(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせるアポトーシス誘導剤。    
【化１】
0005845280.tif 000003
．．．．（１）
【請求項２】
ヒメマツタケから得ることができる脂溶性抽出物であって、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分として含有することを特徴とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせるアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から１種又は２種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤が、第一次抽出として、ヒメマツタケの乾燥粉末を極性プロトン性の有機溶媒から選ばれる１または２以上の有機溶媒で抽出物を得て、第二次抽出として、当該第一次抽出で得られた抽出物に蒸留水と低極性の有機溶媒から選ばれる１または２以上の有機溶媒とを加えて撹拌した後に分離して得られる有機溶媒層の濃縮物を得て、さらに、第二次抽出物の分画として、当該濃縮物をシリカゲルカラムに吸着させた後に、極性プロトン性の有機溶媒から選択される１ないし２以上の有機溶媒と低極性の有機溶媒から選択される１ないし２以上の有機溶媒を混合してなる有機溶媒混合液で溶出して複数の分画を得て、当該分画からヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせる分画を選択して製造されることを特徴とするアポトーシス誘導剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エルゴステロール誘導体を有効成分とするアポトーシス誘導剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エルゴステロールとはビタミンＤの前駆物質でステロールの一種であり、キノコなどの菌類において生合成されることが知られている。エルゴステロールの抗がん作用についての研究として、がん細胞に対する血管新生阻害作用の報告がされている（非特許文献１）。しかし、エルゴステロールはがん細胞に対してアポトーシスを誘導することは無い（非特許文献２）。【０００３】
また、エルゴステロール誘導体とは、エルゴステロールを母体とし、化学修飾された化合物をいう。エルゴステロール誘導体についても、抗がん作用に関するいくつかの研究があり、エルゴステロール誘導体のアポトーシス誘導作用の報告がされている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。他にもエルゴステロール誘導体にはメラニン生成抑制の報告もある（特許文献１  ２００３−２６７８７３）。【０００４】
しかしながら、上記の文献からも明白なところ、エルゴステロール誘導体は官能基の導入，酸化あるいは還元などによる化学構造の違いにより、抗がん効果が異なり、特にヒト肺腺がん細胞にアポトーシスの効果をもたらすものは未だに発明されていない。【０００５】
一方、ヒメマツタケとは、ハラタケ科ハラタケ属の担子菌であって学名Agaricus blazei Murrill のことをいう。ヒメマツタケの俗称としてアガリクスまたはアガリクス茸などの名前で呼ばれることも多く、一般的にはアガリクスの名称のほうが著名である。しかしながらアガリクスとは、ハラタケ属の学名Agaricusを日本語読みしたものであり、いわゆるマッシュルーム（Agaricus bisporus (J.Lange) Imbach var.albidus (J.Lange) Sing.）なども含まれてしまうため、本願では、種を特定するためヒメマツタケの名称を使用する。【０００６】
ヒメマツタケは、βグルカンを含有することで、免疫増強作用などが知られていた  （非特許文献７）。免疫増強作用による抗がん治療法は、薬剤を投与すること無く、体内に存在する免疫細胞を活性化することでがん細胞を消滅させる治療法なので、正常細胞への傷害性が無いこと、また天然物由来の成分を使用するため副作用もほとんど無い点で優れている。しかしながら、その効果については個人差も大きく、さらに進行がんにいたっては切除が必要であり、免疫療法だけでの全快は困難であった。【０００７】
ところが、最近はヒメマツタケにも特定のがん細胞に対してアポトーシスを誘導することがわかってきた（特許文献２  ２００８−１１５１５８）。特許文献２にはヒメマツタケ子実体またはその破砕物から得ることができるステロイド誘導体にヒト肺大細胞癌細胞およびヒト胃癌細胞に対するアポトーシス誘導作用が記載されており、ヒメマツタケ由来ステロイド誘導体によるアポトーシス誘導作用が明らかにされている。さらにこのステロイド誘導体はヒト大腸癌細胞並びにヒト肝癌細胞に対してもアポトーシス誘導作用を有することが明らかとされた(特許文献３  ２０１０−２２９０７７)。【０００８】
しかしながら、死亡率の高い肺腺がんの細胞に対してヒメマツタケがアポトーシスを誘導するということは全く知られていない。さらに、他にもヒト子宮頸がん細胞やヒト舌がん細胞に対してもヒメマツタケがアポトーシス誘導を示すことは全く知られていない。抗がん剤は、がんの種類によって特異的な場合が多く、各種がん細胞ごとにアポトーシス効果を見出さなければならないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−２６７８７３号公報
【特許文献２】特開２００８−１１５１５８号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２９０７７号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Takeshi Takaku 、「Isolation of an antitumor compound from Agaricus blazei Murill and its  mechanism of Action」、J Nutr. 2001. 131(5): 1409-1413.
【非特許文献２】Tatsuki Kunoh、「A novel human dynactin-associated protein, dynAP, promotes activation of Akt, and ergosterol-related compounds induce dynAP-dependent apoptosis of human cancer cells.」、Mol Cancer Ther. 2010. 9(11): 2934-2942.
【非特許文献３】Yu-Kuo chen、「Cytotoxic activities of 9,11-dehydroergosterol peroxide and ergosterol peroxide from the fermentation mycelia of Ganoderma lucidum cultivated in the medium containing leguminous plants on Hep 3B cells.」、J Agric Food Chem. 2009. 57: 5713-5719.
【非特許文献４】Hiroko Itoh、「Blazein of a new steroid isolated from Agaricus blazei Murrill  (himematsutake) induces cell death and  morphological change  indicative of apoptotic chromatin condensation in human lung  cancer LU99 and stomach cancer KATO III cells.」、Oncology Reports. 2008. 20: 1359-1361.
【非特許文献５】A. Russo、「Pro-apoptotic activity of ergosterol peroxide and  (22E)-ergosta-7,22-dien-5-hydroxy-3,6-dione in human prostate cancer cells.」、Chemico-Biological Interactions. 2010. 184: 352-358.
【非特許文献６】Hisashi Matsuda、「Apoptosis-Inducing Effects of Sterols from the Dried Powder of Cultured  Mycelium of Cordyceps sinensis.」、Chem Pharm Bull. 2009. 57(4): 411-414.
【非特許文献７】小林仁・増本純也、「Endotoxin contamination of Agaricus blazei murrill extract enhances murine immunologic responses and inhibits the growth of sarcoma 180 implants in vivo」、J Environ Pathol Toxicol Oncol.  2010. 29 (2): 159-168.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、エルゴステロール誘導体を有効成分とするアポトーシス誘導剤であって、特にヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対するアポトーシス誘導剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねたところ、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体をヒメマツタケの脂溶性抽出物から見いだし、さらにヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞に対してアポトーシスを誘導させることを見いだして発明を完成させた。【００１３】
すなわち、請求項１に係る発明は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせるアポトーシス誘導剤である。    
【化１】
0005845280.tif 000002
．．．．（１）
【００１４】
請求項２に係る発明は、ヒメマツタケから得ることができる脂溶性抽出物であって、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分として含有することを特徴とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせるアポトーシス誘導剤である。
【００１５】
請求項３に係る発明は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から１種又は２種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤が、第一次抽出として、ヒメマツタケの乾燥粉末を極性プロトン性の有機溶媒から選ばれる１または２以上の有機溶媒で抽出物を得て、第二次抽出として、当該第一次抽出で得られた抽出物に蒸留水と低極性の有機溶媒から選ばれる１または２以上の有機溶媒とを加えて撹拌した後に分離して得られる有機溶媒層の濃縮物を得て、さらに、第二次抽出物の分画として、当該濃縮物をシリカゲルカラムに吸着させた後に、極性プロトン性の有機溶媒から選択される１ないし２以上の有機溶媒と低極性の有機溶媒から選択される１ないし２以上の有機溶媒を混合してなる有機溶媒混合液で溶出して複数の分画を得て、当該分画からヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から任意に選ばれる１種又は２種以上のがん細胞に対し、アポトーシスを起こさせる分画を選択して製造されることを特徴とするアポトーシス誘導剤の製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
請求項１にかかる発明の効果は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体によりヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導し当該がん細胞を死滅させることができる。【００１７】
請求項２にかかる発明は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体が含有されているヒメマツタケの脂溶性抽出物により、ヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導し当該がん細胞を死滅させることができる。さらに天然物由来のため副作用の無い抗がん作用をもつ物質を提供することができる。【００１８】
請求項３にかかる発明は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体を有効成分とするヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞の中から１種又は２種以上の細胞に対するアポトーシス誘導剤をヒメマツタケから製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明にかかるエルゴステロール誘導体の製造についての概略工程図である。
【図２】ヒメマツタケ由来エルゴステロール誘導体がヒト肺腺がん細胞に対して濃度依存的に細胞死を誘導したことを示す図である。
【図３】ヒメマツタケ由来エルゴステロール誘導体がヒト肺腺がん細胞に対して濃度依存的にアポトーシスを誘導したことを示す図である。
【図４】ヒメマツタケ由来エルゴステロール誘導体がヒト肺腺がん細胞（Ａ５４９）、ヒト舌がん細胞（ＨＳＣ−３)及びヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ）に対してアポトーシスを誘導したことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明にかかるヒト肺腺がん細胞、ヒト舌がん細胞又はヒト子宮頸がん細胞に対してアポトーシスを誘導する物質は、式（１）で表されるエルゴステロール誘導体である。
従って、構造が明確なため、当該エルゴステロール誘導体を合成することができれば、合成物を使用することができる。
【００２１】
また、本発明にかかるエルゴステロール誘導体はヒメマツタケの菌糸体又は子実体に含有されるため、ヒメマツタケの菌糸体又は子実体から抽出することもできる。
【００２２】
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は脂溶性であるのはその構造上明確である。
【００２３】
ヒメマツタケから脂溶性抽出物を得るためには、ヒメマツタケの菌糸体、子実体または菌糸体と子実体との混合物を用いることができるが、好ましくは子実体をさらにより好ましくは子実体の乾燥粉末を使用する。
【００２４】
ヒメマツタケの乾燥子実体は、天日干し、温風乾燥、熱風乾燥または凍結乾燥などで乾燥することができる。
【００２５】
次に第一次抽出について説明する。
【００２６】
ヒメマツタケの乾燥子実体あるいはその粉末にプロトン性極性の有機溶媒から選択される１または２以上の有機溶媒を加えて混合液とし、一定時間静置しまたは撹拌してその後、混合液を吸引濾過し、抽出液を回収する。このときの残渣については、さらに上記有機溶媒を添加して一定時間の静置および吸引濾過を繰り返すことにより、抽出物をより多く回収することができる。回収した抽出液を減圧濃縮して有機溶媒を蒸発させ第一次抽出物を得ることができる。
【００２７】
ここで、プロトン性極性の有機溶媒としては、１−ブタノール、２−プロパノール、１−プロパノール、エタノール又はメタノール等があり、好ましくはエタノール、メタノール又は１−プロパノールの何れかを単独または２以上の混合溶媒として用いる。
【００２８】
また、静置又は撹拌時間は２４時間以上が好ましく、より好ましくは４８時間静置である。
【００２９】
次に第二次抽出について説明する。
【００３０】
第一次抽出で得られた抽出物に蒸留水と低極性の有機溶媒から選択される１または２以上の有機溶媒とを添加して混合し、静置した後混合液が分離したら、蒸留水層を除いて有機溶媒層のみを残す。次に当該有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、減圧濃縮して第二次抽出物を得ることができる。
【００３１】
ここで、上記低極性の有機溶媒には、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等があり、好ましくは酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンの何れかを単独または２以上の混合溶媒として用いる。
【００３２】
第二次抽出物は、さらに純度を上げるために分画することができる。すなわち、第二次抽出物をシリカゲルに吸着させ、その後当該シリカゲル吸着物を有機溶媒で溶出させて、１乃至１０の画分に適宜に分画することで分画物を得ることができる。
【００３３】
ここで、上記シリカゲル吸着物を溶出させる有機溶媒は、低極性の有機溶媒から選択される１または２以上の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒から選択される１または２以上の有機溶媒とを混合して得られる有機溶媒が好ましく、より好ましくはヘキサンと酢酸エチルとメタノールとを適宜に混合して得られる有機溶媒である。
【００３４】
次に第二次抽出物の分画物についてさらに純度を高めて単離する方法について説明する。
【００３５】
第二次抽出物の分画物を珪藻土に吸着させたのち、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）を充填したオープンカラムを使用して、蒸留水と非プロトン性極性の有機溶媒と低極性の有機溶媒とを混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の有機溶媒を用いて、第二次抽出物の分画物を溶出させる。溶出させた液は、任意の溶出量ごとに分取して、任意の分画を集めて減圧濃縮し、第二次分画物を得る。
【００３６】
上記第二次分画物を得る場合の非プロトン性極性の有機溶媒には、アセトニトリルやアセトンなどを使用することができるが、好ましくはアセトニトリルを用いる。また、低極性の有機溶媒については、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等があり、好ましくは酢酸エチルを用いる。
【００３７】
第二次分画物について、薄層クロマトグラフィ―法により抽出成分が単離されているか否かを確認し、抽出成分が単離されていない場合には、さらに分画を行う。
【００３８】
第二次分画物を珪藻土に吸着させたのち、シリカゲルを充填したオープンカラムを使用して、低極性の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒とを混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の有機溶媒を用いて、第二次分画物を溶出させる。溶出させた液は、任意の溶出量ごとに分取して、任意の分画を集めて減圧濃縮し、第三次分画物を得る。
【００３９】
ここで、上記第三次分画物を得る場合に分取する溶出量は５ｍｌ以下が好ましくより好ましくは１ｍｌである。また、低極性の有機溶媒としては、塩化メチレン、酢酸エチル、クロロホルム、ジエチルエーテル、トルエン、ベンゼン、ヘキサン等を用いることができるがより好ましくはクロロホルムを用いる。さらに、プロトン性極性の有機溶媒としては、１−ブタノール、２−プロパノール、１−プロパノール、エタノール、メタノール等を用いることができるが、より好ましくは、メタノールを用いる。
【００４０】
第三次分画物についても、薄層クロマトグラフィ―法により抽出成分が単離されているか否かを確認する。 薄層クロマトグラフィー法での抽出成分の単離の確認は次の方法ですることができる。
【００４１】
抽出成分を有機溶媒で溶解し、その溶液を毛細管を用いて薄層クロマトグラフィープレートの下端から７mmの高さに点で塗布する。当該抽出成分の塗布された薄層クロマトグラフィープレートを低極性の有機溶媒とプロトン性極性の有機溶媒とを混合した溶媒の入った密閉容器内に立てかけ、有機溶媒をプレート全体に展開させる。展開後は有機溶媒を十分に乾燥させた後、アニスアルデヒド発色試薬で成分を発色させ、成分の単離を確認する。
【００４２】
抽出成分の単離を確認したのち、赤外吸収スペクトル、1ＨＮＭＲスペクトル、13ＣＮＭＲスペクトルを解析することで、式（１）で表される化学構造を確認することができる。
【００４３】
次にがん細胞に対するアポトーシス誘導について説明する。
【００４４】
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞（Ａ５４９細胞、東北大学加齢医学研究所、ＴＫＧ ０１８４）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞、東北大学加齢医学研究所、ＴＫＧ ０３３１）およびヒト舌がん細胞（ＨＳＣ−３細胞、東北大学加齢医学研究所、ＴＫＧ ０４８４）に、上記アガリクス抽出物すなわち第三次分画物をジメチルスルホキシドに溶解させてから添加する。２４時間経過後、それぞれに細胞増殖測定試薬を添加して、１時間経過後、吸光度を測定することで細胞生存率を算出する。細胞生存率の算出方法は未処理群の吸光度の値を細胞生存率１００％として、処理群の吸光度の値と比較して細胞生存率を求める。
【００４５】
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞に第三次分画物を添加する。２４時間経過後、TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出する。TUNEL法とはアポトーシスによってDNAが断片化した細胞を特異的に染色し検出する方法をいう。すなわち、TUNEL法で細胞が検出されればアポトーシスを起こしていることが明白となる。
【００４６】
また、上記第三次分画物は、ヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞のアポトーシスを起こすことが確認されることで、抗がん作用が期待できる。そして、上記第三次分画物は、ヒメマツタケから抽出された脂溶性抽出物であり、ヒメマツタケの食経験からすれば安全性も確保される。
【００４７】
以上に説明した抽出方法で抽出されたヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケから得ることができる脂溶性抽出物に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、乳化剤、安定化剤、着色剤、香料などを１または複数加えて、通常の方法で食品に配合し、錠剤に打錠し、顆粒化しまたはカプセルに内包した状態にして健康食品または抗がん剤とすることができる。
【００４８】
また、上記ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物は、そのままあるいは乾燥して粉末化しただけの抗がん剤であっても良く、例えば、家庭で炊飯やお茶に簡単に加えられるように、ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物またはその乾燥粉末化した抗がん剤を小パックに詰めておいても良い。
【００４９】
さらに、ヒト肺腺がん細胞のアポトーシスを誘導するヒメマツタケからの脂溶性抽出物は、そのままあるいは乾燥して粉末化したものを様々な加工食品に添加することで、抗がん作用のある健康食品とすることができる。
【００５０】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。ただし、本発明の構成は、下記実施例に記載された内容に限られるものではなく、また、実施例の記述については、特許請求の範囲を限定し、あるいは特許請求の範囲を減縮するように解すべきものでもない。そして、本発明の構成は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において種々の変形が可能である。
【実施例１】
【００５１】
式（１）で表されるエルゴステロール誘導体のヒメマツタケからの製造工程について図１に示すとともに、以下に本発明にかかるエルゴステロール誘導体のヒメマツタケからの抽出例を詳説する。【００５２】
（第一次抽出）
アガリクスの子実体、９７１１．５７ｇをエタノール２０lに浸漬し、室温で２４時間静置した。その後、混合液を吸引濾過し、エタノールと残渣を分離して回収した。次に当該残渣を、再度エタノール２０lに浸漬し、室温で４８時間静置した後、混合液を吸引濾過し、エタノールと残渣を分離して回収した。更に当該残渣をエタノール２０lに浸漬し、室温で２４時間静置した後、混合液を吸引濾過して、エタノールを回収した。回収されたエタノール全てを一つにまとめて抽出液とした。抽出液を減圧濃縮し、そこへ、任意の量の蒸留水と任意の量の酢酸エチルを加え、分液ロート内で混合して攪拌した。蒸留水層を除いて、酢酸エチル層のみに対して無水硫酸ナトリウムを加え脱水処理した後、減圧濃縮して、酢酸エチル可溶画分２０．７３ｇを得た。【００５３】
（第二次抽出およびその分画）
酢酸エチル可溶画分のうち２０．２８ｇを珪藻土に吸着させ、シリカゲルを充填したオープンカラムにアプライし、ヘキサンと酢酸エチルとメタノールを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は２００ｍｌずつ分取し、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１乃至１：３の混合比率で溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、分画物Ｆ−５（２５０ｍｇ）を得た。【００５４】
（第二次分画）
抽出物Ｆ−５（２５０ｍｇ）を珪藻土に吸着させ、ＯＤＳを充填したオープンカラムにアプライし、蒸留水とアセトニトリルと酢酸エチルを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は８ｍｌずつ分取し、アセトニトリル：酢酸エチル＝７：３乃至酢酸エチルで溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、分画物Ｇ−１０（２４．４ｍｇ）を得た。【００５５】
（第三次分画）
分画物Ｇ−１０（２４．４ｍｇ）を珪藻土に吸着させ、シリカゲルを充填したオープンカラムにアプライし，クロロホルムとメタノールを任意の混合割合で混合した溶媒、あるいはそれぞれ単独の溶媒を用いて、抽出物を溶出させた。溶出した液は１ｍｌずつ分取し、クロロホルム：メタノール＝４９：１で溶出された分画をまとめ、減圧濃縮して、単離成分２．６ｍｇを得た。【００５６】
（構造解析）
単離した成分は、赤外吸収スペクトル、1ＨＮＭＲスペクトル、13ＣＮＭＲスペクトルを解析した結果、5α,9α-epidioxy-(22E)-ergosta-7,22-diene-3β,6β-diolであることが分かった。
【実施例２】
【００５７】
（１）ヒト肺腺がん細胞の細胞死誘導試験【００５８】
ヒト肺腺がん細胞はＡ５４９細胞を使用した。【００５９】
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞を初回濃度１×１０４個/１００μｌの濃度に調整して平底プレート内で培養した。第三次分画で得られたエルゴステロール誘導体をそれぞれジメチルスルホキシドに溶解させ、濃度が０、２．５、５．０、７．５、１０．０ μｇ/ｍｌになるようにそれぞれ培地で希釈し、培養した細胞に添加した。このときのジメチルスルホキシドの濃度は培地に対して１％だった。当該添加後２４時間経過後、それぞれに細胞増殖測定試薬を添加し、さらに２時間経過後、それぞれの吸光度を測定し、その測定値から細胞生存率を算出した。なお、培地としては１０％牛胎児血清、１％ストレプトマイシン・ペニシリンを含むＲＰＭＩ１６４０を使用した。細胞生存率の算出方法はコントロール(１％ ジメチルスルホキシドを含む細胞培地で培養した細胞群)の吸光度を生存率１００％とし、エルゴステロール誘導体添加群の吸光度の値とコントロールの吸光度の値を比較して算出した。上記細胞生存率を図２に示した。本発明にかかるエルゴステロール誘導体は顕著にヒト肺腺がん細胞に対して細胞死を引き起こした。
【実施例３】
【００６０】
（２）アポトーシス誘導作用の検証【００６１】
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞を初回濃度２×１０５個/２ｍｌで平底プレートに培養し、本発明にかかるエルゴステロール誘導体の濃度が０、１．０、４．０ μｇ/ｍｌなるようにそれぞれ培地で希釈し、その培養したヒト肺腺がん細胞に添加した。２４時間経過後に、TUNEL法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出した。【００６２】
TUNEL法によるアポトーシス誘導作用の検証の結果は、図３に示したとおりで、アポトーシスが誘導された細胞を顕著に検出した。このことにより、本発明にかかるエルゴステロール誘導体が引き起こしたヒト肺腺がん細胞の細胞死は、アポトーシスであることが明確となった。
【実施例４】
【００６３】
(３)他のがん細胞へのアポトーシス誘導作用【００６４】
ヒト肺腺がん細胞以外の細胞として、ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）、ヒト舌がん細胞（ＨＳＣ−３細胞）を使用した。【００６５】
あらかじめ継代培養したヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞、ヒト舌がん細胞を初回濃度２×１０５個/２ｍｌで平底プレート内でそれぞれ培養した。エルゴステロール誘導体が５.０  μｇ/ｍｌになるように培地で希釈した後、平板プレート内で培養したそれぞれの細胞に添加した。２４時間経過後に、ＴＵＮＥＬ法に従い、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞を検出した。【００６６】
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は、ヒト肺腺がん細胞、ヒト子宮頸がん細胞およびヒト舌がん細胞にアポトーシス誘導効果を発揮することが明白となった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明にかかるエルゴステロール誘導体は、肺腺がん、子宮頸がんおよび舌がんに対してアポトーシス誘導を起こさせる効果が期待でき、さらに食用のヒメマツタケから抽出ができるから食経験もあり、また天然素材のため安全性も期待でき、医薬品や健康食品の産業分野で利用することが可能である。
【図１】
0005845280.tif 000004
【図２】
0005845280.tif 000005
【図３】
0005845280.tif 000006
【図４】
0005845280.tif 000007