(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスに投入されたサンプルと熱連通している熱制御要素を較正するための方法であって：
前記マイクロ流体デバイスにおいて、前記熱制御要素と熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供することであって、前記コンパウンドキャリブレータが少なくとも第１のアンプリコンと第２のアンプリコンを含む混合物であって；
前記熱制御要素を利用して、前記コンパウンドキャリブレータ上で熱変動を実現することにより、前記コンパウンドキャリブレータに関する熱融解曲線を生成すること；
前記第１のアンプリコンに関して前記熱融解曲線の第１の融解温度Ｔｍ１を特定し、前記第１のアンプリコンの既知の融解温度と前記熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成すること；
前記第２のアンプリコンに関して前記熱融解曲線の第２の融解温度Ｔｍ２を特定し、前記第２のアンプリコンの既知の融解温度と前記熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成すること；および
熱制御要素及び１又は複数の較正係数の測定値に基づいた熱制御要素により、加熱されたサンプルの温度を計算するために、前記第１および第２の関係に基づいて、前記熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算すること
を含む方法。
【請求項２】
前記測定値が、前記熱制御要素の抵抗である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンプリコンが、ヒトゲノムの超保存エレメントからのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アンプリコンが、合成により生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記較正係数が、一次較正方程式の係数である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記コンパウンドキャリブレータがさらに第３のアンプリコンを含み、
前記第３のアンプリコンに関して前記熱融解曲線の第３の融解温度Ｔｍ３を特定し、前記第３のアンプリコンの既知の融解温度と前記熱制御要素の第３の測定値との間の第３の関係を生成するステップをさらに含み；前記計算するステップが、前記第１、第２、および第３の関係に基づいて、前記熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記較正係数が、二次較正方程式の係数である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
特定された融解温度の数が、計算された較正係数の数よりも多い、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の融解温度Ｔｍ１が、前記コンパウンドキャリブレータ内の３種以上のアンプリコンの第１のものの融解温度にあり、前記第２の融解温度Ｔｍ２が、前記コンパウンドキャリブレータ内の前記３種以上のアンプリコンの第２のものの融解温度にあり、前記第３の融解温度Ｔｍ３が、前記コンパウンドキャリブレータ内の前記３種以上のアンプリコンの第３のものの融解温度にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
既知の周囲温度と前記熱制御要素の測定値との間の関係を特定するステップ
をさらに含み；
前記１つまたは複数の較正係数を計算するステップは、さらに、少なくとも前記第１の関係、前記第２の関係、および前記既知の周囲温度と前記熱制御要素の測定値との間の関係に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロ流体デバイスに投入されたサンプルと熱連通している熱制御要素を較正するための方法であって：
前記マイクロ流体デバイスにおいて、前記熱制御要素と熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供することであって、前記コンパウンドキャリブレータが少なくとも第１のアンプリコンと第２のアンプリコンを含む混合物であって；
前記熱制御要素を利用して熱勾配を実現し、前記コンパウンドキャリブレータに関する融解曲線を生成すること；
前記第１のアンプリコンに関して前記融解曲線の第１の融解温度Ｔｍ１を特定し、前記第１のアンプリコンの既知の融解温度と前記熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成すること；
前記第２のアンプリコンに関して前記融解曲線の第２の融解温度Ｔｍ２を特定し、前記第２のアンプリコンの既知の融解温度と前記熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成すること；および
熱制御要素及び１又は複数の較正係数の測定値に基づいた熱制御要素により、加熱されたサンプルの温度を計算するために、少なくとも前記第１および第２の関係に基づいて、前記熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算すること
を含む方法。
【請求項１２】
既知の周囲温度と前記熱制御要素の第３の測定値との間の第３の関係を特定することをさらに含み；
前記１つまたは複数の較正係数を計算するステップは、さらに、少なくとも前記第３の関係に基づく、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体の開示が本明細書に組み込まれている、２０１０年８月３１日に出願した米国仮特許出願第６１／３７８，５９１号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、熱センサを較正するためのシステムおよび方法に関する。より具体的には、本発明の態様は、較正熱センサと併せて使用される熱センサの温度と電気特性との間の関係を計算するためにコンパウンドキャリブレータ（compound calibrator）を使用する、システムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学的、生物学的、またはその他の反応を行うためのデバイス（例えば、ＤＮＡ分子のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を行うためのマイクロ流体デバイス、または、患者サンプルでＰＣＲを行い次いで高分解能融解分析を行うことにより遺伝子型を特定するためにこのＰＣＲ生成物を使用するマイクロ流体分子診断プラットフォーム）は、反応物を所望の熱プロファイルに供するのに使用される１つまたは複数の熱制御要素をしばしば特徴とする。ＰＣＲ増幅に関する記述と、ＰＣＲ増幅および熱融解分析のために熱制御要素を含んだ１つの可能性あるマイクロ流体デバイスの一例が、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１２／１６５，０４３号に提示されている。
【０００４】
そのようなマイクロ流体デバイスの多くの適用例（例えば、ＰＣＲおよび／または熱融解分析）において、それらデバイスの熱制御要素は、精密に較正されなければならない。即ち、熱制御要素の温度と熱制御要素の電気特性との間の対応関係は、精密に決定されなければならない。例えば、抵抗温度検出器の場合、温度と抵抗との間の対応関係は、精密に決定されなければならない。追加のタイプの熱制御要素は、白金抵抗加熱器、サーミスタ、ダイオード温度センサ、熱電対、または任意のその他の適切な温度測定デバイスを含むことができる。温度に対応する熱制御要素の追加の電気特性は、要素のキャパシタンスもしくはインダクタンス、周波数、パルス幅、または信号の大きさ、または当技術分野で公知のその他のセンサ特性を含むことができる。熱制御要素を較正する方法は、較正方程式を定める係数の系列またはルックアップ表、即ち、熱制御要素の温度を電気特性に関連付けるルックアップ表または方程式を生成することをしばしば含む。
【０００５】
較正は、正確な測定を得るために第三者試験所にデバイスを送り、係数の系列またはルックアップ表を生成することによって行うことができ；しかしこの手順は、一般に費用が高く時間がかかる。さらに、多くのデバイス（例えば、多くの一般的なマイクロ流体デバイス）には、多くの熱制御要素（例えば、何ダースもの、または何百もの加熱器およびセンサ）がある場合もあり、そのそれぞれは、それ自体の精密な較正を必要とし、第三者による較正を非現実的なものにする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、正確であり、ダウンタイムを短縮し、高いスループットを維持することができる、熱センサのロバスト（robust）な較正が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、熱制御要素を較正するための方法を含む。この方法は、（ａ）熱制御要素と熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供するステップ、（ｂ）熱制御要素を利用して、熱変動を実現することにより、コンパウンドキャリブレータの熱応答プロファイルを生成するステップ、（ｃ）熱応答プロファイルの第１のフィーチャを特定し、第１のフィーチャの既知の温度と熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成するステップ、（ｄ）熱応答プロファイルの第２のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成するステップ、および（ｅ）第１および第２の関係に基づいて、熱制御要素の１つまたは複数の較正係数を計算するステップを含んでいてもよい。
【０００８】
他の実施形態では、熱応答プロファイルは、熱融解曲線であってもよい。さらに他の実施形態では、第１のフィーチャがコンパウンドキャリブレータの第１の融解温度に対応していてもよく、第２のフィーチャがコンパウンドキャリブレータの第２の融解温度に対応していてもよい。その他の実施形態では、測定値は、熱制御要素の抵抗であってもよい。
【０００９】
その他の実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、核酸の２種以上のアンプリコンの混合物であってもよい。アンプリコンは、例えばヒトゲノムの超保存エレメントであってもよい。他の実施形態では、アンプリコンは、合成により生成されてもよい。さらに別の実施形態では、較正係数は、一次較正方程式の係数であってもよい。さらに別の実施形態では、第１のフィーチャが、コンパウンドキャリブレータ内の２種以上のアンプリコンの第１のものの融解温度にあってもよく、第２のフィーチャが、コンパウンドキャリブレータ内の２種以上のアンプリコンの第２のものの融解温度にあってもよい。
【００１０】
他の実施形態では、方法は、熱応答プロファイルの第３のフィーチャを特定すると共に、第３のフィーチャの既知の温度と熱制御要素の第３の測定値との間の第３の関係を生成するステップをさらに含む。この実施形態では、１つまたは複数の較正係数を計算するステップが、前記第１、第２、および第３の関係に基づいて、前記熱制御要素の１つまたは複数の較正係数を計算することを含む。この方法の実施形態では、較正係数が、二次較正方程式の係数であってもよい。この方法の別の実施形態では、第１のフィーチャが、コンパウンドキャリブレータ内の３種以上のアンプリコンの第１のものの融解温度にあってもよく、第２のフィーチャが、コンパウンドキャリブレータ内の３種以上のアンプリコンの第２のものの融解温度にあってもよく、第３のフィーチャが、コンパウンドキャリブレータ内の３種以上のアンプリコンの第３のものの融解温度にあってもよい。別の実施形態では、第１、第２、および第３のフィーチャの１つが、コンパウンドキャリブレータ内の第１のアンプリコンの融解温度にあってもよく、第１、第２、および第３のフィーチャのその他２つが、コンパウンドキャリブレータの第２のアンプリコンの融解温度にあってもよい。
【００１１】
別の実施形態では、方法は、既知の周囲温度と熱制御要素の測定値との間の第３の関係を特定する追加のステップを、さらに含んでいてもよい。この実施形態では、１つまたは複数の較正係数を計算するステップは、さらに、少なくとも第１、第２、および第３の関係に基づいていてもよい。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、熱デバイス内の複数の熱制御要素を較正するための方法を含む。この方法は、（ａ）第１の熱ゾーンにコンパウンドキャリブレータを提供するステップであって、第１の熱ゾーンが前記複数の熱制御要素の第１のものに熱接触しているステップ、（ｂ）第１の熱制御要素を利用して熱変動を実現し、コンパウンドキャリブレータの第１の熱応答プロファイルを生成するステップ、（ｃ）第１の熱応答プロファイルの第１のフィーチャを特定し、第１のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成するステップ、（ｄ）第１の熱応答プロファイルの第２のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成するステップ、（ｅ）少なくとも第１および第２の関係に基づいて、第１の熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算するステップ；および（ｆ）第２の熱ゾーンでコンパウンドキャリブレータを使用してステップａ〜ｅを繰り返すステップであって、第２の熱ゾーンが第２の熱制御要素に熱接触しているステップを含んでいてもよい。
【００１３】
他の実施形態では、方法は、熱デバイス内の追加の各熱要素ごとに、ステップａ〜ｅを繰り返すことを含んでいてもよい。他の態様では、熱デバイスは、複数の熱制御要素と熱連通しているマイクロ流体チャネルであってもよい。
【００１４】
他の実施形態では、第１の熱ゾーンは、第２の熱ゾーンから熱的に隔離されていてもよい。第１の熱ゾーンおよび第２の熱ゾーンは、並行して較正されてもよい。別の実施形態では、第１の熱ゾーンおよび第２の熱ゾーンは、順次較正されてもよい。さらに別の実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、核酸の２種以上のアンプリコンの混合物であってもよい。
【００１５】
本発明の別の態様は、熱デバイス内の複数の熱制御要素を較正するための方法である。この態様において、方法は、（ａ）第１の熱ゾーンにコンパウンドキャリブレータを提供するステップであって、第１の熱ゾーンが前記複数の熱制御要素の第１のものに熱接触しているステップ、（ｂ）第１の熱制御要素を利用して熱変動を実現し、コンパウンドキャリブレータの第１の熱応答プロファイルを生成するステップ、（ｃ）第１の熱応答プロファイルの第１のフィーチャを特定し、前記第１のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成するステップ、（ｄ）第１の熱応答プロファイルの第２のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成するステップ、（ｅ）既知の周囲温度と第１の熱制御要素の測定値との間の第３の関係を特定するステップ、（ｆ）少なくとも第１、第２、および第３の関係に基づいて、第１の熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算するステップ、および（ｇ）第２の熱ゾーンでコンパウンドキャリブレータを使用してステップａ〜ｆを繰り返すステップであって、第２の熱ゾーンが第２の熱制御要素に熱接触しているステップを含んでいてもよい。
【００１６】
別の実施形態では、（ａ）熱制御要素と熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供するステップ、（ｂ）熱制御要素を利用して熱勾配を実現するステップ、（ｃ）コンパウンドキャリブレータの融解曲線を生成するステップ、（ｄ）融解曲線の第１のフィーチャを特定し、第１のフィーチャの既知の温度と熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成するステップ、（ｅ）融解曲線の第２のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成するステップ、および（ｆ）少なくとも第１および第２の関係に基づいて、熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算するステップを含んでいてもよい、熱制御要素を較正するための方法が提供される。
【００１７】
この実施形態では、方法は、既知の周囲温度と熱制御要素の第３の測定値との間の第３の関係を特定することをさらに含んでいてもよく、１つまたは複数の較正係数を計算するステップは、さらに、少なくとも第３の関係に基づいている。
【００１８】
他の実施形態では、（ａ）複数の熱制御要素の第１のものに熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供するステップ、（ｂ）第１の熱制御要素を利用して熱勾配を実現し、コンパウンドキャリブレータの第１の融解曲線を生成するステップ、（ｃ）第１の融解曲線の第１のフィーチャを特定し、第１のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第１の測定値との間の第１の関係を生成するステップ、（ｄ）第１の融解曲線の第２のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と第１の熱制御要素の第２の測定値との間の第２の関係を生成するステップ、（ｅ）少なくとも第１および第２の関係に基づいて、第１の熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算するステップ、（ｆ）前記複数の熱制御要素の第２のものに熱接触しているコンパウンドキャリブレータを提供するステップ、（ｆ）第２の熱制御要素を利用して熱勾配を実現し、コンパウンドキャリブレータの第２の融解曲線を生成するステップ、（ｇ）第２の融解曲線の第３のフィーチャを特定し、第３のフィーチャの既知の温度と第２の熱制御要素の第３の測定値との間の第３の関係を生成するステップ、（ｈ）第２の融解曲線の第４のフィーチャを特定し、第２のフィーチャの既知の温度と第２の熱制御要素の第４の測定値との間の第４の関係を生成するステップ、および（ｉ）少なくとも第３および第４の関係に基づいて、第２の熱制御要素に関する１つまたは複数の較正係数を計算するステップを含んでいてもよい、マイクロ流体チャネル内の複数の熱制御要素を順次較正するための方法が提供される。
【００１９】
本明細書に組み込まれかつ本明細書の部分を形成する添付図面は、本発明の様々な実施形態を例示する。図面において、同様の符号は、同一のまたは機能的に類似する要素を示す。さらに、（１つまたは複数の）符号の最も左の桁は、符号が最初に現れた図面を特定する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の方法と併せて使用することができる、マイクロ流体デバイスを示す図である。
【図２】本発明の方法と併せて使用することができるマイクロ流体デバイスを使用するためのシステムの機能ブロック図である。
【図３】本発明の実施形態による、コンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセスを示す図である。
【図４】本発明の実施形態に関連して生成することができる、コンパウンドキャリブレータの例示的な融解曲線を示す図である。
【図５】図４の融解曲線から生成された、コンパウンドキャリブレータの融解曲線の微分プロットである。
【図６】初期較正係数で生成された融解曲線の第１の微分プロットと、較正の基準として使用された既知の融解曲線を示す第２のプロットを示す図である。
【図７】本発明の実施形態でコンパウンドキャリブレータとして使用することができる２つの融解フィーチャを備えた、アンプリコンの野生型、ヘテロ接合、およびホモ接合変異体遺伝子型に関する融解曲線の、第１の微分プロットを示す図である。
【図８】本発明の態様で使用することができる２つの異なるコンパウンドキャリブレータに関する融解曲線および微分プロットを示す図である。
【図９】本発明の実施形態によるコンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセスを示す図である。
【図１０】本発明の実施形態によるコンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセスを示す図である。
【図１１】本発明の態様による、較正サンプルが第１の熱ゾーンを占有した状態にある２つの熱ゾーンを備えた、マイクロ流体チャネルの概略図である。
【図１２】本発明の態様による、較正サンプルが第２の熱ゾーンを占有した状態にある２つの熱ゾーンを備えた、マイクロ流体チャネルの概略図である。
【図１３】本発明の態様による、較正サンプルが両方の熱ゾーンを占有した状態にある２つの熱ゾーンを備えた、マイクロ流体チャネルの概略図である。
【図１４】本発明の実施形態による、較正前にマイクロ流体デバイスで得られた熱融解曲線および微分プロットを示す図である。
【図１５】本発明の実施形態による、較正の後にマイクロ流体デバイスで得られた熱融解曲線および微分プロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
一態様において、本発明は、単一のコンパウンドキャリブレータを使用してインサイチュで熱制御要素を較正するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイス上で熱制御要素を較正するコンパウンドキャリブレータを使用する。非限定的な実施形態で、コンパウンドキャリブレータは、加熱したときに複数のフィーチャ（例えば、最大値、最小値、変曲点、線形領域など）を有する熱応答プロファイルをもたらす任意の適切な溶液の、液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流とすることができる。
【００２２】
本発明の上述およびその他の態様およびフィーチャ、ならびに本発明の様々な実施形態の構造および適用例について、添付図面を参照しながら以下に記述する。
【００２３】
図１は、本発明の態様を実施するのに使用してもよい、マイクロ流体デバイス１００を示す。その他のデバイス（その他のマイクロ流体デバイスを含む）を本発明により使用してもよいことが、当業者に理解されよう。具体的には、本発明の態様は、その他の分子生物学的機器、例えばＰＣＲ機器または熱較正を必要とするその他の機器などに使用することができる。マイクロ流体デバイスの例示的な実施形態では、マイクロ流体デバイス１００は、基板１０１の端から端まで延びるいくつかのマイクロ流体チャネル１０２を含む。各チャネル１０２は、１つまたは複数の入口ポート１０３（例示される実施形態は、チャネル１０２当たり２つの入口ポート１０３を示す）と、１つまたは複数の出口ポート１０５（例示される実施形態は、チャネル１０２当たり１つの出口ポート１０５を示す）とを含む。例示的な実施形態において、各チャネルは、ＰＣＲ熱ゾーン１０４内を延びる第１の部分（以下に記述される）と、熱融解ゾーン１０６内を延びる第２の部分（以下に記述される）とに細分されていてもよい。
【００２４】
実施形態では、マイクロ流体デバイス１００はさらに、マイクロ流体チャネル１０２に関連付けられた薄膜抵抗加熱器１１２の形をした、熱制御要素を含む。ある非限定的な実施形態では、薄膜抵抗加熱器１１２は、その抵抗がそれぞれの温度を制御するために測定される白金抵抗加熱器であってもよい。図１に示される実施形態では、各加熱器要素１１２は、２つの加熱器セクション：ＰＣＲゾーン１０４内のＰＣＲ加熱器セクション１１２ａと、熱融解ゾーン１０６内の熱融解加熱器セクション１１２ｂとを含む。
【００２５】
マイクロ流体デバイス１００は、様々な薄膜加熱器１１２ａおよび１１２ｂに接続された複数の加熱器電極１１０を含んでいてもよい。非限定的な実施形態では、加熱器電極１１０は、ＰＣＲセクション・リード１１８、１つまたは複数のＰＣＲセクション共通リード１１６ａ、熱融解セクション・リード１２０、および１つまたは複数の熱融解セクション共通リード１１６ｂを含んでいてもよい。本発明の一実施形態によれば、個別のＰＣＲセクション・リード１１８が、薄膜ＰＣＲ加熱器１１２ａのそれぞれに接続され、個別の熱融解セクション・リード１２０が、薄膜熱融解加熱器１１２ｂのそれぞれに接続されている。
【００２６】
図２は、マイクロ流体デバイス１００などのマイクロ流体デバイスを使用するための、例示的なシステム２００の機能ブロック図を示す。例示的な実施形態では、ＤＮＡサンプルが、調製ステージ２０２からマイクロ流体チップ１００に投入される。調製ステージ２０２は、サンプル２０４を調製するための、および１種または複数の試薬２０６をサンプルに添加するための、適切なデバイスを含んでいてもよい。サンプルがマイクロ流体チップ１００に、例えば入口ポート１０３で投入されると、サンプルはチャネル１０２内を流れてＰＣＲゾーン１０４に至り、そこでＰＣＲが行われる。即ち、以下により詳細に説明されるように、サンプルがＰＣＲゾーン１０４内を通ってチャネル１０２内に流れるにつれ、サンプルは、ＰＣＲ温度サイクルに複数回曝されるようになり、ＰＣＲ増幅が行われる。次に、サンプルは熱融解ゾーン１０６に流入し、そこで高分解能熱融解プロセスが引き起こされる。マイクロ流体チップ１００へのサンプルの流入は、流れ制御器２０８によって制御することができる。一実施形態では、流れ制御器は、１つまたは複数の圧力モニタ・デバイス（例えば、ＭＥＭＳ圧力センサ）と、１つまたは複数のポンピング要素（例えば、蠕動ポンプ）とを含んでいてもよい。制御システム２５０は、例えば、流れ制御器２０８、ＰＣＲゾーン温度制御器２１０、ＰＣＲ流れモニタ２１８、熱融解ゾーン温度制御器２２４、およびゾーン蛍光測定システム２３２を含んでいてもよい。
【００２７】
ＰＣＲゾーン１０４の温度は、ＰＣＲゾーン温度制御器２１０によって制御することができる。プログラム式コンピュータまたはその他のマイクロプロセッサであってもよいＰＣＲゾーン温度制御器２１０は、温度センサ２１４（例えば、ＲＴＤもしくは薄膜サーミスタ、または薄膜熱電対温度計など）により決定された温度に基づいて、加熱器デバイス２１２（例えば、ＰＣＲ加熱器１１２ａ）に信号を送信する。このように、ＰＣＲゾーン１０４の温度は、所望のレベルで維持することができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＣＲゾーン１０４は、ＰＣＲゾーン温度制御器２１０によって制御されてもよい冷却デバイス２１６によって、冷却されてもよい（例えば、チャネル温度を９２℃から５５℃まで急速に低下させるため）。例示的な実施形態では、冷却デバイス２１６は、例えばペルチェ素子、ヒート・シンク、または強制対流空冷デバイスとすることができる。
【００２８】
マイクロ流体チャネル１０２を通るサンプルの流れは、ＰＣＲゾーン流れモニタ・システム２１８によって測定することができる。一実施形態では、流れモニタ・システムは、参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願第１１／５０５，３５８号に例示されている、蛍光色素拡散撮像および追跡システムとすることができる。本発明の一実施形態によれば、ＰＣＲゾーンのチャネルは励起デバイス２２０により励起することができ、サンプルから発せられた蛍光は、検出器デバイス２２２により検出することができる。撮像システムの部分を形成する、１つの可能性ある励起デバイスおよび検出デバイスの例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／６０６，００６号および第１１／５０５，３５８号に例示される。
【００２９】
熱融解ゾーン温度制御器２２４、例えばプログラム式コンピュータまたはその他のマイクロプロセッサは、熱融解ゾーン１０６の温度を制御するのに使用することができる。ＰＣＲゾーン温度制御器２１０の場合のように、熱融解ゾーン温度制御器２２４は、例えばＲＴＤまたは薄膜熱電対とすることができる温度センサ２２８により測定された温度に基づいて、加熱構成要素２２６（例えば、熱融解加熱器１１２ｂ）に信号を送信する。さらに、熱融解ゾーン１０６は、独立して、冷却デバイス２３０によって冷却されてもよい。例示的な実施形態では、冷却デバイス２３０は、例えばペルチェ素子、ヒート・シンク、または強制対流空冷デバイスとすることができる。サンプルの蛍光のサインは、熱融解ゾーン蛍光測定システム２３２により測定することができる。蛍光測定システム２３２は、励起デバイス２３４によりサンプルを励起し、サンプルの蛍光は、検出デバイス２３６によって検出することができる。１つの可能性ある蛍光測定システムの一例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／６０６，００６号および第１１／５０５，３５８号に例示される。
【００３０】
本発明の態様によれば、薄膜加熱器１１２は、加熱器としてかつ温度検出器として機能してもよい。したがって本発明の一実施形態では、加熱要素２１２および２２６と温度センサ２１４および２２８の機能性は、薄膜加熱器１１２によって実現することができる。
【００３１】
一実施形態では、システム２００は、薄膜加熱器１１２ａおよび／または１１２ｂに電力を送信し、それによって、ＰＣＲゾーン温度制御器２１０または熱融解ゾーン温度制御器２２４により送信された制御信号に基づいて、加熱器を温める。制御信号は、例えば、パルス幅変調（ＰＷＭ）制御信号とすることができる。加熱器２１２を制御するのにＰＷＭ信号を使用する利点は、ＰＷＭ制御信号により、必要とされる様々な温度の全てに関して、加熱器の両端の同じ電圧電位を使用してもよいことである。別の実施形態では、制御信号は、振幅変調または交流電流を利用することができる。いくつかの実施形態では、大きな電圧ステップではなく連続的で適度な電圧変化によってスルーレート限界が回避されセトリング時間が改善されるので、加熱器２１２を制御するよう振幅変調された制御信号を使用することが有利と考えられる。振幅変調に関するさらなる考察は、参照により本明細書に組み込まれている２０１０年６月２９日出願の米国特許出願第１２／８２５，４７６号に見出すことができる。いくつかの実施形態では、加熱器に関する所望の温度には、制御信号のデューティ・サイクルを変化させることによって到達する。例えば、ＰＣＲ加熱器内で９５℃を実現するための制御信号のデューティ・サイクルは約５０％と考えられ、ＰＣＲ加熱器内で７２℃を実現するための制御信号のデューティ・サイクルは約２５％と考えられ、ＰＣＲ加熱器内で５５℃を実現するための制御信号のデューティ・サイクルは約１０％と考えられる。
【００３２】
マイクロ流体デバイス１００およびシステム２００は、本発明の態様と併せて使用することができる。例えば、マイクロ流体デバイス１００は、本発明の態様により、コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流を使用してマイクロ流体デバイス１００の加熱器１１２を較正するために、上述のシステム２００と関連付けて使用することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、熱制御要素の較正は、較正方程式、即ち熱制御要素の温度と測定値との間の関係をモデル化する方程式の係数を決定することを含むことができる。実施形態では、その測定値が、熱制御要素の電気特性であってもよい。例えば抵抗加熱器１１２に関する較正方程式は、加熱器１１２の温度と加熱器１１２の抵抗との間の関係をモデル化してもよい。この実施形態では、較正方程式は、方程式１に示されるような線形関係をモデル化してもよい：
Ｔ＝ｋ０＋ｋ１Ｒ      方程式１
この場合、Ｔは熱制御要素の温度であり、Ｒは熱制御要素の抵抗であり、ｋ０およびｋ１は較正により決定される定数（即ち、係数）である。２つの較正係数は、例えば２つの既知の温度（Ｔ１およびＴ２）で抵抗Ｒを測定することにより決定することができる。本発明のいくつかの態様では、これらの測定値は、コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流と熱接触している熱制御要素（例えば、加熱器１１２）を加熱し（例えば、コンパウンドキャリブレータが、加熱器１１２に対応するマイクロ流体チャネル１０２内にある間）、コンパウンドキャリブレータの熱応答プロファイルの２つ以上のフィーチャに一致する温度で熱制御要素の抵抗を測定する（例えば、加熱器１１２の抵抗を測定する）ことによって、得ることができる。
【００３４】
その他の実施形態では、較正方程式は、電流、電位、印加電力、抵抗率、導電率、またはその他の関連ある量などの、その他の電気的因子の間の関係をモデル化してもよい。いくつかの態様では、測定値は、熱制御要素の温度に関連する熱制御要素の独立して制御された態様であってもよい。その他の態様では、測定値は、熱制御要素の温度に関連した任意の因子にすることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、較正方程式は、より多くの決定される係数を含有していてもよい。例えば、測定値が抵抗である場合、いくつかの較正方程式は、方程式２に示されるような二次的関係をモデル化することができる：
Ｔ＝ｋ０＋ｋ１Ｒ＋ｋ２Ｒ２      方程式２
この場合、その熱応答プロファイルに３つ以上のフィーチャを有するコンパウンドキャリブレータは、係数の全てをより正確に決定するのに好ましい。さらに当業者なら、この手法を、方程式３を使用して、ｎ以上のフィーチャを有するコンパウンドキャリブレータにまで拡張してもよいことを理解するであろう：
Ｔ＝ｋ０＋ｋ１Ｒ＋ｋ２Ｒ２＋．．．ｋｎ−１Ｒｎ−１      方程式３
さらに、いくつかの実施形態では、係数に関するより正確な値は、決定される係数がある場合よりも多くのフィーチャを有する（即ち、係数がある場合よりも熱制御要素の温度と抵抗との間でより多くの対応を決定する）コンパウンドキャリブレータを利用することによって、得ることができる。得られる優決定系は、例えば最小二乗法を使用して解くことができる。
【００３６】
図３は、本発明の実施形態による、コンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセス３００を示す。以下にさらに詳細に説明するように、プロセス３００は、コンパウンドキャリブレータを含有する単一の液滴、プラグ、セグメント、またはスラグで較正方程式の係数を決定するのに使用することができる。あるいは、プロセス３００は、較正物質の連続流で較正方程式の係数を決定するのに使用することができる。
【００３７】
プロセス３００は、インサイチュ熱応答プロファイルがコンパウンドキャリブレータに関して得られるステップ３０２で、開始することができる。本明細書で使用される「熱応答プロファイル」は、熱変動に曝される溶液に関連した従属変数の分析を指し、即ち溶液の温度と従属変数との間の関係の分析を指す。いくつかの実施形態では、熱応答プロファイルは、「融解曲線」であってもよく、即ち蛍光の量と溶液の温度との間の関係を決定するための溶液の蛍光融解分析である。その他の可能性ある熱応答プロファイルは、コンパウンドキャリブレータの吸光度、透過率、反射率、または放射率に基づいてもよい。いくつかの実施形態では、そのような熱応答プロファイルを生成することは、マイクロ流体チップ（例えば、マイクロ流体チップ１００）をマイクロ流体チップでの反応を制御するためのシステム（例えば、システム２００）に投入すること、コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流をチップに（例えば、マイクロ流体チャネル１０２）投入すること、および熱制御要素の温度をモニタしながらかつコンパウンドキャリブレータの従属変数（例えば、融解曲線が得られる場合は蛍光）をモニタしながら、コンパウンドキャリブレータ（例えば、加熱器１１２）と熱連通している熱制御要素を制御してコンパウンドキャリブレータを加熱することを含むことができる。
【００３８】
一実施形態によれば、較正係数の初期推定値（例えば、それぞれが方程式１のｋ０およびｋ１の推定値であるｋ０’およびｋ１’）を使用して、初期熱変動に関して熱制御要素を制御することができる。熱変動は、ある時間にわたる熱制御要素の温度の任意の変動であってもよい。そのような熱変動の一例は、熱勾配（例えば、コンパウンドキャリブレータ熱応答プロファイルのフィーチャに対応した温度を含む温度範囲で、例えば１秒当たり０．５℃で熱制御要素を加熱すること）である。熱勾配中、較正プラグ（例えば）の従属変数（例えば、蛍光強度）および熱制御要素の測定値をモニタして、熱応答プロファイルを生成する。図４は、そのような熱応答プロファイルの例であり、初期推定較正係数（例えば、ｋ０’およびｋ１’）により推定された温度の値を使用して、温度（即ち、Ｆ対Ｔ）の関数として未処理の蛍光をプロットした融解曲線である。いくつかの実施形態では、熱応答プロファイルは、従属変数の未処理の測定値から誘導されたデータおよび温度データを使用して表示してもよい。例えば図５は、温度の関数として、温度に対する蛍光の微分を示す（例えば、−（δＦ／δＴ）対Ｔ）、いわゆる「微分プロット」を例示する。いくつかの実施形態では、微分プロットは、Ｓａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタを使用して生成することができる。図４および５に示される融解曲線は、２種のアンプリコンの混合物を含有するコンパウンドキャリブレータ（即ち、２つのフィーチャ融解曲線を有するコンパウンドキャリブレータ）に該当する。上述のように、その他の実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、３種以上のアンプリコンを有していてもよく、またはそうでない場合には、３つ以上のフィーチャを有する熱応答プロファイルを有していてもよい。
【００３９】
元のプロセス３００を参照すると、ステップ３０４で、各フィーチャの見掛けの温度（例えば、各アンプリコンにそれぞれ対応する見掛けの融解温度Ｔｍ１’およびＴｍ２’）は、ステップ３０２で生成されるインサイチュ熱応答プロファイルから明らかにされる。いくつかの実施形態では、見掛けの温度は、ピーク・ピッキングを使用して微分プロットから決定することができる。その他の実施形態では、見掛けの温度は、微分プロットと既知のテンプレート（即ち、予測される熱応答プロファイル）とを各フィーチャごとに相互相関させることによって、または熱応答プロファイルを所定のテンプレートに一致するようにシフトさせもしくは延伸することによって、決定することができる。図６は、同じコンパウンドキャリブレータに関する微分プロット・テンプレートと比較した、ステップ３０２により得られたような微分プロットの一例を示す。相関用のテンプレートは、第三者から、理論予測（例えば、最近傍熱力学計算）から、または類似の機器、同じ機器、もしくは「ゴールド・スタンダード」の機器に関するトレーニング・セットから得てもよい。いくつかの実施形態では、類似する機器で作成されたテンプレートを使用することにより、光退色や温度逸脱などの影響（artifact）は確実に、コンパウンドキャリブレータとテンプレートとの間で一致する。
【００４０】
ステップ３０６では、初期較正係数ｋ０’およびｋ１’を使用して、各フィーチャの見掛けの温度（例えば、見掛けの融解温度Ｔｍ１’およびＴｍ２’）を、各フィーチャに対応する測定値Ｍｍ１およびＭｍ２に変換する（例えば、測定された値が抵抗の場合、測定された値Ｍｍ１およびＭｍ２は、それぞれ、コンパウンドキャリブレータの融解転移での熱制御要素の抵抗Ｒｍ１およびＲｍ２であってもよい）。
【００４１】
ステップ３０８で、各フィーチャに対応する測定値をそれぞれ、較正係数（例えば、方程式１のｋ０およびｋ１）を決定するために、各フィーチャの既知の真の温度に一致させる（例えば、コンパウンドキャリブレータの既知の融解転移にそれぞれ対応する真の融解温度Ｔｍ１およびＴｍ２）。熱応答プロファイルのフィーチャの数が較正係数の数以上である限り、測定された値と既知の真の温度との間の関係（例えば、（Ｍｍ１，Ｔｍ１）および（Ｍｍ２，Ｔｍ２））を使用して連立方程式を解くことにより較正係数を決定することができる。
【００４２】
本発明で有用なコンパウンドキャリブレータは、温度変化に曝されたときに物理変化を受ける任意の化合物または任意の化合物の混合物であってもよい。一実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、熱変動に曝されたときに変性（即ち、「融解」）する核酸であってもよい。コンパウンドキャリブレータは、２つの融解フィーチャを有する単一の核酸であってもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願第１２／７５９，４１５号の図１９〜２２に示されるような、ＭＴＨＦＲ  ６６７遺伝子を含有する核酸）。その他の化合物、例えばタンパク質、タンパク質複合体、または加熱されたときに熱遷移を受けるその他の化合物および複合体などを、コンパウンドキャリブレータとして使用してもよい。上述のように、いくつかの実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、核酸の２種以上のアンプリコンの混合物を含有していてもよい。この実施形態におけるアンプリコンは、ヒトゲノムを含めた任意の生物のゲノムを形成してもよい。他の実施形態では、コンパウンドキャリブレータ内のアンプリコンは、ヒトゲノムのいわゆる「超保存」領域（いわゆる超保存エレメント、例えば、その開示全体が本明細書に組み込まれている２０１０年８月３１日出願の米国特許出願第６１／３７８，９２７号および米国特許出願第１３／２２３，２５８号参照）を形成することもできる。
【００４３】
さらに、別の実施形態では、１種または複数のアンプリコンが完全に合成されたものであってもよく、または任意の生物のゲノムに見出されないものであってもよい。いくつかの実施形態では、（１種または複数の）アンプリコン内のＧＣおよびＡＴ結合の数を変化させてその融解温度を変化させることにより、融解特性を細かく設計製作することができるので、合成アンプリコンが好ましいと考えられる。さらに、塩基対の数は、融解温度および融解特性が変化するように設計することができる。さらなる欠失およびその他の変化を使用して融解特性を変化させることができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、アンプリコン領域から離れたプローブ領域によるその他のアッセイまたはスナップバックに基づいてもよい。そのようなコンパウンドキャリブレータの例示的な実施形態を図７に示すが、この図は、野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合（ＨＴ）、およびホモ接合変異体（ＨＭ）遺伝子型の、時間に対する−ｄＦ／ｄＴのプロットを示している。図７は、第１の融解温度に該当する４０秒から６０秒の間のプローブに関連した融解フィーチャを示す。これは、コンパウンドキャリブレータの第１のフィーチャを形成することができる。８５秒付近で第２のアンプリコンに該当する第２のフィーチャも存在する。このグラフに示される野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合（ＨＴ）、およびホモ接合変異体（ＨＭ）遺伝子型は全て、それぞれが２つの融解フィーチャを有するので、適切なコンパウンドキャリブレータにすることができる。さらに、これらの例はヒトゲノムＤＮＡに基づくが、異なるテンプレート（合成ＤＮＡテンプレートを含む）も適切と考えられる。
【００４５】
ある実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、多くの容易に区別可能なフィーチャを有する熱応答プロファイルをもたらすことになる。さらに、コンパウンドキャリブレータの熱応答プロファイルは、好ましくは非常に反復可能になる。コンパウンドキャリブレータは、好ましくは、測定機器に固有のバックグラウンドおよびノイズ・レベルに比べて強いフィーチャ信号を示す。例えば、熱融解データが熱応答プロファイルに使用される場合、個々の構成成分の融解転移は、好ましくは、融解のない温度に起因する蛍光の減衰よりも非常に大きく、そのためソフトウェアはバックグラウンド・ノイズから融解転移を検出することが可能になる。また、個々の構成成分の融解転移は、好ましくは、検出器限界に起因する蛍光のランダムな変動に比べて大きく、そのためソフトウェアはノイズから真のフィーチャを区別することが可能になる。
【００４６】
図８は、熱応答プロファイルに強力なフィーチャを有することの望ましさを示す。図８は、２つの異なるコンパウンドキャリブレータの融解曲線および微分プロットである。左側の曲線（ヒトゲノムから増幅したＤＮＡの混合物に基づく）は、システムのノイズおよびバックグラウンドとは容易に識別される２つの強力なフィーチャ８０２および８０４を示す。右側の曲線（オリゴヌクレオチドの混合物に基づく）は、バックグラウンドに比べて小さいフィーチャ信号８０６および８０８を示し、ノイズの多い微分プロットを表す。右側の微分曲線にピーク・ピッキングを使用することにした場合、見掛けのＴｍの大きな誤差が、ノイズの多いピークから得られる可能性がある。
【００４７】
隣接するフィーチャの間の相対的な関係は、較正の精度に影響を及ぼす可能性もある。いくつかの実施形態では、１つのフィーチャが非常に小さい場合、より大きなフィーチャの次に区別することは難しくなる可能性がある。特に、より小さいフィーチャは、バックグラウンドの一部であるかのように見えることになる。ある実施形態では、化合物の混合物を含有するコンパウンドキャリブレータ内の構成成分の濃度は、フィーチャを区別するのがより容易になるように調節することができる。例えば２種のアンプリコンの濃度は、フィーチャ・サイズを同様にするように調節することができる。いくつかの実施形態では、構成成分のモル濃度が固定された比であってもよい。その他の実施形態では、モル濃度は、例えば、コンパウンドキャリブレータ内の第１および第２の化合物の間で等しくしてもよい。
【００４８】
上述のように、いくつかの実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、３つまたは４つまたはそれ以上のフィーチャを有する熱応答プロファイルをもたらすことができる。３つのフィーチャの場合、二次的関係（３つの較正係数）を容易に決定することができる。４つのフィーチャでは、三次的関係（４つの較正係数）を容易に決定することができる。この同じ概念は、より高い次数にも拡張することができる。さらに、いくつかの実施形態では、較正方程式は多項式である必要はなく、代わりに、例えばべき法則、指数、対数、および三角関数の関係などのいくつかの異なる数学的関係に従うことができる。上記にて論じたように、３つまたは４つまたはそれ以上のフィーチャでは、追加のフィーチャを使用することにより、より多くの較正係数を使用することなく較正の品質を改善することができる（即ち、系を優決定（over-determined）することができる）。例えば、既知の３点をもたらす３つのフィーチャの場合、線形較正（２つの係数）を、最小二乗法による当てはめを使用して決定することができる。また、その他のデータの当てはめ技法は、例えば通常および全体最小二乗当てはめ法も共に含めて、当業者に明らかにされるように使用することができる。その他の例には、絶対最大差を最小限に抑えもしくは絶対差の和を最小限に抑えるような方法（例えば、最小絶対偏差法）またはその他のロバスト回帰技法が含まれる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、熱制御要素は、熱応答プロファイルのフィーチャに基づいて決定された１つまたは複数の温度に加え、周囲温度（即ち、室温）を使用して較正することができる。図９は、本発明の実施形態によるコンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセス９００を示す。プロセス９００のステップ９０２、９０４、９０６、および９０８は、それぞれ、上述のプロセス３００のステップ３０２、３０４、３０６、および３０８に実質的に等しい。さらに、プロセス９００は、熱制御要素が既知の周囲温度にある間、熱制御要素の出力（例えば、加熱器１１２の抵抗）を決定するステップ９１０を含む。いくつかの実施形態では、周囲温度は、例えば精密ＲＴＤまたは熱電対などの別の温度測定デバイスで測定することができる。しかし、非接触法を含めた任意のその他の適切な温度測定デバイスが、当業者に理解されるように、適切である。
【００５０】
実施形態では、熱制御要素の望ましくない自己加熱を、最小限に抑えることができる。熱制御要素が抵抗加熱器でありかつ測定値が抵抗や電流、印加電位などの電気特性またはその他の電気特性である実施形態では、熱制御要素は、好ましくは、正確な読取りを得るのに必要な最小限の電力または電流を使用して、読み取られる。さらに実施形態では、周囲温度較正点は、熱制御要素の自己加熱特性による温度上昇を含むように定義されてもよい（例えば、Ｔ較正＝Ｔ周囲＋ΔＴ自己）。いくつかの実施形態では、熱制御要素の自己加熱特性は、分析的に、モデルにより、または実験的に決定することができる。
【００５１】
周囲温度での熱制御要素の測定値および周囲温度は、いくつかの実施形態において、最大階数系を定義する点として使用することができまたは較正の品質を改善するために優決定系で使用することができる、追加の対応（correspondence）を定義する。例えば、測定値が加熱要素の抵抗である実施形態では、周囲温度で測定された抵抗（即ち、加熱器１１２のＲ周囲）および周囲温度（即ち、Ｔ周囲）が、２つのその他の測定された対応（例えば、（ＲＴｍ１，Ｔｍ１）および（ＲＴｍ２，Ｔｍ２））と共に使用することができる追加の対応（Ｒ周囲，Ｔ周囲）を定義することができる。
【００５２】
低温で熱応答プロファイルにフィーチャを生成することは難しくなる可能性があるので、周囲温度較正は、低温の適用例で特に役立てることができる。
【００５３】
本発明の態様は、例えば、停止もしくは連続流システム、またはマイクロ流体デバイス内でサンプルの移動と休止（pause）とが交互に行われる「ストップ・アンド・ゴー」システムで、利用することができる。
【００５４】
本発明の態様は、抵抗センサ、サーミスタ、ダイオード温度センサ、熱電対、または任意のその他の適切な温度測定デバイスを較正するのに使用することができる。本発明はさらに、薄膜白金要素（またはニッケルもしくは銅、または当業者により理解されるような任意のその他の材料）などの加熱にも使用される抵抗センサを較正するのに使用することができる。
【００５５】
本発明の実施形態は、様々な機器で使用することができるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断を行う熱融解システムおよびＰＣＲで特に有用である。本発明の実施形態は、サンプル（診断）の熱融解が意図されるセンサおよび加熱器、ならびに完全に異なる機能（例えば、サンプル調製またはＰＣＲ）を果たす機器内のその他の加熱器およびセンサを較正するのに使用することができる。その他の適用例は、例えばデバイスの温度較正が望まれかつ／または適切である任意の適用例または核酸製造もしくはサンプル調製などに使用される機械またはシステムなどが適切である。
【００５６】
ある好ましい実施形態では、機器はサンプル・プラグを生成してもよく、このプラグは、コンパウンド較正プラグが先行しまたはコンパウンド較正プラグにより進められるアッセイ用のサンプルを含有するものである。コンパウンド較正プラグは、一実施形態では、コンパウンドキャリブレータを含むプラグであってもよい。較正プラグは、所望の精度を維持するのにシステム設計者がどの周波数を必要としているかに応じて、投入し使用することができる。別の実施形態では、コンパウンドキャリブレータは、サンプル導入の前に、連続流体流中の機器に導入することができる。一実施形態では、コンパウンドキャリブレータを機器に導入し、全較正期間中に所定位置に保持することができる。
【００５７】
図１０は、本発明に実施形態による、コンパウンドキャリブレータを使用して熱制御要素を較正するためのプロセス１０００を示す。以下に記述されるようにかつ図１０および図１１を参照すると、プロセス１０００は、マルチゾーン・マイクロ流体デバイス（その１つの非限定的な例は、ＰＣＲゾーン１０４および熱融解ゾーン１０６を有するマイクロ流体チップ１００である）を順次較正するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、プロセス１０００は、１種または複数のサンプルと任意選択で連続的に、マイクロ流体チップ内を移動しているコンパウンドキャリブレータの液滴、スラグ、プラグ、セグメント、または連続流を使用して、実施することができる。図１０はコンパウンドキャリブレータの液滴を指すが、実際、「液滴」は、例えばスラグ、プラグ、セグメント、または連続流とすることができる。ステップ１００２で、熱デバイス（例えば、マイクロ流体チップ）は、この熱デバイス内の反応を制御しモニタするためのシステム（例えば、システム２００）に投入される。ステップ１００４で、周囲温度測定を行う。いくつかの実施形態では、ステップ１００４は、プロセス９００のステップ９１０に関して既に述べたように周囲温度測定を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、周囲温度測定は、初期係数の１つまたは複数（例えば、ｋ０’）を調節するのに使用することができる。
【００５８】
次のステップ（ステップ１００６）の前に、指標変数（ｉ）を初期値に設定する。以下に記述されるようにかつ図１０に示されるように、指標変数は、コンパウンドキャリブレータにより較正される熱制御要素に対応することができる（例えば、ｉがｎに等しい場合、ｎ番目の熱制御要素を較正することができる）。
【００５９】
ステップ１００６で、コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流（例えば、２種以上のアンプリコンの混合物）を、第１の熱ゾーンに投入してもよい。この第１の熱ゾーンは、マイクロ流体チップの第１の熱ゾーンである（例えば、システム２００は、コンパウンドキャリブレータを入口ポート１０３に投入し、このコンパウンドキャリブレータを、マイクロチャネル１０２のＰＣＲゾーン１０４に移動させることができる）。しかし第１の熱ゾーンは、例えばサンプル調製用、ＤＮＡ抽出用、またはポリメラーゼを「ホットスタート」させる（例えば、Ｔａｑ）デバイスなど、その他の適用例における熱ゾーンであってもよい。図１１に示されるように、アッセイ・サンプルは、隣に隣接する熱ゾーン内に存在してもよい。
【００６０】
ステップ１００８で、熱融解分析は、熱ゾーン（例えば、加熱器１１２ａ）に関連付けられた熱制御要素の較正係数（例えば、ｋ０およびｋ１）を決定するために行われる。いくつかの実施形態では、ステップ１００８は、プロセス３００に関して既に述べたステップの１つまたは複数を含んでいてもよい。隣接する熱ゾーンが熱的に隔離されている限り、隣に隣接する熱ゾーン内に存在するアッセイ・サンプルは、第１の熱ゾーンの熱制御要素の較正と並行して、独立した処理または分析を受けてもよい。
【００６１】
ステップ１００８の後、ステップ１０１０で既知の数の熱制御要素Ｎに対するインデックス・カウンターをチェックすることによって、較正するための追加の熱制御要素があるか否かの決定を行ってもよい。較正するための追加の要素がある場合、インデックス・カウンターをステップ１０１２でインクリメントしてもよく（例えば、ｉ＝ｉ＋１）、プロセス１０００はステップ１００６に戻る。コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流は、デバイスの次の熱ゾーンに移動してもよい（例えばシステム２００は、コンパウンドキャリブレータを熱融解ゾーン１０６に移動させる）。図１２に示されるように、いくつかの実施形態では、第１の熱ゾーンからコンパウンドキャリブレータをフラッシングし、サンプル・アッセイで置き換えることを含んでもよい（例えばシステム２００は、サンプルを入口ポート１０３に投入し、サンプルをＰＣＲゾーン１０４に移動させてもよい）。
【００６２】
次いでプロセス１０００は、第２の熱ゾーンに関連付けられた熱制御要素を使用して（例えば、加熱器１１２ｂを使用して）、ステップ１００８を繰り返す。代替の実施形態では、第１の熱ゾーン内のアッセイ・サンプルは、第２の熱ゾーン内の熱制御要素の較正と並行して、独立した処理または分析を受けてもよい。いくつかの実施形態では、第２の熱ゾーンは、第１のゾーンから熱的に隔離されていてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、マイクロ流体チップは、３つ以上の熱ゾーンを有していてもよい。図１０に示されるように、プロセス１０００は、各熱ゾーンが較正されるまで（例えば、指標変数ｉがＮ（但しＮは、較正される熱制御要素の数である）に等しくなるまで）、１００６（即ち、コンパウンドキャリブレータの液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流を、次の熱ゾーンに移動させる）および１００８（即ち、熱融解分析）のステップを繰り返す。
【００６４】
熱制御要素が熱的に隔離されているいくつかの実施形態では、マイクロ流体チャネルに沿う熱制御要素（例えば、単一のマイクロ流体チャネル１０２に沿う加熱器１１２ａおよび１１２ｂ）の較正を、並行して行うことができる。いくつかの実施形態では、チャネル全体にコンパウンドキャリブレータを充填することを含むことができる。図１３に示されるように、その他の実施形態では、コンパウンドキャリブレータの個別の液滴、プラグ、スラグ、セグメント、または連続流を各熱制御要素に移動させ（例えばシステム２００は、１つの液滴を熱融解ゾーン１０６に移動させ、別の液滴をＰＣＲゾーン１０４に移動させる）、各熱制御要素に関する較正プロセスを同時に行う。
【００６５】
例示的な実施例
染色体１７上の超保存エレメント（Ultra-Conserved Element）４１５および鎌状赤血球遺伝子（sickle cell gene）からのアンプリコンからなるコンパウンドキャリブレータを使用して、一組の較正データを、上述のシステムおよびプロセスに従い生成した。
【００６６】
図１４は、較正されていない熱制御要素に関する未処理の熱融解曲線と、初期推定係数ｋ０’およびｋ１’を使用したその曲線に基づく微分プロットとを示す。図１４からわかるように、較正前の融解曲線のフィーチャは、インサイチュ温度測定のその他の不正確さまたは異なる熱制御要素間の固有のばらつきにより、整合状態にない。
【００６７】
図１５は、ｋ０およびｋ１のより正確な値を決定するために上述のシステムおよび方法を使用した後の、同じシステムに関する熱融解曲線および微分プロットを示す。図１５に示されるように、本発明は、有意に、より正確に較正された熱制御要素をもたらした（即ち、融解曲線のフィーチャは、真の既知の温度Ｔｍに十分整合する）。
【００６８】
本発明の実施形態について、描いた図を参照しながらこれまで完全に記述してきた。本発明を、これら好ましい実施形態に基づき記述してきたが、ある修正、変形、および代替構成を、本発明の精神および範囲内で、記述される実施形態に行うことができることが当業者に明らかにされよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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