(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子の共有結合固定化の方法であって、
ａ．−ＳＨ基を含む表面を準備するステップと、
ｂ．少なくとも１つの貴金属イオンの存在下で酸化還元反応により−ＳＨ基を含む表面を酸化するステップと
ｃ．前記表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させて、前記表面への前記少なくとも１つの分子の共有結合を得るステップと
の順次的なステップを含み、前記少なくとも１つのアミノ基が前記共有結合を得るステップに関与する上記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの貴金属イオンがＡｕ及びＰｔからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化還元反応が前記表面上の少なくとも１つの官能基を生じさせ、前記少なくとも１つの官能基がチオール、ジスルフィド、チオスルフィネート基及びチオスルホネート基からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記表面上の前記官能基が前記貴金属イオンと反応する、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酸化還元反応を用いて前記表面を酸化するステップの前に−ＳＨ基の少なくとも一部を互いに反応させる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
酸化還元反応を用いて前記表面を酸化するステップの前にすべての−ＳＨ基を互いに反応させる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子が、炭素原子を含む分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体及びアプタマーからなる群から選択される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子が、タンパク質及び抗体からなる群から選択される少なくとも１つの分子である、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酸化還元反応を水溶液中で実施する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸化還元反応を2種以上の溶媒の混合液中で実施する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記表面を前記少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させるステップを水溶液中で実施する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記表面を前記少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させるステップを溶媒の混合液中で実施する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
１５℃〜３００℃の温度で実施される、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記酸化還元反応が電気酸化を含み、前記電気酸化が０．５〜３Ｖの電位を用いて実施される、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酸化還元反応が電気酸化を含み、前記電気酸化が１秒から１０分までの期間中に実施される、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記表面と前記少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子との接触が１０分から１０時間までの期間中に実施される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面上の官能基を得るために前記表面を誘導体化に供し、前記官能基が−ＳＨ基及び−ＳＳ−基からなる群から選択される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と後に共有結合するために、−ＳＨ基を含む表面上で貴金属イオンの存在下に酸化還元反応を実施して、アミノ基と反応性で共有結合を形成し得る硫黄-金属イオンコンプレックス又はクラスターを形成する、−ＳＨ基を含む表面を修飾する方法。
【請求項１９】
貴金属イオンの存在下での酸化還元反応により生成される表面結合チオスルフィネート及び表面結合チオスルホネートの少なくとも１つと、アミノ基とを共有結合させる、少なくとも１つのアミノ基を含む分子を固定化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に少なくとも１つのアミノ基を含む分子の共有結合固定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面上の分子の共有結合固定化のための技術は、表面科学において決定的に重要である。例えば、固定化酵素は、反応において固定化酵素が全く溶解しないか又は極めて少量の固定化酵素のみが溶解することを含む多くの利点を有する。完結時に、反応混合物は、一般的に溶媒及び反応生成物のみを含む。固定化酵素は、反応物から容易に除去され、リサイクルすることが容易となる。
【０００３】
例は、触媒反応、バイオセンサー、マイクロコンタクトプリンティング、クロマトグラフィー、及び分析装置などの分野を含むが、これらに限定されない。例えば、シラノール化学、クリック化学及び生体分子の固定化のために１つの一般的に用いられている方法、いわゆるＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）法に基づくいくつかの固定化技術が今日利用可能である。それらのすべての技術の欠点は、固定化分子と表面との間の不安定な結合、高価な有毒化学物質又は表面への反応性構造の導入時の有機溶媒に関する必要条件などである。
【０００４】
今日最も使用されている技術は、いわゆるＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）カップリング法である。この技術のいくつかの短所のうちの１つは、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋにより記載された。後者の著者によれば、この方法は、特に、一点結合分子について不安定な結合をもたらすことが公知である。例えば、この方法により固定化されたアラニンの５０％が４０日で失われ得ることが報告された（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１巻、２２９１頁、１９７２年）。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６巻、２１５５頁、１９８７年におけるＷｉｌｃｈｅｋらによれば、ＮＨＳエステル（すなわちＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミド）を調製するための標準的な方法は、ヒドロキシル基も含むポリマー上の不安定な固定化化合物の形成をもたらす。この現象は、不安定な結合をもたらす、ヒドロキシ含有ポリマーに結合しているｐ−アラニン誘導体の形成に起因する。
【０００５】
ＮＨＳ法の他の短所は、アラニン又はＩｇＧなどの分子の共有結合固定化に用いられるエステル結合が水性媒体中でエステルの加水分解と競合すること、及びジオキサンの使用を含む、この最終的なエステル結合の調製のためのいくつかのステップにおいて無水条件を用いなければならないことなどである。この方法におけるステップ１は、マトリックスへのジアミン（３’，３−ジアミノジプロピルカルボジイミド）の固定化であり、その後、ステップ２における、次のステップ３のために無水条件を作り出すことができるようにジオキサンによる集中的な洗浄が続く。ステップ３において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがマトリックス及び３’，３−ジアミノジプロピルアミンと一緒に加えられ、これがジオキサン中で表面上の導入されたアミン基と反応する。
【０００６】
ＮＨＳ法の代替法が存在するが、反応条件は、有機溶媒及び高価な化学物質の使用を含む。
【０００７】
Ｐａｖｌｏｖｉｃらは、エレクトロコンタクトプリンティングを用いて、チオールのチオールスルフィネートへの部位選択的酸化によりチオール基含有平坦ケイ素表面上にタンパク質をパターンで固定化した（Ｎａｎｏｌｅｔｔｅｒｓ、３巻、６号、７７９〜７８１頁、２００３年）。
【０００８】
国際公開第２００９／０７４６９２号は、電気酸化を含む湾曲表面を部分的に誘導体化する方法を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術の短所の少なくとも一部を軽減し、少なくとも１つのアミノ基を含む分子の固定化の改善された方法を提供し、そのような固定化分子を含む物体を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子の共有結合固定化の方法であって、
ａ．−ＳＨ基を含む表面を準備するステップと、
ｂ．少なくとも１つの貴金属イオンの存在下で酸化還元反応により−ＳＨ基を含む表面を酸化するステップと
ｃ．表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させて、表面への少なくとも１つの分子の共有結合を得るステップと
の順次的なステップを含み、前記少なくとも１つのアミノ基が前記共有結合を得るステップに関与する上記方法を提供する。
【００１１】
第２の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子が表面に共有結合しており、少なくとも１つの分子が上述の方法により表面上に固定化されている、少なくとも１つの表面を含む物体を提供する。
【００１２】
発明者らは、広範な研究を行い、Ａｕイオン又はＰｔイオンなどの貴金属イオンの存在下での表面上のチオール基を含む酸化還元反応により形成する基が、分子上のチオール及びアミノ基に関する次のステップにおいて反応性である硫黄−Ａｕクラスター又は硫黄−Ｐｔクラスターの形成をもたらすことを見いだした。
【００１３】
本発明の長所は、分子上にチオール基を導入するための特別なステップをなくすことができ、すべての反応ステップを水溶液中で実施することができるので、分子の固定化のためのより汎用的な技術であることなどである。
【００１４】
さらなる長所は、すべてのステップを室温（約２０〜２５℃）で実施することができることである。
【００１５】
他の長所は、表面上の基及びアミノ基を含む酸化還元反応中に形成される共有結合が一点結合分子についてさえ安定であることである。
【００１６】
さらに他の長所は、非常に少ないステップを用いて方法を実施することができることである。チオール基が最初から表面上で利用できる場合、方法は１段階法である。該方法は、従来技術による方法と比較して実施するのに容易である。
【００１７】
さらなる長所は、用いる化学物質が従来技術比較して安価であり、毒性が少ないことである。
【００１８】
酸化還元法は、迅速であり、数秒でナノクラスターの形成をもたらす。
【００１９】
以下の図面を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】表面上の−ＳＨ含有分子を電気酸化する実施形態を示す図である。
【００２１】
【図２】磁気ビーズの電気酸化の１つの実施形態に用いる器具一式を示す図である。磁気ビーズは、電極の下に取り付けられた永久磁石を用いることにより作用電極（Ｗ）に引き付けられる。電位は、作用電極と対電極（Ｃ）との間の電流も測定するポテンシオスタットを用いて作用電極と参照電極（Ｒ）との間に印加する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明を開示し、詳細に説明する前に、本発明は、本明細書で開示する特定の化合物、構成、方法ステップ、基材及び材料に限定されないことを理解すべきである。その理由は、そのような化合物、構成、方法ステップ、基材及び材料は、多少変化し得るからである。本明細書で用いる用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のために用いるものであって、限定的であるものでないということも理解すべきである。その理由は、本明細書の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれと同等のものによってのみ限定されるからである。
【００２３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いているように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が他の状態に明らかに示されない限り、複数の指示物を含むことに注意しなければならない。
【００２４】
他に何も定義されていない場合、本明細書で用いるいずれの用語及び科学術語も、本発明が属する技術分野の技術者により一般的に理解されている意味を有するものとする。
【００２５】
説明及び特許請求の範囲全体を通して数値に関連して用いる「約」という語は、当業者によく知られ、容認されている正確さの区間を意味する。前記区間は、±１０％である。
【００２６】
特許請求の範囲及び説明全体を通して用いているように、分子に関連する「固定化」という用語は、物質への結合を意味する。本発明は、基材への分子の共有結合に関する。
【００２７】
特許請求の範囲及び説明全体を通して用いているように、「電気酸化」という用語は、印加外部電位又は電流による酸化を意味する。
【００２８】
少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子の固定化の方法であって、ａ）−ＳＨ基を含む表面を準備するステップと、ｂ）−ＳＨ基を含む表面へのＡｕイオン又はＰｔイオンなどの貴金属イオンの存在下で−ＳＨ基を含む表面を酸化するステップと、ｃ）表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させて、表面への少なくとも１つの分子の共有結合を得るステップとの順次的なステップを含み、前記少なくとも１つのアミノ基が前記共有結合を得るステップに関与する上記方法を提供する。
【００２９】
一実施形態において、−ＳＨ基を含む表面を出発として用い、代替実施形態において、−ＳＨ基を表面上に導入する。
【００３０】
一実施形態において、酸化は、電気酸化を含む。
【００３１】
酸化後、表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させる。それにより、少なくとも１つの分子が表面に共有結合するように、少なくとも１つの分子上のアミノ基が反応し、表面への共有結合を形成する。
【００３２】
第２の実施形態において、−ＳＨ基を含む表面を出発として用い、代替実施形態において、−ＳＨ基を表面上に導入する。表面をその後、電気酸化による処理に供する。電気酸化後、表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させる。それにより、少なくとも１つの分子が表面に共有結合するように、少なくとも１つの分子上のアミノ基が反応し、表面への共有結合を形成する。
【００３３】
いずれかの特定の科学的理論に拘束されることを望むものではないが、発明者らは、金又は白金イオンなどの貴金属イオンの存在下での酸化還元反応は、例えば、Ａｕ−硫黄ナノクラスターの形成時に表面上のチオールをジスルフィドに酸化すると考えている。
【００３４】
一実施形態において、表面を酸化するステップの前に−ＳＨ基の少なくとも一部分を互いに反応させる。一実施形態において、−ＳＨ基の少なくとも一部分を反応させて、−Ｓ−Ｓ−結合を生じさせる。
【００３５】
一実施形態において、表面を酸化するステップの前に本質的にすべての−ＳＨ基を互いに反応させる。本質的にすべてとは、分子の数の少なくとも９９％、好ましくは９９．９％以上が反応することを意味する。
【００３６】
一実施形態において、少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子は、少なくとも１つの炭素原子を含む分子、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、アプタマー、ウイルス、ウイルス断片、細菌、細菌断片、細胞及び細胞断片からなる群から選択される少なくとも１つの分子である。一実施形態において、少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子は、タンパク質及び抗体からなる群から選択される少なくとも１つの分子である。
【００３７】
一実施形態において、酸化還元反応を水溶液中で実施する。一実施形態において、電気酸化を溶媒の混合液中で実施する。
【００３８】
一実施形態において、表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させるステップを水溶液中で実施する。一実施形態において、表面を少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子と接触させるステップを溶媒の混合液中で実施する。
【００３９】
一実施形態において、方法を１５℃〜３０℃の温度で実施する。代替実施形態において、方法を約２０℃〜２５℃の室温で実施する。さらに他の実施形態において、方法を５℃〜４５℃の温度で実施する。温度感受性生体分子を含まない代替実施形態において、方法を数百度までの温度で実施する。一実施形態において、方法を１５℃〜３００℃の温度で実施する。
【００４０】
電気酸化を用いる一実施形態において、電気酸化を参照電極としての標準白金電極に対して０．３〜３Ｖの電位を用いて実施する。一実施形態において、電気酸化を０．１〜５Ｖの電位を用いて実施する。一実施形態において、電気酸化を０．５〜２Ｖの電位を用いて実施する。他の実施形態において、電気酸化を０．５〜１．５Ｖの電位を用いて実施する。一実施形態において、電気酸化を１秒から１０分の期間中に実施する。代替実施形態において、電気酸化を０．１秒から１０時間の期間中に実施する。
【００４１】
電気酸化を用いる一実施形態において、電気酸化用の器具一式は、作用電極及び対電極を含む。場合によって器具一式は、作用電極の電位を測定するように構成された参照電極をさらに含む。一実施形態において、電極の少なくとも１つは、金で被覆されている。一実施形態において、電極の少なくとも１つは、電気酸化時に溶液中で回転するように構成されている。一実施形態において、流体セル（ｆｌｕｉｄ  ｃｅｌｌ）は、電気酸化が起こる作用電極の大表面積を得るように構成されている。
【００４２】
一実施形態において、表面と少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子との接触を１０分から１０時間の期間中に実施する。代替実施形態において、電気酸化を０．１秒から７２時間の期間中に実施する。
【００４３】
一実施形態において、表面上の官能基を得るために表面を誘導体化に供し、誘導体化の後に表面上で最終的に得られる官能基は、−ＳＨ基及び−ＳＳ−基から選択される。好ましくは、電気酸化の前に表面を誘導体化に供する。
【００４４】
一実施形態において、４〜５のｐＨを有する酢酸Ｎａ緩衝液を用いる。
【００４５】
第２の態様において、少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子が表面に共有結合しており、上述の方法により少なくとも１つの分子が表面上に固定化されている、少なくとも１つの表面を含む物体を提供する。
【００４６】
一実施形態において、物体は、粒子である。一実施形態において、物体は、センサーである。一実施形態において、物体は、クロマトグラフ分離媒体である。一実施形態において、物体は、生体材料である。一実施形態において、物体は、歯科用修復材料である。一実施形態において、物体は、診断目的に適する物体である。
【００４７】
物体が歯科用修復材料である一実施形態において、１つの表面は、チオールを含み、局所的に電気酸化されるが、他の表面は、アミノ基を含む。
【００４８】
一実施形態において、方法を酸化されるチオールを含む１つの表面とアミノ基を含む１つの表面を結合する接着剤として用いる。一実施形態において、物体は、アミノ基を含む少なくとも１つの表面と結合した酸化チオール基を含む少なくとも１つの表面を含む。
【００４９】
一実施形態において、方法をマイクロコンタクトプリンティング及びタンパク質アレイ用マイクロチップの製造に用いる。
【００５０】
少なくとも１つのアミノ基を含む少なくとも１つの分子の後の共有結合のために、貴金属イオンの存在下における−ＳＨ基を含む表面を修飾するための酸化還元反応の使用も提供する。
【００５１】
少なくとも１つのアミノ基を含む分子を固定化するための貴金属イオンの存在下での酸化還元反応により生成される少なくとも１つの表面結合Ａｕ−Ｓクラスターの使用をさらに提供する。
【実施例】
【００５２】
（例１）
Ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  ＰＥＧ−ＮＨ２
市販の単分散Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）−Ｍ粒子（Ｍｉｃｒｏｍｏｄ  Ｐａｒｔｉｋｅｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ＧｍｂＨ）をこれらの検討に用いた。各粒子は、アミノ官能基を有する二官能性ポリエチレングリコール（−ＮＨ−（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）２００−ＮＨ２）で修飾された架橋メタクリル酸メチル−メタクリル酸コポリマーマトリックスからなる表面コーティングを施したスチレン−マレイン酸コポリマーに埋め込まれたマグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）ナノ粒子のコアからなっている。ビーズは、４．９μｍの平均直径及び０．２μｍの標準偏差を有していた。それらは、７×１０８粒子／ｍｌの濃度、５０ｍｇ／ｍｌの磁気物質含量で水中に分散させた。置換度は、製造業者によれば、１ｍｇ当たり５〜６ｎｍｏｌＮＨ２基又は１粒子当たり２．２×１０８ＮＨ２基であった。
【００５３】
Ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  ＰＥＧ−ＮＨ２へのＳＳ−ピリジルの導入
Ｍｉｃｒｏｍｅｒ（登録商標）−Ｍ  ＰＥＧ−ＮＨ２（１００μＬ、７×１０８粒子／ｍｌ）を１０００μＬのＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で３回洗浄し、１０００μＬのＰＢＳに再懸濁した。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）（２５μＬ、ＤＭＳＯ中２０ｍＭ）をビーズ懸濁液に加え、９０分間反応させた。ビーズを１０００μＬのＰＢＳで５回洗浄し、１０００μＬのＰＢＳに再懸濁し、４℃に維持した。
【００５４】
ＳＳ−ピリジル／粒子比の測定
Ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  ＰＥＧ−ＳＳ−ピリジル（１００μＬ、７×１０７粒子）を１０００μＬの２％ｗ／ｖＤＴＴ含有ＰＢＳ中ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。粒子を磁石で収集し、上清をＳＳ−ピリジルの分光光度分析にさらに用い、ＳＳ−ピリジル含量（図２）をＳｈｉｍａｄｚｕ（京都、日本）ＵＶ−２１０１ＰＣ分光光度計及び石英キュベットを用いて波長３４３ｎｍ（ξ＝８０８０Ｍ−１ｃｍ−１）で分光光度法により測定した。約１．０×１０８ＳＳ−ピリジル基が各粒子に結合していた。
【００５５】
Ｍｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  ＰＥＧ−ＳＨの調製
電気酸化の直前に、１０００μＬの懸濁液中のＭｉｃｒｏｍｅｒ−Ｍ  ＰＥＧ−ＳＳ−ピリジル粒子（７×１０７粒子／ｍｌ）を外部磁石で収集し、緩衝液を１０００μＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５、２％ｗ／ｖＤＴＴ）中ジチオトレイトール（ＤＴＴ）に変え、室温で２０分間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で５回洗浄し、８０ｍｌのＰＢＳに８．７５×１０６粒子／ｍｌの最終濃度になるように再懸濁し、室温に維持した。
【００５６】
アガロース−ＳＨ粒子の調製
セファロース６Ｂをガラスフィルター上で蒸留水で洗浄し、吸引乾燥した。３ｇの乾燥ゲル粒子を２．４ｍｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に再懸濁し、室温で撹拌しながら０．４５ｍｌのエピクロロヒドリンを１滴ずつ加えた。温度を６０℃に上昇させ、２時間維持した。セファロースゲルをガラスフィルター上で中性まで蒸留水で洗浄した。さらにエポキシド活性化ゲル（３ｇ）をガラスフィルター上で５０ｍｌの０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．３で洗浄し、吸引乾燥した。ゲルをリン酸緩衝液（６ｍｌ）に再懸濁した。３ｍｌの２Ｍチオ硫酸ナトリウムを加え、混合物を室温で６時間振とうした。過剰のチオ硫酸ナトリウムを蒸留水でチオ硫酸エステルゲルから洗い流した。チオール基含有ゲルを調製するために、チオ硫酸エステルゲルをジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元した。１ｇのチオ硫酸エステルゲルをガラスフィルター上で洗浄し、３ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液に再懸濁した。２ｍｌ（１ｍＭ）ＥＤＴＡ溶液中０．１ｇのＤＴＴを加え、エステルゲルを３０分間還元した。還元ゲルを３０ｍｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（１Ｍ塩化ナトリウム及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で、最後に１００ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で洗浄した。チオール基含有セファロース６Ｂ粒子を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に懸濁した。
【００５７】
電気酸化の実験準備
粒子の電気酸化に用いた反応セルは、金プレートの上部に取り付けたテフロン（登録商標）円筒からなっていた。金プレートの下に取り付けた永久磁石（金プレートの内表面で３５０ｍＴ）を用いて垂直磁場を印加した。対及び参照電極を反応セルの内側に取り付け、作用電極として機能する金プレートを反応セルの外側に接続した（図２）。
【００５８】
粒子上のチオールの電気酸化
実験の前に、反応セル及び作用電極を７．５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素（Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃ．、Ｐ．Ａ．グレード）と１５ｍｌの硫酸（Ｐ．Ａ．グレード）の混合物で洗浄した後、水ですすいだ。３ｍｌのＰＢＳに入れたチオール基含有粒子、０．７５ｍｇ若しくは０．２５ｍｇ磁気粒子又は２〜６ｍｇアガロース粒子を次に反応セルに加えた。粒子を重力（アガロース粒子）及び磁場（磁気粒子）により５分間にわたり金表面上に分布させた。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対する０．４５〜０．９０Ｖの範囲の電位を１秒間印加した。チオール基含有粒子の異なる酸化の間に作用、対及び参照電極をＰＢＳで洗浄した。その後、粒子を再懸濁し、永久磁石により磁気粒子を、遠心分離によりアガロース粒子を収集することにより、容積を２００μＬに減少させた。測定の前に、金作用電極が適切に機能していたことを確認するために粒子の非存在下でＰＢＳ溶液中でサイクリックボルタンモグラム（−０．２〜＋１．５Ｖ、５０ｍＶ／ｓ）を記録した。
【００５９】
電気酸化粒子への生体分子の結合
電気酸化実験からの粒子懸濁液を１００μＬの生体分子（ＩｇＧ、β−アラニン、α−ラクトアルブミン、α−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）及びプロテインＡ）（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ）と混合し、４０分間インキュベートした。約１０ｍｌのＰＢＳで粒子を洗浄することにより、非結合生体分子を除去した。反応は、粒子表面の蛍光の程度に関して、及びアミノ酸分析により評価した。蛍光は、Ｎｉｋｏｎ  Ｃｏｏｌｐｉｘカメラを装備したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光顕微鏡により評価した。４９４ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長を得るように蛍光フィルターを調整した。アミノ酸分析は、特殊フィルターの使用によるアンモニアの除去がＵｌｔｒａｐａｃ  ８樹脂を含む４．６×２００ｍｍ高分解能ＰＥＥＫカラム（Ｂｉａｃｈｒｏｍｅ）上のすべてのアミノ酸の分離を可能にする、Ｓｐａｃｋｍａｎ、Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｏｒｅにより開発された古典的方法の改善された変法により実施した。アミノ酸の量は、Ｂｉａｃｈｒｏｍｅ２０及びＢｉａｃｈｒｏｍｅ３０分析機器を用いることにより２種の波長４４０ｎｍ及び５７０ｎｍで検出した。検出限界は２５〜５０ｐｍｏｌであり、定量限界は５０〜１００ｐｍｏｌであった。２ｍｌの６Ｍ  ＨＣｌ（内部標準を含む）を既知重量の一定容積の粒子懸濁液に加え、次にこれを１００℃で２４時間加水分解した。アミノ酸分析の前にアガロース粒子を凍結乾燥した。
【００６０】
（例２）
電気酸化時の異なる電位の試験
固定化分子は、ＦＩＴＣマーカー付き分子を用いることにより検討した全ビーズ表面に均一に分布していた。分子を結合する能力は、電気酸化ステップ中に印加された電圧に依存し（表１ａ参照）、ゼロボルトで分子の非特異的吸着が起こり、０．９Ｖの電圧で最大であった。表１に示す結果から、印加電圧及び粒子濃度の両方により粒子上の分子の置換の程度を制御することが可能であることがわかる。生体分子の結合容量をアガロース（セファロース６Ｂ）において検討したところ、凍結乾燥アガロース１ｇ当たりＩｇＧ２９．４ｍｇであることがわかった。
【表１】
0005845257.tif 000002
α−ラクトアルブミンをアガロースに結合する能力を各種ボルトについて検討した。電気酸化を６０秒間実施した。アミノ酸分析を実施して、結合α−ラクトアルブミンの量を計算した。表１ｂにおける結果を参照のこと。
【表２】
0005845257.tif 000003
【００６１】
（例３）
安定性試験
表面と固定化生体分子との間の結合の安定性を検討するために、ＩｇＧ及びβ−アラニンを電気酸化磁気粒子に固定化した。粒子を大過剰のｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水で数時間にわたり徹底的に洗浄し、徹底的な洗浄処置の前後にアミノ酸分析を実施した。
【００６２】
徹底的な洗浄後の磁気粒子上の固定化ＩｇＧ及びβ−アラニンの安定性は、それぞれ１００％及び７５％である。表２ａを参照のこと。
【００６３】
磁気粒子の表面上の反応性硫黄／Ａｕコンプレックスの安定性は、ＩｇＧの結合の前に新たに電気酸化した粒子をジオキサン及びエタノール（蒸留水中５０％ｖ／ｖ）中で３０日間貯蔵することによって検討した。表２ｂを参照のこと。電気酸化で形成された反応性構造は、それぞれ６６％及び４２％の安定性を示している。
【００６４】
電気酸化中に形成されたアガロース上の反応性硫黄／Ａｕコンプレックスの安定性の検討。アガロースを１．０Ｖで６０秒間電気酸化した。アガロースの半分を参照試料としてα−ラクトアルブミンと反応させ、他の半分を酢酸緩衝液ｐＨ５中に貯蔵した。４０日後に酢酸緩衝液を除去し、α−ラクトアルブミンを加えた。両試料についてアミノ酸分析を実施した。参照試料は、１ｇの乾燥アガロース当たり３１ｍｇのα−ラクトアルブミンを得たが、酢酸緩衝液中に貯蔵したアガロース粒子は、１ｇの乾燥アガロース当たり２７ｍｇのα−ラクトアルブミンを得た。したがって、硫黄／Ａｕコンプレックスの反応性は、酢酸緩衝液中に貯蔵した後に８８％であった。
【００６５】
表２ａ及び２ｂ。上部Ａ、電気酸化磁気粒子に固定化されたＩｇＧ及びβ−アラニンの結合の安定性。下部Ｂ、ＩｇＧの結合の前のジオキサン及びエタノール５０％中の粒子表面上の反応性構造の安定性。
【表３】
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【００６６】
（例４）
低ｐＨにおける安定性試験
電気化学的酸化アガロースへの固定化タンパク質の低ｐＨにおける安定性を検討するために、上述のようにプロテインＡ及びＩｇＧを成功裏に固定化した。その後、アガロース−タンパク質粒子をグリシン緩衝液ｐＨ３で２０分間処理した。表３に示すように、固定化プロテインＡ及びＩｇＧ間の結合は、ｐＨ３で少なくとも２０分間安定であった。固定化分子は低ｐＨで安定であると結論付けることができる。
【００６７】
表３。ｐＨ３におけるプロテインＡとアガロースとの間の結合の安定性の検討のための電気酸化チオールアガロース粒子上に固定化したＩｇＧ及びプロテインＡ
【表４】
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（例５）
アガロース−ＳＨ粒子の化学的酸化と電気酸化との比較
過酸化水素による化学的酸化。２ｍｇのチオール基含有アガロース粒子を２ｍｌの酢酸緩衝液ｐＨ５中３．５％Ｈ２Ｏ２で２０時間酸化した。酸化後、粒子をガラスフィルター上で１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。生体分子である５００μｌのα−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ）を酸化アガロース−ＳＨ粒子に加えた。４０分後及び２４時間後に反応を粒子表面の蛍光の程度に関して評価した。４０分後に蛍光は認められなかった。２４時間後に２００倍の蛍光顕微鏡で見える弱い蛍光が粒子表面上に出現した。α−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）の蛍光が４０分後に肉眼で見える電気酸化アガロース−ＳＨ粒子と比較して、これは、アガロース粒子上の天然生体分子の固定化の非効率的な技術である。
【００６８】
過酸化水素及び塩化金（ＩＩＩ）による化学的酸化
８ｍｇのチオール基含有アガロース粒子を１０ｍｌの酢酸緩衝液ｐＨ５中３．５％Ｈ２Ｏ２で１２時間酸化した。酸化後、粒子をガラスフィルター上で５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次に粒子を１０ｍｌの塩化金（ＩＩＩ）（ＰＢＳ中８ｍＭ）と２分間混合した。粒子をガラスフィルター上で１００ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次に生体分子である５００μｌのα−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ）と４０分間混合した。粒子を再びガラスフィルター上で５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。粒子は、強い均一な蛍光を示し、生体分子がアガロース粒子上に成功裏に固定化されたことがわかる。
【００６９】
塩化金（ＩＩＩ）による化学的酸化
８ｍｇのチオール基含有アガロース粒子を１０ｍｌの塩化金（ＩＩＩ）の溶液（ＰＢＳ中８ｍＭ）と２分間混合した。粒子をガラスフィルター上で１００ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次に生体分子である５００μｌのα−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌ）と４０分間混合した。粒子を再びガラスフィルター上で５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。粒子は、強い均一な蛍光を示し、生体分子がアガロース粒子上に成功裏に固定化されたことがわかる。
【００７０】
表４。異なる酸化処置後の金及び酸化アガロース−ＳＨ粒子上への生体分子の固定化後のα−ラクトアルブミン（ＦＩＴＣ）（ＬＡＬＢＡ）の含量を示す。ｅ．Ｏｘは、１．０ボルトで６０秒間の上述のような電気酸化であり、Ｃ．Ｏｘアガロース（ＡｕＣｌ３）は、塩化金（ＩＩＩ）による化学的酸化であり、Ｃ．Ｏｘアガロース（Ｈ２Ｏ２／ＡｕＣｌ３）は、過酸化水素及び塩化金（ＩＩＩ）による化学的酸化である。８ｍｇのアガロース−ＳＨ粒子は、すべての場合に酸化される。金含量は、ＩＣＰにより測定し、ＬＡＬＢＡ含量は、アミノ酸分析により測定する。
【表５】
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【図１】
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【図２】
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