(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または２種以上のテルペノイドを産生する大腸菌細胞におけるテルペノイド産生を増加させる方法であって、
上流のメチルエリトリトールリン酸（ＭＥＰ）経路を介してイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生するためにｄｘｓならびにｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦの１種または２種以上の遺伝子を発現し、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを組み換え発現される下流のテルペノイド合成経路を介してテルペノイドに変換する大腸菌細胞を提供すること、および
大腸菌細胞を培養し、テルペノイドを産生すること、
を含み、
培養物中のインドールの蓄積を以下：
上流のＭＥＰ経路モジュールを下流のテルペノイド合成経路モジュールと均衡化させ、インドールの蓄積を制限する、
インドール経路を修飾または調節する、
細胞の培養物中の蓄積されたインドールを除去する、
の１または２以上により制御し、前記細胞におけるテルペノイド産生を増加させる、前記方法。
【請求項２】
大腸菌細胞がゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を組み換え発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が異種のｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上流のＭＥＰ経路モジュールが下流のテルペノイド合成経路モジュールに関して：
１または２以上の上流のまたは下流の経路酵素に対する遺伝子コピー数を増加させること、
異なる強度のプロモーターを用いる、個々の遺伝子としてのまたはオペロンとしての、上流および／または下流経路の遺伝子の発現レベルを増加または低減させること、
リボソーム結合部位への修飾を用いる、個々の遺伝子としてのまたはオペロンとしての、上流および／または下流経路の遺伝子の発現レベルを増加または低減させること、
上流および／または下流経路の天然遺伝子を同種の酵素をコードする異種の遺伝子と置き換えること、
上流および／または下流経路における１または２以上の異種の酵素のコドン最適化、
上流および／または下流経路の１または２以上の遺伝子におけるアミノ酸変異、
または
異種のオペロンにおける上流および／または下流経路の遺伝子の順序を修飾すること
の１または２以上により均衡される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御するステップが、蓄積されたインドールを、化学的方法により、吸収剤または捕捉剤を用いて、細胞培養物から除去することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
１種または２種以上のテルペノイドが、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、またはテトラテルペノイドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１種または２種以上のテルペノイドがタキサジエンまたは任意のタキソール前駆体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞培養物中のインドールの蓄積を１００ｍｇ／Ｌ以下に制御する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養物中のインドールの量または濃度を測定することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
方法が、インドールの量または濃度を２回または３回以上測定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インドールの測定量または濃度を、１種または２種以上のテルペノイド産生のプロセスを導くために、および／または株の作成を導くために用いる、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
大腸菌がＭＥＰ経路のｉｄｉ、ｄｘｓ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ遺伝子の増幅したコピー数を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
テルペノイドがゲラニオール、シトロネロール、クベボール、ヌートカトン、シネオール、リモネン、エリュテロビン、サルコジクチイン、シュードプテロシン、ギンコライド、ステビオシド、レバウジオシドＡ、スクラレオール、ラブデンジオール、レボピマラジエン、サンドラコピマラジエンまたはイソピマラジエンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
インドールの蓄積を、上流のＭＥＰ経路モジュールを下流のテルペノイド合成経路モジュールと均衡化させることにより制御し、前記均衡化を、様々な発現レベルの下流経路モジュールおよび様々な発現レベルの上流経路モジュールを発現する大腸菌細胞のライブラリをスクリーニングすることにより、およびインドールの蓄積がより低い大腸菌を選択することにより行う、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２００９年１１月１０日出願の米国仮出願第61/280,877号、名称「イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学」、および２０１０年９月３０日出願の米国仮出願第61/388,543号、名称「イソプレノイド経路から化学品および医薬品を産生するための微生物工学」のもとの利益を主張し、それらの全体の開示は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
政府の利益
本研究は、認可番号1-R01-GM085323-01A1のもとで、米国国立衛生研究所から部分的に資金援助を受けた。政府は本発明に一定の権利を有する。
発明分野
本発明は、微生物工学による、１種または２種以上のテルペノイドの産生に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タキソールおよびその構造類似体は、この十年間に導入された最も強力で商業的に成功した抗癌剤として認められている１。タキソールはまずタイヘイヨウイチイ（Pacific Yew tree）の樹皮から単離され２、初期段階の生産方法においては、一人の患者に対して十分な用量を供給するためには２〜４本の完全に成長した木を犠牲にすることを要した３。タキソールの構造的複雑さのため、３５〜５１ステップの複雑な化学的合成経路を必要とし、最大で０．４％の収率であった４、５、６。しかし、生合成中間体バッカチンＩＩＩをまず植物源から単離し続いてタキソールに変換する、半合成経路が考案された７。この手段（approach）および続く植物細胞培養物に基づく生産努力によりイチイを収穫する必要性は低下したが、それでも生産は依然として、生産性および拡張性の限界、およびより有効な薬物の探索において合成されることができるタキソール誘導体の数に対する制約を伴う、植物に基づくプロセス８に依存している９、１０。
【発明の開示】
【０００３】
発明の概要
代謝工学および合成生物学における近年の発達により、より技術的に適した微生物宿主を介した、複雑な天然産物の過剰産生の新しい可能性がもたらされている１１、１２。イチイ属におけるタキソールの生合成機構の解明において顕著な進展がなされてきているが１３〜１６、商業的に関連するタキソール産生株により、この複雑な生合成機構（machinery）の微生物宿主への移行を目指す従前の試行が回避される１７、１８。それにもかかわらず、他の天然産物のように、代謝的な改変（engineered）株を介した微生物産生により、抗癌および他の薬学的活性を有する多様で多数の新規な化合物を合成するための、魅力的な経済性と大きな可能性が提供される１９、２０。
【０００４】
タキソールおよびその類似体の代謝経路は、大腸菌（E. Coli）に天然の上流イソプレノイド経路および異種の下流テルペノイド経路からなる（図６）。上流メバロン酸（ＭＶＡ）またはメチルエリトリトールリン酸（ＭＥＰ）経路は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の２つの共通する構成単位を産生することができ、これらから、タキソールおよび他のイソプレノイド化合物が形成される１２。最近の研究は、上記の上流経路を改変して、リコペンおよびアルテミシニン酸（artemisinic acid）などの異種イソプレノイドの生合成を支援することを強調している２１〜２３。下流タキサジエン経路は大腸菌において再構成されたが、しかし今日まで、力価は１．３ｍｇ／Ｌを超えていない２４。
【０００５】
上記の合理的な代謝工学手段は、修飾が相加的であること、すなわち線形挙動であることを黙示的に想定し、上流（ＭＶＡまたはＭＥＰ）または下流テルペノイド経路のどちらかに焦点を当てていた２５〜２７。この手段はフラックスにおける中程度の増加をもたらすことができるが、一般的に、非特異的な効果、例えば中間代謝物の毒性、発現に用いられるベクターの細胞効果、および主経路と競合して所望の標的からフラックスをそらし得る隠された未知の経路などを無視している。組合せ手段は、パラメータ空間を適切にサンプリングする機会を提供し、これらの複雑な非線形相互作用を解明することによってかかる問題を回避することができる２１、２８、２９、３０。しかし、かかる手段には高スループットスクリーンが必要であり、これは多くの所望の天然産物に対してはしばし利用可能ではない３１。さらに別のクラスの経路最適化法により、目的の経路を含む異種遺伝子の異なる源の組合せ空間について、探求がなされてきた３２。依然高スループットアッセイに依存するが、これらの方法は一般に、個々の経路の遺伝子に対する最適な発現レベルを決定する必要性を無視しており、したがって、最適化経路の構築においては有効性が低いと証明されている。
【０００６】
本研究において、本発明の側面の一例として、上流のＩＰＰ形成経路間における、下流のタキサジエン合成のテルペノイド経路との最適な均衡化に焦点を当てる。これは９個の酵素の経路を、２つのモジュール  −  タキサジエンへの、４遺伝子、上流、天然（ＭＥＰ）経路モジュールおよび２遺伝子、下流、異種経路  −  へとグループ化することにより達成される（図１）。この基本的構造を用いて、細胞生理学上のプラスミドコピー数の効果、発現カセットにおける遺伝子順序およびプロモーター強度、および染色体への組込みなどのパラメータを、タキサジエン産生に対するそれらの効果に対して評価した。このモジュラー方式なおよび多変数組合せな手段により、高スループットスクリーンを必要とすることなく、経路フラックスに影響する主要なパラメータを効率的にサンプリングすることができる。各経路モジュールに対する多数のプロモーターおよびコピー数にわたる多変量探索は、全体最大で、対照に対しタキサジエン産生において１５，０００倍の増加を示し、小規模の発酵において３００ｍｇ／Ｌのタキサジエン産生をもたらす、高度に非線形なタキサジエンフラックスの展望を明らかにする。さらに我々は、大腸菌中のタキソール生合成におけるＰ４５０に基づく酸化化学を改変し、改変株においては従来技術に対してタキサジエン−５α−オール産生の２４００倍の改善を為した。これらの改善により、良好に確立された微生物系による数千もの有用なテルペノイド類の大規模産生に対する可能性が解き放たれる。
【０００７】
本発明の側面は、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分を過剰発現する細胞において、タキサジエンシンターゼ酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を組み換え発現することを含む方法に関する。いくつかの態様において、細胞は、大腸菌（Escherichia Coli）細胞などの細菌細胞である。いくつかの態様において、細菌細胞は、バシラス（Bacillus）細胞などのグラム陽性菌である。いくつかの態様において、細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）細胞またはヤロウイア（Yarrowia）細胞などの酵母細胞である。いくつかの態様において、細胞は、藻細胞または植物細胞である。
【０００８】
いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素は、Taxus brevifolia酵素などのイチイ属酵素である。いくつかの態様において、ＧＧＰＰＳ酵素は、Taxus canadenis酵素などのイチイ属酵素である。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素に対してコードする遺伝子および／またはＧＧＰＰＳ酵素に対してコードする遺伝子および／またはＭＥＰ経路の１または２以上の成分に対してコードする遺伝子は、１または２以上のプラスミドから発現される。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素に対してコードする遺伝子および／またはＧＧＰＰＳ酵素に対してコードする遺伝子および／またはＭＥＰの１または２以上の成分に対してコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【０００９】
いくつかの態様において、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢからなる群から選択される。ある態様において、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦは過剰発現される。例えば、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦは、オペロンｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦ上で過剰発現されることができる。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素に対してコードする遺伝子およびＧＧＰＰＳ酵素に対してコードする遺伝子は、オペロン上で一緒に発現される。
いくつかの態様において、細胞はさらに、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）またはその触媒活性部分を発現する。ある態様において、Ｔ５αＯＨ酵素またはその触媒活性部分を、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合させる。例えば、Ｔ５αＯＨ酵素は、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲであることができる。
【００１０】
タキサジエンシンターゼ酵素、ＧＧＰＰＳ酵素および、ＭＥＰ経路の１または２以上の成分の発現を、タキサジエンの産生を最大化するように均衡化できる。本発明に関連する方法はさらに、細胞を培養して、タキサジエンまたはタキサジエン−５α−オールを産生することを包含できる。いくつかの態様において、少なくとも１０ｍｇＬ−１のタキサジエンが産生される。ある態様において、少なくとも２５０ｍｇＬ−１のタキサジエンが産生される。いくつかの態様において、少なくとも１０ｍｇＬ−１のタキサジエン−５α−オールが産生される。ある態様において、少なくとも５０ｍｇＬ−１のタキサジエン−５α−オールが産生される。いくつかの態様において、タキサジエンの、タキサジエン−５α−オールおよび副産物５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサンへの変換のパーセンテージは、少なくとも５０％、少なくとも７５％、または少なくとも９５％である。
【００１１】
本発明に関連する方法はさらに、細胞培養物からタキサジエンまたはタキサジエン−５α−オールを回収することを含む。いくつかの態様において、タキサジエンまたはタキサジエン−５α−オールは気相から回収され、一方他の態様においては、有機層が細胞培養物に添加され、タキサジエンまたはタキサジエン−５α−オールは有機層から回収される。
本発明の側面は、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分を過剰発現し、タキサジエンシンターゼ酵素およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を組み換え発現する細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、大腸菌細胞などの細菌細胞である。いくつかの態様において、細菌細胞は、バシラス（Bacillus）細胞などのグラム陽性菌である。いくつかの態様において、細胞は、サッカロミセス（Saccharomyces）細胞またはヤロウイア（Yarrowia）細胞などの酵母細胞である。いくつかの態様において、細胞は、藻細胞または植物細胞である。
【００１２】
いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素は、Taxus brevifolia酵素などのイチイ属酵素である。いくつかの態様において、ＧＧＰＰＳ酵素は、Taxus canadenis酵素などのイチイ属酵素である。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および／またはＧＧＰＰＳ酵素をコードする遺伝子および／またはＭＥＰ経路の１または２以上の成分をコードする遺伝子は、１または２以上のプラスミドから発現される。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子および／またはＧＧＰＰＳ酵素をコードする遺伝子および／またはＭＥＰの１または２以上の成分をコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれている。
【００１３】
いくつかの態様において、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分は、ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢからなる群から選択される。ある態様において、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦは過剰発現される。例えば、ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦは、オペロンｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦ上で過剰発現されることができる。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素をコードする遺伝子およびＧＧＰＰＳ酵素をコードする遺伝子は、オペロン上で一緒に発現される。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼ酵素、ＧＧＰＰＳ酵素および、ＭＥＰ経路の１または２以上の成分の発現は、タキサジエンの産生を最大化するように均衡化させることができる。
【００１４】
いくつかの態様において、細胞はさらに、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）またはその触媒活性部分を発現する。ある態様において、Ｔ５αＯＨ酵素またはその触媒活性部分を、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合させる。例えば、Ｔ５αＯＨ酵素は、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲであることができる。いくつかの態様において、細胞はタキサジエンおよび/またはタキサジエン５α−オールを産生する。
本発明の側面は、テルペノイドの高産生を示す細胞を選択する方法であって、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分を過剰発現する細胞を作り出すかまたは入手すること、該細胞からテルペノイドを産生すること、該細胞から産生されたテルペノイドの量を対照細胞で産生されたテルペノイドの量と比較すること、および対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第１の改善細胞を選択することを含み、ここで、対照細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第１の改善細胞は、テルペノイドの高産生を示す細胞である、前記方法に関する。
【００１５】
いくつかの態様において、細胞は、テルペノイドシンターゼ酵素および／またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素を組み換え発現する。方法はさらに、第１の改善細胞における非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分、テルペノイドシンターゼ酵素および／またはゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素の発現レベルを変化させて第２の改善細胞を作成すること、および第２の改善細胞から産生されたテルペノイドの量を第１の改善細胞で産生されたテルペノイドの量と比較することを含むことができ、ここで、第１の改善細胞よりも大量のテルペノイドを産生する第２の改善細胞は、テルペノイドの高産生を示す細胞である。いくつかの態様において、テルペノイドシンターゼ酵素は、タキサジエンシンターゼ酵素である。細胞はさらに、本発明に関連する任意のポリペプチドを組み換え発現することができる。
【００１６】
本発明の側面は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素またはその触媒活性部分に融合した、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）またはその触媒活性部分を含む、単離されたポリペプチドに関連する。いくつかの態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素は、イチイ属シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）である。いくつかの態様において、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼおよびＴＣＰＲは、ＧＳＴＧＳ（配列番号：５０）などのリンカーにより結合されている。いくつかの態様において、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼおよび／またはＴＣＰＲは切断されて、膜貫通領域の全てまたは一部が除去されている。ある態様において、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼの８、２４、または４２個のＮ末端アミノ酸が切断されている。ある態様において、ＴＣＰＲの７４個のアミノ酸が切断されている。いくつかの態様において、追加のペプチドがタキサジエン５α−ヒドロキシラーゼに融合されている。ある態様において、ペプチドはＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号：５１）である。ある態様において、単離されたポリペプチドは、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲである。本発明の側面はまた、本発明に関連する任意のポリペプチドをコードする核酸分子、および本発明に関連する任意のポリペプチドを組み換え発現する細胞を包含する。
【００１７】
本発明の側面は、１種または２種以上のテルペノイドを産生する細胞における、テルペノイド産生を増加させる方法に関する。方法は、細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御し、これにより細胞におけるテルペノイド産生を増加させることを含む。本明細書に記載された、大腸菌細胞などの細菌細胞；バシラス（Bacillus）細胞などのグラム陽性菌細胞；サッカロミセス（Saccharomyces）細胞またはヤロウイア（Yarrowia）細胞などの酵母細胞；藻細胞；植物細胞；および本明細書に記載の任意の改変された細胞を含む任意の細胞を、この方法に用いることができる。
【００１８】
いくつかの態様において、細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御するステップは、上流非メバロン酸イソプレノイド経路を、下流の産物合成経路と均衡化させること、および／またはインドール経路を修飾または調節することを含む。他の態様において、細胞中または細胞の培養物中のインドールの蓄積を制御するステップは、蓄積されたインドールを、化学的方法により、例えば吸収剤または捕捉剤を用いて、発酵物から除去することを含む。
細胞（単数または複数）によりまたは培養物中で産生された１種または２種以上のテルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、またはテトラテルペノイドであることができる。ある態様において、テルぺノイドは、タキサジエンまたは任意のタキソール前駆体である。
【００１９】
本発明の側面は、１種または２種以上のテルペノイドを産生する細胞中の、または１種または２種以上のテルペノイドを産生する細胞の培養物中の、インドールの量または濃度を測定することを含む方法に関する。かかる方法は、インドールの量または濃度を２回または３回以上測定することを含むことができる。いくつかの態様において、インドールの測定量または濃度を、１種または２種以上のテルペノイド産生のプロセスを導く（guide）ために用いる。いくつかの態様において、インドールの測定量または濃度を、株の構築を導くために用いる。
本発明のこれらおよびその他の側面、ならびにその種々の態様は、図面および本発明の詳細な説明を参照することにより、さらに明らかにされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
付随する図面は、正確な縮尺で描くことを意図しない。図面において、種々の図に描かれた同一または同一に近い成分の各々は、同様の数字で表す。明確化のため、全ての図において全ての成分にラベル付けをしているわけではない。図面において：
【００２１】
【図１ａ】図１ａは２つのモジュールを示した模式図である。
【図１ｂ】図１ｂは多変量モジュラーイソプレノイド経路改変手段を示した模式図である。
【図２ａ】図２ａはタキサジエン蓄積の応答を示したグラフである
【図２ｂ】図２ｂは上流経路の強度における一定の増加に対する下流経路への依存を示したグラフである。
【図２ｃ】図２ｃはタキサジエン応答を示したグラフである。
【図２ｄ】図２ｄは失われた探索空間を同定を示したグラフである。
【図２ｅ】図２ｅはタキサジエン産生株の遺伝的詳細を示した図である。
【図３ａ】図３ａは代謝産物の質量スペクトルを示したグラフである。
【図３ｂ】図３ｂは図３ａのイソプレノイド副産物およびタキサジエンの間の相関を示したグラフである
【図４ａ】図４ａは相対的転写レベルＤＸＳ遺伝子発現を示したグラフである。
【図４ｂ】図４ｂは相対的転写レベルＴＳ遺伝子発現を示したグラフである。
【図４ｃ】図４ｃは改変株２５〜２９の細胞増殖を示したグラフである。
【図４ｄ】図４ｄは株１７、２２、２５〜３２の増殖表現型を示したグラフである。
【図５ａ】図５ａはタキサジエンのタキサジエン５α−オールへの、さらにタキソールへの変換を示した模式図である。
【図５ｂ】図５ｂは膜貫通改変および構築を示した図である。
【図５ｃ】図５ｃはＡｔ８Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲおよびＡｔ４２Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ構築の機能的活性を示したグラフである。
【図５ｄ】図５ｄは株１８−Ａｔ２４Ｔ５ａＯＨ−ｔＴＣＰＲの増殖プロファイルを示したグラフである。
【００２２】
【図６】図６は大腸菌におけるタキソール産生のための生合成スキームを示した図である。
【図７】図７はモジュラー経路発現探索からのタキサジエン産生における倍数改善を示したグラフである。
【図８ａ】図８ａは代謝産物蓄積に対するタキサジエン間の相関を示したグラフである。
【図８ｂ】図８ｂは株２６〜２８からの代表的なＧＣプロファイルを示したグラフである。
【図８ｃ】図８ｃは代謝産物（１）とタキサジエン（２）のＧＣ−ＭＳプロファイルを示したグラフである。
【図９ａ】図９ａは３種の構築からの抽出物のＧＣプロファイルを示したグラフである。
【図９ｂ】図９ｂは３つの株から定量化されたタキサ−４（２０），１１，１２−ジエン−５α−オールおよびＯＣＴの産生を示したグラフである。
【図９ｃ】図９ｃは質量スペクトルの同一性の確認を示したグラフである。
【図９ｄ】図９ｄは質量スペクトルの同一性の確認を示したグラフである。
【図１０】図１０はテルペノイド生合成経路およびこの経路により産生される天然の産物を示した模式図である。
【図１１】図１１はタキサジエン産生を増幅するための上流経路の調節を示す模式図である。
【図１２】図１２はタキサジエン産生を増幅するための下流経路の調節を示す模式図である。
【図１３】図１３は新たに同定された経路の分岐が下流合成経路の特性ではないことを示す模式図である。
【図１４ａ】図１４ａは３１任意単位での上流経路強度および下流強度の増加によるｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ遺伝子の相対的発現を示す図である。
【図１４ｂ】図１４ｂは６１任意単位での上流経路強度および下流強度の増加によるｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ遺伝子の相対的発現を示すグラフである。
【００２３】
【図１５ａ】図１５ａはタキサジエンとインドールの逆相関を示すグラフである。
【図１５ｂ】図１５ｂは高産生株２６のタキサジエン産生に対する外部導入したインドールの効果を示すグラフである。
【図１５ｃ】図１５ｃは外部的に導入したインドールの大腸菌改変株の細胞増殖に対する効果を示すグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは細胞培養物からヘキサンを用いて抽出した未知の代謝産物のガスクロマトグラムを示す図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂはヘキサンに溶解した純粋インドールのガスクロマトグラムを示す図である。
【図１６ａ】図１６ａは細胞培養物からヘキサンを用いて抽出した未知の代謝産物の質量スペクトルを示す図である。
【図１６ｂ】図１６ｂはヘキサンに溶解した純粋インドールの質量スペクトルを示す図である。
【図１６ｃ】図１６ｃは細胞培養物から抽出されたインドールの１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１６ｄ】図１６ｄは１３ＣＮＭＲを示す図である。
【図１６ｅ】図１６ｅは純粋インドールの１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７ａ】図１７ａはタキサジエン蓄積の時系列変化を示すグラフである。
【図１７ｂ】図１７ｂは細胞増殖の時系列変化を示すグラフである。
【図１７ｃ】図１７ｃは酢酸蓄積の時系列変化を示すグラフである。
【図１７ｄ】図１７ｄは全基質（グリセロール）添加の時系列変化を示すグラフである。
【００２４】
図１．多変量モジュラー式イソプレノイド経路改変により、テルペノイド蓄積における強い非線形応答が明らかとなる。  上流ＭＥＰ経路を介してフラックスを増加させるため、我々は、オペロン（ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦ）による過剰発現のために、報告された障害となる酵素ステップ（ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ）を標的化した２８。汎用イソプレノイド前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰからのオーバーフローフラックスを、タキソール生合成に向けるために、下流遺伝子ＧＧＰＰシンターゼ（Ｇ）およびタキサジエンシンターゼ（Ｔ）の合成オペロン１６を作成した。上流イソプレノイドおよび下流合成タキサジエン経路を、誘導性プロモーターの制御下に置き、その相対的遺伝子発現を制御した。（ａ）２つのモジュールの模式図：天然の上流ＭＥＰイソプレノイド経路（左）および合成タキサジエン経路（右）。大腸菌生合成ネットワークにおいて、ＭＥＰイソプレノイド経路は、解糖からの前駆体であるグリセルアルデヒド−３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）およびピルベート（ＰＹＲ）の縮合により開始される。タキソール経路の分岐は、汎用イソプレノイド前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから始まり、最初に「線形」前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸を、次に、タキソールに対する関係する鍵となる中間体である「環式」タキサジエンを形成する。環式オレフィンタキサジエンは、立体特異的酸化、アシル化、側鎖アセンブリーによるベンゾイル化の複数ラウンドを経て、最終的にタキソールを形成する。（ｂ）上流および下流経路で改変された細胞からのテルペノイド蓄積における、非線形応答を厳密に調査するための、多変量モジュラーイソプレノイド経路改変手段の模式図。上流および下流経路の発現は、プロモーターの強度（Ｔｒｃ、Ｔ５およびＴ７）を変えることにより、または異なるプラスミドを用いてコピー数を増加させることにより、調節する。上流および下流経路の発現の変化は、タキサジエン蓄積における異なる最大値を与える。
【００２５】
図２．上流および下流モジュラー経路の発現の調節による、タキサジエン産生の最適化。  （ａ）一定値の下流経路に対する上流経路の強度の増加に対するタキサジエン蓄積の応答。（ｂ）上流経路の強度における一定の増加に対する下流経路への依存。タキサジエン応答において観察される複数の極大値は、上流または下流の経路発現強度における増加に依存する。（ｃ）均衡化された発現を有するタキサジエン応答の同定する、高い上流経路過剰発現を有する（２０〜１００）、２種の異なる下流発現を有する（〜３０および〜６０）改変株（１７〜２４）からのタキサジエン応答。強いプロモーターＴ７ＴＧオペロンのもと、低いコピープラスミド（ｐ５およびｐ１０）からの下流経路の発現を用いて、これらの発現を調節した。異なるプロモーターを用いて異なるプラスミドから発現された上流および下流経路の両方は、プラスミドから生じる代謝負担（plasmid born metabolic burden）を課すことができることに注意。（ｄ）２つの異なる下流発現（〜３０および〜６０）で染色体からのプロモーター強度を増加させることで上流経路を調節することにより、毒性効果の低減された、失われた探索空間を同定する（株２５〜３２）。（ｅ）タキサジエン産生株の遺伝的詳細。数字は、異なる株および対応する遺伝子型に対応する。Ｅ  −  大腸菌K12mG1655 ΔrecAΔendA、ＥＤＥ３  −  染色体内にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼＤＥ３構築を有する大腸菌K12mG1655 ΔrecAΔendA、ＭＥＰ  −  ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロン、ＧＴ  −  ＧＰＰＳ−ＴＳオペロン、ＴＧ  −  ＴＳ−ＧＰＰＳオペロン、Ｃｈ１  −  染色体内に１コピー、Ｔｒｃ  −  Ｔｒｃプロモーター、Ｔ５  −  Ｔ５プロモーター、Ｔ７  −  Ｔ７プロモーター、ｐ５、ｐ１０、ｐ２０  −  〜５（ＳＣ１０１）、〜１０（ｐ１５）、および〜２０（ｐＢＲ３２２）コピープラスミド。
【００２６】
図３．タキサジエン産生に逆相関する代謝産物。  （ａ）図２の株構築においてタキサジエン産生と逆相関すると検出された代謝産物の質量スペクトル。代謝産物の観測された特性ピークは、２３３、２０７、１７８、１１７、８９および６２である。（ｂ）図３ａのイソプレノイド副産物およびタキサジエンの間の相関。株２６〜２９および３０〜３２は、全て染色体に組み込まれた上流経路発現を有し、一貫した比較のために選択された。株２６〜２９および３０〜３２において、プロモーターをＴｒｃからＴ５およびＴ７にそれぞれ変えることにより、上流発現が増加した。かかる２セットの株は、下流経路の発現においてのみ異なり、第２のセット（３０〜３２）が第１のセットより２倍高いレベルの発現を有した。第１のセットでは、最適な均衡化は、Ｔｒｃプロモーターを上流経路発現に使用し、また最低レベルの代謝産物蓄積を示す株２６で達成された。株３０〜３２では、株３１は最小の代謝産物蓄積および最大のタキサジエン産生を示す。データにより、未知の代謝産物およびタキサジエン産生の間に観察される逆相関が実証される。
【００２７】
図４．上流および下流経路転写遺伝子発現レベルおよび改変株の細胞生理における変化。  上流（ＤＸＳ）および下流（ＴＳ）経路のオペロンにおける第１の遺伝子の相対的発現を、ｑＰＣＲにより定量化する。オペロンの下流における遺伝子で、類似する発現プロファイルが観察された。対応する株の番号をグラフ内に示す。（ａ）２つの異なる下流発現のもとで、プロモーターおよびプラスミドを用いて調節される異なる上流発現から定量化した相対的転写レベルＤＸＳ遺伝子発現。（ｂ）異なる上流発現のもとでｐ５Ｔ７およびｐ１０Ｔ７プラスミドを用いて調節した２つの異なる下流発現から定量化した相対的転写レベルＴＳ遺伝子発現。我々の遺伝子発現分析は、プラスミドコピー数（５、１０および２０）およびプロモーター強度（Ｔｒｃ、Ｔ５およびＴ７）の増加で、上流および下流経路の発現が調節できるという仮説を直接的に支持した。（ｃ）改変株２５〜２９の細胞増殖。増殖表現型は、イソプレノイド代謝の活性化（株２６）、組み換えタンパク質発現（株２５）およびプラスミドから生じる代謝負担（対照ｖｓ改変株）により影響された、および（ｄ）株１７、２２、２５〜３２の増殖表現型。黒線はタキサジエン産生改変株、灰色線は下流発現なしでプロモーターおよび複数クローニング部位を有する空のプラスミドを担持する対照株。増殖は、テルペノイド代謝の活性化、プラスミドから生じる代謝負担および組み換えタンパク質発現に相関された。
【００２８】
図５．大腸菌における改変タキソールＰ４５０酸化化学。  （ａ）タキサジエンのタキサジエン５α−オールへの、さらにタキソールへの変換の模式図。（ｂ）タキサジエン５α−オールヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）およびイチイ属シトクロムｐ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）からの１成分キメラタンパク質の、膜貫通改変および構築。１および２は、それぞれ４２および７４個のアミノ酸ＴＭ領域で同定されたＴ５αＯＨおよびＴＣＰＲの完全長タンパク質を表し、３  −  ５残基ＧＳＴＧＳリンカーペプチドを用いた７４ＡＡ切断ＴＣＰＲ（ｔＴＣＰＲ）での翻訳融合を介して、３つの異なるＴＭ改変されたＴ５αＯＨ構築（８残基合成ペプチド（Ａ）を８、２４、および４２ＡＡ切断Ｔ５αＯＨに融合させることにより構築された、Ａｔ８Ｔ５αＯＨ、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨおよびＡｔ４２Ｔ５αＯＨ）から産生されたキメラ酵素。（ｃ）タキサジエン産生株１８中へと形質転換されたＡｔ８Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲおよびＡｔ４２Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ構築の機能的活性。（ｄ）タキサジエン５α−オール蓄積の時系列プロファイルおよび１Ｌバイオリアクター内で発酵された株１８−Ａｔ２４Ｔ５ａＯＨ−ｔＴＣＰＲの、増殖プロファイル。
【００２９】
図６．大腸菌におけるタキソール産生のための生合成スキーム。  ２つのモジュールの模式図、天然の上流イソプレノイド経路（左）および合成タキソール経路（右）。大腸菌生合成ネットワークにおいて、ＭＥＰイソプレノイド経路の分岐は、解糖（Ｉ〜Ｖ）からの前駆体グリセルアルデヒド−３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）およびピルベート（ＰＹＲ）から開始される。タキソール経路の分岐は、大腸菌イソプレノイド前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰから始まり、「線形」前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸（ＶＩＩＩ）、「環式」タキサジエン（ＩＸ）、「酸化」タキサジエン５α−オール（Ｘ）へ、さらに初期の前駆体バッカチンＩＩＩ（ＸＩＩ）に対する立体特異的酸化、アシル化、ベンゾイル化およびエポキシ化の複数ラウンドへ、および最終的に側鎖アセンブリーによりタキソール（ＸＩＩＩ）へと進行する。ＤＸＰ  −  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸、ＭＥＰ  −  ２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸、ＣＤＰ−ＭＥ  −  ４−ジホスホシチジル−２Ｃメチル−Ｄ−エリトリトール、ＣＤＰ−ＭＥＰ  −  ４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸、ＭＥ−ｃＰＰ  −  ２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェート、ＩＰＰ  −  イソペンテニル二リン酸、ＤＭＡＰＰ  −  ジメチルアリル二リン酸。遺伝子は、Ｇ３ＰおよびＰＹＲからタキソールへの生合成経路に関与した。ＤＸＳ  −  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ、ｉｓｐＣ  −  １−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ、ＩｓｐＤ  −  ４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、ＩｓｐＥ  −  ４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、ＩｓｐＦ  −  ２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロジホスフェートシンターゼ、ＩｓｐＧ  −  １−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ、ＩｓｐＨ  −  ４−ヒドロキシ−３−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ、ＩＤＩ  −  イソペンテニル−二リン酸イソメラーゼ、ＧＧＰＰＳ  −  ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、タキサジエンシンターゼ、タキソイド５α−ヒドロキシラーゼ、タキソイド−５α−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、タキソイド１３α−ヒドロキシラーゼ、タキソイド１０β−ヒドロキシラーゼ、タキソイド２α−ヒドロキシラーゼ、タキソイド２−Ｏ−ベンゾイルトランスフェラーゼ、タキソイド７β−ヒドロキシラーゼ、タキソイド１０−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、タキソイド１β−ヒドロキシラーゼ＊、タキソイド９α−ヒドロキシラーゼ、タキソイド９−ケト−オキシダーゼ＊、タキソイドＣ４，Ｃ２０−β−エポキシ＊、フェニルアラニンアミノムターゼ、側鎖ＣｏＡリガーゼ＊、タキソイド１３−Ｏ−フェニルプロパノイルトランスフェラーゼ、タキソイド２’−ヒドロキシラーゼ＊、タキソイド３’−Ｎ−ベンゾイルトランスフェラーゼ２１６，２１９。＊印の遺伝子は、未だに同定または特徴付けされていない。
【００３０】
図７．モジュラー経路発現探索からのタキサジエン産生における倍数改善。  （ａ）株１に対して比較した、図２ａ、ｂ、およびｃからの全ての観察された極大値からの倍数改善でのタキサジエン応答。２つの最大極大値の間の２．５倍の差（株１７と２６）、および最小値との２３倍の差（株２６と１０）は、最適応答を失うと顕著に低い力価がもたらされることを示す。
図８．代謝産物  （ａ）代謝産物蓄積に対するタキサジエン間の相関。改変株からの代謝産物蓄積は、タキサジエン産生と指数関数的に逆比例する。この相関に対する相関係数は０．９２と決定された。（ｂ）タキサジエンおよび代謝産物の蓄積における変化を実証する株２０〜２２からの代表的なＧＣプロファイル。クロマトグラムにおける１および２の数字は、それぞれ代謝産物およびタキサジエンのピークに対応する。（ｃ）代謝産物（１）とタキサジエン（２）のＧＣ−ＭＳプロファイル。代謝産物の観測される特性ピークは、２３３、２０７、１７８、１１７、８９および６２である。タキサ−４（２０），１１，１２−ジエン特性イオンｍ／ｚ272(P+), 257 (P+-CH3), 229 (P+-C3H7); 121, 122, 123（Ｃ環断片クラスター）６０。星印をつけたピークは、内部標準カリオフィレンである。
【００３１】
図９．株２６において改変された人工キメラ酵素からのＧＣ−ＭＳプロファイルおよびタキサジエン／タキサジエン−５α−オール産生。  （ａ）株２６へと移入され５日間発酵された３種の構築（Ａ−Ａｔ８Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲおよびＡｔ４２Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ）からの、ヘキサン：エーテル（８：２）抽出物のＧＣプロファイル。ピークにおける１、２および３のラベルは、それぞれタキサジエン、タキサジエン−５α−オールおよび５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサン（ＯＣＴ）に対応する。（ｂ）３つの株から定量化されたタキサ−４（２０），１１，１２−ジエン−５α−オールおよびＯＣＴの産生。（ｃ）および（ｄ）タキサ−４（２０），１１，１２−ジエン−５α−オールおよびＯＣＴのＧＣ−ＭＳプロファイルと断片化に対応するピークを真正標準と比較し、および前の報告４２，４７のＧＣ−ＭＳ分析により、真正のタキサ−４（２０），１１，１２−ジエン−５α−オールとの質量スペクトルの同一性を、特性イオンｍ／ｚは288(P+), 273 (P+-H2O), 255 (P+-H2O-CH3)で確認した。
図１０は、テルペノイド生合成経路およびこの経路により産生される天然の産物を表す模式図である。
図１１は、タキサジエン産生を増幅するための上流経路の調節を示す模式図である。
【００３２】
図１２は、タキサジエン産生を増幅するための下流経路の調節を示す模式図である。
図１３は、新たに同定された経路の分岐が下流合成経路の特性ではないことを示す模式図である。
図１４．経路の強度は、転写遺伝子発現レベルに相関する。  （ａ）３１任意単位での上流経路強度および下流強度の増加による、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ遺伝子の相対的発現、および（ｂ）６１任意単位での上流経路強度および下流強度の増加による、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦ遺伝子の相対的発現。予想されたように、遺伝子発現は、上流経路強度の増加と共に増加する。対応する株の番号は棒グラフに示す。相対的発現は、ハウスキーピングｒｒｓＡ遺伝子の発現を用いて定量した。データは、４回の反復試験に対する平均＋／−ＳＤである。
【００３３】
図１５．代謝産物副産物インドールの蓄積の、タキサジエンの産生および増殖に対する影響。  （ａ）タキサジエンとインドールの逆相関。株２６〜２８および３０〜３２は全て、染色体に上流経路発現が組み込まれているが、これらを一貫した比較のために選択した。２セットの株は、下流経路の発現においてのみ違いがあり、第２のセット（３０〜３２）は第１のセットの２倍の発現レベルを有する。株２６〜２８および３０〜３２において、上流発現は、プロモーターをＴｒｃからそれぞれＴ５およびＴ７に変えることにより増加した。第１のセットでは、最適な均衡化は、Ｔｒｃプロモーターを上流経路発現に用い、また最小のインドール蓄積を示す株２６で達成される。株３０〜３２では、株３１は最小のインドール蓄積と最大のタキサジエン産生を示す。２つのセットに対し、それぞれ、倍数改善は株２５および２９に相対する。（ｂ）高産生株２６のタキサジエン産生に対する外部導入したインドールの効果。異なる濃度のインドールを、０．５％酵母抽出物を有する最小培地で培養した細胞の培養物中に導入した。タキサジエン産生は、インドール濃度が５０ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌへと増加するにつれて、顕著に低下した。（ｃ）外部的に導入したインドールの、大腸菌改変株の細胞増殖に対する効果。データは、３回の反復試験に対する平均＋／−ＳＤである。下流経路なしでかつ異なる強度の上流経路の株（１、２、６、２１、４０、および１００）を選択した。株２６は高タキサジエン産生者であり、最も強い阻害を示す。
【００３４】
図１６．インドールとして同定された未知の代謝産物。  （Ａ）および（ａ）細胞培養物からヘキサンを用いて抽出した未知の代謝産物の、ガスクロマトグラムおよび質量スペクトル。（Ｂ）および（ｂ）は、ヘキサンに溶解した純粋インドールの、ガスクロマトグラムおよび質量スペクトルに対応する。化学的同一性をさらに確認するために、代謝産物を、ヘキサン抽出を用いて発酵ブロスから抽出し、シリカカラムクロマトグラフィーによりヘキサン：酢酸エチル（８：２）を溶離液として用いて精製した。化合物の純度は、ＴＬＣおよびＧＣ−ＭＳにより確認した。１ＨＮＭＲおよび１３ＣＮＭＲスペクトルにより、代謝産物のインドールとの化学的同一性が確認された。（ｃ）細胞培養物から抽出されたインドールの１ＨＮＭＲスペクトル(CDCl3, 400 MHz) δ: 6.56 (d, 1H, Ar C-H), 7.16 (m, 3H, Ar C-H), 7.38 (d, 1H, Ar C-H), 7.66 (d, 1H, Ar C-H), 8.05 (b, 1H, インドール NH). (d) 13CNMR δ: 135.7, 127.8, 124.2, 122, 120.7, 119.8, 111, 102.6。（ｅ）は、純粋インドールの１ＨＮＭＲスペクトルである。
【００３５】
図１７．１Ｌバイオリアクターにおける改変株のフェドバッチ培養。  最小培地および０．５％酵母抽出物を用いる制御されたｐＨおよび酸素条件下の１Ｌバイオリアクター容器内での５日間のフェドバッチバイオリアクター培養の間の、株２２、１７、および２６に対するタキサジエン蓄積（ａ）、細胞増殖（ｂ）、酢酸蓄積（ｃ）、および全基質（グリセロール）添加（ｄ）の時系列変化。グリセロールが発酵槽内で〜０．５〜１ｇ／Ｌに減少した後、３ｇ／Ｌのグリセロールを発酵中にバイオリアクターに導入した。データは、２回の反復のバイオリアクターの平均である。
【００３６】
発明の詳細な説明
タキソールはまず、タイヘイヨウイチイ（Taxus brevifolia）の樹から天然産物として単離された、強力な抗癌剤である。しかし、植物抽出物からの従来の生産経路によるタキソールまたはタキソール類似体の信頼性の高いコスト効率的な生産は限られている。ここで、我々は、改変された大腸菌におけるタキサジエン産生を〜１５０００倍増幅するための、代謝経路改変に対する多変量モジュラー手段を報告する。最初に介入したタキソール中間体であるタキサジエンは、大腸菌における非メバロン酸経路の生合成産物であり、この経路は２つのモジュール、すなわちイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を形成する天然の上流経路および異種の下流テルペノイド形成経路を含む。系統的多変量探索によって、阻害性中間体の蓄積と副産物へのフラックス分流を最小化するための、２つの経路モジュールの均衡を最適化する条件を同定した。我々はまた、タキサジエンの後のタキソール生合成における次のステップ、すなわち、＞９８％の基質変換を産生するＰ４５０に基づく酸化ステップを改変し、大腸菌における任意の機能性タキソール中間体のin vivo産生の、最初の例を提示した。モジュラー経路改変手段は、多数ステップ経路の複雑さを強調するのみでなく、小規模発酵において高いタキサジエンおよびタキサジエン−５α−オール力価の蓄積を許容し（それぞれ〜３００ｍｇ／Ｌおよび６０ｍｇ／Ｌ）、こうして、タキソールおよびその誘導体の微生物産生の可能性を例示した。
【００３７】
本発明は、その用途において、以下の説明または図面に示された要素の構成および配列の詳細に限定されない。本発明は他の態様も可能であり、種々の方法で実践し実施することができる。また、本明細書において用いられる表現および用語は説明を目的とするものであり、限定的とみなされるべきではない。本明細書において「含む（including）」、「含有する（comprising）」、または「有する（having）」、「含む（containing）」、「関連する（involving）」、およびこれらの変化形は、その後に挙げた項目およびその均等物、ならびにさらなる事項を包含することを意味する。
【００３８】
タキサジエンなどのテルペノイドの微生物産生を本明細書において実証する。微生物ルートは、十分なレベルで発現された場合に、かかる化合物の産生コストを大幅に低減させる。さらに、微生物ルートは安価、豊富かつ再生可能な原料（例えば糖類およびその他の炭化水素類など）を利用し、元来の化合物よりもはるかに優れた特性を示し得る多数の誘導体合成の源となり得る。イソプレノイド経路の化合物の、微生物ルートを用いるコスト競争力のある産生における鍵となる要素は、これら分子の過剰産生を許容するための、この経路の増幅である。フラックスを大腸菌におけるテルペノイド産生へと増強または増幅する方法が、本明細書に記載される。特に、代謝フラックスをイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）（イソプレノイド化合物産生の鍵となる中間体）、ジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）、およびファルネシルゲラニル二リン酸（ＦＧＰＰ）、パクリタキセル（タキソール）、ギンコリド、ゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、イソプレン、メントールなどのモノテルペノイド、リコペンなどのカロテノイド、ポリイソプレンまたは天然ゴムなどのポリイソプレノイド、エリュテロビン（eleutherobin）などのジテルペノイド、およびアルテミシニンなどのセスキテルペノイドの合成へ増幅するための方法が提供される。
【００３９】
本発明の側面は、テルペノイドの産生に関する。本明細書において、イソプレノイドとも呼ばれるテルペノイドは、５炭素イソプレン単位に由来する有機化学物質である。含有するイソプレン単位の数に基づいて分類されるテルペノイドのいくつかの非限定的な例は、ヘミテルペノイド（１イソプレン単位）、モノテルペノイド（２イソプレン単位）、セスキテルペノイド（３イソプレン単位）、ジテルペノイド（４イソプレン単位）、セスタテルペノイド（５イソプレン単位）、トリテルペノイド（６イソプレン単位）、テトラテルペノイド（８イソプレン単位）、およびより多数のイソプレン単位のポリテルペノイドを含む。いくつかの態様において、産生されるテルペノイドはタキサジエンである。いくつかの態様において、産生されるテルペノイドは、シトロネロール、クベボール、ヌートカトン、シネオール、リモネン、エリュテロビン、サルコジクチイン、シュードプテロシン、ギンコライド、ステビオシド、レバウジオシドＡ，スクラレオール、ラブデンジオール、レボピマラジエン、サンドラコピマラジエン、またはイソピマラジエン（isopemaradiene）である。
【００４０】
上流経路および下流経路に関与する遺伝子またはタンパク質を制御することにより細胞におけるテルペノイドの産生を最適化するための方法および組成物が、本明細書に記載される。上流経路には、イソペンチルピロリン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）の産生が関与し、これは２つの異なる代謝経路により実施される：メバロン酸（ＭＶＡ）経路、およびＭＥＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸）経路、これはまたＭＥＰ／ＤＯＸＰ（２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸）経路、非メバロン酸経路またはメバロン酸独立性経路とも呼ばれる。
【００４１】
下流経路は、テルペノイドの産生をもたらす合成経路であり、テルペノイドシンターゼ（テルペンシクラーゼとも言う）酵素とゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）酵素の組み換え遺伝子発現が関与する。いくつかの態様において、テルペノイドシンターゼ酵素はジテルペノイドシンターゼ酵素である。ジテルペノイドシンターゼ酵素のいくつかの非限定的例は、カスベンシンターゼ、タキサジエンシンターゼ、レボピマラジエンシンターゼ、アビエタジエンシンターゼ、イソピマラジエンシンターゼ、ｅｎｔ−コパリル二リン酸合成酵素、ｓｙｎ−ステマル−１３−エンシンターゼ、ｓｙｎ−ステモダ−１３（１７）−エンシンターゼ、ｓｙｎ−ピマラ−７，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−サンダラコピマラジエンシンターゼ、ｅｎｔ−カッサ−１２，１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−ピマラ−８（１４），１５−ジエンシンターゼ、ｅｎｔ−カウラ−１５−エンシンターゼ、ｅｎｔ−カウラ−１６−エンシンターゼ、アフィディコラン−１６β−オールシンターゼ、フィロクラダン−１６α−オールシンターゼ、フシコッカ−２，１０（１４）−ジエンシンターゼ、およびテルペンテトリエンシクラーゼを含む。
【００４２】
驚くべきことに、実施例のセクションで実証されるように、本明細書に記載の上流および下流経路の操作によるテルペノイド合成の最適化は、単純な線形または付加的なプロセスではなかった。むしろ、複雑な組合せ解析を介して上流および下流経路の成分を均衡化させることにより、最適化が達成された。予想外なことに、図１および２に示すように、タキサジエンの蓄積は、上流ＭＥＰ経路と下流合成タキサジエン経路の相対的強度に対して、強く非線形な依存を示した。
本発明の側面は、タキサジエンなどのテルペノイドの最適化された産生のための、ＭＥＰ経路における遺伝子およびタンパク質発現の制御に関する。テルペノイドの最適化された産生とは、最適化戦略に従って、かかる戦略なしの場合に達成されるよりも多量のテルペノイドを産生することを言う。ＭＥＰ経路内の任意の遺伝子および／またはタンパク質は、本明細書に記載の方法および組成物に包含されると理解されるべきである。いくつかの態様において、ＭＥＰ経路内の任意の遺伝子とは、以下の１つである：ｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡまたはｉｓｐＢ。ＭＥＰ経路内の１または２以上の遺伝子および／またはタンパク質の発現を、上方制御および／または下方制御することができる。ある態様において、ＭＥＰ経路内の１または２以上の遺伝子および／またはタンパク質の上方制御は、ＭＥＰ経路内の１または２以上の遺伝子および／またはタンパク質の下方制御と組み合わせることができる。
【００４３】
遺伝子および／またはタンパク質は、それのみで、または組み合わせて、調節可能であると理解されるべきである。例えば、ｄｘｓの発現は、それのみで、またはｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＣの発現を、単独で、またはｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＤの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＥの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＦの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＧの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＨの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｄｉ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｄｉの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｓｐＡおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＡの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉおよびｉｓｐＢの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。ｉｓｐＢの発現を、それのみで、またはｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、ｉｄｉおよびｉｓｐＡの１または２以上の発現の上方制御または下方制御と組み合わせて、上方制御または下方制御することができる。いくつかの態様において、１または２以上のｄｘｓ、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＧ、ｉｓｐＨ、およびｉｄｉの遺伝子および／またはタンパク質の発現は上方制御され、一方ｉｓｐＡおよび／またはｉｓｐＢの遺伝子および／またはタンパク質の発現は下方制御される。
【００４４】
ＭＥＰ経路内の遺伝子の発現は、モジュラー法で調節することができる。本明細書において、モジュラー法による調節とは、複数遺伝子をともに調節することを言う。例えば、いくつかの態様において、ＭＥＰ経路内の複数遺伝子は、オペロンなどのＤＮＡの隣接領域上で組み換え的に発現される。かかるモジュールを発現する細胞はまた、ＭＥＰ経路内で１または２以上のその他の遺伝子も、組み換え的にまたは内因的に発現することができると考えられるべきである。
ＭＥＰ経路内の遺伝子のモジュールの非限定的な例は、実施例のセクションに示されている、遺伝子ｄｘｓ、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦを含むモジュールであり、本明細書においてｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦと呼ぶ。ＭＥＰ経路内の遺伝子のモジュールは、本発明の側面に整合して、ＭＥＰ経路内の任意の遺伝子を任意の順序で含むことができることを、理解すべきである。
【００４５】
下流合成テルペノイド合成経路内の遺伝子およびタンパク質の発現もまた、テルペノイド産生を最適化するために調節することができる。合成下流テルペノイド合成経路には、テルペノイドシンターゼ酵素およびＧＧＰＰＳ酵素の組み換え発現が関与する。上で論じた任意のテルペノイドシンターゼ酵素を、産生される下流産物に依存して、ＧＧＰＰＳと共に発現することができる。例えば、タキサジエンシンターゼを、タキサジエン産生に用いる。タキサジエンシンターゼ酵素およびＧＧＰＰＳ酵素の組み換え発現は、独立してまたは一緒に調節することができる。いくつかの態様において、２つの酵素はモジュラー様式で一緒に調節される。例えば、２つの酵素は、１つのオペロンにおいて、いずれの順序でも発現することができる（ＧＧＰＰＳ−ＴＳ、「ＧＴ」と呼ぶ、またはＴＳ−ＧＧＰＰＳ、「ＴＧ」と呼ぶ）。
【００４６】
ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンなどのモジュールを含む遺伝子および／またはタンパク質、およびＴＳ−ＧＧＰＰＳオペロンの発現の操作を、当業者に知られる方法により実施することができる。例えば、遺伝子またはオペロンの発現を、異なる強度の誘導性プロモーターなどの、プロモーターの選択により調節することができる。プロモーターのいくつかの非限定的な例は、Ｔｒｃ、Ｔ５およびＴ７を含む。さらに、遺伝子またはオペロンの発現は、細胞における遺伝子またはオペロンのコピー数の操作を介して調節することができる。例えば、ある態様において、Ｔｒｃプロモーターの制御下で、その染色体上にｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンの追加のコピーを含む株は、合成下流経路のみを過剰発現するものと比べて、より多量のタキサジエンを産生する。いくつかの態様において、遺伝子またはオペロンの発現は、モジュール内の遺伝子の順序を操作することを介して調節可能である。例えば、ある態様において、下流合成オペロンにおける遺伝子の順序をＧＴからＴＧに変えると、タキサジエン産生における２〜３倍の増加が得られる。いくつかの態様において、遺伝子またはオペロンの発現は、１または２以上の遺伝子またはオペロンを染色体に組み込むことにより、調節される。例えば、ある態様において、上流ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンを細胞の染色体に組み込むと、タキサジエン産生の増加がもたらされる。
【００４７】
本発明に関連する遺伝子をさまざまな源から得られると理解されるべきである。いくつかの態様において、ＭＥＰ経路内の遺伝子は、大腸菌遺伝子などの細菌遺伝子である。いくつかの態様において、ＧＧＰＰＳをコードする遺伝子は植物遺伝子である。例えば、ＧＧＰＰＳをコードする遺伝子は、Taxus canadensis (T. canadensis)などのイチイ属の種からであることができる。いくつかの態様において、タキサジエンシンターゼをコードする遺伝子は、植物遺伝子である。例えば、タキサジエンシンターゼをコードする遺伝子は、Taxus brevifolia (T. brevifolia)などのイチイ属の種からのものである。T. canadensis ＧＧＰＰＳおよびT. brevifoliaタキサジエンシンターゼにについての代表的なGenBankアクセッション番号はAF081514およびU48796であり、その配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４８】
当業者が認識するように、本発明に関連する方法において用いるための相同遺伝子は、他の種から得ることができ、相同性探索、例えば全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のインターネットサイト（www.ncbi.nlm.nih.gov）において利用可能なタンパク質ＢＬＡＳＴ検索により同定することができる。本発明に関連する遺伝子および／またはオペロンは、例えばＰＣＲ増幅および／または制限消化により、与えられた遺伝子を含む任意のＤＮＡ源からのＤＮＡから、クローニングすることができる。いくつかの態様において、本発明に関連する遺伝子および／またはオペロンが合成される。本発明に関連する遺伝子および／またはオペロンを得る任意の方法は、本発明に適合する。
【００４９】
いくつかの態様において、テルペノイド産生のさらなる最適化を、細胞で組み換え発現される前に遺伝子を修飾することにより実施する。いくつかの態様において、ＧＧＰＰＳ酵素は、次の変異の１または２以上を有する：Ａ１６２Ｖ、Ｇ１４０Ｃ、Ｌ１８２Ｍ、Ｆ２１８Ｙ、Ｄ１６０Ｇ、Ｃ１８４Ｓ、Ｋ３６７Ｒ、Ａ１５１Ｔ、Ｍ１８５Ｉ、Ｄ２６４Ｙ、Ｅ３６８Ｄ、Ｃ１８４Ｒ、Ｌ３３１Ｉ、Ｇ２６２Ｖ、Ｒ３６５Ｓ、Ａ１１４Ｄ、Ｓ２３９Ｃ、Ｇ２９５Ｄ、Ｉ２７６Ｖ、Ｋ３４３Ｎ、Ｐ１８３Ｓ、Ｉ１７２Ｔ、Ｄ２６７Ｇ、Ｉ１４９Ｖ、Ｔ２３４Ｉ、Ｅ１５３ＤおよびＹ２５９Ａ。いくつかの態様において、ＧＧＰＰＳ酵素は、残基Ｓ２３９および／または残基Ｇ２９５において変異を有する。ある態様において、ＧＧＰＰＳ酵素は、変異Ｓ２３９Ｃおよび／またはＧ２９５Ｄを有する。
【００５０】
いくつかの態様において、細胞内で組み換え発現される前の遺伝子の修飾には、細菌細胞における発現についてのコドンの最適化が関与する。種々の生物に対するコドンの使用は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）からアクセス可能である。種々の生物に対する最適なコドンの同定を含むコドンの最適化、およびコドン最適化を達成する方法は、当業者によく知られており、標準的な方法を用いて実施できる。
いくつかの態様において、細胞内で組み換え発現される前の遺伝子の修飾には、細胞内で組み換え発現される前に、遺伝子に１または２以上の変異を作成することが関与する。例えば、変異は、１つのヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドの置換または欠失に関与することができる。いくつかの態様において、遺伝子の１または２以上のヌクレオチドの変異は、該遺伝子から産生されるタンパク質における変異、例えば１または２以上のアミノ酸の置換または欠失をもたらすであろう。
【００５１】
いくつかの態様において、テルペノイド産生に対し最適化された細胞を用いることが有利となり得る。例えば、いくつかの態様において、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分を過剰発現する細胞を、少なくとも部分的に用いて、ＧＧＰＰＳの基質であるイソペンチル二リン酸（ＩＰＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を増幅する。いくつかの態様において、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分の過剰発現は、非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分のコピー数を増加させることにより、達成される。例えば、ＭＥＰ経路における律速段階の成分、例えば（ｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ｉｄｉ）のコピー数を、追加のエピソーム発現などにより増幅することができる。
【００５２】
いくつかの態様において、「合理的な設計」が、酵素などのタンパク質における特異的な変異の構築に関与する。本明細書において用いられる「合理的な設計」とは、酵素または酵素に関連する情報、例えばその３次元構造、その活性部位（単数または複数）、その基質（単数または複数）、および／または酵素と基質の間の相互作用などを、特定変異の設計に組み込むことを言う。合理的設計手段に基づき、変異を酵素に創出し、次に対照レベルと比較して、テルペノイド産生の増加についてスクリーニングすることができる。いくつかの態様において、変異を、相同性モデリングに基づき合理的に設計することができる。本明細書において用いられる「相同性モデリング」とは、アミノ酸配列および関連する相同タンパク質の３次元構造から、１つのタンパク質の原子分解モデルを作成するプロセスを指す。
【００５３】
いくつかの態様において、遺伝子、例えば酵素をコードする遺伝子などにランダム変異をなすことができ、これらの変異を、対照レベルとは相対的に増加したテルペノイド産生に関してスクリーニングすることができる。例えば、テルペノイドの高産生を導く、ＭＥＰ経路の成分または他の経路の成分における変異についてのスクリーニングを、ランダム変異原性スクリーンを介して、または既知の変異のスクリーニングを介して実施することができる。いくつかの態様において、ゲノム断片のショットガンクローニングを用いて、テルペノイド産生の増加についてのこれらの断片を有する細胞または生物のスクリーニングを介して、テルペノイド産生の増加をもたらすゲノム領域を同定することができる。いくつかのケースにおいて、同一の細胞または生物において、１または２以上の変異を組み合わせてもよい。
【００５４】
いくつかの態様において、細胞におけるテルペノイドの産生を、本発明に関連する酵素と同じ経路において作用する酵素の操作を介して、増加させることができる。例えば、いくつかの態様において、本発明に関連する酵素などの標的酵素の上流で作用する酵素またはその他の因子の発現を、増加させることが有利となりえる。これは、任意の標準的な方法を用いて上流因子を過剰発現させることにより、実現することができた。
タンパク質発現の最適化はまた、適切なプロモーターおよびリボソーム結合部位を選択することにより、実施可能である。いくつかの態様において、これには、高コピー数プラスミド、または中程度のコピー数フラスミドの選択を含んでよい。転写終了のステップもまた、ステムループなどの構造の導入または除外により、遺伝子発現の調節の標的とすることができる。
【００５５】
本発明の側面は、細胞での組み換え遺伝子の発現に関する。本発明は、本発明に関連する遺伝子を組み換え発現する、原核細胞および真核細胞を含む、任意の種の細胞を包含する。いくつかの態様において、細胞は例えばEscherichia種、Streptomyces種、Zymonas種、Acetobacter種、Citrobacter種、Synechocystis種、Rhizobium種、Clostridium種、Corynebacterium種、Streptococcus種、Xanthomonas種、Lactobacillus種、Lactococcus種、Bacillus種、Alcaligenes種、Pseudomonas種、Aeromonas種、Azotobacter種、Comamonas種、Mycobacterium種、Rhodococcus種、Gluconobacter種、Ralstonia種、Acidithiobacillus種、Microlunatus種、Geobacter種、Geobacillus種、Arthrobacter種、Flavobacterium種、Serratia種、Saccharopolyspora種、Thermus種、Stenotrophomonas種、Chromobacterium種、Sinorhizobium種、Saccharopolyspora種、Agrobacterium種、およびPantoea種などの細菌細胞である。細菌細胞は、大腸菌などのグラム陰性菌、またはBacillus種などのグラム陽性菌であることができる。他の態様において、細胞は酵母細胞などの真菌細胞、例えばSaccharomyces種、Schizosaccharomyces種、Pichia種、Paffia種、Kluyveromyces種、Candida種、Talaromyces種、Brettanomyces種、Pachysolen種、Debaryomyces種、Yarrowia種、および工業用倍数酵母株である。好ましくは、酵母株はS. cerevisiae株またはYarrowia種株である。真菌のその他の例としては、Aspergillus種、Pennicilium種、Fusarium種、Rhizopus種、Acremonium種、Neurospora種、Sordaria種、Magnaporthe種、Allomyces種、Ustilago種、Botrytis種、およびTrichoderma種が挙げられる。他の態様において、細胞は藻細胞または植物細胞である。本発明に適合するいくつかの細胞は、本発明に関連する１または２以上の遺伝子の内因性コピーおよび組み換えコピーを発現できること理解されるべきである。いくつかの態様において、細胞が本発明に関連する１または２以上の遺伝子の内因性コピーを有する場合は、方法は必ずしも、内因的に発現される１または２以上の遺伝子の組み換えコピーを加えることを必要としない。いくつかの態様において、細胞は、テルペノイドの効率的産生のために、本明細書に記載の経路からの１または２以上の酵素を内因的に発現することができ、および、本明細書に記載の経路からの１または２以上の酵素を組み換え発現することができる。
【００５６】
本発明のさらなる側面は、最適なテルペノイド産生を示す細菌細胞または株のスクリーニングに関する。上述のように、本発明に関連する方法は、ＭＥＰ経路で１または２以上の遺伝子を過剰発現する細胞を生成することを含む。かかる細胞の培養からのテルペノイド産生を測定して対照細胞と比較することができ、ここで、対照細胞と比較してテルペノイド産生の量が大きい細胞を、第１の改善細胞として選択する。この細胞を、テルペノイドシンターゼ酵素およびＧＧＰＰＳ酵素の組み換え発現により、さらに修飾することができる。細胞における非メバロン酸（ＭＥＰ）経路の１または２以上の成分、テルペノイドシンターゼ酵素、および／またはＧＧＰＰＳ酵素の発現レベルを次に操作することができ、テルペノイド産生を再度測定することができ、第１の改善細胞よりも多量のテルペノイドを産生する第２の改善細胞を選択する。いくつかの態様において、テルペノイドシンターゼ酵素はタキサジエンシンターゼ酵素である。
【００５７】
本発明のさらなる側面は、細菌性大腸菌細胞におけるこれまで未知であった代謝産物の、（ＧＣ−ＭＳによる）同定および特徴づけに関する（図３および６）。新しく同定された代謝産物インドールの蓄積のレベルを、イソプレノイド経路遺伝子の過剰発現、下方制御または変異により、微生物経路を遺伝的に操作して、制御することができる。代謝産物インドールは、直接的な変数として、改変株におけるタキサジエン産生に逆相関する（図３、６および１５）。インドールの蓄積をさらに制御して、細菌系（例えば大腸菌細胞などの細胞において特異的に）またはその他の細胞において、テルペノイド生合成に向かうフラックスを改善することは、上流の非メバロン酸イソプレノイド経路を下流の産物合成経路と均衡化させることにより、またはインドール経路の修飾または調節により、実現することができる。こうすることにより、当業者はインドールの蓄積を低減または制御することができ、これにより、タキサジエンおよび記載の経路に由来する他のテルペノイド、例えばモノテルペノイド、セスキテルペノイド（アモルファジエンを含む）、ジテルペノイド（レボピマラジエンを含む）、トリテルペン、テトラテルペンの産生に対する、インドールの阻害効果を低減することができる。インドール蓄積の低減または制御のための他の方法は、吸収剤または捕捉剤等を用いるなどの化学的方法による、蓄積したインドールを発酵物から除去することを含む。
【００５８】
他の態様において、１種または２種以上のテルペノイドを産生する細胞における、または１種または２種以上のテルペノイドを産生する細胞の培養物における、インドールの量または濃度を測定することを含む方法が提供される。インドールの量または濃度を、当分野に知られた方法を用いて、本明細書に記載のようにして、１回、２回または３回以上、適切に測定することができる。かかる方法は、１種または２種以上のテルペノイドを産生するプロセスを導くため、例えば、プロセス改善において用いることができる。かかる方法は、株の作成を導くため、例えば、株の改善のために用いることができる。
【００５９】
この均衡化を達成する方法の同定により、異種のタキサジエン生合成経路で発現された野生型細菌細胞と比べて、タキサジエンなどのテルペノイドの過剰産生における、１５０００倍の改善が生み出された。産生は、約２ｇ／Ｌの濃度を産生する改変された発酵法によりさらに増加され、これは、以前に報告されたいかなるタキサジエン産生と比べても１５００倍高い値である。本明細書で実証されるように、大腸菌の非メバロン酸イソプレノイド経路を遺伝的に改変することにより、この代謝産物の蓄積が制御でき、これにより、細菌性大腸菌細胞におけるイソプレノイド生合成に向かうフラックスが調節される。本明細書においてさらに、タキサジエン産生の、タキソールへの次に鍵となる前駆体であるタキサジエン−５α−オールへのさらなるチャネリングであり、これは、タキソール生合成の酸化化学の改変を介して達成されることが実証される。例５は、タキサジエンからタキサジエン−５α−オールへの合成経路の、最初に成功した拡張である。その他の大部分のテルペノイドと同様、タキソールの生合成は「２相」生合成プロセスの統合された様式に従う：（ｉ）プレニル前駆体（ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰ）のＧＧＰＰへの線形結合の「シクラーゼ相」と、これに続く、関係する前駆体タキサジエンに対する、分子の環化および再配列である（図６、ＶＩＩＩ−ＩＸ）５７、５８。関係する前駆体の後、（ｉｉ）「酸化相」、環式オレフィンタキサジエンコア構造は次に、７つのシトクロムＰ４５０オキシゲナーゼとその酸化還元パートナーにより官能化され、アシルおよびアロイルＣｏＡ−依存性トランスフェラーゼにより２つの酢酸基および１つの安息香酸基で修飾され、ケトオキシダーゼによりケト基で、およびエポキシダーゼによりエポキシド基で修飾されて、後期の中間体バッカチンＩＩＩとなり、これにＣ１３側鎖が付着してタキソールとなる（図６、Ｘ〜ＸＩＩＩ）１５。初期の酸化相反応の大まかな順序は推定されているが、いくつかのヒドロキシル化、アシル化、およびベンゾイル化反応の正確なタイミング／順序は明らかでない。しかし、初期の分岐は、シトクロムＰ４５０媒介性のタキサジエンコアのＣ５位でのヒドロキシル化から開始され、互いに高い還元類似性（＞７０％）を有するが他の植物ｐ４５０とは限定的な類似性（＜３０％）を持つ、シトクロムＰ４５０酵素の類似のファミリーを用いる、下流のヒドロキシル化が続くことは明らかである４１，５９。さらに、構造的および機能的多様性と潜在的な進化分析により、タキサジエン−５α−オール遺伝子は、タキソール生合成経路における他のヒドロキシラーゼ遺伝子がそれから進化した親配列であり得て、ヒドロキシル化の順序を反映していることを暗示する１５。
【００６０】
本発明のさらなる側面は、キメラＰ４５０酵素に関する。植物のシトクロムＰ４５０の機能的発現は、例えば電子伝達機構であるシトクロムＰ４５０レダクターゼの不在などの、細菌プラットフォーム固有の制限、および小胞体の欠如による、Ｐ４５０酵素の膜シグナル伝達モジュール翻訳不適合性のために、困難である（challenging）と考えられている。
いくつかの態様において、本発明の方法に関連するタキサジエン−５α−ヒドロキシラーゼの最適化は、Ｎ末端膜貫通改変および／またはＣＰＲ酸化還元パートナーとの翻訳融合を介した、キメラ酵素の生成により実施される。いくつかの態様において、ＣＰＲ酸化還元パートナーはイチイ属シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ；図５ｂ）である。ある態様において、シトクロムＰ４５０タキサジエン−５α−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）は、Taxus cuspidateから得られる（GenBankアクセッション番号AY289209、この配列は、本明細書に参照により組み込まれる）。いくつかの態様において、ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）は、Taxus cuspidateから得られる（GenBankアクセッション番号AY571340、この配列は、本明細書に参照により組み込まれる）。
【００６１】
タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼおよびＴＣＰＲを、ＧＳＴＧＳ（配列番号：５０）などのリンカーにより結合することができる。いくつかの態様において、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼおよび／またはＴＣＰＲを切断して、片方または両方のタンパク質の膜貫通領域の全てまたは一部を取り除く。例えば、いくつかの態様においては、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼを切断して、８、２４または４２個のＮ末端アミノ酸を取り除く。いくつかの態様において、ＴＣＰＲのＮ末端の７４個のアミノ酸を切断する。追加のペプチドをタキサジエン５α−ヒドロキシラーゼに融合することもできる。例えば、ウシ１７αヒドロキシラーゼからの１または２以上のアミノ酸を、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼに付加することができる。ある態様において、ペプチドＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号：５１）を、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼに付加する。ＴＣＰＲに融合したタキサジエン５α−ヒドロキシラーゼを含むポリペプチドの非限定的例は、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲである。
【００６２】
いくつかの態様において、キメラ酵素は最初の酸化ステップを、タキサジエンの、タキサジエン−５α−オールおよび副産物５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサンへの１０％より大きい変換率で実施することができる。例えば、タキサジエンのタキサジエン−５α−オールおよび副産物５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサンへの変換率パーセントは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、約９９％、または約１００％であることができる。
ある態様において、キメラ酵素はＡｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲであり、これは、最初の酸化ステップを、タキサジエンの、タキサジエン−５α−オールおよび副産物５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサンへの９８％より大きい変換率で実施可能であることが見出された（ＯＣＴ；図９ａ）。タキサジエン−５α−オール産生ステップの改変は、タキソール産生において決定的に重要であり、酵母においてこの経路を構築する従前の努力を制限することが見出されている。本明細書で開発される改変された構築は、in vivoでのタキサジエンの９８％より大きい変換と、酵母における前の異種発現に対して２４００倍の改善を実証した。したがって、鍵となるタキソール中間体の顕著に多量の合成に加えて、この研究はさらに類似するＰ４５０化学による、この経路における続く代謝産物の合成についての土台もまた提供する。
【００６３】
本明細書において用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に用いられ、したがってポリペプチドの用語は全長ポリペプチドを指すのに用いてよく、さらにまた、全長ポリペプチドの断片を指すのに用いてもよい。本明細書において用いられるポリペプチド、タンパク質、またはそれらの断片に関し、「単離された」とは、その天然の環境から分離され、その同定または使用を許容するのに十分な量で存在することを意味する。タンパク質またはポリペプチドを指す場合、単離されたとは、例えば：（ｉ）発現クローニングにより選択的に産生されたか、または（ｉｉ）クロマトグラフィーもしくは電気泳動により精製されたことを意味する。単離されたタンパク質またはポリペプチドは、実質的に純粋であってもよいが、そうである必要はない。用語「実質的に純粋」とは、タンパク質またはポリペプチドが、他の物質を実質的に含まず、産生、天然、またはin vivo系においてその意図された使用に対して実際に適切な程度に見出し得ることを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、天然で得ることができ、または本明細書に記載の方法を用いて産生することができ、および当分野に知られた技法により精製することができる。単離されたタンパク質は調製物において他の成分と混合することができるため、タンパク質は調製物中で少ないパーセンテージのみを占めてもよい。それでもタンパク質は、生体で関連していた物質から分離されたものであれば、すなわち、他のタンパク質から単離されたものであれば、単離されたという。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載の全てのポリペプチドをコードする核酸、本明細書に記載の全ての核酸および／またはポリペプチドを含むライブラリ、および本明細書に記載の全ての核酸および／またはポリペプチドを含む組成物を包含する。
いくつかの態様において、本発明に関連する１または２以上の遺伝子は、組み換え発現ベクター中に発現される。本明細書において、「ベクター」は、任意の数の核酸であって、その中に、異なる遺伝的環境の間の移送のため、または宿主細胞での発現のために、所望の１つの配列または複数配列を制限またはライゲーションにより挿入できる前記核酸であることができる。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターは、限定はしないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含む。
【００６５】
クローニングベクターとは、宿主細胞のゲノム内で、自立的に複製することができるか、これに組み込まれており、さらに、１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を特徴とするものであり、該エンドヌクレアーゼ制限部位において、ベクターが確定的な様式で切断され、そこに所望のＤＮＡ配列がライゲートされて、新しい組み換えベクターが宿主細胞中で複製するその能力を保持している。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、宿主細菌などの宿主細胞内でプラスミドのコピー数が増加するにつれて、多数回起こってもよいし、または、宿主が有糸分裂により複製される前に宿主あたり１回起こってもよい。ファージの場合、複製は溶菌相の間に活発に起こってもよいし、または溶原相の間に不活発に起こってもよい。
【００６６】
発現ベクターとは、その中に所望のＤＮＡ配列が制限およびライゲーションにより挿入されて、これが調節配列に作動可能に結合されてＲＮＡ転写物として発現され得る、ベクターである。ベクターはさらに、細胞の同定に用いるのに適した１または２以上のマーカー配列を含んでよく、該配列は、ベクターと形質転換またはトランスフェクトされていても、されていなくてもよい。マーカーは、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のどちらかを増加または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、当分野に知られた標準アッセイによりその活性が検出可能な酵素をコードする遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリホスファターゼ）、および、形質転換またはトランスフェクトされた、細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に視覚的に影響を与える遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質）を含む。好ましいベクターは、それが作動可能に結合するＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の、自律的複製および発現が可能なものである。
【００６７】
本明細書において、コード配列と調節配列が「作動可能に（operably）」結合されるとは、コード配列の発現または転写を、調節配列の影響または制御下におくようにこれらが共有結合されることを言う。コード配列を機能性タンパク質に翻訳することが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列が作動可能に結合されるとは、５’調節配列におけるプロモーターの誘発がコード配列の転写をもたらし、および、２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域の、コード配列の転写を方向付ける能力に干渉せず、または（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力に干渉しないことを言う。したがって、プロモーター領域がコード配列に作動可能に結合するとは、プロモーター領域がこのＤＮＡ配列の転写に影響を及ぼすことができ、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳可能となることである。
【００６８】
クレームされた本発明の任意の酵素をコードする核酸分子が細胞に発現されると、種々の転写制御配列（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）を用いて、その発現を方向付けることができる。プロモーターは、天然のプロモーター、すなわち、内因性コンテキストでの遺伝子のプロモーターであって、遺伝子発現の正常な制御を提供するものである。いくつかの態様において、プロモーターは構成的であり、すなわち制御されておらず、こうしてその関連遺伝子の連続的転写を許容する。種々の条件的プロモーターもまた使用可能であり、例えば、分子の有無によって制御されるプロモーターである。
【００６９】
遺伝子発現に必要な調節配列の正確な性質は、種や細胞型の間で変化し得るが、しかし一般に、必要に応じて、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含み、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などである。特に、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含む、プロモーター領域を含む。調節配列はまた、所望により、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含むことができる。本発明のベクターは、任意に、５’リーダーまたはシグナル配列を含んでよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
【００７０】
発現に必要な全ての要素を含有する発現ベクターは市販されており、当業者に知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。細胞は、細胞内に異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）を導入することにより、遺伝的に改変される。この異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞中の異種ＤＮＡの発現を許容する転写要素の作動可能な制御下に置かれる。タキサジエンなどのテルペノイド産生のための、本発明に関連する遺伝子の異種発現は、大腸菌を用いて実施例のセクションで実証されている。テルペノイドを産生するための新規な方法を、他の細菌細胞、真菌（酵母細胞含む）、植物細胞等においてもまた、発現させることができる。
【００７１】
本発明に関連する酵素をコードする核酸分子を、当分野で標準の方法および技術を用いて、１つの細胞または複数細胞中に導入することができる。例えば、核酸分子は、化学的形質転換およびエレクトロポレーション、形質導入、微粒子銃などを含む、形質転換などの標準プロトコルにより、導入することができる。本発明にクレームされた酵素をコードする核酸分子の発現はまた、核酸分子をゲノムに組み込むことによっても達成可能である。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明に関連する１または２以上の遺伝子は、細菌細胞内に組み換え発現される。本発明による細菌細胞は、任意の種類（富化または最小）および任意の組成の培地で培養可能である。当業者が理解するように、ルーチンの最適化により、種々の種類の培地の使用が可能となる。選択された培地には、種々の追加の成分を補足することができる。補足成分のいくつかの非限定的な例は、グルコース、抗生物質、遺伝子導入用のＩＰＴＧ、ATCC Trace Mineral Supplementおよびグリコレートを含む。同様に、培地のその他の側面、および本発明の細胞の増殖条件を、ルーチンの実験により最適化してもよい。例えば、ｐＨおよび温度は、最適化可能な因子の非限定的な例である。いくつかの態様において、培地の選択、培地のサプリメント、および温度などの因子は、タキサジエンなどのテルペノイドの産生レベルに影響を及ぼし得る。いくつかの態様において、補足的成分の濃度および量を最適化してもよい。いくつかの態様において、培地を１または２以上の補足成分で補足する頻度、およびタキサジエンなどのテルペノイドを収穫する前にこの培地を培養する時間を最適化する。
【００７３】
本発明の側面により、タキサジエンなどの高い力価のテルペノイドを、本発明に関連する遺伝子の組み換え発現を介して、細胞中で産生する。本明細書において、「高い力価」とは、１Ｌ当たりのミリグラム（ｍｇＬ−１）スケールでの力価をさす。ある産物に対する産生された力価は、培地の選択を含む複数の因子の影響を受ける。いくつかの態様において、総タキサジエン力価は、少なくとも１ｍｇＬ−１である。いくつかの態様において、総タキサジエン力価は、少なくとも１０ｍｇＬ−１である。いくつかの態様において、総タキサジエン力価は、少なくとも２５０ｍｇＬ−１である。例えば、総タキサジエン力価は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００であるか、または９００ｍｇＬ−１より大、ならびに任意の中間の数値であることができる。いくつかの態様において、総タキサジエン力価は、少なくとも１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０で、または５．０ｇＬ−１より大、ならびに任意の中間の数値であることができる。
【００７４】
いくつかの態様において、総タキサジエン５α−オール力価は、少なくとも１ｍｇＬ−１である。いくつかの態様において、総タキサジエン５α−オール力価は、少なくとも１０ｍｇＬ−１である。いくつかの態様において、総タキサジエン５α−オール力価は、少なくとも５０ｍｇＬ−１である。例えば、総タキサジエン５α−オール力価は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、または７０ｍｇＬ−１より大、ならびに全ての中間の数値であることができる。
【００７５】
本発明に関連する細胞の増殖に用いる液体培養物は、当分野で知られ用いられている任意の培養容器に入れることができる。いくつかの態様において、攪拌槽型反応器などのエアレーション反応容器中での大規模産生を用いて、多量のタキサジエンなどのテルペノイドを産生し、細胞培養物から回収することができる。いくつかの態様において、テルペノイドを、例えば、ドデカンなどの有機層を細胞培養物に付加し、有機層からテルペノイドを回収することにより細胞培養物のガス相から回収する。
【００７６】
本明細書に記載の方法により産生されたタキサジエンなどのテルペノイドは、例えばパクリタキセル（タキソール）、アルテミシニン、ギンコライド、エリュテロビンおよびプソイドプテロシンなどの医薬および、その他多くの潜在的医薬化合物を含む広範囲の用途を有する。さらなる用途は、例えばゲラニオール、ファルネソール、ゲラニルゲラニオール、リナロール、リモネン、ピネン、シネオールおよびイソプレンなどの香料および化粧品に用いられる化合物を含む。さらなる用途は、例えば５、１０、および１５炭素長のアルコールなどのバイオ燃料として用いるための化合物を含む。顕著には、上記の化合物は現在、種々の植物の抽出物として産生されている。植物抽出物に基づく方法は面倒であり、非常に少量のみが産生され、得ることのできる実際の分子について限界があり、すなわち、もとの化合物よりも遥かに優れた特性を有する可能性のある誘導体の、容易な産生を許容しない。
【００７７】
例
方法
株、プラスミド、オリゴヌクレオチドおよび遺伝子
大腸菌K12MG1655株を、全てのタキサジエン株構築の宿主株として用いた。大腸菌K12MG1655Δ(recA,endA)および大腸菌K12MG1655Δ(recA,endA)ED3株は、ＭＩＴ（Cambridge, MA）のKristala Prather教授の研究室から提供を受けた。この研究で作成された全プラスミドの詳細を表２に示す。本研究で用いた全てのオリゴヌクレオチドは、表３に含まれている。
【００７８】
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）５０、タキサジエンシンターゼ（ＴＳ）５１、シトクロムＰ４５０タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）およびイチイ属ＮＡＤＰＨ：シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）４６は、Taxus canadensis、Taxus brevifolia、Taxus cuspidate（Genbankアクセッションコード：AF081514、U48796、AY289209およびAY571340）から得た。遺伝子は、Kodumal et al５２（補足詳細は付録１）に報告されたプラスミドおよびプロトコルを用いてカスタム合成し、大腸菌翻訳コドンを組み込み、クローニングのために制限部位を除去した。ＧＧＰＰＳおよびＴＳの９８および６０個のＮ末端アミノ酸に対応するヌクレオチド（プラスチド移行ペプチド）を除去し、翻訳挿入配列Ｍｅｔを挿入した１７。
【００７９】
ＭＥＰ経路の作成（ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロン）
初めにｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンを、Ｔ７プロモーターを有するｐＥＴ２１Ｃ＋プラスミドのもとでプライマーｄｘｓ（ｓ）、ｄｘｓ（ａ）、ｉｄｉ（ａ）、ｉｓｐＤＦ（ｓ）およびｉｓｐＤＦＩ（ａ）を用いて、大腸菌K12MG1655のゲノムから各遺伝子をクローニングすることにより構築した（ｐ２０Ｔ７ＭＥＰ）５３。プライマーｄｘｓｉｄｉｉｓｐＤＦＮｃｏＩ（ｓ）およびｄｘｓｉｄｉｉｓｐＤＦＫｐｎＩ（ａ）を用いて、ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンを、ＮｃｏＩおよびＫｐｎＩでｐＴｒｃ消化後にＨｉｓ２Ｂ（Invitrogen）プラスミド中にサブクローニングして、ｐＴｒｃＭＥＰプラスミド（ｐ２０ＴｒｃＭＥＰ）を得た。ｐ２０ＴｒｃＭＥＰプラスミドをＭｌｕＩおよびＰｍｅＩで消化し、ＭｌｕＩおよびＰｍｅＩ消化ｐＡＣＹＣ１８４−ｍｅｌＡ（Ｐ２Ａ）プラスミドにクローニングして、ｐ１０ＴｒｃＭＥＰプラスミドを構築した。ｐＴｒｃＭＥＰプラスミドをＢｓｔＺ１７ＩおよびＳｃａＩｄｅで消化し、ＰｖｕＩＩ消化ｐＣＬ１９２０プラスミドにクローニングして、ｐ５ＴｒｃＭＥＰプラスミドを構築した。ｐ２０Ｔ５ＭＥＰプラスミドの作成のために、最初にｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロンをＴ５プロモーター（ｐＱＲ−ＭＥＰ）を有するｐＱＥプラスミドに、プライマーｄｘｓｉｄｉｉｓｐＤＦＮｃｏＩ（ｓ）およびｄｘｓｉｄｉｉｓｐＤＦＸｈｏＩ（ａ）を用いてクローニングした。Ｔ５プロモーターを有するオペロンＤＮＡの画分を、ｐＱＥＭＥＰプラスミドからプライマーＴ５ＡｇｅＩ（ｓ）およびＴ５ＮｈｅＩ（ａ）を用いて増幅した。ＤＮＡ断片をＡｇｅＩ（ｓ）／Ｔ５ＮｈｅＩ（ａ）で消化し、ＳＧｒＡＩ／ＮｈｅＩ酵素で消化したｐ２０Ｔ７ＭＥＰプラスミドへとクローニングした。
【００８０】
タキサジエン経路（ＧＴおよびＴＧオペロン）の構築
下流タキサジエン経路（ＧＴおよびＴＧオペロン）を、ＧＧＰＳおよびＴＳのＰＣＲ断片をｐＴｒｃＨＩＳ２ＢプラスミドのＮｏｃＩ−ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ部位へとクローニングして、プライマーＧＧＰＰＳＮｃｏＩ（ｓ）、ＧＧＰＰＳＥｃｏＲＩ（ａ）、ＴＳＥｃｏＲＩ（ｓ）、ＴＳｓａｌＩ（ａ）、ＴＳＮｃｏＩ（ｓ）、ＴＳＥｃｏＲＩ（ａ）、ＧＧＰＰＳＥｃｏＲＩ（ｓ）およびＧＧＰＰＳＳａｌＩ（ａ）を用いてｐ２０ＴｒｃＧＴおよびｐ２０ＴｒｃＴＧを生成することにより構築した。ｐ２０Ｔ５ＧＴを作成するために、初めにオペロンをプライマーＧＧＰＰＳＮｃｏＩ（ｓ）およびＴＳＸｈｏＩ（ａ）で増幅し、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化したＴ５プロモーターの下でｐＱＥプラスミドへとクローニングした。さらに、配列をＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、プライマーｐＴｒｃＳａｌ（ｓ）およびｐＴｒｃＸｂａ（ａ）を用いて増幅したｐＴｒｃプラスミド骨格へとクローニングした。ｐ１０Ｔ７ＴＧは、ｐ２０ＴｒｃＴＧからＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化したＴＧオペロンを、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化したｐＡＣＹＣ−ＤＵＥＴ１プラスミドへとサブクローニングすることにより構築した。ｐ５Ｔ７ＴＧは、ＢｓｐＥＩ／ＸｂａＩ消化断片を、ｐＣＬＢｓｐＥＩ（ｓ）およびｐＣＬＸＢａＩ（ａ）プライマーを用いてｐＣＬ１９２０プラスミドから増幅されたＸｂａＩ／ＢｓｐＥＩ消化ＤＮＡにクローニングして構築した。
【００８１】
染色体組込みＭＥＰ経路プラスミドの構築
組込み用配列の増幅のためのＦＲＰ−Ｋｍ−ＦＲＰカセットを有するプラスミドを構築するために、ｐ２０Ｔ７ＭＥＰおよびｐ２０Ｔ５ＭＥＰをＸｈｏＩ／ＳｃａＩで消化した。ＦＲＰ−Ｋｍ−ＦＲＰカセットをｐｋＤ１３プラスミドからのＦＲＰ配列を有するＫｍカセットから、プライマーＫｍＦＲＰＸｈｏＩ（ｓ）およびＫｍＦＲＰＳｃａＩ（ａ）を用いて増幅した。増幅したＤＮＡをＸｈｏＩ／ＳｃａＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＳｃａＩ消化ｐ２０Ｔ７ＭＥＰおよびｐ２０Ｔ５ＭＥＰプラスミドにクローニングした（ｐ２０Ｔ７ＭＥＰＫｍＦＲＰおよびｐ２０Ｔ５ＭＥＰＫｍＦＲＰ）。同様に、ｐ２０ＴｒｃＭＥＰプラスミドをＳａｃＩ／ＳｃａＩで消化し、プライマーＫｍＦＲＰＳａｃＩ（ｓ）およびＫｍＦＲＰＳｃａＩ（ａ）を用いて増幅したＤＮＡを消化して、ｐ２０ＴｒｃＭＥＰプラスミドへとクローニングした（ｐ２０ＴｒｃＭＥＰＫｍ−ＦＲＰ）。
【００８２】
ＭＥＰ経路カセット（ＬａｃＩｑ−ＭＥＰ−ＦＲＰ−Ｋｍ−ＦＲＰ）カセットの染色体組込み
プロモーターＴ７、Ｔ５およびＴｒｃの下で作成されたＭＥＰ経路を、Ｋａｎマーカー付き染色体におけるａｒａオペロン領域に局在化させた。ｐ２０Ｔ７ＭＥＰＫｍＦＲＰ、ｐ２０Ｔ５ＭＥＰＫｍＦＲＰ、およびｐ２０ＴｒｃＭＥＰＫｍＦＲＰからのＰＣＲ断片を、プライマーＩｎｔＴ７Ｔ５（ｓ）、ＩｎｔＴｒｃ（ｓ）、およびＩｎｔ（ａ）を用いて増幅し、次に大腸菌MG1655recA-end-および大腸菌MG1655recA-end-EDE3細胞にエレクトロポレーションして、λＲｅｄ組み換え技法を介する染色体組込みを行った５４。成功的な遺伝子組込み後に、部位特異的局在化を確認し、ＫｍマーカーをＦＬＰリコンビナーゼの作用を介して除去した。
【００８３】
タキサジエン５α−オール経路の作成
タキサジエン５α−オールヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）およびイチイ属シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）の膜貫通領域（ＴＭ）を、PredictProteinソフトウェア（www.predictprotein.org）を用いて同定した５５。膜貫通改変のために、タキサジエン５α−オールヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）のＮ末端膜貫通領域の８、２４および４２個のアミノ酸残基および、ＴＣＰＲでの７４個のアミノ酸領域において、選択的切断を行った。タキサジエン５α−オールヒドロキシラーゼ（Ｔ５αＯＨ）のＮ末端アミノ酸の８、２４および４２個のアミノ酸残基の除去、１つのアミノ酸が置換されたウシ１７ａヒドロキシラーゼＮ末端８残基ペプチドＭＡＬＬＬＡＶＦ（配列番号：５１）の、Ｎ末端切断Ｔ５αＯＨ配列４４およびＧＳＴＧＳペプチドリンカーへの組込みを、プライマーＣＹＰ１７Ａｔ８ＡＡＮｄｅＩ（ｓ）、ＣＹＰ１７Ａｔ２４ＡＡＮｄｅＩ（ｓ）、ＣＹＰ１７Ａｔ４２ＡＡＮｄｅＩ（ｓ）、およびＣＹＰＬｉｎｋＢａｍＨＩ（ａ）を用いて行った。これらのプライマーを用いて、各修飾ＤＮＡを増幅し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化し、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＡＣＹＣＤＵＥＴ１プラスミドにクローニングして、ｐ１０Ａｔ８Ｔ５αＯＨ、ｐ１０Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ、およびｐ１０Ａｔ４２Ｔ５αＯＨプラスミドを構築した。７４アミノ酸切断ＴＣＰＲ（ｔＴＣＰＲ）配列を、プライマーＣＰＲＢａｍＨＩ（ｓ）およびＣＰＲＳａｌＩ（ａ）を用いて増幅した。増幅されたｔＴＣＰＲ配列およびプラスミドｐ１０Ａｔ８Ｔ５αＯＨ、ｐ１０Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ、およびｐ１０Ａｔ４２Ｔ５αＯＨを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、クローニングして、プラスミドｐ１０Ａｔ８Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ、ｐ１０Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ、およびｐ１０Ａｔ４２Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲを構築した。
【００８４】
タキサジエンのスクリーニング用の培養物増殖およびタキサジエン５α−オール分析
上流（ＭＥＰ）、下流タキサジエン経路およびタキサジエン５α−オールを有する適切なプラスミドを含む、前もって改変された大腸菌株の単一の形質転換体を、Luria-Bertani（ＬＢ）培地（適切な抗生物質、１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリン、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンまたは５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンで補足）中３０℃で１８時間培養した。改変株をスクリーニングするための小規模培養物ついては、これらの前接種材料（preinnoculum）を用いて新鮮な２ｍＬの富化培地（６ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのトリプトン、１５ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、１００ｍＭのＨＥＰＳ、３ｍＬ／Ｌの消泡剤Ｂ、ｐＨ７．６、１００ｕｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび３４ｕｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）に播種し、ここで開始時のＡ６００は０．１であった。培養物は適切な抗生物質および１００ｍＭのＩＰＴＧを用いて、遺伝子誘導のために２２℃にて５日間維持した。
【００８５】
タキサジエン５α−オール産生株のためのバイオリアクター実験
３−Ｌ  Biofloバイオリアクター（New Brunswick）を製造業者の指示書に従って組み立てた。１％グリセロール（ｖ／ｖ）入りの富化培地１Ｌに、同じ濃度で抗生物質（１００ｍｇ／ｍＬのカルベニシリン、３４ｍｇ／ｍＬのクロラムフェニコール）を含有するＬＢ培地で増殖させた株２６−Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲの８時間培養物（Ａ６００〜２．２）５０ｍＬを植菌した。１Ｌのバイオリアクターで、２０％ｖ／ｖドデカンを用いた２相性液体−液体発酵。酸素を、ろ過空気として０．５ｖ／ｖ／ｍで供給し、溶存酸素レベルを５０％より高く維持するように撹拌を調節した。培養物のｐＨは、１０％ＮａＯＨを用いて７．０に調節した。発酵槽内の培養物の温度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定した光学密度が約０．８になるまで細胞が増殖するまでは、３０℃に調節した。発酵槽の温度を２２℃に下げ、細胞を０．ｌｍＭのＩＰＴＧで誘導した。ドデカンを無菌的に培地容積の２０％（ｖ／ｖ）まで加えた。発酵の経過の間、グリセロールの濃度および酢酸塩の蓄積は、一定の時間間隔でモニタリングした。発酵の間、グリセロール濃度が０．５ｇ／Ｌ未満に下がった際には、グリセロール（３ｇ／Ｌ）をバイオリアクターに導入した。
【００８６】
発酵はさらに、０．５％酵母抽出物および２０％（ｖ／ｖ）ドデカンを含有する規定の流加培地（１３．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７ｇ／Ｌのクエン酸、０．００８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、０．００２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２、０．０１５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２、０．００１５ｇ／ＬのＣｕＣｌ２、０．００３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．００２５ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４、０．００８ｇ／ＬのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２、０．０６ｇ／ＬのＦｅ（ＩＩＩ）酢酸塩、０．００４５ｇ／Ｌのチアミン、１．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４、１０ｇ／Ｌのグリセロール、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、ｐＨ７．０）によるフェドバッチ培養を用いて最適化した。同じ培地組成を用い、適切な抗生物質（株１７：１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン、株２６：５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン）を加えて、株１７および２６の発酵を行った。
【００８７】
タキサジエン−５α−オール産生株については、１％グリセロール（ｖ／ｖ）を有する複合培地１Ｌに、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンおよび３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で増殖させた株２６−Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲの８時間培養物（ＯＤ〜２．２）５０ｍＬを植菌した。酸素を、ろ過空気として０．５（ｖｖｍ）で供給し、溶存酸素レベルを３０％より高く維持するように撹拌を調節した。培養物のｐＨは、１０％ＮａＯＨを用いて７．０に調節した。発酵槽内の培養物の温度は、６００ｎｍ（ＯＤ６００）の波長で測定した光学密度が約０．８になるまで細胞が増殖するまでは、３０℃に調節した。発酵槽の温度を２２℃に下げ、経路を０．ｌｍＭのＩＰＴＧで誘導した。ドデカンを無菌的に培地容積の２０％（ｖ／ｖ）加えた。発酵の経過の間、グリセロール濃度および酢酸塩の蓄積は、一定の時間間隔でモニタリングした。発酵の間、グリセロール濃度が０．５〜１ｇ／Ｌ未満に下がった際には、グリセロール（３ｇ／Ｌ）をバイオリアクターに導入した。
【００８８】
タキサジエンおよびタキサジエン−５α−オールのＧＣ−ＭＳ分析
小規模培養物からのタキサジエンの分析のために、１．５ｍＬの培養物を１ｍＬのヘキサンで３０分、ボルテックスした。混合物を遠心分離して有機層を分離した。バイオリアクターで、１ｕＬのドデカン層をヘキサンを用いて２００ｕＬに希釈した。１ｕＬのヘキサン層を、ＧＣ−ＭＳ（Varian saturn 3800 GC付きVarian 2000 MS）で分析した。試料をＨＰ５ｍｓカラム（３０ｍ×２５０ｕＭ×０．２５ｕＭ厚さ）（Agilent Technologies USA）に注入した。ヘリウム（超純粋）を流量１．０ｍｌ／分でキャリアガスとして用いた。オーブン温度は初めは５０℃一定に１分間保ち、次に２２０℃に１０℃／分の速度で上昇させ、最後にこの温度で１０分間維持した。注入および移送ラインの温度は、それぞれ２００℃および２５０℃に設定した。
【００８９】
タキサジエンおよびタキサジエン５α−オール用の、生物学的源または合成源からの標準化合物は、市販されていない。したがって、タキサジエン産生大腸菌の発酵を２Ｌバイオリアクター内で行って、純粋な物質を抽出した。タキサジエンは、ヘキサンを用いた溶媒抽出により抽出し、次に複数回のシリカカラムクロマトグラフィーにより、ＧＣ−ＭＳ分析の標準曲線構築のための純粋物質を得た。純粋タキサジエンのＧＣおよびＭＳプロファイルを報告された文献と比較して、化合物の信頼性を確認した６０。純度をチェックするために、タキサジエンの１ＨＮＭＲを実施した。タキサジエン−５α−オールの蓄積は非常に低レベルであるため、我々は、この分子の産生を定量化するための測度としてタキサジエンを、および前の報告からの信頼できる質量スペクトルフラグメンテーション特性を用いた４２。
【００９０】
改変株の転写分析のためのｑＰＣＲ測定
各遺伝子の転写遺伝子発現レベルは、適切な株から単離されたｍＲＮＡのｑＰＣＲにより検出した。分解を防ぐために、ＲＮＡを、RNAPprotect細菌試薬（Qiagen）を用いて細胞溶解の前に安定化させた。続いて、RNeasy mini kit（Qiagen）をヌクレアーゼに基づくゲノムＤＮＡ不純物除去と組み合わせて用いて、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡをiScript cDNA合成キット（Biorad）を用いて増幅した。ｑＰＣＲを、iQ SYBR Green Supermix（Biorad）を用いてBio-Rad iCycler（Biorad）上で実施した。発現が変化しないｒｒｒＡ遺伝子の発現レベルを、ｑＰＣＲ値の正規化に用いた５６。表３に、ｑＰＣＲに用いたプライマーを示す。各プライマー対について、大腸菌のｍＲＮＡをテンプレートとして標準曲線を作成した。
【００９１】
例１：タキサジエン蓄積は、上流ＭＥＰ経路と下流合成タキサジエン経路の相対的強度に強い非線形の依存を示す。
図１ｂは、プロモーターおよび遺伝子コピー数を組み合わせて、タキサジエン合成の上流および下流経路を介して相対的フラックス（または強度）を調節する、種々の方法を示す。ＭＥＰ回路の障害を取り除き、これを下流タキサジエン経路と最適に均衡化させるために、全部で１６株を作成した。図２ａ、ｂは、これらの各株におけるタキサジエン蓄積の結果の概要であり、図２ａは、下流経路の一定の値について、タキサジエン蓄積の上流経路への依存性を強調し、図２ｂは、上流経路強度の一定の値について、下流経路への依存性を強調する（報告されたプロモーター強度およびプラスミドコピー数からの、上流および下流経路発現の計算については、表１も参照のこと３３−３６）。明らかに、上流および下流経路発現の両方について、極大値が示されている。一定の下流経路発現に対して（図２ａ）、上流経路発現が非常に低いレベルから増加すると、全体の経路への前駆体供給の増加により、タキサジエン産生は最初に増加する。しかし、中間値を過ぎると、下流経路の能力のために上流経路のさらなる増加は生じない。この経路の非均衡により、細胞に阻害性であるか、または競合経路へのフラックス分流を単純に示すかのどちらかである、中間体（下記参照）の蓄積がもたらされ、最終的にタキサジエン蓄積の低下が生じる。
【００９２】
一定の上流経路発現に対して（図２ｂ）、下流経路発現のレベルについても同様に極大値が観察される。これは、下流経路の低い発現レベルによる、タキサジエン産生の初期の制限のためであり、これは従って、タキサジエン産生について律速的である。下流経路発現の高いレベルにおいて、我々は細胞生理学に対する高コピー数の負の効果を予想しがちであり、したがって、下流経路発現についても極大値が存在する。これらの結果は、タキサジエン蓄積における大きな変化を、上流および下流経路の発現レベルの狭いウィンドウ内の変化から得られることを実証する。例えば、Ｔｒｃプロモーター制御下でその染色体上に上流経路の追加のコピーを含有する株（株８、図２ａ）は、合成下流経路のみを過剰発現するもの（株１、図２ａ）よりも、２０００倍多くのタキサジエンを産生した。さらに、下流合成オペロンの遺伝子の順序をＧＴ（ＧＰＰＳ−ＴＳ）からＴＧ（ＴＳ−ＧＰＰＳ）へ変化させると、２〜３倍の増加がもたらされた（株５、８、１１および１４と比較した、株１〜４）。観察された結果は、タキサジエン過剰産生の鍵となるのは、豊富な下流経路容量および、上流前駆体経路と下流合成タキサジエン経路の間の注意深い均衡化であることを示す。これらを合わせると、改変株は、内因性上流経路および合成下流経路の広範囲の発現レベルを同時に探索すれば、ＭＥＰ経路フラックスが本質的となり得ることを確立させた。
【００９３】
例２：上流および下流経路の染色体組込みおよび精緻な調整は、タキサジエン産生をさらに強化する。
プラスミドが担う代謝負担を最小化しつつ３７、豊富な下流経路強度を提供するために３７、各４株の２つの新しいセットを改変したが（株２５〜２８および２９〜３２）、ここで、下流経路は、それぞれ比較的低いコピー数である５および１０コピーを維持しつつ、強いプロモーター（Ｔ７）の制御下に配置された。示されるように（図２ｃ）、タキサジエンの極大値は、高い下流強度において維持され（株２１〜２４）、低い下流経路強度においては単調な応答が得られた（株１７〜２０、図２ｃ）。この観察は、前と同じレベルの下流経路強度を維持しているが、非常に低レベルの上流経路を発現する、それぞれ４株の追加の２セットの作成を促進した(株２５〜２８および２９〜３２、図２ｄ)。さらに、後者株セットの上流経路のオペロンを、染色体に組み込んだ。タキサジエン最大値が回復したばかりでなく、非常に低い上流経路レベルにおいても、大幅に高いタキサジエン最大値が達成された（３００ｍｇ／Ｌ）ことがわかる。我々は、この顕著な増加は、細胞の代謝負担の減少による可能性があると考える。これは、１）経路を染色体に組み込むことによりプラスミド依存性を除去し、および２）上流および下流経路発現の間の精巧な均衡化を得ることにより、達成された。
【００９４】
３２の組み換え構築により、モジュラー経路発現空間を適切に精査して、タキサジエン産生における〜１５０００倍の改善の増幅が可能となった。これは、報告された大腸菌ＭＥＰイソプレノイド経路からの圧倒的に最大の産生である（図３ａ）。さらに、テルペノイド産生において観察された改善倍数は、イソプレノイド経路の何億もの組合せ変異体を含む拡張された遺伝空間を探索するという、報告されている組合せ代謝工学手段のものより顕著に高い３０。このことは、経路の最適化は、複数源の組合せ遺伝子最適化よりも、経路モジュールの発現の精密な均衡化により強く依存することを示唆する。図１の表現型ランドスケープに示された複数の極大値は、最適な全体経路性能領域を同定するのに十分な解像度で、発現空間を精査することの重要さを強調する。図７は、モジュラー経路発現探索から得られるタキサジエン産生における改善倍数を示す。
【００９５】
例３：代謝産物はタキサジエン産生に逆相関する、および代謝産物の同定。
前に改変された株のメタボロミクス解析は、経路発現レベルおよびタキサジエン産生に強く相関する、まだ未知の代謝副産物を同定した（図３および図８）。この代謝産物の化学的同一性は未知であったが、我々はこれを、経路分岐から生じた、直接的変数として改変株からのタキサジエン産生に逆相関するイソプレノイド副産物であるとの仮説を立てた（図３および図８）。我々の最適株の重大な属性は、この代謝産物の蓄積を緩和する精密な均衡化であり、これにより、より高いタキサジエン産生がもたらされる。この均衡化は、異なるプロモーターを用いて、染色体からの異なるレベルまたは異なるコピー数のプラスミドにおいて、顕著に異なるタキサジエン蓄積について調節することができる。
【００９６】
続いて、ガスクロマトグラフィ−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）クロマトグラムにおける対応するピークを、ＧＣ−ＭＳ、１Ｈおよび１３Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学研究により、インドールと同定した（図１６）。我々は、株２６によるタキサジエン合成は、外因性インドールによって、〜１００ｍｇ／Ｌより高いインドールレベルにおいて顕著に阻害されることを見出した（図１５ｂ）。インドール濃度をさらに増加させると、細胞増殖も阻害され、阻害のレベルは株に大きく依存していた(図１５ｃ)。インドールのイソプレノイド経路との相互作用の生化学的メカニズムは現在不明であるが、図１５に示す結果は、細胞増殖の阻害における、インドールとイソプレノイド経路のテルペノイド化合物との間の、潜在的相乗効果を示唆する。特定のメカニズムは知られていないが、株２６はインドールの効果を軽減したようであり、これをさらなる試験に用いた。
【００９７】
例４：改変株の培養。
改変株について、制御された条件下でのタキサジエン産生の可能性を調査するために、３つの最大のタキサジエン蓄積株（株２２から〜６０ｍｇ／Ｌ、株１７から〜１２５ｍｇ／Ｌ、株２６から〜３００ｍｇ／Ｌ）のフェドバッチ培養を１Ｌバイオリアクター内で行った（図１７）。フェドバッチ培養試験は、２０％（ｖ／ｖ）ドデカンオーバーレイを用いた液体−液体２相発酵として実施した。予備的所見に示されるように、有機溶媒を導入して、発酵培地から分泌されたタキサジエンのエアストリッピングを防いだ。制御されたグリセロール供給の規定培地中で、タキサジエンの産生力は株２２、１７および２６について、それぞれ１７４±５ｍｇ／Ｌ（ＳＤ）、２１０±７ｍｇ／Ｌ（ＳＤ）、および１０２０±８０ｍｇ／Ｌ（ＳＤ）に増加した（図１７ａ）。さらに、タキサジエン産生は、増殖表現型、酢酸塩蓄積およびグリセロール消費に顕著に影響した（図１７ｂ〜１７ｄ）。
【００９８】
図１７ｃは、全ての株における初期の酢酸塩蓄積を示す。しかし〜６０時間以降、酢酸塩は株１７および２６で減少し、一方株２２では増加し続ける。この現象は、高ＭＥＰフラックス株（２６および１７）と低ＭＥＰフラックス株（２２）の間の、中心炭素代謝における差を強調する。さらにこの観察は、良好に均衡化され機能する株を特徴づける、良好な生理の別の説明となる。オーバーフロー代謝の産物としての酢酸は、これらの発酵で用いられる初期の高いグリセロール濃度および対応する高いグリセロール経路フラックスのために、初めは全ての株により産生される。このフラックスは、ＭＥＰ経路および、細胞における他の代謝経路への供給に十分である。
【００９９】
〜４８時間において、初期のグリセロールが消耗され、培養はフェドバッチモードに切り替わり、この間、一定の低いグリセロールレベルが維持される。これにより、全体の低グリセロールフラックスがもたらされ、高いＭＥＰフラックスの株（株２６および１７）については、これはオーバーフロー代謝を最小化しつつ、ほとんどがＭＥＰ経路に分岐される。その結果酢酸産生は低下するか、または完全になくなる。酢酸濃度の低下については、ある程度の酢酸同化が生じた可能性はあるが、これはフラックス分析の点からさらには検討しなかった。いくらかの蒸発およびグリセロールの供給による希釈は、観察された酢酸濃度の低下にさらに寄与する。対照的に低ＭＥＰフラックスの株（株２２）については、ＭＥＰ経路へのフラックス分流は顕著ではなく、したがってグリセロールフラックスは、全ての必要な炭素およびエネルギー必要量を供給し続ける。オーバーフロー代謝は生じ続けて、酢酸塩の分泌をもたらす。
明らかに、株２６の高い生産性およびより堅固な増殖は、非常に高いタキサジエン蓄積を可能とした。さらなる改善は、バイオリアクター条件の最適化、増殖培地の栄養分の均衡化、および炭素送達の最適化により、可能となるだろう。
【０１００】
例５：上流経路および下流経路の発現レベルおよび細胞増殖は、潜在する複雑性を明らかにする。
経路発現における改変された均衡化のより詳細な理解のために、我々は、タキサジエンの最大産生株および図２ｃおよびｄからの隣接する株（株１７、２２および２５〜３２）について、ｄｘｓ（上流経路）およびＴＳ（下流経路）の転写遺伝子発現レベルを定量した（図４ａ、ｂ）。我々の立てた仮説のとおり、上流経路の発現は、天然プロモーター、Ｔｒｃ、Ｔ５、Ｔ７、および１０コピーおよび２０コピープラスミドからのＭＥＰベクターについてのプロモーター強度およびコピー数と共に単調に増加し、これは、ＤＸＳ発現において見られるのと同様であった（図４ａ）。したがって我々は、ｄｘｓ発現レベルが、上流経路強度と良好に相関することを見出した。同様の相関は、上流経路の他の遺伝子、ｉｄｉ、ｉｓｐＤおよびｉｓｐＦについても見出された（図１４ａ、ｂ）。下流遺伝子発現において、〜２倍の改善が、経路を５コピーから１０コピープラスミドに移行させた後に定量された（２５〜２８系および２９〜３２系）（図４ｂ）。
【０１０１】
プロモーターおよびコピー数効果は遺伝子発現に影響したが、他の経路の発現に対する二次効果もまた顕著であった。図４ａは、同じｄｘｓ発現カセットについて、ＴＳプラスミドのコピー数を５から１０に増やすことにより、ｄｘｓ発現が増加したことを示す。興味深いことに、５コピーのＴＳプラスミド（株２５〜２８系）は、１０コピーのＴＳプラスミドよりも実質的により高いタキサジエン収率と（図２ｄ）、より低い増殖を有する（図４ｃ、ｄ）。タキサジエン異種経路を含まない対照プラスミドは２倍の密度で増殖し、このことは、株２５〜２８系における増殖の阻害が、タキサジエン代謝経路とタキサジエンおよびその直接の中間体の蓄積に直接関連していることを示唆する（図４ｃ）。しかし、株２９〜３２系は、空の対照プラスミドをタキサジエン発現株と比べると、中程度の増殖収率の増加のみを示した（図４ｄ）。この増殖、タキサジエン産生、および発現レベルの間の相互作用は、プラスミドに基づく上流発現ベクターでも見ることができる（株１７および２２）。増殖の阻害は、１０コピー高タキサジエン産生株（株１７）において、２０コピーの低タキサジエン産生株（株２２）よりも大幅に大きかった（図４ｄ）。したがって、産物の毒性および異種経路への炭素の分流は、プラスミドの維持よりも増殖を妨害するようである。
【０１０２】
また予想外であったのは、上流発現ベクターの、下流発現に対する大きな効果であった。図４ｂでは、経路間にクロストークがなければ、２つの直線が存在したであろう。しかし、異なるＭＥＰ発現ベクターについては、ＴＳ発現における〜３倍の変化が観察される。これは、４つの上流遺伝子および２つの下流遺伝子の両方の過剰発現のための、宿主代謝から引き出される、源（原料およびエネルギー）に対する重大な競合のためであろう３８。対照株２５ｃと比較して、株２５に観察される４倍の増殖阻害は、合成タキサジエン経路の高い過剰産生が毒性を誘発し、天然経路の過剰発現と比較して、増殖表現型を変化させたことを示す（図４ｃ）。しかし、上流発現が増加するにつれて、我々のケースでは何かの事情により、下流発現は上流経路と下流経路を均衡化させるような所望のレベルに減少し、増殖阻害を最小化した（株２６）。
【０１０３】
タンパク質過剰発現の極限において、Ｔ７プロモーター駆動性のＭＥＰ経路は、４種のタンパク質の高レベルでの合成により、顕著な増殖阻害をもたらした（株２８および３２）。Ｔ７によるＴＳ遺伝子の発現は、それ自体顕著な影響を有するようにはみられない。Ｔ７誘発性発現からの高率のタンパク質合成（図４ａｂ）は、初期の増殖相からのハウスキーピング遺伝子の成分を含む、タンパク質合成機構の下方制御をもたらし得て、細胞増殖を弱め、バイオマスの増加を低下させる３９、４０。我々は、ここで観察された複雑な増殖表現型は、（１）イソプレノイド／タキサジエン代謝の活性化により誘発された毒性、および（２）高い組み換えタンパク質発現の効果の２つの累積効果であるとの仮説を立てた。合わせて、我々の多変量モジュラー経路改変手段は、テルぺノイド代謝およびその経路発現との相関と細胞生理学に対して、予測できない多様性を生み出した。二次代謝産物産生のための合理的な微生物の設計は、プロモーター強度およびコピー数の線形／非依存性の理解を越えた、経路発現に対する理解を必要とする。しかし、ここで用いたような単純な多変量手段は、（１）高産生者を見出すこと、および（２）代謝経路改変において優勢であるが正当に評価されていない、より高次の効果のシステマチックな調査のための展望を提供することの両方に対し、必要な多様性を導入できる。
【０１０４】
例６：大腸菌におけるタキソールＰ４５０に基づく酸化化学の改変
タキソール生合成の中心的特徴は、タキサンコア構造の複数部位における酸素化、すなわち、シトクロムＰ４５０依存性モノオキシゲナーゼにより媒介されると考えられている反応である４１。経路の関係する環化ステップの完了後、親オレフィンであるタキサ−４（５），１１（１２）−ジエンが次に、Ｃ５位においてシトクロムＰ４５０酵素によりヒドロキシル化され、タキソールへの道における（タキサンコアの）８つの酸素化ステップの第１のものを表す（図６）４２。したがって、タキソール産生微生物を改変する鍵となるステップは、in vivoでのＰ４５０に基づく酸化化学の開発である。第１の酸素化ステップはシトクロムＰ４５０、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼにより触媒され、これは、ジテルペン前駆体タキサジエンにおける二重結合マイグレーションと共にヒドロキシル化反応を触媒する、独特のモノオキシゲナーゼである(図５ａ)。我々は、タキサジエンからタキサジエン−５α−オールへの合成経路の最初の成功した拡張を報告し、大腸菌における任意の官能化タキソール中間体の、in vivo産生の最初の例を示す。
【０１０５】
一般的に、植物シトクロムＰ４５０の機能発現は、例えば電子伝達機構、シトクロムＰ４５０レダクターゼの不在などの細菌プラットフォーム固有の制限、および小胞体の欠如による、Ｐ４５０酵素の膜シグナル伝達モジュール翻訳不適合性のために、困難である４３。近年、膜貫通（ＴＭ）改変ならびにＰ４５０およびＣＰＲレダクターゼのキメラ酵素の生成により、いくつかの植物Ｐ４５０が、機能分子の生合成のために大腸菌で発現された２２、４４。それでもなお、全ての植物シトクロムＰ４５０は、その膜貫通シグナル配列および電子伝達特性において、そのレダクターゼ対応物から独特である４５。我々の最初の研究は、Ｎ末端膜貫通改変および、イチイ種からのＣＰＲ酸化還元パートナーであるイチイ属シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＴＣＰＲ）との翻訳融合を介したキメラ酵素の生成によってコドン最適化した合成タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼの発現を最適化することに焦点を当てた（図５ｂ）２２、４４、４６。生成されたキメラ酵素の１つ、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲは、第１酸化ステップを、タキサジエンからタキサジエン−５α−オールおよび副産物５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサン（ＯＣＴ）への変換率９８％より大で実施するのに、非常に効率的であった(図９ａ)。
【０１０６】
他のキメラＰ４５０と比較すると、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲは、タキサジエン−５α−オールを２倍多く（２１ｍｇ／Ｌ）産生した。また、Ａｔ８Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲおよびＡｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲの弱い活性は、最近特徴づけられた副産物、タキサジエンの環式エーテルへの複雑な構造的再配列（complex structural rearrangement）である５（１２）−オキサ−３（１１）−シクロタキサン（ＯＣＴ）の蓄積をもたらした（図９）４７。副産物は、所望の産物であるタキサジエン−５α−オールとほぼ同量蓄積された。ＯＣＴの形成は、酸化および続く環化が関与する新規なイチイ属シトクロムＰ４５０反応順序により媒介された４７。したがって、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼのタンパク質改変により、環化に先立つ反応の終了がかかる不所望な副産物の蓄積を防ぎ、タキサジエン−５α−オールへのフラックスのチャネリングを達成することができたようである。
【０１０７】
株２６−Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲの生産性は、共に前に記載された特徴づけされていない代謝産物の蓄積における増加に伴い、親株２６（〜３００ｍｇ／Ｌ）によるタキサジエン産生の生産性とは相対的に、顕著に低減した。タキサジエンの蓄積は観察されなかった。明らかに、Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲ構築を有する追加の培地コピープラスミド（１０コピー、ｐ１０Ｔ７）の導入は、株２６の上流経路と下流経路の注意深く改変された均衡化を妨害した。小規模発酵をバイオリアクターで行って、株２６−Ａｔ２４Ｔ５αＯＨ−ｔＴＣＰＲによるアルコール産生を定量した。タキサジエン−５α−オール蓄積の時系列プロファイル（図５ｄ）は、アルコールの５８±３ｍｇ／Ｌまでの産生と等量のＯＣＴ副産物が産生されたことを示す。観察されたアルコール産生は、前のS. cerevisiaeにおける産生よりも〜２４００倍高かった１７。タキサジエン−５α−オール産生のさらなる増加は、経路の最適化およびタンパク質改変により可能であろう。
【０１０８】
経路最適化の多変量モジュラー手段は、重要なタキソール前駆体の非常に高い産生株を生み出した。さらに、組み換え構築は、フラックスをその他の複雑な医薬化合物、例えば、同じ経路から改変されたモノ−、セスキ−およびジ−テルペン（ゲラニオール、リナロール、アモルファジエンおよびレボピマラジエン）産物などの合成へと再度向かわせることにおいても、同様に有効であった（未発表の結果）。したがって、我々の経路改変は、天然産物の生合成のために、特に再生可能源から化学物質および燃料として用いる微生物由来のテルペノイドの文脈において、新しい道を開く。汎用テルペノイド前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰに焦点を当て、重要な経路モジュールを最初に規定し、次に発現を調節して、例えば途切れのない前駆体変換および最少の中間体蓄積のために、経路モジュールを最適に均衡化させることが可能となった。この手段は、大きな遺伝空間の組合せ探索よりも効率的であるようであり、また高スループットスクリーンに依存することもない。
【０１０９】
ＭＥＰ経路はエネルギー的に均衡化されており、したがってグルコースまたはグリセロールのどちらかをイソプレノイドへ変換するのに全体的により効率的である。しかし、過去１０年間、大腸菌においてＭＥＰ経路を改変して、カルテノイド２８、４７、セスキテルペノイド２３およびジテルペノイド６１の過剰産生のための鍵となる前駆体ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの供給を増やす多くの試みは、限定的な成功のみであった。この非効率性は、大腸菌のＭＥＰ経路の発現に特異的に関連する、未知の調節効果のためであった２３。ここで我々は、かかる制限は、経路の非最適な発現による、代謝産物インドールの蓄積に関連し、これは、イソプレノイド経路活性を阻害するとの証拠を提供する。タキサジエン過剰産生（インドール形成抑制の条件下で）は、ＭＥＰ経路を、イソプレノイドファミリーの薬学的および化学的産物の生合成のための非常の効率的な経路として確立する。必要なのは単純に、我々の多変量モジュラー経路改変手段で示唆されたように、モジュラー経路を注意深く均衡化させることである。
【０１１０】
タキソールの微生物産生を成功させるために、Ｐ４５０に基づく酸化化学による、タキサジエンの化学的修飾の実証は必須である４１。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ類は、タキソール生合成経路における１９の異なる酵素ステップの約半分を構成する。特徴的には、これらの遺伝子は、お互いに極めて高い配列類似性（＞７０％）を、しかし他の植物Ｐ４５０とは低い類似性（＜３０％）を示す１４。タキソールモノオキシゲナーゼ類は明らかに類似しているので、特定のＰ４５０酸化化学の実施のための適切な活性を発現することは、特に挑戦的である。ＴＭ改変および酸化還元パートナーとの人工的キメラ酵素（ＴＣＰＲ）の構築を介して、タキソールシトクロムＰ４５０、タキサジエン５α−ヒドロキシラーゼを大腸菌に機能的に発現させて、in vivoでタキサジエンを対応するアルコール産物へと効率的に変換することが示された。前のin vitroの研究において、タキサジエンをタキサジエン−５α−オールへと、天然のタキサジエン５α−ヒドロキシラーゼ酵素により変換するメカニズムが記載されたが、in vivoでの同じ変換については述べられていない４２。この酸性化および再配列反応は、タキサジエンのＣ２０位から水素を抽出してアリルラジカル中間体を形成し、続いてＣ５位への部位特異的および立体特異的酸素挿入により、アルコール誘導体を産生する（図５ａ）。イチイ属細胞で観察された酵素の中程度の豊富さ、および低いｋｃａｔ値は、タキソール生合成の５α−ヒドロキシル化ステップが、下流の酸素化およびタキソール経路におけるアシル化と比較して遅いことを示唆した４１。したがって、このステップの改変はタキソール合成の鍵となり、特に、大腸菌などの原核宿主におけるタキソールＰ４５０機能性改変の文脈においてそうである。さらに、このステップは、酵母において経路を作成するという前の努力において、制限的であった１７。この研究で改変された構築は、in vivoでタキサジエンの＞９８％の変換を、産物蓄積〜６０ｍｇ／Ｌにおいて示し、前の酵母における異種発現より２４００倍の改善であった。この研究は従って、鍵となるタキソール中間体の顕著に多量の合成に成功したのみでなく、同様のＰ４５０化学によって、経路における続く代謝産物の合成に対するに基づく提供する。
【０１１１】
タキソールの構造−活性関係についての前の研究は、その官能基のいくつかの除去または付加のどちらかによる改変が、タキソールの活性を物質的に変化しなかったことを示した１、４８。しかしかかる研究は、化学合成によって変化を導入する能力の制限により限定されていた。タキソール合成についての微生物経路の利用可能性は、試験可能な化学的修飾の空間を大幅に拡張し、こうして、より強力な薬物候補を同定する確率を増加させる。これにより、特に、かかる薬物候補が効率的産生経路とも関連するだろうことを考慮すると、薬物開発に対する魅力的な新しい機会が提供される。
【０１１２】
過去数十年の間、タキソールは、他のいかなる天然産物薬物候補よりも、科学コミュニティ内および一般大衆に大きな興味を引き起こしてきた１０。タキソールまたはタキソール類似体の、癌の化学療法への使用に想定される増加から、主要な供給危機が予測されており、新しい産生経路、例えば微生物におけるタキソールの生合成機構の改変などが求められている８。イチイ種の２、３の内部増殖性真菌が、天然にタキソールを産生できるとして単離されたが、これらの微生物系は、薬物の持続可能な産生についての好適性を実証されていない４９。本明細書に報告された結果は、関係する前駆体経路における障害を除去することによって、微生物由来のタキソールまたはタキソール前駆体に対する、抑圧的なステップを示す。さらに、合成経路のアセンブリーは、経路を選択的に改変し、これによりタキサン構造を変化させてタキソール類似体を調整する、新しい可能性を提供する。これらの開発は、タキソールまたは好適なタキソール前駆体の、費用効率的な産生のための微生物経路に対する楽観をもたらす。
【０１１３】
表１．任意単位（ａ．ｕ．）における、上流および下流経路発現のランキング。ＭＥＰ経路およびＧＧＰＰシンターゼ／タキサジエンシンターゼ経路発現レベルを、公開されているプロモーター強度およびコピー数の値を用いて推定した。プロモーター強度は、Brosius et al. and Brunner et al.３３、３４に基づき、ｔｒｃ＝１、Ｔ５＝１．９６、Ｔ７＝４．９７として計算した。遺伝子コピー数は、用いた異なるプラスミドについて、複製の起点に対する公開されたコピー数から割り当て、組込み（integration）には１コピーを用いた３５−３７。全発現は、プロモーター強度と遺伝子コピー数の結果として計算した。ＭＥＰ経路の天然の発現には、１の値を任意に割り当て、ＧＧＰＰシンターゼおよびタキサジエンのオペロン順序の変化は、タキサジエンシンターゼ発現に２０％影響すると仮定した３５。これらの全発現の推定値から、改変エフォートを導いた。Ｅ  −  ２つの欠失、ΔrecAΔendAを有する大腸菌K12MG1655；ＥＤＥ３：K12MG1655ΔrecAΔendAに、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ＤＥ３）を組込み；ＭＥＰ  −  ｄｘｓ−ｉｄｉ−ｉｓｐＤＦオペロン；ＧＴ  −  ＧＰＰＳ−ＴＳオペロン；ＴＧ  −  ＴＳ−ＧＰＰＳオペロン；Ｃｈ１  −  染色体内に１コピー、Ｔｒｃ  −  ｔｒｃプロモーター；Ｔ５  −  Ｔ５プロモーター；Ｔ７  −  Ｔ７プロモーター；ｐ５  −  〜５コピープラスミド（ｐＳＣ１０１）；ｐ１０  −  〜１０コピープラスミド（ｐ１５Ａ）；およびｐ２０  −  〜２０コピープラスミド（ｐＢＲ３２２）。
【０１１４】
【表１−１】
0005844738.tif 000002
【０１１５】
【表１−２】
0005844738.tif 000003
【０１１６】
【表２】
0005844738.tif 000004
表２．研究用に作成された全プラスミドの詳細。
【０１１７】
【表３−１】
0005844738.tif 000005
【０１１８】
【表３−２】
0005844738.tif 000006
【０１１９】
【表３−３】
0005844738.tif 000007
【０１２０】
【表４−１】
0005844738.tif 000008
【０１２１】
【表４−２】
0005844738.tif 000009
【０１２２】
【表４−３】
0005844738.tif 000010
【０１２３】
【表４−４】
0005844738.tif 000011
【０１２４】
【表５−１】
0005844738.tif 000012
【０１２５】
【表５−２】
0005844738.tif 000013
【０１２６】
【表５−３】
0005844738.tif 000014
【０１２７】
【表５−４】
0005844738.tif 000015
【０１２８】
この発明の少なくとも１態様のいくつかの側面をこうして記載したので、当業者には、種々の改変、修正および改善が容易に思い浮かぶであろうことが理解されるであろう。かかる改変、修正および改善は、この開示の一部であることが意図され、本発明の精神および範囲内であることが意図される。したがって、前述の説明および図面は、例示のためのみである。当業者は定例の実験のみを用い、本明細書に記載された発明の特定の態様の多くの均等物を認識するか、または確認することができる。かかる均等物は、以下のクレームに包含されることが意図される。
本明細書に開示された全ての参考文献は、本明細書に述べられた特定の目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
【図１ａ】
0005844738.tif 000016
【図１ｂ】
0005844738.tif 000017
【図２ａ】
0005844738.tif 000018
【図２ｂ】
0005844738.tif 000019
【図２ｃ】
0005844738.tif 000020
【図２ｄ】
0005844738.tif 000021
【図２ｅ】
0005844738.tif 000022
【図３ａ】
0005844738.tif 000023
【図３ｂ】
0005844738.tif 000024
【図４ａ】
0005844738.tif 000025
【図４ｂ】
0005844738.tif 000026
【図４ｃ】
0005844738.tif 000027
【図４ｄ】
0005844738.tif 000028
【図５ａ】
0005844738.tif 000029
【図５ｂ】
0005844738.tif 000030
【図５ｃ】
0005844738.tif 000031
【図５ｄ】
0005844738.tif 000032
【図６】
0005844738.tif 000033
【図７】
0005844738.tif 000034
【図８ａ】
0005844738.tif 000035
【図８ｂ】
0005844738.tif 000036
【図８ｃ】
0005844738.tif 000037
【図９ａ】
0005844738.tif 000038
【図９ｂ】
0005844738.tif 000039
【図９ｃ】
0005844738.tif 000040
【図９ｄ】
0005844738.tif 000041
【図１０】
0005844738.tif 000042
【図１１】
0005844738.tif 000043
【図１２】
0005844738.tif 000044
【図１３】
0005844738.tif 000045
【図１４ａ】
0005844738.tif 000046
【図１４ｂ】
0005844738.tif 000047
【図１５ａ】
0005844738.tif 000048
【図１５ｂ】
0005844738.tif 000049
【図１５ｃ】
0005844738.tif 000050
【図１６ａ】
0005844738.tif 000051
【図１６ａ】
0005844738.tif 000052
【図１６ｂ】
0005844738.tif 000053
【図１６ｂ】
0005844738.tif 000054
【図１６ｃ】
0005844738.tif 000055
【図１６ｄ】
0005844738.tif 000056
【図１６ｅ】
0005844738.tif 000057
【図１７ａ】
0005844738.tif 000058
【図１７ｂ】
0005844738.tif 000059
【図１７ｃ】
0005844738.tif 000060
【図１７ｄ】
0005844738.tif 000061
【配列表】
0005844738000001.app