(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：７，２２，２５，２８，２９，３０，３６，３７，４３，４４，４５，４６，４７，４９，５５，５６，５９，６１，６２，６３，６５，６６，７１，７２，７３，７４，７５，７６，８３，８４，８５，８６，９３，９４，９５，９６，９８，９９，１００，１０３，１０４，１０５，１０６，１１４，１２０，１２１，１２２，１２３及び１３６よりなる群から選択される配列を有する免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドまたはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
当該オリゴデオキシヌクレオチドが担体またはハプテンに結合している請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のオリゴデオキシヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
免疫賦活性量の請求項１または２に記載のオリゴデオキシヌクレオチドおよび／または請求項３に記載のベクター、免疫学性量の抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする、感染症の予防または防止用ワクチン。
【請求項５】
前記抗原成分がその野生型形態において家禽に対し病原性であるウイルスまたは微生物であるかまたはそれに由来することを特徴とする請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ウイルスまたは微生物が、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、トリ呼吸器感染症病原菌、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリ伝染性コリザ病原菌（鼻感冒）、水痘ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、Ｅｉｍｅｒｉａ種、トリ感染症病原菌（オルニソバクテリウム・ライノトラキア）、出血性敗血症菌（パスツレラ・ムルトシダ）、トリ病原菌（マイコプラズマ・シノビエ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種および大腸菌から成る群より選択されることを特徴とする請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
薬剤としての使用のための請求項１又は２に記載の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項８】
家禽の感染予防における使用のための請求項１又は２に記載の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド、当該オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターおよびワクチン、薬剤としてのその使用、感染症予防または防止におけるその使用、当該オリゴデオキシヌクレオチドの検出方法ならびに当該方法において使用される細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２０年間に、免疫系科学において脊椎動物の免疫系は、いわゆる病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）が同起源の宿主の病原体認識受容体（ＰＲＲ）と相互作用するという病原体特有の性質を受容体媒介的に認識することによって、微生物感染を検知して迅速な免疫活性化の引き金を引くための機序を有することが明らかとなった（Ｉｗａｓａｋｉ  Ａ、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．２００１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７、２９１‐２９５。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．，２００９．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０、７６６−７７５）。
【０００３】
病原体のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一定の形態が当該ＰＡＭＰの一つであることは今や明らかである。１９９５年に細菌ＤＮＡ中の非メチル化ＣｐＧモチーフがマウスＢ細胞の活性化の引き金を引くことが報告された（Ｋｒｉｅｇら、１９９５年）。この研究は、細菌の免疫賦活性非メチル化ＣｐＧを含むＤＮＡの特異的認識と、哺乳動物ＤＮＡに広く存在するＣｐＧメチル化はもちろん. 以前に認知されたＣｐＧサプレッションとの間の関連を初めて引き起こした。最も有効なＢ細胞刺激性非メチル化ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧを含むＯＤＶ）は、配列エレメントＧＡＣＧＴＴを有することが明らかにされた。
【０００４】
当該分野における次の画期的な論文は、日本の大阪の審良静男・研究室によって発表された（辺見ら、２０００年）。マウスにおける遺伝子クローニングおよび標的遺伝子ノックアウト法によってＣｐＧ‐ＯＤＮに対するマウスにおける細胞応答は、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって媒介されることが疑いの余地なく示された。その後ＣｐＧ‐ＯＤＮは、主にＮＦｋａｐｐａ‐Ｂ経路によるＴＬＲ９のシグナル伝達に対するアゴニストであることが明らかにされた（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  ２００１年）。次の１０年間に、相当な数の研究が基礎研究トピックスおよび一般的に有望な免疫療法の応用に関して発表された（例えば、Ｋｒｉｅｇ  ２００２年、２００３年、２００６年；Ｋｌｉｎｍａｎ  ２００４年、Ｖｏｌｌｍｅｒ  ２００５年、Ｗｉｌｓｏｎら、２００６年、Ｋｉｎｄｒａｃｈｕｋら、２００８年、ＤｏｒｎおよびＫｉｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ  ２００８年、ＶｏｌｌｍｅｒおよびＫｒｉｅｇ  ２００９年、Ｗｉｌｓｏｎら、２００９年に概説されている）。いくつかの総説が、ＣｐＧ‐ＯＤＮの抗感染応用（Ｋｒｉｅｇ  ２００７年）、癌治療におけるＴＬＲ９アゴニストの使用（Ｋｒｉｅｇ  ２００７年、Ｗｅｉｎｅｒ  ２００９年）、喘息およびアレルギー治療用のＴＬＲ９活性化（Ｋｌｉｎｅ  ２００７年、ＫｌｉｎｅおよびＫｒｉｅｇ  ２００８年、ＦｏｎｓｅｃａおよびＫｌｉｎｅ  ２００９年）ならびにワクチンアジュバントとしてのＴＬＲ９活性化（Ｋｌｉｎｍａｎら、２００４年、Ｋｌｉｎｍａｎ  ２００６年、Ｄａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ  ２００７年、Ｗａｇｎｅｒ  ２００９年、Ｍｕｔｗｉｒｉら、２００９年、Ｋｌｉｎｍａｎら、２００９年）に焦点を合わせている。
【０００５】
ＣｐＧを含むＯＤＶは、獣医学上の応用において、特にウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ニワトリおよび魚において免疫賦活剤およびワクチンアジュバントとして記載され論じられている（Ｂａｂｉｕｋら、２００３年、ＣａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＳｅｃｏｍｂｅｓ  ２００６年、Ｇｒｉｅｂｅｌら、２００５年、Ｍｕｔｗｉｒｉら、２００３年、ＳｉｎｇｈおよびＯ‘Ｈａｇａｎ  ２００３年、ＷｅｒｌｉｎｇおよびＪｕｎｇｉ  ２００３年）。
【０００６】
ニワトリにおける獣医学上の使用分野において、例えばニューカッスル病に対しニワトリを保護するためのワクチンにおけるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの使用が記載されている（Ｌｉｎｇｈｕａ  ２００７年）。
【０００７】
最近ニワトリにおいて、ＴＬＲ２１はＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの認識において哺乳動物のＴＬＲ９の機能的ホモログとして作動することが明らかにされた（Ｂｒｏｗｎｌｉｅら、２００９年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Babiuk L.A., Gomis S., Hecker R., 2003. Molecular approaches to disease control. Poult. Sci. 82, 870-875.
【非特許文献２】Brownlie, R., Zhu J., Allan B., Mutwiri G.K., Babiuk L.A., Potter A., Griebel P., 2009. Chicken TLR21 acts as a functional homologue to mammalian TLR9 in  the recognition of CpG oligodeoxynucleotides. Mol. Immunol. 46, 3163-3170
【非特許文献３】Carrington A.C., Secombes C.J., 2006. A review of CpGs and their relevance to aquaculture. Vet. Immunol. Immunopathol. 112, 87-101.
【非特許文献４】Daubenberger C.A., 2007. TLR9 agonists as adjuvants for prophylactic and therapeutic vaccines. Curr. Opin. Mol. Ther. 9, 45-52.
【非特許文献５】Dorn A., Kippenberger S., 2008. Clinical application of CpG-, non-CpG-, and antisense oligodeoxynucleotides as immunomodulators. Curr. Opin. Mol. Ther. 10, 10-20.
【非特許文献６】Fonseca D.E., Kline J.N., 2009.Use of CpG oligodeoxynucleotides in treatment of         asthma and allergic disease. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 256-262.
【非特許文献７】Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C., Nairn, R.,  1977.  Characteristics of a human cell line         transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-74.
【非特許文献８】Griebel P.J., Brownlie R., Manuja A., Nichani A., Mookherjee N., Popowych Y., Mutwiri G., Hecker R., Babiuk L.A., 2005. Bovine toll-like receptor 9: a comparative analysis of molecular structure, function and expression. Vet. Immunol. Immunopathol. 108, 11-16.
【非特許文献９】Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T., Kaisho T., Sato S., Sanjo H., Matsumoto M., Hoshino K., Wagner H., Takeda K., Akira S., 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408, 740-745.
【非特許文献１０】Iwasaki A, Medzhitov R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. 2010. Science 327, 291-295.
【非特許文献１１】Keestra A.M., 2008. Molecular dissection of the chicken Toll-like receptor repertoire. PhD thesis (Proefschrift), University of Utrecht, The Netherlands
【非特許文献１２】Kline J.N.,  2007. Immunotherapy of asthma using CpG oligodeoxynucleotides. Immunol. Res. 39, 279-286.
【非特許文献１３】Kline J.N., Krieg A.M., 2008. Toll-like receptor 9 activation with CpG oligodeoxynucleotides for asthma therapy. Drug News Perspect. 21, 434-439.
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【非特許文献１５】Klinman D.M., 2006. Adjuvant activity of CpG oligodeoxynucleotides. Int. Rev. Immunol. 25, 135-154.
【非特許文献１】Klinman D.M., Klaschik S., Sato T., Tross D., 2009. CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants for vaccines targeting infectious diseases. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 248-255.
【非特許文献１６】Kindrachuk J., Potter J., Wilson H.L., Griebel P., Babiuk L.A., Napper S., 2008. Activation and regulation of toll-like receptor 9: CpGs and beyond. Mini Rev. Med. Chem. 8, 590-600.
【非特許文献１７】Krieg A.M., Yi A,K., Matson S,, Waldschmidt T,J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M., 1995. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature 374, 546-549.
【非特許文献１８】Krieg A.M., 2002. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects. Annu. Rev. Immunol. 20,709-760.
【非特許文献１９】Krieg A.M., 2003. CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts? Nat. Med. 9, 831-835.
【非特許文献２０】Krieg A.M., 2006. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 471-484.
【非特許文献２１】Krieg A.M., 2007a. Anti-infective applications of toll-like receptor 9 agonists. Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 289-294.
【非特許文献２２】Krieg A.M., 2007b. Development of TLR9 agonists for cancer therapy. J. Clin. Invest. 117, 1184-1194.
【非特許文献２３】Linghua Zhang et al., 2007. Vaccination with Newcatle disease vaccine and CpG oligodeoxynucleotides induces specific immunity and protection against Newcastle disease virus in SPF chicken. Vet. Immun. And Immunopath. 115, 216-222.
【非特許文献２４】Medzhitov R., 2001.  CpG DNA: security code for host defense. Nat. Immunol. 2, 15-16.
【非特許文献２５】Medzhitov R., Approaching the asymptote: 20 years later. 2009. Immunity 30, 766-775)
【非特許文献２６】Mutwiri G., van Drunen Littel-van den Hurk S., Babiuk L.A., 2009. Approaches to enhancing immune responses stimulated by CpG oligodeoxynucleotides. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 226-232.
【非特許文献２７】Mutwiri G., Pontarollo R., Babiuk S., Griebel P., van Drunen Littel-van den Hurk S., Mena A., Tsang C., Alcon V., Nichani A., Ioannou X., Gomis S., Townsend H., Hecker R., Potter A., Babiuk L.A., 2003. Biological activity of immunostimulatory CpG DNA motifs in domestic animals. Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 89-103.
【非特許文献２８】Schindler, U., and Baichwal, V.R., 1994. Moll. Cell. Biol. 14: 5820-5831.
【非特許文献２９】Singh M., O'Hagan D.T., 2003. Recent advances in veterinary vaccine adjuvants. Int. J. Parasitol. 33, 469-478.
【非特許文献３０】Vollmer J., 2005. Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9. Expert Opin. Biol. Ther. 5, 673-682.
【非特許文献３１】Vollmer J., Krieg A.M., 2009. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 195-204.Wagner H., 2009. The immunogenicity of CpG-antigen conjugates. Adv. Drug.Deliv. Rev. 61, 243-247.
【非特許文献３２】Weiner G.J., 2009. CpG oligodeoxynucleotide-based therapy of lymphoid malignancies. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 263-267.
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【非特許文献３４】Wilson H.L., Dar A., Napper S.K., Marianela Lopez A., Babiuk L.A., Mutwiri G.K., 2006. Immune mechanisms and therapeutic potential of CpG oligodeoxynucleotides. Int. Rev. Immunol. 25, 183-213.
【非特許文献３５】Wilson K.D., de Jong S.D., Tam Y.K., 2009. Lipid-based delivery of CpG oligodeoxynucleotides enhances immunotherapeutic efficacy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 233-242.
【非特許文献３６】Yang, T.T., Sinai, P., Kitts, P.A., Kain, S.R., 1997. Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechniques 23, 1110-1114.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
免疫調節剤としての特異的ＣｐＧを含むＯＤＶの設計はこれまで極めて行き当たりばったりだった。これは非哺乳動物のＣｐＧを含むＯＤＶに関しては特にあてはまっている。これに対する理由には複数の要因があるが、まず第一に、ヒトＴＬＲに対する免疫調節性ＣｐＧモチーフと、非哺乳動物種は言うまでもなく非ヒトにおけるＴＬＲに対するそれとの間の相関性について知識が存在しない。第二に、極めて低濃度のＣｐＧを含むＯＤＶの効果を選択的に試験するために、ノイズレベルに対し十分に低いバックグラウンドを具備する利用可能な細胞系が存在しない。さらに、利用可能な高処理のスクリーニング法が存在せず、存在したとしても、非哺乳動物種における免疫調節剤としてのＣｐＧを含むＯＤＶのインビボとインビトロでの効果の間の明確な相関性が存在しない。
【００１０】
従って、高い免疫調節効果を有しそれ故に低用量で効果的な新規のＣｐＧを含むＯＤＶの必要性がある。しかも、ＣｐＧ‐活性のインビトロとインビボ活性の間の相関性を示す、獣医学上の目的のための選択的で鋭敏なＣｐＧを含むＯＤＶ選択系の必要性がある。
【００１１】
それが当該新規ＣｐＧを含むＯＤＶを提供する本発明の目的の一つである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この点で本発明の１実施態様は、一般式5’［Ｎ1］x［Ｎ7］r｛Ｎ3［Ｎ4］pＣＧ［Ｎ5］qＮ6｝n［Ｎ8］s［Ｎ2］z3’を有し、ここで各々のＮ１は独立してＣまたはＧであり；各々のＮ２は独立してＣまたはＧであり；Ｎ３およびＮ４が双方Ｃである組合せは除外するという条件でＮ３はＴ、ＣまたはＧであり；各々のＮ４およびＮ５は独立してＣまたはＴであり；Ｎ６＝Ａ、Ｔ、ＧまたはＣであり；Ｎ７＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり；Ｎ８＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり；ｘ＝３〜１０であり；ｚ＝０〜１０であり；ｎ＝２〜１００であり；ｐ＝１〜６、またはＮ４＝Ｔであれば１〜２５であり；ｑ＝１〜６、またはＮ５＝Ｔであれば１〜２５であり；ｒ＝０〜８、またはＮ７＝Ｔおよびｓ＝０〜８であれば１〜２５であり、またはＮ８＝Ｔであれば１〜２５である、免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドまたは前記オリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｐｃＤＮＡ３．１（＋）‐ｃｈｉＴＬＲ２１のプラスミド地図
【図２】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞株のＳＥＡＰ活性の概要
【図３】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞株のＳＥＡＰ活性の概要
【図４】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞株のＳＥＡＰ活性の概要
【図５】種々のｚｅｏ／Ｇ４１８二重耐性クローン細胞株のＳＥＡＰ活性の概要
【図６】ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株に関する２０００ｎＭから始まる滴定試験
【図７】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図８】２０００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株の結果
【図９】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１０】２０００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株の結果
【図１１】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１２】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１３】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１４】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１５】１００ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１６】５０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１７】５０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図１８】５０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３ＸＬ‐ｐＵＮＯ‐ｈｕＴＬＲ９‐ｐＮｉｆＴｙ２クローン細胞株の結果
【図１９】２０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図２０】２５ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図２１】２０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図２２】２０ｎＭから始まる滴定試験において得られたＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の結果
【図２３】骨格の３量体に隣接するＴ数の効果
【図２４】ＣＧエレメントを「分離する」Ｔ数の効果
【図２５】ＴＴＣＧＴＴ繰り返し数の効果
【図２６】ＴＴＣＧＴＴ繰り返し数の効果
【図２７】繰り返し三量体の型の効果
【図２８】ＴＴＣＧＴＴ繰り返しの境界におけるＴ残基数の効果
【図２９】ＯＤＮ‐Ｘ４２モチーフ数の効果
【図３０】ＯＤＮ‐Ｘ４３モチーフ数の効果
【図３１】ＯＤＮ‐Ｘ４３モチーフ数の効果
【図３２】ＯＤＮ‐Ｘ４のさらなる変異型
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド」とは、ＮＦ‐κＢまたはインターフェロン制御因子３（ＩＲＦ３）等の転写因子の活性化をもたらしてシグナル伝達カスケードの開始を刺激する、非メチル化シチジン‐リン酸-グアノシンジヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドを言う。炎症性サイトカインおよび他の細胞活性化事象の発現において次々に生じるのはこの活性化である。ＮＦ‐κＢ結合部位およびＮＦ‐κＢによって影響を受ける遺伝子発現は、ＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＢａｉｃｈｗａｌ（１９９４年）によって記載されている。
【００１５】
用語オリゴデオキシヌクレオチドは、デオキシヌクレオチドの短い核酸ポリマー、換言すればリン酸基および交換可能な有機塩基に結合する多数のデオキシリボースを含む分子を意味する。当該有機塩基とは置換ピリミジンまたは置換プリンである。例は、それぞれシトシンおよびチミン、アデニンおよびグアニンである。
【００１６】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは修飾を含んでもよい。当該修飾の例は、例えばヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオチド間架橋中の修飾である。当該修飾は、例えばホスホロチオエートまたはジチオリン酸によるリン酸ジエステルの置換に関連する。
【００１７】
他の修飾は、例えばデホスホ架橋によるリン酸ジエステル架橋の置換である。デホスホ架橋の例は、メチルヒドロキシルアミン、ギ酸アセタールおよびジメチレンスルホン基である。
【００１８】
さらなる他の修飾は、非天然ヌクレオシド塩基、例えば５‐フルオロシトシン、７‐デアザ‐７‐置換グアニン、７‐デアザ‐８‐置換グアニン、２‐チオウラシル、ジヒドロウラシル、５‐ブロモ‐シトシン、６‐置換シトシン、Ｎ４‐置換シトシン等による天然ヌクレオシド塩基の置換に関係する修飾である。
【００１９】
また他の例としては、糖単位の置換、例えばＬ‐２’‐デオキシリボースまたは２’‐Ｌ‐アラビノース等の修飾糖単位によるβ‐リボース糖単位またはβ‐Ｄ‐２’‐リボース糖単位の置換に関係する修飾である。
【００２０】
オリゴデオキシヌクレオチドのより以上の識見を与えてくれる教科書は、例えば「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＰＣＲプライマー：実験マニュアル）」第２版、２００３年、Ｃａｒｌ  Ｗ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（アメリカ国立アレルギー・感染症研究所）；Ｇａｂｒｉｅｌａ  Ｓ．Ｄｒｅｋｓｌｅｒ（軍人保健科学大学）編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ  ９７８‐０８７９６９６５４‐２である。
【００２１】
ＣｐＧモチーフを保有する構造｛Ｎ３［Ｎ４］ｐＣＧ［Ｎ５］ｑＮ６｝ｎは、本発明のＯＤＮの活性な免疫賦活性部を表す。それ故に本発明は、このいわゆる「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」を含む免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドを提供する。
【００２２】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの骨格、構造｛Ｎ３［Ｎ４］ｐＣＧ［Ｎ５］ｑＮ６｝ｎは少なくとも２回、好ましくは３回存在しなければならないことが見出された。それ故に、ｎは少なくとも２であるべきである。またｎが増加すると、オリゴデオキシヌクレオチドの活性が増大することも見出された。この効果はｎが増加するにつれ横ばいとなる。基本的に、骨格構造の数字ｎは、それ故に少なくとも２であるべきである。好ましくはｎの範囲は３≦ｎ≦１００であるが、といって合成配列が長くなればなるほど合成するのがますます困難となるという事実がある。実際に好ましいのは、２≦ｎ≦１８の範囲である。より好ましいのは３≦ｎ≦１８の範囲であり、より一層好ましいのは４≦ｎ≦１８の範囲であり、さらなるより一層好ましいｎの範囲は５≦ｎ≦１８の範囲である。
【００２３】
本発明のＣｐＧを含むＯＤＶの検出確認は、ＮＦ‐κＢ活性化の検出用に現在使用されている系よりもより選択的な検出系を使用することによって可能となった。Ｂｒｏｗｎｌｉｅら（２００９年）はＮＦ‐κＢルシフェラーゼを含むレポーター系を記載している。他の系は、例えばＩＬ‐８転写産物の測定またはサイトカイン分泌またはＮＯ分泌の検出に基づいている。
【００２４】
これに反して本発明においては、分泌型アルカリホスファターゼに基づく検出系（ＳＥＡＰ）を使用した。ＳＥＡＰは哺乳動物系におけるレポーター酵素である（Ｙａｎｇら、１９９７年）。この系は、驚くほど鋭敏でありしかも加えて驚くべきことに、試験したＣｐＧを含むＯＤＶのインビトロ活性およびインビボ活性の間の緊密な相関性を提供することが分かった。ＳＥＡＰ系は基質としてパラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）と共に使用した。
【００２５】
現行系に関するもう一つの改善は、ＳＥＡＰ遺伝子を保有するプラスミドの細胞への導入と安定した保持だった。今まで、すべての検出系はレポーター遺伝子による細胞の一過性形質移入を使用した。今度初めて用量反応曲線を作成することができたのは、レポーター遺伝子の細胞への導入と安定した保持のためである。当該曲線は、種々のＣｐＧを含むＯＤＶ活性間で信頼できる比較をするために必須である。
【００２６】
それ故に、実施例の欄において詳細に記載する本発明の方法および細胞株が、種々のＣｐＧを含むＯＤＶ間の信頼できる並行比較を行うことを初めて可能とする。
【００２７】
使用した系のそれ以上の詳細は、実施例の欄に提示する。
【００２８】
今や本発明の方法および細胞株により種々のＣｐＧを含むＯＤＶ間の信頼できる当該並行比較が可能であるので、Ｎ６＝Ａ、ＴまたはＣである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｎ６＝Ｇよりも高い活性を有することが証明され得た。  それ故に、この実施態様の好ましい形態においてＮ６＝Ａ、ＴまたはＣである。
【００２９】
同じ理由で、他の好ましい形態においてＮ３はＴまたはＧ；およびＮ６＝Ｙ（Ｙ＝ＣまたはＴ）である。
【００３０】
この実施態様のより好ましい形態において、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５およびＮ６＝Ｔである。
【００３１】
この実施態様の他の好ましい形態は、Ｎ３、Ｎ４およびＮ５＝ＴおよびＮ６＝Ｃである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３２】
この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、Ｎ３がＧでありＮ６＝Ｔである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３３】
この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、Ｎ５＝ＴおよびＮ６＝Ｃである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３４】
またこの実施態様の好ましい形態は、Ｎ５＝Ｃ、Ｎ６＝Ｃおよびｑ＝１である本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３５】
この実施態様の他の好ましい形態は、Ｎ４＝ＹおよびＮ５＝Ｙである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３６】
この最後の実施態様のより好ましい形態は、Ｎ４＝ＴおよびＮ５＝Ｙである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３７】
この最後の実施態様のより一層好ましい形態は、Ｎ４＝ＴおよびＮ５＝Ｔである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３８】
この実施態様の他の形態は、ｘが４〜７およびｒ＝０またはＮ７がＡまたはＴである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００３９】
この実施態様の好ましい形態は、ｘが６およびｒ＝０またはＮ７がＡまたはＴである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００４０】
この実施態様の他の形態は、ｚが０〜６およびｓ＝０またはＮ８がＡまたはＴである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００４１】
この実施態様の好ましい形態は、ｚが０〜３およびｓ＝０またはＮ８がＡまたはＴである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００４２】
この実施態様のさらなる他の形態は、Ｎ１がＧである。
【００４３】
この実施態様の好ましい形態は、Ｎ２がＧである。
【００４４】
３’‐および５’‐末端ヌクレオチドの双方の数に関し広い範囲が存在するとはいえ、双方の値に関して最適範囲が存在することが見出された。ｓ＝０またはＮ８がＡまたはＴであるならば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格の３’‐フランキング領域を形成する［Ｎ２］ヌクレオチドの数は、好ましくは０と５ヌクレオチドの間、より好ましくは０と３ヌクレオチドの間の範囲である。
【００４５】
またｒ＝０またはＮ７がＡまたはＴであるならば、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格の５’‐フランキング領域を形成する［Ｎ１］ヌクレオチドの数は、４と７ヌクレオチドの間の範囲において最適であることも見出された。
【００４６】
この実施態様の最も好ましい形態は、ｒ＝０またはＮ７がＡまたはＴであり、ならびにｓ＝０またはＮ８がＡまたはＴであり、ならびにｎ＝５〜１８およびｘ＝４〜７およびｚ＝０〜３である。
【００４７】
上述の通り、ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するリン酸ジエステルのヌクレオチド間架橋における数種の修飾が実行可能である。しかし基本的に、２のヌクレオチド間の一般的な通常の結合型は、合成の方法に依存してリン酸ジエステル結合（ＰＤＥ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）結合である。ＣｐＧを含むＯＤＶの安定性および免疫賦活効果を改善するために、合成オリゴデオキシヌクレオチドの構成要素にはホスホロチオエートが提供され、その結果ＰＴＯ結合を形成する。
【００４８】
しかし驚いたことには、［Ｎ１］ヌクレオチドおよび［Ｎ２］ヌクレオチドだけがＰＴＯ結合で結合し、ならびに他のヌクレオチドがＰＤＥ結合で結合しているときに、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの効力が強く増強されることが見出された。（その場合、Ｎ１ないしＮ７結合（ＧＴ）はＰＴＯであり、一方でＮ８ないしＮ２（ＴＧ）結合はＰＤＥである。）
これは［Ｎ１］および［Ｎ２］ヌクレオチドがＧであるときの特別な場合である。
【００４９】
それ故にこの実施態様の他の好ましい形態は、Ｎ１および／またはＮ２がホスホロチオエート結合を有して、他のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合を有する本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００５０】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関してＮ７＝ＴおよびＮ８＝Ｔであるとき、より一層効果的なオリゴデオキシヌクレオチドが得られることが見出された。
【００５１】
従って、この実施態様のさらなる他の好ましい形態は、Ｎ７＝ＴおよびＮ８＝Ｔである本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関する。この場合、ｒおよびｓは独立して１〜２５の間である。
【００５２】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド骨格、構造｛Ｎ３［Ｎ４］ｐＣＧ［Ｎ５］ｑＮ６｝ｎはあらゆるｎに対して同一である必要はない。これは本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが、｛ＴＴＣＧＴＴ｝｛ＣＴＣＧＴＧ｝｛ＧＴＣＧＴＡ｝のようであり得ることを意味する。３の異なる連続する異なる骨格のこのような系列は、ヘテロポリマーと表される。３の同一の複製物の一続きはホモポリマーと呼ばれる。
【００５３】
好ましくは本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ホモポリマー｛Ｎ３［Ｎ４］ｐＣＧ［Ｎ５］ｑＮ６｝を含む。
【００５４】
本発明のＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロおよびインビボでの双方の試験系においてほとんどの場合ナノモル量で活性である。しかし本発明のＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチドの幾つかは、ピコモル（ナノモル以下）量でさえ活性であり、そのＥＣ５０（５０％有効濃度）は１ｎＭ未満である。
【００５５】
オリゴデオキシヌクレオチドの最大半量効果濃度（ＥＣ５０）とは、レポーター細胞（ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆｔｙ２‐ニワトリＴＬＲ２１またはＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙ２Ｈｙｇ）中の、最大半量吸収を与えるレポーター酵素ＳＥＡＰ（４０５ｎｍに吸収をもつ着色産物を産生する）の量を誘導するのに必要であるオリゴデオキシヌクレオチドの量である。オリゴデオキシヌクレオチドのＥＣ５０がこれらの細胞中で１ｎＭ未満であれば、ピコモル（ナノモル以下）量で活性であると考えられる。
【００５６】
以下に列挙する４の一般式の一と一致するほとんどのＣｐＧを含むＯＤＮは、インビトロでナノモル量での効果の引き金を引くことが明らかとなった。
【００５７】
１）５’［Ｇ］ｘ｛ＴＴＣＧＴＮ６｝ｎ［Ｇ］ｚ３’ ここでＮ６＝ＡまたはＴ、ｎ＝５〜１００、ｘ＝３〜１０、ｚ＝０〜１０
２）５’［Ｇ］ｘ｛Ｎ３ＴＣＧＴＣ｝ｎ［Ｇ］ｚ３’ ここでＮ３＝ＧまたはＴ、ｎ＝５〜１００、ｘ＝３〜１０、ｚ＝０〜１０
３）５’［Ｇ］ｘ｛ＴＴＣＧＣＣ｝ｎ［Ｇ］ｚ３’ ここでｎ＝５〜１００、ｘ＝３〜１０、ｚ＝０〜１０
４）５’［Ｇ］ｘ｛Ｔ［Ｔ］ｐＣＧ［Ｔ］ｑＴ｝ｎ［Ｇ］ｚ３’ ここでｐ＝１〜１０、ｑ＝１〜１０、ｎ＝５〜１００、ｘ＝３〜１０、ｚ＝０〜１０
これら４の全ての式にとって、費用対効果の理由からｎは好ましくは５〜１８の範囲である。Ｘは４〜９、５〜８、６または７の範囲がその優先順位で好ましく、ｚは８、７、６、５、４、３、２、１または０がその優先順位で好ましい。該当する場合は、ｐは好ましくは１〜５ならびにｑは好ましくは１〜５である。
【００５８】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを、反応性の化学基によって担体またはハプテンに結合することも可能である。当該結合は結合分子の免疫賦活作用を亢進する。
【００５９】
当該成分の例にすぎないが、ジゴキシゲニン、アミノヘキシル、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄおよびビオチンがある。好ましい担体またはハプテンは、３’‐および５’‐標識Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄおよび５’‐標識ジゴキシゲニンである。ハプテン／担体へのオリゴデオキシヌクレオチドの結合は当該分野において周知である。
【００６０】
本発明の他の実施態様は、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターに関する。当該ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは分子生物学において使用される任意の他のベクター等の核酸分子であり得る。単に例に過ぎないが、免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドを含むベクターはＤＮＡ分子、例えば、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドがクローンされた、細菌中で増殖でき得るプラスミド等であり得る。当該プラスミドは好ましくは、多数のプラスミドが宿主中に存在することを招来する活性な複製起点を有する。その後プラスミドの単離へと続く大規模な当該細菌の増殖は、本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドの合成による生産の代替法を提供する。
【００６１】
本発明の目的の一つは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体と共に感染症を予防または防止するワクチン中の奏功する免疫賦活性成分として使用し得る、新規ＣｐＧを含むＯＤＶを提供することである。
【００６２】
一般的に用語抗原成分とは、ヒトまたは動物に投与されたときに免疫応答を誘導、刺激または亢進し得る少なくとも１のエピトープを含む物質の組成物を言う。
【００６３】
抗原成分は任意の種類の抗原成分であってもよいが、好ましくは、その野生型の形態においてヒトまたは動物に対し病原性である微生物またはウイルス由来である。
【００６４】
抗原成分は病原体の全体であり得るが、好ましくは不活化または弱毒化形態、病原体の抽出物または病原体の免疫原性タンパク質であり得る。
【００６５】
抗原成分が病原体の免疫原性タンパク質であるならば、当該免疫原性タンパク質は好ましくはインビトロでの培養細胞において発現し同細胞から回収する。
【００６６】
それ故に他の実施態様は、感染症を予防または防止するためのワクチンに関し、前記ワクチンは免疫賦活性量の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドおよび／または本発明のベクター、免疫原性量の抗原成分または免疫成分をコードする遺伝情報、ならびに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする。
【００６７】
もちろん、免疫賦活性量のオリゴデオキシヌクレオチドおよび免疫原性量の抗原成分は強く相互に関係している。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの存在が、感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量を低下させ得ることは、本発明の利点の一つである。
【００６８】
感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量は、抗原成分の免疫原性量とも呼ばれる。
【００６９】
オリゴデオキシヌクレオチドの免疫賦活性量とは、抗原成分の免疫原性量、即ち感染症を予防または防止するために必要である抗原成分量を減少させることのできる量である。
【００７０】
それゆえ基本的に、「オリゴデオキシヌクレオチドの免疫賦活性量」および「免疫原性量」という表現は、互い同士の関係において検討されなくてはならない。
【００７１】
言うまでもないが、ワクチンが抗原成分をコードする遺伝情報を含むならば、この遺伝情報によって発現される抗原成分量は、感染症を予防または防止するために十分であるべきであり、即ち免疫原性量でなければならない。
【００７２】
本発明の非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドが免疫賦活性であるという事実は、それらがワクチン中の抗原成分の免疫学的効果を亢進することを意味する。その理由から本発明のワクチンは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが存在しないとすればそうであろう場合よりも、多くの場合より少ない抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報を含むであろう。
【００７３】
いくつかの場合には抗原成分それ自体が、免疫賦活性オリゴヌクレオチドの添加なしでは、非常に低い免疫原性の性質しか有さないために、望む免疫原性に達しないにもかかわらず大量に与えられなければならない。しかしながら今やこのような場合に、抗原成分は望むレベルの免疫原性を得るために本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと共に、通常の高濃度で与えることができる。
【００７４】
従って本発明のオリゴヌクレオチドと共に投与される抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報の量は、大ざっぱに言うとオリゴヌクレオチド非存在下で与えられる量と同等かまたは低いであろう。特定のワクチンの製造に関与する当業者は、その特定のワクチンに対するその量を知っているであろう。また実施例には、例えば異なる３の不活化ウイルスワクチン：ニューカッスル病ウイルスワクチン、伝染性気管支炎ウイルスワクチンおよび七面鳥鼻気管炎ワクチンにおいて使用される抗原成分量に関する豊富なガイダンスを提供する。
【００７５】
抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報と共に投与される必要のある本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量は、選択されたオリゴデオキシヌクレオチドおよび抗原成分の双方に依存する。
【００７６】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの非常に適した量は、通常１および１００ナノモルの間で変動するであろう。例えば、平均長３０デオキシヌクレオチドを有する１〜１０μｇの本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに関し非常に良いインビボでの結果が得られ、それはインビトロ試験においてナノモル範囲で活性であることが明らかにされた。
【００７７】
オリゴデオキシヌクレオチドがピコモル範囲で活性であるオリゴデオキシヌクレオチド群から選択されるならば、当業者はナノモル量で試験する前に１ナノモル未満の、おそらく１ナノモルに到底達しない量、即ちピコモル量を試験する価値があるであろうことを了解するであろう。
【００７８】
本発明のワクチンは薬学的に許容可能な担体を含む。この担体の性質は投与経路に依存する。投与経路が経口または鼻腔内経路であるならば、担体は滅菌水、生理食塩水または緩衝液のように単純であり得るであろう。注射が好ましい経路であるならば、担体は好ましくは等張であり、しかもそれを注射に適化するｐＨ制限を有するべきであろう。しかしながら当該担体は当該分野において広く知られている。
【００７９】
本発明のワクチンは、抗原成分または抗原成分をコードする遺伝情報、および本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに加えて、アジュバントを含んでもよい。アジュバントは一般的に、宿主の免疫応答を非特異的に追加免疫する物質である。
【００８０】
多くのアジュバント、例えば完全および不完全フロイントアジュバント、ビタミンＥ、硫酸デキストラン等の非イオン性ブロックポリマーおよびポリアミン、カーボポールおよびピラン、水酸化アルミニウム等が適していることが当該分野で知られている。また、しばしばリン酸アルミニウム、サポニン、トコフェロール等の植物油および鉱物油が使用される。非常に効果的なアジュバントは、水中油型エマルジョンおよび特に油中水型エマルジョンであり、また水中油型アジュバントおよび油中水型アジュバントとも言う。
【００８１】
好ましくは抗原成分は、その野生型の形態において家禽に対し病原性であるウイルスまたは微生物であるかまたはそれらに由来する。
【００８２】
より好ましくは、前記のウイルスまたは微生物は、伝染性気管支炎ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病（ガンボロ病）、ニワトリ貧血ウイルス、トリレオウイルス、トリ呼吸器感染症病原菌、七面鳥鼻気管炎ウイルス、トリ伝染性コリザ病原菌（鼻感冒）、水痘ウイルス、ニワトリ脳脊髄炎ウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、Ｅｉｍｅｒｉａ種、トリ感染症病原菌（オルニソバクテリウム・ライノトラキア）、出血性敗血症菌（パスツレラ・ムルトシダ）、トリ病原菌（マイコプラズマ・シノビエ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種および大腸菌から成る群より選択される。
【００８３】
本発明のさらなる他の実施態様は、薬剤としての使用のための本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００８４】
本発明のさらなる他の実施態様は、家禽における感染症の予防または防止における使用のための本発明の免疫賦活性非メチル化オリゴデオキシヌクレオチドに関する。
【００８５】
今まですべての検出系は、レポーター遺伝子による細胞の一過性の形質移入を使用していた。当該一過性の系は、ＣｐＧを含むＯＤＶの効果の信頼できる並行比較を可能としない。上述の通り、現行系にまさった主な改善は、レポーター遺伝子を保有するプラスミドの細胞中への導入および安定した保持だった。安定したとは、プラスミドが数回の細胞分裂周期後にも細胞中に依然として存在することを意味する。
【００８６】
しばしばプラスミドの安定した保持は、プラスミド上にそれに対する耐性遺伝子が存在する抗生物質等の１または複数の選択剤の圧力下で細胞を増殖することによって得られる。プラスミドの消失は次にプラスミドを消失した細胞を死滅させるであろう。残った生細胞は、プラスミドをまだ内部に保持するであろう。
【００８７】
従って本発明のさらなる他の実施態様は、ＴＬＲ２１‐受容体およびＮＦ‐κＢレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含む細胞に関し、そのプラスミドは細胞中で安定して保持される。当該細胞はＣｐＧ分子のスクリーニング、より具体的には本発明のＣｐＧ分子のスクリーニングにおける使用に非常に適している。
【００８８】
実施例は、細胞中に安定して保持され得るレポーター遺伝子をコードするプラスミドを含む当該細胞をいかにして得るかについて、豊富なガイダンスを提供する。
【００８９】
また上述の通り、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に基づく検出系は、使用する検出系に非常に適していることも示された。
【００９０】
従って好ましくは、レポーター遺伝子は分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子である。
【００９１】
基本的に、ＮＦ‐κＢレポーター遺伝子、上述の通り好ましくはＳＥＡＰ遺伝子を保有するプラスミドの導入および好ましくは安定した保持を可能とし、ＴＬＲ２１を保有する任意の細胞または細胞株は、ＴＬＲ２１に特異的なＣｐＧを含むＯＤＶの試験に適している。
【００９２】
ＴＬＲ２１に特異的なＣｐＧを含むＯＤＶを試験するための当該適した細胞株の好ましい例は、ニワトリ細胞株ＨＤ１１である。
【００９３】
それ故に好ましくは、検出系における使用のための細胞株は、レポーター遺伝子をコードする安定したプラスミド含むＨＤ１１細胞株である。
【００９４】
ＨＤ１１細胞株等のニワトリの細胞株は、ニワトリのＴＬＲの全パネルを示す。このことが一定の条件下で一定のバックグラウンドアクティビティを引き起こすのかもしれない。
【００９５】
それ故に、哺乳動物の細胞株等の非家禽細胞株がより好ましい細胞株である。当該哺乳動物の細胞株の例は、ＴＬＲ２１がクローン化されたＨＥＫ２９３細胞である。当該細胞株はＴＬＲ２１の活性化シグナルに対しより特異的で選択的である。
【００９６】
それ故により好ましくは、検出系における使用のための細胞株は、安定して保持されるレポーター遺伝子を含み、その中にＴＬＲ２１が既にクローンされている哺乳動物の細胞株ＨＥＫ２９３である。
【００９７】
本発明のさらなる他の実施態様は、本発明の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出法に関し、ここで当該方法は、ａ）本発明のオリゴデオキシヌクレオチドを細胞と接触させ、ｂ）レポーター遺伝子の産物レベルを検出する段階を含む。
【００９８】
この方法の好ましい形態において、レポーター遺伝子の産物はＳＥＡＰである。
【００９９】
この実施態様のより好ましい形態は、本発明の免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドの検出法に関し、ここで細胞はニワトリの細胞株ＨＤ１１、またはその中にニワトリＴＬＲ２１が既にクローンされたＨＥＫ２９３細胞株の細胞である。
【実施例１】
【０１００】
ニワトリＴＬＲ２１の遺伝子クローニングおよび異種発現
最近のニワトリＴＬＲ研究の進歩は、ＴＬＲ２１は鳥類における哺乳動物のＴＬＲ９の機能的ホモログであることを示唆する（Ｋｅｅｓｔｒａ  ２００８年、Ｂｒｏｗｎｌｉｅら、２００９年）。
【０１０１】
ＴＬＲ２１遺伝子クローニングの概要
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの配列ＮＭ＿００１０３０５５８に基づいて、ニワトリＴＬＲ２１遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用にプライマー対を合成した：
【化１】
0005876889.tif 000002
【０１０２】
プライマーは、開始コドンおよび終止コドン（ボールド体）にフランキング制限クローニングサイト（下線）およびコザック配列（イタリック体）を提供するように設計した。これらのプライマーおよび鋳型としてニワトリ脾臓全ＲＮＡを使用して逆転写ＰＣＲ（ＲＴ‐ＰＣＲ）を実施した。所期サイズ（〜３０００ｂｐ）のＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１‐Ｔｏｐｏにクローンし、それから５の独立したプラスミドクローン（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４）を配列決定した。
【０１０３】
使用したニワトリＴＬＲ２１のＤＮＡ塩基配列
【化２】
0005876889.tif 000003
0005876889.tif 000004
【０１０４】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）‐Ｎｅｏ‐ｃｈｉＴＬＲ２１によるＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐Ｚｅｏ（クローン細胞株）の形質移入
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞２９３は１９７０年代にウイルスによる形質転換によって樹立され（Ｇｒａｈａｍら、１９７７年）、今ではＡＴＣＣ等の細胞株寄託機関経由で研究者たちに入手可能である。
【０１０５】
ｐＮｉｆｔｙ２は、多くの免疫賦活性作用、その中のＴｏｌｌ様受容体活性化の特徴である、転写因子ＮＦ‐κＢの活性化の検出を可能とするプラスミドである。その転写／翻訳においてＮＦκＢ活性化に依存するｐＮｉｆＴｙ２中のレポーター遺伝子は分泌型アルカリホスファターゼである（ＳＥＡＰ）。詳細はこのプラスミドの販売会社Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎのデータシートに記載されている。ｐＮｉｆｔｙ２による形質転換／形質移入の現象は、増殖培地へのｚｅｏｃｉｎ添加によって細菌細胞および哺乳動物細胞の双方において選択される。
【０１０６】
ＨＥＫ２９３細胞を標準法（リポフェクション）によってｐＮｉｆＴｙ２を用いて形質移入して、安定した細胞株を選択し、ヒト腫瘍壊死因子α（Ｓｉｇｍａ）を用いた刺激によってＮＦ‐κＢ／ＳＥＡＰ軸の機能性を確立した。刺激された細胞の培養上清中の分泌ＳＥＡＰは、アルカリ性緩衝液（ＮａＨＣＯ３  ５０ｍＭ、ｐＨ９．６、ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ）中で発色基質ｐ‐ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ、５ｍＭ）を使用してマイクロタイタープレート比色分析法によって測定した。発色（λ＝４０５ｎｍ）をマイクロタイタープレートリーダーによって測定した。またこの読み出し値は、高信号雑音比を有するクローン細胞株を（限界希釈法によって）選択するためにも使用した。この選択クローンの一（クローン１１と呼ぶ）をその後ニワトリＴＬＲ２１に関する研究にさらに使用した。
【０１０７】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）‐ｎｅｏは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した標準的な哺乳動物発現ベクターである。このベクターへのニワトリＴＬＲ２１遺伝子のサブクローニングは、ＰＣＲによって導入されたフランキングＨｉｎｄ  ＩＩＩ（開始コドン）およびＮｏｔ  Ｉ（終止コドン）サイトにより行った（図１を参照）。
【０１０８】
このプラスミドは次にクローン細胞株ＮＥＫ２９３‐ｐＮｉｆｔｙ２‐ｚｅｏに形質移入し（リポフェクション）、それから増殖培地へのｚｅｏｃｉｎおよびＧ４１８の双方の添加によって組換え細胞を選択した。生じたポリクローナル組換え細胞株の機能性は、ＯＤＮ‐Ｘ４およびＯＤＮ‐ＨＥＫ１‐ＰＴＯを用いた培地の刺激およびＳＥＡＰの検出によって評価した。次に優れたクローン細胞株はその後に刺激およびＳＥＡＰ検出を伴う限界希釈法によって同定した。
【０１０９】
ＳＥＡＰは哺乳動物系におけるレポーター酵素である（Ｙａｎｇら、１９９７年）。ＳＥＡＰは、ヒト胚性アルカリホスファターゼの分泌型である。その主な利点は、高い安定性および極めて高い比活性であり、それらは検出の感度および堅牢性を保証する。数個の基質がＳＥＡＰの検出用に記載されてきたが、その反応産物ｐ‐ニトロフェノラートが高感度で検出されるので（ε４０５＝１８５００Ｍ−１ｃｍ−１）、経済的でかつ堅牢なｐＮＰＰが選択された。発明者らの試験設定において、それらが定量のより広い動作範囲（ダイナミックレンジ）を提供するので、発明者らは動力学的アッセイを実施する。
【０１１０】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐Ｚｅｏ細胞は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）‐Ｎｅｏ‐ｃｈｉＴＬＲ２１（Ｐｖｕ  Ｉで直線化した）を用いて形質移入し、それから培地に３５０μｇ／ｍｌのｚｅｏｃｉｎおよび６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を補給することによってポリクローナル細胞株を選択した。機能試験は、ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ‐ＨＥＫ１（ＰＴＯ）を用いて細胞を刺激することによって実施した。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）は選択細胞によって産生されたが、親細胞株ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐Ｚｅｏによっては産生されなかった。シングルセルクローニングを実施し、それから個々のクローンは、ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）（ＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＧ）およびＯＤＮ‐ＨＥＫ１（ＰＴＯ）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）に対するそれらの応答性に関し分析した。
【０１１１】
ｚｅｏ／Ｇ４１８の双方に耐性であるクローン細胞株４６株の中３株だけが明確にＯＤＮ刺激に対し応答性であったが、一方で細胞株の３ないし４株は弱いシグナルを示した。それ故に選択されたクローンの８５％は機能的でなかった。
【０１１２】
それ以降の全ての研究のためには、ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）およびＯＤＮ‐ＨＥＫ１（ＰＴＯ）の刺激に対する応答の最高のＳＥＡＰの読み出しシグナルを産生した、クローン細胞株３８を使用した。
【０１１３】
図２〜５は、種々のｚｅｏ／Ｇ４１８‐二重耐性クローン細胞株のＳＥＡＰ活性の概要を示す。
【実施例２】
【０１１４】
Ｎ３〜Ｎ６の性質の活性に関する影響の分析
以下のＰＤＥ型ＣｐＧ‐ＯＤＶを試験した：
【化３】
0005876889.tif 000005
【０１１５】
さらに対照として、そのＰＴＯ型カウンターパートがヒト腫瘍治療における薬剤／ワクチン候補であるＯＤＮ‐２００６（ＣｐＧ７９０９）のＰＤＥ型バージョンを正の対照として使用し、一方ではそのＧｐＣ型カウンターパートを負の対照として使用した（ＯＤＮ２００６‐対照）。
【０１１６】
ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株に関して、２０００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図６に示す。
【０１１７】
この試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４＞ＯＤＮ‐Ｘ２＞ＯＤＮ‐Ｘ１＞＞ＯＤＮ‐２００６（ＰＤＥ型）である。
【０１１８】
ＯＤＮ‐Ｘ３、ＯＤＮ‐Ｘ５、ＯＤＮ‐Ｘ６、ＯＤＮ‐Ｘ７、ＯＤＮ‐２００６‐対照（ＰＤＥ型）は不活性である。
【０１１９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図７に示す。
【０１２０】
この試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４＞＞ＯＤＮ‐Ｘ２である。
【０１２１】
ＯＤＮ‐Ｘ１、ＯＤＮ‐Ｘ３、ＯＤＮ‐Ｘ５、ＯＤＮ‐Ｘ６、ＯＤＮ‐Ｘ７は不活性である。
【０１２２】
まとめるとこれらの試験より、典型的なマウス（ＯＤＮ‐Ｘ１）およびヒト（ＯＤＮ‐Ｘ２）ではなくＰＤＥ型ＣｐＧを含むＯＤＶ‐Ｘ４が、ニワトリ細胞株ＨＤ１１および異種ニワトリＴＬＲ２１試験系の双方において最も効果的な試薬であることが証明された。
【実施例３】
【０１２３】
ＣｐＧモチーフに直に隣接するヌクレオチドの役割
ニワトリＨＤ１１細胞および異種的に発現されたニワトリＴＬＲ２１に対する異型の６塩基配列モチーフの活性を同定するために、ＣｐＧエレメントに直に隣接する位置が並び替えられた誘導体を作成した。
【０１２４】
（ＴＮＣＧＮＴ）３モチーフを基礎とする。
【化４】
0005876889.tif 000006
【０１２５】
配列の並べ替えは一度ＯＤＮ‐Ｘ４モチーフ（→ＯＤＮ‐Ｙ１１）に戻りつくことを指摘しておくべきであろう。
【０１２６】
ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株に関して、２０００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図８に示す。
【０１２７】
ＨＤ１１‐ｐＮｉｆｔｙｈｙｇにおけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｙ１１（＝ＯＤＮ‐Ｘ４）＞ＯＤＮ‐Ｙ１５＞ＯＤＮ‐Ｙ１２＞ＯＤＮ‐Ｙ９＞ＯＤＮ‐Ｙ３＞ＯＤＮ‐Ｙ１６＞ＯＤＮ‐Ｙ７〜ＯＤＮ‐Ｙ６〜ＯＤＮ‐Ｙ１０〜ＯＤＮ‐Ｙ１４＞ＯＤＮ‐Ｙ８〜ＯＤＮ‐Ｙ５である。
【０１２８】
ＯＤＮ‐Ｙ１、ＯＤＮ‐Ｙ２、ＯＤＮ‐Ｙ４、ＯＤＮ‐Ｙ１３は不活性である。
【０１２９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図９に示す。
【０１３０】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１におけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｙ１１（＝ＯＤＮ‐Ｘ４）＞＞ＯＤＮ‐Ｙ１５＞ＯＤＮ‐Ｙ９＞ＯＤＮ‐Ｙ１２＞ＯＤＮ‐Ｙ１４〜ＯＤＮ‐Ｙ６＞ＯＤＮ‐Ｙ７〜ＯＤＮ‐Ｙ８〜ＯＤＮ‐Ｙ１０〜ＯＤＮ‐Ｙ１６＞ＯＤＮ‐Ｙ３〜ＯＤＮ‐Ｙ５である。
【０１３１】
ＯＤＮ‐Ｙ１、ＯＤＮ‐Ｙ２、ＯＤＮ‐Ｙ４、ＯＤＮ‐Ｙ１３は不活性である。
【０１３２】
まとめると双方の試験系より、同様の結論が引き出され得る。即ちＯＤＮ‐Ｘ４と同一であるＯＤＮ‐Ｙ１１は、ＨＤ１１マクロファージおよびニワトリＴＬＲ２１を異種的に発現するＨＥＫ２９３細胞の最強の刺激物質として確認される。ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株の識別力はＨＤ１１‐ｐＮｉｆｔｙｈｙｇのそれよりも高いように思われる。
【実施例４】
【０１３３】
ＯＤＮ‐Ｘ４中のＴｐＣｐＧｐＴエレメントの３’側隣接位置の役割。
【０１３４】
ニワトリＤ１１細胞および異種的に発現されたニワトリＴＬＲ２１に対する好ましい６塩基配列モチーフをさらに同定するために、ＯＤＮ‐Ｘ４中のＴｐＣｐＧｐＴエレメントの３’側の隣接位置を並び替えた。
【０１３５】
（ＴＴＣＧＴＮ）３モチーフを基礎とする。
【化５】
0005876889.tif 000007
【０１３６】
ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇクローン細胞株に関して、２０００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１０に示す。
【０１３７】
ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇにおけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４〜ＯＤＮ‐Ｘ４３＞ＯＤＮ‐Ｘ４２〜ＯＤＮ‐Ｘ４１である。
【０１３８】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１１に示す。
【０１３９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１におけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４３＞＞ＯＤＮ‐Ｘ４〜ＯＤＮ‐Ｘ４２＞ＤＮ‐Ｘ４１である。
【実施例５】
【０１４０】
ＯＤＮ‐Ｘ４中のＴｐＣｐＧｐＴエレメントの５’側隣接位置の役割
ニワトリ細胞ＨＤ１１に対するさらなる６塩基配列モチーフをさらに同定するために、ＯＤＮ‐Ｘ４中のＴｐＣｐＧｐＴエレメントの５’側の隣接位置を並び替えた。
【０１４１】
（ＮＴＣＧＴＴ）３モチーフを基礎とする。
【化６】
0005876889.tif 000008
【０１４２】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１２に示す。
【０１４３】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１におけるこの英検に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４＞＞ＯＤＮ‐Ｘ２５＞ＯＤＮ‐Ｘ２＞ＯＤＮ‐Ｘ２４である。
【実施例６】
【０１４４】
５’‐ｄＧ６（デオキシグアノシン）の短縮または削除の効果
ニワトリ細胞ＨＤ１１および異種的に発現されたニワトリＴＬＲ２１におけるＰＤＥ型ＯＤＮ  Ｘ４に対する構造活性相関（ＳＡＲ）をさらに特性化するために、５’‐ｄＧ６の短縮または削除の効果を研究した。
【化７】
0005876889.tif 000009
【０１４５】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１３に示す。
【０１４６】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１におけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐１＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐２＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐３＞＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐４＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐６≒ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐５である。
ＯＤＮ‐Ｘ４‐５’‐４〜‐６はこの濃度範囲では不活性である。
【実施例７】
【０１４７】
３’‐ｄＧ６の短縮または削除の効果
ニワトリＨＤ１１細胞および異種的に発現されたニワトリＴＬＲ２１におけるＰＤＥ型ＯＤＮ  Ｘ４に対する構造活性相関（ＳＡＲ）をさらに特性化するために、３’‐ｄＧ６の短縮または削除の効果を研究した。
【化８】
0005876889.tif 000010
【０１４８】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１４に示す。
【０１４９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１におけるこの試験に基づく活性順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４‐３’‐５≒ＯＤＮ‐Ｘ４‐３’‐４≒ＯＤＮ‐Ｘ４‐３’‐３≒ＯＤＮ‐Ｘ４‐３’‐２＞ＯＤＮ‐Ｘ４‐３’‐１＞ＯＤＮ‐Ｘ４である。
【０１５０】
３’ｄＧ６および３’ｄＧ５を欠くＯＤＮ  Ｘ４‐ｍｉｎｕｓＧは双方とも、この濃度範囲では不活性である。
【０１５１】
さらに、５’‐ｄＧ６および３’ｄＧ５でのＧの付加が効力を有するかどうか研究した。
【化９】
0005876889.tif 000011
【０１５２】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、１００ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１５に示す。
【０１５３】
ＯＤＮ‐Ｘ４の両側への１個のＧの付加は、ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１における刺激活性に有益な効果も有害な効果も有さない一方で、２個のＧの付加は低効力の分子を生じるように思われる。
【実施例８】
【０１５４】
ホスホロチオエート型（ＰＴＯ）アナログによるリン酸ジエステル（ＰＤＥ）結合の置換
ＣｐＧ‐ＯＤＮの安定性および免疫賦活性の効力を改善するために、ホスホロチオエート型（ＰＴＯ）アナログによるリン酸ジエステル（ＰＤＥ）結合の置換を研究した。ＨＤ１１‐ｐＮｉｆＴｙｈｙｇニワトリマクロファージおよび異種的に発現されたニワトリＴＬＲ２１におけるＰＤＥ‐ＯＤＮ  Ｘ４に対する構造活性相関（ＳＡＲ）という観点をさらに特性づけるために、ＰＴＯによるすべてのＰＤＥ結合の置換（ＯＤＮ‐Ｘ４‐ＰＴＯ）の効果および５’‐ｄＧ６および３’‐ｄＧ５の連続配列だけにおけるＰＴＯによるＰＤＥ結合の置換（ＯＤＮ‐Ｘ４‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙ）の効果を研究した。
【０１５５】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、５０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１６に示す。
【０１５６】
この読み出し系において、Ｘ４‐ＰＤＥに比較してＸ４‐ＰＴＯの効力がより低いことが見出された。Ｘ４‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙは、ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１において親のＸ４‐ＰＤＥよりも高い効力であることが証明された。
【０１５７】
インビトロでの効力順位は、ＯＤＮ‐Ｘ４‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙ＞ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）＞ＯＯＤＮ‐Ｘ４‐ＰＴＯである。
【実施例９】
【０１５８】
ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）の種特異性の研究
ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）の種特異性を研究するために、ＨＥＫ２９３‐ＸＬ‐ｐＵＮＯ‐ヒトＴＬＲ９細胞を購入し、その後ｐＮｉｆＴｙ２を用いて形質移入し、文献のＰＴＯ‐ＣｐＧに対するそれらの応答性を確立し、機能細胞株を樹立し、それからその中の一つをＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１に関する比較試験に使用した。
【０１５９】
この比較試験においてＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）に加えて、ヒトＴＬＲ９に対し確立した高い効力を有するＰＴＯ‐ＯＤＮ２００６（＝ＣｐＧ７９０９）および２００７およびそれらのＧｐＣ対照カウンターパートを使用した。
【０１６０】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、５０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１７に示す。
【０１６１】
次の活性順位、ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）〜ＰＴＯ‐２００６＞ＰＴＯ‐２００７が得られた。
【０１６２】
ＧｐＣ対照のＰＴＯ‐ＯＤＮ２００６および２００７はここで考慮した濃度範囲において不活性だった。
【０１６３】
ＨＥＫ２９３‐ＸＬ‐ｐＵＮＯ‐ｈｕＴＬＲ９‐ｐＮｉｆＴｙ２クローン細胞株に関して、５０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１８に示す。
【０１６４】
次の活性順位、ＰＴＯ‐２００６＞ＰＴＯ‐２００７が得られた。
【０１６５】
ＧｐＣ対照のＰＴＯ‐ＯＤＮ２００６および２００７ならびにＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）はここで考慮した濃度範囲において不活性だった。
【０１６６】
この結果は、ＯＤＮ‐Ｘ４（ＰＤＥ）のニワトリ種特異性を確立した。
【実施例１０】
【０１６７】
ＴＴＣＧＴＴ繰り返しの最適回数に関する研究
ＴＴＣＧＴＴ繰り返しの最適回数を研究するために以下のコンストラクトを作成した。
【化１０】
0005876889.tif 000012
【０１６８】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、２０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図１９に示す。
【０１６９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１に対して、以下の刺激効力順位、Ｘ４‐ｈｅｘ〜Ｘ４‐ｐｅｎｔ＞Ｘ４‐ｑｕａｄ＞Ｘ４‐ｔｉｐ（＝「元の（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」Ｘ４）が確認された。
【０１７０】
Ｘ４‐ｄｏｕｂおよびＸ４‐ｓｉｎｇはここで適用された試験濃度では不活性だった。
【実施例１１】
【０１７１】
分離するＴ数の効果
ＣｐＧモチーフを分離するＴの数の効果を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１１】
0005876889.tif 000013
【０１７２】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、２５ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図２０に示す。
【０１７３】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１に対して、以下の賦活性の効力順位、Ｘ４‐Ｌｉ６〜Ｘ４‐Ｌｉ５〜Ｘ４‐Ｌｉ４（＝「元の（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」Ｘ４）＞Ｘ４‐Ｌｉ３＞Ｘ４‐Ｌｉ２〜Ｘ４‐Ｌｉ１が確認された。
【実施例１２】
【０１７４】
ｄＧ連続配列の境界にあるＴ残基の最適数に関する研究
ｄＧ連続配列の境界にあるＴ残基の最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１２】
0005876889.tif 000014
【０１７５】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、２０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図２１に示す。
【０１７６】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１に対して、以下の刺激効力順位、Ｘ４‐Ｂｏ４〜Ｘ４‐Ｂｏ３＞Ｘ４‐Ｂｏ２（＝「元の（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」Ｘ４）＞Ｘ４‐Ｂｏ１が確認された。
【０１７７】
ｄＧ連続配列の境界にあるＴ残基の最適数をさらに研究するために、以下の（同一のおよびより長い）コンストラクトを作成しそれから（再）試験した。
【化１３】
0005876889.tif 000015
【０１７８】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１クローン細胞株に関して、２０ｎＭから始まる滴定試験において得られた結果を図２２に示す。
【０１７９】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｐｃＤＮＡ３．１‐ｃｈｉＴＬＲ２１に対して、以下の刺激効力順位、Ｘ４‐Ｂｏ６＞Ｘ４‐Ｂｏ５＞Ｘ４‐Ｂｏ４＞Ｘ４‐Ｂｏ３＞Ｘ４‐Ｂｏ２（＝「元の（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）」Ｘ４）＞Ｘ４‐Ｂｏ１が確認された。
【実施例１３】
【０１８０】
骨格の三量体と隣接するＴ数の効果のさらなる研究
骨格の三量体と隣接するＴの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１４】
0005876889.tif 000016
【０１８１】
最大刺激作用に関してもおよび「５０％効果濃度」（＝ＥＣ５０）に関しても、Ｘ４‐Ｂｏ５からのＴのさらなる付加によって引き起こされる増加はわずかであるか存在しない。それにもかかわらず、Ｘ４‐Ｂｏ１０は未だに高活性である。従って、より以上のＴの付加による効果は横ばいになると仮定して差し支えない。Ｘ４‐Ｂｏ２０、Ｘ４‐Ｂｏ２５またはＸ４‐Ｂｏ３０へのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。図２３を参照。
【実施例１４】
【０１８２】
ＣＧエレメントを「分離する」Ｔ数の効果のさらなる研究
ＣＧエレメントを分離するＴの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１５】
0005876889.tif 000017
0005876889.tif 000018
【０１８３】
既に検討した通り、Ｘ４‐Ｌｉ１およびＸ４‐Ｌｉ２は考慮した濃度範囲（＜２０ｎＭ）において不活性である。ＥＣ５０はＸ４‐Ｌｉ３からＸ４‐Ｌｉ７ではそれほど変化しない一方で、達成可能な最大刺激作用はその順で増加するように思われる。驚くべきことは、Ｘ４‐Ｌｉ７からＸ４‐Ｌｉ８でのＥＣ５０におけるジャンプであり、それはまた最大刺激作用における増加も伴う。Ｘ４‐Ｌｉ８、Ｘ４‐Ｌｉ９およびＸ４‐Ｌｉ１０は、ＥＣ５０および最大刺激作用に関しておよそ同等の効力である。にもかかわらず、Ｘ４‐Ｌｉ１０はなお極めて有効である。従って、より以上のＴの付加による効果は横ばいすると予想して差し支えない。Ｘ４‐Ｌｉ２０、Ｘ４‐Ｌｉ２５またはＸ４‐Ｌｉ３０へのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。図２４を参照。
【実施例１５】
【０１８４】
ＴＴＣＧＴＴ繰り返し数の効果のさらなる研究
ＴＴＣＧＴＴ繰り返しの最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１６】
0005876889.tif 000019
0005876889.tif 000020
【０１８５】
既に検討した通り、Ｘ４‐ｓｉｎｇおよびＸ４‐ｄｏｕｂは考慮した濃度範囲（＜２０ｎＭ）において不活性である。達成可能な最大刺激作用はＸ４‐ｔｒｉｐからＸ４‐ｈｅｐｔまで強く増加し、またその順でＥＣ５０も強く減少するように思われる。特にＸ４‐ｑｕａｄからＸ４‐ｐｅｎｔへのジャンプは顕著である。Ｘ‐ｈｅｐｔからＸ４‐ｄｅｃまでは、中程度にしかし連続的に、最大刺激作用は増加しＥＣ５０は減少する。従って、より以上の三量体の付加による効果は横ばいすると予想して差し支えない。Ｘ４‐Ｘ、Ｘ４‐ＸＶまたはＸ４‐ＸＶＩＩＩへのコンストラクトでさえなお非常に適しているということが容易に予想し得る。しかしながら当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図２５および２６を参照。
【実施例１６】
【０１８６】
繰り返し三量体の型の効果のさらなる研究
繰り返し三量体の最適型を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１７】
0005876889.tif 000021
【０１８７】
刺激作用レベルがＸ４‐ｔｉｐないしＸ４‐Ｉで、ないしＸ４‐ＩＩ／Ｘ４‐ＩＩＩで強く増加する。そのうえＥＣ５０は、Ｘ４からＸ４‐Ｉで強く減少し、それからＸ４‐ＩＩＩで徐々に小さくなる。Ｘ４‐ＩＩＩはなお高活性である。図２７を参照。
【実施例１７】
【０１８８】
ＴＴＴＣＧＴＴＴ繰り返しの効果のさらなる研究
ＴＴＣＧＴＴＴ繰り返しの境界でのＴ残基の最適数を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１８】
0005876889.tif 000022
【０１８９】
Ｘ４系列におけると同様に、Ｘ４‐Ｉ‐ｓｉｎｇおよびＸ４‐Ｉ‐ｄｏｕｂは考慮した濃度範囲では不活性である（＜２０ｎＭ）。最初の効力のあるＯＤＮはＸ４‐Ｉであり、それから達成可能な最大刺激作用がＸ４‐ｑｕａｄおよびＸ４‐Ｉ‐ｐｅｎｔ／Ｘ４‐Ｉ‐ｈｅｘに関して増加する。ＥＣ５０はＸ４‐Ｉ‐ｔｒｉｐ〜Ｘ４‐Ｉ‐ｈｅｘに関して同じ桁（低ｎＭ）である。
【０１９０】
Ｘ４‐Ｉ‐ｈｅｘはなお高活性である。図２８を参照。
【実施例１８】
【０１９１】
３量体性の６量体ＣＧモチーフの３’隣接位置の研究
３量体性の６量体ＣＧモチーフの最適の３’隣接位置を研究するために、以下のコンストラクトを作成した。
【化１９】
0005876889.tif 000023
【０１９２】
ＥＣ５０算出：        Ｘ４：          ６１．６  ｎＭ
Ｘ４１：        未検、  ＞＞  １００  ｎＭ
Ｘ４２：        ６２．１  ｎＭ
Ｘ４３：          ３．３  ｎＭ
これら（および以前の）結果に基づくと、最大刺激作用およびＥＣ５０値の双方に関してＯＤＮ‐Ｘ４３はＯＤＮ‐Ｘ４より優れている。ＯＤＮ‐Ｘ４２は最大刺激作用に関してはやや低いが、ＥＣ５０はＯＤＮ‐Ｘ４のそれと同等である。
【実施例１９】
【０１９３】
３量体性の６量体ＣＧモチーフのさらなる研究―ＧＴＣＧＴＣの同定
ＰＤＥ‐ＯＤＮの効力をＯＤＮ‐Ｘ２に基づき探索するために、以下のＯＤＮを６量体の５’末端および３’末端の修飾体として合成した。Ｘ２、Ｘ２４、Ｘ２５およびＸ２６／Ｘ４の結果は上述した。
【化２０】
0005876889.tif 000024
【０１９４】
Ｘ２１およびＸ２２と同様に、Ｘ２、Ｘ２４、Ｘ２５はＸ２６／Ｘ４と比べて活性が単に不十分かまたは不活性である。しかしながらＸ２３は、Ｘ２６／Ｘ４のそれより優れた予期しない高い活性を示した。
【０１９５】
ＥＣ５０算出：       Ｘ２３：            ３．１  ｎＭ
Ｘ４：            ６１．６  ｎＭ
これらの（および以前の）結果に基づくと、ＯＤＮ‐Ｘ２３は最大刺激作用およびＥＣ５０値の双方に関してＯＤＮ‐Ｘ４より優れている。
【実施例２０】
【０１９６】
ＯＤＮ‐Ｘ４２モチーフ数の効果
ＯＤＮ‐Ｘ４２はＴＴＣＧＴＡモチーフの三量体に基づいている。モチーフ数の効果を試験するために、１から６までモチーフ数を研究した。
【化２１】
0005876889.tif 000025
0005876889.tif 000026
【０１９７】
ＥＣ５０
ＯＤＮ‐Ｘ４‐ｔｒｉｐ                                ４０．６    ｎＭ
ＯＤＮ‐Ｘ４２‐ｔｒｉｐ                              ３３        ｎＭ
ＯＤＮ‐Ｘ４２‐ｑｕａｄ                                ３．１    ｎＭ
ＯＤＮ‐Ｘ４２‐ｐｅｎｔ                                ０．８４  ｎＭ
ＯＤＮ‐Ｘ４２‐ｈｅｘ                                  ０．３７  ｎＭ
ＯＤＮ‐Ｘ４‐ｔｒｉｐ‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙ              ６．８    ｎＭ
先の試験で検討した通り、Ｘ４‐ｔｒｉｐおよびＸ４２‐ｔｒｉｐの効力は同等である。Ｘ４２系列におけるヘキサヌクレオチド繰り返し数を減少させることは、活性の損失をもたらすが（Ｘ４２‐ｓｉｎｇ、Ｘ４２‐ｄｏｕｂ）、一方で４、５および６までの数の増加は、最大シグナルおよびＥＣ５０におけるその順での増加をもたらし、Ｘ４２‐ｐｅｎｔではピコモルの効力に達する。また驚くべきは、Ｘ４２‐ｑｕａｄ以降のＯＤＮがＯＤＮ‐Ｘ４‐ｔｒｉｐ‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙよりも優れているという事実である。
【０１９８】
ｎ＝１０、ｎ＝１５またはｎ＝１８へのコンストラクトでさえなお非常に適していることは容易に想像し得る。しかしながら当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図２９を参照。
【実施例２１】
【０１９９】
ＯＤＮ‐Ｘ４３モチーフ数の効果
ＯＤＮ‐４３はＴＴＣＧＴＣモチーフの三量体に基づいている。モチーフ数の効果を試験するために、１から６までモチーフ数を研究した。
【０２００】
さらに、Ｘ４３‐ｔｒｉｐ〜Ｘ４３‐ｈｅｘのＰＴＯＧ−ｏｎｌｙ変異型を合成し試験した。
【化２２】
0005876889.tif 000027
【０２０１】
0005876889.tif 000028
以前の試験で検討した通り、Ｘ４３‐ｔｒｉｐの効力はＸ４‐ｔｒｉｐのそれより優れている。
【０２０２】
Ｘ４３系列におけるヘキサヌクレオチド繰り返し数を減少させることは、活性の損失をもたらすが（Ｘ４３‐ｓｉｎｇ、Ｘ４３‐ｄｏｕｂ）、一方で数の４、５および６への増加はその順で最大シグナルおよびＥＣ５０の増加をもたらし、Ｘ４３‐ｑｕａｄで既にピコモルの効力に達する。また驚くべきことは、Ｘ４３‐ｔｒｉｐ以降のすべてのＸ４３‐ＯＤＮがＯＤＮ‐Ｘ４‐ｔｒｉｐ‐ＰＴＯ‐Ｇｏｎｌｙよりも優れているという事実である。
【０２０３】
Ｘ４３‐ｔｒｉｐ〜Ｘ４３‐ｈｅｘのＰＴＯＧ‐ｏｎｌｙバージョンは、少なくとも純粋にリン酸ジエステル結合したＯＤＮバージョンと同程度に有効である。
【０２０４】
Ｘ４３‐ｈｅｘおよびＸ４３‐ｈｅｘ‐ＰＴＯＧ‐ｏｎｌｙはなお高度に有効であり、換言すれば限界および／または最適になお到達していなかった。
【０２０５】
さらにｎ＝１０、ｎ＝１５またはｎ＝１８へのコンストラクトさえなお非常に適していることは容易に予想され得る。しかしながら、当該コンストラクトは、合成することがますます困難となるであろう。図３０および図３１を参照。
【実施例２２】
【０２０６】
ＯＤＮ‐Ｘ４のさらなる変異型
ＰＤＥ‐ＯＤＮの効力をＯＤＮ‐Ｘ４に基づきさらに探索することを目的として、ＣｐＧエレメントの５’‐側および３’‐側のＴＴジヌクレオチドをＧＧ、ＡＡおよびＣＣそれぞれで置換してＯＤＮを合成した。
【化２３】
0005876889.tif 000029
【０２０７】
ＨＥＫ２９３‐ｐＮｉｆＴｙ２‐ｃｈｉＴＬＲ２１刺激試験において、Ｘ４‐ＧＧ、Ｘ４‐ＡＡ、Ｘ４‐ＣＣ、ＧＧ‐ＸおよびＡＡ‐Ｘは考慮した濃度範囲にわたり不活性であることが証明された。しかしながら、ＣＣ‐Ｘ（ＥＣ５０＝６．９４ｎＭ）はＸ４（ＥＣ５０＝５２．３ｎＭ）のそれに対し７倍優れたＥＣ５０活性を示し、しかもまたより高い最大刺激シグナルも示した。図３２を参照。
【実施例２３】
【０２０８】
本発明のＣｐＧモチーフの動物試験
１  諸言
１．１  目的
Ｗ／Ｏ型エマルジョンと組み合わせた、最小限量の不活化ＮＤＶクローン３０抗原と併用するＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）が、生ＮＤＶ  Ｈｅｄｒｔｓ３３／５６の攻撃感染に対し保護を与えるかどうかを評価すること。
【０２０９】
１．２
２  材料と方法
２．１  試験の簡単な概略
隔離飼育器に収容した、３週齢のＳＰＦホワイトレグホンニワトリの１８群に、表１「群分けおよび投薬」に示す製剤の一つにより、右胸筋の筋肉内に１回だけワクチン接種した（筋肉内注射）。１２羽の動物からなる各々の群から、１０羽だけにワクチン接種し、残りの２羽は対照として役立てた。血液試料は、ワクチン接種一日前（Ｔ＝０）に無作為に選びとった１８羽の動物（各々の群から１羽）から、およびワクチン接種後のＴ＝３週間目に全群の全動物から採取した。ワクチン接種後のＴ＝３週間目の血液採取後に、全ニワトリは、ニワトリ当たり０．２ｍｌの短潜伏期性のＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ３３／５６（１０６．０ＥＩＤ５０）を用いて右下肢筋に筋肉内（ｉ．ｍ．）経路により攻撃感染した。攻撃感染後の１４日の期間、ニワトリはＮＤＶ感染の臨床エビデンスまたは致死率の発生に関し毎日点数化した。攻撃感染後の２週間目に、血液を全動物から採取し、その後動物を安息死させた。局所反応は肉眼的にしらべて点数化した。反応または病変が観察可能であるときは型通りの組織学用試料を採取した。
【０２１０】
２．２  試験材料
２．２．１
２．２．１．１  ワクチン：０．２５％ｗ／ｗの不活化ＮＤＶクローン３０（Ｗ／Ｏ型エマルジョン中）
２．２．１．２  ＴＬＲリガンド：Ｘ４‐ＰＤＥ（Ｙ１１）―Ｂｉｏｌｅｇｉｏ社製―オランダ
Ｘ４‐ＰＴＯ（Ｙ１１）‐ＴｉｂＭｏｌＢｉｏｌ社製―ベルリン‐ドイツ
Ｘ４‐ＰＴＯ‐Ｇ‐ｏｎｌｙ（Ｙ１１）―ＴｉｂＭｏｌＢｉｏｌ社製
２００７‐ＰＴＯ（文献公知）―ＴｉｂＭｏｌＢｉｏｌ社製
２．２．１．３  ＣｐＧ配列：
【化２４】
0005876889.tif 000030
【表１】
0005876889.tif 000031
【０２１１】
２．２．２  ワクチン調製
各々のＴＬＲリガンドについて一定の希釈液を新たに作成し、０．５ｍｌ当たり１μｇまたは１０μｇの用量となるように、終濃度２．５％ｖ／ｖになるまでそれを［０．２５％ｗ／ｗＮＤＶのＷ／Ｏ型エマルジョン］‐ワクチンに添加した。（ここで使用する試験ワクチンのワクチン総投与量は、８．０６％ｗ／ｖＮＤＶ感染卵尿膜腔液／Ｗ／Ｏ型エマルジョンを含む。）ワクチンへＴＬＲリガンドを添加した後、ミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。
【０２１２】
（「不活化ニューカッスル病ウイルスの１／４用量」とは、オリゴデオキシヌクレオチドがない場合に、ＤＮＶ感染から家禽を保護することのできる抗体力価を与えると知られた不活化ＮＤＶの最小限量の１／４を意味する。）
２．３  ワクチン接種
各々の群の動物１０羽に、３週齢で０．５ｍｌのワクチンを用いて筋肉内注射で右胸筋に接種した。各々の群の残りの動物２羽は接種せずに対照として役立てた。
【０２１３】
２．４  攻撃感染
ワクチン接種後３週間目に、全１８群の全１２動物を、０．２ｍｌの生ＮＤＶ  Ｈｅｒｔｓ３３／６５（ニワトリ当たり１０６．０ＥＩＤ５０）を用いて筋肉内注射経路により右下肢筋に攻撃感染した。
【０２１４】
２．５  血液試料
血清学用の血液は、ワクチン接種一日前に（Ｔ＝０）無作為に選びとった１８羽の動物（各々の群から１羽）から、および一次接種後Ｔ＝３週間目に全動物から採取した。攻撃感染後２週間目の血液を、ＮＤＶ攻撃感染に生き残った全ての残っている動物から採取した。
【０２１５】
２．６  ＨＩアッセイ
ＮＤＶ特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによって測定した。血清の２段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからＮＤＶ抗原５０μｌ中に８赤血球凝集単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球（緩衝食塩水中１％（ｖ／ｖ））の血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、１：２以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなした。
【０２１６】
３  結果
【表２】
0005876889.tif 000032
【０２１７】
ＮＤＶのＨＩ力価：
結果から、またＮＤＶのＨＩ力価は保護と正確に相関することも明らかである。保護を誘導した各々のＴＬＲリガンドに対し、最高のＨＩ力価が、換言すれば用量当たり１０μｇで、最高の保護と相関することが見出された。対照的に、ＴＬＲリガンドの最も高い用量でＨＩ力価は最も低かった。
【０２１８】
組織学および病理学
注射部位の肉眼観察による研究において、異なる群由来のトリの注射部位の間に肉眼観察による差異は認められなかった。これらの観察は、使用したＴＬＲリガンドが安全であり、しかもそれらが例えば局所反応等の追加の副作用を誘発しなかったことを示している。
【０２１９】
保護／生存：
結果から、ＮＤＶのＷ／Ｏ型エマルジョンだけを用いては保護が得られなかったことが明らかであり（群１）、一方いくつかの他の群においては２０％ないし９０％のトリが、０．２５％（ｗ／ｗ）ＮＤＶクローン３０Ｗ／Ｏ型エマルジョンへのＴＬＲリガンドの付加により保護された。
【０２２０】
非ワクチン接種の対照ニワトリ（ｎ＝３６）において保護は観察されなかった。
【実施例２４】
【０２２１】
本発明のＣｐＧモチーフのさらなる動物試験。
【０２２２】
１  諸言
１．１  目的
Ｗ／Ｏ型エマルジョン（鉱物油に基づいた油中水型エマルジョン）と組み合わせたＸ４‐Ｐｅｎｔ‐ＰＤＥのニワトリにおける抗ＮＤＶ、抗ＩＢＶおよび抗ＴＲＴ抗体力価に及ぼす影響を評価すること。
【０２２３】
１．２  動機付け
本試験において発明者らは、Ｗ／Ｏ型エマルジョンと組み合わせた総用量の１／４の不活化ＮＤＶ、ＩＢＶまたはＴＲＴ抗原へのＸ４‐Ｐｅｎｔ‐ＰＤＥの付加が、ＮＤＶおよびＴＲＴの総用量、またはＩＢＶの半分の用量と比べたときに同等かより高い抗体力価を惹起することができるか否かを研究した。
【０２２４】
２  材料と方法
２．１  試験の簡単な概要
４週令のＳＰＦホワイトレグホンニワトリの群（群当たりｎ＝１０）に、表２に示す製剤の一つにより右下肢筋に１回、筋肉内注射でワクチン接種した。血液試料は、ワクチン接種一日前（Ｔ＝０）に無作為に選びとった２０羽の動物から、およびワクチン接種後のＴ＝４およびＴ＝６週間目に全群の全動物から採取した。血清は、抗ＮＤＶ、抗ＩＢＶおよび抗ＴＲＴ抗体力価を測定するために使用した。
【０２２５】
２．２  試験材料
２．２．１  試験物質
２．２．１．１  抗原（不活化）：ＮＤＶクローン３０：ワクチン総用量は、ＮＤＶ‐感染卵／Ｗ／Ｏ型エマルジョンの８．０６％ｗ／ｖ尿膜腔液を含む。
【０２２６】
ＩＢＶ‐２４９Ｇ：ワクチン総用量は、ＩＢ‐感染卵／Ｗ／Ｏ型エマルジョンの３０％ｗ／ｖ尿膜腔液を含む。
【０２２７】
ＴＲＴ：原生産単位。ワクチン総用量は１００Ｅ．Ｕ．／用量を含む。
【０２２８】
２．２．１．２  ワクチン：表２を参照。
【０２２９】
２．２．１．３  免疫賦活剤：
【化２５】
0005876889.tif 000033
【０２３０】
２．２．２  ワクチン調製
Ｘ４‐Ｐｅｎｔ‐ＰＤＥ型ＴＬＲリガンドの予備希釈液を新たに作成し、ワクチン０．５ｍｌ当たり１μｇまたは１０μｇの用量となるように、終濃度２．５％ｖ／ｖまでワクチンに添加した。ＴＬＲリガンドの添加後にワクチンをミニ‐ボルテックスを使用して激しく混合した。
【０２３１】
２．３  ワクチン接種
各々の群由来の動物は、４周齢のときにワクチン０．５ｍｌを用いて右下肢筋に筋肉内注射で接種した。
【０２３２】
２．４  血液試料
血清学用の血液試料は、ワクチン接種前（Ｔ＝０）に無作為に選びとられた動物２０羽からおよび一次接種後Ｔ＝４週間目に全動物から採取した。
【０２３３】
２．５  抗体力価
２．５．１  ＮＤＶのＨＩ‐アッセイ
ＮＤＶ特異抗体の血清レベルは、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによって測定した。血清の２段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからＮＤＶ抗原５０μｌ中に８赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球（緩衝食塩水中１％（ｖ／ｖ））の血球凝集を完全に抑制する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、１：４以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、２の対数で示す。
【０２３４】
２．５．２  ＩＢＶのＨＩ‐アッセイ
ＩＢ特異抗体力価の血清レベルは、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによって測定した。血清の２段階希釈液をマイクロタイタープレート中で調製し、それからＩＢＶ‐Ｄ２７４抗原５０μｌ中に８〜１６赤血球凝集素単位を含む等容量と混合した。力価は、ニワトリの赤血球（緩衝食塩水中１％（ｖ／ｖ））の血球凝集を完全に阻害する最高希釈倍数の逆数で表した。試料は、１：１６以上の希釈倍数における赤血球凝集抑制に対して陽性とみなしたが、２の対数で示す。
【０２３５】
２．５．３  ＴＲＴのＥＬＩＳＡ
ＴＲＴ特異抗体の血清レベルは、標準ＥＬＩＳＡによって測定した。手短に言えば、１：２００希釈ＴＲＴ抗原材料の１００μｌをマイクロタイタープレートに被覆した。血清は１：１００および１：８００に予備希釈し、それからマイクロタイタープレートに添加した。血清力価は、５以上の力価で陽性とみなしたが、２の対数で示す。
【０２３６】
２．５．４  結論
表２の結果より以下のことが直ちに結論し得る。
【０２３７】
１）１／４用量のＮＤＶワクチンは、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ１０μｇと共に投与されるとき、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ無添加の総用量のＮＤＶに匹敵する力価を与える。
【０２３８】
２）１／４用量のＮＤＶ／ＩＢＶ併用ワクチンは、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ１０μｇと共に投与されるとき、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ無添加の総用量のＮＤＶ／ＩＢＶ併用ワクチンに匹敵するＮＤＶ力価およびＩＢＶ力価を与える。
【０２３９】
３）１／４用量のＴＲＴワクチンは、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ１０μｇと共に投与されるとき、Ｘ４‐Ｐｅｎｔ無添加の総用量のＴＲＴワクチンに匹敵する力価を与える。
【０２４０】
３  結果
【表２】
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【図１】
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【図２】
0005876889.tif 000036
【図３】
0005876889.tif 000037
【図４】
0005876889.tif 000038
【図５】
0005876889.tif 000039
【図６】
0005876889.tif 000040
【図７】
0005876889.tif 000041
【図８】
0005876889.tif 000042
【図９】
0005876889.tif 000043
【図１０】
0005876889.tif 000044
【図１１】
0005876889.tif 000045
【図１２】
0005876889.tif 000046
【図１３】
0005876889.tif 000047
【図１４】
0005876889.tif 000048
【図１５】
0005876889.tif 000049
【図１６】
0005876889.tif 000050
【図１７】
0005876889.tif 000051
【図１８】
0005876889.tif 000052
【図１９】
0005876889.tif 000053
【図２０】
0005876889.tif 000054
【図２１】
0005876889.tif 000055
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
0005876889.tif 000065
【図３２】
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【配列表】
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