(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型領域の対立遺伝子が試料中に存在するか否かを決定する方法であって、
試料内の出発ポリヌクレオチド分子にアダプターを付着させることであって、このとき、前記アダプターが、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｎ、およびこれらの修飾型から選択される少なくとも１つのヌクレオチド塩基を含む、縮重塩基領域（ＤＢＲ）を含むものであることと、
前記アダプターを付着させたポリヌクレオチドを増幅して、増幅したアダプター付着ポリヌクレオチドを製造することと、
複数の前記増幅したアダプター付着ポリヌクレオチドを配列決定することであって、このとき、前記ＤＢＲおよび前記ポリヌクレオチドの少なくとも一部分の配列が、前記複数のアダプター付着ポリヌクレオチドのそれぞれについて得られるものであることと、
標的多型領域の対立遺伝子について、前記複数の配列決定されたアダプター付着ポリヌクレオチド内に存在する別個のＤＢＲ配列の数を決定して、対立遺伝子についての出発ポリヌクレオチドの数を評価することと、
前記対立遺伝子についての出発ポリヌクレオチドの数に基づいて、前記対立遺伝子が前記試料中に存在するか否かを決定することと、
を含む、方法。
【請求項２】
標的多型領域の一つの対立遺伝子について、前記対立遺伝子に関連する異なるＤＢＲ配列の数を決定することと、
標的多型領域の前記対立遺伝子について、異なるＤＢＲ配列のそれぞれを含む配列読み出しの数を決定することと、
計数した異なる配列の数と計数した配列読み出しの数とを用いて、前記対立遺伝子が前記試料中に存在する可能性を算出することと、
前記対立遺伝子が前記試料中に存在するか否かを決定することであって、このとき可能性が高いほど前記決定の信頼度が増すこと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アダプターが、再帰的配列、およびプロモーター部位のうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＢＲが、少なくとも２個のヌクレオチド塩基を含み、前記少なくとも２個のヌクレオチド塩基のそれぞれが、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、およびＮから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＢＲが３〜１０個のヌクレオチド塩基を含み、前記３〜１０個のヌクレオチド塩基のそれぞれが、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、およびＮから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アダプターが試料を同定する固有の多重識別子を含み、前記方法が、配列決定の前に前記試料を他の複数の試料とプールすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、ゲノムＤＮＡ試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記他の複数の試料が、異なる対象に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料がヒトゲノムＤＮＡの試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
さらに前記試料が、試料内の出発ポリヌクレオチド分子にアダプターを付着させる前に、目的とする領域に対して富化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
目的とする領域に対して、前記アダプター付着ポリヌクレオチドを富化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記アダプターが非対称アダプターであり、第１のアダプタードメインが前記ポリヌクレオチドの第１の末端に存在し、第２のアダプタードメインが前記ポリヌクレオチドの第２の末端に存在し、前記ＤＢＲが、前記第１のアダプタードメイン内の少なくとも２個のヌクレオチド塩基のうちの１つ以上と、前記第２のアダプタードメイン内の少なくとも２個のヌクレオチド塩基のうちの１つ以上とを含む、分割ＤＢＲである、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記アダプターが、増幅反応において前記ポリヌクレオチド分子に付着され、前記ＤＢＲが、前記増幅反応に用いられる合成プライマーに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅反応がＰＣＲである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記試料中の前記ポリヌクレオチドの遺伝的異質性を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、腫瘍組織に由来するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、微生物および／またはウイルスに由来するポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記他の複数の試料に存在する前記ポリヌクレオチドの遺伝的異質性を決定することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１９】
前記他の複数の試料が、経時的な対象に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が感染を有する対象から収集され、経時的に前記感染の病原体（一又は複数）の遺伝的異質性が決定される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
遺伝子型決定は、ゲノムを解読し、遺伝形質（例えば、遺伝性疾患）に関連している遺伝子の位置を特定するための遺伝子研究において重要な技法である。対象の遺伝子型は、一般に、対象のＤＮＡから得られる配列データに基づいて、１つ以上のゲノム遺伝子座を決定する対立遺伝子を含む。２倍体ゲノム（例えば、ヒトゲノム）は、それらがその遺伝子座に有する異なる対立遺伝子の数に応じて、ゲノム遺伝子座で、例えば、ホモ接合性またはヘテロ接合性として分類される場合があり、ヘテロ接合体は、ある遺伝子座に２つの異なる対立遺伝子を有し、ホモ接合体は、その遺伝子座に同一対立遺伝子の２つの複製を有する。高い統計的信頼度で、遺伝子型を表現型と関連付けるために必要とされる大集団において研究が行われる場合、試料の適切な遺伝子型決定が重要である。
【０００２】
シーケンシングによる２倍体ゲノムの遺伝子型決定解析では、特定のゲノム遺伝子座のカバレージ（配列決定読み出しの数）を使用して、遺伝子型同定の信頼度を確立する。しかしながら、試料の調製中にバイアスが導入される場合、例えば、出発試料が限られた量である場合、および／または１つもしくは複数の増幅反応を用いて配列決定の試料を調製する場合、遺伝子型同定における信頼度は、著しく低減する。したがって、限られた量のＤＮＡを有する試料では、増幅バイアス（例えば、たった数個、または１つのポリヌクレオチド分子からの増幅）に起因して、異なる染色体上の対立遺伝子よりも１つの染色体上の対立遺伝子について、高いカバレージ（すなわち、多数の配列決定読み出し）が見られる場合がある。この場合、遺伝子型同定における信頼度を測定すると、カバレージ単独では誤解を招く恐れがある。
【０００３】
本発明は、対立遺伝子呼び出しにおける信頼度の増加、ならびに核酸配列解析に基づく他の適用、特に大集団の試料において遺伝子型を研究する文脈での利用を見出す。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の態様は、特定の配列解析構成またはプロセスで配列決定された同一の原試料の同一のゲノム領域から生じる個別のポリヌクレオチド分子の数を決定するための方法および組成物を含む。発明のこれらの態様では、縮重塩基領域（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｂａｓｅ  ｒｅｇｉｏｎ）（ＤＢＲ）は、後次に配列決定される出発ポリヌクレオチド分子に付着される（例えば、所定のプロセスステップ、例えば、増幅および／または富化が行われた後）。配列決定のランにおいて存在する異なるＤＢＲ配列の数を使用して、特定の配列解析構成またはプロセスで配列決定された同一の原試料の同一のゲノム領域から生じる個別のポリヌクレオチド分子の数を決定／推定することができる。ＤＢＲを使用して、多くの異なる核酸配列決定適用の解析を向上させることができる。例えば、ＤＢＲは、読み出し数のみから派生し得ない遺伝子型決定解析における対立遺伝子呼び出しの統計値の決定を可能にする。
【０００５】
所定の実施形態では、対象発明の態様は、複数の異なる試料から配列決定される出発ポリヌクレオチド分子の数を決定する方法に関する。所定の実施形態では、方法は、（１）複数の異なる試料内の出発ポリヌクレオチド分子にアダプターを付着させることであって、このとき、それぞれの試料のアダプターが、試料に特異的な固有のＭＩＤと、縮重塩基領域（ＤＢＲ）（Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｎ、およびこれらの修飾型から選択される少なくとも１つのヌクレオチド塩基を有するＤＢＲ）とを含むものであることと、（２）複数の異なるアダプターを付着させた試料をプールして、プール試料を生成することと、（３）プール試料内のアダプターを付着させたポリヌクレオチドを増幅させることと、（４）複数の増幅したアダプターを付着させたポリヌクレオチドを配列決定することであって、ＭＩＤ、ＤＢＲ、およびポリヌクレオチドの少なくとも一部分の配列が、複数のアダプターを付着させたポリヌクレオチドのそれぞれについて得られるものであることと、（５）それぞれの試料から前記複数の配列決定されたアダプターを付着させたポリヌクレオチド内に存在する別個のＤＢＲ配列の数を決定して、配列決定工程で配列決定されたそれぞれの試料から出発ポリヌクレオチドの数を決定することと、を含む。
【０００６】
本発明は、添付の図面と併せて読まれる場合、以下の詳細な説明から最も良く理解される。以下の図が図面に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】表示された量の出発物質から調製される試料中のそれぞれのＭＩＤの対立遺伝子比を示す（各パネルの上部、ナノグラム単位）。
【図２】合成多型位置でそれぞれの対立遺伝子と関連付けられたそれぞれのＭＩＤについてＤＢＲ配列の画分を示す。試料は、表示された量の出発物質から調製された（各パネルの上部、ナノグラム単位）。
【図３】ＤＢＲ配列を有するプライマーを使用して、ＰＣＲの最初の２サイクルで生成される生成物を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。さらに、所定の要素は、明白性および参照の容易性のために定義される。
【０００９】
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、その分野の標準的な論文およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）等の用語および記号に従う。
【００１０】
「単位複製配列」は、ポリヌクレオチド増幅反応の生成物を意味する。つまり、１つ以上の出発配列から複製される、通常二本鎖のポリヌクレオチドの集団である。１つ以上の出発配列は、同一配列の１つ以上の複製であり得るか、または異なる配列の混合であってよい。単位複製配列は、その生成物が１つ以上の標的核酸の複数の複製である様々な増幅反応により生成され得る。一般に、単位複製配列を生成する増幅反応は、「テンプレート主導型」であり、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかの反応物質の塩基対合は、反応生成物の形成に必要なテンプレートポリヌクレオチドの相補体を有する。一態様では、テンプレート主導型反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチド結紮である。そのような反応には、これらに限定されないが、参照することにより本明細書に組み込まれる以下の参考文献、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，９６５，１８８号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号（ＰＣＲ）、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，２１０，０１５号（「ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）」プローブを有するリアルタイムＰＣＲ）、Ｗｉｔｔｗｅｒらの米国特許第６，１７４，６７０号、Ｋａｃｉａｎらの米国特許第５，３９９，４９１号（「ＮＡＳＢＡ」）、Ｌｉｚａｒｄｉの米国特許第５，８５４，０３３号、Ａｏｎｏらの日本特許公開第ＪＰ４−２６２７９９（ローリングサークル増幅）等に開示される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、線形ポリメラーゼ反応、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅等が挙げられる。一態様では、本発明の単位複製配列は、ＰＣＲにより生成される。反応生成物が増幅反応の進行として測定されるのを許す検出化学が使用可能な場合、増幅反応は、「リアルタイム」増幅、例えば、以下に記載される「リアルタイムＰＣＲ」またはＬｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：２１５０−２１５５（１９９８）および同様の参考文献に記載される「リアルタイムＮＡＳＢＡ」であってよい。本明細書で使用するところの用語「増幅する」は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、これらに限定されないが、反応の間にｐＨを選択されたレベルで維持する緩衝剤、塩、共因子、スカベンジャー等を含み得る、反応を行うための全ての必要な反応物質を含有する溶液を意味する。
【００１１】
用語「査定する」は、測定の任意の形態を含み、要素が存在するか否かを決定することを含む。用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、「推定する」、「査定する」、および「分析する」は、交換可能に使用され、定量的および定性的測定を含む。「の存在を査定する」は、存在する何かの量を決定すること、および／またはそれが存在するか、または非存在であるかを決定することを含む。
【００１２】
「非対称的にタグ付けされた」ポリヌクレオチドは、同一でない左右アダプタードメインを有する。このプロセスは、一般的にアダプターを非対称的に付着させること、またはポリヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチド断片を非対称にタグ付けすることと称される。非対称アダプター末端を有するポリヌクレオチドの生成は、任意の従来の方法で達成されてよい。例示的な非対称アダプターは、米国特許第５，７１２，１２６号および第６，３７２，４３４号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号および第２００７／０１７２８３９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０３２１６７号に記載され、これらの全ては参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、用いられる非対称アダプターは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年４月２９日に出願された米国特許出願第１２／４３２，０８０号に記載される。
【００１３】
一例として、対象発明の使用者は、非対称アダプターを使用してポリヌクレオチドをタグ付してよい。「非対称アダプター」は、二本鎖核酸断片の量末端に結紮されると、目的とするゲノム挿入に隣接する非同一配列を有する、プライマー伸長または増幅生成物の生成をもたらす。結紮は、通常、非同一の末端アダプター配列を生成するように、後次処理ステップが続く。例えば、非対称アダプターが付着された断片の複製（複数可）は、ポリヌクレオチド生成物を生じ、末端アダプター配列の間に、少なくとも１つの核酸配列差、またはヌクレオチド／ヌクレオシド修飾が存在する。アダプターを非対称的にポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド断片）に付着させることは、他方の末端上のアダプター配列と比較して、存在しないか、または異なる核酸配列を有するかのいずれかである、一方の末端上に１つ以上のアダプター配列（例えば１つ以上の領域またはドメイン、例えばプライマー結合部位）を有するポリヌクレオチドを生じる。「非対称アダプター」と呼ばれるアダプターは、必ずしもそれ自体が構造的に非対称であるとは限らず、非対称アダプターをポリヌクレオチド断片に付着させる単なる行為が即時にそれを非対称にするものでもないことが指摘される。むしろ、同一の非対称アダプターをそれぞれの末端に有する、非対称のアダプターが付着したポリヌクレオチドは、反対端上のアダプター配列に関して非対称である、複製生成物（または単離された一本鎖ポリヌクレオチド）を生成する（例えば、増幅／プライマー伸長を少なくとも一周した後）。
【００１４】
任意の便利な非対称アダプター、またはアダプターを非対称的に付着させるためのプロセスは、本発明を実施する際に用いられてよい。例示的な非対称アダプターは、米国特許第５，７１２，１２６号および第６，３７２，４３４号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号および第２００７／０１７２８３９号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０３２１６７号に記載され、これらの全ては参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、用いられる非対称アダプターは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年４月２９日に出願された米国特許出願第１２／４３２，０８０号に記載されるものである。
【００１５】
「相補的な」または「実質的に相補的な」は、ヌクレオチドもしくは核酸の間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖の間、または一本鎖核酸上のオリゴヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーションもしくは塩基対合または二本鎖の形成を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（もしくはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。最適に整列および比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する、一本鎖のヌクレオチドが、他方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、およびより好ましくは約９８〜１００％と対合するとき、２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、実質的に相補的であると言われる。あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が、その相補体に対して選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするとき、実質的な相補性が存在する。典型的に、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにわたって、少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性があるとき、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照されたい。
【００１６】
「二本鎖」は、完全または部分的に相補的である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドは、それらのヌクレオチドの全てまたは大部分の中でワトソン−クリック型塩基対合を経て、安定した複合体が形成されるようにする。用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、安定した二本鎖の形成を意味するように交換可能に使用される。二本鎖に関して「完全に適合した」は、二本鎖を形成するポリヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖は、互いに二本鎖構造を形成し、それぞれの鎖の全てのヌクレオチドが、他の鎖のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対合を経ることを意味する。安定した二本鎖は、二本鎖の鎖の間にワトソン−クリック塩基対合および／または非ワトソン−クリック塩基対合を含み得る（塩基対合は、水素結合の形成を意味する）。所定の実施形態では、非ワトソン−クリック塩基対合は、ヌクレオシド類似体、例えば、デオキシイノシン、２，６−ジアミノプリン、ＰＮＡ、ＬＮＡ等を含む。所定の実施形態では、非ワトソン−クリック塩基対合は、「ゆらぎ塩基」、例えば、デオキシイノシン、８−オキソ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＧなどを含み、「ゆらぎ塩基」とは、相補核酸鎖の第１のヌクレオチド塩基と塩基対合できるが、核酸合成のテンプレート鎖として用いられると、第２の異なるヌクレオチド塩基対の合成鎖への組み込みをもたらす核酸塩基を意味する（ゆらぎ塩基は、以下でさらに詳述される）。２つのオリゴヌクレオチドポリヌクレオチド間の二本鎖の「不適合」は、二本鎖の一対のヌクレオチドが、ワトソン−クリック結合に失敗したことを意味する。
【００１７】
ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドに関する「遺伝子座」、「座」、または「目的とする座」は、ゲノムまたは標的ポリヌクレオチドの隣接する小領域またはセグメントを意味する。本明細書で使用するところの、遺伝子座、座、もしくは目的とする座は、ミトコンドリアＤＮＡもしくは他の非染色体ＤＮＡ（例えば、細菌プラスミド）を含む、ゲノムのヌクレオチド、遺伝子もしくは遺伝子の一部分を指し得るか、またはそれが遺伝子内にあるか、もしくは遺伝子と関連付けられるかに関わらず、ゲノム配列の任意の隣接部分を指し得る。遺伝子座、座、または目的とする座は、単一ヌクレオチドから数百もしくは数千ヌクレオチド長以上であり得る。一般に、目標とする座は、それと関連付けられた参照配列を有する（以下「参照配列」に関する説明を参照）。
【００１８】
「キット」は、本発明の方法を実行するための材料または試薬を送達する任意の送達システムを指す。反応分析の文脈において、そのような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器中のプローブ、酵素等）および／または支持材料（例えば、緩衝剤、分析を行うための文書指示等）を一方の位置から別の位置に保管、輸送、または送達するのを可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連反応試薬および／または支持材料を含有する、１つ以上の筐体（例えば、ボックス）を含む。そのような含有物は、一緒に、または別個に意図される受容体に送達されてよい。例えば、第１の容器は、分析に使用するための酵素を含有し得るが、第２の容器は、プローブを含有する。
【００１９】
「結紮（ライゲーション）」は、２つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することを意味する。結合または連結の性質は、広く異なってよく、結紮は、酵素的または化学的に実行され得る。本明細書で使用するところの結紮は、通常、酵素的に実行されて、あるオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５′炭素と、別のオリゴヌクレオチドの３′炭素との間にリン酸ジエステルを形成する。様々なテンプレート主導型結紮反応は、参照することにより組み込まれる、以下の参考文献：Ｗｈｉｔｅｌｅｙらの米国特許第４，８８３，７５０号、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒらの米国特許第５，４７６，９３０号、Ｆｕｎｇらの米国特許第５，５９３，８２６号、Ｋｏｏｌの米国特許第５，４２６，１８０号、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎらの米国特許第５，８７１，９２１号、ＸｕおよびＫｏｏｌのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７：８７５−８８１（１９９９）、ＨｉｇｇｉｎｓらのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：５０−７１（１９７９）、ＥｎｇｌｅｒらのＴｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１５：３−２９（１９８２）、およびＮａｍｓａｒａｅｖの米国特許公開第２００４／０１１０２１３において説明される。
【００２０】
本明細書で使用するところの「多重識別子（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＭＩＤ））」は、ポリヌクレオチドと関連付けられたタグまたはタグの組合せを指し、それらの同一性（例えば、タグＤＮＡ配列）を使用して、試料中のポリヌクレオチドを区別することができる。所定の実施形態では、ポリヌクレオチド上のＭＩＤを使用して、ポリヌクレオチドが由来する源を同定する。例えば、核酸試料は、異なる源に由来するポリヌクレオチド（例えば、異なる個体、異なる組織もしくは細胞、または異なる時点で単離されたポリヌクレオチド）のプールであってよく、それぞれ異なる源からのポリヌクレオチドは、固有のＭＩＤでタグ付けされる。そのためＭＩＤは、ポリヌクレオチドとその源との間に相関を提供する。所定の実施形態では、ＭＩＤを用いて、試料中のそれぞれ個別のポリヌクレオチドを固有にタグ付けする。試料中の固有のＭＩＤの数の同定は、試料中に個別のポリヌクレオチドがいくつ存在するか（または操作されたポリヌクレオチド試料がいくつの原ポリヌクレオチドに由来するか、例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２００９年５月２６日に発行された米国特許第７，５３７，８９７号を参照）に関する読み出しを提供することができる。ＭＩＤは、典型的に、ヌクレオチド塩基で構成され、２〜１００個のヌクレオチド塩基長以上の範囲であり得、複数のサブユニットを含んでもよく、それぞれ異なるＭＩＤは、独自の同一性および／またはサブユニットの順序を有する。ＭＩＤとしての使用が見出される例示的な核酸タグは、２００９年６月６日に発行された米国特許第７，５４４，４７３号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｏｋｅｎｓ」ならびに２００８年７月１日に発行された米国特許第７，３９３，６６５号、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、それらはいずれも、核酸タグおよびポリヌクレオチドを同定する際のそれらの使用に関する説明について、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる。所定の実施形態では、本明細書に記載される方法が、広範な固有のＭＩＤ群を収容できるため、複数の試料をタグ付けするために用いられるＭＩＤの群は、任意の特定の共通特性（例えば、Ｔｍ、長さ、塩基組成等）を有する必要はない。ＭＩＤが単に所与の実験において固有である必要があることが強調される。したがって、同一のＭＩＤを使用して、異なる実験で処理される異なる試料をタグ付けしてもよい。さらに、所定の実験では、ユーザは、同一のＭＩＤを使用して、同一の実験において異なる試料のサブセットをタグ付けしてもよい。例えば、特定の表現型を有する個体に由来する全ての試料、例えば、対照（または野生型）対象に由来する全ての試料は、第１のＭＩＤでタグ付けされ得るが、病態を有する対象は、第２のＭＩＤ（第１のＭＩＤとは異なる）でタグ付けされ得る。別の例として、同一の源に由来する異なる試料（例えば、経時的に派生する試料または組織内の異なる部位に由来する試料）を異なるＭＩＤでタグ付けす���ことが望ましい場合がある。さらに、ＭＩＤは、多様な異なる方法、例えば、第１のＭＩＤが結紮によって付着され、第２のＭＩＤがプライマー伸長によって付着される、複合タグ付けアプローチによって生成され得る。したがって、ＭＩＤは、プロセスおよび分析中にポリヌクレオチド断片を追跡するように、多様な異なる方法で設計および実施することができ、したがって、この点に関していかなる制限も意図されない。
【００２１】
本明細書で使用するところの「次世代配列決定」（ＮＧＳ）は、従来の配列決定法（例えば、標準サンガーまたはマクサム−ギルバート配列決定法）を使用して前例のなかった速度で、ポリヌクレオチドを配列決定する能力を有する、配列決定技法を指す。これらの前例のない速度は、数千〜数百万の配列決定反応を並行して行うことによって達成される。ＮＧＳ配列決定プラットホームには、これらに限定されないが、以下のＭａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、４５４ｐｙｒｏ配列決定（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、固相、可逆的終了配列（Ｓｏｌｅｘａ／Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＳＯＬｉＤ技法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、イオン半導体配列決定（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、およびＤＮＡナノボール配列決定（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）が挙げられる。所定のＮＧＳプラットホームに関する記述は、以下のＳｈｅｎｄｕｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，″Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，″Ｎａｔｕｒｅ，２００８，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．１０，１１３５−１１４５、Ｍａｒｄｉｓ，″Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，″Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７，ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．３，ｐｐ．１３３−１４１、Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，″Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ″Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ，２０１１，１１（３）：３３３−４３、およびＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｔｈｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ″，Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１，３８（３）：９５−１０９において見出され得る。
【００２２】
本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」には、天然ヌクレオチドが挙げられ、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載される、２′−デオキシおよび２′−ヒドロキシル形態を含む。ヌクレオシドに関する「類似体」は、それらが特異的なハイブリダイゼーションが可能であるという条件で、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）、Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）等に記載される、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。そのような類似体は、結合特性を強化し、複雑性を低減し、特異性を高める等するように設計される合成ヌクレオシドを含む。強化されたハイブリダイゼーションまたは耐ヌクレアーゼ特性を有する類似体を含むポリヌクレオチドは、Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ（上述）、Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，６：８５５−８７０（１９９６）、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３４３−３５５（１９９５）等に記載される。二本鎖の安定性を強化することができるポリヌクレオチドの例示型には、オリゴヌクレオチドＮ３′→Ｐ５′ホスホルアミド酸塩（本明細書では「アミド酸塩」と称される）、ペプチド核酸（本明細書では「ＰＮＡ」と称される）、オリゴ−２′−Ｏ−アルキルリボ核酸、Ｃ−５プロピニルピリミジンを含有するポリヌクレオチド、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）等が挙げられる。そのようなオリゴヌクレオチドは、市販されているか、または文献に記載される方法を使用して合成されてもよい。
【００２３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による、特定のＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための反応を意味する。換言すれば、ＰＣＲは、両側にプライマー結合部位が並ぶ標的核酸の複数コピーまたは複製を作製するための反応であり、そのような反応は、（ｉ）標的核酸を変性させる工程と、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングする工程と、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸塩の存在下で、核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させる工程と、を１回以上反復することを含む。通常、反応は、熱循環装置において、それぞれの工程について最適化される異なる温度によって循環される。特定の温度、それぞれの工程における期間、および工程間の変化率は、当業者に良く知られている多くの要因に依存し、例えば、参考文献ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（それぞれＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１  ａｎｄ  １９９５）により例示される。例えば、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲにおいて、二本鎖標的核酸は、９０℃を超える温度で変性し、プライマーは、５０〜７５℃の範囲の温度でアニールされ、プライマーは、７２〜７８℃の範囲の温度で伸長され得る。用語「ＰＣＲ」は、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネストしたＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、多重化ＰＣＲ等を含むが、これらに限定されない反応の派生形態を含む。反応体積は、数ナノリットル（例えば、２ｎＬ）〜数百μＬ（例えば、２００μＬ）の範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、標的ＲＮＡを相補的一本鎖ＤＮＡに変換する、逆転写反応が先行し、次いで増幅されるＰＣＲを意味し、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｔｅｃｏｔｔらの米国特許第５，１６８，０３８号を参照されたい。「リアルタイムＰＣＲ」は、反応が進行するにつれて反応生成物、すなわち、単位複製配列の量がモニターされるＰＣＲを意味する。主に反応生成物をモニターするために使用される検出化学が異なるリアルタイムＰＣＲの多くの形態があり、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第５，２１０，０１５号（「ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）」）、Ｗｉｔｔｗｅｒらの米国特許第６，１７４，６７０号および第６，５６９，６２７号（挿入染料）、Ｔｙａｇｉらの米国特許第５，９２５，５１７号（分子ビーコン）を参照されたい。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、これもまた参照することにより本明細書に組み込まれる、ＭａｃｋａｙらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１２９２−１３０５（２００２）においてレビューされる。「ネストしたＰＣＲ」は、２段階ＰＣＲを意味し、第１のＰＣＲの単位複製配列は、新しいプライマー群を使用して、第２のＰＣＲの試料になり、それらのうちの少なくとも１つは、第１の単位複製配列の内部位置に結合する。ネストした増幅反応に関する、本明細書で使用するところの「初期プライマー」は、第１の単位複製配列を生成するために使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」は、第２のネストした単位複製配列を生成するために使用される１つ以上のプライマーを意味する。「多重化ＰＣＲ」は、複数の標的配列（または単一の標的配列および１つ以上の参照配列）は、同一の反応混合物内で同時に実行され、例えば、ＢｅｒｎａｒｄらのＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７３：２２１−２２８（１９９９）（２色リアルタイムＰＣＲ）を参照されたい。通常、別個のプライマーの群が、増幅されるそれぞれの配列に用いられる。
【００２４】
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、それぞれヌクレオチドモノマーの線形ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを作製するモノマーは、規則的なパターンのモノマー対モノマー相互作用、例えば、ワトソン−クリック型の塩基対合、塩基の積み重ね、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型の塩基対合、ゆらぎ塩基対合等によって、天然ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。以下に詳述されるように、「ゆらぎ塩基」とは、相補的核酸鎖内の第１のヌクレオチド塩基と塩基対合できるが、核酸合成のテンプレート鎖として用いられるとき、第２の異なるヌクレオチド塩基の合成鎖への組み込みをもたらすことを意味する。そのようなモノマーおよびそれらのインターヌクレオシド結合は、自然発生し得るか、またはその類似体、例えば、自然発生または非自然発生する類似体であってよい。非自然発生する類似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３９，０８２号に記載される）、ロックド核酸（ＬＮＡ、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，６７０，４６１号）、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、標識の付着を可能にする塩基含有連結基、例えば、蛍光色素分子またはハプテン等を含み得る。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が酵素処理、例えば、ポリメラーゼによる伸長、リガーゼによる結紮等を必要とするたびに、当業者は、そのような場合のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ヌクレオシド間結合の所定の類似体、糖部分、または任意もしくはいくつかの位置の塩基を含まないことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的に、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と称されるとき、数個のモノマー単位（例えば、５〜４０）〜数千モノマー単位のサイズの範囲である。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」等の文字配列（大文字または小文字）により表されるときはいつも、別段の指示がないか、または文脈から明らかでない限り、ヌクレオチドは左から右に５′→３′の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことを理解されたい。特に断りのない限り、用語論および原子番号付け規則は、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）に開示されるものに従う。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合により結合される、４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡのデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、それらのＲＮＡのリボーゼ対応物）を含むが、それらは、非天然ヌクレオチド類似体、例えば、修飾された塩基、糖、またはヌクレオシド間結合も含む。活性の酵素が特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質要件、例えば、一本鎖ＤＮＡ，ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖等を有し、次にオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質に対する適切な組成物の選択は、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）等の論文および同様の参考文献からのガイダンスとともに、十分に当業者の知識の範囲内であることは、当業者には明らかである。
【００２５】
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートを用いて二本鎖を形成するとき、核酸合成の開始点として作用し、伸長した二本鎖が形成されるように、テンプレートに沿ってその３′末端から伸長され得る、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセスの間に添加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長生成物の合成におけるその使用に適合する長さであり、通常、８〜１００ヌクレオチド長、例えば、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０等の範囲内であり、より典型的に、１８〜４０、２０〜３５、２１〜３０ヌクレオチド長の範囲内、および規定された範囲の間の任意の長さであり得る。典型的なプライマーは、１０〜５０ヌクレオチド長、例えば、１５〜４５、１８〜４０、２０〜３０、２１〜２５等、および規定された範囲内の任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、通常、約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ヌクレオチド長以下である。
【００２６】
プライマーは、通常、増幅の最大効率のために一本鎖であるが、代替として二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、プライマーは、通常、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にその鎖を分離するように処理される。この変性工程は、典型的に、熱により影響を受けるが、代替としてアルカリを使用して実行された後、中和されてもよい。したがって、「プライマー」は、テンプレートに相補的であり、水素結合またはテンプレートを用いたハイブリダイゼーションにより複合して、ポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／テンプレート複合体を生じ、これは、ＤＮＡ合成のプロセスにおいて、テンプレートに相補的なその３′末端で連結される、共役結合塩基の添加により伸長される。
【００２７】
本明細書で使用するところの「プライマー対」は、標的核酸の核酸ベースの増幅に適した核酸配列を有する第１および第２のプライマーを指す。そのようなプライマー対は、一般に、標的核酸の第１の部分の配列と同一または類似する配列を有する第１のプライマーと、標的核酸の第２の部分に相補的な配列を有する第２のプライマーと、を含み、標的核酸またはその断片の増幅を提供する。本明細書における「第１の」および「第２の」プライマーに関する言及は、特に別段の指定のない限り、任意である。例えば、第１のプライマーは、「順方向プライマー」（標的核酸の５′末端から核酸合成を開始する）または「逆方向プライマー」（順方向プライマーから開始される合成から生成された生成物の伸長の５′末端から核酸合成を開始する）として設計され得る。同様に、第２のプライマーは、順方向プライマーまたは逆方向プライマーとして設計され得る。
【００２８】
「読み出し」は、数または値に変換され得る、測定および／または検出されるパラメータ（複数可）を意味する。いくつかの文脈では、読み出しは、そのような収集または記録されたデータの実際の数値表現を指し得る。例えば、マイクロアレイからの蛍光強度信号の読み出しは、マイクロアレイのそれぞれのハイブリダイゼーション部位で生成される信号のアドレスおよび蛍光強度であり、したがって、そのような読み出しは、様々な方法、例えば、マイクロアレイの画像、数値の表等として登録または保存されてよい。
【００２９】
「再帰的部位」、「再帰的配列」、および相当物を使用して、ポリヌクレオチドのその初期位置から異なる位置までドメインを分子内的に移動させるように用いられる、ポリヌクレオチドに存在する１つ以上の配列を示す。再帰的配列の使用は、参照することにより本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０２２４３号、２０１１年２月２４日に公開された表題″Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ″（第ＷＯ２０１１／０２１１０２号）に詳述される。所定の実施形態では、再帰的配列は、ポリヌクレオチドの他の配列と異なるように選択される（すなわち、ポリヌクレオチドに存在する可能性がある他の配列、例えば、処理されるゲノムまたはサブゲノム配列に対して配列相同性をほとんど有しない）。そのように、再帰的配列は、再帰的プロセスで用いられる条件下で、その相補体を除く任意の配列に対してハイブリダイズされないように選択されるべきである。再帰的配列は、合成または人工的に生成された配列（例えば、アダプタードメイン内のポリヌクレオチドに添加される）または分析されるポリヌクレオチド内に通常存在する配列（例えば、分析されるポリヌクレオチドにおいて目的とする領域内に存在する配列）であり得る。再帰的システムでは、再帰的配列に対する相補体は、再帰的配列と同一のポリヌクレオチド鎖上（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの同一鎖または同一の一本鎖ポリヌクレオチド上）に存在し（例えば、アダプタードメインに挿入される）、相補体は、そのような特定の鎖上の分子内結合および重合イベントを促進するように、特定の位置に配置される。本明細書に記載される再帰的プロセスで用いられる再帰的配列は、したがって、広範な長さおよび配列を有し得る。再帰的配列は、５〜２００ヌクレオチド塩基長であり得る。
【００３０】
「固体支持体」、「支持体」、および「固相支持体」は、交換可能に使用され、剛性または半剛性表面（複数可）を有する材料または材料の群を指す。多くの実施形態では、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの実施形態では、例えば、ウェル、隆起した領域、ピン、エッチングされたトレンチ等を有する異なる化合物について、合成領域を物理的に分離することが望ましい場合がある。他の実施形態に従って、固体支持体（複数可）は、ビーズ、樹脂、ゲル、微小球の形態、または他の幾何学的形状を取る。マイクロアレイは、通常、ガラス顕微鏡スライド等の少なくとも１つの平坦な固相支持体を含む。
【００３１】
ある分子をプローブの標識された標的配列等の別の分子に結合することに関する「特異的」または「特異性」は、２つの分子間の安定した複合体の認識、接触、および形成と一緒に、その分子と他の分子とのそれよりも低い認識、接触、または複合体形成を意味する。一態様では、第１の分子を第２の分子に結合することに関する「特異的」とは、第１の分子が反応液または試料中の別の分子との複合体を認識および形成する程度に、第２の分子と最大数の複合体を形成する。好ましくは、この最大数は、少なくとも５０％である。一般に、特異的な結合イベントに関与する分子は、それらの表面上または空洞内に面積を有し、互いに結合する分子間に特異的な認識を生じる。特異的結合の例には、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドの中での二本鎖または三本鎖の形成、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン相互作用、受容体−リガンド相互作用等が挙げられる。特異性または特異的結合に関して本明細書で使用するところの「接触」は、２つの分子が、非共有化学相互作用、例えば、ファンデルワールス力、水素結合、塩基積み重ね相互作用、イオンおよび疎水性相互作用等を脆弱化するのに十分近接し、分子の相互作用を支配することを意味する。
【００３２】
本明細書で使用するところの用語「Ｔｍ」は、「溶融温度」に関して使用される。溶融温度は、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖に半解離される温度（例えば、℃で測定される）である。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの等式は、当該技術分野において既知である（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の参考文献（例えば、Ａｌｌａｗｉ，Ｈ．Ｔ．＆  ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊ．，Ｊｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１０５８１−９４（１９９７））は、Ｔｍの計算に構造的特徴および環境的特徴、ならびに配列特徴を考慮する代替の計算方法を含む。
【００３３】
「試料」は、標的核酸の検出、測定、または標識が求められる生物学的、環境的、医学的、または患者源に由来する、ある量の材料を意味する。一方で、それは標本または培養物（例えば、微生物培養物）を含むことを意味する。他方で、それは生物学的試料および環境的試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の標本を含んでよい。生物学的試料は、ヒト、流体、固体（例えば、排泄物）または組織、ならびに液体および固体食品および食餌生成物、および乳製品、野菜、肉および肉複製品、および廃棄物等の成分であり得る。生物学的試料は、これらに限定されないが、培養物、血液、唾液、骨髄液、胸水、乳汁、リンパ液、痰、精液、針穿孔等を含む、患者から取られた材料を含み得る。生物学的試料は、これらに限定されないが、有蹄動物、クマ、魚類、齧歯類等の動物を含む、家畜ならびに野生化または野生動物の様々な系統から得られてよい。環境試料には、表面物質、土壌、水、および産業試料等の環境物質、ならびに食品および乳製品加工装置、器具、設備、工具、使い捨ておよび非使い捨て物品から得られる試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能な試料型を制限するとみなされるものではない。
【００３４】
核酸分子の配向および／または重合について説明する際の用語「上流」および「下流」は、本明細書において、当業者に理解されるように使用される。そのように、「下流」は、概して、５′から３′方向、すなわち、ヌクレオチドポリメラーゼが通常配列を伸長する方向に進行することを意味し、「上流」は、概して、その逆を意味する。例えば、同一の標的核酸分子上の第２のプライマーの「上流」をハイブリダイズする第１のプライマーは、第２のプライマーの５′側に位置する（およびしたがって、第１のプライマーからの核酸重合は、第２のプライマーに向かって進行する）。
【００３５】
請求項は、いかなる任意の要素をも除外するように草案され得ることがさらに指摘される。そのように、この陳述は、請求要素の列挙と併せて「単に」、「〜のみ」等の排他的用語を使用するか、または「負の」制限を使用するための先行詞として機能するものとする。
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明を説明する前に、この発明は、記載される特定の実施形態に制限されるものではなく、そのため当然のことながら変動し得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、制限するものではないことも理解されたい。
【００３７】
一連の値が提供される場合、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間に介在するそれぞれの値も特異的に開示されることを理解されたい。表示される範囲内の任意の表示される値または介在する値と、その表示される範囲内の任意の他の表示される値または介在する値との間のより小さい範囲それぞれは、本発明に含まれる。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立してその範囲内に含まれるか、または除外されてよく、一方を制限する、両方を制限しない、または両方を制限するそれぞれの範囲は、より小さい範囲に含まれ、これもまた表示される範囲内の任意の特異的に除外される制限を条件として、本発明に包含される。表示される範囲は、制限の一方または両方を含み、それらの包含される制限の一方または両方を除く範囲もまた本発明に含まれる。
【００３８】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、この発明が属する技術分野において通常の技術を有する者によって共通して理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものに類似するか、または相当する任意の方法および材料は、本発明の実践または試験に使用され得るが、いくつかの潜在的かつ好適な方法および材料がここで説明される。本明細書に記述される全ての発行物は、参照することにより本明細書に組み込まれ、その発行物が引用されるものと併せて、方法および／または材料を開示および説明する。本開示は、矛盾が存在する限度において、組み込まれる発行物の任意の開示を優先することを理解されたい。
【００３９】
本明細書で使用されるとおり、かつ添付の請求項において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「核酸」に関する言及は、複数のそのような核酸を含み、「化合物」に関する言及は、当業者に既知の１つ以上の化合物およびその相当物等に関する言及を含む。
【００４０】
本発明の実践は、別段の指示がない限り、当該技術分野の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技術を含む）、細胞生物学、生物化学、および免疫学の従来技術および説明を用いてよい。そのような従来技術は、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、結紮、および標識を使用するハイブリダイゼーションの検出を含む。適切な技術の特異的な例証は、本明細書において以下の例を参照して行われ得る。しかしながら、他の相当する従来の手順も当然のことながら使用することができる。そのような従来技術および説明は、あらゆる目的で全て参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ  Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｇａｉｔ，″Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ″１９８４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｘ（２０００），Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．等の標準研究質マニュアルに見出され得る。
【００４１】
本明細書で論じられる発行物は、本出願の出願日に先行して、単にそれらの開示のために提供される。本発明におけるいずれも、本発明が、先行発明によるそのような発行物に先行することは認めらないという許可とみなされるものではない。さらに、提供される発行日は、実際の公開日とは異なる場合があるため、独立して確認される必要があり得る。
【００４２】
上で要約されるように、本発明の態様は、ポリヌクレオチドに添加される、変性ヌクレオチド塩基（例えば、縮重塩基領域またはＤＢＲにおける）の使用について描かれ、特定の配列解析構成またはプロセスにおいて配列決定された同一の原試料の同一ゲノム領域を起源とする個別のポリヌクレオチド分子の数を確立する際の使用を見出す、配列解析を経る。配列解析を経るポリヌクレオチドにＤＢＲを含めることは、多様な遺伝子解析における使用を見出し、対立遺伝子呼び出しの統計的値を決定する機序を提供することにより対立遺伝子呼び出しの信頼度を増加させることを含み、値は、読み出し数のみに由来し得ない。ＤＢＲは、配列決定されるポリヌクレオチドに付着したアダプター（またはアダプターのプール）の一部として含む、任意の従来の方法でポリヌクレオチドに添加されてよく、例えば、ＤＢＲは、配列決定プライマー部位も含むアダプター内にあり得るか、またはＤＢＲは、核酸合成プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー内に存在してよく、プライマーが重合反応で使用されるとき、ＤＢＲが標的ポリヌクレオチドに添加されるようにする。
【００４３】
ＤＢＲは、プールされたポリヌクレオチド試料に関して遺伝子解析を行う際の利用も見出され、プールされた試料中のそれぞれのポリヌクレオチドは、その試料の起源に特異的なＭＩＤを含む（以下に詳述される）。これは、ユーザが、プールされた試料を生成するように複合された試料の起源のそれぞれから、特異的なポリヌクレオチド種（または多種）の配列カバレージを決定するのを可能にする。したがって、本発明の実施形態は、プールされた試料中のポリヌクレオチドの配列解析を含み、それぞれのポリヌクレオチドは、ＭＩＤおよびＤＢＲを含有する。
【００４４】
核酸
本発明（以下に詳述される）は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ，リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ等）、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、合成ＤＮＡ等を含むが、これらに限定されない、事実上任意の核酸源から目的とする核酸配列（またはポリヌクレオチド）の操作および解析に用いられ得る。さらに、任意の有機体、有機材料、または核酸含有物質は、本発明に従って処理される核酸の源として使用され得、植物、動物（例えば、爬虫類、哺乳類、昆虫、蠕虫、魚類等）、組織試料、細菌、菌類（例えば、酵母菌）、ファージ、ウイルス、死体組織、考古学的／古代試料等を含むが、これらに限定されない。所定の実施形態では、核酸試料中の核酸は、哺乳類に由来し、所定の実施形態では、哺乳類はヒトである。
【００４５】
所定の実施形態では、核酸配列は富化される。富化されるとは、核酸（例えば、ポリヌクレオチド試料中）が、一般に試料中の特定の核酸種の相対濃度を増加させることによって、核酸の複雑性を低減するプロセスに供されること（例えば、目的とする特異的遺伝子座を有する、特定の核酸配列を含む、遺伝子座または配列を欠失する、特異的なサイズ範囲内である等）を意味する。特異的な特徴（複数可）または配列を有する核酸を富化する様々な方法が存在し、そのためこれを達成する任意の従来の方法が用いられてよい。富化（または複雑性の低減）は、プロセスの多くの工程のいずれかにおいて行うことができ、使用者の希望により決定される。例えば、富化は、個別の親試料（例えば、アダプター結紮前のタグ無し核酸）または多重試料（例えば、ＭＩＤをコードするアダプター配列でタグ付けされた核酸。ＭＩＤは以下に詳述される）において行われ得る。
【００４６】
所定の実施形態では、核酸試料中の核酸は、解析前に増幅される。これらのうちのある実施形態では、増幅反応は、目的とする配列または遺伝子座の出発核酸試料を富化する役割も果たす。例えば、出発核酸試料は、目的とする１つ以上の領域を増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供され得る。所定の実施形態では、増幅反応は、増幅反応は、指数関数的増幅反応であるが、所定の他の実施形態では、増幅反応は線形増幅反応である。出発核酸試料に対して増幅反応を行うための任意の従来の方法は、対象の発明を実践する際に使用され得る。所定の実施形態では、増幅反応に用いられる核酸ポリメラーゼは、プルーフリード能力を有するポリメラーゼである（例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカスリトラリスＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサスＤＮＡポリメラーゼ等）。
【００４７】
所定の実施形態では、解析される核酸試料は、単一源（例えば、単一の有機体、ウイルス、組織、細胞、対象等）に由来するが、他の実施形態では、核酸試料は、複数の源から抽出された核酸のプールであり（例えば、複数の有機体、組織、細胞、対象等からの核酸のプール）、「複数の」とは、２つ以上を意味する。そのように、所定の実施形態では、核酸試料は、２以上の源、３以上の源、５以上の源、１０以上の源、５０以上の源、１００以上の源、５００以上の源、１０００以上の源、５０００以上の源、１０，０００以上の源、２５，０００以上の源等からの核酸を含み得る。
【００４８】
所定の実施形態では、核酸断片は、複数の源（例えば、複数の有機体、組織、細胞、対象等）に由来する核酸断片とともにプールされ、「複数の」とは２つ以上を意味する。そのような実施形態では、それぞれの源に由来する核酸は、多重識別子（ＭＩＤ）を含み、それぞれのタグ付けされた核酸断片からの源が決定され得るようにする。そのような実施形態では、それぞれの核酸試料の源は、固有のＭＩＤと相関され、固有のＭＩＤとは、用いられるそれぞれの異なるＭＩＤが、少なくとも１つの特徴、例えば、ＭＩＤの核酸配列に基づいて、用いられる１つおきのＭＩＤから区別され得ることを意味する。任意の型のＭＩＤを使用することができ、これらに限定されないが、いずれもそれらの核酸タグに関する記述およびポリヌクレオチドを識別する際のそれらの使用に関して、参照することによりそれら全体が本明細書に組み込まれる、２００７年１月２２日に出願された係属中の米国特許出願第１１／６５６，７４６号、表題″Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｏｋｅｎｓ″ならびに２００８年７月１日に発行された米国特許第７，３９３，６６５号、表題″Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔａｇｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ″に記載されるものを含む。所定の実施形態では、非対称タグ付け法（およびこれらに限定されないが、タグの配列決定またはタグの長さの測定を含む、多くのタグ読み出し法）は、多様な固有のＭＩＤ群に対応し得るため、複数の試料をタグ付けするために用いられるＭＩＤの群が、任意の特定の共通特性（例えば、Ｔｍ、長さ、塩基組成物等）を有する必要はない。
【００４９】
縮重塩基領域（ＤＢＲ）
本発明の態様は、特定の配列解析構成またはプロセスにおいて配列決定された同一起源の試料の同一ゲノム領域から生じる個別のポリヌクレオチド分子の数を決定または推定するための方法および組成物を含む。本発明のこれらの態様では、縮重塩基領域（ＤＢＲ）は、後次に配列決定される出発ポリヌクレオチド分子に付着される（例えば、所定のプロセスステップ、例えば、増幅および／または富化、例えばＰＣＲが行われた後）。以下に詳述されるように、配列決定ランに存在する異なるＤＢＲ配列の数（および場合によっては組み合わせ）は、特定のポリヌクレオチド（または目的とする領域、ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（ＲＯＩ））について配列決定された異なる出発ポリヌクレオチドの数（または最小数）の確立を可能にする。この数を使用して、例えば、対立遺伝子呼び出しの信頼度の統計的測定を付与し、したがって、そのような対立遺伝子決定を行う際の信頼度を増加させる（例えば、ホモ接合性対立遺伝子を呼び出す（ｃａｌｌｉｎｇ）とき）。ＤＢＲは、検出されない場合、遺伝子解析に負の影響を及ぼす、潜在的配列決定または増幅エラーの同定も可能にする。
【００５０】
ＤＮＡ配列決定は、典型的に、配列決定される試料中のポリヌクレオチドにアダプターを付着させる工程を含み、アダプターは、配列決定プライマー部位（例えば、結紮による）を含む。本明細書で使用するところの「配列決定プライマー部位」は、配列決定プライマーの配列に同一であるか、または相補的であるかのいずれかであるポリヌクレオチドの領域（一本鎖形態であるとき）、または配列決定プライマー配列とその相補体との間に形成される二本鎖領域である。配列決定プライマー部位の特異的配向は、配列決定プライマー部位を含有する特異的ポリヌクレオチドの構造特徴から当業者により推定され得る。
【００５１】
配列決定プライマー部位に加えて、縮重塩基領域（ＤＢＲ）はまた、配列決定プライマー部位を含有するアダプターの一部として、または独立して（例えば、ポリヌクレオチドに付着される第２のアダプターにおいて）ポリヌクレオチドに付着される。ＤＢＲをポリヌクレオチドに付着または添加するための任意の従来の方法が用いられてよい。ＤＢＲは、試料中の他のタグ付けされたポリヌクレオチドと比較して、様々な塩基組成物または配列を有し得る（「ランダム」として考慮され得る）領域である。試料中のポリヌクレオチド集団における異なるＤＢＲの数は、ＤＢＲ内の塩基数ならびにそれぞれの位置に存在し得る異なる塩基の潜在的数に依存する。したがって、それぞれの位置がＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴのいずれか１つであり得る、２つの塩基位置を有するＤＢＲを付着させたポリヌクレオチドの集団は、潜在的に１６の異なるＤＢＲ（ＡＡ、ＡＣ、ＡＧ等）を有する。ＤＢＲは、したがって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、１５以上、２０以上等の塩基を含んでよい。所定の実施形態では、ＤＢＲは、３〜１０塩基の長さである。さらに、ＤＢＲ内のそれぞれの位置は、異なる塩基組成物を有し得る。例えば、４つの塩基ＤＢＲは、以下の組成物：ＮＮＮＮ、ＮＲＳＮ、ＳＷＳＷ、ＢＤＨＶのいずれかを有し得る（ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードについては、以下の表を参照）。所定の実施形態では、ＤＢＲ内の塩基が、検出可能な修飾、またはそこに付着される他の部分を有することにより異なり得ることがさらに指摘される。例えば、所定の次世代配列決定プラットホーム（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を使用して、配列決定プロセス中の塩基におけるメチル化差を検出することができる。そのためＤＢＲ内の非メチル化塩基は、ＤＢＲ内のメチル化塩基から区別され得る。したがって、ＤＢＲの長さまたは塩基組成物に関していかなる制限も意図されない。
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【００５２】
ＤＢＲは、単一領域であり得るか（すなわち、互いに隣接する全てのヌクレオチド塩基を有する）、またはポリヌクレオチド上の異なる位置に存在し得る（すなわち、ＤＢＲの塩基は、非ＤＢＲ配列（分割ＤＢＲとも呼ばれる）により分離される）。例えば、ＤＢＲは、ポリヌクレオチド上の第１の位置で、第１のアダプター内に１つ以上の塩基、および同一ポリヌクレオチド上の第２の位置で、第２のアダプター内に１つ以上の塩基を有し得る（例えば、ＤＢＲは、非対称的にタグ付けされたポリヌクレオチド、すなわち非対象アダプターを有するポリヌクレオチドの両末端に存在する塩基を有し得る）。この点に関して、いかなる制限も意図されない。
【００５３】
ＤＢＲは、配列決定反応自体において発生する配列解析および／またはエラーに先行して実行される、増幅プロセスの間にＤＢＲ内で発生するエラーの検出を促進するように設計され得る。そのような実施形態では、用いられるＤＢＲ配列は、ＤＢＲ配列におけるエラーが、必ずしも別の可能なＤＢＲ配列の生成に至らないように設計される（それによって、ＤＢＲ変異に起因して異なるテンプレートに由来するものと同一のテンプレートから派生するレプリコンの不適切な同定を生じる）。例えば、配列Ｎを有するＤＢＲの使用を考慮する。Ｎにおけるエラーは、あるＤＢＲを別のＤＢＲに変えるため、遺伝子型を正確に割り当てる可能性を過大評価させる可能性がある。これを、配列Ｙを有するＤＢＲと比較する。この位置でＲを見る場合、エラーが存在したことが分かる。正しいＤＢＲは、必ずしもこのエラーを含有するＤＢＲに割り当てられ得るとは限らないが、それがエラーに起因することを検出することができる（例えば、配列決定または増幅において）。
【００５４】
いくつかの実施形態では、変性塩基配列は、（１）試料同定の割当ておよび（２）分子の追跡／計数の両方を行うことができる、複合されたＭＩＤ−ＤＢＲとして使用されてよい。例えば、２つの試料（一方はＹＹＹでタグ付けされ、他方はＲＲＲでタグ付けされる）を考慮する。配列決定反応では、複合ＭＩＤ−ＤＢＲ配列構造のいずれにも適合しない配列ＴＡＴを有するＭＩＤ−ＤＢＲを観察する。ＹＹＹをＴＡＴに変換するには、１つの変異が必要である。ＲＲＲをＴＡＴに変換するには、２つの変異が必要である。したがって、ＭＩＤ−ＤＢＲがＲＲＲではなくＹＹＹであった可能性が高いと言うことができる。
【００５５】
例示的なエラー同定（またはエラー訂正）配列に関する説明は、文献全体で見出され得る（例えば、いずれも参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願第ＵＳ特許出願公開第ＵＳ２０１０／０３２３３４８号、表題″Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｅｒｒｏｒ−ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ａｎｄ／ｏｒ  ｅｒｒｏｒ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ｂａｒｃｏｄｅｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ″および同第ＵＳ２００９／０１０５９５９号、表題″Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅ″に記載される）。
【００５６】
ＤＢＲが他の機能ドメイン（例えば、配列決定プライマー部位、ＭＩＤ、再帰的配列）を含むアダプター集団内に存在する所定の実施形態では、アダプター集団内の機能ドメインは、互いに同一であるが、ＤＢＲは異なる。換言すれば、アダプター集団内の他のドメインとは異なり、ＤＢＲは、可変（またはランダム）塩基組成物を有する。「アダプター集団」、「アダプターの集団」等は、試料中のポリヌクレオチドに付着されるように設計される、アダプター分子の試料を意味する。
【００５７】
ＤＢＲを有するアダプターを生成することは、任意の従来の方法、例えば、当該技術分野において良く知られているＤＮＡ合成法を使用して達成されてよい（上記定義のセクションの引用を参照）。
【００５８】
一旦親試料内のポリヌクレオチドに付着されると、ポリヌクレオチドは、さらなる処理に供され、最終的に配列決定され得る。行われ得る処理工程は、使用者により所望される任意のプロセスステップ、例えば、富化、増幅等を含む。配列決定工程では、ＤＢＲの配列ならびにポリヌクレオチドの一部分（例えば、目的とする領域を含有する）が得られる。一旦配列が得られると、目的とするポリヌクレオチドに付着された異なるＤＢＲの数が決定される。この数を用いて、配列決定の結果に表される出発親試料から目的とする異なるポリヌクレオチドの数を決定または推定することができ、いくつかの実施形態では、決定された数は、配列決定の結果に表される出発親試料からの、目的とする異なるポリヌクレオチドの最小数である。
【００５９】
例えば、特定の対象試料について対立遺伝子呼び出しを行うために遺伝子座を配列決定する際に用いられる（すなわち、対象がその遺伝子座においてホモ接合性であるか、またはヘテロ接合性であるか）、塩基組成物ＮＮを有する２つの塩基ＤＢＲを考慮する（Ｎは、任意のデオキシヌクレオチド塩基、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴである）。オリゴヌクレオチド合成からいくつかのバイアスが存在し得るが、アダプターの集団内に１６の異なるＤＢＲが、ほぼ等しい確率で存在すると予想することができる（上述のとおり）。潜在的なホモ接合性対立遺伝子呼び出しが識別されると、配列決定ランに存在するＤＢＲの数の決定を使用して、実際に配列決定されたポリヌクレオチド分子の数（または最小数）（およびしたがって、処理工程の間に増幅された数）を決定／推定することができる。
【００６０】
２倍体ゲノムの場合、対立遺伝子呼び出し（理想的または理論的例において）は、二項分布によりモデル化され得る。２つの対立遺伝子の複製（ＸおよびＹ）は、いくつかの部位において異なることを前提として、全てのＸまたは全てのＹを観察する確率は、式（?）ｃにより付与され、ｃは部位の観察（読み出し）数である。ある部位においてＸを１０回観測する場合（Ｙはない）、試料は、Ｘ型に対してホモ接合性である可能性があると言うことができる。この同定におけるエラーの確率は、したがって（１／２）１０である（１０００に１つ未満）。
【００６１】
当実験は、試料調製の早期段階において、少量のＤＮＡは、１つの対立遺伝子に対応する全ての読み出しの高いカバレージをもたらし得ること、およびこれは、二項分布に従って予測されるはずの何倍も多く発生し得ることを示す。これは、単一染色体上の遺伝子座から派生する多数の読み出しを生じるＤＮＡの数個の分子（またはさらには単一分子）（すなわち、実際に目的とする試料に存在する２つの２倍体染色体の１つのみ）の増幅に起因する。この結果は、カバレージの関数としてのエラーが、予測されるニ項エラーから大幅に逸脱することである。
【００６２】
本明細書に記載されるとおりＤＢＲを使用することは、制限された量のＤＮＡを有する試料から対立遺伝子呼び出しを行う際の信頼度を増加させる。例えば、全ての遺伝子座から１つの対立遺伝子の１６配列決定読み出しが、ＤＢＲ配列ＧＡを含有する場合、次にこれらの読み出しは全て、同一の親ポリヌクレオチド分子に由来する可能性がある（およびしたがって、ホモ接合性対立遺伝子呼び出しは正当化されない）。しかしながら、１６の配列決定読み出しがそれぞれ異なるＤＢＲ配列を有する場合、それぞれの読み出しが異なる親ポリヌクレオチド分子から生じるため、ホモ接合性の同定をより高い信頼度で行うことができる。
【００６３】
多くの実施形態では、複数の同一ＤＢＲが、ＤＢＲが付着されたポリヌクレオチド内に存在し得るため、同一のＤＢＲ配列を有するポリヌクレオチドが、同一の親ポリヌクレオチド分子から派生すると結論することは不可能であることがここで指摘される。例えば、２つのＮ塩基のＤＢＲを含有するアダプター集団を使用して、１６を超えるポリヌクレオチドを含有する試料をタグ付けする場合、タグ付けされたポリヌクレオチドのサブセットは、同一のＤＢＲを有し、したがって、それらの配列が、異なる親ポリヌクレオチド分子から派生したと決定することは不可能である。
【００６４】
出発分子または親分子の実際の数をより正確に決定する１つの例示的な方法は、全ての単一分子が異なるＤＢＲを有する可能性が高くなるように、ＤＢＲの変性を増加させること（すなわち、目的とする特定の試料を標識するために使用されるＤＢＲ内の固有配列の数を増加させること）である。任意のイベントでは、例示的な方法で、観察されたＤＢＲの数を使用するか、または観察されたＤＢＲの数を生成する可能性がある読み出しの予想数の確率分布を使用するかのいずれかを行うことができる。
【００６５】
特定の対立遺伝子呼び出しがヘテロ接合性であるか、またはホモ接合性であるかの推定を計算するとき、ｒを参照、ｖを変異型読み出しとして、遺伝子型の尤度を戻す適切な関数Ｌ（ｒ、ｖ）を作製／採用することができる。本明細書に記載されるようにＤＢＲを用いるとき、推定値Ｌ（ｒ′、ｖ′）を計算するための修正された関数が使用されてよく、ｒ′は参照読み出しの固有ＤＢＲの数であり、ｖ′は変異型読み出しの固有ＤＢＲの数である。対立遺伝子呼び出しを行うための任意の従来の関数を用いて、本明細書に記載されるように、ＤＢＲ読み出しに関するデータを用いてもよい。
【００６６】
本発明の態様を使用して、ポリヌクレオチド試料、例えば、ゲノム試料内の複製数の変動を同定することにおける信頼度を高めることができる。複製数の変動は、欠失、複製、反転、および転位等のゲノム再配置、または一染色体、二染色体、三染色体、四染色体、および五染色体等の全染色体異数性を含み得る。例えば、親が遺伝子型ＡＣおよびＣＣを所与のＳＮＰに有する複製イベントでは、プロバンドは遺伝子型ＡＣＣを有する。遺伝子型ＡＣを有する親では、十分な深度の配列決定カバレージ（すなわち、十分な配列決定読み出し）を条件として、Ｃ−対立遺伝子およびＡ−対立遺伝子と関連付けられたＤＢＲの数は、類似することが予想される。プロバンドでは、十分な深度の配列決定カバレージを条件として、Ｃ−対立遺伝子と関連付けられたＤＢＲの数は、Ａ−対立遺伝子と関連付けられたＤＢＲの数の２倍となることが予想され、Ｃ−対立遺伝子を包含する複製イベントに対する証拠を提供する。配列決定読み出しの数ではなく、ＤＢＲの使用は、ＤＢＲを使用して、異なるポリヌクレオチド分子から派生する読み出しを同定できるため、複製数の変動を同定する際により高い信頼度を提供する。
【００６７】
ＤＢＲの例示的な適用
上で詳述されるように、ＤＢＲは、複雑なゲノムまたはプールを含む、不均一試料中の配列変異型の統計的検証を可能にする。例えば、ＤＢＲは、腫瘍試料、微生物試料、環境試料等における複雑なゲノムの解析での使用が見出される。
【００６８】
ＤＢＲの例示的な統計方法および例示的な適用は以下に提供される。以下の説明は、単なる例示の目的であり、ポリヌクレオチド解析においてＤＢＲを用いる範囲を制限することを意図するものではない。
【００６９】
統計方法
上述のように、本発明の態様では、変性塩基ラン（ＤＢＲ）を使用して、所与のプロセスで配列決定または解析されたテンプレート分子の実際の数を推定するか、または定量測定を行う。２つの読み出しは、その読み出しが同一のテンプレート分子を起源とするためか、または分子が偶然に同一のＤＢＲを受容したために、同一のＤＢＲを有し得る。配列決定された別個のテンプレート分子の潜在的な数は、ＤＢＲの数から読み出しの数の範囲である。出発分子の数からのＤＢＲの分布は、占有分布により付与される［Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒａｌａｍｂｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃ．Ａ．Ｃｈａｒａｌａｍｂｉｄｅｓ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２００５を参照］。ＤＢＲの観測された数を条件として、出発分子の可能な数は、最大の可能な推定、または他の適切な技法を使用して計算され得る。あるいは、それぞれのＤＢＲについて、最も可能性の高いテンプレート分子は、その特定のＤＢＲとともに、全ての読み出しのコンセンサス配列を使用して推定され得る。このアプローチは、特定の変異型と関連付けられたテンプレート分子の数の正確な推定を生成するように組み合わされ得る。
【００７０】
ＰＣＲ増幅におけるＤＢＲ
ＤＢＲを使用して、ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用される出発分子の数を推定するか、または測定を行うことができる。例えば、出発ポリヌクレオチド試料は、ＰＣＲプライマー対を使用して、最初のサイクルまたは最初の数サイクルのためにＰＣＲ増幅されてよく、一方（または両方）のプライマーは、一般的プライマー配列および標的特異的配列に対するＤＢＲ５′を含む。初期サイクル（複数可）の後、このＤＢＲを含有するＰＣＲプライマー対は、除去され得るか、または不活性化され、残りのサイクルに対するＤＢＲを有しないＰＣＲプライマーと置き換えられてよい。ＤＢＲを含有するプライマーの除去／不活性化は、任意の便宜的な方法で、例えば、物理的または生化学的手段により達成されてよい。例えば、ＤＢＲを含有するプライマーは、そこに結合対の第１の構成要因（例えば、ビオチン）を付着させてもよく、それによって固体支持体に付着された結合パートナー（例えば、固体支持体に結合されたストレプトアビジン）に試料を接触させて、非結合画分を収集することにより、これらのプライマーの除去を促進する。あるいは、遊離ＤＢＲを含有するプライマーは、試料を一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）で処理するか、プライマーをさらなるプライマー伸長工程に関与できないようにするか（例えば、ジデオキシヌクレオチドを３′末端に組み込むことによる）、または固相可逆的不動化（ＳＰＲＩ）プロセス（例えば、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ−ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりプライマーを除去され得る。第２のＰＣＲプライマーは、最初のサイクル／最初の数サイクルで使用されるＤＢＲを含有するＰＣＲプライマーから生成されたテンプレートでＤＢＲを複製するように、第１群のプライマーのそれぞれの５′末端上に存在する配列を含むように設計される。したがって、ＰＣＲの残りのサイクルは、ＤＢＲを含有する最初のサイクル／最初の数サイクルの生成物のみを増幅させる。別の実施形態では、ＤＢＲを含有するプライマーは、ＤＢＲを含有しない第２群のプライマーよりも高いＴｍを有するように設計され得る（すなわち、第１のＰＣＲプライマーの標的特異的配列のＴｍが、５′一般的プライマー配列に特異的な第２のＰＣＲプライマーのそれよりも高い）。この例示的なシナリオでは、ＤＢＲを含有するプライマーは、制限量で存在する場合があり、ＰＣＲの最初のサイクル／最初の数サイクルは、より高いＴｍで行われ、ＤＢＲを含有するプライマーのみがアニールし、核酸合成に関与するようにする。ＤＢＲを含有するプライマーが制限量で存在するため、それらは最初のサイクル／最初の数ＰＣＲサイクルで使い果たされる。残りのＰＣＲサイクルをより低いＴｍで行うことは、ＤＢＲを含まない第２群のＰＣＲプライマーによるさらなる増幅を可能にするが、最初のサイクル／最初の数サイクルの生成物からＤＢＲを複製する（上述のとおり）。
【００７１】
ＰＣＲプライマーの多くの異なる組み合わせ、および上述のＤＢＲ  ＰＣＲ増幅を達成するために用いられ得る増幅条件が存在することが指摘される。例えば、そのような反応は、３つのプライマーを含んでよく、プライマー１（標的ポリヌクレオチドに特異的な順行性プライマーであり、ＤＢＲおよび５′一般的プライミング配列を含有する）およびプライマー２（標的ポリヌクレオチドに特異的な逆行性プライマーであり、ＤＢＲを含まない）を使用して、最初のサイクル／最初の数サイクルで標的を増幅させ、プライマー３（プライマー１の５′一般的プライミング配列に特異的な順行性プライマー）およびプライマー２は、残りのサイクルに使用される。
【００７２】
ＤＢＲを有するＰＣＲ生成物の両端をタグ付けする（すなわち、最初のサイクル／最初の数サイクルで使用される両方のプライマーが、ＤＢＲを含む）ことは、増幅された出発ポリヌクレオチドの数を推定する際の信頼度の増加を提供し得ることが指摘される。２サイクルを超えるＰＣＲを使用してＤＢＲを付着させる場合、次にＤＢＲを使用して、生成物がそこから増幅された初期テンプレート（または出発）分子を追跡するとき、データの解析中に追加の予防策を取る必要があることが指摘される。これは、ＰＣＲの第３サイクル目に、ＤＢＲを有するＰＣＲプライマーが、以前に生成されたＰＣＲ生成物内の既存のＤＢＲ部位を越えて結合し得る可能性に起因し、それによって、新しいＤＢＲ配列を導入する。以下で概説されるように、ＰＣＲの最初の３サイクルの理論的解析は、分子の系統を追跡することが可能であることを示す。以下の解析は、理論的に、ＤＢＲ配列を追加するための任意の数のＰＣＲサイクルに使用することができるが、配列決定の深度は十分でなければならないことが指摘される。
【００７３】
以下に記載される方法は、ＤＢＲを含有するＰＣＲプライマーを使用する１サイクル以上のＤＢＲ追加後に、配列読み出しを分類するのを可能にする。表Ｉは、単一の二本鎖テンプレートから３つのＰＣＲサイクルのそれぞれで生成されるＰＣＲ生成物のそれぞれを示す（図３のサイクル０に示される、上鎖Ａおよび下鎖Ｂを有するテンプレート）。表Ｉにおいて、それぞれのサイクルに存在するそれぞれの鎖（文字Ａ〜Ｐとして表される）は、そのそれぞれのテンプレート鎖（すなわち、表示される鎖の合成中にテンプレートとして機能した鎖）および、存在する場合は、その鎖上に存在する５′ＤＢＲおよび３′ＤＢＲ（番号１〜１４として示される）とともに示される。「５′ＤＢＲ」とは、それがＰＣＲプライマーの一部として組み込まれたＤＢＲ配列を意味する。「３′ＤＢＲ」は、５′ＤＢＲ配列の相補的配列（すなわち、既存の５′ＤＢＲ配列にわたるプライマー伸長の結果として生成される）を意味する。サイクル３において、ＤＢＲの上書きが発生し得ることが分かる（右端のカラムに示される。例えば、サイクル３で生成された鎖ＫおよびＮを参照）。
表Ｉ    単一の二本鎖テンプレート（ＡおよびＢ）に対するＰＣＲ反応のサイクル０〜３におけるＤＢＲタグ付け
【表Ｉ】
0005992911.tif 000003
【００７４】
上記表Ｉおよび図３は、全体ＰＣＲプロセス中に蓄積した鎖を示す（サイクル０〜サイクル１、２、および３からの鎖ＡおよびＢのキャリーオーバー、サイクル１〜サイクル２、および３における鎖ＣおよびＤのキャリーオーバー等）。
【００７５】
十分な配列決定深度を条件として、ＤＢＲの上書きが発生した場合であっても、ＤＢＲを使用して起源となる分子を遡ることができる。例えば、鎖Ｋは、５′ＤＢＲ  ＃９および３′ＤＢＲ  ＃４を有する。ＤＢＲ  ＃４は、鎖Ｆと共有され、５′ＤＢＲ  ＃４および３′ＤＢＲ  ＃１を有する。ＤＢＲ  ＃１は、鎖Ｃと共有される。したがって、鎖ＫおよびＦは、本来、鎖Ｃから派生する。同様に、鎖Ｎは、５′ＤＢＲ  ＃１２および３′ＤＢＲ  ＃５を有する。ＤＢＲ  ＃５は、５′ＤＢＲ  ＃５および３′ＤＢＲ  ＃２を有する、鎖Ｇと共有される。ＤＢＲ  ＃２は、鎖Ｄと共有される。したがって、鎖ＮおよびＧは、本来、鎖Ｄから派生する。
【００７６】
上述のように、ＤＢＲを含有するＰＣＲプライマーは、最初の数サイクル後に除去される（例えば、表Ｉに示されるサイクル３の完了後）。
【００７７】
図３は、表Ｉに示される、単一の二本鎖テンプレートについて、ＰＣＲの最初の２サイクルの概略を示す。サイクル０では、二本鎖テンプレート鎖のみ、すなわち、上鎖Ａおよび下鎖Ｂが存在する。図３のそれぞれの鎖上の矢印の方向は、５′〜３′方向を示すことに留意されたい。最初のＰＣＲサイクル（サイクル１）において、２つの生成物は、ＰＣＲプライマー対（ＤＢＲ配列を含むプライマー対の両方の要素）、ＤＢＲ  ＃１（図に示される「１」）を有する第１の（Ｃ）およびＤＢＲ２を有する第２の（Ｄ）（図に示される「２」）により生成される。ＰＣＲの第２のサイクル（サイクル２）では、４つのテンプレート（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）は、４つの生成物（Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）を生成し、それぞれ後次ＤＢＲを付着させている（それぞれＤＢＲ  ＃３、＃４、＃５、および＃６）。テンプレートＣおよびＤ（ＦおよびＧ）から生成される生成物は、ここで両端にＤＢＲを有することに留意されたい。サイクル３（図３に示されない）は、次にサイクル２からの８つのテンプレートを使用して、８つの生成物を生成し、それぞれ追加のＤＢＲを付着させている（表Ｉに示される生成物を参照）。サイクル３は、ＤＢＲの上書きが発生し得る最初のサイクルである（すなわち、後次ＤＢＲ標識されたＰＣＲプライマーによるテンプレートＦおよびＧのプライミングおよび伸長は、ＤＢＲ  ＃１およびＤＢＲ  ＃２を上書きし、これらは、鎖ＫおよびＮとして表Ｉに示される）。
【００７８】
ＤＢＲの上書きが可能なポリヌクレオチドのＤＢＲを解析する際に、読み出しは５′および３′ＤＢＲ配列により分類され、親分子の系統が追跡される。
【００７９】
上記から明らかであるように、ＤＢＲは、（１）早期サイクル中に生じるＰＣＲエラーの同定および（２）正確な対立遺伝子呼び出し／複製数の決定に有用である。エラー同定の場合、独立したプライミングイベントを分類することは明らかに許容され得る。対立遺伝子呼び出しの計算精度は、プライミングイベントが必ずしも独立した出発分子を表すとは限らないことを条件として、複雑性がわずかに増加する。しかしながら、プライミングイベントがいずれかの対立遺伝子上で等しく可能であるということは合理的な仮定であり、したがってこの解析は、対立遺伝子呼び出しの精度を向上させるために有用である。
【００８０】
極めて低い初期テンプレートの場合、ＤＢＲ追加の複数サイクルを使用する複製が有利であり得る。例えば、極めて低いＤＮＡ濃度では、標準アプローチを使用して、正確な遺伝子型を付与するために十分な数のＤＢＲを回復できない場合がある。同一のテンプレート分子上に複数のプライミングイベントを可能にすることは、この場合、より多くのデータを提供することにより対立遺伝子呼び出しを行うために十分な信頼度を付与する。
【００８１】
最初の増幅生成物におけるＤＢＲの解析を使用して、反応で増幅された出発分子の数を推定することができる。そのような解析は、使用者が、ＰＣＲ反応の生成物がたった数個（またはさらには１つ）の出発ポリヌクレオチドの選択的増幅を表し、および／または増幅数に発生したＰＣＲエラーの決定を支援するか否かを決定するのを可能にする（例えば、上述のとおり）。
【００８２】
異種腫瘍試料におけるＤＢＲ
ＤＢＲはまた、腫瘍試料中、例えば、対象の単一腫瘍内または異なる腫瘍間の染色体異常の異種性を評価する際の使用が見出される。例えば、１つ以上の腫瘍試料は、単一の腫瘍から（例えば、腫瘍内または周囲の異なる位置）および／または対象の異なる腫瘍から取得され、１つ以上の染色体位置での遺伝的変異について解析され得る。所定の実施形態では、試料は、経時的に腫瘍（または対象）から取得され得る。そのような変異は、当該技術分野において知られているように、特異的な塩基変化、欠失、挿入、複製等を含み得る。ＤＢＲを用いて、特異的な遺伝的変異を同定する前に、腫瘍試料（複数可）内のポリヌクレオチドをタグ付けしてよく、それにより同定される任意の変異型を認証する統計解析を行う方法を提供する。例えば、統計解析を使用して、検出された変異が、腫瘍の細胞のサブセットにおける変異を表すか否か、対象における特定の腫瘍に特異的な変異であるか否か、個体の非腫瘍細胞において見出される変異であるか否か、または変異型が同定されたプロセスのアーチファクト（例えば、ＰＣＲアーチファクト）であるか否かを決定することができる。
【００８３】
微生物多様性の評価におけるＤＢＲ
ＤＢＲ解析は、単一試料中または異なる試料（例えば、異なる時点で、または異なる位置から収集された試料）の間でマイクローブ／ウイルスの集団の遺伝的変異／多様性を決定する際に使用することもできる。例えば、感染の経過で個体から収集された試料は、本明細書に記載されるＤＢＲを使用して、感染プロセス中の遺伝的変異について解析され得る。しかしながら、微生物／ウイルス試料の型に関するいかなる制限も意図されず、そのため試料は任意の源、例えば、感染した対象、環境源（土壌、水、植物、動物、または動物の排泄物等）、食物源、または１つ以上の遺伝子座または領域において、試料中の微生物の遺伝的多様性の決定が望ましい任意の他の試料に由来し得る。この方法を実践する際に、試料から派生したポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、ＤＢＲで標識され（富化工程の前または後のいずれか）、目的とする１つ以上の遺伝子部位または遺伝子座における遺伝的変動を同定するように処理される。次にＤＢＲの解析を行って、目的とする遺伝子座（複数可）において決定された試料中のマイクローブの遺伝的多様性の高い信頼度を提供することができる。そのような解析は、様々な源から、および／または源からの様々な時点で収集された試料上で行うことができる。微生物多様性を評価する際に使用が見出される例示的な遺伝子座は、これらに限定されないが、リボソームＲＮＡ、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ，抗生物質耐性遺伝子、代謝酵素遺伝子等が含まれる。
【００８４】
試料中の異なるポリヌクレオチド種のレベルの評価におけるＤＢＲ
ＤＢＲ解析は、試料中の異なるポリヌクレオチド種のレベルを評価する際にも使用することができる。特異的に、ＤＢＲ解析は、試料中の親ポリヌクレオチドの数を決定（または推定）することができるため、相対量または定量の特異的ポリヌクレオチド種およびそのような種の決定における信頼度が評価され得る。例えば、ＤＢＲを使用するｃＤＮＡ試料の解析を用いて、試料中の異なるｃＤＮＡ種の相対レベルまたは定量レベルを評価することができ、したがって、それらの相対遺伝子発現レベルを決定する方法を提供する。
【００８５】
プールされた試料の解析におけるＤＢＲ
ＤＢＲの別の適用は、プールされた試料中のそれぞれのポリヌクレオチドが、その試料の起源に特異的なＭＩＤを含む（上で詳述される）、プールされたポリヌクレオチド試料に関して遺伝子解析を行うことにある。これは、使用者が、プールされた試料を生成するために複合された試料のそれぞれの起源から、特異的なポリヌクレオチド種（または複数の種）の配列カバレージを決定することを可能にする。これは、プールされた試料中のそれぞれの出発試料からのポリヌクレオチドが適切に表されることを保証する機序を提供する。したがって、本発明の実施形態は、プールされた試料中のポリヌクレオチドの配列解析を含み、それぞれのポリヌクレオチドは、ＭＩＤおよびＤＢＲを含有する。これらの実施形態では、試料特異的配列解析で使用されるのはＭＩＤ／ＤＢＲの複合であるため、同一のＤＢＲ設計は、全ての親試料／ＭＩＤと併用されてよい。
【００８６】
ＭＩＤおよびＤＢＲを使用するプールされた試料の解析は、対立遺伝子呼び出し、配列のエラー訂正、相対的および定量的遺伝子発現解析等を含む、多数の遺伝子解析における使用が見出される。本発明の態様によりプールされた試料中のポリヌクレオチドを解析する際に、一方または他方のドメインの喪失は得られる結果に負の影響を及ぼすため、用いられるワークフローの各工程において、ＭＩＤおよびＤＢＲドメインの両方を維持することが重要であることが指摘される。
【００８７】
遺伝子解析におけるＭＩＤおよびＤＢＲドメインの使用は、次世代配列決定（ＮＧＳ）プラットホームと併用されると、特に強力であり、それらの多くは、配列決定される試料中に存在するそれぞれの個別のポリヌクレオチドについて配列データを提供することがさらに指摘される。ポリヌクレオチドの個別のクローンが独立して配列決定される従来の配列決定アプローチとは反対に、ＮＧＳプラットホームは、試料中の複数の異なるポリヌクレオチドの配列を同時に提供する。この差異は、それぞれのポリヌクレオチドをクローン化し、独立して配列決定する必要により拘束されない、試料特異的統計解析が行われるのを可能にする。したがって、本明細書に記載されるＭＩＤ／ＤＢＲドメイン解析は、ＮＧＳプラットホームと相乗作用して、プールされた試料からの極めて大量の配列を解析する向上した統計アプローチを提供する。
【００８８】
キットおよびシステム
対象の方法を実践するため、すなわち、ＤＢＲを使用して特定のポリヌクレオチドについて配列決定された異なる出発ポリヌクレオチドの数（または最小数）を決定するためのキットおよびシステムも対象の発明により提供される。そのためシステムおよびキットは、ＤＢＲを含有するポリヌクレオチド（例えば、アダプター）ならびに本明細書に記載される目的とする任意の他の機能ドメイン（例えば、配列決定プライマー部位、ＭＩＤ、再帰的配列等）を含んでよい。システムおよびキットは、親試料中のポリヌクレオチドにアダプターを付着させること、アダプター／ＤＢＲ付着のための親試料、ならびに／または配列決定反応を行うための試薬（例えば、リガーゼ、制限酵素、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、プライマー、配列決定プライマー、ｄＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ、エキソヌクレアーゼ等）を調製することにおける任意の工程を行うための試薬も含み得る。このシステムおよびキットの様々な構成要素は、別個の容器に存在し得るか、または必要に応じて、所定の適合構成要素が単一の容器に、事前に組み入れられてもよい。
【００８９】
対象のシステムおよびキットは、対象の方法により核酸試料を調製または処理するための１つ以上の他の試薬を含んでもよい。試薬は、１つ以上のマトリクス、溶媒、試料調製試薬、緩衝液、脱塩試薬、酵素試薬、変性試薬を含んでよく、正の対照および負の対照などの較正基準も同様に提供され得る。そのためキットは、バイアルまたはボトル等の１つ以上の容器を含んでよく、それぞれの容器は、本発明により試料の処理または調製工程を行うための別個の構成要素を含有する。
【００９０】
上述の構成要素に加えて、対象キットは、典型的に、キットの構成要素を使用して対象方法を実践する、例えば、上述のようにＤＢＲを用いるための指示をさらに含む。対象方法を実践するための指示は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、指示は、紙またはプラスチック等の基材にプリントされてよい。そのため指示は、キットの容器またはその構成要素のラベル付において、パッケージ挿入物としてキットに存在してもよい（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングと関連付けられる）。他の実施形態では、指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスク等に存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の指示は、キットに存在しないが、遠隔ソースから、例えば、インターネットを介して指示を取得するための手段が提供される。この実施形態の例は、指示を見ることができ、および／またはそこから指示をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。この指示に関して、指示を取得するためのこの手段は、適切な基材に記録される。
【００９１】
対象データベース、プログラミング、および指示に加えて、キットは、１つ以上の対照試料および試薬、例えば、キットを試験する際に使用する２つ以上の対照試料を含んでもよい。
【実施例】
【００９２】
方法
マウスゲノムＤＮＡの２つの同一試料をアダプターで標識した。１つの例は、７つの塩基（ＲＹＢＤＨＶＢ）から成る重複して合成された領域を有するアダプターを使用し、それぞれ塩基ＡＣＡに続く２つの塩基（ＲおよびＹ位）または３つの塩基（Ｂ、Ｄ、Ｈ、またはＶ位）（または合計９７２の異なる配列）のうちの１つであり得、第２の試料は、７つの塩基（ＲＹＢＤＨＶＢ）から成る重複して合成された領域を有するアダプターを使用し、それぞれ塩基ＡＣＧに続く２つの塩基（ＲおよびＹ位）または３つの塩基（Ｂ、Ｄ、Ｈ、またはＶ位）（または合計９７２の異なる配列）のうちの１つであり得る。太字の下線付き塩基は、合成多形部位に対応することに留意されたい。これらのアダプターにおいて、配列ＲＹＢは、ＤＢＲ領域として機能し、ＤＨＶＢはＭＩＤとして機能する。したがって、１２の可能なＤＢＲ（２×２×３）コードおよび８１の異なるＭＩＤ（３×３×３×３）が存在した。
【００９３】
次いで当量の２つの試料を一緒に混合して、事実上、ＭＩＤから下流にあるＡおよびＧの３つの塩基の完全な５０／５０ヘテロ接合体（すなわち、ＤＨＶＢ配列）を形成する。異なる量の混合物（１００ｎｇ、３００ｎｇ、６００ｎｇ、２５００ｎｇ、５０００ｎｇ、および１０，０００ｎｇ）は、ＴｉＡおよびＴｉＢプライマーを有するＰＣＲの１０サイクルを経る増幅に続いてハイブリダイゼーションプルダウン反応に供された。用いられる捕捉プローブは、５′−ビオチニル化６０−ｍｅｒ逆相カートリッジ精製されたオリゴヌクレオチド（ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）であった。ＴｉＡおよびＴｉＢによる増幅後、Ｔｉａおよび末尾にＴｉＢを有する配列特異的プライマーによる二次ＰＣＲ反応（５′−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＴＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣＡＧＣ−３′）（配列番号１）を使用して、特異的断片を増幅させた。ハイブリダイゼーションプルダウン／ＰＣＲにおいて各試料から精製されたＰＣＲ断片は、ＤＢＲ、ＭＩＤ、およびＡ／Ｇ対立遺伝子を決定するように、４５４Ｔｉ  Ｓｈｏｔ配列決定に送られた。
【００９４】
ハイブリダイゼーションプルダウン／ＰＣＲからの単位複製配列を以下に示す（配列番号２）。ＤＢＲ領域は下線、ＭＩＤは太字、対立遺伝子（ＡまたはＧに対応するＲ）は太字の下線である。
0005992911.tif 000004
【００９５】
結果
図１は、試料中の各ＭＩＤの対立遺伝子比を示す。６つのパネルのそれぞれの上部にある数字は、使用されるゲノムＤＮＡのインプット質量（ナノグラム）を示す。横座標は、任意の特定のＭＩＤについて、Ａ配列読み出しの画分、または決定の総数に対する決定（すなわち、合成ＳＮＰ位における多形塩基の１つの読み出し数）の比、例えば、（Ａ決定）／（Ａ決定＋Ｇ決定）の比を示す。これは、対立遺伝子比と呼ばれる。座標は、特定の対立遺伝子比（上記のＭＩＤの総数は８１）で観察されるＭＩＤの数である。インプットＤＮＡは、５０／５０のＡ／Ｇ比であることが知られているため、それぞれの試料の対立遺伝子比は、０．５であるはずである。
【００９６】
低インプット質量で、対立遺伝子比は、第１のＰＣＲ工程に対するインプット上の分子が制限され、２つの対立遺伝子のうちの１つが選好的に観察されたため、過剰に高いか過剰に低いかのいずれかに歪められる。第１の工程への質量が増加するにつれて、両方の対立遺伝子が観察され、予想される０．５比に徐々に近づく。この解析は、１００ｎｇ、３００ｎｇ、６００ｎｇで相当の対立遺伝子の脱落が存在したが、より高いインプットレベルでは対立遺伝子の脱落はほとんどまたは全く発生しなかったことを示す。
【００９７】
図２は、それぞれの対立遺伝子と関連付けられたそれぞれのＭＩＤについて、ＤＢＲ配列の画分を示す。インプット材料は、合成多形位置において、名目上５０／５０ＡおよびＧであるため、８１の有効なＭＩＤのそれぞれが５０％Ａ読み出しおよび５０％Ｇ読み出しと関連付けられると予想する（上記のとおり）。さらに、１２ＤＢＲはランダムかつ８１の異なるＭＩＤのそれぞれと関連付けられるため、十分なインプットＤＮＡ複製とともに、Ａ対立遺伝子については１２個のＤＢＲ全てが観察され、Ｇ対立遺伝子については１２個全てが観察される。したがって、理想的な例において特定の塩基について観察されるＤＢＲの画分は、それぞれの対立遺伝子について１２／２４または０．５である。不十分な数の分子が処理工程に進む範囲で、それぞれのＭＩＤ対立遺伝子について１２個未満のＤＢＲが存在し得るため、比率は理想から外れ得る。
【００９８】
図２において、横座標は、任意の特定のＭＩＤについて、それぞれの対立遺伝子に実際に観察されたＤＢＲを実際に観察されたＤＢＲの総数で割った比率を示す。座標は、対立遺伝子と関連付けられた特定の比率またはＤＢＲとともに観察されたＭＩＤの数である。合計８１個の異なるＭＩＤが見られ、かつ見られるはずである。低インプット質量において、過度に高いか過度に低いかのいずれかである歪んだ比率を頻繁に見ることができる。これは、第１のＰＣＲ工程への分子インプットの制限数に起因する可能性があり、２つの対立遺伝子のうちの１つは、選好的に観察された。第１の工程への質量が増加するにつれて、両方の対立遺伝子は、より頻繁に観察され、それぞれの対立遺伝子と関連付けられて、より多くのＤＢＲが観察されるため、比率は０．５に近づく。
【００９９】
図１および２の日付の比較は、本明細書に記載されるＤＢＲを用いる追加の特徴を示す。真のヘテロ接合体の場合、ＤＢＲ解析（図２）においてより早い段階で（すなわち、より低い質量で）、分布が予想される０．５比の周囲に集合するのを見始める。例えば、Ａ対立遺伝子の場合１２個のＤＲＢのうち６個、Ｇ対立遺伝子の１２個のＤＢＲのうち４個の観察が、（６／［６＋４］）＝０．６０の比率を生じ、実際に予想される０．５にかなり近いため、これは意味を為す。正味の影響は、ＤＢＲの使用が真のヘテロ接合体または真のホモ接合体の存在下ではるかに高い信頼度を付与することである。
【０１００】
前記の発明は、理解を明確にする目的で、例証および実施例によりある程度詳細に説明されたが、本発明の教示に照らして、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、所定の変更および修正をそこに行ってよいことは当業者には容易に明らかである。
【０１０１】
したがって、前述は発明の原則を例証するに過ぎない。当然のことながら、当業者は、本明細書に明示的に説明または図示されていないが、発明の原則を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な手配を考案することができるであろう。さらに、本明細書に列挙される全ての実施例および条件的言語は、原則的に、発明の原則およびこの技術分野を促進するように発明者らにより寄与される概念を理解することにおいて、読者を支援することが意図され、そのような特異的に列挙された実施例および条件を制限しないものとみなされる。さらに、本発明の原則、態様、および実施形態、ならびにそれらの特異的な実施例に関する本明細書における全ての陳述は、その構造的および機能的相当物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような相当物は、現在知られている相当物および今後開発される相当物の両方、すなわち、構造に関係なく、同一の機能を行うように開発された任意の要素を含むことが意図される。本発明の範囲は、したがって、本明細書に図示および記載される例示的実施形態に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の請求項により具体化される。
【図１】
0005992911.tif 000005
【図２】
0005992911.tif 000006
【図３】
0005992911.tif 000007
【配列表】
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