(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において産生する方法であって、
ａ）植物において活性のある調節領域を含み、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）へ融合されたウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインを連続してコードするキメラのヌクレオチド配列へ、その調節領域が作動可能に連結された核酸を、植物または植物の一部の中へ導入する工程と、
ｂ）植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのウイルス表面タンパク質からなるウイルスタンパク質を含有するＶＬＰを産生する工程と
を含み、
前記ＴＭ／ＣＴがインフルエンザ赤血球凝集素からであり、前記外部ドメインがＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、またはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス科に由来する、
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において産生する方法。
【請求項２】
前記ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインが、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ属、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属またはＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ属に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、またはエボラウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインが、Ｆタンパク質、Ｓタンパク質、ｅｎｖタンパク質、Ｇタンパク質、Ｅエンベロープ糖タンパク質、Ｂエンベロープ糖タンパク質、Ｃエンベロープ糖タンパク質、Ｉエンベロープ糖タンパク質、Ｈエンベロープ糖タンパク質、ＧＰ糖タンパク質または赤血球凝集素に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸が、導入工程（工程ａ）において、植物において一過性に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、導入工程（工程ａ）において、植物において安定的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ｃ）植物を収穫しＶＬＰを精製する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数のシャペロンタンパク質、プロトンチャンネルタンパク質、プロテアーゼ阻害剤またはその組み合わせをコードするヌクレオチド配列の群から選択される１つまたは複数の追加の核酸が、導入工程（工程ａ）において、植物へ導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＶＬＰが、ウイルス性のマトリックスタンパク質またはコアタンパク質を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインが、導入工程（工程ａ）において、Ｈ５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン、Ｈ１膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン、またはＨ３膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスタンパク質を含有するウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ウイルスタンパク質がキメラのウイルス表面タンパク質からなり、該キメラのウイルス表面タンパク質がインフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）へ融合されたウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインを含有し、前記ＴＭ／ＣＴがインフルエンザ赤血球凝集素からであり、そして前記外部ドメインがＲｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、またはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス科に由来するものであるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１２】
前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインが、Ｈ５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン、Ｈ１膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン、またはＨ３膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインである、請求項１１に記載のＶＬＰ。
【請求項１３】
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを持つキメラのウイルスタンパク質を含む、請求項１１に記載のＶＬＰ。
【請求項１４】
植物に由来する１つまたは複数の脂質を含む請求項１１に記載のＶＬＰ。
【請求項１５】
免疫反応の誘導のために効果的な用量の請求項１１に記載のＶＬＰ、および薬学的に許容されるキャリアーを含む組成物。
【請求項１６】
前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインが、Ｈ５（Ａ／インドネシア／０５／２００５）から得られ、配列番号：４１において定義されたヌクレオチド配列を含むか、または前記インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインが、Ｈ３（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７）から得られ、配列番号：４２において定義された配列を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラのウイルスタンパク質の植物における産生に関する。より具体的には、本発明は、キメラのウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子の植物における産生にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクチン接種は、被験体への感染前の防御の搭載を誘導することによって、類似の病原体によって引き起こされる疾患に対する防御を提供する。慣習的には、これは、免疫原として病原菌の生の弱毒化された形態または全粒子の不活化された形態の使用を介して遂行されてきた。ワクチンとして全粒子ウイルス（死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルス等）を使用する危険を回避するために、組換えウイルス性タンパク質（例えばサブユニット）がワクチンとして求められている。ペプチドワクチンおよびサブユニットワクチンの両方に、多数の限界の可能性がある。サブユニットワクチンは、不正確な折り畳み、抗原提示の低さ、または炭水化物および脂質組成の差異のために、低免疫性を示し得る。主要な問題は、操作されたタンパク質の立体配座が天然環境における抗原の立体配座を模倣することを保証するのが難しいということである。免疫反応のブーストには、好適なアジュバント、およびペプチドの事例においてキャリアタンパク質を使用しなくてはならない。加えて、これらのワクチンは主として液性応答を誘発し、したがって効果的な免疫を誘発しない。サブユニットワクチンは、大抵の場合全粒子不活化ウイルスが防御を提供すると実証される疾患については効果がない。
【０００３】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は免疫原性組成物中の含有物の有力候補である。ＶＬＰは成熟ビリオンに非常に類似しているが、それらはウイルス性ゲノム材料を含有していない。したがって、ＶＬＰは天然で複製可能ではなく、そのことによりワクチンとしてのそれらの投与は安全になる。加えて、ＶＬＰはウイルス性糖タンパク質をＶＬＰの表面上で発現するように操作することができ、それはそれらの最も生来の生理的立体配置である。さらに、ＶＬＰはインタクトなビリオンに類似し、多価微粒子構造であるので、ＶＬＰは、可溶性エンベロープタンパク質抗原よりも、糖タンパク質に対する中和抗体の誘導においてより効果的であり得る。
【０００４】
３０を超える異なるウイルスについてのＶＬＰが、ワクチン目的のために昆虫および哺乳類のシステムにおいて生成されてきた（Ｎｏａｄ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒｏｙ，Ｐ．，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１：４３８−４４）。複数の研究から、哺乳類発現プラスミドまたはバキュロウイルスベクターを使用する組換えインフルエンザタンパク質は細胞培養においてＶＬＰへと自己集合することが実証されている（例えばＧｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，８０，１６３５−１６４５；Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，５４７−５５１；Ｌａｔｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｌａｒｚａ，２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７５，６１５４−６１６５）。
【０００５】
Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０，１６３５−１６４５）は、インフルエンザＶＬＰの効果的な形成はウイルス性タンパク質の発現レベルに依存することを実証した。Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４，５４７−５５１）は、クローン化されたｃＤＮＡからの感染性インフルエンザウイルス様粒子の完全な生成のための哺乳類発現のプラスミドベースのシステムを確立した。Ｌａｔｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｌａｒｚａ（２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５，６１５４−６１６５）は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスにより感染させた昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。この研究から、インフルエンザビリオンタンパク質は真核細胞における共発現に際して自己集合し、Ｍ１マトリックスタンパク質はＶＬＰ産生のために必要とされることが実証された。
【０００６】
バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、ショウジョウバエ（ＤＳ−２）細胞、ベロ細胞および酵母スフェロブラストを含む複数の発現システムにおいて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からのＰｒ５５ｇａｇの発現は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（未成熟ＨＩＶビリオンの形態に類似している）の集合および放出をもたらす（Ｄｅｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４２：２５９−２７７によって概説される）。
【０００７】
ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０をＧａｇ由来ＶＬＰの中へ取り込むことができる。しかしながら、Ｐｒ５５ｇａｇの高い発現にもかかわらず限定的な数のエンベロープタンパク質のみが取り込まれる。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）を、インフルエンザ赤血球凝集素を含む他のウイルス性エンベロープタンパク質のものによって置換することが、Ｐｒ５５ｇａｇ由来ＶＬＰの中へのエンベロープタンパク質の取り込みの増加をもたらすことを示した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，８１：１０８６９−１０８７８）。  ＨＡ  ＴＭ／ＣＴを含むキメラのＨＩＶエンベロープタンパク質は、バキュロウイルス発現システムを使用する昆虫細胞において共発現されたときに、インフルエンザＭ１由来ＶＬＰの中へ取り込まれることも示された（ＷＯ２００８／００５７７７）。
【０００８】
細胞の中へのインフルエンザウイルスの浸透はＨＡ依存性受容体仲介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザウイルス感染サイクルは、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）へのビリオン表面ＨＡタンパク質の付着によって開始される。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質はシアル酸受容体のプロセッシングを媒介する。インフルエンザビリオンを含有する内部移行するエンドソームの酸性境界において、ＨＡタンパク質はウイルス性膜と細胞膜の融合を引き起こすコンフォメーション変化を受け、ウイルス外殻が外れ、ヌクレオカプシドと会合したリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）からＭ１タンパク質がＭ２の媒介により放出され、ウイルス性ＲＮＡ合成のために細胞核の中へ移動する。Ｌａｔｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｌａｒｚａ（２００１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５，６１５４−６１６５）は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスにより感染させた昆虫細胞におけるインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。さらに、Ｇｏｍｅｚ−Ｐｕｅｒｔａｓ  ｅｔ  ａｌ（２０００，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７４，１１５３８−１１５４７）は、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えて、インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が昆虫細胞からのＶＬＰの出芽に必須であることを教示する。しかしながら、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１，７１１１−７１２３）は、Ｍ１がＶＬＰ形成のために必要とされないことを教示する。
【０００９】
大部分の特徴づけられた出芽機構は宿主の液胞タンパク質選別（ＶＰＳ）経路を使用する（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７２，２００８を参照されたい）。エンベロープを有する多くのウイルスは、ＶＰＳ経路のタンパク質と相互作用し、エンドソーム輸送選別複合体（ＥＳＣＲＴ）のタンパク質複合体の作用を必要とすることが示された（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ  ２００８の表Ｉを参照されたい）。ＶＰＳ経路のタンパク質と相互作用する後期タンパク質ドメインはウイルスのコアタンパク質およびマトリックスタンパク質上で見出され、したがってＶＰＳ依存性出芽はマトリックスタンパク質またはコアタンパク質の存在を必要とする。インフルエンザＨＡの細胞質尾部のパルミトイル化は出芽のために必要とされるが、機構は十分に理解されておらず、他の表面タンパク質ドメインの関与が含まれ得る。出芽のために最小必要要件は未知のままであり、このプロセスにおける外部ドメインの参加は除外することができない。加えて、植物におけるＶＰＳ経路はよく理解されていない（Ｓｃｈｅｌｌｍａｎｎ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｐｉｍｐｌ  Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ  １２：６７０−６７６，２００を参照されたい）。
【００１０】
インフルエンザの出芽はＶＰＳ経路から独立していることが公知である。インフルエンザウイルスの出芽はＲａｂ１１経路を伴う（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８４：５８４８−５８５９，２０１０）。Ｒａｂタンパク質は細胞の内部の輸送小胞の表面に配置されるＧＴＰａｓｅアンカーであり、それらはドナーコンパートメントからの小胞形成、輸送、ドッキングおよびアクセプターコンパートメントへの融合に関与する（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ａｎｄ  Ｍａｌａｇｏｎ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２：１−９，２０１１）。Ｒａｂ１１経路の成分は植物において同定されている。しかしながら、植物のトラフィッキングコンポーネントは進化し、植物の細胞内膜システムの複数の特異的特色をもたらし、それらは例えば大きく特殊化した液胞、ゴルジスタックの迅速な移動およびエンドソームコンパートメントのユニークな構成、ならびにＲａｂ  ＧＴＰａｓｅ数の増幅を含む（Ｒｏｊｏ  Ｅ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｅｋｅ  Ｊ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ  １４７：１４９３−１５０３，２００８）。インフルエンザ粒子またはウイルスの出芽はＲａｂ１１に依存する（Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８４：５８４８−５８５９，２０１０）が、Ｒａｂ１１またはＲａｂ１１関連タンパク質と相互作用するタンパク質またはタンパク質ドメインは同定されていない。しかしながら、出芽プロセスおよびＶＬＰ産生のために必要とされ得るＨＡの最小領域またはドメインは未知である。
【００１１】
植物において、葉緑体における蓄積について操作されなければ、ＨＩＶ  Ｐｒ５５ｇａｇは非常に少ないレベルで蓄積する（Ｍｅｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：５３；Ｓｃｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｌａｎｔａ  ２２９：１１０９−１１２２）。しかしながら、葉緑体における蓄積は、正確に折り畳まれたＨＩＶエンベロープタンパク質を取り込むこととは両立困難である。なぜならば後者の成熟および折り畳みが分泌経路の特異的翻訳後修飾を必要とするからである。Ｒｙｂｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：６２０−６３７）は、「．．．全粒子ＨＩＶ  Ｅｎｖ  ｇｐ１６０タンパク質またはさらにタンパク質の大部分を植物において適切な収率で成功して発現させることは、まだできないようである．．．」と指摘する。
【００１２】
狂犬病ウイルス（ＲＶ）はＲｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（ラブドウイルス）科のメンバーである。この科の大部分のメンバーのように、ＲＶは非分節型マイナスストランドＲＮＡウイルスであり、そのゲノムは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ）；核タンパク質（Ｎ）；リン酸化タンパク（Ｐ）；ウイルス性タンパク質エンベロープの内側に位置するマトリックスタンパク質（Ｍ）；および外表面糖タンパク質（Ｇ）の５つのウイルス性タンパク質をコードする。Ｄｉｅｔｚｓｃｈｏｌｄ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４２７−４３９。
【００１３】
狂犬病のための細胞培養ベースのワクチンは、細胞培養におけるウイルスの不活化株の増殖に限定されている。これらのワクチンは細胞培養において増殖させたウイルスを含む。現行の生物工学的アプローチは、狂犬病ウイルスの外殻タンパク質遺伝子を発現させて、活性のあるワクチンとして配備され得る安全な組換えタンパク質を開発することを目標とする。狂犬病ウイルス糖タンパク質の安定した発現がチャイニーズハムスター卵巣細胞において示されている（Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。ウイルス感染細胞から単離されたＧタンパク質と共移動する、全長の糖鎖が付加した６７Ｋのタンパク質が得られた。
【００１４】
ＷＯ／１９９３／００１８３３は、狂犬病Ｍタンパク質および狂犬病Ｍ１タンパク質の鞘によって囲まれた３’ドメインおよびフィラードメインを含むＲＮＡゲノムを含有するバキュロウイルス発現システムにおけるウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生を教示する。ＶＬＰは狂犬病Ｇタンパク質の脂質エンベロープも含む。
【００１５】
ヒトヘルペスウイルス３（ＨＨＶ−３）として公知の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、ウイルスのＨｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（ヘルペスウイルス）科のａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（アルファヘルペスウイルス）亜科のメンバーである。糖タンパク質またはテグメントタンパク質を発現するＶＬＰは、異なる疱疹ウイルス科メンバーから今までに生成されていた。エンベロープに包まれたテグメントタンパク質からなる軽量粒子（Ｌ−粒子）は、単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）、ウマ疱疹ウイルスタイプ１（ＥＨＶ−１）または仮性狂犬病ウイルスのいずれかにより感染した細胞から得られた（ＭｃＬａｕｃｈｌａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｘｏｎ（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２６９−２７６；米国特許第５３８４１２２号）。ウイルス性ＤＮＡ複製阻害剤の存在下において、ＨＳＶ−１により感染した細胞から、プレウイルス性ＤＮＡ複製エンベロープ粒子（ＰＲＥＰ）と称される異なるタイプのＶＬＰを生成することができた。ＰＲＥＰはＬ−粒子に構造的に類似するが、別のタンパク質組成物を含有していた（Ｄａｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：４９２４−４９３２；米国特許第５９９４１１６号）。ＶＺＶからｇＥタンパク質の断片を発現するハイブリッドＶＬＰは、酵母Ｔｙレトロトランスポゾンによってコードされたタンパク質ｐ１を使用する技法によって産生された（Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｃａｒｃｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：７０９−７１９；Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５９：７８−８３；米国特許第６０６００６４号）。ＵＳ２０１１／０００８８３８は、少なくとも１つのＶＺＶタンパク質を含むが、酵母Ｔｙタンパク質を含まないキメラのＶＬＰを記述する。キメラのＶＬＰは、ウイルス性コアタンパク質（インフルエンザＭ１またはニューカッスル病タンパク質Ｍ等）および少なくとも１つの水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を含む。
【００１６】
新しく進化したコロナウイルス（ＣｏＶ）の広がりにより、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）パンデミックの世界的脅威が２００３年に引き起された（Ｋｕｉｋｅｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：２６３−２７０）。他のコロナウイルスと同様に、ＳＡＲＳ−ＣｏＶは、ウイルスコアの表面を囲む、典型的な末梢突起（「コロナ」または「スパイク」と称される）を備えたエンベロープに包まれた粒子の形態を有する（Ｋｓｉａｚｅｋ，Ｔ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：１９５３−１９６６；Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｉｉｖｉｒ  Ｔｈｅｒ  ９：２８７−２８９）。コロナウイルス粒子コアの外部は、３つの膜タンパク質（最も豊富なＭ（膜）タンパク質、少量のＥ（エンベロープ）タンパク質およびＳ（スパイク）タンパク質）を主に含有する脂質エンベロープの層である。Ｓタンパク質のホモ三量体は集合的に前述のコロナを形成し、それは宿主受容体へのウイルス結合、ウイルス侵入のための膜融合、細胞間伝播およびコロナウイルスの組織指向性に関与する。
【００１７】
バキュロウイルス発現システムはＳＡＲＳ  ＶＬＰを産生するために使用されている（Ｈｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３１８：８３３−８３８；Ｍｏｒｔｏｌａ，Ｅ．ａｎｄ  Ｒｏｙ，Ｐ．，２００４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５７６：１７４−１７８）。しかしながら、昆虫細胞と哺乳類細胞との間の内因的な差異に起因して、昆虫（ＳＦ９）細胞において集合させたＶＬＰは直径１１０ｎｍのサイズを示し、それは７８ｎｍである真のＳＡＲＳ−ＣｏＶビリオンよりもはるかに大きい（Ｌｉｎ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００４、前出、およびＨｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００４、前出）。さらに、昆虫細胞ベースのＳＡＲＳ−ＶＬＰの免疫原性は未調査のままである。他の研究者は哺乳類発現システムを使用してＳＡＲＳ  ＶＬＰを産生することも試みた（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７８：１２５５７−６５）。しかしながら、ＶＬＰの細胞外放出は効果的ではなく、ＶＬＰの収率は十分ではない。例えば、ＷＯ／２００５／０３５５５６は、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｅ−タンパク質、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｍタンパク質およびＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓタンパク質を哺乳類細胞において発現する１つまたは複数の組換えベクターを含むＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス様粒子（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ−ＶＬＰ）の作製のためのシステムを記述する。
【００１８】
任意のシステムにおけるＶＬＰの形成はタンパク質の構造に対して多くの要求を課す。タンパク質の配列のストレッチの改変はポリペプチドそれ自体の発現に対する効果をほとんど有していないかもしれないが、ＶＬＰの形成に対するかかる改変の効果を実証する構造研究は欠けている。タンパク質の様々な領域および構造の協同は、ウイルスと共に進化しており、ＶＬＰ形成の損失を伴わないで類似の改変への修正は可能ではないかもしれない。
【００１９】
ワクチン候補としてＶＬＰを改善するために、昆虫細胞および哺乳類細胞以外の他の発現システムを調査することが必要である。したがって、植物発現システムがキメラタンパク質ＶＬＰを産生する能力を査定する必要性がある。特に、ＶＬＰへと集合するウイルスタンパク質の最小数を同定し、それらのＶＬＰの形態および免疫原性を評価する必要性がある。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、キメラのウイルスタンパク質の植物における産生に関する。より具体的には、本発明は、キメラのウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子の植物における産生にも関する。
【００２１】
本発明は、
ａ）植物において活性のある調節領域を含み、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部へ融合されたウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインを連続してコードするキメラのヌクレオチド配列へ、その調節領域が作動可能に連結された核酸を、植物または植物の一部の中へ導入し、外部ドメインが非インフルエンザウイルス三量体表面タンパク質からであり、インフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部に関して異種である工程と、
ｂ）植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を植物において産生する方法を提供する。
【００２２】
上記の方法は、（ｃ）植物を収穫し、ＶＬＰを精製する工程をさらに含み得る。さらに、ＶＬＰはウイルス性マトリックスタンパク質またはコアタンパク質を含有していなくてもよい。
【００２３】
本発明は、ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片からの外部ドメインが、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ（レトロウイルス）科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（ラブドウイルス）科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ（ヘルペスウイルス）科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（コロナウイルス）科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（パラミクソウイルス）科、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ（ポックスウイルス）科またはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ（フィロウイルス）科のウイルスに由来し得る、上記の方法を提供する。ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインは、例えばＬｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（レンチウイルス）属、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ（レッサウイルス）属、Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ（バリセロウイルス）属、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（コロナウイルス）属またはＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ（エボラウイルス）属に由来し得る。ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインは、例えばＨＩＶ、狂犬病ウイルス、ＶＺＶ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳウイルス、エボラウイルス、麻疹、耳下腺炎、水痘、サイトメガロウイルス、エボラ／フィロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルスまたは天然痘に由来し得るが、これらに限定されない。その生来の形態におけるウイルス三量体表面タンパク質は、例えばＦタンパク質（ＲＳＶ、麻疹、耳下腺炎、ニューカッスル病）、Ｓタンパク質（ＳＡＲＳ）、ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ）、Ｇタンパク質（狂犬病）、Ｅ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、Ｈを含むエンベロープ糖タンパク質（ＶＺＶ、サイトメガロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス）、ＧＰ糖タンパク質（エボラ、マールブルグ）、赤血球凝集素（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）の外部ドメインおよび膜貫通ドメイン／細胞質尾部を含み得るが、これらに限定されない。
【００２４】
本発明は、Ｈ５（Ａ／インドネシア／０５／２００５）またはＨ３（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７）からインフルエンザ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部が得られる上記の方法も含む。膜貫通ドメインおよび細胞質尾部は、配列番号：４１または配列番号：４２中で定義されるヌクレオチド配列を含み得る。
【００２５】
本発明は、導入工程（工程ａ）において、核酸が植物において一過性に発現される上記の方法も提供する。あるいは、導入工程（工程ａ）において、核酸は植物において安定的に発現され得る。
【００２６】
本発明は、導入工程（工程ａ）において、１つまたは複数のシャペロンタンパク質、プロトンチャンネルタンパク質、プロテアーゼ阻害剤またはその組み合わせをコードするヌクレオチド配列の群から選択される１つまたは複数の追加の核酸が、植物へ導入される、上記の方法も含む。
【００２７】
本発明は、上記の方法によって産生されたＶＬＰを提供する。ＶＬＰのキメラのウイルス三量体表面タンパク質は、植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾されたＮ−グリカンを含み得る。ＶＬＰは植物に由来する１つまたは複数の脂質も含み得る。
【００２８】
本発明は、免疫反応の誘導のために効果的な用量の上記のようなＶＬＰ、および薬学的に許容されるキャリアーを含む組成物を含む。
【００２９】
本発明は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科またはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスからキメラのウイルス三量体表面タンパク質を産生すること、およびキメラのウイルス三量体表面タンパク質を含むこれらのウイルス様粒子を植物において産生することに関する。
【００３０】
さらに、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、狂犬病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスまたはエボラウイルスのキメラの三量体表面タンパク質の植物における産生に関する。本発明は、ＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳ、エボラのキメラのウイルス様粒子の植物における産生に関する。
【００３１】
本発明によれば、植物において活性のある調節領域に作動可能に連結されたキメラのＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラウイルスのタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラのＶＬＰを産生することを含む、キメラのＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラのＶＬＰを植物において産生する方法が提供される。
【００３２】
本発明は、キメラのＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラのタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。ＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラのＶＬＰも植物内で産生することができる。
【００３３】
本発明によれば、ＨＩＶ、狂犬病、ＶＺＶ、ＳＡＲＳまたはエボラに由来するタンパク質から産生されたキメラのＶＬＰまたはＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質は、ＶＬＰ調製の混入物と判断され得るＲＮＡを結合することが公知である。抗原性（ＶＬＰ）産物のための規制認可を得る場合ＲＮＡの存在は所望されず、したがってＲＮＡを欠くキメラのＶＬＰ調製は有利だろう。
【００３４】
生来のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は植物においてあまり蓄積しないが、インフルエンザＨＡから膜貫通（ＴＭ）および細胞質尾部（ＣＴ）ドメインに融合したキメラのＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質は、植物において、高いレベルで蓄積し、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてＨＩＶ  ＶＬＰへと出芽する。
【００３５】
本発明のこの要約は必ずしも本発明のすべての特色を記述するとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本発明のこれらおよび他の特色は、添付の図面を参照する以下の記述からより明らかになるだろう。
【００３７】
【図１Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩのコンセンサス核酸配列（配列番号：１）を示す（生来のシグナルペプチドは太字で、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに下線が引かれる）。
【図１Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：２）。
【図１Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＳｐＰＤＩ−ＨＩＶ  ｇｐ１４５．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：３）。
【図１Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＩＦ−ＳｐＰＤＩ−ｇｐ１４５．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：４）。
【図１Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＷｔｄＴｍ−ｇｐ１４５．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：５）。
【図１Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号９９５のヌクレオチド配列（配列番号：６）を示す。取り除かれたＳｂｆＩ制限部位は太字で示される。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩに下線が引かれる。
【図１Ｇ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩのアミノ酸配列を示す（配列番号：７）。
【図１Ｈ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号９９５の図式的な表示を示す。
【００３８】
【図２Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＩＦ−Ｈ３ｄＴｍ＋ｇｐ１４５．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：８）。
【図２Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＧｐ１４５＋Ｈ３ｄＴｍ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：９）。
【図２Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＨ３ｄＴｍ．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：１０）。
【図２Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号９９７のヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す。取り除かれたＳｂｆＩ制限部位は太字で示される。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ−Ａ／ブリズベーン／１０／２００７  Ｈ３  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる。
【図２Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩＡ／ブリズベーン／１０／２００７  Ｈ３  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：１２）。
【図２Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号９９７の図式的な表示を示す。
【００３９】
【図３Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ｇｐ１４５．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：１３）。
【図３Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＧｐ１４５＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：１４）。
【図３Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。オリゴヌクレオチドＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：１５）。
【図３Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号９９９のヌクレオチド配列（配列番号：１６）を示す。取り除かれたＳｂｆＩ制限部位は太字で示される。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる。
【図３Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩＡ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：１７）。
【図３Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＨＩＶのための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号９９９の図式的な表示を示す。
【００４０】
【図４Ａ】本発明の様々な実施形態に従うアミノ酸配列およびｐ１９のための複数の発現カセットを示した図である。ＸｍａＩ（プラストシアニンプロモーターの上流）からＥｃｏＲＩ（プラストシアニンターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号１７２のヌクレオチド配列（配列番号：１８）を示す。ＴＢＳＶ  Ｐ１９核酸配列に下線が引かれる。
【図４Ｂ】本発明の様々な実施形態に従うアミノ酸配列およびｐ１９のための複数の発現カセットを示した図である。ＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーのアミノ酸配列（配列番号：１９）を示す。
【図４Ｃ】本発明の様々な実施形態に従うアミノ酸配列およびｐ１９のための複数の発現カセットを示した図である。コンストラクト番号１７２の表示を示す。
【００４１】
【図５】本明細書において記述されるように発現されるキメラのＨＩＶ  Ｅｎｖ遺伝子の図式的な表示を示した図である。
【００４２】
【図６】アグロインフィルトレーションしたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ葉におけるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示した図である。レーン１〜４、モックインフィルトレーションした植物から抽出された２０μｇの葉タンパク質中の、それぞれ１００、５０、１０および５ｎｇの組換えＨＩＶ−１  ｇｐ１６０（ａｂ６８１７１）（陽性対照）。レーン５、モックインフィルトレーションした植物からの２０μｇのタンパク質（陰性対照）。レーン６〜８、ＡＧＬ１／９９５をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質（それぞれ２０μｇ、１０μｇおよび２μｇ、モックインフィルトレーションした植物から抽出された葉タンパク質により２０μｇにした）。レーン９および１０、ＡＧＬ１／９９７をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質（それぞれ２０μｇおよび１０μｇ、モックインフィルトレーションした植物から抽出された葉タンパク質により２０μｇにした）。レーン１１および１２、ＡＧＬ１／９９９をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質（それぞれ２０μｇおよび１０μｇ、モックインフィルトレーションした植物から抽出された葉タンパク質により２０μｇにした）。
【００４３】
【図７Ａ】サイズ排除クロマトグラフィーによってＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩに由来する構造の特徴評価を示した図である。Ｅｎｖ／Ｈ５キメラタンパク質を産生するＡＧＬ１／９９９によりインフィルトレーションした葉からのタンパク質抽出物を、キャリブレーションしたＳ−５００高分解能カラム上でゲル濾過によって分離した。溶出画分のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質含有量を抗ｇｐ１２０抗体を使用する免疫検出によって明らかにした。レーン１〜４、モックインフィルトレーションした植物から抽出された２０μｇの葉タンパク質中の、それぞれ１００、５０、１０および５ｎｇの組換えＨＩＶ−１  ｇｐ１６０（ａｂ６８１７１）（陽性対照）。レーン５、モックインフィルトレーションした植物からの２０μｇのタンパク質（陰性対照）。レーン６、ＡＧＬ１／９９９をインフィルトレーションした葉から抽出された２０μｇのタンパク質。レーン７〜１８、ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出画分７〜１８。
【図７Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィーによってＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩに由来する構造の特徴評価を示した図である。Ｅｎｖ／Ｈ５キメラタンパク質を産生するＡＧＬ１／９９９によりインフィルトレーションした葉からのタンパク質抽出物は、キャリブレーションしたＳ−５００高分解能カラム上でゲル濾過によって分離された。ゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出画分７〜１８の相対的タンパク質含有量。
【００４４】
【図８Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。コンストラクト１０７４の概略図を示す（プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター含有ベクター上のＣ−２×３５Ｓ−狂犬病糖タンパク質Ｇ（ＲａｂＧ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ）。
【図８Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃを示す（配列番号：３２）。
【図８Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。プライマーＲａｂＧ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｒを示す（配列番号：３３）。
【図８Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。合成されたＲａｂ  Ｇ遺伝子を示す（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ２０６７０７からのヌクレオチド３３１７〜４８９１に対応する；生来のシグナルペプチドは太字で、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに下線が引かれる；配列番号：３４）。
【図８Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｃを示す（配列番号：３５）。
【図８Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。左ｔ−ＤＮＡから右ｔ−ＤＮＡ（下線が引かれる）のコンストラクト１４１を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットによる２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現システム（配列番号：３６）。
【図８Ｇ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。コンストラクト１４１の図式的な表示を示す。プラスミド線形化のために使用するＳｂｆＩおよびＳｔｕＩの制限酵素部位は表示上で注釈される。
【図８Ｈ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。２×３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまでの発現カセット番号１０７４のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ−Ｒａｂ  Ｇ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる（配列番号：３７）。
【図８Ｉ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。ＰＤＩＳＰ−Ｒａｂ  Ｇ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：３８）。
【図８Ｊ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。左ｔ−ＤＮＡから右ｔ−ＤＮＡ（下線が引かれる）のコンストラクト１４４についてのヌクレオチド配列を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットによるＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ発現システムの中の２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ（配列番号：３９）。
【図８Ｋ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。コンストラクト１４４の図式的な表示を示す。プラスミド線形化のために使用するＳｂｆＩおよびＳｔｕＩの制限酵素部位は表示上で注釈される。
【図８Ｌ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。右から左のＢｅＹＤＶ  ＬＩＲの発現カセット番号１０９４のヌクレオチド配列を示す。ＰＤＩＳＰ−Ｒａｂ  Ｇ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる（配列番号：４０）。
【図８Ｍ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号１０９４の図式的な表示を示す。
【図８Ｎ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。狂犬病Ｇタンパク質の植物における発現のイムノブロット分析を示す。狂犬病Ｇタンパク質は、ＰＤＩ  Ｓｐ（コンストラクト１０７１）、ＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐ、Ｈ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメイン、またはその組み合わせとの融合で発現させた。より具体的には、コンストラクト１０７４は、ＰＤＩ  ＳｐおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。コンストラクト１０９４は、ＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐ、ＰＤＩ  ＳｐおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。コンストラクト１０９１は、ＰＤＩ  ＳｐおよびＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。
【図８Ｏ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびに狂犬病のための発現カセットを示した図である。コンストラクト１０７４およびコンストラクト１０９４から発現されたタンパク質の抽出物を濃縮および清澄化したもののサイズ排除クロマトグラフィーのイムノブロット分析を示す。
【００４５】
【図９Ａ】コンストラクト１０７４から発現された精製狂犬病Ｇタンパク質のイムノブロット分析を示した図である。
【図９Ｂ】コンストラクト１０７４の発現に由来する精製ＶＬＰの透過電子顕微鏡写真を示した図である。
【００４６】
【図１０Ａ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。プライマーＩＦ−ｗｔＳｐ−ＶＺＶｇＥ．ｃを示す（配列番号：２０）。
【図１０Ｂ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ＶＺＶｇＥ．ｒを示す（配列番号：２１）。
【図１０Ｃ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。合成されたＶＺＶ  ｇＥ遺伝子を示す（配列番号：２２；Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ０１３７５２．１からのヌクレオチド３４７７〜５３４８に対応する）（生来のシグナルペプチドは太字で、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに下線が引かれる）。
【図１０Ｄ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。ＶＺＶｇＥ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃのためのプライマーを示す（配列番号：２３）。
【図１０Ｅ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号９４６（配列番号：２４）を示す。ＶＺＶ  ｇＥ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる。
【図１０Ｆ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。ＶＺＶ  ｇＥ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：２５）。
【図１０Ｇ】Ａ−２×３５Ｓ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）を調製するための配列を示した図である。コンストラクト番号９４６の図式的な表示を示す。
【００４７】
【図１１Ａ】水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）Ｅタンパク質の発現のイムノブロット分析を示した図である。レーン１〜５、それぞれ５００、１００、５０、１０および５ｎｇの組換えＶＺＶ  ｇＥ（陽性対照）。レーン６、モックインフィルトレーションした葉からの抽出物（陰性対照）。レーン７〜９、それぞれ２０、１０および２μｇのコンストラクト９４６からの組換えタンパク質の抽出物。コンストラクト９４６は、野生型シグナルペプチドおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインを持つＶＺＶ  ｇＥ遺伝子を含む。
【図１１Ｂ】粗製抽出物（コンストラクト９４６）のサイズ排除クロマトグラフィーの発現のイムノブロット分析を示した図である。
【００４８】
【図１２Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号９１６の概略図を示す（Ｂ−２×３５Ｓ−重症急性呼吸器症候群ウイルス糖タンパク質Ｓ（ＳＡＲＳ  ｇＳ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ）。
【図１２Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。プライマーＩＦ−ｗｔＳｐ−ＳＡＲＳｇＳ．ｃを示す（配列番号：２６）。
【図１２Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ＳＡＲＳｇＳ．ｒを示す（配列番号：２７）。
【図１２Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。合成されたＳＡＲＳ  ｇＳ遺伝子を示す（配列番号：２８；Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７８７４１．１からのヌクレオチド２１４９２〜２５２５９に対応する；生来のシグナルペプチドは太字で、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに下線が引かれる）。
【図１２Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。プライマーＳＡＲＳｇＳ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃを示す（配列番号：２９）。
【図１２Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。ＰａｃＩ（プロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの発現カセット番号９１６（配列番号：３０）のヌクレオチド配列を示す。ＳＡＲＳ  ｇＳ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴに下線が引かれる。
【図１２Ｇ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。ＳＡＲＳ  ｇＳ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：３１）。
【図１２Ｈ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにＳＡＲＳのための発現カセットを示した図である。重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスタンパク質Ｓの発現のイムノブロット分析を示す。コンストラクト９１６は、野生型シグナルペプチドおよびＨ５  Ａ／Ｉｎｄｏ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを持つＳＡＲＳ  ｇＳ遺伝子を含む。レーン１、モックインフィルトレーションした植物からの抽出物（陰性対照）。レーン２〜４、コンストラクト９１６からの組換えタンパク質（２０、１０および５ｇの抽出物）。
【００４９】
【図１３Ａ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。プライマーＩＦ−Ｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ．ｓ２＋４ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：４３）。
【図１３Ｂ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。プライマーＨ５ｉＴＭＣＴ＋Ｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ．ｒのヌクレオチド配列を示す（配列番号：４４）。
【図１３Ｃ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。至適化した合成されたＧＰ遺伝子のヌクレオチド配列を示す（野生型遺伝子配列についてのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３５４４５８からのヌクレオチド６０３９〜８０６９に対応する。配列（配列番号：４５）は、コドン使用およびＧＣ含量について至適化され、隠れたスプライス部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、配列を不安定にするＲＮＡおよび原核細胞リボゾーム侵入部位が削除され；生来のシグナルペプチドは太字で、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに下線が引かれる）。
【図１３Ｄ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。プライマーｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ＋Ｈ５ｉＴＭＣＴ．ｃのヌクレオチド配列を示す（配列番号：４６）。
【図１３Ｅ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。コンストラクト１１９２の図式的な表示を示す。プラスミド線形化のために使用されたＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩの制限酵素部位は表示上で注釈される。
【図１３Ｆ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界（下線が引かれる）のコンストラクト１１９２についてのヌクレオチド配列を示す。プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニンサイレンシングインヒビター発現カセットによる２×３５Ｓ／ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ（配列番号：４７）。
【図１３Ｇ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。２×３５ＳプロモーターからＮＯＳターミネーターまで発現カセット番号１３６６についてのヌクレオチド配列を示す。ザイール９５エボラウイルスからのＰＤＩＳＰ−ＧＰ−Ａ／インドネシア５／２００５からのＨ５  ＴＭ＋ＣＴ配列に下線が引かれる（配列番号：４８）。
【図１３Ｈ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。ザイール９５エボラウイルスからのＰＤＩＳＰ−ＧＰ−Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を示す（配列番号：４９）。
【図１３Ｉ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。コンストラクト番号１３６６の図式的な表示を示す。
【図１３Ｊ】本発明の様々な実施形態に従う複数のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列ならびにエボラのための発現カセットを示した図である。エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）タンパク質の発現のイムノブロット分析を示す。５００ナノグラムをモックインフィルトレーションした植物から抽出した２０μｇのタンパク質中に添加し、陽性対照（Ｃ＋）としてロードした。モックインフィルトレーションした植物から抽出した２０マイクログラムのタンパク質を陰性対照（Ｃ−）としてロードした。コンストラクト１３６６は、野生型シグナルペプチドおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインを持つエボラウイルスＧＰ遺伝子を含む。括弧内の数は、インフィルトレーションのためのイノキュラムの調製において使用された最初の細菌培養の量を示す。（２００）は２００ｍｌの培養を２．３Ｌのインフィルトレーションバッファーと混合しとことを示し、（４００）は４００ｍｌの培養を２．１Ｌのインフィルトレーションバッファーと混合しとことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下の記述は好ましい実施形態である。
【００５１】
本発明はウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。より具体的には、本発明は、キメラのウイルスタンパク質を含むＶＬＰ、および植物内のキメラのＶＬＰを産生する方法に関する。ＶＬＰは、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）へ融合した、ウイルス三量体表面タンパク質（ウイルス性三量体表面タンパク質）またはその断片からの外部ドメインを連続して含む融合（キメラの）タンパク質を含む。ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインはＴＭ／ＣＴに関して異種である。ＴＭ／ＣＴはインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）からのＴＭ／ＣＴである。
【００５２】
ウイルス三量体表面タンパク質（ウイルス性三量体表面タンパク質とも称される）は、エンベロープウイルスの表面上で三量体（通常ホモ三量体）の形態で見出されるタンパク質であり、各々のモノマーのＣ末端に配置される膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）ならびに各々のモノマーのＮ末領域に配置される外部ドメインを含む。ウイルス三量体表面タンパク質は糖タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。三量体は通常非共有結合された３つのタンパク質によって形成される巨大分子複合体である。理論により束縛されることは意図しないが、タンパク質の三量体化ドメインはかかる三量体の形成に重要であり得る。したがってウイルス三量体表面タンパク質またはその断片のモノマーは三量体化ドメインを含み得る。ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片は外部ドメインをさらに含む。三量体表面タンパク質の外部ドメインは外側の環境に曝露され、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部のドメインを含まない。本明細書において記述されるように、ウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインはインフルエンザウイルスに由来しない。本明細書において記述されるように、ウイルス三量体表面タンパク質の断片が使用されるならば、ウイルス三量体表面タンパク質が三量体を形成する能力を保持することが好ましい。
【００５３】
ウイルス三量体表面タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ／ＣＴ）、インフルエンザタンパク質のＴＭ／ＣＴ、または両方は、当業者によって公知であるような方法を使用して容易に同定することができ、例えば、例えば膜貫通予測プログラムを使用してタンパク質のアミノ酸配列の疎水性の程度を決定すること（例えばＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓによって操作されるＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＥｘＰＡＳｙ．ｏｒｇ；またはＤｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄ、Ｃｓｅｒｚｏ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．ｖｏｌ．１０，ｎｏ．６，６７３−６７６；Ｌｏｌｋｅｍａ  Ｊ．Ｓ．１９９８，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２２，ｎｏ  ４，３０５−３２２）、タンパク質のアミノ酸配列の疎水性プロファイルを決定すること（例えばＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性プロファイル）、三次元のタンパク質構造を決定することおよび膜中で熱力学的に安定している構造を同定すること（例えば単一のαへリックス、複数の膜貫通αへリックスの安定した複合体、膜貫通βバレル、βヘリックス、または膜中で熱力学的に安定している他の構造）によるものである。一旦同定されたならば、ウイルス三量体表面タンパク質のＴＭ／ＣＴ領域は、以下で記述されるようにインフルエンザウイルスから得られる膜貫通および細胞質尾部と置き換えることができる。
【００５４】
本発明の様々な実施形態に記載のキメラのＶＬＰは、ウイルス性三量体表面タンパク質、またはウイルス性三量体表面タンパク質の断片を含み、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）はインフルエンザＨＡから得られたＴＭ／ＣＴと置き換えられる。ウイルス三量体表面タンパク質はＴＭ／ＣＴに関して異種である。ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科またはＦｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに由来し得るが、これらに限定されない。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えば、Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ属、Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ属、Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ属、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ属またはＥｂｏｌａｖｉｒｕｓ属に由来し得る。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えばＨＩＶ、狂犬病ウイルス、ＶＺＶ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳウイルス、エボラウイルス、麻疹、耳下腺炎、水痘、サイトメガロウイルス、エボラフィロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルスまたは天然痘に由来し得るが、これらに限定されない。ウイルス三量体表面タンパク質は、例えば三量体表面タンパク質であり得、その生来の形態において膜貫通ドメイン／細胞質尾部を含み得る。それらは、例えば、以下のものであるが、それらに限定されない。
ａ．Ｆタンパク質（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科：ＲＳＶ、麻疹、耳下腺炎、ニューカッスル病）
ｂ．Ｓタンパク質（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科：ＳＡＲＳ）；
ｃ．ｅｎｖタンパク質（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科：ＨＩＶ）；
ｄ．Ｇタンパク質（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科：狂犬病）；
ｅ．Ｅ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、Ｈ等のエンベロープ糖タンパク質（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科：ＶＺＶ、サイトメガロウイルス、疱疹ウイルス、エプスタインバーウイルス）；
ｆ．ＧＰ糖タンパク質（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科：エボラ、マールブルグ）；
ｇ．赤血球凝集素（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科：痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス）。
本発明に従って使用することができる複数のウイルス三量体表面タンパク質の非限定例は、以下でより詳細に記述される。
【００５５】
ＨＩＶ
本発明は、キメラのヒト免疫不全（ＨＩＶ）タンパク質を含むＶＬＰ、およびキメラのＨＩＶ  ＶＬＰを産生する方法を提供し、キメラのＨＩＶタンパク質は、例えばＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）の一部（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）等）との融合タンパク質を含む。
【００５６】
本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＨＩＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５７】
さらに、本発明はキメラのＨＩＶ  ＶＬＰを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＨＩＶタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのＨＩＶ  ＶＬＰを産生することを含む。
【００５８】
本発明は、キメラのＨＩＶタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。
【００５９】
狂犬病ウイルス
本発明は、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質を含むＶＬＰ、およびキメラの狂犬病ＶＬＰを産生する方法も提供し、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質は、例えば狂犬病Ｇタンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）の一部（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）等）との融合タンパク質を含む。
【００６０】
本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラの狂犬病ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６１】
さらに、本発明はキメラの狂犬病ウイルスＶＬＰを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラの狂犬病ウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラの狂犬病ウイルスＶＬＰを産生することを含む。
【００６２】
本発明は、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。
【００６３】
ＶＺＶ
本発明は、キメラの水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）タンパク質を含むＶＬＰ、およびキメラのＶＺＶ  ＶＬＰを産生する方法にも関し、キメラのＶＺＶタンパク質は、例えばＶＺＶ糖タンパク質Ｅおよびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）の一部（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）等）との融合タンパク質を含む。
【００６４】
本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＶＺＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６５】
さらに、本発明はキメラのＶＺＶ  ＶＬＰを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＶＺＶタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのＶＺＶ  ＶＬＰを産生することを含む。
【００６６】
本発明は、キメラのＶＺＶタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。
【００６７】
ＳＡＲＳ
本発明は、キメラの重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスタンパク質を含むＶＬＰ、およびキメラのＨＩＶ  ＶＬＰを産生する方法にも関し、キメラのＳＡＲＳタンパク質は、例えばＳＡＲＳ糖タンパク質Ｓおよびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）の一部（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）等）との融合タンパク質を含む。
【００６８】
本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＳＡＲＳタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００６９】
さらに、本発明はキメラのＳＡＲＳ  ＶＬＰを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのＳＡＲＳウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのＳＡＲＳ  ＶＬＰを産生することを含む。
【００７０】
本発明は、キメラのＳＡＲＳウイルスタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。
【００７１】
エボラ
本発明は、キメラのエボラウイルスタンパク質を含むＶＬＰ、およびキメラのエボラＶＬＰを産生する方法にも関し、キメラのエボラウイルスタンパク質は、例えばエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質およびインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）の一部（膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）等）との融合タンパク質を含む。
【００７２】
本発明は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのエボラウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００７３】
さらに、本発明はキメラのエボラＶＬＰを植物において産生する方法を提供する。方法は、植物において活性のある調節領域へ作動可能に連結されたキメラのエボラウイルスタンパク質をコードする核酸を植物または植物の一部の中へ導入し、植物または植物の一部を核酸の発現を可能にする条件下でインキュベーションし、それによってキメラのエボラウイルスＶＬＰを産生することを含む。
【００７４】
本発明は、キメラのエボラウイルスタンパク質を含むＶＬＰをさらに提供する。ＶＬＰは本発明によって提供されるような方法によって産生することができる。
【００７５】
キメラ化およびＶＬＰ形成
水疱性口内炎ウイルス（狂犬病のようなラブドウイルス）および単純ヘルペスウイルス（水痘帯状疱疹ウイルスのようなヘルペスウイルス）の両方は、ＶＳＰ４依存性様式で出芽する（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８１：１３６３１−１３６３９，２００７；Ｃｒｕｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８１：７３８０−７３８７，２００７）。ＶＳＰ４がマトリックスタンパク質の後期ドメインと相互作用するので、出芽のために、および必然の結果としてＶＬＰ産生のために、マトリックスタンパク質が必要とされることを示唆する。しかしながら、本明細書において記述されるように、ＴＭ／ＣＴドメインをインフルエンザＨＡのものにより置き換える場合、狂犬病およびＶＺＶのＶＬＰをマトリックスタンパク質なしに産生することができる。理論により束縛されることは意図しないが、これは、キメラ化が狂犬病およびＶＺＶのＶＬＰ形成のためのマトリックスタンパク質の共発現に対する依存性を取り除き得ることを示唆する。
【００７６】
上記のようなウイルス性三量体表面タンパク質の外部ドメインは、ウイルス三量体表面タンパク質がＴＭ／ＣＴに関して異種であるように、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメイン（ＴＭ／ＣＴ）へ融合される。ＴＭ／ＣＴはインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）からのＴＭ／ＣＴ、例えばＨ５またはＨ３からのＴＭ／ＣＴであり得、例えば、Ａ／インドネシア／５／０５サブタイプ（Ｈ５Ｎ１；「Ｈ５／Ｉｎｄｏ」；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＷ０６１０８．１）、Ｈ５  Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ａ−ベトナム；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＲ４８８７４．１）、Ｈ５  Ａ／アンホイ／１／２００５（Ａ−アンホイ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ２８１８０．１）；Ｈ３  Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（「Ｈ３／Ｂｒｉ」；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＩ２６３１８．１）、Ｈ３  Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ａ−ＷＣＮ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＯ３７５９９．１）であるがこれらに限定されない。複数のＨ３およびＨ５のＴＭ／ＣＴ境界の配列はＷＯ２０１０／１４８５１１（参照として本明細書に援用される）中に記述される。例えば、限定すると判断すべきではないが、ＴＭ／ＣＴのためのアミノ酸配列は以下のものを含み得る。
Ｈ５（Ａ／インドネシア０５／２００５）ＴＭ／ＣＴ（配列番号：４１）：
ＱＩＬＳＩＹＳＴＶＡＳＳＬＡＬＡＩＭＭＡＧＬＳＬＷＭＣＳＮＧＳＬＱＣＰＪＣＩ
Ｈ３（Ａ／ブリズベーン／１０／２００７）ＴＭ／ＣＴ（配列番号：４２）：
ＤＷＩＬＷＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＡＬＬＧＦＩＭＷＡＣＱＫＧＮＩＲＣＮＩＣＩ
および配列番号：４１または４２のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列。
【００７７】
本発明において参照される特異的核酸配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において定義されるような1つまたは複数のヌクレオチド配列へハイブリダイズする配列に「実質的に相同」もしくは「実質的に類似」し得るか、またはその配列もしくは配列の相補物であり得る。もしかかる相同配列が、配列の１つもしくは複数の特性または本明細書において記述されるようなコードされた産物を示すならば、ヌクレオチドの少なくとも約７０％、より好ましくは７５％が、ヌクレオチド配列の定義された長さにわたってマッチするとき、配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」する。例えば、Ｈ３もしくはＨ５から得られた膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインへ融合したウイルス三量体表面タンパク質からのものに実質的に相同な外部ドメイン、Ｈ３もしくはＨ５のＴＭ／ＣＴに実質的に相同でありウイルス三量体表面タンパク質からの外部ドメインへ融合した膜貫通ドメインおよび細胞質尾部、またはウイルス三量体表面タンパク質からのものに実質的に相同なＴＭ／ＣＴおよび実質的に相同な外部ドメインの両方は、ＶＬＰを形成する。キメラタンパク質の正確な折り畳みは、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成および機能に重要であろう。タンパク質の折り畳みは、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、折り畳まれるか、部分的に折り畳まれるか、または折り畳まれていないタンパク質と結合または一過的に会合するコファクターの利用可能性を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の因子によって影響を受け得る。
【００７８】
かかる配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されたもの等のヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定することができる（例えば以下のパラメータを使用するが、これらに限定されない：ＧＡＰペナルティ５、トップダイアゴナル数５、固定ＧＡＰペナルティ１０、ｋ−タプル２、フローティングギャップ１０およびウィンドウサイズ５）。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法は、当該技術分野において周知であり、例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）のアルゴリズム、およびこれらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ、ＮＩＨを介して利用可能）によるもの、または手動式アライメントおよび目視検査（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編、１９９５年サプリメントを参照）によるもの、またはストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーション（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年を参照）を使用するものである。好ましくは、実質的に相同な配列は、分子の定義された長さにわたって、少なくとも約８０％および最も好ましくは少なくとも約９０％の配列類似性を示す。
【００７９】
かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、４×ＳＳＣ中で６５℃で一晩（約１６〜２０時間から）のハイブリダイゼーション、続いて０．１×ＳＳＣ中で６５℃で１時間の洗浄、または０．１×ＳＳＣ中で６５℃で各々２０分もしくは３０分間の２回の洗浄であり得る。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で４２℃で一晩（１６〜２０時間）、続いて０．１×ＳＳＣ中で６５℃で１時間の洗浄、または０．１×ＳＳＣ中で６５℃で各々２０分もしくは３０分間の２回または一晩（１６〜２０時間）の洗浄、またはＣｈｕｒｃｈ水性リン酸緩衝液（７％ＳＤＳ；０．５Ｍ  ＮａＰＯ４バッファーｐＨ７．２；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で６５℃のハイブリダイゼーション、そして０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で各々２０分もしくは３０分間のいずれかで２回の洗浄、またはユニーク配列領域のためには２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で各々２０分もしくは３０分間の２回の洗浄であり得る。
【００８０】
キメラのポリペプチド、キメラのタンパク質、融合タンパク質、キメラのウイルス性タンパク質またはキメラのウイルス三量体表面タンパク質をコードする核酸は、「キメラの核酸」または「キメラのヌクレオチド配列」として記述することができる。例えば、限定すると判断すべきではないが、キメラのＨＩＶタンパク質、キメラの狂犬病ウイルスタンパク質、キメラのＶＺＶタンパク質、キメラのＳＡＲＳまたはキメラのエボラウイルスタンパク質を含むウイルス様粒子は、「キメラのＶＬＰ」として記述することができる。
【００８１】
「キメラのタンパク質」または「キメラのポリペプチド」（融合タンパク質とも称される）によって、２つまたはそれ以上のソースからのアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドが意味され、例えば、ウイルス三量体表面タンパク質またはその断片（例えば、Ｆタンパク質（例えばＲＳＶ、麻疹、耳下腺炎、ニューカッスル病）、Ｓタンパク質（例えばＳＡＲＳ）、ｅｎｖタンパク質（ＨＩＶ）、Ｇタンパク質（狂犬病）、Ｅ、Ｂ、Ｃ、Ｉ、Ｈ等のエンベロープ糖タンパク質（ＶＺＶ、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス）、ＧＰ糖タンパク質（例えばエボラ、マールブルグ）；赤血球凝集素（例えば痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス））からの外部ドメイン、および例えばＨＡのＴＭ／ＣＴは、単一のポリペプチドとして融合されるが、これらに限定されない。キメラのタンパク質またはポリペプチドは、残りのポリペプチドまたはタンパク質と同じまたは異種のシグナルペプチドを含むことができる。
【００８２】
「シグナルペプチド」という用語は当該技術分野において周知であり、アミノ酸の短い（約５〜３０アミノ酸）配列を一般的には指し、一般的にはポリペプチドのＮ末で見出され、新しく翻訳されたポリペプチドが特定の細胞内小器官へ移行することを導けるか、またはポリペプチド鎖の特異的ドメインが他のドメインに対してポジショニングすることを補助できるものである。非限定例として、シグナルペプチドは、タンパク質が小胞体の中へ移行すること、および／またはＮ末近位ドメインが新生ポリペプチドの膜アンカードメインに対してポジショニングすることを補助して成熟タンパク質（例えば、限定すると判断すべきではないが、成熟ＨＡタンパク質）の切断および折り畳みを補助することを標的とすることができる。
【００８３】
シグナルペプチド（ＳＰ）はタンパク質またはウイルスタンパク質に対して生来のものであり得るか、またはシグナルペプチドは発現されるタンパク質またはウイルスタンパク質の一次配列に関して異種であり得る。タンパク質またはウイルスタンパク質は、１つまたは複数の異なるインフルエンザのタイプ、サブタイプまたは系統からのＨＡにバランスがとれた第１のインフルエンザのタイプ、サブタイプまたは系統からのシグナルペプチドを含むことができる。例えば、ＨＡサブタイプＢ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ９またはインフルエンザタイプＢの生来のシグナルペプチドを使用して、キメラのウイルスタンパク質を植物システムにおいて発現させることができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＰはインフルエンザタイプＢ、Ｈ１、Ｈ３もしくはＨ５のもの；またはサブタイプＨｌ／Ｂｒｉ、Ｈｌ  ＮＣ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／ＢｒｉもしくはＢ／Ｆｌｏのものであり得る。いくつかの実施形態において、ＳＰは、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質、狂犬病Ｇタンパク質、ＶＺＶ糖タンパク質Ｅ、ＳＡＲＳ糖タンパク質ＳまたはＥｂｏｌｏａウイルスエンベロープ糖タンパク質のものであり得る。
【００８４】
シグナルペプチドは非生来のもの、例えば、タンパク質、ウイルス性タンパク質、ウイルス三量体表面タンパク質もしくはウイルス三量体表面タンパク質以外のウイルスの赤血球凝集素、または植物、動物もしくは細菌のポリペプチドからのものであり得る。使用することができるシグナルペプチドの非限定例は、アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ  ＳＰ；アクセッション番号Ｚ１１４９９のヌクレオチド３２〜１０３）のものである。
【００８５】
したがって、本発明は、生来または非生来のシグナルペプチドを含むキメラのウイルスタンパク質、およびかかるキメラのウイルスタンパク質をコードする核酸を提供する。
【００８６】
発現されたキメラのウイルスタンパク質の正確な折り畳みは、いくつかある特徴の中でも、タンパク質の安定性、多量体の形成、ＶＬＰの形成、キメラのウイルスタンパク質の機能、および抗体によるキメラのウイルスタンパク質の認識に重要であろう。タンパク質の折り畳みおよび蓄積は、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内の密集度、細胞コンパートメント中のｐＨ、折り畳まれるか、部分的に折り畳まれるか、もしくは折り畳まれていないタンパク質と結合もしくは一過的に会合するコファクターの利用可能性、１つもしくは複数のシャペロンタンパク質の存在、または同種のものを含むが、これらに限定されない１つまたは複数の因子によって影響を受け得る。
【００８７】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、シャペロンタンパク質の例であり、それは、タンパク質合成、細胞内トラフィッキング、誤った折り畳みの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の集合および脱集合、タンパク質の折り畳みならびにタンパク質脱凝集を含む様々な細胞のプロセス中に参加し得る。かかるシャペロンタンパク質の例は、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、サイクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシンおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含むが、これらに限定されない（例えば、Ｍａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓ．２５：５９−７０．１９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．＆  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照されたい）。本明細書において記載されるように、シャペロンタンパク質（例えばＨｓｐ４０およびＨｓｐ７０であるがこれらに限定されない）を使用して、キメラのウイルスタンパク質の折り畳みを保証することができる。
【００８８】
Ｈｓｐ７０の例は、哺乳類細胞からのＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特に癩菌、結核菌およびウシ結核菌（カルメット・ゲラン桿菌等：本明細書においてＨｓｐ７１と称される）等のマイコバクテリアからのＤｎａＫを含む。大腸菌、酵母および他の原核生物からのＤｎａＫ、および真核生物（シロイヌナズナ等）からのＢｉＰおよびＧｒｐ７８（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ６：２０１−２０８）。Ｈｓｐ７０の特定の例はシロイヌナズナＨｓｐ７０である（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号：ＡＹ１２０７４７．１によってコードされる）。Ｈｓｐ７０は折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに加えてＡＴＰも特異的に結合することができ、それによってタンパク質複合体の集合および脱集合に加えてタンパク質を折り畳むことおよび折り畳みをほどくことにも参加する。
【００８９】
Ｈｓｐ４０の例は、大腸菌およびマイコバクテリア等の原核生物からのＤｎａＪならびにアルファルファ等の真核生物からのＨＳＪ１、ＨＤＪ１およびＨｓｐ４０を含む（Ｆｒｕｇｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：３９７−４０８）。Ｈｓｐ４０の特定の例はアルファルファＭｓＪ１（Ｇｅｎｂａｎｋ参照番号：ＡＪ０００９９５．１）である。Ｈｓｐ４０は、他の細胞活性の中でも、タンパク質の折り畳み、熱耐性およびＤＮＡ複製における分子的シャペロンとしての役割を果たす。
【００９０】
Ｈｓｐｓ中でもＨｓｐ７０およびコシャペロン（Ｈｓｐ４０）は、合成が完了する前に、翻訳中のポリペプチドおよび新しく合成されたポリペプチドの安定化に関与する。理論により束縛されることは意図しないが、Ｈｓｐ４０は、折り畳まれていない（新生のまたは新しく移行させられた）ポリペプチドの疎水性パッチへ結合し、したがってＨｓｐ７０−ＡＴＰ複合体がポリペプチドと相互作用することを促進する。ＡＴＰ加水分解は、ポリペプチドとＨｓｐ７０とＡＤＰとの間の安定した複合体の形成ならびにＨｓｐ４０の放出を引き起こす。Ｈｓｐ７０−ＡＤＰ複合体がポリペプチドの疎水性パッチと会合することは、他の疎水性パッチとの相互作用を防止し、不正確な折り畳みおよび他のタンパク質との凝集の形成を防止する（Ｈａｒｔｌ，ＦＵ．１９９６．Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：５７１−５７９中で概説される）。
【００９１】
生来のシャペロンタンパク質は低レベルの組換えタンパク質の正確な折り畳みを促進することができるが、発現レベルが増加するにつれて、生来のシャペロンの存在量が限定因子になり得る。アグロインフィルトレーションした葉におけるキメラのウイルスタンパク質の高レベルの発現は、サイトゾル中でキメラのウイルスタンパク質の蓄積を引き起こし、１つまたは複数のシャペロンタンパク質（Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ４０またはＨｓｐ７０およびＨｓｐ４０の両方等）の共発現は、誤って折り畳まれたタンパク質または凝集したタンパク質のレベルを低下させ、ウイルス様粒子の形成を可能にする三次構造および四次構造の特性を示すタンパク質の数を増加させることができる。
【００９２】
したがって、本発明は、キメラのウイルスタンパク質をコードする第１の核酸が、シャペロンをコードする第２の核酸と共発現される、キメラのウイルスタンパク質ＶＬＰを植物において産生する方法も提供する。第１および第２の核酸は同じ工程で植物へ導入することができるか、または植物へ連続して導入することができる
【００９３】
本発明に従うウイルス由来タンパク質から産生されたキメラのＶＬＰは、ウイルス性マトリックスまたはコアタンパク質を含まない。ウイルス性マトリックスタンパク質はビリオン構造を組織化し維持するタンパク質である。ウイルス性マトリックスタンパク質は通常細胞膜と直接相互作用し、出芽プロセスに関与することができる。ウイルス性コアタンパク質は、ヌクレオカプシドの一部を構成し、典型的にはウイルス性核酸と直接会合するタンパク質である。ウイルス性マトリックスタンパク質またはコアタンパク質の例は、インフルエンザのＭ１タンパク質、ＲＳＶのＭタンパク質およびレトロウイルスのｇａｇタンパク質である。Ｍ１タンパク質はＶＬＰ調製の混入物であるＲＮＡに結合することが公知である（Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ  Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｇ．Ｇ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ  １１：８５６９−８５８０，１９８９）。キメラのＶＬＰ産物のための規制認可を得る場合ＲＮＡの存在は所望されず、したがってＲＮＡを欠くキメラのＶＬＰ調製は有利だろう。
【００９４】
本出願における「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」という用語の使用は、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡおよびＲＮＡの両方のいずれかからなる遺伝子のタンパク質コーディング領域の常にではないが典型的には上流の核酸の一部を表わすことを意味する。調節領域が活性があり、対象となる遺伝子と作動可能に会合または作動可能に連結されている場合に、これは対象となる遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介することができるか、または発生過程でまたは時間的に遺伝子活性化を制御することができるだろう。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基本プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外的な刺激に応答して誘導可能なエレメント、負の調節エレメント等のプロモーター活性を媒介するエレメント、または転写エンハンサーを含むことができる。本明細書において使用される時、「調節領域」は、転写後に活性のあるエレメント、例えば遺伝子発現を調整する調節エレメント（翻訳および転写エンハンサー、翻訳および転写リプレッサー、上流活性化配列ならびにｍＲＮＡ不安定デターミナント等）も含むことができる。これらの後者エレメントのいくつかのものは、コーディング領域に対して近位に位置することができる。
【００９５】
本開示のコンテキストにおいて、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、典型的には構造遺伝子のコード配列に対して常にではないが通常は上流（５’）のＤＮＡの配列を指し、それはＲＮＡポリメラーゼおよび／または転写を特定の部位で開始するのに必要とされる他の因子のための認識の提供によって、コーディング領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内または配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も、対象となるコーディング領域の発現の調節に寄与し得ることを理解すべきである。ＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供して特定の部位での開始を保証する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。すべてではないが大部分の真核生物プロモーターエレメントはＴＡＴＡボックス（通常は転写開始部位の約２５塩基対上流にあるアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基ペアからなる保存された核酸配列）を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基本プロモーターエレメントに加えて、遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント（上でリストされるような）を含む。
【００９６】
発生的に調節されるもの、誘導可能なもの、または構成的なものを含む複数のタイプの調節領域がある。発生的に調節される調節領域、またはその制御下の遺伝子の差異的発現を制御する調節領域は、特定の器官または器官の組織内でその器官または組織の発生の間の特異的な時間に活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は特異的な発生段階で特定の器官または組織内で優先的に活性があってもよく、それらは発生的に調節される様式で、または植物内の他の器官または組織において基底レベルで同様に活性があってもよい。組織特異的調節領域の例は、例えばナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む特異的な調節領域を参照されたい（Ｒａｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５２：５９５−５９９；Ｂｉｌｏｄｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：１２５−１３０）。葉特異的プロモーターの例はプラストシアニンプロモーターを含む（ＵＳ７１２５９７８を参照されたい、これは参照として本明細書に援用される）。
【００９７】
誘導可能調節領域は、誘導物質に応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。誘導物質の非存在下においてＤＮＡ配列または遺伝子は転写されないだろう。典型的には、誘導可能調節領域へ特異的に結合して転写を活性化するタンパク質因子は不活性形態で存在することができ、次いでそれは誘導物質によって直接または間接的に活性形態に転換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。誘導物質は、化学的薬剤（タンパク質、代謝物質、増殖調節物質、除草剤またはフェノール化合物等）、または熱、低温、塩もしくは有毒物質によって直接的にまたは病原体もしくは病因物質（ウイルス等）の作用を介して間接的に課された生理的ストレスであり得る。誘導可能調節領域を含有している植物細胞は、噴霧、散水、加熱または類似の方法等によって細胞または植物へ誘導物質を外部から適用することによって、誘導物質に対して曝露され得る。誘導可能調節エレメントは植物または非植物遺伝子のいずれかに由来し得る（例えばＧａｔｚ，Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｎｋ，ＬＲ．Ｐ．，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．３，３５２−３５８；参照として援用される）。可能性のある誘導可能プロモーターの例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Ｇａｔｚ，Ｃ．，１９９７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，８９−１０８；参照として援用される）、ステロイド誘導可能プロモーター（Ａｏｙａｍａ．Ｔ．ａｎｄ  Ｃｈｕａ，Ｎ．Ｈ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  １．２，３９７−４０４；参照として援用される）およびエタノール誘導可能プロモーター（Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６，１２７−１３２；Ｃａｄｄｉｃｋ，ＭＸ，ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６，１７７−１８０、参照として援用される）サイトカイニン誘導可能ＩＢ６およびＣＫＩ１遺伝子（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｋ．ｉｅｂｅｒ，Ｕ  ．，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０，１００９−１０１９；Ｋａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９８２−９８５；参照として援用される）およびオーキシン誘導可能エレメント、ＤＲ５（Ｕｌｍａｓｏｖ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ９，１９６３−１９７１；参照として援用される）を含むがこれらに限定されない。
【００９８】
構成的調節領域は、植物の様々な部分を通しておよび植物発生を通して連続的に遺伝子の発現を導く。公知の構成的調節エレメントの例は、ＣａＭＶ  ３５Ｓ転写物（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２）、コメアクチン１（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，３：１１５５−１１６５）、またはｔｍｓ２（米国５，４２８，１４７、参照として本明細書に援用される）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１（Ｘｕ  ｅｔ．ａｌ．，１９９４，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６：４５９−４６７）遺伝子、トウモロコシユビキチン１遺伝子（Ｃｏｒｎｅｊｏ  ｅｔ  ａｉ，１９９３，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、シロイヌナズナユビキチン１および６遺伝子（Ｈｏｌｔｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：６３７−６４６）、およびタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：９９５−１００４）と結び付いているプロモーターを含む。
【００９９】
本明細書において使用される時、「構成的」という用語は、必ずしも構成的調節領域の制御下の遺伝子がすべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現されることを示さないが、たとえ存在量の変動が多くの場合観察されても、遺伝子が広範囲の細胞タイプで発現されることを示す。構成的調節エレメントを他の配列とカップルさせて、それらが作動可能に連結されるヌクレオチド配列の転写および／または翻訳をさらに促進することができる。例えば、ＣＰＭＶ−ＨＴシステムはササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）の非翻訳領域に由来し、結び付いているコード配列の増強された翻訳を実証する。「生来の」によって、核酸またはアミノ酸配列が天然に存在するか、または「野生型」であることが意味される。「作動可能に連結された」によって、特定の配列（例えば対象となる調節エレメントおよびコーディング領域）が直接または間接的に相互に作用して意図された機能（遺伝子発現の媒介または調整等）を実行することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介され得る。
【０１００】
キメラのタンパク質またはポリペプチドは、ウイルスベースのＤＮＡまたはＲＮＡの発現システム、例えばコモウイルスベースの発現カセットおよびジェミニウイルスベースの増幅エレメントであるが、これらに限定されないものを含む発現システムにおいて発現させることができる。
【０１０１】
本明細書において記述されるような発現システムは、２分節ウイルスベースの発現カセットまたは２分節ゲノムを持つウイルスを含み得る。例えば、２分節ウイルスはＣｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ（コモウイルス）科であり得る。Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ科の属は、Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ（コモウイルス）、Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ（ネポウイルス）、Ｆａｂａｖｉｒｕｓ（ファバウイルス）、Ｃｈｅｒａｖｉｒｕｓ（チェラウイルス）およびＳａｄｗａｖｉｒｕｓ（サドワウイルス）を含む。コモウイルスは、ササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）、ササゲシビアモザイクウイルス（ＣＰＳＭＶ）、西洋カボチャモザイクウイルス（ＳｑＭＶ）、アカクローバ斑紋ウイルス（ＲＣＭＶ）、マメサヤ斑紋ウイルス（ＢＰＭＶ）、カブリングスポットウイルス（ＴｕＲＳＶ）、ソラマメトゥルーモザイクウイルス（ＢＢｔＭＶ）、ソラマメステインウイルス（ＢＢＳＶ）、ダイコンモザイクウイルス（ＲａＭＶ）を含む。本発明の様々な態様に有用であり得るエンハンサーエレメントを含むコモウイルスＲＮＡ−２配列の例は、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３５５０）、ＲＣＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３７３８）、ＢＰＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３４９５）、ＣＰＳＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３５４４）、ＳｑＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３８００）、ＴｕＲＳＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０１３２１９．１）ＢＢｔＭＶ  ＲＮＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ８１０９０４）、ＢＢＳＶ  ＲＮＡ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ０２８６５０）、ＲａＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３８００）を含むが、これらに限定されない。
【０１０２】
２分節コモウイルスのＲＮＡゲノムのセグメントはＲＮＡ−１およびＲＮＡ−２と称される。ＲＮＡ−１は複製に関与するタンパク質をコードし、一方ＲＮＡ−２は細胞間移動のために必要なタンパク質および２つのカプシドタンパク質をコードする。使用することができる任意の好適なコモウイルスベースのカセットは、ＣＰＭＶ、ＣＰＳＭＶ、ＳｑＭＶ、ＲＣＭＶまたはＢＰＭＶを含み、例えば、発現カセットはＣＰＭＶベースである。
【０１０３】
「発現カセット」は、適切なプロモーターまたは宿主細胞において対象となる核酸の転写のための他の調節エレメントの制御下で、それに作動できるように（または作動可能に）連結された対象となる核酸を含むヌクレオチド配列を指す。
【０１０４】
発現システムは、ジェミニウイルスからの増幅エレメント（例えばマメ黄化矮小ウイルス（ＢｅＹＤＶ）からの増幅エレメント）も含むことができる。ＢｅＹＤＶは双子葉植物に適合したＭａｓｔｒｅｖｉｒｕｓｅｓ（マストレウイルス）属に属する。ＢｅＹＤＶは１分節で単一ストランド環状ＤＮＡゲノムを有し、ローリングサークル機構によって非常に高いコピー数まで複製することができる。ＢｅＹＤＶ由来ＤＮＡレプリコンベクターシステムは、植物で迅速な高収率のタンパク質産生のために使用されている。
【０１０５】
本明細書において使用される時、「増幅エレメント」という語句は、ジェミニウイルスゲノムの１つまたは複数の長い遺伝子間領域（ＬＩＲ）の少なくとも一部を含む核酸セグメントを指す。本明細書において使用される時、「長い遺伝子間領域」は、ジェミニウイルスｒｅｐタンパク質による切り出しおよび複製を媒介することができるｒｅｐ結合部位を含有する長い遺伝子間領域の領域を指す。いくつかの態様において、１つまたは複数のＬＩＲを含む核酸セグメントは、ジェミニウイルスゲノムの短い遺伝子間領域（ＳＩＲ）をさらに含むことができる。本明細書において使用される時、「短い遺伝子間領域」は相補的ストランド（Ｍａｓｔｒｅｖｉｒｕｓｅｓ属の短いＩＲ（ＳＩＲ））を指す。任意の好適なジェミニウイルス由来の増幅エレメントを本明細書において使用することができる。例えば、ＷＯ２０００／２０５５７；ＷＯ２０１０／０２５２８５；Ｚｈａｎｇ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９３，２７１−２７９）、Ｈｕａｎｇ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０３，７０６−７１４）、Ｈｕａｎｇ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．１０６，９−１７）；（これらは参照として本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１０６】
キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドはキメラのヌクレオチド配列からの転写物として産生することができ、キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドは合成後に切断され、必要に応じて会合して多量体タンパク質を形成する。したがって、キメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドは、ジスルフィド架橋によって会合するサブユニットからなるタンパク質またはポリペプチド（すなわち多量体タンパク質）も含む。例えば、２つまたはそれ以上のソースからのアミノ酸配列を含むキメラのポリペプチドは、サブユニットへとプロセシングされ、サブユニットはジスルフィド架橋によって会合されてキメラのタンパク質またはキメラのポリペプチドを産生することができる。
【０１０７】
本発明の様々な実施形態に記載のキメラのウイルスタンパク質は、インフルエンザＨＡからの膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ／ＣＴ）を含む。ＴＭ／ＣＴは、例えばＢ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６タイプまたはサブタイプを含む、インフルエンザウイルスの任意のタイプ、サブタイプからの生来のＨＡ  ＴＭ／ＣＴであり得る。Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５またはＢタイプまたはサブタイプの非限定例は、Ａ／ニューカレドニア／２０／９９サブタイプ（Ｈ１Ｎ１）、Ｈ１  Ａ／カリフォルニア／０４／０９サブタイプ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／インドネシア／５／０５サブタイプ（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ブリズベーン／５９／２００７、Ｂ／フロリダ／４／２００６およびＨ３  Ａ／ブリズベーン／１０／２００７を含む（例えばＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ  ２００９／０７６７７８；ＷＯ  ２０１０／００３２２５；ＷＯ  ２０１０／００３２３５を参照されたい、これらは参照として本明細書に援用される）。さらに、ＴＭ／ＣＴは、１、２、３、４もしくは５アミノ酸が欠失されるか、または１、２、３、４もしくは５アミノ酸の任意の種類のスペーサーまたはリンカー配列が添加されたこれらＨＡ  ＴＭ／ＣＴのいずれかであり得る。
【０１０８】
好ましくは、ＴＭ／ＣＴはＨ５またはＨ３からのものであり、例えば、Ａ／インドネシア／５／０５サブタイプ（Ｈ５Ｎ１；「Ｈ５／Ｉｎｄｏ」；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＷ０６１０８．１）、Ｈ５  Ａ／ベトナム／１１９４／２００４（Ａベトナム；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＲ４８８７４．１）、Ｈ５  Ａアンホイ／１／２００５（Ａアンホイ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ２８１８０．１）；Ｈ３、ブリズベーン／１０／２００７（「Ｈ３／Ｂｒｉ」；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＩ２６３１８．１）、Ｈ３  Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ａ−ＷＣＮ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＯ３７５９９．１）であるが、これらに限定されない。複数のＨ３およびＨ５のＴＭ／ＣＴ境界の配列はＷＯ２０１０／１４８５１１（参照として本明細書に援用される）中に記述される。ＴＭ／ＣＴのためのアミノ酸配列の非限定例は、配列番号：４１および４２ならびに配列番号：４１または４２のアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を含む。
【０１０９】
アミノ酸変動はインフルエンザウイルスの赤血球凝集素において許容される。かかる変動は継続的に同定されている新しい株を提供する。新しい株間の伝染力は変動し得る。しかしながら、赤血球凝集素三量体の形成（それは続いてＶＬＰを形成する）は維持される。したがって、本発明は、植物においてＶＬＰを形成する、赤血球凝集素アミノ酸配列を含むキメラのウイルスタンパク質、または赤血球凝集素アミノ酸配列を含むキメラのウイルスタンパク質をコードする核酸を提供し、公知の配列および発生し得るバリアントＨＡ配列を含む。
【０１１０】
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、または「ウイルス様粒子（複数）」または、「ＶＬＰ（複数）」という用語は、自己集合し、キメラのウイルスタンパク質等の構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰおよびキメラのＶＬＰは、一般的には感染で産生されるビリオンに形態学的および抗原性的に類似するが、複製するための十分な遺伝情報を欠き、したがって非感染性である。ＶＬＰおよびキメラのＶＬＰは植物宿主細胞を含む好適な宿主細胞において産生され得る。宿主細胞からの抽出後ならびに好適な条件下での単離およびさらなる精製に際して、ＶＬＰおよびキメラのＶＬＰはインタクトな構造として精製することができる。
【０１１１】
本発明のキメラのＶＬＰは、タンパク質をシアル化する能力を欠くことによって特徴づけられる宿主細胞において産生することができ、それらは例えば、植物細胞、昆虫細胞、菌類、および他の生物（海綿、腔腸動物、環形動物、節足動物、軟体動物、線形動物、輪形動物、扁形動物、毛顎動物、触手動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、古細菌、または同種のものを含む）である。例えば、Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：３７０−３７２；Ｔｏｕｋａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５：Ｄ２８０−Ｄ２８６；Ｎａｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：Ｄ３６８−Ｄ３７１を参照されたい。
【０１１２】
本発明は、キメラのＶＬＰが発現される細胞の原形質膜からの脂質エンベロープを得るキメラのＶＬＰも提供する。例えば、キメラのウイルスが植物ベースのシステムにおいて発現されるならば、生じたキメラのＶＬＰは植物細胞の原形質膜からの脂質エンベロープを得ることができる。
【０１１３】
一般的には、「脂質」という用語は脂溶性（親油性）の天然に存在する分子を指す。本発明のいくつかの態様に記載の植物において産生されるキメラのＶＬＰは、植物由来脂質と複合体化することができる。植物由来脂質は、脂質二重層の形態であり、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含むことができる。植物由来脂質はＶＬＰが産生される植物の原形質膜の脂質成分を含むことができ、リン脂質、トリグリセリド、ジグリセリドおよびモノグリセリドに加えて、脂溶性ステロールまたはステロールを含む代謝物質を含む。例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、グリコスフィンゴリピド、植物ステロールまたはその組み合わせを含む。植物由来脂質は、代わりに「植物脂質」と称することができる。植物ステロールの例は、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、δ−７−スチグマステロール、δ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはβ−シトステロールを含む（例えばＭｏｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照されたい）。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、培養または細胞もしくは生物の増殖条件、または細胞が得られる種に応じて変動し得る。一般的には、β−シトステロールは最も豊富な植物ステロールである。
【０１１４】
細胞膜は、一般的には様々な機能のためのタンパク質と同様に脂質二重層を含む。特定の脂質の局在化した濃縮は脂質二重層において見出すことができ、「脂質ラフト」と称される。これらの脂質ラフトミクロドメインではスフィンゴ脂質およびステロールが濃縮され得る。理論により束縛されることは意図しないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の病原菌の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞または生物の他の構造成分（細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックス等）との相互作用において重要な役割を有することができる。
【０１１５】
植物内で産生されたＶＬＰは、植物特異的Ｎ−グリカンを含むキメラのウイルスタンパク質を誘導することができる。したがって、本発明は植物特異的Ｎ−グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を含むＶＬＰも提供する。
【０１１６】
さらに、植物におけるＮ−グリカンの修飾は公知であり（例えば米国の６０／９４４，３４４を参照されたい；参照として本明細書に援用される）、修飾されたＮ−グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を産生することができる。修飾された糖鎖付加パターンを含む、例えばフコシル化、キシロシル化、もしくはフコシル化およびキシロシル化の両方が減少したＮ−グリカンを持つキメラのウイルスタンパク質を得ることができるか、またはタンパク質がフコシル化、キシロシル化もしくはその両方を欠き、増加したガラクトシル化を含む、修飾された糖鎖付加パターンを有するキメラのウイルスタンパク質を得ることができる。さらに、翻訳後修飾の調整（例えば末端ガラクトースの添加）は、キメラのウイルスタンパク質を発現する野生型植物に比較した場合、発現されたキメラのウイルスタンパク質のフコシル化およびキシロシル化の減少をもたらし得る。
【０１１７】
例えば、限定すると判断すべきではないが、修飾された糖鎖付加パターンを有するキメラのウイルスタンパク質の合成は、β−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）をコードするヌクレオチド配列と共にキメラのウイルスタンパク質を共発現することによって達成することができ、例えば哺乳類ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴ、しかしながら他のソースからのＧａｌＴも使用することができるがこれらに限定されない。ＧａｌＴの触媒ドメインをＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（すなわち細胞質尾部、膜貫通ドメイン、ステム領域）へ融合して、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を産生することもでき、ハイブリッド酵素はキメラのウイルスタンパク質と共発現させることができる。キメラのウイルスタンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）をコードするヌクレオチド配列とも共に共発現することができ、例えば哺乳類ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩ、他のソースからのＧａｌＴも使用することができるがこれらに限定されない。加えて、ＧｎＴ−ＩＩＩへ融合したＧＮＴ１のＣＴＳを含むＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素も使用することができる。
【０１１８】
したがって、本発明は修飾されたＮ−グリカンを有するキメラのウイルスタンパク質を含むＶＬＰも提供する。
【０１１９】
理論により束縛されることは意図しないが、キメラのウイルスタンパク質上の植物Ｎ−グリカンの存在は、抗原提示細胞によるキメラのウイルスタンパク質の結合を促進することによって、免疫反応を刺激することができる。植物のＮグリカンを使用する免疫反応の刺激はＳａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）によって提唱されている。さらに、ＶＬＰの立体配座は抗原の提示のために有利であり、植物由来脂質層と複合体化された場合ＶＬＰのアジュバント効果を促進することができる。
【０１２０】
ＶＬＰは、例えば赤血球凝集分析、電子顕微鏡検査、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、構造およびサイズについて査定され得る。
【０１２１】
サイズ排除クロマトグラフィーのために、全可溶性タンパク質は、凍結破砕された植物材料のサンプルを抽出バッファー中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって植物組織から抽出することができ、不溶性物質は遠心分離によって除去される。氷冷アセトンまたはＰＥＧによる沈殿も有益であり得る。可溶性タンパク質は定量化され、抽出物はＳｅｐｈａｃｒｙｌ（ＴＭ）カラム（例えばＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ５００カラム）を通して通過させる。ブルーデキストラン２０００をキャリブレーションスタンダードとして使用することができる。クロマトグラフィー後に、画分をイムノブロットによってさらに解析して、画分のタンパク質補体を決定することができる。
【０１２２】
分離された画分は、例えば上清（遠心分離、沈降、または沈殿されたならば）または濾液（濾過されたならば）であり得、タンパク質または上位構造タンパク質（例えばロゼット様構造等）またはより高次のおよびより高分子量の粒子（ＶＬＰ等）について濃縮されている。分離された画分をさらにプロセシングして、例えば追加の遠心分離工程、沈殿、クロマトグラフィー工程（例えばサイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過またはその組み合わせによって、タンパク質または上位構造のタンパク質の単離、精製、濃縮、またはその組み合わせを行なう。精製されたタンパク質または上位構造タンパク質の存在は、例えば未変性ＰＡＧＥもしくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適切な検出抗体を使用するウエスタン分析、キャピラリー電気泳動、電子顕微鏡検査または当業者に明らかな他の方法によって確認することができる。
【０１２３】
溶出プロフィールは使用される溶出条件に応じて変動させることができる。図７、８Ｏおよび１１Ｂは、キメラのＶＬＰを含む植物抽出物のサイズ排除クロマトグラフィー分析の溶出プロフィールの一例を示す。この事例において、キメラのＨＩＶ、キメラの狂犬病ＧおよびキメラのＶＺＶウイルス三量体表面タンパク質を含むＶＬＰは、カラムの空隙体積中に溶出し、ロゼット構造および高分子量構造はおよそ画分１３〜１４に溶出し、より低分子量のものまたはキメラのウイルス三量体表面タンパク質の可溶性形態はおよそ１５〜およそ１７の画分中に溶出する。
【０１２４】
ＶＬＰは任意の好適な方法（例えば化学的抽出または生化学的抽出）を使用して、精製または抽出することができる。ＶＬＰは、乾燥、熱、ｐＨ、界面活性剤およびデタージェントに対して比較的感受性が高い。したがって、収率を最大にし、細胞タンパク質によるＶＬＰ画分の汚染を最小限にし、タンパク質またはＶＬＰおよび必要に応じて会合した脂質エンベロープまたは膜の完全性を維持する方法、細胞壁を緩めてタンパク質またはＶＬＰを放出する方法を使用することが有用であろう。例えば、プロトプラストおよび／またはスフェロプラストを産生する方法を使用して（例えばＷＯ２０１１／０３５４２２を参照、参照として本明細書に援用される）、本明細書において記述されるようなＶＬＰを得ることができる。デタージェントまたは界面活性剤（例えばＳＤＳまたはトリトンＸ−１００等）の使用を最小限にするかまたは取り除くことは、ＶＬＰ抽出の収率の改善のために有益であろう。次いで、ＶＬＰは、例えば電子顕微鏡またはサイズ排除クロマトグラフィーによって構造およびサイズについて上記のように査定することができる。
【０１２５】
本発明の１つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、本発明のヌクレオチド配列またはコンストラクトまたはベクターによって形質転換された任意の好適な植物宿主において発現させることができる。好適な宿主の例は、アルファルファ、キャノーラ、Ｅｒａｓｓｉｃａ属の種、トウモロコシ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属の種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、カラスムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、コットン、および同種のものを含む農作物を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明の１つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルおよびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へポリアデニル酸トラックの添加をもたらすことで特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルの変動は稀ではないが、一般的には基準型５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって認識される。好適な３’領域の非限定例は、アグロバクテリウム腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子（ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子等）、植物遺伝子（ダイズ貯蔵タンパク質遺伝子等）、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；米国４，９６２，０２８；参照として本明細書に援用される）、プラストシアニン発現の調節において使用されるプロモーター（参照として本明細書に援用されるＵＳ７，１２５，９７８中で記述される）のポリアデニル化シグナルを含有する３’の転写される非翻訳領域である。
【０１２７】
本発明の１つまたは複数のキメラの遺伝的コンストラクトは、さらなるエンハンサー（翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれか）も必要に応じて含むことができる。エンハンサーは転写されている配列に対して５’または３’に位置することができる。エンハンサー領域は当業者へ周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列または同種のものを含んでもよい。開始コドンは、存在するならば、コード配列のリーディングフレームと同位相（「インフレーム」）であって、転写配列の正確な翻訳を提供することができる。
【０１２８】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、微小注射、電気穿孔などを使用して、植物細胞の中へ導入することができる。かかる技法の総説については、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＶＩＩＩ、４２１〜４６３ページ（１９８８）；Ｇｅｉｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｅｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８８）；およびＭｉｋｉ  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、第２版ＤＴ．Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨ  Ｔｕｒｐｉｎ，ＤＤ  Ｌｅｆｅｂｒｖｅ，ＤＢ  Ｌａｙｚｅｌｌ（編）、Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ  Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ、５６１〜５７９ページ（１９９７）を参照されたい。他の方法は、直接的ＤＮＡ取り込み（リポソーム、電気穿孔の使用）、例えばプロトプラスト、顕微注入、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、およびバキュームインフィルトレーションの使用をを含む。例えば、Ｂｉｌａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  １００：２４７−２５０，１９９１）、Ｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２，１９９１）、Ｇｕｅｒｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５２：１１１−１１６，１９８７）、Ｎｅｕｈａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．７５：３０−３６，１９８７）、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７）；Ｈｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８：１２６５，１９８０）、Ｈｏｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１，１９８５）、  ＤｅＢｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９１：６９４−７０１，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｃｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、１９８９）、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ，１０５：３４３−３４８，２００２）、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；および第５，１００，７９２号、米国特許出願第０８／４３８，６６６号（１９９５年５月１０日に出願）および第０７／９５１，７１５号（１９９２年９月２５日に出願）（その全ては参照として本明細書に援用される）を参照されたい。
【０１２９】
以下に記述されるように、一過性発現方法を使用して本発明のコンストラクトを発現させることができる（Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０５：３４３−３４８を参照；参照として本明細書に援用される）。あるいは、Ｋａｐｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参照として本明細書に援用される）によって記述されるような真空ベースの一過性発現方法を使用することができる。これらの方法は、例えばアグロ−イノキュレーションまたはアグロ−インフィルトレーション、シリンジインフィルトレーションの方法を含み得るが、これらに限定されない。しかしながら、上で指摘されるように、他の一過性方法も使用することができる。アグロ−イノキュレーション、アグロ−インフィルトレーション、またはシリンジインフィルトレーションにより、所望される核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）または植物全体の細胞間隙に侵入する。表皮を通過した後、アグロバクテリアは感染し、細胞の中へｔ−ＤＮＡコピーを移行させる。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染細胞中で対象となるタンパク質の産生を引き起こすが、核の内部へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
【０１３０】
形質転換した植物細胞の同定を支援するために、本発明のコンストラクトをさらに操作して植物選択マーカーを含めることができる。有用な選択マーカーは、抗生物質（例えばゲンタマイシンおよびハイグロマイシン、カナマイシン）または除草剤（ホスフィノトリシン、グリホサート、クロロスルフロン等）および同種のもの等の化学薬品に対する抵抗性を提供する酵素を含む。同様に、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）等の色変化またはルシフェラーゼまたはＧＦＰ等の発光によって識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用することができる。
【０１３１】
本発明がさらに考慮する部分は、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、植物細胞または種子である。植物細胞から植物全体を再生する方法も当該技術分野において公知である。一般に、形質転換された植物細胞は適切な培地（抗生物質等の選択的薬剤を含有し得る）中で培養され、選択マーカーを使用して形質転換された植物細胞の同定を促進する。いったんカルスが形成されたなら、芽形成は公知の方法に従って適切な植物ホルモンを用いることによって促進することができ、芽は植物の再生のための発根培地へ移される。次いで、植物は、種子または栄養繁殖技法の使用のいずれかから反復世代を確立するのに使用することができる。トランスジェニック植物は組織培養を使用せずに生成することもできる。
【０１３２】
本発明は以下のヌクレオチド配列を含む。
表１。配列番号のリスト。
【表１】
0006038041.tif 000002
0006038041.tif 000003
【０１３３】
本発明は以下の実施例においてさらに示されるだろう。
実施例
コンストラクト
表２：ＨＩＶタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト
【表２】
0006038041.tif 000004
表３：狂犬病ウイルスタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト
【表３】
0006038041.tif 000005
表４：ＶＺＶタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト
【表４】
0006038041.tif 000006
表５：ＳＡＲＳタンパク質をコードする配列を含むコンストラクト
【表５】
0006038041.tif 000007
【０１３４】
実施例１：ＨＩＶタンパク質を持つ発現カセットの組立て
２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ−ＮＯＳ（コンストラクト番号９９５）
【０１３５】
生来の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を持つＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩへ融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。最初に、生来のシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ遺伝子の核酸配列は、Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３５３：２６８−２８２）中で開示された配列に従ってＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成された。ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩの核酸配列は図１Ａ中で提示される（配列番号：１）。アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩＳＰ）（ヌクレオチド３２〜１０３；アクセッション番号Ｚｌ１４９９）のシグナルペプチドを、Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法によってＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩに連結した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、コンストラクト番号５４０（コンストラクト番号５４０の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図５２、配列番号：６１を参照）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＳｐＰＤＩ−ＨＩＶ  ｇｐ１４５．ｒ（図１Ｃ、配列番号：３）を使用して、ＰＤＩＳＰを含有する断片を増幅した。合成されたＣｏｎＳΔＣＦＩセグメント（図１Ａ、配列番号：１）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ＳｐＰＤＩ−ｇｐ１４５．ｃ（図１Ｄ、配列番号：４）およびＷｔｄＴｍ−ｇｐ１４５．ｒ（図１Ｅ、配列番号：５）を使用して、生来のシグナルペプチドなしのＣｏｎＳΔＣＦＩを含有する第２の断片を増幅した。ＰＣＲの第２のラウンドにおいて、テンプレートとしてのＰＣＲの第１のラウンドからの両方のＰＣＲ産物と共に、プライマーＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＷｔｄＴｍ−ｇｐ１４５．ｒ（図１Ｅ、配列番号：５）を使用した。生じたＰＣＲ産物をＡｐａＩ制限酵素により消化し、ＡｐａＩ−ＳｔｕＩにより消化された修飾した９７２のコンストラクトの中へクローン化した。修飾した９７２のアクセプタープラスミド（コンストラクト番号９７２のオリジナルの配列については参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）を処理して、２×３５Ｓプロモーターの上流のＳｂｆＩ制限部位を取り除いた。ＳｂｆＩ部位をＳｂｆＩによるプラスミド９７２の消化によって取り除き、生じたプラスミドをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼにより処理して３’突出を除去し、処理したプラスミドを再ライゲーションして、ＳｂｆＩ部位なしの修飾した９７２のプラスミドを生じた。生じたコンストラクトに番号９９５を与えた（図１Ｆ、配列番号：６）。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩのアミノ酸配列を図１Ｇ中で示す（配列番号：７）。９９５プラスミド表示を図１Ｈ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１３６】
２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ＋Ｈ３  Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（膜貫通ドメイン＋細胞質尾部）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９９７）
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩへならびにＨ３  Ａ／ブリズベーン／１０／２００７の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの中へクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、コンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＩＦ−Ｈ３ｄＴｍ＋ｇｐ１４５．ｒ（図２Ａ、配列番号：８）を使用して、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩを含む断片を増幅した。コンストラクト番号７７６（コンストラクト番号７７６の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図６０、配列番号：６９を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＧｐ１４５＋Ｈ３ｄＴｍ．ｃ（図２Ｂ、配列番号：９）およびＨ３ｄＴｍ．ｒ（図２Ｃ、配列番号：１０）を使用して、Ｈ３  Ａ／ブリズベーン／１０／２００７の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＨ３ｄＴｍ．ｒ（図２Ｃ、配列番号：１０）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第２のＰＣＲの産物をＡｐａＩにより消化し、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化されたコンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号９９７を与えた（図２Ｄ、配列番号：１１）。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ−Ａ／ブリズベーン／１０／２００７  Ｈ３  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図２Ｅ中で示す（配列番号：１２）。９９７プラスミド表示を図２Ｆ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１３７】
２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ−Ｈ５    Ａ／インドネシア／５／２００５（膜貫通ドメイン＋細胞質尾部）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９９９）
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ    ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩへならびにＨ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したアルファルファＰＤＩシグナルペプチドをコードする配列を、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、コンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ｇｐ１４５．ｒ（図３Ａ、配列番号：１３）を使用して、生来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩを含む断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＧｐ１４５＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃ（図３Ｂ、配列番号：１５）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＡｐａＩ−ＳｐＰＤＩ．ｃ（図１Ｂ、配列番号：２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第２のＰＣＲの産物をＡｐａＩにより消化し、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化されたコンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号９９９を与えた（図３Ｄ、配列番号：１６）。ＰＤＩＳＰ−ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩＡ／インドネシア５／２００５のＨ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列。ＴＭ＋ＣＴを図３Ｅ中で示す（配列番号：１７）。９９９プラスミド表示を図３Ｆ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１３８】
プラストシアニン−Ｐ１−プラストシアニン（コンストラクト番号１７２）
トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）からのＰ１９サイレンシングサプレッサーをコードする配列を、アルファルファプラストシアニンプロモーターと３’ＵＴＲおよびターミネーターとの間に以下のようにクローン化した。コンストラクト番号Ｒ４７２（組立てについては参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５Ａ１およびＲ４７２プラスミドの表示についてはＷＯ２０１０／００３２２５Ａ１の図８６を参照）を、制限酵素ＤｒａＩＩＩ（最初のＡＴＧの８４塩基対上流）およびＳａｃＩ（終止コドンの９塩基対下流）により消化して、アルファルファプラストシアニンプロモーターからの８４ｐｂおよびＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーのための配列コーディングを含む断片を取り出した。生じた断片を、事前にＤｒａＩＩＩおよびＳａｃＩにより消化したコンストラクト５４０（組立てについては参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５および５４０プラスミドの表示については同じ特許の図６を参照）の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号１７２を与えた（配列番号：４Ａ、図１８）。ＴＢＳＶ  Ｐ１９タンパク質のアミノ酸配列を図４Ｂ中で提示する（配列番号：１９）。１７２プラスミド表示を図４Ｃ中で示す。
【０１３９】
植物バイオマス、イノキュラムおよびアグロインフィルトレーションの調製
「バイオマス」および「植物物質」という用語は、本明細書において使用される時、植物に由来する任意の材料を反映することを意味する。バイオマスまたは植物物質は、植物全部、組織、細胞またはその任意の画分を含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、細胞内植物コンポーネント、細胞外植物コンポーネント、液体もしくは固体の植物抽出物、またはその組み合わせを含み得る。さらに、バイオマスまたは植物物質は、植物の葉、茎、果実、根またはその組み合わせからの、植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはその組み合わせを含むことができる。植物の一部は植物物質またはバイオマスを含み得る。
【０１４０】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の３週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の３週間温室中に放置して成長させる。
【０１４１】
各々のコンストラクトによりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、０．６〜１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６を補足したＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで２分間置いた。収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて１：１比率で系統ＡＧＬ１／１７２との共インフィルトレーションとして実行された。
【０１４２】
本明細書において記述されるような様々なコンストラクトを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株は、「ＡＧＬ１」接頭語の使用によって参照される。例えば、コンストラクト番号９９５（図１Ｈを参照）を含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓは「ＡＧＬ１／９９５」と称される。
【０１４３】
葉収穫および全タンパク質抽出
インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、３体積の冷５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１４４】
タンパク質分析およびイムノブロット
清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン−２０により４℃で１６〜１８時間、膜をブロッキングした。
【０１４５】
ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で２μｇ／ｍｌに１：２５００で希釈したヤギポリクローナル抗ｇｐ１２０一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１１７９）とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１：１００００で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヤギ二次抗体（ＪＩＲ  ７０５−０３５−１４７）とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）としてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。
【０１４６】
実施例２：生来およびキメラのＨＩＶエンベロープタンパク質の植物における発現
ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩは、短縮された可変的ループ、切断部位の削除、融合ドメインおよびｇｐ４１における免疫優勢領域を備えたコンセンサスＨＩＶグループのＭエンベロープタンパク質である。モルモットにおいて野生型エンベロープタンパク質と類似するか、またはより大きな範囲および力価のクロスサブタイプ中和抗体を誘導することが実証された（Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００６）３５３：２６８−２８２）。
【０１４７】
図５はこの研究において使用されるコンストラクトを示す。コンストラクト番号９９５において、生来のＴＭ／ＣＴを含む成熟ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩ（以下Ｅｎｖと称される）についてのコーディング領域を、ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの制御下に置いた。コンストラクト番号９９７および９９９において、ＨＩＶ  ＥｎｖのＴＭ／ＣＴドメインを、Ａ／ブリズベーン／１０／２００７（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／インドネシア／０５／２００５（Ｈ５Ｎ１）からのインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）のものによってそれぞれ置き換えた。すべての事例において、植物起源のシグナルペプチド（アルファルファタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）タンパク質からのもの）で、生来のＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質シグナルペプチドを置換した。
【０１４８】
コンストラクト９９５、９９７および９９９からのＨＩＶ  Ｅｎｖの産生を、アグロインフィルトレーションしたＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物において比較した。ＡＧＬ１／９９５、ＡＧＬ１／９９７およびＡＧＬ１／９９９によりインフィルトレーションした植物からのタンパク質抽出物をウエスタンブロットによって解析し、結果を図６中で示し、レーン１〜４は様々な量の組換えＨＩＶ−１  ｇｐ１６０（ａｂ６８１７１）を含有する陽性対照；レーン５、陰性対照；レーン６〜８、ＡＧＬｌ／９９５をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質；レーン９および１０、ＡＧＬｌ／９９７をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質；レーン１１および１２、ＡＧＬｌ／９９９をインフィルトレーションした葉から抽出されたタンパク質である。
【０１４９】
図６中で示されるように、検出のために使用した条件において生来のＨＩＶ  Ｅｎｖの発現を検出することができず、植物におけるＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質について以前に報告された非常に低い蓄積レベルが確認される（Ｒｙｂｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：６２０−６３７）。  インフルエンザＨ３（コンストラクト番号９９７）またはＨ５（コンストラクト番号９９９）のものによってＴＭ／ＣＴドメインが置き換えられたＥｎｖのキメラの形態は、生来の形態よりもはるかに高レベルで蓄積された。上で指摘されるように、番号９９７および番号９９９のコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１５０】
実施例３  キメラのＨＩＶ  Ｅｎｖをウイルス様粒子へと集合させる
コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてＶＬＰへと集合させるキメラのＨＩＶ  Ｅｎｖの能力も検討した。ＡＧＬ１／９９７（Ｅｎｖ／Ｈ３）およびＡＧＬ１／９９９（Ｅｎｖ／Ｈ５）からのタンパク質抽出物をゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いてＥｎｖ含有量についてヤギ抗ｇｐ１２０抗体を使用して溶出画分を分析した。図７Ａ中で示されたウエスタンブロットは、ＡＧＬ１／９９９をインフィルトレーションした植物からの抽出物について、溶出画分中のキメラのＥｎｖ／Ｈ５含有量が画分７〜１０においてピークに達することを示し、２００万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。画分７〜１８における相対的タンパク質含有量の検討から、宿主タンパク質の大部分が画分１１〜１８において溶出したことが明らかに示される（図７Ｂ）。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へとＥｎｖ／Ｈ５が集合することを示す。類似の結果がＡＧＬ１／９９７をインフィルトレーションした植物におけるＥｎｖ／Ｈ３について得られた。総合すれば、これらの結果は、キメラのＨＩＶ  Ｅｎｖ／Ｈ５がアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合したことを実証する。これらの結果は、非インフルエンザ抗原へのインフルエンザＨＡのＴＭ／ＣＴドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを集合して放出するのに十分であることも実証する。
【０１５１】
実施例４：狂犬病タンパク質を持つ発現カセットの組立て
Ｃ−２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−狂犬病糖タンパク質Ｇ（ＲａｂＧ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号１０７４；図８Ａ、８Ｈ）。
【０１５２】
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合した狂犬病糖タンパク質Ｇ（ＲａｂＧ）外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおける２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、合成されたＲａｂ  Ｇ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ２０６７０７からのヌクレオチド３３１７〜４８９１に対応する）（図８Ｄ、配列番号：３４）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図８Ｂ、配列番号：３２）およびＲａｂＧ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図８Ｃ、配列番号：３３）を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＲａｂ  Ｇ外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｃ（図８Ｅ、配列番号：３５）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図８Ｂ、配列番号：３２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（融合）クローニングシステムを使用して、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＮＯＳ発現システム中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドと共に、生じた断片をインフレームでクローン化した。コンストラクト１４１（図８Ｆ、８Ｇ）をＳｂｆＩおよびＳｔｕＩ制限酵素により消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組立て反応のために使用した。コンストラクト番号１４１は、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中への対象となる遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはｐＣＡＭＢＩＡベースのプラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図中で８Ｆ示す（配列番号：３６）。ベクター１４１の図式的な表示を図８Ｇ中で示す。生じたコンストラクトに番号１０７４を与えた（図８Ｈ、  配列番号：３７）。ＰＤＩＳＰ−Ｒａｂ  Ｇ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図８Ｉ中で示す（配列番号：３８）。１０７４プラスミド表示を図８Ａ中で示す。このコンストラクトはＭ１タン��ク質をコードしない。
【０１５３】
ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅システムの中のＤ−２×３５Ｓ−ＰＤＩＳＰ−狂犬病糖タンパク質Ｇ（ＲａｂＧ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号１０９４：図８Ｌ、８Ｍ）
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ    ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合した狂犬病糖タンパク質Ｇ（ＲａｂＧ）外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおけるＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ発現システム中の２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳの中へ以下のようにクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、合成されたＲａｂ  Ｇ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ２０６７０７からのヌクレオチド３３１７〜４８９１に対応する）（図８Ｄ、配列番号：３４）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図８Ｂ、配列番号：３２）およびＲａｂＧ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図８Ｃ、配列番号：３３）を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＲａｂ  Ｇ外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｃ（図８Ｅ、配列番号：３５）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ＲａｂＧ−Ｓ２＋４．ｃ（図８Ｂ、配列番号：３２）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して、ＢｅＹＤＶ＋レプリカーゼ増幅システムの中の２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＮＯＳ発現カセット中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドと共に、生じた断片をインフレームでクローン化した。コンストラクト１４４をＳｂｆＩおよびＳｔｕＩ制限酵素により消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組立て反応のために使用した。コンストラクト番号１４４は、  ＢｅＹＤＶ増幅システムの中のＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中への対象となる遺伝子の「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはｐＣＡＭＢＩＡベースのプラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図中で８Ｊ示す（配列番号：３９）。ベクター１４４の図式的な表示を図８Ｋ中で示す。生じたコンストラクトに番号１０９４を与えた（図８Ｌ、配列番号：４０）。ＰＤＩＳＰ−Ｒａｂ  Ｇ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図８Ｉ中で示す（配列番号：３８）。１０９４プラスミド表示を図８Ｍ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１５４】
実施例５：キメラの狂犬病タンパク質の植物における発現
【０１５５】
Ｇタンパク質をＰＤＩ  Ｓｐとの融合で発現させた（コンストラクト１０７１）。コンストラクト１０７４は、ＰＤＩ  ＳｐおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。コンストラクト１０９４は、ＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐ、ＰＤＩ  ＳｐおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。コンストラクト１０９１は、ＰＤＩ  ＳｐおよびＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐとの狂犬病Ｇタンパク質の融合物である。
【０１５６】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の３週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の３週間温室中に放置して成長させる。
【０１５７】
各々のコンストラクト（コンストラクト１０７１、１０７１、１０７４、１０９１および１０９４）によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、０．６〜１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６を補足したＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで２分間置いた。収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて１：１比率で系統ＡＧＬ１／１７２との共インフィルトレーションとして実行された。
【０１５８】
インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、３体積の冷５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１５９】
清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン−２０により４℃で１６〜１８時間、膜をブロッキングした。
【０１６０】
ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中の０．５μｇ／μｌのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＥ−５７９９５一次抗体とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１：１００００で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス（ＪＩＲ、１１５−０３５−１４６）二次抗体とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）としてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。
【０１６１】
図８Ｎ中で示されるように、狂犬病Ｇタンパク質を、ＰＤＩ  Ｓｐ（コンストラクト１０７１）、ＢｅＹＤＶ＋ｒｅｐ（コンストラクト１０９４または１０９１）、Ｈ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメイン（コンストラクト１０７４）またはその組み合わせとの融合で発現させた。
【０１６２】
実施例６：キメラの狂犬病Ｇタンパク質のウイルス様粒子への集合
【０１６３】
コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてＶＬＰへと集合させる狂犬病Ｇタンパク質の能力も検討した。コンストラクト１０７４またはコンストラクト１０９４を使用して形質転換された植物からのタンパク質抽出物を清澄化し、ゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いて狂犬病Ｇ含有量についてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＳＥ−５７９９５一次抗体を使用して溶出画分を分析した。図８Ｏ中で示されたウエスタンブロットは、インフィルトレーションした植物からの抽出物で、コンストラクト１０７４を使用して産生されたタンパク質についての溶出画分中のキメラの狂犬病Ｇ５含有量が画分８〜１４においてピークに達し、コンストラクト１０９４を使用して調製されたタンパク質抽出物については画分８〜１２中で大部分のタンパク質の溶出が分画されることを示し、２００万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へと狂犬病Ｇが集合することを示す。
【０１６４】
図９Ａは、コンストラクト１０７４から発現された精製狂犬病Ｇタンパク質のイムノブロット分析を示す。図９Ｂは、ＶＬＰ形態を示すコンストラクト１０７４の発現に由来する精製狂犬病Ｇタンパク質ＶＬＰの透過電子顕微鏡写真を示す。
【０１６５】
したがって、狂犬病Ｇはアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合した。これらの結果は、非インフルエンザ抗原（狂犬病Ｇ等）へのインフルエンザＨＡのＴＭ／ＣＴドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを集合して放出するのに十分であることも実証する。
【０１６６】
実施例７：ＳＡＲＳ  Ｂ−２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−重症急性呼吸器症候群ウイルス糖タンパク質Ｓ（ＳＡＲＳ  ｇＳ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳを持つ発現カセットの組立て（コンストラクト番号９１６；図１２Ａ、１２Ｆ）
【０１６７】
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したＳＡＲＳ糖タンパク質Ｓ（ＳＡＲＳ  ｇＳ）外部ドメインをコードする配列を、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、合成されたＳＡＲＳ  ｇＳ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２７８７４１．１からのヌクレオチド２１４９２〜２５２５９に対応する；図１２Ｄ、配列番号：２８）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ｗｔＳｐ−ＳＡＲＳｇＳ．ｃ（図１２Ｂ、配列番号：２６）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ＳＡＲＳｇＳ．ｒ（図１２Ｃ、配列番号：２７）を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＲａｂ  Ｇ外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＳＡＲＳｇＳ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃ（図１２Ｅ、配列番号：２９）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ｗｔＳｐ−ＳＡＲＳｇＳ．ｃ（図１２Ｂ、配列番号：２６）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第２のＰＣＲの産物をＡｐａＩおよびＳｔｕＩにより消化し、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化されたコンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号９１６を与えた（図１２Ｆ、配列番号：３０）。ＳＡＲＳ  ｇＳ−Ａ／インドネシア／５／２００５  Ｈ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図１２Ｇ中で示す（配列番号：３１）。９１６プラスミド表示を図１２Ａ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１６８】
実施例８：植物における産生を促進する因子の存在および非存在下でキメラのＳＡＲＳによる発現実験
【０１６９】
野生型シグナルペプチドならびにＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを持つＳＡＲＳ  ｇＳ遺伝子を含むコンストラクト９１６を使用して、ＳＡＲＳタンパク質を発現させた。
【０１７０】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の３週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の３週間温室中に放置して成長させる。
【０１７１】
各々のコンストラクト（コンストラクト９１６）によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、０．６〜１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６を補足したＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで２分間置いた。収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて１：１比率で系統ＡＧＬ１／１７２との共インフィルトレーションとして実行された。
【０１７２】
インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、３体積の冷５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１７３】
清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン−２０により４℃で１６〜１８時間、膜をブロッキングした。
【０１７４】
Ｉｍｇｅｎｅｘの２μｇ／μｌとのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。ＩＭＧ−６９０一次抗体はＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中である。ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１：１００００で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートマウス抗ウサギＩｇＧ（ＪＩＲ、１１５−０３５−１４４）二次抗体とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）としてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。
【０１７５】
図１２Ｈは重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスタンパク質Ｓのタバコにおける発現のイムノブロット分析を示す。コンストラクト９１６（野生型シグナルペプチドならびにＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ膜貫通ドメインおよび細胞質尾部ドメインを持つＳＡＲＳ  ｇＳ遺伝子）の発現が観察される。
【０１７６】
実施例９：ＶＺＶタンパク質を持つ発現カセットの組立て
【０１７７】
Ａ−２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶｇＥ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号９４６）
【０１７８】
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ        ２６：７７−８５  （１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、ＨＩＶ  ＣｏｎＳΔＣＦＩへならびにＨ５        Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したＶＺＶ糖タンパク質Ｅ（ＶＺＶ  ｇＥ）外部ドメインをコードする配列を、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ−ＨＴ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、合成されたＶＺＶ  ｇＥ遺伝子（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＡＹＯ１３７５２．１からのヌクレオチド３４７７〜５３４８に対応する；図１０Ｃ、配列番号：２２）をテンプレートとして使用して、プライマーＩＦ−ｗｔＳｐ−ＶＺＶｇＥ．ｃ（図１０Ａ、配列番号：２０）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ＋ＶＺＶｇＥ．ｒ（図１０Ｂ、配列番号：２１）を使用して、生来のシグナルペプチド、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなしのＶＺＶ  ｇＥ外部ドメインを含有する断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＶＺＶｇＥ＋Ｈ５ｄＴｍ．ｃ（図１０Ｄ、配列番号：２３）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−ｗｔＳｐ−ＶＺＶｇＥ．ｃ（図１０Ａ、配列番号：２０）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。次いで第２のＰＣＲの産物をＡｐａＩおよびＳｔｕＩにより消化し、ＡｐａＩおよびＳｔｕＩの制限酵素により消化されたコンストラクト番号９９５（図１Ｆ、配列番号：６）の中へクローン化した。生じたコンストラクトに番号９４６を与えた（図Ａ５、  配列番号：Ａ５）。ＶＺＶ  ｇＥ−Ａ／インドネシア／５／２００５    Ｈ５    ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図１０Ｆ中で示す（配列番号：２５）。９４６プラスミド表示を図１０Ｇ中で示す。このコンストラクトはＭ１タンパク質をコードしない。
【０１７９】
実施例１０：キメラのＶＺＶタンパク質の植物における発現
【０１８０】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）Ｅタンパク質の発現を、野生型シグナルペプチドおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインを持つＶＺＶ  ｇＥ遺伝子を含むコンストラクト９４６を使用して実証した。
【０１８１】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の３週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の３週間温室中に放置して成長させる。
【０１８２】
各々のコンストラクト（コンストラクト９４６）によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、０．６〜１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６を補足したＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで２分間置いた。収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。特別の定めのない限り、インフィルトレーションはすべて１：１比率で系統ＡＧＬ１／１７２との共インフィルトレーションとして実行された。
【０１８３】
インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、３体積の冷５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１８４】
清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン−２０により４℃で１６〜１８時間、膜をブロッキングした。
【０１８５】
一次抗体としてＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中の１μｇ／μｌのマウスモノクローナル抗体抗ＶＺＶｇＥタンパク質（ａｂｃａｍ、ａｂ５２５４９）とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。二次抗体としてＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１：１００００で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス（ＪＩＲ、１１５−０３５−１４６）とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）としてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。
【０１８６】
図１１Ａは、レーン７〜９においてコンストラクト９４６からの水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）Ｅタンパク質の発現のイムノブロット分析を示す（それぞれ２０、１０および２  ｇの抽出物）。レーン１〜５、陽性対照（それぞれ５００、１００、５０、１０および５ｎｇの組換えＶＺＶ  ｇＥ）；レーン６、陰性対照。
【０１８７】
コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下で、植物においてＶＬＰへと集合させるＶＺＶ  Ｅタンパク質の能力も検討した。コンストラクト９４６を使用して形質転換された植物からのタンパク質抽出物を清澄化し、ゲル濾過クロマトグラフィーへかけ、続いてＶＺＶ  Ｅタンパク質についてマウスモノクローナル抗体抗ＶＺＶｇＥタンパク質（ａｂｃａｍ、ａｂ５２５４９）一次抗体を使用して溶出画分を分析した。図１１Ｂ中で示されたウエスタンブロットは、インフィルトレーションした植物からの抽出物において、キメラのＶＺＶ  Ｅタンパク質溶出画分は画分１０〜１３においてピークに達することを示し、ＶＺＶ  Ｅタンパク質は２００万ダルトンを超える非常に高分子量の構造で集合することを指摘する。これらの結果は、ホモ三量体の予想される分子量のものを越えたサイズの高分子量構造へとＶＺＶ  Ｅタンパク質が集合することを示す。
【０１８８】
したがって、ＶＺＶ  Ｅタンパク質はアグロインフィルトレーションした植物において高レベルで蓄積され、コアタンパク質またはマトリックスタンパク質の非存在下においてウイルス様粒子へと集合した。これらの結果は、非インフルエンザ抗原（ＶＺＶ  Ｅタンパク質等）へのインフルエンザＨＡのＴＭ／ＣＴドメインの融合が非インフルエンザ抗原を提示するＶＬＰを集合して放出するのに十分であることも実証する。
【０１８９】
実施例１１：キメラのエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）を持つ発現カセットの組立て
【０１９０】
Ａ−２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ザイールエボラウイルスＧＰ（ＥｂｏＧＰ）＋Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５膜貫通ドメインおよび細胞質尾部（ＴＭ＋ＣＴ）−ＮＯＳ（コンストラクト番号１３６６）
【０１９１】
Ｄａｒｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ    ２６：７７−８５（１９９５））によって示されたＰＣＲベースのライゲーション方法を使用して、Ｈ５  Ａ／インドネシア／５／２００５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインへ融合したザイール１９９５系統エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）の外部ドメインをコードする配列を、プラストシアニン−Ｐ１９−プラストシアニン発現カセットを含有するプラスミドにおける２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＰＤＩＳＰ−ＮＯＳ発現システムの中へ以下のようにクローン化した。エボラＧＰ遺伝子は、野生型遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３５４４５８からのヌクレオチド６０３９〜８０６９に対応する）から、コドン使用およびＧＣ含量について至適化した。隠れたスプライス部位、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、配列を不安定にするＲＮＡおよび原核細胞リボゾーム侵入部位を、次いで至適化された配列から除去して、望まれない構造または配列を回避した。ＰＣＲの第１のラウンドにおいて、合成されたＧＰ遺伝子（図１３Ｃ、配列番号：４５）をテンプレートとして用いて、プライマーＩＦ−Ｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ．ｓ２＋４ｃ（図１３Ａ、配列番号：４３）およびＨ５ｉＴＭＣＴ＋Ｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ．ｒ（図１３Ｂ、配列番号：４４）を使用して、外部ドメイン（シグナルペプチドならびに膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインなし）をコードする配列を含有する至適化されたＧＰ遺伝子の断片を増幅した。コンストラクト番号９７２（コンストラクト番号９７２の配列については、参照として本明細書に援用されるＷＯ２０１０／００３２２５の図９４、配列番号：１３４を参照）をテンプレートとして使用して、プライマーＯｐｔ＿ＥｂｏＧＰ＋Ｈ５ｉＴＭＣＴ．ｃ（図１３Ｄ、配列番号：４６）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）を使用して、インフルエンザＡ／インドネシア／５／２００５からのＨ５の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有する第２の断片を増幅した。次いで両方の増幅からＰＣＲ産物を混合し、ＩＦ−Ｏｐｔ＿ＥｂｏＧＰ．ｓ２＋４ｃ（図１３Ａ、配列番号：４３）およびＩＦ−Ｈ５ｄＴｍ．ｒ（図３Ｃ、配列番号：１５）をプライマーとして使用する増幅の第２のラウンドのために、テンプレートとして使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して、２×３５Ｓ−ＣＰＭＶ  ＨＴ−ＮＯＳ発現システム中のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドと共に、生じたＰＣＲ産物をインフレームでクローン化した。コンストラクト１１９２（図１３Ｅ）をＳａｃＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素により消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ組立て反応のために使用した。コンストラクト番号１１９２は、ＣＰＭＶ  ＨＴベースの発現カセット中への対象となる遺伝子のアルファルファＰＤＩシグナルペプチドとインフレームでの「Ｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ」クローニングのために意図されたアクセプタープラスミドである。それは、アルファルファプラストシアニン遺伝子プロモーターおよびターミネーター下のＴＢＳＶ  Ｐ１９サイレンシングサプレッサーの共発現のための遺伝子コンストラクトも取り込む。ベクターはｐＣＡＭＢＩＡベースのプラスミドであり、左ｔ−ＤＮＡ境界から右ｔ−ＤＮＡ境界の配列を図中で１３Ｆ示す（配列番号：４７）。生じたコンストラクトに番号１３６６を与えた（図１３Ｇ、  配列番号：４８）。ザイール９５エボラウイルスからのＰＤＩＳＰ−ＧＰ−Ａ／インドネシア／５／２００５からのＨ５  ＴＭ＋ＣＴのアミノ酸配列を図１３Ｈ中で示す（配列番号：４９）。１３６６プラスミド表示を図１３Ｉ中で示す。
【０１９２】
実施例１２：キメラのエボラウイルスＧＰの植物における発現
【０１９３】
エボラウイルス（ＥＶ）糖タンパク質（ＧＰ）の発現を、野生型シグナルペプチドおよびＨ５Ａ／Ｉｎｄｏ  ＴＭ＋ＣＴドメインを持つＥＶ  ＧＰ遺伝子を含むコンストラクト１３６６を使用して実証した。
【０１９４】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ植物を商業用ピートモス基質により満たされた平面で種子から成長させた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。播種の３週間後に、個別の苗木を選び、ポット中に移植し、同じ環境条件下で追加の３週間温室中に放置して成長させる。
【０１９５】
各々のコンストラクト（コンストラクト９４６）によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、０．６〜１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６を補足したＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの植物全体を、２０〜４０Ｔｏｒｒの真空下の気密性のステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中に上下逆さまで２分間置いた。収穫までの２〜６日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。
【０１９６】
インキュベーション後に、植物の地上部を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。凍結破砕した植物材料の各々のサンプルを、３体積の冷５０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００および１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル中でホモジナイズすること（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）によって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で１０分間１０，０００ｇで遠心分離し、これらの清澄化された粗製抽出物（上清）を解析のために保存した。
【０１９７】
清澄化された粗製抽出物の全タンパク質含有量は、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）によって決定した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）上に電子的に転写した。イムノブロットの前に、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン−２０により４℃で１６〜１８時間、膜をブロッキングした。
【０１９８】
一次抗体としてＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中の１５０ｎｇ／ｍｌの親和性精製したウサギ抗エボラＧＰザイール（ＩＢＴ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ、０３０１−０１２）とのインキュベーションによって、イムノブロットを実行した。ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１：７５００で希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体（ＪＩＲ  １１−０３５−１４４）とのインキュベーション後に、化学発光検出を実行した。基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）としてルミノールを使用する化学発光によって、免疫反応性複合体を検出した。図１３Ｊは、コンストラクト番号１３６６により形質転換された植物からのタンパク質抽出物におけるキメラのエボラウイルスＧＰの発現のイムノブロット分析を示す。得られた結果は、キメラのエボラＧＰが一過性に発現されることを示す。
【０１９９】
すべての引用は参照として本明細書に援用される。
【０２００】
本発明は１つまたは複数の実施形態に関して記載された。しかしながら、請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行なえることは当業者に明らかだろう。
【図１Ｂ】
0006038041.tif 000008
【図１Ｃ】
0006038041.tif 000009
【図１Ｄ】
0006038041.tif 000010
【図１Ｅ】
0006038041.tif 000011
【図２Ａ】
0006038041.tif 000012
【図２Ｂ】
0006038041.tif 000013
【図２Ｃ】
0006038041.tif 000014
【図３Ａ】
0006038041.tif 000015
【図３Ｂ】
0006038041.tif 000016
【図３Ｃ】
0006038041.tif 000017
【図６】
0006038041.tif 000018
【図８Ｂ】
0006038041.tif 000019
【図８Ｃ】
0006038041.tif 000020
【図８Ｅ】
0006038041.tif 000021
【図１０Ａ】
0006038041.tif 000022
【図１０Ｂ】
0006038041.tif 000023
【図１０Ｄ】
0006038041.tif 000024
【図１２Ｂ】
0006038041.tif 000025
【図１２Ｃ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｄ】
0006038041.tif 000030
【図１３Ｊ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｆ−１】
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【図１Ｆ−２】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ｄ−１】
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【図２Ｄ−２】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ｄ−１】
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【図３Ｄ−２】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｆ−１】
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【図８Ｆ−２】
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【図８Ｆ−３】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ−１】
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【図８Ｊ−２】
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【図８Ｊ−３】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ−１】
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【図８Ｌ−２】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｅ−１】
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【図１０Ｅ−２】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｄ−１】
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【図１２Ｄ−２】
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【図１２Ｆ−１】
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【図１２Ｆ−２】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ｃ−１】
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【図１３Ｃ−２】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ−１】
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【図１３Ｆ−２】
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【図１３Ｇ−１】
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【図１３Ｇ−２】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【配列表】
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