(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体と、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）と、ウイルス粒子とを含んだ試料混合物から、ＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法であって、
前記ＨＣＰ減少型抗体調製物は、前記試料混合物と比較して減少したウイルス粒子の数または減少したウイルス活性を含み、
前記方法が、
（ａ）前記抗体を含んだ前記試料混合物をｐＨの低下に供し、そうして一次回収試料を形成するステップであり、前記ｐＨの低下が３から４の間のｐＨであり０．５時間から２時間の範囲の期間にわたるステップ、
（ｂ）前記一次回収試料をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにアプライし、プロテインＡに結合した前記抗体をｐＨ３．５で溶出するステップ、ならびに
（ｃ）溶出した前記抗体を、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、またはそれらの組み合わせにアプライするステップ
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ｐＨの減少が、適した酸と前記試料混合物とを混合することによって達成され、前記適した酸が、クエン酸、リン酸、酢酸、およびカプリル酸から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオン交換樹脂が、陰イオン交換樹脂または陽イオン交換樹脂のいずれかである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン交換樹脂が陽イオン交換樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン交換樹脂が、置換されたマトリックスを含み、その置換基が、カルボキシメチル、スルホエチル、スルホプロピル、ＳＯ３−、リン酸塩、およびスルホン酸塩から成る群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記置換基がＳＯ３−である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン交換樹脂が陰イオン交換樹脂である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン交換樹脂が、置換されたマトリックスを含み、その置換基が、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、および４級アミン基から成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記置換基が４級アミン基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換ステップが、第１のイオン交換ステップおよび第２のイオン交換ステップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のイオン交換ステップが陽イオン交換ステップであり、第２の陰イオン交換ステップが続く、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１および前記第２のイオン交換ステップの間に起こる濾過ステップである中間ステップをさらに含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記濾過ステップが、捕獲限界濾過／透析濾過によって達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）が、置換されたマトリックスを含んだ樹脂を含み、その置換基が１つまたは複数の疎水基からなる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の疎水基が、アルキル基、アリール基およびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記置換基が、３−オクトキシプロパン−１，２−ジオール、エーテル、プロピル、メチル、フェニル、およびブチル基から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記樹脂が、フェニル置換基を含んだアガロースマトリックスを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルス粒子を除去してバッファー交換を促進させるための濾過ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記調製物がＨＣＰを実質的に含まない、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法に従って生成されたＨＣＰ減少型抗体調製物中のプロテインＡの残留レベル量を決定するステップをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がアダリムマブである、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
精製されたアダリムマブが医薬品グレードである、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００８年１０月２０日に出願した米国仮出願第６１／１９６，７５４号の利益を主張するものである。
【０００２】
発酵培養により産生される医薬品グレードのモノクローナル抗体の精製工程は、一般的に４つの基本的なステップが関係する。これらのステップとして（１）収集／清澄化−発酵培養物に由来する宿主細胞を分離するステップ；（２）捕獲−清澄化された収集物に含まれる成分の大半から抗体を分離するステップ；（３）精密精製−残渣宿主細胞汚染物および凝集体を除去するステップ；（４）処方化−安定性および寿命が最大限得られるように、適する担体内に抗体を配置するステップ、が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、これらのステップは、起こり得るウイルス汚染に必ずしも対応していない場合が多い。汚染性の有害ウイルスの減少および／または不活性化を含めた臨床用途に適する対象抗体の製造方法および精製方法に対する現在のニーズが存在する。本発明はこのようなニーズに対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、試料マトリックスから抗体を単離および精製する方法に関する。本発明の１つの態様は、抗体精製の様々なステップにおいて生み出される試料のウイルス不活性化に関する。１つの具体的な態様では、本明細書の方法は酸不活性化ステップとこれに続く１つまたは複数のクロマトグラフィーステップを採用する。当該クロマトグラフィーステップは、１つまたは複数の下記クロマトグラフィー手順を含み得る：イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー。さらに、本発明は、本明細書に記載する方法により精製される１つまたは複数の抗体を含む医薬組成物に関する。
【０００５】
１つの実施形態または本発明は、得られた抗体組成物が、宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）を実質的に含まないように、試料マトリックスから抗体またはこの抗原結合部分を精製する方法に関する。１つの態様では、試料マトリックス（または、単に「試料」）は、本発明の特異的抗体を産生するために採用される細胞系収集物を含む。１つの具体的な態様では、試料マトリックスは抗ＩＬ−１２抗体を産生するために使用される細胞系から調製される。別の態様では、試料マトリックスは抗ＴＮＦα抗体を産生するために使用される細胞系から調製され、また別の態様では、試料マトリックスは抗ＩＬ−１８抗体を産生するために使用される細胞系から調製される。
【０００６】
本発明の一方法は、推定上の対象抗体またはこの抗原結合部分を含む試料マトリックスについて、ｐＨ調整するステップを含む。１つの態様では、ｐＨは酸性のｐＨに調整される。適するｐＨの例は、約３と約５の間であり、好ましくは約３．５である。この一次回収は、一つには、ｐＨ感受性ウイルスを低減／または不活性化するために実施される。ウイルスを減少および／または不活性化するのに加えて、酸性条件は細胞および細胞残屑の除去に役立ち、こうして一次回収試料を形成する。一定期間経過後、ｐＨはより中性または塩基性のｐＨに調整可能であり、ある種の実施形態では、試料は１つまたは複数のクロマトグラフィーステップに供され、これにはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０００７】
１つの実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーステップは、一次回収試料を適するアフィニティークロマトグラフィー支持体を備えるカラムに供するステップを含む。かかるクロマトグラフィー支持体の非限定的な例として、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、対象とする抗体が生み出された元となる抗原を含むアフィニティー支持体およびＦｃ結合タンパク質を含むアフィニティー支持体が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。プロテインＡ樹脂は抗体（ＩｇＧ）のアフィニティー精製および単離で有用である。１つ態様では、プロテインＡカラムは、試料を負荷する前に適するバッファーで平衡化される。適当なバッファーの例として、トリス／ＮａＣｌバッファー、ｐＨ約７．２が挙げられる。この平衡化の後に、試料はカラム上に負荷可能である。カラムに負荷した後、当該カラムは、例えば平衡バッファーを用いて単回または複数回洗浄可能である。カラム溶出前に、異なるバッファーを用いる洗浄を含むその他の洗浄も利用可能である。次に、プロテインＡカラムは、適当な溶出バッファーを用いて溶出可能である。適当な溶出バッファーの例として、酢酸／ＮａＣｌバッファー、ｐＨ約３．５が挙げられる。溶出液は、当業者に周知の技法を用いてモニター可能である。例えば、ＯＤ２８０における吸光度に基づくことができる。次に、対象とする溶出分画（単数または複数）は、さらに処理するために調製可能である。
【０００８】
ある種の実施形態では、試料は１つまたは複数の追加のクロマトグラフィー手順の対象となる。１つの態様では、一次回収試料はイオン交換クロマトグラフィーに供される。この実施形態では、イオン交換ステップは、陽イオン交換クロマトグラフィーもしくは陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、または両方組み合わせたものであり得る。このステップは陽イオン交換ステップとこれに続く陰イオン交換ステップまたはこの逆のような複数のイオン交換ステップを含み得る。１つの態様では、イオン交換ステップは２つのイオン交換工程ステップを含む。１つの具体的な態様では、第１の陽イオン交換ステップには、第２の陰イオン交換ステップが続く。適した陽イオン交換カラムは、固定相が陰イオン性の基を備えるカラムである。かかるカラムの例として、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＳＯ３−カラムが挙げられる。このイオン交換捕獲クロマトグラフィーステップは、一次回収の混合物からの対象とする抗体の単離を促進する。適した陰イオン交換カラムは、固定相が陽イオン基を含むカラムである。かかるカラムの例は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムである。１つまたは複数のイオン交換ステップは、宿主細胞タンパク質およびＤＮＡ、適用できる場合はアフィニティマトリックスタンパク質などの不純物を減少させることによって抗体をさらに単離する。この陰イオン交換手順は、（陽イオン交換手順とは対照的に）クロマトグラフィーのフロースルー様式であり、抗体は、陰イオン交換樹脂（または固相）と相互作用または結合しない。しかし、多くの不純物は、陰イオン交換樹脂と相互作用および結合する。
【０００９】
別の実施形態では、イオン交換試料はさらなるクロマトグラフィーに供される。１つ態様では、このステップは疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）の使用を含む。適したカラムとして、その固定相が疎水性の基を含むものが挙げられる。かかるカラムの例として、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムが挙げられる。抗体は単離／精製工程中に凝集体を形成してしまう可能性がある。この疎水性クロマトグラフィーステップは、これらの凝集体を除去するのに役立つ。同ステップは、不純物の除去にも役立つ。この手順は、抗体（またはその凝集体）と疎水性カラムとの相互作用を促進する高塩濃度バッファーを用いる。カラムは低濃度の塩を用いて溶出される。
【００１０】
１つの実施形態では、第１および第２のイオン交換ステップは、一次回収に続いて行う。この実施形態では、イオン交換試料は、中間濾過ステップに供される。１つの態様では、この濾過ステップは、捕獲限外濾過／透析濾過（「ＵＦ／ＤＦ」）を含む。この濾過ステップは、例えば、抗体およびその抗原結合部分の濃縮に役立つ。
【００１１】
別の実施形態では、ＨＩＣ溶出液は、Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターなどのウイルス性除去フィルターを用いて濾過する。この手順は、フェニル溶出液からウイルス粒子を分離して、安全なレベルまでウイルスの量（存在する場合）を低減する。当業者に周知のフィルターが、この実施形態で利用可能である。
【００１２】
得られる試料生成物中のモノクローナル抗体の純度は、当業界で周知の方法、例えばウェスタンブロット分析法を用いて分析可能である。
【００１３】
なおも別の実施形態では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはこの抗原結合部分および許容される担体を含む１つまたは複数の医薬組成物に関連する。別の態様では、組成物は１つまたは複数の医薬品をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗ＩＬ−１２抗体（ＡＢＴ−８４７）の非限定的な例として、重鎖および軽鎖可変領域の配列を開示する図である。
【図２】抗ＩＬ−１８抗体（ＡＢＴ−３２５）の非限定的な例として、重鎖および軽鎖の配列を開示する図である。
【図３】抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ））の非限定的な例として、重鎖および軽鎖の配列を開示する図である。
【図４】本発明の精製スキームの非限定的なフロー図を示す図である。
【図５】清澄化された培地のｐＨを下げた時に、精製対象抗体分子が溶液中に留まっていることを示す、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの写真の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、試料マトリックスから抗体を単離および精製する方法に関する。本発明の１つの態様は、抗体精製の様々なステップにおいて生み出される試料のウイルス不活性化に関する。１つの具体的な態様では、本明細書の方法は酸不活性化ステップとこれに続く１つまたは複数のクロマトグラフィーステップを採用する。当該クロマトグラフィーステップは、１つまたは複数の下記クロマトグラフィー手順を含み得る：イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー。さらに、本発明は、本明細書に記載する方法により精製される１つまたは複数の抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１６】
明確にするために、限定するものではないが、この詳細な説明は、次の従属部に分割される：
１．定義、
２．抗体の生成、
３．抗体の産生、
４．抗体の精製、
５．試料純度をアッセイする方法、
６．さらなる修飾、
７．医薬組成物および
８．抗体の使用
１．定義
本発明をより容易に理解するために、ある種の用語を最初に定義する。
【００１７】
用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から成る免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖の可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと省略される）および重鎖の定常領域（ＣＨ）から成る。重鎖の定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖の可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと省略される）および軽鎖の定常領域から成る。軽鎖の定常領域は、１つのドメイン、すなわちＣＬから成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存される領域が散在し、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【００１８】
抗体の「抗原結合部分」（または「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ｈＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８）と特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを含む。抗体の抗原結合の機能は、完全長抗体のフラグメントによって果たせることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合性フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを含む１価のフラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含むＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインを含むＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁）ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、すなわちＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え方法を用いて連結されることができ、合成リンカーによって、ＶＬおよびＶＨ領域対により一価の分子を形成できる単一タンパク質鎖としてそれらをつくることが可能になる（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁を参照されたい）。かかる単一鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。二重特異性抗体などの単一鎖抗体の他の形態も包含される。二重特異性抗体は、２価の二重特異的な抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上で発現するが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対にできないリンカーを用い、それによってドメインを別の鎖の相補性ドメインと対にさせ、２つの抗原結合部位がつくられる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３頁を参照されたい）。その上さらに、抗体またはこの抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドと共有または非共有結合によって形成される、より大きな免疫接着分子の一部であってよい。かかる免疫接着分子の例には、ストレプトアビジンのコア領域を用いて四量体のｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１頁）、およびシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグを用いて２価のビオチン化ｓｃＦｖ分子をつくること（その全体の教示が参���により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８頁）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体部分は、全抗体のそれぞれに、パパインまたはペプシン消化などの従来技法を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載のような標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて得ることができる。１つの態様では、抗原結合部分は、完全ドメインまたは完全ドメインの対である。
【００１９】
「ヒトインターロイキン１２」という表現（本明細書でｈＩＬ−１２またはＩＬ−１２と省略される）は、本明細書で使用するとき、マクロファージおよび樹状細胞によって主に分泌されるヒトサイトカインを含む。用語は、ジスルフィド架橋により一緒になって連結される３５ｋＤのサブユニット（ｐ３５）および４０ｋＤのサブユニット（ｐ４０）を含むヘテロ二量体タンパク質を含む。ヘテロ二量体タンパク質は、「ｐ７０サブユニット」と呼ばれる。ヒトＩＬ−１２の構造は、例えば、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７０：８２７−８４５頁；Ｓｅｄｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０１８８−１０１９２；Ｌｉｎｇら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１５４：１１６−１２７；Ｐｏｄｌａｓｋｉら（１９９２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９４：２３０−２３７にさらに記載され、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１２をコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００８８２として入手でき、ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００８７３．２として入手することができる。用語ヒトＩＬ−１２は、標準的な組換え発現方法によって調製できる、組換えヒトＩＬ−１２（ｒｈＩＬ−１２）を含むことを意図する。
【００２０】
「ヒトインターロイキン１８」という表現（本明細書では、ｈＩＬ−１８またはＩＬ−１８と略称する）は、本明細書で用いる場合、生物学的に不活性な１９３個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質として当初合成されるヒトサイトカインの他、例として、ただし限定目的ではなく、例えばカスパーゼ−１またはカスパーゼ−４により前駆体タンパク質が開裂することによって生成される１５６個のアミノ酸からなる成熟タンパク質を含み、これはＴ細胞増殖の副刺激、ＮＫ細胞の細胞毒性の強化、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生の誘導、ならびにＴヘルパータイプ１（Ｔｈ１）分化の増強を含む、生物学的活性を示す。ＩＬ−１８をコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１５６２として入手可能であり、またポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１５５３として入手可能である。用語ヒトＩＬ−１８は、組換えヒトＩＬ−１８（ｒｈ  ＩＬ−１８）を含むように意図されており、これは標準的な組換え発現方法により作製可能である。
【００２１】
「ヒト腫瘍壊死因子−α」という表現（本明細書では、ｈＴＮＦαまたはＴＮＦαと略称する）とは、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性および内皮機能に影響を及ぼす、単球／マクロファージによって主に分泌される多機能性炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦαは、１７ｋＤタンパク質サブユニットからなる可溶性の同種三量体である。ＴＮＦαの膜結合型２６ｋＤ前駆体の形態も存在する。これは、滑膜細胞中および組織のマクロファージ中に見出される。単球またはマクロファージ以外の細胞も、ＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞系はＴＮＦαの他、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球を産生し、またいくつかの培養されたＴ細胞系およびＢ細胞系はＴＮＦαを産生する。ＴＮＦαをコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ０２９１０として入手可能であり、またポリペプチド配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ２６６６９として入手可能である。用語ヒトＴＮＦαは、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈ  ＴＮＦα）を含むように意図されており、これは標準的な組換え発現方法により作製可能である。
【００２２】
「Ｋａｂａｔの番号付け」、「Ｋａｂａｔの規定」および「Ｋａｂａｔのラベル化」という用語は、本明細書では互換的に使用される。当技術分野で認識されるこれらの用語は、抗体またはこの抗原結合部分の重鎖および軽鎖の可変領域における他のアミノ酸残基より可変的（すなわち、超可変的）であるアミノ酸残基を番号付けるシステムをいう（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔら（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１頁およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置３１から３５、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置９５から１０２に及ぶ。軽鎖の可変領域について、超可変領域は、ＣＤＲ１についてはアミノ酸位置２４から３４、ＣＤＲ２についてはアミノ酸位置５０から６５、およびＣＤＲ３についてはアミノ酸位置８９から９７に及ぶ。
【００２３】
「ヒト抗体」という用語は、Ｋａｂａｔらによって記載されたような、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に対応する、可変および定常領域を有する抗体を含む（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。変異は、「選択的変異誘発アプローチ」を用いて導入することができる。ヒト抗体は、アミノ酸残基、例えば、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列によってコードされない活性増強型アミノ酸残基と置換された、少なくとも１つの位置を有することができる。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列の一部ではないアミノ酸残基と置換された、最大２０個の位置を有することができる。他の実施形態では、最大１０、最大５、最大３または最大２つの位置が置換される。１つの実施形態では、これらの置換は、ＣＤＲ領域内である。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、ＣＤＲ配列が、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来し、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含まないことを意図する。
【００２４】
「選択的変異誘発アプローチ」という表現は、少なくとも１つの適した選択的変異誘発位置、高頻度変異および／または接触位置で、ＣＤＲアミノ酸を選択し、個々に変異させることによって、抗体の活性を改善する方法を含む。「選択的に変異させた」ヒト抗体は、選択的変異誘発アプローチを用いて選択された位置での変異を含む抗体である。別の態様では、選択的変異誘発アプローチは、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＨ１、Ｈ２およびＨ３）または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（下文ではそれぞれＬ１、Ｌ２およびＬ３という）において、選択された個々のアミノ酸残基を優先的に変異させる方法を提供することを意図する。アミノ酸残基は、選択的変異誘発位置、接触位置または高頻度変異位置から選択することができる。個々のアミノ酸は、軽鎖または重鎖の可変領域におけるそれらの位置に基づいて選択される。高頻度変異位置が、接触位置であってもよいことを理解されたい。１つの態様では、選択的変異誘発アプローチは、「標的型アプローチ」である。言葉「標的型アプローチ」は、標的法、例えば、「群に対する標的型アプローチ」または「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」において、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３において選択された個々のアミノ酸残基を変異させる方法を含むことを意図する。「群に対する標的型アプローチ」では、特定の群における個々のアミノ酸残基は、群Ｉ（Ｌ３およびＨ３を含む）、ＩＩ（Ｈ２およびＬ１を含む）およびＩＩＩ（Ｌ２およびＨ１を含む）を含む選択的変異について標的にされ、前記群は、標的の優先度の順番で載せる。「ＣＤＲに対する標的型アプローチ」では、特定のＣＤＲにおける個々のアミノ酸は、次のような標的の優先度の順番：Ｈ３、Ｌ３、Ｈ２、Ｌ１、Ｈ１およびＬ２で、選択的変異について標的にされる。選択されたアミノ酸残基は、例えば、少なくとも２つの他のアミノ酸残基に変異させ、抗体の活性への変異の効果を決定する。活性は、抗体の結合特異性／親和性、および／または抗体の中和効力における変化として測定する。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源に由来する任意の抗体の最適化に使用することができることを理解されたい。選択的変異誘発アプローチは、ファージ提示技術を用いてさらに最適化できない抗体に置いて使用することができる。ファージ提示、ヒトＩｇＧ生殖系列遺伝子を有するトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離したヒト抗体が挙げられる任意の供給源由来の抗体を、選択的変異誘発アプローチの前または後に逆突然変異に供することができることを理解されたい。
【００２５】
「組換えヒト抗体」という表現は、宿主細胞に形質移入した組換え発現ベクターを用いて発現した抗体、組換え体から単離した抗体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５頁を参照されたい）または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライスを含む任意の他の手段によって調製、発現、作成もしくは単離した抗体などの、組換え手段によって調製、発現、作成または単離するヒト抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリンの配列に由来する可変および定常領域を有する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロでの変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニック動物を使用するときは、インビボでの体細胞変異誘発）に供し、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連するが、インビボにおいて生殖系列のヒト抗体レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。しかし、ある種の実施形態では、かかる組換え抗体は、選択的変異誘発アプローチもしくは逆突然変異または両方の結果である。
【００２６】
「単離した抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を含む（例えば、ｈＩＬ−１２と特異的に結合する単離した抗体は、ｈＩＬ−１２以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ｈＩＬ−１２と特異的に結合する単離した抗体は、他の種由来のＩＬ−１２分子と結合することができる。さらに、単離した抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。本発明に関連して精製され得る、適する抗ＩＬ−１２抗体は、米国特許第６，９１４，１２８号（これをそのまま参照により本明細書に組み込む）で開示されており、これには当該特許でＪ６９５として識別され、その後ＡＢＴ−８７４として識別された抗ＩＬ−１２抗体が含まれるが、ただしこれに限定されない。本発明に関連して精製、単離され得る、適する抗ＩＬ−１８抗体は、ＵＳＳＮ第０９／７８０，０３５号および同第１０／９８８，３６０号で開示されており、これにはその後ＡＢＴ−３２５として識別された抗体が含まれる。適する抗ＴＮＦα抗体はアダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）である。
【００２７】
「中和抗体」（またはｈＩＬ−１２活性を中和した抗体）は、ｈＩＬ−１２との結合により、ｈＩＬ−１２の生物活性の阻害をもたらす抗体を含む。ｈＩＬ−１２の生物活性のこの阻害は、フィトヘマグルチニンの芽細胞増殖アッセイ（ＰＨＡ）におけるフィトヘマグルチニンのヒト芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害などの、ｈＩＬ−１２の生物活性の１つまたは複数の指標を測定することによって評価することができる。ｈＩＬ−１２の生物活性のこれらの指標は、当技術分野で既知のインビトロまたはインビボにおける１つまたは複数のいくつかの標準的なアッセイによって評価することができる。
【００２８】
「中和抗体」（または「ｈＩＬ−１８活性を中和する抗体」）は、ｈＩＬ−１８と結合すると、ｈＩＬ−１８の生物学的な活性を阻害する抗体を含む。このｈＩＬ−１８が有する生物学的活性の阻害は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生誘導、またはヒトＩＬ−１８受容体結合アッセイにおけるＩＬ−１８受容体結合阻害などの、ｈＩＬ−１８の生物学的活性の１つまたは複数の指標を測定することにより評価可能である。ｈＩＬ−１８が有する生物学的活性のこれらの指標は、当技術分野で既知のインビトロまたはインビボにおける１つまたは複数のいくつかの標準的なアッセイにより評価可能である。
【００２９】
「活性」という用語は、例えば、ＩＬ−１２抗原に結合する抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗体の抗原に対する結合特異性／親和性、および／または例えば、ｈＩＬ−１２との結合により、ｈＩＬ−１２の生物活性を阻害する抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗体の中和効力、例えば、ＰＨＡ芽細胞増殖の阻害またはヒトＩＬ−１２受容体結合アッセイにおける受容体結合の阻害などの活性を含む。用語の「活性」は、抗ＩＬ−１８抗体、例えばＩＬ−１８抗原に結合する抗ｈＩＬ−１８抗体のその抗原に対する結合特異性／親和性などの活性および／または抗体の中和能力、例えばｈＩＬ−１８への結合がｈＩＬ−１８の生物学的活性を阻害するような抗ｈＩＬ−１８抗体の中和能力も含む。「活性」という用語は、抗ＴＮＦα抗体、例えばＴＮＦα抗原に結合する抗ＴＮＦα抗体のその抗原に対する結合特異性／親和性などの活性および／または抗体の中和能力、例えばｈＴＮＦαへの結合がｈＴＮＦαの生物学的活性を阻害するような抗ＴＮＦα抗体の中和能力も含む。
【００３０】
「表面プラズモン共鳴」という表現は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することによって、リアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を含む。さらなる説明については、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．ら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１頁およびＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７頁を参照されたい。
【００３１】
「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用するとき、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数をいうことを意図する。
【００３２】
「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用するとき、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数をいうことを意図する。
【００３３】
「核酸分子」という表現は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む。核酸分子は、単一鎖または二重鎖でよいが、１つの態様では、二重鎖ＤＮＡである。
【００３４】
ｈＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８と結合するものなどの抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して本明細書で使用するとき、「単離した核酸分子」という表現は、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ｈＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まず、他の配列が、天然ではヒトゲノムＤＮＡにおける該核酸に隣接し得る、核酸分子を含む。したがって、例えば、抗ＩＬ−１２ｈ、抗ＴＮＦα、または抗ｈＩＬ−１８抗体のＶＨ領域をコードする本発明の単離した核酸は、例えばＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。「単離した核酸分子」という表現は、ＶＨおよびＶＬ領域が、二重特異性抗体の配列以外の他の配列を含まない二重特異性抗体などの、２価の二重特異的な抗体をコードする配列を含むことも意図する。
【００３５】
「組換え宿主細胞」という表現（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫もいうことを意図すると理解されたい。変異または環境の影響のいずれかにより、後の世代である種の改変が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではあり得ないが、本明細書で使用するとき、「宿主細胞」という用語の範囲内にやはり含まれる。
【００３６】
「変性」という用語は、本明細書で使用するとき、抗体またはこの抗原結合部分における１つまたは複数のアミノ酸の変更をいうこと意図する。変更は、１つまたは複数の位置でアミノ酸を付加、置換または欠失させることによって生じさせることができる。変更は、ＰＣＲ変異誘発などの既知の技法を用いて生じさせることができる。
【００３７】
「約」という用語は、本明細書で使用するとき、基準値よりおよそ１０−２０％大きいまたは小さい範囲をいうことを意図する。ある種の環境では、当業者は、基準値の性質のため、「約」という用語は、その値から１０−２０％より多くまたは少なく逸脱することを意味できると理解する。
【００３８】
「ウイルスの減少／不活性化」という表現は、本明細書で使用するとき、特定の試料中のウイルス粒子の数の低下（「減少」）および例えば、これに限定されないが、特定の試料中のウイルス粒子の感染力または複製能などの活性の低下（「不活性化」）をいうことを意図する。ウイルス粒子の数および／または活性のかかる低下は、およそ約１％から約９９％、好ましくは約２０％から約９９％、より好ましくは約３０％から約９９％、より好ましくは約４０％から約９９％、さらにより好ましくは約５０％から約９９％、さらにより好ましくは約６０％から約９９％、さらにより好ましくは約７０％から約９９％、さらにより好ましくは約８０％から約９９％、さらにより好ましくは約９０％から約９９％程度であってよい。ある種の非限定的な実施形態では、ウイルスの量は、精製した抗体産物中に少しでも存在すれば、そのウイルスについてＩＤ５０（標的集団の５０％に感染するウイルスの量）より少なく、好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０倍少ない、より好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１００倍少ない、さらにより好ましくはそのウイルスについてＩＤ５０より少なくとも１０００倍少ない。
【００３９】
「接触位置」という表現は、２６の既知の抗体−抗原構造のうち１つにおいて、抗原と接触するアミノ酸によって占められる抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３におけるアミノ酸位置を含む。２６の既知の解明された抗体−抗原複合体の構造のいずれかにおいて、ＣＤＲアミノ酸が抗原と接触すれば、そのときそのアミノ酸は接触位置を占めると考えることができる。接触位置は、抗原と接触するアミノ酸によって占められる確率が、非接触位置より高い。１つの態様では、接触位置は、２６の構造の３つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞１．５％）。別の態様では、接触位置は、２５の構造のうち８つより多い構造において抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である（＞３２％）。
【００４０】
２．抗体の生成
「抗体」という用語は、このセクションで使用するとき、インタクトな抗体またはこの抗原結合フラグメントをいう。
【００４１】
本開示の抗体は、対象とする抗原による動物の免疫化を含む様々な技法に続き、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技法によって生成させることができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が原則として好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性形質転換を採用することができる。
【００４２】
ハイブリドーマを調製するための１つの好ましい動物系は、マウス系である。ハイブリドーマの産生は、非常によく確立された手順である。免疫化プロトコールおよび融合のために免疫化した脾細胞を単離するための技法は、当技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も既知である。
【００４３】
抗体は、好ましくは、ヒト、キメラまたはヒト化抗体であってよい。本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖および軽鎖の免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象とする非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウス可変領域を、ヒト定常領域に連結させることができる（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）。ヒト化抗体を作成するために、当技術分野で既知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒらの米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１；５，５８５，０８９；５，６９３，７６２および６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【００４４】
１つの非限定的な実施形態では、本開示の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはＩＬ−１８を対象とするかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを用いて生成させることができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）およびＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）として本明細書で称されるマウスを含む。
【００４５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスクロモソミック動物系は、当技術分野で入手でき、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体などの、本開示の抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」として称される、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用でき、かかるマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有する雌ウシは、当技術分野で記載されており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願ＷＯ２００２／０９２８１２）、本開示の抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ１８抗体を産生するために使用することができる。
【００４６】
これらだけには限らないが、本明細書で開示される、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、もしくは抗ＩＬ−１８抗体もしくはその抗体結合性部分または抗ＩＬ−１２関連、抗ＴＮＦα関連、もしくは抗ＩＬ−１８関連抗体を含む本発明の組換えヒト抗体は、コンビナトリアル組換え抗体ライブラリ、例えば、ヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製したヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを用いて調製したｓｃＦｖファージ提示ライブラリの選別によって単離することができる。かかるライブラリを調製および選別するための方法論は、当技術分野で既知である。ファージ提示ライブラリを作成するための市販のキット（例えば、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージ提示キット、カタログ番号２４０６１２）に加えて、抗体提示ライブラリの作成および選別の使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号明細書；ＫａｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ出願ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ出願ＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２頁；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５頁；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１頁；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４頁；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８頁；Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０頁；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７頁およびＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２頁で見出すことができ、その全体の教示が本明細書に組み込まれる。
【００４７】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫化において生成できるようにヒト免疫細胞を再構築したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。かかるマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６および５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【００４８】
ある種の実施形態では、本発明の方法は、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体および抗体部分、抗ＩＬ−１２関連、抗ＴＮＦα関連、または抗ＩＬ−１８関連抗体および抗体部分、ならびに低度の解離速度によるｈＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８抗体との高親和性結合および高中和能などの、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体と同等の特性を有するヒト抗体および抗体部分を含む。１つの態様では、本発明は、共に表面プラズモン共鳴による測定にて約１×１０−８Ｍ以下のＫｄ速度定数および１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でｈＩＬ−１２、ｈＴＮＦα、またはｈＩＬ−１８から解離する単離されたヒト抗体またはこの抗原結合部分を用いる治療を提供する。具体的な非限定的な実施形態では、本発明に従って精製した抗ＩＬ１２抗体は、生理的条件下で、ＡＢＴ−８７４とＩＬ１２との結合を競合的に阻害する。具体的な非限定的な実施形態では、本発明に従って精製した抗ＩＬ−１８抗体は、生理的条件下で、ＡＢＴ−３２５とＩＬ−１８との結合を競合的に阻害する。具体的な非限定的な実施形態では、本発明に従って精製さし抗ＴＮＦα抗体は、生理的条件下で、アダリムマブとＴＮＦαとの結合を競合的に阻害する。
【００４９】
本発明のさらなる別の実施形態では、これらだけには限らないが、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、もしくは抗ＩＬ−１８抗体、またはこれらのフラグメントなどの抗体またはフラグメントは、変化させることができ、抗体の定常領域が、非改変の抗体と比較して、少なくとも１つの定常領域媒介性生物学的エフェクター機能を低下させるように改変される。本発明の抗体がＦｃ受容体との低下した結合性を示すように、それを改変するために、抗体の免疫グロブリンの定常領域セグメントを、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定の領域で変異させることができる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１頁ならびにＬｕｎｄら（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２頁を参照されたい）。抗体のＦｃＲ結合能の低下により、オプソニン作用および食作用および抗原依存性細胞毒性などの、ＦｃＲ相互作用に頼る他のエフェクター機能も低下させることができる。
【００５０】
３．抗体の産生
本発明の抗体を発現させるために、遺伝子が、転写および翻訳調節配列に操作的に連結されるように、部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、１つまたは複数の発現ベクターに挿入される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９１４，１２８号明細書を参照されたい）。この文脈では、「操作的に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、それらが目的とする抗体遺伝子の転写および翻訳の制御機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中にライゲートされることを意味すると意図する。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入でき、またはより典型的には、両遺伝子は、同じ発現ベクター中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位がなければ平滑末端のライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。抗体または抗体関連軽鎖または重鎖配列の挿入の前に、発現ベクターは、抗体の定常領域配列を既に保有することができる。例えば、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、もしくは抗ＩＬ−１８抗体または抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、もしくは抗ＩＬ−１８抗体関連ＶＨおよびＶＬ配列を、完全長抗体遺伝子に転換する１つのアプローチは、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメント（複数可）に操作的に連結し、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに操作的に連結するように、重鎖の定常および軽鎖の定常領域をそれぞれ既にコードする発現ベクター中にそれらを挿入することである。追加的または代替的には、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進させるシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングさせることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンのシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってよい。
【００５１】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する１つまたは複数の制御配列を保有することができる。「制御配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。かかる制御配列は、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような因子によって決められることは、当業者に理解されよう。哺乳動物宿主細胞の発現に適した制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、主要な後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高いタンパク質発現レベルを指示するウイルス性エレメントを含む。ウイルス性制御エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５，１６８，０６２号明細書、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４，５１０，２４５号明細書およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４，９６８，６１５号明細書を参照されたい。
【００５２】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）などの１つまたは複数の追加の配列および／または選択可能なマーカー遺伝子を保有することができる。選択可能なマーカー遺伝子により、ベクターが導入された宿主細胞の選択が促進される（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、全てＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６、４，６３４，６６５および５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。適した選択可能なマーカー遺伝子には、（メトトレキサートの選択／増幅を用いるｄｈｆｒ宿主細胞の使用については）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択については）ネオ遺伝子が挙げられる。
【００５３】
本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞における免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。組換えで抗体を発現させるために、軽鎖および重鎖が、宿主細胞中で発現され、宿主細胞を培養する培地中に分泌され、抗体が培地から回収できるように、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリンの軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保有する１つまたは複数の組換え発現ベクターを形質移入する。抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を得て、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組込み、ベクターを宿主細胞中に導入するために、標準的な組換えＤＮＡ方法論が使用され、これらは、その全体の教示が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）ならびに米国特許第４，８１６，３９７＆６，９１４，１２８号明細書などに記載されている。
【００５４】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技法によって宿主細胞中に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核または真核宿主細胞中への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される幅広い様々な技法、例えば、電気穿孔法、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを包含することを意図する。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて、本発明の抗体を発現させることは理論上可能であるが、かかる真核細胞、特に哺乳動物細胞は、原核細胞に比べて、正確にフォールドされた免疫学的な活性抗体を会合および分泌しやすいため、哺乳動物宿主細胞などの真核細胞中での抗体の発現が適している。抗体遺伝子の原核生物の発現は、活性抗体の高収率の産生に効果がないことが報告された（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＢｏｓｓおよびＷｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３頁）。
【００５５】
本明細書でベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母またはより高等な真核生物である。この目的に適した真核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例として、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などのエシュリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）などのセラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）ならびにＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日に出版されたＤＤ２６６，７１０に開示されたＢ．リケニフォルミス４１Ｐ）などのバチリ属（Ｂａｃｉｌｌｉ）、Ｐ．アエルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などのシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ならびにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。Ｅ．コリＢ、Ｅ．コリＸ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株が適しているが、宿主をクローニングする１つの適したＥ．コリは、Ｅ．コリ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）である。これらの例は、限定というよりむしろ実例となるものである。
【００５６】
原核微生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物が、ベクターをコードするポリペプチドに適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母が、より下等な真核宿主微生物の中でもっとも一般的に使用される。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィララム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびＫ．マルキシアナス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）などのクリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウィア属（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；スクワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのスクワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；ならびに例えば、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラミジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）ならびにＡ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主などの糸状菌などの多くの他の属、種および菌株が一般的に入手でき、本明細書に有用である。
【００５７】
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、アエデス・アエギプティ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、アエデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスタ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの対応する許容昆虫宿主細胞が同定された。形質移入のための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体およびボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ−５菌株が公的に利用でき、かかるウイルスは、本発明に従う本明細書でのウイルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質移入のために使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。
【００５８】
本発明の組換え抗体の発現に適した哺乳動物宿主細胞には、（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のようなＤＨＦＲ選択可能なマーカーを用いて使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを、哺乳動物宿主細胞中に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現または宿主細胞を増殖させる培養液中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体は産生される。有用な哺乳動物宿主細胞系の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１頁（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８頁（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞種株（Ｈｅｐ  Ｇ２）であり、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
宿主細胞は、抗体産生のために上記の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に修正された従来の栄養培地で培養する。
【００６０】
抗体を産生するために使用する宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。ＨａｍのＦ１０（商標）（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（商標）（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびＤｕｌｂｅｃｃｏのＭｏｄｉｆｉｅｄ  ＥａｇｌｅのＭｅｄｉｕｍ（商標）（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４頁（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５頁（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；４，５６０，６５５または５，１２２，４６９号明細書；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号明細書に記載の任意の培地を、宿主細胞用の培養液として使用でき、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる。任意のこれらの培地は、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン薬など）、微量元素（通常マイクロモーラーの範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充も、当業者に既知である適切な濃度で含むことができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に以前に使用したものであり、当業者には明白である。
【００６１】
宿主細胞は、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの、インタクトな抗体の部分を産生するために使用することもできる。上記の手順のバリエーションが、本発明の範囲内であることは理解されよう。例えば、ある種の実施形態では、宿主細胞に、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか（両方ではない）をコードするＤＮＡを形質移入することを所望することができる。組換えＤＮＡ技術は、抗ＩＬ−１２抗体との関連においてＩＬ−１２、具体的にはｈＩＬ−１２に結合するのに不要な軽鎖および重鎖のいずれか一方または両方をコードするＤＮＡ、または抗ＩＬ−１８抗体との関連においてＩＬ−１８、具体的にはｈＩＬ−１８に結合するのに不要なＤＮＡ、または抗ＴＮＦα抗体との関連においてＴＮＦα、具体的にはｈＴＮＦαに結合するのに不要なＤＮＡの一部または全部を除去するためにも利用可能である。かかる切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の抗体に包含される。さらに、本発明の抗体の特異性に応じて、標準的な化学的架橋法により、本発明の抗体と第２抗体を架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が、本発明の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、またはＩＬ−１８以外の抗原に特異的である二機能性抗体を、産生することができる。
【００６２】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分の組換え発現のための適した系では、抗体の重鎖および抗体の軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターは、リン酸カルシウム媒介型形質移入によって、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内では、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子は、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーターの制御エレメントにそれぞれ操作的に連結して、遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターは、ＤＨＦＲ遺伝子も保有し、これにより、メトトレキサートの選択／増幅を用いて、ベクターに形質移入したＣＨＯ細胞を選択することが可能になる。選択された形質転換体宿主細胞は、抗体の重鎖および軽鎖の発現を可能にするために培養され、無傷の抗体は、培養液から回収される。組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞に形質移入し、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収するために、標準的な分子生物学的技法が用いられる。
【００６３】
組換え技法を使用するとき、抗体は、細胞膜周辺腔中で細胞内に産生され得、または培地中に直接分泌され得る。１つの態様では、抗体が細胞内に産生されれば、第１ステップとして、（例えば、遠心分離の結果として生じた）粒状の残骸、宿主細胞または溶解した細胞のいずれかを、例えば、遠心分離または限界濾過によって除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、かかる発現系からの浮遊物を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮することができる。
【００６４】
本発明の工程の前に、細胞の残骸から抗体を精製するための手順を、抗体の発現部位によって最初に決める。いくつかの抗体は、細胞から増殖培地の周辺に直接分泌され得、他の抗体は、細胞内につくられる。後者の抗体について、精製工程の第１ステップは、典型的には、機械的な剪断、浸透圧ショックまたは酵素処理が挙げられる様々な方法によって起こり得る細胞の溶解を伴う。かかる破壊により、細胞の全体の内容物が破砕物中に放出され、さらに、それらの小ささのために除去するのが難しい細胞内の断片が産生される。これらは、一般的に、異なる遠心分離によって、または濾過によって除去される。抗体が分泌される場合、かかる発現系からの浮遊物は、一般的に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（商標）限界濾過ユニットを用いて、まず濃縮される。抗体が培地中に分泌される場合、組換え宿主細胞は、例えば、接線流濾過によって、細胞培養液から分離することもできる。抗体は、本発明の抗体精製方法を用いて、培養液からさらに回収することができる。
【００６５】
４．抗体の精製
４．１  一般的な抗体の精製
本発明は、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物から精製された（または「ＨＣＰ減少型」）抗体調製物を生成するための方法を提供する。本発明の精製工程は、上記の方法および当技術分野の従来の方法を用いて抗体を生成する場合、分離のステップで始まる。表１に、精製計画の１つの実施形態をまとめる。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーステップの省略、またはイオン交換ステップの順序の逆転を含め、ただしこれらに限定されないこのスキームの諸変更は予定されており、本発明の範囲内である。
【００６６】
【表１】
0006023140.tif 000002
【００６７】
抗体を含む清澄化した溶液または混合物を得たらすぐに、細胞が産生したＨＣＰなどの他のタンパク質からの抗体の分離を、イオン交換分離ステップ（複数可）および疎水性相互作用分離ステップ（複数可）を含む異なる精製技法の組合せを用いて行う。分離ステップにより、それらの電荷、疎水性の程度または大きさに基づいて、タンパク質の混合物が分離される。本発明の１つの態様では、分離は、陽イオン、陰イオンおよび疎水性相互作用が挙げられるクロマトグラフィーを用いて行う。いくつかの異なるクロマトグラフィー樹脂をこれらの各技法に利用でき、関連する特定のタンパク質に対する精製計画の正確な組立てを可能にする。各分離方法の本質は、タンパク質が、異なる速度でカラムを横切り落ちることにより、カラムをさらに通って落ちるにつれて物理的分離の増加が達成されること、または分離媒体に選択的に付着することにより、次いで異なる溶媒によって別個に抽出されることのいずれかをもたらせることである。いくつかの場合では、不純物がカラムに特異的に付着し、抗体が付着しない、すなわち抗体がフロースルー中に存在するとき、抗体は不純物から分離される。
【００６８】
上述のように、精製計画の正確な組立ては、精製するタンパク質の濃度に依存する。ある種の実施形態では、本発明の分離ステップは、１つまたは複数のＨＣＰから抗体を分離するステップが採用される。本明細書に記載の方法を用いてうまく精製できる抗体には、これに限定されないが、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭ抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、本発明の精製戦略は、ＩｇＧ３抗体がプロテインＡに非効率に結合するため、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの使用、例えばＩｇＧ３抗体の精製を除外する。精製計画の具体的な組立てを可能にする他の因子には、これに限定されないが、（例えば、抗体のＦａｂフラグメントと比べて完全長抗体に関連する）Ｆｃ領域の存在または非存在（なぜならプロテインＡはＦｃ領域に結合する）、対象とする抗体の生成に採用する特定の生殖系列の配列および抗体のアミノ酸組成（例えば、抗体の一次配列および分子の全体の変化／疎水性）が挙げられる。１つまたは複数の特徴を共有する抗体は、その特徴を利用するように組み立てた精製戦略を用いて精製することができる。
【００６９】
４．２一次回収
本発明の精製方法の最初のステップは、清澄化の第１相および試料マトリックスからの抗体の一次回収に関連する。さらに、一次回収工程は、試料マトリックス中に存在し得るウイルスを不活性化する時点であってもよい。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５３４，９７２号明細書のような、熱不活性化（低温殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／洗剤処理、ＵＶおよびγ線照射ならびにβ−プロピオラクトンまたは例えば銅フェナントリンなどの追加のある種の化学的不活性剤が挙げられる、任意の１つまたは複数の様々なウイルス不活性化方法を、精製の一次回収相の間に使用することができる。本発明のある種の実施形態では、試料マトリックスは、一次回収相の間にｐＨウイルス不活性化に供する。
【００７０】
ｐＨのウイルス不活性化の方法には、これに限定されないが、低ｐＨである期間混合物をインキュベートするステップ、続いてｐＨを中和するステップ、および濾過によって粒子を除去するステップが挙げられる。ある種の実施形態では、混合物は、約２から５の間のｐＨ、好ましくは約３から４の間のｐＨ、より好ましくは約３．５のｐＨでインキュベートする。試料マトリックスのｐＨは、これに限定されないが、クエン酸、酢酸、カプリル酸が挙げられる任意の適した酸または他の適した酸によって低下させることができる。ｐＨレベルの選択は、主として抗体産物の安定性プロファイルおよびバッファー成分に依存する。低ｐＨのウイルス不活性化の間の標的抗体の質は、ｐＨおよび低ｐＨインキュベーションの持続時間に影響を受けることが知られている。ある種の実施形態では、低ｐＨインキュベーションの持続時間は、０．５時間から２時間、好ましくは０．５時間から１．５時間であり、より好ましくは、持続時間は１時間である。ウイルス不活性化は、タンパク質濃度に加えて、高濃度で不活性化を低下させ得るこれらのいくつかのパラメータに依存する。したがって、タンパク質濃度、ｐＨおよび不活性化の持続時間の適したパラメータは、ウイルス不活性化の所望のレベルを達成するように選択することができる。
【００７１】
ある種の実施形態では、ウイルスの不活性化は、適したフィルターの使用によって達成することができる。適したフィルターの非限定的な例は、Ｐａｌｌ社のＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターである。本発明のある種の実施形態は、一次回収相の間にかかる濾過を採用するが、他の実施形態では、それは、精製の最後から２番目または最終ステップのいずれかが挙げられる、精製工程の他の相で採用する。ある種の実施形態では、これに限定されないが、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）；Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ、Ｃｏｎｎ．）およびＰｌａｎｏｖａ（商標）フィルター（旭化成ファーマ、Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、Ｉ１１．）などの代替的なフィルターが、ウイルスの不活性化に採用される。
【００７２】
それらの実施形態では、ウイルスの不活性化を採用する場合、必要に応じて、さらなる精製ステップのために、試料マトリックスを調整することができる。例えば、低ｐＨのウイルス不活性化に続いて、試料マトリックスのｐＨは、典型的には精製工程を続ける前に、より中性ｐＨ、例えば、約４．５から約８．５、好ましくは約４．９に調整する。さらに、混合物を注射用水（ＷＦＩ）で流して、所望の伝導性を得ることができる。
【００７３】
ある種の実施形態では、一次回収は、試料マトリックスをさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体の精製を助ける１つまたは複数の遠心分離ステップを含む。試料の遠心分離は、例えば、限定するものではないが、７，０００×ｇからおよそ１２，７５０×ｇで実行することができる。大規模な精製に関して、かかる遠心分離は、例えば、限定するものではないが、結果として生じる浮遊物において１５０ＮＴＵの濁度レベルに達成する流速設定によりオンラインで行うことができる。かかる浮遊物は、次いでさらなる精製のために収集することができる。
【００７４】
ある種の実施形態では、一次回収は、試料マトリックスをさらに清澄化し、それによって抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体の精製を助ける１つまたは複数の深層濾過ステップの使用を含む。深層濾過は、段階的密度を有する濾過媒体を含む。かかる段階的密度により、より大きい粒子はフィルターの表面付近で捕捉する一方、より小さい粒子はフィルターの表面のより大きく開いた部分を透過し、フィルターの中央により近いより小さい開きのみで捕捉することが可能になる。ある種の実施形態では、深層濾過ステップは、デリピッド深層濾過ステップであってよい。ある種の実施形態は、一次回収相の間のみ深層濾過ステップを採用するが、他の実施形態は、１つまたは複数の追加の精製の相の間にデリピッド深層濾過を含む深層濾過を採用する。本発明に関して使用できる深層濾過の非限定的な例には、Ｃｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルター（３Ｍ社）および０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジが挙げられる。
【００７５】
４．３  アフィニティークロマトグラフィー
ある種の実施形態では、一次回収試料は、ＨＣＰを取り除いて対象とする抗体の純度をさらに高めるためにアフィニティークロマトグラフィーに供される。ある種の実施形態では、クロマトグラフィー材料は、対象とする抗体と選択的に、または特異的に結合する能力を有する。かかるクロマトグラフィー材料の非限定的な例として、下記事項が挙げられる：プロテインＡ、プロテインＧ、対象とする抗体が結合する抗原を含むクロマトグラフィー材料およびＦｃ結合タンパク質を含むクロマトグラフィー材料。具体的な実施形態では、アフィニティークロマトグラフィーステップは、一次回収試料を適当なプロテインＡ樹脂を含むカラムで処理するステップを含む。プロテインＡ樹脂は、様々な抗体アイソタイプ、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４のアフィニティー精製および単離に有用である。プロテインＡは、哺乳動物のＩｇＧに、主にそのＦｃ領域を介して結合するバクテリアの細胞壁タンパク質である。天然の状態では、プロテインＡは、５つのＩｇＧ結合ドメインの他、未知の機能を担うその他のドメインを有する。
【００７６】
プロテインＡ樹脂についていくつかの販売元がある。１つの適する樹脂はＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）である。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）が充填された、適するカラムの非限定的な例として、直径約１．０ｃｍ×長さ約２１．６ｃｍのカラム（約１７ｍＬのベッドボリューム）が挙げられる。このサイズのカラムは、小スケールの精製に利用可能であり、またスケールアップに用いられる他のカラムと比較可能である。例えば、ベッドボリュームが約６．６Ｌの２０ｃｍ×２１ｃｍカラムが、大規模な精製に利用可能である。カラムを問わず、カラムはＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）等の適する樹脂を用いて充填可能である。
【００７７】
ある種の実施形態では、対象となる具体的な抗体について精製を特別設計するために、プロテインＡ樹脂の動的結合容量（ＤＢＣ）を特定することが有利である。例えば、ただし限定する目的ではなく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）カラムのＤＢＣは、シングル流速負荷またはデュアルフロー負荷戦略のいずれかにより決定可能である。シングル流速負荷は、全負荷期間を通じて約３００ｃｍ／時の速度で評価可能である。デュアル流速負荷戦略は、線速度約３００ｃｍ／時で、樹脂１ｍＬ当たり最大約３５ｍｇのタンパク質をカラムに負荷し、次に負荷物の最後の部分がより長い時間滞留するように線速度を半減することにより決定可能である。
【００７８】
ある種の実施形態では、プロテインＡカラムは、試料を負荷する前に適するバッファーで平衡可能である。適するバッファーの非限定的な例として、トリス／ＮａＣｌバッファー、ｐＨ約７．２が挙げられる。適する平衡化条件の非限定的な例として、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ約７．２が挙げられる。この平衡化に続いて、試料はカラム上に負荷可能である。カラムへの負荷後に、当該カラムは、例えば平衡化バッファーを用いて単回または複数回洗浄可能である。異なるバッファーを用いた洗浄を含むその他の洗浄も、カラム溶出前に利用可能である。例えば、カラムはカラムボリュームの１倍または複数倍の２０ｍＭクエン酸／クエン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ約６．０を用いて洗浄可能である。この洗浄は、場合によって平衡化バッファーを用いた１回または複数回の洗浄を後続させることができる。プロテインＡカラムは、次に適当な溶出バッファーを用いて溶出可能である。適する溶出バッファーの非限定的な例として、酢酸／ＮａＣｌバッファー、ｐＨ約３．５が挙げられる。適する条件は、例えば０．１Ｍ酢酸、ｐＨ約３．５である。溶出液は、当業者に周知の技法を用いてモニター可能である。例えば、ＯＤ２８０における吸光度に基づくことができる。カラム溶出液は、約０．５ＡＵの初期偏位に始まり、溶出ピークのテーリング末端部における約０．５ＡＵの値まで収集可能である。対象とする溶出分画（単数または複数）は、次にさらに処理するために調製可能である。例えば、収集された試料は、ｐＨ約１０のトリス（例えば１．０Ｍ）を用いてｐＨ約５．０まで徐々に滴加することが可能である。場合により、この滴加試料は濾過可能およびさらに処理可能である。
【００７９】
４．４  イオン交換クロマトグラフィー
ある種の実施形態では、本発明は、抗体を含む溶出液が得られるように、少なくとも１つのイオン交換分離ステップに混合物を供することによって、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法を提供する。イオン交換分離は、２つの基質を、それらのそれぞれのイオン電荷の差に基づいて分離する任意の方法を含み、陽イオン交換物質または陰イオン交換物質のいずれかを採用することができる。
【００８０】
陽イオン交換物質対陰イオン交換物質の使用は、タンパク質の全体の電荷に基づく。したがって、陽イオン交換ステップの使用の前に陰イオン交換ステップ、または陰イオン交換ステップの使用の前に陽イオン交換ステップを採用することは、本発明の範囲内である。さらに、陽イオン交換ステップのみ、陰イオン交換ステップのみまたは２つの任意の連続的な組合せを採用することも、本発明の範囲内である。
【００８１】
分離の実行において、最初の抗体混合物は、任意の様々な技法を用いて、例えば、バッチ精製技法またはクロマトグラフィー技法を用いて、イオン交換物質と接触させることができる。
【００８２】
例えば、バッチ精製に関して、イオン交換物質は、所望の開始バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。調製または平衡化において、イオン交換物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーに接触させて、分離する抗体をイオン交換物質に吸着させる。イオン交換物質に結合しないＨＣＰ（複数可）を含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、浮遊物を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つまたは複数の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーを、より高い伝導性の溶液に接触させて、イオン交換物質に結合したＨＣＰを脱着させることができる。結合したポリペプチドを溶出するために、バッファーの塩濃度を上昇させることができる。
【００８３】
イオン交換クロマトグラフィーは、イオン交換分離技法として使用することもできる。イオン交換クロマトグラフィーは、分子の全体の電荷の間の差に基づいて分子を分離する。抗体の精製について、抗体は、結合するために、イオン交換物質、例えば樹脂に付着される官能基の電荷と反対の電荷をもたなければならない。例えば、一般的にそのｐＩより低いｐＨのバッファー中で、全体的に正電荷を有する抗体は、負に荷電した官能基を含む陽イオン交換物質によく結合する。
【００８４】
イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶質の表面上の荷電したパッチは、クロマトグラフィーのマトリックスに付着した反対の電荷によって誘引され、これにより周囲のバッファーのイオン強度は低くなる。溶出は、一般的にイオン交換マトリックスの荷電部位について溶質と競合するようにバッファーのイオン強度（すなわち、伝導性）を増加させることによって達成される。ｐＨを変更し、それにより溶質の電荷を変化させることは、溶質の溶出を達成する別のやり方である。伝導性またはｐＨの変更は、漸進的（勾配溶出）または段階的（段階溶出）であってよい。
【００８５】
陰イオンまたは陽イオン置換基は、クロマトグラフィーのための陰イオンまたは陽イオン担体を形成するために、マトリックスに付着させることができる。陰イオン交換置換基の非限定的な例には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、４級アミノエチル（ＱＡＥ）および４級アミン（Ｑ）基が挙げられる。陽イオン置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸塩（Ｐ）およびスルホン酸塩（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３（商標）、ＤＥ３２（商標）、ＤＥ５２（商標）、ＣＭ−２３（商標）、ＣＭ−３２（商標）およびＣＭ−５２（商標）などのセルロースイオン交換樹脂は、Ｗｈａｔｍａｎ社、メイドストーン、ケント、Ｕ．Ｋ．から入手することができる。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ベースのおよびロクロスリンク型イオン交換体も既知である。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−およびＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）ならびにＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−およびＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ならびにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから全て入手することができる。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭおよびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ両方の誘導体化エチレングリコール−メタクリル酸コポリマーは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ社、フィラデルフィア、Ｐａ．から入手することができる。
【００８６】
抗体および不純物、例えばＨＣＰ（複数可）を含む混合物は、陽イオン交換カラムなどのイオン交換カラム上に負荷する。例えば、限定するものではないが、混合物は、使用するカラムに依存して、約８０ｇのタンパク質／Ｌ樹脂の負荷で負荷する。適した陽イオン交換カラムの例は、ベッドボリュームが約１１６Ｌであり、直径８０ｃｍ×長さ２３ｃｍのカラムである。この陽イオンカラム上に負荷された混合物は、続いて洗浄用バッファー（平衡バッファー）で洗浄することができる。抗体は、次いでカラムから溶出し、最初の溶出液を得る。
【００８７】
このイオン交換ステップにより、対象とする抗体の捕獲が促進される一方、ＨＣＰなどの不純物が減少する。ある種の態様では、イオン交換カラムは、陽イオン交換カラムである。例えば、限定するものではないが、かかる陽イオン交換カラムに適した樹脂は、ＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ樹脂である。これらの樹脂は、Ｐａｌｌ社などの商業的供給源から入手することができる。この陽イオン交換手順は、室温またはその付近で行うことができる。
【００８８】
４．５  限界濾過／透析濾過
本発明のある種の実施形態は、抗体試料をさらに精製および濃縮するために、限界濾過および／または透析濾過ステップを採用する。限界濾過は、「Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＡ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９９６）および「Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９８６；ＩＳＢＮ  Ｎｏ．８７７６２−４５６−９）に詳細に記載されている。好ましい濾過方法は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログの表題「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ」、１７７−２０２頁（ベッドフォード、Ｍａｓｓ．、１９９５／９６）に記載のような接線流濾過である。限界濾過とは、一般的に０．１μｍより小さい孔径を有するフィルターを用いる濾過を意味すると考えられる。かかる小さい孔径を有するフィルターを採用することによって、抗体はフィルターの後に保持される一方で試料の体積が、フィルターを通る試料バッファーの透過により減少できる。
【００８９】
透析濾過は、塩、糖、および非水溶媒の除去および交換、結合した種からの遊離した種の分離、低分子量の物質の除去、ならびに／またはイオンおよび／もしくはｐＨ環境の迅速な変化を引き起こすために、限界フィルターを用いる方法である。マイクロ溶質は、限界濾過速度とほぼ同等の速度で限界濾過する溶液に溶媒を添加することによって、もっとも効率的に除去される。これにより、一定体積で溶液から微細種が洗浄され、保持された抗体が効率的に精製される。本発明のある種の実施形態では、透析濾過ステップは、場合によってさらなるクロマトグラフィーまたは他の精製ステップの前に、および抗体調製物から不純物を除去するために、本発明に関連して使用される様々なバッファーを交換するために採用される。
【００９０】
４．６  疎水性相互作用クロマトグラフィー
本発明は、疎水性相互作用分離ステップをさらに含み、抗体および少なくとも１つのＨＣＰを含む混合物からＨＣＰ減少型抗体調製物を生成するための方法も特徴とする。例えば、減少したレベルのＨＣＰを有する第２溶出液が得られるように、イオン交換カラムから得た最初の溶出液を、疎水性相互作用物質に供することができる。本明細書に記載されているものなどの疎水性相互作用クロマトグラフィーステップは、一般的に抗体凝集体などのタンパク質凝集体および工程関連不純物を除去するために行う。
【００９１】
分離の実行において、試料混合物は、例えば、バッチ精製技法を用いて、またはカラムを用いてＨＩＣ物質と接触させる。ＨＩＣ精製の前に、例えば、混合物をプレカラムに通すことによって、任意のカオトロピック剤または非常に疎水的な物質を除去することを所望することができる。
【００９２】
例えば、バッチ精製に関して、ＨＩＣ物質は、所望の平衡バッファー中で調製する、またはそれに平衡化する。ＨＩＣ物質のスラリーを得る。抗体溶液をスラリーと接触させて、分離する抗体をＨＩＣ物質に吸着させる。ＨＩＣ物質に結合しないＨＣＰを含む溶液は、例えば、スラリーの定着を可能にし、浮遊物を除去することによって、スラリーから分離する。スラリーは、１つまたは複数の洗浄ステップに供することができる。必要であれば、スラリーをより低い伝導性の溶液と接触させて、ＨＩＣ物質に結合した抗体を脱着させることができる。結合した抗体を溶出するために、塩濃度を低下させることができる。
【００９３】
イオン交換クロマトグラフィーは、抗体の電荷に依存してそれらを単離する一方、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、抗体の疎水性特性を用いる。抗体上の疎水基は、カラム上の疎水基と相互作用する。より疎水的なタンパク質ほど、より強くカラムと相互作用する。したがって、ＨＩＣステップにより、宿主細胞由来の不純物（例えば、ＤＮＡならびに他の高および低分子量産物関連種）が除去される。
【００９４】
疎水性相互作用は、高いイオン強度でもっとも強く、したがって、この分離の形態は、塩析またはイオン交換手順に続いて便利に行われる。ＨＩＣカラムへの抗体の吸着は、高い塩濃度が好ましいが、実際の濃度は、抗体の性質および選択された特定のＨＩＣリガンドに依存して、非常に広範にわたることができる。様々なイオンは、それらが疎水性相互作用を促進するか（塩析効果）、または水の構造を破壊し（カオトロピック効果）、疎水性相互作用の減退を引き起こすかどうかに依存する、いわゆる疎溶媒性系列において配置することができる。ＰＯ−−−；ＳＯ４−−；ＣＨ３ＣＯ３−；Ｃｌ−；Ｂｒ−；ＮＯ３−；ＣｌＯ４−；Ｉ−；ＳＣＮ−のような陰イオンは、カオトロピック効果の増加に関して位置づけることができる一方、Ｂａ＋＋；Ｃａ＋＋；Ｍｇ＋＋；Ｌｉ＋；Ｃｓ＋；Ｎａ＋；Ｋ＋；Ｒｂ＋；ＮＨ４＋のような陽イオンは、塩析効果の増加に関して位置づけられる。
【００９５】
一般的に、Ｎａ、ＫまたはＮＨ４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド−タンパク質相互作用を効果的に促進する。次の関係：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮによって相互作用の強度に影響を与える塩を処方することができる。一般的に、約０．７５から２Ｍの間の硫酸アンモニウムまたは約１から４Ｍの間のＮａＣｌの塩濃度が有用である。
【００９６】
ＨＩＣカラムは、通常、疎水性リガンド（例えば、アルキルまたはアリール基）が共役する基盤マトリックス（例えば、架橋結合したアガロースまたは合成コポリマー物質）を含む。適したＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む（例えば、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム）。多くのＨＩＣカラムが、商業的に入手可能である。例には、これに限定されないが、低いまたは高い置換を有するＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＢ、スウェーデン）；Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  ＰｒｏｐｙｌまたはＦａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｐｈｅｎｙｌカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）；Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ＭｅｈｙｌまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（商標）ｔ−Ｂｕｔｙｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア）；ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー）およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）フェニルまたはブチルいずれかのカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、ＰＡ）が挙げられる。
【００９７】
４．７  典型的な精製戦略
ある種の実施形態では、一次回収は、産生バイオリアクターの収集物から細胞および細胞残骸（ＨＣＰを含む）を除去するために、ｐＨの低下、遠心分離および濾過のステップを連続的に採用することによって進行することができる。例えば、限定するものではないが、抗体、培地および細胞を含む培養物は、およそ１時間、約３．５の酸性ｐＨを用いてｐＨ媒介ウイルス不活性化に供することができる。ｐＨの低下は、クエン酸、例えば３Ｍのクエン酸などの既知の酸調製を用いて促進することができる。ｐＨ感受性ウイルス混入物を完全に排除しない場合、酸性ｐＨへの曝露により、この混入物を減少させ、いくらかの培地／細胞混入物を沈殿させる。このウイルス減少／不活性化ステップに続いて、水酸化ナトリウム、例えば３Ｍの水酸化ナトリウムなどの塩基を用いて、約２０から約４０分間、ｐＨを約４．９または５．０に調整する。この調整は、およそ２０℃で行うことができる。ある種の実施形態では、ｐＨ調製した培養物を、次いでおよそ７０００×ｇからおよそ１１，０００×ｇで遠心分離する。ある種の実施形態では、結果として生じる試料浮遊物を、多数の深層フィルターを含むフィルタートレインに通す。ある種の実施形態では、フィルタートレインは、およそ１２個の１６インチのＣｕｎｏ（商標）モデル３０／６０ＺＡ深層フィルター（３Ｍ社）および３つの３０インチの０．４５／２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２フィルターカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を装着したおよそ３回転のフィルターハウジングを含む。清澄化した浮遊物は、事前に滅菌した収集容器などの容器中に収集し、およそ８℃で維持する。この温度は次いで、捕獲クロマトグラフィーステップまたは以下に概説するステップの前に、およそ２０℃に調整する。当業者は、上述の条件を変えることができ、これも本発明の範囲内であることに注目されたい。
【００９８】
ある種の実施形態では、一次回収の後にプロテインＡ樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーが続く。プロテインＡ樹脂についていくつかの販売元がある。１つの適する樹脂はＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）である。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）が充填された、適するカラムの例として、直径約１．０ｃｍ×長さ約２１．６ｃｍのカラム（約１７ｍＬのベッドボリューム）が挙げられる。このサイズのカラムは、ベンチスケールで利用可能である。このカラムは、スケールアップに用いられる他のカラムと比較可能である。例えば、ベッドボリュームが約６．６Ｌの２０ｃｍ×２１ｃｍカラムが、スケールアップに利用可能である。カラムを問わず、カラムはＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）等の適する樹脂を用いて充填可能である。
【００９９】
他の実施形態では、清澄化した浮遊物は、陽イオン交換カラムを用いてさらに精製する。ある種の実施形態では、陽イオン交換カラムに使用する平衡化バッファーは、約５．０のｐＨを有するバッファーである。適したバッファーの例は、ｐＨ５．０の約２１０ｍＭの酢酸ナトリウムである。平衡化に続いて、カラムに、上記の一次回収ステップから調製した試料を負荷する。カラムに、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの陽イオン交換樹脂を充填する。カラムを、次いで平衡化バッファーを用いて洗浄する。カラムは、次に平衡化または洗浄用バッファーと比較して、より大きいイオン強度を有するバッファーを用いて、溶出ステップに供する。例えば、適した溶出バッファーは、ｐＨ５．０の約７９０ｍＭの酢酸ナトリウムであってよい。抗体を溶出し、ＯＤ２８０ｎｍでセットしたＵＶ分光光度計を用いてモニターすることができる。特定の実施例では、溶出収集物は、上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側８ＯＤ２８０ｎｍであってよい。当業者は条件を変えることができ、これもさらに本発明の範囲内であることを理解されたい。
【０１００】
ある種の実施形態では、一次回収から得た清澄化した浮遊物は、代わりに陰イオン交換カラムを用いてさらに精製する。このステップに適したカラムの非限定的な例は、ベッドボリュームが約８５Ｌであり、直径６０ｃｍ×長さ３０ｃｍのカラムである。カラムに、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの陰イオン交換樹脂を充填する。カラムは、約７つのカラム容積のトリス／塩化ナトリウムなどの適切なバッファーを用いて平衡化することができる。適した条件の例は、ｐＨ８．０の、２５ｍＭのトリス、５０ｍＭの塩化ナトリウムである。当業者は条件を変えられるが、これも本発明の範囲内である。カラムに、上記で概説した一次回収ステップから収集した試料を負荷する。別の態様では、カラムは、陽イオン交換の間に収集された溶出液から負荷する。カラムの負荷に続いて、カラムを平衡バッファー（例えば、トリス／塩化ナトリウムバッファー）で洗浄する。抗体を含むフロースルーは、ＵＶ分光光度計を用いてＯＤ２８０ｎｍでモニターすることができる。この陰イオン交換ステップにより、核酸様ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質などの工程関連不純物が減少する。対象とする抗体が、カラムの固相、例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）と実質的に相互作用も結合もしないが、多くの不純物が、カラムの固相と相互作用および結合するという事実により、分離は起こる。陰イオン交換は、約１２℃で行うことができる。
【０１０１】
ある種の実施形態では、イオン交換ステップが最初に採用されることに依存して、陽イオン交換または陰イオン交換溶出液は、次に例えば１６インチのＣｕｎｏ（商標）デリピッドフィルターを用いて濾過する。デリピッドフィルターを用いるこの濾過に続いて、例えば、３０インチの０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）二重層フィルターカートリッジを用いることができる。イオン交換溶出バッファーは、フィルター中に残る残留量を流すために使用でき、限界濾過／透析濾過のために調製することができる。
【０１０２】
限界濾過／透析濾過ステップを遂行するために、濾過媒体は、可溶性バッファー、例えば、ｐＨ７．０の２０ｍＭのリン酸ナトリウム中で調製する。塩化ナトリウムなどの塩、例えば１００ｍＭ塩化ナトリウムを添加して、イオン強度を増加させることができる。この限界濾過／透析濾過ステップは、抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体の濃縮、酢酸ナトリウムの除去およびｐＨの調整に役立つ。商業的なフィルターが、このステップを達成するために利用可能である。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは、３０ｋＤの分子量のカットオフ（ＭＷＣＯ）セルロース限界フィルターメンブレンカセットを製造している。この濾過手順は、室温またはその付近で行うことができる。
【０１０３】
ある種の実施形態では、上記の捕獲濾過ステップからの試料を、第２のイオン交換分離ステップに供する。好ましくは、この第２のイオン交換分離は、第１のイオン交換分離の反対の電荷に基づいた分離を含む。例えば、陰イオン交換ステップを一次回収後に採用すれば、第２のイオン交換クロマトグラフィーステップは、陽イオン交換ステップとすることができる。反対に、一次回収ステップに続いて陽イオン交換ステップを行えば、そのステップに続いて陰イオン交換ステップを行う。ある種の実施形態では、第１のイオン交換の溶出を、適切なバッファーの条件に調整する場合、第１のイオン交換の溶出は、第２のイオン交換クロマトグラフィーステップに直接供することができる。適した陰イオンおよび陽イオン分離の物質および条件は、上記に説明する。
【０１０４】
本発明のある種の実施形態では、抗体を含む試料は、疎水性相互作用分離ステップを用いてさらに処理される。かかるステップに適したカラムの非限定的な例は、ベッドボリュームが約７５Ｌである、直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラムであり、これに限定されないが、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデンのＰｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）などのＨＩＣに使用される適切な樹脂を充填する。対象とする抗体を含む、前の陰イオン交換クロマトグラフィーステップから得たフロースルー調製物は、ｐＨ７．０の同等量のおよそ１．７Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムで希釈することができる。これを、次いで０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ（商標）２二重層フィルターまたはその同等物を用いて、濾過に供することができる。ある種の実施形態では、疎水性クロマトグラフィー手順は、２つ以上のサイクルを含む。
【０１０５】
ある種の実施形態では、ＨＩＣカラムは、適したバッファーを用いて最初に平衡化する。適したバッファーの非限定的な例は、ｐＨ７．０の、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムである。当業者は、緩衝剤の濃度を変化させることによって、および／または同等のバッファーを代用することによって、平衡化バッファーを変えることができ、これも本発明の範囲内である。ある種の実施形態では、カラムに、次いで陰イオン交換のフロースルー試料を負荷し、複数回、例えば３回、硫酸アンモニウム／リン酸ナトリウムなどの適した緩衝系で洗浄する。適した緩衝系の例には、およそ７．０のｐＨを有する、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーが挙げられる。場合によって、カラムは、さらなる洗浄サイクルを受けることができる。例えば、第２洗浄サイクルは、適切な緩衝系を用いて、例えば１から７回の複数のカラム洗浄を含むことができる。適した緩衝系の非限定的な例には、ｐＨ７．０の、０．８５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムが挙げられる。１つの態様では、負荷したカラムは、適切な緩衝系を用いて、第３洗浄をさらに受ける。カラムは、およそｐＨ７．０で、１．１Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウムなどの緩衝系を用いて、複数回、例えば１から３回洗浄することができる。再び当業者は緩衝条件を変えることができ、これも本発明の範囲内である。
【０１０６】
カラムは、適切な溶出バッファーを用いて溶出する。かかる溶出バッファーの適した例は、およそｐＨ７．０の０．５Ｍの硫酸アンモニウム、１５ｍＭのリン酸ナトリウムである。対象とする抗体は、ピークの上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側３ＯＤ２８０ｎｍまで従来の分光光度計を用いて検出および収集することができる。
【０１０７】
本発明のある種の態様では、疎水性クロマトグラフィーステップからの溶出液は、存在すれば、無傷のウイルスを含むウイルス粒子の除去のために、濾過に供することができる。適した濾過の非限定的な例は、Ｐａｌｌ社のＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルターである。他のウイルス用フィルターをこの濾過ステップに使用でき、当業者によく知られている。ＨＩＣ溶出液は、約０．１μｍの事前に湿らしたフィルターおよびおよそ３４ｐｓｉｇで２×３０インチのＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（商標）フィルタートレインに通す。ある種の実施形態では、濾過工程に続いて、フィルターハウジング中に保持された任意の抗体を除去するために、例えばＨＩＣ溶出バッファーを用いて、フィルターを洗浄する。フィルターは、およそ１２℃で事前に滅菌した容器中に保管することができる。
【０１０８】
ある種の実施形態では、上記からの濾液を、再び限界濾過／透析濾過に供する。当業者の終点が、例えば医薬製剤における抗体の使用であれば、このステップは重要である。この工程を採用する場合、これにより、抗体の濃縮、事前に使用する緩衝塩の除去および特定の処方用バッファーとこれとの交換を促進することができる。ある種の実施形態では、処方用バッファーの複数の体積、例えば２つの体積を用いる連続的な透析濾過を行う。適した処方用バッファーの非限定的な例は、ｐＨ５．９の、５ｍＭのメチオニン、２％のマンニトール、０．５％のショ糖のバッファー（Ｔｗｅｅｎは含まない）である。このダイアボリューム交換が完了すると、抗体は濃縮される。抗体が所定の濃度に達成されると、次いで当業者は、Ｔｗｅｅｎの最終濃度が約０．００５％（ｖ／ｖ）に達するように添加するべきである１０％のＴｗｅｅｎの量を計算することができる。
【０１０９】
本発明のある種の実施形態は、さらなる精製ステップを含む。イオン交換クロマトグラフィー方法の前、間または後に行うことができる追加の精製手順の例には、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィー、さらなる陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／またはさらなる陽イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、特異的な基質、リガンドまたは捕獲剤としての抗原を用いる）が挙げられる。
【０１１０】
本発明のある種の実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭのアイソタイプの抗体である。好ましい実施形態では、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のアイソタイプの抗体であり、より好ましくは、抗ＩＬ−１２抗体は、図１に概説される重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１抗体である。本発明のある種の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、図３に概説する重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭのアイソタイプの抗体である。好ましい実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、図３に概説する重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のアイソタイプの抗体であり、より好ましくは、抗ＴＮＦα抗体は、図３に概説する重鎖および軽鎖の可変領域の配列を含むＩｇＧ１抗体である。
【０１１１】
５．試料純度のアッセイ方法
５．１  宿主細胞タンパク質のアッセイ
本発明は、単離／精製した抗体組成物中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の残留レベルを決定するための方法も提供する。上記のように、ＨＣＰは、望ましくは最終標的物質産物、例えば抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体から排除される。典型的なＨＣＰは、抗体産生の源から生じるタンパク質を含む。標的抗体からＨＣＰを同定し、十分に除去できなければ、低下した有効性および／または被験者の有害な反応を引き起こし得る。
【０１１２】
本明細書で使用するとき、用語「ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ」は、アッセイに使用する二次抗体が、抗体（例えば抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体）を生成するために使用される細胞、例えばＣＨＯ細胞から産生されるＨＣＰに特異的である場合のＥＬＩＳＡをいう。二次抗体は、当業者に既知の従来の方法によって産生することができる。例えば、二次抗体は、見せかけの産生および精製の実行によって得られるＨＣＰを用いて、産生することができる、すなわち、対象とする抗体を産生するために使用する同じ細胞系を使用するが、細胞系に抗体ＤＮＡを形質移入しない。典型的な実施形態では、二次抗体は、最適な細胞発現系、すなわち、標的抗体を産生するために使用する細胞発現系において発現するＨＣＰと同様のものを用いて産生する。
【０１１３】
一般的に、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、抗体の２つの層、すなわち一次抗体および二次抗体の間にＨＣＰを含む液体試料をサンドイッチするステップを含む。試料中のＨＣＰが一次抗体、例えばこれに限定されないが、アフィニティー精製したヤギ抗ＣＨＯ（Ｃｙｇｎｕｓ）によって捕獲される時間の間、試料をインキュベートする。抗体を生成するために使用した細胞から精製したＨＣＰに特異的な、ラベル化した二次抗体または抗体のブレンド、例えばビオチン化した抗ＣＨＯ  ＨＣＰを添加し、試料内のＨＣＰに結合させる。ある種の実施形態では、一次および二次抗体は、ポリクローナル抗体である。ある種の態様では、一次および二次抗体は、ＨＣＰに対して産生されたポリクローナル抗体のブレンド、例えば、これに限定されないが、ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物５９９／６２６／７４８である。試料中に含まれるＨＣＰの量は、二次抗体のラベル化に基づく適切な試験を用いて決定される。
【０１１４】
ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、上に記載した方法を用いて得た溶出液またはフロースルーなどの抗体組成物中のＨＣＰのレベルを決定するために使用することができる。本発明は、抗体を含む組成物も提供し、ＨＣＰの酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）によって決定するとき、前記組成物は、検出可能なレベルのＨＣＰを有さない。
【０１１５】
５．２  アフィニティークロマトグラフィー材料のアッセイ
ある種の実施形態では、本発明は、単離／精製された抗体組成物中に存在するアフィニティークロマトグラフィー材料の残留レベルを求めるための方法も提供する。特定の状況では、かかる材料は精製工程中に抗体組成物内に滲出する。ある種の実施形態では、単離／精製された抗体組成物中に存在するプロテインＡの濃度を特定するためのアッセイ法が利用される。本明細書で用いる場合、用語「プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ」とは、当該アッセイ法で用いられる第２抗体が、対象とする抗体、例えば抗ＩＬ−１２抗体、抗ＴＮＦα抗体または抗ＩＬ−１８抗体を精製するために利用されるプロテインＡに特異的であるＥＬＩＳＡを指す。第２抗体は当業者に既知の従来法により製造可能である。例えば、第２抗体は、抗体を産生および製造するための従来法に関連して、天然または組換えプロテインＡを用いて製造可能である。
【０１１６】
一般的に、プロテインＡ  ＥＬＩＳＡは、プロテインＡを含む（またはプロテインＡを含むと考えられる）液体サンプルを抗プロテインＡ抗体、すなわち第１の抗プロテインＡ抗体および第２の抗プロテインＡ抗体からなる２つの層の間にサンドイッチするステップを含む。試料は抗プロテインＡ抗体、例えば、限定するものではないが、ポリクロナール抗体またはポリクロナール抗体の混合物からなる第１の層に暴露され、試料中のプロテインＡが第１の抗体に捕獲されるのに十分な時間インキュベーションされる。ラベル化された第２の抗体、例えば、限定するものではないが、プロテインＡに特異的なポリクロナール抗体またはポリクロナール抗体の混合物が次に添加され、試料中の捕獲されたプロテインＡに結合する。本発明に関連して有用な抗プロテインＡ抗体のさらなる非限定的な例として、ニワトリ抗プロテインＡ抗体およびビオチン化された抗プロテインＡ抗体が挙げられる。試料中に含まれるプロテインＡの量は、第２抗体のラベルに基づく適当な試験法を用いて決定される。同様のアッセイ法が、別のアフィニティークロマトグラフィー材料の濃度を特定するために利用され得る。
【０１１７】
プロテインＡ  ＥＬＩＳＡは、上記工程を用いて得られた溶出液またはフロースルーなどの抗体組成物中のプロテインＡのレベルを決定するために利用可能である。本発明は、抗体を含む組成物も提供し、当該組成物はプロテインＡ酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）により判明するような検出可能レベルのプロテインＡを有さない。
【０１１８】
６．さらなる修飾
本発明の抗体は、修飾することができる。いくつかの実施形態では、抗体またはこの抗原結合フラグメントを化学的に修飾し、所望の効果をもたらす。例えば、本発明の抗体または抗体フラグメントのペグ化は、例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる次の文献：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ３：４−１０頁（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６およびＥＰ０４０１３８４に記載のような、当技術分野で既知の任意のペグ化反応によって行うことができる。１つの態様では、ペグ化は、ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行う。本発明の抗体および抗体フラグメントのペグ化のための適した水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用するとき、「ポリエチレングリコール」は、モノ（Ｃｌ−ＣｌＯ）アルコキシまたはアリールオキシポリエチレングリコールなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意味する。
【０１１９】
本発明のペグ化された抗体および抗体フラグメントを調製するための方法は、一般的に（ａ）抗体または抗体フラグメントが、１つまたは複数のＰＥＧ基に付着するのに適した条件下で、抗体または抗体フラグメントと、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコールとを反応させるステップおよび（ｂ）反応生成物を得るステップを含む。既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは、当業者に明らかである。
【０１２０】
ＩＬ１２、ＴＮＦα、またはＩＬ−１８に特異的なペグ化した抗体および抗体フラグメントは、一般的に本明細書に記載の抗ＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体および抗体フラグメントを投与することによって、本発明のＩＬ−１２関連、ＴＮＦα関連、または抗ＩＬ−１８関連障害を治療するために使用することができる。一般的に、ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、非ペグ化抗体および抗体フラグメントと比較して、増加した半減期を有する。ペグ化した抗体および抗体フラグメントは、単独に、一緒にまたは他の医薬組成物との組合せで、採用することができる。
【０１２１】
本発明の抗体または抗体部分は、別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に誘導体化または連結することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、イムノアドへシン分子を含む、本明細書に記載の誘導体化および他のやり方で修飾したヒト抗ｈＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ｈＩＬ−１８抗体の形態を含むことを意図する。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異的な抗体または二重特異性抗体）、検出可能な薬剤、細胞毒性薬、医薬品および／または抗体もしくは抗体分子と（ストレプトアビジンのコア領域またはポリヒスチジンタグなどの）他の分子との会合を媒介できるタンパク質もしくはペプチドなどの１つまたは複数の分子要素に、（化学的共役、遺伝子的融合、非共有結合または他のやり方によって）機能的に連結することができる。
【０１２２】
誘導体化した抗体の１つのタイプは、（例えば、二重特異的な抗体を作成する、同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体と架橋結合することによって生成する。適した架橋剤は、適切なスペーサーによって明瞭に分離される２つの反応基を有する二機能のヘテロ（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）または二機能のホモ（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）のものが挙げられる。かかる架橋剤は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ロックフォード、ＩＬ．から入手することができる。
【０１２３】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化できる有用な検出可能な薬剤は、蛍光性化合物を含む。典型的な検出可能な蛍光性薬剤には、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルフォニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。抗体は、アルカリンホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能な酵素で誘導体化するとき、それは、酵素が検出可能な反応産物の生成に使用する追加の試薬を添加することによって検出することができる。例えば、検出可能な薬剤の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加により、検出可能な有色の反応生成物がもたらされる。抗体は、ビオチンを用いて誘導体化することもでき、アビジンまたはスプレプトアビジン結合の間接的な測定によって検出することもできる。
【０１２４】
７．医薬組成物
本発明の抗体および抗体部分は、患者への投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。典型的に、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性のある任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、１つまたは複数の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびこれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えばマンニトール、ソルビトールなどの糖、多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含むことが望ましい。薬学的に許容される担体は、抗体または抗体部分の有効期間または効果を増強させる、少量の湿潤剤または乳化剤などの補助物質、保存剤またはバッファーをさらに含むことができる。
【０１２５】
本発明の抗体および抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。抗体または抗体部分は、例えば、０．１−２５０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む注射可能な溶液として調製することができる。注射可能な溶液は、フリントまたはアンバーバイアル中の液体または凍結乾燥型投与形態、アンプルまたは事前に満たしたシリンジのいずれかから構成することができる。バッファーは、ｐＨ５．０から７．０（最適はｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジンおよそ１−５０ｍＭ（最適は５−１０ｍＭ）であってよい。他の適したバッファーには、これに限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムが挙げられる。塩化ナトリウムは、０−３００ｍＭの濃度（最適は液体型投与形態について１５０ｍＭ）で、溶液の毒性を緩和するために使用することができる。抗凍結剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に０−１０％のスクロース（最適は０．５−１．０％）を含むことができる。他の適した抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが挙げられる。バルク剤は、凍結乾燥型投与形態について、主に１−１０％のマンニトール（最適は２４％）を含むことができる。安定化剤は、液体および凍結乾燥型投与形態の両方で使用でき、主に１−５０ｍＭのＬ−メチオニン（最適は５−１０ｍＭ）である。他の適したバルク剤には、グリシン、アルギニンが挙げられ、０−０．０５％のポリソルベート８０（最適は０．００５−０．０１％）として含むことができる。追加の界面活性剤には、これに限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０１２６】
１つの態様では、医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で抗体を含む。別の態様では、抗体の投薬量には、１週間おきの投与でおよそ１ｍｇ／ｋｇまたは毎週の投与でおよそ０．３ｍｇ／ｋｇが挙げられる。当業者は、患者への投与のために適切な投薬量および投与計画を突き止めることができる。
【０１２７】
本発明の組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射および注入可能な溶液）、分散剤または浮遊物、錠剤、丸剤、粉末、リポソームおよび坐薬などの液体、半固体および固体の投与形態が挙げられる。形態は、例えば目的とする投与様式および治療の適用に依存する。典型的な組成物は、他の抗体によるヒトの受動免疫化に使用するものと同様の組成物などの、注射および注入可能な溶液の形態である。１つの投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。１つの態様では、抗体は、静脈内注射または注入によって投与する。別の態様では、抗体は、筋肉内または皮下注射によって投与する。
【０１２８】
治療用組成物は、典型的に、製造および貯蔵の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散剤、リポソームまたは高い薬物濃度に適した他の整った構造として処方することができる。無菌の注射可能な溶液は、適切な溶媒中で必要とされる量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）に、上記に列挙される成分の１つまたは組合せを組み込むことによって調製することができ、必要に応じて、続いて濾過滅菌する。一般的に、分散剤は、基本的な分散剤媒体および上記の列挙からの必要とされる他の成分を含む無菌媒介物中に、活性化合物を組み込むことによって調製する。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の凍結乾燥した粉末の場合、調製方法は、前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分の粉末に加えて任意の追加の所望の成分を生成する、真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の遷延性吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアレート塩およびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０１２９】
本発明の抗体および抗体部分は、当技術分野で既知の様々な方法によって投与することができ、投与の１つの経路／様式は、皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者に理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に依存して変わる。ある種の実施形態では、活性化合物は、移植、経皮パッチおよびマイクロカプセル化した送達系が挙げられる放出調節した製剤などの、迅速な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製するための多くの方法は、特許を取られている、または一般的に当業者に既知である。例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０１３０】
ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体を用いて、経口的に投与することができる。化合物（および所望されれば他の成分）は、錠剤中に圧縮したまたは患者の食事の中に直接組み込んだ硬いまたは柔らかいゼラチンシェル中に封入することもできる。経口の治療用投与のために、組成物は、賦形剤とともに組み込むことができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、浮遊物、シロップ、ウエハーなどの形態で使用することができる。非経口投与以外によって本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防ぐ物質で化合物の表面を覆うまたはそれと化合物とを共投与することが必要になり得る。
【０１３１】
補充的な活性化合物も、組成物中に組み込むことができる。ある種の態様では、本発明の抗体または抗体部分は、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、またはＩＬ−１８活性が有害である障害を治療するのに有用である１つまたは複数の追加の治療剤と共処方および／または共投与する。例えば、本発明の抗ｈＩＬ−１２、抗ＴＮＦα、または抗ＩＬ−１８抗体または抗体部分は、他の標的と結合する１つまたは複数の追加の抗体（例えば、他のサイトカインと結合するまたは細胞表面分子と結合する抗体）と共処方および／または共投与することができる。さらに、本発明の１つまたは複数の抗体は、２つ以上の前述の治療剤と組み合わせて使用することができる。かかる組合せ治療は、より低い投薬量の投与される治療剤を好都合に利用することができ、したがって可能性のある毒性または様々な単独治療に関連する合併症を回避することができる。本発明の抗体を、組合せ治療の一部として使用するとき、抗体を単独で患者に投与するときより、低い投薬量の抗体を所望することができることは当業者に理解される（例えば、相乗的な治療効果が、組合せ治療の使用によって達成でき、順により低い用量の抗体の使用により、所望の治療効果の達成が可能になる）。
【０１３２】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分が、単独でまたは追加の薬剤、例えば治療剤と組み合わせて使用でき、前記追加の薬剤が、その意図する目的のために当業者によって選択されることは理解されたい。例えば、追加の薬剤は、本発明の抗体によって治療する疾患または状態を治療するのに有用であると当技術分野で認識されている治療剤であってよい。追加の薬剤は、治療用組成物に有益な貢献をもたらす薬剤、例えば、組成物の粘性に影響する薬剤であってもよい。
【０１３３】
本発明内に含まれ得る組合せが、それらの意図する目的に有用なそれらの組合せであることもさらに理解されたい。以下に示される薬剤は例示であり、限定することを意図していない。本発明の一部である組合せは、本発明の抗体および以下のリストから選択される少なくとも１つの追加の薬剤であってよい。組合せは、１つ以上の追加の薬剤、例えば、形成される組成物がその意図される機能を果たせるような組合せであれば、２または３つの追加の薬剤を含むこともできる。
【０１３４】
いくつかの組合せは、イブプロフェン様薬物を含むＮＳＡＩＤＳともいわれる非ステロイド性抗炎症薬（複数可）である。他の組合せは、プレドニゾロンを含む副腎皮質ステロイドであり、よく知られているステロイド使用の副作用は、本発明の抗ＩＬ−１２抗体と組み合わせて患者を治療するときに必要とされるステロイド用量を減らすことによって、低下または排除することさえできる。本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる、関節リウマチ用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：サイトカイン抑制性抗炎症薬（複数可）（ＣＳＡＩＤ）；他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０またはＣＤ１５４を含むそれらのリガンド（ｇｐ３９またはＣＤ４０Ｌ）などの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。
【０１３５】
治療剤のいくつかの組合せは、自己免疫および続く炎症カスケードにおける異なる時点で干渉でき、例にはＴＮＦアンタゴニスト様キメラ、ヒト化またはヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７、（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、１９９６年２月９日に出願された米国特許第０８／５９９，２２６号明細書）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）および可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、その誘導体、すなわちｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））またはｐ５５ＴＮＦＲ１ｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）およびＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤も挙げられ、同様にＩＬ−１阻害剤（例えば、Ｖｘ７４０またはＩＬ−１ＲＡなどのインターロイキン１変換酵素阻害剤）は、同じ理由から効果的であり得る。他の組合せは、インターロイキン１１、抗Ｐ７およびｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）を含む。さらなる他の組合せは、ＩＬ−１２の機能に平行、依存または協調して働き得る自己免疫応答の他のキープレーヤーを含み、特に、ＩＬ−１８抗体もしくは可溶性ＩＬ−１８受容体またはＩＬ−１８結合タンパク質を含むＩＬ−１８アンタゴニストが含まれる。ＩＬ−１２およびＩＬ−１８は、オーバーラップを有するが、両方に対するアンタゴニストの異なる機能および組合せは、もっとも効果的であり得ることが示された。さらなる別の組合せは、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤を含む。さらなる他の組合せは、抗体、可溶性受容体またはアンタゴニストのリガンドを含む、同時刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストを含む。
【０１３６】
本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキニン／ヒドロキシクロロキン、ペンシルアミン、金チオリンゴ酸（筋肉内および経口）、アザチオプリン、コチシン、副腎皮質ステロイド（経口、吸入および局所注射）、β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテラル）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリク酸、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウムおよびオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えば、イブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体および誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ．ＴＭ．）およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることができる。いくつかの組合せは、メトトレキサートまたはレフルノミドを含み、中等度または重度の関節リウマチの場合、シクロスプリンを含む。
【０１３７】
本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる炎症性腸疾患用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：ブデノシド、上皮細胞増殖因子、副腎皮質ステロイド、シクロスポリン、スルファサラジン、アミノサリチル酸、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、メトロニダゾール、リポキシゲナーゼ阻害薬、メサラミン、オルサラジン、バルサラジド、抗酸化薬、トロンボキサン阻害剤、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、抗ＩＬ−１αモノクローナル抗体、抗ＩＬ−１６モノクローナル抗体、増殖因子、エラスターゼ阻害剤、ピリジニルイミダゾール化合物、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ９０などの細胞表面分子またはそれらのリガンドに対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスプリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることができる。
【０１３８】
抗体または抗原結合部分と組み合わせることができるクローン病用の治療剤の例には、次のもの：ＴＮＦアンタゴニスト、例えば、抗ＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、１９９６年２月９日に出願された米国特許第０８／５９９，２２６号明細書）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ構築物（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（商標））およびｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｌｅｎｅｒｃｅｐｔ）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）およびＰＤＥ４阻害剤が挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、副腎皮質ステロイド、例えば、ブデノシドおよびデキサメタソンと組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸およびオルサラジン、ならびにＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインの合成または作用に干渉する薬剤、例えばＩＬ−１変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）およびＩＬ−１ｒａとも組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤６−メルカプトプリンとも使用することができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＩＬ−１１と組み合わせることができる。
【０１３９】
本発明の抗体または抗体部分と組み合わせることができる多発性硬化症用の治療剤の非限定的な例には、次のもの：副腎皮質ステロイド、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、４−アミノピリジン、チザニジン、ＩＦＮβ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ；Ｂｉｏｇｅｎ）、ＩＦＮβ１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ；Ｃｈｉｒｏｎ／Ｂｅｒｌｅｘ）、コポリマー１（Ｃｏｐ−１、Ｃｏｐａｘｏｎｅ、Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社）、高圧酸素、静脈内免疫グロブリン、クラブリビン、他のヒトサイトカインまたは増殖因子、例えば、ＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦおよびＰＤＧＦに対する抗体またはこのアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９０またはそれらのリガンドなどの細胞表面分子に対する抗体と組み合わせることができる。本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、メトトレキサート、シクロスプリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノレートモフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤｓ、例えばイブプロフェン、プレドニゾロンなどの副腎皮質ステロイド、ホスホジエステラーゼ阻害薬、アデノシンアゴニスト、抗血栓薬、補体阻害薬、アドレナリン系薬剤、ＴＮＦαまたはＩＬ−１などの炎症誘発性サイトカインによってシグナル伝達に干渉する薬剤（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８またはＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐセレクチン糖タンパク質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＡＣＥ阻害剤、キナーゼ阻害剤などのＴ細胞シグナル伝達阻害剤、メタロプロテアーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体およびその誘導体（例えば、可溶性ｐ５５またはｐ７５ＴＮＦ受容体、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））および抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３およびＴＧＦβ）などの薬剤と組み合わせることもできる。
【０１４０】
抗体またはこの抗原結合タンパク質と結合することができる多発性硬化症用の治療剤の例には、ＩＦＮβ、例えばＩＦＮβ１ａおよびＩＦＮβ１ｂ、コパキソン、副腎皮質ステロイド、ＩＬ−１阻害剤、ＴＮＦ阻害剤ならびにＣＤ４０リガンドおよびＣＤ８０に対する抗体が挙げられる。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含むことができる。「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。抗体または抗体部分の治療的有効量は、病態、年齢、性別および個人の体重などの因子ならびに個人において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力によって変えることができる。治療的有効量は、抗体または抗体部分の任意の毒性または有害な効果より、治療的に有益な効果が勝るものでもある。「予防的有効量」とは、所望の予防効果を達成するために必要な投薬量および期間での効果的な量をいう。典型的に、予防的用量は、疾患の初期段階より前またはそのときに患者において使用し、予防的有効量は、治療的有効量より少なくなる。
【０１４２】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療または予防の応答）をもたらすように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与でき、いくつかの分割した用量を経時的に投与でき、または治療状況の緊急性が示されるとき、用量を比例的に減少または増加させることができる。ある種の実施形態では、各投与についての投薬単位形態および投与の均一性において、非経口組成物を処方することは特に好都合である。本明細書で使用するとき、投薬単位形態とは、治療する哺乳動物の患者に対する単一の投薬量として適した、物理的に別々の単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすために計算された、活性化合物の所定の量を含む。本発明の投薬単位形態に関する規格は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成すべき特定の治療または予防効果ならびに（ｂ）個人における感受性の治療のための、かかる活性化合物の配合の当技術分野における固有の制限によって決定され、およびこれに直接依存する。
【０１４３】
本発明の抗体または抗体部分の治療的または予防的有効量に関する典型的な非限定的範囲は、０．０１−２０ｍｇ／ｋｇまたは１−１０ｍｇ／ｋｇまたは０．３−１ｍｇ／ｋｇである。投薬量の値が、緩和すべき状態のタイプおよび重症度とともに変わり得ることに注目されたい。任意の特定の患者に関する具体的な投与計画は、個人の必要性および投与するまたは組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って、経時的に調整されるべきであり、本明細書に示される投薬量の範囲は、単に模範例であり、特許請求される組成物の範囲または実行を制限することを意図しないことをさらに理解されたい。
【０１４４】
８．本発明の抗体の使用
８．１  抗ＩＬ−１２抗体の一般的な使用
ＩＬ−１２に結合するそれらの能力を所与とし、本発明の抗ＩＬ−１２抗体またはこの部分は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織の免疫組織化学などの従来のイムノアッセイを用いて、（例えば、試料マトリックス、１つの態様では血清または血漿などの生物試料中の）ＩＬ−１２、１つの態様ではｈＩＬ−１２を検出するために使用することができる。本発明は、本発明の抗体または抗体部分と試料を接触させるステップおよびＩＬ−１２に結合した抗体（もしくはは抗体部分）または結合していない抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出し、それによって試料中のＩＬ−１２を検出するステップを含む、生物試料中のＩＬ−１２を検出するための方法を提供する。抗体は、検出可能な物質で直接または間接的にラベル化し、結合したまたは結合していない抗体の検出を促進する。適した検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例には、ルミノールが挙げられ、適した放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。試料中のＩＬ−１２の検出は、診断状況、例えば、増加したＩＬ−１２に関連する状態の診断に有用であり得、および／または抗ＩＬ−１２抗体での治療から恩恵を受け得る患者を同定するのに有用であり得る。
【０１４５】
抗体のラベル化の代替として、例えば、検出可能な物質でラベル化したｒｈＩＬ−１２基準物質およびラベル化していない抗ｈＩＬ−１２抗体などの抗ＩＬ−１２抗体を利用して、競合的イムノアッセイによって試料中でＩＬ−１２をアッセイすることができる。このアッセイにおいて、試料、ラベル化ｒｈＩＬ−１２標準物質および抗ｈＩＬ−１２抗体を組合せ、非ラベル化抗体に結合したラベル化ｒｈＩＬ−１２標準物質の量を決定する。試料中のｈＩＬ−１２の量は、抗ｈＩＬ−１２抗体に結合したラベル化ｒｈＩＬ−１２標準物質の量に反比例する。
【０１４６】
本発明の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボでのＩＬ−１２活性、１つの態様ではｈＩＬ−１２活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、例えば、ＩＬ−１２を含む細胞培養物中、ヒト患者中または本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１２を有する他の哺乳動物患者（例えば、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルなどの霊長類）中で、ＩＬ−１２活性を阻害するために使用することができる。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１２ならびにヒヒＩＬ−１２、マーモセットＩＬ−１２、チンパンジーＩＬ−１２、カニクイザルＩＬ−１２およびアカゲザルＩＬ−１２から成る群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類ＩＬ−１２の活性を中和するが、マウスＩＬ−１２の活性は中和しない、単離されたヒト抗体またはこの抗原結合部分を提供する。１つの態様では、ＩＬ−１２は、ヒトＩＬ−１２である。例えば、ｈＩＬ−１２を含むまたは含む疑いのある細胞培養物中で、本発明の抗体または抗体部分を培養液に添加し、培養物中のｈＩＬ−１２活性を阻害することができる。
【０１４７】
別の態様では、本発明は、ＩＬ−１２活性が有害である障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１２活性を阻害するための方法を提供する。ＩＬ−１２は、幅広い様々な障害の病態生理において関連付けられた（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１９８５−１９９６頁；Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ．４１：３０６−３１４頁；Ｂｕｃｈｔら（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３：３４７−３６７頁；Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２頁；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１１２：１１６９−１１７８頁およびＢｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ  １５２：６６７−６７２頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：８２３−８３２頁）。本発明は、かかる障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１２活性を阻害するための方法を提供し、方法は、患者においてＩＬ−１２活性を阻害するように、本発明の抗体または抗体部分を患者に投与するステップを含む。１つの態様では、ＩＬ−１２はヒトＩＬ−１２であり、患者はヒトの患者である。あるいは、患者は、本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１２を発現する哺乳動物であってよい。よりさらなる患者は、（例えば、ｈＩＬ−１２の投与またはｈＩＬ−１２導入遺伝子の発現によって）ｈＩＬ−１２を導入した哺乳動物であってよい。本発明の抗体は、治療目的のためにヒト患者に投与することができる。その上、本発明の抗体は、獣医学の目的のため、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が架橋結合するＩＬ−１２を発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。後者に関して、かかる動物モデルは、本発明の抗体の治療的有効性の評価に有用であり得る（例えば、投薬量の試験および投与の時間経過）。
【０１４８】
本明細書で使用するとき、表現「ＩＬ−１２活性が有害である障害」は、障害に苦しむ患者においてＩＬ−１２の存在が、障害または障害の悪化に寄与する因子のいずれかの病態生理の原因であることが示された、またはその疑いがある疾患および他の障害を含むことを意図する。したがって、ＩＬ−１２活性が有害である障害は、ＩＬ−１２活性の阻害により、障害の症状および／または進行が緩和することが期待される障害である。かかる障害は、例えば、障害に苦しむ患者の体液中のＩＬ−１２濃度の増加（例えば、患者の血清、血漿、滑液などにおけるＩＬ−１２濃度の増加）によって証明でき、例えば、上記のような抗ＩＬ−１２抗体を用いて検出することができる。ＩＬ−１２活性が有害である障害の例は多数ある。１つの態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を扱う治療に使用することができる。別の態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための医薬品の製造に使用することができる。数種の非限定的で具体的な疾患の治療における本発明の抗体および抗体部分の使用は、以下にさらに議論する。
【０１４９】
インターロイキン１２は、免疫および炎症の要素に関わる様々な疾患に関連する病理において、重要な役割を果たす。これらの疾患には、これに限定されないが、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、粥状動脈硬化、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホシェーンライン紫斑、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ぶどう膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染症、寄生虫病、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性多腺性欠乏症Ｉ型および多腺性欠乏症ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、関節症に伴うエルシニアおよびサルモネラ、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱症、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明の自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｃ型肝炎、一般変異型免疫不全（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、線維性肺疾患、原因不明の線維化肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、間質性肺疾患に伴う結合組織病、肺疾患に伴う混合性結合組織病、間質性肺疾患に伴う全身性硬化症、間質性肺疾患に伴う関節リウマチ、肺疾患に伴う全身性エリテマトーデス、肺疾患に伴う皮膚筋炎／多発性筋炎、肺疾患に伴うシェーグレン病、肺疾患に伴う強直性脊椎炎、血管炎性びまん性肺疾患、肺疾患に伴うヘモシデリン沈着症、薬剤性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性またはルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介型低血糖、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に伴う急性免疫疾患、臓器移植に伴う慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患ＮＯＳ、糸球体腎炎、顕微鏡的腎血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、男性不妊特発性またはＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（全サブタイプ）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、結合組織病に対する二次的な肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状  、急性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、ぶどう膜炎、原発性血管炎ならびに白斑が挙げられる。本発明のヒト抗体および抗体部分は、自己免疫疾患、特にリウマチ性脊椎炎、アレルギー、自己免疫性糖尿病および自己免疫性ぶどう膜炎が挙げられる、炎症を伴う疾患を治療するために使用することができる。
【０１５０】
ある種の態様では、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病および乾癬を治療するために使用される。
【０１５１】
８．２  関節リウマチにおける抗ＩＬ−１２抗体の使用
インターロイキン１２は、関節リウマチなどの炎症性疾患に役割を果たすことが関連付けられた。誘発性ＩＬ−１２ｐ４０のメッセージは、関節リウマチ患者由来の滑液中に検出され、ＩＬ−１２は、関節リウマチを有する患者由来の滑液中に存在することが示された（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｒｉｔａら（１９９８）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１：３０６−３１４頁を参照されたい）。ＩＬ−１２陽性細胞は、関節リウマチの滑膜の下内層中に存在することが見出された。本発明のヒト抗体および抗体部分は、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、ライム関節炎、リウマチ性脊椎炎、骨関節炎および痛風性関節炎を治療するために使用することができる。典型的に、抗体または抗体部分は、全身的に投与されるが、ある種の障害については、抗体または抗体部分の局所投与が有益であり得る。本発明の抗体または抗体部分は、自己免疫疾患の治療に有用な１つまたは複数の追加の治療剤とともに投与することもできる。
【０１５２】
関節リウマチ用のコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスモデルにおいて、関節炎より前に、抗ＩＬ−１２ｍＡｂ（ラット抗マウスＩＬ−１２モノクローナル抗体、Ｃ１７．１５）でマウスを処置することにより、発症が大いに抑制され、疾患の発症率および重症度が低下した。関節炎の発症後、早期に抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処置することにより、重症度は低下したが、疾患発症後に抗ＩＬ−１２ｍＡｂでマウスを処置する後者は、疾患重症度に最小の効果を有した。
【０１５３】
８．３  クローン病における抗ＩＬ−１２抗体の使用
インターロイキン１２は、炎症性腸疾患、すなわちクローン病にも役割を果たす。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２の増加した発現が、クローン病を有する患者の腸粘膜において起こる（例えば、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆａｉｓら（１９９４）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１４：２３５−２３８頁；Ｐｙｒｒｏｎｃｈｉら（１９９７）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：８２３−８３２頁；Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅら（１９９７）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１２：１１６９−１１７８頁；Ｂｅｒｒｅｂｉら（１９９８）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：６６７−６７２頁を参照されたい）。抗ＩＬ−１２抗体は、大腸炎のマウスモデル、例えば、ＴＮＢＳ誘導型大腸炎ＩＬ−２ノックアウトマウスおよび最近ではＩＬ−１０ノックアウトマウスにおいて、疾患を抑制することが示された。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、炎症性腸疾患の治療に使用することができる。
【０１５４】
８．４  多発性硬化症における抗ＩＬ−１２抗体の使用
インターロイキン１２は、多発性硬化症の主要なメディエーターとして関連付けられた。誘導性ＩＬ−１２ｐ４０のメッセージまたはＩＬ−１２自体の発現は、多発性硬化症を有する患者の病変において実際に示すことができる（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｎｄｈａｇｅｎら（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８２：１９８５−１９９６頁、Ｄｒｕｌｏｖｉｃら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１４７：１４５−１５０頁）。多発性硬化症を有する慢性進行性の患者は、ＩＬ−１２の上昇した血中濃度を有する。多発性硬化症を有する患者由来のＴ細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いる研究により、Ｔｈ１型免疫応答を引き起こす進行性多発性硬化症の基礎として、免疫相互作用の自己永続的な一連が明らかになった。Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの増加した分泌により、ＡＰＣによるＩＬ−１２の増加した産生が引き起こされ、Ｔｈ１型免疫活性化および疾患の慢性状態を引き起こす循環が永続化した（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｌａｓｈｏｖら（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：５９９−６０３頁）。多発性硬化症におけるＩＬ−１２の役割は、マウスおよびラットの多発性硬化症の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルを用いて研究した。マウスにおける多発性硬化症の再発寛解型ＥＡＥモデルにおいて、抗ＩＬ−１２ｍＡｂを用いて前処理することにより、麻痺が遅延され、臨床スコアが減少した。麻痺のピークで、または続く寛解期間の間に、抗ＩＬ−１２ｍＡｂで処理することにより、臨床スコアが減少した。したがって、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、ヒトにおいて多発性硬化症に関連する症状を緩和させる働きをし得る。
【０１５５】
８．５  インスリン依存性糖尿病における抗ＩＬ−１２抗体の使用
インターロイキン１２は、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）の重要なメディエーターとして関連付けられた。ＩＤＤＭは、ＩＬ−１２の投与によってＮＯＤマウスにおいて誘発され、抗ＩＬ−１２抗体は、ＩＤＤＭの養子伝達モデルにおいて保護的であった。早期発症のＩＤＤＭ患者は、いくつかの残りの島細胞機能が維持される、いわゆる「ハネムーン期間」をしばしば経験する。これらの残りの島細胞は、インスリンを産生し、インスリン投与より優れた血中グルコース濃度を制御する。抗ＩＬ−１２抗体でこれらの早期発症患者を治療することにより、島細胞のさらなる破壊を防ぐことができ、それによってインスリンの内在性供給源が維持できる。
【０１５６】
８．６  乾癬における抗ＩＬ−１２抗体の使用
インターロイキン１２は、乾癬における主要なメディエーターとして関連付けられた。乾癬は、ＴＨ１型サイトカイン発現プロファイルに関連する急性および慢性皮膚病変に関わる（その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｍｉｄら（１９９６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２２５−２３１頁；Ｔｕｒｋａら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：６９０−６９９頁）。ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０のｍＲＮＡは、罹患したヒトの皮膚試料中に検出された。したがって、本発明の抗体またはこの抗原結合部分は、慢性皮膚障害であるかかる乾癬を緩和させる働きをし得る。
【０１５７】
８．７  抗ＩＬ−１８抗体の一般的使用
ＩＬ−１８に結合する能力を前提とし、本発明の抗ＩＬ−１８抗体またはその一部は、ＩＬ−１８、１つの態様ではｈＩＬ−１８（例えば、試料マトリックス中の、１つの態様では血清または血漿などの生物試料）を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）などの従来型の免疫測定法を用いながら検出するのに利用可能である。本発明は生物試料中のＩＬ−１８を検出する方法を提供し、この方法は、試料を本発明の抗体または抗体部分と接触させるステップ、およびＩＬ−１８に結合した抗体（もしくは抗体部分）または非結合抗体（もしくは抗体部分）のいずれかを検出するステップを含み、これにより試料中のＩＬ−１８を検出する。抗体は、結合抗体または非結合抗体の検出に役立つ検出可能物質により直接的または間接的にラベル化される。適する検出可能物質として、様々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。適する酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリンホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセン、フルオレセンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例として、ルミノールが挙げられ、適する放射性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。試料中のＩＬ−１８を検出すれば、それは診断状況、例えばＩＬ−１８の増加に関連する症状の診断に有用であり得、および／または抗ＩＬ−１８抗体を用いた治療から利益を得ることができる患者を識別するのに有用であり得る。
【０１５８】
抗体をラベル化するのに代えて、試料中のＩＬ−１８は、例えば検出可能な物質でラベル化したｒｈＩＬ−１８標準物質およびラベル化していない、抗ｈＩＬ−１８抗体などの抗ＩＬ−１８抗体を利用して、競合的イムノアッセイによってアッセイ可能である。このアッセイでは、試料、ラベル化ｒｈＩＬ−１８標準物質および抗ｈＩＬ−１８抗体が組み合され、非ラベル化抗体に結合したラベル化ｒｈＩＬ−１８標準物質の量が決定される。試料中のｈＩＬ−１８の量は、抗ｈＩＬ−１８抗体に結合したラベル化ｒｈＩＬ−１８標準物質の量に反比例する。
【０１５９】
本発明の抗体および抗体部分は、インビトロおよびインビボでＩＬ−１８活性、１つの態様ではｈＩＬ−１８活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、例えば、ＩＬ−１８を含む細胞培養物中、本発明の抗体が架橋反応するＩＬ−１８を有するヒト患者中または他の哺乳動物患者（例えば、ヒヒ、カニクイザルおよびアカゲザルなどの霊長類）中のＩＬ−１８活性を阻害するために使用することができる。１つの態様では、本発明は、ヒトＩＬ−１８ならびにヒヒＩＬ−１８、マーモセットＩＬ−１８、チンパンジーＩＬ−１８、カニクイザルＩＬ−１８およびアカゲザルＩＬ−１８からなる群から選択される少なくとも１つの追加の霊長類ＩＬ−１８の活性を中和するが、マウスＩＬ−１８の活性は中和しない、単離されたヒト抗体またはこの抗原結合部分を提供する。１つの態様では、ＩＬ−１８はヒトＩＬ−１８である。例えば、ｈＩＬ−１８を含むまたは含む疑いのある細胞培養物中では、本発明の抗体または抗体部分が、培養物中のｈＩＬ−１８活性を阻害するように培地に添加可能である。
【０１６０】
別の態様では、本発明は、ＩＬ−１８活性が有害である障害に苦しむ患者において、ＩＬ−１８活性を阻害する方法を提供する。インターロイキン−１８は、免疫要素および炎症要素を含む様々な疾患を伴う病理学において重要な役割を演じている。
【０１６１】
本明細書で使用する場合、表現「ＩＬ−１８活性が有害である障害」は、障害に苦しむ患者においてＩＬ−１８が存在すると、その存在が、当該障害の病態生理学または当該障害の悪化に寄与する因子のいずれかに関与している、またはその疑いがあることが立証された疾患および他の障害を含むように意図されている。したがって、ＩＬ−１８活性が有害である障害とは、ＩＬ−１８活性を阻害すれば、障害の症状および／または進行を緩和することが期待される障害である。かかる障害は、例えば、障害に苦しむ患者の体液中のＩＬ−１８濃度の増加（例えば、患者の血清、血漿、滑液などに含まれるＩＬ−１８濃度の増加）によって立証可能であり、この濃度上昇は例えば、上記の抗ＩＬ−１８抗体を用いて検出可能である。ＩＬ−１８活性が有害である障害の例は多数ある。１つの態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための療法で使用可能である。別の態様では、抗体またはこの抗原結合部分は、本明細書に記載の疾患または障害を治療するための医薬品製造に使用可能である。いくつかの非限定的で具体的な障害の治療で、本発明の抗体および抗体部分を使用することについて、以下でさらに議論する。
【０１６２】
本発明は、ＩＬ−１８活性の調節を必要とする疾患または症状を治療するための医薬組成物を提供する。これらの疾患または症状として、自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、虚血性心疾患（心臓発作を含む）、虚血性脳傷害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎などが挙げられる。
【０１６３】
したがって、本明細書に記載の抗ＩＬ−１８抗体もしくはこの抗原結合部分またはインビボで当該抗体を発現するベクターは、ＩＬ−１８の過剰を引き起こすＩＬ−１８の異常な発現が認められる、または外部から投与されたＩＬ−１８に起因した合併症の場合の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、移植片拒絶、炎症性腸疾患、敗血症、多発性硬化症、心臓発作を含む虚血性心疾患、虚血性脳傷害、慢性肝炎、乾癬、慢性膵炎、急性膵炎および類似疾患を治療するために適応される。
【０１６４】
８．８  抗ＩＬ−１８抗体の肝損傷における使用
本発明の１つの態様は、肝損傷を治療および／または予防するための新規手段を提供することである。ＩＬ−１８阻害剤は、肝損傷の予防および治療に有効であることが見出された。したがって、本発明は、肝損傷の治療用および／または予防用薬剤を製造するために、ＩＬ−１８阻害剤を使用することにも関連する。より具体的には、本発明は、アルコール性肝炎、ウイルス性肝炎、免疫性肝炎、劇症肝炎、肝硬変および原発性胆汁性肝硬変の治療および／または予防に関連する。
【０１６５】
８．９  抗ＩＬ−１８抗体の関節炎での使用
ＩＬ−１８の阻害剤は関節炎の治療に有効であることも、本発明に基づき見出された。治療効果として、疾患の重症度の低減、ならびに疾患の拡大阻止が挙げられる。したがって、本発明は関節炎を治療および／または予防するためにＩＬ−１８の阻害剤を使用することに関連する。これまでに概説した最新技術からは、関節炎に関与する１つの特定因子、すなわちインターロイキンＩＬ−１８を遮断すれば、関節炎の緩和または関節炎に罹患した関節の治癒さえも引き起こすと結論付けることはできなかったので、この新知見は予想外であった。
【０１６６】
用語「関節炎」は、例えば、関節炎に関するワシントン大学の整形外科部門のホームページで定義するような、急性および慢性関節炎の両方を含む、すべての異なる種類の関節炎および関節炎の症状を含む。関節炎の症状として、強直性脊椎炎、背痛、手根管症候群、エーラー・ダンロス症候群、痛風、若年性関節炎、全身性紅斑性狼瘡、筋炎、骨形成不全症、骨粗しょう症、多発性関節炎、多発性筋炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、強皮症、腸疾患を伴う関節炎、ベーチェット病、小児関節炎、変形性関節疾患、線維筋痛、感染性関節炎、ライム病、マルファン症候群、変形性関節症、骨壊死、パジェット病、リウマチ性多発性筋痛、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、リウマチ、シェーグレン症候群、家族性大腸腺腫症などが挙げられる。
【０１６７】
関節リウマチ（ＲＡ）は、関節の内膜（単一細胞層の上皮である滑膜）および／または内臓に炎症を引き起こす。この疾患は長年にわたり持続する傾向があり、一般的には身体全体の多くの異なる関節に影響を与え、最終的には軟骨、骨、腱および靭帯に損傷を引き起こし得る。ＲＡの影響を受け得る関節は、例えば首、肩、肘、腰、手首、手、膝、足首および足に位置する関節である。多くの場合、ＲＡでは対称的なパターンで関節に炎症が生ずる。
【０１６８】
ＲＡは、米国において人口の約１％に見られ、すべての人種および年齢に分布している。ＲＡは世界中で生じており、ＲＡを有する者の中で女性は男性の３倍多い。
【０１６９】
ＩＬ−１８阻害剤を投与すると、関節炎のマウスモデルにおいて軟骨浸食が顕著に低下することが見出された。したがって、本発明は軟骨破壊を治療および／または予防するための薬剤の製造において、ＩＬ−１８の阻害剤を使用することにも関連する。
【０１７０】
８．１０  抗ＴＮＦα抗体の一般的な使用
腫瘍壊死因子−αは、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性および内皮機能に影響を及ぼす単球／マクロファージによって主に分泌される多機能性炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦαは、１７ｋＤタンパク質サブユニットからなる可溶性の同種三量体である。ＴＮＦαの膜結合型２６ｋＤ前駆体の形態も存在する。これは、滑膜細胞中および組織のマクロファージ中に見出される。単球またはマクロファージ以外の細胞も、ＴＮＦαを産生する。例えば、ヒト非単球腫瘍細胞系はＴＮＦαの他、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋末梢血Ｔリンパ球を産生し、またいくつかの培養されたＴ細胞系およびＢ細胞系はＴＮＦαを産生する。ＴＮＦαは関節リウマチに関与しているが、これに限定されないが、また多くの炎症性疾患において生じている。ＴＮＦαの受容体は、滑膜の他、末梢血および滑液中のいくつかの単核細胞上にある。ＴＮＦαは関節リウマチにおける重要な炎症メディエーターであり、したがって特異的免疫療法の有用な標的であり得る。
【０１７１】
ＴＮＦαは、血管内皮細胞に凝固促進活性を誘発する、好中球およびリンパ球接着を増加させる、ならびにマクロファージ、好中球および血管内皮細胞に由来する血小板活性化因子の遊離を刺激する、軟骨および骨の破壊、接着分子の誘導など組織の損傷を引き起こす炎症促進性作用の原因となる。最近のエビデンスは、ＴＮＦαを感染、免疫異常、腫瘍病理学、自己免疫病理学および移植片対宿主の病理学と関連付ける。
【０１７２】
ＴＮＦαは、グラム陰性菌敗血症ならびに発熱、不快感、拒食症および悪液質を含む内毒素性ショックにおいて中心的な役割を演じると考えられている。内毒素は、単球／マクロファージの生成およびＴＮＦαやその他のサイトカインの分泌を強く活性化する。ＴＮＦαおよびその他の単球由来サイトカインは、内毒素に対する代謝反応および神経ホルモン反応を調節する。ヒト志願者に内毒素を投与すると、発熱、頻脈、代謝速度の向上およびストレスホルモンの放出を含むインフルエンザ様の症状を伴う急性の病気が引き起される。循環ＴＮＦαは、グラム陰性菌敗血症に苦しむ患者で増加している。
【０１７３】
したがって、ＴＮＦαは炎症疾患、自己免疫疾患、ウイルス性、細菌性および寄生性感染症、悪性腫瘍および／または神経変性疾患に関連しており、また関節リウマチおよびクローン病などの疾患において特異的な生物療法を行うための有用な標的である。ＴＮＦαに対するキメラ化モノクローナル抗体を用いた非盲検試験では、炎症の抑制ならびに関節リウマチおよびクローン病の再発後に、再治療が成功したという有益な効果が報告されている。
【０１７４】
ＴＮＦαに対する中和抗血清またはｍＡｂは、哺乳動物において有害な生理的変化を無効にし、また実験的内毒素血症および菌血症において致死的な抗原投与を行った後でも、死亡を阻止することが明らかにされている。アダリムマブ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な商品名ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）としても公知）は、ＴＮＦαに特異的な組換えヒトモノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体はＴＮＦαに結合し、ＴＮＦαとｐ５５およびｐ７５細胞表面ＴＮＦα受容体との相互作用を遮断する。このモノクローナル抗体は、これがＴＮＦβの活性を阻害しないと考えられることから、ＴＮＦαに対して極めて特異的である。補体の存在下で、アダリムマブはＴＮＦαを発現する細胞の表面を溶解する。
【実施例】
【０１７５】
１．抗ＩＬ−１８抗体の精製および単離中のウイルスの除去
本試験の目的は、抗ＩＬ−１８抗体の精製工程におけるウイルス除去の有効性を評価することであった。評価されたステップには、低ｐＨによる不活性化、陽イオン交換捕獲クロマトグラフィー（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＥＭＤ  Ｓ０３−樹脂）、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＦＦ樹脂）および疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ樹脂）精密精製クロマトグラフィーが含まれる。本試験は、薬物製造期間中における直交法によるウイルス除去に関するＩＣＨガイドラインを満たしている。
【０１７６】
本試験は２種類のウイルス、すなわち異種指向性マウス白血病レトロウイルス（Ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ（Ｘ−ＭｕＬＶまたはＸ−ＭＬＶ）およびマウス微小ウイルス（ＭＶＭまたはＭＭＶ）の除去を対象とした。ＩＣＨガイドラインに従い、２種類のウイルスが、「一般的にウイルスを除去するシステムの能力を試験することを目的として、製品に混入するおそれのあるウイルスに類似させるため、および幅広い範囲の物理化学特性を代表させるために」選択された（「Ｑ５Ａ  Ｖｉｒａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ」を参照、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒにて出版／第６３巻、第１８５号／１９９８年９月２４日木曜日／注記（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄｓ．ｇｏｖｅ／ｃｂｅｒ／ｇｄｌｎｓ／ｖｉｒｓａｆｅ．ｐｄｆ、この教示全体をそのまま参照により本明細書に組み込む）。これら２種類のウイルスの特性を表２に示す。非感染性のレトロウイルス様粒子は、抗ＩＬ−１８抗体などの抗体を産生するために用いられるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系を含むＣＨＯ細胞などのげっ歯類起源細胞系に見出される場合が多いので、レトロウイルスであるＸ−ＭＬＶが特異的モデルウイルスとして選択された。いくつかの報告書は、ＣＨＯ細胞培養物上清の数ロットにＭＶＭが存在することを示唆しているので、物理化学的不活性化処理に対して高い抵抗性を示すＭＶＭは、関連ウイルスとみなし得る（Ｒ．Ｌ．Ｇａｒｎｉｃｋ、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｔａｎｄ．、第８８巻、４９−５６頁（１９９６年））。ＭＶＭはマウス微小ウイルス、ＭＭＶと同義である。
【０１７７】
【表２】
0006023140.tif 000003
【０１７８】
１．１  方法
本試験は図４に概説するプロトコールに従い実施された。各工程ステップは、供給流体中に濃縮されたウイルススパイクを添加実施された（ウイルススパイクボリューム１−７．１％ｖ／ｖ）。負荷物、生成物および保持コントロール流体は、ウイルス数について分析され、また各ステップについて対数減少係数を求めた。
【０１７９】
各工程ステップ（図４を参照）は、２回実施された。クロマトグラフィー樹脂は、表４に示すように、通常の製造稼働条件のスケールダウンモデルで用いられた。すべての１ｃｍＩＤカラムでは、カラム非対称係数は合格範囲内であった（０．５−２．０）。各スケールダウンカラムの許容されるベッド高範囲は、製造カラムと同じであった。稼働条件をまとめたものを表３に示す。
【０１８０】
【表３】
0006023140.tif 000004
【０１８１】
【表４】
0006023140.tif 000005
【０１８２】
１．２  バッファー毒性／妨害の結果
ウイルス除去試験の一環として、試料およびバッファーのいずれかがアッセイで用いたウイルス細胞系に有毒であるかどうか判定するために、これらは試験された。試料とバッファーは、これらが選択したウイルスが指標細胞系に感染する能力に与える影響についても評価された。結果を関連する陽性対照と比較したときに、試験したいずれのバッファーについても、ウイルスの感染性が有意に低下するようなことは検出されなかった。この試験の結果から、精製工程で用いられたバッファーは、クロマトグラフィーおよびナノ濾過ステップのチャレンジ試験での使用を目的として、超遠心分離後のウイルス調製物の再懸濁用として承認された。
【０１８３】
１．３  ウイルス除去試験結果
ウイルス力価を低減させる際の各工程ステップの有効性は、下記式により対数減少係数（ＬＲＦ）を計算して求められた：
【０１８４】
【数１】
0006023140.tif 000006
【０１８５】
ウイルス対数減少データは、表５にまとめられ、提示されている。下限（例えば、ＬＲＦ≧４．５４）として表わされた結果は、ウイルスが定量限界よりも低いレベルにおいて存在したことを示している。
【０１８６】
【表５】
0006023140.tif 000007
【０１８７】
ＭＭＶは、低ｐＨによる不活性化に対して極めて抵抗性であることが知られているので、低ｐＨによる不活性化ステップはＸ−ＭＬＶについてのみ実施された。高レベルの減少が０分の時点において達成された。１５分の時点では、ウイルス感染性は認められなかった。アッセイ感度を高めるために、バルク接種が６０分の時点の試料に用いられ、≧４．５４ｌｏｇ１０の、また２回目の測定では≧５．０７ｌｏｇ１０の減少係数が得られた。清澄化収集物が、約０．５％の遠心分離による清澄化工程に由来する残存細胞を含み、また培地成分に由来する高濃度のタンパク質を含むという事実にかかわらず、Ｘ−ＭＬＶでは、ウイルスの不活性化速度は速かった。
【０１８８】
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＳＯ３−クロマトグラフィーステップは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＳＯ３−平衡化バッファー中において、Ｘ−ＭＬＶまたはＭＭＶのいずれかでスパイクされたＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）ＳＯ３−負荷物質について実施された。感染性ウイルスは、試験された両ウイルスについてＦｒａｃｔｏｇｅｌ（商標）カラムから得られた溶出分画中に認められた。Ｘ−ＭＬＶについて認められた減少係数は５．７８ｌｏｇ１０および２回目の測定では５．２２ｌｏｇ１０であった。ＭＭＶでは、減少係数は≧１．３９ｌｏｇ１０および≧１．３３ｌｏｇ１０であった。
【０１８９】
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）クロマトグラフィーステップは、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）平衡化バッファー中において、Ｘ−ＭＬＶまたはＭＭＶのいずれかでスパイクされたＱ−負荷物質について実施された。感染性ウイルスは、試験されたいずれのウイルスについても、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラムから得られたフロースルー溶出試料中に認められず、いずれの場合においてもアッセイの最低限界に達した。Ｘ−ＭＬＶについて認められた減少係数は≧５．５１ｌｏｇ１０および２回目の測定では≧５．５９ｌｏｇ１０であった。ＭＭＶでは、減少係数は両測定共に≧７．０４ｌｏｇ１０であった。
【０１９０】
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰクロマトグラフィーステップは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ平衡化バッファー中において、Ｘ−ＭＬＶまたはＭＭＶのいずれかでスパイクされたＰｈｅｎｙｌ負荷物質について実施された。感染性ウイルスは、試験された両ウイルスについてＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰカラムから得られた溶出分画中に認められた。Ｘ−ＭＬＶについて認められた減少係数は２．４５ｌｏｇ１０および２回目の測定では２．０３ｌｏｇ１０であった。ＭＭＶではこの工程ステップの堅牢性はより低く、減少係数は０．４９ｌｏｇ１０および０．９６ｌｏｇ１０であった。
【０１９１】
Ｐａｌｌ  ＤＶ５０（商標）ナノフィルターが、Ｘ−ＭＬＶを用いたウイルス感染実験に用いられた。Ｐａｌｌ  ＤＶ２０（商標）フィルターは、ＭＭＶを用いた濾過実験に用いられた。両ウイルスは、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ溶出物質に添加する前に、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＨＰ溶出バッファーに再懸濁された。ＤＶ２０（商標）フィルターは、ＭＭＶを用いた除去性能用として選択された。感染性ウイルスは、Ｘ−ＭＬＶについてＤＶ５０フィルターを用いた濾過試料中に認められなかった。Ｘ−ＭＬＶについて認められた減少係数は≧４．９５ｌｏｇ１０および２回目の測定では≧４．６１ｌｏｇ１０であった。感染性ウイルスは、ＭＭＶについてＤＶ２０フィルターを用いた濾過試料中に認められた。ＭＭＶについて認められた減少係数は≧２．９８ｌｏｇ１０および２回目の測定では≧４．８８ｌｏｇ１０であった。各フィルターに関する稼働条件およびウイルススパイク力価のパラメータは事前決定された仕様を満たしていたのでの、ＤＶ２０の２回の測定間における結果の差異は、これらの差異によって説明することはできなかった。しかし、当該差異は、稼働前のフィルターデバイスの組立てに原因するものと考えられる。メンブレンフィルターはあらかじめ濡らされ、オートクレーブ処理され、一方フィルターハウジングは別に蒸気滅菌処理された。稼働前、速やかに当該フィルターハウジングは分解され、メンブレンが当該ハウジング内に配置され、そして再組立てされた。再組立てする前に、Ｏ−リングが取り付けられた末端部材を締め付けるが、このステップが当該フィルターハウジング内に配置されたメンブレンの最適性能の低下を引き起こした可能性がある。
【０１９２】
ウイルスの不活性化／除去データ（表６）は、抗体精製工程は、ＤＶ５０ナノ濾過メンブレンを用いて少なくとも２１．９１ｌｏｇ１０単位のＸ−ＭＬＶを除去する能力を有することを実証している。ＭＭＶの全減少係数は、ＤＶ５０メンブレンを除き、少なくとも８．３７ｌｏｇ１０である。ＤＶ２０メンブレンを抗体精製工程に導入したとすれば、ＭＭＶの全減少係数は、少なくとも１１．２９ｌｏｇ１０まで増加する。これらのデータは、精製工程は抗体原薬（例えば、抗ＩＬ−１８抗体）のウイルス安全性を保証することを実証している。
【０１９３】
【表６】
0006023140.tif 000008
【０１９４】
抗ＩＬ−１８抗体を含む細胞培養収集物は、遠心分離（３０００×ｇ）および０．２μｍ濾過により清澄化された。清澄化収集物は１Ｍクエン酸を用いて調節され、室温に保持された。析出したタンパク質は、遠心分離（１６，０００×ｇ）により可溶性タンパク質から分離された。可溶性タンパク質および不溶性タンパク質の試料は、ＳＤＳの存在下、６０℃で３０分間熱処理され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。
【０１９５】
電気泳動ゲル（図５）から、宿主細胞関連タンパク質および培地成分も含む清澄化された培地のｐＨを下げても、抗体分子は溶液中に留まっていることは明白である。低ｐＨでは、宿主細胞タンパク質は選択的に析出し、遠心分離により除去可能である。ｐＨ４からｐＨ３．５の範囲で、最大の析出が認められる。
【０１９６】
負荷ｐＨが、陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーによる抗ＩＬ−１８抗体の結合能力に与える影響について検討された（表７を参照）。細胞培養収集物のｐＨは、クエン酸の添加によって調節された。室温に１時間保持した後、収集物は遠心分離され、０．２μｍ濾過された。次に、伝導度は水で１０ｍＳに調節された。被験物質は、０．５×５ｃｍのＣＥＸカラム上に負荷された。動的結合容量は、２００ｃｍ／時の線速度で負荷した際に求められた。負荷中の５％貫流（ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ）を決定するために、定量分析によるプロテインＡ  ＨＰＬＣアッセイが、カラムフロースルー試料中の抗体力価測定に用いられた。
【０１９７】
【表７】
0006023140.tif 000009
【０１９８】
抗ＩＬ−１８抗体の等電点（ｐＩ）は８．４３である。ｐＩよりも１ｐＨ単位低い溶液では、抗体分子は正に荷電し、低伝導度で負に荷電した陽イオン交換樹脂に結合するはずである。しかし、上記表１に見られるように、抗体は、ｐＩの８．４３から１ｐＨ単位よりも十分低い中性のｐＨ７．０でまったく結合しなかったが、ｐＨが低められると捕獲樹脂の結合容量は高まった。収集物のｐＨを徐々に高めると、析出事象が生ずるという別の結果を得る。しかし、宿主細胞関連タンパク質および核酸の選択的析出があるので、これは有益である。
【０１９９】
細胞の生存率。細胞培養物の一定量が、２リットルのバイオリアクターから取り出された；生成ステージの最後では高い生存率であった。収集培養物は、３Ｍクエン酸で最初にｐＨ５．０まで、次いでｐＨ３．５まで酸性化され、そして室温で１時間保持された。１時間の保持期間の後に、当該培養物は３Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ４．８に調節された。試料は取り出され、そして処理済みの培養物の細胞数および細胞生存率が測定された。結果について表８を参照。
【０２００】
【表８】
0006023140.tif 000010
【０２０１】
細胞培養物をｐＨ３．５に１時間暴露した後、生存率に１９．６％の若干の低下（９２．８％に対して７４．６％）が認められる。全体の細胞密度は１２．４％低下した（５．４６×１０６に対して４．７７×１０６）。
【０２０２】
酸性化培養物を、ｐＨ５および４℃で一晩保持すると、生存率の低下（３％−７４．６％に対して７２．４％）および細胞密度の減少（１０．５％−４．７７×１０６に対して４．２７×１０６）がわずかに増大した。宿主細胞タンパク質および核酸の析出に起因して濁度が増すので、細胞密度および生存率の正確な測定は困難である。しかし、巨視的観察によれば、細胞で何らかの大規模な溶解が生じたというエビデンスは存在しない。
【０２０３】
抗体の回収。細胞培養物は、発酵工程の最後に製造バイオリアクターから得られた。細胞は、７０００×ｇの遠心分離により、いくつかある一定量の１つから取り出された。試料は３Ｍクエン酸を用いて酸性化され、そして室温で１時間保持された。１時間保持した後、当該培養物は３Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ４．９に調節された。酸性化試料は、１１，０００×ｇでの遠心分離および０．２μｍの濾過により清澄化された。抗体力価を測定するために、定量分析によるプロテインＡ  ＨＰＬＣアッセイが用いられた。酸性化／清澄化後の力価は、回収率（％）を求めるために開始時の対照の力価と比較された。試料は、ｐＨ５まで中和した後および４℃でさらに一晩保持した後の両方について分析された。
【０２０４】
【表９】
0006023140.tif 000011
【０２０５】
表９のデータから分かるように、抗体収集物を酸性化／清澄化した後の抗体力価回収に関する至適ｐＨは、３．７から３．９の範囲内のｐＨであった。ｐＨ３．５では、抗体力価に若干の減少が認められた（５．１から６．４％に）。この力価の若干の損失は、細胞の有無によらず酸性化された培養物に認められた。至適ｐＨは、具体的な抗体分子の生化学特性および物理特性に基づき異なる。
【０２０６】
抗体の機能。バイオリアクター培養物は、３Ｍクエン酸を用いてｐＨ３．５に酸性化され、室温で１時間保持された。次に、酸性化された収集物は、３Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ５まで滴定され、そして遠心分離および０．２μｍの濾過により清澄化された。酸性化／清澄化された収集物から得られた抗体は、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製された。酸性化されないバイオリアクター培養物は、遠心分離および０．２μｍの濾過により清澄化され、そして抗体はプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。酸性化された、および酸性化されない収集物から得られた精製済抗体の結合反応速度が標的抗原について求められた。表１０を参照。
【０２０７】
【表１０】
0006023140.tif 000012
【０２０８】
データは、抗体に関して、バイオリアクターの酸性化は、精製後の抗体機能にほとんど影響を及ぼさないことを実証している。
【０２０９】
酸の種類が抗体回収に与える効果。細胞培養物が、発酵工程の最後に製造バイオリアクターから得られた。試料は３Ｍクエン酸、３Ｍリン酸または３Ｍ塩酸を用いて徐々に酸性化され、そして室温で１時間保持された。１時間保持した後、当該培養物は３Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０に調節された。酸性化試料は、１１，０００×ｇでの遠心分離および０．２μｍの濾過により清澄化された。抗体力価を測定するために、定量分析によるプロテインＡ  ＨＰＬＣアッセイが用いられた。酸性化／清澄化後の力価は、回収率（％）を求めるために開始時の対照の力価と比較された。表１１を参照。
【０２１０】
【表１１】
0006023140.tif 000013
【０２１１】
表１１のデータから分かるように、抗体収集物の低ｐＨ酸性化／清澄化でクエン酸またはリン酸のいずれかを用いると、抗体力価の回収は最適となる。これまでに認められたように、３Ｍクエン酸を用い、培養物を若干高めのｐＨに調節すると、より良好な抗体回収が実現する。ｐＨ３．５では、抗体力価に若干の低下が認められた（３Ｍクエン酸の場合２．１％、３Ｍリン酸の場合１％および３Ｍ塩酸の場合７．７％）。
【０２１２】
２．抗ＩＬ−１２抗体組成物における宿主細胞タンパク質濃度の決定
この手順では、抗ＩＬ−１２抗体試料中の残留宿主細胞タンパク質濃度を決定するための試験方法論を記載する。酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、特異抗体の２つの層の間に宿主細胞タンパク質（抗原）をサンドイッチする。これに続いて、カゼインを用いて非特異的部位をブロックする。宿主細胞タンパク質を、次いで抗原分子が一次抗体に捕獲される間、インキュベートする（抗原のコーティング）。抗原（宿主細胞タンパク質）に固定する二次抗体（ビオチン化した抗宿主細胞タンパク質）を次いで添加する。ビオチン化抗宿主細胞タンパク質に結合するＨＲＰコンジュゲート型ニュートラアビジンを添加する。これに続いてＫブルーサブストレートを添加する。青色を生成する発色性基質を、結合した酵素コンジュゲート型抗体によって加水分解する。色を黄色に変える２ＭのＨ３ＰＯ４で反応を止める。色の強度は、ウェル中の結合した抗原の量に直接的に比例する。
【０２１３】
ｐＨ９．４の５０ｍＭの重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー）の調製。１Ｌのビーカーに、９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーター；４．２０ｇ±０．０１ｇの重炭酸ナトリウムを添加する。完全に溶解するまで撹拌する。１ＮのＮａＯＨでｐＨ９．４まで調整する。１Ｌのメスフラスコに移行し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。均一になるまで反転により混合する。０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。調製の日から最大７日間、名目上４℃で貯蔵する。
【０２１４】
０．１０４ＭのＮａ２ＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．３７ＭのＮａＣｌ、０．０２７ＭのＫＣｌ、０．０１７６ＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝６．８−６．９（１０×ＰＢＳ）の調製。およそ４００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをガラスビーカーに添加する。１３．９４ｇ±０．０１ｇのＮａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏを添加する。４０．０ｇ±０．１ｇのＮａＣｌを添加する。１．００ｇ±０．０１ｇのＫＣｌを添加する。１．２０ｇ±０．０１ｇのＫＨ２ＰＯ４を添加する。均一になるまで撹拌する。５００ｍＬのメスフラスコに移行する。Ｍｉｌｌｉ−ＱウォーターでＱＳを５００ｍＬの体積にする。反転混合する。０．２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。室温で最大７日間貯蔵する。
【０２１５】
１×ＰＢＳ＋０．１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．４０（プレート洗浄バッファー）の調製。４Ｌのメスシリンダー中で、４００ｍＬの１０×ＰＢＳ（ステップ５．２）と３５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターを混合する。ｐＨを確認し、必要に応じて１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＮａＯＨで７．４０±０．０５に調整する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やす。シリンダーをパラフィルムできつく覆い、均一になるまで逆回転により混合する。４Ｌのボトルに移行する。４ｍＬの１×ＰＢＳを除去し、捨てる。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍＬの１×ＰＢＳに添加する。撹拌プレート上に置き、完全に溶解するように撹拌する。希釈バッファーの調製に必要な量のプレート洗浄バッファーを、０．２２μｍの無菌フィルターユニットに通して濾過する。最大７日間、室温で貯蔵する。
【０２１６】
コーティング抗体混合物：アフィニティー精製したヤギ抗ＣＨＯ５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０１＠１．５３４ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。一定量を調製する。使用時に１プレートにつき一定量取り出す。使用する前にすぐに、次のように冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中で最終濃度４μｇ／ｍＬになるように抗体混合物を希釈する。例えば、３１μＬのコーティング抗体混合物を１１９６９μＬの冷たいコーティングバッファーに添加する。反転により穏やかに混合する。
【０２１７】
ビオチン化ヤギ抗宿主細胞タンパク質混合物、５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０２＠０．８２２ｍｇ／ｍＬ）の調製。注意：バイアル中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。一定量を調製する。使用時に１プレートにつき一定量取り出す。使用する前にすぐに、次のように３７℃±２℃のカゼイン中で最終濃度１μｇ／ｍＬになるようにビオチン化抗体混合物を希釈する。例えば、１４．６μＬのビオチン化抗体混合物を１１９８５μＬの３７℃±２℃のカゼインに添加する。逆回転により穏やかに混合する。
【０２１８】
ニュートラアビジン−ＨＲＰの調製。次のように新しいロット（２ｍｇ／バイアル）を１ｍｇ／ｍＬに再構築する。４００μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑウォーターをバイアルに添加し、次いで１６００μＬの１×ＰＢＳを添加し、全体で２ｍＬにする。穏やかに混合する。名目上−２０℃で貯蔵する。１プレートにつき一定量を使用できるように、所望の体積の一定量を調製する。ポリプロピレンチューブ中で調製する。新しいロットを限定して実施濃度を決定する。調製の日から６カ月の終了を指定する。例えば、実施濃度が０．２μｇ／ｍＬと決定されれば、次のように調製する。使用する前にすぐに、室温でニュートラアビジン−ＨＲＰの一定量を解凍する。１ｍｇ／ｍＬのニュートラアビジン溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）に希釈する。例えば、×１０希釈し、５０μＬのニュートラアビジンを４５０μＬのカゼインに添加する。穏やかに混合する。１００μｇ／ｍＬ溶液を３７℃±２℃のカゼインで０．２μｇ／ｍＬにさらに希釈する。例えば、×５００希釈し、２４μＬのニュートラアビジン（１００μｇ／ｍＬ）を１１９７６μＬのカゼインに添加する。穏やかに混合する。
【０２１９】
５．７２Ｍのリン酸（停止液）の調製。次のように濃縮したリン酸から２Ｍのリン酸溶液を調製する。ラベル上に提示された％リン酸、密度（１．６８５ｇ／ｍＬ）および式量（９８ｇ／モル）から、２Ｍのリン酸５００ｍＬを調製するのに必要な濃縮したリン酸の体積を計算する。上記で計算した濃縮したリン酸の体積をフラスコに添加する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑウォーターで体積を増やし、均一になるまで逆回転により混合する。調製の日から最大６カ月間、室温で貯蔵する。
【０２２０】
希釈溶液（ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で×１００希釈したカゼイン）の調製。（上記から得た）ｐＨ７．４の０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００中で３７℃±２℃のカゼインＸ１００を希釈する。例えば、１ｍＬの３７℃±２℃のカゼインを９９ｍＬの０．２２μｍの滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００、ｐＨ７．４に添加する。よく混合する。各使用について新鮮に調製する。
【０２２１】
標準物質の調製。宿主細胞タンパク質標準物質（抗原標準物質）（ロット＃Ｇ１１２０３＠１．２１８ｍｇ／ｍＬ）。注意：７０μＬ一定量中で名目上−８０℃で貯蔵した貯蔵物である。室温で一定量を解凍する。希釈バッファーを用いて、ポリプロピレンチューブ中で連続希釈を行う。
【０２２２】
試料の調製。ポリプロピレンチューブにおいて、希釈バッファー中で最終バルク試料を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。濃度を記録する。注意：スパイクした試料の調製および以下に参照の１２ｍｇ／ｍＬの溶液の調製のために以下の溶液を使用する。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファー中で２４ｍｇ／ｍＬの溶液を１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。全部で６ウェルについて、プレート上に１２ｍｇ／ｍＬの各溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。
【０２２３】
スパイクの調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、希釈バッファーで２Ｘ希釈することによって、上記で調製した２０ｎｇ／ｍＬの標準物質から１０ｎｇ／ｍＬの宿主細胞タンパク質スパイクを調製する。１０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液をプレート上の３ウェルに負荷する。スパイク試料について、ステップ６．１から得た２０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を使用する。
【０２２４】
スパイクした試料の調製。ポリプロピレンマイクロチューブにおいて、２４ｍｇ／ｍＬの各最終バルク溶液３００μＬを、３００μＬの２０ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液（６．１）でスパイクする。全部で６ウェルについて、スパイクした各試料溶液をトリプリケートでウェルに負荷する。
【０２２５】
対照の調製。対照の範囲は、通例の試験で使用する前に、新しい対照貯蔵溶液ごとに設定しなければならない。対照貯蔵物は、１５０μＬの一定量のバッチのＡＢＴ−８７４薬物濃度を調製し、最大３年間、名目上−８０℃で凍結貯蔵する。
【０２２６】
作業用対照の調製。対照の一定量を室温で解凍する。ポリプロピレンチューブ中で、希釈バッファーで対照を２４ｍｇ／ｍＬに希釈する。ポリプロピレンマイクロチューブ中で、２４ｍｇ／ｍＬの対照溶液を希釈バッファーで１２ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。単一の希釈液を調製し、プレートの３ウェル中に対照を負荷する。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡの手順。プレート洗浄ボトルをプレート洗浄バッファーで満たす（ステップ５．３を参照されたい。１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００）。プレートウォッシャーを用意する。次のパラメータを確認する。パラメータは、プレートタイプ：各サイクルについて１（全部で５サイクル）、体積：４００μｌ、浸漬時間：１０秒、Ａｓｐ．時間：４秒に設定すべきである。
【０２２８】
アッセイの手順。冷たい５０ｍＭの重炭酸ナトリウム中の４μｇ／ｍＬのヤギコーティング抗体混合物を１００μＬ／ウェルでプレートにコートする。コーティング溶液が、ウェルの底を均一に覆うまで、プレートの側面をたたき、密封テープで覆い、プレートシェーカー（または同等物）上で、１８時間±１時間、スピード３で振動させながら、名目上４℃でインキュベートする。一晩中インキュベートした後、冷蔵庫からプレートを取り出し、室温に平衡化することができる。コーティングを振り落とす。ペーパータオル上でプレートをブロットする。３００μＬ／ウェルの３７℃±２℃のカゼインでブロックし、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃でインキュベートする。ブロッキングインキュベーションの間、標準物質、試料、対照、スパイクおよびスパイクした試料を調製する。洗浄バッファーで５回プレートを洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。８チャンネルピペットを用いて、１００μＬ／ウェルの標準物質、試料、スパイク、スパイクした試料およびコントロールを、プレートのトリプリケートのウェル中にピペットで入れる。１００μＬ／ウェルの希釈バッファーを、プレートの全て空のウェル中にピペットで入れ、ブランクとして役立てる。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃でインキュベートする。鋳型を記入し、プレートに負荷するときにガイドとして使用する。
【０２２９】
プレートリーダーの設定。標準物質についての濃度を入力してテンプレートを設定する。試料、対照、スパイクまたはスパイクした試料についての希釈因子は入力しない。全ウェルから差し引く、ブランクとしての希釈液を含むウェルを指定する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのビオチン化ヤギ抗体を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃でインキュベートする。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルのニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液を添加する。密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（または同等物）上で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで１時間、振動させながら、３７℃±２℃でインキュベートする。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。ペーパータオル上でプレートをブロットする。１００μＬ／ウェルの冷たいＫブルーサブストレートを添加し、密封テープで覆い、Ｌａｂ−ｌｉｎｅタイタープレートシェーカー（または同等物）上でスピード３で振動させながら、室温で１０分間インキュベートする（基質を最初の列に添加したらすぐにタイマーを開始する）。１００μＬ／ウェルの２Ｍのリン酸を添加することによって反応を停止させる（ステップ５．７）。スピード３で３−５分間プレートシェーカー上にプレートを置く。４５０ｎｍでプレートを読み込む。
【０２３０】
データ解析および計算。注意：光学密度が標準曲線の実際的な定量化の限界内に入り、後述の％ＣＶまたは％差の基準を満たす、試料、スパイク、スパイクした試料および対照のみが許容可能である。試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、結果は２．５ｎｇ／ｍＬ以下として報告すべきである。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。上記の標準曲線となる非スパイクおよび／またはスパイクした試料を引き起こす宿主細胞濃度において試料が高ければ、＞１００ｎｇ／ｍＬとして値を報告する。この値を次いで希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割って、ｎｇ／ｍｇでの値を報告すべきである。試料が、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下であるとき、スパイクリカバリー計算について試料の値をゼロと考える。
【０２３１】
標準曲線。標準物質の濃度は、プロトコールのテンプレート中に入力される必要がある。二次曲線適合が用いられる。決定係数は＝０．９９でなければならず、トリプリケートのウェル間の％ＣＶは＝２０％でなければならない。この基準が満たされなければ、１つの標準物質（１つの濃度、３ウェル）が除外され得る。１．２５ｎｇ／ｍＬが除外される場合には、光学密度が２．５ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬ（残りの標準曲線の点）の光学密度の範囲内に収まる光学密度を有する試料およびスパイクした試料に限り許容され得る。さらに、各標準物質レベルのトリプリケートについて、１つのウェルが明らかに汚染されているまたは低い結合を示す場合には、そのウェルは除外され得る。あるウェルが標準物質レベルから除外された場合、残りの複写は％差異＝２０％でなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示す最低濃度の標準物質の％ＣＶは、＝３０％であるべきである。ある１つのウェルが除外された場合、残りの複写の％差異は、＝３５％でなければならない。最低濃度の標準物質が除外された場合、残りの標準曲線レベルの光学密度の範囲内に収まる光学密度を有する試料およびスパイクした試料に限り許容され得る。
【０２３２】
試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。各試料希釈からの１つのウェルを除外することができる。残りの複写は＝２０％の％差をもたなければならない。注意：非スパイクの試料のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質のＯＤより下であれば、％差の基準は、非スパイクの結果に適用しない。上記の計算を参照する。
【０２３３】
ｎｇ／ｍｇにおける実際の宿主細胞濃度を、次のように平均（ｎｇ／ｍＬ）値から計算する：ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝平均の「非スパイクの試料の結果（ｎｇ／ｍＬ）」＿希釈した試料濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）。
【０２３４】
スパイク。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶを報告する。スパイクからの１つのウェルを除外することができる。残りの点は％差＝２０％でなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける宿主細胞濃度を報告する。この結果は、スパイクリカバリー計算に使用する。スパイクについての結果の濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、理論上のスパイクの濃度の±２０％でなければならない。結果を報告し合否を示す。スパイクの結果が、理論上の２０％以内でなければ、アッセイは繰り返さなければならない。平均のスパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００は、＝１００％±２０％  １０ｎｇ／ｍＬでなければならない。
【０２３５】
スパイクした試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。スパイクした各試料希釈からの１つのウェルを除外することができる。残りの複写は、％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。各希釈についてｎｇ／ｍＬで「スパイクした試料の結果」を報告する。デュプリケートの希釈物間での％差を報告する。希釈物間の％差は＝２５％でなければならない。これらの結果はスパイクリカバリー計算に使用する。
【０２３６】
以下の式を用いて、各希釈物セットについて％スパイクリカバリーを計算する：％スパイクリカバリー＝スパイクした試料の値−非スパイクの試料の値×１００スパイクの値。（１）非スパイク試料の値のＯＤが、２．５ｎｇ／ｍＬの標準物質より下に入れば、％スパイクリカバリー計算においてゼロと値を考えることに注目する。％スパイクリカバリーは、各試料の各希釈について、１００％±５０％（５０％−１５０％）でなければならない。結果および合否を報告する。
【０２３７】
対照。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％であるべきである。％ＣＶ結果を報告する。対照からの１つのウェルを除外することができる。残りの複写は％差＝２０％をもたなければならない。上記の計算を参照する。ｎｇ／ｍＬにおける対照での宿主細胞濃度を報告する。次のようにｎｇ／ｍｇでの宿主細胞濃度を計算する：宿主細胞タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）＝ｎｇ／ｍＬでの対照の宿主細胞タンパク質。
【０２３８】
３．抗ＩＬ−１２抗体組成物中のプロテインＡ濃度の決定
このＥＬＩＳＡでは、プレートはニワトリ抗プロテインＡでコーティングされ、インキュベーションされた。非特異的部位は、ＰＢＳ中のカゼインでブロックされる。プレートは、未結合物質を除去するために１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００内で洗浄される。試料およびＣｙｓ−ｒプロテインＡ標準物質は１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ＋１０％カゼインで希釈される。当該溶液は、９５℃±２℃で加熱することにより変性を受け、プロテインＡをＡＢＴ８７４から分離する。次に、溶液はプレートに添加され、インキュベーションされる。未結合物質は、１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００で洗浄除去される。ビオチン化されたニワトリ抗プロテインＡはマイクロタイタープレートに添加され、インキュベーションされる。当該プレートは未結合物質を除去するために洗浄され、またニュートラアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートが添加される。
【０２３９】
ニュートラアビジンは、ウェルに結合したビオチン化ニワトリ抗プロテインＡと結合する。当該プレートは、未結合のニュートラアビジンを除去するために再度洗浄され、そしてＫ−ブルー（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））基質がプレートに添加される。当該基質は結合したニュートラアビジンにより加水分解されて青色に発色する。反応はリン酸によって停止されて黄色に変化する。ウェル内の黄色の強度は、ウェル内に存在するプロテインＡの濃度と直に比例する。
【０２４０】
試薬および溶液の調製では、カゼインのボトルは３７℃±２℃に加温され、２分間超音波処理され、および等分割されなければならない。一定量は名目上４℃で保存される。アッセイが行われる際には、必要ないくつかのカゼインの一定量は、３７℃±２℃に配置される必要がある。コーティングバッファーおよび基質は冷やして用いられる（使用直前に名目上４℃から取り出される）。
【０２４１】
５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー）、ｐＨ９．４。１Ｌのビーカーに、９００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水、４．２０ｇ±０．０１ｇの重炭酸ナトリウムを添加する。完全に溶解するまで攪拌する。１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを９．４に調節する。１Ｌの容量フラスコに移し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で容量に合わせる。均一になるまで転倒混和する。０．２２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットを通して濾過する。調製した日から最長７日間、名目上４℃で保管する。
【０２４２】
１０４Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＊７Ｈ２Ｏ、１．３７Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２７Ｍ  ＫＣｌ、０．０１７６Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝６．８−６．９（１０×ＰＢＳ）：約４００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水をガラスビーカーに添加する。１３．９４ｇ±０．０１ｇのＮａ２ＨＰＯ４×７Ｈ２Ｏを添加する。４０．０ｇ±０．１ｇのＮａＣｌを添加する。１．００ｇ±０．０１ｇのＫＣｌを添加する。１．２０ｇ±０．０１ｇのＫＨ２ＰＯ４を添加する。均一になるまで攪拌する。５００ｍＬの容量フラスコに移す。ＱＳから５００ｍＬになるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ水で容量を合わせる。反転混合する。０．２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットを通して濾過する。最長７日間、室温で保管する。
【０２４３】
１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００、ｐＨ７．４０：（プレート洗浄バッファー）。４Ｌのメスシリンダー内で、４００ｍＬの１０×ＰＢＳ（上記参照）を３５００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水と混合する。ｐＨをチェックし、必要ならば１Ｎ  ＨＣｌまたは１Ｎ  ＮａＯＨを用いて７．４０±０．０５に調節する。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で容量に合わせる。当該シリンダーをパラフィルムでしっかりと封印し、均一になるまで反転混合する。４リットルのボトルに移す。４ｍＬの１×ＰＢＳを取り出し廃棄する。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍＬの１×ＰＢＳに添加する。攪拌プレート上に配置し、完全に溶解するまで攪拌する。室温で最長７日間保管する。
【０２４４】
ニワトリ抗プロテインＡコーティング抗体。使用時に、１プレート毎に抗体の一定量を取り出す。新ロットのニワトリ抗プロテインＡを適格性確認するために、ニワトリ抗プロテインＡ−ビオチンコンジュゲート（コーティング物のロットと同じロットから作製される）を共に使用し、適格性確認する必要がある場合がある。使用直前：コーティング物を適格性確認する際に、抗体混合物を５０ｍＭの冷重炭酸ナトリウム内で、決定された濃度に希釈する。例えば：適格性確認する際に、プレート上に負荷するコーティング物の濃度が６μｇ／ｍＬと決定され、またストックの濃度が３０００μｇ／ｍＬである場合には、２４μＬのコーティング抗体を、１１９７６μＬの冷コーティングバッファーに添加する。緩やかに反転混合する。
【０２４５】
ビオチン化ニワトリ抗プロテインＡ。使用時に、１プレート毎に抗体の一定量を取り出す。新ロットのニワトリ抗プロテインＡ−ビオチンコンジュゲート化物を適格性確認するために、これが調製されたものと同一ロットのニワトリ抗プロテインＡと共に使用し、適格性確認する必要がある場合がある。使用直前：ビオチン化抗体を適格性確認する際に、ビオチン化抗体を３７℃±２℃のカゼイン内で、決定された濃度に希釈する。例えば：適格性確認する際に、プレート上に負荷するビオチン化抗体の濃度が４μｇ／ｍＬと決定され、またストックの濃度が１０００μｇ／ｍＬである場合には、４８μＬのビオチン化抗体を３７℃±２℃で、１１９５２μＬのカゼインに添加する。緩やかに反転混合する。
【０２４６】
ニュートラアビジンＨＲＰ。下記要領で新規ロット（２ｍｇ／バイアル）を１ｍｇ／ｍＬに再構成する：バイアルにＭｉｌｌｉ−Ｑ水、４００μＬを添加し、次に１×ＰＢＳ、１６００μＬを添加し、全量２ｍＬとする。巻き込むように緩やかに混合する。名目上−８０℃で保存する。１プレート毎に一定量が用いられるように、所望の容量で一定量を分注する。ポリプロピレンチューブ内に分注する。調製日から６ヶ月の有効期限を設定する。例えば、実施濃度が０．１μｇ／ｍＬに決定された場合には、下記要領で調製する。使用直前に、ニュートラアビジンＨＲＰの一定量を室温で解凍する。１ｍｇ／ｍＬのニュートラアビジン溶液を０．０１ｍｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬ）に、３７℃±２℃のカゼインで希釈する。例えば：５０μＬのニュートラアビジンを、４５０μＬのカゼインに添加して１０倍希釈する。巻き込むように緩やかに混合し、１００μＬの１０倍希釈ニュートラアビジンを、９００μＬのカゼインに添加して再び１０倍希釈する。巻き込むように緩やかに混合する。さらに、１０μｇ／ｍＬの溶液を０．１μｇ／ｍＬに、３７℃±２℃のカゼインで希釈する。例えば：１２０μＬのニュートラアビジン（１０μｇ／ｍＬ）を、１１８８０μＬのカゼインに添加して１００倍希釈する。数回反転して緩やかに混合する。
【０２４７】
停止溶液（購入した１Ｎリン酸が使用される）。納入日から最長１年間、室温で保存する。希釈バッファー（１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ１００＋１０％カゼイン、ｐＨ７．４）。１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００、ｐＨ７．４（ステップ５．３からの）、８６ｍＬをビーカーまたはフラスコに添加し、トリトンＸ−１００、４ｍＬおよびＰＢＳ内のブロッカーカゼイン、１０ｍＬを添加し、そして溶解／混合するために攪拌する。トリトンを溶解するのに２０から３０分を要すると考えられる。これは、１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ１００＋１０％カゼイン、ｐＨ７．４溶液に等しい。０．２２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットを通して濾過する。使用毎に新たに調製する。これは１プレートに十分である。
【０２４８】
プロテインＡ標準物質（抗原標準物質）。注記：ストックは名目上−２０℃、各７０μＬの一定量で保存される。氷上で一定量を解凍する。ポリプロピレンチューブの下の表中の実施例に基づき、希釈バッファー（上記参照）を用いて連続希釈操作を行うが、その際メーカーのＣＯＡに記載されている濃度を用いる：例えば、ＣＯＡが、ストック濃度が２．１ｍｇ／ｍＬ（２１０００００ｎｇ／ｍＬ）と記載する場合には：氷上で試料を解凍する。ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ内で、最終バルク試料を希釈バッファー（上記）内で２０ｍｇ／ｍＬに希釈する。２回の分離した希釈操作を行う。濃度を記録する。スパイクした試料を調製するために、また１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製するために下記の溶液を使用する。ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ内で、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を希釈バッファー内で１０ｍｇ／ｍＬにさらに希釈する。
【０２４９】
スパイク品の調製。ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ内で、上記ステップ６．１で調製された０．５９３ｎｇ／ｍＬの標準物質から、希釈バッファーでこれを２倍に希釈することにより、０．２９６ｎｇ／ｍＬのプロテインＡスパイク品を調製する。単回の希釈操作を行う。０．２９６ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液について３重のウェルがプレート上に負荷される。試料にスパイクするために、ステップ６．１から得られる０．５９３ｎｇ／ｍＬ標準溶液を用いる。
【０２５０】
スパイクした試料の調製。ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ内で、０．５９３ｎｇ／ｍＬのスパイク溶液、５００μＬを用いて、各２０ｍｇ／ｍＬの最終バルク溶液、５００μＬをスパイクする。変性するように保持する。各スパイクした試料溶液について３重のウェル、合計６ウェルがプレート上に負荷される。
【０２５１】
対照の調製。ＡＢＴ−８７４製剤原料のある１ロットを入手する。１５０μＬの一定量に分注し、分注日から３年間、名目上−８０℃で凍結保存する。
【０２５２】
実施対照：氷上で一定量の対照を解凍する。ポリプロピレンマイクロ遠心チューブ内で、最終容積が１０００μＬとなるように希釈バッファーで対照を１０ｍｇ／ｍＬに希釈する。単一の希釈物を調製する。変性するように保持する。対照の３つ重複したウェルをプレート上に負荷する。
【０２５３】
変性。プレートのブランクとして、プレート上で操作されるブランクと同数のマイクロ遠心チューブに、１０００μＬの希釈バッファーを添加する。チューブのキャップは加熱中に突然開放しないようにパラフィルムで封印可能、またはキャップを閉鎖状態に保つために２番目のラックをこれらのキャップ上に配置可能である。標準物質、非スパイク試料、スパイクした試料、スパイク品、ブランクおよび対照を、９５℃±２℃で１５分間加熱する。パラフィルムを使用した場合には、冷却中にこれをチューブから取り除く。１５分間冷却放置し、約１００００ｒｐｍで５分間遠心分離する。プレート上に負荷するために上清の７００μＬをマイクロチューブに移す。トリトン／タンパク質ペレットを乱さないように注意する。
【０２５４】
プレート洗浄機の説明およびウォーターバスの設置。プレート洗浄バッファーでプレート洗浄ボトルを満たす（ステップ５．３、１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００を参照）。プレート洗浄機を準備する。下記パラメータをチェックする：パラメータを次のように設定する必要がある：プレートタイプ：各サイクルについて１（全４サイクル）：Ａｓｐスピード：１０ｍｍ／秒；体積：４００μｌ；浸漬時間：５秒；Ａｓｐ．時間：６秒。ウォーターバスのスイッチを入れ、９５℃に設定する。ウォーターバスの温度が、９５℃±２℃で平衡となるように、少なくとも３０分間放置する。
【０２５５】
アッセイ手順：ステップが完了したら、これらのステップをチェックする手引きとしてチェックリストが利用可能である。さらに、アッセイ中に使用したすべての機器を記録する。アッセイが行われる日毎に、用いられるカゼインの一定量は３７℃±２℃に置かれなければならない。コーティングバッファーおよび基質は冷やして用いられる。ブロッキングインキュベーション前およびその期間中、標準物質、試料、対照、スパイクおよびスパイクした試料を調製する。希釈物を調製し、エッペンドルフチューブに移し、１５分間変性し、１５分間冷却し、５分間遠心分離し、そしてマイクロチューブに移すのに、１時間のブロックインキュベーションよりも長くなる可能性がある。プレートをブロッキングする前に、少なくとも４０分間放置する。試料、スパイクした試料、標準物質、対照、アッセイスパイク品およびブランクは、１２チャネルピペットを用いてＢ行からＧ行までプレート上に水平方向に負荷される。標準物質は高濃度から低濃度の順番で負荷される。プレートのコーティング、ビオチンの添加、ニュートラアビジンの添加、基質の添加および停止溶液の添加は、２列から１１列まで垂直方向に行われる。
【０２５６】
５０ｍＭの冷重炭酸ナトリウム中のコーティング抗体、１００μＬ／ウェルを用いてプレートをコーティングする。コーティング溶液がウェルの底を均一に覆うまでプレートの側面を軽くたたき、密封テープでカバーし、そしてプレートシェーカー（または同等品）上にてスピード３で振とうさせながら名目上４℃でインキュベートする。
【０２５７】
一晩インキュベーションした後、プレートを冷蔵庫から取り出し、室温で平衡化するように放置する。コーティング物を振り落とす。ペーパータオル上でプレートをブロットする。３７℃±２℃、３００μＬ／ウェルのカゼインでブロックし、密封テープでカバーし、そしてＬａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  プレートシェーカー（または同等品）上にて８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃±２℃で１時間±１０分間インキュベートする。
【０２５８】
ブロッキングインキュベーションの前および期間中に、標準物質、試料、対照、スパイク品およびスパイクした試料を調製する。洗浄バッファーで４回プレートを洗浄する。プレートをペーパータオル上でブロットする。８チャンネルピペットを用いて、変性させた標準物質、試料、スパイク品、スパイクした試料、ブランクおよび対照を１００μＬ／ウェルずつ、プレートの３つの重複したウェルにピペット分注する。プレートの外側のウェルは使用されず、未処理の希釈バッファーがこれらのウェルに添加される。密封テープでカバーし、そしてＬａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  プレートシェーカー（または同等品）上にて８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃±２℃で２時間インキュベートする。テンプレートに記入をしてプレートに負荷する際のガイドとして用いる。
【０２５９】
プレートリーダーの設定。洗浄バッファーを用いて４回プレートを洗浄する。プレートをペーパータオルでブロットする。ビオチン化抗体を１００μＬ／ウェル添加する。密封テープでカバーし、そしてＬａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  プレートシェーカー（または同等品）上にて８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃±２℃で１時間インキュベートする。
【０２６０】
洗浄バッファーを用いて４回プレートを洗浄する。プレートをペーパータオルでブロットする。ニュートラアビジンＨＲＰコンジュゲート溶液を１００μＬ／ウェル添加する。ニュートラアビジンが最後の行に添加され次第、タイマーをスタートさせる。密封テープでカバーし、そしてＬａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  プレートシェーカー（または同等品）上にて８０ｒｐｍ±５ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃±２℃で３０分間インキュベートする。洗浄バッファーを用いて４回プレートを洗浄する。プレートをペーパータオルでブロットする。冷Ｋ−ブルー基質を１００μＬ／ウェル添加し、密封テープでカバーし、そしてＬａｂ−ｌｉｎｅ  タイタープレートシェーカー（または同等品）上にてスピード３で振とうさせながら、室温で１０分間インキュベートする（基質が最初の行に添加され次第タイマーをスタートさせる）。１Ｎリン酸を１００μＬ／ウェル添加して反応を停止する。プレートをプレートシェーカー上にスピード３で３分間配置する。４５０ｎｍでプレートを読み取る。
【０２６１】
データ解析および計算。注記：光学密度が標準曲線の実用的定量限界内に収まり、後述の％ＣＶまたは％差異基準を満たす、試料、スパイク品、スパイクした試料および対照に限り許容され得る。試料のＯＤが、標準曲線を下回る場合には、結果は０．１８ｎｇ／ｍＬ（アッセイＬＯＱ）未満として報告される必要がある。次に、この値は、ｎｇ／ｍｇで表わされる値を報告するように、希釈試料濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）で割り算される必要がある。試料のプロテインＡ濃度が高く、非スパイクおよび／またはスパイクした試料が標準曲線を上回る（２ｎｇ／ｍＬ）場合には、標準曲線範囲内に収まるようにさらに希釈する。次いで、この値は、ｎｇ／ｍｇで表わされる値を報告するように、希釈試料濃度で割り算される必要がある。スパイクリカバリー計算の場合、非スパイク試料の値（ｎｇ／ｍＬ）が曲線を下回る場合であっても、スパイクした試料の値（ｎｇ／ｍＬ）から非スパイク試料の値（ｎｇ／ｍＬ）を引き算する。値が負である、または「範囲（ｒａｎｇｅ）」が得られる場合には、非スパイク試料はスパイクリカバリー計算に関してゼロとみなされる。
【０２６２】
標準曲線。標準物質の濃度は、プロトコールのテンプレート中に入力される必要がある。二次曲線適合が用いられる。決定係数は＝０．９９でなければならず、トリプリケートのウェル間の％ＣＶは＝２０％でなければならない。この基準が満たされなければ、１つの標準物質（１つの濃度、３ウェル）が除外され得る。０．１８ｎｇ／ｍＬが除外される場合には、光学密度が０．２６ｎｇ／ｍＬおよび２ｎｇ／ｍＬ（残りの標準曲線の各点）の光学密度の範囲内に収まる光学密度を有する試料およびスパイクした試料に限り許容され得る。さらに、各標準物質レベルのトリプリケートについて、１つのウェルが明らかに汚染されているまたは低い結合を示す場合には、そのウェルは除外され得る。あるウェルが標準物質レベルから除外された場合、残りの複写は％差異＝２０％でなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示す最低濃度の標準物質の％ＣＶは、＝３０％であるべきである。ある１つのウェルが除外された場合、残りの複写の％差異は、＝３５％でなければならない。最低濃度の標準物質が除外された場合、残りの標準曲線レベルの光学密度の範囲内に収まる光学密度を有する試料およびスパイクした試料に限り許容され得る。
【０２６３】
下記要領で％差異を計算する：％差異＝（吸光度（希釈１の結果−希釈２の結果）／平均値）×１００％。標準物質が上記基準を満たさない場合には、アッセイが繰り返されなければならない。％ＣＶおよび／または％差異値および標準曲線の決定係数の結果を報告する。
【０２６４】
試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％である必要がある。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを報告する。各試料希釈から１つのウェルが除外可能である。残りの複写は、％差異が＝２０％でなければならない。注記：非スパイク試料のＯＤが、最低濃度の標準物質のＯＤを下回る場合、％差異の基準は非スパイクの結果に適用されない。上記の計算を参照。
【０２６５】
各希釈について、「非スパイク試料の結果」をｎｇ／ｍＬ表示で報告する。これらの値はスパイクリカバリー計算で用いられる。平均「非スパイク試料の結果（ｎｇ／ｍＬ）」および希釈間の％差異を計算する。結果を報告する。希釈間の％差異は、＝２５％でなければならない。下記要領で、実際のプロテインＡの濃度をｎｇ／ｍｇ表示で、平均値（ｎｇ／ｍＬ）から計算する：プロテインＡ（ｎｇ／ｍｇ）＝平均の「非スパイク試料の結果（ｎｇ／ｍＬ）」（／）希釈試料濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）。結果を記録する。
【０２６６】
スパイク品。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％である必要がある。％ＣＶを記録する。スパイク品から１つのウェルが除外可能である。残りの測定ポイントは、％差異＝２０％でなければならない。上記の計算を参照。ｎｇ／ｍＬ表示でプロテインＡ濃度を報告する。この結果は、スパイクリカバリー計算で用いられる。スパイク品について得られた濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、理論上のスパイク濃度±２０％でなければならない。結果を記録し、合否を示す。スパイク結果が、理論値の２０％以内でなければ、アッセイは繰り返されなければならない。０．２９６ｎｇ／ｍＬについて、平均スパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００＝１００％±２０％でなければならない。
【０２６７】
スパイクした試料。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％である必要がある。トリプリケートのウェル間の％ＣＶを記録する。スパイクした各試料希釈物から１つのウェルが除外可能である。残りの複写は、％差異＝２０％でなければならない。上記の計算を参照。各希釈物についてｎｇ／ｍＬ表示で「スパイクした試料の結果」を報告する。二重で実施した希釈物間の％差異を記録する。希釈物間の％差異は＝２５％である必要がある。これらの結果はスパイクリカバリー計算で用いられる。以下の式を用いて、各希釈セットについて％スパイクリカバリーを計算する：％スパイクリカバリー＝スパイクした試料の値−非スパイク試料の値×１００。スパイク値。注記：スパイクリカバリー計算において、非スパイク試料値（ｎｇ／ｍＬ）が曲線を下回る場合であっても、スパイクした試料の値（ｎｇ／ｍＬ）から非スパイク試料の値（ｎｇ／ｍＬ）を引き算する。値が負である、または「範囲（ｒａｎｇｅ）」が得られる場合には、非スパイク試料はスパイクリカバリー計算に関してゼロとみなされる。％スパイクリカバリーは、各試料の各希釈物について１００％±５０％（５０％−１５０％）でなければならない。結果および合否を記録する。
【０２６８】
対照。％ＣＶは、トリプリケートのウェル間で＝２０％である必要がある。％ＣＶ結果を記録する。対照から１つのウェルが除外可能である。残りの複写は、％差異が＝２０％でなければならない。
【０２６９】
様々な文献が本明細書に引用され、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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