(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類において癌を治療するための組成物であって、該組成物はｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）アゴニストを含み、
該癌はＴＬＲ５を発現せず、ＴＬＲ５を発現する肝臓組織中に存在し、
該癌はｔｏｌｌ様受容体を発現せず、そして、
該ＴＬＲ５アゴニストがフラジェリンである、組成物。
【請求項２】
前記フラジェリンが配列番号８を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記癌が転移性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記転移性癌が、黒色腫、結腸、乳房、前立腺、および血液の悪性腫瘍から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記血液の悪性腫瘍がリンパ腫である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記癌が腫瘍である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＴＬＲ５アゴニストが単剤療法として投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記哺乳類が、癌の併用療法を受けない、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記哺乳類が、化学療法も放射線療法も受けない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記哺乳類が十分な自然免疫を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記十分な自然免疫レベルが、化学療法の最初のラウンドまたは次のラウンドの適格性に必要なレベルに相当する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記哺乳類が、臨床的に正常な範囲内の白血球数を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、腫瘍除去前、腫瘍除去後、または腫瘍除去と同時に前記哺乳類に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＴＬＲ５アゴニストが、ＦＡＳアゴニストと共投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＦＡＳアゴニストがＦＡＳアゴニスト抗体である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
哺乳類において癌の再発を減少させるための組成物であって、該組成物はＴＬＲ５アゴニストを含み、
該癌はＴＬＲ５を発現せず、ＴＬＲ５を発現する肝臓組織中に存在し、
該ＴＬＲ５アゴニストがフラジェリンである、組成物。
【請求項１７】
前記癌の再発が、転移または腫瘍再増殖から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記フラジェリンが配列番号８を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
哺乳類において転移性癌を治療するための組成物であって、該組成物は配列番号８のアミノ酸配列を含むＴＬＲ５アゴニストを含み、該転移性癌はＴＬＲ５を発現しないが、ＴＬＲ５を発現する肝臓組織中に存在する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＬＲアゴニストを用いて、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する組織の癌を治療する方法、ならびに肝毒性の影響から肝臓を保護する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞死受容体ファミリーのメンバーとそれらの同族リガンドとの間の相互作用は、組織、特に、免疫系における細胞集団のホメオスタシスを制御するアポトーシスを誘導する。多くの腫瘍細胞型は、細胞死リガンドに感受性があるが、Ｆａｓシグナル伝達の活性化は、臓器不全および細胞死に至る肝臓での広範なアポトーシスも誘導し、これにより全身抗癌治療に対するその使用を妨げている。Ｆａｓリガンドは、活性化リンパ球および多くの腫瘍細胞上で発現するＦａｓシグナル伝達の４０ｋＤａの生理的アゴニストであり、メタロプロテアーゼによる切断を介して分泌され、オートクリンおよびパラクリン的に感受性細胞を死滅させることもできる。Ｆａｓは、活性化リンパ球、様々な組織および腫瘍細胞上で発現する膜貫通受容体である。Ｆａｓシグナル伝達は、オートクリン自殺（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ
ｓｕｉｃｉｄｅ）またはパラクリン死（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｄｅａｔｈ）（アポトーシス）を引き起こし、活性化リンパ球を排除することによって免疫反応を抑制することにより免疫系の調節に重要な役割を果たしている。結合すると、ＦＡＳは、ＤＩＳＣ形成、カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０が関与するアポトーシスの外因性経路を介したp５３依存性細胞死、内因性（ミトコンドリア）アポトーシスを活性化するカスパーゼ−８およびＢｉｄ切断、ならびにシトクロム放出を誘導する。両方のアポトーシス経路は、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７の活性化につながる。ミトコンドリアアポトーシスは、プロアポトーシスＢｃｌ２ファミリーおよび抗アポトーシスＢｃｌ２ファミリーのメンバーによって調節されている。腫瘍細胞において、Ｆａｓシグナル伝達は、Ｆａｓ受容体の欠損、またはｃ−Ｆｌｉｐ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬなどの抗アポトーシス遺伝子の発現をもたらすＮＦ−κＢの構成的活性化のいずれかによって調節解除される場合が多い。ＮＦ−κＢ応答性遺伝子であるｃ−Ｆｌｉｐは、腫瘍においてカスパーゼ−８およびＦａｓ媒介アポトーシスを抑制することが証明されている（ＲＥＦｓ,Ｋａｔａｏｋａ ｅｔ ａｌ ２０００）。
【０００３】
腫瘍細胞は、通常、p５３機能を損なっているので、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬおよびＴＮＦａの細胞死受容体シグナル伝達を介したp５３非依存性アポトーシスメカニズムの発見の際、それらは、抗癌治療のための有望な標的であるように思われた。しかし、重度の肝毒性が、細胞死受容体リガンドによって誘導される。これは、これらの抗癌治療の開発を妨げている。Ｆａｓアゴニストは肝損傷を引き起こし、ＴＮＦ−ａは、肝臓、肺および他の臓器に強い炎症を誘発するが、ＴＲＡＩＬは、ヒトにおいて最も毒性がない。したがって、ＴＲＡＩＬは、抗癌治療の臨床応用に対して、他のアゴニストよりも多くの注目を集めている。しかし、多くの腫瘍は、ＴＲＡＩＬ治療に感受性を示さない。細胞死受容体の毒性問題を解決するいくつかのアプローチが現在行われており、そのうちのほとんどは、ＮＦ−κＢ活性の阻止および受容体発現の増加により腫瘍感受性を増加させ、それによって、効果的な治療に必要な薬物の量を減らすことを目的としている。別の方向は、遠位の臓器に対する毒作用を最小にするために腫瘍への薬物送達を限定することである。今までに、臨床試験において細胞死受容体アゴニストの全身適用を可能にする（肝損傷を含む）毒性防止に対する信頼性のあるアプローチはない。したがって、細胞死受容体アゴニストが、癌を治療するために用いられる場合、細胞死受容体の望ましくない影響を防止する方法が当技術分野において必要とされている。特に、これらの望ましくない影響から肝臓を保護する必要がある。一般に、肝毒性から肝臓を保護する必要もある。
【０００４】
ＴＬＲは、上皮細胞および内皮細胞の両方ならびに免疫細胞で発現することが見出されている。現在のところ、１３種類のＴＬＲが哺乳類において同定されている。受容体刺激の際に、生存率の増加、細胞増殖の刺激ならびに走化性機能および炎症促進性機能を有する多くのサイトカインの分泌につながるＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）などのいくつかの共通のシグナル伝達経路が活性化される。癌細胞におけるＴＬＲの誘導を用いて、癌を治療することができるが、種々のＴＬＲの分布は、様々な臓器および細胞型間で著しく変化する。これは、サイトカインプロファイルおよび細胞の炎症反応の程度に影響を及ぼす。したがって、ＴＬＲ５発現の存在に依存しない癌免疫療法が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
哺乳類の癌を治療する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含み得る方法を本明細書に提供する。哺乳類の癌の再発を減少させる方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含み得る方法も提供する。癌は、ＴＬＲを発現する組織に存在し得る。癌は、転移性であるか、または腫瘍再増殖であり得る。
【０００６】
ＴＬＲアゴニストはフラジェリンであり得る。癌は、ＴＬＲ５であり得るＴＬＲを発現しなくてよい。組織は、肝臓、肺、膀胱、または腸であり得る。癌は、転移性であり得る。癌は、黒色腫、結腸、乳房、前立腺、またはリンパ腫であり得る血液の悪性腫瘍であり得る。癌は、腫瘍であり得る。
【０００７】
薬剤は、単剤療法として投与され得る。哺乳類は、併用療法を受けなくてもよい。哺乳類は、化学療法または放射線療法も受けなくてよいが、外科的に治療することができる。哺乳類は、化学療法の最初のラウンドまたは次のラウンドの適格性に必要なレベルに相当するレベルであり得る十分な自然免疫を有し得る。哺乳類は、正常の範囲内の白血球数を有するか、または軽度の免疫抑制を示す白血球数を有し得る。ＴＬＲアゴニストは、腫瘍除去前、腫瘍除去後、または腫瘍除去と同時に哺乳類に投与され得る。ＴＬＲアゴニストは、腫瘍除去中に投与され得る。
【０００８】
哺乳類の癌を治療する方法であって、ＦＡＳアゴニストおよびフラジェリンであり得るＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含み得る方法をさらに本明細書に提供する。ＦＡＳアゴニストは、ＦＡＳアゴニスト抗体であり得る。癌は、転移性であり、腫瘍であり得る。癌は、ＴＬＲを発現しなくてよい。癌は、ＴＬＲを発現する浸潤組織に転移していてよい。浸潤組織は、肝臓、膀胱、肺、または腸であり得る。
【０００９】
肝毒性の影響から哺乳類の肝組織を保護する方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含み得る方法も本明細書に提供する。この毒性は、ＦＡＳリガンド、ＦＡＳアゴニスト抗体、ＴＮＦａ、アセトアミノフェン、アルコール、肝臓のウイルス感染、または化学療法剤であり得る。この毒性は、ネズミチフス菌由来であり得るサルモネラ感染でもあり得る。このＴＬＲアゴニストは、フラジェリンであり得る。
本発明の好ましい実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
哺乳類においてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を発現する組織中に存在する癌を治療する方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
（項目２）
哺乳類においてＴＬＲを発現する組織中に存在する癌の再発を減少させる方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
（項目３）
前記癌の再発が、転移および腫瘍再増殖からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＴＬＲアゴニストがフラジェリンである、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記癌がＴＬＲを発現しない、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ＴＬＲがＴＬＲ５である、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記組織が、肝臓、肺、膀胱、および腸からなる群から選択される、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記癌が転移性である、項目１〜７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記癌が、黒色腫、結腸、乳房、前立腺、または血液の悪性腫瘍からなる群から選択される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記癌が腫瘍である、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記血液の悪性腫瘍がリンパ腫である、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記アゴニストが単剤療法として投与される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記哺乳類が、癌の併用療法を受けない、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記哺乳類が、化学療法または放射線療法を受けない、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記哺乳類が十分な自然免疫を有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記十分な免疫レベルが、化学療法の最初のラウンドまたは次のラウンドの適格性に必
要なレベルに相当する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記哺乳類が、臨床的に正常な範囲内の白血球数を有する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記ＴＬＲアゴニストが、腫瘍除去前、腫瘍除去後、または腫瘍除去と同時に前記哺乳類に投与される、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
哺乳類の癌を治療する方法であって、ＦＡＳアゴニストおよびＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
（項目２０）
前記ＴＬＲアゴニストがフラジェリンである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ＦＡＳアゴニストがＦＡＳアゴニスト抗体である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記癌が転移性である、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記癌が腫瘍である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記転移性癌がＴＬＲを発現せず、前記癌がＴＬＲを発現する浸潤組織に転移する、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記浸潤組織が、肝臓、膀胱、肺、および腸からなる群から選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
哺乳類の肝組織を、肝毒性の作用から保護する方法であって、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
（項目２７）
前記毒性が、ＦＡＳリガンド、ＦＡＳアゴニスト抗体、ＴＮＦａ、アセトアミノフェン、アルコール、肝臓のウイルス感染、および化学療法剤からなる群から選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
哺乳類のサルモネラ感染を治療する方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法。
（項目２９）
前記ＴＬＲアゴニストがフラジェリンである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記サルモネラがネズミチフス菌である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記感染が肝組織に存在する、項目２８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】細菌フラジェリンのドメイン構造を示す図である。Ｆ４１のＣａ骨格トレース、疎水性コア分布および構造情報。ドメインＤｌ、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂおよびＤ３を画定する４つの異なる疎水性コア。全ての疎水性側鎖原子は、Ｃａ骨格で示される。側鎖原子は色分けされている：Ａｌａは黄色、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌは橙色、ＰｈｅおよびＴｙｒは紫色（炭素原子）および赤色（酸素原子）。ｃ、フラジェリンのアミノ酸配列における様々な構造的特徴の位置および領域。上から下に以下のものを示す：青色のＦ４１断片；茶色の３つのｂ葉状折りたたみ構造（ｆｏｌｉｕｍ ｆｏｌｄ）；黄色のａ−ヘリックス、緑色のｂ−構造、および紫色のｂ−ターンを有する２次構造分布；青色の５０残基ごとの目盛り（ｔｉｃ  ｍａｒｋ）；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３；シアンのプロトエレメント内の軸方向のサブユニット接触領域；赤色のよく保存されたアミノ酸配列および紫色の可変領域；異なるスーパーコイルのエレメントを生成するＦ４１内の点変異。下の文字は、変異エレメント：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌ型直鎖；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒ型直鎖；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、ｃｕｒｌｙ３３の形態を示す。
【図２】サルモネラフラジェリンドメイン、その断片、およびＴＬＲ５とのその相互作用の模式図である。黒い棒は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’およびＢ’を含む断片を構築するために用いられるフラジェリン遺伝子の領域を表す。
【図３】フラジェリン誘導体を示す図である。（右側に列挙してある）選択されたフラジェリン誘導体のドメイン構造および近似境界（アミノ酸配位）。ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｄｕｂｌｉｎのＦｌｉＣフラジェリンは、５０５個のアミノ酸（ａａ）内にコードされている。
【図４】以下のフラジェリン変異体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号７〜８）、ＡＢ’（配列番号９〜１０）、ＢＡ’（配列番号１１〜１２）、ＢＢ’（配列番号１３〜１４）、ＣＡ’（配列番号１５〜１６）、ＣＢ’（配列番号１７〜１８）、Ａ（配列番号１９〜２０）、Ｂ（配列番号２１〜２２）、Ｃ（配列番号２３〜２４）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号２５〜２６）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号２７〜２８）、ＡＡ’ｎ１〜１７０（配列番号２９〜３０）、ＡＡ’ｎ１〜１６３（配列番号３３〜３４）、ＡＡ’ｎ５４〜１７０（配列番号３１〜３２）、ＡＡ’ｎ５４〜１６３（配列番号３３５〜３６）、ＡＢ’ｎ１〜１７０（配列番号３７〜３８）、ＡＢ’ｎ１〜１６３（配列番号３９〜４０）、ＡＡ’ｎ１〜１２９（配列番号４１〜４２）、ＡＡ’ｎ５４〜１２９（配列番号４３〜４４）、ＡＢ’ｎ１〜１２９（配列番号４５〜４６）、ＡＢ’ｎ５４〜１２９（配列番号４７〜４８）、ＡＡ’ｎ１〜１００（配列番号４９〜５０）、ＡＢ’ｎ１〜１００（配列番号５１〜５２）、ＡＡ’ｎ１〜７０（配列番号５３〜５４）およびＡＢ’ｎ１〜７０（配列番号５５〜５６）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列をイタリック体で示す（リーダーは、ＦｌｉＣのアミノ酸１でもあるＭｅｔを含む）。Ｎ末端定常ドメインに下線を引く。アミノ酸リンカー配列を大文字で示す。Ｃ末端定常ドメインに下線を引く。存在する場合、ＧＳＴを強調する。
【図５】２１種類の細菌の保存されたアミノ末端（図５Ａ）およびカルボキシ末端（図５Ｂ）のアミノ酸配列の比較を示す。ＴＬＲ５活性に重要な１３個の保存されたアミノ酸を陰影で示す。これらのアミノ酸配列は、ＴｒＥＭＢＬ（最初の文字＝Ｑ）またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（最初の文字＝Ｐ）のそれらの受託番号によって識別される。
【図６】ヒトＴＬＲ５の配列を示す。
【図７】ＣＢＬＢ５０２およびＬＰＳの注射に応答したインビボのＮＦ−κＢ活性化を示す。Ａ．ＢＡＬＢ／ｃ−Ｔｇ（ｌＫＢａ−ｌｕｃ）ＸｅｎレポーターマウスにおけるバックグラウンドおよびＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ発現を、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）での治療後２時間の非侵襲イメージングによって検出した。Ｂ．肝臓、小腸（回腸部分）、結腸、脾臓、腎臓、肺および心臓におけるＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ発現を、ＰＢＳ、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれか１００μｌの皮下注射後２時間のレポーターマウスにおいて評価した。タンパク質抽出物１μｇあたりの正規化されたルシフェラーゼ活性を、各群３匹のマウスで検出した。棒は、平均＋／−標準偏差を示す。Ｃ．ＣＢＬＢ５０２またはＬＰＳのいずれかを皮下注射したＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの肝臓におけるアゴニストＬＰＳおよびＣＢＬＢ５０２の生物活性を示すＮＦ−κＢ（ｐ６５）の核転座の動態。対照マウスにＰＢＳを注射した。組織試料を、治療後２０分、４０分および６０分の時点で取得し、パラフィンブロックに加工した。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスから単離したマウスの初代肝細胞（Ｄ）およびＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入したヒト肝細胞（Ｅ）におけるｐ６５の核転座を、示した期間、ＣＢＬＢ５０２（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）でインビトロ処理した後に検出した。対照の肝細胞は、未処理のままにした。ｐ６５を緑色蛍光で染色し、サイトケラチン８を赤色蛍光で染色し、非特異的Ｄａｐｉブルー染色で核を染色した。２０倍の倍率で撮影する。矢印は、形態学的基準に基づいて判断したクッパー細胞および内皮細胞を示す。
【図８】Ｆａｓ媒介肝毒性からのＣＢＬＢ５０２保護を示す。Ａ．抗Ｆａｓ抗体４μｇを単独で腹腔内注射するか、または抗体（注射）の３０分前、２時間前および６時間前に、ＣＢＬＢ５０２（１μｇ／マウス）と組み合わせて腹腔内注射した後のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの生存率を示す。治療ごとのマウスの数を括弧内に示す。Ｂ．抗Ｆａｓ抗体毒性からの肝臓の保護。抗Ｆａｓ抗体の注射後５時間の肝臓におけるアポトーシスを、ＴＵＮＥＬ法を用いて検出した。Ｃ.Ｈ＆Ｅ染色による組織形態を、抗Ｆａｓ抗体注射およびＣＢＬＢ５０２による保護により、肝臓への壊死損傷を明らかにした。Ｄ.肝臓における出血を、赤血球自己蛍光（ローダミンチャンネル、赤）、マウスＩｇＧ対照（Ｃy５標識抗マウスＩｇＧ抗体、紫色の疑似カラー）およびＤＡＰＩ核（青色）を用いて検出した。Ｅ.ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの肝臓試料におけるカスパーゼ３／７活性を、ＣＢＬＢ５０２の３０分間の前治療がある場合とない場合とで、抗Ｆａｓ抗体３μｇの注射後５時間の組織タンパク質溶解物において測定した。Ｎ＝３。棒は、平均＋／−標準偏差を表す。Ｆ.ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）蓄積を、ＣＢＬＢ５０２がある場合とない場合で、抗Ｆａｓ抗体注射後５時間に検出した。Ｎ＝３。棒は、平均＋／−標準偏差を表す。Ｇ.ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの肝臓試料におけるカスパーゼ−８活性を、ＣＢＬＢ５０２の３０分間の前治療がある場合とない場合とで、抗Ｆａｓ抗体３μｇの注射後５時間の組織タンパク質溶解物において測定した。Ｎ＝３。棒は、平均＋／−標準偏差を表す。
【図９】肝臓におけるＣＢＬＢ５０２によるアポトーシス関連因子の調節およびＣＴ−２６腫瘍モデルにおけるＦａｓ媒介抗腫瘍活性に対するＣＢＬＢ５０２の効果を示す。ＣＢＬＢ５０２によるカスパーゼ−８（Ａ）およびＢｉｄ（Ｂ）切断の阻害を、抗Ｆａｓ抗体５μｇの単独注射後、またはＣＢＬＢ５０２と組み合わせた注射後２時間のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した肝臓においてウェスタンブロットにより検出した。未治療のマウスおよびＣＢＬＢ５０２で３０分間および２時間治療したマウスの肝臓におけるＢｃｌ２ＡｌＢ、Ｂｃｌ２ＡｌＤ、ＩＥＲ−３、Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびＪｕｎＢの遺伝子のＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した。ＧＡＰＤＨを対照として用い、遺伝子発現の誘導を監視した。Ｄ．皮下増殖ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスに、抗Ｆａｓ抗体（４μｇ／マウス）およびＣＬＢ５０２またはそれらの組み合わせのいずれかを注射した。対照マウス（「未治療」）には、ＣＢＬＢ５０２および抗体の代わりにＰＢＳを注射した。各群の腫瘍の数を括弧内に示す。結果は、平均腫瘍体積（ｍ＋／−標準誤差）を表す。（＊）−未治療群と組み合わせ治療群との差は有意である（ｐ＜０．０５）。Ｅ.ルシフェラーゼ発現ＣＴ−２６腫瘍細胞の脾臓内注射後５日目に、マウスを、抗Ｆａｓ抗体単独でまたはＣＢＬＢ５０２と組み合わせて治療した。肝臓における腫瘍増殖を、腫瘍細胞接種後１０日、１５日、１７日、２２日、２８日および４０日目にＸｅｎｏｇｅｎ社のＩＶＩＳイメージングシステムを用いて測定した。１５日目に撮影した各群３匹のマウスの画像を示す。ＣＢＬＢ５０２治療群と対照群における腫瘍のない肝臓を有するマウスの比率の差は、アスタリスクで示した日に統計的有意性（ｐ＜０．０５）に達する。Ｆ.ＣＢＬＢ５０２での治療後５時間のマウスの肝臓において増殖した腫瘍小結節内への免疫細胞の移行および浸潤（矢印）。
【図１０】ＣＢＬＢ５０２（５μｇ、皮下）およびＬＰＳ（２０μｇ、皮下）の注射後の異なる臓器におけるＮＦ−κＢ活性化の動態を示す。マウスを、ＣＯ２吸入の２時間後、６時間後、２４時間後および４８時間後に安楽死させた。肝臓、大腸、腎臓および肺からのタンパク質抽出物中のルシフェラーゼ活性を、タンパク質抽出物１μｇあたりに正規化し、平均値を臓器ごとに計算した。ルシフェラーゼ誘導倍率を、ＴＬＲアゴニスト治療マウスの臓器からのタンパク質抽出物中の平均ルシフェラーゼ活性と、ＰＢＳを注射した対照マウス（３匹のマウス／群）の対応する臓器からの抽出物において得られた平均ルシフェラーゼ活性との比として計算した。棒は、平均±標準誤差としての誘導倍率を表す。
【図１１】ルシフェラーゼレポーターマウスから単離し、ＣＢＬＢ５０２（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳ対照で３時間インビトロ処理したマウス肝細胞の初代培養物中のＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ発現を示す。その後、肝細胞をＰＢＳですすぎ、細胞溶解緩衝液（プロメガ社）で収集した。タンパク質上清中のルシフェラーゼ活性を、プロメガ社のレポーターシステムによって測定し、タンパク質抽出物１μｇあたりに正規化した。棒は、ルシフェラーゼ単位（平均±標準偏差）を表す。
【図１２】ＣＢＬＢ５０２、抗Ｆａｓ抗体（３μｇ）またはそれらの組合せで治療し、治療後の異なる時間点で得たＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの肝臓試料のＨ＆Ｅ染色を示す。肝臓の試料を、抗Ｆａｓ抗体注射後５時間、１２時間および２６時間に取得し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシンで組織形態について染色した。
【図１３】Ｂ１６細胞およびＣＴ−２６細胞中のＴＬＲ５発現を示す。Ａ．Ｂ１６細胞およびＣＴ−２６細胞中のＴＬＲ５およびＧＡＰＤＨ（対照）の遺伝子をコードするｍＲＮＡの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。マウスＴＬＲ５遺伝子に特異的なプライマーを用いて、マウスＴＬＲ５ｍＲＮＡの領域を増幅した：フォワード（５'−ＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣ−３'）およびリバース（５'−ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＴＧＡＧＴ−３'）。Ｂ.ＣＢＬＢ５０２、マウスＴＮＦａおよびＬＰＳに応答した、Ｂ１６腫瘍細胞およびＣＴ−２６腫瘍細胞中のＮＦ−κＢ活性化を、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて試験した。データは、ルシフェラーゼ単位（平均±標準偏差）を表す。
【図１４】ＣＴ−２６腫瘍細胞およびＡ２０リンパ腫細胞におけるＴＬＲ５発現を示す。図１４Ａおよび図１４Ｃについては、全ＲＮＡを、本明細書の本文に記載したようなＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、ＣＴ−２６腫瘍細胞およびＢ１６腫瘍細胞（図１４Ａ）ならびにＣＴ−２６細胞およびＡ２０細胞（図１４Ｃ）から抽出した。ＴＬＲ５用のプライマーを、ＬａｓｅｒＧｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて設計した。マウスＴＬＲ５遺伝子に特異的なプライマーを用いて、マウスＴＬＲ５ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６９２８.２）の領域を増幅した：フォワード（５'−ＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＴＴＣ−３'）およびリバース（５'−ＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＡＧＣＡＧＴＧＡＧＴ−３'）。ＧＡＰＤＨを、遺伝子発現の誘導を監視するための対照として用いた。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩ逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて合成した。Ｂ.Ｂ１６（ＴＬＲ５陽性）腫瘍細胞およびＣＴ−２６（ＴＬＲ５陰性）腫瘍細胞におけるＮＦ−κＢ活性化について、インビトロルシフェラーゼアッセイを行った。
【図１５】ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（無治療）での治療（０.２ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日、２日、３日）後の胸腺欠損ヌードマウスにおけるＴＬＲ５陽性ＨＣＴ１１６腫瘍増殖の動態を示す。ｎ＝６〜１０。
【図１６】ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（無治療）での治療（０.２ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日、２日、３日）後の胸腺欠損ヌードマウスにおける２９３−ＴＬＲ５腫瘍増殖を示す。ｎ＝６〜１０。
【図１７】ＣＢＬＢ５０２対ＰＢＳ（対照）治療（１日、２日、３日、１４日、１５日および１６日）の２コースの間の胸腺欠損ヌードマウスにおける異種間Ａ５４９腫瘍増殖の動態を示す。ｎ＝６〜１０。胸腺欠損マウスの異種移植片として皮下増殖させたＨＣＴ１１６結腸腺癌の抗腫瘍活性。腫瘍を誘導するために、ＨＣＴ１１６を８匹の胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射した（０.５×１０６／ＰＢＳ１００ｍｌ）。腫瘍の直径が約３〜５ｍｍになった時（注射後６日目まで）、マウスを、ＣＢＬＢ５０２治療群については５匹のマウスおよびＰＢＳ対照群については３匹のマウスの２群に無作為に分けた。
【図１８】４００ｍｍの腫瘍サイズに達するようにＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（無治療）での治療（０.１ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日、２日、３日）後のＣ３Ｈ同系マウスにおけるＳＣＣＶＩＩ同所性腫瘍の増殖率を示す。ｎ＝６〜１０。右図は、ＣＢＬＢ５０２で治療した場合と治療しない場合での、腫瘍が４００ｍｍ３体積に到達するのに必要な日数を表す。
【図１９】同系のウォード（Ｗａｒｄ）結腸腫瘍が皮下で増殖しているフィッシャーラットに、３日間、１日１回、ＣＢＬＢ５０２（０.２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
【図２０】ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（対照）治療（１日、２日、３日）後の胸腺欠損ヌードマウスにおける異種Ａ５４９−ｓｈＶおよびＡ５４９−ｓｈＴＬＲ５の腫瘍増殖の動態を示す。Ａ５４９−ｓｈＶ腫瘍において観察された２日目、４日目、６日目および８日目の腫瘍体積間の統計的差異（ｐ＜０．０５）、ｎ＝９〜１４。右図は、ＣＢＬＢ５０２治療に応答してＡ５４９−ｓｈＶおよびＡ５４９−ｓｈＴＬＲ５におけるルシフェラーゼレポーター発現のＮＦ−κＢ依存的誘導を示す。
【図２１】ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（対照）の治療（１日、２日、３日）後の胸腺欠損ヌードマウスにおけるＨ１２９９（対照）およびＨ１２９９−ＴＬＲ５の腫瘍増殖の動態を示す。ｎ＝６。右図は、Ｈ１２９９−ＴＬＲ５細胞におけるＴＬＲ５機能の指標として、ＣＢＬＢ５０２治療に応答したＩＬ−８産生を示す。
【図２２】膀胱が、ＣＢＬＢ５０２に強く応答することを示す。
【図２３】ＣＢＬＢ５０２治療が、肝臓において、さらに、ＴＬＲ５を発現しない腫瘍において腫瘍の外観および増殖を遅らせることを示す。
【図２４】Ｆaｓ媒介肝毒性からのＣＢＬＢ５０２保護を示す。
【図２５】肝臓が、ＣＢＬＢ５０２によってＴＮＦａおよびＬＰＳの毒性から保護されることを示す。
【図２６】ＣＢＬＢ５０２が、ＴＮＦおよびＬＰＳの毒性から肺を保護することを示す。
【図２７】ＣＢＬＢ５０２が、サルモネラの法的経口投与からマウスを保護することを示す。
【図２８】イリノテカンが、フラジェリン（ＣＢＬＢ５０２）の抗腫瘍効果を抑制することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明者らは、フラジェリンのようなＴＬＲ５アゴニストなどのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストを提供すると、細胞がＴＬＲ５を発現しなくとも、癌細胞の増殖を効果的に抑制し、減少させることができるという驚くべき発見をした。このＴＬＲアゴニストは、原発性または転移性であろうとなかろうと肝癌、膀胱癌、肺癌、および腸癌、ならびに他のＴＬＲ５陽性組織に影響を及ぼす癌の治療に特に有用であり得る。このＴＬＲアゴニストを用いて、肝臓、膀胱、肺、腸以外の組織、ならびに他のＴＬＲ５陽性組織で生じるが、これらの組織に転移する癌を治療することもできる。これらの転移性癌細胞がＴＬＲ５を発現しなくとも、癌が肝臓などのＴＬＲ５発現組織に転移した場合に、この癌はＴＬＲアゴニストで治療可能であり得る。理論に縛られることなく、本発明で実効する考えは、ＴＬＲアゴニストが、強い自然免疫系を有する組織に影響を及ぼす癌細胞を効果的に減少または死滅させ、それによって、これらの癌細胞においてＴＬＲ５が前もって発現している必要がないということである。予想外に、ＴＬＲアゴニストを提供することにより、自然免疫系が、ＴＬＲ５発現を欠いている癌を治療するのに十分に誘導される。したがって、ＴＬＲアゴニストが癌細胞を効果的に減少または死滅させるために、ＴＬＲ５はこれらの癌細胞に供給される必要はない。
【００１２】
発明者らは、ＴＬＲアゴニストが肝毒性から肝臓を保護することができるという驚くべき発見もした。例えば、ＦＡＳリガンドおよび抗ＦＡＳアゴニスト抗体などの細胞死リガンドならびにＦＡＳ媒介アポトーシスの活性化因子は、用量依存的肝毒性を誘導することができる。ＴＬＲアゴニストの投与は、かかる毒性に対して肝臓を保護することができる。この予想外のＴＬＲアゴニストの性質により、癌治療のためのＦＡＳアゴニストまたはＴＮＦとの組み合わせが可能になり、その結果、ＦＡＳアゴニストまたはＴＮＦの悪影響を減少させるかまたは防止する。
【００１３】
１．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形の「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特に本文が明らかにしない限り、複数の指示対象を含む。
【００１４】
本明細書の数値範囲の記載については、その間にあるそれぞれの数も、同じ精度で明確に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて、７および８の数が企図され、６.０〜７.０の範囲では、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、および７.０の数が明確に企図される。
【００１５】
「投与」とは、１つもしくは複数の薬剤の単回用量または複数回用量を意味し得る。
【００１６】
「類似体」とは、ペプチドまたはポリペプチドとの関連で、１つもしくは複数の非標準的アミノ酸または従来のアミノ酸セットとは別の構造変化を含むペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。
【００１７】
「抗体」とは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｄを含む、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤもしくはＩｇＥのクラスの抗体、またはその断片もしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、ダイアボディ、２重特異性抗体、２機能性抗体およびそれらの誘導体を意味し得る。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に十分な結合特異性を示すモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、またはそれらの混合物であり得る。抗体は、キメラ抗体でもあり得る。抗体は、当技術分野で公知の１つまたは複数の化学物質、ペプチド、またはポリペプチド部分の結合によって誘導体化されてもよい。抗体は、化学物質部分と結合させてもよい。
【００１８】
「誘導体」とは、１次構造（アミノ酸およびアミノ酸類似体）とは異なるペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。誘導体は、翻訳後修飾の一つの形態であるグリコシル化によって異なり得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、異種系における発現によってグリコシル化パターンを示し得る。少なくとも１つの生物学的活性が保持される場合、これらのペプチドまたはポリペプチドは、本発明に係る誘導体である。他の誘導体には、共有結合的に修飾されたＮ−末端もしくはＣ−末端を有する融合ペプチドまたは融合ポリペプチド、ＰＥＧ化されたペプチドまたはポリペプチド、脂質部分と結合したペプチドまたはポリペプチド、アルキル化されたペプチドまたはポリペプチド、アミノ酸側鎖官能基によって他のペプチド、ポリペプチドもしくは化学物質に連結されたペプチドまたはポリペプチド、および当技術分野で理解されているようなさらなる修飾物が含まれ得る。
【００１９】
「断片」とは、参照ペプチドまたはポリペプチドの部分を意味し得る。
【００２０】
「相同体」とは、共通の進化の祖先を共有するペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。
【００２１】
「リーダー配列」とは、目的のペプチドまたはポリペプチドが、細胞膜からの細胞外分泌の目的で、真核細胞の小胞体およびゴルジ複合体を経由して適切に移動することができるように、目的のペプチドまたはポリペプチドに連結され、翻訳される任意のペプチド配列をコードする核酸であり得る。リーダーペプチド配列は、アルカリホスファターゼに由来し得る。リーダー配列は、ａｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｇｃｃｔｇａｇｇｃｔａｃａｇｃｔｃｔ
ｃｃｃｔｇｇｇｃを含むＤＮＡ配列を有し得る。
【００２２】
「リポソーム」は、細胞膜と同じ材料で作られた小さな泡（小胞）を意味し得る。リポソームは、薬物で充填され、癌および他の疾患のための薬剤を送達するために用いられ得る。リポソームは、ベクターで充填することができる。リポソーム膜は、頭部基および尾部基を有する分子であるリン脂質から作ることができる。リポソームの頭部は水に誘引され得、長い炭化水素鎖で作られている尾部は水にはじかれる。尾部は水ではじかれ、整列して、水から離れて表面を形成することができる。原形質膜の脂質は、主にホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンのようなリン脂質であり得る。リポソームは、（卵のホスファチジルエタノールアミンのような）混合脂質鎖を有する天然由来のリン脂質、またはＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）のような純粋な界面活性剤成分で構成され得る。
【００２３】
「ペプチド」または「ポリペプチド」とは、アミノ酸の連結配列を意味し、天然配列であるか、合成配列であるか、または天然配列と合成配列の改変もしくは組み合わせであり得る。
【００２４】
「実質的に同一」とは、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列が、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であることを意味し得る。
【００２５】
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｏ
ｔｒｅａｔ）」はそれぞれ、症状の様子、臨床徴候、または病状もしくは障害の根底にある病理を、一時的または恒久的に軽減するか、抑制するか、抑止するか、除去するか、防止するかまたは遅らせることを意味し得る。病状または障害の防止には、その疾患の発症前に本発明の薬剤を対象に投与することが含まれる。病状または障害の抑制には、症状または障害の誘発後ではあるが、その臨床的所見の前に、本発明の薬剤を対象に投与することが含まれる。病状または障害の抑止には、その疾患の臨床的所見後に本発明の薬剤を対象に投与することが含まれる。
【００２６】
「改変体」は、アミノ酸の挿入、欠失または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。「生物活性」の代表例として、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する能力、および特異的抗体によって結合される能力が挙げられる。改変体は、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度および分布）を有する異なるアミノ酸で置換することは、当技術分野では、一般的に微小変化を含むと認識されている。これらの微小変化は、当技術分野において理解されるとおり、アミノ酸の疎水性親水性指数を考慮することによってある程度確認することができる。Ｋｙｔｅ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性親水性指数は、その疎水性および電荷の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指数を有するアミノ酸は、置換しても、なおタンパク質機能を保持できることが当技術分野で知られている。一態様において、疎水性親水性指数±２を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにすることもできる。ペプチドとの関連で、アミノ酸の親水性を考慮すると、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することができ、この最大局所平均親水性は、抗原性および免疫原性と良く相関することが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。同様の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野において理解されるとおり、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行われ得る。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の性質によって明らかにされるように、アミノ酸、特に、それらのアミノ酸の側鎖の相対類似度に依存すると理解されている。
【００２７】
「ベクター」とは、複製開始点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、酵母または乳動類の人工染色体であり得る。ベクターは、ＲＮＡベクターまたはＤＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれか一方であり得る。
【００２８】
２．Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト
ＴＬＲアゴニストを本明細書に提供する。ＴＬＲアゴニストは、病原体に由来する保存された分子産物であり得るＰＡＭＰであり得る。病原体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、またはウイルスであり得る。ＴＬＲアゴニストは損傷関連分子パターン（（ＤＡＭＰ）リガンドであり得、これは、損傷した細胞または死細胞から放出される内因性分子であり得る。ＤＡＭＰまたはＰＡＭＰは、ＴＬＲシグナルを介して免疫応答を開始し、シグナルを伝えるために、細胞質内でアダプター分子をリクルートし得る。このＴＬＲアゴニストは、以下の表１のリガンドであり得るＴＬＲに対するアゴニストであり得る。
【００２９】
【表１】
0006041444.tif 000002
【００３０】
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲに結合し、ＮＦ−κＢ活性の活性化などのＴＬＲ媒介活性を誘導するＰＡＭＰまたはＤＡＭＰの断片、改変体、類似体、相同体または誘導体であり得る。ＴＬＲアゴニストの断片、改変体、類似体、相同体または誘導体は、ＴＬＲアゴニストのアミノ酸と少なくとも３０〜９９％同一であり、ＴＬＲ媒介活性を誘導することができる。
【００３１】
ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−５などのＴＬＲを標的にすることができる。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ−５のアゴニストであり得、ＴＬＲ−５活性を刺激することができる。ＴＬＲアゴニストは、抗ＴＬＲ５抗体または他の小分子であり得る。ＴＬＲアゴニストは、フラジェリンであり得る。
【００３２】
フラジェリンは、フラジェリンまたはフラジェリン関連ポリペプチドでもあり得る。フラジェリンは、様々なグラム陽性菌種およびグラム陰性菌種を含む任意の供給源に由来し得る。フラジェリンは、その内容が参照により本明細書に完全に組み込まれる米国特許公開第２００３／００００４４４２９号に開示されているフラジェリンポリペプチドを含むがこれに限定されない任意のグラム陽性菌種またはグラム陰性菌種のフラジェリンポリペプチドであり得る。例えば、フラジェリンは、米国特許公開第２００３／００４４４２９号の図７に示される細菌種のアミノ酸配列を有し得る。米国特許公開第２００３／００４４４２９号の図７に列挙されているフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを含む情報源で公的に利用可能である。フラジェリンは、米国特許公開第２００３／００００４４４２９号の図２５に示されるＢＬＡＳＴ結果に列挙されている受託番号に相当するフラジェリンペプチドまたはその改変体でもあり得る。フラジェリンは、その内容が本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００１１９８２号に開示されているフラジェリンポリペプチドでもあり得る。フラジェリンは、本明細書の図３および図４に開示されるフラジェリンポリペプチドのいずれか１つであり得る。
【００３３】
フラジェリンは、ＴＬＲ５に結合し、ＮＦ−κＢ活性の活性化などのＴＬＲ５媒介活性を誘導するフラジェリンの断片、改変体、類似体、相同体または誘導体であり得る。フラジェリンの断片、改変体、類似体、相同体または誘導体は、ＴＬＲ５に結合し、ＴＬＲ５媒介活性を誘導するフラジェリンのアミノ酸と少なくとも３０〜９９％同一であり得る。
【００３４】
フラジェリンは、サルモネラ属の一種に由来し得、その代表例として、（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８４９７２によってコードされる）Ｓ．ｄｕｂｌｉｎが挙げられる。フラジェリン関連ポリペプチドは、ＴＬＲ５に結合し、ＮＦ−ｋＢ活性の活性化などのＴＬＲ５媒介活性を誘導するＭ８４９７２の断片、改変体、類似体、相同体もしくは誘導体、またはその組合せであり得る。フラジェリンの断片、改変体、類似体、相同体または誘導体は、フラジェリンのドメイン構造およびＴＬＲ５によって認識される保存された構造に基づく合理的設計によって得ることができる。
【００３５】
フラジェリンは、図２に示す１３個の保存されたアミノ酸（位置８９、９０、９１、９５、９８、１０１、１１５、４２２、４２３、４２６、４３１、４３６および４５２）のうち少なくとも１０個、１１個、１２個または１３個を含み得る。フラジェリンは、Ｍ８４９７２のアミノ酸１〜１７４および４１８〜５０５と少なくとも３０〜９９％同一であり得る。その内容が本明細書に完全に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００１１９８２号の図２６は、Ｍ８４９７２と比較した、既知のＴＬＲ−５刺激活性を有するフラジェリンのアミノ末端およびカルボキシ末端の同一性の割合を示す。
【００３６】
フラジェリンは、細菌鞭毛の主成分であり得る。フラジェリンは、３個のドメインで構成され得る（図１）。ドメイン１（Ｄ１）およびドメイン２（Ｄ２）は、不連続であり得、アミノ末端およびカルボキシ末端の残基がヘアピン構造の形成によって隣接する時に形成され得る。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインを含むアミノ末端ならびにカルボキシ末端が最も保存され得るが、真ん中の超可変領域（Ｄ３）は大きく変化し得る。大腸菌のヒンジによって分離されるアミノＤ１およびアミノＤ２ならびにカルボキシＤ１およびカルボキシＤ２（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）を含む組換えタンパク質を用いる研究は、Ｄ１およびＤ２が、ＥＣＨエレメントに結合する時に、生理活性を有し得ることを示す。このキメラは、２種類の腸管上皮細胞株において、ＩｋＢａの分解、ＮＦ−ｋＢの活性化、ならびにＮＯおよびＩＬ−８の産生を誘導することができるが、ヒンジ単独では誘導できない。保存されていないＤ３ドメインは、鞭毛繊維の表面に存在し、主要な抗原エピトープを含み得る。フラジェリンの強力な炎症促進性活性は、高度に保存されたＮのＤ１およびＤ２領域ならびにＣのＤ１およびＤ２領域に存在し得る（図１参照）。
【００３７】
フラジェリンは、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）に結合することによって、ＮＦ−ｋＢ活性を誘導することができる。ＴＬＲは、フラジェリンに特有の保存された構造を認識することができる。この保存された構造は、アミノ酸含有量の変化にある程度許容的である残基の大きなグループで構成され得る。その内容が参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２４７−５３（２００３）は、ＴＬＲ５によって認識される保存された構造の一部であるフラジェリン中の１３個の保存されたアミノ酸を同定した。ＴＬＲ５活性に重要であり得るフラジェリンの１３個の保存されたアミノ酸を図２に示す。
【００３８】
少なくとも幾分かＴＬＲ５刺激活性を保持するフラジェリンの多数の欠失変異体が作製されている。フラジェリンは、かかる欠失変異体であってもよく、本明細書の実施例に開示される欠失変異体であってもよい。フラジェリンは、アミノ酸１８５〜３０６もしくは４４４〜４９２を欠くＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１３６８９、もしくはアミノ酸１７９〜４１５を欠くＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８４９７３、またはその改変体から翻訳された配列を含み得る。
【００３９】
フラジェリンは、可変Ｄ３ドメインへのトランスポゾンの挿入および変化を含んでいてよい。Ｄ３ドメインは、改変体がＴＬＲ５活性を刺激するように、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインを適切に折り畳むことを可能にするヒンジまたはリンカーポリペプチドで、部分的または全体的に置換することができる。異なるヒンジエレメントが、大腸菌のＭｕｋＢタンパク質中に見出され得、２０１０年１０月６日に出願され、その内容が参照より本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／５１６４６に記載の配列を有し得る。
【００４０】
上記のフラジェリンは、さらにリーダー配列を含み得る。リーダー配列をさらに含むフラジェリンは、ＣＢＬＢ５０２Ｓであり得る。
【００４１】
３．薬剤
本発明は、治療有効量のＴＬＲアゴニストを含む薬剤にも関する。本薬剤は、ポリペプチドであり得る。本薬剤は、ベクターでもあり得る。このベクターは、ＴＬＲアゴニストをコードする核酸を含み得る。このベクターは、哺乳類細胞に形質導入することができる。このベクターは、ウイルスまたはリポソームに関連するベクター系によって哺乳類細胞に送達することができる。このウイルスベクター系は、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスであり得る。
【００４２】
本薬剤は、ベクターを含むリポソームであり得る。このリポソームは、発現のために哺乳類細胞に形質導入し、ベクターを送達することができる。
【００４３】
本薬剤は、ＴＬＲを活性化し、それによって、腸壁を通り抜ける大規模侵入の状況を模倣する宿主免疫系に腫瘍または感染細胞を曝露させる製剤であり得る。本薬剤は、筋肉内投与などの投与用の溶液で全身送達することができる。本薬剤は、ナノ粒子の形態でＴＬＲアゴニストを発現する製剤であり得、哺乳類細胞の細胞表面に機能的アゴニストを輸送することができる。
【００４４】
本薬剤は、上記製剤を含む薬剤であり得、当技術分野で公知の方法を用いて製造することができる。本薬剤は、共薬剤（ｃｏａｇｅｎｔ）も含み得る。
【００４５】
このベクターは、フラジェリンをコードする核酸を含み得る。このベクターは、強力なプロモーターを用いてフラジェリンを発現することができる。この発現ベクターは、さらに、ＴＬＲアゴニストをコードする遺伝子の上流にクローニングされたリーダー配列を含み得る。この製剤は、以下のものを発現するアデノウイルスであり得る：
筋肉内投与などの投与用の溶液で全身送達されるＴＬＲアゴニスト；または
ＣＢＬＢ５０２に由来し得るフラジェリンなどの機能的ＴＬＲアゴニストをその表面に保有するナノ粒子の形態で発現されるＴＬＲアゴニスト。
【００４６】
このナノ粒子は、バクテリオファージＴ７に基づくか、またはその生物活性を保持するように完全に形成され得る。このナノ製剤は、用量依存的なＮＦ−κＢ応答レポーターの活性化を提供し、有効な免疫法のためのエンドサイトーシスによって細胞内部移行をもたらし得る（Ｍｏｂｉａｎ
ＡＰ−Ａ）。
【００４７】
ａ．投与
本明細書に記載の方法を用いた薬剤の投与は、全身投与、経口投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、経直腸投与、経粘膜投与、局所投与、吸入、口腔投与またはそれらの組合せであり得る。非経口投与には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与および関節内投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与は、皮下投与、静脈内投与、エアダクト内投与、または腫瘍内投与でもあり得る。獣医学用途の場合、本薬剤は、正常な獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。本薬剤は、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物またはトリに投与することができる。
【００４８】
本薬剤は、単剤療法として投与されるか、または腫瘍の手術もしくは腫瘍の除去であり得る他の治療と同時にもしくは規則正しく投与され得る。本明細書で使用する「同時の」または「同時に」という用語は、本薬剤および他の治療が、互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、更により好ましくは６時間以内、最も好ましくは３時間以内またはそれ以下で投与されることを意味する。本明細書で使用する「規則正しく」という用語は、繰り返し投与と比べて、他の治療とは異なる時に、特定の頻度で薬剤を投与することを意味する。
【００４９】
本薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、別の治療の前の任意の時点で投与され得る。本薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、薬剤の第２の治療の前の任意の時点で投与され得る。
【００５０】
本薬剤は、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、および１２０時間を含む、別の治療の後の任意の時点で投与され得る。本薬剤は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分を含む、薬剤の第２の治療の前後の任意の時点で投与され得る。
【００５１】
ｂ．製剤
本方法は、本薬剤の投与を含み得る。本明細書に記載の薬剤は、従来の方法で製剤化される錠剤またはトローチ剤の形態であり得る。例えば、経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、滑剤、崩壊剤および湿潤剤であり得る従来の賦形剤を含み得る。結合剤には、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、デンプン漿剤およびポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。充填剤は、ラクトース、糖、微結晶セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールであり得る。滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカが含まれるが、これらに限定されない。崩壊剤は、ジャガイモデンプンおよびナトリウムデンプングリコラートであり得る。湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムであり得る。錠剤は、当技術分野で公知の方法に従ってコーティングすることができる。
【００５２】
本明細書に提供する薬剤は、水性または油性の懸濁液、液剤、乳剤、シロップ剤、およびエリキシル剤などの液体製剤でもあり得る。本薬剤は、使用前に水または他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として製剤化することもできる。かかる液体調製物は、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび防腐剤などの添加剤を含み得る。懸濁化剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および食用の硬化油脂であり得る。乳化剤は、レシチン、ソルビタンモノオレエート、およびアラビアゴムであり得る。非水性ビヒクルは、食用油、アーモンド油、分画ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコールおよびエチルアルコールであり得る。防腐剤は、メチルｐ−ヒドロキシベンゾアートまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアートおよびソルビン酸であり得る。
【００５３】
本明細書に提供する薬剤は、カカオバターまたはグリセリドなどの坐剤基剤を含み得る坐剤として製剤化されてもよい。本明細書に提供する薬剤は、吸入用に製剤化することもでき、これは、乾燥粉末として投与され得る液剤、懸濁剤、もしくは乳剤などの形態であり得るか、またはジクロロジフルオロメタンもしくはトリクロロフルオロメタンなどの噴霧剤を用いるエアロゾルの形態であり得る。本明細書に提供する薬剤は、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ペースト剤、薬用硬膏剤、貼付剤、もしくは膜などの水性または非水性のビヒクルを含む経皮製剤として製剤化されてもよい。
【００５４】
本明細書に提供する薬剤は、注射、腫瘍内注射もしくは持続注入などの非経口投与用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、液剤もしくは乳剤の形態であってよく、懸濁化剤、安定化剤、および分散剤を含むがこれらに限定されない薬剤を含んでもよい。本薬剤は、発熱物質を含まない滅菌水を含むがこれに限定されない適切なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供されてもよい。
【００５５】
本明細書に提供する薬剤は、移植または筋肉内注射によって投与され得るデポー製剤として製剤化されてもよい。本薬剤は、（例えば、許容される油中の乳剤として）適切なポリマーもしくは疎水性材料、イオン交換樹脂を用いて、またはやや難溶性の誘導体として（例えば、やや難溶性の塩として）製剤化されてもよい。
【００５６】
ｃ．投与量
本方法は、治療有効量の薬剤を、それを必要としている患者に投与することを含み得る。治療に使用するのに必要な治療有効量は、治療される病状の性質、ＴＬＲ活性を活性化するのに求められる時間の長さ、および患者の年齢／病状によって変化する。しかし、一般に、成人の治療に使用される用量は、典型的には、１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。この用量は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。所望の用量は、都合よく、単回用量で、または適切な間隔、例えば、１日に２回、３回、４回またはそれ以上のサブ用量で投与される複数回用量として投与され得る。複数回用量は望ましいか、または必要であり得る。
【００５７】
投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、２７５ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、３２５ｍｇ／ｋｇ、３５０ｍｇ／ｋｇ、３７５ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、４２５ｍｇ／ｋｇ、４５０ｍｇ／ｋｇ、４７５ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、５２５ｍｇ／ｋｇ、５５０ｍｇ／ｋｇ、５７５ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、６２５ｍｇ／ｋｇ、６５０ｍｇ／ｋｇ、６７５ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、７２５ｍｇ／ｋｇ、７５０ｍｇ／ｋｇ、７７５ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、８２５ｍｇ／ｋｇ、８５０ｍｇ／ｋｇ、８７５ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、９２５ｍｇ／ｋｇ、９５０ｍｇ／ｋｇ、９７５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇなどの任意の投与量であり得る。
【００５８】
ｄ．単剤療法
本薬剤は、化学療法、放射線療法、別の生物療法、または他の併用療法などの任意の他のタイプの癌治療と共に投与されないという条件の下、単剤療法として投与されてもよい。ただし、「単剤療法」は、外科治療と共に本薬剤を投与することを含み得る。本薬剤は、腫瘍除去であり得る手術と併用して投与されてもよい。本薬剤は、手術前、手術と共に、または手術後に投与されてよい。本薬剤は、手術中に投与されてもよい。
【００５９】
４．癌の治療法
ＴＬＲ５などのＴＬＲを発現する組織中に存在し得る癌を、薬剤を必要としている哺乳類にその薬剤を投与することによって治療する方法を本明細書に提供する。この癌は、腫瘍または転移癌であり得る。この癌は、肝臓、膀胱、肺または腸組織にも存在し、結腸、乳房、または前立腺などの別のタイプの組織で生じたものでもあり得る。この癌は、黒色腫、またはリンパ腫などの悪性血液疾患でもあり得る。この癌は、肝臓、肺、膀胱、腸などのＴＬＲ発現組織、または他のＴＬＲ発現組織に転移した任意の癌でもあり得る。この癌は、ＴＬＲ陰性癌であり得、したがって、Ｔｏｌｌ様受容体の発現を欠く。この癌は、Ｔｏｌｌ様受容体の内因性発現および外因性発現の両方を欠いていてもよい。本方法は、Ｔｏｌｌ様受容体を癌に提供するステップを含まなくてよく、Ｔｏｌｌ様受容体を外因的にもまたは内因的にも提供することを含まなくてよい。この癌は、Ｔｏｌｌ様受容体発現を全く欠いていてよい。
【００６０】
ａ．Ｔｏｌｌ様受容体
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、総称して病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、およびウイルスを含む病原体由来の保存された分子産物であるが、宿主分子と区別可能な分子を認識することができる。ＴＬＲは、総称して損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる、損傷した細胞または死細胞から放出される内因性分子を認識することもできる。さらに下記に記載するとおり、ＰＡＭＰまたはＤＡＭＰは、ＴＬＲアゴニストであり得る。ＴＬＲは、シグナルを伝えるために、細胞質内にアダプター分子をリクルートする断片、変異体、類似体、相同体または誘導体であり得る。ＴＬＲは、ヒト、またはアカゲザル、マウス、もしくはラットなどの他の哺乳類種由来であり得る。ＴＬＲは、シグナルを伝えるために、細胞質内にアダプター分子をリクルートするＴＬＲと少なくとも３０〜９９％同一であり得る。
【００６１】
ＴＬＲは、ほとんどの哺乳類種で存在すると推定される１０〜１５種類のＴＬＲのうちの１つであり得る。ＴＬＲは、ヒトおよびマウスの両方で同定された１３種類のＴＬＲ（単純に、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３と命名される）のうちの１つであり得るか、または他の哺乳類種で見られる同等の形態であり得る。ＴＬＲは、ヒトで同定された１１種類のメンバー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１）のうちの１つであり得る。
【００６２】
通常、異なる種類の免疫細胞がＴＬＲを発現し、ＴＬＲは細胞表面上または細胞質内に位置し得る。通常、ＴＬＲは、癌細胞上で発現し得る。通常、消化器系の正常な上皮細胞、皮膚の正常なケラチノサイト、肺胞および気管支上皮細胞、および女性生殖器系の上皮細胞がＴＬＲを発現し得る。臓器を覆うこれらの細胞は、微生物の侵入に対する最前線の防御であり得、通常、上皮細胞で発現するＴＬＲは、増殖およびアポトーシスの制御において重要な役割を有し得る。
【００６３】
癌細胞は、ＴＬＲを発現することができない。ＴＬＲ陰性癌細胞は、ＴＬＲｍＲＮＡも、ＴＬＲタンパク質も、または機能性ＴＬＲタンパク質も全く発現することができない。ＴＬＲタンパク質は、ＴＬＲリガンドに結合する能力の低下またはリガンド結合によって始動する下流のシグナルを送達する能力の低下により機能することができない。ＴＬＲ陰性癌細胞は、ＴＬＲのｍＲＮＡ、タンパク質、またはＴＬＲ機能のレベルも低下させ得る。この低下は、癌細胞が生ずる組織由来の正常細胞と比較すると、または別の既知のＴＬＲ発現細胞型と比較すると、１００％、または９９.９％、９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、もしくは５０％を上回り得る。ＴＬＲ発現細胞は、腫瘍細胞株もしくは腫瘍異種移植片などの正常細胞または腫瘍細胞であり得る。
【００６４】
通常、癌細胞上で発現するＴＬＲは、ＮＦ−κΒカスケードを上方制御し、発癌および癌細胞増殖に寄与する抗アポトーシスタンパク質を産生することができる。
【００６５】
ＴＬＲの４つのアダプター分子は、シグナル伝達に関与することが知られている。これらのタンパク質は、骨髄分化因子８８（ＭｙＤ８８）、（Ｍａｉとも呼ばれる）Ｔｉｒａｐ、Ｔｒｉｆ、およびＴｒａｍとして知られている。これらのアダプターは、シグナルを増幅し、最終的に炎症反応を調整する遺伝子の誘導または抑制につながる特定のタンパク質キナーゼ（ＩＲＡＫＩ、ＩＲＡＫ４、ＴＢＫ１、およびＩＫＫｉ）を含む他の分子を細胞内で活性化する。病原体認識中のＴＬＲシグナル伝達経路は、ＭｙＤ８８、活性化Ｂ細胞の核因子κ軽鎖エンハンサー（ＮＦ−κＢ）、およびマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）によって媒介される細胞外経路および細胞内経路によって免疫反応を誘導することができる。全部で数千の遺伝子がＴＬＲシグナル伝達によって活性化され、まとめると、ＴＬＲは、遺伝子調節のための最も多面的で、さらに厳密に制御された出入口のうちの１つを構成する。
【００６６】
インターロイキン１受容体と共に、ＴＬＲは、「インターロイキン−１受容体／Ｔｏｌｌ様受容体スーパーファミリー」として知られる受容体スーパーファミリーを形成する。このファミリーの全メンバーは、いわゆるＴＩＲ（Ｔｏｌｌ−ＩＬ−1受容体）ドメインを共通して有する。ＴＩＲドメインの３つのサブグループが存在し得る。サブグループＩのＴＩＲドメインを有するタンパク質は、マクロファージ、単球および樹状細胞によって産生されるインターロイキンの受容体であり、全ては、細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを有する。サブグループＩＩのＴＩＲドメインを有するタンパク質は標準的なＴＬＲであり、微生物起源の分子に直接的または間接的に結合する。ＴＩＲドメインを含むタンパク質の第３のサブグループ（ＩＩＩ）は、もっぱら細胞質性であり、サブグループ１およびサブグループ２のタンパク質からのシグナル伝達を媒介するアダプタータンパク質から成る。ＴＬＲは、サブグループＩのＴＩＲドメイン、サブグループＩＩのＴＩＲドメイン、またはサブグループＩＩＩのＴＩＲドメインのいずれかを保持する断片、変異体、類似体、相同体または誘導体であり得る。
【００６７】
ＴＬＲは、２量体として機能することができる。例えば、ほとんどのＴＬＲはホモ２量体として機能するように思われるが、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１またはＴＬＲ６とヘテロ２量体を形成し、それぞれの２量体は異なるリガンド特異性を有する。ＴＬＲは、ＭＤ−２を必要とするＴＬＲ４のＬＰＳ認識の場合のように、完全なリガンド感受性については他の共受容体にも依存し得る。ＣＤ１４およびＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）は、ＬＰＳのＭＤ−２への提示を促進することが知られている。
【００６８】
（１）ＴＬＲ１
ＴＬＲは、グラム陽性菌に対して特異性を有するＰＡＭＰを認識するＴＬＲ１であり得る。ＴＬＲ１は、ＣＤ２８１と命名されてもいる。
【００６９】
（２）ＴＬＲ５
ＴＬＲは、Ｔｏｌｌ様受容体５であり得る。ＴＬＲ５によってコードされるタンパク質は、病原体認識および自然免疫の活性化に重要な役割を果たすことができる。ＴＬＲ５は、感染病原体上で発現するＰＡＭＰを認識し、有効な免疫の発達に必要なサイトカインの産生を媒介することができる。ＴＬＲ５は、細菌のフラジェリン、細菌の鞭毛および毒性因子の主成分を認識することができる。ＴＬＲ５の活性化は、核因子ＮＦ−κＢを動員し、腫瘍壊死因子−α産生を刺激することができる。
【００７０】
（３）癌の種類
癌は、原発性癌または転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能である発生部位の癌細胞領域であり、原発性腫瘍であり得る。これとは対照的に、転移性癌は、一臓器または一部分から別の非隣接臓器または別の非隣接部分への疾患の蔓延であり得る。転移性癌は、局部において周囲の正常組織に侵入および浸潤する能力を獲得する癌細胞によって引き起こされ、局所転移であり得る新しい腫瘍を形成することができる。
【００７１】
転移性癌は、リンパ管および／または血管の壁を通りぬける能力を獲得する癌細胞によっても引き起こされ、その後、この癌細胞は、血流を介して体内の他の部位および組織に循環することができる（したがって、循環腫瘍細胞である）。転移性癌は、リンパ性転移または血行性転移などのプロセスに起因し得る。転移性癌は、別の部位で静止し、血管または壁を通りぬけて再侵入し、増殖し続け、最終的に別の臨床的に検出可能な腫瘍を形成する腫瘍細胞によっても引き起こされ得る。転移性癌は、転移性（または続発性）腫瘍であり得るこの新しい腫瘍であり得る。
【００７２】
転移性癌は、続発性腫瘍または転移性腫瘍であり得る転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得る。転移性腫瘍の細胞は、原発性腫瘍中の細胞と類似している。一例として、乳癌または結腸癌が肝臓に転移する場合、続発性腫瘍は、肝臓に存在するが、異常な肝細胞ではなく、異常な乳腺細胞または結腸細胞で構成される。したがって、肝臓の腫瘍は、肝臓癌ではなく、転移性乳癌または転移性結腸癌であり得る。
【００７３】
転移性癌は、任意の組織からの起源を有し得る。転移性癌は、黒色腫、結腸、乳房、または前立腺が起源であり得、したがって、本来、皮膚、結腸、乳房、または前立腺であった細胞でそれぞれ構成され得る。転移性癌は、リンパ腫であり得る悪性血液腫瘍でもあり得る。転移性癌は、肝臓、肺、膀胱、または腸などの組織に浸潤することができる。浸潤組織はＴＬＲを発現することができるが、転移性癌は、ＴＬＲを発現しても、しなくてもよい。
【００７４】
ｂ．組み合わせ
本方法は、抗癌治療とＴＬＲアゴニストの併用投与も含み得る。抗癌治療は、ＦＡＳリガンド、ＦＡＳアゴニスト抗体、ＴＮＦａ、ＴＮＦａアゴニスト抗体、ＴＲＡＩＬ、またはＴＲＡＩＬアゴニスト抗体であり得る。ＴＬＲ５アゴニストを用いて、癌を抗癌治療に対して感作させることができる。本方法は、免疫刺激剤、サイトカイン、または化学療法剤の使用を含む、癌を治療するための他の方法と組み合わせてもよい。免疫刺激剤は、成長ホルモン、プロラクチンまたはビタミンＤであり得る。
【００７５】
５．癌の再発を減少させる方法
癌の再発を減少させる方法であって、ＴＬＲアゴニストを、それを必要としている哺乳類に投与することを含む方法も本明細書に提供する。癌は、ＴＬＲ５などのＴＬＲを発現するかまたは発現しない組織中に存在しても、または存在しなくてもよい。癌、組織、ＴＬＲ、哺乳類、および薬剤は、上記に記載したとおりであり得る。本方法は、癌の再発を防ぐこともできる。この癌は、腫瘍性疾患であり得る。
【００７６】
癌は、癌の転移に起因し得る休眠腫瘍であり得る。この休眠腫瘍は、腫瘍の外科的切除から取り残されたものでもあり得る。癌の再発は、腫瘍再増殖、肺転移、または肝転移であり得る。
【００７７】
６．哺乳類
哺乳類は、完全に機能的な免疫系を有しており、免疫不全ではない。哺乳類は、哺乳類を第一ラウンドまたは第二ラウンドの化学療法に適するようにするのに十分なレベルに相当するレベルの免疫も有し得る。哺乳類は、化学療法によって誘発され得る白血球数の低下を有していなくてもよい。この白血球数の低下は、化学療法中の正常細胞の損失によって引き起こされ得る。この損失は、化学療法薬の予想される副作用であり得る。この白血球数の低下は、化学療法によって引き起こされる重篤な免疫抑制であり得る。この白血球数の低下は、薬剤の抗腫瘍効果を損ない得る。この白血球数の低下は、化学療法治療後７〜１４日で回復し得る。
【００７８】
哺乳類は、正常範囲内である白血球数を有し得る。哺乳類は、軽度の免疫抑制を示す白血球数も有し得る。哺乳類は、７〜１４日間、または少なくとも１４日間の化学療法治療を受けていなくてよい。哺乳類は、全血１ｍｌあたり少なくとも３０００細胞もしくは３５００細胞の全白血球数、全血１ｍｌあたり少なくとも１８００細胞もしくは２１００細胞の顆粒球数、または全血１００ｍｌあたり少なくとも３.０ｇもしくは３.５ｇのアルブミンレベルも有し得る。白血球数、顆粒球数、またはアルブミンレベルも、これらのレベルの＋／−５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以内に入り得る。
【００７９】
７．肝臓を保護する方法
上述したように、細胞死リガンドなどのＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＮＦａの細胞死受容体シグナル伝達を介してアポトーシスを誘発する抗癌治療は、重度の肝毒性を引き起こし得る。したがって、ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＮＦａなどの分子の抗癌治療としての使用は、標的癌細胞におけるこれらの分子の有効性をよそに、制限されている。したがって、哺乳類の肝組織を肝毒性の影響から保護する方法も本明細書に提供する。肝臓は、哺乳類に薬剤を投与することによって保護することができる。この細胞死受容体シグナル伝達のアゴニストは、ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、またはＴＮＦａであり得る。細胞死リガンドは、肝毒性であり得る。ＦＡＳ、ＴＲＡＩＬ、またはＴＮＦａは、抗癌剤として使用することができる。
【００８０】
肝毒性は、ネズミチフス菌由来であり得るサルモネラ感染症でもあり得る。本薬剤を用いて、ＦＡＳ媒介性であり得る肝毒性から保護することもできる。この毒性は、ＦＡＳリガンド、ＦＡＳアゴニスト抗体、ＴＮＦａ、アセトアミノフェン、アルコール、肝臓のウイルス感染、または化学療法剤でもあり得る。本薬剤は、哺乳類に投与することができる。
【００８１】
実施例１  ＴＬＲ５アゴニストが肝毒性から肝臓を保護する
薬理学的に最適化されたＴＬＲ５アゴニストであるＣＢＬＢ５０２は、少なくとも部分的に放射線感受性組織におけるアポトーシス阻害による強力な放射線防護剤である。ＣＢＬＢ５０２を、Ｆａｓ媒介アポトーシスからの肝臓保護について試験した。以下の実施例は、ＣＢＬＢ５０２による刺激の際に、ＴＬＲ５経路が、マウスおよびヒトの肝細胞において活性があり、抗アポトーシスタンパク質をコードする遺伝子のＮＦ−κＢ依存的誘導をもたらすことを示す。ＣＢＬＢ５０２でマウスを前治療すると、致死量のＦａｓアゴニスト抗体から肝細胞が保護され、血液中の肝酵素、肝臓抽出物中のカスパーゼ活性のＦａｓ誘導性上昇が低下し、肝組織の完全性が維持された。ＣＢＬＢ５０２は、黒色腫および結腸癌の同系マウスモデルにおいて腫瘍を保護しなかった。これらの観察は、ＣＢＬＢ５０２などのＴＬＲ５アゴニストの保護下で、癌治療のためにＦａｓアゴニストを使用することを支持する。
【００８２】
ＮＦ−κＢ応答を、ＴＬＲ５アゴニストのＣＢＬＢ５０２および別の既知のＮＦ−κＢ活性化因子であるＴＬＲ４アゴニストのＬＰＳの投与後に、異なる臓器で比較した。ＣＢＬＢ５０２は、肝細胞におけるＮＦ−κＢの速い直接活性化を誘導することが見出されたが、肝細胞におけるＮＦ−κＢのＬＰＳ活性化は、異なる種類の細胞を介して媒介された。したがって、以下のデータは、ＣＢＬＢ５０２による前治療が、マウスの抗癌治療中のＦａｓ媒介肝毒性を低減することができることも示す。下記の方法は、ネズミチフス菌のフラジェリン由来のＴｏｌｌ様受容体−５（ＴＬＲ５）アゴニストＣＢＬＢ５０２によって、ＮＦ−κＢシグナル伝達の活性化を介した有害な副作用に対する正常組織の抵抗性の増加に基づく。
【００８３】
１．ＴＬＲ４アゴニストおよびＴＬＲ５アゴニストに応答したインビボでのＮＦ−κ活性化の決定
ＴＬＲ５アゴニストＣＢＬＢ５０２に対するＮＦ−κＢの応答を、ＴＬＲ４を介して作用する細菌のＬＰＳと比較して、マウスの異なる臓器で調べた。Ｘｅｎｏｇｅｎ社のＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼレポーターマウスモデルにおいて、ルシフェラーゼ導入遺伝子は、ＩｋＢａ遺伝子のＮＦｋＢ依存性天然プロモーターの制御下で発現する（Ｚｈａｎｇ
Ｎ,ｅｔ ａｌ,２００５）。ＮＦｋＢ活性化剤の投与時に、ルシフェラーゼ活性は、所定の薬剤に応答する細胞および組織で増加した。Ｘｅｎｏｇｅｎ社の非侵襲イメージングシステムおよびエキソビボルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、マウスの肝臓におけるＮＦ−κＢの検出された強力な活性化を、ＣＢＬＢ５０２の皮下注射後２時間に検出した（図７Ａ）。異なる臓器におけるＮＦ−κＢ活性化の定量分析により、ＬＰＳと比較して、ＣＢＬＢ５０２が、肝臓におけるＮＦ−κＢの非常に強力な活性化を誘導し、腸におけるＮＦ−κＢ活性レベルは同様に高いが、脾臓、骨髄、腎臓および肺では、ＮＦ−κＢ活性は低いことが明らかになった（図７Ｂ）。ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼレポーター活性の動態は、両方のＴＬＲアゴニストについて同様であり、活性化プロファイルは、注射後約２時間でピークに達し、６時間の時点で減少し、注射後２４時間で事実上検出できなくなった（図１０）。
【００８４】
核へのp６５転座について、マウス肝臓試料を免疫組織化学染色すると、ＣＢＬＢ５０２は、早くも注射後２０分で肝細胞においてＮＦ−κＢを直接活性化したが、クッパー細胞および内皮細胞の応答はなかったことが明らかになった（図７Ｃ）。ＣＢＬＢ５０２の注射後１時間までに、クッパー細胞および内皮細胞を含む全ての肝細胞が、P６５の核内蓄積を示し、このことは、１次効果および２次効果と、パラクリン機構によるＮＦ−κＢのその後の活性化とが重複することを示唆した。これとは対照的に、その後、肝細胞において、ＬＰＳによって活性化されるＮＦ−κＢの核移行が著しく生じた。ＮＦ−κＢの活性化は、クッパー細胞および内皮細胞で最初に観察され、その後、ＬＰＳ投与後約１時間で肝細胞が結合した。
【００８５】
ＬＰＳではなく、ＣＢＬＢ５０２で処理した初代肝細胞培養物（マウスおよびヒト）は、核へのＮＦ−κＢの転座を示した（図７Ｄ、図７Ｅ）。ＣＢＬＢ５０２媒介ＮＦ−κＢ活性化は、マウス肝細胞培養を用いたＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ発現により確認されたが、ＬＰＳは、この細胞においてＮＦ−κＢ活性化を誘導しなかった（図１１）。ＬＰＳ処理肝細胞で見られたＮＦ−κＢ活性化のレベルの低さは、他の間質肝細胞による初代肝細胞培養の汚染に起因する可能性が高かった。
【００８６】
これらの結果は、肝細胞がＴＬＲ４ではなくＴＬＲ５を発現し、ＣＢＬＢ５０２が肝細胞においてＮＦ−κＢを直接活性化することを可能にするが、ＬＰＳは、最初に他の細胞型（免疫および／または間質）を活性化し、その後に、２次的事象として肝細胞を間接的に活性化する。
【００８７】
２．Ｆａｓ媒介肝毒性からのＣＢＬＢ５０２保護
実証されているとおり、抗Ｆａｓ抗体は、用量依存性肝毒性を誘導し、アポトーシス、肝組織壊死および出血を誘導することによって急速にマウスを殺すことができる（Ｏｇａｓａｗａｒａ
Ｊ ｅｔ ａｌ,Ｎａｔｕｒｅ １９９３,Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ
ａｌ １９９７）。したがって、肝細胞においてＴＬＲ５アゴニストＣＢＬＢ５０２によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化が、Ｆａｓ媒介アポトーシスから肝臓を保護することができる。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスに、抗Ｆａｓ抗体（クローンＪｏ２）４μｇを腹腔内注射すると、肝臓で大量のアポトーシス、壊死および出血が誘導され（図８Ｂ、図８Ｃおよび図８Ｄ）、抗体注射後最初の１〜２日以内にマウスが死滅した（図８Ａ）。未治療の対照マウスと比較すると、ＣＢＬＢ５０２治療マウスの病理形態学的動態試験は、それらのマウスの肝臓が肝細胞の空胞変性を有することを示した（図１２）。抗Ｆａｓ抗体のサブ致死量（３μｇ／マウス）を注射したマウスの動態試験により、末端（中心）静脈に隣接した、良好に保存された細胞を有する門脈路の周囲の肝細胞の顕著なアポトーシスが明らかになり、これは５時間の時点で最も顕著になり、時間と共に（注射後１２時間および２４時間の時点で）減少した。ＣＢＬＢ５０２および抗Ｆａｓ抗体で治療したマウスの肝臓における変化は最小限であり、肝細胞は、正常に近いように見えた。すなわち、わずかな空胞形成および単一のアポトーシス細胞が見られた。
【００８８】
抗Ｆａｓ抗体の３０分前にＣＢＬＢ５０２をマウスに注射した場合、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの約８０％における注射後の良好な全生存をゆがめる肝臓への損傷は非常に少なかった（図８Ａ）。ＣＢＬＢ５０２を抗体の２時間前に注射した場合には、全てのマウスが生存した。その後、保護レベルは、前処理の６時間の時点まで減少した。
【００８９】
抗Ｆａｓ抗体２μｇおよび３μｇが、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスにおける肝毒性、肝臓におけるカスパーゼ３／７の活性化、および血液中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の分泌を一時的に誘導した（図８Ｅ、図８Ｆ）。両方の試験は、マウスをＣＢＬＢ５０２で前処理した場合に、抗Ｆａｓ抗体により誘導される肝損傷の有意な減少を示した。興味深いことに、Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂ１／６マウスは、ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスより抗Ｆａｓ抗体に対して感受性が低いように思われた。ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの致死量である抗Ｆａｓ抗体４μｇは、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂ１／６マウスにおいてカスパーゼ３／７活性化を一時的に誘導するが、これは、抗体の３０分前のＣＢＬＢ５０２注射によって十分に阻止された（図１３）。
【００９０】
これらのデータは、肝細胞におけるＴＬＲ５媒介ＮＦ−κＢ活性化が、Ｆａｓ媒介毒性に対する抵抗性の増加の指標であり、尺度となり得ることを支持する。
【００９１】
３．肝臓におけるＣＢＬＢ５０２によるアポトーシス促進因子の抑制および抗アポトーシス因子の誘導
カスパーゼ３および７は、内因性（ミトコンドリア）および外因性（カスパーゼ）の両方のＦａｓ媒介アポトーシスシグナル伝達の下流の標的である。この受容体の活性化の際に、最初にカスパーゼ−８がリン酸化および切断され、アポトーシス促進Ｂｉｄタンパク質の切断およびチトクローム放出を介して作用するミトコンドリアアポトーシスメカニズムの活性化をもたらす（Ｌｏｕ
ｅｔ ａｌ １９９８）。したがって、発明者らは、ＣＢＬＢ５０２がこのメカニズムを抑制するのか否かを調べた。
【００９２】
カスパーゼ−８およびＢｉｄの両方についての肝臓タンパク質抽出物のウェスタンブロット分析により、抗Ｆａｓ抗体の単回注射と比較して、ＣＢＬＢ５０２および抗Ｆａｓ抗体を組み合わせて注射したマウスにおいて、これらのタンパク質の切断は非常に少ないことが示された（図９Ａ、図９Ｂ）。蛍光発生基質アッセイを用いることによって示されるとおり、一貫して、カスパーゼ−８活性化は、バックグラウンドレベルまで減少した（図８Ｆ）。
【００９３】
ＣＢＬＢ５０２によるＦａｓ媒介肝毒性からのマウスの保護は、時間とともに増加し、３０分〜２時間で最大ピークに達するという事実は、肝細胞内のプレコンディショニング事象の存在を示唆する。多数のサイトカインおよび抗アポトーシス因子の中で、２種類の抗アポトーシスｂｃｌ２ファミリーメンバーのｂｃｌ２ＡｌＢおよびｂｃｌ２ＡｌＤ（Ｃｈａｏ
ａｎｄ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ,１９９８,Ａｒｉｋａｗａ ｅｔ ａｌ
２００６）の肝臓における上方制御が、ＣＢＬＢ５０２投与後３０分および２時間のＲＮＡアレイハイブリダイゼーションによって明らかとなり、ＲＴ−ＰＣＲによって確認された（図９Ｃ）。ＣＢＬＢ５０２は、別の抗アポトーシスタンパク質の前初期応答タンパク質（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ
ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＩＥＲ−３（図９Ｃ、ＩＥＸ−１が別の名前である）のＲＮＡ発現も迅速に誘導し、これは、活性酸素種の生成およびミトコンドリアアポトーシス経路を抑制することが示された（Ｓｈｅｎ
ｅｔ ａｌ ２００９）。肝臓試料のＲＴ−ＰＣＲ分析により、投与後３０分で、ＣＢＬＢ５０２によってＩＥＲ−３のＲＮＡ発現が誘導され、２時間まで著しく増加することが明らかになった。ＭＡＰＫ経路のいくつかのタンパク質が、ＣＢＬＢ５０２治療マウスの肝臓において上方制御されることが見出された。腫瘍におけるＭＡＰＫ経路の活性化が、これらの細胞のＦａｓ受容体アポトーシス（ＲＥＦ）に対する抵抗性を媒介することが示された。ＣＢＬＢ５０２での前処理に続く抗Ｆａｓ抗体注射後に、Ｊｕｎ、Ｊｕｎ−ＢおよびＦｏｓの遺伝子発現の上方制御がマウスの生存率と直接相関することは、Ｊｕｎ、Ｊｕｎ−ＢおよびＦｏｓが、Ｆａｓ肝毒性からのＣＢＬＢ５０２媒介型保護において役割を担う可能性を示唆した。
【００９４】
４．Ｆａｓ媒介抗腫瘍活性に対するＣＢＬＢ５０２の効果
ＬＰＳは、多くの臓器で強い炎症を誘導し、ＦＡＤＤ／カスパーゼ−８アポトーシス経路（ＲＥＦ）を介して直接細胞毒性になり得るので、臨床応用のための良好な候補ではない。ＣＢＬＢ５０２について、マウス、非ヒト霊長類およびヒト健常ボランティアで試験すると、短時間的な炎症のやや穏やかな誘導物質であることが判明した。組織を保護する化合物を評価する場合、毒性副作用を低減することによって、ＣＢＬＢ５０２は、腫瘍細胞をより耐性にさせることもでき、抗腫瘍療法の有効性を危うくする可能性が常にある。ＣＢＬＢ５０２と抗Ｆａｓ抗体との併用治療のインビボ抗腫瘍効果を、皮下増殖腫瘍および実験的肝転移のＣＴ−２６結腸癌マウスモデルにおいて試験した。この腫瘍モデルは、ＦａｓＬを発現するネズミチフス菌（完全に弱毒化した細菌）を利用する最近発表された研究において、熱帯腫瘍にＦａｓＬを送達し、Ｆａｓ媒介抗腫瘍効果を誘導するために用いられた（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ
ｅｔ ａｌ ２００８）。ＣＴ−２６腫瘍細胞およびＡ２０リンパ腫細胞は、ＲＴ−ＰＣＲおよびＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼレポーターアッセイによって測定されたとおり、ＴＬＲ５を発現しない（図１４）。本発明では、腫瘍を有するマウスを、抗Ｆａｓ抗体単独で治療するか、または組換えＣＢＬＢ５０２を抗Ｆａｓ抗体の単回注射（４μｇ／マウス、図９Ｄ）の２４時間前および１時間前の２回与える併用療法で治療した。治療したマウスにおける皮下増殖腫瘍の体積を、未治療のマウスにおいて増殖する腫瘍と比較した。ＣＴ−２６腫瘍は、毒性に対してかなり抵抗性があるが、致死量の抗Ｆａｓ抗体には抵抗性がないことが見出された（図９Ｄ）。ＣＢＬＢ５０２での前処理は、抗Ｆａｓ抗体に対して腫瘍をわずかに感作させ、これは、腫瘍の増殖阻害応答を反映する。ルシフェラーゼ発現ＣＴ−２６腫瘍細胞の脾臓内注射により誘導し、その後、脾臓摘出術を行う肝転移の実験モデルにおいて、Ｆａｓ媒介抗腫瘍効果を試験した。肝臓腫瘍の増殖を、Ｘｅｎｏｇｅｎ社のルシフェラーゼイメージングを用いて、治療後４〜６日ごとに評価した。各撮像手順で、肝腫瘍増殖が依存として存在しないマウスの数を数えた（図９Ｅ）。結果は、抗Ｆａｓ抗体単独の治療またはＣＢＬＢ５０２での前処理後に与えられる抗Ｆａｓ抗体治療の両方による、肝臓における腫瘍の外観（図９Ｇ）および増殖の大幅な遅延を示す。抗ＦａｓとＣＢＬＢ５０２との併用治療に対するＴＬＲ５陰性ＣＴ−２６腫瘍の感受性の増加は、ＣＴ−２６腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答の活性化を示唆する。実際、抗−Ｆａｓ／ＣＢＬＢ５０２治療後２４時間に取得したＣＴ−２６腫瘍を有する肝臓試料の免疫組織化学的分析により、腫瘍小結節の内部および周囲に好中球の蓄積が明らかになった（図９Ｆ）。したがって、ＣＢＬＢ５０２は、抗Ｆａｓ抗体の毒性から腫瘍を保護せず、ＣＴ−２６腫瘍に対するＦａｓ媒介抗腫瘍効果をわずかではあるが高めることができる。Ｆａｓ媒介毒性からの正常な肝組織の同時保護は、肝転移の完全予防に及ぶＦａｓアゴニスト量および皮下増殖腫瘍に対する治療効果の増加を可能にすることができる。
【００９５】
材料および方法
マウス
メスのＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスを、ＮＣＩ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ社、メリーランド州）から購入し、メスのＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７Ｂ１／６マウスをジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州）から購入した。全マウスを、１０〜１４週齢で実験に使用した。ＮＦ−κＢ誘導性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＢａｌｂ／Ｃ−Ｔｇ（ｌＫＢａ−ｌｕｃ）Ｘｅｎマウスを、最初、Ｘｅｎｏｇｅｎ社（アラメダ、カリフォルニア州）から購入し、発明者らの施設で飼育した。
【００９６】
試薬
細菌のフラジェリン誘導体であるＣＢＬＢ５０２を、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社から取得した。大腸菌０５５：Ｂ５の細菌リポ多糖（ＬＰＳ）を、Ｓｉｇｍａ社から購入した。精製アゴニストのハムスター抗マウスＦａｓ抗体、クローンＪｏ２を、ＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した。
【００９７】
ＮＦ−κＢレポーターマウスモデルを用いたインビボでのＮＦ−κΒ活性化の分析
ＢＡＬＢ／ｃ−Ｔｇ（ｌＫＢａ−ｌｕｃ）Ｘｅｎレポーターマウスに、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。ＣＢＬＢ５０２によるＮＦ−κＢの誘導を、治療後２時間の非侵襲インビボイメージングにより検出した（図１Ａ）。マウスに、Ｄ−ルシフェリン（３ｍｇ／１００μｌ、腹腔内、プロメガ社）を注射し、イソフルランですぐに麻酔し、Ｘｅｎｏｇｅｎ社のＩＶＩＳイメージングシステム１００シリーズを用いて撮像した。結果を定量化するために、ＰＢＳ、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれか１００μｌを皮下注射したＮＦ−κΒレポーターマウスの肝臓、肺、腎臓、脾臓、心臓および腸の試料を、注射後２時間、６時間、および２４時間の時点で取得した（図７Ｂ、図１０）。組織試料を、プロテアーゼ阻害剤混合物を含む溶解緩衝液（製造者の勧告に従う、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）で覆い、溶解緩衝液１ｍｌあたり組織１００ｍｇを得た。その後、これをホモジナイズし、４℃で１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。試料２０μｌ中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン試薬（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）３０μｌの添加直後に測定した。ルシフェラーゼ活性を、タンパク質抽出物１ｇあたりに正規化した。ルシフェラーゼの誘導倍率を、ＴＬＲリガンド治療マウスの肝臓における平均ルシフェラーゼ単位とＰＢＳを注射した対照マウスの肝臓における平均ルシフェラーゼ単位との間の割合として計算した。
【００９８】
p６５の転座についての免疫組織化学的染色
ｐ６５局在を、ＣＢＬＢ５０２（０．０４ｍｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれか一方を皮下注射したＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスから単離した肝臓で検出した。対照マウスにはＰＢＳを注射した。組織試料を治療後２０分、４０分および６０分に取得し、パラフィンブロックに加工した。全肝組織を、ＮＦ−ｋＢ
ｐ６５に対するウサギポリクローナル抗体およびサイトケラチン８に対するラットモノクローナル抗体、続いて、適切な蛍光標識２次抗体で染色した（ｐ６５は緑色、サイトケラチン８は赤色）。ＮＩＨ−ＳｗｉｓｓマウスのＥＧＴＡ（ＰＢＳ中０．５ｍＭ）灌流肝組織から単離し、その後、コラゲナーゼ消化したマウス初代肝細胞を有するプレート、ならびにＢＤ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入したヒト肝細胞培養物を有するプレートで同様の染色を行った。両方の種類の肝細胞を、ＣＢＬＢ５０２（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で、指定した期間インビトロ処理した。対照の肝細胞は未処理のままにした。２０倍の倍率で撮影した（図７Ｃ、図７Ｄ、図７Ｅ）。
【００９９】
生存率分析
ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスに、ＰＢＳ２００μｌ中抗Ｆａｓ抗体２μｇ、３μｇ、４μｇ、および５μｇを腹腔内注射して、１００％致死量を決定し、このマウス系統では４μｇ／マウスであることが判明した。次いで、ＣＢＬＢ５０２（０．０４ｍｇ／ｋｇ）を、抗Ｆａｓ抗体４μｇの腹腔内注射の３０分前、２時間前および６時間前に皮下注射した（図８Ａ）。通常、抗Ｆａｓ肝毒性による死亡は、抗体注射後の最初の１〜２日中に発生する。マウスの生存を３０日間観察し、記録した。
【０１００】
肝臓におけるアポトーシス細胞のＴＵＮＥＬ染色
抗Ｆａｓ抗体の３０分前に、ＣＢＬＢ５０２（皮下、０．０４ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳを注射した５時間後のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの肝臓におけるアポトーシスを、パラフィン包埋検体で検出した。アポトーシス細胞を、ＴＵＮＥＬ
ＰＯＤキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、関節末端デオキシヌクレオチド転移酵素媒介デオキシウリジン３リン酸ニック末端標識（ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｎｉｃｋ ｅｎｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ））法により染色した（図８Ｂ）。
【０１０１】
肝臓の形態の組織学的評価
肝標本を、抗体の３０分前のＣＢＬＢ５０２（０．０４ｍｇ／ｋｇ）による前治療がある場合とない場合とで、抗Ｆａｓ抗体注射後５時間のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス（図２Ｃ）から収集し、抗Ｆａｓ抗体注射後５時間、１２時間および２６時間の動態を調べた（図Ｓ３）。治療していない（「未治療の」）マウスを対照として用いた。組織検体を、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、切片にし、加工して、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
【０１０２】
出血についての肝臓の組織学的染色
パラフィン切片を、Ｃｙ５標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社、紫色の疑似カラー）で染色し、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、青色核染色）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄアンチフェード試薬をマウントした。赤血球を、赤色チャネルで、赤色自己蛍光によって可視化した（図２Ｄ）。ＡｘｉｏＣａｍ
ＨＲｃ １３メガピクセルデジタルカメラを備えるＡｘｉｏｌｍａｇｅｒ Ｚ１蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）下で、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ｒｅｌ.４．６.３）を用いて撮像した。
【０１０３】
カスパーゼ活性化
肝臓を小片にカットし、２ｍＭのＤＴＴを補充した緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％
ＣＨＡＰＳ、２％グリセロール）中で、組織グラインダー（Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ、ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ社）を用いてホモジナイズした。全ステップを氷上で行った。肝臓ホモジネートを１３,０００×ｇで２０分間遠心分離し、上清を−２０℃で保存した。肝臓ホモジネート（全タンパク質５０μｇを含む）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．４ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．２％ ＣＨＡＰＳ、２％グリセロールおよび２ｍＭ ＤＴＴを含む無細胞系の緩衝液２００μｌ中５０μＭの蛍光発生基質アセチル−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｖａｌ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−アミノメチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ａｍｃ）（ＥＮＺＯ、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社）とインキュベーションすることによって、カスパーゼ活性を測定した。蛍光光度計（励起：３５５、蛍光：４８５）（Ｖｉｃｔｏｒ３,ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）により、３７℃でのインキュベーション後０時間および２時間の時点で、蛍光ａｍｃの放出を測定した。ｔｗｐと０時間との差としてデータを示す（図８Ｅ）。
【０１０４】
ＣＢＬＢ５０２注射がある場合とない場合における抗Ｆａｓ抗体治療マウスの血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の検出
ＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウス（１群あたり３匹）に、抗Ｆａｓ抗体の３０分前にＣＢＬＢ５０２を１μｇ皮下注射した。マウスの血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の存在を、市販の酵素アッセイを用いて、製造業者（Ｓｔａｎｂｉｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ベルネ、テキサス州、米国）の取扱説明書に従って決定した。３４０ｎｍの吸光度を６０秒間隔（ＡＡ／分）で測定した（図８Ｆ）。
【０１０５】
ウェスタンブロット解析
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、治療したマウスの肝臓および治療していないマウスの肝臓から全タンパク質を単離した。タンパク質抽出物を、４〜２０％の変性ポリアクリルアミドＮｏｖｅｘゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）で電気泳動により分離し、ナイロンポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ビレリカ、マサチューセッツ州）に移した。以下の抗体を用いた：カスパーゼ−８抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、ダルムシュタット、ドイツ）、抗ＢＩＤ（ＡｂＣａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギ２次抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス２次抗体を、Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した（サンタクルーズ、カリフォルニア州）（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【０１０６】
ＲＮＡ解析
製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）の取扱説明書に従って、ＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて、治療したマウスの肝臓および治療していないマウスの肝臓から全ＲＮＡを抽出した。結果として生じるゲノムＤＮＡの混入を除去するために、単離したＲＮＡをＤＮａｓｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）で処理した。ｃＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ
ＩＩ逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて合成した。未治療のマウス、ならびにＣＢＬＢ５０２およびＬＰＳで３０分間および２時間治療したマウスの肝臓中のＢｃｌ２ＡｌＢ、Ｂｃｌ２ＡｌＤ、ＩＥＲ−３、Ｆｏｓ、ＪｕｎおよびＪｕｎＢの遺伝子のＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって検出した。ＧＡＰＤＨを、遺伝子発現の誘導を監視するための対照として用いた。プライマーを、ＬａｓｅｒＧｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いて設計し、次いで、ＵＣＳＣゲノムブラウザインシリコＰＣＲウェブサイト（Ｇｅｎｏｍｅ
Ｂｒｏｗｓｅｒ Ｉｎ− Ｓｉｌｉｃｏ ＰＣＲ ｗｅｂｓｉｔｅ）を用いて、プライマーの位置を調べた。ＩＥＲ３遺伝子に特異的なプライマー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１３３６６２．２）（センス５’−ＡＣＴＣＧＣＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣＡＣ−３’およびアンチセンス５’−ＣＴＣＧＣＡＣＣＡＧＧＴＡＣＣＣＡＴＣＣＡＴ−３’）、Ｂｃｌ２ＡｌＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７５３４．３）（センス５’−ＴＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ−３’およびアンチセンス５’−ＣＴＣＣＡＴＴＣＣＧＣＣＧＴＡＴＣＣＡＴ−３’、Ｂｃｌ２ＡｌＤ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７５３６．２）（センス５’−ＴＣＴＡＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＴＣ−３’およびアンチセンス５’−ＡＴＴＣＣＧＣＣＧＴＡＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣ−３’、Ｊｕｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０５９１．２（センス５’−ＴＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡＡＧＡＴ−３’およびアンチセンス５’−ＧＧＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴ−３’、Ｆｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１０２３４．２（センス５’−ＧＡＧＣＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’およびアンチセンス５’−ＴＴＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＡＧＧ−３’、ＪｕｎＢ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００８４１６．２（センス５’−ＡＧＣＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣ−３’およびアンチセンス５’−ＧＴＧＡＴＣＡＣＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＧ−３’、ＧＡＰＤＨ遺伝子（センス５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’およびアンチセンス５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’）を用いた。ｃＤＮＡの増幅を、各遺伝子の特異的プライマー対を用いて２０〜３０サイクル行った（図３Ｃ）。
【０１０７】
ＣＴ−２６担癌マウスの実験的治療
抗Ｆａｓ抗体への腫瘍の感受性に対するＣＢＬＢ５０２の効果を、結腸腺癌ＣＴ−２６腫瘍の２つの同系モデル：１）ＣＴ−２６皮下増殖腫瘍、および２）ＣＴ−２６腫瘍の実験的肝転移モデルを用いて分析した。ＣＴ−２６細胞を、ルシフェラーゼの構成的発現のためのＣＭＶプロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子を運ぶレンチウイルスベクターで形質導入した。ＢＡＬＢ／ｃマウスの両脇腹に、ＣＴ−２６腫瘍細胞（２．５×１０５／１００μｌ）を皮下注射することによって腫瘍を誘導した。腫瘍が直径約４〜５ｍｍに達した時に、マウスを無作為に３群に分け、治療を開始した。１群のマウスに、抗Ｆａｓ抗体（４μｇ／マウス）を腹腔内注射し、別の群のマウスを、抗Ｆａｓ抗体（４μｇ／マウス）注射の２４時間前および１時間前にＣＢＬＢ５０２（１μｇ／マウス）で治療した。対照マウス（未治療）には、ＣＢＬＢ５０２および抗体の代わりにＰＢＳを皮下注射および腹腔内注射した。腫瘍体積を、キャリパーを用いて１日おきに測定し、以下の式により計算した。
【０１０８】
【数１】
0006041444.tif 000003
式中、ａ＜ｂである。
【０１０９】
対照群は２週間生存し、腫瘍が大きくなったために実験を終了した（図９Ｄ）。腫瘍体積の統計的な差を、ＡＮＯＶＡの一方向分散分析を用いて推定した（ｐ＜０．０５）。肝腫瘍増殖の進行については、ＣＴ−２６腫瘍細胞（２．５×１０５／５０μｌ）を、直接脾臓に注射し、５分後に脾臓を摘出した。マウスを、皮下腫瘍について記載したのと同じ方法で、腫瘍細胞の接種後５日目に始める抗Ｆａｓ抗体および抗体とＣＢＬＢ５０２の組み合わせで治療した。イソフルランで麻酔し、Ｄ−ルシフェリン（３ｍｇ／１００μｌ、腹腔内）注射したマウスの非侵襲生物発光イメージングを、腫瘍細胞注射の１４日後、１７日後、２２日後および２８日後にＸｅｎｏｇｅｎ
ＩＶＩＳイメージングシステム１００シリーズを用いて行った。肝臓の腫瘍増殖を測定する時に、マウスを屠殺した。腫瘍のない肝臓の曲線の統計比較を、ログランク（マンテルコックス）検定（ｐ＜０．０５）を用いて行った（図９Ｇ）。
【０１１０】
実施例２
胸腺欠損マウスの異種モデルにおけるＨＣＴ１１６結腸腺癌の皮下増殖に対するＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍活性
ＨＣＴ１１６（０．５×１０６／ＰＢＳ１００μｌ）を８匹の胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射し、腫瘍を誘導した。腫瘍が直径約３〜５ｍｍ（注射後６日まで）になった時に、マウスを、ＣＢＬＢ５０２治療群については５匹のマウスおよびＰＢＳ対照群については３匹のマウスの２群に無作為に分けた。腫瘍増殖の抑制を、ＣＢＬＢ５０２治療マウスにおいて測定した。データを図１５に示す。
【０１１１】
実施例３
胸腺欠損マウスの異種モデルにおける２９３−ＴＬＲ５皮下腫瘍増殖に対するＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍活性
腫瘍細胞（２×１０６／ＰＢＳ１００μｌ）を１０匹の胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射し、腫瘍を誘導した。腫瘍が直径約３〜５ｍｍ（注射後７日まで）になった時に、マウスを、ＣＢＬＢ５０２治療群については５匹のマウスおよびＰＢＳ対照群では５匹のマウスの２群に無作為に分けた。腫瘍増殖の抑制が、ＣＢＬＢ５０２治療マウスにおいて見られた。データを図１６に示す。
【０１１２】
実施例４
胸腺欠損マウスの異種モデルにおけるＡ５４９腺癌の皮下増殖に対するＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍活性
初代Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ、ＣＬＬ−１８５）（０．５×１０６／ＰＢＳ１００μｌ）を８匹の胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射し、腫瘍を誘導した。腫瘍が直径約３〜５ｍｍ（注射後６日まで）になった時に、マウスを、ＣＢＬＢ５０２治療群については５匹のマウスおよびＰＢＳ対照群では３匹のマウスの２群に無作為に分けた。Ａ５４９担癌マウスに、ＣＢＬＢ５０２（１μｇ／マウス）またはＰＢＳのいずれか一方を、２４時間の時間間隔で三回注射した。ＰＢＳを注射したマウスの対照群では、腫瘍体積は、徐々に、定期的に増加した。一方で、ＣＢＬＢ５０２注射マウスは、注射後最初の数日間は腫瘍増殖の抑制を示し、次いで、腫瘍増殖が回復した。最初の治療の２週間後（１４日、１５日および１６日目）の第２ラウンドのＣＢＬＢ５０２注射は、腫瘍増殖の再開前の約１〜２週間に、類似の腫瘍増殖抑制を誘導した。その結果、実験の終わりまでにＡ５４９腫瘍の大きさは、２群のマウスにおいて著しく異なり、ＰＢＳ治療マウスと比べてＣＢＬＢ５０２治療マウスではるかに小さかった。データを図１７に示す。
【０１１３】
実施例５
同系の同所性（皮下）増殖扁平上皮癌ＳＣＣＶＩＩ腫瘍に対するＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍効果
４００ｍｍ３腫瘍サイズに達するまでの、ＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳ（未治療）治療（０．１ｍｇ／ｋｇ、皮下、１日、２日、３日）後の同系Ｃ３ＨマウスにおけるＳＣＣＶＩＩ同所性腫瘍増殖の速度。ｎ＝６〜１０。図１８のｘ軸は、ＣＢＬＢ５０２での治療がある場合とない場合での、腫瘍の体積が４００ｍｍに達するのに必要とされる日数を表す。データを図１８に示す。
【０１１４】
実施例６
皮下に進行性ウォード結腸直腸癌を有するフィッシャーラットにおけるＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍活性
ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ×５用量）を、４匹のラットへの腫瘍移植後５日目に開始して、１日に１回、５日間、腹腔内投与した。対照の４匹のラットに、ビヒクル対照としてＰＢＳを注射した。腫瘍重量を毎日測定した。完全寛解（腫瘍の完全消失）が、ＣＢＬＢ５０２で治療した３匹のラットにおいて観察された（図１９）。この群の第４のラットは、対照群のラットと同様の腫瘍増殖を有していた。
【０１１５】
実施例７
ＴＬＲ５発現の点で異なるＡ５４９腫瘍（Ａ５４９−ｓｈＴＬＲ５対Ａ５４９−ｓｈＶ）に対するＣＢＬＢ５０２注射の効果
ＴＬＲ５発現を抑制するために、ＮＦ−ｋＢプロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するＡ５４９細胞（Ｃｅｌｌｅｃｔａ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州）を、ヒトＴＬＲ５遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルスｐＬＫＯｌ−ｐｕｒｏベクター（ＣＣＧ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＣＣＴ−ＡＣＡ−ＡＣＡ−ＡＧＡ−ＴＡＡ−ＡＣＴ−ＣＧＡ−ＧＴＴ−ＴＡＴ−ＣＴＴ−ＧＴＴ−ＧＴＡ−ＧＧＣ−ＡＡＧ−ＧＴＴ−ＴＴＴ−Ｇ）または対照の空ベクター（ｓｈＶ,Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）で形質導入した。ピューロマイシン選択後、Ａ５４９−ｓｈＶ細胞およびＡ５４９−ｓｈＴＬＲ５細胞を、製造業者のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｅ４５３０、マディソン、ウィスコンシン州）に従って、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＣＢＬＢ５０２治療に応答したＮＦ−ｋＢ活性化について試験した。次いで、Ａ５４９−ｓｈＶ細胞およびＡ５４９−ｓｈＴＬＲ５細胞（１×１０６／ＰＢＳ１００μｌ）を、２０匹の胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射し、腫瘍を誘導した。Ａ５４９−ｓｈＶ腫瘍およびＡ５４９−ｓｈＴＬＲ５腫瘍の異種移植片が皮下で増殖しているマウスを、ＣＢＬＢ５０２または対照として作用するＰＢＳのいずれか一方で治療した。これらの結果は、ＣＢＬＢ５０２のみを繰り返し投与すると、Ａ５４９−ｓｈＶ（ＴＬＲ５発現）腫瘍異種移植片において腫瘍増殖率が低下したことを示し、これはこの薬物の直接的な腫瘍抑制効果を示す。Ａ５４９由来の腫瘍について示されるとおり、この効果は、ヒトＴＬＲ５に対するｓｈＲＮＡのレンチウイルス形質導入によって引き起こされるＴＬＲ５ノックダウンにより、Ａ５４９腫瘍は、ＣＢＬＢ５０２の直接的な抗腫瘍効果に対してもはや感受性を示さないので、ＴＬＲ５依存的であった。データを図２０に示す。
【０１１６】
実施例８
ＴＬＲ５発現の点で異なるＨ１２９９腫瘍（ＨＩ２９９−対照対ＨＩ２９９−ＴＬＲ５）に対するＣＢＬＢ５０２注射の効果
ＴＬＲ５発現を誘導するために、Ｈ１２９９細胞（本来はＴＬＲ５陰性）を、ヒトＴＬＲ５遺伝子を発現するレンチウイルスコンストラクトで形質導入した。ＴＬＲ５の機能活性を、ＣＢＬＢ５０２治療に応答したＩＬ−８産生によって調べた。次いで、両方の腫瘍細胞型（１×１０６／ＰＢＳ１００μｌ）を、胸腺欠損ヌードマウスの両脇腹に皮下注射し、腫瘍を誘導した。上記のＡ５４９モデルと同様に、担癌マウスを、ＣＢＬＢ５０２または対照として作用するＰＢＳのいずれか一方で治療した。結果は、ＣＢＬＢ５０２のみを繰り返し投与すると、Ｈ１２９９−ＴＬＲ５（ＴＬＲ５発現）腫瘍異種移植片においてのみ腫瘍増殖率が低下したことを示し、これはこの薬物の直接的な腫瘍抑制効果を示す。対照Ｈ１２９９（ＴＬＲ５陰性）について示されるとおり、腫瘍増殖はＣＢＬＢ５０２治療に影響を与えなかった。データを図２１に示す。
【０１１７】
実施例９
この実施例は、膀胱組織がＣＢＬＢ５０２に強く応答することを示す。上記のとおり、肝組織について実験を行った。ＰＢＳ、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）またはＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）のいずれか１００μｌの皮下注射後２時間のレポーターマウスにおいて、肝臓、小腸（回腸部分）、結腸、脾臓、腎臓、肺および心臓におけるＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼ発現を評価した。タンパク質抽出物１μｇあたりに正規化したルシフェラーゼ活性を、各群３匹のマウスで検出した。データを図２２に示す。
【０１１８】
実施例１０
表２は、マウスの標的臓器においてＣＢＬＢ５０２によって転写活性化される遺伝子のスペクトルを示す（膀胱の結果を示す）。ＣＢＬＢ５０２で治療したマウスの膀胱で、注射後１時間および３時間に強く上方制御される遺伝子を、それらの機能に応じてクラスター化する。最大グループは、自然免疫を動員するメカニズムの活性化を示すケモカイン、サイトカインおよびそれらの受容体からなる。
【０１１９】
実施例１１
ＴＬＲ５を発現しないＣＴ２６腫瘍細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ同系マウスに皮下注射し、腫瘍を誘導した。腫瘍を有するマウスを、２４時間の間隔をあけて２回、ＣＢＬＢ５０２（０．０４ｍｇ／ｋｇ、皮下）で治療した。治療マウスにおける皮下増殖腫瘍体積を、未治療のマウスで増殖する腫瘍と比較した。ＣＢＬＢ５０２での前治療は、腫瘍増殖にいかなる影響も与えなかった。その後、ルシフェラーゼ発現ＣＴ−２６腫瘍細胞（図２３Ｂおよび２３Ｃ）およびＡ２０リンパ腫細胞（図２３Ｄ）の脾臓内注射により誘導し、その後、脾臓摘出術を行う肝転移の実験モデルにおいて、ＣＴ２６腫瘍増殖を試験した。肝臓腫瘍増殖を、治療後４〜６日ごとにＸｅｎｏｇｅｎ社のルシフェラーゼイメージングを用いて評価した。各撮像手順で、肝臓腫瘍増殖の無いマウスの数を数えた。結果は、両方の腫瘍モデルにおいて、ＣＢＬＢ５０２治療による肝臓の腫瘍増殖の防止および腫瘍の外観の著しい遅延を示す。肝臓腫瘍モデルにおけるＣＢＬＢ５０２治療群と対照群との差は有意である（ログランクｐ＜０．０５）。データを図２３に示す。
【０１２０】
実施例１２
Ｆａｓ媒介肝毒性からのＣＢＬＢ５０２保護
Ａ．抗Ｆａｓ抗体４μｇを単独で腹腔内注射するか、または抗体の３０分前、２時間前および６時間前に注射するＣＢＬＢ５０２（１μｇ／マウス）と組み合わせて腹腔内注射した後のＮＩＨ−Ｓｗｉｓｓマウスの生存率。各治療あたりのマウスの数を括弧に示す。Ｂ．抗Ｆａｓ抗体毒性からの肝臓の保護。抗Ｆａｓ抗体注射後５時間の肝臓におけるアポトーシスを、ＴＵＮＥＬ法を用いて検出した。Ｈ＆Ｅ染色による組織形態は、抗Ｆａｓ抗体注射による肝臓への壊死損傷およびＣＢＬＢ５０２による保護を明らかにした。肝臓の出血を、組織中の赤血球浸潤、マウスＩｇＧ対照（紫色）およびＤＡＰＩ核（青色）によって検出した。データを図２４に示す。
【０１２１】
実施例１３
ＴＮＦαおよびＬＰＳ毒性からの肝臓保護
Ａ．ＴＰＳ／ＴＮＦ−ａの３０分前にＣＢＬＢ５０２治療をした場合としない場合のマウスにおいて、カスパーゼ３／７を、ＴＮＦ−ａまたはＬＰＳの注射後５時間で検出し、（炎症損傷を示す）脂質酸化を、注射後２４時間で検出した。肺においてＴＮＦ（１ｍｇ／マウス）によって誘導されるカスパーゼ活性化および脂質酸化を、ＣＢＬＢ５０２注射によって防止した。ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）によって誘導される損傷効果を、ＬＰＳの３０分前のＣＢＬＢ５０２注射によって完全に無効にした。治療後２４時間に、データをタンパク質濃度によって正規化した（ｎ＝３）。ＣＢＬＢ５０２をｈ−ＴＮＦの３０分前に注射すると、マウスの肝臓において、カスパーゼ活性化は無く（ＴＮＦ注射後５時間）、脂質酸化は非常に少なかった（炎症性損傷の指標として、ＴＮＦ注射後２４時間）。Ｂ．免疫組織化学的分析（Ｈ＆Ｅ染色）により、ＴＮＦ−ａ前のＣＢＬＢ５０２注射による肝臓の完全性の保存が確認された。未治療の対照と比較して、ＴＮＦ治療マウスの肝臓は、門脈周囲においてわずかに顕著であり、用量依存的である（ＴＮＦ０．４ｍｇ／マウスでより重症な）肝細胞の空胞化を示した。ＣＢＬＢ５０２とＴＮＦ０．２ｍｇ／マウスまたはＣＢＬＢ５０２とＴＮＦ０．４ｍｇ／マウスで治療したマウスの肝臓において、変化は最小であり、わずかな空胞化がまだ見られたが、肝細胞は正常に近かった。データを図２５に示す。
【０１２２】
実施例１４
ＴＮＦ−ａおよびＬＰＳの毒性からの肺保護
未治療の対照と比較して、ＴＮＦ治療マウスの肺は、気腔の減少につながる肺胞における肺胞細胞の反応性増殖、充血、間質性浮腫および滲出液を示し、変化は用量依存的（ＴＮＦ４００でより深刻）であった。ＣＢＬＢ５０２とＴＮＦ２００ｎｇまたはＣＢＬＢ５０２とＴＮＦ４００ｎｇで治療したマウスの肺において、変化は最小であった。肺胞壁のわずかな肥厚がまだ見られたが、形態は正常に近かった（図２６Ｂ）。ＣＢＬＢ５０２を、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはｈ−ＴＮＦ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の３０分前に注射した場合、マウスの肺の脂質酸化（炎症損傷の指標）レベルはほぼ正常であった（図２６Ａ）。データを図２６に示す。
【０１２３】
実施例１５
ＣＢＬＢ５０２注射による致死的なネズミチフス菌の経口投与からのマウスの保護
実験条件を図２７に示す。
【０１２４】
実施例１６
この実施例は、イリノテカンがフラジェリンの抗腫瘍効果を無効にすることを示す。データを図２８に示す。同系のウォードＷａｒｄ結腸腫瘍が皮下で増殖しているフィッシャーラットを、ＣＢＬＢ５０２（０．２ｍｇ／ｋｇ）で治療し、これを３日間、１日に１回、腹腔内投与した。イリノテカン（２００ｍｇ／ｋｇ）を、各ＣＢＬＢ５０２注射後３０分の時点で静脈内注射した。ＰＢＳをビヒクル対照として用いた（図２８Ａ）。ＣＢＬＢ５０２は、イリノテカン抗腫瘍活性と干渉せず、イリノテカン毒性からラットを救出した（図２８Ｂ）。しかし、ＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍効果は、イリノテカン治療ラットにおいて観察されなかった（図２８Ｃ）。これは、ＣＢＬＢ５０２の抗腫瘍効果が、十分な自然免疫レベルを必要とすることを示す。
【表２】
0006041444.tif 000004
0006041444.tif 000005
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【図１】
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【図２】
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【図３】
0006041444.tif 000043
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0006041444.tif 000045
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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