(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーセットおよびプローブを含み、リアルタイムＰＣＲ法を用いて爪白癬の起因菌を同定するための同定用キットであって、
前記プライマーセットが、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであり、
前記プローブが、配列番号５の塩基配列を有するプローブ、および、配列番号６の塩基配列を有するプローブからなる、爪白癬の起因菌の同定用キット。
【請求項２】
被検者より採取した爪から全ＤＮＡを抽出する工程と、
爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的な、プライマーセットおよびプローブを用意する工程と、
リアルタイムＰＣＲ法を用いて、前記プライマーセットによって前記抽出した全ＤＮＡにおける爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅すると同時に、前記プローブによって前記増幅したＤＮＡを検出し、菌種を同定する工程と
を含み、
前記プライマーセットが、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであり、
前記プローブが、配列番号５の塩基配列を有するプローブ、および、配列番号６の塩基配列を有するプローブからなる、爪白癬の起因菌の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ法を用いた爪白癬の起因菌の同定用キットおよびその同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
爪白癬は爪の真菌感染症の９０％以上を占めており、重症になると爪が白または黄褐色に変色し、肥厚し、爪床から離れていく。爪白癬の起因菌は様々であるが、紅色白癬菌（トリコフィトン・ルブルム）および毛瘡白癬菌（トリコフィトン・メンタグロファイテス）の２菌種が分離された起因菌の殆どを占めている（非特許文献１）。爪白癬の治療には、テルビナフィン、イトラコナゾール、グリセオフルビン等の経口抗真菌薬や、イミダゾール系、アリルアミン系、ベンジルアミン系、チオカルバミン酸系等の外用抗真菌薬が用いられている。しかしながら、爪白癬は、通常の足白癬または体部白癬に比べて完治しにくく、特に既存の外用抗真菌薬の有効性が低いという問題点がある。爪白癬の治療効果を向上させるためには、起因菌の早期特定および的確な抗真菌剤の選定が不可欠である。【０００３】
爪白癬を含む白癬の診断には、患部から爪や角質等の試料を採取し、顕微鏡で観察して菌要素の有無を確認するＫＯＨ直接鏡検法と、選択培地上で数週間培養してコロニーや菌の微細構造を観察することにより菌種を同定する培養法とがある。しかし、ＫＯＨ直接鏡検法による診断には熟練が必要のうえ、基本的には菌種を同定できない。一方、培養法は菌種の同定はできるものの、数週間という長い期間を要し、培養陽性率も低く、さらに形態学的な同定には熟練を必要とする。【０００４】
別の白癬の診断方法として、例えば、爪白癬患者の爪甲から抽出した白癬菌アクチンｍＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで定量し白癬菌の検出と菌量の推定を試みる方法がある（非特許文献２）。しかし、この方法はｍＲＮＡを検出対象としているため取扱いの利便性に欠ける。【０００５】
さらに、爪真菌症の起因菌を正確に検出できる診断法として、第１回ＰＣＲおよびｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う方法が開示されている（特許文献１）。しかし、この方法は電気泳動を必要とするため大量検体の処理には適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−０６７６０５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】西本勝太郎：真菌誌  ４７：１０３−１１１，２００６
【非特許文献２】坪井良治：臨皮  ５７（５）：９４−９７，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ウイルスや病原菌の検出にはリアルタイムＰＣＲ法を用いることがある。リアルタイムＰＣＲ法は、サーマルサイクラーと蛍光検出器を一体化した機器を用いてＰＣＲによるＤＮＡの増幅と蛍光による増幅産物の検出を同時に行う手法である。この方法は、電気泳動による増幅産物の確認を必要としないため、簡便でかつ迅速に結果が得られ、コンタミネーションのリスクも低いという利点がある。しかし、これまで爪白癬の起因菌をリアルタイムＰＣＲ法で感度良く定量的に検出・同定するための方法はなかった。【０００９】
したがって、本発明は、菌種特異的なプライマーセットおよびプローブを用い、リアルタイムＰＣＲ法により起因菌を迅速かつ正確に同定することができる、爪白癬の起因菌の同定用キットおよびその同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究の結果、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的なプライマーセットおよびプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行うことで迅速かつ正確に爪白癬の起因菌を同定できることを見出し、本発明の完成に至った。【００１１】
すなわち、本発明は、プライマーセットおよびプローブを含み、リアルタイムＰＣＲ法を用いて爪白癬の起因菌を同定するための同定用キットであって、プライマーセットが、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであり、プローブが、配列番号５の塩基配列を有するプローブ、および、配列番号６の塩基配列を有するプローブからなる群より選択される少なくとも一つである、爪白癬の起因菌の同定用キットを提供する。【００１２】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットによれば、真菌全般（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の全長（およそ３５０ｂｐ）を増幅することができ、また、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットによれば、主な起因菌である紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）および毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の一部（およそ１５０ｂｐ）を特異的に増幅することができる。【００１３】
配列番号５の塩基配列を有するプローブによれば、毛瘡白癬菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的に検出でき、配列番号６の塩基配列を有するプローブによれば、紅色白癬菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的に検出することができる。【００１４】
したがって、本発明の同定用キットによれば、主な爪白癬の起因菌である紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）および毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）を迅速かつ正確に同定することができる。【００１５】
本発明は、また、被検者より採取した爪から全ＤＮＡを抽出する工程と、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的な、プライマーセットおよびプローブを用意する工程と、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、プライマーセットによって抽出した全ＤＮＡにおける爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅すると同時に、プローブによって増幅したＤＮＡを検出し、菌種を同定する工程とを含む、爪白癬の起因菌の同定方法を提供する。本発明の同定方法によれば、爪白癬の起因菌を迅速かつ正確に同定することができる。【００１６】
本発明の同定方法において、上記プライマーセットが、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットによれば、より広範囲の起因菌を同定することができ、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットによれば、主な２種類爪白癬の起因菌、すなわち、紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）および毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）を正確に効率よく同定することができる。また、プライマーセットは目的に応じて２種類の混合物を使用してもよい。【００１７】
本発明の同定方法において、上記プローブが、配列番号５の塩基配列を有するプローブ、および配列番号６の塩基配列を有するプローブからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。プローブは目的に応じて、１種類または２種類の混合物を使用してもよい。２種類の混合物を使用する場合、一回のリアルタイムＰＣＲで同時に２菌種の同定を可能とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の同定用キットおよび同定方法によれば、従来のＫＯＨ直接鏡検法または培養法に比べて、高度の熟練や数週間の培養期間が不要となるため、より簡便で迅速な爪白癬の起因菌の同定が可能となる。また、従来のｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲによる同定に比べても、定量性、検出精度、および菌種特異性が向上されるうえ、電気泳動を必要としないため所要時間が大幅に短縮できるという利点がある。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の同定方法は、被検者より採取した爪から全ＤＮＡを抽出する工程と、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的な、プライマーセットおよびプローブを用意する工程と、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、プライマーセットによって抽出した全ＤＮＡにおける爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域を増幅すると同時に、プローブによって増幅したＤＮＡを検出し、菌種を同定する工程とを含む。
【００２０】
本発明の同定方法によって同定できる爪白癬の起因菌は特に限定されないが、紅色白癬菌（トリコフィトン・ルブルム；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ  ）、毛瘡白癬菌（トリコフィトン・メンタグロファイテス；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、菫色白癬菌（トリコフィトン・ビオラセウム；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、岩穴状白癬菌（トリコフィトン・トンズランス；Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、アルスロデルマ・バンブルゼミイ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉ）、アルスロデルマ・ベンハミイ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｂｅｎｈａｍｉａｅ）、イヌ小胞子菌（ミクロスポルム・カニス；Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）、石膏状小胞子菌（ミクロスポルム・ギプセウム；Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇｙｐｓｅｕｍ）、および鼠径表皮菌（エピデルモフィトン・フロッコーズム；Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）が挙げられる。特に、紅色白癬菌および毛瘡白癬菌が分離された爪白癬の起因菌の９割以上を占めているため、この２種類の菌種を同定できることは爪白癬の治療において重要な意義がある。
【００２１】
本発明の同定方法は、爪白癬患者または患者の疑いのあるヒトの爪を検体とする。爪検体は、ニッパーや爪切り等で切り取ることによって採取すればよい。爪検体の量は、リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）の鋳型として十分量のＤＮＡを抽出できる量であればいい。爪の厚みや湿度で変化し得るがおよそ２×２ｍｍ、或いはおよそ５〜１０ｍｇ採取すればよい。
【００２２】
爪検体から全ＤＮＡを抽出するには、常法で行うことができ、例えば爪をビーズショックにより粉砕し、１００°Ｃで１０分間煮沸等により殺菌した後、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱することにより行うことができる。抽出した全ＤＮＡを必要に応じて市販の核酸定量キットで定量してもよい。
【００２３】
本発明の同定方法に使用されるプライマーセットは、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ  １）領域に特異的なものであれば特に限定されない。ＩＴＳ１領域は転写されない領域であり、転写される他の領域（例えば、２８Ｓ領域など）に比べて種の進化の段階でＤＮＡ配列の多様性を獲得しやすいため、菌種に限定した特異性の高い配列を保持していると考えられている。当業者は周知の方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （３ｒｄ  Ｅｄ．）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載の方法を用いて、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の塩基配列に基づき、本発明の同定方法に使用されるプライマーセットを適宜に設計することができる。プライマーの長さは好ましくは１５〜３０ｂｐであり、より好ましくは１８〜２５ｂｐであり、ＧＣ含量は好ましくは４０〜６０％、より好ましくは５０％前後である。Ｔｍ値は所望のＰＣＲアニーリング温度により５〜１０℃高く設定することが好ましく、本発明の同定方法においてアニーリング温度が好ましく６０〜６５℃であり、Ｔｍ値が６５〜７０℃であることが好ましい。プライマーセットによって増幅されるＤＮＡ配列の長さは５０〜４００ｂｐであればよく、好ましくは約１５０ｂｐ以下であることが好ましい。
【００２４】
広範囲の真菌の菌種を同定するためには、真菌リボゾームＤＮＡのＩＴＳ１領域の特異的配列に相補的であり、真菌全般（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）のリボゾームＤＮＡのＩＴＳ１領域を特異的に増幅するプライマーセットを使用することが好ましい。例えば、配列番号１の塩基配列を有するプライマー（ｄｅｒｍａＦ）と配列番号２の塩基配列を有するプライマー（ｄｅｒｍａＲ）とからなるプライマーセットは、殆どの真菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の全長（およそ３５０ｂｐ）を増幅することができるため好ましく用いられる。
【００２５】
一方、爪白癬の起因菌の９割以上を占める主な起因菌である紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）および毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）にターゲットを絞って効率よく検出・同定するためには、これらの菌種に限定した特異的なプライマーセットを使用することが好ましい。例えば、配列番号３の塩基配列を有するプライマー（ｄｅｒｍａＦ２）と配列番号４の塩基配列を有するプライマー（ｄｅｒｍａＲ２）とからなるプライマーセットは、紅色白癬菌および毛瘡白癬菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の一部（およそ１５０ｂｐ）を特異的に増幅することができるため、好ましく用いられる。また、毛瘡白癬菌と同じく系統分類上のグループＩに属するＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉやＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｓｉｍｉｉもこのプライマーセットによって増幅される。このプライマーセットによる増幅産物はｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマーセットによる増幅産物に比べて配列が短いため、リアルタイムＰＣＲに要する時間が短縮でき、主な爪白癬の起因菌の同定を正確かつ効率よく行うことを可能とする。
【００２６】
配列番号１：５’−ＴＡＡＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴ−３’
配列番号２：５’−ＴＣＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡ−３’
配列番号３：５’−ＳＳＣＣＣＣＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＡＣＭＴＹＡＣ−３’
配列番号４：５’−ＡＡＣＧＣＴＣＡＧＡＣＴＧＡＣＡＧＣＴＣＴＴＣ−３’
【００２７】
本発明の同定方法に使用されるプローブは、爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的なものであれば特に限定されない。当業者は周知の方法、例えば、Ｗｏｏｔｔｏｎら（Ｆｅｄｅｒｈｅｎ  Ｓ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９９６；２６６：５５４−７１）の方法を用いて、様々な爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の配列に基づいて、菌種特異的なプローブを検索し、設計することができる。プローブの長さは特に限定されておらず、また、特異的な領域の塩基配列の長さやＧＣ含量、Ｔｍ値によって変動し得るが、１０〜５０ｍｅｒであることが好ましい。プローブのＴｍは好ましくプライマーのＴｍ値より高く、より好ましくはそれより１０℃ほど高い。また、Ｔｍの上昇および特異性の向上のため、例えばＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ；アプライドバイオシステムズジャパン社製）を結合させてもよい。
【００２８】
毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的にハイブリダイズするプローブとしては、配列番号５の配列を有するものが好ましい。このプローブによれば、毛瘡白癬菌であるかどうかを正確に同定することができる。また、毛瘡白癬菌の有性世代であるＡｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ  ｖａｎｂｒｅｕｓｅｇｈｅｍｉｉもこのプローブによって検出されるが、両者は臨床症状も治療法も同じであるため、臨床上両者をさらに区別・同定する必要はない。また、紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的にハイブリダイズするプローブとしては、配列番号６の配列を有するものが好ましい。このプローブによれば、紅色白癬菌であるかどうかを正確に同定することができる。また、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍもこのプローブとハイブリダイズする。両者を区別するには、ＩＴＳ１領域の塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ５２０８４０およびＡＢ１９４２４６）を比較すること（例えば、ＰＣＲ増幅産物のシークエンシングを行うこと）によって達成できるが、爪白癬の起因菌としてＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍはごく稀であるため、臨床上両者を区別・同定する意味が殆どない。さらに、全真菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域に特異的にハイブリダイズするプローブとしては、配列番号７の配列を有するものが好ましい。このプローブによって表在性真菌を広範囲に検出することができ、また定量することにより、表在性真菌の全体量や爪白癬の起因菌が全真菌における割合も確認することができる。
【００２９】
配列番号５：５’−ＣＴＣＴＣＴＴＴＡＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣ−３’
配列番号６：５’−ＣＧＣＧＣＴＣＣＣＣＣＴＧＣ−３’
配列番号７：５’−ＴＴＹＡＡＣＡＡＹＧＧＡＴＣＴＣＴ−３’
【００３０】
本発明の同定方法に使用されるプローブはリアルタイムＰＣＲによって検出されるために標識する必要がある。標識プローブは当業者がリアルタイムＰＣＲシステムによって任意に選択できるが、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが好ましく用いられる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする塩基配列の５’末端に蛍光色素、３’末端にクエンチャー（消光色素）およびＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ  Ｇｒｏｏｖｅ  Ｂｉｎｄｅｒ）によって標識したプローブである。蛍光色素としては、ＦＡＭ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、Ｃｙ−３、ＲＯＸ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、およびＣｙ−５などが挙げられる。
【００３１】
ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、そのままの状態では、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。しかし、リアルタイムＰＣＲの増幅反応中において、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブがアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、さらに、伸長反応ステップの際に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのもつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発せられ、リアルタイムＰＣＲシステムによって検出される。また、検出される蛍光強度はサンプル中の標的ＤＮＡのコピー数に依存するため、検体中の菌体由来ＤＮＡを定量することもできる。
【００３２】
本発明において、目的に応じてプライマーセットおよびプローブを選択することができる。主な起因菌であるかどうかを確認する場合、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号５および／または配列番号６の配列を有するプローブとの組み合わせが好ましい。稀な起因菌を含めた広範囲の真菌の同定には、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットと、例えば配列番号５および／または配列番号６の配列を有するプローブなど各種起因菌に特異的なプローブとの組み合わせが好ましい。また、一つのプライマーセットおよび一つのプローブを添加した系（シングル系）のほか、複数のプライマーセットおよび複数のプローブを添加した系（マルチ系）を用いて複数の菌種を同時に同定することも可能である。マルチ系の場合、プライマーやプローブ同士が干渉し、検出感度が低下する可能性があるため、使用するプライマーやプローブの配合比や濃度を検討する必要がある。
【００３３】
本発明において、起因菌の菌種の同定は以下のように行われる。シングル系においては、プローブから遊離した蛍光色素が検出された場合、被験起因菌は当該プローブの特異的な菌種であると判定し、蛍光色素が検出されなかった場合、被験起因菌は当該プローブの特異的な菌種でないと判定する。マルチ系においては、複数のプローブが異なる蛍光色素によって標識されるため、検出された蛍光色素の種類に基づき、被験起因菌は当該蛍光色素が標識したプローブの特異的な菌種であると判定する。また、ＤＮＡの抽出・精製の失敗による偽陰性を排除するためには、内部標準物（インターナルコントロール）を使用してもよい。インターナルコントロールとしては当業者が適切に選択・モディファイすることができ、例えば、Ｖｏｌｌｍｅｒらが開発したＲＮＡ用インターナルコントロール（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｕｎｇｉ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００８  Ｊｕｎ；４６（６）：１９１９−２６．  Ｅｐｕｂ  ２００８  Ａｐｒ  ２．）をＤＮＡ用にモディファイすることができる。
【００３４】
本発明の同定キットは、プライマーセットおよびプローブを含み、リアルタイムＰＣＲ法を用いて爪白癬の起因菌を同定するための同定用キットである。プライマーセットが、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット、および、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットからなる群より選択される少なくとも一つであり、プローブが、配列番号５の塩基配列を有するプローブ、および、配列番号６の塩基配列を有するプローブからなる群より選択される少なくとも一つである。
【００３５】
本発明の同定キットは、上記特定のプライマーセットおよびプローブのほか、一般的なリアルタイムＰＣＲ用キットに含まれる試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファー、ポジティブコントロールテンプレートなどが含まれてもよい。使用利便性の観点から、ＰＣＲおよび蛍光検出するための試薬が全て適量でミックスされている状態で提供されることが好ましい。
【００３６】
本発明の同定キットは、同定目的に応じたプライマーセットおよびプローブの組合せを含むことが好ましい。主な爪白癬の起因菌を同定するためのキットは、配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットと、配列番号５または配列番号６の塩基配列を有するプローブとの組合せが好ましく使用される。稀な起因菌を同定するためのキットは、配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセットは好ましく含まれる。
【００３７】
複数のプライマーセットおよびプローブが含まれる同定キットは、一回のリアルタイムＰＣＲで複数の起因菌を同定できるため好ましい。この場合、プライマーセット同士やプローブ同士の干渉による検出感度の低下を防ぐため、ポジティブコントロールによって決定された最適な配合比および配合濃度のプライマーセットおよびプローブを含むキットが好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３９】
（実施例１）  プライマーセットおよびプローブの菌種特異性
爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の配列に特異的なプライマーセットおよびプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、菌種特異性を検討した。プライマーセットは、（１）配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号２の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット（ｄｅｒｍａＦ／ｄｅｒｍａＲ）、および、（２）配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号４の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット（ｄｅｒｍａＦ２／ｄｅｒｍａＲ２）の２種類を使用した。インターナルコントロール用プライマーセットとして、配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号９の塩基配列を有するプライマーとからなるプライマーセット（ＭＳ２−ＴＭ３−Ｆ／ＭＳ２−ＴＭ３−Ｒ）を使用した。プライマーは全てシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。
dermaF: 5’-TAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCT-3’
dermaR: 5’-TCGCTGCGTTCTTCATCGA-3’
dermaF2: 5’-SSCCCCATTCTTGTCTACMTYAC-3’
dermaR2: 5’-AACGCTCAGACTGACAGCTCTTC-3’
MS2-TM3-F: 5’- GGCTGCTCGCGGATACCC-3’
MS2-TM3-R: 5’-TGAGGGAATGTGGGAACCG -3’【００４０】
プローブは、（１）配列番号５の塩基配列の５’末端にＦＡＭ（商標）蛍光色素、３’末端にＮＦＱおよびＭＧＢによって標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（ＴＭＥ−ＩＴＳ１Ｆ）、（２）配列番号６の塩基配列の５’末端にＶＩＣ（商標）蛍光色素、３’末端にＮＦＱおよびＭＧＢによって標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（ＴＲＵ−ＩＴＳ１Ｖ）、（３）配列番号７の塩基配列の５’末端にＮＥＤ（商標）蛍光色素、３’末端にＮＦＱおよびＭＧＢによって標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（ＦＵ−ＩＴＳ１Ｎ）の３種類を使用した。（４）インターナルコントロール用プローブとして、配列番号１０の塩基配列の５’末端にＣｙ５蛍光色素、３’末端にＢＨＱ３によって標識したＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（ＭＳ２−ＴＭ２−Ｃｙ５）を使用した。なお、ＮＦＱ（Ｎｏｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ；商標）もＢＨＱ３（Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ３；商標）も非蛍光性消光剤（クエンチャー）である。プローブはアプライドバイオシステムズジャパン株式会社およびシグマアルドリッチジャパン株式会社より購入した。
TME-ITS1F: 5’-[FAM]-CTCTCTTTAGTGGCTAAAC-[NFQ-MGB]-3’
TRU-ITS1V: 5’- [VIC]CGCGCTCCCCCTGC-[NFQ-MGB]-3’
FU-ITS1N: 5’- [NED]TTYAACAAYGGATCTCT-[NFQ-MGB]-3’
MS2-TM2-Cy5: 5’-[Cy5]-ACCTCGGGTTTCCGTCTTGCTCGT-[BHQ3]-3’【００４１】
皮膚糸状菌などの様々な常在菌を各菌株保存施設より入手した。これらの菌株を通常の培養方法にしたがって培養し、フェノール／クロロホルム法で全ＤＮＡを抽出した。それぞれの全ＤＮＡをインビトロジェン社Ｑｕｂｉｔ定量キットにより定量し、０．３ｐｇ（概ね１００コピーのリボソーマルＤＮＡ遺伝子に相当する量）を鋳型とし、リアルタイムＰＣＲシステム７５００Ｆａｓｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。反応液（１９μＬ×５０反応分）の組成は以下の通りである。ウェルに１９μＬずつ分注し、上記抽出したＤＮＡを１μＬずつ入れた。
水                                          ３５７  μＬ
プライマー（３０μＭ）×４                  ６．５  μＬ×４
ＲＯＸ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｙｅ  ＩＩ    ２０    μＬ
プローブ（〜１５）μＭ）×４                ２０    μＬ×４
Ｐｒｅｍｉｘ                                ５００  μＬ
合計              ９５０  μＬ【００４２】
リアルタイムＰＣＲシステムの操作はメーカ取扱説明書に従った。初期ホールドは９５℃、３０秒、ＰＣＲ反応は、９５℃で１０秒、６０℃で３０秒を６０サイクル行った。リアルタイムＰＣＲの結果は表１に示した。増幅が見られた場合（陽性）を「＋」で示し、増幅が見られなかった場合（陰性）を「−」で示した。【００４３】
【表１】
0005992685.tif 000002
【００４４】
表１から、本検出系では、ＩＴＳ１領域の全長を増幅するｄｅｒｍａＦ／ｄｅｒｍａＲプライマーとＦＵ−ＩＴＳ１Ｎプローブにより広範囲の真菌を検出した。また、ｄｅｒｍａＦ／ｄｅｒｍａＲまたはｄｅｒｍａＦ２／ｄｅｒｍａＲ２とプローブとのセットで、共に毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、および、紅色白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）を特異的に検出できた。さらに、菌種特異的なプローブは当該菌種のみに反応し、それ以外の菌種には全く反応しなかった（種特異性１００％）。【００４５】
（実施例２）  リアルタイムＰＣＲの検出感度
爪白癬の起因菌のリボゾーマルＤＮＡのＩＴＳ１領域の配列に特異的なプライマーセットおよびプローブを用いて、本発明の同定方法の検出感度を検討した。ポジティブコントロールとして、インビトロジェン社ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔに付属するｐＣＲ２．１ベクターに、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓのＩＴＳ１領域をクローニングしたものを使用した。鋳型濃度を希釈して検出感度の下限を調べた。【００４６】
本検出系においては、各濃度あたり４回繰り返しのレプリケートで再現性を確認した。結果は表２に示した。１回の増幅を「＋」で示し、４回測定において全て増幅が見られた場合、「＋＋＋＋」で示した。【００４７】
【表２】
0005992685.tif 000003
【００４８】
鋳型が非常に希薄な領域においては有限な時間と少数の分子が関与する確率的なＰＣＲ増幅現象（ポアソン過程）となるため、陰性／陽性ではなく確率的な値、すなわち検出率で表した。検出系やそれぞれの立場で値は上下するが、一般的にリアルタイムＰＣＲ検出系での検出感度は９０〜９５％が境界として採用されているため、本検出系では１００％検出された鋳型濃度をその最低検出感度とした。本検出系において、リボソーマルＤＮＡ３〜５０コピーの鋳型があれば１００％増幅する結果となった。これは白癬などの真菌でおよそ１〜２細胞分に相当するため、実用的には十分な感度であると推定される。また、この検出感度は、１００〜５００コピーを必要とするｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法よりも２〜１６６倍感度が高いことが分かった。【００４９】
（実施例３  本発明の同定方法を用いた臨床試験）
爪真菌症未治療の皮膚科患者に熟練した医師により直接鏡検を行い、感染の有無を確認した。感染が確認された患者の爪に対してエタノール消毒後、爪の遠位側を爪切りまたはニッパーで切り取り採取した。採取した爪をビーズショッカー（多検体細胞破砕機）（安井器械株式会社）で粉砕し、糸状菌バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．０，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１００℃１０分間煮沸後、フェノール／クロロホルム抽出し、次いでエタノール沈澱してＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを５０μＬの超純水に溶解して保存した。得られたＤＮＡ含有液２５μＬを鋳型ＤＮＡサンプルとし、既知の濃度のポジティブコントロールと共に、実施例１の方法と同様にリアルタイムＰＣＲを行った。【００５０】
結果を表３に示した。表中、ＣＴは増幅カーブより得られる情報であり、設定された閾値に相当するＰＣＲサイクル数を示す。ＣＴよりは検量線法または比較ＣＴ法のいずれかを使用することにより鋳型量の定量的な見積ができる。今回は、大量検体に適した比較ＣＴ法を採用し、そこから算出される鋳型数を示した。なお、比較ＣＴ法はＰＣＲ効率が１００％であると仮定して、既知のポジティブコントロールとのＣＴの差を利用して鋳型数を概算する方法である。この方法は増幅効率の差による定量誤差が生じるというデメリットがあるが、対数的な挙動を示すＰＣＲにおいては些末な問題であると考えられる。そして臨床検体においてはソフトウェアＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（Ｒｕｉｊｔｅｒ  ＪＭら、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｂａｓｅｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄａｔａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００９  Ａｐｒ；３７（６）：ｅ４５．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｆｅｂ  ２２．）により増幅効率を確認したところ、実際には差がほとんどなかったため、比較ＣＴ法を使用した場合において増幅効率は殆ど問題でなく、鋳型のコピー数の概算量を求めることが可能であると判断した。【００５１】
対照として健常人の爪７人分を本発明の同定方法に付したところ、最大でも１００コピー程度の真菌の鋳型量しか検出されなかったため、１００コピー程度は通常でも常在しているものと考え、それ以上を爪白癬診断の目安とした。また、実際に臨床検体で検出された鋳型量はどれも１００コピーを大幅に上回ったため、この基準が適当であると考えた。【００５２】
表３より、熟練した医師により直接鏡検陽性と判断された３３例の爪白癬爪検体を本発明の同定方法で診断したところ、全例が陽性となった（検出精度１００％）。一方、培養法にて菌種が同定された検体は１５例であり、そのうち１３例が本発明の同定方法の判定結果と一致した。不一致の２例については、本発明の同定方法が種特異性１００％であることから、培養法が誤同定である可能性が考えられた。したがって、培養法による菌種同定が３９％であったのに対し、本発明の同定精度が１００％であった。また、培養法で菌種が同定できなかった残りの１６例については全て菌種同定された。一方、健常爪を本発明の同定方法に付しても白癬菌由来のシグナルは全く検出されず（７例全例）、擬陽性判定がないことも示された。なお、表３中、ＴＲはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍを表し、ＴＭはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓを表し、ＮＤは検出されなかったことを表し、また、ＩＴＳ１は、一応増幅バンドが見られたものの、同定には至らなかったものを表す。【００５３】
【表３】
0005992685.tif 000004
【００５４】
同様な方法で、皮膚白癬の起因菌を同定した結果は表４に示した。
【表４】
0005992685.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の同定方法によれば、爪白癬の起因菌を迅速かつ正確に同定することができ、治療方針の策定に有効な起因菌情報を提供できるため、産業上の利用可能性は大である。
【配列表】
0005992685000001.app