(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ．ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程；
ｂ．Ｆｃ結合タンパク質を該溶液に取り込む工程；
ｃ．液相から沈降物を分離する工程；
ｄ．Ｆｃ結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程を含み、
Ｆｃ結合タンパク質は、結合が起こることを可能とする条件下で、正確に２つの結合部位を有し、Ｆｃ結合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合ドメインのダイマーであり、ダイマーの２つのモノマーが、ジスルフィド橋によって一緒に連結されている、
免疫グロブリンまたはＦｃドメインを含む他のタンパク質（ターゲットタンパク質）の選択的濃縮のためのプロセス。
【請求項２】
Ｆｃ結合ドメインが、配列番号１から配列番号１１の配列の１つを含むまたは含有することを特徴とする、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
ダイマーがホモダイマーであり、そのモノマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７の配列、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有することを特徴とする、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
Ｆｃ結合タンパク質が、ターゲットタンパク質に対して０．５〜２０のモル比で使用されることを特徴とする、請求項１〜３の１項記載のプロセス。
【請求項５】
工程ａ．の溶液が、５．５〜９のｐＨを有することを特徴とする、
請求項１〜４の１項記載のプロセス。
【請求項６】
工程ａ．の溶液が、６〜８のｐＨを有することを特徴とする、
請求項１〜５の１項記載のプロセス。
【請求項７】
工程ｄ．の結合の解離が、ｐＨ２〜４．５で起こることを特徴とする、請求項１〜６の１項記載のプロセス。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７の配列、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有する２つの同一のサブユニットからなるＦｃ結合タンパク質であって、２つのサブユニットはジスルフィド結合を介して一緒に連結されている、前記Ｆｃ結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、タンパク質、特に免疫グロブリンまたはＦｃドメインを有する他のタンパク質のための精製プロセスに関する。
【０００２】
最新技術
生体分子、例えばタンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などは、医薬として、診断剤として、食品、洗浄剤などにおける添加剤として、研究試薬として、および多くの他の適用のために次第に商業的重要性を増している。このような生体分子の需要は、もはや通常では対応できず、例えばタンパク質の場合、天然源から分子を単離することによっては対応できず、バイオテクノロジーによる産生法の使用を必要とする。
【０００３】
バイオテクノロジーによるタンパク質の調製は、典型的には、適切な発現ベクターへのＤＮＡフラグメントのクローニングで始まる。適切な原核または真核発現細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、続いてトランスフェクションされた細胞を選択した後、後者をバイオリアクターで培養し、そして所望のタンパク質が発現される。その後、細胞または培養上清を収集し、そしてそれに含有されるタンパク質を後処理し精製する。
【０００４】
真核生物発現系の場合、すなわち例えばＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞などの哺乳動物細胞培養液を使用する場合、発現工程において達成され得る細胞培養液または細胞培養上清中の所望のタンパク質の濃度の有意な増加が過去１５年間において認められた。同期間かけて、タンパク質のその後の精製において使用されるクロマトグラフィー材料の結合能は、比較するとほんの僅かしか増加しなかった。この理由のために、大規模な工業的スケールで実施できる生体分子、特にタンパク質の、改良され、最適化された精製法が緊急に必要とされる。
【０００５】
例えば薬物として使用されるタンパク質、例えば治療抗体などのバイオ医薬品の場合、生成物の収量に加えて、不純物の分離は非常に重要である。プロセス依存性不純物と生成物依存性不純物とを区別することができる。プロセス依存性不純物は、タンパク質（宿主細胞タンパク質、ＨＣＰ）および核酸などの宿主細胞の成分を含有し、そして細胞培養液（例えば培地の成分など）からまたは後処理（例えば塩または溶解したクロマトグラフィーリガンドなど）から派生する。生成物依存性不純物は、異なる特性を有する生成物の分子変異体である。これらは、前駆体および加水分解産物などの短くなった形態を含むが、例えば脱アミノ化、正しくないグリコシル化または間違って連結されたジスルフィド橋による、改変された形態も含む。生成物依存性変異体には、ポリマーおよび凝集体も含まれる。他の不純物は汚染物質である。この用語は、産生プロセスに直接的に属さない化学的、生化学的または微生物学的性質の全ての他の材料を網羅する。汚染物質の例としては、細胞培養液中に望ましくない様式で存在し得るウイルスが挙げられる。
【０００６】
バイオ医薬品の場合、不純物は安全性の懸念をもたらす。これらの懸念は、バイオ医薬品では非常にしばしば起こることであるが、治療タンパク質が注射または注入によって血流に直接的に投与される場合に高まる。従って、宿主細胞成分はアレルギー反応または免疫病理学的作用を起こし得る。さらに、不純物はまた、投与されるタンパク質の望ましくない免疫原性を引き起こし得、すなわち、それらは、患者において治療剤に対する望ましくない免疫反応をトリガーし、生命に危険を及ぼすアナフィラキシーショックを引き起こす可能性がある。それ故、全ての不要な物質を無害なレベルまで減少させることのできる適切な精製プロセスが必要とされる。
【０００７】
他方で、バイオ医薬品の場合でさえも、経済的な考慮も無視できない。従って、使用される産生法および精製法は、このようにして産生されるバイオ医薬製品の経済的な実行可能性を損なうべきではない。
【０００８】
タンパク質の後処理および処理工程として、（カラム）クロマトグラフィープロセス並びに濾過および沈降プロセスは非常に重要である。従って、抗体を濃縮する正確な操作は、アフィニティクロマトグラフィーによる精製工程を含む。従って、これらのプロセスにおいて使用することのできる数多くのカラムクロマトグラフィー法およびクロマトグラフィー材料が現在知られている。
【０００９】
アフィニティクロマトグラフィーマトリックスは、固定相として種々の物質の工業的精製に使用されている。固定されたリガンドは、使用される特定のリガンドに対して特定の親和性を有する物質を特異的に濃縮および精製するために使用され得る。抗体（免疫グロブリン）の工業的精製のために、特にモノクローナル抗体の精製のために、固定されたプロテインＡがしばしば最初の精製工程として使用される。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣＨ２／ＣＨ３ドメインに高い親和性で（１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのヒトＩｇＧ）結合する黄色ブドウ球菌の約４１ｋＤａのタンパク質である。プロテインＡクロマトグラフィーでは、移動相に由来するプロテインＡに結合するＦｃ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質が、担体（例えばセファロース）に共有結合しているプロテインＡリガンドに特異的に結合する。黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡ（野生型プロテインＡ）および遺伝子的に改変された組換えプロテインＡ（組換えプロテインＡ）は、非共有結合的な相互作用を通して、抗体の定常領域（Ｆｃフラグメント）と相互作用する。この特異的な相互作用を使用して、効率的に抗体から不純物を分離することができる。ｐＨを変化させることによって、抗体とプロテインＡリガンドとの間の相互作用を計画的に停止させることができ、そして抗体を固定相から遊離または溶出させることができる。
【００１０】
アフィニティリガンドとしてのプロテインＡとは別に、Ｆｃフラグメントに結合する現在知られている多くの他の分子がある。従って、プロテインＡの個々のドメインが、完全なタンパク質の代わりに使用される（８）。Ｆｃフラグメント含有分子と結合するのに適した、プロテインＡのＢドメインとは正確に異なる、タンパク質変異体が知られている（１６、１７）。これらの異なる変異体は、安定性または結合親和性を増加させるために挿入された突然変異の点で本質的に異なっている。Ｂドメインのこれらの突然変異体は、通常、Ｚ−ドメインまたはプロテインＺとして知られている。プロテインＡまたはプロテインＧの他に、種々のペプチドもまた、Ｆｃフラグメントへの選択的な結合のために適している（１４）。Ｆｃフラグメントに対するアフィニティリガンドへの現在の多大な関心により、さらにより多くのアフィニティリガンドが見つかると想定される。
【００１１】
アフィニティクロマトグラフィーおよび特に頻繁に使用されるプロテインＡクロマトグラフィーは高価であり、そして発酵槽中の生成物の濃度が増え大量の生成物がある場合には正に、実施することのできるクロマトグラフィー精製プロセスには限界がある。重要な点は、ローディング能力、サイクル数、プロセス時間、プール容量および緩衝液の量である。将来は、それ故、代替的な精製プロセスが不可欠となろう。アフィニティクロマトグラフィーおよび代替的なアフィニティクロマトグラフィー法を含む、従来の精製戦略の一般的な概要を、以下の文献（７、１０）に見出すことができる。
【００１２】
アフィニティクロマトグラフィーのより最近の方法は、常に固定されたアフィニティリガンドではなく、まず、ターゲットタンパク質と混合された可溶化されたアフィニティリガンドを使用する（１１）。アフィニティリガンドは、第２工程で起こる固相上へのアフィニティリガンドの固定を行なうことを可能とする、融合タグまたは融合タンパク質を有する。次の工程で、従来のアフィニティクロマトグラフィーのように、ターゲットタンパク質が適切な条件下でリガンドから分離され、そしてこのようにカラムから溶出される。
【００１３】
ここに記載した本発明は、生体分子を精製するのにアフィニティクロマトグラフィーの代わりにアフィニティ沈降を使用する。この方法は、より大規模で使用した場合に正確に大きな可能性を有するようである（１、２）。
【００１４】
アフィニティ沈降は、最も効果的なタンパク質沈降法である（２）。一般に溶液からのタンパク質の沈降は、頻繁に使用される周知のプロセスである。従って、多くのタンパク質が、タンパク質混合物からの硫酸アンモニウムによる沈降によって溶液からすでに分離されている。この沈降中に、巨大分子（例えばタンパク質）が溶液から除去され、そして粒子へと変換される。粒子と溶液との間の密度の差および粒子直径に依存して、この工程は沈降へと至る。しかしながら、この沈降は通常、非特異的に起こる。
【００１５】
それ故、分子（例えばタンパク質）のより選択的な濃縮のために、アフィニティ沈降が開発された。アフィニティ沈降は、ターゲット分子へのアフィニティ分子の選択的な結合を使用する。アフィニティ分子は、例えば、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたは小さな化学的分子であり得る。１次アフィニティ沈降と２次アフィニティ沈降という２つの原理のアフィニティ沈降は区別される（７）。１次アフィニティ沈降では、アフィニティ分子とターゲット分子の両方が２つの結合部位を有し、よって２つの分子間でネットワークを形成することが可能となり、そして特定のサイズで沈降するアフィニティ複合体が形成される。２次アフィニティ沈降では、例えばアフィニティマクロリガンド（ＡＭＬ）が使用される。このタイプの沈降では、アフィニティ分子は、刺激性物質に、通常ポリマーに結合している。刺激性物質は、例えばｐＨまたは温度の変化などの周囲の条件の変化の結果として、その可溶性特徴を変化させ、そして沈降が起こる。１次アフィニティ沈降とは異なり、二官能基アフィニティ分子または二官能基ターゲット分子のいずれも必要ではない。
【００１６】
最も使用されるアフィニティ沈降では、アフィニティリガンドは、現在、ポリマーまたは他のメディエーターに結合している（１５）。
【００１７】
Ｆｃフラグメントを含有する分子のアフィニティ沈降はすでに多くの研究に記載されている。現在のところ最も一般的な適用は、いわゆる「スマートポリマー」の使用によって特徴づけられる。「スマートポリマー」（または刺激応答性「インテリジェント」ポリマーまたはアフィニティマクロリガンド）は、外的な影響（物理的または化学的刺激）に応答してその特性を変化させることのできるポリマーである。これらの刺激は、例えば、ｐＨまたは温度の変化であり得る（１２〜１３）。通常、スマートポリマーはその刺激に反応して、溶液中で沈降する。この沈降は、適切な条件による、上清溶液の望ましい分離後に戻り得る。スマートポリマーを種々の生体分子とコンジュゲートさせることができ、これにより全種類の適用に使用することのできるポリマー／生体分子システムが大規模に蓄積される。これらの生体分子の例としては、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび糖が挙げられる。
【００１８】
別の形態のアフィニティ沈降は、近年記載されている「アフィニティシンキング（sinking）」法である。この形態のアフィニティ沈降では、連結している分子足場を使用して、多くのアフィニティリガンドを互いに結合させる。その後、これにより、沈降に必要とされるネットワークを形成することが可能となる。ネットワーク形成成分へのアフィニティリガンドの結合は、非共有結合的および共有結合的に起こり得る。この方法は、特許「Compositions and methods for purifying and crystallizing molecules of interest」（６）に最近記載された。ここでは、まず始めに、抗体を含有する溶液を、架橋剤と共有結合したアフィニティリガンドと混合する。沈降は全く観察されない。配位するイオンまたは分子のその後の添加後にのみ、沈降が起こる。第２の類似した適用では、アフィニティリガンドはビオチン結合タンパク質に連結され、前記タンパク質はメディエーターのアビジンとネットワークを形成している（９）。
【００１９】
米国特許第７，０８３，９４３号は、ターゲットタンパク質のための結合ドメインが、足場ドメイン（そのアミノ酸配列は沈降する傾向を支援するためのものである）に連結されている、アフィニティ沈降を記載する。
【００２０】
ChenおよびHoffman（１５）は、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−プロテインＡコンジュゲートを用いてのＩｇＧのアフィニティ沈降を記載する。しかしながら、改変されていないプロテインＡを用いての抗体の沈降は効果的であるとは証明されなかった。
【００２１】
従来技術に記載される方法の１つの欠点は、１次アフィニティ沈降中には架橋分子を介してのみ沈降が可能であるか、または２次アフィニティ沈降では刺激性物質が必要とされることである。最もよく知られているアフィニティ沈降の他の欠点は、一方で、ａ）立体障害（ターゲットタンパク質の結合が、高分子量のアフィニティマクロリガンドの結合によって制限されている）、ｂ）沈降したポリマー複合体の再可溶化が遅いこと、ｃ）不純物の非特異的な共沈降（これは一般的に２回目の沈降工程を必要とする）、ｄ）アフィニティタンパク質をポリマーまたは架橋剤へ結合させるさらなる工程（２〜５）である。
【００２２】
発明の簡潔な要約
本発明は、２つの結合部位を有する結合タンパク質を使用したアフィニティ沈降に関し、これは、追加の融合タンパク質またはリンカー分子を完全に省略する。アフィニティタンパク質はそのままで沈降するのに十分であり、そして固定相の必要が全くない。ここに使用した本発明はまた、アフィニティタンパク質を回収することも容易にする。
【００２３】
本発明は、特に、以下の工程：
ａ．ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程；
ｂ．結合が起こることを可能とする条件下で、正確に２つの結合部位を有するＦｃ結合タンパク質を取り込む工程；
ｃ．液相から沈降物を分離する工程；
ｄ．Ｆｃ結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程
を含む、免疫グロブリンまたはＦｃドメインを含む他のタンパク質（ターゲットタンパク質）の選択的濃縮のためのプロセスに関する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、Ｆｃ結合タンパク質がプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合ドメインのダイマーであるプロセスに関する。好ましくは、ダイマーの２つのモノマーは、ジスルフィド橋を介して互いに連結されている。
【００２５】
別の局面において、本発明は、ダイマーがホモダイマーであり、そのモノマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号７、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有する、プロセスに関する。
【００２６】
別の局面において、Ｆｃ結合タンパク質は、ターゲットタンパク質に対して０．５〜２０の比で使用される。工程ａ．の溶液は好ましくはｐＨ５．５〜８を有する。好ましくは工程ｄ．の結合の解離はｐＨ２〜４．５で起こる。
【００２７】
別の局面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７の配列、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有する２つの同一のサブユニットからなるＦｃ結合タンパク質に関し、２つのサブユニットは共有結合を介して互いに連結されている。好ましくは、共有結合はジスルフィド結合である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＺダイマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。システインを介してのダイマー化を実証するために、ヨードアセトアミドまたはジチオスレイトールとヨードアセトアミドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥへの適用前に加えた。
【表１】
0005917417.tif 000002
【図２】Ｚダイマーを使用したアフィニティ沈降。第１工程としてプロテインＺが酸化される。第２工程でＺダイマーが抗体（ｍＡＢ）を含む溶液に加えられ、これにより抗体の選択的な沈降が起こる。
【図３】抗体からＺダイマーを分離するための酸性条件下におけるイオン交換クロマトグラフィーのＵＶ図（実験２）。２２０nmにおけるＵＶクロマトグラムは赤色で示され、２８０nmにおけるＵＶクロマトグラムは青色で示され、緩衝液Ｂ（２０mMリン酸、３Ｍ ＮａＣｌ）の漸増する含量は緑色で示されている。
【図４】実験２についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【表２】
0005917417.tif 000003
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞培養液（タンパク質が組換え発現または内因的に発現されている）から得られるようなタンパク質組成物から、不純物、特に宿主細胞のタンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡを枯渇させる方法に関する。特に、本発明は、少なくとも２つの結合部位を有するＦｃ結合タンパク質またはそのマルチマーと結合させることによって、タンパク質（ターゲットタンパク質）を精製または濃縮する方法に関する。さらなる工程において沈降物を分離し、そしてその後、ターゲットタンパク質へのＦｃ結合タンパク質の結合を適切な条件を使用して除去する。
【００３０】
本発明は、以下の工程：
ａ．ターゲットタンパク質を含む溶液を調製する工程；
ｂ．結合が起こることを可能とする条件下で、正確に２つの結合部位を有するＦｃ結合タンパク質を取り込む工程；
ｃ．液相から沈降物を分離する工程；
ｄ．Ｆｃ結合タンパク質からターゲットタンパク質の結合を解離する工程
を含む、免疫グロブリンまたはＦｃドメインを含む他のタンパク質（ターゲットタンパク質）の選択的濃縮のためのプロセスに関する。
【００３１】
ターゲットタンパク質は特に、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインを含むタンパク質であり得、そしてプロテインＡまたはプロテインＡのフラグメントに結合することができる。免疫グロブリンは２本の重鎖および２本の軽鎖からなる。重鎖は各々、免疫グロブリンに依存して、１つの可変ドメインおよび３〜４つの定常ドメインを有する。これらは類似して、ＶＨおよびＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３と呼ばれる。軽鎖および重鎖の可変ドメインは抗原結合部位を形成する。ドメインＣＨ２は、補体系のための結合部位を形成する糖鎖を含む。ＣＨ３ドメインはＦｃレセプター結合部位を含む。本発明によるプロセスを適用できるターゲットタンパク質は、Ｆｃドメインを有する全てのタンパク質である。ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むタンパク質の例は、抗体、イムノアドヘシンおよび融合タンパク質であり、対象のタンパク質はＣＨ２／ＣＨ３領域に接続される。本発明の１つの態様において、ターゲットタンパク質は、例えばＣＨ２／ＣＨ３領域を有し、従ってプロテインＡに結合することのできる抗体である。ＣＨ２／ＣＨ３領域という用語は、プロテインＡと相互作用する抗体のＦｃ領域におけるアミノ酸を指す。
【００３２】
Ｆｃ結合タンパク質は、本発明によれば、１つのＦｃドメインに対する正確に２つの結合部位を含む。
【００３３】
別の局面において、本発明は、Ｆｃ結合タンパク質がプロテインＡまたはプロテインＧのＦｃ結合ドメインのダイマーである、プロセスに関する。ダイマーの２つのモノマーは、好ましくは、ジスルフィド橋によって一緒に連結されている。
【００３４】
Ｆｃ結合タンパク質によって、Ｆｃ領域に結合することのできるタンパク質またはペプチドを意味する。好ましくは、Ｆｃ結合タンパク質は、１０−２〜１０−１３Ｍの範囲の解離定数（ＫＤ値）で結合する。
【００３５】
本発明の好ましい態様において、Ｆｃ結合タンパク質は、表１に列挙した配列を含むまたは含有するＦｃ結合ドメインのホモダイマーまたはヘテロダイマーである。
【００３６】
【表３】
0005917417.tif 000004
【００３７】
ホモダイマーによって、本明細書においては、同じ配列の２つのサブユニットからなるＦｃ結合タンパク質を意味する。
【００３８】
ヘテロダイマーによって、本明細書においては、異なる配列の２つのサブユニット（その各々はＦｃドメインに対する結合部位を有する）からなるＦｃ結合タンパク質を意味する。好ましくは、サブユニットは、表１の配列から選択される配列を含む。
【００３９】
別の局面において、本発明は、ダイマーがホモダイマーであり、そのモノマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有する、プロセスに関する。１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のアミノ酸において配列番号１とは異なるモノマーは、１０−２〜１０−１３Ｍの範囲のＫＤ値でＦｃドメインに結合する特性を有する。ＫＤ値を決定する方法は当業者には公知である。
【００４０】
結合条件は、Ｆｃ結合タンパク質によるターゲットタンパク質への結合が起こる条件、好ましくはｐＨ５．５〜９、好ましくは６〜８のｐＨ範囲である。
【００４１】
沈降は、例えば無細胞真核生物培養上清に見られる条件などの結合条件下で自発的に起こる。ポリマーを用いての沈降を促進するために、本発明によるダイマーをポリマーに、例えばポリエチレングリコールに連結させる必要は全くない。
【００４２】
別の局面において、Ｆｃ結合タンパク質は、ターゲットタンパク質に対して０．５〜２０のモル比で使用される。
【００４３】
沈降物の分離は、遠心分離およびその後の上清の除去によって行ない得るが、濾過技術によっても行ない得る。
【００４４】
ターゲットタンパク質への結合の解離は、Ｆｃ結合タンパク質がターゲットタンパク質から分離されることを可能とする条件下で行なわれる。好ましくは、これはｐＨをｐＨ２〜４．５の間の範囲に調整することによって行なわれ得る。
【００４５】
別の局面において、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７の配列、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０のアミノ酸において配列番号１とは異なる配列を有する２つの同一のサブユニットからなるＦｃ結合タンパク質に関し、２つのサブユニットは共有結合によって一緒に連結されている。好ましくは、共有結合はジスルフィド結合である。
【００４６】
実施例
装置および方法：
ダイマー化したプロテインＺの調製
プロテインＺは、E.coliから組換えタンパク質として得られた。不純物の除去は、細胞片の分離後にイオン交換クロマトグラフィーによって行なった。
【００４７】
使用したＺドメインのタンパク質配列：
【表４】
0005917417.tif 000005
【００４８】
Ｚドメインのペプチド鎖に非天然のシステインを挿入することによって、ジスルフィド橋を介して２つのプロテインＺ分子を計画的に接続することが可能である。組換えプロテインＺの精製直後に、後者は酸化によってダイマー化したタンパク質として得られる。
【００４９】
無細胞真核生物培養上清
分泌産生に最適化されたＣＨＯ細胞の細胞培養上清は、数日間の培養後に濾過または遠心分離によって得られた。
【００５０】
ＳＥＣ分析
実験１の試料のタンパク質不純物および抗体含量の分析を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって実施した。ＴＳＫ−ＧＥＬ ＳＷ３０００を製造業者（TOSOH Bioscience）によって推奨されたプレカラムと共に使用した。分析を、Dionex Ultimate装置で、２８０および２２０nmにおけるＵＶシグナルのモニタリングをしながら行なった。
【００５１】
抗体からＺダイマーを分離するためのイオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーを、AKTA Explorer 10装置（GE Healthcare）で、２２０および２８０nmにおけるＵＶ吸収を観察しながら行なった。使用したカラム材料はＳＰセファロースＦＦ（１９mLのゲルベッド体積）であった。酸性ｐＨで再懸濁したペレットを適用した後、カラムをｐＨ３．３の２０mMリン酸緩衝液を用いて平衡化し、そしてその後、抗体およびＺダイマーを互いに２５カラム容量長の勾配にかけて分離した。ｐＨ３．３の３Ｍ ＮａＣｌを含む２０mMリン酸緩衝液を溶出のために使用した。
【００５２】
プロテインＡ ＨＰＬＣ
WatersまたはDionex装置（インジェクターポンプおよびカラムオーブンＷ２７９０／５、ＵＶ検出器Ｗ２４８９）でのプロテインＡ ＨＰＬＣを使用して、細胞培養液を含まない上清および精製抗体の抗体含量を決定した。溶液の抗体含量を、酸性で溶出するピークのＵＶシグナルを使用して決定した。
【００５３】
濃縮
試験で得られた溶液を、分析法（Amicon Ultra、排除サイズ３ｋＤ）のために一部濃縮した。
【００５４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：
２０％の均一なＳＤＳゲルを使用して、個々の画分および上清を試験した。タンパク質バンドを、Heukeshovenによる銀染色によって検出した。
【００５５】
ＥＬＩＳＡアッセイによる宿主細胞タンパク質の分析
実験３において宿主細胞タンパク質の分析をＥＬＩＳＡアッセイを使用して行なった。
【００５６】
ＤＮＡ分析
ＤＮＡ分析を、１本鎖産生後に、酵素的に触媒される検出反応によって行なった。
【００５７】
ＵＦ／ＤＦ
表面積１８０cm２を有するMessrs Pallによって製造された５０ｋＤａのCentramateシートＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）を、実験３でのＵＦ／ＤＦ試験に使用した。ＵＦ／ＤＦを実施して、抗体を６倍に最初に濃縮し、そしてその後、ダイアフィルトレーションし（６容量の緩衝液と交換）、その後、保持液バルブを完全に開けたまま１０分間循環した。ダイアフィルトレーションを２回繰り返した。全ＵＦ／ＤＦを、５０mM酢酸緩衝液＋１００mMアルギニン＋１５０mM ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて行なった。
【００５８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（実験３）をAKTA装置で２７mLのカラムを用いて行なった。使用したカラム材料は東ソーによって製造されたトヨパールフェニル６５０Ｍであった。この目的のために、ＵＦ／ＤＦ後に、１６５ｍＳ／cmの伝導率が得られるまで、３．５Ｍ硫酸アンモニウム緩衝液を保持液に加えた。緩衝液（５０mMアセテートおよび１．２Ｍ硫酸アンモニウムｐＨ４）を用いて平衡化したカラムにＵＦ／ＤＦからの保持液をチャージし、そしてその後、５０mM酢酸緩衝液（ｐＨ４）までの勾配を４０倍のベッド体積にかけて流した。
【００５９】
実験：
システインによるプロテインＺのダイマー化の検出
システインによるプロテインＺのダイマー化の検出をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって行なった（図１）。後処理がプロテインＺの酸化を全く誘導しないことを確実にするために、まず始めに遊離システイン基をヨードアセトアミドを用いてアルキル化した。モノマーを検出するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いてさらに還元を行なった。２．６nmolのＺダイマーをＤＴＴまたは対応する容量の緩衝液と混合し、そして９５℃で５分間インキュベーションした。その後、混合物を周囲温度まで冷却し、そしてヨードアセトアミドまたは対応する容量の緩衝液を加え、そして混合物を暗闇でさらに２０分間インキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液と共に５分間インキュベーションした後、調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｚモノマーが還元剤ＤＴＴの添加によって形成され、そしてＺダイマーのゲルバンドが消失することを示す。
【００６０】
Ｚダイマーを使用した選択的沈降
以下に記載した試験は、抗体の選択的沈降をＺダイマーを用いて達成することができることを示す（図２、実験１）。Ｚダイマーは、２つの非天然のシステインを介して連結した黄色ブドウ球菌に由来するプロテインＡのダイマー化したＢドメインであり、これは野生型と比較して突然変異を有する（装置および方法を参照）。さらに、実験２は、得られたペレットを酸性ｐＨ範囲での再懸濁によって溶液に戻すことができ、そしてその後、酸性ｐＨでのイオン交換クロマトグラフィーによってＺダイマーから再度抗体を取り出すことができることを実証する。
【００６１】
実験１：
無細胞の真核生物培養上清中に存在するプロテインＺと抗体の種々の比を試験した。さらに、個々のバッチの容量を変化させた。試験１では、０．１３μmolのＺダイマーを、振とうしながら、無細胞真核生物培養上清に含まれる０．０６５μmolのＩｇＧ４と共に、全容量５．４７mL中で２時間かけてインキュベーションした。試験２では、１６．２５nmolのＺダイマーを、振とうしながら、無細胞真核生物培養上清に含まれる１６．２５nmolのＩｇＧ１と共に、全容量５．２mL中でここでも２時間かけてインキュベーションした。その後、混合物を４０００rpmで１０分間かけて遠心分離し、そして上清をペレットから分離した。上清の抗体含量は、分析用ＳＥＣのＵＶシグナルによっておよびプロテインＡクロマトグラフィーによって決定した（装置および方法）。ペレット中の抗体の含量は、使用した抗体の全含量から上清の抗体含量を差し引くことによって決定した。９９％までの抗体の沈降が観察された（試験１：９９％／試験２：７６％）。さらに、培養上清を、分析用ＳＥＣによる沈降の前後にタンパク質不純物について調べた。無細胞真核生物培養上清からのクロマトグラムを、直接、沈降後の上清と比較した。９０〜９９％の範囲のタンパク質不純物の欠失が観察された（試験１ ９０％／試験２ ９９％）。これは、タンパク質不純物の１％または１０％が共沈降したことを意味する。ここでのタンパク質不純物は、宿主細胞タンパク質およびフラグメントの両方またはターゲットタンパク質の凝集体であり得る。
【００６２】
実験２：
陽イオン交換体（ＳＰセファロースＦＦ）を使用して抗体からＺダイマーを分離した。０．２μmolの精製抗体を、１０．１mLの容量中で０．２μmolのＺダイマーと共に３６分間かけてインキュベーションした。その後の遠心分離（４０００rpm、１０分間）後に、上清を除去した。その後、ペレットをバッチ毎に１０mLリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、そして再度遠心分離した（４０００rpm、１０分間）。このようにして得られたペレットを２０mLリン酸緩衝液（２０mMリン酸、ｐＨ３．３）に再懸濁し、そしてイオン交換体を使用して精製した。Ｚダイマーは、２５ベッド体積におよぶ勾配を通して抗体から分離され得る（図３および４）。
【００６３】
実験３：
多段階抗体精製プロセスは、捕獲工程としてアフィニティ沈降を用いて行なわれた。
無細胞培養上清からの沈降において、５００mgの抗体（３．３μmol）がＺダイマー（６．６μmol）に対して１：２の比率で使用された。穏やかに撹拌しながら１時間インキュベーションした後、全懸濁液を０．２２μmフィルター（Millipore）に加え、そしてこのようにして沈降物の上清を濾過によって分離した。その後、沈降物を緩衝液（２３１mLの５０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で洗浄し、そして次の工程でフィルター中に酢酸緩衝液（１７９mLの５０mM酢酸緩衝液＋１００mMアルギニン＋１５０mM ＮａＣｌ ｐＨ３．０）と共に再懸濁した。抗体からＺダイマーを分離するために、ＵＦ／ＤＦを５０ｋＤａのメンブレンを用いて実施した。次の工程は、Ｚダイマーおよびさらに不純物を分離するためのＨＩＣであった。
【００６４】
抗体の全収率は沈降後に９８％であり、ＵＦ／ＤＦの後に８７％に減少し、そしてＨＩＣ後に６４％に減少した。抗体の選択的な沈降で得られた良好な収率に加えて、ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の分析は、沈降工程とその後のＵＦ／ＤＦによってＤＮＡを９９％減少させることができ、そして宿主細胞タンパク質含量を初期値（無細胞培養上清）と比較して９９．９％減少させることができることを示した。
【００６５】
【表５】
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【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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