５】
【表１】
0005909755.tif 000008
【００８６】
（実施例５：求核触媒としてのアニリン存在下でのアミノオキシ−ＰＳＡのｒＦＩＸへのカップリング）
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）１．４ｍＬ中に溶解したｒＦＩＸ  ３．０ｍｇに、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）１４．１μＬを添加した。この混合物を、暗所下、４℃にて１時間振盪し、１Ｍグリセロール１．５μＬの添加によって、室温にて１５分間クエンチした。ＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare, Fairfield, CT）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、低分子量の夾雑物を除去した。酸化したｒＦＩＸ１．２ｍｇを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）１．３３ｍＬに溶解し、これをアニリン（２００ｍＭストック水溶液）７０μＬと混合し、室温にて４５分振盪した。次に、アミノオキシ−ＰＳＡ  ４．０ｍｇを添加し、この混合物を室温にて２時間、さらに４℃にて１６時間振盪した。１時間後、２時間後、および１８時間後の反応終了時に、サンプルを取得した。次に、HICによって、過剰なＰＳＡ試薬および遊離ｒＦＩＸを除去した。この冷却した反応混合物の電気伝導度を１８０ｍＳ／ｃｍに上げ、５ｍＬ HiTrap Butyl FF（GE Healthcare, Fairfield, CT）HICカラム（１．６×２．５ｃｍ）に注入した。このカラムは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３Ｍ塩化ナトリウム、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。結合体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４、流速５ｍＬ／分のリニアグラジエントで２０ＣＶ内に溶出させた。
【００８７】
（実施例６：アミノオキシ−ＰＳＡのｒＦＩＸへのカップリングおよびＮａＣＮＢＨ３を用いた還元）
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）５．２５ｍＬ中に溶解したｒＦＩＸ  １０．５ｍｇに、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）５３μＬを添加した。混合物を、暗所下、４℃にて１時間振盪し、１Ｍグリセロール５．３μＬの添加によって、室温にて１５分間クエンチした。Vivaspin（Sartorius, Goettingen, Germany）濃縮器（３０ｋＤ膜、再生セルロース）を用いるＵＦ／ＤＦによって、低分子量の夾雑物を除去した。次に、アミノオキシ−ＰＳＡ  ３５．９ｍｇをＵＦ／ＤＦ保留物に添加し、混合物を室温にて２時間振盪した。次に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（５Ｍ）５３μＬを添加し、この反応をさらに１６時間進行させた。次いで、HICによって、過剰なＰＳＡ試薬を除去した。この冷却した反応混合物の電気伝導度を１８０ｍＳ／ｃｍに上げ、５ｍＬ HiTrap Butyl FF HIC（GE Healthcare, Fairfield, CT）カラム（１．６×２．５ｃｍ）に注入した。このカラムは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３Ｍ  塩化ナトリウム、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。結合体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４を用いて、流速５ｍＬ／分にて２．４ＣＶ内に溶出させた。
【００８８】
（実施例７：アミノオキシ−ＰＳＡ（リンカー：ＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］４ＯＮＨ２）のｒＦＩＸへのカップリングおよび結合体の精製）
５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）２．８ｍＬ中に溶解したｒＦＩＸ  ５．６ｍｇに、過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（１０ｍＭ）１０２μＬを添加した。混合物を、暗所下、４℃にて１時間振盪し、１Ｍグリセロール２．９μＬの添加によって、室温にて１５分間クエンチした。Vivaspin（Sartorius, Goettingen, Germany）濃縮器（３０ｋＤ膜、再生セルロース）を用いるＵＦ／ＤＦによって、低分子量の夾雑物を除去した。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ１９ｍｇをＵＦ／ＤＦ保留物に添加し、混合物を４℃にて１８時間振盪した。HICによって過剰なＰＳＡ試薬を除去した。冷却した反応混合物の電気伝導度を１８０ｍＳ／ｃｍに上げ、５ｍＬ HiTrap Butyl FF（GE Healthcare, Fairfield, CT）HICカラム（１．６×２．５ｃｍ）に注入した。このカラムは、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３Ｍ塩化ナトリウム、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。結合体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、６．７ｍＭ塩化カルシウム、０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４を用いて、流速５ｍＬ／分にて２．４ＣＶ内に溶出させた。
【００８９】
（実施例８：アミノオキシ−ＰＳＡのｒＦＶＩＩＩへのカップリング）
Ｈｅｐｅｓバッファー、ｐＨ６（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）１１ｍＬ中に溶解したｒＦＶＩＩＩ  １１ｍｇに、１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム５７μＬを添加した。混合物を、暗所下、４℃にて３０分振盪し、１Ｍグリセロール水溶液１０７μＬを加えることによって、４℃にて３０分間クエンチした。次いで、アミノオキシ−ＰＳＡ（１８．８ｋＤ）１９．８ｍｇを添加し、この混合物を４℃にて一晩振盪した。８Ｍ酢酸アンモニウムを含むバッファー（８Ｍ酢酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）を最終濃度が２．５Ｍの酢酸アンモニウムになるまで添加することによって、イオン強度を上昇させた。次に、反応混合物を、平衡化バッファー（２．５Ｍ酢酸アンモニウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９）で平衡化したHiTrap Butyl FF（GE Healthcare, Fairfield, CT）カラムに注入した。この生成物を、溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．４）で溶出させ、溶出液を３０，０００ＭＷＣＯを備えたVivaspin（Sartorius, Goettingen, Germany）装置を用いて遠心濾過によって濃縮した。
【００９０】
（実施例９：ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２の調製）
ホモ二官能性リンカーＮＨ２［ＯＣＨ２ＣＨ２］６ＯＮＨ２
【００９１】
【化７】
0005909755.tif 000009
【００９２】
（３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン−１，１７−ジオキシアミン）（２つの活性アミノオキシ基を含む）を、Boturynら（Tetrahedron 1997; 53: 5485-92）に従い、一級アミンの改変ガブリエル合成を用いる二工程有機反応で合成した。第１の工程では、ＤＭＦ中、１分子のヘキサエチレングリコールジクロライドを２分子のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミドと反応させた。所望のホモ二官能性生成物を、エタノール中、ヒドラジン分解によって、生じた中間体から調製した。
【００９３】
（実施例１０：マレイミド／アミノオキシリンカーシステムを用いたｒＦＩＸのポリシアル酸化）
Ａ．修飾試薬の調製
アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を、マレイミド／アミノオキシリンカーシステム（Toyokuniら、Bioconjugate Chem 2003; 14, 1253-9）を用いることによって調製する。遊離末端ＳＨ基を含むＰＳＡ−ＳＨ（２０ｋＤ）は、二工程の手順を用いて調製する：ａ）ＮＨ４Ｃｌでの酸化したＰＳＡの還元的アミノ化によるＰＳＡ−ＮＨ２の調製（WO 05016973 Alに従う）およびｂ）末端の一級アミノ基と２−イミノチオラン（トラウト試薬／Pierce, Rockford, IL）との反応によるスルフヒドリル基の導入（US7645860に記載の通り）。ＰＳＡ−ＳＨを、ＰＢＳバッファー中、ｐＨ７．５にてリンカーのマレイミド基にカップリングさせる（１０倍モル過剰のリンカーおよび５０ｍｇ／ｍＬのＰＳＡ−ＳＨ濃度を使用）。反応混合物を室温にて穏やかな振盪下、２時間インキュベートする。次いで、過剰なリンカー試薬を除去し、アミノオキシ−ＰＳＡを透析濾過によって酸化バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）にバッファー交換する。バッファーをPellicon XL5kD 再生セルロース膜（Millipore, Billerica, MA）を用いて２５回交換する。
【００９４】
Ｂ．ＮａＩＯ４での事前酸化後のｒＦＩＸの修飾
ｒＦＩＸを、バッファー中に１００μＭ過ヨウ素酸ナトリウムを用いた５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）中で酸化する。この混合物を、暗所下、４℃にて１時間振盪し、グリセロールを最終濃度５ｍＭとなるように添加して、室温にて１５分間クエンチした。ＰＤ−１０脱塩カラム（GE Healthcare, Fairfield, CT）を用いた。次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、低分子量の夾雑物を除去した。酸化したｒＦＩＸを、アニリンに添加して１０ｍＭの最終濃度として、５倍モル過剰のＰＳＡとなるようにアミノオキシ−ＰＳＡ試薬と混合する。反応混合物を、暗所下、室温にて穏やかな振盪の下、２時間インキュベートした。
【００９５】
Ｃ．結合体の精製
HICによって、過剰なＰＳＡ試薬および遊離ｒＦＩＸを除去する。この反応混合物の電気伝導度を１８０ｍＳ／ｃｍに上げ、４８ｍＬ Butyl - Sepharose FF（GE Healthcare, Fairfield, CT）を充填したカラムに注入する。このカラムは、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３Ｍ  塩化ナトリウム、６．７ｍＭ  塩化カルシウム、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．９であらかじめ平衡化しておいた。その後、結合体を、６０％溶出バッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、６．７ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．４）のリニアグラジエントにて４０ＣＶ内に溶出させる。最終的に、ＰＳＡ−ｒＦＩＸ含有画分を集め、再生セルロース製の３０ｋＤ膜（Millipore）の使用によって、ＵＦ／ＤＦに供する。この調製物を、総タンパク質量（ＢＣＡ）およびＦＩＸ発色活性を測定することによって解析評価した。両改変体を用いて調製したＰＳＡ−ｒＦＩＸ結合体について、本来のｒＦＩＸと比べて５０％を上回る比活性が求められた。
【００９６】
（実施例１１：アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の調製）
実施例３に従って、アミノオキシ−ＰＳＡ試薬を調製した。最終生成物は、５ｋＤ膜（再生セルロース、Millipore）を用いて、ｐＨ７．２のバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ）に対して透析濾過し、−８０℃にて凍結し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、この試薬を適切な容量の水に溶解し、糖質修飾を介するＰＳＡ−タンパク質結合体の調製に用いた。
【００９７】
（実施例１２：アミノオキシ−ＰＳＡ試薬の合成の詳細）
Botyrynら（Tetrahedron 1997; 53: 5485-92）に従って、実施例１に概説した二工程有機合成にて、３−オキサ−ペンタン−１，５ジオキシアミンを合成した。
【００９８】
工程１：
無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド７００ｍＬ中のエンド−Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミド（５９．０ｇ；１．００ｅｑ）の溶液に、無水Ｋ２ＣＯ３（４５．５１ｇ；１．００ｅｑ）および２，２−ジクロロジエチルエーテル（１５．８４ｍＬ；０．４１ｅｑ）を添加した。この反応混合物を５０℃にて２２時間撹拌した。この混合物を減圧下、乾燥するまで蒸発させた。残渣をジクロロメタン２Ｌ中に懸濁し、飽和ＮａＣｌ水溶液（各１Ｌ）で２回抽出した。ジクロロメタン層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、次いで、減圧下、乾燥するまで蒸発させ、高真空中で乾燥させ、３−オキサペンタン−１，５−ジオキシ−エンド−２’，３’−ジカルボキシジイミドノルボルネン６４．５ｇを黄色がかった白の固体（中間体１）として得た。
【００９９】
工程２：
無水エタノール８００ｍＬ中の中間体１（６４．２５ｇ；１．００ｅｑ）の溶液に、ヒドラジン水和物３１．０ｍＬ（４．２６ｅｑ）を添加した。次いで、この反応混合物を２時間還流した。混合物を、減圧下、溶媒を蒸発させることによって、開始容量の半分に濃縮した。生成した沈殿物を濾別した。残存するエタノール層を、減圧下、乾燥するまで蒸発させた。粗生成物である３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンを含む残渣を真空中で乾燥させ、４６．３ｇを得た。この粗生成物を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０；ジクロロメタン／メタノール混合物、９＋１の定組成溶離）によってさらに精製し、精製した最終生成物の３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン１１．７ｇを得た。
【０１００】
（実施例１３：アミノオキシ−ＰＳＡポリマーの調製）
酸化したコロミン酸（２３ｋＤａ）１．３ｇは、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５±０．０２）１８ｍＬ中に溶解した。２０倍モル過剰の１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミンともよばれる）を、最小量の５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５±０．０２）中に溶解し、ＰＳＡ溶液に加えた。最終的なコロミン酸の濃度は６２．５ｍｇ／ｍＬであった。この反応混合物を、穏やかなミキサー（１分あたり２２の振動）上で、２２±１．０℃にて２±０．１時間インキュベートした。この後、上記反応混合物に１６０ｍｇ／ｍＬ  ＮａＣＮＢＨ３溶液０．６５ｍＬを加え、最終濃度を５．００ｍｇ／ｍＬとした。これを、混合のための十分なヘッドスペースを持つエンドトキシンフリーの気密容器内で、シェーカー（１分あたり２２の振動）上で、４．０±１．０℃にて３．０±０．２０時間インキュベートした。精製のために、サンプルを２ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０±０．０２）で希釈し、２０ｍｇ／ｍＬの最終コロミン酸濃度とした。反応混合物を脱塩し、過剰な１，１１−ジアミノ−３，６，９−トリオキサウンデカン、ＮａＣＮＢＨ３、および反応の副生物を除去した。これに引き続いて、２０ｍＭトリエタノールアミンバッファー（ｐＨ８．０±０．０２）を用いてSephadex G25カラムで脱塩した。脱塩したサンプルのｐＨを、ｐＨ７．８〜８．０に調整し、２０ｍＭ  ＴＥＡ  ｐＨ８．０で１回、２ｍＭトリエタノールアミン（ＴＥＡ）ｐＨ８．０で２回、限外濾過／透析濾過した。このサンプルを凍結乾燥し、−８０℃にて保存した。
【０１０１】
あるいは、脱塩および限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程の間、高塩濃度下で精製を行った。高塩濃度下での陰イオン交換クロマトグラフィーもまた用いて、高純度のアミノオキシ−ＰＳＡを作製した。同様にして、種々の分子量のアミノオキシ−ＰＳＡを合成した。
【０１０２】
（実施例１４：ジアミノオキシ（３，６，９−トリオキサ−ウンデカン−１，１１−ジオキシアミン）−ＰＳＡのβ−ガラクトシダーゼへのカップリング）
β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）の酸化のために、種々の濃度（０．１５７ｍＭから２ｍＭまで及ぶ）のＮａＩＯ４を用いた。β−Ｇａｌ  ０．５ｍｇを、５．７５の酸性ｐＨのもと、暗所下、４℃にて３０分間酸化した。最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したβ−ＧａｌとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２２ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５ｍＭであり、一方、β−Ｇａｌの濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬ〜０．７６ｍｇ／ｍＬまで及んだ。全ての反応をｐＨ５．７５で行った。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて実施し、１、２、および２４時間の期間でサンプルを集めた。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、このことを、ウエスタンブロッティングによっても確認した。
【０１０３】
最良の反応条件に基づき、β−Ｇａｌ  １．９ｍｇを、１．５ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化し、次いで、最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したβ−ＧａｌとジアミノオキシＰＳＡポリマーとを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物のポリマーおよびタンパク質の最終濃度はそれぞれ１．２５ｍＭおよび０．７６ｍｇ／ｍＬであった。反応混合物中の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて２時間実施した。精製および非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、このことを、抗ＰＳＡ抗体を用いたウエスタンブロッティングによっても確認した。オールインワンβＧａｌアッセイキット（Pierce）を用いると、ＰＳＡ−βＧａｌ結合体のインビトロでの活性は、本来のタンパク質に匹敵した。アルデヒドリンカーケミストリーを用いて作製した比較結合体では５０％未満の活性を観察した。さらに、プロセス全体を３倍までスケールアップした。
【０１０４】
（実施例１５：ジアミノオキシ−ＰＳＡのフェチュインへのカップリング）
フェチュインを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、暗所下、４℃にて６０分間酸化し、１０ｍＭの最終濃度となるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したフェチュインとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２３ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度はｐＨ５．７５で２．５ｍＭであった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。この反応で最終タンパク質濃度は０．７１４ｍｇ／ｍＬであり、反応を４℃にて２時間実施した。これらの結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、このことを、ウエスタンブロッティングによっても確認した。
【０１０５】
スケールアップ反応のために、フェチュイン５ｍｇを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、暗所下、４℃にて６０分間酸化し、次いで、最終濃度が１０ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したフェチュインとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２３ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は５．７５のｐＨで２．５ｍＭであった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて実施し、２時間後にサンプルを集めた。精製および非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、このことを、ウエスタンブロッティングによっても確認した。
【０１０６】
（実施例１６：求核触媒として作用するアニリンを用いたジアミノオキシ−ＰＳＡのフェチュインへのカップリング）
フェチュイン０．２ｍｇを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、暗所下、４℃にて３０分間酸化し、次いで、最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したフェチュインとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２３ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物の最終ｐＨは５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。この反応で最終タンパク質濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。２００ｍＭアニリン溶液８４．２１μＬを反応混合物１．６ｍＬに加えた。反応を４℃にて一晩実施した。
【０１０７】
（実施例１７：ジアミノオキシ−ＰＳＡのエリスロポイエチン（ＥＰＯ）へのカップリング）
ＥＰＯ  ０．２ｍｇを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化した。最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したＥＰＯと２３ｋＤａのジアミノオキシポリマーとを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物中のＥＰＯの最終濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。反応混合物の最終ｐＨは５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて２４時間実施した。非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られた。
【０１０８】
（実施例１８：求核触媒として作用するアニリンを用いたジアミノオキシ−ＰＳＡのＥＰＯへのカップリング）
ＥＰＯ  ０．２ｍｇを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化した。最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することにより、酸化を停止させた。酸化したＥＰＯとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２２ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物の最終ｐＨは５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。この反応で最終タンパク質濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。２００ｍＭアニリン溶液８４．２１μＬを反応混合物１．６ｍＬに加えた。反応を４℃にて一晩実施した。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて特徴付けた。この結合体でバンドの移動が見られた。この結合体の活性において、アニリンの悪影響は観察されなかった。
【０１０９】
（実施例１９：ジアミノオキシ−ＰＳＡのＤＮＡ分解酵素へのカップリング）
ＤＮＡ分解酵素の糖ポリシアル酸化のために、ウシ膵臓ＤＮＡ分解酵素を結合体化反応に用いた。このＤＮＡ分解酵素のソースは凍結乾燥粉末として供給され、−２０℃にて保存した。反応前に、本凍結乾燥粉末を酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．７５）中に溶解した。糖ポリシアル酸化に用いたポリマーは、１０ｋＤａ〜２２ｋＤａの範囲の分子量を有した。ＤＮＡ分解酵素のグリコン部分の酸化のために、ＮａＩＯ４を酸化剤として１ｍＭの最終濃度で用いた。５．７５の酸性ｐＨのもと、４℃にて３０分間、ＤＮＡ分解酵素を酸化した。最終濃度が２ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化が完了した後、ジアミノオキシＰＳＡポリマーを１．２５ｍＭの最終濃度となるように添加することによって、結合体化反応を実施した。最終濃度が５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬとなるようにＮａＣＮＢＨ３を反応混合物に添加し、ＤＮＡ分解酵素のポリシアル酸化を、４．０±１．０℃にて少なくとも２時間実施した。反応をポリマーに対して２５倍モル過剰のＴｒｉｓで停止させた。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。活性は９５％であると測定された（アルデヒドリンカーケミストリーを用いて作製した比較結合体で観察した５０％以下と比較して）。
【０１１０】
（実施例２０：ジアミノオキシ（３オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミンリンカー）−ＰＳＡのβ−ガラクトシダーゼへのカップリング）
β−ガラクトシダーゼの酸化のために、２ｍＭの濃度でＮａＩＯ４を用いた。β−ガラクトシダーゼ  ３ｍｇを５．７５の酸性ｐＨのもと、４℃にて３０分間酸化し、次いで、最終濃度が２ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することにより、酸化を停止させた。酸化したβ−ガラクトシダーゼとジアミノオキシＰＳＡポリマー（２３ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．５ｍＭであった。反応混合物中のβ−ガラクトシダーゼの最終濃度は０．８６７ｍｇ／ｍＬであった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて２時間実施した。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。
【０１１１】
（実施例２１：ヒドラジド−コロミン酸の調製）
本発明者らは、アジピン酸ジヒドラジドを用いてＰＳＡ−ヒドラジド（コロミン酸−ヒドラジド）を調製するため、以下のプロトコールを用いた。他のＰＳＡ−ヒドラジドを作製するために類似の方法を用いた。
１    活性化コロミン酸１ｇを２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５±０．０２）約１０ｍＬ中に溶解する。最終的なコロミン酸の濃度は６２．５ｍｇ／ｍＬとする。
２    ２５倍モル過剰（酸化したコロミン酸「ＣＡＯ」に対して）のアジピン酸ジヒドラジド（分子量１７４．２ｇ）を最小量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５±０．０２）中に溶解し、１の溶液に加える。
３    添加するアジピン酸ジヒドラジド量
【０１１２】
【数１】
0005909755.tif 000010
【０１１３】
４    アジピン酸ジヒドラジド溶液を加えた後、コロミン酸の容量を最終濃度が６２．５ｍｇ／ｍＬとなるように酢酸ナトリウムで補充する。したがって、総反応容量は１６ｍＬである。
５    反応混合物を、シェーカー（１分あたり２２振動）上で、２２．０±１．０℃にて２±０．１時間インキュベートする。
６    濃縮したＮａＣＮＢＨ３溶液（１６５ｍｇ／ｍＬ）を調製し、０．５ｍＬを１の溶液に加えて、最終反応混合物中のこの最終濃度が５．０ｍｇ／ｍＬとなるようにする。反応混合物を、シェーカー（１分あたり２２振動）上で、４．０±１．０℃にて３．０±０．２０時間インキュベートする。
７    適切な混合のために５０ｍＬ余分ヘッドスペース（反応混合物が容器の蓋に触れないよう十分なスペースがある）を持つエンドトキシンフリーの気密容器内に反応混合物を保存する。
８    ４℃にて３時間反応後、２ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０±０．０２）でサンプルを希釈し（５０ｍＬまでボリュームアップする）、最終コロミン酸濃度を２０ｍｇ／ｍＬとする。
９    反応混合物を脱塩し、ポリマーから過剰な未処理のアジピン酸ジヒドラジド、ＮａＣＮＢＨ３などを除去する。これは、ＧＰＣ（XK 50 Sephadex G-25 medium matrix；１．８ｍｇＣＡ／ｍＬマトリックス以下；ベッド高３５ｃｍ；カラムボリューム６８７ｍＬ）によって、ＵＶ２２４ｎｍおよび電気伝導度を観察することによってなされ得る。脱塩は２０ｍＭトリエタノールアミン（ｐＨ８．０±０．０２）バッファーを用いて実施する。
１０    脱塩後、コロミン酸−ヒドラジドは、限外濾過１サイクル、２０ｍＭ  ＴＥＡ（ｐＨ８．０±０．０２）を用いた透析濾過１サイクル、および２ｍＭ  ＴＥＡ（ｐＨ８．０±０．０２）を用いた透析濾過少なくとも３サイクルに供する。これは３ｋＤａのVivaflowカセットを用いてなされ得る。
１１    脱塩したサンプルのｐＨをｐＨ７．８〜８．０に調整する。必要に応じて、このサンプルを凍結乾燥し、引き続き再乾し、過剰な湿気を除去する。
【０１１４】
（実施例２２：ヒドラジド−ＰＳＡのエリスロポイエチンへのカップリング）
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）の酸化のために、ＮａＩＯ４を１０ｍＭの濃度で用いた。ＥＰＯ（１ｍｇ）を、ｐＨ５．７５で４℃にて３０分間酸化し、次いで、最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したＥＰＯとヒドラジド−ＰＳＡポリマーとを用いて、結合体化反応を実施した。結合体化に用いたヒドラジド−ＰＳＡの分子量は２４．３４ｋＤａであった。反応混合物中のヒドラジド−ＰＳＡの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物中のＥＰＯの最終濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬであった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて２４時間実施した。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。
【０１１５】
（実施例２３：ヒドラジド−ＰＳＡのβ−ガラクトシダーゼへのカップリング）
β−ガラクトシダーゼ（０．５〜４．５ｍｇ）を、０．６２５〜２ｍＭのＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化した。最終濃度が５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したβ−ガラクトシダーゼと２４．３４ｋＤａ〜２７．９ｋＤａまで及ぶヒドラジド−ＰＳＡとを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のヒドラジド−ＰＳＡの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物中のβ−ガラクトシダーゼの最終濃度は０．１２５ｍｇ／ｍＬ〜０．７６ｍｇ／ｍＬまでの範囲内であった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて実施し、１、２、および２４時間でサンプルを集めた。精製および非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。活性は８４％であると測定された。アルデヒドリンカーケミストリーを用いて作製した比較結合体で５０％未満の活性を観察した。
【０１１６】
（実施例２４：ヒドラジド−ＰＳＡのフェチュインへのカップリング）
フェチュイン（０．２５ｍｇ）を、ＮａＩＯ４（５または１０ｍＭ）を用いて、４℃にて３０または６０分間酸化した。酸化に用いたＮａＩＯ４の濃度に一致させるのに適当であるように、最終濃度が５または１０ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することにより、酸化を停止させた。酸化したフェチュインとアジピン酸ジヒドラジド−ＰＳＡポリマーとを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５〜２．５ｍＭの間であった。反応混合物の最終ｐＨは５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて１時間〜４時間実施した。結合体をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。反応条件の各セットにつき、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。
【０１１７】
フェチュイン５ｍｇのスケールアップ反応、引き続き、生じた結合体の精製を実施した。フェチュイン５ｍｇを、１０ｍＭ  ＮａＩＯ４を用いて、４℃にて６０分間酸化し、次いで、１０ｍＭの最終濃度となるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したフェチュインとアジピン酸ジヒドラジド−ＰＳＡポリマーとを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は２．５ｍＭであった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて実施し、２時間でサンプルを集めた。精製および非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。
【０１１８】
（実施例２５：ヒドラジド−ＰＳＡのＤＮＡ分解酵素へのカップリング）
ＤＮＡ分解酵素を、０．２ｍＭ〜２ｍＭまで及ぶ最終濃度になるようＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化した。酸化に用いたＮａＩＯ４の濃度に依存する２〜５ｍＭの間の最終濃度となるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したＤＮＡ分解酵素に１．２５ｍＭの最終濃度となるようヒドラジド−ＰＳＡポリマーを添加することによって、酸化したＤＮＡ分解酵素の糖ポリシアル酸化を実施した。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加し、ＤＮＡ分解酵素の糖ポリシアル酸化を、４℃にて１時間から２時間に及ぶ期間実施した。反応をポリマーに対して２５倍モル過剰のＴｒｉｓで停止させた。結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて特徴付けた。ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られ、ウエスタンブロッティングから陽性結果を得た。活性は４９％であると測定された。
【０１１９】
（実施例２６：アミノオキシリンカー（３−オキサ−ペンタン−１，５−ジオキシアミン）を用いたβ−ガラクトシダーゼのＰＥＧ化）
β−ガラクトシダーゼ（１ｍｇ）を、１．５ｍＭのＮａＩＯ４を用いて、４℃にて３０分間酸化した。最終濃度が１．５ｍＭとなるようにＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。
【０１２０】
酸化したβ−ガラクトシダーゼとジアミノオキシ−ＰＥＧポリマー（２０ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．２５ｍＭであった。反応混合物中のβ−ガラクトシダーゼの最終濃度は１ｍｇ／ｍＬであった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応を４℃にて２時間実施した。非精製の結合体を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて特徴付け、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて結合体に関してバンドの移動が見られた。活性は５９％であると測定された。
【０１２１】
（実施例２７：アミノオキシリンカーを用いたエリスロポイエチンのＰＥＧ化）
エリスロポイエチン（ＥＰＯ；０．２ｍｇ）を、５または１０ｍＭのＮａＩＯ４を用いて、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．７５）中で４℃にて４５分間酸化し、次いで、（酸化に用いられたＮａＩＯ４の濃度に一致させるように）５ｍＭまたは１０ｍＭの最終濃度となるようＮａＨＳＯ３を添加することによって、酸化を停止させた。酸化したＥＰＯとジアミノオキシ−ＰＥＧポリマー（２０ｋＤａ）とを用いて、結合体化反応を実施した。反応混合物中のポリマーの最終濃度は１．５ｍＭであった。反応混合物の最終ｐＨはおよそ５．７５であった。５０ｍＭまたは３．１７ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加した。反応の最終タンパク質濃度は０．４ｍｇ／ｍＬであった。結合体化反応を４℃にて一晩実施した。
【０１２２】
したがって、本発明は、血液凝固タンパク質以外の化合物と、水溶性ポリマー、特に、ＰＳＡおよびｍＰＳＡ、との結合体を提供する。
【図１】
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【図２】
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