(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁性金属ナノ粒子の水性懸濁液がアルコキシシランとインキュベーションされる、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物の懸濁液を製造する方法であって、インキュベーションが、実質的に有機溶媒の不在下において行われることを特徴とし、ここで、アルコキシシランはトリアルコキシシランであり、かつ0.9molの金属あたり0.3〜0.6×10-3molのトリアルコキシシランが加えられる、方法。
【請求項２】
金属ナノ粒子が、鉄、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
鉄塩が、酸化鉄である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
酸化鉄が、磁鉄鉱および/または磁赤鉄鉱である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液が、
a)塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の混合物を含有する溶液を水酸化ナトリウムによって沈殿させることによって提供されるか、または
b)鉄塩または鉄錯体化合物の熱分解によって提供される、
請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
磁性金属ナノ粒子が、インキュベーションの前にH2O2で処理される、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
トリアルコキシシランが、3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシラン、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、トリメトキシシリルプロピル-ジエチレントリアミン、およびN-(6-アミノヘキシル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
トリアルコキシシランが、3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシランである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
0.9molの金属あたり、0.4〜0.5×10-3molのトリアルコキシシランが加えられる、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
0.9molの金属あたり、0.43〜0.45×10-3molのトリアルコキシシランが加えられる、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
インキュベーションがpH2〜6において実施される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
金属磁性ナノ粒子が、アルコキシシランとのインキュベーションの前に崩壊される、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アルコキシシランとのインキュベーションを開始した後に磁性ナノ粒子を崩壊させる工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
コーティングの不完全なナノ粒子を除去する工程をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
光散乱法によって決定された、30〜450nmの平均サイズが達成されるまで凝集物を崩壊させる、請求項12〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
光散乱法によって決定された、70〜300nmの平均サイズが達成されるまで凝集物を崩壊させる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
凝集物の懸濁液が、その金属含有量によって決定された、少なくとも約2Mの濃度へと濃縮される、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
凝集物の懸濁液が、その金属含有量によって決定された、少なくとも約6Mの濃度へと濃縮される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物を含む組成物であって、該凝集物が、光散乱法によって決定された、30〜450nmの平均サイズを有し、かつ該金属ナノ粒子のζ電位が、pH5.2および2.0mS/cmの導電率において25〜80mVである、組成物。
【請求項２０】
凝集物が、光散乱法によって決定された、50〜350nmの平均サイズを有する、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
凝集物が、光散乱法によって決定された、70〜300nmの平均サイズを有する、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
実質的に有機溶媒を含有しない、請求項19〜21のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
金属ナノ粒子が、電子顕微鏡法によって決定された、5〜25nmのサイズの金属コアを有する、請求項19〜22のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
金属ナノ粒子が、電子顕微鏡法によって決定された、7〜20nmのサイズの金属コアを有する、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
金属ナノ粒子がさらに、請求項2〜4のいずれか一項において定義される通りに特徴付けされる、請求項19〜24のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
金属ナノ粒子のζ電位が、pH5.2および2.0mS/cmの導電率において、35〜70mVである、請求項19〜25のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７】
金属ナノ粒子のζ電位が、pH5.2および2.0mS/cmの導電率において、45〜60mVである、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
凝集物が、水性の生理学的に許容される緩衝液中に懸濁されている、請求項19〜27のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
ナノ粒子が、金属含有量によって決定された、少なくとも約2Mの濃度を有する、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
ナノ粒子が、金属含有量によって決定された、少なくとも約6Mの濃度を有する、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
回転式レオメトリーによって決定された、100/sのせん断速度での懸濁液の粘度が、0.005Pa s以上である、請求項19〜30のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
回転式レオメトリーによって決定された、100/sのせん断速度での懸濁液の粘度が、0.01Pa s以上である、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
回転式レオメトリーによって決定された、100/sのせん断速度での懸濁液の粘度が、0.1Pa s以上である、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
3.5kA/mの磁界強度および100kHzの周波数において決定された、懸濁液中のナノ粒子の比吸収率(SAR)が、金属の2W/g以上である、請求項19〜33のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３５】
3.5kA/mの磁界強度および100kHzの周波数において決定された、懸濁液中のナノ粒子の比吸収率(SAR)が、金属の4〜12W/gである、請求項34記載の組成物。
【請求項３６】
同質遺伝子的(isogen)腫瘍モデル中への懸濁液の注入において、注入後の7日目またはそれ以降において、適用された金属の少なくとも90％が、注入された腫瘍内に留まる、請求項19〜35のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
適用された金属の少なくとも93％が、注入された腫瘍内に留まる、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
適用された金属の少なくとも98％が、注入された腫瘍内に留まる、請求項37記載の組成物。
【請求項３９】
請求項19〜38のいずれか一項記載の組成物を含む医療装置。
【請求項４０】
請求項19〜38のいずれか一項記載の組成物を含む医用薬品。
【請求項４１】
患者における、増殖性疾患、癌、腫瘍、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染を処置または予防する方法における使用のための、請求項19〜38のいずれか一項記載の組成物。
【請求項４２】
前記方法が、患者を交流磁界に曝露させる工程をさらに含む、請求項41記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体などの、充実性腫瘍の腫瘍治療における最近の進歩にもかかわらず、より有効で費用対効果に優れた治療選択肢が、依然として必要とされている。
【０００２】
温熱療法、より詳細には、高熱療法は、化学療法または放射線治療と比べ、癌の治療にとっての魅力的なアプローチであり、その物理的作用様式から、様々な腫瘍性疾患に対して、より少ない副作用が期待される。しかしながら、現在利用可能なモダリティは、依然として最適には及ばず(Morozら、2002年)、改良が必要である。
【０００３】
温熱療法の好ましいモダリティの1つは、磁性ナノ粒子を腫瘍中に直接導入する方法である。続いて、該ナノ粒子は、交流磁界内において加熱される。治療の所要時間および達成される腫瘍内温度に応じて、腫瘍細胞は、直接破壊されるか(熱焼灼法)、または同時に行われる化学療法または放射線療法(高熱療法)に対して影響を受けやすくなる。この新しい手法により、腫瘍を内側から攻撃することが可能となり、その結果、周囲の健康な組織を傷つけないで済む。この治療モダリティは、膠芽細胞腫の治療において有望な治療効果を示している(Maier-Hauffら 2011)。
【０００４】
最初の臨床試験からの好ましい結果にもかかわらず、依然として、治療の有効性の向上および/または潜在的副作用もしくは制限の低減に対しての余地がある。未解決の問題の1つは、ナノ粒子の点滴注入の間、標的エリアの外側の磁性ナノ粒子の沈着が、周囲の組織において生じることである。そのような外部貯留物は、交流磁界での加熱の際に、標的エリアの外側において温度上昇を引き起こすため、望ましくない副作用の原因となるか、あるいは、周囲組織のそのような加熱が避けられるのであればナノ粒子の貯留物を加熱するために使用される適切な磁界強度を制限する。この問題は、注入された腫瘍組織内の高い圧力に起因し得、これにより、注入の間もしくは注入直後に、沈着したナノ粒子の流出が生じる。さらに、高い比吸収率(SAR)を有するためにナノスケールの粒子が必要とされる一方で、そのようなナノ粒子は、間質腔内を容易に移動することができるため、結果として、標的組織から失われ得る。さらに、今までクリニックにおいて使用されていたナノ粒子/磁性流体における最適には及ばない比吸収率(SAR)により、(最初にナノ粒子を沈着させ、続いてそれを交流磁界によって励磁させることによって)腫瘍内に「沈着させる」ことができる熱量が、制限される。
【０００５】
さらに、そのようなナノ粒子は、大規模で妥当な費用において、制御された様式で製造される必要があり、ならびに、市場品とするためには、安定な製剤に製剤化できることが必要である。
【０００６】
GuptaおよびGupta(2005)によって概説されるように、先行技術には、そのようなナノ粒子のいくつかの方法および使用が記載されている。
【０００７】
Lesniakら(1997)は、凝集物を含有しないナノ粒子の調製のためのプロセスについて記載している。該プロセスは、(i)部分的に凝集物を形成する酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液を調製する工程、(ii)トリアルコキシシランおよび水混和性の極性有機溶媒、例えばエチレングリコールなど、を加える工程、(iii)結果として得られる懸濁液を超音波で処理して凝集物を減少させる工程、(iv)超音波の作用下において蒸留により水を除去する工程；ならびに(v)残存する凝集物を除去する工程、を含む。該プロセスにより、結果として、アルコキシシランをベースとする加水分解抵抗性コーティングを備える凝集物不含のナノ粒子が得られる。しかしながら、これらのナノ粒子は、充実性腫瘍に対して局所的に適用される場合、おそらく、それらの凝集物不含の特性に起因して、注入部位に一部しか留まらない。これらのナノ粒子は、身体に幅広く分配され、その結果、標的エリア内に留まるナノ粒子の量も制限され、ならびに周囲組織または身体の他の場所におけるナノ粒子の蓄積による副作用のリスクが増加する。その上、使用されるエチレングリコールは、アルコキシシランコーティングのアミノ基との相互作用およびその高い沸点(197℃)から、取り除くのが非常に困難である。したがって、最終製造物中におけるエチレングリコールの存在は、安全性および規制状況の面から、該ナノ粒子の適用性を制限する。
【０００８】
Ruefenachtら(2006年)は、液体担体中の発熱性ナノ粒子の、注入可能なポリマーベースの製剤について開示しており、これは、体液または組織との接触において、インサイチューでインプラントを形成することができる。この製剤は、腫瘍からのナノ粒子の流出の問題を解決しそうではあるが、その一方で、系は、好ましくは、溶媒、例えば、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)またはジメチルスルホキシド(DMSO)など、を使用する。両溶媒は、一般的に、その毒性は低いと見なされており、しばしば、薬物の経口および経皮製剤に使用される。しかしながら、組織または腫瘍への、とりわけ脳腫瘍の場合の脳への該溶媒の注入についてはほとんど分かっていない。したがって、そのような溶媒は避けるべきである。さらに、そのような製剤は、注入の際に、定義されたインプラントを形成し、その一方で、本発明との関連においては、腫瘍/組織内において、注入されたナノ粒子のある特定の分布を達成することが想定されるが、ただし、これは、腫瘍/組織に限局される。このシステムの別の欠点は、これら注入可能なポリマーベースの製剤が腫瘍中に注入された場合に、腫瘍内での体積増加が予想されることであり、これは、ある特定の腫瘍症状、とりわけ脳腫瘍においては頭蓋骨内の空間が限られているため、問題の原因となり得る。同時に、そのようなポリマーベースの製剤は、手術不可能な腫瘍の治療には適していない。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、改善された生体適合性磁性ナノ粒子を提供することである。特に、本発明の目的は、腫瘍の処置のための、改善された生体適合性磁性ナノ粒子を提供することである。
【００１０】
実施例に示されているように、本発明者は、驚くべきことに、有機溶媒不在下での酸化鉄ナノ粒子の制御されたアミノシラン化により、表面アミノシランの不完全な縮合を伴う磁性ナノ粒子が生じ、これにより、結果として、高濃縮することができる磁性ナノ粒子の安定な水性製剤(磁性流体)が得られることを見出した。組織または腫瘍への注入において、これらの磁性流体は、標的組織内での高い保持率を有する好ましい貯留物を形成する。したがって、本発明者は、改良された製造方法、改良されたナノ粒子、ならびに、改良された生体適合性を有する好適な懸濁液および組成物(磁性流体)、標的エリア内での改良された貯留物形成、ならびに有機溶媒の不在および/または処置領域からの沈着されたナノ粒子の流出減少に起因する少ない副作用、を提供する。
【００１１】
その結果、本発明は、高い比吸収率(SAR)を有する生体適合性磁性ナノ粒子であって、日常的なルーチンで腫瘍組織中に注入することができ、例えば腫瘍など、意図される処置エリア内の注入部位およびその付近に留まり、実質的に周囲組織に広がらない磁性ナノ粒子を提供する。さらに、本発明は、そのような生体適合性の磁性ナノ粒子のための、頑強で費用効率の高い製造方法を提供する。
[本発明1001]
磁性金属ナノ粒子の水性懸濁液がアルコキシシランとインキュベーションされる、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物の懸濁液を製造する方法であって、インキュベーションが、実質的に有機溶媒の不在下において行われることを特徴とする、方法。
[本発明1002]
金属ナノ粒子が、鉄、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩、好ましくは鉄塩を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
鉄塩が、酸化鉄、好ましくは、磁鉄鉱および/または磁赤鉄鉱である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液が、
a)塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の混合物を含有する溶液を水酸化ナトリウムによって沈殿させることによって提供されるか、または
b)鉄塩または鉄錯体化合物の熱分解によって提供される、
本発明1003の方法。
[本発明1005]
磁性金属ナノ粒子が、インキュベーションの前にH2O2で処理される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
アルコキシシランが、好ましくは3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシラン、3-アミノプロピルトリエトキシシラン、トリメトキシシリルプロピル-ジエチレントリアミン、およびN-(6-アミノヘキシル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランからなる群より選択されるトリアルコキシシランであり、とりわけ3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシランである、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
0.9molの金属あたり0.3〜0.6×10-3mol、好ましくは0.4〜0.5×10-3mol、とりわけ0.43〜0.45×10-3molのトリアルコキシシランが加えられる、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
インキュベーションがpH2〜6において実施される、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
金属磁性ナノ粒子が、アルコキシシランとのインキュベーションの前に崩壊される、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
アルコキシシランとのインキュベーションを開始した後に磁性ナノ粒子を崩壊させる工程をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
コーティングの不完全なナノ粒子を除去する工程をさらに含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
光散乱法によって決定された、30〜450nm、好ましくは50〜350nm、とりわけ70〜300nmの平均サイズが達成されるまで凝集物を崩壊させる、本発明1009〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
凝集物の懸濁液が、その金属含有量によって決定された、少なくとも約2M、好ましくは少なくとも約3M、より好ましくは少なくとも約4M、さらにより好ましくは少なくとも約5M、とりわけ少なくとも約6Mの濃度へと濃縮される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
本発明1001〜1013のいずれかの方法によって得ることができる、アルコキシシランでコーティングされた金属含有磁性ナノ粒子の凝集物の懸濁液。
[本発明1015]
アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物を含む組成物であって、該凝集物が、光散乱法によって決定された、30〜450nm、好ましくは50〜350nm、とりわけ70〜300nmの平均サイズを有する、組成物。
[本発明1016]
実質的に有機溶媒を含有しない、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
金属ナノ粒子が、電子顕微鏡法によって決定された、5〜25nm、好ましくは7〜20nm、とりわけ9〜15nmのサイズの金属コアを有する、本発明1015または1016の組成物。
[本発明1018]
金属ナノ粒子がさらに、本発明1002〜1004のいずれか一項において定義される通りに特徴付けされる、本発明1015〜1017のいずれかの組成物。
[本発明1019]
金属ナノ粒子のζ電位が、pH5.2および2.0mS/cmの導電率において、25〜80mV、好ましくは35〜70mV、とりわけ45〜60mVである、本発明1015〜1018のいずれかの組成物。
[本発明1020]
凝集物が、水性の生理学的に許容される緩衝液中に懸濁されている、本発明1015〜1019のいずれかの組成物。
[本発明1021]
ナノ粒子が、金属含有量によって決定された、少なくとも約2M、好ましくは少なくとも約3M、より好ましくは少なくとも約4M、より好ましくは少なくとも約5M、とりわけ少なくとも約6Mの濃度を有する、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
回転式レオメトリーによって決定された、100/sのせん断速度での懸濁液の粘度が、0.005Pa s以上、好ましくは0.01Pa s以上、より好ましくは0.1Pa s以上、とりわけ1Pa s以上である、本発明1020または1021の組成物。
[本発明1023]
3.5kA/mの磁界強度および100kHzの周波数において決定された、懸濁液中のナノ粒子の比吸収率(SAR)が、2W/g金属以上、好ましくは3W/g金属以上、とりわけ4〜12W/g金属以上である、本発明1020〜1022のいずれかの組成物。
[本発明1024]
同質遺伝子(isogen)腫瘍モデル中への懸濁液の注入において、注入後の7日目またはそれ以降において、適用された金属の少なくとも90％、好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも95％、とりわけ少なくとも98％が、注入された腫瘍内に留まる、本発明1020〜1023のいずれかの組成物。
[本発明1025]
本発明1001〜1012のいずれかの方法によって得ることができる、本発明1020〜1024のいずれかの組成物。
[本発明1026]
本発明1014の懸濁液または本発明1015〜1025のいずれかの組成物を含む医療装置。
[本発明1027]
本発明1014の懸濁液または本発明1015〜1025のいずれかの組成物を含む医用薬品。
[本発明1028]
患者における、増殖性疾患、癌、腫瘍、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染を処置または予防する方法における使用のための、本発明1014の懸濁液または本発明1015〜1025のいずれかの組成物。
[本発明1029]
ヒトまたは動物患者に、本発明1014の懸濁液または本発明1015〜1025のいずれかの組成物を投与する工程を含む、増殖性疾患、癌、腫瘍、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染を処置または予防する方法。
[本発明1030]
前記方法が、患者を交流磁界に曝露させる工程をさらに含む、本発明1028の使用のための懸濁液もしくは組成物、または本発明1029の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
「比吸収率」(SAR)は、交流磁界に曝露された際にナノ粒子によってエネルギーが吸収される割合の尺度である。これは、磁界強度および磁界の極性の交代の頻度に依存する。SARは、好ましくは、Jordanら(1993)によって開発された方法により、100kHzの周波数および18kA/mまでの、好ましくは3.5kA/mの磁界強度において決定され、ならびに使用される金属、例えば鉄、の質量を参照している(単位W/g金属)。
【００１３】
「ζ電位」は、pH5.2および2.0mS/cmの導電率(どちらも25℃で測定)において、Malvern ZetaSizer 3000 HSAなどの機器で測定された、水性環境中でのコロイド状ナノ粒子の測定電位を意味する。ζ電位は、バルク溶液と流体力学的せん断領域もしくは拡散層との間の境界での電位を記述するものである。
【００１４】
本発明との関連において、用語「約」は、所定の数または値からの±10％、好ましくは±5％、とりわけ±1％の偏位を意味する。
【００１５】
用語「磁性」は、磁性、常磁性、強磁性、反強磁性体、フェリ磁性、反フェリ磁性、および超常磁性を包含する。好ましくは、本発明によるナノ粒子は、常磁性、より好ましくは強磁性、フェリ磁性、反フェリ磁性、または超常磁性である。
【００１６】
特に好ましい態様において、ナノ粒子は超常磁性である。
【００１７】
用語「ナノ粒子」は、ナノメートル範囲のナノ粒子を意味するものであり、電子顕微鏡法によって決定され得るような、その金属コアに関して1〜100nmのナノ粒子を意味する。好ましくは、ナノ粒子は、5〜25nm、より好ましくは7〜20nm、とりわけ9〜15nmのサイズを有する。
【００１８】
「金属ナノ粒子」は、磁性ナノ粒子を意味し、これは、金属または金属イオンを含有する。
【００１９】
「有機溶媒」は、固体、気体、または液体を溶解することのできる液体有機化合物、すなわち炭化水素、を意味するものである。本発明による有機溶媒の例としては、これらに限定されるわけではないが、エチレングリコール、アセトン、トルオール、および同等物が挙げられる。
【００２０】
用語「アルコキシシランコーティング」は、「アミノシランコーティング」とも呼ばれるプロセスである、アルコキシシランの重縮合から結果として得られるコーティングを意味する。用語「重縮合」は、本明細書において使用される場合、概して、ポリマーの形成をもたらす、2つの官能基を有するモノマーの任意の縮合反応を意味する。
【００２１】
第一の局面において、本発明は、磁性金属ナノ粒子の水性懸濁液がアルコキシシランとインキュベーションされる、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物の懸濁液を製造する方法であって、インキュベーションが、実質的に有機溶媒の不在下において行われることを特徴とする方法に関する。
【００２２】
本発明との関連において、用語「インキュベーションする」または「インキュベーション」は、アルコキシシランの重縮合を可能にし、それによりナノ粒子のアミノシランコーティングを可能にする、任意の実験構成、実験条件、または反応混合物を意味する。
【００２３】
実施例に示されているように、本発明に関連して、腫瘍および他の疾患の処置のために、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物は、標的エリア内に、より良好に沈着を形成することができ、かつ凝集物を形成しないアルコキシシランでコーティングされた金属ナノ粒子よりも、血液循環中へ消失したりまたは標的領域の外側に沈着を形成したりするナノ粒子がより少ないことが見出された。「凝集化」とは、この文脈において、いくつかの個々のナノ粒子が、ナノ粒子の凝集物またはクラスターを形成することを意味する。「凝集物」は、凝集したナノ粒子またはナノ粒子のクラスターを意味する。
【００２４】
本発明の不可欠の工程は、実質的に有機溶媒の不在下での、アルコキシシランとのインキュベーション/反応である。有機溶媒との関連における「実質的に不在下において」とは、少量の有機溶媒が存在し得ることを意味し、好ましくは、有機溶媒の量は、10体積％より少なく、より好ましくは5体積％より少なく、より好ましくは1体積％より少なく、とりわけ0.5体積％より少ない。例えば、少量のメタノールが反応の際に生成され得、その結果、生成物中にある程度残る場合がある。好ましい態様において、コーティングは有機溶媒の不在下において実施され、とりわけ、コーティングは、添加された有機溶媒の不在下において実施される。コーティング反応にとって好ましい溶媒は水である。いかなる科学理論にも束縛されるものではないが、本発明者は、これらの反応条件が、定義された、しかしながら不完全なアルコキシシランの縮合反応を引き起こし、これがナノ粒子の凝集特性をもたらすと考えている。
【００２５】
本発明の方法は、好ましくは、エチレングリコールの不在下において実施される。エチレングリコールは、本発明のコーティング反応を妨げる。さらに、通常、比較的多量のエチレングリコールがナノ粒子のコーティングに付着したまま残り、ならびに197℃とその高い沸点のために、エチレングリコールをナノ粒子調製物から完全に除去することは、不可能でなくても、少なくとも非常に困難である。このことは、Lesniakら(1997、上記)に従って調製された調製物にも当てはまる。ヨーロッパ薬局方によれば、最終医療製品において容認されるエチレングリコールは600ppmのみであり、これが、より多量のエチレングリコールを含むナノ粒子調製物の商業的臨床利用を不可能にしている。
【００２６】
一態様において、金属ナノ粒子は、鉄、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩を含むが、鉄塩が好ましい。鉄を含むナノ粒子は、他の磁性金属、例えば、コバルトまたはニッケルなど、と比べて毒性が低いことから好ましい。好ましい態様において、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩は、毒性を避けるために、実質的に他の金属および他の不純物を含有しない。化学物質が痕跡量の不純物を含有し得ることは、当技術分野において周知である。したがって、「実質的に含有しない」とは、この文脈において、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩内に、他の不純物が1重量％未満、好ましくは0.1重量％未満しか含まれないことを意味している。とりわけ好ましいのは、他の不純物を実質的に含有しない鉄塩である。
【００２７】
とりわけ好ましい態様において、鉄塩は、酸化鉄であり、好ましくは、磁鉄鉱および/または磁赤鉄鉱である。酸化鉄で作成されたそのような鉄ナノ粒子は、塩化鉄(III)および塩化鉄(II)を含有する溶液を水酸化ナトリウムによって沈殿させることによって製造することができる。本発明による「鉄ナノ粒子」は、Fe原子またはFeイオンを含有するナノ粒子である。
【００２８】
したがって、好ましい態様において、酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液は、塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の混合物を含有する溶液を水酸化ナトリウムによって沈殿させることによって提供される。
【００２９】
ここで、塩化鉄(III)と塩化鉄(II)との間の比率は、好ましくは約2：1である。
【００３０】
本発明との関連において、用語「鉄ナノ粒子」および「酸化鉄ナノ粒子」は、同等に使用される。
【００３１】
好適な沈殿反応および条件は、Massart(1981)によって説明されており、ならびにMohapatraおよびAnand(2010)によって概説されている。沈殿反応にとって好ましい条件は、(i)塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の比率が約2：1であり；(ii)塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の溶液を、約2.13Mの濃度の水酸化ナトリウム溶液中に注ぐ工程；(iii)約25℃の沈殿温度；および(iv)約52分の沈殿反応時間、である。任意に(その代わりに逆に)水酸化ナトリウム溶液を、約15℃で約39分間において塩化鉄溶液中に注いでもよい。溶液中の鉄塩を沈殿させることによって、コーティングされた酸化鉄ナノ粒子を製造する方法は、例えば、実施例1.1に例示されている。
【００３２】
あるいは、酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液は、鉄塩または鉄錯体化合物の熱分解によって提供することができる。用語「鉄錯体化合物」は、本明細書において使用される場合、概して、鉄を含有する任意の錯体、好ましくは錯体化された鉄を含む任意の化合物を意味する。好適な方法は、WaldoefherおよびStief(2011)によって説明されている。簡潔に言えば、鉄含有化合物および有機溶媒を、10分間、50℃と反応温度より50℃低いとの間の温度に維持する。次に、溶液を200〜400℃に加熱し、ナノ粒子を得る。ナノ粒子を、酸素、過酸化物、または第三級アミン酸化物によって酸化し、ならびに硝酸および硝酸鉄で処理し、その結果として磁赤鉄鉱ナノ粒子が得られる。熱分解による酸化鉄ナノ粒子の調製のための別の好適な方法は、Guardiaら(Guardiaら  2010 a；Guardiaら  2010 b；Guardiaら  2012)によって説明されている。簡潔に言えば、鉄(III)アセチルアセトナートを、ジベンジルエーテル中におけるデカン酸と混合する。該溶液を200℃で一定に加熱する。200℃で2時間後、該溶液を還流するまで加熱し、この温度を1時間維持し、最後に室温まで冷却し、洗浄して、遠心分離法により収集する。両方法は、結果として得られるナノ粒子のSARが高いことにより、好ましい。本発明による、熱分解により酸化鉄ナノ粒子を製造する方法は、例えば、実施例1.2に記載されている。
【００３３】
したがって、代替の好ましい態様において、酸化鉄ナノ粒子の水性懸濁液は、鉄塩または鉄錯体化合物の熱分解によって提供される。本発明の方法に適用できる鉄塩および鉄錯体化合物は、当業者に周知であり、以下に限定されるわけではないが、塩化鉄(III)、塩化鉄(II)、鉄(III)アセチルアセトナート、鉄カルボニル、および同等物が挙げられる。
【００３４】
好ましい態様において、金属ナノ粒子は、アルコキシシランとのインキュベーション/反応の前に、H2O2で処理される。この任意の工程では、定義された条件下において鉄がFe2O3(磁赤鉄鉱)へと完全に酸化され、結果として、続く反応工程を保護ガス(例えば、アルゴン)の不在下において実施することができるので、好ましい。H2O2不在の別の方法では、反応条件を制御するために、アルゴンなどの保護ガス下で作業するのが好ましい。
【００３５】
アルコキシシランは、好ましくはトリアルコキシシランである。これは、好ましくは、3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシラン(DIAMO)、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)、トリメトキシシリルプロピル-ジエチレントリアミン(TRIAMO)、およびN-(6-アミノヘキシル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランからなる群より選択される。とりわけ好ましい態様において、アルコキシシランは、3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル-トリメトキシシランである。
【００３６】
さらなる好ましい態様において、コーティング反応は、0.9molの金属あたり0.3〜0.6×10-3mol、好ましくは0.4〜0.5×10-3mol、とりわけ0.43〜0.45×10-3molのトリアルコキシシランを加えることによって実施される。
【００３７】
本発明の好ましい態様により、アルコキシシランとのインキュベーション/反応は、2〜6のpH(これは、2または6のpHもこの範囲に含まれることを意味する)、好ましくは、2.5〜5.5、とりわけ4.5±1のpHにおいて実施される。インキュベーション/反応の間、必要であれば、pHが上記の値に調節され得る。したがって、酢酸を使用してpHを調節することができる。
【００３８】
好ましくは、金属磁性ナノ粒子は、アルコキシシランとのインキュベーション/反応の前に崩壊される。該ナノ粒子は、ボール形状もしくは立方体の高電子密度ナノ粒子の懸濁液を作成するために好ましくは超音波処理によって崩壊され、次いで、該ナノ粒子に対して、コーティング反応が行われ得る。一態様において、超音波処理は、超音波浴において、45kHzで30分〜2時間、とりわけ約1時間行われる。この崩壊法は、好ましくは、酸性条件において、好ましくはpH2.5〜3.0において実施される。本発明によるナノ粒子の崩壊は、例えば、実施例1.1において説明される。
【００３９】
ナノ粒子を崩壊させるための別の好適な方法は、レーザーベースでの解砕/レーザー断片化技術である(Schnoorら 2010)。
【００４０】
本発明の方法は、さらに、アルコキシシランとのインキュベーション/反応を開始した後に凝集物を崩壊させる工程を含んでいてもよく、これは、上記において説明したように実施することができる。一態様において、ナノ粒子の崩壊は、コーティング工程と共にまたはコーティング工程の後に開始される。しかしながら、さらなる好ましい態様において、崩壊工程は、コーティング工程の前に開始され、さらに、コーティング工程と共におよび/またはコーティング工程の後にも実施される。とりわけ、崩壊は、コーティング工程の前に開始され、コーティング工程中およびコーティング工程後も継続される。好ましくは、崩壊は、合計で約24時間以上実施される。
【００４１】
コーティングおよび崩壊により、室温で安定に貯蔵することができる懸濁液を作成することができ、これがそれを好ましい態様にしている。いかなる科学的理論にも束縛されるものではないが、ほとんどの個々のナノ粒子は、アルコキシシランによって完全にコーティングされており、これが、図1に見られるように、隣接するナノ粒子に容易に付着し、本発明による凝集物を形成すると考えられる。それでも、該懸濁液は、シリンジを容易に通過するのに、ならびに腫瘍組織中に注入されるのに、十分に流動的である。
【００４２】
好ましい態様では、コーティングの不完全な凝集物および/または非常に大きな凝集物(例えば、2,000ナノ粒子を超える凝集物)を懸濁液から除去するための追加工程が実施される。この工程にとって好適な方法は、遠心分離(例えば、2,000rpmで10分間)およびろ過(例えば、12〜25μmの孔径のひだ折りろ紙により)である。とりわけ好ましい態様では、遠心分離およびろ過の両方が実施される。大部分の完全にアルコキシシランでコーティングされたナノ粒子は、例えば、2,000rpmで10分間遠心分離した場合、懸濁液から沈降しないことが観察された。したがって、遠心分離の上澄みおよび/またはろ過のフロースルーが、本発明による懸濁液であり、1日、好ましくは1週間、とりわけ1ヶ月にわたって沈降を示さず、したがって、長期間貯蔵することができる。
【００４３】
その一方で、コーティングの不完全なナノ粒子は、例えば遠心分離などによって、懸濁液から大部分を除去することができる。コーティングの不完全なナノ粒子は、低いSARを有しており、したがって、懸濁液の体積SARを減じるので、コーティングの不完全なナノ粒子のそのような除去は好ましい。
【００４４】
崩壊工程および任意により除去工程は、好ましくは、金属ナノ粒子の凝集物が、光散乱法によって決定された、30〜450nm、好ましくは50〜350nm、とりわけ70〜300nmの平均サイズ(z平均)を有するまで、実施される。この文脈において、平均サイズは、実施例3に従って、水中において決定される。この光散乱測定では、凝集物を形成しているボール形状もしくは立方体の高電子密度の単一ナノ粒子のサイズではなく、ナノ粒子による凝集物のサイズが決定される。凝集物のサイズに関して、「Z平均」は、実施例3において実施したように、光散乱によるサイズ決定の読み出しを意味する。所与の範囲を超えるZ平均値は、結果としてナノ粒子の沈降につながり、したがって、概して、これらのナノ粒子の期待される用途にとって好適ではない。腫瘍への点滴注入前に分散液を再構成することができるとしても、分散液は、針を通過する間に緩衝液および凝集物へと部分的に分離し得、それが、結果として組織内でのナノ粒子の偏在につながるので、大きな凝集物によって深刻な問題が生じる場合がある。
【００４５】
本発明の別の好ましい態様において、凝集物の懸濁液は、その金属含有量によって決定された、少なくとも約2M、好ましくは少なくとも約3M、より好ましくは少なくとも約4M、より好ましくは少なくとも約5M、とりわけ少なくとも約6Mの濃度へと濃縮される。本発明による懸濁液内における所望の金属濃度は、ロータリーエバポレーターにおいて水を蒸発除去することによって調節することができる。懸濁液試料は、固体含有量および金属濃度に関して、下記において開示される方法(例えば、実施例2を参照のこと)を用いて分析することができる。
【００４６】
驚くべきことに、本発明による組成物中のナノ粒子は、医療装置もしくは医用薬品としてのそれらの有用性が失われることなく、2M以上の金属含有量の高濃度に濃縮することができることが見出された。これら高濃度の懸濁液は、依然として、日常的なルーチンで点滴または注射によって注入することができ、ならびに、重要なことに何ヶ月にもわたって貯蔵することができる。該懸濁液をオートクレーブ処理した後、いくらかのゲル化が観察され得るが、しかしながら、激しくボルテックスすることによって(例えば、約12時間)、戻すことができる。より低い金属濃度の懸濁液と比較して、これらの懸濁液は、体積ベースのより高い比吸収率(SAR)および高い粘度を有している。驚くべきことに、本発明のナノ粒子では、腫瘍などの意図される組織内におけるそのようなナノ粒子の貯留物形成は、ナノ粒子の濃度に依存しており、すなわち、ナノ粒子の濃度を増加させることにより、貯留物形成が改善されることが示された。合理的には、注入されたナノ粒子の濃度は組織内の異なる濃度に対して急速に均等化され、その結果、異なる濃度の同じナノ粒子が異なる挙動を示すことはないと予想されるため、この結果は、予期せぬものであった。
【００４７】
本発明の別の局面は、上記において説明した方法によって得ることができる、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物の懸濁液である。下記の実施例に示されるように、この懸濁液は、日常的なルーチンで腫瘍中に注入することができ、腫瘍組織内に留まり得、それにより、高熱療法および熱焼却法のために使用することができる。驚くべきことに、組織内への注入において凝集物がほとんど注入部位の付近に留まるが依然として取り扱いが容易であるように凝集物化するナノ粒子の特性が、本発明によるアルコキシシランコーティングによって生じることが見出された。このことが、これらの凝集物を、例えば高熱療法および/または熱焼却法のための腫瘍組織内への注入にとって、とりわけ好適にしている。
【００４８】
本発明のさらなる局面は、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物を含む組成物であって、該凝集物が、光散乱法によって決定された、30〜450nm、好ましくは50〜350nm、とりわけ70〜300nmの平均サイズを有する、組成物である。本発明による凝集したナノ粒子のサイズ測定は、例えば、実施例3において説明される。
【００４９】
好ましくは、凝集物を含むこの組成物は、実質的に有機溶媒を含有しない。この文脈における「実質的に有機溶媒を含有しない」は、少量の有機溶媒が存在し得ることを意味しており、例えば、有機溶媒の量は、5体積％未満、好ましくは1体積％、より好ましくは0.5体積％未満、とりわけ0.1体積％未満である。とりわけ好ましい態様では、通例の方法により、ナノ粒子調製物に有機溶媒は全く検出できない。
【００５０】
そのような組成物の金属ナノ粒子は、好ましくは、電子顕微鏡によって決定された、5〜25nmのサイズ、7〜20nmのサイズ、とりわけ9〜15nmのサイズの金属コアを有するナノ粒子である。懸濁液の凝集物は、好ましくは、数十〜数百のそのような個々のナノ粒子で構成され、その一方で、全くもしくは非常にわずかだけが、10個未満のナノ粒子（透過電子顕微鏡法(TEM)において決定された）による小さい凝集物であり、−好ましくは、700×700nmおよび少なくとも1000個のナノ粒子を示す代表的なTEM写真において、10個以下のナノ粒子による凝集物が3個未満である。本発明による透過電子顕微鏡法については、例えば、実施例6において説明される。
【００５１】
同様に、700×700nmおよび少なくとも1000個のナノ粒子を示す代表的TEM写真において、10個未満の個別のナノ粒子、好ましくは5個未満の個別のナノ粒子、とりわけ1個もしくは0個の個別のナノ粒子が検出され得る。この文脈におけるナノ粒子は、透過電子顕微鏡において視認することができる、基本的にボール形状または立方体の高電子密度ナノ粒子の1個である。単一のナノ粒子は、少なくとも他のナノ粒子1つに付着していないナノ粒子である。
【００５２】
好ましくは、単一のナノ粒子の形状は、ボール形状または立方体である。ナノ粒子のサイズおよび形状は、pH、イオン強度、温度、塩の性質(過塩素酸塩、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩)、またはFe(II)/Fe(III)濃度比を調節することによって適合させることができる(MohapatraおよびAnand 2010によって概説されている)。
【００５３】
好ましくは、金属ナノ粒子は、鉄、鉄錯体化合物、鉄カルボニル化合物、または鉄塩、好ましくは鉄塩を含む。鉄塩は、好ましくは酸化鉄、とりわけ磁鉄鉱である。好ましいナノ粒子は、上記において説明されるような方法によって、好ましくは、塩化鉄(III)および塩化鉄(II)の混合物を含有する溶液を水酸化ナトリウムによって沈殿させることにより酸化鉄ナノ粒子の懸濁液を提供することによって、得ることができる。
【００５４】
好ましい態様において、本発明の、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物を含む組成物は、25〜80mV、好ましくは35〜70mV、とりわけ45〜60mVのζ電位を有する。該組成物のζ電位は、pH5.2および2.0mS/cmの導電率(どちらも25℃において決定した)において、実施例4において説明されるように決定される。ζ電位は、アルコキシシランのアミノ基に依存するので、ナノ粒子の成功裏のコーティングに応じて決まる。ζ電位が低いほど、ナノ粒子のコーティングが不十分なことを示している。所与の範囲内の適正なζ電位は、組織への注入に関するナノ粒子の特性、すなわち、注入されたナノ粒子が、例えば腫瘍内の注入された部位およびその付近に留まり、周りの組織に広がらない特性、に寄与する。これは、加えられる磁界を制限し、それにより治療の成功がもたらされるであろう。さらに、所与の範囲のζ電位は、最適なコロイド安定性を保証し、その結果、ナノ粒子組成物の保存期間を延ばす。
【００５５】
本発明のさらなる好ましい態様は、アルコキシシランでコーティングされた磁性金属ナノ粒子の凝集物を含む組成物であって、該凝集物が水性の生理学的に許容される緩衝液中に懸濁されている、組成物である。生理学的に許容される緩衝液は、当技術分野において公知であり、例えば、5〜8、好ましくは5〜6、とりわけ5.1〜5.8のpH(25℃)および1.5〜2.5mS/cm、好ましくは1.7〜2.3mS/cmの導電率(25℃)の、酢酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、またはリン酸塩が挙げられる。好適な懸濁液の浸透圧重量モル濃度は、0.01〜0.05オスモル/kg、好ましくは0.02〜0.04オスモル/kgである。そのような懸濁液は、好ましくは、全身療法のための点滴、または間質性もしくは腫瘍内用途のための注射液として使用準備済みである。
【００５６】
本発明の組成物は、好ましくは、その金属含有量によって決定された、少なくとも約2M、好ましくは少なくとも約3M、より好ましくは少なくとも約4M、より好ましくは少なくとも約5M、とりわけ少なくとも約6Mのナノ粒子濃度を有する。高すぎる濃度は、ある特定の用途の場合、分散液の高粘度のために注射の際に困難を生じ得るため、好ましくはナノ粒子濃度は約8M未満である。鉄に関して、2Mは112mg/mlに等しい。金属の濃度は、ある特定の金属錯体の光度測定によって決定することができ、例えば、鉄は、実施例2において説明されるように、鉄(II)フェナントロリン錯体への転換後に決定することができる。
【００５７】
驚くべきことに、本発明による組成物中のナノ粒子は、医療装置もしくは医用薬品としてのそれらの有用性が失われることなく、2M以上の金属含有量の高濃度に濃縮することができることが見出された。これら高濃度の懸濁液は、依然として、日常的なルーチンで点滴もしくは注射によって注入することができ、ならびに、重要なことに数ヶ月にわたって貯蔵することができる。該懸濁液をオートクレーブ処理した後、いくらかのゲル化が観察され得るが、しかしながら、激しくボルテックスすることによって(例えば、12時間)、戻すことができる。より低い金属濃度の懸濁液と比較して、これらの懸濁液は、体積ベースでのより高いSARおよび高い粘度を有している。驚くべきことに、本発明のナノ粒子では、腫瘍などの意図される組織内におけるそのようなナノ粒子の貯留物形成は、ナノ粒子の濃度に依存しており、すなわち、ナノ粒子の濃度を増加させることにより、貯留物形成が改善されることが示された。合理的には、注入されたナノ粒子の濃度は組織内の異なる濃度に対して急速に均等化され、その結果、異なる濃度の同じナノ粒子が異なる挙動を示すことはないと予想されるため、この結果は、予期せぬものであった。
【００５８】
実施例9に見られるように、高濃度の組成物では、より多くのナノ粒子が、腫瘍内に沈着し得るであろう(例えば、0日目では、6Mの懸濁液では注入された鉄の95％に対し、2Mの懸濁液では90％)。この知見は、2Mの懸濁液に比べて、6Mの懸濁液では、肺、肝臓、および脾臓において見出される鉄が少ないという結果と一致している(例えば、0日目では、3%に対し14%)。したがって、濃度が高いほど、血液循環中に入り最終的に他の器官に入ることになるナノ粒子が少ないと結論付けられる。
【００５９】
さらに、より高い濃度の本発明のナノ粒子は、7日間の時間フレーム内において腫瘍内に完全に留まっていることが見出され(6Mの懸濁液の場合：0日目の95％に対し、7日目では96％)、その一方で、より低い濃度の懸濁液では、同じ時間フレームにおいて、いくらかの鉄含有量の損失が観察され得る(2Mの懸濁液：0日目の90％に対し、7日目では86％)。ナノ粒子は腫瘍組織中へ注入されるとすぐに希釈されて、長い期間にわたって異なる挙動を示すことはないと予想していたので、この知見は、とりわけ驚くべきものである。
【００６０】
本発明の組成物は、好ましくは、回転式レオメトリーによって決定された、0.005Pa s以上、好ましくは0.01Pa s以上、より好ましくは0.1Pa s以上、とりわけ1Pa s以上の、100/sのせん断速度における粘度を有する。本発明による回転式レオメトリーは、例えば、実施例8に例示されている。本発明による懸濁液の場合、粘度は、ナノ粒子または鉄の濃度の増加に伴って増加する。
【００６１】
好ましい態様において、本発明の組成物内のナノ粒子の比吸収率(SAR)は、Jordanら(1993)によって説明される通りの方法により、3.5kA/mの磁界強度および100kHzの周波数において決定された、それぞれの金属(例えば、鉄)の2W/g以上、好ましくはそれぞれの金属の3W/g以上、とりわけそれぞれの金属の4〜50W/g以上である。概して、高いSAR値は、交流磁界への曝露の間に、結果としてより高い温度を達成することができるので、好ましい。ナノ粒子のSAR値が低すぎる場合、すなわち、所与の数値より低い場合、交流磁界への曝露において、腫瘍全体にわたって達成される温度が低すぎるため、治療効果に達することができないであろう。
【００６２】
本発明のさらなる好ましい態様は、同質遺伝子的腫瘍モデル中への組成物の注入において、注入の7日目以降において、適用された金属の少なくとも90％、好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも95％、とりわけ少なくとも98％が、注入された腫瘍内に留まる、本発明による組成物である。本発明による同質遺伝的腫瘍モデルは、腫瘍を誘発するために使用される腫瘍細胞が遺伝子的に宿主動物に一致する腫瘍モデルである。例えば、C3H-HeN系統のマウスにおいて腫瘍を発生されるために、C3H RS1乳癌細胞株が使用される。腫瘍内に留まっている金属は、分光計を使用して、例えば、Tecan Infinite M 200分光器によって、金属回収率を測定することにより、決定することができる。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、本発明の任意の方法によって得ることができる組成物である。
【００６４】
本発明のさらなる局面は、本発明による懸濁液もしくは組成物を含む医療装置である。磁性ナノ粒子は、交流磁界への曝露において、物理的作用様式として熱を発生させることにより、その治療効果を働かせるのであって、患者の代謝とは直接は相互作用しないので、これらのナノ粒子は、医療装置として複数の管轄権に分類される。それでも、それらは、高熱療法および/または熱焼却法による、腫瘍疾患ならびに細胞が身体のある特定の領域において正常に機能していない他の疾患の処置または予防のための強力なツールとして使用することができる。
【００６５】
本発明により処置することができるそのような他の疾患の例は、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染である。本発明によるナノ粒子で処置することができる腫瘍疾患は、好ましくは、充実性腫瘍、とりわけ局所性もしくは局所的に進行した腫瘍、または手術不能の転移などの局所的問題を引き起こす全身性腫瘍疾患である。その例は、脳腫瘍、例えば、グリア芽腫および星状細胞腫、脳転移、前立腺癌、膵臓癌、肝細胞癌、頭頸部癌、膀胱癌、胃癌、腎細胞腫、卵巣癌、子宮頚癌、肉腫、基底細胞癌、ならびに黒色腫である。
【００６６】
本発明のさらなる局面は、本発明による懸濁液もしくは組成物を含む医用薬品である。本発明の懸濁液もしくは組成物は、抗癌剤、例えば化学療法剤(アルキル化剤、抗新生物抗生物質、代謝拮抗物質、天然源誘導体に分類することができる)、ホルモン/成長因子またはホルモン/成長因子類似体もしくは阻害剤、シグナル伝達阻害剤、ならびに免疫治療薬などの有効医薬と共に製剤化することができる。好適な医薬は、例えば、WaldoemerおよびStief(2011,[0096]〜[0102]段落)に列挙されている。したがって、本発明によるナノ粒子を、そのような有効医薬と組み合わせることは、本発明の一局面である。
【００６７】
さらなる局面において、本発明は、上記および下記において定義されるような患者において、上記および下記において詳細に説明されるような増殖性疾患、癌、腫瘍、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染を処置または予防する方法においての使用のための、本発明の懸濁液または組成物に関する。
【００６８】
本発明のさらなる局面は、本発明の懸濁液もしくは組成物を、上記および下記において詳細に説明されるようなヒトまたは動物患者に投与する工程を含む、増殖性疾患、癌、腫瘍、リウマチ、関節炎、関節症、および細菌感染を処置または予防する方法である。
【００６９】
好ましくは、本発明による使用のための懸濁液もしくは組成物、あるいは疾患を処置または予防するための本発明による方法は、さらに、患者を交流磁界に曝露させる工程を含む。通常、交流磁界は、該懸濁液もしくは組成物を患者の標的領域、例えば腫瘍、に注入した数時間後または数日後に適用される(Johannsenら 2007；ThiesenおよびJordan 2008；Maier-Hauffetら 2011)。
【００７０】
Jordanら(2008)と同様に、本発明の懸濁液もしくは組成物はさらに、本明細書において説明されるようなナノ粒子凝集物を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程、ならびに少なくとも1種の抗癌剤を少なくとも1種の薬学的に許容される賦形剤、担体、および/または溶媒と一緒に投与する別の工程を含む、抗癌剤の活性を増加させる方法で使用することができる。2つの投与は、同時に、または一方の後に他方を(最初にナノ粒子、次に抗癌剤、またはその逆)、ただしナノ粒子および抗癌剤が一緒に作用してお互いの治療効果を高めることを可能にするようにそれらが患者の体内に同時に存在するような方法で行ってもよい。本発明により、ナノ粒子凝集物は、標的エリア内において、数ヶ月または数年、組織内に留まり、交流磁界への曝露において熱を発生させることができるが、その一方で、投与された抗癌剤は、典型的には、数時間または数日間機能するため、この文脈における「一緒に作用する」は、依然として十分な薬学的に活性なレベルの抗癌剤が組織内に存在することを意味する。したがって、本発明のさらなる一局面は、腫瘍疾患の予防および/または処置のための方法における使用のための本発明のナノ粒子であって、該ナノ粒子および抗癌剤が同時に患者の体内に存在するような方法において抗癌剤と一緒に投与される、ナノ粒子ある。
【００７１】
好ましい態様において、本発明によるナノ粒子の凝集物は、有効薬剤または標的化剤、例えば、当技術分野において公知の抗体、抗体断片、またはリガンドに対して、錯体化されるかまたは共有結合される。例えば、ナノ粒子への有効医薬品および/またはリガンドの結合は、Jordanら(2008)、Gaoら(2011)、WaldoefherおよびStief(2011)、ならびにIvkovら(2005)に記載されている。
【００７２】
懸濁液以外の本発明によるナノ粒子の凝集物の他の好適な医薬または医療装置形態は、例えば吸入剤、または点滴もしくは注射の前に再構成することができる凍結乾燥物などのための粉末、あるいは、本発明によるナノ粒子の凝集物を含むインプラント、例えば、Jordan(2009)において詳しく説明されるような固体もしくはゲル様医療装置、スポンジ、またはフィルムである。
【００７３】
概して、本発明による医用薬品または医療装置は、疾患の処置または予防それぞれのために使用される従来の治療法、例えば、化学療法または放射線など、と容易に組み合わせることができる。それらは、本発明の医用薬品または医療装置と組み合わされる場合に、個々の処置の有効性を増加させるため、および/または、それらの用量を少なくすることにより従来の治療法の副作用を減じるために使用することができる。
【００７４】
上記の一般的な説明の観点から、下記において提示される特定の図および実施例は、単に例示のためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。他の一般的および特定の構成は、当業者にとって明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例1により製造された磁性酸化鉄ナノ粒子の2Mの懸濁液の透過電子顕微鏡写真。
【図２】実施例8による回転式レオメトリーによって決定された、実施例1による3つの異なる酸化鉄ナノ粒子調製物の粘度。Pa sで示されるせん断粘度は、AS1(6MのFe)[塗りつぶしのひし形]、AS2(3MのFe)[白抜きの円形]、およびAS1(2MのFe)[塗りつぶしの四角形]について、/sで示されるせん断速度に対応して表されている。
【図３】実施例5により決定した、実施例1による3つの異なるナノ粒子調製物のSAR。W/g Feで示されるSARは、AS1(6MのFe)[塗りつぶしのひし形]、AS2(3MのFe)[白抜きの円形]、およびAS1(2MのFe)[塗りつぶしの四角形]について、kA/mで示される交流磁界強度に対応して表されている。
【実施例】
【００７６】
実施例1.コーティングされた磁性酸化鉄ナノ粒子の製造
1.1.鉄塩溶液から酸化鉄を沈殿させることによる(AS1およびAS2)
沈殿および洗浄：
NaOHをフラスコに計り取り、2.13Mの濃度まで精製水に溶解させ、続いて25℃に冷却する。塩化鉄(III)および塩化鉄(II)(比率2：1)をガラス瓶に充填し、精製水中に溶解させて、0.48M塩化鉄(III)/0.24M塩化鉄(II)溶液を得る。該塩化鉄溶液を、NaOH溶液に注ぎ入れ、温度を25℃で一定に維持しながら、約53分間混合する。発生したナノ粒子を沈降させて、上澄みを除去する。該上澄みの導電率が＜5mS/cmに達するまで、該ナノ粒子を脱ガス処理した水で洗浄する。
【００７７】
任意で、15℃において、約39分間かけて、NaOH溶液を塩化鉄溶液中に注ぎ入れてもよい(その代わりに逆に)。プロセスのこの変更は、AS2ナノ粒子に対して実施した。
【００７８】
コーティングおよび崩壊
上記からのナノ粒子懸濁液を、pHが2.5〜3.0になるように希釈HClで調節する。その後、フラスコを超音波浴に入れ、撹拌しながら、45kHzで1時間、超音波で処理する。90分間かけて、3-(2-アミノエチルアミノ)-プロピル)トリメトキシシラン(Fluka、1,2lのナノ粒子懸濁液あたり48 ml)を滴加し、それと同時に、酸性酸を滴加することにより、pHを5.5の閾値未満に維持するが、pHは5.0より低くしないものとする。この工程の後、希釈HClによってpHを4.65に調節し、該懸濁液をさらに、超音波で23時間処理する。このプロトコルにより製造される粒子(任意の工程は無い)は、AS1ナノ粒子と呼ばれる。
【００７９】
任意で、ナノ粒子のより微細な分散液および良好なコロイド安定性を達成するために、コーティングの前に、ナノ粒子を、H2O2で2日間処理する。さらに、H2O2を使用して、制御された条件下において、FeをFe2O3へと完全に酸化させてもよい。その結果として、保護ガス(例えば、アルゴン)の不在下において後続の反応を実施することができる。この任意の工程は、上記からのAS2ナノ粒子に対して実施した。
【００８０】
透析：
懸濁液を、400μS/cmの導電率に達するまで、脱ガス処理された超純水に対して血液透析カートリッジ(Fresenius F8 HPS)によって精製する。
【００８１】
遠心分離および濃縮：
結果として得られる懸濁液の半分を遠心分離バケットに充填し、2,000rpmで10分間遠心分離処理する。次に、上澄みをひだ折りろ紙(12〜25μm)を通して、前もって5分間アルゴン置換しておいたガラス瓶中へとろ過する。この手順を、懸濁液の残りの半分にも同様に繰り返す。その後、ナノ粒子懸濁液を、ロータリーエバポレーターによって所望のFe濃度まで濃縮する(例えば、112mg/mlのFeは2MのFeに等しく、168mg/mlのFeは3MのFeに等しく、または335mg/mlのFeは6MのFeに等しい)。ナノ粒子試料は、固体含有量およびFe濃度に関して分析することができる。
【００８２】
1.2.鉄錯体の熱分解による(AS4およびAS5)
WaldoefherおよびStief  (2011)に記載されている方法と同様に、AS4粒子を作成した。簡潔に言えば、塩化鉄(III)、酢酸ナトリウム、ジアミノヘキサン、およびエチレングリコールを、三ツ口フラスコにおいて組み合わせて、均一な溶液が得られるまで撹拌した。次いで、混合物を沸点付近まで激しく加熱し、5時間還流させた。粒子を洗浄して遠心分離によって収集した後、乾燥させた粒子を、エチレングリコール中における酸化トリメチレンと混合し、130℃に加熱して2時間維持した。次いで、該混合物を還流下で1時間加熱した。続く酸化工程では、洗浄した粒子を硝酸に再懸濁させて、窒化鉄で処理した。次いで、洗浄した後、ならびに遠心分離によって粒子を収集した後、厚いSiO2シェルを形成するために、該粒子をテトラアルコキシシランでコーティングした。結果として得られる粒子を遠心分離によって収集し、水に再懸濁させた。AS1粒子に対して上記において開示したのと同じ方法において、仕上げコーティング、崩壊、および精製(透析、遠心分離、および濃縮)を行うことができる。
【００８３】
Guardiaら(Guardiaら 2010 a；Guardiaら 2010 b；Guardiaら 2012)によって説明される方法と同様に、AS5粒子を作製した。
【００８４】
ジベンジルエーテル中における鉄(III)アセチルアセトナートおよびデカン酸の溶液を、撹拌しながら、200℃に急激に加熱した。次いで、混合物をこの温度で2時間撹拌し、15分以内に298℃まで加熱した。この温度をさらに1時間維持した。最後に、懸濁液を室温まで冷却した。
【００８５】
次いで、混合物にアセトンを加え、沈殿物を風乾させた。粒子を水に再懸濁させた。AS1粒子に対して上記において開示したのと同じ方法において、仕上げコーティング、崩壊、および精製を行うことができる。
【００８６】
実施例2.鉄濃度/固体含有量の決定
懸濁液内の鉄濃度の決定は、鉄(II)フェナントロリン錯体の消光の光度測定に基づいている。該錯体は、目視検査によって確認しながら抽出が完了するまで、塩酸によってナノ粒子を抽出することによって作り出される。含有される全ての鉄を、塩酸ヒドロキシルアミンを使用して鉄(II)に還元し、酢酸/酢酸緩衝液中においてフェナントロリン錯体へと転化させる。錯体の消光を、硫酸鉄(II)エチルエンジアンモニウム標準に対して、Shimadzu UV-1700 Pharmaspecを使用して513nmにおいて決定する。
【００８７】
懸濁液の固体含有量は、1mlの懸濁液を、溶媒(例えば、水)を蒸発除去する前後に秤量することによって決定する。
【００８８】
実施例3.粒度測定
ナノ粒子の平均サイズを測定するために、光散乱手法を用いて、ナノ粒子調製物の流体力学的サイズを決定する(例えば、Malvern ZetaSizer 3000 HSAまたはMalvern Zetasizer Nano ZS)。一次パラメータはz平均値であり、これは、散乱強度によって重み付けされている。したがって、多分散分布の場合、より大きな粒子には、小さい粒子よりも強い重み付けが為される。さらに、この方法は、ナノ粒子凝集物の平均サイズを決定するが、単一または一次ナノ粒子のサイズは決定しない。
【００８９】
原理：
より小さいナノ粒子ほど、溶媒分子によってさらに「弾かれ」、より速く移動するので、ナノ粒子または分子がレーザーによって照らされると、散乱された光の強度は、ある比率において変動し、それは、ナノ粒子/凝集物のサイズに依存する。これらの強度の変動の分析から、ブラウン運動の速度が得られ、したがって、ストークス-アインシュタイン相関を使用することでナノ粒子のサイズが得られる。
【００９０】
手順：
試験物質の一部を、その濃度に応じて希釈する(1：1000〜1：3000)。希釈した懸濁液の試料を測定装置に入れ、Malvern ZetaSizer 3000 HSAの推奨に従って処理する。
【００９１】
実施例4.ζ電位測定
ナノ粒子のζ電位を測定するために、試料を30秒間ボルテックスする。超純水中におけるFeに対して、約0.11mg/mlの濃度の1：1000希釈率の溶液75mlを調製し、15分間超音波処理する。該溶液20mlを、Malvern ZetaSizer 3000 HSA(またはMalvern Zetasizer Nano ZS)の測定用細胞に注入し、製造元の推奨に従って測定する。該溶液のpHを、別々のpHメーターにより決定する。
【００９２】
実施例5.SAR測定
実施例1からの試料のSARを、Jordanら(1993)よって開発された方法に従い、100kHzの周波数および3.5kA/mまでの磁界強度において決定した。3.5kA/m以上の磁界強度に対する結果を表1に示す。
【００９３】
（表１）比吸収率
0005844902.tif 000002
【００９４】
様々な交流磁界強度でのAS1およびAS2ナノ粒子のいくつかの製造試行からのSAR平均を図3に示す。
【００９５】
実施例6.透過電子顕微鏡法
Jordanら(1996,712頁,3.2.2)記載の方法に類似したTEM分析によってナノ粒子の電子顕微鏡法を行うことができる。
【００９６】
実施例1により製造した磁性酸化鉄ナノ粒子の2Mの懸濁液をTEMにより分析した。結果として得られる顕微鏡写真を図1として示す。該顕微鏡写真に、ナノ粒子の大きな凝集物を観察することができる(単一のナノ粒子を矢印によって指し示す)。表されたエリア内に個別のナノ粒子を観察することはできない、すなわち全てのナノ粒子は他の粒子に付着している。
【００９７】
実施例7.懸濁液の仕様
実施例1による一製造試行により、表2に表されるような物理的/化学的仕様を得る。
【００９８】
（表２）代表的な装薬の仕様
0005844902.tif 000003
【００９９】
実施例8.回転式レオメトリー/粘度測定
Malvern材料特性評価サービスにより、20℃において、回転式レオメトリーを用いてナノ粒子試料の粘度を決定し、この場合、せん断速度(7〜1500/s)にに対応してせん断粘度(Pa s)を決定した。実施例1によるナノ粒子調製物についての結果を図2に示す。
【０１００】
実施例9.インビボでの磁性流体の貯留物形成
C3H RS1乳癌細胞株の1×106の腫瘍細胞を、C3H-HeN系統(Harlan Laboratories,ボルヒェン)のネズミの右の後肢に注入した。誘発された腫瘍は、0.57〜0.85cm3の体積を有し、動物を無作為化し(1群あたり動物15匹)、右の後肢の腫瘍に、112または335mg/mlのFe濃度を有する実施例1の磁性流体を注入した。正確な注入体積含有量を、注入前後の注射器を秤量してその差を計算することによって決定した(平均31μl±5.8μl)。
【０１０１】
0日目または7日後に、Spektroquant 14761試験(Merck,ダルムシュタット)およびCary 50(Agilent Technologies,サンタクララ,Ca,USA)およびTecan Infinite M 200(Tecan Group Ltd,メンネドルフ,スイス)分光計を用いて、565nmでのUV-vis測定により、マウスの組織/腫瘍の総Fe含有量を決定した。組織/腫瘍の総Fe含有量から、組織の初期含有量(接種していない左肢のFe含有量を測定することによって決定した)および接種の際、使用した綿棒によって吸収された磁性流体の損失を引き算することにより、最初に適用されたFe含有量を決定した。最初に適用されたFe含有量で除算された総Fe含有量として、Fe回収率(1群あたり平均15腫瘍)を計算した。
【０１０２】
（表３）Cary 50によって決定したFe回収率
0005844902.tif 000004
【０１０３】
（表４）Tecan Infinite M 200によって決定したFe回収率
0005844902.tif 000005
【０１０４】
初期Fe含有量(左肢において決定した)ならびに磁性流体のより少ない接種量に起因する損失を考慮して、全ての4つの群に対する総Feの平均回収率は、Cary 50の場合に99％であり、Tecan Infinite M 200では104％であった。概して、回収率の数値は、Cary 50(表3)よりもTecan Infinite M 200(表4)を用いた方が高かった。
【０１０５】
112mg/mlのFe製剤と335mg/mlのFe製剤のFe回収率を比較すると、両方の決定から、0日目では、335mg/mlの製剤の方が、より多くのFeナノ粒子が腫瘍内に留まっている傾向が明らかとなった(Caryによって決定した場合、95％対90％、およびTecanで決定した場合、98％対95％)。その一方で、0日目において他の組織(肺、肝臓、および脾臓)に見出されたFeナノ粒子の量は、112mg/mlのFe製剤の方がはるかに高かった(112mg/mlの場合、14％/16％対335mg/mlの場合、3％/3％)。したがって、より低い濃度の製剤では、より高い濃度の製剤と比べて、0日目での適用の間および潜在的に直後において、より多くのFeナノ粒子が腫瘍から抜け出ると結論付けることができる。
【０１０６】
0日目に腫瘍に対して効果的に適用されたFeに対する、7日後に腫瘍内に残っているFeの比率を決定するために、0日目でのFe回収率を、7日目でのFe回収率で除算して、Cary 50およびTecan Infinite M 200による決定の間で平均化した(結果を表5に示す)。同様に、0日目に、肺、肝臓、および脾臓に沈着されたFeの結末を、7日目に依然としてこれらの器官内に存在するFeの量と比較することによって分析した。
【０１０７】
（表５）7日後に腫瘍/器官内に残っているFe(0日目と7日目の間の比率、CaryおよびTecanの間で平均化した)
0005844902.tif 000006
【０１０８】
112mg/mlのFe製剤の場合、0日目から7日目において約3％のさらなる損失が存在したが、335mg/mlのFe製剤では、Fe含有量は、この時間フレームの間、一定のままであった。興味深いことに、112mg/mlのFe製剤では、肺、肝臓、および脾臓への経路を見つけ出したFeの約1/4が1週間以内に消失し、その一方で、0日目にこれらの器官において見出される、335mg/mlの製剤からのFeの全てが、7日目までそこに留まっていた(335mg/mlのFe製剤の場合にこれらの器官において見出されるFeの全量は、合計で、112mg/mlのFe製剤の場合にこれらの器官において見出させるFeの量の約1/4だけに過ぎないことを考慮しなくてはならない、表3および表4の「Fe回収率 肺/肝臓/脾臓」の列を参照されたい)。
【０１０９】
したがって、より高い濃度のナノ粒子製剤はさらに、7日間にわたって腫瘍内でのナノ粒子の改善された保持率を示しており、これは、患者が数週間または数ヶ月にわたって磁界による複数回の処置を受ける場合、非常に重要である。
【０１１０】
文献
0005844902.tif 000007
0005844902.tif 000008
【図１】
0005844902.tif 000009
【図２】
0005844902.tif 000010
【図３】
0005844902.tif 000011