(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のフィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインおよび第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む、フィブロネクチンをベースとするタンパク質二量体であって、第一の１０Ｆｎ３ドメインおよび第二の１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれが、
（ｉ）ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、およびＦＧループを含み；かつ
（ｉｉ）配列番号：１と少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ１００ｎＭ未満のＫＤで標的分子に結合し；かつ
（ｉｉｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含み、かつＤＫ配列を含有しない、４−１０アミノ酸のＣ末端テールを含む、
タンパク質二量体。
【請求項２】
１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれが、配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて、変化したアミノ酸配列を備える、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループから選択される少なくとも一つのループを有する、請求項１に記載のタンパク質二量体。
【請求項３】
一以上の１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端テールが、リジンまたはシステイン残基をさらに含む、請求項１または２に記載のタンパク質二量体。
【請求項４】
一以上の１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端テールが、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４および配列番号：３５からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１または２に記載のタンパク質二量体。
【請求項５】
Ｃ末端テールが４−８アミノ酸である、請求項１−４のいずれか一項に記載のタンパク質二量体。
【請求項６】
一以上の１０Ｆｎ３ドメインが、１−１０アミノ酸を含むＮ末端伸長をさらに含む、請求項１−５のいずれか一項に記載のタンパク質二量体。
【請求項７】
Ｎ末端伸長が、Ｍ、ＭＧ、Ｇならびに配列番号：１９−２１および２６−３１のいずれかからなる群から選択される配列を含む、請求項６に記載のタンパク質二量体。
【請求項８】
二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含む、請求項１−７のいずれか一項に記載のタンパク質二量体。
【請求項９】
請求項８に記載のタンパク質二量体であって、該タンパク質二量体が異なる標的に結合する第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む、タンパク質二量体。
【請求項１０】
少なくとも二つの１０Ｆｎ３ドメインが、１−３０アミノ酸を含むポリペプチドリンカーにより連結される、請求項８または９に記載のタンパク質二量体。
【請求項１１】
ポリペプチドリンカーが、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンリンカーおよびＦｎをベースとするリンカーからなる群から選択される、請求項１０に記載のタンパク質二量体。
【請求項１２】
請求項８−１０のいずれか一項に記載のタンパク質二量体であって、該タンパク質二量体が：
（ｉ）ＩＧＦ−ＩＲに結合する一つの１０Ｆｎ３ドメインおよびＥＧＦＲに結合する別の１０Ｆｎ３ドメイン、または
（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ２に結合する一つの１０Ｆｎ３ドメインおよびＩＧＦ−ＩＲに結合する別の１０Ｆｎ３ドメイン
を含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体である、タンパク質二量体。
【請求項１３】
請求項１２に記載のタンパク質二量体であって、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインが：
（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループ、または
（ｉｖ）配列番号：２のアミノ酸配列
を含む、タンパク質二量体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のタンパク質二量体であって、該タンパク質二量体が：
（ｉ）配列番号：２５に示されるアミノ酸配列と９０％同一であるアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号：２５に示されるアミノ酸配列と９５％同一であるアミノ酸配列、または
（ｉｉｉ）配列番号：２５のアミノ酸配列
を含む、タンパク質二量体。
【請求項１５】
請求項１−１４のいずれか一項に記載のタンパク質二量体であって、該タンパク質二量体が、少なくとも４週間、ｐＨ４．０で、溶液中での保存の間に、４％未満の断片化を有する、タンパク質二量体。
【請求項１６】
ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリンおよびＦｃ断片から選択される一以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む、請求項１−１５のいずれか一項に記載のタンパク質二量体。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか一項に記載のタンパク質二量体をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１０年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／３４８，６４７号および２０１０年５月２６日に出願された同第６１／３４８，６６３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
序論
フィブロネクチンをベースとする足場は、対象とする任意の化合物と結合するよう進化させることができるタンパク質のファミリーである。一般に、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）またはＦｎ３様ドメインに由来する足場を使用するこれらのタンパク質は、天然の抗体または操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナルまたは一本鎖抗体）に特徴的な形で機能し、さらに、構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、普通は抗体における構造および機能の喪失につながる条件下でも、フォールディング、安定性および溶解性が最適となるように設計されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の一例として、アドネクチン商標（Ａｄｎｅｘｕｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂの完全所有の子会社）がある。
【０００３】
フィブロネクチンは、細胞外マトリックスの形成および細胞−細胞相互作用において重要な役割を果たす大きなタンパク質であり；３種（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型）の小さなドメインの多数の反復からなる（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。Ｆｎ３自体が、細胞接着分子、細胞表面ホルモンおよびサイトカイン受容体、シャペロンおよび炭水化物結合ドメインの部分を含む大きなサブファミリーのパラダイムである。総説については、Ｂｏｒｋ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２  Ｏｃｔ  １；８９（１９）：８９９０−４；  Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９４  Ｓｅｐ  ３０；２４２（４）：３０９−２０；  Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＆  Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．  １９９４  Ｍａｙ  １５；２（５）：３３３−７；  Ｈａｒｐｅｚ  ＆  Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９４  Ｍａｙ  １３；２３８（４）：５２８−３９）参照。
【０００４】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、βまたはβ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；βまたはβ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；βまたはβ様鎖、Ｃ；ループ、ＣＤ；βまたはβ様鎖、Ｄ；ループ、ＤＥ；βまたはβ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；βまたはβ様鎖、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびβまたはβ様鎖、Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたは全てが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造上および機能上の両面で類似している。米国特許第７，１１５，３９６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＴＮＦαバインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。米国公開第２００７／０１４８１２６号には、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの変化が高親和性ＶＥＧＦＲ２バインダーをもたらすＦｎ３ドメインタンパク質が記載されている。
【０００５】
タンパク質製剤は、それらの生成、精製、保存および運搬の間、物理学的および化学的な不安定さを伴い得る。これらの不安定さの問題は、タンパク質治療と関連する生物学的特性に悪影響を与え、それによってそのタンパク質治療の有効性を低減させる。Ｓｏｌａ，  ２００９，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，  ９８（４）：  １２２３−１２４５。従って、改善された安定性、例えば低減された断片化（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）および／または凝集に関連し、治療および診断目的の両方のために用いることができる、改善されたフィブロネクチンドメイン足場タンパク質を獲得することは有利だろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
概要
本出願の一態様は、低減された断片化および／または低減された凝集を含む、増大した安定性に関連する、新規のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含み、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１と少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、１００ｎＭ未満のＫＤで標的分子に結合するものであり、かつ、該１０Ｆｎ３ドメインは、ＤＫ配列を含有しないＣ末端テールをさらに含むものである。例示的な実施形態では、Ｃ末端テールは配列番号：４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールはシステイン残基をさらに含む。他の実施形態では、Ｃ末端テールは配列番号：５の配列を含む。
【０００８】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、野生型の１０Ｆｎ３ドメインによっては結合されない標的に結合する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＥＧＦＲ、ヒト血清アルブミンまたはＰＣＳＫ９の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＥＧＦＲ、ヒト血清アルブミンまたはＰＣＳＫ９の一以上に結合しない。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組合せ：ｉ）ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲ；ｉｉ）ＥＧＦＲおよび任意の他の標的タンパク質；またはｉｉｉ）ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、の一以上に結合しない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の１０Ｆｎ３ドメインは、１−１０アミノ酸を含むＮ末端伸長をさらに含む。他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の１０Ｆｎ３ドメインは：Ｍ、ＭＧ、Ｇならびに配列番号：１９−２１および２６−３１のいずれかからなる群から選択される配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、第二の１０Ｆｎ３ドメインをさらに含み、ここに、該第二の１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１と少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含み、１００ｎＭ未満のＫＤで標的分子に結合するものであり、かつ、該第二の１０Ｆｎ３ドメインは、ＤＫ配列を含有しないＣ末端テールをさらに含むものである。例示的な実施形態では、第二の１０Ｆｎ３ドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインは異なる標的に結合する。いくつかの実施形態では、第二の１０Ｆｎ３ドメインは１−１０アミノ酸を含むＮ末端伸長をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長は：Ｍ、ＭＧ、Ｇならびに配列番号：１９−２１および２５−３１のいずれかからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインは、１−３０アミノ酸を含むポリペプチドリンカーにより連結される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンリンカーおよびＦｎをベースとするリンカーからなる群から選択される。
【００１１】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループ、ＥＦ；およびループ、ＦＧを含む、一以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、各々、独立して、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて、変化したアミノ酸配列を備える、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される少なくとも一つのループを有する。特定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号：１により表される天然に存在するヒト１０Ｆｎ３ドメインと、少なくとも５０、６０、７０または８０％同一であるアミノ酸配列を含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む二量体である。
【００１２】
別の態様では、本出願はＰＣＴ特許出願国際公開第２００９／１４２７７３号に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体と比べ、低減されたタンパク質断片化に関連する、新規なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
別の態様では、本出願はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。特定の実施形態では、Ｎ１およびＮ２は０−１０アミノ酸を独立して含む任意のＮ末端伸長であり；Ｄ１およびＤ２は、（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）であって、ここに、前記１０Ｆｎ３ドメインは５００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、および（ｉｉ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインであって、ここに、前記１０Ｆｎ３ドメインは５００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２に結合するものである、からなる群から独立して選択され；Ｌは０−３０アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり；Ｃ１は配列番号：４に示されるアミノ酸配列を含み；ならびに、Ｃ２は配列番号：４、５または６に示されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｄ１は配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含み、Ｄ２は配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含むものである。他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｄ１は配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含み、Ｄ２は配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含むものである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｃ２は配列番号：６のアミノ酸配列を含むものである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｎ１はＭ、ＭＧ、Ｇならびに配列番号：１９−２１および２６−３１のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。例示的な実施形態では、Ｎ１は配列番号：１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｎ２はＭ、ＭＧ、Ｇならびに配列番号：１９−２１および２６−３１のいずれか一つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである。例示的な実施形態では、Ｎ２は配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有し、ここに、Ｌは、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンリンカーおよびＦｎをベースとするリンカーからなる群から選択されるポリペプチドリンカーである。他の実施形態では、Ｌは配列番号：７のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ポリオキシアルキレン部分、ヒト血清アルブミン結合タンパク質、シアル酸、ヒト血清アルブミン、トランスフェリン、ＩｇＧ、ＩｇＧ結合タンパク質およびＦｃ断片から選択される一以上の薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、ポリオキシアルキレン部分であり、かつ、前記ポリオキシアルキレン部分はポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、ＣｙｓまたはＬｙｓアミノ酸を介してフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と共有結合によって連結している。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは約０．５ｋＤａおよび約１００ｋＤａの間である。
【００１９】
一態様では、本出願は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬上許容される組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本質的に発熱物質を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、微生物汚染を実質的に含まず、これによって、インビボ投与に適したものとなる。組成物は、例えば、ＩＶ、ＩＰまたは皮下投与のために製剤され得る。いくつかの実施形態では、組成物は生理学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは４．０−６．５の間である。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは４．０−５．５の間である。他の実施形態では、組成物のｐＨは５．５である。他の実施形態では、組成物のｐＨは４．０である。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の濃度は、組成物において５ｍｇ／ｍｌである。
【００２０】
別の態様では、本出願は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬製剤を提供し、ここに、該製剤は少なくとも５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含み、４．０のｐＨを有し、かつ静脈内投与に適しているものである。いくつかの実施形態では、該医薬製剤は、２５℃で４週間、安定である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は４％未満の断片化を有する。いくつかの実施形態では、該製剤は４％未満の凝集を有する。
【００２１】
別の態様では、本出願は、本明細書に記載される任意の組成物の治療有効量を、必要とされる対象へ投与することを含む、対象における過剰増殖性障害（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するための方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本出願は、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸を提供する。このようなタンパク質のためのポリヌクレオチドを含有するベクターも同様に含まれる。適したベクターとして、例えば、発現ベクターが挙げられる。本出願のさらなる態様は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド、ベクターまたは発現ベクターを含む細胞を提供する。配列は、好ましくは、使用される細胞種において発現を最大にするよう最適化される。いくつかの実施形態では、発現は微生物細胞にある。他の実施形態では、発現はほ乳類細胞にある。好ましくは、発現は大腸菌にある。一態様では、細胞はフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を発現する。一態様では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、選択された細胞種における発現のために最適化されたコドンである。また、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸を含む、ヌクレイック（ｎｕｃｌｅｉｃ）、ベクターまたは発現ベクターを含む宿主細胞を培養することと、および培養物から発現されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を回収することを含む、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】２種の濃度のＰＥＧ化Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）に対する、時間経過に伴うタンパク質凝集の量を示す、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）データ。ＰＥＧ化タンパク質は、３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール、ｐＨ５．５中に、１２ヶ月間４℃で保存された。
【図２】２種の濃度のＰＥＧ化Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）に対する、時間経過に伴うタンパク質断片化の量を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。ＰＥＧ化タンパク質は、３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール、ｐＨ５．５中に、１２ヶ月間４℃で保存された。
【図３】ＰＥＧ化Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）に対する、時間経過に伴うタンパク質凝集へのｐＨの影響を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。ＰＥＧ化タンパク質は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４および５に対して）または２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６および７に対して）と、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する製剤中に、３週間２５℃で保存された。
【図４】ＰＥＧ化Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）に対する、時間経過に伴うタンパク質断片化へのｐＨの影響を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。ＰＥＧ化タンパク質は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４および５に対して）または２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６および７に対して）と、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する製剤中に、３週間２５℃で保存された。
【図５】ｐＨ５．５で、１０ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に、４週間２５℃での保存後の、ＰＥＧ化Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）分子（配列番号：２２）の切断部位を示す、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）プロファイル。図に示されるように、タンパク質切断は、以下の位置、Ｄ９５、Ｄ１０６、Ｄ１８０およびＤ２００で直接起こり、大部分は以下の位置、Ｄ９５およびＤ２００で直接起こる。ＰＥＧ化タンパク質は、５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．５中に、２５℃で４週間保存された。
【図６】ＰＥＧ化Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２３）に対する、時間経過に伴うタンパク質凝集へのｐＨの影響を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。ＰＥＧ化タンパク質は、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール、ｐＨ４．０、４．５および５．５中に、２５℃で４週間保存された。
【図７】ＰＥＧ化Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２３）に対する、時間経過に伴うタンパク質断片化の量へのｐＨの影響を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。ＰＥＧ化タンパク質は、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール、ｐＨ４．０、４．５および５．５中に、２５℃で４週間保存された。
【図８】５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール、ｐＨ４．０中に、４週間２５℃での保存後の、ＰＥＧ化Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２３）の切断部位を示す、ＲＰ−ＨＰＬＣプロファイル。図に示されるように、タンパク質切断は、以下の位置、Ｄ９５、Ｄ１９９およびＤ２１８で直接起こる。
【図９】様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質構築体に対する、時間経過に伴うタンパク質凝集へのｐＨの影響を示す、ＳＥ−ＨＰＬＣデータ。様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に対する凝集レベルが、２５℃で４週間の保存の間、ｐＨ５．５またはｐＨ４．０のいずれかで試験された。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）は配列番号：２３であり；Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）は配列番号：２４であり；Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）は配列番号：２５であり；かつ、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）は配列番号：２２である。
【図１０】２５℃で４週間の保存の間の、種々のｐＨでの様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の断片化の量を示す、ＲＰ−ＨＰＬＣデータ。ＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ｐＨ５．５と比較して、ｐＨ４．０で断片化の影響をより受けやすい。ＤＫ配列を含有しないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と比較して、ｐＨ４．０で断片化に対してより抵抗性である。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）は配列番号：２３であり；Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）は配列番号：２４であり；Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）は配列番号：２５であり；かつ、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）は配列番号：２２である。
【図１１】Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）分子（配列番号：２４）における主要な切断部位がＤ１９９である一方、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）分子（配列番号：２３）における主要な切断部位がＤ２１８であることを実証する、ＬＣ−ＭＳデータ。
【図１２】Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）分子（配列番号：２５）における主要な切断部位がＤ１９９であることを実証する、ＬＣ−ＭＳデータ。
【図１３】ＳＥ−ＨＰＬＣ解析により評価される、最長２ヶ月間２５℃での保存下で、ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）およびＶＩ（ＤＫ−）（配列番号：５７）において観察される凝集率。
【図１４】ＲＰ−ＨＰＬＣ解析により評価される、最長２ヶ月間２５℃での保存下で、ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）およびＶＩ（ＤＫ−）（配列番号：５７）において観察されるクリップ率。
【図１５】２５℃で２ヶ月間のインキュベーション後の、ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）およびＶＩ（ＤＫ−）（配列番号：５７）のＲＰ−ＨＰＬＣの重ね合わせた（ｏｖｅｒｌａｉｄ）クロマトグラムのクリップ領域。ＶＩ（ＤＫ＋）に対する総％クリップは１６％であるのに対し、ＶＩ（ＤＫ−）に対しては６．９％である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
定義
「ポリペプチド」によって、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、二以上のアミノ酸の任意の配列が意味される。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用される。ポリペプチドは、出典明示により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５５９，１２６号に記載されるものなどの天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた、種々の標準的な化学法のいずれかで修飾されていてもよい（例えば、アミノ酸は保護基で修飾されていてもよい；カルボキシ末端アミノ酸は、末端アミド基にされてもよい；アミノ末端残基は、例えば、親油性を増強するための基で修飾されてもよい；またはポリペプチドは、化学的にグリコシル化されていてもよく、あるいは、安定性もしくはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）半減期を増大するよう修飾されていてもよい）。ポリペプチド修飾は、ポリペプチドへの、環状化合物または他の分子などの別の構造の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を含み、また変化した立体配置（すなわち、ＲもしくはＳ；または、ＬもしくはＤ）で一以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含み得る。
【００２５】
本明細書において、「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」とは、配列同一性の一部分として保存的置換は全く考慮することなく、最大配列同一性パーセントを達成するために、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、選択された配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的上、アラインメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者ならば、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定できる。しかしながら、本明細書における目的上、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータープログラムＡＬＩＧＮ−２を用いることによって、以下に記載されるように得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著作され、ユーザー文書とともに米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９に提出されており、ここでは、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．を通じて公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄで使用するために作成されるべきである。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００２６】
本明細書における目的上、所与のアミノ酸配列Ｂと、それに関して、または、それに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂと、それに関して、または、それに対して特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現される場合もある）は、以下のとおりに算出される：１００×Ｘ／Ｙ比、式中、ＸはＡおよびＢのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一マッチとしてスコアリングされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。当然のことではあるが、アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは等しくならない。
【００２７】
用語「治療有効量」とは、ほ乳類における疾患または障害を治療するために有効な薬物の量を指す。癌の場合には、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を低減し得る；腫瘍の大きさを低減し得る；末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度遅延し得る、好ましくは、停止し得る）；腫瘍増殖をある程度阻害し得る；および／または障害と関連している一以上の症状をある程度軽減し得る。薬物が増殖を妨げ、かつ／または既存の癌細胞を死滅させ得る限り、細胞分裂停止性および／または細胞傷害性であり得る。癌治療について、インビボでの有効性は、例えば、無増悪期間（ｔｉｍｅ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）（ＴＴＰ）を評価することおよび／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定できる。
【００２８】
アミノ酸配列または化合物の半減期は、一般に、インビボでポリペプチドの血清濃度が、例えば、天然の機序による、配列もしくは化合物の分解および／または配列もしくは化合物のクリアランスもしくは隔離によって５０％低減されるのにかかる時間として定義され得る。半減期は、薬物動態解析によってなど、それ自体公知の任意の方法で決定できる。適した技術は、当業者には明らかであり、例えば、通常治療される霊長類に、アミノ酸配列または化合物の適した用量を適宜投与する工程；前記霊長類から定期的に血液サンプルまたは他のサンプルを採取する工程；前記血液サンプル中の本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのように得られたデータ（のプロット）から、本発明のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与時の初期レベルと比べて５０％低減されるまでの時間を算出する工程を含み得る。例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ  ｅｔ  ａｌ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）などの標準的なハンドブックが参照される。Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、２ｎｄ  Ｒｅｖ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８２）により公開された「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｍ  Ｇｉｂａｌｄｉ＆Ｄ  Ｐｅｒｒｏｎもまた参照される。
【００２９】
半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメーターを用いて表現され得る。本明細書において、「半減期の増大」とは、これらのパラメーターのうちいずれか１種、例えば、これらのパラメーターのうち任意の２種、または本質的に３種のこれらのパラメーターの全ての増大を指す。「半減期の増大」とは、特に、ｔ１／２−αおよび／またはＡＵＣまたは両方の増大を伴うか、または伴わない、ｔ１／２−βの増大を指す。
【００３０】
概説
本明細書には、増大した安定性に関連する、改善されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が記載されている。本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一以上の所望の標的に結合するように修飾された、一以上の第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む。本明細書にはまた、１つがＶＥＧＦＲ２に特異的に結合するように修飾され、１つがＩＧＦ−ＩＲに特異的に結合するように修飾された、２つのヒト第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含み、増大した安定性に関連する、改善されたＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲ二重特異的フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体が記載されている。ＰＣＴ特許出願国際公開第２００９／１４２７７３号には、共有結合によって、または非共有結合によって連結されることができ、かつＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲの両方に結合する、フィブロネクチン足場多量体が記載されている。本出願は、幾分かは、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲに結合する二重特異的なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が、特定のアスパラギン酸残基で、高頻度の断片化を受けるという驚くべき発見に関する。特に、リジン残基が直接後に続くアスパラギン酸残基が、他のアミノ酸が後に続くアスパラギン酸残基と比べて、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質において、切断に対してより感受性であることが発見された。本出願はまた、同一の保管条件およびこれらの類似するタンパク質間で共有される配列同一性の高いパーセンテージにもかかわらず、ＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の断片化の程度が、関連するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、すなわち、二重特異的なＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に関連する断片化の程度よりも相当高い、という驚くべき発見に関する。本出願はまた、ＤＫ部位が除去、または、異なるアミノ酸、例えばグルタミン酸でアスパラギン酸残基を置換するために修飾される場合、モデルのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の断片化が著しく低減されることを実証する。本明細書において、保管の間、増大した安定性を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の改善された組成物もまた提供される。
【００３１】
フィブロネクチンをベースとする足場
Ｆｎ３はフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインを指す。Ｆｎ３ドメインは小さく、単量体であって、可溶性で、かつ安定である。それはジスルフィド結合を欠くため、還元条件下でも安定である。Ｆｎ３の全体構造は免疫グロブリンと似ている。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順に、βまたはβ様鎖、Ａ；ループ、ＡＢ；βまたはβ様鎖、Ｂ；ループ、ＢＣ；βまたはβ様鎖、Ｃ；ループ、ＣＤ；βまたはβ様鎖、Ｄ；ループ、ＤＥ；βまたはβ様鎖、Ｅ；ループ、ＥＦ；βまたはβ様鎖、Ｆ；ループ、ＦＧ；およびβまたはβ様鎖、Ｇを含む。７つの逆平行β鎖は、安定なコアを形成する２つのβシートとしてまとめられ、一方で、βまたはβ様鎖に結合するループから構成される２つの「顔」を作成している。ループＡＢ、ＣＤおよびＥＦは１つの顔に位置し、ループＢＣ、ＤＥおよびＦＧは反対側の顔に位置する。任意の、または全てのループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧが、リガンド結合に参加し得る。少なくとも１５種のＦｎ３の異なるモジュールが存在し、モジュール間の配列相同性は低いが、それらは全て三次構造において高い類似性を共有する。
【００３２】
アドネクチン商標（Ａｄｎｅｘｕｓ，ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ）は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、すなわちＦｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に基づくリガンド結合足場タンパク質である。天然に存在するヒト１０Ｆｎ３のアミノ酸配列は、配列番号：３７に示される：
【化１】
0006023703.tif 000002
【００３３】
配列番号：３７において、ＡＢループは残基１５−１６に対応し、ＢＣループは残基２１−３０に対応し、ＣＤループは残基３９−４５に対応し、ＤＥループは残基５１−５６に対応し、ＥＦループは残基６０−６６に対応し、かつＦＧループは残基７６−８７に対応する。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２  ９：９３３−９４２を参照のこと。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは分子の１つの顔に沿って整列し、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは分子の反対側の顔に沿って整列する。配列番号：３７において、β鎖Ａは残基９−１４に対応し、β鎖Ｂは残基１７−２０に対応し、β鎖Ｃは残基３１−３８に対応し、β鎖Ｄは残基４６−５０に対応し、β鎖Ｅは残基５７−５９に対応し、β鎖Ｆは残基６７−７５に対応し、かつβ鎖Ｇは残基８８−９４に対応する。鎖は、対応するループを介して互いに結合する、例えば、鎖ＡおよびＢは、鎖Ａ、ループＡＢ、鎖Ｂの順番で、ループＡＢを介して結合する等。配列番号：３７の最初の８アミノ酸（上記斜字体）は、分子の結合活性を保有しながら、欠失され得る。配列番号：３７において、疎水性コアの形成に関与する残基（「コアアミノ酸残基」）は、配列番号：３７の以下のアミノ酸：Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０およびＹ９２に対応するアミノ酸を含み、ここに、該コアアミノ酸残基は、一文字アミノ酸コードと、それに続く配列番号：３７内でそれらが位置する位置によって表されている。例えば、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３６：１０７９−１０９２（１９９４）を参照のこと。
【００３４】
１０Ｆｎ３ドメインは、構造的および機能的に抗体、特に抗体の可変領域に類似している。１０Ｆｎ３ドメインは「抗体模倣物」または「抗体様タンパク質」と記載され得る一方、それらは従来の抗体を超える多数の利点を示す。特に、それらは抗体に比べてより良好なフォールディングと熱安定性特性を示し、また、特定の条件下で正しいフォールディングを妨害もしくは阻害すると知られているジスルフィド結合を欠く。
【００３５】
１０Ｆｎ３ドメインのＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似している。これらのループ領域でのアミノ酸配列の変化が、１０Ｆｎ３の結合特性を変化させる。ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループでの修飾を備える１０Ｆｎ３ドメインもまた、所望の標的に結合する分子を生成するために作製され得る。ループの外側のタンパク質配列は免疫グロブリン由来のフレームワーク領域に類似し、１０Ｆｎ３の構造的立体配座（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）において役割を果たす。１０Ｆｎ３のフレームワーク様領域における変化は、リガンド結合を撹乱するほど構造的立体配座が変化されない限り、許容される。１０Ｆｎ３リガンド特異的バインダーを生成するための方法は、高親和性ＴＮＦαバインダーを開示するＰＣＴ国際公開第００／０３４７８７号、同第０１／６４９４２号および同第０２／０３２９２５号、高親和性ＶＥＧＦＲ２バインダーを開示するＰＣＴ国際公開第２００８／０９７４９７号、高親和性ＩＧＦ−ＩＲバインダーを開示するＰＣＴ国際公開第２００８／０６６７５２号、ならびに高親和性多価ＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲバインダーを開示するＰＣＴ国際公開第２００９／１４２７７３号に記載される。１０Ｆｎ３バインダーおよびバインダーを選択するための方法を議論するさらなる参考文献には、ＰＣＴ国際公開第９８／０５６９１５号、同第０２／０８１４９７号および同第２００８／０３１０９８号、ならびに米国特許出願公開第２００３／０１８６３８５号が挙げられる。
【００３６】
上述のように、配列番号：３７の残基２１−３０、５１−５６および７６−８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを定義する。しかしながら、ＶＥＧＦＲ２またはＩＧＦ−ＩＲなどの、所望の標的に対する強い親和性を有する１０Ｆｎ３結合ドメインを獲得するために、ループ領域内の全ての残基が修飾される必要があるというわけではないことが理解されるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、ＢＣループのアミノ酸２３−２９、ＤＥループのアミノ酸５２−５５およびＦＧループのアミノ酸７７−８６に対応する残基のみが修飾され、高親和性１０Ｆｎ３バインダーを生成した（例えば、配列番号：３を有するＶＥＧＦＲ２結合コアを参照）。従って、特定の実施形態では、ＢＣループは配列番号：３７の残基２３−２９に対応するアミノ酸配列により定義され、ＤＥループは配列番号：３７の残基５２−５５に対応するアミノ酸配列により定義され、かつＦＧループは配列番号：３７の残基７７−８６に対応するアミノ酸配列により定義される。
【００３７】
さらに、高親和性１０Ｆｎ３結合ドメインを生成しながら、ループ領域における挿入および欠失もまた作製され得る。例えば、配列番号：３を有するＶＥＧＦＲ２バインダーのＦＧループは野生型１０Ｆｎ３ドメインと同じ長さのＦＧループを有する、すなわち、配列番号：３７の１０個の残基７７−８６が配列番号：３の１０個の残基６９−７８で交換された。対照的に、配列番号：２を有するＩＧＦ−ＩＲバインダーのＦＧループは野生型１０Ｆｎ３ドメインの対応するＦＧループよりも長さにおいて短い、すなわち、配列番号：３７の１０個の残基７７−８６が配列番号：２の６個の残基６９−７４で交換された。最終的に、配列番号：３９を有するＥＧＦＲバインダーのＦＧループは野生型１０Ｆｎ３ドメインの対応するＦＧループよりも長さにおいて短い、すなわち、配列番号：３７の１０個の残基７７−８６が配列番号：３９の１５個の残基６９−８３で交換された。
【００３８】
従って、いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される一以上のループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３における対応するループと比べて、長さにおいて伸長または短縮されてもよい。いくつかの実施形態では、ループの長さを２−２５アミノ酸分、伸長することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さを１−１１アミノ酸分、短縮することができる。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループは１２残基長である一方、抗体重鎖における対応するループは４から２８残基の範囲である。それゆえ、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、４−２８残基のＣＤＲ３の範囲を覆うように、長さならびに配列において変化され、抗原結合において最も高い可能な可動性および親和性を獲得する。いくつかの実施形態では、インテグリン結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）（配列番号：３７のアミノ酸７８−８０）の一以上の残基が、インテグリン結合を撹乱するように交換され得る。一実施形態では、ＲＧＤ配列は、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端方向）により交換される。別の実施形態では、ＲＧＤ配列はＳＧＥで交換される。
【００３９】
１０Ｆｎ３、つまり「１０Ｆｎ３足場」の非リガンド結合配列は、１０Ｆｎ３ドメインがリガンド結合機能および／または構造安定性を保持するという条件で、変化され得る。いくつかの実施形態では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３の一以上は、たとえば、非負荷電アミノ酸残基（たとえばＡｓｎ、Ｌｙｓ等）などの他のアミノ酸により交換される。これらの変異は、野生型形態と比べて、中性ｐＨにて、変異体１０Ｆｎ３のより大きな安定性を促進する効果を有することが報告された（ＰＣＴ国際公開第０２／０４５２３号を参照されたい）。有益なまたは中間的な１０Ｆｎ３足場における様々なさらなる改変が開示されている。例えば、Ｂａｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２００２  １５（１２）：１０１５−２０；Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１  ４０（３４）：１０３２６−３３を参照されたい。
【００４０】
１０Ｆｎ３足場は、一以上の保存的置換によって修飾され得る。１０Ｆｎ３足場中の５％、１０％、２０％、またはさらに３０％以上ものアミノ酸が、リガンドに対する１０Ｆｎ３の親和性を実質的に変化することなく、保存的置換により変化され得る。特定の実施形態では、足場は、約０−１５、０−１０、０−８、０−６、０−５、０−４、０−３、１−１５、１−１０、１−８、１−６、１−５、１−４、１−３、２−１５、２−１０、２−８、２−６、２−５、２−４、５−１５または５−１０個の保存的アミノ酸置換を含み得る。例示的な実施形態では、足場修飾は、好ましくは、リガンドに対する１０Ｆｎ３バインダーの結合親和性を１００分の１、５０分の１、２５分の１、１０分の１、５分の１、または２分の１未満まで低下させる。このような変化は、インビボで１０Ｆｎ３の免疫原性を変化する場合があり、免疫原性が減少する場合には、このような変化は望ましいであろう。本明細書で用いる場合、「保存的置換基」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似している残基である。すなわち、保存的置換基およびその参照残基は、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２  （１９７８  ＆  Ｓｕｐｐ．）において承認された点突然変異について定義された基準を満たすものである。保存的置換の例は、以下のグループ内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。
【００４１】
一態様において、本出願はフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、例えば、少なくとも一つの１０Ｆｎ３ドメインを含み、ＤＫ配列を欠くＣ末端テールを有するポリペプチドを提供する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。このようなフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一以上のＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場と比べて、改善された安定性を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するヒト１０Ｆｎ３ドメインと、少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。変動（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）の大半は、一般に一以上のループで起こる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれのβまたはβ様鎖は、このような変動が生理学的条件においてポリペプチドの安定性を撹乱しないという条件で、配列番号：１の対応するβまたはβ様鎖の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。例示的な実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤで所望の標的に結合する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、野生型１０Ｆｎ３ドメイン、特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインによって結合されない標的に、特異的に結合する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本開示内容は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドを提供し、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは、ループ、ＡＢ；ループ、ＢＣ；ループ、ＣＤ；ループ、ＤＥ；ループ、ＥＦ；およびループ、ＦＧを含み、かつ、ヒト１０Ｆｎ３ドメインの対応するループの配列と比べて変化したアミノ酸配列を備えるループＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される、少なくとも一つのループを有するものである。いくつかの実施形態では、ＢＣおよびＦＧループが変化されている。いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループが変化されている、すなわち該１０Ｆｎ３ドメインは天然に存在しないループを含む。「変化した」によって、鋳型配列（すなわち対応するヒトフィブロネクチンドメイン）に比べて一以上のアミノ酸配列変化を意味し、アミノ酸付加、欠失および置換を含む。アミノ酸配列を変化させることは、一般に核酸コード配列の意図的、盲目的、または自発的な配列変動を通して達成されてもよく、任意の技術、たとえばＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、または化学的ＤＮＡ合成によって起こってもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧから選択される一以上のループは、対応するヒトフィブロネクチンループと比べて、長さにおいて伸長または短縮してもよい。いくつかの実施形態では、ループの長さは２−２５アミノ酸分、伸長することができる。いくつかの実施形態では、ループの長さは１−１１アミノ酸分、短縮することができる。特に、ヒト１０Ｆｎ３のＦＧループは１２残基長である一方、抗体重鎖における対応するループは４−２８残基の範囲である。それゆえ、抗原結合を最適化するために、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さは、４−２８残基のＣＤＲ３の範囲を覆うように、長さならびに配列において変化され、抗原結合において最も高い可能な可動性および親和性を獲得する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、少なくとも一つの選択されたＢＣ、ＤＥおよびＦＧが変化される、配列番号：１の非ループ領域と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または１００％同一のアミノ酸配列を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、変化したＢＣループは、最大１０のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１０のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、変化したＤＥループは、最大６のアミノ酸置換、最大４のアミノ酸欠失、最大１３のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。いくつかの実施形態では、ＦＧループは、最大１２のアミノ酸置換、最大１１のアミノ酸欠失、最大２５のアミノ酸挿入、またはそれらの組合せを有する。
【００４６】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一般に以下の配列により定義される１０Ｆｎ３ドメインを含む：
【化２】
0006023703.tif 000003
配列番号：３８において、ＢＣループはＸｘにより表され、ＤＥループはＸｙにより表され、かつＦＧループはＸｚにより表される。Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸の数の整数値を表す。特に、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、約２−２０、２−１５、２−１０、２−８、５−２０、５−１５、５−１０、５−８、６−２０、６−１５、６−１０、６−８、２−７、５−７、または６−７個のアミノ酸の範囲であり得る。好ましい実施形態では、ｘは７アミノ酸、ｙは４アミノ酸、かつｚは６、１０または１５アミノ酸である。β鎖の配列（下線）は、配列番号：３８に示される対応するアミノ酸に比べて、７種の足場領域の全てにわたって、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で置換、欠失または付加を有し得る。例示的な実施形態では、β鎖の配列は、配列番号：３８に示される対応するアミノ酸に比べて、全ての７種の足場領域にわたって、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で保存的置換を有し得る。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定され、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。太字で示されるＥＩＥＫテール（配列番号：４）は固定される。特定の実施形態では、ループ領域を直接挟むアミノ酸（例えば、下線を引かれていない残基）は、それぞれ独立して、置換または欠失され得る。ループを直接挟む残基を置換する時、各残基は同数のアミノ酸を有する配列で、またはより多くのアミノ酸配列（例えば、０−１０、０−８、０−５、０−３もしくは０−２個のアミノ酸残基の挿入）で置換され得る。下線を引かれていない残基はループ領域の一部分であり、そのため、１０Ｆｎ３ドメインの構造に著しく影響を与えることなく、置換を受け入れる。
【００４７】
１０Ｆｎ３ドメインは一般に、配列番号：３７のアミノ酸番号１から開始する。しかしながら、アミノ酸欠失を備えるドメインもまた、本発明により包含される。いくつかの実施形態では、配列番号：３７の最初の８アミノ酸が欠失している。さらなる配列もまた、配列番号：３７の１−９４に対応するアミノ酸または配列番号：３７のアミノ酸９−９４を有する、１０Ｆｎ３ドメインのＮまたはＣ末端に付加され得る。例えば、さらなるＭＧ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に配置されてもよい。このＭは通常切断され、Ｎ末端にＧが残るだろう。いくつかの実施形態では、Ｎ末端伸長は、Ｍ、ＭＧ、Ｇおよび配列番号：１９−２１のいずれかからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００４８】
１０Ｆｎ３ドメインは、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸のＮ末端伸長を任意に含み得る。例示的なＮ末端伸長は、（一文字アミノ酸コードにより表わされる）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：１９）、ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２０）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２１）、または配列番号：１９、２０もしくは２１のいずれか１つのＮ末端切断型（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む。他の適したＮ末端伸長は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２６）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２７）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号：２８）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号：２９）、ＸｎＲＤＬ（配列番号：３０）、ＸｎＤＬ（配列番号：３１）またはＸｎＬを含み、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。Ｍｅｔ−Ｇｌｙ配列が１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端に付加される場合、このＭは通常切断され、Ｎ末端にＧが残るだろう。
【００４９】
本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。例示的なＣ末端テールは、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５または１−４アミノ酸であるポリペプチドを含む。テール配列の具体的な例は、例えば、ＥＩＥＫ（配列番号：４）、ＥＧＳＧＣ（配列番号：５）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）、ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）を含む、必須としてなる、またはからなる、ポリペプチドを含む。このようなＣ末端配列は本明細書においてテールまたは伸長と呼ばれ、本明細書でさらに記載される。例示的な実施形態では、Ｃ末端テールは配列番号：６のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、Ｃ末端配列はＤＫ配列を欠く。例示的な実施形態では、Ｃ末端テールは、ＰＥＧによる修飾を容易にする残基、すなわちリジンまたはシステイン残基を含む。好ましい実施形態では、Ｃ末端テールはＤＫ配列を欠き、システイン残基を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を有する１０Ｆｎ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓ６−タグがＮ末端またはＣ末端に配置されてもよい。
【００５１】
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインを含む。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、５００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２に結合し、ＢＣループは配列番号：４３のアミノ酸配列を含み、ＤＥは配列番号：４４のアミノ酸配列を含み、ＦＧループは配列番号：４５のアミノ酸配列を含み、かつ該タンパク質はＤＫ配列を欠くＣ末端テールを含む。例示的な実施形態では、Ｃ末端テールはＥＩＥＫ（配列番号：４）、ＥＧＳＧＣ（配列番号：５）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）、ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）を含む。好ましい実施形態では、Ｃ末端テールはＥＩＥＫ（配列番号：４）またはＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含む多価タンパク質である。例えば、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、共有結合される２、３またはそれより多い１０Ｆｎ３ドメインを含んでもよい。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む二価または二量体タンパク質である。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、第一の標的分子に結合する第一の１０Ｆｎ３ドメインおよび第二の標的分子に結合する第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む。第一および第二の標的分子は同一または異なる標的分子であってもよい。第一および第二の標的分子が同一である場合、１０Ｆｎ３ドメイン、すなわち結合ループは、同一または異なっていてもよい。それゆえ、第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインは、同一の標的ではあるが異なるエピトープで結合する。
【００５３】
例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の各１０Ｆｎ３ドメインは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤで所望の標的に結合する。例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の各１０Ｆｎ３ドメインは、野生型１０Ｆｎ３ドメイン、特に野生型ヒト１０Ｆｎ３ドメインによって結合されない標的に、特異的に結合する。
【００５４】
多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における１０Ｆｎ３ドメインは、ポリペプチドリンカーにより結合され得る。例示的なポリペプチドリンカーとして、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３または１−２アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、該リンカーは、本明細書に記載されるＣ末端テールポリペプチド、本明細書に記載されるＮ末端伸長ポリペプチド、以下に記載されるリンカーポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００５５】
多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の場合には、好ましくは１０Ｆｎ３ドメインのどれもがＤＫ配列を含有するＣ末端テールを含まない。例示的な実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここに、各ドメインは、ＤＫ配列を含有しないＣ末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここに、各ドメインは、ＤＫ配列を含有せず、リジンまたはシステイン残基などの、ＰＥＧ部分の付加のために適した残基を含有するＣ末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここに、各ドメインは、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含むものである。特定の実施形態では、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二以上の１０Ｆｎ３ドメインを含み、ここに、Ｎ末端１０Ｆｎ３ドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、Ｃ末端１０Ｆｎ３ドメインはＥＩＥＫ（配列番号：４）、ＥＧＳＧＣ（配列番号：５）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）、ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含むものである。
【００５６】
１０Ｆｎ３ドメインのループ配列を変えることにより、任意の所望の標的に結合するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成することができる。例示的な実施形態では、増大した安定性を有する、本明細書で提供されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、例えば、ＴＮＦα、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲまたはＥＧＦＲなどの治療上望ましい標的に結合し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的：ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＳＡおよびＰＣＳＫ９、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的：ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＳＡおよびＰＣＳＫ９、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、単一の１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的：ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＳＡおよびＰＣＳＫ９、または前述のいずれかの断片、のいずれかに結合しない。特定の実施形態では、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、以下の標的：ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＨＳＡおよびＰＣＳＫ９、または前述のいずれかの断片、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組み合わせ：ｉ）ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲ；ｉｉ）ＥＧＦＲおよび任意の他の標的タンパク質；またはｉｉｉ）ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、の一以上に結合しない。特定の実施形態では、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、標的分子の以下の組み合わせ：ｉ）ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−ＩＲ；ｉｉ）ＥＧＦＲおよび任意の他の標的タンパク質；またはｉｉｉ）ヒト血清アルブミンおよび任意の他の標的タンパク質、のいずれかに結合しない。
【００５７】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体
特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む二量体である。一実施形態では、本出願は、（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：４−６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、１０Ｆｎ３ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４４のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４５のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：４−６のいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＶＥＧＦＲ２に結合するものである、１０Ｆｎ３ドメイン：からなる群から選択される第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。例示的な実施形態では、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤでその標的に結合する。
【００５８】
特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＩＧＦ−ＩＲ結合ドメインおよびＶＥＧＦＲ２結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、（ｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、第一の１０Ｆｎ３ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４４のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４５のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＶＥＧＦＲ２に結合するものである、第二の１０Ｆｎ３ドメイン：を含む。例示的な実施形態では、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤでその標的に結合する。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＶＥＧＦＲ２結合ドメインおよびＩＧＦ−ＩＲ結合ドメインを含む。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、（ｉ）配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４４のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４５のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＶＥＧＦＲ２に結合するものである、第一の１０Ｆｎ３ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループ、および配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣ末端テールを含み、ＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、第二の１０Ｆｎ３ドメイン：を含む。例示的な実施形態では、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤでその標的に結合する。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、（ｉ）配列番号：２と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、配列番号：４−６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＣ末端テールを含む、必須としてなる、またはからなるものであり、ＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、１０Ｆｎ３ドメイン；ならびに（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、配列番号：４−６のいずれか一つのアミノ酸配列を有するＣ末端テールを含む、必須としてなる、またはからなるものであり、ＶＥＧＦＲ２に結合するものである、１０Ｆｎ３ドメイン：からなる群から選択される第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインのそれぞれは、５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤでその標的に結合する。例示的な実施形態では、第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインはポリペプチドリンカーを介して連結される。特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｎ末端ＶＥＧＦＲ２結合１０Ｆｎ３ドメインおよびＣ末端ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｎ末端ＩＧＦ−ＩＲ結合１０Ｆｎ３ドメインおよびＣ末端ＶＥＧＦＲ２結合１０Ｆｎ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端１０Ｆｎ３ドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を有するＣ末端テールを含み、Ｃ末端１０Ｆｎ３ドメインは配列番号：６のアミノ酸配列を有するＣ末端テールを含む。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：４８−５５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：４８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：４８−５５のいずれか一つのアミノ酸配列と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、Ｖ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｎ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有するポリペプチドを含み、ここに、Ｎ１およびＮ２は０−１０アミノ酸を独立して含む任意のＮ末端伸長であり、Ｄ１およびＤ２は、（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは５００ｎＭ、１００ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ未満またはそれ以下のＫＤでＩＧＦ−ＩＲに結合するものである、および（ｉｉ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性を有する１０Ｆｎ３ドメイン、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは５００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２に結合するものである：からなる群から独立して選択され；Ｌは０−３０アミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーであり；Ｃ１は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり；Ｃ２は配列番号：４、５または６のアミノ酸配列のいずれか一つを含む、必須としてなる、またはからなるものである。特定の実施形態では、Ｄ１はＶＥＧＦＲ２に結合し、Ｄ２はＩＧＦ−ＩＲに結合する。他の実施形態では、Ｄ１はＩＧＦ−ＩＲに結合し、Ｄ２はＶＥＧＦＲ２に結合する。
【００６３】
特定の実施形態では、Ｄ１またはＤ２領域は、配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４４のアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するＦＧループを含む、ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインであって、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは１００ｎＭ未満のＫＤでＶＥＧＦＲ２に結合するものである。
【００６４】
特定の実施形態では、Ｄ１またはＤ２領域は、以下のアミノ酸配列により表されるＶＥＧＦＲ２バインダーである：
【化３】
0006023703.tif 000004
配列番号：３において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは太字で示される固定された配列を有し（例えば、配列番号：４３のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４４のアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号：４５のアミノ酸配列を有するＦＧループ）、かつ、下線が引かれた残りの配列（例えば、７つのβ鎖ならびにＡＢ、ＣＤおよびＥＦループの配列）は、配列番号：３に示される対応するアミノ酸と比べて、０から２０、０から１５、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で置換、保存的置換、欠失または付加を有する。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定され、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。
【００６５】
ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインは、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸のＮ末端伸長（Ｎ１またはＮ２）に、任意に連結され得る。例示的なＮ末端伸長は、（一文字アミノ酸コードにより表わされる）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：１９）、ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２０）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２１）、または配列番号：１９、２０もしくは２１のいずれか１つのＮ末端切断型（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む。他の適したＮ末端伸長は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２６）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２７）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号：２８）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号：２９）、ＸｎＲＤＬ（配列番号：３０）、ＸｎＤＬ（配列番号：３１）またはＸｎＬを含み、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。好ましい実施形態では、Ｎ１は、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、Ｎ２は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。
【００６６】
ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｃ末端テール（Ｃ１またはＣ２）を任意に含み得る。クレームされる発明のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＣ末端テールは、ＤＫ配列を含有しない。例示的なＣ末端テールとして、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸であるポリペプチドが挙げられる。Ｃ末端テールの具体例として、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）およびＥＩＥＫ（配列番号：４）が挙げられる。他の実施形態では、適したＣ末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列（一文字アミノ酸コードにより表わされる）の一つ：ＥＩＥ、ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）を含む、配列番号：４、６または３２のＣ末端切断された断片であってもよい。他の適したＣ末端テールには、例えば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号：３６）またはＥＧＳＧＣ（配列番号：５）が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ１は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。特定の実施形態では、Ｃ２は、配列番号：４、５または６のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、Ｃ１は、配列番号：４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｃ２は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。
【００６７】
特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、Ｎ１はＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まり、Ｃ１はシステイン残基を含有せず、Ｎ２はＭｅｔで開始せず、かつＣ２はシステイン残基を含む。ＶＥＧＦＲ２に結合する１０Ｆｎ３ドメインの具体例は：（ｉ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。
【００６８】
特定の実施形態では、Ｄ１またはＤ２領域は、配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループを含む、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインであって、ここに、該１０Ｆｎ３ドメインは１００ｎＭ未満のＫＤでＩＧＦ−ＩＲに結合するものである。
【００６９】
特定の実施形態では、Ｄ１またはＤ２領域は、以下のアミノ酸配列により表されるＩＧＦ−ＩＲバインダーである：
【化４】
0006023703.tif 000005
配列番号：２において、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは太字で示される固定された配列を有し（例えば、配列番号：４０のアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号：４１のアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号：４２のアミノ酸配列を有するＦＧループ）、かつ、下線が引かれた残りの配列（例えば、７つのβ鎖ならびにＡＢ、ＣＤおよびＥＦループの配列）は、配列番号：２に示される対応するアミノ酸と比べて、０から２０、０から１５、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で置換、保存的置換、欠失または付加を有する。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定され、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。
【００７０】
ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸のＮ末端伸長（Ｎ１またはＮ２）に、任意に連結され得る。例示的なＮ末端伸長は、（一文字アミノ酸コードにより表わされる）Ｍ、ＭＧ、Ｇ、ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：１９）、ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２０）およびＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２１）、または配列番号：１９、２０もしくは２１のいずれか１つのＮ末端切断型（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む。他の適したＮ末端伸長は、例えば、ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２６）、ＸｎＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２７）、ＸｎＶＰＲＤＬ（配列番号：２８）、ＸｎＰＲＤＬ（配列番号：２９）、ＸｎＲＤＬ（配列番号：３０）、ＸｎＤＬ（配列番号：３１）またはＸｎＬを含み、ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１である場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２である場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである。好ましい実施形態では、Ｎ１は、配列番号：１９のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、Ｎ２は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。
【００７１】
ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｃ末端テール（Ｃ１またはＣ２）を任意に含み得る。クレームされる発明のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＣ末端テールは、ＤＫ配列を含有しない。例示的なＣ末端テールとして、長さにおいて１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３、１−２または１アミノ酸であるポリペプチドが挙げられる。Ｃ末端テールの具体例として、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）、ＥＩＥＫＰＣＱ（配列番号：６）およびＥＩＥＫ（配列番号：４）が挙げられる。他の実施形態では、適したＣ末端テールは、例えば、以下のアミノ酸配列（一文字アミノ酸コードにより表わされる）の一つ：ＥＩＥ、ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）、ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）またはＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）を含む、配列番号：４、６または３２のＣ末端切断された断片であってもよい。他の適したＣ末端テールには、例えば、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、ＥＧＣ、ＥＧＳＧＳ（配列番号：３６）またはＥＧＳＧＣ（配列番号：５）が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃ１は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。特定の実施形態では、Ｃ２は、配列番号：４、５または６のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。好ましい実施形態では、Ｃ１は、配列番号：４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｃ２は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなる。
【００７２】
特定の実施形態では、ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端伸長およびＣ末端テールの両方を含む。例示的な実施形態では、Ｎ１はＧｌｙまたはＭｅｔ−Ｇｌｙで始まり、Ｃ１はシステイン残基を含有せず、Ｎ２はＭｅｔで開始せず、かつＣ２はシステイン残基を含む。ＩＧＦ−ＩＲに結合する１０Ｆｎ３ドメインの具体例は：（ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。
【００７３】
Ｌ領域はポリペプチドリンカーである。例示的なポリペプチドリンカーとして、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３または１−２アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。特定の実施形態では、該リンカーは、本明細書に記載されるＣ末端テールポリペプチド、本明細書に記載されるＮ末端伸長ポリペプチド、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００７４】
特定の実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｌ、Ｃ１またはＣ２の一以上が、システインまたはリジン残基などの、ＰＥＧ化に適したアミノ酸残基を含み得る。例示的な実施形態では、Ｃ２が、システインまたはリジン残基などの、ＰＥＧ化に適した少なくとも一つのアミノ酸を含む。適したポリペプチドリンカーの具体例は、以下にさらに記載される。Ｎ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の具体例は：（ｉ）配列番号：４８−５５のいずれか一つに示されるアミノ酸配列または（ｉｉ）配列番号：４８−５５のいずれか一つと、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドである。
【００７５】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有し、ここに、Ｄ１およびＤ２は、各々、以下の配列を有するアミノ酸配列を含むものである：
【化５】
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配列番号：３８において、ＢＣループはＸＸにより表され、ＤＥループはＸｙにより表され、かつＦＧループはＸｚにより表される。β鎖の配列（下線）は、配列番号：３８に示される対応するアミン酸に比べて、７種の足場領域の全てにわたって、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で置換、保存的置換、欠失または付加を有し得る。例示的な実施形態では、β鎖の配列は、配列番号：３８に示される対応するアミン酸に比べて、全ての７種の足場領域にわたって、０から１０、０から８、０から６、０から５、０から４、０から３、０から２、または０から１の範囲で保存的置換を有し得る。特定の実施形態では、コアアミノ酸残基は固定され、任意の置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。太字で示されるＥＩＥＫ配列（配列番号：４）は固定される。特定の実施形態では、ループ領域を直接挟むアミノ酸（例えば、下線を引かれていない残基）は、それぞれ独立して、置換または欠失される。ループを直接挟む残基を置換する時、各残基は同数のアミノ酸を有する配列で、またはより多くのアミノ酸配列（例えば、０−１０、０−８、０−５、０−３もしくは０−２個のアミノ酸残基の挿入）で置換され得る。下線を引かれていない残基はループ領域の一部分であり、そのため、１０Ｆｎ３ドメインの構造に著しく影響を与えることなく、置換を受け入れる。
【００７６】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有し、ここに、Ｄ１およびＤ２は：（ｉ）配列番号：３８を含む１０Ｆｎ３ドメイン、ここに、ＸＸは配列番号：４０のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４１のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである、および、（ｉｉ）配列番号：３８を含む１０Ｆｎ３ドメイン、ここに、ＸＸは配列番号：４３のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４５のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである、からなる群から選択されるものである。
【００７７】
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有し、Ｄ１は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、ここに、ＸＸは配列番号：４０のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４１のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものであって、かつ、Ｄ２は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、ここに、ＸＸは配列番号：４３のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４５のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである。
【００７８】
別の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体はＮ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有し、Ｄ１は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、ここに、ＸＸは配列番号：４３のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４４のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４５のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものであって、かつ、Ｄ２は配列番号：３８のアミノ酸配列を含み、ここに、ＸＸは配列番号：４０のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、Ｘｙは配列番号：４１のアミノ酸配列を含み、必須としてなり、またはからなり、かつＸｚは配列番号：４２のアミノ酸配列を含む、必須としてなる、またはからなるものである。
【００７９】
特定の実施形態では、Ｎ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｃ末端テールをさらに含む。例示的な実施形態では、Ｃ末端テールは、ＰＥＧ部分の付加のために適した残基、例えばリジンまたはシステイン残基、を含む。好ましい実施形態では、Ｃ末端テールは配列ＰＣＱを含む。
【００８０】
様々な実施形態では、Ｎ１−Ｄ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２構造を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＬ領域は、ポリペプチドリンカーである。例示的なポリペプチドリンカーとして、１−２０、１−１５、１−１０、１−８、１−５、１−４、１−３または１−２アミノ酸を有するポリペプチドが挙げられる。適したポリペプチドリンカーの具体例は、本明細書にさらに記載される。加えて、Ｎ１およびＮ２は本明細書で上述のＮ末端伸長である。
【００８１】
好ましい実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）または両方のいずれかで、増大した安定性を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、溶液中での保存の間、低減された断片化および／または減少した凝集を有する。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、増大した血清半減期を有する。
【００８２】
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、ＤＫ配列を含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、低減された断片化を有する。特に、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｃ末端テール、Ｎ末端伸長または２つの１０Ｆｎ３ドメインの間のリンカーのいずれか一つにおいて、一以上のＤＫ配列を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、増大した安定性を有する。例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、例えば、第一および／または第二１０Ｆｎ３サブユニットの後に配列番号：４６を有するテールを含む、一方または両方のＣ末端テール領域でＤＫ配列を有する、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体よりも、より安定である。例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、Ｃ１および／またはＣ２が配列番号：４６を含む、Ｎ１−Ｄ１−Ｃ１−Ｌ−Ｎ２−Ｄ２−Ｃ２式を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体に比べて、低減された断片化を有する。断片化は、例えば、実施例３に記載されるＲＰ−ＨＰＬＣ解析を用いて評価され得る。
【００８３】
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、ｐＨ４．０で４週間の溶液中での保存中に、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２％未満またはそれ以下の断片化を示す。特定の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｖｅｒｓｉｏｎ）に比べて、少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％以上低減される断片化のレベルを示す。
【００８４】
例示的な実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型の血清半減期に比べて、少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％以上増大した血清半減期を示す。他の実施形態では、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、一以上のＤＫ配列を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の同等型の血清半減期に比べて、２倍、３倍、５倍、１０倍以上増大した血清半減期を示す。
【００８５】
特定の実施形態では、本出願は、ＥＧＦＲに結合する一つの１０Ｆｎ３ドメインおよびＩＧＦ−ＩＲに結合する一つの１０Ｆｎ３ドメインを含む、Ｅ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。特定の実施形態では、Ｅ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：２２−２５のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、Ｅ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ／Ｉフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体は、配列番号：２２−２５のいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８６】
ポリペプチドリンカー
本出願は、ポリペプチドリンカーを介して連結された少なくとも２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。一実施形態では、本出願は、ポリペプチドリンカー（Ｌ）を介して連結された少なくとも２つの１０Ｆｎ３ドメインを含む、多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体を提供する。ポリペプチドは、第一の１０Ｆｎ３ドメインを含むＮ末端ドメインおよび第二の１０Ｆｎ３ドメインを含むＣ末端ドメインを含む。第一および第二の１０Ｆｎ３ドメインは、直接的またはポリペプチドリンカー（Ｌ）を介して間接的に連結され得る。さらなるリンカーまたはスペーサー、例えば、配列番号：４、６または３２が、１０Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間の第一の１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端において、導入されてもよい。さらなるリンカーまたはスペーサーが、１０Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間の第二の１０Ｆｎ３ドメインのＮ末端において、導入されてもよい。
【００８７】
１０Ｆｎ３ドメインを連結するための適したリンカーとして、別個のドメインが、互いとは独立にフォールディングして、標的分子との高親和性結合を可能にする三次元構造を形成するのを可能にするものがある。本出願は、これらの条件を満たす、適したリンカーが、グリシン−セリンをベースとするリンカー、グリシン−プロリンをベースとするリンカー、プロリン−アラニンをベースとするリンカー、ならびにリンカー配列番号：７を含むことを提供する。国際公開第２００９／１４２７７３号に記載される例は、これらのリンカーを介して連結されたＦｎ３ドメインが、その標的結合機能を保持することを実証する。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシン−セリンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびセリン残基を含み、８−５０、１０−３０および１０−２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号：８−１２が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは配列番号：８および９から選択される。いくつかの実施形態では、リンカーはグリシン−プロリンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはグリシンおよびプロリン残基を含み、３−３０、１０−３０および３−２０個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号：１３、１４および１５が挙げられる。いくつかの実施形態では、リンカーはプロリン−アラニンをベースとするリンカーである。これらのリンカーはプロリンおよびアラニン残基を含み、長さにおいて、３−３０、１０−３０、３−２０および６−１８個の間のアミノ酸の長さであり得る。このようなリンカーの例として配列番号：１６、１７および１８が挙げられる。最適なリンカー長およびアミノ酸組成は、当技術分野で周知の方法による、日常の実験により、決定され得ると考えられる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは配列番号：７である。例示的な実施形態ではリンカーはＤＫ配列を全く含有しない。
【００８８】
薬物動態部分
一態様では、本出願は、薬物動態（ＰＫ）部分をさらに含むフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。薬物動態は、例として、対象による吸収、分布、代謝および排泄を含む、化合物の特性を包含する。改善される薬物動態は、認識される治療的必要性に従って評価できる。おそらくは、タンパク質が、投与後の血清において利用可能なままである時間を増大することによって、バイオアベイラビリティを増大すること、および／または用量間の時間を増大することが望ましいことが多い。場合によっては、経時的な（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）タンパク質の血清濃度の連続性を改善すること（例えば、投与の直後および次の投与の直前のタンパク質の血清濃度の相違の減少）が望ましい。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、哺乳類（例えば、マウス、ラットまたはヒト）においてポリペプチドのクリアランス速度（ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｒａｔｅ）を、修飾されていないポリペプチドに比べて三倍超低減する部分に結合させてもよい。薬物動態の改善の他の尺度として、血清半減期を挙げることができ、これはα相およびβ相に分けられることが多い。いずれかの相または両方の相が、適当な部分の付加によって大幅に改善され得る。ＰＫ部分は、生物学的に活性な分子と融合される場合、生物学的に活性な分子の薬物動態特性に影響を及ぼす、任意のタンパク質、ペプチドまたは部分を指す。
【００８９】
血液からのタンパク質のクリアランスを遅延する傾向があるＰＫ部分として、ポリオキシアルキレン部分、例えば、ポリエチレングリコール、糖（例えば、シアル酸）および耐容性良好であるタンパク質部分（例えば、Ｆｃ、Ｆｃ断片、トランスフェリンまたは血清アルブミン）が挙げられる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、米国公開第２００７００４８２８２号に記載される、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変種と融合してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、米国公開第２００７／０１７８０８２号および同第２００７／０２６９４２２号に記載されるものなどの、血清アルブミン結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＫ部分は、米国公開第２００７／０１７８０８２号に記載されるものなどの、血清免疫グロブリン結合タンパク質である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、非タンパク質性ポリマーを含むＰＫ部分に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリマーは、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載されるような、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである。例示的な実施形態では、ポリマーはＰＥＧ部分である。
【００９１】
ＰＥＧは、市販されているが、当技術分野で周知の方法に従うエチレングリコールの開環重合によって調製することもできる、周知の、水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｖｏｌ．  ３，  ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）。用語「ＰＥＧ」は、広く使用され、大きさ、ＰＥＧの末端での修飾にかかわらず、任意のポリエチレングリコール分子を包含し、式：Ｘ−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−１ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（１）（式中、ｎは、２０から２３００であり、Ｘは、Ｈまたは末端修飾、例えば、Ｃ１−４アルキルである）によって表され得る。一実施形態では、本発明のＰＥＧは、一方の末端でヒドロキシまたはメトキシで終結する、すなわち、Ｘは、ＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。ＰＥＧは、結合反応に必要な；分子の化学合成に起因する；または分子の部分の最適距離のためのスペーサーである、さらなる化学基を含み得る。さらに、このようなＰＥＧは、一緒に連結している一以上のＰＥＧ側鎖からなり得る。二以上のＰＥＧ鎖を有するＰＥＧは、マルチアームの、または分岐ＰＥＧと呼ばれる。分岐ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリスリトールおよびソルビトールを含む種々のポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製できる。例えば、４アームの分岐ＰＥＧをペンタエリスリトールおよびエチレンオキシドから調製できる。分岐ＰＥＧは、例えば、欧州公開出願番号第４７３０８４Ａ号および米国特許第５，９３２，４６２号に記載されている。ＰＥＧの１つの形として、リジンの第一級アミノ基を介して連結している２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）が挙げられる（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６  （１９９５）  ６２−６９）。
【００９２】
ペプチドまたはタンパク質とのＰＥＧコンジュゲーションは、一般に、ＰＥＧの活性化および活性化されたＰＥＧ中間体の、標的タンパク質／ペプチドとの直接的な、またはリンカーとのカップリングを含み、リンカーは、その後に活性化され、標的タンパク質／ペプチドとカップリングされる（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５２，  ３５７１  （１９７７）およびＪ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５２，  ３５８２  （１９７７），  Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ．  ａｌ．，  ｉｎ：  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；  （Ｊ．  Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｄ．）  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２；  Ｃｈａｐ．２１  ａｎｄ  ２２参照）。ＰＥＧ分子を含有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、複合タンパク質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としても知られているのに対し、結合しているＰＥＧ分子を欠くタンパク質は、コンジュゲートしていないと呼ばれることもあるということに留意されたい。
【００９３】
利用されるＰＥＧの大きさは、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の意図される用途を含む、いくつかの因子に応じて変わる。より大きいＰＥＧが、身体、血液、非血液細胞外液または組織において半減期を増大するために好ましい。インビボ細胞活性のためには、約１０から６０ｋＤａの範囲のＰＥＧ、ならびに約１００ｋＤａ未満のＰＥＧが好ましく、約６０ｋＤａ未満がより好ましいが、約１００ｋＤａを超える大きさも同様に使用できる。インビボイメージング適用には、大きなＰＥＧと同じ程度には半減期を増大せず、より迅速な分布およびより短い半減期を可能にする、より小さいＰＥＧ、一般に、約２０ｋＤａ未満を使用してもよい。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質へのコンジュゲーションのために、種々の分子量の形態のＰＥＧ、例えば、約１，０００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ（ｎは、２０から２３００である）が選択できる。ＰＥＧ中の反復単位の数「ｎ」は、ダルトンで記載される分子量に対して見積もられている。活性化されたリンカー上のＰＥＧの組み合わされた分子量が、製薬学的用途にとって適していることが好ましい。したがって、一実施形態では、ＰＥＧ分子の分子量は、１００，０００Ｄａを超えない。例えば、３ＰＥＧ分子が、リンカーと結合しており、各ＰＥＧ分子が、１２，０００Ｄａの同一分子量を有する場合には（各ｎが約２７０である）、リンカー上のＰＥＧの総分子量は、約３６，０００Ｄａである（総ｎは、約８２０である）。リンカーと結合しているＰＥＧの分子量は異なっていてもよく、例えば、リンカー上の３分子のうち２つのＰＥＧ分子が、各５，０００Ｄａであり（各ｎは、約１１０である）、１つのＰＥＧ分子が１２，０００Ｄａであり得る（ｎは、約２７０である）。いくつかの実施形態では、１つのＰＥＧ部分が、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質とコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０ＫＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分は、約４０ＫＤａである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、一、二以上のＰＥＧ部分を含む。一実施形態では、ＰＥＧ部分（単数または複数）は、標的リガンドと接触するタンパク質の表面上にある、および／または表面から離れたアミノ酸残基と結合している。一実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中のＰＥＧの組み合わされた分子量または総分子量は、約３，０００Ｄａから６０，０００Ｄａまたは約１０，０００Ｄａから３６，０００Ｄａである。一実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、実質的に直線の、直鎖ＰＥＧである。
【００９５】
当業者ならば、例えば、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が、どのように治療的に使用されるか、所望の投与量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性、免疫原性および他の検討事項に基づいてＰＥＧの適した分子量を選択できる。タンパク質の特性を増強するためのＰＥＧおよびその使用についての論述については、Ｎ．  Ｖ．  Ｋａｔｒｅ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０：  ９１−１１４  （１９９３）を参照のこと。
【００９６】
いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、アミド結合を形成するポリ（エチレングリコール）基の−ＣＯ（すなわち、カルボニル）を用いて、式：−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲの１つのポリ（エチレングリコール）基と、結合ポリペプチドのアミノ基の１つと共有結合によって連結しており；Ｒは低級アルキルであり；ｘは２または３であり；ｍは約４５０から約９５０であり；ｎおよびｍは結合ポリペプチドを引いたコンジュゲートの分子量が、約１０から４０ｋＤａであるよう選択される。一実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のリジンのε−アミノ基が、利用可能な（遊離）アミノ基である。
【００９７】
特定の一実施形態では、ＰＥＧ−フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を形成するためにＰＥＧの炭酸エステルが用いられる。Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカルボネート（ＤＳＣ）を、ＰＥＧとの反応において用いて、活性な混合ＰＥＧ−スクシンイミジルカルボネートを形成してもよく、これを続いて、リンカーの求核基またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のアミノ基と反応させてもよい（米国特許第５，２８１，６９８号および米国特許第５，９３２，４６２号参照）。同様の種類の反応において、１，１’−（ジベンゾトリアゾリル）カルボネートおよびジ−（２−ピリジル）カルボネートをＰＥＧと反応させて、ＰＥＧ−ベンゾトリアゾリルおよびＰＥＧ−ピリジル混合カルボネートをそれぞれ形成してもよい（米国特許第５，３８２，６５７号）。
【００９８】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のＰＥＧ化は、最先端の方法に従って、例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と求電子的に活性なＰＥＧとの反応によって実施できる（供給業者：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，  ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｓｈｅａｒｗａｔｅｒｃｏｒｐ．ｃｏｍ）。本発明の好ましいＰＥＧ試薬として、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルプロピオネート（ＰＥＧ−ＳＰＡ）、ブタノエート（ＰＥＧ−ＳＢＡ）、ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネートまたはｍＰＥＧ２−ＮＨＳなどの分岐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドがある（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６  （１９９５）  ６２−６９）。このような方法を用いて、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のリジンのε−アミノ基、またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のＮ末端アミノ基でＰＥＧ化してもよい。
【００９９】
別の実施形態では、ＰＥＧ分子を、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質上のスルフヒドリル基とカップリングしてもよい（Ｓａｒｔｏｒｅ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２７，  ４５  （１９９１）；Ｍｏｒｐｕｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ７，  ３６３−３６８  （１９９６）；  Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９９０）  ８，  ３４３；米国特許第５，７６６，８９７号）。米国特許第６，６１０，２８１号および同第５，７６６，８９７号には、スルフヒドリル基とカップリングしてもよい例示的な反応性ＰＥＧ種が記載されている。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、部位指定ＰＥＧ化によって、特にシステイン部分とのＰＥＧのコンジュゲーションによって生成される。特定の実施形態では、Ｃｙｓ残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の、Ｎ末端に、Ｎ末端と最もＮ末端のβまたはβ様鎖の間に、Ｃ末端に、またはＣ末端と最もＣ末端の間に位置し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は二量体であり、Ｃｙｓ残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の各結合ドメインの、Ｎ末端に、Ｎ末端と最もＮ末端のβまたはβ様鎖の間に、Ｃ末端に、またはＣ末端と最もＣ末端の間に位置し得る。特定の実施形態では、Ｃｙｓ残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＮ末端に、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の（すなわち、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＮ末端結合ドメインの）Ｎ末端と最もＮ末端のβまたはβ様鎖の間に、あるいはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＣ末端に、またはフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体の（すなわち、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質二量体のＣ末端結合ドメインの）Ｃ末端と最もＣ末端のβまたはβ様鎖の間に、位置し得る。Ｃｙｓ残基は、同様に他の位置、特に、標的結合に関与しないループのいずれか、または多価フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の結合ドメインの間に位置していてもよい。ＰＥＧ部分はまた、アミンとのコンジュゲーションによるものを含めて、他の化学反応によって結合させてもよい。
【０１０１】
ＰＥＧ分子が、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質上のシステイン残基とコンジュゲートしている、いくつかの実施形態では、システイン残基は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に対して天然である一方、他の実施形態では、一以上のシステイン残基がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中で操作されている。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする配列中に変異を導入し、システイン残基を生成してもよい。これは、例えば、一以上のアミノ酸残基をシステインに変異することによって達成され得る。システイン残基に変異するための好ましいアミノ酸として、セリン、トレオニン、アラニンおよび他の親水性残基が挙げられる。システインに変異される残基は、表面にさらされている残基であることが好ましい。一次配列またはタンパク質に基づいて残基の表面到達性を予測するためのアルゴリズムは、当技術分野で周知である。あるいは、それに基づいてフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が設計されている、第１０ｆｎ３ドメインフレームワークの結晶構造が解かれていることを考えると、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のアミノ酸配列を比較することにより、表面残基を予測することができ（Ｈｉｍａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  （２００１）  ２０−２７；４１４  （６８６６）：９３３−８参照）、それゆえ、表面にさらされている残基が同定される。一実施形態では、システイン残基がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に、Ｎおよび／またはＣ末端で、もしくはその付近で、またはループ領域内で導入される。システイン残基のＰＥＧ化は、例えば、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−ビニルスルホン、ＰＥＧ−ヨードアセトアミドまたはＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィドを用いて実施できる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、Ｎ末端アミノ酸のαアミノ基と共有結合しているＰＥＧ分子を含む。部位特異的Ｎ末端還元的アミノ化は、Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ｅｔａｌ．，  （２００１）  ＪＰＥＴ，  ２９７，  １０５９および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されている。他の利用可能な求核アミノ基を利用するタンパク質の還元的アミノ化のためのＰＥＧ−アルデヒドの使用は、米国特許第４，００２，５３１号に、Ｗｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５４，１２５７９に、およびＣｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５，１３３に記載されている。
【０１０３】
別の実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、リンカーと共有結合している一以上のＰＥＧ分子を含み、リンカーは、次いで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のＮ末端でアミノ酸残基のαアミノ基と結合される。このようなアプローチは、米国公開第２００２／００４４９２１号および国際公開第９４／０１４５１号に開示されている。
【０１０４】
一実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、Ｃ末端でＰＥＧ化される。特定の実施形態では、タンパク質は、Ｃ末端アジド−メチオニンの導入およびその後のスタウディンガー反応を介するメチル−ＰＥＧ−トリアリールホスフィン化合物のコンジュゲーションによって、Ｃ末端でＰＥＧ化される。このＣ末端コンジュゲーション法は、Ｃａｚａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  Ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００４；１５（５）：１００５−１００９に記載されている。
【０１０５】
例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、本明細書にさらに記載されるＣ末端テール領域でＰＥＧ化される。例示的なＣ末端テールとして、例えば、配列番号：５、６または３５のいずれか一つを有するポリペプチドが挙げられる。
【０１０６】
サイズ排除（例えば、ゲル濾過）およびイオン交換クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の従来の分離および精製技術を用いて、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を精製できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて生成物を分離してもよい。分離できる生成物として、モノ−、ジ−、トリ−、ポリＰＥＧ化された、およびＰＥＧ化されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、ならびに遊離ＰＥＧが挙げられる。モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、溶出ピーク周辺の広い画分をプールすることによって制御し、組成物中のモノＰＥＧのパーセンテージを高めることができる。約９０パーセントのモノＰＥＧコンジュゲートは、収率および活性の良好なバランスに相当する。例えば、コンジュゲートの少なくとも９２パーセントまたは少なくとも９６パーセントが、モノＰＥＧ種である組成物が望ましいものであり得る。本発明の実施形態では、モノＰＥＧコンジュゲートのパーセンテージは、９０パーセントから９６パーセントである。
【０１０７】
本発明の一実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質中のＰＥＧは、ヒドロキシルアミンアッセイ、例えば、室温で、８から１６時間かけて、４５０ｍＭヒドロキシルアミン（ｐＨ６．５）を用いて、ＰＥＧ化アミノ酸残基から加水分解されず、したがって、安定である。一実施形態では、組成物の８０％超が、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％が、安定なモノＰＥＧフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質である。
【０１０８】
別の実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、非修飾タンパク質と関連する生物活性の少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を保持することが好ましい。一実施形態では、生物活性とは、ＫＤ、ｋｏｎまたはｋｏｆｆによって評価される、一以上の標的分子に結合するその能力を指す。具体的な一実施形態では、ＰＥＧ化されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＰＥＧ化されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と比べて、一以上の標的分子との結合における増大を示す。
【０１０９】
ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の血清クリアランス速度は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のクリアランス速度と比べて、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％さえも減少され得る。ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期と比べて、増強されている半減期（ｔ１／２）を有し得る。ＰＥＧ修飾されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期は、修飾されていないフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、４００％または５００％、またはさらに１０００％まで増強され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質半減期は、緩衝生理食塩水または血清中などインビトロで決定される。他の実施形態では、タンパク質半減期は、動物の血清または他の体液中でのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の半減期などの、インビボ半減期である。
【０１１０】
核酸−タンパク質融合技術
一態様では、本出願は、例えば、ＴＮＦ−α、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲまたは他のタンパク質などの、ヒト標的に結合するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。特異的結合特性を備えるＦｎ３ドメインを、迅速に作製し、試験する１つの方法は、Ａｄｎｅｘｕｓ，Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ企業の核酸−タンパク質融合技術である。核酸−タンパク質融合体（ＲＮＡ−およびＤＮＡ−タンパク質融合体）を利用する、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎ商標と呼ばれる、このようなインビトロ発現およびタグ技術を用いて、タンパク質との結合にとって重要である、新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフを同定し得る。核酸−タンパク質融合技術は、タンパク質をそのコードする遺伝情報と共有結合によってカップリングする技術である。ＲＮＡ−タンパク質融合技術およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質ライブラリースクリーニング法の詳細な説明については、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｓｚｏｓｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２５８，５５８号；同第６，２６１，８０４号；同第６，２１４，５５３号；同第６，２８１，３４４号；同第６，２０７，４４６号；同第６，５１８，０１８号；国際公開第００／３４７８４号；国際公開第０１／６４９４２号；国際公開第０２／０３２９２５号；およびＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９４：１２２９７−１２３０２，  １９９７参照。
【０１１１】
ベクター＆ポリヌクレオチド
本明細書に開示される様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質のいずれかをコードする核酸は、化学的に、酵素的にまたは組換えによって合成してもよい。コドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）は、細胞における発現を改良するよう選択され得る。このようなコドン使用頻度は、選択される細胞種に応じて変わる。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞については、特定化されたコドン使用パターンが開発されている。例えば：Ｍａｙｆｉｅｌｄｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００３  Ｊａｎ  ２１；１００（２）：４３８−４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００２  Ｏｃｔ；２６（１）：９６−１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＮＤ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００１  Ｏｃｔ；１２（５）：４４６−９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．  １９９６  Ｓｅｐ；６０（３）：５１２−３８；およびＳｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｙｅａｓｔ．  １９９１  Ｏｃｔ；７（７）：６５７−７８参照。
【０１１２】
核酸操作の一般的な技術は、例えば、出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｖｏｌｓ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２  ｅｄ．，  １９８９またはＦ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７）および定期的更新に記載されている。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来する適した転写または翻訳調節エレメントと作動可能に連結されている。このような調節エレメントとして、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主において複製する能力は、通常、複製起点により付与され、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子がさらに組み込まれる。
【０１１３】
本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、直接的にだけではなく、好ましくは、シグナル配列または成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても、組換えによって生成してもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであることが好ましい。天然シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列で置換される。酵母分泌のためには、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含む）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダーまたはＰＣＴ国際公開９０／１３６４６に記載されるシグナルによって置換してもよい。哺乳類細胞発現では、哺乳類シグナル配列ならびにウイルスの分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。このような前駆体領域のＤＮＡを、タンパク質をコードするＤＮＡにリーディングフレームでライゲートしてもよい。
【０１１４】
発現ベクターおよびクローニングベクターは両者とも、ベクターが一以上の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含有する。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立に複製するのを可能にするものであり、複製起点または自立複製配列を含む。このような配列は、様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌にとって適しており、２ミクロンのプラスミド起点が酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が、哺乳類細胞中のクローニングベクターにとって有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳類発現ベクターにとって必要ではない（ＳＶ４０起点は、通常、単に、それが初期プロモーターを含むために、使用され得る）。
【０１１５】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求欠損を補完する、または（ｃ）複合培地からは利用できない決定的な栄養素を供給するタンパク質をコードするものであり、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１１６】
酵母において使用するために適した選択遺伝子として、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子がある（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：３９  （１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異株、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２  （１９７７）。酵母宿主細胞ゲノム中にｔｒｐ１病変部が存在することは、ひいては、トリプトファンの不在下での増殖により、形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する既知のプラスミドにより補完される。
【０１１７】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主とともに使用するために適したプロモーターとして、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかし、他の既知細菌プロモーターも適している。細菌系において使用するためのプロモーターはまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするＤＮＡと作動可能に連結されたシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有するだろう。
【０１１８】
真核生物のためのプロモーター配列は公知である。実質的にすべての真核細胞遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写の開始から７０から８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核細胞遺伝子の３’末端には、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列のすべてが、真核細胞発現ベクターに適宜挿入される。
【０１１９】
酵母宿主とともに使用するために適した促進配列の例として、３−ホスホグリセレートキナーゼ、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のためのプロモーターが挙げられる。
【０１２０】
増殖条件によって制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである、他の酵母プロモーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域がある。酵母発現における使用のための適したベクターおよびプロモーターは、欧州特許公報番号７３，６５７にさらに記載されている。酵母エンハンサーも、酵母プロモーターとともに有利に用いられる。
【０１２１】
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、（アデノウイルス２などの）アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、ヒートショックプロモーターから得られたプロモーターにより、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合するならば、制御され得る。
【０１２２】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限断片として都合よく得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる、哺乳類宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の改変は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関しては、Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１  （１９８２）も参照。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）をプロモーターとして用いることができる。
【０１２３】
高等真核生物によるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増大されることが多い。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）に由来する多数のエンハンサー配列が現在知られている。しかし、通常、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを用いるだろう。例として、複製起点の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関しては、Ｙａｎｉｖ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５’または３’の位置でベクター中にスプライシングされ得るが、プロモーターの５’側に位置することが好ましい。
【０１２４】
真核宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物由来の有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写の終結のために、かつｍＲＮＡを安定化するために必要な配列も含有するだろう。このような配列は一般に、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’ 非翻訳領域、および場合により、３’非翻訳領域から得ることができる。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写される、ヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開９４／１１０２６およびそこで開示される発現ベクターを参照。
【０１２５】
組換えＤＮＡはまた、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を精製するために有用であり得る任意の種類のタンパク質タグ配列を含み得る。タンパク質タグの例として、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主とともに使用するために適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８５）中に見ることができ、その関連の開示内容は、出典明示により本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
発現コンストラクトは、当業者には明らかであるように、宿主細胞にとって適当な方法を用いて宿主細胞に導入される。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法が当技術分野で公知であり、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および（ベクターが感染性物質である）感染が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
適した宿主細胞として、原核生物、酵母、哺乳類細胞または細菌細胞が挙げられる。適した細菌として、グラム陰性またはグラム陽性菌、例えば、大腸菌またはバチルス種が挙げられる。好ましくは、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの、サッカロミセス種に由来する酵母も、ポリペプチドの生成のために使用してよい。様々な哺乳類または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現することもできる。昆虫細胞において異種タンパク質を生成するためのバキュロウイルス系は、Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ６：４７，  １９８８）に総説されている。適した哺乳類宿主細胞株の例として、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胚性腎細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３ＴおよびＢＨＫ細胞株が挙げられる。精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、組換えタンパク質を発現するために適した宿主／ベクター系を培養することにより調製される。多数の適用のために、本明細書に開示される小さいサイズのフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、発現のための好ましい方法として大腸菌において発現を行う。次いで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、培養培地または細胞抽出物から精製される。
【０１２８】
タンパク質生成
宿主細胞は、タンパク質生成のために本明細書に記載される発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に改変された従来の栄養培地で培養される。
【０１２９】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成するために用いられる宿主細胞は、種々の培地で培養してもよい。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ））などの市販の培地が、宿主細胞を培養するために適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  ５８：４４  （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５  （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；国際公開９０／０３４３０；国際公開８７／００１９５；または米国特許第Ｒｅ．３０，９８５号に記載される培地のいずれかも、宿主細胞のための培養培地として用いてよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェートなど）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ商標薬など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等なエネルギー供給源を用いて補給され得る。任意の他の必要な栄養補助剤を、当業者に公知である適当な濃度で含めてもよい。温度、ｐＨ等などの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかであろう。
【０１３０】
本明細書に開示されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、無細胞翻訳系を使用して生成できる。このような目的上、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質をコードする核酸は、インビトロ転写を可能にしてｍＲＮＡを生成し、使用されている特定の無細胞系（哺乳類または酵母細胞などの真核細胞を含まない翻訳系または細菌細胞などの原核生物を含まない翻訳系）におけるｍＲＮＡの細胞を含まない翻訳を可能にするよう改変されなければならない。
【０１３１】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、化学合成によって（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  １９８４，  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬに記載される方法によって）生成できる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質への修飾も化学合成によって生成できる。
【０１３２】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られている、タンパク質の単離／精製法により精製できる。非限定的な例として、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムを用いる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配またはこれらの任意の組合せが挙げられる。精製後、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を、濾過および透析を含むが、これらに限定されるものではない、当技術分野で公知の種々の方法のいずれかにより、異なるバッファーに交換してもよく、かつ／または、濃縮してもよい。
【０１３３】
精製されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、好ましくは少なくとも８５％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、最も好ましくは、少なくとも９８％純粋である。純度の正確な数値にかかわらず、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は医薬製剤として使用するために十分に純粋である。
【０１３４】
例示的な使用
一態様では、本出願は、検出可能な部分で標識されたフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、種々の診断的適用のために用いてもよい。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで生じることができる任意のものであり得る。例えば、検出可能な部分は、Ｈ３、Ｃ１４、Ｃ１３、Ｐ３２、Ｓ３５またはＩ１３１などの放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンもしくはルシフェリンなどの蛍光もしくは化学発光化合物；またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であり得る。
【０１３５】
Ｈｕｎｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５  （１９６２）；  Ｄａｖｉｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４  （１９７４）；Ｐａｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ４０：２１９  （１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，  Ｊ．  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．  ３０：４０７  （１９８２）によって記載される方法を含む、タンパク質を検出可能な部分にコンジュゲートするための、当技術分野で公知の任意の方法を使用してもよい。インビトロ法は、ＣｙｓおよびＬｙｓなどの特定のアミノ酸のための化学反応などの、タンパク質と適合する化学反応を含む当技術分野で周知であるコンジュゲーション化学を含む。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に、検出可能な部分を連結するために、連結基または反応性基が用いられる。適した連結基は当技術分野で周知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安的な基、感光基、ペプチダーゼに不安定な基およびエステラーゼに不安的な基が挙げられる。好ましい連結基として、適用に応じて、ジスルフィド基およびチオエーテル基がある。Ｃｙｓアミノ酸を含まないポリペプチドのために、Ｃｙｓを、コンジュゲーションのための位置を作り出しながら、タンパク質の活性が存在するのを可能にする位置に操作して入れてもよい。
【０１３６】
検出可能な部分で連結されているフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、インビボイメージングにとって有用である。ポリペプチドは、対象に、好ましくは、血流中に投与される、放射線を通さない（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）物質または放射性同位元素と連結でき、対象における標識されたタンパク質の存在および位置がアッセイされる。このイメージング技術は、例えば、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が癌に関連する標的に結合する場合、悪性腫瘍のステージ分類および治療において有用である。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、核磁気共鳴、放射線学によってであれ、当技術分野で公知の他の検出手段によってであれ、対象において検出可能である任意の部分を用いて標識してもよい。
【０１３７】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、アフィニティー精製物質としても有用である。この過程では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、当技術分野で周知の方法を用いて、セファデックス樹脂または濾紙などの適した支持体上に固定化されている。
【０１３８】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、競合結合実験、直接および間接サンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイなどの、任意の公知のアッセイ法において使用できる（Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８７））。
【０１３９】
特定の態様では、本開示内容は、ＶＥＧＦＲ２、ＩＧＦ−ＩＲまたはＥＧＦＲなどのサンプル中の標的分子を検出する方法を提供する。方法は、サンプルを、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質と接触させること、ここに、前記接触は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質−標的複合体形成を可能にする条件下で実施されるものである；および前記複合体を検出し、それによって前記サンプル中の前記標的を検出することを含み得る。検出は、例えば、Ｘ線撮影、免疫学的アッセイ、蛍光検出、質量分析または表面プラズモン共鳴などの、当技術分野で公知の任意の技術を用いて実施してもよい。サンプルは、生検、特に、腫瘍、疑わしい腫瘍の生検などの、生物学的サンプルであることが多い。サンプルは、ヒトまたは他の哺乳類に由来するものであり得る。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、放射活性部分、蛍光部分、発色性部分、化学発光部分またはハプテン部分などの標識部分を用いて標識され得る。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、固体支持体上に固定化され得る。
【０１４０】
一態様では、本出願は、障害の治療において有用であるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を提供する。治療され得る疾病あるいは障害は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の結合特異性により決まるだろう。本出願はまた、対象にフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、哺乳類、特に、ヒトにとって医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、相当な有害な医学的結果を伴わずに動物に投与されるポリペプチドを指す。医薬上許容されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の例として、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメインおよび本質的にエンドトキシンを含まない、または極めて低いエンドトキシンレベルを有する１０Ｆｎ３ドメインが挙げられる。
【０１４１】
特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質、特に、ＩＧＦ−ＩＲ、ＶＥＧＦＲ２および／またはＥＧＦＲに結合するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、癌などの障害の治療において有用である。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＶＥＧＦＲ２および／またはＥＧＦＲの変異または発現レベルに関連する癌の障害の治療において有用である。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与は、対象における抗増殖性障害（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を治療する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与は、インビボでの腫瘍細胞増殖を阻害する。腫瘍細胞は、表皮、上皮、内皮、白血病、肉腫、多発性骨髄腫または中胚葉細胞を含む任意の細胞種に由来するものであり得るが、これに限定されない。異種移殖片腫瘍研究において使用するための一般的な腫瘍細胞株の例として、Ａ５４９（非小細胞肺癌）細胞、ＤＵ−１４５（前立腺）細胞、ＭＣＦ−７（乳房）細胞、Ｃｏｌｏ２０５（結腸）細胞、３Ｔ３／］ＧＦ−ＩＲ（マウス繊維芽細胞）細胞、ＮＣＩ  Ｈ４４１細胞、ＨＥＰ  Ｇ２（肝細胞腫）細胞、ＭＤＡ  ＭＢ２３１（乳房）細胞、ＨＴ−２９（結腸）細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ（乳房）細胞、Ｕ２６６細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、Ｓｋ−Ｍｅｌ−２細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＲＰＭ１８２２６およびＡ４３１細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、未処置動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、未処理動物における腫瘍の増殖と比べて、腫瘍細胞増殖を５０、６０、７０、８０％以上阻害する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖の阻害は、動物がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を開始した後、少なくとも７日または少なくとも１４日測定される。いくつかの実施形態では、別の抗悪性腫瘍薬がフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質とともに動物に投与される。
【０１４２】
特定の態様では、本開示内容は、腫瘍および／または腫瘍転移の治療および／または予防のためにフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を投与する方法を提供し、ここで、腫瘍は、脳腫瘍、尿生殖路の腫瘍、リンパ系の腫瘍、胃の腫瘍、咽頭腫瘍、単球性白血病、肺腺癌、小細胞肺癌腫、膵臓癌、膠芽腫および乳癌からなる群から選択されることが特に好ましいが、それに制限されない。
【０１４３】
特定の態様では、本開示内容は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を、扁平上皮癌、膀胱癌、胃癌、肝臓癌、腎臓癌、結腸直腸癌、乳癌、頭部癌、頚部癌、食道癌、婦人科の癌、甲状腺癌、リンパ腫、慢性白血病および急性白血病からなる群から選択される癌性疾患の治療のために投与する方法を提供する。
【０１４４】
他の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αなどの、炎症反応および／または自己免疫疾患に関与する標的に結合する。このようなフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、クローン病、乾癬および難治性の喘息などの、自己免疫疾患を治療するために有用なものであり得る。
【０１４５】
製剤および投与
本出願は、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む医薬上許容される組成物をさらに提供し、該組成物は、本質的にエンドトキシンを含まないものである。
【０１４６】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含む治療用製剤は、所望の程度の純度を有する記載されるタンパク質を、所望による生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、水溶液、凍結乾燥された、または他の乾燥された製剤の形態で、保存のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０））。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用される投与量および濃度で受容者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）にとって非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（オクタデシイジメチルベンジル（ｏｃｔａｄｅｃｙｉｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ）塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖およびグルコース、マンノースまたはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／あるいはＴＷＥＥＮ商標、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ商標またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１４７】
また、本明細書における製剤とは、治療されている特定の適応症にとって必要な二以上の活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含み得る。このような分子は、意図される目的上効果的である量の組み合わせで適宜存在する。
【０１４８】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に封入されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）に開示されている。
【０１４９】
特定の実施形態では、本出願は、ｐＨ４．０−６．５を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、ｐＨ４．０−５．５を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、ｐＨ５．５を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。他の実施形態では、本出願は、ｐＨ４．０を有するフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。特に、本出願は、溶液中での保存の間、低減された断片化および／または低レベルの凝集を有する、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物を提供する。例示の節で実証されるように、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、ｐＨ４．０で増大した安定性を有し、一方でそれと同時に、ｐＨ５．５と比較してｐＨ４．０で減少した凝集レベルを示した。ｐＨ４．０を有するこのような安定で、可溶性の製剤は、特に静脈内投与に適している。いくつかの実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、少なくとも３ｍｇ／ｍＬである。例示的な実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、少なくとも５ｍｇ／ｍＬである。特定の実施形態では、このような安定な製剤におけるタンパク質濃度は、３−１０ｍｇ／ｍＬ、３−８ｍｇ／ｍＬ、３−６ｍｇ／ｍＬ、３−５ｍｇ／ｍＬ、４−１０ｍｇ／ｍＬ、４−８ｍｇ／ｍＬ、４−６ｍｇ／ｍＬ、５−１０ｍｇ／ｍＬ、５−８ｍｇ／ｍＬまたは５−６ｍｇ／ｍＬの範囲である。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な組成物は、より高いｐＨで、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の同等製剤（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と比べて、低減された凝集を有する。例えば、安定な製剤は、ｐＨ５．５以上で４週間の保存の間、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の保存の間に見られる凝集レベルと比べて、ｐＨ４．０で４週間の溶液中での保存の間、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％以下の凝集を示し得る。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも４週間の２５℃での保存の後、１０％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の凝集を有する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、ｐＨ４．０かつ２５℃で４週間、溶液中での保存で、７％、６％、５％、４％、３．５％、３％、２％未満またはそれ以下の断片化を有する。特定の実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも４週間の２５℃での溶液中での保存の間、５％未満の断片化および５％未満の凝集を有する。例示的な実施形態では、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定な製剤は、少なくとも４週間の２５℃での溶液中での保存の間、４％未満の断片化および４％未満の凝集を有する。
【０１５０】
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１５１】
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の適した例として、本明細書に記載されるフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、ここで、マトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例として、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタミンのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ商標（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日にわたる分子の放出を可能にする一方、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を放出する。被包された本発明のタンパク質が体内に長時間とどまる場合には、それらは、３７℃で湿度に対する曝露の結果として変性または凝集し、生物活性の喪失および免疫原性の可能性ある変化をもたらし得る。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考え出すことができる。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると見い出される場合には、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、水分含量を制御すること、適当な添加物を用いることおよび特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１５２】
当業者ならば、各フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の投与量は、タンパク質の正体によって変わることは理解するであろうが、好ましい投与量は、約１０ｍｇ／平方メートルから約２０００ｍｇ／平方メートル、より好ましくは、約５０ｍｇ／平方メートルから約１０００ｍｇ／平方メートルの範囲であり得る。
【０１５３】
治療適用のために、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、医薬上許容される剤形で対象に投与される。それらは、ボーラスとして、または一定時間にわたる連続注入によって静脈内に、筋肉内、皮下、関節内、滑液内、くも膜下腔内、経口、局所または吸入経路によって投与され得る。タンパク質はまた、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内または病変部周囲経路によって投与され、局所ならびに全身治療効果を発揮し得る。適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は周知であり、臨床状況が必要とする際に、当業者によって決定され得る。適した担体、希釈剤および／または賦形剤の例として：（１）約１ｍｇ／ｍｌから２５  ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  ＮａＣｌ）および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられる。本発明の方法は、インビトロ、インビボまたはエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で実施できる。
【０１５４】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質および一以上のさらなる治療薬の投与は、同時投与されるか、逐次投与されるかにかかわらず、治療適用のために、上記のように起こり得る。同時投与に適した医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤は、当業者によって、同時投与されている特定の治療薬の正体に応じて変わると理解される。
【０１５５】
凍結乾燥されているのではなく水性の剤形で存在する場合には、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、通常、約０．１ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤されるが、これらの範囲の外側の広い変動も容認される。疾患の治療のための、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の適当な投与量は、上記で定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、これまでの治療の経過、患者の病歴およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質に対する反応、ならびに主治医の裁量に応じて変わる。フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質は、１回で、または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。
【０１５６】
配列表
ＷＴコア配列
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号：１）
Ｉコア（配列番号：２）
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＳＡＲＬＫＶＡＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＫＮＶＹＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＲＦＲＤＹＱＰＩＳＩＮＹＲＴ
Ｖコア（配列番号：３）
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＲＨＰＨＦＰＴＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＬＱＰＰＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩＰＩＳＩＮＹＲＴ
短いテール（配列番号：４）
ＥＩＥＫ
修飾されたＣｙｓテール（配列番号：５）
ＥＧＳＧＣ
Ｃｙｓテール（配列番号：６）
ＥＩＥＫＰＣＱ  
Ｆｎをベースとするリンカー（配列番号：７）
ＰＳＴＳＴＳＴ
ＧＳ５リンカー（配列番号：８）
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ
ＧＳ１０リンカー（配列番号：９）
ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ
（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号：１０）
ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ
（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号：１１）
ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ
Ｇ４ＳＧ４ＳＧ３ＳＧ（配列番号：１２）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ
ＧＰＧ（配列番号：１３）
ＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号：１４）
ＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧ（配列番号：１５）
ＰＡ３リンカー（配列番号：１６）
ＰＡＰＡＰＡ
ＰＡ６リンカー（配列番号：１７）
ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ
ＰＡ９リンカー（配列番号：１８）
ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ
ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：１９）
ＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２０）
ＧＶＳＤＶＰＲＤＬ（配列番号：２１）
ＤＫ＋ＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（配列番号：２２）
【化６】
0006023703.tif 000007
ＤＫ＋ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（配列番号：２３）
【化７】
0006023703.tif 000008
ＧＳＧＣテールを備えるＤＫ−ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（配列番号：２４）
【化８】
0006023703.tif 000009
ＥＩＥＫＰＣＱテールを備えるＤＫ−ＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（配列番号：２５）
【化９】
0006023703.tif 000010
ＸｎＳＤＶＰＲＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：２６）
ＸｎＤＶＰＲＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：２７）
ＸｎＶＰＲＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：２８）
ＸｎＰＲＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：２９）
ＸｎＲＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：３０）
ＸｎＤＬ，  ｎ＝０、１または２アミノ酸であり、ｎ＝１の場合、ＸはＭｅｔまたはＧｌｙであり、ｎ＝２の場合、ＸはＭｅｔ−Ｇｌｙである（配列番号：３１）
ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号：３２）
ＥＩＥＫＰ（配列番号：３３）  
ＥＩＥＫＰＳ（配列番号：３４）
ＥＩＥＫＰＣ（配列番号：３５）
ＥＧＳＧＳ（配列番号：３６）
ＷＴフィブロネクチン配列
【化１０】
0006023703.tif 000011
ＥＩＥＫテールを備える１０Ｆｎ３コア
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷ（Ｘ）ｘＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰ（Ｘ）ｙＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴ（Ｘ）ｚＰＩＳＩＮＹＲＴＥＩＥＫ（配列番号：３８）
Ｅコア（配列番号：３９）
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＷＡＰＶＤＲＹＱＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＲＤＶＹＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＤＹＫＰＨＡＤＧＰＨＴＹＨＥＳＰＩＳＩＮＹＲＴ  
ＩＧＦ−ＩＲ  ＢＣループ（配列番号：４０）  
ＳＡＲＬＫＶＡ
ＩＧＦ−ＩＲ  ＤＥループ（配列番号：４１）
ＫＮＶＹ
ＩＧＦ−ＩＲ  ＦＧループ（配列番号：４２）
ＲＦＲＤＹＱ
ＶＥＧＦＲ２  ＢＣループ（配列番号：４３）
ＲＨＰＨＦＰＴ
ＶＥＧＦＲ２  ＤＥループ（配列番号：４４）
ＬＱＰＰ
ＶＥＧＦＲ２  ＦＧループ（配列番号：４５）
ＤＧＲＮＧＲＬＬＳＩ
ＥＩＤＫ（配列番号：４６）
ＥＩＤＫＰＣＱ（配列番号：４７）
Ｃｙｓテールを備えるＩ−Ｆｎ−Ｖ（２ＤＫ−）（配列番号：４８）
【化１１】
0006023703.tif 000012
ｓｅｒテールを備えるＩ−Ｆｎ−Ｖ（２ＤＫ−）（配列番号：４９）
【化１２】
0006023703.tif 000013
ｓｅｒまたはｃｙｓテールを備えるＩ−ＧＳ５−Ｖ（２ＤＫ−）（配列番号：５０）
【化１３】
0006023703.tif 000014
ｓｅｒまたはｃｙｓテールを備えるＩ−ＧＳ１０−Ｖ（２ＤＫ−）（配列番号：５１）  
【化１４】
0006023703.tif 000015
ｓｅｒテールを備えるＶ−Ｆｎ−Ｉ（２ＤＫ−）（配列番号：５２）
【化１５】
0006023703.tif 000016
ｃｙｓテールを備えるＶ−Ｆｎ−Ｉ（２ＤＫ−）（配列番号：５３）
【化１６】
0006023703.tif 000017
ｓｅｒまたはｃｙｓテールを備えるＶ−ＧＳ５−Ｉ（２ＤＫ−）（配列番号：５４）
【化１７】
0006023703.tif 000018
ｓｅｒまたはｃｙｓテールを備えるＶ−ＧＳ１０−Ｉ（２ＤＫ−）（配列番号：５５）
【化１８】
0006023703.tif 000019
ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）
【化１９】
0006023703.tif 000020
ＶＩ（ＤＫ−）（配列番号：５７）
【化２０】
0006023703.tif 000021
【実施例】
【０１５７】
本発明を、以下の実施例を参照することによって説明するが、これは、単に例示的なものであって、本発明を制限しようとするものではない。本発明は、特定の実施形態を参照して詳細に説明されているが、その趣旨および範囲を逸脱することなく、それに種々の変更および改変を行ってもよいということは当業者には明らかであろう。
【実施例１】
【０１５８】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質
ＶＥＧＦＲ２／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（「Ｖ／Ｉバインダー」）およびＥＧＦＲ／ＩＧＦ−ＩＲバインダー（「Ｅ／Ｉバインダー」）を含む、様々なフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成した。以下の表は、本明細書に記載される構築体およびそれらの対応する配列番号を表す。
【０１５９】
表１．様々なＶ／ＩバインダーおよびＥ／Ｉバインダーの概説。
【表１】
0006023703.tif 000022
【０１６０】
配列番号：２２は、国際公開２００９／１４２７７３に最初に記載されたＶ／Ｉ（ＤＫ＋）二価構築体のアミノ酸配列である。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）は、ＩＧＦ−ＩＲおよびＶＥＧＦＲ２に結合するフィブロネクチンドメインを含む。ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチンコアは配列番号：２に示される配列を有し、ＶＥＧＦＲ２結合フィブロネクチンコアは配列番号：３に示される配列を有する。２つのドメインは、ヒトフィブロネクチンにおいて第一および第二Ｆｎ３ドメインを連結するアミノ酸配列に由来するポリペプチドリンカー（配列番号：７）により連結される。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）のＩ結合サブユニットは、配列番号：４６のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ１）を含有する、すなわち、ＤＫ部位を含有する。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）のＶ結合サブユニットは、配列番号：４７のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ２）を含有する、すなわち、ＤＫ部位を含有する。
【０１６１】
配列番号：２３は、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）二価構築体のアミノ酸配列である。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）は、ＩＧＦ−ＩＲおよびＥＧＦＲに結合するフィブロネクチンドメインを含む。ＩＧＦ−ＩＲ結合フィブロネクチンコアは配列番号：２に示される配列を有し、ＥＧＦＲ２結合フィブロネクチンコアは配列番号：３９に示される配列を有する。２つのドメインは、配列番号：９を有するグリシン−セリンポリペプチドリンカーにより連結される。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）のＩ結合サブユニットは、配列番号：４６のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ１）を含有する、すなわち、ＤＫ部位を含有する。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）のＥ結合サブユニットは、配列番号：４７のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ２）を含有する、すなわち、ＤＫ部位を含有する。
【０１６２】
配列番号：２４は、Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）二価構築体のアミノ酸配列である。Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）は、グリシン−セリンリンカー（配列番号：９）により連結された、ＩＧＦ−ＩＲコア（配列番号：２）およびＥＧＦＲコア（配列番号：３９）を含む。ＩＧＦ−ＩＲ結合サブユニットは、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ１）を含有する、すなわち、ＤＫ部位よりもＥＫ部位を含有する。ＥＧＦＲ結合サブユニットは、配列番号：５のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ２）を含有する、すなわち、ＤＫ部位を欠く。
【０１６３】
配列番号：２５は、Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）二価構築体のアミノ酸配列である。Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）は、グリシン−セリンリンカー（配列番号：９）により連結された、ＩＧＦ−ＩＲコア（配列番号：２）およびＥＧＦＲコア（配列番号：３９）を含む。ＩＧＦ−ＩＲ結合サブユニットは、配列番号：４のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ１）を含有する、すなわち、ＤＫ部位よりもＥＫ部位を含有する。ＥＧＦＲ結合サブユニットは、配列番号：６のアミノ酸配列を有するＣ末端伸長（Ｃ２）を含有する、すなわち、ＤＫ部位よりもＥＫ部位を含有する。
【実施例２】
【０１６４】
フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の発現および精製
Ｅ／Ｉ分子の発現
Ｅ／Ｉ二価構築体を可溶型で大腸菌細胞中で発現させた。封入体は細胞破壊と遠心分離により回収される。Ｅ／Ｉタンパク質は濾過され、カラムクロマトグラフィーを用いて捕捉される。精製されたタンパク質は、次いで、単一のシステイン残基で、マレイミド化学反応を介して、ＰＥＧに共有結合される。ＰＥＧ化生成物は次いで、カラムクロマトグラフィーを用いて仕上げられ（ｐｏｌｉｓｈ）、タンジェンシャルフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を用いて製剤化される。
【０１６５】
Ｖ／Ｉ分子の発現
Ｖ／Ｉ二価構築体の発現のために、構築体をコードするヌクレオチド配列が誘導性発現ベクターにクローニングされ、大腸菌細胞中で細胞内封入体内に発現させた。単一の蒔かれたコロニーから生成した細胞バンクバイアルを用いて、大規模発酵のための接種材料として振盪フラスコ培養に接種した。あるいは、種子発酵（ｓｅｅｄ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）は最終の発酵容量に応じて、接種原培養に用いられる。大規模発酵は、生物量を蓄積させるための増殖期およびフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質を生成するための生成期を含む。一次回収のため、細胞内封入体は、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、回収された細胞から放出され、遠心分離により回収され、続いてバッファーおよび水で洗浄された。
【０１６６】
二価構築体のための精製工程は、塩酸グアニジンをベースとする封入体の再可溶化、続いてタンパク質のリフォールディングを用いる。リフォールディングされたタンパク質は濾過され、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの上にロードされる。生成物は次いで、疎水性相互作用カラムを用いて精製され、生じる溶出プールをＰＥＧ試薬の添加によりＰＥＧ化し、ＰＥＧ化タンパク質を生成する。
【０１６７】
ＰＥＧ化タンパク質は次いで、第二の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを渡って精製される。溶出は標的タンパク質濃度に濃縮され、次いで、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を用いて、製剤バッファーへ交換される。ＵＦ／ＤＦ生成物は、０．２２μｍのファイナルフィルターを用いて濾過される。濾過された生成物は、次いで、バイアル内に満たされ、最終製剤を生成する。
【実施例３】
【０１６８】
Ｖ／Ｉタンパク質の安定性へのタンパク質濃度の影響
精製されたＶ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）の物理学的（凝集）および化学的（断片化）安定性へのタンパク質濃度の影響を試験した。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質を、ｐＨ５．５で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化した。Ｖ／Ｉタンパク質濃度は、３ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍｌのいずれかであった。サンプルを１２ヶ月の期間４℃で保管し、該サンプルを１ヶ月目、６週目、２ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目および１２ヶ月目に回収して解析した。
【０１６９】
凝集量は、経時的に（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）、（高分子量（「ＨＭＷ」）種として測定される）凝集を形成した総タンパク質のパーセンテージを評価することにより、測定する。凝集を、サイズ排除−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）解析を用いて測定し、経時的に（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）ＨＭＷのレベルを評価した。ＳＥ−ＨＰＬＣ解析は、スーパーデックス２００  １０／３００  ＧＬカラムを用いて、０．２Ｍリン酸カリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ  ６．８の移動相で、実行した。２８０ｎｍでの検出で、流速は０．５ｍＬ／分であった。経時的な（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）（０−１２ヶ月）、Ｖ／Ｉタンパク質の凝集へのタンパク質濃度の影響は、図１に表される。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）は、３ｍｇ／ｍＬの濃度で０．３％／月の速度で凝集する。より高いタンパク質濃度（５ｍｇ／ｍＬ）は、より速い凝集速度を導く。
【０１７０】
断片化は、経時的に（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）、断片化した、または「クリップ化」した総タンパク質のパーセンテージを評価することにより測定する。クリップ化したタンパク質のレベルは、逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を利用することにより、決定した。ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｖａｒｉａｎ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（４．６＊２５０ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）を用いて実行された。様々な種の分離は、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸からなるグラジエントを介して達成される。流速は１．０ｍＬ／分であった。二重検出は、（タンパク質関連種のため）２８０ｎｍで、および蒸発光散乱（ＥＬＳ、ＰＥＧ関連種のため）で、実行された。図２は、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）の断片化が、凝集よりも、タンパク質濃度への依存が少ないことが発見されたことを示す。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）についての断片化速度は、４℃で、〜０．１％／月であった。
【０１７１】
これらの凝集および断片化データに基づき、凝集を最低限にし、１年間の十分な安定性を確保するためには、３ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有するＶ／Ｉ（ＤＫ＋）の製剤が、５ｍｇ／ｍＬの濃度よりも、好ましいであろう。
【実施例４】
【０１７２】
Ｖ／Ｉタンパク質の安定性へのｐＨの影響
精製されたＶ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）の物理学的および化学的安定性へのｐＨの影響を試験した。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４および５のため）または２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６および７のため）であるバッファー組成物と共に、５０ｍＭ塩化ナトリウム中に製剤化し、２５℃で保存した。
【０１７３】
４週間の期間、一週間に一度、サンプルを回収し、実施例３に記載されるようにＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、凝集の評価を実行した。経時的な（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）（０−４週間）、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質の凝集へのｐＨの影響は、図３に表される。最も低い凝集率が、試験された最低ｐＨ（ｐＨ４．０）を有するサンプルにおいて観察された。最も高い凝集率が、試験された最高ｐＨ（ｐＨ７．０）を有するサンプルにおいて観察された。
【０１７４】
４週間の期間、一週間に一度、サンプルを回収し、実施例３に記載されるようにＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、断片化の評価を実行した。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質の断片化へのｐＨの影響は、図４に表される。低ｐＨ（ｐＨ４．０）でＶ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質の経時的な（ｏｖｅｒ  ｔｉｍｅ）凝集を阻害することがわかった（図３）一方、低ｐＨはＶ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質のタンパク質断片化における増加を引き起こすことがわかった（図４）。
【０１７５】
断片化されたＶ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質におけるクリップ部位を同定するために、液体クロマトグラフ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）が実行された。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質を、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ５．５、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に製剤化した。ＬＣ−ＭＳは、実施例３に記載されるＲＰ−ＨＰＬＣ法に従って、続いて、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱイオントラップ質量分析計（ＭＳ）に結合して実行された。ＨＰＬＣ溶出は、０．２ｍＬ／分フローで１：５にスプリットされ、ＭＳに向けられた。２８０ｎｍでのオンライン検出が継続された。図５は、この実験からのＬＣ−ＭＳデータを表し、断片化が起こる主要な部位であるＤ９５およびＤ２００と、数個のアスパラギン酸（Ｄ）残基が断片化に関与することを実証する。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質の至る所に数個のＤ残基が存在する（例えばＤ５、Ｄ９、Ｄ１１０）が、Ｄ９５およびＤ２００だけが直後にリジン残基が続くことに注目すべきである。「ＶＩ  ｄｅｓ  Ｍｅｔ」は、熱ストレスの結果としてＰＥＧコンジュゲーションのマレイミド結合で起こる切断事象を示す。
【０１７６】
これらの実験に基づいて、凝集および断片化は、ｐＨ５．５で製剤を準備することにより、最良のバランスが保たれるが、しかしながら、このｐＨレベルだけに頼ることによっては、どちらの分解経路（凝集および断片化）も除去することができない。
【実施例５】
【０１７７】
Ｅ／Ｉタンパク質での凝集および断片化の評価
Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）で観察される凝集および断片化の不安定さの問題が、他の構造的に関連した二価構築体に共通している問題であったことを確認するために、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２３）の凝集および断片化特性もまた、数種のｐＨレベルで評価された。
【０１７８】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）を、ｐＨ４．０、４．５または５．５で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化した。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）は、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、所望の製剤に製剤化された。少なくとも６透析容量（ｄｉａ−ｖｏｌｕｍｅ）のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はＡ２８０により確認され、さらなる製剤バッファーで５ｍｇ／ｍＬに調節された。製剤化されたＥ／Ｉ（ＤＫ＋）はラミナーフローフード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ（ｃｒｉｍｐ）され、続いて４、２５および３７℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。
【０１７９】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）の凝集率は、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析を実行することにより評価された。ＳＥ−ＨＰＬＣは、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ４０４−４Ｆ  ＨＰＬＣカラム（４．６＊２５０ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）およびｐＨ５．５で１０ｍＭコハク酸／３％ソルビトール／０．４Ｍアルギニンからなる移動相を用いて実行された。流速は０．３５ｍＬ／分であり、検出は２８０ｎｍで実行された。図６は、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）と同様に、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）の凝集率は、２５℃でより低いｐＨで保存されたサンプルについてよりも、２５℃でより高いｐＨレベルで保存されたサンプルについて、より高かったことを示す。同一のデータ傾向が、３７℃でストレスを加えられたサンプルについても観察された。
【０１８０】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）の凝集率へのタンパク質濃度の影響もまた評価された。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）と同様に、表２は、４週後、より高い濃度（７ｍｇ／ｍｌ）のＥ／Ｉ（ＤＫ＋）が、より高いパーセンテージの凝集形成（より低いパーセンテージの単量体）に関連したことを図示している。表２は、タンパク質濃度とともにｐＨを低減することにより、凝集のパーセンテージがさらに減少することを実証している。
【表２】
0006023703.tif 000023
【０１８１】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）の断片化は、実施例３に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣ解析を実行することにより、評価された。図７は、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）と同様に、２５℃でより高いｐＨで保存されたサンプルについてよりも、２５℃でより低いｐＨレベルで保存されたサンプルについて、より高かったことを示す。同一のデータ傾向が、３７℃でストレスを加えられたサンプルについても観察された。
【０１８２】
断片化されたＥ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質におけるクリップ部位を同定するために、実施例４に記載されるようにＬＣ−ＭＳが実行された。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）タンパク質が、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ４．０、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために２５℃で維持された。図８は、この実験からのＬＣ−ＭＳデータを表し、Ｄ９５およびＤ２１８（Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）におけるＤ２００に相同な位置）を含む、数個のアスパラギン酸（Ｄ）残基が断片化に関与することを実証する。断片化はＤ１９９でも観察された。Ｄ１９９部位は、ＥＧＦＲ結合領域のＦＧ結合ループに位置するので、これらのＥ／Ｉ分子に特有であり、Ｖ／Ｉ分子では見られない。
【実施例６】
【０１８３】
ＤＫマイナスＥ／Ｉ変種での凝集および断片化の評価
様々なＥ／Ｉバインダー（配列番号：２３−２５）が製剤化され、それらの物理学的（凝集）および化学的（断片化）安定性が、同一の条件下で互いに比較された（表１参照）。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）で観察されたＤ９５およびＤ２１８クリップ部位の特徴付けに基づき（実施例５）、またこれらのＤＫクリップ部位が構造的に必須でないＣ末端テールに位置するという事実に基づき、Ｃ末端テールＤＫ部位が除去または置換されている、二つの異なるＥ／Ｉ構築体が生成された。
【０１８４】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）分子（配列番号：２３）は、２つの結合ドメインのそれぞれの後に、ＤＫ部位（Ｄ９５およびＤ２１８）を含むＣ末端テールを含有する、コントロールＥ／Ｉバインダーである。この分子の物理学的および化学的安定性は、実施例５で特徴づけられた。Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）分子（配列番号：２４）は、ＤＫ部位を全く含有しない。この分子では、位置９５のアスパラギン酸塩がグルタミン酸に変異しており、かつＥＩＤＫＰＣＱテール（配列番号：４７）がＥＧＳＧＣテール（配列番号：５）と交換されている。Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）分子（配列番号：２５）もまた、ＤＫ部位を全く含有しない。この分子では、位置９５および２１８のアスパラギン酸塩がグルタミン酸と交換されている。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）はコントロールとして、この実験に含まれた。
【０１８５】
Ｅ／Ｉタンパク質（配列番号：２３−２５）が、ｐＨ４．０で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化された。さらに、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２３）およびＶ／Ｉ（ＤＫ＋）（配列番号：２２）が、ｐＨ５．５で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化された。予備的な界面活性剤スクリーニングに基づいて、界面活性剤は必要なものとは認められなかった。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）は、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により、所望の製剤に製剤化された。少なくとも６透析容量（ｄｉａ−ｖｏｌｕｍｅ）のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はＡ２８０により確認され、さらなる製剤バッファーで５ｍｇ／ｍＬに調節された。製剤化された各二価構築体はラミナーフローフード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ（ｃｒｉｍｐ）され、続いて４、２５および３７℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。
【０１８６】
異なるＥ／Ｉ分子の凝集率は、実施例５により記載されるように、ＳＥ−ＨＰＬＣを実行することにより評価され、この実験からの結果は図９に図示される。予想通り、凝集率は、２５℃でＥ／Ｉ（ＤＫ＋）について、ｐＨ４．０よりもｐＨ５．５で著しく高い。図９に見られる傾き（ｓｌｏｐｅ）に基づき、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）についての凝集率は、２５℃で、ｐＨ４．０よりもｐＨ５．５でおよそ７倍高い。ＤＫ部位を欠く２つのＥ／Ｉ分子について、凝集率はｐＨ４．０で影響を受けなかった。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）およびＶ／Ｉ（ＤＫ＋）は、ｐＨ５．５で同様の凝集率を表した。
【０１８７】
異なるＥ／Ｉ分子の断片化率は、実施例３に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣ解析を実行することにより評価され、この実験からの結果は図１０に図示される。クリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）に関して、図１０は、２５℃でＥ／Ｉ（ＤＫ＋）について、ｐＨ４．０よりもｐＨ５．５で、より低いクリップ率（ｃｌｉｐ  ｒａｔｅ）を示す。図１０で示される分子の間で、最も高いクリップ率は、ｐＨ４．０でＥ／Ｉ（ＤＫ＋）において見られ、それは製剤のｐＨをｐＨ５．５へ増大させた場合、著しく最小化された。しかしながら、上述の通り、この分子はｐＨ５．５で凝集率が最も高かった。ＤＫ部位を欠く他の２つのＥ／Ｉ分子について、ｐＨ４．０でのクリップ率は、同じｐＨでのＥ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較して、およそ３倍減少した。Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）は、同じｐＨ（ｐＫ５．５）でＥ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較してより高い程度の断片化を示し、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）およびＥ／Ｉ（ＤＫ＋）分子は類似するが、Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）分子は断片化の影響をより受けやすいことを示す。
【０１８８】
Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）に対するクリップ化部位と比較して、Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）に対するクリップ化部位の特徴付けは、実施例４に記載されるようにＬＣ−ＭＳを用いて実行された。２つの異なるＥ／Ｉバインダーが、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ４．０、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中にそれぞれ製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために２５℃で維持された。図１１は、この実験からのＬＣ−ＭＳデータを表し、断片化プロファイルが２つの異なるＥ／Ｉバインダー間で異なることを実証する。Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）における断片化に関与する主要なアスパラギン酸（Ｄ）残基は、Ｄ９５、Ｄ２１８およびＤ１９９であった。一方、Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）における断片化に関与する主要なアスパラギン酸残基は、Ｄ１９９、Ｄ８２およびＤ１９３であった。しかしながら、以下の表３に図示されるように、４週間後のＥ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）における総クリップのパーセンテージは、この同じ期間後のＥ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較して、ほぼ半減していた（７．５％と比べて３．８％）。これらの結果は、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較して、Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）が低減された断片化と関連することを示している。
【０１８９】
Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）に対するクリップ化部位の特徴付けは、実施例４に記載されるようにＬＣ−ＭＳを用いて実行された。Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）が、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ｐＨ４．０、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に製剤化され、タンパク質ストレスを誘導するために２５℃で維持された。図１２は、この実験からのＬＣ−ＭＳデータを表し、Ｅ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）と同様に、Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）における断片化に関与する主要なアスパラギン酸残基が、Ｄ１９９、Ｄ８２およびＤ１９３であったことを実証する。また、以下の表３に図示されるように、４週間後のＥ／Ｉ（２ＤＫ−）における総クリップのパーセンテージは、この同じ期間後のＥ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較して、半減以上であった。（７．５％と比べて３．５％）これらの結果は、Ｅ／Ｉ（ＤＫ＋）と比較して、Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）が低減された断片化と関連することを示している。
【０１９０】
表３．２５℃での保存の４週間後の様々なＥ／Ｉバインダーについての断片化の量および位置。
【表３】
0006023703.tif 000024
【０１９１】
上記のように、Ｄ１９９部位はＥＧＦＲ結合領域のＦＧ結合ループ内に位置する。そのため、Ｄ１９９はおそらく結合機能のために必要であり、Ｅ／Ｉ（２ＤＫ−）分子またはＥ／Ｉ（ＤＫ−、Ｃ末端無し）分子から除去することは難しいだろう。
【０１９２】
Ｖ／Ｉ（ＤＫ＋）およびＥ／Ｉ（ＤＫ＋）で観察されたアスパラギン酸部位でのクリッピングの正確な機序は、明らかではない。ＮＭＲ法により測定される、グルカゴンでの３つのアスパラギン酸の見かけのｐＫａ値に基づき、Ｊｏｓｈｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ９４  （９），  ２００５）は、アスパラギン酸部位での切断反応に対するいくつかの機序を提案した。理論に束縛されるものではないが、提案された機序のいくつかは、五員環を形成するためのアスパラギン酸側鎖の環化、続いて、ペプチド結合切断を次いで引き起こす、ペプチドカルボニルへの求核攻撃を含む可能性がある。アスパラギン酸をグルタミン酸で置換することにより、立体障害に起因して容易に環形成が起こらず、それゆえその位置でのペプチド結合切断を阻害する可能性がある。
【実施例７】
【０１９３】
ＤＫマイナスＶ／Ｉ変種での凝集および断片化の評価
２つのＶＥＧＦＲ−ＩＧＦＲ（ＶＩ）フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質の安定性が比較された。第一の構築体は、ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）であり、第二の構築体ＶＩ（ＤＫ−）（配列番号：５７）は、配列番号：５６の位置９４および１９９で、アスパラギン酸のグルタミン酸との置換を含有する。
【０１９４】
両分子は、ｐＨ４．０、４．５および５．５で、１０ｍＭコハク酸、５％ソルビトール中に、３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で製剤化された。これらの製剤の制限された安定性を、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣによる解析のために引かれた定期的な時点で、最長２ヶ月間、４および２５℃で実行した。さらに、ＬＣ−ＭＳでの特徴付けを、両タンパク質での正確なクリップ部位を決定するために、２ヶ月２５℃のサンプルで実行した。
【０１９５】
ＶＩフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における凝集率へのｐＨの影響
過去のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質での経験に基づき、低ｐＨ製剤が、これらの分子に対して最良の生物物理学的安定性（すなわち、より低い凝集）を提供することが認識されている。今回の研究では、２つのＶＩ構築体が、図１３に図示されるように、以前見られたものと同じ傾向を明示する。凝集の開始レベルは２つの分子間でわずかに異なるが、安定性期間にわたって観察された率は、所与の各ｐＨで非常に類似しており、両分子についての凝集率は同じ順序、ｐＨ５．５＞＞ｐＨ４．５＞ｐＨ４．０、を示す。
【０１９６】
ＶＩフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率へのｐＨの影響
過去のフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質での経験に基づき、クリッピングの影響を受けやすい部位がタンパク質配列に存在する場合、低ｐＨ製剤が、これらのタンパク質に対して最低の化学的安定性を提供することが認識されている。ＶＩ（ＤＫ＋）（配列番号：５６）に対して実行された過去の安定性研究では、多数のクリップ部位が同定され、最も重度であるＤ９４およびＤ１９９でのクリッピングを有していた。今回の研究では、２つのＶＩ構築体が、図１４に図示されるように、以前見られたものと同じ傾向を明示し、ＶＩ（ＤＫ−）に対するよりもＶＩ（ＤＫ＋）に対する方がより悪い、クリップ率へのｐＨの影響を有している。クリップ率は、両分子について、ｐＨ４．０＞ｐＨ４．５＞ｐＨ５．５という一般的な傾向に追随するが、ＶＩ（ＤＫ−）は、全３種のｐＨ値にわたり、そのクリップ率についてほとんど相違がないことを示す。
【０１９７】
図１３および１４に示される安定性データ傾向から、製剤ｐＨが５．５から４．０に減少した場合、ＶＩ（ＤＫ＋）についての一週間あたりのクリップ率は３．３倍増加するが、他方では、ＶＩ（ＤＫ−）分子については、２つの位置での主要なクリップ部位の除去により、この率は１．６倍増加した。それゆえ、これらのアミノ酸置換で、ＶＩフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率は、ｐＨ４製剤を用いる場合、同じ安定性期間にわたり、約５０％減少した。一方で、製剤ｐＨが５．５から４．０に減少した場合、ＶＩ（ＤＫ＋）およびＶＩ（ＤＫ−）についての一週間あたりの凝集率は、それぞれ８６倍および２１６倍減少する。凝集率へのｐＨ影響は、それゆえ、ＶＩフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるクリップ率への影響よりも劇的である。
【０１９８】
ＬＣ−ＭＳによるクリップ部位の同定
ＶＩ（ＤＫ＋）およびＶＩ（ＤＫ−）において観察されたクリップ部位の構造的特徴付けが、ＬＣ−ＭＳにより実行された。２５℃／２ヶ月時点からのクリップ領域の重ね合わせた（ｏｖｅｒｌａｉｄ）ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムが図１５に見られ、ピーク同定が表４に要約される。
【０１９９】
表４．質量分析によるピーク同定の要約。赤で強調される残基は、ＶＩ（ＤＫ−）構築体ではグルタミン酸に交換された、本来のＶＩ配列に存在するアスパラギン酸を示す。
【表４】
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【０２００】
いくつかのクリップが２つの分子間で同一のままである一方、ＶＩ（ＤＫ−）においてＤ９４とＤ１９９での主要なクリップ部位は除去され、２５℃で２ヶ月のストレスの後、総クリップのレベルを６．９％までもたらす。他方では、ＶＩ（ＤＫ＋）における総クリップは、同じ安定性期間にわたり、１６．０％で高いままであった。低レベルの他のクリップもまたＶＩ（ＤＫ−）において同定されたが、ＶＩ（ＤＫ＋）では見られなかった。
【０２０１】
表５．ＶＩ（ＤＫ＋）およびＶＩ（ＤＫ−）でのクリップ率の比較。
【表５】
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【０２０２】
ｐＨ４．０でのＶＩ（ＤＫ＋）のクリップ率は、ｐＨ４．５および５．５でのＶＩ（ＤＫ＋）のクリップ率よりも、それぞれ、１．６倍および３．３倍速かった。ｐＨ４．０でのＶＩ（ＤＫ−）のクリップ率は、ｐＨ４．５および５．５でのＶＩ（ＤＫ−）のクリップ率よりも、それぞれ、１．５倍および１．６倍速かった。
【０２０３】
表６．ＶＩ（ＤＫ＋）およびＶＩ（ＤＫ−）での凝集率の比較。
【表６】
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【０２０４】
ｐＨ４．５および５．５でのＶＩ（ＤＫ＋）の凝集率は、ｐＨ４．０でのＶＩ（ＤＫ＋）の凝集率よりも、それぞれ、４．４倍および８６倍速かった。ｐＨ４．５および５．５でのＶＩ（ＤＫ−）の凝集率は、ｐＨ４．０でのＶＩ（ＤＫ−）の凝集率よりも、それぞれ、４．０倍および２１６倍速かった。
【０２０５】
２種類のＶＩフィブロネクチンをベースとする足場タンパク質で得られた安定性結果は、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における特定の化学分解を除去する目的で、問題のあるアスパラギン酸のグルタミン酸への選択的置換の有効性および利益を実証する。このアプローチを通じて除去された主要な化学分解で、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質におけるより良い生物物理学的安定性が、低ｐＨでの製剤を介して、これから達成され得る。ＶＩでの本研究からの結果、ならびにＥＩ二重機能的フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質からこれまでに得られたものは、クリッピングされやすいと知られている特定のアスパラギン酸を除去することの必要性を実証し、同様に、フィブロネクチンをベースとする足場タンパク質における生物物理学的安定を最大限にするために、酸性ｐＨでの製剤化が用いられることを可能にする。
【０２０６】
材料および方法
製剤：各分子は、３０ｋＤ  ＭＷＣＯ膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）を介して、所望の製剤に製剤化された。少なくとも６透析容量（ｄｉａ−ｖｏｌｕｍｅ）のバッファーを交換して、最終製剤を達成した。生じるタンパク質の濃度はＡ２８０により確認され、さらなる製剤バッファーで３ｍｇ／ｍＬに調節された。
【０２０７】
バイアル充填および安定性：製剤化された各タンパク質は、ラミナーフローフード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）にて無菌濾過され、安定性監視のため無菌ガラスバイアル中に充填された。バイアルは蓋をされクリンプ（ｃｒｉｍｐ）され、続いて４および２５℃で温度制御されたインキュベーター内に配置された。
【０２０８】
解析方法：
サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）：解析は、Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ４０４−４Ｆ  ＨＰＬＣカラム（４．６＊２５０ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）およびｐＨ５．５で１０ｍＭコハク酸／３％ソルビトール／０．４Ｍアルギニンからなる移動相を用いて実行された。流速は０．３５ｍＬ／分であり、検出は２８０ｎｍで実行された。
【０２０９】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＢ）：解析は、Ｖａｒｉａｎ  ＰＬＲＰ−Ｓカラム（４．６＊２５０ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）を用いて実行された。様々な種の分離は、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸からなるグラジエントを介して達成される。流速は１．０ｍＬ／分であった。二重検出は、（タンパク質関連種のため）２８０ｎｍで、および蒸発光散乱（ＥＬＳ、ＰＥＧ関連種のため）で、実行された。
【０２１０】
ＬＣ−ＭＳ：クリップ部位の特徴付けは、Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱイオントラップ質量分析（ＭＳ）に連結された、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（４．６＊２５０ｍｍ、細孔径３００Å、粒径５μｍ）を用いて実行された。ＨＰＬＣ溶出は、０．２ｍＬ／分フローで１：５にスプリットされ、ＭＳに向けられた。２８０ｎｍでのオンライン検出が継続された。
【０２１１】
出典明示による組み込み
特許出願文書およびウェブサイトを含む、本明細書に記載される全ての文書および参考文献は、あたかもそれらが全体または一部分において本文書に書かれたのと同程度に、出典明示により本文書に個々に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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