(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディスク面におけるグルーブおよびランドからなる溝構造またはピットが設けられた構造を有するトラック領域に固定化された、生体高分子が結合している標識用ビーズを、光学的読み取り手段によって数量を計測するための試料分析用ディスクにおいて、
前記標識用ビーズの直径が、前記グルーブまたは前記ピットの幅より小さく且つ前記グルーブまたは前記ピットの幅方向に前記標識用ビーズが１個のみ配置される大きさであり、前記標識用ビーズの直径Ｒと、前記グルーブまたは前記ピットの幅Ｗとの比率Ｒ／Ｗが、０．６≦Ｒ／Ｗ＜１．０の関係を満たし、且つ、前記グルーブまたは前記ピットの幅Ｗと、前記試料分析用ディスクの半径方向において隣接する前記グルーブまたは前記ピットとの周期Ｔとの比率Ｗ／Ｔが、０．６５≦Ｗ／Ｔの関係を満たし、さらに、前記グルーブまたは前記ピットの深さＤと、前記光学的読み取り手段におけるレーザ光の波長λが、λ／２０≦Ｄ≦λ／５の関係を満たし、
前記標識用ビーズの直径は、前記光学的読み取り手段における光スポットの直径よりも小さく、
前記標識用ビーズの表面における光の反射率は、前記トラック領域における面の光の反射率より高い反射率であることを特徴とする、試料分析用ディスク。
【請求項２】
前記標識用ビーズは、前記グルーブまたは前記ピットの内部のみに固定化される構造としたことを特徴とする、
請求項１に記載の試料分析用ディスク。
【請求項３】
前記トラック領域における面の反射率ＲSに対する、前記標識用ビーズの表面における反射率ＲBの比率ＲB／ＲSが、ＲB／ＲS≦０．５の関係を満たすことを特徴とする、請求項１に記載の試料分析用ディスク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学的な方法により血液等の生体試料に含まれる抗原もしくは抗体などの生体高分子を分析するための、試料用分析ディスクに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、疾患の診断や健康診断における疾病の早期発見などを目的として、血液等に含まれる生体試料から抗原や抗体を検出する免疫検査法（イムノアッセイ）が様々な場面で用いられている。免疫検査法（イムノアッセイ）とは、生体試料に含まれる特定の抗原（または抗体）と特異的に結合する抗体（または抗原）に測定が可能な標識をつけ、両者が反応した結果を定量することで試料に含まれる抗原（または抗体）の濃度を求め疾患の判定を行う方法である。
【０００３】
この方法は比較的感度が高く、操作方法が簡単であることから様々な標識方法が開発された。例えば標識に放射性同位元素を使ったRIA法（ラジオイノムアッセイ）や酵素を利用したEIA法（エンザイムイムノアッセイ）、蛍光標識を使ったFIA法、化学発光を使ったCLIA法などがある。
【０００４】
中でも酵素を利用した方法のひとつであるELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）はマイクロプレートを用いた検査方法が広く一般に普及して利用されている。マイクロプレートを使った方法は、９６穴プレートと汎用のマイクロプレートリーダーを用いて多数の検体を一度に測定することが可能で、コストが比較的安価である。また、放射性物質を使うRIA法と比べ、使用する場所の制限が少ないといったメリットがある。しかしながら、プレートに抗体を固定する前処理、抗体と抗原を反応させる反応時間、反応しなかった標識を洗い流すB/F（bond/free）分離、標識の酵素反応などそれぞれに数十分から数時間を要し、トータルの検査時間は数時間から１日程度かってしまうという問題がある。
【０００５】
このため検査時間を短縮するために、微細加工の技術を利用してマイクロプレートの各ウェルでの操作手順を数センチ角のチップ上に置き換えた分析用チップ（Lab on a chip）も開発されている。抗体の固定や専用の試薬をチップ上に準備し、一般的なELISA法の前処理をあらかじめチップに施しておくことで処理時間を短縮する。また、抗原−抗体反応を数十マイクロメートルから数ミリメートルの狭い流路の中で行うことで反応時間を短縮している。これは、各検査用に専用の分析チップとすることで、検査時間を数十分に短縮することが可能としている。従来、患者の検体を採取した後、検査室に送り結果が出るまでに長い時間がかかっていた検査が、心筋マーカーなど一部の検査においては、診察室や患者のベッドサイドでの検査、いわゆるPOCT（ポイント・オブ・ケア・テスト）が可能な機器が開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００４−５３３６０６号公報
【特許文献２】特表２００６−５２１５５８号公報
【特許文献３】特表２００２−５３０７８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１および特許文献２には、多検体を同時に検査が可能というマイクロプレートの利点と、短い時間で検査結果が得られる分析用チップの利点を合わせた特徴を持つ分析デバイスとして、円盤型の分析デバイスが提案されている。具体的には、円盤状のデバイスに複数のマイクロチャネル構造を設け、試料に含まれる物質を反応させるための固相物質が流路の一部に充填されている。蛍光色素等の標識をレーザにより励起して得られる蛍光の強度を光検出器によって検出することにより測定が行われる。また特許文献３には、ディスクを使用した方法で、光ディスクの構造を利用した方法が開示されている。光ディスクのトラック形状が形成されている面と同一の面に生体試料や粒子を付着させ、光ピックアップを用いて信号の変化を検出する方法が示されている。
【０００８】
特許文献１および特許文献２の方法は、ディスク上に設けられた流路に試料を展開し試薬と反応した結果を蛍光強度や吸光度の変化として検出し、試料に含まれる抗原や抗体の量を測定している。検出方法としてはウェルプレートを用いた方法と原理的に同じであり、溶液中に含まれる標識物質の濃度を蛍光や吸光度で測定している。そのため、定量的な測定が出来る濃度範囲が狭く、濃度の高い試料については数段階に希釈した複数のサンプルを用意する必要があった。一方、低濃度の試料を感度良く検出する方法として特許文献３では光ディスクのフォーカス面にラッテックスビーズや磁気ビーズを結合させて検出する方法が示されているが、標識用ビーズの大きさとグルーブのサイズに関する最適な記述がなく、例えばビーズの直径がグルーブの幅の半分以下の場合、グルーブ内に複数のビーズが載置されることになり、試料を精度良く検出することが困難となってしまう。
【０００９】
反対に標識用ビーズの直径がグルーブの幅よりも大きい場合、トラッキング信号を乱したり、隣接トラックでのクロストークが発生したりするなど、試料の定量性に問題を与える。さらには、トラッキング信号を得るための凹凸構造のサイズと標識用ビーズの大きさおよび基板の反射率と標識用ビーズの反射率に対して最適な条件が存在し、不適切な条件下では全く信号が検出できないなどの問題を生じる。
【００１０】
本発明はこのような問題点に鑑みなされたものであり、分析する試料に含まれる抗原や抗体を高い精度で検出が可能な、試料分析用ディスクを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、第１の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、ディスク面におけるグルーブ（１０７）およびランド（１０８）からなる溝構造またはピット（１０９）が設けられた構造を有するトラック領域（１０５）に固定化された、生体高分子が結合している標識用ビーズを（１１０）、光学的読み取り手段によって数量を計測するための試料分析用ディスク（１００）において、前記標識用ビーズ（１１０）の直径が、前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の幅より小さく且つ前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の幅方向に前記標識用ビーズ（１１０）が１個のみ配置される大きさであり、前記標識用ビーズ（１１０）の直径Ｒと、前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の幅Ｗとの比率Ｒ／Ｗが、０．６≦Ｒ／Ｗ＜１．０の関係を満たし、且つ、前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の幅Ｗと、前記試料分析用ディスク（１００）の半径方向において隣接するグルーブ（１０７）またはピットと（１０９）の周期Ｔとの比率Ｗ／Ｔが、０．６５≦Ｗ／Ｔの関係を満たし、さらに、前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の深さＤと、前記光学的読み取り手段におけるレーザ光の波長λが、λ／２０≦Ｄ≦λ／５の関係を満たし、前記標識用ビーズ（１１０）の直径は、前記光学的読み取り手段における光スポット（１２０）の直径よりも小さく、前記標識用ビーズ（１１０）の表面における光の反射率は、前記トラック領域（１０５）における面の光の反射率より高い反射率であることを特徴とする。
【００１５】
第２の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、第１の発明において、前記標識用ビーズ（１１０）は、前記グルーブ（１０７）または前記ピット（１０９）の内部のみに固定化される構造としたことを特徴とする。
【００１７】
第３の発明に係る試料分析用ディスク（１００）は、第１の発明において、前記トラック領域（１０５）における面の反射率ＲSに対する、前記標識用ビーズ（１１０）の表面における反射率ＲBの比率ＲB／ＲSが、ＲB／ＲS≦０．５の関係を満たすことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の試料分析用ディスクによれば、光ディスクの情報を再生する光学ピックアップと同様の構成で検出が可能であり、装置の小型化、低価格化が可能となる。また、標識用ビーズを高い精度で測定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明に係る試料分析用ディスクの読み取り装置の概念ブロック図
【図２】本発明に係る試料分析用ディスクの構成概念図
【図３】本発明に係る試料分析用ディスクにおけるトラック領域の断面模式図
【図４】本発明に係る試料分析用ディスクの断面構造とビーズの読み取り状態を表した模式図
【図５】試料分析用ディスク上における試料の反応を示す模式図
【図６】試料分析用ディスク上における試料の反応を示す模式図
【図７】本発明に係る試料分析用ディスクの製造工程を説明する模式図
【図８】本発明に係る試料分析用ディスクを用いた、標識用ビーズ検出信号例
【図９】標識用ビーズ検出信号の比較例
【図１０】グルーブおよびピットと標識用ビーズの反射光による信号レベルの例を表した模式図
【図１１】標識用ビーズの反射率に対する反射光による信号出力の割合を表した図
【図１２】グルーブおよびピットと標識用ビーズの反射光による信号レベルの例を表した模式図
【図１３】標識用ビーズの反射率に対する反射光による信号出力の割合を表した図
【図１４】グルーブ深さに対する、標識用ビーズが存在する場合と存在しない場合の検出信号の大きさを示した図
【図１５】基板の反射率と標識用ビーズの反射率の比率に対する変調度の大きさを示した図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
図１は、本発明における試料分析用ディスク１００を光学的に読み取り、抗体や抗原の検出を行う読み取り装置１の構成ブロック図である。
【００２１】
読み取り装置１の構成は、データやコンテンツ情報が記録された光ディスクを読み取る装置と同一の構成である。読み取り装置１は、スピンドルモータ２、対物レンズ３、アクチュエータ４、ビームスプリッタ５、レーザ発振器６、コリメータレンズ７、集光レンズ８、光検出部９、制御部１０を備える。
【００２２】
制御部１０は、回転制御部１１、計測部１２、フォーカス・トラッキング制御部１３を備える。読み取り装置１の構成は、上記以外にも必要に応じて他の要素を備えてもよい。
【００２３】
スピンドルモータ２は、回転制御部１１の制御によって試料分析用ディスク１００を所定の回転速度で回転させる。対物レンズ３は、例えば開口数（NA）が０．８５の対物レンズであり、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させる。
【００２４】
アクチュエータ４は、フォーカス・トラッキング制御部１３の制御によって、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させるための調整を行う、例えば２軸のアクチュエータである。ビームスプリッタ５は、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を対物レンズ３の方向に反射させるとともに、試料分析用ディスク１００からの反射光を光検出部９に導く。
【００２５】
レーザ発振器６は、例えばBlu-ray（BD）ディスクの再生用と同一の波長４０５ｎｍの半導体レーザ発振器である。コリメータレンズ７は、レーザ発振器６から出力されたレーザ光を並行な光束とする。
【００２６】
集光レンズ８は、ビームスプリッタ５より導かれた光を光検出部９に導く。光検出部９は、フォトダイオードであり、試料分析用ディスク１００から反射された光の光量に対応する検出信号を計測部１２およびフォーカス・トラッキング制御部１３に出力する。
【００２７】
制御部１０は、例えばＣＰＵ（Central Processing Unit）やＤＳＰ（Digital Signal Processor）により構成され、図示しない記憶部等を備える。制御部１０は、図示しない操作部による操作に応じた各種制御、光検出部９により出力された検出信号に基づく各種制御等を行う。上記各種制御のうち、本発明の説明に必要な制御として、回転制御部１１による制御、計測部１２による制御、フォーカス・トラッキング制御部１３による制御がある。回転制御部１１、計測部１２、フォーカス・トラッキング制御部１３は、制御部１０における処理やプログラム等によって実現される。
【００２８】
回転制御部１１は、スピンドルモータ２を制御し、試料分析用ディスク１００を所定の回転数で回転させる。計測部１２は、光検出部９により出力された検出信号よりＲＦ信号を生成し、生成したＲＦ信号によりグルーブ１０７やピット１０９上に固定化された標識用ビーズ１１０を計数する。
【００２９】
フォーカス・トラッキング制御部１３は、光検出部９により出力された検出信号よりＦＥ（フォーカスエラー）信号やＴＥ（トラッキングエラー）信号を生成し、生成した各信号の値によって、アクチュエータ４等を制御し、試料分析用ディスク１００の読み取り面に集光させる制御や、トラックに追従させる制御を行う。
【００３０】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００の構造について、図２から図４を用いて説明する。図２は、本発明に係る試料分析用ディスク１００の概念図である。
【００３１】
試料分析用ディスク１００は、例えばＣＤ（Compact Disc）やＤＶＤ（Digital Versatile Disc）等と同じ直径の円盤形状であり、素材もポリカーボネートなど同様な素材を用いる。
【００３２】
試料分析用ディスク１００は、内周側に複数の注入孔１０１を、試料分析用ディスク１００の中心Ｏに対して回転対象に備えられる。注入孔１０１は、分析対象となる試料を滴下させるための孔であり、その容積は検査に必要な試料を計量する大きさになっている。具体的には、試料は注入孔１０１の容積を注入可能となっており、注入された試料は、試料分析用ディスク１０１の回転により、後述する流路１０２を伝わり、検出領域１０４において標識用ビーズ１１０が検出されるために適切な量である。
【００３３】
また、注入孔１０１の各々からは滴下された試料が流れる流路１０２が、試料分析用ディスク１００の中心Ｏから見て放射状に備えられる。さらに、流路１０２の各々に接続され、試料分析用ディスク１００の外周部に位置する検出領域１０４が備えられる。また、流路１０２の一部には、試料に含まれる特定の抗原に対して結合する抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が規定量充填されているビーズ充填部１０３が備えられる。
【００３４】
検出領域１０４の面積は、流路１０２を通過して流れてきた試料が、検出領域１０４において均等に広がり、確実に検出されるよう、接続されている流路１０２の面積より大きく構成されている。
【００３５】
試料分析用ディスク１００は、ディスク上で抗原、抗体、標識用ビーズなどの試料の反応操作を施すエリアを設けるために、ＭＥＭＳ等のプロセスを利用し、流路２２を設けた分析ディスクとすることも可能である。
【００３６】
さらに、試料分析用ディスク１００の外周部には、検出領域を含むように、光ディスクの信号面と同様の構造である、スパイラル状のグルーブ１０７またはピット１０９が形成されるトラック領域１０５が備えられる。トラック領域１０５にグルーブ１０７が形成されていることにより、試料分析用ディスク１００の読み取り面には、図３（ａ）に示すように、溝となるグルーブ１０７とランド１０８とが存在する。また、トラック領域１０５にピット１０９が形成されている場合は、図３（ｂ）に示すように、スパイラル状にピット１０９が形成されている。
【００３７】
このため、図３（ａ）においては、グルーブ１０７が凹部１２０であり、ランド１０８が凸部１２１である。また、図３（ｂ）においては、ピット１０９が凹部１２０であり、ピット１０９以外が凸部１２１となる。
【００３８】
図４は、試料分析用ディスク１００の断面構造と標識用ビーズ１１０の読み取り状態を表した模式図である。試料分析用ディスク１００の内周側には、注入孔１０１と、注入孔１０１に連続している深さ１００μｍから５００μｍの流路１０２が形成されており、分析対象の試料が通過する流路１０２の一部に特定の抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が充填されているビーズ充填部１０３が備えられる。また、試料分析用ディスク１００の読み取り面側は、保護層１０６が設けられている。保護層１０６は、流路１０２、ビーズ充填部１０３および検出領域１０４を覆うように設けられていてもよい。図４においては、検出領域１０４の上方にグルーブ１０７またはピット１０９が形成されている。
【００３９】
図４において、試料分析用ディスク１００がBlu-rayディスクである場合は、厚さが０．１ｍｍの保護層１０６を通して信号を読み取るように規格が定められている。一般的なBlu-ray用光ピックアップの対物レンズは、上記の保護層１０６の表面までの距離（作動距離）が０．３ｍｍから０．４ｍｍ程度で設計されているものが多い。
【００４０】
Blu-rayディスクのように、集光したレーザ光でディスク表面を直接走査して標識用ビーズ１１０を検出することも可能であるが、可能な限り微小なゴミなどが検出領域１０４内に存在させないようにするためにも、図４に示すように流路１０２を設けた構造の試料分析用ディスク１００にすることが適切である。
【００４１】
この場合、流路１０２の深さに対して検出領域１０４で試料が展開される厚さ方向のスペースは、対物レンズの作動距離以下に薄くすることが好ましい。一方、ＤＶＤの光学系を利用した場合は、厚さ０．６ｍｍの基板を介してレーザ光を検出領域１０４の表面に集光させることが出来るため、ゴミなどの不必要因子は検出領域の上部に保護層１０６を設置することで安易に回避できる。
【００４２】
抗原−抗体反応は溶液中で抗原と抗体が接触することで反応し標識用ビーズ１１０と分析対象の抗原が結合する。一般にイムノアッセイで対象としている抗原の溶液中の濃度は非常に薄い。そのため流路１０２の大きさを小さくし、狭い領域に多くの標識用ビーズ１１０を充填し反応効率を上げることで短時間に標識用ビーズ１１０と結合するようにする。
【００４３】
ビーズ充填部１０３において試料と反応した標識用ビーズ１１０は試料分析用ディスク１００の回転による遠心力でさらに外側の領域に流れ検出領域１０４に展開される。検出領域１０４は光ディスクと同様にグルーブ１０７やピット１０９が設けられている。ＢＤの場合、厚さ０．１ｍｍの保護層１０６を通して信号を読み取るように規格が定められている。一般的なＢＤ用光ピックアップの対物レンズ３は、保護層１０６までの距離（作動距離）が０．３ｍｍから０．４ｍｍ程度で設計されているものが多い。よって、装置の設計余裕を考慮すると流路１０２の深さに対して検出領域１０４で試料が展開される厚さ方向のスペースは薄くすることが好ましい。図４においては、流路１０２の深さと検出領域１０４の深さを階段的に異なる構成としているが、流路１０２において徐々に薄くしていってもよい。
【００４４】
また標識用ビーズ１１０を１個ずつ計数するために、流路１０２に充填されている標識用ビーズ１１０が厚さ方向に重ならない十分な面積となる必要がある。検出領域１０４の面積は、流路１０２に充填された標識用ビーズ１１０の個数と標識用ビーズ１１０の直径から決まる面積を掛けた面積よりも、グルーブ１０７もしくはピット１０９の面積が大きくなるように作られている。標識用ビーズ１１０に磁気ビーズを使用した場合には、磁気によりグルーブ１０７やピット１０９の形成された面に標識用ビーズ１１０を誘導することで反応時間を短縮することも出来る。
【００４５】
試料分析用ディスク１００の構造がグルーブ構造またはピット構造の場合、検出領域１０４に捕捉されている標識用ビーズ１１０の位置を、対物レンズ３により集光されたスポット光が通過した場合、反射した反射光の位相が変化し、光検出部９で得られる検出信号の光量が変化する。標識用ビーズ１１０の直径がＢＤの最短ピット長とほぼ等しい場合、トラック上に標識用ビーズ１１０が１個から検出することが出来る。
【００４６】
標識用ビーズ１１０を検出する位置は試料分析用ディスク１００の検出領域１０４、すなわちトラック領域１０５としてグルーブ１０７やピット１０９を有する部分で流路１０２と接続されている部分である。トラック領域１０５において、流路１０２と接続していない部分には、予めアドレス信号として記録しておくことで半径方向とトラック方向の情報を得ることが出来る。このため、記録されているアドレス情報に基づき、標識用ビーズ１１０が検出された位置を特定することができる。
【００４７】
その他の方法として、グルーブ構造の場合はグルーブ１０７をカッティングする際にディスクの半径方向にうねりを生じるように試料分析用ディスク１００を製作し、その変動をＴＥ信号から検出して、周波数からディスク上のアドレスを計算する方法であるウォブル検出を利用しても良い。
【００４８】
また、信号面にＢＤ―ＲやＢＤ−ＲＷのような記録型または追記型のディスクと同様な相変化材料や色素材料を用いることで情報を追記することも可能である。例えば滴下した試料のIDナンバーを追記することで、装置から一旦試料分析用ディスク１００を取り出し、再び分析のために装置で読み取る場合の試料の特定に利用する。また、すでに利用済みの試料分析用ディスク１００の分析領域に誤って別の試料を滴下してしまうことを防止することが出来る。
【００４９】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００を用いた、分析用試料の分析について、図５および図６に基づき説明する。
【００５０】
注入孔１０１より試料が注入され、読み取り装置１によって試料分析用ディスク１００を回転させると滴下された試料は遠心力により抗原−抗体反応のための流路１０２に導かれる。流路１０２につながるビーズ充填部１０３には試料に含まれる特定の抗原に対して結合する抗体が修飾された標識用ビーズ１１０が予め規定量充填されている。
【００５１】
標識用ビーズ１１０は直径が１００ｎｍから１μｍ程度の大きさのポリマー粒子、または内部にフェライト等の磁性材料を含む磁気ビーズ等を用いる。また、金コロイドなどの金属微粒子やシリカビーズ等を用いることも可能である。標識用ビーズ１１０の直径は、検出に利用する光学系により最適な大きさが決定する。光学的解像限界ｄは使用するレーザの波長λと、対物レンズの開口数ＮＡから、次式のように表すことができる。
【００５２】
光学系を限定しなければこの範囲ではないが、現在一般に普及している光ディスクの中で、もっとも高解像度のものはＢｌｕ−ｒａｙ  Ｄｉｓｃ（ＢＤ）で波長４０５ｎｍの半導体レーザの光を開口数（ＮＡ）０．８５の対物レンズでディスク上にスポットを集光させることができる。ＢＤの信号の最短ピット長は約１５０ｎｍである。したがって、ＢＤの光学系を利用する場合には、上記光学的解像限界ｄを表す式より、標識用ビーズ１１０の大きさは直径およそ１２０ｎｍ程度の大きさまで信号として検出することが出来る。既存の光ディスクのドライブ、特に光ピックアップに利用されている部品を利用することが出来れば、現在高額な分析装置と同等もしくはそれ以上の高精度な生体高分子が測定（検出）できる分析装置を非常に安価に製造することが出来るという利点がある。
【００５３】
また、標識用ビーズ１１０の表面には試料に含まれる抗原２００と特異的に結合する抗体２１０をあらかじめ結合させておく。抗体２１０の種類には様々なものがあり、例えばB型肝炎の検査の場合には血液中に含まれるHBｓ抗原と特異的に結合するHBｓAgモノクローナル抗体を標識用ビーズ１１０に修飾しておく。修飾する抗体２１０の種類は検出する抗原２００の種類にあわせ特異的に結合するものを選択する。
【００５４】
流路１０２中のビーズ充填部１０３で抗体２１０が修飾された標識用ビーズ１１０と試料が混合されると、試料に含まれる抗原２００が標識用ビーズ１１０の表面に修飾された抗体２１０と結合し、標識用ビーズ１１０、抗体２１０、抗原２００の複合物が形成される。
【００５５】
この段階で溶液中には試料に含まれる抗原２００の量に応じて、抗原２００と抗体２１０が反応した複合物の標識用ビーズ１１０と、抗原２００と反応していない標識用ビーズ１１０が一定の割合で存在している。さらに試料分析用ディスク１００の回転に伴う遠心力により、流路１０２で反応した溶液を外周部の検出領域１０４に展開させる。
【００５６】
検出領域１０４上面には、流路１０２の底面が接する面が、光ディスクの信号面と同様に、スパイラル状のグルーブ構造またはピット構造となっている。グルーブ構造の場合、グルーブ１０７の幅は標識として使用する標識用ビーズ１１０の直径とほぼ同じ幅になっていることが好ましい。また、ピット構造の場合は、各ピット１０９の幅が標識用ビーズ１１０の直径とほぼ同じ幅になっていることが好ましい。
【００５７】
グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅に対して、標識用ビーズ１１０の直径に小さく例えば半分以下の直径である場合、グルーブ１０７内に複数個の標識用ビーズ１１０が凝集して固定化され、試料を精度良く検出することが困難となってしまう。そのため、グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅は、標識用ビーズ１１０の大きさと同じかそれ以下が好ましく、標識用ビーズ１１０が２個以上固定化しないためには、標識用ビーズ１１０の大きさは、グルーブ１０７もしくはピット１０９の幅に対して、最低でも半分以上である必要がある。好ましくは、標識用ビーズ１１０の直径（大きさ）Ｒと基板表面上の微細凹凸周期構造であるグルーブ１０７またはピット１０９の幅Ｗの比率Ｒ／Ｗが、以下の式に示される関係を満たす必要がある。
【数２】
0005958066.tif 000002
【００５８】
反対に標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７またはピット１０９の幅よりも大きい場合、標識用ビーズ１１０がグルーブ１０７またはピット１０９からはみ出す形となるため、トラッキング信号を乱したり、隣接トラックでのクロストークが発生したりするなど、試料の定量性に問題を与えてしまう。
【００５９】
更には、例えばピペット等で試料を滴下させただけの場合、ランド１０８の部分にも標識用ビーズ１１０が固定化されてしまうため、クロストーク成分が発生して精度良く計測することが困難となってしまう。このため、ランド１０８に標識用ビーズ１１０が固定化されないような、ランド１０８とグルーブ１０７の幅の比率、もしくはピット１０９の幅についても配慮し、グルーブ１０７もしくはピット１０９の内部にのみ標識用ビーズ１１０が固定化される必要がある。
【００６０】
良好なＴＥ信号を得るためには、一般的にランドグルーブ比（グルーブ１０７またはピット１０９の幅Ｗと、グルーブ１０７またはピット１０９の周期Ｔの比率Ｗ／Ｔ）は０．５程度が良いとされているが、トラッキング誤差信号を損ねない範囲内でランドグルーブ比が大きい方が好ましい。好ましくは、基板表面上の微細凹凸周期構造であるグルーブ１０７またはピット１０９の幅Ｗと、グルーブ１０７またはピット１０９の周期Ｔの比率Ｗ／Ｔが、以下の式の関係を満たす必要がある。
【００６１】
グルーブ１０７またはピット１０９の深さは、ＴＥ信号の出力に最適な深さ（一般的にはλ／８程度）とするのが好ましいが、用いる標識用ビーズ１１０の大きさと出力（検出）信号の関係や、試料分析用ディスク１００の表面におけるキズやゴミとの信号を区別するなどの観点から、最適な信号レベルが得られる深さにすればよく、この限りではない。
【００６２】
これらの検出領域１０４には、標識用ビーズ１１０の表面に修飾したものと同じ種類の抗体２１０がシランカップリング等の方法で固定されている。検出領域１０４に展開された溶液に含まれている抗原２００、すなわち流路１０２の中で抗体２１０が修飾された標識用ビーズ１１０と反応した複合物は、さらに検出領域１０４に固定されている抗体２１０と結合し、標識用ビーズ１１０、抗体２１０、抗原２００、検出領域に固定された抗体２１０（固相化抗体とも言う）によるサンドイッチ型の複合物を形成し、検出領域１０４の基板上に固定化される。抗原２００と反応していない標識用ビーズ１１０は、検出領域１０４にとどまらず、試料分析用ディスク１００の回転に伴う遠心力によりさらにディスク外周に送られ、検出領域１０４の外、具体的には試料分析用ディスク１００の外にに排出される。
【００６３】
グルーブ１０７のみに固定化された標識用ビーズ１１０の反応速度を早めたり、検出精度を向上させるために、標識用ビーズ１１０の内部にフェライトなどの磁性体材料を用いて、試料分析用ディスク１００の外部または内部より磁気操作を行うことも可能である。
【００６４】
図５は試料分析用ディスク１００上で、抗原２００と抗体２１０が反応した後の複合物の構成を模式的に表した図である。図５（ａ）は、ウェルプレートで行われるのと同様の抗原−抗体反応を利用したサンドイッチ法による原理により、試料に含まれる抗原２００に計測可能な標識である標識用ビーズ１１０が付けられた状態で、検出領域１０４に固定されていることになる。サンドイッチ法は検出対象の絶対量に対して出力がリニアに得られることから定量測定が行いやすい方法として多く用いられている。固定化の方法はこれに限らず、競合法など他の方法を用いることも出来る。
【００６５】
また、検出対象が抗原２００ではなく抗体２１０の場合には、図５（ｂ）に示すように、抗体２１０に特異的に結合する抗原２００を検出領域１０４に固定化しておき、二次抗体２１３により標識用ビーズ１１０を結合させる方法によって、抗原２００の検出と同様に抗体２１０に対してもサンドイッチ法による測定を行うことが出来る。
【００６６】
図６は、試料分析用ディスク１００の半径方向に対して、所定範囲毎に各々異なる抗体をつけた場合の検出領域１０４の説明をするものである。分析対象の試料に含まれる複数種類の抗原２００Ａ〜２００Ｃに対して特異的に結合するモノクローナル抗体２１１Ａ〜２１１Ｃを試料分析用ディスク１００おける複数の領域に分けられたトラックに固定してある。
【００６７】
標識用ビーズ１１０には、複数種類の抗原に結合するポリクローナル抗体２１２が修飾されている。検出領域１０４に展開された標識用ビーズ１１０は、試料分析用ディスク１００の半径位置に応じて異なる種類の抗原と反応し、グルーブ１０７またはピット１０９に結合する。
【００６８】
図６においては、検出領域１０４の内周側より所定範囲は、抗原２００Ａに特異的に結合するモノクローナル抗体２１１Ａが固定されている。また、次の所定範囲には、抗原２００Ｂに特異的に結合するモノクローナル抗体２１１Ｂが固定されており、さらに次の所定範囲には抗原２００Ｃに特異的に結合するモノクローナル抗体２１１Ｃが固定されている。
【００６９】
各々の種類のモノクローナル抗体２１１が固定されている範囲は、トラック領域１０５における流路１０２と接続されていない部分に記録されたアドレス信号により特定できる。
【００７０】
通常、蛍光や酵素反応により複数種類の抗原を同時に検出するためには、複数種類の標識を利用して、蛍光波長の違いや発色の違いを検出しているが、その場合は複数種類の波長の光源や波長フィルターと光検出器の組み合わせが必要となる。図６に示した手法は、試料分析用ディスク１００の半径位置をアドレスから得ることにより、同じ検出方法で複数種類の抗原をほぼ同時に計測することが出来る。さらに、複数種類の抗原の含まれる比率から、統計的に疾病の可能性を判定するような分析方法の場合にも、同一試料を同じ条件で測定することが出来、別々に計測した場合の誤差に比べ測定ばらつきを小さくすることが可能となる。
【００７１】
次に、本発明の試料分析用ディスク１００の製造方法について、図７を用いて説明する。本発明の試料分析用ディスク１００は、ＣＤ、ＤＶＤなどと類似の方法で作製される。
【００７２】
先ず、図７（ａ）に示すように、光学研磨が施され、洗浄し十分に乾燥させた円盤状の基板５０１に対し、マグネトロンスパッタ等により膜厚が１０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の無機レジスト膜５０２を成膜する。基板５０１としては、石英ガラス基板またはシリコンウエハー基板を使用することができる。特にシリコンウエハー基板は、半導体分野で使用されており、十分に研磨及び洗浄された状態で入手が可能であり、石英ガラスに比べ表面が平滑性と洗浄度とが高い。さらに、シリコンウエハー基板は導電性を有するため、スタンパを作製する際に別途導電膜を形成する必要が無いため好適である。
【００７３】
次に、図７（ｂ）に示すように、基板５０１上に形成された無機レジスト膜５０２に対し、ＤＶＤ等の既存の露光装置等で用いられるような波長４００ｎｍ程度のレーザー光５０４を、開口数ＮＡが０．９程度の対物レンズ５０５で集光させることによって入力情報信号に基づいて露光を行い、所望の潜像パターン５０３を形成する。
【００７４】
次に、図７（ｃ）に示すように、基板５０１上の無機レジスト膜５０２に形成された潜像パターン５０３に対し現像を行い、潜像パターン５０３を除去しレジストパターン５０６を形成する。ここで、現像の際に用いられる現像液としては、主としてアルカリ性の現像液を用いる。
【００７５】
無機レジスト膜５０２としては、露光に使用するレーザ光波長での露光感度が高いタングステン（Ｗ）の酸化物が用いられる。タングステン（Ｗ）の酸化物の一種であるＷＯ2は室温で安定であり、過熱することによりＷＯ3となる。スパッタリング法で形成されたＷＯ2はアモルファス構造であり、レーザ光で露光されることにより加熱され結晶構造のＷＯ3となることで、現像液に用いられるアルカリ溶液に可溶となる。
【００７６】
次に、図７（ｄ）に示すように、基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６をマスクとして、基板５０１の露出部をドライエッチングすることにより基板５０１に直接エッチングパターン５０７を形成する。エッチングガスとして、ＣＦ4、ＣＨＦ3、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8等のフルオロカーボン系ガスを用いることにより、レジストパターン５０６に対して基板５０１のエッチングレートを高くすることができ、選択比の大きなエッチングかできる。
【００７７】
特に、基板に石英ガラスを用いて、フロロカーボン系ガスとしてＣＨＦ3を用いたエッチングは、図７（ｄ）における下方向へのエッチングレートが、左右方向へのエッチングレート比べ大きな異方性エッチングを行うことができるため、円盤状の基板５０１のディスク半径方向におけるエッチングパターン５０７の断面形状は矩形に近い形となり、凹凸形状の側面は円盤状の基板５０１の板面に対して概ね直交した状態となる。更に、エッチングによって凹凸形状を形成するため、従来レジスト膜の膜厚で規定されていた凹凸形状の深さが、エッチング条件により制御可能であり、深い溝の形成も可能である。
【００７８】
次に、図７（ｅ）に示すように、基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６に対して、フロロカーボン系ガスを用いて、フロロカーボン系ガス雰囲気下で電圧を印加して等方的にレジストパターンのアッシングおよびトリミングを行い、レジストパターン５０６の除去、及び表面の粗度を低減し、入力情報信号に基づいたエッチングパターン５０７を有する円盤状の原盤５０８を得る。
【００７９】
ここで、フロロカーボン系ガスとしては、ＣＦ4、ＣＨＦ3、Ｃ3Ｆ8、Ｃ4Ｆ8等を用いる。特に、ＣＦ4は、等方性エッチングを行いやすいため、エッチングガスとして好適である。
【００８０】
図７（ｆ）に示すように、円盤状の光ディスクの原盤５０８の凹凸形状が形成された面に対してスパッタリング法により厚さ５０〜２００ｎｍのＮｉ膜を形成した後、電鋳法により、厚さ１００〜５００μｍのＮｉメッキ膜を形成することにより、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７を転写して凸凹形状を有する円盤状のスタンパ５０９を作製する。
【００８１】
スタンパ５０９に形成される凸凹形状は、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７と凹凸が逆の関係になる。次に、図７（ｇ）に示すように、凸凹形状を有する円盤状のスタンパ５０９を射出成型機（図示せず）に装着して、射出成型法により、内周から外周に向かって、或いは外周から内周に向かって入力情報信号に基づいたグルーブ１０７またはピット１０９が螺旋状に形成された凹凸形状を有する円盤状の試料分析用ディスク１００を成形する。上記射出成形を繰り返すことにより、試料分析用ディスク１００を大量に複製することができる。
【００８２】
次に、本発明における試料分析用ディスク１００を、本発明の製造方法に基づいて製造し、試料を分析した実施例について説明する。
【００８３】
先ず、図７（ａ）に示すように、表面研磨を施し洗浄及び乾燥を行った石英ガラスからなる基板（以下、基板５０１）に対し、マグネトロンスパッ夕方式によりタングステン（Ｗ）の合金ターゲットを用いて、アルゴン４４ｓｃｃｍ、酸素６ｓｃｃｍを導入して反応性スパッタリングを行い、膜厚が５０ｎｍであるアモルファス無機レジスト膜５０２を形成した。
【００８４】
次に、図７（ｂ）に示すように、基板５０１上に形成されたアモルファス構造の無機レジスト膜（以下、無機レジスト膜５０２）に対し、波長４０５ｎｍの半導体レーザと、ＮＡ＝０．９０の対物レンズを有する回転一軸系の露光装置を用いて、線速度５．０ｍ／ｓの速さで露光を行い、トラックピッチ３２０ｎｍの等幅のグルーブ１０７とランド１０８が連続したパターンであるランドグルーブ形状の潜像パターン５０３を形成した。無機レジスト膜５０２の露光された潜像パターン５０３の領域は結晶状態に変化する。レーザの発光パターンを制御することにより、ピット形状やランダム変調信号などランドグルーブ形状以外の任意の潜像パターンを形成することができる。
【００８５】
次に、図７（ｃ）に示すように、基板５０１上に形成された潜像パターン５０３に対し、現像をおこなった。現像は、アルカリ性であるテトラメチルアンモニウムハイドロオキサイド溶液（濃度２．３８ｗｔ％）を現像液として用い、潜像パターン５０３が形成された基板５０１を室温で２０分間液侵して、潜像パターン５０３を除去することによりレジストパターン５０６を形成した。
【００８６】
次に、図７（ｄ）に示すように、基板５０１上に形成されたレジストパターン５０６をマスクとして、ＣＨＦ３ガスを用いて、基板５０１の露出部に対してドライエッチングを行なった。
【００８７】
ドライエッチングは、異方性を高めるため４Ｐａの雰囲気下で１００Ｗの電力を６分間印加することにより行ない、基板５０１にラインアンドスペース形状のエッチングパターン５０７を形成した。エッチングパターン５０７は、深さ１４０ｎｍであり、グルーブ半値幅は２２０ｎｍであった。
【００８８】
次に、図７（ｄ）に示すように、基板５０１上に形成されたエッチングパターン５０７に対し、ＣＦ4ガスを用いてアッシングをおこなった。アッシングは、ＣＦ4と０２との混合比５：２のガスを用い１５Ｐａの雰囲気下で７０Ｗの電力を印加することによって行い、レジストパターン５０６の除去を行うと同時に、基板５０１の表面の荒れの低減を行った。これによって、図７（ｅ）に示すエッチングパターン５０７を有する試料分析用ディスク１００の原盤５０８が形成された。
【００８９】
次に、図７（ｆ）に示すように、原盤５０８上にスパッタリング法により厚さ１５０ｎｍのＮｉ膜を形成した後、電鋳法により、厚さ３００μｍのＮｉメッキ膜を形成することにより、原盤５０８に形成されているエッチングパターン５０７を転写してスタンパ５０９を作製した。
【００９０】
次に、図７（ｇ）に示すように、スタンパ５０９を射出成型機（図示せず）に装着して、射出成型法により、内周から外周に向かって、螺旋状のランドグルーブ形状が形成された試料分析用ディスク１００を成形した。成形された試料分析用ディスク１００の形状は、厚さは１．１ｍｍであり、トラックピッチが３２０ｎｍ、深さ１４０ｎｍで、グルーブ半値幅は２２０ｎｍであった。
【００９１】
このように形成された試料分析用ディスク１００のトラック領域１０５に、試料となる抗原２００と特異反応を起こす抗体２１０を予め固定しておくが、トラック領域１０５におけるグルーブ１０７とランド１０８またはピット１０９とその周辺部に、抗体２１０が固定される。本発明の試料分析用ディスク１００においては、グルーブ１０７の内部のみ、またはピット１０９の内部のみに抗体２１０を固定させてもよい。
【００９２】
次に、上記実施例で作製された試料分析用ディスク１００上に、抗体となるビオチンを１０μＬピペットで滴下させた。次に、濃度１００μg／ｍＬの直径１４０ｎｍの標識用ビーズ表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒１μＬを基板上の１０μＬビオチンを滴下した場所にピペットで滴下させ、基板上でサンドイッチ抗原−抗体反応を行った後、未反応の標識用ビーズを純水で洗い流し、その後基板表面を乾燥させた。
【００９３】
この試料分析用ディスク１００を線速度４．９２ｍ／ｓ一定で回転させながら、波長４０５ｎｍの半導体レーザ光を０．３５ｍＷで発光し、ＮＡが０．８５の対物レンズ３で基板表面に集光させ、反射して戻ってきた光を光検出部９における４分割フォトダイオードで受光し、フォトダイオードの各成分の信号を制御してスパイラル状のグルーブ１０７にトラッキングをかけながら総和信号を観察した。
【００９４】
標識用ビーズ１１０の計測カウント数は、１００トラック分の合計をカウントした。その結果、標識用ビーズ１１０のカウント数は４５６８５個であった。検出信号の一部分が例えば図８のように計測することができ、標識用ビーズ１１０の１個に対応する信号が標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルに対し、十分低い信号レベルとして検出することができ、その周波数成分を解析した結果、確かに標識用ビーズ１１０の１個分の直径である１４０ｎｍと一致した。
【００９５】
図８は、標識用ビーズ１１０を検出したときの検出電圧を表した図であり、例えば検出信号が平坦な部分Ａは、標識用ビーズ１１０が検出されていない箇所であり、Ｂのように部分的に低い値をとる箇所は、標識用ビーズ１１０が検出された箇所である。このように、標識用ビーズ１１０を検出した信号を明確に特定することができる。
【００９６】
次に、高濃度から低濃度の標識用ビーズ１１０のカウント精度を確認するため、上記実施例で用いた標識用ビーズ１１０の表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒の濃度に対し、１００倍、１０倍、１倍、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍の６種類の濃度の溶媒を用いる以外は上記実施例と同様の方法で標識用ビーズ１１０の個数をカウントした結果を表１に示す。濃度に比例した計測結果が得られ、高濃度から低濃度まで非常に精度の高い計測結果が得られている。また、濃度１倍の結果が上記計測結果とほぼ一致し、再現性も高いことが確認できた。
【表１】
0005958066.tif 000003
【００９７】
次に、比較例として標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７の幅よりも大きい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を３００ｎｍとした以外は上記実施例と同様の方法で、標識用ビーズ１１０のカウントを行った。標識用ビーズ１１０の直径が大きく、隣接するトラックへのクロストーク成分の増加による影響により安定したトラッキングを取ることが困難で、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができなかった。
【００９８】
次に、他の比較例として、標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７の幅よりも小さい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を１００ｎｍとした以外は上記実施例と同様の方法で、標識用ビーズ１１０のカウントを行った。この場合、トラッキング信号は安定しており、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができた。その結果を表２に示す。また、検出信号の一部分について、図９に示す。
【００９９】
図９は、標識用ビーズ１１０を検出したときの検出電圧を表した図であり、例えば検出信号が平坦な部分Ａは、標識用ビーズ１１０が検出されていない箇所であり、Ｂのように部分的に低い値をとる箇所は、標識用ビーズ１１０が検出された箇所であるが、Ｃのように不明瞭な信号も検出されている。これは、標識用ビーズ１１０が小さすぎるため、グルーブ１０７に対して複数の標識用ビーズ１１０が固定化されたり、グルーブ１０７の中心からオフセットした状態で標識用ビーズ１１０が固定化された結果によるもので、溶媒の濃度に比例した結果が得られず、高濃度から低濃度まで精度の高い結果を得ることはできなかった。
【表２】
0005958066.tif 000004
【０１００】
次に、本発明における試料分析用ディスク１００の他の実施の形態について、図１０から図１３を用いて説明する。ここで用いられる試料分析用ディスク１００の基本的な構成や試料分析用ディスク１００を読み取る読み取り装置１の構成は同一である。特徴としては、標識用ビーズ１１０の直径を、対物レンズ３によって検出領域１０４に集光された光スポット１２０よりも小さい標識用ビーズ１１０を用いる。これによって、標識用ビーズ１１０による回折現象を用いた信号の検出を可能とする。さらに、標識用ビーズ１１０の表面における照射光の反射率を、試料分析用ディスク１００を構成する基板の反射率よりも高いものを用いる。これによって標識用ビーズ１１０が生じさせる回折光成分を増強し、その結果として対物レンズ３の瞳面における回折光に起因する干渉の効果を増大させることで、標識用ビーズ１１０による信号振幅を増加させる。
【０１０１】
本実施例においても、光ディスクの再生と同様にピット１０９またはグルーブ１０７からの回折光と、ピット１０９またはグルーブ１０７以外の部分からの回折光の干渉現象を用いて振幅の大きな信号を検出することにより、標識用ビーズ１１０を検出する。このような手法を用いる場合、標識用ビーズ１１０によって回折された照射光と標識用ビーズ１１０が固定化された基板表面からの反射光との位相差が、照射光の波長の半波長となる場合に、標識用ビーズ１１０の有無による反射光量の差に基づく信号の振幅を最大にすることができる。
【０１０２】
標識用ビーズ１１０による回折光の反射位相は、標識用ビーズ１１０の形状や材質等さらには標識用ビーズ１１０の３次元的な複素屈折率分布により定まる。一例として、空気中において標識用ビーズ１１０を検出する場合では、標識用ビーズ１１０の直径は照射光の波長の１／４程度の大きさであれば良い。したがって、波長４０５ｎｍのレーザ光を用いる場合は、標識用ビーズ１１０の直径は１００ｎｍ前後、波長６５０ｎｍのレーザ光を用いる場合は、標識用ビーズ１１０の直径は１６０ｎｍ前後であることが好ましい。
【０１０３】
上述したような直径が１００ｎｍから２００ｎｍ程度の標識用ビーズ１１０は、検出対象としてタンパク質を検出する場合、タンパク質との大きさに極端な差がないため、安定した検出を可能とすることができる。一方、標識用ビーズ１１０の直径が例えば数１００ｎｍ以上である場合は、標識用ビーズ１１０の自重によって一旦補足したタンパク質から標識用ビーズ１１０が剥離するなどの不都合が生じる。
【０１０４】
上述したような直径が１００ｎｍから２００ｎｍ程度の標識用ビーズ１１０は、光ディスクを読み取るためのレーザ光における光スポット１２０より直径が小さい。このためピット１０９またはグルーブ１０７からの回折光と、ピット１０９またはグルーブ１０７以外の部分からの回折光の干渉現象を用いた信号の検出を行うことができる。例えば、光スポット１２０の直径をエアリーディスク直径と定義した場合、Ｂｌｕ−ｒａｙディスク用ピックアップ装置に用いるレーザ光は、波長が４０５ｎｍでレンズの開口数が０．８５であるため、光スポット１２０の直径は５８１ｎｍとなる。また、ＤＶＤ用ピックアップ装置に用いるレーザ光は、波長が６５０ｎｍでレンズの開口数が０．６であるため、光スポット１２０の直径は１３００ｎｍとなる。
【０１０５】
上述したような標識用ビーズ１１０を用いた場合の信号の検出においては、ピット１０９またはグルーブ１０７の反射率は次の２通りが好ましい。第１の構成としては、ピット１０９またはグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０が存在しない状態で反射率が十分に高く、標識用ビーズ１１０が存在する場合には反射率が低下することである。この場合、反射率が低下したときの反射率がゼロとなると、フォーカスサーボ動作およびトラッキングサーボ動作が困難となるため、適切に低い反射率とすることが望ましい。
【０１０６】
このような構成を実現するためには、グルーブ１０７またはピット１０９の反射回折光の位相がゼロまたはｎ波長（ｎ：整数）に近くなるようなグルーブ１０７またはピット１０９の深さであればよい。なお、反射回折光の位相が完全に同相の場合は、グルーブ１０７またはピット１０９によりトラッキング信号を生成することができなくなる。このため、同相からは適切な位相差を付けることが望ましい。また、グルーブ１０７またはピット１０９の深さが変化する場合、周期的に位相が変化するため、深さには複数の選択肢がある。
【０１０７】
第２の構成としては、ピット１０９またはグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０が存在しない状態で反射率が十分に低く、標識用ビーズ１１０が存在することにより反射率が上昇することである。これら２つの構成の場合に、標識用ビーズ１１０による信号振幅が最大となる。
【０１０８】
このような構成を実現するためには、グルーブ１０７またはピット１０９の反射回折光の位相が１／２波長に近くなるようにすることにより、標識用ビーズ１１０が存在することにより、反射率を上げる構成とする。この場合は標識用ビーズ１１０からの回折光の位相が同相に近づき、反射率が高いため、第１の構成とは逆極性の信号が得られる。
【０１０９】
上述したようなピット１０９またはグルーブ１０７および標識用ビーズ１１０の構成によって、標識用ビーズ１１０に対して大きな信号振幅が得られる検出が可能となる。この場合、標識用ビーズ１１０の大きさが光スポット１２０より小さくなるため、読み取り装置１における空間周波数特性の低下による影響を受け、信号振幅が低下する。このような空間周波数特性による信号振幅の低下は、標識用ビーズ１１０による回折光成分の減少によって生じる。このため、本発明においては標識用ビーズ１１０の反射率を高めることによって、信号振幅を増幅させる。
【０１１０】
図１０は、上述した第１の構成としての、ピット１０９またはグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０が存在しない状態で反射率が十分に高く、標識用ビーズ１１０が存在する場合には反射率が低下する場合を説明した図である。図１０の左側はグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０として低反射ビーズ１１１と高反射ビーズ１１２が固定化され、光スポット１２０のトレースによって反射光を読み取っている模式図である。図１０の右側はピット１０９に標識用ビーズ１１０として低反射ビーズ１１１と高反射ビーズ１１２が固定化され、光スポット１２０のトレースによって反射光を読み取っている模式図である。
【０１１１】
図１０の構成の例としては、例えば標識用ビーズ１１０の直径が１４０ｎｍであり、反射光の位相が約１／２波長の標識用ビーズ１１０をグルーブ１０７またはビット１０９に固定化し、ブルーレイディスクの読み取りと同等の光学定数を有する読み取り装置１で再生する。この場合のトラックピッチは、ブルーレイディスクと同等の３２０ｎｍとし、グルーブ１０７またはピット１０９の深さは１２０ｎｍとする。これにより、グルーブ１０７またはピット１０９の形状は読み取り装置１側からみて凹形状となり、標識用ビーズ１１０の直径がグルーブ１０７またはピット１０９の深さより大きいことから、標識用ビーズ１１０はトラック領域１０５の表面から突出した形で固定化されている。
【０１１２】
また、図１０に上述した構成において標識用ビーズ１１０を読み取った場合の信号を模式的に示す。図１０に示すように、標識用ビーズ１１０がグルーブ１０７またはランド１０９内に存在することで、逆相成分の回折光が生じ、信号出力レベルが低下する（波形（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ））。ここで標識用ビーズ１１０の反射率が高い場合は、信号出力の変化率を大きくすることができる（波形（ｂ）、（ｅ））。
【０１１３】
このような、標識用ビーズ１１０の反射率と信号出力の変化率を解析した結果を図１１に示す。図１１の結果は、標識用ビーズ１１０の反射率による信号出力の変化率の依存性をスカラ解析理論に基づき計算した結果である。また、実験においてもほぼ同じ傾向の特性が得られることを確認している。
【０１１４】
このように、標識用ビーズ１１０の反射率を上げることで、回折光の逆送成分を増加させることにより、信号振幅を増加させることができる。
【０１１５】
図１２は、上述した第２の構成としての、ピット１０９またはグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０が存在しない状態で反射率が低く、標識用ビーズ１１０が存在する場合には反射率が高くなる場合を説明した図である。図１２の左側はグルーブ１０７に標識用ビーズ１１０として低反射ビーズ１１１と高反射ビーズ１１２が固定化され、光スポット１２０のトレースによって反射光を読み取っている模式図である。図１２の右側はピット１０９に標識用ビーズ１１０として低反射ビーズ１１１と高反射ビーズ１１２が固定化され、光スポット１２０のトレースによって反射光を読み取っている模式図である。
【０１１６】
図１２の構成の例としては、例えば直径が１４０ｎｍの標識用ビーズ１１０をグルーブ１０７またはピット１０９に固定化し、ブルーレイディスクの読み取りと同等の光学定数を有する読み取り装置１で再生する。この場合のトラックピッチは、ブルーレイディスクと同等の３２０ｎｍとし、グルーブ１０７またはピット１０９の深さは２０ｎｍとする。これにより、グルーブ１０７またはピット１０９の形状は読み取り装置１側からみて凹形状となり、標識用ビーズ１１０の直径がグルーブ１０７またはピット１０９の深さより大きいことから、標識用ビーズ１１０はトラック領域１０５の表面から突出した形で固定化されている。
【０１１７】
また、図１２に上述した構成において標識用ビーズ１１０を読み取った場合の信号を模式的に示す。図１０に示すように、標識用ビーズ１１０がグルーブ１０７またはランド１０９内に存在することで反射率が上昇し、信号出力レベルを上昇させる（波形（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ））。ここで標識用ビーズ１１０の反射率が高い場合は、信号出力の変化率を大きくすることができる（波形（ｂ）、（ｅ））。
【０１１８】
このような、標識用ビーズ１１０の反射率と信号出力の変化率を解析した結果を図１３に示す。図１３の結果は、標識用ビーズ１１０の反射率による信号出力の変化率の依存性をスカラ解析理論に基づき計算した結果である。このように、標識用ビーズ１１０の反射率を上げることで、信号振幅を増加させることができる。
【０１１９】
さらに、標識用ビーズ１１０の直径がグルーブ１０７またはピット１０９の幅より小さく、且つグルーブ１０７またはピット１０９の幅方向に２個の標識用ビーズ１１０が固定化されることのない直径とすることで、確実にグルーブ１０７またはピット１０９に標識用ビーズ１１０を捕捉させる。このため、グルーブ１０７またはピット１０９にトラッキングをかけて標識用ビーズ１１０を検出する際の信号振幅の変動、誤検出を抑制し、高Ｓ／Ｎの検出を実現する。
【０１２０】
次に、本発明における第２の実施例について説明する。第２の実施形態においては、図７において説明した試料分析用ディスク１００の製造方法を用いて、トラックピッチが３２０ｎｍ、深さ７０μｍ、グルーブ半値幅２２０ｎｍの試料分析用ディスク１００を作成した。
【０１２１】
次に、作製した試料分析用ディスク１００の基板表面をアミノシラン剤による修飾方法でアミノ基化した後、抗体となるビオチン溶液を１０μＬピペットで滴下させた。次に、濃度１０μg／ｍＬの直径２００ｎｍの標識用ビーズ１１０の表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒５μＬを基板上の１０μＬビオチンを滴下した場所にピペットで滴下させ、基板上でサンドイッチ反応を行った後、未反応の標識用ビーズを純水で洗い流し、その後基板表面を乾燥させた。
【０１２２】
この試料分析用ディスク１００を、線速度４．９２ｍ／ｓ一定で回転させながら、波長４０５ｎｍの半導体レーザ光を０．３５ｍＷで発光し、ＮＡが０．８５の対物レンズ３で基板表面に集光させ、反射して戻ってきた光を光検出部９における４分割フォトダイオードで受光し、フォトダイオードの各成分の信号を制御してスパイラル状のグルーブ１０７にトラッキングをかけながら総和信号を観察した。
【０１２３】
標識用ビーズ１１０の計測カウント数は、１５００トラック分の合計をカウントした。その結果、標識用ビーズ１１０のカウント数は２２５０７９個であった。検出信号の一部分が例えば図７のように計測することができ、標識用ビーズ１１０の１個に対応する信号が標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルに対し、十分低い信号レベルとして検出することができ、その周波数成分を解析した結果、確かに標識用ビーズ１１０の１個分の直径である２００ｎｍと一致した。
【０１２４】
次に高濃度から低濃度の標識用ビーズ１１０のカウント精度を確認するため、標識用ビーズ１１０の表面にビオチンを修飾させ、さらにビオチンに特異的に反応するアビジンを修飾させた溶媒の濃度に対し、１００倍、１０倍、１倍、１／１０倍、１／１００倍、１／１０００倍の６種類の濃度の溶媒を用いる以外は上記実施例と同様の方法で標識用ビーズ１１０の個数をカウントした結果を表３に示す。濃度に比例した計測結果が得られ、高濃度から低濃度まで非常に精度の高い計測結果が得られている。また、濃度１倍の結果が上記計測結果とほぼ一致し、再現性も高いことが確認できた。
【表３】
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【０１２５】
次に、比較例として、標識用ビーズ１１０の直径が、グルーブ１０７の幅よりも大きい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を３００ｎｍとした以外は上記実施零と同様の方法で標識用ビーズ１１０のカウントを行った。標識用ビーズ１１０の直径が大きく、隣接するトラックへのクロストーク成分の増加による影響により安定したトラッキングを取ることが困難で、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができなかった。
【０１２６】
次に、他の比較例として、標識用ビーズ１１０の直径がグルーブ１０７の幅よりも小さい場合の例として、用いる標識用ビーズ１１０の直径を１００ｎｍとした以外は上記実施例と同様の方法で標識用ビーズ１１０のカウントを行った。この場合、トラッキング信号は安定しており、標識用ビーズ１１０の個数をカウントすることができた。その結果を表４に示す。しかしこの場合、検出信号レベルが不均一で、標識用ビーズ１１０が小さすぎるため、グルーブ１０７に対して複数の標識用ビーズ１１０が固定化されたり、グルーブ１０７の中心からオフセットした状態で標識用ビーズ１１０が固定化されたりするので、溶媒の濃度に比例した結果が得られず、高濃度から低濃度まで精度の高い結果を得ることはできなかった。
【表４】
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【０１２７】
次に、図７（ｄ）を用いて説明したドライエッチング工程の時間を調整した以外は同様の方法で、トラックピッチ３２０ｎｍ、グルーブ半値幅２２０ｎｍであり、エッチングパターン深さが２０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍ、１２０ｎｍ、１４０ｎｍ、１６０ｎｍ、１８０ｎｍ、２００ｎｍのみで１１種類の試料分析用ディスク１００を作製した。
【０１２８】
この試料分析用ディスク１００の表面反射率が２０％程度となるようにスパッタリング成膜法によりシリコン（Ｓｉ）を約１０ｎｍ形成した後、検出領域１０４においてアビジン−ビオチンサンドイッチ反応を行わせ、グルーブ１０７内に捕捉された標識用ビーズ１１０の検出信号と標識用ビーズ１１０の存在しない基板表面の信号レベルを計測した。
【０１２９】
図１４は、横軸をグルーブ１０７の深さ、縦軸を検出信号レベルでプロットしたグラフである。このときの標識用ビーズ１１０の反射率は１０％程度で、基板の反射率に対して１／２となるように設定した。図１４においては、グルーブ１０７の深さが２０ｎｍ〜８０ｎｍのサンプルでは標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルと標識用ビーズ１１０の信号レベルに明瞭な差が生じた。また、グルーブ１０７の深さが１００ｎｍ〜２００ｎｍのサンプルは、各々の信号レベルが似たような値となり、信号面のキズや欠陥との判別が非常に困難であった。このため、標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルと標識用ビーズ１１０が存在する信号レベルに明瞭な差を生じる範囲は、グルーブ１０７の深さが２０ｎｍ〜８０ｎｍの範囲にあることがわかる。
【０１３０】
この場合におけるレーザ光の波長λは、４０５ｎｍであるため、標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルと標識用ビーズ１１０が存在する信号レベルに明瞭な差となる、グルーブ１０７の深さＤは、λ／２０≦Ｄ≦λ／５となる。
【０１３１】
次に上記作製した、グルーブ１０７の深さが２０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍの基板表面にスパッタリング成膜法で形成したシリコンの膜厚を変化させ、基板の反射率を５０％〜５％とし、標識用ビーズ１１０の反射率１０％に対して相対的な標識用ビーズ１１０の反射率比（基板表面の反射率ＲSと標識用ビーズ１１０の反射率ＲBの比率ＲB／ＲS）を０．２〜２．０まで変化させ、標識用ビーズ１１０の存在しない信号レベルと標識用ビーズ１１０が存在する信号レベルとの比率（変調度と呼ぶ）をプロットしたグラフを図１５に示す。
【０１３２】
一般的に、標識用ビーズ１１０を検出した際の実信号と信号面のキズや欠陥などの誤った信号との判別の精度を高くするためには、変調度が３０％以上であることが望ましい。また、基板の反りやレーザ光の焦点深度などの余裕度を考慮すると、変調度は４０％以上であることが望ましい。以上の点から、基板の反射率に対する標識用ビーズ１１０の相対的な反射率比（基板表面の反射率ＲSと標識用ビーズの反射率ＲBの比率ＲB／ＲS）は０．５以下であることが望ましい。
【符号の説明】
【０１３３】
１：読み取り装置、２：スピンドルモータ、３：対物レンズ、４：アクチュエータ、５：ビームスプリッタ、６：レーザ発振器、７：コリメータレンズ、８：集光レンズ、９：光検出部、１０：制御部１００：試料分析用ディスク、１０１：注入孔、１０２：流路、１０３：ビーズ充填部、１０４：検出領域、１０５：トラック領域、１０６：保護層、１０７：グルーブ、１０８：ランド、１０９：ピット、１１０：標識用ビーズ、２００：抗原、２１０：抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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