(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の神経学的状態を検出するための方法であって、
前記対象から採取された生物試料中の１つ以上のニューロン特異的バイオマーカーの量を測定する工程であって、ここで、前記ニューロン特異的バイオマーカーがＧＦＡＰまたはその分解産物に対する自己抗体であり、前記バイオマーカーの合成が、前記対象の損傷後に変化する、工程と
前記生物試料中の１つ以上の前記バイオマーカー量の比率に基づいて神経学的状態を検出する工程と
を含み；
ここで、前記神経学的状態が、外傷性脳損傷である、
方法。
【請求項２】
前記ＧＦＡＰ分解産物が、配列番号１１４中のＡｓｎ５９、Ｔｈｒ３８３またはその両方での切断により形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比率が、コントロール対象における前記バイオマーカーの濃度に対する前記損傷後の前記バイオマーカーの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物試料が、血液、血清、血漿、ＣＳＦ、尿、唾液または組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ニューロン特異的バイオマーカーの存在が、損傷後７２時間より後の前記生物試料中において検出可能である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年９月１４日に出願された米国特許仮出願第６１／２４２，１２３号、２０１０年６月１４日に出願された同第６１／３５４，５０４号、２０１０年６月１７日に出願された同第６１／３５５，７７９号および２０１０年９月３日に出願された同第６１／３８０，１５８号に対する優先権を主張するものであり、上記各明細書はその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病および慢性外傷性脳損傷（ＣＴＥ）を含めた外傷性脳損傷（ＴＢＩ）またはその他の神経学的状態のマーカーの同定に関する。本発明のマーカーには、中枢神経系の機能および治療に関与し得る自己抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが含まれる。また本発明は、脳損傷におけるバイオマーカーの検出方法ならびに脳損傷の傾向または進行の処置および監視のための診断法を含めた、診断および治療用の材料および方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
臨床神経学の分野では、最初の傷害が迅速に診断され、また進行性障害の場合には、中枢神経系組織へのストレスが事前に選択された閾値に達する前に診断されさえすれば、最初の傷害に対する生理的反応に関連した中枢神経系組織の二次的損傷を低減できたはずだという認識に不満が抱かれている。一般的傷害と共に外傷、虚血および神経毒性化学物質による傷害はすべて、脳損傷の可能性を示すものである。こうした脳損傷の重症型の各原因の診断は、臨床応答試験、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により直接的に行われるが、画像診断は、分光画像法の高いコストおよび長い診断時間の両方により制限される。通常の生活が不可能な個人の臨床応答試験はその有用性が限られており、微妙な診断が不可能な場合が多い。さらに、現存の診断法には限界があるため、対象が自らの神経学的状態に対するストレスを経験することはあっても、わずかな症状がすぐに消散する場合が多く、損傷が生じたことに気付かないか、治療を求めないことが多いという状況が生じる。対象の神経学的状態に対するこのような軽度から中程度の問題の処置法がないことから、累積的な影響を有するか、または重篤な脳損傷イベントを生じる可能性があり、いずれも臨床予後は不良である。
【０００４】
神経学的状態の分光学的診断および臨床応答診断に関連した制限を克服するために、対象の分子また細胞レベルでの健康状態の変化を内側から示すものとして、バイオマーカーの使用が注目されつつある。バイオマーカー検出では、対象から採取した試料、通常は脳脊髄、血液または血漿を使用して、試料中のバイオマーカーを検出するため、バイオマーカー検出は、神経学的状態の安価で迅速、かつ客観的な測定法としての可能性を秘めている。神経学的状態の迅速で客観的な指標が得られれば、正常でない脳状態の重症度をこれまで実現されなかった客観度で判定し、転帰を予測し、状態の治療を導くだけでなく、対象の応答性および回復をモニターすることも可能となる。さらに、多数の対象から得られたこのような情報により、脳損傷の機構に対する洞察をある程度得ることが可能となる。
【０００５】
中枢神経系（ＣＮＳ）損傷のバイオマーカーは医師および基礎研究に、損傷の重症度および細胞病理の判定に役立つ定量化可能な神経化学的マーカーだけでなく、治療的介入の代替マーカーも提供し得る。ＴＢＩに対する潜在的な生化学的マーカーが数多く報告されているが、ＭＴＢＩとＴＢＩを識別してＴＢＩを診断することができる、または治療的投与の成功もしくは治療上の利点を示すことができる決定的なマーカーおよび方法は示されていない。個人が多臓器損傷も患っているのであれば、この欠点はより明らかである。脳損傷を効果的に治療することは一般に困難であり、良好な転帰は一般に、個人において特定の損傷サブタイプをいかに迅速に診断するかに左右される。したがって、患者管理を向上させ、治療評価を容易にするために、脳振盪後の頭蓋内病理を評価する診断能力を有するＴＢＩの高感度かつ特異的なマーカー（１つまたは複数）が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
損傷後にバイオマーカーの合成または産生が変化する、生物試料中の１つ以上のニューロン特異的バイオマーカー量の定量、および前記生物試料中の１つ以上のバイオマーカーの量の比率に基づく神経学的状態の検出を含めた、対象における神経学的状態を検出するための材料および工程を提供する。ニューロン特異的バイオマーカーは、任意にタンパク質、タンパク質分解産物、核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのようなオリゴヌクレオチド）またはそのいずれかに対する自己抗体である。任意に、複数のバイオマーカーの組合せを１つ以上の生物試料において測定する。バイオマーカーの具体例としては、タンパク質に対する自己抗体が挙げられ、前記タンパク質は：ＧＦＡＰ；タウ；Ｓ１００ベータ；ベータＩＩＩ−チューブリン；神経フィラメント軽、中、もしくは重ポリペプチド（ＮＦ−Ｌ、−Ｍおよび−Ｈ）；Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ；ガンマ−エノラーゼ（ＮＳＥ）；ビメンチン；エンドフィリン−Ａ１；微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ−２）；アルファ−インターネキシン；ニューロセルピン；ニューロモジュリン；シナプトタグミン−１；電位依存性カリウムチャネル；コラプシン応答媒介タンパク質（ＣＲＭＰ−１〜５）；αＩＩ−スペクトリン；ニューロファシン；ＭＢＰ；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼ；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）；これらの分解産物；これらの誘導体；またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、タンパク質の少なくとも一部分をコードしている核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドなどであり、タンパク質はＧＦＡＰ；αＩＩ−スペクトリン；αＩＩ−スペクトリン分解産物；ニューロファシン；ＭＢＰ；ＭＡＰ２；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼ；ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素；ニューロン局在細胞内タンパク質；ＭＡＰ−タウ；Ｃ−タウ；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）；コラプシン応答媒介タンパク質；これらの分解産物、これらの誘導体またはこれらの組合せである。バイオマーカーは任意にｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、任意に脳に多く含まれるか脳特異的である。ｍｉＲＮＡ任意に、タンパク質の発現を調節するｍｉＲＮＡの少なくとも一部分であり、タンパク質はＧＦＡＰ；αＩＩ−スペクトリン；αＩＩ−スペクトリン分解産物；ニューロファシン；ＭＢＰ；ＭＡＰ２；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼ；ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素；ニューロン局在細胞内タンパク質；ＭＡＰ−タウ；ｐ５３；ＳＹＴＬ１；カルパスタチン；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）；ＣＡＰＮ１、２もしくは６；ＩＲＳ−１；ＳＭＡＤ５；コラプシン応答媒介タンパク質；シナプトタグミン−１もしくは−９；Ｒｈｏキナーゼ；シナプシン１；シンタフィリン；ＡＴＸＮ１；これらの誘導体；またはこれらの組合せである。ｍｉＲＮＡは、任意に配列番号：５１〜１１３のうちの１つ、任意に配列番号：５１〜６０もしくは８４〜９３のうちの１つ、または任意にｍｉＲ−９、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−９２ｂ、ｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２４ｂ、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１５３、��ｉＲ−１８３、ｍｉＲ−２１９、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−２１８ａもしくはこれらの組合せである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ニューロンに局在するタンパク質の分解産物である。分解産物は任意に、ＧＢＤＰのようなＧＦＡＰの分解産物またはＴＢＤＰのようなタウの分解産物である。ＧＦＡＰ分解産物は、配列番号１１４のＡｓｎ５９、Ｔｈｒ３８３またはその両方での切断により任意に生成される。ＴＢＤＰは、それぞれ配列番号１１においてＣ末端からアミノ酸２５、４４、１２９、１５７、２２９、４２１までの切断またはその組合せにより任意に生成される。あるいはまたは加えて、ＴＢＤＰは、Ｃ末端からアミノ酸４３、１２０、２２０、３７０、４１２までの切断またはその組合せによるラットタウ（配列番号５）分解産物である。
【０００８】
測定された１つ以上のバイオマーカーの濃度を、任意に１つ以上のコントロール対象由来の同様の生物試料中のバイオマーカーレベルと比較して、濃度の比率を得る。比率は任意に、対象由来の生物試料中のバイオマーカーレベルがコントロール対象よりも高い場合に陽性であるか、または対象由来の生物試料中のバイオマーカーレベルがコントロール対象よりも低い場合に陰性である。
【０００９】
適切な生物試料がいずれも使用可能であることが理解される。具体例としては、血液、血漿、血清、ＣＳＦ、尿、唾液または組織が挙げられる。生物試料は、任意に無細胞血漿または無細胞血清である。
【００１０】
損傷は、任意に化合物により誘発される。具体例として、治療薬または創薬中であるような候補治療薬として化合物を対象に投与する。
【００１１】
この材料および工程は、１つ以上の状態、例えば脳損傷（例えば、外傷性脳損傷）、多臓器損傷、脳卒中、神経変性疾患またはこれらの組合せなどを検出、診断または測定するものである。
【００１２】
また生物試料中のバイオマーカーを検出および任意に定量するための検出試薬も提供する。検出試薬は、配列番号１１４の５９位または３８３位アミノ酸での切断部位から１０アミノ酸以内のＧＦＡＰの一部分またはそのバリアントと任意に結合する。検出試薬は、２５位、４４位、１２９位、１５７位、２２９位または４２１位での切断部位から１０アミノ酸以内でヒトタウ（配列番号１１）アミノ配列と任意に結合する。任意に、検出試薬は、配列番号１１またはそのバリアントのアミノ酸配列と、Ｃ末端〜Ｓｅｒ１２９の１０アミノ酸以内、Ｎ末端〜Ｖａｌ２２９の１０アミノ酸以内、Ｎ末端〜Ａｓｐ４２１の１０アミノ酸以内、Ｃ末端〜Ｌｙｓ４４の１０アミノ酸以内、Ｎ末端〜Ｓｅｒ１２９の１０アミノ酸以内で結合する。検出試薬は、配列番号２０もしくは１２３、２１もしくは１４３、２４もしくは１４４、２５もしくは１２０、２６もしくは１２１もしくは１４５、２７もしくは１４６もしくは１４７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは１４８、３９もしくは１４９、４０、４１、４２、４３または４４の少なくとも一部分であるアミノ酸配列と任意に結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、検出試薬は、配列番号５のアミノ酸配列またはそのバリアントと：４３位、１２１位、２２９位、３８位または４１２位アミノ酸での切断部位から１０アミノ酸以内で；任意に、Ｎ末端〜Ａｓｐ４２１の１０アミノ酸以内、Ｎ末端〜Ｖａｌ２２０の１０アミノ酸以内、Ｃ末端〜Ｓｅｒ１２０の１０アミノ酸以内、Ｃ末端〜Ｌｙｓ４３の１０アミノ酸以内またはＣ末端〜Ａｒｇ３７０の１０アミノ酸以内で結合する。検出試薬は、配列番号２０もしくは１２３、２１もしくは１４３、２２、２３、２４もしくは１４４、２５もしくは１２０、２６もしくは１２１もしくは１４５、２７もしくは１４６もしくは１４７、２８、２９、３８もしくは１４８、３９もしくは１４９、４０または４１の少なくとも一部分と任意に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】外傷性脳損傷および定量化後のラット組織におけるＧＦＡＰおよびＧＢＤＰのウエスタンブロットの図である。
【図２】外傷性脳損傷後のラットＣＳＦにおけるＧＦＡＰおよびＧＢＤＰのウエスタンブロットの図である。
【図３】ラットＣＣＩ試料および消化ヒト試料と比較したインビトロ消化脳ライセートのウエスタンブロットの図であり、ＧＢＤＰ（Ａ）およびＳＢＤＰ（Ｂ）のレベルを示している。
【図４】各種神経毒性傷害におけるＧＦＡＰからＧＢＤＰへのタンパク質分解の違いを示す図である。
【図５】カルパインによる組換えヒトＧＦＡＰの切断を示す図である。
【図６】ニューロンにおけるタウ切断によるＴＢＤＰ生成を表す模式図であり、出現順にそれぞれ配列番号１５０、１５１、１３７、１５２および１５３を開示している。
【図７】抗全タウ（Ａ）、抗タウＢＤＰ−４５Ｋ（Ｂ）および抗タウＢＤＰ−３５Ｋ（Ｃ）を用いたウエスタンブロットによりＴＢＤＰ特異的抗体を示す図である。
【図８】全タウ抗体（Ａ）；ラットＴＢＤＰ−３５Ｋ抗体（Ｂ）またはラットＴＢＤＰ−１３Ｋ特異的抗体（Ｃ）によりプローブしたヒトおよびラットタウの分解産物を示す図である。
【図９】各種薬剤で攻撃したラット大脳皮質培養物を示す図であり、（Ａ）は位相差顕微鏡法によるもの、また（ｂ）は、２４時間後の核の壊死に対するヨウ化プロピジウム標識および％アポトーシスの証拠としてヘキスト３３３４２染色した核ＤＮＡを用いて評価したものである。
【図１０】各種薬剤により攻撃し、タウおよびＴＢＤＰをプローブしたラット培養物を示す図である。
【図１１】ラット皮質（Ａ、Ｂ）または海馬（Ｃ、Ｄ）のＣＣＩ攻撃後のタウおよびＴＢＤＰを示す図である。
【図１２】実験的ＣＣＩ後のラット皮質におけるカルパイン−１特異的切断を示す図である。
【図１３】ＣＣＩ後のラット皮質におけるカルパイン−１およびカルパイン−２の活性化を示す図である。
【図１４】ウエスタンブロット法（Ａ）およびそのデンシトメトリー解析（Ｂ）により観察された、ＣＣＩ直後のＳＮＪ−１９４５インビボ投与によるタウ−ＢＤＰ３５Ｋのカルパイン特異性を示す図である。
【図１５】２例の患者（ＡおよびＢ）における、損傷後の各種時点でのＧＦＡＰおよびＧＢＤＰに関するヒトＣＳＦのウエスタンブロットの図である。
【図１６】死後のヒト脳タンパク質ライセートに見られた脳特異的タンパク質に対するヒト血清自己抗体の存在を示す図であり、（Ａ）はクーマシーブリリアントブルー染色により測定された総タンパク質負荷、（Ｂ）はコントロール血清でプローブしたウエスタンブロット、（Ｃ）はプールされたＴＢＩ後の患者血清でプローブしたウエスタンブロットである。
【図１７】ＴＢＩの７２時間後および３０日後のヒト対象の血清中における自己抗体の存在を示す図である。
【図１８】ＴＢＩ後５日以内に検出可能なヒト対象の血清中の自己抗体の存在を示す図であり、そのＩｇＧ特異性が（Ｂ）で確認される。
【図１９】ＴＢＩによる自己抗原が脳特異的であることを示す図である。
【図２０】ヒト血清中の自己抗体がラット脳のカルパイン特異的切断産物を認識することを示す図である。
【図２１】損傷の１０日後に採取したヒトＴＢＩ対象の血清中におけるＧＦＡＰ、ニューロファシンおよびＭＢＰに対する自己抗体の存在を示す図である。
【図２２】ＴＢＩの１０日後に採取したヒト対象の血清を用いて、クーマシーブルーで染色した（Ａ）およびウエスタンブロット法によりプローブしたヒト脳ライセートのイオン交換画分を示す図であり、オーバーラップしたバンドの配列決定により、自己抗体が表２に記載のＧＦＡＰおよびその他のタンパク質に対するものであることが示される。
【図２３】ＴＢＩ後のヒト血清中におけるＧＦＡＰに対する自己抗体の存在を示す抗原競合実験を示す図である。
【図２４】自己抗体がインタクトＧＦＡＰではなくカルパイン仲介によるＧＦＡＰ分解産物を優先的に認識することを示す図である。
【図２５】複数の調査グループにわたるヒトＴＢＩ患者の血清中における自己抗体の存在を示す図である。
【図２６】ヒト調査におけるＴＢＩ後の血清中の自己抗体レベルに関して、性別よび年齢による違いを示す図である。
【図２７】ＧＣＳスコアにより分析した、ＴＢＩ診断対象における自己抗体レベルの増加を示す図である。
【図２８】６ヶ月目における自己抗体と生存との相関を示す図である。
【図２９Ａ】血清ＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１レベルと自己抗体強度との間の相関を示す図であり、（Ａ）は散布図を示し、（Ｂ）は相関関係を示す。
【図２９Ｂ】血清ＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１レベルと自己抗体強度との間の相関を示す図であり、（Ａ）は散布図を示し、（Ｂ）は相関関係を示す。
【図３０】ＣＳＦのＧＦＡＰ、ＵＣＨＬ１およびＳＢＤＰ１４５と自己抗体強度との間の相関を示す図である。
【図３１】（Ａ）自己抗体強度を性別の関数として；（Ｂ）自己抗体強度を転帰の関数として；および（Ｃ）自己抗体強度と死亡率を性別の関数として示す図である。
【図３２】（Ａ）自己抗体強度を生存の関数として；ならびに自己抗体の強度および傾向を（Ｂ）雌および雄（Ｃ）の関数として示す図である。
【図３３】自己抗体強度をＧＣＳスコアの関数として示す図である。
【図３４】ニューロン損傷における神経細胞による核放出の模式図である。
【図３５】軽度および中等度の損傷度を有するＴＢＩヒト対象の血清中のＧＦＡＰ、ＵＣＨＬ１およびＳ１００βのレベルを示す図である。
【図３６】ｍｉＲＮＡクラスター解析の結果を示す図である。
【図３７】生物試料中の同定されたｍｉＲＮＡ数の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
脳組織またはＢＢＢの損傷は、細胞内分子、例えばタンパク質、分解タンパク質フラグメント、ＤＮＡおよびＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）などの脳脊髄液（ＣＳＦ）または血流中への放出を引き起こす。このような抗原の漏出は、それに対する自己抗体の形成を引き起こし得る。本発明は、生物試料中の本発明のニューロン特異的バイオマーカーの増加または減少の測定を利用し、したがって、異常な神経学的状態の診断および管理に有用である。特に本発明は、疾患に関連した損傷を含むニューロン損傷、具体例として外傷性脳損傷（ＴＢＩ）およびそのサブタイプを同定または分類するための診断法としてばかりでなく、対象が耐えてきた特定の脳損傷タイプに有効な潜在的な治療法の同定にも有用である。
【００１６】
この工程は、将来の疾患または損傷を予測するまたは示す神経学的外傷または状態を検出するのに有用である。具体例として、この工程は、創薬のためのインビボまたはインビトロの安全なまたは有効なスクリーニングプロトコールとして有用である。創薬は神経学的状態に対する薬物に限定されるわけではない。また本発明のバイオマーカーは、解析のためのリード化合物の選択手段として、または既に同定された薬剤候補の安全性の評価手段として、インビボ動物実験での予期されるまたは予期せぬ神経学的副作用を検出するのにも有用である。
【００１７】
本明細書で使用される「損傷」とは、単一のまたは連続的な事象、任意に複数の事象に起因する、細胞または分子の整合性、活性、レベル、ロバスト性、状態の変化またはその他の変化のことである。損傷の具体例としては、細胞的または分子的特徴の物理的、機械的、化学的、生物学的、機能的、感染的またはその他のモジュレーター的事象が挙げられる。損傷は、具体的例として、衝撃（例えば、打撃性のもの）のような物理的外傷、または血管の遮断もしくは漏出による脳卒中のような生物学的異常の結果である。典型的な衝撃損傷は外傷性脳損傷（ＴＢＩ）である。損傷は、任意に感染病原体による感染である。いくつかの実施形態では、損傷は化合物への曝露である。当業者は、損傷または事象という用語に包含される数多くの同等の損傷を認識する。
【００１８】
損傷は、任意に打撃性の衝撃のような物理的事象である。衝撃は、頭蓋構造が無傷のままであるかまたは頭蓋構造の破損を生じる頭部の強打などにより生じる打撃損傷と同類のものである。実験ではいくつかの衝撃方法が使用され、具体例として、ヒトでの重症ＴＢＩに相当する１．６ｍｍの陥没深度などでの制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）が挙げられる。この方法は、Ｄｉｘｏｎ，ＣＥら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１９９９；１６（２）：１０９−２２により詳細に記載されている。衝撃損傷を生じさせるその他の実験的方法も同様に使用可能であることが理解される。
【００１９】
ＴＢＩは脳卒中によっても生じ得る。げっ歯類における中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）により、虚血性脳卒中が任意にモデル化される。例えば、軽度のＭＣＡＯの後にＵＣＨＬ１タンパク質レベルが増加し、これが重度のＭＣＡＯ攻撃後にさらに増加する。軽度のＭＣＡＯ攻撃により、２時間以内に一過性のバイオマーカーレベルの増加を生じる場合があり、２４時間以内にコントロールレベルまで回復する。これに対し、重度のＭＣＡＯ攻撃では、損傷後２時間以内にバイオマーカーレベルの増加が生じるが、はるかに持続性があり、統計的に有意なレベルを７２時間以上に及んで示し得る。
【００２０】
１つの理論またはモデルに限定されるわけではないが、軽度外傷性脳損傷（ｍＴＢＩ）とＴＢＩの間の線引きの１つの提案は、損傷後の体液中の分子バイオマーカーの識別可能な増加または減少である。分子バイオマーカーの具体例としては、Ｋｏｂｅｉｓｓｙ  ＦＨら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００６；５：１８８７−１８９８に記載されているものが挙げられる。ＴＢＩの典型的な定義は、バイオマーカーレベルが少なくとも２倍増加または減少している少なくとも１つの識別可能なバイオマーカーの存在である。
【００２１】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」とは、生物学的活性または応答の測定に有用なタンパク質、核酸またはその他の識別物質のことである。ニューロン特異的バイオマーカーとは、ニューロンまたはグリアの構造、機能または活性に関連したバイオマーカーのことである。具体例として、タンパク質は抗体または生理的タンパク質の分解産物である。「核酸」または「オリゴヌクレオチド」は、本明細書では、２個以上のヌクレオチドからなる、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのような高分子と定義される。具体例として、本明細書で使用されるバイオマーカーは、ニューロン特異的またはニューロン中に多量に存在するバイオマーカーである、すなわち、バイオマーカーは、１つ以上のタイプのニューロン以外では、感知可能なレベルで通常見られない分子である。バイオマーカーの具体例としては：タンパク質、具体例として、特にＧＦＡＰ、αＩＩ−スペクトリン、ＵＣＨＬ１の１つ以上の分解産物；抗体；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ；またはＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質もしくはその有無、レベルまたは活性が神経学的損傷または疾患と相関するか、またはそれを予測させるその他の生体物質の１つ以上のフラグメントが挙げられる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは抗体、具体例として自己抗体である。自己抗体とは、対象または対象の組織もしくは細胞において通常見られる抗原を認識する、それと結合する、またはそれと相互作用する抗体のことである。抗原の具体例は、；αＩＩ−スペクトリン；ニューロファシン；ＭＢＰ；ＭＡＰ２；ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼ；ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素；ニューロン局在細胞内タンパク質；微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰ−タウ）；ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）；コラプシン応答媒介タンパク質（ＣＲＭＰ−１〜５）；これらの分解産物、本明細書の１つ以上の表または参考文献に記載されているその他の任意のバイオマーカーおよびこれらの組合せである。
【００２３】
あるいはまたは加えて、バイオマーカーはタンパク質の一部分であり、そのタンパク質は、ＧＦＡＰ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ユビキチンＣ末端加水分解酵素Ｌ１（ＵＣＨＬ１）、ニューロン核タンパク質（ＮｅｕＮ）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、可溶性細胞間接着分子−１（ｓＩＣＡＭ−１）、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、本明細書の１つ以上の表または参考文献に記載されているその他の任意のバイオマーカーおよびこれらの組合せである。具体例として、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）は主としてニューロン中に見られ；ＧＦＡＰはアストロサイト中に見られ；またＣＮＰａｓｅは中枢神経系のミエリン中に見られる。したがって、具体例として、バイオマーカーはタンパク質の分解産物（ＢＤＰ）である。分解産物を生成する数多くの方法が当該技術分野で公知である。具体例として、ニューロン特異的タンパク質のカルパインまたはカスパーゼによるタンパク質分解性切断により、そのタンパク質の１つ以上のＢＤＰが生成される。
【００２４】
バイオマーカーは、任意に核酸である。具体例として、核酸はオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。したがって、核酸バイオマーカーは任意に、ニューロンで発現されるタンパク質の少なくとも一部分をコードするＤＮＡまたはＲＮＡである。全身性狼瘡および関節リウマチの研究では、これらの疾患における血中のＤＮＡ量がかなり高いため、循環ＤＮＡが使用されてきた（Ｔａｎら，１９６６）。血中遊離ＤＮＡも癌に特異的なバイオマーカーとして提案されている（Ｌｅｏｎら，１９７７）。メチル化ＤＮＡ（Ｍｕｌｌｅｒら，２００３）および特定の変異を有する遊離ＤＮＡ（Ｓｉｌｖａら，１９９９）が血漿中に見られ、癌と関連付けられている。また母体の血漿および血清中に胎児ＤＮＡを見出すことも可能である（Ｌｏら，１９９７）。急性脳卒中の患者の血漿中に循環ＤＮＡが見出されている（Ｒａｉｎｅｒら，２００３）。したがって、ＤＮＡの循環レベルは疾患と相関し得る。本発明者らは、ニューロン損傷がニューロン起源の循環ＤＮＡのレベル増加を引き起こすことを発見した。ＣＳＦまたは血清中のＤＮＡレベル増加の測定は、ニューロン損傷および損傷重症度の指標となる。
【００２５】
ＲＮＡは血中で容易に分解されるため、疾患または損傷のマーカーとしては機能しないと考えられてきた。これは外部から加えられたＲＮＡの場合であり、外傷を患っている組織由来の内在性ＲＮＡは高い安定性を示すため、バイオマーカーとして有用であり得る。１つの特定の理論に限定されるわけではないが、内在性ＲＮＡはタンパク質と複合体を形成して、アポトーシス小体中に存在するときに分解から保護される可能性がある（Ｈａｓｓｅｌｍａｎら、２００１）。さらに、ＲＮＡは、損傷部位および疾患タイプの配列を容易に認識して、この配列を細胞タイプに特異的なＲＮＡ発現と関連付けることができるため、損傷部位および疾患タイプ対してより特異的であり得る。したがって、バイオマーカーは、任意にＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子としては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが挙げられる。
【００２６】
バイオマーカーは、任意にｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡの分解を介して転写後の遺伝子発現を調節し、タンパク質発現を減少させることができる非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡバイオマーカーは、１つ以上のニューロン特異的タンパク質、例えば本明細書の表およびその他に記載されている任意のタンパク質などをコードする遺伝子の発現を調節するｍｉＲＮＡである。
【００２７】
工程は、生物試料中の１つ以上のバイオマーカーの定量を含む。バイオマーカーは、絶対量、相対量または量を表す値、例えば、バックグラウンドまたはその他の比較物と比べた蛍光の増加または減少を決定するための、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載の任意の方法または工程により測定される。任意に、１つ以上の生物試料の１つ、２つ、３つ、４つ以上のバイオマーカーを同時にまたは順番に測定する。第二のまたは追加のバイオマーカーは、任意に第一のバイオマーカーと異なる。
【００２８】
具体例としてバイオマーカーは、タンパク質の分解産物である、タンパク質もしくはその一部分と結合する、タンパク質もしくはその一部分をコードする、またはタンパク質の発現を調節し、ここではタンパク質は：ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１（ＵＣＨＬ１）；ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）；スペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）、具体例としてＳＢＤＰ１５０、ＳＢＤＰ１５０ｉ、ＳＢＤＰ１４５もしくはＳＢＤＰ１２０；Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ（Ｓ１００β）；微小管関連タンパク質（ＭＡＰ）、任意にＭＡＰ２、ＭＡＰ１、ＭＡＰ３、ＭＡＰ４、ＭＡＰ５；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；タウ、具体例としてＭＡＰ−タウまたはタウＢＤＰ；神経フィラメントタンパク質（ＮＦ）；カンナビノイド受容体（ＣＢ）；ＣＡＭタンパク質；シナプスタンパク質；コラプシン応答媒介タンパク質（ＣＲＭＰ−１〜５）；誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）；ニューロン核タンパク質（ＮｅｕＮ）；システイニル−特異的ペプチダーゼ（ＣＳＰアーゼ）；ニューロセルピン；アルファ−インターネキシン；軽鎖３タンパク質（ＬＣ３）；ニューロファシン；グルタミン酸トランスポーター（ＥＡＡＴ）；ネスチン；コルチン−１，２’，３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ）；βＩＩＩ−チューブリン、または本明細書の表１またはその他の表に記載されている任意のバイオマーカー、またはこれらの組合せである。
【００２９】
【表１】
0005909447.tif 000002
0005909447.tif 000003
【００３０】
バイオマーカーは、任意にＧＦＡＰまたはタウの分解産物である。ヒトＧＦＡＰのアミノ酸配列は、アイソフォーム１および２がそれぞれＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００２０４６およびＮＰ＿００１１２４４９１で見られる。ヒトタウのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００５９０１およびＮＰ＿７７６０８８で見られる。ラットタウのアミノ酸配列は、３７４アミノ酸型がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０５８９０８で見られる。各上記アクセッション番号およびその他のアクセッション番号で見られる配列は、各配列が完全かつ明確に記載された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
バイオマーカーは任意に、損傷または事象の間または後に発現増加または発現減少を示す任意のタンパク質もしくはその一部分、核酸または抗体である。発現は、発現増加がバイオマーカーの合成増加である合成として認識される。任意に、合成はプロテアーゼ、例えばカルパインまたはカスパーゼがタンパク質を切断して分解産物が合成または生成される、切断産物の生成である。具体例として、ニューロン損傷がカルパインまたはカスパーゼを活性化し、次いでこれがＧＦＡＰを酵素的に切断して、１つ以上のＧＢＤＰが生成され得る。したがって、ＧＢＤＰは損傷または事象の間または後に生成、すなわち合成されるものと理解される。同様に、自己抗体は損傷または事象の間または後に経時的に生成される。したがって、自己抗体は合成されるものと理解される。核酸は通常、細胞内で全く発現されないか、または特定のレベルで発現される。損傷または事象は、ｍｉＲＮＡのようなＲＮＡがゲノムＤＮＡから翻訳される速度を変化させ得る。したがって、核酸は、損傷または事象の間または後の合成の増加または減少のいずれかを示すことが理解される。
【００３２】
任意の数、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上などのバイオマーカーを検出または測定し得る。検出は、同時的または連続的のいずれかであり得、また同じ生物試料に由来するか、または同じもしくは異なる対象由来の複数の試料に由来し得る。複数のバイオマーカーの検出は、任意に同じアッセイチャンバ内である。本発明の工程は任意に、第一のバイオマーカーの量および少なくとも１つの追加の向神経活性バイオマーカーを、第一のバイオマーカーの量および少なくとも１つの追加の向神経活性バイオマーカーそれぞれの正常なレベルと比較して、対象の神経学的状態を判定することをさらに含む。
【００３３】
本発明は、任意にＵＣＨＬ１またはＧＦＡＰに関して記載される。これらのバイオマーカーが単に例示目的で示されるものであり、本発明の範囲がＵＣＨＬ１またはＧＦＡＰに限定されることを特に示すことなどを意図しないことが理解される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーはＧＦＡＰ（ＧＢＤＰ）の分解産物である。ＧＦＡＰは、アストロサイトのようなグリア細胞と関連する。バイオマーカーは、任意に１つ以上のＧＢＤＰである。ＧＤＢＰは任意に、泳動による分子量が３８〜５２ｋＤａの間である。ＧＤＢＰは、任意にＧＦＡＰのタンパク質消化の産物である。プロテアーゼの具体例としては、カルパインおよびカスパーゼが挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、オリゴヌクレオチドのような核酸である。オリゴヌクレオチドとはＤＮＡまたはＲＮＡ分子のことである。ＲＮＡ分子の好適な例は、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ分子である。
【００３６】
歴史的には、ＲＮＡ分子は血漿中での半減期が短いと考えられていた。ごく最近では、ＲＮＡ分子が血漿中でタンパク質または脂質小胞により保護されている可能性があることが研究により示されている。したがって、本発明の工程では、損傷の後または間に放出されるＲＮＡ分子を、例えば、全血、血漿、血清、ＣＳＦまたはその他の生体物質中で検出し、損傷の存在と関連付けることができる。生物試料からＲＮＡを単離するための数多くの方法が当該技術分野で公知である。具体例として、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｌ−Ｈｅｆｎａｗａｙ，Ｔら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．，２００４；５０（３）；５６４−５７３に記載されている方法が本発明において使用可能である。任意に、生物試料を核酸の検出または測定前にろ過する。ろ過により余分な細胞物質が除去されて、バイオマーカー核酸のより正確な測定が行われる。生物試料のろ過方法は、具体例として、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＲａｉｎｅｒ，ＴＨ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００４；５０：２０６−２０８に記載されているように、当該技術分野で公知である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＵＣＨＬ１またはＧＦＡＰの発現をコードまたは調節するＲＮＡを検出または測定する。ヒトＵＣＨＬ１のＲＮＡまたはそれに由来するｃＤＮＡは既知の配列であり、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＮＭ＿００４１８１に見ることができる。その他のＴＢＩに関連したＲＮＡ配列、例えば本明細書の表に記載されているタンパク質をコードする配列なども同様にＮＣＢＩデータベースにおいて見出し得ることは、当業者に公知である。さらなる例として、ＧＦＡＰのｍＲＮＡ配列が、ＧＦＡＰの２つのアイソフォームに関してアクセッション番号ＮＭ＿００１１３１０１９．１およびＮＭ＿００２０５５．３で見られる。
【００３８】
核酸を検出または測定する典型的な方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法、具体例として、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。核酸は、ＰＣＲに基づかない方法論、具体例として、質量分析法、蛍光、染色、その他の当該技術分野で公知の方法を用いて測定し得る。任意にマイクロアレイを用いて、試料中の１つまたは多数の核酸バイオマーカーのレベルを検出または測定する。核酸の検出および測定のためのマイクロアレイの作製および使用は、当該技術分野で公知である。またプライマーおよびプローブ設計も当該技術分野の技術レベルの範囲内である。任意の適当なプライマーおよびプローブならびにそれへの標識が、本発明における核酸バイオマーカーの検出に使用可能である。具体例として、商業的供給源から入手可能な自動プログラムを用いて、プライマーおよびプローブ設計を行い得る。あるいは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含めた数多くの商業的供給者がプライマーおよびプローブ設計のサービスを提供している。
【００３９】
神経学的状態を検出する工程は、神経学的状態を有することが疑われ得る対象から生物試料を採取すること；試料中のニューロン特異的バイオマーカーを定量すること；検出されたバイオマーカーのレベルを、神経学的状態を有さない対象由来の同じまたは異なるバイオマーカーのレベルと比較して比率を得ること；およびその比率に基づき、対象における神経学的状態の有無を診断または検出することを任意に含む。
【００４０】
任意に、工程は複数のバイオマーカーの存在に関して生物試料を分析することを含む。複数は１を超える任意の数であり得る。任意に２つのバイオマーカーを分析する。具体例として、バイオマーカーはＵＣＨＬ１およびＧＦＡＰに関連したバイオマーカーである。具体例として３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、１０００個またはその間のもしくはそれを超える任意の数を含めたさらに多くのバイオマーカーを、本発明の工程において同時にまたは順番にアッセイし得る。
【００４１】
バイオマーカーの検出および定量化の方法の具体例としては、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が挙げられる。ＲＴ−ＰＣＲでは、同時に複数のバイオマーカーに対して増幅および定量化を同時に行うことが可能である。あるいは、飛行時間型検出および高速液体クロマトグラフィーと組合せたエレクトロスプレーイオン化質量分析のような質量分析法も同様に使用可能である。当業者により理解されるように、その他の方法も同様に検出に使用可能であることが理解される。
【００４２】
本発明において、数多くのｍｉＲＮＡ分子がバイオマーカーとして使用可能である。「ｍｉＲＮＡ」という用語は、それ本来の普通の意味に従って使用され、真核生物において見られる、ＲＮＡによる遺伝子調節に関与するマイクロＲＮＡ分子を指す。例としては、表１に記載されている１つ以上のタンパク質の発現を調節するｍｉＲＮＡ分子が挙げられる。いくつかのｍｉＲＮＡ分子が同定されており、本発明においてバイオマーカーとして使用可能である。具体例として、Ｒｅｄｅｌｌ，ＪＢら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２００９；８７：１４３５−４８；Ｌｅｉ，Ｐ．ら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｒａｉｎｒｅｓ．２００９．０５．０７４；Ｌｕ，Ｎら，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２００９；ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｎｅｕｒｏｌ．２００９．０６．０１５；およびＪｅｙａｓｅｅｌａｎ，Ｋら，Ｓｔｒｏｋｅ，２００８；３９：９５９−９６６に記載されているｍｉＲＮＡ分子があり、上記各参考文献は、そこで定義されているｍｉＲＮＡのみならず、特に各参考文献に記載されているｍｉＲＮＡの単離および定量化の方法に関しても、その内容が参照により本明細書に組み込まれる。このような方法またはその改変物は、当業者により認識されており、かつ本発明の方法において使用し得る。
【００４３】
神経学的状態を判定する工程は、生物試料中の１つ以上の抗体の検出または測定を任意に含む。抗体は、任意に自己抗体である。自己抗体は、ＴＢＩ、疾患、損傷またはその他の異常のような神経学的外傷の部位から放出される抗原に対するものである。特定の理論に限定されるわけではないが、ＴＢＩは、細胞内または細胞膜の内容物をＣＳＦまたは血流中に放出する細胞損傷を引き起こす。本明細書の表１およびその他の表に記載されているような多くのタンパク質、またはタンパク質をコードするもしくはその発現を調節する核酸のレベルは、通常は、脳組織のような神経組織の細胞質または細胞膜以外である体液中には存在しない。こうした抗原の存在は、対象内でその抗原に対する自己抗体産生を引き起こす。任意にバイオマーカーとしての自己抗体の検出を用いて、対象における異常な神経学的状態の存在を診断する。
【００４４】
米国特許第６，０１０，８５４号には、抗原の作製法およびニューロンのグルタミン酸受容体に対する自己抗体のスクリーニング法が記載されている。これらの方法も同様に本発明に適用可能である。したがって、自己抗体のスクリーニングに使用可能なスクリーニング抗原の作製法の教示に関して、米国特許第６，０１０，８５４号が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６，０１０，８５４は、同様に自己抗体の検出法の教示に関して参照により本明細書に組み込まれる。具体例としてＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、質量分析法、クロマトグラフィー、染色およびその他の当該技術分野で公知の方法を含めたその他の抗体検出法が同様に使用可能であることが理解される。
【００４５】
いくつかの抗体が神経学的状態の発症後に自己抗体を産生させるということが見出されている。このような抗原は、表２に具体例として記載されている抗原である。
【００４６】
【表２】
0005909447.tif 000004
【００４７】
さらに、上記抗原のうちのいくつかおよびその他の抗原が脳損傷と関連する。脳損傷に関連する自己抗原の特定の具体例を表３に記載する。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
【表４】
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【００５０】
いくつかの実施形態では、表１〜４に記載されている任意のタンパク質のような完全長タンパク質またはその分解産物が、自己抗体のスクリーニング抗原として使用可能である。例えば、ＵＣＨＬ１は抗原性であり、対象において自己抗体を産生させる。ヒトＵＣＨＬ１タンパク質の配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４１７２．２で見られる。同様に、ヒトＧＦＡＰはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２０４６．１で見られる。その他の例示的な抗原の具体例としては、αＩＩ−スペクトリンもしくはその分解産物、ＭＡＰ、タウ、ニューロファシン、ＣＲＭＰ−２、ＭＡＰ２粗試料、ＭＢＰおよびヒト脳ライセートまたはこれらの任意の亜分画が挙げられる。
【００５１】
表１〜４のペプチドおよびタンパク質を作製する任意の適当な方法が本明細書で使用可能である。具体例として、精製タグと共にまたはそれなしで用いるクローニングおよびタンパク質発現系を任意に使用する。抗原性ペプチドの作製法の具体例としては、当該技術分野で公知の方法による合成ペプチドの合成が挙げられる。ペプチド合成の化学的方法は当該技術分野で公知であり、固相ペプチド合成および液相ペプチド合成、またはＨａｃｋｅｎｇ，ＴＭら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１９９７；９４（１５）：７８４５−５０の方法によるものが挙げられ、上記文献はその内容が参照により本明細書に組み込まれる。いずれの方法も自己抗体の存在に関する生物試料のスクリーニングに使用可能な抗原作製に使用可能である。
【００５２】
本明細書で使用される「ペプチド」は、任意の長さのペプチドを意味し、タンパク質を包含する。「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は、特定のサイズが別途記述されない限り、本明細書では特定の意図されたサイズに全く限定されずに使用される。
【００５３】
ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡおよび自己抗体のようなバイオマーカーのパターンがニューロン異常の部位および重症度の特定に使用可能であることが理解される。具体例として、脳への損傷により、中枢神経系の他の部位への損傷とは異なる複数のバイオマーカーのパターンが示される。また、海馬への損傷も前頭葉への損傷とは異なるバイオマーカーのパターンを生じる。したがって、複数のバイオマーカーの比較検出により損傷の位置特定が行われる。例えば、ＴＢＩに応答して細胞内のｍｉＲＮＡレベルが特定のパターンに変化する（Ｒｅｄｅｌｌ，Ｊら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２００９；８７：１４３５−１４４８を参照されたい）。驚くべきことに本発明者らは、表１のタンパク質の発現を調節するｍｉＲＮＡバイオマーカーのレベルが同様に、損傷の重症度または損傷後の時間に応じて上方制御または下方制御のいずれかにより変化することを発見した。ｍｉＲＮＡおよびその他のバイオマーカーのパターンは、損傷または疾患の進行に伴って変化する。これは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはタンパク質の放出を変化させる二次的損傷事象、細胞アポトーシスの遅延またはその他の機序の結果であり得る。参照により本明細書に組み込まれる上記Ｒｅｄｅｌｌ，Ｊは、３時間および２４時間で細胞内のｍｉＲＮＡバイオマーカーが変化することを例証している。ｍｉＲＮＡは、３時間で上方制御される場合もあれば、２４時間でようやく上方制御される場合もある。同様の結果がｍｉＲＮＡの下方制御で観察される。したがって、Ｒｅｄｅｌｌ，Ｊ，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，２００９；８７：１４３５−１４４８のｍｉＲＮＡバイオマーカーの調節、その検出方法および一時的な発現変化が等しく本発明に適用可能であるものとして、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。同様に、Ｊｅｙａｓｅｅｌａｎ，Ｋら，Ｓｔｒｏｋｅ，２００８；３９：９５９−９６６により観察された脳卒中に応答したｍｉＲＮＡ発現の一時性も、そこで教示される特定のｍｉＲＮＡならびにそこで教示される単離、定量化および検出方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる。これまで研究者により理解も考慮もされなかったことは、損傷後に核酸およびタンパク質が血液またはＣＳＦ中に移動するということである。バイオマーカー、特にＲＮＡのレベルは、細胞の核またはおそらく細胞質に局在したままであると考えられていた。血液（またはその画分）またはＣＳＦのような非細胞性生物試料中の上記バイオマーカーのレベルを検出する本発明者らの能力により、対象における神経学的状態または神経学的状態の危険性を判定するためのはるかに堅固かつ簡便な検出工程がもたらされた。
【００５４】
したがって、いくつかの実施形態では、生物試料を第一および第二のバイオマーカーに関してスクリーニングする。これより数が多くても同様に使用可能である。ＧＦＡＰバイオマーカーが好適な第一のバイオマーカーである。ＧＦＡＰはアストロサイトのようなグリア細胞に関連するため、他のバイオマーカーは、神経機能と関連した異なる細胞タイプの健常性に関連していることが好ましい。より好ましくは、他の細胞タイプは軸索、ニューロンまたは樹状突起である。グリア細胞および少なくとも１つの他のタイプの神経細胞に関連するバイオマーカーを含む本発明のアッセイの使用においては、ストレスを加えられたまたは殺された神経細胞タイプおよび神経学的状態の定量化が得られる。任意に少なくとも１つの追加のバイオマーカーと共に行うＧＦＡＰバイオマーカーの共同的測定、ならびにＧＦＡＰバイオマーカーおよび追加のバイオマーカーの量とマーカーの正常レベルとの比較により、対象の神経学的状態の判定が得られる。ＧＦＡＰバイオマーカーと共に測定された場合に対象の神経学的状態の優れた評価が得られる特定のバイオマーカーレベルの具体例としては、ＳＢＤＰ１４５（カルパイン仲介による急性の神経壊死）、ＳＢＤＰ１２０（カスパーゼ仲介による神経アポトーシスの遅延）、ＵＣＨＬ１（神経細胞体損傷マーカー）およびＭＡＰ２が挙げられる。
【００５５】
本発明のバイオマーカーに関連する特定のタンパク質の性質により、損傷の程度、位置および重症度の確実な判定が可能となる。本発明のバイオマーカーに関連するタンパク質の生体での位置を表５に示す。例えばペリフェリンに対する自己抗体またはＲＮＡの増加は、ＵＣＨＬ１に対する自己抗体またはＲＮＡの増加とは異なる異常であることが理解される。
【００５６】
【表５】
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【００５７】
また本発明のバイオマーカーの検出は、潜在的な薬剤候補のスクリーニングまたは既に同定されている薬剤候補の安全性の解析にも使用可能である。このようなアッセイはインビトロまたはインビボのいずれであってもよい。インビボでのスクリーニングまたはアッセイプロトコールの具体例としては、マウス、ラットまたはヒトを具体例として含めた動物におけるバイオマーカーの測定が挙げられる。ＵＣＨＬ１またはＧＦＡＰバイオマーカーなどのレベルを決定またはモニターするための研究を、行動解析または運動障害解析、例えば：具体例としてロータロッド、ビーム歩行試験、歩行運動解析、グリッド試験、ぶら下がり試験およびストリングテスト（ｓｔｒｉｎｇ  ｔｅｓｔ）を含めた運動協調性試験；具体例としてオープンフィールド試験での自発的歩行活動の検出を含めた鎮静試験；異痛症の感受性試験―冷浴試験、３８℃でのホットプレート試験およびＶｏｎ  Ｆｒｅｙ試験；痛覚過敏感受性試験―５２℃でのホットプレート試験およびＲａｎｄａｌｌ−Ｓｅｌｌｉｔｏ試験；ならびに感覚および運動神経伝導、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）およびｈ波反射のようなＥＭＧ評価などと任意に組み合わせる。
【００５８】
本発明のバイオマーカー解析は、具体例として、病的状態の検出、診断もしくは治療または疾患を治療するための化学物質もしくはその他の治療剤のスクリーニングに使用可能である。疾患または状態の具体例としては：神経変性疾患；多発性硬化症のようなミエリン関連疾患；脳卒中；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；化学療法；癌；パーキンソン病；尺骨神経炎および手根管症候群症候群のような化学的または物理的異常に起因する神経伝導異常；具体例として坐骨神経挫滅（外傷性神経障害）、ストレプトゾトジン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｚｉｎ）（ＳＴＺ）（糖尿病性神経障害）および抗有糸分裂誘導性神経障害（化学療法誘導性神経障害）を含めたその他の末梢神経傷害；実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）；遅延型過敏性（ＤＴＨ）；関節リウマチ；癲癇；疼痛；神経障害性疼痛；および子宮内外傷が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
対象に対する爆風損傷の解析により、バイオマーカーとニューロン損傷間の本発明の相関がいくつか明らかになる。ニューロン損傷は任意に、全身爆風の結果、身体の特定部分への爆破衝撃、または検出可能なもしくは識別可能なバイオマーカーレベルを生じるその他のニューロン外傷もしくは疾患の結果である。したがって、再現可能な実験モデルにおける一次爆風脳損傷（ＢＢＩ）の発症経路の同定は、重症、中等度および軽度（ｍＴＢＩ）を外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）と区別するための診断アルゴリズムの開発に役立つ。したがって、爆風衝撃の機構を研究するために数多くの実験動物モデルが導入されており、げっ歯類およびヒツジのような大型動物がこれに含まれる。しかし、異なる研究で使用された爆風発生装置がかなり汎用的であるため、脳損傷機序および推定バイオマーカーに関するデータを解析および比較することは困難である。
【００６０】
神経学的状態とバイオマーカー測定量の間の関連付けを行うために、具体例として、ＣＳＦまたは血清試料を対象から採取してバイオマーカーの測定に供する。試料は、任意に生物試料である。次いで任意に、検出されたＧＦＡＰバイオマーカーレベルを、ＣＴスキャンの結果およびＧＣＳスコアリングと関連付ける。この結果に基づき、本発明のアッセイを開発し有効性を確認する（Ｌｅｅら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：３１２−３２８、２００６）。ＧＦＡＰバイオマーカーが、ＣＳＦおよび血清から採取されることに加えて、血液、血漿、唾液、尿だけでなく固体組織の生検からも容易に採取されることが理解される。神経系と直接接触していることから、ＣＳＦが一般的に使用されるサンプリング液であるが、他の目的には他の体液をサンプリングすることが有利であり、したがって、単一の試料、例えば血液、血漿、血清、唾液または尿などで行う一連の試験の一部として本発明の神経学的状態の判定がこれにより可能となることが理解される。
【００６１】
生物試料は、従来の技術により対象から採取される。例えば、ＣＳＦは腰椎穿刺により採取される。任意に、血液は静脈穿刺により採取され、血漿および血清は既知の方法に従って全血を分画することにより採取される。ＣＳＦは任意に、カニューレ挿入法またはその他の技術により採取されることが理解される。血液は任意に、他の技術、具体例として心臓穿刺により採取される。固体組織試料を採取するための外科技術が当該技術分野で公知である。例えば、神経系組織試料を採取するための方法が、標準的な神経外科学テキスト、例えばＡｔｌａｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ：Ｆ．ＭｅｙｅｒによるＢａｓｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｃｒａｎｉａｌ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９９；Ｄａｖｉｄ  Ｇ．Ｔ．ＴｈｏｍａｓによるＳｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ，第１版，ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，１９９３；ならびにＣｒａｎｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ：Ｌ．Ｎ．ＳｅｋｈａｒおよびＥ．Ｄｅ  ＯｌｉｖｅｉｒａによるＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１版，Ｔｈｉｅｍｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９などに記載されている。また脳組織の採取および解析のための方法も、Ｂｅｌａｙら，Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８：１６７３−１６７８（２００１）；およびＳｅｉｊｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３８９２−３８９５（２０００）に記載されている。
【００６２】
任意に、バイオマーカーは脳損傷などのような神経学的状態の検出または診断に対して選択的である。バイオマーカーは任意に、ＴＢＩのレベルの検出および識別に特異的かつ効率的である。このようなバイオマーカーは任意に、神経特異的または向神経活性バイオマーカーと呼ばれる。
【００６３】
バイオマーカーの存在または活性の一時性は、ＴＢＩサブタイプの指標または識別物として使用可能である。非限定的な例では、実験的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）はＣＳＦ中のＵＣＨＬ１バイオマーカーの一時的な維持と相関する。３０分間のＭＣＡＯにより、６時間でピークに達して急速に減少する一過性のＵＣＨＬ１バイオマーカーレベルが生じるのに対し、２時間のＭＣＡＯでは、３日間にもわたるＵＣＨＬ１バイオマーカーレベルの維持が生じる。同様に、損傷後の各種時点でのその他のバイオマーカーの出現率は、ＴＢＩサブタイプを区別するために使用可能である。ＧＢＤＰは、損傷後２４時間以内に、打撃性の爆風損傷後のヒトＣＳＦを含めた生物試料中に現れ、損傷後７日間にもわたって強度が増加する。同様の結果がＳＢＤＰ１５０／１４５のようなＳＢＤＰで見られる。自己抗体は一般に、損傷後５日以内に見られ、損傷後３０日まで量が増加する。
【００６４】
バイオマーカー解析は、任意に生物試料または体液を用いて行う。本明細書で使用可能な例示的生物試料の具体例としては、細胞、組織、脳脊髄液（ＣＳＦ）、人工ＣＳＦ、全血、血清、血漿、細胞質液、尿、糞便、胃液、消化液、唾液、鼻もしくはその他の気道液、腟液、精液、緩衝生理食塩水、生理食塩水、水または当該技術分野で認識されているその他の体液が挙げられる。いくつかの実施形態では、生物試料はＣＳＦまたは血清である。対象の神経学的状態を明らかにするために、２つ以上の別々の生物試料を任意にアッセイすることが理解される。任意に、生物試料は細胞でも細胞質物質でも核質物質でもない。
【００６５】
細胞での発現の増加に加え、バイオマーカーは、損傷細胞とコミュニケートしている体液中にも現れる。対象からの体液、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿、血清、唾液および尿などの採取は通常、固体組織の生検試料採取よりも侵襲性および外傷性がかなり低い。特にＣＳＦは、神経系と直接接触し、容易に採取可能であることから、対象における神経損傷の検出に広く使用されている。血清は、容易に採取可能で、提供対象に対する損傷または副作用の危険性がかなり低いため、広く用いられている生物試料である。
【００６６】
神経学的状態とバイオマーカーの測定量の間の相関関係を得るために、本発明のいくつかの実施形態では、具体例として対象からＣＳＦまたは血清の試料を採取し、試料をＧＦＡＰ関連核酸、ＧＢＤＰまたはＧＦＡＰ関連自己抗体の測定に供する。対象によって神経学的状態が異なる。次いで、検出されたバイオマーカーレベルを任意にＣＴスキャンの結果またはＧＣＳスコアリングと関連付ける。これらの結果に基づき、本発明のアッセイを開発し有効性を確認する（Ｌｅｅら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：３１２−３２８，２００６）。バイオマーカーが、ＣＳＦおよび血清から採取されることに加えて、血液，血漿，唾液，尿のみならず固体組織の生検からも容易に採取されることが理解される。ＣＳＦが神経系と直接接していることから、本発明の多くの実施形態ではＣＳＦがサンプリング液となるが、他の目的には他の体液をサンプリングすることが有利であり、したがって、単一の試料、例えば血液、血漿、血清、唾液または尿などで行う一連の試験の一部として本発明の神経学的状態の判定がこれにより可能となることが理解される。
【００６７】
傷害後、対象の神経細胞は、傷害を受けなかった細胞に比べて変化した１つ以上のタンパク質または核酸分子のレベルまたは活性を発現する。したがって、神経細胞を含有する試料、例えば、中枢神経系または末梢神経系組織の生検は、本発明のいくつかの実施形態における使用に適した生物試料である。しかし、神経細胞に加え、具体例としてＧＦＡＰを発現する他の細胞としては、例えば、心筋細胞、骨格筋中の筋細胞、肝細胞、腎細胞および精巣中の細胞が挙げられる。上記細胞または上記細胞から分泌される液体を含めた生物試料は、上記非神経細胞に対する損傷の判定および／または特徴付けへの本発明の方法の適用にも使用し得る。
【００６８】
対象の具体例としては、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ヒト、ラット、モルモット、ハムスターおよびマウスが挙げられる。本発明は任意にヒト対象と関連するため、本発明の方法の対象は、任意にヒトである。
【００６９】
本発明から最も恩恵を受ける対象は、異常な神経学的状態を有することが疑われるまたはその発症の危険性のある対象、例えば、外傷性傷害（例えば、銃創、自動車事故、スポーツ事故、揺さぶられ症候群、その他の打撃損傷）により引き起こされる脳損傷、虚血事象（例えば、脳卒中、脳出血、心停止）、神経変性障害（例えばアルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病；プリオン関連疾患；その他の形態の認知症など）、癲癇、薬物乱用（例えば、アンフェタミン、エクスタシー／ＭＤＭＡまたはエタノールによる）ならびに糖尿病性神経障害、化学療法誘導性神経障害および神経障害性疼痛のような末梢神経系病態などの傷病者である。
【００７０】
バイオマーカーのベースラインレベルは、既知の神経学的状態を有さない所望の対象種の標的生物試料において得られるレベルである。これらのレベルは粗濃度で表す必要はなく、代わりに、並行したコントロール実験から識別され、蛍光単位、密度単位などで表し得る。通常、神経学的状態がなければ、ＧＢＤＰが生物試料中にごく微量に存在する。具体例として、ＧＦＡＰまたはＧＢＤＰに対する自己抗体は、神経学的状態を有することが疑われない対象由来の生物試料中には存在しない。しかし、ＧＦＡＰおよびＧＢＤＰは、ニューロン中に非常に多く存在することが多い。例えば特定の種のニューロン、血漿またはＣＳＦ中のＧＦＡＰ、ＧＢＤＰ、自己抗体およびＲＮＡのベースラインレベルの決定は、当該分野の技術の範囲内である。同様に、その他のバイオマーカーのベースラインレベルの濃度の決定は、当該分野の技術の範囲内である。
【００７１】
本明細書で使用される「診断すること」という用語は、神経学的またはその他の状態、例えば損傷または疾患などの有無を識別することを意味する。診断することは任意に、特定の比率またはレベルのバイオマーカーが検出されるかまたは存在しないアッセイの結果を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「比率」は、標的バイオマーカーのレベルが、第二の試料中の標的バイオマーカーよりも、または同じ標的バイオマーカーの既知のもしくは認められているベースラインレベルよりも高い陽性の比率である。陰性の比率は、標的バイオマーカーのレベルが、第二の試料中の標的バイオマーカーよりも、または同じ標的バイオマーカーの既知のもしくは認められているベースラインレベルよりも低いことを表す。中立な比率は、標的バイオマーカーの変化が観察されないことを表す。したがって、生物試料中で測定されたバイオマーカーの量を、任意にコントロール対象のレベルと比較して、対象におけるレベルが変化したか否かを判定する。したがって、バイオマーカー量の変化は、コントロール対象において測定または予測される値からの体液中のバイオマーカーレベルの変化である。コントロール対象とは、既知の神経学的損傷または疾患を有さない対象のことである。
【００７３】
本明細書で使用される用語「投与すること」とは、対象への治療剤の送達のことである。治療剤は、特定の対象に適切であると当業者により判断される経路により投与する。例えば、治療剤を経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に、筋肉内注射により、腹腔内注射により、腫瘍内に、吸入によりまたは経皮的に）投与する。必要な治療剤の正確な量は、対象の年齢、体重および全般的状態、治療される神経学的状態の重症度、使用される特定の治療剤、その投与様式などに応じて、対象ごとに異なる。適切な量は、必要以上の実験を行うことなく、本明細書の教示または当該技術分野の知識により示される日常的な実験のみを用いて当業者により決定され得る。
【００７４】
生物試料中の１つ以上の向神経活性バイオマーカーの有無を検出する典型的な工程は、ヒトのような対象から生物試料を採取すること、解析されるバイオマーカーの検出が可能な化合物または薬剤（具体例として、プライマー、プローブ、抗体、アプタマーまたは自己抗体バイオマーカー検出などの場合は抗原を含む）と生物試料を接触させること、および洗浄後の化合物または薬剤と試料との結合を解析することを含む。化合物または薬剤と特異的に結合した試料は、解析されるマーカーを発現する。その他の検出方法、具体例として、タンパク質または核酸に特異的な染色物質との接触が同様に使用可能であることが理解される。
【００７５】
本発明の工程を用いて、インビトロだけでなくインビボの生物試料中のバイオマーカーも検出し得る。試料中のバイオマーカーを適当なコントロール、例えば検出可能なレベルの解析されるマーカーを発現することが既知である第一の試料（陽性コントロール）および検出可能なレベルの解析されるマーカーを発現しないことが既知である第二の試料（陰性コントロール）などと比較する。例えば、マーカー検出のためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法、放射測定法、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、免疫沈降、免疫蛍光法、質量分析法、ＲＴ−ＰＣＲ、ＰＣＲ、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、酵素活性アッセイ、細胞アッセイ、陽電子放射断層撮影、質量分光測定法、これらの組合せまたは当該技術分野で公知のその他の技術が挙げられる。さらに、マーカー検出のためのインビボ技術としては、マーカーと特異的に結合する標識された薬剤を生物試料または対象内に導入することが挙げられる。例えば、生物試料または試験対象中での存在または局在が標準的な画像法により検出可能な放射性マーカーで薬剤を標識し得る。
【００７６】
バイオマーカーと特異的に結合することができる、またはバイオマーカーを認識するために使用され得る任意の適当な分子が本発明で使用可能である。自己抗体を検出するための薬剤の具体例は、自己抗体または解析されるバイオマーカーと結合可能な抗体と結合することができる抗原である。任意に、抗体と検出可能な標識とをコンジュゲートする。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。またインタクト抗体、そのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）またはその操作されたバリアント（例えば、ｓＦｖ）も使用し得る。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含めた任意の免疫グロブリンクラスに属し得る。本発明の多数のバイオマーカーに対する抗体が、当業者に公知の販売業者から入手可能である。具体例として、本発明のバイオマーカーに対する抗体がＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）より入手可能である。
【００７７】
ＲＮＡ結合およびＤＮＡ結合抗体が当該技術分野で公知である。具体例として、ＲＮＡ結合抗体がファージディスプレイライブラリー由来の一連の抗体フラグメントから合成される。ＲＮＡ結合抗体を合成するための方法の具体例は、ＲＮＡ結合抗体の作製法としてその内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅ，Ｊら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，２００８；１０５：８２−８７に見られる。したがって、ＲＮＡベースのバイオマーカーに対する抗体の作製は、当該分野の技術の範囲内である。
【００７８】
ＤＮＡ結合抗体が同様に当該技術分野で公知である。ＤＮＡ結合抗体の作製法の具体例は、抗ＤＮＡ抗体の典型的な作製法としてその内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｔｔｓ，ＲＡら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９０；６９（３）：３４８−３５４に見られる。
【００７９】
任意に、バイオマーカーを検出または測定するための薬剤または化合物を標識する。当業者は、本明細書で使用可能な数多くの標識を認識する。標識および標識用キットは、任意にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入できる。標識の具体例としては、蛍光標識、ビオチン、ペルオキシダーゼ、放射性ヌクレオチドまたはその他の当該技術分野で公知の標識が挙げられる。
【００８０】
１つ以上のバイオマーカーの存在に関して生物試料を解析するためには、抗体ベースのアッセイが有用である。適当なウエスタンブロット法が下の実施例の節に記載されており、また当該技術分野で公知である。より迅速な解析（救急医療時に重要な場合がある）には、免疫吸着アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ）および免疫沈降アッセイを使用し得る。一例として、ニトロセルロース製もしくはＰＶＤＦ製の膜のような基質；またはポリスチレン製またはその他のプラスチックポリマー製の硬い基質、例えばマイクロタイタープレートなどに生物試料またはその一部分を固定化し、抗体と解析されるバイオマーカーとが結合できる条件下で、ＧＦＡＰバイオマーカーまたはその他のバイオマーカーの１つと特異的に結合する抗体と、この基質とを接触させる。洗浄後、基質上の抗体の存在により、評価されるマーカーが試料中に含まれていることが示される。抗体が酵素、フルオロフォアまたは放射性同位元素のような検出可能な標識と直接コンジュゲートされている場合、検出可能な標識に関して基質を調べることにより、任意に標識の存在を検出する。あるいは、検出可能に標識したマーカー特異的抗体と結合する二次抗体を基質に加える。洗浄後の基質上の検出可能な標識の存在により、マーカーが試料中に含まれていることが示される。あるいは、バイオマーカーに対する特異的一次抗体を固体基質に結合させるサンドイッチアッセイを使用する。生物試料をプレートでインキュベートし、非特異的に結合した物質を洗浄して取り除く。標識されたまたはその他の方法により検出可能な二次抗体を用いて、一次抗体により基質に付着したバイオマーカーと結合させる。二次抗体結合の検出により、生物試料中のバイオマーカーの存在が示される。
【００８１】
上記基本的な免疫測定法の数多くの置き換えも本発明で使用可能である。これには基質上に固定化される試料ではなくバイオマーカー特異的抗体が含まれ、検出可能な標識とコンジュゲートしたバイオマーカーと基質を、抗体と標識マーカーとの結合が生じる条件下で接触させる。次いで、解析されるマーカーと抗体との結合が可能な条件下で、基質と試料を接触させる。洗浄後の基質上の標識可能な基質の量の減少により、試料がマーカーを含んでいることが示される。
【００８２】
抗体は広範に特徴付けられているため、本発明において有用であるが、バイオマーカーと特異的に結合する他の任意の適当な薬剤（例えば、ペプチド、アプタマーまたは有機小分子）を、抗体の代わりに上記免疫測定法において任意に使用する。例えば、アプタマーを使用し得る。アプタマーとは、特定のリガンドと結合する核酸ベースの分子である。特定の結合特異性を有するアプタマーの作製法が知られており、米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，６７０，６３７号；同第５，６９６，２４９号；同第５，２７０，１６３号；同第５，７０７，７９６号；同第５，５９５，８７７号；同第５，６６０，９８５号；同第５，５６７，５８８号；同第５，６８３，８６７号；同第５，６３７，４５９；および同第６，０１１，０２０号で詳述されている。
【００８３】
バイオマーカー発現の診断検査で使用可能な数多くの検出可能な標識が、当該技術分野で公知である。ＧＦＡＰ関連またはその他のニューロン特異的タンパク質関連のバイオマーカーの検出法で使用する薬剤を、検出可能な標識、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素とコンジュゲートさせる。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した薬剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼの存在下で色の変化を生じる適当な基質を加えることにより検出し得る。使用し得るその他の検出可能な標識がいくつか知られている。その一般的な例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、蛍光化合物、発光化合物、コロイド金、磁性粒子、ビオチン、放射性同位元素およびその他の酵素が挙げられる。任意に一次／二次抗体システムを用いて、１つ以上のバイオマーカーを検出されることが理解される。１つ以上のバイオマーカーを特異的に認識する一次抗体を、対象となるバイオマーカーを含有し得る生物試料に曝露する。次いで、一次抗体の種類またはアイソタイプを認識し適当な標識を有する二次抗体を試料と接触させて、試料中の１つ以上のバイオマーカーの特異的検出を行う。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗原を用いて自己抗体を検出する。具体例として、ＧＦＡＰまたは１つ以上のＧＢＤＰのような抗原を、ＰＶＤＦ膜のような基質上で分離するか、または基質上に配置し、神経学的状態を有することが疑われる対象由来の血清のような生物試料で膜をプローブし、自己抗体を抗体タイプ特異的抗体、例えば検出可能な標識が結合しているかまたは結合していない単独のまたは抗ＩｇＭ抗体と組み合わせた抗ＩｇＧなどと接触させることにより、自己抗体の存在を検出する。
【００８５】
工程では任意に、生物試料中のＧＢＤＰまたはそれに対する自己抗体のようなバイオマーカーの存在または量を、神経細胞損傷の重症度および／またはタイプと関連付ける段階を用いる。生物試料中のバイオマーカー量を、外傷性脳損傷のような神経学的状態と関連付ける。バイオマーカーを測定したアッセイの結果は、医師または獣医が損傷した細胞のタイプを推測して損傷のタイプおよび重症度を決定するのに役立ち得る。これらの結果はＣＴスキャンおよびＧＣＳの結果と一致し、さらに定量的で、迅速に得られ、またコストがかなり低い。
【００８６】
本発明は、１つ以上のバイオマーカーの量を正常なレベルと比較して、対象の神経学的状態を判定する段階を提供する。追加のバイオマーカーの選択により、異常な神経学的状態に関与する細胞のタイプだけでなく、例えば軸索損傷マーカーの場合などにおいて、細胞死の性質を同定することが可能となる。本発明の工程の実施により、対象への最適効果のために投与する適切な治療剤または対象への最適効果のために行う適切な治療を医師が決定するのに役立ち得る試験が提供される。本明細書の実施例で提供されるデータは、あらゆる外傷性脳損傷に関して提供されるものであるが、この結果は、虚血事象、神経変性障害、プリオン関連疾患、癲癇、化学的病因および末梢神経系病理に適用可能であることが理解される。任意に性別が考慮される。
【００８７】
対象の細胞損傷を解析するためのアッセイも提供される。アッセイは任意に以下のものを含む：（ａ）損傷神経細胞を有することが疑われる対象から単離した生物試料を保持するための基質であり、かつ試料は、対象から単離される前に対象の神経系とコミュニケートしていた液体である；（ｂ）バイオマーカー特異的結合物質；（ｃ）任意に別のバイオマーカーに特異的な結合物質；および（ｄ）薬剤を生物試料または生物試料の一部分と反応させてバイオマーカーの存在または量を検出するための、および任意に、別のバイオマーカーに特異的な薬剤を生物試料または生物試料の一部分と反応させて生物試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの存在または量を検出するための印刷された指示書。本発明のアッセイを用いて、財政的報酬のために神経学的状態を検出し得る。
【００８８】
アッセイは任意に、検出可能な標識、例えば薬剤とコンジュゲートした標識または薬剤と特異的に結合する二次抗体のような物質とコンジュゲートした標識などを含む。
【００８９】
本発明は任意に、１つ以上の治療剤、例えば標的バイオマーカーの１つ以上の特徴を変化させ得る化合物などの存在を含む。治療剤は任意に、標的バイオマーカーまたはバイオマーカーの上流エフェクターのアゴニストまたはアンタゴニストとして働く。治療剤は任意に、バイオマーカーの下流機能に影響を与える。例えば、アセチルコリン（Ａｃｈ）は病的な神経興奮に関与し、またＴＢＩ誘導性のムスカリン性コリン受容体の活性化は興奮毒性プロセスに寄与し得る。したがって、バイオマーカーは任意に、Ａｃｈまたはムスカリン受容体のレベルまたは活性に関連する。任意に、使用可能なバイオマーカーは、ムスカリン受容体（１つまたは複数）の活性に影響される分子、タンパク質、核酸またはその他である。したがって、本発明で使用可能な治療剤の具体例としては、ムスカリン性コリン受容体活性化の様々な側面を調節する治療剤が挙げられる。
【００９０】
治療標的または治療標的のモジュレーターとして使用可能である具体的なムスカリン受容体としては、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５ムスカリン受容体が挙げられる。
【００９１】
ＴＢＩの検出および治療におけるムスカリン性コリン受容体経路の適切性は、実験的ＴＢＩ（Ｇｏｒｍａｎら，１９８９；Ｌｙｅｔｈら，１９９３ａ）および虚血（ＫｕｍａｇａｅおよびＭａｔｓｕｉ，１９９１）後の脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡＣｈ上昇、ならびにコリン作用薬の適用による高レベルのムスカリン性コリン受容体活性化の有害性（Ｏｌｎｅｙら，１９８３；Ｔｕｒｓｋｉら，１９８３）を示した研究によるものである。さらに、ムスカリンアンタゴニストの急性投与により、実験的ＴＢＩ後の行動回復が改善される（Ｌｙｅｔｈら，１９８８ａ；Ｌｙｅｔｈら，１９８８ｂ；ＬｙｅｔｈおよびＨａｙｅｓ，１９９２；Ｌｙｅｔｈら，１９９３ｂ；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，１９９０）。
【００９２】
本発明で使用可能な治療用化合物の具体例は、ＴＢＩまたはＭＴＢＩのようなニューロン損傷の危険性がある、またはその傷病者である対象の治療転帰を変化させる、好ましくは改善するために使用可能である任意の分子、化合物、ファミリー、抽出物、溶液、薬物、プロドラッグまたはその他の機序である。治療剤は任意に、ムスカリン性コリン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのようなモジュレーターである。アゴニストまたはアンタゴニストは、直接的なものでも間接的なものでもよい。任意で間接的アゴニストまたはアンタゴニストは、アセチルコリンまたはその他のムスカリン受容体関連分子を分解または合成する分子、具体例として、アルツハイマー病の治療で現在使用されている分子である。コリン作用薬または同様の分子が本明細書で使用可能である。本明細書で使用可能な治療剤の典型的なリストとしては：ジサイクロミン、スコプラミン（ｓｃｏｐｌａｍｉｎｅ）、ミラメリン、Ｎ−メチル−４−ピペリジニルベンジラート、ＮＭＰ、ピロカルピン、ピレンゼピン、アセチルコリン、メタコリン、カルバコール、ベタネコール、ムスカリン、オキソトレモリンＭ、オキソトレモリン、タプシガルギン、カルシウムチャネル遮断剤またはアゴニスト、ニコチン、キサノメリン、ＢｕＴＡＣ、クロザピン、オランザピン、セビメリン、アセクリジン、アレコリン、トルテロジン、ロシベリン、ＩＱＮＰ、インドールアルカロイド、ヒンバシン、シクロステレッタミン、これらの誘導体、これらのプロドラッグおよびこれらの組合せが挙げられる。治療剤は任意に、カルパインまたはカスパーゼのレベルまたは活性を変化させるために使用可能な分子である。このような分子およびその投与は当該技術分野で公知である。
【００９３】
本発明の方法は、具体例として、対象における神経学的状態の診断、神経学的状態を有する対象の治療またはその両方を含む。いくつかの実施形態では、工程は、具体例として、対象から生物試料を採取することを含む。生物試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在を検出または測定するために、生物試料を当該技術分野で公知の機序によりアッセイする。生物試料中の標的バイオマーカーの量または存在に基づき、任意に１つ以上のバイオマーカーの比率を算出する。任意に比率は、同じ試料もしくは並行試料中の別のバイオマーカーのレベルと比較した１つ以上のバイオマーカーのレベル、または病的な神経学的状態を有さないことが既知である対象における同じバイオマーカーの測定されたもしくは既に確立されたベースラインレベルに対するバイオマーカー量の比率である。この比率により、対象における神経学的状態の診断が可能となる。また本発明の工程では、１つ以上のバイオマーカーの比率を直接的または間接的に変化させる治療剤を任意に対象に投与する。
【００９４】
治療剤を任意に、対象の免疫応答を調節するように設計する。具体例として、自己抗体のレベル、産生、分解またはその他の関連するパラメーターは、免疫調節療法により変化する。具体例としてＧＦＡＰまたは１つ以上のＧＢＤＰに対する自己抗体の存在に適用可能な、多発性硬化症に用いられる治療法などの免疫調節療法の具体例は、当該技術分野で公知である。このような治療法の具体例としては、酢酸グラチラマー（ＧＡ）、ベータ−インターフェロン、ラキニモドまたは当該技術分野で公知のその他の治療剤の投与が挙げられる。任意に、治療剤の組合せを免疫調節療法の形態として投与する。組合せの具体例としては、ＩＦＮβ−１ａとメトトレキサート、ＩＦＮβ−１ａとアザチオプリンおよびミトキサントロンとメチルプレドニゾロンが挙げられる。その他の適当な組合せは当該技術分野で公知である。
【００９５】
また本発明の工程が、多臓器損傷の診断およびに任意に治療のためにも提供される。多臓器の具体例としては、脳、脊髄などのような神経性組織のサブセット、または皮質、海馬などのような脳の特定領域が挙げられる。多臓器損傷の具体例としては、カスパーゼ誘導性ＧＢＤＰの存在により検出されるアポトーシス性細胞死、およびカルパイン誘導性ＧＢＤＰの存在により検出可能な膨張細胞死が挙げられる。本発明の工程は、具体例として、対象から採取した生物試料中の複数のバイオマーカーのアッセイであって、生物試料を対象から採取したときに、採取された体液が損傷を受けたことが疑われる臓器またはコントロール臓器と任意に液体で接触していたアッセイを含む。本発明の工程では、複数のバイオマーカーの第一の比率に基づいて、臓器損傷の第一のサブタイプを決定する。また本発明の工程では、生物試料中の複数のバイオマーカーの第二の比率に基づいて、第二の臓器損傷の第二のサブタイプを決定する。比率は、具体例として、本発明に記載のまたは当該技術分野で公知の工程により決定する。
【００９６】
本発明の工程における多臓器損層の治療は、具体例として、第一の臓器損傷に応答して活性またはレベルが変化するタンパク質または核酸の活性を調節するのに効果的な少なくとも１つの治療用アンタゴニストまたはアゴニストを対象に投与すること、および第二の臓器損傷に応答して活性が変化するタンパク質または核酸の活性を調節するのに効果的な少なくとも１つの治療用アンタゴニストまたはアゴニストを投与することにより行われる。
【００９７】
本発明は、具体例として、対象における神経学的状態の程度を識別するための組成物を含む。本発明の組成物は、薬剤単位または複数の薬剤の混合物である。いくつかの実施形態では、組成物は混合物である。混合物は、対象由来の生物試料を任意に含有する。対象は任意に、神経学的状態を有することが疑われる。生物試料は、対照から単離される前に、対象の神経系とコミュニケートしている。また本発明の組成物は任意に、生物試料中に存在し得る少なくとも２つのバイオマーカーと特異的にかつ独立して結合する少なくとも２つの主要な薬剤、任意に抗体または核酸を含有する。いくつかの実施形態では、第一の主要薬剤は、ＧＦＡＰまたは１つ以上のＧＢＤＰと特異的に結合する抗体中にある。第二の主要薬剤は任意に、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素、好ましくはＵＣＨＬ１、またはスペクトリン分解産物と特異的に結合する抗体である。
【００９８】
本発明の組成物の薬剤は、任意に固定化またはその他の方法で基質と接触している。また本発明の薬剤は、少なくとも１つの検出可能な標識で任意に標識されている。いくつかの実施形態では、各薬剤の検出可能な標識は固有であり、同じアッセイチャンバまたは別のチャンバのいずれにおいても独立して検出可能である。任意に、主要薬剤の検出またはそれとの結合に特異的な第二の薬剤を、少なくとも１つの検出可能な標識で標識する。非限定的な例では、主要薬剤はウサギ由来抗体である。第二の薬剤は任意に、ウサギ由来一次抗体に特異的な抗体である。抗原と結合する抗体の検出機序は当該技術分野で公知であり、当業者は、生物試料中の抗原またはバイオマーカーの検出に適した数多くの方法および薬剤を容易に思いつく。
【００９９】
生物試料中の標的バイオマーカーを結合するのに適切な基質を含むキットも提供される。生物試料は任意に、キットと共に提供されるか、本発明のキットを使用する開業医により採取される。本発明のキットは、少なくとも２つのバイオマーカーと特異的にかつ独立して結合する少なくとも２つの抗体を任意に含む。抗体は、２つのバイオマーカーを識別し得る。任意に、第一の抗体は、第一のバイオマーカーとの結合およびその認識に対して特異的かつ独立である。第二の抗体は、第二のバイオマーカーとの結合およびその認識に対して特異的かつ独立である。このようにして、単一生物試料中の複数のバイオマーカーの有無を判定または識別し得る。生物試料中の抗体の具体例としては、バイオマーカーのαＩＩ−スペクトリン、αＩＩ−スペクトリン分解産物（ＳＢＤＰ）、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素、ＧＦＡＰ、ＧＢＤＰおよびＭＡＰ２タンパク質に対する抗体が挙げられる。また本発明のキットは、生物試料中のバイオマーカーの存在または量を検出するように抗体を生物試料または生物試料の一部分と反応させるための説明書も含む。
【０１００】
キットでは、生物試料はＣＳＦ、血液、尿または唾液であり得、薬剤は神経学的状態の少なくとも１つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体、アプタマー、プライマー、プローブまたはその他の分子であり得る。適当な薬剤が本明細書に記載されている。またキットは、検出可能な標識、例えば薬剤とコンジュゲートしている標識または薬剤と特異的に結合する物質（例えば、二次抗体）とコンジュゲートしている標識なども含み得る。
【０１０１】
本発明では任意に、生物試料中のバイオマーカーの存在もしくは量を、神経細胞（もしくはその他のバイオマーカー発現細胞）損傷の重症度および／またはタイプと関連付ける段階を用いる。生物試料中のバイオマーカー（１つまたは複数）の量は、神経組織損傷の重症度と直接関連し、損傷ダメージが重症であるほど、生物試料（例えば、ＣＳＦ；血清）中に多量のバイオマーカー（１つまたは複数）を蓄積させる神経細胞が多い。神経細胞損傷がアポトーシス型および／または壊死型の細胞死を誘発するか否かも、具体例として生物試料中に存在するＧＢＤＰを調べることにより判定し得る。壊死性細胞死ではカルパインが優先的に活性化されるのに対し、アポトーシス性細胞死ではカスパーゼ−３が優先的に活性化される。カルパインおよびカスパーゼ−３ＧＢＤＰは識別可能であるため、２つのマーカーの測定により対象における細胞損傷のタイプが示される。また、生物試料中に存在するＵＣＨＬ１および／またはＧＦＡＰの動態程度のレベルでも、任意に軽度の損傷と重度の損傷を識別し得る。具体例では、重度のＭＣＡＯ（２ｈ）では、軽度の攻撃（３０分）に比べてＣＳＦおよび血清両方のＵＣＨＬ１の増加が生じ、また両者では未損傷対象を上回るＵＣＨＬ１レベルを生じる。さらに、生物試料中のマーカーの持続性または動態程度は、損傷の重症度の指標となり、大きな損傷ほど、具体例として対象のＧＢＤＰ、ＵＣＨＬ１またはＳＢＤＰの持続性増加を示し、このことは、損傷後のいくつかの時点で本発明の工程により生物試料において測定される。
【０１０２】
このような試験の結果は、特定の治療剤、例えばカルパインおよび／またはカスパーゼ阻害剤またはムスカリン性コリン受容体アンタゴニストまたは任意の免疫調節剤などの投与が患者に有効であるか否かを医師が決定するのに役立ち得る。この方法は、細胞死機序の年齢および性別による違いを検出する上で特に重要であり得る。
【０１０３】
その他の試薬、例えばアッセイグレードの水、緩衝剤、膜、アッセイプレート、二次抗体、塩類およびその他の補助試薬が当業者に公知の販売業者から入手可能であることが理解される。具体例として、アッセイプレートはＣｏｒｎｉｎｇ社（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）から入手可能であり、試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能である。
【０１０４】
従来の生物学的技術を含む方法が本明細書に記載されている。このような技術は一般に当該技術分野で公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第１−３巻，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２（定期更新を含む）；およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，第５２版．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００２などの方法論の専門書で詳述されている。免疫学的方法（例えば、抗原特異的抗体の調製、免疫沈降およびイムノブロッティング）が、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２に記載されている。
【０１０５】
ＰＣＲプロトコールのようなさらなるプロトコールを、Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹに見ることができる。タンパク質精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿法、カラムクロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、結晶化およびその他が挙げられる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７年および定期的追補）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１８２巻および本シリーズの他の巻；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；ならびに当業者に公知のタンパク質精製用製品の使用に関する製造者の文献を参照されたい。
【０１０６】
神経細胞の生物学的活性のアッセイが、例えば、Ｗｏｕｔｅｒｌｏｏｄ（編、１９９５）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｍｏｄｕｌｅｓ  １０，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＮｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪに記載されている。
【０１０７】
本発明の様々な態様を以下の非限定的な実施例により説明する。実施例は例示が目的であり、本発明のいかなる実施も制限するものではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなく変更および修正を行い得ることが理解されるであろう。実施例は一般に、哺乳動物組織、特にラット組織の解析を対象としたものであるが、当業者は、同様の技術および当該技術分野で公知のその他の技術により、実施例がヒトのような他の哺乳動物に容易に置き換えられることを認識する。本明細書に例示されている試薬は、一般に哺乳動物種間で交差反応するものであり、また同様の特性を有する別の試薬が市販されており、当業者は、このような試薬が入手可能な場所を容易に理解する。本発明の概念の範囲内の変更は当業者に明らかである。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：バイオマーカー解析のための材料
本発明の実施の際に使用する試薬の具体例としては、炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｃ−３０４１）、ブロッキング緩衝液（Ｓｔａｒｔｉｎｇｂｌｏｃｋ  Ｔ２０−ＴＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号：３７５４３）、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水  （ＴＢＳＴ；Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｔ−９０３９）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｐ−３８１３）；Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｐ５９２７）；Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ  カタログ番号：３４０２８）；およびＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｆｉｓｈｅｒ）が挙げられる。モノクローナルおよびポリクローナルのＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１抗体は、自社製またはＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手したものである。αＩＩスペクトリン、ＧＦＡＰおよび分解産物、ならびにＭＡＰ２、ＭＢＰ、ニューロファシン、ＩｇＧおよびＩｇＭに対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手可能である。
【０１０９】
完全長タウに対する抗タウ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから購入する。タウ−ＢＤＰに特異的な抗体を作製するために、カスパーゼ−３生成Ｃ末端タウ分解産物（タウＢＤＰ−４５Ｋ）の配列である合成ペプチド（Ｃｙｓ−Ｃ６−ＳＩＤＭＶＤ−ＣＯＯＨ）（配列番号１）（Ｃｈｕｎｇら，２００１）、およびカルパイン仲介性タウＢＤＰ−３５ＫのＮ末端を表す第二のペプチド（ＮＨ２−ＫＤＲＴＧＮ−Ｃ６−Ｃｙｓ）（配列番号２）をペプチド合成による特別注文品である（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｎａｐａ、ＣＡ）。後のスルホ連結架橋試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質とのカップリングのために、Ｃ６リンカーおよびＮ末端システインを導入する。カップリング効率の決定後に、ペプチドを透析して濃縮する。注射により２ｍｇのコンジュゲートタンパク質でウサギを免疫化する。３ヵ月後に血清試料を採取し、スルホ連結樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）とカップリングした、試料に抗体産生させた合成ペプチドを用いてアフィニティー精製する。次いで、アフィニティー精製抗体をＴＢＳ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析し、−２０℃、５０％グリセロール中での保存のために濃縮する。
【０１１０】
数多くの抗体サブタイプに対する標識がＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手可能である。生物試料中のタンパク質濃度を、アルブミン標準品によるビシンコニン酸微小タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて決定する。その他のすべての必要な試薬および材料は当業者に公知であり、容易に確認できる。
【０１１１】
実施例２：バイオマーカーアッセイの開発
抗バイオマーカー特異的ウサギポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびに抗原を研究室で作製するか、または市販のものを購入する。標的バイオマーカーを検出するための抗体の反応特異性を判定するために、既知量の単離されたまたは部分的に単離されたバイオマーカーを解析するか、または組織パネルをウエスタンブロットによりプローブする。ＥＬＩＳＡプレートに結合させた組換えバイオマーカータンパク質による間接ＥＬＩＳＡを用いて、アッセイで使用する抗体の最適濃度を決定する。マイクロプレートをウサギポリクローナル抗ヒトバイオマーカー抗体でコーティングする。最大シグナルのウサギ抗ヒトバイオマーカー抗体濃度を決定した後、間接ＥＬＩＳＡの検出下限を各抗体に関して決定する。適当な希釈試料を、ウサギポリクローナル抗ヒトバイオマーカー抗体と２時間インキュベートし、次いで洗浄する。次いで、ビオチン標識モノクローナル抗ヒトバイオマーカー抗体を加え、捕捉されたバイオマーカーとインキュベートする。十分に洗浄した後、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを加える。１時間のインキュベーションおよび最後の洗浄段階の後、残ったコンジュゲートを過酸化水素テトラメチルベンザジンの基質と反応させる。酸性溶液の添加により反応を停止させ、得られた黄色反応産物の吸光度を４５０メートルで測定する。吸光度はバイオマーカーの濃度に比例する。較正物質試料を用いて、吸光度値をバイオマーカー濃度の関数としてプロットすることにより標準曲線を作成し、この標準曲線を用いて未知試料の濃度を決定する。
【０１１２】
実施例３：ＴＢＩのインビボモデル：
制御式皮質衝撃（ＣＣＩ）装置を用いて、既に記載されている通りにラットでＴＢＩモデルを作製する（Ｐｉｋｅら，１９９８）。成体雄（２８０〜３００ｇ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ：Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、１：１Ｏ２／Ｎ２Ｏのキャリヤガス中４％のイソフルランで麻酔し（４分）、同じキャリヤガス中２．５％のイソフルランで維持する。中核体温を直腸内サーミスタプローブにより継続的にモニターし、ラットの下に調節可能な温度制御式加温パッドを敷いて３７±１℃に維持する。ラットを腹臥位で定位フレームに載せ、耳棒および切歯棒で固定する。正中頭蓋切開および軟組織反転を行った後、ブレグマとラムダの中間部分、中央縫合のすぐ横で片側（衝撃部位と同側）開頭（直径７ｍｍ）を行う。皮質を覆う硬膜はそのままにしておく。直径５ｍｍのアルミニウム製インパクタ先端部（空気圧シリンダー内に収納されている）を用いて、圧縮１．６ｍｍおよび休止時間１５０ｍｓ、３．５ｍ／秒の速度で右側（同側）皮質に衝撃を与えて脳外傷を生じさせる。偽損傷コントロール個体には同じ外科処置を行うが、衝撃損傷は与えない。適切な損傷前および損傷後を行って、Ｆｌｏｒｉｄａ大学の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）記載のガイドラインおよび実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）で詳述されている米国国立衛生研究所ガイドラインを確実に遵守する。さらに、動物および動物実験に関連した動物福祉法（Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ａｃｔ）ならびにその他の連邦の制定法および規制に従って、また「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，ＮＲＣ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，１９９６年版」に記載されている原則に忠実に従って研究を行う。
【０１１３】
実施例４：中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）損傷モデル：
イソフルラン麻酔（導入チャンバを介した５％イソフルラン、次いでノーズコーンを介した２％イソフルラン）の下で温置し、正中頸部切開によりラットの右側総頸動脈（ＣＣＡ）を外頸動脈および内頸動脈（ＥＣＡおよびＩＣＡ）分岐レベルで露出させる。ＩＣＡを吻側に翼口蓋部の分岐までたどり、ＥＣＡを結紮して、その舌部および上顎部の分岐を切る。次いで、ＥＣＡ断端の切開部分から３−０ナイロン縫合糸をＩＣＡに挿入し（血管壁を通して縫合糸の進路を視覚的に監視する）、前大脳動脈の狭窄部で詰まり中大脳動脈の起点を塞ぐまで、頸動脈管内を頸動脈分岐から約２０ｍｍ進める。次いで皮膚の切開を閉じ、血管内の縫合糸を所定の位置で３０分または２時間放置する。ラットを短時間、再び麻酔した後、縫合糸を引き抜いて再灌流させる。偽ＭＣＡＯ手術では、同じ手順に従うが、糸は内外頸動脈分岐から１０ｍｍだけ進め、ラットを屠殺するまで所定の位置に放置する。すべての外科的処置の間、保温毛布（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）でマウスを３７±１℃に維持した。各実験の終わりに、ラット脳が剖検時に、くも膜下出血の病理学的証拠を示した場合、それを実験から除外することに留意することが重要である。適切な損傷前および損傷後の管理を行って、動物の管理と使用のガイドラインをすべて確実に遵守する。
【０１１４】
実施例５：組織および試料の調製：
損傷後の適当な時点（２、６、２４時間および２、３、５日）でマウスを麻酔し、断頭により直ちに屠殺する。脳を素早く取り出し、氷冷ＰＢＳで洗浄して二等分する。右半球（衝撃部位周辺の大脳皮質および海馬）を素早く解剖し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、液体窒素で急速凍結させ、使用するまで−８０℃で保管する。免疫組織化学用に、脳を乾燥氷スラリーで急速に凍結させ、ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ  ＰＬＵＳ  ＧＯＬＤ（登録商標）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スライド上にクリオスタットで切片（２０μｍ）を作製し、次いで使用するまで−８０℃で保管する。左半球では、右側と同じ組織を採取した。ウエスタンブロット解析用に、脳試料を乾燥氷上で小型の乳鉢と乳棒のセットを用いて微粉末に粉砕する。次いで、粉砕した脳組織粉末を、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、１×プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の緩衝剤中、４℃で９０分間、溶解させた。次いで、脳ライセートを４℃で５分間、１５，０００×ｇで遠心分離して清澄化し、不溶性の残骸を除去して、急速凍結させ、使用するまで−８０℃で保管する。
【０１１５】
ゲル電気泳動およびエレクトロブロットでは、蒸留Ｈ２Ｏ中０．２５Ｍトリス（ｐＨ６．８）、０．２Ｍ  ＤＴＴ、８％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルーおよび２０％グリセロールを含有する２×ローディング緩衝液によるドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用に、清澄化したＣＳＦ試料（７μｌ）を調製する。１レーン当たり２０マイクログラム（２０μｇ）のタンパク質を、１０〜２０％トリス／グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＥＣ６１３５２）上で、１３０Ｖで２時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより通常通りに分離する。電気泳動後、分離されたタンパク質を、セミドライ転写ユニット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、３９ｍＭグリシン、４８ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）および５％メタノールを含有する転写緩衝液中、外界温度下、２０Ｖの一定電圧で２時間、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に横方向に転写する。電気転写後、ＴＢＳ中５％の脱脂乳および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２（ＴＢＳＴ）中、外界温度で膜を１時間ブロッキングし、次いで、製造者の推奨通りに、４℃で一晩、５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ中１：２０００の希釈の一次モノクローナルＧＦＡＰ抗体とインキュベートする。この後、ＴＢＳＴで３回洗浄し、外界温度でビオチン化連結二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ１１７７ｖ１）と２時間インキュベートし、ストレプトアビジンコンジュゲートアルカリホスファターゼ（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ試薬：ＫＰＬ、カタログ番号５０−８１−０８）と３０分間インキュベートする。多色の分子量標準品（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＲＰＮ８００Ｖ）を用いて、インタクトのバイオマーカータンパク質の分子量を評価する。コンピュータ支援によるデンシトメトリースキャン（Ｅｐｓｏｎ  ＸＬ３５００スキャナ）およびＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）による画像解析により、インタクトのＧＦＡＰ、ＵＣＨＬ１またはＳＢＤＰタンパク質レベルの半定量的評価を行う。
【０１１６】
実施例６：ニューロン損傷のバイオマーカーとしての分解産物
実施例３に記載のラットでのＣＣＩの後、実施例５の通りにＣＳＦを調製する。抗ＧＦＡＰ抗体を用いたウエスタンブロット法により、ＣＣＩ損傷後に経時的なＧＦＡＰの増加が明らかになっている（図１Ａ、１Ｂ）。同様に、ＧＦＡＰのレベルがＣＣＩ後に経時的に増加し、損傷後１４日目に統計的に有意な最大レベルとなる（図１Ｃ）。ラット同側皮質におけるＧＦＡＰおよびＧＢＤＰのレベルも測定し、偽（１つまたは複数）処置個体に比べて増加したレベルが示される（図２）。これらのデータは、重度ＴＢＩと同様の、ＣＣＩ後のＣＳＦおよび神経組織におけるＧＦＡＰおよびＧＢＤＰの増加を示している。
【０１１７】
ニューロンにおけるＧＦＡＰの分解は損傷に特異的である。実施例３の偽処置個体のラット脳組織ライセートおよび非ＴＢＩの死体由来のヒト脳試料を、２つのレベルのカルパイン−２およびカスパーゼ−３で処置し、次いで、ＧＦＡＰおよびＧＢＤＰまたはＳＢＤＰに対する一次抗体を用いてウエスタンブロットを行う。図３は、カルパイン−２によるラット脳ライセートのインビトロ消化が、消化ヒト脳ライセートと重なり合うＧＢＤＰを示すことを示している。ラット脳のカスパーゼ−３切断により、ＣＣＩ処置ラットと同様のＧＢＤＰが明らかになった（図３）。
【０１１８】
同様に、ＣＣＩ後のラットＣＳＦにおいて、損傷後２４時間および７日後の両方でＳＢＤＰ１５０／１４５のレベルが増加する（図３Ｂ）。
【０１１９】
混合したグリア／ニューロン培養物のライセートを、各種処置後にＧＢＤＰの存在に関して調べる。培養物を得るために、１日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット脳から大脳皮質細胞を採取し、Ｎａｔｈら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，１９９８；７１：１８６−１９５の方法に従って、ポリ−Ｌ−リジンでコートした６ウェル培養プレート（Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＮＨ、ＵＳＡ）上に４．３６×１０５細胞／ｍＬの密度で播く。培養物を、加湿恒温器内で、３７℃、１０％ＣＯ２の雰囲気中、１０％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）で維持する。培養の５日後、培地を５％ウマ血清を含むＤＭＥＭに交換する。それ以降の培地交換は週３回行う。アストログリアが形態学的に成熟したニューロンの下にコンフルエントな単層を形成した１０〜１１日目に、インビトロの実験を行う。
【０１２０】
未処置コントロールに加えて、以下の条件を調べた：メトトレキサート（ＭＴＸ）（１μＭ）；カルパインおよびカスパーゼ−３を２４時間活性化するアポトーシス誘導剤スタウロスポリン（ＳＴＳ）（０．５μＭ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（Ｚｈａｎｇら，２００９）；カスパーゼ主体の攻撃としてのＣａ２＋キレート剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）で最大２４時間（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，１９９６；Ｃｈｉｅｓａら，１９９８；Ｍｉｚｕｎｏら，１９９８；ＭｃＧｉｎｎｉｓら，１９９９；Ｚｈａｎｇら，２００９）。薬理学的介入では、ＳＴＳ、ＥＤＴＡまたはＭＴＸ攻撃の１時間前にカルパイン阻害剤ＳＮＪ１９４５（Ｓｅｎｊｕ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）または汎カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ（ＯＭｅ）−ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）で培養物を前処置した（Ｓｈｉｒａｓａｋｉら，２００５；３Ｏｋａら２００６；Ｋｏｕｍｕｒａら，２００８）。
【０１２１】
ＭＴＸ処置した培養細胞は、ＳＪＡ処置を用いたＧＢＤＰの減少およびＶＡＤ処置による阻害の欠如により示されるように、ＧＦＡＰのカルパイン特異的切断を示した（図４）。これに対しＥＤＴＡ処置では、ＳＪＡ処置による効果がないこと、およびＶＡＤ処置によるＧＢＤＰがないことで示されるように、カスパーゼ仲介によるＧＤＢＰ形成が生じる。アポトーシス誘導剤ＳＴＳでの処置では、カルパインおよびカスパーゼの両方による均衡のとれたＧＦＡＰ切断が示された。
【０１２２】
神経細胞においてカルパインおよびカスパーゼにより仲介されるＧＦＡＰの切断部位を特定するために、異なるレベルのカルパインまたはカスパーゼによる切断を組換えＧＦＡＰに対して行う。図５は、クーマシーブルー染色、組換えＧＦＡＰに関連したＣ末端タグの検出により検出されたＧＦＡＰ消化を示し、また抗ＧＦＡＰ抗体でのウエスタンブロット法により、カルパインおよびカスパーゼの両方による良好な切断を示している。クーマシーブルー染色したゲルからＧＢＤＰバンドを切り出し、Ｎ末端配列決定を行うことにより、カルパイン２によるＡｓｎ５９（ＧＡＬＮ＊５９ＡＧＦＫＥＴＲＡＳＥＲＡＥ）（配列番号３）での切断により、新たなＣ−末端ＶＤＦＳＬＡＧＡＬＮ−ＣＯＯＨ（配列番号１３９）を有するＧＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＡＧＦＫＥＴＲＡＳＥ（配列番号１４０）を有するＧＢＤＰ、ならびにＴｈｒ３８３（ＴＩＰＶＱＴ＊３８３ＦＳＮＬＱＩＲＥＴ）（配列番号４）での切断により、新たなＣ−末端ＥＮＲＩＴＩＰＶＱＴ−ＣＯＯＨ（配列番号１４１）を有するＧＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＦＳＮＬＱＩＲＥＴＳ（配列番号１４２）を有するＧＢＤＰが生成され、組換えヒトＧＦＡＰでは全体として４９〜３８ｋＤａの間の複数のＧＢＤＰが生成されることが明らかになっている。
【０１２３】
ＣＣＩの４８時間後のラット海馬におけるタウの分解産物が、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４５６，０２７号で同定されている。ＣＣＩ損傷による実験的ＴＢＩ後に、そのラットタウが切断されて分子量４０〜５５ｋＤａ、３６ｋＤａ、２６ｋＤａ、１８ｋＤａおよび１３ｋＤａのＴＢＤＰが生成されることが示された。切断部位とニューロン損傷の特定タイプとの関連性は不明であった。タウにおける切断部位は、カルパイン２またはカルパイン１を用いた組換えラットタウのインビトロ消化により同定される。消化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより切断フラグメントを分離し、クーマシーブルーで染色し、バンドを切り出して、Ｎ末端配列決定を行う。配列の結果を既知のラットタウの配列と比較する。完全長ラットタウをカルパインおよびカスパーゼによる切断部位と共に図６に示す。
【０１２４】
【表６】
0005909447.tif 000008
【０１２５】
カルパインは、ラットタウをＬｙｓ４３（ＬＫ＊４３ＥＳＰＰＱＰＰＡＤＤ（配列番号６））で切断して、新たなＣ−末端ＱＥＧＤＭＤＨＧＬＫ−ＣＯＯＨ（配列番号１１５）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＱＥＧＤＭＤＨＧＬＫ（配列番号１１６）を有するＴＢＤＰを生成し；Ｓｅｒ１２０（ＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳ＊１２０ＫＤＲＴＧＮＤＥＫ（配列番号７）で切断して、新たなＣ−末端ＶＴＱＡＲＶＡＧＶＳ−ＣＯＯＨ（配列番号１１７）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＫＤＲＴＧＮＤＥＫＫ（配列番号１１８）を有するＴＢＤＰ、Ｖａｌ２２０（ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ＊２２０ＲＴＰＰＫＳＰＳＡＳ（配列番号８））で切断して、新たなＣ−末端ＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１１９）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＲＴＰＰＫＳＰＳＡＳ（配列番号１２０）を有するＴＢＤＰを生成し；Ａｒｇ３７０（ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ＊３７０ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩ（配列番号９））（図５）で切断して、新たなＣ−末端ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ−ＣＯＯＨ（配列番号１２１）を有するＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧ（配列番号１２２）を有するＢＤＰを生成する。カスパーゼ−３は、ラットタウをＡｓｐ４１２（ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ＊４１２ＳＰＱＬＡＴＬＡ（配列番号１０））で切断して、新たなＣ−末端ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ−ＣＯＯＨ（配列番号１２３）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥ（配列番号１２４）を有するＴＢＤＰを生成する。
【０１２６】
ヒトタウは、同様の位置でカルパインおよびカスパーゼにより切断される。表７はヒトタウにおける切断位置を示す。
【０１２７】
【表７】
0005909447.tif 000009
【０１２８】
ヒトＴＢＤＰはカルパイン切断によりヒトタウから生成され、Ｓｅｒ１２９（ＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳ１２９ＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤ（配列番号１２））での切断で、新たなＣ−末端ＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳ−ＣＯＯＨ（配列番号１２５）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤ（配列番号１２６）を有するＴＢＤＰが生成され、Ｖａｌ２２９（ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ＊２２９ＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡ（配列番号１３））での切断で、新たなＣ−末端ＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ−ＣＯＯＨ（配列番号１２７）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡ（配列番号１２８）を有するＴＢＤＰが生成され、Ｇｌｙ１５７（ＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧ＊１５７ＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＴＡ（配列番号１４））での切断で、新たなＣ−末端ＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧ−ＣＯＯＨ（配列番号１２９）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡ（配列番号１３０）を有するＴＢＤＰが生成され、Ｌｙｓ４４（（ＬＫ＊４４ＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤ（配列番号１５））での切断で、新たなＣ−末端ＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫ−ＣＯＯＨ（配列番号１３１）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤ（配列番号１３２）を有するＴＢＤＰが生成され、Ａｒｇ３７９（ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ＊３７９ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩ（配列番号１６））での切断で、新たなＣ−末端ＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲ−ＣＯＯＨ（配列番号１３３）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧ（配列番号１３４）を有するＴＢＤＰが生成される。ヒトタウにおけるカスパーゼ切断部位は、新たなＣ−末端ＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤ−ＣＯＯＨ（配列番号１３５）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱ（配列番号１３６）を有するＴＢＤＰを生成するＡｓｐ２５（ＧＤＲＫＤ＊２５ＱＧＧＹＴＭＨＱＤ（配列番号１７））、ならびに新たなＣ−末端ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ−ＣＯＯＨ（配列番号１３７）を有するＴＢＤＰおよび新たなＮ−末端ＮＨ２−ＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥ（配列番号１３８）を有するＴＢＤＰを生成するＡｓｐ４２１（ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ＊４２１ＳＰＱＬＡＴＬＡ（配列番号１８））である。ヒトタウの全体的なニューロン損傷切断経路を図６に示す。
【０１２９】
タウＢＤＰ−４５Ｋ（カスパーゼ）およびタウＢＤＰ−３５Ｋ（カルパイン）に対して抗体を産生させる。カスパーゼ−３により生成されたタウＢＤＰ−４５ＫのタウＣ末端に基づくペプチド（Ｃｙｓ−Ｃ６−ＳＩＤＭＶＤ）（配列番号１）（Ｃｈｕｎｇら，２００１）およびカルパイン仲介性タウＢＤＰ−３５Ｋの新たなＮ末端に基づく別のペプチド（ＫＤＲＴＧＮＤＥＫ−Ｃ６−Ｃｙｓ）（配列番号１９）は、特別注文品である（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｎａｐａ、ＣＡ）。ＴＢＤＰに特異的な抗体に対するその他の典型的なエピトープを表８に示す。
【０１３０】
【表８】
0005909447.tif 000010
【０１３１】
後のスルホ連結架橋試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたペプチドとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質とのカップリングのために、Ｃ６リンカーおよびＮ末端システインを導入する。カップリング効率の決定後に、ペプチドを透析して濃縮し、２ｍｇのコンジュゲートタンパク質を２匹のウサギへの複数回の抗原注射に使用する。３ヵ月後にウサギから血清試料を採取し、スルホ連結樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）とカップリングした同じ合成ペプチドを用いてアフィニティー精製する。アフィニティー精製抗体をＴＢＳ（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して透析した後、濃縮し、５０％グリセロール中、−２０℃で保存する。
【０１３２】
特定の切断産物に対するさらなる抗体も作製する。使用される抗原には以下のものが含まれる：ヒトおよびラットにおけるＴＢＤＰ−４５Ｋ（カスパーゼ）に特異的な抗体を作製するためのＣｙｓ−ｅＡｈｘ−ＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤ−ＯＨ（配列番号４０）；ヒトおよびラットＴＢＤＰ−１４Ｋ−２０Ｋ（カルパイン）に特異的な抗体を作製するためのＣｙｓ−Ｃ６−ＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶ（配列番号４１）；ヒトＴＢＤＰ−３５Ｋ（カルパイン）に対するＮＨ２−ＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤ−Ｃ６−Ｃｙｓ（配列番号４２）；ヒトＴＢＤＰ−１４ｋに対するＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤ−Ｃ６（配列番号４３）；およびヒトＴＢＤＰ−１０ｋＣ末端に対するＣｙｓ−Ｃ６−ＨＶＴＱＡＲＭＶＳ（配列番号４４）。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００５／０２６０６９７号に示されるその他の抗体も作製する。
【０１３３】
ラットタウタンパク質（１００ｎｇ）をカルパイン−２またはカスパーゼ−３で消化する。得られたフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、産生された抗体でのウエスタンブロットによりプローブする。カルパイン−１および−２が共にタウを消化して、いくつかの免疫反応性のフラグメント（４２ｋＤａ、３５ｋＤａおよび１５ｋＤａ）を生じるのに対し、カスパーゼ−３消化は４８ｋＤａ／４５ｋＤａの限られた一対のフラグメントのみを生じる（図７）。タウＢＤＰ−３５Ｋ（カルパイン）およびタウＢＤＰ−４５Ｋ（カスパーゼ）抗体によるプロービングにより、抗体のフラグメント特異性およびインタクトタンパク質またはその他のフラグメントとの交差反応性がないことが確認される。
【０１３４】
ＴＢＤＰ抗体をヒトタウＢＤＰとの交差反応に関して解析する。精製ヒトタウを未処置、カルパイン−２処置またはカスパーゼ−３処置に供してＴＢＤＰを生成させる。これらを、上記のＭＴＸまたはＥＤＴＡ処置したラット大脳皮質培養細胞（ＣＴＸ）、ならびに未処置またはＴＢＩの同側海馬（ＩＨ）または同側皮質（ＩＣ）モデルと比較する。図８に示すように、得られたフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗全タウモノクローナル抗体でプローブする。ヒトタウのカルパインまたはカスパーゼでの処置により、数多くの分解産物が生じる。ＭＴＸ処置したＣＴＸ細胞ではタウのカルパイン特異的切断が明らかとなり、ＥＤＴＡ処置したＣＴＸ細胞ではタウのカスパーゼ特異的切断が示される。ＴＢＩ後のタウのプロテアーゼ仲介性切断をＩＨおよびＩＣのＴＢＩモデルにおいて示す（図８Ａ）。抗ＴＢＤＰ−３５Ｋ特異的抗体はヒトタウに対して交差反応性を示さない（図８Ｂ）。
【０１３５】
ＴＢＤＰ特異的抗体を用いて、未処置のまたは以下のものによる処置を行ったラット大脳皮質培養物をプローブする：興奮毒性攻撃ＮＭＤＡ―（Ｎａｔｈら，１９９８）；カルパインおよびカスパーゼ−３を２４時間活性化するアポトーシス誘導剤スタウロスポリン（ＳＴＳ）（０．５μＭ）（Ｚｈａｎｇら，２００９）；またはカスパーゼ主体の攻撃としてのＣａ２＋キレート剤およびアポトーシス誘導剤エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，１９９６；Ｃｈｉｅｓａら，１９９８；Ｍｉｚｕｎｏら，１９９８；ＭｃＧｉｎｎｉｓら，１９９９；Ｚｈａｎｇら，２００９）。ＮＭＤＡ、ＥＤＴＡおよびＳＴＳ処置は、それぞれインビトロで広範な神経変性を生じさせる。ＮＭＤＡが壊死／アポトーシスの混合した形質を誘導するのに対し、ＳＴＳおよびＥＤＴＡは共に強いアポトーシス形質を生じさせる（図９）。
【０１３６】
ラット大脳皮質培養物ライセートを、全タウ抗体またはフラグメント特異的抗体でプローブする。ＮＭＤＡ処置では、タウが著しく分解されて、カルパイン仲介性タウＢＤＰ−３５Ｋの優勢なシグナルおよび最小のカスパーゼ仲介性タウ−ＢＤＰ４５Ｋを含めた複数のフラグメント（４２Ｋ、３５Ｋおよび１５Ｋ）を生じる（図１０）。カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ；２０μＭ）は、タウ分解パターンの有意な変化を生じさせない。阻害剤（ＳＮＪ−１９４５；２０μＭ）は、いくつかの高分子量フラグメント（４２５〜４８Ｋ）は残るが、低分子量のフラグメントを有意に減少させ、そのうちカルパイン仲介性タウＢＤＰ−３５Ｋは完全にブロックされる。抗カスパーゼ仲介性タウ−ＢＤＰ４５Ｋ抗体でブロットをプローブすると、タウＢＤＰ−４５／４８Ｋがカルパイン阻害剤−ＮＭＤＡ共処置のレーンで検出されることは興味深い。ＮＭＤＡ処置により、カスパーゼ−３仲介性ＳＢＤＰ１２０の微量のバンドと共に、顕著なカルパイン仲介性ＳＢＤＰ１５０／ＳＢＤＰ１４５が得られる。これらのフラグメントは、それぞれのプロテアーゼ阻害剤（ＳＮＪ、Ｚ−ＶＡＤ）により強く阻害される。まとめると、上記データは、ＮＭＤＡ系列では、カルパインがタウ断片化の優位な経路であり、カスパーゼの寄与は少ないということ示している。
【０１３７】
アポトーシス阻害剤ＥＤＴＡを用いた場合、全タウのブロットおよびカスパーゼ仲介性抗タウ−ＢＤＰ４５Ｋのブロットにより確認されるように、タウはタウ−ＢＤＰ４８Ｋ／４５Ｋへのみ切断される（図１０）。両フラグメントは、カスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ）感受性であるが、カルパイン阻害剤（ＳＮＪ−１９４５）に対しては非感受性である。したがって、ＥＤＴＡ攻撃では、端的なカスパーゼ優位のタウ断片化条件が生じる。ＥＤＴＡ攻撃によるαＩＩ−スペクトリン分解パターンにより、カスパーゼ仲介性ＳＢＤＰ１２０の存在が確認されるが、カルパイン生成フラグメントＳＢＤＰ１４５は確認されない。
【０１３８】
スタウロスポリン処置では、高分子量（４５〜４８Ｋ）と低分子量（３５Ｋ、１５Ｋ）のタウ−ＢＤＰのバランスが示される（図１０）。４８／４５Ｋフラグメントはカスパーゼ仲介性であり、これはタウ−４５Ｋフラグメント特異的抗体のブロットおよびそのカスパーゼ阻害剤（Ｚ−ＶＡＤ）に対する感受性により確認される。同様に、タウＢＤＰ−３５Ｋ特異的抗体およびそのカルパイン阻害剤ＳＮＪ−１９４５に対する感受性によりカルパインの関与が確認される。カルパインとカスパーゼ両方の二重関与を示す全タウのブロットおよび抗タウ−４８／４５Ｋのブロットから、カルパイン阻害剤の存在がタウ−ＤＢＰ−４８ｋ／４５Ｋを強力に上昇させたということは重要である。このことは、αＩＩ−スペクトリンの分解パターンとも一致する。ＳＴＳ処置により、タウ断片化においてカルパインとカスパーゼの両方の二重でありかつバランスのとれた寄与が存在する神経変性系列が生じる。
【０１３９】
ラットにおけるＣＣＩ損傷によりＴＢＤＰが生じる。実施例３のようにＣＣＩ損傷後に採取した皮質および海馬組織試料を溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、ウエスタンブロット法を行って特定のＴＢＤＰの存在を確認する。ラット皮質では、ＣＣＩ後に、早くも２時間で急速に増加し、６時間後までに最大レベルに達する（図１１Ａ、１１Ｂ）。続いて、損傷後４８時間にレベルが低下する。ＴＢＤＰ−２５Ｋはより緩やかな増加を示し、４８時間後に最大レベルに達する（図１１Ａ、１１Ｂ）。他のタウ−ＢＤＰも観察される。偽処置およびＣＣＩ後の両方において観察される数多くのバンドは、タウタンパク質のリン酸化状態およびアイソフォームを数多く示している。反対側の皮質では、タウの免疫ブロットを意図的に過剰に展開させても全３群でタウタンパク質分解は観察されない（データ不掲載）。ラット海馬では、損傷後２時間でＴＢＤＰ−１５Ｋが現れ、２４時間で最大レベルが観察される（図１１Ｃ、１１Ｄ）。同様の結果がＴＢＤＰ−３５Ｋで観察される（図１１Ｃ、１１Ｄ）。全体的には、インビトロでのカルパイン仲介性タウタンパク質断片化のパターン（タウＢＤＰ−３５Ｋ、２５Ｋおよび１５Ｋ）（図７）は、ＴＢＩ後のインビボでのタウタンパク質分解（図１１）とよく一致する。制御式皮質衝撃装置は皮質を標的とするため、打撲性の力により間接的に衝撃を与えた海馬組織よりも、同側皮質組織における方が大きな局所的損傷を生じる。その結果、皮質では海馬よりも広範なタウタンパク質分解が存在する。
【０１４０】
同じ試料をＴＢＤＰ特異的を用いてプローブする。図１２Ａは、ラットにおいてＴＢＤＰ−３５Ｋを生成する特異的カルパイン活性があること、およびＣＣＩ後のラット皮質におけるカスパーゼ仲介性切断がないことを示している。同様の結果がラット海馬において観察される（図１２Ｂ）。したがって、損傷皮質において、ＣＣＩ誘導性神経変性はカルパイン仲介性ＴＢＤＰの形成および蓄積を伴い、カスパーゼ生成タウフラグメントに対してわずかに寄与するのみである。
【０１４１】
抗活性化カルパイン−１新規Ｎ末端（抗ＬＧＲＨＥＮＡ）（配列番号３９および１４９）抗体またはプロカルパイン−２Ｎ末端（抗ＳＨＥＲＡＩＫ）（配列番号３８および１４８）抗体を用いて、タウＢＤＰ−３５Ｋのカルパイン−１およびカルパイン−２の一時的な活性化プロファイルを調べる。図１３は、損傷皮質におけるカルパイン−１（Ａ）およびカルパイン−２（Ｂ）両方の活性化を示している。カルパイン−１は２日目および３日目に初期ピークがあり、その後低下したのに対し（図１３Ａ）、カルパイン−２は同様に２日目にピークに達するが、３〜５日持続した（図１３Ｂ）。カルパイン−１活性化は、カルパイン特異的ＴＢＤＰ−３５Ｋの出現と非常によく一致する。
【０１４２】
タウのカルパイン仲介性切断は、ＣＣＩ直後に投与する（１００ｍｇ／ｋｇ、ボーラス静注）カルパイン阻害剤ＳＮＪ−１９４５を用いたその阻害によりさらに示される。皮質組織のプローブをＴＢＤＰ−３５Ｋ特異的抗体によるイムノブロッティングに供する。ＳＮＪ−１９４５によりＴＢＤＰ−３５Ｋ増加が抑制される（図１４）。したがって、カルパイン−１は、ＴＢＩ後の主要なタウ切断プロテアーゼとして働く。
【０１４３】
実施例７：重度ヒト外傷性脳損傷調査
調査には、重度外傷性脳損傷を有する４６例のヒト対象が含まれていた。各対象は、年齢が１９歳以上、ＧＣＳが８以下であり、かつ日常的な治療の一部として脳室フィステル形成術および神経モニタリングが必要であることを特徴とする。詳細にはＣＳＦコントロールと同義であるコントロール群Ａには、同様に１９歳以上でかつ損傷を有さない１０人が含まれていた。水頭症または髄膜炎の治療に関連した日常的な外科的処置またはＣＳＦ入手のための脊椎麻酔の際に試料を採取する。正常コントロールと同義として表されるコントロール群Ｂは、それぞれ１８歳以上でかつ脳損傷を伴わない複数の損傷を経験している合計６４人であった。調査の人口動態に関するさらなる詳細を表９に記載する。
【０１４４】
【表９】
0005909447.tif 000011
【０１４５】
第一および第二の患者で最初に入手したＣＳＦ試料に見られるバイオマーカーのレベル（図１５Ａおよび１５Ｂ）は、最初の患者の緊急治療室入院時のＧＦＡＰおよびＧＢＤＰが高いことを示している（図１５Ａ）。同様に、ＴＢＩ後６時間以内にＣＳＦを抜き取った第二の患者は、この時点で高レベルのＧＦＡＰおよびＧＢＤＰの存在が明らかとなった（図１５Ｂ）。また第二の患者は、損傷の１８時間後に、検出可能ではあるが低レベルのＧＦＡＰおよびＧＢＤＰを示した。第一の患者のＣＳＦでは、ＳＢＤＰ１５０／１４５およびＳＢＤＰ１２０のレベルも緊急治療室入院時に上昇しているが、後の時点では比較的低レベルである（図１５Ａ）。
【０１４６】
実施例８：ＴＢＩのバイオマーカーとしての自己抗体の同定
重度ＴＢＩ後、対象の血液中でニューロンタンパク質に対する自己抗体が産生され、で検出可能となる。ヒトＴＢＩ対象から死後に脳ライセートを入手し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４およびプロテアーゼインヒビターカクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含有する溶解緩衝液で可溶化する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりライセートを分離し、次いで全タンパク質に関して染色し（図１６Ａ）、プロービングのためにポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に転写する。ヒトコントロールドナーから採取（Ｂ）またはＴＢＩ１０日後にヒトから採取（Ｃ）した血清を用いてブロットをプローブし、抗ＩｇＧ／ＩｇＭを用いて自己抗体を検出する。ＴＢＩ後の対象由来の血清では、血清自己抗体の存在を示す強いバンドが観察される。
【０１４７】
ヒト血清は、ＴＢＩ後に増加したレベルで観察される自己抗体を含有する。５人のヒトコントロールおよびＴＢＩ対象由来の血清を、自己抗体の有無に関してプローブする。上記の可溶化したヒトＴＢＩ後脳ライセートの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ｉｂｌｏｔ法によりＰＶＤＦ膜に転写する。正常コントロールヒト対象由来またはＴＢＩの７２時間後またはＴＢＩの３０日後に試料を採取する５人のＴＢＩ対象由来の血清によりブロットをプローブする。ＴＢＳＴで数回洗浄した後、ＰＶＤＦ膜をマルチスクリーン装置から取り出してさらに３回洗浄した、次いで最後に、１：１０，０００に希釈したＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ＋ＩｇＭまたはＡＰコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧと１時間インキュベートし、次いでＴＢＳＴで洗浄する。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）ホスファターゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて陽性シグナルを視覚化する。図１７は、ＴＢＩ後に存在するいくつかのヒト脳タンパク質に対する自己抗体の存在を示している。遅い時点でのシグナル増強により示されるように、自己抗体の量は７２日目〜３０日目まで増加する。
【０１４８】
自己抗体のレベルは、ＴＢＩ後に時間と共に増加する。入院時およびＴＢＩの３０日後までに採取した１人のヒト対象由来の血清を用いて、ゲルの各レーンに等濃度で負荷したヒト脳ライセートをプローブし、ＰＶＤＦに転写する。自己抗原は、抗ＩｇＧ二次抗体を用いた検出により示されるＩｇＧである（図１８Ａ）。自己抗体が産生される速度は驚くほど速く、５日目に検出可能なレベルで出現し、３０日目まで増加する（図１８Ａ）。自己抗体がＩｇＧ特異的であることの確証は、ブロットが特定の免疫グロブリン種に対する二次抗体でプローブされている図１８Ｂで示される。
【０１４９】
自己抗体は脳特異的抗原に対するものである。ヒトの脳、心臓、腎臓、肺、脾臓、腸、皮膚、筋肉および精巣由来のライセート（３０μｇのタンパク質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦに転写し、１：１００の希釈でヒトＴＢＩ対象の血清をプローブすることによるウエスタンブロット法を用いて検出する。１：１０，０００希釈のＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭにより、任意の結合した自己抗体を検出する。図１９は、ＴＢＩ対象由来の自己抗体が、３８〜５２ｋＤａの間に移動する脳由来の自己抗原だけ認識することを示している。
【０１５０】
カルパイン消化の結果として、自己抗体が分解産物に対して産生される。ナイーブラット脳ライセートをゲルに負荷し、ヒトＴＢＩ対象の血清でプローブする。カルパイン切断産物の非存在下では、抗原認識が観察されない（データ不掲載）。しかし、同一の濃度で負荷したカルパイン消化ラット脳ライセートは、ＴＢＩ後の５日目（レーン１２）に現れ１０日目（レーン１７）まで増加する検出可能なヒトＴＢＩ患者の自己抗体により認識される（図２０）。
【０１５１】
ＴＢＩ後のヒト血清中の自己抗体により認識される抗原を特定するために、精製ＧＦＡＰ、ニューロファシンおよびＭＢＰをゲルに負荷して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦに転写して、損傷の１０日後に採取したＴＢＩヒト対象の血清でプローブした後、抗ＩｇＧ抗体を用いて検出した。ＧＦＡＰ、ニューロファシンおよびＭＢＰはそれぞれ、ＴＢＩ後のヒト血清中で産生された自己抗体により認識される自己抗原として検出される（図２１）。
【０１５２】
ＧＦＡＰは、ＴＢＩの１０日後に採取したヒト対象の血清中の自己抗体により認識されることが確認される。死後ヒト脳ライセートをイオン交換クロマトグラフィーに供し、溶出画分をゲルに負荷して分離する。各画分中の全タンパク質をクーマシーブルーで染色する（図２２Ａ）。ヒトＴＢＩ対象の血清でのプロービングによる自己抗原検出のために、同じ画分を分離してＰＶＤＦに転写する（図２２Ｂ）。染色ゲル上のオーバーラップしているバンドを切り出し、配列解析を行う。配列解析により、ＴＢＩ後のヒト血清中に存在する自己抗体がＧＦＡＰを認識することが明らかとなる。
【０１５３】
抗原競合実験により、ＴＢＩ後のヒト血清中に存在する自己抗体がＧＦＡＰおよびタウを認識することが確認される。ヒト脳ライセート（３００μｇ）を、単独のまたは各種濃度のＧＦＡＰ（２．６μｇ；１０μｇ（Ｂａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ））もしくはタウ（２．６μｇもしくは１０μｇ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  Ｃｏ．））とプレインキュベートした３人のヒトＴＢＩ対象由来の血清でプローブする。２．５μｇのＧＦＡＰの存在により、ＧＦＡＰ特異的自己抗体が脳ライセート中に存在するＧＦＡＰを認識する能力が低下する（図２３）。１０μｇのＧＦＡＰにより、シグナルがさらに減少する。同様に、血清と１０μｇのタウタンパク質とのプレインキュベーションは２．６μｇのタウよりも低い抗原認識を示し、このことはヒトＴＢＩ後血清中のタウ特異的自己抗体の存在を示している（図２３）。
【０１５４】
ＧＦＡＰに対する自己抗体はＧＢＤＰを優先的に認識する。ヒト脳ライセートおよびインタクトの精製組換えＧＦＡＰをゲルに負荷し、抗ＧＦＡＰ（図２４Ａ）抗体、ＧＦＡＰに対する自己抗体を含有するヒトＴＢＩ後血清（図２４Ｂ）のいずれかでプローブし、かつ／またはゲルをクーマシーブルーで染色する（図２３Ｃ）。自己抗体は、インタクトの組換えＧＦＡＰよりも脳ライセートに生来的に由来するＧＢＤＰに対してはるかに高い認識を示す。
【０１５５】
実施例９：ヒトＴＢＩ調査における自己抗体の検出
ＴＢＩ後の様々な時点でヒト対象から血清試料を採取する。表１０は、３つの異なるＴＢＩ相：急性＋亜急性相（損傷〜１０日目）；重度ＴＢＩ亜急性相（１日目〜３０日目）；および重度ＴＢＩ慢性相（ＴＢＩ後１ヶ月超）で試料を得た患者数を示す。
【０１５６】
【表１０】
0005909447.tif 000012
【０１５７】
信頼区間は修正Ｗａｌｄ法により定める。全体的に、血清中に自己抗体を示すＴＢＩ患者数は、正常コントロールよりもはるかに多い。
【０１５８】
実施例８に記載の手順を用いたウエスタンブロット法により、自己抗体の強度を測定する。最高レベルの自己抗体は強度レベル５と採点され、強度レベルゼロはウエスタンブロット法により検出可能な自己抗体が存在しないことを表す。健常コントロールを、Ｂａｎｙａｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ、ＵＰおよびイタリアの調査主催者により採取された調査試料と比較する。大部分のＴＢＩ患者で血清中の自己抗体レベルが検出可能であった（図２５）。
【０１５９】
実施例１０：
自己抗体の存在と生存率との相関を解析するために、ＴＢＩと診断されたヒト対象の調査をさらに行う。重度（ＧＣＩスコアが３〜５）または軽度（ＧＣＩスコアが６〜１５）ＴＢＩを有する２０例のヒト対象から血清試料を採取する。表１１は、調査対象の特徴を示す。
【０１６０】
【表１１】
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【０１６１】
全体的に、６例（３０パーセント）の対象が血清中の自己抗体に関して陰性である。表１２に示すように、７０パーセントが陽性の自己抗体発生を示し、１０パーセントが高陽性の自己抗体レベルを示している。
【０１６２】
【表１２】
0005909447.tif 000014
【０１６３】
【表１３】
0005909447.tif 000015
【０１６４】
全体的に、自己抗体を示す男女対象が示さない対象を上回っている（図２６Ａ）。５６歳未満では、自己抗体を示す対象が示さない対象を上回っている。５７〜７１歳と７２〜８４歳の対象では、２例の対象が自己抗体を示し、２例の対象が示さない（図２６Ｂ）。
【０１６５】
自己抗体の存在はＧＣＳスコアが６〜１５の対象で相対的に高いが、ＧＣＳスコアが３〜５の対象でも自己抗体陽性の方が多い（図２７）。転帰不良（６ヶ月未満で死亡）の対象は、転帰良好な対象よりも血清中の自己抗体発生が高い傾向を示している（図２８）。このことは、自己抗体の存在が生存率と相関することを示している。
【０１６６】
５ポイントの強度段階での自己抗体レベルは、ＴＢＩの２４時間以内に採取した血清中のＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１レベルと相関する。ＴＢＩの２４時間後以内に採取したヒト対象の血清も、ＵＣＨＬ１、ＧＦＡＰおよびＳＢＤＰ１４５の存在およびレベルに関して、基本的に実施例２に記載の通りのＥＬＩＳＡにより解析する。次いで、これらのレベルを自己抗体の強度に対してプロットする。図２９に図示されるように、ＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１レベルの増加は自己抗体の強度増加と相関する。ＧＦＡＰは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数０．７２およびＰ値０．０００９で相関する。ＵＣＨＬ１は、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数０．５６およびＰ値０．０２で相関する。
【０１６７】
ＴＢＩ後２４時間以内にヒト対象から採取したＣＳＦで同様の相関が見られる。ＧＦＡＰレベルは後の自己抗体発生と、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数０．４７およびＰ値０．０７で相関する。ＵＣＨＬ１レベルと自己抗体強度は、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数が０．５６およびＰ値が０．０２で相関する。またＳＢＤＰ１４５レベルも自己抗体強度と相関し、統計的に有意なＰｅａｒｓｏｎ相関係数０．６２およびＰ値０．０１を示す（図３０）。したがって、自己抗体のレベルは、ヒト対象の血清中およびＣＳＦ中両方の可溶性バイオマーカータンパク質のレベルと相関する。
【０１６８】
対象の血清中の自己抗体の相対存在量を、最大強度レベル５の実施例９に記載のものと同様の手法でウエスタンブロット法により測定する。全体的に、女性対象の方が男性対象よりも高い自己抗体強度を示す（図３１Ａ）。転帰良好（６ヶ月を超える生存）な対象では、男性対象の方が女性対象よりも自己抗体強度が高い（図３１Ｂ）。全体的に、女性対象が低い死亡率を示し、かつ高い自己抗体強度を示すのに対し、男性対象は高い死亡率を示し、自己抗体強度は低い（図３１Ｃ）。これらのデータは、自己抗体強度と転帰の間には性別により逆相関関係があることを示している。
【０１６９】
平均強度を性別と無関係に生存率と相関させると、自己抗体強度と６ヶ月超の生存との間の相関は見られない（図３２Ａ）。したがって、強度は、性別依存的なレベルに関してのみ転帰の予測因子として機能する。また自己抗体の強度に無関係な自己抗体の存在も性別依存的なレベルに関して転帰を予測するために機能する。女性対象では、平均の強度は低いが、自己抗体の存在が生存率の増加と相関する（図３２Ｂ）。女性の非生存者は、自己抗体の存在をあまり示さないが、強度は高い（図３２Ｂ）。したがって、女性の調査対象では、低レベルの自己抗体の存在が、高レベルの自己抗体の存在よりも転帰を改善することを示している。男性の調査対象では、自己抗体の存在を示す転帰良好な調査対象は少ないが、強度の高い対象ほど生存する可能性が高い（図３２Ｃ）。非生存男性は自己抗体を有する傾向が強いが、その強度は低い（図３２Ｃ）。全体的に、自己抗体の頻度および強度は、性別依存的に転帰と相関する。
【０１７０】
自己抗体の強度は、ＧＣＳスコアにより測定されるＴＢＩの重症度と共に高くなる傾向を示す（図３３）。ＧＣＳ値が３の対象は、高いＧＣＳスコア７の対象よりもはるかに高い自己抗体強度を示す。ＧＣＳスコアの増加に伴う傾向線の低下は、自己抗体強度の高い対象ほどＧＣＳスコアが低く、ＴＢＩ重症度が高い傾向にあることを示している。
【０１７１】
実施例１１：ニューロン損傷の尺度としての核酸バイオマーカーの血清またはＣＳＦレベル
臓器または脳損傷後にタンパク質がＣＳＦおよび血漿区画に侵入するのと同様に、ＲＮＡおよびＤＮＡも侵入する。アポトーシスまたは壊死を起こしている細胞は、血液またはＣＳＦ中に核酸バイオマーカーを放出する（図３４）。損傷の重症度および部位は、細胞タイプに特異的なＲＮＡ量を定量化する適当なリアルタイムＰＣＲアッセイにより特定できる。神経特異的ＲＮＡの例としては、βＩＩＩチューブリン、ＵＣＨＬ１、ＧＦＡＰおよびシナプトフィジンが挙げられる。
【０１７２】
実施例７の調査のヒト対象から採取した全血試料を用いて、その中のＧＦＡＰまたはＵＣＨＬ１をコードする核酸のレベルを決定する。図３５は、重度ＴＢＩの対象における血清ＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１タンパク質レベル増加の存在を示している。血清中にＧＦＡＰまたはＵＣＨＬ１をコードするＲＮＡが存在するか否かを決定するために、Ｒａｉｎｅｒ，ＴＨら，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ，２００３；４９：５６２−５６０により記載されているものと同様の技術による血清の解析を用いる。簡潔には、入院時に各対象の肘前静脈から１０ｍＬの対象血液を採血して、ＥＤＴＡの入ったチューブに集め、３０００×ｇで１５分間、二重遠心分離する。あるいはまたは加えて、０．２マイクロメートルのフィルターを用いた遠心分離により、血漿をろ過して細胞物質を除去する。上清無細胞血漿を、血液／骨髄用のＲＮＡ／ＤＮＡスタビライゼーション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を入れた普通のポリプロピレンチューブ内に移し、さらなる処理まで−８０で保管する。
【０１７３】
血液／骨髄用のｍＲＮＡアイソレーションキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を製造者のプロトコールに従い使用して、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡを合成し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬セット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた５０μＬのＰＣＲ反応で増幅する。簡潔には、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ酵素混合物（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、血漿６μＬ中のｍＲＮＡをＧＦＡＰまたはＵＣＨＬ１に特異的なプライマーで逆転写する。得られたｃＤＮＡをＰａｔｔｙｎ，Ｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３；３１（１）：１２２−１２３のプロトコールの通りに６０℃のアニーリング温度を用いた、ＧＦＡＰに対するプライマーおよびプローブ：順方向プライマー―ＡＣＡＴＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡ（配列番号４５）；逆方向プライマー―ＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＧＡＡＴＧＧＴＧＡＴ（配列番号４６）；および標識プローブ―ＡＧＣＴＧＣＴＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＧ（配列番号４７）を用いたＴａｑｍａｎアッセイにより測定する。ＵＣＨＬ１検出では、プライマーおよびプローブは：順方向プライマー―ＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧ（配列番号４８）；逆方向プライマー―ＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＣＣＡＣＧＧ（配列番号４９）；標識プローブ―ＡＡＴＧＡＧＧＣＣＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧ（配列番号５０）であり、６０℃のアニーリング温度を用いる。全体的に、ＴＢＩ後の対象の無細胞血漿において、ＧＦＡＰおよびＵＣＨＬ１の両方のｍＲＮＡの存在が示される。
【０１７４】
実施例１２：
ＴＢＩの１日後のヒト血清において、ヒトのＴＢＩに関連したｍｉＲＮＡの存在を検出する。血清を採取し、３０００×ｇで１５分間遠心分離し０．２マイクロメートルフィルターを通過させて無細胞とし、全ＲＮＡの調製に使用する。全ＲＮＡ（５μｇ）を、ＹＭ−１００  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠視分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてサイズ分画する（ｂ３００ヌクレオチド）。回収した低分子ＲＮＡ（ｂ３００ｎｔ）を、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてポリ（Ａ）テールで３’延長する。後の蛍光色素染色のために、オリゴヌクレオチタグをポリ（Ａ）テールに連結する。低分子ＲＮＡを一晩、マイクロ循環ポンプを用いてμＰａｒａｆｌｏマイクロ流体チップ上でハイブリダイズさせる（Ａｔａｃｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。チップ上の各検出プローブは、標的ヒトｍｉＲＮＡ配列に相補的な化学修飾したヌクレオチドコードセグメントからなる。
【０１７５】
ＴＢＩ対象の血清対ヒトコントロール対象の血清で少なくとも２倍の増加または減少を示すｍｉＲＮＡ配列を表１４および１５に示す。
【０１７６】
【表１４】
0005909447.tif 000016
0005909447.tif 000017
0005909447.tif 000018
【０１７７】
【表１５】
0005909447.tif 000019
0005909447.tif 000020
【０１７８】
図３６に図示するように、同定された配列のクラスター解析を行う。
【０１７９】
関連する局在を有するさらなるｍｉＲＮＡを表１６および１７に記載する。
【０１８０】
【表１６】
0005909447.tif 000021
【０１８１】
【表１７】
0005909447.tif 000022
【０１８２】
ＧＦＡＰの調節に関連するｍｉＲＮＡの存在も上記無細胞血漿試料において測定する。神経変性状態を有する対象ではｍｉＲＮＡ−１２５ｂが増加する（Ｐｏｇｕｅ，ＡＩら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２０１０；４７６：１８−２２）。ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ検出したものと同じプライマーおよびプローブを用いて、ＴＢＩ後の対象の無細胞血漿におけるこのｍｉＲＮＡのレベル増加が検出される。簡潔には、製造者の説明書に従い、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で無細胞血漿の全ＲＮＡを抽出する。２６０／２８０ｎｍおよび２６０／２３０ｎｍでの分光測定によりＲＮＡの純度を決定する。１．８よりも大きい２６０／２８０ｎｍ吸光度比は通常、ＲＮＡ純度の許容される指標と見なされる。次いで、各試料由来の全ＲＮＡ１０ｎｇを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびｍｉＲＮＡ特異的プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡへ逆転写する。Ｄｈａｒａｐ，ＡおよびＶｅｍｕｇａｎｔｉ，Ｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，２０１０；１１３：１６８５？１６９１により同定されたｍｉＲＮＡの存在を、ＴＢＩ対象の無細胞血漿および虚血性脳卒中後の無関係な一組の対象において検出する。また、Ｌｅｉ，Ｐら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９；１２８４：１９１−２０１により同定されたｍｉＲＮＡのレベルも無細胞血漿中の存在について調べる。
【０１８３】
実施例１３：
【表１８】
0005909447.tif 000023
【０１８４】
本明細書で言及される特許文献および刊行物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標となるものである。これらの文献および刊行物は、各文献または刊行物が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれた場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
上記記載は本発明の特定の実施形態の具体例であるが、その実施を制限することを意図するものではない。以下の特許請求の範囲は、そのあらゆる均等物を含めて、本発明の範囲を定めることを意図するものである。
【０１８６】
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ＢＲＡＭＬＥＴＴ，Ｈ．Ｍ．，ａｎｄ  ＤＩＥＴＲＩＣＨ，Ｗ．Ｄ．（２００２）．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ａｎｄ  ｇｒａｙ  ｍａｔｔｅｒ  １  ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．（Ｂｅｒｌ）．１０３，６０７−６１４．
ＢＵＫＩ，Ａ．，ＯＫＯＮＫＷＯ，Ｄ．Ｏ．，ＷＡＮＧ  Ｋ．Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ  ＰＯＶＬＩＳＨＯＣＫ，Ｊ．Ｔ．（２０００）Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ａｘｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，２８２５−２８３４．
ＢＵＫＩ，Ａ．，ＳＩＭＡＮ，Ｒ．，ＴＲＯＪＡＮＯＷＳＫＩ，Ｊ．Ｑ．，ａｎｄ  ＰＯＶＬＩＳＨＯＣＫ，Ｊ．Ｔ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｘｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８，３６５−３７５．
ＢＡＲＴＵＳ，Ｒ．Ｔ．（１９９７）．Ｔｈｅ  ｃａｌｐａｉｎ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｔｉｓｔ．３，３１４−３２７．
ＣＡＮＵ，  Ｎ．，  ＤＵＳ，  Ｌ．，  ＢＡＲＢＡＴＯ，  Ｃ．，  ＣＩＯＴＴＩ，  Ｍ．Ｔ．，  ＢＲＡＮＣＯＬＩＮＩ，  Ｃ．，  ＲＩＮＡＬＤＩ  Ａ．Ｍ．，  ＮＯＶＡＫ，  Ｍ．，  ＣＡＴＴＡＮＥＯ，  Ａ．，  ＢＲＡＤＢＵＲＹ  Ａ．，  ａｎｄ  ＣＡＬＩＳＳＡＮＯ，  Ｐ．  （１９９８）．  Ｔａｕ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ８，  ７０６１−７０７４．
ＣＨＲＩＳＴＭＡＮ，Ｃ．Ｗ．，ＧＲＡＤＹ，Ｍ．Ｓ．，ＷＡＬＫＥＲ，Ｓ．Ａ．，ＨＯＬＬＯＷＡＹ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ  ＰＯＶＬＩＳＨＯＣＫ，Ｊ．Ｔ．（１９９４）．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ａｘｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１１，１７３−１８６．
ＣＨＵＮＧ，Ｃ．Ｗ．，ＳＯＮＧ，Ｙ．Ｈ．，ＫＩＭ，Ｉ．Ｋ．，ＹＯＯＮ，Ｗ．Ｊ．，ＲＹＥ，Ｂ．Ｒ．，ＪＯ，Ｄ．Ｇ．，ＷＯＯ，Ｈ．Ｎ．，ＫＷＯＮ，Ｙ．Ｋ．，ＫＩＭ，Ｈ．Ｈ．，ＧＷＡＧ，Ｂ．Ｊ．，ＭＯＯＫ−ＪＵＮＧ，Ｉ．Ｈ．，ａｎｄ  ＪＵＮＧ，Ｙ．Ｋ．（２００１）．Ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔａｕ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｓｐａｓｅ−３．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．８，１６２−１７２．
ＣＬＡＲＫ，Ｒ．Ｓ．，ＫＯＣＨＡＮＥＫ，Ｐ．Ｍ．，ＷＡＴＫＩＮＳ，Ｓ．Ｃ．，ＣＨＥＮ，Ｍ．，ＤＩＸＯＮ，Ｃ．Ｅ．，ＳＥＩＤＢＥＲＧ，Ｎ．Ａ．，ＭＥＬＩＣＫ，Ｊ．，ＬＯＥＦＦＥＲＴ，Ｊ．Ｅ．，ＮＡＴＨＡＮＩＥＬ，Ｐ．Ｄ．，ＪＩＮ，Ｋ．Ｌ．，ａｎｄ  ＧＲＡＨＡＭ，Ｓ．Ｈ．（２０００）．Ｃａｓｐａｓｅ−３  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅａｔｈ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  ７４，７４０−７５３．
ＤＥＬＯＢＥＬ  Ｐ，ＬＥＲＯＹ  Ｏ，ＨＡＭＤＡＮＥ  Ｍ，ＳＡＭＢＯ  ＡＶ，ＤＥＬＡＣＯＵＲＴＥ  Ａ，ＢＵＥＥ  Ｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ：  ａｎ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５７９，１−５．
ＤＩＸＯＮ，Ｃ．Ｅ．，ＣＬＩＦＴＯＮ，Ｇ．Ｌ．，ＬＩＧＨＴＨＡＬＬ  Ｊ．Ｗ．，ＹＡＧＨＭＡＩ，Ａ．Ａ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．（１９９１）．Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ３９，２５３−２６２．
ＤＲＵＢＩＮ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ  ＫＩＲＳＣＨＮＥＲ，Ｍ．Ｗ．（１９８６）．Ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０３，２７３９−２７４６．
ＦＲＡＮＺ，Ｇ．，ＢＥＥＲ，Ｒ．，ＫＡＭＰＦＬ，Ａ．，ＥＮＧＥＬＨＡＲＤＴ，Ｋ．，ＳＣＨＭＵＴＺＨＡＲＤ，Ｅ．，ＵＬＭＥＲ，Ｈ．，ａｎｄ  ＤＥＩＳＥＮＨＡＭＭＥＲ，Ｆ．（１９９５）．Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  １−４２  ａｎｄ  ｔａｕ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．６０，１４５７−１４６１．
ＧＡＢＢＩＴＡ  ＳＰ，ＳＣＨＥＦＦ  ＳＷ，ＭＥＮＡＲＤ  ＲＭ，ＲＯＢＥＲＴＳ  Ｋ，ＦＵＧＡＣＣＩＡ  Ｉ，ＺＥＭＬＡＮ  ＦＰ．（２００５）Ｃｌｅａｖｅｄ−ｔａｕ：ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２２，８３−９４．
ＧＡＭＢＬＩＮ  ＴＣ，ＣＨＥＮ  Ｆ，ＺＡＭＢＲＡＮＯ  Ａ，ＡＢＲＡＨＡ  Ａ，ＬＡＧＡＬＷＡＲ  Ｓ，ＧＵＩＬＬＯＺＥＴ  ＡＬ，ＬＵ  Ｍ，ＦＵ  Ｙ，ＧＡＲＣＩＡ−ＳＩＥＲＲＡ  Ｆ，ＬＡＰＯＩＮＴＥ  Ｎ，ＭＩＬＬＥＲ  Ｒ，ＢＥＲＲＹ  ＲＷ，ＢＩＮＤＥＲ  ＬＩ，ＣＲＹＮＳ  ＶＬ．Ｃａｓｐａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔａｕ，ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，１００３２−１００３７．
ＧＡＲＣＩＡ−ＳＩＥＲＲＡ  Ｆ，ＭＯＮＤＲＡＧＯＮ−ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ  Ｓ，ＢＡＳＵＲＴＯ−ＩＳＬＡＳ  Ｇ．（２００８）．Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１４，４０１−９．
ＧＡＬＥ，Ｓ．Ｄ．，ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｓ．Ｃ．，ＢＩＧＬＥＲ，Ｅ．Ｄ．，ａｎｄ  ＢＬＡＴＴＥＲ，Ｄ．Ｄ．（１９９５）．Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｓｏｃ．１，１７−２８．
ＧＡＲＣＩＡ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  ＣＬＥＶＥＬＡＮＤ，Ｄ．Ｗ．（２００１）．Ｇｏｉｎｇ  ｎｅｗ  ｐｌａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｌｄ  ＭＡＰ：ｔａｕ，ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３，４１−４８．
ＧＵＩＬＬＯＺＥＴ−ＢＯＮＧＡＡＲＴＳ  ＡＬ，ＧＡＲＣＩＡ−ＳＩＥＲＲＡ  Ｆ，ＲＥＹＮＯＬＤＳ  ＭＲ，ＨＯＲＯＷＩＴＺ  ＰＭ，ＦＵ  Ｙ，ＷＡＮＧ  Ｔ，ＣＡＨＩＬＬ  ＭＥ，ＢＩＧＩＯ  ＥＨ，ＢＥＲＲＹ  ＲＷ，ＢＩＮＤＥＲ  ＬＩ．（２００５）Ｔａｕ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２６，１０１５−１０２２．
ＨＩＧＵＣＨＩ，Ｍ．，ＬＥＥ，Ｖ．Ｍ．，ａｎｄ  ＴＲＯＪＡＮＯＷＳＫＩ，Ｊ．Ｑ．（２００２）．Ｔａｕ  ａｎｄ  ａｘｏｎｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．２，１３１−１５０．
ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｇ．Ｖ．，ＪＯＰＥ，Ｒ．Ｓ．，ａｎｄ  ＢＩＮＤＥＲ，Ｌ．Ｉ．（１９８９）．Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔａｕ  ｂｙ  ｃａｌｐａｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，１５０５−１５１１．
ＫＡＭＰＦＬ，Ａ．，ＰＯＳＭＡＮＴＵＲ，Ｒ．Ｍ．，ＺＨＡＯ，Ｘ．，ＳＣＨＭＵＴＺＨＡＲＤ，Ｅ．，ＣＬＩＦＴＯＮ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ  Ｒ．Ｌ．（１９９７）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １４，１２１−１３４．
ＫＩＲＡＬＹ  Ｍ，ＫＩＲＡＬＹ  ＳＪ．（２００７）Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｓｅｑｕｅｌａｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ−−ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｍｉｌｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ（ｃｏｎｃｕｓｓｉｏｎ）ａｒｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｔｏ  ｌａｔｅｒ−ｏｎｓｅｔ  ｂｒａｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｅｍｅｎｔｉａ．ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌ．２００７  Ｎｏｖ  １２；７：１７６８−７６．
ＫＮＯＢＬＡＣＨ，Ｓ．Ｍ．，ＮＩＫＯＬＡＥＶＡ，Ｍ．，ＨＵＡＮＧ，Ｘ．，ＦＡＮ，Ｌ．，ＫＲＡＪＥＷＳＫＩ，Ｓ．，ＲＥＥＤ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  ＦＡＤＥＮ，Ａ．Ｉ．（２００２）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｓｐａｓｅｓ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １９，１１５５−１１７０．
Ｋｏｓｉｋ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｆｉｎｃｈ，Ｅ．Ａ．（１９８７）．ＭＡＰ２  ａｎｄ  ｔａｕ  ｓｅｇｒｅｇａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ａｎｄ  ａｘｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｎｅｕｒｉｔｅｓ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｒｕｍ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７，３１４２−３１５３．
ＫＯＶＥＳＤＩ  Ｅ，ＬＵＣＫＬ  Ｊ，ＢＵＫＯＶＩＣＳ  Ｐ，ＦＡＲＫＡＳ  Ｏ，ＰＡＬ  Ｊ，ＣＺＥＩＴＥＲ  Ｅ，ＳＺＥＬＬＡＲ  Ｄ，ＤＯＣＺＩ  Ｔ，ＫＯＭＯＬＹ  Ｓ，ＢＵＫＩ  Ａ．（２０１０）．  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ（Ｗｉｅｎ）．１５２（１）：１−１７．
ＫＲＩＳＨＮＡＭＵＲＴＨＹ，Ｓ．，ａｎｄ  ＳＮＥＩＧＥ，Ｎ．（２００２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ．Ａｄｖ．Ａｎａｔ．Ｐａｔｈｏｌ．９，１８５−１９７．
ＬＩＴＥＲＳＫＹ，Ｊ．Ｍ．，ＳＣＯＴＴ，Ｃ．Ｗ．，ａｎｄ  ＪＯＨＮＳＯＮ，Ｇ．Ｖ．（１９９３）．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ，ｃａｌｐａｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｂｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔａｕ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６０４，３２−４０．
ＭＣＣＲＡＣＫＥＮ，Ｅ．，ＨＵＮＴＥＲ，Ａ．Ｊ．，ＰＡＴＥＬ，Ｓ．，ＧＲＡＨＡＭ，Ｄ．Ｉ．，ａｎｄ  ＤＥＷＡＲ，Ｄ．（１９９９）．Ｃａｌｐａｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｌｌｏｓｕｍ  ｏｆ  ｈｅａｄ−ｉｎｊｕｒｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １６，７４９−７６１．
ＭＣＩＮＴＯＳＨ，Ｔ．Ｋ．，ＳＭＩＴＨ，Ｄ．Ｈ．，ＭＥＡＮＥＹ，Ｄ．Ｆ．，ＫＯＴＡＰＫＡ，Ｍ．Ｊ．，ＧＥＮＮＡＲＥＬＬＩ，Ｔ．Ａ．，ａｎｄ  ＧＲＡＨＡＭ，Ｄ．Ｉ．（１９９６）．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｌａｅ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７４，３１５−３４１．
ＭＣＫＥＥ  ＡＣ， ＣＡＮＴＵ  ＲＣ， ＮＯＷＩＮＳＫＩ  ＣＪ， ＨＥＤＬＥＹ−ＷＨＹＴＥ  ＥＴ， ＧＡＶＥＴＴ  ＢＥ， ＢＵＤＳＯＮ  ＡＥ， ＳＡＮＴＩＮＩ  ＶＥ， ＬＥＥ  ＨＳ， ＫＵＢＩＬＵＳ  ＣＡ， ＳＴＥＲＮ  ＲＡ．（２００９）．Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ａｔｈｌｅｔｅｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｈｅａｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ． ６８（７）：７０９−３５．
ＭＥＤＡＮＡ，Ｉ．Ｍ．，ａｎｄ  ＥＳＩＲＩ，Ｍ．Ｍ．（２００３）．Ａｘｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ：ａ  ｋｅｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＣＮＳ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｒａｉｎ．１２６，５１５−５３０．
ＮＡＴＨ，Ｒ．，ＭＣＧＩＮＮＩＳ，Ｋ．Ｊ．，ＮＡＤＩＭＰＡＬＬＩ，Ｒ．，ＳＴＡＦＦＯＲＤ，Ｄ．，ａｎｄ  ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．（１９９６）．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＩＣＥ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ．８，２４９−２５５．
ＮＡＴＨ，Ｒ．，ＰＲＯＢＥＲＴ，Ａ．，ＪＲ．，ＭＣＧＩＮＮＩＳ，Ｋ．Ｍ．，ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．（１９９８）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ−３−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎ  Ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｎｓ−ａｎｄ  Ｈｙｐｏｘｉａ／ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ−Ｉｎｊｕｒｅｄ  Ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７１，  １８６−１９５．
Ｎｅｗｃｏｍｂ  ＪＫ，Ｋａｍｐｆｌ  Ａ，Ｐｏｓｍａｎｔｕｒ  ＲＭ，Ｚｈａｏ  Ｘ，Ｐｉｋｅ  ＢＲ，Ｌｉｕ  ＳＪ，Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＧＬ，ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ  ＲＬ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｔｏ  ａｌｐｈａ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１４，３６９−３８３．
ＮＧ，Ｈ．Ｋ．，ＭＡＨＡＬＩＹＡＮＡ，Ｒ．Ｄ．，ａｎｄ  ＰＯＯＮ，Ｗ．Ｓ．（１９９４）．Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ａｘｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｂｌｕｎｔ  ｈｅａｄ  ｔｒａｕｍａ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｘｏｎ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．９６，２４−３１．
ＰＡＲＫ  ＳＹ，ＦＥＲＲＥＩＲＡ  Ａ．（２００５）Ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  １７  ｋＤａ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  ｗｈｉｃｈ  ｔａｕ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５，５３６５−５３７５．
ＰＥＴＴＵＳ，Ｅ．Ｈ．，ＣＨＲＩＳＴＭＡＮ，Ｃ．Ｗ．，ＧＩＥＢＥＬ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  ＰＯＶＬＩＳＨＯＣＫ，Ｊ．Ｔ．（１９９４）．Ｔｒａｕｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ：ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｒａｕｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｘｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１１，５０７−５２２．
ＰＩＫＥ，Ｂ．Ｒ．，ＺＨＡＯ，Ｘ．，ＮＥＷＣＯＭＢ，Ｊ．Ｋ．，ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．，ＰＯＳＭＡＮＴＵＲ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．（１９９８ｂ）．Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｏ−ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．５２，５０５−５２０．
ＰＩＫＥ，Ｂ．Ｒ．，ＺＨＡＯ，Ｘ．，ＮＥＷＣＯＭＢ，Ｊ．Ｋ．，ＰＯＳＭＡＮＴＵＲ，Ｒ．Ｍ．，ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．（１９９８）．Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ．９，２４３７−２４４２．
ＰＩＫＥ，Ｂ．Ｒ．，ＦＬＩＮＴ，Ｊ．，ＤＡＶＥ，Ｊ．Ｒ．，ＬＵ，Ｘ．Ｃ．，ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．，ＴＯＲＴＥＬＬＡ，Ｆ．Ｃ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．（２００４）．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｌｐｈａＩＩ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｆｔｅｒ  ｍｉｄｄｌｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２４，９８−１０６．
ＰＯＳＭＡＮＴＵＲ，Ｒ．，ＫＡＭＰＦＬ，Ａ．，ＳＩＭＡＮ，Ｒ．，ＬＩＵ，Ｊ．，ＺＨＡＯ，Ｘ．，ＣＬＩＦＴＯＮ，Ｇ．Ｌ．，ａｎｄ  ＨＡＹＥＳ  Ｒ．Ｌ．（１９９７）．Ａ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏｓｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．７７，８７５−８８．
ＲＡＯ  ＭＶ，ＭＯＨＡＮ  ＰＳ，ＰＥＴＥＲＨＯＦＦ  ＣＭ，ＹＡＮＧ  ＤＳ，ＳＣＨＭＩＤＴ  ＳＤ，ＳＴＡＶＲＩＤＥＳ  ＰＨ，ＣＡＭＰＢＥＬＬ  Ｊ，ＣＨＥＮ  Ｙ，ＪＩＡＮＧ  Ｙ，ＰＡＳＫＥＶＩＣＨ  ＰＡ，ＣＡＴＡＬＤＯ  ＡＭ，ＨＡＲＯＵＴＵＮＩＡＮ  Ｖ，ＮＩＸＯＮ  ＲＡ．（２００８）．Ｍａｒｋｅｄ  ｃａｌｐａｓｔａｔｉｎ（ＣＡＳＴ）ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＡＳＴ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（４７）：１２２４１−５４．
ＲＩＳＳＭＡＮ  ＲＡ，ＰＯＯＮ  ＷＷ，ＢＬＵＲＴＯＮ−ＪＯＮＥＳ  Ｍ，ＯＤＤＯ  Ｓ，  ＴＯＲＰ  Ｒ，ＶＩＴＥＫ  ＭＰ，ＬＡＦＥＲＬＡ  ＦＭ，ＲＯＨＮ  ＴＴ，ＣＯＴＭＡＮ  ＣＷ．（２００４）Ｃａｓｐａｓｅ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔａｕ  ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔａｎｇｌｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（１），１２１−３０．
ＲＯＨＮ，Ｔ．Ｔ．，ＲＩＳＳＭＡＮ，Ｒ．Ａ．，ＨＥＡＤ，Ｅ．，ａｎｄ  ＣＯＴＭＡＮ，Ｃ．Ｗ．（２００２）．Ｃａｓｐａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｂｒａｉｎ：Ｔｏｒｔｕｏｕｓ  ａｎｄ  Ｔｏｒｔｕｒｏｕｓ．Ｄｒｕｇ  Ｎｅｗｓ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１５，５４９−５５７．
ＳＡＡＴＭＡＮ，Ｋ．Ｅ．，ＢＯＺＹＣＺＫＯ−ＣＯＹＮＥ，Ｄ．，ＭＡＲＣＹ，Ｖ．，ＳＩＭＡＮ，Ｒ．，ａｎｄ  ＭＣＩＮＴＯＳＨ，Ｔ．Ｋ．（１９９６）．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｃａｌｐａｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｒｅｇｉｏｎａｌｌｙ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５，８５０−８６０．
ＳＡＡＴＭＡＮ，Ｋ．Ｅ．，ＭＵＲＡＩ，Ｈ．，ＢＡＲＴＵＳ，Ｒ．Ｔ．，ＳＭＩＴＨ，Ｄ．Ｈ．，ＨＡＹＷＡＲＤ，Ｎ．Ｊ．，ＰＥＲＲＩ，Ｂ．Ｒ．，ａｎｄ  ＭＣＩＮＴＯＳＨ  Ｔ．Ｋ．（１９９６）．Ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＡＫ２９５  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｍｏｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，３４２８−３４３３．
ＳＡＡＴＭＡＮ，Ｋ．Ｅ，ＺＨＡＮＧ，Ｃ．，ＢＡＲＴＵＳ，Ｒ．Ｔ．，ａｎｄ  ＭＣＩＮＴＯＳＨ，Ｔ．Ｋ．（２０００）．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｏｓｔｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ，ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ，ｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．２０，６６−７３．
ＳＨＩＭＯＨＡＭＡ  Ｓ，ＴＡＮＩＮＯ  Ｈ，ＦＵＪＩＭＯＴＯ  Ｓ．（１９９９）Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃａｓｐａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｇｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２５６，３８１−３８４．
ＳＩＭＡＮ  Ｒ，ＭＣＩＮＴＯＳＨ  ＴＫ，ＳＯＬＴＥＳＺ  ＫＭ，ＣＨＥＮ  Ｚ，ＮＥＵＭＡＲ  ＲＷ，ＲＯＢＥＲＴＳ  ＶＬ．（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｒｅ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｂｒａｉｎ  ｄａｍａｇｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．１６（２），３１１−２０．
ＳＩＮＪＯＡＮＵ  ＲＣ，ＫＬＥＩＮＳＣＨＭＩＤＴ  Ｓ，ＢＩＴＮＥＲ  ＲＳ，ＢＲＩＯＮＩ  ＪＤ，ＭＯＥＬＬＥＲ  Ａ，ＦＥＲＲＥＩＲＡ  Ａ．（２００８）．Ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ａ−７０５２５３  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｙｎａｍｉｎ  １  ａｎｄ  ｔａｕ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ．５３（３−４）：７９−８８．
ＵＲＹＵ  Ｋ，ＣＨＥＮ  ＸＨ，ＭＡＲＴＩＮＥＺ  Ｄ，ＢＲＯＷＮＥ  ＫＤ，ＪＯＨＮＳＯＮ  ＶＥ，ＧＲＡＨＡＭ  ＤＩ，ＬＥＥ  ＶＭ，ＴＲＯＪＡＮＯＷＳＫＩ  ＪＱ，ＳＭＩＴＨ  ＤＨ．（２００７）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｉｎ  ａｘｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｂｒａｉｎ  ｔｒａｕｍａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０８，１８５−９２．
ＶＡＮ  ＤＥＮ  ＨＥＵＶＥＬ  Ｃ，ＴＨＯＲＮＴＯＮ  Ｅ，ＶＩＮＫ  Ｒ．（２００７）Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｐｒｏｇ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１６１：３０３−１６．
ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．（２０００）．Ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ：ｃａｎ  ｙｏｕ  ｔｅｌｌ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ？  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３，２０−２６．
ＷＡＲＲＥＮ，Ｍ．Ｗ．，ＫＯＢＥＩＳＳＹ，Ｆ．Ｈ．，  ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．，ＧＯＬＤ，Ｍ．Ｓ．，ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．（２００５）Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  αＩＩ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ａｎｄ  ｔａｕ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ：Ａ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｔｏ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ７８：３０１−３０９．
ＷＡＲＲＥＮ，ＭＷ．  ＺＨＥＮＧ，Ｗ．Ｒ．，ＫＯＢＥＩＳＳＹ，Ｆ．，ＬＩＵ，Ｍ．Ｃ．，，ＨＡＹＥＳ，Ｒ．Ｌ．，ＧＯＬＤ，ＭＡＲＫ，Ｍ．Ｃ．ＬＩＵ，ＡＮＤ  ＷＡＮＧ，Ｋ．Ｋ．Ｗ．（２００６）Ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  αＩＩ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  ａｎｄ  ｔａｕ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｅｒｅｂｒｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｅｃｓｔａｓｙ（ＭＤＭＡ）ｏｒ  ｍｅｔｈａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｐｈａｒｍ．９，１−１１．
ＹＡＮＧ  Ｌ．Ｓ．，ａｎｄ  ＫＳＩＥＺＡＫ−ＲＥＤＩＮＧ，Ｈ．（１９９５）．Ｃａｌｐａｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｔａｕ  ａｎｄ  ｔａｕ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｉｒｅｄ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３３，９−１７．
ＹＥＮ，Ｓ．，ＥＡＳＳＯＮ，Ｃ．，ＮＡＣＨＡＲＡＪＵ，Ｐ．，ＨＵＴＴＯＮ，Ｍ．，ａｎｄ  ＹＥＮ，Ｓ．Ｈ．（１９９９）．ＦＴＤＰ−１７  ｔａｕ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔａｕ  ｔｏ  ｃａｌｐａｉｎ  Ｉ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１，９１−９５．
ＹＯＳＨＩＹＡＭＡ  Ｙ，ＵＲＹＵ  Ｋ，ＨＩＧＵＣＨＩ  Ｍ，ＬＯＮＧＨＩ  Ｌ，ＨＯＯＶＥＲ  Ｒ，ＦＵＪＩＭＯＴＯ  Ｓ，ＭＣＩＮＴＯＳＨ  Ｔ，ＬＥＥ  ＶＭ，ＴＲＯＪＡＮＯＷＳＫＩ  ＪＱ．（２００５）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｔｒｏｐｈｙ，ａｎｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｍｉｌｄ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔａｕｏｐａｔｈｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２２，１３４−１１４１．
ＺＥＭＬＡＮ，Ｆ．Ｐ．，ＪＡＵＣＨ，Ｅ．Ｃ．，ＭＵＬＣＨＡＨＥＹ，Ｊ．Ｊ．，ＧＡＢＢＩＴＡ，Ｓ．Ｐ．，ａｎｄ  ＲＯＳＥＮＢＥＲＧ，Ｗ．Ｓ．Ｓｐｅｃｉａｌｅ  ＳＧ，ａｎｄ  Ｚｕｃｃａｒｅｌｌｏ  Ｍ．（２００２）．Ｃ−ｔａｕ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２３，１３１−１３９．
ＺＥＭＬＡＮ，Ｆ．Ｐ．，ＭＵＬＣＨＡＨＥＹ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ  ＧＵＤＥＬＳＫＹ，Ｇ．Ａ．（２００３）．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋａｉｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ：ｃｌｅａｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔａｕ（Ｃ−ｔａｕ）．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２１，３９９−４０９．
ＺＨＡＮＧ  ＪＹ，ＰＥＮＧ  Ｃ，ＳＨＩ  Ｈ，ＷＡＮＧ  Ｓ，ＷＡＮＧ  Ｑ，ＷＡＮＧ  ＪＺ．（２００９）Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｔａｕ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃａｌｐａｉｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．Ｊ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１６，３９−４７．
ＺＨＡＮＧ  Ｚ，ＬＡＲＮＥＲ  Ｓ，ＬＩＵ  ＭＣ，ＺＨＥＮＧ  Ｗ，ＨＡＹＥＳ  ＲＬ，ＷＡＮＧ  ＫＫＷ．（２００９）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  αＩＩ−ｓｐｅｃｔｒｉｎ  Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  Ｃａｌｐａｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｄｏｍｉｎａｔｅｄ  Ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｐａｔｈｗａｙｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ， １４，１２８９−１２９８．
【図１】
0005909447.tif 000024
【図２】
0005909447.tif 000025
【図３】
0005909447.tif 000026
【図４】
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【図５】
0005909447.tif 000028
【図６】
0005909447.tif 000029
【図７】
0005909447.tif 000030
【図８】
0005909447.tif 000031
【図９】
0005909447.tif 000032
【図１０】
0005909447.tif 000033
【図１１】
0005909447.tif 000034
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
0005909447.tif 000037
【図１５】
0005909447.tif 000038
【図１６】
0005909447.tif 000039
【図１７】
0005909447.tif 000040
【図１８】
0005909447.tif 000041
【図１９】
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【図２０】
0005909447.tif 000043
【図２１】
0005909447.tif 000044
【図２２】
0005909447.tif 000045
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0005909447.tif 000049
【図２７】
0005909447.tif 000050
【図２８】
0005909447.tif 000051
【図２９Ａ】
0005909447.tif 000052
【図２９Ｂ】
0005909447.tif 000053
【図３０】
0005909447.tif 000054
【図３１】
0005909447.tif 000055
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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