(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、
Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾すること、
修飾されたタンパク質を熱に暴露すること及び／又は修飾されたタンパク質を濃縮すること、並びに
未修飾タンパク質と比較して凝集する傾向が低下しているタンパク質を選択すること
を含む方法。
【請求項２】
抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、
Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにＶＬを修飾すること、
修飾されたタンパク質を熱に暴露すること及び／又は修飾されたタンパク質を濃縮すること、並びに
未修飾タンパク質と比較して凝集する傾向が低下しているタンパク質を選択すること
を含み、未修飾のタンパク質が２以上の負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
【請求項３】
抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、前記方法は、
前記タンパク質が、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むように前記タンパク質を修飾すること、
修飾されたタンパク質を熱に暴露すること及び／又は修飾されたタンパク質を濃縮すること、並びに
未修飾タンパク質と比較して凝集する傾向が低下しているタンパク質を選択すること
を含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
【請求項４】
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、前記方法は、
前記タンパク質が、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むように前記タンパク質を修飾すること、
修飾されたタンパク質を熱に暴露すること及び／又は修飾されたタンパク質を濃縮すること、並びに
未修飾タンパク質と比較して凝集する傾向が低下しているタンパク質を選択すること
を含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
【請求項６】
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＶＬがさらにＣＤＲ１にて１以上の負に荷電したアミノ酸を含み、及び／又はＶＨがさらにＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基２６、３９、４０、５０、５２、５２ａ及び５３から成る群から選択される１以上の残基で負に荷電したアミノ酸を含むようにタンパク質を修飾することをさらに含む請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、「修飾された可変ドメイン分子及びその製造方法３」と題する２０１１年４月２１日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１１９０１５２２及び「修飾された可変ドメイン分子及びその製造方法４」と題する２０１１年１１月２１日に出願されたオーストラリア特許出願第２０１１９０４８５６の優先権を主張する。これらの出願の内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は電子形式にて配列表と共に出願される。配列表の内容全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本開示は、凝集耐性の抗体可変ドメインを含むタンパク質及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗体及び抗原結合ドメインを含むタンパク質は、研究試薬、診断／予後予測試薬、工業試薬及び治療剤として今や広く使用されている。この広い範囲にわたる適用性は、高度な特異性及び親和性で抗原を結合する抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質の能力から生じる。従って、抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質は試料中の抗原に特異的に結合することができ、検出、定量を可能にし、又は抗原を発現している細胞を殺傷し、治療上の有効負荷量を送達することを可能にする。しかしながら、それらの汎用性にもかかわらず、抗体のあるサブセットしか診断上／予後予測上／工業的な／治療上の応用に適する生物物理学的特性を有さない。たとえば、治療上又は生体内での診断上の抗体／タンパク質は所望の標的にて蓄積するように対象にて長い血清半減期を必要とするので、それらは凝集に耐性でなければならない（Willuda et al., 1999）。工業的な応用は、長い半減期を有し、過酷な条件、たとえば、高温への暴露の後、凝集せずに機能することができる抗体／タンパク質を必要とすることが多い（Harris, 1999）。抗体の可変ドメインを含むタンパク質の凝集は、発現及び／又は精製の困難さ、免疫原性、毒性、分解、損傷した結合活性又は保存後の活性の喪失を招き得る。
【０００５】
タンパク質の凝集は、折り畳み経路と競合する過程又は折り畳み経路における中間体から生じ得る過程であり、普通、折り畳まれないタンパク質又は部分的に折り畳まれないタンパク質の会合が関与する。凝集への耐性は、自然の状態を安定化する（すなわち、折り畳みがほどけることに抵抗する）ことによって、又はタンパク質の折り畳まれない又は部分的に折り畳まれた状態の凝集する傾向を減らすことによって達成することができる。自然の状態を安定化することの短所は、タンパク質が折り畳まない環境に暴露される可能性が高いことである。一般にタンパク質が変性する又は折り畳まない場合、通常タンパク質の内部で分子内接触に介在するアミノ酸残基が露出する。そのような露出によってタンパク質は分子間接触を形成し、凝集しやすくなる。折り畳みがほどけることに抵抗するタンパク質とは対照的に、折り畳まれない場合凝集する傾向が低いタンパク質はそのような環境に暴露された後、生物活性のある非凝集状態に簡単に折り畳み直すであろう。
【０００６】
抗体及びその抗原結合ドメインを含むタンパク質の凝集耐性又は凝集傾向は、その中に含有される最も凝集しやすいドメインによって、及び（存在するならば）周囲のドメインとの相互作用の強さによって普通限定される。これは、そのドメインの折り畳みがいったんほどけると、それが折り畳み直すことができなければ、同じタンパク質又は他のタンパク質の他のドメインと相互作用し、凝集を形成し得るからである。抗体の定常ドメインは一般に凝集せず、配列ではさほど変化しない（その名称によって示唆されるように）。従って、抗体の最も弱いドメインは抗体から抗体へと変化する領域、すなわち、可変ドメイン（たとえば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ））であると一般にみなされる（Ewert et al., 2003）。この点で、さもなければ安定な組換え抗体産物への凝集傾向にあるｓｃＦｖ分子の組み入れは、新しい組換え設計にこれらの一般に望ましくない形質を付与することが多い。Ｅｗｅｒｔら、２００８が言及したように、「合理的な操作によって準最適な抗体構築物を改善するには、「最弱なリンク」を特定し、改善しなければならない」。Ｅｗｅｒｔらもまた、可変ドメインが抗体又は抗体関連分子における一般に「最弱なリンク」であることを強調している。従って、可変ドメインを凝集耐性であるように操作することは、その可変ドメインを含むタンパク質全体を凝集耐性にする可能性が最も高い。
【０００７】
種々の戦略、たとえば、凝集耐性のタンパク質の合理的な設計、相補性決定領域（ＣＤＲ）の移植、又は可変ドメインへのジスルフィド結合の組み入れが可変ドメインの凝集を低減するために提案されている。
【０００８】
凝集耐性のタンパク質の合理的な設計には一般に、タンパク質の凝集傾向に対する点突然変異の効果を予測するコンピュータ解析の使用が関与する。しかしながら、このアプローチには幾つかの困難さがある。たとえば、折り畳まれていないタンパク質の凝集を低減する可能性がある変異を単に特定することは十分ではない。むしろ、変異は折り畳まれたタンパク質の凝集を増やしてはならず、又は折り畳まれたタンパク質の機能に影響を及ぼしてはならない。さらに、合理的な設計は、改善される特定のタンパク質の詳細な構造解析を必要とするので、十分に性状分析されていないタンパク質と共に使用するのは難しく、種々の異なったタンパク質に容易には適用できない。
【０００９】
ＣＤＲ移植には、１つの可変ドメインから別の可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）へのＣＤＲの移植が関与する。この戦略は、抗ＥＧＰ−２のｓｃＦｖを安定化するのに有用であることが示された(Willuda et al., 1999)。しかしながら、この戦略は一般に、折り畳み構造がほどけることに抵抗する可変ドメインを作出するのに使用され、上記で議論したように、タンパク質の最も望ましい形態ではない。このアプローチの短所には、ＣＤＲ移植に続いて生じ得る親和性の低下が挙げられる。親和性のこの喪失は、ＦＲに変異を導入することによって克服することができるが、そのような変異はタンパク質にて免疫原性のエピトープを作出することができ、それによってタンパク質は治療の観点から望ましくなくなる。さらに、ＣＤＲ移植は一般に移植への好適性を評価するドナーと受容体可変ドメインの結晶構造の解析又は相同性モデル化を必要とする。明らかに、そのようなアプローチは手間がかかり、特殊化した知識を必要とする。さらに、各可変ドメインは異なった構造を有するので、方法は種々の分子全体にわたって容易に適用されない。
【００１０】
可変ドメインにジスルフィド結合を導入することが関与する方法については、結合はタンパク質が正しく折り畳み直すのを助け得る一方で、それはまた可変ドメインに硬性を導入する。そのような硬性は抗原に対する抗体の親和性を低減することができる。さらに、親和性を失うことなく又は免疫原性エピトープを導入することなく、ジスルフィド結合形成に必要なシステイン残基の導入を可変ドメインのすべてが支えることができるわけではない。さらに、高いタンパク質濃度のもとでのジスルフィド結合の形成は、タンパク質の凝集を招き得るので、結合の可能性のある有益な効果を無効にしてしまう。
【００１１】
前述のことから明らかなように、凝集耐性の可変ドメインを含有するタンパク質及びその製造方法に対する当該技術におけるニーズがある。好ましくは、方法は種々の異なる可変ドメインに容易に適用可能である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明に至る作業中、本発明者らは、たとえば、熱又は濃縮に暴露した後、凝集に対する耐性を付与する、抗体の可変ドメインにおけるアミノ酸残基を特定しようとした。そのような凝集耐性のタンパク質は種々の適用、たとえば、治療及び／又は診断／予後予測に有用である。（たとえば、凍結乾燥による）濃縮の間又は濃縮後の凝集を低減する能力はまた、たとえば、凍結乾燥されたタンパク質として操作され得る治療用タンパク質の製造及び／又は保存に利益を提供する。本発明者らは、負に荷電したアミノ酸をＶＬに導入し、凝集耐性を付与する多数の残基を特定した。本発明者らによって特定された残基は、ＶＬの相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の中に又はそれに隣接して存在する。本発明者らは、ＶＬのＣＤＲ２における単一の負に荷電したアミノ酸残基が可変ドメインにて凝集耐性を付与することを確定した。本発明者らはさらに、ＶＬのＣＤＲ２における２以上の負に荷電したアミノ酸を含めることによって、それらが凝集耐性のレベルをさらに高め得ることを見い出した。本発明者らはまた、それらが、凝集耐性を高めるように事前に存在するＶＬを修飾し、抗原に結合する能力を維持することができることを見い出した。本発明者らはまた、ＶＬ又はｓｃＦｖの抗原への親和性を有意に低下させることなく、凝集耐性を高めるように事前に存在するＶＬ（単独で又はｓｃＦｖにて）を修飾することができることを見い出した。
【００１３】
本発明者らは、ＣＤＲ２にて又はそれに隣接する１以上の負に荷電したアミノ酸を伴ったＶＬと、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うアミノ酸２８〜３５に及ぶ領域で１以上の負に荷電したアミノ酸を含む凝集耐性のＶＨを含むタンパク質を作出した。本発明者らは、これらのタンパク質が高い凝集耐性を示し、抗原に結合する能力を保持することを見い出した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らによって特定された残基の多くは抗体のＣＤＲにあるので、様々な抗体間、たとえば、異なったフレームワーク領域を含む異なるクラス又はサブクラスの抗体間で容易に転移可能である。これは、抗体の可変ドメインがＣＤＲにて配列の変異を収容するように選択されてきたのに対して、フレームワーク領域は一般にＣＤＲループを提示するための足場を提供するので有意に変化しないからである。
【００１５】
本発明者らによる知見は、凝集耐性である修飾されたＶＬを含有するタンパク質（又はＶＬ及びＶＨを含有するタンパク質）の基準及びその様々な使用を提供する。
【００１６】
従って、本開示は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９と５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬを含む単離されたタンパク質を提供し、該タンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００１７】
一例では、タンパク質はＣＤＲ１にて荷電した残基を含むＶＨをさらに含む。
【００１８】
本開示はさらに又は代わりに、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９と５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬを含む単離されたタンパク質を提供し、該タンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００１９】
一例では、タンパク質はＣＤＲ１にて荷電した残基を含むＶＨをさらに含む。
【００２０】
本開示はさらに、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬと
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＨ
を含む単離されたタンパク質を提供し、該タンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００２１】
一例では、タンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う、ＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸及びＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００２２】
本開示はさらに、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬと
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＨ
を含む単離されたタンパク質を提供し、該タンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００２３】
一例では、ＶＬは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３、及び５６から成る群から選択される１以上（又は２以上）の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００２４】
一例では、ＶＬは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、及び５３から成る群から選択される１以上（又は２以上）の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００２５】
一例では、ＶＬは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＣＤＲ２の中での１以上（又は２以上）の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００２６】
負に荷電したアミノ酸が凝集耐性を付与するＶＬ内の例となる位置は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基５０、５１、５２、及び５３及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００２７】
負に荷電したアミノ酸が凝集耐性を付与するＶＬ内の位置の例となる組み合わせは、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５１；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５２；
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５３；
（ｉｖ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５１と５２；
（ｖ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５２と５３；
（ｖｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５１と５３；
（ｖｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５１と５２と５３；
（ｖｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５２と５３；
（ｉｘ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５０と５１と５２と５３
から成る群から選択される。
【００２８】
一例では、ＶＬはＫａｂａｔの番号付け方式に従う５０位と５２位と５３位にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００２９】
一例では、ＶＬはさらにＣＤＲ１又はＣＤＲ２にて荷電した残基を含む。
【００３０】
一例では、ＶＬはさらに、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＣＤＲ１における１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。例となる位置は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う２４位；
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う２９位；
（ｉｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う３０位と３１位；
（ｉｖ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う３１位と３２位
から成る群から選択される。
【００３１】
別の例では、タンパク質はさらに、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２６、３９、４０、５０、５２、５２ａ及び５３から成る群から選択される１以上の残基にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００３２】
追加の又は代わりの例では、タンパク質は凝集耐性のＶＬと、任意で凝集耐性のＶＨを含む。
【００３３】
一例では、負に荷電したアミノ酸残基は、本明細書で記載される領域内で表面に露出した残基である。この例によれば、タンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの５４位で負に荷電したアミノ酸を含まない。
【００３４】
一例では、負に荷電したアミノ酸残基は、抗原と直接相互作用しない、又は抗原との結合を形成しない、又は抗原と直接相互作用しない若しくは抗原との結合を形成しないと予測される残基に位置づけされる。相互作用又は結合形成を判定する方法は技量のある熟練者に明らかであろうし、それには、たとえば、分子モデル化又はＸ線結晶試験が挙げられる。
【００３５】
一例では、タンパク質は、上記で議論した負に荷電したアミノ酸を伴わないタンパク質に比べて凝集する傾向が低下している。たとえば、タンパク質は、負に荷電したアミノ酸を伴わないタンパク質に比べて少なくとも約６０℃又は７０℃又は好ましくは８０℃に加熱した後、凝集する傾向が低い。
【００３６】
一例では、タンパク質は、少なくとも約６０℃又は７０℃又は好ましくは８０℃に加熱した後、抗原に特異的に結合する能力を保持する。
【００３７】
別の例では、タンパク質は、濃縮の後、たとえば、凍結乾燥又は透析濾過による濃縮の後、凝集する低い傾向を有する。一例では、濃縮は、乾燥を含む。別の例では、濃縮は、タンパク質が少なくとも５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は８５％含有される組成物の体積を減らすことを含む。
【００３８】
たとえば、開示のタンパク質は、凍結乾燥及び再構成に続いて凝集する低い傾向を有する。たとえば、開示のタンパク質は、凍結乾燥及び再構成に続いて、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質よりも１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％少なく凝集し、その際、凝集は、濁度、たとえば、３２０ｎｍでの吸収を測定することによって測定する。
【００３９】
別の例では、開示のタンパク質は、透析濾過に続いて凝集する低い傾向を有する。たとえば、開示のタンパク質は、透析濾過に続いて、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質よりも１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％少なく凝集し、その際、凝集は、濁度、たとえば、３２０ｎｍでの吸収を測定することによって測定する。
【００４０】
一例では、タンパク質は、ヒトタンパク質に結合する（好ましくは特異的に結合する）ことが可能である。
【００４１】
別の例では、タンパク質は、ヒトの状態に関連する又はヒトの状態の原因となるタンパク質に結合する（好ましくは特異的に結合する）ことが可能である。そのようなタンパク質は、ヒトのタンパク質又は、たとえば、病原性生物に由来するタンパク質であり得る。一例ではタンパク質は、ヒトのタンパク質であることができる。例となるタンパク質は、可溶性である及び／又は分泌されたタンパク質又は受容体（たとえば、受容体の細胞外ドメイン）又は膜結合性タンパク質（たとえば、膜結合性タンパク質の細胞外ドメイン）である。
【００４２】
一例では、負に荷電したアミノ酸はグルタミン酸である。別の例では、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸である。
【００４３】
一例では、ＶＬにおける負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸である。
【００４４】
一例では、ＶＨの２８位及び／又は３０位及び／又は３１位及び／又は３３位及び／又は３５位における負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸である。
【００４５】
一例では、ＶＨの３２位における負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸である。
【００４６】
例となる形態では、タンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの３２位及び３３位にて負に荷電したアミノ酸を含む。別の例となる形態では、タンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの３１位及び３２位及び３３位にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００４７】
例となる形態の１つでは、開示のタンパク質は、ＶＬの５２位及び／又は５３位にて負に荷電したアミノ酸及びＶＨの３０位にて負に荷電したアミノ酸を含む。一例では、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸である。
【００４８】
ＶＨにおける負に荷電したアミノ酸の追加の例となる位置は、共所有され、同時係属である国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ２０１０／００１４１６に記載されており、その内容すべてが参照によって本明細書に組み入れられる。
【００４９】
本開示はまた、改善された凝集耐性を有する既存のタンパク質の修飾された形態を製造するのにも有用である。従って、本開示はさらに、抗原に特異的に結合することが可能である修飾されたＶＬを含むタンパク質を提供し、その際、ＶＬはＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含み、ＶＬの未修飾の形態は負に荷電したアミノ酸を含まない。
【００５０】
本開示はさらに、抗原に特異的に結合することが可能である修飾されたＶＬを含むタンパク質を提供し、その際、ＶＬはＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含み、ＶＬの未修飾の形態はその位置にて２以上の負に荷電したアミノ酸を含まない。
【００５１】
本開示はさらに、
（ｉ）ＶＬの未修飾の形態がその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む修飾されたＶＬ；と
（ｉｉ）ＶＨの未修飾の形態がその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む修飾されたＶＨ
を含むタンパク質を提供し、その際、修飾されたタンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００５２】
本開示はさらに、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸を含むＶＬ；と
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸を含むＶＨ
を含むように修飾されたタンパク質を提供し、その際、未修飾のタンパク質は、ＶＬにて負に荷電したアミノ酸及びＶＨにて負に荷電したアミノ酸を含まず、修飾されたタンパク質は抗原に特異的に結合することが可能である。
【００５３】
一例では、未修飾のタンパク質は修飾されたタンパク質と同一の抗原（たとえば、同一のエピトープ）に結合する。
【００５４】
一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の親和性定数（ＫＤ）は、未修飾のタンパク質の約５０％又は４０％又は３０％又は２０％又は１０％以内である。一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の親和性定数（ＫＤ）は、未修飾のタンパク質の約５％以内である。
【００５５】
一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の会合速度（Ｋａ）は未修飾のタンパク質の約５０％又は４０％又は３０％又は２０％又は１０％以内である。一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の会合速度（Ｋａ）は未修飾のタンパク質の約５％以内である。
【００５６】
一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の解離速度（Ｋｄ）は未修飾のタンパク質の約５０％又は４０％又は３０％又は２０％又は１０％以内である。一例では、抗原に結合する修飾されたタンパク質の解離速度（Ｋa）は未修飾のタンパク質の約５％以内である。
【００５７】
一例では、タンパク質は、修飾された凝集耐性のＶＬと、任意で修飾された凝集耐性のＶＨを含む。
【００５８】
そのようなタンパク質の例となる特徴（たとえば、負に荷電したアミノ酸及び／又は特定の負に荷電したアミノ酸についての追加の部位）は本明細書で記載され、開示の本形態に準用して適用されるように解釈されるべきである。
【００５９】
一例では、タンパク質は抗体である。
【００６０】
一例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるようなタンパク質は、たとえば、ＣＤＲ３内にてＣＤＲの範囲内でのジスルフィド結合、たとえば、ＣＤＲ内ジスルフィド結合を含まない。
【００６１】
別の例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるようなタンパク質の中での可変ドメインは全体的に酸性の等電点を有さない。
【００６２】
本開示の例となるタンパク質は、ヒトのタンパク質、ヒト化タンパク質、脱免疫化タンパク質又はヒトタンパク質若しくはその領域に融合されたタンパク質（たとえば、キメラ抗体）である。
【００６３】
一例では、本開示のタンパク質は、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）の形態又は別のタンパク質（たとえば、Ｆｃ領域又は免疫エフェクター細胞に結合することが可能であるタンパク質）に融合されたｄＡｂの形態である。
【００６４】
代わりの例では、本開示のタンパク質は、ＶＬとＶＨを含み、その際、ＶＨとＶＬは会合してＦｖを形成する（たとえば、抗原結合部位を含む）。一例では、Ｆｖは抗原を特異的に結合することが可能である。
【００６５】
一例では、ＶＨ及びＶＬは異なるポリペプチド鎖に存在する。たとえば、タンパク質は、抗体、二価抗体、三価抗体、四価抗体又はＦｖの形態である。
【００６６】
別の例では、ＶＨ及びＶＬは同一のポリペプチド鎖に存在する。たとえば、タンパク質は、（ｓｃＦｖ）ｎ又は（ｓｃＦｖ）ｎを含む融合タンパク質の形態であり、ｎは、たとえば、１〜１０の間の数である。
【００６７】
一例では、タンパク質は、約１０μＭ又は５μＭ未満、たとえば、１μＭ未満、たとえば、５００ｎＭ未満、たとえば、１００ｎＭ未満のような２００ｎＭ未満、たとえば、１ｎＭ未満のような１０ｎＭ未満の親和性定数（ＫＤ）にて標的抗原又はエピトープに特異的に結合する。
【００６８】
代わりの又は追加の例では、本明細書で議論されるタンパク質は、１００ｐＭのような、たとえば、１ｐＭのような１０ｐＭ未満の親和性定数（ＫＤ）にて標的抗原又はエピトープに特異的に結合する。
【００６９】
追加の又は代わりの例では、本開示のタンパク質は、３００ｎＭ以下、３００ｎＭ〜５ｐＭ、好ましくは５０ｎＭ〜２０ｐＭ、又は５ｎＭ〜２００ｐＭ又は１ｎＭ〜１００ｐＭのＫｄにて標的抗原から解離する。
【００７０】
一例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるタンパク質は、残基４９〜５６の間で少なくとも１又は２の負に荷電したアミノ酸又は少なくとも約８０％それに同一である配列を含むように修飾された配列番号１、３、７又は１１（たとえば、７又は１１）のいずれか１つで示される配列を含むＶＬを含む。
【００７１】
一例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるタンパク質は、配列番号９に示される配列を含むＶＬ及びＶＨを含み、その際、ＶＬは残基４９〜５６の間で少なくとも１又は２の負に荷電したアミノ酸又は少なくとも約８０％それに同一である配列を含むように修飾され、任意でＶＨは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上又は２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される。
【００７２】
一例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるタンパク質は、配列番号１３に示される配列を含むＶＬ及びＶＨを含み、その際、ＶＬは残基４９〜５６の間で少なくとも１又は２の負に荷電したアミノ酸又は少なくとも約８０％それに同一である配列を含むように修飾され、任意でＶＨは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上又は２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される。
【００７３】
任意で、前述の３つの段落にて記載されたタンパク質はＶＬにおけるＮ末端のグルタミンについて置換されたアスパラギン酸を含む。
【００７４】
一例では、任意の実施例に従って本明細書で記載されるタンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間で少なくとも１又は２の負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された配列番号１１に示される配列を含むＶＬを含み、該タンパク質はヒト表皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）に特異的に結合する。
【００７５】
一例では、タンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う５２位又は５３位又は５２位と５３位双方にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００７６】
一例では、タンパク質はさらに、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上又は２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された配列番号１３に示される配列を含むＶＨを含む。
【００７７】
一例では、ＶＨは３０位にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００７８】
本開示はまた、化合物に抱合された本開示のタンパク質を提供する。たとえば、化合物は、放射線同位元素、検出可能な標識、治療用化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象にて当該タンパク質の半減期を高める化合物及びそれらの混合物から成る群から選択される。
【００７９】
本開示はまた、本開示のタンパク質及び薬学上許容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００８０】
本開示はさらに本開示のタンパク質をコードする核酸を提供する。一例では、核酸は発現構築物の中にあり、操作可能にプロモータに連結される。たとえば、発現構築物は発現ベクターである。
【００８１】
本開示はまた、本開示のタンパク質を発現する細胞も提供する。たとえば、細胞は、本開示の核酸又は発現構築物を含む。例となる細胞には哺乳類細胞、植物細胞、真菌細胞及び原核細胞が挙げられる。
【００８２】
本開示はまた、本開示のタンパク質を製造する方法も提供し、該方法は、コードされたタンパク質が産生されるのに十分な条件下（又は産生されるような条件下）にてある時間、本開示の発現構築物を維持することを含む。たとえば、方法は、本開示のタンパク質が産生されるのに十分な条件下（又は産生されるような条件下）にてある時間、本開示の細胞を培養することを含む。
【００８３】
一例では、方法はさらに本開示のタンパク質を単離することを含む。一例では、方法はさらにタンパク質を単離する前、その間、又はその後、少なくとも約５０℃又は６０℃又は７０℃又は８０℃にタンパク質を加熱することを含む。たとえば、発現及び精製の過程で自然に生じる二量体及び／又は三量体の量をそれによって減らすように加熱する。そのような方法は本開示のタンパク質の高いレベルの回収を円滑にする。
【００８４】
任意で、方法はさらに、タンパク質を化合物に抱合する又は化合物を医薬組成物に製剤化することを含む。
【００８５】
本開示はさらに、本開示のタンパク質を複数含むライブラリを提供する。
【００８６】
本開示はまた、ＶＬを含むタンパク質を含むライブラリも提供し、ＶＬは、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む。
【００８７】
本開示はさらに、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質を含むライブラリを提供し、該タンパク質は、
（ａ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬと、
（ｂ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＨを含む。
【００８８】
一例では、ライブラリにおけるタンパク質の少なくとも３０％（又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％又は９８％又は９９％）が負に荷電したアミノ酸を含む。
【００８９】
本開示はまた、ＶＬを含むタンパク質を含むライブラリを提供し、ＶＬの少なくとも３０％（又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％又は９８％又は９９％）は、本明細書で記載されるように負に荷電したアミノ酸を含む。タンパク質はさらに本明細書で記載される位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＨを含むことができる。
【００９０】
一例では、タンパク質は粒子（たとえば、ファージ又はリボゾーム）又は細胞の表面で表示される。
【００９１】
一例では、上記で記載されるように位置づけられる負に荷電したアミノ酸以外のＶＬ及びＶＨ（存在すれば）のＣＤＲにおける（たとえば、ＣＤＲ３における、又はＣＤＲ１と３における、又はＣＤＲ１と２と３における）アミノ酸は無作為又は半無作為であり、又はヒト抗体に由来する。
【００９２】
明らかに、本開示はライブラリをコードする核酸のライブラリも提供する。
【００９３】
本開示はさらに、本開示のタンパク質を単離する方法を提供し、該方法は、タンパク質が抗原に結合するのに十分な条件下（結合するような条件下）である時間、本開示のライブラリを抗原に接触させること、及びタンパク質を単離することを含む。
【００９４】
本開示はさらに、本開示のタンパク質を複数含むライブラリを製造する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）上記で議論した位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬを含む複数のタンパク質をコードするアミノ酸を入手すること又は作製することと；
（ｉｉ）以下の操作可能に連結された核酸：
（ａ）プロモータ、
（ｂ）（ｉ）にて入手した又は作製した核酸、及び
（ｃ）細胞又は粒子にてＶＬを含有するタンパク質の発現を円滑にするポリペプチドをコードする核酸を含む発現構築物を作製することと；
（ｉｉｉ）細胞又は粒子にて発現されるように発現構築物によってコードされたタンパク質を発現することを含む。
【００９５】
一例では、負に荷電したアミノ酸以外のＶＬのＣＤＲにおける（たとえば、ＣＤＲ３における、又はＣＤＲ１と３における、又はＣＤＲ１と２と３における）アミノ酸は無作為又は半無作為であり、又はヒト抗体に由来する。
【００９６】
一例では、方法はさらにタンパク質をコードする核酸を単離することを含む。そのような核酸は発現構築物に導入することができる。任意でタンパク質を発現させることができる。
【００９７】
一例では、方法はさらにＶＬを含むタンパク質を１つ又は複数、熱に暴露すること及び／又はタンパク質を濃縮することと、負に荷電したアミノ酸を欠く対照タンパク質に比べて凝集する傾向が低下しているタンパク質を選択することを含む。
【００９８】
本開示はまた、たとえば、親和性成熟及び／又はヒト化及び／又は脱免疫化のような、単離されたタンパク質への修飾を熟考する。
【００９９】
そのような単離されたタンパク質を使用して、たとえば、抗体を作出することができる。
【０１００】
本開示はまた、既存の抗体又はＶＬを含み、任意でＶＨを含むタンパク質の凝集傾向を低下させること又は凝集耐性を高めることにも有用である。たとえば、本開示は、ＶＬを含むタンパク質の凝集耐性を高める方法を提供し、方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置におけるアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することを含む。
【０１０１】
本開示はさらに、ＶＬを含むタンパク質の凝集耐性を高める方法を提供し、方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにＶＬを修飾することを含み、その際、未修飾のタンパク質は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＣＤＲ２の中に２以上の負に荷電したアミノ酸を含まない。
【０１０２】
本開示はさらに、ＶＬ及びＶＨを含むタンパク質の凝集耐性を高める方法を提供し、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むようにタンパク質を修飾することを含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない。
【０１０３】
一例では、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む。
【０１０４】
本開示はさらに、ＶＬ及びＶＨを含むタンパク質の凝集耐性を高める方法を提供し、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むようにタンパク質を修飾することを含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない。
【０１０５】
たとえば、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む。
【０１０６】
一例では、方法はさらに、ＶＬがＣＤＲ１にて１以上の負に荷電したアミノ酸をさらに含み、及び／又はＶＨがＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基２６、３９、４０、５０、５２、５２ａ及び５３から成る群から選択される１以上の残基にて負に荷電したアミノ酸をさらに含むようにタンパク質を修飾することを含む。
【０１０７】
修飾の追加の部位及び／又は置換され得る特定のアミノ酸残基は、本明細書で記載され、本実施例に準用して適用されるように解釈されるべきである。
【０１０８】
一例では、方法は、タンパク質からＶＬ（及び任意でＶＨ）を単離することと、本開示の方法に従ってＶＬ（及び任意でＶＨ）を修飾することと、ＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質を作出することを含む。たとえば、方法は、抗体からＶＬ（及び任意でＶＨ）を単離することと、本開示の方法に従ってＶＬ（及び任意でＶＨ）を修飾することと、修飾されたＶＬ（及び任意でＶＨ）を含む抗体を作出することを含む。
【０１０９】
一例では、方法はさらに修飾されたタンパク質の抗原に結合する能力を判定することを含む。一例では、方法はさらに、たとえば、未修飾のタンパク質に類似した（たとえば、約１０％以内）親和性（たとえば、３／４、Ｋａ及び／又は３／４）を持つ抗原に結合する修飾されたタンパク質を選択することを含む。
【０１１０】
一例では、本開示の方法はさらに、本開示に係る同一の以下の修飾を含むＶＬ（及び任意でＶＨ）又はタンパク質を親和性成熟させること及び／又はタンパク質を脱免疫化させること及び／又はタンパク質をキメラ化させることを含む。
【０１１１】
一例では、方法はさらに、修飾されたタンパク質を熱に暴露すること及び／又はタンパク質を濃縮することと、未修飾のタンパク質に比べて凝集する傾向が低いタンパク質を選択することを含む。
【０１１２】
一例では、本開示の方法は、ＶＬ（及び任意でＶＨ）に追加のアミノ酸を挿入する（置換することに対抗して）ことを含まない。
【０１１３】
上述の方法は、タンパク質の発現を高める及び／又はわずかな凝集と共に高い濃度で保存が可能なタンパク質を製造する及び／又はクロマトグラフィ樹脂からのタンパク質の回収を増やす又はクロマトグラフィ樹脂からタンパク質を回収することを必要とする溶液の体積を減らす方法を準用して適用されると解釈されるべきである。
【０１１４】
たとえば、本開示は、抗体ＶＬを含む可溶性タンパク質の生産のレベルを高める方法を提供し、該方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基５１、５２及び５３から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することを含み、その際、産生される可溶性タンパク質のレベルは、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の産生レベルに比べて高められる。
【０１１５】
本開示はさらに抗体ＶＬを含む可溶性タンパク質の産生のレベルを高める方法を提供し、該方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにＶＬを修飾することを含み、その際、未修飾のタンパク質はＫａｂａｔの番号付け方式に従うＣＤＲ２の中で２以上の負に荷電したアミノ酸を含まず、産生される可溶性タンパク質のレベルは、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の産生レベルに比べて高められる。
【０１１６】
本開示はさらに抗体ＶＬ及びＶＨを含む可溶性タンパク質の産生のレベルを高める方法を提供し、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにタンパク質を修飾することを含み、その際、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まず、産生される可溶性タンパク質のレベルは、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の産生レベルに比べて高められる。
【０１１７】
一例では、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む。
【０１１８】
本開示はまた、クロマトグラフィ樹脂からタンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積を減らす方法も提供し、該方法は、任意の実施例に従って本明細書で記載されるようにタンパク質又は修飾されたタンパク質でクロマトグラフィを実施することを含む。
【０１１９】
本開示はまた、クロマトグラフィ樹脂から抗体ＶＬを含むタンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積を減らす方法も提供し、該方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基５１、５２及び５３から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってタンパク質のＶＬを修飾することを含み、その際、クロマトグラフィ樹脂からタンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積のレベルは、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の体積と比べて低下する。
【０１２０】
本開示はまた、クロマトグラフィ樹脂から抗体ＶＬを含むタンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積を減らす方法も提供し、該方法は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにＶＬを修飾すること、及びクロマトグラフィを実施することを含み、その際、未修飾のタンパク質はＫａｂａｔの番号付け方式に従うＣＤＲ２の中で２以上の負に荷電したアミノ酸を含まず、タンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積は、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の体積と比べて低下する。
【０１２１】
本開示はさらに、クロマトグラフィ樹脂から抗体ＶＬ及びＶＨを含むタンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積を減らす方法を提供し、該方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶLの残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにタンパク質を修飾すること、及びクロマトグラフィを実施することを含み、その際、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まず、タンパク質を回収するのに必要とされる溶液の体積は、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の体積と比べて低下する。
【０１２２】
一例では、方法は、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む。
【０１２３】
一例では、クロマトグラフィはサイズ排除クロマトグラフィ又は結合溶出クロマトグラフィである。
【０１２４】
本開示はまた医療における本開示のタンパク質又は本開示の組成物の使用を提供する。
【０１２５】
本開示はまた対象における状態を治療する又は予防する方法も提供し、該方法は、それを必要とする対象に本開示のタンパク質又は組成物を投与することを含む。一例では、対象は癌及び／又は炎症性疾患及び／又は自己免疫疾患及び／又は神経学的疾患を病んでいる。
【０１２６】
本開示はまた、状態を治療する又は予防するための薬物の製造における本開示のタンパク質の使用も提供する。
【０１２７】
本開示はまた、化合物を細胞に送達する方法も提供し、該方法は本開示のタンパク質又は組成物に細胞を接触させることを含む。
【０１２８】
本開示はまた、対象における状態を診断する又は予後予測する方法を提供し、該方法は、タンパク質が抗原に結合し、複合体を形成するように対象に由来する試料を本開示のタンパク質又は組成物に接触させることと、該複合体を検出することを含み、その際、複合体の検出が対象における状態の診断又は予後予測である。一例では、方法は、複合体のレベルを測定することを含み、その際、前記複合体の増大したレベル又は低下したレベルが対象における状態の診断又は予後予測である。
【０１２９】
本開示はさらに対象における抗原を局在化する又は検出する方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）タンパク質が抗原に結合するように本開示のタンパク質又は組成物を対象に投与することと、
（ｉｉ）生体内で検出可能な標識を局在化する又は検出することを含み、
タンパク質は検出可能な標識に抱合される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】ＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含むＤＰＫ９由来のＶＬの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。Ｙ軸は、本明細書で例示されるファージでの「加熱／冷却」アッセイに供した場合の保持されたタンパク質Ｌの結合の比率を示す。ＤＰＫ９は低レベルの凝集耐性を有するＶＬの例である。
【図２】残基４９〜５６の間で単一の負に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸）の交換及びその組み合わせを含むＤＰＫ９由来のＶＬの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。Ｙ軸は、本明細書で例示されるファージでの「加熱／冷却」アッセイに供した場合の保持されたタンパク質Ｌの結合の比率を示す。
【図３】５２位及び５３位にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＬのライブラリの個々のメンバーの凝集耐性を示すグラフである。野生型可変ドメイン（ＷＴ）の凝集耐性も示す。Ｙ軸は、未処理の対照に比べたファージでの加熱した及び冷却した可変ドメインのタンパク質Ｌへの結合の比率を示す。***ｐ＜０．００１
【図４Ａ】８５℃に加熱した後のＶＬの濁度を示すグラフである。負に荷電したアミノ酸を含まないＶＬ（ＤＰＫ９）、負に荷電したアミノ酸を１つ含むＶＬ（５０Ｄ、５１Ｄ、５２Ｄ又は５３Ｄ）、負に荷電したアミノ酸を２つ含むＶＬ（５０／５２ＤＤ、５０／５３ＤＤ、５１／５３ＤＤ、５２／５３ＤＤ）及び負に荷電したアミノ酸を３つ含むＶＬ（５０〜５３ＤＡＤＤ）及び負に荷電したアミノ酸を４つ含むＶＬ（５０〜５３ＤＤＤＤ）を用いて生成した結果を示す。X軸はＶＬが８５℃で維持される時間を示す。Ｙ軸は３６０ｎｍで測定した吸収を示す。
【図４Ｂ】１００μＭの可溶性タンパク質として８５℃に加熱した後、ＶＬのＣＤＲ２にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含むＤＰＫ９に由来するＶＬの凝集耐性を示すグラフである。ＶＬの凝集は濁度の測定として（Ｙ軸で示すように）３２０ｎｍでの吸収によって判定する。ＤＰＫ９は低レベルの凝集耐性を有するＶＬの例である。
【図５Ａ】可溶性の発現レベルのような改善された生物物理学的特性を持つ負に荷電したアミノ酸を含む生殖細胞系列ＶＬドメインＤＰＫ９（５Ａ）、ゲル濾過カラムでの保持（５Ｂ）及び加熱後の精製されたタンパク質の凝集耐性（５Ｂ）を示す一連のグラフである。「１×」は負に荷電したアミノ酸が１つ、「２×」は負に荷電したアミノ酸が２つ、「３×」は負に荷電したアミノ酸が３つである。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６】残基５０〜５３の間で単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含むアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）由来のＶＬの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。ＤＰＫ９は低レベルの凝集耐性を有するＶＬの例である。「ＷＴ」はアダリムマブのＶＬである。
【図７】残基５０〜５３の間で単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む抗体４Ｄ５由来のＶＬの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。ＤＰＫ９は低レベルの凝集耐性を有するＶＬの例である。「ＷＴ」は４Ｄ５のＶＬである。
【図８Ａ】ＶＬのＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む抗体４Ｄ５由来のｓｃＦｖの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図８Ｂ】ＶＬのＣＤＲ２にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む抗体４Ｄ５由来のｓｃＦｖの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図９】（Ｘ軸上で示すように）残基５０〜５３の間で単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖ及びその変異形態のＨｅｒ２への結合を示すグラフである。Ｙ軸は４５０ｎｍで測定した吸収を示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１０】加熱前の結合レベルの比率としての、８０℃に加熱した後の残基５０〜５３の間で単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖ及びその変異形態のＨｅｒ２への結合を示すグラフである。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１１】ＶＬのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１２】ＶＬのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖの凝集耐性を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１３】ＶＬのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖの抗原への結合を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。Ｙ軸は４５０ｎｍでの吸収を示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１４】ＶＬのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ１にて単一の負に荷電したアミノ酸の交換及びその組み合わせを含む４Ｄ５由来のｓｃＦｖの８０℃に加熱した後の抗原への結合を示すグラフである。置換の位置取りはＸ軸上で示す。「ＷＴ」は４Ｄ５のｓｃＦｖである。
【図１５】４Ｄ５から作出されたｓｃＦｖの変異形態の凝集を示すグラフである。変異の位置は、上に記すＶＨの変異及び下に記すＶＬの変異によって各線について示す。「ＷＴ」は野生型４Ｄ５の配列を意味する。Ｘ軸は時間（分）を表し、０時間は８０℃への加熱の開始である。Ｙ軸は濁度の測定として３６０ｎｍで測定した吸収を表す。
【図１６Ａ】フローサイトメトリーで測定したときのＶＨのＣＤＲ１及びＶＬのＣＤＲ２にて変異を含有する完全なＩｇＧとしての４Ｄ５のＳＫ−ＢＲ−３細胞への結合曲線を示すグラフである。
【図１６Ｂ】４d５（ＷＴ／ＷＴ）及びＶＨ（３０Ｄ／ＷＴ）、ＶＬ（ＷＴ／５２Ｄ）、ＶＨとＶＬ（３０Ｄ／５２Ｄ）にて負に荷電したアミノ酸を含有するその変異体又はアイソタイプ対照抗体によるＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖の阻害を示すグラフである。データはアイソタイプ対照の存在下での増殖比率として表す。
【図１７Ａ】サイズ排除クロマトグラフィで測定したときの、それぞれＣＤＲＨ１及びＣＤＲＬ２にて負に荷電したアミノ酸を含有する生殖細胞系列ＶＨ３ＤＰ４７及び生殖細胞系列ＶＬｋＤＰＫ９を含むヒトＩｇＧ１の溶出特性を示す図である。Ｘ軸は溶出容積全体を示す。Ｙ軸は２８０ｎｍでの吸収を示す。
【図１７Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィで測定したときの、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＬ２にて負に荷電したアミノ酸を含有するＩｇＧ全体としての４Ｄ５の溶出特性を示す図である。Ｘ軸は溶出容積全体を示す。Ｙ軸は２８０ｎｍでの吸収を示す。
【図１７Ｃ】サイズ排除クロマトグラフィで測定したときの、ＣＤＲＬ２にて負に荷電したアミノ酸を含有する（示すように単一又は三重）ＤＰＫ９のＶＬの溶出特性を示す図である。Ｘ軸は溶出容積全体を示す。Ｙ軸は２８０ｎｍでの吸収を示す。
【０１３１】
配列表への鍵
配列番号１はＤＰＫ９のＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号２はＤＰＫ９のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３はＶＬｋＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号４はＶＬｋＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号５は対照ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号６は対照ｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号７はアダリムマブ由来のＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号８はアダリムマブ由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号９はアダリムマブ由来のｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１０はアダリムマブ由来のｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１１は対照４Ｄ５由来のＶＬのアミノ酸配列である。
配列番号１２は対照４Ｄ５由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１３は対照４Ｄ５由来のＶＨのアミノ酸配列である。
配列番号１４は対照４Ｄ５由来のＶＨをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号１５は対照４Ｄ５由来のｓｃＦｖのアミノ酸配列である。
配列番号１６は対照４Ｄ５由来のｓｃＦｖを
コードするヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
一般
この明細書全体を通して、具体的に言及されない限り又は文脈が要求しない限り、単一工程、内容の組成、工程の群又は内容の組成の群に対する参照は、それらの工程、内容の組成、工程の群又は内容の組成の群の１つ及び複数（すなわち、１以上）を包含するように解釈されるべきである。
【０１３３】
当業者は、本開示が具体的に記載されたもの以外の変更及び改変を受け入れる余地があることを十分に理解するであろう。本開示がそのような変更及び改変を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書を参照する又はそれに記載される工程、特徴、組成物及び化合物すべてを個々に又はまとめて含み、且つ前記工程又は特徴の任意の若しくはすべての組み合わせ又はそれらの２以上を含む。
【０１３４】
本開示は、例示のみを目的とすることが意図される本明細書で記載される具体的な例による範囲で限定されることはない。機能的に同等の生成物、組成物及び方法は明らかに本明細書で記載されるような本開示の範囲内にある。
【０１３５】
本明細書における開示の任意の実施例は、具体的に言及されない限り、開示の他の実施例を準用して適用されると解釈されるべきである。
【０１３６】
抗体のＶＬを含むタンパク質又はその使用を指向する本明細書の任意の実施例は、免疫グロブリンの可変ドメイン及びその使用を準用して適用されると解釈されるべきである。
【０１３７】
具体的に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて当業者（たとえば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学）によって一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【０１３８】
指示されない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学の技法は当業者に周知の常法である。そのような技法は、たとえば、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１及び２巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ及びＢ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１−４巻，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６），並びにＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの改訂すべてを含む），Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編者）  抗ｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），並びにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの改訂すべてを含む）のような情報源における文献全体を通して記載され、説明されている。
【０１３９】
本明細書における可変ドメイン及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ（１９８７及び／又は１９９１），Ｂｏｒｋら、（１９９４）及び／又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７及び１９８９）又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）における議論によってさらに明確化され得る。
【０１４０】
用語「及び／又は」、たとえば、「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するように理解されるべきであり、双方の意味又はいずれかの意味に対する明確な支持を提供するように解釈されるべきである。
【０１４１】
本明細書の全体を通して、語句「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又はたとえば、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のようなその変異形は、言及される要素、整数又は工程、又は要素、整数又は工程の群の包含を意味するが、他の要素、整数又は工程、又は要素、整数又は工程の群の排除を意味しないように理解されるであろう。
【０１４２】
本明細書で使用されるとき、「に由来する」は、特定の整数が、必ずしもその供給源から直接得られるものではないが、特定の供給源から得られ得ることを指し示すように解釈されるべきである。
【０１４３】
アミノ酸の残基又は位置を参照する場合の用語「間」は、列記される最後の残基を含む。たとえば、「残基４９〜５６の間」は、残基４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５及び５６を含む。
【０１４４】
本開示の文脈にて、マーカッシュ群（すなわち、「から成る群から選択される」）への参照は、「から成る群から個々に又はまとめて選択される」についての明確な支持を含み、提供するように理解されるであろう。
【０１４５】
「個々に」によって、開示は、言及される残基又は残基の群を別々に包含し、個々の残基又は残基の群が本明細書では別々に列記されないかもしれないにもかかわらず、添付のクレームはそのような残基又は残基の群を互いに別々に且つ分割可能に定義し得ることを意味する。
【０１４６】
「まとめて」によって、開示は、任意の数の又は組み合わせの言及される残基又は残基の群を包含し、そのような数の又は組み合わせの言及される残基又は残基の群が本明細書では具体的に列記されないかもしれないにもかかわらず、添付のクレームは、残基又は残基の群の他の組み合わせとは別に且つ分割可能にそのような組み合わせ又は下位組み合わせを定義し得ることを意味する。
【０１４７】
選択された定義
本明細書で使用されるとき、「凝集」は、自然の状態に又は非凝集状態にタンパク質を折り畳み直す剤でタンパク質を処理しないと元に戻せないタンパク質間の会合又はタンパク質の結合を意味する。そのような凝集は機能の喪失、自然の折り畳みの喪失、及び／又は細胞傷害性若しくは免疫原性の獲得を招き得る。この定義には、生体内で形成される有害で非機能的なタンパク質の集合体及び生物医学研究及びバイオテクノロジーにて試験管内で形成される非機能的なタンパク質の集合体が含まれる。しかしながら、それには、等電点析出又は「塩析」析出は含まれず、そこでは、天然様の緩衝液条件に移すと構成しているタンパク質は直ちにその可溶性の天然の状態に戻る。
【０１４８】
「凝集耐性」によって、タンパク質を変性させる又はタンパク質若しくはそのドメインの凝集を誘導する若しくは促進する条件（たとえば、加熱又は長期保存（たとえば、少なくとも約１週間又は１ヵ月又は２ヵ月又は３ヵ月又は１２ヵ月）のようなある期間の保存又は濃縮）に暴露した後、本開示のタンパク質が、本明細書で記載される負に荷電したアミノ酸を含まないタンパク質に比べて、凝集しない又は低下したレベル（たとえば、１０％未満又は２０％未満又は３０％未満又は４０％未満又は５０％未満又は６０％未満又は７０％未満又は８０％未満又は９０％未満）で凝集する、及び／又は立体構造特異的に折り畳み直し、結合相手に結合することが可能であることを意味する。たとえば、条件に暴露した後、タンパク質は抗原及び／又は、たとえば、プロテインＡ又はプロテインＬのようなスーパー抗原に特異的に結合することが可能である。一例では、部分的な又は完全な変性（又は折り畳み構造がほどけること）の後、タンパク質は抗原又はスーパー抗原への特異的な結合を可能にする立体構造に折り畳み直すことが可能である。例となるタンパク質は、タンパク質又はそのドメインを一般に変性させる条件（たとえば、熱）に暴露した後、有意に凝集しない。たとえば、複数の前記タンパク質を含む組成物における本開示のタンパク質の約１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％を超えるものが、たとえば、６０℃又は７０℃又は８０℃での加熱に暴露した後、凝集しない。従って、本開示のタンパク質は加熱に対して折り畳み直し可能であるともみなされ得る。別の例では、タンパク質はたとえば、凍結乾燥及び／又は室温での濃縮によって濃縮された場合、凝集しない。たとえば、タンパク質は、凍結乾燥及び／又は室温での濃縮（たとえば、透析濾過による）の後、負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質よりも約１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％少なく凝集する。
【０１４９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、複数のポリペプチド鎖、たとえば、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）で構成される可変ドメインを含むタンパク質を意味するように解釈されるべきである。抗体はまた一般に定常ドメインも含み、それは、定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）に配置され得る。抗体は１又は２、３の密接に関係する抗原に特異的に結合することができる。一般に、抗体はその基本単位として４鎖構造を含む。完全長の抗体は２つの軽鎖（各およそ２３ｋＤ）に共有結合する２つの重鎖（各およそ５０〜７０ｋＤ）を含む。軽鎖は一般に可変ドメインと定常ドメインを含み、哺乳類ではκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は一般に可変ドメインと、ヒンジ領域によって追加の定常ドメインに連結される１又は２の定常ドメインを含む。哺乳類の重鎖は以下の型、α、δ、ε、γ又はμの１つである。各軽鎖はまた重鎖の１つに共有結合する。たとえば、２つの重鎖と重鎖及び軽鎖は鎖間ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒に保持される。鎖間ジスルフィド結合の数は抗体の異なる型の間で異なり得る。各鎖は、Ｎ末端可変ドメイン（それぞれおよそ１１０アミノ酸の長さであるＶＨ又はＶＬ）及びＣ末端における１以上の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは（およそ１１０アミノ酸の長さであるＣＬ）は、重鎖の第１定常ドメイン（およそ３３０〜４４０アミノ酸の長さであるＣＨ）と共に並び、それにジスルフィド結合する。軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと共に並ぶ。抗体の重鎖は２以上の追加のＣＨドメイン（たとえば、ＣＨ２、ＣＨ３等）を含むことができ、ＣＨ１とＣＨ２の定常ドメイン間で特定することができるヒンジ領域を含むことができる。抗体は、任意の型（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡi及びＩｇＡ２）又はサブクラスであることができる。一例では、抗体はＩｇＧ３のようなＩｇＧである。一例では、抗体はネズミ類（マウス又はラット）の抗体又は霊長類（たとえば、ヒト）の抗体である。用語「抗体」はまた、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体も包含する。この用語は、Ｔ細胞受容体のような抗体様の分子を包含せず、そのような分子は用語「免疫グロブリン」によって包含される。
【０１５０】
本明細書で使用されるとき、「可変ドメイン」は、ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにＦＲのアミノ酸配列を含む、本明細書で定義されるような抗体又は免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の一部を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本開示で使用される方法によれば、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸の部分はＫａｂａｔ（１９８７及び１９９１年）に従って定義され、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従って番号が付けられる。技量のある熟練者は、本開示の実施における他の番号付け方式、たとえば、ＣｌｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（１９８７）及び／又はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９）及び／又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）の超可変ループ番号付け方式を容易に使用することができるであろう。たとえば、ＶＬのＣＤＲ２はＫａｂａｔ又はＣｌｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）及び／又はＣｈｏｔｈｉａ（１９８９）の番号付け方式を用いて同一位置にて定義される。
【０１５１】
本明細書で使用されるとき、「重鎖可変ドメイン」又は「ＶＨ」は１以上の抗原に結合する、好ましくは１以上の抗原に特異的に結合する、且つＣＤＲ１を含むことが可能であるタンパク質を意味するように解釈されるべきである。好ましくは、重鎖は３つのＣＤＲと一緒に３つ又は４つのＦＲ（たとえば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意でＦＲ４）を含む。一例では、重鎖は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従って番号付けられた以下のような残基１〜３０（ＦＲI）、２６〜３５又は３１〜３５（又は３５ｂ）（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）及び１０３〜１１３（ＦＲ４）に位置づけられるＦＲ及びＣＤＲを含む。一例では、重鎖は、前記重鎖及び複数（好ましくは３又は４）の定常ドメインを含む抗体に由来し、又は定常断片（Ｆｃ）に連結される。
【０１５２】
本明細書で使用されるとき、「軽鎖可変ドメイン」又は「ＶＬ」は、１以上の抗原に結合する、好ましくは１以上の抗原に特異的に結合する、且つＣＤＲ１を含むことが可能であるタンパク質を意味するように解釈されるべきである。好ましくは、軽鎖は３つのＣＤＲと一緒に３つ又は４つのＦＲ（たとえば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意でＦＲ４）を含む。好ましくは、軽鎖は、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従って番号付けられた以下のような残基１〜２３（ＦＲｌ）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）及び９８〜１０７（ＦＲ４）に位置づけられるＦＲ及びＣＤＲを含む。一例では、軽鎖は定常ドメイン１つに連結される前記軽鎖を含む抗体に由来し、及び／又は定常断片（Ｆｃ）に連結されない。
【０１５３】
本開示の一部の例では、用語「フレームワーク領域」はＣＤＲの残基以外の可変ドメインの残基を意味するように理解されるであろう。天然に存在する抗体の各可変ドメインは通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として定義される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従って定義されるのであれば、例となる軽鎖ＦＲ（ＬＣＦＲ）残基は、残基１〜２３（ＬＣＦＲｌ）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）にほぼ位置づけられる。λＬＣＦＲ１はＫＬＣＦＲＩに含まれる残基１０を含まないことに留意のこと。例となる重鎖ＦＲ（ＨＣＦＲ）残基は、１〜３０（ＨＣＦＲｌ）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）にほぼ位置づけられる。
【０１５４】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又は超可変ドメイン）は、その存在が抗原結合に必要である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として特定される３つのＣＤＲを有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔ（１９８７又は１９９１又は１９９２）によって定義されたような「相補性決定領域」に由来するアミノ酸残基を含み得る。本開示の一例では、重鎖可変ドメインでは、ＣＤＲＨ１は、Ｋａｂａｔ番号付け方式に従う残基２６〜３５（又は３５ｂ）の間、ＣＤＲＨ２は残基５０〜６５の間、及びＣＤＲＨ３は残基９５〜１０２の間にある。軽鎖では、ＣＤＲＬ１はＫａｂａｔ番号付け方式に従う残基２４〜３４の間、ＣＤＲＬ２は残基５０〜５６の間、及びＣＤＲＬ３は残基８９〜９７の間にある。これらのＣＤＲはまた、たとえば、Ｋａｂａｔ（１９８７又は１９９１又は１９９２）にて記載されたように多数の挿入も含み得る。
【０１５５】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドで構成されるようと単一のポリペプチドで構成されようと、ＶＬとＶＨが会合し、抗原結合部位を有する、すなわち、抗原に特異的に結合することが可能である複合体を形成するタンパク質を意味するように解釈されるべきである。抗原結合部位を形成するＶＨ及びＶＬは単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖にあることができる。さらに、本開示のＦｖは（本開示の任意のタンパク質と同様に）、同一の抗原に結合してもよい又はしなくてもよい複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片と同様に組換え手段を用いて作製されるそのような断片に相当するタンパク質を包含するように理解されるべきである。一部の例では、ＶＨは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）１に連結されず、及び／又はＶＬは軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結されない。例となるＦｖを含有するポリペプチド又はタンパク質には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、四価抗体又はさらに高次の複合体、ドメイン抗体（たとえば、ＶＨ）又は定常領域若しくはそのドメイン、たとえば、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインに連結される前述のいずれかが挙げられる。「Ｆａｂ断片」は、抗体の一価の抗原結合断片から成り、免疫グロブリン全体を酵素パパインで消化し、未処理の軽鎖及び重鎖の一部から成る断片を得ることによって作製することができ、又は組換え手段によって作製することができる。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、抗体全体をペプシンで処理し、その後還元して未処理の軽鎖及び重鎖の一部から成る分子を得ることによって得ることができる。２つのＦａｂ’断片がこの方法で処理した抗体当たり得られる。Ｆａｂ’断片はまた組換え手段によっても作製することができる。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は２つのジスルフィド結合によって一緒に保持される２つのＦａｂ’断片の二量体から成り、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後還元しないことによって得られる。「Ｆａｂ２」断片は、たとえば、ロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いて連結した２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、好適な自由度の高いポリペプチドリンカーによってＶＬとＶＨが共有結合される抗体の可変ドメイン断片（Ｆｖ）を含有する組換え分子である。この用語の範囲に入る例となるＦｖを含有するタンパク質の詳細な議論は本明細書にて以下で提供される。
【０１５６】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合することが可能であるタンパク質によって形成される構造を意味するように解釈されるべきである。抗原結合部位は、一連の隣接したアミノ酸である必要はなく、さらに単一のポリペプチド鎖である必要はない。たとえば、２つの異なるポリペプチド鎖から作製されたＦｖでは、抗原結合部位は、抗原と相互作用し、各可変ドメインのＣＤＲの１以上に一般にあるが、常にそうとは限らないＶＬ及びＶＨの一連の領域で構成される。一例では、抗原結合部位への本明細書での参照は、抗体のＣＤＲ又はその可変領域への参照である。
【０１５７】
「定常ドメイン」は、その配列が同一型、たとえば、ＩｇＧ又はＩｇＭ又はＩｇＥの抗体にて高度に類似する抗体におけるドメインである。抗体の定常領域は一般に複数の定常ドメインを含み、たとえば、γ、α及びδ重鎖の定常領域は３つの定常ドメインを含み、γ、α及びδ重鎖のＦｃは２つの定常ドメインを含む。μ及びε重鎖の定常領域は４つの定常ドメインを含み、Ｆｃ領域は２つの定常ドメインを含む。
【０１５８】
用語「結晶化可能な断片」又は「Ｆｃ」は本明細書で使用されるとき、少なくとも１つの定常ドメインを含み、一般に（必ずしもではないが）グリコシル化され、１以上のＦｃ受容体及び／又は補体カスケード（たとえば、エフェクター機能を付与する）の成分に結合する抗体の一部を指す。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかから選択することができる。さらに、種々のサブクラス（たとえば、重鎖のＩｇＧサブクラス）は異なるエフェクター機能に関与するので、所望の重鎖定常領域を選択することによって所望のエフェクター機能を持つタンパク質を作製することができる。好まれる重鎖定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）及びガンマ３（ＩｇＧ３）である。
【０１５９】
「Ｋａｂａｔの番号付け方式」によって、Ｋａｂａｔ（１９８７及び／又は１９９１及び／又は１９９２）にて設定された方式に一致する方法での免疫グロブリンの可変ドメインにおける残基を番号付けする方式を意味する。
【０１６０】
用語「表面に露出した」は、タンパク質が存在する又は懸濁される溶媒と接触するのが可能なように折り畳まれる場合、アミノ酸の側鎖が表面にあることを意味するように理解されるべきである。ＶＬの場合、表面に露出した残基は、たとえば、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５５から成る群から選択される。Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの５４位は一般に表面に露出されない。アミノ酸が表面に露出されるかどうかを予測する方法は、当該技術で既知であり、たとえば、Ｈｏｌｂｒｏｏｋら（１９９０）に記載されている。
【０１６１】
用語「タンパク質」は、単一のポリペプチド、すなわち、ペプチド結合によって連結される一連の隣接するアミノ酸又は互いに共有結合若しくは非共有結合で連結される一連のポリペプチド（すなわち、ポリペプチド複合体）を含むように解釈されるべきである。たとえば、一連のポリペプチドは好適な化学結合又はジスルフィド結合を用いて共有結合することができる。非共有結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が挙げられる。本開示によって熟考される非共有結合は、たとえば、二価抗体又は三価抗体又は四価抗体又は抗体の一部の形態におけるＶＨとＶＬの間での相互作用である。
【０１６２】
用語「ポリペプチド」はペプチド結合によって連結される一連の隣接するアミノ酸を意味する前述の段落から意味するように理解されるであろう。
【０１６３】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原」は、それに対して免疫グロブリン反応（たとえば、抗体反応）を生じることができる物質の任意の組成を意味するように理解されるべきである。例となる抗原には、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、リン酸基、ホスホル−ペプチド又はポリペプチド、グリコシル化されたペプチド又はペプチド等が挙げられる。
【０１６４】
本明細書で使用されるとき、用語「特異的に結合する」又は「特異的に結合する」は、本開示のタンパク質が、代わりの抗原又は細胞よりも特定の抗原（単数）又は抗原（複数）又は細胞と頻繁に、迅速に、長い持続時間で及び／又は大きな親和性で反応する又は会合することを意味するように解釈されるべきである。たとえば、ある抗原に特異的に結合するタンパク質は、他の抗原に結合するよりも大きな親和性、結合活性で、容易に及び／又は長い持続時間でその抗原に結合する。この定義を読むことによって、たとえば、第１の抗原に特異的に結合するタンパク質は、第２の抗原に特異的に結合してもよく、又はしなくてもよいことも理解される。そのようなものとして、「特異的な結合」は、別の抗原の排他的な結合又は検出できない結合を必ずしも必要としない。一般に、しかし必然的ではなく、結合への参照は特異的な結合を意味し、各用語は他の用語に対する明白な支持を提供するように理解されるべきである。
【０１６５】
本明細書で使用されるとき、ＶＬ（及び任意でＶＨ）の文脈にて用語「修飾された」は、ＶＬの配列が元々の（未修飾の）ＶＬに比べて変更されることを意味する。たとえば、残基４９〜５６の間にて負に荷電したアミノ酸以外のアミノ酸を含むＶＬは、これらのアミノ酸の１以上を負に荷電したアミノ酸で置換するように修飾される。たとえば、ＶＬは残基４９〜５６の間にて修飾されて、これらの位置にて負に荷電したアミノ酸の数を、たとえば、合計１又は２又は３又は４又は５以上に増やす。例となる形態の１つでは、言及された位置での負に荷電したアミノ酸の数は少なくとも２に増やされる。
【０１６６】
可変ドメインを含有するタンパク質
本開示は、１以上の抗原に特異的に又は選択的に結合し、任意の実施例に従って本明細書で記載されるように修飾される免疫グロブリンの軽鎖可変ドメインを含むタンパク質を熟考する。用語「免疫グロブリン」はＫａｂａｔの番号付け方式に一致する免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質を含むように技量のある熟練者によって理解されるであろう。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例にはＴ細胞受容体が挙げられる。
【０１６７】
一例では、本開示は、たとえば、抗原結合部位に基づいて１以上の抗原に特異的に又は選択的に結合し、任意の実施例に従って本明細書で記載されるように修飾される抗体のＶＬを含むタンパク質を熟考する。
【０１６８】
抗体の可変ドメイン
本明細書の記載に基づいて技量のある熟練者に明らかなように、本開示のタンパク質は、本明細書で記載される位置にて負に荷電したアミノ酸を含むように修飾された抗体の１以上のＶＬ（及び場合によっては、修飾することができるが、必ずしも本明細書で記載されるように修飾されないＶＨ）を含むことができる。そのようなタンパク質には抗体（たとえば、全体としての又は完全長の抗体）が挙げられる。そのような抗体は、先ず当該抗原に対する抗体を作出し、その抗体を修飾する（たとえば、組換え手段を用いて）ことによって又は予め作出した抗体を修飾することによって作出され得る。或いは、本開示のＶＬを含むタンパク質を作出し、次いでそのタンパク質を修飾して又は使用して抗体を作出する。
【０１６９】
抗体を作出する方法は当該技術で既知である。たとえば、ハイブリドーマ法のようなモノクローナル抗体を作出する方法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって記載されている。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適当な宿主動物を免疫原又は抗原又はそれを発現している細胞で免疫して免疫原又は抗体に特異的に結合する抗体を産生する又は産生することが可能であるリンパ球を導き出す。次いで免疫された動物に由来するリンパ球又は脾臓細胞を、たとえば、ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を用いて不死化細胞株に融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, 1986）。好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖又は生き残りを制限する１以上の物質を含有する好適な培養培地にて、得られたハイブリドーマ細胞を培養し得る。たとえば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠くのであれば、ハイブリドーマ用の培養培地は通常、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ」培地）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。たとえば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ（１９９０）又はＷｅｉｓｓｉｎｇｅｒら（１９９１）によって一般的に詳細に記載されたＡＢＬ−ＭＹＣ法を用いた、抗体を産生する他の方法も本開示では熟考される。
【０１７０】
或いは、抗体又はそれをコードする配列は、当該抗体を発現する、予め作出された細胞、たとえば、ハイブリドーマ又はトランスフェクトーマから生成される。そのようなハイブリドーマ及び／又はトランスフェクトーマの種々の供給源は、技量のある熟練者には明らかであろうし、たとえば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）及び／又は細胞培養の欧州コレクション（ＥＣＡＣＣ）が挙げられる。ＶＬをコードする配列を抗体から単離する又はそれを修飾する方法は、技量のある熟練者には明らかであり、及び／又は本明細書で記載される。本開示に従って修飾することができる例となる抗体には、ヒト化抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）モノクローナル抗体であるシナジス（登録商標）（パリビズマブ；ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；ヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であるハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；キメラ抗ＴＮＦｃｃモノクローナル抗体であるレミケード（登録商標）（インフリキシマブ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；抗糖タンパク質Ｉｉｂ／ＩＩＩａ受容体抗体であるレオプロ（登録商標）（アブシキマブ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体であるゼナパックス（登録商標）（ダクリズマブ；Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；キメラ抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体であるリツキサン（商標）／マブテラ（商標）（リツキシマブ）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｒｏｃｈｅ）；キメラ抗ＩＬ−２Ｒａ抗体であるスチムレクト（商標）（バシリミマブ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；キメラ抗ＥＧＦＲ抗体であるアービタックス（セツキシマブ；ＩｍＣｌｏｎｅ）；ヒト化抗ＣＤ３３抗体であるミロタルグ（商標）（ゲムツズマブ；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ／Ｗｙｅｔｈ）；ヒト化抗ＣＤ５２ＩｇＧ１抗体であるキャンパス１Ｈ／ＬＤＰ−０３（アレムツズマブ；ＩＬＥＸ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ／Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）；ヒト化抗ＩｇＥ  Ｆｃ抗体であるゾレア（商標）（オマリズマブ；Ｔａｎｏｘ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ヒト化抗ＣＤ１１ａ抗体であるラプチバ（商標）（エファリズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）；ヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体であるルセンティス（ラニビズマブ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ヒト化抗インテグリンα４抗体であるタイサブリ（商標）（ナタリズマブ；Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ／Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ヒト化抗補体タンパク質Ｃ５抗体であるソリリス（商標）（エクリズマブ；Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；完全なヒト抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体であるベクチビックス（登録商標）（パニツムマブ；Ａｍｇｅｎ）；完全なヒト抗ＴＮＦαであるフミラ（登録商標）（アダリムマブ；Ａｂｂｏｔｔ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）；シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ抗−ＴＮＦα；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）；アーゼラ（登録商標）（オファツムマブ抗−ＣＤ２０；Ｇｌａｘｏ  Ｇｒｏｕｐ  ａｎｄ  ＧｅｎＭａｂ  ＡＳ）；オムニタ��グ（登録商標）（パーツズマブ抗−Ｈｅｒ２；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のＶＬを含む他の抗体及びタンパク質が当該技術で既知であり、排除されない。
【０１７１】
既知の抗体のＶＬの配列は当業者によって容易に入手可能である。例となる配列には、アダリムマブのＶＬ（配列番号７）又は４Ｄ５のＶＬ（配列番号１１）が挙げられる。これらの配列は本開示に従って容易に修飾される。
【０１７２】
抗体の作出及びそれをコードする配列の単離に続いて、たとえば、任意の実施例に従って本明細書で記載されるように、抗体又はそのＶＬを、必要な位置にて負に荷電したアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含んで凝集耐性を付与するように修飾する。一般に、これは、ＶＬ又は抗体をコードする核酸を単離することと、必要な位置にてアスパラギン酸（すなわち、ＧＡＡ又はＧＡＧ）又はグルタミン酸（すなわち、ＧＡＴ又はＧＡＣ）をコードする１以上のコドンを含むように修飾することを含む。
【０１７３】
キメラのヒト化及びヒト抗体
本開示のタンパク質はヒト化抗体又はヒトの抗体又はそのＶＬであってもよい。用語「ヒト化抗体」は、一般に組換え法を用いて調製され、非ヒト種由来の抗体に由来する抗原結合部位及びヒト抗体の構造及び／又は配列に基づいた分子の残りの抗体構造を有するキメラタンパク質を指すように理解されるべきである。抗原結合部位は、ヒト抗体の可変ドメインにおける適当なＦＲ（すなわち、ＣＤＲ以外のＶＬにおける領域）に植え込まれた非ヒト抗体に由来するＣＤＲ及びヒト抗体に由来する残りの領域を含む。抗原結合部位は、野生型であってもよく又は１以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。一部の例では、ヒト抗体のフレームワーク残基は相当する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、受け入れたＣＤＲ又はフレームワークの配列にも見られない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲ及びヒト抗体のＦＲ領域又はそのコンセンサス配列のすべて又は実質的にすべてを含むであろう。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術で既知である。ヒト化は、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ６０５４２９７又はＵＳ５５８５０８９の方法に従って実質的に実施することができる。抗体をヒト化する他の方法は排除されない。
【０１７４】
抗体及び結合部位と併せて本明細書で使用されるとき、用語「ヒト抗体」は、ヒト、たとえば、ヒトの生殖細胞又は体細胞に見られる配列に由来する又はそれに相当する可変及び任意で定常の抗体領域を有する抗体を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、たとえば、試験管内での無作為の又は部位特異的な変異により導入される変異（特に抗体の少数の残基、たとえば、抗体の１、２、３、４又は５の残基、好ましくは、たとえば、抗体の１以上のＣＤＲを構成する１、２、３、４又は５の残基における保存的な置換又は変異）、及び／又は本明細書で記載される位置での負に荷電したアミノ酸を含むことができる。例となるヒトの抗体又はタンパク質は、ヒトのフレームワーク領域（たとえば、ヒトの生殖細胞に由来する）及び負に荷電したアミノ酸が含まれる位置以外でＣＤＲにおける無作為なアミノ酸を含む。これらの「ヒト抗体」は実際、ヒトによって産生される必要はなく、むしろ、組換え手段を用いて作出することができ、及び／又はヒト抗体の定常ドメイン及び／又は可変ドメインをコードする核酸を含むトランスジェニック動物（たとえば、マウス）から単離することができる。ヒト抗体又はその断片は、ファージディスプレイライブラリ（たとえば、Hoogenboom and Winter 1991; US5,885,793 に記載されたように及び／又は以下で記載するように）を含む、又はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物を用いて（たとえば、WO2002/066630; Lonberg et al. (1994)or Jakobovits et al. (2007)に記載されたように）当該技術で既知の種々の技法を用いて作出することができる。
【０１７５】
一例では、本開示のタンパク質はヒトＶＬを含む。たとえば、タンパク質は完全なヒトフレームワーク領域を含む。
【０１７６】
一例では、タンパク質はヒト化されたＶＬを含まず、又はヒト化抗体に由来するＶＬを含まない。一例では、タンパク質は、たとえば、ＵＳ６４０７２１３に記載されたようなヒト化Ｆａｂ４Ｄ５、たとえば、ヒトＡｂ４Ｄ５−１のようなヒトＡｂ４Ｄ５に由来するＶＬを含まない。
【０１７７】
一例では、本明細書で記載されるタンパク質は鶏卵リゾチームに結合しない。
【０１７８】
一例では、本明細書で記載されるようなタンパク質はヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）及び／又はヒトｈｅｒ２／ｎｅｕに結合しない。
【０１７９】
一例では、本開示のタンパク質はキメラ抗体である。用語「キメラ抗体」は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種（たとえば、マウスのようなネズミ類）に由来する抗体における又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における相当する配列に一致する又は相同である一方で、それらが所望の生物活性を呈する限り、鎖の残りが、別の種（たとえば、ヒトのような霊長類）に由来する抗体における又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における相当する配列に一致する又は相同である抗体を指す（ＵＳ４８１６５６７）。ヒトのドメインを優勢に持つ抗体を作出するために、通常、キメラ抗体は齧歯類又はウサギの可変ドメイン及びヒトの定常領域を利用する。たとえば、キメラ抗体はヒトの定常領域に融合させた、本開示に従って修飾したマウス抗体に由来する可変ドメインを含む。そのようなキメラ抗体の作出は当該技術で既知であり、標準的な手段（たとえば、ＵＳ５８０７７１５；ＵＳ４８１６５６７及びＵＳ４８１６３９７に記載されたように）によって達成され得る。
【０１８０】
ＶＬを含有するタンパク質
単一ドメイン抗体
一例では、本開示のタンパク質は単一ドメイン抗体（用語「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」と相互交換可能に使用される）である。単一ドメイン抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である。特定の例では、単一ドメイン抗体はヒトの単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA; たとえば、US6,248,516; WO90/05144; WO2003/002609 and/or WO2004/058820を参照）。一例では、単一ドメイン抗体は、抗原に特異的に結合することが可能であり、本開示に従って修飾することが可能である抗体の軽鎖可変ドメインのすべて又は一部から成る。本開示はまた、別の分子、たとえば、別のドメイン抗体又はＦｃ領域に融合されたドメイン抗体も熟考する。
【０１８１】
二価抗体、三価抗体、四価抗体
ＶＬを含む例となるタンパク質は、ＷＯ９８／０４４００１及びＷＯ９４／００７９２１に記載されたもののような二価抗体、三価抗体、四価抗体及びさらに高次のタンパク質複合体である。
【０１８２】
本明細書で使用されるとき、用語「二価抗体」は、２つの会合したポリペプチド鎖を意味し、各ポリペプチド鎖は構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ又はＶＨ−Ｘ−ＶＬを含み、ＶＬは抗体の軽鎖可変ドメインであり、ＶＨは抗体の重鎖可変ドメインであり、Ｘは単一ポリペプチド鎖にてＶＬとＶＨが会合する（又はＦｖを形成する）には不十分な残基を含み又は非存在であり、ポリペプチド鎖のＶＨがポリペプチド鎖のＶＬに結合して抗原結合部位を形成し、すなわち、１以上の抗原に特異的に結合することが可能であるＦｖ分子を形成するように解釈されるべきである。ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖にて同一であることができ、又はＶＬ及びＶＨは二重特異性の二価抗体を形成するように各ポリペプチド鎖にて異なることができる（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）。
【０１８３】
本明細書で使用されるとき、用語「三価抗体」は、３つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味し、各ポリペプチド鎖は二価抗体に関して上記で言及したような構造を含み、一方のポリペプチド鎖のＶＨが別のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、それによって三量体タンパク質（三価抗体）を形成するように解釈されるべきである。
【０１８４】
本明細書で使用されるとき、用語「四価抗体」は、４つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味し、各ポリペプチド鎖は二価抗体に関して上記で言及したような構造を含み、一方のポリペプチド鎖のＶＨが別のポリペプチド鎖のＶＬと会合し、それによって四量体タンパク質（四価抗体）を形成するように解釈されるべきである。
【０１８５】
技量のある熟練者は、二価抗体、三価抗体、四価抗体及びそれらの作出方法に気付くであろう。ＶＨ及びＶＬは任意の順、すなわち、ＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬにて位置づけることができる。一般に、これらのタンパク質は、ＶＨとＶＬが直接連結される又はＶＨとＶＬが会合できるには不十分な長さのリンカーを用いて連結されるポリペプチド鎖を含む。ＶＨとＶＬを含むタンパク質が会合して、リンカー（存在すれば）の長さ及び／又はＶＨドメインとＶＬドメインの順に応じて二価抗体、三価抗体及び／又は四価抗体を形成する。好ましくは、リンカーは１２以下のアミノ酸を含む。たとえば、ＮからＣの順に配置される以下の構造ＶＨ−Ｘ−ＶＬを有するポリペプチド鎖の場合、Ｘはリンカーであり、３〜１２の残基を有するリンカーは一般に二価抗体の形成を生じ、1又は２の残基を有するリンカー又はリンカーが存在しない場合、一般に三価抗体の形成を生じる。ＮからＣの順に配置される以下の構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨを有するポリペプチド鎖の場合、Ｘはリンカーであり、３〜１２の残基を有するリンカーは一般に二価抗体の形成を生じ、1又は２の残基を有するリンカーは一般に二価抗体、三価抗体及び四価抗体の形成を生じ、リンカーを欠くポリペプチドは一般に三価抗体又は四価抗体を形成する。
【０１８６】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）
技量のある熟練者は、ｓｃＦｖが単一ポリペプチド鎖にてＶＨとＶＬの領域を含むことに気付くであろう。好ましくは、ポリペプチド鎖はさらに、ｓｃＦｖが抗体結合にとって所望の構造を形成するのを可能にするＶＨとＶＬの間でポリペプチドリンカーを含む（すなわち、単一ポリペプチド鎖のＶＨとＶＬが互いに会合してＦｖを形成できるように）。これは、異なるポリペプチド鎖に由来する可変ドメインが互いに会合する又は結合する二価抗体又はさらに高次の多量体とは異なる。たとえば、リンカーは１２を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３はｓｃＦｖにとってさらに都合の良いリンカーの1つである。
【０１８７】
本開示はまた、ジスルフィドで安定化したＦｖ（又はｄｉＦｖ又はｄｓＦｖ）も熟考し、その際、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入され、システイン残基がジスルフィド結合で連結されて安定なＦｖを得る（たとえば、Brinkmann et al., 1993を参照）。
【０１８８】
代わりに又はさらに、本開示は二量体のｓｃＦｖ、すなわち、非共有結合又は共有結合によって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を提供する。そのような二量体のｓｃＦｖの例には、ロイシンジッパードメイン（たとえば、Ｆｏｓ又はＪｕｎに由来する）に連結された２つのｓｃＦｖが挙げられ、それによってロイシンジッパードメインが会合し二量体化合物を形成する（たとえば、Kostelny 1992又はKruif and Logtenberg, 1996を参照にこと）。或いは、たとえば、ＵＳ２００６０２６３３６７に記載されたように、２つのｓｃＦｖは双方のｓｃＦｖが形成し、抗原に結合するのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
【０１８９】
たとえば、ＵＳ６３２３３２２に記載されたように、グリコシル化を可能にするように修飾されたリンカーを含むｓｃＦｖのようなｓｃＦｖの修飾された形態も本開示によって熟考される。
【０１９０】
技量のある熟練者は、ｓｃＦｖ又は本明細書の開示に基づいて本開示に従って好適な修飾されたＶＬを含むその修飾された形態を容易に作出することができるであろう。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）を参照のこと。ｓｃＦｖのさらなる記載は、たとえば、Ｂｉｒｄら、１９８８にて見られるべきである。
【０１９１】
小型抗体
技量のある熟練者は、小型抗体が抗体のＣＨ２及び／又は３／４  ３ドメインに融合された抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことに気付くであろう。任意で、小型抗体はＶＨとＶＬの間のヒンジ領域及びＣＨ２及び／又はＣＨ３のドメインを含み、この立体構造はＦｌｅｘ小型抗体と呼ばれることもある（Hu et al., 1996）。小型抗体はＣＨ１又はＣＬを含まない。好ましくは、ＶＨ及びＶＬのドメインは抗体のヒンジ領域及びＣＨ３ドメインに融合される。領域のそれぞれは、同一抗体に由来し得る。或いは、ＶＨ及びＶＬのドメインは1つの抗体に由来し、ヒンジ及びＣＨ２／ＣＨ３は別の抗体に由来し、又はヒンジ及びＣＨ２／ＣＨ３は異なる抗体に由来することもできる。本開示はまた、１つの抗体に由来するＶＨとＶＬ及び別の抗体に由来するＶＨとＶＬを含む多重特異性の小型抗体も熟考する。
【０１９２】
例となる小型抗体及びその作出方法は、たとえば、ＷＯ９４／０９８１７に記載されている。
【０１９３】
他の可変ドメインを含有するタンパク質
ＵＳ５７３１１６８は、一対のＦｖの界面を組換え細胞の培養から回収されるヘテロダイマーの比率を最大化するように操作し、それによって二重特異性のタンパク質を作出する分子を記載している。好まれる界面はＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１のタンパク質の界面に由来する１以上の小型アミノ酸鎖がさらに大きな側鎖（たとえば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えられる。大きなアミノ酸側鎖をさらに小さなもの（たとえば、アラニン又はスレオニン）で置き換えることによって第２のタンパク質の界面上に、大きな側鎖と同じ又は類似するサイズの代償性の「空洞」が創られる。
【０１９４】
可変ドメインを含む二重特異性のタンパク質は、架橋した又はヘテロ抱合体のタンパク質を含む。たとえば、ヘテロ抱合体におけるタンパク質の一方をアビジンに結合し、他方をビオチンに結合することができる。そのようなタンパク質は、たとえば、免疫系細胞を望ましくない細胞に向けるのに提案されている（ＵＳ４６７６９８０）。可変ドメインを含むヘテロ抱合体のタンパク質は好都合な架橋方法を用いて作製され得る。好適な架橋剤は当該技術で既知であり、多数の架橋法とともにＵＳ４６７６９８０に開示されている。
【０１９５】
可変ドメインを含む二重特異性のタンパク質は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ（１９８５）は未処理の抗体をタンパク分解切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する手順を記載している。これらの断片はジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して近隣のジチオールを安定化させ、分子間のジスルフィド形成を妨げる。次いで生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いでＦａｂ’−ＴＮＢの一方をメルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再び変換し、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性のタンパク質を形成する。
【０１９６】
追加の可変ドメインを含有するタンパク質には、たとえば、単鎖Ｆａｂ（たとえば、Hust et al., 2007）、又はＦａｂ３（たとえば、EP19930302894に記載されたような）が挙げられる。
【０１９７】
定常ドメインの融合
本開示は、開示の修飾されたＶＬと定常領域（たとえば、Ｆｃ）又はそのドメイン、たとえば、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むタンパク質を包含する。たとえば、本開示は、小型抗体（上記で議論したような）又はドメイン抗体−Ｆｃの融合又はｓｃＦｖ−Ｆｃの融合又は二価抗体−Ｆｃの融合又は三価抗体−Ｆｃの融合又は四価抗体−Ｆｃの融合又はドメイン抗体−ＣＨ２の融合又はSCFC−ＣＨ２の融合又は二価抗体−ＣＨ２の融合又は三価抗体−Ｃn２の融合又は四価抗体−ＣＨ２の融合又はドメイン抗体−ＣＨ３の融合又はSCFV−ＣＨ３の融合又は二価抗体−ＣＨ３の融合又は三価抗体−ＣＨ３の融合又は四価抗体−ＣＨ３の融合を提供する。これらのタンパク質のいずれかがリンカー、好ましくは可変ドメインと定常領域又は定常ドメインとの間での抗体のヒンジ領域を含み得る。好ましくは、そのようなＦｃ融合タンパク質はエフェクター機能を有する。
【０１９８】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ２ドメイン」は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け方式（Kabat 1991 or 1992に開示されたように）に従ってほぼ２３１〜３４０位の間から伸びる重鎖抗体分子の一部を含む。２つのＮ結合の糖鎖が未処理の天然のＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に一般に介在する。一例では、本開示のタンパク質はＩｇＧ１分子（たとえば、ヒトのＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。一例では、本開示のタンパク質はＩｇＧ４分子（たとえば、ヒトのＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ２ドメインを含む。
【０１９９】
本明細書で使用されるとき、用語「ＣＨ３ドメイン」は、ＣＨ２ドメインのＮ末端から、たとえば、ほぼ１１０残基、３４１〜４４６ｂ位（Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付け方式）から伸びる重鎖抗体分子の一部を含む。ＣＨ３ドメインは通常、ＩｇＧ抗体のＣ末端部分を形成する。しかしながら、一部の抗体では、追加のドメインがＣ３／４ ３ドメインから伸びて分子のＣ末端部分を形成する（たとえば、ＩｇＭのμ鎖及びＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一例では、本開示のタンパク質はＩｇＧ１分子（たとえば、ヒトのＩｇＧ１分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。別の例では、本開示のタンパク質はＩｇＧ４分子（たとえば、ヒトのＩｇＧ４分子）に由来するＣＨ３ドメインを含む。
【０２００】
本開示のタンパク質を作出するのに有用な定常領域の配列は多数の異なる供給源から入手され得る。好まれる例では、タンパク質の定常領域又はその一部はヒト抗体に由来する。しかしながら、定常領域又はその一部は、たとえば、齧歯類（たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）又は非ヒト霊長類（たとえば、チンパンジー、アカゲザル）の種を含む別の哺乳類種の免疫グロブリン又は抗体に由来し得ることが理解される。さらに、定常領域ドメイン又はその一部は任意の抗体クラスに由来し得る。
【０２０１】
本明細書で使用されるとき、用語「エフェクター機能」は、タンパク質及び／又は免疫系の細胞に結合し、種々の生物効果に介在するＦｃ領域又はその一部（たとえば、ＣＨ２ドメイン）の機能的能力を指す。エフェクター機能は、抗原依存性であってもよいし、抗原非依存性であってもよい。「抗原依存性のエフェクター機能」は、抗体の抗原への結合に続いて通常誘導されるエフェクター機能を指す。典型的な抗原依存性のエフェクター機能には、補体タンパク質（たとえば、Ｃ１ｑ）を結合する能力が挙げられる。たとえば、補体のＣ１成分のＦｃ領域への結合は、古典的な補体系を活性化し、オプソニン作用及び細胞病原体の溶解、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）と呼ばれる過程をもたらす。補体の活性化はまた炎症性反応を刺激し、自己免疫性の過敏反応にも関与し得る。他の抗原依存性のエフェクター機能には、細胞上でのＦｃ領域を介して特定のＦｃ受容体（「ＦｃＲ」）への抗体の結合が介在する。ＩｇＧ（ガンマ受容体又はＩｇＸＲ）、ＩｇＥ（イプシロン受容体又はＩｇｓＲ）、ＩｇＡ（アルファ受容体又はＩｇａＲ）及びＩｇＭ（ミュー受容体又はｉ＾Ｒ）を含む、抗体の様々なクラスに特異的である多数のＦｃ受容体がある。細胞表面上でのＦｃ受容体への抗体の結合は、免疫複合体のエンドサイトーシス、抗体を被覆した粒子又は微生物の貪食及び破壊（抗体依存性の貪食又はＡＤＣＰとも呼ばれる）、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体を被覆した標的細胞の溶解（抗体依存性の細胞介在性細胞傷害性又はＡＤＣＣとも呼ばれる）、炎症性メディエータの放出、免疫系の細胞活性化の調節、抗体産生の胎盤通過及び制御を含む多数の重要な且つ多様な生物反応を始動させる。
【０２０２】
本明細書で使用されるとき、用語「抗原非依存性のエフェクター機能」は、抗体が相当する抗原に結合しているか、していないかにかかわらず、抗体によって誘導され得るエフェクター機能を指す。典型的な抗原非依存性のエフェクター機能には、細胞性の輸送、抗体の循環半減期及びクリアランス速度、及び増殖の促進が挙げられる。構造的に独特のＦｃ受容体である「新生児Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲｎ」はサルベージ受容体としても知られ、半減期及び細胞性の輸送を調節するのに重要な役割を担う。微生物（たとえば、ブドウ球菌タンパク質Ａ又はＧ）から精製される他のＦｃ受容体は、高親和性にてＦｃ領域に結合することが可能であり、Ｆｃ含有のタンパク質の精製を円滑にするのに使用することができる。
【０２０３】
ポリメラーゼ鎖反応及び当該ドメインを増幅するように選択されるプライマーを用いて定常領域のドメインをクローニングすることができる。抗体配列のクローニングは、たとえば、ＵＳ５６５８５７０に記載されている。
【０２０４】
本開示のタンパク質は異なる種類の多数の定常領域／ドメインを含み得る。
【０２０５】
タンパク質の定常領域を構成する定常ドメイン又はその一部は異なる抗体分子に由来し得る。たとえば、タンパク質は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２ドメイン又はその一部及びＩｇＧ３分子に由来するＣＨ３ドメイン又はその一部を含み得る。
【０２０６】
本開示の別の例では、本開示のタンパク質はＦｃＲｎ結合を付与するのに十分なＦｃの少なくとも一領域を含む。たとえば、ＦｃＲｎに結合するＦｃの一部は、Ｋａｂａｔ  ＥＵ番号付けに従ってＩｇＧ１のほぼ２８２〜４３８のアミノ酸を含む。
【０２０７】
一例では、本開示の改変されたタンパク質は１以上の定常領域のドメインが部分的に又は全体として欠失する修飾された定常領域（「ドメイン欠失定常領域」）を含む。本開示はまた、変化した、たとえば、改善した又は軽減したエフェクター機能を有する修飾されたＦｃ領域又はその一部も熟考する。多数のそのような修飾されたＦｃ領域は当該技術で既知であり、たとえば、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０６３８１５又はＷＯ２００５／０４７３２７に記載されている。
【０２０８】
本開示はまたエフェクター機能を誘導することが可能である追加の領域を含むタンパク質も熟考する。たとえば、タンパク質は、Ｔ細胞（たとえば、ＢｉＴＥのようなＣＤ４に結合する）又はＮＫ細胞（ＣＤ１９に結合する）に結合することが可能な抗体の可変領域を含む。
【０２０９】
脱免疫化タンパク質
本開示はまた脱免疫化タンパク質も熟考する。脱免疫化タンパク質は１以上のエピトープ、たとえば、Ｂ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープを排除し（変異させ）、それによって対象がタンパク質に対する免疫応答を生じる可能性を減らす。脱免疫化タンパク質を作出する方法は当該技術で既知であり、たとえば、ＷＯ００／３４３１７、ＷＯ２００４／１０８１５８及びＷＯ２００４／０６４７２４に記載されている。たとえば、方法は、タンパク質にてエピトープを予測するコンピュータによる解析を行い、予測されたエピトープにおける１以上の残基を変異させ、それによってその免疫原性を低減することを含む。次いでコンピュータで又は試験管内で又は生体内でタンパク質を解析し、それが抗原に結合する能力を保持することを保証する。たとえば、変異が抗原結合を減らすことが疑わしい限り、ＣＤＲ内の存在するエピトープは変異させない。エピトープを予測する方法は当該技術で既知であり、たとえば、Ｓａｈａら（２００４）に記載されている。
【０２１０】
好適な変異を導入し、得られたタンパク質を発現させ、解析する方法は、本明細書の記載に基づいて技量のある熟練者には明らかであろう。
【０２１１】
ライブラリ及びスクリーニング法
本開示はまた、本開示に従って修飾された複数のＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質のライブラリも熟考し、たとえば、ライブラリは異なる結合特性を有する複数のタンパク質を含む。
【０２１２】
本開示の例には、天然のライブラリ、免疫したライブラリ又は合成したライブラリが挙げられる。天然のライブラリは、どんな免疫原にも感作されていないし、感染又は炎症に徴候を示していない好適な宿主のＢリンパ球に由来する。免疫したライブラリは、好適に「免疫された」宿主、すなわち、免疫原にて感作されている宿主から得られたＢ細胞と形質細胞の混合物から作られる。一例では、当該技術で既知の方法（たとえば、オリゴｄＴプライマーと逆転写酵素）を用いてこれらの細胞に由来するｍＲＮＡをｃＤＮＡに翻訳する。代わりの例では、宿主細胞に由来する抗体をコードする核酸（ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を好適なプライマーと共にＰＣＲによって増幅する。そのような抗体遺伝子の増幅のためのプライマーは当該技術で既知である（たとえば、ＵＳ６０９６５５１及びＷＯ００／７００２３）。さらなる例では、宿主細胞由来のｍＲＮＡをｃＤＮＡに合成し、次いでこれらｃＤＮＡを抗体特異的なプライマーと共にＰＣＲ反応にて増幅する（たとえば、ＵＳ６３１９６９０）。或いは、ＰＣＲを用いることなく、従来のｃＤＮＡクローニング法（Sambrook and Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdEd, vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）によってレパトアをクローニングしてもよい。ＤＮＡは、クローニング中に又はその後で、必要な部位にて負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される。
【０２１３】
別の例では、抗体配列が互いに並べられるヒト起源の公開された抗体配列のデータベースを確立する。データベースを用いてＣＤＲループ（抗体構造の解析によって決定されるような）の配列及び標準折り畳みの双方にて高い程度の類似性を示す抗体配列の亜群を規定する。亜群のそれぞれについて、この亜群のメンバーを表すコンセンサス配列を推定し；従ってコンセンサス配列の完全な収集はヒト抗体の完全な構造的レパトアを表す。
【０２１４】
たとえば、全遺伝子合成によって又は合成遺伝子サブユニットの使用によって次いでこれらの人工的な遺伝子を構築する。これらの遺伝的なサブユニットはポリペプチドレベルで構造的な部分要素に相当する。ＤＮＡレベルでは、これらの遺伝的なサブユニットは、部分要素それぞれの開始と終了での切断部位によって定義され、それらはベクター系で独特である。コンセンサス配列の収集のメンバーである遺伝子すべては、それらが相当する遺伝的部分配列の類似パターンを含有するように構築される。たとえば、前記ポリペプチドは、ＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子：ＶκＩ、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖλｌ、Ｖλ２、Ｖλ３、ＶＨｌＡ、ＶＨｌＢ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＣK、Ｃλ、ＣＨｌ又は前記ＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子の任意の組み合わせである又はそれらに由来する。次いでＤＮＡ分子の収集を用いて、抗原に特異的に結合するタンパク質の供給源として使用され得る抗体、好ましくはＦｖ、ジスルフィド結合したＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片又はＦａｂ’断片の「合成ライブラリ」を創る。ＵＳ６，３００，０６４は合成ライブラリを作る方法を開示している。そのような合成ライブラリは、本開示に従って負に荷電したアミノ酸を含むように修飾される。別の例では、定義されたＶ遺伝子の要素からの合成によって合成ヒト抗体が作られる。Ｗｉｎｔｅｒ（ＥＰ０３６８６８４）は、抗体の可変ドメインの遺伝子を増幅し（たとえば、ＰＣＲによって）、クローニングし、発現させる方法を提供している。これらの遺伝子で開始して、彼は重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ３を無作為化することによって機能的な抗体断片のライブラリを創ることができた。この過程は、免疫系におけるＢ細胞の発生の間に生じるＶＪとＶＤＪの組換えの天然の過程と機能的に同等である。たとえば、ヒト生殖細胞系列のＶＨ遺伝子断片のレパトアは、５つの無作為なアミノ酸残基の合成「Ｄ断片」とＪ断片を接合して８残基の第３の合成した相補性決定領域（ＣＤＲ）を創ることによって試験管内で再構成することができる。ＵＳ５８８５７９３はそれらのような抗体ライブラリを作る方法を開示している。技量のある熟練者に明らかなように、本開示のタンパク質を含むライブラリは、増幅されたＶ領域が本明細書で記載される位置にて負に荷電したアミノ酸をコードするコドンを含むように作出される。
【０２１５】
本開示に係るタンパク質は可溶性の分泌タンパク質であってもよく、又は細胞又は粒子（たとえば、ファージ、又は他のウイルス、リボソーム又は胞子）の表面にて融合タンパク質として提示されてもよい。
【０２１６】
種々のディスプレイライブラリ構成が当該技術で既知であり、たとえば、Ｌｅｖｉｎ及びＷｅｉｓｓ（２００６）にて概説されている。たとえば、ライブラリは試験管内のディスプレイライブラリ（すなわち、宿主細胞の非存在下で前記ドメインが提示されるように発現させた核酸に発現ドメインを連結する試験管内ディスプレイを用いてタンパク質を表示させる）である。従って、試験管内でのディスプレイ法によって作出したライブラリは形質転換又は形質移入の効率によって限定されない。試験管内ディスプレイの例にはリボソームディスプレイ、共有結合ディスプレイ及びｍＲＮＡディスプレイが挙げられる。
【０２１７】
一例では、試験管内ディスプレイのライブラリはリボソームディスプレイのライブラリである。技量のある熟練者は、リボソームディスプレイのライブラリが、発現ライブラリによってコードされたｍＲＮＡを直接、それがコードするタンパク質に関連付けることに気付くであろう。リボソームディスプレイのライブラリを作出する手段は、適当なプロモータ配列と操作可能に併せてＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質をコードする核酸及びリボソーム結合配列を配置することを含む。好まれるプロモータ配列はバクテリオファージＴ３及びＴ７プロモータである。好ましくは、核酸は、スペーサー配列及び取り外されるターミネータコドンを伴ったターミネータ配列と操作可能に併せて配置される。本文脈で使用されるとき、用語「スペーサー配列」は、ペプチドに融合されるペプチドをコードする一連の核酸を意味するように理解されるべきである。スペーサー配列によってコードされるペプチドは翻訳後リボソームトンネルに止まる一方でＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質は自由に折り畳み、別のタンパク質又は核酸と相互作用することができるので、スペーサー配列を遺伝子構築物に組み入れる。好まれるスペーサー配列は、たとえば、フィラメント様ファージＭ１３ｍｐ１９の遺伝子ＩＩＩのアミノ酸２１１〜２９９をコードする核酸である。
【０２１８】
当該技術で既知の及び／又は、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）にて記載された方法を用いて、ディスプレイライブラリを試験管内で転写し、翻訳する。試験管内の転写及び翻訳のための市販の方式の例には、たとえば、ＰｒｏｍｅｇａからのＴＮＴ試験管内転写及び翻訳方式が挙げられる。氷上で発現反応を冷却することが一般に翻訳を終結させる。たとえば、酢酸マグネシウム又はクロラムフェニコールのような試薬の添加によって、ペプチド及び又はそれをコードするｍＲＮＡからの解離に対してリボソーム複合体を安定化させる。そのような試験管内ディスプレイライブラリは本明細書で記載されるような種々の方法によってスクリーニングされる。
【０２１９】
別の例では、本開示のディスプレイライブラリはリボソーム不活化ディスプレイライブラリである。この例によれば、核酸は第１のスペーサー配列をコードする核酸に操作可能に連結される。このスペーサー配列は、それらにコードされるＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質が自由に折り畳み、標的抗原と相互作用するのを可能にするグリシン／セリンが豊富な配列であることが好まれる。第１のスペーサー配列はリボソームを不活化する毒素をコードする核酸に連結される。毒素は、リシンＡ鎖を含むことが好まれ、それは真核細胞のリボソームを不活化し、ｍＲＮＡ又はコードされたペプチドを放出することなく翻訳複合体上でリボソームを引き止める。毒素をコードする核酸は第２のスペーサー配列をコードする別の核酸に連結される。第２のスペーサーは、リボソームのトンネルを占有し、ペプチドと毒素の双方が正しく折り畳み、活性化するのを可能にするアンカーである。そのようなスペーサー配列の例には、Ｍ１３バクテリオファージの遺伝子ＩＩＩに由来する配列である。たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているウサギの網状赤血球溶解系のような系を用いて、リボソーム不活化ディスプレイライブラリは一般に試験管内で転写され、翻訳される。毒素をコードするｍＲＮＡの翻訳及びこのタンパク質の正しい折り畳みの際、リボソームは、コードされたポリペプチド及びそれが翻訳されたｍＲＮＡに結合したままで不活化される。
【０２２０】
別の例では、ディスプレイライブラリはｍＲＮＡディスプレイライブラリである。この例によれば、核酸は、スペーサー配列、たとえば、本開示の発現ライブラリによってコードされたＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質が自由に折り畳み、標的抗原と相互作用するのを可能にするグリシン／セリンが豊富な配列をコードする核酸に操作可能に連結される。スペーサー配列をコードする核酸は転写ターミネータに操作可能に連結される。ｍＲＮＡディスプレイライブラリは一般に、たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているＨｅＬａＳｃｒｉｂｅ核抽出物試験管内転写方式のような当該技術で既知の方法を用いて試験管内で転写される。コードされたｍＲＮＡはその後、当該技術で既知の及びたとえば、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）にて記載されている技法を用いて、たとえば、ピューロマイシンのようなリボソームに結合する分子に共有結合するＤＮＡオリゴヌクレオチドに共有結合させられる。好ましくは、オリゴヌクレオチドはソラレン部分に共有結合し、それによってオリゴヌクレオチドは、本開示の発現ライブラリによってコードされたｍＲＮＡに光架橋する。発現ライブラリから転写されたｍＲＮＡは次いで当該技術で既知の方法を用いて翻訳される。リボソームがｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドの接合部に達すると、リボソームは停止し、ピューロマイシン部分はリボソームのホスホトランスフェラーゼ部位に入るので、コードされたポリペプチドをそれから発現したｍＲＮＡに共有結合する。
【０２２１】
さらに別の例では、ディスプレイライブラリは共有結合ディスプレイライブラリである。この例によれば、ＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質をコードする核酸は、それがコードされたＤＮＡと相互作用するタンパク質をコードする第２の核酸に共有結合する。それが相互作用するＤＮＡと相互作用するタンパク質の例には大腸菌バクテリオファージＰ２ウイルスＡタンパク質（Ｐ２Ａ）及びファージ１８６、ＨＰ１及びＰＳＰ３から単離される同等のタンパク質が挙げられる。たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているウサギの網状赤血球溶解系のような系を用いて、共有結合ディスプレイ遺伝子構築物は試験管内で転写され、翻訳される。ＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質とＰ２Ａタンパク質の融合物の翻訳の際、Ｐ２Ａタンパク質は、それが結合し、それと共有結合を形成する核酸にニックを入れる。従って、核酸断片はそれがコードするペプチドに共有結合する。
【０２２２】
さらに別の例では、ディスプレイライブラリは、ＶＬ（及び任意でＶＨ）を含む発現されたタンパク質が、たとえば、ＵＳ５８２１０４７；ＵＳ６２４８５１６及びＵＳ６１９０９０８にて記載されたようにバクテリオファージの表面に表示されるファージディスプレイライブラリである。記載される基本原理は、ＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質をコードする配列を含む第１の核酸の、たとえば、Ｍ１３タンパク質−３、Ｍ１３タンパク質−７又はＭ１３タンパク質−８から選択されるファージコートタンパク質のようなファージコートタンパク質をコードする配列を含む第２の核酸への融合に関する。次いでこれらの配列を適当なベクター、すなわち、細菌細胞にて複製できるものに挿入する。次いで、たとえば、大腸菌のような好適な宿主細胞を組換えベクターで形質転換する。核酸断片が操作可能に連結されるコートタンパク質の未修飾形態をコードするヘルパーファージ粒子を前記宿主細胞に感染させる。形質転換し、感染させた宿主細胞を、粒子表面にて融合タンパク質の１を超えるコピーを含む組換えファージミド粒子を形成するのに好適な条件下で培養する。この系は、たとえば、λファージ、Ｔ４ファージ、Ｍ１３ファージ、Ｔ７ファージ及びバキュロウイルスのようなウイルス粒子の生成に有効であることが示されている。そのようなファージディスプレイ粒子を次いでスクリーニングして標的抗原に結合するのに十分な立体構造を有する表示されたドメインを特定する。
【０２２３】
他のウイルスディスプレイライブラリには、ＵＳ６２９７００４にて記載されたように発現されたペプチド又はタンパク質のドメインがレトロウイルス粒子の表面にて表示されるレトロウイルスディスプレイライブラリが挙げられる。
【０２２４】
本開示はまた、たとえば、ＵＳ５５１６６３７にて記載されたような細菌ディスプレイライブラリ、たとえば、ＵＳ６４２３５３８にて記載されたような酵母ディスプレイライブラリ、又はＳｔｒｅｎｇｌｉｎら、１９８８にて記載されたような哺乳類ディスプレイライブラリも熟考する。
【０２２５】
ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法は当該技術で既知である。一例では、本開示のディスプレイライブラリはアフィニティ精製を用いてスクリーニングされる。アフィニティ精製法は、当該技術で既知であり、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）にて記載されている。アフィニティ精製の方法には通常、ライブラリによって表示されたＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質を標的抗原及び／又はスーパー抗原（たとえば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌ）に接触させ、その後、洗浄し、抗原に結合したままであるドメインを溶出することが含まれる。抗原は好ましくは、別の分子、たとえば、プロテインＧ、セファロース、アガロース、ビオチン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びＦＬＡＧエピトープから成る群から選択される分子に結合して精製を容易にすることが可能である。従って、標的のタンパク質又は核酸は、遠心を介して、又は別の分子、たとえば、ストレプトアビジンへの結合を介して、又は特異抗体、たとえば、抗ＦＬＡＧ抗体若しくは抗ＧＳＴ抗体の結合を介して簡単に単離される。
【０２２６】
別の例では、本開示のディスプレイライブラリは、ＦＡＣＳ解析を用いて結合したペプチドの特定を可能にするように発現される。ＦＡＣＳ解析を用いたライブラリのスクリーニングはＵＳ６４５５６３に記載されている。たとえば、試験管内ディスプレイライブラリはＦＡＣＳソーティングによってスクリーニングされる。試験管内ディスプレイライブラリは、ＦＡＣＳソーティングに好適な粒子又はビーズ、たとえば、とりわけ、ガラス、ポリマー、たとえば、ポリスチレン、ラテックス、又は架橋デキストラン、たとえば、セファロース、セルロース、ナイロン、テフロン（登録商標）に共有結合される。粒子又はビーズに結合したディスプレイライブラリを、検出可能な標識、たとえば、蛍光分子、又は第２の蛍光分子によって検出される分子によって標識されている抗原又はスーパー抗原に加える。次いでビーズを洗浄し、ＦＡＣＳによるソーティングに供し、それは、蛍光標的のタンパク質又は核酸に結合していないビーズから、結合した蛍光抗原又はスーパー抗原を伴ったビーズが分離されるのを可能にする。
【０２２７】
或いは、バイオセンサーに基づくアッセイ、たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップ法（英国、ＢｉａｃｏｒｅＡＢ）を用いてライブラリをスクリーニングする。Ｂｉａｃｏｒｅセンサーチップは、カルボキシメチル化デキストランで修飾した金の薄層で被覆したガラス表面であり、その上に標的のタンパク質又は核酸が共有結合する。次いで本開示のライブラリは抗原を含むＢｉａｃｏｒｅセンサーチップに暴露される。
【０２２８】
タンパク質の精製
突然変異誘発
当該技術の常法を用いて、可変ドメインを含むタンパク質をコードするＤＮＡを単離する。たとえば、当該領域に隣接する可変ドメイン内で保存された領域をアニーリングするようにプライマーを設計し、次いでそれらのプライマーを用いて、たとえば、ＰＣＲによって介在する核酸を増幅する。好適な方法及び／又はプライマーは当該技術で既知であり、たとえば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（ｅｄ），１９９５及び／又はＦｒｏｙｅｎら、１９９５にて記載されている。そのような増幅法のための鋳型ＤＮＡの好適な供給源は、たとえば、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ及び／又は本明細書で記載されるような可変ドメインを含むタンパク質を発現する細胞に由来する。
【０２２９】
単離に続いて、当該技術で既知の種々の方法のいずれかによって必要な位置にて負に荷電したアミノ酸をコードするコドンを含むようにＤＮＡを修飾する。これらの方法には、部位特異的（オリゴヌクレオチド介在性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びタンパク質をコードする以前調製したＤＮＡのカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。組換えタンパク質の変異体は、制限断片の操作によって又は合成オリゴヌクレオチドによる重複伸長ＰＣＲによって構築され得る。変異誘発性プライマーは、負に荷電したアミノ酸をコードし、たとえば、負に荷電したアミノ酸、たとえば、アスパラギン酸（すなわち、ＧＡＡ又はＧＡＧ）又はグルタミン酸（すなわち、ＧＡＴ又はＧＡＣ）をコードするコドンを構成する残基を含む。標準の突然変異誘発法を採用してそのような変異ＤＮＡをコードするＤＮＡを生成することができる。一般的な指針はＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら、１９９３にて見つけることができる。
【０２３０】
部位特異的な突然変異誘発は、置換変異、すなわち、変異体タンパク質を調製する方法の１つである。この方法は当該技術で既知である（たとえば、Carter et al 1985; or Ho et al 1989を参照）。手短には、ＤＮＡの部位特異的な突然変異誘発を実施することにおいて、所望の変異（たとえば、１以上の負に荷電したアミノ酸をコードするコドンの挿入）をコードするオリゴヌクレオチドを先ず、出発ＤＮＡの一本鎖とハイブリッド形成させることによってそのような出発ＤＮＡを改変する。ハイブリッド形成の後、ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、出発ＤＮＡの一本鎖を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを用いて第２の鎖全体を合成する。従って、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは得られた二本鎖ＤＮＡに組み入れられる。発現プラスミドにて変異誘発されるタンパク質を発現する遺伝子の中で部位特異的な突然変異誘発を行い、得られたプラスミドの配列を決定して所望の負に荷電したアミノ酸の置換変異の導入を確認し得る。部位特異的なプロトコール及び構成には、市販のキット、たとえば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）多重部位特異的突然変異誘発キット（カリフォルニア州、ラ・ホヤのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）が挙げられる。
【０２３１】
ＰＣＲ突然変異誘発も出発タンパク質のアミノ酸配列変異体を作製するのに好適である。Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９９０；Ｉｔｏら、１９９１を参照のこと。手短には、ＰＣＲにて少量の鋳型ＤＮＡを出発物質として使用する場合、鋳型ＤＮＡにおける相当する領域とは配列がやや異なるプライマーを使用して、プライマーが鋳型と異なる位置のみにて鋳型配列とは異なる特定のＤＮＡ断片を相対的に多量に生成することができる。
【０２３２】
変異体を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌら、１９８５によって記載された技法に基づく。出発物質は変異させる出発タンパク質のＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異させる出発ＤＮＡにおけるコドンを特定する。特定された変異部位の各側には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位があるはずである。そのような制限部位が存在しないのであれば、上述したオリゴヌクレオチドが介在する変異誘発法を用いて出発ＤＮＡの適当な位置にそれを導入することによってそれを生成してもよい。これらの部位でプラスミドＤＮＡを切断してそれを直鎖化する。標準の手順を用いて、制限部位間のＤＮＡの配列をコードするが、所望の変異を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、その際、オリゴヌクレオチドの２本の鎖は別々に合成し、次いで常法を用いて一緒にハイブリッド形成させる。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットは、直鎖化したプラスミドの末端に適合する５’及び３’の末端を有するように設計されるので、それを直接プラスミドに連結することができる。このプラスミドは今や変異したＤＮＡ配列を含有する。コードされた負に荷電したアミノ酸の置換を含有する変異体ＤＮＡはＤＮＡの配列決定によって確認することができる。
【０２３３】
ＰＣＲに基づく変異誘発による二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型としたオリゴヌクレオチド特異的変異誘発によって単一の変異を生成することもできる（Sambrook et al., 2001）。
【０２３４】
一例では、本開示のタンパク質が５０位にてアスパラギン酸及び５６位にてグルタミン酸を含むのであれば、以下の１以上が適用される：
（ｉ）５１位におけるアミノ酸はアラニンではない；
（ｉｉ）５２位におけるアミノ酸はセリンではない；
（ｉｉｉ）５３位におけるアミノ酸はアスパラギン又はセリンではない；
（ｉｖ）５４位におけるアミノ酸はロイシンではない；及び／又は
（ｖ）５６位におけるアミノ酸はスレオニン又はセリンではない。
【０２３５】
一例では、本開示のタンパク質が５０位にてアスパラギン酸及び５３位にてアスパラギン酸を含むのであれば、以下の１以上が適用される：
（ｉ）５１位におけるアミノ酸はアラニンではない；
（ｉｉ）５２位におけるアミノ酸はリジンではない；
（ｉｉｉ）５４位におけるアミノ酸はロイシンではない；
（ｉｖ）５５位におけるアミノ酸はヒスチジンではない；及び／又は
（ｖ）５６位におけるアミノ酸はスレオニン又はセリンではない。
【０２３６】
一例では、本開示のタンパク質が負に荷電したアミノ酸を１つ含み、それが５０位又は５５位であるならば、以下の１以上が適用される：
（ｉ）５１位におけるアミノ酸はアラニンではない；
（ｉｉ）５２位におけるアミノ酸はリジンではない；
（ｉｉｉ）５３位におけるアミノ酸はアスパラギン又はセリン又はスレオニンではない；
（ｉｖ）５４位におけるアミノ酸はロイシン又はアルギニン又はトリプトファン又はリジンではない；及び／又は
（ｖ）５６位におけるアミノ酸はスレオニン又はセリン又はフェニルアラニンではない。
【０２３７】
一例では、本開示のタンパク質は１以上（たとえば、２又は３又は４）のＦＲを含まず、又はＯ８、Ｏ１８、Ｌ１８、Ｌ４、Ｌ１２、Ｌ２２、Ａ２、ＤＰＫ１４、Ａ１７、Ａ１、Ａ１１、Ｌ２０、Ｌ６及びＢ３から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列のｖｋ断片に由来しないし、又は基づかない。
【０２３８】
一例では、２以上の負に荷電したアミノ酸を含む本開示のタンパク質は１以上（たとえば、２又は３又は４）のＦＲを含まず、又はＯ８、Ｏ１８、Ｌ１８、Ｌ４、Ｌ１２及びＬ２２から成る群から選択されるヒト生殖細胞系列のｖｋ断片に由来しないし、又は基づかない。
【０２３９】
一例では、本開示のタンパク質はＶＬの完全なヒトＣＤＲ２を含まない。「ＶＬの完全なヒトＣＤＲ２」によって、ＣＤＲ２がヒト以外の種に由来し得る又は合成することができる又は、たとえば、アフィニティ変異によって作出されたヒトＣＤＲ２の変異形態であることができることを意味するように理解されるであろう。
【０２４０】
組換え発現
組換えタンパク質の場合、それをコードする核酸は好ましくは発現ベクターに配置され、次いで宿主細胞、好ましくはジスルフィド架橋又はジスルフィド結合を作出できる細胞、たとえば、大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はたとえば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞若しくは免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような哺乳類細胞に形質移入して組換え宿主細胞にてタンパク質の合成を得る。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文にはＳｋｅｒｒａら（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，（１９９２）が挙げられる。これらの目的を達成するための分子クローニング技法は当該技術で既知であり、たとえば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）にて記載されている。組換え核酸の構築には多種多様なクローニング及び試験管内での増幅の方法が好適である。組換え抗体を作出する方法も当該技術で既知である。ＵＳ４８１６５６７を参照のこと。
【０２４１】
単離に続いて、本開示のタンパク質をコードする核酸は好ましくは、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は無細胞系若しくは細胞における発現のために発現構築物又は複製可能なベクターに挿入される。好ましくは、核酸はプロモータに操作可能に連結される。
【０２４２】
本明細書で使用されるとき、用語「プロモータ」は、最も広い文脈で解釈されるべきであり、ＴＡＴＡボックス又は開始要素を含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、それは、たとえば、発生上の及び／又は外部の刺激に応答して又は組織特異的に核酸の発現を変化させる追加の調節要素（たとえば、上流の活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサ及びサイレンサ）と共に、又はそれを伴わずに実際の転写開始に必要とされる。本文脈では、用語「プロモータ」は、それが操作可能に連結される核酸の発現を付与する、活性化する又は高める組換えの、合成の又は融合の核酸又は誘導体を記載するのにも使用される。好まれるプロモータは、１以上の特定の調節要素の追加のコピーを含有して発現をさらに高めることができ、及び／又は前記核酸の空間的な発現及び／又は時間的な発現を変化させることができる。
【０２４３】
本明細書で使用されるとき、用語「操作可能に連結される」は、核酸の発現がプロモータによって制御されるように核酸に対してプロモータを位置づけることを意味する。
【０２４４】
無細胞発現系も本開示によって熟考される。たとえば、本開示のタンパク質をコードする核酸は好適なプロモータ、たとえば、Ｔ７プロモータに操作可能に連結され、得られた発現構築物は転写及び翻訳に十分な条件に暴露される。試験管内での発現又は無細胞での発現に典型的な発現ベクターは記載されており、ＴＮＴＴ７及びＴＮＴＴ３系（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ及びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４５】
細胞における発現について多数のベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に、以下：シグナル配列、本開示のタンパク質をコードする配列（たとえば、本明細書で提供される情報に由来する）、エンハンサ要素、プロモータ及び転写終結配列の１以上が含まれるが、これらに限定されない。技量のある熟練者はタンパク質の発現に好適な配列に気付くであろう。たとえば、例となるシグナル配列には、原核細胞の分泌シグナル（たとえば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（たとえば、インベルターゼリーダー、因子リーダー又は酸性ホスファターゼリーダー）又は哺乳類の分泌シグナル（たとえば、単純性ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【０２４６】
例となるプロモータには、原核細胞にて活性があるもの（たとえば、ｐｈｏＡプロモータ、β−ラクタマーゼ及びラクトースのプロモータ系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）のプロモータ系、及びたとえば、ｔａｃプロモータのようなハイブリッドプロモータ）が挙げられる。これらのプロモータは、グラム陰性又はグラム陽性の生物のような真正細菌、たとえば、 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、たとえば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａのような腸内細菌科、並びにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのような桿菌、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのようなシュードモナス菌を含む原核生物における発現に有用である。好ましくは、宿主は大腸菌である。大腸菌Ｂ，大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、ＤＨ５α又はＤＨ１０Ｂのような他の株も好適であるが、好まれる大腸菌クローニング宿主の１つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）である。
【０２４７】
哺乳類細胞で活性のある例となるプロモータには、サイトメガロウイルス中早期プロモータ（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモータ（ＥＦ１）、小分子核ＲＮＡプロモータ（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、ミオシン重鎖プロモータ、サルウイルス４０プロモータ（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモータ（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモータ、β−アクチンプロモータ、ＣＭＶエンハンサ／β−アクチンプロモータを含むハイブリッド調節要素、又は免疫グロブリンプロモータ又はその活性断片が挙げられる。有用な哺乳類の宿主細胞株の例は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓細胞株（２９３細胞又は浮遊培養における増殖用に継代された２９３細胞）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０２４８】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅを含む群から選択される酵母細胞のような酵母細胞における発現に好適な典型的なプロモータには、ＡＤＨ１プロモータ、ＧＡＬ１プロモータ、ＧＡＬ４プロモータ、ＣＵＰ１プロモータ、ＰＨＯ５プロモータ、ｎｍｔプロモータ、ＲＰＲ１プロモータ、又はＴＥＦ１プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４９】
昆虫細胞における発現に好適な典型的なプロモータには、ＯＰＥＩ２プロモータ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｕｒｉから単離された昆虫アクチンプロモータ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐ．Ｄｓｈのプロモータ（Marsh et al., 2000)、及び誘導可能なメタロチオネインのプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。組換えタンパク質の発現にとって好まれる昆虫細胞には、ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４細胞及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞（たとえば、ｓｆ１９細胞、ｓｆ２１細胞）が挙げられる。核酸断片の発現に好適な昆虫にはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｐ．が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの使用も熟考される。
【０２５０】
単離された核酸分子又はそれを含む遺伝子構築物を発現のために細胞に導入する手段は当該技術で既知である。所与の細胞に使用される技法は既知の上手く行く技法に依存する。細胞に組換えＤＮＡを導入する手段には、とりわけ、微量注入、ＤＥＡＥ／デキストランが介在する形質移入、リポフェクトアミン（米国、ＭＤのＧｉｂｃｏ）及び／又はセルフェクチン（米国、ＭＤのＧｉｂｃｏ）を使用することによるようなリポソームが介在する形質移入、ＰＥＧが介在するＤＮＡの取り込み、エレクトロポレーション及びＤＮＡを被覆したタングステン又は金粒子を用いることによるような微粒子衝撃（米国、ＷＩのＡｇｒａｃｅｔｕｓ社）が挙げられる。
【０２５１】
本開示のタンパク質を作出するのに使用される宿主細胞は、使用される細胞種に応じて様々な培地で培養され得る。たとえば、ハムのＦｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は哺乳類細胞を培養するのに好適である。本明細書で議論される他の細胞種を培養する培地は当該技術で既知である。
【０２５２】
タンパク質の単離
本開示のタンパク質は好ましくは単離される。「単離される」によって、タンパク質がその天然に存在する環境から精製される又は取り出される、たとえば、不均質な環境にあることを意味する。「実質的に精製される」によってタンパク質が混入物質を実質的に含まない、たとえば、混入物質を少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％含まないことを意味する。
【０２５３】
本開示のタンパク質を精製する方法は当該技術で既知であり、及び／又は本明細書で記載される。たとえば、結合が生じるのに十分な条件下である時間、それに結合することが可能である剤にタンパク質を接触させる。任意で、洗浄して未結合のタンパク質を取り除いた後、本開示のタンパク質を単離する、たとえば、溶出する。
【０２５４】
組換え法を使用する場合、本開示のタンパク質は、細胞周辺腔にて細胞内で産生され得、又は培地に直接分泌され得る。タンパク質が細胞内で産生されるのであれば、第１の工程として、粒子状の残渣、宿主細胞又は溶解断片を、たとえば、遠心又は限外濾過によって取り除く。Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）は大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。手短には、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間、細胞ペーストを溶解する。遠心によって細胞残渣を取り除く。タンパク質が培地に分泌される場合、一般に先ず、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅのＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて、そのような発現系の上清を濃縮する。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を前述の工程のいずれかに含めてタンパク質分解を阻害し、抗生剤を含めて有害な混入物の増殖を妨げ得る。
【０２５５】
たとえば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィを用いて、細胞から調製されたタンパク質を精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好まれる精製法である。プロテインＡのアフィニティリガンドとしての好適性は、タンパク質に存在する（とにかく存在すれば）抗体のＦｃドメインの種類及びアイソタイプに左右される。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Lindmark et al. 1983）。マウスのアイソタイプすべて及びヒトのγ３についてはプロテインＧが推奨される（Guss et al. 1986）。さもなければ、本開示のタンパク質における可変ドメインが結合する又は作られた抗原又はエピトープ性決定基を用いてアフィニティ精製を行うことができる。アフィニティリガンドが結合するマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。制御された孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。たとえば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィ、アニオン又はカチオン交換樹脂（たとえば、ポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィ、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安沈殿のようなタンパク質精製のための他の技法も回収されるタンパク質に応じて利用可能である。
【０２５６】
技量のある熟練者は、本開示のタンパク質が、タグ、たとえば、ポリヒスチジンタグ、たとえば、ヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）タグ、又はサルウイルス５（Ｖ５）タグ、又はＦＬＡＧタグ又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含んで精製又は検出を円滑にするように修飾され得ることにも気付くであろう。好ましくは、タグはヘキサ−ｈｉｓタグである。次いで、得られたタンパク質をアフィニティ精製のような当該技術で既知の方法を用いて精製する。たとえば、ヘキサ−ｈｉｓタグを含むタンパク質は、タンパク質を含む試料を、固形又は半固形の支持体に不動化されたヘキサ−ｈｉｓタグを特異的に結合するニッケル／ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）に接触させ、試料を洗浄して未結合のタンパク質を取り除き、その後結合したタンパク質を溶出することによって精製される。代わりに、又はさらに、タグに結合するリガンド又は抗体をアフィニティ精製法にて使用する。
【０２５７】
予備精製工程に続いて、本開示のタンパク質と混入物を含む混合物を低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供してもよい。
【０２５８】
タンパク質の合成
たとえば、ＢＯＣ又はＦＭＯＣ化学法を用いた標準の技法を用いて、決定されたアミノ酸配列から本開示のタンパク質が容易に合成される。合成ペプチドは、固相、液相、又はペプチド縮合又はそれらの組み合わせの既知の技法を用いて調製され、天然及び／又は非天然のアミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３の元々の固相法の脱保護、中和、結合及び洗浄のプロトコールを伴った標準Ｂｏｃ（Ｎａ−アミノ保護Ｎｃｔ−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、又はＣａｒｐｉｎｏ及びＨａｎ，１９７２によって記載された塩基に不安定なＮａ−アミノ保護９―フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃのＮａ−アミノ保護アミノ酸は種々の商業的供給源、たとえば、Ｆｌｕｋａ、Ｂａｃｈｅｍ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｂａｃｈｅｍ、又はＰｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｓから入手することができる。
【０２５９】
タンパク質の凝集耐性を評価する方法
本開示のタンパク質又は組成物の凝集耐性は、当該技術で既知の方法を用いて解析することができる。当業者に許容可能な凝集耐性パラメータを採用し得る。例となるパラメータを以下でさらに詳細に記載する。一部の例では、熱による再折り畳み性を評価する。一部の例では、本開示のタンパク質の発現レベル（たとえば、％収率によって測定されるような）を評価する。他の例では、本開示のタンパク質の凝集レベルを評価する。特定の例では、本開示のタンパク質又は組成物の凝集耐性を好適な対照のそれと比較する。
【０２６０】
本開示のタンパク質の凝集耐性は当該技術で既知の多数の非限定の生物物理学的な又は生化学的な技法を用いて解析し得る。そのような技法の例は、たとえば、円偏光二色性（ＣＤ）分光分析法のような解析用分光分析法である。ＣＤ分光分析法は、上昇する温度の関数としてタンパク質の光学活性を測定する。円偏光二色性（ＣＤ）分光分析法は構造的な非対称性のために生じる右側の偏光に対する左側の偏光の吸収における差異を測定する。無秩序な又は折り畳みがほどけた構造は、秩序のある又は折り畳まれた構造とは非常に異なるＣＤスペクトルを生じる。ＣＤスペクトルは、上昇する温度の変性効果に対するタンパク質の感度を反映するので、タンパク質の凝集耐性を示すことになる（van Mierlo and Steemsma, 2000を参照）。
【０２６１】
凝集耐性を測定するための別の例となる解析用分光分析法は、蛍光発光分光分析法（上記van Mierlo and Steemsma, supraを参照）である。凝集耐性を測定するためのさらに別の例となる解析用分光分析法は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析法（上記van Mierlo and Steemsma, supraを参照）である。
【０２６２】
他の例では、本開示の組成物又はタンパク質の凝集耐性は生化学的に測定される。凝集耐性を評価するための例となる生化学的な方法は熱負荷アッセイである。「熱負荷アッセイ」では、本開示のタンパク質を一連の時間の間、ある範囲の上昇する温度に供する。たとえば、試験タンパク質をある範囲の上昇する温度に供する。次いで関連する生化学的なアッセイによってタンパク質の活性を評価する。たとえば、結合タンパク質の結合活性は機能的な又は定量的なＥＬＩＳＡによって測定され得る。結合親和性を測定する別の方法は表面プラスモン共鳴を採用する。表面プラスモン共鳴は、たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅ方式（スウェーデンのウプサラ及びニュージャージー州、ピスカタウエイのＰｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ）を用いたバイオセンサーマトリクス内でのタンパク質の濃度の変化を検出することによってリアルタイムの二重特異性の相互作用の解析を可能にする光学現象である。
【０２６３】
他の例では、本開示の組成物又はタンパク質の凝集耐性は凝集する傾向を測定することによって判定される。凝集は、多数の非限定の生化学的な又は生物物理学的な技法によって測定することができる。たとえば、本開示の組成物又はタンパク質の凝集は濁度の測定によって評価され得る。この目的で、３２０ｎｍ、又は代わりに３３０ｎｍ、３４０ｎｍ、又は３５０ｎｍでの吸収がモニターされる。
【０２６４】
代わりに又はさらに、組成物又はタンパク質の凝集耐性は、クロマトグラフィ、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて評価することができる。ＳＥＣはサイズに基づいて分子を分離する。イオン及び小さな分子をその内部に収容するが、大きいものは収容しないポリマーゲルの半固形ビーズでカラムを満たす。タンパク質又は組成物をカラムの上に載せると、小型の折り畳まれたタンパク質（すなわち、非凝集タンパク質）は大きなタンパク質凝集体に利用可能なものよりも多量に溶媒を介して分布する。その結果、大きな凝集体はさらに迅速にカラムを移動し、このように混合物を分離することができ、又はその成分に分画することができる。それがゲルから溶出されるにつれて各分画を別々に（たとえば、光散乱によって）定量することができる。従って、本開示の組成物又はタンパク質の凝集比率は、ゲルに載せたタンパク質の総濃度に分画の濃度を比較することによって決定することができる。凝集耐性の組成物は本質的に単一分画としてカラムから溶出し、溶出特性又はクロマト図にて本質的に単一ピークとして見える。
【０２６５】
他の例では、本開示の組成物の凝集耐性は、タンパク質の発現（たとえば、組換え発現）に続いて回収されるタンパク質の量（本明細書では％収率）を測定することのよって評価される。たとえば、％収率は、宿主の培養培地のｍｌごとに回収されるタンパク質のミリグラム（たとえば、タンパク質のｍｇ／ｍｌ）を確定することによって測定することができる。好まれる例では、％収率は、哺乳類の宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ細胞）における発現に続いて評価される。
【０２６６】
さらに別の例では、本開示の組成物の凝集耐性は、定義された時間の間での保存に続いてある範囲の温度（たとえば、約２５℃〜約８０℃）でのタンパク質の損失をモニターすることによって評価される。回収されたタンパク質の量又は濃度は当該技術で既知のタンパク質定量法を用いて測定し、タンパク質の当初の濃度と比較することができる。例となるタンパク質定量法にはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析又はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイが挙げられる。
【０２６７】
さらに他の例では、本開示のタンパク質の凝集耐性は、結合分子の変性部分又は折り畳みがほどけた部分への標識化合物の結合を定量することによって評価され得る。そのような分子は、通常天然のタンパク質の内部に埋もれるが、変性した又は折り畳みがほどけた結合分子では露出されるアミノ酸の大きな疎水性の斑部と好ましくは結合する又は相互作用するので、好ましくは疎水性である。例となる標識される化合物は、疎水性蛍光色素、１−アニリノ−８−ナフタリンスルホネート（ＡＮＳ）である。
【０２６８】
他の例には、正しく折り畳まれた可変ドメインに結合するのみであるタンパク質の結合（たとえば、プロテインＡは正しく折り畳まれたＩｇＧ３のＶＨに結合する）を検出することが含まれる。
【０２６９】
抱合体
本開示はまた、別の化合物に抱合された本開示のタンパク質、たとえば、異なる部分、たとえば、直接又は間接的にタンパク質に結合する治療剤に抱合された本開示のタンパク質を含む抱合体（免疫抱合体）も提供する。他の部分の例には、酵素、蛍光色素分子、細胞毒素、放射性同位元素（たとえば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０又はインジウム−１１１）、免疫調節剤、抗血管形成剤、抗血管新生、及び／又は他の血管新生剤、毒素、増殖抑制剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤及び治療用核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７０】
細胞毒素には細胞に有害な（たとえば、細胞を殺傷する）剤が挙げられる。当該技術で既知のこれらの部類の薬剤の記載、及び作用のメカニズムについては、Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０）を参照のこと。抗体免疫毒素の調製に関する追加の技法は、たとえば、ＵＳ５，１９４，５９４に提供されている。例となる毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Pｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに由来の）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。たとえば、ＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。
【０２７１】
本開示の免疫抱合体を形成するのに好適な治療剤には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、代謝抑制剤（たとえば、メソトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、サイクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン及び他の白金誘導体、たとえば、カルボプラチン）、抗生剤（たとえば、ダクチノマイシン（前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（前のダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミオキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））が挙げられる。
【０２７２】
放射性抱合された抗体の作出には種々の放射性核種が利用可能である。例には２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７３】
別の例では、プレターゲティングで利用するためにタンパク質を「受容体」（たとえば、ストレプトアビジン）に抱合してもよく、その際、タンパク質／受容体の抱合体は患者に投与され、その後、清浄剤を用いて、次いで治療剤（たとえば、放射性核種）に抱合する「リガンド」（たとえば、アビジン）の投与を用いて循環から未結合の抱合体を取り除く。
【０２７４】
本開示のタンパク質は、当該技術で既知であり、容易に利用可能である追加の非タンパク様部分を含有するようにさらに修飾することができる。好ましくは、タンパク質の誘導体化に好適な部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン又はポリビニルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７５】
タンパク質残基を化合物に抱合させる当該技術で既知の種々の方法が当該技術で既知であり、技量のある熟練者に明らかであろう。
【０２７６】
使用
本開示のタンパク質は、研究、診断／予後診断、工業及び治療への適用を含む種々の適用に有用である。タンパク質が結合する抗原に応じて、それは、化合物を細胞に送達するのに、たとえば、細胞を殺傷する又は増殖を抑制する及び／又は画像診断するのに及び／又は試験管内のアッセイに有用であり得る。一例では、タンパク質は画像診断する及び細胞傷害剤を細胞に送達することの双方に有用であり、すなわち、それは、検出可能な標識及び細胞傷害剤に抱合され、又は組成物はその一部が細胞傷害剤に抱合され、一部が検出可能な標識に抱合されるタンパク質の混合物を含む。
【０２７７】
本明細書で記載されるタンパク質はまた、拮抗剤として作用し、（ａ）受容体への結合（たとえば、リガンドの、阻害剤）、（ｂ）受容体のシグナル伝達機能、及び／又は（ｃ）刺激機能を阻害する（低減する又は抑制することができる）ことができる。受容体機能の拮抗剤として作用するタンパク質はリガンドの結合を直接又は間接的に（たとえば、立体構造の変化を起こすことによって）阻止することができる。
【０２７８】
本開示のタンパク質はまた、たとえば、（ａ）受容体への（リガンドの）結合を高める又は誘導する、（ｂ）受容体のシグナル伝達機能高める又は誘導する、及び／(c)又は刺激機能を提供する受容体の作動薬であってもよい。
【０２７９】
抗原
本開示は、本明細書における任意の実施例、実施例又はクレームにて具体的に除外されるもの以外の抗原に特異的に結合することが可能である本開示に従って修飾された少なくとも１つのＶＬ（及び任意でＶＨ）を含むタンパク質を熟考し、すなわち、本開示の例は特定の抗原を要求することとは対照的に一般的である。
【０２８０】
一例では、本開示のタンパク質は微生物に由来する及び／又は鳥類に由来するタンパク質に結合しない。
【０２８１】
一例では、タンパク質は、リゾチーム（たとえば、鶏卵リゾチーム）及び／又はβ−ガラクトシダーゼ及び／又はアミラーゼ（たとえば、α−アミラーゼ）及び／又は脱水酵素（たとえば、炭酸脱水酵素）及び／又はＢ５Ｒ（たとえば、Ｖａｃｃｉｎｉａ由来）に結合しない。一例では、タンパク質は、ヒトのアルブミンに結合しない。一例では、タンパク質は、ヒトのＶＥＧＦに結合しない。
【０２８２】
例となるタンパク質はヒトのタンパク質に特異的に結合し、ヒトのタンパク質に対して生じた抗体に由来する。
【０２８３】
本開示の実施例は、疾患又は障害（すなわち、状態）に関連する、たとえば、癌細胞又は癌性／形質転換された細胞に関連する又はそれによって発現される及び／又は自己免疫疾患に関連する及び／又は炎症性の疾患又は状態に関連する及び／又は神経変性疾患に関連する及び／又は免疫不全障害に関連する抗原に特異的に結合するタンパク質を熟考する。
【０２８４】
本開示のタンパク質を作出することができる例となる抗原には、ＢＭＰＲｌＢ（骨形成タンパク質受容体−ＩＢ型；ＷＯ２００４０６３３６２）；Ｅｌ６（ＬＡＴｌ、ＳＬＣ７Ａ５、ＷＯ２００４０４８９３８）；ＳＴＥＡＰｌ（前立腺の６回膜貫通上皮抗原、ＷＯ２００４０６５５７７）；ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６、ＷＯ２００４０４５５５３）；ＭＰＦ（ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増殖因子、メソテリン、ＷＯ２００３１０１２８３）；Ｎａｐｉ３ｂ（ＷＯ２００４０２２７７８）；Ｓｅｍａ５ｂ（ＷＯ２００４０００９９７）；ＰＳＣＡ（ＵＳ２００３１２９１９２）；ＥＴＢＲ（ＷＯ２００４０４５５１６）；ＭＳＧ７８３（ＷＯ２００３１０４２７５）；ＳＴＥＡＰ２（ＷＯ２００３０８７３０６）；ＴｒｐＭ４（ＵＳ２００３１４３５５７）；ＣＲＩＰＴＯ（ＵＳ２００３２２４４１１）；ＣＤ２１（ＷＯ２００４０４５５２０）；ＣＤ７９ｂ（ＷＯ２００４０１６２２５）；ＳＰＡＰｌＢ（ＷＯ２００４０１６２２５）；ＨＥＲ２（ＷＯ２００４０４８９３８）；ＮＣＡ（ＷＯ２００４０６３７０９）；ＭＤＰ（ＷＯ２００３０１６４７５）；ＩＬ−２０Ｒα（ＥＰ１３９４２７４）；ブレビカン（ＵＳ２００３１８６３７２）；ＥｐｈＢ２Ｒ（ＷＯ２００３０４２６６１）；ＡＳＬＧ６５９（ＵＳ２００４０１０１８９９）；ＰＳＣＡ（ＷＯ２００４０２２７０９）；ＧＥＤＡ（ＷＯ２００３０５４１５２）；ＢＡＦＦ−Ｒ（ＷＯ２００４０５８３０９）；ＣＤ２２（ＷＯ２００３０７２０３６）；ＣＤ７９ａ（ＷＯ２００３０８８８０８）；ＣＸＣＲ５（ＷＯ２００４０４００００）；ＨＬＡ−ＤＯＢ（ＷＯ９９５８６５８）；Ｐ２Ｘ５（ＷＯ２００４０４７７４９）；ＣＤ７２（ＷＯ２００４０４２３４６）；ＬＹ６４（ＵＳ２００２１９３５６７）；ＦｃＲＨｌ（ＷＯ２００３０７７８３６）；ＩＲＴＡ２（ＷＯ２００３０７７８３６）；ＴＥＮＢ２（ＷＯ２００４０７４３２０）；ＣＤ２０（ＷＯ９４／１１０２６）；ＶＥＧＦ−Ａ（Ｐｒｅｓｔａら、１９９７）；ｐ５３；ＥＧＦＲ；プロゲステロン受容体；カテプシンＤ；Ｂｃｌ−２；Ｅカドヘリン；ＣＥＡ；ＬｅｗｉｓＸ；Ｋｉ６７；ＰＣＮＡ；ＣＤ３；ＣＤ４；ＣＤ５；ＣＤ７；ＣＤ１１ｃ；ＣＤ１１ｄ；ｃ−Ｍｙｃ；ｔａｕ；ＰｒＰＳＣ；ＴＮＦα；ソニックヘッジホッグ；肝細胞増殖因子；肝細胞増殖因子受容体；ＥＰＨＡ２；プロラクチン受容体；プロラクチン；ＩＬ−２；ＴＮＦ−受容体；ＩＬ−２１；ＩＬ−２１受容体；ＣＸＣＲ７；ＦＧＦＲ２；ＦＧＦ２又はＡβが挙げられる。
【０２８５】
別の例では、本開示のタンパク質は可溶性タンパク質、好ましくは生体内で分泌される可溶性タンパク質に結合する。例となる可溶性タンパク質にはサイトカインが挙げられる。用語「サイトカイン」は、細胞間メディエータとして別の細胞に作用する細胞の一集団から放出されるタンパク質又はペプチドに対する一般的な用語である。サイトカインの例には、リンホカイン、モノカイン、増殖因子、及び従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインに含められるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、レラキシン、プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α及び−β、ミュラー管抑制物質、性腺刺激関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−Ｂのような神経増殖因子、血小板増殖因子、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βのような形質転換増殖因子（ＴＧＦ）インスリン様増殖因子−Ｉ又はＩＩ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、β又はγのようなインターフェロン、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、たとえば、ＩＬ−１、ＩＬ−ｌα、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１及びＬＩＦのようなインターロイキンである。例となるサイトカインはインターロイキン２、１３又は２１、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＢＡＦＦ及びＧＭ−ＣＳＦから成る群から選択される。
【０２８６】
別の例では、可溶性タンパク質はケモカインである。ケモカインは一般にケモカイン発現の部位に免疫エフェクター細胞を動員する化学誘引物質として作用する。ケモカインにはＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭｌＰｌ−α又はＭＩＰｌ−βが挙げられるが、これらに限定されない。技量のある熟練者は、特定のサイトカインは化学誘引物質の効果も有し、用語ケモカインのもとで分類され得ることを認識するであろう。好まれるケモカインはＲＡＮＴＥＳである。
【０２８７】
別の例では、可溶性タンパク質はペプチドホルモンである。例となるペプチドホルモンにはインスリン、ＮＰＹ、ＰＹＹ、グルカゴン及びプロラクチンが挙げられる。
【０２８８】
さらなる例では、可溶性タンパク質はプロテアーゼである。例となるプロテアーゼには因子Ｘ、因子ＶＩＩ、因子ＩＸ又はカリクレインが挙げられる。
【０２８９】
別の例では、本開示のタンパク質は受容体又は膜関連タンパク質に結合する。例となる抗原には、Ｇタンパク質結合受容体（たとえば、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ３、Ｃ５ａＲ又はβ−２−アドレナリン作動性受容体）又はイオンチャンネル（たとえば、ナトリウムチャンネル又はカリウムチャンネル又はカルシウムチャンネル、好ましくはニコチン酸アセチルコリン受容体）又は膜１回貫通型タンパク質（たとえば、Ｔ細胞受容体又はプロラクチン受容体又はサイトカイン受容体（たとえば、ＩＬ−２１受容体）又はＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラス２又はＣＤ４又はＣＤ８）が挙げられる。
【０２９０】
さらなる例では、本開示のタンパク質は、インターフェロンα受容体１（ＩＦＮＡＲ１）、アンギポイエチン−２、ＩＬ−４Ｒα、ＩＬ−３３、ＣＸＣＬ１３、  糖化最終産物の受容体（ＲＡＧＥ）、ＩＣＯＳ、ＩｇＥ、インターフェロンα、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、ＥｐｈＢ４、ＣＤ１９、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＣＤ２２、ＩＬ−２２、ＥｐｈＡ２、ＩＬ−１３、高移動群タンパク質１（ＨＭＧｌ）、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、インテグリン（たとえば、インテグリンαＶβ３）、Ｅｐｈ受容体、ＩＬ−９、ＥｐｈＡ４、ＰＣ−細胞−由来の増殖因子（ＰＣＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板−由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板−由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ、たとえば、ＰＤＧＦＲα又はＰＤＧＦＲβ）又はＩＬ−５の１以上に結合する。
【０２９１】
本開示のタンパク質が由来することができる例となる抗体は技量のある熟練者には明らかであろうし、上文に列記されたものが含まれる。
【０２９２】
例となる二重特異性のタンパク質は当該抗原の２つの異なるエピトープに結合する。他のそのようなタンパク質は、１つの抗原結合部位を別のタンパク質の結合部位に組み合わせ得る。或いは、当該領域の抗−抗原は、たとえば、Ｔ−細胞受容体分子（たとえば、ＣＤ３）又はたとえば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及び／又はＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤｌ６）のようなＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のような、当該抗原を発現する細胞に細胞性の防御機構を集中させ、局在させるように引き金を引く白血球上の分子に結合する領域と組み合わせられ得る。二重特異性のタンパク質を用いて当該抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を局在させ得る。これらのタンパク質は、当該抗原を結合する領域及び細胞傷害剤（たとえば、サポニン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メソトレキセート、又は放射性同位元素ハプテン）を結合する領域を持つ。ＷＯ９６／１６６７３は二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５，８３７，２３４号は二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体はＷＯ９８／０２４６３にて示されている。米国特許第５，８２１，３３７号は二重特異性抗−ＥｒｂＢ２／抗−ＣＤ３抗体を教示している。
【０２９３】
医薬組成物及び治療方法
本開示のタンパク質（同義語：有効成分）は、予防療法及び治療療法のための非経口、外用、経口又は局所の投与、エアゾール投与又は経皮投与に有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて種々の単位投与形態で投与することができる。たとえば、経口投与に好適な単位投与形態には、粉剤、錠剤、丸薬、カプセル、及びトローチが挙げられ、又は非経口投与による。本開示の医薬組成物は経口で投与される場合、消化から保護されるべきであることが認識される。このことは通常、組成物によってタンパク質を複雑にし、それを酸性及び酵素性の加水分解に耐性にすることによって、又はリポソームのような適宜耐性のキャリアに化合物を包み込むことによって達成される。消化からタンパク質を保護する手段は当該技術で既知である。
【０２９４】
通常、治療上有効な量のタンパク質を対象への投与のための組成物に製剤化する。語句「治療上有効な量」は、対象における治療又は他の治療効果を促進する、誘導する及び／又は向上させるのに十分な量を指す。明らかになるように、これらの製剤における本開示のタンパク質の濃度は広く変化することができ、主として、選択される投与の特定の方式及び患者の必要性に従って流体容積、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。疾患の種類及び重症度に応じて、たとえば、１以上の別々の投与によるのであろうと連続点滴によるのであろうと、治療上有効な量は約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）のタンパク質である。典型的な毎日の投与量は約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上に及び得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて疾患の症状の所望の抑制が生じるまで治療が持続される。例となる投与計画は、約４ｍｇ／ｋｇの当初負荷用量、その後の約２ｍｇ／ｋｇのタンパク質の毎週の維持用量を含む。他の投与計画も有用となり得る。たとえば、リツキシマブのような抗ＣＤ２０抗体は、約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。ベバシズマビスのような抗ＶＥＧＦ抗体は５〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。トラツズマブのような抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は４〜８ｍｇ／ｋｇの負荷用量及び２〜６ｍｇ／ｋｇの毎週の／２週ごとの維持用量で投与される。アダリムマブのような抗ＴＮＦα抗体は関節リウマチを治療するには週当たり約４００ｍｇの用量で、又は１週目には１６０ｍｇの負荷用量及び週当たり４０ｍｇの維持用量で、又は乾癬には８０ｍｇの負荷用量と週当たり４０ｍｇの維持用量で投与される。従来の技法及びアッセイによって治療の進行が容易にモニターされる。
【０２９５】
本開示のタンパク質の好適な投与量は、特定のタンパク質、診断される／治療される／予防される状態及び／又は治療される対象に応じて変化するであろう。準最適な投与量で開始し、投与量を漸増して修正して最適な又は有用な投与量を決定することは技量のある内科医の能力の範囲内である。或いは、治療／予防のための適切な投与量を決定するには、培養アッセイ又は動物試験のデータを使用し、その際、好適な用量は、毒性がほとんどない又はない有効成分のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、採用される投与形態及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。治療上／予防上有効な用量は最初に細胞培養アッセイから推定することができる。動物モデルにて用量を製剤化し、細胞培養で決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半分の抑制を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する。そのような情報を用いてヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿におけるレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィによって測定され得る。
【０２９６】
或いは、対象への投与に先立って治療上有効な量に希釈する濃縮された用量で本開示のタンパク質を製剤化する。
【０２９７】
本開示の組成物は、蠕動投与及び腫瘍又は疾患の部位への直接設置（腔内投与）を含む、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮又は他の経路を介した注射用に製剤化された非経口投与に特に有用である。投与用の組成物は一般に薬学上許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解された本開示のタンパク質の溶液を含む。たとえば、緩衝化生理食塩水等のような種々の水性キャリアを使用することができる。他の例となるキャリアには水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、及び５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。混合した油とオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルも使用され得る。リポソームもキャリアとして使用され得る。ビヒクルは、等張性及び化学的安定性を高める軽微な量の添加剤、たとえば、緩衝液及び保存剤を含有し得る。組成物は、生理的条件に近似するのに必要とされる薬学上許容可能な補助物質、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝化剤、毒性調整剤等、たとえば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等を含有し得る。
【０２９８】
医薬組成物を調製する技法は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０によって例示されたように当該技術で一般に既知である。
【０２９９】
ＷＯ２００２／０８０９６７は、たとえば、喘息の治療のためのタンパク質を含むエアゾール化組成物を投与するための組成物及び方法を記載しているが、それは本開示のタンパク質の投与にも好適である。
【０３００】
本開示のタンパク質は、医薬的併用、製剤化、又は併用療法としての投与計画において第２の化合物と組み合わせられ得る。医薬的併用、製剤化又は投与計画の第２の化合物は好ましくは、それらが互いに有害に影響しないように併用のタンパク質に対して相補性の活性を有する。
【０３０１】
第２の化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤であり得る。そのような分子は意図する目的に有効な量で併用に好適に存在する。本開示のタンパク質を含有する医薬組成物はまた、治療上有効な量の化学療法剤、たとえば、チューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡ結合剤も有し得る。
【０３０２】
医薬の「徐放性」カプセル又は組成物も使用され得る。徐放性製剤は一般に長い時間にわたって薬剤の一定レベルを与えるように設計され、本開示の化合物を送達するのに使用され得る。
【０３０３】
本開示はまた対象における状態を治療する又は予防する方法を提供し、該方法はそれを必要とする対象に治療上有効な量の本開示のタンパク質を投与することを含む。
【０３０４】
本明細書で使用されるとき、用語「予防すること」、「予防する」又は「予防」は状態を予防する文脈で、特定された疾患又は状態の少なくとも１つの症状の進展を止める又は遅らせるのに十分な量の本明細書で記載されるタンパク質を投与することを含む。
【０３０５】
本明細書で使用されるとき、用語「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、特定された疾患又は状態の少なくとも１つの症状を軽減する又は排除するのに十分な治療上有効な量の本明細書で記載される阻害剤及び／又は剤を投与することを含む。
【０３０６】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は、ヒトを含む任意の動物、好ましくは哺乳類を意味するように解釈されるべきである。例となる対象には、ヒト、霊長類、家畜（たとえば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット動物（たとえば、イヌ、ネコ）、実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲した野生動物（たとえば、キツネ、シカ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳類はヒト又は霊長類である。さらに好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０３０７】
本明細書で使用されるとき、「状態」は正常機能の破壊又は妨害であり、特定の状態に限定されることはなく、疾患又は障害が含まれる。例では、状態は癌又は自己免疫疾患又は炎症性疾患である。
【０３０８】
例となる癌には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病又はリンパ系の悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のさらに特定の例には、血液癌（たとえば、リンパ腫又は白血病）、扁平上皮癌（たとえば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化器癌を含む胃癌、膵臓癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌、並びに頭頸部の癌が挙げられる。たとえば、癌は乳癌又は肺癌又は卵巣癌又は前立腺癌である。
【０３０９】
炎症性又は自己免疫性の状態は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体の抗原への反応によって生じる状態である。これらの状態には、自己免疫疾患及び過敏症反応（たとえば、Ｉ型：アナフィラキシー、蕁麻疹、食物アレルギー、喘息；ＩＩ型：自己免疫性溶血性貧血、輸血反応：ＩＩＩ型：血清病、壊死性血管炎、糸球体腎炎、関節リウマチ、ループス；ＩＶ型：接触性皮膚炎、移植片拒絶）が挙げられる。自己免疫疾患には、リウマチ性疾患（たとえば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥ及びループス性腎炎のようなループス、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群及び乾癬性関節炎）、変形性関節症、自己免疫性の消化管及び肝臓の疾患（たとえば、炎症性大腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫性胃炎及び悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、及びセリアック病）、血管炎（たとえば、チャーグ・ストラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症及び多発性関節炎を含むＡＮＣＡ関連の血管炎）、自己免疫性の神経疾患（たとえば、多発性硬化症、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、多発性神経障害）、腎疾患（たとえば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群及びベルガー病）、自己免疫性の皮膚疾患（たとえば、乾癬、蕁麻疹、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、及び皮膚エリテマトーデス）、血液疾患（たとえば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後紫斑病、及び自己免疫性溶血性貧血）、アテローム性硬化症、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚障害（たとえば、内耳疾患及び難聴）、ベーチェット病、レイノー症候群、臓器移植、及び自己免疫性内分泌疾患（たとえば、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）のような糖尿病関連の自己免疫疾患、アジソン病、及び自己免疫性甲状腺疾患（たとえば、グレーヴズ病及び甲状腺炎）が挙げられる。さらに好まれるそのような疾患には、たとえば、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連の血管炎、ループス、多発性硬化症、シェーグレン症候群、グレーヴズ病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎及び糸球体腎炎が挙げられる。
【０３１０】
別の例では、炎症性の状態は、好中球、単球、肥満細胞、好塩基球、好酸球、マクロファージが関与する状態であり、サイトカインの放出、ヒスタミンの放出、酸化的バースト、他の顆粒酵素の放出及び走化性が生じる。過敏性反応（上述した）も、補体の活性化及び好中球、肥満細胞、好塩基球等のような種々の白血球の動員／浸潤が関与することが多いので、炎症性疾患（急性又は慢性の）とみなすことができる。
【０３１１】
本開示の組成物は、投与製剤に適合するように、且つ治療上／予防上有効な量で投与されるであろう。製剤は、種々の方法、たとえば、摂取又は注射又は吸入によって容易に投与される。
【０３１２】
本開示のタンパク質の投与に他の治療計画を組み合わせ得る。併用療法は、同時計画又は順次計画として投与され得る。順次投与される場合、組み合わせは２回以上の投与にて投与される。併用投与には、別々の製剤を用いた同時投与、又は単一医薬製剤、及びいずれかの順での連続投与が挙げられ、好ましくは、双方（又はすべて）の活性剤が同時にその生物活性を発揮する間の時間が存在する。
【０３１３】
治療上の使用に先立って、本開示のタンパク質は好ましくは、たとえば、以下で記載されるように試験管内及び／又は生体内で調べられる。
【０３１４】
試験管内での試験
一例では、本開示のタンパク質は、化合物に抱合されていても抗原に結合する。すでに存在するタンパク質（たとえば、抗体）に由来するタンパク質の場合、本開示のタンパク質は、それが由来するタンパク質と少なくとも同様に抗原に結合し得る。或いは、本開示のタンパク質は、それが由来するタンパク質の又は負に荷電したアミノ酸を欠くタンパク質の形態の親和性又は結合活性の少なくとも１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％で抗原に結合する。
【０３１５】
タンパク質の結合親和性を決定する例となる方法には、標的抗原への抗体を阻止するタンパク質の能力を示す単純な免疫アッセイ、たとえば、競合結合アッセイが挙げられる。競合結合は、試験下のタンパク質が共通する抗原への参照抗体の特異的な結合を阻害するアッセイで測定される。多数の種類の競合結合アッセイ、たとえば、固相での直接又は間接の放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相での直接又は間接の酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al., 1983を参照）；固相での直接ビオチン／アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., 1986を参照）；固相での直接標識アッセイ、固相での直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane, 1988を参照）；固相での直接ビオチン／アビジンＥＩＡ（Cheung et al., 1990）；又は直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., 1990）が知られている。通常、そのようなアッセイには、固形表面に結合した精製抗原又はそれらのいずれかを担った細胞、非標識の試験タンパク質及び標識した参照タンパク質が含まれる。競合阻害は、試験タンパク質の存在下で固形表面又は細胞に結合した標識の量を確定することによって測定される。
【０３１６】
本開示はまた、本開示のタンパク質の活性を調べる方法も包含する。本開示のタンパク質の活性を試験管内で評価する種々のアッセイが利用可能である。たとえば、本開示のタンパク質を細胞又はその集団に投与して前記細胞に結合することができるかどうか及び／又は前記細胞によって内部に取り込まれ得るかどうかを判定する。そのようなアッセイは本開示のタンパク質を検出可能な標識で標識する（すなわち、抱合体を作製する）ことによって円滑にされるが、これは、本開示のタンパク質が標識されたタンパク質で検出することができるので必須ではない。そのようなアッセイは、本開示のタンパク質の化合物を細胞に送達する（すなわち、ペイロード）能力及び／又は画像診断におけるその有用性を評価するのに有用である。好ましくは、細胞は、本開示のタンパク質が結合する抗原を発現し、さらに好ましくは、検出される又は処理されることが望ましい細胞種の細胞株又は一次細胞培養である。
【０３１７】
一般に、たとえば、細胞傷害性分子に抱合された本開示のタンパク質の細胞傷害性又は細胞増殖抑制性の活性は、本開示のタンパク質が結合する抗原を発現する細胞を本開示のタンパク質に暴露することと；タンパク質が生物効果を発揮するのに好適な時間、たとえば、約６時間〜約５日間、細胞を培養することと；細胞の生存率、細胞傷害性及び／又は細胞死を測定することによって測定される。生存率（増殖）、細胞傷害性及び細胞死を測定するのに有用な細胞に基づく試験管内のアッセイは当該技術で既知である。
【０３１８】
たとえば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイは市販の（ウィスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ社）、甲虫ルシフェラーゼの組換え発現に基づく均質アッセイ法である（米国特許第５，５８３，０２４；５，６７４，７１３及び５，７００，６７０号）。この細胞増殖アッセイは、代謝的に活性のある細胞の指標である、細胞に存在するＡＴＰの定量に基づいて培養における生細胞の数を決定する。或いは、細胞の生存率は非蛍光のレサズリンを用いてアッセイし、それは本開示のタンパク質の存在下で培養された細胞に添加される。生細胞は、レサズリンを、たとえば、顕微鏡又は蛍光プレートリーダーを用いて容易に検出可能な赤色蛍光のレソルフィンに還元する。細胞の生存率の解析のためのキットは、たとえば、米国、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能である。
【０３１９】
細胞の生存率のための他のアッセイには、合成される際の３Ｈ−チミジン又は４Ｃ−チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定すること（すなわち、細胞分裂に関連するＤＮＡ合成を測定すること）が挙げられる。そのようなアッセイでは、標識したチミジンの存在下で細胞分裂が起きるのに十分な時間、細胞をインキュベートする。洗浄して取り込まれなかったチミジンを取り除いた後、シンチレーションカウンタを用いて標識（たとえば、放射活性のある標識）を検出する。細胞増殖を測定する代わりのアッセイには、たとえば、ＢｒｄＵの取り込みによるＤＮＡ合成の測定（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手可能なキットであるＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学による）が挙げられる。
【０３２０】
細胞死を検出するための例となるアッセイには、アポトーシス初期のＡＰＯＰＴＥＳＴ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈから入手可能）染色細胞が含まれ、細胞試料の固定を必要としない（Martin et al. 1994）。この方法はアネキシンＶ抗体を利用して、アポトーシスを受けている細胞に特徴的な細胞膜の再構成を検出する。この方法で染色されたアポトーシスを起こした細胞は、次いで、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、ＥＬＩＳＡ又は不動化されたアネキシンＶ抗体を用いた接着とパンニングのいずれかによって仕分けすることができる。或いは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ介在性のビオチン化ＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて細胞死のレベルを決定する。ＴＵＮＥＬアッセイは、酵素、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い、アポトーシス中に生成された３’−ＯＨ ＤＮＡ末端をビオチン化ヌクレオチドで標識する。次いで検出可能なマーカーに抱合されたストレプトアビジンを用いてビオチン化ヌクレオチドを検出する。ＴＵＮＥＬ染色のためのキットは、たとえば、ニューヨーク州、パーチェスのＩｎｔｅｒｇｅｎ社から入手可能である。
【０３２１】
本開示のタンパク質を血清及び／又は細胞に暴露し、その後、たとえば、免疫親和性精製を用いて本開示のタンパク質を単離することによって、本開示のタンパク質の生体内での安定性を評価する、又は予測することもできる。回収された本開示のタンパク質の量の低下は、本開示のタンパク質が血清にて又は細胞に暴露された際、分解されることを示している。
【０３２２】
別の例では、リガンドの受容体への結合を阻止する本開示のタンパク質の能力は標準の放射性免疫アッセイ又は蛍光免疫アッセイを用いて評価される。
【０３２３】
受容体を刺激する又はそれに拮抗する本開示のタンパク質の能力はタンパク質の存在下又は非存在下にて受容体のシグナル伝達を測定することによって評価することもできる。
【０３２４】
生体内試験
本開示のタンパク質はまた生体内での安定性及び／又は有効性についても調べることができる。たとえば、本開示のタンパク質を対象に投与し、ＥＬＩＳＡを用いて又はタンパク質に抱合された検出可能な標識を検出することによって経時的にタンパク質の血清レベルを検出する。これによって本開示のタンパク質の生体内での安定性の判定が可能になる。
【０３２５】
本開示のタンパク質をヒト疾患の動物モデルに投与し、その症状に対する効果を判定することができる。技量のある熟練者は、本開示のタンパク質が結合する抗原に基づいて好適なモデルを容易に決定することができるであろう。たとえば、ヒト癌の例となるモデルは当該技術で既知である。たとえば、乳癌のマウスモデルには、線維芽細胞増殖因子３(Muller et al., 1990); ＴＧＦ−α (Matsui et al, 1990); ｅｒｂＢ２(Guy, et al., 1992)を過剰発現するマウス；又はＳＣＩＤマウスへのヒト乳癌細胞の移植が挙げられる。卵巣癌のモデルには、マウスへの卵巣癌細胞の移植（たとえば、Roby et al., 2000に記載されたような）；黄体形成ホルモンを慢性的に分泌するトランスジェニックマウス（Risma et al., 1995）；又はＷｘ／Ｗｖマウスが挙げられる。前立線癌のマウスモデルも当該技術で既知であり、たとえば、ＳＶ４０早期遺伝子の強制発現で生じたモデルが挙げられる（最少ラットプロバシンプロモータを利用してＳＶ４０早期遺伝子を発現するＴＲＡＭＰモデル、又は長いプロバシンプロモータを用いて「ＬＡＤＹ」モデルと総称されるラージＴ抗原を発現するトランスジェニックマウス、又はｃ−ｍｙｃ若しくはＢｃｌ−２若しくはＦｇｆＳｂを発現する又は優勢阻害のＴＧＦＢを発現するマウス（前立腺癌のトランスジェニックモデルの概説についてはMatusik et al., 2001を参照のこと））。
【０３２６】
本開示のタンパク質を癌以外の疾患の動物モデル、たとえば、ＮＯＤに投与して糖尿病を抑制する、予防する、治療する又は遅らせることもでき（たとえば、Tang et al., 2004に記載されたように）、及び／又はＧＶＨＤのマウスモデル（たとえば、Trenado, 2002に記載されたように）及び／又は乾癬のマウスモデル（たとえば、Wang et al. 2008）及び／又は間接リウマチのモデル、たとえば、マウスのＳＫＧ系（Sakaguchi et al.）、ラットのＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、マウスのＩＩ型コラーゲン関節炎モデル又は幾つかの種における抗原誘導性の関節炎モデル（Bendele, 2001）及び／又は多発性硬化症のモデル（たとえば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ：Bradl and Linington, 1996)) 及び／又は炎症性気道疾患（たとえば、ＯＶＡ感作又はゴキブリ抗原感作（Chen et al. 2007）及び／又は炎症性大腸疾患のモデル（たとえば、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性の大腸炎又は大腸炎のＭｕｃ２欠損マウスモデル（Van der Sluis et al. 2006）に投与することができる。
【０３２７】
診断／予後予測の方法
一例では、本開示は状態を診断する又は予後予測する方法を提供する。
【０３２８】
本明細書で使用されるとき、用語「診断」及びたとえば、「診断する」、「診断された」、又は「診断すること」のような、しかし、これらに限定されないその変形は、臨床状態の一次診断又は再発疾患の診断を含む。
【０３２９】
「予後予測」、「予後予測すること」及びその変形は本明細書で使用されるとき、回復又は再発の機会を含む疾患のありそうな転帰又は経過を指す。
【０３３０】
一例では、方法は、試料における抗原の量を決定することを含む。従って、本開示のタンパク質は、診断目的又は研究目的のためにセルソーティング（たとえば、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング）のような適用にて有用性を有する。たとえば、抗原に結合し、複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で試料を本開示のタンパク質に接触させ、次いで複合体を検出する又は複合体のレベルを決定する。これらの目的で、タンパク質を標識することができ、又は未標識であることができる。本明細書で記載される標識を用いてタンパク質を直接標識することができる。未標識の場合、たとえば、凝集アッセイのような好適な手段を用いてタンパク質を検出することができる。たとえば、タンパク質又は他の好適な試薬（たとえば、標識されたプロテインＡ）と反応性の標識抗体（たとえば、二次抗体）のような、タンパク質を検出するのに使用することができる別の（すなわち、１以上の）好適な試薬と組み合わせて未標識の抗体又は断片を使用することもできる。
【０３３１】
好ましくは、本開示のタンパク質を免疫アッセイで使用する。好ましくは、免疫組織化学、免疫蛍光、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸収アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、バイオセンサーアッセイ、タンパク質チップアッセイ及び免疫染色アッセイ（たとえば、免疫蛍光）から成る群から選択されるアッセイを使用すること。
【０３３２】
種々の試料からタンパク質の濃度を決定するには標準の固相ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡの形式が特に有用である。
【０３３３】
一例では、そのようなアッセイには、たとえば、ポリスチレン又はポリカーボネートのマイクロウェル又はディップスティック、膜又はガラス支持体（たとえば、ガラススライド）のような固形マトリクス上に生物試料を不動化することが含まれる。当該抗原に特異的に結合する本開示のタンパク質を不動化した試料に直接接触させ、タンパク質は前記試料に存在する標的抗原のいずれかと直接結合を形成する。本開示のこのタンパク質は一般に、検出可能なレポーター分子、たとえば、ＦＬＩＳＡの場合、蛍光標識（たとえば、ＦＩＴＣ又はテキサスレッド）又は蛍光半導体ナノ結晶（ＵＳ６，３０６，６１０に記載されたような）、又はＥＬＩＳＡの場合、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はβ−ガラクトシダーゼ）によって標識され、又は代わりに本開示のタンパク質に結合する標識抗体を使用することができる。洗浄して未結合のタンパク質を取り除いた後、標識は、蛍光標識の場合、直接検出され、又は酵素標識の場合、たとえば、過酸化水素、ＴＭＢ、又はトルイジン、又は５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨード−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）のような基質の添加を介して検出される。そのようなＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡに基づく方式は、たとえば、単離した及び／又は組換えのタンパク質又はその免疫原性断片又はそのエピトープのようなタンパク質が結合するタンパク質標準の既知の量に対して検出方式を較正することによって試料におけるタンパク質の量を定量するのに特に好適である。
【０３３４】
別の形態では、ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡは、当該抗原に結合する本開示のタンパク質又は抗体を、たとえば、膜、ポリスチレン又はポリカーボネートのマイクロウェル又はポリスチレン又はポリカーボネートのディップスティック又はガラス支持体に不動化することを含む。次いで試料は本開示のタンパク質又は抗体と直接接触し、前記化合物が結合するタンパク質が結合する又は「捕捉される」。次いで、同一抗原における異なるタンパク質又は異なる部位に結合する本開示の標識されたタンパク質を用いて、結合したタンパク質を検出する。或いは、第２の（検出する）タンパク質を結合する第３の標識抗体を使用することができる。
【０３３５】
画像診断法
前述のことから技量のある熟練者には明らかなように、本開示はまた本開示のタンパク質を用いた画像診断法も熟考する。画像診断のために、本開示のタンパク質を検出可能な標識に抱合させ、それは、画像診断によって検出可能であるシグナルを放出することができる分子又は剤であることができる。たとえば、検出可能な標識は、タンパク質、放射性同位元素、蛍光色素分子、可視光放出蛍光色素分子、赤外光放出蛍光色素分子、金属、強磁性物質、電磁気放出物質、特定の磁気共鳴（ＭＲ）分光識別特性を持つ物質、Ｘ線を吸収する又は反射する物質、又は音響を変える物質であってもよい。
【０３３６】
本開示のタンパク質は、画像診断処置に先立って、腫瘍、臓器、又は画像診断される組織に全身性に又は局所的に投与することができる。一般に、腫瘍、組織又は臓器の所望の最適な画像を達成するのに有効な用量でタンパク質が投与される。そのような用量は採用される特定のタンパク質、画像診断処置に供される腫瘍、組織又は臓器、使用される画像診断装置等に応じて広く変化し得る。
【０３３７】
本開示の一部の例では、本開示のタンパク質は、腫瘍の画像診断、臓器の断層撮影画像診断、臓器の機能のモニタリング、冠状動脈血管造影、蛍光内視鏡、レーザーガイド手術、光音響及び音響蛍光の方法等を含むが、これら限定されない種々の生物医学上の適用にて組織及び臓器の生体内光学画像診断剤として使用される。例となる疾患、たとえば、本開示のタンパク質が画像診断に有用である癌は本明細書で記載されており、本開示の本実施例に準用して適用されると解釈されるべきである。一例では、本開示のタンパク質抱合体は、本開示の特定のタンパク質が対象にてどこに濃縮されるかをモニターすることによって腫瘍及びその他の異常の存在を検出するのに有用である。別の例では、本開示のタンパク質は、腹腔鏡検査の際、腫瘍の微小転移の検出のためのレーザー支援ガイド手術に有用である。さらに別の例では、本開示のタンパク質は、アテローム性硬化症のプラーク及び血液凝固の診断に有用である。
【０３３８】
画像診断法の例には、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、ＭＲ分光法、Ｘ線造影法、ＣＴ、超音波、平面ガンマカメラ画像診断、単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ）、他の核医学に基づく画像診断、可視光を用いた光学画像診断、ルシフェラーゼを用いた光学画像診断、蛍光色素分子を用いた光学画像診断、他の用いた光学画像診断、近赤外線を用いた画像診断、又は赤外線を用いた画像診断が挙げられる。
【０３３９】
本開示の方法の特定の例は対象における手術処置の間に組織を画像診断することをさらに含む。
【０３４０】
画像診断のための種々の技法が当業者に知られている。本開示の画像診断法の文脈にてこれらの技法のいずれかが適用されて検出可能な標識からのシグナルを測定することができる。たとえば、光学画像診断は、医学の特定の領域にて幅広い受容を得ている画像診断様式の１つである。例には、細胞成分の光学標識、及びフルオレセイン血管造影及びインドシアニングリーン血管造影のような血管造影が挙げられる。光学画像診断剤の例には、たとえば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーンの誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリスリロジン、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノゴールドスルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジロキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル色素が挙げられる。
【０３４１】
検出可能な標識に由来するシグナルを測定するのに利用することができる画像診断の方法としてガンマカメラ画像診断が熟考される。当業者は、ガンマカメラ画像診断の適用についての技法に精通しているであろう。一例では、シグナルを測定することには、１１１Ｉｎ又は９９ｍＴｃ抱合体、特に１１１Ｉｎ−オクトレオチド又は９９ｍＴｃ−ソマトスタチン類似体のガンマカメラ画像診断の使用が含まれる。
【０３４２】
本開示の文脈における画像診断様式としてコンピュータ断層撮影（ＣＴ）が熟考される。種々の角度からのＸ線を取り込み、次いでコンピュータソフトウエアを用いてそれを組み合わせることによって、ＣＴは生体の任意の部分の三次元画像を構築することを可能にする。コンピュータは、任意の角度と任意の深さからの二次元断片を表示するようにプログラムされる。断片を組み合わせて三次元の像を組み立て得る。
【０３４３】
ＣＴでは、当初のＣＴ走査が診断できない場合、当該抗原に結合する本開示のタンパク質に抱合されたＸ線不透過性の造影剤の静脈注射が組織塊（たとえば、軟組織塊）の特定及び描写に役立つことができる。同様に、造影剤は、軟組織病変の血管分布を評価するのに役立つ。たとえば、造影剤の使用は、腫瘍と隣接する血管構造の関係の描写に役立ち得る。
【０３４４】
ＣＴの造影剤には、たとえば、ヨード造影媒体が挙げられる。これらの剤の例には、ヨータラム酸、イオヘキソール、ジアトリゾエート、イオパミドール、エチオドール及びイオパノエートが挙げられる。ガドリニウム剤、たとえば、ガドペンテートもＣＴの造影剤として使用されることが報告されている。
【０３４５】
磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）は高い強度の磁気と高周波シグナルを用いて画像を作製する画像診断様式の１つである。ＭＲＩでは、画像診断される試料を強い静磁場に置き、高周波（ＲＦ）照射のパルスで励起して試料における正味の磁化を生成する。次いで種々の磁場勾配と他のＲＦパルスが作用して記録されたシグナルに空間情報をコードする。これらのシグナルを回収し、解析することによって、ＣＴ画像のように通常、二次元断片で表示される三次元画像を計算することが可能である。断片を組み合わせて三次元の像を組み立て得る。
【０３４６】
ＭＲＩ又はＭＲ分光画像診断で使用される造影剤は、他の画像診断法で使用されるものとは異なる。ＭＲＩ造影剤の例には、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、及び鉄キレートが挙げられる。たとえば、本開示のタンパク質は、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、徹、コバルト、ニッケル、銅、モリブデン、ルテニウム、セリウム、インジウム、プラセオジミウム、ネオジミウム、プロメチウム、サマリウム、ユーポリウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホリミウム、エルビウム、ツリウム、及びイッテルビウムから成る群から選択される常磁性金属のキレートを含む化合物に抱合される。本開示に有用な画像診断剤のさらなる例は、ＰＦＯＢのようなハロ炭素に基づくナノ粒子、又はフッ素に基づくＭＲＩ剤である。ＣＴ及びＭＲＩ双方は組織の境界及び血管の構造を区別するのに役立つ解剖学的な情報を提供する。
【０３４７】
細胞レベルでの情報、たとえば、細胞の生存性に関する情報を提供する画像診断様式には、ポジトロン放出コンピュータ断層撮影（ＰＥＴ）及び単光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。ＰＥＴでは、患者はポジトロンを放出する放射活性物質を摂取し、又は注射され、それは生体を通って移動する物質としてモニターすることができる。
【０３４８】
ＰＥＴとＳＰＥＣＴの間の主な差異は、ポジトロン放出物質の代わりに、ＳＰＥＣＴは高エネルギーの光子を放出する放射活性トレーサを使用する。ＳＰＥＣＴは冠状動脈疾患を含む複数の病気を診断するのに有益であり、すでに約２５０万のＳＰＥＣＴ心臓試験が毎年米国で実施されている。
【０３４９】
ＰＥＴについては、本開示のタンパク質は一般に、たとえば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕ、及び６８Ｇａのようなポジトロン放射体によって標識される。本開示のタンパク質は、ＳＰＥＣＴについては９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ及び６７Ｇａ、１１１Ｉｎのようなポジトロン放射体によって標識される。
【０３５０】
動物及びヒトの非侵襲性の蛍光画像診断も生体内の診断情報を提供することができ、種々の臨床の専攻で使用することができる。たとえば、進んだ機器を用いた洗練された分光画像診断までの、蛍光色素分子のＵＶ励起に続く単純な観察を含む技法が長年かけて開発されている（たとえば、Andersson-Engels et al, 1997を参照）。たとえば、蛍光色素分子又は蛍光タンパク質からの蛍光の生体内での検出のための当該技術で既知の具体的な装置又は方法には、生体内での近赤外線蛍光（たとえば、Frangioni, 2003を参照）、Ｍａｅｓｔｒｏ（商標）生体内の蛍光画像診断システム（Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; Woburn, MA）、フライングスポットスキャナーを用いた生体内の蛍光画像診断システム（たとえば、Ramanujam et al, 2001を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５１】
光学反応を検出するための他の方法又は装置には、限定しないで、視覚的検査、ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光計、光ダイオード、量子カウンタ、落射蛍光顕微鏡、走査顕微鏡、フローサイトメータ、蛍光マイクロプレートリーダー、又は光電子増倍管用いたシグナル増幅が挙げられる。
【０３５２】
一部の例では、ヒトにて使用する前に、たとえば、本明細書で記載されるモデルを用いた試験管内又は生体内のアッセイを用いて画像診断剤を調べる。
【０３５３】
製造物品
本開示はまた、本開示のタンパク質を含む製造物品又は「キット」も提供する。製造物品は、容器と、たとえば、任意の実施例に従って本明細書で記載される方法にて本開示のタンパク質を使用するための指示書を提供する、容器上の又は容器に伴ったラベル又は添付文書を含むことができる。好適な容器には、たとえば、ビン、バイアル、シリンジ、ブリスターパック等が挙げられる。容器はたとえば、ガラス又はプラスチックのような種々の素材から形成され得る。容器は本開示の組成物のタンパク質を保持し、無菌のアクセスポートを有し得る（たとえば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射用針による穴開け可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。代わりに又はさらに、製造物品はさらに、たとえば、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液のような薬学上許容可能な緩衝液を含む第２（又は第３）の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針及びシリンジを含む、商業的な及びユーザーの見地から望ましい他の物質を含み得る。キットはまた、又は代わりに本開示のタンパク質を検出するための及び／又は本開示のタンパク質を抱合するための試薬を含み得る。
【実施例】
【０３５４】
以下の非限定の実施例にて本開示をさらに説明する。
【０３５５】
実施例１：材料及び方法
１．１：変異ＶＬ及びｓｃＦｖの生成
Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）によって導入された改変を伴ったＺｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ（１９８７）によって記載されたような方法を用いてヒト可変ドメインの変異体を生成した。この目的で、所望の変異をコードする合成オリゴヌクレオチドをウラシル含有の一本鎖鋳型ＤＮＡ（ｄＵ−ｓｓＤＮＡ）にアニーリングし、酵素的に伸長し、連結して共有結合で閉環した環状ＤＮＡを形成した。単一のヒト軽鎖可変（ＶＬ）ドメイン（ＤＰＫ９：配列番号２）又はアダリムマブのＶＬ（配列番号８）又は４Ｄ５のＶＬ（配列番号１２）をコードするＤＮＡ断片をＡｐａＬｌ及びＮｏｔｌ部位を用いてファージディスプレイベクターＦｄＭｙｃにクローニングすることによって鋳型を生成した。エレクトロポレーションによってｕｎｇ＋大腸菌株ＴＧＩを共有結合で閉環した環状ＤＮＡにて形質転換し、非変異のｄＵ−ｓｓＤＮＡの優先的な破壊を生じた。構築した変異体の配列はＤＮＡ配列の解析によって確認した。
【０３５６】
ｓｃＦｖ変異体の生成のために、ＡｐａＬｌ及びＳａｉｌクローニング部位を用いて、ＶＨドメイン及び合成リンカー領域をコードするＤＮＡ断片を相当するＶＬ−ＦｄＭｙｃ構築物にクローニングした。構築した変異体の配列はＤＮＡ配列の解析によって確認した。対照のｓｃＦｖをコードする配列は配列番号６に示し、アダリムマブに由来するｓｃＦｖをコードする配列は配列番号１０に示し、４Ｄ５に由来するｓｃＦｖをコードする配列は配列番号１４に示す。
【０３５７】
ＶＬが可溶性タンパク質として発現された場合、Ｎ末端のグルタミンはアスパラギン酸で置換した。ＶＨ又はｓｃＦｖが可溶性タンパク質として発現された場合、Ｎ末端のグルタミンはグルタミン酸で置換した。
【０３５８】
ヒトＶＬドメインのファージディスプレイレパトアは、ＶＫ１／ＤＰＫ９に基づいて生成した。レパトアは合成オリゴヌクレオチドが介在する多様化を用いてＦｄＭｙｃにて構築した（Kunkel et al., 1987）（Ｋａｂａｔに従うアミノ酸の番号付け及びＩＵＰＡＣ−ＩＵＢに従うヌクレオチドのコード、Cornish-Bowden, 1985）。この目的で、２８、３０、３１及び３２位にて縮重したコドンＫＭＴ（Ｙ／Ａ／Ｄ／Ｓ）をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて多様性をＬ１に導入した。（２０％Ｙ；１７％Ｇ；１５％Ｓ；７％Ｄ／Ａ；４％Ｔ／Ｐ／Ｖ／Ｒ／Ｉ／Ｌ；２％Ｗ／Ｆ／Ｍ／Ｑ／Ｎ／Ｈ／Ｋ／Ｅ）をコードするトリヌクレオチドホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド（Virnekas et al., 1994）を用いて９１、９２、９３、９４及び９６位にてＬ３多様性を導入した。Ｌ２は、生殖細胞系列ＶＫ１／ＤＰＫ９コンセンサス配列（ＷＴ）又は５２位及び５３位におけるアスパラギン酸（５２Ｄ／５３Ｄ）に拘束された。
【０３５９】
１．２：凝集耐性のためのファージＥＬＩＳＡ（「加熱／冷却アッセイ」）
ファージＥＬＩＳＡ形式（McCafferty et al., 1990; Jespers et al., 2004）にて加熱インキュベートの後のシグナルの保持を測定することによってクローンの凝集耐性を解析した。炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のプロテインＡ、プロテインＬ又は標的抗原によってＮｕｎｃのＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートのウェルを一晩被覆した。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで希釈した約４％の粉ミルク（ＭＰＢＳ）でブロックした。単一のコロニーを寒天プレートから取り出し、約１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補完した２×ＴＹ培地（約１６ｇ／ｌのトリプトン、約１０ｇ／ｌの酵母抽出物、約５ｇ／ｌのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．０）にて一晩、約３０℃で振盪しながら増殖させた。遠心によって細胞を取り除き、ビオチン−ＰＥＯ４−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ、約５０μＭの最終濃度）を加えることによって培養上清中でファージを直接ビオチン化した。１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて過剰のビオチン化剤を失活させた。加熱選抜については、上清を先ず約８０℃で１０分間インキュベートし、次いで約４℃で１０分間インキュベートした。上清をブロックしたＥＬＩＳＡのウェルに加えた。ＰＢＳで３回洗浄した後、エクストラビジン-ＨＲＰ抱合体（Ｓｉｇｍａ）及び３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて、結合したファージ粒子を検出した。４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでの測定値を差し引くことによって吸収を算出した。
【０３６０】
標的抗原におけるクローンの凝集耐性は、ファージＥＬＩＳＡ形式（McCafferty et al., 1990; Jespers et al., 2004）にて加熱インキュベートの後のシグナルの保持を測定することによって解析した。ＰＢＳ緩衝液におけるストレプトアビジンによってＮｕｎｃのＭａｘｉｓｏｒｐ免疫プレートのウェルを一晩被覆した。プレートをＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで希釈した約４％の粉ミルク（ＭＰＢＳ）でブロックした。次いでビオチン化抗原をプレートに加えた。単一のコロニーを寒天プレートから取り出し、約１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを補完した２×ＴＹ培地（約１６ｇ／ｌのトリプトン、約１０ｇ／ｌの酵母抽出物、約５ｇ／ｌのＮａＣｌを含有する、ｐＨ７．０）にて一晩、約３０℃で振盪しながら増殖させた。遠心によって細胞を取り除いた。１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５を上清に加えた。加熱選抜については、上清を先ず約８０℃で１０分間インキュベートし、次いで約４℃で１０分間インキュベートした。上清をブロックしたＥＬＩＳＡのウェルに加えた。ＰＢＳで３回洗浄した後、エクストラビジン-ＨＲＰ抱合体（Ｓｉｇｍａ）及び３,３’，５,５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて、結合したファージ粒子を検出した。４５０ｎｍ及び６５０ｎｍでの測定値を差し引くことによって吸収を算出した。
【０３６１】
１．３：ＶＬドメインの発現及び精製
天然の及び変異体のＶＬの可溶性発現のレベルを確定するために実験を実施した。この目的で、Ｓａｉｌ及びＢａｍＨｌ部位を用いて、ドメインをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターｐＥＴ１２にクローニングした。大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（クローンＤＥ３）をプラスミドで形質転換し、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；最終濃度１ｍＭ）の添加によって可溶性タンパク質の発現を誘導した。次いで、２４時間後再誘導工程と共に細胞を３０℃にて４８時間増殖させた。遠心によって細胞を取り除き、発現されたタンパク質を含有する上清を濾過した（０．２２μｍ）。ＶＬドメインの上清をｒプロテインＬ樹脂（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄する前に上清が樹脂を通過できる重力カラムにプロテインＬ樹脂を加えた。０．１Ｍのグリシン／ＨＣｌ、ｐＨ２．７を加えることによってＶＬドメインを溶出し、０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０を加えることによって分画を中和した。ＰＢＳに対してドメインを透析し、濃縮した。４〜１２％のビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質の純度を評価した。
【０３６２】
１．４：ＶＴドメインの可溶性発現のレベルを決定すること
タンパク質ＬのＥＬＩＳＡを用いて各ＶＬ変異体の可溶性発現のレベルを決定したが、その際、可溶性ドメインの濃度は同一精製タンパク質の検量線に対して測定した。この目的で、３つの別々のコロニーで新しく形質転換した大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄを上述のように増殖させ、４８時間発現を誘導した。遠心によって細胞を取り除き、ビオチン−ＰＥ０４−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｐｉｅｒｃｅ，最終濃度５０μＭ）を加えることによって培養上清にて断片を直接ビオチン化した。５μｇ／ｍｌのプロテインＬ（Ｓｉｇｍａ）によって一晩被覆し、ＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ）の脱脂乳粉でブロックした９６穴のＭａｃｉｓｏｒｐ免疫プレート（Ｎｕｎｃ）に、培養上清と既知濃度での同じ変異体のビオチン化した精製断片を加えた。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、エクストラビジン−ＨＲＰ抱合体（Ｓｉｇｍａ）及びＴＭＢ基質を用いて、結合した抗体断片を検出した。吸収は４５０ｎｍ（参照６５０ｎｍ）にて測定し、線形回帰解析を用いて検量線から各試料の濃度を推定した。
【０３６３】
１．５：サイズ排除クロマトグラフィ及び加熱後の再折り畳み性
サイズ排除クロマトグラフィによってＶＬの溶出体積及び加熱後の再折り畳み性の収率を決定した。この目的で、２０ｍＭのＰＯ４（ｐＨ７．４）中の１００μＭでの精製ＶＬ変異体を８５℃で２０分間加熱し、その後４℃で１０分間置き、又は加熱しなかった。加熱した及び非加熱の試料は双方とも１６，０００×ｇで１０分間遠心し、その後、ＰＢＳで平衡化し、ＡＫＴＡ清浄器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｇ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて解析した。５００μｌの体積にて０．５ｍｌ／分の流速で試料を注入した。加熱試料の曲線下面積を測定することによって各変異体の回収を確定し、非加熱試料の比率として表した。
【０３６４】
サイズ排除クロマトグラフィによってＩｇＧ全分子の溶出体積も測定した。この目的で、ＣＤＲ−Ｈ１（３１〜３３ＤＥＤ）、ＣＤＲ−Ｌ２（５０、５２〜５３ＤＤＤ）又は双方一緒のドメイン（３１〜３３ＤＥＤ／５０，５２〜５３ＤＤＤ）のいずれかにてアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の置換と共に生殖細胞系列ＶＨドメインＤＰ４７及び生殖細胞系列ＶＬドメインＤＰＫ９を含有するヒトＩｇＧ１を、ＰＢＳで平衡化し、ＡＫＴＡ清浄器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続したＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて解析した。１００μｌの体積で０．５ｍｌ／分の流速にてＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍｌの試料を注入した。同様に、ＣＤＲ−Ｈ１（３０位）、ＣＤＲ−Ｌ２（５２位）又は双方にてアスパラギン酸置換を含有する４Ｄ５のＩｇＧの溶出体積を上述のようなサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。
【０３６５】
１．６：濁度の測定
加熱しながら、精製断片の３６０ｎｍでの吸収を測定することによって、変異体生殖細胞系列ＶＬ及びｓｃＦｖの断片を含有する溶液の濁度の測定を実施した。各断片型の条件は以下のとおりだった：生殖細胞系列ＶＬ変異体は８５℃にて２０ｍＭのＰＯ４（ｐＨ７．４）中１００μＭであり；ｓｃＦｖ変異体は８５℃にてリン酸緩衝化生理食塩水中で１０μＭだった。測定は、ＱＳ−２４石英キュベットを用い、１ｃｍのパス長さにてＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ５０ＢｉｏＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計(Agilent Technologies)にて行った。
【０３６６】
１．７：ＳＫ-ＢＲ−３細胞の結合アッセイ
ＳＫ−ＢＲ−３ヒト乳癌細胞株にて全ＩｇＧとして４Ｄ５変異体を用いた全細胞結合アッセイを行った。この目的で、ＣＤＲ−Ｈ１（３０位）、ＣＤＲ−Ｌ２（５２位）又はその双方に変異を含有するヒトＩｇＧ１としての４Ｄ５の様々な濃度を、氷上にて１時間２つ組の細胞（２．５×１０４個／試料）に加えた。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した後、氷上にて３０分間、二次抗体抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）を加えた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて生細胞集団の蛍光強度を記録し、ＦｌｏｗＪｏ７.６．５ソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
【０３６７】
１．８：ＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖アッセイ
ＳＫ−ＢＲ−３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補完したＲＰＭＩ−１６４０（カリフォルニア州、カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて維持した。０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞を剥がし、２×１０４個／ｍｌにて完全培地に浮遊させた。５００μｌのアリコートを４８穴細胞培養プレート（マサチューセッツ州、ローエルのＣｏｒｎｉｎｇ）に加え、３０分間付着させた後、最終濃度１０μｇ／ｍｌで４Ｄ５ＩｇＧ変異体を加えた。７日後、細胞をＲＰＭＩ培地（ＦＢＳなし）で洗浄し、剥がし（上記のように）、生細胞を数えた。ＩｇＧの非存在下で増殖した細胞の比率として細胞増殖のレベルを算出した。
【０３６８】
１．９：親和性の測定
表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて４Ｄ５ｓｃＦｖ変異体の結合親和性を測定した。ビオチン化したＨＥＲ２の細胞外ドメインをストレプトアビジンセンサーチップに不動化した。各ｓｃＦｖ変異体の連続希釈を流速２０μｌ／分で注入し、曲線を１：１のラングミュア結合モデルに適合させた。
【０３６９】
実施例２：ＤＰＫ９のＣＤＲ１変異体の凝集耐性
ＤＰＫ９のＣＤＲ１に単一又は複数の負に荷電したアミノ酸を導入する効果を調べるために実験を実施した。上記で詳述した（材料及び方法の項を参照）ように変異体ＶＬを構築し、凝集耐性について調べた。手短には、ファージで表示させたＶＬを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。タンパク質ＬのＥＬＩＳＡによって正しく折り畳まれたＶＬを捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。
【０３７０】
結果を図１に示す。要約すると、ＤＰＫ９ ＶＬのＣＤＲ１への負に荷電したアミノ酸の導入は、最高レベルの凝集耐性を付与する２４位及び２９位での置換によってわずかに凝集耐性を改善した。
【０３７１】
実施例３：ＤＰＫ９のＦＲ２／ＣＤＲ２の変異体の凝集耐性
ＤＰＫ９のＣＤＲ２及び隣接するＦＲ２残基に単一又は複数の負に荷電したアミノ酸を導入する効果を調べるために実験を実施した。
【０３７２】
上記で詳述した（材料及び方法の項を参照）ように、ＤＰＫ９ ＶＬドメインのＣＤＲ２及び隣接するＦＲ２残基における単一アミノ酸の交換及び交換の組み合わせを構築し、凝集耐性について調べた。手短には、ファージで表示させたＶＬを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。タンパク質ＬのＥＬＩＳＡによって正しく折り畳まれたＶＨを捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。
【０３７３】
結果を図２に示す。要約すると、ＦＲ２の４９位又はＣＤＲ２の５０、５１、５２及び５３位のいずれか１つにおける負に荷電したアミン酸の導入はＶＬドメインのかなりの凝集耐性を生じた。さらに、２、３又は４の変異の組み合わせは凝集耐性を生じ、これらの組み合わせの多くはほとんど１００％の凝集耐性を達成した。
【０３７４】
実施例４：凝集耐性の可変ドメインのライブラリの作出
表面に露出したＣＤＲ残基を無作為化し、抗体のレパトアにおける天然のアミノ酸分布を模倣することによってＶＨ及びＶＬの変異体のライブラリを作出した。ＶＨの３２位及び３３位及びＶＬの５２位及び５３位におけるアスパラギン酸塩の導入は、ライブラリの平均の凝集耐性を有意に高めた（図３）。見られた効果が他のＣＤＲ残基とは無関係に高かったということは、ホットスポットの位置での変異の優勢な効果を強調している。
【０３７５】
実施例５：溶液における凝集耐性の評価
代表的なタンパク質変異体を単一ドメインとして発現させて可溶性タンパク質としてその凝集傾向を評価した。生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬドメインは、その溶融温度を上回って加熱すると容易に凝集する。ＶＬ（５０、５１、５２又は５３位を含む）内での単一の負の電荷の導入は凝集に対する耐性を控えめに高めた（図４）。５０〜５３位から選択した２以上の位置での電荷は凝集耐性をさらに高めた（図４Ａ及び４Ｂ）。負の電荷の導入数の増加も抗体可変ドメインの他の生物物理的特性の範囲を改善する（表１及び図５）。変異の数がゼロから３に増えるにつれて発現レベルはＶＬドメインについて２倍に増加する。たとえば、ゲル濾過における溶出体積及び再折り畳み収率のような他の一般的な測定も顕著に改善する（表１及び図５）。
【０３７６】
（表１）ＶＬにおける負に荷電した残基の効果
0006038121.tif 000002
【０３７７】
実施例６：アダリムマブに由来する変異体ＶＬの凝集耐性
上記で詳述した（材料及び方法の項を参照）ように、ＬＣＤＲ２の中での単一又は複数の位置にて負に荷電したアミノ酸を導入するようにアダリムマブのＶＬを変異させ、ファージの表面に発現させ、凝集耐性について調べた。手短には、ファージを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。正しく折り畳まれたＶＬをタンパク質ＬのＥＬＩＳＡによって捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。タンパク質ＬのＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。手短には、調べた負に荷電したアミノ酸及びその組み合わせはすべて、野生型（非変異体）のＶＬに比べて加熱した後、タンパク質ＬへのＶＬの結合を高めた。５０位と５２位での負に荷電したアミノ酸の組み合わせは最高レベルの凝集耐性を提供した。
【０３７８】
実施例７：４Ｄ５に由来する変異体ＶＬの凝集耐性
４Ｄ５のＶＬのＣＤＲ２に単数又は複数の負に荷電したアミノ酸を導入する効果を調べるために実験を実施した。
【０３７９】
上記で詳述した（材料及び方法の項を参照）ように、４Ｄ５のＶＬドメインのＣＤＲ２における単一アミノ酸の変化及び変化の組み合わせを構築し、凝集耐性について調べた。
【０３８０】
手短には、ファージで発現されたＶＬを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。正しく折り畳まれたＶＬをタンパク質ＬのＥＬＩＳＡによって捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。
【０３８１】
タンパク質ＬのＥＬＩＳＡの結果を図７に示す。要約すると、５０〜５３位のいずれかでの負に荷電したアミノ酸の導入及び調べたそれらの組み合わせのいずれかは野生型（非変異体）のＶＬに比べてＶＬの凝集耐性を高めた。
【０３８２】
実施例８：４Ｄ５に由来する変異体ｓｃＦｖの凝集耐性
ｓｃＦｖの構成にてリンカーを介して４Ｄ５のＶＬ及びＶＨを対合させた（実験の詳細については材料及び方法の項を参照のこと）。さらに、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２の中の単一又は複数の位置にて負に荷電したアミノ酸を導入するようにＶＬを変異させた。上記で詳述したように（材料及び方法の項を参照のこと）、単鎖Ｆｖをファージの表面に発現させ、凝集耐性について調べた。手短には、ファージを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。正しく折り畳まれたｓｃＦｖをタンパク質ＬのＥＬＩＳＡ又は不動化したＨｅｒ２を用いたＥＬＩＳＡによって捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。
【０３８３】
タンパク質ＬのＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。手短には、ＣＤＲ２内での１以上の位置に負に荷電したアミノ酸を導入することは、野生型（非変異体）ｓｃＦｖに比べてｓｃＦｖの凝集耐性をかなり高めた。ＣＤＲ１における負に荷電したアミノ酸も野生型ｓｃＦｖに比べて凝集耐性を高めたが（図８Ａ）、ＣＤＲ２における変異とは同等ではなかった（図８Ｂ）。最大の効果を提供するＣＤＲ１における位置は、２９位及び３０と３１の組み合わせ及び３１と３２の組み合わせだった。
【０３８４】
図９は、４Ｄ５に由来するｓｃＦｖのＣＤＲ２に負に荷電したアミノ酸を導入することがＨｅｒ２へのｓｃＦｖの結合を妨げないことを示す。幾つかの場合で、負に荷電したアミノ酸の導入が、野生型（非変異体）ｓｃＦｖで検出されるレベルに比べて検出された結合のレベルを実質的に変化させなかった。
【０３８５】
図１０は、上述のような加熱及び冷却に続いて、５０〜５３位の間での単一の負に荷電したアミノ酸又は５２位と５３位での負に荷電したアミノ酸の組み合わせが、加熱後のＨｅｒ２抗原への結合によって測定されたように、野生型（非変異体）ｓｃＦｖに比べて凝集耐性を高めたことを示す。
【０３８６】
実施例９：ＶＬ及びＶＨにおける負に荷電したアミノ酸の組み合わせ
４Ｄ５のＶＬ及びＶＨをｓｃＦｖとして発現させた。ＶＬのＣＤＲ２内で１以上の負に荷電したアミノ酸及びＶＨのＣＤＲ１内で１以上の負に荷電したアミノ酸を含有するこれらｓｃＦｖの変異体形態も作出した。上記で詳述したように（材料及び方法の項を参照のこと）、単鎖Ｆｖをファージの表面に発現させ、凝集耐性について調べた。手短には、ファージを８０℃で１０分間加熱し、その後、４℃で１０分間冷却した。正しく折り畳まれたｓｃＦｖをタンパク質ＡのＥＬＩＳＡ又はタンパク質ＬのＥＬＩＳＡ又は不動化した抗原を用いたＥＬＩＳＡによって捕捉し、処理した試料の吸収シグナルを未処理の試料の比率として算出した。
【０３８７】
タンパク質ＡのＥＬＩＳＡの結果を図１１に示す。負に荷電したアミノ酸の組み合わせはすべて、野生型（非変異体の４Ｄ５に由来する）ｓｃＦｖで見られたものを上回ってｓｃＦｖの凝集耐性のレベルを高めた。
【０３８８】
タンパク質ＬのＥＬＩＳＡの結果を図１２に示す。負に荷電したアミノ酸の組み合わせはすべて、野生型（非変異体）に相当するｓｃＦｖで見られたものを上回って変異体ｓｃＦｖの凝集耐性のレベルを高めた。
【０３８９】
図１３は、ＶＬのＣＤＲ２及びＶＨのＣＤＲ１にて負に荷電したアミノ酸を伴ったとしても、ｓｃＦｖは標的抗原に結合することが可能であり、一部の変異体ｓｃＦｖの結合のレベルは相当する野生型（非変異体）ｓｃＦｖで見られたレベルに匹敵したことを示す。
【０３９０】
図１４は、加熱及び冷却に続いて、一部の変異体ｓｃＦｖが野生型（非変異体）ｓｃＦｖに比べて保持された抗原結合のレベルを高めたことを示す。調べた組み合わせはすべて野生型（非変異体）ｓｃＦｖよりも良い成績をあげた。
【０３９１】
実施例１０：ＶＬ及び／又はＶＨにおける負に荷電したアミノ酸の組み合わせは生物活性を抑えない
モデル系としてＨＥＲ２を結合する治療用抗体、４Ｄ５の変異体形態を検討した。４Ｄ５のＨＣＤＲ１の３０位及び／又はＬＣＤＲ２の５２位及び／又は５３位のいずれか又は双方にて負に荷電したアミノ酸に置換し、抗体断片として発現させた。凝集に対する耐性を調べるために、４Ｄ５変異体を高濃度で加熱し、濁度を測定した。変異の数が増えるにつれて耐性は相当に改善し、単なる視覚的検査によってさえ明瞭な差異は明らかだった。この傾向は４Ｄ５のＶＨ及びＶＬドメインの双方で見られた。ｓｃＦｖ断片の構成にてドメイン間リンカーを介してドメインを対合させた場合も、単一ドメインの構成で見られたのに類似する結果が見られた（図１５）。
【０３９２】
組換えＨＥＲ２抗原に対する代表的な４Ｄ５変異体の結合親和性も測定した（表２）。ｓｃＦｖ断片の構成における親和性は、４Ｄ５についての約１ｎＭから変異体の一部についての約５００ｎＭに及んだ。幾つかの位置での交換は上手く認容され、平衡結合親和性（ＫＤ）の損失は認められなかった。さらに、ＶＨ及びＶＬの中での交換を組み合わせた場合、ＫＤの損失は認められなかった。高度に凝集耐性のｓｃＦｖ二重変異体（４Ｄ５−ｄ）の１つは、野生型（４Ｄ５）と類似の親和性でＨＥＲ２に結合した（表２）。
【０３９３】
（表２）４Ｄ５ｓｃＦｖ変異体の親和性
0006038121.tif 000003
【０３９４】
ＨＣＤＲ１（３０位）及び／又はＬＣＤＲ２（５２位）での負に荷電したアミノ酸の抗原結合に対する効果をさらに検討するために、免疫グロブリンＧ（ヒトＩｇＧ１）の構成で４Ｄ５変異体を発現させた。未処理の４Ｄ５ＩｇＧと比べた変異体の全細胞（ＳＫ−ＢＲ−３）の結合に対する負に荷電したアミノ酸の効果をフローサイトメトリーによって評価した（図１６Ａ）。これらの実験は４Ｄ５ＩｇＧ変異体の結合曲線及びＥＣ５０値が非変異の４Ｄ５ＩｇＧと大幅には異なることはなかったことを明らかにしている（図１６及び表３）。
【０３９５】
図１６Ｂはまた、４Ｄ５変異体が野生型４Ｄ５と同程度にＳＫ−ＢＲ−３細胞の増殖を阻害したことも示す。
【０３９６】
（表３）ＳＫ−ＢＲ−３結合アッセイで測定したときの負に荷電したアミノ酸置換を含
有するヒトＩｇＧ１としての４Ｄ５のＥＣ５０値
0006038121.tif 000004
【０３９７】
実施例１１：完全長抗体における負に荷電したアミノ酸の効果
完全長抗体の他の特性に対する負に荷電したアミノ酸の効果を検討するために、ＣＤＲ−Ｈ１（３１〜３３ＤＥＤ）、ＣＤＲ−Ｌ２（５０，５２〜５３ＤＤＤ）又は双方のドメイン一緒（３１〜３３ＤＥＤ／５０，５２〜５３ＤＤＤ）にてアスパラギン酸塩及び／又はグルタミン酸塩の置換を伴う生殖細胞系列ＶＨドメインＤＰ４７及び生殖細胞系列ＶＬドメインＤＰＫ９を含有するヒトＩｇＧ１分子をサイズ排除クロマトグラフィによって解析した。結果を図１７Ａに示す。溶出特性は、ＶＨ及びＶＬドメインの双方にて（３１〜３３ＤＥＤ／５０，５２〜５３ＤＤＤ）３つの負に荷電したアミノ酸を含有するＩｇＧが、ＶＨ（３１〜３３ＤＥＤ／ＷＴ）又はＶＬ（ＷＴ／５０，５２〜５３ＤＤＤ）のみに三重の変異を含有するＩｇＧよりも少ない体積で溶出したが、それは、同様に負に荷電した変異を伴わないＩｇＧ（ＷＴ／ＷＴ）よりもはるかに少ない体積で溶出した。
【０３９８】
同様に負に荷電したアミノ酸置換を含有するＩｇＧとしての４Ｄ５をサイズ排除クロマトグラフィによって評価した。結果を図１７Ｂに示す。溶出特性は、ＶＨ及びＶＬドメインの双方：ＶＨの３０位及びＶＬの５２位（３０Ｄ／５２Ｄ）にて負に荷電したアミノ酸置換を含有する４Ｄ５ＩｇＧが、単一ドメインのみで（３０Ｄ／ＷＴ又はＷＴ／５２Ｄ）で負に荷電したアミノ酸置換を含有する４Ｄ５ＩｇＧと比べて少ない体積で溶出することを示した。これらは同様に、追加の負に荷電したアミノ酸置換を含有しない（ＷＴ／ＷＴ）４Ｄ５ＩｇＧよりも少ない体積で溶出した。
【０３９９】
これらのデータは、Ｊｅｓｐｅｒｓら（２００４）によって記載されたように、ＨＣＤＲ１又はＬＣＤＲ２の位置にて負に荷電したアミノ酸置換を含有するＩｇＧはそのような変異のないＩｇＧよりも非特異的相互作用が少なく、ゲル精製マトリクスとの「粘性」が少ないことを示している。これによって全ＩｇＧの作出及び製造の間に高レベルの精製抗体が得られる。類似の結果は抗体断片、たとえば、ＤＰＫ９のＶＬでも得られた（図１７Ｃ）。
【０４００】
実施例１２：可溶性タンパク質の精製及び濁度の測定
ＤＰＫ９又は４Ｄ５に由来するＶＬの野生型及び変異形態を可溶性タンパク質として発現させ、プロテインＬ樹脂を用いたアフィニティクロマトグラフィによって精製した。図４Ｂは、加熱し、冷却した後、５１位にて単一の負に荷電したアミノ酸又は５０〜５３位にて複数の負に荷電したアミノ酸を含有する変異体ＶＬが濁度によって測定したとき、野生型（非変異体）ＶＬに比べて高い凝集耐性を有することを示す。５０〜５３位の間での負に荷電したアミノ酸の組み合わせは最高レベルの凝集耐性を提供した。
【０４０１】
実施例１３：濃縮後の安定性に対する負に荷電したアミノ酸の効果
濃縮（すなわち、凍結乾燥又は透析濾過）に続く凝集に対する耐性における負に荷電したアミノ酸の効果を検討するために、ＣＤＲ−Ｌ２におけるアスパラギン酸塩の置換（５０、５２〜５３ＤＤＤ）を伴う又は置換を伴わない（対照）ＤＰＫ９に相当するＶＬドメインを解析した。
【０４０２】
凍結乾燥実験については、２０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の１００μＭ（１．１５ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質を先ず液体窒素でスナップ凍結し、次いで「室温条件」での２時間の乾燥のためにスピードバックに移した。凍結乾燥の後、タンパク質を水中で再構成し又は再懸濁し、分光光度計（バイオフォトメータ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて３２０ｎｍにて吸収を測定することによって濁度を解析した。凍結乾燥に続いて、対照のＤＰＫ９のＶＬは２．４４４の吸収を有したが、変異体のＶＬは０．０２３の吸収を有した。
【０４０３】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いたゲル濾過後のタンパク質の回収も実質的に上記で記載したように解析した。この解析の結果は、約６９％の対照ＤＰＫ９のＶＬを回収することができるに対し、８７％の変異体ＶＬを回収することができることを示した。
【０４０４】
透析濾過実験については、ＰＢＳ緩衝液中２ｍｇ/ｍｌの試料２００μｌをＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ（０．５ｍｌ、１０Ｋ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて合計２０分間、１３，２００×ｇで遠心した。３０μｌの残余分に２０μｌのＰＢＳを加え、分光光度計（バイオフォトメータ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて３２０ｎｍにて吸収を測定した。透析濾過による濃縮に続いて、対照のＤＰＫ９のＶＬは０．５８０の吸収を有したが、変異体のＶＬは０．０６４の吸収を有した。
【０４０５】
これらの結果はＶＬのＣＤＲ２における負に荷電したアミノ酸が濃縮の後の可変ドメイ
ンの凝集を実質的に減らすことを示している。
上記の開示に基づく本発明の具体例は以下のとおりである。
[１]  単離されたタンパク質であって、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、前記タンパク質が抗原に特異的に結合することが可能であるタンパク質。
[２]  Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される位置にて２以上の負に荷電したアミノ酸を含む[１]に記載のタンパク質。
[３]  単離されたタンパク質であって、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
前記タンパク質が抗原に特異的に結合することが可能であるタンパク質。
[４]  Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む、又はＫａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む[３]に記載のタンパク質。
[５]  単離されたタンパク質であって、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
前記タンパク質が抗原に特異的に結合することが可能であるタンパク質。
[６]  ＶＬが、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む[３]又は[４]に記載のタンパク質。
[７]  ＶＬがさらにＣＤＲ１にて１以上の負に荷電したアミノ酸を含み、及び／又はＶＨがさらにＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基２６、３９、４０、５０、５２、５２ａ及び５３から成る群から選択される１以上の残基で負に荷電したアミノ酸を含む[３]〜[６]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[８]  タンパク質が１０μＭを超える親和性で抗原に特異的に結合することが可能である[１]〜[７]のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
[９]  負に荷電したアミノ酸を伴わないタンパク質に比べて凝集する傾向が低下した[１]〜[８]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１０]  負に荷電したアミノ酸を伴わないタンパク質に比べて、少なくとも約６０℃に加熱した後、凝集する傾向が低下した[１]〜[９]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１１]  少なくとも約６０℃に加熱した後、抗原に特異的に結合する能力を有する[１]〜[９]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１２]  濃縮、及び任意で希釈又は再構成の後、凝集する傾向が低下した[１]〜[１１]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１３]  ヒトタンパク質に結合することが可能である[１]〜[１２]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１４]  ヒトの状態に関連する又はヒトの状態の原因となるタンパク質に結合することが可能である[１]〜[１３]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１５]  負に荷電したアミノ酸がアスパラギン酸である[１]〜[１４]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１６]  ヒトのものである又はヒト化される又は脱免疫化される又はヒトのタンパク質又はその領域に融合される[１]〜[１５]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[１７]  抗原に特異的に結合することが可能な修飾された抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質であって、ＶＬが、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含み、ＶＬの未修飾の形態が負に荷電したアミノ酸を含まないタンパク質。
[１８]  ５５位にて負に荷電したアミノ酸をさらに含む[１７]に記載のタンパク質。
[１９]  抗原に特異的に結合することが可能な修飾された抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質であって、ＶＬが、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含み、ＶＬの未修飾の形態がその位置で２以上の負に荷電したアミノ酸を含まないタンパク質。
[２０]  タンパク質であって、
（ｉ）ＶＬの未修飾の形態がその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での位置にて負に荷電したアミノ酸を含む修飾された抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；と
（ｉｉ）ＶＨの未修飾の形態がその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む修飾された抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
修飾されたタンパク質が抗原に特異的に結合することが可能であるタンパク質。
[２１]  Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む[１９]又は[２０]に記載のタンパク質。
[２２]  タンパク質が、
（ｉ）抗体；
（ｉｉ）単一ドメイン抗体；
（ｉｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含有するタンパク質；
（ｉｖ）二価抗体、三価抗体又は四価抗体；
（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つと抗体のＦｃドメイン又はそのドメインを含む融合タンパク質；及び
（ｖｉ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）のいずれか１つと免疫エフェクター細胞に結合することが可能であるタンパク質を含む融合タンパク質
から成る群から選択される[１]〜[２１]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[２３]  化合物に抱合される[１]〜[２２]のいずれか１項に記載のタンパク質。
[２４]  [１]〜[２３]のいずれか１項に記載のタンパク質と、薬学上許容可能なキャリアを含む組成物。
[２５]  [１]〜[２４]のいずれか１項に記載のタンパク質を複数含むライブラリ。
[２６]  抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質を含むライブラリであって、ＶＬがＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むライブラリ。
[２７]  ＶＬが２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含む[２６]に記載のライブラリ。
[２８]  抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質を含むライブラリであって、前記タンパク質が
（ａ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での１以上の位置にて少なくとも１つの負に荷電したアミノ酸を含むＶＬと、
（ｂ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むＶＨを含むライブラリ。
[２９]  タンパク質がライブラリの少なくとも３０％を構成する[２６]〜[２８]のいずれか１項に記載のライブラリ。
[３０]  [１]〜[２２]のいずれか１項に記載のタンパク質を単離する方法であって、[２６]〜[２８]のいずれか１項に記載のライブラリを抗原に接触させることと、それに結合するタンパク質を単離することを含む方法。
[３１]  抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９、５０、５１、５２、５３及び５６から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することを含む方法。
[３２]  抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸を含むようにＶＬを修飾することを含み、未修飾のタンパク質が２以上の負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
[３３]  抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、前記方法は、前記タンパク質が、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むように前記タンパク質を修飾することを含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
[３４]  （ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される１以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む[３３]に記載の方法。
[３５]  抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むタンパク質の凝集耐性を高める方法であって、前記方法は、前記タンパク質が、
（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸と、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＨの残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置にて負に荷電したアミノ酸
を含むように前記タンパク質を修飾することを含み、修飾前のタンパク質は、ＶＬ及びＶＨのその位置にて負に荷電したアミノ酸を含まない方法。
[３６]  （ｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従うＶＬの残基４９〜５６の間での２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＬを修飾することと、
（ｉｉ）Ｋａｂａｔの番号付け方式に従う残基２８、３０、３１、３２、３３及び３５から成る群から選択される２以上の位置でのアミノ酸を負に荷電したアミノ酸で置換することによってＶＨを修飾すること
を含む[３５]に記載の方法。
[３７]  ＶＬがさらにＣＤＲ１にて１以上の負に荷電したアミノ酸を含み、及び／又はＶＨがさらにＫａｂａｔの番号付け方式に従う残基２６、３９、４０、５０、５２、５２ａ及び５３から成る群から選択される１以上の残基で負に荷電したアミノ酸を含むようにタンパク質を修飾することをさらに含む[３３]〜[３６]のいずれか１項に記載の方法。
[３８]  医療における[１]〜[２３]のいずれか１項に記載のタンパク質又は[２４]に記載の組成物の使用。
[３９]  対象における状態を治療する又は予防する方法であって、それを必要とする対象に[１]〜[２３]のいずれか１項に記載のタンパク質又は[２４]に記載の組成物を投与することを含む方法。
[４０]  化合物を細胞に送達する方法であって、前記細胞を[２３]に記載のタンパク質又は[２４]に記載の組成物に接触させることを含み、前記タンパク質は前記化合物に抱合される方法。
[４１]  対象における状態を診断する又は予後予測する方法であって、タンパク質が抗原に結合し、複合体を形成するように対象に由来する試料を[１]〜[２３]のいずれか１項に記載のタンパク質又は[２４]に記載の組成物に接触させること及び前記複合体を検出することを含み、前記複合体の検出が対象における状態の診断又は予後予測である方法。
[４２]  複合体のレベルを決定することを含み、前記複合体の増強されたレベル又は軽減されたレベルが対象における状態の診断又は予後予測である[４１]に記載の方法。
[４３]  対象において抗原を局在化する又は検出する方法であって、対象にて[２３]に記載のタンパク質又は[２４]に記載の組成物を検出する又は局在化することを含み、前記タンパク質が検出可能な標識に抱合される方法。
【０４０６】
（表４）参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0006038121.tif 000014
【図５Ｂ】
0006038121.tif 000015
【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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