(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９を含み、不安及び／又は不安関連障害の治療又は予防のための薬物組成物。
【請求項２】
組成物が、少なくとも１種の他の種類の他の食品用微生物を追加的に含み、食品用微生物が、乳酸菌、ビフィズス菌、プロピオニバクテリア又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、少なくとも１種のプレバイオティクスをさらに含有する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
プレバイオティクスが、オリゴ糖類からなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
オリゴ糖類が、フルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆及び／若しくはイヌリン、食物繊維、又はそれらの混合物を含有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９の少なくとも一部分が組成物中で生きている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９の少なくとも一部分が組成物中で生きていない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
日用量当たり、１０４〜１０１０のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９の非複製細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
組成物の乾燥重量１グラム当たり、１０２〜１０８のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９の非複製細胞を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
海馬ＢＤＮＦ発現を増加させるための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
不安関連障害が、うつ病、物質乱用、過食症、並びにストレスの悪影響からなる群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
物質乱用がアルコール乱用、コカイン乱用及びアヘン剤乱用を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ストレスの悪影響が睡眠障害及び認識機能障害を含む、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、全般的にはプロバイオティクスを含む食用組成物に関する。より具体的には、本発明はビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を含む食用組成物、並びに海馬ＢＤＮＦ発現の増加及び／又は不安及び関連障害の治療若しくは予防のためのその使用に関する。
【０００２】
１８歳以上のアメリカ人の成人約４千万人が不安障害に冒されている。これは平均すると成人人口の約１８％を意味している。短期間の不安は、例えば試験又は少し恥ずかしいと思われる状況等のストレスのたまる出来事によって生じる場合がある。しかしながら不安は、ずっと長く、例えば半年以上続くこともあり、治療しなければ、この不安状態が続いてより重症になり精神障害（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）になる可能性がある。不安障害は、アルコール乱用や薬物乱用等の、他の精神疾患又は身体的疾患と一緒に生じることもある。代表的な不安障害は、パニック障害、強迫性障害（ＯＣＤ）、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、社会恐怖症（即ち社会不安障害）、特定恐怖症及び全般性不安障害（ＧＡＤ）である。
【０００３】
現在利用できる不安関連障害の治療法はいくつかある。一般的には、不安障害は抗うつ薬、抗不安薬又はβ遮断薬等の薬物で治療する。
【０００４】
これらの薬物は脳内の化学反応を変化させ、また時には激しい副作用がある。またこれらの薬物は、摂取頻度の高い薬物と望ましくない相互作用を有することもある。
【０００５】
選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）は、脳細胞の情報伝達を支援する脳内の神経伝達物質であるセロトニンのレベルを変化させる。ＳＳＲＩは昔からの抗うつ薬よりも副作用は少ないが、初めて摂取を始める時には軽い悪心や神経過敏を生じることが時々ある。中にはＳＳＲＩによって性機能不全を経験する人もいる。
【０００６】
三環系抗うつ薬は、めまい、傾眠、口渇及び体重増加を引き起こすことが時々ある。
【０００７】
モノアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）は最も古いクラスの抗うつ薬である。ＭＡＯＩを摂取する人は、チラミンを含有する様々な食物及び飲料（チーズや赤ワインが挙げられる）を食べることができず、またある特定の薬物を摂取することもできない。ＭＡＯＩはカフェインと相互作用を起こすこともある。ＭＡＯＩは、錯乱、幻覚、発汗増加、筋肉強直、発作、血圧若しくは心拍リズムの変化、及びその他の命に関わる可能性のある症状を引き起こすこともある。
【０００８】
ベンゾジアゼピンは傾眠を引き起こすことがあり、患者はベンゾジアゼピンに慣れてしまうことがある。ベンゾジアゼピンを中止した後には禁断症状が報告されることが多い。ベンゾジアゼピンによって食物摂取量が増加したり記憶力が減退したりもする。
【０００９】
β遮断薬は、特定の不安障害、特に社会恐怖症に伴う身体症状を予防することができる。
【００１０】
この薬物はすべて、望まれない副作用を生じることがある。重症度の差はあるが、多くの人々が不安関連障害に冒されているという事実を踏まえると、副作用のリスクがなく安全に投与できる組成物が利用可能であることが望ましい。
【００１１】
国際公開第２００４０９８６２２号パンフレットは、被験者に菌株を投与することを含む、うつ病を治療する方法について記載している。
【００１２】
しかしながら本発明者らは、不安、不安関連障害及び／又は神経変性障害の、治療及び／又は予防における有効性は、用いる細菌の属、種及び株によって異なることを見出した。
【００１３】
したがって、最新の技術水準を向上させること、及び特に、不安、不安関連障害又は神経変性障害等の、海馬ＢＤＮＦ発現が低いことに関連している障害の治療又は予防のために用いることができる、有効で、容易に入手可能で、低価格で、且つ投与しても望まれない副作用がなく安全な菌株を含む組成物を当該技術分野にもたらすことが本発明の目的であった。
【００１４】
本発明者らはこのニーズに取り組んできた。本発明者らは、本独立クレームの主題によってこの目的が達成できるとわかって驚いた。本従属クレームでは、本発明のアイデアをさらに発展させている。
【００１５】
したがって本発明の一実施形態は、ビフィドバクテリウム・ロンガム、特にビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を含む食用組成物である。ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は市販されている。
【００１６】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９（ＢＬ９９９）は、例えば日本の森永乳業株式会社からＢＢ５３６の商標で入手することができる。ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９（ＢＬ９９９）は、任意の好適な方法に従って培養することができ、カプセル化用、又は例えば凍結乾燥形態若しくはスプレー乾燥形態の生成物への付加用に調製することができる。
【００１７】
本発明は、好ましいビフィドバクテリウム・ロンガム株であるビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９に関して開示されているが、本開示はビフィドバクテリウム・ロンガム種全般に等しく適用されることを理解すべきである。
【００１８】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９が特に有効であることがわかった。
【００１９】
「食用」（“ｅｄｉｂｌｅ”）とは、ヒト又は動物による摂取が認可されている物質を意味する。
【００２０】
「ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ ＢＡＡ−９９９」という用語は、細菌を含むことを意味している。
【００２１】
食用組成物は薬剤であってもよいが、食品組成物、ペットフード組成物、健康補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）及び／又は飲料であることが好ましい。
【００２２】
本発明の組成物が食品組成物である場合、かかる組成物を薬局やドラッグストアだけでなく普通のスーパーマーケットにも流通させることができ、そこで本組成物を誰でも簡単に入手できる、という利点がある。
【００２３】
食品組成物が普遍的に美味しい味であると、その製品が受け入れられることにさらに寄与することになる。特に小さな子供やペットは、普遍的に好まれる味の組成物を喜んで摂取する傾向が非常に強い。
【００２４】
本発明に適用可能な食物製品としては、ヨーグルト、ミルク、フレーバーミルク、アイスクリーム、すぐ食べられるデザート、ミルクや水等で液戻しするための粉末、チョコレートミルク飲料、麦芽飲料、すぐ食べられる食事、ヒト用インスタント食品若しくは飲料、又はペット若しくは家畜用の完全食又は部分食を表す食品組成物が挙げられる。
【００２５】
したがって、一実施形態において、本発明の組成物はヒト、ペット又は家畜用の食物製品である。特に本組成物はイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、家禽又はヒトからなる群より選択される動物用であり、好ましい実施形態において、本組成物は成体種、特にヒトの成人用の食物製品である。
【００２６】
本発明の組成物は、保護親水コロイド（ゴム、タンパク質、加工デンプン等）、結合剤、被膜剤、封入剤／封入材料、壁材料／シェル材料、マトリックス化合物、被覆剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、蝋、レシチン等）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物（ｃｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶剤）、流動化剤、味マスキング剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤及び抗菌剤をさらに含有していてもよい。また本組成物は、限定するものではないが、水、任意の起源のゼラチン、植物ガム、リグニンスルホン酸塩、タルク、砂糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、香味剤、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、着色剤、湿潤剤、充填剤等を含む、従来の医薬品添加物及び補助剤、賦形剤、並びに希釈剤を含有していてもよい。すべての場合において、このようなさらなる成分は、対象となる受け手に対する適合性を考慮して選択される。
【００２７】
本組成物は、栄養的に完全な調整乳であってもよい。
【００２８】
本発明の組成物はタンパク源を含んでいてもよい。
【００２９】
任意の好適な食事タンパク質、例えば動物性タンパク質（乳タンパク質、食肉タンパク質及び卵タンパク質等）、植物性タンパク質（大豆タンパク質、小麦タンパク質、米タンパク質及びエンドウタンパク質等）、遊離アミノ酸の混合物、又はそれらの組合せを用いることができる。カゼイン及び乳清等の乳タンパク質並びに大豆タンパク質が特に好ましい。
【００３０】
タンパク質は、インタクトなタンパク質若しくは加水分解タンパク質、又はインタクトなタンパク質と加水分解タンパク質の混合物であってもよい。例えば牛乳アレルギーを発症するリスクのあるヒト被験者及び／又は動物に対しては、部分加水分解タンパク質（加水分解度は２〜２０％）を与えることが望ましい場合がある。加水分解タンパク質が必要な場合、加水分解プロセスは、所望に応じて、当技術分野で知られているように実施することができる。例えば、乳清タンパク加水分解物は、１つ又は複数のステップで乳清画分を酵素的に加水分解することによって調製することができる。出発物質として用いる乳清画分が実質的にラクトースフリーである場合、タンパク質中のリジンブロックが、加水分解プロセス中にはるかに減少することが見出されている。これにより、リジンブロックの範囲を、全リジンの約１５重量％からリジンの約１０重量％未満、例えばタンパク源の栄養価が大きく高まるリジンの約７重量％に減少させることができる。
【００３１】
本組成物は、炭水化物源及び脂肪源を含有していてもよい。
【００３２】
本組成物が脂肪源を含む場合、この脂肪源は本組成物のエネルギーの５〜４０％、例えばエネルギーの２０〜３０％を作り出すことが好ましい。好適な脂肪プロフィールはキャノーラ油、コーン油及び高オレイン酸ひまわり油のブレンドを用いて得ることができる。
【００３３】
炭水化物源を本組成物に加えてもよい。
【００３４】
炭水化物源は本組成物のエネルギーの４０〜８０％を作り出すことが好ましい。任意の好適な炭水化物、例えばスクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固形物、マルトデキストリン及びそれらの混合物を用いてもよい。所望により食物繊維を加えてもよい。食物繊維は酵素で消化されずに小腸を通過し、天然の増量剤及び緩下剤として機能する。食物繊維は可溶性でも不溶性でもよく、一般的にはこの２つのタイプのブレンドが好ましい。好適な食物繊維源としては、大豆、エンドウ豆、オート麦、ペクチン、グアーガム、部分加水分解グアーガム、アラビアゴム、フラクトオリゴ糖、酸性オリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、シアリルラクトース及び畜乳由来のオリゴ糖が挙げられる。好ましい繊維ブレンドは、イヌリンと比較的短鎖のフラクトオリゴ糖との混合物である。繊維が存在する場合の繊維含有量は、好ましくは摂取される組成物１リットル当たり２〜４０ｇ、より好ましくは１リットル当たり４〜１０ｇである。
【００３５】
また本組成物は、ＵＳＲＤＡ等、政府機関の勧告に従って、ミネラル並びに微量元素及びビタミン等の微量栄養素を含有していてもよい。例えば本組成物は、日用量当たり所定の範囲の以下の微量栄養素を１種又は複数種含有していてもよい。即ち、３００〜５００ｍｇのカルシウム、５０〜１００ｍｇのマグネシウム、１５０〜２５０ｍｇのリン、５〜２０ｍｇの鉄、１〜７ｍｇの亜鉛、０．１〜０．３ｍｇの銅、５０〜２００μｇのヨウ素、５〜１５μｇのセレン、１０００〜３０００μｇのβカロテン、１０〜８０ｍｇのビタミンＣ、１〜２ｍｇのビタミンＢ１、０．５〜１．５ｍｇのビタミンＢ６、０．５〜２ｍｇのビタミンＢ２、５〜１８ｍｇのナイアシン、０．５〜２．０μｇのビタミンＢ１２、１００〜８００μｇの葉酸、３０〜７０μｇのビオチン、１〜５μｇのビタミンＤ、３〜１０μｇのビタミンＥ。
【００３６】
所望により、１種又は複数種の食品用乳化剤、例えばジアセチル酒石酸エステルモノグリセリド及びジアセチル酒石酸エステルジグリセリド、レシチン並びにモノグリセリド及びジグリセリドを本組成物に組み込んでもよい。同様に、好適な塩及び安定剤を含んでもよい。
【００３７】
本組成物は、例えばミルク又は水で液戻しするための粉末の形態で、経口的又は経腸的に投与可能であることが好ましい。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態によれば、本組成物は、少なくとも１種の他の種類の他の食品用微生物を含む。
【００３９】
「食品用」（“ｆｏｏｄ  ｇｒａｄｅ”）微生物とは、食品に使用しても安全な微生物である。
【００４０】
食品用微生物は、好ましくは食品用細菌又は食品用酵母である。食品用細菌は、乳酸菌、ビフィズス菌、プロピオニバクテリア又はそれらの混合物からなる群より選択することができる。食品用酵母としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ及び／又はサッカロマイセス・ブラウディを用いることができる。
【００４１】
食品用細菌はプロバイオティクス細菌であってもよい。
【００４２】
「プロバイオティクス」とは、宿主の健康又は幸福に有益な効果をもたらす、微生物細胞調製物又は微生物細胞の構成要素を意味する。（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ、Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら“Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９：１０  １０７−１０）。
【００４３】
プロバイオティクス細菌は、乳酸菌、ビフィズス菌、プロピオニバクテリア又はそれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。プロバイオティクス細菌は、確立されたプロバイオティクス特性を有するいずれかの乳酸菌又はビフィズス菌であってもよい。例えばそれらの菌は、ビフィズス菌腸内微生物叢の発達を促進することもできる。
【００４４】
好適なプロバイオティクスは、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、レンサ球菌属及びサッカロマイセス属又はそれらの混合物からなる群より選択することができ、特にビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サリバリウス、エンテロコッカス・フェシウム、サッカロマイセス・ブラウディ及びラクトバチルス・ロイテリ又はそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＮＣＣ５３３；ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＮＣＣ４９０；ＣＮＣＭ  Ｉ−２１７０）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（ＮＣＣ２７０５；ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（２８１８；ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６）、ラクトバチルス・パラカゼイ（ＮＣＣ２４６１；ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６）、ラクトバチルス・ラムノサスＧＧ（ＡＴＣＣ５３１０３）、ラクトバチルス・ラムノサス（ＮＣＣ４００７；ＣＧＭＣＣ１．３７２４）、エンテロコッカス・フェシウムＳＦ６８（ＮＣＩＭＢ１０４１５）、及びそれらの混合物からなる群より選択される。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態において、組成物は少なくとも１種のプレバイオティクスをさらに含有する。「プレバイオティクス」とは、腸内のプロバイオティクス細菌の増殖を促進するための食品物質を意味する。
【００４６】
したがって、プレバイオティクスは腸内の特定の食品用細菌、特にプロバイオティクス細菌の増殖を促進させることができ、それゆえにビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の作用を増進することができる。さらに、いくつかのプレバイオティクスは、例えば消化に対して好ましい影響を及ぼす。
【００４７】
好ましくは、プレバイオティクスはオリゴ糖類からなる群より選択され、場合によりフルクトース、ガラクトース、マンノース、大豆及び／若しくはイヌリン、食物繊維、又はそれらの混合物を含有する。
【００４８】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は、不活化菌種としてだけでなく生きた細菌としても用いることができる。
【００４９】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の少なくとも一部分は、組成物中で生きていることが好ましく、腸内に生きて届くことが好ましい。このようにビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は腸内で生き残ることができ、増殖によってその有効性を増大させることができる。またビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は、共生細菌及び／又は宿主と相互作用することによって有効になることもできる。
【００５０】
例えば特殊な滅菌した食物製品用又は薬剤用には、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は組成物中で生きていないことが好ましい場合もある。ゆえに、本発明の一実施形態において、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の少なくとも一部分は組成物中で生きていない。
【００５１】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９は、いかなる濃度でも有効となろう。
【００５２】
本発明の組成物については、組成物の日用量には１０４〜１０１２ｃｆｕ（コロニー形成単位）のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９が含まれていることが通常好ましい。ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の特に好適な日用量は、１０５〜１０１１ｃｆｕ、より好ましくは１０７〜１０１０ｃｆｕである。
【００５３】
また本発明の組成物は、組成物の乾燥重量１グラム当たり、１０２〜１０１０ｃｆｕ、好ましくは１０３〜１０８コロニー形成単位、より好ましくは１０５〜１０８ｃｆｕのビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を含んでいてもよい。
【００５４】
不活化ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の場合、本発明の組成物は、組成物の乾燥重量１グラム当たり、１０２〜１０１０のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の非複製細胞を含んでいることが通常好ましい。ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９の特に好適な用量は、組成物の乾燥重量１グラム当たり１０３〜１０８の非複製細胞、より好ましくは１０５〜１０８の非複製細胞である。
【００５５】
本発明者らは、本発明の組成物を首尾よく使用することにより、海馬ＢＤＮＦ発現を著しく増加させることができることを見出して特に驚いた。
【００５６】
ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）は、神経細胞及び非神経細胞の増殖、分化、生存及び死に影響を及ぼすポリペプチド成長因子の独特のファミリーに由来する成長因子である。ＢＤＮＦ並びにその他の神経栄養因子、例えば、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）及びＮＴ−４（ニューロトロフィン−４）は、神経系の健康と安寧に必須であり、細胞生存におけるそれらの役割だけでなく、学習、記憶、行動等の高次活動を仲介する。ニューロトロフィンレベルの変化は、アルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病等の神経変性障害、並びにうつ病及び物質乱用を含む精神障害に関与してきた（Ｃｈａｏら、２００６、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．、１１０：１６７−１７３）。
【００５７】
したがって本発明の一実施形態は、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を含む食用組成物、及び／又は海馬ＢＤＮＦ発現を増加させるためのその増殖培地である。
【００５８】
本発明は、海馬ＢＤＮＦ発現を増加させる製剤を調製するための上記の組成物の使用にも関する。
【００５９】
ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９、及び／又は本発明の組成物は、したがって、海馬ＢＤＮＦ発現の減少に関連する障害の治療又は予防のために使用することができる。有効量のビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９を投与すれば、海馬ＢＤＮＦ発現の減少を抑えるのにも役立つ。
【００６０】
したがって本発明の組成物は、不安、及び／又は不安関連障害並びにそれらの症状の治療又は予防のために用いることができる。本発明の組成物は、神経変性疾患の治療又は予防のために用いることもできる。
【００６１】
不安関連障害は、うつ病、アルコール乱用、コカイン乱用、アヘン乱用等の物質乱用、過食症、並びに睡眠障害及び認識機能障害等のストレスの悪影響からなる群より選択することができる。
【００６２】
神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脳炎及び糖尿病からなる群より選択されることが好ましい。
【００６３】
重要なことであるが、本発明の主題は、特に高齢者及び／又は加齢中の脳機能を改善するために用いることもできる。
【００６４】
注目すべきは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９及び／又は本発明の組成物は、海馬ＢＤＮＦ発現の減少に関連した障害の治療又は予防のために必要な薬物の量を減らすために用いることもできる。
【００６５】
本明細書に記載のいずれの特徴も、開示された本発明の範囲を逸脱しない範囲で自由に組み合わせることができることは、当業者には明らかである。特に、本発明の組成物に関して記載されたすべての特徴は本発明の使用に適用可能であり、逆もまた然りである。
【００６６】
本発明のさらなる特徴及び利点は以下の実施例及び図から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】黒箱／明箱試験：明箱内で過ごした合計時間及び再び明箱に入るまでの潜時、並びにネズミ鞭虫（Ｔｍ）に感染したマウスのステップダウン試験の結果を示す図である。Ｔｍ−培地及びＴｍ−Ｂ．ロンガムは、それぞれ新鮮な培地（陰性対照）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＴｍ感染マウスであり、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈ）株で処理したＴｍ群を比較のために示す。
【図２】ネズミ鞭虫（Ｔｍ）に感染したマウスの脳の海馬領域におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。Ｔｍ−Ｂ．ロンガムは、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＴｍ感染マウスであり、Ｌ．ラムノサス株で処理したマウスのＴｍ群を比較のために示す。オートラジオグラフィー及び画像解析により、３５Ｓシグナルの定量化を行った（右上パネル）。
【図３】ネズミ鞭虫（Ｔｍ）に感染したマウスにおける、ミエロペルオキシダーゼ活性測定で測定した大腸炎症（左パネル）及び単核細胞浸潤（右パネル）によって得られた結果を示す図である。Ｔｍ−培地及びＴｍ−Ｂ．ロンガムは、新鮮な培地（陰性対照）及びビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＴｍ感染マウスであり、Ｌ．ラムノサス株で処理したマウスのＴｍ群を比較のために示す。
【図４】黒箱／明箱試験：明箱内で過ごした合計時間及び再び明箱に入るまでの潜時、並びに慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスのステップダウン試験の結果を示す図である。ＤＳＳ−培地及びＤＳＳ−Ｂ．ロンガムは、それぞれ、新鮮な培地（陰性対照）又はビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスである。
【図５】慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスの脳の海馬領域におけるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示す図である。ＤＳＳ−培地及びＤＳＳ−Ｂ．ロンガムは、それぞれ新鮮な培地（陰性対照）又はビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスである。３５Ｓシグナルの定量化は、オートラジオグラフィー及び画像解析により行った（右上パネル）。
【図６】慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスにおける、ミエロペルオキシダーゼ活性測定で測定した大腸炎症（左パネル）及び単核細胞浸潤（右パネル）によって得られた結果を示す図である。ＤＳＳ−培地及びＤＳＳ−Ｂ．ロンガムはそれぞれ、新鮮な培地（陰性対照）又はビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９で処理したＤＳＳ誘発性大腸炎を有するマウスである。
【図７】慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎を有し、さらに新鮮な培地（ＭＲＳ、陰性対照）又は様々なビフィドバクテリウム種で処理したマウスで実施した不安様行動試験（ステップダウン試験）の結果を示す図である。試験をしたＢ．ロンガム株はビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９であり、Ｂ．ラクティス株、Ｂ．アニマルス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｓ）株及びＢ．インファンティス株によって得た結果を比較のために示す。
【図８】マウスの慢性ネズミ鞭虫感染、慢性ＤＳＳ大腸炎、行動試験及びステップダウン試験を示す。
【実施例】
【００６８】
寄生虫ネズミ鞭虫に慢性的に感染したマウスは、２つの行動試験で不安様行動の増加を示した。１）黒箱／明箱試験では、感染動物は明箱内で過ごした時間の減少、及び再び明箱に入るまでの潜時の増加を示し、２）ステップダウン試験では、感染によって台から降りる（ステップダウン）までの潜時が増加した（図１）。行動に与える影響は、Ｂ．ロンガムで処理したマウスのみで観察された、ネズミ鞭虫の介在による海馬のＢＤＮＦレベル低下の正常化と相関関係にあった（図２）。一方で、Ｌ．ラムノサスで処理した上にＢ．ロンガムで処理をすると、ネズミ鞭虫感染によって既に誘発されていたミエロペルオキシダーゼ活性及び単核細胞浸潤が減少するという結果になり（図３）、これによって行動の正常化は細菌の抗炎症作用とは無関係であることが示された。
【００６９】
Ｂ．ロンガムの作用は、慢性ＤＳＳ誘発性大腸炎のマウスモデルにおいて確認された。ネズミ鞭虫感染の影響ほど重要ではないにしても、ＤＳＳは不安を増加させ（図４）、且つ海馬のＢＤＮＦレベルを低下させる傾向があった（図５）。黒箱／明箱試験での、明箱内で過ごした合計時間の増加及び再び明箱に入るまでの時間の減少並びに横断回数（図４）から、またステップダウン試験で観察された、台から降りるまでの潜時の減少（図４）からも明らかなように、ＤＳＳ−マウスをＢ．ロンガムで処理すると不安が減少して対照マウスのレベルよりもさらに下回った。さらに行動試験によると、Ｂ．ロンガムで処理すると海馬のＢＤＮＦレベルが増加して基礎レベルを上回った（図５）。ネズミ鞭虫感染のモデルで観察されたものと同じように、Ｂ．ロンガムによって大腸炎症が減少した（図６）。
【００７０】
変化した行動を正常化させるＢ．ロンガムの能力が他のビフィズス菌にも共通のものかどうかを判定するため、本発明者らは、ＤＳＳ誘発性大腸炎のモデル及びステップダウン試験（図７）を用いて、Ｂ．ロンガムが行動に与える影響を、他の３つのビフィドバクテリウム種−１つはＢ．ラクティス、１つはＢ．アニマリス、及び１つはＢ．インファンティス−と並行して測定した。Ｂ．ロンガムを除き、試験した他のビフィドバクテリウム種はどれも台から降りるまでの潜時をできず、Ｂ．ロンガムのこの独特な性質をビフィドバクテリウム属の他の種にあてはめて推定することは不可能であることを明確に示している。
【００７１】
材料及び方法：
細菌培養条件
プロバイオティクスを嫌気的条件下にてＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）ブロス（０．５％システインを含むビフィズス菌）で増殖させた。３７℃にて２４時間後、６００ｎｍ（１ＯＤ６００＝１０８細菌／ｍＬ）における光学密度を測定することにより細菌数を推定した。４℃にて１５分間５０００×ｇで遠心分離することにより細菌細胞をペレット化し、さらに濃度１０１０／ｍＬで使用済み培地に再懸濁させた。１ｍＬずつに分注したものを、使用するまで凍結保存した。
【００７２】
動物
雄のＢＡＬＢ／ｃマウス又はＡＫＲマウス（Ｈａｒｌａｎ、Ｃａｎａｄａ）は６〜８週齢の購入品であり、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙの特定病原菌がいない通常ユニットに収容した。すべての実験はＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て行った。
【００７３】
設計
慢性ネズミ鞭虫感染（図８、パネルＡ参照）：
雄のＡＫＲマウスに、ネズミ鞭虫（３００卵／マウス）（ｎ＝２６）又はプラセボ（ｎ＝９）を強制摂取させた。次いで感染マウスに３０日目から１０日間、Ｌ．ラムノサス、Ｂ．ロンガム又は新鮮なＭＲＳを毎日強制摂取させた。非感染マウスに、３０日目から４０日目までの毎日、新鮮なＭＲＳを強制摂取させた。プロバイオティクス投与又はプラセボ投与の最後に、マウスを黒箱／白箱試験及び／又はステップダウン試験に供した。その後マウスを犠牲にして組織サンプルを得た。大腸サンプルは、組織学的解析用にホルマリンで固定するか、又はＭＰＯ測定用に急速凍結した。脳を液体窒素で急速凍結し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に保存した。
【００７４】
慢性ＤＳＳ大腸炎（図８、パネルＢ参照）：
雄のＡＫＲマウス（ｎ＝２０）を、３サイクルの３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）で処理した（１サイクルは１週間のＤＳＳとそれに続く１週間の休薬期間からなる）。追加のマウスのグループ（ｎ＝１０）にはプラセボ飲料水しか与えなかった。感染マウスに、ＤＳＳ処理の最後のサイクルの２週間の間毎日、Ｂ．ロンガム又はその他のビフィズス菌を強制摂取させた。対照マウスに２週間ＭＲＳで毎日強制摂取させた。プロバイオティクス投与又はプラセボ投与の最後に、マウスを黒箱／白箱試験及び／又はステップダウン試験に供した。その後マウスを犠牲にして組織サンプルを得た。大腸サンプルは、組織学的解析用にホルマリンで固定するか、又はＭＰＯ測定用に急速凍結した。脳を液体窒素で急速凍結し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション用に保存した。
【００７５】
行動試験
黒箱／明箱（図８、パネルＣ参照）：
マウスの不安行動を、文献に記載されているように黒箱／白箱を使用して個々に評価した。簡単に述べると、開口部（１０×３ｃｍ）によってより小さい黒箱（３０×１５ｃｍ）とつながった照明のついた白箱（３０×３０ｃｍ）の中心に各マウスを置いた。白箱内での各マウスの運動行動をデジタルビデオカメラで１０分間記録し、オフライン解析用にコンピュータに保存した。白箱内で過ごした合計時間、再び白箱に入るまでの潜時（最初に黒箱に入った後に黒箱内で過ごした時間）、及び横断回数（黒箱から白箱に渡った回数）を含むいくつかのパラメータが、盲検観察者によって評価された。
【００７６】
ステップダウン試験（図８、パネルＤ参照）：
不安行動を、文献に記載されているようにステップダウン試験を使用して評価した。簡単に述べると、各マウスを黒い床の中央に位置する高い壇（直径７．５ｃｍ、高さ３ｃｍ）の中心に置いた。台から降りるまでの潜時をストップウォッチで測定した。試験の最大持続時間は５分間であった。
【００７７】
組織検査
大腸サンプルを１０％のホルマリンに固定し、次いでヘマトキシリン−エオシンで染色した。スライドを光学顕微鏡法で観察し、急性及び慢性炎症性浸潤に類別した。
【００７８】
ミエロペルオキシダーゼ活性測定
急性腸炎を評価するために、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性測定を、以前に記載されているように凍結組織で行った。ＭＰＯ活性は組織１ｍｇ当たりの単位で表し、ＭＰＯ１単位は１μｍｏｌの過酸化水素を１分間に室温で水に変換できる酵素の量と定義する。
【００７９】
ＣＮＳでのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
海馬のＢＤＮＦレベルを、以前に記載されているように（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら、１９９０；Ｆｏｓｔｅｒら、２００２）、３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブを用いて凍結脳切片でのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションで評価した。簡単に述べると、脳を除去し、−６０℃の２−メチルブタンに浸漬させて急速に凍結させ、−７０℃で保存した。クリオスタットで切った厚さ１２μｍの冠状の切片を、ゼラチンコーティングしたスライド上に解凍して載せ、乾燥させ、−３５℃で保存した。組織切片を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．１Ｍトリエタノールアミン−ＨＣｌ中０．２５％無水酢酸、ｐＨ８．０、でアセチル化し、脱水し、クロロホルムで脱脂した。α−３５Ｓ−ＵＴＰ（比活性＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用したリボプローブシステム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）、並びにＴ３及びＴ７ポリメラーゼをそれぞれに用いて、アンチセンスＢＤＮＦリボヌクレオチドプローブを線状プラスミドから転写した。放射性標識プローブをハイブリダイゼーション緩衝液（０．６Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１０％硫酸デキストラン、０．０１％剪断サケ精子ＤＮＡ、０．０５％トータル酵母ＲＮＡ、ＸＩ型、０．０１％酵母ｔＲＮＡ、１×デンハルト溶液）中に希釈し、脳切片（約５００，０００ＣＰＭ／切片）に適用した。スライドを加湿チャンバー中にて５５℃で一晩インキュベートした。プローブの非特異的結合を減少させるため、スライドを室温で３０分間２０μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼ溶液中で洗浄し、その後５０℃の２×ＳＳＣ、５５℃及び６０℃の０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ１時間洗浄した。スライドを脱水し、オートラジオグラフィー用に風乾させた。スライド及び１４Ｃプラスチック標準物質（ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｔａｎｄａｒｄ）をＸ線カセットの中に置き、５日間フィルム（バイオマックスＭＲ（ＢｉｏＭａｘ  ＭＲ）；Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に並置し、現像した（コダックメディカルＸ線プロセッサ（Ｋｏｄａｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｘ−Ｒａｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ））。脳切片及び標準物質のオートラジオグラフィーのフィルム画像を、Ｑキャプチャー（ＱＣａｐｔｕｒｅ）ソフトウェア（Ｑアイカム（Ｑｉｃａｍ）；Ｑｕｏｒｕｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｇｕｅｌｐｈ、ＯＮ）を用いた６０ｍｍニコンレンズ付きの固体カメラ、及びイメージ（Ｉｍａｇｅ）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ）を用いたマッキントッシュコンピュータベースの画像解析システムでデジタル化した。モニター上に構造の輪郭を描くことによってフィルムの光透過率を測定した。ＢＤＮＦｍＲＮＡに関しては、標準物質に適用したＲｏｄｂａｒｄ曲線を用いて透過率を放射能レベルに変換した。次に算出したＤＰＭに面積を乗じて積分密度の測定値を出した。図示は、取り込み画像から直接行った。
【００８０】
統計解析
データは適宜、平均値±標準偏差、又は中央値と四分位範囲で示す。データは適宜、二元配置ＡＮＯＶＡ、検定又は対応のないｔ検定のいずれかを用いて解析した。ｐ値が＜０．０５の場合に統計的に有意と見なした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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