(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化膜を有するガス入りの微小胞を含む医薬製剤であって、
前記微小胞が、前記膜の構成要素に共有結合した抗原を含み、
免疫調節の治療で使用するためのものであり、
前記治療が、超音波照射の不存在下で施されることを特徴とする、
医薬製剤。
【請求項２】
請求項１に記載の製剤であって、
前記治療が、ワクチン接種を含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項３】
請求項２に記載の製剤であって、
前記抗原が、ワクチン抗原であることを特徴とする、
製剤。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記治療が、寛容導入の治療を含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記治療が、免疫賦活の治療を含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項６】
請求項１に記載の製剤であって、
前記構成要素が、リン脂質であることを特徴とする、
製剤。
【請求項７】
請求項６に記載の製剤であって、
前記リン脂質が、ペグ化リン脂質であることを特徴とする、
製剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記抗原が、前記膜中に０．１％〜２０％のモル量で存在することを特徴とする、
製剤。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記微小胞中に含まれる前記ガスが、フッ素化ガスを含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の製剤であって、
前記ガスが、空気または窒素との混合物であることを特徴とする、
製剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記安定化膜が、少なくとも５０重量％のリン脂質を含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記膜が、さらに免疫調節アジュバントを含むことを特徴とする、
製剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の製剤であって、
前記アジュバントが、前記膜の０．１モル％〜５０モル％に相当することを特徴とする、
製剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の製剤であって、
前記抗原が、アレルギー性抗原、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、毒素由来抗原、寄生性抗原、自己抗原、腫瘍抗原またはそれらの混合であることを特徴とする、
製剤。
【請求項１５】
前記ガス入りの微小胞を含む水性懸濁液の形態にある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１６】
生理的に許容できる水性担体中で再構成可能な乾燥粉末物質の形態にある、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１７】
免疫調節の治療で使用するための医薬の製造における、安定化膜を有するガス入りの微小胞の、水性懸濁液の使用であって、
前記微小胞が、前記膜の構成要素に共有結合した抗原を含み、
前記治療が、超音波照射の不存在下で施されることを特徴とする、
使用。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用であって、
前記微小胞が、抗原提示細胞による効果的な取り込みをもたらすことを特徴とする、
使用。
【請求項１９】
免疫調節の治療においてそれぞれの抗原提示細胞による抗原の取り込みを増加させるための医薬の製造における抗原の使用であって、
前記抗原は、ガス入りの微小胞に共有結合しており、
前記治療が、超音波照射の不存在下で施されることを特徴とする、
使用。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用であって、
前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般論として、特にワクチン、および免疫調節の製剤での使用のための、それに結合した抗原を含むガス入りの微小胞、および前記微小胞を含む水性懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、極性化サイトカインの放出を介した獲得免疫の開始と調節、および、特異的なＴ細胞応答を刺激するまたは復活させるための捕捉抗原（Ａｇ）のプロセシングと提示において、極めて重要な役割を果たす。免疫応答の調節を目指す、ワクチン接種を含む免疫療法の戦略は、これらの専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）へのＡｇの送達に重点を置いてきた。ワクチン接種は、通常、抗原性の実体物（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）（ＤＮＡ、ペプチドまたはタンパク質）のインビボ送達により達成され、それは、それらの低い免疫学的活性のため、一般的に、補強された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）デリバリーシステムで処方される。
【０００３】
過去の年月の間に様々なデリバリーシステムが研究されており、特にＡｇ微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｉｏｎ）に基づく、異なるアジュバントが、場合により抗原の送達を強化して、したがって免疫系を活性化する、それらの有効性に関して試験されている。例えば、抗原−リポソーム製剤でのリポソームのアジュバント効果が研究されている（例えば、Ｔａｎａｋａら、"Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｅｘｅｒｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｖｉａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ"Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１５（１）、２００４、ｐｐ．３５〜４０（非特許文献１）を参照）。最近では、中国特許ＣＮ１００５４６６４（特許文献１）に開示されるように、ガス入りの微小胞も免疫アジュバントおよびワクチン担体として提案されている。ガス入りの微小胞は、一般に、とりわけ超音波イメージングのための、造影剤としてのそれらの使用で知られている。それらは典型的に、水性媒体中に分散された数ミクロンの直径を有する気泡の懸濁液を含み、ガスを含むための安定化膜を形成する適切な物質を含む。
【０００４】
ＣＮ１００５４６６４（特許文献１）は、特に、抗原が微小胞の内側に封入されているか、あるいはその表面に付着している（静電気的吸着により）かのいずれかのガス入りの微小胞の調製を開示する。そして微小胞は局所的に投与されて、微小胞を破壊して抗原を放出するために超音波が局所的に加えられる。前記特許によれば、ガス入りの微小胞と超音波照射を組み合わせた使用で観察されるプラス効果に反して、付着した抗原を有する微小胞の単独の投与は、実質的に効果がない（ブランク対照に比較して）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】中国特許ＣＮ１００５４６６４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｅｘｅｒｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｖｉａ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ"Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．１５（１）、２００４、ｐｐ．３５〜４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願人は、ここで、抗原が微小胞の膜の構成要素、特にリン脂質に共有結合している、ガス入りの微小胞を調製することにより、微小胞の顕著なアジュバント効果が、いかなる超音波照射も実質的に不存在下で（例えば超音波照射なしで）、観察されることができ、このようにして、抗原特異的な免疫応答を強化／調節するために、抗原提示細胞、特に樹状細胞による抗原の効果的な取り込みを可能にすることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、安定化膜を有するガス入りの微小胞を含む医薬製剤であって、前記微小胞が前記膜の構成要素に共有結合した抗原を含む、免疫調節の治療で使用するための、医薬製剤に関する。
好ましい態様によれば、前記免疫調節の治療は、ワクチン接種を含む。
好ましい実施態様では、前記製剤は、前記微小胞を含む水性懸濁液である。
さらに好ましい実施態様によれば、前記抗原は、ワクチン抗原である。
【０００９】
別の態様によれば、本発明は、ガス入りの微小胞の、水性懸濁液の使用であって、前記微小胞の構成要素に共有結合した抗原を含む、ワクチンまたは免疫調節剤を調製するための、使用に関する。
【００１０】
本発明の別の態様は、それぞれの抗原提示細胞による抗原の取り込みを増加させるための方法であって、前記抗原を前記細胞に接触させることを含み、ここで前記抗原は、ガス入りの微小胞に共有結合している方法に関する。好ましい実施態様によれば、前記抗原提示細胞は樹状細胞である。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、それを必要としている患者での免疫系の調節を誘導するための方法であって、前記微小胞の構成要素に共有結合した抗原を含む、ガス入りの微小胞の水性懸濁液の効果的な量を、前記患者に投与することを含む方法に関する。
好ましい実施態様によれば、前記安定化膜は、免疫調節アジュバントを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
用語「ガス入りの微小胞」は、安定化物質の膜または層（膜形成層を含む）で囲まれた、ミクロンまたはナノメータのサイズの気泡を含む、任意の構造を含む。当該用語は、ガス入りのリポソーム、マイクロバブル、マイクロスフェア、マイクロバルーンまたはマイクロカプセルとして当技術分野で知られているものを含む。安定化物質は、例えば、界面活性剤、脂質、スフィンゴ脂質、オリゴ脂質、糖脂質、リン脂質、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、および、合成または天然のポリマー物質を含む、当技術分野で典型的に知られている任意の物質であってよい。
【００１３】
用語、ガス入りの微小胞の「前駆体」は、ガスの存在下で水性担体と再構成するとガス入りの微小胞の懸濁液を産生する、任意の組成物を含む。前記組成物は、典型的に、ガスの存在下でその水性懸濁液を振ると、ガス入りの微小胞を形成することが可能な、任意の上記の安定化物質を、乾燥粉末の形態（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥）で含む。
【００１４】
用語「マイクロバブル」は、ガスと液体の界面（ときには、当技術分野で「エバネセント（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ）」膜と呼ばれる）に配置された安定化両親媒性物質を含む非常に薄い膜（フィルム）によって、気泡が、ガス／液体の界面で境界される、水性懸濁液を含む。マイクロバブル懸濁液は、粉末の両親媒性物質（例えば凍結乾燥の、予め形成されたリポソーム、または、凍結乾燥か噴霧乾燥のリン脂質溶液）のような適切なその前駆体を、空気またはその他のガスに接触させて、それから、マイクロバブル懸濁液を産生するためにかき混ぜながら水性担体と接触させることにより調製することができ、それから、好ましくはその調製の直後に、投与することができる。ガスマイクロバブルの水性懸濁液、前駆体、およびその調製の例は、例えば、参照により本明細書に援用される、ＵＳ５，２７１，９２８、ＵＳ５，４４５，８１３、ＵＳ５，４１３，７７４、ＵＳ５，５５６，６１０、ＵＳ５，５９７，５４９、ＵＳ５，８２７，５０４およびＷＯ０４／０６９２８４に開示されている。
【００１５】
用語「マイクロバルーン」または「マイクロカプセル」は、気泡が、脂質または天然か合成のポリマーの固形物膜で囲まれている懸濁液を含む。マイクロバルーンおよびその調製の例は、例えば、参照により本明細書に援用される、ＵＳ５，７１１，９３３およびＵＳ６，３３３，０２１に開示されている。
【００１６】
語句「膜形成部分」は、ガス入りの微小胞の安定化膜の形成に関与することが可能な任意の部分を含む。前記部分は、好ましくは、両親媒性物質であり、好ましくは、リン脂質を含む。
【００１７】
用語「免疫調節」または「免疫応答の調節」は、それを必要としている患者での免疫賦活および／または寛容に向けたまたは導入が可能な、任意の医学的な治療（「免疫調節の治療」）を、その意味の中に含む。同様に、用語「免疫調節剤」、または、「免疫調節の」化合物または製剤は、患者に免疫応答の所望の調節を誘導することが可能な、免疫賦活の、および／または、寛容原性の化合物または製剤を含むことを意図する。
【００１８】
用語「免疫賦活」は、患者の免疫原性応答における任意の増加を含む。同様に、「免疫賦活の」化合物または製剤は、前記免疫応答を増加させることが可能な化合物または製剤を含む（例えば、感染、がん、および／または免疫不全症の治療において有用である）。
【００１９】
用語「寛容」は、抗原に対する、患者の免疫系の実質的な非反応性の任意の状態を、その意味の中に含む。「寛容原」は、患者において抗原に対して寛容導入することが可能な化合物または製剤を含む（例えば、環境−例えば花粉アレルギー、または栄養学的アレルギーのようなアレルギーの治療において有用である）。
【００２０】
用語「ワクチン接種」は、抗原の化合物または製剤、典型的にはワクチン抗原の患者への投与を含む、任意の免疫調節の治療を含む。同様に、用語「ワクチン」は、ワクチン抗原を含む任意の化合物または製剤を、その意味の中に含む。
【００２１】
用語「（医学的な）治療」は、予防的な治療および／または治療的な治療のいずれかを、その意味の中に含む。
【００２２】
本発明によるガス入りの微小胞は、ガス入りのマイクロバブル、マイクロカプセルおよびマイクロバルーンを含む、当技術分野で知られている任意の微小胞であってよい。
【００２３】
ガス入りのマイクロバブルは、一般に、１つまたは複数の両親媒性の構成要素により、安定化される。マイクロバブルの安定化膜を形成するために適切な両親媒性の構成要素は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸のような脂肪酸；キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーを有する、「ペグ化脂質」とも呼ばれる脂質；スルホン化−単糖類、ニ糖類、オリゴ糖類または多糖類を有する脂質；コレステロール、硫酸コレステロールまたはヘミコハク酸コレステロール；ヘミコハク酸トコフェロール；エーテルまたはエステル結合脂肪酸を有する脂質；重合脂質；ジアセチルホスフェート；ジセチルホスフェート；セラミド；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル（ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸のような）、ポリオキシエチレン脂肪アルコール、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化ダイズステロール、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）とプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロック共重合体；酪酸コレステロール、イソ酪酸コレステロール、パルミチン酸コレステロール、ステアリン酸コレステロール、酢酸ラノステロール、パルミチン酸エルゴステロール、またはｎ−酪酸植物ステロールを含む、ステロール脂肪酸エステル；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、グルコン酸コレステロール、グルコン酸ラノステロールまたはグルコン酸エルゴステロールを含む、糖酸のステロールエステル；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、糖酸とアルコール類のエステル；ラウリン酸スクロース、ラウリン酸フルクトース、パルミチン酸スクロース、ステアリン酸スクロース、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、糖類と脂肪酸のエステル；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン；グリセロールまたはトリパルミチン酸グリセロール、ジステアリン酸グリセロール、トリステアリン酸グリセロール、ジミリスチン酸グリセロール、トリミリスチン酸グリセロール、ジラウリン酸グリセロール、トリラウリン酸グリセロール、ジパルミチン酸グリセロールを含む、グリセロールエステル；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシルジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニルグリセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；例えば、Ｎ−ステアリルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）のような、少なくとも１つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アルキル鎖を含む、アルキルアミンまたはアルキルアンモニウム塩；例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）のような、（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン架橋を介してＮ原子に結合した１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）アシル鎖を含む、第３級または第４級アンモニウム塩；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。
【００２４】
好ましい実施態様によれば、マイクロバブルの膜を形成している化合物の少なくとも１つは、場合により他の上記の物質のいずれかと混合した、リン脂質である。本記載によれば、用語「リン脂質」は、最終的なマイクロバブル懸濁液中のガス−水の境界面において、その分子が、物質の安定化膜（典型的に、単分子層の形態で）を形成することが可能な、任意の両親媒性リン脂質化合物を含むことが意図される。したがって、これらの物質は、当技術分野で「膜形成リン脂質」とも呼ばれる。
【００２５】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的に、少なくとも１つのリン酸基および少なくとも１つ、好ましくは２つの、脂溶性長鎖炭化水素基を含む。
【００２６】
適切なリン脂質の例は、１つまたは好ましくは２つの（同じか異なる）脂肪酸残基およびリン酸と、グリセロールとのエステルを含み、ここでリン酸基は、例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）のような親水性基に次々に結合される。ただ１つの脂肪酸残基を有するリン脂質のエステルは、一般に、当技術分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質中に存在する脂肪酸残基は、一般に、長鎖脂肪酸であり、典型的に、１２〜２４好ましくは１４〜２２の炭素原子を含み；脂肪族鎖は１つか複数の不飽和を含んでよく、または好ましくは完全に飽和である。リン脂質中に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が用いられる。
【００２７】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸、すなわち、グリセロール−リン酸と脂肪酸のジエステル；スフィンゴミエリンのようなスフィンゴ脂質、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖で置換されている、これらのホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン、すなわち、１，３−ジホスファチジルグリセロールと脂肪酸のエステル；ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシドのようなグリコリピド；グルコリピド；スルファチドおよびグリコスフィンゴ脂質である。
【００２８】
本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独で、または混合物としてのいずれかで用いることができる、自然発生、半合成または合成的に調製される生成物のいずれかを含む。
【００２９】
自然発生のリン脂質の例は、典型的には、大豆または卵黄レシチンのような、天然のレシチン（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）である。
【００３０】
半合成のリン脂質の例は、自然発生のレシチンの部分的な、または完全な水素化誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルである。
【００３１】
好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル−ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。
【００３２】
適切なリン脂質は、さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーをそれに結合させることにより修飾されたリン脂質を含む。好ましいポリマー修飾のリン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（手短に「ＰＥ−ＰＥＧ」）、すなわち、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ（または、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧ）のような、親水性エタノールアミンの部分が可変の分子量（例えば３００〜２００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合しているホスファチジルエタノールアミンである。例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００は、それに結合した、約２０００の中間平均分子量（ｍｅａｎ  ａｖｅｒａｇｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を有するＰＥＧポリマーを有する、ＤＰＰＥを指す。
【００３３】
特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。
【００３４】
リン脂質の混合物はまた、例えば、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣと、ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣとの混合物のようにして用いることができる。
【００３５】
本発明の一実施態様によれば、リン脂質はマイクロバブルの安定化膜の主な構成要素であり、ガス入りのマイクロバブルの膜を形成する構成要素の全量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも７５％になる。いくつかの好ましい実施態様では、実質的に膜の全体（すなわち少なくとも９０％ｗ／ｗ）がリン脂質で形成されてよい。
【００３６】
リン脂質は、上述の両親媒性化合物のいずれかとの混合で好適に使用することができる。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはパルミチン酸アスコルビルのような脂質、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体のような脂肪酸、またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物を、例えば好ましくは０〜５０重量％、さらに好ましくは最大で２５％までの範囲の比率で、場合により１つまたは複数の前述のリン脂質に加えることができる。特に好ましいのはパルミチン酸である。
【００３７】
抗原は、従来型の方法により、特に、抗原をマイクロバブルの安定化膜を形成している両親媒性の構成要素（手短に「膜形成構成要素」）に共有結合させることにより、マイクロバブルの安定化膜に共有結合している。前記構成要素は、前に説明したものの中から選択することができ、リン脂質であることが特に好ましく、特にホスファチジルエタノールアミン（例えばＤＳＰＥまたはＤＰＰＥ）である。抗原は、膜形成構成要素に、例えばそれぞれの構成要素に含まれる反応基に関わる共有結合を用いて、直接結合させることができ、このようにして、膜形成に結合した抗原を含むコンストラクトを得る。あるいは、スペーサーの構成要素を抗原と膜形成構成要素との間に導入して、抗原／スペーサー／膜形成構成要素のコンストラクトを得ることができる。適切なスペーサーの例は、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリヒドロキシメチルアクリレートのような、例えば親水性合成ポリマーを含む。好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が用いられる。合成ポリマーは、２〜約５００モノマー単位、好ましくは約１２〜約２５０、およびさらにより好ましくは約２０〜約１３０モノマー単位を含んでよい。
【００３８】
反応性構成要素は、所望の反応基を含むか、または、従来型の技術により修飾されて（「官能化されて」）構成要素中に所望の反応基を含むことができるかの、いずれかでよい。
【００３９】
例えば、２つの反応性構成要素の１つが反応性アミノ基を含む場合は、イソチオシアネート基（チオカルバミド結合を形成するため）、反応性エステル（アミド結合を形成するため）、またはアルデヒド基（アルキルアミン結合に還元され得るイミン結合を形成するため）のような適切な対応する反応性部分を含む他の構成要素と反応されることができる。あるいは、２つの反応性構成要素の１つが反応性チオール基を含む場合は、他の構成要素上の適切な相補の反応性部分は、ハロアセチル誘導体、マレイミド（チオエーテル結合を形成するため）、またはチオールを有する構成要素に由来するチオールとの反応の際に２つの構成要素の間に安定なジスルフィド結合の形成をもたらす、２−ピリジルチオ基の形態での硫化物を含む混合ジスルフィドを含んでよい。さらに、２つの反応性構成要素の１つが反応性カルボン酸基を含む場合は、他の構成要素上の適切な反応性部分は、アミンおよびヒドラジド（アミドまたはＮ−アシル、Ｎ’−アルキルヒドラジド機能を形成するため）であることができる。例えば、マレイミド誘導体化リン脂質（例えばホスファチジルエタノールアミン）を調製して、それから、脱アセチル化溶液中で事前にインキュベートされたメルカプトアセチル化抗原（例えばタンパク質）と反応させてよい。別の例としては、マレイミド誘導体化ペグ化リン脂質（例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド）を調製して、それから、例えば、最初にタンパク質を（（スルホスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］−ヘキサノエート）（スルホ−ＬＣ−ＳＤＰＤ）と反応させて、そして、トリス（２−カルボキシ−エチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加えることによりジスルフィド結合を還元することにより得られる、利用しやすいチオール機能を有する抗原（例えばタンパク質）と反応させてよい。
【００４０】
本発明によるシステムにおけるガス入りの微小胞に共有結合されることができる抗原、特にワクチン抗原は、限定されないが、天然、組み換えまたは合成の生成物、およびそれらのフラグメントを含む。適切な抗原、特にワクチン抗原は、例えば：例えば、植物花粉、昆虫毒（例えば、セイヨウミツバチ由来のホスホリパーゼＡ２）、食品、動物の鱗屑、チリダニに由来するか関連するアレルギー性抗原；例えば、アデノウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、ジステンパー、エンテロウイルス種、エプスタイン・バー・ウイルス、フラビウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス種、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ１、ヒトレトロウイルス種、インフルエンザ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、麻疹、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、パラミクソウイルス、パロウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）、ポリオ、ポリオーマ腫瘍ウイルス、狂犬病、レオウイルス、トガウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスに由来するか関連するウイルス抗原；例えば、百日咳菌、ライム病ボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｉｒｆｅｒｉ）、ブルセラ属、クラミジア、アナプラズマ科エンテロバクター属（ａｎａｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ  ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、大腸菌、ヘモフィルス属、ピロリ菌、肺炎桿菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌（ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃｕｓ）、マイコバクテリウム属、淋菌、パスツレラ（ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）属、肺炎球菌、シュードモナス、リケッチア（ｒｉｃｋｓｅｔｔｉａ）、サルモネラ属、ブドウ球菌、連鎖球菌、梅毒トレポネーマ、ビブリオ、腸炎エルシニアに由来するか関連する、細菌性抗原；例えば、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉ）、ヒストプラスミン、トリコフィチン、デルマトフィチン、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス、クラドスポリウム・ハーバルム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｈｅｒｂａｒｕｍ）、ニューモシスチス・イロヴェチ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）に由来するか関連する、真菌抗原；例えば、百日咳菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、破傷風菌に由来するか関連する、毒素由来抗原；例えば、コクシジウム、フィラリア性線虫類、リーシュマニア、マラリア原虫、肉胞子虫、住血吸虫、条虫類、トキソプラズマ原虫、旋毛虫、膣トリコモナス、トリパノソーマに由来するか関連する寄生虫抗原；例えば、１型糖尿病、セリアック病、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、関節リウマチ、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、シェーグレン症候群、慢性のリンパ球性甲状腺炎の原因となるもののような、自己抗原；または、例えば、チロシナーゼ、メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１または他のメラノーマ関連の抗原、がん／精巣抗原、発がん性胚抗原、多形性上皮性ムチン、上皮細胞の接着分子、ヒト乳頭腫ウイルス、前立腺に特異的な因子またはα−フェトプロテインのような、腫瘍抗原を含んでよい。
【００４１】
微小胞の膜に結合される抗原の量は、抗原のタイプおよび患者に誘導されるべき免疫調節のタイプにより依存して変化させることができる。例えば、抗原は、微小胞の膜を形成する構成要素の全量に対して、約０．１モル％〜約２０モル％に変化させてよい。好ましくは、前記量は、約０．２モル％〜約１０モル％、そしてさらにより好ましくは、約０．５モル％〜約５モル％に変化させることができる。
【００４２】
好ましい実施態様では、ガス入りの微小胞は、微小胞のアジュバント効果を増加する／改良するための、好ましくは両親媒性の、免疫調節の化合物（アジュバント）を有利に含んでよい。実際に、適切な免疫調節のアジュバントの、製剤への添加は、免疫応答をブーストし得るだけでなく、その特性を改良することもできる。したがって、他が好ましくは１型Ｔリンパ球（Ｔｈ１）を活性化する一方で、いくつかのアジュバントは好ましくは２型Ｔリンパ球（Ｔｈ２）を活性化する。他のいくつかが、産生される免疫グロブリンのアイソタイプに影響を与え得る一方で、いくつかのアジュバントはまた、例えば、遅延型過敏症、または、細胞傷害性Ｔリンパ球に対する反応のような免疫応答のいくつかの側面に有利に働き得る。アジュバントの例は、例えば、Ｒｅｅｄ  ＳＧ、Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ  Ｓ、Ｃｏｌｅｒ  ＲＮらによる、"Ｎｅｗ  ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８"、３０（１）：２３−３２；またはＷｉｌｓｏｎ−Ｗｅｌｄｅｒ  ＪＨ、Ｔｏｒｒｅｓ  Ｍ、Ｋｉｐｐｅｒ  ＭＪらによる、"Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ"、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００９；９８（４）：１２７８−１３１６に開示される。免疫調節の化合物の好ましい例は、細菌性リポペプチド、リポタンパク質およびリポタイコ酸（ＬＴＡ）を含むＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、マイコバクテリアのリポ多糖、酵母のザイモサン、ポーリン、ムラミル−ジペプチドおよびムラミル−トリペプチドおよび誘導体（ＭＴＰ−ＰＥ、スレオニルＭＤＰ、ＧＭＤＰ、ＤＴＰ−ＧＤＰ）、Ｐａｍ３ＣＳＫ４またはＰａｍ２ＣＳＫ４（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）のようなジ−またはトリ−アシル化リポペプチド、リポペプチド−２（ＭＡＬＰ−２）を活性化するマクロファージ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ；ウイルス二重鎖ＲＮＡ；Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）のようなリポ糖（ｌｉｐｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ムラパルミチン、オレイン酸マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ  ｏｌｅａｔｅ）（ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ５１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０）、ソルビタントリオレート；リポ多糖（ＬＰＳ）、リピドＡ、モノホスホリル  リピドＡ（ＭＰＬＡ）、ＡＧＰｓ；フラジェリン；ウイルス一本鎖ＲＮＡ、イミダゾキノリン；細菌性ＤＮＡ、ＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）、ヘモゾイン、ヌクレオシドアナログ  イミキモドおよびレシキモド；レシキモドおよびイミキモドのようなイミダゾキノリン（ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）；尿路疾患性細菌、原生動物プロファイリングである。他のアジュバント化合物は、毒素（不活性化および／または不安定毒素を含む）、例えば、コレラ毒素Ｂサブユニット（ビブリオ・コレラ）、コレラホロ毒素、コレラ毒素Ａ１サブユニットを含むコレラ毒素、破傷風毒素、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）の不活性化毒素および大腸菌の不安定毒素；ＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）；ＱＳ−７、ＱＳ−２１、Ｑｕｉｌ−Ａの��うなサポニン；インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンγ、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン１β、インターロイキン−７、インターロイキン−１２のようなサイトカイン；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物または塩化物）、Ｎ，Ｎジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（アブリジン（登録商標））のような脂溶性アミン；レシキモドおよびイミキモドのようなイミダゾキノリン；デキストラン、マンナン、グルカンまたはγイヌリンのような、天然（Ｎ）および合成の単糖類または多糖類；ＢＡＹ  Ｒ１００５のような糖脂質；ポリホスファゼン（Ａｄｊｕｍｅｒ（商標））のようなポリマー；カルシトリオールおよびそれらの混合物を含んでよい。
【００４３】
アジュバントビヒクルを、さらに、本発明の製剤中に含むことができる；これらは、無機塩類（例えばアラム（ａｌｕｍ）、リン酸カルシウム）、エマルション（例えば水中スクアレン−（またはスクアレン−）エマルション（ＭＦ５９））、水中油型エマルション（ＡＳ０３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１  ａｎｄ  ＩＳＡ−７２０）、リポソーム、ビロソーム、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭｓ）、高分子マイクロスフェア、キトサンなどを含んでよい。
【００４４】
上記のアジュバント化合物はいずれも、単独または他のアジュバントのいずれかと混合（ブレンド）のいずれかで用いることができる。アジュバントブレンドの例は、完全フロイントアジュバント、ＳＡＦ−２１（スレオニル−ＭＤＰおよび水中スクアレンエマルションで作られている）、水酸化アルミニウムに吸着したリピドＡを含むウォルターリードリポソーム、ＭＰＬＡとリポソームとＱＳ２１とで作られているＡＳ０１を含む。他の例は、ＭＰＬＡを含む生分解性ポリマー粒子、ＣｐＧ  ＤＮＡモチーフ、または、他の免疫調節分子を含む。
【００４５】
安定化膜における免疫調節のアジュバントの量は、約０．１モル％〜約５０モル％、好ましくは約０．５モル％〜約２０モル％、およびさらにより好ましくは約１モル％〜約１０モル％（安定化膜を形成している物質の全モル量に対して）に変化させてよい。
【００４６】
他の賦形剤または添加剤は、マイクロバブルの安定化膜の形成に必ずしも関与することなく（または部分的にのみ関与して）、マイクロバブルの乾燥製剤中に存在してよいか、それの再構成のために用いられる水性担体とともに加えられてよいかのいずれかである。これらはｐＨ調節剤、浸透圧調整剤、粘度増強剤、乳化剤、充填剤などを含み、そして従来の量で使用されてよい。例えば、ポリオキシプロピレングリコールやポリオキシエチレングリコールおよびそれらの共重合体のような化合物を用いることができる。粘度増強剤または安定剤の例は、直鎖および架橋した多糖類、オリゴ糖類、糖類およびポリエチレングリコールのような親水性ポリマーから選択される化合物である。
【００４７】
ガス入りのマイクロバブルの調製は凍結乾燥または噴霧乾燥のステップを含んでよいので、凍結保護および／またはリオプロテクティブ（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）効果を有する薬剤および／または増量剤、例えばグリシンのようなアミノ酸；糖質、例えばスクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、グルコース、ラクトースまたはシクロデキストリンのような糖、またはデキストラン、キトサンおよびその誘導体（例えば：カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサン）のような多糖；またはポリエチレングリコールのようなポリオキシアルキレングリコール、などの凍結乾燥添加剤を製剤中に含むことが好都合であり得る。
【００４８】
本発明による組成物のマイクロバブルは、当技術分野で知られている方法のいずれかによって生産することができる。典型的に、製造方法は、前記物質を含む水性または有機物の懸濁液の好ましくは凍結乾燥（フリーズドライ）による、上記の両親媒性物質を含む乾燥粉末物質の調製を含む。
【００４９】
例えば、ＷＯ９１／１５２４４に記載されるように、膜形成両親媒性化合物は、最初に、リポソームの形成のために用いられる任意の方法により、層状の形態に変換することができる。そのために、膜形成脂質および場合により他の添加剤（例えば粘度増強剤、非−膜形成の界面活性剤、電解質など）を含む水性溶液を高スピードの機械的ホモジナイズまたは音響周波数または超音波周波数の下での超音波処理にさらすことができ、そしてそれから、流動性粉末を形成するために凍結乾燥されて、それからガスの存在下で保存される。例えばＵＳ５，５９７，５４９に記載されるような任意的な洗浄ステップは、凍結乾燥の前に行なうことができる。
【００５０】
別の実施態様（例えばＵＳ５，５９７，５４９に記載される）によれば、膜形成化合物および親水性安定剤（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、グリコール酸、リンゴ酸またはマルトール）は、有機溶媒（例えば第３級ブタノール、２−メチル−２−ブタノールまたはＣ２Ｃｌ４Ｆ２）に溶解することができ、そして溶液を凍結乾燥して乾燥粉末を形成することができる。
【００５１】
好ましくは、例えば国際特許出願ＷＯ２００４／０６９２８４に記載されるように、リン脂質（上記のものの中から選択され、そして上記で特定された荷電リン脂質の少なくとも１つを含む）およびリオプロテクティング（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ）剤（前に記載したもののような、特に糖質、糖アルコール、ポリグリコール、ポリオキシアルキレングリコールおよびそれらの混合物）は、撹拌の下で、水に不混和の有機溶媒（例えば分岐または直鎖のアルカン、アルケン、シクロアルカン、芳香族炭化水素、アルキルエステル、ケトン、ハロゲン化炭化水素、全フッ素置換された炭化水素またはそれらの混合物）を有する水のエマルションに分散することができる。エマルションは、少なくとも１つのリン脂質の存在下で、水性の媒体および溶媒を、例えば、超音波処理、振とう、高圧ホモジナイズ、マイクロミキシング、膜乳化、高スピード撹拌または高せん断混合のような、当技術分野で知られている任意の適切なエマルション生成技術に供することにより、得ることができる。例えば、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ＰＴ３０００のようなローター・ステーターホモジナイザーを用いることができる。ローター・ステーターホモジナイザーの撹拌スピードは、エマルションの構成要素、エマルションの量、有機溶媒の相対量、エマルションを含んでいる容器の直径およびエマルション中の溶媒の微小滴の所望の最終直径に依存して選択することができる。あるいは、例えば、第一注入口を通じて（例えば０．０５〜５ｍＬ／分の流速で）有機溶媒をミキサーの中に、そして第二注入口を通じて（例えば２〜１００ｍＬ／分の流速で）水相を導入することによって、混合物を乳化するためにマイクロミキシング技術用いることができる。エマルション法によっては、乳化ステップの間または乳化ステップを始める直前に、有機溶媒を徐々に導入することができる。あるいは、乳化ステップの間または乳化ステップを始める直前に、水性媒体を、水に不混和の溶媒に徐々に加えることができる。好ましくは、この後者が有機溶媒と混合する前に、リン脂質は水性媒体中に分散される。あるいは、リン脂質は、有機溶媒中に分散することができ、または、乳化ステップの前または間に、水性−有機物混合物に、別に加えられてよい。こうして得られた、リン脂質物質によって（および場合により、他の両親媒性の膜形成化合物および／または添加剤によって）包囲されて安定化された溶媒の微小滴を含むマイクロエマルションは、それから、従来技術により凍結乾燥されて、凍結乾燥された物質を得て、それは（例えば適切なガスの存在下でバイアル中に）保存されて、マイクロバブルの寸法とサイズの分布が実質的に微小滴の懸濁液の寸法とサイズの分布と同程度であるガス入りのマイクロバブル懸濁液を最終的に与えるために水性担体で再構成することができる。
【００５２】
ガス入りのマイクロバブルを調製するためのさらなる方法は、所望のガスの存在下で、リン脂質（および場合により、他の両親媒性の膜形成化合物および／または添加剤）を含む水性媒体を、制御された高い撹拌エネルギー（例えばローター・ステーターミキサーを用いて）にさらして、そして得られた分散物を凍結乾燥に供して、乾燥した再構成可能な生成物を生産することにより、ガスマイクロバブルの分散物を産生するステップを含む。この方法の例は、例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ９７／２９７８２に与えられている。
【００５３】
噴霧乾燥技術（例えばＵＳ５，６０５，６７３に開示されるように）もまた、ガス入りのマイクロバブルを得るために生理学的水性担体と接触させると再構成可能な乾燥粉末を得るために、用いることができる。
【００５４】
上記の技術のいずれかで得られる乾燥または凍結乾燥された生成物は、一般に、粉末または固形状の形態であり、所望のガスと接触して保存（例えばバイアル中に）することができる。生成物は、適切な生理的に許容できる水性液体担体中、典型的に注射用に、容易に再構成可能であり、懸濁液を穏やかに撹拌するとガス入りのマイクロバブルを形成する。適切な生理的に許容できる液体担体は、滅菌水、生理食塩水（注射用の最終生成物が低張でないように有利に平衡されてよい）のような水性溶液、または、塩類か糖類、糖アルコール、グリコールまたは他の非イオン性ポリオール物質（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）のような１つか複数の浸透圧調製物質、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンのようなキトサン誘導体、または、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランのようなゲル化（ｇｅｌｉｆｙｉｎｇ）化合物の溶液である。
【００５５】
本発明の一実施態様によれば、抗原を含むコンストラクト（すなわち抗原／膜形成構成要素コンストラクトまたは抗原／スペーサー／膜形成構成要素コンストラクト）は、上記の調製方法のいずれかにより得られる凍結乾燥された物質の再構成のときに安定化膜の中に取り込まれるように、それ自体として製剤の他の構成要素と混合することができる。
【００５６】
あるいは、コンストラクトは、適切に機能化された中間体（例えばマレイミド含有ホスファチジルエタノールアミンのような機能化膜形成構成要素）として最初の製剤に混合して、前記中間体を含む凍結乾燥された物質を生産することができ；適切な相補の反応性部分（例えばチオール）を含む抗原は、それから、それぞれの反応性部分を反応させることにより、再構成されたマイクロバブルの膜中に既に取り込まれた中間体化合物に結合することができる。
【００５７】
ＷＯ２００４／０６９２８４に開示される方法の場合、抗原を含むコンストラクトは、乳化と凍結乾燥のステップを行なおうとしている最初の混合物の構成要素と混合することもできる。あるいは、コンストラクトを含むミセル懸濁液を別々に調製して、そしてその後に、好ましくは加熱して、既に形成されたエマルション（他の膜形成構成要素を含む）に加えることができる。上述のように、形成されたコンストラクトの代わりに、機能化された中間体を代替的に用いることができ、それから、方法の任意のステップにおいて（例えば、乳化の段階に、または凍結乾燥された化合物の再構成のときに）、相補の反応性部分を含む抗原と反応させることができる。一実施態様によれば、機能化された膜形成構成要素（または膜形成／スペーサー中間体コンストラクト）は、ミセル懸濁液として、形成されたエマルションに撹拌下で加えられる。抗原（相補の反応性部分を含む）を含む化合物は、それから、得られたエマルションに加えられる。
【００５８】
例えば、膜形成構成要素のマレイミド誘導体（ＤＳＰＥ−マレイミドまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドのような）のミセル懸濁液を、形成された膜形成構成要素のエマルションに加えてよい。それから、エマルションの凍結乾燥前に、脱アセチル化溶液（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ヒドロキシルアミン。ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中でインキュベートされたメルカプトアセチル化抗原（例えばＤＭＦ中で１０ｍｇ／ｍＬのＧタンパク質）の溶液を、穏やかな撹拌下でエマルションに加える。あるいは、膜形成構成要素のマレイミド誘導体を含むエマルションは凍結乾燥されて、そしてそれから、その後に、無保護の抗原が、再構成されたガス入りの微小胞の懸濁液に加えられる。
【００５９】
代替的な実施態様によれば、抗原は、ガス入りのマイクロカプセルに共有結合させることができる。マイクロカプセルの好ましい例は、ポリマー、好ましくは生分解性ポリマー、または、場合により生分解性ポリマーとの混合物での、生分解性で水に不溶性の脂質（トリパルミチンのような）を含む安定化膜を有するものである。適切なマイクロカプセルおよびその調製の例は、例えば、それらの全体で参照により本明細書中に援用される、ＵＳ５，７１１，９３３およびＵＳ６，３３３，０２１に開示されている。タンパク性の膜を有する、すなわちＵＳ−Ａ−４，２７６，８８５またはＥＰ−Ａ−０，３２４，９３８（参照により本明細書に援用される）に記載されているもののような天然のタンパク質（アルブミン、ヘモグロビン）で作られたマイクロカプセルもまた、用いることができる。抗原は、前述の調製方法によりマイクロカプセルの膜形成構成要素にそれを共有結合させることによって、または、前述したもののような、前記抗原に共有結合された両親媒性の構成要素を、マイクロカプセルの膜を形成する構成要素に混合することによって、マイクロカプセルの膜中に取り込まれることができる。
【００６０】
任意の生体適合性ガス、ガス前駆体、またはそれらの混合物が、上記の微小胞を充填するために用いられてよい（以降、「微小胞形成ガス」とも定義される）。
【００６１】
ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトンのような希ガスまたは不活性ガス；低分子量の炭化水素（例えば、最大で７炭素原子までを含む）、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンまたはイソペンタンのようなアルカン、シクロブタンまたはシクロペンタンのようなシクロアルカン、プロペン、ブテンまたはイソブテンのようなアルケン、またはアセチレンのようなアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化、フッ素化または全フッ素置換された低分子量の炭化水素（例えば、最大で７炭素原子までを含む）のような、ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス；または前述のいずれかの混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合は、前記化合物中のハロゲン原子の好ましくは少なくともいくつか、さらに好ましくは全てがフッ素原子である。
【００６２】
フッ素化ガス、特に、全フッ素置換されたガスが好ましい。フッ素化ガスは、例えば、フッ素化炭化水素（１つか複数の炭素原子とフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくは全フッ素置換された、ペルフルオロアセトンのようなケトン類；およびフッ素化、好ましくは全フッ素置換された、ペルフルオロジエチルエーテルのようなエーテル類のような、少なくとも１つのフッ素原子を含む物質を含む。好ましい化合物は、例えば、参照により本明細書中に援用されるＥＰ０５５４２１３に開示されるような、特に安定したマイクロバブル懸濁液を形成することが知られている、ＳＦ６またはペルフルオロカーボン（全フッ素置換された炭化水素）のような全フッ素置換されたガス、すなわち全ての水素原子がフッ素原子により置換されている炭化水素である。
【００６３】
用語「ペルフルオロカーボン」は、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボンを含む。生体適合性で生理的に許容できるペルフルオロカーボンの例は：ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタンのようなペルフルオロアルカン（例えば、場合によりペルフルオロ−イソブタンのような他の異性体との混合で、ペルフルオロ−ｎ−ブタン）、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサンまたはペルフルオロヘプタン；ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン（例えばペルフルオロブタ−２−エン）またはペルフルオロブタジエンのようなペルフルオロアルケン；ペルフルオロアルキン（例えばペルフルオロブタ−２−イン）；およびペルフルオロシクロアルカン（例えばペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサンおよびペルフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和ペルフルオロカーボンは、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１２を含む。
【００６４】
任意の比率で上記のガスのいずれかの混合物を用いることも好都合であり得る。例えば、混合物は、窒素、空気または二酸化炭素のような従来型のガス、および、六フッ化硫黄または前述したペルフルオロカーボンのような、安定したマイクロバブル懸濁液を形成するガスを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えば、参照により本明細書中に援用されるＷＯ９４／０９８２９に見られることができる。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）と（Ｂ）の混合物であって、ガス（Ｂ）は前述したものの中から選択されるフッ素化ガスであり、それらの混合物を含み、そして（Ａ）は空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、混合物全体の約０．５％〜約９５％（ｖ／ｖ）、好ましくは約５％〜８０％を示すことができる。
【００６５】
特に好ましいガスは、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０またはそれらの混合物であり、場合により、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物との混合である。
【００６６】
特定の状況では、ガス状の物質の前駆体（すなわち、インビボでガスに変換されることが可能な物質）を含むことが望ましくあり得る。好ましくは、ガス状の前駆体およびそれから得られるガスは、生理的に許容できる。ガス状の前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化などであってよい。例えば、あるペルフルオロカーボンは、温度活性化ガス状の前駆体として用いてよい。ペルフルオロペンタンまたはペルフルオロヘキサンのような、これらのペルフルオロカーボンは、室温（または、物質が産生され、および／または保存される温度）より高いが体温より低い液体／気体相転移温度を有する；このように、それらは液体／気体相転移を経て、人体中でガスに変換される。
【００６７】
上述したとおり、本発明の微小胞は、特にワクチンおよび／または免疫調節の製剤として有用である。
【００６８】
本出願人は、特に、抗原がそれに共有結合している本発明の微小胞（および好ましくはその安定化膜中に少なくとも５０重量％のリン脂質を含む微小胞）は、抗原がそれに共有結合されていない（例えば封入または吸着されている）微小胞と比較して、抗原提示細胞、特に樹状細胞による取り込みに、特に効果的であることを見出した。本出願人により見出されたとおり、前記の増加した取り込みは、共有結合した抗原に対する特異抗体の、より高い産生、および抗原特異的なＴ細胞応答の増加をもたらす。特定の理論のいずれにも結び付くことを意思せずに、本発明の微小胞では、抗原が抗原提示細胞により、より効果的に取り込まれることが仮説され得る。
【００６９】
免疫応答の促進／調節に対するそれらの有利なアジュバント効果を考慮すると、本発明の微小胞は、それに共有結合した前述の（ワクチン）抗原のいずれかを効果的に投与するために用いることができる。微小胞の投与は、例えば、皮下、皮内、経皮、筋肉内または静脈内注射により、または経口、舌下、経鼻、膀胱内、膣または直腸送達のような粘膜経路により行なうことができる。最大で例えば全部で５回までの投与を、例えば２週間〜６か月の間を含む間隔で行うことができる。組成物は、好ましくはガス入りの微小胞の水性懸濁液の形態で投与される。あるいは、組成物は、凍結乾燥物として、またはゲル溶液として投与することができる。
【００７０】
注射／免疫付与のプロトコルの例は、本明細書中の実施例に示されている。
【００７１】
本発明の微小胞は、このように、それを必要とする患者における免疫応答の調節を含む、または誘導する、任意の医学的な治療、特に、それを必要とする患者における免疫応答を調節するための治療で使用することができる。典型的に、治療は、患者のワクチン接種を含む。
【００７２】
例えば、免疫調節の治療は、感染の治療（例えば、マラリア、髄膜炎、麻疹、エイズ、流感（インフルエンザ）、コレラまたはリステリア症のような、典型的に、細菌性、ウイルス性、寄生性および／または真菌性の感染）、腫瘍の治療（例えば、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、膀胱がん、または食道がん、肉腫、またはメラノーマのような；）および、例えば環境または栄養学的アレルギー（例えば、花粉、ハチ毒、チリダニ、ラテックス、ミルク（ラクトース）、ピーナッツおよび／または卵（アルブミン）アレルギーのような）を含むアレルギーの治療を含んでよい。
【００７３】
以下の例は、本発明をさらに説明するのに役立つ。
【表１】
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【実施例】
【００７４】
（実施例１）共有結合した抗原（ＯＶＡ）を含むガス入りの微小胞の調製。
［ＯＶＡのチオール化］
ＯＶＡ（６ｍｇ−１３３ｎｍｏｌｅｓ）をＰＢＥ（リン酸緩衝液２５ｍＭ、１５０ｍＭ生理食塩水、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に溶解して、２０ｍｇ／ｍＬでの溶液を得た。トラウト試薬の溶液（２ｍｇ／ｍＬ−１４．５ｍＭ）をＰＢＥ中に調製して、この溶液の９２μＬ（１０当量）をＯＶＡ溶液に加えた。結果として生じた混合物を、室温で１時間、撹拌下でインキュベートした。この溶液を、ＰＢＥ中で平衡化されたスピンカラム（Ｚｅｂａ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ２ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ、＃８９８９０）を用いて回転した。溶液の最終的な量は、約３９０μＬであった。
【００７５】
最終のＯＶＡ濃度（２８０ｎｍでのＵＶにより測定された）は約３００ｎｍｏｌ／ｍＬであった。
チオールの酸化の可能性を制限するために、チオール化ＯＶＡ溶液は、精製の直後に用いた。
【００７６】
［共有結合されたＯＶＡを有する微小胞の調製］
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド（６．６ｍｇ−２．２４μｍｏｌｅｓ）を、４５℃で撹拌（ボルテックス）して、リン酸緩衝液１００ｍＭ  ｐＨ６（０．５ｍＬ）中に溶解して、透明な溶液を得た。
【００７７】
ＤＳＰＣ／パルミチン酸（モルで８０／２０）の混合物の６０ｍｇを、シクロオクタン（４．８ｍＬ）中に７０℃で溶解した。別々に、上で調製されたミセル溶液（０．５ｍＬ）を、５９．５ｍＬのＰＥＧ４０００  １０％溶液に加えた。それから、リン脂質を含む有機相を水相に加えて、そして、高スピードホモジナイザー（Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００）を５分間（１１５００ｒｐｍ）用いて乳化して、エマルションを得た。エマルションを、ＰＰチューブ（１５ｍＬファルコン）中に、１０ｍＬのフラクションに分けた。
【００７８】
チオール化ＯＶＡ（７８ｎｍｏｌｅｓ−２６０μＬ）を１０ｍＬのエマルションに加えて、結果として生じた混合物を、２２℃で３時間、撹拌した。得られたエマルションを、最終的に、１０％のＰＥＧ４０００溶液で２回希釈して、ＤＩＮ４Ｒバイアル（１バイアルあたり５００μＬ）中にサンプリングした。バイアルを−５０℃で２時間凍結して（Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ凍結乾燥機）、それから、−２５℃および０．２ｍＢａｒで１２時間、凍結乾燥した。それから、凍結乾燥された生成物を、３５％のペルフルオロ−ｎ−ブタンと６５％の空気を含む雰囲気にさらした。
【００７９】
穏やかなハンドシェイキングによって、生成物を、生理食塩水（１ｍＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）のボリューム中に分散した。
【００８０】
（実施例２）共有結合された抗原（ＯＶＡ）とアジュバントを含む、ガス入りの微小胞の調製。
シクロオクタンへの溶解の前に８．１ｍｇのＭＰＬＡ（５％モル比）をＤＳＰＣ／ＡＰの混合物中に加えたことを除き、実施例１に従って、マイクロバブルを調製した。
【００８１】
（実施例３）マウス樹状細胞による、ガス入りの微小胞に共有結合された抗原のインビトロでの内部移行。
微小胞に共有結合された抗原を内部移行する、マウスＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）の能力を試験するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の脾臓を収集して、抗−ＣＤ１１ｃ  ｍＡｂ／磁性粒子技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた陽性選択に先立ち、単細胞懸濁液に処理した。濃縮されたＣＤ１１ｃ＋細胞をポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたマイクロタイタープレートに２時間播き、そしてそれから、微小胞に共有結合された、Ｃｙ３色素で蛍光ラベルしたＯＶＡ、または抗原を有さない微小胞（実施例１のように調製された）とともに、３７℃で３時間インキュベートした。細胞と微小胞の接触を促進するために、ＤＣとのインキュベーション時間の間、マイクロタイタープレートは裏返した。実際に、ガス入りの微小胞は、沈降する代わりに、溶液中で一度、上方へ移動する。それから細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄して、そしてそれからＣｙ３：ＯＶＡに関連する蛍光を消光するために、ＰＢＳ中で、Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅとともにインキュベートした（ＤＣの細胞表面で吸着され得る）。この方法では、細胞に関係する蛍光シグナルは、ＤＣによって細胞内に取り込まれたＯＶＡのもののみを反映した。それから、細胞を、ＣＤ３（ＰＥ*Ｃｙ７−結合）、ＭＨＣＩＩ（ＦＩＴＣ−結合）およびＣＤ１１ｃ（ＡＰＣ−結合）に対するｍＡｂｓで標識し、洗浄して、そしてフローサイトメトリーにより分析した。死細胞を除外するためにＤＡＰＩを用いた。ＤＡＰＩ−ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋Ｃｙ３＋細胞の割合を計算して、そして、ＤＡＰＩ−ＣＤ３−ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣＩＩ＋細胞でのＣｙ３シグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＬＳＲ  ＩＩ  フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定した。
【００８２】
実験は、３匹のマウス（表１）から回収された細胞で独立におこなって、そして、得られた結果は、これらの条件下では、上述のように分析された３１．２±９．４％の細胞が、微小胞に共有結合したＣｙ３：ＯＶＡの存在下でＣｙ３＋であり、一方で、対照の単純な（ｐｌａｉｎ）微小胞を用いると、たったの１．０±０．７％の細胞がＣｙ３＋であったことを示した。微小胞に共有結合したＣｙ３：ＯＶＡの内部移行は、Ｃｙ３シグナルＭＦＩを分析した場合にも明らかであった。実際に、ＤＣを、微小胞に共有結合したＣｙ３：ＯＶＡとともにインキュベートした場合、Ｃｙ３シグナルのＭＦＩ（８７９．７±９５．１）は、対照の微小胞で観察した場合（９２．３±７．５）よりも、有意に高かった。
【００８３】
【表２】
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【００８４】
（実施例４）マウスＣＤ４  Ｔ細胞に対する、インビトロの抗原提示：微小胞に共有結合した抗原と微小胞に共有結合していない抗原との比較。
接着性マウスＤＣ１９４０細胞株（２５０００細胞／ウェル）を、マイクロタイタープレート中に２時間播き、そしてそれから、ＰＢＳ中に希釈された異なる製剤での、滴定濃度のＯＶＡとともに、３７℃で４時間インキュベートした：（ａ）ＯＶＡ３２３−３３９ペプチド（対照ペプチド：樹状細胞の膜上に発現されたＭＨＣクラスＩＩ分子に直接的に結合するＯＶＡのフラグメント；ペプチド：ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、内部移行およびプロセシングを必要とせずに、ＣＤ４  Ｔ細胞に提示される）、（ｂ）ＯＶＡ、（ｃ）実施例１により調製されたマイクロバブルに共有結合したＯＶＡ、（ｄ）ラテックスビーズに結合したＯＶＡ、または（ｅ）両方の構成要素を１０分間混合することにより、カチオン性微小胞（２０％  ＤＳＴＡＰ）上に吸着されたＯＶＡ。微小胞を用いた場合、細胞と微小胞の接触を促進するために、ＤＣ１９４０細胞とのインキュベーションの期間の間、マイクロタイタープレートは裏返した。コインキュベーション期間後、細胞を収集して、ＰＢＳで洗浄して、顕微鏡下でノイバウエル・チャンバー（Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）を用いて計数して、そして、（２５０００細胞／ウェル）を、ＣＤ４  Ｔ細胞ハイブリドーマＢＯ９７．１１（２００００細胞／ウェル）とともに２４時間、混合した。上清をピペッティングにより回収して、そして、Ｔ細胞活性化の指標である、ＩＬ−２産生を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により定量化した。
【００８５】
得られた滴定曲線−ＯＶＡ濃度（アゴニスト）対ＯＤ４５０ｎｍ（応答）に基づき、シグモイド適合曲線（ｓｉｇｍｏｉｄ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０３ソフトウェアを用いて作った。それから、試験された各実験条件の比較を可能にする、各曲線に関する最大半量ＯＤ４５０ｎｍを与えるＯＶＡ濃度を計算した（ＥＣ５０）。表２の結果は、マイクロバブルに共有結合したＯＶＡが、試験されたいかなる他のＯＶＡ製剤よりも、さらに効率的にＣＤ４  Ｔ細胞に提示されたことを示す。特に、共有結合した抗原を含む微小胞で得られたＥＣ５０は、フリーのＯＶＡのものよりも、４０００倍よりさらに低く（ｐ＝０．０１５９）、ラテックスビーズに結合したＯＶＡのものよりも１０倍低く（ｐ＝０．０３５７）、そして、カチオン性微小胞上に吸着したＯＶＡのものよりも、１０倍よりさらに低い（ｐ＝０．０３５７）ことが観察される。言い換えれば、これは、微小胞に共有結合したＯＶＡでＣＤ４  Ｔ細胞の活性化の最大半量を達成するためには、試験された他の製剤と比較して、より少ないＯＶＡが必要とされることを意味する。したがって、微小胞に共有結合したＯＶＡは、約１・１０−３μＭのＯＶＡ濃度で既に、ＣＤ４  Ｔ細胞の活性化を誘導する。それどころか、ＯＶＡがラテックスビーズに結合されているか、またはカチオン性微小胞上に吸着されている場合は、１・１０−２μＭまたはそれよりも高い濃度が、ＣＤ  ４Ｔ細胞を活性化するために必要とされる。最大で１μＭまでのフリーの抗原は、Ｔ細胞の無視できるほどの活性化を誘導する。
【００８６】
【表３】
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【００８７】
（実施例５）微小胞に共有結合した抗原、抗原単独、および抗原＋アラムアジュバントの投与時にインビボで産生される、Ｔ細胞応答の比較。
本発明の、抗原を含む微小胞の、インビボでのＴ細胞免疫応答を産生する能力と効率を、微小胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射することにより評価した。結果を、同程度の量の抗原分子単独およびアラムと組み合わせた注射と比較した。
【００８８】
実施例１により調製された、微小胞に共有結合したＯＶＡを、２週間間隔で３回、マウスへ注射し、最後の注射の１４日後に屠殺して、そして脾臓を各マウスから収集して処理し、単細胞懸濁液を得た。ＯＶＡ−特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答は、以下のように、カルボキシフルオセインサクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）に基づく増殖分析により評価した：脾細胞を、３７℃で、ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ中で、ＣＦＳＥで標識して、それからＰＢＳ−５％ウシ胎仔血清で洗浄した。それから、脾細胞を、丸底の９６ウェルプレートに、５・１０６細胞／ウェルで播き、そして培地単独、ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）、または陽性対照としてのコンカナバリンＡ（１．５μｇ／ｍＬ）のいずれかとともにインキュベートした。２日後、２．５Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を各ウェルに加えて、そして２日後、細胞を収集してＰＢＳで洗浄した。それから、細胞を、マウスＣＤ３（ＰＥ＊Ｃｙ７−結合）、ＣＤ４（ＰＥ−結合）およびＣＤ８（Ａｌｅｘａ６４７−結合）に対するｍＡｂｓで標識して、洗浄して、そしてＤＡＰＩを最後に、フローサイトメトリーによる分析の直前に添加した。細胞が分裂するときにＣＦＳＥ色素が薄まるので、ＣＦＳＥｌｏｗＣＤ３＋ＣＤ４＋ＤＡＰＩ−またはＣＦＳＥｌｏｗＣＤ３＋ＣＤ８＋ＤＡＰＩ−の細胞の割合を、加えられた刺激に対して応答した細胞として記録した。結果は、培地単独に対して応答する細胞の頻度により割られたＯＶＡに対して応答する細胞の頻度として計算される、刺激指数（ＳＩ）として表わされる。
実験設定は、実施例３で説明したものと同様であった。
【００８９】
表３に示されるように、微小胞に共有結合したＯＶＡの３回の注射後に測定されたＳＩは、フリーのＯＶＡの注射により誘導されるものよりも上回って、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方を誘導した。これは、フリーのＯＶＡで注射されたマウスでの同一母集団に関して得られたＳＩ（それぞれ、２．８２および２．０７）と比較して、微小胞に共有結合したＯＶＡを受け取ったマウスにおけるＯＶＡに対するＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の、有意により高いＳＩ（それぞれ、１１．０８および７．９８）によって表される（ＣＤ４  Ｔ細胞に関してｐ＝０．００２２、そしてＣＤ８  Ｔ細胞に関してｐ＝０．００２２）。加えて、ＯＶＡ−特異的なＣＤ４  Ｔ細胞応答は、マウスが微小胞に共有結合したＯＶＡ（１１．０８）またはアラムと混合されたＯＶＡ（１０．３０）を受けた場合と、同様であった（ｐ＝０．９３６０）。
【００９０】
インビトロで４日の刺激後に計算されたＳＩは、インビボで生じる頻度を反映する。したがって、上で示されたデータは、フリーのＯＶＡに勝る、ＭＢに共有結合したＯＶＡの、ＯＶＡ−特異的なＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答をインビボで誘導する、優れた能力を明示する。それはまた、本出願人により示された試薬が、ＣＤ４  Ｔ細胞応答の誘導において、アジュバントアラムと同じくらい強力であることを示す。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
（実施例６）ガス入りの微小胞に共有結合した抗原、抗原単独および抗原＋アラムアジュバントの投与時の、インビボでの抗体応答の比較。
本発明の、抗原を含む微小胞の、インビボの抗体免疫応答を産生する能力および効率を、微小胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射することにより評価した。結果を、同程度の量の抗原単独の注射、およびアラムアジュバントと混合した抗原の注射と、比較した。
【００９３】
実施例１により調製された、微小胞に共有結合したＯＶＡを、２週間間隔でマウスへ注射して、そして、血清を２回目および３回目の注射の後に収集して、ＯＶＡ−特異抗体の存在を評価した。ＯＶＡ−特異抗体（表２中の全ＩｇＧ）の存在および力価を、以下のプロトコルによるＥＬＩＳＡによって決定した。手短には、マキシソーププレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ｐｌａｔｅｓ）（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのＯＶＡでコーティングして、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−１％  ＢＳＡでブロッキングして、そして、滴定用量の血清の添加前に洗浄した。４℃でのオーバーナイトのインキュベーションに続いて、プレートを洗浄して、そしてＯＶＡ−特異ＩｇＧの存在を、ＨＲＰ結合抗−ＩｇＧ抗体とのインキュベーションにより評価した。洗浄に続いて、ＨＲＰ基質を加えて、数分後に反応を１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で止めて、そしてＯＤ４５０ｎｍを測定した。得られた滴定曲線に基づき（血清希釈（アゴニスト）対ＯＤ４５０ｎｍ（応答））、シグモイド適合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０３ソフトウェアおよび３つのパラメータｌｏｇ（アゴニスト）対応答の関数を用いて作った。それから、試験された各条件の比較を可能にする、各曲線に関する最大半量ＯＤ４５０ｎｍを与える血清希釈（滴定量）を計算した（ＥＣ５０）。
【００９４】
ＯＶＡを含む微小胞の投与で得られた結果を、ＯＶＡ単独、またはアラムアジュバント（ヒトワクチンで７０年よりも前から用いられている標準的なアジュバント）と混合したＯＶＡのいずれかを投与することによるインビボ試験で同様に得られた結果と比較した。
【００９５】
この点で、８μｇの抗原に対応する、ＯＶＡを含む製剤１００μＬを、２週間間隔で３回、マウス（実験グループあたり６）の尾の基部に皮下注射した。ＯＶＡグループ由来のマウスは、ＰＢＳ中に希釈されたＯＶＡを注射した。ＯＶＡ微小胞のグループ由来のマウスは、穏やかにハンドミキシングして１ｍＬのＰＢＳ中で再構成された製剤を注射した。注射の前に、ハンドミキシングを繰り返した。ＯＶＡ／アラムのグループ由来のマウスは、ＰＢＳ中に希釈されて回転ホイール上で３０分間混合されたＯＶＡとアラムの溶液を注射した。注射の前に、製剤をＰＢＳで洗浄した。各マウスに投与されたアラムの最終的な量は１ｍｇであった。
【００９６】
表４に示すように、微小胞に共有結合したＯＶＡの注射後（２回または３回のいずれかの注射後）に測定されたＩｇＧ  ＥＣ５０の力価（平均）は、ＯＶＡ単独に関して観察されるものに対して、有意に、より高かった（それぞれ、ｐ＝０．０２４７およびｐ＝０．０２６０；マンホイットニー検定）。さらに、ＯＶＡ−微小胞で得られたＩｇＧの力価を、アラムアジュバントと混合されたＯＶＡを用いて得られたものと比較した（２回の注射後ｐ＝０．３９３９および３回の注射後ｐ＝０．９３７２；マンホイットニー検定）。
【００９７】
これらの結果は、ＥＬＩＳＡにより検出されるのと同程度の量のＡｂを得るためには、ＭＢに共有結合したＯＶＡまたはアラムアジュバント上に吸着されたＯＶＡで免疫化されたマウス由来のものと比較して、より低く希釈された、フリーのＯＶＡで免疫化されたマウス由来の血清が必要とされることを意味する。したがって、より多くのＡｂが、ＭＢに共有結合したＯＶＡに応答してインビボで産生され、フリーのＯＶＡに勝って、本出願人により提案された試薬に利点を与える。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
（実施例７）免疫調節剤ＭＰＬＡを含む、または含まない、ガス入りの微小胞に共有結合した抗原の投与時の、インビボでの抗体応答の比較。
本発明の、抗原を含む微小胞へのアジュバントの追加を、ＭＰＬＡを含む微小胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射することにより評価した。結果を、ＭＰＬＡを伴わずに抗原を含む微小胞の、同程度の量の注射と比較した。
【０１００】
微小胞に共有結合し、かつ、実施例２により調製されたＭＰＬＡを含むＯＶＡを、２週間間隔でマウスに注射して、そして血清を２回目および３回目の注射の後に収集して、ＯＶＡ−特異抗体の存在を評価した。実施例６で説明したように、ＯＶＡ−特異抗体（表５中の全ＩｇＧ）の存在と力価をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０１０１】
ＯＶＡ−特異ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の存在と力価（表６）を、以下のプロトコルによるＥＬＩＳＡによって決定した。手短には、マキシソーププレート（Ｎｕｎｃ）を１０μｇ／ｍＬのＯＶＡでコーティングして、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−１％  ＢＳＡでブロッキングして、そして、滴定用量の血清の添加前に洗浄した。４℃でのオーバーナイトのインキュベーションに続いて、プレートを洗浄して、そして、ＯＶＡ−特異ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの存在を、ビオチン化抗−ＩｇＧ１または抗−ＩｇＧ２ａ抗体とのインキュベーションにより評価した。それから、プレートを洗浄して、そしてさらにｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰとともにインキュベートした。洗浄に続いて、ＨＲＰ基質を加えて、数分後に反応を１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で止めて、そしてＯＤ４５０ｎｍを測定した。得られた滴定曲線に基づき（血清希釈（アゴニスト）対ＯＤ４５０ｎｍ（応答））、シグモイド適合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０３ソフトウェアおよび３つのパラメータｌｏｇ（アゴニスト）対応答関数を用いて作った。それから、試験された各条件の比較を可能にする、各曲線に関する最大半量ＯＤ４５０ｎｍを与える血清希釈（滴定量）を計算した（ＥＣ５０）。ＯＶＡ−特異ＩｇＧ１抗体力価とＯＶＡ−特異ＩｇＧ２ａ抗体力価の比率を、それぞれのＩｇＧサブタイプに関して得られたＥＣ５０値を用いて、各マウスに関して計算して、そしてそれから、平均を、各実験グループに関して計算した。
【０１０２】
ＭＰＬＡを含むＯＶＡ−微小胞の投与で得られた結果を、ＭＰＬＡを伴わずに抗原を含む微小胞を投与することによるインビボ試験で同様に得られた結果と比較した。
８μｇの抗原に対応する、ＯＶＡを含む製剤１００μＬを、２週間間隔で３回、マウス（実験グループあたり６）の尾の基部に皮下注射した。
【０１０３】
表５に示すように、ＭＰＬＡ−ＯＶＡ−微小胞の注射後（２回または３回のいずれかの注射の後）に測定されたＩｇＧ  ＥＣ５０の力価（平均）は、ＯＶＡ−微小胞に関して観察されるものに対して、有意に、より高かった（それぞれ、ｐ＝０．００４３およびｐ＝０．００８７；マンホイットニー検定）。注目すべきことに、ＭＰＬＡ−ＯＶＡ製剤での２回の注射後の抗体力価は、ＯＶＡ−微小胞での３回の注射後に得られる力価よりも高い。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
表６は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａの力価の比率が、ＯＶＡ−微小胞に比べて、ＭＰＬＡ−ＯＶＡ−微小胞の注射後に、有意に、より低かったことを示す（ｐ＝０．０１５２；マンホイットニー検定）。
【表７】
0005992920.tif 000008
【０１０６】
これらの結果は、ＯＶＡ単独と比較して、微小胞に共有結合したＯＶＡに応答して、より多くの抗体がインビボで産生されるが（実施例６に示される）、ＭＰＬＡを含む製剤は、さらに、より高い抗体力価を産出したことを明示する。
さらに、ＭＰＬＡを含む、または含まないＯＶＡ−微小胞に関する免疫応答のタイプは異なった：ＭＰＬＡの存在下では、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が低かった。これは、Ｔｈ１タイプの免疫応答への移行を示している。
【０１０７】
（実施例８）Ｃ５７ＢＬ／６マウス株での、微小胞に共有結合した抗原の投与後にインビボで産生される、Ｔ細胞と抗体の応答。
本発明の、抗原を含む微小胞の、インビボでのＴ細胞とＡｂの免疫応答を産生する能力を、微小胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射することにより、さらに評価した。結果を、Ｂａｌｂ／ｃマウスでの、同程度の量の微小胞製剤の注射と比較した。
【０１０８】
実施例１により調製された、共有結合したＯＶＡを有する微小胞を、２週間間隔で３回、マウスに注射して、最後の注射の１４日後に屠殺した。血液と脾臓を各マウスから収集して、実施例５および６に記載されたプロトコルにしたがって、ＯＶＡ−特異的なＡｂとＴ細胞の応答の存在に関して分析した。
【０１０９】
微小胞の３回の注射後に測定されたＳＩは、同じ製剤のＢａｌｂ／ｃマウスへの注射により誘導されたものと同様に、ＣＤ４とＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方を誘導した（表７）。両方の株において、共有結合した抗原を有する微小胞の投与は、抗原を有さない対照の微小胞の注射で得られたものよりも、有意に高いＳＩを生じた（それぞれ、ＣＤ４  Ｔ細胞応答に関しては、Ｂａｌｂ／ｃマウスについてｐ＝０．００８７およびＣ５７ＢＬ／６マウスについてｐ＝０．０２８６、そして、ＣＤ８  Ｔ細胞に関しては、Ｂａｌｂ／ｃマウスについてｐ＝０．００５０およびＣ５７ＢＬ／６マウスについてｐ＝０．０２８６）。
【表８】
0005992920.tif 000009
【０１１０】
血清中の全ＯＶＡ−特異ＩｇＧを定量化すると、同様の結果が得られた。微小胞に共有結合したＯＶＡの注射は、単純な微小胞で行われる対照の注射と比較して、両方のマウス株において、有意により高いレベルのＡｂを誘導した（Ｂａｌｂ／ｃマウスに関してｐ＝０．００５０およびＣ５７ＢＬ／６マウスに関してｐ＝０．０２８６）。同等のＩｇＧ力価もまた、両株間で観察された。さらに、ＯＶＡ−特異ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａのＡｂの分析は、免疫化Ｂａｌｂ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６での両方のアイソタイプと同程度の力価を示した（表８）。
【表９】
0005992920.tif 000010
【０１１１】
これらの結果は、本発明の微小胞は、２週間間隔で３回皮下注射すると、試験されるマウス株に非依存的に、有意に、Ａｇ−特異的なＡｂとＴ細胞応答を誘導することを示す。
【０１１２】
（実施例９）共有結合した抗原を含む、ガス入りの微小胞の調製。
Ａ）ＰＬＡ２抗原の変性。
ＰＬＡ２（１ｍｇ−５４．０５ｎｍｏｌｅｓ）を、尿素の変性溶液（ＰＢＥ中で５４０．５４ｇ／Ｌ−９Ｍ）に溶解して、４ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。ＤＴＴの溶液（８ｍｇ／ｍＬ−５１．８６ｍＭ）を、尿素９Ｍ中に調製して、そして、この溶液の１０４μＬ（１００当量）を、ＰＬＡ２尿素溶液に加えた。結果として生じた混合物を、一晩（１６時間）、室温で放置した。この溶液を、ＰＢＥ中で平衡化されたスピンカラム（Ｚｅｂａ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ２ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ、＃８９８９０）を用いて回転した。溶液の最終的な量は、約３５０μＬであった。
変性ＰＬＡ２溶液は、精製の直後に用いた。
【０１１３】
Ｂ）共有結合したＰＬＡ２を有する微小胞の調製：
ＰＬＡ２を含む微小胞を、実施例１に記載された方法論により調製した。
【０１１４】
このようにして、実施例１により調製された１０ｍＬのエマルション（ＤＳＰＣ／パルミチン酸とＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミドを含む）を、１０または２０ｎｍｏｌｅｓ（１５４μＬまたは３０８μＬ）の変性ＰＬＡ２と混合した。
【０１１５】
希釈と凍結乾燥の後、後に続く使用のために、穏やかなハンドシェイキングによって、生成物を、生理食塩水（１ｍＬ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）のボリュームの中に分散した。
【０１１６】
（実施例１０）微小胞に共有結合したＰＬＡ２抗原の投与後にインビボで産生される、Ｔ細胞と抗体の応答。
本発明の、抗原を含む微小胞の、インビボでのＴ細胞とＡｂの免疫応答を産生する能力を、実施例９により調製された微小胞をＢａｌｂ／ｃマウスに皮下注射することにより評価した。
【０１１７】
実施例９により調製された微小胞を、２週間間隔でマウスに注射して、そして、血清と脾臓を３回目の注射後に収集して、ＯＶＡ−特異的な抗体とＴ細胞の存在を評価した。プロトコルは、ＯＶＡがＰＬＡ２に置き換えられたことを除き、実施例５および６に記載されたものと同じであった。
【０１１８】
共有結合したＰＬＡ２抗原微小胞の投与で得られた結果を、抗原を含まない対照微小胞の投与で得られた結果と比較した。
【０１１９】
表９に示すように、微小胞に共有結合したＰＬＡ２の３回の注射後に測定されたＳＩは、対照微小胞を受け取ったマウスで得られたものより、有意に高かった。これは、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞応答の両方に関して当てはまった（それぞれ、ｐ＝０．０２３８およびｐ＝０．０２７５）。同様に、全ＰＬＡ２−特異ＩｇＧの力価もまた、抗原を有さない微小胞の投与により得られたものに有意に勝るレベルで測定された（ｐ＝０．０２３８）。
【表１０】
0005992920.tif 000011
【０１２０】
これらの結果は、本発明の微小胞は、それらに共有結合された抗原の性質に非依存的に、強力なＴ細胞とＡｂの免疫応答を誘導するＡｇ担体としての役割を果たすことを示す。
【０１２１】
（実施例１１）抗原を有する微小胞での免疫化は、病原性細菌を意図的に感染させたマウスでの細菌負荷を減少させる。
本発明の、抗原を含む微小胞の投与により誘導される免疫応答の、ＯＶＡ発現リステリア菌での感染後の細菌負荷を減少させる能力を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。
【０１２２】
実施例１により調製された微小胞、または対照微小胞を、２週間間隔で３回、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。最後の投与の２週間後、５００００のＯＶＡ発現リステリア菌を静脈内注射して、免疫化マウスと対照マウスの両方を感染させた。マウスを、細菌感染の４日後に屠殺して、脾臓を収集して、細菌負荷を評価した。そのために、脾臓を０．１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０を含むＰＢＳ中に溶解して、４０μｍの細胞濾過を通してメッシュして（ｍｅｓｈｅｄ）、ホモジナイズされた脾臓懸濁液を得た。後者の１：１０段階希釈（Ｓｅｒｉａｌ  １：１０  ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｔｔｅｒ）を、ストレプトマイシンを含むブレインハートインフュージョン／アガロース細菌培養プレート上にアプライして、そして３７℃で３６時間、インキュベートした。コロニー形成単位をプレート上で計数して、そして脾臓あたりの細菌負荷を計算した。
【０１２３】
表１０での結果は、本発明の、ＯＶＡ抗原を含む微小胞でのマウスの免疫化は、対照微小胞を投与されたマウスと比較して、注目すべき１２０倍の倍数で、これらのマウス脾臓中で見られる細菌負荷を減少させるのに十分効果的な、特異的な免疫応答を産生することを明示し（ｐ＝０．０１５２）、部分的な保護がこの高感度モデルで生じることを示す。
【表１１】
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