(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母において、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする内在遺伝子をヘテロで破壊した組換え酵母。
【請求項２】
上記アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする内在遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の組換え酵母。
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質
【請求項３】
キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母において、ＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めた変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子を導入した組換え酵母。
【請求項４】
上記変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項３記載の組換え酵母。
(a)配列番号４又は６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号４又は６に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を有するタンパク質
【請求項５】
上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１又は３記載の組換え酵母。
(a)配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号８に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
請求項１乃至５いずれか一項記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシロース代謝能を有する組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグノセルロースに含まれる主要な糖は、セルロースを構成するグルコースと、ヘミセルロースを構成するキシロースである。リグノセルロースを化学的あるいは酵素的に分解すると、こうした単糖を主として含む糖化組成物が得られる。リグノセルロースから有用物質を工業的に製造するためには、こうした糖化組成物中に含まれる糖を効率的に利用し、高収量、高生産性で発酵できる微生物が求められる。
【０００３】
サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のエタノール発酵能力の高い酵母は、一般に、グルコース、マンノース、ガラクトースを利用することができるが、キシロースを利用できない。したがって、リグノセルロースを原料として高効率に発酵するためには、こうした酵母がキシロースを利用可能となるように改変することが求められている。
【０００４】
例えば、サッカロマイセス属酵母に、キシロースを利用可能な酵母を作製する試みが行われている（特許文献１、２、非特許文献１）。特許文献１及び非特許文献１では、いずれも異種微生物由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）及びキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする遺伝子を導入してキシロース資化性を付与した酵母におけるエタノール収量やキシロースの利用能力を上げるための改良が報告されている。これらの文献では、ＸＲ及びＸＤＨによるキシロース資化経路の導入によって余剰に発生するＮＡＤＨを後段の反応で消費させるために、ホスホケトラーゼ（ＰＫ）経路を増強し、アセトアルデヒド脱水素酵素によりＮＡＤＨを消費することが報告されている。
【０００５】
また、特許文献２では、キシロースからキシルロースへの異性化酵素であるキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）を用いることが報告されている。ＸＩを用いる場合、余剰のＮＡＤＨは発生しない。したがって、解糖系のペントースリン酸経路（ＰＰＰ）をそのまま用い、ホスホケトラーゼ経路を増強することは記載されていない。
【０００６】
しかしながら、ＸＩ遺伝子を導入したキシロース資化酵母に対して、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子を導入することで、ＮＡＤＨが過剰に消費する可能性があるものの、キシロースの資化が向上したことも報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ０３／０７８６４３
【特許文献２】特表２００５−５１４９５１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２３９９２５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sonderegger M, Schumperli M, Sauer U. 2004. Metabolic engineering of a phosphoketolase pathway for pentose catabolism in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 70(5): 2892-2897
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＸＩ遺伝子を導入したキシロース資化酵母では、エタノール発酵能、すなわちエタノールの生産効率が十分とはいえなかった。そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、特に、キシロース資化及びエタノール発酵に優れたキシロース資化酵母及び当該酵母を用いることでエタノールの収率に優れたエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、キシロース代謝能を有する酵母に対して、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させることでキシロース資化性を向上でき、エタノール収率を向上できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下を包含する。
【００１２】
（１）  キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入した組換え酵母において、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させた組換え酵母。
（２）  内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を低下させたことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（３）  アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする、内在遺伝子の発現量を低下させたことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（４）  上記内在遺伝子を破壊したことを特徴とする（３）記載の組換え酵母。
（５）  上記内在遺伝子をヘテロで破壊したことを特徴とする（４）記載の組換え酵母。
（６）  ＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めた変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子を導入したことを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
（７）  上記アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする内在遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（３）記載の組換え酵母。
(a)配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号２に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質
（８）  上記変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをコードする遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（６）記載の組換え酵母。
(a)配列番号４又は６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号４又は６に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を有するタンパク質
（９）上記キシロースイソメラーゼ遺伝子は、以下の(a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１）記載の組換え酵母。
(a)配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質
(b)配列番号８に示すアミノ酸配列に対して70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースをキシルロースにする酵素活性を有するタンパク質
（１０）  上記（１）乃至（９）いずれかに記載の組換え酵母を、キシロースを含有する培地にて培養してエタノール発酵を行う工程を有するエタノールの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係る組換え酵母は、培地中のキシロースを資化する能力に優れ、キシロースからのエタノール生産効率に優れたものとなる。したがって、本発明に係る組換え酵母を使用することによって、キシロースを含有する培地におけるエタノール収率を大幅に向上させることができる。
【００１４】
本発明に係るエタノールの製造方法では、培地中のキシロースを糖源としたエタノール発酵の効率を高く維持することができ、優れたエタノール収率を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】バリン・ロイシン生合成経路の一部を記載した特性図である。
【図２】pUC-GRE3U-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-GRE3Dを模式的に示す構成図である。
【図３】pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC変異型-T_ACT1-TRP1-3U_ADH2を模式的に示す構成図である。
【図４】pUC-ILV5U-TRP1-ILV5Dを模式的に示す構成図である。
【図５】pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2Dを模式的に示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
【００１７】
＜組換え酵母＞
本発明に係る組換え酵母は、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入し、且つ、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）の生産量を低下させたものである。
【００１８】
キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入された組換え酵母は、キシロースイソメラーゼ遺伝子が機能する組換え酵母である。キシロースイソメラーゼ遺伝子が機能するとは、導入されたキシロースイソメラーゼ遺伝子が転写・翻訳され、酵素活性を有するキシロースイソメラーゼが発現することを意味する。
【００１９】
キシロースイソメラーゼ遺伝子が導入さえた組換え酵母は、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能を獲得した組換え酵母、本来的にはキシロース代謝能を有しない酵母に対してキシロースイソメラーゼ遺伝子及びその他のキシロース代謝関連遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能を獲得した酵母、本来的にキシロース代謝能を有する酵母に対してキシロースイソメラーゼ遺伝子が導入されることによりキシロース代謝能を強化した組換え酵母のいずれも含む意味である。
【００２０】
本発明に係る組換え酵母は、培地中に含まれるキシロースを資化してエタノールを生産することができる。なお、培地中に含まれるキシロースとは、キシロースを構成糖とするキシランやヘミセルロース等を糖化するプロセスによって得られたものでも良いし、培地に含まれるキシランやヘミセルロース等が糖化酵素により糖化されることで培地に供給されるものであってもよい。後者の場合は、所謂、同時糖化発酵の系を意味する。
【００２１】
また、本発明に係る組換え酵母は、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させている。アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼとは、図１に示すように、バリン・ロイシン生合成経路における、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する活性を有する酵素である（図１においてILV5と記載されている酵素）。
【００２２】
アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させるには、組換え酵母に内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を低下させる、組換え酵母に内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量を低下させるといった方法が挙げられる。或いは、ＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めた変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を導入する方法でもよい。すなわち、当該変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子がコードする変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼが発現することで、内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を相対的に低下させることができる。これにより、内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによるＮＡＤＨ生産量が低下し、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによるＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）生産量がその分増加することとなる。なお、図１において、この変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼをIilvC(NADP依存型)として記載している。
【００２３】
ここで、組換え酵母に内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を低下させるには、例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を阻害する物質を共存させる、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの活性を中和する抗体を共存させるといった方法が挙げられる。また、組換え酵母に内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の発現量を低下させるには、内在する当該遺伝子のプロモーターを改変する、当該遺伝子を欠損・破壊するといった方法が挙げられる。遺伝子の発現を抑制する手法としては、所謂、トランスポゾン法、トランスジーン法、転写後遺伝子サイレンシング法、RNAi法、ナンセンス仲介減衰（Nonsense mediated decay, NMD）法、リボザイム法、アンチセンス法、miRNA（micro-RNA）法、siRNA（small interfering RNA）法等を挙げることができる。特に、組換え酵母に内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子を欠損・破壊する場合であって、対立遺伝子のうち一方の遺伝子を欠損・破壊することが好ましい。
【００２４】
内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子とは、本発明に係る組換え酵母に本来的に備わっている遺伝子であって、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。したがって、内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は特に具体的に塩基配列に限定されるものではない。
【００２５】
一例として、Saccharomyces cerevisiaeに内在するアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２に示す。
【００２６】
ただし、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００２７】
また、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００２８】
さらに、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号２のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００２９】
さらにまた、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号１及び２にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００３０】
上述したように、配列番号１と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号２とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を測定すればよい。アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性とは、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨに変換する活性を意味する。よって、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性は、基質として２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、２−アセト乳酸及びＮＡＤ＋の減少量及び/又は２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＨの生成量を測定することで評価できる。
【００３１】
一方、ＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めた変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子とは、特に限定されないが、野生型のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼにおけるＮＡＤＰＨ結合部位を構成するアミノ酸残基を改変して、ＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めた変異型酵素をコードする遺伝子である。この変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子については、例えば、米国特許第８，０９７，４４０公報やArch. Biochem. Biophys. 338, p. 83-89 (1997) に開示されている遺伝子を適宜使用することができる。
【００３２】
具体的には、大腸菌由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼにおいて、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を導入することでＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めることができる。同様に、大腸菌由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼにおいて、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を導入することでＮＡＤ＋依存性を低下させＮＡＤＰ＋依存性を高めることができる。
【００３３】
より具体的に、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を導入した大腸菌由来の変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号３、当該遺伝子によりコードされる変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を導入した大腸菌由来の変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列番号５、当該遺伝子によりコードされる変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００３４】
また、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号３〜６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号４又は６のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ただし、配列番号４に対して所定の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列は、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を保存しているものとする。同様に、配列番号６に対して所定の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列は、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を保存しているものとする。ここで、配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。
【００３５】
なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００３６】
さらに、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号３〜６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号４又は６のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。ただし、配列番号４に対して所定の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列は、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を保存しているものとする。同様に、配列番号６に対して所定の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列は、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を保存しているものとする。
【００３７】
さらにまた、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号３〜６にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号３又は５の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する酵素活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。
【００３８】
より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。ただし、配列番号３の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を保存したアミノ酸配列をコードしているものとする。同様に、配列番号６の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を保存したアミノ酸配列をコードしているものとする。
【００３９】
上述したように、配列番号３又は５と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号４又は６とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質の変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性を測定すればよい。変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性とは、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋をそれぞれ２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨに変換する活性を意味する。よって、変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ活性は、基質として２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋を含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、２−アセト乳酸及びＮＡＤＰ＋の減少量及び/又は２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸及びＮＡＤＰＨの生成量を測定することで評価できる。
【００４０】
ところで、本発明に係る組換え酵母は、上述したように、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入したものである。キシロースイソメラーゼ遺伝子（XI遺伝子）としては、特に限定されず、如何なる生物種由来の遺伝子を使用しても良い。例えば、特開2011-147445号公報に開示されたシロアリの腸内原生生物由来の複数のキシロースイソメラーゼ遺伝子を、特に制限されることなく使用することができる。また、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、嫌気性のカビであるピロマイセス（Piromyces）sp. E2種由来（特表2005-514951号公報）、嫌気性のカビであるシラマイセス・アベレンシス（Cyllamyces aberensis）由来、バクテリアであるバクテロイデス・セタイオタミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）由来、バクテリアであるクロストリディウム・ファイトファーメンタス由来、ストレプトマイセス・ムリナスクラスター由来の遺伝子を利用することもできる。
【００４１】
具体的に、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子を使用することが好ましい。このヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子のコーディング領域の塩基配列及び当該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７及び８に示す。
【００４２】
ただし、キシロースイソメラーゼ遺伝子としては、配列番号７及び８にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００４３】
また、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号７及び８にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００４４】
さらに、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号７及び８にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号８のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、キシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００４５】
さらにまた、キシロースイソメラーゼ遺伝子は、これら配列番号７及び８にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号７の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシロースイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００４６】
上述したように、配列番号７と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号８とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、キシロースイソメラーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のキシロースイソメラーゼ活性を測定すればよい。キシロースイソメラーゼ活性とは、キシロースをキシルロースに異性化する活性を意味する。よって、キシロースイソメラーゼ活性は、基質としてキシロースを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、キシロースの減少量及び/又はキシルロースの生成量を測定することで評価できる。
【００４７】
なお、上述したように、本発明に係る組換え酵母は、キシロースイソメラーゼ遺伝子の他に、他のキシロース代謝関連遺伝子が導入されたものでもよい。キシロースイソメラーゼ遺伝子以外のキシロース代謝関連遺伝子とは、キシロースをキシリトールに変換するキシロースリダクターゼをコードするキシロースリダクターゼ遺伝子、キシリトールをキシルロースに変換するキシリトールデヒドロゲナーゼをコードするキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びキシルロースをリン酸化してキシルロース5-リン酸を生成するキシルロキナーゼをコードするキシルロキナーゼ遺伝子を含む意味である。なお、キシルロキナーゼにより生成されたキシルロース5-リン酸は、ペントースリン酸経路に入り代謝されることとなる。
【００４８】
より詳細に、キシロース代謝関連遺伝子としては、特に限定されないが、Pichia stipitis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子及びキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子、Saccharomyces cerevisiae由来のキシルロキナーゼ遺伝子を挙げることができる（Eliasson A. et al., Appl. Environ. Microbiol, 66:3381-3386及びToivari MN et al., Metab. Eng. 3:236-249参照）。その他にも、キシロースリダクターゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシロースリダクターゼ遺伝子を利用することができる。キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子としては、Candida tropicalisやCandida prapsilosis由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を利用することができる。キシルロキナーゼ遺伝子としては、Pichia stipitis由来のキシルロキナーゼ遺伝子を利用することもできる。
【００４９】
特に、本発明に係る組換え酵母では、キシロースイソメラーゼ遺伝子の他に、キシルロキナーゼ遺伝子を導入したものであることが好ましい。キシルロキナーゼは、キシロースイソメラーゼにより生成したキシルロースを基質としてキシルロース5-リン酸を生成する反応に関与する。よって、このキシルロキナーゼ遺伝子を導入することで、キシロースイソメラーゼが関与するキシロース代謝経路の代謝活性を向上させることができる。
【００５０】
本発明に係る組換え酵母の宿主がSaccharomyces cerevisiaeである場合、Saccharomyces cerevisiaeに内在するキシルロキナーゼ遺伝子の発現を強化することでキシロースイソメラーゼが関与するキシロース代謝経路の代謝活性を向上させることができる。ここでSaccharomyces cerevisiaeに内在するキシルロキナーゼ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子がコードするアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９及び１０に示す。
【００５１】
ただし、キシルロキナーゼ遺伝子としては、配列番号９及び１０にて特定されるものに限定されず、塩基配列やアミノ酸配列は異なるがパラログの関係又は狭義のホモログの関係にある遺伝子であっても良い。
【００５２】
また、キシルロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有し、キシルロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。配列類似性及び同一性の値は、BLASTアルゴリズムを実装したBLASTNやBLASTXプログラムにより算出することができる（デフォルトの設定）。なお、配列類似性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基と、物理化学的に機能が類似するアミノ酸残基との合計を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記合計数の割合として算出される。なお、同一性の値は、一対のアミノ酸配列をペアワイズ・アライメント分析した際に完全に一致するアミノ酸残基を算出し、比較した全アミノ酸残基中の上記アミノ酸残基数の割合として算出される。
【００５３】
さらに、キシルロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列に対して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有し、キシルロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでも良い。ここで、数個とは、例えば、２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、最も好ましくは２〜５個である。
【００５４】
さらにまた、キシルロキナーゼ遺伝子は、これら配列番号９及び１０にて特定されるものに限定されず、例えば、配列番号９の塩基配列からなるDNAの相補鎖の全部又は一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキシルロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものでもよい。ここでいう「ストリンジェントな条件」とはいわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味し、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition)を参照して適宜決定することができる。具体的には、サザンハイブリダイゼーションの際の温度や溶液に含まれる塩濃度、及びサザンハイブリダイゼーションの洗浄工程の際の温度や溶液に含まれる塩濃度によりストリンジェンシーを設定することができる。より詳細には、ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム濃度が25〜500mM、好ましくは25〜300mMであり、温度が42〜68℃、好ましくは42〜65℃である。より具体的には、5×SSC(83mM NaCl、83mMクエン酸ナトリウム)、温度42℃である。
【００５５】
上述したように、配列番号９と異なる塩基配列からなる遺伝子、又は配列番号１０とは異なるアミノ酸配列をコードする遺伝子が、キシルロキナーゼ遺伝子として機能するか否かは、当該遺伝子を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて例えば大腸菌等の宿主を形質転換し、発現するタンパク質のキシルロキナーゼ活性を測定すればよい。キシルロキナーゼ活性とは、キシルロースをキシルロース5-リン酸にする活性を意味する。よって、キシルロキナーゼ活性は、基質としてキシルロースとATPを含む溶液を準備し、検査対象のタンパク質を適当な温度で作用させ、キシルロース及びATPの減少量及び/又はキシルロース5-リン酸の生成量を測定することで評価できる。
【００５６】
＜組換え酵母の作製＞
本発明に係る組換え酵母は、宿主となる酵母にキシロースイソメラーゼ遺伝子を導入するとともに、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させるように改変することで作製することができる。宿主となる酵母は、特に限定されないが、キシロース代謝能を有しない酵母でも良いし、キシロース代謝能を本来的に有する酵母でもよい。宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae、Pichia stipitis、Pachysolen tannophilus、Saccharomyces cerevisiae及びSchizosaccaromyces pombeなどの酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。なかでもキシロース代謝能を本来的に有する酵母としては、特に限定されないが、Pichia stipitis、Candida tropicalis及びCandida prapsilosis等を挙げることができる。
【００５７】
また、酵母としては、実験面での利便性のために使われる実験株でも良いし、実用面での有用性のために使われている工業株（実用株）でも良い。工業株としては、例えば、ワイン、清酒や焼酎作りに用いられる酵母株を挙げることができる。また、宿主となる酵母としては、ホモタリック性を有する酵母を使用することが好ましい。特開２００９−３４０３６号公報に開示される手法によれば、ホモタリック性を有する酵母を利用することで、簡便にゲノムへの多コピー遺伝子導入が可能となる。ホモタリック性を有する酵母とは、ホモタリックな酵母と同義である。ホモタリック性を有する酵母としては、特に限定されず、如何なる酵母をも使用することができる。ホモタリック性を有する酵母としては、Saccharomyces cerevisiae OC-2株（NBRC2260）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。その他にもホモタリック性を有する酵母としては、アルコール酵母（台研396号、NBRC0216）（出典：「アルコール酵母の諸特性」酒研会報、No37、p18-22(1998.8)）、ブラジルと沖縄で分離したエタノール生産酵母（出典：「ブラジルと沖縄で分離したSaccharomyces cerevisiae野生株の遺伝学的性質」日本農芸化学会誌、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4)）及び180（出典「アルコール発酵力の強い酵母のスクリーニング」日本醸造協会誌、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6)）を挙げることができる。また、ヘテロタリックな表現型を示す酵母においても、HO遺伝子を発現可能に導入することによってホモタリック性を有する酵母として使用することができる。すなわち、本発明において、ホモタリック性を有する酵母とは、HO遺伝子を発現可能に導入された酵母も含む意味である。
【００５８】
なかでも、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、従来ワイン醸造の場面で利用されてきた安全性を確認されている菌株であるため好ましい。また、Saccharomyces cerevisiae OC-2株は、後述する実施例で示したように、高糖濃度の条件下におけるプロモーター活性が優れた菌株であるため好ましい。特にSaccharomyces cerevisiae OC-2株は、高糖濃度条件においてピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーター活性が優れているため好ましい。
【００５９】
また、導入するキシロースイソメラーゼ遺伝子や変異型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子のプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。
【００６０】
すなわち、上述した遺伝子は、発現を制御するプロモーターやその他の発現制御領域とともに酵母のゲノムに導入してもよい。または、上述した遺伝子は、宿主となる酵母のゲノムに本来的に存在する遺伝子のプロモーターやその他の発現制御領域により発現制御されるように導入してもよい。
【００６１】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００６２】
＜エタノール製造＞
本発明に係る組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、少なくともキシロースを含有する培地にてエタノール発酵培養を行う。すなわち、エタノール発酵を行う培地とは、炭素源として少なくともキシロースを含有することとなる。なお、培地には、予めグルコース等の他の炭素源が含まれていても良い。
【００６３】
また、エタノール発酵に利用する培地に含まれるキシロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスと、セルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースを糖化してキシロースを生成するヘミセルラーゼとを含む組成であってもよい。ここで、セルロース系バイオマスとしては、従来公知の前処理を施したものであっても良い。前処理としては、特に限定されないが、例えば、リグニンを微生物によって分解する処理や、セルロース系バイオマスの粉砕処理等を挙げることができる。また、前処理としては、例えば、粉砕したセルロース系バイオマスを希硫酸溶液やアルカリ溶液、イオン液体に浸漬する処理、水熱処理、微粉砕処理といった処理を適用しても良い。これら前処理により、バイオマスの糖化率を向上させることができる。
【００６４】
なお、本発明に組換え酵母を使用してエタノールを製造する際には、上記培地が更にセルロース及びセルラーゼを含む組成であってもよい。この場合、上記培地には、セルラーゼがセルロースに作用することで生成するグルコースを含有することとなる。エタノール発酵に利用する培地がセルロースを含有する場合、当該セルロースは、バイオマス由来とすることができる。言い換えると、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスに含まれるセルラーゼを糖化できるセルラーゼを含む組成であってもよい。
【００６５】
また、エタノール発酵に利用する培地は、セルロース系バイオマスを糖化処理した後の糖化液を添加してもよい。この場合、糖化液には、残存するセルロースやセルラーゼとセルロース系バイオマスに含まれるヘミセルロースに由来するキシロースとが含まれる。
【００６６】
以上のように、本発明に係るエタノールの製造方法は、少なくともキシロースを糖源とするエタノール発酵の工程を含むこととなる。本発明に係るエタノールの製造方法は、キシロースを糖源としたエタノール発酵によりエタノールを製造することができる。本発明に係る組換え酵母を利用したエタノールの製造方法では、エタノール発酵の後、培地からエタノールを回収する。エタノールの回収方法は、特に限定されず、従来公知のいかなる方法も適用することができる。例えば、上述したエタノール発酵が終了した後、固液分離操作によってエタノールを含む液層と、組換え酵母や固形成分を含有する固層とを分離する。その後、液層に含まれるエタノールを蒸留法によって分離・精製することで、純度の高いエタノールを回収することができる。なお、エタノールの精製度は、エタノールの使用目的にあわせて適宜調整することができる。
【００６７】
また、本発明に係るエタノールの製造方法は、培地に含まれるセルロースをセルラーゼにより糖化する工程と、キシロースと糖化により生成されたグルコースとを糖源とするエタノール発酵の工程とが同時に進行する、いわゆる同時糖化発酵処理としても良い。ここで、同時糖化発酵処理とは、セルロース系バイオマスを糖化する工程とエタノール発酵工程とを区別せずに同時に実施する処理を意味する。
【００６８】
なお、糖化方法としては、特に限定されないが、セルラーゼやヘミセルラーゼ等のセルラーゼ製剤を利用する酵素法等を挙げることができる。セルラーゼ製剤は、セルロース鎖及びヘミセルロース鎖の分解に関与する複数の酵素を含んでおり、エンドグルカナーゼ活性、エンドキシラナーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性、グルコシダーゼ活性及びキシロシダーゼ活性等の複数の活性を示す。セルラーゼ製剤としては、特に限定されないが、例えば、Trichoderma reeseiや、Acremonium cellulolyticusなどが生産するセルラーゼを挙げることができる。セルラーゼ製剤としては、市販されているものを使用しても良い。
【００６９】
同時糖化発酵処理では、セルロース系バイオマス（前処理後であってもよい）を含む培地にセルラーゼ製剤と上述した組換え微生物とを加え、所定の温度範囲で当該組換え酵母を培養する。培養温度としては特に限定されないが、エタノール発酵の効率を考慮して25〜45℃とすることができ、30〜40℃とすることが好ましい。また、培養液のpHを4〜6とすることが好ましい。また、培養に際して、攪拌や振とうしてもよい。さらに、先に酵素の至適温度（40〜70℃）で糖化を行い、その後、温度を所定の温度（30〜40℃）に下げて酵母を添加するといった変則的な同時糖化発酵でもよい。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７１】
〔実施例１〕
本実施例では、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入することでキシロース資化能を獲得した組換え酵母に対して、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させるように改変した組換え酵母を作製し、この組換え酵母のキシロース資化能及びエタノール生産能を評価した。なお、本実施例で作製した組換え酵母は、キシルロキナーゼ遺伝子を導入することでキシロースの代謝活性を向上させている。
【００７２】
＜導入ベクターの作製＞
（１）XI遺伝子及びXKS1遺伝子導入、GRE3遺伝子破壊用ベクター
GRE3遺伝子座にGRE3遺伝子を破壊しながらヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子と酵母由来のキシルロキナーゼ遺伝子を酵母に導入可能なベクター、pUC-GRE3U-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-GRE3Dを作製した(図２)。
【００７３】
このベクターには、５’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株のTDH1プロモーターと、３’側にCYC1ターミネーターが付加された、ヤマトシロアリ（Reticulitermes speratus）腸内原生生物由来のキシロースイソメラーゼ遺伝子（RsXI-C1, 特開2011-147445参照）、５’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株のTDH3プロモーターと、３’側にHIS3ターミネーターが付加された、Saccharomyces cerevisiae BY4742株のキシルロキナーゼ遺伝子（XKS1）、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、GRE3遺伝子の５’側末端より上流約700bpの領域の遺伝子配列（GRE3U）、及びGRE3遺伝子３’側末端より下流の約800bpの領域のDNA配列（GRE3D）、並びにマーカーとして、G418遺伝子を含む遺伝子配列（G418 marker）が含まれるように構築した。なお、マーカー遺伝子は両側にLoxP配列を導入することで、マーカー除去が可能な配列にしている。
【００７４】
なお、各DNA配列は表１のプライマーを用いて増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、上記表１のプライマーに隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加したプライマーを用いて、目的のDNA断片を増幅させ、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて順次DNA断片を結合し、ベクターを作製した。
【００７５】
（２）ilvC (NADP依存型)遺伝子導入用ベクター
大腸菌E. coli由来のNADP依存型アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子の酵母導入用ベクター、pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC変異型-T_ACT1-TRP1-3U_ADH2を作製した(図３)。このベクターには、５’側にSaccharomyces cerevisiae BY4742株のTDH3プロモーターとDLD2遺伝子のミトコンドリアへ輸送する輸送シグナルペプチドと推定される部分の配列（５’側末端から135塩基、M_DLD2）、３’側にACT1ターミネーターが付加された、E. coli K12株由来のアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼであるilvC（genebank：948286）をNADP依存型に変異した遺伝子、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、ADH2遺伝子の３’側末端より上流約450bpの領域の遺伝子配列（ADH2part）、及び３’側末端より下流の約700bpの領域のDNA配列（ADH2D）、ADH2のターミネーターとしてCYC1ターミネーター、並びにマーカーとして、TRP1遺伝子を含む遺伝子配列（TRP1 marker）が含まれるように構築した。本実施例では、NADP依存型ilvC遺伝子として、R68D変異、K69L変異、K75V変異及びR76D変異を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子（Arch. Biochem. Biophys. 338, 83-89 (1997)）であって、酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した塩基配列を有する遺伝子を使用した。本実施例では、NADP依存型ilvC遺伝子を全合成した。また、本実施例では、異なるNADP依存型ilvC遺伝子として、A71S変異、R76D変異、S78D変異、Q110V変異、D146G変異及びG185R変異を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子（United States Patent 8097440）であって、酵母のコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した塩基配列を有する遺伝子を使用した。本実施例では、このNADP依存型ilvC遺伝子についても全合成した。
【００７６】
なお、各DNA配列は表１のプライマーを用いて増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、上記表１のプライマーに隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加したプライマーを用いて、目的のDNA断片を増幅させ、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて順次DNA断片を結合し、ベクターを作製した。
【００７７】
（３）ILV5遺伝子破壊用ベクター
ILV5遺伝子の破壊用ベクター、pUC-ILV5U-TRP1-ILV5Dを作製した（図４）。このベクターには、酵母ゲノム上への相同組換えおよびアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ遺伝子（ILV5）遺伝子を破壊するための領域として、ILV5遺伝子の上流約850bpのDNA配列（ILV5U）、ILV5遺伝子の下流約800bpのDNA配列（ILV5D）、並びにマーカーとして、TRP1遺伝子を含む遺伝子配列（TRP1 marker）が含まれるように構築した。
【００７８】
なお、それぞれのDNA配列は表１のプライマーを用いて増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、上記表１のプライマーに隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加したプライマーを用いて、目的のDNA断片を増幅させ、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて順次DNA断片を結合し、ベクターを作製した。
【００７９】
（４）コントロールベクター(マーカー遺伝子のみ)
マーカー遺伝子のみ導入するコントロールベクター、pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2Dを作製した（図５）。このベクターには、酵母ゲノム上への相同組換え領域として、ADH2遺伝子の３’側末端より上流約450bpの領域の遺伝子配列（ADH2part）、及び３’側末端より下流の約700bpの領域のDNA配列（ADH2D）、ADH2のターミネーターとしてCYC1ターミネーター、並びにマーカーとして、TRP1遺伝子を含む遺伝子配列（TRP1marker）が含まれるように構築した。
【００８０】
なお、それぞれのDNA配列は表１のプライマーを用いて増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、上記表１のプライマーに隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加したプライマーを用いて、目的のDNA断片を増幅させ、In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて順次DNA断片を結合し、ベクターを作製した。
【００８１】
【表１】
0005845210.tif 000002
【００８２】
＜ベクター導入酵母株の作製＞
2倍体酵母でトリプトファン要求性であるSaccharomyces cerevisiae OC2-T株(Saitoh, S.ら、J. Ferment. Bioeng. 1996年、81巻、98-103)を宿主とした。酵母の形質転換はFrozen-EZ Yeast Transformation II（ZYMO RESEARCH）を用い、添付のプロトコルに従って行った。
【００８３】
先ず、pUC-5U_GRE3-P_TDH1-XI-T_CYC1-P_TDH3-XKS1-T_HIS3-LoxP-G418-LoxP-3U_GRE3のベクターの相同組換え部位をPCRで増幅した断片を用いて、OC2-T株の形質転換を行い、トリプトファンを含まないSD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株をUz979株と命名した。本株を胞子形成培地（1% リン酸カリウム、0.1% イーストエキストラクト、0.05% ブドウ糖、2% 寒天）で胞子を形成させ、ホモタリック性を利用して2倍化を行った。2倍体である染色体のGRE3遺伝子座領域にXI遺伝子及びXKS1遺伝子が組み込まれGRE3遺伝子が破壊されている株を取得した。これをUz979株とした。
【００８４】
次に、pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC変異型R68D K69L K75V R76D -T_ACT1-TRP1-3U_ADH2、pUC-ADH2part-T_CYC1-P_TDH3-M_DLD2-ilvC変異型A71S R76D S78D Q110V D146G G185R -T_ACT1-TRP1-3U_ADH2、pUC-ILV5U-TRP1-ILV5D、pUC-ADH2part-T_CYC1-TRP1-ADH2Dの各ベクターの相同組換え部位間をPCRで増幅した断片を用いて、Uz979株の形質転換を行い、トリプトファンを含まないSD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。純化された選択株をそれぞれ、Uz999株、Uz1000株、Uz1089株及びUz1034株と命名した。なお、それぞれの株はヘテロに（1コピー）組換えが起こっていることを確認した。
【００８５】
＜発酵試験＞
次に、上述のように得られたUz999株、Uz1000株、Uz1089株及びUz1034株からそれぞれ発酵能力が高い2株を選び、フラスコ発酵試験を以下のように実施した。まず、グルコース濃度20g/LのYPD液体培地（イーストエキストラクト 10ｇ/L、ペプトン 20g/L、グルコース20g/L）を20ml分注した100ml容バッフル付きフラスコに供試株を植菌し、30℃、120rpmで24時間培養を行った。集菌後、D5X65YPAc3培地（グルコース5g/L、キシロース65g/L、イーストエキストラクト10g/L、ペプトン20g/L、酢酸3g/L）を10ml分注した20ml容フラスコに植菌し（菌濃度0.3g乾燥菌体/L）、振盪培養（80rpm、振幅35mm、30℃）にて発酵試験を行った。なお、フラスコにつける栓は、内径1.5mmニードルを通したゴム製で、ニードルの先に逆止弁を取り付けることでフラスコが嫌気的に保たれるようにした。
【００８６】
発酵開始から90時間後、114時間後及び138時間後にサンプリングを行い、発酵液中のキシロース濃度及びエタノール濃度についてHPLC（LC-10A；島津製作所）を使用して、下記条件にて測定した。なお、３回のサンプリングのうち、最もエタノール濃度が高い時間のデータを発酵試験の結果に採用した（データは２株の平均値）。
【００８７】
[HPLC条件]
カラム：AminexHPX-87H
移動相：0.01N  H2SO4
流量：0.6ml/min
温度：30℃
検出器：示差屈折率検出器  RID-10A 
【００８８】
＜発酵試験結果＞
発酵試験の結果を表２に示す。
【００８９】
【表２】
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【００９０】
表２から判るように、コントロールのUz1034株と比較して、NADP依存型ilvC遺伝子を導入したUz999株及びUz1000株、内在するILV5遺伝子をヘテロに破壊したUz1089株では、キシロースの資化速度が大幅に向上し、その結果エタノールの生産性が向上した。以上の結果から、キシロースイソメラーゼ遺伝子を導入したキシロース資化能を有する組換え酵母において、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼの酵素反応に起因するＮＡＤＨの生産量を低下させることで、キシロース資化能及びエタノール生産能が大幅に向上することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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