(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
0005845486.tif 000012
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、炭素数４〜３０の一価の鎖式炭化水素基を示す。
Ｒ３は、水素、又は炭素数４〜３０のアルカノイル基を示す。
Ｙは一般式（２）：
【化２】
0005845486.tif 000013
（式中、
Ｘ３は、アラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を示す。
Ｘ４は、トレオニン残基、セリン残基、アルギニン残基、リシン残基、又はヒスチジン残基を示す。
Ｘ５は、プロリン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基を示す。
Ｘ６は、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、又はグルタミン酸残基を示す。
Ｘ７は、セリン残基、又はトレオニン残基を示す。
Ｘ８は、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、又はイソロイシン残基を示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端のアミノ基から一つの水素が除かれ且つＣ末端のカルボキシル基から一つの水酸基が除かれてなる二価の基を示す。］
で表されるリポペプチド。
【請求項２】
Ｙが一般式（３）：
【化３】
0005845486.tif 000014
［式中、
ｍは０〜３の整数を示す。
ｎは０〜１０の整数を示す。
ｐは０〜１０の整数を示す。
Ｘ１は、同一又は異なってアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を示す。
Ｘ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。
Ｘ９は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。］
で表される二価の基である、請求項１に記載のリポペプチド。
【請求項３】
Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって炭素数１２〜１８のアルキル基である、請求項１又は２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
ｍが０〜３の整数であり、ｎが０〜１０の整数であり、ｐが０〜１０の整数であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がトレオニン残基であり、Ｘ５がプロリン残基であり、Ｘ６がアスパラギン残基であり、Ｘ７がセリン残基であり、且つＸ８がフェニルアラニン残基である、請求項２又は３に記載のリポペプチド。
【請求項５】
ｍが０〜３の整数であり、ｎが０〜１０の整数であり、ｐが０〜１０の整数であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がアルギニン残基であり、Ｘ５がグルタミン酸残基であり、Ｘ６がアスパラギン酸残基であり、Ｘ７がトレオニン残基であり、且つＸ８がロイシン残基である、請求項２又は３に記載のリポペプチド。
【請求項６】
ｍ、ｎ、及びｐが０である、請求項４に記載のリポペプチド。
【請求項７】
ｍ、ｎ、及びｐが０である、請求項５に記載のリポペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のリポペプチドを含有する免疫活性化剤。
【請求項９】
請求項８に記載の免疫活性化剤及びがん抗原を含有する抗がんワクチン。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１つに記載のリポペプチドを含有する抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポペプチドに関する。さらには、該リポペプチドを含有する免疫活性化剤、抗がん剤、並びに抗がんワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に抗原を投与することにより、抗体産生や細胞傷害性T細胞を誘導し、がんや感染症の治療・予防を行うという例が知られている。この抗原投与により抗体および細胞傷害性T細胞を誘導させるために、免疫反応の起点となる樹状細胞を活性化するための免疫活性化剤が利用されている。この免疫活性化剤の作用により、免疫反応が活性化され、効率的に抗体産生および細胞傷害性T細胞が誘導される。【０００３】
免疫活性化剤の例としては、例えばCys-Arg-Gly-Asp-Serの配列を有するペプチドのN末端システイン残基がパルミチン酸２分子に修飾された構造を有するリポペプチドが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
しかしながら、一般に、免疫活性化剤は免疫反応を活性化するが故に、炎症反応（例えば免疫活性化剤の投与部位における皮膚炎症反応）をも引き起こすことが知られている。このような副作用は、患者のQOLの維持が求められている場合、例えば免疫活性化剤を抗がんワクチンに使用してがん治療を行う場合に特に問題となる。従って、副作用を引き起こさない免疫活性化剤の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cancer Science, July 2010, Vol.101, No.7, pp1596-1603, ‘Adjuvant engineering for cancer immunotherapy: Development of a synthetic TLR2 ligand with increased cell adhesion’
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より効率的に免疫反応を活性化できる新規化合物を提供することを目的とする。さらには、炎症反応などの副作用が少ない免疫活性化剤として有用な新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、特定のアミノ酸配列を有するリポペプチドが、免疫を効率的に活性化し、且つ抗がん効果を発揮しながらも、炎症反応などの副作用を生じさせないことを見出した。さらに、驚くべきことに、上記リポペプチドは、がん細胞抗原と共に投与しなくとも、単独で抗がん効果を発揮することを見出した。本発明は、かかる知見に基づきさらに鋭意研究することにより完成された。【０００８】
即ち、本発明は、下記の構成を有する発明を包含する。【０００９】
項１．
一般式（１）：【００１０】
【化１】
0005845486.tif 000002
【００１１】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、炭素数４〜３０の一価の鎖式炭化水素基を示す。
Ｒ３は、水素、又は炭素数４〜３０のアルカノイル基を示す。
Ｙは一般式（２）：【００１２】
【化２】
0005845486.tif 000003
【００１３】
（式中、
Ｘ３は、アラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を示す。
Ｘ４は、トレオニン残基、セリン残基、アルギニン残基、リシン残基、又はヒスチジン残基を示す。
Ｘ５は、プロリン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基を示す。
Ｘ６は、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、又はグルタミン酸残基を示す。
Ｘ７は、セリン残基、又はトレオニン残基を示す。
Ｘ８は、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、又はイソロイシン残基を示す。）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端のアミノ基から一つの水素が除かれ且つＣ末端のカルボキシル基から一つの水酸基が除かれてなる二価の基を示す。］
で表されるリポペプチド。【００１４】
項２．
Ｙが一般式（３）：【００１５】
【化３】
0005845486.tif 000004
【００１６】
［式中、
ｍは０〜３の整数を示す。
ｎは０〜１０の整数を示す。
ｐは０〜１０の整数を示す。
Ｘ１は、同一又は異なってアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を示す。
Ｘ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。
Ｘ９は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。］
で表される二価の基である、項１に記載のリポペプチド。【００１７】
項３．
Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって炭素数１２〜１８のアルキル基である、項１又は２に記載のリポペプチド。【００１８】
項４．
ｍが０〜３の整数であり、ｎが０〜１０の整数であり、ｐが０〜１０の整数であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がトレオニン残基であり、Ｘ５がプロリン残基であり、Ｘ６がアスパラギン残基であり、Ｘ７がセリン残基であり、且つＸ８がフェニルアラニン残基である、項２又は３に記載のリポペプチド。【００１９】
項５．
ｍが０〜３の整数であり、ｎが０〜１０の整数であり、ｐが０〜１０の整数であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がアルギニン残基であり、Ｘ５がグルタミン酸残基であり、Ｘ６がアスパラギン酸残基であり、Ｘ７がトレオニン残基であり、且つＸ８がロイシン残基である、項２又は３に記載のリポペプチド。【００２０】
項６．
ｍ、ｎ、及びｐが０である、項４に記載のリポペプチド。【００２１】
項７．
ｍ、ｎ、及びｐが０である、項５に記載のリポペプチド。【００２２】
項８．
項１〜７のいずれか１つに記載のリポペプチドを含有する免疫活性化剤。【００２３】
項９．
項８に記載の免疫活性化剤及びがん抗原を含有する抗がんワクチン。【００２４】
項１０．
項１〜７のいずれか１つに記載のリポペプチドを含有する抗がん剤。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、より効率的に免疫反応を活性化できる新規リポペプチドを提供することができる。このリポペプチドは、免疫反応を効率的に活性化し、且つ抗がん効果を発揮しながらも、炎症反応などの副作用を生じさせないため、免疫活性化剤や抗がんワクチン中の抗がんアジュバントの有効成分として有用である。さらに、本発明のリポペプチドは単独でも抗がん効果を発揮することから、抗がん剤の有効成分としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施例１の質量分析データを示す。
【図２】実施例２の質量分析データを示す。
【図３】比較例１の質量分析データを示す。
【図４】比較例２の質量分析データを示す。
【図５】E.G7-OVA細胞可溶化物との混合投与の場合におけるリポペプチドの抗がん効果を評価した結果を示す。
【図６】E.G7-OVA細胞可溶化物との混合投与の場合におけるリポペプチドの抗がん効果と、リポペプチド単独の抗がん効果を評価した結果を示す。
【図７】OVA蛋白のペプチド断片との混合投与の場合におけるリポペプチドの抗がん効果を評価した結果を示す。
【図８】担がんマウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性を評価した結果を示す。
【図９】正常マウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性を評価した結果を示す。
【図１０】WT1ペプチドとの混合投与の場合におけるリポペプチドの抗がん効果を評価した結果を示す。
【図１１】正常マウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性を、リポペプチドの濃度を変えて評価した結果を示す。
【図１２】FITC-h11cの質量分析結果を示す。
【図１３】FITC-SK4の質量分析結果を示す。
【図１４】投与されたリポペプチドの動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
１．定義
本明細書において、アミノ酸は、Ｌ体、Ｄ体、又はＤＬ体のいずれであってもよいが、好ましくはＬ体である。また、アミノ酸残基とは、アミノ酸のα炭素に結合しているカルボキシル基から一つの水酸基を除き、且つ該α炭素に結合しているアミノ基から一つの水素を除いて得られる２価の基を示す。表記されるアミノ酸残基は、定法に従って、α炭素に結合しているアミノ基から一つの水素が除かれた基が左側に配置され、α炭素に結合しているカルボキシル基から一つの水酸基が除かれた基が右側に配置されるように記載される。
【００２８】
２．リポペプチド
本発明のリポペプチドは、一般式（１）：
【００２９】
【化４】
0005845486.tif 000005
【００３０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＹは前記に同じである。］
で表されるリポペプチドである。
【００３１】
Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、炭素数４〜３０の一価の鎖式炭化水素基である。Ｒ１で示される基の炭素数としては、好ましくは８〜２６が挙げられ、より好ましくは１０〜２２が挙げられ、さらに好ましくは１２〜１８が挙げられ、よりさらに好ましくは１４〜１６が挙げられる。一価の鎖式炭化水素基としては、例えば直鎖状若しくは分枝状のアルキル基、又は直鎖状若しくは分枝状のアルケニル基が挙げられ、好ましくは直鎖状のアルキル基又は直鎖状のアルケニルが挙げられ、より好ましくは直鎖状のアルキル基が挙げられる。Ｒ１の具体例としては、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、エイコシル基、ヘンイコシル基、ヘンエイコシル基、又はドコシル基等が挙げられ、好ましくはドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、又はオクタデシル基が挙げられ、より好ましくはテトラデシル基、ペンタデシル基、又はヘキサデシル基が挙げられる。
【００３２】
Ｒ３は、水素又は炭素数４〜３０のアルカノイル基である。アルカノイル基とは、飽和カルボン酸から水酸基を除いてなる基（「飽和アルカノイル基」と示す）、又は不飽和カルボン酸から水酸基を除いてなる基（「不飽和アルカノイル基」と示す）を意味する。アルカノイル基の炭素数としては、好ましくは９〜２７が挙げられ、より好ましくは１１〜２３が挙げられ、さらに好ましくは１３〜１９が挙げられ、よりさらに好ましくは１５〜１７が挙げられる。アルカノイル基としては、例えば直鎖状若しくは分枝状の飽和アルカノイル基、又は直鎖状若しくは分枝状の不飽和アルカノイル基が挙げられ、好ましくは直鎖状の飽和アルカノイル基又は直鎖状の不飽和アルカノイル基が挙げられ、より好ましくは直鎖状の飽和アルカノイル基が挙げられる。Ｒ３の具体例としては、水素、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、エイコサノイル基、ヘンイコサノイル基、ヘンエイコサノイル基、ドコサノイル基、又はトリコサノイル基等が挙げられ、好ましくは水素、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、又はノナデカノイル基が挙げられ、より好ましくは水素、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、又はヘプタデカノイル基が挙げられ、さらにより好ましくは水素が挙げられる。
【００３３】
Ｙは一般式（２）：
【００３４】
【化５】
0005845486.tif 000006
【００３５】
（式中、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、及びＸ８は前記に同じである。）
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドのＮ末端のアミノ基から一つの水素が除かれ且つＣ末端のカルボキシル基から一つの水酸基が除かれてなる二価の基を示す。
【００３６】
一般式（２）において、さらには後述の一般式（３）において、Gluはグルタミン酸残基を示し、Aspはアスパラギン酸残基を示し、Glyはグリシン残基を示し、Argはアルギニン残基を示し、Serはセリン残基を示す。
【００３７】
Ｘ３は、アラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基である。Ｘ３としては、好ましくはアラニン残基又はグリシン残基が挙げられ、より好ましくはアラニン残基が挙げられる。
【００３８】
Ｘ４は、トレオニン残基、セリン残基、アルギニン残基、リシン残基、又はヒスチジン残基である。Ｘ４として、好ましくはトレオニン残基、又はアルギニン残基が挙げられる。
【００３９】
Ｘ５は、プロリン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、グルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基である。Ｘ５として、好ましくはプロリン残基、又はグルタミン酸残基が挙げられる。
【００４０】
Ｘ６は、アスパラギン残基、グルタミン残基、アスパラギン酸残基、又はグルタミン酸残基である。Ｘ６として、好ましくはアスパラギン残基、又はアスパラギン酸残基が挙げられる。
【００４１】
Ｘ７は、セリン残基、又はトレオニン残基である。
【００４２】
Ｘ８は、フェニルアラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、ロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、又はイソロイシン残基である。Ｘ８として、好ましくはフェニルアラニン残基、又はロイシン残基が挙げられる。
【００４３】
一般式（２）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドとは、一般式（２）で表されるアミノ酸配列を有している限り特に限定されず、一般式（２）で表されるアミノ酸配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に任意のアミノ酸配列が付加されたペプチドを示す。
【００４４】
Ｙとして、好ましくは一般式（３）：
【００４５】
【化６】
0005845486.tif 000007
【００４６】
［式中、ｍ、ｎ、ｐ、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ９は前記に同じである。］
で表される二価の基が挙げられる。
【００４７】
ｍは、０〜３の整数である。ｍとしては、好ましくは０〜２の整数が挙げられ、より好ましくは０又は１が挙げられ、さらに好ましくは０が挙げられる。
【００４８】
ｎは、０〜１０の整数である。ｎとしては、好ましくは０〜５の整数が挙げられ、より好ましくは０〜３の整数が挙げられ、さらに好ましくは０又は１が挙げられ、よりさらに好ましくは０が挙げられる。
【００４９】
ｐは、０〜１０の整数である。ｐとしては、好ましくは０〜５の整数が挙げられ、より好ましくは０〜３の整数が挙げられ、さらに好ましくは０又は１が挙げられ、よりさらに好ましくは０が挙げられる。
【００５０】
Ｘ１は、同一又は異なってアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基を示す。
【００５１】
Ｘ２は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。任意のアミノ酸残基としては、特に限定されず、例えば公知のαアミノ酸残基、具体的にはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、システイン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、リシン残基、又はアルギニン残基等が挙げられる。Ｘ２として、好ましくはアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基が挙げられる。
【００５２】
Ｘ９は、同一又は異なって任意のアミノ酸残基を示す。任意のアミノ酸としては、特に限定されず、例えば公知のαアミノ酸残基、具体的にはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、メチオニン残基、システイン残基、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、ヒスチジン残基、リシン残基、又はアルギニン残基等が挙げられる。
【００５３】
Ｙに結合している一般式（１）中の基である、式（４）：
【００５４】
【化７】
0005845486.tif 000008
【００５５】
で表される基に、ペプチドのアミノ末端が結合したリポペプチドを有効成分とする免疫活性化剤が各種報告されている。これら既報のリポペプチドにおいては、式（４）で表される基に直接結合するアミノ酸残基（一般式（１）で表されるリポペプチド中のＸ１（ｍが１〜３の整数の場合）、Ｘ２（ｍが０であり且つｎが１〜１０の整数の場合）、又はＸ３（ｍ及びｎが０の場合）に相当）としては、分子量の小さいアミノ酸が好ましい旨が報告されている。このような報告が記載された文献としては、例えば、文献１（Immunity, Vol 21, December 18, 2009, pp873-884, ‘Recognition of Lipopeptide Patterns by Toll-like Receptor 2-Toll-like Receptor 6 Heterodimer’）がある。従って、一般式（１）中、式（４）で表される基と直接結合するアミノ酸残基（Ｘ１（ｍが１〜３の整数の場合）、Ｘ２（ｍが０であり且つｎが１〜１０の整数の場合）、又はＸ３（ｍ及びｎが０の場合））としてアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基のような分子量の小さいアミノ酸残基を用いても、本発明所望の効果に影響はないと予想される。
【００５６】
また、式（４）にペプチドのアミノ末端が結合したリポペプチドを報告している文献には、Ｒ３に相当する部位が水素であっても、或いはアルカノイル基であっても、同様の活性を示すことが報告されている。このような文献としては、例えば、文献２（Journal of Biological Chemistry, Vol 280, Number 44, November 4, 2005, pp36616-36625）、文献３（Cell 130, September 21, 2007, pp1071-1082）、及び文献４（Journal of Leukocyte Biology, Vol 83, March 2008, pp692-701）が挙げられる。
【００５７】
さらに、式（４）で表される基にＹとは異なるペプチド（Ser-Lys-Lys-Lys）が結合したリポペプチドが報告されている文献（文献５：Eur. J. Immunol. 2005. 35: 282-289）には、該アミノ酸配列が含まれている限り、該アミノ酸配列に他のアミノ酸配列が付加されていても、同様の活性を示すことが示されている。したがって、本願においても、一般式（２）で表されるアミノ酸配列を含む限り、一般式（２）で表されるアミノ酸配列に任意のアミノ酸が付加されていても、同様の活性を示すことが予想される。
【００５８】
本発明のリポペプチドの一つの態様としては、好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１０〜２２の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１０〜２２の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が水素又は炭素数１０〜２２の直鎖状の飽和アルカノイル基であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０又は１であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ１がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ３がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ４がトレオニン残基、又はセリン残基であり、Ｘ５がプロリン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基であり、Ｘ６がアスパラギン残基、又はグルタミン残基であり、Ｘ７がセリン残基、又はトレオニン残基であり、且つＸ８がフェニルアラニン残基、チロシン残基、又はトリプトファン残基であるリポペプチドが挙げられ、
より好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１２〜１８の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１２〜１８の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が水素であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ３がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ４がトレオニン残基、又はセリン残基であり、Ｘ５がプロリン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はイソロイシン残基であり、Ｘ６がアスパラギン残基、又はグルタミン残基であり、Ｘ７がセリン残基、又はトレオニン残基であり、且つＸ８がフェニルアラニン残基、チロシン残基、又はトリプトファン残基であるリポペプチドが挙げられ、
さらに好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１４〜１６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１４〜１６の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が水素であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がトレオニン残基であり、Ｘ５がプロリン残基であり、Ｘ６がアスパラギン残基であり、Ｘ７がセリン残基であり、且つＸ８がフェニルアラニン残基であるリポペプチドが挙げられる。
【００５９】
本発明のリポペプチドの別の一つの態様としては、好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１０〜２２の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１０〜２２の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が水素又は炭素数１０〜２２の直鎖状の飽和アルカノイル基であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０又は１であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ１がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ３がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ４がアルギニン残基、リシン残基、又はヒスチジン残基であり、Ｘ５がグルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基であり、Ｘ６がアスパラギン酸残基、又はグルタミン酸残基であり、Ｘ７がトレオニン残基、又はセリン残基であり、且つＸ８がロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、又はイソロイシン残基であるリポペプチドが挙げられ、
より好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１２〜１８の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ２が炭素数１２〜１８の直鎖状のアルキル基であり、Ｒ３が水素であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ３がアラニン残基、グリシン残基、又はセリン残基であり、Ｘ４がアルギニン残基、リシン残基、又はヒスチジン残基であり、Ｘ５がグルタミン酸残基、又はアスパラギン酸残基であり、Ｘ６がアスパラギン酸残基、又はグルタミン酸残基であり、Ｘ７がトレオニン残基、又はセリン残基であり、且つＸ８がロイシン残基、アラニン残基、バリン残基、プロリン残基、又はイソロイシン残基であるリポペプチドが挙げられ、
さらに好ましくは、一般式（１）においてＲ１が炭素数１４〜１６の直鎖状のアルキル基、Ｒ２が炭素数１４〜１６の直鎖状のアルキル基、Ｒ３が水素であり、Ｙが一般式（３）で表される二価の基であり、ｍが０であり、ｎが０であり、ｐが０であり、Ｘ３がアラニン残基であり、Ｘ４がアルギニン残基であり、Ｘ５がグルタミン酸残基であり、Ｘ６がアスパラギン酸残基であり、Ｘ７がトレオニン残基であり、且つＸ８がロイシン残基であるリポペプチドが挙げられる。
【００６０】
本発明のリポペプチドは、公知の合成方法により合成することができる。例えば、一般式（５）：
【００６１】
【化８】
0005845486.tif 000009
【００６２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は前記に同じである。］
で表される化合物と、固相合成法（例えばＦｍｏｃ合成法）により合成した所望の配列を有するペプチドを、カップリング試薬を用いて反応させた後、必要に応じて保護基の脱保護処理を行うことにより得ることができる。なお、一般式（５）中、Ｒ３が水素である場合は、該水素を含むアミノ基を、公知の保護基（Ｆｍｏｃ基等）で保護したものを、一般式（５）で表される化合物の代わりに用いることが好ましい。また、本発明のリポペプチドは、簡便には、合成受託サービスにより得ることができる。
【００６３】
本発明のリポペプチドは、公知の方法に従って標識されていてもよい。標識されていることにより、リポペプチド投与後の生体内における挙動を可視化することができる。この可視化により、例えば、投与部位のリポペプチドが適切にリンパ節等に移行しているか否かを確認することができる。標識としては、公知の標識であれば特に限定されない。標識としては、例えばFluorescein isothiocyanate（FITC）、Rhodamine、及びCy5等の蛍光標識、ビオチン標識、並びにペルオキシダーゼ標識等が挙げられる。
【００６４】
３．リポペプチドの用途
本発明のリポペプチドは、免疫反応を効率的に活性化できることから、免疫活性化剤の有効成分として有用である。また、がん抗原との混合物が優れた抗がん効果を発揮できることから、本発明のリポペプチドは、抗がんワクチン中の抗がんアジュバントとしても有用である。さらに、本発明のリポペプチドは、単独でも抗がん効果を発揮できることから、抗がん剤の有効成分としても有用である。以下にこれらの用途について説明する。
【００６５】
３−１．免疫活性化剤、抗がんアジュバント、及び抗がんワクチン
本発明によれば、一般式（１）で表されるリポペプチドを含有する免疫活性化剤、抗がんアジュバントを提供することができる。さらに、本発明によれば、前記免疫活性化剤及びがん抗原を含有する抗がんワクチンを提供することができる。
【００６６】
本発明において、免疫活性化剤とは、免疫反応（より具体的には樹状細胞）を活性化できる試薬又は製剤を意味する。従って、本発明の免疫活性化剤は、抗原と混合し、ヒト又は動物の生体内に投与することにより、免疫反応を効率的に活性化し、該抗原に対する抗体及び／又は該抗原に対する細胞傷害性リンパ球を効率的に誘導させることができる。また、生体から採取した免疫細胞（例えば樹状細胞）を本発明の免疫活性化剤と（必要に応じて抗原と共に）接触させることにより処理し、該処理細胞を生体に再度戻す方法（いわゆる免疫細胞療法）、生体内における免疫反応を効率的に活性化できる。
【００６７】
本発明の免疫活性化剤は、一般式（１）で表されるリポペプチドの免疫反応活性化効果を妨げない限り、他の成分を含んでいてもよい。かかる他の成分としては、例えば、結合剤、着色剤、乾燥剤、防腐剤、湿潤剤、安定剤、賦形剤、接着剤、可塑剤、粘着付与剤、増粘剤、パッチ材料、軟膏基材、角質除去剤、塩基性物質、吸収促進剤、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール、界面活性剤、水、緩衝剤等が挙げられるが、好ましくは緩衝剤、軟膏基材、脂肪酸、防腐剤、塩基性物質または界面活性剤である。
【００６８】
本発明の免疫活性化剤は、一般式（１）で表されるリポペプチド及び上述のような各種成分を適宜混合することにより製造される。混合方法としては、例えば手振り、機械的振盪超音波分散、ホモミキサーによる分散、自己乳化、膜乳化、Ｄ相乳化法、真空乳化、超高圧乳化法などが挙げられる。
【００６９】
本発明の免疫活性化剤における一般式（１）で表されるリポペプチドの濃度としては、生体内の免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、適宜決定されてもよく、例えば０．１ｍＭ〜１Ｍ、より好ましくは１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲内の濃度が挙げられる。
【００７０】
前述したように、本発明の免疫活性化剤は、抗原と混合し、ヒト又は動物の生体内に投与することにより免疫反応を効率的に活性化し、該抗原に対する抗体及び／又は該抗原に対する細胞傷害性リンパ球を効率的に誘導させることができる。
【００７１】
抗原と混合する免疫活性化剤の量は、免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、例えば、一回の投与における投与対象重量１ｋｇ当り、例えば０．１ｎｍｏｌ〜１００μｍｏｌ、好ましくは１０ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌの一般式（１）で表されるリポペプチドが含まれるように含有させればよい。
【００７２】
抗原としては、免疫反応を効率的に活性化し、該抗原に対する抗体及び／又は該抗原に対する細胞傷害性リンパ球を効率的に誘導させることができる限り特に限定されない。抗原としては、例えばがん抗原、タンパク質（糖タンパク質、リポ蛋白質等）、ペプチド、炭水化物（多糖類等）、脂質（糖脂質等）、核酸（オリゴヌクレオチド、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ等）、細胞可溶化物、又はウィルス可溶化物等を挙げることができる。
【００７３】
抗原としては、好ましくはがん抗原が挙げられる。本発明の免疫活性化剤は、がん抗原と混合するための用途、すなわち抗がんアジュバントとして用いるのが好ましい。さらには、本発明の免疫活性化剤は、がん抗原と混合した状態、すなわち抗がんワクチンとして用いるのが好ましい。がん抗原としては、がん細胞特異的抗原を含むものであれば特に限定されず、例えばがん細胞可溶化物、がん抗原タンパク質、又はがん抗原ペプチド等が挙げられる。がん細胞可溶化物は、例えば、がん細胞を凍結融解させることにより調製することができる。がん抗原タンパク質としては、具体的にはMAGE-A3、NY-ESO-1、又はWT1等の公知のがん抗原タンパク質を用いることができる。がん抗原ペプチドとしては、前記がん抗原タンパク質中の、がん抗原になり得るアミノ酸配列として公知の配列からなるペプチドが挙げられる。
【００７４】
免疫活性化剤と混合する抗原の量は、抗体を産生させることができる限り特に限定されず、例えば、抗原としてがん細胞可溶化物を用いる場合は、一回の投与における投与対象重量１ｋｇ当り、１×１０４〜１×１０１０個のがん細胞から調製されたがん細胞可溶化物を含有させればよい。
【００７５】
免疫活性化剤と抗原の混合物（例えば抗がんワクチン）として使用する場合は、さらに薬学的に許容可能な担体をさらに含ませてもよく、さらに製剤技術分野の公知の手法により、例えば、液剤、懸濁剤、軟膏、粉末、ローション剤、Ｗ／Ｏエマルジョン、Ｏ／Ｗ型エマルジョン、乳剤、クリーム剤、パップ剤、貼付剤、ゲル等の形態に調製し、好ましくは医薬として用いられる。
【００７６】
免疫活性化剤と抗原の混合物の投与方法は、生体内の免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、公知の方法、例えば注射剤に調製して皮下又は皮内に注射するという投与方法を採用できる。
【００７７】
また、前述したように、生体から採取した免疫細胞（例えば樹状細胞）を本発明の免疫活性化剤と（必要に応じて抗原と共に）接触させることにより処理し、該処理細胞を生体に再度戻すことにより、生体内における免疫反応を効率的に活性化できる。
【００７８】
接触の態様は、免疫細胞の免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、例えば採取された免疫細胞を培養している培地に、免疫活性化剤を添加すればよい。また、この態様において、培地中の免疫活性化剤の濃度は、免疫細胞の免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、例えば０．１〜１００００ｎＭ、好ましくは１〜１０００ｎＭ、より好ましくは１０〜１００ｎＭの濃度を採用すればよい。
【００７９】
処理細胞を生体に戻す方法は、公知の方法、例えば処理細胞を注射により皮下、静脈内、又は腫瘍内に投与することにより行うことができる。生体に戻す細胞数は、生体内における免疫反応を活性化できる限り特に限定されず、例えば、投与対象重量１ｋｇ当り、１×１０６〜１×１０９個の細胞数を採用すればよい。
【００８０】
本発明の免疫活性化剤は、免疫反応を効率的に活性化することができる。また、本発明の抗がんアジュバントは、免疫反応を効率的に活性化することができる為、がん抗原と混合して投与することにより、優れた抗がん効果を発揮することができる。さらに、本発明の抗がんワクチンは、優れた抗がん効果を発揮することができる。本発明の免疫活性化剤、抗がんアジュバント、及び抗がんワクチンは、皮膚炎症などの副作用を引き起こすことなく、上記効果を達成できる点で特に優れている。
【００８１】
３−２．抗がん剤
本発明によれば、一般式（１）で表されるリポペプチドを含有する抗がん剤を提供することができる。
【００８２】
本発明の抗がん剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００８３】
経口投与用には、一般式（１）で表されるリポペプチドを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００８４】
非経口投与用には、一般式（１）で表されるリポペプチドを、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、一般式（１）で表されるリポペプチドを粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、一般式（１）で表されるリポペプチドを粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、一般式（１）で表されるリポペプチドをカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の抗がん剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００８５】
一般式（１）で表されるリポペプチドの、抗がん剤中の濃度としては、生体内の免疫反応を活性化できる限り特に限定されないが、例えば０．０００１ｍＭ〜１００ｍＭ、より好ましくは０．０１ｍＭ〜１ｍＭの範囲内の濃度が挙げられる。
【００８６】
抗がん剤の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば一般式（１）で表されるリポペプチドの分子量換算で、一回の投与における投与対象重量１ｋｇ当り、例えば０．１ｎｍｏｌ〜１００μｍｏｌ、好ましくは１０ｎｍｏｌ〜１μｍｏｌになるような投与量が挙げられる。
【００８７】
本発明の抗がん剤は、通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、皮内注、静注、筋注、腹腔内注、局所注など）、経皮、経粘膜、経鼻、又は経肺などで投与され好ましくは皮下注で投与される。
【実施例】
【００８８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００８９】
（１）リポペプチドの製造
表１に記載の実施例１、実施例２、比較例１、及び比較例２にかかるリポペプチドを、バイオロジカ社を通じてBiosynthesis社に合成を依頼した。具体的には、以下の通りである。ペプチド部分はFmoc（Fluorenyl-MethOxy-Carbonyl）合成法（固相合成法）により作製した。Fmoc-Cys((RS)-2,3-di(palmitoyloxy)-propyl)-OHはBachem社（米国）より購入した。Fmoc-Cys((RS)-2,3-di(palmitoyloxy)-propyl)-OHと各ペプチドは一般的なカップリング試薬を用いて一晩反応させた後、保護基の脱保護処理を行い、HPLCで精製した。【００９０】
【表１】
0005845486.tif 000010
【００９１】
（１−１）実施例１
得られたリポペプチドを質量分析器（MALDI-TOF）で解析した結果、表１の実施例１に示されるリポペプチドの合成が確認できた。実施例１の質量分析結果を図１に示す。【００９２】
（１−２）実施例２及び比較例１〜２
実施例１に準じた方法で製造した。得られたリポペプチドを質量分析器で解析した結果、表１の実施例２に示されるリポペプチド、比較例１に示されるリポペプチド、及び比較例２に示されるリポペプチドの合成が確認できた。実施例２の質量分析結果を図２に、比較例１の質量分析結果を図３に、比較例２の質量分析結果を図４に示す。【００９３】
（２）リポペプチドの性質の評価
得られたリポペプチドの抗がん効果（試験例１）、及び皮膚刺激性（試験例２及び３）を評価した。【００９４】
（２−１）材料の調製
（ａ）リポペプチド：
実施例１〜２及び比較例１〜２に係るリポペプチドそれぞれを、ジメチルスルフォキシドで10 mMになるように溶解し、これを原液として用いた。【００９５】
（ｂ）細胞可溶化物：
E.G7-OVA細胞（ATCC:CRL-2113）を培養液（10%FCS、400μg/mL G418、2mM L-glutamine、55μM 2-mercaptoethanol、10mM HEPES、1mM sodium pyruvate、100U/mL penicillin G、及び100μg/mL streptomycinを含有するRPMI1640培地）中で培養した。培養後の細胞を回収し、PBS（0.15M NaCl, 10mMリン酸ナトリウム，pH7.4 ）で洗浄した。洗浄後の細胞をPBSで108 cell/mLになるように希釈し、該細胞希釈液の凍結融解を3回繰り返した。3回目の凍結融解後の融解液を遠心分離（10000xgで10分間）し、上清を細胞可溶化物として用いた。【００９６】
（ｃ）Ovalbumin（OVA）ペプチド：
OVAペプチド（Biosynthesis社により合成）（配列：Ser-Ile-Ile-Asn-Phe-Glu-Lys-Leu）をジメチルスルフォキシドで10 mMになるように溶解し、これを原液として用いた。【００９７】
（ｄ）WT1ペプチド：
WT1ペプチド（Biosynthesis社により合成）（配列：Arg-Met-Phe-Pro-Asn-Ala-Pro-Tyr-Leu）をジメチルスルフォキシドで10 mMになるように溶解し、これを原液として用いた。【００９８】
（ｅ）投与液：
表２に記載の各種投与液（実施例３〜９及び比較例３〜１０）を調製した。成分１として、上記（ａ）で調製した原液を1μl（10 nmol）用いた。成分２として、細胞可溶化物は上記（ｂ）で調製した細胞可溶化物を2μl（2×105 cells相当）用い、OVAペプチドは上記（ｃ）で調製した原液を1μl（10 nmol）用い、WT1ペプチドは上記（ｄ）で調製した原液を1μl（10 nmol）用いた。成分１、成分２、又は成分１及び成分２に、PBSを加えて、計30μlの投与液を調製した。【００９９】
【表２】
0005845486.tif 000011
【０１００】
（２−２）試験例１：リポペプチドの抗がん効果１
C57BL6マウス雌8-10週齢（日本クレア株式会社より購入）の背部をバリカンで毛刈りし、E.G7-OVA細胞（OVA遺伝子の導入によりOVA蛋白を発現するがん細胞株）を2x106 cell/200μL PBS/匹でマウス背部皮下に移植した。移植 10日目よりノギスで腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積は長径(cm) x 短径(cm) x 短径(cm) x0.4として算出した。12-14日目までに腫瘍体積の平均値と標準偏差が整うように群分けを行った。上記（２−１）で調製した投与液（以下単に「投与液」と示す）の投与は翌日から開始し、移植13-20日目の間に計3回の治療（2、3日間隔）を行いながら、腫瘍体積を継続的に測定した。投与液は腫瘍周辺（1回目：右側、2回目：左側、3回目：尾側）の皮内に投与した。21-23日目を目安に評価を終了し、マウスを安楽死処分した。【０１０１】
結果を図５〜７に示す。図５〜７中、各マウスの群分け日の体積を100%として、以降の体積（%）を求め、平均値と標準誤差を示した。【０１０２】
図５より、E.G7-OVA細胞可溶化物と混合投与の場合において、m11c（実施例２）は既知のSK4（比較例１）またはRGDS（比較例２）と同等の抗がん効果を発揮することが示された。【０１０３】
図６より、E.G7-OVA細胞可溶化物と混合投与の場合において、h11c（実施例１）は既知のSK4（比較例１）と同等の抗がん効果を発揮することが示された。また、h11c（実施例１）は、E.G7-OVA細胞可溶化物と混合せずとも、単独で十分な抗がん効果を発揮することが示された。【０１０４】
図７より、E.G7-OVA細胞可溶化物中に含まれるOVA蛋白のペプチド断片との混合投与の場合においても、h11c（実施例１）及びm11c（実施例２）は、E.G7-OVA細胞可溶化物と混合投与した場合と同様に、抗がん効果を発揮することが示された。さらに、その抗がん効果は、SK4（比較例１）と同等以上であった。このように、がん抗原として、がん細胞可溶化物や該可溶化物中に含まれるOVAペプチドを用いても、抗がん効果が発揮されたことから、様々な種類および形の抗原を利用できる免疫活性化剤として有用であることが推認された。【０１０５】
（２−３）試験例２：担がんマウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性
試験例１において、マウス安楽死処分前に、投与液投与部位の皮膚応答を写真撮影した。【０１０６】
結果を図８に示す。SK4（比較例１）が投与されたマウスは、ほぼ全匹、投与部位の炎症・壊死を示した。RGDS（比較例２）が投与されたマウスは、SK4（比較例１）の場合よりも発生確率は低いが、およそ半数のマウスで皮膚炎症・壊死応答が認められた。この炎症・壊死反応は、特に患者のQOLの観点からは避けるべき反応である。h11c（実施例１）が投与されたマウス及びm11c（実施例２）が投与されたマウスは、これらの皮膚応答をほとんど起こさなかった。この結果より、h11c（実施例１）及びm11c（実施例２）は、副作用症状をおこさない、優れた免疫活性化剤であることが示された。【０１０７】
（２−４）試験例３：正常マウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性１
C57BL6マウス雌8-10週齢の背部をバリカンで毛刈りした。マウス背部両側の皮内に調製しておいた投与液を30μLずつ投与し、5日間経過観察した。マウスを安楽死させた後、投与液投与部位の皮膚を採取し、該皮膚を写真撮影した。【０１０８】
マウスより採取した皮膚を凍結組織切片作製用包埋剤（ユーアイ化成株式会社）に包埋後、4μmに薄切し、スライドガラスに付着させサンプルとした。サンプルは氷冷アセトンで10分間固定した後、5% FCS PBS溶液で室温30分間ブロッキング処理を行い、染色操作を行った。【０１０９】
各切片は5%FCSを含むPBSで調製したそれぞれの抗体溶液（1μg/mL PE標識抗Gr-1抗体（12-5931, eBioscience社）、2.5μg/mL FITC標識抗CD11b （Mac-1）抗体（11-0112, eBioscience社）、1μg/mL 抗マウスCD31抗体（1次抗体, 550274, BD Pharmingen社）-5μg/mL Alexa fluor 488標識抗ラットIgG抗体（2次抗体, Molecular probe社））で、室温30分間反応させた後、PBSで5回洗浄し、Mountant PermaFluor(Thermo社)でカバーガラスに封入後、蛍光顕微鏡で観察した。【０１１０】
HE染色はアセトン固定後、マイヤーヘマトキシリン染色液（#3000-2, 武藤化学株式会社）で5分間染色後水洗し、エオジン染色液（ピュア・エオジン液, #3204-2, 武藤化学株式会社）で5分間染色し、エタノール洗浄した。キシレンで透徹後、封入剤で（EUKITT,O.Kindler社, ドイツ)カバーガラスに封入し、顕微鏡で観察した。【０１１１】
結果を図９に示す。左からワクチン投与部位の皮膚表・裏側の撮影写真、表面のHE染色写真、血管新生のマーカーであるCD31蛍光染色写真、炎症応答に関わる免疫細胞であるマクロファージのマーカー（Mac1)および好中球のマーカー（Gr1）の蛍光染色写真を示した。SK4（比較例１）投与部位には皮膚に壊死・炎症像が認められ、皮膚表面が肥厚や細胞の浸潤（HE）、血管新生（CD31）や炎症性細胞の浸潤（Gr1）が強く認められた。h11c（実施例１）及びm11c（実施例２）はこれらの皮膚における炎症・壊死応答を引き起こさなかった。これらの結果から、h11c（実施例１）及びm11c（実施例２）が皮膚炎症を誘発しない免疫活性化剤として有用である事が示された。【０１１２】
（２−５）試験例４：リポペプチドの抗がん効果２
成分２としてWT1ペプチドを用いた場合の抗がん効果を、試験例１に準じた方法で調べた。具体的には、次のように行った。【０１１３】
C57BL6マウス雌8-10週齢（日本クレア株式会社より購入）の背部をバリカンで毛刈りし、mWT1-C1498細胞（マウスWT1遺伝子の導入によりWT1蛋白を発現するがん細胞株）を3x105 cell/100μL PBS/匹でマウス側腹部右に皮下移植した。なお、mWT1-C1498細胞は文献６（Vaccine, Vol 30, Jannuary 17, 2012, pp722-729）に記載の方法に従って調製した。移植 14日目よりノギスで腫瘍の長径と短径を測定し、腫瘍体積は長径(cm) x 短径(cm) x 短径(cm) x0.4として算出した。16日目までに腫瘍体積の平均値と標準偏差が整うように群分けを行った。表２に示したOVAペプチドの代わりにWT1ペプチドを用いて同濃度の投与液を調製した。投与は翌日から開始し、移植16-22日目の間に計3回の治療（2、3日間隔）を行いながら、腫瘍体積を継続的に測定した。投与液は腫瘍周辺（1回目：左側、2回目：左側、3回目：尾側）の皮内に投与した。26日目を目安に評価を終了し、マウスを安楽死処分した。各マウスの群分け日の体積を100%として、以降の体積（%）を求め、平均値と標準誤差を示した。【０１１４】
結果を図１０に示す。図１０中、縦軸と横軸の意味は図５〜７と同一である。【０１１５】
図１０より、mWT1-C1498細胞に対するWT1ペプチドを用いたワクチン治療モデルにおいても、h11cは有効な抗がん効果を示すことから、種々のペプチドワクチン療法に対して、サポートアジュバントとして幅広く適用できる可能性が示唆された。また、mWT1-C1498細胞のモデルにおいてもh11c単独投与による抗がん効果が認められた。この結果は、がん抗原が未同定の患者さんに対して、ペプチドワクチンの併用がなくとも、h11cは一定の治療効果を提供できる可能性が示唆された。【０１１６】
（２−６）試験例５：正常マウスに対するリポペプチドの皮膚刺激性２  リポペプチドの皮膚刺激性の評価を、比較例１の投与液（SK4 10nmol）と実施例１の投与液（h11c 10nmol）に加えて、SK4 1nmolの投与液を用いて、皮膚刺激性を調べた。具体的には、試験例３と同様に行った。【０１１７】
結果を図１１に示す。図１１の上段はワクチン投与部位の皮膚表側の撮影写真を示し、下段は裏側の撮影写真を示す。図１１より、SK4は1nmolでも炎症を引き起こすが、h11cはその10倍量である10nmol加えても、炎症を引き起こさなかった。このことより、h11cは従来のペプチドよりも皮膚刺激性が顕著に（10倍以上）低いことが示唆された。【０１１８】
（２−７）試験例６：投与されたリポペプチドの動態の解析
蛍光標識したリポペプチドを用いて、投与されたリポペプチドの動態を調べた。具体的には次のように行った。【０１１９】
＜蛍光標識リポペプチド（FITC-SK4及びFITC-h11c）の製造＞
FITC標識リポペプチドはバイオロジカ社を通じてBiosynthesis社に合成を依頼した。Fmoc-Cys((RS)-2,3-di(palmitoyloxy)-propyl)-OHと側鎖の保護された各ペプチド（Ser-Lys-Lys-Lys-Lys又はAla-Thr-Pro-Glu-Asp-Asn-Gly-Arg-Ser-Phe-Ser）を一般的なカップリング試薬を用いて一晩反応させた後、Fmoc基を除去し、次にFmoc-aminohexanoic acid(Ahx)と一般的なカップリング試薬を用いて4-6時間反応させた。再びFmoc基を除去した後、ここにFITCを結合させた。脱保護処理の後、HPLCで精製し、質量分析器（MALDI-TOF）で解析した結果、FITC標識リポペプチドの合成が確認できた（図１２及び１３）。【０１２０】
＜FITC-SK4及びFITC-h11cの動態の解析＞
各蛍光標識リポペプチドをジメチルスルフォキシドで10mMになるように溶解した溶液を1μlと、PBS 29μlとを混合したものを投与液として用いた。C57BL6マウス雌8-10週齢（日本クレア株式会社より購入）の背部をバリカンで毛刈りし、E.G7-OVA細胞を2x106 cell/200μL PBS/匹でマウス背部皮下に移植した。移植12-14日目以降に、投与液を腫瘍右側の皮内に投与した。投与24時間後にマウスを安楽死処分し、投与部位の皮膚を採取し、凍結組織切片作製用包埋剤（ユーアイ化成株式会社）に包埋後、4μmに薄切し、スライドガラスに付着させサンプルとした。サンプルは氷冷アセトンで10分間固定した後、PBSで5回洗浄し、Mountant PermaFluor(Thermo社)でカバーガラスに封入後、蛍光顕微鏡で観察した。【０１２１】
結果を図１４に示す。図１４より、h11cは投与部位の皮膚から速やかに（24時間以内に）消失するが、SK4は大量に蓄積することが分かった。このことより、h11cの低皮膚刺激性は、投与部位の皮膚からの消失が早いことに起因することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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