(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．  トリコデルマ属の種であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物、ならびに
ｂ．  トリコデルマ属の種であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）とは異なる、菌界のいずれか１種であるペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）に由来する１つ以上の酵素であって、キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、セルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、およびベータ−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６）から選択される酵素、
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここに、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン加水分解酵素活性の少なくとも６１％は、トリコデルマ属であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物に由来する、酵素複合体。
【請求項２】
前記菌界のいずれか１種に由来する１つ以上の酵素が、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の発酵によって得られる発現産物である、請求項１に記載の酵素複合体。
【請求項３】
前記菌界のいずれか１種の発酵によって得られる発現産物が、キシラナーゼを含む、請求項１または２に記載の酵素複合体。
【請求項４】
エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシド  グルコヒドロラーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼ、キシログルカン−特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ、およびα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される１または複数の酵素活性を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素複合体。
【請求項５】
ａ．少なくとも６１％の、トリコデルマ属であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物、および
ｂ．３９％未満の、ペニシリウム属の種であるペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の発酵によって得られる発現産物、
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここで、百分率は、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン加水分解酵素活性に基づく、酵素複合体。
【請求項６】
本明細書における「アッセイ１」によって測定して少なくとも３０００Ｕ／ｇの、トリコデルマ属であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵に由来する、酵素活性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素複合体。
【請求項７】
本明細書における「アッセイ１」によって測定して少なくとも４０００Ｕ／ｇの合計酵素活性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵素複合体。
【請求項８】
酵素複合体を生産するプロセスであって、
ａ．培地においてトリコデルマ属であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）を発酵させて、発酵ブロスを得る工程；
ｂ．培地においてペニシリウム属であるペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）を発酵させて、発酵ブロスを得る工程、および
ｃ．前記発酵からの無細胞ブロスの形状の工程ａ）およびｂ）由来の各々の酵素複合体を、回収し、および組合せて、酵素複合体を得る工程、ここで、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定したベータ−１，４−エンドグルカン加水分解酵素活性の少なくとも６１％が、トリコデルマ属であるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物に由来する、
を含む、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって得られうる、酵素複合体。
【請求項１０】
醸造マッシュの生産のための、麦芽酒の生産における、ウイスキー生産における、またはバイオ燃料生産における、プロセスにおける、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵素複合体の使用。
【請求項１１】
酵素複合体が、ロータリングおよび／またはマッシュ濾過ならびに／またはビール濾過における補助のためにマッシュにおいて使用される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
果汁、ワイン、穀物加工、燃料アルコール、または飲料アルコールの生産における、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵素複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコデルマ属の発酵によって得られる発現産物の複数の酵素活性を、異なる菌株の種の１または複数の酵素との組合せで有する、改善した酵素複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビール生産における酵素の使用は、よく知られている。酵素をマッシュ工程に適用してマッシュろ過器能を改善させ、および抽出物収率を上昇させることが、ＷＯ９７／４２３０２に記載されている。
【０００３】
ＷＯ２００５１１８７６９およびＷＯ２００５０５９０８４は、ビールの生産のためのプロセスにおける、マッシングおよび濾過工程、および、このようなプロセスにおける使用のための酵素組成物に関する。
【０００４】
ＷＯ１９９９０５７３２５は、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の株、それから得られる新しい酵素混合物、およびそれについての核酸配列に関する。
【０００５】
しかしながら、食品生産物の生産において、例えば、アルコール飲料、例えば、ビールまたはウイスキーの生産におけるマッシング、料理および濾過工程において、有用な改善した酵素複合体が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の課題
食品生産物等の調製において、例えば、ビールもしくはウイスキーなどのアルコール飲料、またはバイオ燃料の生産におけるマッシング、料理および／または濾過工程において、改善した生産方法を可能にする、改善した酵素複合体を提供することが、本発明の実施態様の目的である。
【０００７】
本発明の要旨
トリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物と、異なる菌の種の任意の１つの特定の酵素とを組合わせることによって、改善した特性の酵素複合体が得られることが、本発明者（ら）によって見出された。
【０００８】
そのため、第一の側面において、本発明は、
ａ．  トリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物、ならびに
ｂ．  キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、セルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、およびベータ−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６）から選択される、菌界の異なる種の任意の１つの、１または複数の酵素
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここに、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン活性の少なくとも約６１％は、トリコデルマ属の発酵に由来する、酵素複合体
に関する。
【０００９】
「菌界の異なる種の任意の１つ」は、（ａ）におけるトリコデルマ属の種とは異なる種を指すことが理解されるべきである。
【００１０】
第２の側面において、本発明は、
ａ．少なくとも約６１％の、トリコデルマ属の発酵によって得られる発現産物、および
ｂ．約３９％未満の、ペニシリウム属の異なる菌の発酵によって得られる発現産物
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここで、百分率は、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン活性に基づく、酵素複合体
に関する。
【００１１】
第３の側面において、本発明は、酵素複合体を生産するプロセスであって、
ａ．培地においてトリコデルマ属を発酵させて、発酵ブロスを得る工程；
ｂ．培地においてペニシリウム属を発酵させて、発酵ブロスを得る工程、および
ｃ．前記発酵からの無細胞ブロスの形状の工程ａ）およびｂ）由来の各々の酵素複合体を、回収し、および組合せて、酵素複合体を得る工程、ここで、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定したベータ−１，４−エンドグルカン活性の少なくとも約６１％が、トリコデルマ属の発酵に由来する、
を含む、プロセスに関する。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は、醸造マッシュの生産のための、例えば、麦芽酒、例えばビール、例えば麦芽酒ビール、の生産における、および／またはウイスキー生産における、および／またはバイオ燃料生産における、プロセスにおける、本発明の酵素複合体の使用に関する。
【００１３】
さらなる側面において、本発明は、果汁、ワイン、穀物  加工、燃料アルコール、および飲料アルコールの生産における、酵素複合体の使用に関する。
【００１４】
さらなる側面において、
本発明は、
ａ．  トリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物、ならびに
ｂ．  ファミリー１１キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、セルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、およびベータ−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６）から選択される、菌界の異なる種の任意の１つの、１または複数の酵素
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここに、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン活性の少なくとも約６１％は、トリコデルマ属の発酵に由来する、酵素複合体
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実験室規模のマッシュ検査１−麦汁β−グルカンおよび濾過体積。
【図２】実験室規模のマッシュ検査２−ロータリング体積、残留β−グルカン、および（１２°Ｐでの）粘度データ。
【図３】試験的検査的ロータリングデータ−合計ロータリング時間、平均流率および合計圧力増強。Ａ：陰性対照群、酵素なし対照群；Ｂ：０．２０ｋｇ／トンでのラミネックス（登録商標）スーパー；Ｃ：０．１３３ｋｇ／トンでのラミネックス（登録商標）ＸＧ（ラミネックス（登録商標）スーパー  １．５  ＋  ５０％超Ｔ．リーゼイ活性）。
【００１６】
本発明の詳細な開示
ビールは、伝統的に、オオムギに由来する麦芽等の麦芽、および穀草類穀物等の任意的な付加物に由来し、ホップで風味付けられるアルコール飲料と呼ばれる。オオムギ麦芽等の穀草類穀物に主に由来し、でんぷん含有材料の醸造および発酵によって生産される任意の発酵した麦汁は、用語「ビール」のうちに包含される。小麦、トウモロコシ、およびコメは使用されてもよい。
【００１７】
本明細書において使用される場合、用語「麦芽酒」は、完全麦芽ビール、エール、ドライビール、ニアビール、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウトビール、麦芽酒、ノンアルコール麦芽酒および同等物のような泡形成して発酵した麦芽酒を包含する。用語「麦芽酒」は、非−発泡ビールおよび代替麦芽酒、例えば、かんきつ類風味付け、例えば、レモン−、オレンジ−、ライム−、またはベリー−風味付け麦芽酒等の果物風味付け麦芽酒、ウオツカ−、ラム酒−、またはテキーラ−風味付け麦芽酒等の酒風味付け麦芽酒、またはカフェイン−風味付け麦芽酒等のコーヒー風味付け麦芽酒、および同等物をも包含する。
【００１８】
ビールは、様々な穀物から、本質的に同一のプロセスによって、作ることができる。全ての穀物でんぷんは、グルコースホモポリマーであり、そこにおいて、該グルコース残基は、アルファ−１，４−またはアルファ−１，６−結合のいずれかによって接続され、前者が優位である。発酵した麦芽酒を作るプロセスは、通常、醸造と呼ばれる。これらの飲料を作るにあたって使用される主たる生材料は、水、ホップ、および麦芽である。さらに、付加物、例えば、普通ひき割りトウモロコシ、精製ひき割りトウモロコシ、醸造者製粉酵母、コメ、ソルガム、精製トウモロコシでんぷん、オオムギ、オオムギでんぷん、脱穀オオムギ、小麦、小麦でんぷん、焙焼穀草類、穀草類フレーク、ライ麦、オートムギ、ジャガイモ、タピオカ、およびシロップ、例えば、トウモロコシシロップ、サトウキビシロップ、転化糖類シロップ、オオムギおよび／または小麦シロップ、および同等物が、でんぷんの源として、使用されてもよい。該でんぷんは、最終的には、デキストリンおよび発酵性の糖類に転化されるであろう。
【００１９】
選択されたいろいろなオオムギから主に生産される該麦芽は、多数の理由で、ビールの全体の特徴および品質に最も重大な効果を与える。第一に、麦芽は、ビールにおける第一の風味付け剤である。第二に、麦芽は、発酵性の糖類の主要な部分を提供する。第三に、麦芽は、タンパク質を提供し、これは、ビールの本体および泡の特徴に寄与するであろう。第四に、麦芽は、マッシングの間における必要な酵素的な活性を提供する。
【００２０】
ホップも、風味を包含するビール品質に顕著に寄与する。特に、ホップ（またはホップ構成物質）は、ビールに望ましい苦味物質を加える。さらに、ホップは、タンパク質沈殿剤としての機能を果たし、防腐剤を確立させ、および、泡形成および安定性において助力する。
【００２１】
ビールを作るためのプロセスは、本技術分野においてよく知られているが、手短に言えば、（ａ）マッシングおよび／または付加物料理、（ｂ）麦汁分離および抽出、（ｃ）麦汁の沸騰およびホッピング、（ｄ）冷却、発酵および保存、および（ｅ）熟成、加工および梱包、の５つの工程を伴う。
【００２２】
典型的には、第一工程において、製粉されたまたは破砕された麦芽を、水と混合し、そして、制御された温度の下で、一定期間保持して、麦芽に存在する酵素によって、麦芽に存在するでんぷんを発酵性の糖類に転化させる。
【００２３】
第二の工程において、マッシュは、「ロータータン」またはマッシュろ過器に移動され、そこにおいて、液体が穀物残渣から分離される。この甘味液体は、「麦汁」と呼ばれ、穀物残渣に関する残りは、「使用済み穀物」と呼ばれる。使用済み穀物から残留水溶性抽出物を回収するため、マッシュは、マッシュに水を加えることを伴う抽出に、典型的には、さらされる。
【００２４】
第三工程において、麦汁は、活発に沸騰させられる。これが、麦汁を滅菌し、色、風味付けおよび香の発達に役立つ。ホップは、沸騰の間のある時点で加えられる。
【００２５】
第四工程において、麦汁は、冷却され、そして、酵母を含有する発酵槽に移動されるか、発酵槽に移動され酵母が発酵槽に加えられるかのいずれかがなされる。酵母は、発酵によって、糖類をアルコールおよび二酸化炭素ガスに転化させる。発酵の終わりに、発酵を停止するために、発酵槽は冷やされる、あるいは発酵槽は冷やされてもよい。酵母は、羊毛状の塊になり、そして、除去される。
【００２６】
最後の工程において、ビールは、一定期間冷却され、および貯蔵され、その間、ビールが浄化され、およびその風味が発達し、およびビールの外見、風味付けおよび保存可能期間を損ねるかもしれない任意の材料が、沈降する。梱包に先立ち、ビールへの炭酸ガス注入がなされ、および任意的に、ろ過されおよび低温滅菌される。
【００２７】
発酵の後、通常は重量で約２％から約１０％のアルコールを含有する飲料が、得られる。非−発酵性の炭水化物は、発酵の間に転化されて、最終ビールにおける溶解した固形物の主要部分を形成する。
【００２８】
この残基が、残るのは、麦芽アミラーゼが、でんぷんアルファ−１，６−接続を加水分解することができないためである。非−発酵性の炭水化物は、１２オンスのビールにつき約５０カロリーに寄与する。
【００２９】
最近特に米国市場において、ライトビール、低下カロリービール、または低カロリービールと呼ばれる醸造飲料が幅広く普及してきた。米国において定義されるように、これらのビールは、製造者の「普通の」ビールよりも、おおよそ３０％カロリーが少ない。
【００３０】
伝統的な醸造プロセスについてのさらなる情報、および本発明に適用されるべき醸造技術の分野において使用される用語の定義は、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｕｎｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ、ベルリン（ＶＬＢ）、による「醸造および麦芽製造技術」第２改訂版１９９９、ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−３９−０または第３版（２００４）：ＩＳＢＮ  ３−９２１６９０−４９−８において見出されうる。
【００３１】
定義
本明細書において使用される用語「酵素複合体」は、現在の文脈において、異なる酵素的な活性を有する、および／または異なる酵素委託番号（ＥＣ番号）の下で分類される、いくつか酵素を含む、実質的に無細胞な組成物を意味する。「酵素複合体」が発酵によって得られる場合、それは、実質的に無細胞発酵ブロス、任意的に濃縮発酵ブロスであり、最終産物に含められる。用語「酵素複合体」は、異なる微生物をも伴う２またはそれ以上の分離発酵プロセスによって引き出されるいくつかの酵素を含む組成物を包括するものと、理解されるべきである。いくつかの実施態様において、酵素複合体は、食品生産物の調製のために使用されてもよいことを意味する食品等級酵素複合体である。
【００３２】
本発明のいくつかの側面において、本発明による酵素複合体は、醸造プロセスにおいて、マッシュ等のまさしく複合体化合物を分解するのに必要な付随活性を含有する。該用語「付随活性」は、現在の文脈において、その主要基質ではない他の基質に対する酵素の活性を指す、あるいは、酵素複合体がその主要活性の他に有しうる他の活性を指す。
【００３３】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体は、少なくとも５つの異なる付随活性を含む。
【００３４】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体は、少なくとも１０の異なる付随活性を含む。
【００３５】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体は、少なくとも１５の異なる付随活性を含む。
【００３６】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体は、少なくとも２０の異なる付随活性を含む。
【００３７】
キシラナーゼは、ＥＣ  ３．２．１．８、ＥＣ  ３．２．１．３２、ＥＣ  ３．２．１．１３６およびＥＣ  ３．２．１．１５６に分類され、活性は、例えば、「アッセイ２」の記載どおりに測定されうる。
【００３８】
エンド−１，４−ベータ  キシラナーゼは、ＥＣ  ３．２．１．８として分類される。該酵素は、キシランにおける１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド接続のエンド加水分解をもたらす。
【００３９】
本明細書において使用される用語「ファミリー１１キシラナーゼ」は、Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔのアミノ酸配列類似性に基づくグリコシルヒドロラーゼの分類によれば、ＥＣ  ３．２．１．８として分類され、キシランにおける１，４−ベータ−Ｄ−キシロシド接続のエンド加水分解をもたらし、ファミリー１１キシラナーゼとして分類される、エンド−１，４−ベータ  キシラナーゼを指す。
【００４０】
１つの側面において、本発明による酵素複合体は、「アッセイ」という表題の下で下記における記載どおりの「アッセイ２」によって測定して、エンド−１，４−ベータ  キシラナーゼ活性を有する。
【００４１】
「アッセイ２」は、ｐＨ３．５またはｐＨ５および５０°Ｃで、キシランを基質として使用して  実行することができ、または酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨおよび温度値において、遂行することができる。酵素活性は、ユニット時間ごとにキシロースによってもたらされる５４０ｎｍでの吸光度における上昇から計算される。
【００４２】
本明細書において、キシラナーゼ活性の１ユニットは、「アッセイ２」（ｐＨ３．５および５０°Ｃ）の条件下においてΔＯＤ５４０ｎｍ．分−１における上昇を与える酵素の量（合計アッセイ体積について正規化）として定義される。
【００４３】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、「アッセイ２」によって測定して、少なくとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約６０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約７０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約８０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約８５００Ｕ／ｇ、のキシラナーゼ活性を含む。
【００４４】
本発明による酵素複合体は、セルロース分解活性を有する。セルロースの分類法上の名前は、４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン  ４−グルカノヒドロラーゼであり、セルロース分解酵素またはセルラーゼは、ＥＣ  ３．２．１．４．に分類される。セルラーゼは、セルロース、リケニンおよび穀草類  β−Ｄ−グルカンにおける（１→４）−β−Ｄ−グルコシド接続をエンド加水分解し、そして、１，３−接続をも含有するβ−Ｄ−グルカンにおける１，４−接続をも加水分解するであろう。セルラーゼは、他の名前、例えば、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカン  ヒドロラーゼ、セルラーゼＡ、セルロシン  ＡＰ、エンドグルカナーゼ  Ｄ、アルカリ  セルロース、セルラーゼＡ３、セルデキストリナーゼ、９．５セルラーゼ、アビセラーゼ、パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン  ４−グルカノヒドロラーゼをも有する。
【００４５】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体のセルラーゼ活性は、「アッセイ」という表題の下で下記において記載されるとおりの「アッセイ１」によって測定される。
【００４６】
さらなる側面において、本発明による酵素複合体は、β−グルカナーゼ活性を有し、「アッセイ  ７」における記載どおりに決定される。
【００４７】
標準的なアッセイは、ｐＨ５．０で実行され、および付加的な特徴付け、および酵素の特定のためには、異なるｐＨ値で遂行されうる。１ユニットのエンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ活性は、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定されるように）および５０°Ｃ）下で、分ごとに１μモル  グルコース等価物を生産する酵素の量として定義される。
【００４８】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、「アッセイ  ７」によって測定して少なくとも約１００００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１２０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１４０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１５０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１８０００Ｕ／ｇのβ−グルカナーゼ活性を含む。
【００４９】
本明細書において使用される  「β−グルカナーゼ」または「ベータ−グルカナーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．６．のエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼを指し、加水分解されるべき接続に伴う還元性基を有するグルコース残基がそれ自体Ｃ−３において置換される場合、ベータ−Ｄ−グルカンにおける（１−＞３）−または（１−＞４）−接続のエンド加水分解を触媒する。
【００５０】
さらなる側面において、本発明による酵素複合体は、「アッセイ  ３」において記載されるとおりに決定されるラミナリナーゼ活性を有する。
【００５１】
ラミナリナーゼは、Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．６に分類されるエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼ、またはＥ．Ｃ．  ３．２．１．３９．に分類されるグルカン  エンド−１，３−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼであってもよい。代替的な名前であるラミナリナーゼを持つエンド−１，３（４）−ベータ−グルカナーゼ、エンド−１，３−ベータ−グルカナーゼ、エンド−１，４−ベータ−グルカナーゼは、Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．６．に分類される。基質は、ラミナリン、リケニンおよび穀草類  Ｄ−グルカンを包含し、そして、加水分解されるべき接続を伴うグルコース残基を有する還元性基が、それ自体  Ｃ−３で置換される場合、該酵素は、ベータ−Ｄ−グルカンにおける（１−＞３）−または（１−＞４）−接続のエンド加水分解を触媒する。代替的な名前である（１−＞３）−ベータ−グルカン  エンドヒドロラーゼ、エンド−１，３−ベータ−グルカナーゼおよびラミナリナーゼを有するグルカン  エンド−１，３−ベータ−Ｄ−グルコシダーゼは、Ｅ．Ｃ．  ３．２．１．３９に分類され、そして、例えば、ラミナリン、パラミロンおよびパキマンのような基質における（１−＞３）−ベータ−Ｄ−グルカンにおける（１−＞３）−ベータ−Ｄ−グルコシド接続を加水分解する。
【００５２】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、アラビナナーゼ活性を有する。アラビナナーゼは、ＥＣ  ３．２．１．９９．として分類される。分類法上の名前は、５−α−Ｌ−アラビナン  ５−α−Ｌ−アラビナノヒドロラーゼであるが、それは、いくつかの他の名前、例えば、アラビナン  エンド−１，５−α−Ｌ−アラビノシダーゼ、およびエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、エンド−α−１，５−アラバナーゼ、エンド−アラバナーゼ、１，５−α−Ｌ−アラビナン、および１，５−α−Ｌ−アラビナノヒドロラーゼを有する。アラビナーゼは、（１→５）−アラビナンにおける（１→５）−α−アラビノフラノシド接続をエンド加水分解する。アラビナナーゼは、アラビナンにも作用する。
【００５３】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体のアラビナーゼ活性は、「アッセイ」の表題の下での下記において記載される「アッセイ  ４」によって測定される。アッセイは、ｐＨ３．５および５０°Ｃで基質としてテンサイアラビナンをを使用して、実行することができ、そして、それは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨおよび温度値で遂行することができる。酵素活性は、ユニット時間ごとの５４０ｎｍでの吸光度における上昇から計算される。
【００５４】
アラビナーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ３．５および５０°Ｃ）下で、ΔＯＤ５４０ｎｍ．  分−１における上昇を与える酵素の量（合計アッセイ体積で正規化）として定義される。
【００５５】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、ベータ−Ｄ−グルコシド  グルコヒドロラーゼ活性を有する。ベータ−Ｄ−グルコシド  グルコヒドロラーゼは、Ｅ．Ｃ  ３．２．１．２１．の酵素を指す。
【００５６】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、β−キシロシダーゼ活性を有する。「β−キシロシダーゼ」または「キシラン  １，４−ベータ−キシロシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ  ３．２．１．３７．の酵素を指す。β−キシロシダーゼは、（１−＞４）−ベータ−Ｄ−キシランの加水分解を触媒し、非−還元末端からの連続するＤ−キシロース残基を除去する。
【００５７】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体のセロビオヒドロラーゼ活性は、表題「アッセイ」の下で、下記において記載されるように「アッセイ  ６」によって測定される。標準的なアッセイは、ｐＨ５．０において実行され、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨ値で遂行することができる。
【００５８】
セロビオヒドロラーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定されるように）および５０°Ｃ）下で、分ごとにｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−セロビオピラノシドから１μモル  ｐ−ニトロフェノールを生産する酵素の量として定義される。
【００５９】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、セロビオヒドロラーゼ活性を有する。  「セロビオヒドロラーゼ」または「セルロース  １，４−ベータ−セロビオシダーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．９１．の酵素を指す。セルロース  １，４−ベータ−セロビオシダーゼは、セルロースおよびセロテトラオースにおける１，４−ベータ−Ｄ−グルコシド接続の加水分解を触媒して、鎖の非−還元端からセロビオースを放出させる。
【００６０】
本発明の１つの側面において、本発明による酵素複合体のアラビノフラノシダーゼ活性は、表題「アッセイ」の下で、下記において記載どおりの「アッセイ  ５」によって測定される。標準的なアッセイは、ｐＨ５．０および５０°Ｃで実行することができ、および酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために異なるｐＨおよび温度値で遂行することができる。
【００６１】
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ５．０および５０°Ｃ（または指定されるように））下で、分ごとにｐ−ニトロフェニル  α−Ｌ−アラビノフラノシドから１μモル  ｐ−ニトロフェノールを生産する酵素の量として定義される。
【００６２】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ活性を有する。「α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ」または「アルファ−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ」は、ＥＣ  ３．２．１．５５．の酵素を指す。α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼは、アルファ−Ｌ−アラビノシドにおける末端の非−還元アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒する。
【００６３】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼ活性を有する。「グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼ」または「グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼ」は、Ｅ．Ｃ３．２．１．７４．の酵素を指す。グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼは、（１−＞４）−ベータ−Ｄ−グルカンにおける（１−＞４）−接続の加水分解を触媒して、連続するグルコースユニットを除去する。
【００６４】
ある側面において、本発明による酵素複合体は、キシログルカン−特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ活性を有する。「キシログルカン−特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼ」は、Ｅ．Ｃ３．２．１．１５５．の酵素を指す。キシログルカン−特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼは、キシログルカンにおける（１−＞４）−ベータ−Ｄ−グルコシド接続のエキソ加水分解を触媒する。
【００６５】
手順的側面による酵素複合体は、でんぷん加水分解物を含む水性溶液の粘度を低下させることを含むプロセスにおいて使用されてもよい。
【００６６】
酵素複合体は、でんぷん加水分解物を含む水性溶液の濾過を含むプロセスにおいて、使用されてもよい。いくつかの実施態様において、でんぷん加水分解物を含む水性溶液は、ビール作りのためのマッシュであり、他の実施態様において、でんぷん加水分解物を含む水性溶液は、食品組成物である。
【００６７】
あるいは、本発明による酵素複合体は、果汁、ワイン、穀物加工、バイオエタノール等の燃料アルコール、および飲料アルコールの生産において使用されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施態様において、バイオエタノールは、農業供給原料、例えば、サトウキビ、ジャガイモ、トウモロコシ、小麦ソルガム等から、またはセルロースの材料、例えば、トウモロコシ茎葉、スイッチグラスまたは他の植物材料から、生産される。両方の場合において、発酵性の糖類は、生材料から抽出され、微生物によってアルコールに発酵され、蒸留され、輸送燃料として使用されてもよい。本発明による酵素複合体は、バイオ燃料のこの生産において使用されてもよい。生材料からの多糖抽出を増進するために、多糖を発酵性の糖類に分解するのに役立てるために、ならびに／または、例えば、固形物からの液体の分離、流量特性、およびポンプ能力などの加工パラメーターを増進するために、酵素複合体は、加えられてもよい。
【００６９】
本発明のプロセスは、任意のグリストのマッシングにおいて適用されてもよい。本発明によると、グリストは、任意の植物および塊茎、根、茎、葉および種を包含する植物の一部から引き出せる植物材料を含有する任意のでんぷん、および／または糖類を含んでもよい。いくつかの実施態様において、グリストは、穀物、例えば、オオムギ、小麦、ライ麦、オートムギ、トウモロコシ、コメ、ミロ、きびおよびソルガムからの穀物を含み、そして、より好ましくは、少なくとも１０％、または、より好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、または非常に好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％（ｗ／ｗ）の麦汁のグリストが、穀物に由来する。
【００７０】
いくつかの実施態様において、グリストは、麦芽穀物、例えば、オオムギ麦芽を含み、そして、好ましくは、少なくとも１０％、またはより好ましくは少なくとも１５％、さらにより好ましくは少なくとも２５％、または非常に好ましくは少なくとも３５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％（ｗ／ｗ）の麦汁のグリストは、麦芽穀物に由来する。
【００７１】
用語「発酵」は、現在の文脈において、培養物における微生物の培養による物質、例えば、酵素の生産を意味する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「麦芽」は、任意の麦芽穀草類穀物、例えば、オオムギとして理解される。
【００７３】
用語「付加物」は、オオムギ麦芽でないグリストの一部として理解される。付加物は、任意の炭水化物豊富材料であってもよい。
【００７４】
用語「マッシュ」は、例えば、破砕オオムギ麦芽、破砕オオムギ、および／または他の付加物またはこれに関する組合せを含み、のちに麦汁＋使用済み穀物に分離されるべき水と混合される、水性でんぷんスラリーとして理解される。
【００７５】
用語「マッシュ分離」は、例えば、ロータリングまたはマッシュ濾過による、使用済み穀物からの麦汁の分離として理解される。
【００７６】
用語「ビール濾過」は、ビールにおいていまだ存在する酵母細胞および他の濁り誘発材料が、例えば、精密濾過または膜処理によって除去される、分離プロセスとして理解される。
【００７７】
例えば、本発明に従って調製される食品成分の形状における酵素複合体調製物は、使用および／または適用の様式ならびに／または投与の様式に依存して、溶液の形状におけるもの、または固形物としてのものであってもよい。固形物形状は、乾燥酵素粉末として、または粒状酵素として、のいずれかであることができる。
【００７８】
１つの側面において、本発明は、本発明による酵素複合体、酵素担体、ならびに、任意的に安定剤および／または防腐剤を含む、酵素複合体調製物を提供する。
【００７９】
本発明のまださらなる側面において、酵素担体は、グリセロールまたは水からなる群から選択される。
【００８０】
さらなる側面において、該調製物は、安定剤を含む。１つの側面において、安定剤は、無機塩、ポリオール、糖類およびこれに関する組合せからなる群から選択される。１つの側面において、該安定剤は、無機塩、例えば、塩化カリウムである。もうひとつの側面において、該ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、またはソルビトールである。まだもうひとつの側面において、該糖類は、小−分子炭水化物、特に、任意のいくつかの甘味−呈味物、例えば、グルコース、フルクトースおよびサッカロースである。
【００８１】
まださらなる側面において、該調製物は、防腐剤を含む。１つの側面において、該防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸エステル、ソルベートもしくは他の食品認可防腐剤、またはその混合物である。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
本発明の特定の実施態様
上記のように、本発明は、
ａ．  トリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物、ならびに
ｂ．  キシラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８）、セルラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４）、およびベータ−グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６）から選択される、菌界の異なる種の任意の１つの、１または複数の酵素
の組合せに由来する酵素複合体であって、
ここに、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定されるベータ−１，４−エンドグルカン活性の少なくとも約６１％は、トリコデルマ属の発酵に由来する、酵素複合体に関する。
【００８３】
いくつかの実施態様において、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定したベータ−１，４−エンドグルカン活性の少なくとも約６２％、例えば、少なくとも約６３％、例えば、少なくとも約６４％、例えば、少なくとも約６５％、例えば、少なくとも約６６％、例えば、少なくとも約６８％、例えば、少なくとも約６９％が、トリコデルマ属の発酵に由来する。
【００８４】
いくつかの実施態様において、本明細書における「アッセイ１」方法によって測定したベータ−１，４−エンドグルカン活性の約９０％以下、例えば、約８５％以下、例えば約８０％以下、例えば、約７５％以下、例えば、約７０％以下、例えば約６５％以下が、トリコデルマ属の発酵に由来する。
【００８５】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体における異なる菌の１または複数の酵素は、この異なる菌の発酵によって得られる発現産物である。
【００８６】
いくつかの実施態様において、該異なる菌は、ペニシリウム属のものである。
【００８７】
いくつかの実施態様において、該異なる菌の発酵によって得られる発現産物は、トリコデルマ属由来のキシラナーゼとは異なるキシラナーゼ等のキシラナーゼを含む。いくつかの実施態様において、該異なる菌の発酵によって得られる発現産物は、トリコデルマ属由来のファミリー１１キシラナーゼとは異なるファミリー１１キシラナーゼ等の、ファミリー１１キシラナーゼを含む。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ、セルラーゼ、ラミナリナーゼ、エンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシド  グルコヒドロラーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルカン  １，４−ベータ−グルコシダーゼ、キシログルカン−特異的エキソ−ベータ−１，４−グルカナーゼおよびα−Ｎ−アラビノフラノシダーゼからなるリストから選択される１または複数酵素活性を含む。
【００８９】
いくつかの実施態様において、トリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物は、種トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の１つの単一培養物からのものである。
【００９０】
いくつかの実施態様において、ペニシリウム属の種の発酵によって得られる発現産物は、種ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の１つの単一培養物からのものである。
【００９１】
いくつかの実施態様において、発酵のために使用される該単一培養物は、遺伝学的に修飾されていない。
【００９２】
いくつかの実施態様において、トリコデルマ属の種の発酵によって得られる該発現産物は、浸水発酵によって得られる。
【００９３】
いくつかの実施態様において、トリコデルマ属の発酵によって得られる該発現産物は、種トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのものである。
【００９４】
いくつかの実施態様において、異なる菌の発酵によって得られる該発現産物は、種ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の単一培養物からのものである。
【００９５】
いくつかの実施態様において、発酵によって得られる該発現産物は、野生型種からのものである。
【００９６】
いくつかの実施態様において、本発明の酵素複合体を調製するために使用される株は、ブダペスト条約の下で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））ＩＰ、ライセンシングおよびサービス、１０８０１  大学  ブールバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９、ＵＳＡにおいて、株名称ＧＣ  セルロース  Ａ８３  ＧＩＣＣ  ０００４、Ｍ０３０００００４、およびＡＴＣＣ（登録商標）特許寄託名称ＰＴＡ−１００１を有し、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓの代理として、２００９年５月５日の日にちに、寄託された、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはその誘導体または子孫である。（該寄託は、国際寄託機関：アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））、マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡで、２００９年５月１４日に、テストされ、そして、その日、該種／株は、生存していた）。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本発明の酵素複合体を調製するにあたり使用される株は、ブダペスト条約の下で、国際菌類学研究所において、番号ＩＭＩ  ３７８５３６の下で、寄託されたペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、またはその誘導体または子孫である。
【００９８】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、本明細書における「アッセイ１」によって測定して、トリコデルマ属の発酵に由来する、少なくとも約３０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約４０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約６０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約７０００Ｕ／ｇの酵素活性を有する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、本明細書における「アッセイ１」によって測定して、少なくとも約４０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約５０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約６０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約７０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約８０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約９０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１００００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１１０００Ｕ／ｇ、例えば、少なくとも約１２０００Ｕ／ｇ、の合計酵素活性を有する。
【０１００】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの約３１００ｕ／ｇ、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの約５２００ｕ／ｇからなり、ここで、前記ユニット／ｇは、本明細書における「アッセイ１」によって決定される。
【０１０１】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの約２３６２ｕ／ｇ、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの約５３１５ｕ／ｇからなり、ここで、前記  ユニット／ｇは、本明細書における「アッセイ１」によって決定される。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、本発明による酵素複合体は、本明細書において定義されるように、「ラミネックス（登録商標）ＸＧ」産物の仕様を有する。
【０１０３】
まださらなる側面において、本発明によって使用されるトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株は、ブダペスト条約の下で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）において寄託され、株名称ＧＣ  セルロース  Ａ８３  ＧＩＣＣ  ０００４、Ｍ０３０００００４を有し、２００９年５月５日の日にちに、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓによって寄託された、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株の特徴と実質的に等しい特徴を有する。
【０１０４】
さらなる側面において、該株は、ブダペスト条約の下で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）において、寄託され、２００９年５月５日の日にちに、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓによって寄託され、株名称ＧＣ  セルロース  Ａ８３  ＧＩＣＣ  ０００４、Ｍ０３０００００４を有する、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株である。
【０１０５】
本発明の文脈において、語句「実質的に等しい特徴」は、該株が、ブダペスト条約の下で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、特許寄託、１０８０１  大学  Ｂｌｖｄ、マナッサス、ＶＡ  ２０１１０において、寄託され、株名称ＧＣ  セルロース  Ａ８３  ＧＩＣＣ  ０００４、Ｍ０３０００００４を有し、２００９年５月５日の日にちにＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓによって寄託された、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の特徴の１または複数（好ましくは全て）を有することを意味する。
【０１０６】
上記のように、本発明は、醸造マッシュの生産のためのプロセスにおける、例えば、麦芽酒ビールの生産における、および／またはウイスキー生産における、本発明による酵素複合体の使用に関する。下記実施態様は、醸造マッシュの生産のためのプロセスに特に関連する。
【０１０７】
いくつかの特定の実施態様において、本発明による酵素複合体は、種トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物と、種ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の発酵によって得られる発現産物との組合せに由来せず、ここで、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）に由来する、および、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に由来する、ベータ−１，４−エンドグルカン活性の比は、約０．２５／０．７５〜０．３７／０．６３、例えば、約０．２６／０．７４〜０．３６／０．６４、例えば、約０．２７／０．７３〜０．３５／０．６５、例えば、約０．２８／０．７２〜０．３４／０．６６、例えば、約０．２９／０．７１〜０．３３／０．６７、例えば、約０．３０／０．７０〜０．３２／０．６８、例えば、約０．３１／０．６９である。
【０１０８】
いくつかの特定の実施態様において、本発明による酵素複合体は、種トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物と、種ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の発酵によって得られる発現産物との組合せに由来し、ここで、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）に由来する、および、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に由来する、ベータ−１，４−エンドグルカン活性の比は、約０．２５／０．７５〜０．３７／０．６３、例えば、約０．２６／０．７４〜０．３６／０．６４、例えば、約０．２７／０．７３〜０．３５／０．６５、例えば、約０．２８／０．７２〜０．３４／０．６６、例えば、約０．２９／０．７１〜０．３３／０．６７、例えば、約０．３０／０．７０〜０．３２／０．６８、例えば、約０．３１／０．６９〜である。
【０１０９】
いくつかの実施態様において該酵素複合体は、ロータリングおよび／またはマッシュ濾過および／またはビール濾過を補助するために、マッシュにおいて使用される。
【０１１０】
いくつかの実施態様において該酵素複合体は、マッシュ分離を補助するために、マッシュにおいて使用される。
【０１１１】
いくつかの実施態様において、たとえば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して少なくとも２％、５％、または１０％の低下などの、麦汁残留β−グルカンにおける低下がある。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、例えば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも２．５％、少なくとも５％、または少なくとも７．５％の低下などの、低下した麦汁粘度等の粘度がある。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、例えば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して少なくとも２．５％、少なくとも５％、または少なくとも１０％の上昇などの、醸造サイクル／日における上昇があり、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）成分に基づく同一または匹敵する酵素活性を有する。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、増進したろ過性がある。
【０１１５】
いくつかの実施態様において、増進したマッシュ分離がある。
【０１１６】
いくつかの実施態様において、マッシュ分離間の上昇した流率、例えば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも２．５％、少なくとも５％、または少なくとも１０％の、上昇がある。
【０１１７】
前記流率は、合計分離時間から計算される平均流率として定義されることが、理解されるべきである。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、スパージングまたは抽出時間における減少、例えば、酵素なしの対照群、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％の減少がある。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、合計ロータリング時間における減少がある。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、減少した合計マッシュ分離時間、例えば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％の、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも２．５％、少なくとも５％、または少なくとも１０％の減少がある。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、ろ過池に関するマッシュ再循環の間、および／またはロータリングのプロセス間において、ろ過池にわたる減少した平均ΔＰがある。
【０１２２】
ΔＰは、該池にわたる圧力降下を指すことが、理解されるべきである。
【０１２３】
いくつかの実施態様において、ろ過池に関するマッシュ再循環の間、および／またはロータリングプロセスの間、分離表面わたる減少した平均ΔＰがある。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、マッシュ分離プロセスの間、分離表面にわたる平均ΔＰの減少、例えば、酵素なしの対照群、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％の減少がある。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、麦汁もやにおける変化がない。
【０１２６】
いくつかの実施態様において、麦汁ペントサンにおける低下があるがある。
【０１２７】
いくつかの実施態様において、改善した抽出物収率がある。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、ビール濾過間における上昇した流率がある。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、ビール濾過の間、ろ過器にわたる圧力増強における徐々の減少、例えば、酵素なしの対照群、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％の減少がある。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、減少したビールもや、例えば、酵素なしの対照群、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％の減少がある。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、泡安定性における減少がない。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、減少したビールβ−グルカン、例えば、酵素なしの対照群、またはラミネックス（登録商標）スーパーを使用する対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％の減少がある。
【０１３３】
いくつかの実施態様において、ビールペントサンにおける減少、例えば、酵素なしの対照群と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％の減少がある。
【０１３４】
いくつかの実施態様において、トン  グリストごとの約０．５ｋｇ未満の酵素複合体が、醸造マッシュの生産のためのプロセスにおいて、例えば、麦芽酒ビールの生産において、および／またはウイスキー生産において、使用される。いくつかの実施態様において、トン  グリストごとの約０．４ｋｇ未満の酵素複合体が、使用され、例えば、トン  グリストごとに約０．３ｋｇ未満の酵素複合体が、使用され、例えば、トン  グリストごとに約０．２５ｋｇ未満の酵素複合体が、使用され、例えば、トン  グリストごとに約０．２ｋｇ未満の酵素複合体が、使用され、例えば、トン  グリストごとに約０．１９ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１８ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１７ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１６ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１５ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１４ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１３ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１２ｋｇ未満の酵素複合体、例えば、トン  グリストごとに約０．１１ｋｇ未満の酵素複合体が、使用される。
【０１３５】
本発明に従って使用される菌の株は、上で触れた寄託された株の培養物であってよいが、上で触れた単離されおよび寄託された株と実質的に等しい特性を有する株の培養物であってもよいことが、理解されるべきである。好ましい実施態様において、該株は、該寄託された株またはその子孫である。
【０１３６】
本発明によって使用されるトリコデルマ属の種の発酵によって得られる発現産物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）等の任意のトリコデルマに由来するもの、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手できる組成物  ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）であってもよい。ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）は、水溶性セルロースの基質に対する著しい粘度低下効果を有する。あるいは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）から生産され、そして、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから入手できる、ラミネックス（登録商標）ＢＧ、商用セルラーゼ調製物が、使用されてもよい。
【０１３７】
本発明によって使用されるペニシリウム属の種の発酵によって得られる発現産物は、任意のペニシリウム、例えば、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）に由来してもよい。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、該株は、ブダペスト条約の下で、国際菌類学研究所において、番号  ＩＭＩ  ３７８５３６の下で、寄託されたペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、またはその誘導体もしくは子孫である。あるいは、該ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）は、ＷＯ９９５７３２５において開示されるとおりである。いくつかの代替的な実施態様において、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）に由来する発現産物であるラミネックス（登録商標）Ｃ２Ｋ（Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから得られる）が、本発明によって使用される。
【０１３９】
ラミネックス（登録商標）スーパーは、ロータリングまたはマッシュ濾過における補助のためにマッシュにおいて使用されるべき醸造酵素産物である。該ラミネックス（登録商標）スーパー産物は、２つの異なる発酵酵素産物、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）セルラーゼ、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼのブレンドである。ラミネックス（登録商標）スーパーは、Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから得られる。ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）成分は、麦汁粘度を低下させる、およびロータリングまたはマッシュ濾過を改善する可溶化β−グルカンおよびキシランを加水分解するために、含められる。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）成分は、麦汁において低測定（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  混合−接続ベータ−グルカンアッセイ手順による）β−グルカンを手に入れるために、およびビール濾過割合を上昇させるために、含められる。
【０１４０】
ラミネックス（登録商標）ＢＧ−Ｄａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓから得られ、ビール濾過を改善させるために使用されるＴ．リーゼイ産物（複数も可）
【０１４１】
ラミネックス（登録商標）スーパー産物は、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）濃縮物からの１５７５ｕ／ｇ（「アッセイ１」によって決定される）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からの２３６２ｕ／ｇ（「アッセイ１」によって決定される）を構成するものとして、定義される。
【０１４２】
これは、最終ラミネックス（登録商標）スーパー産物仕様において３９００ｕ／ｇに四捨五入された。ラミネックス（登録商標）スーパー仕様は、以下のとおりである。
セルラーゼ活性≧３９００ｕ／ｇ（「アッセイ１」によって決定される）
ｐＨ３．７−４．２
Ｍｉｃｒｏ仕様は標準的であろう
０．２５％  ナトリウム安息香酸エステルを用いて安定化
【０１４３】
ラミネックス（登録商標）ＸＧは、種トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵によって得られる発現産物と、種ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）の発酵によって得られる発現産物との組合せに由来し、ここで、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）由来の、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）由来のベータ−１，４−エンドグルカン活性の比は、約０．２５／０．７５から０．３７／０．６３である酵素複合体、例えば、約２３６３ｕ／ｇ（「アッセイ１」によって測定された活性）が、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）濃縮物に由来し、約５３１５ｕ／ｇ（「アッセイ１」によって測定された活性）が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）に由来する酵素複合体で構成されるとして定義される。この特定の実施態様において、ラミネックス（登録商標）ＸＧ産物は、「アッセイ」の下で記載される「アッセイ１」によって測定した活性Ｕに基づく、０．３１／０．６９のペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）／トリコデルマ比を与える。
【実施例１】
【０１４４】
実験室規模のマッシュ研究１
酵素活性：
【０１４５】
この特定の実験のために混合されたラミネックス（登録商標）スーパー産物：
【０１４６】
名目活性：３９３７ＣＭＣｕ／ｇ。測定された活性：３６８２ＣＭＣｕ／ｇ（方法「アッセイ１」によって測定される活性）０．２ｋｇ／トン  グリストで投与、７３６４００ＣＭＣｕ／トン  グリスト（＝  ０．７３６ｕ／ｇ  グリスト）の付与。
【０１４７】
「アッセイ１」によって測定されるＣＭＣ活性に基づく、０．４０ｘＰ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）産物および０．６０ｘＴ．リーゼイ産物のラミネックス（登録商標）スーパー産物定義の付与。
−  Ｐ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの活性寄与  −  ０．２９５  ＣＭＣｕ／ｇ  グリスト
−  Ｔ．リーゼイからの活性寄与  −  ０．４４２  ＣＭＣｕ／ｇ  グリスト。
【０１４８】
ラミネックス（登録商標）スーパー（０．２００ｋｇ／トン  グリスト）＋  Ｔ．リーゼイ成分（ラミネックス（登録商標）ＸＧ）の５０％活性：
【０１４９】
３６８２  ＣＭＣｕ／ｇ（「アッセイ１」によって測定される活性）０．２ｋｇ／トン  グリストで投与  ＋  ０．０９５３４ｇ  Ｔ．リーゼイ成分（１２５３９  ＣＭＣｕ／ｇ、「アッセイ１」による）／ｇ  ラミネックス（登録商標）スーパー産物、９７５４９４  ＣＭＣｕ／トン  グリスト（＝  ０．９７５ｕ／ｇ  グリスト）の付与
−  Ｐ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの活性寄与  −  ０．２９５  ＣＭＣｕ／ｇ  グリスト
−  Ｔ．リーゼイからの活性寄与  −  （０．４４２  ＋  ０．２３９）ＣＭＣｕ／ｇ  ＝  ０．６８１  ＣＭＣｕ／ｇ  グリスト。
【０１５０】
ラミネックス（登録商標）ＸＧ  実験室規模のマッシュ研究１におけるＰ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）／Ｔ．リーゼイ寄与比  −  ０．３０／０．７０
【０１５１】
ラミネックス（登録商標）スーパー（０．２００ｋｇ／トン  グリスト）対、ラミネックス（登録商標）スーパー（０．２００ｋｇ／トン  グリスト）＋  ５０％活性の１０％  Ｆａｗｃｅｔｔのオオムギマッシュ（９０％  Ｆａｗｃｅｔｔの麦芽：１０％  Ｆａｗｃｅｔｔのオオムギ）におけるＴ．リーゼイ成分のテスト：−  合計２５０ｇ水中の５０ｇ  グリスト。マッシング分析結果：０．５ｍｍで挽いた５０ｇの混合グリストが使用され、１９０ｍｌ水が６７°Ｃで加えられた。マッシング温度サイクルは、６５°Ｃで６０分、次に、７２°Ｃで１０分であった。マッシュは、次に、冷却され、２５０ｇ重量へ上げ、および溝付きろ過紙（Ｅｄｅｒｏｌ  １２）を通してろ過された。
【０１５２】
ラミネックス（登録商標）スーパー産物と比較して、Ｔ．リーゼイ成分の５０％加えられた別活性を有するラミネックス（登録商標）スーパーの酵素溶液（０．２００ｋｇ／トン  グリスト）は、
・低下した麦汁残留β−グルカン（図１参照）
・上昇した濾過（図１参照）
を示した。
低下した麦汁残留β−グルカンは、低下した粘度および下記上昇した麦汁分離／濾過のための潜在性、ならびに醸造サイクル／日における上昇の潜在性を表す。
上昇した濾過は、中断（ラッキング等）なしの濾過サイクルの長さが上昇する肯定的な潜在性を表し、これは、順に合計濾過時間を減少させ、それゆえ、醸造サイクル／日における上昇を結果しえた。
【実施例２】
【０１５３】
実験室規模のマッシュ研究  ２
酵素活性：
ラミネックス（登録商標）スーパー：
４３８０ＣＭＣｕ／ｇ（単一成分寄与から計算される活性）を０．２ｋｇ／トン  グリストで投与、８７６０００ＣＭＣｕ／トン  グリスト（＝  ０．８７６ｕ／ｇ  グリスト）の付与。
Ｐ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）成分、２０６９  ＣＭＣｕ／ｇ（「アッセイ１」による）で寄与、０．４１４  ＣＭＣｕ／ｇ  グリストに対応。
Ｔ．リーゼイ成分、２３１１  ＣＭＣｕ／ｇ（「アッセイ１」による）で寄与、０．４６２  ＣＭＣｕ／ｇ  グリストに対応。
この研究におけるラミネックス（登録商標）スーパー産物に対するＰ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）／Ｔ．リーゼイ寄与比は、０．４７／０．５２である。
【０１５４】
ラミネックス（登録商標）ＸＧ（ラミネックス（登録商標）スーパー  １．５倍濃縮＋  Ｔ．リーゼイ成分の付加的な別５０％活性）：
８３０４  ＣＭＣｕ／ｇ（単一成分寄与から計算される活性）、０．１３３ｋｇ／トン  グリストで投与、１１０４４３２  ＣＭＣｕ／トン  グリスト（＝  １．１０４ｕ／ｇ  グリスト）の付与。
Ｐ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）成分、３１０４  ＣＭＣｕ／ｇ（「アッセイ１」による）で寄与、０．４１３  ＣＭＣｕ／ｇ  グリストに対応
Ｔ．リーゼイ成分、５２００ＣＭＣｕ／ｇ（「アッセイ１」による）で寄与、０．６９２  ＣＭＣｕ／ｇ  グリストに対応
ラミネックス（登録商標）ＸＧ  実験室規模のマッシュ研究２におけるＰ．フニクロサム（ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）／Ｔ．リーゼイ寄与比−０．３７／０．６３
【０１５５】
ラミネックス（登録商標）スーパー（０．２００ｋｇ／トン  グリスト）対、混合グリスト−  ２５．８％  スピッツ  麦芽および７４．２％ピルスナー麦芽  −  マッシュにおけるラミネックス（登録商標）ＸＧ（０．１３３ｋｇ／トン  グリスト）のテスト。マッシュ分析結果：５０ｇグリストは、１５０ｇ水とともに、マッシュされ、そして、表１において与えられるマッシュ計画が、続けて行われた：
【０１５６】
【表１】
0005876823.tif 000002
【０１５７】
マッシングの終わりに、３０ｍｌ温水（７６°Ｃで）が、各々のマッシュに加えられ、そして、該マッシュは、Ｅｄｅｒｏｌ  １２ろ過器紙を使用して温ろ過された。
【０１５８】
ラミネックス（登録商標）スーパー産物（０．２ｋｇ／トン  グリスト投与）と比較して、ラミネックス（登録商標）ＸＧ（０．１３３ｋｇ／トン  グリスト投与）の酵素溶液は、
・低下した残留麦汁β−グルカン濃度（図２参照）
・徐々に上昇した濾過体積（図２参照）
・低下した麦汁粘度（図２参照）
を示した。
麦汁β−グルカン濃度の低下の重要性は、明確ではないが、しかしながら、理論は、低下した麦汁β−グルカンを、低下した麦汁粘度に結び付ける。マッシュ分離を醸造プロセスのボトルネックとして、結果としての肯定的な上昇は、マッシュ分離に費やされる時間が減少したことに起因して醸造サイクル／日の数を上昇させることによって、醸造所容量を上昇させることができた。
より高い濾過割合は、濾過に費やされる時間を肯定的に減少させ、潜在的に、醸造サイクル／日の数を上昇させることによって、醸造所容量における上昇を結果する。
低下した麦汁粘度は、濾過割合を上昇させ、それゆえ、醸造所容量を上昇させる肯定的な潜在性を有する。
【実施例３】
【０１５９】
試験的醸造検査
実験室規模のマッシュ研究２と同一の酵素組成物。
【０１６０】
ラミネックス（登録商標）スーパー（０．２００ｋｇ／トン  グリスト等価物）およびラミネックス（登録商標）ＸＧ（ラミネックス（登録商標）スーパー  １．５倍濃縮＋  付加的な５０％別活性、Ｔ．リーゼイ成分の場合）（０．１３３ｋｇ／トン  グリスト）のテスト。該試験的醸造マッシング研究は、３１ｋｇ  混合グリスト  −  ２５．８％スピッツ麦芽および７４．２％ピルスナー麦芽  −  １１０Ｌのマッシュ体積中を使用して実施された。マッシング分析結果は、表２において見られる。
【０１６１】
【表２】
0005876823.tif 000003
【０１６２】
試験的醸造マッシング検査
ラミネックス（登録商標）スーパーと比較して、マッシングプロセスにおいてラミネックス（登録商標）ＸＧを加えることは、以下を結果する。
・１３％まで減少したスパージング時間（表３参照）
減少したスパージング時間は、麦汁分離に費やされる時間の減少に肯定的に寄与し、それゆえ、醸造サイクル／日の数が上昇することによって、醸造所容量を潜在的に上昇させる。
・ラミネックス（登録商標）スーパーと比較して８％までの、そして、水対照群（酵素を加えない）と比較して２０％までの、合計ロータリング時間の減少（表３および図３参照）。
ロータリングプロセスを醸造プロセスのボトルネックとして、ロータリング時間を減少させることは、醸造サイクル／日の数を上昇させることによって、醸造所容量を強化する潜在性を有する。
・ロータリングプロセスの間「継続的に」測定された流率の平均として、または、「ロータリングの合計時間」ごとの「合計ろ過体積」としてのいずれかとして計算される平均流率の上昇（表３および図３参照）。
上昇した平均流率は、麦汁分離に費やされる合計時間を肯定的に減少させ、それゆえ、潜在的に、醸造所容量を上昇させることができた。
・ロータリングプロセスの間のろ過池にわたる平均ΔＰの１９％までの減少（表３参照）。
潜在的に、ろ過池にわたる平均ΔＰの減少は、ろ過池ラッキングの必要性の減少を結果し、そして、ろ過された体積を徐々に上昇させることができた。両方の因子は、ロータリング時間を減少させ、それゆえ、醸造所容量を上昇させる肯定的な潜在性を有する。
・ろ過池に関するマッシュ再循環の間の減少した圧力増強（２２％まで）、およびロータリング間の減少した圧力増強（２４％まで）（表３参照）。
再循環およびロータリング間の両方の減少した圧力増強は、濾過を上昇させ、それゆえ、合計ロータリング時間を減少させるのに寄与する潜在性を有する。かさねて、これは、上昇した醸造所容量を結果することができた。濾過の割合の上昇は、圧力における上昇と通常結び付けられるであろうから、見られる効果は、とりわけ強い。−そして、本データは、濾過における上昇と同時に、圧力増強における減少を示す。
・麦汁もやにおける無変化（表３参照）
もやは、変化せず、上昇したもやが、レイキングの誘導の選択を結果する因子でありえたので、このことは、肯定的である。ラッキングは、時間消費であり、麦汁分離の合計時間を上昇させ、それゆえ、醸造所容量を減少させるであろう。
・ロータリング間の「合計圧力増強」の２４％までの減少（表３および図３参照）。
麦汁分離の間の「合計圧力増強」の減少は、濾過割合を上昇させ、それゆえ、麦汁分離プロセスに費やされる時間を減少させることによって、醸造所容量を上昇させるであろう。
・圧力増強によって誘導されるろ過池ラッキングがないこと。表３の下の（１）によって示されるように、強制的ラッキングだけが、マッシング工程でラミネックス（登録商標）ＸＧを包含させる際に、導入された（表３の（１）に示される）。
スパージング時間を減少させることは、合計ロータリング時間における減少、および醸造サイクル／日の数における潜在的な上昇に寄与する。
【０１６３】
【表３】
0005876823.tif 000004
【０１６４】
マッシングプロセスにおいてラミネックス（登録商標）ＸＧを加えたマッシュの麦汁サンプル解析は、以下を結果する。
・Ｍｅｇａｚｙｍｅ混合接続ベータ−グルカン方法（標準的なＡＯＡＣ方法９９５．１６を順守したＭｅｇａｚｙｍｅカタログ参考文献Ｋ−ＢＧＬＵ）によって測定した麦汁β−グルカンの減少（表４参照）。
麦汁残留β−グルカンの減少は、麦汁粘度における肯定的な減少、それゆえ、醸造サイクル／日の数を上昇させることによる濾過および醸造所容量の上昇を結果することができた。
・２．３％までの抽出物の上昇（表４参照）。
抽出物における上昇は、醸造所収率における肯定的な上昇、−同一量の生材料から生産されるより多くの産物−他の用語でいうと、よりコスト効率的な方法での醸造所容量の上昇を与えるであろう。
【０１６５】
【表４】
0005876823.tif 000005
【０１６６】
試験的醸造ビール濾過
ラミネックス（登録商標）スーパーと比較して、マッシングプロセスにおいてラミネックス（登録商標）ＸＧを加えることは、以下を結果する。
・ビール濾過間における流率の上昇（表５参照）。
ビール濾過の間の流率の上昇は、濾過容量の上昇の肯定的な効果を有し、それゆえ、別のブライトビールタンク（ＢＢＴ）容量の必要を潜在的に減少（制限）させる。（ＢＢＴは、濾過後充填までビール保存のために使用される圧力タンクである。これらのタンクは、安定な圧力を維持し、二酸化炭素の損失を避け、そして、泡の形成を阻むことができる。）
・徐々に起こるろ過器にわたる圧力増強の顕著な減少（表５参照）。
ろ過器にわたる圧力増強における徐々の減少は、洗浄の間の濾過サイクルの長さを徐々に肯定的に上昇させる。これは、適所の洗浄、水およびエネルギー消費を肯定的に制限する。また、必要とされるろ過器材料量は、減少し、コスト節約がもたらされる。洗浄の間のより長い濾過サイクルは、ビール濾過プロセスの開始および停止から来るビールの損失を肯定的に低下させる。
【０１６７】
【表５】
0005876823.tif 000006
【０１６８】
試験的醸造ビール解析
マッシングプロセスにおいてラミネックス（登録商標）ＸＧを加えたマッシュから生産されたビールの解析は、以下を示す。
・ビールベータ−グルカンの減少（表６参照）
減少したビールβ−グルカンは、ビール粘度を肯定的に減少させ、それゆえ、濾過サイクルを上昇させ、ろ過助剤およびユーティリティ消費を低下することができた（コスト節約）。
・ビールもやの減少（表６参照）。
ビールもやの主要な原因は、非ベータ−グルカン材料に関係しうる。低下したビールβ−グルカンは、減少したビールもやに肯定的に寄与し、ビールの肯定的な外見を与えることもできた。
・泡安定性における減少のなさ（表６参照  −  泡持ち値）
「ラミネックス（登録商標）スーパー  １．５倍濃度  ＋  Ｔ．リーゼイ成分の付加的な５０％別活性」を使用するビール泡安定性は、減少しなかった。それは、ビール外見および品質を損なう因子であろうから、これは、肯定的である。
・減少したビールペントサンが期待されえた。
減少したビールペントサンは、ビール濾過の上昇に肯定的に寄与することができた。
【０１６９】
【表６】
0005876823.tif 000007
【実施例４】
【０１７０】
完全スケール醸造研究。
系列１検査：
検査は、醸造ごとに９５００ｋｇのグリスト（３０００ｋｇ  オオムギ、６５００ｋｇ  麦芽）を使用する３１．６％オオムギグリスト組成物に向けられた。
【０１７１】
表７によって実証されるように、マッシュ分離に関して良好な結果が、ラミネックス（登録商標）ＸＧで観察された。ロータリング時間を減少させることは、醸造サイクル／日の数を上昇させることによって醸造所容量を強化する潜在性を有する。
【０１７２】
【表７】
0005876823.tif 000008
【０１７３】
系列２検査：
検査は、醸造ごとに１２３００ｋｇのグリスト（３５００ｋｇオオムギ、８８００ｋｇ麦芽）を使用する２８％オオムギグリスト組成物に向けられた。
【０１７４】
表８によって実証されるように、ビール濾過に関する良好な結果が、ラミネックス（登録商標）ＸＧで観察された。
・洗浄の間のビール濾過サイクルを上昇させることは、洗浄に費やされる時間を減少させること、およびビール濾過醸造サイクル／日の数を上昇させることによって、醸造所容量を強化する潜在性を有する。また、ビール濾過サイクルを上昇させることは、コスト節約、ならびに、エネルギー消費の低下、およびビール濾過の開始および停止から来るビールの損失の低下を結果する。
・ろ過助剤、およびユーティリティ消費の低下（珪藻土消費の低下）は、直接的なコスト節約を結果する。
【０１７５】
【表８】
0005876823.tif 000009
【０１７６】
・表９において提示されるように、マッシングプロセスにおいてラミネックス（登録商標）ＸＧを加えた系列２から生産されたビールの解析は、以下を示した。減少したビールベータ−グルカン。減少したビールβ−グルカンは、ビール粘度を肯定的に減少させ、それゆえ、濾過サイクルを上昇させ、およびろ過助剤およびユーティリティ消費を低下させること（コスト節約）ができた。
・ビールペントサンの低下が期待されえた。
減少したビールペントサンは、粘度を低下させることによって、ビール濾過の上昇に肯定的に寄与することができた。
・ビール動的粘度の低下。
低下したビール粘度は、濾過サイクルを肯定的に上昇させ、そして、ろ過助剤およびユーティリティ消費を低下させること（コスト節約）ができた。上昇した濾過サイクルは、ビール濾過サイクル／日の数を上昇させることによって、醸造所容量を上昇させることもできた。
【０１７７】
【表９】
0005876823.tif 000010
【０１７８】
要旨−検査において使用された酵素活性投与
データは、ちょうど各々の成分からの合計活性に対する寄与の比であるＰＦ／ＴＲ比において与えられる。ＰＦは、ペニシリウム・フニクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）による寄与であり、ＴＲは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）による寄与である。
【０１７９】
【表１０】
0005876823.tif 000011
【０１８０】
アッセイ
【０１８１】
アッセイ  １：ＤＮＳセルラーゼ活性方法（ＤＮＳ  ＣＭＣ方法）
分類法上の名前：１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン  ４−グルカノヒドロラーゼ
ＩＵＢ  番号：ＥＣ  ３．２．１．４
【０１８２】
原理
セルラーゼのアッセイは、β−１，４−グルカンであるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）における１，４−β−Ｄ−グルコシド結合の酵素的なエンド加水分解に基づく。反応の産物（β−１，４  グルカン  オリゴ糖）は、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を使用して、還元性基における結果的な上昇を測定することによって、比色分析で決定された。酵素活性は、グルコース等価物としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍでの吸光度との関係から、計算された。
【０１８３】
該アッセイは、ｐＨ５．０で実行されたが、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のため、異なるｐＨ値において、遂行されることができる。
【０１８４】
ユニット定義  
セルラーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定されるように）および５０°Ｃ）下、分ごとに１μモル  グルコース等価物を生産する酵素の量として定義される。
【０１８５】
材料  
カルボキシメチルセルロース。供給者：Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｌｔｄ。産物番号：ＣＭ−セルロース  ４Ｍ  Ｄ−グルコース  ‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。
産物番号：１０１１７。分子量：１８０．１６
無水酢酸ナトリウム塩‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２３６。分子量：８２．０３  
酢酸（「氷」）‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０００１。分子量：６０．０５  
３，５−ジニトロサリチル酸  ＧＰＲ（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシ安息香酸）。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：２８２３５  
ナトリウム水酸化物ペレット‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２５２。分子量：４０．００  
カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩  ‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２１９。分子量：２８２．２２  
０．１Ｍ  ナトリウム酢酸塩緩衝液中、１．５％（ｗ／ｖ溶液）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）溶液、ｐＨ５．０（基質溶液）。
３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液。
３２ｇ／Ｌ  ナトリウム水酸化物ペレット、および６００ｇ／Ｌ  カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩を含有する緩衝液中の２０ｇ／ＬのＤＮＳ。
グルコース標準溶液（０．５０ｍｇ／ｍｌ）
【０１８６】
手順
酵素複合体は、サンプル中へ希釈され、そして、図２において示されるグルコース標準曲線が、０、０．１２５、０．２５、０．３７５、および０．５ｍｇ／ｍｌのグルコース濃度を使用して作られた。
【０１８７】
酵素溶液の０．２５ｍｌが、５０°Ｃで基質溶液（１．５％  ｗ／ｖ）の１．７５ｍｌと混合され、そして、反応は、ＤＮＳ溶液を加えることによって、１０分後に停止された。これに、９５°Ｃへの５分間の加熱が続く。
【０１８８】
光学的密度が、異なるサンプルについて、５４０ｎｍ（ＯＤ５４０ｎｍ）で測定された。
【０１８９】
計算  
酵素活性は、図２に示される標準曲線から決定される。
該活性は、次のように計算される。
0005876823.tif 000012
ここで、
Ｔ  ＝  ΔＯＤ５４０ｎｍテスト
＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
ｍ  ＝  標準曲線の勾配（おおよそ１．０）
ｃ  ＝  標準曲線のｙ軸切片（常に負数およびおおよそ−０．０２）
１８０．１６  ≡  グルコースの分子量
１０３    ≡    μモルに転化させる
Ａ  ≡  ｍｌでのアッセイ体積
Ｖ  ≡  ｍｌでの酵素体積
ｔ  ≡  分でのアッセイ時間
Ｄ  ≡  実際の酵素希釈因子（１リットルに希釈される１．０００ｇにとってＤ  ＝  １０００等）
【０１９０】
アッセイ２．  エンド−１，４−β−キシラナーゼ（ＤＮＳカバ材キシラン方法）
原理
エンド−１，４−β−キシラナーゼによって触媒される反応は、β−１，４  キシラン  オリゴ糖を形成するキシラン（カバ材キシランまたは穀草類置換キシラン、例えば、小麦アラビノキシラン等）における１，４−β−Ｄ−キシロシド結合のエンド加水分解を伴う。
【０１９１】
該反応の産物（β−１，４−キシランオリゴ糖）は、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を使用して還元性基における結果的な上昇を測定することによって、比色分析で決定された。酵素活性は、キシロース等価物としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍでの吸光度との関係から、計算される。
【０１９２】
標準アッセイは、ｐＨ３．５で実行されたが、それは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨ値で遂行されることができる。
【０１９３】
ユニット定義
エンド−１，４−β−キシラナーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ３．５（または指定されるように）および５０°Ｃ）下、分ごとに１μモル  キシロース等価物を生産する酵素の量として、定義される。
【０１９４】
材料：
セルラーゼ活性アッセイのために上で与えられる材料のリストを参照のこと。
カバ材キシラン。供給者：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ。産物番号：Ｘ０５０２
Ｄ（＋）−キシロース  ‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０３７２  分子量：１５０．１３
０．１ナトリウム酢酸塩緩衝液中の１．５％（ｗ／ｖ溶液）カバ材キシラン溶液、ｐＨ４．０（基質溶液）
キシロース標準溶液（０．５０ｍｇ／ｍｌ）
【０１９５】
手順
１．７５ｍｌカバ材キシラン溶液が、０．２５ｍｌの希釈酵素溶液と、５０°Ｃで１０分間混合され、該反応は、２ｍｌＤＮＳ溶液を加えることによって、停止させられ、続いて、９５°Ｃへの５分間の加熱がなされた。光学的密度は、５４０ｎｍ（ＯＤ５４０ｎｍ）で測定された。
【０１９６】
標準曲線は、０．１２５、０．２５０、０．３７５、０．５００ｍｇ／ｍｌキシロースから作られた。
【０１９７】
計算
活性は、次のように計算される。
0005876823.tif 000013
ここで、
Ｔ  ＝  ΔＯＤ５４０ｎｍテスト
＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
ｍ  ＝  標準曲線の勾配（おおよそ  １．０）
ｃ  ＝  標準曲線のｙ軸切片（常に負数およびおおよそ−０．０２）
１５０．１３  ≡  キシロースの分子量
１０３    ≡    μモルに転化させる
Ａ  ≡  ｍｌでのアッセイ体積
Ｖ  ≡  ｍｌでの酵素体積
ｔ  ≡  分でのアッセイ時間
Ｄ  ≡  実際の酵素希釈因子（１リットルに希釈される１．０００ｇにとってＤ  ＝  １０００等）
【０１９８】
アッセイ  ３．  ラミナリナーゼ（ＤＮＳラミナリン方法）
原理
ラミナリナーゼによって触媒される反応は、１，３−β−Ｄ−グルカンにおける１，３−グルコシド結合のエンド加水分解を伴う。基質は、ラミナリン、パラミロンおよびパキマンを包含する。反応の産物（β−１，３−グルカン  オリゴ糖）は、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を使用して、還元性基における結果的な上昇を測定することによって、比色分析で決定される。酵素活性は、グルコース等価物としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍでの吸光度との関係から、計算される。該アッセイは、ｐＨ５．０および５０°Ｃで実行されたが、それは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨおよび温度の値で、遂行されることができる。
【０１９９】
ユニット定義
ラミナリナーゼ活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ５．０（または指定されるように）および５０°Ｃ）下、分ごとに１μモル  グルコース等価物を生産する酵素の量として、定義される。
【０２００】
材料
セルラーゼ活性アッセイのために上で与えられる材料を参照のこと。
ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａからの）。供給者：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ。産物番号：Ｌ  ９６３４  
１．００％（ｗ／ｖ溶液）ラミナリン溶液（基質溶液０．１Ｍナトリウム酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．０）
１．７５ｍｌラミナリン溶液は、０．２５ｍｌの希釈酵素溶液と、５０°Ｃで、１０分間混合され、そして、該反応は、２ｍｌＤＮＳ溶液を加えることによって、停止させられた。
標準曲線は、０、０．１２５、０．２５、０．５および０．７５ｍｇ／ｍｌグルコース溶液を使用して作られた。
光学的密度は、５４０ｎｍ（ＯＤ５４０ｎｍ）で測定された。
【０２０１】
計算
活性は、次のように計算される。
0005876823.tif 000014
ここで、
Ｔ  ＝  ΔＯＤ５４０ｎｍテスト
＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
ｍ  ＝  標準曲線の勾配（おおよそ１．０）
ｃ  ＝  標準曲線のｙ軸切片（常に負数およびおおよそ−０．０３）
１８０．１６  ≡  グルコースの分子量
１０３    ≡    μモルに転化させる
Ａ  ≡  ｍｌでのアッセイ体積
Ｖ  ≡  ｍｌでの酵素体積
ｔ  ≡  分でのアッセイ時間
Ｄ  ≡  実際の酵素希釈因子（１リットルに希釈される１．０００ｇにとってＤ  ＝  １０００等）
【０２０２】
アッセイ  ４．  アラビナーゼアッセイ。
原理
アラビナーゼ活性のアッセイは、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を使用して、還元性基における結果的な上昇を測定することによる、比色分析的な決定に基づく。酵素活性は、アラビノース等価物としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍでの吸光度との間の関係から計算された。
【０２０３】
該アッセイは、ｐＨ３．５で実行されたが、それは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨ値で遂行されることができる。
【０２０４】
ユニット定義
アラビナーゼ（アラビナナーゼ（エンド−１，５−アルファ−Ｌ−アラビナナーゼ））活性の１ユニットは、アッセイの条件（ｐＨ３．５（または指定されるように）および５０°Ｃ）下で、分ごとに１μモル  アラビノース等価物を生産する酵素の量として、定義される。
【０２０５】
材料
Ｍｅｇａｚｙｍｅ  テンサイアラビナン
アラビノース  Ｓｉｇｍａ  Ａ３１３１  分子量：１５０．１
無水酢酸ナトリウム塩‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２３６。分子量：８２．０３  
酢酸（「氷」）‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０００１。分子量：６０．０５  
３，５−ジニトロサリチル酸  ＧＰＲ（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシ安息香酸）。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：２８２３５  
ナトリウム水酸化物ペレット‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２５２。分子量：４０．００
カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩‘ＡｎａｌａＲ’。供給者：Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）。産物番号：１０２１９。分子量：２８２．２２  
０．１Ｍナトリウム酢酸塩緩衝液中の１．５％（ｗ／ｖ溶液）アラビナン溶液、ｐＨ３．５（基質溶液）。
３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液。
３２ｇ／Ｌ  ナトリウム水酸化物ペレット、および６００ｇ／Ｌ  カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩を含有する緩衝液中の２０ｇ／ＬのＤＮＳ。
アラビナーゼ標準溶液（０．５０ｍｇ／ｍｌ）
【０２０６】
手順
酵素複合体は、サンプル中へ希釈され、グルコース標準曲線は、０、０．１２５、０．２５、０．３７５、および０．５ｍｇ／ｍｌのアラビナーゼ濃度を使用して作られた。
【０２０７】
酵素溶液の０．２５ｍｌが、５０°Ｃで基質溶液（１．５％  ｗ／ｖ）の１．７５ｍｌと混合され、そして、該反応は、ＤＮＳ溶液を加えることにより、１０分後に、停止させられた。続いて、５分間、９５°Ｃへ加熱された。
【０２０８】
光学的密度が、異なるサンプルの５４０ｎｍ（ＯＤ５４０ｎｍ）で測定された。
【０２０９】
計算
酵素活性は、標準曲線から決定される。
活性は、次のように計算される。
0005876823.tif 000015
ここで、
Ｔ  ＝  ΔＯＤ５４０ｎｍテスト
＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
ｍ  ＝  標準曲線の勾配（おおよそ  １．０）
ｃ  ＝  標準曲線のｙ軸切片（常に負数およびおおよそ−０．０２）
１５０．１３  ≡  アラビナーゼの分子量
１０３    ≡    μモルに転化させる
Ａ  ≡  ｍｌでのアッセイ体積
Ｖ  ≡  ｍｌでの酵素体積
ｔ  ≡  分でのアッセイ時間
Ｄ  ≡  実際の酵素希釈因子（１リットルに希釈される１．０００ｇにとってＤ  ＝  １０００等）
【０２１０】
アッセイ  ５．  アラビノフラノシダーゼアッセイ。
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼによって触媒される反応は、α−Ｌ−アラビノシドの、非−還元α−Ｌ−アラビノフラノシド残基での、末端結合の加水分解を伴う。該酵素は、（１，３）−および／または（１，５）−接続を含有するα−Ｌ−アラビナンであるα−Ｌ−アラビノフラノシド、アラビノキシランおよびアラビノガラクタンに対して作用する。
【０２１１】
α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼのアッセイは、ｐ−ニトロフェニル  α−Ｌ−アラビノフラノシドの酵素的な加水分解に基づく。アッセイは、「継続的モニタリング」というよりはむしろ「二点」方法である。酵素活性の計算は、インキュベーション期間の始めおよび終わりのみでとられる測定に基づく。反応の産物であるｐ−ニトロフェノールは、比色分析で決定される（ｐＨ調整後）。酵素活性は、ｐ−ニトロフェノールの濃度と、４００ｎｍでの吸光度との間の関係から計算される。
【０２１２】
希釈された酵素溶液の調製：
全ての酵素溶液を粉末または液体酵素調製物から、ガラス蒸留水を用いて調製する。小体積または重量を伴う大希釈工程を避けることによって、アッセイ希釈誤差を最小化する。酵素希釈を作る際、最初の酵素サンプルを検量することが、液体サンプルについてさえ、より正確である。液体サンプルの場合において、これがなされる場合、２０°Ｃでの液体の特定重力を測定することが、したがって、必要である。
【０２１３】
アッセイが、「継続的モニタリング」というよりはむしろ「二点」方法であるので、異なる酵素系および条件を用いてインキュベーション期間内における線形性を確保することが、重要である。基質濃度、ｐＨ、温度およびアッセイ時間の標準的なアッセイ条件下、アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍテスト（Ｔ）＝  ０．２０−１．５０の範囲において、線形であることが、実証されてきた。しかしながら、優れた実践のためには、アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍテスト（Ｔ）＝  ０．４００−０．８００の定義された範囲内で、作動される。
【０２１４】
手順
各々の酵素サンプルアッセイは、３つの解析を伴う。二重のテスト（テスト）解析およびブランク（ブランク）解析。与えられる手順は、単一の酵素サンプルの解析を記載する。
0005876823.tif 000016
【０２１５】
０．２５ｍｌの希釈酵素溶液が、５０°Ｃで溶液に加えられ、４ｍｌの０．４Ｍグリシン溶液、ｐＨ１０．８（停止試薬）を加えることによって、反応が、１０分後に停止させられた。
【０２１６】
吸光度が、水ブランクと対照して、２５°Ｃで４００ｎｍで測定された。
・二重のテストのために測定されたＯＤ４００ｎｍテストを決定し、
・ＯＤ４００ｎｍブランクを決定する。
【０２１７】
計算
0005876823.tif 000017
0005876823.tif 000018
ここで、
Ｔ  ＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
１８３００＝  ｐ−ニトロフェノール（１ｃｍ経路長）についてのモル吸光係数
Ｖ  ＝  ７．２５（ｍｌでのテストにおける合計液体体積）
ｔ  ＝  １０（分）
１ｕ  ＝  １μｍｏｌ．分−１
Ｅ  ＝  ０．２５（ｍｌでの希釈酵素サンプルの体積）
Ｄ  ＝  酵素希釈因子、１リットルに希釈される１ｍｌにとってＤ  ＝  １０００等）
【０２１８】
アッセイ  ６．セロビオヒドロラーゼアッセイ。
原理
セロビオヒドロラーゼによって触媒される反応は、セルロースおよびセロテトラオースにおける１，４−β−Ｄ−グルコシド接続の加水分解を伴い、鎖の非−還元端からセロビオースを放出させる。
【０２１９】
セロビオヒドロラーゼのアッセイは、ｐ−ニトロフェニル  β−Ｄ−セロビオピラノシドの酵素的な加水分解に基づく。反応の産物であるｐ−ニトロフェノールが、比色分析で決定される（ｐＨ調整後）。酵素活性は、ｐ−ニトロフェノールの濃度と、４００ｎｍでの吸光度との間の関係から計算される。
【０２２０】
アッセイは、ΔＯＤ５４０ｎｍテスト（Ｔ）＝  ０．４００−０．８００の線形に定義される範囲内で、作動される。
【０２２１】
手順
各々の酵素サンプルアッセイは、３つの解析を伴う。二重のテスト（テスト）解析およびブランク（ブランク）解析。与えられる手順は、単一酵素サンプルの解析を記載する。
【０２２２】
0005876823.tif 000019
【０２２３】
０．２５ｍｌの希釈酵素溶液が、５０°Ｃでテスト溶液に加えられ、３０分後、４ｍｌの０．４Ｍグリシン溶液、ｐＨ１０．８（停止試薬）が、各々のチューブに加えられた。１ｃｍガラスキュベットにおいて、２０°Ｃで４００ｎｍで吸光度が、水ブランクと対照して測定された。
・二重のテストのために測定されたＯＤ４００ｎｍテストを決定し、
・ＯＤ４００ｎｍブランクを決定する。
【０２２４】
計算  
0005876823.tif 000020
0005876823.tif 000021
ここで、
Ｔ  ＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
１８３００＝  ｐ−ニトロフェノール（１ｃｍ経路長）についてのモル吸光係数
Ｖ  ＝  ７．２５（ｍｌでのテストにおける合計液体体積）
１０００  ＝  リットルに転化させる
１０６    ＝    μモルに転化させる
ｔ  ＝  ３０（分）
１ｕ  ＝  １μｍｏｌ．分−１
Ｅ  ＝  ０．２５（ｍｌでの希釈酵素サンプルの体積）
Ｄ  ＝  酵素希釈因子、１リットルに希釈される１ｍｌにとってＤ  ＝  １０００等）
【０２２５】
アッセイ７．  β−グルカナーゼアッセイ。
原理
加水分解されるべき結合に関与する還元性基を有するグルコース残基が、それ自体Ｃ−３で置換される場合、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼによって触媒される反応は、β−Ｄ−グルカンにおける１，３−または１，４−グルコシド結合のエンド加水分解を伴う。基質は、穀草類β−Ｄ−グルカン、ラミナリン、およびリケニンを包含する。定義によると、この酵素は、ＥＣ  ３．２．１．３９（エンド−１，３−β−グルカナーゼ、またはラミナリナーゼ）とは異なる。
【０２２６】
エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼのアッセイは、β−１，３（４）−グルカンであるオオムギβ−グルカンにおける１，３−または１，４−グルコシド結合の酵素的な加水分解に基づく。反応の産物（β−１，３（４）−グルカンオリゴ糖）は、３，５−ジニトロサリチル酸試薬を使用して、還元性基における結果的な上昇を測定することによって、比色分析で決定される。酵素活性は、グルコース等価物としての還元性基の濃度と、５４０ｎｍでの吸光度との間の関係から計算される。
【０２２７】
このアッセイにおいて、ＤＮＳ試薬を加え、そして、混合した後、アッセイチューブは、沸騰した水浴（９５°Ｃ最小値）に置かれ、厳密に１５分間、インキュベートされる。これは、他の基質を用いてインキュベーション期間が５分であるＤＮＳに基づく酵素アッセイとは対照的である。この変化は、テストにおいて容認できるΔＯＤ５４０ｎｍテスト（Ｔ）値の範囲にも影響を与える。
【０２２８】
標準アッセイは、ｐＨ５．０で実行されるけれども、それは、酵素の付加的な特徴付けおよび特定のために、異なるｐＨ値で遂行されることができる。この場合において、緩衝液溶液（下で述べる）のｐＨだけが変化する。
【０２２９】
要求される試薬
全ての場合において、ベータ−グルカンを除き、重要であるのは、試薬の同一性および純度であって、供給者ではない。
【０２３０】
ベータ−グルカン（オオムギ；培地粘度）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｌｔｄ、産物番号Ｐ−ＢＧＢＭ、粘度：２０−３０ｃＳｔ  
Ｄ−グルコース  ‘ＡｎａｌａＲ’、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号１０１１７、分子量：１８０．１６  
無水酢酸ナトリウム塩  ‘ＡｎａｌａＲ’、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号１０２３６、分子量  ８２．０３  
酢酸（「氷」）‘ＡｎａｌａＲ’、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号１０００１、分子量  ６０．０５  
３，５−ジニトロサリチル酸  ＧＰＲ（３，５−ジニトロ−２−ヒドロキシ安息香酸）、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号．２８２３５、
ナトリウム水酸化物ペレット‘ＡｎａｌａＲ’、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号１０２５２、分子量  ４０．００  
カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩  ‘ＡｎａｌａＲ’、Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ（ＢＤＨ）、産物番号１０２１９、分子量２８２．２２  
【０２３１】
試薬
１．５％（ｗ／ｖ  ０．１Ｍナトリウム酢酸塩緩衝液中の溶液  ｐＨ５．０）ベータ−グルカン（オオムギ；３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液：１０ｇ  ＤＮＳ、１６ｇ  ナトリウム水酸化物ペレット、３００ｇ  カリウム  ナトリウム（＋）−酒石酸塩が、１０００ｍｌ蒸留ガラスに溶解された。
１Ｍナトリウム酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．０  
グルコース標準溶液（１．０００ｍｇ／ｍｌ）  
【０２３２】
手順
各々の酵素サンプルアッセイは、３つの解析を伴う。二重のテスト（テスト）解析およびブランク（ブランク）解析。グルコース標準曲線も、要求される。
【０２３３】
０．２５ｍｌの希釈酵素溶液が、５０°Ｃで１．７５ベータ−グルカン溶液に加えられ、２ｍｌＤＮＳ溶液が１０分後に加えられ、そして、チューブが、９５°Ｃ最小値で１５  分間、置かれた。２５°Ｃ水まで冷却される。
【０２３４】
１０ｍｌのガラス蒸留水が、加えられ、および光学的密度が、１ｃｍ経路長キュベットを使用して５４０ｎｍ（ＯＤ５４０ｎｍ）で測定された。
・二重のテストのために測定されたＯＤ５４０ｎｍテストを決定し、
・ＯＤ５４０ｎｍブランクを決定し、
・０．００ｍｇ／ｍｌ  グルコース標準サンプルと対照して（または全く水と対照して）、参照される０．１２５、０．２５０、０．５００、０．７５０ｍｇ／ｍｌグルコース標準について、ＯＤ５４０ｎｍ標準を決定する。
【０２３５】
計算
0005876823.tif 000022
を決定する。
活性は、次のように計算される。
0005876823.tif 000023
ここで、
Ｔ  ＝  ΔＯＤ５４０ｎｍテスト
＝  ＯＤ５４０ｎｍテスト  −  ＯＤ５４０ｎｍブランク
ｍ  ＝  標準曲線の勾配（おおよそ１．０）
ｃ  ＝  標準曲線のｙ軸切片（常に負数およびおおよそ−０．０２）
１５０．１３  ≡  グルコースの分子量
１０３    ≡    μモルに転化させる
Ａ  ≡  ｍｌでのアッセイ体積  ２．００ｍｌ使用
Ｖ  ≡  ｍｌでの酵素体積  ０．２５ｍｌ使用
ｔ  ≡  分でのアッセイ時間  １０分使用
Ｄ  ＝  酵素希釈因子（１リットルに希釈される１ｍｌにとって  Ｄ  ＝  １０００等）
【図１】
0005876823.tif 000024
【図２】
0005876823.tif 000025
【図３】
0005876823.tif 000026