(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号２；
（ｃ）配列番号３；
（ｄ）配列番号４；
（ｅ）配列番号５；
（ｆ）配列番号６；
（ｇ）配列番号７；
（ｈ）配列番号３２；
（ｉ）配列番号３３；
（ｊ）配列番号３４；
（ｋ）配列番号３５；
（ｌ）配列番号３６；及び
（ｍ）配列番号３７
からなる群から選択されるポリメラーゼと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、
配列番号１の７０９番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡであり、そして
当該対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の７０９番目に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ、Ｌ、又はＭであることを除き、当該ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌ（配列番号８）
［ここで、
Ｘ1は、Ａ、Ｄ、Ｓ、Ｅ、Ｒ又はＱであり；
Ｘ2は、Ｗ又はＹであり；
Ｘ3は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ4は、Ｅ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｎ又はＤであり；
Ｘ5は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｑ、Ｈ又はＮであり；
Ｘ6は、Ｔ、Ｖ、Ｍ又はＩであり；
Ｘ7は、Ｌ、Ｖ又はＫであり；
Ｘ8は、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＱであり；
Ｘ9は、Ｅ又はＦであり；
Ｘ10は、Ｇ又はＡであり；
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｔ又はＱであり；
Ｘ13は、Ｒ、Ｋ又はＨであり；そして
Ｘ14は、Ｅ、Ｒ又はＴである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
Ａ−Ｗ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｔ−Ｌ（配列番号１１）
［ここで、
Ｘ3は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、又はＡであり；
Ｘ4は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ5は、Ｋ又はＧであり；
Ｘ12は、Ｋ又はＲであり；そして
Ｘ13は、Ｒ又はＫである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１の５８０番目に対応するアミノ酸が、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
配列番号１の５８０番目に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
配列番号１の５８０番目に対応するアミノ酸がＧである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号２；
（ｃ）配列番号３；
（ｄ）配列番号４；
（ｅ）配列番号５；
（ｆ）配列番号６；
（ｇ）配列番号７；
（ｈ）配列番号３２；
（ｉ）配列番号３３；
（ｊ）配列番号３４；
（ｋ）配列番号３５；
（ｌ）配列番号３６；及び
（ｍ）配列番号３７
からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する請求項６に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記ポリメラーゼが、配列番号１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする、組換え核酸。
【請求項１０】
プライマー伸長を行うための方法であって、
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼと、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸とを、当該プライマーの伸長に適切な条件下で接触させ、これにより伸長プライマーを生成することを含んでなる、方法。
【請求項１１】
前記方法が、少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤及び／又は逆転写活性阻害剤の存在下で行なわれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む少なくとも１つの容器を含んでなる、伸長プライマーを生成するためのキット。
【請求項１３】
（ａ）プライマー伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なプライマーを含む容器；
（ｂ）ヌクレオシド三リン酸を含む容器；及び
（ｃ）プライマー伸長に適切な緩衝液を含む容器
からなる群から選択される１つ以上の追加の容器をさらに含んでなる、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも一つのプライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸を含んでなる反応混合物。
【請求項１５】
前記混合物が、少なくとも一つのＤＮＡポリメラーゼ活性阻害剤及び／又は逆転写活性阻害剤を含んでなる、請求項１４に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又は逆転写酵素（ＲＴ）及びポリメラーゼ阻害剤耐性を含む改良された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びに核酸ポリヌクレオチドの伸長及び増幅を含む様々な用途におけるかかるポリメラーゼの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼはゲノムの複製や保持という、世代から世代へと遺伝情報を正確に伝達するための中心的な役割を担っている。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの合成を担う酵素として細胞内で機能しており、複製される鋳型ＤＮＡ又は鋳型ポリヌクレオチドに必要なオーダーのＭｇ2+のような金属活性化因子の存在下、デオキシリボヌクレオシド３リン酸を重合付加している。In vivoにおいて、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅を含む一連のＤＮＡ合成過程に関与している。それぞれのＤＮＡ合成過程の間に、鋳型ＤＮＡは一度又は多くとも数回複製され、同一の複製物を生成する。これに対しin vitroでは、例えばポリメラーゼ連鎖反応の際のように、ＤＮＡ複製は何回も繰り返すことができる（例えば、米国特許第４,６８３,２０２号参照）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の初期の研究では、各サイクルのＤＮＡ複製開始時にＤＮＡポリメラーゼを加えていた（前述の米国特許第４,６８３,２０２号参照）。その後、高温で生育する細菌から熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが得られ、これらの酵素を一度だけ加えればよくなった（米国特許第４,８８９,８１８号及び米国特許第４,９６５,１８８号参照）。ＰＣＲ中に使用する高温下で、これらの酵素は不可逆的に不活性化されない。その結果、合成付加過程の開始時ごとに新しい酵素を加えることなく、ポリメラーゼ連鎖反応の反復的サイクルを行うことができる。ＤＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性ポリメラーゼは、ＤＮＡ組換え研究や疾病の医療診断における数多くの技術にとって重要である。特に診断に用いられる場合、標的核酸配列は問題となるＤＮＡ又はＲＮＡのごく一部のみとなり得るため、増幅しないで標的核酸配列の存在を検出するのは難しい可能性がある。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼの折りたたみパターン全体はヒトの右手に似ており、パーム（手のひら）、フィンガー（指）、サム（親指）の３つの異なるサブドメインを含む(Beese et al., Science 260:352-355, 1993); Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995参照)。フィンガー及びサム・サブドメインの構造は、サイズ及び細胞内での機能が異なるポリメラーゼ間で大きく異なる一方、触媒作用を持つパーム・サブドメインは全て重ね合わせることができる。例えば、取り込むｄＮＴＰと相互作用して化学触媒作用中に遷移状態を安定化させるモチーフＡは、哺乳類のｐｏｌα及び原核生物のｐｏｌＩ  ＤＮＡポリメラーゼファミリーの中で、約１Åの平均偏差で重ね合わせることができる（Wang et al., Cell 89: 1087-1099, 1997）。モチーフＡは構造的に、主に疎水性残基を含む逆平行β−ストランドで始まり、α−ヘリックスへと続く。ＤＮＡポリメラーゼ活性部位の一次アミノ酸配列は、非常によく保存されている。モチーフＡの場合、例えば、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号２２）は、例えばサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及び大腸菌（Escherichia coli）を含む、何百万年もの間の進化により分化した生物のポリメラーゼの中に保持されている。
【０００５】
よく保存されていることに加え、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は比較的変異しやすく、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に低下させることなく特定のアミノ酸置換を有することができることも示されている（例えば、米国特許第６,６０２,６９５号参照）。このような変異ＤＮＡポリメラーゼは、例えば核酸合成反応を含んでなる診断及び研究用途において種々の選択的優位性を提供することができる。
【０００６】
ＤＮＡ重合の酵素的プロセスにおいて、１）流入するヌクレオチドの組み込み工程、及び２）新たに組み込まれたヌクレオチドの伸長工程の少なくとも二つの工程が存在する。ＤＮＡポリメラーゼの全体的な忠実性又は「正確性」は、一般的にこれらの二つの酵素活性の集合であると考えられるが、これらの工程は明確に異なる。ＤＮＡポリメラーゼは、流入するヌクレオチドを誤って取り込み得るが、効率的に伸長されない場合、伸長速度は著しく減少し、全体的な生成物形成は少なくなる。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼに流入するヌクレオチドを誤って取り込ませ、新たに形成されるミスマッチを容易に誤って伸長させることが可能である。この場合、全体的な伸長速度は早いが、全体的な正確性は低くなる。この種類の酵素の例は、二価金属イオン活性化因子としてＭｎ2+を用いる場合、ＥＳ１１２  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ６８３Ｒ  Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ；米国特許第７，１７９，５９０号を参照のこと）である。該酵素は、ミスマッチと遭遇した場合に躊躇い／失速する傾向を有する典型的なＤＮＡポリメラーゼとは異なるため、大変高い効率性を有し、ＥＳ１１２  ＤＮＡポリメラーゼは、ミスマッチを容易に伸長する。ＥＳ１１２に表われる表現型は、恐らく、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖対ＤＮＡ／ＤＮＡホモ二本鎖の構造的効果のために、逆転写（ＲＴ）工程の間、より顕著である。第二の例は、ＤＮＡポリメラーゼが、容易に誤って取り込まない（誤って取り込むことが更に少ない）が、ミスマッチを誤って伸長する増大した能力を有する場合である。この場合、正確性は、全体的な生成物に対して著しく改変されない。一般的に、この種類の酵素は、生成物の正確性が改良されるので、Ｍｎ2+におけるＥＳ１１２の特性よりも伸長反応に好都合である。しかしながら、この寄与は、例えば単一の配列のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列多様性を有する標的（例えば、ウイルス標的）とハイブリダイズする場合、ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドプライマーの誤った伸長を許容するために用いることができるが、正常の又は低い誤った取り込み速度は、元のオリゴヌクレオチドプライマーを超えるＤＮＡ合成の完了を可能にする。この種類のＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許出願第２００９／０１４８８９１号を参照のこと）である。この種類の活性は、オリゴヌクレオチドプライマーにおけるミスマッチに対してより耐性を有するので、「ミスマッチ耐性」として称される。上記の例は、プライマー伸長型反応について議論しているのに対し、該活性は、プライマー伸長がしばしば再び起こる反応、例えばＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲにおいて、より重要である。データは、酵素、例えばＺ０５  Ｄ５８０Ｇが、よりミスマッチに対する「耐性」を有する一方で、これらが、ＤＮＡ結合色素、例えばＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（例えば、ｔ−ブチルベンジル修飾塩基）の存在下で、修飾された塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する増大した能力を有することを示唆する（米国特許出願第２００９／０２８０５３号を参照のこと）。
【０００７】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、増幅によりＲＮＡ標的を検出及び／又は定量する多くの応用において用いられる技術である。ＰＣＲによりＲＮＡ標的を増幅するために、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに最初に逆転写することが必要である。典型的に、ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、最初のｃＤＮＡ合成工程（ＲＴ）のために、中温性生物由来の非熱安定性逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）に頼る。ｃＤＮＡの増幅のために、追加の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲにおいて核酸変性に要求される高温に耐性を有することが要求される。ＲＴ−ＰＣＲアッセイのためのより効率的な逆転写を行なうために改変された熱活性又は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることのいくつかの潜在的な利点が存在する。ＲＮＡ鋳型二次構造を緩和する高い逆転写インキュベーション温度を用いる能力に加えて、増加した逆転写酵素活性は、全体的に高いｃＤＮＡ合成効率及びアッセイ感度をもたらすことができる。高いインキュベーション温度は、逆転写工程における誤ったプライミングを減少させることにより特異性を増大させることができる。改良された逆転写効率を有する酵素は、減少したＲＴインキュベーション時間及び／又は酵素濃度を可能にすることによりアッセイ設計を簡便にすることを可能にする。ｄＵＴＰ及びＵＮＧを用いる場合、非ストリンジェントな設定条件において形成されるｄＵＭＰを含む非特異的な伸長生成物は、ＵＮＧにより分解され、プライマー又は鋳型のいずれかとして用いることができない。中温性生物由来の非熱安定性逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を用いる場合、ｄＵＴＰ及びＵＮＧ方法論を用いることは可能でない（Myers, T.W. et al., Amplification of RNA: High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermus thermophilus DNA Polymerase , in PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H., and Sninsky, J.J., Eds., Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)）。しかしながら、逆転写工程のための本発明の熱活性又は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用は、ｄＵＴＰ／ウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）繰り越し予防システムの利用に完全に適合する反応を可能にする（Longo et al., Use of Uracil DNA Glycosylase to Control Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990)）。繰り越しコンタミネーション制御の提供に加えて、ｄＵＴＰ及びＵＮＧの使用は、非特的な増幅を減少させる「ホットスタート」を提供する（Innis and Gelfand (1999)、同上）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４,６８３,２０２号
【特許文献２】米国特許第４,８８９,８１８号
【特許文献３】米国特許第４,９６５,１８８号
【特許文献４】米国特許第６,６０２,６９５号
【特許文献５】米国特許第７,１７９,５９０号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号
【特許文献７】米国特許出願公開第２００９／０２８０５３号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Beese et al., Science 260:352-355, 1993
【非特許文献２】Patel et al., Biochemistry 34:5351-5363, 1995
【非特許文献３】Wang et al., Cell 89: 1087-1099, 1997
【非特許文献４】Myers, T.W. et al., "PCR Strategies," Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995)
【非特許文献５】Longo et al., Gene 93:125-128, (1990)
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、対応する非改変対照ポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を含む、改良された活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、並びにこのようなＤＮＡポリメラーゼを作製及び使用する方法を提供する。態様によっては、配列番号１の７０９番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ、Ｌ又はＭ以外の任意のアミノ酸であり、そして、対照ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の７０９番目に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ、Ｌ又はＭであることを除いては、前記ＤＮＡポリメラーゼと同じアミノ酸配列を有する。例えば、態様によっては、改良された配列番号１の７０９番目に対応する位置のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨから選択される。
【００１１】
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌ：
［ここで、
Ｘ1は、Ａ、Ｄ、Ｓ、Ｅ、Ｒ又はＱであり；
Ｘ2は、Ｗ又はＹであり；
Ｘ3は、Ｉ、Ｌ又はＭ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｅ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｎ又はＤであり；
Ｘ5は、Ｋ、Ｇ、Ｒ、Ｑ、Ｈ又はＮであり；
Ｘ6は、Ｔ、Ｖ、Ｍ又はＩであり；
Ｘ7は、Ｌ、Ｖ又はＫであり；
Ｘ8は、Ｅ、Ｓ、Ａ、Ｄ又はＱであり；
Ｘ9は、Ｅ又はＦであり；
Ｘ10は、Ｇ又はＡであり；
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｔ又はＱであり；
Ｘ13は、Ｒ、Ｋ又はＨであり；そして
Ｘ14は、Ｅ、Ｒ又はＴである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号８）。
【００１２】
態様によっては、Ｘ3は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ又はＨから選択される。
【００１３】
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｅ−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌ：
［ここで、
Ｘ1は、Ａ、Ｄ又はＳであり；
Ｘ2は、Ｗ又はＹであり；
Ｘ3は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｅ、Ａ又はＱであり；
Ｘ5は、Ｋ、Ｇ、Ｒ又はＱであり；
Ｘ6は、Ｔ又はＶであり；
Ｘ7は、Ｌ又はＶであり；
Ｘ8は、Ｅ、Ｓ又はＡであり；
Ｘ10は、Ｇ又はＡであり；
Ｘ11は、Ｒ又はＫであり；
Ｘ12は、Ｋ、Ｒ又はＥであり；
Ｘ13は、Ｒ又はＫであり；そして
Ｘ14は、Ｅ又はＲである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号９）。
【００１４】
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ａ−Ｗ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｔ−Ｌ：
［ここで、
Ｘ3は、Ｉ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ5は、Ｋ又はＧであり；
Ｘ12は、Ｋ又はＲであり；そして
Ｘ13は、Ｒ又はＫである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号１０）。
【００１５】
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼは、
Ａ−Ｗ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｔ−Ｌ：
［ここで、
Ｘ3は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡであり；
Ｘ4は、Ｅ又はＡであり；
Ｘ5は、Ｋ又はＧであり；
Ｘ12は、Ｋ又はＲであり；そして
Ｘ13は、Ｒ又はＫである］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号１１）。
【００１６】
態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸はＤ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。
【００１７】
態様によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１の５８０及び５８８から選択される位置に対応する１以上のアミノ酸において、さらに変異を含む。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８０番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。態様によっては、配列番号１の５８８番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８８番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択される。態様によっては、配列番号１の５８８番目に対応するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｔである。
【００１８】
様々なＤＮＡポリメラーゼが本発明による変異に従う。特に適切なものは、様々な種の好熱性細菌由来の野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼを含む熱安定性ポリメラーゼ、ならびに、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失、又は他の改変により、そのような野生型又は天然型の酵素から得た合成熱安定性ポリメラーゼである。非改変型ポリメラーゼの例としては、例えば、ＣＳ５、ＣＳ６もしくはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。他の非改変ポリメラーゼとしては、例えば、以下の好熱性細菌の種のいずれかに由来するＤＮＡポリメラーゼ（又は、そのようなポリメラーゼと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる：サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（配列番号３４）；サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（配列番号２）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（配列番号６）；サーマス・フラバス（Thermus flavus）（配列番号４）；サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）（配列番号３）；サーマス種ｓｐｓ１７（Thermus sp. Sps17）（配列番号５）；サーマス種Ｚ０５（Thermus sp. Z05）（配列番号１）；サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neopolitana）（配列番号３５）；サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）（配列番号３３）；サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）（配列番号７）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）（配列番号３２）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）（配列番号３６）又はバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）（配列番号３７）。適切なポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素（ＲＴ）活性及び／又は、リボヌクレオチドもしくは他の２’改変ヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを取り込む能力を有するものが挙げられる。
【００１９】
効率的な逆転写活性を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、特にＲＴ−ＰＣＲ、特に単一酵素ＲＴ−ＰＣＲを行うのに適切である一方、逆転写活性を有する熱活性であるが、熱安定性ではないＤＮＡポリメラーゼもまた本発明による変異に従う。例えば、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又は逆転写酵素（ＲＴ）及びポリメラーゼ阻害剤耐性の特性は、ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＴ工程に重要であり、この工程は、熱活性であるが、熱安定性でないＤＮＡポリメラーゼを不活性化する温度において行う必要がない。ＲＴ工程の後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを添加することができ、あるいはＰＣＲ増幅工程を行うための反応混合物に予め含ませることができる。この二番目の方法は、ＲＴ工程の間、完全に活性化しないように、化学的に改変された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（あるいは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを不活性化するための他のホットスタート技術）を用いることにより、特に有用である。効率的な逆転写活性を有し、熱活性であるが、熱安定性でないＤＮＡポリメラーゼの例は、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス（Carboxydothermus hydrogenoformans）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｙ；配列番号４８）である。例えば、米国特許第６，４６８，７７５号及び第６，３９９，３２０号を参照のこと。
【００２０】
態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、
（ａ）サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）（配列番号１）；
（ｂ）サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）（配列番号２）；
（ｃ）サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）（配列番号３）；
（ｄ）サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）（配列番号４）；
（ｅ）サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）（配列番号５）；
（ｆ）サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）（配列番号６）；
（ｇ）サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）（配列番号７）；及び
（ｈ）カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンスＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｙ）（配列番号４８）からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２１】
態様によっては、上記ＤＮＡポリメラーゼはサーモトガＤＮＡポリメラーゼである。例えば、態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、
（ａ）サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）（配列番号３４）；
（ｂ）サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）（配列番号３５）；
からなる群から選択されるポリメラーゼと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２２】
態様によっては、上記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）ＤＮＡポリメラーゼであり、且つ７０９番目のアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、配列番号１）であり、７０９番目のアミノ酸は、Ｉ、Ｌ又はＭ以外の任意のアミノ酸である。例えば、態様によっては、７０９番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨから選択される。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、７０９番目のアミノ酸は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ又はＡである。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼは、５８０番目にさらに置換を含んでなるＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｄ又はＥ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｄ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該ＤＮＡポリメラーゼはＺ０５ＤＮＡポリメラーゼであり、５８０番目のアミノ酸は、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｒ及びＫからなる群から選択される。
【００２３】
態様によっては、変異ポリメラーゼは、対照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又は逆転写酵素（ＲＴ）及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する変異ポリメラーゼであり、ここで配列番号１の５８８番目に対応する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｉ又はＶ以外の任意のアミノ酸であり、そして対照ＤＮＡポリメラーゼとは、配列番号１の５８８番目に対応する対照ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸がＩ又はＶであることを除いて熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有する。態様によっては、配列番号１の５８８番目に対応する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｍ又はＨから選択される。態様によっては、ポリメラーゼは、
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｘ1−Ｐｒｏ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ
［ここで、
Ｘ1は、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ2は、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＶａｌ（Ｖ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ3は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ4は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ5は、Ｐｒｏ（Ｐ）又はＧｌｕ（Ｅ）であり；
Ｘ6は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＧｌｕ（Ｅ）である］
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる（配列番号２９）。
【００２４】
変異誘発された又は改良されたポリメラーゼは、置換によらない他の改変を含むことができる。そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、典型的にポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。かかる熱可逆的修飾のための典型的な試薬は、米国特許第５，７７３，２５８号及び第５，６７７，１５２号に記載されている。
【００２５】
態様によっては、逆転写酵素活性は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅、及びｐＳＰ６４ポリ（Ａ）におけるＨＣＶ遺伝子型Ｉｂ  ５’ＮＴＲの最初の８００塩基から生成されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写物の検出により行われる（Promega）ことにより決定される。２又はそれ以上の反応混合物において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写物のコピー数を滴定することができる（数種類の反応混合物において、例えば、１：５滴定、１：１０滴定、例えば、１０，０００コピー、１０００コピー、１００コピー、１０コピー、１コピー、０コピー）。本発明のポリメラーゼの逆転写酵素能力を、本明細書に記載されるように、事前に選択された単位時間にわたり、参照ポリメラーゼ（例えば、天然又は非改変ポリメラーゼ）の逆転写酵素能力と比較することができる。逆転写酵素能力が改良されたポリメラーゼは、天然又は非改変ポリメラーゼと比較して、より優れた効率で転写物を増幅し、転写物を増幅するのに、より少ないＰＣＲサイクル数を必要とする（すなわち、本明細書で計算されるように、低いＣｐ値を示す）。さらに、態様によっては、改良されたＲＴ機能を有するポリメラーゼはまた、長いＲＮＡ鋳型（例えば、少なくとも５００又は１０００又は２０００又は５０００又それ以上のヌクレオチド長）の改良された複製物を有する。
【００２６】
様々な他の面においては、本発明は、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、前記組換え核酸を含んでなるベクター、及び前記ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。特定の態様においては、当該ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターを含んでなる宿主細胞は、組換え核酸の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することにより変異又は改良ポリメラーゼを生成するための本発明の方法に有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び／又はキットに含まれていてもよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの態様は、上記及び本明細書に記載される通りである。
【００２７】
さらに別の面においては、ポリヌクレオチド伸長を行う方法が提供される。本方法は通常、本明細書に記載される増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するＤＮＡポリメラーゼを、プライマーが伸長するのに適切な条件下で、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、これにより伸長されたプライマーを生成する工程を含む。該鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。特定の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。ヌクレオチド三リン酸は、例えば、リボヌクレオチド及び／又は標識されたヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを含むことができる。さらに、プライマー及び／又は鋳型は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長方法は、変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを、ポリヌクレオチドの増幅に適切な条件下でプライマー対、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させる工程を含むポリヌクレオチド増幅方法である。ポリヌクレオチド伸長反応には、例えば、ＰＣＲ、等温伸長又はシークエンシング（例えば、４５４シークエンシング反応）がなりうる。特定の態様では、プライマー伸長方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の生体サンプルに由来してもよい。
【００２８】
任意で、プライマー伸長反応は、参照又は非改変のポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤を含む。阻害剤は、参照又は非改変（対照）のポリメラーゼの核酸伸長速度及び／又は逆転写効率を阻害することができる。態様によっては、阻害剤は、ヘモグロビン、又はこの分解産物である。例えば、態様によっては、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマトポルフィリン、又はビリルビンである。態様によっては、阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の態様では、阻害剤は、ヘパリン又はメラニンである。特定の態様では、阻害剤は、インターカレーション染料である。態様によっては、インターカレーション染料は、［２−［Ｎ−ビス−（３−ジメチルアミノプロピル）−アミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチルインデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋である。態様によっては、インターカレーション染料は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチルインデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋である。態様によっては、インターカレーション染料は、［２−［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−プロピルアミノ］−４−［２，３−ジヒドロ−３−メチル−（ベンゾ−１，３−チアゾール−２−イル）−メチルインデン］−１−フェニル−キノリニウム］＋ではない。態様によっては、伸長に好適な条件は、Ｍｇ++を含む。態様によっては、伸長に好適な条件は、Ｍｎ++を含む。
【００２９】
本発明はまた、そのようなポリヌクレオチド伸長方法において有用なキットも提供する。通常キットは、本明細書に記載される変異又は改良ＤＮＡポリメラーゼを提供する、少なくとも１つの容器を含む。特定の態様においては、キットはさらに、１つ以上の追加の試薬を提供する１つ以上の追加の容器を含む。例えば、特定の変形においては、１つ以上の追加の容器は、ヌクレオシド三リン酸；ポリヌクレオチド伸長に適切な緩衝液；及び／又は、ポリヌクレオチド伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な１つ以上のプライマー若しくはポリヌクレオチドプローブを提供する。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の種類の生体サンプルに由来してもよい。
【００３０】
さらに、本発明のポリメラーゼを含んでなる反応混合物が提供される。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のポリヌクレオチドプライマー又はポリヌクレオチドプローブ、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、標識されたヌクレオシド三リン酸、特殊なヌクレオシド三リン酸を含む）、緩衝液、塩類、標識（例えば、蛍光体）も含むことができる。態様によっては、鋳型ポリヌクレオチドはＲＮＡである。態様によっては、反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含んでなる。例えば、特定の態様では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン（hematophoryn）、及びビリルビンを含んでなる。他の態様では、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。任意で、反応混合物は、インターカレート染料（限定することなく、上記又は本明細書の他の場所に記載されたものを含む）を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含んでなる。他の態様では、鋳型核酸はＲＮＡであり、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。
【００３１】
本発明のさらなる態様が本明細書に記載される。
【００３２】
定義
他に断りがない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本質的に本明細書に記載のものと同様の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法と材料のみを記載する。本発明の目的上、以下の用語は下記のとおり定義される。
【００３３】
用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００３４】
「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、以下の２０個の天然の又は遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）。「Ｘ」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義する。これらの２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステイン及びピロリジンのような追加のアミノ酸もまた、遺伝的にコードされうる（Stadtman (1996) "selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolidine, " Curr Biol. 12(13):R464-R466）。「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸、（例えば修飾された側鎖及び／又は骨格を有する）修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログも含む。例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxy tryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315,Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, and Budisa et al. (2001) "Proteins with ｛beta｝-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7): 1281-1292を参照のこと。
【００３５】
さらに例示すると、アミノ酸は典型的には、置換又は非置換のアミノ基、置換又は非置換のカルボキシ基、及び１つ以上の側鎖もしくは基、又はそれらの基のいずれかの類似体を含む有機酸である。側鎖の例としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン又はこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、限定しないが、光励起性架橋剤を含んでなるアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージされた(photocaged）及び／又は光異性化可能アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含んでなるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的開裂可能な、及び／又は光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び１つ以上の有毒部位を含んでなるアミノ酸が挙げられる。
【００３６】
「生体サンプル」という用語は、生物から得られる様々なサンプルの種類を包含し、診断又はモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。該用語は、尿、尿沈渣、血液、唾液、及び他の生物起源の液体サンプル、固体組織サンプル、例えば生検材料、若しくは組織培養物、又はこれらに由来する細胞、及びこれらの後代を包含する。該用語は、これらの調達後に何らかの操作、例えば試薬での処理、可溶化、沈殿又は特定の成分の濃縮をしたサンプルを包含する。該用語は、臨床サンプルを包含し、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、組織サンプルも含む。
【００３７】
「変異」という用語は、本発明のＤＮＡポリメラーゼに関しては、対応する機能的なＤＮＡポリメラーゼに対して、１つ以上のアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド、典型的には組換え体を意味する。
【００３８】
「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼに関しては、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼを定義づけるために本明細書で用いられる用語である：「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼを特徴づけるものとして特定された１つ以上のアミノ酸位置を除き、変異ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼを指す。したがって、(ａ)その非改変型及び(ｂ)１つ以上の特定のアミノ酸置換という観点から変異ＤＮＡポリメラーゼのことを述べた場合、それは、変異ポリメラーゼが、特定のアミノ酸置換を除き、それ以外では特定のモチーフ中に非改変型と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「非改変ポリメラーゼ」（及び、したがって増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度及び／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する改変型）は所望の機能性、例えば、ジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチドの取り込みの改良、５’ヌクレアーゼ活性の調節、３’ヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング）活性の調節等を提供するために追加の変異を含んでもよい。したがって、本明細書に記載されるように本発明を実施する際には、ＤＮＡポリメラーゼの非改変型をあらかじめ決定する。ＤＮＡポリメラーゼの非改変型には、例えば、野生型及び／又は天然ＤＮＡポリメラーゼ又は既に意図的に改変されたＤＮＡポリメラーゼがなりうる。ポリメラーゼの非改変型は、好ましくは種々な好熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼと実質的な配列同一性を有するその機能的変異体である。そのような変異体としては、例えば、米国特許第６,２２８,６２８号及び米国特許第７,１４８,０４９号に記載されたキメラＤＮＡポリメラーゼのようなキメラＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。特定の態様においては、ポリメラーゼの非改変型は逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。
【００３９】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定で、耐熱性で、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間、高温にさらした際に、続くポリヌクレオチド伸長反応を行うために十分な活性を保持し、不可逆的に変性（不活性化）しない酵素を指す。核酸の変性に必要な加熱条件は、当業界で周知であり、例えば、米国特許第４,６８３,２０２号、第４,６８３,１９５号及び第４,９６５,１８８号に例示されている。本明細書で使用するとおり、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）のような温度サイクル反応での使用に適切である。本明細書での不可逆的変性とは、不変で完全な酵素活性の欠失を指す。熱安定性ポリメラーゼにとって酵素活性とは、鋳型核酸鎖と相補的なポリヌクレオチド伸長産物を生成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を触媒する作用を指す。好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリティマ、サーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、サーマス・フィリホルミス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５、サーマス・カルドフィラス、バチルス・カルドテナクス、サーモトガ・ネアポリタナ及びサーモシフォ・アフリカヌス由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００４０】
「熱活性」という用語は、ＲＴ−ＰＣＲ及び／又はＰＣＲ反応における逆転写又はアニーリング／伸長工程で通常用いられる温度（すなわち、４５〜８０℃）で触媒機能を維持する酵素を指す。熱安定性酵素とは、核酸の変性に必要な高温にさらした際に、不可逆的に不活性化又は変性しないものである。熱活性酵素は熱安定性であってもなくてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、限定しないが、大腸菌、モロニーマウス白血病ウイルス及びトリ骨髄芽球症ウイルスを含む好熱性種又は中温性種由来のＤＮＡ又はＲＮＡ依存性であってよい。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列の部分配列の融合産物であるタンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列を直接操作することにより生成されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。特定の態様においては、例えば、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼの非改変型は、サーマス種ＤＮＡポリメラーゼ由来のアミノ末端（Ｎ末端）領域とＴｍａＤＮＡポリメラーゼ由来のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域からなるキメラタンパク質である。Ｎ末端領域は、Ｎ末端（１番目のアミノ酸）から内部アミノ酸までの領域をさす。同様に、Ｃ末端領域は、内部アミノ酸からＣ末端までの領域を指す。
【００４２】
「アプタマー」という用語は、米国特許第５,６９３,５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマー及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、例えば、Smith, E.S. et al, （Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thrmostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003)）に開示される。
【００４３】
変異ＤＮＡポリメラーゼに関する文脈において、別の配列（例えば領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置等）との「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号によるナンバリングをし、次いで配列同一性の割合を最大にするように配列をアラインメントする方法に基づく。「［特定の配列］の位置［Ｘ］に対応する」アミノ酸とは、特定された配列の同等のアミノ酸とアライメントする目的のポリペプチドにおけるアミノ酸を意味する。一般的に、本明細書に記載されるように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、下記に記載するアライメントアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴを用いて決定することができる。得られた「対応領域」内の全ての位置が同一である必要はないため、対応領域内の一致しない位置が「対応位置」とみなされる場合もある。したがって、本明細書で、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」といえば、他のＤＮＡポリメラーゼ、構造的類似体及びファミリーの中で、それらをアラインメントさせたものに基づいた同等の位置を指す。本発明の態様によっては、アミノ酸位置の「対応」を、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８の１つ以上のモチーフを含んでなるポリメラーゼの領域に対して決定する。ポリメラーゼのポリペプチド配列が配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８と異なる場合には（例えば、アミノ酸の変化又はアミノ酸の付加又は欠失により）、本明細書で述べる改良された活性に関与する特定の変異は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８のものと同じ位置番号にはないかもしれない。このことは、例えば、表１で示される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「組換え体」とは、組換え法により意図的に改変されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを指す。本明細書では、「組換え核酸」という用語は、一般的には制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常ない形で、元々はin vitroで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された変異ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常は結合しないＤＮＡ分子を結合させることによりin vitroで生成した発現ベクターは、どちらも本発明の目的の組換え体とみなす。一旦組換え核酸を生成し、宿主細胞中に再導入すれば、それは非組換え的に、すなわち、in vitroでの操作よりもむしろ宿主細胞のin vivoの細胞機構を使って複製するだろう；しかし、一旦組換えで生成されたそのような核酸は、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。
【００４５】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結しており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作用可能に連結している。
【００４６】
「宿主細胞」という用語は、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば細菌、酵母及び放線菌類）、そしてより高等の植物又は動物由来の単細胞を指す。
【００４７】
「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖のＤＮＡ断片を指し、外来ＤＮＡ断片がその中に挿入されていてもよい。又は、ベクターは例えば、プラスミド由来でもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来存在しないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に又はそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入ＤＮＡの複数のコピーを生成することができる。その上、ベクターは挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又は挿入ＤＮＡからＲＮＡの複数のコピーを複製する、必要な因子も含むことができる。発現ベクターの中には、発現したｍＲＮＡの半減期を長くし、かつ／又はｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列因子をさらに含むものもある。このように、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を、迅速に合成することができる。
【００４８】
「ヌクレオチド」という用語は、天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのモノマーを指すのに加え、本明細書中では、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、ヌクレオチドが用いられている個々の状況（例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション）に関して機能的に同等である、誘導体及び類似体を含む、関連するその構造的変異体も指すことが理解されるべきある。
【００４９】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指すと本明細書で理解される。これは、ＲＮＡやＤＮＡのようなヌクレオチドのポリマー、ならびに合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、任意で、明示された任意の配列に加え、相補的配列を含んでなるか、又はコードする。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約１７５の核酸モノマー単位、より典型的には約８〜約１００の核酸モノマー単位、さらにより典型的には約１０〜約５０の核酸モノマー単位（例えば約１５、約２０、約２５、約３０、約３５又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの要因によって決まる。オリゴヌクレオチドは場合により、限定しないが、既存の又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法；Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981)のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法；自動合成法；もしくは米国特許第４，４５８，０６６号の固相支持体法などの方法による直接化学合成、又は当業者に公知の他の方法を含む任意の適切な方法により調製される。
【００５１】
「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド伸長が開始する条件下（例えば適切な緩衝液中及び適切な温度又は温度サイクル（例えばポリメラーゼ連鎖反応でのような）で、必要なヌクレオシド三リン酸（コピーされる鋳型により決まる）の存在とポリメラーゼを含んでなる条件下）に置かれた時に、鋳型依存（鋳型−directed）の核酸合成の開始点として作用しうるポリヌクレオチドのことを指す。さらに例示すると、プライマーは様々な他のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばＲＮＡのde novo合成及びin vitro転写関連過程（例えば核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）等）の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適切な長さは、プライマーの企図される用途により決まるが、典型的には６〜４０ヌクレオチド、より典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマーを伸長させるために、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の態様においては、「プライマー対」という用語は、増幅させる核酸配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’センスプライマー（「フォワード」と呼ばれる場合もある）と、増幅させる配列の３’末端とハイブリダイズする３’アンチセンスプライマー（「リバース」と呼ばれる場合もある）とを含むプライマーのセットを意味する（例えば、標的配列がＲＮＡとして発現されるか、又はＲＮＡである場合）。プライマーは、必要であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出可能な標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡアッセイに汎用される）、ビオチン、又はそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
【００５２】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドについて述べる場合、「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの（すなわち、ＤＮＡの場合にはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）を指す。加えて、シークエンシングのような、in vitroでのＤＮＡ合成反応においては、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが頻繁に用いられ、ｄＡＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＡＴＰを用いることができる。それらをまとめて、ｄＮＴＰと呼んでもよい。
【００５３】
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドについて述べる場合、「特殊な」又は「改変された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に本来存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの改変、誘導、類似体を含む。特定の特殊なヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰと比較してリボース糖の２’位で改変されている。したがって、ＲＮＡの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド（すなわちＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、総称してｒＮＴＰ）だが、それらのヌクレオチドは、比較したらｄＮＴＰには存在しない、糖の２’位にヒドロキシル基を有するため、本明細書では、リボヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの基質としては特殊なヌクレオチドである。本明細書では、特殊なヌクレオチドとしては、限定しないが、核酸シークエンシングにターミネーター（terminator）として用いられる化合物が挙げられる。ターミネーター化合物の例としては、限定しないが、２’，３’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰは、まとめてｄｄＮＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物のその他の例としては、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体（例えば、米国特許出願公開第２００５／００３７９９１号及び第２００５／００３７３９８号を参照）が挙げられる。他の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［α−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−[α−ボラノ］−ｄＮＴＰ、[α]−メチルホスホネートｄＮＴＰ及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰ）が挙げられる。特殊な塩基は、32Ｐ、33Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ビオチンのようなハプテン標識；又は、ストレプトアビジンもしくはアビジンのような酵素標識により標識してもよい。蛍光標識としては、フルオレセインファミリーの色素のような負に帯電した色素、又はローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、又はシアニンファミリーの色素のような正に帯電した色素を挙げることができる。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、テキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド及びＴＡＭＲＡにより標識した様々な色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA)又はInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)より販売されている。シアニンファミリーの色素としてはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ７が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)により販売されている。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウを通して２つの最適にアラインメントさせた配列を比較することにより求められ、ここで比較ウィンドウ中の配列部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を調べて一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果を１００倍して配列同一性の割合を求めることにより算出する。
【００５５】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性」の割合という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、配列が同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定の割合で有する場合（例えば、特定の領域にわたって少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性）、配列は互いに「実質的に同一」である。これらが少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％の同一性を有する場合、配列は互いに「実質的に同一」である。それらの定義は、試験配列の相補体にも適用する。場合により、同一性は少なくとも長さ約５０ヌクレオチド、又はより典型的には長さ１００〜５００もしくは１０００以上のヌクレオチドの領域にわたって存在する。
【００５６】
２つ以上のポリペプチド配列に関する文脈における「類似性」又は「類似性の割合」という用語は、比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの１つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、保存されたアミノ酸置換により定義されるものと同一か又は類似のアミノ酸残基を特定の割合（例えば、特定領域にわたって６０％の類似性、場合により６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％の類似性）で有する、２つ以上の配列又は部分配列のことをいう。少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％又は少なくとも５５％が互いに類似している場合、配列は互いに「実質的に類似」している。場合により、この類似性は、少なくとも長さ約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約１００〜５００又は１０００以上のアミノ酸の領域にわたって存在する。
【００５７】
配列比較においては、通常１つの配列を参照配列とし、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータが通常用いられるが、代替パラメータを指定することもできる。そしてプログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性の割合を算出する。
【００５８】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか一つのセグメントを指すことを含み、ここでは、２つの配列を最適にアラインメントした後で、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。比較のための配列のアラインメント方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Watermanのローカルホモロジーアルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）、Needleman and Wunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）、Pearson and Lipmanの類似性検索法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（例えば、GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）又は手動での配列及び目視検査（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照）により実施できる。
【００５９】
配列同一性及び配列類似性の割合を求めるのに適切なアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられ、それらはそれぞれ、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)及びAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から市販されている。このアルゴリズムは、第１に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた際に、いくつかの正の値の閾値Ｔと一致する又は満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、高スコア配列ペア(ＨＳＰ)を同定する。Ｔを、近接(neighbourhood)文字列スコア閾値と呼ぶ（上述のAltschul el al.,)。これらの初期近接文字列のヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための初期検索の種（シード）として機能する。文字列のヒットは、各々の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加し得る限り両方向に伸長する。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータＭ（一致残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、累積スコアを計算するために使用される。各々の方向への文字列のヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最高値から量Ｘ減少した時、負のスコアの残基アラインメントの１つ以上の累積によって累積スコアがゼロ又はそれ以下になった時、又はいずれかの配列の末端に達した時に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラムは、（ヌクレオチド配列の場合）初期値として文字列の長さ（Ｗ）が１１、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合は、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として文字列の長さが３、期待値（Ｅ）が１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989参照)アラインメント(Ｂ)が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。
【００６０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムが提供する類似性の1つの基準は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。Ｐ（Ｎ）は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した最小和確率が約０．２未満、典型的には約０．０１未満、より典型的には約０．００１未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
【００６１】
「逆転写効率」という用語は、所定の逆転写反応において、ｃＤＮＡとして逆転写されるＲＮＡ分子の比率を指す。特定の態様では、本発明の変異ＤＮＡポリメラーゼは、これらのＤＮＡポリメラーゼの非改変の形態と比較して、改良された逆転写効率を有する。即ち、これらの変異ＤＮＡポリメラーゼは、特定の反応条件下でこれらの非改変の形態のものよりも高い比率でＲＮＡ鋳型を逆転写する。逆転写効率を、例えば、ＲＮＡ鋳型を用いたＰＣＲ反応のクロッシングポイント（Ｃｐ）を測定すること、及びそのＣｐ値と、ＲＮＡ及びＤＮＡ増幅が、例えば実施例に記載されるような共通のプライマーセット及び同一のポリメラーゼを使用する（ＵがＴに置き換えられることを除いて）同一の配列のＤＮＡ鋳型が増幅される対照反応のＣｐ値を比較することにより、測定することができる。ＲＮＡが鋳型として用いられる場合、試験ポリメラーゼが対照ポリメラーゼと比較して減少したＣｐ値を有するが、ＤＮＡが鋳型として用いられる場合、対照ポリメラーゼと比較して、実質的に変化していないＣｐ値を有する場合、試験ポリメラーゼは、改良されたＲＴ効率を有する。態様によっては、本発明のポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型に関して、Ｃｐが、対応する対照ポリメラーゼよりも少なくとも、１、２、３、４又は５単位少ない、改良されたＲＴ効率を有する。
【００６２】
「ミスマッチ耐性」という用語は、核酸に１以上のヌクレオチドを（例えば共有結合的に）付加することにより鋳型依存的に核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）を伸長する際に、ミスマッチ含有配列を許容するポリメラーゼの能力を意味する。用語「３’末端ミスマッチ耐性」とは、伸長される核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、プライマーの３’末端のヌクレオチドにおいてその鋳型内にミスマッチを有する場合に、（ほぼ相補的な）ミスマッチ含有配列を許容するポリメラーゼの能力を意味する。鋳型に対するミスマッチはまた、プライマーの３’末端から二番目のヌクレオチド、又はプライマーの配列内の別の場所に位置してもよい。
【００６３】
「ミスマッチ識別能」という用語は、１つ以上のヌクレオチドを核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）に（例えば、共有結合的に）付加することにより鋳型依存的に核酸を伸長する際に、完全に相補的な配列をミスマッチ含有配列から識別するポリメラーゼの能力を指す。「３’末端ミスマッチ識別能」という用語は、伸長させる核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、その核酸の３’末端にミスマッチを有する場合に、（ほぼ相補的な）ミスマッチ含有配列から完全に相補的な配列を識別するポリメラーゼの能力を指す。「ミスマッチ」という用語は、相補的な二重鎖形成（又は潜在的な二重鎖形成）配列ではない伸長における、１以上の塩基の不対合（又は「非相補的な塩基対合」）の存在を意味する。
【００６４】
「Ｃｐ値」又は「クロッシングポイント」値という用語は、標的核酸の投入量の定量ができる値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（second−derivative maximum method）（Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction," BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293）により求めることができる。二次導関数最大値法において、Ｃｐは二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは指数増大期の開始に相当する。二次導関数法により、リアルタイムの蛍光強度曲線の二次導関数値が算出され、１つの値のみが得られる。オリジナルのＣｐ法は、ある区間で定義された強度値の微分可能な近似、例えば、多項式関数によるものに基づく。その後三次導関数を算出する。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐはまたフィットポイント法（fit point method）を用いて求めることもでき、ここでは、Ｃｐは指数増大範囲における補助線（threshold line）との平行線の交点から求める（Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February2005, pp. 287-293）。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法による計算により、Rocheにより提供されるLightCycler装置により提供された。
【００６５】
「ＰＣＲ効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、式：ＰＣＲ効率（％）＝（１０(-傾き)−１）×１００を用いて、それぞれの条件で算出される。ここで、傾きは、ｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐを用いた直線回帰により算出した。ＰＣＲ効率を、完全一致鋳型プライマー又はミスマッチ鋳型プライマーを用いて測定することができる。
【００６６】
用語「核酸伸長速度」とは、生体触媒（例えば酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼ等）が、核酸に１以上のヌクレオチドを（例えば共有結合的に）付加することにより鋳型依存的又は鋳型非依存的に核酸（例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド）を伸長する速度を意味する。説明するように、本明細書で記載される特定の変異ＤＮＡポリメラーゼは、これらが、所定の反応条件下でこれらの非改変の形態と比較してより高い伸長速度においてプライマーを伸長することができるように、これらのＤＮＡポリメラーゼの非改変の形態と比較して改良された核酸伸長速度を有する。
【００６７】
用語「ＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性」とは、対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性又は逆転写活性を阻害する量の阻害剤の存在下において活性（ポリメラーゼ又は逆転写活性）を維持するポリメラーゼの能力を意味する。態様によっては、改良されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼ活性を実質的に排除する量の阻害剤の存在下において、ポリメラーゼ又は逆転写活性を有することができる。「対照ポリメラーゼ」とは、配列番号１の７０９番目に対応する位置にイソロイシン（Ｉ）を含むが、それ以外は改良されたポリメラーゼと同一であるポリメラーゼを意味する。
【００６８】
「５’ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも１つの発光標識部位を含んでなり、標的核酸の検出をする５’ヌクレアーゼ反応で用いられるオリゴヌクレオチドを指す。態様によっては、例えば、５’ヌクレアーゼプローブは、わずかに１つの発光部位（例えば、蛍光色素等）を含む。特定の態様においては、５’ヌクレアーゼプローブは、選択された条件下でプローブがヘアピン構造を形成することができるような自己相補的領域を含む。さらに例示すると、態様によっては、５’ヌクレアーゼプローブは少なくとも２つの標識部位を含んでなり、２つの標識のうち１つが開裂又はオリゴヌクレオチドから分離した後、発光強度が増す。特定の態様においては５’ヌクレアーゼプローブを、２つの異なる蛍光色素、例えば５’末端レポーター色素及び３’末端クエンチャー色素又は部位で標識する。態様によっては、５’ヌクレアーゼプローブを、末端部位以外の、又は末端位置に加えて１つ以上の部位で標識する。プローブがインタクトな状態であれば、典型的には、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的には消光されるように、２つの蛍光色素分子間でエネルギー転移が起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程で、例えば、鋳型核酸に結合した５’ヌクレアーゼプローブは、例えばＴａｑポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性により、レポーター色素の蛍光発光がこれ以上消光されないように開裂する。５’ヌクレアーゼプローブの例は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；米国特許第５，９９４，０５６号；及び米国特許第６，１７１，７８５号にも記載されている。他の態様においては、５’ヌクレアーゼプローブは、２つ以上の異なるレポーター色素と３’末端クエンチャー色素又は部位で標識してもよい。
【００６９】
「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー転移」又は「フェルスター共鳴エネルギー転移」という用語は、少なくとも二つの発色分子、ドナー発色分子及びアクセプター発色分子（クエンチャーと呼ぶ）間のエネルギー転移を指す。ドナーは通常、適切な波長の光放射により励起された時、アクセプターにエネルギーを転移する。アクセプターは通常、異なる波長での光放射の形で転移されたエネルギーを再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーの場合、転移されたエネルギーは光以外の形で放出される。特定の蛍光色素分子がドナー又はアクセプターとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対の他の要素の性質による。通常用いられるドナー−アクセプター対としては、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対が挙げられる。通常用いられるクエンチャーはＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。通常用いられるダーククエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー（BlackHole Quencher）（登録商標）（ＢＨＱ）、（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、アイオワブラック（Iowa Black）（登録商標）（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa）、及びブラックベリー（登録商標）クエンチャー６５０（ＢＢＱ−６５０））（BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.）が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、様々な細菌種由来の例示的なＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：サーマス種Ｚ０５（Ｚ０５）（配列番号１２）、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）（配列番号１３）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｆｉ）（配列番号１４）、サーマス・フラバス（Ｔｆｌ）（配列番号１５）、サーマス種ｓｐｓ１７（Ｓｐｓ１７）（配列番号１６）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号１７）、サーマス・カルドフィラス（Ｔｃａ）（配列番号１８）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号１９）、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｎｅ）（配列番号２０）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号２１）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｒａ）（配列番号２３）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂｓｔ）（配列番号２４）及びバチルス・カルドテナクス（Ｂｃａ）（配列番号２５）。さらに、示したポリペプチド領域は、アミノ酸モチーフＸ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌ（配列番号２６）を含んでなり、その可変位置は本明細書でさらに定義される。このモチーフは、各ポリメラーゼ配列において太字で強調されている。本発明にしたがって変異を受け入れるアミノ酸位置を、アスタリスク（＊）で示す。アライメントにおけるギャップをドット（.）で示す。
【００７１】
【図２】図２は、以下のＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の配列同一性を示す：サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）；サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）；デイノコッカス・ラディオデュランスＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｒａ）；サーモトガ・マリティマＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａ）；サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ）；サーモシフォ・アフリカヌスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｆ）；バチルス・ステアロサーモフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ）；及びバチルス・カルドテナクスＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ）。（Ａ）全ポリメラーゼＩ酵素にわたる配列同一性（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメインにわたる配列同一性。
【００７２】
【図３】図３は、様々なサーマス種ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素の配列同一性を示す：サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５）； サーマス・アクアティカスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）；サーマス・フィリホルミスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉ）；サーマス・フラバスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ）；サーマス種Ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｐｓ１７）；サーマス・サーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ）；サーマス・カルドフィラスＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｃａ）。（Ａ）全ポリメラーゼＩ酵素にわたる配列同一性（Ｚ０５のアミノ酸１〜８３４に対応する）；及び（Ｂ）Ｚ０５のアミノ酸４２０〜８３４に対応するポリメラーゼサブドメインにわたる配列同一性。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
本発明は、機能的なＤＮＡポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼドメイン中の１以上のアミノ酸に変異導入した、改良されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼの非改変の形態と比較して、（例えば、Ｍｎ2+及びＭｇ2+二価陽イオンの存在下で）増大した逆転写酵素効率、及び／又は増大したミスマッチ耐性、伸長速度、並びに逆転写酵素（ＲＴ）及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する活性酵素である。特定の態様では、変異ＤＮＡポリメラーゼは、親酵素として優れた又は同等の性能のために、低い濃度で用いてもよい。
【００７４】
逆転写をより効率的に行なうＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＲＮＡ標的を検出及び／又は定量するためのＲＴ−ＰＣＲを用いるアッセイに関する様々な用途において有用である。ＤＮＡポリメラーゼは、それ故、例えば、組み換えＤＮＡ研究及び疾患の医療診断における用途を含む、ポリヌクレオチド伸長及び鋳型ポリヌクレオチドの逆転写又は増幅に関する様々用途において有用である。変異ＤＮＡポリメラーゼはまた、変化しやすい配列（例えば、ウイルス標的、又は癌及び他の疾患の遺伝子マーカー）を有する検出標的のためのミスマッチに対するこれらの耐性のために、特に有用である。
【００７５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｘ14−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書において、１文字コードで、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌとも呼ぶ）；
ここで、
Ｘ1は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ2は、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＴｙｒ（Ｙ）であり；
Ｘ3は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＭｅｔ（Ｍ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）又はＡｓｐ（Ｄ）であり；
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｈｉｓ（Ｈ）又はＡｓｎ（Ｎ）であり；
Ｘ6は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｍｅｔ（Ｍ）又はＩｌｅ（Ｉ）であり；
Ｘ7は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ8は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ9は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＰｈｅ（Ｆ）であり；
Ｘ10は、Ｇｌｙ（Ｇ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ11は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｈｒ（Ｔ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＨｉｓ（Ｈ）であり；そして
Ｘ14は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＴｈｒ（Ｔ）である（配列番号８）。
【００７６】
態様によっては、Ｘ3は、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ又はＨから選択される。
【００７７】
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｇｌｕ−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｘa14−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書において、１文字コードで、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｅ−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｘ14−Ｔ−Ｌとも呼ぶ）；
ここで、
Ｘ1は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｓｐ（Ｄ）又はＳｅｒ（Ｓ）であり；
Ｘ2は、Ｔｒｐ（Ｗ）又はＴｙｒ（Ｙ）であり；
Ｘ3は、Ｉｌｅ（Ｉ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｌａ（Ａ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｌｎ（Ｑ）であり；
Ｘ6は、Ｔｈｒ（Ｔ）又はＶａｌ（Ｖ）であり；
Ｘ7は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＶａｌ（Ｖ）であり；
Ｘ8は、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ10は、Ｇｌｙ（Ｇ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ11は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）又はＧｌｕ（Ｅ）であり；
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；そして
Ｘ14は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＡｒｇ（Ｒ）である（配列番号９）。
【００７８】
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書において、１文字コードで、Ａ−Ｗ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｔ−Ｌとも呼ぶ）；
ここで、
Ｘ3は、Ｉｌｅ（Ｉ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＡｒｇ（Ｒ）であり；そして
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）である（配列番号１０）。
【００７９】
態様によっては、配列番号９又は配列番号１０のモチーフを含むＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２ではない。態様によっては、配列番号９又は配列番号１０の位置Ｘ3に対応するアミノ酸は、Ｌｅｕ（Ｌ）以外の任意のアミノ酸である。
【００８０】
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる：
Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ（本明細書において、１文字コードで、Ａ−Ｗ−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｔ−Ｌ−Ｅ−Ｅ−Ｇ−Ｒ−Ｘ12−Ｘ13−Ｇ−Ｙ−Ｖ−Ｅ−Ｔ−Ｌとも呼ぶ）；
ここで、
Ｘ3は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｙ（Ｇ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ4は、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＡｌａ（Ａ）であり；
Ｘ5は、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＧｌｙ（Ｇ）であり；
Ｘ12は、Ｌｙｓ（Ｋ）又はＡｒｇ（Ｒ）であり；そして
Ｘ13は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）である（配列番号１１）。
【００８１】
このモチーフは、多くのファミリーＡ型ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、特に好熱性細菌由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの「フィンガー」ドメインの中に存在する。（Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998）。例えば、図１は、以下のいくつかの細菌種由来のＤＮＡポリメラーゼの「フィンガー」ドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す：バチルス・カルドテナクス、バチルス・ステアロサーモフィラス、デイノコッカス・ラディオデュランス、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーマス・アクアティカス、サーマス・カルドフィラス、サーマス・フィリホルミス、サーマス・フラバス、サーマス種ｓｐｓ１７、サーマス種Ｚ０５及びサーマス・サーモフィルス。図示されるように、上記のモチーフに対応する天然の配列がこれらのポリメラーゼの各々に存在しており、ポリメラーゼのこの領域が保存された機能を有することが示唆される。図２は、これらのＤＮＡポリメラーゼの間の配列同一性を示す。
【００８２】
したがって、態様によっては、本発明は、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、本明細書に記載するように活性及び／又は特性が改良されているポリメラーゼを提供し、ここで、ＤＮＡポリメラーゼは、それ以外は、例えば、上記の好熱性細菌の任意の種由来のポリメラーゼのような野生型もしくは天然型のＤＮＡポリメラーゼであるか、又はそのような野生型もしくは天然型のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。一つの変形においては、ポリメラーゼの非改変型は、サーマス属の種由来である。本発明の他の態様では、非改変ポリメラーゼはサーマス以外の好熱性種、例えば、サーモトガ由来である。非常に多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの全核酸及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）（配列番号２）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）（配列番号６）、サーマス種Ｚ０５（配列番号１）、サーマス種ｓｐｓ１７（配列番号５）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）（配列番号３４）及びサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔａｆ）（配列番号３３）のポリメラーゼの各配列が、国際公開第９２／０６２００号で公開されている。サーマス・フラバス（配列番号４）由来のＤＮＡポリメラーゼの配列は、Akhmetzjanov and Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992) で公開されている。サーマス・カルドフィラス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号７）は、EMBL/GenBank Accession No. U62584で入手できる。サーマス・フィリホルミス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３）は、表１で提供される配列情報とともに、例えば米国特許第４,８８９,８１８号で提供された方法を用いて、ＡＴＣＣ受託番号４２３８０から得ることができる。サーモトガ・ネアポリタナＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３５）は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144及び国際公開第９７／０９４５１号のものである。バチルス・カルドテナクス由来の熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼの配列（配列番号３７）は、例えば、Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993; Swiss-Prot database Accession No. Q04957 and GenBank Accession Nos. D12982 and BAA02361も参照）に記載されている。本明細書に記載されるように改変できるＤＮＡポリメラーゼの非改変型の例はまた、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号；第６,３４６,３７９号；第７,０３０,２２０号；第６,８８１,５５９号；第６,７９４,１７７号；第６,４６８,７７５号；及び米国特許第７，１４８，０４９号；第７，１７９，５９０号；第７，４１０，７８２号；第７，３７８，２６２号にも記載されている。代表的な全長ポリメラーゼ配列はまた、本配列表でも提供されている。
【００８３】
すでに（例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失により）改変されている機能的なＤＮＡポリメラーゼもまた、本明細書で記載される変異に従う。態様によっては、そのような機能的に改変されたポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）、及び任意で配列番号３８のアミノ酸モチーフを保持する。したがって、好適な非改変のＤＮＡポリメラーゼはまた、野生型又は天然型のポリメラーゼの機能的な変異体を含む。かかる変異体は、典型的には、野生型又は天然型ポリメラーゼと実質的な配列同一又は配列類似性、少なくとも８０％の配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するだろう。
【００８４】
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなるポリメラーゼドメインを有し、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｚ０５の１〜２９１番目に対応する）をも含んでなる。
【００８５】
態様によっては、本発明のポリメラーゼはキメラポリメラーゼであり、すなわち、２つ以上の酵素由来のポリペプチド領域を含んでなる。そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第６，２２８，６２８号に記載されている。特に適切なものは、キメラＣＳファミリーＤＮＡポリメラーゼであり、それにはＣＳ５（配列番号２７）、ＣＳ６（配列番号２８）ポリメラーゼ、及び配列番号２７又は配列番号２８と実質的なアミノ酸配列同一性又は類似性（典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性）を有するその変異体が含まれ、したがって、それらは配列番号８を含むように改変することができる。ＣＳ５及びＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５及びサーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素のＮ末端５’ヌクレアーゼドメインとＴｍａ酵素のＣ末端３’−５’エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインを含んでなる。これらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰならびにフルオレセイン及びシアニン色素ファミリーで標識されたｄＮＴＰを組み込むことができる。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼは効率的なＭｇ2+活性化ＰＣＲ酵素でもある。ＣＳ５及びＣＳ６キメラポリメラーゼは、さらに例えば、米国特許第７，１４８，０４９号に記載されている。
【００８６】
態様によっては、アミノ酸置換は一つのアミノ酸置換である。本明細書で提供されるＤＮＡポリメラーゼは、非改変のポリメラーゼと比較して、活性部位において１以上のアミノ酸置換を含むことができる。態様によっては、アミノ酸置換は、配列番号８に記載されるモチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）の少なくともＸ3の位置に含む。この位置におけるアミノ酸置換は、非改変のポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を与え、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する変異ＤＮＡポリメラーゼを生ずる。典型的に、Ｘ3の位置におけるアミノ酸は、配列番号８に記載されるモチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）内の天然の配列に対応しないアミノ酸で置換される。したがって、典型的に、Ｘ3の位置におけるアミノ酸は、置換される場合、天然のポリメラーゼにおいてこれらの位置に生ずるようなＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＭｅｔ（Ｍ）ではない。例えば、図１を参照のこと。特定の態様では、アミノ酸置換は、Ｘ3の位置において、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ｒ又はＨを含む。特定の態様では、アミノ酸置換は、Ｘ3の位置においてリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、グリシン（Ｇ）又はアラニン（Ａ）を含む。１以上の同定される部位における他の好適なアミノ酸置換を、例えば、部位特異的変異誘発、及び本明細書でさらに記載されるアッセイにおけるポリヌクレオチド伸長性能の決定の既知の方法、あるいは当業者に知られている他のものを用いて決定することができる。
【００８７】
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０又は１１を含んでなり、さらに、天然のポリメラーゼと比較して１つ以上の追加のアミノ酸の変化（例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失による）を含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは、配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）を保持し、さらに、以下のように配列番号３８のアミノ酸モチーフ（Ｚ０５（配列番号１）のＤ５８０Ｘ変異に対応する）を含んでなる：
Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（本明細書において、１文字コードで、Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘ7−Ｘ8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎとも呼ぶ）
ここで、Ｘ7は、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＴｈｒ（Ｔ）であり；
Ｘ8は、Ａｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）以外の任意のアミノ酸である（配列番号３８）。
【００８８】
配列番号３８により特徴づけられる変異は、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１４８８９１号でより詳細に述べられている。かかる機能的な変異体ポリメラーゼは、典型的には、野生型又は天然型のポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８）と実質的な配列同一性、又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
【００８９】
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号８、９、１０、又は１１を含み、さらに、天然のポリメラーゼと比較して１以上の更なるアミノ酸変化（例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失による）を含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは配列番号８のアミノ酸モチーフ（又は配列番号９、１０又は１１のモチーフ）を保持し、さらに、以下のように配列番号２９のアミノ酸モチーフ（Ｚ０５（配列番号１）のＩ５８８Ｘ変異に対応する）を含んでなる：
Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｘ1−Ｐｒｏ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇｌｙ（本明細書において、１文字コードで、Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ−Ｘ1−Ｐ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｇとも呼ぶ）；
ここで、
Ｘ1は、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ2は、Ｉｌｅ（Ｉ）又はＶａｌ（Ｖ）以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ3は、Ａｒｇ（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ）であり；
Ｘ4は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）又はＬｅｕ（Ｌ）であり；
Ｘ5は、Ｐｒｏ（Ｐ）又はＧｌｕ（Ｅ）であり；そして
Ｘ6は、Ｌｅｕ（Ｌ）又はＧｌｕ（Ｅ）である（配列番号２９）。
【００９０】
態様によっては、そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ（例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、３２、３３、３４、３５、３６、３７又は４８）と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
【００９１】
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、Ｘ3の位置に（例えば、配列番号８、９、１０又は１１から選択されるモチーフにおいてのような）アミノ酸置換を含んでなり、配列番号３８及び配列番号２９に対応するアミノ酸置換を含んでなる。
【００９２】
１以上の同定された部位における他の好適なアミノ酸置換を、例えば、部位特異的変異誘発、及び本明細書、又は当業者に知られている他のもの、例えば、米国特許出願第２００９／０１４８８９１号及び第２００９／０２８０５３９号に記載されるアミノ酸置換に記載されるアッセイにおけるポリヌクレオチド伸長性能の決定の既知の方法を用いて決定される。
【００９３】
ＤＮＡポリメラーゼの正確な長さは変わるので、Ｘ3（例えば、配列番号８、９、１０及び１１のもの）、Ｘ8（配列番号３８のもの）及びＸ2（配列番号２９のもの）のそれぞれに対応する正確なアミノ酸位置は、使用する特定の変異ポリメラーゼにより変化しうる。アミノ酸及び核酸配列アラインメントプログラムは容易に入手でき（例えば、上述のもの参照）、本明細書で同定された特定の得られたモチーフが、本発明に従った改変のための正確なアミノ酸（及び対応するコドン）を同定するのに役立つ。代表的なキメラ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける、Ｘ3、Ｘ8及びＸ2のそれぞれに対応する位置を表１に示す。
【００９４】
表１．例示的なポリメラーゼにおけるモチーフの位置Ｘ3（例えば、配列番号８、９、１０及び１１のもの）、Ｘ8（配列番号３８のもの）及びＸ2（配列番号２９のもの）に相当するアミノ酸の位置
【表１】
0006023173.tif 000002
【００９５】
態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号１）由来又はその変異体（例えば、Ｄ５８０Ｇ変異等）である。上述したように、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼにおいては、Ｘ3の位置は７０９番目のイソロイシン（Ｉ）に対応し；Ｘ8の位置は５８０番目のアスパラギン酸（Ｄ）に対応する。このように本発明の特定の変形において、変異ポリメラーゼは、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼに対し、Ｉ７０９及び/又はＤ５８０において、少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる。従って、典型的には、７０９番目のアミノ酸は、Ｉではない。態様によっては、７０９番目のアミノ酸は、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｒ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、又はＨから選択される。特定の態様においては、７０９番目のアミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｇ、又はＡである。特定の態様においては、Ｄ５８０の位置のアミノ酸残基は、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択されうる。さらに、特定の態様では、配列番号１の５８８番目のアミノ酸は、Ｉ以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号１の５８８番目のアミノ酸は、Ｌ、Ｖ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＨから選択される。態様によっては、配列番号１の５８８番目のアミノ酸は、Ｔである。
【００９６】
代表的なサーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体の例としては、アミノ酸置換Ｉ７０９Ｋ（又はＩ７０９Ｒ、Ｉ７０９Ｓ、Ｉ７０９Ｇ、Ｉ７０９Ａ）、及び／又はＩ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇを含んでなるものが挙げられる。態様によっては、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換Ｉ７０９Ｋ（又はＩ７０９Ｒ、Ｉ７０９Ｓ、Ｉ７０９Ｇ、Ｉ７０９Ａ）、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇを含んでなる。態様によっては、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換Ｉ７０９Ｋ及びＤ５８０Ｇ、又はＩ７０９Ｒ及びＤ５８０Ｇ、Ｉ７０９Ｓ及びＤ５８０Ｇ、Ｉ７０９Ｇ及びＤ５８０Ｇ、又はＩ７０９Ａ及びＤ５８０Ｇを含んでなる。態様によっては、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換Ｉ７０９Ｋ及びＩ５８８Ｔ、又はＩ７０９Ｒ及びＩ５８８Ｔ、Ｉ７０９Ｓ及びＩ５８８Ｔ、Ｉ７０９Ｇ及びＩ５８８Ｔ、又はＩ７０９Ａ及びＩ５８８Ｔを含んでなる。特定の態様では、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、Ｉ７０９Ｋ、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、例えば、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、Ｉ７０９Ｒ、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、Ｉ７０９Ｓ、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、Ｉ７０９Ｇ、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、Ｉ７０９Ａ、Ｉ５８８Ｔ、及び／又はＤ５８０Ｇから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。
【００９７】
本明細書に記載される配列番号８、９、１０、１１、２９及び３８のモチーフの変異に加えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、他の置換によらない改変を含むことができる。かかる改変は、例えば、ポリヌクレオチド伸長を含む適用において更なる利点を与えることが当業者に知られている共有結合修飾を含んでもよい。例えば、そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、典型的にポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。かかる熱可逆的な修飾のための典型的な試薬は、米国特許出願第５，７７３，２５８号、及び第５，６７７，１５２号に記載される。
【００９８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、対応する非改変ポリメラーゼ（例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼの由来となっている対応する変異体）をコードするＤＮＡ配列を、部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を用いて変異させることにより生成することができる。ポリメラーゼの非改変型をコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により変異させることができる（例えば、PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990参照）。
【００９９】
非限定的な例として、ポリメラーゼの非改変型をコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入するために、クロンテック（Clontech）の部位特異的変異導入キット（Transformer Site-Directed Mutagenesis kit）を用いた２プライマー法を採用してもよい。この方法で標的プラスミドを変性した後、２つのプライマーを同時にそのプラスミドにアニーリングさせる；これらのプラスミドのうちの一方は所望の部位特異的変異を含み、他方は制限部位を削除する、プラスミド中の別の箇所の変異を含む。その後第二鎖合成を行い、これらの二つの変異をしっかりと連結し、得られたプラスミドで大腸菌ｍｕｔＳ株を形質転換する。形質転換した菌からプラスミドＤＮＡを単離し、関連する制限酵素で切断し（これにより変異していないプラスミドを線状化する）、次いで大腸菌を再び形質転換する。この方法を用いれば、サブクローニング又は一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミドに直接変異を生成できる。２つの変異の強固な連結及びそれに続く変異していないプラスミドの線状化により高い変異効率が得られ、最小限のスクリーニングが可能になる。最初の制限部位プライマーを合成すれば、後はこの方法では変異部位当たりたった１つの新規プライマー型の使用が必要なだけである。それぞれの位置の変異体を個別に調製するよりも、定められた部位に所望の変異の全てを同時に導入するために、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーセットを合成することができる。変異誘発された領域を含めてプラスミドＤＮＡの配列を決定し、変異体クローンを同定、選別することにより、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで各変異ＤＮＡを切断し、例えばMutation Detection Enhancement gel(Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）での電気泳動により分析して、配列中に他の変更が起こらなかったことを確かめる（変異誘発しなかった対照とのバンドシフトの比較による）。又は、全ＤＮＡ領域の配列を決定して、標的領域の外側で追加の変異現象が起こらなかったことを確かめることができる。
【０１００】
１つより多いアミノ酸が置換されたＤＮＡポリメラーゼは、様々な方法で生成することができる。ポリペプチド鎖中で互いに近接した位置にあるアミノ酸の場合、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを変異させてもよい。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて位置している（例えば、１０アミノ酸を超えて離れている）場合、所望の変化の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを生成するのはより困難である。その代わりに、２つの代替法の１つを使用してもよい。第一の方法では、置換する各アミノ酸のために、個別にオリゴヌクレオチドを生成する。次にそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングさせれば、鋳型から合成されるＤＮＡの第二鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。別の方法では、所望の変異体を生成する２ラウンド以上の変異誘発を行う。第一ラウンドは、１つの変異について記載された通りである：非改変ポリメラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせ、次にヘテロ二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。変異誘発の第二ラウンドでは、変異誘発の第一ラウンドで生成した変異したＤＮＡを鋳型として使用する。このように、この鋳型はすでに１つ以上の変異を含む。次に、追加の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアリーリングすれば、得られたＤＮＡ鎖は、変異誘発の第一及び第二ラウンドの両方からの変異をコードすることとなる。この得られたＤＮＡは変異誘発の第三ラウンド等で鋳型として使用できる。あるいは、Seyfang & Jin（Anal. Biochem. 324:285-291, 2004）の多部位変異誘発法を使用してもよい。
【０１０１】
したがって、本発明のＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸もまた提供される。ＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を用いて、様々なベクターを生成することができる。宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと調節配列を含む任意のベクターを、本発明の実施に用いることができる。一般的に発現ベクターは、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸と作用可能に連結された転写及び翻訳調節核酸領域を含む。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物において、作用可能に連結されたコード配列が発現するのに必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な調節配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。さらに、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を長くするPositive Retroregulatory Element(ＰＲＥ)を含んでもよい（Gelfand et al.,米国特許第４，６６６，８４８号参照）。転写及び翻訳調節核酸領域は、ポリメラーゼを発現させるために用いる宿主細胞に一般的に適したものである。様々な宿主細胞のための、非常に多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当業界において公知である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な態様では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは通常、外来ＤＮＡの挿入のための複数の制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の態様においては、精製及び、所望であれば、続けて行うＦＬＡＧタグ配列の除去を容易にするために「融合フラッグ」、例えば「Ｈｉｓタグ」が用いられる。しかしながら、一般的に、「加熱工程」を使用できる中温性宿主（例えば、大腸菌）から熱活性及び／又は熱安定性タンパク質を精製する際には、それらは不要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び対象となるポリメラーゼをコードするＤＮＡを含む適切なベクターの生成は、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて行われる。当業界で周知のように（例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、NY、2nd ed. 1989)参照）、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びＤＮＡ断片を切断し、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを生成する。
【０１０２】
特定の態様においては、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができ、こうした耐性遺伝子により、それらのベクターで形質転換された細胞がそれらの抗生物質の存在下で増殖できるようになる。
【０１０３】
本発明の一つの面においては、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞内に導入される。本明細書で使用する場合、「に導入される」又はその文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び／又は発現に適切な方法で細胞内に入ることを意味する。導入の方法は、標的となる細胞の種類により大きく異なる。導入方法の例としては、ＣａＰＯ4沈澱、リポソーム融合、LIPOFECTIN（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染等が挙げられる。
【０１０４】
態様によっては、本発明の最初のクローニング工程の宿主として、典型的に、原核生物が用いられる。それらは、大量のＤＮＡの迅速な生成、部位特異的変異誘発に用いる一本鎖鋳型ＤＮＡの生成、多数の変異体の同時スクリーニング、及び生成された変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、大腸菌Ｋ１２株９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１，４４６）、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣＮｏ．２７，３２５）、大腸菌Ｋ１２株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３，６０６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１，５３７）及び大腸菌Ｂが挙げられる；しかし、他の多くのＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のような大腸菌株、及び、枯草菌（Bacillus subtilis）のようなバチルス属、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）又はセラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）のような他の腸内細菌、様々なシュードモナス（Pseudomonas）種を含む他の多くの原核生物の種及び属は、どれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、通常上述のsection 1.82 of Sambrook et al.に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物の形質転換技術は、例えばDower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol, 204:63, 1991に記載されている。大腸菌の形質転換に通常用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣＩ８、ｐＵＣＩ９、ｐＵＣＩ１８、ｐＵＣ１１９及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３が挙げられ、それらは全て上述のsections 1.12-1.20 of Sambrook et al.に記載されている。しかし、他の多くの適切なベクターも同様に利用可能である。
【０１０５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、典型的に、ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適切な条件下で培養することにより生成する。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適切な条件下で培養する方法は、当業界で周知である（例えば前述のSambrook et al.参照）。ラムダｐＬプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に適切な宿主細胞としては、大腸菌株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣＮｏ．５３６０６）（米国特許第５，０７９，３５２号及びLawyer, F.C.et al., PCR Method and Applications 2:275-87, 1993参照）が挙げられる。発現後、ポリメラーゼを回収、単離することができる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法は、例えば前述のLawyer et al.に記載されている。一度精製されると、改良されたＲＴ効率、増大したミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性の能力を（例えば、実施例において記載されるように）試験することができる。
【０１０６】
本発明の改良ＤＮＡポリメラーゼは、この種の酵素活性が必要又は所望である任意の目的に使用してよい。したがって、本発明の別の面においては、ポリメラーゼを用いたポリヌクレオチド伸長の方法（例えば、ＰＣＲ）が提供される。ポリヌクレオチド伸長に適切な条件は、当業界で公知である（例えば、上述のSambrook et al.参照。Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed.,John Wiley & Sons 1999)も参照）。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、すなわちハイブリダイズさせて、プライマー−鋳型複合体を形成させる。プライマー−鋳型複合体を適切な環境下でＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、プライマーの３’末端に１つ以上のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成する。プライマーとしては、例えば、１つ以上のヌクレオチド類似体を挙げることができる。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又は標識されたヌクレオチド）又はその混合物でありうる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー対を用いた核酸増幅に適切な条件もまた、当業界で公知である（例えば、ＰＣＲ増幅法）。（例えば、上述のSambrook et al.,；上述のAusubel et al.,； PCR Applications： Protocols for Functional Genomics （Innis et al. eds., Academic Press 1999参照））。他の相互排他的でない実施形態では、ポリヌクレオチド伸長反応は、ＲＮＡ鋳型の逆転写を含む（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）。態様によっては、改良されたポリメラーゼは、４５４シークエンシングにおける使用が見出される（Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380を参照のこと）。
【０１０７】
任意で、プライマー伸長反応は、参照又は非改変のポリメラーゼの実際のあるいは潜在的な阻害剤を含む。阻害剤は、例えば、参照又は非改変の（対照）ポリメラーゼの核酸伸長速度及び／又は逆転写効率を阻害することができる。態様によっては、阻害剤は、ヘモグロビン又はこの分解産物である。例えば、態様によっては、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンである。態様によっては、阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の態様では、阻害剤はヘパリンである。特定の態様では、阻害剤は、インターカレート染料である。特定の態様では、阻害剤は、ポリメラーゼ阻害剤として記載されているメラニンである。例えば、Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)を参照のこと。
【０１０８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ阻害剤、例えば血液を含むサンプルから単離された鋳型ポリヌクレオチドの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、血液の主成分であるヘモグロビンの存在下で、又はヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘモグロビンは、様々なヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンに分解され得る。従って、特定の態様では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、限定することなく、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンを含む、ヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。特定の態様では、ヘモグロビン分解産物は、ヘミンである。態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約０．５〜２０．０μＭ、約０．５〜１０．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約１．０〜１０．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、又は約２．０〜３．０μＭのヘミンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、２０．０又は２０μＭ超のヘミンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘモグロビンの分解産物は、鉄キレート剤及び紫色色素を含む。従って、態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、鉄キレート剤及び／又は紫色色素の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼにより同一の鋳型の伸長を阻害する量のヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。
【０１０９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘパリンは、一般的に、血液から単離されたサンプルにおいて抗凝固因子として存在する。態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、約１．０〜４００ｎｇ／μｌ、１．０〜３００ｎｇ／μｌ、１．０〜２００ｎｇ／μｌ、５．０〜４００ｎｇ／μｌ、５．０〜３００ｎｇ／μｌ、５．０〜２００ｎｇ／μｌ、１０．０〜４００ｎｇ／μｌ、１０．０〜３００ｎｇ／μｌ又は１０．０〜２００ｎｇ／μｌヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。態様によっては、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎｇ／μｌ、又は４００ｎｇ／μｌ超のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、参照又は対照ＤＮＡポリメラーゼにより同一の鋳型の伸長を阻害する量のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。
【０１１０】
態様によっては、本発明の改良されたポリメラーゼは、逆転写反応に用いられる。態様によっては、逆転写反応は、ＲＮＡ鋳型、１以上のプライマー、及び本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含んでなる混合物中で行なわれる。反応混合物は、典型的に、全て４つの標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸、及び二価陽イオン、及び一価の陽イオンを含むバッファを含んでなる。陽イオンの例としては、例えば、Ｍｇ2+挙げらるが、他の陽イオン、例えばＭｎ2+又はＣｏ2+もまた、ＤＮＡポリメラーゼを活性化することができる。他の態様では、逆転写反応は、本発明の熱活性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行なってもよい。特定の実施形態では、本発明の改良されたポリメラーゼは、実施例に記載されるような、Ｍｎ2+又はＭｇ2+の存在下でのＤＮＡ鋳型の効率的な増幅を妥協することなく、ＲＮＡ鋳型のより効率的な増幅を可能にする。
【０１１１】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける最も効率的なＲＴ活性は、二価金属イオン活性化因子としてをＭｎ2+用いて達成される。しかしながら、反応中にＭｎ2+が存在する場合、ＤＮＡポリメラーゼの正確性は低くなることがよく知られている。変異の生成を試みない限り、一般的に、高い正確性を維持することが好まれる。幸いなことに、最も従来通りの配列決定、ＰＣＲ、及びＲＴ−ＰＣＲ増幅は、検出システムが一般的に、生成物の集合で判断するため、高い正確性条件を必要としない。次世代の配列決定であるデジタルＰＣＲ等の出現に伴い、生成物の正確性はより重要となり、高い正確性のＤＮＡ合成を可能にする方法は、重要である。二価金属イオン活性化因子としてＭｇ2+を用いて効率的なＲＴ活性を達成することは、ＤＮＡポリメラーゼの正確性を実質的に向上させ、核酸標的のより信頼できる複製を可能にする優れた方法である。
【０１１２】
本明細書に記載されるポリメラーゼは、増加したミスマッチ耐性を有し得るので、該ポリメラーゼは、標的鋳型の変化が起こりやすいが、鋳型が、標的鋳型における変異に関わらず増幅することが望まれる方法において、用途を見出す。かかる鋳型の例としては、例えば、ウイルス、細菌、又は他の病原体配列が挙げられる。多くの実施形態では、感染している個体が有する正確なウイルス変形に関わらず、個体（ヒト又はヒト以外の動物）がウイルス又は他の感染を有しているか否かを単に決定することが望まれる。例としては、個体を感染させる特定のウイルスが、プライマーハイブリダイゼーション部位においてミスマッチをもたらす変異を有する場合であっても、本発明のポリメラーゼを用いたＨＣＶを増幅するためにプライマー対を使用することができ、ＨＣＶの存在を検出することができる。
【０１１３】
標的核酸は、生物学的起源又は合成的起源に由来してもよい。標的は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡでもよい。一般的に、増幅産物が生成される場合、増幅産物はＤＮＡからなるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドはまた、蔵副産物に組み込まれ得る。ＲＮＡを検出することを望む場合、増幅プロセスは、典型的に、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む、逆転写の使用に関する。
【０１１４】
特定の標的配列としては、例えば、ウイルス核酸（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、パルボウイルスＢ１９、エプスタイン・バールウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マリーバレー脳炎ウイルス、及びクンジンウイルス）、細菌核酸（例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、熱帯熱原虫（Plasmodium falciparum）、クラミジア・ムリダルム（Chlamydia muridarum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis））、マイコバクテリア核酸、真菌核酸、又は動物若しくは植物由来の核酸が挙げられる。態様によっては、標的核酸は、動物（例えば、ヒト）核酸であり、動物（例えば、ヒト）サンプル由来でもよい（即ち、ウイルス又は他の病原生物核酸は、動物生検からのサンプル、血液サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、唾液等中に存在してもよい）。態様によっては、標的核酸は、例えば、疾患（例えば、癌、糖尿病等）に関連する変化を含み得るヒト遺伝子領域である。態様によっては、本発明のポリメラーゼがミスマッチ耐性を有するので、かかる酵素は、例えば、関連する配列の多様性が標的配列中に存在する場合、特に有用である。例としては、配列中の変化が知られている又は変化が起こる可能性が高いウイルスゲノム、又は癌若しくは他の疾患の遺伝子マーカーの大部分あるいは全てを増幅する一つの又は少数のプライマーを設計することをこれらのゲノムにおいて困難、又は不可能にするのに十分な変形を有するウイルス病原体を検出するために用いることができる。
【０１１５】
本明細書に記載する改良ポリメラーゼを用いた、伸長産物又は増幅産物の他の検出方法としては、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素又は蛍光二本鎖ヌクレオチドインターカレーション色素の使用が挙げられる。蛍光二本鎖ＤＮＡ結合色素の例としては、ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ（Molecular Probes）が挙げられる。二本鎖ＤＮＡ結合色素は、プライマー伸長産物及び／又は増幅産物を測定する融解曲線分析と併せて使用できる。融解曲線分析は、ＡＢＩ５７００／７０００（９６ウェル型）又はＡＢＩ７９００（３８４ウェル型）装置のようなリアルタイムＰＣＲ装置と搭載ソフトウェア（ＳＤＳ２．１）を用いて行うことができる。もしくは、融解曲線分析はエンドポイント分析として行うこともできる。融解曲線分析の方法の例が米国特許出願公開第２００６／０１７２３２４号に記載されている。
【０１１６】
本発明の別の面では、本明細書に記載するプライマー伸長方法に用いられるキットが提供される。態様によっては、キットは、使用の簡易性のために区分され、本発明にしたがって改良されたＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含む。追加の試薬を提供する１つ以上の追加の容器を含むこともできる。態様によっては、キットは、血液回収チューブ、容器、又はヘパリン若しくはこれらの塩を含む、又は溶液にヘパリンを放出するユニットを含んでもよい。血液回収ユニットは、ヘパリン化したチューブでもよい。そのような追加の容器は、上述の方法にしたがったプライマー伸長法で用いる当業者に認識された任意の試薬又は他の要素を含むことができ、それには、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬が含まれる。例えば、特定の態様においては、キットはさらに、プライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマー及び対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を提供する容器を含む。他の相互排他的でない変形においては、キットは（従来の及び／又は特殊な）ヌクレオシド三リン酸を提供する１つ以上の容器を含む。特定の態様では、キットは、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、及び／又は例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。さらに他の相互排他的でない態様においては、キットは、プライマー伸長反応に適切な緩衝液を提供する１つ以上の容器を含む。
【０１１７】
本発明の別の面においては、反応混合物は、本明細書に記載されるように、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに／又はＲＴ及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するポリメラーゼを含んで提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング法又はＤＮＡラベリング法で用いる試薬をさらに含むことができる。例えば、特定の態様においては、反応混合物はプライマー伸長反応に適切な緩衝液を含んでなる。反応混合物はまた、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む）、塩類（例えば、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+）、標識（例えば、蛍光色素分子）を含むこともできる。態様によっては、反応混合物はプライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な５’センスプライマー、又は５’センスプライマー及び対応する３’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を含む。態様によっては、反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートｄＮＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＩＴＰ、及び／又は例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーｄＮＴＰのような標識されたｄＮＴＰを含む。態様によっては、反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含んでなる。例えば、特定の態様では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン（hematophoryn）、及びビリルビンを含んでなる。他の態様では、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含んでなる。他の態様では、鋳型核酸はＲＮＡであり、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例は本発明を例示するために提供されるが、何ら限定するものではない。
【０１１９】
実施例１：ライブラリー生成
簡単に言えば、このスクリーニング過程における工程には、ライブラリー作成、変異酵素の発現及び部分精製、所望の性質をもつ酵素のスクリーニング、ＤＮＡシークエンシング、クローン精製、選択された変異体候補のさらなる特性評価が含まれた。これらの工程のそれぞれについて、以下にさらに説明する。
【０１２０】
クローンライブラリー作成：Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩ制限部位の間でエラープローン（変異誘発）ＰＣＲにかけた。増幅した配列を配列番号３９とした。これに用いたプライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：５’−ＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡ−３’（配列番号３０）；及び
リバースプライマー：５’−ＡＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＣＧＴＧＴＡＡ−３’（配列番号３１）。
【０１２１】
様々な変異率のライブラリーを作成するために、１．８〜３．６ｍＭのＭｇ2+濃度の範囲でＰＣＲを実施した。緩衝液条件は、５０ｍＭビシンｐＨ８．２、１１５ｍＭ  ＫＯＡｃ、８％ｗ／ｖグリセロール、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰであった。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＡｃｃｕＲＴホットスタートＰＣＲ酵素を０．１５Ｕ/μＬで使用した。反応容量５０μＬ当たり５×１０5コピーの線状化Ｚ０５  Ｄ５８０ＧプラスミドＤＮＡで開始し、９４℃、６０秒で変性させ、続いて変性温度９４℃で１５秒、アニーリング温度６０℃で１５秒、伸長温度７２℃で１２０秒の条件で３０サイクルの増幅を行い、最後に７２℃で５分間最終伸長を行った。
【０１２２】
得られた増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA）で精製し、ＢｌｐＩ及びＢｇｌＩＩで切断し、次いでＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで再び精製した。Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇベクタープラスミドは、同じ２つの制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ、組換え体（RAS, cat＃03359123001）で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製することにより調製した。切断したベクターと変異した挿入断片を１：３の比で混合し、室温で５分間Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより処理した（ＮＥＢ  Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ（登録商標）キット）。ライゲーションしたものをＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キットで精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌宿主株を形質転換した。
【０１２３】
各形質転換における特徴的な形質転換体の数を調べるために、発現した培養物の一部をアンピシリン選択培地にまいた。形質転換体は、凍結保護物質としてのグリセロールの存在下−７０℃〜−８０℃で保存した。
【０１２４】
次に、各ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天培地にまいた。個々のコロニーを、自動コロニーピッカー（QPix2, Genetix Ltd）を用いて、アンピシリンと１０％ｗ／ｖグリセロールを含む２×Luriaブロスの入った３８４ウェルプレートに移した。それらのプレートを３０℃で一晩インキュベートして培養物を増殖させ、その後−７０℃〜−８０℃で保存した。２×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分なほど少量だったが、凍結保護のためには十分多い量だった。後に使用するために、この方法により複数の変異誘発（Ｍｇ2+）レベルで数千個のコロニーを調製した。
【０１２５】
抽出物ライブラリー調製１−発酵：上述のクローンライブラリーから、スクリーニング用に適切な、部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この過程の第一工程は、各クローンの小規模の発現培養物を生成することであった。それらの培養物を９６ウェルフォーマットで増殖させた；したがって、３８４ウェルライブラリープレート毎に４枚の発現培養物プレートとなった。０．５μＬをクローンライブラリープレートの各ウェルから、１５０μＬの培地Ａ（下記表３を参照）を含む９６ウェルの種プレートのウェルへと移した。この種プレートを、ｉＥＭＳプレートインキュベーター／シェーカー（ThemoElectron）中で、１１５０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪培養した。次に、それらの種培養物を同じ培地に接種するのに用い、今度は大型の９６ウェルプレート（Nunc #267334）の２５０μＬの培地Ａ中に２０μＬを接種した。それらのプレートを３７℃で一晩振盪しながらインキュベートした。発現プラスミドは、３７℃で発現するが３０℃では発現しない転写調節因子を含んでいた。一晩インキュベートした後、培養物は典型的には全細胞タンパク質の１〜１０％でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により回収した。それらの細胞を凍結するか（−２０℃）又は後述するようにすぐに処理した。
【０１２６】
表２．培地Ａ（使用前に濾過滅菌したもの）
【表２】
0006023173.tif 000003
【０１２７】
抽出物ライブラリー調製２−抽出：発酵工程で得た細胞ペレットを２５μＬの溶解緩衝液（下記表３)中に再懸濁し、３８４ウェルのサーモサイクラープレートに移して密閉した。なお、緩衝液は細胞溶解を補助するためにリゾチームを含み、抽出物からＤＮＡを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を含む。細胞を溶解させるために、プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、−２０℃で一晩凍結し、３７℃で１５分間再びインキュベートした。硫酸アンモニウムを添加し（２Ｍ溶液を１．５μＬ）、外来的に添加されたヌクレアーゼを含む汚染タンパク質を沈澱、不活性化させるために、プレートを７５℃で１５分間インキュベートした。プレートを３０００×ｇで１５分間、４℃で遠心し、上清を新しい３８４ウェルサーモサイクラープレートに移した。それらの抽出物プレートを後にスクリーニングで使用するために−２０℃で凍結した。各ウェルには約０．５〜３μＭの変異ライブラリーポリメラーゼ酵素が含まれていた。
【０１２８】
表３．溶解緩衝液
【表３】
0006023173.tif 000004
【０１２９】
実施例２：改良された逆転写効率を有する変異ＤＮＡポリメラーゼの同定
改良された逆転写効率についての抽出ライブラリーのスクリーニング：抽出ライブラリーを、ｐＳＰ６４ポリ（Ａ）（Promega）中のＨＣＶ遺伝子型Ｉｂ  ５’ＮＴＲの最初の８００塩基を含むＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）転写物ＪＰ２−５からの２４０塩基対増幅産物の増幅から、ＲＴ−ＰＣＲシステムにおける粗製酵素の蛍光５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）活性により生成された増殖曲線からのＣｐ（クロッシングポイント）値を比較することによりスクリーニングした。
【０１３０】
反応を、１８．５μＬの表４に記載するＲＴ−ＰＣＲマスター混合物に添加された、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含んでなるバッファで５倍希釈された１．５μＬの個々の酵素抽出物を含む各ウェルを用いて、３８４ウェル形式において、Roche LC 480カイネティックサーモサイクラー上で行なった。熱サイクル条件は、６５℃において１分（「ＲＴ」工程）；９４℃で１５秒間、その後６０℃で３０秒の５サイクル；及び９１℃で１５秒、その後６０℃で３０秒の４５サイクルであった。
【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
上記のプロトコールを用いて、約５０００個のクローンをスクリーニングした。２１個のクローンを、Abs Quant/2nd derivative max法により算出された任意のカットオフ値を上回るもっとも早いクロッシングポイント（Ｃｐ）値及び蛍光プラトー値に基づいて、再スクリーニングのための元のプールから選択した。上位の抽出物に対応する培養ウェルを新鮮な増殖培地に採取して移し、最も優れた変異を含む新たな培養プレートを作るために再増殖させ、同様にいくつかの親のＺ０５  Ｄ５８０Ｘ（Ｘ＝Ｇ、Ｋ、及びＲ）を比較に用いるために培養する。これらの培養プレートを、その後、新鮮な粗製抽出物を作製するために用い、これを定量し、表１に記載される同一のマスター混合条件を用いた２０ｎＭ濃度において際すクリーニングした。表５は、ＴａｑＭａｎプローブの切断により、ＦＡＮシグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。結果は、クローン０８１３−Ｌ１５により発現されたポリメラーゼが、親のＺ０５  Ｄ５８０Ｇよりも高い効率でＲＮＡ標的を増幅することを示す。
【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
ポリメラーゼ遺伝子の変異誘発領域のＤＮＡ配列を、任意の単一のクローンに存在する変異を決定するために配列決定した。クローン０８１５−Ｌ１５を更なる試験のために選択し、このような変異ポリメラーゼタンパク質をフラスコ培養において発現させ、均一化のために精製し、そして定量した。
【０１３５】
Ｍｎ2+型ＲＴ−ＰＣＲにおけるＺ０５  Ｄ５８０Ｇ変異体の使用：配列決定の結果は、クローン０８１３−Ｌ１５により発現されるポリメラーゼが、親のＤ５８０Ｇ変異に加えて、Ｉ７０９Ｋ及びＡ８０３Ｓ変異を有していることを明らかにした。精製された変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓ（０８１３−Ｌ１５）を、ＴａｑＭａｎ  Ｍｎ2+型ＲＴ−ＰＣＲにおいて親のＺ０５  Ｄ５８０Ｇと比較した。逆転写及びＰＣＲ効率を、ＪＰ２−５  ＲＮＡ転写物及び制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いて消化されるｐＪＰ２−５  ＤＮＡ線状プラスミドの増幅からのＣｐ値を比較することにより測定した。オリゴヌクレオチド及びマスター混合条件（表１）は、元のスクリーニングに用いたものと同一であった。各反応は、ＪＰ２−５転写物の１００，０００コピー、ｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１００，０００コピー、又はｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１０００コピーのいずれかを有した。全ての標的を、２４０塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、上記のようにプライマー１及びプライマー２を用いて増幅した。全ての反応を１５μＬの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント（Ｃｐ）をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。増幅を２．５ｎＭ〜３０ｎＭの濃度の範囲のＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。熱サイクル条件は、６５℃において１分（「ＲＴ」工程）；９４℃で１５秒間、その後６０℃で３０秒の５サイクル；及び９１℃で１５秒、その後６０℃で３０秒の４５サイクルであった。表６は、２０ｎＭ酵素条件において、ＴａｑＭａｎプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。
【０１３６】
【表６】
0006023173.tif 000007
【０１３７】
結果は、変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓが、親酵素と比較して、ＤＮＡ標的に関するＰＣＲ効率を損なうことなく、ＲＮＡ標的のより効率的な増幅を可能にすることを示す。
【０１３８】
Ｍｇ2+型ＲＴ−ＰＣＲにおけるＺ０５  Ｄ５８０Ｇ変異体の使用：精製された変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓを、Ｍｇ2+の存在下で、ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを遂行する能力についても親のＺ０５  Ｄ５８０Ｇと比較した。マスター混合条件には、ＫＯＡｃ濃度が、２０ｍＭ〜１６０ｍＭに変更され、Ｍｎ（ＯＡｃ）2が、２．１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2で置き換えられることを除いて、表１に記載されるものと同一のものを用いた。各反応は、３０ｎＭ酵素と、ＪＰ２−５転写物の１００，０００コピー、ｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１００，０００コピー、又はｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１０００コピーのいずれかを有した。全ての標的を、２４０塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ効率をＤＮＡとＲＮＡのＣｐ値を比較することにより決定した。全ての反応を１５μＬの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント（Ｃｐ）をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、６５℃において５分、７０℃において５分、及び７５℃において５分（３温度「ＲＴ」工程）；９４℃で１５秒間、その後６２℃で３０秒の５サイクル；並びに９１℃で１５秒、その後６２℃で３０秒の４５サイクルであった。表７は、４０ｎ  ＫＯＡｃ条件において、ＴａｑＭａｎプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。
【０１３９】
【表７】
0006023173.tif 000008
【０１４０】
結果は、変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓが、これらの条件下で、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇよりも著しく優れた効率で、Ｍｇ2+型ＲＴ  ＰＣＲを行うことを示す。
【０１４１】
変異に寄与する表現型の決定：クローン０８１５−Ｌ１５により発現されたポリメラーゼは、ＲＴ−ＰＣＲスクリーニングにおいて、親のＺ０５  Ｄ５８０Ｇを上回る最も改良されたＲＮＡ増幅を示す。クローン０８１５−Ｌ１５は、親のＤ５８０Ｇ変異に加えて変異Ｉ７０９Ｋ及びＡ８０３を有する二重変異ポリメラーゼを発現する。アミノ酸変化の性質、及びＡ８０３Ｓとタンパク質のＣ末端の近さに基づいて、我々は、Ｉ７０９Ｋ変異が、観察される表現型に寄与することを予測した。Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ変異をＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発により構築し、精製し、定量し、２０ｍＭ〜１６０ｍＭの様々なＫＯＡｃ及び３０ｎＭ酵素を用いて、Ｍｇ2+で活性化されたＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲにおいて、０８１５−Ｌ１５（Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓ）と比較した。マスター混合条件は、Ｍｎ（ＯＡｃ）2が２．１ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2で置き換えられることを除いて、先に表１に記載したものと同様であった。各反応は、ＪＰ２−５転写物の１００，０００コピー、ｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１００，０００コピー、又はｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１０００コピーのいずれかを有した。全ての標的を、２４０塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ効率をＤＮＡとＲＮＡのＣｐ値を比較することにより決定した。全ての反応を１５μＬの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント（Ｃｐ）をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、５０℃で２分（「ＵＮＧ」工程）；６５℃で５分、６８℃で５分、及び７２℃で５分（３温度「ＲＴ」工程）；９４℃で１５秒間、その後６２℃で３０秒の５サイクル；並びに９１℃で１５秒、その後６２℃で３０秒の４５サイクルであった。表８は、６０ｍＭ  ＫＯＡｃ条件において、ＴａｑＭａｎプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。
【０１４２】
【表８】
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【０１４３】
Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ及びＺ０５  Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９Ｋ＿Ａ８０３Ｓは、ＲＮＡ及びＤＮＡ標的に関して、同様のＣｐ値を有し、Ｉ７０９Ｋ変異は、ＲＴ−ＰＣＲ性能において観察される改良に寄与することを示す。
【０１４４】
位置Ｉ７０９における様々なアミノ酸置換：Ｚ０５  Ｄ５８０ＧＤＮＡポリメラーゼのＭｇ2+型ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ効率に関する位置Ｉ７０９における様々なアミノ酸置換の効果を試験した。最初に、Ｚ０５  Ｄ５８０ＧＤＮＡポリメラーゼにおいて、該変異をＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発技術を用いて作製し、変異酵素を、精製し、定量した。、Ｚ０５Ｄ５８０Ｇ＿Ｉ７０９変異体Ｋ（リジン）、Ａ（アラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｓ（セリン）、Ｒ（アルギニン）、Ｌ（ロイシン）及びＤ（アスパラギン酸）を、２０ｍＭ〜１６０ｍＭの様々な濃度のＫＯＡｃ及び１０ｎＭ酵素を用いて、Ｍｇ2+で活性化されたＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲにおいて比較した。マスター混合条件は、２．０ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2が用いられることを除いて、先に表１に記載したものと同様であった。各反応は、ＪＰ２−５転写物の１００，０００コピー、ｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１００，０００コピー、又はｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１０００コピーのいずれかを有した。全ての標的を、２４０塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。全ての反応を１５μＬの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント（Ｃｐ）をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、５０℃で３分（「ＵＮＧ」工程）；６５℃にで５分、６８℃で５分、及び７２℃で５分（３温度「ＲＴ」工程）；９５℃で１５秒間、その後６２℃で３０秒の５サイクル；並びに９１℃で１５秒、その後６２℃で３０秒の４５サイクルであった。表９は、８０ｍＭ  ＫＯＡｃ条件において、ＴａｑＭａｎプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。
【０１４５】
【表９】
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【０１４６】
この実施例は、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  ＤＮＡポリメラーゼの位置７０９におけるいくつかのアミノ酸置換が、ＲＮＡ標的のより効率的な増幅をもたらすことを示す。
【０１４７】
実施例３：改良された３’プライマーミスマッチ耐性についての抽出ライブラリースのスクリーニング
実施例１の抽出ライブラリーを、プライマーＭ１３ｍｐ１８の配列に完全に一致するプライマー（ＤＧ４８；配列番号４０、表１０）の酵素による伸長後の最終的な蛍光と、３’Ａ：Ａミスマッチを有するプライマー（ＦＲ７４４；配列番号４２；表１０）の最終的な蛍光を比較することにより、改良された３’プライマーミスマッチ耐性についてスクリーニングした。
【０１４８】
ＤＧ４８  完全一致：
５’−ＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣ−３’（配列番号４０）
ＦＲ７４４  Ａ：Ａミスマッチ：
５’−ＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＣＴＴＣＧＣＡ−３’（配列番号４２）
【０１４９】
上記の酵素抽出物を、３８４ウェルサーモサイクラープレート中で、２．５μＬの抽出物と、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含んでなる２２．５μＬのバッファを合わせることにより、プライマー伸長反応のために１０倍に希釈し、蓋をし、９０℃で１０分間加熱した。完全一致プライマーを含む対照反応は、３８４ウェルＰＣＲプレート中で、０．５μＬの希釈された抽出物と１５μＬマスター混合物を合わせた。プライムする鋳型の伸長を、ＣＣＤカメラを用いた改変されたカイネティックサーマルサイクラーにおいて、１５秒毎に観察した（Watson、同上を参照のこと）。マスター混合物は、１ｎＭのプライムする鋳型プライマー、２５ｍＭトリシン、ｐＨ８．３、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．６Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１００ｎＭアプタマー、及び２．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2を含んでなる。伸長に由来する蛍光と、バックグラウンドの蛍光を区別するために、並行するウェルを、プライマー鎖伸長が、反応マスター混合物からヌクレオチドを除くことにより防がれる実験に含んだ。３’ミスマッチプライマー（ＦＲ７４４、配列番号４２）を含む反応を、１．０μＬの希釈された抽出物を各反応に添加することを除いて、上記のように行った。
【０１５０】
上記のプロトコールを用いて、約５７００個の変異体抽出物をスクリーニングした。クローンを、４０℃で１分の伸長、その後の６４℃における８．５分の伸長後に開始のベースラインと比較した最大蛍光に基づいて選択した。この基準に基づいて、比較的少数の抽出物を精製及び更なる試験のために選択した。これらを、クローンの純度を確実にするために、選択寒天プレートに縞状に播種し、ポリメラーゼ遺伝子の変異領域のＤＮＡ配列を、任意の単一のクローンに存在した変異を決定するために、配列決定した。この試験に並行して、変異ポリメラーゼタンパク質をフラスコ培養において発現させ、均一性のために精製し、定量した。
【０１５１】
実施例４：Ｍ１３鋳型に対する様々な３’ミスマッチのプライマー伸長
この実施例は、位置５８８及び７０９における置換が、３’ミスマッチのプライマーを用いて鋳型を伸長する改良された効率を有するポリメラーゼをもたらすことを例証する。
【０１５２】
精製されたＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ５８８Ｔ  Ｉ７０９Ｋを、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型に対する様々な３’ミスマッチのプライマー伸長において、親酵素Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇと比較した。鋳型及びプライマを下記の表１０に列挙する。
【０１５３】
【表１０】
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【０１５４】
プライマーを１０：１のプライマー：鋳型比において、Ｍ１３ｍｐ１８鋳型と予めアニーリングさせ、５ｎＭ酵素及び２５ｍＭトリシン、ｐＨ８．３、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、０．６Ｘ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、２００μＭ各ｄＮＴＰ、１００ｎＭアプタマー、並びに２．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）2と併せて、１ｎＭ最終濃度で伸長反応に添加した。反応をＣＣＤカメラを用いて、改変されたカイネティックサーマルサイクラー中で、１５秒毎に観察されるプライムされた鋳型の伸長を用いて３重に行なった（Watson、同上を参照のこと）。複製物を、平均し、各条件についての最大勾配を、時間にわたる蛍光の変化として算出した。結果を下記の表１１に示す。
【０１５５】
【表１１】
0006023173.tif 000012
【０１５６】
この実施例は、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ５８８Ｔ  Ｉ７０９Ｋが、完全一致プライマー鋳型の伸長において親酵素Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇより約２倍超早く、３’末端ミスマッチに依存して３’末端ミスマッチプライマー鋳型の伸長において、約２〜１０倍超早いことを示す。
【０１５７】
実施例５：変異ポリメラーゼを用いた、野生型ＢＲＡＦヒトゲノム鋳型と比較した、変異ＢＲＡＦプラスミド鋳型の増幅
この実施例は、変異５８８及び７０９が、親酵素と比較して改良されたミスマッチ耐性を有するポリメラーゼをもたらすことを示す。
【０１５８】
精製されたＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ５８８Ｔ  Ｉ７０９Ｋを、野生型ヒトゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおける、変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的の改良されたミスマッチ耐性について、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲにおいて親酵素Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇと比較した。
【０１５９】
フォワードプライマーは、変異配列と完全に一致し、野生型配列に対して一つの３’Ａ：Ａミスマッチを有する。反応は、１６μＬの最終容量中、野生型ヒトゲノム細胞株ＤＮＡの最も早い１０，０００コピー（３３ｎｇ）、又はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異配列を含む線状プラスミドの１００又は１０，０００コピーを有する。酵素の様々な塩の最適化を可能にするために、増幅を、４０〜１４５ｍＭのＫＣｌの濃度範囲を用いて行った。バッファ条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．０２Ｕ／μＬ  ＵＮＧ、及び２００ｎＭアプタマーであった。フォワード及びリバースプライマーは、１００ｎＭであり、ＴａｑＭａｎプローブは、２５ｎＭであった。全てのＤＮＡポリメラーゼを、２０ｎＭにおいて評価し、２％（ｖ／ｖ）酵素保存バッファ（５０％ｖ／ｖグリセロール、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加した。反応を、Roche LightCycler 480サーマルサイクラー中で行い、６０秒間、９５℃の温度で変性させ、その後１０秒間、９２℃の変性温度、及び３０秒間、６２℃のアニーリング温度を用いて９９サイクルの増幅を行った。
【０１６０】
反応を二重に行い、クロッシングポイント（“Ｃｐ”）をAbs Quant/2nd derivative Max法により算出し、Ｃｐを平均した。平均されたＣｐ値を表１２に示し、最も早い高コピー変異Ｃｐをもたらす各酵素についてのＫＣｌ濃度においてＰＣＲ効率を算出した。高コピーΔＣｐは、３’ミスマッチを有する野生型ゲノム標的の１０，０００コピーを含む反応の平均Ｃｐ値と、完全一致プラスミド標的の１０，０００コピーを含む反応の平均Ｃｐ値との差に等しい。
【０１６１】
【表１２】
0006023173.tif 000013
【０１６２】
本実施例は、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ５８８Ｔ  Ｉ７０９Ｋが、高コピーΔＣｐにおいて２．３サイクルの改良をもたらすこと例証し、本ＰＣＲシステムにおいて、３’末端Ａ：Ａミスマッチの改良された耐性を例証する。
【０１６３】
実施例６：変異ポリメラーゼは、阻害剤の存在下で改良された活性を有する。
本実施例は、Ｉ７０９Ｋ変異が、ＤＮＡポリメラーゼの既知の阻害剤の存在下で改良されたＲＴ−ＰＣＲ効率をもたらすことを例証する。
【０１６４】
ヘミン
血液中の重要な成分であるヘモグロビンは、様々なヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及び最終的にはビリルビンに分解され得る。これらの分子は、鉄キレート剤及び紫色色素の双方であるので、これらは、ポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素活性を阻害するいくつかの機構を用い得る。
【０１６５】
ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物を用いたモデルシステムは、Ｚ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ又はＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋポリメラーゼを用いたＲＴ−ＰＣＲにおけるヘミンの阻害的効果を決定するために用いられる。４５Ｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｚ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ又はＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋを、２．５ｕＭヘミン（ＤＮＡ  ｐｏｌに対して４０Ｍ倍過剰）の添加及び不添加で、ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物の１，０００コピーを増幅するＲＴ−ＰＣＲ条件（１２０ｍＭ  ＫＯＡｃ、３．３ｍＭ  Ｍｎ2+、６０ｍＭトリシン；合計５０ｕＬ）において試験した。これらの反応を、１２分のＲＴ工程、続く変性及び伸長の５０サイクルを用いてRoche LightCycler 480リアルタイムＰＣＲ装置中で行った。リアルタイム蛍光を、最後の５０サイクルの間、ＪＡ２７０及びＣＹ５．５チャネルにおいて検出した。各反応について、蛍光５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）活性により生成される増殖曲線からのＣｐ（クロッシングポイント）値を、装置の「2nd derivative Max analysis」法を用いて決定した。全ての正常な反応のＣｐを、表１３に示すように、ヘミンを含むものと比較した。２．５ｕＭヘミンの存在下で、ＨＣＶ  ＲＮＡの増幅は、Ｚ０５により観察されなかったのに対し、変異体Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇは、３．４サイクル遅れたＣｐ（対ヘミンを含まない対照）でＨＣＶを検出し、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋは、２．５サイクル早いＣｐ（対ヘミンを含まない対照）でＨＣＶを検出した。
【０１６６】
【表１３】
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【０１６７】
アガロース電気泳動は、これらの効果は、減少した増幅に寄るものであり、ポルフィリンヘミン分子によるクエンチングによるものではないことを確証した。同様の結果は、ＨＣＶ  ＤＮＡ鋳型存在下で得られ、ヘミンが一般的にＰＣＲ阻害剤として作用することを示唆する。
【０１６８】
ヘパリン
ヘパリンは、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、最も高い負の電荷密度を有する任意の既知の生体分子の一つを含む。それ自体、核酸基質をによく似ており、しばしばタンパク質‐ＤＮＡ／ＲＮＡ結合アッセイにおいて非特異的競合物として用いられる。ヘミンが一般的なポリメラーゼ及びＰＣＲ阻害剤として作用するのに対し、ヘパリンは、好ましいことに逆転写、例えば、Ｚ０５型ＤＮＡポリメラーゼを阻害する。
【０１６９】
上記のＨＣＶ  ＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅モデルシステムを用いて、１００、２００、４００又は１０００ｎｇ／ｕＬのヘパリンの存在を、Ｚ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ、又はＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋポリメラーゼを用いて、阻害的効果を決定するために試験した。全ての正常な反応のＣｐを、ヘパリンを含むものと比較した（表１４）。野生型Ｚ０５酵素が１２．５ｎｇ／ｕＬヘパリンの存在下でＨＣＶ  ＲＮＡを増幅することができないのに対し、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ及びＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋ変異体は、最小のＣｐ遅延とともに、最大２００又は１０００ｎｇ／ｕｌヘパリンに対する耐性を有し、これらの変異体が、それぞれ少なくとも１５〜８０倍超の耐性を有することを示す。
【０１７０】
ＲＮＡ及びＤＮＡ基質間の直接的な比較は、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ及びＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９ＫによるＤＮＡの増幅が、高レベルのヘパリンの存在により完全に影響を受けないことを明らかにした。全体として、これらのデータは、ヘパリンが逆転写をより特異的に阻害する阻害剤であるという考えを支持する。ＤＮＡ  ｐｏｌのヘパリンに対する耐性は、それぞれの特定の酵素についての本質的なＲＴ活性と直接的に相関する。
【０１７１】
【表１４】
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【０１７２】
本実施例は、Ｉ７０９Ｋ変異が、阻害剤であるヘミン及びヘパリンの存在下において改良されたＲＴ−ＰＣＲ効率をもたらすことを示す。
【０１７３】
実施例７：変異ポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型を伸長する場合に、改良されたプライマーミスマッチ耐性を有する。
本実施例は、Ｄ５８０Ｇ及びＩ７０９Ｋ変異が、ＲＮＡ鋳型に対するプライマーミスマッチについての改良された耐性を有するポリメラーゼをもたらすことを例証する。
【０１７４】
ミスマッチ耐性
末端、Ｎ−１及びＮ−２のミスマッチを、ポリメラーゼＺ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ及びＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋを含む、ＲＴ−ＰＣＲ条件（１２０ｍＭ  ＫＯＡｃ、３．３ｍＭ  Ｍｎ2+、６０ｍＭトリシン；５０ｕＬの合計反応容量）において体系的に評価することができるように、ＨＣＶ  ＲＮＡ転写物をプライマー３’末端の領域において変異誘発した。これらの反応を、１２分のＲＴ工程、続く変性及び伸長の５０サイクルを用いてRoche LightCycler 480リアルタイムＰＣＲ装置中で行った。リアルタイム蛍光を、最後の５０サイクルの間、ＪＡ２７０及びＣＹ５．５チャネルにおいて検出した。各反応についての蛍光５’ヌクレアーゼ（ＴａｑＭａｎ）活性により生成される増殖曲線からのＣｐ（クロッシングポイント）値を、装置の「2nd derivative Max analysis」法を用いて決定した。様々なＤＮＡポリメラーゼについてのプライマーミスマッチ耐性を、Ｃｐ値を比較することにより決定した。表１５に示すように、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇは、ミスマッチプライマーを用いた場合に、一貫してＺ０５よりもより早いＣｐ値を有した（Ｎは、下に示すプライマー：鋳型ミスマッチを有するプライマー３’末端上の位置を表す）。重要なことに、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇは、親Ｚ０５酵素が検出することのできないいくつかのミスマッチを検出することができる。
【０１７５】
【表１５】
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【０１７６】
表１６では、ΔＣｐ値を、示されるような各ミスマッチについて、Ｚ０５  Ｄ５８０ＧのＣｐ値をＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋと比較することにより決定した。従って、正のΔＣｐ値は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）シグナルがＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋにより何回のサイクル先に検出されるかを示す。全体として、変異Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋは、優れたプライマーミスマッチ耐性を示し、示されるミスマッチについて、親酵素Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇよりも平均で４サイクルの改良を提供し、ＰＣＲ性能において１６倍の改良を示す。
【０１７７】
【表１６】
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【０１７８】
上記の実施例は、Ｚ０５ポリメラーゼの位置５８０及び７０９における置換が、ミスマッチプライマーを用いた場合に、改良されたＲＴ−ＰＣＲ効率をもたらすことを示す。
【０１７９】
実施例８：７０９変異は、ＲＴ−ＰＣＲ効率を改良する。
本実施例は、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼにおけるＩ７０９Ｋの単一の変異が、ＤＮＡ鋳型を増幅する場合に、効率を減少ることなく、改良されたＲＴ−ＰＣＲ効率を有するポリメラーゼをもたらすことを示す。
【０１８０】
Ｉ７０９Ｋ変異を、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ骨格に、単一の変異としてサブクローニングした。発現及び精製後、変異体Ｚ０５  Ｉ７０９ＫのＲＴ−ＰＣＲ効率を、Ｍｎ2+型ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＤＮＡポリメラーゼＺ０５、Ｚ０５  Ｄ５８０Ｇ、及びＺ０５  Ｄ５８０Ｇ  Ｉ７０９Ｋと比較した。マスター混合物条件を、Ｍｎ（ＯＡｃ）2濃度が１．５ｍＭ、ＵＮＧ濃度が０．２Ｕ／μＬ、及びプローブ濃度が１００ｎＭであることを除いて、先の表４に記載されるものと同一であった。各ＤＮＡポリメラーゼを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含んでなるバッファで希釈し、個々に５Ｘ酵素酵素ストックを作製した。その後、３μＬの５Ｘ酵素ストックを１５μＬの合計反応容量中、最終酵素濃度２０ｎＭとなるように、適切な反応ウェルに添加した。各反応は、ＪＰ２−５転写物の１００，０００コピー、ｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１００，０００コピー、又はｐＪＰ２−５線状プラスミドＤＮＡの１０００コピーのいずれかを有した。全ての標的を、２４０塩基対増幅産物を生成するための四重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。全ての反応をRoche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント（Ｃｐ）をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、５０℃で２分（「ＵＮＧ」工程）；５５℃で３０秒、６０℃で１分、及び６５℃で１．５分（３温度「ＲＴ」工程）；９４℃で１５秒間、その後６２℃で３０秒の５サイクル；並びに９１℃で１５秒、その後６２℃で３０秒の４５サイクルであった。表１７は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの切断により、蛍光シグナルから得られるＣｐ値が増加することを示す。
【０１８１】
【表１７】
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【０１８２】
本実施例は、Ｉ７０９Ｋ変異が、親酵素Ｚ０５と比較した場合、ＤＮＡ鋳型を用いる増幅効率を減少させることなく、ＲＮＡ鋳型を用いる増加した逆転写及び増幅効率をもたらすことを示す。
【０１８３】
本明細書に記載する実施例及び態様は、単に例示することが目的であり、その内容を踏まえた様々な改変又は変形が当業者に提示されるであろうことが分かる。
【０１８４】
非公式配列表
【０１８５】
【表１８】
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【０１８６】
【表１９】
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【０１８７】
【表２０】
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【０１８８】
【表２１】
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【０１８９】
【表２２】
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【０１９０】
【表２３】
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【０１９１】
【表２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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