(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドと、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドとを含む、キメラウイルス様粒子であって、前記レンチウイルスＧａｇポリペプチドは、サル免疫不全ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスのものである、キメラウイルス様粒子。
【請求項２】
前記アルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドが、トリ白血病ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスに由来する、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
哺乳動物型グリコシル化をさらに含む、請求項１から２のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
前記ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
前記ウイルス様粒子の外部に前記アジュバントが配置される、請求項４に記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
前記ウイルス様粒子の内部に前記アジュバントが配置される、請求項４に記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
前記アジュバントが、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに共有結合して、共有結合を形成する、請求項４から６のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、パリビズマブである、請求項８に記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
さらなるＶＬＰ会合抗原をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
第２の抗原に連結された、さらなるＶＬＰ会合ポリペプチドをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
キメラウイルス様粒子を生成させる方法であって、
（ａ）レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを発現する、１または複数の発現ベクターを併せて用意するステップであって、ここで前記レンチウイルスＧａｇポリペプチドは、サル免疫不全ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスのものである、ステップと、
（ｂ）前記１または複数の発現ベクターを、培地中の真核細胞内に導入するステップと、
（ｃ）前記Ｇａｇポリペプチドおよび前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記キメラウイルス様粒子を生成させるステップと
を含む方法。
【請求項１３】
前記真核細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記真核細胞が培養されている前記培地から、前記ウイルス様粒子を回収するステップをさらに含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターがヘルパー細胞内で増殖される場合、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を下方制御するか、または前記真核細胞内で前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を上方制御する、転写制御因子を、前記ウイルスベクターがさらに包含する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写制御因子が、ｔｅｔレプレッサーまたはメタロチオネイン誘導性エンハンサーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記真核細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ  ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、ジャーカット細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３細胞、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群から選択される、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防するための組成物であって、免疫原性量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項２２】
免疫原性量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を含む医薬組成物。
【請求項２３】
呼吸器合胞体ウイルス感染に対する防御を提供するための組成物であって、免疫原性量の、請求項１から１１のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または請求項１２から２０のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆポリペプチド、およびレンチウイルスＧＡＧポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧＡＧポリペプチドを包含する、キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）の分野に関する。好ましい実施例では、該分野が、キメラＶＬＰおよびキメラＶＬＰを生成させる方法を包含する。ある実施形態では、キメラＶＬＰが、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）Ｇａｇポリペプチド、ラウス肉腫ウイルスＧａｇポリペプチド、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）Ｇａｇポリペプチド、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｇａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを含む。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、乳児および１歳未満の小児における、気管支炎および肺炎の主要原因である（ＣＤＣ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００４年）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）。ＲＳＶはまた、免疫不全成人および老齢者においても重要な下気道病原体であり得る。ＲＳＶの自然感染は、防御的免疫を誘導しないので、個体は、何度も感染する可能性がある。
【０００３】
ＲＳＶは、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科のＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属に属する、ネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＲＳＶのゲノムは、螺旋形のヌクレオカプシドにより取り囲まれており、少なくとも１０のタンパク質：３つの膜貫通構造タンパク質（Ｆタンパク質、Ｇタンパク質、およびＳＨタンパク質）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍタンパク質およびＭ２タンパク質）、３つのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質）、および２つの非構造タンパク質（ＮＳ１タンパク質およびＮＳ２タンパク質）をコードする（非特許文献１）。中和抗体を誘発するのは、Ｆタンパク質およびＧタンパク質だけであると考えられる。ＲＳＶは、Ｇタンパク質に基づき亜群Ａおよび亜群Ｂに分けられるが、Ｆタンパク質は、亜群間での関連がより緊密である。Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける中和効果、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防効果を有することが示されている（例えば、非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；ならびに特許文献１）。
【０００４】
数十年間にわたる研究にも関わらず、ＲＳＶの安全かつ有効なワクチンは存在しない。ホルマリンで不活化したウイルスワクチンが乳児および小児において調べられたが、感染に対する保護をもたらさず、野生型ＲＳＶウイルスによるその後の感染では、重度の症状を示す危険性の増大と関係付けられた（非特許文献７；非特許文献８）。また、温度感受性の弱毒化突然変異体による生ワクチンの開発に焦点を絞ったその後の試みも、弱毒化のレベルが適切な候補ウイルスの同定ができなかったため、および一部の候補ウイルスが遺伝子的に不安定であるために、失敗した（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００５】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、従来のワクチン法を上回る複数の利点をもたらす。ワクチン開発にとって重要なＶＬＰの利点は、ＶＬＰが、３次元構造、ならびに一次エピトープおよび立体構造エピトープのいずれに対しても中和抗体反応を誘導する能力の点で天然のウイルスを模倣し、したがって、他のワクチン製剤を上回る免疫原性を示すことである。ウイルスベクター法と異なり、ＶＬＰは、既存の免疫に対して問題を示さず、したがって、繰り返しの使用を可能とする。昆虫細胞において、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を、ＲＳＶマトリックス（Ｍ）タンパク質または異種Ｍタンパク質と共発現させることを介して、ＲＳＶ抗原を含有するＶＬＰの生成がなされている（特許文献２）。しかし、ＵＳ２００８／０２３３１０５０は、実際に、ＲＳＶ−Ｆタンパク質を、レンチウイルスＧＡＧタンパク質またはアルファレトロウイルスＧＡＧタンパク質と共に発現させることについては教示していない。加えて、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．６１／１１５，７８０における出願人らは、エンベロープウイルスのコア形成ポリペプチドの非存在下においてＲＳＶ−Ｆタンパク質を発現させることについて教示している。しかし、該出願人らは、ＲＳＶ−Ｆタンパク質と共発現させると、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ；ガンマレトロウイルス）のＧＡＧタンパク質が、ＶＬＰを効果的には形成しないことを見出した。したがって、天然のＲＳＶ  Ｍタンパク質以外の構造ポリペプチドにより形成されるコア上でＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するＶＬＰが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，８１８，２１６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８／０２３３１５０号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｏｌｌｉｎｓら（１９９６年）、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ、１３１３〜１３５１頁、Ｂ．Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ
【非特許文献２】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８８年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６２巻：４２３２〜４２３８頁
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８６年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏ．２３巻：４７５〜４８０頁
【非特許文献４】ＢｅｅｌｅｒおよびＣｏｅｌｉｎｇｈ、１９８９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：２９４１〜５０頁
【非特許文献５】Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら、１９８９年、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻：９２５〜３２頁
【非特許文献６】Ｔａｙｌｏｒら、１９８４年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５２巻：１３７〜１４２頁
【非特許文献７】Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６９年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９巻：４０５〜２１頁
【非特許文献８】Ｃｈｉｎら、１９６９年、Ａｍ．  Ｊ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９巻：４４９〜６３頁
【非特許文献９】Ｈｏｄｅｓら（１９７４年）Ｐｒｏｃ．  Ｓｏｃ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．、１４５巻、１１５８〜１１６４頁
【非特許文献１０】Ｋｉｍら（１９７３年）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、５２巻、５６〜６３頁
【非特許文献１１】Ｗｒｉｇｈｔら（１９７６年）Ｊ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、８８巻、９３１〜９３６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示の様々な態様は、キメラＶＬＰを生成させる方法およびキメラＶＬＰを含む組成物に対するこの必要を、本明細書で開示される様々な方法および組成物を提供することにより満たすものである。好ましい実施形態では、キメラＶＬＰが、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを含む。
【０００９】
開示される組成物のある態様は、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドと、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドとを含むキメラウイルス様粒子を包含し、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドが、本明細書の例で開示される呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドのアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。一部の実施形態では、Ｇａｇポリペプチドが、ヒト免疫不全ウイルス由来であり、本明細書の例で開示されるヒト免疫不全ウイルスＧａｇポリペプチドのアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し得るか、またはサル免疫不全ウイルス由来であり、本明細書の例で開示されるサル免疫不全ウイルスＧａｇポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。他の実施形態では、Ｇａｇポリペプチドが、トリ白血病ウイルス由来であり、本明細書の例で開示されるトリ白血病ウイルスＧａｇポリペプチドのアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。別の実施形態では、ウイルス様粒子が、哺乳動物型グリコシル化（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をさらに含む。
【００１０】
前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態ではまた、調製物が、ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含む。アジュバントを包含する、前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、該アジュバントを、ウイルス様粒子の外部に配置する場合もあり、ウイルス様粒子の内部に配置する場合もある。アジュバントを包含する、前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、該アジュバントを、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに共有結合し、共有結合を形成することができる。
【００１１】
前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに結合し得る（該ＲＳＶ  Ｆポリペプチドが、実質的に天然の立体構造にあることを裏付ける）。このような中和抗体を包含する、前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得るある実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、パリビズマブであり得る。
【００１２】
前出の実施形態または態様のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、キメラウイルス様粒子が、さらなるＶＬＰ会合抗原、または第２の抗原に連結された、さらなるＶＬＰ会合ポリペプチドをさらに含む。
【００１３】
別の態様は、キメラウイルス様粒子を生成させる方法であって、（ａ）レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドと、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドとを発現する１または複数の発現ベクターを併せて用意するステップであって、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドが、本明細書の例で開示される呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの核酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得るステップ；（ｂ）該１または複数の発現ベクターを、培地中の真核細胞内に導入するステップ；ならびに（ｃ）該レトロウイルスＧａｇポリペプチドおよび該呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを発現させて、該キメラウイルス様粒子を生成させるステップを含む方法を包含する。ある実施形態では、真核細胞が、酵母細胞または哺乳動物細胞である。ある実施形態では、真核細胞が、哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、Ｇａｇポリペプチドが、ヒト免疫不全ウイルスであり、本明細書の例で開示されるヒト免疫不全Ｇａｇポリペプチドの核酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し得るか、またはサル免疫不全ウイルス由来であり、本明細書の例で開示されるサル免疫不全ウイルスＧａｇポリペプチドのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。他の実施形態では、Ｇａｇポリペプチドが、トリ白血病ウイルスに由来し、本明細書の例で開示されるトリ白血病ウイルスＧａｇポリペプチドの核酸配列のうちのいずれかに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。別の実施形態では、ウイルス様粒子が、哺乳動物型グリコシル化をさらに含む。
【００１４】
前出の態様と組み合わせ得る別の実施形態では、該方法が、真核細胞を培養する培地から、ウイルス様粒子を回収するステップをさらに包含する。
【００１５】
前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、発現ベクターが、ウイルスベクターであり得る。前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択され得る。ウイルスベクターを包含する、前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、該ウイルスベクターがヘルパー細胞内で増殖される場合、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を下方制御するか、または真核細胞内では呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を上方制御する、転写制御因子を該ウイルスベクターがさらに包含する。ある実施形態では、転写制御因子が、ｔｅｔレプレッサーの場合もあり、メタロチオネイン誘導性エンハンサーの場合もある。前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、真核細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ  ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ジャーカット細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３細胞、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群から選択され得る。
【００１６】
前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、発現した呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに結合する（該ＲＳウイルスＦポリペプチドが、実質的に天然の折りたたみにあることを裏付ける）ことができる。中和抗体を包含する、前出の実施形態および態様と組み合わせ得る別の実施形態では、抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、パリビズマブである。
【００１７】
別の態様は、呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防する方法であって、対象に、免疫原性量の、該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの調製物、または該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により生成させた調製物を投与するステップを含む方法を包含する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与が、対象において防御的免疫反応を誘導する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与が、皮下送達（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮送達、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬（ｂｕｃｃａｌ）送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内（ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ）送達、肛門（ａｎａｌ）送達、および頭蓋内送達からなる群から選択され得る。
【００１８】
別の態様は、免疫原性量の、該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの調製物、または該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により生成させた調製物を含む医薬組成物を包含する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００１９】
別の態様は、呼吸器合胞体ウイルス感染に対する防御を提供する方法であって、対象に、免疫原性量の、該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの調製物、または該態様の前出の実施形態のうちのいずれかの方法により生成させた調製物を投与するステップを含む方法を包含する。前出の態様の実施形態のうちのいずれかと組み合わせ得る別の実施形態では、投与が、皮下送達（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮送達、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、および頭蓋内送達からなる群から選択され得る。
【００２０】
前出の態様およびそれらの実施形態は、本明細書で開示される実施形態のうちのいずれかとさらに組み合わせることができる。本明細書で開示される組成物および方法のさらなる態様は、本明細書の全体において見出すことができ、これらを、本明細書で開示される前出の実施形態および／またはさらなる実施形態のうちのいずれかと共に組み入れることができる。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドと、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドとを含む、キメラウイルス様粒子。
（項目２）
前記Ｇａｇポリペプチドが、サル免疫不全ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスに由来する、項目１に記載のウイルス様粒子。
（項目３）
前記Ｇａｇポリペプチドが、トリ白血病ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスに由来する、項目１に記載のウイルス様粒子。
（項目４）
哺乳動物型グリコシル化をさらに含む、項目１から３のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目５）
前記ウイルス様粒子と混合されたアジュバントをさらに含む、項目１から４のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目６）
前記ウイルス様粒子の外部に前記アジュバントが配置される、項目５に記載のウイルス様粒子。
（項目７）
前記ウイルス様粒子の内部に前記アジュバントが配置される、項目５に記載のウイルス様粒子。
（項目８）
前記アジュバントが、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに共有結合して、共有結合を形成する、項目５から７のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目９）
抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに結合する、項目１から８のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目１０）
前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、パリビズマブである、項目９に記載のウイルス様粒子。
（項目１１）
さらなるＶＬＰ会合抗原をさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目１２）
第２の抗原に連結された、さらなるＶＬＰ会合ポリペプチドをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載のウイルス様粒子。
（項目１３）
キメラウイルス様粒子を生成させる方法であって、
（ａ）レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを発現する、１または複数の発現ベクターを併せて用意するステップと、
（ｂ）前記１または複数の発現ベクターを、培地中の真核細胞内に導入するステップと、
（ｃ）前記Ｇａｇポリペプチドおよび前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを発現させて、前記キメラウイルス様粒子を生成させるステップと
を含む方法。
（項目１４）
前記真核細胞が、酵母細胞、哺乳動物細胞、または昆虫細胞である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記真核細胞が、哺乳動物細胞である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｇａｇポリペプチドが、サル免疫不全ウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスに由来する、項目１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｇａｇポリペプチドが、トリ白血病ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスに由来する、項目１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記真核細胞が培養されている前記培地から、前記ウイルス様粒子を回収するステップをさらに含む、項目１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記発現ベクターが、ウイルスベクターである、項目１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ウイルスベクターがヘルパー細胞内で増殖される場合、前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を下方制御するか、または前記真核細胞内で前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの発現を上方制御する、転写制御因子を、前記ウイルスベクターがさらに包含する、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記転写制御因子が、ｔｅｔレプレッサーまたはメタロチオネイン誘導性エンハンサーである、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記真核細胞が、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ  ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（ＴＭ）細胞、ジャーカット細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞、ＳＢ２０細胞、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３細胞、およびＣＥＭＸ１７４細胞からなる群から選択される、項目１３から２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
さらなるＶＬＰ会合抗原をさらに含む、項目１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
第２の抗原に連結された、さらなるＶＬＰ会合ポリペプチドをさらに含む、項目１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、発現した前記呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドに結合する、項目１３から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記抗ＲＳＶ−Ｆ中和抗体が、パリビズマブである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防する方法であって、対象に、免疫原性量の、項目１から１０のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または項目１３から２７のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を投与するステップを含む方法。
（項目２９）
前記投与するステップが、前記対象において防御的免疫反応を誘導する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記投与するステップが、皮下送達（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮送達、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、および頭蓋内送達からなる群から選択される、項目２８から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
免疫原性量の、項目１から１１のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または項目１３から２７のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を含む医薬組成物。
（項目３２）
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目３１に記載の医薬組成物。
（項目３３）
呼吸器合胞体ウイルス感染に対する防御を提供する方法であって、対象に、免疫原性量の、項目１から１１のいずれか一項に記載のウイルス様粒子、または項目１３から２７のいずれか一項に記載の方法により生成させたウイルス様粒子を投与するステップを含む方法。
（項目３４）
前記投与するステップが、皮下送達（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮送達、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）、筋肉内送達、経口（ｐｅｒｏｒａｌ）送達、経口（ｏｒａｌ）送達、鼻腔内送達、頬送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達、および頭蓋内送達からなる群から選択される、項目３３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ１のプラスミドマップを示す図である。
【図２】図２は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ２のプラスミドマップを示す図である。
【図３】図３は、ｐ３．１−Ｇａｇのプラスミドマップを示す図である。
【図４】図４は、ＲＳＶ  Ｆ発現ベクターおよびＧａｇ発現ベクターをトランスフェクトした細胞におけるＲＳＶ  Ｆの表面発現についてのサイトメトリーによる解析を示す図である。非トランスフェクト細胞およびｐ３．１−Ｇａｇを単独でトランスフェクトした細胞は、バックグラウンドの蛍光レベルを呈示する。ｐ３．１−Ｇａｇを伴うＲＳＶ  Ｆ発現ベクターをトランスフェクトした細胞、およびｐ３．１−Ｇａｇを伴わないＲＳＶ  Ｆ発現ベクターをトランスフェクトした細胞は、９Ｃ５モノクローナル抗体および蛍光二次抗体によるＦ検出の結果として、有意レベルの蛍光を示す。
【図５】図５は、Ｇａｇ遺伝子の共トランスフェクションを伴ってＲＳＶ  Ｆ遺伝子をトランスフェクトした細胞の培地、およびＧａｇ遺伝子の共トランスフェクションを伴わずにＲＳＶ  Ｆ遺伝子をトランスフェクトした細胞の培地に由来する、１００，０００×ｇによるペレットにおいて、ＲＳＶ  Ｆ抗原活性が検出されることを示す図である。
【図６】図６は、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇのプラスミドマップを示す図である。
【図７】図７は、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩのプラスミドマップを示す図である。
【図８】図８は、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇにｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩを加えたトランスフェクションに由来するＶＬＰによる、ＨＩＶ−１  Ｇａｇについてのウェスタンブロットを示す図である。「Ｇ」は、ｂｒｕＧａｇだけの発現を表示する。「Ｆ」は、Ｆ−ＧＰＩだけの発現を表示する。「１：１」、「３：１」、および「９：１」は、ｂｒｕＧａｇ対Ｆ−ＧＰＩの比を表示する。
【図９】図９は、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇにｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩを加えたトランスフェクションに由来するＶＬＰによる、ＲＳＶ  Ｆについてのウェスタンブロットを示す図である。「Ｇ」は、ｂｒｕＧａｇだけの発現を表示する。「Ｆ」は、Ｆ−ＧＰＩだけの発現を表示する。「１：１」、「３：１」、および「９：１」は、ｂｒｕＧａｇ対Ｆ−ＧＰＩの比を表示する。
【図１０】図１０は、トランスフェクトされた２９３Ｆ細胞から放出されるＶＬＰ内のｂｒｕＧａｇおよびＦ−ＧＰＩを示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを示す図である。銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、左パネルに示す。ウェスタンブロットを、右パネルに示す。
【図１１】図１１は、ｂｒｕＧａｇをコードするプラスミドおよびＦ−ＧＰＩをコードするプラスミドをトランスフェクトした後に、２９３Ｆ細胞から放出されるＶＬＰ内で、ＥＬＩＳＡによりＦ抗原が検出されたことを示す図である。黒丸は、ｂｒｕＧａｇ＋Ｆ−ＧＰＩ  ＶＬＰを表示する。濃いグレーの丸は、陰性対照を表示する。三角形は、ＲＳＶによる陽性対照を表示する。
【図１２】図１２は、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴのプラスミドマップを示す図である。
【図１３】図１３は、トランスフェクトされた２９３Ｆ細胞から放出されるＶＬＰ内のｂｒｕＧａｇ産物およびＲＳＶＦＴ産物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを示す図である。銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、左パネルに示す。ウェスタンブロットを、右パネルに示す。
【図１４】図１４は、ｂｒｕＧａｇをコードするプラスミドおよびＲＳＶＦＴをコードするプラスミドをトランスフェクトした後に、２９３Ｆ細胞から放出されるＶＬＰ内で、ＥＬＩＳＡによりＦ抗原が検出されたことを示す図である。黒丸は、ｂｒｕＧａｇ＋Ｆ−ＧＰＩ  ＶＬＰを表示する。濃いグレーの丸は、陰性対照を表示する。三角形は、ＲＳＶウイルスによる陽性対照を表示する。
【図１５】図１５は、２９３Ｆ細胞にプラスミドｐ３．１−ｂｒｕＧａｇおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴをトランスフェクトすることにより誘導し、陰性染色し、スクロースによりバンド形成させたＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】図１６は、マウスにＶＬＰを接種した後で、ＲＳＶ中和抗体反応が誘導されることを裏付ける、プラーク低減アッセイを示す図である。列１〜２は、それぞれ、対照のＳｙｎａｇｉｓ抗体およびヤギ抗ＲＳＶ抗体を用いるＲＳＶの中和を示す。列３〜４は、ナイーブマウスに由来する血清では中和が見られないことを示す。列５〜１０は、ＶＬＰ免疫化マウス血清において検出される中和活性を示す。列１１〜１２は、無抗体の対照および中和の欠如を示す。
【図１７】図１７は、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲのプラスミドマップを示す図である。
【図１８】図１８は、２９３Ｆ細胞にｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴをトランスフェクトした後に、Ｆ抗原によるａｌｖＧａｇ  ＶＬＰのシュードタイピングが、ＥＬＩＳＡにより検出されたことを示す図である。
【図１９】図１９は、２９３Ｆ細胞に、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴ、ならびにｐ３．１−ｂｒｕＧａｇおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴをそれぞれ共トランスフェクトした後に、Ｆ抗原によるａｌｖＧａｇ  ＶＬＰおよびＨＩＶＧａｇ  ＶＬＰのシュードタイピングが、ＥＬＩＳＡにより検出されたことを示す図である。黒丸は、ＲＳＶウイルスによる陽性対照を表示する。濃いグレーの丸は、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ＦＴ（３：１）を表示する。下向き三角形は、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ（３：１）を表示する。上向き三角形は、ＨＩＶＧａｇ＋ＦＴ（３：１）を表示する。
【図２０】図２０は、各種のＧａｇ産物をコードするベクターと共に、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴを共トランスフェクトすることにより生成される、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰが、ＥＬＩＳＡにより検出されたことを示す図である。黒丸は、ＭＰＭＶ−Ｇａｇ＋ＦＴを表示する。濃いグレーの丸は、ＢＬＶ−Ｇａｇ＋ＦＴを表示する。下向き三角形は、ＥＩＡＶ−Ｇａｇ＋ＦＴを表示する。上向き三角形は、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ＦＴを表示する。
【図２１】図２１は、レトロウイルスプロテアーゼ活性が無欠な、完全ａｌｖＧａｇポリタンパク質をコードするｐ３．１−ａｌｖＧａｇのプラスミドマップを示す図である。
【図２２】図２２は、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよび／またはｐ３．１−ａｌｖＧａｇと組み合わせてｐ３．１−ＲＳＶＦＴまたはｐ３．１−ＲＳＶＦＬをトランスフェクトした細胞の培地中で、ＲＳＶ  Ｆ抗原活性が検出されたことを示す図である。超遠心分離により培地からＶＬＰを回収し、次いで、底部がフィルターであるＥＬＩＳＡプレート上でこれを捕捉した。黒丸は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋ＦＬ（３：１）を表示する。濃いグレーの丸は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋ＦＴ（３：１）を表示する。下向き三角形は、Ｇａｇ＋ＦＬ（３：１）を表示する。上向き三角形は、Ｇａｇ＋ＦＴ（３：１）を表示する。黒四角形は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋Ｇａｇ＋ＦＬ（１０：１：３）を表示する。グレーの四角形は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋Ｇａｇ＋ＦＴ（１０：１：３）を表示する。グレーのダイアモンド形は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋Ｇａｇ＋ＦＬ（３：１：１．３）を表示する。薄いグレーのダイアモンド形は、Ｇａｇ−ｄＰＲ＋Ｇａｇ＋ＦＴ（３：１：１．３）を表示する。
【図２３】図２３は、細胞にプラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよび／またはｐ３．１−ａｌｖＧａｇをトランスフェクトした後に、ペレット化させたＶＬＰ内で、ＡＬＶ  Ｇａｇが、タンパク質分解によりプロセシングされることを示す、銀染色ＰＡＧＥを示す図である。レーンは、以下の通りである：レーン１：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ＦＬ（３：１）；レーン２：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ＦＴ（３：１）；レーン３：ａｌｖＧａｇ＋ＦＬ（３：１）；レーン４：ａｌｖＧａｇ＋ＦＴ（３：１）；レーン５：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ａｌｖＧａｇ＋ＦＴ（１０：１：３）；レーン６：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ａｌｖＧａｇ＋ＦＬ（１０：１：３）；レーン７：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ａｌｖＧａｇ＋ＦＬ（３：１：１．３）；およびレーン８：ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ａｌｖＧａｇ＋ＦＴ（３：１：１．３）。
【図２４】図２４は、２９３Ｆ細胞にプラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ、およびｐ３．１−ＲＳＶＦＴを１０：１：３の比でトランスフェクトすることにより誘導し、陰性染色し、スクロースによりバンド形成させたＶＬＰの電子顕微鏡写真を示す図である。
【図２５】図２５は、ＲＳＶ「ＦＴ」およびＲＳＶ「ＦＬ」でシュートタイピングしたＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰにより免疫化された、各種のマウス株における（パネルＡ）ＥＬＩＳＡによる力価、および（パネルＢ）プラーク低減による力価を示す図である。パネルＡ：ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されたＲＳＶウイルスに特異的な抗体力価。パネルＢ：プラーク低減による中和力価。
【図２６】図２６は、ｐ３．１−ＨＳＶｇＤのプラスミドマップを示す図である。
【図２７】図２７は、ＨＳＶｇＤ−およびａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞培養上清液についての直接的ＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２８】図２８は、ＨＳＶｇＤ−およびａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞の超遠心分離（ＵＣ）によるペレット化物質のイムノブロットを示す図である。パネル（Ａ）および（Ｂ）はいずれも、左から右に：基準（左に分子量を示す）；Ａ（トランスフェクション番号３１４−８５；表１を参照されたい）、Ｂ（トランスフェクション番号３１４−８５；表１を参照されたい）、Ｃ（トランスフェクション番号３１４−８５；表１を参照されたい）；基準；Ｄ（トランスフェクション番号３１４−９１；表１を参照されたい）、Ｅ（トランスフェクション番号３１４−９１；表１を参照されたい）、Ｆ（トランスフェクション番号３１４−９１；表１を参照されたい）、およびＧ（トランスフェクション番号３１４−９１；表１を参照されたい）を示す。パネル（Ａ）は、抗ＨＳＶｇＤモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットを示し、パネル（Ｂ）は、抗Ｐ２７ａｌｖＧＡＧポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロットを示す。
【図２９】図２９は、試料Ｃ：ｐ３．１−ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲだけをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞の超遠心分離（ＵＣ）によるペレット化物質についての２枚の電子顕微鏡写真を示す図である。いずれの電子顕微鏡写真も、５００ｎｍのスケールバーを示す。
【図３０】図３０は、試料Ｄ：ｐ３．１−ＨＳＶｇＤだけをトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞の超遠心分離（ＵＣ）によるペレット化物質についての５枚の電子顕微鏡写真を示す図である。５枚の電子顕微鏡写真すべてが、１０００ｎｍのスケールバーを示す。実線矢印は、約１５０〜２００ｎｍの、大型で三角形の粒子またはフォールド粒子を指し示す。破線矢印は、約９０〜１２０ｎｍの、小型で卵形〜球形の粒子を指し示す。
【図３１】図３１は、試料Ｆ：ｐ３．１−ＨＳＶｇＤおよびｐ３．１−ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ（２．３：１）をトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞の超遠心分離（ＵＣ）によるペレット化物質についての５枚の電子顕微鏡写真を示す図である。上部２枚の電子顕微鏡写真は、１０００ｎｍのスケールバーを示す。
【図３２】図３２は、ｐ３．１−ＳＩＶａｇｍＧａｇのマップを示す図である。
【図３３】図３３は、ＳＩＶａｇｍＧａｇをコードするプラスミドおよびＲＳＶＦＴをコードするプラスミドをトランスフェクトした後に、２９３Ｆ細胞から放出されるＶＬＰ内で、ＥＬＩＳＡによりＦ抗原が検出されたことを示す図である。
【図３４】図３４は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ＴＯのプラスミドマップを示す図である。
【図３５】図３５は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡＬＶ−Ｇａｇ−ｄＰＲのプラスミドマップを示す図である。
【図３６】図３６は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＴＯ−ＦＬのプラスミドマップを示す図である。
【図３７】図３７は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｄＰＲ−ＴＯ−ＦＬ−ｒｅｖのプラスミドマップを示す図である。
【図３８ａ】図３８は、（ａ）段階的なスクロース勾配の３０％の段階と６０％の段階との間で回収された、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰの可視的バンド、および（ｂ）Ｖｅｒｏ細胞にアデノウイルスベクターを形質導入することにより生成させた、ＲＳＶ  Ｆでシュートタイピングした精製ＶＬＰについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図３８ｂ】図３８は、（ａ）段階的なスクロース勾配の３０％の段階と６０％の段階との間で回収された、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰの可視的バンド、および（ｂ）Ｖｅｒｏ細胞にアデノウイルスベクターを形質導入することにより生成させた、ＲＳＶ  Ｆでシュートタイピングした精製ＶＬＰについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図３９】図３９は、Ｆ抗原の存在を示すＶＬＰについてのウェスタンブロットを示す図である。
【図４０】図４０は、アデノウイルスベクターを形質導入したＶｅｒｏ細胞に由来する最終的なＶＬＰ調製物中の、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰについての電子顕微鏡写真を示す図である。
【図４１】図４１は、ＲＳＶ  ＶＬＰにより免疫化されたコトンラットにおけるＲＳＶの中和力価を示す図である。
【図４２】図４２は、免疫化され、感作された、コトンラットの肺におけるウイルス力価を示す図である。
【図４３】図４３は、ＶＬＰで免疫化され、感作された、コトンラットにおける肺組織病理学スコア（肺胞炎および間質性肺炎）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書で開示される組成物および方法の様々な態様は、限定されることなく、少なくともＲＳＶ−Ｆポリペプチド、およびレンチウイルスＧＡＧポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧＡＧポリペプチドを包含するキメラＶＬＰ；このようなキメラＶＬＰを発現または生成させる（哺乳動物細胞による発現系においてであり得る）方法；このようなＶＬＰを、ワクチン組成物へとさらに加工する方法；ならびにこのようなワクチン組成物を用いる方法を包含する。
【００２３】
ある実施形態では、本明細書で開示されるキメラＶＬＰが、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを含む。
【００２４】
本明細書で開示されるキメラＶＬＰのある態様および実施形態は、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドを、マウス白血病ウイルスＧａｇタンパク質、メイソン−ファイザーサルウイルスＧａｇタンパク質、ウシ白血病ウイルスＧａｇタンパク質、およびウマ感染性貧血ウイルスＧａｇタンパク質を包含する、多数のレトロウイルスＧａｇタンパク質と共発現させると、ＶＬＰ量が顕著に低減される結果が得られ、これは、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドが、なんらかの形で、ＭＬＶ  Ｇａｇタンパク質の出芽機能に干渉することを示唆する、という驚くべき発見に基づいている。ＲＳＶ−Ｆポリペプチドの細胞外部分を、ＧＰＩアンカータグを介してＶＬＰへと係合させた構築物もなお、ＶＬＰの形成に干渉したので、この結果は、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドの細胞質テールと、ＭＬＶ  ｇａｇとの干渉には依存しない。これに対し、本明細書の例で裏付けられる通り、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドは、驚くべきことに、ラウス肉腫ウイルスＧａｇタンパク質、トリ白血病ウイルスＧａｇタンパク質、サル免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質、またはヒト免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質によるＶＬＰの形成には干渉しない。
【００２５】
キメラＶＬＰを生成させる例示的な方法は、具体的な実施形態では、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞であり得る、真核細胞内での発現を介し、さらなるポリペプチド抗原の共発現を包含し得る。
【００２６】
開示される方法およびプロトコールの実施は、別段に示唆されない限り、当業者の能力の範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学による従来の技法を使用する。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．  Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版、１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら（１９９５年、および定期的な補遺、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９、１３、および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．  Ｒｏｅ、Ｊ．  Ｃｒａｂｔｒｅｅ、およびＡ．  Ｋａｈｎ、１９９６年、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｊ．  Ｍ．  ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ  Ｏ’Ｄ．  ＭｃＧｅｅ、１９９０年、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ（編）、１９８４年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．  Ｍ．  Ｊ．  ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．  Ｅ．  Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ａ部：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００２７】
定義
本明細書で用いられる「キメラＶＬＰ」とは、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドと同時に発現させ得る、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドを用いて形成されるウイルス様粒子を指す。例には、限定されることなく、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの細胞質部分を実質的に欠く呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチド、または呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質部分を実質的に欠き、かつ、加えて、ＧＰＩアンカーシグナルに連結されている呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドを含むＶＬＰが包含される。
【００２８】
「哺乳動物型グリコシル化」とは、哺乳動物細胞発現系によりもたらされるグリコシル化パターンを指す。このようなグリコシル化パターンは、哺乳動物のグリコシル化酵素を包含するように改変された昆虫細胞が、哺乳動物発現系または哺乳動物細胞に基づく発現系により天然でもたらされるグリコシル化パターンではなく、「哺乳動物様」のグリコシル化をもたらす限りにおいて、このような改変昆虫細胞によりもたらされるグリコシル化パターンを包含しない。哺乳動物型グリコシル化パターンの非限定的な例には、ヒト（例えば、ＨＥＫ  ２９３、ＨｅＬａ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、イヌ（例えば、ＭＤＣＫ）細胞、マウス（例えば、Ｈ９）細胞、ラット（例えば、ＩＥ）細胞、および非ヒト霊長動物（例えば、ＮＣＴＣ）細胞が包含される。
【００２９】
本明細書で用いられる「Ｇａｇポリペプチド」には、レンチウイルス（ただし、ＥＩＡＶを除く）またはアルファレトロウイルスに由来する、任意のレトロウイルスＧａｇポリペプチドが包含される。本明細書で説明されるキメラＶＬＰのある実施形態は、ＡＬＶ  ＧａｇポリペプチドまたはＨＩＶ  Ｇａｇポリペプチドにより形成される。
【００３０】
レトロウイルスのゲノムは、３つの主要な遺伝子産物：構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子；逆転写酵素、ならびに関連するタンパク質分解ポリペプチド、ヌクレアーゼ、およびインテグラーゼに関連する機能をコードするｐｏｌ遺伝子；それによりコードされる糖タンパク質である膜タンパク質が、感染細胞表面上で検出され、また、放出された成熟ウイルス粒子の表面上でも検出されるｅｎｖ遺伝子による遺伝子産物をコードする。すべてのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子は、全体的な構造類似性を有し、各レトロウイルス群内において、そのアミノ酸レベルが保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除いたコアタンパク質をもたらす。
【００３１】
ＭＬＶでは、Ｇａｇ前駆体であるポリタンパク質が、Ｐｒ６５Ｇａｇであり、該前駆体におけるその順序がＮＨ２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ｐ１０−ＣＯＯＨである４つのタンパク質へと切断される。これらの切断は、ウイルス性プロテアーゼに媒介され、ウイルスに応じて、ウイルス放出の前に生じる場合もあり、ウイルス放出の後に生じる場合もある。ＭＬＶ  Ｇａｇタンパク質は、グリコシル化形態および非グリコシル化形態で存在する。グリコシル化形態は、非グリコシル化Ｐｒ６５ＧａｇのＡＵＧコドンより上流に位置する、異なるインフレームの開始コドンにより合成される、ｇＰｒ８０Ｇａｇから切断される。グリコシル化Ｇａｇを合成しないＭＬＶの欠失突然変異体もなお感染性であり、該非グリコシル化Ｇａｇもなおウイルス様粒子を形成し得ることから、グリコシル化イベントの重要性について疑問が生じる。ウイルスによりコードされるプロテアーゼを介してＨＩＶ−１  Ｇａｇ前駆体であるｐｒ５５Ｇａｇが翻訳後切断されると、Ｎ−ミリストイル化および内部リン酸化されたｐ１７マトリックスタンパク質（ｐ１７ＭＡ）、リン酸化ｐ２４カプシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、およびｐ１５ヌクレオカプシドタンパク質（ｐ１５ＮＣ）（これはｐ９およびｐ６へとさらに切断される）がもたらされる。
【００３２】
構造的には、原型的なＧａｇポリタンパク質が、レトロウイルスｇａｇ遺伝子では常に同じ順序で生じる３つの主要なタンパク質：マトリックスタンパク質（ＭＡ）（インフルエンザマトリックスタンパク質であるＭ１は、マトリックスという名称を共有しているが、ＭＡとは異なるタンパク質であり、これとは区別する）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）へと分けられる。Ｇａｇポリタンパク質の成熟タンパク質へのプロセシングは、レトロウイルスによりコードされるプロテアーゼを介して触媒され、新たに出芽したウイルス粒子が成熟するときに生じる。機能的には、Ｇａｇポリタンパク質が、３つのドメイン：細胞膜をＧａｇポリタンパク質の標的とする膜結合ドメイン；Ｇａｇの多量体化を促進する相互作用ドメイン；および宿主細胞から発生したビリオンの放出を促進する後期ドメインへと分けられる。アセンブリーを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。したがって、アセンブリードメインは、後期に形成される切断産物のうちのいずれかの内部にもれなく収まる必要がない。当技術分野の現況は、これらの重要な機能エレメントに関して、極めて進展している。例えば、Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６４巻、５３０６〜５３１６頁、１９９０年；Ｗｉｌｌら、ＡＩＤＳ  ５巻、６３９〜６５４頁、１９９１年；Ｗａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、７９５０〜７９５９頁、１９９８年；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７９巻、９２１〜９２８頁、１９９８年；ＳｃｈｕｌｔｚおよびＲｅｉｎ、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３巻、２３７０〜２３７２頁、１９８９年；Ａｃｃｏｌａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、２０７２〜２０７８頁、１９９８年；Ｂｏｒｓｅｔｔｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、９３１３〜９３１７頁、１９９８年；Ｂｏｗｚａｒｄら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、９０３４〜９０４４頁、１９９８年；Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７２巻、５６４〜５７７頁、１９９８年；Ｗｉｌｌｓら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６８巻、６６０５〜６６１８頁、１９９４年；Ｘｉａｎｇら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７０巻、５６９５〜５７００頁、１９９６年；Ｇａｒｎｉｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７３巻、２３０９〜２３２０頁、１９９９年を参照されたい。
【００３３】
レトロウイルスのＧａｇポリペプチド供給源の例には、アルファレトロウイルス（トリ白血病ウイルス、またはラウス肉腫ウイルスなど）、またはレンチウイルス（１型ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルスなど（ただし、ウマ感染性貧血ウイルスを除く））が含まれる。
【００３４】
トリ白血病ウイルスなどのアルファレトロウイルスは、他の大半のレトロウイルスの場合と同様に、それらのプロテアーゼドメインを、Ｐｏｌポリタンパク質ではなく、Ｇａｇポリタンパク質の一部として含有する。本明細書で説明される組成物および方法で用いられるＧａｇポチペプチドは、Ｃ末端のプロテアーゼドメインを実質的に欠いている場合がある。
【００３５】
本明細書で用いられる「脂質ラフト」とは、ウイルス粒子のアセンブリー過程においてｇａｇポリペプチドを濃縮することが可能であり、したがって、天然でそれに会合しているか、またはそれに会合したポリペプチドに連結されている、さらなる抗原を組み込む手段として用い得る、細胞膜のマイクロドメインを指す。
【００３６】
本明細書で用いられる「ＶＬＰ会合ポリペプチド」とは、ＶＬＰと直接的または間接的に会合する任意のポリペプチドを指すが、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドに干渉する、任意のエンベロープウイルスコア形成ポリペプチドは除外される。本明細書で開示される組成物および方法で用いられる具体的なＶＬＰ会合ポリペプチドは、該ＶＬＰの所望の使用、および該ＶＬＰ会合ポリペプチドの役割（例えば、１もしくは複数のさらなる抗原またはアジュバントを該ＶＬＰに結合させる役割）に依存する。
【００３７】
ＶＬＰ会合ポリペプチドは、内在性膜タンパク質または脂質ラフト会合部分の場合もあり、脂質による修飾など、膜との会合を引き起こすタンパク質修飾を介してＶＬＰと直接的に会合するタンパク質またはその部分の場合もあり、脂質ラフト会合ポリペプチドを介してＶＬＰと間接的に会合するポリペプチドの場合もある。
【００３８】
脂質アンカーを伴う多くのタンパク質は、脂質ラフトと会合する。このようなタンパク質の短い断片は、それら自身が天然で脂質ラフトと会合し得るわけではない他のタンパク質およびポリペプチドへと容易に結合させ得るので、脂質との結合に十分であることが多く、このような断片を脂質ラフトとの会合に理想的なものとしている。ポリペプチドを脂質ラフトへと連結する脂質アンカーには、ＧＰＩアンカー、ミリストイル化、パルミトイル化、および二重アセチル化が含まれる。
【００３９】
脂質ラフトと会合するポリペプチドには、多くの異なる種類がある。脂質ラフトは、シグナル伝達、膜トラフィキング、ウイルスの侵入、ウイルスアセンブリー、およびアセンブリーされた粒子の出芽を包含する、多数の生物学的活性のプラットフォームとして機能し、したがって、これらの過程に関与する各種のポリペプチドと会合する。
【００４０】
シグナル伝達カスケードに関与する各種のポリペプチドは、シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。シグナル伝達プラットフォームとして機能する脂質ラフトの１つの種類は、カベオラと呼ばれている。カベオラとは、カベオリンファミリーに由来するポリペプチド（例えば、カベオリンおよび／またはフロチリン（ｆｌｏｔｔｉｌｌｉｎ））を含有する、フラスコ形の原形質膜陥没部である。
【００４１】
膜トラフィキングポリペプチドは、膜トラフィキングプラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。例には、シンタクシン−１タンパク質、シンタクシン−４タンパク質、シナプシンＩタンパク質、アデューシンタンパク質、ＶＡＭＰ２タンパク質、ＶＡＭＰ／シナプトブレビンタンパク質、シナプトブレビンＩＩタンパク質、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、シナプトタグミンＩ、およびシナプトタグミンＩＩなど、エンドサイトーシスおよびエクソサイトーシス（ｅｘｃｏｃｙｔｏｓｉｓ）に関与するタンパク質が包含される。
【００４２】
ウイルス性受容体、受容体−共受容体複合体、ウイルスの侵入過程の調節を支援する他の任意のコンポーネントは、ウイルスの侵入に特化した膜トラフィキングプラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。脂質ラフトと会合するウイルス性受容体の例には、崩壊促進因子（ＤＡＦまたはＣＤ５５）、多くのエンテロウイルスの受容体であるＧＰＩアンカー膜糖タンパク質；ガングリオシド、Ｈｓｃ７０タンパク質、アルファ２−ベータ１インテグリンおよびアルファ５−ベータ２インテグリンを包含する、複数のコンポーネントを含有する複合体である、Ａ群ロタウイルスの受容体；ＨＩＶウイルス、ＭＬＶウイルス、麻疹ウイルス、およびエボラウイルスなど、複数のエンベロープウイルスの糖タンパク質；ならびにＣＤ５ポリペプチド、ＣＣＲ５ポリペプチド、およびｎｅｆポリペプチドなど、ＨＩＶの侵入に関与するポリペプチドが包含される。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｔｒｙ，  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｂｕｄｄｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｒａｆｔｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ＆  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  Ｒｅｖ．６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。
【００４３】
ウイルス粒子のアセンブリーに関与するポリペプチドは、ウイルスアセンブリープラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。ウイルス性ヌクレオカプシド、ウイルス性カプシド、またはウイルス性コアの形成の一因となる部分が除去されている限りにおいて、このようなポリペプチドまたはそれらの部分は、ＶＬＰ会合ポリペプチドとして用いることができる。このようなポリペプチドの例には、インフルエンザのエンベロープ糖タンパク質であるＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質、麻疹に由来するＨタンパク質およびＦ１−Ｆ２融合成熟タンパク質、ならびにＨＩＶに由来するｇｐ１６０タンパク質、ｇｐ４１タンパク質、およびＰｒ５５ｇａｇタンパク質が含まれる。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｔｒｙ，  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｂｕｄｄｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｒａｆｔｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  Ｒｅｖ．６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。
【００４４】
アセンブリーされたウイルスの出芽に関与するポリペプチドは、ウイルス出芽プラットフォームとして機能する脂質ラフトと会合する。宿主細胞からのＨＩＶ−１の出芽は、膜のラフトにおいて生じることをデータは示唆している。ＣｈａｚａｌおよびＧｅｒｌｉｅｒ、２００３年、Ｖｉｒｕｓ  Ｅｎｔｒｙ，  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，  Ｂｕｄｄｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｒａｆｔｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  Ｒｅｖ．６７巻（２号）：２２６〜２３７頁を参照されたい。ウイルスの出芽に関与するポリペプチドについての一般的な情報は、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第４版）、２００１年において見出すことができる。
【００４５】
一部のＶＬＰ会合ポリペプチドには、赤血球凝集素ポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、融合タンパク質ポリペプチド、糖タンパク質ポリペプチド、およびエンベロープタンパク質ポリペプチドなど、ウイルス性ポリペプチドが包含される。これらのポリペプチドの各々は、任意の種類のウイルスに由来し得る；しかし、ある実施形態は、ＨＩＶ−１ウイルスに由来するエンベロープタンパク質、呼吸器合胞体ウイルスまたは麻疹ウイルスに由来する融合タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはエボラウイルスに由来する糖タンパク質、および麻疹ウイルスに由来する赤血球凝集素タンパク質を包含する。
【００４６】
ある種の非ウイルス性病原体によるＶＬＰ会合ポリペプチドは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ；Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが包含されるがこれらに限定されない、病原性原虫、病原性蠕虫、および他の真核微生物病原体から得ることができる。このような非ウイルス性ＶＬＰ会合ポリペプチドは、そのＶＬＰ会合ポリペプチド自体が抗原として作用するので、天然では脂質ラフトと会合していない抗原に連結することなく用いることができる。
【００４７】
キメラＶＬＰにより包含され得るウイルス性ＶＬＰ会合ポリペプチドの例は、赤血球凝集素ポリペプチドである。本明細書で用いられる「赤血球凝集素ポリペプチド」は、インフルエンザウイルスが感染される細胞へと結合することを媒介するインフルエンザウイルスタンパク質に由来する。赤血球凝集素ポリペプチドはまた、同等の麻疹ウイルスタンパク質にも由来し得る。赤血球凝集素タンパク質は、単一の膜貫通ドメインを介してインフルエンザウイルスの表面に係合されていることが見出される、抗原性の糖タンパク質である。インフルエンザウイルスの赤血球凝集素については、少なくとも１６の亜型が同定され、Ｈ１〜Ｈ１６と標識されている。ヒトインフルエンザウイルスにおいて見出されるのは、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３である。赤血球凝集素Ｈ５および赤血球凝集素Ｈ７を伴う、高病原性トリインフルエンザウイルスがヒトに感染する割合は小さいことが判明している。赤血球凝集素Ｈ５がトリＨ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を著明に変化させることを可能とし、それらにヒト受容体に結合する能力をもたらすようにその受容体特異性を変化させる、トリインフルエンザウイルス株の赤血球凝集素Ｈ５型における単一のアミノ酸変化が、ヒト患者において見出されている（１０９および１１０）。この知見は、通常ではヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスが、どのようにして突然変異し、ヒト細胞に効率的に感染し得るようになるのかを説明する。
【００４８】
赤血球凝集素は、ホモ三量体の内在性膜ポリペプチドである。その膜貫通ドメインは、天然でラフト脂質ドメインと会合し、それを呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドと会合させて、ＶＬＰへと組み込むことを可能とする。赤血球凝集素は、円筒様の形状であり、約１３５Åの長さである。ＨＡを構成する３つの同一の単量体は、中央部のコイルドコイルおよびＶＬＰ表面上に曝露されているシアル酸結合部位を含有する球状ヘッドを形成する。ＨＡの単量体は、グリコシル化されて２つの小型のポリペプチド：ＨＡ１サブユニットおよびＨＡ２サブユニットへと切断される、単一のポリペプチド前駆体として合成される。ＨＡ２サブユニットは、膜へと係合する三量体のコイルドコイルを形成し、ＨＡ１サブユニットは、球状ヘッドを形成する。
【００４９】
本明細書で開示されるある種のＶＬＰにおいてＶＬＰ会合ポリペプチドとして用いられる赤血球凝集素ポリペプチドは、少なくとも膜アンカードメインを包含するものとする。赤血球凝集素ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの任意の類型、亜型、株、または亜株に由来することが可能であり、これらは、例えば、赤血球凝集素Ｈ１、赤血球凝集素Ｈ２、赤血球凝集素Ｈ３、赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７、および赤血球凝集素Ｈ９に由来し得る。加えて、赤血球凝集素ポリペプチドは、異なるインフルエンザ赤血球凝集素のキメラ体でもあり得る。赤血球凝集素ポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、そのコード配列へとスプライシングすることにより生成させ得る、天然では脂質ラフトと会合しない、１または複数のさらなる抗原を包含し得る。さらなるポリペプチドを赤血球凝集素ポリペプチドへと挿入するための例示的な部位は、Ｎ末端である。
【００５０】
ウイルス性ＶＬＰ会合ポリペプチドの別の例は、ノイラミニダーゼポリペプチドである。本明細書で用いられる「ノイラミニダーゼポリペプチド」は、糖タンパク質から末端のシアル酸残基を切断することにより、細胞からのインフルエンザウイルスの放出を媒介する、インフルエンザウイルスタンパク質に由来する。ノイラミニダーゼの糖タンパク質は、ウイルス表面に発現する。ノイラミニダーゼタンパク質は、四量体であり、ベータ−ピンホイール構造を伴う球状ヘッド、細いストーク状領域、および単一の膜貫通ドメインを介してウイルス膜に該タンパク質を係合させる小型の疎水性領域からなる共通の構造を共有する。シアル酸残基切断の活性部位は、すべてのＡ型インフルエンザウイルスにおいて保存されている１５の帯電アミノ酸により形成される各サブユニット表面においてポケット部分を包含する。インフルエンザノイラミニダーゼについては、少なくとも９つの亜型が同定されており、Ｎ１〜Ｎ９と標識されている。
【００５１】
本明細書で開示されるある種のＶＬＰで用いられるノイラミニダーゼポリペプチドは、少なくとも膜アンカードメインを包含するものとする。機能領域に関する当技術分野の現況は、極めて高度である。例えば、Ｖａｒｇｈｅｓｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３巻、３５〜４０頁、１９８３年；Ｃｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３巻、４１〜４４頁、１９８３年；Ｌｅｎｔｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６巻、５３２１〜５３８５頁、１９８７年；Ｗｅｂｓｔｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．１３５巻、３０〜４２頁、１９８４年を参照されたい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、インフルエンザウイルスの任意の類型、亜型、株、または亜株に由来することが可能であり、これらは、ノイラミニダーゼＮ１およびノイラミニダーゼＮ２に由来し得る。加えて、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラ体でもあり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは、１または複数のさらなるポリペプチドのコード配列を、赤血球凝集素ポリペプチドへとスプライシングすることにより生成させ得る、天然では脂質ラフトと会合しない、１または複数のさらなる抗原を包含し得る。さらなるポリペプチドをノイラミニダーゼポリペプチドのコード配列へと挿入するための例示的な部位は、Ｃ末端である。
【００５２】
ＶＬＰ会合ポリペプチドの別の例は、ファシクリンＩ（ＦａｓＩ）と称する、昆虫に由来する接着タンパク質である。本明細書で用いられる「ファシクリンＩポリペプチド」は、胚の発生に関与する昆虫タンパク質に由来する。この非ウイルス性タンパク質は、ＦａｓＩの脂質ラフト会合体をもたらす昆虫細胞のバキュロウイルス発現系で発現させることが可能である（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻、６２６５〜６２７３頁、２００３年）。したがって、ファシクリンＩポリペプチドに異種抗原を結合させ、ＲＳ  Ｆポリペプチドと共発現させると、キメラ分子がＶＬＰへと組み込まれる。本明細書で開示されるＶＬＰにおいて用いられるファシクリンＩポリペプチドは、少なくとも膜アンカードメインを包含するものとする。
【００５３】
ＶＬＰ会合ポリペプチドの別の例は、Ｇ糖タンパク質と称する、ＲＳＶに由来するウイルス性結合タンパク質である。本明細書で用いられる「Ｇグリコポリペプチド」は、ＲＳＶ  Ｇ糖タンパク質に由来する。近年のデータは、インフルエンザウイルスの粒子出芽にとってと同様、ＲＳＶの粒子出芽にとっても、脂質ラフトドメインが重要であることを裏付けている（Ｖｉｒｏｌ  ３２７巻、１７５〜１８５頁、２００４年；Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．１４９巻、１９９〜２１０頁、２００４年；Ｖｉｒｏｌ．３００巻、２４４〜２５４頁、２００２年）。ＲＳＶに由来するＧ糖タンパク質は、ウイルス性結合タンパク質、ならびにＲＳＶ感染に対する防御用抗原として用いられる、３２．５ｋＤの内在性膜タンパク質である。インフルエンザウイルスに由来する赤血球凝集素の場合と同様、Ｇ糖タンパク質の抗原性は、それに結合させた任意の非脂質ラフト抗原の抗原性を増強し得る。非脂質ラフト性外来抗原を結合させることを介してＧグリコポリペプチドに任意の修飾を施す結果として、該外来抗原に対する著明な免疫反応を誘導することが可能なキメラＶＬＰがもたらされる。
【００５４】
抗原
本明細書で開示される組成物および方法のある態様は、キメラＶＬＰと会合するさらなる抗原を包含する。このようなさらなる抗原は、同じ組成物中に包含することができ、共有結合または非共有結合を介してＶＬＰとさらに会合させることができる。ある実施形態では、Ｇａｇポリペプチドが、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドおよび／または他のＶＬＰ会合ポリペプチドを含有するキメラＶＬＰを形成するのに容易に適合可能なプラットフォームである。本節では、開示されるＶＬＰと共に用いられる例示的な抗原について説明する。
【００５５】
抗原とＶＬＰ会合ポリペプチドとの連結
天然ではＶＬＰと会合しない抗原を含有するＶＬＰを形成するための手段として、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドおよび／またはＶＬＰ会合ポリペプチドと該抗原との連結を形成することができる。ＶＬＰの免疫原性を増大させるか、多様な病原体に対する免疫原性を賦与するか、または特定の病原体の多様な株に対する免疫原性を賦与するために、ＶＬＰ会合ポリペプチドを、単一の抗原に連結することもでき、複数の抗原に連結することもできる。
【００５６】
抗原とＶＬＰ会合ポリペプチドとの連結は、その結果として該抗原をＶＬＰへと組み込むのに十分な任意の種類の連結であり得る。結合は、共有結合の場合もあり、イオン性相互作用の場合もあり、水素結合の場合もあり、イオン結合の場合もあり、ファンデルワールス力の場合もあり、金属−配位子間相互作用の場合もあり、抗体−抗原間相互作用の場合もある。ある実施形態では、連結が、ペプチド結合、炭素−酸素間結合、炭素−硫黄間結合、炭素−窒素間結合、炭素−炭素間結合、またはジスルフィド結合などの共有結合である。
【００５７】
抗原は、ＶＬＰ会合ポリペプチドとの既存の連結を伴う組換えにより生成させることもでき、単離物質として生成させ、次いで、後の時点でＶＬＰ会合ポリペプチドに連結することもできる。
【００５８】
抗原の種類
本明細書で用いられる抗原は、免疫反応を誘発することが可能であり、天然では脂質ラフトと会合しない任意の物質であり得る。抗原には、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質、およびタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを包含する）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖および他の分子のペプチド模倣体および非ペプチド模倣体、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が包含されるがこれらに限定されない。抗原が、天然ではＶＬＰと直接的にも間接的にも会合しないならば、ＶＬＰ会合ポリペプチドへの連結を伴わないＶＬＰへの組込みは期待されないであろう。抗原は、疾患または障害に関与する任意の抗原、例えば、微生物抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原、蠕虫抗原、酵母抗原など）、腫瘍抗原、アレルゲンなどであり得る。
【００５９】
抗原の供給源
本明細書で説明される抗原は、化学的または酵素的に合成することもでき、組換えにより生成させることもでき、天然の供給源から単離することもでき、以上の組合せの場合もある。抗原は、精製抽出物の場合もあり、部分精製抽出物の場合もあり、粗抽出物の場合もある。
【００６０】
ポリペプチド抗原は、液体クロマトグラフィー（例えば、高性能液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィー）、サイズ除外クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を包含する）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製法が包含されるがこれらに限定されない、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製法を用いて、天然の供給源から単離することができる。多くの実施形態では、抗原が、例えば、純度が約５０％〜約７５％であるか、純度が約７５％〜約８５％であるか、純度が約８５％〜約９０％であるか、純度が約９０％〜約９５％であるか、純度が約９５％〜約９８％であるか、純度が約９８％〜約９９％であるか、または純度が９９％を超える精製抗原である。
【００６１】
当業者に公知である固相ペプチド合成法を用いることができる。Ｊｏｎｅｓ、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）（１９９４年）を参照されたい。このような方法では一般に、固相に結合させた伸長するペプチド鎖に、活性化させた単量体ユニットを逐次的に付加することにより、ペプチドを生成させる。
【００６２】
ポリペプチドを生成させるには、十分に確立された組換えＤＮＡ法を、脂質ラフト会合ポリペプチドと同じベクター内で使用することができ、この場合、例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現構築物を、適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物中の単細胞実体として増殖させる真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞など、または原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養物中で増殖させる）のいずれか）において用いて、遺伝子改変された宿主細胞を生成させ、適切な培養条件下において、該遺伝子改変された宿主細胞によりタンパク質を生成させることができる。
【００６３】
ウイルス抗原
適切なウイルス抗原には、以下の群：Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（また、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、もしくはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称する））；また、ＨＩＶ−ＬＰなど、他の単離物；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスを包含する、胃腸炎を引き起こすウイルス株）；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒａｄａｅ）科（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、コロナウイルス）；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、エボラウイルス）；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、インフルエンザウイルス）；Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス）；Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ科（出血熱ウイルス）；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）；Ｂｉｍａｖｉｒｉｄａｅ科；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科（Ｂ型肝炎ウイルス）；Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）科（パルボウイルス）；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ科（大半のアデノウイルス）；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ科（１型および２型の単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ科（天然痘ウイルス、牛痘ウイルス、ポックスウイルス）；およびＩｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）；ならびに未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の病原因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトウイルスと考えられる）、非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎の病原因子（クラス１＝内部伝染による；クラス２＝非経口伝染による（すなわち、Ｃ型肝炎））；およびアストロウイルス）のうちの１または複数のウイルスと会合する抗原（例えば、これらにより合成される抗原）が包含される。
【００６４】
Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ（Ｎｏｒｖｉｒｕｓ）抗原
本明細書で開示されるＶＬＰは、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ科に由来する多様な抗原を包含し得る。また「ノーウォーク様ウイルス」とも称するノロウイルスは、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅウイルス科内の４つの属のうちの１つを表わす。Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ属内には、Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩおよびＧｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩと命名されている２つの主要な遺伝子群が存在する。Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩのＮｏｒｏｖｉｒｕｓ株には、ノーウォークウイルス、サウサンプトンウイルス、デザートシールドウイルス、およびチバウイルスが包含される。Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩのＮｏｒｏｖｉｒｕｓ株には、ヒューストンウイルス、ハワイウイルス、ローズデールウイルス、グリムズビーウイルス、メキシコウイルス、およびスノーマウンテンエージェントが包含される（Ｐａｒｋｅｒ，  Ｔ．Ｄ．ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）７９巻（１２号）：７４０２〜９頁；Ｈａｌｅ，  Ａ．Ｄ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏ．（２０００年）３８巻（４号）：１６５６〜１６６０頁）。ノーウォークウイルス（ＮＶ）は、急性ウイルス性胃腸炎の全世界的大流行の大半の原因となるヒトカリチウイルスの１つの群の原型株である。ノーウォークウイルスのカプシドタンパク質は、２つのドメイン：シェルドメイン（Ｓ）および突出ドメイン（Ｐ）を有する。Ｐドメイン（アミノ酸２２６〜５３０、ノーウォークウイルス株の番号付けによる）は、２つのサブドメインであるＰ１およびＰ２に分けられる。Ｐ２ドメインは、Ｐ１ドメイン内の１２７アミノ酸の挿入配列であり（アミノ酸２７９〜４０５）、フォールドした単量体の最も遠位側の表面に位置する。Ｐ２ドメインは、ノロウイルス株間でＶＰ１の最も保存の程度が低い領域であり、Ｐ２内の超可変領域が、受容体の結合および免疫反応性において重要な役割を果たすと考えられている。Ｐドメインの外部における位置を踏まえるなら、Ｐ２ドメインは、本明細書で開示されるＶＬＰワクチンの抗原として用いられる、例示的な抗原またはポリペプチドエピトープの供給源である。Ｐ２ドメインは、Ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩまたはＧｅｎｏｇｒｏｕｐ  ＩＩのＮｏｒｏｖｉｒｕｓ株の例示的な抗原である。さらに別の例は、ノロウイルス株の範囲にわたり保存されているＰ２ドメインの領域内に存在することが近年同定されたｍＡｂ  ６１．２１エピトープ、ならびにｍＡｂ  ５４．６エピトープである（Ｌｏｃｈｒｉｄｇｅ，  Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．（２００５年）８６巻：２７９９〜２８０６頁）。
【００６５】
インフルエンザ抗原
本明細書で開示されるＶＬＰは、赤血球凝集素抗原、ノイラミニダーゼ抗原、またはさらなるインフルエンザ抗原が包含されるがこれらに限定されない、インフルエンザに由来する多様な抗原を包含し得る。さらなるインフルエンザ抗原は、Ｍ２ポリペプチドである。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、スプライシングイベント後におけるＲＮＡのセグメント７（マトリックスセグメント）によりコードされる、９７アミノ酸の低分子ＩＩＩ型内在性膜タンパク質である（８０、８１）。ウイルス粒子上に存在するＭ２は極めてわずかであるが、感染細胞上においてより豊富に見出すことができる。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要な、プロトン選択性イオンチャネルとして用いられる（８２、８３）。感染時または従来のワクチン接種時における免疫原性は最小限であることから、その保存が説明されるが、代替的なフォーマットで存在する場合は、より免疫原性であり防御性である（８４〜８６）。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２モノクローナル抗体の受動伝達により、ウイルスクリアランスが加速化され、結果として防御がもたらされるという観察（８７）と符合する。Ｍ２の外部ドメインエピトープを、融合タンパク質として、ＨＢＶのコア粒子に連結すると、非経口接種および鼻腔内接種のいずれによっても、マウスにおいて防御性であり、３回のタンデムコピーを該コアタンパク質のＮ末端へと融合させると、最も免疫原性となる（８８〜９０）。これは、エピトープ密度が増大すると免疫原性が増大することを示す他のキャリア−ハプテンデータ（９１）と符合する。
【００６６】
Ｍ２ワクチンを鼻腔内送達する場合、良好な防御を達成するにはアジュバントが必要とされ、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）により良好な結果が達成されている。ペプチドはまた、ＫＬＨ、またはＮ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓの外膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスのＶＬＰなどのキャリアに化学的にコンジュゲートすることもでき、マウスおよび他の動物におけるワクチンとして防御性である（９２、９３）。
【００６７】
Ｍ２タンパク質は、高度に保存性ではあるが、配列の相違をまったく示さないわけではない。一般的な株であるＡ／ＰＲ／８／３４株（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８株（Ｈ３Ｎ２）のＭ２外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７株（Ｈ５Ｎ１）を除き、今日配列決定されている他のすべてのヒト株と、免疫学的に交差反応性であることが示された（９２）。インフルエンザデータベースの配列の検討からも、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４株など、他のより近年の病原性Ｈ５Ｎ１ヒト単離物のＭ２配列内において、同様の相違が示されている。この知見は、Ｍ２エピトープを組み込む、有効なＨ５特異的な流行性ワクチンが、ヒトＨ１単離物およびＨ３単離物中において現在行きわたっているＭ２配列ではなく、病原性のトリ株に固有のＭ２配列を反映する必要があることを裏付ける。
【００６８】
インフルエンザウイルスに由来するさらなるタンパク質（ＨＡ、ＮＡ、およびＭ２以外のタンパク質）も、共発現により、またはさらなる抗原の全部もしくは一部を、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドもしくは他のＶＬＰ会合ポリペプチドに連結することにより、ＶＬＰワクチン内へと組み込むことができる。これらのさらなる抗原には、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＮＳ１、およびＮＳ２が包含される。これら後者の抗原は、一般に、抗体反応を中和するための標的ではなく、Ｔ細胞により認識される重要なエピトープを含有し得る。このようなエピトープに対してＶＬＰワクチンにより誘導されるＴ細胞反応が、防御的免疫性を促進するのに有益であることが判明し得る。
【００６９】
他の病原性抗原
適切な細菌性抗原には、例えば、病原性Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種などの病原性グラム陽性菌；また、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ属、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）属のグラム陰性病原体などのグラム陰性病原体を包含する、各種の病原性細菌のうちのいずれかと関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が包含される。例えば、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，  Ｍ、Ｈ．  Ｍｅｄｏｆｆ、Ｄ．  Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９年）を参照されたい。
【００７０】
感染性の病原性真菌と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、およびＳｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉが包含されるがこれらに限定されない、感染性真菌と関連する抗原が包含される。
【００７１】
病原性原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）適切な抗原には、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなどのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ；Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ；Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ；Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ；Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどが包含されるがこれらに限定されない、原虫、蠕虫、および他の真核微生物病原体と関連する抗原が包含される。
【００７２】
適切な抗原には、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ種（例えば、Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．  ａｖｉｕｍ、Ｍ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．  ｋａｎｓａｓｉｉ（Ｍ．  ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．  ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＢ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ｖｉｒｉｄａｎｓ群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性の種）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉなどの病原性微生物と関連する（例えば、これらにより合成され、また、これらに内因性である）抗原が含まれる。病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ株の非限定的な例は、ＡＴＣＣ第３１６１８号、同第２３５０５号、同第４３８８６号、同第４３８９２号、同第３５４０１号、同第４３８９６号、同第３３９８５号、同第３１６１９号、および同第３１６１７号である。
【００７３】
細胞内病原体と関連する各種のポリペプチドまたは他の抗原のうちのいずれかを、ＶＬＰ内に包含することができる。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープとは、その断片が、ＭＨＣクラスＩ分子と併せて、ＣＤ８＋リンパ球の表面上におけるＴ細胞抗原受容体により認識される、例えば、これにより結合されるように、感染細胞の表面上に提示される、細胞内病原体と関連する（例えば、これによりコードされる）任意のポリペプチドである。細胞内病原体と関連するポリペプチドエピトープおよびペプチドエピトープは当技術分野において公知であり、これらには、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０またはその抗原性断片と関連する抗原；サイトメガロウイルス抗原；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗原（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど）；Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｃ  ｃａｒｉｎｉｉ）（ＰＣＰ）抗原；４１−３、ＡＭＡ−１、ＣＳＰ、ＰＦＥＭＰ−１、ＧＢＰ−１３０、ＭＳＰ−１、ＰＦＳ−１６、ＳＥＲＰなど、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍまたは他の任意のマラリア種と関連する抗原が包含されるがこれらに限定されない、マラリア抗原；真菌抗原；酵母抗原（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ種抗原）；Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ、または他のＴｏｘｏｐｌａｓｍａ種と関連する抗原が包含されるがこれらに限定されない、トキソプラズマ抗原；エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）による抗原；Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗原（例えば、ｇｐ１９０／ＭＳＰ１など）などが包含されるが、これらに限定されない。
【００７４】
別のＶＬＰワクチンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを指向してもよい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、好気性または通性嫌気性でグラム陽性の非運動性桿菌であり、幅１．０μｍ、長さ３．０〜５．０μｍである。Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、悪条件下でも耐性の高い内性胞子を形成し、これは、感染した動物がかつて死亡した場所で見出すことができる。本明細書で開示されるＶＬＰワクチン内で用いる抗原は、哺乳動物細胞上の受容体に結合し、Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓが疾患を引き起こす能力にとって極めて重要な、８３ｋＤａのタンパク質である防御抗原（ＰＡ）である。別の抗原は、対象においてＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに対する防御的免疫性を誘導するのに用い得る、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ  ＰＡのＣ末端における１４０アミノ酸の断片である。炭疽菌に対するＶＬＰワクチン内において用いられる他の例示的な抗原は、炭疽菌胞子に由来する抗原（例えば、ＢｃｌＡ）、該細菌の栄養期に由来する抗原（例えば、細胞壁抗原、被膜抗原（例えば、ポリ−ガンマ−Ｄ−グルタミン酸、すなわちＰＧＡ）、分泌抗原（例えば、防御抗原、致死性因子、または浮腫因子などの外毒素））である。ＶＬＰワクチンで用いる別の抗原は、Ｂ．  ａｎｔｈｒａｃｉｓに固有のアントロースを含有する四糖である（Ｄａｕｂｅｎｓｐｅｃｋ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．（２００４年）、２７９巻：３０９４５頁）。四糖は、ＶＬＰ会合ポリペプチドに連結することができ、これにより、ＶＬＰワクチンとの抗原の会合が可能となる。
【００７５】
腫瘍関連抗原
公知の各種腫瘍特異抗原または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）のうちのいずれかを、ＶＬＰに包含することができる。全ＴＡＡを用い得るが、その必要はない。代わりに、ＴＡＡの一部、例えば、エピトープを用いることができる。ＶＬＰ内で用い得る腫瘍関連抗原（またはそれらのエピトープを含有する断片）には、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＨＥＲ−２、高分子量黒色腫関連抗原であるＭＡＡ、ＧＤ２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＴＡＧ−７２、卵巣関連抗原であるＯＶ−ＴＬ３およびＭＯＶ１８、ＴＵＡＮ、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＯＦＰ、ＣＡ−１２５、ＣＡ−５０、ＣＡ−１９−９、腎腫瘍関連抗原であるＧ２５０、ＥＧＰ−４０（ＥｐＣＡＭとしても知られる）、Ｓ１００（悪性黒色腫関連抗原）、ｐ５３、およびｐ２１ｒａｓが包含されるがこれらに限定されない。前出のうちのいずれかを包含する、任意のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の合成類似体を用いることができる。さらに、１または複数のＴＡＡ（またはそれらのエピトープ）の組合せを、組成物中に包含することができる。
【００７６】
アレルゲン
一態様では、ＶＬＰワクチンの一部である抗原が、各種のアレルゲンのうちのいずれかであり得る。アレルゲンベースのワクチンを用い、対象におけるアレルゲンに対する忍容性を誘導することができる。チロシンとの共沈殿を伴うアレルゲンワクチンの例は、米国特許第３，７９２，１５９号、同第４，０７０，４５５号、および同第６，４４０，４２６号において見出すことができる。
【００７７】
各種のアレルゲンのうちのいずれかをＶＬＰ内に包含することができる。アレルゲンには、環境空中アレルゲン；ブタクサ／花粉症などの植物の花粉；雑草花粉アレルゲン；芝草花粉アレルゲン；ジョンソングラス；樹木花粉アレルゲン；ライグラス；イエダニアレルゲン（例えば、Ｄｅｒ  ｐ  Ｉ、  Ｄｅｒ  ｆ  Ｉなど）などのクモ形類動物アレルゲン；コナダニアレルゲン；スギ花粉／花粉症；カビ胞子アレルゲン；動物アレルゲン（例えば、イヌ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラット、マウスなどによるアレルゲン）；食物アレルゲン（例えば、甲殻類；ラッカセイなどの堅果；柑橘類によるアレルゲン）；昆虫アレルゲン；毒（膜翅目、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ  ｊａｃｋｅｔ）、ミツバチ、カリバチ、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）、ヒアリ）；ゴキブリ、ノミ、蚊などによる他の環境昆虫アレルゲン；連鎖球菌抗原などの細菌アレルゲン；Ａｓｃａｒｉｓ抗原などの寄生虫アレルゲン；ウイルス抗原；真菌胞子；薬物アレルゲン；抗生剤；ペニシリンおよび関連化合物；他の抗生剤；ホルモン（インスリン）、酵素（ストレプトキナーゼ）などの全タンパク質；不完全抗原またはハプテンとして作用することが可能なすべての薬物およびそれらの代謝物；ハプテンとして作用し、アレルゲンとして機能することが可能な、産業用化学物質および代謝物（例えば、酸無水物（トリメリト酸無水物など）およびイソシアン酸（ジイソシアン酸トルエンなど））；小麦粉（例えば、ベーカー喘息を引き起こすアレルゲン）、トウゴマ、コーヒー豆、また、上記で説明した産業用化学物質などの職業アレルゲン；ノミアレルゲン；ヒト以外の動物におけるヒトタンパク質が包含されるが、これらに限定されない。
【００７８】
アレルゲンには、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖のペプチド性および非ペプチド性模倣体、ならびに他の分子、低分子、脂質、糖脂質、ならびに炭水化物が包含されるが、これらに限定されない。
【００７９】
特定の天然の動物アレルゲンおよび植物アレルゲンの例には、以下の属：Ｃａｎｉｓ（Ｃａｎｉｎｅ）属（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属（例えば、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ）；Ｆｅｌｉｓ属（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；Ａｍｂｒｏｓｉａ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ））；Ｌｏｌｉｕｍ属（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅまたはＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（Ａｌｔｅｍａｒｉａ）属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ（Ａｌｔｅｍａｒｉａ  ａｌｔｅｍａｔａ））；Ａｌｄｅｒ属；Ａｌｎｕｓ属（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏａｓ））；Ｂｅｔｕｌａ属（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；Ｑｕｅｒｃｕｓ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）；Ｏｌｅａ属（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ））；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；Ｐｌａｎｔａｇｏ属（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ属（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓまたはＰａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）；Ｂｌａｔｔｅｌｌａ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）；Ａｐｉｓ属（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ属（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａ、およびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ属（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ）；Ｔｈｕｙａ属（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ属（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）；Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ属（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ属（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）；Ｓｅｃａｌｅ属（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）；Ｔｒｉｔｉｃｕｍ属（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；Ｄａｃｔｙｌｉｓ属（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；Ｆｅｓｔｕｃａ属（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）；Ｐｏａ属（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（Ｐｏａｐｒａｔｅｎｓｉｓ）またはＰｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；Ａｖｅｎａ属（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）；Ｈｏｌｃｕｓ属（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）；Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ属（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ  ｏｄｏｒａｔｕｍ）；Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ属（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｎ  ｅｌａｔｉｕｓ）；Ａｇｒｏｓｔｉｓ属（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；Ｐｈｌｅｕｍ属（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；Ｐｈａｌａｒｉｓ属（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；Ｐａｓｐａｌｕｍ属（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）；Ｓｏｒｇｈｕｍ属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；ならびにＢｒｏｍｕｓ属（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）に特異的なタンパク質が包含されるが、これらに限定されない。
【００８０】
哺乳動物細胞からキメラＶＬＰを作成する例示的な方法
キメラＶＬＰは、当業者が利用可能な任意の方法により作成することができる。キメラＶＬＰは、ＲＳＶ−Ｆポリペプチドを伴っている、ＶＬＰを形成する一因となるレンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドを包含する。加えて、キメラＶＬＰは、膜（脂質ラフトを包含する）会合ポリペプチドなど、１または複数のさらなるポリペプチドを包含することにより、（ＶＬＰまたはＲＳＶ−Ｆポリペプチドを形成する一因となる１または複数のポリペプチドの一部として、天然において、または人工的に存在する抗原以外の）さらなる抗原をもたらすことができる。ある実施形態では、ポリペプチドを、例えば、原形質膜内に脂質ラフトドメインを包含する哺乳動物細胞ベースの系を包含する、任意の利用可能なタンパク質発現系において、共発現させることができる。
【００８１】
ＶＬＰ用ポリペプチドの組換え発現は、該ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを伴う。ポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の技法を用いる組換えＤＮＡ法により、該ポリペプチドを生成させるためのベクターを生成させることができる。このようにして、本明細書では、ＶＬＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のうちのいずれかを含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製する方法が説明される。当業者に周知の方法を用いて、ＶＬＰポリペプチドをコードする配列と、適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。例えば、これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける組換えＤＮＡ法、合成法、また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける遺伝子組換えが包含される。したがって、本明細書で開示される方法および組成物は、すべてを１または複数のプロモーターに作動可能に連結した、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチド、および場合によって、１または複数のさらなるＶＬＰ会合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む複製可能なベクターを提供する。
【００８２】
本明細書で説明されるＶＬＰへとアセンブリーされる配列を発現させるのに用い得るベクターの非限定的な例には、ウイルスベースのベクター（例えば、レトロウイルスベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、アデノ随伴ウイルスベースのベクター、レンチウイルスベースのベクター、ポックスウイルスベースのベクター、バキュロウイルスベースのベクター）、プラスミドベクター、非ウイルス性ベクター、哺乳動物用ベクター、哺乳動物用人工染色体（例えば、リポソーム、粒子担体など）、およびこれらの組合せが包含される。
【００８３】
発現ベクター（複数可）は、コード配列と、適切な宿主における該コード領域の発現を可能とする発現制御エレメントとを含有することが典型的である。制御エレメントは一般に、プロモーター、エンハンサー、エクソン、イントロン、スプライシング部位、翻訳開始コドン、ならびに翻訳終結配列および転写終結配列、ならびにベクター内に挿入配列を導入するための挿入部位を包含する。翻訳制御エレメントは、Ｍ．  Ｋｏｚａｋ（例えば、Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．、Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ、７巻（８号）：５６３〜５７４頁、１９９６年；Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７６巻（９号）：８１５〜８２１頁、１９９４年；Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８巻（２号）：２２９〜２４１頁、１９８９年；Ｋｏｚａｋ，  Ｍ．およびＳｈａｔｋｉｎ，  Ａ．  Ｊ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６０巻：３６０〜３７５頁、１９７９年）により総説されている。
【００８４】
例えば、哺乳動物細胞における発現に用いられる典型的なプロモーターにはとりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ即初期プロモーターなどのＣＭＶプロモーター（ＣＭＶプロモーターは、イントロンＡを包含し得る）、ＲＳＶ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター（ＭＭＬＶ−ＬＴＲ）、ＦＩＶ−ＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルスプロモーターが包含される。また、マウスメタロチオネイン遺伝子に由来するプロモーターなど、他の非ウイルス性プロモーターも、哺乳動物における発現に用いられる。転写終結配列およびポリアデニル化配列もまた、翻訳停止コドンの３’側に配置されて存在することが典型的である。翻訳の開始を最適化するための配列もまた、コード配列の５’側に配置されて存在し得る。転写ターミネーター／ポリアデニル化シグナルの例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において説明されているＳＶ４０に由来する配列の他、ウシ成長ホルモンターミネーター配列が包含される。スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含有するイントロンもまた、本明細書で説明される構築物内にデザインすることができる（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１年）１９巻：３９７９〜３９８６頁）。
【００８５】
本発明ではまた、例えば、哺乳動物宿主細胞における構築物の発現レベルを増大させるのに、エンハンサーエレメントも用いることができる。例には、Ｄｉｊｋｅｍａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５年）４巻：７６１頁において説明されている、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９８２年ｂ）７９巻：６７７７頁において説明されている、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター、およびＣＭＶイントロンＡ配列（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１年）１９巻：３９７９〜３９８６頁）に包含されるエレメントなど、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ（１９８５年）４１巻：５２１頁において説明されているヒトＣＭＶに由来するエレメントが包含される。
【００８６】
ベクターは、本明細書で説明される１または複数の配列を含有し得ることが明らかである。例えば、単一のベクターは、ＶＬＰ内で見出されるすべてのタンパク質をコードする配列を保有し得る。代替的に、複数のベクターを用いることもできる（例えば、各々が単一のポリペプチドコード配列をコードする複数の構築物、または各々が１または複数のポリペプチドコード配列をコードする複数の構築物）。単一のベクターが複数のポリペプチドコード配列を含む実施形態では、配列を、同じベクター内の同じ転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することもでき、同じベクター内の異なる転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結することもできる。
【００８７】
加えて、免疫調節分子（例えば、以下で説明されるアジュバント）、例えば、免疫調節オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ）、サイトカイン、弱毒化細菌毒素などを含み、かつ／またはコードする配列が包含されるがこれらに限定されない、非ＲＳＶタンパク質をコードする１または複数の配列を発現させ、ＶＬＰへと組み込むことができる。
【００８８】
従来の技法により、発現ベクターを宿主細胞へと伝達することができ、次いで、従来の技法により、トランスフェクトされた細胞を培養し、ＶＬＰポリペプチド（複数可）を生成させることができる。したがって、本明細書で開示される組成物および方法は、異種プロモーターに作動可能に連結された、ＶＬＰポリペプチドのうちの１または複数をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。以下で詳述される通り、ＶＬＰを生成させるためのある実施形態では、レンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチド、および呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチド、ならびに場合によって、さらなるＶＬＰ会合抗原、またはさらなる抗原もしくはアジュバントに連結されたＶＬＰ会合ポリペプチドをコードするベクターを、宿主細胞において（共）発現させて、ＶＬＰを生成させることができる。
【００８９】
トランスフェクション、継代細胞株の確立（当業者に公知の標準的なプロトコールを用いる）、および／または対象のＲＳＶ遺伝子を保有するＤＮＡ分子の感染の後、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞において、ＶＬＰを生成させることができる。選択された遺伝子の転写を駆動する真核生物プロモーターまたはウイルスプロモーターの配列を最適化することにより、ＶＬＰの形成に必要とされるタンパク質の発現レベルを最大化する。ＶＬＰは培地内へと放出されるが、そこからＶＬＰを精製し、その後、ワクチンとして調合することができる。ＶＬＰは、感染性ワクチンではなく、したがって、ワクチンの不活化は必要とされない。
【００９０】
本明細書で説明される配列から発現させるレンチウイルスＧａｇポリペプチドまたはアルファレトロウイルスＧａｇポリペプチドが、その表面上に抗原性タンパク質を存在させるＶＬＰへと自己アセンブリーする能力は、所望の配列を共導入することにより、これらのＶＬＰを任意の宿主細胞内で生成させることを可能とする。多様に組み合わされた配列（複数可）（例えば、１または複数の発現ベクター内における）を、宿主細胞内へと安定的に統合することもでき、および／または一過性に統合することもできる。
【００９１】
適切な宿主細胞には、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、およびＸｅｎｏｐｕｓ細胞が包含されるがこれらに限定されない。
【００９２】
例えば、当技術分野では多数の哺乳動物細胞株が公知であり、これらには、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＷＩ  ３８細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ジャーカット細胞、ＨＵＴ細胞、ＳＵＰＴ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＯＬＴ４／クローン８細胞、ＭＴ−２細胞、ＭＴ−４細胞、Ｈ９細胞、ＰＭ１細胞、ＣＥＭ細胞、骨髄腫細胞（例えば、ＳＢ２０細胞）、ＬｔＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＷＩ−３８細胞、Ｌ２細胞、ＣＭＴ−９３細胞、およびＣＥＭＸ１７４細胞（このような細胞株は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）から入手可能である）などであるがこれらに限定されない、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．から入手可能な初代細胞ならびに不死化細胞株が包含される。
【００９３】
同様に、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種などの細菌宿主も、本発現構築物と共に用いられる。
【００９４】
本開示において有用な酵母宿主には、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが包含される。真菌宿主には、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓが包含される。
【００９５】
バキュロウイルスによる発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞にはとりわけ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが包含される。ＬａｔｈａｍおよびＧａｌａｒｚａ（２００１年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７５巻（１３号）：６１５４〜６１６５頁；Ｇａｌａｒｚａら（２００５年）Ｖｉｒａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８巻（１号）：２４４〜〜５１頁；ならびに米国特許公開第２００５５０１８６６２１号および同第２００６０２６３８０４号を参照されたい。
【００９６】
本明細書で示される開示を踏まえれば、ＶＬＰの呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドをコードする１または複数の配列（発現ベクター）を安定的に統合することにより、上記で説明した配列のうちの１または複数を発現する細胞株を容易に生成させることができる。安定的に統合された呼吸器合胞体ウイルスＦポリペプチドの配列（複数可）の発現を制御するプロモーターは、構成的プロモーターの場合もあり、誘導性プロモーターの場合もある。
【００９７】
キメラＶＬＰ生成細胞株が由来する親細胞株は、例えば、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞株、細菌細胞株を包含する、上記で説明した任意の細胞から選択することができる。ある実施形態では、該細胞株が、哺乳動物細胞株（例えば、２９３細胞、ＲＤ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＨＴ１０８０細胞、および骨髄腫細胞）である。哺乳動物細胞を用いてキメラＶＬＰを生成させることにより、（ｉ）ＶＬＰを形成すること；（ｉｉ）ミリストイル化、グリコシル化、および出芽が適正に行われること；（ｉｉｉ）哺乳動物以外の細胞夾雑物が存在しないこと；および（ｉｖ）精製が容易であることがもたらされる。
【００９８】
細胞株を創出することに加えてまた、さらなる抗原またはアジュバントを伴うかまたは伴わずに、レンチウイルスＧａｇまたはアルファレトロウイルスＧａｇをコードする配列、およびＲＳＶ−Ｆをコードする配列を、宿主細胞内で一過性に発現させることもできる。適切な組換え発現用宿主細胞系には、当技術分野において周知である、細菌系、哺乳動物系、バキュロウイルス／昆虫系、牛痘系、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）系、アデノウイルス系、アルファウイルス系（シンドビスウイルス系、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルス系）、哺乳動物系、酵母系、およびＸｅｎｏｐｕｓによる発現系が包含されるがこれらに限定されない。例示的な発現系は、哺乳動物細胞株、牛痘系、シンドビス系、昆虫系、および酵母系である。
【００９９】
例えば、以下の発現系：バキュロウイルスによる発現系（Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｐ．  Ｒ．ら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２年）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１巻：３７８頁（１９９１年）；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）、牛痘による発現系（Ｅａｒｌ，  Ｐ．  Ｌ．ら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら編）、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１年）；１９９２年８月４日に交付されたＭｏｓｓ，  Ｂ．ら、米国特許第５，１３５，８５５号）、細菌における発現系（Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ、Ｐａ．；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、酵母における発現系（参照により本明細書に組み込まれる、１９９８年３月１７日に交付されたＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ＳおよびＴｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ，  Ｐ．、米国特許第ＲＥ３５，７４９号；参照により本明細書に組み込まれる、１９９７年５月１３日に交付されたＳｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．、米国特許第５，６２９，２０３号；Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，  Ｇ．ら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、６２巻（１〜２号）：７９〜９３頁（１９９２年）；Ｒｏｍａｎｏｓ，  Ｍ．  Ａ．ら、Ｙｅａｓｔ  ８巻（６号）：４２３〜４８８頁（１９９２年）；Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｄ．  Ｖ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５巻（１９９０年）；Ｇｕｔｈｒｉｅ，  Ｃ．およびＧ．  Ｒ．  Ｆｉｎｋ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４巻（１９９１年））、哺乳動物細胞における発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒｏｕｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．；例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（Ｈａｙｎｅｓ，  Ｊ．ら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．１１巻：６８７〜７０６頁（１９８３年）；１９８３年、Ｌａｕ，  Ｙ．  Ｆ．ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．４巻：１４６９〜１４７５頁（１９８４年）；Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．  Ｊ．、「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、５３７〜５６６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９１年））、および植物細胞における発現系（植物用クローニングベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．；およびＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｔｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．；Ｈｏｏｄ，  Ｅ．ら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６８巻：１２９１〜１３０１頁（１９８６年）；Ｎａｇｅｌ，  Ｒ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．６７巻：３２５頁（１９９０年）；Ａｎら、「Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、およびＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ内のその他の論考、Ａ３巻：１〜１９頁（１９８８年）；Ｍｉｋｉ，  Ｂ．  Ｌ．  Ａ．ら、２４９〜２６５頁、およびＰｌａｎｔ  ＤＮＡ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ内のその他の論考（Ｈｏｈｎ，  Ｔ．ら編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｗｉｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ（１９８７年）；Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐ．  Ｇ．  ＪｏｎｅｓおよびＪ．  Ｍ．  Ｓｕｔｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ、１９９７年；Ｍｉｇｌａｎｉ、Ｇｕｒｂａｃｈａｎ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８年；Ｈｅｎｒｙ，  Ｒ．  Ｊ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ（１９９７年）を包含する、多くの適切な発現系が市販されている。
【０１００】
ＶＬＰの形成に必要とされるタンパク質をコードする改変遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞（複数可）へと導入し、その後、必要なレベルで発現させると、該ＶＬＰはアセンブリーされ、次いで、細胞表面から培地へと放出される。
【０１０１】
選択される発現系および宿主に応じて、粒子を形成するポリペプチドが発現し、ＶＬＰが形成され得る条件下で、発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより、ＶＬＰを生成させる。適切な増殖条件の選択は、当分野の技術範囲内である。
【０１０２】
次いで、密度勾配遠心分離、例えば、スクロース勾配、ＰＥＧ沈殿、ペレット形成など（例えば、Ｋｉｍｂａｕｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）６７巻：６９２９〜６９３６頁を参照されたい）、ならびに例えば、イオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを包含する標準的な精製法など、それらの完全性を保存する方法を用いて、粒子を単離（または実質的に精製）する。
【０１０３】
キメラＶＬＰ中における感染作用物質を不活化する例示的方法
電磁放射は、キメラＶＬＰの免疫原性を実質的に低下させることなく、感染作用物質を不活化することが可能なので、例示的な不活化の方法は、電磁放射を介する方法である。電磁放射の例示的な３つの方式のすべて（すなわち、光反応性化合物を伴うＵＶ照射、ＵＶ照射単独、およびガンマ照射）には、血液、食品、ワクチンなど、多種多様な試料中における病原体を不活化するのに用いられてきた長い歴史があるため、不活化用電磁放射を適用するための多種多様な装置が市販されており、これらは、本明細書で開示される方法を実施するのにほとんど〜まったく改変せずに用いることができる。さらに、当技術分野では、波長および線量の最適化がルーチン化しており、したがって、当業者の能力範囲内で容易に実施される。
【０１０４】
光反応性化合物を伴うＵＶ照射
電磁放射による例示的な不活化の方法は、感染作用物質中のポリヌクレオチドと反応する光反応性化合物などの、光反応性化合物の存在下における、ＵＶ−Ａ照射などの紫外線照射の組合せである。
【０１０５】
例示的な光反応化合物には、アクチノマイシン、アントラサイクリノン、アントラマイシン、ベンゾジピロン、フルオレン、フルオレノン、フロクマリン、マイトマイシン、Ｍｏｎｏｓｔｒａｌ  Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ、Ｎｏｒｐｈｉｌｌｉｎ  Ａ、フェナントリジン、フェナザチオニウム塩、フェナジン、フェノチアジン、フェニルアジド、キノリン、およびチオキサンテノン（ｔｈｉａｘａｎｔｈｅｎｏｎｅｓ）が含まれる。１つの分子種は、２つの主要なカテゴリーのうちの１つに属するフロクマリンである。第１のカテゴリーは、ソラーレン［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オン、または６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、直鎖状であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の６位に結合している。第２のカテゴリーは、イソソラーレン［２Ｈ−フロ（２，３−ｈ）−（１）−ベンゾピラン−２−オン、または４−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のデルタ−ラクトン］であり、これらは、曲鎖状であり、中央の芳香環部分に付随する２つの酸素残基が１，３の配向性を有し、またさらに、フラン環部分が二環クマリン系の８位に結合している。３、４、５、８、４’、または５’位において直鎖状フロクマリンを置換することによりソラーレン誘導体を生成させ得る一方、３、４、５、６、４’、または５位において曲鎖状フロクマリンを置換することによりイソソラーレン誘導体を生成させ得る。ソラーレンは、二本鎖核酸の塩基対間に挿入することができ、長波長の紫外光（ＵＶＡ）を吸収すると、ピリミジン塩基に対する共有結合付加体を形成する。例えば、Ｇ．  Ｄ．  Ｃｉｍｉｎｏら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４巻：１１５１頁（１９８５年）；Ｈｅａｒｓｔら、Ｑｕａｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７巻：１頁（１９８４頁）を参照されたい。
【０１０６】
例示的なＵＶ（または場合によって、可視光）放射の波長は、光付加体が生成される波長に依存し、これは、光反応性化学物質の化学反応に依存する。例示を目的として述べると、多くのソラーレンには、３２０〜３８０ｎｍの波長にあるＵＶ放射が極めて有効であり、３３０〜３６０ｎｍが最大の有効性を示す。
【０１０７】
ＵＶ照射単独
光反応性化合物の存在下におけるＵＶ照射に加え、感染作用物質は、ＵＶ照射単独でも不活化することができる。ある実施形態では、放射の波長が、約１８０〜３２０ｎｍ、または約２２５〜２９０ｎｍ、または約２５４ｎｍ（すなわち、ポリヌクレオチドの最高吸光度ピーク）であるＵＶＣ放射である。ＵＶＣ放射は、エンベロープを形成する脂質二重層など、本明細書で開示されるキメラＶＬＰのコンポーネントに対して、安定性および免疫原性の両面で有害性が低い一方で、感染作用物質を不活化するのに十分なエネルギーを保持するので、用いることができる。しかし、例えば、ＵＶＡおよびＵＶＢなど、他の種類のＵＶ放射もまた用いることができる。
【０１０８】
ガンマ照射
本明細書で開示される方法を実施して組成物を生成させるには、ガンマ照射（すなわち、イオン化放射）もまた用いることができる。ガンマ照射は、感染作用物質のゲノムをコードするポリヌクレオチド内において鎖の切断を導入することにより、感染作用物質を不活化することもでき、該ポリヌクレオチドを損傷させるヒドロキシルラジカルを生成することにより、感染作用物質を不活化することもできる。
【０１０９】
キメラＶＬＰを用いる例示的な方法
製剤
本明細書で説明されるキメラＶＬＰの例示的な使用は、ワクチン調製物としての使用である。典型的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液の注射剤として調製されるが、注射前に液体中に溶解させるか、または懸濁させるのに適する固体形態もまた調製することができる。このような調製物はまた、乳化させることもでき、乾燥粉末として生成させることもできる。免疫原性の有効成分は、薬学的に許容され、また、有効成分に適合する、賦形剤と混合することが多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノールなどであり、また、これらの組合せである。加えて、所望の場合、ワクチンは、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または該ワクチンの有効性を増強するアジュバントを含有し得る。
【０１１０】
ワクチンは、注射、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）注射、皮内注射、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）注射、または筋肉内注射を介する、従来の非経口投与が可能である。他の投与方式に適する、さらなる製剤には坐剤が包含され、場合によっては、経口製剤、鼻腔内製剤、口腔内製剤、舌下製剤、腹腔内製剤、膣内製剤、経肛門製剤、および頭蓋内製剤も包含される。坐剤の場合、従来の結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコール（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）またはトリグリセリドが包含される場合があり、このような坐剤は、０．５％〜１０％、または１〜２％の範囲でも、有効成分を含有する混合物から形成することができる。ある実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低温溶融ワックスをまず溶融させ、本明細書で説明されるキメラＶＬＰを、例えば、撹拌することにより、均一に分散させる。次いで、溶融した均一の混合物を、適当なサイズの鋳型に流し込み、冷却して固形化させる。
【０１１１】
鼻腔内送達に適する製剤には、液体（例えば、エアゾールまたは点鼻液として投与する水溶液）および乾燥粉末（例えば、鼻孔内への急速沈殿用）が包含される。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、およびキトサンなど、通常用いられる賦形剤を包含する。液体製剤または粉末製剤において、キトサンなどの粘膜付着剤を用いて、鼻腔内投与された製剤の粘液線毛クリアランスを遅延させることができる。マンニトールおよびスクロースなどの糖を、液体製剤では安定化剤として用いることができ、また、乾燥粉末製剤では安定化剤、充填剤、または粉末流動剤および粉末サイズ剤として用いることができる。加えて、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）またはＣｐＧオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）などのアジュバントを、液体製剤および乾燥粉末製剤の両方において、免疫刺激性アジュバントとして用いることもできる。
【０１１２】
経口送達に適する製剤には、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、トローチなどが包含される。経口送達に適する製剤には、錠剤、トローチ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが包含される。製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど、通常用いられる賦形剤を包含する。他のキメラＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、持続放出製剤、または粉末の形態を取る場合があり、１０〜９５％、または２５〜７０％の有効成分を含有する場合がある。経口製剤の場合、コレラ毒素が興味深い製剤パートナーである（また、可能なコンジュゲーションパートナーでもある）。
【０１１３】
膣内投与用に調合する場合、キメラＶＬＰワクチンは、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレーの形態であり得る。前出の製剤のうちのいずれもが、キメラＶＬＰに加えて、担体など、当技術分野で適切であることが公知の薬剤を含有し得る。
【０１１４】
一部の実施形態では、キメラＶＬＰを、全身送達用に調合する場合もあり、局所送達用に調合する場合もある。このような製剤は、当技術分野において周知である。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が包含される。静脈内媒体には、流体および栄養物質補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づく補給剤など）などが包含される。全身投与経路および局所投与経路には、例えば、皮内経路、局所適用経路、静脈内経路、筋肉内経路などが包含される。
【０１１５】
キメラＶＬＰは、中性製剤または塩ベースの製剤を包含するワクチンへと調合することができる。薬学的に許容される塩には、酸添加塩（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され、また、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される）が包含される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、また、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【０１１６】
ワクチンは、剤形に適合した形で、また、治療的に有効であり免疫原性となる量で投与することができる。投与量は、例えば、個体の免疫系が免疫反応を誘発する能力、および所望される防御の程度を包含する、治療される対象に依存する。適切な用量範囲は、１回のワクチン接種当たりの有効成分が数百マイクログラムのオーダーであり、例示的な範囲は、約０．５μｇ〜１０００μｇの範囲、またはさらに１μｇ〜５００μｇの範囲、または、約１０μｇ〜１００μｇの範囲など、約０．１μｇ〜２０００μｇの範囲である（１〜１０ｍｇの範囲にある高量も意図される）。初回投与および追加投与に適するレジメンもまた可変的であるが、初回投与にその後の接種または他の投与が続く形が典型的である。
【０１１７】
適用方式は多様に変化させることができる。従来のワクチン投与方法のうちのいずれもが適用可能である。これらには、固体の生理学的に許容されるベース上における経口適用、または注射など、生理学的に許容される分散剤による非経口適用が包含される。ワクチンの用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人の年齢、および抗原製剤により変化する。
【０１１８】
ワクチン製剤の一部は、製剤自体でワクチンとして十分に免疫原性であるが、他の製剤では、該ワクチンがアジュバント物質をさらに包含すると、免疫反応が増強される場合がある。
【０１１９】
とりわけ、鼻腔内ベース、経口ベース、または肺内ベースの送達製剤の場合、送達および免疫原性を改善するには、粘膜付着を改善する送達剤を用いることもできる。このような化合物である、キチンのＮ−脱アセチル化形態であるキトサンは、多くの医薬製剤で用いられる（３２）。それが粘液線毛クリアランスを遅延させ、粘膜による抗原の取込みおよびプロセシングのためにより多くの時間を許容する能力のために、キトサンは、鼻腔内におけるワクチン送達にとって魅力的な粘膜付着剤である（３３、３４）。加えて、キトサンは、密着結合を一過性に開口させ、これにより、ＮＡＬＴへの抗原の経上皮輸送が増強され得る。近年のヒト試験では、キトサンを伴うが、さらなるアジュバントは伴わずに、三価の不活化インフルエンザワクチンを鼻腔内投与したところ、筋肉内接種後に得られたセロコンバージョンおよびＨＩ力価をごくわずかに下回るセロコンバージョンおよびＨＩ力価がもたらされた（３３）。
【０１２０】
キトサンはまた、遺伝子的に解毒したＥ．  ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンの突然変異体であるＬＴＫ６３など、鼻腔内において良好に機能するアジュバントと共に調合することもできる。これにより、キトサンにより付与される送達および付着の利益の上に、免疫刺激効果が付加され、その結果、粘膜反応および全身反応の増強をもたらす（３５）。
【０１２１】
最後に、キトサン製剤はまた、ワクチンの安定性を改善し、さらに、粘液線毛クリアランスにおいて液体製剤を上回る遅延を結果としてもたらすことが示されている乾燥粉末フォーマットでも調製することができることに注目すべきである（４２）。これは、キトサンと共に調合された、鼻腔内用乾燥粉末によるジフテリア毒素ワクチンを伴う、近年のヒト臨床試験において見られ、ここで、鼻腔内経路は、従来の筋肉内経路と同程度に有効であり、分泌性ＩｇＡ反応の利益が付加された（４３）。該ワクチンはまた、忍容性も極めて良好であった。キトサンおよびＭＰＬを含有する炭疽菌用の鼻腔内乾燥粉末ワクチンは、ウサギにおいて、筋肉内接種より強力な反応を誘導し、また、エアゾールによる胞子投与に対しても防御的であった（４４）。
【０１２２】
鼻腔内ワクチンは、下気道に対してより良好に作用する非経口投与ワクチンに対して、上気道および下気道に作用し得るので、好ましい製剤を表わす。これは、アレルゲンベースのワクチンには忍容性を誘導し、また、病原体ベースのワクチンには免疫性を誘導する点で有益である。
【０１２３】
鼻腔内ワクチンは、上気道および下気道の両方において防御をもたらすのに加え、注射針による接種の煩雑さを回避し、また、粒子抗原および／または可溶性抗原が、鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）と相互作用することを介して、粘膜および全身における体液性反応および細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす（１６〜１９）。歴史的に、鼻腔内経路は、非経口接種ほど有効ではなかったが、新規の送達製剤であるキメラＶＬＰおよびアジュバントを用いることにより、この枠組みが変わりつつある。実際、鼻腔粘膜内にはシアル酸を含有する受容体が豊富であるため、鼻腔内送達には、機能性の赤血球凝集素ポリペプチドを含有するキメラＶＬＰがとりわけよく適しており、その結果、ＨＡ抗原の結合が増強され、粘液線毛クリアランスが低減される可能性をもたらす。
【０１２４】
アジュバント
ワクチンに対するアジュバント効果を達成する各種の方法が公知であり、本明細書で開示されるキメラＶＬＰと共に用いることができる。一般的な原理および方法は、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．  Ｓ．  Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．、ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６において詳述されており、また、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、１９９５年、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇら（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９においても詳述されている。
【０１２５】
一部の実施形態では、キメラＶＬＰワクチンが、重量ベースの比率約１０：１〜約１０１０：１のキメラＶＬＰ：アジュバント、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、または約１０９：１〜約１０１０：１のキメラＶＬＰ：アジュバントで、少なくとも１つのアジュバントと混合したキメラＶＬＰを包含する。当業者は、アジュバントに関する情報、また、最適の比を決定する日常的実験に関する情報により、適切な比率を容易に決定することができる。
【０１２６】
アジュバントの例示的な例には、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、合成脂質Ａ、脂質Ａの模倣体または類似体、アルミニウム塩、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、水中油エマルジョン、ビロソーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子、ポロキサマー粒子、マイクロ粒子、およびリポソームが包含され得るがこれらに限定されない。アジュバントは、細菌由来の外毒素ではないことが好ましい。好ましいアジュバントは、３ＤＭＰＬ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、またはＱＳ２１など、Ｔｈ１型反応を刺激するアジュバントである。
【０１２７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに由来する、脂質Ａの非毒性誘導体であるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）は、ワクチンアジュバントとして開発された、強力なＴＬＲ−４アゴニストである（Ｅｖａｎｓら、２００３年）。マウスによる前臨床研究では、鼻腔内ＭＰＬが、分泌性ならびに全身性の体液反応を増強することが示されている（Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら、２０００年；Ｙａｎｇら、２００２年）。ＭＰＬはまた、１２０，０００例を超える患者による臨床研究でも、ワクチンアジュバントとして安全かつ有効であることが分かっている（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００２年；２００４年）。ＭＰＬは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激し、したがって、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ウイルス、および寄生虫を包含する、広範な範囲にわたる感染性病原体に対して、非特異的な免疫反応を誘発することが可能である（Ｂａｌｄｒｉｃｋら、２００４年；Ｐｅｒｓｉｎｇら、２００２年）。鼻腔内製剤中にＭＰＬを包含することにより、ウイルス感作に由来する非特異的な免疫反応を誘発する自然反応が迅速に誘導される一方で、該ワクチンの抗原成分により生成させる特異的反応が増強される。
【０１２８】
したがって、一実施形態では、本発明が、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））または３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３  Ｄｅ−Ｏ−ａｃｙｌａｔｅｄ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ）（３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標））を、後天免疫および自然免疫の増強剤として含む組成物を提供する。化学的に述べると、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）とは、４位アシル化鎖、５位アシル化鎖、または６位アシル化鎖との３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい形態は、参照により本明細書に組み込まれる、欧州特許第０６８９４５４Ｂ１号（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ）において開示されている。別の実施形態では、本発明が、合成脂質Ａ、ＢｉｏＭｉｒａによるＰＥＴ  Ｌｉｐｉｄ  Ａなど、脂質Ａの模倣体もしくは類似体、またはＴＬＲ−４アゴニストと同様に機能するようにデザインされている合成誘導体を含む組成物を提供する。
【０１２９】
アジュバントの例示的な例は、キメラＶＬＰのポリペプチドコンポーネントと共発現させるか、または該ポリペプチドコンポーネントと融合させて、キメラポリペプチドを生成させることにより、本明細書で説明されるキメラＶＬＰに容易に添加し得るポリペプチドアジュバントである。鞭毛の主要なタンパク質成分である細菌性フラジェリンは、それが、ｔｏｌｌ様受容体であるＴＬＲ５を介する先天性免疫系により認識されるために、アジュバントタンパク質としてますます注目を集めているアジュバントである（６５）。ＴＬＲ５を介するフラジェリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟化および移動の他、マクロファージ、好中球、および腸上皮細胞の活性化も誘導することにより、先天性免疫機能および後天性免疫機能の両方に影響を及ぼし、その結果、炎症促進メディエーターを生成させる（６６〜７２）。
【０１３０】
ＴＬＲ５は、免疫学的圧力に応答するその突然変異を除外し、このタンパク質に固有であり、また、鞭毛機能に必要とされる、フラジェリン単量体内における保存的構造を認識する（７３）。該受容体は、１００ｆＭの濃度に対して感受性であるが、完全な線維は認識しない。鞭毛が単量体へと解体されることが、結合および刺激に必要とされる。
【０１３１】
アジュバントとしてのフラジェリンは、非経口投与または鼻腔内投与された異種抗原に対する防御反応を誘導する強力な活性を有し（６６、７４〜７７）、また、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果もまた報告されている（７８）。マウスまたはサルにおいてフラジェリンを用いると、Ｔｈ２バイアス（これは、インフルエンザなどの呼吸器ウイルスには適切である）は観察されるが、ＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。加えて、サルにおける鼻腔内投与または全身投与後における、局所炎症反応または全身炎症反応も報告されていない（７４）。ＴＬＲ５を介して、ＭｙＤ８８依存的な形でなされるフラジェリンシグナル、およびＴＬＲを介する、他のすべてのＭｙＤ８８依存的シグナルは、Ｔｈ１バイアスを結果としてもたらすことが示されている（６７、７９）ため、フラジェリンを使用した後で誘発される反応におけるＴｈ２の特徴は、ある意味で驚くべきことである。フラジェリンに対して予め存在する抗体が、アジュバントの有効性に対してさほどの影響を及ぼさない（７４）ことから、フラジェリンは、複数回使用のためのアジュバントとして魅力的となっていることが重要である。
【０１３２】
近年における鼻腔内ワクチン試験における共通の主題は、ワクチンの有効性を改善するアジュバントおよび／または送達系の使用である。このような一研究では、遺伝子的に解毒したＥ．  ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ  Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンが、Ｈ５による感作に対してヘテロ亜型的な防御を結果としてもたらしたが、これは、鼻腔内送達後に限られた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づき、これにより、新たなワクチンの開発における鼻腔内経路についての重要な示唆が示された（２２）。
【０１３３】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２、インターフェロン、および他の同様の増殖因子は、ポリペプチドコンポーネントと混合または融合させることにより、キメラＶＬＰワクチン内に容易に包含され得るので、これらもまたアジュバントとして用いることができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチン組成物が、５’−ＴＣＧ−３’配列を含む、核酸のＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンのＴＬＲ７リガンド；置換グアニンのＴＬＲ７／８リガンド；ロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、およびレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンドなど、Ｔｏｌｌ様受容体を介して作用する他のアジュバントを包含し得る。
【０１３５】
ある種のアジュバントは、樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント；毒素、サイトカイン、およびマイコバクテリア派生物などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；ＭＰＬ；および封入アジュバントからなる群から選択される。
【０１３６】
アジュバントのさらなる例には、緩衝生理食塩液中０．０５〜０．１パーセントの溶液として一般的に用いられる水酸化物またはリン酸などのアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、Ｎｉｃｋｌａｓ（１９９２年）Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３巻：４８９〜４９３頁を参照されたい）、０．２５パーセントの溶液として用いられる糖の合成ポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標））との混合物、それぞれ、７０℃〜１０１℃の範囲の温度で３０秒間〜２分間にわたる熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集物などの薬剤が包含され、また、架橋形成剤による凝集物も可能である。ペプシン処理した、アルブミンに対する抗体（Ｆａｂ断片）との再活性化による凝集物、Ｃ．  ｐａｒｖｕｍまたはグラム陰性菌の内毒素もしくはリポ多糖コンポーネントなどの細菌細胞との混合物、モノオレイン酸マンニド（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に許容される油媒体中におけるエマルジョン、または保護置換基として用いられる、ペルフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０パーセント溶液によるエマルジョンもまた用いることができる。スクアレンおよびＩＦＡなどの油との混合物もまた用いることができる。
【０１３７】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は、アジュバントの興味深い候補物質であるが、フロイントの完全アジュバントおよびフロイントの不完全アジュバントの他、ＱｕｉｌＡおよびＱＳ２１などのキラヤサポニンもまた興味深い。さらなる可能性には、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、およびトレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）など、リポ多糖のポリ［ジ（カルボキシレートフェノキシ）ホスファゼン（ｐｏｌｙ［ｄｉ（ｅａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）誘導体が包含される。例えば、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａなどのモノホスホリル脂質Ａをアルミニウム塩と併せた組合せを包含する、主にＴｈ１型の反応をもたらすリポ多糖ベースのアジュバントを用いることもできる。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから市販されている（例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号を参照されたい）。
【０１３８】
リポソーム製剤もまた、アジュバント効果を付与することが知られており、したがって、リポソームアジュバントは、キメラＶＬＰと併用して用いることができる。
【０１３９】
免疫刺激複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）アジュバントは、とりわけ、この型のアジュバントが、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することが可能であるため、キメラＶＬＰと共に用いることもできる。ＩＳＣＯＭマトリックスは、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａに由来する（場合によって画分された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質からなる。ＶＬＰ中のものなどの免疫原性タンパク質と混合する場合、結果として得られる粒子状製剤は、サポニンが６０〜７０％ｗ／ｗを占めることが可能であり、コレステロールおよびリン脂質が１０〜１５％ｗ／ｗ、およびタンパク質が１０〜１５％ｗ／ｗを占めることが可能な、ＩＳＣＯＭ粒子として公知の製剤である。免疫刺激複合体の組成および使用に関する詳細は、例えば、アジュバントを扱う上述の教科書中に見出し得るが、また、Ｍｏｒｅｉｎ  Ｂら、１９９５年、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３巻：４６１〜４７５頁の他、Ｂａｒｒ  Ｉ  ＧおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ  Ｇ  Ｆ、１９９６年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７４巻：８〜２５頁も、完全な免疫刺激複合体を調製するのに有益な教示を提供している。
【０１４０】
本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンとのアジュバントの組合せにおいて用い得るサポニンには、それらがｉｓｃｏｍ形態にある場合であれ、そうでない場合であれ、米国特許第５，０５７，５４０号、および「Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｋｅｎｓｉｌ，  Ｃ．  Ｒ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｈｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ、１９９６年、１２巻（１〜２号）：１〜５５頁；およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１で説明される、Ｑｕｉｌ  Ａと称する、Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮に由来するサポニン、ならびにそれらの画分が包含される。Ｑｕｉｌ  Ａの例示的な画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、およびＱＳ１７である。
【０１４１】
β−エスシンは、キメラＶＬＰのアジュバント組成物中で用いる別の溶血性サポニンである。エスシンは、メルクインデックス（第１２版：登録番号３７３７）において、ラテン名：Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍであるトチノキの種子内で発生するサポニンの混合物として説明されている。クロマトグラフィーおよび精製（Ｆｉｅｄｌｅｒ、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−Ｆｏｒｓｃｈ．４巻、２１３頁（１９５３年））による、およびイオン交換樹脂（Ｅｒｂｒｉｎｇら、米国特許第３，２３８，１９０号）によるその単離が、説明されている。エスシンの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ  Ｍら（Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（東京）、１９９６年８月；４４巻（８号）：１４５４〜１４６４頁））。β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）はまた、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）としても公知である。
【０１４２】
キメラＶＬＰにおいて用いる別の溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、メルクインデックス（第１２版：登録番号３２０４）において、Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａの種子に由来し、また、Ｇｉｓｖｏｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｏｃ．、１９３４年、２３巻、６６４頁；およびＲｕｈｅｎｓｔｒｏｔｈ−Ｂａｕｅｒ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９５５年、３０１巻、６２１頁において説明される手順により精製されるサポニンとして説明されている。その使用は、コレステロールを判定するための臨床試薬であると説明されている。
【０１４３】
アジュバント効果を達成する別の興味深い可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら、１９９２年において説明される技法を用いることである。略述すると、本明細書で開示されるキメラＶＬＰの抗原などの関与抗原の提示は、該抗原を、単球／マクロファージ上におけるＦＣ受容体に対する抗体（または抗原に結合する抗体断片）にコンジュゲートすることにより増強することができる。とりわけ、抗原と抗ＦＣＲＩとのコンジュゲートは、ワクチン接種のための免疫原性を増強することが示されている。該抗体は、キメラＶＬＰのポリペプチドコンポーネントのうちのいずれか１つに対する融合体としての発現によることを包含する生成後において、または該生成の一部として、キメラＶＬＰにコンジュゲートすることができる。
【０１４４】
他の可能性は、標的化物質および免疫調節物質（すなわち、サイトカイン）の使用を伴う。加えて、ポリＩ：Ｃなど、合成のサイトカイン誘導物質もまた用いることができる。
【０１４５】
適切なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、フロイントの完全アジュバント、ＲＩＢＩ（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ならびに、ＴＤＭおよびＴＤＥなど、トレハロースのジエステルからなる群から選択することができる。
【０１４６】
適切な免疫標的化アジュバントの例には、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体、またはこれらの特異的結合断片（上記の議論を参照されたい）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が包含される。
【０１４７】
適切なポリマーアジュバントの例には、デキストランなどの炭水化物、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、およびマンノース；塑性ポリマー；ならびにラテックスビーズなどのラテックスが包含される。
【０１４８】
免疫反応を調節するさらに別の興味深い方法は、「仮想リンパ節」（ＶＬＮ）（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ、Ｉｎｃ．、３６０  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．  １００１７−６５０１により開発された、特許品の医療デバイス）内に免疫原（場合によって、アジュバント、ならびに薬学的に許容される担体および媒体と併せて）を包含することである。ＶＬＮ（細長型の管状デバイス）は、リンパ節の構造および機能を模倣する。ＶＬＮを皮下に挿入することにより、サイトカインおよびケモカインの急増による無菌的炎症部位が創出される。Ｔ細胞およびＢ細胞の他、ＡＰＣも、危険シグナルに応答し、炎症部位へと至り、ＶＬＮの多孔性マトリックスの内部に蓄積される。ＶＬＮを用いると、抗原に対する免疫反応を誘発するのに必要とされる抗原用量が低下し、ＶＬＮを用いるワクチン接種により付与される免疫的防御が、Ｒｉｂｉをアジュバントとして用いる従来の免疫化を凌駕することが示されている。この技法は、Ｇｅｌｂｅｒ  Ｃら、１９９８年、「Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍｏｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｍａｌｌ  Ａｍｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ  ｔｈｅ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ」、「Ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃ、梗概、１９９８年１０月１２〜１５日、Ｓｅａｓｃａｐｅ  Ｒｅｓｏｒｔ、Ａｐｔｏｓ  Ｃａｌｉｆ．」において略述されている。
【０１４９】
キメラＶＬＰと共に、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いることができ、少なくとも３つ以上の、またはさらに、少なくとも６つ以上のヌクレオチドで隔てられた２つ以上のジヌクレオチドによるＣｐＧモチーフを含有することができる。ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドは、メチル化されていない）は、主にＴｈ１反応を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号において説明されている。
【０１５０】
このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、デオキシヌクレオチドであり得る。ある実施形態では、該オリゴヌクレオチド内のヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオエート結合であるか、またはホスホロチオエート結合であるが、骨格結合を混合したオリゴヌクレオチドを包含する、ホスホジエステル骨格、およびＰＮＡなど他のヌクレオチド骨格も用いることができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドまたはホスホロジチオエートを生成させる方法は、米国特許第５，６６６，１５３号、米国特許第５，２７８，３０２号、およびＷ０９５／２６２０４において説明されている。
【０１５１】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する。配列は、ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチド骨格を含有することができる。
【０１５２】
【化１】
0005917402.tif 000002
代替的なＣｐＧオリゴヌクレオチドには、これらに対する重要でない欠失または付加を伴う上記の配列が包含される。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知である任意の方法（例えば、ＥＰ４６８５２０）により合成することができる。例えば、自動合成器を用いてこのようなオリゴヌクレオチドを合成し得る。このようなオリゴヌクレオチドによるアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであり得る。別のアジュバント系は、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドと、サポニン誘導体との組合せを伴い、特に、ＣｐＧとＱＳ２１との組合せが、ＷＯ００／０９１５９において開示されている。
【０１５３】
多くの単相または複相のエマルジョン系が説明されている。エマルジョンが、キメラＶＬＰの構造を破壊しないように、当業者は、キメラＶＬＰと共に用いられるこのようなエマルジョン系を容易に適合させることができる。水中油エマルジョンによるアジュバントは、それ自体、アジュバント組成物として有用であることが示唆されており（ＥＰＯ３９９８４３Ｂ）、また、水中油エマルジョンと他の活性薬剤との組合せも、ワクチン用のアジュバントとして説明されている（ＷＯ９５／１７２１０；ＷＯ９８／５６４１４；ＷＯ９９／１２５６５；ＷＯ９９／１１２４１）。油中水エマルジョン（米国特許第５，４２２，１０９号；ＥＰ０４８０９８２Ｂ２）、および水中油中水エマルジョン（米国特許第５，４２４，０６７号；ＥＰ０４８０９８１Ｂ）など、他の油エマルジョンによるアジュバントが説明されている。
【０１５４】
本明細書で説明されるキメラＶＬＰと共に用いられる油エマルジョンによるアジュバントは、天然の場合もあり、合成の場合もあり、また、無機性の場合もあり、有機性の場合もある。鉱油および有機油の例は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１５５】
任意の水中油組成物が、ヒトへの投与に適するためには、エマルジョン系の油相が、代謝性油を包含していてよい。代謝性油という用語の意味は、当技術分野において周知である。代謝性とは、「代謝により変換可能であること」と定義することができる（「Ｄｏｒｌａｎｄ’ｓ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ」、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第２５版（１９７４年））。油は、受容者に毒性でなく、代謝により変換可能な、任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であることが可能である。堅果（ラッカセイ油など）、種、穀類が、植物油の一般的な供給源である。合成油も用いることができ、これらには、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）および他の油など、市販の油が包含され得る。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油中に高量で見出され、また、オリーブ油、コムギ胚種油、コメぬか油中、および酵母に低量で見出される不飽和油であり、キメラＶＬＰと共に用いることができる。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間体であるという事実により、代謝性油である（「メルクインデックス」、第１０版、登録番号８６１９）。
【０１５６】
例示的な油エマルジョンは水中油エマルジョンであり、特に、水中スクアレンエマルジョンである。
【０１５７】
加えて、キメラＶＬＰと共に用いる油エマルジョンによるアジュバントには、油であるα−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ０３８２２７１Ｂ１）などの、抗酸化剤が包含され得る。
【０１５８】
ＷＯ９５／１７２１０およびＷＯ９９／１１２４１は、場合によって、免疫刺激剤であるＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬと共に調合される、スクアレン、α−トコフェロール、およびＴＷＥＥＮ  ８０（ＴＭ）に基づくエマルジョンによるアジュバントを開示している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相へのステロールの添加による、これらのスクアレンエマルジョンに対する改善を開示している。加えて、エマルジョンを安定化させるために、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを、油相へと添加することができる（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０１５９】
安定的な水中油エマルジョン中で見出される油滴のサイズは、光子相関分光分析により測定したときに、１ミクロン未満であってよく、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲内、実質的に直径約３０〜５００ｎｍ、または、実質的に直径１５０〜５００ｎｍ、また、特に直径約１５０ｎｍであり得る。この点で、油滴数の８０％がこれらの範囲内にあるものとし、油滴数の９０％、または油滴数の９５％超が規定のサイズ範囲内にある。油エマルジョン中に存在する成分の量は、従来、スクアレンなどの油が２〜１０％の範囲内にあり；また、存在する場合、アルファトコフェロールが２〜１０％であり、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤が０．３〜３％である。油：アルファトコフェロールの比は、より安定的なエマルジョンがもたらされるため、１以下であり得る。ＳＰＡＮ  ８５（ＴＭ）もまた、約１％のレベルで存在し得る。一部の場合には、本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンが、安定化剤をさらに含有することが有利であり得る。
【０１６０】
水中油エマルジョンを生成させる方法は、当業者に周知である。一般に、該方法は、油相を、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合し、その後、ホモジナイザーを用いるホモジナイゼーションを包含するステップを包含するが、該混合物に、シリンジ針内を２回流過させるステップを含む方法が、小容量の液体をホモジナイズするのには適切であることが、当業者には明らかであろう。同様に、当業者は、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍ１１０Ｓ型マイクロ流体生成器、最大入力圧６バールで２分間にわたり、最大５０回の流過（約８５０バールの出力圧））内で乳化過程を適合させれば、より低量または高量のエマルジョンを生成させることができるであろう。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物が達成されるまで、結果として得られるエマルジョンの測定を含む日常的な実験により達成し得るであろう。
【０１６１】
本明細書で開示されるキメラＶＬＰによるワクチン調製物は、該ワクチンを、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮内投与、経皮投与、静脈内投与、または皮下投与を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物またはトリを防御または治療するのに用いることができる。ワクチン調製物を全身投与する方法には、従来のシリンジおよび注射針、または固体ワクチンを弾道送達するためにデザインされたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）、または注射針なしの高圧液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号；米国特許第５，９９３，４１２号）、または経皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０；ＷＯ９８／２８０３７）が包含され得る。キメラＶＬＰワクチンはまた、皮膚に貼付することもできる（経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）送達、ＷＯ９８／２０７３４；ＷＯ９８／２８０３７）。したがって、本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンは、キメラＶＬＰワクチンまたはアジュバントによる組成物を予め充填した全身投与用の送達デバイスを包含する。したがって、哺乳動物またはトリなどの個体において免疫反応を誘導する方法であって、本明細書で説明されるキメラＶＬＰ組成物のうちのいずれかを含み、また、場合によって、アジュバントおよび／または担体を包含するワクチンを該個体へと投与するステップを含み、該ワクチンが、非経口経路または全身経路により投与される方法が提供される。
【０１６２】
キメラＶＬＰによるワクチン調製物は、該ワクチンを、経口／経消化管経路、または経鼻経路などの粘膜経路を介して投与することにより、ウイルス感染を受けやすいか、またはこれを患う、哺乳動物またはトリを防御または治療するのに用い得る。代替的な粘膜経路は、膣内経路および直腸内経路である。粘膜投与経路は、経鼻経路を介し、鼻腔内ワクチン接種と称することができる。免疫化される個体の鼻咽頭内へと、ワクチンの液滴形態、スプレー形態、または乾燥粉末形態を投与することを包含する、鼻腔内ワクチン接種の方法は、当技術分野において周知である。噴霧化またはエアゾール化されたワクチン製剤が、本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンの形態として可能性があるものである。経口投与用の胃液耐性のカプセルおよび顆粒などの腸溶製剤、直腸内投与または膣内投与用の坐剤もまた、本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンの製剤である。
【０１６３】
本明細書で開示される、例示的なキメラＶＬＰによるワクチン組成物は、ヒトへの適用に適する経粘膜ワクチンのクラスを表わし、経粘膜ワクチン接種により全身ワクチン接種を代替する。
【０１６４】
キメラＶＬＰワクチンはまた、経口経路を介して投与することもできる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤にはまた、アルカリ性緩衝液、または腸溶性のカプセルもしくはマイクロ顆粒も包含され得る。キメラＶＬＰワクチンはまた、膣内経路によっても投与することができる。このような場合、薬学的に許容される賦形剤には、乳化剤、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）などのポリマー、また、膣内クリームおよび膣内坐剤である他の公知の安定化剤も包含され得る。キメラＶＬＰワクチンはまた、直腸内経路によっても投与することができる。このような場合、賦形剤には、直腸内坐剤を形成するために当技術分野で公知のワックスおよびポリマーも包含され得る。
【０１６５】
代替的に、キメラＶＬＰによるワクチン製剤は、キトサン（上記で説明した）または他のポリカチオンポリマー、ポリラクチド粒子およびポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、多糖または化学修飾した多糖からなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子などからなるワクチン媒体と組み合わせることができる。サポニンはまた、コレステロールの存在下において調合し、リポソームまたはＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成することもできる。さらに、サポニンは、非粒子状の溶液もしくは懸濁液中、または小ラメラリポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒子状構造内において、ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステルと併せて調合することができる。
【０１６６】
本明細書で説明されるキメラＶＬＰを用いる医薬組成物およびワクチン組成物中で用いられる、さらなる例示的なアジュバントには、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆ．、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ、例えば、Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９７年）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６５巻（５号）：１７１０〜１７１５頁を参照されたい）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍのアジュバントシステム番号２；ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油エマルジョン）；ＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍのアジュバントシステム番号４；ミョウバンおよびＭＰＬを含有する）；ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、およびＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ならびに、係属中の米国特許継続出願第０８／８５３，８２６号、および同第０９／０７４，７２０号において説明されるものなど、他のアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）が包含される。
【０１６７】
アジュバントの他の例には、ＨｕｎｔｅｒによるＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）；Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；ニトロセルロース（ＮｉｌｓｓｏｎおよびＬａｒｓｓｏｎ（１９９２年）Ｒｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３巻：５５３〜５５７頁）；Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのモンタニドアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；Ｓｅｐｐｉｃ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）など、鉱油エマルジョン、非鉱油エマルジョン、油中水エマルジョン、または水中油エマルジョンを包含する、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルジョンベースの製剤；およびＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＯＭ−１７４（脂質Ａと関連するグルコサミンジサッカリド）；Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの伸長因子；ＣＲＬ  １００５など、ミセルを形成する非イオン性のブロックコポリマー；ならびにＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が包含されるがこれらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ．１８巻（３号）：６９〜８５頁；および「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｄ．  Ｏ’Ｈａｇａｎ編（２０００年）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１６８】
他の例示的なアジュバントには、一般式
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ  （Ｉ）
［式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキル、またはフェニルＣ１〜５０アルキルである］のアジュバント分子が包含される。
【０１６９】
一実施形態は、一般式（Ｉ）［式中、ｎは１〜５０、４〜２４、または９であり；Ｒ成分はＣ１〜５０、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、またはＣ１２アルキルであり；また、Ａは結合である］のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン製剤からなる。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、０．１〜１０％、または０．１〜１％の範囲であるものとする。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルから選択される。ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックス（第１２版；登録番号７７１７）で説明されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９で説明されている。
【０１７０】
所望の場合、上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルを、別のアジュバントと組み合わせることができる。例えば、アジュバントの組合せは、上記で説明したＣｐＧを包含し得る。
【０１７１】
本明細書で開示されるキメラＶＬＰワクチンと共に用いるのに適する、薬学的に許容される賦形剤のさらなる例には、水、リン酸緩衝生理食塩液、等張性緩衝液が包含される。
【０１７２】
開示される組成物および方法は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解されるであろう。本明細書で説明される通り、本発明は、場合によって、抗原またはアジュバントに連結した、さらなるＶＬＰ会合ポリペプチドを含む、キメラＶＬＰを包含する。以下の実施例では、キメラＶＬＰを包含する、本発明の代表的な実施形態が説明される。
【実施例】
【０１７３】
（実施例１）
ＭＬＶ  ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰをシュードタイピングする試み
本例は、細胞質テール領域を欠くＲＳＶ融合（Ｆ）糖タンパク質の切断形、またはインフルエンザ赤血球凝集素に由来する膜貫通領域および細胞質テール領域を含有するハイブリッドＦタンパク質を哺乳動物細胞により発現させる結果として、ＲＳＶ  Ｆを含有するエンベロープウイルス様粒子（ＶＬＰ）が形成されることを裏付ける。
【０１７４】
本例は、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質を、マウス白血病ウイルスＧａｇ遺伝子産物を共発現する哺乳動物細胞、およびマウス白血病ウイルスＧａｇ遺伝子産物を共発現しない哺乳動物細胞において発現させるようにデザインした。ＲＳＶ  Ｆを、該細胞から出芽するエンベロープＧａｇ  ＶＬＰへと組み込むことを期待した。
【０１７５】
プラスミドｐ３．１−ＲＳＶＦＴにより、その細胞質テールは欠くが、天然の膜貫通ドメインは含有する、Ｆの切断形（ＲＳＶＦＴ）をコードさせた。ｐ３．１−ＲＳＶＦＴのマップを図１６に示し、ＲＳＶＦＴのコード配列を以下の通りに示す。
【０１７６】
【化２】
0005917402.tif 000003
天然のＲＳＶ  Ｆ遺伝子は、細胞の細胞質において複製され、したがって、細胞の核においては適切に発現しないと予測される、パラミクソウイルスに由来するので、ＲＳＶＦＴのコード配列は、特製の合成ＤＮＡ断片として合成し、ウイルスからはクローニングしなかった。コードされるＲＳＶＦＴのアミノ酸配列は、以下の通りである（シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを大文字とする）。
【０１７７】
【化３】
0005917402.tif 000004
プラスミドｐ３．１−ｓｈＦｖ１により、Ａ型インフルエンザに由来する赤血球凝集素Ｈ５の膜貫通ドメインおよび細胞質テールへと融合させたＲＳＶ  Ｆの外部ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードさせた。図１は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ１のマップを示し、ｓｈＦｖ１のコード配列は以下の通りである。
【０１７８】
【化４】
0005917402.tif 000005
【０１７９】
【化５】
0005917402.tif 000006
ｓｈＦｖ１のアミノ酸配列は、以下の通りである（シグナルペプチドのコード配列、ならびにＨＡの膜貫通および細胞質テールの配列を大文字で示す）。
【０１８０】
【化６】
0005917402.tif 000007
【０１８１】
【化７】
0005917402.tif 000008
ＲＳＶＦＴと同様に、ｓｈＦｖ１のコード配列を、ＤＮＡ合成により生成させた。
【０１８２】
プラスミドｐ３．１−ｓｈＦｖ２により、Ａ型インフルエンザに由来する赤血球凝集素Ｈ５の膜貫通ドメインおよび細胞質テールへと融合させたＲＳＶ  Ｆの外部ドメインからなるハイブリッドタンパク質をコードさせた。ｓｈＦｖ２は、インフルエンザＨＡに由来する膜貫通領域およびテール領域が４アミノ酸長い点で、ｓｈＦｖ１とは異なる。図２は、ｐ３．１−ｓｈＦｖ２のプラスミドマップを示す。ｓｈＦｖ２のコード配列は以下の通りである。
【０１８３】
【化８】
0005917402.tif 000009
【０１８４】
【化９】
0005917402.tif 000010
ｓｈＦｖ２のアミノ酸配列は、以下の通りである（シグナルペプチドのコード配列、ならびにＨＡの膜貫通および細胞質テールの配列を大文字で示す）。
【０１８５】
【化１０】
0005917402.tif 000011
【０１８６】
【化１１】
0005917402.tif 000012
ｓｈＦｖ２のコード配列を、ＤＮＡ合成により生成させた。
【０１８７】
プラスミドｐ３．１−Ｇａｇにより、マウス白血病ウイルスに由来するＧａｇ遺伝子産物をコードさせた。図３は、ｐ３．１  Ｇａｇのプラスミドマップを示す。プラスミドｐ３．１−ＧａｇによるＧａｇのコード配列は、以下の通りである。
【０１８８】
【化１２】
0005917402.tif 000013
【０１８９】
【化１３】
0005917402.tif 000014
ＭＬＶ  Ｇａｇのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０１９０】
【化１４】
0005917402.tif 000015
Ｇａｇ遺伝子は、プラスミドｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ）内に見出される、ＭＬＶのゲノムに由来する天然クローンを表わす。
【０１９１】
１０ｃｍ２の組織培養ディッシュ８つに、１０％のウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した２９３−Ｆ細胞を播種した。細胞が約９５％のコンフルエンス（単層培養物）に達したら、以下の通り、各ウェルに合計４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。
【０１９２】
１．ＤＮＡなし
２．４μｇのｐ３．１−Ｇａｇ
３．４μｇのｐ３．１−ＲＳＶＦＴ
４．４μｇのｐ３．１−ｓｈＦｖ１
５．４μｇのｐ３．１−ｓｈＦｖ２
６．２μｇのｐ３．１−ＲＳＶＦＴ＋２μｇのｐ３．１−Ｇａｇ
７．２μｇのｐ３．１−ｓｈＦｖ１＋２μｇのｐ３．１−Ｇａｇ
８．２μｇのｐ３．１−ｓｈＦｖ２＋２μｇのｐ３．１−Ｇａｇ
プラスミドＤＮＡは、製造元の推奨に従い、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの８時間後、トランスフェクション培地を、ＣＤ２９３無血清培地で置換し、培養を継続した。トランスフェクションの４８時間後、ＲＳＶ  Ｆ発現ベクターのうちのいずれかをトランスフェクトした細胞を含有するすべてのディッシュが、著明なレベルの合胞体（融合細胞）を呈示し、適正にフォールドしたＦの表面発現と符合した。トランスフェクションの４８時間後、ピペッティングにより細胞を解離させ、細胞および培地を収集した。その膜への統合状態にある、適正にフォールドしたＦ抗原を認識するマウスモノクローナル抗体（９Ｃ５）により細胞を染色した後、フローサイトメトリーにより、細胞表面におけるＲＳＶ  Ｆ抗原活性の発現をさらに裏付けた。蛍光によりＦ−陽性細胞を検出するために、細胞を、フィコエリトリンへとコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体とさらに反応させた。図４は、フローサイトメトリーの実施によるヒストグラムを示すが、これにより、Ｇａｇベクターを伴うＦ発現ベクター、およびＧａｇベクターを伴わないＦ発現ベクターのうちのいずれかをトランスフェクトした細胞におけるＦの著明な表面発現レベルが裏付けられる。これらのデータは、トランスフェクトされた細胞の集団における合胞体の存在と符合し、細胞表面における、適正にフォールドしたＦ抗原の存在を裏付ける。
【０１９３】
トランスフェクトされた細胞から収集した増殖培地を、２０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離して合胞体および任意の細胞破砕物を取り出し、このステップに由来する上清を、トリス緩衝生理食塩液中に３０％のスクロースクッション上、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離し、Ｇａｇ遺伝子および／またはＦ遺伝子が発現する結果として培地中に放出された可能性のある任意のＶＬＰを回収した。このステップに由来する１００，０００×ｇのペレットを、トリス緩衝生理食塩液中に再懸濁させ、さらなる解析を行った。
【０１９４】
この超遠心分離ステップに由来する再懸濁ペレットを、ウェスタンブロット解析にかけ、ＶＬＰ形成の指標としてのＧａｇ産物の存在を検出した。ｐ３．１−Ｇａｇベクター単独をトランスフェクトした細胞に由来する試料中では、著明量のＧａｇ産物が検出されたが、Ｆ遺伝子ベクターのうちのいずれかと組み合わせてｐ３．１−Ｇａｇをトランスフェクトした細胞に由来するペレット中で見出されるＧａｇの量が顕著に低減されていたことは、予測外であった。この結果は、Ｆ遺伝子産物の発現が、Ｇａｇ産物の出芽機能になんらかの形で干渉することと符合する。
【０１９５】
その後、再懸濁させた超遠心分離ペレットにおけるＦ抗原の存在を、ＥＬＩＳＡにより以下の通りに検証した。再懸濁させた各超遠心分離ペレット試料を、Ｎｕｎｃ  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＴＭ）平底９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの行Ａ中の単一のウェルに投入し、各試料を、該プレートの各列に沿って２倍に系列希釈した。４℃で一晩にわたるコーティングの後、０．０５％のＴＷＥＥＮ  ２０（ＴＭ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）により３回にわたりプレートを洗浄し、次いで、ＳＴＡＲＴＩＮＧ  ＢＬＯＣＫ（ＴＭ）（ＰＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりブロッキングした。ブロッキングの後、ＳＴＡＲＴＩＮＧ  ＢＬＯＣＫ  Ｔ２０（ＴＭ）（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１：１０００に希釈したモノクローナル抗体９Ｃ５  １００μｌを各ウェルに投入し、室温で３時間にわたりプレートをインキュベートした。プレートを再度洗浄し、ＳＴＡＲＴＩＮＧ  ＢＬＯＣＫ  Ｔ２０（ＴＭ）中で１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１．５時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる最終的な洗浄（３回にわたる）の後、１００μｌのＡＢＴＳ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することによりプレートを現像し、室温で４５分間にわたりインキュベートした。
【０１９６】
図５は、Ｆ遺伝子単独によるトランスフェクション、およびＦ遺伝子＋Ｇａｇ遺伝子によるトランスフェクションのいずれに由来する１００，０００×ｇペレットにおいても、著明レベルのＲＳＶ  Ｆ抗原が検出されたことを観察し得る、このＥＬＩＳＡの結果を示す。ＲＳＶ  Ｆ遺伝子単独をトランスフェクトした細胞に由来するペレットでは、より大量のＲＳＶ  Ｆ抗原活性が観察されたことは重要であり、かつ、予測外のことである。これらのデータは、Ｇａｇ発現の非存在下においてＦ遺伝子単独を発現させる結果として、Ｆ抗原を保有するＶＬＰが形成されることを裏付ける。これはまた、ＦおよびＧａｇを共発現させる結果として、おそらくはＦによるＧａｇの出芽に対する干渉のために、Ｇａｇの出芽が抑制されるという上記の観察とも符合する。
【０１９７】
（実施例２）
ＨＩＶ−１  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰのシュードタイピング
本例は、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質のＧＰＩアンカー形でシュートタイピングしたＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＶＬＰの生成を裏付ける。
【０１９８】
材料および方法
プラスミドｐ３．１−ｂｒｕＧａｇは、ＨＩＶ−１のｂｒｕ株に由来するＨＩＶ−Ｇａｇ産物をコードする合成配列を含有する。このプラスミドでは、ＣＭＶ即初期プロモーターが使用されており、一過性トランスフェクションによる発現研究に適する。図６は、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇのマップを示す。ｂｒｕＧａｇのコード配列は、以下の通りである。
【０１９９】
【化１５】
0005917402.tif 000016
【０２００】
【化１６】
0005917402.tif 000017
ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇによりコードされるアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２０１】
【化１７】
0005917402.tif 000018
プラスミドｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩは、ＲＳＶのＡ２株に由来するＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質のＧＰＩアンカー形をコードする合成配列を含有する。このプラスミドは、膜貫通ドメインおよび細胞質テールドメインをコードするＦ遺伝子配列を欠失させ、かつ、これらを、ヒトカルボキシペプチダーゼＭに由来するＧＰＩアンカーシグナルをコードする配列で置換することにより構築した。図７は、ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩのマップを示す。Ｆ−ＧＰＩのコード配列は、以下の通りである。
【０２０２】
【化１８】
0005917402.tif 000019
【０２０３】
【化１９】
0005917402.tif 000020
ｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩによりコードされるアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２０４】
【化２０】
0005917402.tif 000021
プラスミドｐ３．１−ｂｒｕＧａｇおよびｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩを、単独で、または様々な比で（１：１、３：１、および９：１のＧａｇ対Ｆ比で）互いに組み合わせて、２９３Ｆ細胞へとトランスフェクトした。各トランスフェクションでは、２９３Ｆ細胞を単層として増殖させるＴ７５培養フラスコを使用した。製造元により説明される通り、トランスフェクションには、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００を使用した。トランスフェクションの約６時間後、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ増殖培地を、ＣＤ２９３無血清培地で置換した。トランスフェクションの４８時間後、増殖培地を収集し、低速遠心分離により破砕物を除去し、その後、トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）中２０％のスクロースクッションを介する１００，０００×ｇでの遠心分離により、培地中のＶＬＰを回収した。ペレット化させた物質をＴＢＳ中に再懸濁させ、ＨＩＶ−１  ＧａｇおよびＲＳＶ抗原に特異的な抗体を用いるウェスタンブロット解析にかけた。
【０２０５】
結果
図８は、Ｇａｇについてのウェスタンブロットを示し、図９は、ＲＳＶについてのウェスタンブロットを示す。Ｇａｇについてのウェスタンブロット（図８）は、Ｇａｇ遺伝子ベクターを単独でトランスフェクトした場合であれ、Ｆベクターと組み合わせてトランスフェクトした場合であれ、すべての培養物中に豊富な量のＧａｇ産物が存在することを示す。比を１：１とする培養物中では、Ｇａｇ遺伝子産物の収量がある程度低減されたが、ＭＬＶ  Ｇａｇの場合のように、ＲＳＶ  Ｆの発現により、ＨＩＶ  Ｇａｇ遺伝子の発現およびＶＬＰの出芽が遮断されることはなかった。図９に示す通り、ペレット試料中では、ＲＳＶ  Ｆ抗原が検出され、該試料中で見出されるＦ抗原の量は、ＨＩＶ−１  ＧａｇをＲＳＶ  Ｆと共に発現させた培養物において顕著に増大した。共発現するＧａｇの存在下において、高分子量Ｆ抗原の放出がこのように増大したことにより、Ｆ抗原でＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＶＬＰがシュードタイピングされることの証拠が得られた。ＲＳＶについてのウェスタンブロットでは、Ｇａｇ産物がバックグラウンドバンドとして現れ、これは、コンジュゲートされた二次抗体がＧａｇ産物に対して示す、ある低レベルの交差反応性に起因する可能性が高いことに注目すべきである。
【０２０６】
（実施例３）
シュードタイプＨＩＶ−１  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ（ＧＰＩ）ＶＬＰのスケールアップ
本例では、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質のＧＰＩアンカー形でシュートタイピングしたＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＶＬＰを大スケールで生成させることについて説明する。
【０２０７】
材料および方法
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００を用いて、Ｔ１７５フラスコ６つ分の２９３Ｆ細胞に、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇおよびｐ３．１−Ｆ−ＧＰＩを、３：１の比（Ｇａｇ対Ｆ比）でトランスフェクトした。トランスフェクションの約８時間後、トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を、ＣＤ２９３培地で置換した。トランスフェクションの４８時間後、増殖培地を回収し、破砕物を除去し、２０％のスクロースクッションを介して、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離して、ＶＬＰをペレット化させた。ＶＬＰペレットをＴＢＳ中で再懸濁させ、２０〜６０％の段階的なスクロース勾配上で層化させ、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより勾配画分を解析し、Ｇａｇ含有画分を同定した。ピークのＧａｇ含有画分をプールし、ＴＢＳによりスクロースを３倍に希釈し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたる再度の遠心分離により、ＶＬＰを濃縮した。次いで、試料をＴＢＳ中に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、およびＥＬＩＳＡにより解析した。
【０２０８】
結果
図１０は、顕著なｂｒｕＧａｇバンド（約５７Ｋｄ）、およびＧＰＩアンカーＦと符合するより低分子量のバンド（約６１Ｋｄ）を明らかにする、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左パネル）を示す。Ｆバンドの識別は、ウェスタンブロット法により確認した（図１０、右パネル）。ＶＬＰ試料をＥＬＩＳＡプレート上で系列希釈し、ＲＳＶ  Ｆ特異的中和モノクローナル抗体であるＳｙｎａｇｉｓ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）と反応させるＥＬＩＳＡにより、Ｆ抗原の存在についてのさらなる証拠を得た。図１１にＥＬＩＳＡデータを示すが、ここでは、スクロースによりバンド形成させたＶＬＰが、Ｓｙｎａｇｉｓ抗体に対するそれらの反応性において、ＲＳＶの生ウイルスによるシグナルと類似のシグナルを誘発した。
【０２０９】
（実施例４）
シュードタイプＨＩＶ−１  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ（切断型）ＶＬＰのスケールアップ
本例では、細胞質テールの切断形を含有するＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質でシュートタイピングしたＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＶＬＰを大スケールで生成させることについて説明する。
【０２１０】
材料および方法
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００を用いて、Ｔ１７５フラスコ８つ分の２９３Ｆ細胞に、ｐ３．１−ｂｒｕＧａｇおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴを、３：１の比（Ｇａｇ対Ｆ比）でトランスフェクトした。プラスミドｐ３．１−ＦＴは、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質の細胞質テール切断形をコードする合成断片を含有する。図１２は、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴのマップを示す。Ｆをコードする配列は、以下の通りである。
【０２１１】
【化２１】
0005917402.tif 000022
【０２１２】
【化２２】
0005917402.tif 000023
コードされるＦのアミノ酸配列は、以下の通りである（Ｎ末端のシグナルペプチド、およびＣ末端の膜貫通ドメインに下線を付す）。
【０２１３】
【化２３】
0005917402.tif 000024
【０２１４】
【化２４】
0005917402.tif 000025
トランスフェクションの約８時間後、トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を、ＣＤ２９３培地で置換した。トランスフェクションの４８時間後、増殖培地を回収し、破砕物を除去し、２０％のスクロースクッションを介して、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離して、ＶＬＰをペレット化させた。ＶＬＰペレットをＴＢＳ中で再懸濁させ、２０〜６０％の段階的なスクロース勾配上で層化させ、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより勾配画分を解析し、Ｇａｇ含有画分を同定した。ピークのＧａｇ含有画分をプールし、ＴＢＳによりスクロースを３倍に希釈し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたる再度の遠心分離により、ＶＬＰを濃縮した。次いで、試料をＴＢＳ中に再懸濁させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法、およびＥＬＩＳＡにより解析した。
【０２１５】
結果
図１３は、顕著なｂｒｕＧａｇバンド（約５７Ｋｄ）、および切断形Ｆと符合するより低分子量のバンド（約６１Ｋｄ）を明らかにする、銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（左パネル）を示す。Ｆバンドの識別は、ウェスタンブロット法により確認した（図１３、右パネル）。ＶＬＰ試料をＥＬＩＳＡプレート上で系列希釈し、Ｓｙｎａｇｉｓ  ＲＳＶ  Ｆ特異的中和モノクローナル抗体（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）と反応させるＥＬＩＳＡにより、Ｆ抗原の存在についてのさらなる証拠を得た。図１４にＥＬＩＳＡデータを示すが、ここでは、スクロースによりバンド形成させたＶＬＰが、Ｓｙｎａｇｉｓ抗体に対するそれらの反応性において、ＲＳＶの生ウイルスによるシグナルと類似のシグナルを誘発した。
【０２１６】
スクロースによりバンド形成させたＶＬＰ試料はまた、陰性染色を介して電子顕微鏡にもかけた。代表的な顕微鏡写真を図１５に示すが、これにより、ＶＬＰ出芽エンジンとしてＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質前駆体を用いることから予測される通り、未成熟（プロセシングされていない）Ｇａｇコアを含有する、一様なエンベロープ粒子の存在が明らかにされる。
【０２１７】
（実施例５）
シュードタイプＨＩＶ−１  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰの免疫原性
本例は、ＲＳＶ  ＦでシュードタイピングされたＨＩＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰにより、マウスにおいて中和抗体反応が誘導されることを裏付ける。
【０２１８】
材料および方法
実施例３で説明した通りに、ＲＳＶ  Ｆ−ＧＰＩでシュートタイピングしたＨＩＶ−１  Ｇａｇ  ＶＬＰを調製し、マウスを免疫化するのに用いた。マウス各々に４週間の間隔を置いて２回ずつの免疫化を施したが、各回の免疫化は、約０．５μｇのＦ抗原を含有する、ＴＢＳ中のＶＬＰからなった。２回目の免疫化の２週間後、血清試料を回収し、ＲＳＶプラーク低減（ウイルス中和）アッセイに用いた。平均１２５プラーク形成単位（ｐｆｕ）のウイルスからなるＲＳＶ生ウイルスのアリコートを、対照のＲＳＶ中和抗体、または免疫化マウスもしくは対照マウスに由来する血清の系列希釈液で処理した。次いで、抗体で処理したウイルス接種物を、９６ウェルプレートの個々のウェルのＶｅｒｏ細胞に添加し、３７℃で４８時間にわたりプレートをインキュベートして、非中和ウイルスによって細胞を感染させた。４８時間後、細胞を固定することにより、ＲＳＶの増殖プラークを同定し、これらを、ヤギＲＳＶ特異的ポリクローナル抗体と反応させた。
【０２１９】
結果
この実験によるデータを図１６に示すが、ここでは、列１および２が、それぞれ、対照のＳｙｎａｇｉｓ抗体およびヤギ抗ＲＳＶ抗体により呈示されるＲＳＶ中和活性を示す。列３および４は、中和活性が見られなかった陰性対照マウスの血清を表わす。列５〜１０は、６匹の免疫化マウス中６匹において著明な中和活性が観察された、ＶＬＰ免疫化マウス血清を表わす。最後に、列１１および１２は、中和活性が予測も観察もされなかった、非処理ＲＳＶ接種物を表わす。これらのデータにより、ＲＳＶ  Ｆ抗原を含有するシュードタイプＶＬＰが、著明なＲＳＶ特異的中和抗体反応を誘導し得ることが裏付けられた。
【０２２０】
（実施例６）
シュードタイプＡＬＶ  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ（切断形）ＶＬＰ
本例では、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰの生成を裏付ける。ＨＩＶ−１  Ｇａｇ（レンチウイルス）に加えて、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ、アルファレトロウイルス）のＧａｇ産物をコードするベクターも構築した。ＨＩＶウイルスのビリオンが脂質ラフトドメインから出芽し、ＨＩＶ−１  Ｇａｇが脂質ラフトを標的とし得ることは認識されているが、ＡＬＶ  Ｇａｇ産物については同様のデータが欠如している。
【０２２１】
材料および方法
ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質で、ＡＬＶ  Ｇａｇなど、アルファレトロウイルス粒子をシュードタイピングし得るかどうかを決定するために、ＡＬＶ  Ｇａｇをコードするベクターを生成させた。プラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲは、そのＣ末端におけるプロテアーゼドメインを欠くＡＬＶ  Ｇａｇ遺伝子産物をコードする合成配列を含有する。ＡＬＶなどのアルファレトロウイルスは、他の大半のレトロウイルスの場合におけるＰｏｌポリタンパク質ではなく、Ｇａｇポリタンパク質の一部として、それらのプロテアーゼドメインを含有する。該プロテアーゼドメインは、ＶＬＰの出芽にとって不要なので、最終ベクター内には包含しなかった。図１７は、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲのマップを示す。ヌクレオチドによるコード配列は、以下の通りである。
【０２２２】
【化２５】
0005917402.tif 000026
【０２２３】
【化２６】
0005917402.tif 000027
コードされるアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２２４】
【化２７】
0005917402.tif 000028
【０２２５】
【化２８】
0005917402.tif 000029
プラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴを、個別に、または１：１、３：１、および９：１の比（Ｇａｇ対Ｆ比）で併せて、２９３Ｆ細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を収集し、破砕物を除去し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたりＶＬＰをペレット化させた。上記で説明したモノクローナル抗体であるＳｙｎａｇｉｓを用いるＥＬＩＳＡを介して、再懸濁させたペレットを、ＲＳＶ  Ｆ抗原活性について解析した。
【０２２６】
結果
図１８に示すデータにより、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲにｐ３．１−ＲＳＶＦＴを加えて組み合わせた結果、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴ単独の発現について見られるよりはるかに多くのＳｙｎａｇｉｓ反応性ＶＬＰの放出がもたらされることが裏付けられた。したがって、ＲＳＶ  Ｆ抗原は、それ自体におけるある程度のＶＬＰ出芽活性を裏付ける一方で、レンチウイルスおよびアルファレトロウイルスのいずれに由来するＧａｇ産物にもシュードタイピングされ得る。
【０２２７】
（実施例７）
ＨＩＶ−１  Ｇａｇをコードするベクターと、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲをコードするベクターとにおける、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰの生成の比較
本例では、シュードタイピングされたＨＩＶ−１  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰの生成を、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰの生成と比較する。
【０２２８】
材料および方法
プラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲを、１：１および３：１の比で、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴと共に、２９３Ｆ細胞へと共トランスフェクトした。加えて、プラスミドｐ３．１−ｂｒｕＧａｇを、３：１の比で、ｐ３．１−ＲＳＶＦＴと共に２９３Ｆ細胞へと共トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、培地を収集し、破砕物を除去し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたりＶＬＰをペレット化させた。上記で説明したモノクローナル抗体であるＳｙｎａｇｉｓを用いるＥＬＩＳＡを介して、再懸濁させたペレットを、ＲＳＶ  Ｆ抗原活性について解析した。
【０２２９】
結果
これらのデータを図１９に示すが、これにより、３つのトランスフェクションすべてにおいて、同様の量のＳｙｎａｇｉｓ反応性ＶＬＰが検出されたことが示され、これにより、ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ発現ベクターが、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰを生成させることに関して、ＨＩＶ  Ｇａｇ発現ベクターと同等に有効であることが裏付けられた。
【０２３０】
（実施例８）
ＲＳＶ  ＦによりＭＰＭＶ−Ｇａｇ、ＢＶＬ−Ｇａｇ、およびＥＩＡＶ−Ｇａｇをシュードタイピングする試み
本例では、他のレトロウイルスに由来するＧａｇタンパク質が、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰを生成させるのに有効であるかどうかを決定しようと試みる。
【０２３１】
材料および方法
ＤＮＡ配列解析により確認された、特製の合成Ｇａｇコード配列断片を用いて、メイソンファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ、ベータレトロウイルス）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ、デルタレトロウイルス）、およびウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ、レンチウイルス）によるＧａｇ産物をコードするベクターを構築した。これらのベクターを、Ｆをコードするベクターであるｐ３．１−ＲＳＶＦＴと共に、３：１の比（Ｇａｇ：Ｆ）で２９３Ｆ細胞へと共トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、培地を収集し、破砕物を除去し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたりＶＬＰをペレット化させた。上記で説明したモノクローナル抗体であるＳｙｎａｇｉｓを用いるＥＬＩＳＡを介して、再懸濁させたペレットを、ＲＳＶ  Ｆ抗原活性について解析した。
【０２３２】
結果
データを図２０に示すが、Ｆ特異的なモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより決定される通り、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰの放出に関して、３つの代替的なＧａｇ産物をコードするベクターが、ａｌｖＧａｇと同様に機能することはなかったことが裏付けられた。ＭＰＭＶ  Ｇａｇ、ＢＬＶ  Ｇａｇ、およびＥＩＡＶ  Ｇａｇをコードするベクターにより得られる、Ｆの微弱なＥＬＩＳＡシグナルは、Ｆタンパク質の自己出芽（Ｇａｇに依存しない出芽）活性が通常検出される、ＲＳＶ  Ｆを単独で発現させた後に得られることが典型的なシグナルと同様であった。ＭＰＭＶ  Ｇａｇ、ＢＬＶ  Ｇａｇ、およびＥＩＶＡ  Ｇａｇが、Ｆ粒子の放出を著明に増進させることができなかったことは、そのＧａｇ産物がＲＳＶ  Ｆによるシュードタイプを形成せず、したがって、Ｆと共発現させたときに、ＲＳＶ  Ｆを含有する粒子の放出を増大させないことが示された、ＭＬＶ  Ｇａｇによる結果と同様である。さらに、データは、ＭＬＶ  Ｇａｇ、ＭＰＭＶ  Ｇａｇ、ＢＬＶ  Ｇａｇ、およびＥＩＡＶ  Ｇａｇの発現が、ＲＳＶ  Ｆ発現の存在下で抑制されることを示し、これは、これらのＧａｇによるＶＬＰの生成とＲＳＶ  Ｆ発現とが不適合性であることを示す。
【０２３３】
（実施例９）
プロテアーゼが無欠なａｌｖＧａｇのａｌｖＧａｇ−ｄＰＲとの比較
ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲに加えて、そのＣ末端におけるプロテアーゼ活性が無欠な、完全ａｌｖＧａｇも、ＲＳＶ  Ｆタンパク質でシュートタイピングしたＶＬＰを形成し得る。これは、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ（ＦＬまたはＦＴを加えた）によるトランスフェクション後におけるＶＬＰの放出と、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ（ＦＬまたはＦＴを加えた）によるトランスフェクション後におけるＶＬＰの放出と、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇ（ＦＬまたはＦＴを加えた）の混合物によるトランスフェクション後におけるＶＬＰの放出とを対比するトランスフェクション実験において裏付けられた。図２１は、レトロウイルスプロテアーゼ活性が無欠な、完全ａｌｖＧａｇポリタンパク質をコードするプラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇのマップを示す。ヌクレオチドによるコード配列は、以下の通りである。
【０２３４】
【化２９】
0005917402.tif 000030
【０２３５】
【化３０】
0005917402.tif 000031
コードされるアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２３６】
【化３１】
0005917402.tif 000032
【０２３７】
【化３２】
0005917402.tif 000033
トランスフェクション後、培地上清から破砕物を除去し、３０％のスクロースクッションを介して、ＶＬＰをペレット化させた。ＶＬＰをフィルター上で捕獲し、次いで、ＲＳＶ特異的抗体と反応させ、西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体を用いて現像する、底部が０．２ミクロンのフィルターであるＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、ＶＬＰにおいて放出されるＦ抗原量の定量化を実施した。アッセイの結果を図２２に示すが、これにより、Ｆをコードするプラスミドを共トランスフェクトした後に培地へと放出される高分子量ＲＳＶ  Ｆ抗原活性の量に関して、プラスミドｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇの効能が同様であることが示される。また、１０：１または３：１の比でｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇを使用する場合に培地へと放出されるＲＳＶ  Ｆ抗原活性の量も同様であった。図２３は、これらのトランスフェクションの各々におけるＡＬＶ  Ｇａｇタンパク質についての状況を示す。予測される通り、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲをトランスフェクトすると、顕著な６１ｋＤのバンドが結果として得られ、これは、無欠なＧａｇ−ｄＰＲポリタンパク質の発現と符合する（レーン１および２）。残りのレーンは、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ、またはｐ３．１−ａｌｖＧａｇおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲによる組合せをトランスフェクトすると、顕著な２７ｋＤのバンドが結果として得られ、これは、レトロウイルスによるプロテアーゼ活性が存在するためにＧａｇがプロセシングされることと符合することを表わす。
【０２３８】
ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇの組合せ（ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲ対ａｌｖＧａｇ対ＲＳＶＦＴ比を１０：１：３とする）と共にｐ３．１−ＲＳＶＦＴを共トランスフェクトした細胞におけるＶＬＰの生成についての最終的な確認を図２４に示すが、ここでは、このようなトランスフェクションに由来するＶＬＰを、トリス緩衝食塩液中に３０％〜６０％のスクロース層間において１００，０００×ｇで１時間にわたりバンド形成させることにより精製した。ＶＬＰを、ニトロセルロースでコーティングした３００メッシュの銅製グリッドに適用し、２％ｗ／ｖの酢酸ウラニルで陰性染色して、電子顕微鏡により解析した。図２４における顕微鏡写真は、エンベロープＶＬＰの存在を示す。
【０２３９】
（実施例１０）
ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰは、マウスにおいて中和抗体反応を誘導する
ＲＳＶの「ＦＴ」または「ＦＬ」を含有するＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰを、ｐ３．１ＲＳＶＦＴまたはｐ３．１−ＲＳＶＦＬと共に、細胞にｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲをトランスフェクトした後のＨＥＫ２９３細胞から調製した。「Ｇａｇ」対「Ｆ」のプラスミドＤＮＡトランスフェクションの比を３：１とした。３日目に収集した増殖培地から、３０％のスクロースクッションを介して、１００，０００×ｇで遠心分離することにより、Ｆ抗原を含有するＶＬＰをペレット化させ、次いで、２０〜６０％の不連続なスクロース勾配上でバンド形成させた。含有するＦ抗原が１μｇ未満であるＶＬＰのアリコートを、各種のマウス株を免疫化するのに用いたが、この場合、各マウスには、２１日間の間隔を置いて、初回ワクチン接種および追加ワクチン接種を施した。各ワクチン接種物は、「ＦＴ」ＶＬＰおよび「ＦＬ」ＶＬＰの両方を含有した。追加免疫化の２週間後、血清を回収し、これを用いて、ＲＳＶ特異的な抗体反応を測定した。これらのデータを図２５に示すが、ここで、上パネルは、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化したＲＳＶウイルス粒子を使用する、従来のＥＬＩＳＡにおける反応性について血清を調べた、ＥＬＩＳＡによる滴定データを示す。下パネルは、上記の例５で説明したプラーク低減アッセイを用いて測定される、ウイルス中和抗体のレベルを示す。
【０２４０】
（実施例１１）
ＨＳＶ  ｇＤ＋ＡＬＶ  Ｇａｇをシュードタイピングする試み
他のエンベロープウイルスも、ＲＳＶのＦタンパク質と類似の表面糖タンパク質を生成させるが、これらの糖タンパク質は、宿主細胞の受容体との接着および相互作用において機能することが可能であり、ウイルスの発症機序において極めて重要な役割を果たす。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するこのような例の１つは、糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）であり、これは、ウイルスの侵入時において、複数の宿主受容体と相互作用する（Ｊ．Ｃ．  Ｗｈｉｔｂｅｃｋら、「Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｏｖｅｒｌａｐｓ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ」、１９９９年、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３巻（１２号）：９８７９−９８９０頁において総説されている）。ＨＳＶ  ｇＤのサブユニットによるワクチン製剤が、ＨＳＶ感染の予防についての臨床試験において調べられている（Ｄ．Ｉ．  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ−ａｄｊｕｖａｎｔ  ｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖａｃｃｉｎｅ」、２００５年、Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ４０巻：１２７１〜１２８１頁）。
【０２４１】
代替的なウイルス性糖タンパク質の、ＡＬＶ  ＧａｇベースのＶＬＰへのシュードタイピングを比較するために、ｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲとの共発現研究において、ＨＳＶ  ｇＤ遺伝子を使用した。
【０２４２】
材料および方法
２型ヒトＨＳＶ  ｇＤ遺伝子（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＧｅｎｅＩＤ：１４８７３５８）を合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングして、プラスミドｐ３．１−ＨＳＶｇＤを構築した。プラスミドマップを、図２６に示す。核酸によるコード配列は、以下の通りである。
【０２４３】
【化３３】
0005917402.tif 000034
【０２４４】
【化３４】
0005917402.tif 000035
コードされるアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２４５】
【化３５】
0005917402.tif 000036
プラスミドｐ３．１−ＨＳＶｇＤおよびｐ３．１−ａｌｖＧａｇ−ｄＰＲを、単独で、またはＨＳＶｇＤ対ＡＬＶＧａｇ比を１：１、５．６：１、および２．３：１とする組合せで、２９３Ｆ細胞へとトランスフェクトした。Ｔ７５フラスコ内のＨＥＫ  ２９３Ｆ単層に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００を用いて上記のＤＮＡをトランスフェクトし、８時間にわたりインキュベートし、新鮮な無血清培地へと切り替えて４８時間にわたりインキュベートした。培地上清を収集し、遠心分離して細胞をペレット化させ（５００×ｇで３分間にわたる）、細胞破砕物をペレット化させ（４０００×ｇで１０分間にわたる）て、清明な培地上清液を生成させた。これらの試料を、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングにおいて直接使用するか、または３０％のスクロース−ＴＢＳクッション上に上置して、超遠心分離にかけ（１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたる）、ＶＬＰおよび多量体のタンパク質複合体をペレット化させた。超遠心分離によりペレット化した物質（すなわち、ＵＣペレット）を、滅菌ＴＢＳ中に懸濁させ、４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動させ、フッ化ポリビニリデン膜へと転写し、ウェスタンブロット解析にかけた。特異的な抗体試薬：抗ＨＳＶｇＤモノクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）およびヤギ抗ｐ２７ａｌｖＧＡＧポリクローナル抗体（Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ）により、ＨＳＶｇＤタンパク質およびＡＬＶ  Ｇａｇタンパク質の発現を追跡した。
【０２４６】
直接的ＥＬＩＳＡ
Ｉｍｍｕｎｏｎ  ＩＩマイクロ滴定プレートウェルを、被験試料または対照試料（２５〜１００μＬの培地上清）でコーティングすることによりＥＬＩＳＡを実施し、ＴＢＳ中ですすぎ、新鮮なミルクブロック液（０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳ中に５％ｗ／ｖのスキムミルクおよび１％ｗ／ｖのＢＳＡ）中、室温で１時間にわたりブロッキングし、ＴＢＳ中ですすぎ、一次抗体（１ｍＬのブロック液当たり１μｇの抗ＨＳＶｇＤ  ｍＡｂ、ブロック液中で１：１０００に希釈された抗ＡＬＶ  Ｇａｇ  Ａｂ）中、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し（３倍濃度のＴＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０に３倍濃度のＴＢＳを加える）、適切な二次抗体（ブロック液中で１：２０００に希釈したＨＲＰコンジュゲート抗マウス抗体またはＨＲＰコンジュゲート抗ヤギ抗体）中、室温で１時間にわたりインキュベートし、洗浄し、クエン酸緩衝液中のｏ−フェニレンジアミン基質を添加した。１０％の硫酸により着色現像を停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２４７】
イムノブロットアッセイ
ウェスタンブロットアッセイのステップは、以下の通りであった。フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）ブロットを、新鮮なミルクブロック液（上記と同じ）中、室温で１時間にわたりブロッキングし、一次抗体（１μｇ／ｍＬの抗ＨＳＶｇＤ  ｍＡｂ、１：２０００に希釈された抗ＡＬＶ  Ｇａｇ  ｐＡｂ）中、４℃で一晩にわたりインキュベートした。ブロットを、新鮮なブロック液中で１５分間ずつ３回にわたり洗浄し、ブロック液中で１：２０００に希釈されたＡＰコンジュゲート抗マウス抗体またはＡＰコンジュゲート抗ヤギ抗体中、室温で１時間にわたりインキュベートした。ブロットを、ｐＨ９．５のトリス−ＮａＣｌ−ＭｇＣｌ２緩衝液中で、１５分間ずつ３回にわたり洗浄し、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ基質中に浸漬して、着色現像にかけた。ｐＨ８．０の２ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ中で反応を停止させ、未使用の３ＭＭ濾紙シートに挟んでブロットを乾燥させた。
【０２４８】
電子顕微鏡法
ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞にＨＳＶｇＤおよびａｌｖＧａｇ−ｄＰＲをトランスフェクトすることに由来するＵＣペレット化物質を、ニトロセルロースでコーティングした３００メッシュの銅製グリッドに適用し、２％ｗ／ｖの酢酸ウラニルで陰性染色して、電子顕微鏡により解析した。ＳＩＳ  Ｓｏｆｔ−Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓソフトウェアインターフェースを用いて、スケールバーを埋め込んだ８ビットのデータファイルとして、粒子画像を取り込んだ。
【０２４９】
結果
ＨＳＶｇＤおよびａｌｖＧａｇ−ｄＰＲのトランスフェクションによる上清液をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡデータを、図２７に示す。ＨＳＶｇＤタンパク質は、ｐ３．１−ＨＳＶｇＤ構築物をトランスフェクトした細胞に由来する上清試料において、用量依存的な形で検出された。ｐ３．１−ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ構築物を施されたトランスフェクト細胞はすべて、上清液中に実質的なレベルのＡＬＶ  Ｇａｇタンパク質を示した。マイクロ滴定ウェルを、Ｔ７５のトランスフェクト細胞上清で直接的にコーティングする上清容量はわずかに２５μＬであったのにも関わらず、ｇＤ：ＧＡＧ比を５．６：１とする、ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ  ＤＮＡレベルが最低の（フラスコ１個当たり１．５μｇの）トランスフェクションによってもなお、ポリクローナル検出試薬による強力なシグナルがもたらされた。ＨＳＶｇＤの検出抗体がモノクローナル抗体であり、ＡＬＶ  Ｇａｇの検出抗体がポリクローナル抗体であるため、発現レベルの直接的な比較は実施しなかった。
【０２５０】
図２８は、Ｔ７５フラスコのサイズにおける、ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞による２つのトランスフェクション研究のウェスタンブロット結果を示す。以下の表１は、Ａ〜Ｇのフラスコラベル、Ｔ７５フラスコ１個当たりに添加されたマイクログラム単位のＤＮＡ、および結果として得られるＨＳＶｇＤ構築物とａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ構築物との比を列挙する。Ｔ７５への収集物の約１０％を表わすＵＣペレット試料を、ゲルへと二連で投入し、ブロッティングし、抗ＨＳＶｇＤ抗体試薬および抗ｐ２７ａｌｖＧＡＧ抗体試薬によりプロービングした。データは、哺乳動物宿主細胞内における、ＨＳＶｇＤタンパク質およびＡＬＶ  Ｇａｇタンパク質の両方のＤＮＡが用量依存的に発現することを裏付ける。上記のＥＬＩＳＡ結果で言及した通り、ＡＬＶ  Ｇａｇタンパク質の発現は、ＤＮＡレベルが低いとき（投入量が１．５μｇである試料Ｅ）でもなお強力であった。上記で論じた通り、発現するＨＳＶｇＤの質量は、予測される範囲内にある。ＡＬＶ  Ｇａｇ（−ｄＰＲ）は、図２８中のブロットプロファイル（パネル（Ｂ））において分子量の大きなシグナルバンドの１つである、約６０ｋＤａで電気泳動するであろうと予測される。小さなバンドは、分解生成物である可能性が高く、大きなバンドは、ＮｕＰＡＧＥゲル系内で完全には変性または還元されていない多量体または他のタンパク質との複合体である可能性があり、他のＧａｇコアについても、Ｇａｇによる同様のバンド形成パターンが提示されている（例えば、ＨＩＶ−Ｇａｇについての図８のブロット）。ＥＬＩＳＡデータおよびウェスタンブロットデータは、ＨＳＶｇＤおよびＡＬＶ  Ｇａｇが、ＨＥＫ  ２９３Ｆトランスフェクション系内で共発現することを裏付けている。
表１
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞
トランスフェクション番号３１４−８５＝試料Ａ、Ｂ、およびＣ
トランスフェクション番号３１４−９１＝試料Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ
【０２５１】
【表１】
0005917402.tif 000037
ＡＬＶ−ＧａｇおよびＲＳＶ  Ｆの共発現について上記で観察された結果とは異なり、ＡＬＶ−ＧａｇのｇＤとの共発現は、ＡＬＶ  ＧａｇがｇＤでシュートタイピングしたウイルス様粒子を形成しているとすれば予測されることになる、細胞上清中の高分子量ｇＤの放出の増大を結果としてもたらさなかった。ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットによるデータは、ｇＤタンパク質が、ＡＬＶ  Ｇａｇによる粒子の出芽に依存しない形で細胞から移出し得ることを示唆する。
【０２５２】
これらの試料中のＶＬＰを画像化し得るかどうかを決定するために、ｐ３．１−ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ単独のトランスフェクション（試料Ｃ）、ｐ３．１−ＨＳＶｇＤ単独のトランスフェクション（試料Ｄ）、およびｇＤ：ａｌｖＧＡＧ−ｄＰＲ比を２．３：１とするトランスフェクション（試料Ｆ）によるアリコートを電子顕微鏡法にかけた。結果を、各アリコートから取り込まれた２枚以上の光学顕微鏡写真を含有する図２９、３０、および３１に示す。
【０２５３】
図２９は、試料Ｃ中のＡＬＶ  Ｇａｇ（−ｄＰＲ）トランスフェクト細胞により形成される典型的なレトロウイルス粒子を示す。画像化ソフトウェアによりなされた測定（ｎ＝３、個別の視野）は、７１．７±２．６ｎｍの平均ＶＬＰサイズを示唆した。
【０２５４】
図３０は、試料Ｄ中のＨＳＶｇＤトランスフェクト細胞により形成される、多形でサイズにばらつきのある粒子を明らかにする。形状のうちの一部についての粒子サイズは以下の通りであった。大型の三角形の粒子またはフォールド粒子は、１５０〜２００ｎｍであり（黒の実線矢印）、小型の卵形〜球形の粒子は９０〜１２０ｎｍであった（黒の点線矢印）。自己出芽によるＨＳＶｇＤ糖タンパク質粒子についての知見は、自己出芽による多形のＶＬＰをもたらす、ＲＳＶ  Ｆ単独による発現で得られた結果と類似の挙動を示す。
【０２５５】
図３１は、ＡＬＶ  Ｇａｇ−ｄＰＲとの組合せでＨＳＶｇＤをトランスフェクトした試料Ｆによる複数の光学顕微鏡写真を示す。試料Ｆでは、３０〜５０ｎｍでもなお、より組織化された球状構造を示す粒子（１０００ｎｍのスケールバーを含有する、上部の２枚の顕微鏡写真中の黒矢印）の観察がまれであった。３０ｎｍ未満のサイズでは、大半のタンパク質の構造が、組織化されておらず、不均質であると考えられた。試料スクリーニング時に、２０ＥＭの視野にわたり検討したにも関わらず、試料Ｆ中の物質のいずれも、ＡＬＶ  Ｇａｇ単独の試料、またはＨＳＶｇＤ単独の試料で観察されるＶＬＰとは類似しなかった。
【０２５６】
試料ＦにおいてＶＬＰの生成がなされないことは、少なくとも２つの視点から予測されなかった。第１に、とりわけ、沈降物質中では、ＥＬＩＳＡデータおよびウェスタンブロットデータにより、ＨＳＶｇＤおよびＡＬＶ  Ｇａｇの各タンパク質の実質的な発現が示唆される場合に、これらのタンパク質を同じ宿主細胞内で併せて発現させると、いずれも、独立のＶＬＰ構造の作出を維持しなくなるという事実は、直観に反する。第２に、ＨＳＶｇＤ単独の自己出芽挙動は、ＲＳＶ  Ｆと同じ部類であり、ＨＳＶｇＤのＡＬＶ  ＧＡＧ−ｄＰＤ  ＶＬＰへのシュードタイピングも、上記の例で示される通り、哺乳動物宿主細胞におけるＲＳＶ  Ｆによるシュードタイピングと同様に成功するであろうと予測されかねない。これらのデータは、ウイルス性糖タンパク質で、レトロウイルスのＧａｇコアをシュードタイピングするときの困難および予測外の不適合性を例示している。
【０２５７】
（実施例１２）
ＳＩＶ  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰのシュードタイピング
本例では、ＲＳＶ  Ｆを含有するキメラＶＬＰを形成するのに、ＨＩＶ  Ｇａｇ遺伝子産物をコードするベクターが、サル免疫不全ウイルス（アフリカングリーンモンキー）（ＳＩＶａｇｍ）のＧａｇ遺伝子産物をコードするベクターで置換されることを裏付ける。ＳＩＶａｇｍはまた、レンチウイルスファミリーのメンバーでもある。
【０２５８】
材料および方法
図３２は、プラスミドｐ３．１−ＳＩＶａｇｍＧａｇのマップを示す。合成によるＳＩＶａｇｍ  Ｇａｇのコード配列は、以下の通りである。
【０２５９】
【化３６】
0005917402.tif 000038
【０２６０】
【化３７】
0005917402.tif 000039
ｐ３．１−ＳＩＶａｇｍＧａｇによりコードされるＳＩＶａｇｍＧａｇのアミノ酸配列は、以下の通りである。
【０２６１】
【化３８】
0005917402.tif 000040
【０２６２】
【化３９】
0005917402.tif 000041
ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＴＭ）２０００を用いて、Ｔ１７５フラスコ８つ分の２９３Ｆ細胞に、ｐ３．１−ＳＩＶａｇｍＧａｇおよびｐ３．１−ＲＳＶＦＴを、３：１の比（Ｇａｇ対Ｆ比）でトランスフェクトした。トランスフェクションの約８時間後、トランスフェクション培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を、ＣＤ２９３培地で置換した。トランスフェクションの７２時間後、増殖培地を収集し、破砕物を除去し、２０％のスクロースクッションを介して、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離して、ＶＬＰをペレット化させた。ＶＬＰペレットをＴＢＳ中で再懸濁させ、次いで、２０〜６０％の段階的なスクロース勾配上で層化させ、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたり遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより勾配画分を解析し、Ｇａｇ含有画分を同定した。ピークのＧａｇ含有画分をプールし、ＴＢＳによりスクロースを２倍に希釈し、１０℃、１００，０００×ｇで１時間にわたる再度の遠心分離によりＶＬＰを濃縮し、次いで、ＴＢＳ中で再懸濁させ、モノクローナル抗体であるＳｙｎａｇｉｓ（パリビズマブ）を用いるＥＬＩＳＡにより解析した。
【０２６３】
結果
図３３にＥＬＩＳＡデータを示すが、ここでは、スクロースによりバンド形成させたＶＬＰが、Ｓｙｎａｇｉｓ抗体に対するそれらの反応性において、ＲＳＶの生ウイルスによるシグナルと類似のシグナルを誘発した。これらのデータは、ｐ３・１−ＨＩＶＧａｇ発現ベクターを使用する上記の例と同様であり、Ｆを含有するキメラＶＬＰを生成させるのに、ＨＩＶ  Ｇａｇを、ＳＩＶａｇｍ  Ｇａｇで置換し得ることを裏付ける。
【０２６４】
（実施例１３）
アデノウイルスベクターの形質導入を介するシュードタイプＲＳＶ  Ｆ＋ＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰの生成
ＨＥＫ２９３細胞にプラスミドをトランスフェクトすることを介して、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰを調製しても、おそらくは、十分な数のプラスミドＤＮＡのコピーを十分な数の細胞へと送達して、頑健なＧａｇおよびＦの発現、ならびにその後のＶＬＰの形成を誘導することができないために、大収量のＶＬＰをもたらす結果は得られない。この欠点を是正するために、ＧａｇおよびＦのコード配列を、Ｖｅｒｏ細胞など、ＶＬＰを生成させるのに適切な細胞株へと高効率で形質導入する目的で、本例では、ＡＬＶ  Ｇａｇ遺伝子およびＲＳＶ  Ｆ遺伝子を、複製欠損性の組換えアデノウイルスベクターへと挿入した。組換えアデノウイルスベクターの誘導については、以下にまとめる。
【０２６５】
組織培養細胞においてＲＳＶ  Ｆ遺伝子産物を発現させると毒性であるため、本発明者らは、ＨＥＫ２９３ヘルパー細胞株において、ＲＳＶ  Ｆを発現する組換えアデノウイルスベクターを増殖させたなら、Ｆにより誘導される毒性がアデノウイルスベクターの増殖に干渉し、ウイルス収量の低下を結果としてもたらすのであろう、と推論した。同様に、本発明者らはまた、アデノウイルスベクターを増殖させるのに用いられる細胞株においてＦ遺伝子の発現を阻害したなら、十分な量のウイルスベクターを生成させることができ、その後、ＶＬＰの生成に適する細胞株への形質導入が可能となるであろうとも推論した。
【０２６６】
材料および方法
ベクターを増殖させるときに、アデノウイルスベクターにおけるＲＳＶ  Ｆの発現を阻害するために、２コピーのテトラサイクリンオペレーター配列を、そのＣＭＶプロモーターへと挿入することにより、複製欠損性アデノウイルスベクターを誘導するのに用いられる、アデノウイルスによるシャトルベクターであるｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶを改変した。Ｆを含有するアデノウイルスベクターを、テトラサイクリンレプレッサーを発現するＨＥＫ２９３ベースのヘルパー細胞株において増殖させて、Ｆ発現の阻害を引き起こすように、この戦略をデザインした。改変されたシャトルベクターを、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ＴＯと称し、このベクターの機能マップを図３４に示すが、このベクターの配列は、以下の通りである。
【０２６７】
【化４０】
0005917402.tif 000042
【０２６８】
【化４１】
0005917402.tif 000043
【０２６９】
【化４２】
0005917402.tif 000044
【０２７０】
【化４３】
0005917402.tif 000045
【０２７１】
【化４４】
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【０２７２】
【化４５】
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ＧａｇおよびＦの両方を含有する、複製欠損性の組換えアデノウイルスベクターを発生させるため、ＡＬＶ  Ｇａｇ遺伝子のプロテアーゼ欠失形をまずｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶへと挿入し、ＲＳＶ  Ｆ遺伝子をｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶ−ＴＯへと挿入する結果として、それぞれ、新たなプラスミドであるｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡＬＶ  Ｇａｇ−ｄＰＲおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＴＯ−ＦＬが得られる。ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡＬＶ−Ｇａｇ−ｄＰＲのプラスミドマップを、図３５に示すが、その配列は以下の通りである。
【０２７３】
【化４６】
0005917402.tif 000048
【０２７４】
【化４７】
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【０２７５】
【化４８】
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【０２７６】
【化４９】
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【０２７７】
【化５０】
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【０２７８】
【化５１】
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ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＴＯ−ＦＬのプラスミドマップを図３６に示すが、その配列は、以下の通りである。
【０２７９】
【化５２】
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【０２８０】
【化５３】
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【０２８１】
【化５４】
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【０２８２】
【化５５】
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【０２８３】
【化５６】
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【０２８４】
【化５７】
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ＧａｇのシャトルベクターおよびＦのシャトルベクターを個別に完成させた後に、これらからＧａｇおよびＦを組み合わせたシャトルベクターを誘導した。ＰＣＲ法を用いて、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＴＯ−ＦＬに由来する修飾プロモーターおよびＦのコード配列の他、ＳＶ４０のポリアデニル化配列を含有するＤＮＡ断片を生成させ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡＬＶ−Ｇａｇ−ｄＰＲのＨｐａＩ部位へと挿入した。この結果として、２つの遺伝子（Ｇａｇ＋Ｆ）が、それらの間に単一のＳＶ４０ポリアデニル化領域断片を共有しながら転写方向で逆行する、二重シャトルベクターが構築される。新たな二重シャトルベクターであるｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｄＰＲ−ＴＯ−ＦＬ−ｒｅｖのプラスミドマップを図３７に示すが、そのヌクレオチド配列は以下の通りである。
【０２８５】
【化５８】
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【０２８６】
【化５９】
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【０２８７】
【化６０】
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【０２８８】
【化６１】
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【０２８９】
【化６２】
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【０２９０】
【化６３】
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【０２９１】
【化６４】
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【０２９２】
【化６５】
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ＧａｇおよびＦの両方をコードする、複製欠損性のアデノウイルスベクターを生成させるために、ＰｍｅＩによりｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｄＰＲ−ＴＯ−ＦＬ−ｒｅｖを直鎖化し、次いで、それを、Ｅ１を欠失させた５型アデノウイルスゲノムへと組み換える目的で、細菌株であるＢＪ５１８３−ＡＤ−１へと電気穿孔した。アデノウイルスベクターを生成させるこれらの方法は、当業者に一般的である。小規模のコロニー（アデノウイルスゲノムへのプラスミドの組換えを示唆する）を選択し、挿入されたｐＳｈｕｔｔｌｅ−ｄＰＲ−ＴＯ−ＦＬ−ｒｅｖ配列を含有する組換えアデノウイルスＤＮＡを増大させ、かつ単離した。次いで、挿入されたＧａｇ遺伝子およびＦ遺伝子を含有する組換えアデノウイルスＤＮＡクローンを、ＰａｃＩにより消化して、細菌プラスミド配列からアデノウイルスＤＮＡを分離し、複製欠損性アデノウイルス株を生成させる目的で、このＤＮＡをＴ−Ｒｅｘ  ２９３細胞へとトランスフェクトした。Ｔ−Ｒｅｘ  ２９３細胞とは、Ｔｅｔレプレッサー遺伝子を含有するＨＥＫ２９３細胞である。すべての２９３細胞株内に含有されるＥ１遺伝子により、複製欠損性アデノウイルスベクターの複製が可能となり、Ｔ−Ｒｅｘ  ２９３細胞株内のＴｅｔレプレッサーにより、ウイルス増殖時におけるＦ遺伝子の発現が阻害される。
【０２９３】
ＧａｇおよびＦをコードするアデノウイルスベクターを、Ｔ−Ｒｅｘ  ２９３細胞において単離し、増大させることに成功した後、このベクターを用いてＶｅｒｏ細胞に形質導入し、ＶＬＰを生成させた。Ｔ１７５培養フラスコ内の、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させたＶｅｒｏ細胞を、無血清ＶＰ−ＳＦＭ培地で洗浄し、次いで、ＶＰ−ＳＦＭ培地中で確立し、次いで、これに、７０：１の感染倍率でＧａｇ＋Ｆによる二重アデノウイルスベクターを形質導入した。２４時間以内に、形質導入したＶｅｒｏ細胞は、主に合胞体塊の形成からなる細胞変性効果（ＣＰＥ）を示し始めた。７２時間後までに、大型で浮遊する多くの合胞体が観察されるＣＰＥが広範に示された。この時点で培地を収集し、２０００ｒｐｍで１０分間にわたる遠心分離により細胞破砕物を除去した。１０℃、１００，０００×ｇで２時間にわたる、２段階の段階的なスクロース勾配（ｐＨ７．４のトリス緩衝生理食塩液中３０％および６０％のスクロース）による遠心分離を介して、培地中に存在するＶＬＰを精製した。３０％のスクロース層と６０％のスクロース層との接合部において可視的バンドが観察され、これを回収した（図３８（ａ））。
【０２９４】
複数のＴ１７５フラスコからこのようにして精製されたＶＬＰを、トリス緩衝生理食塩液中で２倍に希釈し、次いで、Ｖｅｒｏ細胞へと取り込まれていない、任意の残留アデノウイルスベクターを不活化させる目的で、５０ｍｃｇ／ｍｌのアミノメチルトリメチルソラーレンの存在下において、３ジュールの長波長ＵＶ放射にかけた。残留ベクターを不活化させた後に、最終的な精製ステップとして、ＶＬＰに、３０〜６０％の段階的なスクロース勾配上で再度バンド形成させた。
【０２９５】
結果
図３８（ｂ）は、最終的に精製されたＶＬＰ調製物に対する銀染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示し、図３９は、Ｆ１断片（還元状態）の存在を裏付ける、ＲＳＶ特異的なウェスタンブロットを示す。最後に、電子顕微鏡写真（図４０）は、最終調製物におけるエンベロープＶＬＰの存在を示す。アデノウイルスの発現が、前出の例を少なくとも１０倍上回る収量でもたらされたことから、ウイルス発現の改善が示される。
【０２９６】
（実施例１４）
シュードタイプＡＬＶ  Ｇａｇ＋ＲＳＶ  Ｆ  ＶＬＰの免疫原性
本例では、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＡＬＶ  Ｇａｇ  ＶＬＰの免疫原特性および防御特性についてさらに裏付ける。
【０２９７】
材料および方法
ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰが、免疫原性であり、かつ、防御性であることをさらに裏付けるために、アデノウイルス発現系を用いる前出の例で説明した通りにＶＬＰを調製し、コトンラットによるワクチン接種感作モデルに使用した。上記で説明した通りに生成させた、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＧａｇ  ＶＬＰに加えて、ＡＬＶ  Ｇａｇ遺伝子だけを含有するアデノウイルスベクターを用いる、Ｇａｇだけを伴うＶＬＰ試料も生成させた。後者の、ＲＳＶ  Ｆ抗原を欠く「ネイキッド」ＶＬＰのバッチを、ＦでシュートタイピングしたＧａｇ  ＶＬＰの場合と同様の形で生成させ、かつ精製し、これらを陰性対照ワクチンとして利用した。
【０２９８】
無病原体の特殊な雌コトンラットを用いて、各々１２匹ずつの動物からなる５つの免疫化群を使用する免疫化試験をデザインした。５つの免疫化群には、それぞれ、以下のワクチンを割り当てた。
【０２９９】
１．ＶＬＰ（投与１回当たり３μｇのＦ抗原、３０μｇの全ＶＬＰタンパク質）
２．ＶＬＰ＋ＭＰＬアジュバント（投与１回当たり３μｇのＦ抗原、３０μｇの全ＶＬＰタンパク質、５０μｇのモノホスホリル脂質Ａによるアジュバント）
３．ＧａｇだけによるＶＬＰ（投与１回当たり６０μｇの全ＶＬＰタンパク質）
４．ＲＳＶの生ウイルス（陽性対照：投与１回当たり１×１０５ｐｆｕのＡ型ＲＳＶの生ウイルス）
５．ナイーブ（陰性対照群：ワクチン接種なし）
ワクチン接種群１〜３には、上記で説明した０日目および２１日目に、初回ワクチン接種および追加ワクチン接種を施した。群４の動物には、０日目にＲＳＶの生ウイルスによる単回のワクチン接種を施し、２１日目の追加接種は行わなかった。群５のナイーブ動物には、ワクチン投与を施さなかった。
【０３００】
追加免疫化の２週間後（３５日目）に、血清試料を回収し、標準的なウイルスマイクロ中和アッセイで、ＲＳＶ特異的な中和抗体反応を解析した。
【０３０１】
４９日目に、１×１０５ｐｆｕのＡ型ＲＳＶ生ウイルスにより、すべての動物を感作した。５４日目（感作の５日後）に、各群から６匹ずつの動物を屠殺して、肺ホモジネート中のＲＳＶウイルス力価を決定した。当業者に公知である標準的な技法を用いて、細胞培養物中のウイルス感染性を滴定することにより、肺ホモジネート中のウイルスを定量した。
【０３０２】
また、肺の組織病理学測定を行うのにも、６匹の動物を屠殺した。当業者に公知の方法を用いて、肺試料をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ染色し、熟練した病理学者の手で、肺胞炎および間質性肺炎についてスライドを検証した。
【０３０３】
結果
血清抗体反応
血清抗体反応を裏付ける結果を、図４１に示す。ＭＰＬアジュバントを伴うＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰ、およびＭＰＬアジュバントを伴わないＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰにおいて、高度な中和抗体力価が観察された。Ｇａｇだけを伴うＶＬＰによる免疫化群では中和反応が検出されなかったことから、特異的な免疫反応を誘導するのにＲＳＶ  Ｆ抗原が重要であることが裏付けられる。最後に、ＲＳＶ生ウイルスの陽性対照によるワクチン接種群は、低度のウイルス中和力価を呈示した。
【０３０４】
肺組織におけるウイルス力価
肺ホモジネート中のウイルス力価を裏付ける結果を図４２に示すが、ここで、ナイーブの、ワクチン接種されなかった動物が、高レベルのウイルス複製を呈示したのに対し、ＶＬＰおよびＲＳＶの生ウイルスによりワクチン接種された動物は、感作からの著明な防御を示した。ＶＬＰ＋ＭＰＬにより免疫化された群では、ウイルスがまったく検出されなかった。Ｇａｇだけにより免疫化された動物では、低量の防御が観察されたが、この群ではＲＳＶ特異的な中和免疫反応が見られないので、これは、Ｇａｇだけを伴うＶＬＰによる免疫化を介して、自然免疫が活性化された結果である可能性がある（図４１）。ウイルス感作とウイルス中和とを組み合わせたデータにより、ＲＳＶ  ＦでシュートタイピングしたＶＬＰが、ウイルス感作に対して防御的である、強力な中和免疫反応を誘導する能力が裏付けられる。
【０３０５】
肺組織病理学測定
肺組織病理学測定のスコアを図４３に示すが、これにより、ＶＬＰ＋ＭＰＬによるワクチン接種群およびＲＳＶの生ウイルスによるワクチン接種群の病理学スコアが低いことが裏付けられる。ＭＰＬアジュバントの非存在下におけるＶＬＰによる免疫化群では、中程度の病態が観察された。したがって、ＶＬＰ＋ＭＰＬによるワクチン製剤は、高度な中和抗体力価を誘発し、その結果として、著明な病理学的反応を伴わずに、感作に対する完全なワクチン防御をもたらすことが可能である。
【０３０６】
さらなる参考文献
【０３０７】
【数１】
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【０３０８】
【数２】
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【０３０９】
【数３】
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【０３１０】
【数４】
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【０３１１】
【数５】
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【０３１２】
【数６】
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【０３１３】
【数７】
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【０３１４】
【数８】
0005917402.tif 000075
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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