(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
屈折率ｎＬを有する媒質（１１）中の試料（１０）の光の放出（１４，１５）を観察する方法であって、前記試料は、ｎＬよりも高い屈折率ｎｓを有する透明の支持体（２０）の表面（２０ａ）上に載置され、前記光の放出は、所定の振幅及び位相の複数の発光成分を含み、前記支持体に向けられ、前記表面（２０ａ）に垂直な方向（２０ｂ）に対して角度θを形成し、該複数の発光成分のうち、一方は、角度θが臨界角θｃ＝ａｒｃｓｉｎ（ｎＬ／ｎｓ）より大きい超臨界発光成分であり、他方は、それぞれ角度θが臨界角θｃより小さい又は臨界角θｃと等しい、臨界発光成分又は亜臨界発光成分であり、
前記方法は、
‐前記試料上の一つの観察対象領域から前記光の放出の少なくとも一部を捕捉し、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる発光成分を含む一つの捕捉発光信号を得ること、
‐一つのフィルタリングされた発光信号を取得するために、選択的に、所定の発光成分の前記振幅を減衰するように、及び／又は前記位相を変更するように、複数のフィルタ（１７０）を該捕捉発光信号に適用すること、
‐該フィルタリングされた発光信号を、前記試料上の前記観察対象領域の一つの画像域に変換すること、ができる観察装置（１００）を実行し、
前記方法は、
‐前記フィルタリングされた発光信号の一つの変調を実行すること、そこでは、前記試料上の同一の観察対象領域の複数の画像域（６ａ、６ｂ）を取得するために、該光の放出の前記臨界発光成分又は亜臨界発光成分から生じる発光成分は、通過することが許容され、前記変調は、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生ずる前記捕捉発光信号の前記発光成分の全て又は一部に関連している、
‐前記複数の画像域（６ａ、６ｂ）を結合することにより前記試料の少なくとも一つの有効画像域（６ｃ）が生成され、該結合により、前記変調に関連する前記複数の画像域（６ａ、６ｂ）間の差異を強調すること、を特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記変調の対象である、前記捕捉発光信号の前記発光成分は、試料中の調査される深さの範囲に対応する所定の範囲内である前記角度θの前記光の放出の前記超臨界発光成分から放出されることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記観察装置（１００）を用いて得られる、結合されることによって前記試料の前記有効画像域（６ｃ）を生成する前記複数の画像域（６ａ、６ｂ）は、複数のフィルタ（１７０）を、前記捕捉発光信号に連続的に適用することにより連続的に得られることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法であって、
ａ）前記観察装置（１００）及び、各フィルタが、複数の画像域のうち一つの画像域を取得するためにそれぞれ用いられる、複数のフィルタ（１７０）を用いて、前記試料上の同一の観察対象領域の前記複数の画像域を取得する手順であって、
前記複数のフィルタは、
‐該複数のフィルタのうち一つのフィルタが、前記フィルタリングされた発光信号中の、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる発光成分の通過を許容し、
‐該複数のフィルタの全てが、前記光の放出の前記臨界発光成分又は亜臨界発光成分から生じる、前記捕捉発光信号の発光成分を通過し、かつ、前記光の放出の前記臨界発光成分又は亜臨界発光成分から生じる前記捕捉発光信号の前記発光成分について、該複数のフィルタ間で、互いに実質的に同一となるように動作し、
‐該複数のフィルタが、光の放出の前記超臨界発光成分から生じる捕捉発光信号の発光成分のうち少なくとも一部の振幅又は位相について、該複数のフィルタ間で、互いに実質的に異なるように動作する、少なくとも２つのフィルタ、である、手順と、
ｂ）手順ａ）で取得した複数の画像域を結合する演算によって、前記試料の有効画像域を生成し、前記試料の前記複数の画像域の画像域同士の差異を強調する手順と、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の方法であって、
ａ）前記観察装置と、各フィルタが、該２つの画像域のうち一つの画像域を取得するためにそれぞれ用いられる、２つのフィルタとを用いて、前記試料上の一つの同一の観察対象領域から、少なくとも２つの画像域を取得する手順であって、
前記２つのフィルタは、
‐該２つのフィルタのうち一つのフィルタが、前記フィルタリングされた光信号のうち、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる発光成分の通過を許容し、
‐他方のフィルタが、前記光の放出の前記臨界発光成分又は亜臨界発光成分から生じる捕捉発光信号の前記発光成分について、前記一つのフィルタと実質的に同一となるように動作し、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる前記捕捉発光信号の前記発光成分の少なくとも一部について、前記一つのフィルタよりも振幅を実質的に減衰させる、ように構成される、手順と、
ｂ）手順ａ）で取得した前記２つの画像域を結合する演算によって、前記試料の前記有効画像域を生成する手順であって、前記演算は、前記試料の前記２つの画像域間の算術的な差分を含む、手順と、を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法であって、用いられる前記複数のフィルタは、前記光の放出の前記臨界発光成分と亜臨界発光成分とから生じる前記捕捉発光信号の前記発光成分の全て又は一部の振幅を部分的に減衰させることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法であって、前記光の放出の発光成分から生じる前記捕捉発光信号の、同じ角度θを形成する複数の発光成分は、一つの同一のフィルタで、実質的に同様に、振幅の減衰又は位相の変更がなされることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法であって、観察対象となる前記試料上の現象が所定の特性時間を有する場合、該特性時間の半分以下の間隔で、複数の画像域を連続的に取得することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法であって、
‐前記試料の前記複数の画像域のうち一つの画像域は、前記フィルタリングされた光信号のうち、前記光の放出の超臨界発光成分から生じる捕捉発光信号の全ての前記発光成分を、振幅を減衰させずに通すことを許容されているニュートラルフィルタを用いて取得され、
‐前記試料の前記複数の画像域のうち他方の画像域は、前記フィルタリングされた発光信号中の、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる捕捉発光信号の全ての前記発光成分を相殺する一つのトータルフィルタを用いて取得されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法であって、前記観察装置（１００）は、フルフィールドの油浸レンズ（１１０）を含み、前記複数のフィルタ（１７０）は、該油浸レンズの後焦点面（４００）及び／又は該後焦点面の共役面（４２０）に位置することを特徴とする、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記複数のフィルタ（１７０）は一つの絞り（１７６）を含み、該絞りは、開放位置にあるとき、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる前記捕捉発光信号の発光成分の通過を許容し、且つ、前記絞り（１７６）の閉鎖の程度に応じて、該閉鎖の程度に対応する限界値よりも大きい角度θを有する、前記光の放出の前記超臨界発光成分から生じる前記捕捉発光信号の前記発光成分を覆うことを許容することを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の方法であって、観察対象となる前記試料は生物試料であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動的光学顕微鏡法により試料からの発光を観察する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料からの発光は、散乱又は蛍光に起因する。蛍光顕微鏡法は、蛍光現象を利用して、様々な化合物を観察する技術である。蛍光特性は、一部の物質が有する、自ら蛍光を放射する特性である。
【０００３】
観察対象の化合物の蛍光特性には、その化合物自身が蛍光性である（クロロフィル、油等）一次蛍光と、蛍光色素や蛍光マーカーと呼ばれる蛍光性物質により観察対象の化合物をマーキングした二次蛍光とがある。
【０００４】
特に細胞生物学においては、細胞接着、原形質膜上のレセプターへのホルモン結合、神経伝達物質の分泌、及び膜ダイナミクス（エンドサイトーシス、エキソサイトーシス）等、細胞表面において発生する多数の分子事象を、蛍光顕微鏡法により観察する。
【０００５】
蛍光顕微鏡装置は、通常、励起用の光源と、放出光子から励起光子を分離する手段と、光子を捕捉するレンズ系とを含み、更に、撮像手段も含むのが一般的である。
【０００６】
蛍光技術は、様々な種類の顕微鏡で用いることができる。具体的には、試料又はレンズを励起光が通過する従来型の光学顕微鏡（後者の場合は落射蛍光顕微鏡となる）、レーザー走査等によって試料の三次元画像化が可能な共焦点顕微鏡、エバネッセント波で、試料基板（通常はガラス）と、試料が配置された液状媒質（通常は水）との界面に近接し、極めて浅い深度で蛍光を励起する全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）、等である。超臨界角で入射するレーザー光を照射することにより、エバネッセント波（界面に対して直交に、指数関数的に減少する）を形成する。
【０００７】
近年急速に普及しているＴＩＲＦ顕微鏡法は、精密な観察を可能にするが、欠点もある。この用途に適したレーザー光源は高額であり、また、生成された励起場が均質でない場合がある（光線のコヒーレンスによる干渉のため）。また、レンズによる照射では均質な励起を行うことができず、結果として、観察対象の範囲全体において、透過深度が一定でなくなる。更に、細胞により散乱された固有光に関連する励起場の閉じ込め損失がある。
【０００８】
仏国特許第２９４３４２８号には、屈折率ｎｓを有する透明な支持体上に載置された、屈折率ｎＬを有する液体媒質中の、蛍光成分を含む試料を、蛍光顕微鏡法により観察する方法が開示されている。屈折率ｎｓはｎＬよりも大きく、かつ１．５５以下である。観察装置は、開口数ＯＮが１．３３以上かつｎｓ以下のフルフィールドの液浸レンズと、一以上の画像面に画像を形成するための一連のレンズと、上記液浸レンズの後焦点面又は後焦点面の共役面に配置され臨界角θｃ以下の角度θ方向で試料の蛍光発光成分をマスキングするマスクと、を含み、ここでθｃ＝ａｒｃｓｉｎ（ｎＬ／ｎｓ）であり、角度θは、観察対象の試料が載置された上記支持体の表面の垂直方向に対する蛍光発光の方向の角度である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
この観察方法によれば、低コストの装置により高画質な蛍光画像を得ること、又は、ＴＩＲＦ顕微鏡法で得られる画像の画質を向上させることが可能になる。
【００１０】
上記の装置及び方法によれば、高解像度で高品質な画像を得ることができる。それでもなお、解像度の向上が求められるケースも考えられる。
【００１１】
本発明の目的は、若干の変更にかかるコストのみで、画像の解像度を大幅に向上させる新たな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明により課題を解決する手段は、屈折率ｎＬを有する媒質中の試料からの光の放出を観察する方法であって、試料は、ｎＬよりも高い屈折率ｎｓを有する透明の支持体の表面上に載置され、発光は、所定の振幅及び位相を有し、支持体に対して配向され、かつ、表面に対し垂直な方向に角度θを形成する、複数の発光成分からなり、複数の発光成分のうち、一方は、角度θが臨界角θｃ＝ａｒｃｓｉｎ（ｎＬ／ｎｓ）より真に大きい超臨界角発光成分であり、他方は、角度θが臨界角θｃより小さい又は臨界角θｃと等しい臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分であり、
前記方法は、観察装置を用いて、
‐試料上の観察対象領域からの発光の少なくとも一部を捕捉し、発光の超臨界角発光成分から生じる発光成分を含む捕捉光信号を得ることと、
‐捕捉光信号にフィルタを適用することにより、選択的に所定の発光成分の振幅を減衰、及び／又は位相を変更してフィルタリング済み光信号を得ることと、
‐フィルタリング済み光信号を、試料上の観察対象領域の画像域に変換することと、を可能とする方法であって、
前記方法は、
‐フィルタリング済み光信号の変調を可能にし、変調において、発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる発光成分を通すことにより、試料上の同一の観察対象領域の画像域が得られ、発光の超臨界角発光成分から生じた捕捉光信号の発光成分のうち少なくとも一部が、変調の対象となることと、
‐複数の画像域を結合することにより試料の有効画像域が少なくとも一つ生成され、結合によって、変調に係る複数の画像域間の差異を強調することと、を特徴とする、方法。
【００１３】
試料が発する光は、蛍光（適正な励起による）、又は散乱によるものである。発せられた光の一部は、観察装置により捕捉され、フィルタリングの後、画像域に変換される。
【００１４】
試料の観察対象領域とは、観察の対象となる試料上の部位である。観察対象領域は、拡張又は分割可能である。後者の場合、試料を走査してより大きな画像を再構成できる。画像域とは、試料上の観察対象領域の画像である。つまり、画像域は、試料全体の画像であってもよく、試料の一部の画像や、試料上の一点の画像であってもよい。試料上の同一の観察対象領域から得られた画像域に対し、変調が行われる。
【００１５】
本発明の装置によれば、より高い解像度の顕微画像が得られ、例えば、生物材料の研究に有用な情報が得られる。
【００１６】
このような解像度の向上は、臨界角又は亜臨界角で試料が発した光から生じる成分の全体又は一部を除外した光信号、つまり、試料から超臨界角で発光された光から生じる成分が多く含まれる信号、を直接操作する方法（仏国特許第２９４３４２８号に記載の方法）により実現されるものではなく、試料から超臨界角で発光された光から生じる成分に信号変調を行うことで間接的に操作することにより実現される。この方法が間接的というのは、つまり、画像域の元領域における光信号を変調して生成した画像域間の差異を強調した有効画像域を得るために、試料から複数の画像域を取得して、その後結合する手順を必要とすることからである。
【００１７】
上記変調は、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分の全て又は一部に対して行われ、有効画像域における超臨界角発光成分は、上記結合によって増強される。一方、臨界角又は亜臨界角で試料が発した光から生じた捕捉光信号の成分は、上記変調の対象にならず、有効画像域における臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分は、上記結合によって減弱される。上記結合は、復調と見なしてもよい。このようにして、有効画像域においては、変調された超臨界角発光成分の寄与度が示される。
【００１８】
変調は、捕捉光信号の発光成分の振幅及び／又は位相に影響し得る。つまり、用いられているフィルタが、光波の振幅及び／又は位相を変更する。本明細書内で、フィルタに関連して「作用する」という場合、振幅及び／又は位相を変更することを指す。２つのフィルタが異なる作用をすると言った場合、「変調を行う」ことを意味する。振幅の変更は、ある程度大きな減衰であってよく、完全な遮光に至ってもよい。用いられるフィルタの一部（全てではない）は、作用を持たないニュートラルフィルタであってよく、この場合、フィルタリング後に得られる光信号は捕捉光信号と同一ではあるが、「フィルタリング後の信号」と呼ぶ。発光成分を「通す」と言った場合、フィルタリングの後、減衰（振幅の低下）又は位相の変化の有無にかかわらず、発光成分が残存していることを示す。
【００１９】
カメラ等のセンサを用いて形成された他の画像と同様に、画像域は、フィルタリング後の光信号の係数の二乗に対応する光度情報を含む。
【００２０】
特に、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉信号の全ての発光成分を変調した場合（図７の説明（後述）を参照）には、得られる有効画像域の解像度は、仏国特許第２９４３４２８号に開示された方法で取得される画像域と比較して約２０〜２５％の割合で向上できる。
【００２１】
有効画像域を得るための画像域の取得は、例えば、取得光信号を分割して、分割後の各信号にフィルタを適用するなどして、同時に行ってよい。または、画像域を逐次的に取得してもよい。この場合、その後、光信号を取得し、逐次的にフィルタを適用することで、変調が行われる。このようにして得られたフィルタリング後の光信号のそれぞれに対して、画像域が格納される。
【００２２】
この方法では、少なくとも１つの有効画像域が得られるが、観察装置とフィルタで許されている限り、必要に応じて何度でも行い、所定の間隔で複数の有効画像域を得てよい。試料上の複数の点に対応する画像域を取得すれば、試料の空間的走査が可能となる。
【００２３】
本発明は、特に、屈折率ｎｓを有する支持体と屈折率ｎＬを有する媒質との間の界面に位置する領域で、画像域の高感度な取得を可能にする。この界面から所定の深度の領域に至るまでの領域で発生する事象を可視化することが可能である。ガラスと水との界面（およそｎＬ＝１．３３、ｎｓ＝１．５１）では、上記深度は波長の６分の１、ただし発光のうち、急角度の発光成分（超臨界角発光成分）のみを捕捉する場合にはそれ以下となり、可視領域の波長では５０ｎｍ（ナノメートル）〜１００ｎｍ程度となる。
【００２４】
顕微鏡法、特に蛍光顕微鏡法で広く用いられる支持体はガラス製であり、このガラスは、屈折率が１．５５以下の低コストの従来型のガラスから選択しても良く、より高い屈折率を有するガラスでもよい。
【００２５】
蛍光色素は、信号を伝達できるアンテナの役割を果たす。この伝達物質の近接範囲（数十ナノメートル）には、均質な媒質上ではエバネッセントである電磁成分が配置される。この電磁成分は、蛍光色素が界面近くに位置したときに光を伝播するように挙動する。その後、屈折率が最大となった媒質内で、臨界角よりも大きい角度で光を伝播する。
【００２６】
図５ａは、支持体２０と液体媒質１１との間の界面に位置する伝達物質１２による蛍光発光の発光成分を示したものである。
【００２７】
伝達物質１２による蛍光発光には、０〜θｃの間である角度θで発せられる発光成分１４と、θｃよりも大きい角度θで発せられる発光成分１５（「ノーライト」又は「超臨界光」という）と、が含まれる。発光成分１５は、液状媒質１１に含まれ、透明な支持体２０で光を伝播するよう挙動するエバネッセント成分に対応する。
【００２８】
例えば、ガラスと水との界面では、超臨界光は、発光された全光量の３分の１程度の光量に達し得ることが分かった。
【００２９】
臨界角の値は、スネルの屈折の法則θｃ＝ａｒｃｓｉｎ（ｎＬ／ｎｓ）により求められる。液体が水（ｎＬ＝１．３３）であり、支持体が一般的なガラス（ｎｓ＝１．５２）の場合、θｃは６１°となる。
【００３０】
図５ｂは、より離れた約１００ｎｍに位置する伝達物質１２による蛍光発光の発光成分を示したものである。
【００３１】
発光には、０〜θｃの間である角度θで発せられた同一の発光成分１４が含まれているが、超臨界光に対応する、θｃ以上の角度で発せられた発光成分は含まれないことが分かった。
【００３２】
本発明の方法によれば、超臨界光に含まれる情報を取得することで、構造についての情報と、液体媒質／支持体の界面から深度１００ｎｍにおいて起こり得るその進展についての情報とを含む有効画像域を生成できる。
【００３３】
レンズの開口数ＯＮは、ＯＮ＝ｎ．ｓｉｎ（αｍａｘ）で定義される。ここで、ｎはレンズの動作環境の指標であり、αｍａｘはレンズの最大集束角である。
【００３４】
現在は、油浸（ｎ＝１．５１）の、開口数の高いレンズが開発され、市販されている。このようなレンズのＯＮは、例えば１．４５や１．４９等である。最大集束角は臨界角θｃよりも大きい。したがって、これらのレンズによれば、超臨界光の大部分を捕捉できる。これらのレンズは、高画質のフルフィールドの画像が得られるよう、球面収差及び色収差について補正されることが望ましい。
【００３５】
本発明の実施形態において、本発明は以下の性質のうち少なくとも１つを備えている。‐上記変調の対象となる捕捉光信号の発光成分は、角度θが、試料のうち調査対象となる深度の範囲に対応する所定の範囲内であるような、発光の超臨界角発光成分から発せられる。
‐観察装置を用いて得られ、結合によって、試料の有効画像域を生成する複数の画像域は、捕捉光信号に連続的にフィルタを適用することで連続的に得られる。
‐本方法には、次の手順が含まれてよい。
ａ）観察装置及び複数のフィルタを用いて、試料上の同一の観察対象領域から、複数の画像域を取得する手順であって、各フィルタは、複数の画像域のうち１つの画像域を取得するためにそれぞれ用いられ、複数のフィルタは、
＋複数のフィルタのうち１つのフィルタが、フィルタリング済み光信号のうち、発光の超臨界角発光成分から生じる発光成分を通し、
＋複数のフィルタの全てが、発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分を通し、かつ、発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分に対して、互いに略同一の作用を持ち、
＋複数のフィルタのうち少なくとも２つのフィルタが、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分のうち少なくとも一部の振幅又は位相に対して、互いに異なる作用を持つように構成される。
ｂ）手順ａ）で取得した複数の画像域を結合する演算によって、試料の有効画像域を生成し、試料の複数の画像域の画像域同士の差異を強調する。
‐本方法には、次の手順が含まれてよい。
ａ）観察装置及び２つのフィルタを用いて、試料上の同一の観察対象領域から、少なくとも２つの画像域を取得する手順であって、各フィルタは、２つの画像域のうち１つの画像域を取得するためにそれぞれ用いられ、２つのフィルタは、
‐２つのフィルタのうち１つのフィルタが、前記フィルタリング済み光信号のうち、発光の超臨界角発光成分から生じる発光成分を通し、
‐他方のフィルタが、発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる、前記捕捉光信号の発光成分に対し、一のフィルタと略同一の作用を持ち、発光の超臨界角発光成分から生じる、捕捉光信号の発光成分の少なくとも一部について、一のフィルタより著しく振幅を減衰させるように構成される。
ｂ）手順ａ）で取得した２つの画像域を結合する演算によって、試料の有効画像域を生成する手順であって、演算は、試料の２つの画像域間の代数差を含む。
‐用いられるフィルタは、発光の臨界角発光成分及び亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分の全て又は一部の振幅を部分的に減衰させる作用も有する。
‐前記発光の発光成分から生じる捕捉光信号の、同じ角度θを形成する複数の発光成分は、同一のフィルタで、略同様に、振幅の減衰又は位相の変更がなされる。
‐試料の示す、観察対象となる現象が、所定の特性時間を有する場合、特性時間の半分以下の間隔で、連続して複数の画像域を取得する。
‐試料の画像域のうち１つが、フィルタリング済み光信号のうち、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の全ての発光成分を、振幅を減衰させずに通すニュートラルフィルタを用いて取得され、試料の他方の画像域は、フィルタリング済み光信号のうち、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の全ての発光成分を相殺するトータルフィルタを用いて取得される。
‐観察装置は、フルフィールドの液浸レンズを含み、前記フィルタは、油浸レンズの後焦点面及び／又は後焦点面の共役面に位置する。
‐フィルタは絞りを備え、絞りは、開放位置においては発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の全ての発光成分を通すことができ、又、その絞りの程度に応じて、絞りの程度に関連する限界値よりも大きい角度θを有する、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分をマスキングできる。
‐観察対象の試料は生物試料である。
【００３６】
特定の実施形態では、変調は、発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の全ての発光成分には影響しない。変調は、角度θが所定の範囲内、例えば、［θａ，θｂ］間である発光成分にのみ適用される。ここでθａ及びθｂは、θｃよりも真に大きい。これにより、試料上の対応する範囲を調査できる（図１の説明を参照）。
【００３７】
他の実施形態では、本方法は、ａ）変調後の複数の光信号に対応する複数の画像域を取得する手順を含む。変調のためには、用いられるフィルタのうち少なくとも１つが、発光の超臨界部から生じる発光成分を通すよう構成されていることが必要である。また、その他のフィルタが、捕捉光信号の超臨界角発光成分の全て又は一部に対し、１つのフィルタとは異なる作用を与えるよう構成されていることが必要である。ここで「異なる」とは、フィルタが、処理される発光成分の振幅をより強く、又はより弱く、減衰させることを意味する。また、位相に対する作用の違いであってもよい。振幅に対する作用と位相に対する作用は組み合わせてよい。
【００３８】
その一方で、これらのフィルタは、発光の臨界部又は亜臨界部から生じる発光成分に対しては略同一の作用を有さなくてはならない。フィルタによって、発光の臨界部又は亜臨界部から生じる発光成分を変更して画像域を得てよいが、有効画像域を生成するためには、加えられる変更は、結合される全ての画像域について略同一である必要がある。ここで「略同一」とは、特定の実施形態においては差異がないが、他の実施形態においては、望ましい変調（発光の超臨界角発光成分から生じる発光成分の変調）から若干の差異があって良いことを意味する。フィルタリング済み光信号には、発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる発光成分が残っていることが望ましい。
【００３９】
本方法は、ｂ）手順ａ）で取得した複数の画像域を結合する手順を含む。この結合は、光量に基づいた演算により行われる。この演算は、用いられるフィルタに基づき、変調に起因する画像域間の差異を強調するものである。
【００４０】
複数の画像域を取得する方法のメリットは、例えば演算に平均値を導入することで、バックグラウンドノイズを低減できることである。
【００４１】
例えば、試料上の同一の観察対象領域から、３つ連続で画像域を取得してよい。このうち１つ目の画像域は、捕捉信号の超臨界部から生じる全ての発光成分についての情報を含む、試料の画像域である。つまり、用いられたフィルタはこれらの発光成分を大きく変更していない。このうち２つ目の画像域は、捕捉信号の超臨界部から生じる発光成分についての情報を含まない画像域である。つまり、用いられたフィルタはこれらの発光成分をマスキングしている。３つ目の画像域は、１つ目の画像域と同一の条件で取得される。これら３つの連続した画像域の結合としては、まず１つ目と３つ目の画像域の平均、その後、２つ目の画像域との差異の絶対値を算出する方法が考えられる。これにより、有効画像域中のノイズ（光脱色、励起強度の変化、試料の移動）を低減できる。
【００４２】
これらの画像は、電界全体の（正の）強度についての情報が含まれる。２つの画素間の差異は正でも負でもあり得るため、有効画像域の強度を示す正の結果を得るためには絶対値を用いることが必要である。
【００４３】
別の特定の実施形態では、手順ａ）で、試料上の同一の観察対象領域から、２つの画像域が取得される。１つ目の画像域は、発光の超臨界部から生じる発光成分を通すよう構成されたフィルタで取得される。２つ目の画像域は、捕捉信号の超臨界成分の全て又は一部に対し、１つ目のフィルタとは異なる作用をし、かつ、捕捉信号の臨界成分又は亜臨界成分に対しては、１つ目のフィルタと略同一の作用をするフィルタで取得される。手順ｂ）で、各画素に対して、２つの画像域間の差異の絶対値を算出することにより、２つの画像域が結合される。この結果が、有効画像域の強度を示す。この実施形態のメリットは、画像域の結合が簡易であるため、演算がより簡易、かつ高速に行えることである。
【００４４】
特定の実施形態では、２つの画像域において同様に、発光の臨界角発光成分及び亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分の全て又は一部を減衰させてよい。これは、亜臨界角光線から発せられる光が、超臨界角光線から発せられる光に比べて非常に強い場合に重要な処理である。
【００４５】
一般的に、用いられるフィルタは、発光の発光成分から生じる捕捉光信号の、同じ角度θを形成する複数の発光成分を、回転対称性を考慮し、略同様に処理する。実際には、発光した光の成分のアジマスを調整することには、大きな意義はない。一方、アジマスを調整しない場合には、有効画像域に非点収差が導入されることを妨げる。
【００４６】
試料が、特性時間で経時変化する場合（細胞膜等）には、特性時間の半分よりも短い間隔（ビデオフレームレート）で、連続する画像域（試料を深さ方向に表す）を取得することで、この変化を観察する。この方法により、通常、連続する画像域と同じ速度で、有効画像域（試料の界面を表す）を取得できる。つまり、仏国特許第２９４３４２８号のようにビデオフレームレートの半分ではなく、このビデオフレームレートで取得が可能である。
【００４７】
レンズの後焦点面及び／又は後焦点面の共役面に絞りを追加するのは容易であり、市販の顕微鏡にも適用可能である。これにより、装置の改善のためのコストを削減できる。
【００４８】
絞りは、絞りの開口度に応じた、特定の角度以上の角度θ方向において、試料からの発光の発光成分から生じた捕捉光信号の発光成分をマスキングする働きをもつ。図５ａ及び図５ｂは、蛍光発光の性質を表した図である。本方法のメリットは、結合に用いられる画像域で、亜臨界の情報が必ず得られることである。この情報は、試料の最深部と関連しており、しばしば有益である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明のその他の特徴及び利点については、図面を参照し、発明を限定しない例としての以下の実施形態を通じて説明する。
【図１】図１は、本発明の方法を実施できる顕微鏡装置の模式図である。
【図２】図２は、図１に示した装置の本発明による変形例で、共焦点顕微鏡法に適した装置を表す図である。
【図３】図３は、図１に示した装置の本発明による変形例で、ＴＩＲＦ顕微鏡法に適した装置を表す図である。
【図４】図４は、本発明の方法を実施するためのフィルタの例を表す図である。
【図５】図５ａ及び５ｂは、異なる構成における蛍光発光成分を表す図である（上述）。
【図６】図６ａ及び６ｂは、発光の臨界角発光成分及び亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分がある場合とない場合の、同一の細胞の画像域をそれぞれ表す図である。図６ｃは、図６ａ及び６ｂに示す画像域を結合して得られた、上記の細胞の有効画像域である。
【図７】図７は、同一の実験試料から得られた染色部の光量をグラフで表した図である。一方は仏国特許第２９４３４２８号に記載の方法（臨界要素又は亜臨界要素をマスキング）によるもの、他方は本発明の方法（超臨界要素を変調した後、復調）によるものである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
説明を明確にするために、図面中に描かれた要素は、必ずしも実際の寸法のとおりの比率となっていない。図面内で、同じ参照番号は同じ要素を指す。
【００５１】
図１は、蛍光顕微鏡装置１００の模式図である。蛍光顕微鏡装置１００は、ＯＮが１．３３以上である液浸レンズ１１０を備える。液浸レンズ１１０の上方に、ガラス支持体２０が配置されている。液浸レンズ１１０とガラス支持体２０との間に油が介在している。
【００５２】
観察対象の試料１０は、ガラス支持体２０の上に配置される。この試料１０は、例えば、水中に分散された蛍光発光成分を含む。
【００５３】
レンズの後焦点面を参照番号４００で示す。励起光は、光源からの光線２００により生成され、励起フィルタ２１０を通った後、ダイクロイックミラー１２０により反射され、透明の支持体２０を通過し試料１０に照射される。入射する励起光の光路の一例が、図の上部に向かう矢印により示されている。入射する励起光を、部分的に反射した後、発光フィルタ１３０でフィルタリングすることにより、像面に形成される画像に、試料１０から発行された蛍光のみが含まれるようにしてもよい。
【００５４】
試料１０から発せられた蛍光は、透明の支持体２０と、ダイクロイックミラー１２０と、発光フィルタ１３０とを通過する。
【００５５】
図１に図示された実施形態では、この光はミラー１４０に反射され、装置の残りの部分ではこの反射光を処理することになる。
【００５６】
レンズ１５０はチューブレンズと呼ばれるレンズで、光を中間像面４１０に集束させることができる。
【００５７】
その後、この光はレンズ１６０によって平行化され、レンズ１８０によって像面４３０に集束される。画像はここで、カメラ３００などの適切な装置により取得される。像面４３０及び４１０はいずれも、観察面の共役面である。
【００５８】
レンズ１６０及び１８０は、液浸レンズ１１０の後焦点面の共役面４２０が、レンズ１６０とレンズ１８０との間に位置するよう配置される。
【００５９】
可変開口絞り１７０は、液浸レンズの後焦点面に配置される。この絞りは、捕捉光信号の発光成分に対してフィルタの役割を果たす。絞りを開放位置にすれば、発光の発光成分から生じる捕捉光信号の全ての発光成分を通す。絞りを部分閉鎖位置にすれば、捕捉光信号の発光成分の一部をマスキングする。
【００６０】
具体的には、観察面に位置する試料１０の蛍光発光体から特定の角度で発せられた光線は、レンズの後焦点面４００（もしくは、後焦点面４００のいずれかの共役面４２０）の、その中心（光軸により定義される）から特定の距離ｒ（θ）離れた位置で受け止められる。ｒ（θ）は、θの増加関数である。例えば無収差レンズの場合、ｒ（θ）は、ｓｉｎ（θ）に比例する。したがって、角度θで発せられた光線（円錐形）は、後焦点面において、半径ｒ（θ）の円を形成する。
【００６１】
絞り１７０が、レンズ１１０の後焦点面４００に配置された場合、ｒ（θ）とｓｉｎ（θ）との関係はｒ（θ）＝ｎｉ×ｆｏ×ｓｉｎ（θ）であり、ここでｆｏは液浸レンズ１１０の焦点距離（通常数ミリメートル程度）であり、ｎｉはレンズに用いられる液浸媒質（通常は油）の指標である。
【００６２】
実施形態では、倍率Ｇ＝１００の液浸レンズが用いられ、チューブレンズ１５０の焦点距離はｆｔ＝２００ｍｍである。
【００６３】
つまり、ｆｏ＝ｆｔ／Ｇ＝２ｍｍとなる。この構成においては、ｒ（θｃ）＝２．６６ｍｍである。
【００６４】
絞り１７０が後焦点面の共役面に配置される場合、光学系の拡大係数を考慮に入れる必要がある。例えば、共役面４２０では、増倍率Ｇ´＝ｆ１６０／ｆ１５０を導入する必要がある。ここでｆ１５０はチューブレンズ１５０の焦点距離、ｆ１６０はレンズ１６０の焦点距離である。
【００６５】
発光の臨界角発光成分又は亜臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分は、半径ｒ（θｃ）の、有心閉鎖円盤状に、後焦点面で受け止められる。発光の超臨界角発光成分から生じる捕捉光信号の発光成分（θｃ＜θ＜θｍａｘ）は、後焦点面でｒ（θｃ）＜ｒ（θ）＜ｒ（θｍａｘ）となる解放環を形成する。このように、光軸に中心を有し、開口ｒ（θｃ）が設けられた絞り１７０を採用することで、超臨界角発光成分を全てマスキングできる。
【００６６】
このように、発光の時点で選択がなされる。その結果、標準的な落射蛍光観察装置で用いられる照明装置を、そのまま利用できる。これにより、非コヒーレント光源（水銀灯等で得られる通常の白色光等）によって、照射が可能である。この構成の利点は、レーザー光を必要とするＴＩＲＦＭ顕微鏡法のような多額の追加コストが必要なく、かつ、定量的測定をも可能にし得る均質な視野が得られることである。
【００６７】
一実施形態によれば、絞りの作動手段はビデオフレームレート（通常、数十ヘルツ程度）で動作し、画像取得の速度に合わせて開放位置と閉鎖位置とを交互に切り替える。これにより、体積についての情報と、表面についての情報とを同時に得ることができる。
【００６８】
この画像取得方法は、生物試料の画像取得、特に、細胞接着、エンドサイトーシス／エキソサイトーシス等の生細胞の生物学的作用の研究に好適である。
【００６９】
図２は、図１に示した装置の本発明による変形例を示す模式図であるが、どちらの実施形態でも、像面４３０の前に配置される部材は同じである。図２に図示した装置では、孔１９５を有するピンホール型のマスク１９０が像面に配置される。シングルビーム検出器３５０によって、ポイントごとに、孔１９５を通過する光を取得できる。このように、共焦点顕微鏡法を行うための構成が実現される。
【００７０】
図３は、図１に示した装置の本発明による変形例を示す模式図であるが、顕微鏡装置の部材は同じである一方、光源が異なっている。
【００７１】
図３に図示した装置では、光２５０はレーザーにより発光され、試料の照明は全内部反射により行われる。これにより、改良されたＴＩＲＦ型の装置が実現される。
【００７２】
なお、市販のレンズの後焦点面は、一般的にレンズの内部に位置し、アクセス困難である。そのため、この後焦点面の画像形成を可能にするシステムを設け、センサとレンズとの間にフィルタ系１７０を挿入できるようにするのが望ましい。
【００７３】
一実施形態では、ニコン社製のＴｉ型倒立蛍光顕微鏡を用いる。この顕微鏡は、後焦点面の画像形成と、環状のマスクの位置決めとを行うことができるモジュール（ＴＩ−Ｔ−ＢＨＰ、ＭＥＢ５５８１０）を備えており、高開口数レンズとの（外部）位相コントラストが可能になる。このタイプのモジュールに、本発明の装置の絞り１７０を適用できる。このような、面の心出しと位置調整のシステムは、超臨界角をフィルタリングする絞りに最適である。このシステムは、様々なレンズに対応できるよう、複数の位置を有する。
【００７４】
図４は、液浸レンズ１１０の後焦点面４００又は後焦点面の共役面４２０に位置する、絞り１７０の模式図である。絞り１７０は、光をマスキングできる周辺領域１７６を有する。この領域１７６は、可動式（カメラ等の場合）であってもよいし、モータ駆動の回転式フィルタディスクを回すことで絞りを切り替えられるタイプであってもよい。
【００７５】
絞り１７０は、ソーラボ社製の絞りのように、虹彩絞りであってもよい。このタイプの絞りでは、機械式の可動部品（図示せず）を動かすことで開口を調整する。
【００７６】
また、ディスク上の複数の領域に開口又は半透明の材料を設けたディスクを採用し、これを回転させて用いてもよい。この場合、この絞りは、不透明の材料に開けられた、適切な直径の円形孔として実現されてよい。これにより、きわめて短いサイクルで、例えばカメラによる画像取得のスピードに合わせて、透過／閉鎖を行うことができる。
【００７７】
実施形態の一例では、ニコン社製倒立蛍光顕微鏡Ｔｉ−Ｕ（登録商標）が、位相差用双眼式ベースＴＩ−Ｔ−ＢＰＨ（登録商標）と、開口数１．４９の油浸レンズ（１００倍）と共に用いられる。透過フィルタと、ダイクロイックプレートと、励起フィルタとを含む、蛍光フィルタキューブが用いられる。ここで使用される光源は、１３０Ｗの水銀ランプと発生器Ｃ−ＨＧＦＩ（登録商標）とを備える、ニコン社製のファイバ光源Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔ（登録商標）である。カメラは、ＥＭＣＣＤ  Ａｎｄｏｒ  Ｉｘｏｎ＋を約−７５℃に冷却して用いる。絞り１７０は、ソーラボ社製の虹彩絞りである。
【００７８】
位相リングに代えて、この絞りをニコンＭＥＢ５５８１０モジュール（ＴＩ−Ｔ−ＢＰＨ）に配置する。絞りの位置は、顕微鏡のベルトランレンズによって、また、心出しと軸合わせ用の調整ねじによって、モジュールを移動することにより調整される。以降の調整手順は、モジュールに付属の位相リングの調整と同様にして行う。
【００７９】
ヒト胎児腎臓細胞を、Ａｌｅｘａ４８８とコレラトキシン（細胞膜の糖脂質と脂質ラフトの構成要素に結合する）との組み合わせによって、染色し、ニコン社製Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔの１３０Ｗ水銀ランプ（従来型のランプ）で励起し、観察を行った。使用されるフィルタキューブは、帯域幅４５０〜４９０ｍｍの励起フィルタと、５００ｎｍのダイクロイックミラーと、帯域幅５１０〜５５０ｍｍの透過フィルタと、からなる。
【００８０】
図６ａ及び図６ｂは、開放絞り（６ａ）と、超臨界角発光要素を全てマスキングする閉鎖絞り（６ｂ）とによって、得られた画像をそれぞれ示すものである。図６ａと６ｂにおいて、休止時間（Ｔ＝３００ｍｓ）及びゲイン（Ｇ＝０）は同じである。図６ｃは、図６ａと６ｂの画像の差異（画像に関連する信号の強さの差異）の絶対値として取得した画像である。
【００８１】
図６ａと６ｂの画像は同じように見えるが、６ｃの画像はコントラストが強い。６ａ、６ｂの２つの画像では、細胞内部からの他の情報が含まれているために区別が難しいが、このようにして、膜現象に付随する光量変化を良好に観察することが可能である。
【００８２】
この観察は、レーザーを採用することなく、従来型のランプによって、好適に実現された。
【００８３】
方位分解能の測定は、励起／発光が５８０／６０５ｎｍの蛍光ビーズＦｌｕｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標、インビトロジェン社製）を回転（スピンコーティング）により通常のスライドガラス（厚み０．１３〜０．１６ｍｍ）に付着させ、蒸留水に浸漬することで行った。
【００８４】
図７は、これらのビーズの蛍光光量プロファイル（横軸に示す側方変位の関数として、正規化された信号強度を縦軸に示す。単位ミクロン）を示すものである。本発明の方法により取得した有効画像域に対応するＣ２プロファイルは、仏国特許第２９４３４２８号に記載の方法で取得した画像に対応するＣ１プロファイルよりも狭いことが分かる。分解能の改善率は、２０〜２５％である。
【００８５】
本発明は上記の実施形態に限定されるものでなく、非限定的に解釈されるべきものであり、同等のあらゆる実施形態が本発明の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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