(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞と特異的に結合する被覆ＨＶＪ−Ｅであって、ＨＶＪ−Ｅと、このＨＶＪ−Ｅの表面を覆う被覆層とを有し、この被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に２層以上積層されており、この被覆層のうちの最内層はカチオン性の層であり、かつ、最表層は、ヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層であり、その粒径分布が単峰性である、ことを特徴とする被覆ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項２】
被覆層は、カチオン性の層とアニオン層が交互に４層以上積層されており、最表層以外のアニオン性の層は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成されていることを特徴とする請求項１に記載の被覆ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項３】
カチオン性の層が、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかによって形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の被覆ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項４】
カチオン性の層および／またはアニオン性の層に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤のうちのいずれかが導入されていることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の被覆ＨＶＪ−Ｅ。
【請求項５】
ガン細胞と特異的に結合する被覆ＨＶＪ−Ｅであって、その粒径分布が単峰性である被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法であって、以下の工程：
（１）ＨＶＪ−Ｅとカチオン性材料とを接触させてカチオン性の層を形成する工程；および
（２）ＨＶＪ−Ｅとアニオン性材料とを接触させてアニオン性の層を形成する工程
を含み、前記工程（１）（２）を１回、または２回以上繰り返して、カチオン性の層とアニオン層が交互に２層以上積層されている被覆層を形成するとともに、この被覆層のうちの最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で形成することを特徴とする被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法。
【請求項６】
前記工程（１）の前処理として、ＨＶＪ−Ｅの表面を清浄化する工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法。
【請求項７】
前記工程（２）のアニオン性材料は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかを分散させた溶液であることを特徴とする請求項５に記載の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法。
【請求項８】
前記工程（１）のカチオン性材料は、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかを分散させた溶液であることを特徴とする請求項５に記載の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被覆ＨＶＪ−Ｅ及び被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＨＶＪ）は、１９５３年に東北大学のＩｓｈｉｄａらによって発見され、１９５７年に大阪大学のＯｋａｄａらによって異種の細胞を融合させる作用があることが発見された直径約１５０−２５０ｎｍの楕円形エンベロープウイルスである。
【０００３】
ＨＶＪは、分裂・非分裂細胞を問わず、哺乳類の多くの細胞種、組織に遺伝子を導入可能であり、高い外来遺伝子の発現能を有しているため、バイオ分野での高発現遺伝子ベクターとしての利用が盛んに行われている。また、宿主染色体に影響を与えず、挿入変異や染色体の構造変化の危険性もない等、機能性・安全性の両面で有利な特徴を有しているため、がん、循環器疾患、感染症、神経系疾患等の治療へ向けて、医療分野での応用研究・開発が進められている（非特許文献１）。
【０００４】
このＨＶＪを紫外線照射によってゲノムＲＮＡを破壊し、複製能力を失わせた不活化ＨＶＪ粒子（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ：ＨＶＪ−Ｅ）が遺伝子治療用ベクターとして開発されている。
大阪大学のＫａｎｅｄａらは、ＨＶＪ−Ｅ自体に多様な抗腫瘍活性があり、ガンの転移や再発を抑制できることを報告している。その作用メカニズムは、ＨＶＪ−Ｅは樹状細胞の成熟化を介して、癌特異的な細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導すると同時に、制御性Ｔ細胞の働きを解除することで、抗腫瘍免疫活性を示すと考えられている（非特許文献２、３）。  
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎ．Ｉｓｈｉｄａ，Ｍ．Ｈｏｍｍａ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，２３，３４９（１９７８）
【非特許文献２】Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｓ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．，５３ＰＡ，３０７（２００５）
【非特許文献３】Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，４，  ５９９（２００３）
【非特許文献４】Ｗ．Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ａｇｕｉａｒ，Ｑ．Ｈｕａ，Ｃ．Ｂ．Ｋｎｕｄｓｏｎ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２２８，２１６（１９９６）
【非特許文献５】Ｇ．Ｄｅｃｈｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１２３２（１９９７）
【非特許文献６】Ｆ．Ｃａｒｕｓｏ，Ｒ．Ａ．Ｃａｒｕｓｏ，Ｈ．Ｍｏｈｗａｌｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１１１（１９９８）
【非特許文献７】Ｚ．Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｐｏｄｓｉａｄｌｏ，Ｎ．Ａ．Ｋｏｔｏｖ，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１８，３２０３（２００６）
【非特許文献８】Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｄｅｎｇ，Ｈ．Ｓｈｉ，Ｚ．Ｍｅｉ，Ｈ．Ｚｈａｏ，Ｗ．Ｘｉｏｎｇ，Ｐ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚｈａｏ，Ｃ．Ｑｉｎ，Ｒ．Ｔａｎｇ，Ｓｍａｌｌ，６，３５１（２０１０）
【非特許文献９】Ｐ．Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ａ．Ｊｏｎａｓ，Ａ．Ｌａｓｃｈｅｗｓｋｙ，Ｒ．Ｌｅｇｒａｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．，２１，３１９  （２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＨＶＪは一部を除くほとんどすべての細胞と融合するため、ＨＶＪ−Ｅの組織特異性は乏しく、特定の組織のみにターゲッティングさせることが難しいという欠点がある。
【０００７】
そこで、本発明では、ガン細胞に対する特異的結合性を向上させたＨＶＪ−Ｅおよびその製造方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、以下のことを特徴としている。
＜１＞ガン細胞と特異的に結合する被覆ＨＶＪ−Ｅであって、ＨＶＪ−Ｅと、このＨＶＪ−Ｅの表面を覆う被覆層とを有し、この被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に２層以上積層されており、この被覆層のうちの最内層はカチオン性の層であり、かつ、最表層は、ヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層である。
＜２＞被覆層は、カチオン性の層とアニオン性の層が交互に４層以上積層されており、最表層以外のアニオン性の層は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成されている。
＜３＞カチオン性の層が、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかによって形成されている。
＜４＞カチオン性の層および／またはアニオン性の層に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤のうちのいずれかが導入されている。
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法は、以下のことを特徴としている。
＜５＞ガン細胞と特異的に結合する被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法であって、以下の工程：  （１）ＨＶＪ−Ｅとカチオン性材料とを接触させてカチオン性の層を形成する工程；および（２）ＨＶＪ−Ｅとアニオン性材料とを接触させてアニオン性の層を形成する工程を含み、前記工程（１）（２）を１回、または２回以上繰り返して、カチオン性の層とアニオン層が交互に２層以上積層されている被覆層を形成するとともに、この被覆層のうちの最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で形成することを特徴とする。
＜６＞前記工程（１）の前処理として、ＨＶＪ−Ｅの表面を清浄化する工程を含む。
＜７＞前記工程（２）のアニオン性材料は、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかを分散させた溶液である。
＜８＞前記工程（１）のカチオン性材料は、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩のうちのいずれかを分散させた溶液である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、最表層にヒアルロン酸を有しているので、ガン細胞に対して優れた特異的結合性を発揮する。また、本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法によれば、ＨＶＪ−Ｅの表面にカチオン性の層とアニオン性の層を交互に積層することができ、最表層をヒアルロン酸で形成することができるので、ガン細胞に対して優れた特異的結合性を発揮する被覆ＨＶＪ−Ｅを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの一例を示す図であって、（ａ）は全体模式図であり、（ｂ）は（ａ）のＥ部拡大図である。
【図２】本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅのカチオン性の層Ａを構成する合成高分子などを例示した図である。
【図３】本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法における清浄化工程の一実施形態を例示した工程図である。
【図４】本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法におけるカチオン性の層被覆工程の一実施形態を例示した工程図である。
【図５】本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法におけるアニオン性の層被覆工程の一実施形態を例示した工程図である。
【図６】実施例１のカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の繰り返し工程での表面電位（ＥＬＳ測定）を示したグラフである。
【図７】実施例２のカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の繰り返し工程（各６工程）での粒径分布（ＤＬＳ測定）を示したグラフである。
【図８】実施例３のカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の繰り返し工程（各６工程）での粒径分布（ＤＬＳ測定）を示したグラフである。
【図９】ポリアリルアミン塩酸塩／アニオン性磁性ナノ粒子で修飾されたＨＶＪ−Ｅの挙動を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の発明者は、ＨＶＪ−Ｅのガン細胞に対する特異的結合性を向上させるため、ヒアルロン酸に注目した。
【００１２】
ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの普遍的な構成成分として生体内に広く分布している高分子多糖で、組織の構築に寄与しているばかりでなく、細胞増殖、創傷治癒、血管新生など多くの生物学的機能を有している。そして、悪性胸膜中皮腫などのガンにおいて、その細胞表面上にヒアルロン酸と特異的に結合するＣＤ４４が高発現していることが知られている（非特許文献４）。
したがって、このヒアルロン酸をＨＶＪ−Ｅの表面に安定に被覆することができれば、ガン細胞への結合特異性を向上させることができると考えられる。
【００１３】
一般に、粒子などの基材表面修飾法としては、アルカンチオールやシランカップリング剤に代表される自己集合単分子膜（ＳＡＭ）法、Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ法、高分子グラフト法などが知られている（非特許文献５、６）。しかしながら、これらの方法は、特殊な装置や操作や有機溶剤を必要とする場合が多く、また基材や修飾に用いる材料が限定されるため、タンパク質や細胞などの生体分子への適用が難しいという問題があり、ヒアルロン酸をＨＶＪ−Ｅの表面に被覆することは困難である。
また、ヒアルロン酸をビルディングブロックとして用いた場合、極めて特殊な積層挙動を示すことが知られており、これまでに、ナノ粒子表面上にヒアルロン酸を含む機能性薄膜を形成させた例は報告されていない。
そこで、本発明者は、タンパク質や細胞などの生体分子にも適用できる水系をベースとしたマイルドな条件で、ＨＶＪ−Ｅの表面をヒアルロン酸で被覆した、被覆ＨＶＪ−Ｅを製造する方法として、Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ（ＬｂＬ；交互積層、交互吸着、交互浸漬）法に注目した。
【００１４】
Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ法（ＬｂＬ法）は、分子一層ずつを積層させ機能性薄膜を形成させる手法である（非特許文献７、８）。このＬｂＬ法は、簡便性や汎用性に優れており、水系コーティングを得意とするため、タンパク質や細胞などの生体分子の機能を損なうことなく極めて多種の材料で修飾でき、さらに材料本来の特性を維持したまま新たな機能を表面に付与することができる。
【００１５】
本発明者は、このＬｂＬ法を利用することで、ＨＶＪ−Ｅの表面に、ガン標的リガンドとしてのヒアルロン酸を被覆できるのではないかとの着想を得て、本発明に至った。
以下、本発明の実施形態について説明する。
図１は、本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの一実施形態を例示した模式図である。
図１に示したように、本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、略球状のＨＶＪ−Ｅと、このＨＶＪ−Ｅの表面を覆う被覆層１１と、を有している。
【００１６】
被覆層１１は、カチオン性の層Ａとアニオン層Ｂとが交互に２層以上積層されて形成されている。具体的には、ＨＶＪ−Ｅを覆う被覆層１１のうちの最内層はカチオン性の層Ａで形成され、かつ、被覆層１１のうちの最表層は、ヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層Ｂで形成されている。
【００１７】
カチオン性の層Ａとアニオン層Ｂの合計積層数は、好ましくは、２層〜２０層とすることができる。ＨＶＪ−Ｅの表面をカチオン性の層Ａ（最内層）で被覆し、その上に、アニオン性の層Ｂ、カチオン性の層Ａ、アニオン性の層Ｂ・・・と交互に積層し、被覆層１１の最表層をヒアルロン酸によって形成されたアニオン性の層Ｂで形成するため、カチオン性の層Ａとアニオン層Ｂの合計積層数は、２の倍数とされる。カチオン性の層Ａとアニオン層Ｂの合計積層数を変更することで、被覆層１１を所望の被膜厚さに形成することができる。
【００１８】
また、カチオン性の層Ａとアニオン層Ｂが４層以上の場合、被覆ＨＶＪ−Ｅの被覆層１１の最表層以外のアニオン性の層Ｂは、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成することができる。すなわち、例えば、最表層以外のアニオン性の層Ｂをポリスチレンスルホン酸ナトリウムまたはアニオン性磁性ナノ粒子で形成し、最表層はヒアルロン酸で形成することができる。また、積層するアニオン性の層Ｂ（最表層および最表層以外）を、すべてヒアルロン酸によって形成することもできる。
【００１９】
ヒアルロン酸は下記一般式（１）で表される。
【化１】
0005904434.tif 000002
【００２０】
ポリスチレンスルホン酸ナトリウムは下記一般式（２）で表される。
【化２】
0005904434.tif 000003
【００２１】
アニオン性磁性ナノ粒子は下記一般式（３）で表される。
【化３】
0005904434.tif 000004
カチオン性の層Ａは、例えば、キトサン、キトサン塩酸塩又はポリアリルアミン塩酸塩、カチオン性を有する他の合成高分子、生体高分子、有機あるいは金属ナノ粒子などによって形成することができる。
【００２２】
なかでも、カチオン性の層Ａの材料として、キトサン、キトサン塩酸塩又はポリアリルアミン塩酸塩を用いることにより、ＬｂＬ法で、ＨＶＪ−Ｅの表面を密にかつ単分子の厚さで覆うことができる。また、アニオン性の層Ｂを強固に被覆することができ、安定なアニオン性の層Ｂを有する被覆ＨＶＪ−Ｅとすることができる。
【００２３】
キトサンは、下記一般式（４）で表される。
【化４】
0005904434.tif 000005
【００２４】
キトサン塩酸塩は、下記一般式（５）で表される。
【化５】
0005904434.tif 000006
【００２５】
ポリアリルアミン塩酸塩は、下記一般式（６）で表される。
【化６】
0005904434.tif 000007
【００２６】
また、カチオン性の層Ａを構成する合成高分子は、例えば、アクリレートおよびメタクリレート型高分子、アクリルアミドおよびメタクリルアミド型高分子、ビニルスルフォン型高分子などを挙げることができる。さらに、生体高分子としては、例えば、多糖、タンパク質、ペプチド、核酸などを挙げることができる。さらに、有機あるいは金属ナノ粒子としては、例えば、磁性粒子、量子ドット、金粒子、銀粒子、酸化チタン、シリカなどなどを挙げることができる。
具体的には、図２に例示される合成高分子、生体高分子、有機あるいは金属ナノ粒子を挙げることができる。（非特許文献９）。
カチオン性の層Ａ及び／又はアニオン性の層Ｂに蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入することもできる。
【００２７】
カチオン性の層Ａでは、例えば、キトサン又はキトサン塩酸塩はアミノ基を有するので、水素結合、静電相互作用あるいは縮合反応を利用して、容易に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入できる。また、合成高分子、生体高分子はアミノ基を有していれば、水素結合、静電相互作用あるいは縮合反応を利用して、容易に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入できる。
【００２８】
アニオン性の層Ｂでは、ヒアルロン酸はカルボキシル基を有するので、水素結合、静電相互作用あるいは縮合反応を利用して、容易に蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入できる。これによって、蛍光標識として用いることができたり、ターゲティング能の更なる向上ができたり、抗がん効果をより高めた被覆ＨＶＪ−Ｅとすることができる。
【００２９】
抗がん剤としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、シクロホスファミド、イホスファミド、ドセタキセル、パクリタキセル、酒石酸ビノレルビン、ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸イダルビシン、ブレオマイシン、フルオロウラシル、テガフール・ウラシル、ドキシフルリジン、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム（S1）、塩酸ゲムシタビン、メソトレキサート、シタラビンAra-C、塩酸イリノテカン、エトポシドを例示することができる。水素結合、静電相互作用あるいは縮合反応により導入が容易であり、抗がん効果を高めることができる。
【００３０】
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、ＨＶＪ−Ｅの表面が、カチオン性の層とアニオン層とによって交互に２層以上積層されており、被覆層の最表層は、ヒアルロン酸によって形成されている。このため、被覆ＨＶＪ−Ｅは、ガン細胞へ達するまで正常な細胞との融合を抑制でき、ガン細胞に特異的に結合させることができ、ガン細胞への特異的結合性（標的性）を向上させることができる。また、ガン細胞に到達した場合には、ＨＶＪ−Ｅの作用によって容易にガン細胞と融合させることができ、ＨＶＪ−Ｅの抗ガン効果を発揮させることができる。
【００３１】
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、被覆層を構成する層数が２層以上であるため、表面を多層のアニオン性の層Ｂで保護することができ、ガン細胞へ達するまでの正常な細胞との融合を抑制することができる。
【００３２】
また、本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅは、被覆層を形成するカチオン性の層Ａ及び／又はアニオン性の層Ｂに蛍光色素、ペプチド、抗がん剤を導入することもできるため、被覆層の層数（膜厚）を変化させることで、これらの機能性物質の担持量を精密に制御することができる。さらに、カチオン性の層Ａを磁性粒子で形成した場合には、被覆層の層数（膜厚）を変化させることで、温熱療法を有効にする発熱量の達成や磁石の引きつけ速度などを制御することができる。
【００３３】
次に、本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法の一実施形態について説明する。
ＨＶＪ−Ｅの表面にカチオン性の層Ａ／アニオン性の層Ｂの多層構造を形成するために、Ｌａｙｅｒ−ｂｙ−Ｌａｙｅｒ法（ＬｂＬ法、交互吸着法、交互浸漬法とも呼ばれる。）を用いる。
【００３４】
本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法では、以下の工程：（１）ＨＶＪ−Ｅとカチオン性材料とを接触させてカチオン性の層を形成する工程；および（２）ＨＶＪ−Ｅとアニオン性材料とを接触させてアニオン性の層を形成する工程を含む。
【００３５】
工程（１）では、例えば、適宜、洗浄を行ったＨＶＪ−Ｅを水に分散させた後、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩などのカチオン性材料を含む溶液を添加して、ＨＶＪ−Ｅとカチオン性材料を接触させることで、ＨＶＪ−Ｅの表面をカチオン性の層Ａで覆うことができる。これによって、ＨＶＪ−Ｅの表面を覆う被覆層１１の最内層はカチオン性の層Ａで形成される。
【００３６】
カチオン性材料を含む溶液の溶媒は、例えば、酢酸緩衝液やリン酸緩衝液などを例示することができる。また、例えば、カチオン性材料が、キトサン、キトサン塩酸塩、ポリアリルアミン塩酸塩である場合、ｐＨ５〜ｐＨ７であり、濃度が１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲であることが好ましい。これによって、沈殿物等を形成することなく、生成効率を向上させることができる。
【００３７】
さらに、工程（１）（ＨＶＪ−Ｅの表面にカチオン性の層を形成する工程）の前処理として、ＨＶＪ−Ｅの表面を清浄化することができる。この場合には、例えば、ＨＶＪ−Ｅを水系溶液中に分散させ、遠心分離を行うことで洗浄することができる。これによって、より確実に、ＨＶＪ−Ｅの表面をカチオン性の層で被覆することができる。
【００３８】
さらに、工程（２）では、前記工程（１）を経た、表層にカチオン性の層Ａを有するＨＶＪ−Ｅとアニオン性材料とを接触させる。例えば、表層にカチオン性の層Ａを有するＨＶＪ−Ｅを水中に分散させ、アニオン性材料を添加し、ＨＶＪ−Ｅとアニオン性材料を接触させることで、ＨＶＪ−Ｅのカチオン性の層Ａの上にアニオン性の層Ｂを積層させることができる。
【００３９】
アニオン性材料を含む溶液の溶媒は、酢酸緩衝液やリン酸緩衝液などを例示することができる。また、アニオン性材料の濃度は、およそ１ｍＭ〜３００ｍＭの範囲であることが好ましい。これによって、溶液中に沈殿物等が形成されるのが抑制され、生成効率を向上させることができる。
【００４０】
この工程（２）においても、遠心分離、上澄みの除去などの操作を適宜行うことができる。遠心分離は、例えば、４℃以上３０℃以下、１００００ｒｐｍ以上２００００ｒｐｍ以下の条件で実施することができる。この条件によって、沈殿物等が形成されるのが抑制され、生成効率を向上させることができる。
【００４１】
そして、このような工程（１）（２）を１回、または２回以上繰り返して被覆層１１を形成するとともに、この被覆層１１の最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層Ｂによって形成する。
【００４２】
例えば、被覆ＨＶＪ−Ｅの層数を２層とする場合には、工程（１）を行った後、工程（２）では、アニオン性材料としてヒアルロン酸を使用し、ＨＶＪ−Ｅを被覆する被覆層１１の最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層Ｂとする。
【００４３】
一方、被覆ＨＶＪ−Ｅの被覆層を構成するカチオン性の層Ａとアニオン性の層Ｂの合計層数が２層以上（偶数）の場合、工程（１）（２）を所望の回数（２回以上）繰り返し、カチオン性の層Ａとアニオン性の層Ｂを所望の層数で積層させ、最後に、工程（２）で使用するアニオン性材料としてヒアルロン酸を使用して、被覆層１１の最表層をヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層Ｂとする。
【００４４】
この場合、アニオン性材料およびカチオン性材料は、１種の材料で形成することもできるし、２種以上の異なる材料で形成することもできる。具体的には、最表層以外のアニオン性の層Ｂは、ヒアルロン酸、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、アニオン性磁性ナノ粒子のうちのいずれかによって形成することができる。また、カチオン性材料としては、キトサン又はキトサン塩酸塩などを好ましく用いることができる。また、カチオン性の層の材料としては、カチオン性の生体高分子、合成高分子、有機又は金属ナノ粒子を用いることもできる。例えば、カチオン性材料として、磁性粒子（金属ナノ粒子）を用いた場合、反応や洗浄過程に用いる遠心分離は磁気分離によって行うことが可能になり、製造工程における操作性が向上する。さらに、交流磁場下で熱を発生する磁性粒子などを被覆することで、温熱療法によるガンの治療効果促進も可能となる。このような材料を適宜選択することで、被覆ＨＶＪ−Ｅを構成するカチオン性の層とアニオン性の層は多様な組み合わせが可能である。
【００４５】
また、工程（１）と工程（２）の繰り返し数（カチオン性の層Ａとアニオン性の層Ｂの層数）は、例えば、結合対象となるガン細胞の特性などを考慮して決定することができるが、１回〜１０回程度（カチオン性の層Ａとアニオン性の層Ｂの合計層数２〜２０層）が実際的であり、好ましい。
【００４６】
このような方法によって、被覆層１１の厚さが調整された、所望の層数を有し、最表層がヒアルロン酸によって形成された被覆ＨＶＪ−Ｅを容易に製造することができる。被覆ＨＶＪ−Ｅの被覆層の最表層をヒアルロン酸のアニオン性の層Ｂによって形成することで、ガン細胞への標的性を向上させ、被覆ＨＶＪ−Ｅをガン細胞と特異的に結合させることができる。
【００４７】
また、本発明では、ＬｂＬ法を用いることによって、ＨＶＪ−Ｅの微小の凹凸がある表面でも、ナノ薄膜として、アニオン性の層およびカチオン性の層を一層ずつ積み重ねてそれぞれ密に形成することができ、ＨＶＪ−Ｅ表面を高度に機能制御することを可能としている。
【００４８】
ＨＶＪ−Ｅ上に、カチオン性の層Ａとアニオン性の層Ｂを交互に吸着するだけであることから、簡便であり、水系コーティングを得意とするため、低環境負荷・低コストであり、ステップ数（積層数）によりｎｍからμｍオーダーでの膜厚制御が可能であり、ＨＶＪ−Ｅ本来の特性を維持したまま新しい機能を付与可能である。
【００４９】
本発明の実施形態である被覆ＨＶＪ−Ｅ及びその製造方法は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で、種々変更して実施することができる。
【実施例】
【００５０】
本実施形態の具体例を以下の実施例で示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）ヒアルロン酸／キトサン塩酸塩を用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆
【００５２】
（清浄化工程）
図３の工程図に示したように、「ＨＶＪ−Ｅ」０．５ｍｇを１．５ｍｌエッペンチューブに標量し、酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）１ｍｌに分散し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ）した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００５３】
（カチオン性の層の被覆工程）
図４の工程図に示したように、清浄化工程を経たＨＶＪ−Ｅを、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）に再分散した。ここに、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌキトサン塩酸塩溶液（ＣＨ−ＨＣｌ）（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９、酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え、１５分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００５４】
（アニオン性の層の被覆工程）
図５の工程図に示したように、カチオン性の層の被覆工程を経たＨＶＪ−Ｅを、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）に再分散し、ここに、２ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸溶液（ＨＡ）（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９、酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え、１５分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に合計６工程繰り返し、それぞれの工程での表面電位を、ＥＬＳを用いて測定した。（図６）
【００５５】
なお、カチオン性の層とアニオン性の層の多層構造により被覆されたＨＶＪ−Ｅは、下記化学式（７）で表される。
【化７】
0005904434.tif 000008
式（７）中、Ａはカチオン性材料、Ｂはアニオン性材料を表し、ｎは二層のステップ数を表し、ｎが０．５は１層を、ｎが１の時は２層を表す。さらに、ｎが０．５の奇数倍の時はＡが最表層を形成し、ｎが０．５の偶数倍の時はＢが最表層を形成することを表す。
【００５６】
図５に示したように、このカチオン性の層の被覆工程と、アニオン性の層の被覆工程を交互に繰り返すと、カチオン性の層（ＣＨ−ＨＣｌ）の被覆によって、ＨＶＪ−Ｅの表面電位が、+20ｍｖ〜+30ｍｖの範囲へと変化し、さらに、アニオン性の層（ＨＡ）の被覆によって、ＨＶＪ−Ｅの表面電位が−20ｍｖ〜−30ｍｖの範囲へと変化することが確認された。本発明の被覆ＨＶＪ−Ｅの製造方法によれば、ＨＶＪ−Ｅの表面にカチオン性の層およびアニオン性の層を交互に安定して積層できることが確認された。
【００５７】
（比較例１）ヒアルロン酸／キトサン塩酸塩を用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆におけるＨＶＪ−Ｅ濃度の効果
【００５８】
（清浄化工程）
「ＨＶＪ−Ｅ」１．０ｍｇを１．５ｍｌエッペンチューブに標量し、酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）１ｍｌに分散し遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ，遠心分離はすべてこの条件）した。
遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００５９】
（カチオン性の層の被覆工程）
次に、清浄化工程を経たＨＶＪ−Ｅを、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）に再分散した。ここに、５００μｌの２ｍｇ／ｍｌキトサン塩酸塩溶液（ＣＨ−ＨＣｌ）（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９、酢酸ｂｕｆｆｅｒ）に分散させたキトサン塩酸塩溶液（ＣＨ−ＨＣｌ溶液）を加え、１５分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００６０】
（アニオン性の層の被覆工程）
次に、カチオン性の層の被覆工程を経たＨＶＪ−Ｅを、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）に再分散した。ここに、２ｍｇ／ｍｌヒアルロン酸（ＨＡ）溶液（１５０ｍＭ，ｐＨ５．９、酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え、１５分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
次に、アニオン性の層の被覆工程を経たＨＶＪ−Ｅを、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．９，１５０ｍＭ）に再分散を試みたが凝集が生じなかった。さらに、ここに  ２ｍｇ／ｍｌのＨＡ溶液（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９、酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨て、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒに再分散を試みた。しかし、凝集が生じてしまった。
【００６１】
この結果、ＨＡ溶液に対してＨＶＪ−Ｅが過剰に存在する場合には、カチオン性の層とアニオン性の層による被覆は可能であるものの、ＨＶＪ−Ｅの凝集が生じることが確認された。
【００６２】
（実施例２）ヒアルロン酸／キトサン塩酸塩を用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆におけるイオン強度の効果
【００６３】
（清浄化工程）
「ＨＶＪ−Ｅ」０．５ｍｇを１．５ｍｌエッペンチューブに標量し、酢酸ｂｕｆｆｅｒ（ＰＨ５．９，５０ｍＭ，以下すべて同じ）１ｍｌに分散し遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ，遠心分離はすべてこの条件）した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００６４】
（カチオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒに再分散した。ここに５００μｌの２ｍｇ／ｍｌ「ＣＨ−ＨＣｌ溶液」（５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させ、反応後に遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００６５】
（アニオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒに再分散した。ここに２ｍｇ／ｍｌ「ＨＡ溶液」（５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。ここに２ｍｇ／ｍｌ「ＨＡ溶液」（５０ｍＭ，ｐＨ５．９，酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、溶液を遠心分離し上澄みを捨てた。
次に、５００μｌの酢酸ｂｕｆｆｅｒに再分散を試みた。すると、ＨＶＪ−Ｅの凝集はほとんど確認されず、その割合は実施例１または比較例１と比較して低下した。イオン強度を低下させることで、静電的な遮蔽が抑制されるため粒子間の反発力が大きくなり分散性が大きく向上したと考えられる。
【００６６】
（実施例３）ポリアリルアミン塩酸塩／ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆
【００６７】
（清浄化工程）
「ＨＶＪ−Ｅ」０．５ｍｇを１．５ｍｌエッペンチューブに標量し、超純水（ミリポア社製、「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」）１ｍｌに分散し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ，遠心分離はすべてこの条件）した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００６８】
（カチオン性の層被覆工程）
次に、清浄化工程を経たＨＶＪ−Ｅを、１００μｌの超純水に再分散した。ここに４００μｌの２ｍｇ／ｍｌポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）溶液（溶媒：超純水）を加え、さらに２ｍｇ／ｍｌポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）溶液（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの超純水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００６９】
（アニオン性の層被覆工程）
次に、カチオン性の層被覆工程を経たＨＶＪ−Ｅを、１００μｌの超純水に再分散した。２ｍｇ／ｍｌのポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）溶液（溶媒：超純水）を加え、さらに２ｍｇ／ｍｌポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）溶液（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの超純水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に６工程繰り返し、それぞれの工程でＤＬＳを測定した。（図７）
【００７０】
図７に示したように、カチオン性の層の材料としてポリアリルアミン塩酸塩を使用し、アニオン性の層の材料の材料としてポリスチレンスルホン酸ナトリウムを使用した場合にも、実施例１と同様に、カチオン性の層とアニオン性の層を交互に積層することができることが確認された。さらに、図７に示したようにＤＬＳの結果は粒径分布の単峰性が維持されていることからほとんど凝集を生じず、個々のＨＶＪ−Ｅがカチオン性の層とアニオン性の層で被覆されていることが確認された。
なお、被覆ＨＶＪ−Ｅのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、ＨＶＪ−Ｅの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
【００７１】
（実施例４）ポリアリルアミン塩酸塩／ポリスチレンスルホン酸ナトリウムを用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆における分散媒量の効果
【００７２】
（清浄化工程）
「ＨＶＪ−Ｅ」０．５ｍｌを１．５ｍｇエッペンチューブに標量し、超純水（ミリポア社製、「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」）１ｍｌに分散し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ）した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００７３】
（カチオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」水に再分散した。ここに５００μｌの４ｍｇ／ｍｌポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）溶液（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの超純水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００７４】
（アニオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの超純水に再分散した。ここに５００μｌの４ｍｇ／ｍｌポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）溶液（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。
このカチオン性の層被覆工程とアニオン性の層被覆工程の作業を交互に６工程繰り返し、それぞれの工程でＤＬＳを測定した。（図８）
【００７５】
図８に示したように、ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）溶液およびポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）溶液の濃度を２倍（４ｍｇ／ｍｌ）にし、分散媒量を多くすることで、実施例３と比較して、凝集がなく、より均一に個々のＨＶＪ−Ｅがカチオン性の層とアニオン性の層で被覆できることが確認された。
なお、被覆ＨＶＪ−Ｅのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、ＨＶＪ−Ｅの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
【００７６】
（実施例５）ポリアリルアミン塩酸塩／アニオン性磁性ナノ粒子を用いたＨＶＪ−Ｅの表面被覆
【００７７】
（清浄化工程）
「ＨＶＪ−Ｅ」０．５ｍｌを１．５ｍｇエッペンチューブに標量し、超純水（ミリポア社製、「ｍｉｌｌｉ  Ｑ」）１ｍｌに分散し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ，４℃以下，１５ｍｉｎｕｔｅｓ）した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００７８】
（カチオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの超純水に再分散した。ここに５００μｌの４ｍｇ／ｍｌポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ）（溶媒：１５０ｍＭ，ｐＨ５．９酢酸ｂｕｆｆｅｒ）を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの超純水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。遠心分離後、上澄みを捨てた。
【００７９】
（アニオン性の層被覆工程）
次に、５００μｌの超純水に再分散した。ここに超純水中に分散させた０．１ｗｔ％のアニオン性磁性粒子を加え１５分間反応させた。反応後、５００μｌの超純水を加え遠心分離した。遠心分離後、上澄みを捨てた。
次に、１ｍｌの超純水に再分散し、もう１度遠心分離をおこなった。
図９に示したように、ポリアリルアミン塩酸塩／アニオン性磁性ナノ粒子で修飾されたＨＶＪ−Ｅは磁石に引き付けられ再度分散可能であった。
なお、被覆ＨＶＪ−Ｅのガン細胞への特異的結合性を確保するためには、ＨＶＪ−Ｅの最表層を、ヒアルロン酸で形成されたアニオン性の層で被覆する工程が必要であるが、本実施例では、便宜的に、この工程は省略している。
【符号の説明】
【００８０】
１１  被膜層
Ａ  カチオン性の層
Ｂ  アニオン性の層
【図１】
0005904434.tif 000009
【図２】
0005904434.tif 000010
【図３】
0005904434.tif 000011
【図４】
0005904434.tif 000012
【図５】
0005904434.tif 000013
【図６】
0005904434.tif 000014
【図７】
0005904434.tif 000015
【図８】
0005904434.tif 000016
【図９】
0005904434.tif 000017