(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてＬ−エルゴチオネインを含有し、前記Ｌ−エルゴチオネインの１日当たりの投与量が３〜５０ｍｇであるうつ病の予防薬または抑制薬であって、前記うつ病が、前記うつ病の抑制作用を強制水泳試験および尾懸垂試験で確認できるうつ病である予防薬または抑制薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗うつ剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病の患者数は、日本国内で１００万人以上もいるといわれており、重大な問題となっている。うつ病は、根治させる方法が未だ確立されておらず、抗うつ剤の投与による対症療法が行われている。抗うつ剤としては、三環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬などが知られているが、口渇、便秘、排尿困難、全身の倦怠感、体重増加といった様々な副作用が生じる問題がある。
【０００３】
うつ病の発症原因は明らかになっていないが、イミプラミン等の三環系抗うつ薬の神経終末へのモノアミン再取り込み阻害作用から、セロトニンやノルアドレナリンといったモノアミンの欠乏が関与すると考えられている（モノアミン仮説）。
【０００４】
一方、近年、タモギタケのエキス末に多く含まれるエルゴチオネインに注目が集まっている。タモギタケは、北海道や東北に多く自生するヒラタケ科のキノコであり、エルゴチオネインを生合成することが知られている。エルゴチオネインは、抗酸化作用や抗炎症作用に優れていることが報告されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hartman P． E.，Meth．Enzymol.，186，p.310-318, 1990
【非特許文献２】Ito T. et. al.：Food Sci. Tech. Res., 17, 103-110, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、副作用などの問題が生じにくく、長期摂取しても安全性の高い、安価な抗うつ剤を新たに提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、Ｌ−エルゴチオネインの新たな生体作用を発見すべく鋭意検討を行った結果、Ｌ−エルゴチオネインが抗うつ作用を有することを予想外にも見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明によれば、Ｌ−エルゴチオネインを含有する抗うつ剤が提供される。さらに、本発明によれば、Ｌ−エルゴチオネインを有効成分として含むうつ病の予防薬または抑制薬も提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、副作用などの問題が生じにくく、長期摂取しても安全性の高い、安価な抗うつ剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、強制水泳試験１の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、強制水泳試験２の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、血中のエルゴチオネイン濃度を示すグラフである。
【図４】図４は、脳内のエルゴチオネイン濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、オープンフィールド試験の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、尾懸垂試験の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、血中のエルゴチオネイン濃度を示すグラフである。
【図８】図８は、脳内のエルゴチオネイン濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｌ−エルゴチオネインは、アスコルビン酸と同様に抗酸化物質として知られており、生体内で合成できないため、外部から摂取する必要がある。Ｌ−エルゴチオネインは、アミノ酸の一種であり、熱や酸に強いという性質を有する。Ｌ−エルゴチオネインは、以下の構造を有する。
【化１】
0005904378.tif 000002
この構造は結晶状態のエルゴチオネインを示したものであり、溶液中では、チオール構造との互変異性体となることが知られている。
【００１２】
Ｌ−エルゴチオネインは、化学合成による市販品を用いてもよいが、コストの観点から天然のＬ−エルゴチオネインを抽出したものを用いることが好ましい。Ｌ−エルゴチオネインは、タモギタケ（学名:Pleurotus cornucopiae var.citrinopileatus）等のキノコ類に多く含有される。具体的には、Ｌ−エルゴチオネインを含有するキノコ類としては、エノキタケ属（Flammulina）に属するエノキタケ（Flammulina velutipes）等、オオイチョウタケ属（Leucopaxillus）に属するオオイチョウタケ（Leucopaxillus giganteus）等、キコブタケ属（Phellinus）に属するメシマコブ（Phellinus linteus）等、キシメジ属（Tricholoma）に属するサウーバ（Tricholoma sp.）等、ササクレヒトヨタケ属（Coprinus）に属するササクレヒトヨタケ（Coprinus comatus）等、サンゴハリタケ属（Hericiaceae）に属するヤマブシタケ（Hericium erinaceum）等、シメジ属（Lyophyllum）に属するホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ハタケシメジ（Lyophyllum decastes）等、ショウゲンジ属（Rozites）に属するショウゲンジ（Rozites caperata）等、スギタケ属（Pholiota）に属するナメコ（Pholiota nameko）等、ヒラタケ属（Pleurotus）に属するウスヒラタケ（Pleurotus pulmonarius）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、エリンギ（Pleurotus eryngii）及びタモギタケ（Pleurotus cornucopiae var.citrinopileatus）等、ブナハリタケ属（Mycoleptodonoides）に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）等、フミツキタケ属（Agrocybe）に属するヤナギマツタケ（Agrocybe cylindracea）等、マイタケ属（Grifola）に属するアンニンコウ（Grifola gargal）等を挙げることができる。
好ましいキノコ類としては、Ｌ−エルゴチオネインを長期間に亘って使用しても副作用の心配がなく、安全性が高いと考えられるため特に好ましく、このようなキノコとしてエノキタケ（Flammulina velutipes）、オオイチョウタケ（Leucopaxillus giganteus）、ササクレヒトヨタケ（Coprinus comatus）、ヤマブシタケ（Hericium erinaceum）、ホンシメジ（Lyophyllum shimeji）、ナメコ（Pholiota nameko）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）、エリンギ（Pleurotus eryngii）、タモギタケ（Pleurotus cornucopiae var.citrinopileatus）、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）を挙げることができる。
【００１３】
Ｌ−エルゴチオネインのキノコ類からの抽出は、公知の方法によって実施することができる。例えば、特開２０１２−５６９１４号公報に記載されるように、タモギタケ等のキノコ類を煮出して得た煮汁をイオン交換樹脂に供した後、その樹脂から陽イオン性化合物を溶出し、溶出液を濃縮し、これを高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製し、凍結乾燥することにより、Ｌ−エルゴチオネインを抽出することができる。
【００１４】
タモギタケ等のＬ−エルゴチオネインを多く含有するキノコ類は食品として長年用いられているため、Ｌ−エルゴチオネインを長期間に亘って投与しても副作用の心配がなく、安全性が高いと考えられる。本発明者らによる動物実験によれば、Ｌ−エルゴチオネインを１．２ｍｇ／ｇ（０．００５ｍｍｏｌ／ｇ餌）の濃度で含む餌を、マウスに３ｇ／日で２週間投与しても、体重や行動量に目立った変化は見られず、行動面での毒性は見られなかった。このため、マウスの体重２０ｇとして、１８０ｍｇ／ｋｇ体重／日では毒性は見られないと考えられる。マウスなどの体表面積の小さい動物では、同じ効果を発現するために、ヒトと比較してより大量の投与量が一般に必要なことが知られており、マウスなどの動物の投与量は、経験的にヒト投与量の約１０倍高い投与量が目安とされている。よって、ヒトでは、Ｌ−エルゴチオネインを１８ｍｇ／ｋｇ体重／日投与しても毒性は見られないと考えられる。
【００１５】
本発明は、Ｌ−エルゴチオネインに抗うつ作用を見出したことに基づく。Ｌ−エルゴチオネインの成人１日当たりの投与量は、本発明の所望の効果を得るために、例えば０．００５ｍｇ以上、好ましくは０．５〜１００ｍｇ、より好ましくは３〜５０ｍｇである。Ｌ−エルゴチオネインの投与量は、性別、体重、年齢、摂取期間、症状の重症度等に応じて適宜調整することができる。
【００１６】
Ｌ−エルゴチオネインは、これを有効成分として含む抗うつ剤として提供することができる。抗うつ剤は、Ｌ−エルゴチオネインを、精製物の形態で、またはキノコ抽出物の形態、好ましくはタモギタケ抽出物の形態で含むことができる。Ｌ−エルゴチオネインのキノコ抽出物としては、例えば、「タモギエキス末」（エル・エスコーポレーション社）、「コプリーノエキス」（オリザ油化株式会社）など市販品を使用することができる。キノコ抽出物は、Ｌ体のエルゴチオネインのみ含有するものであっても、Ｄ体とＬ体のエルゴチオネインの混合物を含有するものであってもよい。
タモギタケ抽出物等のキノコ抽出物は、例えば０．１〜５質量％のＬ−エルゴチオネインを含有する。キノコ抽出物に含有されるその他の成分は、その抽出方法によって異なるが、デキストラン等の澱粉分解物、β−グルカン、エルゴステロール、ヘキシトール、セラミド、トリテルペン類、食物繊維等が挙げられる。抗うつ剤は、その用途に応じて、その他の成分を含有してもよい。
【００１７】
Ｌ−エルゴチオネインを含有する抗うつ剤によれば、図１と図２の強制水泳試験および図６の尾懸垂試験で示されるように、動物においてうつ病の抑制効果を奏することが観察された。ここで、強制水泳試験および尾懸垂試験（テールサスペンジョン試験）は、例えば国立遺伝学研究所の「マウス開発研究室」（「小出剛」先生）のホームページ中の行動テストに記載されており（国立遺伝学研究所ＨＯＭＥ／組織図／マウス開発研究室／行動テスト、ＵＲＬ：http://www.nig.ac.jp/labs/MGRL/MGRL_behavior%20test.html）、抗うつ効果を確認するための試験として一般に確立された試験方法である。具体的には、図１では、強制水泳試験において、通常餌投与群ａ１、アスコルビン酸投与群ｂ１、およびタモギエキス末含有餌投与群ｃ１についての無動時間を測定した結果が示されており、タモギエキス末投与群ｃ１の無動時間が、通常餌投与群ａ１およびアスコルビン酸含有餌投与群ｂ１と比較して減少していた。さらに、図２では、通常餌投与群ａ２、タモギエキス末含有餌投与群ｃ２、およびエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ２についての無動時間を測定した結果が示されており、タモギエキス末含有餌投与群ｃ２およびエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ２では、通常餌投与群ａ２と比較して、無動時間の短縮が観察された。無動時間の短縮は、タモギエキス末に含まれるＬ−エルゴチオネインに抗うつ効果があることを示している。
また、図３および図４では、通常餌投与群ａ３、タモギエキス末含有餌投与群ｃ３、およびエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ３の血液中および脳内のエルゴチオネイン濃度を測定した結果がそれぞれ示されている。タモギエキス末含有餌投与群ｃ３とエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ３の血液中および脳内エルゴチオネイン濃度は同程度であり、通常餌投与群ａ３と比較して非常に高い濃度であったことが確認された。この結果から、Ｌ−エルゴチオネインは、抗うつ剤の経口摂取後に血中に移行し、さらに、血液脳関門を通過し、脳に効率よく移行することが判明した。このことは、Ｌ−エルゴチオネインが抗うつ効果を有することを裏付けている。
図６では、尾懸垂試験において、タモギエキス末１％含有餌投与群ｃ５ｓおよびタモギエキス末１０％含有餌投与群ｃ５が、通常餌投与群ａ５と比較して、無動時間が短縮しており、強制水泳試験で示されたＬ−エルゴチオネインの抗うつ効果が確認された。
【００１８】
さらに、エルゴチオネインは、膜輸送体ＯＣＴＮ１によって細胞膜を透過することがマウスｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確認されている（Kato et al., Pharm Res 27, 832, 2010）。ＯＣＴＮ１はヒトにおいても幅広い組織に発現し（Tamai et al., FEBS Lett 419, 107, 1997；Sugiura et al., Drug Metab Dispos 38, 1665, 2010）、脳においても発現が認められる（Tamai et al., FEBS Lett 419, 107, 1997；Nishimura and Naito, Drug Metab Pharmacokinet 20, 452, 2005；Taubert et al., Gut 58, 312, 2009）。さらに、ヒトＯＣＴＮ１はエルゴチオネインを細胞内に取り込む活性を有することが確認されている（Grundemann et al., Proc Natl Acad Sci USA 102, 5256, 2005）。これらの知見と、Ｌ−エルゴチオネインが脳に効率よく移行する図４の結果を考え合わせると、ヒトにおいても、抗うつ剤の摂取により、Ｌ−エルゴチオネインが脳に作用し、うつ症状が改善されるものと考えられる。
【００１９】
本発明に係る抗うつ剤は、うつ病の予防薬または抑制薬の形態でも使用することができる。うつ病の予防薬または抑制薬には、抗うつ剤の他に、賦形剤、基剤、崩壊剤、潤沢剤、結合剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、抗酸化剤、充填剤、風味剤、防腐剤、着色剤、またはコーティング剤などの製剤のために一般的に使用される添加剤をさらに含有してもよい。うつ病の予防薬または抑制薬の製剤化は、公知の製剤技術を用いて行うことができる。
【００２０】
うつ病の予防薬または抑制薬は、例えば、溶液、懸濁液、粉末、または固体成型物などであり、その剤型は、例えば、錠剤、カプセル、粉末剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、貼付剤、坐剤、および吸入剤などが挙げられる。うつ病の予防薬または治療薬の投与方法は、特に限定されないが、好ましくは経口投与である。経口投与に適した剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、シロップ剤、エキス剤、およびエリキシル剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
Ｌ−エルゴチオネインは、うつ病の予防または抑制用の食品添加剤および食品としても提供することができる。食品添加剤としては、Ｌ−エルゴチオネインの精製物、またはＬ−エルゴチオネインを含むキノコ抽出物に食品として許容可能な担体、添加剤などと混合したものを、例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、およびドライシロップ剤などの固形製剤、または液剤、ドリンク剤、およびシロップなどの液状製剤の形態に調製した製品を挙げることができる。食品添加剤は、好ましくは、うつ傾向もしくはうつ状態にある者またはうつ病患者が摂取するための食品の製造時または摂取前に、食品に添加または混合することにより使用される。
【００２２】
食品は、特に限定されないが、例えば、固形、半固形または液体の食品、具体的には、菓子類（クッキー、せんべい、ゼリーなど）、飲料（乳飲料、乳酸菌飲料、清涼飲料、野菜飲料、粉末飲料、スポーツ飲料、サプリメント飲料、栄養飲料など）、茶飲料（コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶、ブレンド茶など）、パン類、スープ類、魚肉加工品、畜肉加工品、麺類、ソース類、惣菜等が挙げられる。食品には、特定保健用食品、栄養機能食品等の保健機能食品や、健康食品、食品に栄養成分を強化する目的で使用されるサプリメント（栄養補助食品）等も含まれる。これらの食品は、その製造過程において上記食品添加剤を材料に配合することにより製造することができる。食品は、上記食品添加剤の他に、食品素材や添加物、例えば、調味料、野菜汁、ゲル化剤、または香料などを任意に含有することができる。食品中の上記食品添加剤の配合量は、食品の外観や味に悪影響を及ぼさない範囲で適宜調整することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明に係る抗うつ剤は下記実施例によって制限されるものではない。
【００２４】
［イミプラミンを用いた強制水泳試験］
強制水泳試験は、マウスの尾が底に届かない程度の深さまで水温２５℃の水を注いだビーカーに７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）を入れ、５分間のうちの泳いで移動している時間と無動の時間を計測することにより行った。抗うつ薬として確立されたイミプラミンの腹腔内投与３０分後に、再び強制水泳試験を行った。その結果、イミプラミンの投与により無動時間が実際に短縮することを観察した（データは示さず）。よって、抗うつ作用が強制水泳試験によって示されることが確認された。
【００２５】
［強制水泳試験１］
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）に強制水泳試験を実施し、５分間のうちの無動時間を測定し、無動時間の平均が同じになるように３群に分けた。１群当たり６匹のマウスとした。強制水泳試験は、上記強制水泳試験と同様の方法に従って行った。この３群のマウスに、（ａ１）通常餌、（ｂ１）通常餌にアスコルビン酸を８８ｍｇ／１００ｇ餌（アスコルビン酸０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌）混ぜた餌（アスコルビン酸含有餌）、（ｃ１）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１０質量％（１０ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末含有餌）を与えて飼育した。このタモギエキス末のＬ−エルゴチオネイン含有量は、ＨＰＬＣによる測定で１．２質量％である。投与開始２週間後に再度、５分間の強制水泳試験を行い、５分間のうちの無動時間を測定した。図１に、無動時間の測定結果を示す。
【００２６】
図１に示されるように、タモギエキス末投与群ｃ１の無動時間は、通常餌投与群ａ１と比較して有意に減少していた。従って、タモギタケエキス末にはうつ病抑制作用があることが示された。一方、アスコルビン酸含有餌投与群ｂ１の無動時間は、通常餌投与群ａ１と比較してほとんど差はなかった。よって、アスコルビン酸は、食物に含まれる水溶性の抗酸化物質である点でエルゴチオネインと同様であるが、うつ病抑制作用はないことも判明した。
【００２７】
［強制水泳試験２］
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）に強制水泳試験を実施し、５分間のうちの無動時間を測定し、無動時間の平均が同じになるように３群に分けた。１群当たり６匹のマウスとした。強制水泳試験は、強制水泳試験１と同様の方法に従って行った。この３群のマウスに、（ａ２）通常餌、（ｃ２）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１０質量％（１０ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末含有餌）、（ｄ２）通常餌にタモギエキス末含有餌に含まれるのと同量（Ｌ−エルゴチオネイン１２０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）／１００ｇ餌）のエルゴチオネイン（フナコシ社、＃ＦＲ−１１１、Ｌ体のみ含有）を混ぜた餌（エルゴチオネイン含有餌）を与えて飼育した。投与開始２週間後に再度、５分間の強制水泳試験を行い、５分間のうちの無動時間を測定した。図２に、無動時間の測定結果を示す。
【００２８】
図２に示されるように、通常餌投与群ａ２と比較して、タモギエキス末含有餌投与群ｃ２およびエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ２では、有意な無動時間の短縮が見られた。従って、タモギエキス末中に含まれるエルゴチオネインに抗うつ作用があることが判明した。
【００２９】
［血中および脳内のエルゴチオネイン濃度の測定−タモギエキス末とエルゴチオネインとの比較］
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）を３群に分け、（ａ３）通常餌、（ｃ３）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１０質量％（１０ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末含有餌）、（ｄ３）通常餌にタモギエキス末含有餌に含まれるのと同量（Ｌ−エルゴチオネイン１２０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）／１００ｇ餌）のエルゴチオネイン（フナコシ社、＃ＦＲ−１１１、Ｌ体のみ含有）を混ぜた餌（エルゴチオネイン含有餌）を与えて１９日間飼育し、血液中および脳内のエルゴチオネイン濃度を測定した。１群当たり６匹のマウスとした。測定は、Kato et al., Pharm Res 27, 832, 2010に記載の方法により、ＨＰＬＣを用いて行った。この結果を図３および図４に示す。
【００３０】
図３および図４に示されるように、タモギエキス末含有餌投与群ｃ３とエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ３の血液中および脳内エルゴチオネイン濃度は同程度であり、通常餌投与群ａ３と比較して非常に高い濃度であった。従って、エルゴチオネインが、経口摂取後に血中に移行すること、および血液脳関門を通過し、脳に効率よく移行することが判明した。この結果と、図２においてタモギエキス末含有餌投与群ｃ２とエルゴチオネイン含有餌投与群ｄ２でほぼ同程度の無動時間短縮が観察されたことから、タモギエキス末による抗うつ作用は、タモギエキス末に含まれるエルゴチオネインによる作用であることが明らかになった。
【００３１】
［自発運動活性測定試験］
強制水泳試験において見られた無動時間の減少が、自発運動量の増加に起因するものではないことを確認するため、自発運動量の測定を行った。自発運動量の測定は、強制水泳試験１で試験した各群のマウスについて、５分間に移動した距離（ｍ）として測定した。
この結果、強制水泳試験１で試験したマウスについて、各群での自発運動量や、マウスの通った経路において顕著な差は見られなかった。従って、強制水泳試験における無動時間の減少は、自発運動量の増加に起因するものではないことが示された。
【００３２】
［オープンフィールド試験］
強制水泳試験１で試験した各群のマウスを、マウスにとって広くて明るく新奇な環境であるオープンフィールドテスト装置（縦４５ｃｍ、横４５ｃｍ、高さ４５ｃｍ）に入れ、５分間の各区画（装置の外側、内側、中央）滞在時間と、立ち上がり回数を測定した。装置内におけるマウスの行動は、観察者が実際に観察記録するとともに、ビデオカメラでも撮影し、データを抽出した。区画滞在時間の測定の結果、各群の各区画での滞在時間に差はなかった。一方、立ち上がり回数は、通常餌投与群ａ４と比較して、タモギエキス末含有餌投与群ｃ４で有意に増加しており（図５）、新奇環境における探索行動が増加する傾向があった。よって、タモギエキス末が、マウスの情動に何らかの作用を有している可能性が示された。一方、アスコルビン酸含有餌投与群ｂ４の立ち上がり回数は、通常餌投与群ａ４と比較してほとんど差はなかった。よって、アスコルビン酸は、食物に含まれる水溶性の抗酸化物質である点でエルゴチオネインと同様であるが、マウスの情動に影響を及ぼさないことも判明した。
【００３３】
［尾懸垂試験］
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）を１２匹ずつ３群に分け、（ａ５）通常餌、（ｃ５ｓ）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１質量％（１ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．０５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末１％含有餌）、（ｃ５）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１０質量％（１０ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末１０％含有餌）を与えて飼育した。投与開始２週間後に尾懸垂試験を行った。尾懸垂試験は、マウスの尾にテープを貼り付け、このテープを尾懸垂測定装置のフックに吊り下げ、２分間のうちの無動であった時間を計測することにより行った。図６に、尾懸垂試験の結果を示す。
【００３４】
図６に示されるように、タモギエキス末１％含有餌投与群ｃ５ｓおよびタモギエキス末１０％含有餌投与群ｃ５は、通常餌投与群ａ５と比較して、尾懸垂試験における無動時間が有意に短い値を示した。よって、尾懸垂試験によっても、タモギエキス末にうつ病抑制作用があることが確認された。さらに、タモギエキス末の投与量が１ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．０５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌）という少量であっても、うつ病抑制作用を発揮することが確認された。
【００３５】
［血中および脳内のエルゴチオネイン濃度の測定−タモギエキス末の投与量による比較］
５週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス（三協ラボ社）を４匹ずつ３群に分け、（ａ６）通常餌、（ｃ６ｓ）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１質量％（１ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．０５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末１％含有餌）、および（ｃ６）通常餌にタモギエキス末（エル・エスコーポレーション社）を１０質量％（１０ｇ／１００ｇ餌（Ｌ−エルゴチオネイン０．５ｍｍｏｌ／１００ｇ餌））混ぜた餌（タモギエキス末１０％含有餌）を与えて２週間飼育し、各群のマウスの血液中および脳内のエルゴチオネイン濃度を測定した。測定は、Kato et al., Pharm Res 27, 832, 2010に記載の方法により除タンパクを行った後、ＨＩＬＩＣ ｃｏｌｕｍｎ（ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、００Ｆ−４４４９−Ｂ０、１５０×２ｍｍ、３μｍ  ＨＩＬＩＣ）を装備したＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて行った。除タンパクを行った後のサンプルを１μＬインジェクションし、０．１％ギ酸／ＭＳ用蒸留水および０．１％ギ酸／アセトニトリルを５：９５−７０：３０の比率で混合した溶媒を用いて、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で溶出した。まず、０．１％ギ酸／アセトニトリルの割合が９５％となるように０．５分間維持し、続く３分間で３０％まで減少させ、その状態でさらに２分間維持した。続いて、０．１秒で０．１％ギ酸／アセトニトリルが９５％の条件に戻し、その状態でさらに２．４分間維持した。カラム温度は５０℃、オートサンプラーの温度は４℃で維持した。分析は、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔに従った。イオン化は、陽イオンエレクトロスプレー法を用いた。ＭＳ／ＭＳでの検出は、ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｍｏｄｅで行った。Ｌ−エルゴチオネインの親イオンはｍ／ｚ値を２３０．３、娘イオンはｍ／ｚ値を１２７．０に、内標として用いたＬ−エルゴチオネイン−ｄ９の親イオンはｍ／ｚ値を２３９．２、娘イオンはｍ／ｚ値を１２７．０に設定した。窒素ガスをネブライザーガスとして、アルゴンガスをコリジョンガスとして用いた。この結果を図７および図８に示す。
【００３６】
図７および図８では、図３および図４で観察されたのと同様に、タモギエキス末投与群が、通常餌投与群ａ３と比較して非常に高い血液中および脳内エルゴチオネイン濃度を示していた。また、タモギエキス末１０％含有餌投与群ｃ６は、タモギエキス末１％含有餌投与群ｃ６ｓよりもより高い血液中および脳内エルゴチオネイン濃度を示していた。図６の結果と合わせると、タモギエキス末の投与量が多いほど血液中および脳内のエルゴチオネイン濃度は増加するが、投与量が少量であっても尾懸垂試験では同程度の無動時間の短縮を達成できることが確認された。
【符号の説明】
【００３７】
ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６      通常餌投与群
ｂ１、ｂ４                              アスコルビン酸含有餌投与群
ｃ１、ｃ２、ｃ３、ｃ４、ｃ５、ｃ６      タモギエキス末１０％含有餌投与群
ｃ５ｓ、ｃ６ｓ                          タモギエキス末１％含有餌投与群
ｄ２、ｄ３                              エルゴチオネイン含有餌投与群
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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