(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロの間接クームス試験について陰性の結果をもたらす含有量の抗Ａおよび抗Ｂ抗体をそれぞれ有する、治療用の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の濃縮物であって、全ＩｇＧ含有量に対する、ミオシン又はジニトロフェニル基によって修飾されたアルブミン（ＤＮＰアルブミン）に対して多反応性を有するＩｇＧの含有量が低下したものである、免疫グロブリンＧの濃縮物。
【請求項２】
請求項１の濃縮物において、前記濃縮物の貯蔵を行うための安定化剤を含有する濃縮物。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかの濃縮物において、前記安定化剤が、糖アルコール、グリシンおよびノニオン性界面活性剤の混合物である濃縮物。
【請求項４】
請求項３の濃縮物において、前記糖アルコールがマンニトールまたはソルビトールまたはそれらの異性体である濃縮物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの濃縮物において、静脈内経路を介して注射することができる濃縮物。
【請求項６】
ａ）ウイルス不活化工程に関連する、エタノール分画および／またはクロマトグラフィ分離によってＩｇＧ濃縮物を調製する工程、
ｂ）該ＩｇＧ濃縮物をイムノアフィニティクロマトグラフィのカラムに通して浸出させる工程であって、該イムノアフィニティクロマトグラフィでは、血液型Ａへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体と、血液型Ｂへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体との混合物をカラムに充填させてイムノアフィニティクロマトグラフィを行う工程であって、血液型Ａへの抗原類似性を有する前記オリゴ糖基が構造Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−ガラクトース（Ｇａｌ）−フコース（Ｆｕｃ）を有し、血液型Ｂへの抗原類似性を有する前記オリゴ糖基が構造ガラクトース（Ｇａｌ）−ガラクトース（Ｇａｌ）−フコース（Ｆｕｃ）を有している工程、および
ｃ）濾過によって、２０ｎｍよりも大きなサイズのウイルスおよび／または粒子を除去する工程
を含む、インビトロの間接クームス試験について陰性の結果をもたらす含有量の抗Ａおよび抗Ｂをそれぞれ有する、治療用のＩｇＧ濃縮物であって、全ＩｇＧ含有量に対する、ミオシン又はジニトロフェニル基によって修飾されたアルブミン（ＤＮＰアルブミン）に対して多反応性を有するＩｇＧの含有量が低下したものである、免疫グロブリンＧの濃縮物を得る方法。
【請求項７】
請求項６の方法において、前記工程ａ）が、血漿から、または血漿のＩｇＧの豊富な画分から脂質汚染物を沈殿させる予備的精製工程と、アルカリ性ｐＨで行うアニオン交換樹脂を用いて行われる単回のクロマトグラフィ工程と、さらにｐＨ４〜７の適切な緩衝液を用いて単工程でＩｇＧを選択的に溶離させる工程とを含む方法。
【請求項８】
請求項６または７のいずれかにおいて、前記ウイルス不活化工程が溶媒−界面活性剤を用いて行われる方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかにおいて、血液型Ａおよび血液型Ｂに対する抗原類似性を有するオリゴ糖基でグラフトされた担体混合物が、血液型Ａおよび血液型Ｂに対応するそれぞれの担体について、２５／７５〜７５／２５（ｖ／ｖ）の各割合を有する方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれかにおいて、血液型Ａおよび血液型Ｂに対する抗原類似性を有するオリゴ糖基でグラフトされた担体混合物が、血液型Ａおよび血液型Ｂに対応するそれぞれの担体について、５０／５０（ｖ／ｖ）の各割合を有する方法。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれかにおいて、限外濾過および滅菌濾過によって濃縮する工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項６〜１１のいずれかにおいて、ウイルスを除去するための濾過が、ナノ濾過によって行われる方法。
【請求項１３】
請求項６〜１２のいずれかにおいて、工程ｃ）の後に、前記ＩｇＧ濃縮物を貯蔵するための安定化剤を加える工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ａ（ＡｃａＡ）および抗Ｂ（ＡｃａＢ）抗体が顕著に減少し、かつ多反応性（polyreactivity）が大きく低下した免疫グロブリンＧ濃縮物（ＩｇＧ）、および該濃縮物を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の感染または先天的欠乏症の治療のための免疫グロブリン（Ｉｇ）が豊富なヒト血漿の画分の使用が、Cohnの開発したエタノール沈殿方法により知られている（Cohnら, 1946, J. Am. Chem. Soc. 68, 459; Oncleyら, 1949, J. Am Chem. Soc. 71, 541）。
【０００３】
例えばヒト血漿から得られ、高度に精製された静注用Ｉｇ濃縮物（ＩｇＩＶ）の生産に対する需要が高まっている。免疫グロブリンが複雑な構造（ジスルフィド架橋によって連結された４つのポリペプチド鎖）を有し、数千のドナーからの血漿混合物には種々の抗体が存在するため、現在、バイオテクノロジーを利用した免疫グロブリンの開発は、促進するのが困難である。モノクローナル抗体は遺伝子工学によって生産されるが、それらの極端な特異性は、多様な特異性が必要であると思われる治療的適用では不利となる。
【０００４】
加えて、例えば自己免疫に起因する数々の疾患が、現在、ＩｇＧ濃縮物で治療されており、このことによって、近年、欧州および合衆国においてＩｇＧ濃縮物の不足を来たしている。
【０００５】
免疫グロブリン、特にＩｇＧ濃縮物を得るための方法では、アナフィラキシー反応の危険性を伴う補体系を活性化し得る免疫グロブリンポリマーの凝集物を除去するために、エタノールによる蛋白質の選択的沈殿に加えて、ポリエチレングリコールによる沈殿や、制御された蛋白質分解酵素処理等のような種々の他の処理を行うことがある。また、ＩｇＧＩＶ（静注用ＩｇＧ濃縮物）におけるダイマーの存在は、インビボにおける動脈圧の降下と相関している（Bleeker W.K.ら, Blood, 95, 2000, p. 1856-1861）。
【０００６】
エタノール沈殿とは別の方法が、Steinbuchら（Rev. Franc. Et. Clin. et Biol. 1969, XIV, 1054）によって報告されており、この方法では、オクタン酸を用いた沈殿を行っている。この酸は、ほとんどの血漿蛋白質を沈殿させ、免疫グロブリンを上清中に残す。これらの免疫グロブリンは、ＩｇＧを保持しない条件下でアニオン交換体ＤＥＡＥ−セルロースを通過させることによって精製される。次いで、保持されなかったＩｇＧの画分を濃縮する。
【０００７】
また、クロマトグラフィ技術を用いて生成物の純度を増加させるために、種々の方法が開発され、特に、特許出願EP 0 703 922およびWO 99/64462を挙げることができる。前者はアニオン交換により、後者はカチオン交換による、少なくとも２つの連続したクロマトグラフィ工程の組合せを記載する。これらの方法では、アニオン交換体の特性を利用し、そこでは、アニオン交換体が、通常のクロマトグラフィ条件下で免疫グロブリンＧを保持することなく、予備精製工程の間に共精製された他の蛋白質のほとんどを固定する。同様に、本出願人によって出願された特許出願WO 02/092632では、ＩｇＧ濃縮物の調製を開示し、この方法ではクロマトグラフィ担体でのＩｇＧ濃縮物の保持のために、アルカリ性ｐＨで行われるアニオン交換体での単一クロマトグラフィ工程が用いられる。
【０００８】
しかしながら、多数の科学文献において、前記した分画技術によって得られるＩｇＧの注射が、治療を受けている患者に対して、時には深刻な偶発性の溶血反応を引き起こしかねないことを示している。その例として、以下の文献を引用することができる：Buchta Cら, Biologicals, 33, 2005, 41-48, Wilson J.R.ら, Muscle & Nerve, 29(9), 1997, 1142-1145, Copelan E.A.ら, Transfusion, 26, 1986, 410-412およびMisbah S.A.ら, Drug Safety, 9, 1993, 254-262。特に、直接クームス試験（direct Coombs test−ＤＣＴ）を用いて行われた、溶血反応を有する患者の血液に対する効果の研究によって、赤血球が、それらの表面に存在する抗原Ａ、ＢまたはＤに対して向けられた免疫グロブリンで被覆されており、それによって溶血が起こることが示された。市販のＩｇＧが、抗Ｄ免疫グロブリンまたは抗Ａもしくは抗Ｂ力価が高い他の抗体の存在を回避するために、選択された血漿から得られるのはこのためである。
【０００９】
先に引用したBuchtaらは、これらの血漿誘導体で患者を処置した場合に、これらの抗体のレベルと直接相関する溶血の危険性を最小化する観点から、さまざまなアプローチを検討して、ＩｇＧのような血漿誘導体において、ＢおよびＯ血液型ドナーに由来する抗Ａ抗体の有意な低下、またＡおよびＯ型ドナーに由来する抗Ｂ抗体の有意な低下を達成している。ここでは、手短な方法として、ドナーを選択することによって、抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去し、特定の血液型、Ａおよび／またはＢ型に由来する血漿の誘導体を生産し、バッチから、抗Ａおよび抗Ｂ抗体において高い力価を有するものを排除することが考えられた。いくつかのアプローチは、コストや採用すべき工程の複雑性のため非現実的であると考えられる。前記したエタノール分画の間に、抗Ａおよび抗Ｂ抗体が部分的に除去されることが、注目に値する。
【００１０】
ＩｇＧに対する需要は常に増加しているので、統計学的に、より多数のＯ型のドナーを含むますます大きなドナープールに対する需要が存在する。その結果、ＩｇＧのような血液誘導体は、慣用的分画によって除去するには余りにも多量の抗Ａおよび抗Ｂ抗体を含有する。
【００１１】
ＩｇＧに対する需要が増大しているため、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の低含有量を保証するという理由から、ＡＢ型ドナーのみを選択するというのは現実的ではない。
【００１２】
精製されたＩｇＧ濃縮物または製剤の各バッチは、インビトロでの間接クームス試験（indirect Coombs test−ＩＣＴ）を適用する欧州薬局方（１９９７）のテスト２．６．２０を用いて、抗Ａおよび抗Ｂ抗体について規制される。ＩＣＴテストは、ＩｇＧ濃縮物に含有されるＩｇＧ型の抗Ａまたは抗Ｂ抗体で被覆された赤血球の懸濁液を、ヒトＩｇＧのモチーフに対する抗体（抗グロブリン）の溶液に加えることから構成される。これらの抗体は赤血球に付着した抗Ａまたは抗Ｂ抗体に結合し、それにより、ＩｇＧ間の架橋の形成を通じてそれらの凝集を引き起こす。抗Ａまたは抗Ｂ抗体の検出のための分析は、血液学的血清学におけるこの慣用的テスト（クームステスト）から直接的に着想したものである。
【００１３】
欧州薬局方によると、ＩｇＩＶまたは静注用免疫グロブリン溶液では、初期濃度を３０ｇ／Ｌまで低下させたＩｇＧ溶液を使用して１：６４の希釈下で行うＩＣＴテストにおいて、ＡまたはＢ型の赤血球を凝集させてはならない。
【００１４】
力価、すなわち、凝集を引き起こさない希釈倍率を得るために、テストすべきＩｇＧ試料を希釈しなければならないのは、このためである。欧州薬局方によれば、その希釈倍率が１：６４よりも低いＩｇＩＶ溶液について、ＩＣＴの結果が陰性であるのは、抗Ａおよび抗Ｂ抗体が低く、その含有量が許容できることを示す。しかし、欧州薬局方によって規定されたテストについて陰性の結果を与えるＩｇＧ濃縮物、すなわち１：６４未満の希釈率を有するものに関してさえ、溶血反応の危険性を排除することはできない（先に引用したBuchtaら）。
【００１５】
合衆国および日本国薬局方が、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の残存含有量を制御する必要性について、何らの規定も設けていないことに注意すべきである。
【００１６】
前記したように、抗Ａおよび抗Ｂ抗体は、エタノール分画によるＩｇＧ濃縮物の調製の間に部分的に除去されるが、欧州薬局方の上限を超える残存含有量が観察されることがある。加えて、出願人によって開発され特許出願WO 02/092632に記載された方法に従って調製された濃縮物は、エタノール分画によって得られたものよりも高い抗Ａおよび抗Ｂ抗体の残存含有量を示す。従って、抗Ａおよび抗Ｂ抗体に関しては、こうして得られたＩｇＧ濃縮物をさらに精製する必要がある。というのは、ＩｇＧ濃縮物のバッチの中には、欧州薬局方によって設定された閾値よりも高い抗Ａおよび抗Ｂ抗体の残存含有量を有するものがあるからである。
【００１７】
ＩｇＧ濃縮物からこれらの抗体を除去するための一つの技術としては、血液型の抗原ＡおよびＢに類似するオリゴ糖タイプを媒体として、免疫吸着剤を用いるアフィニティクロマトグラフィによって精製することよりなり、該オリゴ糖は、特に、クロマトグラフィのマトリックスにグラフトされた三糖である。
【００１８】
その例としては、血液型ＡおよびＢに特徴的な合成オリゴ糖、特にＡ三糖のハプテンがグラフトされたシリカ粒子を含有するクロマトグラフィ担体を用いている、Mazid M.A.らによる文献J.Appl.Biomater.,3(1),1992,9-15を挙げることができる。また、Hout M.S.ら（ASAIO J,46(6),2000,702-706）は、全血から抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去するため、特異的抗Ａおよび抗Ｂ抗原をグラフトしたチューブ状繊維膜を使用することを記載している。該クロマトグラフィ担体は非常に安定しており、また当該濃度でこれらの残存ハプテンの放出を制限することも報告されている。
【００１９】
特許出願WO 01/27623には、血液型ＡおよびＢの抗体において非特異化された血漿、すなわちいかなる受容者にも適した血漿を得る方法が記載されている。これらの特異性は、本質的には、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）が有しているものである。非特異化は、Ａ型については実験的親和性媒体を通し、Ｂ型についてもやはり実験的な別の親和性媒体を通すことによって達成される。抗Ａおよび抗Ｂが同時に存在する（Ｏ型）場合には、２つの媒体支持体を連続的に通すことが必要である。
【００２０】
市販のＩｇＧ濃縮物のさらなる特徴の一つは、その多反応性である。ＩｇＧのようなポリクローナル抗体は、通常は、独自の様式で単一のエピトープ（抗原性モチーフ）と組み合わされる。しかしながら、抗体のこの厳格な特異性は、時に、他の抗原性モチーフまで拡大することがあり、名目的モチーフに対する結合より弱い結合を有する二次的エピトープへの親和性を示す。ポリクローナルＩｇＧは、程度の差はあっても、アクチン、ミオシン、トリニトロフェニル修飾アルブミンのような構造と反応し得る。
【００２１】
この点に関して、静注用免疫グロブリン（ＩｇＩＶ）は、
・外部抗原に向けられ、免疫付与プロセスに由来する免疫抗体；および
・細胞内蛋白質、表面膜抗原、循環する自己蛋白質および他の抗体の可変領域を認識する自然抗体
を含有するポリクローナルヒトＩｇＧの製剤である。後者は、抗イディオタイプ抗体と呼ばれる（Kazatchkine M.D.ら,Immunol.Rev.,139,1994,79-107）。
【００２２】
自然抗体は意図的な免疫付与には由来しない（Coutinho A.ら, Curr. Opin. Immunol., 7, 1995, 812-818）。自然抗体は、自己抗原に対して可変の親和性を発現する点で、多反応性である（Berneman A.ら, Eur. J. Immunol., 22, 1992, 625-631およびLacroix-Desmazesら, J. Immunol. Methods, 216, 1988, 117-137）。
【００２３】
ＩｇＩＶの化学的処理（６Ｍ尿素、１．３Ｍチオシアン酸ナトリウムおよび酸処理  ｐＨ＝２．０）では、これらのポリクローナル免疫グロブリンの多反応性活性を増加させることができる（Bouvet J.P.ら.J.Autoimmun.,16(2)2001,163-172）。しかしながら、該免疫グロブリンで処置された患者において、有益な効果は未だ示されていない。
【００２４】
まとめると、ＩｇＩＶ製剤に存在する抗体の多反応性活性は：
・個々の血漿に含有される自然抗体の存在、
・個々の血漿に含有される抗イディオタイプ抗体の存在、
・本生産方法によって生じる抗体の多反応性
に起因するものであり得る。
【００２５】
従って、幾人かの著者は、多反応性が、人体に自然に存在するＩｇＧの固有の特性であると考えている。
【００２６】
モノクローナルまたはポリクローナルＩｇＧを精製する方法により、精製前には検出不可能な多反応性を解明できることを示している著者もいる。事実、血漿からＩｇＧを生産する方法もまた、生産の間に、酸化的「ストレス」およびＩｇＧの部分的カルボニル化の結果として生じる多反応性を引き起こす。
【００２７】
このことは、Bouvet J.Pら, Journal of Autoimmunity, 16, 2001, pp.163-172によって確認されており、彼らによると、特に尿素での処理の後にポリクローナルＩｇＧが高度に多反応性となる。また、この文献においては、臨床的に使用されるＩｇＧの有効性の一部はその多反応性に由来することが示される。
【００２８】
従って、これらのＩｇＧ濃縮物の多反応性については、自然抗体に由来する多反応性ＩｇＧと、通常の精製方法によって得られ、全ての多価ＩｇＧの０．５〜１％を占める多反応性ＩｇＧとが組み合わさって存在するためであると説明することができる。ＩｇＧ製剤での患者の処置は、１〜２ｇ／ｋｇまでの高用量の投与が必要となり得る。これらの用量は、受容者の生理学的ＩｇＧ量よりも７〜１０倍高い量での短時間処置、例えば１日での処置となり、その結果、ＩｇＧ濃縮物における本生産方法によって生じたこのレベルの多反応性ＩｇＧは、発熱、嘔吐または頭痛のような有害な副作用を引き起こし得る。
【００２９】
従って、自然抗体の多反応性と、本生産方法によって生じた抗体の多反応性と抗イディオタイプ抗体の多反応性とを区別しなければならない。そして、特許出願EP 1 059 088によって出願人が示したように、この出願の方法によって生じた抗体の多反応性から利益を得ることもできる。特許出願EP 1 059 088において、出願人は、ヒト多価ＩｇＩＶから単離された、血漿に元来含有される多反応性ＩｇＧの画分は、この画分の使用用量が少ないために、リウマチ多発性関節炎のようなある種の炎症疾患を治療するのに有利に用いることができることを示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
従って、赤血球の溶血、および治療の間にＩｇＧの大量投与に伴って起こり得る副作用の双方に関する有害反応を回避するために、市場で現在入手可能なＩｇＧ濃縮物と比較して抗Ａおよび抗Ｂ抗体が有意に減少し、免疫療法に関して少なくとも同一の効果を有しつつ、その生産方法によって生じる多反応性が好ましくはかなり低下した、治療用途、特に静脈内注射のためのＩｇＧ濃縮物に対する需要が存在するようである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
従って、本発明は、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の各含有量が、インビトロでの間接クームステストに関して陰性であることを特徴とする、治療用途のための免疫グロブリンＧ濃縮物に関する。
【００３２】
また、本発明は、自然抗体および抗イディオタイプ抗体よりも許容度が低い多反応性抗体を生じさせないことが可能な免疫グロブリンＧを生産する方法に関する。このため、該方法で得られたＩｇＩＶは、テストされた他のＩｇＩＶよりも低い多反応性を有する。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によると、これらの濃縮物中のＩｇＧは、好ましくは、血漿から、またはＩｇＧが豊富な血漿画分から得られるポリクローナルＩｇＧである。治療用途のためのＩｇＧ濃縮物は、好ましくは現在頻繁に使用されるＩｇＧ濃度である５０〜１００ｇ／Ｌを有する。これらの濃縮物は臨床用途を意図し、特に静脈内経路によって注射され得る。この目的のために、該濃縮物はウイルス的に安全でなければならず、所望により、この臨床用途に適合する安定化剤のような添加剤を含有することができる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
出願人は、標準ＩｇＧ濃縮物、すなわちエタノール分画および／または前記したクロマトグラフィに関連する精製技術を用いて得られ、抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去するための処理を受けていないＩｇＧ濃縮物に見出される含有量よりもかなり低い抗Ａおよび抗Ｂ抗体含有量を有するＩｇＧ濃縮物を提供することが可能であることを見出した。また、本発明のＩｇＧ濃縮物における抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量は、治療中である患者の溶血反応を生じさせる危険性について厳しく制限する欧州薬局方が許容している閾値を、大きく下回る。本発明のＩｇＧ濃縮物を、抗Ａおよび抗Ｂ抗体を評価することを意図したテストに供する場合、抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でのＡ、Ｂおよび／またはＡＢ型の赤血球のインビトロでの凝集試験の結果において、欧州薬局方の方法によって公開された３０ｇ／Ｌの初期濃度では、一貫して陰性であることが顕著に観察される。従って、本発明のＩｇＧ濃縮物で、先に定義した間接クームス試験を実施する場合、ＩｇＧ試料それ自体、すなわち希釈されていないＩｇＧ試料であっても一貫して陰性の結果がもたらされる。従って、これらの濃縮物中のこれらの抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量は、もはやＩＣＴテストによって検出できないようである。
【００３５】
ＩｇＧ濃縮物中の抗Ａおよび抗Ｂ抗体のレベルが非常に低い場合、欧州薬局方の条件下においては、もはやＩＡＴテストを適用することができない。というのは、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の密度が余りにも少なく、赤血球に固定された抗Ａおよび抗Ｂ抗体と、抗ヒトＩｇＧ抗体との結合によって赤血球の間に架橋が形成されなくなるために、抗ヒトＩｇＧ抗体を添加しても、赤血球の凝集反応がもはや起こらないからである。
【００３６】
しかしながら、これらの抗体を固定した赤血球の免疫溶血反応を利用することによって、抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去するための処置を受けていない慣用的な濃縮物と本発明の濃縮物とを比較して、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の枯渇の程度を測定し、抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体が非常に低い濃度で存在しているのを証明することは可能である。免疫溶血は、抗体を補体因子の存在下でその標的に付着させた場合に起こる特異的な免疫反応である。補体活性の活性化により、パーフォリンが放出され、これによって、赤血球の膜に穴が開き、ヘモグロビンを放出できるようになる。そして、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の存在量に比例して放出されるヘモグロビンの量を測定するための感度のよい方法、例えば放射性トレーサー（後記参照）を使用する方法を用いればよい。
【００３７】
出願人は、本発明のＩｇＧ濃縮物において、前記抗Ａ抗体の含有量が２３ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ以下、特に１９〜２３ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ、かつ前記抗Ｂ抗体の含有量が２０ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ以下、特に１２〜２０ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧであることを示した。
【００３８】
好ましくは、出願人は、特に本生産方法によって生じた該ＩｇＧ濃縮物が非常に低い多反応性ＩｇＧ含有量を有していること、それにより、先行技術のＩｇＧ濃縮物と同程度の免疫療法の効果を示すこれらの濃縮物において、非多反応性特性を付与することも可能であることを見出した。本生産方法により得られるこれらのＩｇＧには多反応性特性が顕著に存在しないため、高用量を必要とする処置後に起こり得る副作用の危険性が実質的に低下する。
【００３９】
また、好ましくは、本生産方法により得られるＩｇＧ濃縮物では、精製の間に、特に酸化的「ストレス」およびカルボニル化によって生じる多反応性ＩｇＧの存在に由来する有害効果を修正することも可能である。
【００４０】
好ましくは、多反応性ＩｇＧの残存含有量は、０．０１％〜０．１％、特に０．０７〜０．１％の範囲内に含まれる。本発明によると、多反応性ＩｇＧの含有量とは、モルまたは重量パーセントを意味する。この含有量は、特許出願EP 1 059 088において出願人が記載した方法を用いて決定される。
【００４１】
従って、本発明のＩｇＧ濃縮物は、活性成分中に、赤血球上に存在するエピトープに向けられた抗Ａおよび抗Ｂ抗体が顕著に存在しないことによって規定される。
【００４２】
ＩｇＧ濃縮物は、適切な安定化剤の存在下で液体または凍結乾燥形態であることができ、後に使用するために貯蔵することができる。これらの安定化剤は、好ましくは、出願人によって、その特許出願WO 2004/091656 A2において開発されたもの、すなわち、糖アルコール（好ましくはマンニトール、ソルビトールまたはそれらの異性体）、グリシン、およびノニオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８など）の混合物であり、これらの化合物はすべて薬学的に許容される。
【００４３】
処方物の濃度は、出願人によって、液体および／または凍結乾燥形態を安定化するように決定された。
【００４４】
好ましくは、濃縮物中のマンニトールの最終濃度は３０ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの範囲に存在し、界面活性剤の最終濃度は２０〜５０ｐｐｍの範囲に存在し、グリシンの最終濃度は７ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲に存在する。これらの化合物の濃度は、ＩｇＧ濃縮物における最終濃度を表す。
【００４５】
治療用途のための該ＩｇＧ濃縮物は、特に、先に示したように静脈内経路を介して注射することができる。このため、本発明のＩｇＧ濃縮物は、当該分野で知られた慣用的な溶媒−界面活性剤処理（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０／ＴｎＢＰの混合物、またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ  １００／ＴｎＢＰの混合物）に供して、および／または溶媒−界面活性剤を用いた殺ウイルス処理によって除去されなかったおそれのあるウイルスおよび／または他のマクロ分子、例えばプリオン（伝搬性海綿状脳症の病因）を任意に除去するための濾過工程に供して、ウイルス的に安全でなければならない。
【００４６】
また、本発明は、以下の工程：
ａ）ウイルス不活化工程に関連する、エタノール分画および／またはクロマトグラフィ分離によってＩｇＧ濃縮物を調製する工程、
ｂ）該ＩｇＧ濃縮物をイムノアフィニティクロマトグラフィのカラムに通して浸出させる工程であって、該イムノアフィニティクロマトグラフィでは、血液型Ａへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体と、血液型Ｂへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体との混合物をカラムに充填させてイムノアフィニティクロマトグラフィを行う工程、および、
ｃ）濾過によって、２０ｎｍよりも大きなサイズのウイルスおよび／または粒子を除去する工程；を含む、前記したような本発明のＩｇＧ濃縮物を得る方法に関する。
【００４７】
驚くべきことに、出願人によって、この方法が工業規模で好都合に行うことができるのみならず、ＩｇＧ濃縮物を調製する工程を、抗Ａおよび抗Ｂ抗体を除去するための特定の工程と組み合わせることによって、治療用途のための、本発明のＩｇＧ濃縮物を得ることが可能であることが見出された。ここで、好ましくは、本発明では、ＩｇＧの合計含有量に対して多反応性ＩｇＧの含有量が０．１％未満である。さらに、該濃縮物において、望ましくない抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量は、欧州薬局方に記載されたテストの下限をはるかに下回り、希釈していない試料であっても、ＩＣＴテストにおいて陰性の結果を与える。
【００４８】
好ましくは、該方法の工程ａ）は、それ自体、前述したＩｇＧ濃縮物を得る方法であってもよい。例えば、工程ａ）は、Cohnらによって開発されたエタノール分画、または例えばEP 0 703 922およびWO 99/64462に記載されたようなクロマトグラフィ分離に関する。特に、特許出願WO 94/29334およびWO 02/092632における出願人によって開発された方法、より特別には、WO 02/092632 A1に記載された方法が好ましい。この場合、本発明の方法の工程ａ）は、血漿からまたは血漿のＩｇＧが豊富な画分からの脂質汚染物の沈殿させる予備精製工程と、アルカリ性ｐＨで行われ、アニオン交換樹脂を用いた単一のクロマトグラフィ工程と、さらにｐＨ４〜７の適切な緩衝液を用いて単一工程でＩｇＧを選択的に溶離させる工程とを含む。
【００４９】
該方法の工程ａ）はウイルス不活化処理を含み、この処理では、好ましくは米国特許第4,764,369号においてHorowitzによって記載された溶媒−界面活性剤を用いる。この処理は、特に、ａ）の前に、または適用可能な場合には、この処理の後の化学残留物を除去するために行われるクロマトグラフィ工程前に、注意深く行われる。
【００５０】
回収されたＩｇＧ画分は既に十分に濃縮されており、次いで、限外濾過および滅菌濾過によるさらなる濃縮工程を経ることができる。
【００５１】
次いで、この濃縮物は、血液型ＡおよびＢに対して同様性または類似性を有する抗原基でグラフトされた２種類の担体の混合物上で、好ましくは、該担体混合物を充填したカラムを用いて、イムノアフィニティクロマトグラフィに付される。
【００５２】
好ましくは、クロマトグラフィの担体は、アガロースタイプの天然架橋ポリマーマトリックスよりなり、マトリックス上ではスペーサーアームまたはカップリングアームがグラフトされ、これらのアームは次いで血液型ＡおよびＢのエピトープに対応するオリゴ糖、好ましくは三糖であるオリゴ糖でグラフトされている。特に、血液型Ａのエピトープに対応する三糖が構造Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−ガラクトース（Ｇａｌ）−フコース（Ｆｕｃ）を有する該単体を用いる場合や、血液型Ｂのエピトープに対応する三糖が、構造ガラクトース−ガラクトース−フコースを有する該単体を用いる場合、非常に良好な結果が得られている。該担体としては、非常に好ましくは、Ｇｌｙｃｏｒｅｘ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ＡＳ（Ｓｗｅｄｅｎ）から商品名ＧＬＹＣＯＳＯＲＢ  ＡＢＯ（登録商標）として市販されているゲルまたは樹脂が挙げられる。
【００５３】
一例として、この担体を使用する場合、血液型Ａのエピトープに対応する三糖は以下の構造を有する：
【００５４】
【化１】
0005944543.tif 000002
【００５５】
Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）
ガラクトース（Ｇａｌ）
フコース（Ｆｕｃ）
【００５６】
また、例えば、この担体を使用する場合、血液型Ｂのエピトープに対応する三糖は以下の構造を有する：
【００５７】
【化２】
0005944543.tif 000003
【００５８】
好ましくは、血液型Ａおよび血液型Ｂと同様または類似の抗原基でグラフトされた担体混合物において、血液型Ａおよび血液型Ｂに対応するそれぞれの担体の割合は、２５／７５〜７５／２５（ｖ／ｖ）である。効果的には、ドナー集団の血液型の分布に従って、ドナー集団に対するカラム中の２種類の担体の割合を調整することが可能である。通常の使用では、カラムには、好ましくは、前記した各担体の５０／５０（ｖ／ｖ）混合物が充填されている。また長さが１５〜２５ｃｍ、直径が０．５〜１ｃｍの分析カラムを用いることができる。パイロット規模での適用では、長さが４０〜６０ｃｍ、幅が４０〜６０ｍｍのカラムを用いることができる。この場合、カラムに６００ｍＬのイムノアフィニティの担体を充填することが可能である。
【００５９】
該担体は、２サイクルの使用の間は１Ｍ  ＮａＯＨ中で貯蔵され、使用の前に、水で洗浄される。
【００６０】
次いで、イムノアフィニティクロマトグラフィのカラムには、担体１ミリリットル当たり、好ましくは０．２〜４リットル、特に好ましくは１〜２リットルの割合でＩｇＧ濃縮物が負荷される。前記担体が特異性を有するため、予めＩｇＧ画分のパッキング(packing)をすることは必要ではない。すなわち、先行技術において既知の血漿分画技術によって得られたあらゆるＩｇＧ画分または濃縮物が適切に本発明で用いられる。
【００６１】
該濃縮物の浸出（percolation）において、容離メカニズムは何ら伴わない。従って、ＩｇＧ濃縮物が得られる様式にかかわらず、濃縮物は、所望によりポンプを用いてカラムを通って浸出する。この浸出により、抗Ａおよび抗Ｂ抗体、および多反応性ＩｇＧのカラムでの保持が可能となる。好ましくは、カラムを次いで水で洗浄して、カラムのデッドボリュームに依然として存在するＩｇＧを回収する。
【００６２】
ＩｇＧ濃縮物を浸出させた後、本生産方法に由来する抗Ａおよび抗Ｂ抗体、および多反応性ＩｇＧが枯渇したＩｇＧ画分が得られる。抗Ａおよび抗Ｂ抗体は、それらの抗体の立体配座を修飾するクロマトグラフィの担体のそれぞれの抗原性モチーフ上に保持される。そして、本生産方法の間に生じた多反応性ＩｇＧも、この立体配座の変化によって露出する部位に保持される。二次的に保持されたこれらの多反応性ＩｇＧの親和性は、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の親和性よりもかなり低い。これらの保持されたＩｇＧの溶離は、浸出前のＩｇＧ濃縮物を通過させた後、ｐＨ３〜８．６において０．１〜１．５Ｍの濃度の、例えばアルカリ土類金属塩を含有する容離用緩衝液を使用することによって、分取することができる。
【００６３】
工程ｂ）の後、本発明の方法は、限外濾過および滅菌濾過による濃縮工程を含むことができる。
【００６４】
次いで、クロマトグラフィカラムおよび担体を、担体に保持された抗Ａおよび抗Ｂ抗体の脱着のために、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．８）のような酸溶液で洗浄する。次いで、この担体を水ですすぎ、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で処理する。
【００６５】
次いで、抗Ａおよび抗Ｂ抗体、および多反応性ＩｇＧが高度に枯渇したＩｇＧ濃縮物を濾過に付して、溶媒−界面活性剤処理では除去できなかった可能性のあるウイルスおよび／またはプリオンのような２０ｎｍを超えるサイズの他の粒子、生産工程の間に生じたＩｇＧポリマー、ミセルリポ多糖、凝集した核酸および蛋白質のような２０ｎｍよりも大きなサイズの他の粒子を除去する。該処理は、好ましくは、多孔度１００から１５ｎｍに減少させるフィルターを用いて行われ、特に好ましくは、直列に配列され(arranged in series)、１００、５０および２０ｎｍと保持閾値が減少する３つのフィルターで実行されるナノ濾過である。
【００６６】
本発明の方法では、工程ｃ）の後に、安定化剤を加えることにより、第一に、貯蔵の間のＩｇＧ濃縮物の安定性を確保し、第二に、凍結乾燥に関連するさまざまな局面でのＩｇＧの変性を妨げつつ、凍結乾燥を行う工程をさらに含むことができる。好ましくは、特許出願WO 2004/091656 A2に記載されたように、安定化単一製剤が加えられる。この安定化処方物は、医薬上許容され、ＩｇＧの２つの考えられる貯蔵形態、すなわち液体形態または凍結乾燥形態を安定化させ、これらのＩｇＧの治療効率を維持し、さらには改善するという目的に合致している。
【００６７】
他の実施形態によると、他の免疫グロブリンの選択的回収も、特許WO 02/092632 A1に記載されたように、可能である。
【００６８】
ＩｇＧ濃縮物は、所望により、引き続いて限外濾過による濃縮工程、それに続く滅菌濾過に付され、好ましくは４℃の領域における温度の瓶に貯蔵することができる。
【００６９】
先に概ね説明したように、本発明のＩｇＧ濃縮物では、抗Ａおよび抗Ｂ抗体含有量が欧州薬局方によって許容される閾値を大きく下回る。従って、欧州薬局方に記載された分析方法２．６．２０（１９９７）では、本発明のＩｇＧ濃縮物に非常に低いレベルで存在する対象抗体を検出するのには感度が不十分であるおそれがある。従って、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の検出に適用される、欧州薬局方におけるＩＣＴテストの検出閾値よりも低い検出閾値を必要とするこれらの抗体のための分析方法の開発が必要となる。
【００７０】
本発明のＩｇＧ濃縮物中の抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体についての該分析方法は：
ａ）Ｒｈ＋のＡ、Ｂおよび／またはＯ型の赤血球の懸濁液を調製し、それを較正（calibrate）する工程、
ｂ）生物学的に許容される緩衝液中において、０〜２００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲にわたってモノクローナル抗Ｄ抗体の溶液を調製する工程、
ｃ）ＩｇＧ溶液の試料またはモノクローナル抗Ｄ抗体の溶液と、該赤血球とを接触させ、得られた赤血球の混合物を所定時間インキュベートする工程、
ｄ）各赤血球混合物に、蛍光色素で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２の断片を加え、該赤血球をインキュベートすること、
ｅ）工程ｄ）で得られた赤血球の各混合物をフローサイトメトリーに付す工程、
ｆ）ＩｇＧ濃縮物中の抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体の含有量を決定する工程
よりなる工程を含む。
【００７１】
抗Ａおよび／または抗Ｂ抗体の含有量を決定するための該方法の１つの実施形態としては、０．８〜１．５ｗｔ％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有し、ｐＨ７．０〜７．４のＰＢＳ緩衝液において、Ａ、Ｂおよび／またはＯ型の赤血球の１％ｖ／ｖ懸濁液を調製することが挙げられる。懸濁液中の赤血球を、当業者に知られている通常のフローサイトメトリーデバイスでカウントし、次いで、懸濁液を、赤血球３７〜４３×１０６個／１ｍＬ懸濁液に較正する。
【００７２】
濃度０〜２００ｎｇ／１ｍＬ緩衝液のモノクローナル抗Ｄ抗体の溶液が調整され、好ましくは、この溶液は所望により０．８〜１．５ｗｔ％のウシ血清アルブミンＢＳＡを含有する、ｐＨ７．０〜７．４のＰＢＳ緩衝液である。こうして調製された各溶液を吸収測定によって測定して、そのモル吸光係数（ε）を決定する。
【００７３】
次いで、０．８〜１．５ｗｔ％のウシ血清アルブミンＢＳＡを含有し、ｐＨ７．０〜７．４のＰＢＳ緩衝液を用いて、本発明のＩｇＧ濃縮物を１〜５ｍｇ／ｍＬの値の範囲、好ましくは１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整する。
【００７４】
各血液型の赤血球の懸濁液５０〜１００μＬを、マイクロプレート、例えば、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れ、続いて、この赤血球の懸濁液中に５０〜１００μＬのＩｇＧ溶液、または５０〜１００μＬの抗Ｄ抗体溶液を入れる。
【００７５】
全体を、通常は３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で、１時間３０分〜２時間３０分の間、特に２時間インキュベートする。
【００７６】
次いで、得られた赤血球のさまざまな混合物を、好ましくは、前記したＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄し、遠心し、次いで、マイクロウェルプレートに入った赤血球の各混合物に対して、蛍光色素、例えばフィコエリスリンで標識されたＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を含有するＰＢＳおよびＢＳＡ緩衝液５０〜１００μＬを加える。
【００７７】
全体を暗所で２０〜３０分程度インキュベートさせる。
【００７８】
次いで、このようにして得られた赤血球の混合物を洗浄し、分析に供される化合物の蛍光を検出するデバイスを備える市販の適切な装置を用いるフローサイトメトリーに付す。
【００７９】
モノクローナル抗Ｄ抗体の濃度に対して平均蛍光強度（ＭＦＩ）が与えられ、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて直線回帰方程式が得られる。次いで、各試料について、直線回帰方程式を使用して抗Ｄ抗体同等物における濃度を得る。３つのバッチの試料を分析した後、平均濃度を決定し、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて変動係数を計算する。
【００８０】
本発明のＩｇＧ濃縮物における抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量は、そこから推定することができ、これは、好ましくは前記した含有量である。
【００８１】
好ましくは、前記ＩｇＧ濃縮物中での抗Ａおよび抗Ｂ抗体についての１つの分析方法は、本発明の状況に適合させたフローサイトメトリーによって行われ、その原理は、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量に比例した蛍光シグナルの検出を利用して、これらの抗体含有量の所望の特異的定量法に従って、血液型ＡまたはＢのヒト赤血球を用いることに基づく。
【００８２】
該分析方法は：
ａ）血液型ＡまたはＢの赤血球の懸濁液を調製し、較正すること、
ｂ）該赤血球をＩｇＧ溶液の希釈試料と接触させ、得られた混合物を所定の時間の間インキュベートすること、
ｃ）蛍光色素で標識されたＩｇＧ抗体の存在下で該赤血球をインキュベートすること、および、
ｄ）工程ｃ）で得られた赤血球の懸濁液をフローサイトメトリーに付すこと
よりなる工程を含む。
【００８３】
０．８〜１．５ｗｔ％のウシ血清アルブミンＢＳＡを含有し、ｐＨ７．０〜７．４のＰＢＳ緩衝液を用いてＡまたはＢ型の赤血球の１％（ｖ／ｖ）懸濁液を調製する。懸濁液中の赤血球を、その機能が当業者に知られた通常のフローサイトメトリーデバイスでカウントし、懸濁液を赤血球３７〜４３×１０６個／１ｍＬ懸濁液へと較正する。
【００８４】
この懸濁液５０〜１００μＬを９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに入れ、続いて、３０ｇ／Ｌの溶液から０．２３４ｇ／ＬのＩｇＧ溶液が得られるまで、２×２単位ずつで希釈された様々なＩｇＧ溶液を５０〜１００μＬの範囲で入れる。
【００８５】
全体を、通常は３０〜４０℃の範囲、好ましくは３７℃の温度で、１時間３０分〜２時間３０分の間、特に２時間インキュベートする。
【００８６】
次いで、赤血球を、前記ＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄し、遠心し、次いで、フィコエリスリンのような蛍光色素で標識された５０〜１００μＬのＦ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を各ウェルに加える。
【００８７】
前記工程ｃの後、全体を光から遠ざけて２０〜３０分程度インキュベートする。
【００８８】
次いで、得られた懸濁液を洗浄し、分析に供された化合物についての蛍光検出デバイスを備えた市販の適当な装置を用いてフローサイトメトリーに付す。
【００８９】
例えば、３種類のＩｇＧ濃縮物（Ｂ１、Ｂ２およびＢ３と称す）の抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量を、以下の表１に示す。Ｂ１は、Cohnの方法によるエタノール分画、Ｂ２は特許出願WO 02/092632、Ｂ３は特許出願WO 02/092632に続いて抗Ａおよび抗Ｂ抗体を取り除くためのイムノアフィニティクロマトグラフィ操作によってそれぞれ調製された。これらの抗体の含有量を、試料Ｂ１中の抗Ａおよび抗Ｂ抗体の対照力価を１と設定して比較した結果として示す。
【００９０】
【表１】
0005944543.tif 000004
【００９１】
この表中の結果により、第一に、Cohnの方法に従って調製されたＩｇＧ濃縮物（Ｂ１）の抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量は、WO 02/092632に記載された方法に従って調製されたＩｇＧ濃縮物（Ｂ２）における含有量よりも４倍程度少ないことが示される。また、特定のイムノアフィニティカラムを用いてこれらのＩｇＧ濃縮物を引き続いて処理すると（Ｂ３）、抗Ａ抗体の力価を約５倍、また抗Ｂ抗体の力価を約７倍低下させる。
【００９２】
抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量を決定するために、好都合に適用することができる別の方法としては、当業者に知られている補体であって、本発明の需要に応じて特別に設計された補体でのインビトロでの溶解が挙げられる。
【００９３】
この分析方法は：
ａ）Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＯ型の中から選択され、予めカウントされたパパイン処理済赤血球の懸濁液を、適切な放射性マーカーを用いて放射性標識する工程、
ｂ）放射性標識した赤血球を、所定の容量のＩｇＧ濃縮物の試料と接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）における容量と同じ容量の血液型ＡＢからの標準血清を加える工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物を所定の時間の間インキュベートする工程、および
ｅ）インキュベートして得られた溶液の放射活性を測定する工程
よりなる工程を含む。
【００９４】
血液型Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯのパパイン処理赤血球の１％（ｖ／ｖ）懸濁液を調製し、これを、次いで、マラッセ（Malasse）セルを用いてカウントし、１０６個の赤血球を得る。そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（赤血球１容量当たり１容量）を加え、全体を１時間〜２時間インキュベートし、次いで、放射性標識した赤血球を４〜６回洗浄する。
【００９５】
次いで、放射性標識した赤血球をＩｇＧ濃縮物の試料とを、例えば容量１００μＬにおいて、放射性標識した４〜６×１０６個の赤血球当たり、好ましくは１〜３ｍｇ／ｍＬ、特に１．２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃縮物と接触させる。
【００９６】
次いで、前記容量と同一の容量、例えば１００μＬの血液型ＡＢからの標準血清を前記混合物に加えて、別の補体因子を得る。
【００９７】
次いで、得られた反応混合物を、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃の温度で３〜５時間、特に好ましくは４時間インキュベートする。
【００９８】
次いで、反応混合物を好ましくは遠心し、インキュベートされた溶液の放射活性を適切な市販のデバイスを用いて測定する。測定された溶液の放射活性は、処理された赤血球の溶血の程度に比例するため、抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量に比例する。
【００９９】
例として、本発明のＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）、および市販の全ての濃縮物の中で最も低い溶血レベルを有する先行技術のＩｇＧ濃縮物（Ｃ１）を検討し、血液型Ａ、ＢおよびＡＢの赤血球について得られた溶血の程度を、以下の表２に示す。
【０１００】
【表２】
0005944543.tif 000005
【０１０１】
以下の実施例は、本発明の実施形態を説明するが、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１０２】
ＩｇＧ濃縮物の４０ｇ／Ｌ試料（Ｂ２）を、WO 02/092632に記載された方法に従って得る。
【０１０３】
長さが５０ｃｍ、直径が４４ｍｍのクロマトグラフィカラムに、血液型Ａおよび血液型Ｂのエピトープに対応する三糖をグラフトしたＧＬＹＣＯＳＯＲＢ  ＡＢＯ（登録商標）担体の混合物（Ａ型対応物／Ｂ型対応物＝５０／５０（ｖ／ｖ））を充填し、次いで、１２００ｍＬの水で予備洗浄工程に付す。
【０１０４】
ＩｇＧ濃縮物（Ｂ２）を、ポンプを用いて０．２Ｌ／ｍＬ担体の割合で、担体に注入する。一旦この容量がカラムから浸出すれば、注射用製剤（ＩＰ）のための最低量の水で洗浄して、カラムのデッドボリュームに存在するＩｇＧを回収する。
【０１０５】
抗Ａおよび抗Ｂ抗体、および多反応性ＩｇＧが枯渇したＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）を４０ｇ／Ｌ程度で回収し、次いで、これを限外濾過に付して、濃縮物を６０ｇ／Ｌとし、そしてナノ濾過に付して、直列に配列されて１００、５０および２０ｎｍの減少する保持閾値を有する３つのフィルター上でウイルスを除去する。
【０１０６】
グリシン（７ｇ／Ｌ）、マンニトール（３０ｇ／Ｌ）および２０ｐｐｍのＴｗｅｅｎ  ８０（登録商標）の混合物よりなる安定化剤を、濃度６０ｇ／ＬのＩｇＧ濃縮物に溶解させ、そしてＰＩ水（パイウォーター）を用いてＩｇＧ濃縮物の濃度を５０ｇ／Ｌに調整し、次いで、濃縮物を滅菌濾過に付し、瓶に分ける。
【実施例２】
【０１０７】
ＩｇＩＶ中の抗Ａ／Ｂの定量
１）分析の原理
１−１）ヒト赤血球の調製
Ｒｈ＋Ａ型、Ｒｈ＋Ｂ型またはＲｈ＋Ｏ型のヒト赤血球の懸濁液を、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含む）中の４０×１０６赤血球／ｍＬの濃度まで正規化する。
【０１０８】
１−２）モノクローナル抗Ｄレンジの調製
モノクローナル抗Ｄの製剤（Ｒ２９７と呼ばれる）について、ｐＨ７．４のそのＰＢＳ緩衝液に対する２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定する。蛋白質のモル吸光係数（ε）を、さまざまなアミノ酸におけるその組成に対して計算し、モノクローナル抗Ｄの濃度（Ｃ）を、式：
Ｃ＝ＯＤ／Ｅｌ（式中、ｌ＝ＯＤ測定を行うための容器の幅）
を適用することによって得る。
【０１０９】
０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲において、１２の濃度（２００；１５０；１００；７５；５０；２５；１２．５；６．２５；３．１３；１．５６；０．７８および０ｎｇ／ｍＬ）のモノクローナル抗Ｄ抗体を産生する。
【０１１０】
１−３）免疫グロブリン溶液の調製
市販のさまざまな静注用免疫グロブリンをテストした。これらの免疫グロブリンの主な特徴を、以下の表に詳細に記載する。
【０１１１】
【表３】
0005944543.tif 000006
【０１１２】
さまざまな免疫グロブリン製剤を、ｐＨ７．４のＰＢＳ（１％ＢＳＡを含む）緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍＬの濃度に調整する。
【０１１３】
１−４）赤血球の感作
丸底マイクロプレートにおいて、以下のものをウェル中に堆積させる：
・１ｍＬ当り４０×１０６個の赤血球を含む、Ｒｈ＋Ａ型、Ｒｈ＋Ｂ型またはＲｈ＋Ｏ型の赤血球の５０μＬの懸濁液、
・５０μＬの各レンジの抗Ｄ、または５０μＬの測定用の静注用Ｉｇ濃縮物試料。
そして、これらを３つのバッチで堆積させる。
次いで、プレートを撹拌下で３７℃で２時間インキュベートする。
【０１１４】
１−５）洗浄
プレートを７７０ｇで１分間遠心する。逆さにして上清を捨て、次いで、２００μＬの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを各ウェルに加える。該操作を３回繰り返す。
【０１１５】
１−６）コンジュゲートの添加および洗浄
フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｒｅｆ：ＰＮ  ＩＭ０５５０）で標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｆｃ特異的）をｐＨ７．４の１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で１／２０まで希釈し、次いで、この溶液５０μＬを各ウェル中で堆積させる。次いで、プレートを暗所で室温にて２０〜３０分間インキュベートする。パラグラフ１−５）に記載したように連続的に洗浄を３回行う。
【０１１６】
１−７）フローサイトメトリーの読み取り
赤血球の懸濁液を適切なプログラムを用いてフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００）から読み取る。読み取りは、５００００事象で行い、装置は各ドットまたは試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を自動的に計算する。
【０１１７】
１−８）結果の解釈
モノクローナル抗Ｄ抗体の濃度との関連でＭＦＩが得られ、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて直線回帰方程式が得られる。次いで、各試料について、同等な抗Ｄ抗体における濃度を、直線回帰方程式を用いて得る。試料を３反復で測定した後、平均濃度を決定し、Ｅｘｃｅｌソフトウェアを用いて変動係数（ＣＶ）を計算する。
【０１１８】
２）結果
【表４】
0005944543.tif 000007
【０１１９】
【表５】
0005944543.tif 000008
【０１２０】
３）結論
アフィニティ工程は抗Ａおよび抗Ｂ抗体の除去のために非常に有効である。市販のテストしたさまざまな免疫グロブリンの中では、製品ＩｇＮＧ２が最も少ない抗Ａおよび抗Ｂ抗体を含有する製品である。
【実施例３】
【０１２１】
血液型Ａの赤血球の１％（ｖ／ｖ）懸濁液を、１ｗｔ％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で調製する。赤血球の懸濁液を５０μＬ取り、流動を測定する内部標識溶液５０μＬと共にフローサイトメーターのチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ）に加える。懸濁液を赤血球４０×１０６個／ｍＬとなるよう較正する。
【０１２２】
８バッチのＩｇＧ溶液を、実施例１で得られたＩｇＧ濃縮物（ｖ／ｖ）（Ｂ３）を２倍ずつ連続的に希釈して調製した。最も濃度の高いバッチは３０ｇ／Ｌを有し、最も濃度の低いバッチは０．２３４ｇ／Ｌを有する。次いで、前記懸濁液５０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに入れ、続いて、５０μＬのさまざまな濃度に希釈されたＩｇＧ溶液を入れる。
【０１２３】
全体を３７℃、撹拌下で２時間インキュベートさせる。
次いで、各ウェルを１％ＢＳＡを含有する２００μＬのＰＢＳ緩衝液で洗浄し、マイクロプレートを２０００ｒｐｍで１分間遠心する。上清を除去した後、フィコエリスリン蛍光色素（Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で標識し、ＰＢＳ−ＢＳＡで１／２０まで希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２抗体の溶液５０μＬを加える。
【０１２４】
全体を暗所にて３０分間インキュベートさせる。
次いで、得られた懸濁液を前記したように洗浄する。
【０１２５】
各ウェルの残渣を１００μＬのＰＢＳ−ＢＳＡに溶解させる。マイクロプレートの各ウェルに入っている容量を、５００μＬのアイソフロー（Ｉｓｏ  ｆｌｏｗ）シース液（Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を加えたチューブに移し、次いで、データ獲得および結果の分析用のソフトウェアを備えたＣｏｕｌｔｅｒ−Ｂｅｃｋｍａｎｎ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ装置でのフローサイトメトリーに付す。蛍光分析を、各試料について測定する。
【０１２６】
同じ手順を血液型Ｂの赤血球について行う。
この操作モードを３つの異なるバッチのＩｇＧ（Ｂ３）について行い、Cohnの方法（先に引用）に従ってエタノール分画によって調製された３つの異なるバッチのＩｇＧ（Ｂ１）にも適用する。
【０１２７】
得られた結果を以下の表３に示す。
【表６】
0005944543.tif 000009
【実施例４】
【０１２８】
Ａ、Ｂ、ＡＢまたはＯ型のパパイン処理赤血球の１％（ｖ／ｖ）懸濁液を調製し、マラッセセルを用いてカウントし、１０６個の赤血球を得て、１００μＣｉの５１Ｃｒを加える（赤血球の１容量当たり１容量）。全体を１時間インキュベートし、次いで、放射性標識した赤血球を５回洗浄する。
【０１２９】
次いで、放射性標識した赤血球と実施例１で得られたＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）の試料とを、容量１００μＬにおいて、放射性標識した５×１０６個の赤血球に対して、１．２ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃縮物の割合で接触させる。
【０１３０】
次いで、前記１００μＬと同じ容量の血液型ＡＢからの標準血清を前記した混合物に加えて、さまざまな補体因子を得る。
【０１３１】
次いで、得られた反応混合物を３７℃の温度で４時間インキュベートする。
次いで、反応混合物を２０００ｒｐｍで１分間遠心し、インキュベートした上清溶液の放射活性を市販の適切なデバイスを用いて測定する。溶液の測定された放射活性は、処理された赤血球の溶血の程度、そして結果的には抗Ａおよび抗Ｂ抗体の含有量に比例する。
【０１３２】
同じ手順を、全てがＲｈ＋である血液型Ｂ、ＡＢおよびＯの赤血球について、また型Ｏ＋からの血清の試料について行う。この操作モードを３つの異なるバッチのＩｇＧ（Ｂ３）について行う。
【０１３３】
加えて、該手順を、３つのバッチのＩｇＧ濃縮物の市販の試料（Ｃ２〜Ｃ４と称する）、および陰性のコントロールとして含められ、Ｒｈ＋Ｏ型からの血清の試料（Ｃ５と称する）に適用する。
【０１３４】
溶液の測定された放射活性は、処理された赤血球の溶血の程度、そして結果的には赤血球に結合した抗Ａおよび抗Ｂ抗体の量に比例する。
【０１３５】
溶血の結果を以下の表４に示す。
【表７】
0005944543.tif 000010
【０１３６】
得られた結果は、本発明に従ってアフィニティクロマトグラフィに付されたＩｇＧ濃縮物Ｂ３が、最も低い抗Ａおよび抗Ｂ抗体を含有することを示す。なぜなら、Ｂ３ではさまざまな血液型に由来する赤血球の溶血パーセンテージが最も低いからである。
【０１３７】
陰性対照として含めた表現型Ｏ＋の赤血球では溶血は観察されない。
【実施例５】
【０１３８】
実施例１に記載した（イムノアフィニティクロマトグラフィ前の）ＩｇＧ濃縮物（Ｂ２）およびこのクロマトグラフィ後におけるＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）の多反応性の測定。
これらのＩｇＧ濃縮物の多反応性の測定を、多反応性ＩｇＧと反応する２つの抗原を用いて特許出願EP 1 059 088に従って行う。これらはジニトロフェニル基（ＤＮＰアルブミン）によって修飾されたミオシンおよびアルブミンである。
【０１３９】
表５に、ＩｇＧ含有量を参照として任意に１に設定した、実施例３の試料Ｂ２、Ｂ３およびＣ４における多反応性ＩｇＧの濃縮係数（enrichment factor）を示す。
【０１４０】
これらの測定は、検討中のＩｇＧ濃縮物の３つの異なるバッチについて行った。
【表８】
0005944543.tif 000011
【０１４１】
これらの結果は、本発明のＩｇＧ濃縮物Ｂ３が先行技術の濃縮物Ｃ４よりも５〜８倍多反応性の低いＩｇＧを含有することを示す。
【実施例６】
【０１４２】
抗Ａおよび抗Ｂ抗体、および多反応性ＩｇＧが枯渇したＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）の効果を、ＩｇＧ濃縮物（Ｂ１）と比較する実施例
テストは、本発明のＩｇＧ濃縮物の免疫変調活性を評価する目的で処理されたＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ受容体が欠乏したマウスを用いた。これらの動物を、血小板減少性紫斑病のモデルとして用いた。
【０１４３】
対照として、Cohnに従ってエタノール分画によって得られたＩｇＧ濃縮物（Ｂ１）を用いた。
【０１４４】
実験プロトコルは、Teeling J.L.ら(Blood, 15/08/2001, vol.98, number 4, pp. 1095 - 1099）によって記載されたプロトコルであった。
【０１４５】
抗血小板モノクローナルＩｇＧの注射によって９×１０８個／ｍＬから２×１０８個／ｍＬに破壊された血小板は、１ｇ／ｋｇである治療用量のＩｇＧ濃縮物Ｂ１およびＢ３で処理された動物において７×１０８個／ｍＬまで上昇した。
【０１４６】
本発明によるＩｇＧ濃縮物（Ｂ３）の免疫変調活性は、イムノアフィニティクロマトグラフィによって改変されなかった。
なお、本発明は、実施の態様として以下の内容を含む。
〔態様１〕
インビトロの間接クームス試験について陰性の結果をもたらす含有量の抗Ａおよび抗Ｂ抗体をそれぞれ有することを特徴とする、治療用の免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の濃縮物。
〔態様２〕
態様１の濃縮物において、前記抗Ａ抗体の含有量が２３ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ以下であり、かつ前記抗Ｂ抗体の含有量が２０ｎｇ／ｍｇ  ＩｇＧ以下である免疫グロブリンＧの濃縮物。
〔態様３〕
態様１または２のいずれかの濃縮物において、全ＩｇＧ含有量に対する多反応性ＩｇＧの含有量が、０．０１％〜０．１％、特に０．０７〜０．１％である免疫グロブリンＧの濃縮物。
〔態様４〕
態様１〜３のいずれかの濃縮物において、前記濃縮物の貯蔵を行うための安定化剤を含有する濃縮物。
〔態様５〕
態様１〜４のいずれかの濃縮物において、前記安定化剤が、糖アルコール、グリシンおよびノニオン性界面活性剤の混合物であり、好ましくは糖アルコールがマンニトールまたはソルビトールである濃縮物。
〔態様６〕
態様１〜５のいずれかの濃縮物において、静脈内経路を介して注射することができる濃縮物。
〔態様７〕
ａ）ウイルス不活化工程に関連する、エタノール分画および／またはクロマトグラフィ分離によってＩｇＧ濃縮物を調製する工程、
ｂ）該ＩｇＧ濃縮物をイムノアフィニティクロマトグラフィのカラムに通して浸出させる工程であって、該イムノアフィニティクロマトグラフィでは、血液型Ａへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体と、血液型Ｂへの抗原類似性を有するオリゴ糖基がグラフトされたマトリックスを有する担体との混合物をカラムに充填させてイムノアフィニティクロマトグラフィを行う工程、および
ｃ）濾過によって、２０ｎｍよりも大きなサイズのウイルスおよび／または粒子を除去する工程
を含む、態様１〜６のいずれか記載のＩｇＧ濃縮物を得る方法。
〔態様８〕
態様７の方法において、前記工程ａ）が、血漿から、または血漿のＩｇＧの豊富な画分から脂質汚染物を沈殿させる予備的精製工程と、アルカリ性ｐＨで行うアニオン交換樹脂を用いて行われる単回のクロマトグラフィ工程と、さらにｐＨ４〜７の適切な緩衝液を用いて単工程でＩｇＧを選択的に溶離させる工程とを含む方法。
〔態様９〕
態様７または８において、前記オリゴ糖基が、血液型ＡおよびＢのエピトープに対応する三糖である方法。
〔態様１０〕
態様９において、血液型Ａのエピトープに対応する前記三糖が構造Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）−ガラクトース（Ｇａｌ）−フコース（Ｆｕｃ）を有し、血液型Ｂのエピトープに対応する三糖が構造ガラクトース−ガラクトース−フコースを有する方法。
〔態様１１〕
態様７〜１０のいずれかにおいて、前記ウイルス不活化工程が溶媒−界面活性剤を用いて行われる方法。
〔態様１２〕
態様７〜１１のいずれかにおいて、血液型Ａおよび血液型Ｂに対する抗原類似性を有するオリゴ糖基でグラフトされた担体混合物が、血液型Ａおよび血液型Ｂに対応するそれぞれの担体について、２５／７５〜７５／２５（ｖ／ｖ）、好ましくは５０／５０（ｖ／ｖ）の各割合を有する方法。
〔態様１３〕
態様７〜１２のいずれかにおいて、限外濾過および滅菌濾過によって濃縮する工程を含む方法。
〔態様１４〕
態様７〜１３のいずれかにおいて、ウイルスを除去するための濾過が、ナノ濾過によって行われる方法。
〔態様１５〕
態様７〜１４のいずれかにおいて、工程ｃ）の後に、前記ＩｇＧ濃縮物を貯蔵するための安定化剤を加える工程を含む方法。
〔態様１６〕
ａ）血液型ＡまたはＢの赤血球の懸濁液を調製し、それを較正する工程、
ｂ）該赤血球をＩｇＧ溶液の希釈試料と接触させ、得られた混合物を所定の時間インキュベートする工程、
ｃ）蛍光色素で標識された抗ＩｇＧ抗体の存在下で該赤血球をインキュベートする工程、および
ｄ）工程ｃ）で得られた赤血球の懸濁液をフローサイトメトリーに付す工程を含む、態様１〜６のいずれかに記載される免疫グロブリンＧの濃縮物における抗Ａおよび抗Ｂ抗体の分析方法。
〔態様１７〕
ａ）Ａ、Ｂ、ＡＢおよびＯ型の中から選択され、予めカウントされたパパイン処理済赤血球の懸濁液を、適切な放射性マーカーを用いて放射性標識する工程、
ｂ）放射性標識した赤血球を、所定容量のＩｇＧ濃縮物の試料と接触させる工程、
ｃ）工程ｂ）における容量と同一容量であるＡＢ型の標準血清を加える工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた混合物を所定の時間インキュベートする工程、および
ｅ）インキュベートして得られた溶液の放射活性を測定する工程
を含む、態様１〜６のいずれかに記載される免疫グロブリンＧの濃縮物における抗Ａおよび抗Ｂ抗体の分析方法。