(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを有し、
ＢＣループは配列番号：１４を含み、ＤＥループは配列番号：２５を含み、ＦＧループは配列番号：３７を含むか、または
ＢＣループは配列番号：１１２を含み、ＤＥループは配列番号：１３８を含み、ＦＧループは配列番号：１５６を含み、
該ポリペプチドは前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合するポリペプチド。
【請求項２】
フィブロネクチンＩＩＩ型第１０ドメイン（１０Ｆｎ３）を含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを有し、
ＢＣループは配列番号：１４を含み、ＤＥループは配列番号：２５を含み、ＦＧループは配列番号：３７を含み、
該ポリペプチドは前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合するポリペプチド。
【請求項３】
１０ｎＭ未満のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、
配列番号：８２または配列番号：２０９から選択される配列を含み、ＰＣＳＫ９に結合するポリペプチド。
【請求項５】
１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、
配列番号：８２の配列を含み、ＰＣＳＫ９に結合するポリペプチド。
【請求項６】
１０ｎＭ未満のＫＤでＰＣＳＫ９に結合する、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ポリエチレングリコールコンジュゲートをさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８】
シアル酸コンジュゲートをさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
ＦｃまたはＦｃフラグメントをさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
トランスフェリンアミノ酸配列をさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
血清アルブミンアミノ酸配列または血清アルブミン結合タンパク質アミノ酸配列をさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１２】
血清免疫グロブリン結合タンパク質アミノ酸配列をさらに含む、請求項１−６のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される、請求項１−１２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１−１３のいずれかに記載のポリペプチドを含む薬学的に許容される組成物。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される、請求項１４に記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項１６】
アテローム性動脈硬化症または高コレステロール血症の処置のために使用される薬学的に許容される組成物の製造のための、請求項１−１３のいずれかに記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにおいてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体において出典明示により本明細書に包含させる配列表を含む。２０１１年４月１３日に作成された該ＡＳＣＩＩのコピーは、１１５９４  ＰＣＴ．ＳＴ２５．ｔｘｔという名であり、１，３８２ＫＢのサイズである。
【０００２】
技術分野
本発明は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に結合するフィブロネクチンベースのスカフォールドドメインタンパク質に関する。本発明はまた、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患を処置するための治療的適応における革新的なタンパク質の使用に関する。本発明は、さらに、このようなタンパク質、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれらのフラグメントを含む細胞、および革新的なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【背景技術】
【０００３】
序論
アテローム性動脈硬化症は、先進工業国において多数の死の根底にある冠動脈性心臓疾患（ＣＨＤ）に関与する動脈疾患である（Lusis (2000)）。現在、ＣＨＤに関するいくつかの危険因子：脂質異常症、高血圧、糖尿病、喫煙、質の悪い食生活、運動不足およびストレスは、よく確立されている。多数の臨床的に関連した、および一般的な脂質異常症は、高トリグリセリド血症の非存在および存在下で、高コレステロール血症での低比重リポタンパク質および超低密度リポタンパク質（ＬＤＬおよびＶＬＤＬ）の増加により特徴付けられる（Fredricksonら (1967)）。単離されたＬＤＬコレステロールの上昇は、ＣＨＤに対する最も一般的な危険因子の１つである。ＰＣＳＫ９（ＨＣＨＯＬＡ３、ＮＡＲＣ−１またはＦＨ３とも称される）は、分泌サブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロテアーゼである（Naureckieneら Arch. Biochem. Biophy., 420:55-57 (2003)）。ＰＣＳＫ９は、コレステロールホメオスタシスおよび血中低比重リポタンパク質レベルの重要なレギュレーターであることが示されている。血中ＰＣＳＫ９タンパク質は、ＬＤＬ受容体への直接結合および肝細胞における分解の促進により、ＬＤＬ代謝をコントロールする。ＬＤＬ受容体タンパク質および活性のＰＣＳＫ９介在下方制御は、血中からのＬＤＬのクリアランスの減少およびより高いＬＤＬレベルをもたらす。常染色体優性高コレステロール血症（ＡＤＨ）に関連しているＳ１２７Ｒ、Ｆ２１６ＬおよびＤ３７４Ｙを含むＳ１２７Ｒ、Ｎ１５７Ｋ、Ｆ２１６Ｌ、Ｒ２１８ＳおよびＤ３７４Ｙを含む、ＰＣＳＫ９のいくつかの変異体形態が知られている。野生型ＰＣＳＫ９が、より少ないＬＤＬクリアランスを引き起こすＬＤＬ受容体の回転率を増加させるが（Maxwellら Proc. Natl. Acad. Sci., 102(6):2069-2074 (2005); Benjannetら and Lalanneら）、ＰＣＳＫ９機能喪失変異体が低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）のレベルの増加、血中ＬＤＬのクリアランスの増加、および血漿コレステロールレベルの対応する増加をもたらすことが考えられている（Rashidら Proc. Natl. Acad. Sci., 102(15):5374-5379 (2005)）。そのため、ＰＣＳＫ９は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置のための可能性のある標的である。
【０００４】
フィブロネクチンベースのスカフォールドは、興味ある任意の化合物に結合するように発展することができるタンパク質のファミリーである。一般的にフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメイン由来のスカフォールドに使用されるこれらのタンパク質は、天然の抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体）の挙動特性において機能し、加えて、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、通常、抗体における構造および機能の喪失を引き起こす条件下でさえ、最適なフォールディング、安定性および溶解性に設計されている。フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質の例は、アドネクチンである（Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Company）。
【０００５】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ−末端からＣ−末端の順に、ベータまたはベータ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；ベータまたはベータ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；ベータまたはベータ様鎖Ｃ；ループＣＤ；ベータまたはベータ様鎖Ｄ；ループＤＥ；ベータまたはベータ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；ベータまたはベータ様鎖Ｆ；ループＦＧ；およびベータまたはベータ様鎖Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたはすべてが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造的および機能的の両方で類似している。米国特許第７，１１５，３９６号は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対する改変が高親和性ＴＮＦαバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質を記載している。米国公開第２００７／０１４８１２６号は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに対する改変が高親和性ＶＥＧＦＲ２バインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質を記載している。
【０００６】
アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の治療処置のために、ＰＣＳＫ９に結合する改善されたフィブロネクチンドメインスカフォールドタンパク質を得ることは、有利である。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本出願は、ヒトＰＣＳＫ９に対するアドネクチンを提供する。本発明の１つの局面は、１つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異化されているＦｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの野生型第１０モジュール（１０Ｆｎ３）由来のＦｎ３ドメインである。いくつかの態様において、本発明の１０Ｆｎ３ポリペプチドは、ヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一である。
【０００８】
いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、該１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループ、ＥＦ；およびループ、ＦＧを含み；ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有する。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明のポリペプチドは、非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一のアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインを含む。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、表３に示される配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＢＣループは、配列ＰＰＰＳＨＧＹＧ（配列番号：２の残基３−１０）、ＤＡＰＡＨＡＹＧ（配列番号：５の残基３−１０）、ＥＰＦＳＲＬＰＧＧＧＥ（配列番号：１０６の残基３−１３）またはＤＡＰＡＤＧＧＹＧ（配列番号：１０７の残基３−１１）を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、配列番号：１８−２７および１３６−１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、表３に示される配列番号：１８−２７および１３６−１４１のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＤＥループは、配列ＰＧＫＧ（配列番号：１８の残基２−５）、ＶＧＶＧ（配列番号：２７の残基２−５）またはＶＳＫＳ（配列番号：１３７の残基２−５）を含む。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、配列番号：２８−３８および１４２−１７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、表３に示される配列番号：２８−３８および１４２−１７２のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＦＧループは、配列ＥＹＰＹＫＨＳＧＹＹＨＲ（配列番号：２８における残基１−１２）、ＥＹＰＹＤＹＳＧＹＹＨＲ（配列番号：１４２における残基１−１２）またはＥＦＤＦＶＧＡＧＹＹＨＲ（配列番号：１６７における残基１−１２）を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、１０Ｆｎ３ドメインは、アミノ酸置換、挿入または欠失で開始および／または終結し得る。
【００１５】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３に示されるＢＣループ配列；配列番号：１８−２７および１３６−１４１に示される１つのＤＥループ配列；ならびに配列番号：２８−３８および１４２−１７２に示される１つのＦＧループ配列からの１つのループ配列を含む。１つの態様において、本発明のタンパク質は、表３に示される配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３のいずれかの網掛け部分を含む１つのＢＣループ配列；表３に示される配列番号：１８−２７および１３６−１４１のいずれかの網掛け部分を含む１つのＤＥループ配列；ならびに表３に示される配列番号：２８−３８および１４２−１７２のいずれかの網掛け部分を含む１つのＦＧループ配列を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−３８、１０６−１７２および３０１−３０３のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。１つの態様において、本発明のタンパク質は、上記のとおり、表３に示されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの網掛け部分のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３９−７６、１７３−２９０および３０４−３０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３９−７６、１７３−２９０および３０４−３０９のいずれか１つの位置３−９６からのＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。
【００１９】
１つの局面において、本記載は、配列ＳＷ（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：３２３）を有するＢＣループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｚは６−９の数であり、そしてＸ２はＹまたはＨである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２０】
１つの局面において、本記載は、配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ（配列番号：３２４）を有するＤＥループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、そしてＸ３はＧまたはＳである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２１】
１つの局面において、本記載は、配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）を有するＦＧループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＹまたはＦであり；Ｘ５はＹ、ＦまたはＷであり；そしてＸ６はＳまたはＡである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。１つの態様において、Ｘ４およびＸ５は芳香族性残基であり、それぞれ独立してＹ、Ｆ、ＷまたはＨから選択される。
【００２２】
１つの局面において、本記載は、本明細書において定義されているとおり、配列ＳＷ（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：３２３）を有するＢＣループ、配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ（配列番号：３２４）を有するＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）を有するＦＧループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２３】
１つの局面において、本記載は、本明細書において定義されているとおり、配列ＳＷＥＰＦＳＲＬＰＧＧＧＥ（配列番号：１０６）を有するＢＣループ、配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ（配列番号：３２４）を有するＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）を有するＦＧループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２４】
１つの局面において、本記載は、配列（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：４４９）を有するＢＣループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｚは６−９の数であり、そしてＸ２はＹまたはＨである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２５】
１つの局面において、本記載は、配列Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３（配列番号：４５０）を有するＤＥループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、そしてＸ３はＧまたはＳである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２６】
１つの局面において、本記載は、配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲ（配列番号：４５１）を有するＦＧループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンであって、式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＹまたはＦであり；Ｘ５はＹ、ＦまたはＷであり；そしてＸ６はＳまたはＡである抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。１つの態様において、Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立して、Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨから選択される芳香族性残基である。
【００２７】
１つの局面において、本記載は、本明細書において定義されているとおり、配列（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：４４９）を有するＢＣループ、配列Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３（配列番号：４５０）を有するＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲ（配列番号：４５１）を有するＦＧループを含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００２８】
いくつかの態様において、ＰＣＳＫ９アドネクチンのＮ−末端から少なくとも１つのアミノ酸欠失がある。
【００２９】
いくつかの態様において、ＰＣＳＫ９アドネクチンのＣ−末端から少なくとも１つのアミノ酸欠失、挿入または置換がある。
【００３０】
いくつかの態様において、リンカーは、ＰＣＳＫ９アドネクチンのＣ−末端に付加される。
【００３１】
いくつかの態様において、ＰＣＳＫ９アドネクチンは、非−１０Ｆｎ３部分、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／１３３２０８およびＷＯ２００９／０８３８０４に記載されているヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合され得る。
【００３２】
いくつかの態様において、ＰＣＳＫ９アドネクチンは、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／１３３２０８およびＷＯ２００９／０８３８０４に記載されている、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループアミノ酸配列における変異を有し得る。
【００３３】
１つの局面において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、薬物動態学（ＰＫ）部分をさらに含む。１つの態様において、ＰＫ部分は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。１つの態様において、ＰＫ部分は、Ｆｃ領域を含む。いくつかの態様において、ＰＫは、１つ以上の血清アルブミン結合アドネクチンを含む。典型的な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合タンパク質は、表１に示される。典型的な抗−ＰＣＳＫ９−血清アルブミン結合アドネクチンは、配列番号：６１８または６１９を含む。
【００３４】
１つの態様において、ＰＫ部分を有する抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３２２に記載されている配列を含む。
【００３５】
別の局面において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、あらゆるＰＫ部分（すなわち、「裸の」抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン）を含まない。１つの態様において、裸の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、所望の治療効果を十分になし遂げることができる頻度で投与され得る。別の態様において、裸の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、伸長放出製剤（例えば、皮下製剤）を使用して投与することができる。いくつかの態様において、伸長放出製剤は、吸収相の長さを増加するか、もしくは薬物動力学効果の長さを伸長するか、またはそれら両方である。単に説明するために、伸長放出製剤はプロピレングリコール／ＰＢＳ溶液を含む。
【００３６】
１つの局面において、本出願は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置において有用な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。
【００３７】
１つの局面において、本発明は、血清アルブミンに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを含む融合ポリペプチドであって、該血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、１ｕＭ以下のＫｄで血清アルブミン、例えば、ＨＳＡに結合する融合ポリペプチドを提供する。１つの態様において、血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：３３０と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。１つの態様において、血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：３３１に記載されているアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：３３２に記載されているアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号：３３３に記載されているアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。別の態様において、血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、１つ以上の、配列番号：３３１に記載されているアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：３３２に記載されているアミノ酸配列を有するＤＥループおよび配列番号：３３３に記載されているアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。
【００３８】
１つの態様において、融合ポリペプチドの血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインはまた、１つ以上のアカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ）に結合する。他の態様において、血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、１つ以上のＲｈＳＡ、ＣｙＳＡまたはＭｕＳＡと交差反応しない。
【００３９】
１つの態様において、融合ポリペプチドの血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、１ｕＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。いくつかの態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、５００ｎＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。他の態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、少なくとも２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭまたは５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。
【００４０】
他の態様において、融合ポリペプチドの血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのドメインＩまたはＩＩに結合する。１つの態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのドメインＩおよびＩＩの両方に結合する。いくつかの態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、５．５から７．４のｐＨ範囲でＨＳＡに結合する。他の態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、ｐＨ５．５で２００ｎＭ以下のＫｄでＨＳＡに結合する。別の態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、５．５から７．４のｐＨ範囲で少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭまたは５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。１つの態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３ドメインは、ｐＨ５．５で少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭまたは５ｎＭのＫｄでＨＳＡに結合する。
【００４１】
いくつかの態様において、血清アルブミンの存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、血清アルブミンの非存在下での融合ポリペプチドの血清半減期よりも少なくとも５倍良い。１つの態様において、血清アルブミンの存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、血清アルブミンの非存在下での融合ポリペプチドの血清半減期よりも少なくとも２倍、５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍または３０倍良い。いくつかの態様において、血清アルブミンは、ＨＳＡ、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡまたはＭｕＳＡのいずれか１つである。
【００４２】
１つの態様において、血清アルブミンの存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、少なくとも２０時間である。１つの態様において、血清アルブミンの存在下での融合ポリペプチドの血清半減期は、少なくとも１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１５０時間、１７０時間または２００時間である。いくつかの態様において、融合ポリペプチドの半減期は、霊長類（例えば、ヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
【００４３】
前記局面および態様のいずれかにおいて、血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：３３４、３３８、３４２、３４６および３４８−３７０から選択される配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、典型的な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列は、それぞれ下線、イタリック体／下線または太字／下線により同定される。
【００４５】
【図２】図２は、実施例２に記載されている、ＰＣＳＫ９アドネクチンを阻害するＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲの効力を測定するために使用された、ＰＣＳＫ９：上皮細胞増殖因子前駆体相同ドメイン（ＥＧＦＡドメイン）蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを示す図である。
【００４６】
【図３】図３は、実施例２に記載されているＰＣＳＫ９アドネクチンクローン１４５９Ｄ０５、１７８４Ｆ０３、１８１３Ｅ０２、１９２２Ｇ０４および１９２３Ｂ０２（パネルＡ）ならびにクローン１４５９Ｄ０５、２０１２Ａ０４、２０１１Ｈ０５および２０１３Ｅ０１（パネルＢ）によるヒトＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡの阻害を測定するために使用されたＦＲＥＴアッセイから生成された曲線を示す。
【００４７】
【図４】図４は、実施例２に記載されているＰＣＳＫ９アドネクチンクローン１４５９Ｄ０５、１７８４Ｆ０３、１８１３Ｅ０２、１９２２Ｇ０４および１９２３Ｂ０２（パネルＡ）ならびにクローン２０１１Ｈ０５、２０１２Ａ０４および２０１３Ｅ０１（パネルＢ）によるヒトＰＣＳＫ９：ＡＴＩ０００９７２相互作用の阻害を測定するために使用されたＦＲＥＴアッセイから生成された曲線を示す。
【００４８】
【図５】図５は、実施例２に記載されている直接結合ヒトＰＣＳＫ９  ＦＲＥＴアッセイにおけるＰＣＳＫ９アドネクチンクローン１４５９Ｄ０５、１７８４Ｆ０３、１８１３Ｅ０２、１９２２Ｇ０４および１９２３Ｂ０２（パネルＡ）ならびにクローン２０１１Ｈ０５、２０１２Ａ０４および２０１３Ｅ０１（パネルＢ）の活性を示す。
【００４９】
【図６】図６は、実施例２に記載されているＤｉＩ−ＬＤＬ摂取方法によりアッセイされたＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９活性の阻害を示す。
【００５０】
【図７】図７は、実施例２に記載されているＰＣＳＫ９アドネクチンクローン１４５９Ｄ０５、１７８４Ｆ０３、２０１２Ａ０４および２０１１Ｈ０５（パネルＡ）ならびにクローンＩＤ２０１１Ｈ０５、２０１２Ａ０４および２０１３Ｅ０１（パネルＢ）による、ＨｅｐＧ２細胞表面からのＰＣＳＫ９誘導ＬＤＬＲ枯渇の阻害を示す。１７８４Ｆ０３、２０１２Ａ０４、２０１１Ｈ０５および２０１３Ｅ０１のＥＣ５０（ｎＭ）は、それぞれ１５．９８、７．７８、８．８５および１２．４１であり；ＰＣＳＫ９アドネクチンクローン１４５９Ｄ０５、１７８４Ｆ０３、２０１２Ａ０４、２０１１Ｈ０５および２０１３Ｅ０１の７５ｎＭでのＰＣＳＫ９の阻害パーセントは、それぞれ６６．８、１５０．２、１９０．１、１７７．４および１５２．２である。
【００５１】
【図８】図８は、実施例３に記載されているｈＰＣＳＫ９を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける、血漿コレステロール（パネルＡ）および血漿非結合ｈＰＣＳＫ９（パネルＢ）に対するＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ０００９５９（１００ｍｇ／ｋｇ）のインビボ効果を示す。ＡＴＩ０００９５９は、４０ｋＤａの分岐ＮＯＦ  ＰＥＧを含む。
【００５２】
【図９】図９は、実施例３に記載されているｈＰＣＳＫ９を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける、血漿コレステロールレベル（パネルＡ）および血漿非結合ｈＰＣＳＫ９レベル（パネルＢ）に対するＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ００１１１４（１０または６０ｍｇ／ｋｇ）のインビボ効果を示す。
【００５３】
【図１０】図１０は、実施例３に記載されている正常発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウス（平均＋／−ＳＤ）における５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）単回投与で投与された非結合血漿ｈＰＣＳＫ９に対するＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ０００９５９（パネルＡ）またはＡＴＩ００１１１４（パネルＢ）のインビボ効果を示す。
【００５４】
【図１１】図１１は、実施例３に記載されている正常発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスにおける非結合ｈＰＣＳＫ９に対するＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ００１１１４の用量依存効果を示す。
【００５５】
【図１２】図１２は、実施例３に記載されているカニクイザルにおけるＬＤＬ−Ｃ低下に対するＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ００１１１４（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）の単回投与の効果を示す（平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【００５６】
【図１３】図１３。ＰＣＳＫ９アドネクチン親和性およびｈＰＣＳＫ９への結合の化学量論のＩＴＣ決定。ＰＣＳＫ９アドネクチンは、１：１化学量論でｈＰＣＳＫ９に結合する。左パネルはＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ００１０８１に対するデータを示す；右パネルはＰＣＳＫ９アドネクチン  ＡＴＩ００１１７４に対するデータを示す。
【００５７】
【図１４】図１４。ＰＣＳＫ９アドネクチンによるＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡ  ＦＲＥＴアッセイ（左パネル）およびＰＣＳＫ９：ＡＴＩ−９７２  ＦＲＥＴアッセイ（右パネル）の阻害。
【００５８】
【図１５】図１５。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンによるＨｅｐＧ２細胞表面からのＰＣＳＫ９誘導ＬＤＬＲ枯渇の阻害
【００５９】
【図１６】図１６。ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７細胞への侵入の阻害。
【００６０】
【図１７】図１７。ＰＲＤ４６０（ｉ．ｐ．投与）で処置されたトランスジェニックマウスにおける血漿非結合ｈＰＣＳＫ９レベル。
【００６１】
【図１８】図１８。カニクイザルにおけるＬＤＬ−Ｃおよび遊離ＰＣＳＫ９に対するＰＲＤ４６０（１５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）の効果（平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【００６２】
【図１９】図１９。カニクイザルにおける非結合ＰＣＳＫ９レベルに対するＡＴＩ−１０８１（またＡＴＩ００１０８１と称される）の効果。
【００６３】
【図２０】図２０。カニクイザルにおけるＬＤＬ−Ｃレベルに対するＡＴＩ−１０８１の効果。
【００６４】
【図２１】図２１。トランスジェニックマウスにおけるＰＢＳビヒクル中のＡＴＩ−１０８１の効果。図は、トランスジェニックマウスにおける非結合血漿ｈＰＣＳＫ９のレベルを説明する。
【００６５】
【図２２】図２２。トランスジェニックマウスにおけるＰＧビヒクル中で皮下に投与されたＡＴＩ−１０８１の効果。図は、トランスジェニックマウスにおける非結合ｈＰＣＳＫ９のレベルを説明する。
【００６６】
【図２３】図２３。マウスにおけるインビボＨＳＡ半減期。ＨＳＡを、２０ｍｇ／ｋｇ（パネルＡ）または５０ｍｇ／ｋｇ（パネルＢ）でヌードマウスに注射した。
【００６７】
【図２４】図２４。マウスにおけるＳＡＢＡ１．１（パネルＡ）、ＳＡＢＡ２．１（パネルＢ）、ＳＡＢＡ３．１（パネルＣ）およびＳＡＢＡ４．１（パネルＤ）の半減期決定。
【００６８】
【図２５】図２５。ＨＳＡを共注入されたときのＳＡＢＡ１−４のマウスにおける半減期増強の概要を示すグラフ。
【００６９】
【図２６】図２６。カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１（パネルＡ）およびＳＡＢＡ５．１（パネルＢ）の半減期決定。
【００７０】
【図２７】図２７。直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによるヒト、マウスおよびラット由来のアルブミンへのＳＡＢＡ１．２結合。
【００７１】
【図２８】図２８。ＳＡＢＡ１．１およびＨＳＡ化学量論の決定。ＳＡＢＡ１．１およびＨＳＡは、１：１の化学量論で結合する。
【００７２】
【図２９】図２９。ＨＳＡの組換えドメインフラグメントへのＳＡＢＡ１．２結合のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析。
【００７３】
【図３０】図３０。１ｍｐｋおよび１０ｍｐｋで投与されたカニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．２に対する薬物動態学プロフィール。
【００７４】
【図３１】図３１。１ｍｐｋで静脈内または皮下に投与されたサルにおけるＳＡＢＡ１．２に対する薬物動態学プロフィール。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
発明の詳細な説明
定義
「ポリペプチド」は、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、２つ以上のアミノ酸のあらゆる配列を意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用される。ポリペプチドは、米国特許第６，５５９，１２６号（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されているもののような天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含むことができる。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい（例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい；カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい；またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ半減期を増大するように修飾されていてもよい）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの別の構造、例えば、環状化合物または他の分子の結合を含み得、また、１つ以上のアミノ酸を改変された立体配置（すなわち、ＲもしくはＳ；またはＬもしくはＤ）で含むポリペプチドを含み得る。本発明のペプチドは、ＰＣＳＫ９に特異的に結合するように修飾されているフィブロネクチンの第１０ＩＩＩ型ドメイン由来のタンパク質であり、「抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン」または「ＰＣＳＫ９アドネクチン」として本明細書において称される。
【００７６】
「ＰＫ」なる用語は、「薬物動態学」に対する頭字語であり、一例として、対象による吸収、分布、代謝および排出を含む化合物の特性を含む。「ＰＫ調節タンパク質」または「ＰＫ部分」は、生物学的に活性な分子と融合されるか、一緒に投与されるとき、生物学的に活性な分子の薬物動態学的特性に影響するあらゆるタンパク質、ペプチドまたは部分を示す。ＰＫ調節タンパク質またはＰＫ部分の例は、ＰＥＧ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）バインダー（米国公開第２００５／０２８７１５３および２００７／０００３５４９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８３８０４およびＷＯ２００９／１３３２０８に記載されているような、ならびに本明細書に記載されているＳＡＢＡ分子）、ヒト血清アルブミン、ＦｃまたはＦｃフラグメントおよびそれらの変異体および糖（例えば、シアル酸）を含む。
【００７７】
本明細書における「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性の一部として保存的置換は考慮することなく、必要なとき配列同一性最大パーセントなし遂げるように、配列をアラインし、ギャップを導入した後に、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当技術分野における技術の範囲内の種々の方法で、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標））ソフトウェアを使用して、なし遂げることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントをなし遂げるために必要な任意のアルゴリズムを含むアラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定することができる。
【００７８】
「単離された」ポリペプチドは、天然環境の成分から同定および分離および／または回収されているものである。その天然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい態様において、ポリペプチドは、（１）Ｌｏｗｒｙ法により決定される９５重量％以上の、および、より好ましくは９９重量％以上のポリペプチドに、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ−末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも残基を得るために十分な程度に、または（３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質性に精製される。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕでポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程により製造される。
【００７９】
「ｍｐｋ」、「ｍｇ／ｋｇ」または「ｋｇあたりのｍｇ」なる表記は、１キログラムあたりのミリグラムを示す。全ての表記は、本記載中で互換的に使用される。
【００８０】
アミノ酸配列または化合物の「半減期」は、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって、インビボでポリペプチドの血清濃度が、５０％低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、それ自体既知の任意の方法、例えば、薬物動態学分析により決定することができる。適当な技術は当業者に明らかであり、例えば、一般的に、適当な用量のアミノ酸配列または本発明の化合物を霊長類へ適当に投与する工程；一定間隔で該霊長類から血液サンプルまたは他のサンプルを回収する工程；該血液サンプル中のアミノ酸配列または本発明の化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；および、このように得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または本発明の化合物のレベルまたは濃度が投与時の最初のレベルと比較して５０％低減されるまでの時間を計算する工程を含む。例えば、標準ハンドブック、例えば、Kenneth, Aら Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for PharmacistsおよびPetersら Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)が参照される。また、Gibaldi, Mら Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)も参照される。
【００８１】
半減期は、パラメーター、例えば、ｔ１／２−アルファ、ｔ１／２−ベータ、ＨＬ＿ラムダ＿ｚおよび曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して示すことができる。本願明細書において、「半減期における増加」は、これらのパラメーターのいずれか１つ、これらのパラメーターのいずれか２つ、これらのパラメーターのいずれか３つ、またはこれらのパラメーターの全４つにおける増加を示す。「半減期における増加」は、特に、ｔ１／２−アルファおよび／またはＡＵＣまたは両方における増加を伴って、または伴わずのいずれかで、ｔ１／２−ベータおよび／またはＨＬ＿ラムダ＿ｚにおける増加を示す。
【００８２】
概観
本出願は、ヒトＰＣＳＫ９に対するアドネクチンを提供する。ＰＣＳＫ９特異的アンタゴニストを同定するために、ＰＣＳＫ９を、アドネクチンの大型合成ライブラリーに提供した。ＰＣＳＫ９に結合したアドネクチンを、ＰＣＳＫ９結合、生物物理的特性およびＰＣＳＫ９阻害活性についてスクリーニングした。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを変異させ、標的濃度を低下させ、スローオフ速度(slow off-rate)で抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを選択することによるさらなる選択圧に付した。この最適化処理から、アドネクチンファミリーが好ましい生化学的および生物物理的特性を有するＰＣＳＫ９特異的阻害剤として同定された。
【００８３】
フィブロネクチンベースのスカフォールド
本出願の１つの局面は、１つ以上の溶媒接触可能ループがランダム化または変異化されているＦｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）の野生型第１０モジュール由来のＦｎ３ドメインである：ＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：１）。１０Ｆｎ３配列において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは下線を引かれている。
【００８４】
本明細書に記載されているとおり、１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列、すなわち「１０Ｆｎ３スカフォールド」は改変され得るが、１０Ｆｎ３はリガンド結合機能および／または構造安定性を保持する。種々の変異体１０Ｆｎ３スカフォールドが報告されている。１つの局面において、１つ以上のＡｓｐ７、Ｇｌｕ９およびＡｓｐ２３は、別のアミノ酸、例えば、負の電荷を有さないアミノ酸残基（例えば、Ａｓｎ、Ｌｙｓなど）により置換される。これらの変異は、野生型形態と比較して、中性ｐＨで変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０４５２３参照）。有益または中立のいずれかである１０Ｆｎ３スカフォールドにおける種々のさらなる改変が開示されている。例えば、Batoriら Protein Eng., 15(12):1015-1020 (Dec. 2002); Koideら Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug. 28, 2001)参照。
【００８５】
変異体および野生型１０Ｆｎ３タンパク質の両方は、同じ構造、即ち、ＡからＧと示される７つのベータ鎖ドメイン配列ならびに７つのベータ鎖ドメイン配列に連結する６つのループ領域（ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループおよびＦＧループ）により特徴付けられる。Ｎ−およびＣ−末端に最も近くに位置するベータストランドは、溶液中でベータ様コンフォメーションをとり得る。配列番号：１において、ＡＢループは残基１５−１６に対応し、ＢＣループは残基２１−３０に対応し、ＣＤループは残基３９−４５に対応し、ＤＥループは残基５１−５６に対応し、ＥＦループは残基６０−６６に対応し、ＦＧループは残基７６−８７に対応する（Xuら Chemistry & Biology, 9:933-942 (2002)）。
【００８６】
いくつかの態様において、１０Ｆｎ３ポリペプチドは、配列番号：１に示されるヒト１０Ｆｎ３ドメインと少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一であり得る。可変性の多くは、一般的に１つ以上のループ中で起こる。１０Ｆｎ３ポリペプチドのベータまたはベータ様鎖のいずれかは、本質的に、配列番号：１の対応するベータまたはベータ様鎖の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列からなり得るが、このような変異は生理学的条件におけるポリペプチドの安定性を乱さない。
【００８７】
いくつかの態様において、本記載は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、該１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループ、ＥＦ；およびループ、ＦＧを含み；ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比較して、改変されたアミノ酸配列を有するループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループを有するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ＢＣおよびＦＧループは改変され、いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは改変され、すなわち、Ｆｎ３ドメインは非天然ループを含む。いくつかの態様において、ＡＢ、ＣＤおよび／またはＥＦループは改変される。「改変」は、鋳型配列（対応するヒトフィブロネクチンドメイン）と比較して１つ以上のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列の改変は、一般的に核酸コード配列の意図的な、盲検的な(blind)または自発的な配列変異を介して成し遂げられ得、任意の技術、例えば、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲまたは化学的ＤＮＡ合成により起こり得る。
【００８８】
いくつかの態様において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される１つ以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比較して、長さが伸長または短縮され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、２−２５個のアミノ酸により伸長され得る。いくつかの態様において、ループの長さは、１−１１個のアミノ酸により減少され得る。したがって、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のループの長さは、抗原結合において最大の可能な柔軟性および親和性を得るように、長さならびに配列において改変され得る。
【００８９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、配列番号：１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＦｎ３ドメインであって、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも１つのループは、改変されているＦｎ３ドメインを含む。いくつかの態様において、改変されたＢＣループは、最大１０個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸欠失、最大１０個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、改変されたＤＥループは、最大６個のアミノ酸置換、最大４個のアミノ酸欠失、最大１３個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。いくつかの態様において、ＦＧループは、最大１２個のアミノ酸置換、最大１１個のアミノ酸欠失、最大２５個のアミノ酸挿入またはそれらの組合せを有する。
【００９０】
上記のとおり、配列番号：１の残基２１−３０、５１−５６および７６−８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを定義する。しかしながら、該ループ領域内のすべての残基が、所望の標的（例えば、ＰＣＳＫ９）に対する強い親和性を有する１０Ｆｎ３バインダーをなし遂げるために、修飾される必要はないことを理解すべきである。
【００９１】
例えば、配列番号：１に示されるＢＣループの残基２１（Ｓ）および２２（Ｗ）は、ＰＣＳＫ９への結合のために修飾される必要はない。すなわち、ＰＣＳＫ９への高親和性結合を有する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１に示されるループＢＣの残基２３−３０のみを修飾することにより得ることができる。表３に例示されているＢＣループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のＢＣループは、表３に示される配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＢＣループは、配列ＰＰＰＳＨＧＹＧ（配列番号：２の残基３−１０）、ＤＡＰＡＨＡＹＧ（配列番号：５の残基３−１０）、ＥＰＦＳＲＬＰＧＧＧＥ（配列番号：１０６の残基３−１３）またはＤＡＰＡＤＧＧＹＧ（配列番号：１０７の残基３−１１）を含み得る。
【００９２】
同様に、配列番号：１に示されるループＤＥの位置５１（Ｐ）および５６（Ｔ）は、ＰＣＳＫ９への結合のために修飾される必要はない。すなわち、ＰＣＳＫ９への高親和性結合を有する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１に示されるループＤＥの残基５２−５５のみを修飾することにより得ることができる。表３に例示されているＤＥループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のＤＥループは、表３に示される配列番号：１８−２７および１３６−１４１のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＤＥループは、配列ＰＧＫＧ（配列番号：１８の残基２−５）、ＶＧＶＧ（配列番号：２７の残基２−５）またはＶＳＫＳ（配列番号：１３７の残基２−５）を含み得る。
【００９３】
同様に、配列番号：１に示されるＦＧループの位置８７（Ｐ）は、ＰＣＳＫ９への結合のために修飾される必要はない。すなわち、ＰＣＳＫ９への高親和性結合を有する１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１に示されるＦＧループの残基７６−８６のみを修飾することにより得ることができる。表３に例示されているＦＧループにおいて、残基にまたがる網掛け位置のみが改変されたことを示すことを証明する。したがって、いくつかの態様において、この指定のＦＧループは、表３に示される配列番号：２８−３８および１４２−１７２のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＦＧループは、配列ＥＹＰＹＫＨＳＧＹＹＨＲ（配列番号：２８における残基１−１２）、ＥＹＰＹＤＹＳＧＹＹＨＲ（配列番号：１４２における残基１−１２）またはＥＦＤＦＶＧＡＧＹＹＨＲ（配列番号：１６７における残基１−１２）を含み得る。
【００９４】
いくつかの態様において、本出願は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ領域が、一般的に、コンセンサス配列によって表すことができることを証明する。例えば、ＢＣループは、一般的に、コンセンサス配列ＳＷ（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：３２３）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｚは６−９の数であり、そしてＸ２はＹまたはＨである。このコンセンサス配列は、配列番号：１０６により定義されたＢＣループを除けば、表３に示されるＢＣループにより例示される。他の態様において、Ｚは２−５から選択される数である。１つの態様において、Ｚは１０−１５から選択される数である。いくつかの態様において、Ｘ２は任意の芳香族性残基（すなわち、Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ）である。
【００９５】
別の態様において、ＤＥループは、一般的に、コンセンサス配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ、（配列番号：３２４）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり、そしてＸ３はＧまたはＳである。このコンセンサスは、表３に示されるＤＥループにより例示される。
【００９６】
別の態様において、ＦＧループは、一般的に、コンセンサス配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＹまたはＦであり；Ｘ５はＹ、ＦまたはＷであり；そしてＸ６はＳまたはＡである。１つの態様において、Ｘ４およびＸ５は、それぞれ独立してＹ、Ｆ、ＷまたはＨから選択される芳香族性残基である。このコンセンサスは、表３に示されるＦＧループにより例示される。
【００９７】
したがって、１つの態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列ＳＷ（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：３２３）を有するＢＣループ、配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ（配列番号：３２４）を有するＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）を有するＦＧループを含むＰＣＳＫ９結合アドネクチンを提供する。
【００９８】
別の態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列ＳＷＥＰＦＳＲＬＰＧＧＧＥ（配列番号：１０６）を有するＢＣループ、配列ＰＸ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３Ｔ（配列番号：３２４）を有するＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲＰ（配列番号：３２５）を有するＦＧループを含むＰＣＳＫ９結合アドネクチンを提供する。
【００９９】
１つの態様において、ＢＣループは、一般的に、コンセンサス配列（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：４４９）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｚは６−９の数であり、そしてＸ２はＹまたはＨである。このコンセンサス配列は、配列番号：１０６により定義されたＢＣループを除けば、表３に示されるＢＣループにより例示される。他の態様において、Ｚは２−５から選択される数である。１つの態様において、Ｚは１０−１５から選択される数である。いくつかの態様において、Ｘ２は任意の芳香族性残基（すなわち、Ｙ、Ｆ、ＷまたはＨ）である。
【０１００】
１つの態様において、ＤＥループは、一般的に、コンセンサス配列Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３（配列番号：４５０）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はＧまたはＳである。このコンセンサスは、表３に示されるＤＥループにより証明される。
【０１０１】
１つの態様において、ＦＧループは、一般的に、コンセンサス配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲ（配列番号：４５１）により定義され得、式中Ｘ１は任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＹまたはＦであり；Ｘ５はＹ、ＦまたはＷであり；そしてＸ６はＳまたはＡである。いくつかの態様において、Ｘ４およびＸ５はそれぞれ独立してＹ、Ｆ、ＷまたはＨから選択される芳香族性残基である。このコンセンサスは、表３に示されるＦＧループにより例示される。
【０１０２】
したがって、１つの態様において、本記載は、上記定義のとおり、配列（Ｘ１）ＺＸ２Ｇ（配列番号：４４９）を含むＢＣループ、配列Ｘ１Ｘ１Ｘ１Ｘ３（配列番号：４５０）を含むＤＥループおよび配列ＥＸ４Ｘ１Ｘ５Ｘ１Ｘ１Ｘ６ＧＹＸ４ＨＲ（配列番号：４５１）を含むＦＧループを有するＰＣＳＫ９結合アドネクチンを提供する。
【０１０３】
１つの態様において、１０Ｆｎ３スカフォールドに基づく抗体様タンパク質は、一般的に、以下の式により定義することができる：
ＥＶＶＡＡＴ（Ｘ）ａＳＬＬＩ（Ｘ）ｘＹＹＲＩＴＹＧＥ（Ｘ）ｂＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙＡＴＩ（Ｘ）ｃＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：３２８）
【０１０４】
配列番号：３２８において、ＡＢループはＸａにより示され、ＣＤループはＸｂにより示され、ＥＦループはＸｃにより示され、ＢＣループはＸｘにより示され、ＤＥループはＸｙにより示され、そしてＦＧループはＸｚにより示される。Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘの次の下付きはアミノ酸の数の整数を示す。特に、ａは１−１５、２−１５、１−１０、２−１０、１−８、２−８、１−５、２−５、１−４、２−４、１−３、２−３または１−２アミノ酸の範囲であり得；そして、ｂ、ｃ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７または６−７アミノ酸の範囲であり得る。好ましい態様において、ａは２アミノ酸であり、ｂは７アミノ酸であり、ｃは７アミノ酸であり、ｘは９アミノ酸であり、ｙは６アミノ酸であり、そしてｚは１２アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号：１に示される対応するアミノ酸と比較して、全７つのスカフォールド領域にわたって０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１個の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。典型的な態様において、ベータストランドの配列は、配列番号：１に示される対応するアミノ酸と比較して、全７つのスカフォールド領域にわたって０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１個の範囲の保存的置換を有し得る。１つの態様において、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で起こる。
【０１０５】
典型的な態様において、（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚによりそれぞれ示されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、表３に示されるＰＣＳＫ９バインダーのいずれかのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列、またはそれらの網掛け部分、またはコンセンサス配列３２３−３２５もしくは４４９−４５１を含むポリペプチドで置換される。
【０１０６】
１つの態様において、１０Ｆｎ３スカフォールドに基づく抗体様タンパク質は、一般的に配列により定義され得る：
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩ（Ｘ）ｘＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：３２９）
【０１０７】
配列番号：３２９において、ＢＣループはＸｘにより示され、ＤＥループはＸｙにより示され、そしてＦＧループはＸｚにより示される。Ｘは任意のアミノ酸を示し、Ｘの次の下付きはアミノ酸の数の整数を示す。特に、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７または６−７アミノ酸の範囲であり得る。好ましい態様において、ｘは９アミノ酸であり、ｙは６アミノ酸であり、そしてｚは１２アミノ酸である。ベータストランドの配列は、配列番号：１に示される対応するアミノ酸と比較して、全７つのスカフォールド領域にわたって０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１の範囲の置換、欠失または付加を有し得る。典型的な態様において、ベータストランドの配列は、配列番号：１に示される対応するアミノ酸と比較して、全７つのスカフォールド領域にわたって０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１個の範囲の保存的置換を有し得る。１つの態様において、コアアミノ酸残基は固定されており、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で起こる。典型的な態様において、（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚによりそれぞれ示されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、表３に示されるＰＣＳＫ９バインダーのいずれかのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列、またはそれらの網掛け部分、またはコンセンサス配列３２３−３２５もしくは４４９−４５１を含むポリペプチドで置換される。
【０１０８】
１つの態様において、本明細書に記載されている抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３２８または３２９に記載されている配列を含み得、式中（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚによりそれぞれ示されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、表３におけるクローンのいずれかの特定のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのそれぞれのセット、または、表３に記載されているクローンのＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一の配列で置換される。典型的な態様において、本明細書に記載されている抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３２９により定義され、表３に記載されているクローンのいずれかのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列のそれぞれのセットを有する。例えば、表３におけるクローン１４５９Ｄ０５は、配列番号：２、１８および２８にそれぞれ記載されているＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。したがって、これらのループに基づく抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３２８または３２９を含み得、式中（Ｘ）ｘは配列番号：２を含み、（Ｘ）ｙは配列番号：１８を含み、そして（Ｘ）ｚは配列番号：２８を含む。同様の構築物は、表３における他のクローンからのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのセット、またはコンセンサス配列３２３−３２５または４４９−４５１を利用することが考えられる。このような抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンのスカフォールド領域は、配列番号：１のスカフォールドアミノ酸残基と比較して、０から２０、０から１５、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このようなスカフォールド修飾は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンが所望のＫＤでＰＣＳＫ９に結合することができる限り、作成され得る。
【０１０９】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、ＳＷＰＰＰＳＨＧＹＧ（配列番号：２）、ＳＷＲＰＰＩＨＡＹＧ（配列番号：３）、ＳＷＤＡＰＩＨＡＹＧ（配列番号：４）、ＳＷＤＡＰＡＨＡＹＧ（配列番号：５）およびＳＷＤＡＰＡＶＴＹＧ（配列番号：６）、ＳＷＳＰＰＡＮＧＹＧ（配列番号：７）、ＳＷＴＰＰＰＫＧＹＧ（配列番号：８）、ＳＷＲＰＰＳＨＡＹＧ（配列番号：９）、ＳＷＤＰＰＳＨＡＹＧ（配列番号：１０）、ＳＷＥＰＰＳＨＡＹＧ（配列番号：１１）、ＳＷＳＰＰＳＨＡＹＧ（配列番号：１２）、ＳＷＲＰＰＳＮＧＨＧ（配列番号：１３）、ＳＷＶＰＰＳＤＤＹＧ（配列番号：１４）、ＳＷＶＰＳＳＨＡＹＧ（配列番号：１５）、ＳＷＤＰＳＳＨＡＹＧ（配列番号：１６）およびＳＷＥＰＳＳＨＡＹＧ（配列番号：１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、配列番号：１０６−１３５および３０１−３０３から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のＢＣループは、表３に示される配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＢＣループは、配列ＰＰＰＳＨＧＹＧ（配列番号：２の残基３−１０）、ＤＡＰＡＨＡＹＧ（配列番号：５の残基３−１０）、ＥＰＦＳＲＬＰＧＧＧＥ（配列番号：１０６の残基３−１３）またはＤＡＰＡＤＧＧＹＧ（配列番号：１０７の残基３−１１）を含む。
【０１１０】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、ＰＰＧＫＧＴ（配列番号：１８）、ＰＩＶＥＧＴ（配列番号：１９）、ＰＧＳＥＧＴ（配列番号：２０）、ＰＧＳＫＧＴ（配列番号：２１）、ＰＧＳＫＳＴ（配列番号：２２）、ＰＶＧＲＧＴ（配列番号：２３）、ＰＶＧＥＧＴ（配列番号：２４）、ＰＩＧＫＧＴ（配列番号：２５）、ＰＶＮＥＧＴ（配列番号：２６）およびＰＶＧＶＧＴ（配列番号：２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、配列番号：１３６−１４１から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のＤＥループは、表３に示される配列番号：１８−２７および１３６−１４１のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＤＥループは、配列ＰＧＫＧ（配列番号：１８の残基２−５）、ＶＧＶＧ（配列番号：２７の残基２−５）またはＶＳＫＳ（配列番号：１３７の残基２−５）を含む。
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、ＥＹＰＹＫＨＳＧＹＹＨＲＰ（配列番号：２８）、ＥＹＴＦＫＨＳＧＹＹＨＲＰ（配列番号：２９）、ＥＹＴＹＫＧＳＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３０）、ＥＹＴＹＮＧＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３１）、ＥＹＴＹＩＧＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３２）、ＥＹＴＹＥＧＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３３）、ＥＹＡＹＮＧＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３４）、ＥＹＰＷＫＧＳＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３５）、ＥＦＰＦＫＷＳＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３６）、ＥＦＰＷＰＨＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３７）およびＥＹＡＦＥＧＡＧＹＹＨＲＰ（配列番号：３８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、配列番号：１４２−１７２から選択されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質のＦＧループは、表３に示される配列番号：２８−３８および１４２−１７２のいずれかの網掛け部分を含む。例えば、１つの態様において、ＦＧループは、配列ＥＹＰＹＫＨＳＧＹＹＨＲ（配列番号：２８における残基１−１２）、ＥＹＰＹＤＹＳＧＹＹＨＲ（配列番号：１４２における残基１−１２）またはＥＦＤＦＶＧＡＧＹＹＨＲ（配列番号：１６７における残基１−１２）を含む。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３を有するＢＣループ配列から選択される１つのＢＣループ配列、または表３に示される配列番号：２−１７、１０６−１３５および３０１−３０３のいずれかの網掛け部分；配列番号：１８−２７および１３６−１４１を有するＤＥループ配列から選択される１つのＤＥループ配列、または表３に示される配列番号：１８−２７および１３６−１４１のいずれかの網掛け部分；ならびに、配列番号：２８−３８および１４２−１７２を有するＦＧループ配列から選択される１つのＦＧループ配列、または表３に示される配列番号：２８−３８および１４２−１７２のいずれかの網掛け部分を含む。いくつかの態様において、本発明のタンパク質は、配列番号：２−３８、１０６−１７２、３０１−３０３のいずれか１つと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明のタンパク質は、表３に示される配列番号：２−３８、１０６−１７２、３０１−３０３のいずれかの網掛け部分と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループアミノ酸配列を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３９−７６、１７３−２９０および３０４−３０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３９−７６、１７３−２９０および３０４−３０９のいずれか１つの位置３−９６からのＦｎ３ドメインアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、配列番号：３９−７６、１７３−２９０および３０４−３０９のいずれかと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１４】
フィブロネクチンは、天然に、インテグリン結合モチーフ、「アルギニン−グリシン〜アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を介してインテグリンの特定の型に結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは、（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフを欠く１０Ｆｎ３ドメインを含む。インテグリン結合ドメインは、アミノ酸置換、欠失または挿入によってＲＧＤ配列を改変することにより除去され得る。
【０１１５】
１つの態様において、本発明の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン分子は、Ｎ−末端伸長配列および／またはＣ−末端伸長を含むように修飾され得る。例えば、ＭＧ配列は、配列番号：１により定義される１０Ｆｎ３のＮ−末端で置換され得る。Ｍは、通常、切断され、Ｎ−末端でＧを放出する。あるいは、表４に示される抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの最初の１０アミノ酸は、表６（すなわち、配列番号：３７１−３７９）に示される本明細書においてＮ−末端伸長と称される代替Ｎ−末端配列で置換され得る。加えて、Ｍ、ＧまたはＭＧはまた、配列番号：３７１−３７９を有するＮ−末端伸長のいずれかのＮ−末端側で置換され得る。本明細書に記載されている抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンはまた、本明細書においてＣ−末端伸長配列と称される代替Ｃ−末端テール配列を含み得る。例えば、表４に示される抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン配列は、配列番号：１のＴ９４に対応するスレオニンで切断され得る（すなわち、配列のＩＮＹＲＴ（配列番号：６３６）部分後に切断される）。このような切断バージョンは、切断形態において治療分子として使用され得るか、または代替Ｃ−末端伸長がスレオニン残基後に加えられ得る。典型的なＣ−末端伸長配列は、配列番号：３８０−３９５として表６に示される。Ｃ−末端伸長配列を含む典型的な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、表４に示される。例えば、配列番号：４９（クローン１８１３Ｅ０２）は、天然Ｃ−末端伸長ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号：３８０）次にＨｉｓ６タグ（配列番号：６３７）を含む。しかしながら、Ｈｉｓ６タグは完全に任意であることが理解されるべきである。
【０１１６】
１つの態様において、Ｃ−末端伸長配列（「テール」とも呼ばれる）は、ＥおよびＤ残基を含み、８から５０、１０から３０、１０から２０、５から１０および２から４アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、テール配列はＥＤベースのリンカーを含み、該配列はＥＤのタンデムリピートを含む。典型的な態様において、テール配列は、２−１０、２−７、２−５、３−１０、３−７、３−５、３、４または５ＥＤリピートを含む。１つの態様において、ＥＤベースのテール配列はまた、さらなるアミノ酸残基、例えば：ＥＩ（配列番号：３８５）、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣを含み得る。このような配列は、一部、既知のアドネクチンテール配列、例えば、残基ＤおよびＫが除去されているＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号：３８０）に基づく。典型的な態様において、ＥＤベースのテールは、ＥＤリピート前にＥ、ＩまたはＥＩ（配列番号：３８５）残基を含む。
【０１１７】
他の態様において、Ｎ−もしくはＣ−末端配列は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン融合分子を設計するとき、必要なとき、他の既知のリンカー配列（例えば、表６における配列番号：３９６−４１９）と組み合わされ得る。典型的なリンカー配列を含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、表４に示される（例えば、配列番号：５３、５５および５７）。いくつかの態様において、配列は、薬物動態学部分の結合を容易にするように、１０Ｆｎ３ドメインのＣ−末端で置換され得る。例えば、システイン含有リンカー、例えば、ＧＳＧＣ（配列番号：７７）は、システイン残基における部位特異的ペグ化を容易にするように、Ｃ−末端に付加され得る。
【０１１８】
薬物動態学部分
１つの局面において、本出願は、薬物動態学（ＰＫ）部分をさらに含む抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。改善された薬物動態学は、認識される治療的必要性にしたがって評価され得る。しばしば、恐らくタンパク質が投与後の血清において利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること、および／または投与間の時間を増加させることが望ましい。場合によっては、時間とともにタンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与直後および次の投与直前の、タンパク質の血清濃度における違いを減少させること）が望ましい。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、哺乳動物（例えば、マウス、ラットまたはヒト）におけるポリペプチドのクリアランス速度を、非修飾抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンと比較して３倍以上低減させる部分に結合させてもよい。改善された薬物動態学の他の尺度は、しばしば、アルファ相およびベータ相に分類される血清半減期を含み得る。いずれかの相または両方の相は、適当な部分の付加により有意に改善され得る。
【０１１９】
本明細書において「ＰＫ部分」と称される血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向がある部分は、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）、および耐容性良好であるタンパク質部分（例えば、Ｆｃならびにそのフラグメントおよび変異体、トランスフェリンまたは血清アルブミン）を含む。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、米国公開第２００７／００４８２８２号に記載されているアルブミンまたはアルブミンのフラグメント（部分）もしくは変異体に融合され得る。いくつかの態様において、ＰＣＳＫ９アドネクチンは、本明細書に記載されているとおりに、１つ以上の血清アルブミン結合アドネクチンに融合され得る。
【０１２０】
いくつかの態様において、ＰＫ部分は、血清アルブミン結合タンパク質、例えば、米国公開第２００７／０１７８０８２および２００７／０２６９４２２号に記載されているものである。
【０１２１】
いくつかの態様において、ＰＫ部分は、血清免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されているものである。
【０１２２】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。１つ以上のＰＥＧ分子は、タンパク質上の異なる位置で結合してもよく、、このような結合は、アミン、チオールまたは他の適当な反応基との反応によりなし遂げられ得る。アミン部分は、例えば、ポリペプチドのＮ末端で見られる第一級アミンまたはリジンもしくはアルギニンのようなアミノ酸に存在するアミン基であり得る。いくつかの態様において、ＰＥＧ部分は、ａ）Ｎ−末端；ｂ）Ｎ−末端および最もＮ−末端側のベータストランドまたはベータ様鎖間；ｃ）標的結合部位と反対側のポリペプチドの表面上に位置するループ；ｄ）Ｃ−末端および最もＣ−末端側のベータストランドまたはベータ様鎖間；ならびにｅ）Ｃ−末端からなる群から選択されるポリペプチドの位置で結合する。
【０１２３】
ペグ化は、適当な反応基が、ペグ化が優先的に起こる部位を作るように、タンパク質に導入されている部位特異的ペグ化によりなし遂げられ得る。いくつかの態様において、タンパク質は、所望の位置でシステイン残基を導入するように修飾され、システイン上の部位特異的ペグ化を可能にする。ＰＥＧは、分子量を広範に変化し得、分岐状または直線状であり得る。１つの態様において、ＰＥＧは２つの分岐を有する。別の態様において、ＰＥＧは４つの分岐を有する。
【０１２４】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、免疫グロブリンＦｃドメインまたはそのフラグメントもしくは変異体に融合される。典型的な態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１サブクラス由来である、しかしながら、他のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）もまた使用され得る。以下に示されているものは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメインの配列であり、Ｆｃドメイン内のそれぞれの領域の相対位置は、ＥＵ番号付けフォーマットに基づいて示される：
【表１】
0005876034.tif 000002
コアヒンジ配列は下線を引かれており、ＣＨ１領域はイタリック体であり；ＣＨ２およびＣＨ３領域は通常の文字列である。Ｃ−末端リジンは任意であることが理解されるべきである。
【０１２５】
融合物は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンをＦｃ分子のいずれかの末端に結合させることにより、すなわち、Ｆｃ−抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたは抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ配置で形成され得る。１つの態様において、Ｆｃおよび抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、リンカーを介して融合される。典型的なリンカー配列は、ＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号：３１０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：３１１）、ＱＰＤＥＰＧＧＳ（配列番号：３１２）、ＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤ（配列番号：３１３）、ＴＶＡＡＰＳ（配列番号：３１４）、ＫＡＧＧＧＧＳＧ（配列番号：６２０）、ＫＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号：６２１）、ＫＱＰＤＥＰＧＧＳ（配列番号：６２２）、ＫＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤ（配列番号：６２３）、ＫＴＶＡＡＰＳ（配列番号：６２４）、ＫＡＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号：６２５）、ＫＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号：６２６）、ＫＱＰＤＥＰＧＧＳＧ（配列番号：６２７）、ＫＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号：６２８）、ＫＴＶＡＡＰＳＧ（配列番号：６２９）ＡＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号：６３０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号：６３１）、ＱＰＤＥＰＧＧＳＧ（配列番号：６３２）、ＥＬＱＬＥＥＳＡＡＥＡＱＤＧＥＬＤＧ（配列番号：６３３）およびＴＶＡＡＰＳＧ（配列番号：６３４）を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン融合物において使用されるＦｃ領域は、Ｆｃ分子のヒンジ領域を含む。本明細書において使用される「ヒンジ」領域は、ＥＵ番号付けによる位置２２１−２３６に対応するＩｇＧ１の配列番号：３１５のコアヒンジ残基にまたがる位置１０４−１１９（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ；配列番号：３１６）を含む。１つの態様において、ｔｈｅ  抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合物は、一部、ヒンジ領域内で配列番号：３１５の位置１０９および１１２（それぞれ、ＥＵ番号付け２２６および２２９）でのシステイン残基のため、多量体構造（例えば、ダイマー）を採用する。他の態様において、本明細書において使用されるヒンジ領域は、配列番号：３１５に示されるコアヒンジ配列の側面に位置するＣＨ１およびＣＨ２領域由来の残基をさらに含み得る。
【０１２７】
いくつかの態様において、ヒンジ配列は、望ましい薬物動態学的、生物物理学的および／または生物学的特性を与える置換を含み得る。いくつかの典型的なヒンジ配列は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号：３１７；コアヒンジ領域は下線を引かれている）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号：３１８；コアヒンジ領域は下線を引かれている）、ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号：３１９；コアヒンジ領域は下線を引かれている）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号：３２０；コアヒンジ領域は下線を引かれている）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号：３２１、コアヒンジ領域は下線を引かれている）を含む。１つの態様において、配列番号：３１５の位置１２２（ＥＵ番号付け２３８）での残基Ｐは、Ｆｃエフェクター機能を除去するようにＳで置換されている；該置換は、配列番号：３１８、３１９および３２１のいずれか１つを有するヒンジにおいて例示される。別の態様において、配列番号：３１５の位置１０４−１０５（ＥＵ番号付け２２１−２２２）での残基ＤＫは、可能性のあるクリップ部位を除去するようにＧＳで置換されている；該置換は、配列番号：３１９において例示される。別の態様において、配列番号：３１５の位置１０３（ＥＵ番号付け２２０）でのＣは、軽鎖の非存在下で不適当なシステイン結合形成を防止するようにＳで置換されている；該置換は、配列番号：３１７−３１９において例示される。
【０１２８】
１つの態様において、抗ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合物は、以下の立体配置を有し得る：１）抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−ヒンジ−Ｆｃ、または２）ヒンジ−Ｆｃ−抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン。したがって、本発明の任意の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、これらの立体配置によるヒンジ配列を含むＦｃ領域に融合させることができる。いくつかの態様において、リンカーは、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンをヒンジ−Ｆｃ部分に結合するために使用され得る、例えば、典型的な融合タンパク質は、立体配置ヒンジ−抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−リンカー−Ｆｃを有し得る。さらに、融合ポリペプチドが生産される系に依存して、リーダー配列は、融合ポリペプチドのＮ−末端で置換され得る。例えば、融合物が哺乳動物系において生産されるとき、リーダー配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号：３２６）は、融合分子のＮ−末端に付加され得る。融合物が大腸菌において生産されるとき、融合配列は、メチオニンが先行する。
【０１２９】
以下の配列は、哺乳動物系において生産される抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−ヒンジ−Ｆｃ構築物を例示する：
【表２】
0005876034.tif 000003
したがって、Ｆｃドメインは、以下のとおりのヒトＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む：ＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：４４８）および配列番号：３１９のヒンジ配列。配列番号：３２２において、リーダー配列は太字であり、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン配列はイタリック体であり、ヒンジ領域は下線を引かれている。配列番号：３２２の末端でのリジンは任意であることが理解されるべきである。配列番号：３２２に記載されているポリペプチド融合物（本明細書においてＰＲＤ４６０としても記載されている）の有効性は、実施例４において証明される。
【０１３０】
典型的なＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合物は表１に示される。全ての配列は、メチオニンまたは哺乳動物リーダー配列（例えば、配列番号：３２６）で開始され得る。
表１
典型的な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合物タンパク質
【表３】
0005876034.tif 000004
【表４】
0005876034.tif 000005
【表５】
0005876034.tif 000006
【表６】
0005876034.tif 000007
【表７】
0005876034.tif 000008
【表８】
0005876034.tif 000009
【表９】
0005876034.tif 000010
【表１０】
0005876034.tif 000011
【表１１】
0005876034.tif 000012
【表１２】
0005876034.tif 000013
【表１３】
0005876034.tif 000014
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
0005876034.tif 000018
【表１８】
0005876034.tif 000019
【表１９】
0005876034.tif 000020
【表２０】
0005876034.tif 000021
【表２１】
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【表２２】
0005876034.tif 000023
【表２３】
0005876034.tif 000024
【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
0005876034.tif 000028
【表２８】
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【表２９】
0005876034.tif 000030
【表３０】
0005876034.tif 000031
【表３１】
0005876034.tif 000032
【表３２】
0005876034.tif 000033
【表３３】
0005876034.tif 000034
【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
0005876034.tif 000039
【表３９】
0005876034.tif 000040
【表４０】
0005876034.tif 000041
【表４１】
0005876034.tif 000042
【表４２】
0005876034.tif 000043
【表４３】
0005876034.tif 000044
【表４４】
0005876034.tif 000045
【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
0005876034.tif 000050
【表５０】
0005876034.tif 000051
【表５１】
0005876034.tif 000052
【表５２】
0005876034.tif 000053
【表５３】
0005876034.tif 000054
【表５４】
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【表５５】
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【表５６】
0005876034.tif 000057
【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【表６９】
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【表７０】
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【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
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【表７５】
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【表７６】
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【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
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【表８１】
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【表８２】
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【表８３】
0005876034.tif 000084
【表８４】
0005876034.tif 000085
【０１３１】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、Ｆｎ３ドメインおよびＰＫ部分を含む。いくつかの態様において、Ｆｎ３ドメインは１０Ｆｎ３ドメインである。いくつかの態様において、ＰＫ部分は、Ｆｎ３ドメイン単独と比較して、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、２００、４００、６００、８００、１０００％以上、またはそれ以上ポリペプチドの血清半減期を増加させる。
【０１３２】
いくつかの態様において、ＰＫ部分はポリマー糖である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はポリエチレングリコール部分である。いくつかの態様において、ＰＫ部分は血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はヒト血清アルブミンである。いくつかの態様において、ＰＫ部分は血清免疫グロブリン結合タンパク質である。いくつかの態様において、ＰＫ部分はトランスフェリンである。
【０１３３】
いくつかの態様において、ＰＫ部分は、血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対して特異的な別のアドネクチンである。本出願は、本明細書に記載されているとおり、特異的血清アルブミン結合アドネクチン分子（またはＳＡＢＡ）を提供する。１つの態様において、ＳＡＢＡに融合されたＰＣＳＫ９アドネクチンは、一般的に、以下のとおりに定義することができる：Ｘ１−ＰＣＳＫ９アドネクチン  コア−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＳＡＢＡ  コア−Ｘ５（配列番号：６１８）、またはＸ１−ＳＡＢＡ  コア−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−ＰＣＳＫ９アドネクチン  コア−Ｘ５（配列番号：６１９）、式中Ｘ１およびＸ４は任意のＮ−末端伸長配列を示し、Ｘ２およびＸ５は任意のＣ−末端伸長配列を示し、そしてＸ３はリンカーである。１つの態様において、配列番号：６１８および６１９のアドネクチン（ＰＣＳＫ９または血清アルブミン結合のいずれか）は、アドネクチンの「コア」領域を含む、すなわち、ＰＣＳＫ９アドネクチンコア配列は、表４に示されるＰＣＳＫ９アドネクチン配列のいずれか１つであり得、該配列は配列番号：１のＥ８に対応するアミノ酸残基で開始し、配列番号：１の残基Ｔ９４に対応するアミノ酸で終結し；そして、ＳＡＢＡコア配列は、表６に示されるＳＡＢＡコア配列のいずれかから選択され得る。
【０１３４】
いくつかの態様において、Ｘ１およびＸ４は独立して任意であり、存在するとき、独立して表６に記載されている配列番号：３７１−３７９から選択され、そして、このような残基がすでに存在しないとき、所望によりＮ−末端でＭ、ＧまたはＭＧ配列を含み得る。哺乳動物系における発現のために、融合タンパク質は、Ｎ−末端でリーダー配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号：３２６）をさらに含み得る。いくつかの態様において、Ｘ２およびＸ５は独立して任意であり、存在するとき、独立して表６に記載されている配列番号：３８０−３９５から選択される。１つの態様において、Ｘ３は、表６に記載されている配列番号：３９６−４１９から選択されるリンカー配列である。表２に示される配列は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンおよびＳＡＢＡの典型的な融合物を示す。本出願に記載されているあらゆるＰＣＳＫ９アドネクチンおよびＳＡＢＡ配列が、これらの立体配置に組み込まれ得ることを理解すべきである。
表２
【表８５】
0005876034.tif 000086
【０１３５】
生物物理学的および生化学的特性化
本出願は、ＰＣＳＫ９に結合するＦｎ３ドメインを含むアドネクチンを提供する。標的分子へのポリペプチド結合は、平衡定数（例えば、解離、ＫＤ）および速度定数（例えば、結合の速度定数、Ｋｏｎおよび解離の速度定数、ｋｏｆｆ）について評価され得る。アドネクチンは、一般的に、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ未満のＫＤで標的分子に結合するが、より高いＫＤ値は、Ｋｏｆｆが十分に低いか、またはＫｏｎが十分に高いとき許容され得る。
【０１３６】
本発明の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの配列番号は、表３に示される。
表３
抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン  ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ
【表８６】
0005876034.tif 000087
【表８７】
0005876034.tif 000088
【表８８】
0005876034.tif 000089
【表８９】
0005876034.tif 000090
【表９０】
0005876034.tif 000091
【表９１】
0005876034.tif 000092
†  ３７℃でＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄを使用して決定されたＫＤ；＊  ２５℃でＰｒｏｔｅＯｎを使用して決定されたＫＤ；＾  ３７℃でＩＴＣを使用して決定されたＫＤ；（１）ループにおける変異に加えて、これらのクローンはまた、変異Ｖ４５ＬおよびＥ４７Ｑを有し；（２）ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異Ｖ１Ｉ、Ｓ２ＴおよびＶ４５Ｌを有し；（３）ループにおける変異に加えて、これらのクローンはまた、変異Ｅ４７Ｑを有し；（４）ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異Ｖ４５ＬおよびＥ４７Ｇを有し；（５）ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異Ｓ２Ｔ、Ｌ８Ｍ、Ｐ４４Ｔ、Ｖ４５ＬおよびＥ４７Ｑを有し；（６）ループにおける変異に加えて、このクローンはまた、変異Ｖ１Ｉ、Ｓ２Ｖ、Ｖ４５ＫおよびＥ４７Ｑを有する。
【０１３７】
本発明の抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンのファミリーの配列番号は、表４に示される。
表４
抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンファミリー
【表９２】
0005876034.tif 000093
【表９３】
0005876034.tif 000094
【表９４】
0005876034.tif 000095
【表９５】
0005876034.tif 000096
【表９６】
0005876034.tif 000097
【表９７】
0005876034.tif 000098
【表９８】
0005876034.tif 000099
【表９９】
0005876034.tif 000100
【表１００】
0005876034.tif 000101
【表１０１】
0005876034.tif 000102
【表１０２】
0005876034.tif 000103
【表１０３】
0005876034.tif 000104
【表１０４】
0005876034.tif 000105
【表１０５】
0005876034.tif 000106
【表１０６】
0005876034.tif 000107
【表１０７】
0005876034.tif 000108
【表１０８】
0005876034.tif 000109
【表１０９】
0005876034.tif 000110
【表１１０】
0005876034.tif 000111
【表１１１】
0005876034.tif 000112
【表１１２】
0005876034.tif 000113
【０１３８】
本発明のペグ化抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンのファミリーの配列番号は、表５に示される。
表５
ペグ化を可能にする抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンファミリーシステイン変異体
＊注意：記載されているいくつかのタンパク質は、まだペグ化されていないが、システイン変異を介してペグ化可能である。ペグ化されているタンパク質は、アステリスクにより示される。
【表１１３】
0005876034.tif 000114
【表１１４】
0005876034.tif 000115
【表１１５】
0005876034.tif 000116
【表１１６】
0005876034.tif 000117
【表１１７】
0005876034.tif 000118
【０１３９】
核酸−タンパク質融合技術
１つの局面において、本出願は、ＰＣＳＫ９に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特異的結合特性を有するＦｎ３ドメインを迅速に生成し、試験する１つの方法は、Adnexus, a Bristol-Myers Squibb R&D Companyの核酸−タンパク質融合技術である。本記載は、核酸−タンパク質融合物（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合物）を利用して、タンパク質への結合のために重要である新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎと称されるインビトロ発現およびタグ技術を利用する。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコーディング遺伝情報に共有的に連結する技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細な説明のために、Ｓｚｏｓｔａｋら、米国特許第６，２５８，５５８、６，２６１，８０４、６，２１４，５５３、６，２８１，３４４、６，２０７，４４６、６，５１８，０１８および６，８１８，４１８号；ならびにRobertsら Proc. Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997)（出典明示により本明細書に包含させる）参照。
【０１４０】
ベクターおよびポリヌクレオチド態様
本明細書に記載されている種々のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成され得る。コドン使用頻度は、細胞における発現を改善するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞型に依存する。特定化されたコドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に対して開発されている。例えば：Mayfieldら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclairら Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oct. 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oct. 2001); Makridesら Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Sep. 1996);およびSharpら Yeast, 7(7):657-678 (Oct. 1991)参照。
【０１４１】
核酸操作の一般的な技術は、例えば、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)またはAusubel, Fら Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)および定期的アップデートされたもの（出典明示により本明細書に包含させる）に記載されている。一般的に、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳動物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節要素に作動可能に連結される。このような調節要素は、転写プロモーター、転写をコントロールするための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結をコントロールする配列を含む。宿主において複製する能力は、通常、複製起点により与えられ、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子がさらに組み込まれる。
【０１４２】
本明細書に記載されているタンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくはシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ−末端で特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え的に生産され得る。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、プロセッシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物系におけるポリペプチドの生産のための典型的なＮ−末端リーダー配列は、次の発現で宿主細胞により除去されるＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号：３２６）である。
【０１４３】
天然シグナル配列を認識せず、プロセッシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。
【０１４４】
酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)およびクルイベロマイセス(Kluyveromyces)アルファ因子リーダーを含む）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス(albicans)グルコアミラーゼリーダー、または米国特許第５，６３１，１４４号に記載されているシグナルにより置換され得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡにリーディングフレームにおいてライゲートされ得る。
【０１４５】
発現およびクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含む。一般的に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は多数のグラム陰性菌に適当であり、２ミクロンプラスミド起源は酵母に適当であり、種々のウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞においてクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要ではない（ＳＶ４０起点は一般的に、単に初期プロモーターを含むため、使用され得る）。
【０１４６】
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他のトキシン、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える、（ｂ）栄養要求性欠失を補足する、または（ｃ）複合培地から利用できない決定的な栄養素を提供するタンパク質をコードする、例えば、バチルス(Bacilli)のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０１４７】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、本発明のタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーターを含む。原核生物宿主と共に使用するために適当なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｎプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが適当である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結したシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。真核生物のためのプロモーター配列は知られている。実質的には、全ての真核遺伝子は、転写が開始される部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴ−リッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見出される別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチドであってよい。多数の真核遺伝子の３’末端に、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列の全ては、真核発現ベクターに適当に挿入される。
【０１４８】
酵母宿主と共に使用するための適当な促進配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。
【０１４９】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびより好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによりコントロールすることができ、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。
【０１５０】
高等真核生物による本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。哺乳動物遺伝子由来の多数のエンハンサー配列が、現在、知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、一般的に、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後ろ側においてＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側においてポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについて、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、ペプチドコード配列に対して５’または３’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、プロモーターの５’側に位置することが好ましい。
【０１５１】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のため、およびｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列を含む。このような配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および、時折３’非翻訳領域から一般的に利用できる。これらの領域は、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載されている発現ベクター、参照。
【０１５２】
組換えＤＮＡはまた、タンパク質を精製するために有用であり得るあらゆる型のタンパク質タグ配列を含むことができる。タンパク質タグの例は、限定はしないが、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを含む。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主で使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985))（この関連の記載は、出典明示により本明細書に包含させる）において見出すことができる。
【０１５３】
発現構築物は、当業者に明らかであるとおりに、宿主細胞に対して適当な方法を使用して宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法は、当分野で知られており、限定はしないが、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（ベクターが感染性因子である）を含む。
【０１５４】
適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物体、例えば、大腸菌またはバチルス種を含む。好ましくはサッカロミセス種由来の酵母、例えば、サッカロミセス・セレビシエがまた、ポリペプチドの生産のために使用され得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系をまた、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、Luckowら (Bio/Technology, 6:47 (1988))により概説されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例は、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞系を含む。精製ポリペプチドは、適当な宿主／ベクター系を培養し、組換えタンパク質を発現させることにより調製される。多数の適用のために、本明細書に記載されている小さいサイズの多数のポリペプチドは、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現させる。次に、タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【０１５５】
タンパク質生産
宿主細胞は、タンパク質生産のために本明細書において記載されている発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修飾された慣用の栄養培地中で培養される。本明細書に示される例において、ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＰＰ）および中規模生産のために使用された宿主細胞は、ＨＭＳ１７４−細菌株であった。本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ））は、宿主細胞を培養するために適当である。加えて、Hamら Meth. Enzymol., 58:44 (1979)、Baritesら Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許第４，７６７，７０４、４，６５７，８６６、４，９２７，７６２、４，５６０，６５５、５，１２２，４６９、６，０４８，７２８、５，６７２，５０２号、または米国特許第ＲＥ３０，９８５号に記載されている培地が、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地はいずれも、必要なとき、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン薬）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を補給され得る。任意の他の必要な栄養補助剤がまた、当業者に知られている適当な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかである。
【０１５６】
本明細書に記載されているタンパク質はまた、細胞−翻訳系を使用して生産することができる。このような目的のために、ポリペプチドをコードする核酸は、インビトロ転写がｍＲＮＡを生産することを可能にし、利用される特定の無細胞系（真核、例えば、哺乳動物または酵母無細胞翻訳系、または原核生物、例えば、細菌無細胞翻訳系）におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能にするように修飾されるべきである。
【０１５７】
本発明のタンパク質はまた、化学合成（例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)に記載されている方法による）により生産することができる。タンパク質に対する修飾はまた、化学合成により生産することができる。
【０１５８】
本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野において一般的に知られているタンパク質に対する単離／精製方法により精製することができる。非限定的な例は、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで）、遠心分離、透析、限外ろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配またはこれらの任意の組合せを含む。精製後、ポリペプチドは、異なるバッファーに交換され、および／または限定はしないが、濾過および透析を含む当分野で既知の任意の種々の方法により濃縮され得る。
【０１５９】
精製されたポリペプチドは、好ましくは少なくとも８５％純粋、または好ましくは少なくとも９５％純粋、およびより好ましくは少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、ポリペプチドは、医薬品として使用するために十分に純粋である。
【０１６０】
プラットホーム製造工程を使用して、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを調製した。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、大腸菌(E.coli)において生産される。大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）細胞を、タンパク質を可溶性形態において細胞内に生産する発現ベクター（ｐＥＴ９ｄ／ＡＴＩ００１１７３）で形質転換した。組換え株を、かくはん発酵槽において増殖させる。発酵の最後に、細胞を回収し、溶解し、精製のための調製において浄化する。ＡＴＩ００１１７３は、ＡＴＩ００１１１４の非−ｈｉｓタグ  バージョンである。精製された抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを、マレイミドリンカーを使用して４０ｋＤａの分岐メトキシＰＥＧに結合させる。次に、結合した物質を再精製し、遊離ＰＥＧ、遊離抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンおよび製造工程由来不純物を除去する。品質管理試験を、バルク薬物にて行う。
【０１６１】
インビボでの治療使用
１つの局面において、本出願は、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患の処置において有用な抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを提供する。本出願はまた、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを対象に投与するための方法を提供する。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、哺乳動物、特にヒトに対して薬学的に許容される。「薬学的に許容される」ポリペプチドは、重大な有害な医学的結果なしで、例えば、本質的にエンドトキシンなしで、または非常に低いエンドトキシンレベルで動物に投与されるポリペプチドを示す。
【０１６２】
製剤および投与
本出願は、さらに、本明細書に記載されている抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたはその融合タンパク質を含む薬学的に許容される組成物であって、本質的にエンドトキシンを含まない組成物を提供する。抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたはその融合物を含む治療製剤は、所望の程度の純度を有する記載されているポリペプチドを、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Osol, A., Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition (1980)）と混合することにより、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態において保存のために調製される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸、クエン酸および他の有機酸；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノースまたはデキストラン；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１６３】
本明細書における製剤はまた、処置される特定の適応のために必要なとき２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに有害に影響しない相補的活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量において組合せで適当に存在する。
【０１６４】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を介する濾過により容易に成し遂げる。
【０１６５】
当業者は、それぞれの治療剤の用量が薬剤の正体に依存することを理解している。
【０１６６】
治療的適応のために、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたは抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを含む融合タンパク質は、薬学的に許容される投与形態において対象に投与される。それらは、ボーラスとして静脈内に、または期間にわたって連続的な注入により、または皮下経路により投与することができる。適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤はよく知られており、臨床状態が保証されたとき、当業者により決定することができる。適当な担体、希釈剤および／または賦形剤の例は、（１）ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、（２）０．９％の生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースを含む。
【０１６７】
本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボで実施することができる。
【０１６８】
共投与または連続投与であろうとなかろうと、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたはその融合物および１つ以上のさらなる治療剤の投与は、治療的適応のために上記のとおりに生じ得る。共投与のための適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者により理解されており、投与される特定の治療剤の正体に依存する。
【０１６９】
凍結乾燥されるよりむしろ、水性投与形態において存在するとき、タンパク質は、一般的に、約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されるが、これらの範囲の外側の広範な変化も許される。疾患の処置のために、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたはその融合物の適当な用量は、処置される疾患の型、疾患の重症度および経過、タンパク質が予防もしくは治療目的のために投与されるか否か、以前の治療の経過、患者の病歴およびタンパク質に対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。タンパク質は、一度で、または一連の処置にわたって、患者に適当に投与される。
【０１７０】
血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の融合物
１つの局面において、本出願は、ヒト血清アルブミンに結合する１０Ｆｎ３ドメインに融合した抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン（血清アルブミン結合アドネクチン（１０Ｆｎ３ドメイン）またはＳＡＢＡ）を含む融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン単独（例えば、ＰＫ部分に結合していない）と比較して、アルブミンの存在下で伸長した血清半減期を有する。
【０１７１】
１０Ｆｎ３ドメインは、〜１０ｋＤａの小さいサイズのために、腎臓濾過および分解を介して血中から迅速にクリアランスされる（ｔ１／２＝マウスにおいて１５−４５分；サルにおいて１−３時間）。血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む第２のポリペプチドへの１０Ｆｎ３ドメイン、例えば、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの融合物は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンのｔ１／２を延長するために使用され得る。
【０１７２】
１つの態様において、ＳＡＢＡに融合させた抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの血清半減期は、ＳＡＢＡに結合していないときの抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの血清半減期と比較して増加される。１つの態様において、ＳＡＢＡ融合物の血清半減期は、ＳＡＢＡに融合していないときの抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの血清半減期と比較して、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００または３０００％長い。他の態様において、ＳＡＢＡ融合物の血清半減期は、ＳＡＢＡに融合していないときの抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの血清半減期と比較して、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍または５０倍長い。いくつかの態様において、ＳＡＢＡ融合物の血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間または２００時間である。
【０１７３】
１つの態様において、ＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。１つの態様において、ＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、２５℃または３７℃で５．５から７．４のｐＨ範囲で３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤでＨＳＡに結合する。いくつかの態様において、ＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、ｐＨ７．４での結合と比較して、ｐＨ７．４未満でＨＳＡにさらにしっかりと結合する。
【０１７４】
したがって、本明細書に記載されているＳＡＢＡ融合物分子は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンおよびＳＡＢＡ間の融合を作ることにより、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの半減期を増加させるために有用である。このような融合分子は、ＰＣＳＫ９の生物学的活性に応答する状態を処置するために使用され得る。本発明は、ＰＣＳＫ９の異常制御により引き起こされる疾患におけるＳＡＢＡ融合物分子の使用を考慮する。
【０１７５】
融合物は、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンをＳＡＢＡ分子のいずれかの末端に結合させることにより、すなわち、ＳＡＢＡ−抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンまたは抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン−ＳＡＢＡ配置で形成され得る。
【０１７６】
ＨＳＡは、ヒトにおいて６００μＭの血清濃度および１９日間のｔ１／２を有する。ＨＳＡの伸長されたｔ１／２は、一部、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介してリサイクルされることに起因している。ＨＳＡは、内皮細胞へのエンドソーム摂取後にｐＨ依存性においてＦｃＲｎに結合し；該相互作用は、ＨＳＡを血流にもう一度リサイクルし、それによりリソソーム分解から離れる。ＦｃＲｎは広範に発現され、再循環経路は常時的であると考えられる。大多数の細胞型において、多数のＦｃＲｎは、細胞内選別エンドソームに属する。ＨＳＡは、液相飲作用の非特異的メカニズムにより容易に内在化され、ＦｃＲｎによるリソソームにおける分解から救出される。エンドソームにおいて見出される酸性ｐＨで、ＦｃＲｎに対するＨＳＡの親和性は増加される（ｐＨ６．０で５μＭ）。ＦｃＲｎに結合すると、ＨＳＡは、リソソーム分解経路から離れて、トランスサイトーシスされ、細胞表面にで放出される。
【０１７７】
１つの態様において、本明細書に記載されているＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分はまた、サル、ラットまたはマウスの１つ以上からの血清アルブミンに結合し得る。１つの態様において、本明細書に記載されているＳＡＢＡ融合タンパク質のＨＳＡ結合部分は、３ｕＭ、２．５ｕＭ、２ｕＭ、１．５ｕＭ、１ｕＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に結合する。
【０１７８】
１つの態様において、本明細書に記載されているＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、ＨＳＡのドメインＩおよび／またはドメインＩＩに結合する。１つの態様において、本明細書に記載されているＳＡＢＡ融合タンパク質のＨＳＡ結合部分は、ＨＳＡのドメインＩＩＩに結合しない。
【０１７９】
１つの態様において、ＳＡＢＡ融合タンパク質の血清アルブミン結合部分は、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号：１）と少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または８５％同一性を有する配列を含む。１つの態様において、少なくとも１つのＢＣ、ＤＥまたはＦＧループは、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾される。別の態様において、少なくとも２つのＢＣ、ＤＥまたはＦＧループは、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾される。別の態様において、全３つのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾される。他の態様において、ＳＡＢＡは、表６に示される２６コアＳＡＢＡ配列（すなわち、配列番号：３３４、３３８、３４２、３４６および３４８−３７０）のいずれか１つ、または表６に示される伸長されたＳＡＢＡ配列（すなわち、配列番号：４２０−４４７  マイナス  ６×ＨＩＳタグ）のいずれか１つと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一性を有する配列を含む。
【０１８０】
１つの態様において、１０Ｆｎ３スカフォールドに基づく血清結合アドネクチンは、以下の配列により一般的に定義することができる：
ＥＶＶＡＡＴ（Ｘ）ａＳＬＬＩ（Ｘ）ｘＹＹＲＩＴＹＧＥ（Ｘ）ｂＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙＡＴＩ（Ｘ）ｃＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：３２８）
【０１８１】
１つの態様において、１０Ｆｎ３スカフォールドに基づく血清結合アドネクチンは、配列により一般的に定義することができる：
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩ（Ｘ）ｘＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：３２９）
【０１８２】
抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンに対して本明細書に記載されているとおり、配列番号：３２８および３２９は、同じ方法においてＳＡＢＡ分子を定義し、該分子に適用することができる。典型的な態様において、（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚによりそれぞれ示されているＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、以下の表６に示されるＨＳＡバインダーのいずれか（すなわち、表６における配列番号：３３０、３３４、３３８、３４２、３４６および３４８−３７０）のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列を含むポリペプチドで置換される。１つの態様において、表６に示されるＢＣ、ＤＥまたはＦＧループ配列は、Ｎ−および／またはＣ−末端の側面に１つ以上のさらなる残基を含み得る。特に、ＢＣループは、配列番号：３２８において（Ｘ）ｘを置換するとき、表６に示されるＢＣループ配列のＮ−末端でＳＷを含み得る。同様に、ＤＥループは、配列番号：３２８において（Ｘ）ｙを置換するとき、ループＤＥの前にＰおよびループＤＥの後に残基Ｔを含み得る。ＦＧループは、配列番号：３２８において（Ｘ）ｚを置換するとき、ＦＧループの後にＰを含み得る。例えば、配列番号：３３０は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが、それぞれＨＳＹＹＥＱＮＳ（配列番号：６３８）、ＹＳＱＴ（配列番号：６３９）およびＹＧＳＫＹＹＹ（配列番号：６４０）を含むことを示す。しかしながら、配列番号：３２８において（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚ、すなわち、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを置換するとき、（Ｘ）ｘ配列はＳＷＨＳＹＹＥＱＮＳ（配列番号：６４１）であり得、（Ｘ）ｙ配列はＰＹＳＱＴＴ（配列番号：６４２）であり得、（Ｘ）ｚ配列はＹＧＳＫＹＹＹＰ（配列番号：６４３）であり得る。
【０１８３】
１つの態様において、本明細書に記載されている融合物における使用のためのＳＡＢＡは、配列番号：３２８または３２９に記載されている配列を含み得、式中（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚによりそれぞれ示されるＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、２６コアＳＡＢＡ配列のいずれかの特定のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ（すなわち、表６における配列番号：３３０、３３４、３３８、３４２、３４６および３４８−３７０）のそれぞれのセット、または、２６コアＳＡＢＡ配列のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一の配列で置換される。典型的な態様において、本明細書に記載されているＳＡＢＡは、配列番号：３２９により定義され、所望により上記ループ配列へのＮ−および／またはＣ−末端付加を有する、２６コアＳＡＢＡ配列（すなわち、表６における配列番号：３３０、３３４、３３８、３４２、３４６および３４８−３７０）のいずれかのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列のセットを有する。例えば、ＳＡＢＡ１は配列番号：３３０に記載されているコア配列を有し、配列番号：３３１−３３３に記載されているそれぞれのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを含む。したがって、ＳＡＢＡ１コアに基づくＳＡＢＡは、配列番号：３２８または３２９を含み得、式中（Ｘ）ｘは配列番号：３３１を含み、（Ｘ）ｙは配列番号：３３２を含み、そして（Ｘ）ｚは配列番号：３３３を含む。いくつかの態様において、（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙおよび（Ｘ）ｚを置換する配列は、上記ループの末端のいずれか、または両方におけるさらなる残基を含む。同様の構築物は、他のＳＡＢＡコア配列からのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのセットを利用することが考えられる。このようなＳＡＢＡのスカフォールド領域は、配列番号：１のスカフォールドアミノ酸残基と比較して、０から２０、０から１５、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２または０から１の範囲の置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このようなスカフォールド修飾は、ＳＡＢＡが所望のＫＤで血清アルブミン、例えば、ＨＳＡに結合することができる限り、作成され得る。
【０１８４】
１つの態様において、ＳＡＢＡ（例えば、ＳＡＢＡコア配列または上記に基づく配列）は、Ｎ−末端伸長配列および／またはＣ−末端伸長を含むように修飾され得る。典型的な伸長配列は表６に示される。例えば、ＳＡＢＡ１．１として示される配列番号：４２０は、Ｎ−末端配列ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥ（配列番号：３７１、ＡｄＮＴ１として示される）およびＣ−末端配列ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号：３８０、ＡｄＣＴ１として示される）を有するコアＳＡＢＡ１配列（配列番号：３３０）を含む。ＳＡＢＡ１．１はＣ−末端でＨｉｓ６タグをさらに含むが、しかしながら、Ｈｉｓ６タグは完全に任意であり、Ｎ−もしくはＣ−末端伸長配列内のどこにでも位置てよく、または互いの配列に存在しないことが理解されるべきである。さらに、表６において提供される典型的なＮ−もしくはＣ−末端伸長配列のいずれか（配列番号：３７１−３９５）、およびそれらの変異体のいずれかを、表６において提供されるあらゆる所定のＳＡＢＡコア配列を修飾するために使用することができる。
【０１８５】
１つの態様において、Ｃ−末端伸長配列（「テール」とも呼ばれる）は、ＥおよびＤ残基を含み、８から５０、１０から３０、１０から２０、５から１０および２から４アミノ酸長であり得る。いくつかの態様において、テール配列はＥＤベースのリンカーを含み、該配列はＥＤのタンデムリピートを含む。典型的な態様において、テール配列は、２−１０、２−７、２−５、３−１０、３−７、３−５、３、４または５ＥＤリピートを含む。１つの態様において、ＥＤベースのテール配列はまた、さらなるアミノ酸残基、例えば：ＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳおよびＥＧＣを含み得る。このような配列は、一部、既知のアドネクチンテール配列、例えば、残基ＤおよびＫが除去されているＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号：３８０）に基づく。典型的な態様において、ＥＤベースのテールは、ＥＤリピート前にＥ、ＩまたはＥＩ残基を含む。
【０１８６】
他の態様において、テール配列は、ＳＡＢＡ融合物分子を設計するとき、必要なとき、他の既知のリンカー配列（例えば、表６における配列番号：３９６−４１９）と組み合わされ得る。
【０１８７】
コンジュゲーション／リンカー
ＳＡＢＡ融合物は、共有的または非共有的に連結され得る。いくつかの態様において、血清アルブミン結合１０Ｆｎ３は、直接的またはポリペプチドリンカーを介して間接的に抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンに連結され得る。Ｆｎ３ドメインを結合するために適当なリンカーは、個々のドメインが互いに独立してフォールディング可能であり、標的分子への高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するものである。
【０１８８】
本記載は、これらの必要条件を満たす多くの適当なリンカー、例えば、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号：４１６）を有するリンカーを提供する。本明細書に記載されている例は、ポリペプチドリンカーを介して連結したＦｎ３ドメインが標的結合機能を保持することを証明する。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびセリン残基を含み、８から５０、１０から３０および１０から２０アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号：４０３）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号：３９８）およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号：４００）を有するリンカーを含む。他のリンカーは、グルタミン酸を含み、例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号：４０５）およびＧＧＳＥ  ＧＧＳＥ（配列番号：４０９）を含む。他の典型的なグリシン−セリンリンカーは、（ＧＳ）４（配列番号：４０２）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号：４１１）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号：４１２）および（ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号：４１３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、グリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシンおよびプロリン残基を含み、３から３０、１０から３０および３から２０アミノ酸長であり得る。例としては、アミノ酸配列（ＧＰ）３Ｇ（配列番号：４１４）、（ＧＰ）５Ｇ（配列番号：４１５）およびＧＰＧを有するリンカーを含む。他の態様において、リンカーは、３から３０、１０から３０および３から２０アミノ酸長を有するプロリン−アラニンベースのリンカーであり得る。プロリンアラニンベースのリンカーの例は、例えば、（ＰＡ）３（配列番号：４１７）、（ＰＡ）６（配列番号：４１８）および（ＰＡ）９（配列番号：４１９）を含む。最適なリンカーの長さおよびアミノ酸組成物は、本明細書において提供される教示を考慮して、日常の実験により決定することができると考えられる。いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、血液または標的組織中のプロテアーゼにより切断可能であるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介してＳＡＢＡに連結される。このような態様は、より良い送達もしくは治療特性またはより効率的な生産のために抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを放出するために使用することができる。
【０１８９】
さらなるリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインおよびポリペプチドリンカー間のＦｎ３ドメインのＣ末端に導入され得る。さらなるリンカーまたはスペーサーは、Ｆｎ３ドメインおよびポリペプチドリンカー間のＦｎ３ドメインのＮ末端に導入され得る。
【０１９０】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、ＳＡＢＡに、直接的またはポリマーリンカーを介して間接的に連結される。ポリマーリンカーは、融合物のそれぞれの成分間の距離を最適に変化させ、１つ以上の以下の特性を有するタンパク質融合物を生成するために使用することができる：１）興味あるタンパク質に結合するときの、１つ以上のタンパク質ドメインの結合の立体障害の減少または増加、２）タンパク質安定性または溶解度の増加、３）タンパク質凝集の減少、および４）タンパク質の全体的な親和力または親和性の増加。
【０１９１】
いくつかの態様において、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、生体適合性ポリマー、例えば、ポリマー糖を介してＳＡＢＡに連結される。ポリマー糖は、血液または標的組織中の酵素により切断可能である酵素切断部位を含むことができる。このような態様は、より良い送達もしくは治療特性またはより効率的な生産のために抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンを放出するために使用することができる。
【０１９２】
配列の要約
上記「血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の融合物」および「コンジュゲーション／リンカー」の欄に示されている多数の配列は、以下の表６に要約される。特記されない限り、全てのＮ−末端伸長は、一本下線で示され、全てのＣ末端テール／伸長は、二本下線で示され、リンカー配列は囲まれている。ループ領域ＢＣ、ＤＥおよびＦＧは、それぞれのコアＳＡＢＡ配列に対して網掛けされている。さらに上記のとおり、修飾配列（例えば、ＮまたはＣ末端伸長およびリンカー）はまた、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチン分子を修飾するために使用することができる。
表６
典型的な配列の要約
【表１１８】
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【表１１９】
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【表１２０】
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【表１２１】
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【表１２２】
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【表１２３】
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【表１２４】
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【表１２５】
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【表１２６】
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【表１２７】
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【表１２８】
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【実施例】
【０１９３】
実施例１
本明細書において使用される材料および方法
ハイスループットタンパク質生成（ＨＴＰＰ）
ｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞に形質転換された選択されたバインダーを、２４−ウェルフォーマットにおいて５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地に播種し、３７℃で一晩増殖させた。新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）培養物を、一晩培養物から２００μｌの吸引および適当なウェルにに分配することにより、誘導発現のために調製した。培養物を、３７℃でＡ６００  ０．６−０．９まで増殖させた。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）での誘導後、培養物を３０℃で６時間で発現させ、４℃で２７５０ｇで１０分間の遠心分離により回収した。
【０１９４】
細胞ペレット（２４−ウェルフォーマット中）を、４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ（Roche）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、３０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌのアプロチニン、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、１−３時間室温で振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、９６−ウェル、１．２ｍｌのキャッチプレートが取り付けられた９６−ウェル  Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ（登録商標）に移すことにより９６−ウェルフォーマットに再び移し、陽圧により濾過した。浄化された溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化されている９６−ウェル  Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅに移し、５分間インキュベートした。結合していない物質を減圧により除去した。樹脂を、洗浄バッファー＃１（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で２×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄し、それぞれの洗浄液を減圧により除去した。溶離前に、それぞれのウェルを５０μｌの溶離バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、５分インキュベートし、この洗浄液を減圧により除去した。タンパク質を、さらなる１００μｌの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより溶離した。室温で３０分インキュベーション後、プレートを２００ｇで５分間遠心分離し、溶出されたタンパク質を、溶離前に溶離キャッチプレートの底に加えた５μｌの０．５ＭのＭｇＣｌ２を含む９６−ウェルキャッチプレートに回収した。溶出されたタンパク質を、タンパク質標準としてＳＧＥを使用するＢＣＡアッセイを使用して定量した。
【０１９５】
不溶性フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製
不溶性クローンの発現のために、クローン、次にＨＩＳ６タグを、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience, San Diego, CA）ベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞において発現させる。２０ｍｌの接種培養物（単一被覆コロニーから産生された）を使用し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に播種する。培養物を３７℃でＡ６００  ０．６−１．０まで増殖させる。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃で４時間増殖させ、４℃で≧１０，０００ｇで３０分間の遠心分離により回収する。細胞ペレットを−８０℃で凍結する。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジェナイザー（IKA works）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  （Roche）、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁する。細胞溶解は、Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）（Microfluidics）を使用する高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によりなし遂げる。不溶性画分を、４℃で２３，３００ｇで３０分間の遠心分離により分離する。溶解物の遠心分離から回収された不溶性ペレットを２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄する。ペレットを、超音波処理で２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４の６．０Ｍの塩酸グアニジンに再溶解し、次に３７℃で１−２時間インキュベーションする。再溶解されたペレットを０．４５μｍに濾過し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ／６．０Ｍのグアニジン  ｐＨ７．４  バッファーで平衡化されたＨｉｓｔｒａｐカラム上に負荷する。ローディング後、カラムを、同じバッファーでさらなる２５ＣＶのために洗浄する。結合しているタンパク質を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ｍＭのＮａＣｌ／６．０Ｍのｇｕａｎ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４の５０ｍＭのイミダゾールで溶離する。精製されたタンパク質は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム／１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ４．５に対する透析により再フォールディングされる。
【０１９６】
可溶性フィブロネクチンベースのスカフォールドタンパク質バインダーの中規模発現および精製
可溶性クローンの発現のために、クローン、次にＨＩＳ６タグを、ｐＥＴ９ｄ（EMD Bioscience, San Diego, CA）ベクターにクローニングし、大腸菌ＨＭＳ１７４細胞において発現させた。２０ｍｌの接種培養物（単一被覆コロニーから産生された）を使用し、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む１リットルのＬＢ培地に播種した。培養物を３７℃でＡ６００  ０．６−１．０まで増殖させた。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃で４時間増殖させ、４℃で≧１０，０００ｇで３０分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジェナイザー（IKA works）を使用して、２５ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  （Roche）、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞溶解は、Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）（Microfluidics）を使用する高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によりなし遂げた。可溶性画分を、４℃で２３，３００ｇで３０分間の遠心分離により分離した。上清を０．４５μｍフィルターを介して浄化化した。浄化した溶解物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４であらかじめ平衡化されたＨｉｓｔｒａｐ  カラム（ＧＥ）上に負荷した。次に、カラムを、２５カラム容量の同じバッファー、次に２０カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ／２５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４、次に、３５カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ／４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭのリン酸ナトリウム／５００ＭのＮａＣｌ／５００ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４で溶離し、画分をＡ２８０での吸光度に基づいてプールし、１×ＰＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５または５０ｍＭのＮａＯＡｃ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析した。あらゆる沈殿物が、０．２２μｍで濾過することにより除去された。
【０１９７】
実施例２
インビトロの非臨床薬理学
ＳＰＲによるＫＤ
結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により特徴付けた。ヒトＰＣＳＫ９およびカニクイザルＰＣＳＫ９を、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）チップ表面の一次元上の別々のチャネル上に固定し、同じＳＰＲチップ表面の他の次元において６つの異なる濃度の２０１３Ｅ０１に暴露した。これは、再生の非存在下での速度論的定量を与えた。デュプリケートチップを、２５℃でのヒトおよびカニクイザルＰＣＳＫ９の速度論的定量のために使用した。速度論的パラメーターの評価は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ相互作用モデルおよびＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアでの定数パラメーターフィッティングを使用して行った。
【０１９８】
これらの条件下、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンは、８０ｐＭから１．６ｎＭの範囲の解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９に、および８ｎＭから２４ｎＭの範囲の解離定数（ＫＤ）でｃｙｎｏＰＣＳＫ９に結合した（表７）。会合速度は約１０５Ｍ−１ｓ−１であり、加えて、解離は一般的に１０−３−１０−５ｓ１であった。同じアドネクチンにおいて、ヒトＰＣＳＫ９からのオフ速度は、ヒトＰＣＳＫ９からのこれらの解離定数測定を概算することを可能にするような、ＳＰＲ技術の検出限界に近いスロー（１０−５ｓ１の桁）であった。
表７
直接的に固定されたヒトおよびＣｙｎｏＰＣＳＫ９に対する抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンに対するＳＰＲ決定速度論的パラメーター
【表１２９】
0005876034.tif 000130
【０１９９】
ＢＬＩによるＫＤ
アドネクチンおよびヒトＰＣＳＫ９の結合特性はまた、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により決定した。ビオチン化ヒトＰＣＳＫ９をスーパーストレプトアビジンセンサーチップ上に固定し、次に結合相の期間、希釈されたアドネクチンを含むウェルに浸した。次に、チップを、アドネクチン解離の観察のために、バッファーのみのウェルに浸した。実験を、２５または３７℃のいずれかで温度コントロール環境下で行い、振動スピードは１５００ｒｐｍに合わせた。
【０２００】
結合相互作用分析を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏの専有ソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン  ６．３．０．３６）を使用して行った。全体的適合を、１：１結合モデルを使用して全てのサンプルに対して行った。これらの全体的適合の特性は、互いに束縛された結合および解離速度の一対に、全濃度値を強いた。親和性（ＫＤ）、結合および解離速度を、分析において使用された種々のローディングレベルにわたって平均化した。これらの条件下、アドネクチンは、表８に示されるとおり、ヒトＰＣＳＫ９に２００ｐＭから７．５ｎＭの親和性で結合した。会合速度は１０４−１０５Ｍ−１ｓ−１であり、加えて、解離は一般的に１０−３−１０−５ｓ−１であった。
表８
ヒトＰＣＳＫ９に対するＰＣＳＫ９アドネクチンに対するＢＬＩ決定速度論的パラメーター
【表１３０】
0005876034.tif 000131
【表１３１】
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１ＡＴＩ００１１６８はＲ２３Ｅ置換を有する１９２２Ｇ０４の脱免疫化バージョンである。
２ＡＴＩ００１１７５はＲ２３Ｄ置換を有する１９２２Ｇ０４の脱免疫化バージョンである。
【０２０１】
溶液相親和性
ＫｉｎＥｘＡ
ヒトＰＣＳＫ９に対するＡＴＩ００１０８１およびＡＴＩ００１１７４の溶液親和性は、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＫｉｎＥｘＡ）を使用して測定した。相対的非結合アドネクチン濃度は、ｈＰＣＳＫ９固体マトリックス上の捕捉、次に、アドネクチンスカフォールドを認識する蛍光的に標識された抗体での検出により測定した。技術的限界によって、試験することができたアドネクチンの最も低い濃度は１ｎＭであった。全体的ＫＤ分析では、ＡＴＩ００１０８１に対してＫＤ＝７０ｐＭ（９５％信頼区間内で２８−１２７ｐＭ）およびＡＴＩ００１１７４に対してＫＤ＝２２３ｐＭ（９５％信頼区間内で５４−５８５ｐＭの範囲）と概算する。
表９
【表１３２】
0005876034.tif 000133
【０２０２】
ＩＴＣ
ヒトＰＣＳＫ９へのアドネクチンＡＴＩ００１１７４およびＡＴＩ００１０８１の結合の熱力学および化学量論は、等温滴定熱量計（ＩＴＣ）により特徴付けた。溶液相結合は、３７℃で２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４１、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で測定した。１．３±０．２ｎＭの平均単分子結合定数がＡＴＩ００１１７４に対して、および１．４±０．４ｎＭがＡＴＩ００１０８１に対して観察された。詳細な熱力学的分析は、表１０および図１３に示される。２つのアドネクチンに対して観察されるエンタルピーの違い（−３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、ＡＴＩ００１１７４が、エントロピーにおける対応する違い（−１０．４ｃａｌ／ｍｏｌ・Ｋ）によって少なくとも部分的に相殺される、ペグ化によってＰＣＳＫ９に対する親和性における大きさの減少の秩序をもたらすということを示唆する。
表１０
【表１３３】
0005876034.tif 000134
＊３つの実験の平均
【０２０３】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ
これらのＦＲＥＴベースのアッセイは、Ｍａｉｏら（Miao, B.ら Meth. Enzymol., 357:180-188 (2002)参照）により以前に記載されている一般的な方法から採用されたＰＣＳＫ９結合アドネクチンの結合親和性および効力を決定するために開発された。ＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡ  ＦＲＥＴアッセイ（図２および３）によって、バキュロウイルスにおいて発現される組換えヒトＰＣＳＫ９および合成４０−ｍｅｒ  ＥＧＦＡペプチド（ビオチン化）を使用して、低比重リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメイン（ＥＧＦＡドメイン）へのＰＣＳＫ９結合の阻害を測定した。ＥＧＦＡは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの重要な相互作用ドメインを示すことが示されている（Kwon, H.J.ら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105(6):1820-1825 (2008)）。このアッセイは、ストレプトアビジン／アロフィコシアニン  フルオロフォア複合体を介するビオチン化ＥＧＦＡとのＦＲＥＴ相互作用を提供するために、Ｅｕ−キレートで標識化されたＰＣＳＫ９  Ｃ−末端ドメイン結合ｍＡｂ（ｍＡｂ  ４Ｈ５）を使用した。
【０２０４】
２つの他の関連した、ＰＣＳＫ９依存性ＦＲＥＴアッセイもまた構築した。これらのアッセイの１つにおいて、ビオチン化アドネクチン−ＡＴＩ０００９７２またはＡＴＩ００１１２５のアドネクチンによる競合的置換を定量する（図４に示されるＡＴＩ０００９７２結果）。ＡＴＩ０００９７２は１４５９Ｄ０５のビオチン化バージョン、ＡＴＩ００１１２５はＡＴＩ００１０８１のビオチン化バージョンである。別のアッセイにおいて、ＰＣＳＫ９へのアドネクチン（ｈｉｓタグされている）の直接結合は、抗−ｈｉｓ６抗体を使用してアッセイする（図５）。ＦＲＥＴアッセイのそれぞれにおいて、ヒトＰＣＳＫ９濃度は１または５ｎＭのいずれかであった。いくつかの場合において、カニクイザルＰＣＳＫ９をｈＰＣＳＫ９と置き換えた。表１１は、これらの３つのＦＲＥＴアッセイからの全てのデータを要約する。
表１１
ヒトＰＣＳＫ９を使用する３つのＦＲＥＴアッセイおよびＣｙｎｏ  ＰＣＳＫ９に対する１つのアッセイに対するアドネクチン試験データの要約
【表１３４】
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【表１３５】
0005876034.tif 000136
【０２０５】
ＰＣＳＫ９アドネクチンによるＰＣＳＫ９活性の細胞ベースの阻害
ＤｉＩ−ＬＤＬ摂取アッセイ
細胞培養方法を、アドネクチンがＬＤＬＲにおけるＰＣＳＫ９活性を阻害する能力をアッセイするために開発した。細胞性ＬＤＬＲ活性を測定するための有効な方法は、Lagace, T.A.ら(J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006)）により示されているとおりに、標識化ＬＤＬの摂取に関するアッセイを通す。本試験は、Teupserら (Biochim. Biophys. Acta, 1303(3):193-198 (1996))により最初に示された方法から採用された蛍光標識化ＬＤＬ（ＤｉＩ−ＬＤＬ）摂取を使用するＬＤＬＲ機能活性のための方法をさらに採用した。最初に、細胞を示されているアドネクチンの存在および非存在下で組換えヒトＰＣＳＫ９タンパク質（１０ｕｇ／ｍＬ、１３５ｎＭ）とプレインキュベートした。２時間後、残りのＬＤＬＲ活性を、２時間ＤｉＩ−ＬＤＬ（５ｕｇ）とのインキュベーション、次に、高含量蛍光顕微鏡およびイメージング分析（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用する細胞内の蓄積されたＤｉＩ−ＬＤＬの評価によりアッセイした。図６は、ＰＣＳＫ９活性を阻害し、ＨｅｐＧ２細胞においてＬＤＬＲ機能活性を回復させるいくつかのアドネクチンの効果を示す。このアッセイにおいて、アドネクチンは、以下のＥＣ５０値でＰＣＳＫ９を阻害し、ＤｉＩ−ＬＤＬ摂取を回復させた：１４５９Ｄ０５、ＥＣ５０＝１９０ｎＭ；１７８４Ｆ０３、２１０ｎＭ；２０１２Ａ０４、１３０ｎＭ；２０１３Ｅ０１、１６０ｎＭ。
【０２０６】
ＬＤＬＲ枯渇アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％のＦＢＳ（Hyclone）を有する完全培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ（登録商標））中で培養し、トリプシン  ０．２５％（Invitrogen）で週に２回スプリットした。ＬＤＬ受容体の上方調節を誘導するために、細胞をＬＰＤＳ培地［５％のリポタンパク質欠失血清（Intracel）、１００ｎＭのスーパーステイション(superstation)（BMS）および５０ｕＭのメバロン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を有するＲＰＭＩ（ATCC）］中で一晩インキュベートした。次の日、細胞を、簡潔にはトリプシン  ０．０５％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトリプシン処理し、２×１０＾６個の細胞／ｍｌで再懸濁し、次にＶ底９６ウェルプレート中１００ｕｌ／ウェルでアリコートした。その後、アドネクチンを３７℃で１時間ＬＰＤＳ培地中でＰＣＳＫ９とプレインキュベートそた。１時間後、細胞を遠心し、１００ｕｌのアドネクチン／ＰＣＳＫ９混合物に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。次の日、細胞をＬＤＬ受容体に対する抗体（Ｒ＆ＤからのＢＡＦ  ２１４８）、次にフィコエリトリン（ＰＥ）−ストレプトアビジン結合二次抗体（ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのＢＤ５５４０６１）で標識化し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）におけるＦＡＣＳにより分析した。
【０２０７】
１０ｎＭのＰＣＳＫ９を、ＨｅｐＧ２細胞に加える前に、アドネクチン候補物の濃度の増加につれて１時間プレインキュベートした。一晩インキュベーション後、ＬＤＬＲレベルをＦＡＣＳにより測定し、ＰＣＳＫ９誘導ＬＤＬＲ枯渇の阻害パーセントをグラフにし、ＥＣ５０をＰＲＩＳＭを使用して決定した。１４５９Ｄ０５は、試験されたものの中で最も低い効力の候補物を表し、最大阻害に到達しなかったが、他のクローンはＰＣＳＫ９の１５０−２００％最大阻害に到達した（図７）。ＰＣＳＫ９アドネクチンのインビトロ薬理学的データの要約は、以下の表１２に示される。
表１２
【表１３６】
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【表１３７】
0005876034.tif 000138
【表１３８】
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【０２０８】
実施例３
ＰＣＳＫ９アドネクチンのインビボ薬物動力学効果
ヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデル
ＰＣＳＫ９アドネクチンは、２つの異なるヒトトランスジェニックマウスモデルにおけるインビボでの薬物動力学効果を示した。１つのマウスモデルはヒトＰＣＳＫ９レベルを著しく過剰発現し、結果として高コレステロール血症を示す（Lagace, T.Aら J. Clin. Invest., 116(11):2995-3005 (2006)）。他のマウスモデルは、マウスＰＣＳＫ９と同様に肝臓において制御され、血漿中でほぼヒト正常レベルのｈＰＣＳＫ９を発現するゲノムｈＰＣＳＫ９トランスジェニック（ＢＡＣ−トランスジェニック）である。これらの試験のために、種特異的、部位特異的標識された抗体およびアドネクチンを使用するＥＬＩＳＡアッセイを、標的分子への結合の指標としての血漿非結合ヒトＰＣＳＫ９レベル（すなわち、投与されたアドネクチンと複合体化していないｈＰＣＳＫ９）を測定するために開発した。
【０２０９】
ペグ化形態におけるＰＣＳＫ９アドネクチンの単回投与を、図８−９に示される用量で過剰発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデルに腹腔内に注射した。ＰＢＳまたは透析物サンプルもまた、コントロールとして注射した。アドネクチン１４５９Ｄ０５−ＰＥＧ（１００ｍｇ／ｋｇ  腹腔内）処置は、血漿総コレステロール（図８Ａ）およびＬＤＬ−Ｃ（示されていない）を４時間でベースライン以下に、＞３５％迅速に減少させた。アドネクチン処置マウス中のコレステロールレベルは、試験期間４８時間中、コントロールレベル未満を維持した。これは、アドネクチン処置トランスジェニックマウス中の非結合ｈＰＣＳＫ９の血中レベルにおける鋭い減少と同時に起こった（図８Ｂ）。並行試験において６時間で得られた肝臓のウェスタンブロットは、ＬＤＬＲタンパク質レベルがアドネクチン処置マウスにおいて〜２倍増加したことを示した（本明細書に示されていない）。このトランスジェニックマウスモデルにおけるさらなる試験において、ＡＴＩ００１１１４を１０または６０ｍｇ／ｋｇで投与した。血漿コレステロールの著しい用量依存的迅速な低下が、非結合ｈＰＣＳＫ９レベルにおける用量依存的減少と同時に見られた（図９）。これらの試験は、高コレステロール血症ヒトトランスジェニックＰＣＳＫ９マウスモデルにおける有効なコレステロール低下剤としての、ＰＣＳＫ９アドネクチンに対するインビボでの概念実証を示す。
【０２１０】
インビボ試験を、正常発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデルにおいて行った。１４５９Ｄ０５−ＰＥＧまたはＡＴＩ００１１１４の単回投与の注射（５ｍｇ／ｋｇ）は、血漿中の非結合ｈＰＣＳＫ９レベルにおける迅速かつ強い減少をもたらした（図１０）。非結合ｈＰＣＳＫ９におけるこの薬物動力学効果は、より高い親和性／効力アドネクチンに対して観察される効果のより大きな規模および期間で、１４５９Ｄ０５−ＰＥＧと比較してＡＴＩ００１１１４後により顕著であった。用量依存性のさらなる試験は、５０％阻害量（ＥＤ５０）が、図１１に示されるとおり、投与３から４８時間後の時点で、ＡＴＩ００１１１４について０．１ｍｇ／ｋｇ未満であったことを示した。正常発現体トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの発見は、ＰＣＳＫ９阻害アドネクチンが、ＬＤＬＲ制御およびＬＤＬコレステロール低下と相関している薬物動力学終点における著しい、親和性依存性および用量依存効果を示すことを示す。
【０２１１】
カニクイザル
薬物動力学試験を、正常な細身の(lean)カニクイザルにおいて行った。アドネクチンＡＴＩ００１１１４を５ｍｇ／ｋｇでｃｙｎｏの静脈内に投与し、血漿サンプルをＬＤＬ−Ｃアッセイおよび薬物動態学評価のために時間間隔で回収した。ＡＴＩ００１１１４の単回投与は、４８時間以内に、ベースライン（またはＰＢＳコントロールグループ）に対して、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを＞５０％に迅速に低下させた（図１２）。ＬＤＬ−Ｃにおける効果の期間は１週間以上持続し、３週間でベースラインへ最終的に戻った。この効果を、抗−ＰＣＳＫ９アドネクチンの二分岐および四分岐４０ｋＤａペグ化形態（それぞれＡＴＩ００１１１４およびＡＴＩ００１２１１）の両方で観察した。ＡＴＩ００１２１１は、４０ｋＤａの４分岐ＮＯＦ  ＰＥＧ部分と有するＡＴＩ００１０８１である。総コレステロールは同様のパターンを示したが、ＨＤＬまたは他の代謝パラメーターにおける効果は観察されなかった（本明細書に示されていない）。薬物動態学分析は、血漿半減期がｃｙｎｏにおけるＬＤＬ低下の薬物動力学と一致する約８０−１２０時間であったことを示した。これらの発見は、ＰＣＳＫ９アドネクチンが、カニクイザルモデルにおいてＬＤＬ−Ｃ低下に対して迅速な、強力な、特異的な効果で有効かつ即効性であることを示す。
【０２１２】
実施例４
ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合タンパク質であるＰＲＤ４６０のインビトロおよびインビボでの薬理学的評価
ＰＲＤ４６０の生産
ＰＲＤ４６０をコードするベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＨＥＫ−２９３  ６Ｅ細胞にトランスフェクトした。細胞を、８０％加湿および５％ＣＯ２で３７℃で５日間培養した。次に細胞をペレット化し、上清を０．２２ｕｍフィルターに通し、次に、タンパク質Ａカラムに負荷した。カラムをＰＢＳで洗浄し、タンパク質を２０ｍＭのＧｙｌｃｉｎｅ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ２．８に溶離した。溶出されたタンパク質を濃縮し、５０ｍＭのＭＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ５．８中でｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを通した。
【０２１３】
ＳＰＲによるＰＲＤ４６０  ＫＤ
【０２１４】
結合特性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により特徴付けられた。抗−ヒト抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップ上に固定され、ＰＲＤ４６０（配列番号：３２２に記載されている配列）をチップ表面上に捕捉した。種々の濃度のｈＰＣＳＫ９をフロー溶液に置き、サイクル間のチップ再生のためにＭｇＣｌ２（３Ｍ）を使用した。比較のために、ＡＴＩ−１０８１を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）チップ上に固定される抗−Ｈｉｓ抗体に捕捉した。ＰＲＤ４６０に対するデュプリケート実験を異なる日に実施した。速度論的定量を２５℃で実施した。速度論的パラメーターの評価を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアにおける１：１結合アルゴリズムを使用して実施した。
【０２１５】
これらの条件下、ＡＴＩ−１０８１は２５℃で６．７ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９に結合し、ＰＲＤ４６０は２５℃で３．２９＋／−０．５５ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＰＣＳＫ９に結合した（表１３）。このアッセイフォーマットを使用するオフ速度決定は、固定された捕捉抗体からの捕捉されたリガンドのオフ速度により人為的限定され得、したがって、ＰＣＳＫ９の直接的固定化を使用するアッセイフォーマットは、ＡＴＩ−１０８１に対する解離定数（ＫＤ）のさらに正確な反映である。
表１３
捕捉されたヒトＰＣＳＫ９に対するＰＲＤ４６０およびＡＴＩ−１０８１に対する速度論的パラメーター
【表１３９】
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【０２１６】
ＰＣＳＫ９結合ＦＲＥＴアッセイ
２つの蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイを使用して、ｈＰＣＳＫ９へのＰＲＤ４６０および他のアドネクチンの競合的結合効力を決定した。ＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡ  ＦＲＥＴアッセイは、可溶性上皮細胞増殖因子前駆体相同性ドメイン−Ａ（ＥＧＦＡ）ペプチドおよび組換えヒトＰＣＳＫ９を使用して、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を測定する。ＰＣＳＫ９：ＡＴＩ９７２  ＦＲＥＴアッセイは、ＰＣＳＫ９からビオチン化アドネクチンＡＴＩ−９７２のアドネクチンによる競合的置換を測定する。
【０２１７】
ＰＣＳＫ９：ＥＧＦＡ  ＦＲＥＴアッセイ（５ｎＭのＰＣＳＫ９）において、ＰＲＤ４６０は、ＥＣ５０＝０．７ｎＭでＥＧＦＡをＰＣＳＫ９結合部位から完全に、かつ強く置換した（図１、左パネル）。ＰＲＤ４６０は、ＡＴＩ−１１７４（ＥＣ５０＝１．９ｎＭ）またはＡＴＩ−１０８１（ＥＣ５０＝３．７ｎＭ）のいずれかよりもこのアッセイにおいてより強力であった（図１４）。このアッセイにおけるＰＲＤ４６０のより良い明白な効力は、ＡＴＩ−１０８１およびＡＴＩ−１１７４による一価（１：１）結合と比較して、ＰＣＳＫ９へのアドネクチンＰＲＤ４６０の二価（２：１）結合により説明され得る（理論的に）。
【０２１８】
ＰＣＳＫ９：ＡＴＩ−９７２  ＦＲＥＴアッセイ（５ｎＭのヒトＰＣＳＫ９）を使用して、ＰＲＤ４６０は、ＡＴＩ−１１１４に対して０．８ｎＭおよびＡＴＩ−１０８１に対して２．８ｎｍと比較して、ＥＣ５０＝０．３ｎＭで阻害した（図１５）。これらの発見は、ＰＲＤ４６０がビオチン化アドネクチンＡＴＩ−９７２をＰＣＳＫ９上の結合部位から強く置換したことを示す。ＡＴＩ−１０８１およびＡＴＩ−１１７４と比較してＰＲＤ４６０のより高い効力は、ＰＲＤ４６０による二価結合と一致する。
【０２１９】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９誘導ＬＤＬＲ枯渇の阻害
ヒトＰＣＳＫ９は、ＨｅｐＧ２細胞の表面からのＬＤＬＲの枯渇を促進する。ＰＣＳＫ９のＰＣＳＫ９アドネクチンとのプレインキュベーションは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合を阻害し、細胞表面からのＬＤＬＲの枯渇を防止する。このアッセイは、ＡＴＩ−１０８１、ＡＴＩ−１１７４およびＰＲＤ４６０が細胞表面からのＬＤＬＲのＰＣＳＫ９誘導枯渇を阻害する効力を測定するために使用された。
【０２２０】
ＰＣＳＫ９アドネクチンの希釈シリーズを、３７℃で１時間、１０ｎＭのヒトＰＣＳＫ９とプレインキュベーションし、プレインキュベーションされた混合物をＨｅｐＧ２細胞に加え、該細胞を２４時間インキュベートした。該インキュベーション後、ＨｅｐＧ２細胞上のＬＤＬＲのレベルを、ＦＡＣＳ分析を使用して測定した。ＰＣＳＫ９誘導ＬＤＬＲ枯渇の阻害パーセントを計算し、グラフで示した（図１５）。このアッセイにおいて、ＡＴＩ−１０８１、ＡＴＩ−１１７４およびＰＲＤ４６０は、同等のＥＣ５０（それぞれ９ｎＭ、８ｎＭおよび６ｎＭ）でＰＣＳＫ９を阻害したが、応答曲線の左方向−シフトは、一貫して、ＰＲＤ４６０に対して観察された。これらのＥＣ５０は、アッセイの限界を示す。
【０２２１】
ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９細胞への侵入アッセイ
肝細胞の表面上のＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合は、ＬＤＬＲエンドサイトーシス中、ＬＤＬＲ−ＰＣＳＫ９複合体の共内在化をもたらし、ＬＤＬＲの増強された分解をもたらす。。細胞ベースアッセイを、蛍光ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲ依存性細胞侵入を測定するために開発した。ヒトＰＣＳＫ９を、フルオロフォア  ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）−６４７（ＡＦ６４７）を使用して共有的に標識化した。ＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７を、ＰＣＳＫ９−アドネクチンの存在または非存在下でＨｅｐＧ２細胞とインキュベートし、細胞内蛍光を、高含量蛍光顕微鏡および画像分析（Cellomics）により定量した。ＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７細胞への侵入のＬＤＬＲエンドサイトーシスへの依存が、予備実験において確立された。ＨｅｐＧ２細胞を、１０ｎＭのＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７および種々のレベルのアドネクチンと３７℃で４時間インキュベートした。このアッセイにおいて、ＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７細胞内蛍光の強力な阻害は、ＰＲＤ４６０（ＥＣ５０＝６ｎＭ）ならびにＡＴＩ−１１７４（ＥＣ５０＝１０ｎＭ）に対して観察された（図１６）。これらの発見は、アドネクチンＰＲＤ４６０およびＡＴＩ−１１７４が、培養中のヒト肝臓由来の細胞系においてＰＣＳＫ９の細胞表面ＬＤＬＲへの結合を有効にブロックし、それにより、ＬＤＬＲエンドサイトーシス中、ＰＣＳＫ９−ＡＦ６４７の内在化を減少させたことを示す。
【０２２２】
インビボでのトランスジェニックマウス試験
インビボ試験を、正常発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデルにおいて実施した。血漿中のアドネクチンのＰＣＳＫ９への結合は、非結合（遊離）血中ＰＣＳＫ９の測定された量における減少をもたらすことが予期される。非結合ＰＣＳＫ９における減少は、最初の薬物動力学事象であり、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬＲ相互作用の阻害およびＬＤＬコレステロール低下をもたらす。トランスジェニックマウスへのＰＲＤ４６０の単回投与（ｉ．ｐ．投与  ０．６から１８ｍｇ／ｋｇ）は、血漿非結合ｈＰＣＳＫ９レベルにおいて迅速な、強い減少を引き起こした（図１７）。非結合ＰＣＳＫ９における用量依存的増加は、３時間の時点でＥＤ５０＜０．６ｍｇ／ｋｇで観察された。正常発現体ヒトＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスモデルにおけるこれらの発見は、ＰＲＤ４６０がインビボで血中ｈＰＣＳＫ９に強く、強力に結合することを示す。
【０２２３】
カニクイザルにおけるインビボでの薬物動力学
ＰＣＳＫ９アドネクチンＰＲＤ４６０の薬物動力学効果は、正常な細身のカニクイザルにおいて評価した。ＰＲＤ４６０を、１５ｍｇ／ｋｇでのｉ．ｖ．投与によりサルに投与し、ＬＤＬ−Ｃおよび遊離ＰＣＳＫ９レベルのアッセイのために血漿サンプルを４週間にわたって時間間隔で回収した。ＰＲＤ４６０の単回投与は、サルにおいて血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを迅速に低下させ、投与３日後までにベースラインＬＤＬ−Ｃの４２％の平均最大効果（５８％減少；ｎ＝３匹サル）に到達した（図１８）。ＬＤＬ−Ｃレベルは、投与で１週間、５０％またはそれ以上減少し、３週間ベースライン以下を有意に維持し、４週間でベースラインに戻った。総コレステロールは同様のパターンを示したが、ＨＤＬでは効果が観察されなかった（示されていない）。ＰＲＤ４６０での処置は、非結合、遊離形の血漿ＰＣＳＫ９において、０付近（定量下限以下）への即座の低下を引き起こした（図１８）。遊離ＰＣＳＫ９レベルは、数日間、検出下限付近を維持し、４週間の終わりまでにベースラインレベルに徐々に戻り、血漿ＬＤＬ−Ｃとの因果関係と一致した。該データは、血漿ＬＤＬ低下が遊離ＰＣＳＫ９レベルにおける低下を反映し、インビボでのＰＲＤ４６０での処置後、ＬＤＬＲ機能を制御するＰＣＳＫ９阻害と一致することを示す。薬物動態学分析は、アドネクチンＰＲＤ４６０の血漿半減期が該カニクイザル試験において約７０時間であったことを示した。これらの発見は、ＰＣＳＫ９アドネクチン−Ｆｃ融合タンパク質が、カニクイザルモデルにおいてＬＤＬ−Ｃ低下に対する強力な、特異的な、かつ長期の効果で高度に有効的かつ即効性であることを示す。
【０２２４】
非修飾ＰＣＳＫ９アドネクチンＡＴＩ−１０８１のインビボでの薬理学的評価
ＰＫ部分（例えば、ペグ化およびＦｃ−融合アドネクチン）を含む修飾アドネクチンに加えて、非修飾（「裸の」）ＰＣＳＫ９アドネクチンもまた投与することができる。非修飾ＰＣＳＫ９アドネクチン処置のための戦略は、より短いＰＫ半減期に適応させるためにより頻繁な投与、または吸収相の長さを増加させ、薬物動力学効果を伸長させるために持続放出皮下製剤の使用を含む。多数のこのような製剤は、１つの例として、吸収速度を遅延させ、血中でアドネクチンへの暴露時間を増加させるためにプロピレングリコール／ＰＢＳ溶液を含むことを構想することができる。
【０２２５】
非修飾アドネクチンＡＴＩ−１０８１を、ＰＢＳビヒクル中１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルにｉ．ｖ．投与した。ＡＴＩ−１１１４（同じアドネクチンのペグ化バージョン）もまた、比較としてＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇで投与した。ＡＴＩ−１０８１は、非結合血中ＰＣＳＫ９レベルの迅速な、一過性の阻害を引き起こした。３０分以内で、最初の阻害の程度は１００％（定量限界未満）に近づき、数時間後にベースラインに戻った（図１９）。同時に、ＬＤＬ−Ｃレベル低下の傾向は、ＡＴＩ−１０８１処置サルにおいて最初の２４時間にわたって観察された（図２０）。
【０２２６】
非修飾アドネクチンＡＴＩ−１０８１もまた、ＰＢＳビヒクルと比較して、５０：５０  プロピレングリコール：ＰＢＳ  ビヒクル（ＰＧビヒクル）を使用する単一の持続放出皮下製剤において、正常発現体ｈＰＣＳＫ９トランスジェニックマウスに投与した。この製剤は、アドネクチン吸収速度を穏やかに遅延させ、血中でＡＴＩ−１０８１への暴露時間を増加させ、したがって薬物動力学応答を改善することが期待される。ＰＢＳビヒクル中１ｍｇ／ｋｇでＡＴＩ−１０８１の投与（腹腔内）は、０．３ｍｇ／ｋｇでＡＴＩ−１１１４において＞８５％低下と比較して、３時間で非結合血漿ＰＣＳＫ９の〜５０％低下をもたらした（図２１）。トランスジェニックマウスにおける第２の実験において、ＰＧビヒクル中で皮下注射により投与されたＡＴＩ−１０８１は、試験の最初の６時間にわたって効果の改善された期間で、ＡＴＩ−１１７４と比較して非結合ＬＤＬにおいてほぼ同等の減少をもたらした（図２２）。これらの発見は、非修飾ＰＣＳＫ９アドネクチンＡＴＩ−１０８１が、単一の持続放出ビヒクルにおいて皮下に投与されたとき、インビボで標的ヒトＰＣＳＫ９に結合し、最初の薬物動力学応答を引き起こすことを示す。応答の時間依存性は、非修飾ＰＣＳＫ９アドネクチンに関する効果の期間を延長する持続放出と一致した。
【０２２７】
実施例５
血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）
実施例５Ａ．候補血清アルブミン結合アドネクチンのスクリーニングおよび選択
概観
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎとして知られる選択技術（例えば、Robertsら Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(23):12297-12302 (1997)およびＷＯ２００８／０６６７５２参照）を、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループに設計された可変領域を有するＤＮＡライブラリーに適用した。１０１３個以上の分子のランダムライブラリーをこの設計から作りだし、選択圧をＨＳＡのビオチン化形態に対して適用し、望ましい結合特性を有する候補血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）を単離した。
【０２２８】
ハイスループットタンパク質生産（ＨＴＴＰ）処理
種々のＨＳＡ結合アドネクチンを、ハイスループットタンパク質生産処理（ＨＴＰＰ）を使用して精製した。選択されたバインダーを、ＨＩＳ６タグを含むｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。形質転換細胞を２４−ウェルフォーマット中で５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。新鮮な５ｍｌのＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン）培養物を、誘導発現のために、一晩培養物から２００μｌ吸引し、適当なウェルに分配することにより調製した。培養物をＡ６００  ０．６−０．９まで３７℃で培養した。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃でさらに４時間培養し、４℃で３２２０×ｇで１０分遠心分離により回収した。細胞ペレットを−８０℃で冷凍した。
【０２２９】
細胞ペレット（２４−ウェルフォーマット中）を、４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  （Roche）、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、３０ｕｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ、２ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、１時間室温で振盪することにより溶解した。溶解物を浄化し、９６−ウェル、６５０μｌキャッチプレートが取り付けられた９６−ウェル  Ｗｈａｔｍａｎ  ＧＦ／Ｄ  ＵＮＩＦＩＬＴＥＲ（登録商標）に移すことにより９６−ウェルフォーマットに再び移し(re-racked)、２００×ｇで５分遠心した。浄化された溶解物を、平衡バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化されている９６−ウェル  Ｎｉ−Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｐｌａｔｅに移し、５分間インキュベートした。結合していない物質を除去した。樹脂を、洗浄バッファー＃１（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、４０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で２×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄した。次に、樹脂をＰＢＳで３×０．３ｍｌ／ウェルで洗浄した。溶離前に、それぞれのウェルを５０μｌの溶離バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、５分インキュベートし、この洗浄液を減圧により除去した。タンパク質を、さらなる１００ｕｌの溶離バッファーをそれぞれのウェルに適用することにより溶離した。室温で３０分インキュベーション後、プレートを２００×ｇで５分間遠心分離し、溶出されたタンパク質を、Ｎｉ−プレートの底に加えた５μｌの０．５ＭのＭｇＣｌ２を含む９６−ウェルキャッチプレートに回収した。溶出されたタンパク質を、タンパク質標準としてＳＧＥ（コントロール  アドネクチン）を使用するＢＣＡタンパク質アッセイを使用して定量した。ＳＧＥアドネクチンは、インテグリン結合ドメイン（位置７８−８０でアミノ酸ＲＧＤ）がＳＧＥで置換されている野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号：１）である。
【０２３０】
ＨＳＡ、ＲｈＳＡおよびＭｕＳＡ直接結合ＥＬＩＳＡ
ＨＳＡに対する直接的バインダーをアッセイするために、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Nunc International, Rochester, NY）をＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍＬのＨＳＡ（Sigma, St. Louis, MO）で４℃で一晩でコーティングし、カゼインブロックバッファー（Thermo Scientific, Rockford, IL）で室温で１−３時間ブロックした。一点スクリーニングアッセイのために、精製されたＨＴＰＰアドネクチンをカゼインブロックバッファーで１：２０に希釈し、それぞれのウェル中で室温で１時間ＨＳＡに結合させた。用量応答アッセイのために、０．１ｎＭから最大１μＭの範囲の濃度を使用した。非結合アドネクチンを除去するためにＰＢＳＴで洗浄後、カゼインブロックバッファーで１：２５００に希釈された抗−Ｈｉｓ  ｍＡｂ−ＨＲＰコンジュゲート（R&D Systems, MN）を結合Ｈｉｓ−タグ  アドネクチンに室温で１時間で加えた。過剰なコンジュゲートをＰＢＳＴで洗浄することにより除去し、結合したアドネクチンを製造業者の指示にしたがってＴＭＢ検出試薬（BD Biosciences）を使用して検出した。
【０２３１】
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集測定
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＨＴＰＰから得られるＳＡＢＡにおいて実施した。ＨＴＰＰ由来物質のＳＥＣを、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍでのＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎＭ、発光＝３５０ｎｍ）にて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００または１２００ＨＰＬＣシステムにおいてＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ２００  ５／１５０またはＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ７５  ５／１５０  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。１００ｍＭの硫酸ナトリウム、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーをＳＥＣカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を分子量校正のために使用した。
【０２３２】
ＨＴＰＰ精製ＳＡＢＡにおけるＳＥＣの結果は、主にモノマーであることが示され、ほぼ１０ｋＤａの範囲  対  球状ゲル濾過標準（BioRad）において溶離した。
【０２３３】
候補血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）の同定
ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ結合および生物物理学基準のスクリーニングの結果として、４つのユニークな(unique)血清アルブミン結合アドネクチン（ＳＡＢＡ）が、マウスにおいて評価されたそれらの半減期を有するように同定され、選択された。インビトロおよびインビボでの特性化を行うために、中規模を４つのＳＡＢＡのために行った。表６は、ＳＡＢＡ１−２６として示されるＰＲＯｆｕｓｉｏｎから同定された２６個のユニークなＳＡＢＡコア配列の配列を提供する。ＳＡＢＡ４は、スカフォールド変異を有し、中規模化の前に固定された。ＳＡＢＡ４のスカフォールド−完全バージョンはＳＡＢＡ５である。ＳＡＢＡ４およびＳＡＢＡ５は、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループにおいて同一の配列を有する。
【０２３４】
実施例５Ｂ．候補物ＳＡＢＡの生産および製剤
ＳＡＢＡの中規模タンパク質生産
実施例５Ａに記載されている選択されたＳＡＢＡ、次にＨｉｓ６タグを、ｐＥＴ  ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞において発現させた（設計されたＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１およびＳＡＢＡ５．１のそれぞれのＨｉｓ−タグＳＡＢＡ配列について表６参照）。２０ｍｌの接種培養物（単一被覆コロニーから産生された）を使用し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１リットルのＬＢ培地に播種する。培養物を３７℃でＡ６００  ０．６−１．０まで増殖させた。１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導後、培養物を３０℃でさらに４時間増殖させ、４℃で≧１０，０００ｇで３０分間の遠心分離により回収した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。細胞ペレットを、氷上でＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）ホモジェナイザー（IKA works）を使用して、２５ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、１×  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  （Roche）、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞溶解は、Ｍｏｄｅｌ  Ｍ−１１０Ｓ  ＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）（Microfluidics）を使用する高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によりなし遂げた。可溶性画分を、４℃で２３，３００ｇで３０分間の遠心分離により分離した。上清を０．４５μｍフィルターを介して洗浄した。浄化された溶解物を２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４で平衡化されたＨＩＳＴＲＡＰ（登録商標）カラム（ＧＥ）上に負荷した。次に、カラムを、２５カラム容量の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、次に２０カラム容量の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのイミダゾール  ｐＨ７．４、次に３５カラム容量の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール  ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を、１５カラム容量の２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、０．５ＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのイミダゾール  ｐＨ７．４で溶離し、画分をＡ２８０での吸光度に基づいてプールし、１×ＰＢＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ８．５または５０ｍＭのＮａＯＡｃ；１５０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析した。あらゆる沈殿物が、０．２２μｍで濾過することにより除去された。
【０２３５】
中規模発現および精製は、可溶性形態において発現され、細菌サイトゾルの可溶性画分から精製された高度に純粋な、かつ活性なアドネクチンをもたらした。１００ｍＭのＮａＰＯ４、１００ｍＭのＮａＳＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．８（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の移動相におけるＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ２００またはＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ７５  １０／３０ＧＬにおけるＳＥＣ分析は、主にモノマーアドネクチンを証明した。
【０２３６】
ＳＡＢＡ１．２の製剤
１つの特定のＳＡＢＡ、ＳＡＢＡ１．２（配列番号：４１１）を、予備的製剤スクリーンのために選択した。ＳＡＢＡ１．２は、１０Ｆｎ３の「コア１」配列において（ＥＤ）５伸長を含む（表６における配列番号：４２１参照）。ＳＡＢＡ１．２において、１０ｍＭのコハク酸、８％のソルビトール、５％のグリシン  ｐＨ６．０および５ｍｇ／ｍＬの生成物濃度の安定な製剤を同定した。この製剤化において、タンパク質融解温度は１．２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使用して示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により決定されたとき、７５℃であった。該製剤は、４℃および２５℃で１．２％の最初の凝集レベルを有する満足な物理化学的安定性を提供した。１月安定後、凝集レベルは非常に低かった（４℃で１．６％および２５℃で３．８％）。該タンパク質はまた、−８０℃および−２０℃から環境温度への変化としての凍結融解の５サイクル後に該製剤中で安定であった。加えて、この製剤化において、ＳＡＢＡ１．２は、沈殿または凝集の増加なしで４℃および環境温度で少なくとも２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで溶解できた。
【０２３７】
実施例５Ｃ．候補物ＳＡＢＡの生物物理学特性化
サイズ排除クロマトグラフィー
標準サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、中規模プロセスから得られた候補物ＳＡＢＡについて実施した。中規模（midscaled）材料のＳＥＣを、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍでのＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎＭ、発光＝３５０ｎｍ）にて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００または１２００ＨＰＬＣシステムにおいてＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ２００  １０／３０またはＳＵＰＥＲＤＥＸ（登録商標）  ７５  １０／３０  カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。１００ｍＭの硫酸ナトリウム、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーを、ＳＥＣカラムの適当な流速で使用した。ゲル濾過標準（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）を分子量校正のために使用した。
【０２３８】
中規模精製ＳＡＢＡにおけるＳＥＣの結果は、主にモノマーアドネクチンであることが示され、ほぼ１０ｋＤａの範囲  対  球状ゲル濾過標準（BioRad）において溶離した。
【０２３９】
熱安定性
中規模ＳＡＢＡの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を実施して、それぞれのＴｍを決定した。１ｍｇ／ｍｌの溶液を、Ｎ−ＤＳＣ  ＩＩ熱量計（Calorimetry Sciences Corp）において、３気圧下で１分当たり１℃の速度で５℃から９５℃に勾配をつけることによりスキャンした。データは、Ｏｒｇｉｎソフトウェア（ＯｒｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐ）を使用し、最適適合を使用して、適当なバッファーのコントロール実施に対して分析した。ＳＥＣおよびＤＳＣ分析の結果を表１４に要約する。
表１４
候補物ＳＡＢＡにおけるＳＥＣおよびＤＳＣ分析の要約
【表１４０】
0005876034.tif 000141
【０２４０】
実施例５Ｄ．血清アルブミンへの候補物ＳＡＢＡ１結合の特性化
実施例５Ａおよび５Ｂに記載されているＨＴＰＰおよび／または中規模材料から精製された選択されたＳＡＢＡクローンの動力学を、Ｂｉａｓｅｎｓｏｒ  ＣＭ５  チップの表面上のそれぞれの血清アルブミン（ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ）を捕捉し、参照フロー細胞および捕捉アルブミンの両方に、濃度系列のＳＡＢＡを流すことにより決定した。加えて、アルブミンへの結合を、ｐＨ５．５からｐＨ７．４の範囲の種々のｐＨ条件下で行った。ＨＳＡ結合アドネクチン  ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、ＳＡＢＡ４．１およびＳＡＢＡ１．１はＲｈＳＡと公差反応したが、ＭｕＳＡと公差反応しなかった。ＳＡＢＡ２およびＳＡＢＡ４結合はｐＨ感受性であるが、クローンＳＡＢＡ３は、ｐＨ６．０に至るまでＨＳＡへのｐＨ抵抗性結合を証明した。ＳＡＢＡ１．１は、ｐＨ５．５に至るまでｐＨ抵抗性および親和性／動力学に対する生化学的基準に合う。
【０２４１】
ドメインマッピングをＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）により決定した。ＨＴＰＰおよび／または中規模材料から精製された選択されたＳＡＢＡクローンを、Ｂｉａｓｅｎｓｏｒ  ＣＭ５  チップの表面上のちょうどＨＳＡ−ドメインＩ＆ＩＩまたはＨＳＡ−ドメインＩＩＩからなるＨＳＡまたは構築物を捕捉し、参照フロー細胞および捕捉アルブミンの両方に、濃度系列のＳＡＢＡを流すことにより決定した。クローンＳＡＢＡ２＆ＳＡＢＡ１は、ＨＳＡおよびＨＳＡ−ドメインＩ−ＩＩ構築物に結合したが、ＨＳＡ−ドメインＩＩＩ構築物に結合しなかった。クローンＳＡＢＡ３＆ＳＡＢＡ４は、ＨＳＡに結合したが、ＨＳＡ−ドメインＩ−ＩＩまたはＨＳＡ−ドメインＩＩＩ構築物のいずれにも結合しなかった。該結果を表１５に要約する。
表１５
候補物ＳＡＢＡ（ＳＡＢＡ１．１、２．１、３．１および４．１）の結合親和性および動力学
【表１４１】
0005876034.tif 000142
【０２４２】
実施例５Ｅ．候補物ＳＡＢＡのインビボｔ１／２の試験
ＨＳＡ結合アドネクチンがＭｕＳＡと交差反応しないため、マウスにおいてＨＳＡの半減期を、マウスにおいてＨＳＡ結合アドネクチンの評価を可能にするように決定した。ＨＳＡを、２０ｍｇ／ｋｇ（図２３Ａ）および５０ｍｇ／ｋｇ用量（図２３Ｂ）で約６週齢Ｎｃｒ  ｎｕｄｅ  メス  マウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおけるＨＳＡの濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。２０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇでマウスに注射されたＨＳＡのｔ１／２は、それぞれ〜２４時間および〜２０時間であると決定された。
【０２４３】
マウスにおけるＳＡＢＡ１−４の半減期決定
ＨＳＡ結合クローンＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１およびＳＡＢＡ４．１の１リットルの大腸菌培養物を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。それぞれのＳＡＢＡ変異体をマウスの尾静脈に注射し、注射後間隔で採取された血液サンプルにおける濃度をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２４４】
それぞれのＳＡＢＡの薬物動態学プロフィールを、約６週齢のＮｃｒ  ｎｕｄｅ  メス  マウスにおいてＨＳＡの存在または非存在下で比較した。結合クローンはＨＳＡおよびＲｈＳＡに対して選択的であり、マウス血清アルブミンに結合しないため、ＨＳＡを共注入されたマウスは、それぞれのＳＡＢＡ（３−４モル過剰におけるＨＳＡ）と前混合されたＨＳＡを有した。マウス血漿中のＳＡＢＡ１．１（クローン１３１８Ｈ０４）の半減期は０．５６時間であったが、ＨＳＡを共注入されたＳＡＢＡ１．１の半減期は５．６時間であり、半減期において〜１０倍増加した（図２４Ａ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ２．１の半減期は０．２４時間であったが、ＨＳＡを共注入されたＳＡＢＡ２．１の半減期は２．８時間であり、半減期において〜１２倍増加した（図２４Ｂ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ３．１（クローン１２４５Ｈ０７）の半減期は０．２８時間であったが、ＨＳＡを共注入されたＳＡＢＡ３．１の半減期は０．５３時間であり、半減期において〜２倍増加した（図２４Ｃ）。マウス血漿中のＳＡＢＡ４．１の半減期は０．６６時間であったが、ＨＳＡを共注入されたＳＡＢＡ４の半減期は４．６時間であり、半減期において〜７倍増加した（図２４Ｄ）。実施例の要約は図２５に示される。表１６は、ＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１およびＳＡＢＡ５．１に対する同様のデータを要約し；比較は、利用できるときｃｙｎｏにおける半減期にて作成する。
表１６
【表１４２】
0005876034.tif 000143
【０２４５】
カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ５．１の半減期決定
ＳＡＢＡ１．１（図２６Ａ）およびＳＡＢＡ５．１（図２６Ｂ）の概念試験の３週間単回投与試験をカニクイザルにおいて行い、２匹のカニクイザルにおいて１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）のＩＶ投与にて薬物動態学を評価した。薬物動態学は、血漿サンプル中のアドネクチンを検出するために開発された定量ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して評価した。ＳＡＢＡ１．１は、９６−１３７時間（図２６Ａおよび表１７Ａ）の範囲の半減期を有した。ＳＡＢＡ５．１は、約１２時間の半減期を有し、唯一、ＥＬＩＳＡにおいて最大１２０時間測定可能であった（図２６Ｂ）。表１７Ａは、ＳＡＢＡ１．１に対するデータを要約し；表１７Ｂは、ＳＡＢＡ５．１に対するデータを要約する。
表１７Ａ
ＳＡＢＡ１．１
【表１４３】
0005876034.tif 000144
表１７Ｂ
ＳＡＢＡ５．１
【表１４４】
0005876034.tif 000145
【０２４６】
実施例５Ｆ．血清アルブミンへのＳＡＢＡ１結合の特性化
ＳＡＢＡ１．１および１．２はＨＳＡおよびＲｈＳＡに結合する
（ＥＤ）５伸長を含む「コア１」１０Ｆｎ３であるＳＡＢＡ１．２（表６における配列番号：４２１）は、中性ｐＨおよび２５℃で８．２１Ｅ＋０３Ｍ−１ｓ−１の平均会合速度定数（ｋａ）および４．４３Ｅ−０４ｓ−１の平均解離速度定数（ｋｄ）、計算された５５．３ｎＭの平均Ｋｄにてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合した（表１８）。アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）について、測定された平均会合速度定数は６．６Ｅ＋０３Ｍ−１ｓ−１であり、解離速度定数は３．７８Ｅ−０３ｓ−１であり、５８０ｎＭの計算された平均Ｋｄであった。ＳＡＢＡ１．２とマウスまたはラット血清アルブミン間の測定可能な相互作用は、最大１μＭで観察することができなかった（表１８および図２７）。３７℃で、ｋａおよびｋｄは２から５倍増加し、ＨＳＡに対する親和性において〜２倍増加ならびにＲｈＳＡに対する親和性において１／２となった（表１８）。
表１８
ＨＢＳ−Ｐバッファー中のアルブミンへのＳＡＢＡ１．２結合に対する速度論的パラメーター
【表１４５】
0005876034.tif 000146
【０２４７】
さらに、熱量滴定を行い、ＳＡＢＡ１およびＨＳＡ間の化学量論を決定した。本試験において、Ｈｉｓ６伸長を含む「コア」１０Ｆｎ３であるＳＡＢＡ１．１（表６における配列番号：４２０）を使用した。ＨＳＡ（１１５μＭのタンパク質溶液の注射あたり１０μｌ）を８．１μＭの濃度でＳＡＢＡ１．１を含む熱量測定セル(calorimetric cell)に注射した。該実験は、３７℃でＰＢＳバッファーｐＨ７．４中で行った。図２８は、ＳＡＢＡ１．１が１：１化学量論でＨＳＡに結合することを示す。
【０２４８】
ＳＡＢＡ１．２は低ｐＨでＨＳＡに強く結合する
アルブミンの長半減期（例えば、ＨＳＡのｔ１／２は１９日間である）は、主に、エンドソーム内部に存在する低ｐＨ条件下で新生児のＦｃ受容体であるＦｃＲｎに結合することによりエンドサイトーシス経路からリサイクルされるという事実による。表１９に示されるとおり、ＳＡＢＡ１．２は５．５のｐＨでエンドソームにてＨＳＡに強く結合し、ＳＡＢＡ１のｔ１／２は、ＨＳＡに結合すると、また、ＦｃＲｎリサイクルメカニズムから利益を得ることを示唆した。
表１９
ＭＥＳバッファー中のｐＨ７．４および５．５でのアルブミン結合動力学の比較
【表１４６】
0005876034.tif 000147
【０２４９】
ＳＡＢＡ１．２はＨＳＡのドメインＩおよびＩＩに結合するが、ドメインＩＩＩに結合しない
アルブミン上の結合部位ＳＡＢＡ１．２は、組換えＨＳＡフラグメントを使用してＮ−末端ドメインＩまたはＩＩにマッピングされ、ドメインＩＩＩへの検出可能な結合は有さなかった（図２９）。ドメインＩＩＩが主にＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのドメインであるため、ＳＡＢＡ１．２がＦｃＲｎへのＨＳＡ結合に対して競合する可能性は少なく、再び、半減期の延長のためにリサイクルメカニズムを少なくとも利用する可能性を増加させる。
【０２５０】
実施例５Ｇ．ＳＡＢＡ１．２のインビボ薬理学的
ＳＡＢＡ１．２の４週間、単回投与、前毒性試験を、カニクイザルにおいて行い、２つの異なる用量レベルで薬物動態学および免疫原性を評価した。薬物動態学および免疫原性もまた、静脈内および皮下腕投与の両方を含む３週間、単回投与、前毒性試験において評価した。さらに、ＳＡＢＡ１．２の薬物動態学を、血漿サンプル中のＳＡＢＡ１．２を検出するために開発された定量ＥＬＩＳＡベースのアッセイを使用して、カニクイザルにおける２回別々、単回投与、前毒性試験において評価した。
【０２５１】
ＳＡＢＡ１．２を、１ｍｐｋおよび１０ｍｐｋでＩＶでサルに投与した。ＷＩＮＮＯＮＬＩＮ（登録商標）ソフトウェアを使用する非区画分析を行って、薬物動態パラメーターを評価した。図３０および以下に記載されるパラメーターに示されるとおり、ＳＡＢＡ１．２は、濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）評価により決定されるとおり、本試験において用量依存的薬物動態学を示した。１０ｍｐｋでＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は０．１５ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであり、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１４３時間であり、分布容量（Ｖｚ）は３０ｍＬ／ｋｇであり、全薬物暴露（ＡＵＣａｌｌ）は５，６０９，４５７ｈｒ＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表２０）。１ｍｐｋでＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は０．４ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであり、半減期（ｔ１／２）は１２４時間であり、分布容量（Ｖｚ）は７２ｍＬ／ｋｇであり、全薬物暴露（ＡＵＣａｌｌ）は２１４，６３６ｈｒ＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表２０）。
【０２５２】
ＳＡＢＡ１．２のＳＣまたはＩＶ投与後、ベータ相薬物動態学プロフィールは同様であった（図３１）。１ｍｐｋでＩＶでＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は０．２２ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであり、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１２５時間であり、分布容量（Ｖｚ）は４０ｍＬ／ｋｇであり、全薬物暴露（ＡＵＣａｌｌ）は３５７，９９３ｈｒ＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表２０）。１ｍｐｋでＳＣでＳＡＢＡ１．２に対するクリアランス（ＣＬ）は０．３２ｍｌ／ｈｒ／ｋｇであり、ベータ相半減期（ｔ１／２）は１３４時間であり、分布容量（Ｖｚ）は６２ｍＬ／ｋｇであり、全薬物暴露（ＡＵＣａｌｌ）は２５１，３３９ｈｒ＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表２０）。ＩＶと比較してＳＣ相対バイオアベイラビリティ（Ｆ）は０．７であった。
表２０
サルにおけるＳＡＢＡ１．２に対する薬物動態パラメーター
【表１４７】
0005876034.tif 000148
【図１】
0005876034.tif 000149
【図２】
0005876034.tif 000150
【図３−１】
0005876034.tif 000151
【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
0005876034.tif 000154
【図５−１】
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【図５−２】
0005876034.tif 000156
【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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