(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する方法であって、
ＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼを、候補化合物と、Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択されるアセチル化ペプチドである無蛍光活性化基質とで接触させること、
前記候補化合物の存在下で前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを検出すること、および
前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを、前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較することを含んでなり、
前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較して、前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが増加することが、前記化合物がＳＩＲＴ１サーチュイン活性化因子であることを示す、方法。
【請求項２】
前記候補化合物が、蛍光基を含有するアセチル化ペプチドまたはポリペプチド基質のＳＩＲＴ１活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼを、ＮＡＤまたは加水分解性ＮＡＤ類似体の存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
無蛍光活性化基質が、リシンアセチル化の位置に対して＋１でのトリプトファンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、ＮＡＤ加水分解の速度を測定することにより検出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＳＩＲＴ１サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、無蛍光活性化基質脱アセチル化の速度を測定することにより検出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験細胞と接触させ、前記試験細胞でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することをさらに含んでなり、
ＳＩＲＴ１活性化特異的変化がＦＧＦ２１産生の増加またはＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生の減少である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験対象体に投与し、前記試験対象体でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することをさらに含んでなり、
前記試験対象体が、糖尿病モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、血糖の低下であるか、あるいは、
前記試験対象体は、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、または多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される神経変性疾患の神経変性疾患モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、神経変性疾患プロセスまたはマーカーの減少である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択される構造式を有する無蛍光サーチュイン基質。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
遺伝子のサイレントインフォメーションレギュレーター（ＳＩＲ、Silent Information Regulator）ファミリーは、古細菌から真核生物に及ぶ生物のゲノムに存在する高度に保存された遺伝子の群である。コードされたＳＩＲタンパク質は、遺伝子サイレンシングの調節からＤＮＡ修復までの多様なプロセスに関与する。ＳＩＲ遺伝子ファミリーのメンバーによりコードされるタンパク質は、２５０個アミノ酸のコアドメインにおいて高度な配列保存を示す。このファミリーの十分に特徴付けられた遺伝子は、Ｓ．セレビシエＳＩＲ２であり、これは、酵母接合型、テロメア位置効果、および細胞老化を指定する情報を含有するサイレンシングＨＭ遺伝子座に関与する。酵母Ｓｉｒ２タンパク質は、ヒストンデアセチラーゼのファミリーに属する。Ｓｉｒ２相同体、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＣｏｂＢは、ＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）依存性ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼとして機能する。
【０００２】
Ｓｉｒ２タンパク質は、補基質としてＮＡＤ＋を使用するクラスＩＩＩデアセチラーゼである。多くが遺伝子サイレンシングに関与する他のデアセチラーゼとは異なり、Ｓｉｒ２は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）のような、クラスＩおよびＩＩヒストンデアセチラーゼ阻害剤に非感受性である。
【０００３】
Ｓｉｒ２によるアセチル−リジンの脱アセチル化は、ＮＡＤ＋加水分解と密接に関連しており、ニコチンアミドおよび新規のアセチル−ＡＤＰリボース化合物を産生する。Ｓｉｒ２のＮＡＤ＋依存性デアセチラーゼ活性は、酵母においてその生物学的役割を細胞代謝と結び付けることができるその機能に不可欠である。哺乳類Ｓｉｒ２相同体は、ＮＡＤ＋依存性ヒストンデアセチラーゼ活性を有する。
【０００４】
生化学的研究により、Ｓｉｒ２が、ヒストンＨ３およびＨ４のアミノ末端尾部を容易に脱アセチル化することができ、１−Ｏ−アセチル−ＡＤＰ−リボースおよびニコチンアミドの形成をもたらすことが示されている。ＳＩＲ２の追加コピーを有する菌株は、ｒＤＮＡサイレンシングの増加および３０％寿命長期化を示す。最近、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ＳＩＲ２相同体ｓｉｒ−２．１およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｄＳｉｒ２遺伝子の追加コピーは、これら生物の寿命を大きく延長させることが示されている。これは、老化に関するＳＩＲ２依存性調節経路が、進化の初期に生じ、よく保存されていることを示唆する。今日では、Ｓｉｒ２遺伝子は、生物の健康およびストレス耐性を増強して、困難な状況を生き延びる確率を増加させるように進化したと考えられている。
【０００５】
ヒトにおいては、Ｓｉｒ２の保存されている触媒ドメインを共有するＳｉｒ２様遺伝子（ＳＩＲＴ１〜ＳＩＲＴ７）が７つ存在する。ＳＩＲＴ１は、Ｓｉｒ２と最高度の配列類似性を示す核タンパクである。ＳＩＲＴ１は、脱アセチル化により、腫瘍抑制因子ｐ５３、細胞シグナル伝達因子ＮＦ−κＢ、およびＦＯＸＯ転写因子を含む複数の細胞標的を調節する。
【０００６】
ＳＩＲＴ３は、原核生物および真核生物で保存されているＳＩＲＴ１の相同体である。ＳＩＲＴ３タンパク質は、Ｎ末端に位置する固有ドメインにより、ミトコンドリアクリステに標的化される。ＳＩＲＴ３は、ＮＡＤ＋依存性タンパク質デアセチラーゼ活性を有し、遍在的に、特に代謝的に活性な組織で発現される。ミトコンドリアに移行すると、ＳＩＲＴ３は、ミトコンドリアマトリックスプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）により切断されて、より小型の活性型になると考えられる。
【０００７】
カロリー制限は、健康を増進し、哺乳動物の寿命を延長することが、７０年を超える期間にわたって知られている。酵母の寿命も、後生動物の寿命と同様に、低グルコース等の、カロリー制限に類似する介入により延長される。ＳＩＲ２遺伝子を欠如する酵母およびハエは両方とも、カロリー的制限されると長生きしないという発見は、ＳＩＲ２遺伝子が、カロリー制限食の有益な健康効果を媒介することを示す根拠を提供する。更に、酵母グルコース応答性ｃＡＭＰ（アデノシン３’，５’一リン酸）依存性（ＰＫＡ）経路の活性を低減する突然変異は、野生型細胞の寿命を延長させるが、突然変異体ｓｉｒ２菌株の寿命を延長せず、ＳＩＲ２が、カロリー制限経路の重要な下流成分である可能性が高いことを示す。
【０００８】
更に、ＳＩＲＴ１タンパク質および活性レベルがマウスでの遺伝子欠失または過剰発現により操作された研究では、代謝ストレスに関与するものを含む疾患の幾つかのモデルにおいてＳＩＲＴ１活性増加の有益効果が確認されている（Haigis, M. C., and Sinclair, D. (2010) Annu Rev Pathol 5, 253-259；Baur, J. A. (2010) Mech Aging Dev）。これは、最近ヒトにおいても同様に観察されており、インスリン感受性組織におけるＳＩＲＴ１発現の低減が、エネルギー消費の低減と関連していた（Rutanen et. al. (2010) Diabetes）。したがって、ＳＩＲＴ１が役割を果たすと考えられる疾患の多くの場合で、この酵素のデアセチラーゼ活性の活性化因子を投与することから治療効果が得られると予測される。過去数年間にわたって、レスベラトロール、およびより特異的な化学的に異なる分子を含むＳＩＲＴ１活性化化合物（ＳＴＡＣ）が開発されている（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716；Bemis et al. (2009) Bioorg Med Chem Lett 19, 2350-2353；Vu et al. (2009) J. Med. Chem.）。これら疾患の細胞に基づくモデルおよび動物モデルで試験すると、ＳＴＡは、この酵素の直接的活性化と一致する効果を生成する（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716；Feige et al. (2008) Cell Metab 8, 347-358；Funk et al. J Pharmacol Exp Ther; Jin et al. (2009) Protein Sci 18, 514-525；Liu et al. (2008) Nature 456, 269-273；Smith et al. (2009) BMC Syst Biol 3, 31；Yamazaki et al. (2009) Am J Physiol Endocrinol Metab；Yoshizaki et al. (2009) Mol Cell Biol 29, 1363-1374）。
【０００９】
これら化合物がＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を加速する機序は、分子レベルでは、まだよくわかっていない。１つの興味深い分野は、ペプチド基質の構造的特徴に対する活性化の依存性である。
【００１０】
ＳＩＲＴ１活性化のこの側面は、２００５年に初めて注目され、レスベラトロールは、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＡＭＣのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を活性化するが、このペプチドの単純なアミドまたは酸を活性化することができないことが、２つの論文で報告された（Howitz et al. (2003) Nature 425, 191-196；Borra et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 17187-17195；Kaeberlein et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 17038-17045を参照）。最近、レスベラトロールでの結果が確認され（Beher et al. (2009) Chem Biol Drug Des）、Ｐａｃｈｏｌｅｃらは、それら結果を拡張して（Pacholec et al. (2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）により最初に記述された３つの既報ＳＴＡＣ、ＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ１７２０、およびＳＲＴ２１８３を研究に含めた（図１を参照）。Ｐａｃｈｏｌｅｃら（(2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）は、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）により使用されたＴＡＭＲＡ標識２０量体（ＴＡＭＲＡペプチド；このペプチドおよび他のペプチド基質の構造は、表３を参照）を含む幾つかのアセチル化ペプチド基質、およびＳＩＲＴ１の２つのタンパク質基質を使用して、ＳＩＲＴ１のＳＴＡＣ媒介性活性化を調査した。この研究の主な観察は、（ｉ）未修飾ペプチドまたはタンパク質基質で活性化が観察されなかったため、ＴＡＭＲＡ標識の存在が、活性化に必要であること、（ｉｉ）ＳＲＴ１４６０およびＳＲＴ１７２０は、ＴＡＭＲＡペプチドに結合することができること、および（ｉｉｉ）ＳＲＴ１４６０は、ＳＩＲＴ１：ＴＡＭＲＡペプチド複合体と相互作用することであった。これら観察により、著者らは、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１活性化が、活性化因子とＴＡＭＲＡペプチドとの複合体形成を伴う「間接的」機序によるはずであると結論付けた。Ｐａｃｈｏｌｅｃらは、特定機序の仮説を立てるには至らなかっ
たが、ＳＩＲＴ１の活性化は、この複合体のＳＩＲＴ１触媒性代謝回転の動力学が有利であることに起因するものと推測された。本発明者らが「基質増強による活性化」と呼ぶこの提唱は、図２Ａに模式的形態で示されている。図２Ａの提唱機序が、ＳＩＲＴ１のＳＴＡＣ媒介性活性化を説明することができるか否か決定するためには、この提唱機序を徹底的に分析することが必要である。
【００１１】
本発明は、基質増強による活性化という間接的機序が、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１の活性化を説明するには不適当であることを示すサーチュイン活性化化合物の作用機序のより良好な理解を提供する。特に、図２Ａの提供機序には、ＳＴＡＣの活性化効力と基質に対する親和性との間に相関性があることが必要であるが、それは存在しない。加えて、幾つかのＳＴＡＣは、遊離ＳＩＲＴ１に結合することを示すことができる。そのような結合は、図２Ａの機序では説明できない。最後に、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１活性化のデータセットは、図２Ａの機序の速度則にうまくフィッティングすることができない。まとめると、これらの結果により、基質増強による活性化という間接的機序が、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１活性化を説明するには不適当であることが指摘される。
【００１２】
したがって、サーチュイン活性化化合物の作用機序のより良好な理解が、サーチュイン機能の理解を深め、新しい活性化因子化合物の強化されたスクリーニングを開発するために必要とされている。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＳＩＲＴ１活性化因子化合物（ＳＴＡＣ）サーチュイン酵素活性化の特徴を決定する、サーチュイン基質構造の固有な特徴の発見に部分的に基づく。特に、あるＳＴＡＣは、ＴＡＭＲＡ蛍光基（つまりｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド）を欠如するが、ビオチン等の別の大きい基を含有するＴＡＭＲＡペプチド類似体、ならびに天然アミノ酸のみを含んでなるある未標識ペプチド（例えば、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＰｈｅおよびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ）の脱アセチル化を加速することができるが、他のペプチド（例えば、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ａｌａ）の脱アセチル化を加速することができない。したがって、本発明は、インドール（Ｔｒｐ）またはフェニル基（Ｐｈｅ）等の「活性化補助因子」部分、またはＤＢＣ１（乳癌１では欠失）、ＨＩＣ１（癌１では過剰メチル化）、ＡＲＯＳ（ＳＩＲＴ１の活性調節因子）、もしくはＣＬＯＣＫ（Hirayma et al. (2007) Nature 450: 1086-90；Sassone-Corsi et al. (2008) Cell 134, 329-340）等の活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質を含む、無蛍光基ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質基質、ならびにこれら基質を使用してＳＩＲＴ１等のサーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する関連方法を提供する。本発明は、無蛍光活性化基質を活性化することができる、ある新規ＳＴＡＣ化合物を更に提供する。
【００１４】
加えて、本発明は、新規ＳＩＲＴ１活性化因子化合物、その塩、および関連する医薬組成物を提供する。
【００１５】
１つの態様では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する方法を提供する。本方法は、サーチュインデアセチラーゼを、候補化合物、およびサーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質等の無蛍光活性化基質と接触させ、その後、候補化合物の存在下で無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを検出するステップを含む。その後、候補化合物の存在下での無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを、候補化合物の非存在下での無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較する。したがって、候補化合物の非存在下での無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較して、候補化合物の存在下での無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが増加することは、この化合物がサーチュイン活性化因子であることを示す。好ましい実施形態では、無蛍光アセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、リジンアミノ酸残基のイプシロンアミノ基がアセチル化されている。
【００１６】
ある好ましい実施形態では、本発明のこの方法で使用されるサーチュインデアセチラーゼは、ＳＩＲＴ１である。他の実施形態では、サーチュインデアセチラーゼは、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、またはＳＩＲＴ５である。
【００１７】
特定の実施形態では、候補化合物は、蛍光基含有ペプチド基質のＳＩＲＴ１活性化因子である（例えば、ＴＡＭＲＡペプチドＡｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅ−ＳＴＥＧＫ（５−ＴＭＲ）ＥＥ−ＮＨ２）。
【００１８】
好ましい実施形態では、サーチュインデアセチラーゼは、ＮＡＤ＋の存在下で無蛍光活性化基質および候補化合物と接触する。他の実施形態では、サーチュインデアセチラーゼは、ＮＡＤ＋類似体の存在下で無蛍光活性化基質および候補化合物と接触する。
【００１９】
ある好ましい実施形態では、サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルは、無蛍光活性化基質脱アセチル化の速度を測定することにより検出される。他の実施形態では、サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルは、ＮＡＤ＋加水分解の速度を測定することにより検出される。
【００２０】
更なる実施形態では、無蛍光活性化基質は、ビオチン化ポリペプチドである。好ましい実施形態では、無蛍光活性化基質は、蛍光基ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミンおよびＡＭＣ（７−アミド−４−メチルクマリン）を含んでいないアセチル化ペプチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、無蛍光活性化基質は、アセチル化ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドＡｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫＥＥ−ＮＨ２である。更なる実施形態では、無蛍光活性化基質は、Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択されるアセチル化ペプチドである。他の実施形態では、上記の本発明の方法で使用される無蛍光活性化基質は、活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質またはリガンドと組み合わせたサーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質を含んでなる。例えば、活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質は、ＤＢＣ１（乳癌１では欠失）タンパク質、ＨＩＣ１（癌１では過剰メチル化）タンパク質、ＡＲＯＳ（ＳＩＲＴ１の活性調節因子）タンパク質、またはＣＬＯＣＫおよび／もしくはＢＭＡＬタンパク質であってもよい。特定の実施形態では、アセチル化タンパク質は、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ｐ５３、ｐ３００、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＦＯＸＯ４、ｐ６５、ＨＩＶＴａｔ、ＰＧＣ−１α、ＰＣＡＦ、ＭｙｏＤ、ＰＰＡＲγ、またはＫｕ７０である。
【００２１】
本発明の方法のある実施形態では、化合物は、無蛍光活性化基質のＳＩＲＴ１脱アセチル化の活性化因子である。特定の実施形態では、無蛍光活性化基質のＳＩＲＴ１脱アセチル化の活性化因子は、下記式（ＸＬ）による構造物またはその塩を有し、
【００２２】
【化１】
0006038773.tif 000002
式中、Ｒ１は、−（ＣＨ２）３−ＣＨ３および−（ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２から選択され、Ｒ２は、−ピペリジンまたは−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３である。ある好ましい実施形態では、化合物またはその塩は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、または（ＸＩＩＩ）を有する。
【００２３】
【化２】
0006038773.tif 000003
【００２４】
【化３】
0006038773.tif 000004
【００２５】
【化４】
0006038773.tif 000005
【００２６】
本発明の方法のまた更なる実施形態では、本発明は、ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択するステップ、およびＳＩＲＴ１活性化因子を試験細胞と接触させるステップ、および試験細胞におけるＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出するステップを更に含む。ある実施形態では、ＳＩＲＴ１活性化特異的変化は、ＦＧＦ２１産生の増加である。他の実施形態では、ＳＩＲＴ１活性化特異的変化は、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生の減少である。
【００２７】
他の実施形態では、本発明の方法は、ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択するステップ、およびＳＩＲＴ１活性化因子を試験対象体に投与するステップ、および試験対象体におけるＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出するステップを更に含む。ある実施形態では、試験対象体は、糖尿病モデルマウスであり、ＳＩＲＴ１活性化特異的変化は、血糖の低下である。他の実施形態では、試験対象体は、神経変性疾患モデルマウスであり、ＳＩＲＴ１活性化特異的変化は、神経変性疾患プロセスまたはマーカー（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、または多発性硬化症（ＭＳ））の減少である。
【００２８】
別の態様では、本発明は、構造式Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２またはＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２を有する無蛍光サーチュイン基質を提供する。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）のサーチュイン調節化合物を提供する：
【００３０】
【化５】
0006038773.tif 000006
【００３１】
【化６】
0006038773.tif 000007
【００３２】
【化７】
0006038773.tif 000008
【００３３】
【化８】
0006038773.tif 000009
【００３４】
【化９】
0006038773.tif 000010
【００３５】
【化１０】
0006038773.tif 000011
【００３６】
【化１１】
0006038773.tif 000012
【００３７】
【化１２】
0006038773.tif 000013
【００３８】
【化１３】
0006038773.tif 000014
【００３９】
【化１４】
0006038773.tif 000015
【００４０】
【化１５】
0006038773.tif 000016
【００４１】
【化１６】
0006038773.tif 000017
【００４２】
【化１７】
0006038773.tif 000018
【００４３】
【化１８】
0006038773.tif 000019
【００４４】
【化１９】
0006038773.tif 000020
【００４５】
【化２０】
0006038773.tif 000021
【００４６】
【化２１】
0006038773.tif 000022
【００４７】
【化２２】
0006038773.tif 000023
【００４８】
【化２３】
0006038773.tif 000024
【００４９】
【化２４】
0006038773.tif 000025
【００５０】
【化２５】
0006038773.tif 000026
【００５１】
更なる態様では、本発明は、式（Ｉ）〜（ＸＸＩ）のいずれかの１つの化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、追加の活性剤を更に含む。
【００５２】
更に別の態様では、本発明は、式（Ｉ）〜（ＸＸＩ）のいずれか１つの化合物を含んでなる医薬組成物をその必要性のある対象体に投与にすることにより、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれらの合併症を罹患しているか、またはそれらに感受性である対象体を治療するための、または対象体のインスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
【００５３】
また更なる態様では、本発明は、構造式（ＸＸＸＩ）のサーチュイン調節化合物またはその塩を提供し、
【００５４】
【化２６】
0006038773.tif 000027
式中、ＸおよびＹの一方は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１から選択され、ＸおよびＹの他方はＨであり、ここでＲ１は、フェニルまたは融合ヘテロ環（hetereocycle）から選択され、Ｒ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキル、および−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）飽和ヘテロ環から独立して選択される１〜２つの置換基で置換されていてもよく、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−飽和ヘテロ環で置換されていてもよく、飽和ヘテロ環は、ピペリジン、ピロリジン、またはピペラジンから選択され、Ｒ１は、融合ヘテロ環から選択され、融合ヘテロ環は、ベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、またＲ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよく、Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２であり、ここでＲ２は、−ＮＨ（Ｃ1〜Ｃ３アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、または−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）２から選択され、ここでＲ２は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）飽和ヘテロ環であり、飽和ヘテロ環は、モルホリンまたはピペラジンから選択される。
【００５５】
特定の実施形態では、本発明は、構造式（ＸＩＩＩ）〜（ＸＸＩ）を有する構造式（ＸＸＸＩ）の化合物またはその塩を提供する：
【００５６】
【化２７】
0006038773.tif 000028
【００５７】
【化２８】
0006038773.tif 000029
【００５８】
【化２９】
0006038773.tif 000030
【００５９】
【化３０】
0006038773.tif 000031
【００６０】
【化３１】
0006038773.tif 000032
【００６１】
【化３２】
0006038773.tif 000033
【００６２】
【化３３】
0006038773.tif 000034
【００６３】
【化３４】
0006038773.tif 000035
【００６４】
【化３５】
0006038773.tif 000036
【００６５】
特定の態様では、本発明は、構造式（ＸＸＸＩＩ）のサーチュイン調節化合物またはその塩を提供し、
【００６６】
【化３６】
0006038773.tif 000037
式中、Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピロリジンまたは−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたは−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明は、構造式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、および（ＸＶ）を有する構造式（ＸＸＸＩＩ）の化合物またはその塩を提供する。
【００６８】
【化３７】
0006038773.tif 000038
【００６９】
【化３８】
0006038773.tif 000039
【００７０】
【化３９】
0006038773.tif 000040
【００７１】
特定の態様では、本発明は、構造式（ＸＸＸＩＩＩ）のサーチュイン調節化合物またはその塩を提供し、
【００７２】
【化４０】
0006038773.tif 000041
式中、Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよび−（Ｃ１〜Ｃ３）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明は、構造式（ＸＶＩ）および（ＸＶＩＩＩ）を有する構造式（ＸＸＸＩＩＩ）の化合物またはその塩を提供する。
【００７４】
【化４１】
0006038773.tif 000042
【００７５】
【化４２】
0006038773.tif 000043
【００７６】
特定の態様では、本発明は、構造式（ＸＸＸＩＶ）のサーチュイン調節化合物またはその塩を提供し、
【００７７】
【化４３】
0006038773.tif 000044
式中、Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２から選択され、ここでＲ２は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、および−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４）２から選択され、Ｒ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよいフェニルおよびベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、ここでＲ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキルから独立して選択される１〜２つの置換基で更に置換されていてもよく、Ｒ１がフェニルである場合、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−ピペリジンで更に置換されていてもよい。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明は、構造式（ＸＶＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＸＩ）を有する構造式（ＸＸＸＩＶ）の化合物またはその塩を提供する。
【００７９】
【化４４】
0006038773.tif 000045
【００８０】
【化４５】
0006038773.tif 000046
【００８１】
【化４６】
0006038773.tif 000047
【００８２】
【化４７】
0006038773.tif 000048
【００８３】
本発明は、構造式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＩ）の化合物を含む構造式（ＸＸＸＩ）、（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のサーチュイン調節化合物を含有する医薬組成物を更に提供する。
【００８４】
更なる態様では、本発明は、構造式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＩ）を含む式（ＸＸＸＩ）、（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のいずれかの１つの化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。ある実施形態では、医薬組成物は、追加の活性剤を更に含む。
【００８５】
更に別の態様では、本発明は、構造式（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＸＩ）を含む式（ＸＸＸＩ）、（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のいずれか１つの化合物を含んでなる医薬組成物をその必要性のある対象体に投与にすることにより、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれらの合併症を罹患しているか、またはそれらに感受性である対象体を治療するための、または対象体のインスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、サーチュイン調節化合物またはサーチュイン調節化合物を含んでなる組成物を使用するための方法を提供する。ある実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、例えば、細胞の寿命を増加させること、ならびに、例えば老化もしくはストレスに関連する疾患もしくは障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘導性神経障害、虚血事象に伴う神経障害、眼疾患および／もしくは障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、ならびに／または潮紅等を含む多種多様な疾患および障害を治療および／または予防することを含む多様な治療応用に使用することができる。また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ミトコンドリア活性の増加、筋肉性能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素もしくは虚血に伴う筋組織損傷の治療もしくは予防から利益を得る可能性のある対象体の疾患または障害を治療するために使用することができる。他の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を減少させるサーチュイン調節化合物は、例えば、ストレスに対する細胞感受性の増加、アポトーシスの増加、癌の治療、食欲の刺激、および／または体重増加の刺激等を含む多様な治療適用に使用することができる。下記に更に記載されているように、本方法は、薬学的有効量のサーチュイン調節化合物を、その必要性のある対象体に投与することを含んでなる。ある態様では、サーチュイン調節化合物は、単独で、または他のサーチュイン調節化合物もしくは他の治療剤を含む他の化合物と組み合わせて投与してもよい。ある好ましい実施形態では、本発明は、式（Ｉ）〜（ＸＸＩ）のいずれか１つの化合物を含む構造式（ＸＬ）、（ＸＸＸＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のサーチュイン調節化合物またはその塩を対象体に投与にすることにより、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれらの合併症を罹患しているか、またはそれらに感受性である対象体を治療するための、または対象体のインスリン感受性を増加させるための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ１７２０、およびＳＲＴ２１８３の化学構造を示す図である。
【図２Ａ】アセチル化基質（Ｓ）に対するＳＩＲＴ１酵素（Ｅ）の酵素活性化の「間接的」機序を示す図であり、この機序では、活性化因子Ｘが基質Ｓに結合し、活性化は、Ｘ：Ｓ代謝回転の動力学が好ましいことに起因する。
【図２Ｂ】アセチル化基質（Ｓ）に対するＳＩＲＴ１酵素（Ｅ）の酵素活性化のアロステリック機序を示す図であり、この機序では、活性部位の基質とアロステリック非活性部位の活性化因子との結合が、（Ｘ：Ｅ：Ｓ）’の形成に結び付き、γ／β＜１の場合に活性化がもたらされる。
【図３】図２Ａの「間接的」活性化機序を仮定して、表示のＫｄ値での活性化因子濃度に対する相対的初速度の依存性をシミュレーションした図である。シミュレーションは、０．５μＭに設定された［Ｓ］ｏを用いて、数式（５）、および数式（８）の遊離基質濃度の表現、および本文に記載のパラメーター指定を使用して実施した。挿入図は、図２Ａの機序の場合のＫｄに対するＫｘ，ａｐの線形依存性を示す。
【図４Ａ】ＳＩＲＴ１活性化因子（図５の構造４）とＴＡＭＲＡペプチドとの相互作用に関する熱量測定研究を示す図であり、活性化因子とＴＡＭＲＡペプチドとの結合が欠如していることを示す。
【図４Ｂ】ＳＩＲＴ１活性化因子（図５の構造７）とＴＡＭＲＡペプチドとの相互作用に関する熱量測定研究を示す図であり、活性化因子が３６μＭのＫｄでＴＡＭＲＡペプチドと結合することを示す。挿入図は、相対速度対［３］ｏの活性化滴定曲線を示し、この曲線から０．５μＭのＥＣ５０が計算される（ＥＣ１．５＝０．１μＭ）。
【図５】ＳＩＲＴ１の活性化の場合、ＥＣ１．５では、活性化因子とＴＡＭＲＡペプチドとの結合のＫｄに依存性が欠如していることを示す図である。本文で考察した特定の化合物の構造が示されている。白抜き円は、Ｋｄ≧１００μＭを有する化合物についてである。灰色バーは、２．５μＭから１００μＭを超える範囲のＫｄ値を有するが、約０．３μＭの同じＥＣ１．５値を有する一連の化合物を強調する。
【図６】ＴＡＭＲＡペプチドのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化について、活性化因子（図５の構造２２）の相対速度の依存性を示す図である。２つの記号は、２つの独立実験に相当し、実線は、数式（１）による最適フィッティングパラメーター、ＥＣ５０＝３．９±０．５μＭ、ＲＶｍａｘ＝６．８±０．３を使用して描かれた。
【図７Ａ】Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）に示されているデータを使用し、基質を使用して、０．５μＭのＴＡＭＲＡペプチド基質濃度での［ＳＲＴ１４６０］ｏに対する相対速度の依存性を示す図である。このデータによる実線は、数式（５）および（８）、ならびに最適フィッティングパラメーターＫｍ，ｘ＝９０±８ｎＭ、γ＝０．２０＋０．０１を使用して描かれた。このフィッティングでは、以下の制約が使用された：Ｋｄ＝１４０μＭ、［Ｓ］ｏ＝０．０５μＭ、およびＫｍ＝１４．５μＭ。
【図７Ｂ】各データセットが、最良適合パラメーター（表５）を使用してミカエリス−メンテン式にフィッティングされて、実線（記号：▲、３７μＭ；Δ、１μＭ；▼、３μＭ；Ｏ、０μＭ）が描かれていることを示す図である。
【図８Ａ】ＳＩＲＴ１に対する化合物１１（表６を参照）の結合を示す図である。ＩＴＣは、化合物１１が、０．３２μＭのＫｄでＳＩＲＴ（１８３〜６６４）に結合することを示す。
【図８Ｂ】化合物１１（表６を参照）の蛍光は、ＳＩＲＴ（１８３〜６６４）の濃度増加と共に増加することを示す図である。
【図８Ｃ】化合物１１（表６を参照）が、０．２７μＭのＫｄでＳＩＲＴ（１８３〜６６４）に結合することを示す図であり、滴定曲線は、図８Ｂのデータを使用して構築されている。
【図９】活性化因子化合物２２、２３、および２４（下記に示されている構造）によるＳＩＲＴ１の触媒活性の調節を示す図である。黒抜き記号は、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドの脱アセチル化の活性化に対応する。データポイントを数式（１）にフィッティングして、以下を得た：化合物２２  ＥＣ５０＝１．７±０．１μＭ、ＲＶｍａｘ＝２．６±０．１；化合物２３  ＥＣ５０＝２．２±０．３μＭ、ＲＶｍａｘ＝２．８±０．２；２４  ＥＣ５０＝１．５±０．１μＭ、ＲＶｍａｘ＝２．１±０．１。白抜き記号は、脱アセチル化ｐ５３−２０量体の阻害に対応する。データポイントを数式：ＲＶ＝１／（１＋（［Ｘ］ｏ／Ｋｉ，ａｐｐ））にフィッティングして、以下を得た：化合物２２  Ｋｉ，ａｐｐ＝９±４Ｖ、２３  Ｋｉ，ａｐｐ＝１０±１．０μＭ、２４  Ｋｉ，ａｐｐ＝９±３．０μＭ。
【図１０】化合物１０（図９）およびＳＲＴ１４６０（図１）が、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＸのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を活性化することを示す図である。上段パネル：Ｘ＝ＴｒｐＮＨ２、ＥＣ１．５＝１．９μＭ；Ｘ＝ＡＭＣ、ＥＣ１．５＝３．１μＭ。下段パネル：Ｘ＝ＴｒｐＮＨ２、ＥＣ１．５＝５．０μＭ、ＥＣ５０＝２７±８．０μＭ、およびＲＶｍａｘ＝４．１±０．１；Ｘ＝ＰｈｅＮＨ２、ＥＣ１．５＝２６．０μＭ。これら滴定は、３〜５回の独立実験であり、各ポイントは、これら実験の平均±標準偏差である。
【図１１】コアヘテロ環の配向のみが異なる２つのＳＩＲＴ１活性化因子の構造およびＥＣ１．５値を示す図である。
【図１２】ＳＩＲＴ１の活性部位に対するＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２の結合モデルである。
【図１３】ＳＩＲＴ１の活性部位にドッキングしたＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２のＳＩＲＴ３に基づく構造的相同性モデルを示す図である。Ｔｒｐ残基のインドールは、ＳＩＲＴ１相同性モデルのＰｈｅ４１４とＡｒｇ４４６との間に緩やかに挟まれており、この位置で大きい基と結合するための一種の分子「ピンセット」を形成する。
【図１４】活性化補助因子の必要性を伴うＳＩＲＴ１活性化機序のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルを示す図である。
【発明の具体的説明】
【００８８】
１．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、下記に示した意味を有するものとする。別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術的および科学用語は全て、当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００８９】
用語「作用剤(agent)」は、本明細書では、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子（核酸、抗体、タンパク質、またはそれらの部分、例えばペプチド等）、または細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳動物）細胞もしくは組織等の生物学的物質から作られた抽出物を示すために使用される。そのような作用剤の活性は、対象体中で局所的にまたは全身性に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質（複数可）である「治療剤」として、そのような作用剤を好適なものにする。
【００９０】
化合物を参照する場合の用語「生物学的に利用可能な」は、当技術分野で認識されており、投与される化合物または投与される化合物の量の一部が、それを投与する対象体または患者に吸収されるか、取り込まれるか、またはそうでなければ生理学的に利用可能になることを可能にする化合物の形態を指す。
【００９１】
「サーチュインの生物学的活性部分」は、脱アセチルする能力等の生物活性を有するサーチュインタンパク質の部分を指す。サーチュインの生物学的活性部分は、サーチュインのコアドメインを含んでなっていてもよい。ＮＡＤ＋結合ドメインおよび基質結合ドメインを包含するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のＳＩＲＴ１の生物学的活性部分には、例えば、限定ではないが、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド２３７〜９３２によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸６２〜２９３が含まれていてもよい。したがって、この領域は、コアドメインと呼ばれることがある。コアドメインと呼ばれることもあるＳＩＲＴ１の他の生物学的活性部分には、以下のものが含まれる：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド８３４〜１３９４によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２６１〜４４７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド７７７〜１５３２によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２４２〜４９３；またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド８１３〜１５３８によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２５４〜４９５。
【００９２】
用語「コンパニオン動物」は、ネコおよびイヌを指す。本明細書で使用される場合、用語「イヌ（複数可）」は、カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）種の任意のメンバーを指し、それには多数の異なる血統が存在する。用語「ネコ（複数可）」は、家ネコおよびネコ科ネコ属の他のメンバーを含むネコ動物を指す。
【００９３】
「糖尿病」は、高血圧糖またはケトアシドーシス、ならびに長期高血圧糖状態または耐糖能の減少から生じる慢性の一般的な代謝異常を指す。「糖尿病」は、この疾患のＩ型形態およびＩＩ型形態（非インスリン依存性真性糖尿病またはＮＩＤＤＭ）の両方を包含する。糖尿病の危険因子には、下記の因子が含まれる：男性の場合４０インチまたは女性の場合は３５インチを超える胴回り、１３０／８５ｍｍＨｇ以上の血圧、１５０ｍｇ／ｄｌを超えるトリグリセリド、１００ｍｇ／ｄｌを超える空腹時血糖、または男性では４０ｍｇ／ｄｌ未満もしくは女性では５０ｍｇ／ｄｌ未満の高密度リポタンパク質。
【００９４】
用語「ＥＤ５０」は、当技術分野で認識されている。ある実施形態では、ＥＤ５０は、その最大応答または効果の５０％をもたらす薬物の用量、またはその代わりに、試験対象体または調製物の５０％に所定の応答をもたらす用量を意味する。用語「ＬＤ５０」は、当技術分野で認識されている。ある実施形態では、ＬＤ５０は、試験対象体の５０％で致死性である薬物の用量を意味する。用語「治療指数」は、ＬＤ５０／ＥＤ５０として定義される薬物の治療指数を指す、当技術分野で認識されている用語である。
【００９５】
用語「無蛍光活性化基質」は、ＴＡＭＲＡまたはＡＭＣ等の当技術分野で認識されている蛍光標識基を含んでいないが、蛍光特性を有し、サーチュイン活性化因子化合物（ＳＴＡＣ）によるＳＩＲＴ１等のサーチュインの無蛍光活性化を更に可能にするフェニルアラニンおよびトリプトファン等の天然アミノ酸残基を含んでいてもよい、サーチュインデアセチラーゼ（例えば、ＳＩＲＴ１）のアセチル化基質を意味するものとする。そのような無蛍光活性化基質には、以下のものが含まれていてもよい：ヒストンＨ１、Ｈ３、およびＨ４、ｐ５３、ｐ３００、ＦＯＸＯ１、３ａ、および４、ｐ６５、ＨＩＶＴａｔ、ＰＧＣ−１α、ＰＣＡＦ、ＭｙｏＤ、ＰＰＡＲγ、ならびにＫｕ７０等の全長ＳＩＲＴ１タンパク質基質を含むアセチル化ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質基質、ならびにそのようなＳＴＡＣ活性化特性を有するそれらのペプチドおよびポリペプチド断片。そのような無蛍光活性化基質には、サーチュインのＳＴＡＣ活性化も可能にするビオチン等の非蛍光性の大きい基を有するペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質アセチル化基質が更に含まれていてもよい。そのような無蛍光活性化基質には、そのような基質にＳＴＡＣ活性化特性を付与する活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質またはリガンドと組み合わせた、したがって機能性「無蛍光活性化基質」を提供する基質および補助因子の組み合わせの、そうでなければＳＴＡＣ活性化に感受性でない場合があるアセチル化ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質サーチュイン基質がまた更に含まれていてもよい。好適なそのような補助因子には、ＤＢＣ１、ＨＩＣ１、ＡＲＯＳ、およびＣＬＯＣＫタンパク質が含まれ、それらは、そうでなければＳＴＡＣにより活性化されないサーチュイン基質にＳＴＡＣ活性化可能特性を提供する。
【００９６】
用語「高インスリン血症」は、血中のインスリンレベルが正常より高い個体の状態を指す。
【００９７】
用語「インスリン抵抗性」は、正常量のインスリンが、インスリン抵抗性を有していない対象体での生物学的応答と比べて正常未満の生物学的応答をもたらす状態を指す。
【００９８】
「インスリン抵抗性障害」は、本明細書で考察されているように、インスリン抵抗性により引き起こされるかまたは寄与する任意の疾患または状態を指す。例には、以下のものが含まれる：糖尿病、肥満、メタボリック症候群、インスリン抵抗性症候群、Ｘ症候群、インスリン抵抗性、高血圧、血圧上昇、高血中コレステロール、脂質異常症、高脂血症、脂質異常症、脳卒中、冠動脈疾患、または心筋梗塞を含むアテローム性動脈硬化疾患、高血糖症、高インスリン血症および／または高プロインスリン血症、耐糖能異常、遅延インスリン放出、冠動脈心疾患を含む糖尿病合併症、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、認知症の認知機能、網膜症、末梢性神経障害、腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、幾つかのタイプの癌（子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌）、妊娠合併症、不良な女性リプロダクティブヘルス（生理不順、不妊症、不規則な排卵、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）等）、リポジストロフィー、胆石、胆嚢炎（cholescystitis）、および胆石症等のコレステロール関連障害、痛風、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸器障害、骨関節炎、ならびに骨喪失、例えば骨粗鬆症の防止および治療。
【００９９】
用語「家畜動物」は、家畜四足動物を指し、それらには、食料および種々の副産物のために飼育されるもの、例えば、ウシおよびウシ属の他のメンバーを含むウシ動物、家畜ブタおよびイノシシ属の他のメンバーを含むブタ動物、ヒツジおよびヒツジ属の他のメンバーを含むヒツジ動物、家畜ヤギおよびヤギ属の他のメンバーが含まれ、家畜四足動物は、荷役用動物、例えば、家畜ウマおよびウマ科ウマ属の他のメンバーを含むウマ動物としての使用等の特化した使役のために飼育される。
【０１００】
用語「哺乳動物」は、当技術分野で公知であり、例示的な哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物（ウシ、ブタ等を含む）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ等）、およびげっ歯動物（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。
【０１０１】
「肥満」個体または肥満を被っている個体は、一般的に、少なくとも２５以上の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する個体である。肥満は、インスリン抵抗性に関連していてもまたはしていなくともよい。
【０１０２】
用語「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、当技術分野で認識されており、経腸および局所投与以外の通常は注射による投与方法を指し、それには、限定ではないが以下のものが含まれる：静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、アルティクラーレ内、被膜下、蜘蛛膜下、脊髄内、胸骨内の注射および点滴。
【０１０３】
「患者」、「対象体」、「個体」、または「宿主」は、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。
【０１０４】
用語「薬学的に許容される担体」は、当技術分野で認識されており、任意の主題組成物またはその成分の保持または輸送に関与する、液体または固体充填剤、希釈液、賦形剤、溶媒、または封入材料等の、薬学的に許容される材料、組成物、または媒体を指す。各担体は、主題組成物およびその成分と適合性であり、患者に有害ではないという意味で「許容」されなければならない。例えば、薬学的に許容される担体は、少なくとも１ｇ／ｋｇ、３ｇ／ｋｇ、または５ｇ／ｋｇものＬＤ５０を有していてもよい。あるいは、薬学的に許容される担体は、国の規制当局（例えば、米国食品薬品局）により、安全食品認定とみなされている物質（ＧＲＡＳ物質）であってもよい。薬学的に許容される担体としての役割を果たすことができる物質の幾つかの例には以下のものが含まれる：（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびジャガイモデンプン等のデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等のその誘導体；（４）トラガント粉末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバターおよび坐剤ワックス等の賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油等の油；（１０）プロピレングリコール等のグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱性物質水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）医薬製剤に使用される他の無毒適合性物質。
【０１０５】
用語「予防的」または「治療的」治療は、当技術分野で認識されており、薬物を宿主に投与することを指す。薬物が、望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態）の臨床徴候に先立って投与される場合、治療は予防的であり、つまり薬物は、望ましくない状態の発症から宿主を防御する。一方で、望ましくない状態の徴候後に投与される場合、治療は治療的であり、つまり薬物は、既存の望ましくない状態またはその副作用を減少、改善、または維持することが意図される。
【０１０６】
組成物に関する用語「無発熱性」は、組成物が投与されている対象体において有害効果（例えば、刺激、発熱、炎症、下痢、呼吸窮迫、エンドトキシンショック等）に結び付く可能性のある量の発熱性物質を含有していない組成物を指す。例えば、この用語は、例えばリポポリサッカリド（ＬＰＳ）等のエンドトキシンを含んでいないか、または実質的に含んでいない組成物を包含することが意図される。
【０１０７】
細胞の「複製寿命」は、個別の「母細胞」により産生される娘細胞の数を指す。他方では、「経時的老化」または「経時的寿命」は、栄養が奪われた際に非分裂細胞の集団が依然として成育可能である期間を指す。「細胞の寿命を増加させる」または「細胞の寿命を延長させる」は、細胞または生物に適用される場合、１つの細胞により産生される娘細胞の数を増加させること；細胞または生物が、例えばＤＮＡ、タンパク質に対するストレスに対処し、損傷と戦う能力を増加させこと；および／または細胞または生物が、特定の状態、例えばストレス（例えば、熱ショック、浸透圧ストレス、強力なエネルギー放射、化学的誘導されるストレス、ＤＮＡ損傷、不適切な塩レベル、不適切な窒素レベル、または不適切な栄養レベル）下でより長期にわたって生存し、生存状態で存在する能力を増加させることを指す。寿命は、本明細書に記載の方法を使用して、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または２０％〜７０％、３０％〜６０％、４０％〜６０％以上増加させることができる。
【０１０８】
「サーチュイン活性化化合物」は、サーチュインタンパク質のレベルを増加させる、および／またはサーチュインタンパク質の少なくとも１つの活性を増加させる化合物を指す。例示的な実施形態では、サーチュイン活性化化合物は、サーチュインタンパク質の少なくとも１つの生物活性を、少なくとも約１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％以上増加させることができる。サーチュインタンパク質の例示的な生物活性には、例えば、ヒストンおよびｐ５３の脱アセチル化；寿命の延長；ゲノム安定性の増加；転写のサイレンシング；および母細胞と娘細胞と間の酸化タンパク質分配の制御が含まれる。
【０１０９】
「サーチュインタンパク質」は、サーチュインデアセチラーゼタンパク質ファミリー、または好ましくはｓｉｒ２ファミリーのメンバーを指し、それらには、以下のものが含まれる：酵母Ｓｉｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ５３６８５）、Ｃ．エレガンスＳｉｒ−２．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５０１９１２）、およびヒトＳＩＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８およびＮＰ＿０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））、およびＳＩＲＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３７、ＮＭ＿０３０５９３、ＮＰ＿０３６３６９、ＮＰ＿０８５０９６、およびＡＦ０８３１０７）タンパク質。他のファミリーメンバーには、「ＨＳＴ遺伝子」（Ｓｉｒ２の相同体（homologues of Sir two））と称される４つの更なる酵母Ｓｉｒ２様遺伝子、ＨＳＴ１、ＨＳＴ２、ＨＳＴ３、およびＨＳＴ４、ならびに５つの他のヒト相同体、ｈＳＩＲＴ３、ｈＳＩＲＴ４、ｈＳＩＲＴ５、ｈＳＩＲＴ６、およびｈＳＩＲＴ７が含まれる（Brachmann et al. (1995) Genes Dev. 9:2888およびFrye et al. (1999) BBRC 260:273）。好ましいサーチュインは、ＳＩＲＴ１に存在し、ＳＩＲＴ２には存在せず、ＳＩＲＴ３等が有するＮ末端配列の少なくとも一部を有するメンバー等の、ＳＩＲＴ２よりもＳＩＲＴ１と、つまりｈＳＩＲＴ１および／またはＳｉｒ２とより多くの類似点を共有するものである。
【０１１０】
「ＳＩＲＴ１タンパク質」は、サーチュインデアセチラーゼのｓｉｒ２ファミリーのメンバーを指す。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ１タンパク質には、以下のものが含まれる：酵母Ｓｉｒ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ５３６８５）、Ｃ．エレガンスＳｉｒ−２．１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿５０１９１２）、ヒトＳＩＲＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８またはＮＰ＿０３６３７０（またはＡＦ０８３１０６））、およびヒトＳＩＲＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３７、ＮＭ＿０３０５９３、ＮＰ＿０３６３６９、ＮＰ＿０８５０９６、またはＡＦ０８３１０７）タンパク質、ならびにその等価物および断片。別の実施形態では、ＳＩＲＴ１タンパク質には、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９、またはＰ５３６８５に示されているアミノ酸配列を含んでなるか、からなるか、またはから本質的になるポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ１タンパク質には、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９、またはＰ５３６８５；１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、または７５個以上の保存的アミノ酸置換を有するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９、またはＰ５３６８５に示されているアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９、またはＰ５３６８５と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、およびそれらの機能的断片の全てまたは部分を含んでなるポリペプチドが含まれる。また、本発明のポリペプチドには、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０、ＮＰ＿５０１９１２、ＮＰ＿０８５０９６、ＮＰ＿０３６３６９、またはＰ５３６８５の相同体（例えば、オルソログおよびパラログ）、変異体、または断片が含まれる。
【０１１１】
「ＳＩＲＴ３タンパク質」は、サーチュインデアセチラーゼファミリーのメンバー、および／またはＳＩＲＴ１タンパク質の相同体を指す。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ３タンパク質には、ヒトＳＩＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、またはＮＰ＿００１０１７５２４）およびマウスＳＩＲＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０７１８７８）タンパク質、ならびにその等価物および断片が含まれる。別の実施形態では、ＳＩＲＴ３タンパク質には、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４、またはＮＰ＿０７１８７８に示されているアミノ酸配列を含んでなるか、からなるか、またはから本質的になるポリペプチドが含まれる。ＳＩＲＴ３タンパク質には、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４、またはＮＰ＿０７１８７８に示されているアミノ酸配列；１〜約２、３、５、７、１０、１５、２０、３０、５０、または７５個以上の保存的アミノ酸置換を有するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４、またはＮＰ＿０７１８７８に示されているアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４、またはＮＰ＿０７１８７８と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列、およびそれらの機能的断片の全てまたは部分を含んでなるポリペプチドが含まれる。また、本発明のポリペプチドには、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２、ＮＰ＿０３６３７１、ＮＰ＿００１０１７５２４、またはＮＰ＿０７１８７８の相同体（例えば、オルソログおよびパラログ）、変異体、または断片が含まれる。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ３タンパク質には、ミトコンドリアマトリックスプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）および／またはミトコンドリア中間体ペプチダーゼ（ＭＩＰ）による切断により産生されるＳＩＲＴ３タンパク質の断片が含まれる。
【０１１２】
用語「全身性投与」、「全身性に投与される」「末梢投与」、および「末梢投与される」は、当技術分野で認識されており、中枢神経系への直接投与以外の、主題組成物、治療用物質、または他の物質の投与を指し、そのため物質は患者の系に進入し、したがって代謝および他の同様のプロセスの影響を受ける。
【０１１３】
用語「治療剤」は、当技術分野で認識されており、対象体において局所的にまたは全身性に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的活性物質である任意の化学部分を指す。また、この用語は、動物またはヒトにおける疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防に、または望ましい物理的もしくは精神的発達および／もしくは状態の増強に使用するための任意の物質を意味する。
【０１１４】
用語「治療効果」は、当技術分野で認識されており、薬理学的活性物質により引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトにおける局所的または全身性効果を指す。語句「治療上有効量」は、任意の治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、幾つかの所望の局所的または全身性効果をもたらす物質の量を意味する。そのような物質の治療上有効量は、治療する対象体および疾患状態、対象体の体重および年齢、疾患状態の重症度、ならびに投与方法等に応じて変動することになり、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、本明細書に記載のある組成物は、そのような治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、所望の効果をもたらすのに十分な量で投与することができる。
【０１１５】
状態または疾患を「治療する」は、状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒ならびに改善することを指す。
【０１１６】
用語「視覚障害」は、視覚の減少を指し、これは、治療（例えば、外科手術）しても部分的に可逆的に過ぎないかまたは不可逆的であることが多い。特に重症の視覚障害は、「盲目」または「視力喪失」と呼ばれており、視覚の完全な喪失、矯正レンズで改善することができない２０／２００よりも悪い視覚、または直径２０度未満（半径１０度）の視野を指す。
【０１１７】
２．サーチュイン調節因子
１つの態様では、本発明は、例えば、老化またはストレスと関連する疾患または障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、眼疾患および障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、癌、ならびに／または潮紅等を含む多種多様な疾患および障害を治療および／または予防するための新規サーチュイン調節化合物を提供する。また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ミトコンドリア活性の増加、筋肉性能の増強、筋肉ＡＴＰレベルの増加、または低酸素もしくは虚血に伴う筋組織損傷の治療もしくは予防から利益を得る可能性のある対象体の疾患または障害を治療するために使用することができる。本明細書で開示された他の化合物は、本明細書に記載の医薬組成物および／または１つまたは複数の方法での使用に好適であり得る。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明のサーチュイン調節化合物は、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＸＩ）のいずれかの化合物を含む構造（ＸＬ）（ＸＸＸＩ）（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）により表される。
【０１１９】
下記に記載の実施形態は、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＸＩ）のいずれかの化合物を含む構造式：（ＸＬ）（ＸＸＸＩ）（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のいずれかの化合物に当てはまる。
【０１２０】
また、本発明の新規化合物を含む本発明の化合物は、本明細書に記載の方法に使用することができる。
【０１２１】
また、本明細書に記載の化合物およびその塩には、それらの対応する水和物（例えば、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物、四水和物）および溶媒和物が含まれる。当業者であれば、溶媒和物および水和物の調製に好適な溶媒を、一般的に選択することができる。
【０１２２】
化合物およびその塩は、非晶質または結晶性（共結晶性および多形体を含む）形態で存在してもよい。
【０１２３】
本発明のサーチュイン調節化合物は、有利には、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性、特にサーチュインタンパク質のデアセチラーゼ活性を調節する。
【０１２４】
上記の特性とは別にまたは上記の特性に加えて、本発明のあるサーチュイン調節化合物は、サーチュインタンパク質（例えば、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３タンパク質等）の脱アセチル化活性の調節に有効である化合物濃度で、以下の活性の１つまたは複数を実質的に示さない：ＰＩ３キナーゼの阻害、アルドレダクターゼの阻害、チロシンキナーゼの阻害、ＥＧＦＲチロシンキナーゼのトランス活性化、冠状動脈拡張、または鎮痙活性。
【０１２５】
アルキル基は、完全に飽和された直鎖または分岐炭化水素である。典型的には、直鎖または分岐アルキル基は、１から約２０個の、好ましくは１〜約１０個の炭素原子を有する。直鎖および分岐アルキル基に例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチル、およびオクチルが含まれる。Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分岐アルキル基は、「低級アルキル」基とも呼ばれる。
【０１２６】
シクロアルキル基は、完全に飽和された環式炭化水素である。
【０１２７】
炭素環には、５〜７員単環、および８〜１２員二環が含まれ、単環または二環は、飽和、不飽和、および芳香族から選択される。ある実施形態では、炭素環が二環系である場合、各環は、異なる飽和度により特徴付けることができる。例えば、芳香環、例えばフェニルは、飽和または不飽和環、例えばシクロヘキサン、シクロペンタン、またはシクロヘキセンに融合されていてもよい。飽和、不飽和、および芳香族二環のあらゆる組み合わせが、原子価が許容する限り、炭素環の定義に含まれる。例示的な炭素環には、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、アダマンチル、フェニル、およびナフチルが含まれる。
【０１２８】
ヘテロ環には、例えばＮ、Ｏ、およびＳ原子から選択される１つまたは複数のヘテロ原子を含んでなる４〜８員単環および８〜１２員二環が含まれる。ある実施形態では、ヘテロ環基は、飽和、不飽和、芳香族から選択される。ある実施形態では、二環系では、各環は、異なる飽和度により特徴付けることができる。例えば、芳香環、例えばフェニルまたはピリジンは、飽和環、例えばモルホリニルまたはテトラヒドロフランに融合されていてもよい。飽和、不飽和、および芳香族二環のあらゆる組み合わせが、原子価が許容する限り、ヘテロ環の定義に含まれる。飽和ヘテロ環では、ヘテロ環の原子は、単結合により互いに結合されている。
【０１２９】
単環には、５〜７員アリールまたは４〜８員へテロアリール、５〜７員シクロアルキル、および４〜８員非芳香族ヘテロシクリルが含まれる。例示的な単環基には、チアゾリル、オキサゾリル、オキサジニル、チアジニル、ジチアニル、ジオキサニル、イソオキサゾリル、イソチオゾリル、トリアゾリル、フラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、ピラニル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、イミダゾリル、ピリジニル、ピロリル、ジヒドロピロリル、ピロリジニル、チアジニル、オキサジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、モルホリニル、テトラヒドロチオフェニル、チオフェニル、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘプタニル、アゼチジニル、オキセタニル、チイラニル、オキシラニル、アジリジニル、およびチオモルホリニル等の置換または非置換ヘテロ環が含まれる。
【０１３０】
芳香族（アリール）基には、フェニル、ナフチル、およびアントラシル等の炭素環式芳香族基が含まれる。ヘテロ芳香族（へテロアリール）基には、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、ピラニル、ピラゾリル、ピロイル（pyrroyl）、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、およびテトラゾリル等のヘテロ芳香族基が含まれる。
【０１３１】
また、芳香族基には、炭素環式芳香環またはへテロアリール環が、１つもしくは複数の他の芳香族またはへテロアリール環に融合されている融合多環式芳香族環系が含まれる。例には、ベンゾチエニル、ナフチル、ベンゾフリル、インドリル、キノリニル、ベンゾチアゾール、ベンゾモルホリニル、ベンゾキサゾール、ベンズイミダゾール、キノリニル、イソキノリニル、およびイソインドリルが含まれる。
【０１３２】
フルオロ置換には、１フルオロ置換からパーフルオロ置換までが含まれる。例示的なフルオロ置換Ｃ１〜Ｃ２アルキルには、−ＣＦＨ２、ＣＦ２Ｈ、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＨＦ２、−ＣＨＦＣＨ３、−ＣＦ２ＣＨＦ２が含まれる。パーフルオロ置換Ｃ１〜Ｃ２アルキルには、例えば、ＣＦ３および−ＣＦ２ＣＦ３が含まれる。
【０１３３】
置換または非置換であると示されている部分の好適な置換基は、開示化合物が、本明細書で開示された特性の１つまたは複数を示す能力を実質的に妨害しないものである。置換基を有する化合物の特性の強度が、置換基を有していない化合物と比較して、約５０％を超えて低減される場合、置換基は、化合物の特性を実質的に妨害する。
【０１３４】
本発明により起想される置換基および変数の組み合わせは、安定的化合物の形成をもたらすものに限る。本明細書で使用される場合、用語「安定的」は、製造を可能にするのに十分な安定性を有し、本明細書に詳述されている目的に有用な十分な期間にわたって化合物の完全性を維持する化合物を指す。
【０１３５】
また、本明細書で開示された化合物には、部分的におよび完全に重水素化された変異体が含まれる。ある実施形態では、１つまたは複数の重水素原子が、動力学的研究用に存在する。当業者であれば、そのような重水素原子が存在する部位を選択することができる。
【０１３６】
また、本発明には、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物の塩、特に薬学的に許容される塩が含まれる。十分に酸性の、十分に塩基性の、またはその両方の官能基を有する本発明の化合物は、多くの無機塩基ならびに無機酸および有機酸のいずれとも反応することができる。あるいは、四級窒素を有するもの等の本来的に荷電されている化合物は、適切な対イオン（例えば、臭化物、塩化物、またはフッ化物、特に臭化物等のハロゲン化物）と塩を形成することができる。
【０１３７】
酸付加塩を形成するために一般的に使用される酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、およびリン酸等の無機酸、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニル−スルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、および酢酸等の有機酸である。そのような塩の例には、以下のものが含まれる：硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸塩、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオル酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオアート、ヘキシン−１，６−ジオアート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、安息香酸メチル、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩、およびマンデル酸塩等。
【０１３８】
塩基付加塩には、アンモニウムまたはアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物等の無機塩基、炭酸塩、および重炭酸塩等に由来するものが含まれる。したがって、本発明の塩の調製に有用なそのような塩基には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、および炭酸カリウム等が含まれる。
【０１３９】
別の実施形態によると、本発明は、上記で定義されたサーチュイン調節化合物を生成する方法を提供する。化合物は、従来技術を使用して合成することができる。有利には、これら化合物は、容易に入手可能な出発物質から便利に合成される。
【０１４０】
本明細書に記載のサーチュイン調節化合物の合成に有用な合成化学変換および方法は、当技術分野で公知であり、例えば、以下の文献に記載のものが含まれる：R. Larock, Comprehensive Organic Transformations (1989)；T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed. (1991)；L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis (1994)；およびL. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis (1995)。
【０１４１】
例示的な実施形態では、サーチュイン調節化合物は、細胞の細胞膜を越えることができる。例えば、化合物は、少なくとも約２０％、５０％、７５％、８０％、９０％、または９５％の細胞透過性を有することができる。
【０１４２】
また、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、以下の特徴の１つまたは複数を有していてもよい：化合物は、細胞または対象体に対して本質的に無毒であってもよい；サーチュイン調節化合物は、２０００ａｍｕ以下、１０００ａｍｕ以下の有機分子または低分子であってもよい；化合物は、少なくとも約３０日、６０日、１２０日、６か月、または１年の通常大気条件下での半減期を有していてもよい；化合物は、少なくとも約３０日、６０日、１２０日、６か月、または１年の溶液中半減期を有していてもよい；サーチュイン調節化合物は、溶液中でレスベラトロールよりも少なくとも約５０％、２倍、５倍、１０倍、３０倍、５０倍、または１００倍安定していてもよい；サーチュイン調節化合物は、ＤＮＡ修復因子Ｋｕ７０の脱アセチル化を促進してもよい；サーチュイン調節化合物は、ＲｅｌＡ／ｐ６５の脱アセチル化を促進してもよい；化合物は、一般的代謝回転率を増加させ、ＴＮＦα誘導性アポトーシスに対する細胞の感受性を増強してもよい。
【０１４３】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物は、サーチュインのデアセチラーゼ活性の調節に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）クラスＩ、ＨＤＡＣクラスＩＩ、またはＨＤＡＣ  ＩおよびＩＩを阻害するいかなる任意の実質的な能力を有していない。例えば、好ましい実施形態では、サーチュイン調節化合物は、サーチュイン活性化化合物であり、ＨＤＡＣ  Ｉおよび／またはＨＤＡＣ  ＩＩの阻害のＥＣ５０よりも少なくとも５倍小さな、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さな、サーチュインデアセチラーゼ活性の活性化のＥＣ５０を有するように選択される。ＨＤＡＣ  Ｉおよび／またはＨＤＡＣ  ＩＩ活性をアッセイする方法は、当技術分野で周知であり、そのようなアッセイを実施するキットは市販されている場合がある。例えば、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．社（マウンテンビュー、カリフォルニア州；ワールドワイドウェブは、ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ．ｃｏｍ）およびＴｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（スウェズボロ、ニュージャージー州；ワールドワイドウェブは、ｔｈｏｍａｓｓｃｉ．ｃｏｍ）を参照されたい。
【０１４４】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物は、サーチュイン相同体を調節するいかなる実質的な能力も有していない。１つの実施形態では、ヒトサーチュインタンパク質の活性化因子は、ヒトサーチュインのデアセチラーゼ活性の活性化に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、下等真核生物、特に酵母またはヒト病原体に由来するサーチュインタンパク質を活性化するいかなる実質的な能力も有していない場合がある。例えば、サーチュイン活性化化合物は、Ｓｉｒ２等（カンジダ、Ｓ．セレビシエ等）の酵母サーチュイン活性化のＥＣ５０よりも少なくとも５倍小さな、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さな、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３等のヒトサーチュインデアセチラーゼ活性の活性化のＥＣ５０を有するように選択されてもよい。別の実施形態では、下等真核生物、特に酵母またはヒト病原体に由来するサーチュインタンパク質の阻害剤は、下等真核生物に由来するサーチュインのデアセチラーゼ活性の阻害に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、ヒトに由来するサーチュインタンパク質を阻害するいかなる実質的な能力も有していない。例えば、サーチュイン阻害化合物は、Ｓｉｒ２等（カンジダ、Ｓ．セレビシエ等）の酵母サーチュイン阻害のIＣ５０よりも少なくとも５倍小さな、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さな、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、および／またはＳＩＲＴ３等のヒトサーチュインデアセチラーゼ活性の阻害のIＣ５０を有するように選択されてもよい。
【０１４５】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物は、例えば、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数等の１つまたは複数のサーチュインタンパク質相同体を調節する能力を有していてもよい。１つの実施形態では、サーチュイン調節化合物は、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ３タンパク質の両方を調節する能力を有する。別の実施形態では、サーチュイン調節化合物は、ＳＩＲＴ１およびＳＩＲＴ２タンパク質の両方を調節する能力を有する。特定の実施形態では、サーチュイン調節化合物は、ＳＩＲＴ１を活性化し、ＳＩＲＴ２タンパク質を阻害する能力を両方とも有する。
【０１４６】
他の実施形態では、ＳＩＲＴ１調節因子は、ヒトＳＩＲＴ１のデアセチラーゼ活性の調節に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、例えば、ヒトＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数等の他のサーチュインタンパク質相同体を調節するいかなる実質的な能力も有していない。例えば、サーチュイン調節化合物は、ヒトＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数を調節するＥＤ５０よりも少なくとも５倍小さい、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さい、ヒトＳＩＲＴ１デアセチラーゼ活性調節のＥＤ５０を有するように選択してもよい。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ１調節因子は、ＳＩＲＴ３タンパク質を調節するいかなる実質的な能力も有していない。
【０１４７】
他の実施形態では、ＳＩＲＴ２調節因子は、ヒトＳＩＲＴ２のデアセチラーゼ活性の調節に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、例えば、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数等の他のサーチュインタンパク質相同体を調節するいかなる実質的な能力も有していない。例えば、サーチュイン調節化合物は、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数を調節するＥＤ５０よりも少なくとも５倍小さい、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さい、ヒトＳＩＲＴ２デアセチラーゼ活性調節のＥＤ５０を有するように選択してもよい。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ２調節因子は、ＳＩＲＴ１タンパク質を調節するいかなる実質的な能力も有していない。ある特定の実施形態では、ＳＩＲＴ２調節因子は、ＳＩＲＴ２タンパク質を阻害する。
【０１４８】
他の実施形態では、ＳＩＲＴ３調節因子は、ヒトＳＩＲＴ３のデアセチラーゼ活性の調節に有効な濃度で（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで）、例えば、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数等の他のサーチュインタンパク質相同体を調節するいかなる実質的な能力も有していない。例えば、サーチュイン調節化合物は、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、またはＳＩＲＴ７の１つまたは複数を調節するＥＤ５０よりも少なくとも５倍小さい、更により好ましくは少なくとも１０倍、１００倍、または１０００倍さえもより小さい、ヒトＳＩＲＴ３デアセチラーゼ活性調節のＥＤ５０を有するように選択してもよい。１つの実施形態では、ＳＩＲＴ３調節因子は、ＳＩＲＴ１タンパク質を調節するいかなる実質的な能力も有していない。
【０１４９】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物は、約１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２Ｍ以下のサーチュインタンパク質に対する結合親和性を有していてもよい。サーチュイン調節化合物は、その基質またはＮＡＤ＋（または他の補助因子）に対するサーチュインタンパク質の見かけ上のＫｍを、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、または１００倍低減（活性化因子）または増加（阻害剤）させることができる。ある実施形態では、Ｋｍ値は、本明細書に記載の質量分析アッセイを使用して決定される。好ましい活性化化合物は、その基質または補助因子に対するサーチュインのＫｍを、類似の濃度でレスベラトロールにより引き起こされるものよりも大きな程度に低減するか、またはその基質または補助因子に対するサーチュインのＫｍを、より低い濃度でレスベラトロールにより引き起こされるものと同じように低減する。サーチュイン調節化合物は、サーチュインタンパク質のＶｍａｘを、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、または１００倍増加させることができる。サーチュイン調節化合物は、約１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、または約１〜１０ｎＭ、約１０〜１００ｎＭ、約０．１〜１μＭ、約１〜１０μＭ、または約１０〜１００μＭの、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３タンパク質のデアセチラーゼ活性調節のＥＤ５０を有することができる。サーチュイン調節化合物は、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３タンパク質のデアセチラーゼ活性を、細胞アッセイまたは細胞に基づくアッセイで測定して、少なくとも約５、１０、２０、３０、５０、または１００倍だけ調節することができる。サーチュイン活性化化合物は、同じ濃度のレスベラトロールと比べて、少なくとも約１０％、３０％、５０％、８０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、または１００倍より大きな、サーチュインタンパク質のデアセチラーゼ活性の誘導を引き起こすことができる。サーチュイン調節化合物は、ＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３調節のＥＤ５０よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、５０倍より大きな、ＳＩＲＴ５調節のＥＤ５０を有することができる。
【０１５０】
３．例示的な使用
ある態様では、本発明は、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する方法、およびその使用方法を提供する。
【０１５１】
ある実施形態では、本発明は、細胞のサーチュイン１活性を増加させるための方法であって、構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶ）、（ＸＶＩ）、（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、および（ＸＸＩ）のいずれかの化合物を含む構造式（ＸＬ）（ＸＸＸＩ）（ＸＸＸＩＩ）、（ＸＸＸＩＩＩ）、および（ＸＸＸＩＶ）のいずれかにより表される化合物を細胞と接触させるステップを含んでなる方法を提供する。
【０１５２】
ある実施形態では、本発明は、サーチュインタンパク質を活性化する、例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用するための方法を提供する。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、例えば、細胞の寿命を増加させること、ならびに、例えば老化またはストレスに関連する疾患または障害、糖尿病、肥満、神経変性疾患、化学療法誘導性神経障害、心血管疾患、血液凝固障害、炎症、癌、および／または潮紅等を含む多種多様な疾患および障害を治療および／または予防することを含む多様な治療応用に有用であり得る。本方法は、薬学的有効量のサーチュイン調節化合物、例えばサーチュイン活性化化合物を、その必要性のある対象体に投与することを含んでなる。
【０１５３】
出願人らは、理論により束縛されることを望まないが、本発明の活性化因子は、サーチュインタンパク質内の同じ位置（例えば、活性部位、または活性部位のＫｍもしくはＶｍａｘに影響を及ぼす部位）で、サーチュインと相互作用することができると考えられる。これは、あるクラスのサーチュイン活性化因子および阻害剤が、実質的な構造類似性を有する場合がある理由であると考えられる。
【０１５４】
ある実施形態では、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて摂取することができる。１つの実施形態では、２つ以上のサーチュイン調節化合物の混合物を、その必要性のある対象体に投与することができる。別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、以下の化合物の１つまたは複数と共に投与することができる：レスベラトロール、ブテイン、フィセチン、ピセタノール、またはケルセチン。例示的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ニコチン酸と組み合わせて投与することができる。別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を減少させるサーチュイン調節化合物は、以下の化合物の１つまたは複数と共に投与することができる：ニコチンアミド（ＮＡＭ）、スラニム（suranim）；ＮＦ０２３（Ｇタンパク質アンタゴニスト）；ＮＦ２７９（プリン受容体アンタゴニスト）；トロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８，テトラメチルクロマン−２−カルボキシル酸；（−）−エピガロカテキン；（部位３、５、７、３’、４’、５’はヒドロキシ）；（−）−エピガロカテキンガラート（ヒドロキシ部位５、７、３’、４’、５’、および３はガラートエステル）；シアニジンコロリド（cyanidin choloride）（３，５，７，３’，４’−ペンタヒドロキシフラビリウムクロリド；塩化デルフィニジン（３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシフラビリウムクロリド）；ミリセチン（カンナビスセチン；３，５，７，３’，４’，５’−ヘキサヒドロキシフラボン）；３，７，３’，４’，５’−ペンタヒドロキシフラボン；ゴシペチン（３，５，７，８，３’，４’−ヘキサヒドロキシフラボン）、シルチノール；およびスプリトマイシン。更に別の実施形態では、１つまたは複数のサーチュイン調節化合物は、例えば、癌、糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患、血液凝固、炎症、潮紅、肥満、老化、ストレス等を含む種々の疾患を治療または予防するための１つまたは複数の治療剤と共に投与することができる。種々の実施形態では、サーチュイン調節化合物を含んでなる併用療法は、（１）１つまたは複数の治療剤（例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の治療剤）と組み合わせた１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を含んでなる医薬組成物；および（２）１つまたは複数の治療剤と共に１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を同時投与することを指し、サーチュイン調節化合物および治療剤は、同じ組成物中に製剤化されていない（しかし、ブリスター包装または他の多室包装等の同じキットまたは包装内に；使用者により分離することができる接続されている密封容器（例えば、ホイルパウチ）内に；またはサーチュイン調節化合物（複数可）および他の治療剤（複数可）が別々の容器に存在しているキット内に存在していてもよい）。別々の製剤を使用する場合、サーチュイン調節化合物は、別の治療剤の投与と同時に、投与と間隔をおいて、投与と交互に、投与の前に、投与の後で、またはこれらの組み合わせで投与することができる。
【０１５５】
また、ある実施形態では、サーチュイン調節化合物を使用して疾患または障害を低減、予防、または治療するための方法は、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、および／もしくはＳＩＲＴ３、またはそれらの相同体等のサーチュインのタンパク質レベルを増加させることを含んでなる場合もある。タンパク質レベルの増加は、サーチュインをコードする核酸の１つまたは複数のコピーを細胞に導入することにより達成することができる。例えば、サーチュインのレベルは、サーチュインをコードする核酸を哺乳動物細胞に導入することにより、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０に示されているアミノ酸配列をコードする核酸の導入によりＳＩＲＴ１レベルを増加させることにより、および／またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＨ０１０４２に示されているアミノ酸配列をコードする核酸の導入によりＳＩＲＴ３レベルを増加させることにより、哺乳動物細胞中で増加させることができる。
【０１５６】
サーチュインのタンパク質レベルを増加させるために細胞に導入される核酸は、サーチュイン、例えばＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３タンパク質の配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるタンパク質をコードしていてもよい。例えば、タンパク質をコードする核酸は、ＳＩＲＴ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８）および／またはＳＩＲＴ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＣ００１０４２）タンパク質をコードする核酸と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であってもよい。また、核酸は、野生型サーチュイン、例えばＳＩＲＴ１および／またはＳＩＲＴ３タンパク質をコードする核酸に、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、６５℃にて０．２×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションおよび洗浄が含まれてもよい。野生型サーチュインの断片であるタンパク質等の、野生型サーチュインタンパク質とは異なるタンパク質をコードする核酸を使用する場合、タンパク質は、好ましくは生物学的に活性であり、例えば脱アセチル化が可能である。生物学的に活性なサーチュインの部分を細胞中で発現させることが必要であるに過ぎない。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０を有する野生型ＳＩＲＴ１と異なるタンパク質は、好ましくはそのコア構造を含有している。コア構造とは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸６２〜２９３を指すことがあり、それは、ＮＡＤ結合ドメインならびに基質結合ドメインを包含するＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド２３７〜９３２によりコードされる。また、ＳＩＲＴ１のコアドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド８３４〜１３９４によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２６１〜４４７；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド７７７〜１５３２によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２４２〜４９３；またはＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１２２３８のヌクレオチド８１３〜１５３８によりコードされているＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３６３７０のアミノ酸約２５４〜４９５を指すことができる。タンパク質が、生物学的機能、例えば脱アセチル化能力を保持しているか否かは、当技術分野で公知の方法により決定することができる。
【０１５７】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物を使用して疾患または障害を低減、予防、または治療するための方法は、ヒトＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、および／もしくはＳＩＲＴ３、またはそれらの相同体等のサーチュインのタンパク質レベルを減少させることを含んでなる場合もある。サーチュインタンパク質レベルの減少は、当技術分野で公知の方法により達成することができる。例えば、サーチュインを標的とするｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、またはリボザイムを、細胞中で発現させることができる。ドミナントネガティブなサーチュイン突然変異体、例えば脱アセチル化が可能ではない突然変異を使用することもできる。例えば、Luo et al. (2001) Cell 107:137に記載されている、ＳＩＲＴ１の突然変異体Ｈ３６３Ｙを使用することができる。あるいは、転写を阻害する作用剤を使用することができる。
【０１５８】
また、サーチュインタンパク質レベルを調節する方法には、サーチュインをコードする遺伝子の転写を調節するための方法、対応するｍＲＮＡを安定化／不安定化するための方法、および当技術分野で公知の他の方法が含まれる。
【０１５９】
老化／ストレス
１つの実施形態では、本発明は、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる本発明のサーチュイン調節化合物を細胞と接触させることにより、細胞の寿命を延長する、細胞の増殖能を延長する、細胞の老化を遅延させる、細胞の生存を促進する、細胞の細胞老化を遅延させる、カロリー制限の効果を模倣する、ストレスに対する細胞の耐性を増加させる、または細胞のアポトーシスを防止する方法を提供する。例示的な実施形態では、本方法は、サーチュイン活性化化合物を細胞と接触させることを含んでなる。
【０１６０】
本明細書に記載の方法は、細胞、特に初代細胞（つまり、生物、例えばヒトから得た細胞）が、細胞培養で生存し続けることができる期間を増加させるために使用することができる。また、胚幹（ＥＳ）細胞および多能性細胞、ならびにそれらから分化した細胞を、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で処理して、細胞またはそれらの子孫をより長期間にわたって培養中で維持することができる。そのような細胞は、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ修飾後に対象体に移植するために使用することもできる。
【０１６１】
１つの実施形態では、長期保存することを目的とする細胞を、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で処理することができる。細胞は、懸濁液中（例えば、血液細胞、血清、生物学的増殖培地等）または組織もしくは器官に存在していてもよい。例えば、輸血のために個体から採取した血液を、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で処理して、血液細胞をより長期間保存することができる。加えて、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、法医学的目的に使用される血液を保存することもできる。細胞の寿命を延長させるかまたはアポトーシスから保護するために処理することができる他の細胞には、消費用の細胞、例えば非ヒト哺乳動物に由来する細胞（肉等）または植物細胞（野菜等）が含まれる。
【０１６２】
また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、例えば、発育および／または増殖過程を変更、遅延、または加速させるために、哺乳動物、植物、昆虫、または微生物の発育相および増殖相中に適用することができる。
【０１６３】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、例えば、固形組織移植、臓器移植、細胞懸濁液、幹細胞、骨髄細胞等を含む、移植または細胞療法に有用な細胞を処理するために使用することができる。細胞または組織は、自己移植片、同種移植片、同系移植片、または異種移植片であってもよい。細胞または組織は、対象体への投与／移植の前に、投与／移植と同時に、および／または投与／移植の後で、サーチュイン調節化合物を用いて処理することができる。細胞または組織は、ドナー個体から細胞を取り出す前に、ドナー個体から細胞または組織を取り出した後のｅｘ  ｖｉｖｏで、またはレシピエントへの移植後に処理することができる。例えば、ドナーまたはレシピエント個体は、サーチュイン調節化合物で全身性に治療してもよく、または細胞／組織のサブセットを、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で局所的に治療してもよい。ある実施形態では、細胞または組織（またはドナー／レシピエント個体）は、例えば、免疫抑制剤、サイトカイン、血管新生因子等の、移植片生着の延長に有用な別の治療剤で更に処理してもよい。
【０１６４】
更なる他の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を用いて、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで処理して、例えば、細胞の寿命を増加させるか、またはアポトーシスを防止することができる。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で皮膚または上皮細胞を治療することにより、老化（例えば、しわの発生、弾性の喪失等）から皮膚を保護することができる。例示的な実施形態では、皮膚を、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を含んでなる医薬組成物または化粧品組成物と接触させる。本明細書に記載の方法に従って治療することができる例示的な皮膚疾患または皮膚状態には、炎症、日焼けによる損傷、または自然老化に伴うかまたは引き起こされる障害または疾患が含まれる。例えば、組成物は、接触皮膚炎（刺激性接触皮膚炎およびアレルギー性接触皮膚炎を含む）、アトピー性皮膚炎（アレルギー性湿疹としても知られている）、光線性角化症、角質化疾患（湿疹を含む）、表皮水泡症疾患（天疱瘡（penfigus）を含む）、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（多形性紅斑および結節性紅斑を含む）、日光または他の光源により引き起こされる損傷、円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎、乾癬、皮膚癌、および自然老化の影響の予防または治療に有用性が見出される。別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を、例えば、第１度、第２度、もしくは第３度熱傷、および／または熱的な、化学的な、もしくは電気的な熱傷を含む創傷および／または熱傷の治療に使用して、治癒を促進させることができる。製剤は、皮膚または粘膜組織に局所投与してもよい。
【０１６５】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を含んでなる局所用製剤は、予防用組成物、例えば化学予防組成物として使用することもできる。化学予防法に使用される場合、感受性の皮膚は、特定の個体に任意の可視的状態が現れる前に治療される。
【０１６６】
サーチュイン調節化合物は、対象体に局所的または全身性に送達することができる。１つの実施形態では、サーチュイン調節化合物は、注射、局所処方等により対象体の組織または器官に局所的に送達される。
【０１６７】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、対象体の細胞老化により誘導されるまたは悪化する疾患または状態を治療または予防するために；例えば老化の開始後に対象体の老化の速度を低減するための方法に；対象体の寿命を延長するための方法に；寿命に関連する疾患または状態を治療または予防するための方法に；細胞の増殖能に関連する疾患または状態を治療または予防するための方法に；および細胞損傷または細胞死に起因する疾患または症状を治療または予防するための方法に使用することができる。ある実施形態では、本方法は、対象体の寿命を短縮する疾患の発生率を減少させることにより作用するものではない。ある実施形態では、方法は、癌等の疾患により引き起こされる致死性を低減することにより作用するものではない。
【０１６８】
更に別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、一般的に、対象体の細胞の寿命を増加させるために、および対象体の細胞をストレスおよび／またはアポトーシスから保護するために対象体に投与することができる。対象体を本明細書に記載の化合物で治療することは、対象体を、ホーミシス、つまり生物に有益であり、生物の寿命を延長する場合がある軽症のストレスに曝すことに似ている。
【０１６９】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を対象体に投与して、老化、ならびに脳卒中、心臓疾患、心不全、関節炎、高血圧、およびアルツハイマー病等の老化に伴う結果または疾患を予防することができる。治療することができる他の状態には、例えば、白内障、緑内障、および黄斑変性症等の眼の老化に伴う眼障害が含まれる。また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、細胞死から細胞を保護するために、疾患、例えば細胞死に関連する慢性疾患を治療するために対象体に投与することができる。例示的な疾患には、以下の疾患が含まれる：パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、萎縮性（amniotropic）側索硬化症、および筋ジストロフィー等の、神経細胞死、ニューロン機能不全、または筋肉細胞死もしくは機能不全と関連する疾患；ＡＩＤＳ；劇症肝炎；クロイツフェルト−ヤコブ病、色素性網膜炎、および小脳変性症等の脳の変性と関連する疾患；再生不良性貧血等の脊髄形成異常症（myelodysplasis）；心筋梗塞および脳卒中等の虚血性疾患；アルコール性肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎等の肝臓疾患；骨関節炎等の関節疾患；アテローム性動脈硬化症；脱毛；紫外線による皮膚損傷；扁平苔癬；皮膚の萎縮；白内障；および移植片拒絶。細胞死は、手術、薬物療法、化学物質への曝露、または放射線への曝露により引き起こされる場合もある。
【０１７０】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、急性疾患を罹患している対象体、例えば器官または組織に対する損傷を被っている対象体、例えば、脳卒中または心筋梗塞を罹患している対象体または脊髄傷害を被っている対象体に投与することもできる。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、アルコール依存者の肝臓を修復するために使用することもできる。
【０１７１】
心血管疾患
別の実施形態では、本発明は、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を、その必要性のある対象体に処理することにより、心血管疾患を治療および／または予防するための方法を提供する。
【０１７２】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して治療または予防することができる心血管疾患は、特発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬剤誘導性心筋症、虚血性心筋症、および高血圧性心筋症等の心筋症または心筋炎が含まれる。また、本明細書に記載の化合物および方法を使用して治療可能または予防可能なものは、大動脈、冠動脈、頚動脈、脳血管動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、および膝窩動脈等の主要血管のアテローム性障害（大血管性疾患）である。治療または予防することができる他の血管疾患には、血小板凝集、網膜細動脈、糸球体細動脈、神経脈管、心臓細動脈と関連するもの、ならびに眼、腎臓、心臓、中枢神経系、および末梢神経系の毛細血管床に関連するものが含まれる。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、個体の血漿中のＨＤＬレベルを増加させるために使用することもできる。
【０１７３】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で治療することができる更に他の障害には、例えば冠動脈介入後の再狭窄、ならびに高密度コレステロールおよび低密度コレステロールの異常レベルに関連する障害が含まれる。
【０１７４】
１つの実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、別の心血管治療薬との併用治療剤の一部として投与することができる。１つの実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、抗不整脈薬との併用治療剤の一部として投与することができる。別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、別の心血管治療薬との併用治療剤の一部として投与することができる。
【０１７５】
細胞死／癌
サーチュイン調節化合物は、放射線被爆または毒素を最近受容したか、または受容する可能性の高い対象体に投与することができる。１つの実施形態では、放射線被爆または毒素は、例えば予防的手段として投与される研究関連手順または医学的手順の一部として受容される。別の実施形態では、放射線または毒素への曝露は、意図せずに受容される。そのような場合、化合物は、好ましくは、アポトーシスおよびその後の急性放射線症候群の発症を阻害するために、曝露後のできるだけ早期に投与される。
【０１７６】
サーチュイン調節化合物は、癌を治療および／または予防するために使用することもできる。用語「癌」、「腫瘍」、および「新生物」は、本明細書では同義的に使用される。本明細書で使用される場合、癌（腫瘍または新生物）は、以下の特性の１つまたは複数を特徴とする：細胞増殖が、環境中の正常な生化学的および物理的影響により制御されないこと；退形成（例えば、正常な協調的細胞分化の欠如）；および幾つかの場合には転移。本発明のサーチュイン調節化合物により治療および／または予防することができる癌疾患には、以下のものが含まれる：例えば、肛門癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、子宮内膜癌、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肺（小細胞）癌、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、卵巣癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、肝細胞癌、カポジ肉腫、肺（非小細胞癌）、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、および軟部組織肉腫。更なる癌障害は、例えば、Isselbacher et al. (1994) Harrison's Principles of Internal Medicine 1814-1877に見出すことができ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
ある実施形態では、サーチュインタンパク質（例えば、ＳＩＲＴ１）のレベルおよび／または活性を増加させるか、またはサーチュインタンパク質（例えば、ＳＩＲＴ２）のレベルおよび／または活性を減少させるサーチュイン調節化合物は、癌の治療および／または予防に使用することができる。カロリー制限は、癌を含む加齢性障害の発生率の低減と関連している。したがって、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性の増加または減少は、例えば癌等の加齢性障害の発生を治療および／または予防するのに有用であり得る。固形腫瘍を伴う癌では、調節化合物は、腫瘍に直接投与することができる。血液細胞の癌、例えば、白血病は、調節化合物を血流にまたは骨髄に投与することにより治療することができる。良性細胞増殖、例えば疣贅も治療することができる。治療することができる他の疾患には、自己免疫細胞が除去されるべきである自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、強皮症、および関節炎が含まれる。ヘルペス、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＨＴＬＶ−１関連の悪性および良性障害等のウイルス感染も、サーチュイン調節化合物の投与により治療することができる。あるいは、細胞を対象体から取得し、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理してある望ましくない細胞、例えば癌細胞を除去し、同じまたは異なる対象体に投与して戻すことができる。
【０１７８】
化学療法剤は、本明細書で抗癌活性を有すると記載されている調節化合物、例えばアポトーシスを誘導する化合物、寿命を低減する化合物、または細胞をストレスに対する感受性を付与する化合物と共に同時投与することができる。化学療法剤は、細胞死を誘導するか、寿命を低減するか、ストレスに対する感受性を増加させると本明細書に記載されているサーチュイン調節化合物と共に単独で、および／または他の化学療法作用剤と組み合わせて、使用することができる。
【０１７９】
従来の化学療法剤に加えて、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または望ましくない細胞増殖に寄与する細胞成分の発現を阻害する他のポリヌクレオチドと共に使用することもできる。
【０１８０】
サーチュイン調節化合物および従来の化学療法剤を含んでなる併用療法は、併用により従来の化学療法剤がより低い用量でより大きな効果を発揮することが可能であるため、当技術分野で公知の併用療法よりも有利な場合がある。好ましい実施形態では、従来の化学療法剤の、または従来の化学療法剤の組み合わせの有効用量（ＥＤ５０）は、サーチュイン調節化合物と組み合わせて使用される場合、化学療法剤単独のＥＤ５０よりも少なくとも２倍小さく、更により好ましくは５倍、１０倍、または２５倍さえも小さい。反対に、そのような化学療法剤またはそのような化学療法剤の組み合わせの治療指数（ＴＩ）は、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物と組み合わせて使用される場合、従来の化学療法剤投与計画単独のＴＩよりも少なくとも２倍大きく、更により好ましくは５倍、１０倍、または２５倍さえも大きい場合がある。
【０１８１】
ニューロン疾患／障害
ある態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、神経変性疾患、および中枢神経系（ＣＮＳ）、脊髄、または末梢神経系（ＰＮＳ）に対する外傷性または機械的損傷を被っている患者を治療するために使用することができる。神経変性疾患には、典型的には、老化に起因する健常者の脳細胞の萎縮および／または死滅よりもはるかに顕著である萎縮および／または死滅による場合があるヒト脳の質量および容積の低減が関与する。神経変性疾患は、特定の脳領域の進行性変性（例えば、神経細胞機能不全および死滅）により、脳機能が長期間にわたって正常であった後、徐々に発症する場合がある。あるいは、神経変性疾患は、外傷または毒素に関連する神経変性疾患等、急速に発症する場合がある。脳変性の実際の発症は、臨床的発現の何年間も前に始まっている場合がある。神経変性疾患の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリッグ病）、びまん性レヴィ小体病、舞踏病有棘赤血球増加症、原発性側索硬化症、眼疾患（眼神経炎）、化学療法誘導性神経障害（例えば、ビンクリスチン、パクリタキセル、ボルテゾミブによる）、糖尿病誘導性神経障害、およびフリードライヒ運動失調。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、これら疾患および下記に記載の他の疾患を治療するために使用することができる。
【０１８２】
ＡＤは、記憶喪失、異常行動、人格変化、および思考能力低下をもたらすＣＮＳ障害である。これら減退は、特定のタイプの脳細胞の死滅、ならびに脳細胞間の接続および脳細胞の支援ネットワーク（例えば、膠細胞）の破壊に関連する。初発症状には、近時記憶の喪失、判断誤謬、および人格変化が含まれる。ＰＤは、身体運動の制御不全、硬直、振戦、およびジスキネジアをもたらすＣＮＳの障害であり、ドーパミンを生成する脳領域における脳細胞の死滅に関連する。ＡＬＳ（運動ニューロン疾患）は、運動性ニューロン、つまり脳を骨格筋と接続するＣＮＳの成分を攻撃するＣＮＳ障害である。
【０１８３】
ＨＤは、運動の制御不全、知的能力の喪失、および情緒障害を引き起こす別の神経変性疾患である。テイ−ザックス病およびサンドホフ病は、β−ヘキソサミニダーゼのＧＭ２ガングリオシドおよび関連糖脂質基質が神経系に蓄積し、急性神経変性を引き起こす糖脂質蓄積症である。
【０１８４】
アポトーシスが免疫系のＡＩＤＳ病因に役割を果たしていることは周知である。しかしながら、ＨＩＶ−１は、神経系疾患も誘導し、それは、本発明のサーチュイン調節化合物で治療することができる。
【０１８５】
ニューロン喪失は、ヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病、牛のＢＳＥ（狂牛病）、ヒツジおよびヤギのスクラピー病、およびネコのネコ海綿状脳症（ＦＳＥ）等のプリオン病の顕著な特徴でもある。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、これら前述の疾患によるニューロン喪失の治療または予防に有用であり得る。
【０１８６】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、軸索障害に関連する任意の疾患または障害を治療または予防するために使用することができる。遠位軸索障害は、末梢神経系（ＰＮＳ）ニューロンの幾つかの代謝異常または毒性障害に起因する一種の末梢神経障害である。それは、代謝異常または毒性異常に対する神経の最も一般的な応答であり、糖尿病等の代謝疾患、腎不全、栄養失調およびアルコール依存等の不全症候群、または毒素もしくは薬物の影響により引き起こされる場合がある。遠位軸索障害を有するものは、通常、対称的なグローブ−ストッキング型感覚運動障害（glove-stocking sensori-motor disturbance）を示す。深部腱反射および自律神経系（ＡＮＳ）機能も、患部領域で喪失または減少する。
【０１８７】
糖尿病性神経障害は、真性糖尿病に伴う神経障害である。糖尿病性神経障害に伴う場合がある比較的一般的な状態には、以下のものが含まれる：第三脳神経麻痺；単神経障害；多発性単神経炎；糖尿病性筋萎縮症；疼痛を伴う多発神経障害；自律神経障害；および胸腹神経障害。
【０１８８】
末梢神経障害は、神経疾患によるかまたは全身性疾患の副作用によるかのいずれかにより引き起こされる場合がある末梢神経系の神経に対する損傷を指す医学用語である。末梢神経障害の主な原因には、発作、栄養欠乏、およびＨＩＶが含まれるが、糖尿病が、最も可能性の高い原因である。
【０１８９】
例示的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、再発ＭＳおよび単一症状ＭＳを含む多発性硬化症（ＭＳ）、および例えば慢性（chromic）炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）またはそれに伴う症状等の他の脱髄状態を治療または予防することができる。
【０１９０】
更に別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、疾患、傷害（外科的処置を含む）、または環境上の外傷（例えば、神経毒、アルコール依存等）による外傷を含む、神経に対する外傷を治療することができる。
【０１９１】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、種々のＰＮＳ障害の症状を予防、治療、および緩和することにも有用であり得る。用語「末梢神経障害」は、脳および脊髄の外部の神経、つまり末梢神経が損傷した広範囲な障害を包含する。末梢神経障害は、末梢神経炎とも呼ばれる場合があり、多数の神経が関与する場合は、多発神経障害または多発神経炎という用語が使用される場合がある。
【０１９２】
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物で治療可能なＰＮＳ疾患には、以下のものが含まれる：糖尿病、ハンセン病、シャルコー−マリー−トゥース病、ギラン−バレー症候群、および腕神経叢神経障害（腕神経叢の頚部根および第１胸部根、神経幹、索、ならびに末梢神経成分の疾患）。
【０１９３】
別の実施形態では、サーチュイン活性化化合物を使用して、ポリグルタミン病を治療または予防することができる。例示的なポリグルタミン病には、以下のものが含まれる：球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ハウリバー症候群）、脊髄小脳失調症１型、脊髄小脳失調症２型、脊髄小脳失調症３型（マシャド−ジョゼフ病）、脊髄小脳失調症６型、脊髄小脳失調症７型、および脊髄小脳失調症１７型。
【０１９４】
ある実施形態では、本発明は、中枢神経系細胞を治療して、細胞への血流減少に応答した損傷を予防する方法を提供する。典型的には、予防することができる損傷の重症度は、細胞への血流低減の度合いおよび低減期間に大きく依存するだろう。１つの実施形態では、アポトーシスまたは壊死性細胞死を予防することができる。また更なる実施形態では、細胞傷害性（cytoxic）浮腫無酸素血症または中枢神経系組織無酸素血症等の虚血媒介性損傷を予防することができる。各実施形態では、中枢神経系細胞は、脊髄細胞または脳細胞であってもよい。
【０１９５】
別の態様は、サーチュイン活性化化合物を対象体に投与して中枢神経系虚血状態を治療することを包含する。本明細書に記載のサーチュイン活性化化合物により、多数の中枢神経系虚血状態を治療することができる。１つの実施形態では、虚血状態は、アポトーシスまたは壊死性細胞死、細胞障害性浮腫無酸素症、または中枢神経系組織無酸素症等の、任意のタイプの虚血性中枢神経系損傷をもたらす脳卒中である。脳卒中は、任意の脳領域に影響を及ぼす場合があり、または脳卒中の発症をもたらすことが一般的に知られている任意の病因により引き起こされる場合がある。この実施形態の１つの代替形態では、脳卒中は、脳幹卒中である。この実施形態の別の代替形態では、脳卒中は、小脳卒中である。更に別の実施形態では、脳卒中は、塞栓性脳卒中である。更に別の代替形態では、脳卒中は、出血性脳卒中であってもよい。更なる実施形態では、脳卒中は、血栓性脳卒中である。
【０１９６】
更に別の態様では、サーチュイン活性化化合物を投与して、中枢神経系虚血状態後の虚血中心部の梗塞サイズを低減することができる。更に、サーチュイン活性化化合物を投与して、中枢神経系虚血状態後の虚血半影または移行領域のサイズを低減して利益を得ることもできる。
【０１９７】
１つの実施形態では、併用薬物投薬計画は、神経変性障害またはそれら状態に伴う二次的状態を治療または予防するための薬物または化合物を含んでいてもよい。したがって、併用薬物投薬計画は、１つまたは複数のサーチュイン活性化因子および１つまたは複数の抗神経変性剤を含んでいてもよい。
【０１９８】
血液凝固障害
他の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、血液凝固障害（または止血障害）を治療または予防することができる。本明細書で同義的に使用されているように、用語「止血」、「血液凝固」、および「凝血」は、血管収縮および凝固の生理学的特性を含む出血の制御を指す。血液凝固は、傷害、炎症、疾患、先天的欠陥、機能不全、または他の異常後の、哺乳動物循環の完全性の維持を支援する。更に、血餅の形態は、傷害が起こった場合に出血を制限（止血）するだけでなく、アテローム性動脈硬化性疾患の状況では、重要な動脈または血管の閉塞により深刻な器官損傷および死に結び付く場合がある。したがって、血栓症は、誤った時点および地点での血餅形成である。
【０１９９】
したがって、本発明は、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患による四肢の喪失、または肺塞栓症等の血液凝固障害を予防または治療するために、血餅の形成を阻害することを目的とする抗凝固および抗血栓治療を提供する。
【０２００】
本明細書で同義的に使用されているように、「止血を調節することまたは止血の調節」および「止血を制御することまたは止血の制御」は、止血の誘導（例えば、刺激または増加）ならびに止血の阻害（例えば、低減または減少）を含む。
【０２０１】
１つの態様では、本発明は、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を投与することにより、対象体の止血を低減または阻害するための方法を提供する。本明細書で開示された組成物および方法は、血栓障害の治療または予防に有用である。本明細書で使用される場合、用語「血栓障害」は、過剰であるかもしくは望ましくない凝固活性もしくは止血活性または過剰凝固状態を特徴とする任意の障害または状態を含む。血栓障害には、血小板粘着および血栓形成を伴う疾患または障害が含まれ、例えば、血栓を形成する傾向の増大、例えば、血栓数の増加、若年性の血栓、血栓に対する家族性傾向、および通常ではない部位での血栓として顕在化する場合がある。
【０２０２】
別の実施形態では、併用薬物投薬計画は、血液凝固障害またはそれら状態に伴う二次的状態を治療または予防するための薬物または化合物を含んでいてもよい。したがって、併用薬物投薬計画は、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる１つまたは複数のサーチュイン調節化合物および１つまたは複数の抗凝固剤もしくは抗血栓剤を含んでいてもよい。
【０２０３】
体重管理
別の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、対象体の体重増加または肥満の治療または予防に使用することができる。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、対象体の体重を低減するために、または対象体の体重増加を低減もしくは予防するために、例えば、遺伝的肥満、食事性肥満、ホルモン関連肥満、投薬関連肥満を治療または予防することができる。そのような治療を必要とする対象体は、肥満しているか、肥満になる可能性が高いか、体重過剰であるか、または体重過剰になる可能性が高い対象体であってもよい。肥満または体重過剰になる可能性が高い対象体は、例えば、家族歴、遺伝、食事、活動レベル、薬物摂取、またはそれらの種々の組み合わせに基づいて特定することができる。
【０２０４】
更なる他の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、対象体の体重減少を促進することにより治療または予防することができる様々な他の疾患および状態を罹患している対象体に投与してもよい。そのような疾患には、以下のものが含まれる：例えば、高血圧、血圧上昇、高血中コレステロール、脂質異常症、２型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害、高インスリン血症、冠動脈心疾患、狭心症、うっ血性心不全、脳卒中、胆石、胆嚢炎、および胆石症、痛風、骨関節炎、閉塞性睡眠時無呼吸および呼吸器障害、幾つかのタイプの癌（子宮内膜癌、乳癌、前立腺癌、および結腸癌）、妊娠合併症、不良な女性リプロダクティブヘルス（生理不順、不妊症、不規則な排卵等）、膀胱制御問題（ストレス性尿失禁等）；尿酸腎結石症；精神的障害（うつ病、摂食障害、身体像の歪み、および自尊心低下等）。最後に、ＡＩＤＳ患者は、ＡＩＤＳの併用療法に応答するリポジストロフィーまたはインスリン抵抗性を発症する場合がある。
【０２０５】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏに関わらず、脂肪生成または脂肪細胞分化を阻害するために使用することができる。そのような方法は、肥満の治療または予防に使用することができる。
【０２０６】
他の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、食欲を低減および／または満腹感を増加させ、それにより体重減少を引き起こすかまたは体重増加を回避するために使用することができる。そのような治療を必要とする対象体は、体重過剰であるか、肥満しているか、または体重過剰もしくは肥満になる可能性が高い対象体であってもよい。本方法は、例えば、丸剤形態の用量で、対象体に１日１回、または２日に１回、または週１回で投与することを含んでなる。用量は「食欲を減退させる用量」であってもよい。
【０２０７】
例示的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、体重増加または肥満を治療または予防するための併用療法として投与してもよい。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる１つまたは複数のサーチュイン調節化合物は、１つまたは複数の抗肥満剤と組み合わせて投与してもよい。
【０２０８】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を投与して、薬物誘導性体重増加を低減することができる。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、食欲を刺激するか、または体重増加、特に水分保持以外の要因による体重増加を引き起こすことができる薬剤との併用療法として投与してもよい。
【０２０９】
代謝障害／糖尿病
別の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、インスリン抵抗性、前糖尿病状態、ＩＩ型糖尿病、および／またはそれらの合併症等の代謝障害を治療または予防するために使用することができる。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物の投与は、対象体のインスリン感受性を増加させるか、および／またはインスリンレベルを減少させることができる。そのような治療を必要とする対象体は、インスリン抵抗性またはＩＩ型糖尿病の他の前駆症状を有するか、ＩＩ型糖尿病を有するか、またはこれら状態のいずれかを発症する可能性の高い対象体であってもよい。例えば、対象体は、インスリン抵抗性、例えば高循環レベルのインスリンを有する対象体、ならびに／または高脂血症、脂質生成不全（dyslipogenesis）、高コレステロール血症、耐糖能異常、高血中グルコース糖レベル、Ｘ症候群の他の徴候、血圧上昇、アテローム性動脈硬化症、およびリポジストロフィー等の関連状態を有する対象体であってもよい。
【０２１０】
例示的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、代謝障害を治療または予防するための併用療法として投与してもよい。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる１つまたは複数のサーチュイン調節化合物は、１つまたは複数の抗糖尿病剤と組み合わせて投与してもよい。
【０２１１】
炎症性疾患
他の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、炎症に関連する疾患または障害を治療または予防することができる。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、炎症の発症前、発症時、または発症後に投与することができる。予防的に使用される場合、化合物は、好ましくは、任意の炎症応答または症状が現れる前に提供される。化合物の投与は、炎症応答または症状を予防または緩和することができる。
【０２１２】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、喘息、気管支炎、肺線維症、アレルギー性鼻炎、酸素毒性、気腫、慢性気管支炎、急性呼吸窮迫症候群、および任意の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む、アレルギーおよび呼吸状態を治療または予防することができる。本化合物を使用して、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎を含む慢性肝炎感染を治療することができる。
【０２１３】
加えて、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、器官組織自己免疫疾患（例えば、レイノー症候群）、強皮症、重症筋無力症、移植拒絶反応、内毒素ショック、敗血症、乾癬、湿疹、皮膚炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス、アジソン病、自己免疫多腺性疾患（自己免疫多腺性症候群としても知られている）、およびグレーブス病等の自己免疫疾患および／または自己免疫疾患に関連する炎症を治療することができる。
【０２１４】
ある実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる１つまたは複数のサーチュイン調節化合物は、単独でまたは炎症の治療または予防に有用な他の化合物と組み合わせて投与することができる。
【０２１５】
潮紅
別の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ある障害の症状である紅潮および／またはほてりの発生または重症度を低減するために使用することができる。例えば、主題方法は、癌患者の紅潮および／またはほてりの発生または重症度を低減するために、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を単独でまたは他の作用剤と組み合わせて使用することを含む。他の実施形態では、本方法は、閉経期および閉経後の女性の紅潮および／またはほてりの発生または重症度を低減するための、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物の使用を提供する。
【０２１６】
別の態様では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、別の薬物療法の副作用、例えば薬物誘導性紅潮である紅潮および／またはほてりの発生または重症度を低減するための療法として使用することができる。ある実施形態では、薬物誘導性紅潮を治療および／または予防するための方法は、少なくとも１つの潮紅誘導性化合物、ならびにサーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させる少なくとも１つのサーチュイン調節化合物を含んでなる製剤を、その必要性のある対象体に投与することを含んでなる。他の実施形態では、薬物誘導性潮紅を治療するための方法は、潮紅を誘導する１つまたは複数の化合物および１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を別々に投与することを含んでなり、例えば、サーチュイン調節化合物および潮紅誘導剤は、同じ組成物中に製剤化されていない。別々の製剤を使用する場合、サーチュイン調節化合物は、（１）紅潮誘導剤の投与と同時に、（２）紅潮誘導剤の投与と間隔をおいて、（３）紅潮誘導剤の投与と交互に、（４）紅潮誘導剤の投与前に、（５）紅潮誘導剤の投与後に、および（６）それらの種々の組み合わせで投与することができる。例示的な紅潮誘導剤には、例えば、ナイアシン、ファロキシフェン（faloxifene）、抗うつ薬、抗精神病薬、化学療法剤、カルシウムチャネル遮断薬、および抗生物質が含まれる。
【０２１７】
１つの実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、血管拡張剤または抗脂血症剤（コレステロール低下剤および脂肪作用剤を含む）の紅潮副作用を低減することができる。例示的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、ナイアシンの投与に伴う潮紅を低減することができる。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明は、潮紅副作用を低減させて高脂血症を治療および／または予防するための方法を提供する。別の代表的な実施形態では、本方法は、ラロキシフェンの潮紅副作用を低減するための、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物の使用を含む。別の代表的な実施形態では、本方法は、抗うつ薬または抗精神薬の潮紅副作用を低減するための、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物の使用を含む。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、セロトニン再取込み阻害剤または５ＨＴ２受容体アンタゴニストと共に使用することができる（別々にまたは一緒に投与される）。
【０２１９】
ある実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、潮紅を低減するために、セロトニン再取込み阻害剤（ＳＲＩ）による治療の一部として使用することができる。更に別の代表的な実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、シクロホスファミドおよびタモキシフェン等の化学療法剤の潮紅副作用を低減することができる。
【０２２０】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、アムロジピン等のカルシウムチャネル遮断薬の潮紅副作用を低減することができる。
【０２２１】
別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、抗生物質の潮紅副作用を低減することができる。例えば、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、レボフロキサシンと組み合わせて使用することができる。
【０２２２】
眼障害
本発明の１つの態様は、本明細書で開示された化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグ、または代謝誘導体から選択される治療用量のサーチュイン調節因子を患者に投与することにより、視覚障害を阻害、低減、またはそうでなければ治療するための方法である。
【０２２３】
本発明のある態様では、視覚障害は、視神経または中枢神経系に対する損傷により引き起こされる。特定の実施形態では、視神経損傷は、緑内障により生じるもの等の高眼内圧により引き起こされる。他の特定の実施形態では、視神経損傷は、視神経炎等における感染または免疫（例えば、自己免疫）応答に伴うことが多い神経の膨潤により引き起こされる。
【０２２４】
本発明のある態様では、視覚障害は、網膜損傷により引き起こされる。特定の実施形態では、網膜損傷は、眼への血流障害により引き起こされる（例えば、動脈硬化症、血管炎）。特定の実施形態では、網膜損傷は、網膜黄斑の破壊により引き起こされる（例えば、滲出性または非滲出性黄斑変性症）。
【０２２５】
例示的な網膜疾患には、以下のものが含まれる：滲出性加齢性黄斑変性症、非滲出性加齢性黄斑変性症、電子的人工網膜およびＲＰＥ移植による加齢性黄斑変性症（Retinal Electronic Prosthesis and RPE Transplantation Age Related Macular Degeneration）、急性多発性板状色素上皮症、急性網膜壊死、ベスト病、網膜動脈分枝閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、癌関連網膜症および自己免疫関連網膜症、網膜中心動脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、中心性漿液性脈絡網膜症、イールズ病、黄斑上膜、網膜格子状変性、細動脈瘤、糖尿病性黄斑浮腫、アーヴァイン−ガス黄斑浮腫、黄斑円孔、網膜下新生血管膜、広汎性片眼性亜急性視神経網膜炎、非偽水晶体嚢胞黄斑浮腫（Nonpseudophakic Cystoid Macular Edema）、推定眼ヒストプラスマ症候群、滲出性網膜剥離、術後網膜剥離、増殖性網膜剥離、裂孔原性網膜剥離、牽引性網膜剥離、色素性網膜炎、ＣＭＶ網膜炎、網膜芽細胞腫、末熟児網膜症、散弾状網膜症、背景糖尿病網膜症、増殖性糖尿病網膜症、異常ヘモグロビン症網膜症（Hemoglobinopathies Retinopathy）、プルチャー網膜症、バルサルバ網膜症、若年性網膜分離症、老年性網膜分離症、テルソン症候群、および白点症候群。
【０２２６】
他の例示的疾患には、眼細菌感染症（例えば、結膜炎、角膜炎、結核、梅毒、淋病）、ウイルス感染症（例えば、眼単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス性網膜炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））に二次的な進行性外側網膜壊死ならびにＨＩＶまたは他のＨＩＶ関連および他の免疫不全症関連の眼疾患が含まれる。加えて、眼疾患には、真菌感染症（例えば、カンジダ脈絡膜炎、ヒストプラスマ症）、原虫感染症（例えば、トキソプラズマ症）、および眼トキソカラ症およびサルコイドーシス等の他の疾患が含まれる。
【０２２７】
本発明の１つの態様は、治療用量の本明細書で開示されたサーチュイン調節因子を、そのような治療を必要とする対象体に投与することにより、化学療法剤（例えば、神経毒性薬、ステロイド等の眼内圧を上昇させる薬物）による治療を受ける対象体の視覚障害を阻害、低減、または治療するための方法である。
【０２２８】
本発明の別の態様は、治療用量の本明細書で開示されたサーチュイン調節因子を、そのような治療を必要とする対象体に投与することにより、眼科手術、または脊髄手術等の回前位で実施される他の手術を含む手術を受ける対象体の視覚障害を阻害、低減、または治療するための方法である。眼科手術には、白内障、虹彩切開、およびレンズ置換が含まれる。
【０２２９】
本発明の別の態様は、治療用量の本明細書で開示されたサーチュイン調節因子を、そのような治療を必要とする対象体に投与することにより、白内障、眼乾燥、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、および網膜損傷等を含む加齢性眼疾患の阻害および予防治療を含む治療である。
【０２３０】
本発明の別の態様は、治療用量の本明細書で開示されたサーチュイン調節因子を、そのような治療を必要とする対象体に投与することにより、ストレス、化学的傷害、または放射線により引き起こされる眼の損傷を予防または治療することである。放射線または電磁気による眼に対する損傷は、ＣＲＴによりまたは日光もしくはＵＶへの曝露により引き起こされる損傷を含むことができる。
【０２３１】
１つの実施形態では、併用薬物投薬計画は、眼傷害またはそれら状態に伴う二次的状態を治療または予防するための薬物または化合物を含んでいてもよい。したがって、併用薬物投薬計画は、１つまたは複数のサーチュイン活性化因子および眼障害を治療するための１つまたは複数の治療剤を含んでいてもよい。
【０２３２】
１つの実施形態では、サーチュイン調節因子は、眼内圧を低減するための療法と共に投与することができる。別の実施形態では、サーチュイン調節因子は、緑内障を治療および／または予防するための療法と共に投与することができる。更に別の実施形態では、サーチュイン調節因子は、視神経炎を治療および／または予防するための療法と共に投与することができる。１つの実施形態では、サーチュイン調節因子は、ＣＭＶ網膜症を治療および／または予防するための療法と共に投与することができる。別の実施形態では、サーチュイン調節因子は、多発性硬化症を治療および／または予防するための療法と共に投与することができる。
【０２３３】
ミトコンドリア関連疾患および障害
ある実施形態では、本発明は、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患または障害を治療するための方法を提供する。本方法は、それの必要性のある対象体に、治療上有効量のサーチュイン活性化化合物を投与することを含む。ミトコンドリア活性の増加は、ミトコンドリアの全体数（例えば、ミトコンドリアの質量）を維持しつつ、ミトコンドリアの活性を増加させること、ミトコンドリアの数を増加させて、それによりミトコンドリアの活性を増加させること（例えば、ミトコンドリア生合成を刺激することによる）、またはそれらの組み合わせを指す。ある実施形態では、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患および障害には、ミトコンドリア機能不全に関連する疾患または障害が含まれる。
【０２３４】
ある実施形態では、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患または障害を治療するための方法は、ミトコンドリア機能不全を被る対象体を特定することを含んでなる場合がある。ミトコンドリア機能不全を診断するための方法は、分子遺伝的、病理学的、および／または生化学的分析を含む場合がある。ミトコンドリア機能不全に関連する疾患および障害には、ミトコンドリア呼吸鎖活性の欠陥が、哺乳動物のそのような疾患または障害の病態生理の発症に寄与する疾患および障害が含まれる。一般的に、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患または障害には、例えば、フリーラジカル媒介性酸化傷害が組織変性に結び付く疾患、細胞が不適切にアポトーシスを起こす疾患、および細胞がアポトーシスを起こさない疾患が含まれる。
【０２３５】
ある実施形態では、本発明は、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患または障害を治療する方法であって、例えばミトコンドリア機能不全を治療するのに有用な作用剤、またはミトコンドリアの機能不全に関与する疾患または障害に伴う病状を低減するのに有用な作用剤等の別の治療剤と組み合わせて、１つまたは複数のサーチュイン活性化化合物を、その必要性のある対象体に投与することを含む方法を提供する。
【０２３６】
例示的な実施形態では、本発明は、治療上有効量のサーチュイン活性化化合物を対象体に投与することにより、ミトコンドリア活性の増加から利益を得る可能性のある疾患または障害を治療するための方法を提供する。例示的な疾患または障害には、以下のものが含まれる：例えば、神経筋障害（例えば、フリードライヒ運動失調、筋ジストロフィー、多発性硬化症等）、ニューロン不安定性の障害（例えば、発作性障害、偏頭痛（migrane）等）、発育遅延、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症等）、虚血、尿細管性アシドーシス、加齢性神経変性および認知低下、化学療法疲労、加齢性または化学療法誘導性の閉経または月経周期不順もしくは排卵不順、ミトコンドリアミオパチー、ミトコンドリア損傷（例えば、カルシウム蓄積、興奮毒性、一酸化窒素曝露、低酸素等）、およびミトコンドリア脱制御。
【０２３７】
筋ジストロフィーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の、骨格筋の萎縮および心筋機能不全をもたらすことが多い、神経筋構造および機能の低下に関与する疾患のファミリーを指す。ある実施形態では、サーチュイン活性化化合物は、筋ジストロフィーを有する患者の筋肉の機能的能力の低下速度を低減するために、および筋肉の機能的状態を改善するために使用することができる。
【０２３８】
ある実施形態では、サーチュイン調節化合物は、ミトコンドリアミオパチーの治療に有用であり得る。ミトコンドリアミオパチーは、外眼筋の穏やかでゆっくりとした進行性脱力から、重症で致死的な小児性筋障害および多系統脳筋症に及ぶ。幾つかの症候群が明らかになっており、それらの間には幾らかの重複がある。筋肉に影響を及ぼす確立されている症候群には、以下のものが含まれる：進行性外眼筋麻痺、カーンズ−セイヤ症候群（眼筋麻痺、色素性網膜症、心伝導系障害、小脳性運動失調、および感音難聴を有する）、ＭＥＬＡＳ症候群（ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作）、ＭＥＲＦＦ症候群（ミオクローヌス性てんかん、および赤色ぼろ線維）、肢帯分布型脱力、および小児性筋障害（良性または重症および致死性）。
【０２３９】
ある実施形態では、サーチュイン活性化化合物は、カルシウム蓄積による毒性損傷、興奮毒性、一酸化窒素曝露、薬物誘発性毒性損傷、または低酸素等の、ミトコンドリアに対する毒性損傷を被る患者の治療に有用であり得る。
【０２４０】
ある実施形態では、サーチュイン活性化化合物は、ミトコンドリア脱制御に関連する疾患または障害の治療に有用であり得る。
【０２４１】
筋肉性能
他の実施形態では、本発明は、治療上有効量のサーチュイン活性化化合物を投与することにより、筋肉性能を増強するための方法を提供する。例えば、サーチュイン活性化化合物は、身体持久力（例えば、運動等の肉体的作業、肉体労働、スポーツ活動等を行なう能力）を向上させるために、肉体的疲労を阻害または遅延させるために、血中酸素レベルを増強するために、健常個体の活力を増強するために、作業能力および持久力を増強するために、筋肉疲労を低減するために、ストレスを低減するために、心臓および心臓血管機能を増強するために、性的能力を向上させるために、筋肉ＡＴＰレベルを増加させるために、および／または血中の乳酸を低減するために有用であり得る。ある実施形態では、本方法は、ミトコンドリア活性を増加させる、ミトコンドリア生合成を増加させる、および／またはミトコンドリア質量を増加させるある量のサーチュイン活性化化合物を投与することを含む。
【０２４２】
スポーツ能力は、スポーツ活動に参加する際にスポーツ選手の筋肉が機能を果たす能力を指す。スポーツ能力、力強さ、スピード、および持久力の増強は、筋収縮強度の増加、筋収縮振幅の増加、刺激および収縮間の筋肉反応時間の短縮により測定される。スポーツ選手は、例えば、ボディービルダー、自転車競技者、長距離ランナー、短距離ランナー等の、任意のレベルのスポーツに参加し、自らの能力の力強さ、スピード、および持久力のレベル向上を達成しようと努力する個人を指す。スポーツ能力の増強は、筋肉疲労を克服する能力、より長時間にわたって活動を維持する能力、およびより効果的な運動を示す能力により表される。
【０２４３】
スポーツ選手の筋肉性能の領域では、競合またはトレーニングを長期間にわたって高レベルの耐久力で可能にする状態を作り出すことが望ましい。
【０２４４】
また、本発明の方法は、急性筋肉減少症、例えば、筋萎縮症、ならびに／あるいは熱傷、床上安静、四肢固定、または胸部、腹部、および／もしくは整形外科的大手術に伴うカヘキシーを含む筋肉関連病態の治療に有効であろうということが企図される。
【０２４５】
ある実施形態では、本発明は、サーチュイン調節因子を含んでなる新規の食物組成物、それらの調製方法、およびスポーツ能力を向上させるために上記組成物を使用する方法を提供する。したがって、持久力を必要とするスポーツおよび反復筋肉活動を必要とする労働を含む広義の運動に関与する人々の身体持久力を向上させる作用および／または肉体疲労を阻害する作用を有する治療用組成物、食品、および飲料が提供される。そのような食物組成物は、電解質、カフェイン、ビタミン、炭水化物等を更に含んでいてもよい。
【０２４６】
他の使用
サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ウイルス感染症（インフルエンザ、ヘルペス、またはパピローマウイルスによる感染症等）を治療または予防するために、または抗真菌剤として使用することができる。ある実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、ウイルス疾患を治療するための別の治療剤と共に併用薬物療法の一部として投与することができる。別の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、別の抗真菌剤と共に併用薬物療法の一部として投与することができる。
【０２４７】
本明細書に記載のように治療することができる対象体には、哺乳動物、例えばヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、およびラット等の真核生物が含まれる。治療することができる細胞には、例えば上述の対象体に由来する真核細胞、または植物細胞、酵母細胞、および原核細胞、例えば細菌細胞が含まれる。例えば、調節化合物を家畜に投与して、より長期間牧畜条件に耐える家畜の能力を向上させることができる。
【０２４８】
また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、植物の寿命、ストレス耐性、およびアポトーシスに対する耐性を増加させることができる。１つの実施形態では、化合物は、例えば定期的な方式で植物または真菌に適用される。別の実施形態では、植物は、化合物を産生するように遺伝子組換えされる。別の実施形態では、植物および果物を、包装および輸送の前に化合物で処理して、輸送中の損傷に対する耐性を増加させる。また、植物種子を本明細書に記載の化合物と接触させて、例えば、植物種子を保存することができる。
【０２４９】
他の実施形態では、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、酵母細胞の寿命を調節するために使用することができる。酵母細胞の寿命を延長することが望ましい場合がある状況には、酵母が使用されるあらゆるプロセス、例えばビール、ヨーグルト、およびベーカリー品、例えばパンの製造が含まれる。寿命が延長された酵母を使用することにより、より少ない酵母の使用、または酵母のより長期間にわたる活性化をもたらすことができる。タンパク質を組換え的に生成するために使用される酵母または他の哺乳動物細胞も、本明細書に記載のように処理することができる。
【０２５０】
また、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物を使用して、昆虫の寿命、ストレス耐性、およびアポトーシスに対する耐性を増加させることができる。この実施形態では、化合物は、有益昆虫、例えばハチおよび植物の受粉に関与する他の昆虫に適用されるだろう。特定の実施形態では、化合物は、蜂蜜の生産に関与するハチに適用されるだろう。一般的に、本明細書に記載の方法は、商業的重要性を有し得る任意の生物、例えば真核生物に適用することができる。例えば、組成物は、魚類（水産養殖）および鳥類（例えば、ニワトリおよび家禽）に適用することができる。
【０２５１】
より高用量のサーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、発生中のサイレンシングされた遺伝子の制御およびアポトーシスの制御を妨害することにより、殺虫剤として使用することもできる。この実施形態では、化合物は、昆虫の幼虫には化合物が生物学的に利用可能であり、植物には利用可能ではないことを保証する当技術分野で公知の方法を使用して植物に適用することができる。
【０２５２】
少なくとも複製と長寿との間の関連性を考慮すると、サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、昆虫、動物、および微生物等の生物の複製に影響を及ぼすように適用することができる。
【０２５３】
４．アッセイ
本明細書で企図される更なる他の方法には、サーチュインを調節する化合物または作用剤を特定するためのスクリーニング法が含まれる。作用剤は、アプタマー等の核酸であってもよい。アッセイは、細胞に基づく形式または無細胞形式で実施することができる。例えば、アッセイは、サーチュインを調節することが知られている作用剤によりサーチュインが調節され得る条件下で、サーチュインを試験作用剤と共にインキュベートすること（接触させること）、および試験作用剤の存在下におけるサーチュイン調節のレベルを、試験作用剤の非存在下の場合と比べてモニターまたは決定することを含んでなる場合がある。サーチュイン調節のレベルは、基質を脱アセチル化するサーチュインの能力を決定することにより決定することができる。例示的な基質は、アセチル化ペプチドであり、ＢＩＯＭＯＬ社（プリマスミーティング、ペンシルベニア州）から取得することができる。好ましい基質には、アセチル化Ｋ３８２を含んでなるもの等の、ｐ５３のペプチドが含まれる。特に好ましい基質は、Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ−ＳＩＲＴ１（ＢＩＯＭＯＬ社製）、つまりアセチル化ペプチドＡｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２）である。他の基質は、ヒトヒストンＨ３およびＨ４に由来するペプチドまたはアセチル化アミノ酸である。基質は、蛍光発光性であってもよい。サーチュインは、ＳＩＲＴ１、Ｓｉｒ２、ＳＩＲＴ３、またはその部分であってもよい。例えば、組換えＳＩＲＴ１は、ＢＩＯＭＯＬ社から取得することができる。反応は、約３０分間実施し、例えばニコチンアミドを用いて停止させることができる。ＨＤＡＣ蛍光活性アッセイ／ドラッグディスカバリーキット（ＡＫ−５００、ＢＩＯＭＯＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用して、アセチル化のレベルを決定することができる。同様のアッセイは、Bittermanら（(2002) J. Biol. Chem. 277:45099）に記載されている。アッセイにおけるサーチュイン調節のレベルは、本明細書に記載の１つまたは複数の化合物（別々にまたは同時に）の存在下におけるサーチュイン調節のレベルと比較することができ、それは陽性または陰性対照としての役割を果たすことができる。アッセイで使用されるサーチュインは、全長サーチュインタンパク質またはその部分であってもよい。活性化化合物は、ＳＩＲＴ１のＮ末端と相互作用すると考えられることが示されているため、アッセイで使用されるタンパク質には、サーチュインのＮ末端部分、例えばＳＩＲＴ１のアミノ酸約１〜１７６または１〜２５５；Ｓｉｒ２のアミノ酸約１〜１７４または１〜２５２が含まれる。
【０２５４】
１つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、（ｉ）サーチュインが試験作用剤の非存在下で基質を脱アセチル化するのに適切な条件下で、サーチュインを試験作用剤およびアセチル化基質と接触させること；および（ｉｉ）基質のアセチル化レベルを決定することを含んでなり、基質のアセチル化のレベルが、試験作用剤の非存在下の場合と比べて試験作用剤の存在下においてより低いことは、試験作用剤がサーチュインによる脱アセチル化を刺激することを示し、基質のアセチル化のレベルが、試験作用剤の非存在下の場合と比べて試験作用剤の存在下においてより高いことは、試験作用剤がサーチュインによる脱アセチル化を阻害することを示す。
【０２５５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでサーチュインを調節、例えば刺激する作用剤を特定するための方法は、（ｉ）試験作用剤の非存在下でサーチュインが基質を脱アセチル化するのに適切な条件下で、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＤＡＣの阻害剤の存在下で、細胞を試験作用剤および細胞に進入することが可能な基質と接触させること；および（ｉｉ）基質のアセチル化のレベルを決定することを含んでなる場合があり、基質のアセチル化のレベルが、試験作用剤の非存在下の場合と比べて試験作用剤の存在下においてより低いことは、試験作用剤がサーチュインによる脱アセチル化を刺激することを示し、基質のアセチル化レベルが、試験作用剤の非存在下の場合と比べて試験作用剤の存在下においてより高いことは、試験作用剤がサーチュインによる脱アセチル化を阻害することを示す。好ましい基質は、アセチル化ペプチドであり、本明細書に更に記載されているように、好ましくは蛍光発光性でもある。本方法は、基質のアセチル化のレベルを決定するために細胞を溶解することを更に含んでなる場合がある。基質は、約１μＭ〜約１０ｍＭ、好ましくは約１０μＭ〜１ｍＭ、更により好ましくは約２００μＭ等の約１００μＭ〜１ｍＭの範囲の濃度で細胞に添加することができる。好ましい基質は、アセチル化リジン、例えば、ε−アセチルリジン（Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ、ＦｄＬ）またはＦｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓ−ＳＩＲＴ１である。クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＤＡＣの好ましい阻害剤は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）であり、これは、約０．０１〜１００μＭ、好ましくは１μＭ等の約０．１〜１０μＭの範囲の濃度で使用することができる。試験化合物および基質との細胞のインキュベーションは、約１０分〜５時間、好ましくは約１〜３時間実施する場合がある。ＴＳＡは、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＨＤＡＣを全て阻害し、ある基質、例えば、Ｆｌｕｏｒ  ｄｅ  Ｌｙｓは、ＳＩＲＴ２の不良な基質であり、ＳＩＲＴ３〜７の更に不良な基質であるため、そのようなアッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＩＲＴ１の調節因子を特定することができる。
【０２５６】
５．医薬組成物
本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、１つまたは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来方法で製剤化することができる。例えば、サーチュイン調節化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、例えば、注射（例えば、ＳｕｂＱ、ＩＭ、ＩＰ）、吸入もしくは吹送（口または鼻のいずれかを通して）、または経口、バッカル、舌下、経皮、経鼻、非経口、または直腸内投与による投与用に製剤化することができる。１つの実施形態では、サーチュイン調節化合物は、標的細胞が存在する部位、つまり特定の組織、器官、または液体（例えば、血液、脳脊髄液等）に、局所的に投与することができる。
【０２５７】
サーチュイン調節化合物は、全身性投与および局所的投与または限局性投与を含む様々な投与方法用に製剤化することができる。技術および製剤化は、一般的に、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PAに見出すことができる。非経口投与の場合、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下を含む注射が好ましい。注射の場合、化合物は、液体溶液、好ましくはハンクス溶液またはリンゲル液等の生理学適合緩衝液中に製剤化することができる。加えて、化合物は、固体形態に製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥された形態も含まれる。
【０２５８】
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、事前にゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容される賦形剤と共に従来手段により調製される錠剤、ロゼンジ、またはカプセル剤の形態を取っていてもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、液剤、シロップ剤、または懸濁剤の形態を取っていてもよく、または、使用前に水または他の好適な媒体を用いて構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性媒体（例えば、アチオンド油（ationd oil）、油状エステル、エチルアルコール、または分留植物油）；および保存剤（メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート、またはソルビン酸）等の薬学的に許容される添加剤を用いて従来方法により調製することができる。また、調製物は、適切な場合は、緩衝剤塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含有していてもよい。経口投与用の調製物は、活性化合物の制御放出をもたらすように好適に製剤化してもよい。
【０２５９】
吸入（例えば、肺送達）による投与の場合、サーチュイン調節化合物は、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスの使用による、加圧容器または噴霧器からのエアゾルスプレー提供の形態で便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、定量を送達するためのバルブを備えることにより決定することができる。吸入器または吹送器に使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプン等の好適な粉末基剤との粉末混合物を含有させて製剤化することができる。
【０２６０】
サーチュイン調節化合物は、注射、例えばボーラス注射または持続点滴による非経口投与用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤が添加された単位剤形、例えばアンプルでまたは多用量容器で提供することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳剤等の形態を取っていてもよく、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤等の製剤用作用剤を含有していてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に、好適な賦形剤、例えば無発熱性物質蒸留水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【０２６１】
また、サーチュイン調節化合物は、例えば、カカオ脂または他のグリセリド等の従来の坐剤用基剤を含有する坐剤または停留浣腸剤等の直腸用組成物に製剤化することができる。
【０２６２】
以前に記載されている製剤に加えて、サーチュイン調節化合物は、デポー製剤として製剤化することもできる。そのような長期作用製剤は、埋込み（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、サーチュイン調節化合物は、好適なポリマー性材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、または難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化することができる。また、放出制御製剤は、貼付剤を含む。
【０２６３】
ある実施形態では、本明細書に記載の化合物は、中枢神経系（ＣＮＳ）への送達用に製剤化することができる（Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)に概説されている）。ＣＮＳへの薬物送達の従来手法には、以下のものが含まれる：神経外科的戦略（例えば、脳内注射または脳室内注入）；ＢＢＢの内因的輸送経路のうちの１つを利用しようとする作用剤の分子操作（例えば、それ自体がＢＢＢを越えることができない作用剤と組み合わせた、内皮細胞表面分子に対して親和性を有する輸送ペプチドを含んでなるキメラ融合タンパク質を産生すること）；作用剤の脂質溶解度を増加させることを目的とする薬学的戦略（例えば、水溶性作用剤を脂質またはコレステロール担体に結合すること）；および高浸透圧破壊によるＢＢＢ完全性の一時的な破壊（頚動脈にマンニトール溶液を点滴すること、またはアンギオテンシンペプチド等の生理活性剤の使用に起因する）。
【０２６４】
リポソームは、容易に注射可能な更なる薬物送達系である。したがって、本発明の方法では、活性化合物は、リポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、当業者に周知である。リポソームは、コレステロール、ホスファチジルコリンのステアリルアミン等の様々なリン脂質から形成することができる。本発明の方法に使用可能なリポソームは、これらに限定されないが、小型単層膜小胞、大型単層膜小胞、および多層膜小胞を含む全てのタイプのリポソームを包含する。
【０２６５】
レスベラトロールまたはその誘導体等のサーチュイン調節因子の製剤、特に液剤を生産する別の方法は、シクロデキストリンの使用による。シクロデキストリンとは、α−、β−、またはγ−シクロデキストリンを意味する。シクロデキストリンは、Ｐｉｔｈａら、米国特許第４，７２７，０６４号に詳細に記載されており、この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。シクロデキストリンは、グルコースの環式オリゴマーであり、これら化合物は、シクロデキストリン分子の脂肪親和性指向性キャビティーに嵌合することができる任意の薬物と包接複合体を形成する。
【０２６６】
迅速崩壊または溶解剤形は、薬学的活性剤の迅速吸収、特に頬側吸収および舌下吸収に有用である。急速溶解剤形は、高齢患者および小児患者等の、カプレットおよび錠剤等の典型的な固形剤形を嚥下するのが困難な患者に有益である。加えて、急速溶解剤形は、例えば、咀嚼可能な剤形に伴う欠点を回避し、活性剤が患者の口に留まる時間は、味覚遮蔽の量の決定、および患者が活性剤の喉のざらざら感を訴え得る程度に重要な役割を果たす。
【０２６７】
医薬組成物（化粧用調製物を含む）は、０．００１〜１０％または０．１％〜５重量％等の約０．００００１〜１００％の本明細書に記載の１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を含んでなる場合がある。
【０２６８】
１つの実施形態では、本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、局所薬物投与に一般的に好適な局所用担体を含有し、当技術分野で公知な任意のそのような物質を含んでなる局所用製剤に組み込まれる。局所用担体は、所望の形態の、例えば軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、マイクロエマルジョン剤、ゲル剤、油状物、または液剤等としての組成物を提供するように選択することができ、天然または合成由来のいずれの物質で構成されていてもよい。選択された担体は、局所用製剤の活性剤または他の成分に悪影響を及ぼさないことが好ましい。本明細書での使用に好適な局所用担体の例には、以下のものが含まれる：水、アルコールおよび他の無毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、およびワックス等。
【０２６９】
製剤は、無色無臭の軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、マイクロエマルジョン剤、およびゲル剤であってもよい。
【０２７０】
サーチュイン調節化合物は、一般的に、典型的にはペトロラタムまたは他の石油派生物に基づく半固形調製物である軟膏剤に組み込むことができる。使用される特定の軟膏基剤は、当業者であれば理解するであろうが、最適な薬物送達を提供することになるものであり、好ましくは、他の所望の特徴、例えば皮膚軟化等も同様に提供することになるものである。他の担体または媒体の場合と同様に、軟膏基剤は、不活性、安定的、非刺激性、非感作性であるべきである。
【０２７１】
サーチュイン調節化合物は、一般的には肌表面に摩擦なく塗布される調製物であり、活性剤を含む固形微粒子が水またはアルコール基剤中に存在する典型的には液体または半液体調製物であるローション剤に組み込むことができる。ローション剤は、通常は固形物の懸濁物であり、水中油型の液体油状乳剤を含んでなる場合がある。
【０２７２】
サーチュイン調節化合物は、一般的には粘性液体または水中油型もしくは油中水型のいずれかの半固形乳剤であるクリーム剤に組み込むことができる。クリーム剤用基剤は、水洗性であり、油相、乳化相、および水相を含有する。油相は、一般的にペトロラタムおよびセチルまたはステアリルアルコール等の脂肪アルコールで構成されており、水相は、必ずしもそうではないが通常は、容積が油相より多く、一般的に保湿剤を含有する。クリーム剤製剤中の乳化剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、上記に説明されているように、一般的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、または両性の界面活性剤である。
【０２７３】
サーチュイン調節化合物は、界面活性剤分子の界面膜により安定化された、一般的に油および水等の２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的透明分散であるマイクロエマルジョン剤に組み込むことができる（Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9）。
【０２７４】
サーチュイン調節化合物は、一般的に、担体液体の全体にわたって実質的に均一に分布した小型無機粒子（二相系）または大型有機分子（単相ゲル）で作られる懸濁物のいずれかからなる半固体系であるゲル製剤に組み込むことができる。ゲル剤には一般的に水性担体液体が使用されるが、アルコールおよび油も同様に担体液体として使用することができる。
【０２７５】
また、製剤には、以下の他の活性剤が含まれていてもよい：例えば、他の抗炎症剤、鎮痛剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質、ビタミン、酸化防止剤、ならびにこれらに限定されないが、アントラニラート、ベンゾフェノン（特にベンゾフェノン−３）、カンファー誘導体、シンナマート（例えば、オクチルメトキシシンナマート）、ジベンゾイルメタン（例えば、ブチルメトキシジベンゾイルメタン）、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）およびその誘導体、ならびにサリチラート（例えば、サリチル酸オクチル）を含む日焼け止め製剤に一般的に見出される日焼け止め作用剤。
【０２７６】
ある局所用製剤には、活性剤は、製剤のおよそ０．２５重量％〜７５重量％の範囲、好ましくは製剤のおよそ０．２５重量％〜３０重量％の範囲、より好ましくは製剤のおよそ０．５重量％〜１５重量％の範囲、および最も好ましくは製剤およそ１．０重量％〜１０重量％の範囲の量で存在する。
【０２７７】
眼の状態は、例えば、サーチュイン調節化合物の全身性、局所的、眼内への注射により、またはサーチュイン調節化合物を放出する徐放性デバイスの挿入により、治療または予防することができる。サーチュインタンパク質のレベルおよび／または活性を増加させるサーチュイン調節化合物は、眼の角膜および内部領域、例えば、前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／繊毛、レンズ、脈絡膜／網膜、および強膜等への化合物の浸透を可能にするのに十分な時間にわたって、化合物が眼表面との接触を維持するように、薬学的に許容される眼科用媒体中で送達することができる。薬学的に許容される眼科用媒体は、例えば、軟膏、植物油、または封入材料であってもよい。あるいは、本発明の化合物は、硝子体液および房水に直接注射してもよい。更なる代替形態では、化合物は、眼を治療するための静脈点滴または注射等により全身性に投与してもよい。
【０２７８】
本明細書に記載のサーチュイン調節化合物は、無酸素環境で保管してもよい。例えば、レスベラトロールまたはその類似体は、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．社製のＣａｐｓｕｇｅｌ等の、経口投与用気密カプセル中に調製することができる。
【０２７９】
例えばサーチュイン調節化合物を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理した細胞を、対象体に移植片を投与するための方法に従って投与することができ、それには、例えば、免疫抑制剤薬物、例えばサイクロスポリンＡを投与することが伴う場合がある。医薬製剤の基本原則について、読者は、以下を参照されたい：Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996；およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000。
【０２８０】
サーチュイン調節化合物の毒性および治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的医薬手順により決定することができる。ＬＤ５０は、集団の５０％に対する致死用量である。ＥＤ５０は、集団の５０％で治療上有効な用量である。毒性および治療効果間の用量比（ＬＤ５０／ＥＤ５０）は、治療指数である。高い治療指数を示すサーチュイン調節化合物が好ましい。毒性副作用を示すサーチュイン調節化合物を使用してもよいが、非感染細胞に対する損傷可能性を最小限に抑え、それにより副作用を低減するために、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意すべきである。
【０２８１】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを使用して、ヒトで使用する用量の範囲を処方することができる。そのような化合物の用量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあってもよい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変動してもよい。いかなる化合物の場合でも、治療上有効量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（つまり、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、動物モデルに処方することができる。そのような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０２８２】
６．キット
また、本明細書では、キット、例えば、治療目的のキットまたは細胞寿命を調節またはアポトーシスを調節するためのキットが提供される。キット、例えば、予め測定された用量の１つまたは複数のサーチュイン調節化合物を含んでなる場合がある。キットは、必要に応じて、細胞を化合物と接触させるためのデバイスおよび使用説明書を含んでなる場合がある。デバイスには、注射器、ステント、および対象体（例えば、対象体の血管）にサーチュイン調節化合物を導入するための、または対象体の皮膚にサーチュイン調節化合物を塗布するための他のデバイスが含まれる。
【０２８３】
更に別の実施形態では、本発明は、本発明のサーチュイン（sirtruin）調節因子および別の治療剤（併用療法および併用組成物に使用されるものと同じもの）を含んでなる物質の組成物を、別々だが互いに付随する剤形で提供する。本明細書で使用される場合、用語「互いに付随した」は、別々の剤形が、一緒に包装されているか、またはそうでなければ互いに結合されており、そのため別々の剤形が同じ投薬計画の一部として販売および投与されることが意図されていることが直ちに明らかであることを意味する。作用剤およびサーチュイン調節因子は、好ましくは、ブリスターパックまたは他の多室包装中に、または使用者が分離できる（例えば、２つの容器間の点線で引き裂くことにより）接続されている個別の密閉容器（ホイルパウチ等）中に一緒に包装されている。
【０２８４】
更に別の実施形態では、本発明は、別々の容器に、ａ）本発明のサーチュイン調節因子；およびｂ）本明細書の他所に記載されているもの等の別の治療剤を含んでなるキットを提供する。
【０２８５】
本方法の実施には、別様の指定がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術が使用されることになり、それらは当技術分野の技術内にある。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)；DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；専門書Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer
and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)；Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照されたい。
【実施例】
【０２８６】
本発明は、今や一般的に記述されているが、以下の例を参照することによって、より容易に理解されるだろう。以下の例は、本発明のある態様および実施形態を説明する目的のために含まれているに過ぎず、いかなる点においても本発明を制限することは意図されていない。
【０２８７】
実施例１  物質および方法
ペプチドは全て、ＢｉｏＰｅｐｔｉｄｅ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）が調製し、分析用ＨＰＬＣ分析により、純粋が少なくとも９５％であることが示された。ウシグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、α−ケトグルタラート、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ＋は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製だった。全長ヒトＳＩＲＴ１および生物物理学的研究に使用される切断型ＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）は、以前に記述されているように調製し、同等の動力学的特性を有することが示された（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）。ニコチンアミダーゼＰＮＣ１は、Ｄｅｎｕおよび同僚ら（Smith et al. (2009) Anal Biochem 394, 101-109）により記述されるように調製した。
【０２８８】
実施例２  ＳＴＡＣの構造および合成
図５に関連して使用される化合物１〜２０の構造は、化合物表に示されており、２１〜２６の構造は、表１ならびに図９および１１に示されている。１０、１１、および１２の実験手順および特徴付けデータは、本明細書に見出すことができる。ＳＲＴ１４６０、ＳＲＴ１７２０、ＳＲＴ２１８３は、文献の手順に従って調製し（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）、３、２３、および２４も、文献の手順に従って調製した（Vu et al. (2009) J Med Chem）。化合物２５は、構造的に類似した化合物用に記載の手順に従って調製した（Vu et al. (2009) J Med Chem）。化合物３（Nunes et al. (2007)。国際公開第２００７／０１９３４６号）、４（Bemis et. al. (2008)。国際公開第２００８／１５６８６６号）、２６、１３、および１４（Vu et al. (2010)。国際公開第２０１０／００３０４８号）は、関連特許に記載の手順に従って調製した。７の合成は、本明細書に記載されている。
【０２８９】
実施例３  等温滴定熱量測定実験
ＩＴＣ実験は、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＴＣＥＰ、５％（容積／容積）グリセロール、および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．３で構成される緩衝液中で２６℃にて、ＶＰ−ＩＴＣシステムまたはｉＴＣ２００システム（ＭｉｃｒｏＣａｌ社製）のいずれかを使用して実施した。ＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）を精製し、緩衝液に対して透析し、遠心分離し、実験前に脱気した。ペプチドおよび化合物を、最終透析緩衝液に溶解し、それらのｐＨ値をタンパク質溶液のｐＨと一致するように調整した。ＶＰ−ＩＴＣシステムで実施したＳＴＡＣ／ＴＡＭＲＡペプチド相互作用を特徴付ける典型的な結合実験では、１ｍＭ  ＴＡＭＲＡペプチドを、８μＬの３５回等量で（最初のインジェクションを除く、最初のインジェクションは２μＬだった）、１００μＭ  ＳＴＡＣを含有する１．４７ｍｌ試料セルにインジェクトした。ｉＴＣ２００システムを使用してこの相互作用を特徴付けるために、１ｍＭ  ＴＡＭＲＡペプチドを、２μＬの２０回等量で（最初のインジェクションを除く、最初のインジェクションは０．５μＬだった）、１００μＭ  ＳＴＡＣを含有する０．２０２ｍＬ試料セルにインジェクトした。溶解度が不良なＳＴＡＣの場合、それに応じて濃度を調整した。ＳＲＴ１４６０とＴＡＭＲＡペプチドとの相互作用を特徴付けるために、５ｍＭ  ＴＡＭＲＡペプチドおよび０．５μＭ  ＳＲＴ１４６０を使用して、より高品質のデータを取得した。
【０２９０】
ＶＰ−ＩＴＣシステムでＳＴＡＣとＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）との相互作用を特徴付けるために、１００μＭ酵素を、８μＬの３５回等量で（最初のインジェクションを除く、最初のインジェクションは２μＬだった）、１０μＭ  ＳＴＡＣを含有する１．４７ｍＬ試料セルにインジェクトした。ｉＴＣ２００システムでの典型的な結合実験では、１００μＭ酵素を、２μＬの２０回等量で（最初のインジェクションを除く、最初のインジェクションは０．５μＬだった）、１００μＭ  ＳＴＡＣを含有する０．２０２ｍＬ試料セルにインジェクトした。
【０２９１】
全ての場合で、データは、希釈熱を補正し、化学量論（ｎ）、反応のエンタルピー（ΔＨ）、および計算した結合定数（Ｋａ）を用いた単一部位結合モデルを使用して、ＩＴＣ  ｖ７．０３８３のＯｒｉｇｉｎ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ社製）で非線形最小二乗法ルーチンを使用してフィッティングした。
【０２９２】
結果
ＳＩＲＴ１活性化に関する本発明者らの研究の課程で、本発明者らは、幾つかのＳＴＡＣがＴＡＭＲＡペプチドに結合して、活性化因子：基質複合体を形成することを見出した。この複合体の機械論的重要性を探究するため、ＴＡＭＲＡペプチドに対するＳＴＡＣ結合のＫｄ値を、効力がＥＣ１．５＝０．０５から≧１００μＭの範囲だった２０個の活性化因子について、ＩＴＣを使用して決定した（これら化合物の構造は、表６を参照）。図４には、代表的なＩＴＣ滴定が示されている。４の滴定が図４Ａに示されており、この滴定では、ＴＡＭＲＡペプチドに対する検出可能な結合は示されていない。これら実験条件下では、この化合物は、ＴＡＭＲＡペプチドに結合する場合でも、控えめに見積もって１００μＭを超える場合があるＫｄ値で結合する。図４Ｂは、７の滴定であり、３６μＭのＫｄでＴＡＭＲＡペプチドに結合することが示されている。このＫｄ値は、０．５μＭのＫｘ値よりも７２倍高い（７の活性化滴定曲線は、図４Ｂの挿入図を参照）。ＫｄとＫｘとの間にこのような矛盾があることは、７による活性化が、基質との結合に依存しないことを示唆する。
【０２９３】
図２Ａの機序は、図３のシミュレーションにより示されるように、ＥＣ１．５値が、Ｋｄ値に依存するはずであることを予測する。これを調査するために、本発明者らは、ＥＣ１．５をＫｄの関数としてプロットした（図５）。このプロットに見られるように、活性化効力と、ＴＡＭＲＡペプチドに対するＳＴＡＣの親和性との間には相関性が存在しない。灰色で強調されているのは、２．５から１００μＭを超える範囲のＫｄ値を有するが、約０．３μＭの同じＥＣ１．５値を有する一連の化合物である。これにより、ＴＡＭＲＡペプチドのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を活性化するＳＴＡＣの能力が、この基質に対するＳＴＡＣの親和性と無関係であることが明白に示される。
【０２９４】
恐らくは、ある構造クラスのＳＴＡＣの場合、ＥＣ１．５とＫｄとの間に相関性が存在する可能性があると推測することができる。そのような相関性は、図５の１０と２０とを接続する直線を規定することになる。この直線上の特定の化合物の構造を検討することにより、それらが、図５の化合物を含んでなる３つの構造クラス全てを表わすことが明らかにされる。したがって、本発明者らが、ＳＴＡＣ構造クラスにより相関性の可能性を解析しようとする場合でもさえも、ＥＣ１．５とＫｄとの間には相関性が存在しない。
【０２９５】
ＳＩＲＴ１に対する活性化因子の結合は、基質増強と一致しないが、酵素アロステリズムと一致する。試験したおよそ２０個の化合物（表６を参照）の中で、ＩＴＣを使用してＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）と３個のＳＴＡＣとの相互作用を検出することができた。本発明者らは、４、１３、および１４が、それぞれ３．０、０．３２、および０．４３μＭと等しいＫｘ値で結合することを見出した（要約および構造については、表１を参照）。代表的なものとして、１４の実験データが図８Ａに示されている。この化合物の場合、本発明者らは、蛍光結合実験も実施することができた。本発明者らは、４５０ｎｍにおけるこの化合物の発光蛍光が、ＳＩＲＴ１の濃度増加と共に減少したことを観察した（図８Ｂ）。これらデータの定量化により、０．２７μＭのＫｘ値の計算が可能になり（図８Ｃ）、それはＩＴＣ測定と一致した。
【０２９６】
【表１】
0006038773.tif 000049
【０２９７】
図２Ａの機序は、ＳＩＲＴ１と活性化因子との複合体形成の可能性を排除していることに留意されたい。対照的に、図２Ｂのアロステリック機序は、そのような複合体形成を含んでいるが、必要とするわけではない。試験した２０個のＳＴＡＣうち３個のみがＳＩＲＴ１に結合することができ、したがって、この機序と一致する。
【０２９８】
表２には、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｘに対するＳＴＡＣ結合のＫｄ値が要約されている。ＳＲＴ１４６０を除き、化合物の溶解度は、１０％ＤＭＳＯを含有する溶液でこれらＩＴＣ実験を行なうことを必要としたことに留意されたい。これらＳＴＡＣと、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｐｈｅ−ＮＨ２およびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２との相互作用は、Ｃ末端アミノ酸のフェニルおよびインドール部分によるものであり、したがって、疎水性効果により主導される可能性が高いことを考慮すると、これらＫｄ値は、活性化アッセイが実行されるＤＭＳＯ濃度である１％ＤＭＳＯの溶液中でのＫｄ値よりも大きい可能性がある。
【０２９９】
【表２】
0006038773.tif 000050
【０３００】
アミドおよびＡＭＣ誘導体の場合、４個のＳＴＡＣのいずれとも検出可能な相互作用は存在しない。重要なことには、１０は、ＡＭＣ誘導体の脱アセチル化を活性化する。この基質に対する１０の結合が存在しないことと合わせると、基質増強による活性化を除外することができる。
【０３０１】
Ｘ＝ＰｈｅＮＨ２の場合、ＳＲＴ１４６０に対する結合は存在しないが、基質の脱アセチル化の活性化は存在する。対照的に、１０は、この基質に結合するが、その脱アセチル化を活性化しない。最後に、Ｘ＝ＴｒｐＮＨ２の場合、ＳＲＴ１７２０は、結合するが活性化せず、１０は、結合し、かつ活性化する。
【０３０２】
ＴＡＭＲＡペプチドの脱アセチル化の活性化と同様に、ＳＴＡＣの活性化能力と基質に対するその親和性との間に相関は存在しない。
【０３０３】
実施例４  １４とＳＩＲＴ１との相互作用に関する蛍光結合実験
ＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）を、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＴＣＥＰ、５％（容積／容積）グリセロール、および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．３で構成される緩衝液に対して透析した。１４を、最終透析緩衝液に溶解し、そのｐＨ値をタンパク質溶液のｐＨと一致するように調整した。様々な濃度の酵素の非存在下または存在下における１４の蛍光発光スペクトルを、３１５ｎｍで励起させてＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５でモニターした。４５０ｎｍでの蛍光強度変化を、ＳＩＲＴ１（１８３〜６６４）の濃度に対してプロットし、標準結合数式を使用してフィッティングした。
【０３０４】
実施例５  ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドを使用した、Ｓｉｒｔｒｉｓ化合物コレクションのスクリーニング
本発明者らのおよそ５，０００個のＳＩＲＴ１活性化因子のコレクションを、ＢｉｏＴｒｏｖｅ質量分析システムを使用して、以前に記述されているようにスクリーニングした（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）。このスクリーリングでは、［ＳＩＲＴ１］ｏ＝５ｎＭ、［ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド］ｏ＝１μＭ＝Ｋｍ／１０、および［ＮＡＤ＋］ｏ＝３０μＭ＝Ｋｍ／１０である。化合物は、１０μＭで存在し、アッセイは、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＤＴＴ、１％ＤＭＳＯ、および０．０２５％ＢＳＡを含有するｐＨ７．４緩衝液中で実施した。
【０３０５】
結果
Ｓｉｒｔｒｉｓの最初の活性化因子リード構造物を、基質としてＴＡＭＲＡペプチドを用いた蛍光偏光アッセイを使用したハイスループットスクリーニング戦略で特定した（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）。この２０量体は、ＳＩＲＴ１の天然基質である、ｐ５３のＬｙｓ３８２付近を中心とする。ｐ５３に対するＴＡＭＲＡペプチド配列の修飾を、特にこのアッセイ用に製作した（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716；Marcotte et al. (2004) Anal Biochem 332, 90-99）。最初のスクリーニングヒットの特徴付けおよびその後の全研究は、ＴＡＭＲＡペプチドおよび質量分光法に基づくアッセイを使用して実施した（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）。
【０３０６】
これら最初の活性化因子リード化合物付近で構造活性相関が現れたため、これら化合物が、ＴＡＭＲＡ部分を欠如したＴＡＭＲＡペプチド類似体の脱アセチル化を活性化することができるか否かを確かめることが興味深いものとなった。Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）により報告されたものを含む、本発明者らが最初に試験した幾つかのＳＴＡＣのうち、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドの脱アセチル化を活性化することができたものはなかった。これらの結果は、Ｐａｃｈｏｌｅｃら（(2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）により最近報告された結果と一致しており、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１の活性化は、基質の構造的特徴に強く依存することを示す。しかしながら、Ｐａｃｈｏｌｅｃら（(2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）および他者ら（Kaeberlein et al. (2005) J. Biol. Chem. 280, 17038-17045；Beher et. al (2009) Chem Biol Drug Des）は、基質構造に対する活性化の依存性を、基質関連アーチファクトおよびＳＩＲＴ１活性化の「間接的」機序を反映すると解釈しているが、本発明者らは、これらの結果がＳＩＲＴ１のアロステリック制御の重要な特徴を明らかにしていると考える。
【０３０７】
試験した幾つかのＳＴＡＣの中には、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドの脱アセチル化を活性化したものはなかった。この知見の一般性を試験するために、本発明者らは、本発明者らの５，０００個を超えるＳＴＡＣのコレクションを、このペプチドの脱アセチル化を活性化するそれらの能力についてスクリーニングした。このスクリーニングの結果は、３つの構造的に関連するＳＴＡＣ：１０、１１、および１２の特定だった。３つの化合物の活性化滴定曲線は、図６に示されており、３つ全てが、それぞれ約２μＭおよび２．３のＥＣ５０およびＲＶｍａｘ値で、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を活性化することを理解することができる。これらの結果により、ＴＡＭＲＡ部分を欠如するペプチドは、ＳＴＡＣによる活性化を依然として支援することができることが示される。
【０３０８】
ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチドは、活性化を依然として支援するが、ＬｙｓＡｃのＮ末端側にビオチン部分が残留する。これは、ビオチンが単独で活性化を支援することができるか否かに関する疑問に答えていない。この疑問に答えるために、本発明者らは、ｄｅｓ（ビオチン，ＴＡＭＲＡ）ペプチドに対する１０、１１、および１２の効果を検討し、いずれもこの基質の脱アセチル化を活性化しないことを見出した。これは、脱アセチル化がＳＴＡＣにより活性化されるには、ある程度の立体的大きさを有する化学部分がペプチド基質に存在することが必要であることを示唆する。
【０３０９】
実施例６  ＳＴＡＣとＳＩＲＴ１との相互作用の動力学的研究
ＳＴＡＣとＳＩＲＴ１との相互作用を決定するために、２つの動力学的方法を使用した。一方の方法を、ＴＡＭＲＡペプチド、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド、ｄｅｓ（ビオチン，ＴＡＭＲＡ）ペプチド、およびｐ５３−２０量体について使用し、ペプチド反応産物を検出するためには、以前に記述されている質量分光法使用した（Milne et al. (2007) Nature 450, 712-716）。他方の方法を、基本構造Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｘのペプチドで使用し、以前に報告されている連続した酵素結合法を使用した（Smith et al. (2009) Anal Biochem 394, 101-109）。この方法では、ＳＲＴ１産物ニコチンアミドが、ＰＮＣ１の作用により、まずニコチン酸およびアンモニアに変換され、その後アンモニアは、α−ケトグルタラートをグルタメートに変換するためにＧＤＨにより使用される。この反応は、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化と共に生じ、３４０ｎｍの吸光度の変化（Δε３４０＝−６，２００Ｍ−１ｃｍ−１）を伴う。
【０３１０】
活性化因子を特徴付けるために使用される動力学的実験は、２５℃に維持された水ジャケット付の８セルチェンジャーを装備したＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製Ｌａｍｂｄａ２５型分光光度計で実行した。典型的な動力学的実験では、ＳＩＲＴ１を除く反応溶液の全成分を、１ｍＬキュベットに添加し、熱平衡に到達させた。結合系成分の終濃度は、以下の通りだった：１μＭ  ＰＮＣ１、０．２３ｍＭ  ＮＡＤＨ、３．４ｍＭ  α−ケトグルタラート、および２０Ｕ／ｍＬウシＧＤＨ。この溶液も、本文中に示されている濃度のペプチド基質、ＮＡＤ．０．、および活性化因子を含有していた。最終ＤＭＳＯ濃度を１％で一定に維持し、これら試験で使用した緩衝液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５だった。系が熱平衡に到達する間に、吸光度をモニターして、バックグラウンド速度の正確な推定を準備し、それをＳＩＲＴ１の添加後の反応速度から差し引いた。
【０３１１】
結果
表３には、この研究で使用した基質の定常状態動力学的パラメーターが要約されている。この表に報告されているパラメーターは全て、ＰＮＣ１−ＧＤＨ結合アッセイを使用して決定した。また、４つの２０量体の動力学的パラメーターを、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）により最初に記述された質量分光法に基づくアッセイを使用して推定した。それらは、表３に報告されている動力学的パラメーターと一致する。
【０３１２】
【表３】
0006038773.tif 000051
【０３１３】
ＳＴＡＣがどのようにＳＩＲＴ１と相互作用するかに対して、基質構造が強い影響を及ぼすことを示す上記の研究により動機付けられ、ＸがＮＨ２、ＡＭＣ、ＰｈｅＮＨ２、およびＴｒｐＮＨ２であるＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｘの脱アセチル化をＳＴＡＣがどのように達成するかを調査した。Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＡＭＣ（別名Ｆｌｕｏｒ−ｄｅ−Ｌｙｓ（商標登録）、Ｂｉｏｍｏｌ社製）は、レスベラトロールが特定および特徴付けられたアッセイで使用された基質であり（Howitz et al. (2003) Nature 425, 191-196）、ＳＩＲＴ１の活性化因子および阻害剤のスクリーニングに広く使用されている。
【０３１４】
表４には、単一濃度の２２、および５つの基質の脱アセチル化に対する、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）で発表された３つのＳＴＡＣの効果が要約されている。本発明者らが４つの２０量体で観察したのと同様に、特定のＳＴＡＣが脱アセチル化に対して示す効果は、基質の構造に依存する。例えば、ＳＲＴ１４６０は、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｐｈｅ−ＮＨ２およびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２の脱アセチル化を活性化するが、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＡＭＣの脱アセチル化を阻害し、２２は、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＡＭＣおよびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２の脱アセチル化を活性化するが、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＮＨ２の脱アセチル化を阻害する。
【０３１５】
【表４】
0006038773.tif 000052
【０３１６】
これら観察の幾つかを、完全な滴定曲線で更に調査した。図１０Ａから、本発明者らは、２２が、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−ＡＭＣおよびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２の脱アセチル化を用量依存的様式で活性化することを理解する。同様に、図１０Ｂでは、ＳＲＴ１４６０は、Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｐｈｅ−ＮＨ２およびＡｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２の脱アセチル化を用量依存的に活性化する。これらの結果は、非常に重要であり、ＳＴＡＣが、天然アミノ酸のみを含んでなるペプチド基質の脱アセチル化を加速することができることを示している。
【０３１７】
実施例７  活性化データの基本的処理
活性化因子滴定を、相対速度（つまり、活性化因子の非存在下での速度ｖｏに対する活性化因子Ｘの存在下での速度Ｖｘの比率）対活性化因子の初期濃度［Ｘ］ｏとしてプロットし、非線形最小二乗法により、数式（１）の酵素活性化の機序非依存的数式にフィッティングした：
【０３１８】
【数１】
0006038773.tif 000053
式中、ＲＶｍａｘは、最大相対速度（つまり、無限［Ｘ］ｏにおけるｖｘ／ｖｏ）であり、ＥＣ５０は、ｖｘ／ｖｏ＝（ＲＶｍａｘ−１）／２である場合の活性化因子濃度である。ＥＣ５０は、触媒および活性化の両方の動力学的機序および基質の濃度の関数である。
【０３１９】
その不溶性および効力により、ＲＶｍａｘおよびＥＣ５０を正確に推定するのに十分な程度に高い濃度を達成することが妨げられた活性化因子の場合、活性化因子の効力は、１．５倍の活性化を達成するのに必要とされる活性化因子の濃度であるＥＣ１．５として表わすことができる。ＥＣ１．５は、以下の数式と等しいことを示すことができ、
【０３２０】
【数２】
0006038773.tif 000054
したがって、これは、活性化因子の効力を反映し、ＲＶｍａｘおよびＥＣ５０の両方に依存する。ＲＶｍａｘがほぼ同じである一連の活性化因子の場合、比率ＥＣ１．５／ＥＣ５０は、この一連の活性化因子の全てのメンバーで類似することになり、したがって、ＥＣ１．５  ＥＣ５０のいずれかを、活性化因子の効力の指標として使用することができる。
【０３２１】
ＥＣ１．５の逆数は、活性化因子の効力の直接的指標であり、以下の数式と等しい：
【０３２２】
【数３】
0006038773.tif 000055
【０３２３】
（ＥＣ１．５）−１は、標準的定常状態酵素動力学のＶｍａｘ／Ｋｍと類似していることを理解することができる。
【０３２４】
実施例８  活性化因子：基質複合体の形成による酵素活性の動力学的モデル
図２Ａの機序の速度則は、迅速平衡化を仮定して導き出した数式（４）の表現から開始して導き出すことができる。
【０３２５】
【数４】
0006038773.tif 000056
【０３２６】
基質濃度項は、総基質ではなく、遊離基質に対応することに留意されたい。これは、この機序では、Ｘ：Ｓが、［Ｓ］ｏ、［Ｘ］ｏ、およびＫｄに応じて、総基質のかなりの部分を占める場合があるからである。
【０３２７】
総基質および遊離基質の点で速度則を表現するために、数式（４）を、数式（５）に示されているように書き直すことができる。
【０３２８】
【数５】
0006038773.tif 000057
【０３２９】
この展開は、本発明者らが、［Ｓ］ｏ、［Ｘ］ｏ、およびＫｄの点で［Ｓ］を表現することができれば、完成することになる。これは、Ｋｄの定義から開始し、数式（６）に示されている：
【０３３０】
【数６】
0006038773.tif 000058
【０３３１】
無論、数式（６）は、二次方程式として表現することができ：
【０３３２】
【数７】
0006038773.tif 000059
これは、以下の解を有する。
【数７−２】
0006038773.tif 000060
【０３３３】
結果
ＳＩＲＴ１活性化の「間接的」機序の中心的特徴は、Ｘ：Ｓ、活性化因子と基質との複合体である（図２Ａを参照）。この機序を検討すると、活性化はＸ：Ｓ形成により主導されることが示され、それは、より低いＫｄ値を示すＸ：Ｓ複合体が、より強力な活性化をもたらすはずであることを意味する。したがって、本発明者らは、図２Ａの機序の場合は、ＥＣ５０とＫｄとの間に正の相関性があると予想するべきである。これを試験するため、本発明者らは、数式（８）の遊離基質の表現、および式の両側を対照速度ｖｏ／［Ｅ］ｏ＝ｋｃ［Ｓ］ｏ／（ｋｍ＋［Ｓ］ｏ）で除算して、相対速度ｖｘ／ｖｏの表現を得た改良型の数式（５）を使用して、活性化因子滴定曲線をシミュレートした。
【０３３４】
これら曲線は図３に示されており、以下のパラメーター指定を用いて生成した：Ｋｍには、数値５μＭを割り当て、このＫｍはＴＡＭＲＡペプチドのＫｍであり；ＳＴＡＣによる活性化は、主にＫｍ低下の結果であり、ｋｃには変化がほとんどないかまたは全くないことが観察されたため、γには１の値を割り当て；Ｋｍ，ｘには、Ｋｍよりも２０倍小さい０．２５μＭの値を割り当て、ＳＴＡＣによるＳＩＲＴ１活性化が主にＫｍの低下に起因するという実験的観察をここでも重視した。［Ｓ］ｏ＝Ｋｍ／１０＝０．５μＭとし、これは、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）およびＰａｃｈｏｌｅｃら（(2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）の両方の研究で使用された濃度である。最後に、Ｋｄは、３から３００μＭまで変動させ、この範囲は、ＳＴＡＣとＴＡＭＲＡペプチドとの相互作用について測定された値の範囲を包含する。この機序の場合に予想されるように、シミュレーションは、ＥＣ５０がＫｄと正相関することを示す。
【０３３５】
実施例９  アロステリック機序による酵素活性化の動力学的モデル
図２Ｂの機序の速度則は、迅速平衡化を仮定して導き出すことができ、数式（９）に示されている。
【０３３６】
【数８】
0006038773.tif 000061
式中、
【０３３７】
【数９】
0006038773.tif 000062
【０３３８】
【数１０】
0006038773.tif 000063
である。
【０３３９】
結果
基質（susbtrate）増強が、１０またはＳＲＴ１４６０によるＴＡＭＲＡペプチドのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化の活性化を説明することができるか否かを決定するために、図２Ａの間接的機序の妥当性を評価した。化合物１０およびＳＲＴ１４６０が、本研究におけるＳＴＡＣの基質親和性の２つの極値、２．５および１４０μＭのＫｄ値をそれぞれ示すため、化合物１０およびＳＲＴ１４６０を選択した。
【０３４０】
図６は、１０によるＳＩＲＴ１の活性化の滴定曲線を示す。［Ｓ］ｏを０．５μＭの実験値に設定し、Ｋｍを５μＭに制限して、データセットを数式（５）にフィッティングすると、残りのパラメーターの最適フィッティング推定が以下のように算出された：Ｋｄ＝５３±８μＭ、ｋｍ，ｘ＝０．０３５±０．０１１μＭ、およびγ＝０．６９±０．０８。直ちに明らかになることは、Ｋｄの最適フィッティング値が、実験的に測定された２．５μＭのＫｄ値よりも２０倍高いということである。Ｋｄを２．５μＭに制限すると、非線形最小二乗法フィッティングは収束せず、Ｋｄ＝２．５μＭを示すＳＴＡＣのデータを説明することができるｋｍ，ｘおよびγの値が存在しないことを示した。
【０３４１】
本研究におけるＳＴＡＣのＫｄの他方の極値は、ＳＲＴ１４６０で生じ、１４０μＭのＫｄ値を示す。図２Ａの機序がそのような活性化因子を説明することができるか否かを決定するために、本発明者らは、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）に報告されている活性化滴定曲線を数式（５）の表現にフィッティングした。この曲線は、図７Ａに再現されている。１０の滴定曲線とは対照的に、これらのデータは、図２Ａの機序の速度則にフィッティングすることができた。このフィッティングでは、以下の制限を使用した：Ｋｄ＝１４０μＭ、実験的に決定された値；［Ｓ］ｏ＝０．５μＭ、実験で使用した濃度；およびＫｍ＝１４．５μＭ、実験的に決定された値（つまり、図７Ｂからの対照）。これら制限を用いて、本発明者らは、Ｋｍ，ｘ＝９０ｎＭおよびγ＝０．２０であることを見出した。
【０３４２】
図２Ａの機序が、ＳＲＴ１４６０の場合に、上記の分析が示唆するように実際に機能するか否かを確かめるために、本発明者らは、初速度が、幾つかの一定濃度のＳＲＴ１４６０で、基質濃度の機能として決定された別のタイプの活性化実験のデータを検討した。図２Ａの機序がＳＲＴ１４６０の場合に成り立つとすれば、２つのタイプの実験のパラメーター推定は同じでなければならない。本発明者らが検討したデータセットも、Ｍｉｌｎｅら（(2007) Nature 450, 712-716）に由来するものであり、図７Ｂに示されている。このデータを数式（５）にグローバルフィッティングして、以下の結果を得た：Ｋｍ，ｘ＝１．０±０．１μＭおよびγ＝１．５３±０．０７。このフィッティングでは、Ｋｄには、実験的に決定された１４０μＭの値を割り当て、ＫｍおよびＶｍａｘには、［ＳＲＴ１４６０］＝０を用いた曲線からの値を割り当てた（表５を参照）。
【０３４３】
【表５】
0006038773.tif 000064
【０３４４】
２つのタイプの活性化実験には、活性化パラメーターｋｍ，ｘとγの間に非常に大きな矛盾があることに留意されたい。Ｋｍ，ｘ＝０．０９０μＭおよびγ＝０．２０が活性化因子滴定曲線の分析から導き出され、ｋｍ，ｘ＝１．０およびγ＝１．５３が、一定濃度の活性化因子でのミカエリス−メンテンプロット分析から導き出された。したがって、図２Ａの機序は、ＳＲＴ１４６０による活性化を、内部的に一貫した結果に結び付く様式で説明することができない。
【０３４５】
酵素アロステリズムは、ＳＲＴ１４６０によるＴＡＭＲＡペプチドのＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化の活性化を説明することができる。活性化のアロステリック機序の速度則を使用して、図７Ｂのデータをフィッティングすると、以下の最適フィッティングパラメーターが得られる：Ｋｘ＝８．７±０．８μＭ、β＝０．２６±０．０２、およびγ＝１．４８±０．０４。数式（９）およびこれらパラメーターを使用して引かれた直線は、データに対して優れたフィッティングを示す。これら直線は、個々のフィッティングおよび表５のパラメーター推定から引いた直線と一致する。
【０３４６】
ＳＴＡＣによる活性化が、ペプチド配列に依存し得る可能性、および天然基質に対応する配列を有するペプチドにのみ生じ得る可能性を検討するために、本発明者らは、ｐ５３−２０量体のＳＩＲＴ１触媒性脱アセチル化を活性化するそれらの能力について、１０、１１、および１２を試験した。重要なことには、これらの３つの化合物は、この反応を阻害する（図９を参照）。これらの結果は、非活性部位リガンドが活性化因子または阻害剤として作用するか否かが、比率γ／βにより決定される図２Ｂのアロステリック機序と一致している。すなわち、活性化は、γ／β＞１の場合に観察され、阻害は、γ／β＜１の場合に観察される。図２Ａの機序には、酵素と調節因子との複合体の形成に対する準備がないため、阻害を説明することができないことに留意されたい。基質枯渇による阻害（つまり、Ｘ：Ｓは基質ではなく、基質の「捨て場（sink）」として作用するに過ぎない）が、形式的には可能であるが、Ｐａｃｈｏｌｅｃら（(2010) J. Biol. Chem. 285, 8340-8351）が指摘するように、ＳＴＡＣが、ＴＡＭＲＡまたは他の「大きい」基を有していないペプチドには結合しないため、基質枯渇による阻害は除外されることに留意すべきである。
【０３４７】
実施例１０  ＳＩＲＴ１の構造モデル
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ４．０．１（Guex and Peitsch (1997) Electrophoresis 18, 2714-2723）を使用し、ＡＣＳ２ペプチドが結合したＳＩＲＴ３構造（ＰＤＢ  ｉｄ．３ＧＬＲ）（Jin et al. (2009) J. Biol. Chem. 284, 24394-24405）をテンプレートとして用いてＳＩＲＴ１相同性モデルを作成した。Ａｃ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＡｃ−Ｔｒｐ−ＮＨ２ペプチドを、Ａ．フルギダス（Ａ．Ｆｕｌｇｉｄｕｓ）ＳＩＲ２構造（ＰＤＢ  ｉｄ．１ＭＡ３）（Avalos et al. (2002) Mol Cell 10, 523-535）と結合したｐ５３ペプチド、およびＳＩＲＴ３構造（ＰＤＢ  ｉｄ．３ＧＬＲ）（Jin et al. (2009) J. Biol. Chem. 284, 24394-24405）に結合したＡＣＳ２ペプチドに基づいてモデル化した。
【０３４８】
実施例１１  ２−ブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミド（Ｘ）の調製：
ステップ１）２−ブチル−６−ヒドロキシピリミジン−４−カルボキシル酸の合成：
【０３４９】
【化４８】
0006038773.tif 000065
【０３５０】
２１．０ｇ（１００ｍｍｏｌ）のオキサロ酢酸ジエチルナトリウム塩に、８０ｍＬの水を添加した。この撹拌懸濁液に、１６ｍＬの６．２５Ｍ（１００ｍｍｏｌ）ＮａＯＨ（ａｑ．）を周囲温度にて１分間にわたって添加した。微量の不溶解オキサロ酢酸エステルしか残らなくなるまで、混合物を１０分間撹拌し、オレンジ色の溶液を得た。これに、１３．９ｇ（１００ｍｍｏｌ）ｎ−ペンタンアミジン塩酸塩の２０ｍＬ水溶液を添加した。反応をｐＨ計でモニターし、必要に応じて、追加の６．２５Ｍ  ＮａＯＨを添加して、ｐＨを１０〜１１に維持した。周囲温度で２２時間撹拌した後、混合物を氷浴で冷却し、その後ｐＨ＝２になるまで１２Ｍ  ＨＣｌを添加し、白色沈殿を得た。これをろ過し、５０ｍＬの水で洗浄し、その後フィルター上で１時間乾燥した。白色固形物を５０ｍＬのヘプタンに懸濁し、ディーン−スタークトラップを用いて、水がそれ以上トラップに収集されなくなるまで、１ｂａｒで蒸留した。懸濁液を冷却し、ろ過し、フィルター上で乾燥して、８．１３ｇ（４１％）の２−ブチル−６−ヒドロキシピリミジン−４−カルボキシル酸を得た。Ｃ９Ｈ１２Ｎ２Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：１９６；測定値：１９７［Ｍ＋Ｈ］。
【０３５１】
ステップ２）２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボニルクロリドの合成：
【０３５２】
【化４９】
0006038773.tif 000066
【０３５３】
５．０ｇ（２５．４８ｍｍｏｌ）の２−ブチル−６−ヒドロキシピリミジン−４−カルボキシル酸に、３５ｍＬのオキシ塩化リンを添加した。反応を１０５℃で１時間撹拌し、その後減圧下で濃縮した。暗色残渣を５０ｍＬヘプタンに懸濁し、その後減圧下で濃縮して、残りのオキシ塩化リンのほとんどを除去した。次に、残渣を１００ｍＬのヘプタンに懸濁し、水で（３×２５ｍＬ）、その後ブライン（１×２５ｍＬ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮して、５．１ｇ（８６％）の２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボニルクロリドを得た。Ｃ９Ｈ１０Ｃｌ２Ｎ２ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：２３３；測定値：２３４［Ｍ＋Ｈ］。
【０３５４】
ステップ３）６−（ブロモメチル）−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジンの合成：
【０３５５】
【化５０】
0006038773.tif 000067
【０３５６】
以前に公開されている国際公開第２００７／０１９３４６の手順に従って調製した。
【０３５７】
ステップ４）ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０３５８】
【化５１】
0006038773.tif 000068
【０３５９】
２．７３ｇ（１３．５６ｇ）のｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラート、４．７５ｇ（１３．５６ｍｍｏｌ）の６−ブロモメチル−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン、２３０ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）のテトラブチルアンモニウム重硫酸塩、および５．４２ｇ（１３５．６ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムの混合物に、１５ｍＬのトルエンおよび５．４ｍＬの水を添加した。２つの層をよく混合するのに十分な速度で周囲温度にて反応を撹拌した。１５時間後、反応を１００ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌ（ａｑ．）で希釈し、その後酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出した。混合した酢酸エチル層を、水（１×２５ｍＬ）およびブライン（１×２５ｍＬ）に戻して抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して、オレンジ色油状物にした。これを、中圧シリカゲルクロマトグラフィー（２４０ｇのプレパックカラム）で精製し、５０％酢酸エチル：ヘプタンの定組成混合物で溶出した。ｔｅｒｔ−ブチル４−ヒドロキシピペリジン−１−カルボキシラートおよび産物が共溶出した。産物を含有する画分を貯留し、濃縮し、その後粗産物を２０ｍＬの高温酢酸エチルに溶解し、等容積のヘプタンで希釈した。ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートを結晶化して、３．６４ｇの黄色固形物を得た。５０９ｍｇの第２の生産物は、第１の生産物と同様に純粋だった。合計４．１５ｇ（６５％）Ｃ２３Ｈ２６Ｎ４Ｏ５ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４７０；測定値：４７１［Ｍ＋Ｈ］。
【０３６０】
この基本手順を使用し、適切なヒドロキシル成分を選択することにより、様々な２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン誘導体を合成することができる。
【０３６１】
ステップ５）ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−アミノフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０３６２】
【化５２】
0006038773.tif 000069
【０３６３】
３．６４ｇ（７．７４ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートに、２．１３ｇ（３８．７ｍｍｏｌ）の鉄粉末、４９７ｍｇ（９．２３ｍｍｏｌ）の塩化アンモニウムを添加し、その後２０ｍＬのイソプロパノールおよび４ｍＬの水を添加した。反応を還流で１．７５時間加熱し、その後４ｍＬの４Ｍ  ＮａＯＨ（ａｑ．）を添加した。混合物を還流で５分間加熱し、その後ろ過した。固形物を５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と共に１０分間混合し、その後混合物をろ過した。水性イソプロパノール混合物を減圧下で濃縮して、ほとんどのアルコールを除去し、その後残りの溶液を１５ｍＬの水で希釈した。水性懸濁液をＣＨ２Ｃｌ２ろ過液と共に震とうし、その後ろ紙でろ過した。その後、ＣＨ２Ｃｌ２層を、水（１×１５ｍＬ）、２Ｍ  ＮａＯＨ（ａｑ．）（１×１５ｍＬ）、およびブライン（１×１５ｍＬ）で抽出し、その後減圧下で濃縮して泡状物にした。それを、３０ｍＬ酢酸エチルおよび３０ｍＬペンタンの混合物に溶解し、その後２Ｍ  ＮａＯＨ（３×１５ｍＬ）およびブライン（１×１５ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮して黄色固形物にした。粗産物を１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、その後１２０ｇのシリカゲルＭＰＬＣカラムに負荷し、４０−５０％ペンタン：酢酸エチル勾配で溶出した。産物を含有する画分を濃度した後、６５ｍＬの酢酸エチルから再結晶して、７９５ｍｇ（２３％）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−アミノフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートを得た。Ｃ２３Ｈ２８Ｎ４Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４４０；測定値：４４１［Ｍ＋Ｈ］。
【０３６４】
ステップ６）ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボキサミド）フェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０３６５】
【化５３】
0006038773.tif 000070
【０３６６】
７９５ｍｇ（１．８０ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−アミノフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの８ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液に、０．４５ｍＬ（３．２ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加し、その後５０５ｍｇ（２．１７ｍｍｏｌ）の２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボニルクロリドの２ｍＬ  ＣＨ２Ｃｌ２溶液を添加した。１．２５時間後、反応を３０ｍＬのメタノールで希釈して、結晶性沈澱を得た。沈殿物をろ過し、１５ｍＬのメタノールで洗浄し、フィルター上で乾燥して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボキサミド）フェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラート１．０４ｇ（９１％）を得た。Ｃ２３Ｈ２８Ｎ４Ｏ３ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４４０；測定値：４４１［Ｍ＋Ｈ］。
【０３６７】
この基本手順を使用し、適切な酸塩化物と結合させることにより、３−（２−（メチルアミノ）エチルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ベンズアミドおよび３，４−ジメトキシ−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ベンズアミドを調製した。ステップ４でジメチルアミンと結合させることにより、Ｎ−（２−（６−（（ジメチルアミノ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）キノキサリン−２−カルボキサミドを、同様にこの経路で調製した。
【０３６８】
ステップ７）ｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（６−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イルアミノ）−２−ブチルピリミジン−４−カルボキサミド）フェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イルメトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０３６９】
【化５４】
0006038773.tif 000071
【０３７０】
７０９ｍｇ（１．１１ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボキサミド）フェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートおよび２６７ｍｇ（１．３３ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル４−アミノピペリジン−１−カルボキシラートの混合物に、７ｍＬのＤＭＳＯおよび０．４０ｍＬ（２．２４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミンを添加した。混合物を、Ｎ２下で４時間１００℃に加熱した。反応を１Ｈ  ＮＭＲによりモニターした。反応の等量を取り出し、ＣＤＣｌ３に溶解し、その後６ｐｐｍのダウンフィールド領域の共鳴を観察した。出発物質が消費された後、反応を３５ｍＬの水で希釈して、顆粒状沈殿物を得た。これをろ過し、２５ｍＬの水で洗浄して、淡褐色固形物を得た。粗固形物を、３０ｍＬのイソプロパノールから再結晶し、その後産物を６０ｍＬの冷却イソプロパノールで洗浄して、６７４ｍｇ（７６％）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（６−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イルアミノ）−２−ブチルピリミジン−４−カルボキサミド）フェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートを得た。Ｃ４２Ｈ５６Ｎ８Ｏ６ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：８０１；測定値：８０２［Ｍ＋Ｈ］。
【０３７１】
ステップ８）２−ブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミド（Ｘ）の合成：
【０３７２】
【化５５】
0006038773.tif 000072
【０３７３】
６００ｍｇ（０．７５ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチル４−（（２−（２−（６−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イルアミノ）−２−ブチルピリミジン−４−カルボキサミドフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−６−イル）メトキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートに、５ｍＬのトリフルオロ酢酸を、激しい気体発生を制御するためにゆっくりと添加した。溶液を周囲温度で１０分間撹拌し、溶媒を５０℃にて減圧下で除去した。残渣を１２ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３（ａｑ．）で希釈し、ｐＨ＝８の油状懸濁液を得た。これを、８０℃で６０分間撹拌および加熱し、その後周囲温度に冷却して、淡黄色沈殿物を得た。沈殿物をろ過し、その後水に懸濁し、再びろ過した（３×２０ｍＬ）。湿潤固形物をフィルター上で１８時間吸引することにより乾燥して、３６４ｍｇ（８１％）の２−ブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミドを得た。Ｃ３２Ｈ４０Ｎ８Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：６００；測定値：６０１［Ｍ＋Ｈ］。
【０３７４】
実施例１２  ２−イソブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミド（ＸＩ）の調製：
【０３７５】
【化５６】
0006038773.tif 000073
【０３７６】
ステップ６で６−クロロ−２−イソブチルピリミジン−４−カルボニルクロリドを代用することにより、２−ブチルピリミジン類似体の場合と同様の手順で調製した。イソバレリルアミジン塩酸塩から開始し、２−ブチル−６−クロロピリミジン−４−カルボニルクロリドについて記述されているのと同じ２ステップ手順を使用して、酸塩化物を調製した。最終産物を、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後、産物を含有する画分を濃度前にＨＣｌ水溶液で処理して、２−イソブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミドの２ＨＣｌ塩を得た。Ｃ３２Ｈ４０Ｎ８Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：６００；測定値：６０１［Ｍ＋Ｈ］。
【０３７７】
実施例１３  ２−ブチル−６−（２−（メチルアミノ）エチルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミド（ＸＩＩ）の調製：
【０３７８】
【化５７】
0006038773.tif 000074
【０３７９】
ステップ７で（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）エチレンジアミンを代用して、２−ブチル−６−（ピペリジン−４−イルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミドの場合と同様の手順で調製した。最終産物を、逆相ＨＰＬＣで精製し、その後産物を含有する画分を濃縮の前にＨＣｌ水溶液で処理して、２−ブチル−６−（２−（メチルアミノ）エチルアミノ）−Ｎ−（２−（６−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）ピリミジン−４−カルボキサミドを２ＨＣｌ塩として得た。Ｃ３０Ｈ３８Ｎ８Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５７５；測定値：５７６［Ｍ＋Ｈ］。
【０３８０】
実施例１４  Ｎ−（２−（６−（（（Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）−３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンズアミド（Ｖ）の調製：
ステップ１）３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）安息香酸の合成：
【０３８１】
【化５８】
0006038773.tif 000075
【０３８２】
ＨＣｌ塩としての（Ｒ）−キヌクリジン−３−オール（１ｇ、６．１１ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ  Ｈ２Ｏに溶解し、ＮａＨＣＯ３（０．５１ｇ、６．１１ｍｍｏｌ）で中和し、混合物を凍結乾燥した。残渣をＥｔＯＨで抽出し、ＥｔＯＨ層を濃縮して、（Ｒ）−キヌクリジン−３−オールを遊離塩基として得、その後それを、ＤＩＡＤ（２．４ｍＬ、１２．２２ｍｍｏｌ）、ＰＰｈ３（１．６ｇ、１２．２２ｍｍｏｌ）、およびメチル３−ヒドロキシベンゾアート（０．９３ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）と共に３０ｍＬのＴＨＦに溶解した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。その後それを濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２および２Ｎ  ＨＣｌ間に分配した。水層を分離し、洗浄した（１×ＣＨ２Ｃｌ２）。水層をＮａＨＣＯ３で中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して、メチル３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンゾアート（０．８５ｇ、５３．２％）を粗物質として得た。粗物質を、ＬｉＯＨ水溶液を有するエタノール中での標準的塩基性加水分解条件にかけ、還流させた。完了時に、反応を室温に冷却し、５Ｎ  ＨＣｌで中和して、３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）安息香酸を得た。
【０３８３】
ステップ２）３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンゾイルクロリドの合成：
【０３８４】
【化５９】
0006038773.tif 000076
【０３８５】
３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）安息香酸（１当量）を、ＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、この溶液に、塩化オキサリル（２．３５当量）および２滴のＤＭＦを添加した。室温で１時間後、溶媒を減圧下で除去し、その結果生じた残渣を３０分間高減圧下において、３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンゾイルクロリドを得た。
【０３８６】
ステップ３）（Ｒ）−６−（（３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジンの合成：
【０３８７】
【化６０】
0006038773.tif 000077
【０３８８】
以前に公開されている国際公開第２００７／０１９３４６号に類似した手順により調製した。６−（ブロモメチル）−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン（１当量）および（Ｒ）−３−フルオロピロリジン（１当量）を、Ｅｔ３Ｎ（１当量）と共にアセトニトリルに溶解し、５０℃で４時間加熱した。反応を室温に冷却し、更に６０時間撹拌した。シリカゲルクロマトグラフィー（ｐｅｔエーテル：ＥｔＯＡｃ：Ｅｔ３Ｎ）で精製することにより、（Ｒ）−６−（（３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジンを得た。Ｃ１７Ｈ１５ＦＮ４Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：３５８；測定値：３５９［Ｍ＋Ｈ］。
【０３８９】
ステップ４）Ｎ−（２−（６−（（（Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）−３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンズアミド（Ｖ）の合成：
【０３９０】
【化６１】
0006038773.tif 000078
【０３９１】
以前に公開されている国際公開第２００７／０１９３４６号に類似した手順により調製した。（Ｒ）−６−（（３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）−２−（２−ニトロフェニル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジンを、上述の標準的鉄還元条件にかけて、（Ｒ）−２−（６−（（３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）アニリンを得た。アニリン（１当量）をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、トリエチルアミン（１．８当量）を添加した。その後、３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンゾイルクロリド（０．８当量）のＣＨ２Ｃｌ２溶液を添加した。１．２５時間後、反応を３０ｍＬのメタノールで希釈して、結晶性沈澱を得た。沈殿物をろ過し、メタノールで洗浄し、フィルター上で乾燥して、Ｎ−（２−（６−（（（Ｒ）−３−フルオロピロリジン−１−イル）メチル）チアゾロ［５，４−ｂ］ピリジン−２−イル）フェニル）−３−（キヌクリジン−３−イルオキシ）ベンズアミドを得た。Ｃ３１Ｈ３２ＦＮ５Ｏ２ＳのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５５８；測定値：５５９［Ｍ＋Ｈ］。
【０３９２】
実施例１５  Ｎ−（２−（３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）ビフェニル−３−カルボキサミド（Ｉ）の調製：
【０３９３】
【化６２】
0006038773.tif 000079
【０３９４】
Ｐｅｒｎｉら（J. Med. Chem., 2009, 52, 1275-1283）；国際公開第２００７／０１９３４６号により以前に報告されたのと同様の手順で調製した。 
【０３９５】
この基本手順を使用し、適切な酸塩化物およびアミン成分を選択することにより、Ｎ−（２−（３−（ピペラジン−１−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）オキサゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−２−カルボキサミドおよびＮ−（２−（３−（２，５−ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イルメチル）イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イル）フェニル）−４−メチル−２−（ピリジン−３−イル）チアゾール−５−カルボキサミドを調製した。
【０３９６】
実施例１６  Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（６−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド（ＸＸ）の調製：
ステップ１）２−（６−クロロピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸の合成：
【０３９７】
【化６３】
0006038773.tif 000080
【０３９８】
以前に公開されている国際公開第２０１０／００３０４８号の手順により調製した。
【０３９９】
この基本手順を使用して、類似体２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸を調製した。
【０４００】
ステップ２）２−（６−クロロピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミドの合成：
【０４０１】
【化６４】
0006038773.tif 000081
【０４０２】
以前に公開されている国際公開第２０１０／００３０４８号の経路に類似した経路により調製した。２−（６−クロロピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸（２５０ｍｇ、０．９１ｍｏｌ）を、４−アミノ−２−（トリフルオロメチル）ベンゾニトリル（１７０．５７ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（６９５．０６ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）と共にＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解した。ＤＩＥＡ（０．３２ｍＬ、１．８３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で一晩撹拌した。反応混合物を水で希釈し、その結果生じた固形物を減圧ろ過により収集した。シリカゲルクロマトグラフィー（ペンタン／ＥｔＯＡｃ）で精製して、２−（６−クロロピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミドを得た。Ｃ２１Ｈ１１ＣｌＦ３Ｎ５ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４４２；測定値：４４３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４０３】
この基本的アミドカップリングを使用し、適切な酸およびアミン成分を選択することにより、様々な１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド誘導体を製作することができる。
【０４０４】
ステップ３）ｔｅｒｔ−ブチル４−（５−（４−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニルカルバモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）ピリジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシラートの合成：
【０４０５】
【化６５】
0006038773.tif 000082
【０４０６】
以前に公開されている国際公開第２０１０／００３０４８号の経路により調製した。２−（６−クロロピリジン−３−イル）−Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド（１当量）およびｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシラート（１当量）をＤＭＳＯ中に含有する混合物を、１４０℃、２５分間マイクロ波反応器中で撹拌した。反応を室温に冷却し、水で希釈した。その結果生じた固形物をろ過により収集し、水で洗浄し、減圧下で乾燥して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（５−（４−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニルカルバモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）ピリジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシラートを得た。Ｃ３０Ｈ２８Ｆ３Ｎ７Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５９２；測定値：５９３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４０７】
ステップ４）Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（６−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド（ＸＸ）の合成：
【０４０８】
【化６６】
0006038773.tif 000083
【０４０９】
以前に公開されている国際公開第２０１０／００３０４８号の経路により調製した。ｔｅｒｔ−ブチル４−（５−（４−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニルカルバモイル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）ピリジン−２−イル）ピペラジン−１−カルボキシラート（０．０４ｍｍｏｌ）をメタノールＨＣＬ（３Ｎ、２ｍＬ）中に含有する混合物を、１８時間室温で撹拌した。沈殿した固形物を、ろ過により収集し、メタノールで洗浄し、乾燥して、Ｎ−（４−シアノ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−２−（６−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミドを得た。Ｃ２５Ｈ２０Ｆ３Ｎ７ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４９１；測定値：４９２［Ｍ＋Ｈ］。
【０４１０】
上記の基本手順を、Ｎ−（６−メトキシベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−２−（６−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミドおよび２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）−Ｎ−（３−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミドの調製に使用した。
【０４１１】
実施例１７  ２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）−Ｎ−（３−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド（ＸＶＩＩ）の調製：
ステップ１）ｔｅｒｔ−ブチル４−（３−アミノベンジルオキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０４１２】
【化６７】
0006038773.tif 000084
【０４１３】
（３−ニトロフェニル）メタノール（１ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１９．５９ｍｍｏｌ）の混合物を、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、０℃に冷却した。４−トルエンスルホニルクロリド（１．５７ｇ、７．１８ｍｍｏｌ）を、０℃で滴加し、添加完了後に、反応を加温して室温した。完了時に反応を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２に希釈し、反応を停止させ、高減圧下で乾燥し、いかなる更なる精製をせずに次に持ち越した。
【０４１４】
１−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシピペルジン（hydroxypiperdine）（１．５ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２撹拌溶液に、ＮａＨ（０．１９ｇ、７．７３ｍｍｏｌ）を０℃にて数回に分けて添加し、その後更に１０分間撹拌させ、その時点で３−ニトロベンジル４−メチルベンゼンスルホナートを添加した。その後、以前に上述され、以前に国際公開第２０１０／００３０４８号で公開された標準的鉄還元および脱保護手順を行った。Ｃ１７Ｈ２６Ｎ２Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：３０６；測定値：３０７［Ｍ＋Ｈ］。
【０４１５】
ステップ２）ｔｅｒｔ−ブチル４−（３−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド）ベンジルオキシ）ピペリジン−１−カルボキシラートの合成：
【０４１６】
【化６８】
0006038773.tif 000085
【０４１７】
以前に公開された国際公開第２０１０／００３０４８号と類似の経路により調製した。上記の基本アミド手順を参照されたい。Ｃ３０Ｈ３２ＣｌＮ５Ｏ４のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５６１；測定値：５６２［Ｍ＋Ｈ］。
【０４１８】
ステップ３）２−（２−モルホリノピリジン−４−イル）−Ｎ−（３−（（ピペリジン−４−イルオキシ）メチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキサミド（ＸＶＩＩ）の合成：
【０４１９】
【化６９】
0006038773.tif 000086
【０４２０】
以前に公開された国際公開第２０１０／００３０４８号と類似の経路により調製した。上述の基本アミド手順を参照されたい。Ｃ２９Ｈ３２Ｎ６Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５１２；測定値：５１３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４２１】
実施例１８  Ｎ−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−４−（ピペラジン−１−イルメチル）ベンズアミドトリヒドロクロリド（ＸＩＶ）の合成：
ステップ１）２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸の調製：
【０４２２】
【化７０】
0006038773.tif 000087
【０４２３】
２，３−ジアミノ安息香酸（１．０７ｇ、７．０６ｍｍｏｌ）、２−クロロイソニコチンアルデヒド（１．０ｇ、７．０６ｍｍｏｌ）、およびＮａ２Ｓ２Ｏ５（１．７５ｇ、９．１８ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解し、１００℃で１８時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈した。その結果生じた混合物を、室温で１時間撹拌し、ろ過した。収集した固形物を、水で洗浄し、乾燥して、２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸を固形物として得た（１．１４ｇ、５９％収率）。Ｃ１３Ｈ８ＣｌＮ３Ｏ２のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：２７３；測定値：２７４［Ｍ＋Ｈ］。
【０４２４】
ステップ２）ベンジル２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバマートの調製：
【０４２５】
【化７１】
0006038773.tif 000088
【０４２６】
２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−カルボキシル酸（１．１４ｇ、４．１７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．６４ｍＬ、４．５８ｍｍｏｌ）のトルエン（１５ｍＬ）溶液に、ＤＰＰＡ（０．９ｍＬ、４．１７ｍｍｏｌ）を滴加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、その後加熱して２時間還流した。ベンジルアルコール（０．６５ｍＬ、６．２５ｍｍｏｌ）を添加し、その結果生じた混合物を加熱して１８時間還流し、濃縮して乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中９〜１７％酢酸エチル）で精製して、ベンジル２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバマートを黄色固形物（０．６９ｇ、４４％収率）として得た。Ｃ２０Ｈ１５ＣｌＮ４Ｏ２のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：３７８；測定値：３７９［Ｍ＋Ｈ］。
【０４２７】
ステップ３）２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミンの調製：
【０４２８】
【化７２】
0006038773.tif 000089
ベンジル２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバマート（０．６９ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）、ＨＢｒ（８ｍＬ、酢酸中３３重量％）、および酢酸（５ｍＬ）の混合物を、室温で０．５時間撹拌し、固形物をろ過により収集した。固形物をＮａＨＣＯ３水溶液（飽和）と共に０．５時間撹拌し、ろ過により収集し、２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミンを黄色固形物（０．４ｇ、９０％収率）として得た。Ｃ１２Ｈ９ＣｌＮ４のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：２４４；測定値：２４５［Ｍ＋Ｈ］。
【０４２９】
ステップ４）ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートの調製：
【０４３０】
【化７３】
0006038773.tif 000090
【０４３１】
２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミン（２５０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、４−（（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）メチル）安息香酸（３６０ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（５８３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ、３．０６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、室温で１８時間撹拌し、水（４０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ×３）で抽出した。混合した有機物層をブラインで洗浄し、乾燥し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中１７％〜５０％酢酸エチル）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートを、黄色固形物（２７０ｍｇ、４８％収率）として得た。Ｃ２９Ｈ３１ＣｌＮ６Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５４６；測定値：５４７［Ｍ＋Ｈ］。
【０４３２】
ステップ５）ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートの調製：
【０４３３】
【化７４】
0006038773.tif 000091
【０４３４】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラート（１００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン（０．５ｍＬ）のピリジン（２ｍＬ）溶液をマイクロ波で加熱した（１６０℃×２時間）。溶液を濃縮し、調製用ＴＬＣで精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートを黄色固形物（４０ｍｇ、３６％収率）として得た。Ｃ３４Ｈ４４Ｎ８Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：６１２；測定値：６１３［Ｍ＋Ｈ］。
【０４３５】
ステップ６）Ｎ−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−４−（ピペラジン−１−イルメチル）ベンズアミドトリヒドロクロリド（ＸＩＶ）の調製：
【０４３６】
【化７５】
0006038773.tif 000092
【０４３７】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラート（３７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）のメタノール（１．０ｍＬ）溶液を、４Ｍ  ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に添加した。混合物を１時間撹拌し、沈殿物をろ過により収集して、Ｎ−（２−（２−（３−（ジメチルアミノ）プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−４−（ピペラジン−１−イルメチル）ベンズアミドトリヒドロクロリドをＨＣｌ塩として得た（３１ｍｇ、８３％収率）。Ｃ２９Ｈ３６Ｎ８ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５１２；測定値：５１４［Ｍ＋Ｈ］。
【０４３８】
実施例１９  ４−（ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）ベンズアミドジヒドロクロリド（ＸＶＩ）の調製：
ステップ１）２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミンの調製：
【０４３９】
【化７６】
0006038773.tif 000093
【０４４０】
２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミン（７０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）およびプロピルアミン（０．１１ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）のＮＭＰ（１ｍＬ）溶液を、マイクロ波で加熱した（２５０℃×２０分間）。混合物を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、ブラインで洗浄し、乾燥した。残渣を調製用ＴＬＣで精製して、２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミンを黄色固形物（４８ｍｇ、６２％収率）として得た。Ｃ１５Ｈ１７Ｎ５のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：２６７；測定値：２６８［Ｍ＋Ｈ］。
【０４４１】
ステップ２）ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートの調製： 
【０４４２】
【化７７】
0006038773.tif 000094
【０４４３】
２−（２−プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミン（２８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、４−（（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）メチル）安息香酸（２０．２ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（６０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．０５ｍＬ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、水で希釈し、その結果生じた沈殿物をろ過より収集し、乾燥した。固形物を調製用ＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中６．２５％ＭｅＯＨ）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラートを黄色固形物（３０ｍｇ、５３％収率）として得た。Ｃ３２Ｈ３９Ｎ７Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５６９；測定値：５７０［Ｍ＋Ｈ］。
【０４４４】
ステップ３）４−（ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）ベンズアミドジヒドロクロリド（ＸＶＩ）の調製：
【０４４５】
【化７８】
0006038773.tif 000095
【０４４６】
ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）ベンジル）ピペラジン−１−カルボキシラート（３０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）のＨＣｌ／ＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液を、０．５時間撹拌した。形成された沈殿物をろ過により収集し、アセトンで洗浄し、乾燥して、４−（ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）ベンズアミドジヒドロクロリドをＨＣｌ塩として得た（２０ｍｇ、９７％収率）。Ｃ２７Ｈ３１Ｎ７ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４６９；測定値：４７１［Ｍ＋Ｈ］。
【０４４７】
実施例２０  Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−３−（ピロリジン−３−イル）ベンズアミドヒドロクロリド（ＸＶ）の調製：
ステップ１）ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラートの調製：
【０４４８】
【化７９】
0006038773.tif 000096
【０４４９】
２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−アミン（２００ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）、３−（１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−３−イル）安息香酸（２６２ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（４６６ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２．４５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１８時間撹拌し、水で希釈し、その結果生じた沈殿物をろ過より収集した。固形物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中２５％〜５０％酢酸エチル）で精製して、ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラートを黄色固形物（３４５ｍｇ、８１％収率）として得た。Ｃ２８Ｈ２８ＣｌＮ５Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５１７；測定値：５１８［Ｍ＋Ｈ］。
【０４５０】
ステップ２）ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラートの調製：
【０４５１】
【化８０】
0006038773.tif 000097
【０４５２】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−クロロピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラート（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）およびプロピルアミン（０．１６ｍＬ、１．９３ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２ｍＬ）溶液を、封管中で１４０℃にて２４時間加熱した。反応混合物を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、有機相を水で洗浄し、乾燥し、濃縮して乾燥した。残渣を調製用ｔｌｃで精製して、ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラートを褐色固形物（３１ｍｇ、３８％収率）として得た。Ｃ３１Ｈ３６Ｎ６Ｏ３のＭＳ（ＥＳＩ）計算値：５４０；測定値：５４１［Ｍ＋Ｈ］。
【０４５３】
ステップ３）Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−３−（ピロリジン−３−イル）ベンズアミドヒドロクロリド（ＸＶ）の調製：
【０４５４】
【化８１】
0006038773.tif 000098
【０４５５】
ｔｅｒｔ−ブチル３−（３−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イルカルバモイル）フェニル）ピロリジン−１−カルボキシラート（３９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のＨＣｌ／ＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液を、０．５時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をアセトンと共に粉砕して、Ｎ−（２−（２−（プロピルアミノ）ピリジン−４−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−４−イル）−３−（ピロリジン−３−イル）ベンズアミドヒドロクロリドをＨＣｌ塩として得た（３０ｍｇ、９４％収率）。Ｃ２６Ｈ２８Ｎ６ＯのＭＳ（ＥＳＩ）計算値：４４０；測定値：４４２［Ｍ＋Ｈ］。
【０４５６】
実施例２１  生物活性
質量分析法に基づくアッセイを使用して、ＳＩＲＴＩ活性の調節因子を特定した。質量分析法に基づくアッセイでは、以下の２０個アミノ酸残基を有するペプチドを使用する：Ａｃ−ＥＥ−Ｋ（ビオチン）−ＧＱＳＴＳＳＨＳＫ（Ａｃ）ＮｌｅＳＴＥＧ−Ｋ（５ＴＭＲ）−ＥＥ−ＮＨ２（配列番号１）、式中、Ｋ（Ａｃ）はアセチル化リジン残基であり、Ｎｌｅはノルロイシンである。ペプチドのＣ末端を、フルオロフォア５ＴＭＲ（励起５４０ｎｍ  発光５８０ｎｍ）で標識した。ペプチド基質の配列は、幾つかの修飾を有するｐ５３に基づく。加えて、メチオニンは、合成中および精製中の酸化に感受性であり得るため、配列中に天然に存在するメチオニン残基をノルロイシンと置換した。
【０４５７】
質量分析アッセイを以下のように実施する：０．５Ｊ−ｌＭペプチド基質および１２０μＭ  βＮＡＤ＋を、２５分間２５℃にて、１０ｎＭ  ＳＩＲＴｌと共に、反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセタート  ｐＨ８、１３７ｍＭ  ＮａＣＩ、２．７ｍＭ  ＫＣＩ、１ｍＭ  ＭｇＣｌｚ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０５％ＢＳＡ）中でインキュベートする。試験化合物を、上述の反応に添加してもよい。ＳｉｒＴＩ遺伝子を、Ｔ７プロモーター含有ベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換する。ＳＩＲＴ１と共に２５分間インキュベーションした後、１０μＬの１０％ギ酸を添加して、反応を停止させる。反応を密閉し、後の質量分析用に凍結する。基質ペプチドの質量を決定することにより、脱アセチル化ペプチド（産物）と比較したアセチル化度（つまり開始物質）の正確な決定が可能になる。
【０４５８】
サーチュイン活性の阻害の対照は、１μＬの５００ｍＭニコチンアミドを反応開始時に陰性対照として添加することにより実施する（例えば、最大サーチュイン阻害の決定を可能にする）。サーチュイン活性の活性化の対照は、化合物の代わりに１μＬのＤＭＳＯと共に１０ｎＭのサーチュインタンパク質を使用して実施し、アッセイの線形範囲内の所与の時点における基質の脱アセチル化の量を決定する。この時点は、試験化合物に使用された時点と同じであり、線形範囲内にあり、終点は、速度の変化を表わす。
【０４５９】
上記のアッセイの場合、ＳＩＲＴＩタンパク質を、以下のように発現および精製した。ＳｉｒＴ１遺伝子をＴ７プロモーター含有ベクターにクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。タンパク質を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、Ｎ末端Ｈｉｓタグ融合タンパク質として１８℃にて一晩発現させ、３０，０００×ｇで回収した。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、１０μＭ  ＺｎＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣＩ）中でリゾチームを用いて溶解し、完全に溶解させるために超音波処理で１０分間更に処理した。タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）で精製し、純粋なタンパク質を含有する画分を貯留し、濃縮し、サイズ分離カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｓ２００  ２６／６０グローバル）に流した。可溶性タンパク質を含有するピークを収集し、イオン交換カラム（ＭｏｎｏＱ）に流した。勾配溶出（２００ｍＭ−５００ｍＭ  ＮａＣＩ）により、純粋なタンパク質２０を得た。このタンパク質を濃縮し、透析緩衝液（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣＩ、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に対して一晩透析した。タンパク質を等分し、更なる使用まで−８０℃で凍結した。
【０４６０】
ＳＩＲＴ１を活性化したサーチュイン調節化合物を、上述のアッセイを使用して特定した。それらは下記の表４に示されている。ＥＣ１．５値は、ＳＩＲＴ１の１５０％活性化をもたらす試験化合物の濃度を表わす。活性化化合物のＥＣ１．５値は、Ａ（ＥＣ１．５≦１μＭ）、Ｂ（ＥＣ１．５＞１μＭ）により表わされている。最大活性化倍数パーセントは、Ａ（活性化倍数≧２００％）またはＢ（活性化倍数＜２００％）により表わされている。
【０４６１】
【表６】
0006038773.tif 000099
0006038773.tif 000100
0006038773.tif 000101
0006038773.tif 000102
0006038773.tif 000103
【０４６２】
等価物
本発明は、特にサーチュイン活性化化合物およびその方法を提供する。主題発明の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示であり、限定ではない。本発明の多く変異は、本明細書を検討すれば当業者にとって明白になるだろう。本発明の完全な範囲は、請求項およびそれらの完全な範囲の等価物、ならびに本明細書およびそのような変異を参照することにより決定されるべきである。
【０４６３】
参照による援用
本明細書で言及された出版物および特許は全て、あたかも個々の出版物または特許の各々が、具体的におよび個々に参照により組み込まれたことが示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合、本明細書におけるあらゆる定義を含む、本出願を優先することになる。
【０４６４】
ゲノム研究所（ＴＩＧＲ、Institute for Genomic Research）（ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）および／または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、National Center for Biotechnology Information）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により維持されているデータベース等の公開データベース中のエントリーと関連する受入番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
本発明の一つの面によれば、以下の発明が提供される。
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性を活性化する化合物を検出する方法であって、
サーチュインデアセチラーゼを、候補化合物と、前記サーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質を含んでなる無蛍光活性化基質とで接触させること、
前記候補化合物の存在下で前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを検出すること、および
前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルを、前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較することを含んでなり、
前記候補化合物の非存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルと比較して、前記候補化合物の存在下での前記無蛍光活性化基質に対するサーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが増加することが、前記化合物がサーチュイン活性化因子であることを示す、方法。
（２）前記サーチュインデアセチラーゼがＳＩＲＴ１である、前記（１）に記載の方法。
（３）前記サーチュインデアセチラーゼが、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、およびＳＩＲＴ５からなる群から選択される、前記（１）に記載の方法。
（４）前記候補化合物が、蛍光基を含有するアセチル化ペプチドまたはポリペプチド基質のＳＩＲＴ１活性化因子である、前記（１）に記載の方法。
（５）前記蛍光基を含有するペプチド基質が、ＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫ（５−ＴＭＲ）ＥＥ−ＮＨ２である、前記（４）に記載の方法。
（６）前記サーチュインデアセチラーゼを、ＮＡＤの存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、前記（１）に記載の方法。
（７）前記サーチュインデアセチラーゼを、加水分解性ＮＡＤ類似体の存在下で無蛍光活性化基質と候補化合物とで接触する、前記（１）に記載の方法。
（８）前記無蛍光活性化基質が、ビオチン化ポリペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（９）前記無蛍光活性化基質が、ｄｅｓＴＡＭＲＡペプチド：Ａｃ−ＥＥＫ（ビオチン）ＧＱＳＴＳＳＨＳＫＡｃＮｌｅＳＴＥＧＫＥＥ−ＮＨ２である、前記（１）に記載の方法。
（１０）前記無蛍光活性化基質が、蛍光基ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−６−カルボキシローダミン）およびＡＭＣ（７−アミド−４−メチルクマリン）を含んでいないアセチル化ペプチドまたはポリペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（１１）前記無蛍光活性化基質が、Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択されるアセチル化ペプチドである、前記（１）に記載の方法。
（１２）前記無蛍光活性化基質が、前記サーチュインのアセチル化ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質基質および活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質を含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（１３）前記活性化補助因子坦持アクセサリータンパク質が、ＤＢＣ１（乳癌１では欠失）、ＨＩＣ１（癌１では過剰メチル化）、ＡＲＯＳ（ＳＩＲＴ１の活性調節因子）、およびＣＬＯＣＫからなる群から選択される、前記（１２）に記載の方法。
（１４）前記アセチル化タンパク質が、ヒストンＨ１、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、ｐ５３、ｐ３００、ＦＯＸＯ１、ＦＯＸＯ３ａ、ＦＯＸＯ４、ｐ６５、ＨＩＶＴａｔ、ＰＧＣ−１α、ＰＣＡＦ、ＭｙｏＤ、ＰＰＡＲγ、およびＫｕ７０からなる群から選択される、前記（１）に記載の方法。
（１５）前記サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、ＮＡＤ加水分解の速度を測定することにより検出される、前記（１）に記載の方法。
（１６）サーチュインデアセチラーゼ活性のレベルが、無蛍光活性化基質脱アセチル化の速度を測定することにより検出される、前記（１）に記載の方法。
（１７）前記化合物が、無蛍光活性化基質のＳＩＲＴ１脱アセチル化の活性化因子である、前記（１）に記載の方法。
（１８）前記化合物が、下記式またはその塩を有し、
【化８２】
0006038773.tif 000104
式中、
Ｒ１が、−（ＣＨ２）３ＣＨ３、および−（ＣＨ２）ＣＨ（ＣＨ３）２から選択され、かつ
Ｒ２が、−ピペリジンおよび−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＨ３から選択される、前記（１７）に記載の方法。
（１９）前記化合物またはその塩が、
【化８３】
0006038773.tif 000105
【化８４】
0006038773.tif 000106
【化８５】
0006038773.tif 000107
からなる群から選択される、前記（１８）に記載の方法。
（２０）ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験細胞と接触させ、前記試験細胞でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（２１）前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＦＧＦ２１産生の増加である、前記（２０）に記載の方法。
（２２）前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、ＬＰＳ誘導性ＴＮＦα産生の減少である、前記（２０）に記載の方法。
（２３）ＳＩＲＴ１活性化因子である候補化合物を選択すること、および
前記ＳＩＲＴ１活性化因子を試験対象体に投与し、前記試験対象体でのＳＩＲＴ１活性化特異的変化を検出することを更に含んでなる、前記（１）に記載の方法。
（２４）前記試験対象体が、糖尿病モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、血糖の低下である、前記（２３）に記載の方法。
（２５）前記試験対象体が、神経変性疾患モデルマウスであり、前記ＳＩＲＴ１活性化特異的変化が、神経変性疾患プロセスまたはマーカーの減少である、前記（２３）に記載の方法。
（２６）前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、および多発性硬化症（ＭＳ）からなる群から選択される、前記（２５）に記載の方法。
（２７）Ａｃ−ＲＨＫＫＡｃＦ−ＮＨ２およびＡｃ−ＲＨＫＫＡｃＷ−ＮＨ２からなる群から選択される構造式を有する無蛍光サーチュイン基質。
（２８）式（Ｉ）の化合物またはその塩。
【化８６】
0006038773.tif 000108
（２９）式（ＩＩ）の化合物またはその塩。
【化８７】
0006038773.tif 000109
（３０）式（ＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化８８】
0006038773.tif 000110
（３１）式（ＩＶ）の化合物またはその塩。
【化８９】
0006038773.tif 000111
（３２）式（Ｖ）の化合物またはその塩。
【化９０】
0006038773.tif 000112
（３３）式（ＶＩ）の化合物またはその塩。
【化９１】
0006038773.tif 000113
（３４）式（ＶＩＩ）の化合物またはその塩。
【化９２】
0006038773.tif 000114
（３５）式（ＶＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化９３】
0006038773.tif 000115
（３６）式（ＩＸ）の化合物またはその塩。
【化９４】
0006038773.tif 000116
（３７）式（Ｘ）の化合物。
【化９５】
0006038773.tif 000117
（３８）前記（２８）〜（３７）のいずれかに記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
（３９）追加の活性剤を更に含んでなる、前記（３８）に記載の医薬組成物。
（４０）インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれら合併症を罹患しているか、または感受性である対象体を治療するための、あるいは対象体のインスリン感受性を増加させるための方法であって、前記（３８）に記載の組成物をその必要性のある前記対象体に投与にすることを含んでなる方法。
（４１）式（ＸＸＸＩ）の化合物またはその塩。
【化９６】
0006038773.tif 000118
（式中、
ＸおよびＹの一方は、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１から選択され、ＸおよびＹの他方はＨであり、ここで
Ｒ１は、フェニルまたは融合ヘテロ環から選択され、Ｒ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキル、および−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−飽和ヘテロ環から独立して選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｒ１がフェニルである場合、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−飽和ヘテロ環で置換されていてもよく、前記飽和ヘテロ環は、ピペリジン、ピロリジン、またはピペラジンから選択され、
Ｒ１が融合ヘテロ環から選択される場合、前記融合ヘテロ環は、ベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、また、Ｒ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよく、
Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２であり、ここでＲ２は、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）、−ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、または−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ４アルキル）２から選択され、Ｒ２が、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−飽和ヘテロ環である場合、前記飽和ヘテロ環は、モルホリンまたはピペラジンから選択される。）
（４２）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩ）を有する、前記（４１）に記載の化合物またはその塩。
【化９７】
0006038773.tif 000119
【化９８】
0006038773.tif 000120
【化９９】
0006038773.tif 000121
【化１００】
0006038773.tif 000122
【化１０１】
0006038773.tif 000123
【化１０２】
0006038773.tif 000124
【化１０３】
0006038773.tif 000125
【化１０４】
0006038773.tif 000126
および
【化１０５】
0006038773.tif 000127
（４３）式（ＸＸＸＩＩ）の化合物またはその塩。
【化１０６】
0006038773.tif 000128
（式中、
Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピロリジンまたは−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、かつ
Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルまたは−（Ｃ１〜Ｃ３アルキル）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。）
（４４）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＩ）を有する、前記（４３）に記載の化合物またはその塩。
【化１０７】
0006038773.tif 000129
【化１０８】
0006038773.tif 000130
および
【化１０９】
0006038773.tif 000131
（４５）式（ＸＸＸＩＩＩ）の化合物またはその塩。
【化１１０】
0006038773.tif 000132
（式中、
Ｒ１は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジンで置換されていてもよいフェニルであり、かつ
Ｒ２は、−Ｃ１〜Ｃ３アルキルおよび−（Ｃ１〜Ｃ３）−Ｎ（ＣＨ３）２から選択される。）
（４６）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＩＩ）を有する、前記（４５）に記載の化合物またはその塩。
【化１１１】
0006038773.tif 000133
および
【化１１２】
0006038773.tif 000134
（４７）式（ＸＸＸＩＶ）の化合物またはその塩。
【化１１３】
0006038773.tif 000135
（式中、
Ｚ１およびＺ２の一方はＮであり、他方はＣＲ２から選択され、ここで
Ｒ２は、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−モルホリン、−（Ｃ０〜Ｃ２アルキル）−ピペラジン、および−Ｎ（Ｃ１〜Ｃ4）２から選択され、
Ｒ１は、−ＯＣＨ３で置換されていてもよいフェニルおよびベンゾ［ｄ］チアゾールから選択され、ここでＲ１は、−Ｃ≡Ｎ、Ｃ１〜Ｃ２フルオロ置換アルキルから独立して選択される１〜２個の置換基で更に置換されていてもよく、Ｒ１がフェニルである場合、Ｒ１は、−ＣＨ２−Ｏ−ピペリジンで更に置換されていてもよい。）
（４８）以下のものからなる群から選択される式（ＸＸＸＩＶ）を有する、前記（５８）に記載の化合物またはその塩。
【化１１４】
0006038773.tif 000136
【化１１５】
0006038773.tif 000137
【化１１６】
0006038773.tif 000138
および
【化１１７】
0006038773.tif 000139
（４９）前記（４１）〜（４８）のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含んでなる医薬組成物。
（５０）追加の活性剤を更に含んでなる、前記（４９）に記載の医薬組成物。
（５１）インスリン抵抗性、メタボリック症候群、糖尿病、またはそれら合併症を罹患しているか、または感受性である対象体を治療するための、あるいは対象体のインスリン感受性を増加させるための方法であって、前記（５０）に記載の組成物をその必要性のある前記対象体に投与にすることを含んでなる方法。
【図１】
0006038773.tif 000140
【図２】
0006038773.tif 000141
【図３】
0006038773.tif 000142
【図４】
0006038773.tif 000143
【図５】
0006038773.tif 000144
【図６】
0006038773.tif 000145
【図７】
0006038773.tif 000146
【図８】
0006038773.tif 000147
【図９】
0006038773.tif 000148
【図１０】
0006038773.tif 000149
【図１１】
0006038773.tif 000150
【図１２】
0006038773.tif 000151
【図１３】
0006038773.tif 000152
【図１４】
0006038773.tif 000153
【配列表】
0006038773000001.app