(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラスルファターゼをコードするポリヌクレオチドであって、前記キメラスルファターゼが、本質的に、a)ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメインのN-末端-C-末端配列順にある、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
コードされたシグナルペプチドが、配列番号2または配列番号4の群に属する配列を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ヒトスルファターゼが、ヒトスルファミダーゼである、請求項1または2に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
コードされたヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列が、本質的に配列番号8の配列を有する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
コードされたApoB LDLR結合ドメインが、本質的に配列番号10の配列を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
本質的に、以下の群
a)アセンブリhAATsp-SGSH-3×flagカセット(配列番号11)、
b)アセンブリhIDSsp-SGSH-3×flagカセット(配列番号13)、
c)アセンブリhAATsp-SGSH-3×flag-ApoBカセット(配列番号15)、
d)アセンブリhIDSsp-SGSH-3×flag-ApoBカセット(配列番号17)、
e)アセンブリhAATsp-SGSHカセット(配列番号19)、
f)アセンブリhIDSsp-SGSHカセット(配列番号21)、
g)アセンブリhAATsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号23)、
h)アセンブリhIDSsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号25)、
に属する配列を有する、請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
肝臓特異的プロモータの制御下、請求項1から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、MPSの遺伝子治療のために好適な組換えプラスミド。
【請求項８】
前記肝臓特異的プロモータが、ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータである、請求項7に記載の組換えプラスミド。
【請求項９】
前記ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータが、本質的に配列番号27の配列を有する、請求項8に記載の組換えプラスミド。
【請求項１０】
レンチウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルスベクターまたはAAVベクターの群に属する、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクター中にアセンブルされることが可能な、請求項7から9のいずれか一項に記載の組換えプラスミド。
【請求項１１】
請求項7から10のいずれか一項に記載の組換えプラスミドを含む、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクター。
【請求項１２】
前記リソソーム障害が、MPSである、請求項11に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記MPSが、IIIA型MPSである、請求項12に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
AAVウイルスベクターの群に属する、請求項11から13のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
AAV血清型8ベクターである、請求項14に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
請求項11から15のいずれか一項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項１７】
全身投与のための請求項16に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
本質的に、a)ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメインのN末端-C末端配列順にある、キメラスルファターゼ。
【請求項１９】
前記シグナルペプチドが、配列番号2または配列番号4の群に属する配列を有する、請求項18に記載のキメラスルファターゼ。
【請求項２０】
前記ヒトスルファターゼが、ヒトスルファミダーゼである請求項18または19に記載のキメラスルファターゼ。
【請求項２１】
前記ヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列が、本質的に配列番号8の配列を有する、請求項20に記載のキメラスルファターゼ。
【請求項２２】
コードされたApoB LDLR結合ドメインが、本質的に配列番号10の配列を有する、請求項18から21のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ。
【請求項２３】
本質的に、以下の群
a)hAATsp-SGSH-3×flagアミノ酸配列(配列番号12)、
b)hIDSsp-SGSH-3×flagアミノ酸配列(配列番号14)、
c)hAATsp-SGSH-3×flag-ApoBアミノ酸配列(配列番号16)、
d)hIDSsp-SGSH-3×flag-ApoBアミノ酸配列(配列番号18)、
e)hAATsp-SGSHアミノ酸配列(配列番号20)、
f)hIDSsp-SGSHアミノ酸配列(配列番号22)、
g)hAATsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(配列番号24)、
h)hIDSsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(配列番号26)、
に属する配列を有する、請求項18から22のいずれか一項に記載のキメラスルファターゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液脳関門を通過し、ムコ多糖症(MPS)におけるCNS病変、とりわけIIIA型MPSを処置するための、ウイルスベクター仲介遺伝子治療であるか、または改変スルファターゼ、とりわけスルファミダーゼ酵素の投与による治療アプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
IIIA型ムコ多糖症(MPS-IIIA)は、ヘパリン硫酸と呼ばれる大きな高分子の段階分解に関与する酵素であるスルファミダーゼ(SGSH)の欠損によって引き起こされる遺伝病である。結果として、罹患患者の細胞および組織に未分解基質が蓄積して、細胞の損傷を引き起こす。中枢神経系(CNS)は、損傷の主たる標的であり、事実、MPS-IIIA患者は、重度な精神遅延と、(しばしば20年超で)最終的に死を導く神経病理学的減退を示す。臨床症状には、活動過剰、攻撃的行動、および睡眠障害が含まれる(1)。
【０００３】
MPS-IIIAの天然に存在するマウスモデルが、ヒトの状態に類似の病態生理および症状とみなされてきた(2〜4)。これらのマウスは、この障害の病態生理学を研究するため、および新規の治療プロトコールを試験するための理想的なモデルである。
【０００４】
脳障害の処置は、MPS-IIIAに対するすべての治療アプローチの主要なゴールである。脳に至る経路は、治療分子の直接脳内への直接注入にある。いくつかの異なる酵素置換療法(ERT)プロトコールが試験されてきた。これらのプロトコールにおいて、組換えスルファミダーゼ酵素はMPSIIIAマウスの脳内への直接注入により投与された。より若年のマウスにスルファミダーゼが投与されるときに、これらの戦略は神経変性性の変化の出現を遅延させることが可能である(5、6)。さらに、AAVベクターを介したSGSH遺伝子の脳内注入に基づいた遺伝子治療プロトコールが、本発明の著者らによって成功裏に開発された(7)。これらの直接的な脳標的化アプローチは、臨床的に効果的であることが示されてきているが、これらはヒトへの治療適用性に対しては侵襲性の高いアプローチである。
【０００５】
脳内の各ニューロンが、それ自体の血管によって灌流されるので、脳に至る効果的な他の低侵襲性経路として、治療分子の静脈内投与が挙げられる(8)。しかしながら、血管脳関門(BBB)を形成する、この非常に密な微小血管のネットワークは、すべての分子に対して透過性というわけではなく、治療薬剤の効果的な送達を妨害しうる(9)。実際、リソソーム酵素の静脈内投与は、多くのLSDの体細胞病変において治療効果を生じたが、巨大分子に対するBBBの不透過性によって、CNS病変においてほとんど、または全く効果を有しない(10)。MPS-IIIAにおいて、スルファミダーゼの静脈注射は、BBBが形成された後に酵素が供給される場合、MPS-IIIAマウス脳において生じる病変または行動プロセスを変化させなかったことが示されている(11)。
【０００６】
重要なことに、Urayamaらによる最近の研究によって、マンノース6-リン酸受容体仲介輸送を通して、新生仔マウスでスルファミダーゼはBBBを通過して運搬されるが、成体脳内への流入はごく少量であったことが示された(12)。
【０００７】
そのような文脈中、MPS-IIIAの治療に対する、そして一般にCNSを含むすべてのLSDに対する実際のチャレンジは、BBBによって代表される主要な妨害を克服することが可能な、CNS全身処置戦略を開発することである。BBBを通過するための効果的な戦略は、受容体仲介トランスサイトーシスを介したCNSへのタンパク質の標的化である(13)。よく特徴付けられたBBB受容体には、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)、トランスフェリン受容体(TfR)、およびインスリン様増殖因子受容体(IGF-R)が含まれる。LDLRファミリーは、リソソーム内への内在化のために、アポリポタンパク質(Apo)複合体(脂質キャリア)を結合する、細胞表面受容体の一群である14〜16)。BBBの表面上で、Apoに結合しているLDLRが、BBBの内腔側へのトランスサイトーシスをもたらし、そこでアポリポタンパク質は、ニューロンと星状膠細胞によって取り込まれるように放出される。最近の研究によって、ApoのLDLR結合ドメインの、リソソーム酵素への融合が、CNSへのキメラ酵素の効果的な送達をもたらすことが示された(17)。
【０００８】
WO2004108071は、リソソーム蓄積病での治療使用のための、アポリポタンパク質B結合ドメインなどのBBB受容体結合ドメインを含むキメラCNS標的化ポリペプチドに言及している。
【０００９】
WO2004064750は、分泌シグナル配列(すなわちVi-アンチトリプシン(antitrypsin)およびα-1-アンチトリプシン)と、関連したAAVベクターを含む、キメラリソソームポリペプチド(とりわけII型リソソーム蓄積障害グリコーゲン蓄積疾病中に関与するリソソーム酸グルコシダーゼGAA)をコードする核酸に言及している。
【００１０】
WO2005002515は、血液脳関門を通過する、とりわけトランスサイトーシスによる、受容体仲介薬物送達のための、対象とする薬剤に共役したメガリン結合部分を含む化合物に言及している。さらに、本文献は、メガリン結合部分を含む組成物の投与に基づいた、リソソーム蓄積病を処置する方法に言及している。アポリポタンパク質Bおよびムコ多糖症IIIAが言及されている。
【００１１】
WO2009131698は、アポリポタンパク質B結合ドメインによって特徴付けられ、特にムコ多糖症IIIBに向けられたキメラNaGlu酵素に基づいた治療に言及している。
【００１２】
Cardoneら(Hum Mol Gen、2006年、15(7):1225)は、肝臓指向AAV2/8-TBG仲介遺伝子送達による、MPSIIマウスモデルにおける、ハンター症候群(II型リソソーム蓄積病ムコ多糖症)の治療を記述している。
【００１３】
WO2007092563は、まずポリペプチドをコードするトランスジーンを効果的な量、哺乳動物の肝臓組織に送達すること、および次いで哺乳動物の中枢神経系(CNS)に、効果的な量のトランスジーンを投与することによって、外部から投与した酸スフィンゴミエリナーゼポリペプチドに対して哺乳動物の脳を耐性化するための方法と組成物に言及している。治療アプローチは、ニーマン-ピック病、リソソーム蓄積病を対象とする。肝臓特異的プロモータと8型AAVが言及されている。
【００１４】
WO2009075815は、酵素置換療法の文脈での、AAVベクターの投与を含む、ポンプ病(リソソーム蓄積病)を処置する方法に言及している。肝臓特異的プロモータ(甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモータ)および8型AAVが言及されている。
【００１５】
以上の先行技術引用文献のいずれもが、本発明の改変スファミダーゼ酵素を開示も示唆さえもしておらず、IIIA型MPSの処置に対して、本発明の改変スファミダーゼ酵素が治療効果を有し得ることを開示も示唆さえもしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】WO2004108071
【特許文献２】WO2004064750
【特許文献３】WO2005002515
【特許文献４】WO2009131698
【特許文献５】WO2007092563
【特許文献６】WO2009075815
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Cardoneら(Hum Mol Gen、2006年、15(7):1225)
【非特許文献２】Naldini, L., Blomer, U., Gage, F.H., Trono, D.,およびVerma, I.M.(1996a)、In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263〜7頁
【非特許文献３】Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliverio A, Bordignon C, Naldini、In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. L. Nat Med. 2001年3月;7(3):310-6
【非特許文献４】Follenzi A, Naldini L、HIV-Based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 2002年;69:259〜74頁
【非特許文献５】Brunetti-Pierri N, Ng P. Progress towards liver and lung-directed gene therapy with helper-dependent adenoviral vectors. Curr Gene Ther. 2009年10月;9(5):329〜40頁
【非特許文献６】Fraldiら、HMG2007
【非特許文献７】Hemsley, K.M.およびJ.J. Hopwood, Behav Brain Res、2005年
【非特許文献８】Savas P.Sら、Mol Genet Metab、2004年
【非特許文献９】Hemsley ,K.M.ら、Mol Genet Metab、2007年
【非特許文献１０】Fraldiら、Hum Mol Gen 2007年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
背景技術にて開示されたように、脳病変は、リソソーム蓄積障害におけるもっとも一般的特徴である。したがって、脳障害の処置は、これらの障害に対する任意の効果的な治療の主なゴールである。
【００１９】
治療薬剤の全身送達によって効率的に脳を処置するための主要な障害は、血液脳関門(BBB)である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
著者らは、IIIA型ムコ多糖症(MPS-IIIA)、重度な中枢神経系関与を伴うリソソーム蓄積障害における脳病変を処置するための新規の非侵襲性治療アプローチを開発した。本戦略は、血液脳関門(BBB)を通過することによって、脳に多く分泌され、効果的に標的化される能力を改変スルファミダーゼに与える、2つのアミノ酸配列(一方がタンパク質のN末端、他方がC末端に対する)で最適化された、キメラスルファミダーゼ(MPS-IIIAで欠損しているスルファターゼ酵素)の構築に基づく。改変酵素は、特異的に肝臓を標的として、肝臓を治療酵素の工場器官のようにする、アデノ関連ウイルス(AAV)血清型8によって発現される。
【００２１】
改変スルファミダーゼは、遺伝子治療のため、および酵素置換療法(ERT)のための両方で効果的に使用することができる。
【００２２】
改変アプローチは、重度なCNS関与を有する他のムコ多糖症において欠損する他のリソソーム酵素に対して使用することができる。
【００２３】
したがって、キメラスルファターゼをコードするヌクレオチド配列が本発明の目的であり、前記キメラスルファターゼは本質的に、a)ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメインのN末端-C末端配列順にある。
【００２４】
好ましい実施形態において、コードされたシグナルペプチドは、以下の群:MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA(配列番号2)またはMPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALG(配列番号4または6)に属する配列を有する。
【００２５】
好ましい実施形態において、ヌクレオチドヒトスルファターゼは、ヒトスルファミダーゼであり、より好ましくは、本質的に配列:
MSCPVPACCALLLVLGLCRARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNEL(配列番号8)を有するコードされたヒトスルファミダーゼ由来アミノ酸配列である。そのような配列は、配列番号7nt配列によってコードされる。5’-ATGAGCTGCCCCGTGCCCGCCTGCTGCGCGCTGCTGCTAGTCCTGGGGCTCTGCCGGGCGCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAGCCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTGA-3'。
【００２６】
好ましい実施形態において、コードされたApoB LDLR結合ドメインは、本質的に配列:SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS(配列番号10)を有する。
【００２７】
好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、本質的に以下の群に属する配列を有する。
SEQUENCES WITH FLAG(専門家は、フラッグ配列を任意の他の好適なスペーサ配列で簡単に置換するものとする):
a)アセンブリhAATsp-SGSH-3xFlagカセット(1611)(配列番号11)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGTGA-3’
b)アセンブリhIDSsp-SGSH-3xflagカセット(1614bp)(配列番号13)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGTAGTGA-3'
c)アセンブリhAATsp-SGSH-3xflag-ApoBカセット(1734 bp)(配列番号15)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATCTCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'
d)アセンブリhIDSsp-SGSH-3xflag-ApoBカセット(1737 bp)(配列番号17)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTCATCTAGAGGATCCCGGGCTGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGACTACAAGGATGACGATGACAAGATCTCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3’
SEQUENCES WITHOUT FLAG:
e)アセンブリhAATsp-SGSHカセット(配列番号19)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTGA-3'
f)アセンブリhIDSsp-SGSHカセット(配列番号21)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCCTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTACACAATGAGCTCTGA-3'
g)アセンブリhAATsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号23)。
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCTCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGATCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'
h)アセンブリhIDSsp-SGSH-ApoBカセット(配列番号25)。
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGCCGTCCCCGGAACGCACTGCTGCTCCTCGCGGATGACGGAGGCTTTGAGAGTGGCGCGTACAACAACAGCGCCATCGCCACCCCGCACCTGGACGCCTTGGCCCGCCGCAGCCTCCTCTTTCGCAATGCCTTCACCTCGGTCAGCAGCTGCTCTCCCAGCCGCGCCAGCCTCCTCACTGGCCTGCCCCAGCATCAGAATGGGATGTACGGGCTGCACCAGGACGTGCACCACTTCAACTCCTTCGACAAGGTGCGGAGCCTGCCGCTGCTGCTCAGCCAAGCTGGTGTGCGCACAGGCATCATCGGGAAGAAGCACGTGGGGCCGGAGACCGTGTACCCGTTTGACTTTGCGTACACGGAGGAGAATGGCTCCGTCCTCCAGGTGGGGCGGAACATCACTAGAATTAAGCTGCTCGTCCGGAAATTCCTGCAGACTCAGGATGACCGGCCTTTCTTCCTCTACGTCGCCTTCCACGACCCCCACCGCTGTGGGCACTCCCAACCCCAGTACGGAACCTTCTGTGAGAAGTTTGGCAACGGAGAGAGCGGCATGGGTCGTATCCCAGACTGGACCCCCCAGGCCTACGACCCACTGGACGTGCTGGTGCCTTACTTCGTCCCCAACACCCCGGCAGCCCGAGCCGACCTGGCCGCTCAGTACACCACCGTCGGCCGCATGGACCAAGGAGTTGGACTGGTGCTCCAGGAGCTGCGTGACGCCGGTGTCCTGAACGACACACTGGTGATCTTCACGTCCGACAACGGGATCCCCTTCCCCAGCGGCAGGACCAACCTGTACTGGCCGGGCACTGCTGAACCCTTACTGGTGTCATCCCCGGAGCACCCAAAACGCTGGGGCCAAGTCAGCGAGGCCTACGTGAGCCTCCTAGACCTCACGCCCACCATCTTGGATTGGTTCTCGATCCCGTACCCCAGCTACGCCATCTTTGGCTCGAAGACCATCCACCTCACTGGCCGGTCCCTCCTGCCGGCGCTGGAGGCCGAGCCCCTCTGGGCCACCGTCTTTGGCAGCCAGAGCCACCACGAGGTCACCATGTCTTACCCCATGCGCTCCGTGCAGCACCGGCACTTCCGCCTCGTGCACAACCTCAACTTCAAGATGCCCTTTCCCATCGACCAGGACTTCTACGTCTCACCCACCTTCCAGGACCTCCTGAACCGCACCACAGCTGGTCAGCCCACGGGCTGGTACAAGGACCTCCGTCATTACTACTACCGGGCGCGCTGGGAGCTCTACGACCGGAGCCGGGACCCCCACGAGACCCAGAACCTGGCCACCGACCCGCGCTTTGCTCAGCTTCTGGAGATGCTTCGGGACCAGCTGGCCAAGTGGCAGTGGGAGACCCACGACCCCTGGGTGTGCGCCCCCGACGGCGTCCTGGAGGAGAAGCTCTCTCCCCAGTGCCAGCCCCTCCACAATGAGCTGTCATCTAGATCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGTAGATCTTAGTGA-3'。
【００２８】
肝臓特異的プロモータの制御下、以上で開示したようなヌクレオチド配列を含むMPSの遺伝子治療のために好適な組換えプラスミドがさらに本発明の目的であり、好ましくは、肝臓特異的プロモータは、ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータであり、より好ましくは、ヒト甲状腺ホルモン-グロブリン(TBG)プロモータは本質的に配列: 5’-GCTAGCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAAGTCCAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTGTTTGCTCTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCAGATCCGGCGCGCCAGGGCTGGAAGCTACCTTTGACATCATTTCCTCTGCGAATGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAAAAATGGAAAGATGTTGCTTTCTGAGAGACTGCAG-3'(配列番号27)を有する。
【００２９】
本技術分野の専門家は、本発明の組換えプラスミドが、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクター中でアセンブルされなければならないことを認識し、好適な1つを選択するであろう。そのようなウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、ヘルパー依存アデノウイルスベクターまたはAAVベクターの群に属してよい。例としてリソソーム蓄積障害の遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターは、Naldini, L., Blomer, U., Gage, F.H., Trono, D.,およびVerma, I.M.(1996a)、In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272(5259), 263〜7頁; Consiglio A, Quattrini A, Martino S, Bensadoun JC, Dolcetta D, Trojani A, Benaglia G, Marchesini S, Cestari V, Oliverio A, Bordignon C, Naldini. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice、L. Nat Med. 2001年3月;7(3):310-6; Follenzi A, Naldini L.、HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 2002年;69:259〜74頁にて記述されている。さらなる例として、ヘルパー依存アデノウイルスベクターが、Brunetti-Pierri N, Ng P. Progress towards liver and lung-directed gene therapy with helper-dependent adenoviral vectors. Curr Gene Ther. 2009年10月;9(5):329〜40頁にて記述されている。
【００３０】
好ましい実施形態において、組換えプラスミドは、プラスミドベクターAAV2.1より誘導し、AAVウイルスベクター、好ましくはAAV血清型8に対して好適である。
【００３１】
次いで、以上で開示されたような組換え核酸ベクターのいずれかを含む、リソソーム障害の遺伝子治療のためのウイルスベクターが、本発明のさらなる目的である。好ましくは、リソソーム障害はMPSであり、より好ましくはIIIA型MPSである。
【００３２】
好ましくは全身投与のための、以上で開示したようなウイルスベクターを含む医薬組成物が、本発明のさらなる目的である。
【００３３】
a)本質的に、ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)アミノ酸配列またはヒトイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)アミノ酸配列のいずれかに由来するシグナルペプチド、b)そのシグナルペプチドを欠いたヒトスルファターゼ由来アミノ酸配列、c)ApoB LDLR結合ドメイン、のN末端-C末端配列順にあるキメラスルファターゼが、本発明のさらなる目的である。
【００３４】
好ましい実施形態において、キメラスルファターゼは、以下の群:(配列番号2)または(配列番号4)に属する配列を有するシグナルペプチドを有する。
【００３５】
好ましい実施形態において、キメラスルファターゼは、ヒトスルファミダーゼ由来配列、好ましくは(配列番号8)を有する。
【００３６】
好ましい実施形態において、キメラスルファターゼは本質的に、(配列番号10)の配列を有する、コードされたApoB LDLR結合ドメインを含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、キメラスルファターゼは、以下の群に属する配列を本質的に有する。
SEQUENCES WITH FLAG(専門家は、フラッグ配列を任意の他の好適なスペーサ配列で簡単に置換するものとする)
a)hAATsp-SGSH-3xFlagアミノ酸配列(*=終止)(配列番号12)。
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITMKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK**
b)hIDSsp-SGSH-3xflagアミノ酸配列(*=終止)(配列番号14)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK**
c)hAATsp-SGSH-3xflag-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号16)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKISVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
d)hIDSsp-SGSH-3xflag-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号18)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRGSRADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKISVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**、
SEQUENCES WITHOUT FLAG:
e)hAATsp-SGSHアミノ酸配列(*=終止)(配列番号20)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQ PLHNEL*
f)hIDSsp-SGSHアミノ酸配列(*=終止)(配列番号22)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNEL*
g)hAATsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号24)
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLARPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKELQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
h)hIDSsp-SGSH-ApoBアミノ酸配列(*=終止)(配列番号26)
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGRPRNALLLLADDGGFESGAYNNSAIATPHLDALARRSLLFRNAFTSVSSCSPSRASLLTGLPQHQNGMYGLHQDVHHFNSFDKVRSLPLLLSQAGVRTGIIGKKHVGPETVYPFDFAYTEENGSVLQVGRNITRIKLLVRKFLQTQDDRPFFLYVAFHDPHRCGHSQPQYGTFCEKFGNGESGMGRIPDWTPQAYDPLDVLVPYFVPNTPAARADLAAQYTTVGRMDQGVGLVLQELRDAGVLNDTLVIFTSDNGIPFPSGRTNLYWPGTAEPLLVSSPEHPKRWGQVSEAYVSLLDLTPTILDWFSIPYPSYAIFGSKTIHLTGRSLLPALEAEPLWATVFGSQSHHEVTMSYPMRSVQHRHFRLVHNLNFKMPFPIDQDFYVSPTFQDLLNRTTAGQPTGWYKDLRHYYYRARWELYDRSRDPHETQNLATDPRFAQLLEMLRDQLAKWQWETHDPWVCAPDGVLEEKLSPQCQPLHNELSSRSVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGSRS**
【００３８】
医学的利用のため、好ましくはMPS、より好ましくはIIIA型MPSの処置のための、以上で開示したようなキメラスルファターゼが本発明のもう一つの目的である。
【００３９】
以上で開示したようなキメラスルファターゼ、ならびに好適な希釈剤および/または賦形剤および/または担体を含む、医薬組成物が、本発明のもう一つの目的である。
【００４０】
好適な量の、以上で開示したような遺伝子治療のためのウイルスベクターを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、MPS病変の処置のための方法が本発明のもう一つの目的である。好ましくは、MPS病変はIIIA型MPSである。
【００４１】
好適な量の、以上で開示したようなキメラスルファターゼを含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む、MPS病変の処置のための方法が本発明のもう一つの目的である。好ましくは、MPS病変はIIIA型MPSである。
【００４２】
本発明の主要な利点は、肝臓によって生成され、分泌される本発明のキメラ分子が、BBBを通過し、したがってすべての脳区域を標的とすることが可能であることである。
【００４３】
遺伝子治療アプローチに関して、MPS-IIIAに対するAAV2/5仲介遺伝子治療を記述する先行技術Fraldiら、HMG2007と比較して、本発明は、AAV8ベクターが、全身投与され、脳内に直接投与されるわけではないので、侵襲性は少ない。
【００４４】
先行技術Hemsley, K.M.およびJ.J. Hopwood, Behav Brain Res、2005年; Savas, P.Sら、Mol Genet Metab、2004年ならびにHemsley, K.M.ら、Mol Genet Metab、2007年に対する、酵素置換療法アプローチについて、本発明は、酵素の注入を繰り返す必要性を克服し、BBBを通過するように設計される。ERTアプローチに対して、BBBおよび酵素産出の高コストが、非常に重要な制限であることを指摘する価値がある。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】未改変SGSH:予備的in vivo試験1(新生仔処置)を示す図である。AAV2/8-TBG-GFPを注射した新生仔MPSIIIAマウスの肝臓におけるGFPシグナルの解析。新生仔MPSIIIAに、(非改変スルファミダーゼを発現する)AAV2/8-TBG-SGSHベクターを注射した。対照として、新生仔MPSIIIAとヘテロ接合(表現型的に正常)マウスに、AAV2/8-TBG-GFPベクターを注射した。MPS-IIIA注射マウスからの肝臓切片を、注射後異なる時点(注射後1、2、3、5および10週間)で、GFP染色に関して解析した。GFPシグナルは、早期の時点にて非常に強かった。しかしながら、GFPシグナルの有意な減少が、注射後のより遅い時点で観察された。
【図２Ａ】未改変SGSH:予備的in vivo試験1(新生仔処置)を示す図である。新生仔注射マウスの肝臓および血清中でのSGSH活性。スルファミダーゼ活性を、AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウスと、対照マウス(AAV2/8-TBG-GFPを注射したMPS-IIIAおよびヘテロ接合マウス)の血清(A)および肝臓(B)中で測定した。AAV2/8-TBG-SGSH処置MPS-IIIAマウスの血漿中のSGSH活性が、新生仔処置後最初の2週間の間上昇し、次いで、対照GFP注射MPS-IIIAマウス中で測定されたレベルに達するまで時間をかけて減少した。
【図２Ｂ】未改変SGSH:予備的in vivo試験1(新生仔処置)を示す図である。新生仔注射マウスの肝臓および血清中でのSGSH活性。スルファミダーゼ活性を、AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウスと、対照マウス(AAV2/8-TBG-GFPを注射したMPS-IIIAおよびヘテロ接合マウス)の血清(A)および肝臓(B)中で測定した。肝臓SGSH活性の解析により、注射後最初の週内で検出され、より高レベルの活性を伴って血漿で観察されたものと同様の傾向が示された。
【図３】未改変SGSH:予備的in vivo試験2(成体処置)を示す図である。AAV2/8-TBG-GFPを注射した成体MPSIIIAマウスの肝臓中のGFPシグナルの解析。1.5月齢MPSIIIAに、(非改変スルファミダーゼを発現する)AAV2/8-TBG-SGSHベクターを注射した。対照として、1.5月齢のMPSIIIAとヘテロ接合(表現型的に正常)マウスに、AAV2/8-TBG-GFPベクターを注射した。MPS-IIIA注射マウスからの肝臓切片を、注射後1および5週間にてGFP染色に関して解析した。高く、安定したGFPの発現が観察された。
【図４Ａ】未改変SGSH:予備的in vivo試験2(成体処置)を示す図である。注射した成体マウスの血清および肝臓中でのSGSH活性。スルファミダーゼ活性を、AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウス、および対照マウス(AAV2/8-TBG-GFPを注射したMPS-IIIAおよびヘテロ接合マウス)の肝臓(A)および血清(B)中で測定した。AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウスの肝臓において、GFPベクターを注射した動物中で検出された低酵素活性と比較して、SGSH活性の強力な増加が観察された。さらに、本活性は、注射後5週間(解析した最後の時点)、安定して残った。
【図４Ｂ】未改変SGSH:予備的in vivo試験2(成体処置)を示す図である。成体注射マウスの血清および肝臓中のSGSH活性。スルファミダーゼ活性を、AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウス、および対照マウス(AAV2/8-TBG-GFPを注射したMPS-IIIAおよびヘテロ接合マウス)の肝臓(A)および血清(B)中で測定した。(B)同様に、AAV2/8-TBG-SGSHで処置したMPS-IIIAマウスの血清中のSGSH活性の解析は、解析した注射後時間の至る間で、非常に高く、安定していた。
【図５】キメラスルファミダーゼ構築体を示す図である。スルファミダーゼのシグナルペプチド(SP)を、ヒトα-アンチトリプシン(hAAT)またはイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)のいずれかのもので置き換えた。構築体は、「部分的遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質」(IDSsp-SGSHflagおよびhAATsp-SGSHflag)として設計された。最終キメラスルファミダーゼタンパク質を構築するために、ApoB LDLR結合ドメイン(ApoB-BD)を、FlagタグのC末端で融合させて、得られた「最終遺伝子工学的に改変した構築体」(IDSsp-SGSHflag-ApoBおよびhAATsp-SGSHflag-ApoB)を得た。ApoB配列(114bp)を、5’BglII部位を有するフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドを用いて、ヒト血液cDNAからPCRによって増幅した。SP-SGSH配列を含有する骨格プラスミドを、Flagタグの終止コドンの前にBglII部位を変異導入することによって挿入して調製した。すべての得られたキメラスルファミダーゼ配列(IDSsp-SGSHflag、hAATsp-SGSHflag、IDSsp-SGSHflag-ApoBおよびhAATsp-SGSHflag-ApoB)を、CMVプロモータ下、哺乳動物発現プラスミド中に挿入した。
【図６】受容体仲介輸送を示す図である。受容体仲介トランスサイトーシスを介した、BBBの通過。アポリポタンパク質Bの低密度リポタンパク質受容体(LDLR)結合ドメイン(ApoB LDLR-BD)が、スルファミダーゼに、BBBの上皮細胞上に豊富に存在する、LDL受容体に結合することによる脳細胞に到達する能力を与える。本機構は、非効率的な、BBBの至る所のスルファミダーゼの、マンノース-6-リン酸受容体(M6PR)仲介輸送を置換しうる。
【図７Ａ】in vitro試験を示す図である。トランスフェクトしたMPS-IIIA MEF細胞のペレットおよび培地中のSGSH活性。MPS-IIIAマウス由来のMEF細胞に、部分的にまたは最終的にのいずれかで、遺伝子工学的に改変した構築体をトランスフェクトした。スルファミダーゼの活性を、トランスフェクトした細胞の培地(明るい灰色)およびペレット(暗い灰色)中で測定した。
【図７Ｂ】in vitro試験を示す図である。相当する分泌効率(培地中の活性/総活性)をまた評価した。
【図８】in vitro試験を示す図である。すべての遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質のウエスタンブロット解析。MPS-IIIAマウス由来のMEF細胞を、部分的、もしくは最終のいずれかの遺伝子工学的に改変した構築体で、または対照SGSH非改変構築体でトランスフェクトした。(A)すべてのキメラタンパク質の正しい発現を示している抗flag抗体でのブロット解析。トランスフェクション効率の対照として、細胞に、同一の濃度の無関係なタンパク質、flag-タグ化シンタキシン7を含有するプラスミドとともに共トランスフェクトした。(B)パルスおよび追跡実験を、キメラタンパク質の代謝回転率を評価するために、トランスフェクトした細胞中で実施した。(C)Cos-7細胞に、部分的にもしくは最終的にのいずれかで遺伝子工学的に改変した構築体、または対照SGSH未改変構築体でトランスフェクトした。リソソーム位置を、抗SGSH抗体での免疫染色によって、すべてのトランスフェクトした細胞中で観察した。
【図９】in vivo試験を示す図である。最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼを注射したMPSIIIAマウスにおける予備的in vivo結果。著者らは、最終スルファミダーゼ構築体:hAATsp-SGSHflag-ApoBのうちの1つを注射したMPS-IIIAマウスでの、予備的であるが、極めて有望な結果を得た。成体MPS-IIIAマウスにAAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflag-ApoBを全身注射した。MPS-IIIAの一群にまた、対照として、(未改変スルファミダーゼを含有する)AAV2/8-TBG-SGSHも注射した。マウスを注射の1カ月後に屠殺した。本発明者らは、キメラスルファミダーゼを注射したマウスで、対照マウスに比して、より高い肝臓スルファミダーゼ活性と、スルファミダーゼ分泌における非常に強力な増加を観察した。さらに、本発明者らは、非改変スルファミダーゼを注射したマウスの脳中のSGSH活性測定と比較して、キメラスルファミダーゼを注射したマウスの脳内でのSGSH活性の有意な増加を検出した。
【図１０】AAV2.1プラスミドのマップを示す図である。AAV2.8ウイルスベクター生成のために使用した、pAAV2.1プラスミドのマップ。本プラスミドは、肝臓特異的プロモータTBGの制御下、GFP遺伝子を含有する。GFP配列を、NotIとHindIII制限部位を用いることによって、キメラスルファミダーゼカセットをコードするcDNAで置き換えた。得られたプラスミドを、293細胞中、pAdヘルパー、pAAVレップ-キャッププラスミドと共にトランスフェクトし、AAV2.8ウイルスベクターを生成した(方法を参照のこと)。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
方法
キメラSGSHカセット、組換え核酸ベクターおよびウイルスベクターの構築
2つの断片、ヒトSGSH cDNA(断片I)とシグナルペプチド配列(断片II)からの配列のライゲーションによって、別のシグナルペプチドを生成した。断片Iを、hSGSH発現プラスミドから増幅し、(SGSH配列上位置61中のヌクレオチドに相当する)hSGSHシグナルペプチド配列の3’末端で開始し、固有のXBaI部位まで伸張し、全SGSH cDNAを含有した(使用したオリゴ: SGSHFOR 5’-CGT CCC CGG AAC GCA CTG CTG CTC CT-3’(配列番号28)およびSGSHREV 5’-GCG GCC TCT AGA TGA CAG CTC ATT GTG GAG GGG CTG-3’(配列番号29))。断片IIは、各発現カセットに関して固有であった。hAATsp-SGSH-cFlagに関して、断片IIは、ヒトα1-アンチトリプシンシグナルペプチド配列[ヒトa1-アンチトリプシンcDNA: 72bp]を含有する2つの特定のオリゴヌクレオチド配列(hAATspFOR 5’-GGC CGC ATG CCG TCT TCT GTC TCG TGG GGC ATC CTC CTG CTG GCA GGC CTG TGC TGC CTG GTC CCT GTC TCC CTG GCT 3’(配列番号30)およびhAATspREV 5’-AGC CAG GGA GAC AGG GAC CAG GCA GCA CAG GCC TGC CAG CAG GAG GAT GCC CCACGA GAC AGA AGA CGG CAT GC-3’(配列番号31))をアニールすることによって合成した。
【００４７】
そのようなシグナルペプチドをコードする断片は、
5’-ATGCCGTCTTCTGTCTCGTGGGGCATCCTCCTGCTGGCAGGCCTGTGCTGCCTGGTCCCTGTCTCCCTGGCT-3’(配列番号1)であった。
【００４８】
IDSsp-SGSH-cFlag発現カセットに関して、断片IIは、ヒトイズロン酸スルファターゼシグナルペプチド配列[ホモサピエンスイズロン酸2-スルファターゼ(IDS)cDNA: 75bp]を含有する2つの特定のオリゴヌクレオチド配列(IDSspFOR 5’-GGC CGC ATG CCC CCG CCC CGC ACC GGC CGC GGC CTG CTG TGG CTG GGC CTG GTG CTG AGC AGC GTG TGC GTG GCC CTG GGC-3’(配列番号32)およびIDSspREV 5’-GCC CAG GGC CAC GCA CAC GCT GCT CAG CAC CAG GCC CAG CCA CAG CAG GCC GCG GCC GGT GCG GGG CGG GGG CAT GC-3’(配列番号33)をアニールすることによって合成した。そのようなシグナルペプチドをコードする断片は
5’-ATGCCGCCACCCCGGACCGGCCGAGGCCTTCTCTGGCTGGGTCTGGTTCTGAGCTCCGTCTGCGTCGCCCTCGGA-3’(配列番号3)または最適化配列
5’-ATGCCCCCGCCCCGCACCGGCCGCGGCCTGCTGTGGCTGGGCCTGGTGCTGAGCAGCGTGTGCGTGGCCCTGGGC-3’(配列番号5)であった。上記の2つの配列は、コドン利用に関してのみ異なり、同一のシグナルペプチドaa.配列(配列番号4または6)をコードする。断片IIのオリゴヌクレオチド配列は、5’NotI部位と3’平滑末端部位を有する。フォワードおよびリバースオリゴヌクレオチド配列を、100℃にて3分間インキュベートした。RTに冷却した後に、本発明者らは、37℃にて30分間、オリゴにPNKを加えた。断片I(5’NotI-3’平滑)および断片II(5’平滑-3’XBa)を、p3xFlag-CMV14ベクタープラスミド(5’Not-3’XBa)とライゲートした。DH5αコンピテント細胞を、得られたライゲーション混合物で形質転換した。
【００４９】
完全SGSHキメラ構築体を得るために、ヒトApoBのアミノ酸配列3371-3409(114 bp:5’TCTGTCATTGATGCACTGCAGTACAAATTAGAGGGCACCACAAGATTGACAAGAAAAAGGGGATTGAAGTTAGCCACAGCTCTGTCTCTGAGCAACAAATTTGTGGAGGGTAGT-3’(配列番号9)を、ヒトcDNAライブラリ(オリゴ:ApoBDFOR 5’-AGA TCT CTG TCA TTG ATG CAC TGC AGT- 3’(配列番号34)およびApoBDREV 5’-AGA TCT ACT ACC CTC CAC AAA TTT GTT GC-3’(配列番号35))によって増幅し、hAATsp-SGSH-cFlagまたはIDSsp-SGSH-cFlagのいずれかの3×Flagタグの5’末端にて、BglII部位内にクローン化した。
【００５０】
部分的キメラ構築体(hAATsp-SGSH-cFlagおよびhIDSsp-SGSH-cFlag)または完全キメラ構築体(hAATsp-SGSH-cFlag-ApoBおよびhIDSsp-SGSH-cFlag-ApoB)のいずれかを含有する異なる発現カセットを、NotI(5’)およびHindIII(3’)間のpAAV2.1-TBG-GFP内にサブクローン化した(GFP配列を発現カセットで置き換えた)。得られたプラスミド(図10)を、組換えAAV血清型8(AAV2/8)を生成するために使用した(19)。AAVベクターを、293細胞中3つプラスミド、pAdヘルパー、pAAVレップ-キャップ(AAV血清型8のキャップ遺伝子と融合したAAV2レップ遺伝子を含有するパッケージプラスミド)、pAAV Cis(本プラスミドは、キメラスルファミダーゼタンパク質を発現するpAAV2.1-TGBベクターである)の一時的トランスフェクションを用いて生成した。すでに記述されたように(19)、組換えAAV2/8ウイルスベクターを、2回のCsClによって精製した。ゲノムコピー(GC/ml)として発現されたベクタータイターを、リアルタイムPCR(GeneAmp 7000 Applied Biosystem)によって評価した。AAVベクターを、TIGEM AAV Vector Core Facility(http://www.tigem.it/core-facilities/adeno-associated-virus-aav-vector-core)によって生成した。
【００５１】
トランスフェクションおよび細胞内での分泌
HelaおよびMPSIIIA MEF細胞を、10%FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補ったDMEM(正常培養培地)中で維持した。製造業者のプロトコールに従って、サブコンフルエント細胞をLipofectamineTM 2000(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの1日後、培地をDMEM 0.5%FBSで置換した。トランスフェクションの2日後、本発明者らは、酵素アッセイとウエスタンブロット解析のために、馴化培地とペレットを回収した。
【００５２】
WB解析
3×Flag Lysis緩衝液1×(50mM Tris-HCl、pH8、200mM NaCl、1%Triton X100、1mM EDTA、50mM HEPES)を細胞ペレットに加えた。溶解物を、細胞ペレットを氷中にて1時間、溶解緩衝液とともにインキュベートすることによって得た。タンパク質濃度を、Bio-Rad(Bio-Rad、Hercules、CA、USA)比色アッセイを用いて決定した。馴化培地を、13,000rpmにて7分間、培地の遠心によって、vivaspin500(Sartorius)中で濃縮した。フラッグ化したスルファミダーゼタンパク質が、5%ミルク中1:1000で希釈した、抗FLAG M2モノクローナルペルオキシダーゼ-共役抗体(A8592 Sigma-Aldrich)を用いるウエスタンブロット解析によって明らかになった。
【００５３】
免疫蛍光
細胞を冷PBS中で3回洗浄し、15分間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で固定した。固定した細胞を、冷PBS中で4回洗浄し、ブロッキング溶液(PBS中0.1%サポニンおよび10%FBS)で30分間透過処理し、適切な一次抗体、ウサギ抗h-スルファミダーゼ(1:300、Sigma)で免疫標識した。PBS中で4回の洗浄した後、本発明者らは、二次抗体抗ウサギAlexa fluor-488共役物(1:1000)とともに細胞をインキュベートした。次いで、細胞を冷PBS中で4回洗浄し、Vectashieldマウンティング培地中にマウントした。
【００５４】
パルスおよび追跡
スルファミダーゼ酵素の分解速度を決定するために、異なるキメラ構築体でトランスフェクトしたMPSIIIA MEFを、1%ウシ胎児血清を補ったメチオニン:システインフリー培地(Sigma)中で30分間、30μCi/106細胞[35S]メチオニン:システイン混合物(EasyTag(商標)EXPRE35S35S Protein Labeling Mix、[3S];PerkinElmer)で放射標識した。十分に洗浄した後、細胞を、5%ウシ胎児血清の存在下で維持し、メチオニンとシステインを補った。細胞を、異なる時点で回収し、3×flag Lysis緩衝液を用いて溶解した。溶解物を、遠心によって清澄化し、上清を、flagに対するアガロース共役抗体(抗flag M2親和性ゲル、A2220 Sigma-Aldrich)を用いることによって免疫沈降させた。溶解緩衝液で十分に洗浄した後、免疫沈降物を、SDS-PAGEにかけた。乾燥させたゲルをPhosphorImagerスクリーンに曝露し、PhosphorImagerシステムで定量した。
【００５５】
動物
ホモ接合変異体(MPS-IIIA、-/-)とヘテロ接合(表現型的に正常、+/-)C57BL/6マウスを使用した。したがって、用語「正常マウス」は、マウス表現型を表すために使用する。実験は、イタリア健康省により許可された、ナポリのカルダレリ病院の動物ケアおよび利用委員会のガイドラインに従って実施された。
【００５６】
全身注射と組織回収
生後0〜1日の新生仔のMPS-IIIAおよび正常マウスを低温麻酔した。ベクターを、側頭静脈を介した全身経路中に送達した(100μl中2×1011粒子)。成体MPSIIIAマウス(1カ月)に、尾静脈を介して注射した(100μl中2×1011粒子)。酵素アッセイのために、動物の血清、注射後異なる時点で回収した。肝臓および脳形質での形質導入を評価するために、動物を異なる時点で屠殺した。これらの一部を、PBS中4%(w/v)パラホルムアルデヒドで灌流/固定し、次いでGFP染色のために肝臓を取り出した。残りマウスを屠殺し、肝臓および脳を取り出して、SGSH活性を測定した。
【００５７】
SGSH活性アッセイ
SGSH活性は、Fraldiら、Hum Mol Gen 2007年に記載の以下のプロトコールで測定した。
【００５８】
GFP解析
肝臓組織を、ショ糖勾配(10%〜30%)にかけ、4℃にて30%ショ糖中でO/Nでインキュベートした。最後に、組織を、OCT埋込マトリックス(KaItek)中に埋込み、ドライアイスおよびエタノールの浴中でスナップ凍結した。組織凍結切片は10μmの厚さで切り、PBSにて10分間洗浄し、Vectashieldマウント培地中でマウントし、GFP解析のために処理した。
【００５９】
結果
本プロジェクトの目的は、AAV血清型8の静脈内注射に基づく低侵襲性の全身的遺伝子治療戦略を開発することであった。本血清型は、高い肝臓向性を示し(18〜20)、(i)肝臓から多く分泌され、したがって血流中の循環酵素の高いレベルに至るように最適化されたキメラ改変スルファミダーゼをコードする遺伝子工学的に改変した遺伝子を送達するために使用可能である。スルファミダーゼは、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)など他のスルファターゼ酵素に比して、分泌が少ない。(ii)BBBを効率的に通過するように、スルファミダーゼシグナルペプチドを、IDSまたは多く分泌される酵素であるヒトα-アンチトリプシン(AAT)のいずれかのものと置き換えた。キメラスルファミダーゼを特異的脳標的化タンパク質ドメインであるアポリポタンパク質Bの(LDLR)結合ドメイン(ApoB LDLR-BD)でさらに遺伝子工学的に改変した。
【００６０】
MPSIIIAマウス中のin vivo結果
新規処置の効果は、トランスジーンによる形質導入を受けやすい肝臓の能力に強く依存し、その結果、スルファミダーゼが血流中に効果的に分泌され、次いで、BBBを通過し、その脳標的配列の手段によって脳を形質導入する。したがって、治療酵素の血清レベルは、治療の効果を決定する重要な要素を表すことができる。MPS-IIIAマウスに外来SGSHを全身的な遺伝子送達したときの、SGSHの肝臓での形質導入と全身レベルを解析することについては、先行する研究では実施されてきていない。したがって、本発明者らは、効果的な治療戦略を設計するための有用な予備データを得るために、この問題を研究することを決定した。
【００６１】
新生仔マウスへの治療酵素の送達は、MPS-IIIAマウスにおける病変を防止する有用なツールである。次いで、本発明者らは、新生仔MPSIIIAへのAAV2/8を介した全身注射が、本発明者らの新規治療戦略を開発するための実現可能なアプローチでありうるかどうかを試験することを決定した。この目的に対して、本発明者らは、肝臓を特異的に標的化し、それを治療酵素の工場器官とするために、肝臓特異的プロモータ(甲状腺ホルモン-グロブリン、TBG)の制御下、スルファミダーゼコード配列を含有するAAV2/8をMPS-IIIA新生仔マウスに注射した。1×1011個のウイルス粒子を、マウスに側頭静脈を介して注射した。3つのマウスの実験群、AAV2/8-TBG-GFPで処置した対照マウス(ヘテロ接合マウス、これらのマウスは正常な表現型を示す)、AAV2/8-TBG-GFPで処置したMPS-IIIAマウスおよびAAV2/8-TBG-SGSHで処置したMPS-IIIAマウスを設けた。
【００６２】
注射の効率性を試験するために、本発明者らはGFP注射マウス(正常およびMPS-IIIAマウス)の肝臓中のGFP蛍光を解析した。GFPシグナルは、注射後早期または後期の時点のいずれかで存在したが、注射後後期の時点で、解析したマウスの肝臓中で、GFPシグナルの有意な減少が観察された(図1)。
【００６３】
AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPS-IIIAマウスを、注射後の異なる時点(5、8、10、14日ならびに3、4、5および10週間)で、血漿中および肝臓中のSGSH活性に関してチェックした。AAV2/8-TBG-SGSH処置MPS-IIIAマウスの血漿中のSGSH活性は、新生仔処置後の最初の2週間増加し、次いで、対照GFP注射MPS-IIIAマウスで測定されたレベルに達するまで、経時的に減少した(図2A)。肝臓SGSH活性の解析は、注射後の最初の週内により高い活性レベルで検出された血漿中で観察されたものと同様の傾向を示した(図2B)。
【００６４】
新生仔マウスにおける本予備試験は、スルファミダーゼのAAV2/8-仲介新生仔送達によって効果的に肝臓は形質導入されるが、注射の1週間後、この酵素は肝臓および血清のいずれでも低レベル(対照GFP-注射MPS-IIIAマウスと同等)で存在するため、本アプローチは脳を処置するに適さないものとなるを示している。
【００６５】
処置後の期間の肝臓細胞の増殖が、新生仔に注射した後のベクターの肝臓での希釈の原因となるかどうかを評価するために、本発明者らは、肝臓がその成長を完了している成体マウス(1.5月齢)でのSGSHの全身(尾静脈注射)AAV2/8仲介送達に基づく新しい研究を実施した。
【００６６】
この試験においても、本発明者らは、3つのマウス実験群、AAV2/8-TBG-GFPで処置した正常マウス、AAV2/8-TBG-GFPで処置したMPS-IIIAおよびAAV2/8-TBG-SGSHで処置したMPS-IIIAマウスを設けた。処置後の異なる時点(注射後1週間および5週間)でのGFP発現の解析は、成体処置マウスの肝臓におけるトランスジーンの高く、安定した発現を明確に示した(図3)。
【００６７】
MPSIIIA処置マウスをまた、処置後異なる時点(1週間、2、3、4、5週間)で、肝臓中および血清中のSGSH活性に関してチェックした。本発明者らは、AAV2/8-TBG-SGSHを注射したMPSIIIAマウスの肝臓において、GFPベクターを注射した動物中の低い酵素活性と比較して、SGSH活性の強力な増加を観察し、この活性は、注射後5週間(解析した最後の時点)まで安定したままであった(図4A)。また、処置マウスの血清中のSGSH活性の解析は、解析した全注射後期間まで、非常に高く、安定していた(図4B)。重要なことに、この処置では、AAV2/8注射MPS-IIIAマウスの脳内での検出可能なスルファミダーゼ活性は生じなかった(図示せず)。
【００６８】
結論として、これらの予備研究は、(i) AAV2/8仲介全身注射によって、肝臓が高度に形質導入されること、(ii)新生仔処置マウスにおけるSGSH活性の減少は、肝臓中のベクターの希釈によるものであり、本発明者らに、成体マウスを、キメラスルファミダーゼを含有するAAV2/8での全身処置を試験するための良好なモデルであると考慮させるものであること、(iii)分泌された(非改変)スルファミダーゼでは、脳内での検出可能な酵素活性が生じなかったことを示す。後者は、予想された結果であり、さらに、本発明者らのプロジェクトの目的の背後の論拠を正当化する。
【００６９】
キメラスルファミダーゼタンパク質の構築と検証
肝臓からのスルファミダーゼ分泌と、したがって脳を特異的に標的化するために利用可能な血流中の酵素の量を増加させるために、本発明者らは、スルファミダーゼの固有のシグナルペプチド(SP)を他のもので置き換えることによって、スルファミダーゼを遺伝子工学的に改変した。2つのシグナルペプチド、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)シグナルペプチドおよびヒトα-アンチトリプシン(AAT)シグナルペプチドを試験した(図5)。これらの2つのシグナルペプチドの使用の背後にある論拠は、IDSは、肝臓から高いレベルで分泌されることが示された[21]リポソーム酵素であり、一方でAATは多く分泌される酵素であることである。本発明者らのプロジェクトの最終ゴールは、BBBを通過し、受容体仲介トランスシトーシスを介してCNSを標的とすることが可能な改変されたスルファミダーゼを生成することである(図6)。このため、本発明者らは、SGSH中のSPシグナルを置換することの治療効果の評価を目的とする実験を開始する前に、特定の脳標的化タンパク質ドメインである、アポリポタンパク質Bの低密度リポタンパク質(Low Density Lipoprotein)受容体(LDLR)結合ドメイン(ApoB LDLR-BDで改変SGSHをさらに遺伝子工学的に改変した。ApoBのこの結合ドメインは、BBBの内皮細胞上に豊富に存在するLDL受容体に結合することによって、スルファミダーゼが脳細胞に到達することを可能にするであろう(図6)。この2つの最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ構築体は、C末端にApoB LDLR-BDを含み、N末端にIDSまたはhAATシグナルペプチド(IDSsp-SGSHflag-ApoBおよびhAATsp-SGSHflag-ApoB)のいずれかを含む(図5)。
【００７０】
キメラスルファミダーゼタンパク質の機能を評価するために、本発明者らは、部分的にまたは最終のいずれかの遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質でMPSIIIA MEF細胞をトランスフェクトし、遺伝子工学的に改変していないスルファミダーゼでのトランスフェクションから得られるものと、結果を比較した。驚くべきことに、本発明者らは、最終キメラ構築体でトランスフェクトした細胞において、ペレット中および馴化培地中のSGSH活性が、他の構築体でトランスフェクトした細胞中で測定された活性と比較してより高かったことを観察し、これは、最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼが効率的に分泌されたことを示唆している(図7A)。実際、これらの結果は、遺伝子工学的に改変していないスルファミダーゼに比した、最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ酵素のより高い分泌効果と関連していた(図7B)。しかしながら、この分泌効果は、(代替のシグナルペプチドのみを含有する)部分的なキメラスルファミダーゼのトランスフェクション後に測定されたものと同様であった(図7B)。明らかに、本発明者らは、スルファミダーゼの改変、とりわけ最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ中に存在する改変が、キメラタンパク質に対して、遺伝子工学的に改変していないスルファミダーゼと比較してより高い安定性を与えることを観察した(図8AおよびB)。したがって、本発明者らは、遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質でトランスフェクトした細胞の培地中のスルファミダーゼタンパク質レベルにおける増加は、分泌効率の増加および遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼの安定性の増加の両方によるものであったと結論づけた。
【００７１】
さらに、抗SGSH抗体での免疫染色は、部分的におよび最終的に遺伝子工学的に改変した構築体の両方に対する、リソソーム様局在を示した(図8C)。
【００７２】
結論として、これらの結果は、(i)代替のシグナルペプチドを含有するキメラスルファミダーゼ酵素は、機能的であり、活性であること、(ii)これらは、非改変スルファミダーゼに比して、より安定であること、(iii)これらは、遺伝子工学的に改変していないスルファミダーゼ酵素と比較して、より効率的に分泌されること、(iv)最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼを生成するための、ApoB LDLR-BDの導入が、部分的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼでトランスフェクトした細胞で観察された、機能性または増加した分泌効果のいずれにも影響を与えなかったことを示している。さらに、最終的に遺伝子工学的に改変した構築体が、部分的に遺伝子工学的に改変した構築体と比較して、より安定であると思われる。
【００７３】
最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼを注射したMPSIIIAマウスにおけるin vivo結果
本発明者らは、肝臓特異的プロモータTBG下、最終的に遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼ(hAATsp-SGSHflag-ApoB)の1つを含有するAAV2/8ベクターを生成した。本発明者らは、本ウイルスベクターで注射したMPS-IIIAにて、非常に予備的ではあるが、極めて有望な結果を得た。成体MPS-IIIAマウスに、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflag-ApoBを全身注射した。一群のMPS-IIIA群に、対照として(改変していないスルファミダーゼを含有する)AAV2/8-TBG-SGSHも注射した。注射の1カ月後にマウスを屠殺した。本発明者らは、キメラスルファミダーゼを注射したマウスでは、対照マウスに比して、より高い肝臓スルファミダーゼ活性と、スルファミダーゼ分泌における非常に強力な増加を観察した(図9)。さらに、本発明者らは、キメラスルファミダーゼを注射したマウスの脳内でのSGSH活性における有意な増加を検出した(図9)。
【００７４】
他のベクターの利用
本発明者らは、すべての遺伝子工学的に改変したスルファミダーゼタンパク質(部分的および最終的)を含有するAAV2/8ベクターの生成を完了した。とりわけ、本発明者らは、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflag-ApoBに加えて、ここでAAV2/8-TBG-hIDSsp-SGSHflag-ApoB、AAV2/8-TBG-hAATsp-SGSHflagおよびAAV2/8-TBG-hIDSsp-SGSHflagを生成した。
【００７５】
これらのベクターは、以下の手順によって、大規模in vivo研究を実施するために使用することができる。キメラスルファミダーゼ酵素の臨床効果を試験するために、MPS-IIIAマウス(1カ月齢)に、遺伝子工学的に改変した構築体を含有するAAV2/8ベクターを(尾静脈投与経路によって)注射する。結果は、(i)CNS形質導入の効率、および(ii)処置マウスにおけるCNS病変の救済を評価するために有用である。
【００７６】
［参考文献］
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【図５】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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