(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、オートファジーを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
【請求項２】
オートファジーを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制されたＧＳＴ−π発現細胞においてアポトーシスを誘導するための剤。
【請求項３】
変異型ＫＲＡＳを有する細胞においてアポトーシスを誘導するための、請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、医薬組成物。
【請求項６】
細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＫＲＡＳの変異に起因する疾患の治療用である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
がんの治療用である、請求項５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＳＴ−πおよびその抑制剤の新規な用途、新規なアポトーシス誘導剤、該アポトーシス誘導剤を含む医薬組成物およびアポトーシスの異常に伴う疾患の新規な治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは人類が直面している最も重要かつ厄介な疾患の１つであり、その治療のために多大な研究努力がなされている。がんは、遺伝子の突然変異やエピジェネティックな異常などにより、細胞が無制御に増殖する疾患である。がんにおける遺伝子異常としてはすでに数多くのものが報告されており（例えば、Futreal et al., Nat Rev Cancer. 2004;4(3):177-83など）、その多くが、細胞の増殖、分化、生存に関するシグナル伝達に何らかの関連を有していると考えられている。また、かかる遺伝子異常により、正常な分子で構成される細胞内のシグナル伝達が異常を来し、これが特定のシグナルカスケードの活性化や不活性化をもたらし、最終的に細胞の異常増殖を引き起す一因となることもある。初期のがん治療は、細胞増殖自体の抑制に主眼がおかれていたが、かかる治療は生理的に正常に増殖する細胞の増殖をも抑制してしまうため、脱毛、消化器障害、骨髄抑制などの副作用を伴っていた。そこで、かかる副作用を抑えるため、がん特有の遺伝子異常や、シグナル伝達の異常を標的とした分子標的薬などの新たな発想に基づくがん治療薬の開発が進められている。【０００３】
がん特有の遺伝子異常として、ＫＲＡＳ（V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog）の異常がよく知られている。ＫＲＡＳは、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲなどのチロシンキナーゼ型受容体の下流に位置する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質ともいう）であり、これら受容体からの増殖や分化に関するシグナルを、下流のＭＡＰＫカスケードに伝える役割を担っている。正常なＫＲＡＳは、リガンドの結合により活性化された受容体のチロシンキナーゼ活性によりＧｒｂ２およびＳＯＳを介して活性化され、ＲａｆなどのＭＡＰＫをリン酸化してＭＡＰＫカスケードを駆動させるが、変異型ＫＲＡＳは、受容体からの刺激がなくとも恒常的に活性化しており、増殖シグナルを伝達し続ける。このため、異常な細胞増殖が生じると考えられている。【０００４】
一方で、グルタチオン包含を触媒する酵素の１つであるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、特にＧＳＴ−π（glutathione S-transferase pi、ＧＳＴＰ１ともいう）の発現が、種々のがん細胞において増大しており、これが一部の抗がん剤に対する耐性の一因となっている可能性が指摘されている。実際、ＧＳＴ−πを過剰発現しており、薬物耐性を示すがん細胞系に、ＧＳＴ−πに対するアンチセンスＤＮＡやＧＳＴ−π阻害剤を作用させると、薬剤耐性が抑制されることが知られている（Takahashi and Niitsu, Gan To Kagaku Ryoho. 1994;21(7):945-51、Ban et al., Cancer Res. 1996;56(15):3577-82、Nakajima et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003;306(3):861-9）。さらに、最近の報告では、ＧＳＴ−πを過剰発現するアンドロゲン非依存性前立腺がん細胞系にＧＳＴ−πに対するｓｉＲＮＡを作用させるとその増殖が抑制され、アポトーシスが増大することが報告されている（Hokaiwado et al., Carcinogenesis. 2008;29(6):1134-8）。また、ヒト大腸がんにおいて、ＫＲＡＳの変異がＡＰ−１の活性化を介してＧＳＴ−πの過剰発現を誘導すると考えられることも示唆されている（Miyanishi et al., Gastroenterology. 2001;121(4):865-74）。【０００５】
しかしながら、ＧＳＴ−πと細胞増殖やアポトーシスとの関係、ＧＳＴ−πの分子機構、種々の細胞内シグナル伝達におけるＧＳＴ−πの役割などについては未だ殆ど明らかにされていない。細胞内のシグナル伝達は極めて複雑であり、１つの分子が複数の分子の作用に影響を与えたり、逆に１つの分子が複数の分子から影響を受けたりすることがあるうえ、ある分子の作用を抑えても、他のシグナルカスケードが活性化され、期待どおりの効果が得られないことがままある。したがって、より優れた分子標的薬の開発には、複雑に絡み合った細胞のシグナル伝達機構の解明が必要だが、長年の研究によってもそのごく一部が解明されているに過ぎず、さらなる研究努力が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＧＳＴ−πまたはその抑制剤の新たな用途、ならびに、細胞において効果的にアポトーシスを誘導するための組成物およびそれを用いる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ＧＳＴ−πの分子機構を解明すべく鋭意研究を続ける中で、ＧＳＴ−πの発現を阻害するとＲａｆ−１、ＭＥＫおよびＥＲＫの活性化が著しく阻害されることや、同様にＧタンパク共役型受容体やチロシンキナーゼ型受容体の活性化により活性化されるＰＩ３Ｋ（Phosphoinositide 3-kinase）シグナルカスケードにおいてもシグナル伝達の抑制が起こることを見出すとともに、ＧＳＴ−πの発現阻害によりアポトーシスが生じるが、これよりも急速にオートファジーが誘導されることも明らかにした。そして、さらに研究を続けた結果、ＧＳＴ−πを阻害すると同時にオートファジーを抑制することにより、細胞を高効率でアポトーシスへと誘導できることをさらに見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、オートファジーを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤。
（２）オートファジーを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてアポトーシスを誘導するための剤。
（３）変異型ＫＲＡＳを有する細胞においてアポトーシスを誘導するための、上記（１）または（２）に記載の剤。
（４）活性成分が、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターからなる群から選択される、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の剤。【０００９】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の剤を含む、医薬組成物。
（６）細胞の異常増殖に起因する疾患の治療用である、上記（５）に記載の医薬組成物。
（７）ＫＲＡＳの変異に起因する疾患の治療用である、上記（５）に記載の医薬組成物。
（８）がんの治療用である、上記（５）に記載の医薬組成物。【００１０】
（９）ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを促進するための剤。
（１０）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを抑制するための剤。【００１１】
（１１）ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ユビキチン化を抑制するための剤。
（１２）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ユビキチン化を促進するための剤。
（１３）ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、オートファジーを抑制するための剤。
（１４）ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、オートファジーを促進するための剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアポトーシス誘導剤は、従来のものと比較してより効果的にアポトーシスを誘導することができるため、医薬組成物としても効果が高い。特にがんの治療においては、がん細胞をアポトーシスにより死滅させることができるため、がんの進行を阻止するばかりでなく、がんを退縮させる効果も期待できる。また、従来の製剤よりも低い用量で、従来と同等の効果を発揮できるため、副作用の軽減も可能となる。
また、本発明によりＧＳＴ−πの分子機構が明らかとなり、ＧＳＴ−πやその抑制剤の新たな用途が見出された。これは、疾患の処置や、実験手法などに対する新たな選択肢を提供するものであり、医療、獣医療のみならず、生物学、生化学、分子生物学などにおける多大な貢献が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１のａ）は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡによりＧＳＴ−πの発現が特異的に抑制されている様子を表すウェスタンブロッティングの結果である。図１のｂ）は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後１〜４日目における細胞数およびＧＳＴ−πの発現量の変化を示す図である。
【００１４】
【図２】図２は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２日目における、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードに関与するタンパク質の発現の様子を表すウェスタンブロッティングの結果である。ＧＳＴ−πの発現抑制に伴い、Ｒａｆタンパク質の発現量が減少し、さらにＭＥＫやＥＲＫなどのＭＡＰＫのリン酸化が抑制されているのがわかる。
【００１５】
【図３】図３は、Ｒａｆタンパク質の免疫沈降実験の結果を示す。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群において、Ｒａｆタンパク質およびＳｅｒ６２１リン酸化Ｒａｆタンパク質（p-Raf-1(S621)）の発現が若干減少しており、逆にユビキチン化されたＲａｆタンパク質が増加していることがわかる。
【００１６】
【図４】図４は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクタントおよびＳｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡトランスフェクタントを、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２およびネガティブコントロールであるＤＭＳＯで処理した際のＲａｆタンパク質の存在量を比較した図である。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクタントにおいて、プロテアソーム阻害剤で処理することにより、リン酸化Ｒａｆタンパク質（p-Raf-1(S338)）の存在量の増加が観察されたが、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡにおいては変化が見られなかった。これはすなわちＧＳＴ−πの発現抑制により、リン酸化Ｒａｆタンパク質がプロテアソームによる分解を受けていることを示唆しており、図３におけるユビキチン化Ｒａｆタンパク質の増加とも整合する。
【００１７】
【図５】図５は、Ｒａｆタンパク質とＧＳＴ−πとの共免疫沈降実験の結果を表す。抗ｐ−Ｒａｆ−１抗体で沈降したタンパク質において抗ＧＳＴ−π抗体に対する反応が示されたことから、ｐ−Ｒａｆ−１とＧＳＴ−πが複合体を形成していることが示唆される。
【００１８】
【図６】図６は、ＧＳＴ−πノックダウン細胞の免疫蛍光染色像を表す。上段は抗ＬＣ３抗体による染色像であり、下段はＤＡＰＩ染色像である。上段左からそれぞれトランスフェクション後１日目、２日目、３日目、下段左からそれぞれトランスフェクション後４日目、５日目の染色像である。図中矢印で示されている細胞においてオートファゴソームと考えられる点状シグナルが観察され、オートファジーが誘導されていると推測される。
【００１９】
【図７】図７は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２日経過時点でのＧＳＴ−πノックダウン細胞の電子顕微鏡像を表す。左図において、Ｎは核を表し、四角で囲まれたＡの部分の拡大像が右図である。右図においてＭはミトコンドリアを表し、Ｌはリソソームを表す。矢印で示した部分において、ミトコンドリアを取り囲むようにオートファゴソームが形成されているのが観察される。
【００２０】
【図８】図８は、抗ＬＣ３抗体を用いた、ＧＳＴ−πノックダウン（ＫＤ）細胞抽出液のウェスタンブロットの結果を表す。ＧＳＴ−πＫＤ細胞（GST-π siRNA）において、コントロール（Scramble siRNA）と比較して顕著にＬＣ３の発現が増大しているのが観察される。特にＩＩ型のＬＣ３（LC3-II）が大きく増大していることから、オートファゴソームの誘導が推測される。
【００２１】
【図９】図９は、ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。上段はコントロール群の像であり、下段はＧＳＴ−πＫＤ細胞群の像である。左からそれぞれトランスフェクション後３日目、４日目、５日目の染色像を表す。ＧＳＴ−πＫＤ細胞群においてＴＵＮＥＬ陽性細胞が観察された。
【００２２】
【図１０】図１０は、ＧＳＴ−πＫＤ細胞群とコントロール細胞群における、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後１〜４日経過時点での、オートファジー陽性細胞およびアポトーシス陽性細胞の割合の経時的変化を示したグラフ（上）および、ＧＳＴ−πＫＤ細胞におけるＧＳＴ−πの発現量を表す図（下）である。コントロール群ではオートファジーもアポトーシスも殆ど観察されていないのに対し、ＧＳＴ−πＫＤ群では、２日目をピークとしてオートファジー陽性細胞がまず急増し、その後アポトーシスが誘導されていることが示されている。
【００２３】
【図１１】図１１は、ＧＳＴ−πＫＤ細胞における、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルに関与するタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。ＧＳＴ−πＫＤ細胞群において、ＥＧＦＲ、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔのリン酸化が顕著に抑制されていることがわかる。
【００２４】
【図１２】図１２は、ＧＳＴ−πＫＤ細胞をプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２で処理した場合のリン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）の発現量の変化を表すウェスタンブロットの結果を表す。ＧＳＴ−πＫＤ細胞におけるｐ−ＥＧＦＲの発現量低下がプロテアソーム阻害剤処理で回復したことから、ｐ−ＥＧＦＲの発現量低下はプロテアソームによる分解に起因していることが推測された。
【００２５】
【図１３】図１３は、抗ｐ−ＥＧＦＲを用いて共免疫沈降したタンパク質をウェスタンブロットした結果である。抗ＧＳＴ−π抗体においてシグナルが観察されたことから、ｐ−ＥＧＦＲとＧＳＴ−πとが相互作用していることが推測された。
【００２６】
【図１４】図１４は、ＧＳＴ−π阻害剤Ｃ１６Ｃ２を用いた場合のＲａｆタンパク質およびＥＧＦＲの発現レベルの変化を、阻害剤濃度に依存して観察した結果である。ＧＳＴ−π阻害剤を用いた場合も、ＧＳＴ−πノックダウンの場合と同じように、ＥＧＦＲやＲａｆタンパク質のリン酸化が抑制されているのが観察された。
【００２７】
【図１５】図１５は、ＧＳＴ−π阻害剤Ｃ１６Ｃ２を添加した場合における、細胞数の変化を表すグラフである。ＧＳＴ−π阻害剤を添加した場合、細胞数が殆ど増加していないことがわかる。
【図１６】図１６は、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群、ＧＳＴ−πＫＤ群およびＧＳＴ−πＫＤ＋３ＭＡ群における、オートファジー陽性細胞の割合を示すグラフである。ＧＳＴ−πのノックダウンにより増大したオートファジーが、３−ＭＡによって抑制されていることがわかる。
【００２８】
【図１７】図１７は、ＧＳＴ−πＫＤ細胞に３−ＭＡを添加した場合のＴＵＮＥＬ染色像を表す。上段が３−ＭＡを１ｍＭ添加した場合であり、下段が３−ＭＡを５ｍＭ添加した場合である。左からそれぞれトランスフェクション後２日目、３日目、４日目の染色像を表す。３−ＭＡの添加量が多い方が、アポトーシス細胞が多く観察された。
【００２９】
【図１８】図１８は、コントロール細胞群（Scramble siRNA）、ＧＳＴ−πＫＤ細胞群（GST-π siRNA）、ＧＳＴ−πＫＤ細胞＋１ｍＭ  ３−ＭＡ群（GST-π siRNA + 1mM 3-MA）およびＧＳＴ−πＫＤ細胞＋５ｍＭ  ３−ＭＡ群（GST-π siRNA + 5mM 3-MA）における、アポトーシスの割合を経時的に観察した結果を表すグラフである。３−ＭＡの用量依存的にアポトーシスがさらに誘導されることがわかった。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、オートファジーを抑制する薬物とを活性成分として含む、アポトーシスを誘導するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導剤」または「アポトーシス誘導組成物」ともいう）に関する。
本明細書で用いる場合、ＧＳＴ−πは、ＧＳＴＰ１遺伝子によりコードされる、グルタチオン抱合を触媒する酵素を指す。ＧＳＴ−πはヒトを含む種々の動物に存在し、その配列情報も公知である（例えば、ヒト：NP_000843（NM_000852）、ラット：NP_036709（NM_012577）、マウス：NP_038569（NM_013541）など。番号はＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号を示し、括弧外はアミノ酸配列、括弧内は塩基配列の番号である）。
【００３１】
生物個体間には、タンパク質の生理学的機能を損なわない遺伝子配列やアミノ酸配列の変異が生じる可能性があるため、本発明におけるＧＳＴ−πまたはＧＳＴＰ１遺伝子は、上記の公知配列と同一の配列を有するタンパク質や核酸に限定されず、同配列に対し１個または２個以上、典型的には１個または数個、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸または塩基が相違する配列を有するが、なお上記の公知のＧＳＴ−πと同等の機能を有するものを含み得る。ＧＳＴ−πの具体的機能については、後述のとおりである。
【００３２】
なお、本明細書において、「本明細書で用いる場合」、「本明細書で用いる」、「本明細書において」、「本明細書に記載される」等の句は、特に別記しない限り、これに引続く記載が本明細書に記載された全ての発明に適用されることを意味するものとする。また、他に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、公報および他の出版物は、その全体を本明細書に援用する。
【００３３】
本明細書で用いる「ＧＳＴ−πを抑制する薬物」には、限定されずに、例えば、ＧＳＴ−πの産生および／または活性を抑制する薬物や、ＧＳＴ−πの分解および／または不活性化を促進する薬物などが含まれる。ＧＳＴ−πの産生を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えばＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
【００３４】
ＧＳＴ−πの活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＧＳＴ−πに結合する物質、例えば、グルタチオン、グルタチオンアナログ（例えば、WO 95/08563、WO 96/40205、WO 99/54346、上記Nakajima et al.,2003等に記載のもの）、ケトプロフェン（上記Takahashi and Niitsu, 1994）、インドメタシン（Hall et al., Cancer Res. 1989;49(22):6265-8）、エタクリン酸、ピロプロスト（Tew et al., Cancer Res. 1988;48(13):3622-5）、抗ＧＳＴ−π抗体、ＧＳＴ−πのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
【００３５】
ＧＳＴ−πの産生または活性を抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の可能性の低さから、ＧＳＴ−πをコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。
【００３６】
ＧＳＴ−πの抑制は、ＧＳＴ−π抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてＧＳＴ−πの発現や活性が抑制されていることにより決定することができる。ＧＳＴ−πの発現は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、抗ＧＳＴ−π抗体を利用した免疫沈降法、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＩＲＡ、ＩＲＭＡ、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法、ＧＳＴ−πをコードする核酸もしくはそのユニークな断片または該核酸の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）もしくはスプライシング産物に特異的にハイブリダイズする核酸を利用した、種々のハイブリダイゼーション法、ノーザンブロット法、サザンブロット法、種々のＰＣＲ法などにより評価することができる。
【００３７】
また、ＧＳＴ−πの活性は、ＧＳＴ−πの既知の活性、限定されずに、例えば、Ｒａｆ−１（特にリン酸化Ｒａｆ−１）や、ＥＧＦＲ（特にリン酸化ＥＧＦＲ）などのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析することによって評価することができる。
【００３８】
本明細書で用いる場合、ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡ干渉をもたらす任意の分子を指し、限定されずに、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA)、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、ｄｄＲＮＡ（DNA-directed RNA）、ｐｉＲＮＡ（Piwi-interacting RNA）、ｒａｓｉＲＮＡ（repeat associated siRNA）などの二重鎖ＲＮＡおよびこれらの改変体などを含む。これらのＲＮＡｉ分子は市販されているか、公知の配列情報などに基づいて設計、作製することが可能である。
また、本明細書で用いる場合、アンチセンス核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、またはこれらの複合物を含む。
本明細書で用いる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、限定されずに、例えば、特開2003-219893に記載の、標的遺伝子の発現を阻害するＤＮＡとＲＮＡとからなる２本鎖ポリヌクレオチドを含む。
【００３９】
本明細書で用いる場合、オートファジーは、マクロオートファジー、ミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジー等を含み得るが、典型的にはマクロオートファジーを意味する。したがって、本発明における「オートファジー」なる用語は、特に別記しない限り「マクロオートファジー」を指すものとする。
オートファジーは「自食」とも呼ばれる細胞内タンパク質分解機構の一つであり、細胞内におけるタンパク質の分解、リサイクルを担っている。オートファジーは、酵母や哺乳動物を含む広範な生物種でみられ、概ね（ａ）ＰＡＳ（phagophore assembly site）の形成、（ｂ）分解すべきタンパク質を取り囲むファゴフォア（隔離膜）の伸長および拡大と、これによる、分解すべきタンパク質を内包するオートファゴソームの形成、（ｃ）オートファゴソームとリソソームとの融合によるオートリソソームの形成、（ｄ）オートリソソーム内でのタンパク質の分解を含む一連のプロセスを伴う。
【００４０】
上記（ａ）〜（ｃ）のプロセスには特有のオートファジー関連因子が関与している。オートファジー関連因子は、当初酵母において研究がなされ、これまでにＡｔｇ１〜２７を始め数多くのものが同定されているが（Klionsky et al., Dev Cell. 2003;5(4):539-45）、哺乳動物における研究も進み、ホモログが複数同定され、オートファジーのコア分子機構も明らかになりつつある（Yang and Klionsky, Curr Opin Cell Biol. 2010;22(2):124-31）。
【００４１】
哺乳動物におけるオートファジーのコア分子機構に関与するオートファジー関連因子としては、例えば、ＰＡＳの形成に関与するＶＭＰ１、ＴＰ５３ＩＮＰ２、ｍＡｔｇ９、ＵＬＫ複合体（ＵＬＫ１、ＵＬＫ２、ｍＡｔｇ１３、ＦＩＰ２００から構成）、ＰＩ３Ｋ複合体（Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ａｍｂｒａ１、Ａｔｇ１４Ｌから構成されるＡｔｇ１４Ｌ複合体、および、Ｂｅｃｌｉｎ１、ｈＶｐｓ３４、ｐ１５０、Ｂｉｆ−１、ＵＶＲＡＧから構成されるＵＶＲＡＧ複合体）、ファゴフォアの伸長に関与するＬＣ３−ＩＩ、Ａｔｇ１２−Ａｔｇ５−Ａｔｇ１６Ｌ複合体などが挙げられる。
【００４２】
したがって、オートファジーを抑制する薬物としては、限定されずに、例えば、上記のものを含むオートファジー関連因子の産生および／または活性を抑制する薬物や、オートファジー関連因子の分解および／または不活性化を促進する薬物等が挙げられる。オートファジー関連因子の産生を抑制する薬物としては、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクター等が挙げられる。
【００４３】
オートファジー関連因子の活性を抑制する薬物としては、これに限定するものではないが、例えば、ＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、ワートマニン等）、特にクラスＩＩＩＰＩ３Ｋの阻害剤（例えば、３−ＭＡ（３−メチルアデニン）等）、オートファゴソームとリソソームとの融合を阻害する物質（例えば、バフィロマイシンＡ１等）、オートリソソームにおけるタンパク質分解を阻害する物質（例えば、クロロキン、ロイペプチン等）、オートファジー関連因子に結合する物質（例えば、オートファジー関連因子に対する抗体など）、オートファジー関連因子のドミナントネガティブ変異体などが挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。本発明の一態様において、オートファジーを抑制する薬物は、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を含まない。
【００４４】
オートファジーを抑制する薬物としては、特異性の高さや、副作用の低さから、オートファジー関連因子をコードするＤＮＡに対するＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドおよびこれらを発現するベクターが好ましい。
【００４５】
オートファジーの抑制は、本発明のオートファジー抑制剤を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの抑制は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、電子顕微鏡法によるオートファゴソームの検出、オートファジーマーカー（例えば、Ａｔｇ５、Ａｔｇ１２、ＬＣ３、特にＬＣ３−ＩＩなど）の検出などに基づいて評価することができる。ＬＣ３−ＩＩは、限定されずに、例えば、ＬＣ３−ＩＩに対する特異的抗体で検出してもよいし、試料を電気泳動などで分離した後、ＬＣ３−Ｉとは異なるバンドに分れたＬＣ３−ＩＩを、ＬＣ３−ＩＩまたはＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩの両方に反応する抗体を用いてウェスタンブロット法などにより検出することもできる。また、ＬＣ３−Ｉは細胞質内に散在する一方、ＬＣ３−ＩＩは隔離膜、オートファゴソーム、オートリソソームなどのオートファジー特有の構造に局在するため、ＬＣ３−ＩＩに反応する抗体（ＬＣ３−ＩとＬＣ３−ＩＩの両方に反応する抗体を含む）による免疫染色等で顕在化する、これらの構造を示す点状シグナルの存在や数をオートファジーの指標としてもよい。
【００４６】
ＧＳＴ−πを抑制する薬物とオートファジーを抑制する薬物とは、単一の製剤に含まれていてもよいし、２個以上の製剤に別々に含まれていてもよい。後者の場合、各製剤は同時に投与されてもよいし、時間間隔をあけて投与されてもよい。時間間隔をあけて投与される場合、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を含む製剤を、オートファジーを抑制する薬物を含む製剤の前に投与してもよいし、後に投与してもよい。
【００４７】
本発明はまた、オートファジーを抑制する薬物を活性成分として含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてアポトーシスを誘導するための剤または組成物（以下、「アポトーシス誘導剤」または「アポトーシス誘導組成物」ともいう）に関する。
本明細書で用いる場合、「ＧＳＴ−πが抑制された」とは、例えば、ＧＳＴ−πが発現している細胞において、ＧＳＴ−πが抑制されている状態を含む。かかる状態としては、例えば、ＧＳＴ−πが発現している細胞に、ＧＳＴ−πを抑制する薬物（例えば、上述のものなど）を投与した状態などが挙げられる。
ある細胞においてＧＳＴ−πが発現しているか否かは、文献学的に知られているか、または、細胞におけるＧＳＴ−πの発現を実際に検出することにより決定することができる。ＧＳＴ−πの発現は、既に上述したものを含む、既知の任意の手法を用いて検出することができる。
【００４８】
本発明の剤または組成物は、変異型ＫＲＡＳを有する細胞においてアポトーシスを誘導するためのものであってもよい。
本明細書で用いる場合、変異型ＫＲＡＳとしては、限定されずに、例えば、ＫＲＡＳの恒常的な活性化をもたらす変異を有するもの、例えば、内因性ＧＴＰａｓｅを阻害する変異や、グアニンヌクレオチド交換速度を増大させる変異などを有するものが挙げられる。かかる変異の具体例としては、限定されずに、例えば、ヒトＫＲＡＳにおける第１２、１３および／または６１アミノ酸における変異（内因性ＧＴＰａｓｅを阻害）や、ヒトＫＲＡＳにおける第１１６および／または１１９アミノ酸における変異（グアニンヌクレオチド交換速度を増大）等が挙げられる（Bos, Cancer Res. 1989;49(17):4682-9、Levi et al., Cancer Res. 1991;51(13):3497-502）。したがって、本発明の一態様において、変異型ＫＲＡＳは、ヒトＫＲＡＳにおける第１２、１３、６１、１１６、１１９アミノ酸の少なくとも１つに変異を有するＫＲＡＳが挙げられる。本発明の一態様において、変異型ＫＲＡＳは、ヒトＫＲＡＳにおける第１２アミノ酸に変異を有する。また、本発明の一態様において、変異型ＫＲＡＳは、ＧＳＴ−πの過剰発現を誘導するものであってもよい。したがって、変異型ＫＲＡＳを有する細胞は、ＧＳＴ−πの過剰発現を示してもよい。
【００４９】
変異型ＫＲＡＳの検出は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、既知の変異配列に特異的な核酸プローブによる選択的ハイブリダイゼーション、酵素ミスマッチ切断法、シーケンシング（上記Bos, 1989）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法（上記Miyanishi et al., 2001）等が挙げられる。
また、ＧＳＴ−π発現の検出は、上述のものを含む既知の任意の手法を用いて行うことができる。ＧＳＴ−πが過剰発現しているか否かは、例えば、変異型ＫＲＡＳを有する細胞におけるＧＳＴ−πの発現の程度と、正常なＫＲＡＳを有する同種の細胞におけるＧＳＴ−πの発現の程度とを比較することなどにより評価することができる。この場合、変異型ＫＲＡＳを有する細胞におけるＧＳＴ−πの発現の程度が正常なＫＲＡＳを有する同種の細胞におけるＧＳＴ−πの発現の程度を上回っていれば、ＧＳＴ−πが過剰発現しているということができる。
【００５０】
本発明の剤または組成物における活性成分の配合量は、剤または組成物が投与された場合に、アポトーシスが誘導される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導は、種々の既知の手法、例えば、ＤＮＡ断片化、アネキシンＶの細胞膜への結合、ミトコンドリア膜電位の変化、カスパーゼの活性化などのアポトーシス特有の現象の検出や、ＴＵＮＥＬ染色などにより評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
【００５１】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物と、オートファジーを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスを誘導するための剤または組成物を製造する方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物の、アポトーシスを誘導するための剤または組成物の製造への使用、アポトーシスの誘導に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物の組合わせ、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物を投与することを含む、アポトーシスを誘導する方法に関する。
【００５２】
本発明はまた、オートファジーを抑制する薬物を活性成分として配合することを含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてアポトーシスを誘導するための剤または組成物を製造する方法、オートファジーを抑制する薬物の、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてアポトーシスを誘導するための剤または組成物の製造への使用、ＧＳＴ−πが抑制された細胞におけるアポトーシスの誘導に用いるオートファジーを抑制する薬物、ならびに、有効量のオートファジーを抑制する薬物を投与することを含む、ＧＳＴ−πが抑制された細胞においてアポトーシスを誘導する方法に関する。
【００５３】
上記製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
上記アポトーシス誘導方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、当該方法における薬物については既に上述したとおりであり、薬物の有効量は、投与した細胞においてアポトーシスが誘導される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。アポトーシスの誘導は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞にアポトーシスを誘導するものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などにアポトーシスを誘導する量であってよい。
【００５４】
本発明のアポトーシス誘導剤は、細胞増殖に異常がある細胞などにおいても効果的にアポトーシスを誘導できるものであり、医薬組成物の成分として有効である。したがって本発明の一つの側面には、本発明のアポトーシス誘導剤を含む医薬組成物が含まれる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、特にアポトーシスに異常を有する疾患を処置するのに有効である。したがって、本発明の一態様は、上記アポトーシス誘導剤を含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための医薬組成物に関する。本明細書で用いる場合、アポトーシスに異常を有する疾患は、これに限定するものではないが、例えば細胞の異常増殖に起因する疾患、ＫＲＡＳの変異に起因する疾患、ＧＳＴ−πの過剰発現に起因する疾患などが含まれる。細胞の異常増殖に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、過形成症、ケロイド、クッシング症候群、原発性アルドステロン症、紅板症、真性多血症、白板症、過形成瘢痕、扁平苔癬および黒子症などを含む。ＫＲＡＳの変異に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍（がん、悪性新生物ともいう）などを含む。ＧＳＴ−πの過剰発現に起因する疾患としては、限定されずに、例えば、良性または悪性腫瘍、特に薬剤耐性（例えば、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドなどに対して耐性）の悪性腫瘍などを含む。本発明の一態様において、アポトーシスに異常を有する疾患はがんである。
【００５６】
本発明におけるがんとしては、限定されずに、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、リンパ管肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫などの肉腫、脳腫瘍、頭頚部癌、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌、虫垂癌、大腸癌、直腸癌、肝癌、膵癌、胆嚢癌、胆管癌、肛門癌、腎癌、尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、精巣癌、子宮癌、卵巣癌、外陰癌、膣癌、皮膚癌などの癌腫、さらには白血病や悪性リンパ腫などが挙げられる。なお、本発明では、「がん」は、上皮性悪性腫瘍および非上皮性悪性腫瘍を含む。本発明におけるがんは、身体の任意の部位、例えば、脳、頭頚部、胸部、四肢、肺、心臓、胸腺、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸、盲腸、虫垂、直腸）、肝臓、膵臓、胆嚢、肛門、腎、尿管、膀胱、前立腺、陰茎、精巣、子宮、卵巣、外陰、膣、皮膚、横紋筋、平滑筋、滑膜、軟骨、骨、甲状腺、副腎、腹膜、腸間膜、骨髄、血液、血管系、リンパ節等のリンパ系、リンパ液などに存在し得る。
【００５７】
本発明の一態様において、がんは、上記で定義した変異型ＫＲＡＳを有するがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ホルモンまたは成長因子非依存性の増殖を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、ＧＳＴ−πの過剰発現を示すがん細胞を含む。本発明の一態様において、がんは、薬剤耐性である。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミドなどのアルキル化剤、アドリアマイシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍性抗生物質、シスプラチンなどの白金錯体、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。本発明の一態様において、がんは、メルファラン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、シスプラチン、エトポシドからなる群から選択される薬剤に対して耐性を有する。
【００５８】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物とを活性成分としてを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物とを活性成分として配合することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物およびオートファジーを抑制する薬物の、アポトーシスに異常を有する疾患を処置する医薬組成物を製造するための使用、アポトーシスに異常を有する疾患の処置に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物とオートファジーを抑制する薬物との組合せ、ならびに、前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、アポトーシスに異常を有する疾患を処置するための方法に関する。
上記製造方法または使用における薬物や配合量、アポトーシスに異常を有する疾患については、既に上述したとおりである。また、各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
【００５９】
本発明者らは今回、ＧＳＴ−πが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードの上流にあるチロシンキナーゼ型受容体、特にそのリン酸化形態、ならびに、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの構成分子であるＲａｆ、特にそのリン酸化形態とそれぞれ結合し、これらの分子のユビキチン化を阻止することにより、これらのシグナルカスケードを促進することを明らかにした。したがって、本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを促進するための剤または組成物（「シグナルカスケード促進剤」または「シグナルカスケード促進組成物」ともいう）に関する。本発明の剤または組成物は特に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよびＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの両方を同時に促進することができる。
【００６０】
本明細書で用いる「ＧＳＴ−πの機能的変異体」としては、限定されることなく、例えば、（ｉ）ＧＳＴ−πのアミノ酸配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有するが、なおＧＳＴ−πと同等の機能を有する変異体、（ｉｉ）ＧＳＴ−πをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸もしくは同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列に１個または２個以上、典型的には１個または数個の変異を有する核酸によりコードされ、かつＧＳＴ−πと同等の機能を有する変異体、（ｉｉｉ）ＧＳＴ−πをコードする遺伝子の塩基配列を有する核酸、同核酸と同一のポリペプチドをコードする核酸もしくは（ｉｉ）の変異体をコードする核酸の相補鎖、またはその断片にストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によりコードされ、かつ、ＧＳＴ−πと同等の機能を有する変異体、（ｉｖ）ＧＳＴ−πのアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＧＳＴ−πと同等の機能を有する変異体、（ｖ）ＧＳＴ−πをコードする遺伝子の塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸によりコードされ、かつ、ＧＳＴ−πと同等の機能を有する変異体等が挙げられる。
【００６１】
ＧＳＴ−πのアミノ酸配列およびＧＳＴ−πをコードする遺伝子の塩基配列は、上述のとおり各種動物において知られており、当業者はこれらの配列情報をもとに、上記機能的変異体を、既知の任意の手法、例えば、化学合成、制限酵素による核酸の切断または挿入、部位特異的変異導入、放射線もしくは紫外線の照射などにより適宜作製することができる。
【００６２】
ある変異体がＧＳＴ−πと同等の機能を有するか否かは、ＧＳＴ−πの既知の機能、限定されずに、例えば、Ｒａｆ−１（特にリン酸化Ｒａｆ−１）や、ＥＧＦＲ（特にリン酸化ＥＧＦＲ）などのタンパク質との結合性などを、既知の任意の方法、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法などにより解析し、適切な陰性対照や、陽性対照としてのＧＳＴ−πと比較することによって評価することができる。例えば、ある変異体において、上記機能が陰性対照より優れている場合、例えば、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、さらには１００％以上優れている場合、および／または、同機能がＧＳＴ−πの１／１００以上、１／５０以上、１／２５以上、１／１０以上、１／５以上、さらには１／２以上である場合、この変異体をＧＳＴ−πの機能的変異体に含める。
【００６３】
本明細書で用いる「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において周知のパラメータであり、標準的なプロトコル集、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press (2001)や、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)等に記載されている。
【００６４】
本発明におけるストリンジェントな条件は、例えば、６５℃での、３．５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）、フィコール０．０２％、ポリビニルピロリドン０．０２％、ウシ血清アルブミン０．０２％、ＮａＨ２ＰＯ４２５ｍＭ（ｐＨ７）、ＳＤＳ０．０５％、ＥＤＴＡ２ｍＭからなるハイブリダイゼーションバッファーによるハイブリダイゼーションを指す。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２×ＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄する。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb(R)Hybridization Solution（Clontech社）等の市販のハイブリダイゼーションバッファーを用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
【００６５】
同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬等が存在するが、当業者はかかる条件に通じていると思われるため、これらについては、本明細書中に特段記載はしていない。しかしながら、ＧＳＴ−πの変異体をコードしている核酸の明確な同定ができるよう、条件を操作することが可能である。
本発明におけるＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体は、タンパク質としてのＧＳＴ−πやその機能的変異体のほか、ＧＳＴ−πをコードする核酸や、ＧＳＴ−πの機能的変異体をコードする核酸をも含む。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「シグナルカスケード」は、複数のシグナル伝達分子が順々にシグナルを伝えていくシグナル伝達を意味する。例えば「ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケード」の場合、まずＰＩ３Ｋが活性化され、それに起因して次にＡｋｔが活性化され、さらにそれに起因してｍＴＯＲが活性化されるという具合にシグナルが伝達される。これは他のシグナルカスケードの表記においても同様である。シグナルの上流と下流の関係において、活性化の連鎖は直接的に起こっても間接的に起こってもよい。例えばＰＩ３Ｋに起因するＡｋｔの活性化には、ＰＩＰ３（Phosphatidylinositol (3,4,5) trisphosphate）やＰＤＫ１（Phosphoinositide dependent protein kinase 1、ＰＤＰＫ１ともいう）といった分子が介在していることが知られている。
【００６７】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードは、ＰＩ３Ｋの活性化により駆動するシグナルカスケードであり、細胞の生存などに関与するシグナルとして知られている。ＰＩ３Ｋの活性化は、これに限定するものではないが例えばＧタンパク質共役型受容体やチロシンキナーゼ型受容体にリガンドが結合することにより起こり、活性化されたＰＩ３Ｋはイノシトールリン脂質をリン酸化することで、例えばＰＩＰ３などのホスファチジルイノシトールを産生する。これがＰＨドメインにおいてＰＤＫ１やＡｋｔと結合することで、これらのタンパク質の膜への局在化を促す。ＰＤＫ１はＰＩＰ３と結合することで膜において活性化し、活性化されたＰＤＫ１は、Ａｋｔの３０８番目のＴをリン酸化する。Ａｋｔの４７３番目のセリンは、ｍＴＯＲの複合体の一つであるｍＴＯＲＣ２によってリン酸化され、この２箇所のアミノ酸のリン酸化によりＡｋｔは完全に活性化する。
【００６８】
ＡｋｔがｍＴＯＲを活性化する経路についてはまだ完全に解明されたわけではないが、ＰＲＡＳ４０（proline-rich Akt/PKB substrate 40 kDa）が関与していると考えられている。ＰＲＡＳ４０はその名のとおりＡｋｔの基質であり、ｍＴＯＲ複合体に結合してその活性化を抑制していると考えられている分子であり、Ａｋｔが活性化されるとＰＲＡＳ４０がリン酸化され、それによりＰＲＡＳ４０はｍＴＯＲ複合体から脱離してｍＴＯＲが活性化すると考えられている。そしてｍＴＯＲが活性化すると、ＵＬＫ１およびＵＬＫ２（unc-51-like kinase）ならびにｍＡｔｇ１３（mammalian autophagy-related 13）をリン酸化し、オートファジーシグナルの始動を阻害することでオートファジーを抑制する。
【００６９】
一方、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードは、細胞増殖などに関係するシグナルカスケードである。Ｇタンパク質共役型受容体やチロシンキナーゼ型受容体に、例えば成長因子などのリガンドが結合すると、低分子Ｇタンパク質であるＫＲＡＳが活性化され、活性化されたＫＲＡＳはＲａｆ（ＭＡＰＫＫＫの一種）をリン酸化して活性化する。活性化されたＲａｆはＭＥＫ（MAPK/ERK kinase、ＭＡＰ２Ｋの一種）を活性化し、活性化されたＭＥＫはＥＲＫ（Extracellular signal-regulated kinase、ＭＡＰＫの一種）を活性化する。活性化されたＥＲＫは核内へと移行し、様々なｍＲＮＡの転写を促進することで細胞増殖の引き金となる。
【００７０】
本発明において、シグナルカスケードを促進するとは、シグナルカスケードの活性化を高めることのみならず、シグナルカスケードの不活性化を抑制することも意味する。シグナルカスケードが促進されたか否かは、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、シグナルカスケードが活性化されていることにより決定することができる。シグナルカスケードの活性化は、限定されずに、例えば、シグナルカスケード構成分子の活性化（例えば、リン酸化など）や、シグナルカスケードの活性化によりもたらされる細胞現象、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードであれば、オートファジーの抑制など、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードであれば、細胞の増殖などを検出することにより評価することができる。
【００７１】
本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを促進するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを促進するための剤または組成物の製造への使用、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの促進に用いる、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を投与すること含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを促進する方法にも関する。
【００７２】
本発明のシグナルカスケードを促進するための剤または組成物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの異常、特にこれらのシグナルカスケードの抑制に伴う疾患の処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、これらのシグナルカスケードの構成分子の発現や活性の抑制および／または分解や不活性化の増大を伴う疾患（例えば、これらの分子の遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の抑制などによるもの）等が挙げられる。
【００７３】
したがって、本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造への使用、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に伴う疾患の処置に用いる、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を投与すること含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００７４】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを抑制するための剤または組成物（「シグナルカスケード抑制剤」または「シグナルカスケード抑制組成物」ともいう）に関する。
本発明において、シグナルカスケードを抑制するとは、シグナルカスケードの不活性化を誘導することのみならず、シグナルカスケードの活性化を抑制することも意味する。シグナルカスケードが抑制されたか否かは、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、シグナルカスケードが抑制されていることにより決定することができる。シグナルカスケードの抑制は、限定されずに、例えば、シグナルカスケード構成分子の活性化（例えば、リン酸化など）の低減や、シグナルカスケードの抑制によりもたらされる細胞現象、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードであれば、オートファジーの増大など、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードであれば、細胞増殖の抑制などを検出することにより評価することができる。
【００７５】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを抑制するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを抑制するための剤または組成物の製造への使用、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの抑制に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与すること含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを抑制する方法にも関する。
【００７６】
本発明のシグナルカスケードを抑制するための剤または組成物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの異常、特にこれらのシグナルカスケードの活性化に伴う疾患の処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、これらのシグナルカスケードの構成分子の発現や活性の増大および／または分解や不活性化の抑制に伴う疾患（例えば、これらの分子の遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の増大によるもの）、これらのシグナルカスケードの構成分子以外の因子（例えば、受容体型チロシンキナーゼの活性化など）によるシグナルカスケードの活性化に伴う疾患等が挙げられる。
【００７７】
したがって、本発明はさらに、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの活性化に伴う疾患の処置のための医薬組成物、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの活性化に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの活性化に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造への使用、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの活性化に伴う疾患の処置に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与すること含む、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードおよび／またはＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードの活性化に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００７８】
本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ユビキチン化を抑制するための剤または組成物（「ユビキチン化抑制剤」または「ユビキチン化抑制組成物」ともいう）に関する。
ユビキチン化は、タンパク質にユビキチンが結合されることを指し、細胞内で不要となったタンパク質を処理する過程に関与している。ユビキチン化されたタンパク質はプロテアソームにて分解される。
本発明の一態様において、ユビキチン化が抑制されるタンパク質は、ＧＳＴ−πが結合し得るタンパク質である。また、本発明の一態様において、ユビキチン化が抑制されるタンパク質は、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを構成するタンパク質、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードを構成するタンパク質、および、チロシンキナーゼ型受容体からなる群から選択される。本発明の好ましい態様において、ユビキチン化が抑制されるタンパク質は、ＥＧＦＲおよびＲａｆ−１、特にこれらのリン酸化形態からなる群から選択される。
【００７９】
本発明において、ユビキチン化の抑制は、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、ユビキチン化が抑制されていることにより決定することができる。ユビキチン化の抑制は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法などにより評価することができる。
【００８０】
本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、ユビキチン化を抑制するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、ユビキチン化を抑制するための剤または組成物の製造への使用、ユビキチン化抑制に用いる、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を投与すること含む、ユビキチン化を抑制する方法にも関する。
【００８１】
本発明のユビキチン化を抑制するための剤または組成物は、ユビキチン化亢進に伴う疾患の処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、ユビキチンリガーゼの発現や活性の増大および／または分解や不活性化の抑制を伴う疾患（例えば、ユビキチンリガーゼの遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の抑制などによるもの）等が挙げられる。
【００８２】
したがって、本発明はさらに、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、ユビキチン化亢進に伴う疾患の処置のための医薬組成物、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、ユビキチン化亢進に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、ユビキチン化亢進に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造への使用、ユビキチン化亢進に伴う疾患の処置に用いるＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を投与すること含む、ユビキチン化亢進に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００８３】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ユビキチン化を促進するための剤または組成物（「ユビキチン化促進剤」または「ユビキチン化促進組成物」ともいう）に関する。
本発明の一態様において、ユビキチン化が促進されるタンパク質は、ＧＳＴ−πが結合し得るタンパク質である。また、本発明の一態様において、ユビキチン化が促進されるタンパク質は、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードを構成するタンパク質、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードを構成するタンパク質、および、チロシンキナーゼ型受容体からなる群から選択される。本発明の好ましい態様において、ユビキチン化が促進されるタンパク質は、ＥＧＦＲおよびＲａｆ−１、特にこれらのリン酸化形態からなる群から選択される。
【００８４】
本発明において、ユビキチン化の促進は、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、ユビキチン化が促進されていることにより決定することができる。ユビキチン化の促進は、既知の任意の手法、限定されずに、例えば、免疫沈降法、ウェスタンブロッティング法、質量分析法、プルダウン法などにより評価することができる。
【００８５】
本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、ユビキチン化を促進するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、ユビキチン化を促進するための剤または組成物の製造への使用、ユビキチン化促進に用いるＧＳＴ−πを抑制する薬物、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与すること含む、ユビキチン化を促進する方法にも関する。
【００８６】
本発明のユビキチン化を促進するための剤または組成物は、ユビキチン化抑制に伴う疾患の処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、ユビキチンリガーゼの発現や活性の抑制および／または分解や不活性化の増大に伴う疾患（例えば、ユビキチンリガーゼの遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の増大などによるもの）等が挙げられる。
【００８７】
したがって、本発明はさらに、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、ユビキチン化抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、ユビキチン化抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、ユビキチン化抑制に伴う疾患の処置のための医薬組成物の製造への使用、ユビキチン化抑制に伴う疾患の処置に用いる、ＧＳＴ−πを抑制する薬物、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与すること含む、ユビキチン化抑制に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００８８】
本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、オートファジーを抑制するための剤または組成物（「オートファジー抑制剤」または「オートファジー抑制組成物」ともいう）に関する。本発明者らは今回、ＧＳＴ−πが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードの上流にあるチロシンキナーゼ型受容体、特にそのリン酸化形態に結合し、そのユビキチン化を阻止することにより、同シグナルカスケードを促進することを明らかにしたが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードの活性化は、オートファジーを抑制することが知られている（例えば、上記Yang and Klionsky, 2010）。
本発明において、オートファジーの抑制は、本発明の剤または組成物を作用させなかった場合に比べ、細胞においてオートファジーが抑制されていることにより決定することができる。オートファジーの評価手法については、上述のとおりである。
【００８９】
本発明はさらに、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、オートファジーを抑制するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、オートファジーを抑制するための剤または組成物の製造への使用、オートファジー抑制に用いるＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を投与することを含む、オートファジーを抑制する方法にも関する。
【００９０】
本発明のオートファジーを抑制するための剤または組成物は、オートファジーの亢進に伴う疾患などの処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードの抑制に伴う疾患（例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケード構成分子および／またはその上流にある分子の遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の抑制などによるもの）、ミオパシー、肝障害、再灌流障害等が挙げられる。
【００９１】
したがって、本発明はまた、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を活性成分として含む、オートファジーの亢進に伴う疾患を処置するための医薬組成物、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を配合する工程を含む、オートファジーの亢進に伴う疾患を処置するための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体の、オートファジーの亢進に伴う疾患を処置するための医薬組成物の製造への使用、オートファジーの亢進に伴う疾患の処置に用いるＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体、ならびに、有効量のＧＳＴ−πおよび／またはその機能的変異体を、それを必要とする対象に投与することを含む、オートファジーの亢進に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００９２】
本発明者らはまた、ＧＳＴ−πを抑制することによりオートファジーが促進されることを今回明らかにした。したがって、本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、オートファジーを促進するための剤または組成物（「オートファジー促進剤」または「オートファジー促進組成物」ともいう）に関する。本発明はさらに、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、オートファジーを促進するための剤または組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、オートファジーを促進するための剤または組成物の製造への使用、オートファジー促進に用いるＧＳＴ−πを抑制する薬物ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を投与することを含む、オートファジーを促進する方法にも関する。
【００９３】
本発明のオートファジーを促進するための剤または組成物は、オートファジーの抑制に伴う疾患などの処置に有用である。かかる疾患としては、限定されずに、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードの活性化に伴う疾患（例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケード構成分子および／またはその上流にある分子の遺伝子異常や、ＧＳＴ−πの発現や活性の増大などによるもの）、エイジング、虚血性疾患等が挙げられる。
【００９４】
したがって、本発明はまた、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を活性成分として含む、オートファジーの抑制に伴う疾患を処置するための医薬組成物、ＧＳＴ−πを抑制する薬物を配合する工程を含む、オートファジーの抑制に伴う疾患を処置するための医薬組成物の製造方法、ＧＳＴ−πを抑制する薬物の、オートファジーの抑制に伴う疾患を処置するための医薬組成物の製造への使用、オートファジーの抑制に伴う疾患の処置に用いるＧＳＴ−πを抑制する薬物、ならびに、有効量のＧＳＴ−πを抑制する薬物を、それを必要とする対象に投与することを含む、オートファジーの抑制に伴う疾患を処置する方法にも関する。
【００９５】
シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの抑制／促進に係る本発明の上記各種剤または組成物における活性成分の配合量は、当該剤または組成物が投与された場合に、所望の効果（すなわち、シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの抑制／促進）を達成する量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの阻害／促進は、上述のものを含む、種々の既知の手法により評価することができる。活性成分の配合量は、剤や組成物の投薬態様によって変化し得る。例えば、１回の投与に複数の単位の組成物を用いる場合、組成物１単位に配合する有効成分の量は、１回の投与に必要な有効成分の量の複数分の１とすることができる。かかる配合量の調整は当業者が適宜行うことができる。
【００９６】
シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの抑制／促進に係る上記各種剤または組成物の製造方法または使用における薬物やその配合量については、既に上述したとおりである。各薬物の配合は、既知の任意の手法に従って行うことができる。
【００９７】
シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの抑制／促進に係る上記各種方法はいずれも、in vitroの方法であっても、in vivoの方法であってもよい。また、上記方法における薬物の有効量は、投与した細胞において所望の効果（すなわち、シグナルカスケード、ユビキチン化またはオートファジーの抑制／促進）が達成される量であってもよい。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は公知であるか、培養細胞などを用いたin vitro試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。所望の効果の達成は、上述のものを含む種々の既知の手法により評価することができる。上記有効量は、薬物をある細胞集団に投与した場合に、必ずしも同細胞集団の全ての細胞に所望の効果を誘導するものでなくともよい。例えば、上記有効量は、細胞集団における細胞の１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、５％以上、６％以上、８％以上、１０％以上、１２％以上、１５％以上、２０％以上、さらには２５％以上などに所望の効果を誘導する量であってよい。
【００９８】
本明細書に記載される本発明の各種の剤や組成物、処置方法等における活性成分が核酸、例えば、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アンチセンス核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラポリヌクレオチドなどである場合、これらは、裸の核酸としてそのまま利用することもできるが、種々のベクターに担持させることもできる。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター等の公知の任意のものを利用することができる。ベクターは、担持する核酸の発現を増強するプロモーターを少なくとも含んでいることが好ましく、この場合、該核酸は、かかるプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。核酸がプロモーターに作動可能に連結されているとは、プロモーターの作用により、該核酸のコードするタンパク質が適切に産生されるように、該核酸とプロモーターとが配置されていることを意味する。ベクターは、宿主細胞内で複製可能であってもなくてもよく、また、遺伝子の転写は宿主細胞の核外で行われても、核内で行われてもよい。後者の場合、核酸は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００９９】
また、有効成分は、種々の非ウイルス性脂質またはタンパク質担体に担持させることもできる。かかる担体としては、限定されずに、例えば、コレステロール、リポソーム、抗体プロトマー、シクロデキストリンナノ粒子、融合ペプチド、アプタマー、生分解性ポリ乳酸コポリマー、ポリマーなどが挙げられ、細胞内への取込み効率を高めることができる（例えば、Pirollo and Chang, Cancer Res. 2008;68(5):1247-50などを参照）。特に、カチオン性リポソームやポリマー（例えば、ポリエチレンイミンなど）が有用である。かかる担体として有用なポリマーのさらなる例としては、例えば、US 2008/0207553、US 2008/0312174等に記載のものなどが挙げられる。
【０１００】
本明細書に記載される本発明の各種医薬組成物においては、活性成分の効果を妨げない限り、活性成分を他の任意成分と組み合わせてもよい。そのような任意成分としては、例えば、他の化学治療剤、薬理学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤等が挙げられる。また、投与経路や薬物放出様式などに応じて、上記組成物を、適切な材料、例えば、腸溶性のコーティングや、時限崩壊性の材料で被覆してもよく、また、適切な薬物放出システムに組み込んでもよい。
【０１０１】
本明細書に記載される本発明の各種剤および組成物（各種医薬組成物を含む）は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年などを参照）。
例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などが挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤などの注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。
【０１０２】
本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）は、特定の組織や細胞に標的化されていてもよい。標的化は、既知の任意の手法により達成することができる。がんへの送達を企図する場合は、限定されずに、例えば、製剤をＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果の発現に好適な直径５０〜２００μｍ、特に７５〜１５０μｍなどのサイズにすることによるパッシブターゲティングや、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、トランスフェリン受容体、葉酸受容体、ＶＩＰ受容体、ＥＧＦＲ（Torchilin, AAPS J. 2007;9(2):E128-47）、ＲＡＡＧ１０（特表２００５−５３２０５０）、ＰＩＰＡ（特表２００６−５０６０７１）、ＫＩＤ３（特表２００７−５２９１９７）などのリガンドや、ＲＧＤモチーフやＮＧＲモチーフを有するペプチド、Ｆ３、ＬｙＰ−１（Ruoslahti et al., J Cell Biol. 2010;188(6):759-68）などを標的化剤として利用するアクティブターゲティングなどの手法を用いることができる。また、レチノイドががん細胞への標的化剤として有用であることも知られているため（WO 2008/120815）、レチノイドを標的化剤として含む担体を利用することもできる。かかる担体は、上記文献のほか、WO 2009/036368、WO 2010/014117などに記載されている。
【０１０３】
本明細書に記載される本発明の各種剤または組成物（各種医薬組成物を含む）はいずれの形態で供給されてもよいが、保存安定性の観点から、用時調製可能な形態、例えば、医療の現場あるいはその近傍において、医師および／または薬剤師、看護士、もしくはその他のパラメディカルなどによって調製され得る形態で提供してもよい。かかる形態は、本発明の剤または組成物が、脂質やタンパク質、核酸などの安定した保存が難しい成分を含むときに特に有用である。この場合、本発明の剤または組成物は、これらに必須の構成要素の少なくとも１つを含む１個または２個以上の容器として提供され、使用の前、例えば、２４時間前以内、好ましくは３時間前以内、そしてより好ましくは使用の直前に調製される。調製に際しては、調製する場所において通常入手可能な試薬、溶媒、調剤器具などを適宜使用することができる。
【０１０４】
したがって、本発明は、本発明の各種剤または組成物に含まれ得る活性成分を、単独でもしくは組み合わせて含む１個または２個以上の容器を含む組成物の調製キット、ならびに、そのようなキットの形で提供される各種剤または組成物の必要構成要素にも関する。本発明のキットは、上記のほか、本発明の各種剤または組成物の調製方法や投与方法などが記載された指示、例えば説明書や、ＣＤ、ＤＶＤ等の電子記録媒体等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、本発明の各種剤または組成物を完成するための構成要素の全てを含んでいてもよいが、必ずしも全ての構成要素を含んでいなくてもよい。したがって、本発明のキットは、医療現場や、実験施設などで通常入手可能な試薬や溶媒、例えば、無菌水や、生理食塩水、ブドウ糖溶液などを含んでいなくてもよい。
【０１０５】
本明細書に記載される本発明の各種処置方法における有効量とは、例えば、疾患の症状を低減し、または疾患の進行を遅延もしくは停止する量であり、好ましくは、疾患を抑制し、または治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞などを用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタなどのモデル動物における試験により適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、本発明の処置方法に用いる薬物の用量は当業者に公知であるか、または、上記の試験等により適宜決定することができる。
【０１０６】
本明細書に記載される本発明の処置方法において投与する活性成分の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、剤形、および治療に対するコンプライアンスなどを考慮して決定され得る。
投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
投与頻度は、用いる剤や組成物の性状や、上記のものを含む対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎など）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎など）であってもよい。
【０１０７】
本明細書で用いる場合、用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、特定の疾患の処置が企図される場合には、典型的にはかかる疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
また、用語「処置」は、本明細書で用いる場合、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【実施例】
【０１０８】
以下に、本発明を例に基づいてさらに説明するが、かかる例は本発明の例示であり、本発明を限定するものではない。【０１０９】
例１：ＧＳＴ−πノックアウトによるＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードへの影響
（１）細胞培養
Ｋ−ＲＡＳ変異陽性大腸癌細胞株Ｍ７６０９は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で、３７℃で５％ＣＯ２を含む大気下で培養を行った。また、培地には抗生物質として１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えた。【０１１０】
（２）ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションの前日、Ｍ７６０９細胞を１×１０６個／１０ｍＬとなるように抗生物質不含の１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて１００ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに播種した。１ｍＬのOpti-MEM I Reduced Serum Medium（GIBCO社）中にＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ（配列番号１：GGGAGGCAAGACCUUCAUUTT、siRNA ID#2385、Ambion社）を６００ｐｍｏｌ加え、穏やかに混合した。次に、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen社）を１ｍＬのOpti-MEM I Reduced Serum Medium中に３５μＬを希釈し、穏やかに混合した。希釈したＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡと希釈したLipofectamine RNAiMAXを合わせ、穏やかに混合した後、室温で１０分間インキュベートした。この間、培地を１０ｍＬのOpti-MEM I Reduced Serum Mediumに交換した。１０分間のインキュベーション後、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡとLipofectamine RNAiMAXとの複合体を細胞に加え、３７℃で５％ＣＯ２を含む大気下でインキュベートした。５時間のインキュベーション後、１０ｍＬの抗生物質不含の１０％ＦＢＳ入りＲＰＭＩ−１６４０培地に交換した。また、コントロール実験としてＳｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ（配列番号２：CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG、北海道システムサイエンス社）を用いて同様の操作を行った。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後それぞれ１、２、３、４日目において、細胞数を計測するとともにＧＳＴ−πのノックダウンを観察した。ＧＳＴ−πのノックダウンは下記のようにウェスタンブロット法により解析した。【０１１１】
（３）ＧＳＴ−πノックダウンのウェスタンブロット解析
ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の上記各時点において採取した細胞を用いてＧＳＴ−πノックダウンのウェスタンブロット解析を行った。採取した細胞は血清不含培地で１６時間培養した。細胞を冷ＰＢＳで洗った後、冷lysis buffer（１％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、complete Mini EDTA-free（Roche社）、PhosSTOP（Roche社）、ｐＨ７．５）を加えて、氷冷、３０分間インキュベートして可溶化した。４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kit（Thermo SCIENTFIC社）を用いてタンパク質の定量を行ったＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクタント：４．３５μｇ／μＬ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡトランスフェクタント：４．５６μｇ／μＬ）。次に、２０μｇの細胞抽出液を還元条件下で変性させ、マルチゲルＩＩミニ４／２０（１３Ｗ）（コスモ・バイオ社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、タンク式ブロッティング装置を用いて、ＰＶＤＦ膜に電気的に転写した。転写膜を５％スキムミルク／０．０５％  Tween20添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔと略す）で４℃、１６時間でインキュベートしてブロッキングを行った。続いて、ＰＢＳ−Ｔで希釈した抗ＧＳＴ−π抗体（ＭＢＬ社）と４℃で１６時間反応させた。二次抗体反応は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したウサギ抗体を用いて室温で１時間行った。そして、化学発光基質と室温で１分間反応させた後、Ｘ線フィルムを用いて化学発光を検出した。各操作の間の洗浄は、ＰＢＳ−Ｔを用いて５分間の振盪を３回行った。また、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後、１．０×１０５個／５ｍＬになるように６０ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに播種し、ディッシュ中の総細胞数を、ヘモサイトメーターを用いて４日目まで計測した。【０１１２】
（４）ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードに関与するタンパク質のウェスタンブロット解析
ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後２日目に採取した細胞を用いて、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードに関与する主要タンパク質について、上記（３）と同様にウェスタンブロット解析を行った。抗体として抗ＧＳＴ−π抗体に加えて、抗ｐ−Ｒａｆ−１（Ｓｅｒ３３８）抗体（MILLIPORE社）、抗Ｒａｆ−１抗体（Santa Cruz社）、抗ｐ−ＭＥＫ１／２（Ｓｅｒ２１７／２２１）抗体（Cell Signaling社）、抗ＭＥＫ１／２抗体（Cell Signaling社）、抗ｐ−ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（Cell Signaling社）、抗ＥＲＫ抗体（Cell Signaling社）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Abcam社）を用いた。【０１１３】
結果を図１および２に示す。図１ａ）では、ＧＳＴ−πの発現がＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡによって抑制されるが、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡでは抑制されないことが観察された。図１ｂ）では、トランスフェクション後４日経過時点でも、依然としてＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡによって安定的にＧＳＴ−πの発現が抑制されていたこと、さらには、ＧＳＴ−πの発現を抑制した場合、抑制しない場合と比較して、４日間培養後の細胞数が顕著に少ないことがわかった。また、図２から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群において、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードに関与するタンパク質のリン酸化が、いずれも、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群と比べて低下していることが明らかとなった。したがって、ＧＳＴ−πの発現抑制によって、ＲＡＳ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナルカスケードおよび細胞増殖異常が抑制されていることがわかる。【０１１４】
例２：ＧＳＴ−πノックアウトによるユビキチン化への影響
（１）ＧＳＴ−πノックダウンによるＲａｆ−１のユビキチン化への影響
Ｍ７６０９細胞の培養およびＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、例１（１）〜（２）の手順に従って行った。
例１（３）と同様に、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後２日目から血清不含培地で１６時間培養し、細胞抽出液を回収した。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ：８．８８μｇ／μＬ、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ：７．１８μｇ／ｍＬ）。０．５μｇの細胞抽出液をDynabeads Protein G（Invitrogen社）に結合した抗Ｒａｆ−１抗体と混合し、振とう機で穏やかに混合しながら４℃、２時間インキュベートしてＲａｆ−１タンパクを単離した後、抗ユビキチン抗体（Santa Cruz社）を用いて、例１（３）と同様にウェスタンブロット解析を行った。Ｒａｆ−１のプロテアソーム分解の阻害に関与するＳｅｒ６２１のリン酸化修飾は、抗ｐ−Ｒａｆ−１（Ｓｅｒ６２１）抗体（MILLIPORE社）を用いて同様に調べた。【０１１５】
（２）ＧＳＴ−πノックダウン下でのＲａｆ−１発現へのプロテアソーム阻害剤の影響
Ｍ７６０９細胞の培養およびＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、例１（１）〜（２）の手順に従って行った。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後２日目から細胞を血清不含培地で１６時間培養した。５μＭ  ＭＧ１３２で４時間処理した後、細胞抽出液を回収した。ＭＧ１３２処理のコントロールとして、０．０５％  ＤＭＳＯ処理を同様に行った。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ−ＤＭＳＯ処理群：３．３６μｇ／μ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ−ＭＧ１３２処理群：３．１６μｇ／μＬ、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ−ＤＭＳＯ処理群：３．１２μｇ／μＬ、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ−ＭＧ１３２処理群：３．１６μｇ／μＬ）。２０μｇの細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ｐ−Ｒａｆ−１（Ｓｅｒ３３８）抗体および抗Ｒａｆ−１抗体を用いて、例１（３）と同様にウェスタンブロット解析を行った。【０１１６】
（３）ｐ−Ｒａｆ−１とＧＳＴ−πの共免疫沈降
Ｍ７６０９細胞の培養を、例１（１）の手順に従って行った。続いて例１（２）の手順で得たＧＳＴ−πノックダウン細胞を冷ＰＢＳで洗った後、冷共免疫沈降バッファ（０．５％  ＮＰ−４０、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP、ｐＨ  ７．５）を加えて、氷冷、３０分間インキュベートして可溶化した。４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（１２．１μｇ／μＬ）。１ｍｇの細胞抽出液をDynabeads Protein Gに結合した抗ｐ−Ｒａｆ−１（Ｓｅｒ３３８）抗体（US Biological社）と混合し、振とう機で穏やかに混合しながら４℃、１６時間インキュベートして共免疫沈降した。続いて、抗ＧＳＴ−π抗体を用いたウェスタンブロット解析を行った。【０１１７】
結果を図３〜５に示す。図３から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群において、Ｒａｆ−１と共沈降したユビキチン量がＳｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群と比べて多く、Ｒａｆ−１のユビキチン化が増強されていることが明らかとなった。また、図４から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡによるｐ−Ｒａｆ−１の発現低下に、プロテアソームが関与していること、図５から、ＧＳＴ−πがｐ−Ｒａｆ−１と結合していることがそれぞれ示された。以上の結果は、ＧＳＴ−πがｐ−Ｒａｆ−１と結合し、そのユビキチン化を阻害しており、ＧＳＴ−πの抑制により、ｐ−Ｒａｆ−１のユビキチン化が促進され、ｐ−Ｒａｆ−１の存在量が減少することを示唆するものである。【０１１８】
例３：ＧＳＴ−πノックダウンによるオートファジーおよびアポトーシス誘導の解析
（１）免疫蛍光染色によるオートファジー誘導の解析
ＧＳＴ−πノックダウンによるオートファジーの誘導を、オートファジー特異的マーカータンパク質であるＬＣ３の免疫蛍光染色により解析した。例１（２）の手順で得たＧＳＴ−πノックダウン細胞を１×１０５個／２ｍＬになるように３５ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに入れたカバースリップに播種した。培地をアスピレート後、４％パラフォルムアルデヒド添加ＰＢＳを加え、室温で１０分間インキュベートして、細胞を固定した。細胞の浸透化は０．５％TritonX-100添加ＰＢＳを用いて氷上で５分間行った。冷ＰＢＳで１０分間洗浄した後、１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで希釈した抗ＬＣ３Ｂ抗体（Invitrogen社）と湿式チャンバー内で３７℃、１時間反応させた。二次抗体反応はAlexa Fluor488標識したウサギ抗体（Invitrogen社）を用いて３７℃、１時間行った。ProlongGold antifade reagent with DAPIを用いてスライドグラス上にマウントし、４℃で１６時間インキュベートした。抗体反応後の洗浄は、ＰＢＳを用いて３７℃、５分間を３回行った。蛍光顕微鏡観察時におけるオートファジー陽性細胞は、細胞質に存在する点状のＬＣ３シグナルを有する細胞とした。【０１１９】
（２）ウェスタンブロットによるオートファジー誘導の解析
ＧＳＴ−πノックダウン細胞におけるオートファジーの誘導を、さらにＬＣ３のウェスタンブロット解析により解析した。例１（２）の手順で得たＧＳＴ−πノックダウン細胞を１×１０５個／２ｍＬになるように３５ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに入れたカバースリップに播種した。所定の時間インキュベートした後、細胞抽出液を回収し、ウェスタンブロット解析に供した。一次抗体として、抗ＬＣ３Ｂ抗体（SIGMA社）を用いて、転写膜と４℃、１６時間反応させた。ＬＣ３分子の検出は、ＨＲＰ標識二次抗体と反応させた後、化学発光試薬を用いて行った。オートファジーが誘導されているかどうかは、ＬＣ３のＩ型（１８ｋＤａ）とＩＩ型（１６ｋＤａ）への移行で評価した。【０１２０】
（３）電子顕微鏡観察によるによるオートファジー誘導の解析
例１（２）におけるｓｉＲＮＡトランスフェクション後１日目に細胞を０．４×１０５個／０．５ｍＬになるように８ウェル組織培養用カルチャースライドに播種した。２．５％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸バッファ（ｐＨ７．４）で１時間固定し、０．１Ｍカコジル酸バッファでリンスした後、１％ＯｓＯ４と１．５％フェロシアン化カリウムで２時間、後固定した。エタノールで１０分間、３回脱水した後、エポキシ樹脂（TAAB Laboratories Equipment社）で包埋した。超薄切片はダイヤモンドナイフで作製し、酢酸ウラニルとクエン酸鉛で電子染色を行い、切片を電子顕微鏡（日立透過電子顕微鏡H-7500、日立ハイテクノロジーズ社）で観察した。【０１２１】
（４）ＴＵＮＥＬ染色によるアポトーシス誘導の解析
ＴＵＮＥＬ法はIn Situ Cell Death Detection Kit, POD（Roche）を用いて以下のとおりに行った。例１（２）の手順で得たＧＳＴ−πノックダウン細胞を１×１０５個／２ｍＬになるように３５ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに入れたカバースリップに播種した。培地をアスピレート後、４％パラフォルムアルデヒド添加ＰＢＳを加え、室温で６０分間インキュベートして細胞を固定した。内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行うため、３％Ｈ２Ｏ２添加メタノールで室温、１０分間インキュベートした。続いて、０．１％TritonX-100添加０．１％クエン酸ナトリウムで氷上、２分間処理し、細胞の浸透化を行った。ＴＵＮＥＬ反応は湿式チャンバー内で３７℃、６０分間で行った。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の検出は、ペルオキシターゼ標識抗フルオレセイン抗体を３７℃で３０分間反応させた後、ＤＡＢ基質を用いた発色反応により行った。ヘマトキシリンでカウンター染色を行い、光学顕微鏡下で染色細胞を観察し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞をアポトーシス細胞と評価した。各操作の間の洗浄は、ＰＢＳによるリンスで行った。【０１２２】
結果を図６〜１０に示す。図６は抗ＬＣ３抗体での免疫蛍光染色像であり、矢印で示した細胞において、ＬＣ３を示す点状のシグナルが観察された。このＬＣ３の点状シグナルはオートファゴソームであると推測されるところ、ＧＳＴ−πノックダウン細胞においてオートファジーが誘導されていることがわかる。
図７は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡトランスフェクション後２日経過時点での、ＧＳＴ−πＫＤ細胞の電子顕微鏡観察像である。左図において四角で囲まれたＡの部分の拡大像が右図である。右図において、矢印で示された部分には、ミトコンドリアを取り囲むようにオートファゴソームが形成されているのが確認できる。【０１２３】
図８は、ＬＣ３のウェスタンブロットの結果を示す。抗ＬＣ３抗体によって認識されるＬＣ３タンパク質には２つの型が存在する。オートファジーが起こり、ＬＣ３が脂質二重膜に取り込まれると、ＬＣ３はＩ型からＩＩ型へと変化する。したがってＬＣ３−ＩＩ型の検出量の変化により、オートファジーが誘導されているかどうかが確認できる。図８の結果から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群においてＬＣ３がＩ型もＩＩ型もともに発現誘導され、特にＩＩ型の顕著な増加が確認される一方、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群では、Ｉ型、ＩＩ型ともに発現が低く、Ｉ型の方がＩＩ型に比べ発現量が低いことがわかる。
これらの結果から、ＧＳＴ−πの発現を抑制することにより、オートファジーが誘導されていることがわかる。【０１２４】
図９は、ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す。上段はＳｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群の像であり、下段はＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群の像であるが、ＧＳＴ−πをノックダウンした細胞において、ＴＵＮＥＬ陽性細胞、すなわちアポトーシスが観察された。
図１０は、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群とＳｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群におけるオートファジー陽性細胞およびアポトーシス陽性細胞の割合の経時的変化を示したグラフである。なお、オートファジー陽性細胞の割合は、上記（１）の抗ＬＣ３抗体による免疫蛍光染色実験における、細胞５００個に対する、点状のＬＣ３シグナルを有する細胞の割合を、アポトーシス陽性細胞の割合は、上記（４）のＴＵＮＥＬ染色実験における、細胞１０００個に対する、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の割合を、それぞれ示す。これによると、オートファジー陽性細胞の割合は処理後急激に増加し、２日目でピークをつけ、その後下降するのに対し、アポトーシス陽性細胞の割合は、４日目まで徐々にだが継続的に増加していることがわかる。【０１２５】
例４：ＧＳＴ−πノックアウトによるＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードへの影響
（１）ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルのウェスタンブロット解析
一次抗体として抗ｐ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）抗体（Cell Signaling社）、抗ＥＧＦＲ抗体（Santa Cruz社）、抗ｐ−ＰＩ３Ｋ  ｐ８５（Ｔｙｒ４５８）／ｐ５５（Ｔｙｒ１９９）抗体（Cell Signaling社）、抗ＰＩ３Ｋ、ｐ８５抗体（MILLIPORE社）、抗ｐ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Cell Signaling社）、抗Ａｋｔ抗体（Cell Signaling社）、抗ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ３８９）抗体（Cell Signaling社）、抗ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４）抗体（Cell Signaling社）、抗ｐ７０Ｓ６Ｋ抗体（Cell Signaling社）を用いた以外は、例１（１）、（２）、（４）と同様にして、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードを構成する各タンパク質の発現を解析した。【０１２６】
（２）ＧＳＴ−πノックアウト下でのｐ−ＥＧＦＲ発現へのプロテアソーム阻害剤の影響
Ｍ７６０９細胞の培養およびＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを、例１（１）〜（２）の手順に従って行った。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後２日目、細胞を血清不含培地で１６時間培養した。５μＭ  ＭＧ１３２で２時間処理した後、細胞抽出液を回収した。ＭＧ１３２処理のコントロールとして０．０５％ＤＭＳＯ処理を同様に行った。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ−ＤＭＳＯ処理群：１１．９８μｇ／μＬ、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ−ＭＧ１３２処理群：１２．２９μｇ／μＬ、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ−ＤＭＳＯ処理群：８．９１μｇ／μＬ、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ−ＭＧ１３２処理群：９．２４μｇ／μＬ）。８０μｇの細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ｐ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）抗体および抗ＥＧＦＲ抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。【０１２７】
（３）ｐ−ＥＧＦＲとＧＳＴ−πの共免疫沈降
Ｍ７６０９細胞の培養を、例１（１）の手順に従って行った。続いて細胞を冷ＰＢＳで洗った後、冷共免疫沈降バッファ（１．０％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、complete Mini EDTA-free、PhosSTOP、ｐＨ７．５）を加えて、氷冷、３０分間インキュベートして可溶化した。４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、細胞抽出液を得た。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（９．０８μｇ／μＬ）。１ｍｇの細胞抽出液をDynabeads Protein Gに結合した抗ｐ−ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）抗体（Calbiochem社）と混合し、振とう機で穏やかに混合しながら４℃、１６時間インキュベートして共免疫沈降を行った。続いて、抗ＧＳＴ−π抗体を用いてウェスタンブロット解析を行った。【０１２８】
結果を図１１〜１３に示す。図１１から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ処理群において、ＥＧＦＲ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナルカスケードを構成する各タンパク質のリン酸化が、Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ｓｉＲＮＡ処理群と比べ減少していること、図１２から、ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡによるｐ−ＥＧＦＲの発現低下に、プロテアソームが関与していること、そして図１３から、ＧＳＴ−πがｐ−ＥＧＦＲと結合していることがそれぞれ示された。以上の結果は、ＧＳＴ−πがｐ−ＥＧＦＲと結合し、その安定化に寄与しており、ＧＳＴ−πの抑制により、ｐ−ＥＧＦＲのユビキチン化が促進され、ｐ−ＥＧＦＲの存在量が減少することを示唆するものである。【０１２９】
例５：ＧＳＴ−π阻害剤による細胞増殖等への影響
（１）ＧＳＴ−π阻害剤によるＥＧＦＲおよびＲａｆ−１のリン酸化への影響
Ｍ７６０９細胞の培養を、例１（１）の手順に従って行った。細胞を４．０×１０５個／５ｍＬとなるように６０ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに播種した。ＧＳＴ−π阻害剤Ｃ１６Ｃ２（帝人ファーマ社に依頼して作製）を１０、５０、１００μＭになるように加え、２４時間後に細胞抽出液を回収した。得られた細胞抽出液に対し、Micro BCA Protein Assay Kitを用いてタンパク質の定量を行った（非処理：８．５μｇ／μＬ、１０μＬ：８．４９μｇ／μＬ、５０μＭ：７．６８μｇ／μＬ、１００μＭ：６．４μｇ／μＬ）。５０μｇの細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、各タンパク質の発現をウェスタンブロット法により解析した。【０１３０】
（２）ＧＳＴ−π阻害剤による細胞増殖等への影響
Ｍ７６０９細胞の培養を、例１（１）の手順に従って行った。細胞を１．０×１０５個／５ｍＬとなるように６０ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに播種した。１６時間後、ＧＳＴ−π阻害剤を５０μＭになるように加えた。ディッシュ中の総細胞数はヘモサイトメーターを用いて２日目まで計測した。ＧＳＴ−π阻害剤のコントロールとして、０．０５％ＤＭＳＯ処理を行った。【０１３１】
結果を図１４および１５に示す。これらの結果から、ＧＳＴ−π阻害剤によってもＧＳＴ−πノックダウンと同様に、ＥＧＦＲおよびＲａｆ−１のリン酸化（図１４）ならびに細胞増殖（図１５）が抑制されることが明らかとなった。【０１３２】
例６：ＧＳＴ−πノックダウン細胞のオートファジー阻害剤による影響
（１）細胞培養
例１（２）の手順に従ってＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを行った後、抗生物質不含の培地に交換し、３時間インキュベートした。細胞を３５ｍｍ組織培養プラスチックディッシュに入れたカバースリップに播種し、オートファジー阻害剤３−メチルアデニン（３−ＭＡ、SIGMA社）を１および５ｍＭになるように培地に加えた後、所定の時間培養した。
（２）オートファジー陽性細胞の評価
例３（１）と同様に、（１）で培養した細胞を抗ＬＣ３抗体で免疫蛍光染色した。
（３）ＴＵＮＥＬ染色
例３（４）と同様に、（１）で培養した細胞をＴＵＮＥＬ染色した。【０１３３】
結果を図１６〜１８に示す。図１６は、各群における細胞１０００個に対するオートファジー陽性細胞の割合を示すが、オートファジー阻害剤によりオートファジー陽性細胞の割合が顕著に減少したことがわかる。図１７は、上段がＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ＋１ｍＭ  ３−ＭＡ処理群、下段がＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡ＋５ｍＭ  ３−ＭＡ処理群を示す。図９および図１７から、オートファジー阻害剤の併用により、アポトーシス陽性細胞が顕著に増加することがわかる。図１８は、オートファジー阻害剤の用量依存的にアポトーシスがさらに誘導されることを示すグラフである。ＧＳＴ−π  ｓｉＲＮＡの添加によってアポトーシスが誘導されたが、オートファジー阻害剤である３−ＭＡをさらに追加した場合、３−ＭＡの追加用量に依存してさらなるアポトーシスが誘導された。したがって、ＧＳＴ−πを抑制する薬物とオートファジーを抑制する薬物とを組み合わせることにより、より効率的にアポトーシスを誘導できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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