(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、ここで前記投与剤が第１の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第２の反応性基を含み、該第１及び第２の反応性基が、互いに生体直交反応性であるように選択された生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基の一方がジエノフィルであり、他方がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【化２７】
0005992435.tif 000039
ここで、それぞれのＲは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、アリール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＣＲ’ＮＲ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）からなる群から選択される置換基を示し、ここで２つのＲ部位は一緒になって環を形成してもよく、及びここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｈ、又は、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、及びＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、又は一緒になって結合を形成し、１つのＲは前記それぞれの投与剤又は除去剤へ場合によりスペーサーを介してリンケージを形成し、前記除去剤がさらに、タンパク質、デンドリマー及びポリマーからなる群から選択される足場、ミクロ−又はナノ粒子の粒状足場、及び１以上のヘキソースからなる群から選択される１以上を含む、組合せ。
【請求項２】
請求項１に記載の組合せであり、前記ジエノフィルが、式（１ａ）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【化２８】
0005992435.tif 000040
ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、アリール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＣＲ’ＮＲ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）からなる群から選択される置換基を示し；Ｒ又はＲａの１つが、場合によりスペーサーを介して、前記投与剤又は前記除去剤へのリンカー部位に含まれ；２つのＲ又はＲａ部位が一緒になって環を形成してもよく；及びＲａの少なくとも１つ及び最大４つが水素ではない、組合せ。
【請求項３】
請求項２に記載の組合せであり、前記式（１ａ）のジエノフィルが次の要件の１以上を満たす：
ａ）Ｘはメチルであり；
ｂ）Ｙはメチルであり；
ｃ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキルであり；
ｄ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリールであり；
ｅ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアリールであり；
ｆ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がアルキルである、
組合せ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載の組合せであり、Ｘはメチル又は水素であり、Ｙはメチル又は水素であり、及びＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである、組合せ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組合せであり、前記ジエンが、以下で定義される式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）の化合物からなる群から選択され：
【化２９】
0005992435.tif 000041
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’’（Ｒ’、Ｒ’’、及びＲ’’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢが共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択され；
【化３０】
0005992435.tif 000042
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ，Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化３１】
0005992435.tif 000043
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、ＣＯ、Ｃ−アルキル、ＣＮ−アルキル、Ｎ−アルキル及びＮ−アリールからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化３２】
0005992435.tif 000044
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化３３】
0005992435.tif 000045
ここで、Ｒ１は、Ｈ，アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、ＣＣＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【化３４】
0005992435.tif 000046
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニルからなる群から選択される置換基を示し，これらは場合によりＮＯ２、Ｆ，Ｃｌ，ＣＦ３，ＣＮ，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＣＯＮＲ２，ＣＨＯ，ＣＯＲ，ＳＯ２Ｒ，ＳＯ２ＯＲ，ＮＯ，Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換される（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニル、ピリジル又はナフチルを表す）、組合せ。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、プライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤が、ターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
【請求項８】
生体直交反応性基及び１以上のヘキソースを含む、請求項１乃至５のいずれか一項に定義されたとおりの投与剤を除去するための除去剤であり、前記生体直交反応性基が、請求項１乃至５のいずれか一項に定義されたとおりのジエン又はジエノフィルである、除去剤。
【請求項９】
請求項８に記載の除去剤であり、前記ヘキソースがガラクトース部位である、除去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象体の循環から生体分子を除去するための除去剤、例えばターゲット薬物治療、ターゲット造影、プレターゲットなどの目的で該対象体へ投与される除去剤に関する。本発明は特に、プレターゲット方法に使用するための除去剤に関する。本発明はまた、ターゲット部位の循環する分画、又は事前に投与された治療剤又は造影剤を捕捉するなどの、循環から生体分子を除去するための除去剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学診断及び治療の多くの分野において、患者などの対象体の身体の特定の位置又は限定された領域へ、治療薬（医薬）又は診断薬（例えば造影剤）などの剤を選択的に輸送することが望まれている。
【０００３】
器官又は組織の積極的ターゲットは、望ましい活性部位（例えばコントラスト増強剤（contrast  enhancing  agent）又は細胞毒性化合物）をターゲット構成物に直接又は間接的抱合させることで達成され、これは細胞表面に結合し、又は興味対象の標的位置での又は近くでの、細胞内取り込みを促進するものである。かかる剤をターゲットするために使用される前記ターゲット部位は典型的には、細胞表面ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）、又は細胞内ターゲット（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル伝達経路）への親和性を持つ構造を持つ。これらの部位は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖類、同じくペプチド、ペプトイド及び特定の疾患又は障害において蓄積される知られた有機医薬化合物であり得る。又は、コントラスト／治療剤は、代謝経路をターゲットすることができ、これは疾患（感染又は癌などのもの）の際にアップレギュレートされる、例えばＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物取り込みなどである。疾患組織では、上記マーカーは、疾患細胞と正常細胞を識別し、早期発見、特定診断及び（ターゲット）治療のための独自の可能性を提供する。
【０００４】
一般的に、成功を収める分子造影／治療剤及び、特に核造影／治療剤の重要な基準は、それらが高いターゲット取り込みを示す一方で、（腎臓／肝胆道系を通じた）非ターゲット組織から及び血液からの迅速な除去を示す、ことである。しかし、これはしばしば問題を生じる：例えば、ヒトにおける造影研究では、腫瘍位置で放射性ラベルされた抗体の最大濃度は２４時間以内に達成され得るが、循環で前記ラベルされた抗体の濃度が、造影をうまく行うために十分に低濃度となるまでさらに数日を要することが示された。
【０００５】
ターゲット組織における、遅い又は不十分な蓄積及び非ターゲット領域からの除去が遅いという（特に核造影及び治療についての）これらの問題は、プレターゲットアプローチの応用につながる。
【０００６】
プレターゲットは、ターゲット方法におけるひとつのステップを指し、ここではプライマリーターゲット（例えば細胞表面）がプレターゲットプローブに設けられる。後者はセカンダリーターゲットを含み、これは最終的に、セカンダリーターゲット部位を備えるさらなるプローブ（エフェクタープローブ）によりターゲットされるであろう。
【０００７】
従って、プレターゲットでは、プレターゲットプローブが、プライマリーターゲットへ結合される。前記プレターゲットプローブはまた、セカンダリーターゲット（以下「タグ」と称される場合がある）を担持し、これは診断（造影）及び／又は治療剤である、前記エフェクタープローブへ特異的抱合を促進する。前記プレターゲットプローブを形成する前記構造が前記ターゲット位置で局在化された（例えば２４時間）後、過剰な前記プレターゲットプローブは前記血液から除去される必要がある。
【０００８】
自然除去はしばしば不十分であるので、除去剤の使用が望まれる。除去剤は、循環から、それらを特定の器官又は組織へ方向付けることで化合物を除去するように作用する。従って、一般的に、除去剤は、前記レシピエントの循環に存在する投与された部位（例えば、ターゲット部位−リガンド、ターゲット部位−抗リガンド又は抗リガンドのみ）と結合、複合体化又は関連付けられることの可能な剤であり、それにより、前記レシピエントの体内から循環部位除去、血液循環からの除去又は循環中のそれらの不活性化を促進する。前記除去剤は好ましくは、サイズ、電荷、立体配置又はそれらの組合せなどの物性により特徴付けられ、これにより、前記除去剤と同様の処理手順で使用されるターゲット部位により認識されるターゲット細胞の集団へ除去剤がアクセスすることを低減させる。典型的には、除去剤は前記プレターゲット抗体に結合する。又は、ターゲット細胞へアクセスすることが可能となる前に循環により単に迅速に除去する除去剤を提供することが望ましい（it  would  be  desired  to  provide  clearing  agents  that  by  mere  rapid  clearance  from  circulation  prior  to  being  able  to  access  a  target  cell）。この目的で、迅速に反応できる（除去される生体分子と高い反応速度を示す）除去剤を提供することが望ましい。
【０００９】
米国特許出願公開第２００３／０１２９１９１号には、リガンド誘導体又は抗リガンド誘導体を導入する除去剤が開示されている。ここでは本質的に、かかる誘導体は、前記化合物の天然形態より、前記相補的リガンド／抗リガンド対メンバー（pair  member）に対して低い親和性を示す。従って、ビオチン−アビジン又はビオチン−ストレプトアビジンリガンド／抗リガンド対が適用される場合、前記除去剤は、ビオチン又はアビジンよりもより低いアビジン又はストレプトアビジンへの親和性を示すビオチン誘導体、又はアビジン又はストレプトアビジンよりもより低いビオチンへの親和性を示すストレプトアビジン誘導体のいずれかを導入する。
【００１０】
Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．、Ｅｄ２０１０、４９、ｐ．３３７５−３３７８」は、逆電子要求ディールスアルダー反応を用いる腫瘍プレターゲットに関する。
【００１１】
国際公開第２０１０／１１９３８２Ａ１号及び２０１０／１１９３８９Ａ２号は、プレターゲットプローブ及びエフェクタープローブ間のカップリングの提供における［４＋２］逆電子要求（レトロ）ディールスアルダー化学を使用することを含むプレターゲット方法に関する。
【００１２】
米国特許第７０５２８７２Ｂ１号は、ターゲット組織に特異的に結合する少なくとも１つの腕及びターゲット可能抱合体に特異的に結合する少なくとも１つの腕を持つ二重特異的抗体又は抗体断片に関する。
【００１３】
米国特許第５、９６５、１３１Ａ号は、ターゲット位置へ診断剤又は治療剤を輸送するプレターゲット方法に関し、前記方法は、前記ターゲット種のターゲット結合位置に結合する除去剤を用い、抗イデオタイプ抗体及び抗体断片が好ましい除去剤である。
【００１４】
さらに、現在のプレターゲットシステムはそれらの生物学的性質に関連する因子に阻害されている。ビオチンは内因性分子であり、その抱合体は血清ビオチニダ−ゼ酵素により開裂され得る。アンチセンスプレターゲットを使用する場合、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡ分解酵素及びＤＮＡ分解酵素に攻撃される対象とされ得る。タンパク質及びペプチドはまた、天然分解経路の対象とされる。これらの相互作用はさらに、その非共有結合性及び動態性及び制限されたターゲット上のレジデンスタイム（滞留時間）により損なわれる。また、内因性ビオチンは、ストレプトアビジン結合でのビオチン抱合体と競合する。最後にストレプトアビジンは高度に免疫原性である。
【００１５】
さらに、ターゲットの造影は、時には、該ターゲットの循環する分画で阻害され、造影剤を、望ましい位置（遺伝子座）に前記ターゲットを到達させる前に前記造影剤を捕捉する。望ましいことは、かかる循環するターゲットが前記造影剤を投与する前に除去され得るシステムが提供されることである。また、他の状況、例えば治療として、循環から生体分子を除去することが望まれ得る。例えば、治療が、ある腫瘍の細胞外マトリクスで、しかしまた血清中で生じるＭＭＰ−２（マトリクス金属プロテイナーゼ−２）などの酵素との相互作用を対象とする場合、除去という概念が望まれるであろう。
【００１６】
他の例はＣＥＡ（癌胎児性抗原）であり、これは、放射線免疫治療の（プレ）ターゲットのターゲットであり、またこれは血清中に生じ、そこで放射性活性を捕捉するであろう。
他の例は、抗体指向酵素プロドラッグ治療（Antibody  Directed  Enzyme  Prodrug  Therapy）（ＡＤＥＰＴ）のために使用される抗体抱合体であり、ここで、あらゆる抗体抱合体を、前記プロドラッグ投与の前に循環から除去することが有利であろう。除去アプローチにより有利であり得る他の治療剤は、抗体−薬剤抱合体である。これらの抱合体は、長時間循環するが、高い毒性薬物を含み、高安定性であるために抱合リンカーを必要とする。除去剤の使用は、あらゆる遊離の抗体医薬抱合体を、十分な量が腫瘍に結合した後循環から除去することを可能にする。
【００１７】
望まれることは、多用途であり、循環から除去されるべき投与された部位へ迅速に結合され、かつプレターゲットアプローチで使用可能であると考えられる、除去剤の概念が見出されることである。
【００１８】
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１２９１９１号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１０／１１９３８２Ａ１号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１０／１１９３８９Ａ２明細書
【特許文献４】米国特許第７０５２８７２Ｂ１号明細書
【特許文献５】米国特許第５９６５１３１Ａ号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｒｏｓｓｉｎｅｔａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  ２０１０、４９、ｐ．３３７５−３３７８
【発明の概要】
【００２１】
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の目的及び要約
従って、上記除去剤への高い要求を満たす新規な除去剤を提供するための強い必要性が存在する。本発明は、とりわけ、ここで説明される除去剤が、例えば腫瘍などの前記ターゲットには迅速に反応することなく、迅速に血液中で反応して、それにより以下で定義されるであろうＴＣＯなどのターゲット結合分子を、前記プレターゲットプローブとの反応のために遊離させる、という認識に基づく。前記の１以上の要求により良好に対処するために、本発明は、１つの側面で、対象体に投与されるべき投与剤と、同じ対象体へ投与されて前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せを提供し、ここで前記投与剤が第１の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第２の反応性基を含み、該第１及び第２の反応性基が、互いに生体直交反応性（bio−orthogonally  reactive）であるように選択された生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基のいずれかがジエノフィルであり、他の基がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【００２３】
【化１】
0005992435.tif 000002
ここで、それぞれのＲは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、アリール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＣＲ’ＮＲ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、からなる群から選択される置換基を示し、ここで２つのＲ部位は一緒になって環を形成してもよく、及びここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｈ、又は、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、及びＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）からなる群から選択される置換基示し、又は一緒になって結合を形成し、１つのＲは前記それぞれの投与剤又は除去剤へ場合によりスペーサーを介してリンケージ（linkage）を形成する。
【００２４】
本発明は、他の側面では、ターゲット医学造影及び／又は治療のためのキットを提供し、これは、少なくとも１つのプレターゲットプローブ及び少なくとも１つのエフェクタープローブを含み、前記プレターゲットプローブが、プライマリーターゲット部位と第１の生体直交性反応性基を含み、及び前記エフェクタープローブが、ラベル又は薬学的活性化合物などのエフェクター部位と、第２の生体直交性反応性基を含み、前記第２の生体直交性反応性基が、前記第１の生体直交性反応性基に対して反応性を有し、前記キットがさらに、前記第１の生体直交性反応性基に対して生体直交的反応性を有する反応基を持つ除去剤を含む。
【００２５】
さらに他の側面では、本発明は、対象体へ投与されるべき投与剤及び前記投与剤を該対象体の循環から除去するための除去剤を提供するための、生体直交性反応対の使用にある。
【００２６】
さらに他の側面では、本発明は、１以上のヘキソース部位及びジエン部位を持つ化合物を含む除去剤に関する。
【００２７】
さらに他の側面では、本発明は、１以上のヘキソース部位及びジエノフィル部位を持つ化合物を含む除去剤に関する。
【００２８】
さらに他の側面では、本発明は、動物又はヒト対象体の中の循環から生体分子を除去するための方法を提供するものであり、前記方法は、投与剤及び除去剤を投与することを含み、前記投与剤は第１の反応性基を含み、かつ前記除去剤は第２の反応性基を含み、該第１の反応性基及び第２の反応性基が、互いに生体直交的反応性であるように選択される。さらなる側面に関連して、本発明は、上で定めた投与剤及び除去剤の、動物又はヒト対象体中の循環から生体分子を除去するための使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、上で説明したプレターゲットの概念を一般的スキームに示す。
【図２】図２は、（３、６）−ジ−（２−ピリジル）−ｓ−テトラジン及びＥ−シクロオクテン間の［４＋２］ディールスアルダー反応と、それに続く、生成物と二窒素が形成されるレトロディールスアルダー反応のスキームを提供する。このタイプのディールスアルダー反応は、しばしば、「逆電子要求ディールスアルダー反応」と称される。以下の説明において、連続した両方の反応ステップ、即ち最初のディールスアルダー環化付加（通常、逆電子要求ディールスアルダー環化付加反応）及び続くレトロディールスアルダー反応は、省略して「レトロディールスアルダー反応」又は「レトロ−ＤＡ」と称される。
【図３】図３は、プレターゲットの概念の一般的スキームを示し、１）では、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）−タグ（即ち、トランスシクロオクテン）が循環中で分配され、腫瘍に蓄積され、次に２）では、前記循環するｍＡｂ−タグが、レトロ−ＤＡ反応により、ガラクトース部位を持つ足場構造及び相補的タグ（例えば、テトラジン）を含む除去剤と反応し、アシュウェル（Ashwell）レセプターを介して肝臓で捕捉され、次に３）では、前記相補的タグ（例えばテトラジン）を担持する放射性プレターゲットエフェクターが注入され、及び４）で、前記エフェクターが、レトロ−ＤＡ反応により、腫瘍内の前記ｍＡｂ−タグと反応し、又は迅速に循環から除去される。
【図４】図４は、実施例で言及される化合物の合成経路及び化学構造を示す。
【図５】図５は、実施例で言及される化合物の合成経路及び化学構造を示す。
【図６】図６は、実施例で言及される化合物の合成経路及び化学構造を示す。
【図７】図７は、実施例で言及される化合物の合成経路及び化学構造を示す。
【図８】図８は、放射性−ＩＴＬＣを示し、（Ａ）は粗生成物及び（Ｂ）は精製１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ、（Ｃ）は放射性及び（Ｄ）は粗生成物及び精製１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯのタンパク質染色された（protein  stained）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び（Ｅ）は精製１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの放射性及びＵＶ  ＳＥＣ−ＨＰＬＣプロフィル（２６０ｎｍ及び２８０ｎｍ）を示す。
【図９】図９は、実施例５からの正常マウス中の１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの血液プロフィルを示す。データポイントは、平均％ＩＤ／ｇであり、誤差バーは１標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図１０】図１０は実施例５からの、（Ａ）ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）の投与、及び（Ｂ）ＢＳＡ−テトラジン（１４）でコーティングされたポリスチレンビーズの投与の前後での、正常マウス中の１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの血液プロフィルを示す。データポイントは、平均％ＩＤ／ｇであり、誤差バーは１標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図１１】図１１は、実施例５からの、（Ａ）ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）の投与、及び（Ｂ）ＢＳＡ−テトラジン（１４）でコーティングされたポリスチレンビーズの投与の後での選択された器官での１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの生体内分布を示す。バーは、平均％ＩＤ／ｇであり、誤差バーは１標準偏差を表す（ｎ＝３）。
【図１２】図１２は、実施例６からの、１００μｇ  ＣＣ４９−ＴＣＯを投与され、続いてガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）の種々の量を投与された腫瘍保持マウス中での１１１Ｉｎ−テトラジンの生体内分布を示す。バーは、平均％ＩＤ／ｇを示し、誤差バーは１標準偏差を表す（ｎ＝３から４）。
【図１３】図１３は、ＴＣＯ（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（シクロオクタ−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート１８の合成経路を示す。
【図１４】図１４は、ＴＣＯマイナー（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（（シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ）アセテート２０の合成経路を示す。
【図１５】図１５は、腫瘍保持マウス中の（Ａ）１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９及び（Ｂ）ＣＣ４９−ＴＣＯ１８プレターゲット１７７Ｌｕ−テトラジン１５の血液プロフィルを示す。データポイント及び誤差バーは、平均％ＩＤ／ｇ、１標準偏差をそれぞれ表す（ｎ＝４）。
【図１６】図１６は、腫瘍保持マウス中の１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９及びＣＣ４９−ＴＣＯ−１８プレターゲット１７７Ｌｕ−テトラジン１５の排泄プロフィル（糞及び尿を合わせた）を示す。データポイント及び誤差バーは、平均％ＩＤ／ｇ及び１標準偏差をそれぞれ表す（ｎ＝４）。
【図１７】図１７は、ＰＰＩ−Ｇ１−（ガラクトース）２−（テトラジン）２（２３）の合成経路を示す。
【図１８】図１８は、ＰＰＩ−Ｇ３−（ガラクトース）１２−（テトラジン）４（２６）の合成経路を示す。
【図１９】図１９は、ＰＰＩ−Ｇ５−（ガラクトース）１２−（テトラジン）４（２９）の合成経路を示す。
【００３０】
広い意味で、本発明は、生体直交性化学（現代的プレターゲット概念の統合など）が、基本的にあらゆる結合可能な分子を動物、好ましくヒト対象体中の循環から除去するために使用され得るという賢明な認識に関する。結合可能分子は、一般的に生化学性又は有機性分子のあらゆる分子として理解されるべきであり、それにバインダー又はリガンド（抗体を含む）が提供され得る。結合可能分子は循環中に既に存在している分子（タンパク質の循環画分など）であり得る。または、体内で作用する目的で投与された分子（プレターゲットプローブなど）であり得、及びその過剰分が循環から除去されるべきものである。
【００３１】
本発明は１つの側面において、かかるリガンドを第１の生体直交性反応性基を含む投与剤を介して投与し、続いて第２の生体直交性反応性基を含む除去剤を投与する概念を表し、該基は互いに生体直交的に反応することが可能である。
【００３２】
本発明は、投与剤及び除去剤の組合せを提供する。用語「組合せ」とは、広い意味で理解されるべきであり、両方の成分を含むキットに限定されるものではない。従って、前記投与剤及び除去剤は、互いに完全に別々に提供され得る。理解されるべきことは、前記除去剤の機能は、投与剤との組合せで作用する、ということである。
【００３３】
本発明の投与剤は、対象体へ投与される剤、化合物又は部位であり、循環からのその除去が望まれる。この除去は、前記投与剤自体の除去（除去されることが望ましい過剰なプレターゲット剤など）又は、前記投与剤及び循環している生体分子（かかるターゲットの結合画分の造影を阻害する生体ターゲットの循環画分など）により形成される抱合体の除去に関連し得る。従って、いくつかの実施態様では、投与剤は、体内のある位置、例えば腫瘍へターゲットされる目的のために投与されるものであり、その後循環する過剰な前記剤は除去されなければならない。他の実施態様では、投与剤は、造影されるべきターゲットの循環画分を捕捉する目的、又は局所治療を輸送する目的で投与され、これにより非循環の実際の（例えば腫瘍細胞結合）ターゲットが造影されるか、前記ターゲットされた治療剤が輸送される前に、この循環画分が除去される。この実施態様では、前記投与剤は、プレターゲットのステップを必要としないが、それ自体が造影されるべきターゲットのためのリガンドを含み得る。前記投与剤はまた、ターゲット造影又は治療のための剤であり、例えば抗体−医薬抱合体（即ち、必ずしもプレターゲットを含まない）である。例えば、注入される注入可能な放射性ラベルされたｍＡｂは循環し、及び（部分的に）腫瘍に結合し、続いて除去剤が注入されて、これにより放射性ｍＡｂを肝臓へ輸送する。
【００３４】
除去剤は、除去されるべき投与剤に結合又は複合体化させる目的のために対象体に投与される剤であり、これは、循環から除去されるように方向づけられ得る。後者は一般的に、肝臓レセプター系機構を通じて達成されるが、循環から分泌される他の機構も存在する。
【００３５】
広い意味で、本発明は、生体直交反応性対が、投与された剤を循環から除去する目的で使用され得るという認識に基づく。この目的のため、前記投与剤は、反応性基を持ち、これは相補的（生体直交的に）反応性基と生体直交性反応を行うことが可能である。後者は、（特に以下説明する）除去剤中に存在する。
【００３６】
生体直交性化学が、循環から除去する目的のために使用可能であるという認識は、幅広い可能性を開くこととなる。事実、投与されるべきあらゆる剤、薬物又は造影剤などは、生体直交性反応基の形態でタグを提供されている。そして、循環からの除去に影響することができるあらゆる剤は、生体直交性反応基の形態で相補的タグを提供され得、これは該第１の反応性基と生体直交性反応を行うことができるものである。
【００３７】
循環から投与された剤を除去するという概念は、一般的に、ターゲット治療及びターゲット造影に関連し、特にプレターゲットアプローチに関連する。
【００３８】
本発明はさらに、具体的な実施態様に関して説明され、かつ特定の図面を参照して説明されるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲により限定されるものである。特許請求の範囲中のいかなる参照符号も、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。記載された図面は単なる図解であり、なんらを限定するものではない。図面において、いくつかの要素のサイズは誇張されている可能性があり、説明目的のために寸法通りに描かれているものではない。用語「含む」は、本発明の説明及び特許請求の範囲で使用される場合には、他の要素又はステップを排除するものではない。単数を示す不定冠詞「１つの」、「ひとつの」は、特に記載がない限り、複数を含む。
【００３９】
さらに留意すべきことは、詳細な説明及び特許請求の範囲で使用される用語「含む」は、続いて列挙される手段に限定されるものとして解釈されてはならず、他の要素又はステップを排除するものではない。従って、「手段Ａ及びＢを含む装置」なる表現の範囲は、部品Ａ及びＢのみからなる装置に限定されてはならない。本発明に関しては、これは、前記装置の単に関連する部品（the  only  relevant  components  of  the  device）がＡ及びＢである、ということを意味する。
【００４０】
いくつかの化学式で、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この観点で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、Ｏ、Ｎ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０までの、好ましくは１〜６の炭素原子の、脂肪族、直鎖、分岐又は環状アルキル基を示し、「アリール」とは、それぞれ独立して、Ｎ又はＳなどの１〜３のヘテロ原子を含み得る、炭素原子１０までの芳香族又はヘテロ芳香族基を示す。いくつかの式で、基又は置換基は、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」などの文字、及び種々の番号が付された「Ｒ」基を参照して示される。これらの文字の定義は、それぞれの式を参照して読まれるべきであり、即ち特に記載のない限り異なる式ではこれらの文字はそれぞれ独立して異なる意味を持ち得る。
【００４１】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、以下いくつかの化学式において、「アルキル」及び「アリール」が参照される。この点で、「アルキル」とは、それぞれ独立して、１〜１０のＯ、Ｎ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る、１０までの炭素原子の、脂肪族、直鎖、分岐、飽和、不飽和及び／又は環状ヒドロカルビル基を示し、及び「アリール」とは、それぞれ独立して、置換され得、１〜１０のＯ、Ｎ、Ｐ又はＳなどのヘテロ原子を含み得る、２０炭素原子までの芳香族又はヘテロ芳香族基を示す。「アリール」基はまた、「アルキルアリール」又は「アリールアルキル」基（簡易例：ベンジル基）を含む。「アルキル」、「アリール」、「アルキルアリール」及び「アリールアルキル」が含む炭素原子の数は、かかる用語に先行する指定用語により示され得る（即ち、Ｃ１〜１０アルキルとは、該アルキルが炭素原子を１〜１０含み得る、ということを意味する）。本発明のいくつかの化合物は、キラル中心及び／又は互変異性体を含み、全てのエナンチオマー、ジアステレオマー及び互変異性体及びそれらの混合物は本発明の範囲に含まれる。
【００４２】
投与剤
本発明の除去の概念は、以前に投与された投与剤の循環からの除去のために妥当である。前記投与剤は、循環から過剰分が除去されることが望ましいあらゆる剤であり得る。これは特には、対象体、とりわけヒト対象体の体内の腫瘍などの位置に薬物又は造影剤をターゲット輸送するイベントの場合である。本発明においては、前記投与剤がどの機能又は化学的構造を有するということが、いかなる特別の役割を担うものではない。唯一の要件は、生体直交性反応基が提供される、ということである。前記生体直交性反応基の前記投与剤との正確なリンケージは、両方の分子構造に依存するであろうが、留意すべきことは、種々の生体分子について多くの知られた結合部位が存在するので、これは通常当業者にとって特定の課題を表すものではないということである。前記リンケージは、場合により、２から２００、特には３から１１３及び好ましくは５から５０の繰り返し単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖などのスペーサーを介することも可能である。
【００４３】
好ましい実施態様では、前記投与剤は、治療剤又は造影剤などのプレターゲット輸送で使用されるとおりのプレターゲットプローブである。ここで、前記投与剤に添加される反応官能性、即ち、一対の生体直交性反応物の前記生体直交性反応性基のいずれかが、循環からの除去及びそれに続くエフェクタープローブのプレターゲットプローブへの付加の機能を持つ。
【００４４】
なお他の好ましい実施態様では、前記投与剤は、循環に既に存在する生体分子のためのリガンドを含む。これは、例えば、造影されるべきタンパク質ターゲットへのためのモノクローナル抗体を、又は局所薬物治療が施されるものを意味する。留意されるべきは、一般的に、これは広い範囲の生体ターゲット、及び当業者に知られる対応するリガンドへ応用可能である、ということである。
【００４５】
なおさらなる実施態様では、前記投与剤は、ターゲットされるべきターゲット部位（抗体など）及び薬物（又は造影剤）の抱合体を含む。
【００４６】
除去剤
除去剤は、その最小成分として、除去目的成分及び結合成分を含む。前記結合成分は、上記で説明した生体直交性反応基である。前記除去目的成分は、前記捕捉された投与剤を排出器官へ指向することで循環からの除去を保証する。
【００４７】
本発明の前記除去剤は、血液中で比較的短時間循環するが、前記循環を放出される前に血液中で前記残留する投与剤（モノクローナル抗体タグなど）と結合するために十分な反応性を有する。それらは、例えば腫瘍結合ｍＡｂ−タグと反応する十分な時間又は機会を有さず、これはサイズによるか、又は肝臓ヘキソースレセプターとの相互作用によるものであり、又はそれらが循環から放出される速度の結果としてのものである。
【００４８】
場合により、造影可能なシグナルを生成することが可能な除去剤が使用され得る。従って、非侵襲造影化技術が、対象体の体内中で前記除去剤の分布をモニターするために使用され得る。
【００４９】
前記除去剤は、一般的に、それ自体が、既に投与された投与剤に、その望ましい位置で結合されることを防止する（即ち、前記除去剤は投与剤の循環する過剰分と結合し、実質的にはそのターゲット種には結合しないであろう）ように作用するようなサイズ、立体配置、電荷又はこれらの性質の組合せを持つであろう。この目的で、前記除去剤は一般的に足場構造を含む。好適な足場構造は、当業者に知られており、例えばタンパク質、デンドリマー及び高分子量ポリマーなどである。他の好ましい除去剤は生体直交性反応基で変性された、ナノ又はミクロ粒子足場構造を含み、例えばリポソーム又はポリマーソーム、脂質又はポリマー又はタンパク質殻バブル、脂質又はポリマー又はタンパク質粒子、鉄酸化物又は金又はシリカ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、ヨウ素化合物で充填されたカプセル又は他のナノ及びミクロ構造などである。前記粒子自体は除去目的基として機能する。
【００５０】
好ましい除去剤は、ヘキソース系及び非ヘキソース系部位を持つ。ヘキソース系除去剤は、アシュウェルレセプター、又は肝細胞、内皮細胞及び／又は肝臓のクプファ−細胞に関連する前記マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミンレセプター又は前記マンノース６−フォスフェートレセプターなどのその他のレセプターにより認識される１以上のヘキソース（６炭糖部位）を導入するために誘導体化された分子である。
【００５１】
かかるヘキソースの例示は、ガラクトース、マンノース、マンノース−６−フォスフェート、Ｎ−アセチルグルコサミン、ペンタマンノシルフォスフェートなどである。グルコース、Ｎ−ガラクトースアミン、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、ペンタマンノシルフォスフェート、ガラクトースのチオグリコシド及び一般的にＤ−ガタクトシド及びグルコシドなどを含む、アシュウェルレセプターにより認識される他の部位もまた、本発明の実施に使用され得る。ガラクトースは、この説明の目的のための原型的な除去剤ヘキソース誘導体である。タンパク質へのガラクトースチオグリコシド抱合体は、好ましくは、Ｌｅｅらの「２−Ｉｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ  １−Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ：Ｎｅｗ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ａｔｔａｃｈｉｎｇ  Ｓｕｇａｒｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５（１８）：３９５６、１９７６）」の教示に広く類似する手法に従って達成される。他の有用なガラクトースチオグリコシド抱合方法は、Ｄｒａｎｔｚらの「Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｉｖｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ」（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５（１８）：３９６３、１９７６）」に説明されている。
【００５２】
生体直交性反応基
本発明は、一般的に、互いに生体直交性反応性を示す非生物的反応性化学基の全ての対へ適用可能である。生体直交性反応は、生理的条件下で起こり、ここで、前記生体直交性反応性基は互いのみを認識し、一方それらの細胞的／生理学的環境を無視する。
【００５３】
かかる反応の例は広い範囲にわたり、急速に進展している。最近の進展はスタウジンガーライゲーション（Staudinger  ligation）であり、即ち反応相手がアジド及びホスフィンである。ターゲットされる医学的造影及び／又は治療のためのプレターゲット方法での使用のために、これは国際公開第２００６／０３８１８５号に記載されている。他の例は、前記［３＋２］アジド−アルキン環化付加反応であり、これは国際公開第２００７／０３９８５８号に記載されており、「クリック化学」としても知られている。他のタイプのカップリング化学は、「ＮｅａｌＫ．Ｄｅｖａｒａｊ、ＲａｌｐｈＷｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、ａｎｄ  ＳｃｏｔｔＨｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００８、１９、２２９７−２２９９」により記載されている。これは、生体細胞ラベルへの生体直交性テトラジン環化付加の適用に関する。ここで前記反応相手は、３−（ｐ−ベンジルアミノ）−１、２、４、５−テトラジン及びノルボルネン、即ち（１Ｓ、２Ｓ、４Ｓ）−ビシクロ［２、２、１］ヘプタ−５−エン−２−イル酢酸であり、これはディールスアルダー環化付加を行い、次にレトロディールスアルダー反応を行い、二窒素（Ｎ２）を放出する。このカップリング化学はまた、逆電子要求ディールスアルダー反応と称される。これらの他の例示は、国際公開第２０１０／０５１５３０号に記載されており、ここでプレターゲットは、テトラジンなどの特定のジエン及びｔｒａｎｓ−シクロオクテノール（ＴＣＯ）などのジエノフィルとの間の反応性に基づいて検討される。前記逆電子要求ディールスアルダー反応（又は「レトロディールスアルダー反応」）及び反応種の対の挙動についての他の参照文献には：「Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４」；「Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５」；「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ；Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ＯｆＴｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９）」；「Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．ＲｅｎａｒｔＶｅｒｋｅｒｋ、ＳａｎｄｒａＭ．ｖａｎｄｅｎＢｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、ｌ．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ２０１０、４９、３３７５−７８」；「Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ、Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ、Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ、Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ、Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ２００９、４８、７０１３」及び「Ｄｅｖａｒａｊｅｔａｌ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００９、４８、１−５」が含まれる。
【００５４】
前記投与剤は、生体直交性反応基対を形成する前記２つの生体直交性反応基のいずれかを持ち、前記除去剤はかかる対の他方を持つであろう、ということが理解されるであろう。前記除去剤の好ましい使用において、第１のプレターゲットプローブが投与される。最終的には、前記プレターゲットプローブにその望ましい位置（例えば、腫瘍細胞）で反応するように作用する、エフェクタープローブが投与されるであろう。前記エフェクタープローブ上の及び前記除去剤上の前記反応基は、同一でも異なっていてもよいが、前記プレターゲットプローブの前記生体直交性反応基に対しての反応性は変わらないであろう。例えば、前記プレターゲットプローブがジエノフィルを含む場合、前記除去剤および前記エフェクタープローブの両方はジエンを含むであろうが、これらのジエンは必ずしも同一ではない。
【００５５】
好ましくは、前記投与剤及び前記除去剤は、生体直交性［４＋２］環化付加が可能であるように選択される。より好ましくは、両方の剤は互いに、「レトロディールスアルダー反応」を介して反応する。
【００５６】
前記レトロディールスアルダーカップリング化学は一般的には、１対の反応物を含み、これらはカップリングして不安定な中間体を形成し、前記中間体はレトロディールスアルダー反応による唯一の副生成物として小分子（これは出発物質に依存し、例えばＮ２、ＣＯ２、ＲＣＮなどである）を除去して安定な生成物を形成する。前記一対の反応物は、１つの反応物（即ち１つの生体直交反応性基）として、テトラジンの誘導体などを、及び他方の反応物（即ち他の生体直交反応性基）として、以下の式（１）によりシクロオクテン又はシクロオクチンを含む。
【００５７】
例えば電子欠乏性（置換）テトラジンと、例えば歪（strained）Ｅ−シクロオクテンとの例外的に速い反応により、ライゲーション中間体（ligation  intermediate）がもたらされ、これは、Ｎ２を［４＋２］レトロディールスアルダー環化付加での唯一の副生成物として除去することで安定なジヒドロピリダジンへ転位する（rearrange）。これは図２に示される。
【００５８】
この２つの反応種は非生物的であり、従ってインビボでの迅速な代謝を受けない。これらは生体直交性であり、例えば選択的に互いと生理的媒体中で反応する。逆電子要求ディールスアルダー反応及び反応種の挙動についての参考文献には：「Ｔｈａｌｈａｍｍｅｒ、Ｆ；Ｗａｌｌｆａｈｒｅｒ、Ｕ；Ｓａｕｅｒ、Ｊ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９０、３１（４７）、６８５１−６８５４」；「Ｗｉｊｎｅｎ、ＪＷ；Ｚａｖａｒｉｓｅ、Ｓ；Ｅｎｇｂｅｒｔｓ、ＪＢＦＮ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、６１、２００１−２００５」；「Ｂｌａｃｋｍａｎ、ＭＬ；Ｒｏｙｚｅｎ、Ｍ」；及び「Ｆｏｘ、ＪＭ、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００８、１３０（４１）、１３５１８−１９」が含まれる。
【００５９】
本発明の好ましい典型的実施態様によれば、前記生体直交性反応基のいずれかがジエノフィルであり、他方がジエンであり、ここで前記ジエノフィルが８員環ジエノフィルであって式（１）を満たすものである：
【００６０】
【化２】
0005992435.tif 000003
ここで、それぞれのＲは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、アリール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＣＲ’ＮＲ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、からなる群から選択される置換基を示し、ここで２つのＲ部位は一緒になって環を形成してもよく、及びここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｈ、又は、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、及びＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、又は一緒になって結合を形成してもよい。ここで、１つのＲは、前記投与剤の機能的成分又は前記除去剤の機能的成分へ、場合によりスペーサーを介してリンケージを形成するであろう。前者の場合、これは典型的には、プレターゲットプローブへリンケージを含み、後者の場合は除去目的部位へのリンケージであろう。
【００６１】
当業者は、前記レトロディールスアルダー反応で反応性である豊富なジエンを認識する。
【００６２】
好ましくはジエンは、式（２）から（７）を参照して以下に示される。
【００６３】
【化３】
0005992435.tif 000004
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’’Ｒ’’’（ここで、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’、Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（ここで、Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）からなる群から選択される。
【００６４】
シクロオクテンの反応相手として特に好適なジエンは：
【００６５】
【化４】
0005992435.tif 000005
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；
Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯ又はＳであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ，Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００６６】
シクロオクチンの反応相手として特に好ましい同様のジエンは：
【００６７】
【化５】
0005992435.tif 000006
であり、ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、ＣＯ、Ｃ−アルキル、ＣＮ−アルキル、Ｎ−アルキル及びＮ−アリールからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００６８】
シクロオクテンの反応相手として特に好ましい他のジエンは：
【００６９】
【化６】
0005992435.tif 000007
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＦ３、ＣＦ２−Ｒ’、ＮＯ２、ＯＲ’、ＳＲ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ’’’、ＯＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、ＳＣ（＝Ｓ）Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）Ｒ’、Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ’’、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＳＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲ’Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＳ（＝Ｏ）２Ｒ’’’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｏ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｓ）Ｓ−Ｒ’、ＣＣ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、ＣＣ（＝Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’（ここでＲ’及びＲ’’はそれぞれ独立してＨ、アリール又はアルキルであり、Ｒ’’’は独立してアリール又はアルキル）からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００７０】
シクロオクチンの反応相手として特に好ましい同様のジエンは：
【００７１】
【化７】
0005992435.tif 000008
であり、ここで、Ｒ１は、Ｈ，アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；
Ａは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮ、からなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、ＣＣＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択される。
【００７２】
特に有用なテトラジン誘導体は電子欠乏性テトラジンであり、即ち一般的には電子供与性として保持されない基又は部位で置換された、好ましくは電子吸引性置換基を担持するテトラジンである。
【００７３】
これらの電子欠乏性テトラジンは一般に次の構造式を満たす：
【００７４】
【化８】
0005992435.tif 000009
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２、６−ピリミジル、２、５−ピリミジル、３、５−ピリミジル、２、４−ピリミジル又はフェニルからなる群から選択された置換基を示し，これらは場合によりＮＯ２、Ｆ，Ｃｌ，ＣＦ３，ＣＮ，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＣＯＮＲ２，ＣＨＯ，ＣＯＲ，ＳＯ２Ｒ，ＳＯ２ＯＲ，ＮＯ，Ａｒなどの１以上の電子吸引基で置換されている（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、特にフェニル、ピリジル又はナフチルを表す）。
【００７５】
式（２）から（７）のそれぞれの化合物中で、Ｒ１及びＲ２基（Ｘ及びＹ上のものを含む）には、さらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーが提供され得る。同様に及びそれとは独立して、前記式（１）のジエノフィルにはまたさらに、以下説明するような好適なリンカー又はスペーサーが提供され得る。
【００７６】
本発明で使用される前記歪シクロオクテンジエノフィルを、以下Ｅ−シクロオクテンと示す。従来の命名を参照して、置換Ｘ又はＹの結果として、前記置換基の位置及び分子量に依存して、同じシクロオクテン異性体が形式的にＺ異性体と示され得ることが理解されるであろう。本発明において、本発明のあらゆる変更例は、形式的に「Ｅ」又は「Ｚ」、又は「シス」又は「トランス」異性体かどうかにかかわらず、無置換トランス−シクロオクテン又は無置換Ｅ−シクロオクテンの誘導体と考えられるであろう。用語「トランス−シクロオクテン」（ＴＣＯ）はＥ−シクロオクテン同様、交換可能に使用され、本発明の全てのジエノフィルについて維持され、また置換基が形式的に逆の命名を必要とする場合であっても、維持される。即ち、本発明は、以下で番号付けされた炭素原子１及び６がＥ（エントゲ−ゲン）又はトランス位置にあるシクロオクテンに関する。
【００７７】
【化９】
0005992435.tif 000010
【００７８】
さらなる好ましい実施態様では、前記ジエノフィルは式（１ａ）を満たすジエノフィルであり、
【００７９】
【化１０】
0005992435.tif 000011
ここで、Ｒの位置はエカトリアルであり、Ｒａの位置はアキシャルであり、ここで、Ｘ、Ｙ、Ｒ及びＲａのそれぞれは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、アリール、Ｏ−アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓ（Ｏ）−アリール、Ｓ（Ｏ）−アルキル、Ｓ（Ｏ）２−アリール、Ｓ（Ｏ）２−アルキル、Ｓｉ−アリール、Ｓｉ−アルキル、Ｓｉ−Ｏ−アルキル、ＯＣＯ−アルキル、ＯＣＯ−アリール、ＳＣＯ−アルキル、ＳＣＯ−アリール、ＯＣＳ−アルキル、ＯＣＳ−アリール、ＳＣＳ−アルキル、ＳＣＳ−アリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｎ３、ＳＯ２Ｈ、ＳＯ３Ｈ、ＳＯ４Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ＰＯ４Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＯ２、ＮＯ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＳＣＮ、ＮＣＯ、ＮＣＳ、ＣＦ３、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、アリール）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アルキル、Ｃ（＝Ｓ）Ｓ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アルキル（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＯＣＯＮＲ’−アリール（Ｒ’はＨ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’−アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、ＣＲ’ＮＲ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル又はアリール）、からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ又はＲａの１つが、場合によりスペーサーを介して前記投与剤又は前記除去剤のいずれかへの、リンカー部位を含み；２つのＲ又はＲａ部位が一緒になって環を形成してもよく；及びＲａの少なくとも１つ及び最大４つが水素ではない。
【００８０】
これらの好ましいアキシャル置換シクロオクテンジエノフィルは、前記生体直交性カップリング反応の反応速度の１０倍以上までの増加の達成を可能にする。又は言い換えると、反応時間は、最初必要とされた時間のわずか１０％である。又はさらに言い換えると、１つの反応物の濃度が１０倍低くてもよいということである。
【００８１】
説明したように、Ｒａの少なくとも１つ最大４つが水素ではなく、これはかかるＲａが置換基であるか又はリンカー構造の一部分であることを意味する。好ましくは、非水素Ｒａの数は１又は２である。
【００８２】
より好ましくは、非水素のＲａの少なくとも１つ及び最大４つが、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ及びＲ５ａからなる群から選択される位置にある。なおより好ましくは、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ及びＲ５ａの１又は２が非水素である。最も好ましくは、置換基又はリンカー構造が、Ｒ３ａ又はＲ４ａの１つ又は両方に存在することである。
【００８３】
好ましくは、前記置換基は、上記で定められた式（１ａ）を参照して上記で定められた基から選択される。より好ましくは、前記Ｒａはアルキル又はＯ−アルキル、より好ましくはメチル又はＯ−ｔ−ブチルである。特に好ましい実施態様では、前記Ｒａはアリール又はＯ−アルキルである。
【００８４】
留意すべきことは、Ｒａについての選択肢および好ましさは、いかなる置換基がエカトリアル位置に存在するかどうか（即ち上で定められた式（１ａ）中の前記Ｒ基）、他の炭素原子上か同じ炭素原子上にあるかどうかには関係しないということである。好ましくは、１以上のアキシャル置換基に加えて、また１以上のエカトリアル置換基が存在し、該置換基が好ましくはリンカー構造の一部分である前記Ｒ又はＲａを含む。しかし、他の好ましい場合は、合成のための努力及び反応性の間のバランスを取って、１又は２のＲａが水素ではなく、かつ他の全てのＲ及びＲａが水素であるが好ましい。
【００８５】
さらに好ましくは、Ｘ及び／又はＹはＯ−アルキル又はアルキルであり、より好ましくはメチルである。
【００８６】
好ましい実施態様では、前記ジエノフィル、例えばテトラジンは広い範囲の反応性及び安定性を示し得、これを、特定の用途に合わせてプローブを設計することに用いられる。例えば、前記プレターゲットプローブ上でのテトラジン部位に比較して低い反応性を持つテトラジン部位を除去剤に使用して、前記除去剤が腫瘍結合ＴＣＯと反応して前記プレターゲットプローブをブロックする状況を防止することができる。
【００８７】
プレターゲットプローブ
上記の通り、好ましい実施態様では前記投与剤はプレターゲットプローブである。
【００８８】
プレターゲットの一般的概念は、図１にイメージ化して概略で示される。ここで前記エフェクタープローブは、造影モダリティのための検出可能なラベルを含む造影プローブである。前記エフェクタープローブは、（プレ）−結合プレターゲットプローブへ、そのセカンダリーターゲット基を介して結合する。
【００８９】
プレターゲットプローブは、興味の対象である前記プライマリーターゲットへ結合することができる部位を含む。
【００９０】
ターゲット部位は典型的には、細胞表面ターゲット（例えば膜レセプター）、構造タンパク質（例えばアミロイド斑）又は細胞内ターゲット（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞シグナル経路）へ親和性を持つ構造物である。これらの部位は、抗体（断片）、タンパク質、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、同様にペプチド、ペプトイド及び特定の疾患又は障害で蓄積されることが知られている有機薬物化合物であり得る。
【００９１】
本発明のキットに使用される好適なプライマリーターゲット部位の特定の実施態様はここで説明され、レセプター結合性ペプチド及び抗体を含む。本発明の特定の実施態様は、細胞透過性ターゲットプローブを得るために、ペプチドなどの小さいターゲット部位の使用に関する。
【００９２】
本発明で使用される「プライマリーターゲット部位」は、プライマリーターゲットへ結合する前記ターゲットプローブの部分に関連する。プライマリーターゲット部位の特定の例は、レセプターに結合するペプチド又はタンパク質である。プライマリーターゲット部位の他の例は、細胞化合物に結合する抗体又はその断片である。抗体はタンパク質又はペプチドと同様に非タンパク性化合物とし得る。他のプライマリーターゲット部位は、アプタマー、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、同じくペプトイド及び有機薬物化合物から形成され得る。プライマリーターゲット部位は好ましくは、高特異的に、高親和性で、場合により共有結合的にも、結合し、かつ前記プライマリーターゲットは好ましくは体内で安定である。
【００９３】
上記で挙げたプライマリーターゲットの特異的ターゲットを可能にするために、前記ターゲットプローブのプライマリーターゲット部位は、これに限定されるものではないが、抗体、Ｆａｂ２、Ｆａｂ、ｓｃＦＶなどの抗体断片、二重特異的抗体、ポリマー（ＥＰＲ効果による腫瘍ターゲット）、タンパク質、ペプチド例えばオクトレオチド及び誘導体、ＶＩＰ、ＭＳＨ、走化性ペプチド、ボンベシン、エラスチン、ペプチド模倣物、炭水化物、単糖類、多糖類、ウイルス、全細胞、ファージ、医薬、化学療法剤、レセプター作動薬及び拮抗剤、サイトカイン、ホルモン、ステロイドを含む化合物を含むことができる。本発明の意味の範囲内であると想定される有機化合物の例は、エストロゲン、例えば、エストラジオールなど、アンドロゲン、プロゲスチン、コルチコステロイド、パクリタキセル、エトポシド、ドキソルブリシン、メトトレキサート、葉酸及びコレステロールなどであり、又はそれらの誘導体である。
【００９４】
本発明の１つの特定の実施態様によると、前記プライマリーターゲットはレセプターであり、好適なプライマリーターゲット部位には、これに限定されるものではないが、レセプターなどのリガンド又はその一部分であって、なお前記レセプターに結合するもの、例えばレセプター結合性タンパク質リガンドの場合のレセプター結合性ペプチドが含まれる。
【００９５】
タンパク質特性のプライマリーターゲット部分の他の例は、アルファ、ベータ、及びガンマインターフェロンなどのインターフェロン、インターロイキン、及び腫瘍成長因子などのタンパク質成長因子、例えばアルファ、ベータ腫瘍成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ｕＰＡＲターゲットタンパク質、アポリポタンパク質、ＬＤＬ、アネキシンＶ、エンドスタチン及びアンジオスタチンを含む。
【００９６】
プライマリーターゲット部位の代替例は、例えば前記プライマリーターゲットと相補的である、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ及びＬＮＡを含む。
【００９７】
本発明の１つの特定の実施態様によると、細胞内のプライマリーターゲットへ結合し得る小さい脂質親和性プライマリーターゲット部位が使用される。
【００９８】
本発明のさらなる特定の実施態様によると、前記プライマリーターゲット及びプライマリーターゲット部位は、癌、炎症、感染症、心血管疾患、例えば、血栓、アテローム性動脈硬化症、低酸素サイト、例えば脳卒中、腫瘍、心臓血管疾患、脳疾患、アポト−シス、血管形成、器官、およびレポーター遺伝子／酵素などの組織又は疾患の特異的ターゲット又はターゲット強化をもたらすように、選択される。これは、組織、細胞又は疾患特異的発現を用いてプライマリーターゲットを選択することで達成できる。例えば、膜葉酸レセプターは、葉酸塩及びメトトレキサートなどの類縁体の細胞内蓄積を媒介する。発現は正常組織では制限されているが、種々の腫瘍細胞タイプではレセプターが過剰発現している。
【００９９】
１つの実施態様によると、前記プレターゲットプローブ及び前記エフェクタープローブは、多量体化合物であって、複数のプライマリー及び／又はセカンダリーターゲット及び／又はターゲット部位を含む。これらの多量体化合物は、ポリマー、デンドリマー、リポソーム、ポリマー粒子又は他のポリマー性構造物であり得る。検出シグナルの増幅について特に興味の対象となることは、１より多いセカンダリーターゲットを持つターゲットプローブであり、これはいくつかのエフェクタープローブの結合を可能にする。
【０１００】
前記プレターゲットプローブはさらに、上記の第１の生体直交反応基を含む。この基は、「セカンダリーターゲット」として、すなわち、前記レトロディールスアルダーカップリング化学の前記第１の反応相手を与える前記ターゲットプローブの一部分として作用する。
【０１０１】
該セカンダリーターゲットは上記の通り、前記カップリング反応のいずれかの相手となり得る。即ち、１つの好ましい実施態様では、電子欠乏テトラジンである。他の好ましい実施態様では、式（１）のシクロオクテン又はシクロオクチンであり、より好ましくは式（１ａ）のアキシャル置換シクロオクテンである。
【０１０２】
前記プレターゲットプローブでは、前記プライマリーターゲット部位及び前記第１の生体直交反応基は、互いに直接リンクされ得る。これらはまた、互いにリンカーを介して結合され得、さらにこれらは両方ともプライマリーターゲット足場に、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーにリンクされ得る。即ち、最も単純な意味で、前記リンカー部位は１つの結合である。好適なリンカー部位はさらに、これに限定されるものではないが、２から２００、特には３から１１３、及び好ましくは５から５０の間の繰り返し単位のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。前記ＰＥＧ鎖長を調節することで、生理的システム中での前記プローブの循環時間を変更することができる。これは前記プレターゲットプローブについて特に関係がある（前記プライマリーターゲット部位を前記プライマリーターゲットにリンクする最初のターゲットステップが、比較的遅いプロセスを含み得、比較的長い循環時間を必要とするからである）。リンカー部位は場合により生体ポリマー断片、例えばオリゴ又はポリペプチド又はポリラクチドを含む。
【０１０３】
本発明は、前記ジエン及び前記ジエノフィルが前記プレターゲット又はエフェクタープローブのいずれかにくっつく、あらゆる想定可能なやり方を含むことが理解されるであろう。例えばリジン又はシステインなどの反応性アミノ酸を介した、これらのプローブへの抱合に影響を及ぼす方法は、当業者に知られている。
【０１０４】
ひとつの実施態様によれば、本発明は、ターゲット造影のために使用される。
【０１０５】
この実施態様では、特定のプライマリーターゲットの造影は、前記プレターゲットプローブの前記プライマリーターゲット部位への特異的結合及びこの結合を前記エフェクタープローブに含まれる検出可能なラベルを用いて検出することで達成される。
【０１０６】
プライマリーターゲット
本発明で使用される「プライマリーターゲット」は、診断及び／又は造影法で検出されるべき、及び／又は医薬活性化合物又は他の治療的手法により変更され、結合され又は対処されるべきターゲットに関連する。
【０１０７】
前記プライマリーターゲットは、ヒト又は動物体内又は病原体又は寄生体上でのあらゆる好適なターゲットから選択され得るものであり、例えば、細胞膜及び細胞壁などの細胞、細胞膜受容体などの受容体、ゴルジ体又はミトコンドリアなどの細胞内構造、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルスまたはウイルス粒子、抗体、タンパク質、炭水化物、単糖類、多糖類、サイトカイン、ホルモン、ステロイド、ソマトスタチン受容体、モノアミン酸化酵素、ムスカリン受容体、心筋同所性（sympatic）神経系、例えば白血球上ロイコトリエン受容体、ウロキナーゼプラスミノ−ゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、葉酸受容体、アポト−シスマーカー、（抗）血管新生マーカー、ガストリン受容体、ド−パミン作動系、セロトニン作動系、ＧＡＢＡ作動系、アドレナリン作動系、コリン作動系、オポイド受容体、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体及び他の血栓関連受容体、フィブリン、カルシトニン受容体、タフシン受容体、インテグリン受容体、ＶＥＧＦ／ＥＧＦ受容体、ＥＧＦ、マトリックスメタロプロテア−ゼ（ＭＭＰ）、Ｐ／Ｅ／Ｌセレクチン受容体、ＬＤＬ受容体、Ｐ−糖タンパク質、ニュ−ロテンシン受容体、神経ペプチド受容体、サブスタンスＰ受容体、ＮＫ受容体、ＣＣＫ受容体、シグマ受容体、インターロイキン受容体、単純ヘルペスウイルスチロシンキナーゼ、ヒトチロシンキナーゼを含む群から選択され得る。
【０１０８】
本発明の特定の実施態様によると、前記プライマリーターゲットはレセプターなどのタンパク質である。又は、前記プライマリーターゲットは、感染症又は癌などの疾患の際にアップレギュレートされる代謝経路であり得、例えばＤＮＡ合成、タンパク質合成、膜合成及び炭水化物取り込みなどである。疾患組織で、上記マーカーは健康な組織とは異なり、早期検出、特異的診断及び治療、特にターゲット治療のための独自の可能性を提供し得る。
【０１０９】
エフェクタープローブ
エフェクタープローブは、望ましい診断、造影、及び／又は治療効果を与えることのできるエフェクター部位を含む。前記エフェクタープローブはさらに、セカンダリーターゲット部分を含む。
【０１１０】
前記セカンダリーターゲット部位は、前記利用可能なセカンダリーターゲットの反応相手、即ち前記プレターゲットプローブ内に含まれる前記生体直交反応基を形成する前記エフェクタープローブの一部分に関する。例えば、前記セカンダリーターゲットが式（１）のジエノフィルである場合、前記セカンダリーターゲット部位はテトラジンなどのジエンであり、逆もそうであろう。
【０１１１】
前記エフェクター部位は、例えば検出可能なラベルであり得る。ここで使用される「検出可能なラベル」とは、前記エフェクタープローブの一部分を指し、これは、例えば細胞、組織又は器官内に存在する場合に前記プローブの検出を可能にする部分である。本発明の意味の範囲に含まれることが想定される、検出可能なラベルの１つのタイプはコントラスト提供剤（contrast  providing  agent）である。異なるタイプの検出可能なラベルが本発明の意味の範囲内に含まれることが想定され、以下で説明される。
【０１１２】
従って、本発明の特定の実施態様によれば、本発明のプレターゲットキット及び方法は、造影において使用され、特に医用造影において使用される。前記プライマリーターゲットを識別するために、前記エフェクタープローブとして、１以上の検出可能なラベルを含む造影プローブが使用される。前記造影プローブの検出可能なラベルの特定の例は、ＭＲＩ−画像形成可能構造物、スピンラベル、光学ラベル、超音波応答構造物、Ｘ線応答部位、放射性核種、（生体）発光及びＦＲＥＴタイプの色素などの従来の造影システムで使用されるコントラスト提供部位である。本発明の意味の範囲内に含まれることが想定される例示的検出可能なラベルは、必ずしもこれに限定されるものではないが、蛍光分子、例えば自動発光分子、試薬に接触すると発光する分子など、放射性標識；ビオチン、例えば、アビジンによりビオチンの結合を介して検出されるべきものなど；蛍光タグ、常磁性金属を含むＭＲＩのための造影構造物、造影試薬、米国特許第４、７４１、９００号及び５、３２６、８５６号に記載されたものを含む。造影に使用される前記放射性核種は、例えば、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、５１Ｃｒ、５２Ｆｅ、５２Ｍｎ、５５Ｃｏ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｚｎ、６２Ｃｕ、６３Ｚｎ、６４Ｃｕ、６６Ｇａ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７０Ａｓ、７１Ａｓ、７２Ａｓ、７４Ａｓ、７５Ｓｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８２Ｒｂ、８６Ｙ、８８Ｙ、８９Ｓｒ、８９Ｚｒ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１４Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１２０Ｉ、１２２Ｘｅ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１９３Ｐｔ、１９５Ｐｔ、２０１Ｔｌ及び２０３Ｐｂからなる群から選択された同位体であり得る。
【０１１３】
他の元素及び同位体で、治療のためなどに使用されるものはまた、特定の用途において造影に適用され得る。
【０１１４】
ＭＲＩ造影可能部位は、例えば常磁性イオン又は超常磁性粒子であり得る。前記常磁性イオンは、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｔｉ、Ｐａ、Ｌａ、Ｓｃ、Ｖ、Ｍｏ、Ｒｕ、Ｃｅ、Ｄｙ、Ｔｌからなる群から選択された元素であり得る。前記超音波応答部位は、マイクロバブル、リン脂質からなるシェル及び／又は（生分解性）ポリマー、及び／又はヒト血清アルブミンを含み得る。前記マイクロバブルは、フッ化ガス又は液体で充填され得る。
【０１１５】
前記Ｘ線応答部位は、これに限定されるものではないが、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィンを含み、又ベシクル、リポソーム又はヨウ素化合物及び／又は硫酸バリウムで充填されたポリマー性カプセルを含み得る。
【０１１６】
さらに、本発明の意味の範囲内であると想定される検出可能なラベルはまた、例えば検出可能にラベルされた抗体の結合による又はサンドイッチタイプのアッセイによる、抗体結合による検出可能な、ペプチド又はポリペプチドを含む。１つの実施態様では、前記検出可能なラベルは小さいサイズの有機ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴラベルであり、１８Ｆ、１１Ｃ又は１２３Ｉなどである。それらの小さいサイズにより、有機ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴラベルは、細胞内事象をモニターするのに理想的に好適であり、というのはそれらは一般に前記ターゲットデバイスの性質及び特にその膜輸送へ大きくは影響しないからである。ＰＥＴラベル及びセカンダリーターゲット部位として前記レトロディールスアルダー活性部位のいずれかを含む造影プローブは脂質親和性であり、その結合相手を見つけるまで細胞内外で能動的に拡散することができる。さらに、両方の成分は、血液脳関門の横断を排除せず、従って脳内の領域の造影を可能にする。
【０１１７】
前記エフェクタープローブが、ＭＲＩの造影強化のための、ランタニド（例えばＧｄ）などの金属系脱着可能なラベルを含むことが意図され、これは好ましくはキレートの形態で提供される。かかる場合には、前記エフェクタープローブは好ましくは、かかる金属と配位錯体を形成し得る構造部位を含む。この良好な例は、大環状ランタニド（ＩＩＩ）キレートであり、１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−１、４、７、１０−四酢酸（Ｈ４ｄｏｔａ）、及び１、４、７、１０−テトラアザシクロドデカン−α、α’、α’’、α’’’−テトラメチル−１、４、７、１０−四酢酸（Ｈ４ｄｏｔｍａ）から誘導される。
【０１１８】
前記エフェクター部位はまた、医薬活性化合物などの治療部位であり得る。医薬活性化合物の例はここで与えられている。治療プローブは、場合によりまた検出可能なラベルを含み得る。
【０１１９】
従って、他の実施態様によると、本発明の前記プレターゲットキット及び方法は、ターゲット治療に使用される。これは、セカンダリーターゲット部位及び１以上の医薬活性剤（即ち、医薬、毒物又は放射線治療のための放射性同位元素）を含むエフェクタープローブの使用を行うことで達成される。ターゲット医薬輸送の意味における使用に好適な医薬は当該技術分野で知られている。場合により、前記治療プローブはまた、１以上の造影剤などの検出可能なラベルを含むことができる。治療のために使用される放射性核種は、例えば、２４Ｎａ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、７６Ａｓ、７７Ａｓ、８０Ｂｒ、８２Ｂｒ、８９Ｓｒ、９０Ｎｂ、９０Ｙ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１３１Ｉ、１４０Ｌａ、１４１Ｃｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４４Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１４９Ｔｂ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６１Ｔｂ、１６５Ｄｙ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｒ、１７２Ｔｍ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２１３Ｂｉ、２１４Ｂｉ、２２３Ｒａ、及び２２５Ａｃからなる群から選択された同位体であり得る。
又は、前記治療プローブ中の前記薬物は、光力学療法のための感光薬から選択される。
【０１２０】
又は前記治療プローブは、インビボで治療実体（entity）、例えばＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又はタンパク質などのその他の内因性構造物へ結合する認識部位を含む。
【０１２１】
【０１２２】
エフェクタープローブで、前記セカンダリーターゲット部位、即ち前記セカンダリー生体直交反応基及び前記エフェクター部位は、互いに直接リンクされ得る。これらはまた、リンカーを介して互いに結合されることができ、さらにこれらは両方ともセカンダリーターゲット足場に結合され得る。前記リンカーは、独立して、同じ部位から選択されることができ、例えば前記のポリエチレングリコールである。前記セカンダリーターゲット足場は、例えばポリペプチドなどの生体ポリマーであり得る。
【０１２３】
本発明はまた、プレターゲット方法に関し、これは前記セカンダリーターゲット及び循環するプレターゲットプローブの除去の両方のために前記レトロディールスアルダー反応を使用する。ここで、好適なジエンで、好ましくは上記式（２）から（７）のいずれか１つの化合物で、又は上記式（１）のシクロオクテン又はシクロオクチンで官能化された、プライマリーターゲット部位を含むプレターゲットプローブ（例えば抗体及び抗体断片又はレセプター結合ペプチド）を対象物に注入する。前記ターゲット（例えばプライマリー又は転移性腫瘍性病変、動脈硬化性プラーク、梗塞領域（infracted  area）、炎症又は感染サイトなど）への結合の後、前記プレターゲットプローブ上の前記生体直交性反応基に対して反応性である生体直交性反応基を含む除去剤が投与され、それにより循環するプレターゲットプローブを捕捉し、かつ前記循環から及び非ターゲット組織（例えば血液に、肝臓、脾臓、腎臓など）からの除去に影響を与える。その後、例えばシクロオクテン又はテトラジン誘導体をそれぞれ（即ち、前記プレターゲットプローブ中に存在する前記生体直交性反応基の反応性対応物（counterpart））を担持するセカンダリーターゲット部位を含むエフェクタープローブ及び薬物又は造影可能なラベルが注入される。前記エフェクタープローブは前記プライマリーターゲット部位に結合し、高いコントラスト又は前記疾患サイトの選択的処置を提供する。前記プレターゲットプローブ内に存在する前記生体直交性反応基の前記反応性対応物は、前記除去剤に含まれる反応性対応物と（前記プレターゲットプローブ中に存在する同じ生体直交性反応基について）同じでも異なっていてもよい。
【０１２４】
本発明はまた、一般的な代謝経路のターゲットに関し、これは疾患（感染症又は癌など）の際にアップレギュレートされるものであり、例えばＤＮＡ、タンパク質及び膜合成及び炭水化物取り込みなどである。好適なプローブには、当該技術分野で現在使用されている代謝トレーサーである、［１１Ｃ］−メチオニン、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）、デオキシ−［１８Ｆ］−フルオロチミジン（ＦＬＴ）及び［１１Ｃ］−コリンに類似する、ジエン又はジエノフィルラベルされたアミノ酸、糖、核酸及びコリンが含まれる。高い代謝又は増殖を伴う細胞はこれらの構築ブロック（building  block）をより多い取り込みを有する。この方法で、例えばテトラジン又はＥ−シクロオクテン誘導体がこれら又は他の経路に入り、細胞内及び／又は細胞上に蓄積される。十分に増大して遊離プローブを除去した後、検出可能にラベルされた又は医薬担持する（細胞透過性）テトラジンプローブ又はＥ−シクロオクテンプローブ（又は本発明により他のジエン／ジエノフィル担持するプローブ）は、前記蓄積されたＥ−シクロオクテン、テトラジン代謝物それぞれに結合するために送られる。通常のＦＤＧ（フッ素１８フルオロデオキシグルコース）タイプの造影に対する利点としては、放射活性物が送られる前に前記ターゲット部位を高蓄積させるための十分な増幅時間が利用可能であり、それにより前記ターゲットと非ターゲットとの比率を増加させることができる。又は、疾患に特異的な代謝経路及び／又は代謝物がターゲットされ得る。
【０１２５】
本発明はまた、細胞内ターゲットのプレターゲットに関する。それらのサイズが小さいことから、有機ＰＥＴラベル（１８Ｆ、１１Ｃ）は細胞内事象をモニターするために理想的に好適であり、というのは一般に前記ターゲットデバイスの性質及び特に（大きくかつ極性の放射性金属キレート構造抱合体と対照的に）前記膜輸送に対して大きな影響を与えないからである。本発明で使用される前記置換テトラジン部位及び前記Ｅ−シクロオクテンは、小さいことは必須ではないが、それらは比較的非極性であり、細胞内のタンパク質、ｍＲＮＡ、シグナル伝達経路などの造影のために使用され得る。前記セカンダリー（例えばＰＥＴラベルされた）置換テトラジン部位又はＥ−シクロオクテンプローブ（即ち前記エフェクタープローブ）は、その結合相手を見つけるまで細胞内外で能動的に拡散することができ、又は活性取り込み機構の対象となる。これらの性質はまた、両方の成分が血液脳関門を横断することを排除しないので、脳内でプレターゲットのためにレトロディールスアルダー反応の使用を可能にする。
【０１２６】
本発明はまた、プレターゲットされたシグナル増幅及び／又は多価装備（polyvalency  installation）に関する。少なくとも１つのプライマリーターゲットデバイスが、多数のテトラジン部位を含むデンドリマー、ポリマー又はナノ粒子へ抱合される。レセプター結合後、核造影（例えば放射性金属キレート、放射性ハロゲンなど）又はＭＲＩ（例えばＧｄキレート）のための１以上の造影部位が抱合された（１以上の）シクロオクテン又はシクロオクチンが注入される。その結果、その後のレトロディールスアルダー反応により、前記ターゲット組織でＭＲＩ造影剤は高濃度となる。さらに、前記ターゲットサイトでの多価性は、前記ＴＣＯエフェクター抱合の反応速度を増加させ、例えばＭＲＩコントラスト剤の効果的なターゲット蓄積を可能にする。本来は、前記ＴＣＯはまた、前記ターゲットデバイス抱合で、及び前記レポーターに抱合された前記テトラジン（又は本発明の他のジエン）で使用され得る。
【０１２７】
本発明の一部分はまた、プレターゲット方法であり、前記方法は、前記記載のプレターゲット剤を対象体に投与すること、及び前記剤を前記対象体の系中で、前記プライマリーターゲット部位がプライマリーターゲットへ結合することを達成するために十分な時間循環させ、次に前記体内から、上で定めた除去剤により、非結合剤を除去することを、含む。このための典型的な時間は１２から９６時間、特には約４８時間である。
【０１２８】
さらに、本発明は、造影方法を提供し、前記方法は、上記のプレターゲット方法を実施し、ついでまた本発明による造影プローブを投与することを含み、ここで前記プレターゲット剤内及び前記造影プローブ内の前記生体直交性反応基は、一緒になって前記［４＋２］レトロディールスアルダーの反応相手を形成する。同様に本発明は、対象体のターゲット医学処置の方法を提供し、前記方法は、上記のプレターゲット方法を実施し、続いてまた本発明による治療プローブを投与することを含み、ここで前記プレターゲットプローブ内及び前記造影プローブ内の前記生体直交性反応基は、一緒になって［４＋２］レトロディールスアルダーの反応の反応相手を形成する。
【０１２９】
本発明はまた、上記の造影又は治療方法で使用するための前記除去剤に関する。
【０１３０】
本発明は以下、非限定的な実施例及び添付の非限定的図面を参照して説明される。
【実施例】
【０１３１】
材料：
全ての試薬及び溶媒は、市販品（試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｂｉｏｓｏｌｖｅ、ＡＢＣＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＭｅｒｃｋから入手、通常の及び重水素化溶媒はＢｉｏｓｏｌｖｅ、Ｍｅｒｃｋ及びＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）から入手し、特に記載されていない限りさらに精製することなく使用した。ポリスチレンミクロ粒子（ポリビーズ、０．５μｍ）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。塩化［１１１Ｉｎ］インジウム及び［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム溶液はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒから入手した。水は蒸留して、ｍｉｌｌｉ−Ｑ水濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱イオン化（１８ＭΩｃｍ）した。前記ラベル緩衝液は、Ｃｈｅｌｅｘ−１００樹脂（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一晩処理し、次に０．２２μｍを通してろ過し、４℃で貯蔵した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイのキット、ゲルコード青色タンパク質染色溶液及びＺｅｂａ脱塩スピンカラム（７ｋＤａ及び４０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、０．５−２ｍＬ）はＰｉｅｒｃｅ  ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から入手した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４を調製するための錠剤はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）から入手した。ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４及びＵｌｔｒａ−１５遠心濾過ユニット（３０及び５０ｋＤａＭＷカットオフ）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅから入手した。マウス血清及びマウス血清アルブミンはＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。テトラジン１５の合成及び放射性ラベル化（図７）、及びトランスシクロオクテンの前記ｍＡｂ（ＣＣ４９）抱合は、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ  ２０１０、４９、３３７５−８」に記載の方法で実施した。
【０１３２】
方法：
ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ３又は［Ｄ６］ＤＭＳＯ中で、Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ３００スペクトルメータ又はＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ４００スペクトルメータで測定した。１３ＣＮＭＲ多重度（ｑ＝４級、ｔ＝３級、ｓ＝２級及びｐ＝１級）はＤＥＰＴパルスシーケンスを用いて識別した。赤外線吸収スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ１６００ＦＴ−ＩＲを用いて測定した。前記ＭＳＡ−抱合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル（ポジティブ、直線モード）は、α−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸（ＣＨＣＡ）のマトリクスを用いてＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ（商標）Ｐｒｏ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＥ）により測定した。
【０１３３】
分取カラムクロマトグラフは、ＳｉｌｉＣｙｃｌｅシリカカラムを用いて、Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ装置（ＴｅｌｅｄｙｎｅＩｓｃｏ）で行った。分取ＨＰＬＣは、Ｃ１８Ｚｏｒｂａｘカラム（２１．２ｘ１５０ｍｍ、５μｍ粒子）を備え、０．１％ＴＦＡを含む水及びＭｅＣＮのグラジエント溶出液を適用する、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００装置を用いて行った。分析放射性−ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出器（Ｒａｙｔｅｓｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００システムを用いて行った。サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ粒子）に負荷し、０．１％ＴＦＡを含む水中でＭｅＣＮの直線的勾配（２分間は１０％ＭｅＣＮで、次に１１分間４５％ＭｅＣＮに増加）を用いて１ｍＬ／分で溶出した。ＵＶ波長は２５４ｎｍｍと設定された。サイズ排除（ＳＥＣ）ＨＰＬＣは、Ｇａｂｉ放射性検出器（Ｒａｙｔｅｓｔ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００システムを用いて行った。サンプルを、ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００カラム（３００ｘ７．８ｍｍ、５μｍ粒子、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に負荷し、１０％  ＭｅＣＮを含む、ｐＨ６．８の０．２Ｍリン酸溶液を用いて、１ｍＬ／分で溶出した。ＵＶ波長は２６０及び２８０ｎｍに設定された。
【０１３４】
１１１Ｉｎ−テトラジンラベル化の収率は、ＩＴＬＣ−ＳＧストリップ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して放射性ＴＬＣにより行い、０．９％ＮａＣｌ水溶液中の２００ｍＭ  ＥＤＴＡで溶出させ、発光造影器（ＦＬＡ−７０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）上で造影された。これらの条件で、遊離の１１１Ｉｎは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方１１１Ｉｎ−テトラジンは最初の位置にとどまった。１２５Ｉ−ｍＡｂラベル化収率はまた、ＩＴＬＣ−ＳＧストリップを使用して放射性ＴＬＣにより行い、１：１  ＭｅＯＨ／酢酸エチル混合物で溶出させ、発光造影器上で造影された。この条件で、遊離の［１２５Ｉ］及び１２５Ｉ−ＳＨＰＰは、Ｒｆ＝０．９で移動し、一方１２５Ｉ−ｍＡｂｓは最初の位置にとどまった。
【０１３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、７．５％のＰＡＧＥ均一ゲル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＰｈａｓｔｇｅｌｓｙｓｔｅｍで実施した。タンパク質ＭＷ標準溶液（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  ｄｕａｌｃｏｌｏｒ  ｓｔａｎｄａｒｄ）をＢｉｏＲａｄから購入した。電気泳動の際に、前記ゲルをゲルコードブルーで２時間染色し、水中で一晩脱色して、次いで従来のフラットベッドスキャナーでデジタル化した。
【０１３６】
アルブミンへ抱合するテトラジン分子の数及びＣＣ４９溶液の濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００スペクトルフォトメータ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３２２ｎｍ及び２８０ｎｍでの吸収から、それぞれ決定された。マウス血清アルブミン分子当たりのテトラジンの数はまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで決定された。ＣＣ４９溶液の濃度はまた、ＢＣＡで決定された。
【０１３７】
アルブミン−テトラジンでコーティングされたポリスチレンビーズの平均流体力学的直径は、動的光散乱（ＡＬＶ−ＬＳＥ、α＝９０°）により決定された。前記ビース分散物中の凝集物の不存在及びマウスに注入されたビーズの数は、５０μｍ開口チューブを用いてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（マルチサイザー３）で決定された。前記溶液の一部を５０ｍＬのＩｓｏｔｏｎＩＩ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と混合し、それからの１００μｌを、１．１μｍから３０μｍの範囲の直径で分析した。
【０１３８】
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデル
ヒト大腸癌細胞株ＬＳ１７４ＴはＡＴＣＣから入手し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを追加したＥａｇｌｅの最小必要培地（Ｓｉｇｍａ）中に保持した。ヌードメスＢａｌｂ／Ｃマウス（２０〜２５ｇ体重、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中の５ｘ１０６細胞を皮下接種した。
【０１３９】
実施例１：
前記テトラジン誘導部位を本発明の除去剤対象物を得るために足場へリンクする一例として分子５を製造する。分子５は、Ｎ−ヒドロスクシニミジル部位であり、前記分子は、前記足場に、例えばタンパク質に存在するアミノ基とカップリングさせるために使用される。
【０１４０】
５の合成は図４に概説されており、Ｒｏｓｓｉらにより合成された、５−オキソ−５−（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イルアミノ）ペンタン酸（１）から出発する（Ｒｏｓｓｉｎｅｔａｌ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｄｉｔｉｏｎ２０１０、４９（１９）、３３７５−８．）。
【０１４１】
ｔｅｒｔ−ブチル  ４１、４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタノ−１−エート（３）：
ｔｅｒｔ−ブチル  １−アミノ−３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６−ドデカオキサノナトリアコンタノ−３９−エート２（１２３ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ；ＩＲＩＳＢｉｏｔｅｃｈＧｍｂＨ）を、乾燥した反応管へ添加し、トルエンで２回同時蒸発させた（co−evaporated）。前記管を、次いで窒素雰囲気下に置き、極（extra）乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）を添加して無色溶液とした。極乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解した、１（１００ｍｇ、０．２７４ｍｍｏｌ）及び（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ；２６７ｍｇ、０．６０３ｍｍｏｌ）を順に、窒素雰囲気下で反応溶液に添加し、赤色懸濁物を得た。最後に、ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）を反応溶液に滴加し、得られた溶液を一晩撹拌した。前記反応混合物を蒸発させて乾燥し、これをＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ中で１〜１０％ＭｅＯＨのグラジエントを用いて、シリカゲル上でフラッシュカラムクロマトグラフにより精製した。関連する画分を集めて真空蒸発させて、暗ピンク色固体として３を得た（１６７ｍｇ、０．１６４ｍｍｏｌ、９０％）。
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．５８（ｓ、１Ｈ）、９．０５（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．９３（ｄｄｄ、Ｊ１＝０．９Ｈｚ、Ｊ２＝１．７Ｈｚ、Ｊ３＝４．７Ｈｚ、１Ｈ）、８．６２（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．５９（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄｄ、Ｊ１＝２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１５（ｔｄ、Ｊ１＝１．８Ｈｚ、Ｊ２＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．９３（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７３（ｄｄｄ、Ｊ１＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．７Ｈｚ、Ｊ３＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．５７（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．５３−３．４７（ｂｒｏａｄｓ、４６Ｈ）、３．２５−３．１６（ｍ、２Ｈ）、３．４１（ｔ、Ｊ＝６．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．４４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．１７（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．８５（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｓ、９Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７２．１（ｑ）、１７１．７（ｑ）、１７０．４（ｑ）、１６３．０（ｑ）、１６２．８（ｑ）、１５０．６（ｔ）、１５０．２（ｑ）、１４３．８（ｑ）、１４１．３（ｔ）、１３８．５（ｑ）、１３７．８（ｔ）、１２６．５（ｔ）、１２６．１（ｔ）、１２４．８（ｔ）、１２４．２（ｔ）、７９．７（ｑ）、６９．８（ｓ）、６９．７（ｓ）、６９．６（ｓ）、６９．５（ｓ）、６９．１（ｓ）、６６．２（ｓ）、３８．５（ｓ）、３５．８（ｓ）、３５．７（ｓ）、３４．４（ｓ）２７．７（ｐ）、２０．９（ｓ）。
【０１４２】
４１、４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタン−１−酸（４）：
撹拌した、３（１６０ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（２ｍＬ）溶液中に、窒素雰囲気下でＴＦＡ（２ｍＬ）を添加した。反応混合液を２時間室温で撹拌し、その後蒸発乾燥させた。残渣を乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に再溶解して再びＴＦＡ（２ｍＬ）と２時間処理した。このプロセスをもう一度繰り返した。最後に前記反応混合液を蒸発させて乾燥し、ＤＣＭで２回同時蒸発させ、脱保護された生成物４を定量的に得た。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１０．５７（ｓ、１Ｈ）、９．０５（ｂｒｏａｄｓ、１Ｈ）、８．９４（ｂｒｏａｄｓ、１Ｈ）、８．６３（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、８．６０（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、１Ｈ）、８．４３（ｄｄ、Ｊ１＝２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．１６（ｔｄ、Ｊ１＝１．７Ｈｚ、Ｊ２＝７．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．９３（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．７４（ｄｄ、Ｊ１＝４．７Ｈｚ、Ｊ３＝６．８Ｈｚ、１Ｈ）、３．５８（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．５３−３．４６（ｂｒｏａｄｓ、４６Ｈ）、３．４１（ｔ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２Ｈ）、３．２５−３．１７（ｍ、２Ｈ）、２．４４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、２．１７（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．８５（ｑ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）。
【０１４３】
２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４１、４５−ジオキソ−４５−（（６−（６−（ピリジン−２−イル）−１、２、４、５−テトラジン−３−イル）ピリジン−３−イル）アミノ）−４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７−ドデカオキサ−４０−アザペンタテトラコンタノ−１−エート（５）：
無水ＤＣＭ（３ｍＬ）中の４（１５０ｍｇ，０．１５５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液中に、Ｎ２雰囲気下で０℃で、順に、ジ−（Ｎ−スクシニミジル）カーボネート（４７．８ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）、ピリジン（１５μＬ）及びトリエチルアミン（０．２５ｍＬ）を添加した。混合物を２時間撹拌し、その間に室温まで加温し、次に蒸発させて乾燥し、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中で再溶解して、Ｈ２Ｏで洗浄（１０ｍＬで３回）した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥し、ろ過した後真空蒸発させて、暗ピンク色固体として５を得た（９４ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ，５７％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝９．６７（ｓ、１Ｈ）、９．０１−８．９７（ｍ、２Ｈ）、８．７７−８．７１（ｍ、２Ｈ）、８．６４（ｄｄ、Ｊ１＝２．４Ｈｚ、Ｊ２＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、８．０２（ｔｄ、Ｊ１＝１．７Ｈｚ、Ｊ２＝７．７Ｈｚ、１Ｈ）、７．５８（ｄｄｄ、Ｊ１＝１．１Ｈｚ、Ｊ２＝４．７Ｈｚ、Ｊ３＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）、６．６０（ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８４（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３．７０−３．５５（ブロードｓ、４６Ｈ）、３．５２−３．４３（ｍ、２Ｈ）、２．９０（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、２．５８（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．３７（ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．０９（ｑ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１７２．９（ｑ）、１７２．５（ｑ）、１６８．９（ｑ）、１６６．７（ｑ）、１６３．６（ｑ）、１６３．４（ｑ）、１５１．０（ｔ）、１５０．３（ｑ）、１４４．０（ｑ）、１４２．０（ｔ）、１３８．６（ｑ）、１３７．４（ｔ）、１２６．５（ｔ）、１２６．４（ｔ）、１２５．１（ｔ）、１２４．３（ｔ）、７０．７（ｓ）、７０．５（ｓ）、７０．２（ｓ）、６９．６（ｓ）、６５．７（ｓ）３９．３（ｓ）、３５．９（ｓ）、３５．０（ｓ）、３２．１（ｓ）２５．６（ｓ）、２１．３（ｓ）。
【０１４４】
実施例２：
図３で概説される除去剤の一例として化合物１２（図５参照）を調製する。化合物１２は、前記反応相手と反応させるために９から１０のテトラジン分子で官能化されたタンパク質状足場（マウス血清アルブミン；ＭＳＡ）を含み、前記反応相手はこの場合はシクロオクテン誘導体であり、前記レトロ−ＤＡ反応を介するプレターゲットプローブ上にあり、かつ肝臓のアシュウェルレセプターと相互作用するための１６から１８ガラクトース分子を持つ。
【０１４５】
前記除去剤は、最初はガラクトース、次にテトラジンとの２段階の連続するＭＳＡの共有結合変性で製造された。ガラクトース変性は、アミン反応性の２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）を用いて達成され、これはアルブミン上のリジンと抱合する。この剤は、米国特許出願公開第２００３０１２９１９１号の教示（手順１）に従って実施され、μｍｏｌスケールで、アルブミン抱合の前に市販化合物であるシアノメチル  ２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）から直接合成され得る。我々は、手順２におけるこれを改善した：前記アミン反応性カップリング剤２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）自体が、以下説明する最適化手順で高純度で単離され、次いで単一のステップでアルブミンとカップリングさせることができる。
【０１４６】
ガラクトース−ＭＳＡ（１１、手順１、図５）の合成：
無水ＭｅＯＨ溶液中の０．１Ｍのシアノメチル  ２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）に、無水ＭｅＯＨ中の０．１ＭのＮａＯＭｅ溶液の容積の１／１０を添加し、前記混合物を一晩反応させた（１０００ｒｐｍで振盪）。生成物の比率（化合物９の化合物１０に対するもの）を１Ｈ−ＮＭＲで決定し（以下のスペクトルデータを参照）、典型的には、０．７と１の間であった。
【０１４７】
前記粗反応混合物（機能化させるべきＭＳＡの望ましい量に対して化合物９の約３３モル当量を含む）の必要な容積をエッペンドルフバイアル中で凍結乾燥させ、及びＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ８．５の１０：１混合物（２００μＬ）中に溶解したＭＳＡ（３．５ｍｇ、０．０５３０μｍｏｌ）が添加された。反応混合物を室温で２時間振盪（１０００ｒｐｍ）し、その後一晩４℃で保存した。反応混合物を、まず水で平衡化された、Ｚｅｔａ脱塩スピンカートリッジ（７ｋＤａＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。前記ガラクトース変性の程度を続いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により決定した（典型的には、約１５から１９ガラクトース／ＭＳＡ、化合物１１）。
【０１４８】
ガラクトース−ＭＳＡ（１１、手順２、図５）の合成：
ガラクトースカップリング剤２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）は図５に示されるように、２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（６）から出発して３段階で、中間体２−Ｓ−（２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムブロミド（７）及びシアノメチル  ２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）を経て製造された。
【０１４９】
２−Ｓ−（２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムビロミド（７）：
２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（６；１５．００ｇ、３６．４８ｍｍｏｌ）及びチオ尿素（３．０５ｇ、４０．０７ｍｍｏｌ）をアセトン（７５ｍｌ）に溶解した。前記溶液を加熱して２時間還流し、続いて濾過し、２０℃へ冷却した。ペンタン（７５ｍＬ）を添加して生成物を白色結晶性固体として沈殿させた（１６．１１ｇ，９１％）。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、）：δ＝１．９５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．０１（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．０８（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．１４（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、４．０９（ｍ、２Ｈ、Ｈ６、Ｈ６’）、４．４５（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ５）、５．１１（ｔ、Ｊ２、３＝１０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ２）、５．２２（ｄｄ、Ｊ２、３＝９．９Ｈｚ、Ｊ３、４＝３．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ３）、５．３９（ｄ、Ｊ３．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ４）、５．７１（ｄ、Ｊ１、２＝１０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ１）、９．１１（ｂｒ、２Ｈ、ＮＨ２）、９．３５（ｂｒ、２Ｈ、ＮＨ２）。
【０１５０】
シアノメチル  ２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８）：
２−Ｓ−（２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−チオウロニウムブロミド（７；１６．１１ｇ、３１．０７ｍｍｏｌ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（１１．８１ｇ、６２．１４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４．７２ｇ、３４．１８ｍｍｏｌ）及びクロロアセトニトリル（８．２１ｇ、１０８．７ｍｍｏｌ）をアセトン／水（５０：５０体積／体積、２００ｍＬ）中に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷水（３００ｍＬ）へ投入し、かつさらに２時間撹拌した。白色沈殿を濾過して回収し、熱メタノール（３０ｍＬ）から再結晶した。生成物を濾過し、白色結晶固体として得た（９．６１ｇ、７７％）。融点＝９７℃（文献値：９５から９７℃）。１１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝２．００（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．０７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．０９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．１７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、３．３５（ｄ、Ｊ＝１７Ｈｚ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨ）、３．６４（ｄ、Ｊ＝１７Ｈｚ、１Ｈ、Ｓ−ＣＨ’）、４．０１（ｔ、Ｊ６．９Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ５）、４．１６（ｍ、２Ｈ、Ｈ６、Ｈ６’）、４．７（ｄ、Ｊ１、２＝１０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ１）、５．１１（ｄｄ、Ｊ３、４＝３．２Ｈｚ、Ｊ２、３＝１０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ３）、５．２４（ｔ、Ｊ＝１０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ２）、５．４７（ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ４）。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝２２４９（ＣＮ、ｗ）、１７３９（Ｃ＝Ｏ、ｓ）。
【０１５１】
２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）：
シアノメチル  ２、３、４、６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（８；２．０２ｇ、５．００ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）に溶解し、ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（２５重量％、１１５μＬ、０．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌し、続いて１５ｍＬまで容積を濃縮した。生成物を室温で、さらに−１８℃で再結晶化させた（１．１１ｇ；８３％）。融点＝１２９℃。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ＝３．４４（ｄｄ、Ｊ２、３＝１０Ｈｚ、Ｊ３、４＝４．２Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ３）、３．５２（ｄｄ、Ｊ２、３＝１０Ｈｚ、Ｊ１、２＝９．０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ２）、３．５４（ｍ、１Ｈ、Ｈ５）、３．７３（−ＯＣＨ３）、３．７８（ｍ、２Ｈ、Ｈ６、Ｈ６’）、３．８７（ｄｄ、Ｊ３、４＝４．０Ｈｚ、Ｊ４、５＝１．５Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ４）、４．２７（ｄ、Ｊ１、２＝９．６Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ１）。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）：ν＝３２８７（Ｎ−Ｈ、ｓ）、１６５０（Ｃ＝ＮＨ、ｓ）。
【０１５２】
ＭＳＡ−カップリング：
ＰＢＳ  ｐＨ７．４／０．５Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ８．５の１０：１混合物（９００μＬ）に溶解したＭＳＡ（２０ｍｇ、０．３０３μｍｏｌ）の溶液に、同じ緩衝液混合物（２００μＬ）中の新たに調製した２−イミノ−２−メトキシエチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９）の１８．２ｍｇ／ｍｌストック溶液を添加し、ＭＳＡに関して４５倍モル過剰のガラクトースカップリング剤（９）を得た。前記反応混合物を室温で２時間振盪（１０００ｒｐｍ）し、次いで予め水で平衡化させたＺｅｂａ脱塩スピンカートリッジ（７ｋＤａＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて脱塩した。凍結乾燥後、ガラクトース−ＭＳＡ（化合物１１）を白色綿状固体として得た（１５．３ｍｇ，７２％）。ガラクトース変性の程度を、続いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した：ＭＳＡ：ＭＨ＋＝６５９４１。ガラクトース−ＭＳＡ：ＭＨ＋＝６９８２３であり、これは平均１６．４ガラクトース／ＭＳＡ（添加ガラクトース断片の質量は２３６Ｄａ）である。異なるバッチ間の変動は、約１６から１８ガラクトース／ＭＳＡである。４℃での水中でガラクトース−ＭＳＡの１０ｍｇ／ｍｌ溶液の安定性は、全部で５ヶ月かけて２週間ごとにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を繰り返して評価した。抱合物は安定であることが示された。
【０１５３】
ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）の合成：
ＰＢＳ中のガラクトース−機能化マウス血清アルブミン（１１、ガラクトース−ＭＳＡ、１ｍｇ）の溶液を、ＤＭＦ中のテトラジン−ＮＨＳ（５）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（３０μＬ、ガラクトース−ＭＳＡに対して２０当量）と混合し、１Ｍ炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６（７．５μＬ）を添加した。溶液（合計２５０μＬ）を３７℃で３０分間インキュベートし、次にこれをＵｌｔｒａ−１５遠心濾過ユニット（３０ｋＤａＭＷカットオフ）へ移した。生成物１２を水で十分に洗浄し、次に一晩凍結乾燥してピンク色綿状粉末を得た。テトラジン変性の程度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により決定した。ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン：ＭＨ＋＝７９０１０であり、これは平均９．７テトラジン／ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡに対応する（添加テトラジン断片の質量は９４８Ｄａ；ＭＨ＋（ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡ）＝６９８２３）。ナノドロップでのＵＶ−ＶＩＳ測定は、分子当たり９から１０のテトラジンの存在を確認した（測定値：８．９テトラジン／ガラクトース（１６．４）−ＭＳＡ）。
【０１５４】
実施例３：
化合物１４は、前記レトロＤＡ反応を介して血液中でプレターゲットプローブと反応し、それを、サイズなどの物理化学的性質により排出器官、例えば肝臓へ運ぶ除去剤の例として合成される。化合物１４は、テトラジン官能化タンパク質でコーティングされたポリスチレンビーズを含み、図６で概説されるように合成された。
【０１５５】
リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、１．５ｍｇ）の溶液を、ＤＭＦ中のテトラジン−ＮＨＳ（５）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（６３μＬ、ＢＳＡに関して２６当量）と混合し、１Ｍの炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６（７．５μＬ）を添加した。前記溶液（合計２５０μＬ）を３７℃で３０分間インキュベートし、次に低ＭＷ成分を前記溶液から、ＰＢＳで前洗浄したＺｅｔａ脱塩スピンカートリッジ（７ｋＤａＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて除去した。ＰＢＳ中のＢＳＡ−テトラジン（１３）を含む溶出物を、Ｈ２Ｏ中のポリスチレンビーズ（ポリビーズ、０．５μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）懸濁物７５０μＬへ添加し、得られた懸濁物を室温で、転倒回転ミキサー（１０ｒｐｍ）でインキュベートした。インキュベート後、ＢＳＡ−テトラジン（１４）でコーティングしたビーズの懸濁物を、１２０００ｒｐｍで４分間遠心分離させた。上澄みを注意深く除き、ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中の０．３％ＢＳＡ（重量／体積）中に、低パワーのチップソニケーター（Ｓｏｎｉｃｓ  ＶｉｂｒａＣｅｌｌ、５秒パルス４回、４０％出力）を使用して再懸濁させた。遠心分離−再懸濁サイクルを３回繰り返し、次いで前記ビーズペレットをＰＢＳ中の７５０μＬの０．３％ＢＳＡ中に再懸濁させた。前記ビーズ懸濁物中にマクロ凝集物は存在しないことが、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ測定（粒子の９９％が２．７μｍ未満）で確認され、及び５０６ｎｍビーズ直径（加重（number  weighted））が動的光散乱により測定された。
【０１５６】
実施例４：
テトラジン放射線ラベル化：
ＤＯＴＡ抱合テトラジン（１５；図７、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ  ２０１０、４９、３３７５」に記載）を、０．２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．０中に溶解（１ｍｇ／ｍＬ）し、使用前に−８０℃で保存した。１５の一定量を塩化［１１１Ｉｎ］インジウムの適切な量と組み合わせて、ゆっくりと撹拌しつつ３７℃で１０分間インキュベートした。次に、５μＬの１０ｍＭ  ＤＴＰＡを添加して溶液をさらに５分間インキュベートした。典型的には、定量的ラベル収率及び９８％を超える放射化学純度がこの方法で得られた。
【０１５７】
ｍＡｂ放射線ラベル化：
５０μＬのＰＢＳ中の［１２５Ｉ］ヨウ化ナトリウム（５〜１５ＭＢｑ）の十分な量に、ＤＭＳＯ中のＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｎ−スクシニミジル−３−［４−ヒドロキシフェニル］プロピオネート（ＳＨＰＰ））の１ｍｇ／ｍＬ溶液の１μＬ、及び｀ＰＢＳ中のクロラミン−Ｔ（Ｎ−クロロ−４−メチルベンゼンスルホンアミド、ナトリウム塩）の４ｍｇ／ｍＬの２５μＬを添加した。得られた溶液を１０〜２０秒混合して、５μＬのＤＭＦ及び１００μＬのトルエンを前記管に添加し、及び１２５Ｉ−ＳＨＰＰを有機層で抽出し、次にこれをガラス管に移した。トルエンをＮ２のゆっくりとした流れで除去し、その後ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液（５０〜２５０μＬのＰＢＳ中の０．１〜０．５ｍｇ、Ｒｏｓｓｉｎらの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ２０１０、４９、３３７５−８」に記載）を加え、ｐＨを１Ｍ  炭酸塩緩衝液で９に調節し、及び反応混合物を室温で３０分間ゆっくりと振盪しながらインキュベートした。インキュベート後、前記ラベル化収率を放射性−ＩＴＬＣで決定した。粗反応混合物を次に、生理食塩水で予備平衡化させたＺｅｂａスピン脱塩カラム（４０ｋＤａＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ）に負荷した。前記反応管を２０μＬ生理食塩水でリンスし、リンスされたものも前記カラムに同様に負荷した。Ｚｅｂａ精製後、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ溶液の放射化学性純度を放射性−ＩＴＬＣ、放射性−ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定し；タンパク質濃度はＢＣＡアッセイで決定した。
【０１５８】
典型的には、この手順で、７０％を超える１２５Ｉ−ＳＨＰＰｍＡｂ抱合物及び、精製１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ種の９８％を超える放射性純度が得られた（図８参照）。
【０１５９】
実施例５：
本発明の除去剤目的物を使用する方法の一例として、除去剤１２及び１４の注入の有無での１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの血中動態を示す。
【０１６０】
３匹のヌードメスマウス（２０〜２５ｇ）が、１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（約９ＴＣＯ／ｍＡｂ；マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、ｔ＝０）を皮下注射され、血液サンプルを、伏在静脈から、５分、３時間、６時間、１日、２日及び３日後に取り出した。注射後４日で、マウスを屠殺し心臓穿刺して血液を取り出した。血液サンプルは秤量し、１ｍＬのＰＢＳで希釈し、放射活性を、血液の１グラム当たりの注入投与量％（％ＩＤ／ｇ）を決定するために標準物質に沿って（along  with  standards）ガンマカウンターでカウントした。この実験の結果が図９に示される。血液データを双方向指数関数的（bi−exponential）減衰フィッティング（（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ４．１、Ｒ２＝０．９７２）し、前記アルファー相での半減期が１．９７時間、前記ベータ相での半減期が２３．５時間と決定された。
【０１６１】
３匹のヌードメスマウス（２０から２５ｇ）が、１２５Ｉ−ラベル化ＣＣ４９−ＴＣＯ（マウス当たり２０μｇ／７５μＬ、ｔ＝０）を皮下注射され、血液サンプルを、伏在静脈から、５分及び３０分後に取り出した。その後（ｔ＝３５分）、それぞれのマウスは、ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２、マウス当たり１２０μｇ／１００μＬ）、又はＢＳＡ−テトラジンコーティングされたビーズ（１４、マウス当たり約４ｘ１０７ビーズ／１００μＬ）が注射され、血液サンプルが、４５分、６０分、９０分及び１５０分後に取り出された。ｍＡｂ注射後２１０分で、マウスを屠殺し、心臓穿刺して血液を取り出し、選択された器官及び組織を採取した。血液サンプル及び組織（ブロット乾燥）は秤量され、１ｍＬのＰＢＳが添加され、放射活性を、標準物質に沿ってガンマカウンターでカウントした。２つの血液動態の結果を図１０に示した。血液中の１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯレベルの目立った減少が、除去剤投与後すぐに観察された（１２の注射前５分で３５．８±４．７％ＩＤ／ｇ及び注射後２５分で１．６±０．４％ＩＤ／ｇ、及び１４の注射前５分で３２．３±４．７％ＩＤ／ｇ及び注射後１０分で２．７±０．４％ＩＤ／ｇ）。血液放射性レベルの突然の減少は、血液中で、前記除去剤と前記ｍＡｂ−ＴＣＯとの間に反応が起こったこと、及び得られた構成物が肝臓に取り込まれ（図１１）、次いで、腸内を通じて除去された、ことを示す（化合物１２及び１４の注射後１７５分でそれぞれ、注射されたｍＡｂの投与量の２２．８±４．９％及び１３．０±１．８％）。
【０１６２】
実施例６：
本発明の除去剤対象物を使用する方法の例示として、プレターゲットプローブ（１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ）を注射し、続いて異なる量の除去剤（１２）の投与を含む前記エフェクタープローブ（１１１Ｉｎ−１５）を注射する場合に得られる腫瘍取り込み及び腫瘍対血液（Ｔ／Ｂ）比率が示される。
【０１６３】
ＬＳ１７４Ｔ異種移植されたヌードメスマウス（ｎ＝３から４）は、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（ｔ＝０、マウス当たり１００μｇ／１００μｌ）を注射され、続いて、１００μｌ生理食塩溶液に溶解した２０から２００μｇのガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）（ｔ＝２４時間）及び１１１Ｉｎ−ラベルされた１５（マウス当たり、２１．３μｇ／７５μｌ、ｔ＝２６時間）を注射された。ｍＡｂ注射後２９時間で、マウスを屠殺し、血液を心臓穿刺で取り出し、選択された器官及び組織を採取しブロット乾燥した。血液サンプル及び組織を秤量し、１ｍＬのＰＢＳを加えて、放射活性を標準物質に沿ってガンマカウンターで測定して、％ＩＤ／ｇを決定した（表１）。
【０１６４】
表１：二重同位体実験からの、異なる量のガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）を注射された腫瘍を持つマウスにおける、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ及び１１１Ｉｎ−テトラジンの腫瘍取り込み（％ＩＤ／ｇ）及び腫瘍対血液比率（Ｔ／Ｂ）。データは平均±１標準偏差で表される（ｎ＝３から４）。
【表１】
0005992435.tif 000012
【０１６５】
予想通り、腫瘍を持つマウスへの化合物１２の投与量を増加することは、血液中に循環する残留１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯを減少させる結果となった（マウス当たり２０μｇの１２で、２．９±０．３％ＩＤ／ｇからマウス当たり１６０μｇの１２での０．５±０．０％ＩＤ／ｇ）。このことは、除去剤のテトラジン分子とｍＡｂ及びトランスシクロオクテン分子間のレトロ−ＤＡ反応、及び続いて肝細胞でのアッシュウェルレセプターによる捕捉を含む除去機構を支持する。この改善された、循環からのｍＡｂ除去は、マウス当たり２０μｇから１６０μｇの１２の注射で、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ比率についておよそ５倍のＴ／Ｂ増加となる結果である。注目すべきは、マウス当たり１２の１６０μｇまでの除去剤の量の増加は、１１１Ｉｎ−テトラジンの腫瘍取り込みを阻害しない、ということである。これは化合物１２のサイズが最も寄与すると思われ、注射と肝臓での捕捉の間の短い時間で腫瘍組織内への血管外漏出を阻害する。
【０１６６】
循環からの効果的なＣＣ４９−ＴＣＯの除去は、血液中（従って、より高いＴ／Ｂ比率）および血液の多い器官中の１１１Ｉｎ−テトラジン滞留時間の減少をもたらす（図１２）。同時に、前記ｍＡｂ−除去剤構成物が肝細胞へ内部移行する場合に肝臓で１１１Ｉｎ放射活性の増加が観測されず、ここでは極性テトラジンとの相互作用の機会を持たないように思われる。
【０１６７】
しかし、除去剤がマウス当たり１６０μｇを超えると、肝臓は恐らく飽和し、全てのｍＡｂ−除去剤付加物及び残留未反応除去剤を処理できない。事実、血液中に循環するｍＡｂ−関連放射活性は、増加する（１．１±０．６％ＩＤ／ｇ）が、血液中を循環するｍＡｂ種が１１１Ｉｎ−テトラジンとは反応しないことから、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯによるものではない（図１２）。この知見は、高投与量で、前記除去剤−ｍＡｂ抱合物はより非効率的に除去されることを示唆する。２００μｇの除去剤投与量で、腫瘍での１１１Ｉｎ−テトラジンの取り込みは、この組織中に存在する多量のＣＣ４９−ＴＣＯにも拘わらず、やや減少する。前記差は有意ではないが、これは、漏出した除去剤による腫瘍ブロッキングの結果であり得る。この潜在的な現象は、除去剤のより低い投与量では問題とはならない可能性があり、肝臓によりより効果的に排出される。
【０１６８】
実施例７：
本発明の除去剤対象物の使用の方法の例として、前記プレターゲットプローブ（１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ）を注射し、その後除去剤１２の単一投与量及び繰り返し投与量の投与によるエフェクタープローブ（１１１Ｉｎ−１５）の注射の際の、選択された組織での生体内分布及び腫瘍対器官（Ｔ／Ｂ）比率が示される。
【０１６９】
ＬＳ１７４Ｔ異種移植を持つヌードメスマウス（ｎ＝４から６）は、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ（ｔ＝０、マウス当たり１００μｇ／１００μＬ）を注射し、続いて、（ａ）ｍＡｂ注射４８時間後、ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）の１回の１６０μｇ／１００μｌ投与量、又は（ｂ）ｍＡｂ注射４６時間及び４８時間後、１２の２回の１６０μｇ／１００μｌ投与量、又は（ｃ）ｍＡｂ注射２８時間及び４８時間後、１２の２回の１６０μｇ／１００μｌ投与量を注射した。ｍＡｂ注射後５０時間で、マウスは、８．５２μｇの１１１Ｉｎ−テトラジンを受け、次いで３時間後に屠殺され、血液が心臓穿刺で取り出され、及び選択された器官及び組織が採取されブロット乾燥された。前記血液サンプル及び組織は秤量され、１ｍＬのＰＢＳを添加され、放射活性が、標準物質に沿ってガンマーカウンターで測定されて％ＩＤ／ｇを決定した。１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ及び１１１Ｉｎ−テトラジンの生体内分布データは表２に示され、及び１１１Ｉｎ−テトラジンＴ／器官値は表３に示される。
【０１７０】
表２：腫瘍持ちマウスでの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ及び１１１Ｉｎ−テトラジンの生体内分布であって、（ａ）ｍＡｂ注射後４８時間で除去剤１２を１回投与、又は（ｂ）ｍＡｂ投与後４６時間で１回投与かつ４８時間で１回投与、又は（ｃ）ｍＡｂ注射後２８時間で１回投与かつ４８時間で１回投与である。データは平均％ＩＤ／ｇ±１標準偏差（ｎ＝４から６）で示される。
【表２】
0005992435.tif 000013
【０１７１】
表３：腫瘍持ちマウスでの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ及び１１１Ｉｎ−テトラジンの生体内分布であって、ここで（ａ）ｍＡｂ注射後４８時間で除去剤１２を１回投与、又は（ｂ）ｍＡｂ投与後４６時間で１回投与かつ４８時間で１回投与、又は（ｃ）ｍＡｂ注射後２８時間で１回投与かつ４８時間で１回投与である。データは、平均腫瘍対器官比率（Ｔ／器官）±１標準偏差（ｎ＝４から６）である。
【表３】
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【０１７２】
この実施例は、腫瘍持ちマウスでの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの生体内分布への、従って、１１１Ｉｎ−テトラジンの滞留への、除去剤１２の一回投与対二回投与の効果を例示する。
【０１７３】
Ｒｏｓｓｉｎら（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ２０１０、４９、３３７５−８」）により報告されたとおり、前記ＣＣ４９−ＴＣＯ構成物は、血液で持続する循環を有する。従って、除去剤を使用せずに、１００μｇのｍＡｂ／マウスの注射後２７時間ではＴ／血液比率は低い（２．８±０．８）。その結果、非腫瘍結合性ｍＡｂ−ＴＣＯ及びプレターゲットエフェクタープローブ（１１１Ｉｎ−テトラジン）間の反応はまた低いＴ／血液比率となり（ｍＡｂ注射後２４時間で２１．３μｇテトラジン／マウスを投与する場合）、非ターゲット器官で比較的高い１１１Ｉｎ−放射活性バックグラウンドを生じる。
【０１７４】
ここで、マウス当たり１００μｇのＣＣ４９−ＴＣＯを投与し、続いて一回の除去剤１２の投与（１６０μｇ、ｔ＝４８時間）は、血液からのｍＡｂの枯渇により高いＴ／器官比率を与える結果となる（表２、表３）。予想されるように、血液、筋肉及び血液の多い器官（肝臓及び脾臓を除く）のＴ／器官値は、第２の投与量の除去剤をさらに第１の投与量の除去剤投与の後投与することで増加し、これは、前記第１の追い出し（chase）後になお循環する残留１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの除去のためである。留意すべきは、前記２回の除去剤投与の間の時間遅延が、２から２０時間へ増加する場合は、血液からの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯの除去が最も効果的となる、ということである。このことは、肝臓が第１のｍＡｂ−除去剤構成物を処理するために長時間を要することに起因すると考えられる。事実、ガラクトース含有構成物は肝細胞のアッシュウェルレセプターに強く結合し、次に前記レセプター−リガンド複合体はエンドサイトーシス小胞体内へ内在化し、カーゴ（cargo）はゆっくりとレセプターから解離し（Ｋｏｆｆ＜０．９×１０−５秒−１）、ゴルジ−リソソーム領域へ運ばれ、そこで分解される一方で前記レセプターは細胞表面で再利用される（Ａ．Ｌ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９８４、１６、２０７−２３３）。前記生体内分布データは、ｍＡｂ−除去剤構成物の代謝及び排出がむしろ遅いことを確認する。事実、除去剤の前記２回投与がｍＡｂ注射後４６及び４８時間で投与される場合には、マウス屠殺の時点（ｍＡｂ注射後５３時間）に相当量の放射活性がなお肝臓内（２．３５±０．３９％ＩＤ／ｇ）及び腸内（１．４４±０．６７％ＩＤ）に存在する。対照的に、除去剤の第１の投与が第２の投与の前およそ２０時間で投与される場合、マウス屠殺の時点では、肝臓及び腸内のｍＡｂ−関連放射性活性は有意に減少している（それぞれ、肝臓及び腸内で、０．９５±０．１３％ＩＤ／ｇ及び０．５６±０．１３％ＩＤ）。
【０１７５】
前記系から非腫瘍結合性ＣＣ４９−ＴＣＯが枯渇することは、腫瘍（腫瘍−結合ＣＣ４９−ＴＣＯとのテトラジン反応）及び腎臓（テトラジン排出）以外の全ての考慮される器官内で１１１Ｉｎ−テトラジンの滞留を有意に減少させると解釈される。結果として、改善された実験条件では（２回の除去剤を長時間の間隔で別々に投与する）、１１１Ｉｎ−テトラジンのＴ／血液及びＴ／筋肉比率は、それぞれ８９．０±１４．３及び１４６．３±３０．３となり、これは、除去剤の１回投与で達成し得る場合（Ｔ／血液＝８．２±４．１及びＴ／筋肉＝９．２±３．６）について、骨髄などの放射線感受性の器官での線量測定のために極めて好ましい示唆を有するであろう。
【０１７６】
実施例８：
追加のトランス−シクロオクテン構成物及びその対応する抗体抱合物の化学合成
前記ＴＣＯと抗体への抱合は、Ｒ．Ｒｏｓｓｉｎ、Ｐ．ＲｅｎａｒｔＶｅｒｋｅｒｋ、ＳａｎｄｒａＭ．ｖａｎｄｅｎＢｏｓｃｈ、Ｒ．Ｃ．Ｍ．Ｖｕｌｄｅｒｓ、ｌ．Ｖｅｒｅｌ、Ｊ．Ｌｕｂ、Ｍ．Ｓ．Ｒｏｂｉｌｌａｒｄの「Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  ＩｎｔＥｄ２０１０、４９、３３７５−７８」の記載されたとおりに行った。
【０１７７】
ＴＣＯ（Ｅ−マイナー）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ４−（（シクロオクタ−４−エニルオキシ）メチル）ベンゾエート  １８
図１３が参照される。
【０１７８】
（Ｅ）−シクロオクタ−４−エノール（１６、マイナー異性体）を、上記文献の手順にしたがって合成した。６０％の水素化ナトリウム（２．１ｇ、５３ｍｍｏｌ）分散体を、５０ｍＬテトラヒドロフラン中の氷浴冷却された１６（２．５３ｇ、２０．１ｍｍｏｌ）へ添加した。４時間室温で撹拌した後、混合物を再び冷却し、４−ブロモメチル安息香酸（４．５３ｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を５分間で分けながら添加した。テトラヒドロフラン２５ｍｌを添加して、懸濁液を４日、室温で撹拌した。氷を加え、続いて１２．０ｇのクエン酸を加えた。混合物を１５０ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで２回抽出した。有機層を２５ｍＬの水で洗浄し、乾燥して蒸発させた。残渣を、８０ｇシリカゲル及び溶出液として徐々に増加する量の酢酸エチルを含むヘプタンで、クロマトグラフにより精製した。生成物画分（生成物と出発アルコールとは完全に分離されていない）を合わせて、（−１５℃まで冷却して）約３０ｍＬのヘプタンから再結晶させ、白色固体として１７を得た（０．８６ｇ、１７％）。これを４０ｍＬジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．４８ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。Ｎ、Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．８０ｇ，３．８８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷中で３０分間撹拌し、次に室温で１８時間撹拌した。濾過し、ジクロロメタンで洗浄し、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、及び２５ｇのシリカゲルで、ヘプタン−酢酸エチルを溶出液として用いてクロマトグラフを行い生成物を得た。蒸発させた生成物画分を７５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルと混合し、混合物を６０℃に温めて溶液とした。前記溶液を２０ｍＬへ濃縮した。５０ｍＬヘプタンを徐々に加えることで、生成物を沈殿させた。沈殿を濾過して集め、ヘプタンで洗浄して１．０５ｇの１８を得た（１５％）。１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝８．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．７３（ｍ、１Ｈ）、５．５２（ｍ、１Ｈ）、４．６０（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．４５（ｄ、Ｊ＝１３．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．６５（ｍ、１Ｈ）、２．９２（ｓ、４Ｈ）、２．４３−１．１０（ｍ、１０Ｈ）；１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ＝１６９．０（ｑ）、１６１．５（ｑ）、１４６．７（ｑ）、１３５．１（ｔ）、１３２．１（ｔ）、１３０．４（ｔ）、１２７．０（ｔ）、１２３．７（ｑ）、８５．３（ｔ）、６８．０（ｓ）、４０．５（ｓ）、３７．７（ｓ）、３４．２（ｓ）、３２．７（ｓ）、３１．４（ｓ）、２５．４（ｓ）；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：計算値Ｃ２０Ｈ２３ＮＯ５Ｎａ＋（［Ｍ−Ｎａ］＋）：３８０．１４７４、実測値：３８０．１４７２。
【０１７９】
ＴＣＯ  マイナー（Ｅ）−２、５−ジオキソピロリジン−１−イル  ２−（シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ）アセテート  ２０
合成経路の詳細は図１４を参照。
【０１８０】
ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の１６（マイナー、０．７８ｇ、６．１９ｍｍｏｌ）を氷冷溶液にオイル中の水素化ナトリウム（６０％、０．９４ｇ、２３．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間室温で撹拌し、その後５０℃に１時間加熱した。混合物を氷冷し、ブロモ酢酸（１．４１ｇ，１０．１４ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁物を約２５℃で２０時間撹拌し（カップリングが生じていないことが示されるサンプル）、その後５５℃で６時間、２５℃で３日間及びさらに５５℃で６時間撹拌した。ロータリーエバポレーターでＴＨＦをほとんど除去し、５０ｍＬのＭＴＢＥを加え、続いて氷及び２５ｍＬの水を加えた。層は分離して水層を３０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。連続する（successive）有機層を２５ｍＬの水で洗浄した。合わせた水層を氷で冷却し、５０ｍＬのＭＴＢＥを添加し、次いで５．１ｇクエン酸を添加した。前記層を分離し、水層を５０ｍＬのＭＴＢＥで抽出した。これを乾燥してロータリーエバポレーターで蒸発させて得られた残渣（１９）を次のステップに使用した（これは相当量のブロモ酢酸を含むものであった）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．２−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．１（ｓ、２Ｈ）、５．４５−５．６５（ｍ、２Ｈ）。
【０１８１】
生成物１９を３０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．６０ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷冷した。ＤＣＣ（３．１１ｇ、１５．１０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を氷中で３０分間撹拌し、その後室温で３時間撹拌した。濾過、ロータリーエバポレーション、トルエン及び次いでジクロロメタンを溶出液として用いた４０ｇのシリカゲルでのクロマトグラフにより、ブロモ酢酸のＮＨＳエステルと混合された２０を得た。混合物を２５ｍＬのＭＴＢＥ中に溶解し、及び２５ｍＬのヘプタンを溶液に添加した。２時間撹拌後、混合物を濾過した（固体は、ブロモ酢酸のＮＨＳエステルである）。濾液をロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた残渣を温ＭＴＢＥに溶解し、ヘプタンをいくらか添加し、溶液を室温へ冷却した。これにより生成物が沈殿した。濾過により３０ｍｇの生成物２０を得た（０．１１ｍｍｏｌ、２％）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ＝１．１−２．４５（ｍ、１０Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、３．６５−３．７５（ｍ、１Ｈ）、４．４（ｓ、２Ｈ）、５．４−５．７（ｍ、２Ｈ）。
【０１８２】
実施例９：
本発明の除去剤対象物を使用する方法の例示として、プレターゲットプローブ（１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ）を注射し、続いて１又は２の投与量の除去剤（１２）の投与による前記１１１Ｌｕ−ラベルされたテトラジン１５を注射する場合に得られる、選択された器官の生体分布及び腫瘍対血液（Ｔ／器官）比率が示される。この実施例で使用されたガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン１２は、図５で示される手順２により合成され、ここで合成中間体１１は、５との反応の前にサイズ排除クロマトグラフで精製してアルブミン凝固物を除去した。
【０１８３】
ＬＳ１７４Ｔ異種移植されたヌードメスマウス（ｎ＝４）（０．２９±０．１６ｇ）は、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ  １８（ｔ＝０、マウス当たり１００μｇ／１００μｌ）が注射され、ついで、ｍＡｂ注射後３０時間で、１回の１６０μｇ／１００μｌのガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン（１２）を投与するか、又はｍＡｂ注射後３０及び４８時間で、２回の１６０μｇ／１００μｌの１２を投与した。最後の除去剤投与の後２時間でマウスは、１７７Ｌｕ−ラベルされたテトラジン１５（ｍＡｂに対して１０当量）を投与され、テトラジン注射後３時間でマウスを屠殺した。血液を心臓穿刺で取り出し、選択された器官及び組織を採取しブロット乾燥した。血液サンプルおよび組織を秤量し、１ｍＬのＰＢＳを添加し、放射活性を、標準物質に沿ってガンマカウンターで測定して％ＩＤ／ｇを決定した。生体分布データ及び腫瘍／器官比率を表４及び５に示す。列（column）間の差は、両側不対−ｔ検定（two−tailed  unpaired  t−test）（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍｖ．５．０１）を用いて解析した。
【０１８４】
表４：腫瘍持ちマウスでの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ  １８及び１７７Ｌｕ−テトラジン  １５の生体内分布であって：ｍＡｂ注射後３０時間で除去剤１２を１回投与、又はｍＡｂ投与後３０及び４８時間で２回投与である。データは平均％ＩＤ／ｇ±１標準偏差（ｎ＝４）として示される。
【表４】
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【０１８５】
表５：：腫瘍持ちマウスでの１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ  １８及び１７７Ｌｕ−テトラジン  １５の生体内分布であって：ｍＡｂ注射後３０時間で除去剤１２を１回投与、又はｍＡｂ投与後３０及び４８時間で２回投与である。データは平均腫瘍／器官比率±１標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【表５】
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【０１８６】
実施例７と同様に、ここで報告された結果は、除去剤１２の２回投与が、血液及び正常組織から１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ  １８を枯渇させるために一回投与よりもより効果的であることを確認する。さらに、ここで我々は、前記系から非腫瘍結合性ＣＣ４９−ＴＣＯの改善された除去が、ほとんどの考慮される正常組織内での１７７Ｌｕ−テトラジン滞留時間を有意に減少させると解釈されることを示す。留意すべきは、腫瘍内のテトラジン蓄積は、二回の除去剤投与には影響されないということであり、前記％ＩＤ／ｇで観察されるわずかな減少（表４）は、急速な腫瘍の成長により引き起こされる腫瘍内での放射性活性の「希釈」によるものと最も考えられる（１回投与対２回投与群での腫瘍の平均サイズは、それぞれ０．２４±０．２２ｇ及び０．４０±０．０７ｇであった）。ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジンによる腫瘍のブロックの欠如は、Ｇａｌ−ＭＳＡ−テトラジンの高ＭＷによるものであり、注射及び肝臓捕捉の間の短い時間で腫瘍組織への漏出を阻害する。留意すべきは、ガラクトース−ＨＳＡ−ビオチンとは対照的に、腫瘍ブロック代謝物は、肝臓でガラクトース−ＭＳＡ−テトラジンの分解後に再循環されないということである。これは、除去剤代謝に続いて放出され得る未反応テトラジンが、プロトン化され（及び従って、捕捉され）及び／又は肝細胞のリソソーム区画内で分解されるものと予想された。その結果、（長時間の間隔で分けた２回の除去剤投与による）最適化実験条件では、非常に高いＴ／血液比率が１７７Ｌｕ−テトラジンで得られる（１９５．７±１２．９；表５）。これは、除去剤の１回投与で達成し得る投与量の場合（Ｔ／血液＝４５．９±１４．２）に比較して骨髄などの放射線感受性の器官での線量測定のために極めて好ましいことを示唆するであろう。
【０１８７】
実施例１０：
ＣＣ４９−ＴＣＯ  ２０でプレターゲットされた腫瘍を有するマウスでの１７７Ｌｕ−テトラジン  １５の生体分布
腫瘍を有するマウス（約１００ｍｍ３の腫瘍サイズ；ｎ＝４）は、７．５  ＴＣＯ−２０グループ（１００μｇ／マウス、約０．２ＭＢｑ）で機能化された１２５Ｉ−ＣＣ４９を注射された。ｍＡｂ注射後３０及び４８時間で、マウスは一回の除去剤（ガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン、１６０μｇ／投与）を投与され、続いて２時間後に１７７Ｌｕ−テトラジン  １５（前記ｍＡｂに対して１０当量、約０．５ＭＢｑ）を投与された。テトラジン投与後３時間で、マウスは麻酔され頸椎脱臼で屠殺し、心臓穿刺で血液を取り出し、関心のある組織及び器官を採取してブロット乾燥した。全ての集めたサンプルは秤量され、１ｍＬのＰＢＳを添加された。前記サンプルの放射性は、二重同位体プロトコルにより（１２５Ｉでは１０から８０ｋｅＶ窓、１７７Ｌｕについては１５５から３８０ｋｅＶ窓）、１グラムの組織当たりの注入投与量パーセント（％ＩＤ／ｇ）を決定するために標準物質に沿ってガンマーカウンターで測定された。
【０１８８】
生体分布データは、腫瘍による高い１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ  ２０の取り込みを示す。前記腫瘍取り込みは、他のＴＣＯ構成物で得られたものよりも高く（下記参照）、合理的に、これは７．５  ＴＣＯ−２０グループで機能化されたＣＣ４９の長い血液循環による。反対に、全ての他の器官でのｍＡｂ滞留時間は、除去剤の２回の投与量の投与により低く、これは前記除去剤が循環ＣＣ４９−ＴＣＯを捕捉して肝臓へ送り、そこで迅速に代謝されるからである。腫瘍でのより高いｍＡｂ取り込みの結果として、１７７Ｌｕ−テトラジン取り込みもまた、これまでの実施例で得られたものよりも有意に高くなった（以下説明）。また、テトラジン投与の前の追い出し段階での非腫瘍結合性ＣＣ４９−ＴＣＯの除去により、全ての他の器官での１７７Ｌｕ取り込みは無視できるものであった。腎臓のみがむしろ高い１７７Ｌｕ滞留を示したが、これはテトラジンの尿中排出の結果である。これにより、腎臓以外の全ての考慮される器官で、高いターゲット対非ターゲット比率がもたらされた。留意すべきは、腫瘍及び血液内に存在する前記ＴＣＯの、それぞれ３４±４％及び１０±１％がテトラジンと反応したことである。
【０１８９】
表６：二重同位体生体分布データであって：１７７Ｌｕ−テトラジン  １５（マウス当たり８．５μｇ／８０μＬ、約０．５ＭＢｑ）注射後３時間、１２５Ｉ−ＣＣ４９−ＴＣＯ−２０（マウス当たり１００μｇ／１００μＬ、約０．２ＭＢｑ）投与後５０時間である。データは、％ＩＤ／グラム±ＳＤ又は腫瘍／器官比率±ＳＤ（ｎ＝４）で表す。
【表６】
0005992435.tif 000017
【０１９０】
実施例１１
抗体ＤＯＴＡ抱合及び１７７Ｌｕ−放射性ラベル化：
２ｍｇのＣＣ４９（ＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ溶液）を、４当量のＤＯＴＡ−ＮＨＳ（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ；Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）を全容積５００μＬのＰＢＳ中で変性した。ｐＨを１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．６で９に調節した。反応は、室温で３０分間暗所で撹拌することで行った。続いて、前記ＤＯＴＡ−ＣＣ４９をＰＢＳで、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−１５遠心分離デバイスで十分に洗浄し、最終溶液中のｍＡｂ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐにて測定した。ｍＡｂ分子当たりのＤＯＴＡ基の数は、既定量のＤＯＴＡ−ＣＣ４９を既定の過剰量のＬｕＣｌ３（放射性１７７Ｌｕがスパイクされたもの）と２時間３７℃で反応させることにより、及び放射性−ＩＴＬＣ（ｎＤＯＴＡ＝ｎＬｕｘ反応収率／１００）により％結合Ｌｕを測定することにより計算された。この手順で、抱合後、ＣＣ４９分子当たり、平均３ＤＯＴＡ基が検出された。
【０１９１】
１７７Ｌｕのストック溶液は、１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０（金属を含まないもの）中で調製された。その後、望ましい量の放射線活性が前記ＤＯＴＡ−ＣＣ４９溶液（０．２Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ７．０中の１００μｇ）に添加され、前記溶液は、１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ５．０で５０μＬまで希釈された。前記ラベル化混合物は、１時間３７℃でインキュベートされ、その後５μＬの１０ｍＭ  ＤＴＰＡが添加され、前記溶液を１０分間さらにインキュベートした。放射線ラベル化収率は、放射性−ＩＴＬＣで決定され（典型的には、６５から７０％）、次に前記粗１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９が、生理食塩水で予備平衡化されたＺｅｂａ脱塩スピンカラム（７又は４０ｋＤａＭＷカットオフ、Ｐｉｅｒｃｅ）に２回通して精製された。その後溶出溶液中１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９の回収は、前記ラベル化収率及び前記スピンカラムカラムから回収された放射活性から見積もられた。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９の放射化学純度は、ＩＴＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣで評価され（典型的には、＞９８％）、その後比放射活性（specific  activity）を、非放射性ｍＡｂを加えることで望ましい値に調節された。
【０１９２】
実施例１２：
直接ラベルされた１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９の及びＣＣ４９−ＴＣＯ−１８プレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジンの比較生体分布
ＬＳ１７４Ｔ異種移植（７０から１００ｍｍ３）された４マウスの群に、直接ラベルされた１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９（マウス当たり１００μｇ／１００μｌ、約０．５ＭＢｑ）又はＣＣ４９−ＴＣＯ−１８でプレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジン  １５（１００μｇ／１００μｌ  ＣＣ４９−ＴＣＯ−１８、続いて２回の１６０μｇ／１００μｌ投与量のガラクトース−ＭＳＡ−テトラジン  １２を３０及び４８時間で、及びマウス当たり８．５２μｇ／８０μｌ  １７７Ｌｕ−テトラジン  １５、０．８から１．２ＭＢｑ、１００μｇゲンチシン酸を含む）を注射した。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９を注射されたマウスの１群及びプレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジンを注射されたマウスの１群を使用して、選択された時点で、伏在静脈から血液サンプルを取り出され、２つのトレーサーの初期血液分布を評価した（１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９については、２、３０及び６０分、及びプレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジンについては２、５、１０、２０、３０及び４５分後）（図１５）。これらの２つの群のマウスを次に、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９及び１７７Ｌｕ−テトラジンの注射後それぞれ３時間及び１時間後に屠殺した。全ての他のマウス群は、トレーサー注射後７日まで種々の時点で屠殺された。屠殺後、血液を心臓穿刺により取り出し、選択された器官及び組織が採取されブロット乾燥された。血液サンプル及び組織サンプルは秤量されて、１ｍＬのＰＢＳを加え、放射活性を、標準物質に沿ってガンマカウンターで測定して％ＩＤ／ｇ及び％ＩＤを決定した（表７、８）。腫瘍を有するマウスの２つの追加の群は、排泄プロフィルのために使用された（図１６）。１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９を注射されたマウスは、濾過カゴユニット内に置かれて種々の時点で床を標準物質に沿ってガンマカウンターで測定した。マウスの他の群はより高い比放射能で１７７Ｌｕ−テトラジン（マウス当たり約１２ＭＢｑ／８．５２μｇテトラジン）を注射され、全身除去を種々の時点で線量計装器（dose  calibrator）で動物を測定することでモニターした。
【０１９３】
表７：腫瘍を有するマウスでの１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９の生体分布。データは、平均％ＩＤ／ｇ及び％ＩＤ±１標準偏差で表される（ｎ＝４）。
【表７】
0005992435.tif 000018
【０１９４】
表８：腫瘍を有するマウスのＣＣ４９−ＴＣＯ−１８プレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジン  １５の生体分布。データは、平均％ＩＤ／ｇ及び％ＩＤ±１標準偏差で表される（ｎ＝４）。
【表８】
0005992435.tif 000019
【０１９５】
予想の通り、直接ラベルした１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９は、２相血液除去プロフィル（Ｔα＝１．０時間及びＴβ＝３２．６時間）、及び全半減期２２時間（Ｔ１／２＝ｌｎ２ｘＡＵＣ／Ｃ０として計算））を有する長い循環（long  circulation）を示した。長い血液循環の結果として、腫瘍のｍＡｂ取り込みは腫瘍対血液比率が、注射後６時間で約１から注射後４日で約３０の範囲の、高いものであった。全身体ｍＡｂ除去は、ゆっくりであり、注射後４日で、注射された放射活性の約２０％のみが尿及び糞から回収された。従って、全観測期間（７日）の間で、大量の放射活性が全ての考慮される器官、特に肺、肝臓、脾臓及び生殖器官に保持されていた（表７）。
【０１９６】
反対に、ＣＣ４９−ＴＣＯプレターゲットされたマウスでは、１７７Ｌｕ−テトラジンは血液から迅速に除去され（Ｔ１／２＝１１．２分）、注射後３時間で、注射された活性の９５％を超えるものが既に尿中に排出されていた。その結果、腫瘍取り込み（％ＩＤ／ｇ）は注射後数時間内でピークとなり（表８）、その後時間と共に減少した。しかし、実験の７日間の間では腫瘍からの放射活性の放出は観測されず、このことはインビボでのディールスアルダー反応生成物の安定性を確認するものであり、かつ腫瘍取り込み減少は主に腫瘍増殖によるものであった。考慮される器官の中で、テトラジンのかなりの量を保持する非ターゲット器官は腎臓のみであった。しかし、注射後数日内には、この器官からもまた効果的に放射活性が除去された。留意すべきは、比較的低い絶対的腫瘍取り込みにも拘わらず、プレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジンの腫瘍対血液比率は、注射後３時間で既に約２００となり、実験の終了時までには５００を超えるまで増加した、ということである。このことは、１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９の高い腫瘍取り込みにも拘わらず、長時間循環する、直接ラベルされたｍＡｂに関し、骨髄などの放射性感受性器官での線量測定について極めて好ましいであろうことを示唆する。
【０１９７】
実施例１３：
ヒト及びマウス線量：従来の放射免疫治療とディールスアルダー反応でのプレターゲット方法との比較：
放射線線量の見積もりは、男性ヒトモデル（７３ｋｇの一般成人）及びボクセル化（voxelized）マウスモデルについて、ＭＩＲＤ手法により前記のマウス生体分布データ（実施例１２、表７及び８）を計算した。これらの器官の活性濃度は、注射量パーセント投与量（％ＩＤ）に変換され、崩壊については注射時に補正された。血液、筋肉及び骨についての％ＩＤは、組織の％ＩＤ／ｇ及び体重の６％、４２％及び１１％と仮定して見積もられた。可能な場合には、時間活性曲線は、２相指数的除去関数でフィッティングさせた。フィッティング関数は次に積分して分析し、器官滞留時間を得た（表９）。曲線フィッティングができない場合には、積分は、最後に測定された生体分布時点を過ぎた活性は放射線崩壊によってのみ減少する、と仮定して台形方法で実行した。腫瘍での時間活性曲線は、Ｆ（ｔ）＝ａ０（１−ｅｘｐ（−ａ１ｔ））として定められる単一の指数的取り込み関数によりフィッティングさせた。
【０１９８】
表９：滞留時間（時間）。
【表９】
0005992435.tif 000020
【０１９９】
１７７Ｌｕ−ＤＯＴＡ−ＣＣ４９については、いくらかの放射活性が、尿及び糞の混合物として回収された。残留する測定されない活性は、体内の残部にあるものとした（１２１時間）。プレターゲットされた１７７Ｌｕ−テトラジンについては、合計９７．８％ＩＤが排泄された。動物の残量活性から、２０％が残部又は体内で観察されたか、滞留時間１時間に対応するものであった。
【０２００】
ヒト放射線量（表１０）は、前記の測定滞留時間及び次の仮定の元でＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭプログラムを用いて計算された：
・血液滞留時間の１０％は、心臓内容物に、及び９０％は身体の残部に帰属する；
・小腸及び大腸で測定された活性は、器官内容物に帰属する放射線投与量は器官自体に帰属する；
・大腸の活性は上部及び下部大腸に均等に帰属する；
・骨の活性は、骨梁及び海綿状骨成分に均等に帰属する。
ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭにおいて膀胱排尿モデルが使用された。赤色骨髄への滞留時間は、血液滞留時間の画分として計算した（τ骨髄＝０．０８τ血液）。
【０２０１】
表１０：器官放射線線量（ｍＧｙ／ＭＢｑ）。
【表１０】
0005992435.tif 000021
【０２０２】
マウス器官への放射線線量は、ＭＩＲＤ手法を用いて評価し、マウスのＳ−ファクタは、マウスのボクセル化モデルを用いて計算し、電子移送プログラムＥＧＳＮＲＣを用いてエネルギー蓄積を計算した。ＳｅｇａｒｓらのＭＯＢＹマウスファントムを０．２ｍｍ格子に、さらに、次の器官が含まれるようにボクセル化した：腸壁と内容物、胃壁と内容物、膀胱壁と内容物及び２０μＬの胆嚢、である。最終的に、０．５３ｇの腫瘍が、動物の首の左側に追加された。２７のそれぞれ一千万崩壊につき、独立したシミュレーションを、プログラムＥＧＳＮＲＣで実行してそれぞれの元の器官につきそれぞれのターゲット器官でのエネルギー蓄積を計算した。このシミュレーションは、ｗｗｗ．ｎｎｄｃ．ｂｎｌ．ｇｏｖ／ＭＩＲＤｔａｂｌｅｓに列記されたとおりの、１７７Ｌｕからの全ての崩壊粒子を含む。これらのＳ−ファクタは次に、上記測定された器官滞留時間と共に使用された。両方の化合物につき、器官線量は表１１に列記される。
【０２０３】
表１１：マウスモデルでの器官放射線線量（ｍＧｙ／ＭＢｑ）。
【表１１】
0005992435.tif 000022
【０２０４】
実施例１４：ガラクトース及びテトラジン残基で官能基化されたデンドリマー状除去剤の合成
ＰＰＩ−Ｇ１−（ガラクトース）２−（テトラジン）２（２３）の合成；合成経路の詳細は図１７を参照：
ＰＰＩ−Ｇ１−（ガラクトース）２−（ＮＨ２）２（２２）
ＰＰＩ−Ｇ１−（ＮＨ２）４（２１；３５．８６ｍｇ；１．１３＊１０−４ｍｏｌ）を水（１．５ｍＬ）に溶解し、酢酸（３０ｍｇ；５．０９＊１０−４ｍｏｌ）を添加した。２−イミノ−２−メトキシエチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（９；６０．５６ｍｇ；２．２７＊１０−４ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２時間室温で撹拌した。続いて反応混合物を凍結乾燥して生成物２２を白色固体として得た（８６．０ｍｇ；９７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝４．５２（ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ、２Ｈ、ガラクトースＨ１）、３．９６（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、２Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．７５−３．５（ｍ、１４Ｈ、ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’＋ＣＨ２Ｓ）、３．４５（ｂｒ．ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、３．０２（ｍ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、３．０−２．８（ｂｒ．ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、１．９７（ｂｒ．ｍ、８Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、１．６２（ｂｒ．ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３１６．３、５５１．４、７８６．５、１０２１．６Ｄａ（計算値：７８７．１Ｄａ）。
【０２０５】
ＰＰＩ−Ｇ１−（ガラクトース）２−（テトラジン）２（２３）
ＰＰＩ−Ｇ１−（ガラクトース）２−（ＮＨ２）２（２２；７．４７ｍｇ；９．３６＊１０−６ｍｏｌ）を水（０．５ｍＬ）に溶解した。一水素リン酸二ナトリウム（６．００ｍｇ；４．２１＊１０−５ｍｏｌ）を添加して、混合物のｐＨを９に調節した。次に、ＮＨＳ−活性化テトラジン（５；１９．９ｍｇ；１．８７＊１０−５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、透明ピンク色溶液を得た。続いて反応混合物を凍結乾燥して、生成物２３をピンク色固体として得た（３０．５ｍｇ；１２２％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝８．９−７．４（ｂｒ．ｍ、１２Ｈ、テトラジン）、４．５６（ｄ、２Ｈ、ガラクトースＨ１）、３．９９（ｓ、２Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．８−３．６（ｍ、１０２Ｈ、ＰＥＧＣＨ２Ｏ＋ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’＋ＣＨ２Ｓ）、３．４３（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、３．３６（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、３．２１（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＮＨＣＯ）、２．９−２．６（ｂｒ．ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、２．５１（ｍ、４Ｈ、ＣＨ２ＣＯ）、２．４−２．２（ｂｒ．ｍ、８Ｈ、ＣＨ２ＣＯ）、２．０−１．６５（ｂｒ．ｍ、１２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、１．５７（ｂｒ．ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１９７１．６、２６８４．４、３３９４．４Ｄａ（計算値：２６７９．８Ｄａ）。
【０２０６】
ＰＰＩ−Ｇ３−（ガラクトース）１２−（テトラジン）４（２６）の合成
合成経路の詳細は図１８を参照。
【０２０７】
ＰＰＩ−Ｇ３−（ガラクトース）１２−（ＮＨ２）４（２５）
ＰＰＩ−Ｇ３−（ＮＨ２）１６（２４；３３．８ｍｇ；２．００＊１０−５ｍｏｌ）を水（０．６ｍＬ）に溶解し、酢酸（１０ｍｇ；１．６７＊１０−４ｍｏｌ）を添加した。２−イミノ−２−メトキシエチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（９；６４．３ｍｇ；２．４０＊１０−４ｍｏｌ）を添加して、反応混合物を２時間室温で撹拌した。続いて反応混合物を水（２ｍＬ）に希釈し、凍結乾燥して白色固体として生成物を得た（８９ｍｇ；９９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝４．５３（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１２Ｈ、ガラクトースＨ１）、３．９９（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、１２Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．８−３．６（ｍ、６０Ｈ、ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’）、３．２９（ｂｒ．ｍ、２４Ｈ、ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、２．７２（ｂｒ．ｍ、８Ｈ、ＣＨ２ＮＨ２）、２．６５−２．４（ｂｒ．ｍ、８４Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、１．８３（ｂｒ．ｍ、２４Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、１．６６（ｂｒ．ｍ、３２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、１．４６（ｂｒ．ｍ、４Ｈ、ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）ｐｐｍ。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３８０７．３、４０４３．４、４２７８．８、４５１４．４、４７５０．０、４９８４．１Ｄａ（計算値：４５１０．１Ｄａ）。
【０２０８】
ＰＰＩ−Ｇ３−（ガラクトース）１２−（テトラジン）４（２６）
ＰＰＩ−Ｇ３−（ガラクトース）１２−（ＮＨ２）２（２５；１０．０ｍｇ；２．３４＊１０−６ｍｏｌ）を水（０．６ｍＬ）に溶解し、ＮＨＳ−活性化テトラジン（５；１２．４ｍｇ；１．１７＊１０−５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、透明なピンク色溶液を得た。続いて、反応混合物を水（３ｍＬ）で希釈し、凍結乾燥して、生成物をピンク色固体として得た（２１．１ｍｇ；１００％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝８．７−７．３（ｂｒ．ｍ、４０Ｈ、テトラジン）、４．５４（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１２Ｈ、ガラクトースＨ１）、３．９９（ｂｒ．ｍ、１２Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．９−３．６（ｍ、３５５Ｈ、ＰＥＧＣＨ２Ｏ＋ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’）、３．４２（ｂｒ．ｍ、１０Ｈ）、３．３５（ｂｒ．ｍ、２４Ｈ、ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、３．１２（ｂｒ．ｍ、１０Ｈ）、３．０−２．６（ｂｒ．ｍ、８４Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、２．５２（ｂｒ．ｍ、１０Ｈ）、２．２６（ｂｒ．ｍ、２０Ｈ）、２．０−１．６（ｂｒ．ｍ、６０Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）ｐｐｍ。ＦＴ−ＩＲ：ν＝３２９８、２８７１、１６７１、１６４３、１５８３、１５３８、１３９４、１２００、１１２４、１０８２ｃｍ−１。
【０２０９】
ＰＰＩ−Ｇ５−（ガラクトース）５０−（テトラジン）１４（２９）の合成
合成経路の詳細は図１９を参照。
【０２１０】
ＰＰＩ−Ｇ５−（ガラクトース）５０−（ＮＨ２）１４（２８）
ＰＰＩ−Ｇ５−（ＮＨ２）６４（２７；２０．９ｍｇ；２．９２＊１０−６ｍｏｌ）を水（０．６ｍＬ）に溶解し、酢酸（１７．５ｍｇ；２．９２＊１０−４ｍｏｌ）を添加した。２−イミノ−２−メトキシエチル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（９；４６．８ｍｇ；１．７５＊１０−４ｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４時間室温で撹拌した。続いて、反応混合物を水（２ｍＬ）で希釈し凍結乾燥して、生成物を白色固体として得た（７４．４ｍｇ；１２０％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝４．６１（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、５０Ｈ、ガラクトースＨ１）、４．０４（ｄ、Ｊ＝２．８Ｈｚ、５０Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．８−３．６（ｍ、３５０Ｈ、ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’＋ＣＨ２Ｓ）、３．４１（ｂｒ．ｍ、１００Ｈ、ＣＨ２ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ））、３．１−２．６（ｂｒ．ｍ、３８０Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、１．９５（ｂｒ．ｍ、２５２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）、１．９８（ｓ、２７０Ｈ、ＣＨ３ＣＯＯＨ）ｐｐｍ。
【０２１１】
ＰＰＩ−Ｇ５−（ガラクトース）５０−（テトラジン）１４（２９）
ＰＰＩ−Ｇ５−（ガラクトース）５０−（ＮＨ２）１４（２８；２８．３ｍｇ；１．２５＊１０−６ｍｏｌ）を水（０．６ｍＬ）に溶解した。一水素リン酸二ナトリウム（１７．７ｍｇ；１．２５＊１０−４ｍｏｌ）を添加して混合物のｐＨを９に調節した。次に、ＮＨＳ−活性化テトラジン（５；１９．９ｍｇ；１．８８＊１０−５ｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、透明ピンク色溶液を得た。続いて反応混合物を、低ＭＷ副生成物とＰＤ−１０カラムを通して溶出させて精製した。高ＭＷ分画を集めて凍結乾燥して、生成物をピンク色固体として得た（１０．９ｍｇ；２７％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ＝８．９−７．６（ｂｒ．ｍ、１０５Ｈ、テトラジン）、４．５９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、５０Ｈ、ガラクトースＨ１）、４．０２（ｓ、５０Ｈ、ガラクトースＨ２）、３．９−３．５（ｍ、１０７０Ｈ、ＰＥＧＣＨ２Ｏ＋ガラクトースＨ３＋Ｈ４＋Ｈ５＋Ｈ６＋Ｈ６’＋ＣＨ２Ｓ）、３．４１（ｂｒ．ｍ、１５８Ｈ）、３．０−２．６（ｂｒ．ｍ、３８０Ｈ、ＣＨ２Ｎ）、２．４７（ｂｒ．ｍ、４０Ｈ）、２．３５（ｂｒ．ｍ、８０Ｈ）、２．１−１．７（ｂｒ．ｍ、２５２Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）ｐｐｍ。
【０２１２】
さらにいくつかの本発明の実施態様は、以下に関する。
［１］  対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、ここで前記投与剤が第１の反応性基を含み、かつ前記除去剤が第２の反応性基を含み、該第１及び第２の反応性基が、互いに生体直交反応性であるように選択され生体直交反応性基であり、前記生体直交反応性基のいずれかがジエノフィルであり、他方の基がジエンであり、前記ジエノフィルが式（１）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【０２１３】
【化１１】
0005992435.tif 000023
ここで、それぞれのＲは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール、ＣＯＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＯＣＯアルキル、ＯＣＯアリール、ＮＲ’ＣＯアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯアリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、ここで２つのＲ部位は一緒になって環を形成してもよく、及びここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、及びＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、又は一緒になって結合を形成し、１つのＲは前記それぞれの投与剤又は除去剤へ場合によりスペーサーを介してリンケージを形成し、前記除去剤がさらに、１以上のヘキソース系部位を含む、組合せ。
［２］  請求項１に記載の組合せであり、前記ジエノフィルが、式（１ａ）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【０２１４】
【化１２】
0005992435.tif 000024
ここで、それぞれのＸ、Ｙ、Ｒ及びＲａは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール、ＣＯＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＯＣＯアルキル、ＯＣＯアリール、ＮＲ’ＣＯアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯアリール（Ｒ’は、又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、Ｒ又はＲａは、場合によりスペーサを介して、前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部位に含まれ；２つのＲ又はＲａ部位は一緒になって環を形成してもよく；Ｒａの少なくとも１つ最大４つが水素ではない、組合せ。
［３］  実施態様［２］に記載の組合せであり、前記式（１ａ）の前記ジエノフィルが次の要件の１以上を満たす：
ａ）Ｘはメチルであり；
ｂ）Ｙはメチルであり；
ｃ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキルであり；
ｄ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリールである、
組合せ。
［４］  実施態様［２］又は［３］の組合せであり、Ｘがメチル又は水素であり、Ｙがメチル又は水素であり、及びＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである、組合せ。
［５］  実施態様［１］乃至［４」のいずれか１つに記載の組合せであり、前記ジエンが以下で定義される式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）の化合物からなる群から選択され：
【０２１５】
【化１３】
0005992435.tif 000025
ここで、Ｒ１は、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ａ−アルキル、Ｓ（＝Ｏ）２−アルキル、及びＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して水素又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキルからなる群から選択され；
【０２１６】
【化１４】
0005992435.tif 000026
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ，Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２１７】
【化１５】
0005992435.tif 000027
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、ＣＯ、Ｃ−アルキル、ＣＮ−アルキル、Ｎ−アルキル及びＮ−アリールからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２１８】
【化１６】
0005992435.tif 000028
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２１９】
【化１７】
0005992435.tif 000029
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、ＣＣＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２２０】
【化１８】
0005992435.tif 000030
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、ピリミド、フェニル及び１以上の電子吸引基で置換されたフェニルからなる群から選択された置換基を示し、該電子吸引基は、好ましくはＮＯ２、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＣＯＮＲ２，ＣＨＯ，ＣＯＲ，ＳＯ２Ｒ，ＳＯ２ＯＲ，ＮＯ及びＡｒ（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、好ましくはフェニル、ピリジル、ピリミジル及びナフチルから選択された基を表す）、からなる群から選択される、
組合せ。
［６］  実施態様［１］乃至［５］のいずれか１つに記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、好ましくはプライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
［７］  実施態様［１］乃至［５］のいずれか１つに記載の組合せであり、前記投与剤がターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
［８］  生体直交性反応基及び１以上のヘキソース系部位を含む除去剤であり、前記生体直交性反応基が、実施態様［１］乃至［５］のいずれか１つに定義されたジエン又はジエノフィルである、除去剤。
［９］  実施態様［８］の除去剤であり、前記ヘキソース系部位がガラクトース部位である、除去剤。
［１０］  実施態様［６］に定義されたプレターゲットプローブである投与剤を対象体に投与し、前記剤を、対象体のシステム内で、前記プライマリーターゲット部位のプライマリーターゲットへの結合が達成されるために効果的な時間の間循環させ、次に非結合剤を身体から、実施態様［８］又は［９］による除去剤を投与することで除去することを含む、プレターゲット方法。
［１１］  動物又はヒト対象体で循環から生体分子を除去するための方法であり、前記方法が、投与剤及び除去剤を投与することを含み、前記投与剤が第１の反応性基を含み、前記除去剤が第２の反応性基を含み、該第１の反応性基及び第２の反応性基が互いに生体直交的反応性であるように選択され、前記反応性基が実施態様［１］乃至［５］のいずれか１つに定義されたとおりである、方法。
［１２］  動物又はヒト対象体の循環から生体分子を除去するための、実施態様［１］乃至［５］のいずれか１つに定義されたとおりの投与剤及び除去剤の使用であり、前記投与剤が前記生体分子と結合することができる部位を含む、使用。
【０２２１】
本発明のさらなる実施態様は以下に関する。
［実施態様１］  対象体へ投与される投与剤と、同じ対象体へ投与して、前記対象体の血液から循環する投与剤を除去するための除去剤との組合せであり、
前記投与剤が第１の反応性基を含み、前記除去剤が第２の反応性基を含み、該第１及び第２の反応性基が互いに生体直交性反応性であるように選択された生体直交反応性基である、組合せ。
［実施態様２］
実施態様［１］による組合せであり、前記生体直交性反応基のいずれかが、ジエノフィルであり、他がジエンであり、ここで前記ジエノフィルが、式（１）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【０２２２】
【化１９】
0005992435.tif 000031
ここで、それぞれのＲは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール、ＣＯＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＯＣＯアルキル、ＯＣＯアリール、ＮＲ’ＣＯアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯアリール（Ｒ’は、又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、ここで２つのＲ部位は一緒になって環を形成してもよく、及びここで、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して、Ｈ、又はアルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＮＯ２、及びＮＲＲ’（Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立してＨ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し、又は一緒になって結合を形成し、１つのＲが、場合によりスペーサーを介してそれぞれの投与剤又は除去剤とリンケージを形成する、組合せ。
［実施態様３］  「実施態様２］による組合せであり、前記ジエノフィルが、式（１ａ）を満たす８員環ジエノフィルであり：
【０２２３】
【化２０】
0005992435.tif 000032
ここで、それぞれのＸ、Ｙ、Ｒ及びＲａは独立して、Ｈ又は最大６までの、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｓ−アルキル、Ｓｉ−アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＯ２、ＳＯ３、ＳＯ４、ＮＯ２、ＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール、ＣＯＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ、アリール又はアルキル）、ＯＣＯアルキル、ＯＣＯアリール、ＮＲ’ＣＯアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯアリール（Ｒ’は、又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’Ｃ（＝Ｏ）Ｏアリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アルキル（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＯＣＯＮＲ’アリール（Ｒ’はＨ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＯＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、ＮＲ’ＣＳＮＲ’’アルキル（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）、及びＮＲ’ＣＳＮＲ’’アリール（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して、Ｈ又はアルキル）からなる群から選択される置換基を示し；Ｒ又はＲａの一方は、場合によりスペーサーを介して、前記プレターゲットプローブ又は前記エフェクタープローブへのリンカー部位に含まれ；２つのＲ又はＲａ部位は一緒になって環を形成してもよく；Ｒａの少なくとも１つ最大４つが水素ではない、組合せ。
［実施態様４］  ［実施態様３］による組合せであり、前記式（１ａ）のジエノフィルが次の要件の１以上を満たす：
ａ）Ｘはメチルであり；
ｂ）Ｙはメチルであり；
ｃ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アルキルであり；
ｄ）置換基Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、Ｒ４ａ、Ｒ５ａの１以上がＯ−アリールである、
組合せ。
［実施態様５］  ［実施態様３］又は［実施態様４］に記載の組合せであり、Ｘがメチル又は水素であり、Ｙがメチル又は水素であり、及びＲ３ａ又はＲ４ａがＯ−アルキル又はＯ−アリールである、組合せ。
［実施態様６］  ［実施態様２］乃至［実施態様５］のいずれかに１つに記載の組合せであり、前記ジエンが以下で定義される式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）の化合物からなる群から選択され：
【０２２４】
【化２１】
0005992435.tif 000033
ここで、Ｒ１は、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アリール、Ａ−アルキル、Ｓ（＝Ｏ）２−アルキル、及びＮＲ’Ｒ’’（Ｒ’及びＲ’’はそれぞれ独立して水素又はアルキル）からなる群から選択され；Ａ及びＢはそれぞれ独立して、アルキル置換炭素、アリール置換炭素、窒素、Ｎ＋Ｏ−、Ｎ＋Ｒ（Ａ及びＢは共に炭素でない場合にＲはアルキル）からなる群から選択され；Ｘは、Ｏ、Ｎ−アルキル及びＣ＝Ｏからなる群から選択され、及びＹは、ＣＲであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキルからなる群から選択され；
【０２２５】
【化２２】
0005992435.tif 000034
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ−アルキル、Ｎ−アリール、Ｃ＝Ｏ及びＣＮ−アルキルからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ，Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２２６】
【化２３】
0005992435.tif 000035
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、ＣＯ、Ｃ−アルキル、ＣＮ−アルキル、Ｎ−アルキル及びＮ−アリールからなる群から選択され；ＢはＯであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２２７】
【化２４】
0005992435.tif 000036
ここでＲ１及びＲ２はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、Ｃ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２２８】
【化２５】
0005992435.tif 000037
ここで、Ｒ１は、Ｈ、アルキル、アリール、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル、ＣＦ３及びＮＯ２からなる群から選択され；Ａは、Ｎ、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；ＢはＮであり；Ｘは、ＣＨ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、ＣＣ（＝Ｏ）Ｏ−アルキル及びＮからなる群から選択され；Ｙは、ＣＨ、ＣＣＮ、Ｃ−アルキル、Ｃ−アリール、Ｎ及びＮ＋Ｏ−からなる群から選択され；
【０２２９】
【化２６】
0005992435.tif 000038
ここで、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、ピリミド、フェニル及び１以上の電子吸引基で置換されたフェニルからなる群から選択された置換基を示し、該電子吸引基は、好ましくはＮＯ２、Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ、Ｉ、ＣＮ，ＣＯＯＨ，ＣＯＯＲ，ＣＯＮＨ２，ＣＯＮＨＲ，ＣＯＮＲ２，ＣＨＯ，ＣＯＲ，ＳＯ２Ｒ，ＳＯ２ＯＲ，ＮＯ及びＡｒ（ＲはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ａｒとは芳香族基、好ましくはフェニル、ピリジル、ピリミジル及びナフチルから選択された基を表す）、からなる群から選択される、組合せ。
［実施態様７］  ［実施態様１］乃至［実施態様６］のいずれか１つに記載の組合せであり、前記投与剤がプレターゲットプローブであり、好ましくはプライマリーターゲット部位として抗体を含む、組合せ。
［実施態様８］  ［実施態様１］乃至［実施態様６］のいずれか一項に記載の組合せであり、前記投与剤がターゲット造影又は治療のための剤である、組合せ。
［実施態様９］  生体直交性反応性基及び１以上のヘキソース、好ましくはガラクトース部位を含む、除去剤。
［実施態様１０」  ［実施態様９］による除去剤であり、前記生体直交性反応性基が、［実施態様２］乃至［実施態様５］のいずれか１つに記載のジエン又はジエノフィルである、除去剤。
［実施態様１１］  ［実施態様７］に定義されたプレターゲットプローブである投与剤を対象体に投与し、前記剤を、対象体のシステム内で、前記プライマリーターゲット部位のプライマリーターゲットへの結合が達成されるために効果的な時間の間循環させ、次に非結合剤を身体から、［実施態様１］乃至［実施態様６］のいずれか１つによる除去剤を、好ましくは［実施態様９］又は［実施態様１０］に記載の除去剤を投与することで除去することを含む、プレターゲット方法。
［実施態様１２］  動物又はヒト対象体で循環から生体分子を除去するための方法であり、前記方法が、投与剤及び除去剤を投与することを含み、前記投与剤が第１の反応性基を含み、前記除去剤が第２の反応性基を含み、前記第１の反応性基及び第２の反応性基が互いに生体直交的反応性であるように選択される、方法。
［実施態様１３］  ［実施態様１２］に記載の方法であり、前記反応性基が、［実施態様２］乃至［実施態様６］のいずれか１つに定められたとおりである、方法。
［実施態様１４］  動物又はヒト対象体の循環から生体分子を除去するための、［実施態様１］乃至［実施態様６］のいずれか１つに定義されたとおりの投与剤及び除去剤の使用であり、前記投与剤が前記生体分子と結合することができる部位を含む、使用。
【図１】
0005992435.tif 000047
【図２】
0005992435.tif 000048
【図３】
0005992435.tif 000049
【図４】
0005992435.tif 000050
【図５】
0005992435.tif 000051
【図６】
0005992435.tif 000052
【図７】
0005992435.tif 000053
【図８Ａ】
0005992435.tif 000054
【図８Ｂ】
0005992435.tif 000055
【図８Ｃ】
0005992435.tif 000056
【図８Ｄ】
0005992435.tif 000057
【図８Ｅ】
0005992435.tif 000058
【図９】
0005992435.tif 000059
【図１０】
0005992435.tif 000060
【図１１】
0005992435.tif 000061
【図１２】
0005992435.tif 000062
【図１３】
0005992435.tif 000063
【図１４】
0005992435.tif 000064
【図１５】
0005992435.tif 000065
【図１６】
0005992435.tif 000066
【図１７】
0005992435.tif 000067
【図１８】
0005992435.tif 000068
【図１９】
0005992435.tif 000069