(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血またはその成分を採取し、安定化させるための採取用デバイスであって、
前記採取用デバイスは第１の端部および第２の端部ならびにリザーバーを画定する少なくとも１つの内壁を含み、
前記リザーバーはリゾホスホリパーゼ（ＬｙｓｏＰＬＡ）阻害剤を含む安定剤を含み、
さらに、
前記安定剤は、ブチルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤、若しくはそれらの組み合わせを含むか、または、
前記デバイスに抗凝固剤を含むか、
のいずれかを選択することを特徴とする採取用デバイス。
【請求項２】
チューブであることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記チューブは、血液を前記リザーバーに供給するために針によって穿刺できるクロージャーをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記チューブは、少なくとも部分的に真空にされたチューブであることを特徴とする、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記チューブは滅菌されていることを特徴とする、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記内壁はプラスチックまたはガラスからなることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
前記リザーバーは分離要素を含むことを特徴とする、請求項２から５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤は、メチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）
であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤は、ブロモエノールラクトン、エチルオクチルホスホノフルオリデート、イソプロピルドデシルホスホノフルオリデート、ｎ−ドデシル−ベンゾジオキサホスホリン−２−オキシド、パルミチルトリフルオロメチルケトンおよびパルミトイルカルニチンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記ＢＣｈＥ阻害剤はタクリンまたはその誘導体であることを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記安定剤はプロテアーゼ阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼの阻害剤、エンドペプチダーゼの阻害剤、エキソペプチダーゼの阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、またはそれらの２つ以上の組み合わせであることを特徴とする、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記安定剤は凍結乾燥されていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記抗凝固剤はＥＤＴＡもしくはその塩、またはヘパリンであることを特徴とする、請
求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記抗凝固剤は、前記内壁の少なくとも一部にコーティングまたは噴霧乾燥されていることを特徴とする、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記安定剤はブチルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）阻害剤、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤、またはそれらの組み合わせを含まないことを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
全血またはその成分を安定化させるための方法であって、患者から得られた血液を、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデバイスの中に保持するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記全血またはその成分は糖尿病患者から得られ、前記成分はグレリン、グルカゴン、ＧＩＰ(1-42)、ＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ2、ＧＬＰ−１−（７−３７）、およびそれらの２つ以上の組み合わせであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記成分は血漿であることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
代謝性疾患を診断するための、または代謝性疾患を有する患者の治療をモニターするための方法であって、
前記方法は少なくとも１つの所定の時間に全血またはその成分の試料中のグレリンの存在または量を測定するステップを含み、
患者から得られた血液を、前記血液は請求項１から１６のいずれか一項に記載の採取用デバイスの中に保持し、対照よりも高い測定量は代謝性疾患の存在または治療の有効性の指標とする、ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
全血またはその成分中のプロドラッグおよび／またはその活性代謝物の存在または量を検出するための方法であって、
前記方法は、脂肪族エステル基を含むプロドラッグを投与された患者から得られた血液またはその流体成分の試料中における前記プロドラッグの存在を検出しまたはその量を測定するステップであり、
前記血液またはその流体成分を、請求項１から１６のいずれか一項に記載の採取用デバイスに保持するステップと、
前記検出された存在または測定された量を対照と比較するステップとを含む、ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全血またはその成分を採取し、安定化させるための採取用デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年３月４日に出願した米国特許仮出願第６１／４４９，３３７号の出願日の利益を主張するものである。
【０００３】
糖尿病は通常、遺伝的および環境的要因の複合によって起こる代謝障害の症候群であり、異常に高い血糖値（高血糖）をもたらす。血中グルコースレベルは、体内における、多種の化学物質およびホルモン（膵臓のβ細胞において産生されるインスリンホルモンを含む）の複雑な相互作用によって制御されている。真性糖尿病は体内でのインスリンの分泌またはインスリンの作用の欠陥によって高い血中グルコースレベルをもたらす疾患群を指す。
【０００４】
糖尿病は、インスリン産生の減少（１型糖尿病）またはインスリンの効果に対する抵抗性（２型糖尿病および妊娠糖尿病）によって発現する。いずれも高血糖をもたらし、これは主として糖尿病の急性兆候、即ち尿の過剰産生、その結果として生じる代償的口渇および水分摂取の増加、目のかすみ、説明のつかない体重減少、倦怠感、およびエネルギー代謝の変化の原因となる。
【０００５】
注射器、インスリンポンプ、またはインスリンペンによる注射によってインスリンが送達される。これは１型糖尿病の基礎的治療である。２型糖尿病は食事療法、運動、医薬およびインスリンの補充の併用によって管理される。インスリンが医薬として入手可能になってからは、全ての形態の糖尿病は治療可能になったが、いまだに完治はできない。
【０００６】
世界保健機構の２０００年の報告によれば、世界で少なくとも１億７１００万人、即ち人口の２．８％が糖尿病を患っている。しかしながら、その罹患率は急速に増大しており、２０３０年までにこの数はほぼ２倍になると推定されている。真性糖尿病は世界中で発生しているが、先進国であるほど多い（特に２型）。しかし患者数の増加はアジアおよびアフリカで最も多く起こると予想されており、２０３０年までにここで大部分の患者が見出されると考えられる。
【０００７】
糖尿病等の代謝性疾患のペプチドバイオマーカーとして、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴンおよびグレリンが報告されている。体内のＧＬＰ−１の主要な源は腸に見出されている。循環系中のＧＬＰ−１の典型的な正常血中濃度は３〜８５ピコモルの範囲である。ＧＬＰ−１は糖尿病の治療の可能性としての集中的な研究の主題となるようないくつかの生理学的特性を有している（非特許文献１）。ＧＬＰ−１は膵臓からのインスリンの分泌を増加させ、膵臓からのグルカゴンの分泌を減少させ、β細胞の量およびインスリン遺伝子の発現を増加させ、胃における酸の分泌および胃内容物排出を阻害し、満腹感を増大させることによって食物摂取を減少させることが知られている（非特許文献２）。しかしながら、一旦循環系に入れば、ＧＬＰ−１はジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）−ＩＶ等のプロテアーゼによって引き起こされるタンパク質分解のために約１．５〜５分の短い生物学的半減期を示すことが報告されている（非特許文献３）。
【０００８】
ＧＩＰの活性形は、配列：ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＡＭＤＫＩＨＱＱＤＦＶＮＷＬＬＡＱＫＧＫＫＮＤＫＨＮＩＴＧＱ（「ＧＩＰ（１−４２）」）によって表わされる４２アミノ酸ポリペプチドである。ＧＩＰ（１−４２）は消化管の十二指腸および空腸の粘膜に見出されるＫ細胞によって合成される。ＧＩＰ（１−４２）はＧＩＰと膵β細胞上の７個の膜貫通ＧＩＰ（１−４２）レセプターとの相互作用が関与する機構によってインスリンの分泌を誘起すると考えられる。血漿中のＧＩＰ（１−４２）の正常な空腹時濃度は約６〜１２ｐｍｏｌ／Ｌであり、正常な非空腹時濃度は約８０〜３００ｐｍｏｌ／Ｌである。循環系中におけるＧＩＰ（１−４２）の半減期は約５分であると報告されている。
【０００９】
グルカゴンは２９アミノ酸ペプチドで、炭水化物の代謝に関与している。これは膵臓で産生され、血中グルコースレベルが低い時（低血糖）に放出される。これは肝細胞（ヘパトサイト）上のレセプターに結合し、貯蔵されたグリコーゲンの肝臓におけるグルコースへの変換および放出、次いでグルコースの血流中への放出をもたらす。これらの貯蔵が欠乏すると、グルカゴンは肝臓におけるグルコースのさらなる合成を刺激する。したがってグルカゴンの作用は、体内の細胞に血液からグルコースを取り込むよう指令するインスリンの作用とは反対である。グルカゴンはまた、脂肪分解として知られているプロセスを通してグルコースの産生速度を制御する。循環系中のグルカゴンの典型的な正常血中濃度は１１〜１７ピコモルである。一旦循環系に入れば、グルカゴンの半減期は約８〜１８分である。
【００１０】
グレリンは主としてヒトの胃の基底部を裏打ちするＰ／Ｄ１細胞および膵臓のε細胞によって産生されるホルモンであり、食欲を刺激する。典型的な正常血中濃度はこれもピコモルの範囲である。グレリンはＮＨ２−ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ−ＣＯＯＨの配列を有する２８アミノ酸ペプチドである。このペプチドの生物活性型の１つはアシル化グレリンとして知られており、Ｓｅｒ３（即ち−ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯ−）上にｎ−オクタノイル基を含む。このペプチドは脳下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出の刺激等の内分泌作用、ならびに食欲刺激効果および食物摂取の増加ならびに胃酸分泌および運動性の刺激による脂肪過多症（脂肪組織の増加）および体重増加の誘起等の様々な生理学的効果を発揮する（非特許文献４、非特許文献５）。したがって、糖尿病に加えて、アシル化グレリンは食餌誘発性体重減少および絶食等の関連する条件についての既知の代謝バイオマーカーである。グレリンペプチドの別の形態はｄｅｓ−アシルグレリンとして知られており、これは細胞増殖（非特許文献６、非特許文献７）および脂肪生成（非特許文献８）の調節等のそれ自体の機能を有する代謝的に不活性な形態である。活性型および不活性型の両方を含むグレリンの正常血漿中濃度は約３００から約７００ｐｇ／ｍｌ（即ち約０．０８から約０．１９ｎＭまたは約０．０９から約０．１９ｆｍｏｌ／μｌ）の範囲であり、時とともに変動する。グレリンの主な循環形はｄｅｃ−アシルグレリンであり（非特許文献９）、したがってこの量の大部分はより正確な代謝バイオマーカーの形態ではない。一旦循環系に入れば、グレリンの半減期は約３０分である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第７３０９４６８号明細書
【特許文献２】米国特許第５８６０９３７号明細書
【特許文献３】米国特許第６５１６９５３号明細書
【特許文献４】米国特許第６４０６６７１号明細書
【特許文献５】米国特許第６４０９５２８号明細書
【特許文献６】米国特許第６４９７３２５号明細書
【特許文献７】米国特許第５０５３１３４号明細書
【特許文献８】米国特許第５０９６６６９号明細書
【特許文献９】米国特許第５１１２４５５号明細書
【特許文献１０】米国特許第５８２１３９９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５６２８９６１号明細書
【特許文献１２】米国特許第７４１９８２１号明細書
【特許文献１３】米国特許第６７５００５３号明細書
【特許文献１４】米国特許第Ｄ３３７１６４号明細書
【特許文献１５】米国特許第５８５８７５６号明細書
【特許文献１６】米国特許第６００４７９２号明細書
【特許文献１７】米国特許第７２９４４９６号明細書
【特許文献１８】米国特許第４８１６４５６号明細書
【特許文献１９】米国特許第４７５４０５０号明細書
【特許文献２０】米国特許第２６０７７７３号明細書
【特許文献２１】米国特許第４８３３１３８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gautier, et al., Diabetes Met. 31:233-42 (2005)
【非特許文献２】Baggio, et al., J. Gastroenterol. 132:2131-57 (2007)
【非特許文献３】Hui, et al., Eur. J. Endocrinol. 146:863-9 (2002)
【非特許文献４】Kojima, et al., Trends Endocrinol. Metab. 12:118-122 (2001)
【非特許文献５】Kojima, et al., Physiol. Rev. 85:495-532 (2005)
【非特許文献６】Baldanzi, et al., J. Cell Biol. 159:1029-37 (2002)
【非特許文献７】Ariyasu, et al., Endocrinol. 2005:355-64 (2005)
【非特許文献８】Muccioli, et al., Eur. J. Pharmacol. 498:27-35 (2004)
【非特許文献９】Hosoda, et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 279:909-13 (2000)
【非特許文献１０】Yi, et al., J. Proteome Res. 6 (5):1768-81 (2007)
【非特許文献１１】Yi et al., J. Proteome Res. 7 (12):5112-8 (2008)
【非特許文献１２】Lockridge, "Genetic Variants of Human Serum Butyrylcholinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine." (Kalow (ed.) Pharmacogenetics of Drug Metabolism New York: Pergamon Press, Inc, pp.15-50)
【非特許文献１３】Gemma,et al., J. Med. Chem. 49 (11):3421 -25 (2006)
【非特許文献１４】Camps,et al., Mol. Pharmacol. 57:409-17 (2000)
【非特許文献１５】Bencharit, et al. , Chem. Biol. 10:341-9 (2003)
【非特許文献１６】Campiani, et al., J. Med. Chem. 48:1919-29 (2005)
【非特許文献１７】Wong, et al., J. Am. Chem. Soc. 125:363-73 (2003)
【非特許文献１８】Savini, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:1779-82 (2001)
【非特許文献１９】Piazzi, et al., J. Med. Chem. 46:2279-82 (2003)
【非特許文献２０】Hyatt, et al., J. Med. Chem. 50:5727-34(2007)
【非特許文献２１】Mentlein, et al., Eur. J. Biochem. 214, 829 (1993)
【非特許文献２２】Wiltshire, et al., J. Chromatogr. B745:373-88 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
たとえば非特許文献１０には、内因性プロテアーゼによって引き起こされる血清および血漿のタンパク質のタンパク質分解は試料採取および取扱いの最初の数分間に起こることが報告されている（これはエクスビボのタンパク質分解が迅速であることを示唆している）。引き続く出版物である非特許文献１１には、プロテオミクス技術がより強力になり、またより広く利用できるようになるにつれて血液中の疾患マーカーの発見が促進され続けているにも関わらず、これらの発見が臨床的有用性に成功裏に移行することは著しく少なく、この移行に対する障害の理解への関心の増大に拍車をかけていることが報告されている。血漿中のＧＬＰ−１、ＧＩＰ、グルカゴンおよびグレリン（および特にそれらの生物活性型）の半減期が短く、濃度がかなり低いことに加えて、特に採血中および試料の初期取扱い時における、分析前のばらつきによって面倒な問題が起こる。非特許文献１１にも、いくつかのペプチドバイオマーカーの場合にタンパク質分解が数秒で起こることが報告されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
グレリンはペプチド主鎖と８炭素エステル基を含む側鎖とを含み、これらはそれぞれヒト血漿中に存在する内在性プロテアーゼおよびエステラーゼの作用を受けやすい。実施例に示すように、本出願人らは、プロテアーゼまたはエステラーゼの阻害剤とは対照的に、リゾホスホリパーゼ（ＬｙｓｏＰＬＡ）阻害剤を含有させることによって、採取した血液または液体成分（たとえば血清または血漿）試料中でグレリンをより効果的に安定化させることができることを発見した。実際には、本出願人らのデータは、エステラーゼ阻害剤のさらなる存在がインビトロにおけるグレリンの安定性を減損または低減させることを示している。グレリンの側鎖が「エステル」基である事実に加えて、特にＬｙｓｏＰＬＡの活性が胃および腸においては検出されるが、血漿中では検出されないという報告を考慮すると、これらの発見は驚くべきことであり、予期されないことである。したがって、本発明はグレリン等のバイオマーカーの測定等の信頼できる臨床検査を実施するための血液またはその成分の比較的長い保存安定性を提供するものである。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様は、全血またはその成分を採取し、安定化させるための採取用デバイスであって、前記デバイスは第１の端部および第２の端部ならびにリザーバーを画定する少なくとも１つの内壁を含み、前記リザーバーはリゾホスホリパーゼ（ＬｙｓｏＰＬＡ）阻害剤を含む安定剤を含む採取用デバイスを対象とする。いくつかの実施形態においては、前記安定剤はまた、血液中に正常に存在し、代謝性疾患の診断マーカーを分解する別の種類の酵素の少なくとも１つの阻害剤を含む。これらの酵素としてはエステラーゼおよびプロテアーゼが挙げられる。したがって、他の実施形態においては、前記採血デバイスはまた、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）またはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害剤等のエステラーゼの阻害剤、および／またはプロテアーゼの阻害剤（たとえばセリンプロテアーゼの阻害剤、エキソペプチダーゼの阻害剤、ジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、およびそれらの２つ以上の組み合わせ）を含んでもよい。
【００１６】
全血またはその成分（単数または複数）を採取し、保存する目的のためのデバイスを作成および使用する方法も提供される。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、本発明の採血デバイスを用いて、代謝性疾患（たとえば糖尿病）等の疾患を有する個人の疾患を診断し、または治療をモニターするための方法であって、患者から採取した血液試料またはその成分中における生物学的に（代謝的に）活性なグレリン等の１つまたは複数の疾患マーカーの存在または量を経時的に（または少なくとも１つの所定の時間または時間間隔で）測定するステップを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態においては、本方法には、グルカゴン、ＧＩＰ、グレリンおよびＧＬＰ−１（これにはＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ２およびＧＬＰ−１−（７−３７）が含まれる）およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる代謝性疾患マーカーを測定するステップも含まれる。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、脂肪族エステル側鎖基（たとえばアシル基）を含むプロドラッグを投与された個人における前記プロドラッグの血中レベルをモニターする方法であって、本発明の採血デバイスを用いて患者から血液試料を採取するステップと、前記試料またはその成分中の前記プロドラッグおよび／またはその活性代謝物の存在または量を測定するステップとを含む方法を対象とする。プロドラッグおよび前記プロドラッグの活性代謝物の存在または量を測定することができる。プロドラッグおよび／または代謝物の血中レベルの測定は、所定の時間間隔等で２回以上実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の典型的な採血デバイスの透視図である。
【図２】１）ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤であるメチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）、ＥＤＴＡ、エステラーゼ阻害剤であるタクリン、ならびにプロテアーゼ阻害剤であるＬ−スレオ−イソロイシルチアゾリジド、ベスタチンおよびロイペプチン（図に黒三角形で示す本発明の安定剤「ＩＳＡ」）；２）抗凝固剤ＥＤＴＡおよびＭＡＦＰを含む本発明の別の安定剤（図にｘで示す）；３）ＥＤＴＡおよびエステラーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤（図に黒菱形で示す比較の安定剤「ＣＳＡ」）；および４）ＥＤＴＡ単独（図に黒正方形で示す）を含む４本の異なった採血管に１ｐｇ／μＬのアシル−グレリンを添加した、３０時間にわたるアシル−グレリンの安定性を比較して示すグラフである。
【図３】空腹時ヒト対象者から採取した血液試料中のグレリンの経時的安定性を示すグラフである。採取した血液試料はグレリン添加（黒菱形）および非添加（黒正方形）の両方のＥＤＴＡ管ならびに本発明の代表的な安定剤（ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤としてＭＡＦＰを含む）を含む採血管（グレリン添加（黒三角）および非添加（ｘ）の両方）中に保存した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の採取デバイスは、全血または赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮物等の血液成分、ならびに血漿および血清等の血液の液体成分を採取し、安定化させるために用いられる。
【００２１】
概して、本発明の血液試料採取デバイスは、試験管および遠心管等のチューブ；採取バッグ等の閉鎖系血液採取デバイス；注射器（シリンジ）、特にプレフィルドシリンジ；カテーテル；マイクロタイターおよびその他のマルチウェルプレート；アレイ；チューブ類；フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、バイアル等の実験用容器；顕微鏡スライド、顕微鏡スライドアセンブリー、カバースリップ、フィルムならびに多孔質基材およびアセンブリー；ピペットおよびピペットチップ；組織およびその他の生物学的試料の採取容器；および生物学的試料を保持するのに適した任意の他の容器、ならびに試料を移送するための容器および要素等の任意の採取デバイスを包含し得る。いくつかのそのようなデバイスの例および説明は、Ｓｔｅｖｅｎｓらに付与された共有の特許文献１に開示されている。
【００２２】
特許文献１にも示されている図１は本発明において有用な典型的な採血デバイス１０を示し、これは内部チャンバーまたはリザーバー１４を画定する容器１２を含む。示された実施形態において、容器１２は側壁１６、閉じた底端１８および開いた上端２０を有する中空管である。任意選択で、分離部材１３が容器チャンバー１４の内部に取り付けられている。分離部材１３は血液試料の成分をたとえば遠心分離によって分離することを助けるために作用する。容器１２は適切な量の血液を採取するために寸法が決められている。無菌の製品が必要な場合には、開放端２０をカバーして容器１２を閉じるために閉鎖手段２２が必要である。いくつかの実施形態においては、チューブはスクリューキャップ用に構成されている。しかしリザーバーがＢＣｈＥ阻害剤を含むがプロテアーゼ阻害剤を含まない場合のようにチューブが真空にされる実施形態においては、必要な保存期間の間に真空を保つためにぴったりと合った弾力性のあるプラグが一般に用いられる。好ましくは、クロージャー２２は容器１２を効果的に閉じ、生物学的試料をチャンバー１４の中に保持することができるシールを形成する。クロージャー２２は、これだけに限らないが、ゴムクロージャー、ＨＥＭＯＧＵＡＲＤ（商標）クロージャー、金属シール、金属バンド付きゴムシールおよび種々のポリマーおよび設計によるシール等の種々の形態の１つであってよい。保護遮蔽材２４をクロージャー２２の上に被せてもよい。
【００２３】
容器１２は、たとえばプラスチック（たとえばポリオレフィン、ポリアミド、シリコーン、ポリウレタン、エポキシ、アクリル樹脂、ポリアクリレート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリメタクリレート、ＰＥＥＫ、ポリイミドおよびフルオロポリマー）およびシリカガラス等のガラス製品等の実験用容器に適した任意の材料から作ることができる。好ましくは、容器１２は透明である。容器１２に適した透明な熱可塑性材料の例としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートが挙げられる。プラスチック材料は酸素不透過性材料であってよく、または酸素不透過層もしくは半透過層を含んでよい。あるいは、容器１２は水および空気透過性のプラスチック材料から作ることができる。
【００２４】
チャンバー１４の内圧は所定の量の生物学的試料をチャンバー１４の中に吸引するために選択される。好ましくは、クロージャー２２は、大気圧と大気圧未満の圧力との間の内圧差を維持することができる弾力性のある材料から作られる。クロージャー２２は、当技術において知られているように、生物学的試料を容器１２の中に導入するために針２６またはその他のカニューレによって穿刺できるようなものである。好ましくは、クロージャー２２は再シールが可能である。クロージャー２２として好適な材料としては、たとえばシリコーンゴム、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレンプロピレンコポリマーおよびポリクロロプレンが挙げられる。
【００２５】
容器１２の好適な例としては、単壁および多層チューブが挙げられる。好適な容器１２のより具体的な例は特許文献２に開示されている。
【００２６】
容器１２は、ゲル、機械的分離材または他の種類の分離部材（たとえば濾紙その他）等の分離材を含んでもよい。分離材は血液血漿の調製、具体的にはヒトまたは動物の全血から血漿を分離するために有用である。ゲルは望ましくはチクソトロピー性のあるポリマーゲル製剤である。ゲルはホモポリマーまたはコポリマーであってよく、たとえばポリシロキサン等のシリコーン系ゲル、またはたとえばポリアクリル樹脂、ポリエステル、ポリオレフィン、酸化シスポリブタジエン、ポリブテン、エポキシ化大豆油と塩素化炭化水素とのブレンド、二酸とプロパンジオールとのコポリマー、水素化シクロペンタジエンおよびα−オレフィンとジアルキルマレエートとのコポリマー等の有機炭化水素系ゲルが含まれ得る。本発明において有用と思われる機械的分離材の例は、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。
【００２７】
容器１２は、全血試料の重い方の相からリンパ球および単球を遠心分離するために適合させてもよい。そのような実施形態においては、デバイスは液体密度勾配媒体および遠心分離に先立って液体密度勾配媒体と血液試料との混合を防止するための手段を含んでもよい。リンパ球／単球採取チューブの好適な例は特許文献７に開示されている。
【００２８】
図１に示した実施形態に加えて、本発明における使用に適した購入可能な他の採血管としては、以下の、その全てがＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）から販売され、全ての登録および商標がＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社に属する、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ヘマトロジーチューブ（たとえばカタログ番号３６７６５０−１、３６７６６１、６４０５、６３８５、６５６４、３６７６５３、３６７６６５、３６７６５８、３６７６６９、６４５０−８、６５３５−３７および３６７６６２）；ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（たとえばカタログ番号３６７８４１−２、３６７８５６および３６７８６１）；ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＰＳＴチューブ（たとえばカタログ番号３６７７９３−４、６６９８、６５９５および６６７２）；ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＣＰＴチューブ（たとえばカタログ番号３６２７５３および３６２７６０−１）；ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＳＳＴチューブ（たとえばカタログ番号３６７７８２−８９、６５０９−１７および６５９０−９２）；ならびにＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ＡＣＤチューブ（たとえばカタログ番号３６７７５６、３６４０１２および４８１６）、およびＢＤ  Ｍｉｃｒｏｇａｒｄ（商標）クロージャーを有する非排気ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（たとえば３６５９８７、３６５９６５および３６５９７４）または従来のＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（たとえば３６５９５６、３６５９５７、３６５９５８、３６５９５９、３６５９７１および３６５９７３）が挙げられる。市販の多くの採血管は典型的には、２５０μｌから約１０．０ｍｌまで（約１０．０ｍｌを含む）、場合によっては１６ｍｌまでの範囲の標準容積を有する。典型的な容積としては、２５０、４００、および５００μｌ、ならびに２．０ｍｌ、３．５ｍｌ、４．０ｍｌ、５．０ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、および１０．０ｍｌが挙げられる。
【００２９】
他の実施形態においては、デバイスには試験用カートリッジの内部に集約されたリザーバーであって、全血を２〜２００μｌ、より好ましくは５０〜１５０μｌの範囲の量で保持できるリザーバーが含まれ得る。そのようなカートリッジは、たとえばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からｉ−ＳＴＡＴ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍという商品名で販売されており、カートリッジとインターフェース可能な手持ちアナライザーとともに用いることができる。本発明において使用可能なそのようなカートリッジおよび手持ちアナライザーの例としては、それぞれｉ−ＳＴＡＴ  ＣＨＥＭ８＋カートリッジおよびｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）１手持ちアナライザーが挙げられる。そのようなデバイスは、たとえば特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、および特許文献１４に教示されている。
【００３０】
リゾホスホリパーゼ（ＬｙｓｏＰＬＡ）は、リン脂質の代謝における界面活性剤様の中間体であって多くの生理学的および病理学的過程において重要な役割を果たすリゾリン脂質（ＬｙｓｏＰＬ）を、特にカルボン酸エステル結合において加水分解する酵素である。リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）は細胞膜の正常な成分であり、膜レセプターから生じるシグナルを変換する脂質のメッセンジャーとして作用すると考えられる、ＬｙｓｏＰＬＡの内在性基質である。ヒトＬｙｓｏＰＬＡのアミノ酸および対応する核酸の配列は当技術で公知である。たとえば特許文献１５、１６、１７を参照されたい。特許文献１７に提示された１つの証拠によれば、ＬｙｓｏＰＬＡのｍＲＮＡは多くの組織に広く分布しており、心臓、胎盤および骨格筋に最も多く存在し、これに次いで肝臓、膵臓、腎臓、脳および肺に存在している。また別の証拠においては（これにはより多くの組織からのメッセンジャーが含まれる）同様のパターンが観察されたが、いくつかの組織についての相対強度は変化しており、胎盤および精巣がｈＬｙｓｏＰＬＡの最も多い源であり、副腎および唾液腺、肝臓、心臓、骨格筋、および気管、結腸がこれに次いでいる。リゾホスホリパーゼは多くのアイソフォームで存在していることも報告されている。
【００３１】
本発明における使用に適していると思われるＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤の代表的な例としては、エチルオクチルホスホノフルオリデート、イソプロピルドデシルホスホノフルオリデート、ｎ−ドデシル−ベンゾジオキサホスホリン−２−オキシド、パルミトイルカルニチン、ブロモエノールラクトン、パルミチルトリフルオロメチルケトン、およびメチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）が挙げられる。他の阻害剤は、当技術で既知のアッセイ方法を用いて同定することができる。特許文献１７を参照されたい。
【００３２】
ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤は、生物学的試料中に存在すると思われる種々の内在性タンパク質、たとえばグレリン、および生物活性のために脂肪族エステル基を必要とするその他のタンパク質およびペプチドを安定化するために有効な量で採取デバイス中に存在する。したがって、採取デバイスは、糖尿病等の代謝性疾患のマーカーであるグレリンだけでなく、その他のニューロペプチドの安定化をもたらす。ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤は、脂肪族エステル基の切断を阻害することによって機能する。採血デバイス中に含まれるべきＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤の量の決定は、有効性、水溶性、採血デバイスの容量、ならびに非特異的相互作用（たとえば血中の血清アルブミン等の他のタンパク質の存在による）の性質および程度等のいくつかの要因に依存する。したがって、本発明の目的には、ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤の量（および存在し得るさらなる安定剤の量）は、濃度範囲（阻害剤の実際の量がそれから容易に計算できる）の観点において、より便利に表現される。ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤の濃度は一般に約０．１μＭから約１０ｍＭ、いくつかの実施形態においては約１０ｕＭから約１ｍＭ、またいくつかの実施形態においては約１００ｕＭから約１ｍＭ（即ち１，０００，０００ｎＭ）の範囲である。これらの範囲内の全ての小範囲も意図される。本明細書において開示する全ての濃度値に関連して用いる用語「約」は変動幅（プラス／マイナス値）５０％を意味する。
【００３３】
理論に縛られる意図はないが、ＬｙｓｏＰＬＡによる切断からの脂肪族エステル基の保護において、血中に通常見られる内因性プロテアーゼがペプチドのアミノ酸鎖を分解するのを立体的に妨げるので、ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤は二重の利益をもたらすと、本発明者らは考える。被分析物の性質、アッセイフォーマットおよび作業手順（即ち収集した血液試料の分析前の取扱いおよび保存）等の要因に応じて、本発明の採血デバイスはＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤を含まない同様のデバイスよりも数時間または１日もしくは複数日も長く、グレリン等の生化学的マーカーの安定性を提供することができる。
【００３４】
いくつかの実施形態においては、本発明の採血容器はエステラーゼ、たとえばブチルコリンエステラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ等のカルボキシエステラーゼの阻害剤等の、少なくとも１つのさらなる安定剤を含んでもよい。これらの安定剤は、生物活性のために脂肪族エステル基を必要とするタンパク質およびペプチドの、エクスビボ分解からのさらなる保護を提供し得る。したがって、糖尿病等の代謝性疾患のマーカーであるグレリンだけでなく、エステラーゼ阻害剤はその他のニューロペプチドの安定化の強化をもたらす。しかし、いくつかの実施形態においては、安定剤（および全体としてのデバイス）はエステラーゼ阻害剤を含まない。
【００３５】
ブチルコリンエステラーゼ（ＢＣｈＥ）（Ｅ．Ｃ．３．１．１．８）は、血清または血漿コリンエステラーゼとしても知られているが、コカインならびにスクシニルコリンおよびアスピリン等の他の薬剤を代謝する身体の能力において役割を果たしていると考えられる。非特許文献１２を参照されたい。ＢＣｈＥは正常にはヒト血漿中に約５ｍｇ／ｌ（即ち約５Ｕ／ｍｌ）の量で存在する。本発明において有用なＢＣｈＥ阻害剤は、約０．５μＭ（５００ｎＭ）以下のＫｉ値、いくつかの実施形態においては約０．０５μＭ（５０ｎＭ）以下のＫｉ、さらなる実施形態においては約０．０１０μＭ（１０ｎＭ）以下のＫｉ（およびその中の全ての小範囲を含む）を有する。Ｋｉは（分子量、融点および沸点等の物理的特性とは対照的に）動的変数であり、したがって、特にこの値を決定するために用いられる方法に応じて、比較的広く変動し得る。したがって、Ｋｉ値に関して本明細書において用いられる用語「約」は変動幅（即ちプラス／マイナス値）５０％を意味する。
【００３６】
本発明において有用なＢＣｈＥ阻害剤は、タクリンとしても知られている化合物９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン（およびその誘導体）である。特許文献１８を参照されたい。タクリンは、アルツハイマー病の治療用としてＦＤＡによって認可されている中枢作用性コリンエステラーゼ阻害剤である。これはＣＯＧＮＥＸの商品名でＳｃｉｅｌｅ  Ｐｈａｒｍａ社から市販されている。本発明における使用に適していると思われるタクリン誘導体の代表的な例は、以下の式：
【００３７】
【化１】
0005844826.tif 000002
【００３８】
（式中、ｎは１、２または３であり；Ｘは水素、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、トリフルオロメチル、ＮＨＣＯＲ２であり、Ｒ２は低級アルキル、またはＮＲ３Ｒ４であってＲ３およびＲ４は独立に水素または低級アルキルであり；Ｒは水素または低級アルキルであり；Ｒ１は水素、低級アルキル、ジ低級アルキルアミノ低級アルキル、アリール低級アルキル、ジアリール低級アルキル、フリル低級アルキル、チエニル低級アルキル、酸素架橋アリール低級アルキル、酸素架橋ジアリール低級アルキル、酸素架橋フリル低級アルキルまたは酸素架橋チエニル低級アルキルであり；ＹはＣ＝ＯまたはＣＲ５ＯＨであってＲ５は水素または低級アルキルであり；ＺはＣＨ２またはＣ＝ＣＲ６Ｒ７であってＲ６およびＲ７は独立に水素または低級アルキルであり；またはＹおよびＺは一緒にＣＲ５＝ＣＨであってＣＲ５およびＣＨはそれぞれＹおよびＺに対応する）、その光学的対掌体、またはその薬学的に許容される酸付加塩に示されるように、特許文献１９に教示されている。
【００３９】
この式に包含される具体的なタクリン誘導体としては、以下
９−アミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−メトキシアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−フルオロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−６−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−７−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−７−ニトロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；７，９−ジアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；Ｎ−［９−アミノ−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−オキソアクリジン−７−イル］アセトアミド；３，４−ジヒドロ−９−メチルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−メチルアミノ−７−ニトロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−プロピルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−メチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−フルオロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−６−クロロ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−ベンジルアミノ−３，４−ジヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−メチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−メトキシベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；６−クロロ−３，４−ジヒドロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（２−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（３−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−（４−クロロベンジルアミノ）−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノ］アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−６−フルオロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−フェネチルアミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４，４−ジフェニルブチル）アミノアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（４，４−ジフェニルブチルアミノ）−６−トリフルオロメチルアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４，４−ビス（３−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−（３−フェノキシプロピルアミノ）アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［２−［ビス（４−フルオロフェニル）メトキシ］エチルアミノ−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−［４−（ベンジルオキシ）ベンジルアミノ］−３，４−ジヒドロアクリジン−１（２Ｈ）−オン；３，４−ジヒドロ−９−［（２−チエニル）メチルアミノ］アクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−２，３−ジヒドロ−シクロペンタ［ｂ］キノリン−１−オン；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−７−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−メトキシ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１−オール；９−メチルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−プロピルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−６−クロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−ベンジルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−６−トリフルオロメチルアクリジン−１−オール；９−（２−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−メチルベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−メトキシベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；６−クロロ−９−（４−フルオロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（２−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４−クロロベンジルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジル）アミノアクリジン−１−オール；６−フルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（２−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（３−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；１，２，３，４−テトラヒドロ−９−（４−トリフルオロメチルベンジルアミノ）アクリジン−１−オール；９−［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロベンジル）アミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−フェネチルアミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（４，４−ジフェニルブチル）アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４，４−ビス（３−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４，４−ビス（４−フルオロフェニル）ブチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−（３−フェノキシプロピルアミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［［２−［ビス（４−フルオロフェニル）メトキシ］エチル］アミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［４−（ベンジルオキシ）ベンジルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−［（２−チエニル）メチルアミノ］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−３，４−ジヒドロアクリジン；９−アミノ−１−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−１−オール；９−アミノ−３，４−ジヒドロ−２−メチレンアクリジン−１（２Ｈ）−オン；９−アミノ−１，２，３，４−テトラヒドロ−シクロペンタ［ｂ］キノリン−１−オール；２−（３−オキソクロヘキセン−１−イル）アミノベンゾニトリル；および４−クロロ−２−（３−オキソシクロヘキセン−１−イル）アミノベンゾニトリル
が挙げられる。
【００４０】
本発明における使用に適していると思われるその他のブチリルコリンエステラーゼ阻害剤としては、エトプロパジン（即ちＮ，Ｎ，Ｎ−ジエチル−α−メチル−１０Ｈ−フェノチアジン−１０−エタンアミン；１０−（２−ジエチルアミノ−２−メチルエチル）フェノチアジン；またはフェノプロパジン）、およびそれらの誘導体等のタクリンダイマー（ｄｉｍｍｅｒ）が挙げられる。たとえば特許文献２０および特許文献２１を参照されたい。エトプロパジン塩酸塩は、パーキンソン病の治療での使用がＦＤＡによって認可されている。
【００４１】
さらに他のブチリルコリンエステラーゼ阻害剤としては、タクリンと（−）−フペルジンＡ（これは、コスギラン科（Ｈｕｐｅｒｚｉａｃｅａｅ）ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）の種ヒカゲノカズラ、トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）から分離される鏡像異性のリコジンアルカロイドである）とのハイブリッドが挙げられる。フペルジンＡ−タクリンハイブリッドの例は当技術で化合物５ａ、５ｂおよび５ｃならびにフプリンＸとして知られている。それらに対応する化学名は以下の通りである。
（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン）（５ａ）；（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン）（５ｂ）；（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチルアミノ）−９−エチリデン−３−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボン酸メチルエステル）（５ｃ）；および（１Ｓ）−７−クロロ−１５−エチル−１０−アザテトラシクロ［１１．３．１．０２，１１．０４，９］ヘプタデカ−２（１１），３，５，７，９，１４−ヘキサエン−３−アミン）（フプリンＸ）。これらの化合物を合成する方法は非特許文献１３（５ａ、５ｂおよび５ｃ）および非特許文献１４（フプリンＸ）に開示されている。
【００４２】
ＢＣｈＥの濃度は一般に約５μＭから約５００ｍＭ（即ち５×１０８ｎＭ）の範囲であり、いくつかの実施形態においては約０．５μＭから約５０ｍＭ、さらに他の実施形態においては約０．１μＭから約１０ｍＭの範囲である。これらの範囲内の全ての小範囲も意図される。Ｋｉ値の場合と同様に、本明細書において開示する全ての濃度値に関連して用いる用語「約」は変動幅（プラス／マイナス値）５０％を意味する。
【００４３】
安定剤はまた、別の種類の血清エステラーゼ阻害剤、具体的には別のＢ−エステラーゼ（その中にＢＣｈＥが含まれる）阻害剤を含んでもよい。これらのエステラーゼとしてはアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）（ＥＣ３．１．１．７）および非特異的カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）が挙げられる。ＡＣｈＥ阻害剤はコリンエステラーゼに作用し、体内で神経伝達物質として機能するアセチルコリンをコリンエステラーゼが分解するのを阻害する。タクリンおよびフペルジンＡ（ｈｕｐｅｒａｚｉｎｅ  Ａ）等のいくつかのＢＣｈＥ阻害剤も、アセチルコリンエステラーゼを阻害することが知られている。タクリンのＡＣｈＥに対するＫｉの報告された値は６．９ｎＭである（非特許文献１５）。フペルジンＡのＡＣｈＥに対するＫｉの報告された値は４７ｎＭである（非特許文献１３）。ＢＣｈＥがヒト血清中の全エステラーゼ活性のかなりの部分を占めている（即ち、ＡＣｈＥの０．００８ｍｇ／Ｌに対してＢＣｈＥは約５ｍｇ／Ｌ）ことを考慮すれば、採血管中に阻害剤を入れることは任意である。
【００４４】
本発明における使用に適したＡＣｈＥ阻害剤のＫｉは、典型的には約５００ｎＭ以下、他の実施形態においては約４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭまたは１０ｎＭ未満である。本明細書に開示するように、所与のＡＣｈＥ阻害剤に対するＫｉ値は標準的なアッセイ手法に従って決定することができる。
【００４５】
したがって、本発明において有用と思われる他のＡＣｈＥ阻害剤としては以下のものが挙げられる。フプリンＸ（（１Ｓ）−７−クロロ−１５−エチル−１０−アザテトラシクロ［１１．３．１．０２，１１．０４，９］ヘプタデカ−２（１１），３，５，７，９，１４−ヘキサエン−３−アミン）（Ｋｉ０．０２６ｎｍ）；タクリンダイマー４ａ（メチルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ０．０６ｎｍ）；タクリンダイマー４ｄ（２−｛ビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミノ｝エタン−１−オール｜Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−ヒドロキシエチルアミン）（Ｋｉ０．６５ｎｍ）；タクリン誘導体２（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１．０ｎｍ）；タクリンダイマー３ｂ（ホモダイマータクリンアナログ３ｂ｜Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン｜タクリンホモビバレント化合物３ａ）（Ｋｉ１．３ｎｍ）；タクリンダイマー４ｃ（Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−アリルアミン｜プロパ−２−エン−１−イルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ１．６ｎｍ）；タクリンダイマー３ｃ（ホモダイマータクリンアナログ３ｃ｜Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１．９ｎｍ）；タクリジンダイマー４ｂ（Ｎ，Ｎ−ビス［３−［（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］プロピル］−Ｎ−エチルアミン｜エチルビス［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］アミン）（Ｋｉ２．８ｎｍ）；タクリンヘテロビバレント化合物３ｃ（Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ６．０ｎｍ）；フペルジンＡ−タクリンハイブリッド５ｃ（（９Ｅ）−７−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチルアミノ）−９−エチリデン−３−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボン酸メチルエステル｜メチル（１Ｓ）−９−エチリデン−３−メチル−７−｛［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル］アミノ｝ビシクロ［３．３．１］ノナ−３−エン−１−カルボキシレート）（Ｋｉ６．４ｎｍ）；タクリンダイマー４ｊ（Ｎ−メチル−Ｎ−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）−Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］−１，３−プロパンジアミン｜メチル［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］アミン）（Ｋｉ９．１ｎｍ）；フペルジンＡ−タクリンハイブリッド５ｂ（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン｜Ｎ−（７−｛［（１Ｓ）−１−アミノ−９−エチリデン−７−メチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−３−イル］アミノ｝ヘプチル）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１５．７０ｎｍ）；フペルジンＡ−タクリンハイブリッド５ａ（（９Ｅ）−Ｎ１−（７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ヘプチル）−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−１，３−ジアミン｜Ｎ−（７−｛［（１Ｓ）−１−アミノ−９−エチリデン−４，４，７−トリメチルビシクロ［３．３．１］ノナ−６−エン−３−イル］アミノ｝ヘプチル）−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１６．５０ｎｍ）；ＡＰ２２３８（３−（４−｛［ベンジル（メチル）アミノ］メチル｝−フェニル）−６，７−ジメトキシ−２Ｈ−２−クロメノン｜３−（４−｛［ベンジル（メチル）アミノ］メチル｝フェニル）−６，７−ジメトキシ−２Ｈ−クロメン−２−オン）（Ｋｉ２１．７０ｎｍ）；タクリンダイマー４ｉ（Ｎ−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）−Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）オクト−１−イル］アミン｜Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ３０ｎｍ）；タクリンヘテロビバレント化合物３ｇ（６，８−ジクロロ−Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ４１ｎｍ）；タクリンダイマー４ｍ（Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］−Ｎ−［４−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ブチル］アセトミド）（Ｋｉ４７ｎｍ）；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（６−クロロ−２−メトキシアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ４９ｎｍ）；タクリンダイマー４ｋ（Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）プロピル］−Ｎ−［３−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）プロピル］アセタミド）（Ｋｉ５０ｎｍ）；タクリンヘテロビバレント化合物３ｉ（Ｎ−［６−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘキシル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１００ｎｍ）；タクリンホモビバレント化合物３ｂ（６，８−ジクロロ−Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）アミノ］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ１５０ｎｍ）；タクリンダイマー３ａ（Ｎ−［５−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルアミノ）ペンチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ２１０ｎｍ）；タクリンダイマー４ｇ（Ｎ−［８−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）オクチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ２５０ｎｍ）；タクリンヘテロビバレント化合物３ｆ（Ｎ−｛７−［（６，８−ジクロロ−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イル）スルファニル］ヘプチル｝−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン）（Ｋｉ２９０ｎｍ）；１，２−ジオン系化合物、８（１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオン｜１，２−ナフトキノン）（Ｋｉ３２０ｎＭ）；タクリンダイマー４ｆ（Ｎ−［７−（１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−イルスルファニル）ヘプチル］−１，２，３，４−テトラヒドロアクリジン−９−アミン｜タクリンヘテロビバレント化合物３ｅ）（Ｋｉ３４０ｎｍ）；および６，９−ジアミノ−２−エトキシアクリジン（７−エトキシアクリジン−３，９−ジアミン）（Ｋｉ４９０ｎｍ）。上述のＡＣｈＥ阻害剤について本明細書に開示したＫｉ値は、非特許文献１３、非特許文献１６、非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献１５、および非特許文献２０に報告されている。
【００４６】
本発明において有用と思われるＡＣｈＥ阻害剤のさらなる例としては以下のものが挙げられる。有機ホスフェート（たとえばメトリホネート、エコチオフェート、ジイソプロピルフルオロホスフェート、シクロサリン、ジメトエート、サリン、ソマン、タブン、ＶＸ、ＶＥ、ＶＧ、ＶＭ、ダイアジノン、マラチオンおよびパラチオン）；カルバメート（たとえばフィゾスチグミン、ネオスチグミン、ピリドスチグミン、アムベノニウム、デマルカリウム、リバスチグミン、アルジカルブ、ベンジオカルブ、ブフェンカルブ、カルバリール、カルベンダジム、カルベタミド、カルボフラン、クロルブファム、クロロプロファム、エチオフェンカルブ、ホルメタネート、メチオカルブ、メトミル、オキサミル、フェンメジファム、ピンミカルブ、ピリミカルブ、プロパモカルブ、プロファムおよびプロポクスル）；フェナントレン誘導体（たとえばガランタミン）；ピペリジン（たとえばドネペジル（Ｅ２０２０）（Ｋｉ２．９ｎｍ））；エドロホニウム；および天然化合物（たとえばガランタミンおよびオンキダール）。
【００４７】
いくつかのＢＣｈＥ阻害剤は強力なＡＣｈＥ阻害活性をも示すので、本発明の実施形態にはＢＣｈＥとＡＣｈＥの両方の阻害活性を有する単一のエステラーゼ阻害剤が含まれ得る。
【００４８】
採血デバイス中に存在し得るさらなる血清エステラーゼ阻害剤の濃度は、一般に約０．１μＭから約７０ｍＭ、いくつかの実施形態においては約１ｍＭから約７ｍＭの範囲である。
【００４９】
安定剤にはまた、プロテアーゼ阻害剤が含まれ得る。本発明において有用なプロテアーゼ阻害剤は、たとえばセリンプロテアーゼ、エキソペプチダーゼおよびジペプチジルペプチダーゼ等の１種または複数種のプロテアーゼに対する阻害活性を示す。したがって、デバイスには、たとえばセリンプロテアーゼの阻害剤とエキソペプチダーゼの阻害剤、セリンプロテアーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、エキソペプチダーゼの阻害剤とジペプチジルペプチダーゼの阻害剤、ならびにセリンプロテアーゼの阻害剤、エキソペプチダーゼの阻害剤およびジペプチジルペプチダーゼの阻害剤等の２つ以上の阻害剤の混合物が含まれ得る。たとえばＳｔｅｖｅｎｓらに付与された特許文献１を参照されたい。
【００５０】
セリンプロテアーゼ阻害剤の代表的な例としては、アンチペイン、アプロチニン、アンチトロンビン、キモスタチン、ＤＦＰ、エラスタチナール、ＡＰＭＳＦ、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ロイペプチン、トリプシンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられる。セリンプロテアーゼ阻害剤の濃度は一般に約０．１μＭから約１００μＭの範囲である。
【００５１】
本発明において有用と思われるエキソペプチダーゼ阻害剤の代表的な例としては、アマスタチン、ベスタチン、ジプロチンＡおよびジプロチンＢが挙げられる。エキソペプチダーゼ阻害剤の濃度は一般に約０．０１ｍＭから約１ｍＭの範囲である。
【００５２】
循環系中に存在するジペプチジルペプチダーゼの活性（これにはＤＰＰ−ＩＶおよびＤＰＰ−ＩＶ様活性が含まれる）は、ペプチド基質のＮ末端配列の末端から２番目の位置にプロリンまたはアラニンを有する生物活性ペプチドのＮ末端からのジペプチドの放出に高度に特異的である。膵臓からのグルコース誘起性インスリン分泌を促進するグルコース依存的インスリン分泌性ポリペプチド（インクレチン）であるＧＩＰ１−４２およびＧＬＰ−１７−３６はＤＰＰ−ＩＶの基質である。ＤＰＰ−ＩＶ酵素によって、インビトロおよびインビボの両方において、これらのペプチドのＮ末端からジペプチド、チロシニル−アラニンおよびヒスチジル−アラニンがそれぞれ放出される。非特許文献２１。本発明において有用と思われるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）の阻害剤の代表的な例としては、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチンおよびアログリプチンが挙げられる。その他のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤としては、イソロイシン、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、およびＶａｌ等のアミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から生成するジペプチド化合物、ならびにそのＬ−スレオおよびＬ−アロ形等の立体異性体、ならびにその無機および有機塩（たとえばリン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩およびフマル酸塩）が挙げられる。ジペプチド化合物の具体的な例としては、Ｌ−スレオ−イソロイシルチアゾリジド、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジド、Ｌ−スレオ−イソロイシルピロリジド、およびＬ−アロ−イソロイシルピロリジドが挙げられる。ジペプチジルペプチダーゼ阻害剤の濃度は、一般に約０．０１ｍＭから約１ｍＭの範囲である。
【００５３】
安定剤は他の種のプロテアーゼの阻害剤をさらに含み得る。したがって、さらなる実施形態においては、採血デバイスには、システインプロテアーゼの阻害剤（たとえばＩＡＡ（インドール酢酸）およびＥ−６４）、セリン／システインプロテアーゼの阻害剤（たとえばロイペプチン、ＴＰＣＫ、ＰＬＣＫ−ＨＣＬ、２−ヘプタノン−ＨＣＬ、およびアンチペイン−ＨＣｌ）、アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤（たとえばペプスタチン、およびＶｄＬＰＦＦＶｄＬ）、メタロプロテアーゼの阻害剤（たとえばＥＤＴＡ、ベスタチン、１，１０−フェナンスロリンおよびホスホラモドン）、チオールプロテアーゼ、アスパラギン酸／カルパインプロテアーゼの阻害剤（たとえばペプスタチン、Ｎ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−ノルロイシナールおよびＮ−アセチル−ｌｅｕ−ｌｅｕ−メチオニナール）、カスパーゼ、エンドペプチダーゼの阻害剤（たとえばα２−マクログロブリン（ユニバーサルエンドペプチダーゼ阻害剤と称される）、α１−アンチトリプシンおよびチオルファン）、およびそれらの２つ以上の組み合わせも含まれ得る。プロテアーゼ阻害剤のさらなる例としては、大豆またはリママメトリプシン阻害剤、膵臓プロテアーゼ阻害剤、卵白オボスタチンおよび卵白シスタチンが挙げられる。プロテオミクスの分野の当業者には、所与の阻害剤が同じ種類のプロテアーゼの中の１つまたは複数のプロテアーゼに対する阻害活性と同じく、異なった種類のプロテアーゼの中の１つまたは複数のプロテアーゼに対する阻害活性を示し得ることが認識される。たとえばベスタチンおよびアマスタチンはメタロプロテアーゼと同じくエキソプロテアーゼに対する阻害活性を示す。
【００５４】
複数の安定剤を用いる、たとえば、ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤に加えてプロテアーゼ阻害剤、またはＢＣｈＥ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を用いる本発明の実施形態はまた、本明細書において安定剤の混合物と称される。
【００５５】
安定剤は液体（たとえば溶液および懸濁液）および固体（たとえばペレット、錠剤、カプセル、噴霧乾燥材料、フリーズドライ材料、粉末、粒子、結晶および凍結乾燥材料）ならびに半固体（たとえばゲル）等の任意の適切な形態で存在し得る。凍結乾燥は安定性を向上させ（たとえば安定剤の保存寿命の最大化の観点で）、また引き続く滅菌も可能になることから、特に有用であり得る。たとえば安定剤はデバイスの容器中に液体組成物の形態で導入され、次いで標準の手法により凍結乾燥され得る。凍結乾燥はたとえば液体組成物を凍結するステップを伴い、次いで凍結後にゆっくりと加温すると同時に真空にすることによって、フリーズドライされた粉末が採取デバイス中に残る。安定剤のペレット化および血液との接触による凍結乾燥試薬の再構成を容易にするために、フリーズドライに先立ってＰＶＰまたはトレハロース等の種々の添加物を液体組成物に加えてもよい。液体組成物を添加した後に真空乾燥を用いてもよい。他の実施形態においては、安定剤を液体または固体エアロゾルに形成し、容器の１つまたは複数の内部表面に噴霧する。安定剤をカプセル化または製剤化して錠剤の形態にすることによって、これを光への曝露から保護し、阻害剤と容器中の他の成分との間の他の望ましくない相互作用を防止することができる。試料採取時に溶解する錠剤およびカプセルを作成する際に有用なカプセル化剤および賦形剤は、当技術で公知である。
【００５６】
リザーバーへの配置の他に、安定剤は採取した血液と接触する採取デバイスの任意の表面の上に位置してよい。たとえば、安定剤はデバイスを閉鎖するためのストッパーおよびシールの上、またはデバイス内に設置される機械的もしくは他の挿入物の上に位置してもよい。
【００５７】
安定剤の他に、本発明のデバイスは、キャリア媒体（たとえば水またはアルコール）、安定化または再溶解媒体（たとえばポリビニルピロリドン、トレハロース、マンニトール、その他）および／または生物学的試料を処理するための１つまたは複数のその他の添加物を含んでもよい。典型的な添加物としては、フェノール、フェノール／クロロホルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸の塩、ハロゲンのアルカリ金属塩、有機キレート化剤、蛍光染料、抗体、結合剤、クエン酸ナトリウム、ヘパリン、ＥＤＴＡおよびその塩（たとえばＥＤＴＡカリウム）等の抗凝固剤、抗酸化剤、還元剤ならびに緩衝剤が挙げられる。好ましくは、キャリアおよび添加物はタンパク質を分解しない。阻害剤が錠剤の形態である場合には、当業者には公知の医薬錠剤崩壊剤を必要に応じて含ませてもよい。
【００５８】
本発明のデバイスに有用な製造プロセスには、チューブ等の採取容器を得るステップ；安定剤（たとえばＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤）を容器に加えるステップ；阻害剤を凍結乾燥するステップ；容器を真空にするステップ；および容器を滅菌するステップが含まれる。必要に応じて分離部材を容器に加えてもよい。好適な凍結乾燥／真空プロセスの例は下記の通りである。容器を温度約−４０℃、圧力約７６０ｍｍで約６から８時間凍結する；圧力約０．０５ｍｍ、約８から１０時間で温度を−４０℃から約２５℃に上昇させて容器を乾燥する；次いで容器を温度約２５℃、圧力約１２０ｍｍで約０．１時間、真空にする。好ましくは、滅菌手法をコバルト６０の照射で行なう。
【００５９】
全血またはその成分（単数または複数）は、介在するプロセスステップなしに患者から直接採血デバイス中に吸引され得る。全血を患者から直接採取し、安定剤を含むデバイス中に試料を直接導入することによって、そうでなければ試料を安定剤と混合する前に保存する場合に起こるタンパク質の分解および／または断片化を実質的に防止できることが見出された。本発明の方法は、開放採取デバイスおよび開口部が閉鎖手段によって閉鎖される閉鎖採取デバイスの両方において有用である。
【００６０】
好ましい実施形態においては、採取デバイスは、採取時点で直ちにタンパク質を安定化させるため、全血試料を患者から直接吸引するために用いられるチューブである。採取チューブは血液を採取するための真空システムであってよい。あるいは、チューブは血液を採取するための部分真空システムまたは非真空システムであってよい。真空システムの好適な例は閉鎖チューブである。手動によるシリンジ吸引は部分真空システムおよび非真空システムの両方の好適な例である。非真空システムには自動吸引システムも含まれる。真空システムが特に好ましい。
【００６１】
本発明の採血デバイスは、脂肪族エステル側鎖を含むグレリン等のタンパク質、およびプロテアーゼ阻害剤を含む実施形態においては疾患のさらなるタンパク質バイオマーカー、たとえば、これらも糖尿病等の代謝性疾患のバイオマーカーであるＧＬＰ−１、ＧＩＰおよびグルカゴンを安定化するために特に適している。したがって、採取デバイスは、健常者ならびに治療レベルにおけるこれらのタンパク質の循環レベルが含まれる１０−９〜１０−１１Ｍの範囲でのこれらのタンパク質の検出を可能にするＥＬＩＳＡ等のアッセイの設計を容易にする、信頼できる標準を提供するために用いることができる。したがって、代謝性疾患等の疾患を診断する方法（この方法において対照（健常ドナーの統計的に有意な母集団から得られた確立された医学的基準および／または濃度範囲等）に比べて上昇したマーカーレベルは疾患の存在の指標となる）に加えて、これらのタンパク質の量の正常化（または正常化への傾向）が治療の成功の指標となる、代謝性疾患等の疾患に罹患した患者における治療をモニターするための方法が、これらのデバイスによって可能になる。
【００６２】
本発明の採血デバイスは、治療目的のため、たとえば疾患または炎症性状態の治療計画の一部として、アシル化されたプロドラッグ（本明細書においては脂肪族エステル側鎖を有するプロドラッグとも称する）を摂取している患者から血液を採取し、保存する目的のためにも用いられ得る。プロドラッグは一般に治療用として不活性な、もしくは薬剤の活性部分（これは代謝物である場合もある）よりも有意に活性が低い薬剤の実質的な前駆形態である活性薬剤を意味すると理解される。経口摂取等の投与により、多くのプロドラッグは内因性リゾホスホリパーゼによるエステル結合の切断によって活性薬剤／代謝物に変換される。たとえば、エナラプリルは活性代謝物であるエナラプリラートに変換され、プロドラッグであるバラシクロビルは活性薬剤／代謝物であるアシクロビルに変換される。ヘロインは脱アセチル化されて活性薬剤／代謝物であるモルフィンになる。臨床的状況において、また特に臨床試験において、たとえば安全性、有効性、生物活性および生物学的同等性の１つまたは複数の観点から、患者におけるプロドラッグならびに活性代謝物の血中レベルを経時的にモニターすることは有利である。
【００６３】
たとえば、医薬品から活性成分または活性部分が吸収され、作用部位において利用できるようになる速度および程度を測定する生物活性の研究において、親薬剤および代謝物の両方の濃度および活性を決定することが望ましい。生物学的同等性の研究（これは薬学的同等物または代替物が同様な条件において同一のモル用量で投与された場合に、薬剤の作用部位においてその成分または活性部分が利用できるようになる速度および程度における相違の程度を研究するものである）においては、親形態（プロドラッグ）の測定が一般には望ましい（親薬剤のレベルが低すぎて、適切な時間での血液、血清または血漿中における信頼できる分析測定ができない場合、または代謝物が有意に安全性および／または有効性に寄与する場合を除く。これらの場合にはプロドラッグおよび代謝物の両方の濃度および活性が測定される）。
【００６４】
そのような治療を受けた患者（現在そのような治療を受けている患者を含む）から本発明の採血デバイスを用いて採取した血液を定性的または定量的に分析することにより、そのような分析のいずれにおいても精度を高めることができる。それは採取した血液中のプロドラッグのエクスビボにおけるエステラーゼに触媒される分解が保存中に阻害されるからである。血液試料の処理、たとえば採取した血液からの血漿の抽出、ならびにプロドラッグおよび活性代謝物の分離、ならびにこれらの対象物の引き続く測定は、標準的手法に従って行なうことができる。たとえば、プロドラッグおよび活性代謝物は逆相ＨＰＬＣによって分離することができる。プロドラッグおよび活性代謝物の存在または相対量の検出は、マススペクトロメトリーおよび引き続く結果の解析、たとえば加重二次方程式または線形回帰等の標準的手法に従って行なうことができる。非特許文献２２（およびそこに引用されている参考文献）を参照されたい。測定値と比較すべき対照には、較正および品質管理用試料が含まれる（較正曲線として非特許文献２２を参照）。
【００６５】
ここで以下の非限定的実施例を参照して本発明を説明する。他に言明しない限り、全ての部およびパーセントは重量基準である。
【実施例１】
【００６６】
血漿試料中におけるグレリンの安定性の比較
【００６７】
１）ＬｙｓｏＰＬＡ阻害剤であるメチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）、ＥＤＴＡ、エステラーゼ阻害剤であるタクリン、ならびにプロテアーゼ阻害剤であるＬ−スレオ−イソロイシルチアゾリジド、ベスタチンおよびロイペプチン（図に黒三角で示す本発明の安定剤「ＩＳＡ」）；２）抗凝固剤ＥＤＴＡおよびＭＡＦＰを含む本発明の別の安定剤（図にｘで示す）；３）ＥＤＴＡおよびエステラーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤（図に黒菱形で示す比較の安定剤「ＣＳＡ」）；および４）ＥＤＴＡ単独（図に黒正方形で示す）を含む４本の別々のチューブに血液を採取し、次いで１ｐｇ／ｕＬのアシル−グレリンを添加した。４本のチューブの全ては本実験のために同一の対象者から間接的に採取し、同様に処理した。図２に示すデータに、チューブ３およびチューブ４においてアシル−グレリンが経時的に分解したことが明確に示される。しかしＭＡＦＰを含む２本のチューブ（Ｎｏ．１およびＮｏ．２）は３０時間の血漿インキュベーション時間にわたる安定化を示した。ＭＡＦＰおよびＥＤＴＡを含むチューブ２は、エステラーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤を含むチューブ１よりも優れた性能を示した。
【００６８】
別の実験において、空腹の対象者から血液をＥＤＴＡおよびＥＤＴＡ＋ＭＡＦＰに採取した。この実験におけるチューブ中の最終ＭＡＦＰ濃度は０．１ｍＭであった。それぞれのチューブから２本の別々のバイアルに血漿を分離した。一方のバイアルには１ｐｇ／ｕＬのグレリンを添加し、他方のバイアルには添加しなかった。ＥＤＴＡおよびＥＤＴＡ＋ＭＡＦＰからのグレリン添加および非添加血漿を室温で３０時間にわたりインキュベートした。図３に、特定の時間間隔で測定したグレリン濃度を示す。データから、ＭＡＦＰを含むチューブにおいてアシル−グレリンの安定性がより高いことが明確に示されている。
【００６９】
全ての特許出版物および非特許出版物は、本発明が関連する当業者の技能のレベルの指標である。これらの出版物の全ては、それぞれの個別の出版物が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
本明細書において本発明を特定の実施形態を参照して説明したが、これらの実施形態は単に本発明の原理および応用を示すのみであることを理解されたい。
したがって、説明した実施形態に数多くの改変が可能であること、および添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなしに他の配置を考案できることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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