(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体であって、
上記蛍光分子が、Ｚｎ結合プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）、ピラルビシン、およびそれらの混合物から選択され、
上記生体親和性高分子が、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体に官能基を付加したもの、およびそれらの混合物から選択される、複合体。
【請求項２】
上記蛍光分子が、Ｚｎ結合プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
上記蛍光分子が、ピラルビシンである、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
上記蛍光分子と、上記生体親和性高分子が、（１）非共有結合により結合し、かつ、該生体親和性高分子が該蛍光分子を包含するミセルを形成しているものであるか、（２）スペーサーを介して共有結合したものであるか、または、（３）スペーサーを介さずに直接共有結合したものである、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の複合体を含む、腫瘍を蛍光検出するための高分子型蛍光分子プローブ。
【請求項６】
蛍光内視鏡または蛍光腹腔鏡を用いて腫瘍を蛍光検出するためのものである、請求項５に記載の高分子型蛍光分子プローブ。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の複合体を含む、抗腫瘍剤。
【請求項８】
光線力学的療法において使用するためのものである、請求項７に記載の抗腫瘍剤。
【請求項９】
以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体の製造方法：
（ａ）生体親和性高分子を、ｐＨが８を超えるアルカリ水で可溶化する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の水溶液中に、蛍光分子を添加する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液のｐＨを、酸により５未満にして生体親和性高分子−蛍光分子複合体を沈殿させる工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体の製造方法：
（ａ）生体親和性高分子の官能基と、該官能基と反応性であるスペーサーの官能基を結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生成物のスペーサー部分の官能基と、それと反応性である蛍光分子の官能基を結合させる工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体の製造方法：
（ａ）生体親和性高分子の官能基と、該官能基と反応性である蛍光分子の官能基を結合させる工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、日本国特許出願第２０１１−１９３２３７号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
本発明は、例えば蛍光内視鏡または蛍光腹腔鏡を用いて、腫瘍を蛍光検出（可視化）するための、あるいは、蛍光検出に加えて、光線力学的療法を施術するための、蛍光分子プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌（腫瘍）は、日本人の死因第一位の疾患である。その治療成績は、早期の胃癌や子宮がんの手術による成功例や、リンパ性白血病による化学療法による比較的好成績の例を別として、その他の多くの癌腫、例えば肺がん、乳がん、転移性肝癌、膵癌、食道がん、胆のう・胆管癌、腎癌、前立腺癌、卵巣癌、脳腫瘍、癌性胸・腹膜炎等の多くの進行癌の症例に対しては、ここ３０年の間、ほとんど進歩がない（非特許文献１：Fortune誌  2004年3月号）。【０００３】
しかし、発癌の原因としてウイルスが関与する肝癌を別として、早期発見（第一期）に基づく根治手術を行えば、その成果は胃癌と同様、その治療成績は大きく向上することが期待されている。このため、癌の早期診断・早期発見方法の開発は、癌治療法の開発と同様に、その技術的向上が望まれている。【０００４】
一方、本発明者らは、腫瘍部選択的に高分子を送達する方法として、高分子薬剤を中心に研究し、一つの新しい概念として、ＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果を発見し、報告した（非特許文献２：Cancer Research, 1986(12), 46, 6787-6392）。その高分子型癌治療薬、すなわち高分子結合型製剤として世界にさきがけ、スマンクスをはじめ、その他いくつかの高分子型ミセル化制癌剤を報告してきた。［特許文献１：国際公開WO2004/103409、特許文献２：国際公開WO2006/112361、非特許文献３：Adv. Drug Deliv. Rev. 6, 181-202 (1991)、非特許文献４：J. Control. Release, 74, 47-61 (2001)、および非特許文献５：Bioconj. Chem. 21, 797-802 (2010)など］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2004/103409
【特許文献２】国際公開WO2006/112361
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fortune誌  2004年3月号
【非特許文献２】Cancer Research, 1986(12), 46, 6787-6392
【非特許文献３】Adv. Drug Deliv. Rev. 6, 181-202 (1991)
【非特許文献４】J. Control. Release, 74, 47-61 (2001)
【非特許文献５】Bioconj. Chem. 21, 797-802 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、例えば蛍光内視鏡または蛍光腹腔鏡を用いて、効率的な腫瘍の蛍光検出（可視化）のための、あるいは、蛍光検出に加えて、光線力学的療法を施術するための、高分子型蛍光分子プローブ、並びに当該蛍光分子プローブに使用することができる新規複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するため、鋭意検討した結果、特定の波長域の光を照射することによって、蛍光を発する高分子型蛍光（ＦＬ）分子プローブ、あるいは、蛍光を発し、かつ、光照射下で活性酸素の一つである一重項酸素（１Ｏ２）を産生し得る高分子型蛍光／光増感（ＦＬ／ＰＳ）分子プローブとして利用可能な複合体の製造に成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明の態様には、以下のものが含まれる。
［１］  蛍光分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体を含む、腫瘍を蛍光検出するための高分子型蛍光分子プローブ。
［２］  蛍光内視鏡または蛍光腹腔鏡を用いて腫瘍を蛍光検出するためのものである、上記［１］に記載の高分子型蛍光分子プローブ。
［３］  光線力学的療法における抗腫瘍剤として使用するためのものである、上記［１］または［２］に記載の高分子型蛍光分子プローブ。
［４］  蛍光分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体であって、
上記生体親和性高分子が、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体に官能基を付加したもの、およびそれらの混合物から選択される、複合体。
［５］  蛍光分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体であって、
上記蛍光分子が、ローズベンガル、インドシアニングリーン、Ｚｎ結合フタロシアニジン、ポルフィリン類、Ｚｎ結合フェオフォルバイト、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、Ｚｎオルソフェナンスロリン、Ｃｕフェナンスロリン、アクリフラビン、アクリナール、アクリジンジアミン、アクリジン、アクリジンオレンジ、テトラサイクリン、アミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン、アミノローダミン、ジクロロフルオレセイン、およびそれらの混合物から選択され、
上記生体親和性高分子が、スチレン−マレイン酸共重合体、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたスチレン−マレイン酸共重合体、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン、α１酸性糖蛋白質、α１アンチトリプシン、可溶化ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびそれらの混合物から選択される、複合体。
［６］  上記蛍光分子が、ローズベンガル、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、アクリジン、リボフラビン類、クロロフィル、ポルフィリン類、およびそれらの混合物から選択される、上記［４］または［５］に記載の複合体。
［７］  上記生体親和性高分子が、スチレン−マレイン酸共重合体、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたスチレン−マレイン酸共重合体、およびそれらの混合物から選択される、上記［５］に記載の複合体。
［８］  上記蛍光分子と、上記生体親和性高分子が、非共有結合により結合し、かつ、該生体親和性高分子が該蛍光分子を包含するミセルを形成しているものである、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の複合体。
［９］  蛍光分子と、生体親和性高分子が、スペーサーを介して共有結合したものである、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の複合体。
［１０］  蛍光分子と、生体親和性高分子が、スペーサーを介さずに直接共有結合したものである、上記［４］〜［７］のいずれかに記載の複合体。
［１１］  以下の工程を含む、上記［７］に記載の複合体の製造方法：
（ａ）スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）またはその誘導体を、ｐＨが８を超えるアルカリ水で可溶化する工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたＳＭＡまたはその誘導体の水溶液中に、蛍光分子を添加する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた混合液のｐＨを、酸により５未満にしてＳＭＡ−蛍光分子複合体を沈殿させる工程。
［１２］  以下の工程を含む、上記［７］に記載の複合体の製造方法：
（ａ）スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）またはその誘導体のマレイン酸残基または無水マレイン酸残基と、それらの残基と反応性であるスペーサーの官能基を結合させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生成物のスペーサー部分の官能基と、それと反応性である蛍光分子の官能基を結合させる工程。
［１３］  以下の工程を含む、上記［７］に記載の複合体の製造方法：
（ａ）スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）またはその誘導体のマレイン酸残基と、それと反応性である蛍光分子の官能基を反応させて結合させる工程。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、既存の蛍光（ＦＬ）分子に腫瘍標的性を付与することが可能となるため、直径数ｍｍの微小癌の蛍光検出が可能となる。即ち、内視鏡光源を用い励起光を照射し、プローブを発光させることにより腫瘍を特異的に可視化（検出）することができる。  また、蛍光分子がさらに光増感性を有する光増感（ＰＳ）分子である場合には、励起光を照射することで、一重項酸素（１Ｏ２）の生成を行い、腫瘍細胞（組織）を死滅させること（光線力学的療法）が可能となる。
したがって、本発明によれば、内視鏡あるいは腹腔鏡、膀胱鏡などを介して、外部から必要とする波長を含む光源を導入・照射することにより、発光する蛍光部が癌部であることから、癌の高感度の検出および治療を同時に可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の高分子型蛍光分子プローブの製造方法の一つである［方法Ｉ］のフローチャートを示す図である。
【図２】本発明の高分子型蛍光分子プローブの製造方法の一つである［方法II］の反応スキームを示す図である。
【図３】本発明の高分子型蛍光分子プローブによる癌の高感度検出の結果を示す図である。
【図４】ミセル崩壊による蛍光および一重項酸素［１Ｏ２］の発生の概念を示す図である。
【図５】メチレンブルー（ＭＢ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＭＢミセル）の分光学的特性（ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトル（Ａ）および蛍光スペクトル（Ｂ））を示す図である。
【図６】インドシアニングリーン（ＩＣＧ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＩＣＧミセル）の分光学的特性（ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトル（Ａ）（ａ、ｂ）および蛍光スペクトル（Ｂ））を示す図である。
【図７】ローズベンガル（ＲＢ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＲＢミセル）の分光学的特性（ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトル（Ａ）および蛍光スペクトル（Ｂ））を示す図である。
【図８】Ｚｎフォスカム（Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎミセル）の分光学的特性（ＵＶ−ＶＩＳ吸収スペクトル（Ａ）および蛍光スペクトル（Ｂ））を示す図である。
【図９】（ａ）プロトポルフィリン（ＰＰ）−ＨＰＭＡ共有結合複合体（ＨＰＭＡ−ＰＰ）と遊離ＰＰ（ＦｒｅｅＰＰ）、（ｂ）Ｚｎ−プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）−ＨＰＭＡ共有結合複合体（ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰ）と遊離ＺｎＰＰ（Ｆｒｅｅ  ＺｎＰＰ）の紫外可視吸光スペクトル（ＤＭＳＯ中）、（ｃ）ＨＰＭＡ−ＰＰとＦｒｅｅＰＰの蛍光スペクトル（水溶液中）を示す図である。ＨＰＭＡ−ＰＰは水溶液中においてミセルとなっており、蛍光を発しないが、２％  Ｔｗｅｅｎ２０によりミセルが崩壊すると、蛍光が出現する。（ｄ）ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの蛍光スペクトルを示す図である。ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰは水溶液中では蛍光を発しないが、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０によりミセルが崩壊すると蛍光が出現する。
【図１０】（ａ）ＨＰＭＡ−ＰＰミセル、（ｂ）ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰミセルの動的光散乱法による粒子サイズの分子様態を示す図である。
【図１１】（ａ）ＦｒｅｅＰＰとＨＰＭＡ−ＰＰ、（ｂ）Ｆｒｅｅ  ＺｎＰＰとＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの血中動態を示す図である。これらからＡＵＣ（薬物の濃度下面積）についていえば、ＨＰＭＡ−ＰＰまたはＨＰＭＡ−ＺｎＰＰは、ＦｒｅｅＰＰまたはＦｒｅｅ  ＺｎＰＰよりも数十倍高値となり、その分有意であった。
【図１２】励起光照射下でのローズベンガルによる一重項酸素［１Ｏ２］の生成を示す図である。
【図１３】ＳＭＡ−ＭＢミセルによるヒト膵臓癌細胞ＰＣ１．０細胞に対する殺細胞効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の高分子型蛍光分子プローブは、蛍光（ＦＬ）分子（以下、「ＦＬ分子」とも称する。）と生体親和性高分子とを含んでなる複合体を含むものであって、例えば蛍光内視鏡または蛍光腹腔鏡を用いて、腫瘍を蛍光検出（可視化）するために使用することができ、さらに、ＦＬ分子が光照射下で活性酸素の一つである一重項酸素（１Ｏ２）を産生し得る光増感（ＰＳ）分子（以下、「ＦＬ／ＰＳ分子」とも称する。）である場合、蛍光検出に加えて、光線力学的療法を施術するために使用することができるものである。
【００１２】
上記「蛍光（ＦＬ）分子」は、特定の波長域の光を照射することによって蛍光を発する分子であり、例えば、ローズベンガル、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｚｎ結合フタロシアニジン、ポルフィリン類、Ｚｎ結合フェオフォルバイト、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム（Ｆｏｓｃａｎ）、Ｚｎオルソフェナンスロリン、Ｃｕフェナンスロリン、アクリフラビン、アクリナール、アクリジンジアミン、アクリジン、アクリジンオレンジ、テトラサイクリン、アミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン、アミノローダミン、ジクロロフルオレセイン、Ｚｎ結合プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン等が挙げられ、好ましくはローズベンガル、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、Ｚｎ結合プロトポルフィリン、テトラメチルローダミンが挙げられる。
【００１３】
上記ＦＬ分子のなかでも、光照射下で活性酸素の一つである一重項酸素（１Ｏ２）を産生し得る光増感（ＰＳ）分子（ＦＬ／ＰＳ分子）が好ましい。ＦＬ／ＰＳ分子としては、例えば、ローズベンガル、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、Ｚｎ結合プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）、アクラルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン等が挙げられ、好ましくはローズベンガル、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、Ｚｎ結合プロトポルフィリンが挙げられる。
【００１４】
本発明において、ＦＬ分子（ＦＬ／ＰＳ分子を含む）は、単独でも混合物でも使用することができる。
【００１５】
上記「生体親和性高分子」は、生体に対して抗原性、免疫原性がなく、アレルギー、ショック等を諾起せず、また、血液凝固系、補体系に対し、作用せず、かつ生体内に長期間にわたり残留せず、毒性を示すことがない高分子であって、上記ＦＬ分子を高分子化（分子量数万以上の分子サイズ）し、ＥＰＲ効果による腫瘍への高濃度集積を達成するために使用されるものである。例えば、スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたＳＭＡ、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体（ＨＰＭＡ）、ＨＰＭＡに官能基を付加したもの、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン、α１酸性糖蛋白質、α１アンチトリプシン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、キチン/キトサン、ポリビニルピロリドン、可溶化ゼラチン、ポリアミノ酸（例：ポリアスパラギン酸）等が挙げられる。なかでも、ＳＭＡ、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたＳＭＡ、ＨＰＭＡ、ＨＰＭＡに官能基を付加したもの、血清アルブミンが好ましい。
【００１６】
本発明において、生体親和性高分子は、単独でも混合物としても使用することができる。生体親和性高分子を２種以上の混合物として使用する場合、全ての生体親和性高分子がＦＬ分子に結合していなくてもよく、特定の生体親和性高分子のみがＦＬ分子に結合していてもよい。また、生体親和性高分子同士が結合していてもよい（例えば、後述するＳＭＡ−アルブミン、ＳＭＡ−トランスフェリン、ＨＰＭＡ−アルブミン、ＨＰＭＡ−トランスフェリン等）。
【００１７】
上記スチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）は、一般に、下記式（１）に示される繰り返し単位を有する共重合体であり、スチレン由来の構成単位とマレイン酸（無水マレイン酸も含む）由来の構成単位を必須単位とするものである。ＳＭＡは、市販品でもよく、既知の方法によって合成されたものでもよい。一般に、スチレンと無水マレイン酸との共重合により得られる。この場合、マレイン酸由来の部分は、無水物となるが、そのままでも、あるいは使用前に加水分解して遊離酸部分としてもよい。
【化１】
0005904602.tif 000002
【００１８】
上記「マイレン酸側鎖部が多機能化されたＳＭＡ」としては、例えば、側鎖のカルボキシル基にアルブミンまたはトランスフェリンが結合したもの、側鎖のカルボキシル基がエチル化、ブチル化、ブチルセルソルブ化などのアルキル化されたもの、さらに、側鎖のカルボキシル基がアミド化、アミノエチル化、トリスヒドロキシアミノエチル化、ヒドロキシアミノメタン化、メルカプトエチルアミン化、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化、アミノ酸化（リジンやシステイン、その他のアミノ酸結合体など）されたもの、またはヒドラジンにより修飾されたもの、などが挙げられる。
【００１９】
上記側鎖のカルボキシル基にアルブミンまたはトランスフェリンが結合したＳＭＡとしては、例えば、ＳＭＡ−アルブミンおよびＳＭＡ−トランスフェリンが挙げられる。
【００２０】
また、上記側鎖のカルボキシル基がブチル化またはブチルセルソルブ化されたＳＭＡとしては、例えば、SMA(登録商標) Resins（Sartomer社）等が存在する。
【００２１】
上記ヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体（ＨＰＭＡ）は、下記式（２）の［］で示された繰り返し単位を有する重合体である。ＨＰＭＡは、生体親和性に優れており、さらに、免疫原性および炎症性を示さないため、本発明の複合体の構成成分として有利に使用することができる。
本発明におけるＨＰＭＡは、市販品でもよく、既知の方法によって合成されたものでもよい。一般に、ヒドロキシプロピルアクリルアミドモノマーから、溶媒ジメチルアセトアミド中でAIBN（2,2'-azobis-isobutylonitrile）を開始剤として、ラジカル重合反応を常法（例えば７０℃の温度条件下）で行うことにより、合成することができる。
【００２２】
【化２】
0005904602.tif 000003
【化３】
0005904602.tif 000004
【００２３】
上記「ＨＰＭＡに官能基を付加したもの」としては、例えば、式（２）で示されるように末端にアミノ基を有する官能基を付加した誘導体、あるいはカルボキシル基または任意のアミノ酸またはペプチド、ヒドラジンを付加した誘導体、あるいはアミド化、エチルアミン化、メルカプトエチルアミン化、トリスヒドロキシメタン化した誘導体等が挙げられる。
これらのＨＰＭＡ誘導体は、例えば、ペプチド合成において、溶媒中または水溶液中で一般的に行われている反応によって製造することができる。例えば、上記式（２）の誘導体の場合、末端基のアミノ基またはヒドロキシプロピル基の水酸基を介して、ＦＬ分子またはＦＬ／ＰＳ分子を結合させることができる。例えば、ＦＬ分子またはＦＬ／ＰＳ分子がプロトポルフィリン［上記式（３）参照］である場合、プロトポルフィリン上の２個のカルボキシル基の両方または一方に対して、ＨＰＭＡ上のヒドロキシル基を、通常のアミド結合あるいはエステル結合を形成するための脱水縮合剤を用いる反応によって結合させることにより、所望の結合体を合成することができる（図９ａ中、挿入式ＨＰＭＡ−ＰＰの結合は、エステル結合である）。ＨＰＭＡに結合させるＰＰの数は特に限定されない。
【００２４】
上記式（２）で示される末端にアミノ基を有するＨＰＭＡ誘導体の場合、アルブミンやトランスフェリン等のカルボキシル基とアミド結合を形成し、結合体（ＨＰＭＡ−アルブミン、ＨＰＭＡ−トランスフェリン等）を形成することができる。当該結合体は、本発明において、蛍光（ＦＬ）分子と複合体を形成するのに使用することができる。
【００２５】
上記ＳＭＡおよびＨＰＭＡは重合度により各種の分子量のものが存在するが、本発明に用いるＳＭＡは、好適にはトリマー（約６６０Ｄａ）から約４０ＫＤａの分子量を有するもの、より好適には８００〜２５００の分子量を有するものである。また、ＨＰＭＡは、１０００〜２００００の分子量を有するものが好ましい。
【００２６】
上記蛍光（ＦＬ）分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体は、例えば、以下に示す［方法Ｉ］〜［方法III］により製造することができる。製造方法の違いによって、ＦＬ分子と生体親和性高分子が共有結合を介して結合した複合体を形成しているもの、ＦＬ分子と生体親和性高分子が共有結合を介さずに結合し、複合体（ミセル）を形成しているものに区別される。また、共有結合を介して結合した複合体も、集合し、非共有結合的に結合してミセルを形成することができる（例えば、図９ｂ参照）。
【００２７】
［方法Ｉ］  蛍光分子のスチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）ミセル化
方法Ｉは、蛍光分子をＳＭＡミセル内に内包させる方法である。この場合、蛍光分子はＳＭＡに共有結合していない。これは、例えば、図１のフローチャートにしたがって製造することができる。
まず、ＳＭＡを、マレイン酸無水物部分を含むもののまま、あるいは、必要により、その部分を加水分解したり、アルキルエステル化等の誘導体化したりした後、ＳＭＡをアルカリ水（アルカリを含有する水、例えば、０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液）によってｐＨを８超（例えば、ｐＨ８．５付近）に調整し、ＳＭＡを可溶化する。そこに、蛍光分子を添加して反応させる。混合は攪拌下で行うことが好ましい。
この場合、ＳＭＡと蛍光分子の重量比は、特に限定されるものではなく、蛍光分子を内包するＳＭＡミセルが形成される比率であればよいが、例えば、ＳＭＡ１００重量部に対して、蛍光分子を１〜８０重量部使用することができる。ＳＭＡと蛍光分子との混合（攪拌下）時の温度および時間は、特に限定されないが、例えば、室温（２５℃）付近で、１〜２時間程度行えばよい。
次いで、混合物に、酸（例えば、０．１Ｍ  塩酸）を加えて、ｐＨを５未満（例えば、ｐＨ４．８付近）に酸性化する。これにより蛍光分子のＳＭＡミセル化物の沈殿物が得られる。得られた沈殿物を、遠心分離（例えば、５０００ｒｐｍの条件）して回収するとともに、上清を除去する。これにより、蛍光分子−ＳＭＡ（ミセル）複合体を得る。
得られた複合体（沈殿物）は、必要に応じて精製することができる。精製方法は、特に限定されず、既知の方法で行うことができるが、例えば、複合体（沈殿物）をｐＨ７〜８のアルカリ水で可溶化し、これを透析し、限外ろ過し、濃縮する工程を繰り返すことにより、複合体を精製することができる。また、得られた複合体は、精製後、凍結乾燥させることもできる。
【００２８】
以下、方法Ｉをより具体的に説明する。
まず、ＳＭＡコポリマー（あるいはそのアルキルエステル誘導体部分半ブチル化ＳＭＡなど）１００ｍｇを秤量し、２００ｍｌのビーカーにとり蒸留水３０〜６０ｍｌを加え、ｐＨメーターでｐＨをモニターしながら０．１Ｍ  ＮａＯＨを撹拌下ゆっくり滴下しながらｐＨを８．５付近にする。次にメチレンブルーの粉末３０ｍｇを５〜１０ｍｇづつ撹拌下に加える。それを室温で撹拌１〜２時間の後に０．１Ｍ塩酸を徐やかに加え、ｐＨを４．８以下にするとメチレンブルーのＳＭＡミセル化物の沈殿物が得られる。ＳＭＡメチレンブルーミセルが完全に沈殿したところで、５０００ｒｐｍの遠心により沈査を集める。次に、氷冷した１ｍＭ  ＨＣｌを６０ｍｌ加え、懸濁化し、さらに遠心（５０００ｒｐｍ）洗浄し、この沈査を集める。これを蒸留水に３００ｍｌに分散させ、０．１Ｍ  ＮａＯＨを滴下し、ｐＨを中性付近にすることで完全に可溶化する。これをミリポア社ＬａｂＳｃａｌｅＴＦＦシステムのｃｕｔ−ｏｆｆ  １０ｋＤａ分子ふるい膜を装着し、その透析濃縮装置にかけ、３０ｍｌまで加圧下で濃縮する。次いで、蒸留水４００ｍｌを加え、４０ｍｌまでの透析・濃縮を２回繰り返し、濃縮したところで凍結乾燥を行う。収量９０−１００ｍｇで青色の粉末を得る。
上記方法において、メチレンブルーの代わりに、フォスカン、インドシアニングリーン、ローズベンガルその他の蛍光分子を用いることにより、それらを内包する高分子ミセルを製造することができる。
【００２９】
［方法II］  蛍光分子とＳＭＡがスペーサーを介して共有結合した複合体の製造方法
方法IIは、ＳＭＡのマレイン酸残基に、スペーサーを介して蛍光分子をＳＭＡに結合させる方法である。すなわち、蛍光分子をＳＭＡに共有結合させる方法である。
上記スペーサーとしては、ＳＭＡのマレイン酸残基または無水マレイン酸残基に対して反応性である官能基（例えば、アミノ基、またはカルボキシル基、またはヒドロキシル基など）を有し、かつ、蛍光分子の官能基に対して反応性である官能基（例えば、アミノ基またはヒドロキシル基）を有する分子であれば特に限定されないが、例えば、エチレンジアミン、リジン、システイン、ジアミノエタン、ε−アミノカプロン酸等が挙げられる。
上記スペーサーの使用量（モル比）は、ＳＭＡ中の複数ある無水マレイン酸基１モル量に対して０．１〜１．０モル量である。
上記方法において、まず、ＳＭＡのマレイン酸残基または無水マレイン酸残基と、それらの残基と反応性であるスペーサーの官能基を結合させる（工程（ａ））。この際の温度および時間は、特に限定されないが、例えば、室温（２５℃）付近で、一夜程度行えばよい。
次いで、工程（ａ）で得られた生成物のスペーサー部分の官能基と、それと反応性である蛍光分子の官能基を結合させる（工程（ｂ））。この際の温度および時間は、特に限定されないが、例えば、０℃〜８０℃、好ましくは４℃〜３０℃にて、１〜３００時間程度行えばよい。また、この際のｐＨは、使用するＳＭＡ，蛍光分子およびスペーサーに応じて変動し得るが、例えば、８．５〜９．０とすることができる。
【００３０】
以下、方法IIをより具体的に説明する。
この例としてリジンをスペーサーとして用い、ＦＩＴＣ標識する方法を示す（図２）。リジンの代わりに、アルギニン、ヒスチジン、ジアミノエタンやε−アミノカプロン酸などを用いることができる。
Ｌ−リジン（Ｌｙｓ）塩酸塩１００ｍｇを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍｌに溶解する。次に無水マレイン酸を含むＳＭＡコポリマーを加え、攪拌下に室温で一夜反応させる。翌日、反応液をセファデックスＧ−５０にて、未反応のＬ−リジンとＳＭＡ−Ｌｙｓ（リジン化ＳＭＡ）を分離し、ＳＭＡ−Ｌｙｓ画分を回収する。溶出成分はＯＤ  ２３０−２６０ｎｍの吸収によりモニターする。この反応は、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒の存在下で行うことができる。
その凍結乾燥物（１００ｍｇ）に対し、同様に０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液５０ｍｌにｐＨ８．５〜９．０で溶解させる。次いで、ＦＩＴＣ  ２０ｍｇを加え、上記０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に準じた反応でＦＩＴＣ標識ＳＭＡを得る。
上記方法において、ＦＩＴＣの代わりにローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）を用いることにより、ローダミン−ＳＭＡ複合体を製造することができる。
【００３１】
［方法III］  蛍光分子と生体親和性高分子（ＨＰＭＡ）が直接共有結合した複合体の製造方法
方法IIIは、蛍光色素や光増感剤等をヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体（ＨＰＭＡ）などと結合するため、蛍光色素や光増感剤のカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基あるいはケトン基などの官能基を用いるもので、ＨＰＭＡまたはその誘導体に含まれるアミノ基（上記式（２）参照）、ヒドロキシル基、カルボキシル基、システイン基、あるいはヒドラジン基などとの化学反応を介して結合させる。この場合の生体親和性高分子と蛍光分子の重量比は、特に限定されるものではない。生体親和性高分子と蛍光分子との反応時の温度および時間は、特に限定されないが、例えば、３０℃付近で、例えば、５〜２０時間程度行えばよい。
【００３２】
以下、方法IIIをより具体的に説明する。
プロトポルフィリンＩＸなどの蛍光色素または光増感剤（２８１ｍｇ）をＤＭＳＯに溶かし、マグネチックスターラーで撹拌下にＨＰＭＡ（５７０ｍｇ）を加える。その溶液にトリエチルアミン（１ｇ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．２ｇ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（１．９２ｇ）を加え、撹拌下５０℃で反応させる。ＷＳＣの代わりにＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を用い、溶媒中で行うこともできる。反応は１２時間ほど続ける。次いで、反応促進物を除くため、ジエチルエーテルを加え、沈殿物を回収する。この作業を３回繰り返すことにより、プロトポルフィリン結合ＨＰＭＡ（ＨＰＭＡ−ＰＰ）の沈殿物を得る。得られた沈殿物をジメチルホルムアミドに溶解し、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＢｉｏＢｅａｄｓ  Ｓ−Ｘ１）カラムにかけ、未反応のＰＰを除去する。次いで蒸留水によりＨＰＭＡ−ＰＰを溶解し、限外ろ過、あるいはセファデックスＧ−２５またはＧ−５０カラム（サイズ：φ１．０〜５．０ｃｍ×Ｌ３０ｃｍ〜１．５ｍ）のカラムにかけ、蒸留水にて溶出する。次いで、凍結乾燥により粉末を得る。
【００３３】
［方法IV］  蛍光分子と生体親和性高分子（蛋白質）が直接共有結合した複合体の製造方法
方法IVは、ＦＬ等を蛋白等と結合するため、フロレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオネート（ＴＲＩＴＣ）などの各種蛍光色素に含まれるイソチオシアネート（−ＮＣＳ）基などの官能基（反応基）を用いるもので、蛋白質のアミノ基などとの化学反応を介して、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン（ＩｇＧ）など血清タンパク分子上のアミノ基と共有結合で蛍光分子を結合させる。
この場合の生体親和性高分子と蛍光分子の重量比は、特に限定されるものではないが、例えば、生体親和性高分子１００重量部に対して、蛍光分子を０．５〜１０重量部使用することができる。生体親和性高分子と蛍光分子との反応時の温度および時間は、特に限定されないが、例えば、室温（２５℃）付近で、例えば、５〜６時間程度、長い場合で２０時間程度行えばよい。また、生体親和性高分子と蛍光分子との反応時のｐＨは、７〜１０で、例えば、８．５であることが好ましい。
【００３４】
以下、方法IVをより具体的に説明する。
ヒト血清アルブミン（１００ｍｇ）を０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶かし、マグネチックスターラーで撹拌下にｐＨを８．０〜９．０に調整する。その溶液に室温下に蛍光色素テトラメチルローダーミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光化試薬（２０ｍｇ）を加え撹拌を続ける。反応は５〜６時間、より多く蛍光標識するにはｐＨ＞８．５、２０時間ほど反応を続ける。次いで、反応分解物および未反応物を除くため蒸留水により常法通り透析する。あるいは、セファデックスＧ−２５またはＧ−５０カラム（サイズ：φ１．０〜５．０ｃｍ×Ｌ３０ｃｍ〜１．５ｍ）のカラムにかけ、蒸留水にて溶出する。透析内液またはセファデックスにより脱塩した蛍光標識蛋白質フラククション集めて凍結乾燥して複合体を得る。
【００３５】
上記蛍光（ＦＬ）分子と生体親和性高分子とを含んでなる複合体のうち、生体親和性高分子がＨＰＭＡ、ＨＰＭＡに官能基を付加したもの、およびそれらの混合物から選択される複合体は、これまで知られていない。
【００３６】
また、上記複合体のうち、ＦＬ分子がローズベンガル、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｚｎ結合フタロシアニジン、ポルフィリン類、Ｚｎ結合フェオフォルバイト、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム（Ｆｏｓｃａｎ）、Ｚｎオルソフェナンスロリン、Ｃｕフェナンスロリン、アクリフラビン、アクリナール、アクリジンジアミン、アクリジン、アクリジンオレンジ、テトラサイクリン、アミノフルオレセイン、テトラメチルローダミン、アミノローダミン、ジクロロフルオレセイン（好ましくはローズベンガル、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、メチレンブルー、Ｚｎ結合フォスカム、テトラメチルローダミン）、およびそれらの混合物から選択され、かつ、生体親和性高分子がスチレン−マレイン酸共重合体（ＳＭＡ）、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたＳＭＡ、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド重合体（ＨＰＭＡ）、ＨＰＭＡに官能基を付加したもの、血清アルブミン、トランスフェリン、免疫グロブリン、α１酸性糖蛋白質、α１アンチトリプシン（好ましくはＳＭＡ、そのマイレン酸側鎖部が多機能化されたＳＭＡ、ＨＰＭＡ、ＨＰＭＡに官能基を付加したもの、血清アルブミン）、およびそれらの混合物から選択される複合体も、これまで知られていない。
【００３７】
本発明の高分子型蛍光分子プローブは、静脈内投与または腫瘍の栄養動脈内、あるいは油剤化製剤として経口投与することができる。投与後、当該蛍光分子プローブはＥＰＲ効果により腫瘍部に集積、濃染するため、管腔臓器の癌に対しては蛍光内視鏡下に、また癌性腹胸膜炎あるいは腹腔内・胸腔内の転移癌の娘結節に対しては、例えば胸膜、大網、横隔膜上の転移癌に対しては蛍光腹腔鏡下に観察が可能となる。
上記「蛍光内視鏡」としては、各々のＦＬおよびＰＳの分光特性に合致した光学系、とくにフィルターを装備しているものであれば特に限定されないが、例えばオリンパス製やフジフィルム製のファイバー・オプティックスに、上記フィルター系を装備したものが挙げられる。あるいは外部光源としてAsahi Spectra Max-303（Asahi Spectra社製）等を用いることができる。
また、上記「蛍光腹腔鏡」としては、上記と同様の分光特性を備えたものであれば特に限定されないが、例えば新興光器社製のＳＫ-２Ｄ１０ＤあるいはＳＫ-２Ｄ０５Ｓが挙げられる。
【００３８】
また、本発明の高分子型蛍光分子プローブは、がん細胞内にエンドサイトーシスによって取り込まれて初めて崩壊し、これにより蛍光分子を細胞内に放出する。これらは自由分子であり、そしてこれらが光増感分子でもある場合、光照射により、そこで初めて活性酸素の一つである一重項酸素［１Ｏ２］を生成し、それが殺細胞効果を発現するようなミセルである。
【００３９】
本発明における「光線力学的療法」は、ＰＳ含有高分子化薬剤投与後、数時間〜２日経過後、主として管腔臓器では内視鏡光源により照射する、あるいは体表にできた腫瘍に対しては、Ｘｅｎｏｎ光源などを有するプロジェクターあるいは上記のアサヒスペクトラ社の光源を用いて光照射を行い、癌治療を行う療法を意味する。
これまで光線力学的療法における光増感（ＰＳ）分子プローブは、腫瘍部のみならず全身へ分布することが大きな問題点であった。とくに、皮膚など体表面への分布が原因となる光線過敏症が重大な副作用であり、通常の光の作用（室内、室外ともに）によって、体表皮組織（細胞）に傷害を生ずることが難点である。本発明では、低分子型ＰＳを高分子化することにより、そのプローブを腫瘍部により高率に集積させることに成功した。このため正常皮膚への集積が極めて低く、光線過敏症が生じ難い。さらに重要な事項として、正常組織に比べ、腫瘍への集積性が非常に高いため、既存の低分子型ＰＳでは困難である微小腫瘍の蛍光による可視化、ならびに低エネルギー光照射でも治療効果を発揮するに足る一重項酸素を発生させることが可能になった。これにより、高エネルギーレーザーを使用した際に懸念される神経や血管の切断などの損傷の回避ならびに、より深部にある腫瘍に対する治療効果が期待される。
【００４０】
本発明に記載の光増感（ＰＳ）分子としてのインドシアニングリーン（ＩＣＧ）やローズベンガルは静脈注射後、血中でアルブミンと結合することはよく知られているが、その結合物（複合体）は、肝臓においてアルブミンにより離解し、胆汁中に効率よく排泄される。そのため、健常人ではその血中半減期は１５〜３０分以内である。この比較的短時間の血中での滞留時間の長さでは、ＥＰＲ効果を発揮するためには不十分である。これに対し、本発明のローズベンガル含有ＳＭＡミセルあるいはＩＣＧ含有ＳＭＡミセルなどでは、半減期は５００分以上となり、時間依存的現象であるＥＰＲ効果の発現によって一段と高い腫瘍集積性を充分に発現する（図３）。
【００４１】
一重項酸素［１Ｏ２］は反応性が非常に強く、生体内では０．１μｍ程度しか移動できない。このことは、一重項酸素の発生原であるＰＳが標的細胞内に取り込まれていないと細胞障害性を発揮できないことを意味している。つまり、腫瘍組織に集積するのみで腫瘍細胞に取り込まれないような蛍光／光増感（ＦＳ／ＰＳ）プローブでは、腫瘍組織の蛍光可視化は可能であるが、光増感剤としての使用は効率が悪い。ＳＭＡミセル化法を用いた高分子化の利点は、ＦＳ／ＰＳプローブの細胞内への取り込みを増強できることである。さらにＦＳ／ＰＳプローブのＳＭＡミセル以外の高分子化に関しては方法として、アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧなどのＦＬ／ＰＳ結合物もＳＭＡ化により細胞内取り込みを促進することも報告している。
【００４２】
別の問題は、腫瘍部以外での非特異的蛍光は腫瘍特異的蛍光検出を目指す場合には大きな問題となりうることである。正常組織への薬剤の分布・拡散はＥＰＲ効果により微小であることが高分子プローブの特徴であるが、ＥＰＲ効果を発現するためには、ＦＳ／ＰＳプローブが長時間血中を循環する必要がある。そのとき血中からの蛍光発光を起こし、蛍光バッググラウンドとして十分な腫瘍特異的蛍光Ｓ／Ｎ比が得られないという可能性がある。この問題は本発明のＳＭＡミセルを用いたミセル化により解決できる。即ち、ＳＭＡミセル内に密に押し付けられた分子はコンパクトに重層して存在している状態であり、その場合は、蛍光が発生せず消光する。従って、ＳＭＡミセル内にあるＰＳの場合は一重項酸素［１Ｏ２］を生ずることがない。つまり、ＳＭＡミセルとして存在する血中では光照射による蛍光は認められない。高分子化ＦＳ／ＰＳプローブがＥＰＲ効果により腫瘍組織に到達し、腫瘍細胞に取り込まれることにより始めてＳＭＡミセルの崩壊が起こり、ミセル内に重層されたＦＳ／ＰＳが放出され、遊離体のＦＳ／ＰＳとなる。遊離体のＦＳ／ＰＳは励起波長域の光を照射すると、ただちに蛍光を発するとともに、１Ｏ２（一重項酸素）を発生する。従って、このＳＭＡミセル内に集積した状態のプローブは血中では、光が当たっても蛍光もなく、一重項酸素［１Ｏ２］の発生もないため（図４）、正常組織や血管内では無蛍光であり、正常組織での非特異的蛍光や１Ｏ２の発生はなく、腫瘍特異的な蛍光により可視化検出ならびに１Ｏ２の発生が可能となる。
【００４３】
本発明の複合体は、腫瘍等の光線力学的療法（ＰＤＴ, photo dynamic therapy）に使用することができる。ＰＤＴに使用する光源としては、Ｈｅ／Ｎｅレーザー、キセノン光源等が挙げられるが、本発明に使用されるＦＬは、幅広い蛍光分子の励起波長に対応可能なことから、本発明においては、固定された単波長のレーザーよりも、キセノン光源を好ましく使用することができる。
また、本発明の高分子型蛍光分子プローブを効率よく検出するため、蛍光分子プローブの特性に合致した励起波長フィルターおよび蛍光透過フィルターを装着した、ＣＣＤカメラを装備した内視鏡、腹腔鏡、膀胱鏡等を使用することができる。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞  メチレンブルー（ＭＢ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＭＢミセル）
ＳＭＡコポリマー（サートーマー社）（あるいはそのアルキルエステル誘導体部分半ブチル化ＳＭＡなど）１００ｍｇを秤量し、２００ｍｌのビーカーにとり蒸留水３０〜６０ｍｌを加え、ｐＨメーターでｐＨをモニターしながら０．１Ｍ  ＮａＯＨを撹拌下ゆっくり滴下しながらｐＨを８．５付近にした。次にメチレンブルー（和光純薬（株））の粉末３０ｍｇを５〜１０ｍｇづつ撹拌下に加える。それを室温で撹拌１〜２時間の後に０．１Ｍ塩酸を徐やかに加え、ｐＨを４．８以下にするとメチレンブルーのＳＭＡミセル化物の沈殿物が得られる。ＳＭＡメチレンブルーミセルが完全に沈殿したところで、５０００ｒｐｍの遠心により沈査を集め、次に、氷冷した１ｍＭ  ＨＣｌを６０ｍｌ加え、懸濁化し、さらに遠心（５０００ｒｐｍ）洗浄し、この沈査を集めた。これを蒸留水に３００ｍｌに分散させ、０．１Ｍ  ＮａＯＨを滴下し、ｐＨを中性付近にすることで完全に可溶化した。このものをミリポア社ＬａｂＳｃａｌｅＴＦＦシステムのｃｕｔ−ｏｆｆ  １０ｋＤａ分子ふるい膜を装着し、その透析濃縮装置にかけ、３０ｍｌまで加圧下で濃縮、さらに蒸留水４００ｍｌを加え、４０ｍｌまでの透析・濃縮を２回繰り返し、濃縮したところで凍結乾燥を行った。収量９０−１００ｍｇで青色の粉末を得た。
そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図５に示す。【００４５】
＜実施例２＞  インドシアニングリーン（ＩＣＧ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＩＣＧミセル）
メチレンブルーの代わりに、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いた以外は、実施例１と同様の手順を行い、ＳＭＡ−ＩＣＧミセル（収量約１００ｍｇ）を得た。そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図６に示す。【００４６】
＜実施例３＞  ローズベンガル（ＲＢ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−ＲＢミセル）
メチレンブルーの代わりに、ローズベンガル（ＲＢ）を用いた以外は、実施例１と同様の手順を行い、ＳＭＡ−ＲＢミセル（収量約１００ｍｇ）を得た。そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図７に示す。【００４７】
＜実施例４＞  Ｚｎフォスカム（Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎ）含有ＳＭＡミセル（ＳＭＡ−Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎミセル）
メチレンブルーの代わりに、Ｚｎフォスカム（Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎ）を用いた以外は、実施例１と同様の手順を行い、ＳＭＡ−Ｚｎ−ｆｏｓｃａｎミセル（収量 約９０ ｍｇ）を得た。そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図８に示す。【００４８】
＜実施例５＞プロトポルフィリン結合ＨＰＭＡ（ＨＰＭＡ−ＰＰ）およびＺｎ−プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）−ＨＰＭＡ共有結合複合体（ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰ）
プロトポルフィリンＩＸ（２８１ｍｇ）をＤＭＳＯに溶かし、マグネチックスターラーで撹拌下にＨＰＭＡ（５７０ｍｇ）を加えた。その溶液にテトラエチルアミン（１ｇ）、ＤＭＡＰ（１．２ｇ）、ＷＳＣ（１．９２ｇ）を加え、撹拌下５０℃で反応させた。反応は１２時間ほど続けた。次いで、反応促進物を除くため、ジエチルエーテルを加え、沈殿物を回収した。この作業を３回繰り返すことにより、プロトポルフィリン結合ＨＰＭＡ（ＨＰＭＡ−ＰＰ）の沈殿物を得た。ジメチルホルムアミドに溶解し、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＢｉｏＢｅａｄｓ  Ｓ−Ｘ１）カラムにかけ、未反応のＰＰを除去する。次いで蒸留水によりＨＰＭＡ−ＰＰを溶解し、１０ｋＤａの透析膜を用いた限外ろ過、あるいは、セファデックスＧ−２５またはＧ−５０カラム（サイズ：φ１．０〜５．０ｃｍ×Ｌ３０ｃｍ〜１．５ｍ）のカラムにかけ、蒸留水にて溶出した。次いで、凍結乾燥により粉末を得た（収量約６５０ｍｇ）。そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図９ａおよび図９ｃに示す。
プロトポルフィリンＩＸの代わりにＺｎ−プロトポルフィリン（ＺｎＰＰ）（２８０ｍｇ）を使用した以外は同様の手順を行い、ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰを得た（収量約６３０ｍｇ）。そのＵＶ−ＶＩＳスペクトルおよび蛍光スペクトルを図９ｂおよび図９ｄに示す。
【００４９】
＜ＨＰＭＡ−ＰＰおよびＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの粒子径分布＞
上記で得られたＨＰＭＡ−ＰＰまたはＨＰＭＡ−ＺｎＰＰを１ｍｇ／ｍＬとなるように生理食塩水に溶解し、粒子径測定装置（ＥＬＳＺ２、大塚電子）により測定したＨＰＭＡ−ＰＰまたはＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの粒子径分布を図１０ａおよび図１０ｂに示す。その結果、ＨＰＭＡ−ＰＰの平均粒子径は、１８．２±７．４ｎｍであり、ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの平均粒子径は、８２．８±４１．８ｎｍであった。【００５０】
＜ＨＰＭＡ−ＰＰおよびＨＰＭＡ−ＺｎＰＰの血中動態＞
生理食塩水に溶解したＨＰＭＡ−ＰＰを、ｄｄＹマウスの尾静脈よりＨＰＭＡ−ＰＰ（３０ｍｇ／ｋｇ）となるように投与した。投与５分、２時間、２４時間、４８時間後にエーテル麻酔下に屠殺し、開腹しヘパリン含有シリンジを用い、大静脈より採血を行った。遠心分離後（２，０００ｒｐｍ、４℃、２０分）、血漿を回収した。２ｍＬのＤＭＳＯに１０μＬの血漿を加え、蛍光分光光度計（４２０ｎｍ励起）により、ＨＰＭＡ−ＰＰ（６３５〜６６０ｎｍ）の蛍光強度を測定し、血漿中のＨＰＭＡ−ＰＰ濃度の時間的推移を測定した。その結果、ＨＰＭＡ−ＰＰは、ＦｒｅｅＰＰよりも数十倍有意であった（図１１ａ参照）。
ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰについても同様に処理し、ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰ（５８０ｎｍ〜６６０ｎｍ）の蛍光強度を測定し、血漿中のＨＰＭＡ−ＺｎＰＰ濃度の時間的推移を測定した。その結果、ＨＰＭＡ−ＺｎＰＰは、Ｆｒｅｅ  ＺｎＰＰよりも数十倍優位であった（図１１ｂ参照）。【００５１】
＜実施例６＞  ローダミン結合アルブミン（共有結合体）
ヒト血清アルブミン１００ｍｇを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３に溶かし、マグネチックスターラーで撹拌下にｐＨを８．０〜９．０に調整した。その溶液に室温下に蛍光色素テトラメチルローダーミン・イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）（シグマ・アルドリッチ製）などの蛍光化試薬を２０ｍｇ加え撹拌を続けた。反応は５〜６時間、より多く蛍光標識するにはｐＨ＞８．５、２０時間ほど反応を続けた。次いで、反応分解物および未反応物を除くため蒸留水により常法通り透析。あるいは、セファデックスＧ−２５またはＧ−５０カラム（サイズ：φ３．０〜５．０ｃｍ×Ｌ７０〜８０ｃｍ）のカラムにかけ、蒸留水にて溶出した。透析内液またはセファデックスにより脱塩した蛍光標識蛋白質フラククション集めて凍結乾燥して目的物を得た（収量約９８ｍｇ）。【００５２】
＜実施例７＞  高分子型蛍光分子プローブによる腫瘍の検出
ｄｄＹマウスの左右下半身背部に各々一カ所ずつ２×１０６個のＳ−１８０癌細胞を移植した。その固形腫瘍が直径５〜８ｍｍになったところで、実施例７で得られたローダミン結合アルブミン（２００ｍｇ／ｋｇ）または実施例２で得られたＳＭＡ−ＩＣＧミセル（３０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、１５時間後にマウスを蛍光観察した。その結果を図３に示す。
図３中、（Ａ）はローダミン結合アルブミンを投与したマウス（励起光源は５３５ｎｍ±１５ｎｍ、蛍光は６００ｎｍ±１０ｎｍを透過するband pass filterを使用）を、（Ｂ）はＳＭＡ−ＩＣＧを投与したマウス（励起光源は７１０ｎｍ±１５ｎｍ、蛍光は８００ｎｍ±１０ｎｍを透過するband pass filterを使用）を示す。【００５３】
＜実施例８＞  励起光照射下でのローズベンガルによる一重項酸素［１Ｏ２］の生成
励起光照射下にローズベンガルにより生ずる一重項酸素［１Ｏ２］の生成をＥＳＲ（electron spin resonance：電子スピン共鳴）スペクトルにより証明した。即ち１Ｏ２ラジカルの検出を、スピントラップ剤ＴＥＭＰ：（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン）（和光純薬（株））を使用して行った。ＴＥＭＰは、一般的に使用される一重項酸素を捕捉するスピントラップ剤であり、その結果、産生されるＴＥＭＰの１Ｏ２付加体は電子共鳴装置（ＥＳＲ）によりトリプレットシグナルとして検出される。
３３．０μＭの実施例３で得られたＳＭＡ−ローズベンガル（ＳＭＡ−ＲＢ）ミセルまたはローズベンガル（ＲＢ）を含有する生理食塩水溶液に、ＴＥＭＰを３０ｍＭになるように添加し、その溶液に光を下記の条件で照射し、ＥＳＲで測定した。
ＥＳＲ測定は、X-band型ＥＳＲ装置（日本電子（株）、ＦＡ１００）を使用し、Microwave power 4.0 mW、amplitude 200 kHz、modulation width 0.1[mT]の条件で行った。尚、光照射の条件として、光源はキセノンランプ６５０Ｗ（マスタープロジェクター（株）、Master Lux-S、理化学精機株式会社、東京）のレンズ開口部より扇風機空冷下に１０ｃｍの距離で照射した。
図１２に示すように、遊離のＲＢと同様に、ＳＭＡ−ＲＢミセルにおいても光照射により一重項酸素のシグナルが検出されたが、その強度は照射時間依存的に増加した。これに対して、遊離のＲＢの場合、そのシグナルの増加は、照射時間１０分以降に減弱し、２０分以上の照射によりシグナル強度は検出不能となった。光照射による遊離のＲＢの速やかな崩壊が示唆された。この結果より、遊離のＲＢと比較して、ＳＭＡ−ＲＢミセルの方がはるかに有効で、光照射による一重項酸素の産生は長期に渡って安定しており、ほぼ１０倍の有用性があるといえる。このような一重項酸素の産生が腫瘍部で起きると、それが腫瘍細胞と速やかに反応し、腫瘍細胞の壊死やアポトーシスを招き、抗腫瘍作用が発揮できる。【００５４】
＜実施例９＞  ＳＭＡ−ＭＢミセルによるヒト膵臓癌細胞ＰＣ１．０細胞に対する殺細胞効果
ヒト膵臓癌細胞ＰＣ１．０を１０００細胞／ｗｅｌｌで９６穴の培養プレートに播種し、一晩培養した。その後、各濃度のメチレンブルー（ＭＢ）またはＳＭＡ−メチレンブルーミセル（ＳＭＡ−ＭＢ）を細胞に加え、４８時間培養した。光照射の場合、通常のタングステンＸｅ光を用い、細胞接着面から１５ｃｍの距離で２０分間照射した。各処理後の細胞の生存率はＭＴＴ法により算出した。その結果、ＭＢ及びＳＭＡ−ＭＢミセル何れにおいても、光照射によるその細胞毒性の著明な増強が認められた。その結果を図１３および下表１に示す。【００５５】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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