(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法であって、前記方法は：
毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程；及び
組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み；
前記組み換え型毒素タンパク質は、
ａ．クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、
ｂ．ＣＲＭ１９７、ここでこの組み換え型毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ又はＣｕｐＡ２である、発現される時にこの組み換え型毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合され、
ｃ．ジフテリア毒素、ここでこの組み換え型毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ又はＣｕｐＡ２である、発現される時にこの組み換え型毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合され、
ｄ．破傷風毒素フラグメントＣ、
ｅ．緑膿菌外毒素Ａ、
ｆ．コレラ毒素Ｂ、
ｇ．コレラホロトキシン、および、
ｈ．百日咳毒素、から選択され、
前記組換え型毒素タンパク質は、１リットル当たり０．２グラム乃至１リットル当たり１２グラムの可溶性の及び／又は活性な毒素タンパク質の収量で生成されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記毒素タンパク質をコード化する前記ヌクレオチド配列が、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞は、少なくとも１つのプロテアーゼの発現を欠き、又は前記宿主細胞は、少なくとも１つのフォールディングモジュレータ、又はその組み合わせを過剰発現させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、前記宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠くことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組み換え型毒素タンパク質がＣＲＭ１９７であり、宿主細胞が、セラリシン、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、ＡｐｒＡ、又はそれらの任意の組み合わせの発現を欠くことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記宿主細胞がＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現し、前記組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞がセラリシン又はＨｓｌＵ及びＨｓｌＶの発現を欠き、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換え型毒素タンパク質がＣＲＭ１９７であり、前記宿主細胞が野生型であり、前記組み換え型毒素タンパク質が分泌リーダーＡｚｕに融合されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換え型毒素タンパク質が、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、破傷風毒素フラグメントＣ、緑膿菌外毒素Ａ、コレラ毒素Ｂ、コレラホロトキシン又は百日咳毒素であり、
前記組み換え型毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列がその自然の分泌シグナルをコード化する配列に融合されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
活性アッセイにおける前記組み換え型毒素タンパク質の活性を測定する工程をさらに含み、生成された可溶性毒素タンパク質の４０％乃至１００％が活性であると決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性アッセイが、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現ベクターが、タンパク質コード配列に操作可能に連結されたｌａｃ誘導体プロモータを含み、前記培養する工程が、０．０２乃至１．０ｍＭの濃度でＩＰＴＧを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度が、４０乃至２００の吸光度単位（ＡＵ）の光電密度であり、培養のｐＨが６乃至７．５であり、成長温度が２０乃至３５℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が、シュードモナス菌細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が緑膿菌であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド配列がシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターが分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記組み換え型毒素タンパク質がクロストリジウムディフィシレ毒素Ｂであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞がＨｔｐＸの発現を欠き、ＤｅｇＰ１の発現を欠き、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１及びＰｒｃ２の発現を欠き、Ｌｏｎ、ｌａ、及びＤｅｇＰ２の発現を欠き、又は；前記宿主細胞が、Ｌｏｎ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ２、ＡｐｒＡの発現を欠き、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａを過剰発現することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記組み換え型毒素タンパク質が破傷風毒素フラグメントＣであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、Ｌｏｎ、ｌａ及びＡｐｒＡの発現を欠き、又は前記宿主細胞が、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠き、又は前記宿主細胞がｄｓｂＡＢＣＤを過剰発現し、又は前記宿主細胞がＧｒｐＥ、ＤｎａＫ、及びＤｎａＪを過剰発現することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記組み換え型毒素タンパク質がコレラ毒素Ｂであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
前記宿主細胞がＬｏｎ、ｌａ、及びＡｐｒＡの発現を欠き、又はＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠き、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａを過剰発現することを特徴とする、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記組み換え型毒素タンパク質が野生型の百日咳毒素又は百日咳毒素Ｓ１  Ｅ１２９Ａ  Ｒ９Ｋであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記組み換え型毒素タンパク質が、百日咳毒素Ｓ１  Ｅ１２９Ａ  Ｒ９Ｋであり、宿主細胞がＬｏｎ、ｌａ、及びＡｐｒＡの発現を欠くことを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記緑膿菌外毒素Ａが野生型、ＣＲＭ６６又はｒＥＰＡであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、Ｌｏｎ、ｌａ及びＡｐｒＡの発現を欠き、又は前記宿主細胞がｄｓｂＡＢＣＤを過剰発現することを特徴とする、請求項２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〈優先権の主張〉
【０００２】
この出願は、２０１０年４月１６日出願の米国仮特許出願第６１／３２５，２３５号、２０１０年４月９日出願のＰＣＴ／ＵＳ１０／３０５７３、及び２０１０年３月３０日出願の米国仮特許出願第６１／３１９，１５２号に対する、アメリカ合衆国法典第３５巻の第１１９条（ｅ）に基づく優先権を請求する。これら出願の内容は、その全体における引用によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
〈配列表〉
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによってＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体における引用によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩのコピーが、２０１１年３月１６日に作られ、３８１９４２０１．ｔｘｔと命名され、大きさは１５６，９７５バイトである。
【背景技術】
【０００４】
微生物の毒素タンパク質は、医学において、毒素を生産する微生物に対するワクチン接種用免疫原として、及び他のワクチン用の担体タンパク質及びアジュバントとして、及び科学的調査において分子の経路を研究するためのツールとして、使用される。
【０００５】
ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ジフテリア菌の毒素産生菌によって合成され分泌されるタンパク質毒素である。毒素産生菌は、毒素遺伝子を運搬するバクテリオファージ溶原菌を含む。ＤＴは、成熟した毒素を形成するためにタンパク質分解を受ける、５３５−アミノ酸ポリペプチドとして合成される。成熟した毒素は、ジスルフィド架橋によって結合された、２つのサブユニット、Ａ及びＢを含む。無傷のＤＴのＣ末端部分から形成されたＢサブユニットは、結合、及びＤＴの細胞膜を通る細胞質への侵入を可能にする。細胞の侵入に際して、無傷のＤＴのＮ末端部分から形成された酵素のＡサブユニットは、伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰリボシル化を触媒する。その結果、ＥＦ−２は不活性化され、タンパク質合成が止まり、細胞が死ぬ。ジフテリア毒素は非常に細胞毒性である；単一の分子は、細胞に致死的であり得、１０ｎｇ／ｋｇの投与量は、動物とヒトを死滅させ得る。
【０００６】
ＣＲＭ１９７タンパク質は、ＤＴの、無毒な免疫学的に交差反応性の形態である。それは、ＤＴ追加免疫又はワクチン抗原としてのその潜在的な使用のために研究されてきた。ＣＲＭ１９７は、毒素産生性のコリネファージ（ｃｏｒｙｎｅｐｈａｇｅ）βのニトロソグアニジン変異誘発によって作られた無毒のファージβ１９７ｔｏｘ−によって感染した、ジフテリア菌によって生成される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ＤＴと同じ分子量を有するが、Ａサブユニットの単独ベース変化（アデニンに対するグアニン）によって異なる。この単独ベース変化は、アミノ酸置換（グリシンの代わりにグルタミン酸）をもたらし、ＤＴの毒性の特性を除去する。
【０００７】
担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を使用する複合糖質ワクチンは、ヒト使用のために承認された。ワクチンは：Ｍｅｎｖｅｏ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、髄膜炎菌サブグループＡ、Ｃ、Ｙ及びＷ−１３５によって引き起こされる侵襲性の髄膜炎菌の疾患の予防のために示されたワクチン；
Ｍｅｎｊｕｇａｔｅ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、髄膜炎菌のグループＣ結合ワクチン；及びＰｒｅｖｎａｒ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）、肺炎連鎖球菌の７つの血清型を標的とする小児期肺炎ワクチン、及びＨｉｂＴＩＴＥＲ（登録商標）（Ｗｙｅｔｈ）、インフルエンザ菌ｂ型ワクチンを含む。加えて、ＣＲＭ１９７は、ジフテリア菌ワクチン接種用の追加免疫抗原（ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ）としての潜在的な使用を有し、他のワクチンで使用される担体タンパク質として調べられている。
【０００８】
承認された治療上及び研究の使用に関する、ＣＲＭ１９７の高レベルの発現のための方法は、報告されていない。ＣＲＭ１９７は、何十ものｍｇ／Ｌに及ぶレベルで、例えば、ジフテリア菌、枯草菌、大腸菌において発現される。Ｐｒｅｖｎａｒ結合ワクチンの１回量は、約２０μｇのＣＲＭ１９７を含む。それ故、約１ｇ／Ｌ又はそれ以上のレベルで経済的にＣＲＭ１９７を生成する方法は、ワクチン研究及び製造を大いに促進するであろう。
【０００９】
コレラ菌、下痢及び嘔吐によって特徴付けられた感染を引き起こす病原菌によって産出されたコレラ毒素（ＣＴＸ）はまた、ＡＤＰリボシル化毒素である。ＣＴＸは、６つのタンパク質サブユニットから構成されたオリゴマーの複合体である：コレラ毒素Ａサブユニット（ＣＴＡ）の単一のコピー及びコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の５つのコピー。各々１２ｋＤａの重量を有する５つのＢサブユニットは五員環を形成する。Ａサブユニットは、Ａ１部分、ＣＴＡ１、Ｇタンパク質をＡＤＰリボシル化する球状の酵素、及びＡ２鎖、ＣＴＡ２を有し、それは、Ｂサブユニット環の中央のポアにきっちり位置する拡張したα螺旋体を形成する。この環は、宿主細胞表面上のＧＭ１ガングリオシド受容体に結合し、全複合体の内部移行をもたらす。一旦内部移行されると、ＣＴＡ１鎖はジスルフィド架橋の減少によって放出される。その後、ＣＴＡ１は活性化され、アデニル酸シクラーゼのＡＤＰリボシル化を触媒する。アデニル酸シクラーゼ活性において結果として生じる増加は、環状ＡＭＰ合成を増加させ、それは大量の液体及び電解質流出を引き起こし、下痢をもたらす。
【００１０】
ＣＴＸのＢサブユニットは、比較的無害であるが、ＧＭ１ガングリオシド受容体に結合するその能力を保持する。それ故、ＣＴＢは、化学的に又は遺伝学的に結合した異種抗原の粘膜の取り込みの促進における使用を見出す。粘膜及び全身性の免疫を誘発することが実証されており、食用のワクチン生成で使用される候補である。その結合優先（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のため、ＣＴＢはまた、神経細胞のトレーサーとしての使用を見出す。
【００１１】
百日咳毒素（ＰＴＸ）は、百日咳菌、疾患百日咳を引き起こすヒトの呼吸器系の病原菌によって生成された外毒素及び病原性の因子である。百日咳ホロトキシンは、ＡＢ５構造を有するマルチサブユニットの複合体である。酵素学的に活性なＡサブユニット（Ｓ１）は、哺乳動物細胞における幾つかのヘテロ三量体のＧタンパク質のアルファサブユニットを修正する、ＡＤＰリボース転移酵素であり、Ｂオリゴマー（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の２つのコピー、及びＳ５）は、細胞上の複合糖質受容体を結合する。毒素の５つのサブユニットは、百日咳トキソイドオペロンから発現される。
【００１２】
百日咳毒素の無毒な変異体は、保護ワクチンにおける使用、及びワクチンアジュバントとしての使用のために調査された。また、研究において、例えばＧタンパク質シグナル経路の研究のために、百日咳毒素タンパク質を使用する必要がある。
【００１３】
破傷風菌によって産出された破傷風毒素は、１５０ｋＤａの分子量を有する神経毒素である。それは、２つの部分から構成される：１００ｋＤａの重鎖又はＢ鎖及び５０ｋＤａの軽鎖又はＡ鎖。鎖は、ジスルフィド結合によって連結される。Ｂ鎖は、神経細胞の細胞膜上のジシアロガングリオシド（ＧＤ２及びＧＤ１ｂ）に結合する。Ａ鎖、亜鉛エンドペプチダーゼは、小胞に関連する膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を攻撃する。
【００１４】
Ａ鎖の作用は、影響を受けた神経細胞が、タンパク質シナプトブレビンの分解により抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）及びグリシンを放出するのを止める。この結果は、最も小さな刺激からの筋肉における危険な活動過剰、即ち、感覚の刺激による運動反射の阻害ができないことである。これは、テタニー性攣縮と称される、アゴニスト及びアンタゴニスト筋肉組織の一般化された収縮を引き起こす。
【００１５】
破傷風毒素のフラグメントＣ（Ｔｅｔ  Ｃ又はＴＴＣ）は、破傷風毒素のプロテアーゼ開裂（例えば、パパインによる）によって、又はフラグメントの組み換え型発現を通じて生成された、５０ｋＤのポリペプチドである。それは、Ｃ末端での４５１のアミノ酸に相当する（アミノ酸位置８６５−１３１５）。
【００１６】
フラグメントＣは、無毒であることが示された。それが高い特異性と親和性により神経細胞に結合するため、ＴＴＣは、神経細胞の薬物送達、又は研究目的のために標的とする分子としての使用を見出す。また、ＴＴＣタンパク質は、ワクチン担体タンパク質として、及びクロストリジウムテタニ感染から保護するためのワクチンにおいて使用するのに、潜在的に有用である。
【００１７】
クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）は、クロストリジウムディフィシレによって生成された毒性因子であり、それは、院内での（ｈｏｓｐｉｔａｌ  ａｃｑｕｉｒｅｄ）下痢及び偽膜性大腸炎を引き起こす。ＴｃｄＢ、及び第２の大きなクロストリジウム毒素、ＴｃｄＡは、偽膜性大腸炎の進行に関係する。
【００１８】
ＴｃｄＢは、約２７０ｋＤのグルコシル化毒素であり、酵素、転位及び受容体結合のドメインに分けることができる。ＴｃｄＢの第１の５４６アミノ酸は、酵素の領域を含み、それは、推定上の転位及び受容体結合ドメインに続く。ＴｃｄＢは、診断テスト及びそれらの進行と同様に、クロストリジウムディフィシレ感染のための保護ワクチンとしての潜在的な使用を有する。
【００１９】
緑膿菌の外毒素Ａ（ＥＴＡ又はＰＥ）は、ＩＩ型のＡＤＰＲＴである。そのファミリーメンバージフテリア毒素及びコレラ毒素のように、それは、細胞の伸長因子２のＡＤＰリボシル化によってタンパク質合成を阻害する。緑膿菌外毒素Ａは、モノマーとして存在し、６１３のアミノ酸（６６Ｋｄ）の単一のポリペプチド鎖から成る。
【００２０】
ＥＴＡは、ワクチン共役として潜在的に有用である。ＥＴＡの無毒な突然変異体は、黄色ブドウ球菌、マラリア、及びチフス菌から保護するワクチン接種のためのワクチン共役として研究された。
【００２１】
拡大する必要性を満たすのに十分な量におけるこれら毒素の産出は、著しい挑戦（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ）を提示した。従来のタンパク質過剰発現系において作られた時、毒素タンパク質は、毒素の特異的な特性、例えば大きさ及び二次構造に依存する、分解、不適当な折り重ね（ｆｏｌｄｉｎｇ）又はその両方により、非常に低い濃度にてのみ、活性型において回復する。それ故、可溶性及び／又は活性型において、及び低コストで大量のこれら毒素を産出する方法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、シュードモナス菌宿主細胞における組み換え型毒素タンパク質を生成する方法に関し、該方法は：発現ベクターへ、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を連結する工程；発現ベクターによりシュードモナス菌宿主細胞を形質転換する工程；及び組み換え型毒素タンパク質の発現に適している培地において、形質転換されたシュードモナス菌宿主細胞を培養する工程を含み；ここで、組み換え型毒素タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ｂ、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、又は緑膿菌外毒素Ａである。
【００２３】
実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素Ｂ、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、又は緑膿菌外毒素Ａである。
【００２４】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、コレラ毒素Ｂ、コレラホロトキシン、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、又はクロストリジウムディフィシレ毒素Ｂである。
【００２５】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ｂ、百日咳毒素、破傷風毒素フラグメントＣ、又はクロストリジウムディフィシレ毒素Ｂである。
【００２６】
特定の実施形態において、組換え型タンパク質は、１リットル当たり約０．２グラム乃至１リットル当たり約１２グラムの可溶性の及び／又は活性な毒素タンパク質の収量にて生成される。特異的な実施形態において、可溶性の及び／又は活性な毒素タンパク質の収量は、約０．２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、ｌ約０．４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約６．５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約０．５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約０．６ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．３乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約０．７ｇ／Ｌ、約０．４乃至約１ｇ／Ｌ、約０．４乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、又は約１１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌである。
【００２７】
実施形態において、毒素タンパク質をコード化するヌクレオチド配列は、発現される時に毒素タンパク質のペリプラズムへの輸送を誘導する分泌シグナルコード配列に融合される。実施形態において、宿主細胞は、少なくとも１つのプロテアーゼの発現を欠き、又は宿主細胞は、少なくとも１つのフォールディングモジュレータ（ｆｏｌｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、又はその組み合わせを過剰発現させる。
【００２８】
実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ、ＣｕｐＡ２、ＰｂｐＡ２０Ｖ、又はＰｂｐである分泌物リーダーに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、宿主細胞は、ＨｓｌＵ及びＨｓｌＶ、又はＰｒｃ１、又はＤｅｇＰ１、又はＤｅｇＰ２、又はＡｐｒＡの発現を欠く。特異的な実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、宿主細胞は、セラリシン（Ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎ）、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、又はＡｐｒＡの発現を欠き、又は宿主細胞は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現させる。実施形態において、宿主細胞は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現させ、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＡｚｕに融合される。実施形態において、宿主細胞はセラリシンの発現を欠き、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合される。実施形態において、宿主細胞はＨｓｌＵとＨｓｌＶの発現を欠き、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、宿主細胞は野生型であり、ここで、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＰｂｐ又はＡｚｕに融合される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はＣＲＭ１９７であり、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーＡｚｕ、Ｐｂｐ、ＩｂｐＳ３１Ａ、ＣｕｐＡ２、又はＰｂｐＡ２０Ｖに融合される。
【００２９】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はコレラ毒素Ｂであり、宿主細胞は、Ｌｏｎ、Ｌａ、及びＡｐｒＡの発現を欠き、又は宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠く。関連する実施形態において、宿主細胞は、Ｌｏｎ、Ｌａ、及びＡｐｒＡの発現を欠き、ここで、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーＰｂｐ  Ａ２０Ｖに融合される。
【００３０】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、百日咳毒素Ｓ１  Ｅ１２９Ａ  Ｒ９Ｋであり、宿主細胞は、Ｌｏｎ、Ｌａ、及びＡｐｒＡ；ＧｒｐＥ、ＤｎａＫ、及びＤｎａＪ；ＨｔｐＸ；ＲＸＦ０１５９０；又はｐｐｉＢ（ＲＸＦ０５３４５）の発現を欠いている。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、その自然の分泌リーダーに融合される。
【００３１】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Ｃであり、宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、及びＡｐｒＡの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、分泌リーダーＤｓｂＣ、Ｐｂｐ  Ａ２０Ｖ、又はＣｕｐＡ２に融合される。
【００３２】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Ｃであり、宿主細胞は、Ｌｏｎ、Ｌａ、及びＡｐｒＡの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＤｓｂＡに融合される。
【００３３】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は破傷風毒素Ｃであり、宿主細胞は、ＧｒｐＥ、ＤｎａＫ、及びＤｎａＪの発現を欠く。関連する実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は分泌リーダーＮｉｋＡに融合される。
【００３４】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質はクロストリジウムディフィシレ毒素Ｂであり、宿主細胞は、ＨｔｐＸ；ＤｅｇＰ１；ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、及びＰｒｃ２；又はＬｏｎ及びＤｅｇＰ２の発現を欠き、又は宿主細胞は、Ｌｏｎ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ２、ＡｐｒＡの発現を欠き、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａを過剰発現する。
【００３５】
実施形態において、組み換え型毒素タンパク質の活性は、活性アッセイにおいて測定され、ここで、生成された水溶性毒素タンパク質の約４０％乃至約１００％は、活性であると決定される。関連する実施形態において、活性アッセイは、免疫学アッセイ、受容体結合アッセイ、又は酵素アッセイである。
【００３６】
本発明の実施形態において、発現ベクターは、タンパク質コード配列に効果的に連結されたｌａｃ誘導体プロモータを含み、ここで、培養は、約０．０２乃至約１．０ｍＭの濃度でＩＰＴＧを使用するプロモータの誘発を含み、誘発時の細胞密度は、約４０乃至約２００の吸光度単位（ＡＵ）の光学密度であり、培養のｐＨは、約６乃至約７．５であり、及び成長温度は約２０乃至約３５℃である。
【００３７】
実施形態において、宿主細胞は緑膿菌細胞である。関連する実施形態において、宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。
【００３８】
本発明の実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化された。関連する実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナス宿主細胞における発現のために最適化された。他の関連する実施形態において、ヌクレオチド配列はシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における発現のために最適化された。
【００３９】
実施形態において、百日咳毒素は野生型又はＳ１  Ｅ１２９Ａ  Ｒ９Ｋである。実施形態において、緑膿菌外毒素Ａは野生型、ＣＲＭ６６、又はｒＥＰＡである。
【００４０】
本発明の実施形態において、発現ベクターは、分泌シグナルのためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。実施形態において、発現ベクターは、毒素タンパク質のためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って生成された組み換え型毒素タンパク質を提供する。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、ＣＲＭ１９７、ジフテリア毒素、コレラホロトキシン、コレラ毒素Ｂ、百日咳毒素、破傷風毒素のフラグメントＣ、クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂ、又は緑膿菌外毒素Ａである。実施形態において、外毒素Ａは野生型、ＣＲＭ６６、又はｒＥＰＡである。特定の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、毒素の高収率を生成する又は高品質の毒素を生成するものとして本明細書で確認された、シュードモナスフルオレッセンスの菌株で生成される。特定の実施形態において、組み換え型の毒素タンパク質は、毒素タンパク質の最も高い収量をもたらすものとして、本明細書に記載のシュードモナスフルオレッセンスの菌株において生成される。他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質は、毒素の発酵生成に使用されたものとして、本明細書に記載の菌株において生成される。
【００４２】
〈引用による組み込み〉
この明細書で言及されるすべての公報、特許、及び特許出願は、個々の公報、特許、又は特許出願が、それぞれ、明確且つ個々に引用によって組み込まれると示されるように、同じ程度まで、引用によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明の新しい特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を引用することによって、及び以下の添付図面によって得られるであろう。
【図１】ＣＲＭ１９７の高スループット発現分析。図１Ｂで示されるＤＮＡ配列を使用して発現されるＣＲＭ１９７タンパク質は、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験された４０  ＣＲＭ１９７−発現菌株の可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像で示される。表１０に記載されるような菌株名は、各々のレーン上に記録される。シュードモナスフルオレッセンスにより発現されたＣＲＭ１９７は、ＳＤＳ−ＣＧＥ（左の矢印）の上の〜５８ｋＤａにて、単一の結合として遊走した。第１のレーン及び最後のレーンにおける分子量マーカーは、１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａである。
【図２】コレラ毒素Ｂの高スループット発現分析。配列番号：２３で示されるＤＮＡ配列を使用して発現されたコレラ毒素Ｂは、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験された４０のコレラ毒素発現菌株からの可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像で示される。表１１に記載されるような菌株名は、各々のレーン上に記録される。誘発されたＣＴＢは、ＳＤＳ−ＣＧＥ（左の矢印）の上の〜１１．５ｋＤａにて単一の結合として遊走した。第１のレーン及び最後のレーンにおける分子量マーカーは、１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａである。
【図３】百日咳トキソイドオペロン。４２１０の塩基対を有するＢＰＥＴＯＸ＿Ｓ１−Ｒ９Ｋ  ＆  Ｅ１２９Ａが示される。
【図４Ａ】百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する百日咳毒素Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ  ＤＮＡ配列が示される（配列番号：２４）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３に由来する。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。Ｓ１におけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ａの変異が強調される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号２５、２６、２８、２９、及び２７としてそれぞれ開示される。
【図４Ｂ】百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する百日咳毒素Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ  ＤＮＡ配列が示される（配列番号：２４）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３に由来する。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。Ｓ１におけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ａの変異が強調される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号２５、２６、２８、２９、及び２７としてそれぞれ開示される。
【図４Ｃ】百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する百日咳毒素Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ  ＤＮＡ配列が示される（配列番号：２４）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３に由来する。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。Ｓ１におけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ａの変異が強調される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号２５、２６、２８、２９、及び２７としてそれぞれ開示される。
【図４Ｄ】百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する百日咳毒素Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ  ＤＮＡ配列が示される（配列番号：２４）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３に由来する。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。Ｓ１におけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ａの変異が強調される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号２５、２６、２８、２９、及び２７としてそれぞれ開示される。
【図４Ｅ】百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する百日咳毒素Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ  ＤＮＡ配列が示される（配列番号：２４）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３に由来する。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。Ｓ１におけるＲ９Ｋ及びＥ１２９Ａの変異が強調される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号２５、２６、２８、２９、及び２７としてそれぞれ開示される。
【図５Ａ】百日咳トキソイドサブユニットのアミノ酸配列。分泌シグナルが強調される。Ａ．Ｓ１サブユニット（Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ）（配列番号：２５）。Ｂ．Ｓ２サブユニット（配列番号：２６）。Ｃ．Ｓ３サブユニット（配列番号：２７）。Ｄ．Ｓ４サブユニット（配列番号：２８）。Ｅ．Ｓ５サブユニット（配列番号：２９）。
【図５Ｂ】百日咳トキソイドサブユニットのアミノ酸配列。分泌シグナルが強調される。Ａ．Ｓ１サブユニット（Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ）（配列番号：２５）。Ｂ．Ｓ２サブユニット（配列番号：２６）。Ｃ．Ｓ３サブユニット（配列番号：２７）。Ｄ．Ｓ４サブユニット（配列番号：２８）。Ｅ．Ｓ５サブユニット（配列番号：２９）。
【図５Ｃ】百日咳トキソイドサブユニットのアミノ酸配列。分泌シグナルが強調される。Ａ．Ｓ１サブユニット（Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ）（配列番号：２５）。Ｂ．Ｓ２サブユニット（配列番号：２６）。Ｃ．Ｓ３サブユニット（配列番号：２７）。Ｄ．Ｓ４サブユニット（配列番号：２８）。Ｅ．Ｓ５サブユニット（配列番号：２９）。
【図５Ｄ】百日咳トキソイドサブユニットのアミノ酸配列。分泌シグナルが強調される。Ａ．Ｓ１サブユニット（Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ）（配列番号：２５）。Ｂ．Ｓ２サブユニット（配列番号：２６）。Ｃ．Ｓ３サブユニット（配列番号：２７）。Ｄ．Ｓ４サブユニット（配列番号：２８）。Ｅ．Ｓ５サブユニット（配列番号：２９）。
【図５Ｅ】百日咳トキソイドサブユニットのアミノ酸配列。分泌シグナルが強調される。Ａ．Ｓ１サブユニット（Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ）（配列番号：２５）。Ｂ．Ｓ２サブユニット（配列番号：２６）。Ｃ．Ｓ３サブユニット（配列番号：２７）。Ｄ．Ｓ４サブユニット（配列番号：２８）。Ｅ．Ｓ５サブユニット（配列番号：２９）。
【図６】百日咳トキソイド発現サンプルのウェスタンブロット解析。菌株名は各々のレーン上に記録される。誘発されたＰｔｘは、１１乃至２６ｋＤａ（Ｓ１：２６．１Ｋｄａ、Ｓ２：２０．９Ｋｄａ、Ｓ３：２１．８ＫＤａ、Ｓ４（２ｘ）：１２ＫＤａ、Ｓ５：１１ＫＤａ）に及ぶ複数の結合として遊走した。Ａ．減少したサンプル。Ｂ．減少していないサンプル。両方のパネル：レーン１−分子量マーカー（１０、１５、２０、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、２５０ｋＤａ）；レーン２−ヌル；レーン３−菌株３２１；レーン４−菌株３２２；レーン５−菌株３２３；レーン６−菌株３２４；レーン７−菌株３２５；レーン８−菌株３２６；レーン９−菌株３２７；レーン１０−菌株３２８。
【図７】破傷風毒素Ｃのフラグメントの発現。シュードモナスフルオレッセンスにおいて発現された破傷風毒素Ｃのフラグメントは、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験された４０の破傷風毒素発現菌株からの可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像で示される。表１５に記載されるような菌株名は、各々のレーン上に記録される。誘発された破傷風毒素Ｃのフラグメントは、ＳＤＳ−ＣＧＥ（左の矢印）の上の〜５１．６ｋＤａにて単一の結合として遊走した。第１のレーン及び最後のレーンにおける分子量マーカーは、１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａである。
【図８】ＴｃｄＢ発現。シュードモナスフルオレッセンスにおいて発現されたＴｃｄＢは、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験された２４のＴｃｄＢ発現菌株からの可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像で示される。ヌルの抽出物及び標準試料（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）と同様に表１８に記載されるような菌株名は、各々のレーン上に記録される。誘発されたＴｃｄＢは、ＳＤＳ−ＣＧＥ（左の矢印）の上の〜３００ｋＤａにて単一の結合として遊走した。第１のレーン及び最後のレーンにおける分子量マーカーは、１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａである。
【図９Ａ】外毒素Ａアミノ酸配列。緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸配列が示される（配列番号：３４）。３つの外毒素Ａタンパク質が図面によって示される：野生型、ＣＲＭ６６、及びｒＥＰＡ。異なるＣＲＭ６６において、Ｈｉｓ４２６（きわだって強調されたテキスト）は、配列上に示されるようなＴｙｒと交替する。ｒＥＰＡにおいて、配列上に示されるように、Ｇｌｕ５５３（きわだって強調されたテキスト）は消される。
【図９Ｂ】外毒素Ａアミノ酸配列。緑膿菌外毒素Ａのアミノ酸配列が示される（配列番号：３４）。３つの外毒素Ａタンパク質が図面によって示される：野生型、ＣＲＭ６６、及びｒＥＰＡ。異なるＣＲＭ６６において、Ｈｉｓ４２６（きわだって強調されたテキスト）は、配列上に示されるようなＴｙｒと交替する。ｒＥＰＡにおいて、配列上に示されるように、Ｇｌｕ５５３（きわだって強調されたテキスト）は消される。
【図１０】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性のコレラ毒素Ｂの生成。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析。レーン１−１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａの分子量マーカー。それぞれ、ＰＳ５３８−０８８  Ｕ５発酵のレーン２誘発前サンプル及びレーン３誘発後サンプル、及びＰＳ５３８−０８８  Ｕ６発酵のレーン４誘発前サンプル及びレーン５誘発後サンプルであり、それらによるコレラ毒素Ｂの発現は、右の矢印で示される。
【図１１】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性の破傷風毒素のフラグメントＣの生成。Ａ．ＳＤＳ−ＣＧＥ分析。レーン１−１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａの分子マーカー。レーン２、３及び４は、右側で矢印によって示された、破傷風毒素のフラグメントＣを発現する、それぞれＰＳ５３８−５２９  Ｕ１、ＰＳ５３８−５４６  Ｕ５及びＰＳ５３８−５４７  Ｕ７発酵の誘発後のサンプルである。Ｂ．ウェスタンブロット分析。菌株ＰＳ５３８−５３８（Ｕ１とＵ２）、ＰＳ５３８−５４８（Ｕ３とＵ４）、ＰＳ５３８−５５８（Ｕ５とＵ６）及びＰＳ５３８−５６８（Ｕ７とＵ８）からの発酵サンプルは、ウェスタンブロットによって評価された。発酵単位及び誘発後の時間（Ｉ０、Ｉ８、Ｉ２４）は各々のレーン上に示される。分子量（ＭＷ）基準はブロットの左側に示され、破傷風毒素Ｃの標準試料（Ｓｔｄ；  Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，  Ｃａｔ＃  １９３）は右側に示される。ブロットは、抗ラビットＩｇＧペルオキシダーゼが後続するラビット（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｔ＃：  ａｂ３４８９０）で得られ、ヤギ（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｃａｔ＃：  ３１４６０）で得られた、多クローンの抗破傷風毒素Ｃのフラグメントにより調べられた。Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ  ３４０６５）は、検出に使用された。
【図１２】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性のクロストリジウムディフィシレＢ毒素タンパク質産生。レーン１−１６、２０、２９、４８、６９及び１１９ｋＤａの分子量マーカー。マーカーの大きさも、レーン１における遊走に基づき、右側にそれぞれの位置で示される。レーン２、３及び４は、右側にて矢印によって示された、クロストリジウムディフィシレＢ毒素タンパク質を発現する、それぞれＰＳ５３８−６７１  Ｕ５及びＵ６、及びＰＳ５３８−６７４  Ｕ７発酵の誘発後のサンプルである。
【図１３Ａ】野生型の百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する野生型の百日咳毒素のＤＮＡ配列が示される（配列番号：３５）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３からである。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号４１−４５としてそれぞれ開示される。
【図１３Ｂ】野生型の百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する野生型の百日咳毒素のＤＮＡ配列が示される（配列番号：３５）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３からである。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号４１−４５としてそれぞれ開示される。
【図１３Ｃ】野生型の百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する野生型の百日咳毒素のＤＮＡ配列が示される（配列番号：３５）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３からである。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号４１−４５としてそれぞれ開示される。
【図１３Ｄ】野生型の百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する野生型の百日咳毒素のＤＮＡ配列が示される（配列番号：３５）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３からである。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号４１−４５としてそれぞれ開示される。
【図１３Ｅ】野生型の百日咳トキソイドのＤＮＡ配列。翻訳を有する野生型の百日咳毒素のＤＮＡ配列が示される（配列番号：３５）。配列は遺伝子バンクエントリーＭ１３２２３からである。サブユニットＳ１−Ｓ５及びシグナル配列は配列上に示される。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号４１−４５としてそれぞれ開示される。
【図１４Ａ】コレラホロトキシンのアミノ酸及びＤＮＡ配列。Ａ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＡアミノ酸配列（配列番号：３８）（ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１４．１）。Ｂ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＢアミノ酸配列（配列番号：３９）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１３．１）。Ｃ．示された翻訳を有する、ＡとＢのサブユニットを示すＣＴＸ  ＤＮＡ配列（配列番号：４０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ００３８５２）。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号３８及び３９としてそれぞれ開示される。
【図１４Ｂ】コレラホロトキシンのアミノ酸及びＤＮＡ配列。Ａ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＡアミノ酸配列（配列番号：３８）（ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１４．１）。Ｂ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＢアミノ酸配列（配列番号：３９）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１３．１）。Ｃ．示された翻訳を有する、ＡとＢのサブユニットを示すＣＴＸ  ＤＮＡ配列（配列番号：４０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ００３８５２）。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号３８及び３９としてそれぞれ開示される。
【図１４Ｃ】コレラホロトキシンのアミノ酸及びＤＮＡ配列。Ａ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＡアミノ酸配列（配列番号：３８）（ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１４．１）。Ｂ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＢアミノ酸配列（配列番号：３９）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１３．１）。Ｃ．示された翻訳を有する、ＡとＢのサブユニットを示すＣＴＸ  ＤＮＡ配列（配列番号：４０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ００３８５２）。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号３８及び３９としてそれぞれ開示される。
【図１４Ｄ】コレラホロトキシンのアミノ酸及びＤＮＡ配列。Ａ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＡアミノ酸配列（配列番号：３８）（ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１４．１）。Ｂ．分泌リーダー（強調された）とのＣＴＢアミノ酸配列（配列番号：３９）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＥ００３８５２；タンパク質ＩＤ  ＡＡＦ９４６１３．１）。Ｃ．示された翻訳を有する、ＡとＢのサブユニットを示すＣＴＸ  ＤＮＡ配列（配列番号：４０）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ００３８５２）。コード化されたタンパク質は、出現順で、配列番号３８及び３９としてそれぞれ開示される。
【図１５】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性のｒＥＰＡ生成のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様の画像。シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養において発現された可溶性のｒＥＰＡは、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験される、試験された誘発後０及び２４時間での、発現菌株ＰＳ５３８−１６３３（ｕ１とｕ２）、ＰＳ５３８−１６４０（ｕ３とｕ５）及びＰＳ５３８−１６７０（ｕ６、ｕ７及びｕ８）の発酵からの可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像で示される。Ｍｖ＝分子量基準（１６、２０の、２９、４８及び６９キロダルトン）。
【図１６】シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養における可溶性のｒＥＰＡ生成トレンド。可溶性のｒＥＰＡ発現レベルは、それぞれの発酵（ｕ１、ｕ２、ｕ３、ｕ６、ｕ７及びｕ８）における菌株（ＰＳ５３８−１６３３、ＰＳ５３８−１６４０及びＰＳ５３８−１６７０）のＳＤＳ−ＣＧＥ分析によって測定されるように、誘発後の時間に対して図示される。
【図１７】シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養における可溶性のｒＥＰＡ生成のウェスタンブロット。シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養において発現された可溶性のｒＥＰＡは、ウェスタンブロット解析を使用して分析された。誘発後の０及び２４時間での発現菌株ＰＳ５３８−１６３３（ｕ１）、ＰＳ５３８−１６４０（ｕ３とｕ５）及びＰＳ５３８−１６７０（ｕ６とｕ８）の発酵からの可溶性画分は、緑膿菌外毒素Ａに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析において示される。Ｍｗ＝分子量基準。ｓｔｄ＝ｒＥＰＡ標準。
【図１８】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性のＣＲＭ１９７生成のＳＤＳ−ＣＧＥのゲル様の画像。シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養において発現されたＣＲＭ１９７は、毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析された。試験された誘発後の様々な時間（０、１６、２１及び２３時間）での、発現菌株ＰＳ５３８−７７２（ｕ１とｕ２）、ＰＳ５３８−７７６（ｕ３とｕ５）及びＰＳ５３８−７８２（ｕ６とｕ７）の様々な発酵からの可溶性画分は、ＳＤＳ−ＣＧＥデータから発生したゲル様の画像において示される。Ｍｗ＝分子量基準（１６、２０の、２９、４８、６８及び１１９キロダルトン）。
【図１９】シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養における可溶性のＣＲＭ１９７生成トレンド。それぞれの発酵（ｕ１、ｕ２、ｕ３、ｕ６及びｕ７）において異なる菌株（ＰＳ５３８−７７２、ＰＳ５３８−７７６及びＰＳ５３８−７８２）からのＳＤＳ−ＣＧＥによって測定されるような可溶性のＣＲＭ１９７発現レベルは、誘発後の時間に対抗して図示される。
【図２０】シュードモナスフルオレッセンス発酵培養における可溶性のＣＲＭ１９７生成のウェスタンブロット。シュードモナスフルオレッセンスの発酵培養において発現されたＣＲＭ１９７は、ウェスタンブロット解析を使用して分析された。試験される誘発後の様々な時間（０、１６、２１及び２３時間）にて、発現菌株ＰＳ５３８−７７２（ｕ１とｕ２）、ＰＳ５３８−７７６（ｕ３とｕ５）及びＰＳ５３８−７８２（ｕ６とｕ７）の様々な発酵からの可溶性画分は、ジフテリア毒素特異抗体を使用するウェスタンブロット解析において示される。Ｍｗ＝分子量基準（３７、５０の、７５、１００、１５０及び２５０キロダルトン）。ＳＴＤ＝ＣＲＭ１９７基準。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
〈毒素〉
〈ＡＤＰリボシル化毒素〉
ＡＤＰリボシル化毒素（ＡＤＰＲＴ）は、ニコチンアミドとＮＡＤのＮ−リボースの間のＮ−グリコシル結合の切断を促進し、標的タンパク質にＡＤＰリボース部分を移動する。ＡＤＰＲＴはそれぞれの標的に基づいて４つのファミリーに分類される。Ｉ型ＡＤＰＲＴはヘテロマーのＧＴＰ結合タンパク質を標的とする。それらは、コレラ毒素（ＣＴＸ）、百日咳毒素（ＰＴＸ）及び大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）を含む。ＩＩ型ＡＤＰＲＴ（ジフテリア毒素及びシュードモナス菌外毒素Ａは伸長因子２（ＥＦ２）を修正する。ＩＩＩ型ＡＤＰＲＴ（ボツリヌス菌Ｃ３細胞外酵素）は、小さなＧＴＰ結合タンパク質をＡＤＰリボシル化する。ＩＶ型ＡＤＰＲＴ  ＡＤＰ−リボシル化アクチン。これらのアクチンに特異的なＡＤＰＲＴは、クロストリジウムボツリヌス菌Ｃ２毒素、ウェルシュ菌ι−毒素、クロストリジウムディフィシレ毒素（引用により本明細書に組み込まれた、「Ｐｏｐｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  ”Ａｃｔｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｓｔｒａｉｎ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５６（９）：２２９９−２３０６」に記載される、ＴｃｄＡとＴｃｄＢとは異なる毒素）、Ｃ．ｓｐｉｒｏｆｏｒｍｅ毒素、及びセレウス菌の成長力のある殺虫のタンパク質（ＶＩＰ）を含む、二成分の毒素のファミリーを含む。
【００４５】
各々の型のＡＤＰＲＴからの様々な酵素の成分の構造は、ＮＡＤによって又はＮＡＤ無しで決定され、例えば、引用により本明細書に組み込まれた、「Ｔｓｕｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  −ｔｏｘｉｎ，”  ＰＮＡＳ  １０５（２１）：７３９９−７４０４」により考察される。典型的なアクチン特異的ＡＤＰＲＴは２つの類似したドメインを所有する：触媒能力に不可欠であるＣドメイン；及び結合及び転位サブユニットとの相互作用に重要であるＮドメイン。対照的に、サルモネラ菌及びＩＩＩ型ＡＤＰＲＴ  Ｃ３からのＳｐｖＢは、ＡＤＰリボース転移酵素ドメインを１つだけ有し、Ｎ末端アダプタードメインを欠く。すべてのＩＶ型ＡＤＰＲＴにおいて、２つの重要なグルタミン酸残留物を含むＥＸＥモチーフは、触媒中心に存在する。ＥＸＥモチーフの前のグルタメートは、ＡＤＰリボース転移酵素に重要な残留物であると思われ、それはアクチン中のＡｒｇ−１７７から脱プロトン化させられる。後のグルタミン酸は、Ｎ−リボース上でＯ’２を有する水素結合を形成し、オキソカルベニウム陽イオンを安定させると思われる。
【００４６】
ＡＤＰＲＴは、全てが引用によって本明細書に組み込まれる、「Ｂａｒｔｈ,  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  ”Ｂｉｎａｒｙ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｉｎｓ：  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｎｄ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６８（３）：３７３−４０２」；「Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌｈｙｄｒｏｌａｓｅ ３  （ｍＡＲＨ３），”  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｆ６４：１５６−１６２」；「Ｋｕｌｉｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘｏｅｎｚｙｍｅ  Ｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３（１）：１−８」；「Ｓａｋｕｒａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ”Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  Ｉｏｔａ−Ｔｏｘｉｎ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”  Ｔｏｘｉｎｓ  １：２０８−２２８」；及び「Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  ”Ｔｈｅ ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏｃｉｄａｌ  Ｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ，”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７（１４）：  １１９４１−１１９４８」によって更に記載される。
【００４７】
本発明の実施形態において、ＡＤＰＲＴを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、ＡＤＰＲＴのグループは、ＣＴＸ（ＣＴＡ及び／又はＣＴＢ）、ＰＴＸ、ＤＴ（ＣＲＭ１９７及び／又はＷＴ）、及びシュードモナス菌外毒素Ａから成る。実施形態において、ＡＤＰＲＴのグループは、ＣＴＸ（ＣＴＡ及び／又はＣＴＢ）、ＰＴＸ、及びシュードモナス菌外毒素Ａから成る。他の実施形態において、Ｉ型ＡＤＰＲＴを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、Ｉ型ＡＤＰＲＴのグループはＣＴＸ（ＣＴＡ及び／又はＣＴＢ）、及びＰＴＸから成る。他の実施形態において、ＩＩ型ＡＤＰＲＴを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、ＩＩ型ＡＤＰＲＴのグループは、ＤＴ（ＣＲＭ１９７及び／又はＷＴ）、及びシュードモナス菌外毒素Ａから成る。
他の実施形態において、ＩＶ型ＡＤＰＲＴを含むグループから選択された組み換え型毒素タンパク質が生成される。実施形態において、ＩＶ型ＡＤＰＲＴはＴｃｄＢである。
【００４８】
〈ＣＲＭ１９７及びＤＴ〉
交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）は、ミスセンス突然変異を有するＤＴ遺伝子から生成されたジフテリア毒素（ＤＴ）変異体である。ＤＴはＡＤＰリボシル化毒素である；ＣＲＭ１９７は、ＤＴのＡＤＰリボース転移酵素（ＡＤＰＲＴ）活性を欠き、したがって無毒である。ＣＲＭ１９７のための遺伝子は、単独ベース置換を有し、残留物５２にてグリシンの代わりにグルタミン酸の取り込みをもたらす。（例えば、全てが引用によって本明細書に組み込まれる、「Ｂｉｓｈａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  ”Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １６９（１１）：５１４０−５１」、「Ｇｉａｎｎｉｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  ”Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｎｏｎ−Ｔｏｘｉｃ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ：  ＣＲＭ４５  ａｎｄ  ＣＲＭ１９７，”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１０）：  ４０６３−９」、及び「ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．  １００７２１６Ａ」を参照。）
【００４９】
ＣＲＭ１９７タンパク質は、当該技術分野において既知の方法によって、又はジフテリア菌又は他の微生物における発現によって低レベルで調製され得る。自然発生の、又は野生型の、ジフテリア毒素は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を含む様々な公共のソースから利用可能な毒素産生菌から得られ得る。ジフテリア菌においてＣＲＭ１９７タンパク質を生成するためのプラスミドシステムは、例えば、その全体において引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６１４、３８２号、「Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ」に記載される。
【００５０】
ヌクレオチド配列は、コリネバクテリオファージβによって運ばれたジフテリア毒素のための野生型構造遺伝子の既知のＤＴヌクレオチド配列に基づき、組換ＤＮＡ技術（例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９」に記載）の技術を使用して、及び部位特異的変異誘発によっても調製され得る。（例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、「Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３,  ”Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  Ｃａｒｒｉｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  １８，”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８０：６９５３−７」を参照。）本明細書の他の部分に記載されるように、ヌクレオチド配列は最適化され得る。
【００５１】
本発明の実施形態において、ＣＲＭ１９７又はＤＴは、実施例１における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、実施例１に記載の発現ベクター（プラスミド）の何れかと組み合わせて生成される。実施形態において、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型のＣＲＭ１９７又はＤＴタンパク質に融合される、表８及び表３に記載の分泌物リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７又はＤＴタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約０．５ｇ／Ｌ乃至少なくとも約１２ｇ／Ｌの収量で、ＣＲＭ１９７又はＤＴを生成するために使用される。
【００５２】
〈コレラ毒素〉
コレラ菌によって産出されたコレラ毒素（ＣＴＸ）はまた、ＡＤＰリボシル化毒素である。コレラ毒素（ＣＴＸ）は、６つのサブユニットタンパク質から構成されたオリゴマーの複合体である：コレラ毒素Ａサブユニット（ＣＴＡ）の単一のコピー、及びコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）の５つのコピー。各々１２ｋＤａの重量を有する５つのＢサブユニットは五員環を形成する。Ａサブユニットは、Ａ１部分、ＣＴＡ１、Ｇタンパク質をＡＤＰ−リボシル化する球状の酵素、及びＡ２鎖、ＣＴＡ２を有し、それは、Ｂサブユニット環の中央のポアにきっちり位置する拡張したα螺旋体を形成する。この環は、宿主細胞表面上のＧＭ１ガングリオシド受容体に結合し、全複合体の内部移行をもたらす。一旦内部移行されると、ＣＴＡ１鎖はジスルフィド架橋の減少によって放出される。その後、ＣＴＡ１は活性化され、アデニル酸シクラーゼのＡＤＰリボシル化を触媒する。アデニル酸シクラーゼ活性において結果として生じる増加は、環状ＡＭＰ合成を増加させ、それは大量の液体及び電解質流出を引き起こし、下痢をもたらす。
【００５３】
ＣＴＸのＢサブユニットは、比較的無害であるが、ＧＭ１ガングリオシド受容体に結合するその能力を保持する。それ故、ＣＴＢは、化学的に又は遺伝学的に結合した異種抗原の粘膜の取り込みの促進における使用を見出す。粘膜及び全身性の免疫を誘発することが実証されており、食用のワクチン生成で使用される候補である。その結合優先（ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のため、ＣＴＢはまた、神経細胞のトレーサーとしての使用を見出す。
【００５４】
その構造の特徴と同様にＣＴＢの使用も、例えば、その全てが引用により本明細書に組み込まれる、「Ｎｏｚｏｙｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ  Ａｓ１４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｎ  Ｒｉｃｅ  Ｓｅｅｄｓ，”  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ９９５−１０００」；「Ｈａｒａｋｕｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  “Ｈｅｔｅｒｏｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：  ａ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｎｅｗ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｔｏ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，“  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７３（９）：５６５４−５６６５」；「Ｐｒｉｃｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  “Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖａｇｉｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７３（７）：３９４５−３９５３」；及び「Ｓｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  “Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｅｖｏｋｅｓ  Ａｎｔｉｐａｒａｓｉｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ，”  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１０４５−１０５２」に記載される。
【００５５】
本発明の実施形態において、ＣＴＢ又はＣＴＸは、例１において本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、例３に記載の発現ベクターの何れかと組み合わせて生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型ＣＴＢ又はＣＴＸタンパク質に融合される表８及び表３に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、ＣＴＢ又はＣＴＸタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約０．２ｇ／Ｌ乃至少なくとも約５ｇ／Ｌの収量でＣＴＢ又はＣＴＸを生成するために使用される。
【００５６】
〈百日咳毒素〉
百日咳毒素は、百日咳菌によって生成された菌体外毒素と病原性の因子、疾患百日咳を引き起こすヒト気道の病原菌である。百日咳ホロトキシンは、ＡＢ５構造とのマルチサブユニットの複合体である。酵素学的に活性なＡサブユニット（Ｓ１）は、哺乳動物細胞において幾つかのヘテロ三量体のＧタンパク質（主としてＧｉタンパク質）のアルファサブユニットを修正するＡＤＰリボース転移酵素であり、Ｂオリゴマー（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４の２つのコピー、及びＳ５）は、細胞上の複合糖質受容体を結合する。Ｓ１は、細胞エントリーの後にタンパク分解性に処理される。引用により本明細書に組み込まれる、「Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  ”Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｓ１  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  Ｎｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｉｔｓ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，”  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：７」は、Ｓ１の処理が哺乳動物細胞におけるその細胞毒性活性に不可欠ではないと報告した。
【００５７】
百日咳毒素の無毒な変異体はワクチンにおいて使用するために調査された。本発明の方法を使用して生成された百日咳毒素タンパク質は、百日咳から保護するためのワクチンにおける使用のために熟考される。百日咳毒素はまた、例えば、引用によって本明細書に組み込まれる、「Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  “Ａ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｔｈａｔ  Ｌａｃｋｓ  ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ，  Ｉｓ  ａｎ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６３（６）：２１００−２１０８」に記載されるように、ワクチンアジュバントとして試験された。更に、百日咳毒素はまた、研究目的、例えば、Ｇタンパク質シグナル経路（例えば、引用により本明細書に組み込まれる「ＭｃＣｏｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  “ＰＡＲ１  ａｎｄ  ＰＡＲ２  ｃｏｕｐｌｅ  ｔｏ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｅｔｓ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｋｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｆａｓｔ  Ｆｏｒｗａｒｄ  ＭＯＬ  ６２０１８」）に関する研究のために、及び自己免疫性疾患、例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的自己免疫性精巣炎、実験的自己免疫性のブドウ膜炎などの誘発を高めるアジュバントとして役立つ（引用により本明細書に組み込まれる「Ｓｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  “Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｉｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｓｉｇｎａｌｓ，”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：２５０−２５６．」）。
【００５８】
毒素の５つのサブユニットは、図３に示される、百日咳トキソイドオペロンから発現される。特定の変異体を含む百日咳毒素タンパク質の発現及び構造は、全てその全体において引用により組み込まれる、「Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  “Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６０（６）：２２５２−２２５６」；米国特許第５，０８５，８６２号「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ」；及び「Ｋａｓｌｏｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，  “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６（１）：１２３−７」によるものと同様、上記で引用された報告に記載される。
【００５９】
本明細書で使用されるような百日咳毒素又はＰＴＸは、百日咳毒素突然変異体Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ又は野生型のタンパク質を指す。野生型の百日咳毒素及び百日咳毒素突然変異体Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａは、例えば、全てその全体において引用により組み込まれる、「Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５」（上記で引用）；米国特許第７，４２７，４０４号及び米国特許第７，６６６，４３６号、両方の表題「Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｓｕｃｈ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；米国特許第５，９３５，５８０号、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」；米国特許第７，１６９，３９９号、「Ｎｏｎ−Ｔｏｘｉｃ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  ａｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」；米国特許第５，７８５，９７１号及び米国特許第５，４２７，７８８号、両方の表題「Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」；及び米国特許第５，７７３，６００号、「ＤＮＡ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｍｕｔｅｉｎｓ」に記載される。
【００６０】
本発明の実施形態において、百日咳毒素突然変異体Ｓ１  Ｅ１２９Ａ又は野生型の百日咳毒素は、実施例１、５及び７において本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して生成される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型ＰＴＸタンパク質に融合される表８及び表３に記載される分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。実施形態において、配列をコード化するサブユニットの何れか又は全ては、本明細書に別記されるように、選択されるシュードモナス菌宿主における発現のために最適化される。特定の実施形態において、サブユニットは、例えば、当該技術分野において周知の方法に従って個々の配列をサブクローン化することにより、２以上の構築物から発現される。特定の実施形態において、ＰＴＸタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約０．２ｇ／Ｌ乃至少なくとも約５ｇ／Ｌの収量でＰＴＸ又はＰＴＸの個々のサブユニットを生成するために使用される。
【００６１】
〈破傷風毒素のフラグメントＣ〉
破傷風菌によって産出された破傷風毒素は、１５０ｋＤａの分子量を有する神経毒である。それは２つの部分から構成される：１００ｋＤａの重鎖又はＢ鎖及び５０ｋＤａの軽鎖又はＡ鎖。鎖は、ジスルフィド結合によって連結される。Ｂ鎖は、神経細胞の細胞膜上のジシアロガングリオシド（ＧＤ２及びＧＤ１ｂ）に結合する。Ａ鎖、亜鉛エンドペプチダーゼは、小胞に関連する膜タンパク質（ＶＡＭＰ）を攻撃する。
【００６２】
Ａ鎖の作用は、影響を受けた神経細胞が、タンパク質シナプトブレビンの分解により抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡ（γ−アミノ酪酸）及びグリシンを放出するのを止める。この結果は、最も小さな刺激からの筋肉における危険な活動過剰、即ち、感覚の刺激による運動反射の阻害ができないことである。これは、テタニー性攣縮と称される、アゴニスト及びアンタゴニスト筋肉組織の一般化された収縮を引き起こす。
【００６３】
破傷風毒素のフラグメントＣ（ＴｅｔＣ又はＴＴＣ）は、破傷風毒素のプロテアーゼ開裂（例えばパパインによる）によって、又はフラグメントの組み換え型の発現を通じて発生した５０ｋＤのポリペプチドである。それは、Ｃ末端での４５１のアミノ酸に相当する（アミノ酸位置８６５−１３１５）。フラグメントＣの組み換え型の発現は、例えば、その全体において全て引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４４３，９６６号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ」、ＷＯ／２００５／０００３４６、「Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、第６，０１０，８７１号、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」に開示される。
【００６４】
フラグメントＣは、無毒であり、マウスとモルモットにおける防御免疫応答を刺激できることが示された。米国特許第５，４４３，９６６号は、破傷風毒素の配列及び大腸菌におけるフラグメントＣの生成を記載する。酵母における組み換え型のＴＴＣの発現は、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５７１，６９４号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ」に記載された。
【００６５】
それが高い特異性と親和性により神経細胞に結合するため、ＴＴＣは、神経細胞の薬物送達、又は研究目的のために標的とする分子としての使用を見出す。そのような使用は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、「Ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ  Ｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｎｓ，”  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（３４）：５１７６−５１８４」に記載される。
【００６６】
ＴＴＣタンパク質はまた、例えばＷＯ／２００５／０００３４６に記載されるように、ワクチン担体タンパク質として潜在的に有用であり、クロストリジウムテタニ感染から保護するためのワクチンにおいて使用するために調査された。
【００６７】
本発明の実施形態において、ＴＴＣは、実施例１における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、実施例８に記載の発現ベクターの何れかと組み合わせて生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型ＴＴＣのタンパク質に融合する表８及び表３に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を有する。特定の実施形態において、ＴＴＣのタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。実施形態において、本発明の方法は、約０．５ｇ／Ｌ乃至少なくとも約１２ｇ／Ｌの収量でＴＴＣを生成するために使用される。
【００６８】
〈クロストリジウムディフィシル毒素Ｂ〉
クロストリジウムディフィシル毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）は、クロストリジウムディフィシルによって生成された病原性因子であり、それは院内での下痢及び偽膜性大腸炎を引き起こす。ＴｃｄＢ、及び第２の大きなクロストリジウム毒素、ＴｃｄＡは、偽膜性大腸炎の進行に関係する。
【００６９】
ＴｃｄＢ（約２７０ｋＤのグルコシル化毒素）は、酵素、転位及び受容体結合のドメインに分けることができる。ＴｃｄＢの第１の５４６アミノ酸は、酵素の領域を含み、それは、推定上の転位及び受容体結合ドメインに続く。酵素活性は、このフラグメントのアミノ又はカルボキシ末端欠失が活性を減少するように、アミノ末端５４６の残留物を必要とすると報告された。酵素領域内で、トリプトファン１０２は、ＵＤＰ−グルコース結合に不可欠であると示された。ＬＣＴ内で保存されたＤＸＤモチーフは、ＬＣＴグルコシルトランスフェラーゼ活性に不可欠である。ＴｃｄＢ及びＴｃｓＬ酵素ドメインのキメラの分析に関係する研究は、残留物３６４乃至５１６が基質特異性を付与することを示唆する。
【００７０】
ＴｃｄＢの構造及びその発現並びにクロストリジウムディフィシレ感染のための保護ワクチンとしての潜在的な使用は、例えば、その全体において全て引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２２６，５９７号、「Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」；「Ｊａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｎｇ  ｔｏｘｉｎｓ：  ｔｈｅ  ＡＢＣＤ  ｍｏｄｅｌ，”  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６（５）：２２２−２２９」；「Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５（３）：１０３２−１０４０」；及び「Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，”  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１９２」にて考察される。
【００７１】
本発明の実施形態において、ＴｃｄＢは、実施例１、５及び７における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、使用される発現ベクターは、組み換え型ＴｃｄＢタンパク質に結合される表８及び表３に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を含む。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、ＴｃｄＢタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約０．５ｇ／Ｌ乃至少なくとも約１０ｇ／Ｌの収量でＴｃｄＢを生成するために使用される。
【００７２】
〈緑膿菌外毒素Ａ〉
緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ又はＰＥ）は、ＩＩ型ＡＤＰＲＴである。それは、触媒ドメインを哺乳動物細胞へと移動させることができ、細胞の伸長因子２のＡＤＰリボシル化によってタンパク質合成を阻害することができる、分泌された細菌毒素のファミリーの１つのメンバーである。タンパク質はモノマーとして存在し、６１３のアミノ酸（６６Ｋｄ）の単一のポリペプチド鎖から成る。３．０−Ａ分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に決定される、外毒素ＡのＸ線結晶構造は、主として逆平行ベータ構造からなり、分子のおよそ半分；α−ヘリックスからなる中間のドメイン；及び分子のおよそ３分の１を含むカルボキシル末端ドメインを含む、アミノ末端ドメインを示す。カルボキシル末端ドメインは、毒素のＡＤＰリボース転移酵素である。他の２つのドメインは、細胞受容体結合及び膜転位に恐らく関係する。
【００７３】
毒素は細胞表面上の特異的な受容体を介して細胞に結合し、その後、毒素受容体複合体は細胞へ内部移行される。最終的に、ＥＴＡは、それが酵素学的にタンパク質合成を阻害するサイトゾルに伝送される。細胞の中毒が、酸性の小胞におけるｐＨを上げる、ＮＨ４＋などの弱塩基によって予防されるため、伝送プロセスは、酸性の区画から生じると考えられる。酸性の状態への暴露に際して、ＰＥの疎水性のドメインは細胞膜へ入り、酵素のドメインが拡張した形態でサイトゾルを通過するチャネルの形成をもたらす。毒性を減少させたＰＥと突然変異体の活性は、例えば、その全体において両方が引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８９２，８２７号、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ：  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｏｗ  Ｓｉｄｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ」、及び「Ｌｕｋａｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８，  ”Ｔｏｘｏｉｄ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ａｃｔｉｖｅ−Ｓｉｔｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５６（１２）：  ３０９５−３０９８」に記載される。
【００７４】
ワクチン共役としての外毒素Ａ突然変異体ｒＥＰＡの使用は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、「Ｆａｔｔｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  “Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔｙｐｅ  ５  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ８  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ，”  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６１（３）：１０２３−１０３２」；「Ｑｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  “Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＥｘｏＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ：  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，”  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５（２０）：３９２３−３９３３」；及び「ｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  “Ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉ  Ｖｉ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｔｗｏ−Ｔｏ−Ｆｉｖｅ−Ｙｅａｒ−Ｏｌｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，”  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４（１７）：  １２６３−１２６９」に記載される。
【００７５】
本明細書で使用されるような緑膿菌外毒素Ａは、緑膿菌外毒素Ａ突然変異体ＣＲＭ６６、欠失ｒＥＰＡ（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｒＥＰＡ）、又は野生型のタンパク質を指す。本発明の実施形態において、外毒素Ａは、実施例１、５及び７における本明細書に記載の宿主菌株の何れかを使用して、及び組み換え型外毒素Ａタンパク質に融合される表８及び表３に記載の分泌リーダーの何れかを発現する構築物を有する発現ベクターを使用して生成される。実施形態では、核酸配列はシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化される。実施形態において、自然の分泌リーダーが使用される。特定の実施形態において、ＥＴＡタンパク質は、タグ、例えば精製タグにより発現される。実施形態において、本発明の方法は、約０．５ｇ／Ｌ乃至少なくとも約１２ｇ／Ｌの収量で外毒素Ａを生成するために使用される。
【００７６】
本発明の方法を使用して生成された典型的な毒素タンパク質は、表１に記録される。この表は限定していないことが理解される。本発明の実施形態において、本発明の方法を使用する生成のための、本明細書に記載の毒素の核酸配列の何れかは、選択されたシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化することができる。本明細書に別記されるように、所定の配列の最適化に対する複数の選択肢がある。記載されるような選択肢の何れかは、本発明の方法を使用して生成された毒素の配列の最適化における使用のために熟慮される。本明細書で提供される最適化された配列は、本発明の方法に役立つ最適化された配列の限定しない例である。
【００７７】
【表１】
0005839411.tif 000002
【００７８】
〈コドンの最適化〉
異種の発現系において、最適化工程は、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善し得る。タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡの処理、及び翻訳の安定性及びその開始に影響を与えるものを含む、多数の因子によって管理される。ポリヌクレオチド最適化工程は、研究者が発現構築物を効率的に設計するのを援助するための工程と同様、宿主が外来タンパク質を生成する能力を改善するための工程を含み得る。最適化のストラテジーは、例えば、翻訳開始領域の修正、ｍＲＮＡの構造要素の変化、及び異なるコドンバイアスの使用を含み得る。細菌の宿主における異種のタンパク質の発現を改善するための、核酸配列を最適化する方法は、当該技術分野において既知であり、文献に記載されている。例えば、シュードモナス宿主菌株における発現に関するコドンの最適化は、例えば、その全体において引用によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００７／０２９２９１８号「Ｃｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ」に記載される。
【００７９】
最適化は、このように異種遺伝子の多くの配列特徴の何れかに対処できる。特異的な例として、レアコドンに誘発された翻訳の停止は、減少された異種のタンパク質発現をもたらすことができる。レアコドンに誘発された翻訳の停止は、宿主生物においてめったに使用されない対象のポリヌクレオチドにおけるコドンの存在を含み、このことは、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるそれらの欠乏により、タンパク質翻訳に負の影響を及ぼし得る。宿主生物における最適な翻訳を改善する１つの方法は、合成のポリヌクレオチド配列から取り除かれているレア宿主コドンをもたらし得るコドン最適化を行なう工程を含む。
【００８０】
代替の翻訳の開始はまた、減少された異種のタンパク質発現をもたらすことができる。代替の翻訳の開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを不注意に含む、合成のポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部の部位から切り詰められたタンパク質の翻訳の開始をもたらし得る。精製中に取り除くのが難しくなり得る、切り詰められたタンパク質を生成する可能性を減少させる１つの方法は、最適化されたポリヌクレオチド配列から推定上の内部のＲＢＳ配列を除去する工程を含む。
【００８１】
繰り返して誘発されたポリメラーゼスリップ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）は、減少された異種のタンパク質発現をもたらし得る。繰り返して誘発されたポリメラーゼの滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）は、フレームシフト突然変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリップ又はスタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）を引き起こすと示された、ヌクレオチド配列の繰り返しに関係する。そのような繰り返しはまた、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含量バイアスを有する生物体において、Ｇ又はＣヌクレオチドの繰り返しからなる、より高い程度の繰り返しがあり得る。それ故、ＲＮＡポリメラーゼスリッページを誘発する可能性を減少させる１つの方法は、Ｇ又はＣのヌクレオチドの拡張した繰り返しを変える工程を含む。
【００８２】
干渉する二次構造はまた、減少された異種のタンパク質発現をもたらし得る。二次構造は、ＲＢＳ配列又は開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の縮小に関連づけられた。ステムループ構造はまた、転写の停止及び減弱に関係し得る。最適化されたポリヌクレオチド配列は、改善された転写及び翻訳を許容するため、ヌクレオチド配列のＲＢＳ及び遺伝子のコード領域に最小の二次構造を含み得る。
【００８３】
異種のタンパク質発現に影響を与え得る別の特徴は、制限部位の存在である。宿主発現ベクターへの転写単位のその後のサブクローニングにより妨害することができる制限部位を取り除くことによって、ポリヌクレオチド配列は最適化され得る。
【００８４】
例えば、最適化プロセスは、宿主によって異種性に発現される所望のアミノ酸配列を同定することにより始まり得る。アミノ酸配列から、候補のポリヌクレオチド又はＤＮＡ配列が設計され得る。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン利用の頻度は、宿主発現生物体のコドン利用と比較することができ、レア宿主コドンは合成の配列から取り除かれ得る。更に、合成の候補ＤＮＡ配列は、望ましくない酵素制限部位を取り除き、かつ任意の所望シグナル配列、リンカー、又は翻訳されていない領域を加える、又はそれらを取り除くために修正され得る。合成ＤＮＡ配列は、Ｇ／Ｃの繰り返し及びステムループ構造などの翻訳プロセスにより妨害し得る、二次構造の存在に関して分析され得る。候補ＤＮＡ配列が合成される前に、最適化された配列設計は、配列が所望のアミノ酸配列を正確にコード化することを確認するために調べられ得る。最終的に、候補ＤＮＡ配列は、当該技術分野で既知のものなどの、ＤＮＡ合成技術を使用して合成され得る。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、シュードモナスフルオレッセンスなどの宿主生物体における一般的なコドン利用は、異種のポリヌクレオチド配列の発現を最適化するために利用され得る。宿主発現系における特定のアミノ酸に好ましいように、めったに考慮されないコドンの割合及び分布が評価され得る。５％及び１０％の使用の値は、カットオフ値として、レアコドンの測定に使用され得る。例えば、表２に記録されたコドンは、シュードモナスフルオレッセンスＭＢ２１４ゲノムにおいて５％未満の計算された発生を有し、シュードモナスフルオレッセンス宿主において発現した、最適化された遺伝子において一般に回避されるであろう。
【００８６】
【表２】
0005839411.tif 000003
【００８７】
本発明は、使用されているシュードモナス菌宿主細胞における発現のために最適化された任意の配列を含む、生成された毒素のための任意のコード配列の使用を熟考する。使用のために熟考された配列は、限定されないが、以下のものを除去するための最適化を含み、所望されるように任意の程度に最適化され得る：シュードモナス菌宿主細胞において５％未満で生じるコドン、シュードモナス菌宿主細胞において１０％未満で生じるコドン、レアコドンに誘発された翻訳の停止、推定上の内部ＲＢＳ配列、Ｇ又はＣヌクレオチドの拡張した繰り返し、干渉する二次構造、制限部位、又はそれらの組み合わせ。
【００８８】
更に、本発明の方法を実行するのに役立つ任意の分泌リーダーのアミノ酸配列は、任意の適切な核酸配列によってコード化され得る。
【００８９】
〈発現系〉
本発明の方法に役立つ宿主細胞と同様に、シュードモナス菌宿主細胞において、有用な調節配列（例えば、プロモータ、分泌リーダー、及びリボソーム結合部位）を含む異種のタンパク質を発現する方法は、例えば、その全体において引用により全てが本明細書に組み込まれる、米国特許公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願番号第１２／６１０，２０７号、両方の表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄｌｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｈｏｓｔｓ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｃｅｒｔａｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｙｉｅｌｄ  ａｎｄ／ｏｒ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、米国特許公報第２００６／００４０３５２号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ」、及び米国特許公報第２００６／０１１０７４７号、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」に記載される。これら公報はまた、フォールディングモジュレータを過剰発現するために設計され、又は異種のタンパク質発現を増加させるために、欠失を含むプロテアーゼ変異が導入された、本発明の方法を実行するのに役立つ細菌の宿主菌株を記載する。
【００９０】
〈リーダー〉
配列リーダーは、その全体において全てが引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００８／０１９３９７４号及び第２０１０／００４８８６４号、両方の表題「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、及び米国特許出願公報第２００６／０００８８７７号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｃ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ」、同様に米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号に詳しく記載される。
【００９１】
実施形態において、分泌リーダーをコード化する配列は、毒素タンパク質をコード化する配列に融合される。実施形態において、分泌リーダーはペリプラズムの分泌リーダーである。実施形態において、分泌リーダーは自然の分泌リーダーである。
【００９２】
【表３】
0005839411.tif 000004
【００９３】
本発明の方法に役立つ分泌リーダーは、表３に開示されたものに限定されないことが理解される。
【００９４】
実施形態において、分泌リーダーは、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ、ＣｕｐＡ２、又はＰｂｐＡ２０Ｖである。他の実施形態において、分泌リーダーは、Ａｚｕ、ＩｂｐＳ３１Ａ、ＣｕｐＡ２、ＰｂｐＡ２０Ｖ、又はＰｂｐである。
【００９５】
自然のＣＲＭ１９７は、開裂される分泌リーダーを介してジフテリア菌から細胞外空間へ輸送され、ＧＡＤＤのアミノ末端配列（配列番号：２１）を残す。ＣＲＭ１９７の自然のアミノ末端、その後シュードモナスフルオレッセンスにおける発現を保存し、及びジスルフィド結合形成を確実にするために、タンパク質は細胞周辺腔に標的とされる。
【００９６】
〈プロモータ〉
本発明に従って使用されるプロモータは、構成的なプロモータ又は調節されたプロモータであり得る。有用な調節されたプロモータの一般の例は、ｌａｃプロモータ（すなわち、ｌａｃＺプロモータ）、特にＤｅＢｏｅｒによる米国特許第４，５５１，４３３号に記載のｔａｃ及びｔｒｃプロモータ、更にＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、及びＴ７ｌａｃプロモータ由来のファミリーのものを含む。１つの実施形態において、プロモータは宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモータは大腸菌生物体に由来する。
【００９７】
誘導可能なプロモータ配列は、本発明の方法に従って毒素の発現を調節するために使用され得る。実施形態において、本発明の方法に役立つ誘導可能なプロモータは、ｌａｃプロモータ（すなわち、ｌａｃＺプロモータ）、特にＤｅＢｏｅｒによる米国特許第４，５５１，４３３号に記載のｔａｃ及びｔｒｃプロモータ、更にＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、及びＴ７ｌａｃプロモータ由来のファミリーのものを含む。1つの実施形態において、プロモータは宿主細胞生物体に由来しない。特定の実施形態において、プロモータは大腸菌生物体に由来する。
【００９８】
本発明に従った発現系に役立つ非ｌａｃ型プロモータの一般の例は、例えば表４に記録されたものを含む。
【００９９】
【表４】
0005839411.tif 000005
【０１００】
例えば、「Ｊ．  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  ＆  Ｖ．  Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  （１９９９）  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ａ．  Ｄｅｍａｉｎ  ＆  Ｊ．  Ｄａｖｉｅｓ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  ４６０−７４  （ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．）」；「Ｈ．  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  （２００１）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：４３９−４４５」；及び「Ｒ．  Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （２０００  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｊ．  Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｒ．  Ｒａｐｌｅｙ，  ｅｄｓ．）  ｐｐ．  １２５−５４  （Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ））」を参照。選択された細菌の宿主細胞に固有のプロモータのヌクレオチド配列を有するプロモータも、標的ポリペプチド、例えば、シュードモナスアントラニラート又はベンゾアートオペロンのプロモーター（Ｐａｎｔ，  Ｐｂｅｎ）をコード化する、トランスジーンの発現を制御するために使用され得る。１以上のプロモータが別のものに共有結合的に付着される、直列型のプロモータはまた、それが同じ又は異なる配列、例えば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎの直列型プロモータ（プロモータ間混合（ｉｎｔｅｒｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｈｙｂｒｉｄ））、プラーク−プラークの直列型プロモータにあっても、又はそれが同じ或いは異なる生物体に由来するとしても、使用され得る。
【０１０１】
調節されたプロモータは、プロモータがその一部分である遺伝子の転写を制御するために、プロモータ調節タンパク質を利用する。調節されたプロモータが本明細書に使用される場合、相当するプロモータ調節タンパク質はまた、本発明に従った発現系の一部であろう。プロモータ調節タンパク質の例は次のものを含む：活性化タンパク質、例えば、大腸菌カタボライト活性化タンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写活性化因子；リプレッサータンパク質、例えば、大腸菌ＬａｃＩタンパク質；及び二元機能調節タンパク質（ｄｕａｌ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、例えば、大腸菌ＮａｇＣタンパク質。多くの調節されたプロモータ／プロモータ調節タンパク質の対は、当該技術分野では既知である。１つの実施形態において、標的タンパク質のための発現構築物及び対象の異種のタンパク質は、同じ調節要素に制御される。
【０１０２】
プロモータ調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち、プロモータに制御される遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写制御領域に、タンパク質が放出又は結合することを可能にするように、調節タンパク質と可逆的に又は不可逆的に付随する化合物と相互に作用し、それにより遺伝子の転写を開始する際にトランスクリプターゼ酵素の作用を許容又は遮断する。エフェクター化合物は、誘発因子又はコリプレッサーとして分類され、これら化合物は、自然のエフェクター化合物及び無償性誘導物質化合物を含む。多くの規制されたプロモータ／プロモータ調節タンパク質／エフェクター化合物の三つ組は、当該技術分野では既知である。エフェクター化合物は細胞培養又は発酵の全体にわたって使用され得るが、調整されたプロモータが使用される好ましい実施形態において、宿主細胞バイオマスの所望の量又は密度の増加の後、適切なエフェクター化合物は、対象のタンパク質又はポリペプチドをコード化する所望の遺伝子の発現を直接又は間接的にもたらす培養に加えられる。
【０１０３】
ｌａｃファミリープロモータが利用される実施形態において、ｌａｃＩ遺伝子はまたシステムの中に存在し得る。通常構成的に発現した遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、ｌａｃファミリープロモータのｌａｃオペレーターに結合する、Ｌａｃレプレッサータンパク質ＬａｃＩタンパク質（Ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬａｃＩ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコード化する。したがって、ｌａｃファミリープロモータが利用される場合、ｌａｃＩ遺伝子も含まれ、発現系において発現され得る。
【０１０４】
シュードモナスに役立つプロモータシステムは、文献、例えば、米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号に記載され、また上記で引用される。
【０１０５】
〈他の調節要素〉
実施形態において、可溶性タンパク質は、生成中に、細胞の細胞質又はペリプラズムのいずれかに存在する。タンパク質を標的とするのに役立つ分泌リーダーは、本明細書に別記され、及び米国特許出願公報第２００８／０１９３９７４号、米国特許出願公報第２００６／０００８８７７号、及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号に記載される。
【０１０６】
他の要素は、限定されないが、転写エンハンサー配列、翻訳のエンハンサー配列、他のプロモータ、活性化因子、翻訳の開始及び停止の信号、転写ターミネーター、シストロンの調節剤（ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）、多シストロン性の調節剤（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）、発現されたポリペプチドの識別、分離、精製、及び／又は隔離を促進する、ヌクレオチド配列「タグ」及び「タグ」ポリペプチドコード配列などのタグ配列を含む。
【０１０７】
実施形態において、発現ベクターは、分泌シグナルのためのコード配列、又は対象のタンパク質又はポリペプチドのためのコード配列に隣接しているタグ配列を更に含む。１つの実施形態において、このタグ配列は、タンパク質の精製を許容する。タグ配列は、ヘキサ−ヒスチジンアフィニティータグなどの、アフィニティータグであり得る（配列番号：４６）。別の実施形態において、アフィニティータグはグルタチオン−Ｓ−転移酵素分子であり得る。タグはまた、ＹＦＰ又はＧＦＰなど蛍光の分子、又はそのような蛍光タンパク質のアナログであり得る。タグはまた、抗体分子の一部、又は精製に役立つ既知の結合パートナーのための既知の抗原又はリガンドであり得る。
【０１０８】
本発明の方法を実行するのに役立つ発現構築物は、タンパク質コード配列に加えて、操作しやすくそれに結合した以下の調節要素を含み得る：プロモータ、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、及び翻訳の開始及び停止の信号。有用なＲＢＳは、例えば、米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号に従って、発現系における宿主細胞として有用な種の何れかから得られ得る。多くの特異的な及び様々なコンセンサスＲＢＳは既知であり、例えば、それらは、「Ｄ．  Ｆｒｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２３４（２）：２５７−６５  （８  Ｊｕｌ．  １９９９）」；及び「Ｂ．  Ｅ．  Ｓｕｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（１２）：１１２３−３０  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００１）」に記載され、引用される。加えて、自然又は合成のＲＢＳが使用され得、例えば、それらは、「ＥＰ  ０２０７４５９  （ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＲＢＳｓ）」；「Ｏ．  Ｉｋｅｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １８１（３）：５６３−７０  （１９８９）  （ｎａｔｉｖｅ  ＲＢＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＡＡＧＧＡＡＧ）」に記載される。方法、ベクター、及び翻訳並びに転写の要素の更なる例、及び本発明に役立つ他の要素は、当該技術分野において衆知であり、例えば、引用により本明細書に組み込まれる多くの他の公報と同様に、引用により全てが本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｒｏｙによる米国特許第５，０５５，２９４号及びＧｉｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，１２８，１３０号；Ｒａｍｍｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，２５２，４７９号；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，６９５，４５５号及び第４，８６１，５９５号；Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，２５２，４７９号；及びＷｉｌｃｏｘによる米国特許第５，１６９，７６０号に記載される。
【０１０９】
〈宿主菌株〉
シュードモナスを含む細菌の宿主、及び密接に関連した細菌の生物体は、本発明の方法の実行における使用のために熟慮される。特定の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。宿主細胞はまた、大腸菌細胞であり得る。
【０１１０】
本発明の方法を実行するのに役立つ宿主細胞及び構築物は、当該技術分野では既知であり、文献、例えば、その全体において引用により全てが本明細書に組み込まれる、米国特許出願公報第２００９／０３２５２３０号、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載されていた試薬と方法を使用して同定され得る又は作られ得る。
この公報は、ヌクレイン酸構築物を、染色体のｌａｃＩ遺伝子挿入を含む栄養要求性のシュードモナスフルオレッセンス宿主細胞に導入することによる、組み換え型ポリペプチドの生成を記載する。ヌクレイン酸構築物は、宿主細胞におけるヌクレイン酸の発現を方向付けることができるプロモータに操作しやすく結合された、組み換え型ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、また、栄養要求性の選択マーカーをコード化するヌクレオチド配列を含む。栄養要求性の選択マーカーは、原栄養性を栄養要求性の宿主細胞に回復させるポリペプチドである。実施形態において、細胞は、プロリン、ウラシル又はそれらの組み合わせのために栄養要求性である。実施形態において、宿主細胞はＭＢ１０１（ＡＴＣＣデポジットＰＴＡ−７８４１）に由来する。その全体において両方とも引用により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００９／０３２５２３０号、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、及び「Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  “Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｐｙｒＦ  ａｎｄ  ｐｒｏＣ  ｃａｎ  ｒｅｐｌａｃｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｃｅｌｌ−ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ２１（２）：  ３４３−８」は、菌株ＭＢ１０１におけるｐｙｒＦ遺伝子を消すことにより構築されたウラシルのための、生成宿主菌株の栄養要求性を記載する。原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｙ）を回復するためにｐｙｒＦ欠失を補足することができるプラスミドを発生させるため、ｐｙｒＦ遺伝子は、菌株ＭＢ２１４（ＡＴＣＣデポジットＰＴＡ−７８４０）からクローン化された。特定の実施形態において、シュードモナスフルオレッセンス宿主細胞における二重ｐｙｒＦ−ｐｒｏＣ二重栄養要求性（ｄｕａｌ  ｐｙｒＦ−ｐｒｏＣ  ｄｕａｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ）の選択マーカーシステムが使用される。記載されるようなＰｙｒＦ生成宿主菌株（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎ）は、本発明の方法を実行するのに役立つものとして本明細書に記載のものを含む、他の所望のゲノムの変化を導入するためのバックグラウンドとして使用され得る。
【０１１１】
実施形態において、宿主細胞はプセウドモナス目である。宿主細胞がプセウドモナス目である場合、それは、シュードモナス属を含むシュードモナス科のメンバーであり得る。γプロテオバクテリアの宿主は、大腸菌種のメンバー及びシュードモナスフルオレッセンス種のメンバーを含む。
【０１１２】
他のシュードモナス生物体も役立ち得る。シュードモナス及び密接に関連した種は、「“Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｒｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｃｉ”  ｂｙ  Ｒ．  Ｅ．  Ｂｕｃｈａｎａｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｅ．  Ｇｉｂｂｏｎｓ  （ｅｄｓ．），  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ２１７−２８９  （８ｔｈ  ｅｄ．，  １９７４）  （Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．，  ＵＳＡ）  （ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒ  “Ｂｅｒｇｅｙ  （１９７４）”）」に記載の科及び／又は属に属するプロテオバクテリアのグループを含む、グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１を含む。表５は、生物体のこれらの科及び属を提示する。
【０１１３】
【表５】
0005839411.tif 000006
【０１１４】
シュードモナス菌及び密接に関連する細菌は一般に、「グラム（−）プロテオバクテリアサブグループ１（Ｇｒａｍ（−）  Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ  Ｓｕｂｇｒｏｕｐ  １）」又は「グラム陰性好気性の桿菌及び球菌（Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｒｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｃｉ）」に定義されるグループの一部である（Ｂｕｃｈａｎａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｂｂｏｎｓ  （ｅｄｓ．）  （１９７４）  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  ｐｐ．  ２１７−２８９）。シュードモナス宿主菌株は、例えば、上記で引用される文献、米国特許出願公報第２００６／００４０３５２号に記載される。
【０１１５】
「グラム陰性のプロテオバクテリアサブグループ１」はまた、分類において使用される基準に従ったこの見出し（ｈｅａｄｉｎｇ）において分類されるプロテオバクテリアを含む。見出しはまた、アシドボラクス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ）属、ブレバンディモナス（Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ）、バークホルデリア、ヒドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）、オセアニモナス（Ｏｃｅａｎｉｍｏｎａｓ）、ラルストニア、及びステノトロホモナス、ザントモナス属（以前にザントモナス種と呼ばれていた）に属する生物体を再編成することにより作られたスフィンゴモナス属（及びそれに由来するブラストモナス（Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ）属）、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）に定義されるような酢酸菌属に属する生物体を再編成することにより作られたアシドモナス（Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ）属などの、このセクションにおいて以前に分類されたが、もはやそうではないグループを含む。加えて、宿主は、シュードモナス属からの細胞、すなわちそれぞれアルテロモナスハロプランクティス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、アルテロモナスニグリファシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）及びアルテロモナスプトレファシエンス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）として再分類された、シュードモナスエナリア（ｅｎａｌｉａ）（ＡＴＣＣ  １４３９３）、シュードモナスニグリファシエンス（ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ）（ＡＴＣＣ  １９３７５）及びシュードモナスプトレファシエンス（ＡＴＣＣ  ８０７１）を含み得る。同様に、例えば、シュードモナスアシドボランス（ＡＴＣＣ  １５６６８）及びシュードモナステストステロニ（ＡＴＣＣ  １１９９６）は、その後コマモナスアシドボランス及びコマモナステストステローニとしてそれぞれ再分類され；また、シュードモナスニグリファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  １９３７５）及びシュードモナスピスキキダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  １５０５７）は、それぞれシュードアルテロモナスニグリファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ）及びシュードアルテロモナスピスキキダ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ）として再分類された。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１」はまた、以下の科のいずれかに属すると分類されるプロテオバクテリアを含む：シュードモナス科、アゾトバクター科（現在はしばしば、シュードモナス科の「アゾトバクター群」という同義語で呼ばれる）、リゾビウム科及びメチロモナス科（現在はしばしば「メチロコッカス」という同義語で呼ばれる）。従って、本明細書に記載のそれらの属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１」内の他の場合には本明細書に記載されている、更なるプロテオバクテリア属は、以下のものを含む：１）アゾリゾフィルス（Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ）属のアゾトバクター群細菌；２）セルビブリオ、オリゲラ（Ｏｌｉｇｅｌｌａ）及びテレディニバクター（Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ）属のシュードモナス科細菌；３��ケラトバクター（Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ）、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）、リベリバクター（Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）（「カンジダリベリバクター（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ）」とも呼ばれる）、及びシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属のリゾビウム科細菌；及び４）メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロカルダム（Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロサルシナ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ）及びメチロスフェラ（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ）属のメチロコッカス科細菌。
【０１１６】
宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１６」は、以下のシュードモナス種（ＡＴＣＣ又は典型的な株の他の寄託番号を括弧内に示す）のプロテオバクテリアのグループとして定義される：シュードモナスアビエタニフィラ（ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ  ７００６８９）；シュードモナスエルジノーサ  （ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １０１４５）；シュードモナスアルカリゲネス（  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １４９０９）；シュードモナスアンギリセプチカ（ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６０）；シュードモナスシトロネロリス（ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １３６７４）；シュードモナスフラベセンス（ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ５１５５５）；シュードモナスメンドシナ（ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１１）；シュードモナスニトロレデュセンス（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６３４）；シュードモナスオレオボランス（ＡＴＣＣ  ８０６２）；シュードモナスシュードアルカリゲネス（ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）（ＡＴＣＣ  １７４４０）；シュードモナスレジノボランス（ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  １４２３５）；シュードモナスストラミネア（ｓｔｒａｍｉｎｅａ）（ＡＴＣＣ  ３３６３６）；シュードモナスアガリシ（ａｇａｒｉｃｉ）（ＡＴＣＣ  ２５９４１）；シュードモナスアルカリフィラ（ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ）；シュードモナスアルギノボラ（ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ）；シュードモナスアンデルソニイ（ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ）；シュードモナスアスプレニイ（ａｓｐｌｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２３８３５）；シュードモナスアゼライカ（ａｚｅｌａｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ２７１６２）；シュードモナスベイジェリンキイ（ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ＡＴＣＣ  １９３７２）；シュードモナスボレアリス（ｂｏｒｅａｌｉｓ）；シュードモナスボレオポリス（ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ３３６６２）；シュードモナスブラシカセラム（ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）；シュードモナスブタノボラ（ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ）（ＡＴＣＣ  ４３６５５）；シュードモナスセルロサ（ｃｅｌｌｕｌｏｓａ）（ＡＴＣＣ  ５５７０３）；シュードモナスアウランチアカ（ａｕｒａｎｔｉａｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６３）；シュードモナスクロロラフィス（ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）（ＡＴＣＣ  ９４４６、ＡＴＣＣ  １３９８５、ＡＴＣＣ  １７４１８、ＡＴＣＣ  １７４６１）；シュードモナスフラジ（ｆｒａｇｉ）（ＡＴＣＣ  ４９７３）；シュードモナスルンデンシス（ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ４９９６８）；シュードモナスタエトロレンス（ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８３）；シュードモナスシシコーラ（ｃｉｓｓｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ３３６１６）；シュードモナスコロナファシエンス（ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）；シュードモナスジテルペニフィラ（ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ）；シュードモナスエロンガータ（ｅｌｏｎｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  １０１４４）；シュードモナスフレクテンス（ｆｌｅｃｔｅｎｓ）（���ＴＣＣ  １２７７５）；シュードモナスアゾトフォルマンス（ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）；シュードモナスブレンネリ（ｂｒｅｎｎｅｒｉ）；シュードモナスセドレラ（ｃｅｄｒｅｌｌａ）；シュードモナスコルガータ（ｃｏｒｒｕｇａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２９７３６）；シュードモナスエクストレモリエンタリス（ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉ）；シュードモナスフルオレッセンス（ＡＴＣＣ  ３５８５８）；シュードモナスゲサルディイ（ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）；シュードモナスリバネンシス（ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナスマンデリイ（ｍａｎｄｅｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７１）；シュードモナスマージナリス（ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １０８４４）；シュードモナスミグラエ（ｍｉｇｕｌａｅ）；シュードモナスムシドレンス（ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４６８５）；シュードモナスオリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナスローデシアエ（ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）；シュードモナスシンクサンタ（ｓｙｎｘａｎｔｈａ）（ＡＴＣＣ  ９８９０）；シュードモナストラアシイ（ｔｏｌａａｓｉｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１８）；シュードモナスベロニイ（ｖｅｒｏｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７４）；シュードモナスフレデリクスベルゲンシス（ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）；シュードモナスゲニクラタ（ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １９３７４）；シュードモナスギンゲリ（ｇｉｎｇｅｒｉ）；シュードモナスシュードモナスグラミニス（ｇｒａｍｉｎｉｓ）；シュードモナスグリモンティ（ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ）；シュードモナスハロデニトリフィカンス（ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）；シュードモナス・ハロフィラ（ｈａｌｏｐｈｉｌａ）；シュードモナスヒビシコラ（ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ）（ＡＴＣＣ  １９８６７）；シュードモナスヒュッチエンシス（ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  １４６７０）；シュードモナスヒドロゲノボラ（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ）；シュードモナスジェッセニイ（ｊｅｓｓｅｎｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００８７０）；シュードモナスキロネンシス（ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナスランセオラタ（ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）（ＡＴＣＣ  １４６６９）；シュードモナスリニ（ｌｉｎｉ）；シュードモナスマルギナタ（ｍａｒｇｉｎａｔａ）（ＡＴＣＣ  ２５４１７）；シュードモナスメフィチカ（ｍｅｐｈｉｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ３３６６５）；シュードモナスデニトリフィカンス（ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ）（ＡＴＣＣ  １９２４４）；シュードモナスペルツシノゲナ（ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）（ＡＴＣＣ  １９０）；シュードモナスピクトラム（ｐｉｃｔｏｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ２３３２８）；シュードモナスサイクロフィラ（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ）；シュードモナスフィルバ（ｆｉｌｖａ）（ＡＴＣＣ  ３１４１８）；シュードモナスモンテイリイ（ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）（ＡＴＣＣ  ７００４７６）；シュードモナスモッセリイ（ｍｏｓｓｅｌｉｉ）；シュードモナスオリジハビタンス（ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ４３２７２）；シュードモナスプレコグロシシダ（ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）（ＡＴＣＣ  ７００３８３）；シ���ードモナスプチダ（ｐｕｔｉｄａ）（ＡＴＣＣ  １２６３３）；シュードモナスレアクタンス（ｒｅａｃｔａｎｓ）；シュードモナススピノサ（ｓｐｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ  １４６０６）；シュードモナスバレアリカ（ｂａｌｅａｒｉｃａ）；シュードモナスルテオラ（ｌｕｔｅｏｌａ）（ＡＴＣＣ  ４３２７３）；シュードモナススタッツェリ（ｓｔｕｔｚｅｒｉ）（ＡＴＣＣ  １７５８８）；シュードモナスアミグダリ（ａｍｙｇｄａｌｉ）（ＡＴＣＣ  ３３６１４）；シュードモナスアベラナエ（ａｖｅｌｌａｎａｅ）（ＡＴＣＣ  ７００３３１）；シュードモナスカリカパパヤエ（ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３６１５）；シュードモナスシコリー（ｃｉｃｈｏｒｉｉ）（ＡＴＣＣ  １０８５７）；シュードモナスフィクセレクタエ（ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）（ＡＴＣＣ  ３５１０４）；シュードモナスフソコバギナエ（ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）；シュードモナスメリアエ（ｍｅｌｉａｅ）（ＡＴＣＣ  ３３０５０）；シュードモナスシリンゲ（ｓｙｒｉｎｇａｅ）（ＡＴＣＣ  １９３１０）；シュードモナスビリジフラバ（ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）（ＡＴＣＣ  １３２２３）；シュードモナスサーモカルボキシドボランス（ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ）（ＡＴＣＣ  ３５９６１）；シュードモナスサーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）；シュードモナスチベルバレンシス（ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ）；シュードモナスバンコウベレンシス（ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７００６８８）；シュードモナスウィスコンシネンシス（ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）；及びシュードモナスキアメンシス（ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ）。１つの実施形態において、宿主細胞はシュードモナスフルオレッセンスである。
【０１１７】
宿主細胞はまた、「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」から選択され得る。「グラム陰性プロテオバクテリアサブグループ１７」は、例えば、以下のシュードモナス種に属するものを含む「蛍光性シュードモナス菌」として当該技術分野で既知のプロテオバクテリアのグループとして定義される：シュードモナスアゾトフォルマンス（ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）；シュードモナスブレンネリ（ｂｒｅｎｎｅｒｉ）；シュードモナスセドレラ（ｃｅｄｒｅｌｌａ）；シュードモナスコルガータ（ｃｏｒｒｕｇａｔａ）；シュードモナスエクストレモリエンタリス（ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナスフルオレッセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；シュードモナスゲサルディイ（ｇｅｓｓａｒｄｉｉ）；シュードモナスリバネンシス（ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ）；シュードモナスマンデリイ（ｍａｎｄｅｌｉｉ）；シュードモナスマージナリス（ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）；シュードモナスミグラエ（ｍｉｇｕｌａｅ）；シュードモナスムシドレンス（ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）；シュードモナスオリエンタリス（ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；シュードモナスローデシアエ（ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）；シュードモナスシンクサンタ（ｓｙｎｘａｎｔｈａ）；シュードモナストラアシイ（ｔｏｌａａｓｉｉ）；及びシュードモナスベロニイ（ｖｅｒｏｎｉｉ）。
【０１１８】
実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は、ＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２、ＡｐｒＡ、又はそれらの組み合わせの発現を欠く。実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼＨｓｌＵ、ＨｓｌＶ、Ｐｒｃ１、ＤｅｇＰ１、ＤｅｇＰ２及びＡｐｒＡを欠き、ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａを過剰発現する。そのような菌株の一例は、宿主菌株２のように本明細書に開示される。これらプロテアーゼは、当該技術分野で既知であり、例えば米国特許出願公報第２００６／０１１０７４７号に記載される。ＡｐｒＡ、細胞外のセラリシン（ｓｅｒｒａｌｙｓｉｎ）型メタロプロテアーゼメタロプロテイナーゼは、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、「Ｍａｕｎｓｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  “Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡｐｒＡ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｍ１１４：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｒｏｎ，  ｔｈｅ  ＥＣＦ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒ，  ＰｂｒＡ  ａｎｄ  ｐｓｅｕｄｏｂａｃｔｉｎ  Ｍ１１４  ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２（Ｐｔ  １）：２９−４２」に、及び米国特許出願公報第２００８／０１９３９７４号及び第２０１０／００４８８６４号に記載される。
【０１１９】
他の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、及びＤｓｂＤを過剰発現する。ＤｓｂＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、ジスルフィド結合イソメラーゼであり、例えば、米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号に記載される。
【０１２０】
他の実施形態において、シュードモナス菌宿主細胞は野生型であり、すなわち、プロテアーゼ発現の不足が全く無く、任意のフォールディングモジュレータを過剰発現しない。
【０１２１】
プロテアーゼの発現を欠く宿主細胞は、野生型の宿主に関するそのプロテアーゼの正常な活性又は発現レベルの減少をもたらす、任意の修正を有し得る。例えば、ミスセンス変異又はナンセンス変異は、活性ではないタンパク質の発現に通じ得、遺伝子欠失はタンパク質発現を全くもたらすことができない。遺伝子のアップストリームの制御領域の変化は、タンパク質発現の減少をもたらす、又は全くタンパク質発現をもたらすことができない。他の遺伝子欠乏は、タンパク質の翻訳に影響を与え得る。プロテアーゼの処理に必要とされるタンパク質の活性が不完全な場合、プロテアーゼの発現はまた、不完全となり得る。
【０１２２】
本発明の方法に役立つ、プロテアーゼ及びフォールディングモジュレータの例は、表６及び７にそれぞれ示される。ＲＸＦ番号は読取枠を指す。（例えば、米国特許出願公報第２００８／０２６９０７０号及び米国特許出願第１２／６１０，２０７号を参照。）
【０１２３】
【表６−１】
0005839411.tif 000007
【０１２４】
【表６−２】
0005839411.tif 000008
【０１２５】
【表６−３】
0005839411.tif 000009
【０１２６】
【表６−４】
0005839411.tif 000010
【０１２７】
特定のプロテアーゼは、プロテアーゼ及びシャペロン様の活性の両方を有し得る。これらプロテアーゼが、タンパク質収量及び／又は品質に対し負に影響を及ぼすとき、プロテアーゼを欠失させるのに役立ち、プロテアーゼのシャペロン活性がタンパク質収量及び／又は品質に対し陽性に影響を及ぼし得るとき、それらが過剰発現され得る。これらプロテアーゼは、以下のものを含むが、これらに限定されない：Ｈｓｐ１００（Ｃｌｐ／Ｈｓｌ）ファミリーメンバーＲＸＦ０４５８７．１（ｃｌｐＡ）、ＲＸＦ０８３４７．１、ＲＸＦ０４６５４．２（ｃｌｐＸ）、ＲＸＦ０４６６３．１、ＲＸＦ０１９５７．２（ｈｓｌＵ）、ＲＸＦ０１９６１．２（ｈｓｌＶ）；ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼファミリーメンバーＲＸＦ０５３４５．２（ｐｐｉＢ）；メタロペプチダーゼＭ２０ファミリーメンバーＲＸＦ０４８９２．１（アミヒドロラーゼ）；メタロペプチダーゼＭ２４ファミリーメンバー（ＲＸＦ０４６９３．１（メチオニンアミノペプチダーゼ）及びＲＸＦ０３３６４．１（メチオニンアミノペプチダーゼ））；及びセリンペプチダーゼＳ２６シグナルペプチターゼＩファミリーメンバーＲＸＦ０１１８１．１（シグナルペプチターゼ）。
【０１２８】
【表７−１】
0005839411.tif 000011
【０１２９】
【表７−２】
0005839411.tif 000012
【０１３０】
【表７−３】
0005839411.tif 000013
【０１３１】
〈高スループットスクリーン〉
幾つかの実施形態において、高スループットスクリーンは、可溶性の組み換え型毒素タンパク質を発現するための最適条件を決定するために行われ得る。スクリーンにおいて変えられる条件は、例えば、宿主細胞、宿主細胞の遺伝的背景（例えば、異なるプロテアーゼの欠失）、発現構築物におけるプロモータのタイプ、組換え型タンパク質をコード化する配列に融合される分泌リーダー、成長温度、誘導可能なプロモータが使用される際の誘発時のＯＤ、ｌａｃＺプロモータが使用される時の誘発に使用されたＩＰＴＧの濃度、タンパク質誘発の持続時間、培養への誘発剤の追加後の成長温度、培養の撹拌の割合、プラスミド維持のための選択法、血管における培養の量、及び細胞を溶解する方法を含む。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、宿主菌株のライブラリ（あるいは「アレイ」）が提供され、ここで、ライブラリにおける各菌株（又は「宿主細胞の個体群」）は、宿主細胞における１つ以上の標的遺伝子の発現を調節するために遺伝子組み換えが行われた。「最適な宿主菌株」又は「最適な発現系」は、アレイにおける表現型で異なる宿主細胞の他の個体群と比較される、対象の発現されたタンパク質の量、品質、及び／又は位置に基づいて、同定され得る又は選択され得る。したがって、最適な宿主菌株は、所望の明細書に従って対象のポリペプチドを生成する菌株である。所望の明細書が生成されているポリペプチドに依存して変わる一方で、明細書は、タンパク質の品質及び／又は量、例えば、タンパク質が隔離される又は分泌されるかどうか、及びどれくらいの量で、タンパク質が適切に又は望ましいように修飾される（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）及び／又は折り畳まれるかどうかを含む。実施形態において、改善された又は望ましい品質は、分泌リーダーの高忠実度開裂及び低レベルの分解での毒素タンパク質の生成であり得る。実施形態において、最適な宿主菌株又は最適な発現系は、可溶性の異種のタンパク質の量又は含量（ａｍｏｕｎｔ  ｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）、復元可能な異種のタンパク質の量又は含量、適切に処理された異種のタンパク質の量又は含量、適切に折り重ねられた異種のタンパク質の量又は含量、活性の異種のタンパク質の量又は含量、及び／又は特定の絶対レベル又は一定の指示菌株、すなわち、比較に使用された菌株によって生成されたものに関連する特定のレベルの異種のタンパク質の量又は含量によって特徴づけられる、収量を生成する。
【０１３３】
異種のタンパク質の発現における改善された収量及び／又は品質により菌株を同定するために微生物の宿主をスクリーンする方法は、例えば、米国特許出願公報第２００８０２６９０７０号に記載される。
【０１３４】
〈発酵様式〉
本発明による発現系は、任意の発酵様式（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒｍａｔ）において培養され得る。例えば、バッチ、フェドバッチ、半連続式、又は連続式の発酵モードが本明細書において利用され得る。
【０１３５】
実施形態において、発酵培地は、富栄養培地、最少培地及び無機塩培地の中から選択され得る。他の実施形態において、最少培地又は無機塩培地のいずれかが選択される。特定の実施形態において、無機塩培地が選択される。
【０１３６】
無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、スクロース、又はグリセロールなどの炭素源からなる。無機塩培地の例は、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ  １７９）、及びＤａｖｉｓ−Ｍｉｎｇｉｏｌｉ培地（Ｂ  Ｄ  Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｅ  Ｓ  Ｍｉｎｇｉｏｌｉ  （１９５０）  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  ６０：１７−２８を参照）を含む。無機塩培地を作るために使用される無機塩は、例えば、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム又は塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム又は塩化マグネシウム、及び鉄、銅、マンガン及び亜鉛の塩化カルシウム、ホウ酸塩及び硫酸塩などの微量金属の中から選択されるものを含む。典型的には、ペプトン、トリプトン、アミノ酸又は酵母抽出物など有機窒素源は、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えばアンモニウム塩、アンモニア水、気体のアンモニアの中から選択され得る。無機塩培地は、典型的には炭素源としてグルコース又はグリセロールを含むであろう。無機塩培地と比較して、最少培地も無機塩と炭素源を含み得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトン又は他の成分で補われ得、もっとも、これらは、ごく最低限のレベルで加えられる。培地は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第２００６／００４０３５２号に記載され、それは、上に引用され、引用により組み込まれる。本発明の方法において有用な培養手順及び無機塩培地の詳細は、「Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  “Ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｒａｔｅ，”  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０  （１）：１７−２７」によって記載される。
【０１３７】
実施形態において、生成はバイオリアクター培養において達成され得る。培養は、例えば無機塩培地を含む２リットルまでのバイオリアクターにおいて成長し、アンモニアの追加により３２℃及びｐＨ６．５に維持され得る。溶解された酸素は、発酵槽へ散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持され得る。過剰なレベルを維持するため、グリセロールは発光の間中培養に送達され得る。実施形態において、これら条件は、標的培養細胞濁度（ｄｅｎｓｉｔｙ）、例えば、５７５ｎｍ（Ａ５７５）での光学濁度が達するまで、すなわち標的タンパク質生成を開始するためにＩＰＴＧが加えられる時点で、維持される。誘発時の細胞密度、ＩＰＴＧの濃度、ｐＨ及び温度は、発現のための最適条件を決定するために各々変えられ得ることが理解される。実施形態において、誘発時の細胞密度は、Ａ５７５の４０から２００までの吸光度単位（ＡＵ）で変えられ得る。ＩＰＴＧ濃度は、０．０２から１．０ｍＭまでの範囲、６から７．５までのｐＨ、及び２０から３５℃°までの温度において変えられ得る。１６−２４時間後、各々のバイオリアクターからの培養は、遠心分離、及び８０℃で冷凍された細胞ペレットによって採取され得る。その後、サンプルは、例えば、生成物形成のためのＳＤＳ−ＣＧＥによって分析され得る。
【０１３８】
発酵は任意の規模で行なわれ得る。本発明による発現系は、任意の規模での組換え型タンパク質発現に役立つ。したがって、例えば、マイクロリットル規模、ミリリットル規模、センチリットル規模、及びデシリットル規模の発酵容量が使用され得、１リットルの規模及びそれより大きな発酵容量が使用され得る。
【０１３９】
実施形態において、発酵容量は約１リットル、又はそれ以上である。実施形態において、発酵容量は、約１リットル乃至約１００リットルである。実施形態において、発酵容量は、約１リットル、約２リットル、約３リットル、約４リットル、約５リットル、約６リットル、約７リットル、約８リットル、約９リットル、又は約１０リットルである。実施形態において、発酵容量は、約１リットル乃至約５リットル、約１リットル乃至約１０リットル、約１リットル乃至約２５リットル、約１リットル乃至約５０リットル、約１リットル乃至約７５リットル、約１０リットル乃至約２５リットル、約２５リットル乃至約５０リットル、又は約５０リットル乃至約１００リットルである。他の実施形態において、発酵容量は、５リットル又はそれ以上、１０リットル又はそれ以上、１５リットル又はそれ以上、２０リットル又はそれ以上、２５リットル又はそれ以上、５０リットル又はそれ以上、７５リットル又はそれ以上、１００リットル又はそれ以上、２００リットル又はそれ以上、５００リットル又はそれ以上、１，０００リットル又はそれ以上、２，０００リットル又はそれ以上、５，０００リットル又はそれ以上、１０，０００リットル又はそれ以上、又は５０，０００リットル又はそれ以上である。
【０１４０】
〈細菌増殖条件〉
提供される本発明の方法に役立つ増殖条件は、約４℃乃至約４２℃の温度、及び約５．７乃至約８．８のｐＨを含み得る。ｌａｃＺプロモータを有する発現構築物が使用されるとき、発現は、約０．０１ｍＭ乃至約１．０ｍＭの終末濃度で培養にＩＰＴＧを加えることにより誘発され得る。
【０１４１】
培養のｐＨは、当業者には既知のｐＨバッファ及び方法を使用して維持され得る。培養中のｐＨの制御はまた、アンモニア水を使用して達成され得る。実施形態において、培養のｐＨは、約５．７乃至約８．８である。特定の実施形態において、ｐＨは、約５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、又は８．８である。他の実施形態において、ｐＨは、約５．７乃至５．９、５．８乃至６．０、５．９乃至６．１、６．０乃至６．２、６．１乃至６．３、６．２乃至６．５、６．４乃至６．７、６．５乃至６．８、６．６乃至６．９、６．７乃至７．０、６．８乃至７．１、６．９乃至７．２、７．０乃至７．３、７．１乃至７．４、７．２乃至７．５、７．３乃至７．６、７．４乃至７．７、７．５乃至７．８、７．６乃至７．９、７．７乃至８．０、７．８乃至８．１、７．９乃至８．２、８．０乃至８．３、８．１乃至８．４、８．２乃至８．５、８．３乃至８．６、８．４乃至８．７、又は８．５乃至８．８である。また他の実施形態において、ｐＨは、約５．７乃至６．０、５．８乃至６．１、５．９乃至６．２、６．０乃至６．３、６．１乃至６．４、又は６．２乃至６．５である。特定の実施形態において、ｐＨは、約５．７乃至約６．２５である。
【０１４２】
実施形態において、成長温度は約４℃乃至約４２℃に維持される。特定の実施形態において、成長温度は、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、又は約４２℃である。他の実施形態において、成長温度は、約２５℃乃至約２７℃、約２５℃乃至約２８℃、約２５℃乃至約２９℃、約２５℃乃至約３０℃、約２５℃乃至約３１℃、約２５℃乃至約３２℃、約２５℃乃至約３３℃、約２６℃乃至約２８℃、約２６℃乃至約２９℃、約２６℃乃至約３０℃、約２６℃乃至約３１℃、約２６℃乃至約３２℃、約２７℃乃至約２９℃、約２７℃乃至約３０℃、約２７℃乃至約３１℃、約２７℃乃至約３２℃、約２６℃乃至約３３℃、約２８℃乃至約３０℃、約２８℃乃至約３１℃、約２８℃乃至約３２℃、約２９℃乃至約３１℃、約２９℃乃至約３２℃、約２９℃乃至約３３℃、約３０℃乃至約３２℃、約３０℃乃至約３３℃、約３１℃乃至約３３℃、約３１℃乃至約３２℃、約３０℃乃至約３３℃、又は約３２℃乃至約３３℃に維持される。他の実施形態において、温度は培養中に変化する。１つの実施形態において、構築物、例えばＩＰＴＧから発現を誘発する薬剤が培養に加えられる前に、温度は約３０℃に維持される。誘発薬剤を加えた後に、温度は約２５℃に下げられる。
【０１４３】
〈誘発〉
本明細書に別記されるように、誘導可能なプロモータは、組み換え型毒素タンパク質、例えばｌａｃプロモータの発現を制御するため発現構築物において使用され得る。ｌａｃプロモータ誘導体又はファミリーメンバー、例えばｔａｃプロモータの場合、エフェクター化合物は、ＩＰＴＧのような無償性誘導物質（「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれる、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）などの、誘発因子である。実施形態において、ｌａｃプロモータ誘導体が使用され、細胞密度が約８０乃至約１６０のＯＤ５７５によって同定されたレベルに達したとき、組換え型タンパク質発現は、約０．０１ｍＭ乃至約１．０ｍＭの終末濃度にＩＰＴＧを加えることによって誘発される。実施形態において、組換え型タンパク質のための培養誘発の時間でのＯＤ５７５は、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０であり得る。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０乃至約１００、約１００乃至約１２０、約１２０乃至約１４０、約１４０乃至約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０乃至約１２０、約１００乃至約１４０、又は約１２０乃至約１６０である。他の実施形態において、ＯＤ５７５は、約８０乃至約１４０、又は約１００乃至１６０である。細胞密度は、他の方法によって測定され得、他の単位、例えば１つの単位体積当たりの細胞において発現され得る。例えば、シュードモナスフルオレッセンス培養の約８０乃至約１６０のＯＤ５７５は、ｍＬ当たりおよそ８×１０１０乃至約１．６×１０１１のコロニー形成単位又は３５乃至７０ｇ／ｌの乾燥菌体重量に等しい。実施形態において、培養誘発の時間での細胞密度は、細胞密度又は測定の単位を決定するために使用される方法にかかわらず、ＯＤ５７５での吸光度によって本明細書に特定されるような細胞密度に等しい。当業者の１人は、任意の細胞培養のために適切な転換を行う方法を知っているだろう。
【０１４４】
実施形態において、培養の最終のＩＰＴＧ濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、又は約１ｍＭである。他の実施形態において、培養の最終のＩＰＴＧ濃度は、約０．０８ｍＭ乃至約０．１ｍＭ、約．１ｍＭ乃至約０．２ｍＭ、約．２ｍＭ乃至約０．３ｍＭ、約．３ｍＭ乃至約０．４ｍＭ、に対する約．２ｍＭ乃至約０．４ｍＭ、約０．０８乃至約０．２ｍＭ、又は約０．１乃至１ｍＭである。
【０１４５】
非ｌａｃプロモータが使用される実施形態において、本明細書及び文献に記載されるように、他の誘発因子又はエフェクターが使用され得る。１つの実施形態において、プロモータは、構成的なプロモータである。
【０１４６】
薬剤を加えて誘発した後、培養は、期間、例えば約２４時間、組換え型タンパク質が発現される時間の間、成長し得る。誘発剤を加えた後、培養は、約１時間、約２時間、約３時間、約４時、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約３６時間、又は約４８時間成長し得る。誘発剤が培養に加えられた後、培養は、約１乃至４８時間、約１乃至２４時間、約１０乃至２４時間、約１５乃至２４時間、又は約２０乃至２４時間成長し得る。細胞培養は、遠心分離、及び後の溶解手順のため適切なバッファ又は溶液において再懸濁される培養ペレットによって濃縮され得る。
【０１４７】
実施形態において、細胞は、高圧機械細胞分裂のための装置（市販で利用可能であり、例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、Ｎｉｒｏ−Ｓｏａｖｉ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、ＡＰＶ−Ｇａｕｌｉｎ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を使用して分裂される。組換え型タンパク質を発現する細胞は、例えば音波処理を使用して、分裂され得る。細胞を溶解するための当該技術分野で既知の任意の適切な方法は、可溶性画分を放出するために使用され得る。例えば、実施形態において、細胞膜溶解酵素及びＥＤＴＡなどの、化学物質及び／又は酵素の溶解試薬が使用され得る。凍結された培養又は以前に保管された培養の使用はまた、本発明の方法において熟慮される。培養は溶解前にＯＤ標準化することができる。例えば、細胞は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、又は約２０のＯＤ６００に標準化され得る。
【０１４８】
遠心分離は、任意の適切な技術及び方法を使用して実行され得る。不溶性画分から可溶性画分を分離する目的のための細胞培養又は溶解産物の遠心分離は、当該技術分野において周知である。例えば、溶解された細胞は、２０分間の２０，８００×ｇで（４℃で）遠心分離され、及び上清は、手動又は自動化液体処理を使用して除去される。ペレット（不溶性）画分は、緩衝液、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４において再懸濁される。再懸濁は、例えば、オーバーヘッドミキサー、磁気撹拌棒、ロッキングシェーカーに接続された羽根車などの装置を使用して実行され得る。
【０１４９】
「可溶性画分」、すなわち、溶解産物の遠心分離後に得られた可溶性の上清、及び「不溶性画分」、すなわち、溶解産物の遠心分離後に得られたペレットは、培養を溶解し、遠心分離することにより結果として生じる。これらの２つの画分はまた、それぞれ、「第１の可溶性画分」及び「第１の不溶性画分」と称され得る。
【０１５０】
〈生成物の評価〉
多数のアッセイ方法は、タンパク質を特徴づけるための当該技術分野において既知である。組み換え型毒素タンパク質の収量又は品質を特徴づけるための任意の適切な方法の使用は、本明細書で熟慮される。
【０１５１】
〈タンパク質の収量〉
本明細書に記載のような任意の精製画分におけるタンパク質の収量は、当業者に既知の方法、例えば、毛細管のゲル電気泳動法（ＣＧＥ）及びウェスタンブロット解析によって決定され得る。本明細書に記載され、当該技術分野で既知の活性アッセイはまた、タンパク質の収量に関する情報を提供し得る。実施形態において、これらの方法又は当該技術分野で既知の他の方法は、タンパク質の適切な処理、例えば、適切な分泌リーダー開裂を評価するために使用される。
【０１５２】
タンパク質の収量の有用な測定は、例えば、培養量あたりの組換え型タンパク質の量（例えば、タンパク質のグラム又はミリグラム／培養のリットル）、細胞溶解後に得られる不溶性のペレットにおいて測定された組換え型タンパク質のパーセント又は画分（例えば、抽出上清における組み換え型のタンパク質の量／不溶性の画分におけるタンパク質）、活性タンパク質のパーセント又は画分（例えば、活性タンパク質の量／アッセイに使用されるタンパク質の量）、合計の細胞タンパク質（ｔｃｐ）のパーセント又は画分、タンパク質／細胞の量、及び乾燥したバイオマスのパーセント又は比率を含む。実施形態において、本明細書に記載のようなタンパク質の収量の測定は、得られる可溶性のタンパク質の量又は活性タンパク質の量、又はその両方に基づく。
【０１５３】
収量が培養量に関して発現される実施形態において、培養細胞密度は、特に異なる培養間の収量が比較されているとき、考慮され得る。
【０１５４】
実施形態において、本発明の方法は、１リットル当たり約０．２グラムから１リットル当たり約１２グラムまでの、可溶性の及び／又は活性な及び／又は適切に処理された（例えば、適切に分泌リーダーを開裂した）組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の収量を得るために使用され得る。実施形態において、収量は、１リットル当たり約０．５グラムから１リットル当たり約１２グラムまでである。特定の実施形態において、組換え型タンパク質又はサブユニットタンパク質の収量は、約０．２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ、約０．６ｇ／Ｌ、約０．７ｇ／Ｌ、約０．８ｇ／Ｌ、約０．９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約２．５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約３．５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約４．５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約５．５ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ、約６．５ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ、約７．５ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ、約８．５ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ、約９．５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１０．５ｇ／Ｌ、約１１ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約０．５ｇ／Ｌ、約０．２乃至約１ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約０．６ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．３乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約０．７ｇ／Ｌ、約０．４乃至約１ｇ／Ｌ、約０．４乃至約２ｇ／Ｌ、約０．４乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約６ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約７ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約６ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約８ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約７ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約９ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約８ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１０ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約９ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１１ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌ、又は約１１ｇ／Ｌ乃至約１２ｇ／Ｌである。
【０１５５】
実施形態において、生成された組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約１％乃至７５％である。特定の実施形態において、生成された毒素タンパク質又はサブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約１％乃至約５％、約１％乃至約１０％、約１％乃至約２０％、約１％乃至約３０％、約１％乃至約４０％、約１％乃至約５０％、約１％乃至約６０％、約１％乃至約７５％、約２％乃至約５％、約２％乃至約１０％、約２％乃至約２０％、約２％乃至約３０％、約２％乃至約４０％、約２％乃至約５０％、約２％乃至約６０％、約２％乃至約７５％、約３％乃至約５％、約３％乃至約１０％、約３％乃至約２０％、約３％乃至約３０％、約３％乃至約４０％、約３％乃至約５０％、約３％乃至約６０％、約３％乃至約７５％、約４％乃至約１０％、約４％乃至約２０％、約４％乃至約３０％、約４％乃至約４０％、約４％乃至約５０％、約４％乃至約６０％、約４％乃至約７５％、約５％乃至約１０％、約５％乃至約２０％、約５％乃至約３０％、乃至約５％〜約４０％、乃至約５％乃至約５０％、約５％乃至約６０％、約５％乃至約７５％、約１０％乃至約２０％、約１０％乃至約３０％、約１０％乃至約４０％、約１０％乃至約５０％、約１０％乃至約６０％、約１０％乃至約７５％、約２０％乃至約３０％、約２０％乃至約４０％、約２０％乃至約５０％、約２０％乃至約６０％、約２０％乃至約７５％、約３０％乃至約４０％、約３０％乃至約５０％、約３０％乃至約６０％、約３０％乃至約７５％、約４０％乃至約５０％、約４０％乃至約６０％、約４０％乃至約７５％、約５０％乃至約６０％、約５０％乃至約７５％、約６０％乃至約７５％、又は約７０％乃至約７５％である。
【０１５６】
特定の実施形態において、複数のタンパク質は同じ宿主細胞から生成される。例えば、実施形態において、百日咳毒素の全部で５つのサブユニットは、単一の培養で成長した同じ宿主細胞から作られる。そのような実施形態において、観察された濃度、％の合計の細胞タンパク質又は活性は、個々の毒素サブユニットに関する、又は共に得られたすべてのサブユニットに関するものである。すなわち、実施形態において、本発明の方法は、１リットル当たり約１グラムから１リットル当たり約１２グラムの、百日咳毒素タンパク質のＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、又はＳ５サブユニットの収量を得るために使用される。実施形態において、生成されたＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、又はＳ５サブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の１％乃至７５％である。あるいは、本発明の方法は、１リットル当たり約１グラムから１リットル当たり約１２グラムの、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５サブユニットタンパク質の収量を得るために使用される。実施形態において、生成されたＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５サブユニットタンパク質の量は、合計の細胞タンパク質の１％乃至７５％である。特定の実施形態において、得られた各サブユニットの量は、１リットル当たりのグラム又は％の合計の細胞タンパク質において、ほぼ同じである。
【０１５７】
タンパク質の「溶解度」及び「活性」は、品質に関連するが、異なる手段によって一般に決定される。タンパク質の溶解度、特に疎水性タンパク質は、典型的にはタンパク質の折り畳み構造に関係がある；不溶性は、疎水性アミノ酸残留物が折り重ねられたタンパク質の外側に不適当に位置付けられることを示す。方法、例えば下記のものを使用して評価されたタンパク質活性は、適切なタンパク質立体配座の別の指標である。本明細書に使用されるように、「可溶性の、活性な、又はその両方」又は「可溶性の及び／又は活性な」は、当業者に既知の及び本明細書に記載の方法により、可溶性、活性、又は可溶性及び活性の両方であると決定されるタンパク質を指す。与えられたタンパク質の「活性」は、結合活性、例えば、受容体、特異抗体、又は別の既知の基質に結合することにより、又は関連する場合の酵素活性によって表わされるものを含む。活性レベルは、例えば、標準又は対照サンプルの、又は引用として使用される任意のサンプルの活性と比較されるときのように、絶対項又は相対語において記載され得る。
【０１５８】
毒素を評価するための活性アッセイは、当該技術分野で既知であり、文献に記載される。活性アッセイは、免疫学又は抗体結合アッセイ、例えば、ウェスタンブロット解析及びＥＬＩＳＡ、同様に受容体結合アッセイを含み、例えば、ＣＲＭ１９７はジフテリア毒素受容体（ｐｒｏＨＢ−ＥＧＦ）結合アッセイによって評価され得る。これらのアッセイに役立つ抗体は、市販で入手可能である。活性アッセイはまた酵素活性アッセイを含む。野生型のＤＴは、当該技術分野で既知の、緑膿菌外毒素Ａに関して本明細書に別記された方法を使用して、免疫学的に、及びＡＤＰリボシル化活性によってアッセイされ得る。
【０１５９】
例えば、ＣＴＢのウェスタンブロット解析は、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１４０，０８２号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ」に記載されるように実行され得る。この特許は、ボルデテラにおけるＣＴＢの発現を記載する。培養上清からのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解され、又はＣＴＢ五量体をモノマーの形態に変換するために分解される前に沸騰された。タンパク質は、ナイロン細胞膜上に伝送され、ヤギ抗コレラゲノイドＩｇＧ抗体（抗ＣＴＢ、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＃ＧＡＣ−０１Ｃ）により調べた。検出は、発掘作業化学発光（ｄｉｇ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、アルカリフォスファターゼにより結合されたロバ抗ヤギＩｇＧにより行なわれた。ＣＴＡとＣＴＢの両方を含むコレラ毒素標準（Ｓｉｇｍａ）は、比較に使用された。
【０１６０】
ＰＴＸのウェスタンブロット解析は、例えば、実施例において本明細書に記載されるように、市販の抗体を使用して実行され得る。モノクローナル抗体は、例えば、Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡから利用可能である。
【０１６１】
破傷風毒素Ｃフラグメントは、ウェスタンブロット解析、又は引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４４３，９６６号、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ」に記載されるようなＥＬＩＳＡによって評価され得る。抗体は、複数の商業的供給源、例えば、Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡから利用可能である。
【０１６２】
ＴｃｄＢ活性は、当該技術分野に記載されているような、ウェスタンブロット又は他の検出分析によって評価され得る。酵素活性は、例えば、当該技術分野、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２２６，５９７号に記載のグリコシヒドロラーゼ／グリコシル化アッセイ方法を使用して、分析され得る。具体的には、グルコシル化反応は、５０ｍＭのｎ−２ヒドロキシエチルピペラジン−ｎ’−２−エタンスルホン酸、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２ｍＭのＧＤＰ、４０μＭの［１４Ｃ］ＵＤＰ−グルコース（３０３Ｃｉ／ｍｏｌ；ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、１００μＭのＵＤＰ−グルコース及び３ｐｍｏｌのＴｃｄＢ又は１０ｐｍｏｌの各々の融合タンパク質を含む反応混合において実行され得る。アッセイは、３７℃で一晩インキュベートすることを許容され、切断されたグルコースは、ＡＧ１−Ｘ２陰イオン交換レジンを使用して分離し、液体シンチレーション計数器で数えられる。
【０１６３】
緑膿菌外毒素Ａの活性は、免疫学の方法、例えばウェスタンブロット解析を使用して評価され得る。ＥＴＡがＡＤＰリボシル化毒素であるため、それは、例えば、引用により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８９２，８２７号に記載されるような、ＡＤＰリボシル化活性のためにアッセイされ得る。具体的には、ラビット網状赤血球調製又は伸長因子２（ＥＦ−２）により濃縮されたコムギ麦芽抽出物は、ＥＦ−２の源として使用される。アッセイ（５００μｌの全容積）は、約１０ｐｍｏｌｅのＥＦ−２、３７ｐｍｏｌｅの１４Ｃ−ＮＡＤ（０．０６μＣｉ）、０．２５乃至１．２５μｇのＥＴＡ及びバッファ（４０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．１）を含む。活性は、３０分でＥＦ−２に伝送されたＮＡＤのｐｍｏｌｅｓとして測定される。ＰＥの既知の濃度の標準曲線は確立され、大腸菌からの抽出液におけるＰＥの活性を測定するために使用される。３７℃で３０分のインキュベーション後、０．５ｍｌの１２％のＴＣＡは、各々のアッセイ混合物に加えられる。その後、アッセイ混合物は１５分間氷浴に配置され、その後、１０分間、３，０００ｘｇ、４℃で遠心分離を行った。ペレットは、１ｍｌの６％のＴＣＡで洗浄され、上述のように遠心分離される。その後、ペレットはＡＤＰリボシル化活性の指数として、液体シンチレーション計数器において１４Ｃ放射活性のために測定される。
【０１６４】
それ故、活性の測定は、例えば、抗体又は受容体の結合能力、基質の結合能力（カラム材料に関する）、又は酵素活性を表し得る。
【０１６５】
実施形態において、活性は、アッセイされる総量と比較して、抽出した上清における％活性組み換え型毒素タンパク質によって表わされる。これは、アッセイにおいて使用される組み換え型毒素タンパク質の総量に関連するアッセイによって活性であると決定された、組み換え型毒素タンパク質の量に基づく。他の実施形態において、活性は、標準の、例えば自然のタンパク質と比較して、タンパク質の％活性レベルによって表わされる。これは、標準サンプルにおける活性タンパク質の量に関連する、上清抽出液サンプルにおける、活性組み換え型毒素タンパク質の量に基づく（ここで、各々のサンプルから同じ量のタンパク質がアッセイにおいて使用される）。
【０１６６】
実施形態において、毒素タンパク質又はサブユニットの約４０％乃至約１００％は、活性であると決定される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はタンパク質サブユニットの約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％は、活性であると測定される。実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はサブユニットの約４０％乃至約５０％、約５０％乃至約６０％、約６０％乃至約７０％、約７０％乃至約８０％、約８０％乃至約９０％、約９０％乃至約１００％、約５０％乃至約１００％、約６０％乃至約１００％、約７０％乃至約１００％、約８０％乃至約１００％、約４０％乃至約９０％、約４０％乃至約９５％、約５０％乃至約９０％、約５０％乃至約９５％、約５０％乃至約１００％、約６０％乃至約９０％、約６０％乃至約９５％、約６０％乃至約１００％、約７０％乃至約９０％、約７０％乃至約９５％、約７０％乃至約１００％、又は約７０％乃至約１００％は、活性であると決定される。
【０１６７】
他の実施形態において、組み換え型毒素タンパク質又はタンパク質サブユニットの約７５％乃至約１００％は、活性であると決定される。実施形態において、組み換え型の毒素タンパク質又はサブユニットの約７５％乃至約８０％、約７５％乃至約８５％、約７５％乃至約９０％、約７５％乃至約９５％、約８０％乃至約８５％、約８０％乃至約９０％、約８０％乃至約９５％、約８０％乃至約１００％、約８５％乃至約９０％、約８５％乃至約９５％、約８５％乃至約１００％、約９０％乃至約９５％、約９０％乃至約１００％、又は約９５％乃至約１００％は、活性であると決定される。
【０１６８】
誘発されたタンパク質の同一性を確認する手段も、当該技術分野で既知である。例えば、タンパク質は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法、Ｎ−末端配列分析、又はペプチドマッピングを使用する、ペプチド質量フィンガープリントによって分析され得る。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され及び記載されてきた一方で、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、及び置換が現在、当業者に生じるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲及びそれらの同等物の範囲内の方法及び構造が、それによって包含されることが意図される。
【実施例】
【０１７０】
〈実施例１：組み換え型ＣＲＭ１９７タンパク質の高スループット発現〉
ＣＲＭ１９７発現菌株を構築し、菌株において生成された可溶性のＣＲＭ１９７タンパク質の量を毛細管のゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＣＧＥ）を使用して分析した。結果として生じるデータに基づき、菌株を大規模な発現に使用するために選択した。
【０１７１】
〈ＣＲＭ１９７発現菌株の構築及び成長〉
ＣＲＭ１９７コード配列を、ＣＲＭ１９７アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号：１は、発現された合成の最適化されたＣＲＭ１９７遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号：２は、発現された合成の最適化されたＣＲＭ１９７遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０１７２】
表８に示されるような、１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーに融合される、最適化されたＣＲＭ１９７配列を運ぶプラスミドを構築した。ＣＲＭ１９７コード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために融合した。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
組み換え型ＣＲＭ１９７コード配列に融合された１０の分泌リーダー融合を含む構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表９に記録された４つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、微量金属及び５％のグリセロールを有するＨＴＰ増殖培地で再懸濁し、その後、４００μｌのＭ９塩、１％のグルコース培地、及び微量元素を有する９６穴ディーププレート（９６−ｗｅｌｌ  ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に伝送した。９６−ウェルプレートを、４８時間振ることにより、３０℃でインキュベートした。１０μｌの各々の４０の種培養を、各々のウェルが微量元素及び５％のグリセロールにより補足された５００μｌのＨＴＰ培地を含む三重の９６穴ディーププレートに伝送し、２４時間、以前のようにインキュベートした。
【０１７５】
【表９】
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【０１７６】
イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、０．３ｍＭの終末濃度で各々のウェルに加え、標的タンパク質の発現を誘発した。マンニトール（Ｓｉｇｍａ，  Ｍ１９０２）を、１％の終末濃度で各々のウェルに加え、フォールディングモジュレータ過剰発現菌株におけるフォールディングモジュレータの発現を誘発し、温度を２５℃に下げた。誘発の２４時間後に、４００μｌの量のＰＢＳを使用して、細胞をＯＤ６００＝１５にまで標準化した。サンプルを、可溶性及び不溶性の画分を生成する音波処理及び遠心分離によって後で処理するために冷凍した。
【０１７７】
〈サンプル調製及びＳＤＳ−ＣＧＥ分析〉
可溶性及び不溶性の細胞の画分を、標準化された培養の音波処理によって、その後遠心分離によって調製した。冷凍されて標準化された培養液（４００μＬ）を溶かし、３．５分間超音波で処理した。溶解産物を、２０分間２０，８００×ｇ（４℃）で遠心分離し、上清を、手動又は自動化液体処理を使用して取り除いた（可溶性画分）。ペレット（不溶性の画分）を冷凍し、その後、４℃で２０分間２０，０８０ｘｇで再び遠心分離して、残りの上清を取り除いた。その後、ペレットを、４００μＬの１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４において再懸濁した。ＳＤＳ−ＣＧＥ分析のための可溶性及び不溶性のサンプルの更なる希釈を、１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４において行なった。可溶性及び不溶性のサンプルを、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で、ＳＤＳ毛細管ゲル電気泳動法（ＣＧＥ）（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ  Ｋｉｔ，  Ｐａｒｔ  ７６０３０１）のために調製した。
【０１７８】
各々の菌株からの可溶性画分の減少するＳＤＳ−ＣＧＥ分析の結果を示す、代表的なゲル様の画像を図１に示す。表１０は、構築されたＣＲＭ１９７発現菌株の各々に関して、３つの複製の平均の可溶性ＣＲＭ１９７の収量及び標準偏差を示す。各々の菌株のためスクリーンされた宿主菌株及び分泌リーダーも示す。
【０１７９】
分泌リーダー及び宿主菌株の両方は、ＣＲＭ１９７発現への著しい影響を示した。発現は、０．５ｍＬの規模で、検知可能でない収量から１．２ｇ／Ｌ以上までの範囲に及び、最も高い発現レベルは、宿主菌株２バックグラウンドにおいて観察された。ＰＳ５３８−７７６において観察された収量は１２６３ｍｇ／Ｌであり、ＰＳ５３８−７７２におけるものは１２４１ｍｇ／Ｌであり、両方とも３４０ｍｇ／Ｌの平均収量を大幅に上回った。高い収量及び低い収量を、使用されるリーダーに依存する同じ宿主において観察し、及び高い収量及び低い収量を、異なる宿主菌株において同じリーダーを使用して観察した。ＰＳ５３８−７７２、ＰＳ５３８−７７３、ＰＳ５３８−７７６、ＰＳ５３８−７７８、ＰＳ５３８−７８２を、大規模な発酵における評価のため選択した。
【０１８０】
【表１０】
0005839411.tif 000016
【０１８１】
〈実施例２：組み換え型ＣＲＭ１９７タンパク質の大規模発現〉
組み換え型ＣＲＭ１９７タンパク質を、２リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株ＰＳ５３８−７７２、ＰＳ５３８−７７６、及びＰＳ５３８−７８２において生成した。培養は、本明細書に、及び例えばＲｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１によっても記載されるような無機塩培地を含む、２リットルの発酵槽において成長し、アンモニアの追加により３２℃及びｐＨ６．５に維持された。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の撹拌及び流量の増加によって過剰に維持した。過剰レベルに維持するため、グリセロールを発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの状態を、誘発のための標的培養細胞濁度（５７５ｎｍ（Ａ５７５）での光学濁度）が達するまで、すなわちＣＲＭ１９７生成を開始するためにＩＰＴＧが加えられる時点で、維持する。誘発の細胞密度を、Ａ５７５の４０から２００までの吸光度単位（ＡＵ）で変えることができる。ＩＰＴＧ濃度を０．０２から０．４ｍＭまでの範囲で変えることができる。ｐＨ６から７．５、温度２０乃至３５℃。１６−２４時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、及び細胞ペレットを８０℃で冷凍した。サンプルを、生成物形成用のＳＤＳ−ＣＧＥによって分析した。
【０１８２】
複数の発酵条件を、１乃至２ｇ／ＬのＳＤＳ−ＣＧＥによって決定されるようなトップＣＲＭ１９７発現をもたらすと評価した（図１８及び１９を参照）。誘発されたタンパク質の同一性を、ジフテリア毒素特異抗体を使用するウェスタンブロット解析によって確認した（図２０）。
【０１８３】
〈実施例３：組み換え型のコレラ毒素Ｂタンパク質の高スループット発現〉
〈コレラ毒素Ｂ発現菌株の構築及び成長〉
コレラ毒素Ｂコード配列を、コレラ毒素Ｂアミノ酸配列をコード化するため、シュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号：２２は、発現された合成のコレラ毒素Ｂ遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号：２３は、発現された合成の最適化されたコレラ毒素Ｂ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０１８４】
ＣＲＭ１９７と共に使用される、同じ１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化されたコレラ毒素Ｂ配列を運ぶプラスミド（表８に示される）を構築した。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。
【０１８５】
組み換え型コレラ毒素Ｂタンパク質に融合される１０の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表９に記録された４つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現のために上述されるような、９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルのために上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。
【０１８６】
各々の菌株からの可溶性画分の減少するＳＤＳ−ＣＧＥ分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図２に示す。表１１は、構築されたコレラ毒素Ｂ発現菌株の各々に関する３つの複製の平均の可溶性コレラ毒素Ｂの収量及び標準偏差を示す。
【０１８７】
分泌リーダー及び宿主菌株の両方は、コレラ毒素Ｂ発現への著しい影響を示した。発現は、０．５ｍＬの規模で、検知可能でない収量から０．２ｇ／Ｌ以上までの範囲に及び、最も高い発現レベルは、ｈｓｌＵＶ  ｐｒｃ１  ｄｅｇＰ１  ｄｅｇＰ２  ａｐｒＡ欠失／ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ過剰発現宿主バックグラウンドにおいて観察された。リーダー６（ＣｕｐＡ２）及び８（ＰｂｐＡ２０Ｖ）に融合されるコレラ毒素Ｂの発現は、全て４つの菌株において一貫して高いように思われる。
【０１８８】
【表１１−１】
0005839411.tif 000017
【０１８９】
【表１１−２】
0005839411.tif 000018
【０１９０】
〈実施例４：組み換え型コレラ毒素Ｂタンパク質の大規模発現〉
組み換え型コレラ毒素Ｂタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株ＰＳ５３８−０８８及びＰＳ５３８−０９１において生成した。選択された菌株を、本明細書に、及び例えばＲｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１にも記載されるような無機塩培地を含む２リットルの発酵槽で成長させ、アンモニアを付えることにより、３２℃及びｐＨ６．５に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達した。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度（５７５ｎｍ（Ａ５７５）での光学濁度）が達するまで、すなわち標的タンパク質生成を開始するためにＩＰＴＧが加えられた時点で、維持した。ＣＴＢ生成を開始するためにＩＰＴＧを加えた。１６−２４時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍した。
【０１９１】
複数の発酵条件を、０．６乃至１．０ｇ／ＬのＳＤＳ−ＣＧＥによって決定されるような、トップＣＴＢ発現をもたらすと評価した。最上級の（ｔｏｐ  ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）発酵培養を、ｐＨ６．５乃至７．２及び３２℃で、０．２ｍＭのＩＰＴＧを有するおよそ８０乃至１６０のＯＤにて誘発した。可溶性のＣＴＢ濃度を、ＳＤＳ−ＣＧＥによって測定した（図１４及び表１２を参照）。誘発されたタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法を使用するペプチド質量フィンガープリントによって確認した。
【０１９２】
【表１２】
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【０１９３】
〈実施例５：組み換え型百日咳毒素タンパク質の高スループット発現〉
〈百日咳トキソイドＳ１  Ｅ１２９Ａ  Ｒ９Ｋ発現菌株の構築及び成長〉
Ｓ１変異Ｅ１２９Ａ及びＲ９Ｋにより、サブユニットＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５をコード化する百日咳トキソイドオペロンの配列を、組み換え型百日咳毒素の発現に使用した。図３は、オペロンのマップを示す。図４は、翻訳を伴う、オペロンのＤＮＡ配列を示す（配列番号：２４）。図５は、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５の個々のアミノ酸配列を示す。
【０１９４】
構築物を、表１３に示される、８つのシュードモナスフルオレッセンス宿主において発現した。宿主細胞をｐ５３８−０８１により電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現のために上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルのために上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。
【０１９５】
【表１３】
0005839411.tif 000020
【０１９６】
〈発現された百日咳毒素のウェスタンブロット解析〉
上述された８つの培養からの可溶性画分を、百日咳トキソイド発現を評価するためにウェスタンブロットによって分析した。２０マイクロリットルの可溶性画分（２倍希釈され、減少され、及び減少されなかった）を、１Ｘ  Ｂｉｏ＿Ｒａｄ  ＭＥＳランニングバッファー中のＢｉｏ−Ｒａｄ  １２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ上で実行した。減少されたウェスタン分析のため、１ＸのＸＴ還元剤を加えた。タンパク質を、２０％のメタノールを有する１Ｘ  ＮｕＰＡＧＥ転移バッファ（ＮｕＰＡＧＥ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＮＰ０００６−１）を使用して、６０分間１００Ｖで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥから０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ，  １６２  ０２３２）上に伝送した。細胞膜を、ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ，  ３７５２８）におけるＢｌｏｃｋｅｒ（商標）の１％のカゼインにおいて、室温で１時間遮断した。検出のため、希釈剤を捨て、百日咳菌毒素Ｓ４及びＳ１に対する各々のモノクローナル抗体の１：１０００希釈の組み合わせを含んで、多くの物を加えた（Ａｂｃａｍ，  ｃａｔ＃  ａｂ３７６８６  ａｎｄ  ＃３７５４７）。ブロットを４℃で一晩振ることによりインキュベートした。ブロットを、５分間各々ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより３回洗浄し、その後、１時間室温で、ヤギ由来の抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼの１：５，０００の希釈（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ＃Ａ４４１６）を含む、より多くの希釈剤においてインキュベートした。
Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｍｅｔａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ，  ３４０６５）を使用する発色現象の前に、ブロットを、５分間各々ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（Ｓｉｇｍａ，  Ｐ３５６３）により３回洗浄した。複数のサブユニットを、減少する及び減少しない条件下で、抗Ｓ１及び抗Ｓ４抗体によって検出した（図６）。観察された、発現されたトキソイドの減少した及び減少しないサンプルの横縞模様は、Ｓｅｋｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５８：  １４６４７，  １９８３）によって報告されるような、菌株１６５から精製された百日咳毒素に関して観察されたものと一致した。
【０１９７】
〈実施例６：組み換え型百日咳毒素タンパク質の大規模発現〉
組み換え型百日咳毒素タンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株ＰＳ５３８−３２１、ＰＳ５３８−３２４、ＰＳ５３８−３２５、ＰＳ５３８−３２６、及びＰＳ５３８−３２８において生成する。ＣＴＢ大規模発現について上述されるように、選択された菌株を２リットルの発酵槽で成長させ、ＩＰＴＧにより誘発し、サンプルを分析のために調製した。サンプルを、生成物形成のため、ＳＤＳ−ＣＧＥによって分析し、それらの活性をウェスタンブロットによって分析した。
【０１９８】
〈実施例７：組み換え型野生型百日咳トキソイドの高スループット発現〉
〈百日咳トキソイド発現菌株の構築及び成長〉
Ｓ１を有する、サブユニットＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、及びＳ５をコード化する野生型の百日咳毒素オペロンの配列を、組み換え型百日咳トキソイドの発現に使用する。図１３は、翻訳を伴う、野生型のオペロンのＤＮＡ配列を示す（配列番号：３５）。
【０１９９】
構築物を、表１４に示されるシュードモナスフルオレッセンス宿主において発現する。過剰発現プラスミドを有していない、記録される各菌株を、ａ）記載通りに（過剰発現プラスミドを有さない）；ｂ）ＧｒｐＥ  ＤｎａＫＪ過剰発現プラスミドを含んで、及びｃ）ＤｓｂＡＢＣＤ過剰発現プラスミドを含んで試験する。宿主細胞をＰＴＸ  ＷＴ発現プラスミドにより電気穿孔し、ＰＴＸ  Ｓ１  Ｒ９Ｋ  Ｅ１２９Ａ高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＳＤＳ−ＣＧＥによって、また上述されるようにも調製し、分析する。
【０２００】
【表１４−１】
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【０２０１】
【表１４−２】
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【０２０２】
【表１４−３】
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【０２０３】
高小胞化菌株（ｈｙｐｅｒ−ｖｅｓｉｃｕｌａｔｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ）としても知られる、過分泌の菌株は、例えば、その全体において引用により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／００８７６４、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」に記載される。
【０２０４】
〈実施例８：組み換え型破傷風毒素フラグメントＣタンパク質の高スループット発現〉
〈破傷風毒素Ｃ発現菌株の構築及び成長〉
破傷風毒素Ｃコード配列を、破傷風毒素Ｃアミノ酸配列順序をコード化するためにシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号：３０は、発現された合成の破傷風毒素Ｃ遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、及び配列番号：３１は、発現されたた合成の最適化された破傷風毒素Ｃ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０２０５】
ＣＲＭ１９７（表８に示される）と共に使用される、同じ１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化された破傷風毒素Ｃ配列を運ぶプラスミドを構築した。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。
【０２０６】
組み換え型破傷風毒素Ｃタンパク質に融合する１０の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。表９に記録された４つの宿主を、各々のリーダーにより試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。
【０２０７】
各々の菌株からの可溶性画分の減少するＳＤＳ−ＣＧＥ分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図７に示す。表１５は、構築された破傷風毒素Ｃ−発現菌株の各々に関する３つの複製の平均の可溶性破傷風毒素Ｃの収量及び標準偏差を示す。破傷風毒素Ｃフラグメントは、試験されたほとんどの菌株において十分に発現されるように思われ、最も高い収量は、ｈｓｌＵＶ  ｐｒｃ１  ｄｅｇＰ１  ｄｅｇＰ２  ａｐｒＡ欠失／ＤｅｇＰ２  Ｓ２１９Ａ過剰発現発現宿主（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｏｓｔ）において６００ｍｇ／Ｌにまで及ぶ。菌株ＰＳ５３８−５２９、ＰＳ５３８−５３８、ＰＳ５３８−５４４、ＰＳ５３８−５４６、ＰＳ５３８−５４７、ＰＳ５３８−５４８、ＰＳ５３８−５５８、ＰＳ５３８−５６５及びＰＳ５３８−５６８を、更なる評価のため選択した。
【０２０８】
【表１５−１】
0005839411.tif 000024
【０２０９】
【表１５−２】
0005839411.tif 000025
【０２１０】
〈実施例９：組み換え型破傷風毒素フラグメントＣタンパク質の大規模発現〉
組み換え型破傷風毒素Ｃタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株ＰＳ５３８−５２９、ＰＳ５３８−５３８、ＰＳ５３８−５４４、ＰＳ５３８−５４６、ＰＳ５３８−５４７、ＰＳ５３８−５４８、ＰＳ５３８−５５８、ＰＳ５３８−５６５及びＰＳ５３８−５６８において生成した。選択された菌株を、ＣＲＭ１９７について上述されるような無機塩培地を含む２リットルの発酵槽において成長させた。
【０２１１】
複数の発酵条件を、ＳＤＳ−ＣＧＥによって決定されるような６乃至１０ｇ／Ｌの菌株ＰＳ５３８−５２９、ＰＳ５３８−５４６、及びＰＳ５３８−５４７からのトップ可溶性ＴＴＣの発現をもたらすと評価した（図１１Ａ及び表１６を参照）。最上級の発酵培養を、ｐＨ７．２及び３２℃で、０．２ｍＭのＩＰＴＧを有するおよそ１６０のＯＤにて誘発した。誘発されたタンパク質の同一性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法及びウェスタンブロットを使用する、ペプチド質量フィンガープリントによって確認した。質量分光法とウェスタンブロット解析は、ＰＳ５３８−５２９、ＰＳ５３８−５４６及びＰＳ５３８−５４７（それぞれＤｓｂＡ、Ｐｂｐ  Ａ２０Ｖ及びＤｓｂＣ）の分泌リーダーが、これらの発現条件下で１００％の発現されたタンパク質から処理されないことを示した。しかしながら、ＴｏｌＢリーダーを、分泌されたタンパク質から正確に開裂されるものと同定した（示されないデータ）。分泌リーダーの高忠実度開裂及び低レベルの分解によりＴＴＣの生成を可能にした菌株を同定するため、上記で概説された条件を使用して、ＴｏｌＢ−ＴＴＣ発現菌株ＰＳ５３８−５３８、ＰＳ５３８−５４８、ＰＳ５３８−５５８及びＰＳ５３８−５６８を、２Ｌの発酵規模でスクリーンした。菌株ＰＳ５３８−５３８、ＰＳ５３８−５４８及びＰＳ５３８−５５８を、ウェスタンブロット解析によって材料の類似の品質及び収量を生成するために観察した（図１１Ｂ）。
【０２１２】
【表１６】
0005839411.tif 000026
【０２１３】
〈実施例１０：組み換え型クロストリジウムディフィシレＢタンパク質の高スループット発現〉
〈ＴｃｄＢ発現菌株の構築及び成長〉
ＴｃｄＢコード配列を、ＴｃｄＢアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。配列番号：３２は、発現された合成のＴｃｄＢ遺伝子によってコード化されたアミノ酸配列を示し、配列番号：３３は、発現された合成の最適化されたＴｃｄＢ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０２１４】
最適化されたＴｃｄＢ配列を運ぶプラスミドを、表１７に記録された遺伝子型を有する、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。宿主細胞を、細胞質の発現プラスミドｐ５３８−２１１により電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。
【０２１５】
【表１７−１】
0005839411.tif 000027
【０２１６】
【表１７−２】
0005839411.tif 000028
【０２１７】
試験された２４の菌株の各々からの可溶性画分の減少するＳＤＳ−ＣＧＥ分析の結果を示す代表的なゲル様の画像を、図８に示す。表１８は、構築されたＴｃｄＢ発現菌株の各々に関する３つの複製の平均の可溶性ＴｃｄＢの収量及び標準偏差を示す。菌株ＰＳ５３８−６５４、ＰＳ５３８−６５９、ＰＳ５３８−６６９、ＰＳ５３８−６７１、及びＰＳ５３８−６７４を、更なる評価のため選択した。
【０２１８】
【表１８】
0005839411.tif 000029
【０２１９】
〈実施例１１：組み換え型クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂタンパク質の大規模発現〉
組み換え型クロストリジウムディフィシレ毒素Ｂタンパク質を、シュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株ＰＳ５３８−６５４、ＰＳ５３８−６５９、ＰＳ５３８−６６９、ＰＳ５３８−６７１、及びＰＳ５３８−６７４において生成した。選択された菌株を２リットルの発酵槽で成長させ、ＩＰＴＧにより誘発し、ＣＴＢ大規模発現について上述されるように、サンプルを分析して調製した。
【０２２０】
複数の発酵条件を、およそ２ｇ／ｌのＳＤＳ−ＣＧＥによって決定されるようなトップクロストリジウムディフィシレＢ毒素発現をもたらすと評価した。最上級の発酵培養を、ｐＨ６．５及び３２℃で、０．０８ｍＭのＩＰＴＧを有するおよそ１６０のＯＤにて誘発した。可溶性のクロストリジウムディフィシレＢ毒素濃度をＳＤＳ−ＣＧＥによって決定した（図１２及び表１９を参照）。誘発されたタンパク質の同一性をウェスタンブロットによって確認した。
【０２２１】
【表１９】
0005839411.tif 000030
【０２２２】
〈実施例１２：組み換え型外毒素Ａタンパク質の高スループット発現〉
〈緑膿菌外毒素Ａ発現菌株の構築及び成長〉
緑膿菌外毒素Ａ突然変異体ｒＥＰＡコード配列を、ｒＥＰＡアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築した。図１３は、発現した合成のｒＥＰＡ遺伝子のアミノ酸及びＤＮＡ配列を示す。
【０２２３】
ＣＲＭ１９７（表８に示される）と共に使用される同じ１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合される、図１３に示されるような、いずれかの欠失変異株ｒＥＰＡをコード化する最適化された配列を運ぶプラスミドを構築した。分泌リーダーコード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。
【０２２４】
ｒＥＰＡタンパク質に融合される１０の分泌リーダーを発現する構築物を、表２０に記録された、８つのシュードモナスフルオレッセンス宿主において試験した。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。最も高い収量は、可溶性のｒＥＰＡの４．７乃至６．７ｇ／ｌの範囲に及ぶ。
【０２２５】
【表２０】
0005839411.tif 000031
【０２２６】
宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析した。最も高い収量は、可溶性の外毒素Ａタンパク質の１．６乃至２．２ｇ／ｌの範囲に及んだ。表２１は、更なる試験のため選択された発現菌株の各々に関する可溶性のｒＥＰＡの収量を示す。
【０２２７】
【表２１−１】
0005839411.tif 000032
【０２２８】
【表２１−２】
0005839411.tif 000033
【０２２９】
【表２１−３】
0005839411.tif 000034
【０２３０】
〈実施例１３：組み換え型緑膿菌外毒素Ａタンパク質の大規模発現〉
組み換え型緑膿菌外毒素Ａタンパク質（ｒＥＰＡ）を、２リットルの発酵槽におけるシュードモナスフルオレッセンス菌株ＰＳ５３８−１６３３、ＰＳ５３８−１６４０及びＰＳ５３８−１６７０において生成した。培養を、本明細書に、また例えばＲｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１に記載されるような無機塩培地を含む２リットルの発酵槽において成長させ、アンモニアを追加することにより３２℃及びｐＨ６．５に維持した。溶解された酸素を、発酵槽に散布された空気及び酸素の攪拌及び流量の増加によって過剰に維持した。グリセロールを、過剰レベルを維持するために発酵の全体にわたって培養に送達する。これらの条件を、誘発用の標的培養細胞濁度（５７５ｎｍ（Ａ５７５）での光学濁度）が達するまで、すなわちｒＥＰＡ生成を開始するためにＩＰＴＧが加えられた時点で、維持した。誘発時の細胞密度は、Ａ５７５の４０から２００までの吸光度単位（ＡＵ）で変えることができる。ＩＰＴＧ濃度を、０．０２乃至０．４ｍＭの範囲で変えることができる。ｐＨ６乃至７．５及び温度２０乃至３５℃。１６−２４時間後、各々のバイオリアクターからの培養を遠心分離によって採取し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍した。サンプルを生成物形成用のＳＤＳ−ＣＧＥによって分析した。
【０２３１】
複数の発酵条件を、３２ｇ／ＬまでのＳＤＳ−ＣＧＥによって決定されるようなトップｒＥＰＡ発現をもたらすと評価した（図１５及び１６）。誘発されたタンパク質の同一性を、緑膿菌外毒素Ａに特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析によって確認した（図１７）。得た収量を表２２に示す。
【０２３２】
【表２２】
0005839411.tif 000035
【０２３３】
〈実施例１４：組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質の高スループット発現〉
〈野生型ジフテリア毒素発現菌株の構築及び成長〉
ジフテリア毒素コード配列を、野生型ジフテリア毒素アミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。配列番号：３６は、発現された合成のジフテリア毒素遺伝子のアミノ酸配列を示し、配列番号：３７は、発現された合成の最適化されたジフテリア毒素遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
【０２３４】
ＣＲＭ１９７（表８に示される）と共に使用される１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合される、ジフテリア毒素をコード化する最適化された配列を運ぶプラスミドを構築する。分泌リーダーコード配列を、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。
【０２３５】
組み換え型ジフテリア毒素タンパク質に融合する１０の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験する。表９に記録された４つの宿主を、各々のリーダーにより試験する。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析する。
【０２３６】
〈実施例１５：組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質の大規模発現〉
組み換え型野生型ジフテリア毒素タンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株において生成する。選択された菌株を、２リットルの発酵槽において成長させ、ＩＰＴＧにより誘発し、ＣＲＭ１９７大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをＳＤＳ−ＣＧＥによって分析する。
【０２３７】
〈実施例１６：組み換え型コレラホロトキシンタンパク質の高スループット発現〉
〈ＣＴＸ発現菌株の構築及び成長〉
ＣＴＸコード配列を、ＣＴＸアミノ酸配列をコード化するためシュードモナスフルオレッセンスに好ましいコドンを使用して構築する。コード配列は、図１４に示されるＣＴＸ遺伝子のアミノ酸及びＤＮＡ配列に基づく。
【０２３８】
ＣＲＭ１９７（表８に示される）と共に使用される１０のシュードモナスフルオレッセンス分泌リーダーコード配列に融合された、最適化されたＣＴＸ配列を運ぶプラスミドを構築する。分泌リーダーを、ペリプラズムに対するタンパク質を適切に折り重ねられた及び活性型の回収率に向けるために含む。
【０２３９】
組み換え型ＣＴＸタンパク質に融合する１０の分泌リーダーを発現する構築物を、シュードモナスフルオレッセンス宿主において試験する。表９に記録された４つの宿主を、各々の発現プラスミドにより試験する。宿主細胞を、示されたプラスミドにより電気穿孔し、ＣＲＭ１９７高スループット発現について上述されるような９６−ウェルフォーマットにおいて成長させ、誘発した。サンプルを、ＣＲＭ１９７高スループット発現サンプルについて上述されるようなＳＤＳ−ＣＧＥによって調製し、分析する。
【０２４０】
〈実施例１７：組み換え型コレラホロトキシンタンパク質の大規模発現〉
組み換え型コレラホロトキシンタンパク質を、選択されたシュードモナスフルオレッセンスＰｆｅｎｅｘ発現技術（Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（商標）菌株において生成する。選択された菌株を、2リットルの発酵槽において成長させ、ＩＰＴＧにより誘発し、ＣＲＭ１９７大規模発現について上述されるように、サンプルを分析のために調製した。サンプルをＳＤＳ−ＣＧＥによって分析する。
【０２４１】
【表２３−１】
0005839411.tif 000036
【０２４２】
【表２３−２】
0005839411.tif 000037
【図１】
0005839411.tif 000038
【図２】
0005839411.tif 000039
【図３】
0005839411.tif 000040
【図４−１】
0005839411.tif 000041
【図４−２】
0005839411.tif 000042
【図４−３】
0005839411.tif 000043
【図４−４】
0005839411.tif 000044
【図４−５】
0005839411.tif 000045
【図５−１】
0005839411.tif 000046
【図５−２】
0005839411.tif 000047
【図５−３】
0005839411.tif 000048
【図５−４】
0005839411.tif 000049
【図５−５】
0005839411.tif 000050
【図６Ａ】
0005839411.tif 000051
【図６Ｂ】
0005839411.tif 000052
【図７】
0005839411.tif 000053
【図８】
0005839411.tif 000054
【図９Ａ】
0005839411.tif 000055
【図９Ｂ】
0005839411.tif 000056
【図１０】
0005839411.tif 000057
【図１１Ａ】
0005839411.tif 000058
【図１１Ｂ】
0005839411.tif 000059
【図１２】
0005839411.tif 000060
【図１３−１】
0005839411.tif 000061
【図１３−２】
0005839411.tif 000062
【図１３−３】
0005839411.tif 000063
【図１３−４】
0005839411.tif 000064
【図１３−５】
0005839411.tif 000065
【図１４Ａ】
0005839411.tif 000066
【図１４Ｂ】
0005839411.tif 000067
【図１６】
0005839411.tif 000068
【図１９】
0005839411.tif 000069
【図１４Ｃ】
0005839411.tif 000070
【図１４Ｄ】
0005839411.tif 000071
【図１５】
0005839411.tif 000072
【図１７】
0005839411.tif 000073
【図１８】
0005839411.tif 000074
【図２０】
0005839411.tif 000075