(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵プロセスにおいてメチオニンを生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中でエシェリキア属の種からの改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンを回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する遺伝子ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの発現が、物理的刺激により誘導される異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあり、該誘導プロモーターが温度誘導プロモーターであり、
該培養工程が温度誘導を行うことを含む、方法。
【請求項２】
メチオニン生産に関与する遺伝子ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの発現が、異種誘導プロモーターの直接的制御下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
温度誘導プロモーターが、λファージの改変レプレッサーにより調節されるプロモーター、プロモーターＰＲまたはＰＲの誘導体、プロモーターＰＬまたはＰＬの誘導体、および温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーターからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記λファージの改変レプレッサーが、λレプレッサー対立遺伝子ｃＩ８５７またはｃＩ  λレプレッサーの別の温度感受性対立遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
改変微生物において遺伝子ｒｅｃＡが欠失している、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子が、異種誘導プロモーターの間接的制御下にあり、該遺伝子が、その発現が誘導プロモーターの制御下にある異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
異種ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７およびＴ３ポリメラーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、その発現が異種プロモーターの直接的または間接的制御下にある少なくとも１つの遺伝子をさらに含んでなり、該遺伝子が、ｃｙｓＫ、ｃｙｓＺ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＣ、ｓｂｐ、ｐｐｃ、ｐｐｓ、ｐｙｃ、ａｃｓ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＦ、ｍｅｔＨ、ｍｅｔＫ、ｍｅｔＬ、ａｓｄ、ａｓｐＣ、ｌｙｓＣ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｐｕｒＵ、オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨおよびｇｃｖＴＨＰ、ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｌｐｄ、ｇｌｙＡ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、ｓｕｃＣ、ｓｕｃＤ、ｐｃｋ、ｍａｅＢ、ｐｏｘＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ｉｌｖＧ、ｉｌｖＭ、ｉｌｖＩ、ｉｌｖＨ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ｔｈｒＢ、ｔｈｒＣ、ｓｄａＡ、ｓｄａＢ、ｓｐｅＤ、ｓｐｅＣ、ａｓｔＡ、ｄａｐＡ、ｍｄｈ、ｍｑｏおよびｇｌｔＡからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子ｔｈｒＡが、トレオニンに対するフィードバック感受性が低減されたｔｈｒＡ対立遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、遺伝子ｍｅｔＡが異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子ｍｅｔＡが、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ変異型対立遺伝子である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、発酵によるメチオニンの生産における誘導プロモーターの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
システイン、ホモシステイン、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの硫黄含有化合物は、細胞代謝にとって重要であり、食品または飼料添加物および医薬品として使用されるべく工業的に製造される。特に、動物が合成することのできない必須アミノ酸であるメチオニンは、多くの身体機能において重要な役割を果たす。タンパク質生合成におけるその役割とは別に、メチオニンは、メチル基転移ならびにセレニウムおよび亜鉛のバイオアベイラビリティに関与している。メチオニンはまた、アレルギーやリウマチ熱のような障害のための治療薬として直接用いられる。しかしながら、生産されるメチオニンの大部分は動物飼料に添加されている。
【０００３】
ＢＳＥおよび鳥インフルエンザの結果としての動物由来タンパク質の使用が減少するに伴い、純粋なメチオニンに対する需要が高まっている。化学的には、Ｄ，Ｌ−メチオニンは、通常、アクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化水素から生産される。しかしながら、ラセミ混合物は、例えば鶏飼料用添加物において、純粋なＬ−メチオニンほど良好には機能しない(Saunderson, C.L., (1985) British Journal of Nutrition 54, 621-633)。純粋なＬ−メチオニンは、ラセミ型メチオニンから、例えばＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニンのアシラーゼ処理によって生産することができるが、生産コストは大幅に増加する。環境問題に関連して純粋なＬ−メチオニンに対する需要が高まりつつあることから、メチオニンの微生物生産は魅力的である。
【０００４】
バイオテクノロジーのプロセスにおける誘導プロモーターの使用は、化学的生合成の分野である。これらのプロモーターは通常、プロピオネート（ＷＯ２００７００５８３７）、亜鉛（ＷＯ２００４０２０６４０）およびアラビノース（ＷＯ１９９８０１１２３１）、または温度（Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Appl Environ Microbiol. 2009 Mar; 75(6):1628-34)）および光によりそれぞれ例示される化学的または物理的刺激に応答する。
【０００５】
メチオニン生産はいくつかの前駆体供給経路に頼っている。効果的なメチオニン生産はこれらの経路の緻密な調整を必要とする。メチオニン生産を最大とするには、プロセス中に特定の重要な酵素の発現を調整できることが有益となり得る。例えば、（ｉ）ある酵素の発現は生産期でのみ必要であり、バイオマスの生成の際には必要なく、または逆の場合もある。また、静止期でのみ有益な酵素もある。従って、誘導プロモーターの使用は、工業レベルでメチオニンを生産する総収率を向上させる上で注目されるものであり得る。
【０００６】
しかしながら、メチオニン代謝経路の複雑性とメチオニン生産の向上のためのこれらの経路の緻密な調整のために、メチオニン生産に関与する遺伝子の発現を制御するための誘導プロモーターの使用は考慮および報告されたことがない。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者らは今般、メチオニン生合成などの複雑な代謝経路に関与する遺伝子の遺伝子発現を調節するために使用される場合に誘導プロモーターが有益であることを見出した。
【０００８】
発明の簡単な説明
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある、メチオニン生産の向上のために改変された微生物に関する。
【００１０】
特定の一実施形態では、遺伝子ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡは異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法であって、下記工程：
炭素源と硫黄源と窒素源とを含んでなる適当な培養培地中で改変微生物を培養する工程、および
該培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する工程
を含んでなり、
該改変微生物において、メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある方法に関する。
【００１２】
本発明によれば、「発酵プロセス」、「発酵」または「培養」とは、炭素源と硫黄源と窒素源とを含有する適当な増殖培地での細菌の増殖を表して互換的に用いられる。
【００１３】
「適当な培養培地」とは、微生物の培養および増殖に適当な培地である。このような培地は、微生物の発酵の分野で培養される微生物によって周知である。
【００１４】
「微生物」とは、細菌、酵母または真菌を表す。好適には、微生物は腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)およびコリネバクテリウム科(Corynebacteriaceae)の中から選択される。より好適には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシェラ属(Klebsiella)、パンテア属(Pantoea)、サルモネラ菌属(Salmonella)またはコリネバクテリウム属(Corynebacterium)の種である。いっそうより好適には、微生物は、大腸菌（Escherichia coli)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)種のいずれかである。
【００１５】
「改変微生物」とは、メチオニン生産を向上させるために改変された微生物であり、メチオニンの生産収率を向上させる目的で遺伝的に改変された微生物を表す。本発明によれば、「向上された」または「向上させる」とは、微生物により生産されるメチオニンの量、特にメチオニン収率（炭素源当たりに生産されるメチオニンの割合）が、対応する非改変微生物に比べて改変微生物で高いことを意味する。通常の改変としては、形質転換および組換えによる微生物への遺伝子欠失の導入、遺伝子置換、ならびに異種遺伝子の発現のためのベクターの導入を含む。
【００１６】
本発明の方法で用いられる改変微生物は、
メチオニン生産を向上させるために改変されていること、および
メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現が誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあること
の双方の特徴を持つ。
【００１７】
「培養培地からメチオニンおよび／またはその誘導体を回収する」とは、メチオニン、およびおそらくはＳ−アシルメチオニンおよびＮ−アシルメチオニン化合物、例えばＮ−アセチルメチオニンおよびＮ−プロピオニルメチオニン、ならびに得られる他のあらゆる誘導体を回収する操作を表す。
【００１８】
「誘導プロモーター」とは、その活性が外部刺激に対して増強または低減され得るプロモーターを表す。刺激は、温度、光、化学物質などの、本来物理的または化学的なものであってよい。
【００１９】
標的遺伝子の誘導は、刺激の直接的または間接的伝達を介して得ることができる。
【００２０】
直接的伝達は、１つの標的遺伝子の発現が誘導プロモーターの制御下にある場合に達成される。
【００２１】
間接的伝達は、誘導プロモーターの制御下にあり、メチオニン生合成に関与する標的遺伝子の発現を駆動する特定のプロモーターを認識する異種ＲＮＡポリメラーゼを用いることにより達成され得る。この場合、誘導プロモーターは標的遺伝子のプロモーターには直接連結されていないが、標的遺伝子の前記プロモーターを転写するＲＮＡポリメラーゼの発現を駆動する。
【００２２】
これらの異種ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは当業者に知られているその他のポリメラーゼである。
【００２３】
「間接的伝達」とは、その隣接する遺伝子の発現に対するある特定の遺伝子の誘導的発現の「極性効果(polar effect)」を意味する。「極性効果」は、該改変遺伝子の下流にある１以上の遺伝子の発現に対する、ある遺伝子の遺伝子改変の影響を表す。
【００２４】
本発明の特定の態様では、メチオニン生産に関与する特定の遺伝子の誘導は、その特定の遺伝子の下流にある遺伝子の誘導をもたらす。
【００２５】
「異種誘導プロモーターの制御下」とは、誘導プロモーターがその遺伝子の天然プロモーターではなく、それと作動可能なように連結されている遺伝子の発現レベルを少なくとも部分的に制御するように導入されたものであることを表す。誘導プロモーターの活性は、生物因子または非生物因子の有無によって誘導される。遺伝子の発現は、当業者に必要に応じてオン、オフが可能である。これらのプロモーターは化学的に調節（テトラサイクリン、ホルモンなどの存在下）されても、または物理的に調節（特に熱または光による）されてもよい。
【００２６】
本発明の特定の実施形態では、メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子の発現は誘導プロモーターの直接的制御下にある。
【００２７】
本発明の第１の態様において、誘導プロモーターは物理的誘導プロモーター、特に、温度誘導プロモーターまたは光誘導プロモーターである。
【００２８】
プロモーターは有利には温度誘導プロモーター（好適には、λファージの改変レプレッサーにより調節される）、プロモーターＰＲまたはＰＲの誘導体、プロモーターＰＬまたはＰＬの誘導体(A genetic switch. Ptashne M. Blackwell Scientific, Cambridge, MA. 1986; A genetic switch: Phage lambda revisited. Ptashne M. Cold Spring Harbor Lab Press. Cold Spring Harbor, NY. 2004; The bacteriophages, Part II: Life of phages, 8. Gene regulatory circuitry of phage λ. Little J. 2nd edition 2004. Richard Calendar.ed. Oxford University Press)、および温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーターである。
【００２９】
レプレッサーは、プロモーター領域の特定の結合部位に結合し、それによりプロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼの接近を制限し、転写の開始または伸長を減じることによって、同族プロモーターからの発現を抑制する。有利には、該レプレッサーはλレプレッサー対立遺伝子ｃＩ８５７(On a thermosensitive repression system in the Escherichia coli lambda bacteriophage. Sussman R, Jacob F. C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. 1962, 254, p1517)またはｃＩ  λレプレッサーの別の温度感受性対立遺伝子である。
【００３０】
本発明の特定の態様では、メチオニン生産のための改変微生物において、ｒｅｃＡをコードする遺伝子が欠失されている。タンパク質ＲｅｃＡは、ｃＩに対してプロテアーゼとして作用することが知られている。従って、ＲｅｃＡをコードする遺伝子の欠失は、λレプレッサーｃＩのタンパク質分解を排除する。
【００３１】
温度誘導プロモーターは有利にはプロモーターＰＲまたは誘導体、およびプロモーターＰＬまたは誘導体の間で選択することができる。
【００３２】
別の実施形態では、温度誘導プロモーターは温度感受性Ｌａｃレプレッサーにより調節される改変ｌａｃプロモーターである。
【００３３】
本発明の第２の態様において、誘導プロモーターは化学的に調節される。特に、プロモーター活性の誘導は炭素異化代謝産物の抑制の変化に結びつけられる。炭素異化代謝産物の抑制により活性化されるプロモーターは、低濃度のグルコースまたはグルコースの不在下で、アクチベーターＣＲＰを介して正の調節を受ける。
【００３４】
有利には、誘導プロモーターは、炭素源または糖アルコールの存在により誘導される。炭素源または糖アルコールにより誘導されるプロモーターの例としては、それぞれアラビノースまたはラフィノースプロモーター、およびマンニトールプロモーターまたはグルシトールプロモーターが挙げられる。
【００３５】
本発明の特定の態様によれば、目的遺伝子の発現は「間接的伝達」を介して調節され、すなわち、メチオニン生産に関与する少なくとも１つの遺伝子は、その発現が誘導プロモーターの制御下にある異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写される。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、異種ＲＮＡポリメラーゼはＴ７、Ｔ３ポリメラーゼから選択される。
【００３７】
本発明によれば、メチオニン生産またはその前駆体の生産に関与する少なくとも１つの遺伝子は、異種誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にあり、従前に説明したように、遺伝子は誘導プロモーターの直接的制御下にあるか、または遺伝子は誘導ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるか、またはその組合せである。
【００３８】
微生物においてメチオニン生産に関与する遺伝子は当技術分野で公知であり、メチオニン特異的生合成経路に関与する遺伝子、ならびに前駆体供給経路に関与する遺伝子およびメチオニン消費経路に関与する遺伝子を含んでなる。
【００３９】
メチオニンの効率的生産には、メチオニン特異的経路およびいくつかの前駆体供給経路の至適化が必要である。メチオニン生産株は特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２、ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００９／０４３８０３およびＷＯ２００９／０４３３７２に記載されており、これらは引用することにより本願の一部とされる。
【００４０】
その阻害剤ＳＡＭおよびメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼ対立遺伝子を過剰発現するメチオニン生産株が特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。この出願にはまた、これらの対立遺伝子と、特許出願ＪＰ２０００／１５７２６７に示唆されているようなメチオニンレギュロンのダウンレギュレーションを担うメチオニンレプレッサーＭｅｔＪ（ＧｅｎＢａｎｋ１７９０３７３）の欠失との組合せも記載されている。さらに、アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼの過剰発現を伴う２つの改変の組合せも特許出願ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている。
【００４１】
遺伝子ｃｙｓＥ、ｍｅｔＨおよびｍｅｔＦの過剰発現は、ＷＯ２００７／０７７０４１に示唆されている。
【００４２】
メチオニン生産を増大させるために、メチオニン生産に関与する下記遺伝子の少なくとも１つを誘導プロモーターの制御下に置くことができる。
【００４３】
ａ）硫黄同化に関与する遺伝子の発現は、有利には誘導プロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼの制御下に置くことができる。
遺伝子      受託番号          機能
cysK         1788754          システインシンターゼ
cysZ        g1788753          cysK の上流のORF
cysN        g1789108          ATPスルフリラーゼ
cysD        g1789109          硫酸アデニリルトランスフェラーゼ
cysC        g1789107          アデニリル硫酸キナーゼ
cysZ         1788753          硫酸輸送
sbp          1790351          周辺質硫酸結合タンパク質
ｂ）補充反応は以下の遺伝子を発現させることにより増強することができる。
ppc          1790393          ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
pps          1787994          ホスホエノールピルビン酸シンターゼ
pyc          CAB13359         ピルビン酸カルボキシラーゼ
（例えば枯草菌(B. subtilis)由来）
ｃ）酢酸消費反応は下記遺伝子を過剰発現させることにより増強することができる。
acs          1790505          アセチルCoAシンセターゼ
ｄ）メチオニン生合成に直接関与する酵素：
metA         1790443          ホモセリンO-トランススクシニラーゼ
metB         1790375          シスタチオニンγ-シンターゼ
metC         1789383          シスタチオニンβ-リラーゼ
metE         2367304          5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸
-ホモシステインS-メチルトランスフェラーゼ
metF         1790377          5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ
metH         1790450          B12依存性ホモシステイン-N5-
メチルテトラヒドロ葉酸トランスメチラーゼ
metK         1789311          メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ
metL         1790376          アスパルトキナーゼII/ホモセリンデヒドロゲナーゼII
ｅ）アスパラギン酸代謝に関与する酵素：
asd          1789841          アスパラギン酸-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ
aspC         1787159          アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
lysC         1790455          アスパルトキナーゼIII
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子ｔｈｒＡおよび／またはｃｙｓＥの少なくとも１つの発現は、誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。
【００４５】
酵素ＴｈｒＡまたはその任意のホモログ（ＭｅｔＬ、ＬｙｓＣ）は、アスパラギン酸から、メチオニンの前駆体であるホモセリンへの変換反応を触媒する。酵素ＣｙｓＥはセリンのＯ−アセチル化を触媒してシステインの直接的前駆体であるＯ−アセチル−セリンを形成し、次に、メチオニン生合成の硫黄供与体として働く。
【００４６】
メチオニンの生産は、特許出願ＷＯ２００４／０７６６５９（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているように、優先的にまたは排他的にＨ２Ｓを用い、従って、Ｏ−スクシニル−ホモセリンからホモシステインを生成する変異型ｍｅｔＢ対立遺伝子を用いることによってさらに増強させることができる。
【００４７】
メチオニン生産のさらなる増強は、特許出願ＷＯ２００９０４３８０３に記載されているように、遺伝子ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦおよび／またはｐｕｒＵの発現を減弱することによっても得ることができる。これもまた、誘導プロモーターを直接的または間接的に用いることによって達成することができる。
【００４８】
本発明はまた、オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭ、ｃｙｓＪＩＨおよびｇｃｖＴＨＰ、ならびに遺伝子ｓｅｒＡ、ｓｅｒＢ、ｓｅｒＣ、ｌｐｄおよびｇｌｙＡが過剰発現されるメチオニン生産株も記載する。これも同様に、誘導プロモーターを直接的または間接的に用いることによって達成することができる。
【００４９】
さらに、メチオニンを分解する経路における遺伝子（下記の一覧を参照）またはメチオニン生産経路を偏向する経路における遺伝子の発現も、誘導プロモーターを直接的または間接的に用いることによって減弱することができる。本明細書において減弱とは、その発現の低減、酵素の安定性の低下、その分解の増大および／または当業者に知られている他の方策などの手段によって酵素の細胞内活性を低減することを表す。これは誘導プロモーターの発現を低減すること、すなわち、誘導プロモーターを誘導する刺激を除去するか、または誘導ＲＮＡポリメラーゼの発現を低減することによって達成することができる。
【００５０】
遺伝子    Genbankエントリー      活性
ackA         1788633          酢酸キナーゼ
pta          1788635          ホスホトランスアセチラーゼ
aceE         1786304          ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1
aceF         1786305          ピルビン酸デヒドロゲナーゼE2
lpd          1786307          ピルビン酸デヒドロゲナーゼE3
sucC         1786948          スクシニル-CoAシンセターゼ、βサブユニット
sucD         1786949          スクシニル-CoAシンセターゼ、αサブユニット
pck          1789807          ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
maeB
poxB         1787096          ピルビン酸オキシダーゼ
ilvB         1790104          アセトヒドロキシ酸シンターゼI、大サブユニット
ilvN         1790103          アセトヒドロキシ酸シンターゼI、小サブユニット
ilvG         1790202          アセトヒドロキシ酸シンターゼII、大サブユニット
1790203
ilvM         1790204          アセトヒドロキシ酸シンターゼII、小サブユニット
ilvI         1786265          アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、大サブユニット
ilvH         1786266          アセトヒドロキシ酸シンターゼIII、小サブユニット
aroF         1788953          DAHPシンセターゼ
aroG         1786969          DAHPシンセターゼ
aroH         1787996          DAHPシンセターゼ
thrB         1786184          ホモセリンキナーゼ
thrC         1786185          トレオニンシンターゼ
sdaA         1788116          セリンデアミナーゼ
sdaB         1789161          セリンデアミナーゼ
speD         1786311          S-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ
speC         1789337          オルニチンデカルボキシラーゼ
astA         1788043          アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ
dapA         1788823          ジヒドロ二ピコリン酸シンターゼ
mdh          1789632          リンゴ酸デヒドロゲナーゼ
mqo          1788539          リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、FAD/NAD(P)-結合ドメイン
gltA         1786939          クエン酸シンターゼ
aceE         1786304          ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、E1
aceF         1786305          ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、E2
【００５１】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子：ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＡの少なくとも１つの発現が誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。別の特定の実施形態では、遺伝子ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡが、誘導プロモーターの直接的または間接的制御下にある。本発明の好ましい実施形態では、ｔｈｒＡ遺伝子の発現が誘導プロモーターの直接的制御下にあり、ｃｙｓＥ遺伝子の発現がそのｔｈｒＡ遺伝子の誘導発現の「極性効果」下にある。本発明の別の好ましい実施形態では、ｔｈｒＡ遺伝子の発現は誘導プロモーターの直接的制御下にあり、ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡ遺伝子の発現がｔｈｒＡ遺伝子の誘導発現の「極性効果」下にある。
【００５２】
特定の実施形態では、３つの遺伝子ｔｈｒＡ、ｃｙｓＥおよびｍｅｔＡが、上記および実施例で開示される温度誘導プロモーターなどの、同じ誘導プロモーターの制御下にある。
【００５３】
本発明において、「ｔｈｒＡ遺伝子」は、天然ｔｈｒＡ遺伝子、またはＷＯ２００５／１０８５６１に記載されているものなど、トレオニンに対するフィードバック感受性が低減されたｔｈｒＡ対立遺伝子を意味する。本発明によれば、「ｍｅｔＡ遺伝子」は、天然ｍｅｔＡ遺伝子、またはＷＯ２００５／１０８５６１に記載されているものなど、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニンに対するフィードバック感受性が低減された酵素をコードするｍｅｔＡ変異型対立遺伝子を意味する。
【００５４】
誘導プロモーターにより制御される遺伝子は、染色体上のその天然の位置にあってもよいし、または天然でない位置に組み込まれてもよい。最適なメチオニン生産のために、誘導プロモーターにより制御される遺伝子を１回または数回組み込む必要がある場合がある。同様に、最適な発現のために、一コピーまたは数コピーの調節遺伝子が必要となる場合がある。レプレッサー遺伝子とプロモーターの種々の比率を用いて発現を緻密に調整することができる。
【００５５】
誘導プロモーターの制御下にある遺伝子は遺伝子座に組み込まれ、その改変がメチオニン生産に悪影響を与えないのが好適である。遺伝子を組み込み得る遺伝子座の例は下記の通りである。
【００５６】
【表１】
0005944323.tif 000002
0005944323.tif 000003
0005944323.tif 000004
0005944323.tif 000005
0005944323.tif 000006
0005944323.tif 000007
0005944323.tif 000008
0005944323.tif 000009
0005944323.tif 000010
0005944323.tif 000011
【００５７】
本発明の記載において、遺伝子およびタンパク質は大腸菌における対応する遺伝子の名称を用いて識別される。しかしながら、特に断りのない限り、これらの名称の使用は本発明に従うより一般的な意味を有し、他の生物、より詳しくは微生物における対応する遺伝子およびタンパク質の総てを包含する。
【００５８】
当業者ならば、ＧｅｎＢａｎｋに示されている既知の遺伝子に関する参照番号を用いて他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳類、植物などにおける等価な遺伝子を決定することができる。この常法は、有利には、他の微生物由来の遺伝子との配列アラインメントを行い、縮重プローブを設計して、他の生物における対応する遺伝子をクローニングすることにより決定することができるコンセンサス配列を使用して行われる。これらの分子生物学の常法は当業者によく知られており、例えば、Sambrook et al. (1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York)に記載されている。
【００５９】
ＰＦＡＭ(アラインメントのタンパク質ファミリーデータベースおよび隠れマルコフモデル(protein families database of alignments and hidden Markov models);
（http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アラインメントを多数集めたものである。各ＰＦＡＭにより、多重アラインメントを視覚化し、タンパク質ドメインを調べ、生物間の分布を評価し、他のデータベースへのアクセスを確保し、既知のタンパク質構造を視覚化することができる。
【００６０】
主要な系統発生系を示す、完全に配列決定されたゲノムからのタンパク質配列を比較することにより、ＣＯＧ（タンパク質のオーソロガス群のクラスター(clusters of orthologous groups of proteins)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）が得られる。各ＣＯＧは、少なくとも３つの系から定義されるので、前に保存されたドメインを同定することができる。
【００６１】
相同配列およびそれらの相同性％を同定する手段は当業者によく知られており、特にＢＬＡＳＴプログラムが挙げられ、このプログラムは、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに利用することができる。次に、得られた配列を、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)またはＭＵＬＴＡＬＩＮ(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。
【００６２】
発酵プロセスにおいてメチオニン、その前駆体または誘導体を生産するための方法は当業者によく知られている。プロセスを至適化するために、硫黄源、炭素源および窒素源の選択などの発酵プロセスの種々の因子を調整することができる。
【００６３】
本発明の好ましい態様では、培養培地に添加される、Ｌ−メチオニンの発酵生産に用いられる硫黄源は、硫酸塩、チオ硫酸塩、硫化水素、ジチオン酸塩、亜ジチオン酸塩、亜硫酸塩、メチルメルカプタン、二硫化ジメチルおよびその他のメチルキャップ亜硫酸塩または種々の供給源の組合せである。
【００６４】
より好適には、培養培地中の硫黄源は硫酸塩もしくはチオ硫酸塩、またはその混合物である。
【００６５】
本発明による「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を助けるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、六炭糖（グルコース、ガラクトースまたはラクトースなど）、五炭糖、単糖類、二糖類（スクロース、セロビオースまたはマルトースなど）、オリゴ糖、糖蜜、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。特に好ましい炭素源はグルコースである。別の好ましい炭素源はスクロースである。
【００６６】
本発明の特定の実施形態では、炭素源は再生可能な供給原料に由来する。再生可能な供給原料は、短期のうちに、その目的生成物への変換を可能とするに十分な量で再生され得る、特定の工業プロセスに必要とされる原料と定義される。
【００６７】
窒素源とは、アンモニウム塩またはアンモニアガスのいずれかに相当する。
【００６８】
窒素源は、アンモニウムまたはアンモニアの形で供給される。
【００６９】
発酵は一般に、少なくとも１つの単純炭素源、および必要であれば代謝産物の生産のための補助基質を含有する、使用する微生物に適合された適当な培養培地の入った発酵槽で行われる。
【００７０】
当業者ならば、本発明による微生物に対する培養条件を定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好適には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、Ｃ．グルタミクムでは約３０℃、大腸菌では約３７℃の温度で発酵される。
【００７１】
大腸菌に対する既知の培養培地の例として、その培養培地はＭ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。
【００７２】
Ｃ．グルタミクムに対する既知の培養培地の例として、その培養培地はＢＭＣＧ培地(Liebl et al., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210)またはRiedel et al. (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3: 573-583)により記載されているものなどの培地と同一または類似の組成であり得る。
【００７３】
本発明はまた、所望により最終産物の一部または全量（０〜１００％）に留まっている発酵液および／またはバイオマスのメチオニン、その前駆体または誘導体を単離する工程を含んでなる、メチオニンの生産方法に関する。
【００７４】
本発明の特定の態様では、培養は、微生物を無機基質、特に、リン酸塩および／またはカリウムに対して制限する、または飢餓状態にするような条件で行われる。
【００７５】
生物が無機基質の制限を受けるとは、その微生物の増殖が、なお弱い増殖を許容しつつ、供給された無機化学物質の量により支配される条件を定義する。
【００７６】
無機基質に対して微生物を飢餓状態にするとは、その無機基質が存在しないために微生物の増殖が完全に停止する条件を定義する。
【００７７】
本発明はまた、上記のような改変の少なくとも１つを含んでなる微生物に関する。
【実施例】
【００７８】
実施例Ｉ：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）（ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
Ｎ−アセチルメチオニンの蓄積が低減されたメチオニン生産株は、特許出願ＷＯ２００７０７７０４１およびＷＯ２００９０４３８０３（参照により本願の一部とされる）に記載されている。
【００７９】
１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ：：Ｋｍ株の構築
ホスホセリンホスファターゼのレベルを高めるため、構成型人工ｔｒｃプロモーターＳｅｒＢを、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ株のｓｅｒＢ遺伝子の上流に付加した。
【００８０】
この人工ｔｒｃプロモーターを付加するために、Datsenko & Wanner (2000)により記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、カナマイシン耐性カセットだけでなく付加的ＤＮＡ領域を、特にその染色体に挿入することを可能とする。この目的で、２つのオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＦ（配列番号０１）およびＰｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＲ（配列番号０２）を用いた（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）。
【００８１】
Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＦ（配列番号０１）
0005944323.tif 000012
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＢの領域の４６２２８１６〜４６２２８７８の配列と相同な領域（大文字）
・Ｔ７ファージ由来のＴ７Ｔｅ転写ターミネーター配列に関する領域（下線の大文字）(Harrington K.J., Laughlin R.B. and Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr 24;98(9):5019-24.)
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
【００８２】
Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＲ（配列番号０２）
0005944323.tif 000013
この配列は以下の領域を有する。
・遺伝子ｓｅｒＢの領域の４６２２９３９〜４６２２８７９の配列と相同な領域（大文字）
・ｔｒｃプロモーター配列に関する領域（斜体の大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（太字の大文字）（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）
【００８３】
これらのオリゴヌクレオチドＰｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＦ（配列番号０１）およびＰｔｒｃ０７−ｓｅｒＢＲ（配列番号０２）を用いて、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、次に、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能とする）。次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下記に定義されるオリゴヌクレオチドｓｅｒＢＦ（配列番号０３）およびｓｅｒＢＲ（配列番号０４）を用いたＰＣＲ分析により確認した。その後、選択された形質転換体をＤＮＡ配列決定法により確認した。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ：：Ｋｍと呼称した。
【００８４】
ｓｅｒＢＦ（配列番号０３）
0005944323.tif 000014
（遺伝子ｓｅｒＢの領域の４６２２７４７〜４６２２７６５の配列と相同）
【００８５】
ｓｅｒＢＲ（配列番号０４）
0005944323.tif 000015
（遺伝子ｓｅｒＢの領域の４６２３００６〜４６２２９８８の配列と相同）
【００８６】
２．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ株の構築
次に、カナマイシン耐性カセットを除去した。カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するリコンビナーゼＦＬＰを有するｐＣＰ２０プラスミドを、エレクトロポレーションによって組換え株ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ：：Ｋｍに導入した。４２℃での一連の培養の後、カナマイシン耐性カセットが存在しないことを、従前に用いたものと同じオリゴヌクレオチドｓｅｒＢＦ（配列番号０３）／ｓｅｒＢＲ（配列番号０４）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢと呼称した。
【００８７】
３．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）株の構築
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣベクターの構築はＷＯ２００９０４３８０３に記載されている。
【００８８】
ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣベクターを、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ株に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）株を得た。
【００８９】
４．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）（ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株の構築
ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１プラスミドは、プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)、ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥおよびｐＦＣ１(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)に由来する。
【００９０】
ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥの構築はＷＯ２００７０７７０４１に記載されている。
プラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１の構築のため、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ領域およびＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１領域をそれぞれオーバーラッピングＰＣＲによって得た後、一緒にｐＣＬ１９２０ベクターにクローニングした。
【００９１】
まず、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）領域を、下記のオリゴヌクレオチドＡｐａＩ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−Ｆ−１（配列番号０５）およびＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｒ−２（配列番号０６）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/およびhttp://www.genome.jp/dbget-bin/www_bfind?C.acetobutylicum上に参照配列）を用いることにより、ｐＦＣ１ベクターからＰＣＲ増幅した。次に、ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ領域を、オリゴヌクレオチドＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｆ−３（配列番号０７）およびｃｙｓＥ−Ｒ−４（配列番号０８）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用いて、ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥプラスミドからＰＣＲ増幅した。
【００９２】
オリゴヌクレオチドＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｒ−２（配列番号０６）およびＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｆ−３（配列番号０７）は双方とも３２ｂｐの長いオーバーラッピング配列を有するように設計された。このオーバーラッピング配列のために、第三の工程では、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ領域は、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）のＰＣＲ産物とｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥのＰＣＲ産物を混合することにより、オリゴヌクレオチドＡｐａＩ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−Ｆ−１（配列番号０５）およびｃｙｓＥ−Ｒ−４（配列番号０８）を用いてＰＣＲ増幅した。次に、このＰＣＲ産物をｐＳＣＢ(Stratagene)にクローニングし、得られたベクターを配列決定により確認し、ｐＳＣＢ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥと呼称した。
【００９３】
ＡｐａＩ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−Ｆ−１（配列番号０５）
0005944323.tif 000016
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＡｐａＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
・ＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）に関する領域（大文字）
・λバクテリオファージ由来ｃＩ８５７遺伝子の３’末端と相同な領域（太字の大文字）
【００９４】
ＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｒ−２（配列番号０６）
0005944323.tif 000017
この配列は以下の領域を有する。
・ｔｈｒＡ遺伝子の５’末端（１塩基（太字斜体の大文字）を除く３３７〜３４８）と相同な領域（太字の大文字）
・＊（−３５）型ＰＲ（−３５コンセンサスを得るために−３５ボックスがＴＴＧＡＣＴからＴＴＧＡＣＡへ改変されている変異型）を得るための１塩基（斜体の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（大文字）
・ＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｆ−３オリゴヌクレオチドとのオーバーラッピング領域（下線の大文字）
【００９５】
ＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｆ−３（配列番号０７）
0005944323.tif 000018
この配列は以下の領域を有する。
・λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（大文字）
・ｔｈｒＡ遺伝子の５’末端（１塩基（太字斜体の大文字）を除く３３７〜３７７）と相同な領域（太字の大文字）
・ＰλＲ−ｔｈｒＡ−Ｒ−２オリゴヌクレオチドとのオーバーラッピング領域（下線の大文字）
【００９６】
ｃｙｓＥ−Ｒ−４（配列番号０８）
0005944323.tif 000019
（ｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥプラスミドのｃｙｓＥ下流領と相同）
これらのｔｈｒＡ＊１遺伝子およびｃｙｓＥ遺伝子を低コピーベクターに導入するため、ｐＳＣＢ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥベクターをＢｓｒＢＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ断片をベクターｐＣＬ１９２０のＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ベクターｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥを得た。
【００９７】
次に、ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１領域を、オーバーラッピングＰＣＲによりＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１株から増幅した。まず、ＰｇａｐＡプロモーターを、オリゴヌクレオチドＳｍａＩ−ＰｇａｐＡ−Ｆ（配列番号０９）およびＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１０）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用いてＰＣＲ増幅した。次に、ｍｅｔＡ＊１１遺伝子を、オリゴヌクレオチドＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｆ（配列番号１１）およびＢａｍＨＩ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１２）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１０）およびＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｆ（配列番号１１）は双方とも、それらの全配列がオーバーラップするように設計された。この特殊性のため、第三の工程では、ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１領域は、ｍｅｔＡ＊１１のＰＣＲ産物とＰｇａｐＡのＰＣＲ産物を混合することにより、オリゴヌクレオチドＳｍａＩ−ＰｇａｐＡ−Ｆ（配列番号０９）およびＢａｍＨＩ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１２）を用いてＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理した後、ベクターｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥの平滑末端ＢａｍＨＩ部位にクローニングするために、消化断片を平滑末端化した。得られたベクターを配列決定により確認し、ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１と呼称した。
【００９８】
ＳｍａＩ−ＰｇａｐＡ−Ｆ（配列番号０９）
0005944323.tif 000020
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＳｍａＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
・大腸菌(Escherichia coli)のＰｇａｐＡプロモーター配列の１８６０６３９〜１８６０６６１と相同な領域（大文字）
【００９９】
ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１０）
0005944323.tif 000021
この配列は以下の領域を有する。
・ｍｅｔＡ遺伝子の４２１２３３５〜４２１２３０３と相同な領域（太字の大文字）
・ＰｇａｐＡプロモーター配列の１８６０７９４〜１８６０７６１と相同な領域（大文字）
【０１００】
ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｆ（配列番号１１）
0005944323.tif 000022
この配列は以下の領域を有する。
・ｍｅｔＡ遺伝子の４２１２３３５〜４２１２３０３と相同な領域（太字の大文字）
・ＰｇａｐＡプロモーター配列の１８６０７９４〜１８６０７６１と相同な領域（大文字）
【０１０１】
ＢａｍＨＩ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｒ（配列番号１２）
0005944323.tif 000023
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＢａｍＨＩ部位を担持する領域（下線の大文字）
・ＥｃｏＲＩ部位を担持する領域（斜体の大文字）
・ｍｅｔＡ遺伝子配列の４２１３２４８〜４２１３２１８と相同な領域（太字の大文字）
【０１０２】
最後に、ベクターｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）株に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）（ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）株を得た。
【０１０３】
５．温度依存的メチオニン生産の評価
株１：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ（ｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣ）（ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１）
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最小培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））中で、３０℃で２１時間増殖させた。これを用いて、培地ＰＣ１においてＯＤ６００が０．２となるよう５０ｍＬ培養物に植菌を行った。培養温度は３０℃または３７℃のいずれかとした。培養物のＯＤ６００が５〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。各条件につき３反復を行った。
【０１０４】
表１：最小培地の組成（ＰＣ１）
【表２】
0005944323.tif 000024
【０１０５】
表２：種々の培養条件下で株１によりバッチ培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（Ｎ＝反復回数）。
【表３】
0005944323.tif 000025
【０１０６】
細胞外メチオニン濃度は、ＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。残留グルコース濃度は屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は次のように表した。
【数１】
0005944323.tif 000026
【０１０７】
表２に示されるように、培養プロセス中の遺伝子ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの発現の温度誘導は、メチオニンの生産量を増大させる。培養プロセス中の構成的発現で得られるメチオニン収率は低い。
【０１０８】
表３は、誘導時にＨＤＨおよびＳＡＴの活性が高まることを示す。ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの構成的発現は非誘導条件と誘導条件の間のレベルのＨＤＨおよびＳＡＴ活性をもたらし、低いメチオニン収率のある部分を説明する。タンパク質の細胞因子が構成的発現時にこれらの活性に影響及ぼし、これらの活性を低下させる可能性が最も高い。結論として、これらの結果は、ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの誘導がメチオニン収率の引き上げに真に有益であることを示す。
表３：ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ）活性およびセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ）活性を上記培養において測定し、ｍＵＩ／ｍｇ  ＤＷで示した。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した（Ｎ＝反復回数）。
【０１０９】
【表４】
0005944323.tif 000027
in vitroにおいて酵素活性を測定するために、大腸菌株を上記のように最小培地で培養した。
【０１１０】
ＳＡＴ活性の測定は、ＷＯ２００７０７７０４１に記載されている。
【０１１１】
in vitroにおいてＨＤＨ活性を測定するために、大腸菌細胞を冷２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）に再懸濁させ、氷上で音波処理を施した（Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ、７０Ｗ）。遠心分離の後、上清に含まれるタンパク質を定量した(Bradford, 1976)。１０μＬの抽出液（１．５μｇ／ｍＬタンパク質）を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋および２５ｍＭ  Ｌ−ホモセリン中、３０℃で１０分間アッセイした。Ｌ−ホモセリンの存在下でのＮＡＤＰ＋の減少を３４０ｎｍにて３０分間、分光光度の測定により追跡する。
【０１１２】
実施例ＩＩ：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株の構築
Ｎ−アセチルメチオニン蓄積が低減されたメチオニン生産株は、特許出願ＷＯ２００７０７７０４１およびＷＯ２００９０４３８０３（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１１３】
１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株の構築
プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦは、プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１(New England BioLabs; Kim et al, 1996, Genomics, 34, 231-218)およびｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１（上記）に由来する。
【０１１４】
まず、ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ領域（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎａｇｅ部位のためのＳＭＣ）を、下記のオリゴヌクレオチドＳｎａＢＩ−ｔｈｒＡ−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−Ｆ（配列番号１３）およびｃｙｓＥ−Ｒ（配列番号１４）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用いることにより、ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１プラスミドからＰＣＲ増幅した。
【０１１５】
ＳｎａＢＩ−ｔｈｒＡ−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−Ｆ（配列番号１３）
0005944323.tif 000028
この配列は以下の領域を有する。
・ｔｈｒＡ遺伝子の３’末端（２７６５〜２７９９）と相同であり（小文字）、ＳｎａＢＩ制限部位（斜体小文字）を担持する領域
・ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位（斜体太字の文字）を担持するＳＭＣ領域に関する領域（太字の文字）
・ｃｙｓＥ遺伝子の５’上流領域（３７８０７９６〜３７８０８１９）と相同な領域（大文字）
【０１１６】
ｃｙｓＥ−Ｒ（配列番号１４）
0005944323.tif 000029
（ｃｙｓＥ遺伝子の３７８０２２６〜３７８０２４３と相同）
【０１１７】
ＰＣＲ増幅した断片ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥをＳｎａＢＩおよびＳｔｕＩで制限酵素処理し、消化断片をプラスミドｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１のＳｎａＢＩ／ＳｔｕＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１と呼称した。
【０１１８】
次に、ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ領域を、下記のオリゴヌクレオチドＳｆｏＩ−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ＮｄｅＩ−ｔｈｒＡ−Ｆ（配列番号１５）およびｍｅｔＡ−Ｔ７ＴΦ−ＳｆｏＩ−Ｒ（配列番号１６）（ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=21516上に参照配列）を用いることにより、ｐＣＬ１９２０−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＳＭＣ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１プラスミドからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ産物をｐＳＣＢベクター(Stratagene)にクローニングした。得られたベクターを配列決定により確認し、ｐＳＣＢ−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦと呼称した。このＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ領域をシングルコピーベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１に導入し、ｐＳＣＢ−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦをＳｆｏＩにより制限酵素処理し、ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ断片をベクターｐＢｅｌｏＢＡＣ１１の平滑末端化ＮｏｔＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦを得た。
【０１１９】
ＳｆｏＩ−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ＮｄｅＩ−ｔｈｒＡ−Ｆ（配列番号１５）
0005944323.tif 000030
この配列は以下の領域を有する。
・ＳｆｏＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・Ｔ７バクテリオファージのＴ７ｐ４５（１０Ａ）遺伝子のプロモーター領域（２２８５８〜２２９６７）と相同な領域（小文字）
・ｔｈｒＡ遺伝子（１塩基（太字下線の大文字）を除く３３７〜３５９）と相同な領域（太字の大文字）
【０１２０】
ｍｅｔＡ−Ｔ７ＴΦ−ＳｆｏＩ−Ｒ（配列番号１６）
0005944323.tif 000031
この配列は以下の領域を有する。
・ＳｆｏＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・Ｔ７バクテリオファージのＴ７ｐ４５（１０Ａ）遺伝子の転写ターミネーター領域（２４１１１〜２４２１８）と相同な領域（小文字）
・ｍｅｔＡ遺伝子（４２１３２０８〜４２１３２３２）と相同な領域（太字の大文字）
【０１２１】
最後に、このプラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦを、エレクトロポレーションによってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ株に導入し、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株を得た。
【０１２２】
２．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＫＤ４６）株の構築
ｍａｌＳ領域を欠失させてＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７領域に置き換えるため、Datsenko & Wanner (2000)に記載されている相同組換え戦略を用いた。この戦略は、考慮する領域の大部分を欠失させるとともに、カナマイシン耐性カセットと付加的ＤＮＡを挿入することを可能とする。この目的で、下記のプラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍを構築した。
【０１２３】
このｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：ＫｍプラスミドはプラスミドｐＵＣ１８(Norrander et al., 1983, Gene 26,101-106)およびｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＳＭＣ：：Ｋｍ（上記）、ｐＡＲ１２１９(Sigma)、ならびにｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７（Geneartにより合成、下記）に由来する。
【０１２４】
２．１．プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＳＭＣ：：Ｋｍの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＳＭＣ：：Ｋｍの構築のために、ｍａｌＳの上流領域（ｕｐｍａｌＳ）、多重クローニング部位（ＳＭＣ）およびカナマイシンカセット（Ｋｍ）をオーバーラッピングＰＣＲによって得、ｍａｌＳの下流領域（ｄｏｗｎｍａｌＳ）を増幅した後にクローニングした。
【０１２５】
まず、ｕｐｍａｌＳ領域を、下記のオリゴヌクレオチドＨｉｎｄＩＩＩ−ｕｐｍａｌＳ−Ｆ−１（配列番号１７）およびｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｒ−２（配列番号１８）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用いて、ＭＧ１６５５大腸菌ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。次に、Ｋｍ−ＳＭＣ領域を、オリゴヌクレオチドｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｆ−３（配列番号１９）およびＫｍ−ＳＭＣ−Ｒ−４（配列番号２０）を用いて、ｐＫＤ４プラスミド(Datsenko & Wanner,2000)からＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｒ−２（配列番号１８）およびｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｆ−３（配列番号１９）は双方とも４５ｂｐの長いオーバーラッピング配列を有するように設計された。このオーバーラッピング配列のために、第三の工程では、ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−ＳＭＣ領域は、ｕｐｍａｌＳのＰＣＲ産物とＫｍ−ＳＭＣのＰＣＲ産物を混合することにより、オリゴヌクレオチドＨｉｎｄＩＩＩ−ｕｐｍａｌＳ−Ｆ−１（配列番号１７）およびＫｍ−ＳＭＣ−Ｒ−４（配列番号２０）を用いてＰＣＲ増幅した。その後、このＰＣＲ産物をｐＳＣＢ(Stratagene)にクローニングし、得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＳＣＢ−ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−ＳＭＣと呼称した。
【０１２６】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ｕｐｍａｌＳ−Ｆ−１（配列番号１７）
0005944323.tif 000032
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・ｍａｌＳ遺伝子の上流領域（３７３４６２０〜３７３４６４１）と相同な領域（大文字）
【０１２７】
ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｒ−２（配列番号１８）
0005944323.tif 000033
この配列は以下の領域を有する。
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（小文字）（Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列）
・ｍａｌＳ遺伝子の上流領域（３７３５８３６〜３７３５８６０）と相同な領域（大文字）
【０１２８】
ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−Ｆ−３（配列番号１９）
0005944323.tif 000034
この配列は以下の領域を有する。
・ｍａｌＳ遺伝子の上流領域（３７３５８３６〜３７３５８６０）と相同な領域（大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（小文字）（Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列）
【０１２９】
Ｋｍ−ＳＭＣ−Ｒ−４（配列番号２０）
0005944323.tif 000035
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＡｐａＩ制限部位を担持するＳＭＣに関する領域（斜体の大文字）
・カナマイシン耐性カセットの増幅に関する領域（小文字）（Datsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列）
【０１３０】
次に、このｐＳＣＢ−ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−ＳＭＣプラスミドをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し、ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−ＳＭＣ断片をベクターｐＵＣ１８のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、ベクターｐＵＣ１８−ｕｐｍａｌＳ−Ｋｍ−ＳＭＣを得た。
【０１３１】
その後、ｄｏｗｎｍａｌＳ領域を、下記のオリゴヌクレオチドｄｏｗｎｍａｌＳ−Ｆ−１（配列番号２１）およびｄｏｗｎｍａｌＳ−Ｒ−２（配列番号２２）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）を用い、ＭＧ１６５５大腸菌ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。その後、このＰＣＲ産物をｐＳＣＢ(Stratagene)にクローニングし、得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＳＣＢ−ｄｏｗｎｍａｌＳと呼称した。
【０１３２】
ｄｏｗｎｍａｌＳ−Ｆ−１（配列番号２１）
0005944323.tif 000036
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・ｍａｌＳ遺伝子の下流領域（３７３７０２０〜３７３７０４４）と相同な領域（小文字）
【０１３３】
ｄｏｗｎｍａｌＳ−Ｒ−２（配列番号２２）
0005944323.tif 000037
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（大文字）
・ＥｃｏＲＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・ｍａｌＳ遺伝子の下流領域（３７３８３７２〜３７３８３９８）と相同な領域（小文字）
【０１３４】
次に、このｐＳＣＢ−ｄｏｗｎｍａｌＳプラスミドをＥｃｏＲＩにより制限酵素処理し、ｄｏｗｎｍａｌＳ断片をベクターｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ベクターｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＳＭＣ：：Ｋｍを得た。
【０１３５】
２．２．プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍの構築のために、ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７（Geneartにより合成）中に存在するＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７領域（下記）をＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにより制限酵素処理し、断片をプラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＳＭＣ：：ＫｍのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位にサブクローニングし、プラスミドｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７：：Ｋｍを得た。次に、このＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７領域を、下記のオリゴヌクレオチドＡｖｒＩＩ−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−Ｆ（配列番号２４）およびＴ７ＲＮＡｐｏｌ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＴＴ０７−ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−Ｒ（配列番号２５）（ウェブサイトhttp://ecogene.org/およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=21516に参照配列）を用い、ベクターｐＡＲ１２１９(Sigma)から増幅した。次に、このＰＣＲ産物をＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩにより制限酵素処理し、その断片を部分的にＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドにクローニングし、ｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍプラスミドを得、これをＤＮＡ配列決定法により確認した。
【０１３６】
ｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＴＯＰＯ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７（配列番号２３）中に存在するＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ＳＭＣ−ＴＴ０７領域：
0005944323.tif 000038
この配列は以下の領域を有する。
・制限部位ＡｐａＩ、ＰａｃＩ、ＡｖｒＩＩおよびＢａｍＨＩを担持する領域（斜体の小文字）
・ＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同な、クロストリジウム・アセトブチリクム由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）（ＴＴａｄｃ）と相同な領域
・いくつかの制限部位を作出するまたは欠失させる目的でコドン使用変化（斜体の大文字）を担持するｃＩ８５７遺伝子（ＣＩ８５７＊）と相同な領域（大文字）
・＊（−３５）型ＰＲ（−３５コンセンサスを得るために−３５ボックスがＴＴＧＡＣＴからＴＴＧＡＣＡへ改変されている変異型）（ＰλＲ＊（−３５））を得るための１塩基（斜体の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（大文字）
・リボソーム結合部位（ＲＢＳ０１）に関する領域（下線太字の大文字）
・ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位を担持する領域（ＳＭＣ）（下線斜体の大文字）
・Ｔ７Ｔｅ転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24)（ＴＴ０７）に関する領域
【０１３７】
ＡｖｒＩＩ−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−Ｆ（配列番号２４）
0005944323.tif 000039
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＡｖｒＩＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・ＰλＲ０３変異型ＰＲプロモーターを得るための２塩基（斜体の太字の大文字）を除き、λバクテリオファージＰＲプロモーターと相同な領域（太字の大文字）
・リボソーム結合部位（下線の大文字）
・バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ７ｐ０７遺伝子）の５’末端（３１７１〜３１９８）と相同な領域（太字の小文字）
【０１３８】
Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＴＴ０７−ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−Ｒ（配列番号２５）
0005944323.tif 000040
この配列は以下の領域を有する。
・余分な塩基を含む領域（小文字）
・ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を担持する領域（斜体の大文字）
・Ｔ７Ｔｅ転写ターミネーター配列(Harrington et al., 2001, PNAS, 98(9), 5019-24)に関する領域（太字の大文字）
・ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位を担持する領域（下線斜体の大文字）
・バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ７ｐ０７遺伝子）の３’末端（５８０１〜５８２２）と相同な領域（太字の小文字）
【０１３９】
２．３．ｍａｌＳ領域の、ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７領域による置換
最後に、ｍａｌＳ領域を欠失させてＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７領域に置き換えるために、ｐＵＣ１８−ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：ＫｍプラスミドをＳｃａＩおよびＥｃｏＲＶにより制限酵素処理し、ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片を、エレクトロポレーション(electroportation)によってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１（ｐＫＤ４６）株に導入した（ここで、発現されるＲｅｄリコンビナーゼ酵素が相同組換えを可能とする）。次に、このカナマイシン耐性形質転換体を選択し、ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ断片の挿入を、オリゴヌクレオチドｍａｌＳ−Ｆ（配列番号２６）、Ｋｍ−Ｒ（配列番号２７）、Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−Ｆ（配列番号２８）およびｍａｌＳ−Ｒ（配列番号２９）（ウェブサイトhttp://www.ecogene.org/およびhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=genome&Cmd=ShowDetailView&TermToSearch=10461&window=7553&begin=1#protmap；およびDatsenko & Wanner, 2000, PNAS, 97, 6640-6645に参照配列）を用いたＰＣＲ分析により確認した。この株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍと呼称した。
ｍａｌＳ−Ｆ（配列番号２６）：
0005944323.tif 000041
（ｍａｌＳ領域の３７３４２８０〜３７３４２９９と相同）
【０１４０】
Ｋｍ−Ｒ（配列番号２７）：
0005944323.tif 000042
（ｐＫＤ４ベクターのカナマイシン耐性カセットと相同）
Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−Ｆ（配列番号２８）：
0005944323.tif 000043
（バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｔ７ｐ０７遺伝子）の５２７４〜５２９３と相同）
ｍａｌＳ−Ｒ（配列番号２９）：
0005944323.tif 000044
（ｍａｌＳ領域の３７３８４５３〜３７３８４７１と相同）
【０１４１】
３．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株の構築
ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株において、ｍａｌＳ領域を欠失させてＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡＰｏｌ−ＴＴ０７領域に置換するために、ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ構築物を、Ｐ１ファージ形質導入（下記参照）によってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ株からＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株に移入した。カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ領域の挿入を、従前に記載されているオリゴヌクレオチドｍａｌＳ−Ｆ（配列番号２６）、Ｋｍ−Ｒ（配列番号２７）、Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−Ｆ（配列番号２８）およびｍａｌＳ−Ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲ分析により確認した。保持した株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）と呼称した。
【０１４２】
Ｐ１ファージ溶解液(phage lysate P1)の調製：
・カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、グルコース（０．２％）およびＣａＣｌ２（５ｍＭ）を添加した１０ｍＬのＬＢの、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍの一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３０℃で１時間インキュベートする。
・ＭＧ１６５５株で調製されたＰ１ファージ溶解液１００μＬ（約１．１０９ファージ／ｍＬ）を添加する。
・総ての細胞が溶解するまで３０℃で３時間振盪する。
・２００μＬのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移し、２００μＬのクロロホルムを加える。
・溶解液を４℃で保存する。
【０１４３】
形質導入：
・ＬＢ培地中のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株の一晩培養物５ｍＬを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍＬの１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５ｍＭ  ＣａＣｌ２に細胞ペレットを懸濁させる。
・対照試験管：１００μＬの細胞
１００μＬのＰ１ファージＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ株
・供試試験管：１００μＬの細胞＋１００μＬのＰ１ファージＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ株
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μＬの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３０℃で１時間インキュベートする。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を添加したＬＢディッシュ上に拡げる。
・３０℃で一晩インキュベートする。
【０１４４】
４．温度依存的メチオニン生産の評
株２：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ＤｍｅｔＪ  ＤｐｙｋＦ  ＤｐｙｋＡ  ＤｐｕｒＵ  ＤｙｎｃＡ  ＤｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７＊−ＰλＲ０３−ＲＢＳ０１−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ−ＴＴ０７：：Ｋｍ（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７−ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ）株
前培養条件および培養条件は上記の実施例１に記載されている。スペクチノマイシンの代わりにカナマイシンを用いた。培養温度は３０℃または３４℃のいずれかとした。
表４：３０℃および３４℃で株２によりバッチ培養にて生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の厳密な定義については上記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す。
【０１４５】
【表５】
0005944323.tif 000045
ｔｈｒＡおよびｃｙｓＥの誘導はメチオニンの生産量を高める。これはＨＤＨおよびＳＡＴの２つの活性の分析により確認される。両活性とも３４℃に変更した際に増強される。
表５：ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ、ｔｈｒＡ＊１）活性およびセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ、ｃｙｓＥ）活性を上記培養において測定し、ｍＵＩ／ｍｇタンパク質で表した。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した（Ｎ＝反復回数）。
【０１４６】
【表６】
0005944323.tif 000046
【０１４７】
実施例ＩＩＩ：下記の実施例ＩＶおよびＶで試験する温度誘導性株の構築
１．プロトコール
いくつかのプロトコールを用いてメチオニン生産株を構築したが、これらを下記の実施例に記載する。
【０１４８】
プロトコール１：相同組換えによる染色体改変および組換え体の選択(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000)
特定の染色体遺伝子座における対立遺伝子置換または遺伝子破壊は、Datsenko. & Wanner (2000)により記載されているように相同組換えによって行った。Ｆｌｐ認識部位が隣接したクロラムフェニコール（Ｃｍ）耐性ｃａｔ遺伝子、カナマイシン（Ｋｍ）耐性ｋａｎ遺伝子、ゲンタマイシン（Ｇｔ）耐性ｇｍ遺伝子またはテトラサイクリン（Ｔｃ）耐性ｔｅｔ遺伝子を、ＰＣＲにより、鋳型としてそれぞれｐＫＤ３またはｐＫＤ４、ｐ３４Ｓ−Ｇｍ(Dennis et Zyltra, AEM july 1998, p 2710-2715)またはｐＬＯＩ２０６５(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)プラスミドを用いることで増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いて、λＲｅｄ（γ、β、ｅｘｏ）リコンビナーゼを発現するプラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント大腸菌株を形質転換した。次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、表２に一覧化されている適当なプライマーを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１４９】
これらのｃａｔ、ｋａｎ、ｇｍおよびｔｃ耐性遺伝子は、ｐＣＰ２０プラスミドを担持するクローンをＬＢ上、３７℃で培養した後、３０℃で抗生物質耐性の欠如を調べたこと以外は、Datsenko. & Wanner (2000)に記載されているように、プラスミドｐＣＰ２０を用いることにより除去した。次に、抗生物質感受性クローンを、表２に一覧化されているプライマーを用いたＰＣＲにより確認した。
【０１５０】
プロトコール２：Ｐ１ファージの形質導入
染色体改変をＰ１形質導入により、所与の大腸菌レシピエント株に移入した。このプロトコールは、（ｉ）耐性関連の染色体改変を含むドナー株のファージ溶解液の調製と、（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の感染、の２工程から構成される。
【０１５１】
ファージ溶解液の調製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌまたはＫｍ  ５０μｇ／ｍｌまたはＧｔ  １０μｇ／ｍＬまたはＴｅｔ  １０μｇ／ｍＬ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中、目的の染色体改変を有するＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを植菌する。
・振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
・ドナーＭＧ１６５５株で調製されたＰ１ファージ溶解液１００μｌ（約１×１０９ファージ／ｍＬ）を添加する。
・３７℃で３時間、細胞が完全に溶解するまで振盪する。
・２００μＬのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける。
・４５００ｇで１０分間遠心分離して細胞残渣を除去する。
・上清を滅菌試験管に移す。
・溶解液を４℃で保存する。
【０１５２】
形質導入
・ＬＢ培地中で培養した大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分間遠心分離する。
・２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭに細胞ペレットを懸濁させる。
・１００ｍｌの細胞に、染色体に改変を伴うＭＧ１６５５株のＰ１ファージ１００μｌ（供試試験管）および対照試験管としてＰ１ファージを含まない１００μｌ細胞および細胞を含まない１００μｌのＰ１ファージを感染させる。
・振盪せずに３０℃で３０分間インキュベートする。
・各試験管に１００μＬの１Ｍクエン酸ナトリウムを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍＬのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベートする。
・７０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。
・ＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌまたはＫｍ  ５０μｇ／ｍｌまたはＧｔ  １０μｇ／ｍＬまたはＴｅｔ  １０μｇ／ｍＬに播種する。
・３７℃で一晩インキュベートする。
【０１５３】
その後、抗生物質耐性形質導入体を選択し、突然変異遺伝子座の染色体構造を、表２に一覧化されている適当なプライマーを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１５４】
表６：以下の実施例に見られる中間株および生産株の遺伝子型および対応番号の一覧
【表７】
0005944323.tif 000047
１．株３：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１の構築
メチオニン生産株３（表６）は特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されている。これらの出願は引用することにより本願の一部とされる。
【０１５５】
２．株４：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築
特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体改変を、プロトコール２に従い、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ株からのＰ１ファージ溶解液を用いて株３（表６）に形質導入した。
【０１５６】
クロラムフェニコール耐性形質導入体を選択し、ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ染色体改変の存在を、Ｏｍｅ１７０７−ＤｗｃａＭ＿ｖｅｒｉｆ＿Ｆ（配列番号３０）およびＯｍｅ１７０８−ＤｗｃａＭ＿ｖｅｒｉｆ＿Ｒ（配列番号３１）（表７）を用いたＰＣＲにより確認した。得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ株を株４（表１）と呼称した。
【０１５７】
３．株５：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ  ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃの構築
【０１５８】
３．１．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃは、上記のプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＴｃおよびｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣ、下記のｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２、およびｐＬＯＩ２０６５(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)に由来する。
【０１５９】
３．１．１．ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃは、上記のｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２、ｐＬＯＩ２０６５(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)、および特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍに由来する。
【０１６０】
プラスミドｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２の構築
ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２は、GeneArt(http://www.geneart.com/)により合成されたプラスミドｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊１−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２およびｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊３−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２に由来する。ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊１−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２断片およびＴＴａｄｃ−ＣＩ＊３−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２断片をGeneArtからのプラスミドｐＭＡ−ＲＱのＳｆｉＩ部位にクローニングした。これらは下記の配列を含む。
【０１６１】
ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊１−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２（配列番号３２）
0005944323.tif 000048
この配列において
・下線の小文字は、ＳｆｉＩおよびＡｓｃＩ制限部位に相当する。
・太字の小文字は、逆配向のＲＢＳ０１＊２配列(TAAGGAGGTTATAA)およびＰｓｉＩ制限部位に相当する。
・斜体の大文字は、λバクテリオファージＰＲプロモーター（ＰλＲ＊（−３５）(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148))と相同である。
・大文字は、ヌクレオチドＴ６７がＣ６７に変化して１アミノ酸変異Ｔｙｒ２３Ｈｉｓを生じている(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)、λバクテリオファージのレプレッサータンパク質ｃＩの配列に相当する。この配列をｃＩ＊１と呼称した。
・太字の大文字は、逆配向のＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同なクロストリジウム・アセトブチリクム由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）と相同である。
・下線の大文字は、ＡｐａＩ、ＰａｃＩおよびＳｆｉＩに相当する。
【０１６２】
ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊３−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２（配列番号３３）
0005944323.tif 000049
この配列において
・下線の小文字は、ＳｆｉＩおよびＡｓｃＩ制限部位に相当する。
・太字の小文字は、逆配向のＲＢＳ０１＊２配列(TAAGGAGGTTATAA)およびＰｓｉＩ制限部位に相当する。
・斜体の大文字は、λバクテリオファージＰＲプロモーター（ＰλＲ＊（−３５）、(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)）と相同である。
・大文字は、ヌクレオチド１９６−ＣＴＴＧＣＧ−２０１が１９６−ＧＣＧＡＣＡ−２０１に変化して２アミノ酸変異Ｌｅｕ６６ＡｌａおよびＡｌａ６７Ｔｈｒを生じている(Mermet-Bouvier & Chauvat, 1994, Current Microbiology, vol. 28, pp 145-148)、λバクテリオファージのレプレッサータンパク質ｃＩの配列に相当する。この配列をｃＩ＊３と呼称した。
・太字の大文字は、逆配向のＴＴａｄｃ転写ターミネーター配列（ｐＳＬＯ１メガプラスミドの１７９８４７〜１７９８０７と相同なクロストリジウム・アセトブチリクム由来ａｄｃ遺伝子の転写ターミネーター）と相同である。
・下線の大文字は、ＡｐａＩ、ＰａｃＩおよびＳｆｉＩに相当する。
ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２を構築するために、上記のｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊３−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２から精製したＸｍｎＩ／ＮｓｉＩ断片ＮｓｉＩ−ＣＩ＊３−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２−ＸｍｎＩを、上記のプラスミドｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊１−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２のＸｍｎＩ部位とＮｓｉＩ部位の間にクローニングし、ｃＩタンパク質レプレッサーの野生型対立遺伝子を作出した。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２と呼称した。
【０１６３】
プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍの構築
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍプラスミドは、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ、および上記のｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２に由来する。
【０１６４】
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍを構築するために、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理し、ｐＭＡ−ＲＱ−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２から精製したＡｐａＩＩ／ＰｓｉＩ断片ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）を、プラスミドｐＵＣ１８−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍのＳｆｏＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを制限酵素処理により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍと呼称した。
【０１６５】
最後に、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃを構築するために、ＦＲＴ−Ｔｃ−ＦＲＴ耐性カセットを、鋳型としてｐＬＯＩ２０６５を用い、プライマーＯｍｅ  １８３６−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−Ｆ（配列番号３４）およびＯｍｅ  １８３７−ＳｍａＩ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−Ｒ（配列番号３５）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【０１６６】
Ｏｍｅ１８３６−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−Ｆ（配列番号３４）
0005944323.tif 000050
この配列において
・下線の大文字は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ４のＦＲＴ配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、ｐＬＯＩ２０６５に位置するテトラサイクリン耐性遺伝子の配列(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)と相同である。
【０１６７】
Ｏｍｅ１８３７−ＳｍａＩ−ＢｓｔＺ１７Ｉ−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−Ｒ（配列番号３５）
0005944323.tif 000051
この配列において
・下線の大文字は、ＳｍａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、プラスミドｐＫＤ４のＦＲＴ配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、ｐＬＯＩ２０６５に位置するテトラサイクリン耐性遺伝子の配列(Underwood et al., Appl Environ Microbiol. 2002 December; 68(12): 6263-6272)と相同である。
【０１６８】
このＦＲＴ−Ｔｃ−ＦＲＴ  ＰＣＲ産物をＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理した。次に、得られた断片を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理したＢｓｔＺ１７ＩおよびＰａｃＩの間にクローニングした。選択されたプラスミドはｐＵＣ１８プラスミドのａｍｐ耐性カセットと同配向でｔｃ耐性カセットを有し、これをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃと呼称した。
【０１６９】
３．１．２．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣの構築
ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ断片を構築するために、ｙｊｂＩの上流領域（ｕｐｙｊｂＩ）、ＴＴ０２転写ターミネーター、多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびｙｊｂＩの下流領域（ｄｏｗｎｙｊｂＩ）の間でオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【０１７０】
まず、断片ｕｐｙｊｂＩ−ＴＴ０２−ＭＣＳを、プライマーＯｍｅ  １８５２−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号３６）およびＯｍｅ  １８５３−ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｒ（配列番号３７）を用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。次に、ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｙｊｂＩ断片を、プライマーＯｍｅ  １８５４−ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｆ（配列番号３８）およびＯｍｅ  １８５５−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｒ（配列番号３９）を用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーＯｍｅ  １８５３−ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｒ（配列番号３７）およびＯｍｅ  １８５４−ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｆ（配列番号３８）は、３６ヌクレオチド長の領域がオーバーラップするように設計されていた。最後に、ｕｐｙｊｂＩ−ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｙｊｂＩ断片を、ｕｐｙｊｂＩ−ＴＴ０２−ＭＣＳアンプリコンとＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｙｊｂＩアンプリコンを混合することにより、プライマーＯｍｅ  １８５２−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号３６）およびＯｍｅ  １８５５−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｒ（配列番号３９）を用いて増幅した。得られた融合ＰＣＲ産物をＳｆｏＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理した上記のプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍのＥｃｏＲＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＭＣＳと呼称した。
【０１７１】
Ｏｍｅ  １８５２−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号３６）
0005944323.tif 000052
この配列において
・下線の大文字は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、ｙｊｂＩ遺伝子の上流配列（４２４７９８７〜４２４８００９、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１７２】
Ｏｍｅ  １８５３−ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｙｊｂＩ  ａｍｏｎｔ−Ｒ（配列番号３７）
0005944323.tif 000053
この配列において
・下線の大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および多重クローニング部位の開始部に関するものである。
・大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、ｙｊｂＩ遺伝子の下流配列（４２４８９３１〜４２４８９８０、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１７３】
Ｏｍｅ  １８５４−ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｆ（配列番号３８）
0005944323.tif 000054
この配列において
・大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、多重クローニング部位：ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＰａｃＩを含む。
・下線の大文字の配列は、ｙｊｂＩ遺伝子の下流配列（４２５０２８６〜４２５０３３５、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１７４】
Ｏｍｅ  １８５５−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｙｊｂＩ  ａｖａｌ−Ｒ（配列番号３９）
0005944323.tif 000055
この配列において
・下線の大文字は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、ｙｊｂＩ遺伝子の上流配列（４２５１２２４〜４２５１２４９http://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１７５】
３．１．３．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃの構築
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃを構築するために、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃから精製したＢｓｔＺ１７Ｉ／ＳｍａＩ断片ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理したプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＳＭＣのＰａｃＩ／ＢｓｔＺ１７Ｉ部位間にクローニングした。選択されたプラスミドはｐＵＣ１８プラスミドのａｍｐ耐性カセットと同配向でｔｃ耐性カセットを有し、これをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃと呼称した。
３．２．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ  ｐＫＤ４６株の構築
【０１７６】
ｙｊｂＩ遺伝子をＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ領域で置換するために、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＴｃをＡｈｄＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で消化し、残存する消化断片ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃを、プロトコール１に従い、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。
【０１７７】
テトラサイクリン耐性組換え体を選択し、ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ染色体改変の存在を、プライマーＯｍｅ１８５６−ＤｙｊｂＩ−ｖｅｒｉｆ１−Ｆ（配列番号４０）、Ｏｍｅ１８５７−ＤｙｊｂＩ−ｖｅｒｉｆ２−Ｒ（配列番号４１）、Ｏｍｅ  １８３８−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号４２）、およびＯｍｅ１８１５−ｍｅｔＡ＊１１−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号４３）（表７）を用いたＰＣＲにより、また、ＤＮＡ配列決定法により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ（ｐＫＤ４６）と呼称した。
【０１７８】
３．３．ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃの株４への形質導入
ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ染色体改変を、プロトコール２に従い、上記のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ株からのＰ１ファージ溶解液を用い、上記の株４（表６）に形質導入した。
【０１７９】
テトラサイクリン耐性形質導入体を選択し、ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ染色体改変の存在を、Ｏｍｅ１８５６−ＤｙｊｂＩ−ｖｅｒｉｆ１−Ｆ（配列番号４０）、Ｏｍｅ１８５７−ＤｙｊｂＩ−ｖｅｒｉｆ２−Ｒ（配列番号４１）、Ｏｍｅ  １８３８−Ｋ７−ＦＲＴ−Ｔｃ−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号４２）、およびＯｍｅ１８１５−ｍｅｔＡ＊１１−ｓｅｑ−Ｆ（配列番号４３）（表２）を用いたＰＣＲにより確認した。得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ  ＤｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ株を株５（表６）と呼称した。
【０１８０】
４．株６：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ  ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ  ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔの構築
【０１８１】
４．１．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔは、下記のｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＧｔおよびｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔに由来する。
【０１８２】
４．１．１．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔの構築
プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔは、上記のｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：ＧｔおよびｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍに由来する。
【０１８３】
ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔの構築
プラスミドｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔを構築するために、ＦＲＴ−Ｇｔ−ＦＲＴ耐性カセットを、鋳型としてｐ３４Ｓ−Ｇｍを用い、プライマーＢｓｔＺ１７Ｉ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｆ（配列番号４４）およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｒ（配列番号４５）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【０１８４】
ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｆ（配列番号４５）
0005944323.tif 000056
この配列において
・下線の大文字の配列は、ＳｍａＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および余分な塩基に関するものである。
・太字の大文字の配列は、ＦＲＴ配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍに位置するゲンタマイシン遺伝子の配列(Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)と相同である。
【０１８５】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＦＲＴ−Ｇｔ−Ｒ（配列番号４５）
0005944323.tif 000057
この配列において
・下線の大文字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位および余分な塩基に関するものである。
・太字の大文字の配列は、ＦＲＴ配列(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645)に相当する。
・大文字の配列は、ｐ３４Ｓ−Ｇｍに位置するゲンタマイシン遺伝子の配列(Dennis et Zyltra, AEM July 1998, p 2710-2715)と相同である。
【０１８６】
このＦＲＴ−Ｇｔ−ＦＲＴ  ＰＣＲ産物をＢｓｔＺ１７ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳのＢｓｔＺ１７Ｉ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ−Ｇｔと呼称した。
【０１８７】
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｇｔの構築
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｇｔを構築するために、上記のｐＭＡ−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＭＣＳ：：Ｇｔから精製したＳｔｕＩ／ＢｓｒＢＩ断片ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｇｔを、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理したプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍのＥｃｏＲＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：Ｇｔと呼称した。
【０１８８】
最終的なプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔを構築するために、上記のｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍから精製したＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ断片ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１を、プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＳＭＣ：：ＧｔのＡｐａＩ／ＢａｍＨＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔと呼称した。
【０１８９】
４．１．２．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣの構築
ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＭＣＳ断片を構築するために、ｍｅｌＢの上流領域（ｕｐｍｅｌＢ）、ＴＴ０２転写ターミネーター、多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびｍｅｌＢの下流領域（ｄｏｗｎｍｅｌＢ）の間でオーバーラッピングＰＣＲを行った。
【０１９０】
まず、断片ｕｐｍｅｌＢ−ＴＴ０２−ＭＣＳを、プライマーＯｍｅ  １８４１−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号４６）およびＯｍｅ  １８４２−ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｒ（配列番号４７）を用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。次に、ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｍｅｌＢ断片を、プライマーＯｍｅ  １８４３−ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｆ（配列番号４８）およびＯｍｅ  １８４４−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｒ（配列番号４９）を用い、ＰＣＲにより、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーＯｍｅ  １８４２−ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｒ（配列番号４７）およびＯｍｅ  １８４３−ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｆ（配列番号４８）は、３６ヌクレオチド長の領域がオーバーラップするように設計された。最後に、ｕｐｍｅｌＢ−ＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｍｅｌＢ断片を、ｕｐｍｅｌＢ−ＴＴ０２−ＭＣＳアンプリコンとＴＴ０２−ＭＣＳ−ｄｏｗｎｍｅｌＢアンプリコンを混合することにより、プライマーＯｍｅ  １８４１−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号４６）およびＯｍｅ  １８４４−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｒ（配列番号４９）を用いて増幅した。得られた融合ＰＣＲ産物をＳｆｏＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージ（クレノウ）断片により処理した上記のプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：ＣｍのＥｃｏＲＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＭＣＳと呼称した。
【０１９１】
Ｏｍｅ  １８４１−ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｆ（配列番号４６）
0005944323.tif 000058
この配列において
・下線の大文字は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、ｍｅｌＢ遺伝子の上流配列（４３４０４８９〜４３４０５１３、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１９２】
Ｏｍｅ  １８４２（ＳＭＣ−ＴＴ０２−ＤｍｅｌＢ  ａｍｏｎｔ−Ｒ）（配列番号４７）
0005944323.tif 000059
この配列において
・下線の大文字の配列は、ＢｓｔＺ１７Ｉ制限部位および多重クローニング部位の開始部に関するものである。
・大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、ｍｅｌＢ遺伝子の下流配列（４３４１３７７〜４３４１４０６、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１９３】
Ｏｍｅ  １８４３（ＴＴ０２−ＳＭＣ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｆ）（配列番号４８）
0005944323.tif 000060
この配列において
・大文字の配列は、大腸菌ｒｒｎＢの転写ターミネーターＴ１(Orosz A, Boros I and Venetianer P. Eur. J. Biochem. 1991 Nov 1;201(3):653-9)に相当する。
・太字の大文字の配列は、多重クローニング部位：ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩを含む。
・下線の大文字の配列は、ｍｅｌＢ遺伝子の下流配列（４３４２７９３〜４３４２８１８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１９４】
Ｏｍｅ  １８４４（ＳｆｏＩ−ＫｐｎＩ−ＤｍｅｌＢ  ａｖａｌ−Ｒ）（配列番号４９）
0005944323.tif 000061
この配列において
・下線の大文字は、ＳｆｏＩおよびＫｐｎＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・大文字の配列は、ｍｅｌＢ遺伝子の上流配列（４３４３６９４〜４３４３７１９、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０１９５】
４．１．３．プラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔの構築
ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔを構築するために、上記のｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔから精製したＢｓｔＺ１７Ｉ／ＢａｍＨＩ断片ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔを、上記のプラスミドｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＳＭＣのＢｓｔＺ１７Ｉ／ＢａｍＨＩ部位間にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定により確認し、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ＤｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔと呼称した。
【０１９６】
４．２．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ＤｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ  ｐＫＤ４６株の構築
ｍｅｌＢ遺伝子をＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ領域で置換するために、ｐＵＣ１８−ＴＴａｄｃ−ＣＩ＊０−ＰλＲ＊（−３５）−ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：ＧｔをＡｈｄＩおよびＳｐｈＩ制限酵素で消化し、残存する消化断片ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔを、プロトコール１に従ってＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６株に導入した。
【０１９７】
ゲンタマイシン耐性組換え体を選択し、ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ染色体改変の存在を、プライマーＯｍｅ  １８４５−ＤｍｅｌＢ−ｖｅｒｉｆ１−Ｆ（配列番号５０）およびＯｍｅ  １８４６−ＤｍｅｌＢ−ｖｅｒｉｆ２−Ｒ（配列番号５１）（表７）を用いたＰＣＲにより、また、ＤＮＡ配列決定法により確認した。確認済みの選択株をＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ（ｐＫＤ４６）と呼称した。
【０１９８】
４．３．ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔの、株５への形質導入
ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ染色体改変を、プロトコール２に従い、上記のＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ株からのＰ１ファージ溶解液を用い、上記の株５（表６）に形質導入した。
【０１９９】
ゲンタマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ染色体改変の存在を、Ｏｍｅ  １８４５−ＤｍｅｌＢ−ｖｅｒｉｆ１−Ｆ（配列番号５０）およびＯｍｅ  １８４６−ＤｍｅｌＢ−ｖｅｒｉｆ２−Ｒ（配列番号５１）（表７）を用いたＰＣＲにより確認した。得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  Ｐｔｒｃ０７−ｓｅｒＢ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ΔｐｇａＡＢＣＤ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｕｘａＣＡ：：ＴＴ０７−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔＣＰ４−６：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１  ΔｗｃａＭ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｃｍ  ΔｙｊｂＩ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｔｃ  ΔｍｅｌＢ：：ＴＴ０２−ＴＴａｄｃ−ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１：：Ｇｔ株を株６と呼称した。
【０２００】
５．株８：ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦの構築
【０２０１】
５．１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ株の構築
【０２０２】
特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１およびＷＯ２００９／０４３８０３に記載されているプロモーター染色体改変Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ、ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ、ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ、Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰおよびＰｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ、ならびに特許出願ＷＯ２００７／０７７０４１、ＷＯ２００９／０４３８０３およびＷＯ２００５／１１１２０２に記載されている  ΔｍｅｔＪ、ΔｐｙｋＦ、ΔｐｕｒＵおよびΔｙｎｃＡ遺伝子欠失を、プロトコール２に従い、ＷＯ２００５／１１１２０２に記載されているように、Ｓ−アデノシルメチオニンおよび／またはメチオニンに対するフィードバック感受性が低減されたホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＡ＊１１対立遺伝子を含む株に形質導入した。
【０２０３】
株の構築中に各染色体改変または欠失に関連する耐性カセットはプロトコール１に従って除去されていた。
【０２０４】
このΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ染色体改変を、プロトコール２に従い、特許出願ＥＰ１０３０６１６４．４およびＵＳ６１／４０６２４９に記載されているＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  ｐＫＤ４６  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ株からのＰ１ファージ溶解液を用いて、ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ株に形質導入した。
【０２０５】
カナマイシン耐性形質導入体を選択し、ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍ染色体改変の存在を、プライマーＯｍｅ  ０８２６−ｍａｌＳ−Ｆ（配列番号５２）およびＯｍｅ  ０８２７−ｍａｌＳ−Ｒ（配列番号５３）（表７）を用いたＰＣＲにより確認した。得られた株は遺伝子型ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ：：Ｋｍを有する。
【０２０６】
最後に、上記の株のカナマイシン耐性をプロトコール１に従って除去した。カナマイシン耐性カセットの欠如は、プライマーＯｍｅ  ０８２６−ｍａｌＳ−Ｆ（配列番号５２）およびＯｍｅ  ０８２７−ｍａｌＳ−Ｒ（配列番号５３）を用いることにより、ＰＣＲによって確認した。得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ株を株７と呼称した。
【０２０７】
５．１．１．ＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦ株の構築
【０２０８】
ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦプラスミドの構築
プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦプラスミドは、本特許出願の実施例２に記載されているプラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７／ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦに由来する。
【０２０９】
プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦを構築するために、プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７／ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦを、プライマーＯｍｅ  ２０１２−ＳｆｏＩ−ＨｐａＩ−ＡｖｒＩＩ−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−Ｆ（配列番号５４）およびＯｍｅ  ０６２５−Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＥ＊ｒｅｃ（配列番号５５）を用いて増幅した。ＨｐａＩ／ＮｈｅＩで消化したＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１断片を、本特許出願の実施例２に記載されているプラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＴ７／ＲＢＳＴ７−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦのＨｐａＩ部位とＮｈｅＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定法により確認し、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦと呼称した。
【０２１０】
Ｏｍｅ  ２０１２  ＳｆｏＩ−ＨｐａＩ−ＡｖｒＩＩ−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−Ｆ（配列番号５４）
0005944323.tif 000062
この配列において
・下線の大文字は、ＳｆｏＩ、ＨｐａＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位および余分な塩基に相当する。
・太字の大文字の配列は、λバクテリオファージＰＬプロモーター（ＰＬ１  Giladi et al, FEMS Microbiol Rev. 1995 Aug;17(1-2):135-40）の短鎖型に相当し、−１０ボックスにおける突然変異（Kincade & deHaseth, Gene. 1991 Jan 2;97(1):7-12に記載されているＧ−１２Ｔ）を担持する。このプロモーターはＰＬ１＊１と呼ばれる。
・小文字：５つの塩基がＰＬ１＊１の転写開始部位とリボソーム結合部位ＲＢＳ０１＊２の間に挿入されている。
・斜体の大文字は、ＲＢＳ０１＊２配列に相当する。
・下線の大文字の配列は、ｔｈｒＡ＊１遺伝子（３３７〜３５４、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同である。
【０２１１】
Ｏｍｅ  ０６２５  Ｐｔｒｃ−ｃｙｓＥ＊ｒｅｃ（配列番号５５）
ｃｙｓＥ遺伝子（３７８０３６０〜３７８０３７８、ウェブサイトhttp://ecogene.org/上に参照配列）と相同な
0005944323.tif 000063
【０２１２】
上記のｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦをエレクトロポレーションによって株７（表６）に導入した。プラスミドｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−Ｔ７ＴΦの存在を確認し、得られたＭＧ１６５５  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦ  ΔｍｅｔＪ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｕｒＵ  ΔｙｎｃＡ  ΔｍａｌＳ：：ＴＴａｄｃ−ＣＩ８５７−ＰλＲ＊（−３５）−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ  ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１−ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥ−ＰｇａｐＡ−ｍｅｔＡ＊１１−ＴＴ０１株を株８と呼称した。
【０２１３】
表７：上記の染色体改変のＰＣＲ確認のために用いたプライマー
【表８】
0005944323.tif 000064
【０２１４】
実施例ＩＶ：株３、４、５および６の温度依存的メチオニン生産の評価
生産株を小エルレンマイヤーフラスコで評価した。５．５ｍＬの前培養物を混合培地（２．５ｇ／Ｌグルコースおよび９０％最小培地ＰＣ１を含む１０％ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ２５％））中で２１時間増殖させた。これを用いて、培地ＰＣ１においてＯＤ６００が０．２となるよう５０ｍＬ培養物に植菌を行った。必要であれば、ゲンタマイシンを１０ｍｇ／Ｌ濃度、クロラムフェニコールを３０ｍｇ／Ｌ濃度およびテトラサイクリンを５ｍｇ／Ｌ濃度で加えた。培養物のＯＤ６００が５〜７に達した際に、細胞外アミノ酸を、ＯＰＡ／Ｆｍｏｃ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量し、他の関連の代謝産物は、屈折率測定検出を用いたＨＰＬＣ（有機酸およびグルコース）およびシリル化後のＧＣ−ＭＳを用いて分析した。
【０２１５】
培養条件および前培養条件を下表に示す。前培養物は３０℃または３７℃のいずれかで増殖させた。培養物は３０℃もしくは３７℃、または３７℃で２時間、その後、４２℃で２時間、最後に３７℃で残りの培養時間増殖させた。
【０２１６】
表８：最小培地組成（ＰＣ１）
【表９】
0005944323.tif 000065
表９：株３によりバッチ培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の厳密な定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（ｎ＝反復回数）。種々の培養条件を調べた。それらを表に示す。ＰＣは前培養を、Ｃは培養を意味する。
【表１０】
0005944323.tif 000066
【０２１７】
表９に示されるように、培養プロセス中の遺伝子ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥの発現の温度誘導は、メチオニンの生産量を増大させる。培養プロセス中の構成的発現で得られるメチオニン収率は低い。
【０２１８】
最適なメチオニン生産のための最良の培養条件は、前培養物が３０℃、その後の培養は３７℃（２時間）、４２℃（２時間）、３７℃である。このような条件では、株３は９．２％の収率でメチオニンを生産した。
【０２１９】
表１０：株４、５および６によりバッチ培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の厳密な定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（ｎ＝反復回数）。前培養物は３０℃で、培養物は３７℃で２時間、４２℃で２時間、および培養終了まで３７℃で培養した。
【表１１】
0005944323.tif 000067
【０２２０】
株４、５および６を総て、最適なメチオニン生産のための条件で培養した。表１０に示されるように、培養プロセス中の遺伝子ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥの発現の温度誘導は、その生産を誘導プロモーターにより制御される遺伝子のコピー数に比例して増大させる。実際に、Ｐλプロモーターの制御下に７コピーのｔｈｒＡ＊１を有する株６（表６参照）は、株５（６コピーのｔｈＲ＊１）および株４（５コピー）よりも高い収率でメチオニンを生産した。
【０２２１】
正確にいうと、株５および６は３７℃の一定温度では増殖できないことに注目すべきである。結論として、これらの結果は、温度誘導が生産により良いだけでなく、このような場合に不可欠であることを示す。
【０２２２】
細胞外メチオニン濃度を、ＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後、ＨＰＬＣにより定量した。残留グルコース濃度は、屈折率測定検出によるＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は次のように表した。
【数２】
0005944323.tif 000068
【０２２３】
ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥ遺伝子の発現の温度誘導をバリデートするために、粗抽出液において対応する酵素の活性を測定した。
【０２２４】
in vitroで酵素活性を測定するために、大腸菌株を上記のように最小培地で培養し、対数増殖期の終了時に遠心分離によって回収した。ペレットをＥＤＴＡとともにプロテアーゼ阻害剤カクテルの錠剤を含む冷２０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）に再懸濁させた。次に、細胞を、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓシステム(Bertin Technologies)を用いたビーズ破砕(bead beating）により、６５００ｒｐｍで３０秒１回溶解させ、その後、１２０００ｇ（４℃）で３０分遠心分離を行った。上清を脱塩し、分析に用いた。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ試薬(Bradford, 1976)を用いて測定した。
【０２２５】
in vitroでＨＤＨ活性（ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ｔｈｒＡ＊１によりコードされる）を測定するために、１５μｇの細胞粗抽出液を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９、１５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮＡＤＰ＋および２５ｍＭ  Ｌ−ホモセリン中でアッセイした。Ｌ−ホモセリンの存在下でのＮＡＤＰ＋の減少を３４０ｎｍにて３０分間、分光光度の測定によりモニタリングする。
【０２２６】
ＳＡＴ活性（セリンアセチルトランスフェラーゼ、ｃｙｓＥによりコードされる）は、ＣｏＡとＤＴＮＢの反応によるＴＮＢの吸光度を４０８ｎｍで１０分間測定することにより、２５℃で分光光度の測定によりアッセイした。反応は、８０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５、２ｍＭアセチル−ｃｏＡ、３０ｍＭセリンおよび０．１ｍＭ  ＤＴＮＢ中、粗抽出液２μｇで行った。
表１１：ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ、ｔｈｒＡ＊１）およびセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ、ｃｙｓＥ）活性を、種々の条件で増殖させた株３の培養物の粗抽出液で測定した。活性はｍＵＩ／ｍｇタンパク質で示す。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した（Ｎ＝反復回数）。
【０２２７】
【表１２】
0005944323.tif 000069
【０２２８】
表１１は、誘導時にＨＤＨおよびＳＡＴ活性が増強されることを示す。ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥの構成的発現は、非誘導条件と誘導条件の間のレベルのＨＤＨおよびＳＡＴ活性をもたらし、低いメチオニン収率のある部分を説明する。結論として、これらの結果は、ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥの誘導がメチオニン収率の引き上げに真に有益であることを示す。
【０２２９】
株４、５および６についても同様に、誘導時にＨＤＨおよびＳＡＴ活性が増強される。活性は染色体上に組み込まれた遺伝子ｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥのコピー数に比例して増強される（データは示されていない）。
【０２３０】
実施例Ｖ：株８の温度依存的メチオニン生産の評価
株８を、実施例ＩＶに記載されているように小エルレンマイヤーフラスコで評価した。これを株３と比較した。
【０２３１】
表１２：株８および３によりバッチ培養で生産されたメチオニン収率（Ｙｍｅｔ）（メチオニンｇ／グルコースｇの％）。メチオニン／グルコース収率の厳密な定義については下記を参照。ＳＤは、数回の反復に基づいて計算された収率の標準偏差を示す（Ｎ＝反復回数）。前培養物は３０℃で、培養物は３７℃で２時間、４２℃で２時間、その後、培養終了まで３７℃で培養した。
【表１３】
0005944323.tif 000070
【０２３２】
表１２に示されるように、誘導時のメチオニン生産は、構築物ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥを有する株８でも、４コピーの構築物ＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥを有する株３と同様に良好である。
【０２３３】
細胞外メチオニン濃度を、ＯＰＡ／ＦＭＯＣ誘導体化後にＨＰＬＣにより定量した。残留グルコース濃度は、屈折率測定検出によるＨＰＬＣを用いて分析した。メチオニン収率は次のように表した。
【数３】
0005944323.tif 000071
【０２３４】
ＰＬ１＊１誘導プロモーターにより制御されるｔｈｒＡ＊１およびｃｙｓＥ遺伝子の発現の温度誘導をバリデートするために、実施例ＩＶに記載されているように粗抽出液において対応する酵素の活性を測定した。
【０２３５】
表１３：ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＨＤＨ、ｔｈｒＡ＊１）およびセリンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ、ｃｙｓＥ）活性を上記培養において測定し、ｍＵＩ／ｍｇタンパク質で示した。標準偏差は数回の独立した培養に基づいて計算した（Ｎ＝反復回数）。
【表１４】
0005944323.tif 000072
【０２３６】
表１３から分かるように、株８のＨＤＨおよびＳＡＴ活性は株３の場合と同等であった。結果として、ＰＬ１＊１／ＲＢＳ０１＊２−ｔｈｒＡ＊１−ＳＭＣ−ｃｙｓＥからの誘導は、４コピーのＰλＲ＊（−３５）−ＲＢＳ０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥからの誘導と少なくとも等価である。
【０２３７】
参照文献
0005944323.tif 000073
【配列表】
0005944323000001.app