(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシルアミン塩の水溶液をアルカリの水溶液に添加する工程と、続いて前記混合物中に、金または銀の金属イオンの水溶液を、高速ジェットを用いた高速注入によって投入する工程とを含み、前記ヒドロキシルアミン塩が前記金属イオンと混合した際に、前記ヒドロキシルアミン塩のアニオンが水中で１×１０−１０未満の溶解度積（ＫＳＰ）の値を有する金属塩を形成することになるように前記ヒドロキシルアミン塩が選択される、金属コロイド溶液を製造する方法であって、前記金属イオン溶液の投入および混合は、１秒以内で行われ、
前記ヒドロキシルアミン塩がヒドロキシルアミンリン酸塩である、方法。
【請求項２】
前記金属イオン水溶液が硝酸銀溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属イオン水溶液がテトラクロロ金酸の溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記金属イオンが投入される前記混合物の容積が５ｃｍ３未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオン溶液を投入した後に前記混合物が２秒〜３０秒の期間で更なる混合を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルカリが水酸化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒドロキシルアミン塩の濃度が０．０７５×１０−３Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリの濃度が１．３３×１０−３Ｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
得られたコロイド中の粒子径の分布が１０〜２８ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記投入及び分散をポリスチレン製の容器中で実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
安定性を改善させるために前記コロイド溶液を室温超の温度で所定期間熟成させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記コロイド溶液を４０°Ｃ〜５０°Ｃの範囲の温度において熟成することを含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は安定な金属コロイドの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何年もの間、分析化学者は、ラマン分光法が微量検体の検出に必要な感度を達成できないために、ラマン分光法を用いなかった。この主な理由はサンプル又は基材のいずれかに由来する蛍光の非常に高いノイズレベルのためである。  
【０００３】
１９７４年に、フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎ）は、ラマン分光法を使用して銀電極上のピリジンの電気化学的反応を研究しているときに、銀が多量の蛍光ノイズを抑制させるとともに、ピリジンのラマン信号に顕著な増強があることを見いだした。  銀表面が粗面であり平滑でない場合にのみ、表面増強を実現できることが知られている。
【０００４】
クレイトン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）と共同研究者によって、１９７９年に、水溶液中で銀（Ａｇ）又は金（Ａｕ）のコロイド分散体を利用する可能性が初めて実証された（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｊ．Ａ．；  Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄ，  ＣＧ．  ；  Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｊ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  Ｆａｒａｄａｙ  Ｔｒａｎｓ．  ２  、１９７９年  ７５巻、７９０頁）。銀コロイドを用いて、等価な又はもっと高い表面増強が見いだされた。あるコロイドは溶液における金属粒子の懸濁体である。最適の効果を達成するには、銀コロイド粒子の凝集を制御することが必要であり、凝集剤として有機化合物又は無機化合物を使用するのが一般的である。
【０００５】
この表面増強効果の使用により、感度の大幅な増加が達成でき、それ以降、表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）分光法及び表面増強共鳴ラマン散乱（ＳＥＲＲＳ）分光法の分析技術が発展した。
【０００６】
これらの技術の使用は指数関数的に増加したが、主要な問題は、良好な光散乱特性を有し蛍光ノイズを抑制できる安定なコロイドを製造することである。コロイドが引き続き安定であるためには、銀粒子はいつまでも懸濁したままでなければならないが、多くの場合で凝集が発生し、銀は溶液から沈降することが知られている。
【０００７】
銀コロイドは、水素化ホウ素ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを用いた化学的還元によって調製できる。クエン酸塩還元コロイドはより安定性が高いことが周知であり、  多くの分析者はＰ．Ｃ．リー（Ｌｅｅ）及びＯ．マイゼル（Ｍｅｉｓｅｌ）によって発表された方法を使用してこれらを調製した（Ｐ．Ｃ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｏ．  Ｍｅｉｓｅｌ  ；  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，  １９８２年、８６巻、３３９１−３３９５頁）。しかしながら、この方法では、バッチごとの再現性が困難であり、安定性、すなわち保存寿命が変動することが周知である。この方法によるこのような銀コロイドの調製には、超清浄なガラス器具の使用及び温度、撹拌速度などの精密な制御が必要である。
【０００８】
この原型の方法が発表されて以来ずっと、この原型方法の改良が発表されてきた（Ｃ．Ｈ．Ｍｕｎｒｏ，  Ｗ．Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ  及び  Ｐ．Ｃ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ａｎａｌｙｓｔ  １９９３年、１１８巻、７３３−７３５頁）。既知の原型を改良したこの発表方法により、銀コロイドの特性にいくらかの改善がもたらされたが、コロイドの長期安定性はまだ依然として課題となっている。  
【０００９】
所望の光散乱特性を有した銀コロイド製造における以前の試みは芳しくない結果であり、この不本意な結果により、実際は硝酸銀におけるナトリウムイオンの性質が好適な安定性及び保存寿命を持つ銀コロイドを獲得する試みを失敗させた原因であると認識された見識に立ち向かう勇気が無くなっていた。ＰＣＴ国際公開特許ＷＯ２００７／１０７７９２において、本発明者らは、硝酸銀の還元にクエン酸ナトリウムの代わりにクエン酸リチウムを使用することによって、良好なＳＥＲＲＳ特性を有し非常に安定な銀コロイドを製造する方法を開示し、特許権を請求している。
【００１０】
ヒドロキシルアミン塩酸塩を使用して硝酸銀をアルカリ性のｐＨにおいて室温で還元することは、Ｎ．レオポルド（Ｌｅｏｐｏｌｄ）；Ｂ．レンディ（Ｌｅｎｄｉ）により発表されている（Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｎ．；  Ｌｅｎｄｉ，Ｂ；  Ｊ．Ｐｈｙｓ，Ｃｈｅｍ．  ２００３年、１０７巻、５７２３−５７２７）。この論文に発表された結果は、そのコロイドが大きな粒径分布を有し、広いバンド幅及び高いλ（ｍａｘ）値を有するということを示す。これらの特性は品質の悪いコロイドに典型的であり、良好なＳＥＲＲＳスペクトルを与えるとは予想できない。提出されたスペクトルは、高レベルの蛍光ノイズを示し、このことは銀粒子への染料の吸着性が劣ったものに典型的である。その論文では、コロイドの、異なったバッチ由来のＳＥＲＲＳスペクトルの安定性又は再現性について言及がなく、その安定性又は再現性はＳＥＲＲＳ分光法においてずっと主要な問題であった。
【００１１】
金コロイドは種々のナノテクノロジー応用分野、例えば、バイオセンサー、並びにラマン分光分析に使用できる。コロイド形態のその他の金属は、同様な応用分野に利用できる可能性があり、又は新規応用分野を見いだす可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｊ．Ａ．；  Ｂｌａｔｃｈｆｏｒｄ，  ＣＧ．  ；  Ａｌｂｒｅｃｈｔ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｊ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ，  Ｆａｒａｄａｙ  Ｔｒａｎｓ．  ２  、１９７９年  ７５巻、７９０頁」
【非特許文献２】「Ｐ．Ｃ．  Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｏ．  Ｍｅｉｓｅｌ  ；  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，  １９８２年、８６巻、３３９１−３３９５頁」
【非特許文献３】「Ｃ．Ｈ．Ｍｕｎｒｏ，  Ｗ．Ｅ．  Ｓｍｉｔｈ  及び  Ｐ．Ｃ．  Ｗｈｉｔｅ，  Ａｎａｌｙｓｔ  １９９３年、１１８巻、７３３−７３５頁」
【非特許文献４】「Ｌｅｏｐｏｌｄ，Ｎ．；  Ｌｅｎｄｉ，Ｂ；  Ｊ．Ｐｈｙｓ，Ｃｈｅｍ．  ２００３年、１０７巻、５７２３−５７２７」
【非特許文献５】「Ａｂｄａｌｉ，Ｓ．；Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｃ．；Ｎｙｇａａｒｄ，Ｊ．；Ｎｏｒｂｙｇａａｒｄ，Ｔ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ，  ２００７年、１９巻、２８５２０５−２８５２１２頁」
【非特許文献６】「Ｆａｕｌｄｓ，Ｋ．；Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．；Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．；Ｄｅｎｔ，Ｇ．；Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｅ．，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００４年、７６巻、５９２−５９８頁」
【発明の概要】
【００１３】
本発明によると、金属コロイド溶液を製造する方法は、アルカリの水溶液にヒドロキシルアミン塩の水溶液を添加する工程と、続いてその混合物中に金属イオン水溶液を分散させる工程とを含み、そのアニオンが、前記金属イオンと混合した際に水への溶解性が非常に低い金属塩を形成することになるようにヒドロキシルアミン塩が選択される方法であって、金属イオンが前記混合物の中に実質的に１秒以内、及び好ましくは０．５秒以内で、混合物全体に分散されるような方法で、金属イオン溶液を前記混合物中に投入する。
【００１４】
金属イオンの投入は高速ジェットを用いた高速注入によって達成できるであろう。現在は、このことは非常に小容積の溶液を使用して、例えば、プランジャーピペットを使用して小容積の金属イオン溶液をヒドロキシルアミン溶液の中に注入することによって最も良好に達成できる。本発明の方法は、例えば、小さい液滴が迅速かつ高速に噴出される、インクジェットプリンターで使用されるもののような高速、低容積噴射技術を有利に採用できる。金属イオンは銀又は金が好適であるが，その他の金属、例えば、銅もまたコロイドを製造するために使用できる。銀は硝酸銀溶液の形態であってよい。
【００１５】
アルカリは水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムのような強塩基が好ましく、水酸化ナトリウムが推奨される。大気中の炭酸ガス吸収が結果に影響を及ぼすと考えられるため、アルカリ溶液は新規に調整されるのが好ましく、−数時間、２時間でさえも、放置した水酸化ナトリウムに使用により、より高いλ（ｍａｘ）、減少した吸光度及びより大きなバンド幅の値を有した黒っぽいコロイドがもたらされることが認められた。
【００１６】
結果によれば、ＵＶ及びＳＥＲＲＳの最高に望ましい特性を有したコロイドを製造するのに最適な期間は、後続の混合工程が１０秒以内で完全な分散が得られるように実施する場合であることが示された。混合工程をより短時間で（２秒）又はより長時間（３０秒）で実施すると、この場合はより不安定なコロイド形態の著しく劣った結果になる。  
【００１７】
本出願人の方法で製造されたコロイドは、極めて優れたＵＶ特性を提供することが示されている。１ｃｍパス長のキュベット中での希釈コロイド調製物（３ｍＬの水に６０μＬのコロイド液）に対しては、本出願人のコロイドは、λ（ｍａｘ）の値が概して３８９±１ｎｍ、バンド幅が２８±２ｎｍ、及び吸光度が０．４７５±２５、であるＵＶスペクトルを生じる。得られるコロイドはまた、非常に強度の高いＳＥＲＲＳスペクトルを与え、そして本出願人が還元剤としてクエン酸リチウムを使用したときに得られた以前の結果よりもより低い蛍光ノイズを与えた。  
【００１８】
金属塩の還元は金属粒子を生成し、溶液中に存在するアニオンはその粒子表面に引きつけられる。その粒子上に電荷が残っていると仮定すると、粒子は互いに反発し合い溶液中に留まるであろう。理想的には、コロイド溶液中の金属粒子は何時までも溶液中に留まるが、多くのコロイドの製造においてはこの安定性は達成されず、時間と共に粒子の凝集が発生し、コロイドの破壊がもたらされる。この発生はＵＶによってモニタリングでき、ＵＶではある期間を通してλ（ｍａｘ）並びにバンド幅の増加、及び吸光度の低下が観察される。
【００１９】
本出願人の提案するコロイド製造方法では、ヒドロキシルアミン塩、すなわちアニオンの選択がコロイドの安定性に影響を与えることが見いだされた。ヒドロキシルアミンとは異なった塩を用いる銀コロイドの調製では、硫酸塩、硝酸塩又はＯ−スルホン酸塩を用いて安定なコロイドを得ることができなかった。塩酸塩では限定された安定性のコロイドが得られるが、リン酸塩を用いた場合では非常に安定なコロイドが製造された。観察された不安定性の増加は、不溶性すなわち、銀塩の溶解度積（ＫＳＰ）に関連付けでき、各ＫＳＰは、  Ａｇ２ＳＯ４＝１．２×１０−５  ；ＡｇＣｌ＝１．８×１０−１０及びＡｇ３ＰＯ４＝１．２×１０−１６である。
【００２０】
アニオンの原子価がコロイドの安定性に影響することも考えられる。リー及びマイゼルのクエン酸塩還元コロイドでは、クエン酸銀は硫酸銀のＫｓｐと非常に類似したＫｓｐを有し、従って非常に安定ではないと予想されるであろう。しかしながら、クエン酸塩は３価のアニオンであり、恐らくこのことにより予想したよりも高い安定性の度合いが説明される。リン酸塩でも３価のアニオンであるので、そのことにより、ヒドロキシルアミンリン酸塩を用いて達成された安定性の向上が説明できるであろう。本出願人らの提案した調整方法を使用して金コロイドが製造されたが、安定な形態はリン酸塩でのみ達成でき、ヒドロキシルアミンの塩酸塩では達成できなかった。従って、その方法ではアニオンのイオン価が高いように、かつ前記金属イオンと組み合わせる場合には、水への溶解度が低い金属塩を形成することになるように選択されたヒドロキシルアミン塩を使用する。金属イオン溶液としては、例えば硝酸銀、塩化金又は硝酸銅が使用できる。
【００２１】
ヒドロキシルアミン塩酸塩を使用して製造された銀コロイド（ＨＨＡｇコロイド）は、製造から４８時間以内に、それらのＵＶ特性において、吸光度の増加を伴った、バンド幅及びλ（ｍａｘ）の減少を示す。この期間を過ぎると、３０日間を通して、吸光度の大きな変化を伴わずに、λ（ｍａｘ）及びバンド幅が大幅に遅い速度で低下するが、しかしこの期間を超えると吸光度はきわめて早く低下することが観察される。ヒドロキシルアミンリン酸塩を使用して製造されたコロイド（ＨＰＡｇコロイド）は、はるかに大きな安定性を示す。３０日の期間にわたり、これらはＵＶ特性に大きな初期変化を示さず、長期間にわたって、バンド幅及びλ（ｍａｘ）の非常に小さい減少だけを示し、吸光度はそれらのレベルを維持する。
【００２２】
更に、所定期間のコロイドの熟成により、その特性がそれ以上変化しない安定なコロイドを製造できることが見いだされた。熟成の期間は温度によって影響される。室温では，熟成期間は約８週間に延長されるかもしれないが、より高い温度では、安定性を得るのに要する時間は大幅に減少し、例えば４０°Ｃ−５０°Ｃでは約２４時間だけを要する。熟成工程は又、容器の大きさによって促進され、所与の容積に対しては大きな表面積を有する容器を使用することが好ましい。その他のプラスチックス容器、例えばポリカーボネート、ポリプロピレン及びポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）から製造された容器では、ガラス容器で起こるのと同様に、より早いコロイド破壊がもたらされる。安定性は又、コロイドが保存される容器の材質によって影響を受け、ポリスチレン製容器が最高の安定性を与えることが見いだされた。
【００２３】
本発明の方法で製造された銀コロイドは、銀を０．１１４ｍｇ／ｍＬ−1の濃度で含有し、それはリー及びマイゼルのクエン酸で還元されたコロイド中の銀濃度と非常に似ている。しかしながらリー及びマイゼルのものとは違って、ＨＨＡｇ及びＨＰＡｇのコロイドは、コロイドの希釈液を使用した場合、ＳＥＲＲＳ信号の感度にかなりの増加を生じる。希釈は２５〜７０％の範囲内が好ましく、このことは、例えば水、及び／又は塩化ナトリウム、硝酸のような無機凝集剤、若しくはポリ−Ｌ−リジンのような有機凝集剤、などの水溶液の使用によって達成できる。
【００２４】
ＳＥＲＲＳには、銀粒子の凝集が表面増強効果を得るために必須である。典型的には、リー及びマイゼルのクエン酸還元コロイドを用いて分析すると、検体の濃度が１０−５Ｍより大である場合、自己凝集現象が発生する。より低濃度の検体を検出するために、無機又は有機凝集剤を使用する必要がある。ＨＨＡｇコロイドを用いて行われた研究により、最初の４８時間の寿命を通して、そのコロイドはより低濃度（約１０−８Ｍ）において自己凝集の達成及び強いＳＥＲＲＳ信号の取得が可能であり、従って凝集剤のあらゆる必要性及びサンプルの如何なる追加希釈も排除できることが示される。鉄結合蛋白質、すなわち、サイトクロムＣ（Ｃｙｔ  Ｃ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）及びミオグロビン（Ｍｂ）を１０−７Ｍ濃度で用いた自己凝集の研究が達成された。
【００２５】
４８時間を超えたＨＨＡｇコロイドでは、強いＳＥＲＲＳスペクトルは凝集剤の添加によってのみ実現可能である。このコロイドの独特な特性は、そこにあるクロライドイオン（ヒドロキシルアミン塩酸塩由来）の存在に起因する。クロライドイオンは伝統的に凝集剤として使用されてきたし、このことは何故自己凝集が実現できたかを説明するであろう。４８時間後に凝集剤の添加を必要とすることは、それらが溶液から沈降する大きさの凝集物に成長すること及びクロライド濃度が自己凝集に必要なレベル以下に低下したことを示す。放置した後のコロイド溶液がＵＶ吸光度を損失し目視で幾分黒っぽくなることは、後者が起きていることを示すのであろう。  
【００２６】
凝集剤と共にクエン酸ナトリウム−還元コロイドを使用した、Ｍｂについての以前のＳＥＲＲＳ研究（Ｓ．アブダリ（Ａｂｄａｌｉ），Ｃ．ヨハンセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ），Ｊ．ニガルド（Ｎｙｇａａｒｄ），Ｔ．ノルバイガード（Ｎｏｒｂｙｇａａｒｄ），Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ，  ２００７年、１９巻、２８５２０５−２８５２１２頁）と比較すると、原型のレンドル（Ｌｅｎｄｌ）の方法によって調製されたＨＨＡｇコロイドは、実質的により低い蛍光ノイズを生成した。さらに、スペクトルの間で観察された変形は、ヒドロキシルアミン還元コロイドとクエン酸ナトリウム還元コロイドの表面の化学的性質の差異を示す。
【００２７】
ＨＰＡｇコロイドを用いた研究では、そのコロイドは、１０−７Ｍより高い検体濃度に対して如何なるレベルの自己凝集も示さないので、リー及びマイゼルのクエン酸塩の還元塩とより多く類似していることが示される。しかしながら、凝集剤の添加により非常に強いＳＥＲＲＳスペクトルを、非常に低いレベルの蛍光ノイズと共に得ることができる。
【００２８】
そのＨＰＡｇコロイドは独特の特性を有することが観察された。ＵＶ研究からコロイドの自己凝集特性を確認し、コロイド粒子の単分子層被覆が発生する染料濃度を推定するために、以前はベンゾトリアゾール染料が検体として使用された（Ｋ．フォールズ（Ｆａｕｌｄｓ），Ｒ．Ｅ．リトルフォード（Ｌｉｔｔｌｅｆｏｒｄ），Ｄ．グラハム（Ｇｒａｈａｍ），Ｇ．デント（Ｄｅｎｔ），Ｗ．Ｅ．スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００４年、７６巻、５９２−５９８頁）。ＨＰＡｇを用いた同様な研究により、同様に自己凝集が１×１０−６〜１×１０−７Ｍの範囲で発生することが示されたが、リー及びマイゼルのクエン酸塩還元コロイドと比較すると、そのＵＶは、より短波長、例えば，約７２０ｎｍと比較して約６５０ｎｍ、において強くてより狭いバンド幅の吸収を示す。これらの結果は、ＨＰＡｇコロイド粒子径が小さければ小さいほど、小さい凝集クラスターが生成され、従ってリー及びマイゼルのクエン酸塩還元の銀コロイドよりもより低いプラズモン波長を有することを示唆する。観察された影響は又、非常に濃度依存性があり、最高の影響は５×１０−７〜７．５×１０−７Ｍの濃度範囲で発生する。これらの溶液のＴＥＭ観察により、凝集粒子の離散した集塊（７０×１１５μｍ）が示され、６３３ｎｍのレーザーを使用する場合、ラマンスペクトルの強度は濃度範囲５×１０−７〜７．５×１０−７Ｍにおいて最大化されることが示される。  それ故、コロイド粒子の単分子被覆が発生する染料濃度のより正確な推定値を得ることが可能である。更に、限定された濃度を超えた場合のみではあるが、ＨＰＡｇコロイドは、赤色（６３３ｎｍ）レーザー波長を用いた黄色染料の分析のための独特な表面増強方法を提供する。
【００２９】
これらの結果は、本発明の調製方法を用いて、ＳＥＲＲＳ分光法の技術分野の他の技術者によって以前に得られたものよりも大幅に低い検出レベルを得ることが可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
図面では、本発明による方法によって製造されたコロイドに関する研究結果をグラフで示す：
【図１】ヒドロキシルアミン塩酸塩コロイドから得られた結果と、クエン酸リチウムを使用した本出願人らの以前の研究で得られた結果とを比較する、波数に対するラマン強度のグラフである。
【図２ａ】還元剤としてヒドロキシルアミン塩酸塩を使用し、Ｎ．レオポルド（Ｌｅｏｐｏｌｄ）；  Ｂ．レンディ（Ｌｅｎｄｉ）；  Ｊ．Ｐｈｙｓ，  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  、２００３年、１０７巻、５７２３−５７２７頁に発表された方法に従って得られた銀コロイドのＵＶ／可視スペクトルである。
【図２ｂ】還元剤としてヒドロキシルアミン塩酸塩を使用する本発明の方法によって得られた銀コロイドのＵＶ／可視スペクトルであって、３０日を通してそのコロイドの安定性を示す。
【図２ｃ】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する本発明の方法によって得られた銀コロイドのＵＶ／可視スペクトルであって、７ヶ月を通してそのコロイドの安定性を示す。
【図３ａ】ＨＨＡｇコロイドが１０秒以内で完全分散を達成するように投入及び混合工程を実施した場合に得られた結果を示す、時間に対するＳＥＲＲＳ強度（ローダミン６Ｇに関する１６４９、１３６３及び６１２ｃｍ−１での信号）のグラフである。
【図３ｂ】ＨＨＡｇコロイド製造のための投入及び混合工程をより短い期間の２秒で実施した場合に得られた結果を示す、同様なグラフである。
【図３ｃ】ＨＨＡｇコロイド製造のための投入及び混合工程をより長い期間の３０秒で実施した場合の、コロイドの不安定化を示す結果を示す、追加の同様なグラフである。
【図４ａ】凝集剤として塩化ナトリウムを用いたヒドロキシルアミン塩酸塩−還元コロイドの５０％希釈液を使用した場合のローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度の増加を示す、波数（ｃｍ−１）に対するラマン強度のプロットである（５１４ｎｍ）。
【図４ｂ】凝集剤としてポリ−Ｌ−リシンを用いたヒドロキシルアミン塩酸塩−還元コロイドの５０％希釈液を使用した場合のローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度の増加を示す、同様のプロットである（５１４ｎｍ）。
【図４ｃ】凝集剤を用いないヒドロキシルアミン塩酸塩−還元コロイドの５０％希釈液を使用した場合の、ローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度を示すプロットである（５１４ｎｍ）。
【図５】自己凝集と鉄結合蛋白質、ＣｙｔＣ  Ｍｂ及びＨｂの１３７５及び１１６９ｃｍ−１バンドに得られたＳＥＲＲＳ強度とを示す、サンプル中の１０−７Ｍ蛋白質の容積％に対するＳＥＲＲＳ強度（ａ．ｕ．＝任意の単位  ）のグラフである。  そのプロットは、濃度１０−７Ｍにおけるそれぞれの蛋白質に対する最適化されたＳＥＲＲＳ条件（ＨＨＡｇコロイド：検体の容積比）を示す。
【図６】最適化されたＳＥＲＲＳ条件の下での、鉄結合蛋白質、ＣｙｔＣ、Ｍｂ及びＨｂ、（それぞれの蛋白質濃度は１０−７Ｍ）の自己凝集物のＳＥＲＲＳスペクトルを示す、波数に対するＳＥＲＲＳ強度のグラフである。
【図７】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する、本発明の方法によって製造された金コロイドのＵＶ／可視スペクトルである。
【図８】ベンゾトリアゾール染料の７．５×１０−７Ｍ  溶液で凝集されたＨＰＡｇコロイドのＴＥＭ（透過型電子顕微鏡  （Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ））画像である。
【図９】６３３ｎｍのレーザー波長を使用するベンゾトリアゾール染料に対する、１３６８ｃｍ−１信号のラマン強度対濃度のグラフである。
【図１０ａ】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する本発明の方法によって得られた銀コロイドのＵＶスペクトル特性に及ぼす室温での熟成の影響を示す、時間（週）に対するλ（ｍａｘ）のプロットである。
【図１０ｂ】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する本発明の方法によって得られた銀コロイドのＵＶスペクトル特性に及ぼす室温での熟成の影響を示す、時間に対するバンド幅のプロットである。
【図１０ｃ】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する本発明の方法によって得られた銀コロイドのＵＶスペクトル特性に及ぼす室温での熟成の影響を示す、時間に対する吸光度のプロットである。
【図１１】還元剤としてヒドロキシルアミンリン酸塩を使用する本発明の方法により、かつ室温における熟成によって得られる銀コロイドの４つの異なった熟成バッチから得られたリボフラビンのＳＥＲＳスペクトルを示す。
【図１２】ヒドロキシルアミンリン酸塩を用いて硝酸銀を還元する本発明の方法により製造されたコロイドバッチの異なった熟成温度における、時間に対するＵＶバンド幅のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明による例示的な方法は、ヒドロキシルアミンリン酸塩（容積１００μＬ；  ヒドロキシルアミンに関する濃度（０．０７５×１０−３Ｍ  ）をポリスチレンバイアル中の水酸化ナトリウム水溶液（容積４．５ｍＬ；  濃度１．３３×１０−３Ｍ）に添加する工程と、得られた混合物を所定の時間（理想的には３０秒の期間）放置する工程と、その混合物に１０−２Ｍの硝酸銀水溶液（容積５００μＬ）を投入する工程と、それらの溶液を一緒に混合する工程とを含み、硝酸銀溶液は混合物中に急速に（０．５秒未満）投入され、かつ混合は２〜３０秒間の期間内で硝酸銀を混合物中に完全に分散させるように実施される。そして蓋をし、密封した容器を４０−５０°Ｃで２４時間加熱することによって、安定したコロイドが製造される。
【００３２】
金コロイドの調製には、硝酸銀の代わりにテトラクロロ金酸を使用したこと以外は、同じ方法を用いた。
【００３３】
図１は、硝酸銀を還元するためにクエン酸リチウムを使用して得られた以前の結果を、硝酸銀を還元するためにヒドロキシルアミン塩酸塩を使用して得られたより最近の結果と比較する。サンプルは、ローダミン６Ｇの１０−７Ｍ溶液を１０−８Ｍの染料最終濃度を与える０．１７５のＮａＣｌ溶液で凝集したものである。使用したレーザー波長は５１４ｎｍであった。
【００３４】
図２は１ｃｍパス長のキュベット中で６０μＬのコロイドを３ｍＬの水と混合し、続いて分析して得られたＵＶ結果を比較する。図２ａは、Ｎ．レオポルド（Ｌｅｏｐｏｌｄ）；  Ｂ．レンドル（Ｌｅｎｄｌ）；  Ｊ．Ｐｈｙｓ，  Ｃｈｅｍ．  Ｂ  ２００３年、１０７巻、５７２３−５７２７頁の方法によって、還元剤としてヒドロキシルアミン塩酸塩を使用するコロイド生成を示す。図２ｂは、ヒドロキシルアミン塩酸塩を用いて硝酸銀を還元する本発明による方法と、かつ１ヶ月間にわたったコロイド安定性を示す。図２ｃは、ヒドロキシルアミン塩酸塩を用いて硝酸銀を還元する本発明による方法と、かつ７ヶ月間にわたったコロイド安定性を示す。
【００３５】
従ってこれらの結果は、本出願人によって達成された顕著な結果が、ヒドロキシルアミン塩、使用される容積の特定の比率、混合の速度及び継続期間の選定に関連し、得られたコロイドの小さい粒径がコロイド溶液に安定性の増加並びに光散乱特性の増加を与える事を実証する。
【００３６】
図３ａは、水性ヒドロキシルアミン塩酸塩及び水性水酸化ナトリウムを硝酸銀の水溶液と混合する工程が、完全な混合を１０秒以内で達成するように実施される場合、得られるコロイドは安定でかつ所望のＵＶ特性及びＳＥＲＲＳ特性を有することを示す。
【００３７】
図３ｂは、混合工程がより短い期間（２秒）で実施される場合の繰り返し実験の結果を示す。その結果からは、得られるコロイドは不安定であることが明らかである。このことは、時間と共にコロイドが、ラマン強度の短期間における急速な減少によって示される不安定化の徴候を示すという事実によって実証される。  
【００３８】
図３ｃは、混合工程がより長い期間の３０秒にわたって実施される場合の結果を示し、この図は得られるコロイドの不安定性を示し、コロイドの凝集及び不安定化を実証する。  
【００３９】
図３ｂ及び３ｃは、混合期間が、完全な分散が達成される１０秒という最適な期間を越えた場合並びに１０秒未満に変更された場合に得られる、著しく劣った結果と不安定なコロイドであることを実証する。
【００４０】
図４ａは、凝集剤として塩化ナトリウムを用いたＨＨＡｇ還元コロイドの５０％希釈物を使用する場合、ローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度の増加を示す結果を例示する（５１４ｎｍ）。
【００４１】
図４ｂは、凝集剤としてポリ−Ｌ−リシンを用いたＨＨＡｇ還元コロイドの５０％希釈物を使用する場合、ローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度の増加を示す結果を例示する（５１４ｎｍ）。
【００４２】
図４ｃは、凝集剤を用いない（自己凝集）ＨＨＡｇコロイドの５０％希釈物を使用する場合の、ローダミン６Ｇ（１０−８Ｍ）のＳＥＲＲＳ感度を示す（５１４ｎｍ）。
【００４３】
図５、鉄結合蛋白質、ＣｙｔＣ、Ｍｂ及びＨｂの、１３７５及び１１６９ｃｍ−１バンドに得られるＳＥＲＲＳ強度と自己凝集性を示す。プロットは、１０−７Ｍ濃度におけるそれぞれのタンパク質に対する最適化ＳＥＲＲＳ条件（ＨＨＡｇコロイド：検体の容積比）を示す。
【００４４】
図６は、ＨＨＡｇ還元コロイドを用いた最適化ＳＥＲＲＳ条件下の、鉄結合蛋白質、ＣｙｔＣ、Ｍｂ及びＨｂ（それぞれの蛋白質の濃度は１０−７Ｍ）の自己凝集物ＳＥＲＲＳスペクトルを示す。  
【００４５】
図７は、本出願人の方法の、ヒドロキシルアミンリン酸塩を用いたテトラクロロ金酸の還元で製造された金コロイドのＵＶスペクトルを示す。  コロイドは１ｃｍパス長のキュベット中で水を用いて５倍に希釈された。
【００４６】
図８は、７．５×１０−６Ｍの３、５−ジメトキシ４−（５’アクソベンゾトリアクゾリル）フェニルアミン溶液を用いたＨＰＡｇコロイドの凝集物を示すＴＥＭ画像を例示する。倍率は、×２２０、０００である。
【００４７】
図９は、１３７０ｃｍ−１信号のラマン強度のモニタリングによって、３、５−ジメトキシ４−（５’アクゾベンゾトリアクゾリル）フェニルアミンの濃度がＨＰＡｇコロイド（１／１０希釈液）の凝集に及ぼす影響を示す。  レーザー波長は６３３ｎｍであり、１×１０秒集積及び１０％フィルターの条件である。
【００４８】
図１０は、本発明によるヒドロキシルアミンリン酸塩を用いた硝酸銀の還元で製造されたコロイドの室温熟成期間中のＵＶスペクトル特性における変化を示す。
【００４９】
図１１は、各コロイドバッチを使用し濃度１０−６Ｍのリボフラビンと一緒にして得られるＳＥＲＳスペクトルを示し、そのコロイドバッチは、本発明の方法によるヒドロキシルアミンリン酸塩を用いた硝酸銀の還元で製造され、室温で熟成され６，９，１６及び２４週間の室温下熟成期間のものである。これらの結果は、コロイドが約８週間に至るまでの熟成中であっても、リボフラビンのＳＥＲＳ強度は僅か５％未満の増加であり、より古いバッチではで更なる強度増加が無いことを示す。これらの結果により、そのコロイドの長期保存寿命、バッチ間及びＳＥＲＳの再現性が優れていることが確認される。  リボフラビンも蛍光性の極めて高い化合物であり、低レベルの蛍光が観察されたことは、ＨＰＡｇコロイドの高度な蛍光抑制特性に起因すると考えられる。ある濃度（０．０１％ｗ／ｖ）のポリ（Ｌ−リシン）が凝集剤として使用された。レーザー波長は５１４ｎｍであった。
【００５０】
図１２を参照すると、これらのグラフは、本発明の方法によるヒドロキシルアミンリン酸塩を用いた硝酸銀の還元で製造されたコロイド熟成時間に及ぼす温度の影響を示す。この実施例の結果は、１ｃｍパス長のキュベット内でのコロイド溶液（６０μＬを３ｍＬの水で希釈）のＵＶバンド幅変化のモニタリングからのものであり、温度が増加するにつれてどのように熟成期間が減少するかを示す。  
【００５１】
ここに提示したデータは、ポリスチレン及びガラスの容器中で所定の温度範囲における安定性試験の範囲を拡張した実施結果である。
【００５２】
初期にポリスチレン容器中で製造したヒドロキシルアミンリン酸塩コロイド（ＨＰＡｇコロイド）は、通常は３９５ｎｍのλ（ｍａｘ）値、５７ｎｍのバンド幅及び０．２８０の吸光度のＵＶスペクトルを示す。製造されたどのコロイドバッチも、製造後通常は８週間（熟成期間）の間に、λ（ｍａｘ）は３８９±１ｎｍへ減少し、それに伴ったバンド幅の２８±２ｎｍへの減少及び吸光度の０．４７５±２５への増加を示す。８週以降は図１０に見られるように、これらの値は２０週もの間一定に留まる。ガラス容器中で調製したコロイドバッチは、同一の初期ＵＶ特性を示すが、４週間以内に安定性を失い、銀が凝集し、溶液から沈降する。それ故ポリスチレンがコロイドの調製及び保存に好適な材質である。
【００５３】
熟成サンプルのラマン分光分析により、ＳＥＲ（Ｒ）Ｓ強度は徐々に増加し、８週間の熟成期間の後は一定に留まる（図１１）ことが示される。ＴＥＭ調査により、銀コロイド粒子の粒子径或いは分布における変化がないことが示される。これらＵＶ、ラマン及びＴＥＭの結果から、コロイドが最初に調製された時には同一粒径の銀粒子が形成されるが、恐らくは弱い水素結合力によって非常に小さい塊になることが仮定される。熟成するにつれて、恐らくは容器表面との相互作用によって、その微小塊は個々のコロイド銀粒子に解離するのであろう。
【００５４】
コロイドのＵＶ特性で観察された変化はその推論を強く支持し、粒子間に弱い結合力だけがあっても、その後でのコロイド溶液の加熱は粒子塊の解離を促進させる筈であると考えられた。このことは、４℃〜５５℃の温度範囲の中でポリスチレン容器中に保存したコロイドサンプルのＵＶ特性をモニタリングすることによって確認された。コロイド溶液の熟成期間は、サンプルが室温超の温度で保存された場合、図１２に見られるように温度の上昇につれて熟成期間が減少しながら、劇的に低減する。
【００５５】
これらの熟成したコロイドのＵＶ特性は、室温熟成のものと一致した。同様に、これらの熟成期間中のコロイドのラマンスペクトルのモニタリングでは、ＳＥＲ（Ｒ）Ｓ強度が増加することを示したが、一旦熟成されると強度は一定に留まり室温で熟成したコロイドのものと一致することを示した。４°Ｃで保存したサンプルではＵＶ特性の変化が検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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