(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）生理学的に許容可能な分散媒中に、ヒドロゲルの全質量に対する質量で：
グリセロール０．５％乃至２．５％及びヒアルロン酸又はその塩の架橋バイオポリマー０．５％乃至３％を含む注入可能なヒドロゲルであって、
該ヒアルロン酸又はその塩は、５×１０５Ｄａ乃至４×１０６Ｄａ間の分子量を有し、そしてブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）によって該バイオポリマーの鎖の間に共有結合を形成することによって架橋されているヒドロゲルを提供すること、及び（ｂ）湿式加熱で前記注入可能なヒドロゲルを殺菌して１Ｈｚの周波数で１．１０より小さいか又は等しいＴａｎδを有する注入可能な殺菌されたヒドロゲルを提供すること
を含む皮膚にグリセロールを長期にわたって徐々に放出するための注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法。
【請求項２】
１Ｈｚの周波数で前記パラメータＴａｎδが０．８０より小さいか又は等しい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロゲルが生物に又はヒドロゲルに良い影響を奏する、少なくとも１種の他の生体適合性ポリマー及び／又は少なくとも１種の薬理的活性物質及び／又は少なくとも１種の非薬理的活性物質を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｉ）ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）により前記バイオポリマーの鎖の間に共有結合を形成することによって、ヒアルロン酸又はその塩の架橋されたバイオポリマーの少なくとも０．５質量％乃至３質量％を含む第一混合物を調製する段階、
ｉｉ）段階ｉ）中に、ヒアルロン酸又はその塩の架橋バイオポリマーの架橋結合の前、中又後にグリセロールの０．５質量％乃至２．５質量％を添加し、これにより均一の混合物を形成する段階、
ｉｉｉ）これにより得られたゲルをすぐ使用できる形態に転換する段階、
ｉｖ）湿式加熱で生成物を殺菌する段階
を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記殺菌温度が１００℃より高い、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記殺菌は１２１℃より高いか又は等しい温度で実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記殺菌が以下のサイクル：１３１℃１分間、１３０℃３分間、１２５℃７分間、１２１℃２０分間、又は１２１℃１０分間
の１つに従って実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法により製造された注入可能な殺菌されたヒドロゲルをシリンジに入れることを含む、キットの製造方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法により製造された注入可能な殺菌されたヒドロゲルをバイアル又はボトルに入れることを含む、キットの製造方法。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルは哺乳動物の皮膚の化学的な、物理的な及び機械的な特性を改善するのに適したものである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法。
【請求項１１】
前記キットは哺乳動物の皮膚の化学的な、物理的な及び機械的な特性を改善するのに適したものである、請求項８又は請求項９に記載のキットの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は皮膚にグリセロールを長期補足するための注入可能なヒドロゲルに関する。
【０００２】
本発明はまた、皮膚科学分野における上記ヒドロゲルの方法及び使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
グリセロール、内因性分子、は、皮膚に重要な役割を有するトリヒドロキシアルコールである。内因性グリセロールは皮膚弾性力及び表皮バリアの回復における皮膚の水和に特に主要な役割を果たす(British Journal of Dermatology, 159(1):23-34, July 2008, Fluhr, J. W.; Darlenski, R. *; Surber)。
【０００４】
表皮上のグリセロールの種々の有益な効果は、とりわけ角質層（皮膚の再外層）の水和、皮膚のバリア機能、皮膚の機械的性質、刺激物の刺激に対する保護及び創傷治癒の処置の促進を含む (British Journal of Dermatology, 159(1):23-34, July 2008, Fluhr, J.
W.; Darlenski, R. *; Surber)。
【０００５】
グリセロールを含む生成物の局所適用は、アトピー性皮膚炎の場合と同様に、乾燥症及び劣化してきた表皮バリアによって特徴づけられる疾患において皮膚の特性を改善することが従来技術から知られている。
【０００６】
その上、加齢に伴って、我々は皮膚のグリセロール量の減少に気付く。
【０００７】
グリセロールの補足は皮膚にとってとても有益であることは、上述の全てから推測できる。
【０００８】
それゆえ、多くの化粧品はその組成中にグリセロールを有する。このように、１日１回又は２回の適用をすると、皮膚はグリセロールの有益な効果から利益を得る。しかしながら、この溶液は毎日、皮膚の局所的な処置を必要とする。
【０００９】
化粧品の使用と同様に、皮膚へのグリセロール水溶液の注入は極めて短期間にグリセロールの有益な効果から利益を得ることを可能にする。実際に、注入されたグリセロールのほぼ全ては、角質層への注入場所から急速に角質層に移動し、そして毎日の洗浄によって皮膚の表面から取り除かれる。このように、グリセロールの有益な作用は“一度限り”である(PNAS, 100(12):7360-7365, June 2003, Hara, M.W.; Verkman, A.S. / Journal d'Investigation Dermatologique, 125: 288-293, 2005, Choi, H.C)。
【００１０】
ヒアルロン酸（ＨＡ）含有グリセロールの注入溶液は従来技術において記載されている。それら粘弾性特性のおかげで、これらの溶液はグリセロールの放出を遅らせるとされているように思われる。しかしながら、皮膚内に注入した場合、これら溶液はグリセロールの長期補足を提供しない（長くても１週間の期間の補足）。実際に、ヒアルロン酸は１週間足らずで、皮膚内で代謝される(Wenner-Gren International series; The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives, Laurent, T.C.)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
結局、皮膚にグリセロールを長期にわたって徐々に放出するようにする注入可能なヒド
ロゲルは従来技術に存在しない。
【００１２】
従って、本発明の目的は、多くの性質を有し及び上述した欠点のいくつかを避ける新規な注入可能なヒドロゲルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明は生理学的に許容可能な分散媒中に、質量で：
ヒドロゲルの全質量に対してグリセロール０．０１％乃至５％及びヒアルロン酸又はそれらの塩の１種の架橋バイオポリマー０．１％乃至５％を含む注入可能なヒドロゲルであって、該ヒアルロン酸又はそれらの塩の１種は、二官能性の又は多官能性の分子によって前記バイオポリマーの鎖の間に共有結合を形成することによって架橋されることを特徴とし、湿式加熱で殺菌され及び１Ｈｚの周波数で１．１０より小さいか又は等しいＴａｎδを有する、前記注入可能なヒドロゲルに関する。
また本発明は、
（ａ）生理学的に許容可能な分散媒中に、ヒドロゲルの全質量に対する質量で：
グリセロール０．５％乃至２．５％及びヒアルロン酸又はその塩の架橋バイオポリマー０．５％乃至３％を含む注入可能なヒドロゲルであって、
該ヒアルロン酸又はその塩は、５×１０５Ｄａ乃至４×１０６Ｄａ間の分子量を有し、そしてブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）によって該バイオポリマーの鎖の間に共有結合を形成することによって架橋されているヒドロゲルを提供すること、及び（ｂ）湿式加熱で前記注入可能なヒドロゲルを殺菌して１Ｈｚの周波数で１．１０より小さいか又は等しいＴａｎδを有する注入可能な殺菌されたヒドロゲルを提供すること
を含む皮膚にグリセロールを長期にわたって徐々に放出するための注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法に関する。
【００１４】
パラメーターＴａｎδは位相角のタンジェントとして定義される通常のレオロジーパラメーターであり、該位相角は振動レオロジー試験中の応力と歪み間との位相差である。ファルコーネ（Ｆａｌｃｏｎｅ）による研究において実施されているように、位相角のタンジェントは、特に架橋されたヒアルロン酸に基づいてゲルの粘弾性特性を特徴付けることを可能にする(Journal of Biomedical Material Research, part A, January 2008, Falcone, S.J.; Berg, R.A.)。架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルに関し、パラメーターＴａｎδは皮膚におけるゲルの残留、即ち注入部位でのその存在、とおそらく相関がある。
【００１５】
全く驚いたことには、グリセロールの０．０１％乃至５％及び共有結合の形成によって架橋されたヒアルロン酸の０．１％乃至５％基づくヒドロゲルであって、続いて湿式加熱で殺菌され、１Ｈｚの周波数でのＴａｎδが１．１０より少ないか又は等しいような粘弾性特性を有する該ヒドロゲルは、
−グリセロール及び湿式加熱で殺菌された非架橋のヒアルロン酸に基づくゲル（従来技術で記載されているグリセロールを用いたゲルの１種）と比較して、皮膚中にグリセロールの放出持続期間をかなり増加させること（比較例２参照）、
−湿式加熱で殺菌されていない、グリセロールと架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルと比較して、著しく肌にグリセロールの放出持続期間を増加させること（比較例１参照）、
−湿式加熱で殺菌されていないグリセロールと架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルと比較して、著しい残留性、即ち注入部位でのゲルの存在、を増加させること（比較例１参照）、
を可能にする。
【００１６】
適した濃度でのヒアルロン酸の共有架橋結合、適した濃度でのグリセロールの存在、十分に高温での湿式加熱による殺菌及び特有の粘弾特性を有するゲルを得るという４つの選択は、長期間にわたって皮膚にグリセロールを放出するための数ヶ月間の残留性及びボリュームを有するグリセロールを備えた注入可能なヒドロゲルを得ることを可能にする。それ故に、本発明に従う注入可能なヒドロゲルの特別な特性の組合せによって、グリセロールは長期にわたってゲルから徐々に溶出し、このようにして、グリセロールが長期のあいだ補足されることから、ゆっくり時間をかけて皮膚に利益を与える。
【００１７】
本発明によれば、グリセロールの濃度はヒドロゲルの全質量に対して、０．０１％乃至５質量％、好ましくは０．５％乃至２．５％である。５質量％を超えると、ヒドロゲルのオスモル濃度は高すぎて、それを皮膚内に注入するのに適さない。
【００１８】
本発明によれば、架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１種の濃度は、ヒドロゲルの全
質量に対し０．１％乃至５質量％、好ましくは０．５％乃至３質量％である。
【００１９】
本発明によれば、ヒロドゲルは１Ｈｚの周波数で１．１０より低いか又は等しいＴａｎδを有する。好ましくはヒドロゲルは１Ｈｚの周波数で０．８０より低いか又は等しいｔａｎδを有する。
【００２０】
好ましくは、ヒアルロン酸又はその塩の１種（架橋前）の分子量は１０００Ｄａ乃至１０×１０6Ｄａ、好ましくは５００，０００及び４×１０6Ｄａである。
【００２１】
本発明によれば、１つの又は複数の天然起源の他の多糖と共に又は無しに、非架橋の又は既に架橋したヒアルロン酸について、例えばエポキシド、エピハロヒドリン及びジビニルスルホンから選択される二官能性の又は多官能性の分子によって架橋が生じる。例えば、使用される架橋剤はブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）又はジビニルスルホン（ＤＶＳ）である。
【００２２】
本発明の特定の態様によれば、ゲルは、また、生物又はヒドロゲルに有益な効果を有する、（天然起源の多糖のような）他の生態適合性ポリマー及び／又は（リドカイン、局所麻酔薬のような）他の薬理的活性物質又は（ビタミンもしくはミネラル塩のような）非薬理的活性物質も含むことができる。
【００２３】
本発明によれば、前記注入可能なヒドロゲルは湿式加熱で殺菌される。
【００２４】
有利には、殺菌は１００℃より高い温度で実施される。好ましくは、殺菌は１２１℃より高いか又は等しい温度で実施される。
【００２５】
例えば、以下の殺菌サイクルの１種：１３１℃１分間／１３０℃３分間／１２５度７分間／１２１℃２０分間又は１２１℃１０分間
が使用され得る。
【００２６】
本発明はまた、
ａ）二官能性の又は多官能性の分子を用いて、前記バイオポリマーの鎖間を共有結合の形成によって、ヒアルロン酸又はその塩の１種の架橋バイオポリマーの少なくとも０．１％乃至５質量％を含む第１混合物を調製する段階、
ｂ）段階ａ）中に、ヒアルロン酸又はその塩の１種のバイオポリマーの架橋の前に、中に又は後に、０．０１％乃至５質量％のグリセロールを添加して、均質な混合物を形成する段階、
ｃ）このようにして得られたゲルをすぐに使用できる形態に転換する段階、
ｄ）湿式加熱で生成物を殺菌する段階
を含む、上記に記載の注入可能なヒドロゲルの製造方法に関する。
また本発明は上記の注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法のうち、好ましい一態様として、
ｉ）ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）により前記バイオポリマーの鎖の間に共有結合を形成することによって、ヒアルロン酸又はその塩の架橋されたバイオポリマーの少なくとも０．５質量％乃至３質量％を含む第一混合物を調製する段階、
ｉｉ）段階ｉ）中に、ヒアルロン酸又はその塩の架橋バイオポリマーの架橋結合の前、中又後にグリセロールの０．５質量％乃至２．５質量％を添加し、これにより均一の混合物を形成する段階、
ｉｉｉ）これにより得られたゲルをすぐ使用できる形態に転換する段階、
ｉｖ）湿式加熱で生成物を殺菌する段階
を含む、注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法に関する。
【００２７】
グリセロールは実際には、架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルの製造中に架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルに添加でき、即ち、段階ａ）におけるヒアルロン酸に基づくゲルの架橋前もしくは架橋中に、又はまさに段階ａ）の終わり：バイオポリマーの架橋後に添加できる。
【００２８】
この注入可能なヒドロゲルの製造方法中で、殺菌温度は１００℃よりも高い。
【００２９】
好ましくは、殺菌温度は１２１℃より高いか又は等しい温度で実施される。
【００３０】
特に、ヒドロゲルの製造方法中、殺菌は以下のサイクル：
１３１℃１分間／１３０℃３分間／１２５℃７分間／１２１℃２０分間又は１２１℃１０分間の１つに従って実施される。
【００３１】
このようにして得られたゲルは、１Ｈｚの周波数でＴａｎδが１．１０より低いか又は等しい、及び好ましくは０．０８より低いか又は等しいようなレオロジー特性を有する。
【００３２】
本発明の１つの目的はまた、シリンジ形態であり及び上記に記載のような注入可能なヒドロゲルであるキットに関する。
本発明の１つの目的はさらに、上記に記載の方法により製造された注入可能な殺菌されたヒドロゲルをシリンジに入れることを含む、キットの製造方法に関する。
また本発明の１つの目的は、上記に記載の方法により製造された注入可能な殺菌されたヒドロゲルをバイアル又はボトルに入れることを含む、キットの製造方法に関する。
【００３３】
キットの一態様によれば、これは本発明に従う注入可能なヒドロゲルを含有するバイアル又はボトルの形態であり得、及び注入用シリンジに採取するのに適しえる。
【００３４】
本発明はまた、哺乳類の皮膚の化学的、物理的及び機械的特性を改善するための、本発明に従う注入可能なヒドロゲル又は上記に記載のキットの使用に関する。
また本発明は、前記ヒドロゲルが哺乳動物の皮膚の化学的な、物理的な及び機械的な特性を改善するのに適したものである、上記に記載の注入可能な殺菌されたヒドロゲルの製造方法に関する。
さらに本発明は、前記キットが哺乳動物の皮膚の化学的な、物理的な及び機械的な特性を改善するのに適したものである、上記に記載のキットの製造方法に関する。
【００３５】
特に、本発明はまた、しわ及び線を埋めるため、及び／又はボリュームを与えるため、及び／又は皮膚に潤いを与えるため、及び／又は表皮細胞活性を再生させるため、及び／又は皮膚の硬度及び弾性の機械特性の維持のため、及び／又は表皮及び真皮の刺激を維持するため、及び／又は真皮の抗酸化活性を刺激するため、及び／又は皮膚の老化を防ぐため、及び／又は創傷治癒の処置を促進するため、前述の注入可能なヒドロゲル又は上記記載のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
この添付図に関して本発明を実施する実施例の下記記載を読むことで、本発明がよりよく理解され、並びに他の目的、詳細、特徴及びその利点が明確になるだろう。
【図１】図１は数週間かけて、２つのゲル：（湿式加熱で殺菌なされていないゲル）ゲルＡ及び（本発明に従う）ゲルＢから表皮の表面層におけるグリセロールの濃度の％変化を表すカーブを示し、
【図２】同様に図２は、数週間かけて２つのゲル：（本発明に従う）ゲルＢ及び（非架橋のヒアルロン酸に基づくゲル）ゲルＣから表皮の表面層のグリセロールの濃度の％変化を表すカーブを示す。
【実施例】
【００３７】
本発明の実施例：
本発明を説明するためにヒロドゲルの製造例が示されるが、これは本発明の範囲を決して制限しない。
【００３８】
ヒアルロン酸ナトリウム（分子量２．２×１０6Ｄａ）３．５ｇを１％の水酸化ナトリ
ウム溶液２５ｍＬに添加した。この混合物を１時間静置し、その後１０分間スパチュラで混合した。それから架橋反応をブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）２６３μＬを添加することによって開始させ、そしてそれを１０分間スパチュラーを用いて攪拌した。この反応混合物を２時間、５０度の水浴中に置いた。この混合物を１Ｍの塩酸を用いて生理的ｐＨに調製した。体積をｐＨ７に緩衝された溶液で１１６ｍＬに調製した。
【００３９】
その次に、このようにして得られたゲルを、残りの架橋剤を取り除くために、ｐＨ７に緩衝された溶液に対して２４時間透析した（再生セルロース、分画限界：分子量６０ｋＤａ）。
【００４０】
グリセロール１．７質量％を架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルに添加し、次いでこの混合物をスパチュラを使用して１５分間、均質化した。
【００４１】
次いで、このゲルを１ｍＬのガラスシリンジの中にいれた。
【００４２】
ヒアルロン酸ナトリウムの全濃度は２．１質量％と測定された。
【００４３】
グリセロールの全濃度は１．６８質量％と測定された。
【００４４】
ゲルのｐＨは７．０２と測定され、及びそのオスモル濃度は３０８ｍＯｓｍ／ｋｇであった。
【００４５】
初期の生物学的汚染の測定値は１０ＣＦＵ／ｇより少なかった。
【００４６】
得られたシリンジの半分はヒロドゲルＡを構成する。
【００４７】
得られたシリンジの他の半分は以下のサイクル（１３１℃、１分）の湿式加熱で殺菌した。これらシリンジは本発明に従うヒロドゲルＢを構成する。
【００４８】
ヒドロゲルのレオロジー特性は、４０ｍｍのフラットジオメトリー、１０００ミクロンの空隙及び２５度の分析温度を備えた型番ＡＲ１０００レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を使用して調査した。
【００４９】
ヒドロゲルＡに関して、粘弾性パラメーターＴａｎδの測定値（１Ｈｚで）は０．５１に等しい。
【００５０】
ヒドロゲルＢに関して、粘弾性パラメーターＴａｎδの測定値（１Ｈｚ時）は０．６７に等しい。
【００５１】
上記例からのヒロドゲルＡ及び（本発明に従う）ヒドロゲルＢ間の比較試験１
ラビット生体内試験：
ヒロドゲルＡ０．２ｍＬの目盛り付きの皮内注射４本及び（本発明に従うヒドロゲル）ヒロドゲルＢ０．２ｍＬの目盛り付きの皮内注射４本を全く同一のラビットに注射した。
【００５２】
ｔ＝０では、“丘疹”の存在が各々の注入部位で見出され、注入部位でゲルの存在が証明された。各々の丘疹の直径はキャリパーゲージを用いて測定され、それから１つの丘疹の初期平均面積をヒドロゲルＡ及びヒドロゲルＢについて計算した。
【００５３】
ｔ＝３ヶ月では、注射された２種類のヒロドゲルについて、これら丘疹の全ての存在が見えた（丘疹はヒドロゲルＡの４つの丘疹又はヒドロゲルＢの４つの丘疹の初期平均面積の１／２より大きい平均面積を有していた）。
【００５４】
ｔ＝６ヶ月では、本発明に従うヒドロゲルＢを用いて形成された丘疹がまだ存在することが見出されたが（丘疹はヒドロゲルＢの４つの丘疹の初期平均面積の１／２より大きい平均面積を有していた）、ヒドロゲルＡを用いて得られた丘疹は今はかろうじて見えることがわかった（丘疹はヒドロゲルＡの４つの丘疹の初期平均面積の１／２よりも小さい平均面積を有していた）。
【００５５】
それ故、本発明に従うヒドロゲルＢはヒドロゲルＡの面積よりも著しく優れた残留性を有していた。
【００５６】
加えて、得られた各々の丘疹で、ラビットの表皮の表面層のグリセロール濃度を最大１
０週間わたって週に一度測定した。測定されたグリセロール濃度の平均値を調査された各々のゲルに関して及び調査された各々の時間に関して計算した。ヒドロゲルＡに関して及びヒドロゲルＢに関して、時間をかけて測定されたグリセロール濃度の変化を対比した（図１参照）。
【００５７】
皮膚のグリセロール放出のより高速なキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は本発明に従うヒドロゲルＢに関してよりもヒドロゲルＡに関して見出された。
【００５８】
上記例からの（本発明に従う）ヒドロゲルＢ及び湿式加熱で殺菌された、非架橋のヒアルロン酸及びグリセロールに基づくヒドロゲル（下記に記載のヒドロゲルＣ）間の比較試験２
ゲルを、ｐＨ＝７で緩衝された溶液中にグリセロール１．７質量％及び架橋されていないヒアルロン酸（分子量２．２×１０6Ｄａ）２．１質量％で構成した。１ｍＬガラスシ
リンジに充填した後、ゲルを以下のサイクル（１３１℃、１分）の湿式加熱で殺菌した。これらシリンジはヒロドゲルＣを構成する。
【００５９】
ヒドロゲルＣのレオロジー特性は４０mmのフラットジオメトリー、１００ミクロンの空隙及び２５度の分析温度を備えた型番ＡＲ１０００レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社製）を使用して調査した。
【００６０】
ヒドロゲルＣに関して粘弾性パラメーターＴａｎδの測定値（１Ｈｚでの）は０．６４に等しかった。
【００６１】
ラビット生体内試験：
ヒロドゲルＣ０．２ｍＬの目盛り付き注射４本を前試験に関して、同じラビットに実施した。
【００６２】
ｔ＝０で、“丘疹”の存在は各々の注入部位で見出され、注入部位でゲルの存在が証明された。各々の丘疹の直径をキャリパーゲージを用いて測定し、その後ヒドロゲルＣに関し１つの丘疹の初期平均面積を計算した。
【００６３】
ｔ＝１週間で、ヒドロゲルＣを用いて得られた丘疹は今はかろうじて見えことがわかった（丘疹は、ヒドロゲルＣの４つの丘疹の初期平均面積の１／２より小さい平均面積を有していた）。
【００６４】
ｔ＝２週間で、ヒドロゲルＣを用いて得られた丘疹の全てはもはや見えないことがわかった。
【００６５】
それ故、本発明に従うヒドロゲルＢはヒドロゲルＣよりかなり優れた残留性を有する。
【００６６】
加えて、得られた各々の丘疹で、ラビットの表皮の表面層のグリセロール濃度を１、２、３及び４週間後に測定した。測定されたグリセロール濃度の平均値を調査した各々の時間に関して計算した。ヒドロゲルＣに関して及びヒドロゲルＢに関して時間をかけて測定されたグリセロールの濃度変化を比較した（図２参照）。
【００６７】
皮膚のグリセロール放出のキネティクスは、本発明に従うヒドロゲルＢよりもヒドロゲルＣの方が非常に速くなることが見出された。
【００６８】
従って、本発明に従う製剤において、湿式加熱で殺菌した後の、架橋されたヒアルロン酸及びグリセロール間に実質的な相乗効果が見出された。本発明に従う製剤におけるグリ
セロールの存在はその残留性、即ち注入部分でのゲルの残存時間、を著しく増加させ、及びその結果として、それは長い時間をかけた皮膚中のグリセロールの放出を増加させることを可能にする。
【００６９】
それ故に、湿式加熱で殺菌を受け、及び１Ｈｚの周波数でＴａｎδが１．１０よりも低いか又は等しい粘弾性特性を有している、グリセロール及び共有結合を形成することによって架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルは、皮膚中のグリセロールの徐々に、長期間にわたる放出を可能にする。グリセロール及び架橋されたヒアルロン酸は、それらが本発明に従って組み合わされた場合、相乗効果を奏する。このことは、本発明の条件における湿式加熱の殺菌は、グリセロールの及び／又は架橋されたヒアルロン酸の熱活性化が可能になり、それはより優れた架橋されたＨＡ−グリセロール親和力を可能にし、及びその結果として（湿式加熱で殺菌されていないゲルと比較して）皮膚におけるグリセロールの長期間にわたる放出が可能になるという事実によって説明できる。
【００７０】
本発明に関して：
−湿式加熱で殺菌された、グリセロールと（非架橋の）ヒアルロン酸に基づくゲル（従来技術に記載されているゲルの種類）は皮膚におけるグリセロールの長期にわたる放出を確保できないこと
−実際、その放出の持続期間は約１週間より短い、
−湿式加熱で殺菌されていない、グリセロールと共有結合性の架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルは本発明に従う製剤と同等の結果を与えることはできないこと（皮膚中のグリセロール放出持続期間は著しく短い）、
−１Ｈｚの周波数で１．１０よりも大きいＴａｎδのようなレオロジー特性を有している、グリセロールと共有結合性の架橋されたヒアルロン酸に基づくゲルは、本発明に従う製剤と同等の結果を得るには、適した粘弾性特性及び／又は充分な残存性を有しない。実際に、皮膚中のグリセロール放出の持続期間は著しく短いこと、
を明確にして、指摘することは重要である。
【００７１】
これら要因は当業者によって推測できないことを指摘することもまた重要である。
【００７２】
実際、ヒアルロン酸に基づくゲルを架橋することは、皮膚中の該ゲルの残存性を増加させることを、当業者は知っている。しかしながら、ゲルにおけるグリセロールの低い分子量（分子量＝９２ｇ／ｍｏｌ）及びヒアルロン酸の低い濃度（５質量％よりも低い濃度）を踏まえれば、当業者は、グリセロール分子はゲル中を容易に移動すること（ゲル中でグリセロールを補足するのに不十分な、ヒアルロン酸によって誘導されたゲルの立体障害）、及びその結果として皮膚中でグリセロールは素早く放出されることを容易に推測するであろう。また、ヒアルロン酸の鎖の架橋はゲル内部の立体障害の大きな増加をもたらさないので、ヒアルロン酸の架橋は、非架橋のヒアルロン酸に基づくゲルと比較して、皮膚中のグリセロール放出のキネティクスにはほとんど変化をもたらさないことも、当業者は容易に推測するであろう。
【００７３】
言い換えれば、［グリセロール＋共有結合の形成によって架橋されたヒアルロン酸＋湿式加熱の殺菌＋特定の粘弾性特性］の組合せが長期にわたって、徐々に皮膚にグリセロールを放出していくことを可能にするとは、当業者は予測できない。
【００７４】
本発明を特定の態様に関して説明したが、決してこれに制限されないこと、及び、本発明の範囲内であれば、これら組合せと同様に記載された手段についての全ての等しい技術を含むことはきわめて明らかである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００７５】
【非特許文献１】British Journal of Dermatology, 159(1):23-34, July 2008, Fluhr, J. W.; Darlenski, R.*; Surber.
【非特許文献２】PNAS, 100(12):7360-7365, June 2003, Hara, M.W.; Verkman, A.S.
【非特許文献３】Journal d'Investigation Dermatologique, 125: 288-293, 2005, Choi, H.C
【非特許文献４】Wenner-Gren International series; The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives, Laurent, T.C.
【図１】
0005904936.tif 000002
【図２】
0005904936.tif 000003