(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アペリンレセプターを発現する霊長類中胚葉細胞を作製する方法であって、以下の工程、
１．霊長類の万能性幹細胞を、共同培養細胞中に、アペリンレセプターが発現され検出できるまで、ＯＰ９骨髄間質細胞との共同培養で培養する工程、及び
２．アペリンレセプターを発現する共同培養細胞を、アペリンレセプターを発現しない共同培養細胞から分離する工程、
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２】
霊長類の万能性幹細胞が、前記ＯＰ９骨髄間質細胞と約２から約３日間共同培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約１％から約５％の前記アペリンレセプター+細胞が、ｂＦＧＦを含む無血清半固形培地における培養において、間葉幹細胞及び内皮細胞に分化することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
メサンギウム芽細胞を作成する方法であって、以下の工程、
１．霊長類の万能性幹細胞を、共同培養細胞中に、アペリンレセプターが発現され検出できるまで、ＯＰ９骨髄間質細胞との共同培養で培養する工程、
２．アペリンレセプターを発現する共同培養細胞を、アペリンレセプターを発現しない共同培養細胞から分離する工程、及び
３．約5から約100ng/mlのｂＦＧＦを含む無血清半固形培地において、サブセットがメサンギウム芽細胞に分化するまで、アペリンレセプター+細胞を約２日培養する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
メサンギウム芽細胞を、ｂＦＧＦを含む培養培地で培養して、メサンギウム芽細胞を内皮細胞に分化させる工程を更に含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
メサンギウム芽細胞を、ｂＦＧＦの存在下において、培養して、メサンギウム芽細胞を間葉幹細胞に分化させる工程を更に含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
アペリンレセプター+細胞が、更に血小板由来成長因子レセプターアルファ（ＰＤＧＦＲＡ）及びキナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）の少なくとも１つを発現する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アペリンレセプター+細胞が、更にＰＤＧＦＲＡ及びＫＤＲの少なくとも１つを発現する請求項４に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載の方法により得られた、内皮系及び間葉系潜在能力を有するアペリンレセプター+メサンギウム芽細胞の単離された集団。
【請求項１０】
前記無血清半固形培地が、骨形態発生タンパク質４（ＢＭＰ４）を更に含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国特許出願12/726,814（2010年3月18日出願）に対する優先権を主張する。米国特許出願12/726,814は、米国特許出願12/554,696の部分継続出願であり、後者は米国特許出願12/024,770の継続出願であり、米国特許出願12/024,770は、米国仮特許出願60/974,980（2007年9月25日出願）及び米国仮特許出願60/989,058（2007年11月19日出願）に関する優先権を主張する。前記出願の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
本発明は、霊長類のクローン性間葉先駆体(progenitor)及び間葉幹細胞（MSC）株並びにそのような細胞を同定及び作製する方法、より具体的には、無血清条件下でクローン性間葉先駆体及びMSC株を作製する方法に関する。本発明は更に、内皮系及び間葉共有前駆体集団並びにそのような細胞を同定及び作製する方法に関する。本発明は更にまた、側板中胚葉細胞を含む細胞集団並びに培養万能性(pluripotent)幹細胞からそれらを作製及び単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物の胚の発生時に、原腸形成によって三胚葉（すなわち内胚葉、外胚葉及び中胚葉）が形成される（前記胚葉は別個の身体細胞を生じる）。中胚葉は原条（原腸形成開始時に形成される一過性胚性構造）から発達する。初期中胚葉は、過渡的に沿軸中胚葉、中間中胚葉及び側板中胚葉に分化する。沿軸中胚葉は中軸骨格及び骨格筋を生じる。中間中胚葉は尿生殖器系を形成する。側板中胚葉は循環系（血液細胞、血管及び心臓を含む）を生じ、更に内臓及び四肢を形成する。胚体外中胚葉は発育胚の外側に存在する。胚体外中胚葉は原腸形成時に原条から誘導されるという証拠が存在する（Boucher and Pedersen, Reprod. Fertil. Dev. 8:765, 1996）。胚体外中胚葉は、栄養物、老廃物の廃棄手段及び物理的保護を胚に提供するいくつかの組織を生じる。
【０００３】
側板及び胚体外中胚葉はともに内皮細胞及び血液細胞を形成し、FOXF1、HAND1、HAND2、GATA-2、BMP4及びWNT5aを発現することができる。前記の発現は沿軸中胚葉及び中間中胚葉では低いか又は検出不能である（Mahlapuu et al., Development. 128(2):155, 2001；Firulli et al., Nat. Genet. 18(3):266, 1998；Morikawa et al., Circ. Res. 103(12):1422, 2008；Kelley et al., Dev. Biol. 165:193, 1994；Silver et al., Blood 89(4):1154, 1997；Fujiwara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 98(24):13739, 2001；Takada et al., Genes Dev. 8(2):174, 1994）。側板と胚体外中胚葉を区別するマーカーはまだ明らかにされていない。Bosseらの最近の発見では、IRX3が側板中胚葉で発現されるが胚体外中胚葉では発現されないと提唱されている（Bosse et al., Mech. Dev. 69(1-2):169, 1997）。本出願の目的のために、側板という用語は両組織を指すために用いられる。
【０００４】
ある種の拘束中胚葉先駆細胞は2つ以上の系列の細胞を生じることができる。そのような先駆細胞の例には血管芽細胞が含まれ、前記は造血細胞及び内皮細胞の両方を生じることができる（Choi K, et al., "A common precursor of hematopoietic and endothelial cells," Development 125:725, 1998）。
MSCは、少なくとも3つの下流の間葉細胞系列（すなわち骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪細胞）に分化することができる。今日まで、固有のMSCマーカーは同定されていない。したがって、これらの細胞を同定するために形態学的及び機能的基準が用いられる。例えば以下を参照されたい：Horwitz E, et al., "Clarification of the nomenclature for MSC:  the International Society for Cellular Therapy position statement," Cytotherapy 7:393, 2005；及びDominici M, et al., "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.  The International Society for Cellular Therapy position statement," Cytotherapy 8:315, 2006。MSCは多くの細胞タイプに分化することができるので、当業界は、細胞利用療法、再生医療及び再建医療のためにMSCを分化させる方法を熟考している。
【０００５】
典型的には、MSCは成人の骨髄、脂肪、軟骨及び筋肉から単離される（Pittenger F, et al., "Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells," Science 284:143-147, 1999；Zuk P, et al., "Multilineage cells from human adipose tissue:  implications for cell-based therapies," Tissue Eng. 7:211-228, 2001；及びYoung H, et al., "Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors," Anat. Rec. 264:51-62, 2001）。MSCはまたヒトの末梢血から単離された（Kassis I, et al., "Isolation of mesenchymal stem cells from G-CSF-mobilized human peripheral blood using fibrin microbeads," Bone Marrow Transplant. 37:967-976, 2006）。MSCはまたヒトの新生児組織（例えばホウォートンゼリー）（Wang H, et al., "Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord," Stem Cells 22:1330-1337, 2004）、ヒトの胎盤（Fukuchi Y, et al., "Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential," Stem Cells 22:649-658, 2004）及び臍帯血（Erices A, et al., "Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood," Br. J. Haematol. 109:235-242, 2000）並びにヒト胎児組織（Campagnoli C, et al., "Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow," Blood 98:2396-2402, 2001）から単離できる。
【０００６】
本技術は、その後の分化及び使用に対して十分なMSCを単離することができないことによって制限を受けている。適切なドナーが見つかっても、限定的な数の細胞でさえ単離に必要な侵襲的方法はドナーにリスクを与える。更にまた、単離したMSCを長期培養で維持すること、及びそのような培養を細菌又はウイルス汚染を受けないように維持することは困難である。
胚性幹細胞（ESC）（ヒトESC（hESC）を含む）をMSCに分化させる方法を考案する努力は、潜在的に汚染された血清を含む培養液で細胞を培養すること必要とするか、又は未分化hESCの特徴を維持する細胞を採集するものであった。例えば、Barberiらは、アルファ-MEM培養液中で20％熱不活化ウシ胎児血清を用い、有糸分裂不能マウス支質細胞株（すなわちフィーダー細胞）上で40日間hESCをMCSに分化させた（Barberi T, et al. "Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells," PLoS Med. 2:e161, 2005）。細胞を採集しCD73についてアッセイし、続いてCD73+細胞をフィーダー細胞の非存在下で20％のFBSとともにアルファ-MEM中で7から10日間プレートした。Barberiらは、前記MSCを脂肪形成性細胞、軟骨形成性細胞、骨形成性細胞及び筋形成性細胞に分化させた。
【０００７】
同様に、Olivierらは、ラクルア（raclure）（すなわちhESC培養でコロニーの中心又は縁に出現する偶発的に分化した細胞）をD10培養液（DMEM、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン及び1％非必須アミノ酸）を用いてプレートし、厚い多層上皮が発達するまで毎週液を交換することによって、hESCをMSCに分化させた（Olivier E, et al., "Differentiation of human embryonic stem cells into bipotent mesenchymal stem cells," Stem Cells 24:1914-1922, 2006）。ほぼ4週間後に、トリプシン、コラゲナーゼIV型及びディスパーゼの混合物で前記上皮を4から6時間 分離させ、続いてD10培養液に再プレートすることによってMSCを単離した。OlivierらのMSCは激しく増殖し、安定的な核型を有し、接触抑制を示し、20回の継代後に老化を示して脂肪形成性細胞及び骨形成性細胞に分化した。Olivierらは、細胞が軟骨形成性細胞に分化したことは報告しなかった。Barberiらとは異なり、OlivierらはhESCのMSCへの分化の支援にフィーダー細胞を必要としなかった。しかしながら、OlivierらのMSCはSSEA-4陽性であり、これらのMSCがhESCに特徴的な細胞表面マーカーを発現したことを暗示した。
【０００８】
Pike & Shevdeは、間葉特異的培養液（10％FBSを含むメセンカルト（MesenCult(商標)）培養液；グルタミン及びヌクレオシドを含むアルファMEM；又はグルコース及びグルタミンを含むDMEM：前記は2日毎に交換される）で10から12日間インキュベートした胚様体（EB）によりhESCをMSCに分化させた（米国特許公開公報2006/0008902号）。EBを消化し、前間葉細胞を80％コンフルエンシーまで培養した。細胞をトリプシン消化し、間葉特異的培養液で3回継代した。
Meulemanらは無血清培養液でのMSCの培養を報告した。しかしながら、前記培養は実際には成分として動物血清を含んでいたことが後になって見出された（Meuleman N, et al., "Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-minimal essential medium (MEM)," Eur. J. Haematol. 76:309-316, 2006；及びMeuleman N, et al., "Human marrow mesenchymal stem cell culture: serum-free medium allows better expansion than classical alpha-minimal essential medium (MEM)," Eur. J. Haematol. 77:168, 2007；しかしながら以下を参照されたい：Korhonen M, "Culture of human mesenchymal stem cells in serum-free conditions:  no breakthroughs yet," Eur. J. Haematol. 77:167, 2007）。
【０００９】
これらの方法は、血清含有培養液でMSCを培養し分化させた。MSCを培養及び分化させる無血清条件は、もし規定されたならば、バッチ間の変動を減少させ、外因性副生成物及び病原体により伝搬される感染のリスクを排除するであろう（Sotiropoulou P, et al., "Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research," Stem Cells 24:1409-1410, 2006）。
前述の理由のために、初期間葉先駆細胞及びMCSを入手する方法、特に無血清条件下で誘導する場合の方法が希求されている。
中胚葉及び神経冠はともに胚発育時に間葉前駆体を生じる（Dennis, J. E., and P. Charbord, "Origin and differentiation of human and murine stroma," Stem Cells 20:205-214, 2002；Takashima, Y, et al., "Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation," Cell 129:1377-1388, 2007）。胚性幹細胞から神経冠起源のMSCを作製する条件が記載されたが（Takashima et al., 上掲書；Lee, G, et al.,  "Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells," Nat Biotechnol 25:1468-1475, 2007）、中胚葉からMSCを作製する態様は不明である。
上述の理由から、初期間葉先駆細胞及びMCSを入手する新規な方法、特に無血清条件下で入手する方法が希求されている。更にまた、中胚葉由来MSCとともに初期中胚葉先駆細胞、（前記は万能性幹細胞のMSCへの分化中にMSCを生じることができる）を同定及び作製することが希求されている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一般的には、in vitro分化幹細胞から誘導される、新規に同定された共通の間葉及び内皮細胞前駆体、即ち、メサンギウム芽細胞に関する。
第一の特徴では、本発明は霊長類のMSCクローン集団を作製する方法と要約される。前記方法は、間葉先駆体を含む霊長類細胞の不均質な単一細胞懸濁物を、約5から約100ng/mlのbFGFを含む無血清半固形培地で独立コロニーが形成されるまで培養する工程、及び前記独立コロニーを約5から約100ng/ml、又は約5ng/ml、又は約20から約100ng/mlのbFGFを含む無血清液体培地で培養して実質的に純粋なMSCクローン集団を得る工程を含む。
【００１１】
前記方法で使用される不均質懸濁物は、例えば霊長類（例えばヒト）の万能性細胞（例えばESC又は誘導万能性幹（iPS）細胞）を、培養細胞が間葉先駆体となるまで培養で分化させることによって入手できる。これは、本明細書に記載する分化支援培養液で万能性細胞を骨髄間質細胞と一緒に少なくとも2から5日間共同培養することによって、又はEB（それ自体は周知の方法を用いて万能性細胞を培養することによって入手できる）を分離して続いて前記細胞を単一細胞懸濁物として分散させることによって達成できる。骨髄間質細胞はマウスOP9細胞であり得る。万能性細胞のin vitro分化によって誘導されない細胞(特に共同培養骨髄細胞)を実質的にある程度又は全く含まない不均質懸濁物は、前記懸濁物からそれら細胞を枯渇させることによって入手できる。これらの細胞は、例えば、枯渇させるべき細胞上のエピトープに特異的な常磁性モノクローナル抗体と枯渇させるべき細胞を非共有結合的に結合させ、続いて磁石を用いて抗体結合細胞を分離することによって、使用前に懸濁物から枯渇させることができる。万能性細胞から得られる懸濁物中の細胞は少なくともMIXL1及びT(BRACHYURY)を発現することができる。
培養液は、約1％のメチルセルロースを培養液に加えることによって半固形にすることができる。場合によって、培養液は約10から約20ng/mlのPDGF-BBを含むことができる。コロニーを生じさせるために、懸濁物は約10日から約20日又はそれを超えて培養することができる。
【００１２】
bFGFを補充した無血清半固形培地で培養中に間葉コロニーが形成されたら、間葉先駆細胞が懸濁物中に存在していたと認定される。間葉先駆細胞を検出するためのそのようなbFGF-依存コロニー形成アッセイの例は米国特許7,615,374号に記載されている（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。コロニー形成アッセイで得られたコロニーは、少なくとも複数のFOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2の発現によって間葉と同定することができる。コロニーの特徴は機能的、形態学的及び表現型の特徴及び遺伝子発現プロフィルを含む。コロニーの機能的特徴は以下を含む：（1）間葉細胞の増殖を促進する因子（例えばPDGF-BB、EGF及びTGF-アルファ）による増殖刺激及び中胚葉分化に必要な因子（例えばVEGF、TGF-ベータ及びアクチビンA）による増殖抑制；（2）骨形成性、軟骨形成性又は脂肪形成性細胞系列への分化；及び（3）内皮細胞への分化。コロニーの形態学的特徴は以下を含む：（1）直径が100−500μmの丸い（すなわち球状）凝集物を形成する密に詰まった細胞；（2）コンパクトな回転楕円体に更に発達する密に詰まった構造物（コア）の樹立によるコロニー形成；及び（3）長期培養後でも、密集した外側細胞層及び不規則な内部構造を欠くこと（密集した外側細胞層及び不規則な内部構造はEBの特徴である）。コロニーの表現型の特徴は以下を含む：（1）CD44、CD56、CD105及びCD140a（PDGFRA）、CD146を発現するが血液内皮細胞系表面マーカー（すなわちCD31、CD43、CD45及びVE-カドヘリン）を発現しないこと；（2）FOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2の発現；（3）ビメンチン、アルファ平滑筋アクチン及びデスミンの発現。
前記方法でこのようにして形成された間葉コロニーは、細胞外マトリックス、例えばマトリゲル（Matrigel(商標)）、コラーゲン、ゼラチン又はフィブロネクチン或いは前記の組合せの存在下で更に培養することができる。
【００１３】
本発明は更に、上記方法により作製されたクローン由来MSC株の実質的に純粋な集団と要約される。前記は少なくともCD44、CD56、CD73、CD105、CD140a及びCD146について陽性であるが、CD31、CD43、CD45及びVE-カドヘリンについては陰性である。
記載した実施態様は多くの利点を有する。前記利点には、前記方法で入手される間葉先駆細胞及びMSCは、骨、軟骨及び脂肪細胞に関連する疾患の治療に用いることができるということが含まれる。
MSCのクローン集団は単一の間葉コロニーから入手できるということもまた利点である。
前記方法で入手される細胞は、間葉先駆細胞が高い分裂潜在能力を有し、大きなコロニーを形成するので更なる数量拡大のために容易に選択できるということもまた利点である。
前記方法で入手される細胞は、同種免疫及び自己免疫応答又は移植に対して免疫寛容であり得るか又は免疫寛容を形成できるということも更に別の利点である。
前記方法で入手される細胞は、少なくとも骨形成性、軟骨形成性及び脂肪形成性系列に分化できるということも更に別の利点である。
前記方法で入手される間葉コロニーは、血管形成性潜在能力を有するということも更に別の利点である。
【００１４】
本発明は更に、in vitro誘導アペリンレセプター陽性（APLNR+）側板中胚葉細胞の集団と要約される。これらの細胞は、分化中の万能性幹細胞の混合集団からアペリンレセプター（APLNR）の発現を基にして単離することができる。これらの細胞は体壁及び内臓の細胞に分化し、bFGFの存在下の半固形培地でメサンギウム形成性間葉芽細胞及び血管形成性芽細胞コロニーを生じる。APLNR+細胞は、中胚葉、特に側板中胚葉に特徴的な転写物を発現する。
本特許請求の範囲の方法によって入手されるMSCは中胚葉起源であり、側板中胚葉細胞に富むAPLNR+細胞から誘導することができるということは本発明の更に別の利点である。
本発明の前記及び他の特質、特徴並びに利点は以下の説明から更に理解されよう。好ましい実施態様の記載は、本発明を限定し、全ての改変、等価物及び代替物をカバーしようとするものではない。したがって、本発明の範囲の解釈には本明細書の特許請求の範囲が参照されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−Ｅ】2つのタイプのhESC由来コロニー、すなわちメサンギウム芽細胞（MB）に由来する間葉コロニー、及び血管芽細胞（HB）に由来する芽細胞コロニーの特性を示す。図1Aは、半固形培地で3、5、7及び12日間増殖させた後のMB及びHBコロニーの形態を示す。図1Bは、FGF依存コロニー形成の動的態様を示す。棒線は4つの別個の実験の標準偏差を表す。hESC由来単一細胞は最初にOP9細胞と2日間又は3日間共同培養されたか否かに応じて、それらはMB又はHBの潜在能力を帯びる。図1Cは、bFGFはMB及びHBコロニー形成の両方を支援するが、PDGF又はVEGFのみでは支援しないことを示す。データは平均±SD（n＝4）として表されている。星印はFGFのみ及びFGFとPDGF又はVEGFのいずれかとの組合せを含む培養液間の統計的有意を示す。図1Dは、OP9細胞との4日間の共同培養後におけるMB由来及びHB由来コロニーの分化潜在能力を示す。フローサイトメトリーは、クローン形成性培養から12日目に収集したMBコロニー由来細胞はCD146+CD31-間葉細胞及びCD31+CD43-内皮細胞を生じるが、HBコロニー由来細胞はCD31+CD43-内皮及びCD43+造血系列細胞を生じることを示した。図1Eは、クローン形成性培養から5日目に収集した単一MBコロニー（上、スケールバーは100μm）及びHBコロニー（下、スケールバーは50μm）から発達した細胞クラスターの免疫染色解析を示す。細胞は、CD144+（VE-カドヘリンとしても知られている）CD43-内皮系、CD43+造血系、及びカルポニン+CD144-間葉と同定された。スケールバーは100μmを表す。単一MBコロニーの細胞クラスターから発達したコロニーは、カルポニン+CD144（VE-カドヘリン）-間葉細胞及びCD144（VE-カドヘリン）+カルポニン-内皮細胞（上段パネル）を生じる。単一HBコロニーから発達した細胞クラスターから発達したコロニーは、CD43+造血系及びCD144（VE-カドヘリン）+CD43-内皮系細胞（下段パネル）を生じる。
【図２Ａ−Ｃ】OP9細胞と共同培養したhESCの0日目（H1）から7日目における遺伝子発現のマイクロアレイ解析を示す。図2Aは、具体的胚葉及びそれらの亜集団及び誘導細胞を規定する選択遺伝子セットのヒートマップを示す。図2Bは、定量的PCRで決定したMIXL1、T、SNAI1、FOXF1及びSOX17の相対的遺伝子発現を示す。図2Cは、OP9共同培養1−6日後のhESC由来細胞数の前日に対する増加倍数を示す。データは平均±SD（n＝3）として表されている。
【図３Ａ−Ｄ】APLNR+細胞の解析を示す。図3Aはフローサイトメトリーの結果のドットプロットを示す。図3Bは、OP9細胞共同培養におけるH1細胞からのAPLNR+細胞の発生に対する中胚葉形成阻害物質（SB431542（5μg/ml）及びDKK1（150μg/ml））の作用を示す。図3CはAPLNR+細胞とAPLNR-細胞との転写発現の比較である。図3DはAPLNR+細胞及びAPLNR-細胞のコロニー形成潜在能力を示す。
【図４Ａ−Ｃ】OP9細胞との共同培養によって2日間（D2）又は3日間（D3）分化させたH1 hESCから得たAPLNR+細胞、APLNR-細胞、コア、コロニー、及び間葉幹細胞（MSC）株（継代p1及びp5）の遺伝子発現プロフィルを示す。図4Aは、表示の胚葉及びそれらの亜集団／誘導細胞を規定する選択遺伝子セットのヒートマップを示す。コアはクローン形成性培養から3日目に、完全に発達したコロニーはクローン形成性培養から12日目に収集した。EMTは上皮系−間葉転換である。VSMCは血管平滑筋細胞である。図4Bは、分化の全ステージを通してSOX1神経上皮マーカー発現が欠如していることを示す。14日間分化させたH1 hESC由来胚様体を陽性コントロールとして用いた。図4Cは、表示の細胞のサブセットにおける代表的な転写物の定量的RT-PCR解析を示す。棒線は、RPL13に対して標準化した3実験のプールサンプルの遺伝子発現を表している。
【図５】中胚葉系列の発達及び万能性幹細胞からMSCへの分化の模式図を示す。
【図６】hESC分化、MBコロニー及びMSC株の作製に用いたプロトコルの模式図を示す。
【図７】間葉及び芽細胞コロニーの分化潜在能力を評価するために用いたプロトコルの模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似するか又は等価である方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、本明細書では好ましい方法及び材料を述べる。遺伝子の“発現の欠如”又は細胞上にあるマーカーが存在しないということは、本出願時に当業界で公知の方法を用いてそのような遺伝子又はマーカーの発現を検出できないことを指すことは当業者には一般的に理解されている。より感度の高い方法ならばそのような遺伝子又はマーカーの低レベルの発現を検出できる可能性があることは排除し得ない。
実施態様及び本発明の特許請求の範囲の記載において、下記の用語が下記に示す定義にしたがって用いられる。
【００１７】
本明細書で用いられるように、“約”は指摘濃度の5％内を意味する。
本明細書で用いられるように、“クローン”は、細胞の凝集物からではなく単一細胞から培養した細胞の集団を意味する。“クローン集団”の細胞は、細胞表面マーカー及び形態に関して実質的に均一なパターンを提示し、遺伝的に実質的に同一である。
本明細書で用いられるように、“胚様体”又は“EB”は、万能性細胞（例えばESC又はiPS細胞）に由来する細胞の凝集物であり、この場合、細胞凝集は、ハンギングドロップ、非組織培養処理プレート又はスピンナーフラスコ（すなわち低粘着条件）へのプレート、及び典型的なコロニー増殖を形成するために細胞の表面粘着を妨げる任意の方法によって開始できる。EBは細胞の丸い集合物として出現し、3つ胚葉（すなわち外胚葉、中胚葉及び内胚葉）全てに由来する細胞タイプを含む。EBを作製する方法は当業者には周知である。以下を参照されたい：Itskovitz-Eldor J, et al., "Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers," Mol. Med. 6:88-95, 2000；Odorico J, et al., Stem Cells 19:193-204, 2001；及び米国特許6,602,711号（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１８】
本明細書で用いられるように、“無血清”は、培養も培養液も血清又は血漿を含まないが、精製もしくは合成された血清成分又は血漿成分（例えばFGF）は、下記に記載するように再現性のある量で培養に提供することができる。
本明細書で用いられるように、“実質的に純粋な集団”は、少なくとも99％の所望の細胞タイプを含む誘導細胞の集団を意味する。細胞の精製は当業者に公知の任意の手段によって達成できる。例えば実質的に純粋な細胞集団は、本明細書に記載するようにより純度の低い集団から細胞の増殖によって又は選別によって得ることができる。
本明細書で用いられるように、“万能性細胞”は、3つの胚葉の全てに分化して身体の任意の細胞タイプになることができる細胞の集団を意味する。万能性細胞は多様な細胞表面マーカーを発現し、未分化細胞の細胞形態学的特徴を有し、免疫障害動物（例えばSCIDマウス）に導入したとき奇形腫を形成することができる。奇形腫は典型的には3つの胚葉全てに特徴的な細胞又は組織を含む。
【００１９】
本明細書で用いられるように、“多能性”細胞は万能性細胞よりも分化が進んでいるが、永久的に特定の細胞タイプに拘束されているわけではない。万能性細胞はしたがって多能性細胞よりも高い潜在能力を有する。
本明細書で用いられるように、“誘導万能性幹細胞”又は“iPS細胞”は、万能性へと再プログラミングされた分化した体細胞である。前記細胞は、それらの対応する分化した体細胞の起源と遺伝的に実質的に同一であり、より高い潜在能力を有する細胞（例えばES細胞）と類似する特徴を提示する。以下を参照されたい：Yu J, et al., "Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells," Science 318:1917-1920, 2007（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００２０】
本明細書で用いられるように、“間葉幹細胞”（MSC）は、骨格細胞系列（すなわち骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪細胞）に分化することができる細胞である。上記に特記したように、固有のMSCマーカーは未だ同定されていない。したがって、当業者に周知の形態学的及び機能的基準を用いてこれらの細胞を同定する。以下を参照されたい：Horwitz et al., supra; Dominici et al., 上掲書；Trivedi P & Hematti P, "Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells," Exp. Hematol. Jan. 5, 2008 [Epub ahead of print]；Trivedi P & Hematti P, "Simultaneous generation of CD34+ primitive hematopoietic cells and CD56+ mesenchymal stem cells from human embryonic stem cells cocultured with murine OP9 stromal cells," Exp. Hematol. 35:146-154, 2007；米国特許出願の米国公開公報No. 2006/0008902（前記文献の各々は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。本明細書に記載した方法によって作製されたMSCは表現型の基準にしたがって特徴付けることができる。MSCは、球形から卵形の核を有する特徴的な単核の卵形、星形又は紡錘形の形状によって認識することができる。伸長した卵形の核は、典型的にははっきりとした核小体並びに異質染色質及び真正染色質の混合物を有する。これらの細胞はほとんど細胞質をもたないが、核から伸長するように見える多くの細い突起を有する。MSCは典型的には以下のマーカー、CD106（VCAM）、CD73、CD146、CD166（ALCAM）、CD29、CD44及びアルカリ性ホスファターゼの1つ、2つ、3つ又は4つ以上について染色されるが、造血系列の細胞マーカー（例えばCD14又はCD45）及び内皮系列の細胞マーカー（例えばCD31及びVE-カドヘリン）については陰性であると考えられている。MSCはまたマーカーとしてSTRO-1を発現することができる。
【００２１】
本明細書で用いられるように、“メサンギウム芽細胞”はMSCとともに内皮細胞の先駆細胞である。
本明細書で用いられるように、“間葉コロニー”はメサンギウム芽細胞を起源とする間葉細胞を含むコロニーである。
本明細書で用いられるように、“血管芽細胞”は血管細胞とともに内皮細胞の前駆体である。
本明細書で用いられるように、“芽細胞コロニー”は血管芽細胞を起源とするもっぱら造血細胞を含むコロニーである。
本明細書で用いられるように、“中内胚葉（mesendoderm）”は中胚葉及び内胚葉を生じる組織である。
本明細書で用いられるように、“中胚葉”は、POU4F1、SOX1及びPAX6（神経冠）、LAMA3、KRT14及びKRT10（表面外胚葉）、CGA及びPLAC1（栄養外胚葉）、FOXA、FOXA2、APOA1、TMPRSS2、TTR1及びAFP（内胚葉）、並びにSOX2及びDPPA2（未分化hESC）よりもはるかに高レベルでKDR及びPDGFRaを発現する細胞サブセットである。
本明細書で用いられるように、“側板中胚葉”は、少なくともFOXF1及びHAND1を発現するが、MEOX1及びTCF15（沿軸中胚葉）、PAX2及びPAX8（中間中胚葉）の発現を欠き、更に少なくとも内皮系及び造血系に分化する能力を有する中胚葉のサブセットである。
マトリゲル(商標)、ラミニン、コラーゲン（特にコラーゲンI型)、フィブロネクチン及びグリコサミノグリカンはいずれも、細胞外マトリックスとして単独で又は多様な組合せで適切であり得る。
本発明は、以下の非限定的な実施例を熟考するとき更に完全に理解されるであろう。
【実施例１】
【００２２】
無血清条件下で万能性幹細胞からMSCを作製する
hESC（H1；WiCell, Madison, WI）は、無血清培養液（例えば、20％のノックアウト(商標)（KnockoutTM）血清代替物、2mMのL-グルタミン、1ｘ（100μM）非必須アミノ酸、100μMの2-メルカプトエタノール及び4ng/mlのbFGF（いずれもGibco-Invitrogen, Carlsbad, CA）を補充したDMEM/F12培養液）中で、放射線照射マウス胎児線維芽細胞上で維持された。以下を参照されたい：Amit M, et al., "Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture," Dev. Biol. 227:271-278, 2000（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。マウスOP9骨髄間質細胞（Dr. Toru Nakanoより寄贈、更にATCC（カタログ# CRL-2749）からも入手可能）は、20％ウシ胎児血清（FCS；HyClone， Logan, UT）を含むアルファMEM培養液（Gibco-Invitrogen）中でゼラチン被覆皿での4日間の継代培養によって維持された。
hESCは、以前に記載されたように、マウスOP9骨髄間質細胞との共同培養によって分化が誘導された（Vodyanik M, et al., "Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential," Blood 105:617-626, 2005（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。簡単に記せば、hESCの小さな凝集物を、10％FCS及び100μMのMTG（Sigma, St. Louis, MO）を補充したアルファMEM中のOP9細胞に加えた。培養の次の日（1日目）培養液を交換し、下記に示す日に培養を採集した。
hESC（H1）のOP9支質細胞との共同培養から2日目に、原条集団（中内胚葉）（GSC、EOMES、MIXL1及びT（BRACHYURY））及び初期中胚葉（EVX1、LHX1及びTBX6）のための転写因子のピーク発現がニムブレゲン(商標)（NimbleGen(商標)）（Madison, WI）マイクロアレイで検出された。
【００２３】
共同培養から3−5日目に、培養は、間葉先駆細胞を内胚葉及び中胚葉に特徴的な遺伝子を発現する細胞とともに含んでいた。中胚葉に特徴的な遺伝子の中では、側板中胚葉に特徴的な遺伝子のみ（例えばFOXF1、HAND1、NKX2-5及びGATA2）が一貫して発現された。対照的に、中軸中胚葉(CHRD、SHH)、沿軸中胚葉（MEOX1、TCF15）又は中間中胚葉（PAX2、PAX8）に特徴的な遺伝子は一貫しては発現されなかった。したがって、3−5日間OP9細胞と共同培養したhESCは、側板/胚体外中胚葉に特徴的な遺伝子を発現する細胞を生じた。hESC（H1）/OP9共同培養から3−5日目に、細胞はまた最大の細胞分裂によって特徴づけられ、更に上皮系−間葉転換（EMT、SNAI1、SNAI2）及び細胞の数量拡大（HOXB2、HOXB3）に必要な遺伝子の発現を維持した。
hESC（H1）/OP9共同培養から5−7日目に、特異的な中胚葉系列及び内胚葉系列への分化が観察され、このとき発達中の内胚葉系（AFP及びSERPINA1）、間葉（SOX9、RUNX2及びPPARG2）及び血管内皮系（CDH5及びGATA1）細胞のマーカーが検出された。筋肉誘導因子（MYOD1、MYF5及びMYF6）、神経外胚葉（SOX1、PAX6及びNEFL）又は栄養外胚葉（CGB及びPLAC）のマーカーはいずれも7日間の共同培養を通じて発現されず、OP9細胞は、中内胚葉経路へ方向付けられhESC分化のために有効な誘導環境を提供することを示した。
【００２４】
hESC（H1）/OP9共同培養から2日目に、37℃で15分間のコラゲナーゼIV（Gibco-Invitrogen）（DMEM/F12培養液で1mg/ml）及び37℃で10分間の0.05％トリプシン‐0.5mM EDTA（Gibco-Invitrogen）による連続的酵素処理によって、単一細胞懸濁物を共同培養から採集した。細胞をPBS‐5％FBSで3回洗浄し、70μm及び30μm細胞ろ過器（BD Labware, Bedford, MA）でろ過し、抗マウスCD29-PE（AbD Serotec, Raleigh, NC）及び抗PE常磁性モノクローナル抗体（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）で標識した。細胞懸濁物は磁石活性化細胞分類（MACS）により以下のように精製した：細胞懸濁物をMidi-MACS分離ユニット（Miltenyi Biotech）と結合させたLD磁気カラムに通し、OP9枯渇hESC-誘導細胞の陰性分画を得た。純度はパン抗ヒトTRA-1-85モノクローナル抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて立証した、
精製した単一細胞懸濁物を、10−20 ng/ml PDGF-BB（PeproTech）の存在下又は非存在下で半固形無血清培地に0.5−2ｘ104細胞/mlの濃度でプレートした。前記培地は、5−100ng/ml bFGF（PeproTech, Rocky Hill, NJ）及び1％メチルセルロース（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada）を補充したステムライン(商標)（StemLineTM）無血清培地（Sigma, St. Louis, MO）で構成されていた。PDGF-BBは間葉細胞の増殖を改善したが、コロニー形成については必須ではなかった。或いは、単一細胞懸濁物は以下を含む半固形コロニー形成無血清培地にプレートされた：40％ES-CultM3120メチルセルロース、25％無血清エクスパンション培地（SFEM, Stem Cell Technologies）、25％内皮無血清培地（E-SFM, Invotrogen）、10％BIT9500（Stem Cell Technologies）、グルタマックス（GlutaMAX、1：100に稀釈）、エクスサイト（Ex-Cyte, Millipore、1：1000に稀釈）、100μMモノチオグリセロール（MTG）、50μg/mlアスコルビン酸及び20ng/mlのbFGF。
【００２５】
10−20日培養した後、胚様体（EB）と類似する大きくてコンパクトな間葉コロニーが形成された。これらの間葉コロニーは7日目に検出されたが、10−20日の培養が活発に増殖するコロニーを提示するために必要であった。未分化のhESC又は共同培養から1日目もしくは6日目に採集した細胞は、同じ条件下で培養したときこれらの間葉コロニーを形成しなかった。
間葉コロニー（類胚様体に似る）は以下のいくつかの特徴によりEBとは区別された：（1）bFGFを補充した無血清条件下での形成及び増殖、並びに間葉細胞の増殖を促進する因子（例えばPDGF-BB、EGF及びTGF-α）により刺激されるが、間葉コロニーで中胚葉分化に必要な因子（例えばVEGF、TGF-β及びアクチビンA）によって抑制されること；（2）間葉コロニーでは長期間培養後でさえも、EBに特徴的な密集した外側細胞層及び不規則な空洞化構造を欠くこと；（3）間葉コロニーを構成する細胞では形態学的な均質性が提示されること；及び（4）コンパクトな回転楕円体に更に発達する密に詰まった構造物（コア）の樹立によるコロニー形成。
単一細胞懸濁物が半固形培地へのプレート時に凝集物を形成しなかったことを示すために、前記培養方法で得られた間葉コロニーのクローン性が、レトロウイルスによりレポーター遺伝子（例えば強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）又はヒストン2B-(H2BB)mOrange蛍光タンパク質）で目印を付けた細胞から樹立したキメラhESC株を用いて試験し確認された。レポーター遺伝子生成物の発現によってクローン性が示された。キメラhESC株は以下の2つのレンチウイルス構築物から作製された：（1）伸長因子1アルファ（EF1アルファ）プロモーターから構成的に発現されるEGFPタンパク質、及び（2）EF1アルファプロモーターから構成的に発現されるH2BB-mOrangeタンパク質。両構築物を293FT細胞にパッケージし、レンチウイルスによりH1 hESCを形質導入して、緑色のEGFPタンパク質又はオレンジ色のH2BB-mOrangeタンパク質のどちらかを発現する安定なH1 hESC株を作製した。記載の方法により誘導した間葉コロニーは単一コロニーは単色（緑色又はオレンジ色のどちらか）であり、したがってMSCはクローン起源（すなわち単一細胞）であることを示している。更にまた、予想表現型解析によって間葉コロニー形成細胞（CFC）頻度とKDR（VEGFR2）発現との間の正の相関性が示された。ただしもっとも初期の血管形成性前駆体のKDRhighCD34+集団は間葉CFCを欠いていた。間葉コロニー内の細胞の解析によって、CD90、CD140a及びCD166の高発現、CD44、CD56及びCD105の低発現、並びにCD24、CD31、CD43、CD45、CD144（VE-カドヘリン）の発現欠如及びSSEA4の発現欠如によって規定される初期間葉細胞の均質集団であることが示された。更にまた、間葉コロニーはビメンチン、アルファ平滑筋及びデスミンを発現した。更にまた、間葉コロニーはMSC系列に特異的な遺伝子、例えばFOXF1、MSX1、MSX2、SNAI1、SNAI2、SOX9及びRUNX2を発現した。
【００２６】
コラーゲン又はフィブロネクチンを被覆した96ウェルプレートのウェルに個々の間葉コロニーを移した。前記ウェルには、0.2ml/ウェルのステムライン(商標)無血清培地（5−100ng/ml bFGFを補充）又は50％のステムラインII無血清HSCエクスパンション培地（H-SFEM, Sigma）及び50％E-SFM（グルタマックス（1：100に稀釈）、エクスサイト（1：2000に稀釈）、100μMTG及び10ng/mlのbFGFを補充）から成る無血清エクスパンション培地で予め満たされていた。3−4日間培養した後、個々のウェルの粘着細胞をトリプシン処理によって採集し、5−100ng/ml bFGF補充ステムライン(商標)無血清培地又は無血清エクスパンション培地（M-SFEM）（50％のステムラインII（商標）無血清HSCエクスパンション培地（H-SFEM, Sigma）、50％E-SFM、グルタマックス(商標)（1/100稀釈）、エクスサイト(商標)（1/2000稀釈）、100μMTG及び5−100ng/mlのbFGFを含む）中でコラーゲン又はフィブロネクチン被覆皿にて数量を拡大させた。
多数回の継代のためにMSCの数量を拡大させた。個々のコロニーをコラーゲン又はフィブロネクチン被覆プレートにプレートしたとき、線維芽細胞に類似する細胞が即座に粘着し激しく増殖するのが観察された。その後の継代では、最初の10継代の間は細胞は激しく増殖したが、10−15継代で増殖速度は低下し、15−20継代では徐々に老化が観察された。単一MB-CFCに由来する培養は観察期間中に合計1022の細胞を蓄積させた。各コロニーは単一細胞を起源とすると考えられるので、前記の数は単一hESC由来間葉前駆体の数量拡大潜在能力と一致する。
個々のコロニーから樹立された細胞株はbFGF補充無血清培地で10−15継代の間高い分裂速度で維持された。全ての細胞株は、CD44、CD56、CD73、CD105、CD146及びCD140a（PDGFRA）の発現及び血管内皮系マーカー（すなわちCD31、CD43、CD45及びVE-カドヘリン）の欠如を特徴とする間葉表現型を示した。間葉分化潜在能力を出現させる条件下で試験したとき、前記細胞株は骨形成性、軟骨形成性及び脂肪形成性分化能力を示した。興味深いことに、これらの細胞は骨髄MSCに類似しているが、骨髄MSCよりも良好に数量を拡大し分裂する。これらの数量拡大間葉細胞は軟骨形成性細胞系列、骨形成性細胞系列及び脂肪形成性細胞系列に分化することができた。しかしながらこれらの細胞は、OP9細胞とともに培養したとき、又は血管内皮増殖因子（VEGF、bFGF、SCF、TPO、IL3、IL6）とともに無血清培養で培養したとき造血細胞又は内皮細胞を生じることはできず、これらの間葉細胞の限定分化潜在能力を示した。
間葉コロニーはまた種々の誘導万能性幹細胞（iPS）、例えばレンチウイルスベクターを用いて再プログラミングされたiPS(IMR90)-1、iPS(SK)-46及びiPS(FSK)-1（Yu et al., Science 318:1917-1920, 2007）、又はトランスジーンを含まないiPS-5 4-3-7T及びiPS-1 19-9-7T（Yu et al., Science 324:797-801, 2009）から作製された。トランスジーンを含むiPS細胞に由来する間葉コロニーは不規則でより構造の粗い形態を示す。トランスジーンを含まないiPSCは典型的な回転楕円体の間葉コロニーを生じた。
【実施例２】
【００２７】
メサンギウム芽細胞のin vitro作製と性状決定
造血系、内皮系及び間葉幹細胞の潜在能力を有する中胚葉系列の細胞を生じることができる中胚葉系先駆細胞集団を単離し性状を決定するために、実施例1に記載したようにH1 hES細胞をOP9細胞と共同培養した。2から3日間共同培養した後で、原条集団（中内胚葉）の代表的遺伝子（MIXL1、T、EOMES）が発現されたとき、抗マウスCD29抗体を用いてOP9細胞を枯渇させたhESC誘導細胞を、20ng/mlのbFGF（PeproTech, Rocky Hill, NJ）を含む半固形無血清培地（実質的に実施例1に記載したとおり）にプレートした。プレートしたH1由来TRA-1-85+細胞1000個当たりのコロニー形成細胞（CFC）数を計算した。
半固形培地で2−3日経過した後で、細胞は密に詰まった構造（コア）を形成した。OP9細胞との2日間の共同培養で分化したhESCに由来するコアは更に回転楕円体の間葉コロニーへと増殖した。OP9細胞との3日間の共同培養で分化したhESCに由来するコアは更に、造血系及び内皮系潜在能力を有する分散した芽細胞コロニーへと増殖した。
bFGFはhESCに由来する両方のコロニーの形成のために必要かつ十分である。bFGFは間葉コロニー及び芽細胞コロニーの両方の形成を支援した。対照的に、bFGFの非存在下では、VEGFもPDGF-BB（図1A）、SCF、IGF1又はHGF（データは示されていない）も、単独であっても組み合わされてあっても、どちらのコロニーの形成も支援しなかった。一方、PDGF-BB（10ng/ml）は単独ではコロニー形成を支援しなかったが、bFGFと組み合わせたPDGF-BBは間葉コロニーの収量及びサイズをbFGF単独と比較して顕著に増加させた（図1A）。VEGF（20ng/ml）は単独ではコロニー形成を支援しなかったが、bFGF培養に前記を添加したとき芽細胞コロニーの数はわずかに増加したが、ただし間葉コロニーの形成は抑制された（図1A）。各コロニータイプを生じた細胞は、全hESC由来細胞の約2−3％を構成した（図1B）。
【００２８】
間葉コロニー内の細胞が血液血管系列の細胞を生じることができるか否かを決定するために、個々の間葉コロニーを5−7日目にメチルセルロースから採取して、10% FBS並びにサイトカインSCF（50ng/ml）、TPO（50ng/ml）、IL-3（10ng/ml）及びIL-6（20ng/m）を含むアルファ-MEM培養液中でOP9細胞上にプレートした。4日間培養した後で細胞を採集し、フローサイトメトリーで解析するか、又はウサギ抗ヒトCD144（VE-カドヘリン；1μg、eBioscience, San Diego, CA）をマウス抗ヒトCD43（0.5μg/ｍl、BD Bioscience）もしくはマウス抗ヒトカルポニン（0.5μg/ml、Thermo Fisher Scientific）一次抗体と組み合わせて用い、続いて交差吸収した二次ロバ抗マウスIgG-DyLight594及びロバ抗ウサギIgG-DyLight488抗体（両抗体ともに2μg/ml、Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA）でin situ染色した。
間葉コロニーは、内皮系及び間葉細胞を生じる前駆体、すなわちメサンギウム芽細胞起源であった。実施例1で説明したように、粘着培養で間葉コロニーから数量拡大されたMSCは、OP9細胞と培養したとき造血細胞又は内皮細胞を生じなかった。対照的に、半固形培地中で5−7日目のコロニー形成培養から単離した間葉コロニーの約70％が、OP9細胞と培養したときCD31+CD144(VE-カドヘリン)+内皮細胞を生じた（図1D及びE、上段パネル）。したがって、間葉コロニーは、内皮系列及び間葉列の共通の前駆体、すなわちメサンギウム芽細胞起源であった。対照的に、芽細胞コロニーはCD31+CD43+造血細胞を含み、内皮細胞を生じることができた（図1D及びE、下段パネル）。
間葉コロニーの内皮系潜在能力は、コロニー形成アッセイの媒体への骨形態発生タンパク質4（BMP4）の添加により顕著に強化できた（BMP4非添加でCD31+CD43+細胞が3.2±2.4％に対して5ng/mlのBMP4で11.6±0.5％）。
【実施例３】
【００２９】
実質的に側板/胚体外中胚葉細胞に富む細胞集団の作製及び単離
OP9共同培養で分化させたH1 hESCの遺伝的プロファイリングは、外胚葉（栄養外胚葉、神経外胚葉又は表面外胚葉）が検出不能であることにより中胚葉及び内胚葉系列への選択的拘束を明らかにした（図2）。原条遺伝子（MIXL1、T及びEOMES）の同期発現が検出されたとき、細胞は培養2日目までに中内胚葉に拘束された。以降の培養で、中胚葉及び内胚葉特異的遺伝子が、更に最終的には二次性内胚葉及び中胚葉特異的遺伝子が発現された。中胚葉遺伝子のうちで、側板/胚体外中胚葉サブセットに特徴的なもの（FOXF1、HAND1、NKX2-5、GATA2）が一貫して発現されたが、中軸中胚葉（CHRD、SHH）、沿軸中胚葉（MEOX1、TCF15）又は中間中胚葉（PAX2、PAX8）サブセットの遺伝子の発現は一貫しなかった。アペリンレセプター（APLNR）の発現は強く誘導され、分化の2−3日目に中胚葉の拘束と同時にアップレギュレートされた。
APLNR発現及び前記を発現する細胞の特徴を決定するために、アペリンレセプター特異的モノクローナル抗体（R&D Systems）をCD30、KDR、PDGFRA、T及びFOXA2に対する抗体と組み合わせてOP9共同培養で分化させたhESCを染色した。未分化hESC及びOP9共同培養から1日目のhESC由来細胞はAPLNR陰性であった（図3A、Day1パネル）。APLNRの発現は、OP9細胞と2−3日間共同培養した細胞で強くアップレギュレートされた（図3A、Day2及びDay3）．2日目には、15−20％の細胞がAPLNR+で、3日目までに、60−70％の細胞がAPLNR+であった。このアップレギュレーションは中胚葉拘束と同時に生じ、このことは中胚葉マーカー、例えばKDR（VEGFR2）、T及びPDGFRAのアップレギュレーションによって立証された（図3A、Day2及びDay3）。APLNR+細胞数は日が経過するにつれ徐々に減少した（図3B）。逆にhESCマーカー（例えばCD30）は連続してダウンレギュレートした。
PDGFRAは共同培養2日目では低レベルでのみ発現されたが、APLNRは共同培養から2日目に早くも高濃度で発現され、APLNR陰性細胞からAPLNR陽性細胞の分離を可能にする。H1/OP9細胞の共同培養から2、2.5及び3日目に、APLNR+及びAPLNR-細胞を磁気による分類によって分離し、マイクロアレイ解析で遺伝子発現を解析した。
MIXL1、T及びEOMES（原条細胞（中内胚葉）の指標である）はいずれもAPLNR+細胞で発現されたが、神経冠/神経外胚葉と密接に関連する転写物（POU4F1、SOX1、SOX2、SOX3、SOX10）は検出できなかった（図4A及び4B）。予想されたように、APLNR+細胞ではTCF21中胚葉特異的転写物が豊富であったが、全内胚葉（FOXA2、APOA1）、限定内胚葉（FOXA1、TMPRSS2）及び内臓内胚葉（TTR、AFP）は、APLNR-細胞で見出された（図1A及びC）。
【００３０】
興味深いことに、APLNR+細胞は、側板/胚体外中胚葉に典型的なFOXF1、IRX3、BMP4、WNT5A、NKX2.5、HAND1及びHAND2を発現したが、胚の沿軸/筋原性中胚葉（MEOX1、TCF15、PAX3、PAX7）及び中間中胚葉（PAX2、PAX8）のマーカーは発現しなかった。このデータは、APLNR+細胞は、中内胚葉への発達を運命づけられた細胞の全集団ではなく、中胚葉、おそらくは側板/胚体外中胚葉を連想させるその亜集団の代表であることを示している（図3C及び図4）。
更に中胚葉の実体を確認するために、T（初期中胚葉のマーカー）及びFOXA2（内胚葉のマーカー）の発現についてAPLNR+細胞を解析した、図3Aに示すように、APLNR+細胞はT+であり、4日目に収束するまでT発現を維持する。対照的に、FOXA2+細胞（培養の全細胞の5％未満を含んでいた）はAPLNRを発現しなかった。したがって、APLNR+細胞は培養2−3日目ではT+FOXA2-中胚葉系前駆体である。
APLNR+細胞は中胚葉系前駆体であるという見解を更に支持するために、H1/OP9共同培養に中胚葉形成阻害物質SB431542（5μg/ml）又はDKK1（150μg/ml）を補充した。APLNR+細胞は、中胚葉形成阻害物質を加えた培養では検出できず（図3B）、APLNR+細胞は中胚葉系であることが確認された。更にまた、間葉コロニー及び芽細胞コロニー形成潜在能力は完全にAPLNR+細胞集団内でのみ見出され（図3D）、メサンギウム形成性間葉コロニー及び血管形成性芽細胞コロニーの両方がAPLNR+中胚葉系前駆体によって形成されることが更に確認された。
【実施例４】
【００３１】
APLNR+側板/胚体外中胚葉細胞の単離による無血清条件下でのhESC由来メサンギウム芽細胞の濃縮
間葉コロニーの起源を認定し、メサンギウム芽細胞に富む細胞集団を得るために、万能性幹細胞をOP9と2−3日間共同培養し、中胚葉形成を誘導した。マウス特異的CD29抗体によりOP9細胞を枯渇させた後で、APLNR+及びAPLNR-細胞を磁気分類により単離した。bFGF存在下の半固形培地でのコロニー形成アッセイによって、メサンギウム芽細胞及び血管芽細胞の潜在能力は完全にAPLNR+分画内に限られることが示された（図3D）。APLNR+分画内の約1から5％の細胞がメサンギウム芽細胞活性を有していた。
本発明を現在もっとも実践的で好ましい実施態様であると考えられるものと関連して述べてきた。しかしながら、本発明は例示的手段として提供されてきたのであって、開示の実施態様に限定することは意図されていない。したがって、本発明が、添付の特許請求の範囲に示される本発明の範囲内の全ての改変及び代替的取り合わせを包含しようとするものであることは当業者には理解されよう。
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ｃ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ａ−３】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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