(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカゲルの表面にアミノ酸を共有結合させることによって構成されたアミノ酸修飾シリカゲルが主成分として含まれる親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】
前記アミノ酸は、エポキシ基を有するシランカップリング剤を用いて前記シリカゲルの表面に導入された前記エポキシ基と前記アミノ酸を共有結合させることにより、前記シリカゲルの表面に共有結合されている
ことを特徴とする請求項１に記載の親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項３】
前記シランカップリング剤が、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、５，６−エポキシヘキシルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、及び、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランの中から選ばれる一種または二種以上である
ことを特徴とする請求項２に記載の親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項４】
前記アミノ酸が、塩基性アミノ酸である
ことを特徴とする請求項１―３のいずれか一項に記載の親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トリプトファン、及びオルニチンの中から選ばれる一種または二種以上である
ことを特徴とする請求項４に記載の親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項６】
シリカゲルの表面にアミノ酸を共有結合させることによって構成されたアミノ酸修飾シリカゲルが主成分として含まれる親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を固定相とする親水性相互作用クロマトグラフィー法により、親水性化合物を含有する原料から前記親水性化合物を分離する
ことを特徴とする親水性化合物の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤、及び親水性化合物の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィー法は、医薬品、化粧品、及び電子材料など、様々な分野において有用な有機化合物を高純度で得るための精製方法として利用されている。このクロマトグラフィー法としては、順相、逆相、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィーなど多くの方法が開発されている。分離対象とされる有効な有機化合物は脂溶性化合物と水溶性化合物に大別され、脂溶性化合物では、主にシリカゲルを用いた順相クロマトグラフィーが使用される。また、水溶性化合物では、シリカゲルにアルキル基を有する疎水性シランカップリング剤を導入したものを使用した逆相クロマトグラフィーや、イオン交換樹脂などを使用したイオン交換クロマトグラフィーが使用されている。
【０００３】
近年、ペプチド、核酸、プリンなどを基材とした医薬品が多く開発されているが、ペプチド、核酸、プリンのような極度に親水性の高い高極性化合物は従来のクロマトグラフィー法では分離操作が難しいという問題があった。逆相クロマトグラフィーでは、極度に親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合、保持力が低く分離操作が難しいという問題があった。また、非水系溶媒を用いる順相クロマトグラフィーでは、親水性化合物が溶解しにくく、分離操作自体ができないという問題があった。
【０００４】
こうした問題に対し、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）が開発され、親水性の高い高極性化合物を分離することが可能となった。この親水性相互作用クロマトグラフィーは、移動相に、水と有機溶媒を用いる逆相クロマトグラフィー法と同様の条件を用いることができ、高極性化合物を溶解、分析することができる。固定相には、アミノ基、アミド基、ジオール基、双極性イオンのような多様な高極性官能基で修飾されたシリカゲルが対応可能である（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００５】
中でも、分子内にアンモニウムカチオンとスルホン酸アニオンの両方を持つスルフォアルキルベタインを重合修飾した双性イオンタイプのシリカゲルが有効である（例えば、非特許文献文献２〜６参照。）。
【０００６】
また、シリカゲル上にコリンを導入して４級アミンとリン酸のベタイン構造を有する双極イオンタイプもある（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−２５８０１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｅｍｓｔｒｏｍ，Ｐ．；Ｉｒｇｕｍ，Ｋ．  Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．２００６，２９，１７８４−１８２１
【非特許文献２】Ｏｅｒｔｅｌ，Ｒ．；Ｒｅｎｎｅｒ，Ｕ．；Ｋｉｒｃｈ，Ｗ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２００４，３５，６３３−６３８
【非特許文献３】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎ，Ｊ．  ；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｂ．  ；Ｈａｍｍａｒｌｕｎｄ−Ｕｄｅｎａｅｓ，Ｍ．  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２００５，１９，２１１６−２１２２
【非特許文献４】Ｏｅｒｔｅｌ，Ｒ．；Ｎｅｕｍｅｉｓｔｅｒ，Ｖ．；Ｋｉｒｃｈ，Ｗ．  Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ  ２００４，１０５８，１９７−２０１
【非特許文献５】Ｉｄｂｏｒｇ，Ｈ．；Ｚａｍｚｎｉ，Ｌ．；Ｅｄｌｕｎｄ，Ｐ．Ｏ．；Ｓｃｈｕｐｐｅ−Ｋｏｉｓｔｉｎｅｎ，Ｉ．；Ｊａｃｏｂｓｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ２００５，８２８，９−１３
【非特許文献６】Ｈａｇｇｌｕｎｄ，Ｐ．；Ｍａｔｔｈｉｅｓｅｎ，Ｒ．；Ｅｌｏｒｔｚａ，Ｆ．；Ｈｏｊｒｕｐ，Ｐ．；Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｐ．；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｍ．Ｂｕｎｋｅｎｂｏｒｇ，Ｊ．  Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００７，６，３０２１−３０３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、上述したような双性イオンタイプのシリカゲルは、表面修飾の工程が煩雑で非常に高価なものとなるため、特殊な分析用途で使用されるのみに留まっていた。
そのため、医薬品を開発する企業など、極度に親水性の高い高極性化合物を分離対象として扱う技術分野では、従来よりも低コストで良好な分離ができる技術の開発が望まれていた。
【００１０】
このような問題を解決するために、本発明者らは、親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、高極性の親水性化合物の分離を良好に行うことができる材料をさらに鋭意検討して探究した。その結果、特定の官能基で表面を修飾したシリカゲルを充填剤として使用することにより、親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて良好な分離が得られ、さらに、カラムを長期間、安定して使用することができることを見出した。
【００１１】
以下に説明する技術は上記知見に基づいて完成されたものであり、その目的の一つは、親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも良好な分離を実現可能とする親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤、及び親水性化合物の分離方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下に説明する親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤は、シリカゲルの表面にアミノ酸を結合させることによって構成されたアミノ酸修飾シリカゲルが主成分として含まれるものである。
【００１３】
この親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤において、アミノ酸は、エポキシ基を有するシランカップリング剤を用いてシリカゲルの表面に導入されたエポキシ基とアミノ酸を結合させることにより、シリカゲルの表面に結合されていればよい。
【００１４】
また、基材として使用されるシリカゲルは、クロマトグラフィー用に使用される表面積、細孔容積、平均細孔径及び平均粒子径を有するものであればよい。例えば、表面積としては、２０ｍ２／ｇから７００ｍ２／ｇ程度、細孔容積としては０．３ｍＬ／ｇから１．５ｍＬ／ｇ程度、平均細孔径としては３ｎｍから１００ｎｍ程度、平均粒子径としては３μｍ、５μｍ、１０μｍ、３０μｍ、６０μｍ、１００μｍ、５００μｍ程度のものが好適である。
【００１５】
また、上記アミノ酸修飾シリカゲルは、クロマトグラフィーに使用でき、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、フラッシュクロマトグラフィー、中圧液体クロマトグラフィー、オープンカラムクロマトグラフィー、及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）において使用できるが、これらに限定されることはなく、他のクロマトグラフィーにおいても使用できる。
【００１６】
さらに、以下に説明する親水性化合物の分離方法は、シリカゲルの表面にアミノ酸を結合させることによって構成されたアミノ酸修飾シリカゲルが主成分として含まれる親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を固定相とする親水性相互作用クロマトグラフィー法により、親水性化合物を含有する原料から前記親水性化合物を分離することを特徴とする。
【００１７】
このような親水性化合物の分離方法は、上述した親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を用いた方法である。親水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、当該親水性相互作用クロマトグラフィー充填剤を利用した親水性相互作用化合物の分離を行う事例は、過去に報告されたことがない。
【００１８】
上述した親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤を用いて、親水性化合物を分離することにより、親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも良好な分離を実現することができ、その効果は後述する実施例を見れば明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１（ａ）は実験例２．１のクロマトグラム、図１（ｂ）は実験例２．２のクロマトグラム。
【図２】図２（ａ）は実験例３．１のクロマトグラム、図２（ｂ）は実験例３．２のクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（１）親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤の概要
親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤は、まず、シリカゲルの表面にエポキシ基を導入し、下記の化学式（Ｉ）に示すエポキシ基修飾シリカゲルを得て、次いで、前記エポキシ基修飾シリカゲルにアミノ酸を結合させて、下記の化学式（ＩＩ）に示すアミノ酸修飾シリカゲルを得ることにより製造される。
【００２１】
なお、Ｒ１は、エポキシ基を有するシランカップリング剤のエポキシ基以外の原子団である。エポキシ基を有するシランカップリング剤としては、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、５，６−エポキシヘキシルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、及び、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランなどを挙げることができる。これらは単独で一種だけを使用してもよいし、必要があれば二種以上を使用してもよい。また、エポキシ基を有するシランカップリング剤であればよいため、これらに限定されることはない。
【００２２】
Ｒ２は、シリカゲルとエポキシ基を有するシランカップリング剤との反応後、シリカゲルとエポキシ基の間に介在する原子団である。
Ｘは、アミノ酸である。アミノ酸としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及び、バリンなどを挙げることができる。これらは単独で一種だけを使用してもよいし、必要があれば二種以上を使用してもよい。また、アミノ酸は、立体異性体のいずれであってもよく、それら立体異性体の混合物であってもよい。さらに、アミノ酸は、塩基性アミノ酸であってもよい。塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン、リシン、トリプトファン、及びオルニチンなどを挙げることができる。
【００２３】
【化１】
0005914731.tif 000002
【００２４】
【化２】
0005914731.tif 000003
（２）アルギニン修飾シリカゲルの製造例
市販の球状シリカゲル（商品名：ＣＨＲＯＭＡＴＯＲＥＸ、富士シリシア化学株式会社製、グレード：ＳＭＢ  １００−２０／４５）５０ｇを秤取りフラスコに入れた。
【００２５】
ここにトルエン３００ｍＬを加え、スラリーを撹拌しながら３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン１２．４ｇを加え、１１０℃、６時間加熱した。冷却後、スラリーを吸引ろ過し、シリカゲルを有機溶媒で洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥させ、上記の化学式（Ｉ）に示すエポキシ基修飾シリカゲルを５６．１ｇ得た。
【００２６】
５００ｍＬビーカーにＬ−アルギニン１０．４ｇとイオン交換水２００ｍＬを加えて完全に溶解させ、エポキシ基修飾シリカゲルを全量入れた。室温で１時間撹拌した後に、１６時間静置した。再度攪拌しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を適量加えて、ｐＨを４．０に調整した。次にスラリーを吸引ろ過して、固形分をイオン交換水、及び、有機溶媒で洗浄した。固形分を回収し、８０℃で１２時間乾燥させ、下記の化学式（ＩＩＩ）に示すアルギニン修飾シリカゲルを５８．３ｇ得た。
【００２７】
【化３】
0005914731.tif 000004
（２．１）実験例２．１：アルギニン修飾シリカゲルによるカラムの作成と評価（その１）
上記アルギニン修飾シリカゲル試料を４０ｇ採取し、内径２７ｍｍのポリプロピレン製カラムに充填を行った。カラムクロマトグラフィー分析装置に接続し、以下の条件で核酸塩基類の分離を行った。
【００２８】
カラム：アルギニン修飾シリカゲル
カラムサイズ：内径２７ｍｍ×長さ１００ｍｍ
移動相：９０％アセトニトリル／１０％水（容量比）
流速：３０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：トルエン、ウラシル、アデニン、シトシン
その結果、図１（ａ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００２９】
（２．２）実験例２．２：アルギニン修飾シリカゲルによるカラムの作成と評価（その２）
上記アルギニン修飾シリカゲル試料を４０ｇ採取し、内径２７ｍｍのポリプロピレン製カラムに充填を行った。カラムクロマトグラフィー分析装置に接続し、以下の条件でプリン塩基の分離を行った。
【００３０】
カラム：アルギニン修飾シリカゲル
カラムサイズ：内径２７ｍｍ×１００ｍｍ       
移動相：８０％アセトニトリル／２０％水（容量比）
流速：３０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：トルエン、カフェイン、テオフィリン、アデニン、グアニン
その結果として図１（ｂ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００３１】
（３）ヒスチジン修飾シリカゲルの製造例
５００ｍＬビーカーにＬ−ヒスチジン９．３ｇとイオン交換水４００ｍＬを加えて完全に溶解させ、上記（２）の項と同様の手法で作成したエポキシ基修飾シリカゲルを全量入れた。室温で１時間撹拌した後に、１６時間静置した。再度攪拌しながら１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を適量加えて、ｐＨを４．０に調整した。次にスラリーを吸引ろ過して、固形分をイオン交換水、及び、有機溶媒で洗浄した。固形分を回収し、８０℃で１２時間乾燥させ、下記の化学式（ＩＶ）に示すヒスチジン修飾シリカゲルを５４．２ｇ得た。
【００３２】
【化４】
0005914731.tif 000005
（３．１）実験例３．１：ヒスチジン修飾シリカゲルによるカラムの作成と評価（その１）
上記ヒスチジン修飾シリカゲル試料を４０ｇ採取し、内径２７ｍｍのポリプロピレン製カラムに充填を行った。カラムクロマトグラフィー分析装置に接続し、以下の条件で核酸塩基類の分離を行った。
【００３３】
カラム：ヒスチジン修飾シリカゲル
カラムサイズ：内径２７ｍｍ×長さ１００ｍｍ
移動相：９０％アセトニトリル／１０％水（容量比）
流速：３０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：トルエン、ウラシル、アデニン、シトシン
その結果、図２（ａ）のクロマトグラムに示されるように良好な分離が得られた。
【００３４】
（３．２）実験例３．２：ヒスチジン修飾シリカゲルによるカラムの作成と評価（その２）
上記ヒスチジン修飾シリカゲル試料を４０ｇ採取し、内径２７ｍｍのポリプロピレン製カラムに充填を行った。カラムクロマトグラフィー分析装置に接続し、以下の条件でプリン塩基の分離を行った。
【００３５】
カラム：ヒスチジン修飾シリカゲル
カラムサイズ：内径２７ｍｍ×１００ｍｍ
移動相：８０％アセトニトリル／２０％水（容量比）
流速：３０ｍＬ／分
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
試料：トルエン、カフェイン、テオフィリン、アデニン、グアニン
その結果として図２（ｂ）のクロマトグラムに示されるようなカフェインとテオフィリンが重なっている分離が得られた。
【００３６】
（４）変形例等
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記の具体的な一実施形態に限定されず、この他にも種々の形態で実施することができる。
【００３７】
例えば、上記実施例では、シランカップリング剤として、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを使用する例を示したが、シランカップリング剤はこれらに限定されるものではなく、他のシランカップリング剤を使用してもよい。他のシランカップリング剤としては、例えば、５，６−エポキシヘキシルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、及び、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランなどが使用でき、この場合でも、上記実施例同様、良好な分離が得られる。
【００３８】
また、上記実施例では、アミノ酸として、Ｌ−アルギニンを使用する例、Ｌ−ヒスチジンを使用する例を示したが、アミノ酸はこれらに限定されるものではなく、他のアミノ酸を使用してもよい。他のアミノ酸としては、例えば塩基性アミノ酸を使用すると好適である。塩基性アミノ酸の例としては、上述のアルギニン、及びヒスチジンの他、リシン、トリプトファン、及びオルニチンなどを挙げることができる。
【要約】      （修正有）【課題】親水性の高い高極性化合物を分離対象とする場合でも良好な分離を実現可能にし、さらに、シリカゲル表面に修飾した官能基が化学的に安定である親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤、及び親水性化合物の分離方法を提供する。【解決手段】親水性相互作用クロマトグラフィー用充填剤は、シリカゲルの表面にアミノ酸を結合させることによって構成されたアミノ酸修飾シリカゲルが主成分として含まれる。【選択図】なし【図１】
0005914731.tif 000006
【図２】
0005914731.tif 000007