(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする対象における前立腺癌または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を治療するための医薬組成物の製造における２つ又はそれ以上の薬剤の使用であって、
第１の薬剤はＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）発現および／またはＥＮ２活性を阻害するｓｉＲＮＡを含み、該第１の薬剤は配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列又は配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡをコードする発現ベクターを含み、及び、
第２の薬剤がＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する、前記使用。
【請求項２】
前記第１の薬剤が、配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列を含むｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記第１の薬剤が、配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡをコードする発現ベクターを含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記第２の薬剤が、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ、アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＸ２結合阻害剤、βデフェンシン−１（ＤＥＦＢ１）プロモーター内にＰＡＸ２結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、アンギオテンシンＩＩの拮抗剤、アンギオテンシンＩＩ受容体の拮抗剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の拮抗剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）の拮抗剤、細胞外シグナル調節キナーゼ１、２（ＥＲＫ１、２）の拮抗剤、ＡＭＰキナーゼ活性化剤、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の拮抗剤、およびＲＡＳシグナル伝達経路の遮断剤からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記第２の薬剤が、アンチセンスＰＡＸ２ポリヌクレオチドまたはＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記第２の薬剤が、配列番号３〜１５からなる群から選択される配列を含むＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記第２の薬剤が、配列番号３〜１５からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡを含む発現ベクターを含む、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記第２の薬剤が、アンギオテンシンＩＩの拮抗剤、アンギオテンシンＩＩ受容体の拮抗剤、またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の拮抗剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項９】
前記第２の薬剤が、マイトジェン活性化タンパク質／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＭＥＫ）または細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）１および／またはＥＲＫ２の拮抗剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
前記第２の薬剤がＡＭＰキナーゼ活性化剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１１】
前記第２の薬剤がＳＴＡＴ３の拮抗剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１２】
前記第２の薬剤がＰＡＸ２  ＤＮＡ結合の阻害剤を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１３】
前記ＰＡＸ２  ＤＮＡ結合の阻害剤が、ＤＥＦＢ１プロモーター内にＰＡＸ２結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイを含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記デコイが、配列番号１６、１８、および１９からなる群から選択される配列を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、ＤＥＦＢ１遺伝子発現またはＤＥＦＢ１活性を増強する第３の薬剤をさらに含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記第３の薬剤が、ＤＥＦＢ１タンパク質またはＤＥＦＢ１タンパク質を発現する発現ベクターを含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記第１の薬剤および前記第２の薬剤の一方または両方が、前立腺細胞の表面に結合することができる標的化部分を含み、前記標的化部分が、アプタマー、ペプチド、抗体由来エピトープ結合ドメイン、細胞リガンド、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
医薬組成物が前立腺癌を治療するためである、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
（１）Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）発現および／またはＥＮ２活性を阻害する第１の薬剤であって、Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）発現および／またはＥＮ２活性を阻害するｓｉＲＮＡを含み、配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列又は配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列を含む短鎖ヘアピンＲＮＡをコードする発現ベクターを含む、該第１の薬剤；及び
（２）ＰＡＸ２発現および／もしくはＰＡＸ２活性を阻害する第２の薬剤、ならびに／またはＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する薬剤、
を含む、前立腺癌またはＰＩＮを治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は一般に、癌の分野、特に、前立腺病態の処置（治療）のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、種々の形態の悪性細胞成長を表す総称であり、世界におけるヒトの死の主因の１つである。健康な細胞は自らの成長を制御し、健康でなくなれば自らを破壊するが、癌細胞は制御無く分裂および成長し、近傍の身体部分に侵入する。細胞分裂は、本来は厳格に調節される複雑なプロセスである。癌は、細胞内の遺伝子の問題がこれらの制御の働きを妨げる場合に発症する。これらの遺伝子に伴う問題は、遺伝子に対する毒性に由来する場合もあれば、遺伝である場合もある。遺伝子に対する毒性は、細胞の内部または外部の多くの原因から生じ得る。癌細胞の成長を駆動する癌遺伝子と癌の発達を妨げる腫瘍サプレッサー遺伝子の、２つのタイプの遺伝子の誤りが特に重要である。
【０００３】
癌は、特定の徴候および症状の存在、スクリーニング検査、または医療画像法を含む、いくつかの方法で検出することができる。癌の可能性が検出されれば、組織サンプルの顕微鏡検査によって診断される。癌は通常、化学療法、放射線療法および手術により処置される。この疾患からの生存の機会は、癌のタイプおよび場所、ならびに治療開始時の疾患の程度によって大きく左右される。癌の早期検出および治療は生存の機会を大幅に高める。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本出願の１つの態様は、対象において前立腺病態を処置するための方法に関する。該方法は、前記対象にＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）発現および／またはＥＮ２活性を阻害する有効量の第１の薬剤を投与すること；ならびに前記対象にペアードボックスホメオティック遺伝子２(paired box homeotic gene 2)（ＰＡＸ２）発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する有効量の第２の薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、前記対象にβ−デフェンシン−１（ＤＥＦＢ１）遺伝子発現および／またはＤＥＦＢ１活性を増強する有効量の第３の薬剤を投与することをさらに含む。
【０００５】
本出願の別の態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を処置する方法に関する。該方法は、前記対象の前立腺組織にＥＮ２の発現および／または活性を低下させる有効量の第１の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する第２の薬剤を投与することを含む。
【０００６】
本出願の別の態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を処置するための方法に関する。該方法は、（ａ）ＥＮ２、ＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１の発現レベルを決定すること、（ｂ）前記対象由来の罹患前立腺組織においてＰＡＸとＤＥＦＢ１の発現比を決定すること；および（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果に基づき、前記対象に、（１）ＥＮ２発現を阻害する有効量の薬剤と、（２）ＰＡＸ２発現および／もしくはＰＡＸ２活性を阻害する薬剤、ならびに／またはＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する薬剤を投与することを含む。
【０００７】
本出願の別の態様は、前立腺癌またはＰＩＮを処置するための医薬組成物に関する。該医薬組成物は、（１）ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する薬剤と、（２）ＰＡＸ２発現および／もしくはＰＡＸ２活性を阻害する薬剤、ならびに／またはＤＥＦＢ１の発現および／もしくは活性を増強する薬剤とを含む。
添付の図面は、本発明の１以上の実施形態を示し、記載の説明とともに、本発明の原理を説明するためのものである。可能な限り、同じ参照番号はこれらの図面を通じて実施形態の同じまたは類似の要素を表して使用される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｄは、ＤＥＦＢ１発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）分析を示す。
【図１−２】同上。
【図２】図２は、ＤＥＦＢ１により誘導される膜の健全性および細胞形態における変化の顕微鏡分析を示す。膜の波打ちを黒い矢印で示し、アポトーシス体を白い矢印で示す。
【図３】図３は、ＤＥＦＢ１発現を誘導するために１〜３日間ＰｏｎＡで処理し、その後、細胞生存率を決定するためにＭＴＴアッセイを行った、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰにおけるＤＥＦＢ１細胞毒性性の分析を示す。
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞における、ＤＥＦＢ１による細胞死の誘導を示す。
【図４Ｂ】同上。
【図５】図５Ａ〜Ｌは、ＤＥＦＢ１誘導後のパン−カスパーゼ分析を示す。
【図６】図６は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＡＸ２タンパク質発現のサイレンシングを示す。
【図７】図７は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後の前立腺癌細胞増殖の分析を示す。
【図８】図８は、ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の分析を示す。結果を平均±ｓ．ｄ．、ｎ＝９で示す。
【図９】図９は、カスパーゼ活性の分析を示す。
【図１０】図１０Ａ〜Ｃは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子の分析を示す。
【図１１】図１１は、ＤＮＡ認識配列へのＰＡＸ２結合モデルを示す。
【図１２】図１２は、ＤＥＦＢ１リポーター構築物を示す。
【図１３】図１３は、ＰＡＸ２の阻害がＤＥＦＢ１発現をもたらすことを示す。
【図１４】図１４は、ＰＡＸ２の阻害がＤＥＦＢ１プロモーター活性の増強をもたらすことを示す。
【図１５】図１５は、ＤＥＦＢ１発現が膜の健全性の低下をもたらすことを示す。
【図１６】図１６は、ＰＡＸ２阻害が膜の健全性の低下をもたらすことを示す。
【図１７】１７Ａ（上のパネル）および１７Ｂ（下のパネル）は、ＤＥＦＢ１プロモーターへのＰＡＸ２の結合を示すＣｈＩＰ分析を示す。
【図１８】図１８は、化学予防戦略としてのＰＡＸ２の標的化を示す。
【図１９】図１９は、ＤＵ１４５細胞におけるＰＡＸ２発現に対するアンギオテンシンＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）の効果を示す。
【図２０】図２０Ａは、ＤＵ１４５細胞をＡＴ１Ｒ遮断剤ロサルタン（Ｌｏｓ）で処理することによって証明されるように、ＰＡＸ２発現がＲａｓシグナル伝達を介したＡＴ１Ｒ受容体経路により調節されることを示す。図２０Ｂは、ＤＵ４５細胞をＡＴ２Ｒ遮断剤ＰＤ１２３３１９で処理することによって証明されるように、ＰＡＸ２発現がＡＴ１Ｒ受容体経路により調節されることを示す。
【図２１】図２１は、ＬｏｓがＤＵ１４５におけるＰＡＸ２発現に対するアンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）の効果を遮断することを示す。
【図２２】図２２は、ＡｎｇＩＩがＤＵ１４５細胞の増殖を増大させることを示す。
【図２３】図２３Ａは、ロサルタンによるＤＵ１４５細胞の処理がホスホ−ＥＲＫ  １／２およびＰＡＸ２タンパク質レベルを抑制することを示す。図２３Ｂは、ＡＴ１Ｒ遮断剤ロサルタン（Ｌｏｓ）、ＭＥＫキナーゼ拮抗剤ＰＤ９８０５９およびＵ０１２６、ならびにＡＭＰキナーゼ活性化剤、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−４−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）が、非処理対照に比べてＤＵ１４５細胞のＰＡＸ２タンパク質レベルを抑制することを示す。図２３Ｃは、Ｌｏｓ、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、およびＡＩＣＡＲが、非処理対照に比べてＤＵ１４５細胞のホスホ−ＳＴＡＴ３タンパク質レベルを抑制することを示す。
【図２４】図２４Ａは、Ｌｏｓ、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、およびＡＩＣＡＲがホスホ−ＰＡＸ２タンパク質発現レベルを抑制することを示す。図２４Ｂは、ＬｏｓおよびＵ０１２６はホスホ−ＪＮＫタンパク質レベルを低下させることができなかったため、図２４Ａにおけるホスホ−ＰＡＸ２レベルの低下は、ＰＡＸ２のリン酸化の低下ではなく、ＰＡＸ２レベルの低下によるものであったことを示す。
【図２５】図２５は、非処理ｈＰｒＥＣは比較的低いＰＡＸ２発現レベルと高いＤＥＦＢ１発現レベルを示したが、ＰＣ３前立腺癌細胞はこの逆を示すことを示す。ＡｎｇＩＩによるｈＰｒＥＣ細胞の処理は、前立腺癌細胞の場合と同様に、ＰＡＸ２発現レベルを増強し、ＤＥＦＢ１発現レベルを低下させる。
【図２６】図２６は、ＰＡＸ２の発現およびリン酸化に対する、また、前立腺細胞における増殖およびアポトーシスに対する、ＡＴ１Ｒシグナル伝達の模式図を示す。
【図２７】図２７は、前立腺癌に対する療法としてのＰＡＸ２発現の遮断の模式図を示す。
【図２８】図２８は、前立腺組織切片におけるＤＥＦＢ１（ｈＢＤ−１）発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析がグリーソンスコアに相関していることを示し、ここで、相対的ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５より高い患者番号１２５５、１３４３、１４７７、および１５１６はグリーソンスコアが６であり、ＤＥＦＢ１発現レベルが０．００５より低い患者番号１１８８および１２１５はグリーソンスコアが７であった。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、別の患者群からの正常組織、ＰＩＮ組織、および癌組織におけるＤＥＦＢ１発現（図２９Ａ）およびＰＡＸ２発現（図２９Ｂ）のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示し、図２９ＡではＤＥＦＢ発現とグリーソンスコアの間の負の相関を示し、図２９ＢではＰＡＸ２発現とグリーソンスコアの間の正の相関を示す。
【図３０】図３０は、相対的ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比に基づくドナルド予測因子(Donald Predictive Factor）（ＤＰＦ）を示す。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂは、ヒト前立腺組織におけるＤＥＦＢ１（ｈＢＤ−１）発現の分析を示す。
【図３２】図３２Ａは、ポナステロンＡ（Ｐｏｎ  Ａ）で誘導可能なＤＥＦＢ１（ｈＢＤ−１）発現系でトランスフェクトされた前立腺癌細胞株におけるＤＥＦＢ１発現の誘導前後の発現を含む、前立腺細胞におけるＤＥＦＢ１（ｈＢＤ−１）発現の分析を示す。図３２Ｂは、陽性対照ｈＰｒＥＣ細胞（パネル  Ａ：ＤＩＣおよびパネルＢ：蛍光）における、また、ｈＢＤ−１でトランスフェクトし、Ｐｏｎ  Ａで誘導した後のＤＵ１４５前立腺癌細胞（パネルＣ：ＤＩＣおよびパネルＤ：蛍光）におけるＤＥＦＢ１（ｈＢＤ−１）発現レベルを示す。
【図３３】図３３は、前立腺癌細胞におけるｈＢＤ−１細胞傷害性の分析を示す。各バーは、３反復で行った３回の独立する実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図３４】図３４Ａは、正常組織、ＰＩＮ組織および腫瘍組織のＬＣＭヒト前立腺組織切片におけるｈＢＤ−１発現レベルのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。図３４Ｂは、正常組織、ＰＩＮ組織および腫瘍組織のＬＣＭヒト前立腺組織切片におけるｃＭＹＣ発現レベルのＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図３５】図３５は、ｓｉＲＮＡによるＰＡＸ２ノックダウン後のｈＢＤ１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図３６】図３６Ａは、ＨＰｒＥＣ前立腺初代細胞、ならびにＤＵ１４５、ＰＣ３、およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理前のＰＡＸ２の発現を示すウエスタンブロット解析である。図３６Ｂは、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞のＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＡＸ２タンパク質発現のサイレンシングを示すウエスタンブロット解析。
【図３７】図３７は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる処理後の前立腺癌細胞増殖の分析を示す。バー＝２０μｍ。
【図３８】図３８は、ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング後の細胞死の分析を示す。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝９を表す。
【図３９】図３９は、カスパーゼ活性の分析を示す。バー＝２０μｍ。
【図４０−１】図４０Ａ〜４０Ｃは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のアポトーシス因子発現パターンを示す。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝９を表す。アスタリスクは統計的有意差を表す（ｐ＜０．０５）。
【図４０−２】同上。
【図４１】図４１Ａは、ｈＰｒＥＣ前立腺初代上皮細胞、ＤＵ１４５、ＰＣ３、およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＱＲＴ−ＰＣＲによるＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）ｍＲＮＡレベルの分析を示す。図４１Ｂは、ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ｈＰｒＥＣ、およびＤＵ１４５細胞におけるＥＮ２発現のウエスタンブロット解析を示す。
【図４２】４２Ａは、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＥＮ２発現のサイレンシングのＱＲＴ分析を示す。図４２Ｂは、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＣ３におけるＥＮ２発現のサイレンシングのウエスタンブロット解析を示す。図４２Ｃは、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＬＮＣａＰ細胞におけるＥＮ２発現のサイレンシングのウエスタンブロット解析である。
【図４３】図４３は、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞における細胞増殖のチミジン組み込み分析である。
【図４４】図４４Ａは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＥＮ２  ｍＲＮＡ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析である。図４４Ｂは、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＥＮ２タンパク質発現のウエスタンブロット解析である。
【図４５】図４５Ａは、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２  ｍＲＮＡ発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析である。図４５Ｂは、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２タンパク質発現のウエスタンブロット解析である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、開示されている方法および組成物が属する技術分野の熟練者に共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形である「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示語を含むことを注記しておかなければならない。従って、例えば、「ペプチド」という場合には、複数のそのようなペプチドを含み、「そのペプチド」という場合には、１以上のペプチドおよび当業者に知られているその等価物を表すなどである。
【００１０】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」とは、骨格構造によって連結された少なくとも２つ、好ましくは１０以上の塩基から構成されるポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡもしくはその類似体）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡまたはその類似体）を意味する。ＤＮＡでは、共通塩基はアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびシトシン（Ｃ）であり、ＲＮＡでは、共通塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（Ｔの代わりにＵ）であるが、核酸は塩基類似体（例えば、イノシン）および塩基脱落位置（すなわち、１以上の位置にヌクレオチドを欠くホスホジエステル骨格、米国特許第５，５８５，４８１号）を含み得る。例示的核酸としては、一本鎖（ｓｓ）、二本鎖（ｄｓ）、もしくは三本鎖ポリヌクレオチド、またはＤＮＡおよびＲＮＡのオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１１】
用語「ポリヌクレオチド」とは、１０を超えるヌクレオチドを含有する核酸を意味する。
【００１２】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、約１５〜約１００の間のヌクレオチドを含有する一本鎖核酸を意味する。
【００１３】
用語「プロモーター」とは、その最も広い文脈で捉えるべきであり、正確な転写開始のためのＴＡＴＡボックスまたはイニシエーターエレメントをはじめとする、ゲノム遺伝子由来の転写調節エレメント（ＴＲＥ）またはそのキメラＴＲＥを含み、発生刺激および／または外部刺激、およびトランス活性化調節タンパク質または核酸に応答して、それと機能的に連結された遺伝子の活性化または抑制を調節する付加的ＴＲＥ（すなわち、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、およびサイレンサー）を伴うまたは伴わない場合がある。プロモーターは、構成的に活性である場合、または発生段階により調節される様式で１以上の組織または細胞種で活性である場合がある。プロモーターは、ゲノム断片を含んでもよく、または組み合わされた１以上のＴＲＥのキメラを含んでもよい。
【００１４】
用語「ＥＮ２発現」、「ＰＡＸ２発現」または「ＤＥＦＢ１発現」とは、ＥＮ２遺伝子、ＰＡＸ２遺伝子またはＤＥＦＢ１遺伝子の発現レベルを意味する。この発現には、転写レベル（例えば、ｍＲＮＡ）、翻訳レベル（例えば、タンパク質）および翻訳後レベル（例えば、グリコシル化）における発現が含まれる。
【００１５】
用語「ＥＮ２活性」、「ＰＡＸ２活性」または「ＤＥＦＢ１活性」とは、ＥＮ２タンパク質、ＰＡＸ２タンパク質またはＤＥＦＢ１タンパク質の生理活性を意味する。タンパク質の「活性」には、例えば、転写、翻訳、細胞内移動、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、同種親和性結合および他のタンパク質との異種親和性結合、ユビキチン化が含まれる。
【００１６】
処置方法
本出願の１つの態様は、対象において前立腺癌または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）などの前立腺病態を処置するための方法に関する。特定の実施形態では、該方法は、前記対象にＥｎｇｒａｉｌｅｄ−２（ＥＮ２）発現および／またはＥＮ２活性を阻害する有効量の第１の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する有効量の第２の薬剤を投与することを含む。
【００１７】
本出願は、ＰＡＸ／ＥＮ２発現および／または活性の様々な阻害剤を提供する。例示的阻害剤としては、ｓｉＲＮＡ、アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラ、ＰＡＸ２またはＥＮ２結合阻害剤、ＰＡＸ２またはＥＮ２結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、およびそれらの組合せが含まれる。
【００１８】
ｓｉＲＮＡは、ＥＮ２またはＰＡＸ２タンパク質産物の発現を低下または排除することができる、ＥＮ２およびＰＡＸ２の配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導するように操作可能な二本鎖ＲＮＡである。一実施形態では、第１の生理活性成分は、合成ＥＮ２指向性単鎖干渉ＲＮＡ(synthetic EN2-directed short interfering RNA)（ｓｉＲＮＡ）を含む。合成により作製されたｓｉＲＮＡは、酵素ダイサー(Dicer)によって細胞内で通常通り処理されるｓｉＲＮＡ種を構造的に模倣する。
【００１９】
合成により作製されたｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの安定性および機能性を高めることが知られている化学修飾をＲＮＡ構造に組み込むことができる。例えば、場合によっては、ｓｉＲＮＡはロックド核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）修飾ｓｉＲＮＡとして合成され得る。ＬＮＡは、リボースの２’酸素と４’炭素を接続するメチレン架橋を含むヌクレオチド類似体である。この二環式構造は、ＬＮＡ分子のフラノース環を３’−ｅｎｄｏ型コンフォメーションにロックし、それにより、標準的なＲＮＡモノマーを構造的に模倣する。ＬＮＡ修飾ｓｉＲＮＡの治療上の開発はすでに記載されている(Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｉｒ．， １８:３２６−３３３，２０１１；Ｖｅｅｄｕｅｔ ａｌ．， ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．， ６（３)：３２１−３２３，２００９)。
【００２０】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡおよび対応するＥＮ２  ｃＤＮＡ配列は次の通りである。
EN2 cDNA:              5’ TCAACGAGTCACAGATCAA 3’(配列番号106)
センスsiRNA:           5’ UCAACGAGUCACAGAUCAA 3’(配列番号107)
アンチセンス siRNA:    3’ AGUUGCUCAGUGUCUAGUU 5’(配列番号108)
EN2 cDNA:              5’ CCAACTTCTTCATCGACAA 3’(配列番号109)
センスsiRNA:           5’ CCAACUUCUUCAUCGACAA 3’(配列番号110)
アンチセンス siRNA:    3’ GGUUGAAGAAGUAGCUGUU 5’(配列番号111)
EN2 cDNA:              5’ CTCGAAAACCAAAGAAGAA 3’(配列番号112)
センスsiRNA:           5’ CUCGAAAACCAAAGAAGAA 3’(配列番号113)
アンチセンス siRNA:    3’ GAGCUUUUGGUUUCUUCUU 5’(配列番号114)
【００２１】
あるいは、または加えて、合成ＰＡＸ２指向性ｓｉＲＮＡを含むＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡは、前立腺細胞においてＰＡＸ２発現をサイレンシングするまたは低下させるために使用することができる。特定の実施形態では、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡは、配列番号１５および７３〜７８：
GGAUGCAGAUAGACUCGACUU(配列番号15)、
AUAGACUCGACUUGACUUC(配列番号73)、
CUUCAUCACGUUUCCUC(配列番号74)、
GUAUUCAGCAAUCUUGUCC(配列番号75)、
GAUUUGAUGUGCUCUGAUG(配列番号76)、
GUCGAGUCUAUCUGCAUCC(配列番号77)、
AUGUGUCAGGCACACAGACG(配列番号78)、および
その少なくとも１０、１５または２０の核酸の断片および保存的変異体、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の生理活性成分の一方または両方は、細胞内でＥＮ２標的ｓｉＲＮＡへとプロセシングされる短鎖二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を転写するように操作された発現ベクターを含み得る。これらのｓｈＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ社のサイレンサー(登録商標）ｓｉＲＮＡ  Ｃｏｎｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｉｍｇｅｎｅｘ社のＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ(商標）  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）誘導可能ＲＮＡｉプラスミドとレンチウイルスベクターなどのキットを用いて、好適な発現ベクターでクローニングすることができる。ｓｉＲＮＡにより標的化されている他のＰＡＸ２配列としては、＃１  ACCCGACTATGTTCGCCTGG（配列番号１１）、＃２  AAGCTCTGGATCGAGTCTTTG（配列番号１２）、および＃４  ATGTGTCAGGCACACAGACG（配列番号１３）が含まれる。＃４はＰＡＸ２を阻害することが示されている(Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２００４，１３：２３５)。
【００２２】
従って、特定の実施形態では、前記第１の生理活性成分は、配列番号１０７、１０８、１１０、１１１、１１３および１１４からなる群から選択される配列を含むＥＮ２  ｓｉＲＮＡを発現することができる発現ベクターを含む。
【００２３】
あるいは、または加えて、前記第２の生理活性成分は、配列番号３〜６および１１〜１５からなる群から選択されるＥＮ２配列を含むＥＮ２  ｓｉＲＮＡを発現することができる発現ベクターを含み得る。
【００２４】
合成ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、周知のアルゴリズムを用いて設計し、従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて合成することができる。ＰＡＸ２およびＥＮ２  ｓｉＲＮＡ、ならびにＰＡＸ２およびＥＮ２  ｓｈＲＮＡ発現構築物はＯｒｉｇｅｎ社（ロックヴィル、メリーランド州）から商業的に入手可能である。
【００２５】
このｓｉＲＮＡの使用では、ＥＮ２および／またはＰＡＸ２の遺伝子発現をサイレンシグするためにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の機構を利用する。この「サイレンシング」は、もともと、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を細胞にトランスフェクトする場合に見られていたものである。細胞内に入ると、ｄｓＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーによって切断されて、それらの３’末端にヌクレオチド２個のオーバーハングを含む２１〜２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となることが分かっている。ＡＴＰに依存する段階では、これらのｓｉＲＮＡは、相補的ｍＲＮＡ配列のＡＧＯ２媒介切断のためのシグナルを提供する多重サブユニットＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体(RNAi induced silencing complex)（ＲＩＳＣ）に組み込まれるようになり、これは次に、細胞エキソヌクレアーゼによるその次の分解をもたらす。
【００２６】
アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラは、細胞内移行性アプタマーに化学的に連結されたｓｉＲＮＡを含む標的化ｓｉＲＮＡである。アプタマーは、多様な細胞表面分子、タンパク質、および／または高分子構造に高親和性結合を示す特定の三次元構造を形成することができるオリゴヌクレオチド種を含む、核酸型の抗体である。一般に、アプタマーは、ステム−ループまたはＧ−カルテットなどの定義された二次元および三次元構造に折りたたまれる１５〜５０塩基長の範囲の低分子核酸である。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの低分子、ならびに逆転写酵素、トロンビン、および多様な細胞表面受容体などの高分子と結合することができる。
【００２７】
アプタマーは上記の核酸阻害剤と化学的に連結またはコンジュゲートして、標的化核酸阻害剤を形成することができる(Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，３：１７６１−１７７８，２０１０)。アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラは、標的化部分を、ｓｉＲＮＡに連結されたアプタマーの形態で含有する(Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４（１０）：ｅ７３，２００６；Ｚｈｏｕｅｔ ａｌ．，Ｓｉｌｅｎｃｅ，１：４−１０，２０１０)。一実施形態では、阻害剤は、従前に記載されているように前立腺組織を標的とすることができるキメラアプタマー−ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む(Ｄａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７（９）：８３９−８４９，２００９; ＭｃＮａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２４（８）：１００５−１０１５)。好ましくは、アプタマーは、細胞内移行性アプタマーである。特定の細胞表面分子に結合すると、アプタマーは細胞内移行を促進することができ、そこで核酸阻害剤が働く。一実施形態では、アプタマーおよびｓｉＲＮＡは両方ともＲＮＡを含む。アプタマーおよびｓｉＲＮＡは、さらに本明細書に記載されるように、いずれのヌクレオチド修飾を含んでもよい。特定の実施形態では、アプタマーは、前立腺特異的膜抗原(prostate-specific membrane antigen)（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する標的化部分を含む。
【００２８】
アプタマーは、１０−１２Ｍ未満のＫｄで標的分子と極めて強固に結合することができる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、極めて高い特異性で標的分子と結合することができる。例えば、標的分子とその分子上のただ１か所だけが異なる別の分子との間の結合親和性の違いが１０，０００倍より大きいアプタマーが単離されている。
【００２９】
別の実施形態では、第１および第２の生理活性成分の一方または両方が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含み得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＤＮＡ骨格、ＲＮＡ骨格、またはその化学誘導体を含み得る。一実施形態では、第１および第２の生理活性成分の一方または両方が、分解のためにＥＮ２および／またはＰＡＸ２を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、生理活性成分は、ＥＮ２および／またはＰＡＸ２  ｍＲＮＡ配列と相補的な一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、合成により作製されてもよいし、または好適な発現ベクターから発現されてもよい。アンチセンス核酸は、ＲＮアーゼ  Ｈ活性を促進するように、相補的結合を介してｍＲＮＡセンス鎖に結合するように設計され、これにより、そのｍＲＮＡの分解がもたらされる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ安定性および／または結合の増強を促すように化学的または構造的に修飾される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ骨格を有する核酸、メチルホスホネート、二重らせん安定化スチルベンまたはピレニルキャップ、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、およびホスホトリエステルなどを含む、非従来型の化学的または骨格付加または置換を有するオリゴヌクレオチドを作出するように修飾される。例として、修飾オリゴヌクレオチドは類似体を組み込んでもよく、または１以上の天然ヌクレオチドを類似体で置換してもよく；例えば、非電荷結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバメートなど）または電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を組み込むヌクレオチド間修飾；インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター（例えば，金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、もしくはアルキル化剤を組み込む修飾、および／または修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドは、その骨格内に少なくとも１個の中性電荷を含むように内部修飾される。例えば、前記オリゴヌクレオチドは、メチルホスホネート骨格または標的特異的配列に相補的なペプチド核酸（ＰＮＡ）を含み得る。これらの修飾は、ヘリカーゼにより媒介される巻き戻しを阻止または低減することが分かっている。非電荷プローブの使用は、古典的ハイブリダイゼーションにおける負電荷核酸鎖の反発を軽減することによって、サンプル中のポリヌクレオチド標的に対するハイブリダイゼーション率をさらに高めることができる(Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１：８９−１０４)。
【００３２】
ＰＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格がポリアミドに置換されている非電荷核酸類似体であり、これにより、ＰＮＡは、アミド結合によって互いに連結された２−アミノエチル−グリシン単位のポリマーとなる。ＰＮＡは、標準的なペプチド合成で使用されるものと同じＢｏｃまたはＦｍｏｃ化学を用いて合成される。塩基（アデニン、グアニン、シトシンおよびチミン）は、メチレンカルボキシル結合によってその骨格に連結される。よって、ＰＮＡは、非環式であり、アキラルであり、かつ、中性である。ＰＮＡの他の特性は、核酸に比べて高い特異性および融点、三重らせん形成能、酸性ｐＨでの安定性、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼのような細胞酵素により認識されないことなどである(Ｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，２０００，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１４：１０４１−１０６０； Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１：８９−１０４)。
【００３３】
メチルホスホネート含有オリゴヌクレオチドは、非結合ホスホリル酸素の１つの代わりにメチル基を含有する中性ＤＮＡ類似体である。メチルホスホネート結合を有するオリゴヌクレオチドは、中でも第一に、翻訳のアンチセンス遮断を介してタンパク質合性を阻害することが報告されている。しかしながら、この合成プロセスはキラル分子を生じ、オリゴヌクレオチドのカスタム生産のためのキラル的に純粋なモノマーを得るためには、これらを分割しなければならない(Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ1．，１９９６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２４：４５８４−４５９１)。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドのリン酸骨格は、ホスホロチオエート結合またはホスホロアミダートを含み得る(Ｃｈｅｎｅｔ ａｌ1．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２３：２６６２−２６６８ (１９９５))。このようなオリゴヌクレオチド結合の組合せもまた、本発明の範囲内にある。
【００３５】
他の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルヌクレオチド間結合によって連結された修飾糖の骨格を含み得る。これらの修飾糖としては、限定されるものではないが、２−デオキシリボフラノシド、α−Ｄ−アラビノフラノシド、α−２’−デオキシリボフラノシド、および２’、３’−ジデオキシ−３’−アミノリボフラノシドを含むフラノース類似体を含み得る。別の実施形態では、２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノース基は、例えば、β−Ｄ−リボｒｉｂｏフラノースなどの他の糖類で置換されていてもよい。さらに、β−Ｄ−リボフラノースは、そのリボース部分の２−ＯＨがＣ１−６アルキル基でアルキル化されているもの（２−（Ｏ−−Ｃ１−６アルキル）リボース）、もしくはＣ２−６アルケニル基でアルキル化されているもの（２−（Ｏ−−Ｃ２−６アルケニル）リボース）、またはフルオロ基で置換されているもの（２−フルオロリボース）が存在し得る。
【００３６】
関連のオリゴマー形成糖としては、上記のようなロックド核酸（ＬＮＡ）で使用されるものが含まれる。例示的ＬＮＡオリゴヌクレオチドとしては、米国特許第６，２６８，４９０号（その開示は本明細書の一部として援用する）に記載されているものなどの、２’−Ｏ−４’−Ｃメチレン架橋を有する修飾二環式モノマー単位が含まれる。
【００３７】
化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドにはまた、２’位の糖修飾、５位のピリミジン修飾（例えば、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−または５−ヨード−ウラシルの置換、メチル化、イソ塩基であるイソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常塩基対の組合せなどの単独または任意の組合せを含み得る。
【００３８】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。従って、リボザイムは触媒的核酸である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、およびテトラヒメナリボザイムなどの天然系に見られるリボザイムに基づく、ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するいくつかの異なるタイプのリボザイムが存在する。また、天然系には見られないが、ｄｅ  ｎｏｖｏで特定の反応を触媒するように操作されたリボザイムがいくつか存在する。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは一般に、標的基質の認識および結合とそれに続く切断によって核酸基質を切断する。この認識は多くの場合、ほとんどはカノニカルな、または非カノニカルな塩基対相互作用に基づくものである。標的基質の認識は標的基質の配列に基づくものであることから、この特性は、リボザイムを、核酸の特異的切断を標的化するための特に良い候補とする。
【００３９】
三重らせん形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）は、二本鎖および／または一本鎖いずれかの核酸と相互作用することができる分子である。ＴＦＯが標的領域と相互作用すると、三重らせんと呼ばれる構造が形成され、この場合、ワトソン−クリックおよびフーグスティーンの両方の塩基対合に依存して複合体を形成するＤＮＡが３鎖存在する。ＴＦＯは、標的領域と高い親和性および特異性で結合することができる。好ましい実施形態では、三重らせん形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のＫｄで標的分子と結合する。本発明で使用するための例示的ＴＦＯとしては、ＰＮＡ、ＬＮＡ、およびＬＮＡ修飾ＰＮＡ、例えば、Ｚｏｒｒｏ−ＬＮＡ(Ｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１：１９０２−１９１４，２００７； Ｚａｇｈ；ｏｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３９（３）：１１４２−１１５４，２０１１)が含まれる。好ましい実施形態では、三重らせん形成オリゴヌクレオチドは、本明細書で詳しく記載されるＤＥＦＢ１プロモーター内のＰＡＸ２結合部位を標的とする。
【００４０】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、ある複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、この複合体はＲＮアーゼＰにより認識され、ＲＮアーゼＰがこの標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択されたＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを補助する。細菌のＲＮアーゼＰは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、事実上いずれのＲＮＡ配列の切断に対しても動員が可能である。同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮアーゼＰ指向性ＲＮＡ切断も、真核細胞内の目的の標的を切断するために使用可能である。
【００４１】
一実施形態では、ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する薬剤は、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡ、アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、ＥＮ２  ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される１以上のメンバーを含む。
【００４２】
別の実施形態では、ＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する薬剤は、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ、アプタマー−ｓｉＲＮＡキメラ、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、ＰＡＸ２結合阻害剤、βデフェンシン−１（ＤＥＦＢ１）プロモーター内にＰＡＸ２結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイ、アンギオテンシンＩＩの拮抗剤、アンギオテンシンＩＩ受容体の拮抗剤、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の拮抗剤、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＥＫ）の拮抗剤、細胞外シグナル調節キナーゼ１、２（ＥＲＫ１、２）の拮抗剤、ＡＭＰキナーゼ活性化剤、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の拮抗剤、およびＲＡＳシグナル伝達経路の遮断剤、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１以上のメンバーを含む。
【００４３】
一実施形態では、ＰＡＸ２発現または活性の阻害剤（すなわち、第２の生理活性成分）は、ＤＥＦＢ１プロモーターなどのＰＡＸ２標的部位へのＰＡＸ２の結合を遮断する。一実施形態では、第２の生理活性成分は、ＤＥＦＢ１プロモーター内にＰＡＸ２結合部位を含む二本鎖オリゴヌクレオチド結合デコイを含む。このデコイは、ＤＥＦＢ１などの天然ＰＡＸ２標的遺伝子へのその結合を阻止または低減することを目的に、ＰＡＸ２と結合してそれを中和するために過剰量で投与される。好ましい実施形態では、このデコイは、高親和性でＰＡＸ２と結合することが知られている配列を含む。例示的デコイ配列としては、配列番号１６、１８、および１９で例示されるような、ＤＥＦＢ１プロモーター内のＰＡＸ２結合配列が含まれる。
【００４４】
別の実施形態では、ＰＡＸ２発現または活性の阻害剤は、アンギオテンシンＩＩの拮抗剤、アンギオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）の拮抗剤、またはアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の拮抗剤を含む。一実施形態では、この阻害剤は、アンギオテンシンＩＩタイプ１受容体（ＡＴ１Ｒ）の拮抗剤である。例示的ＡＴ１Ｒ拮抗剤としては、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、およびテルミサルタンが含まれる。別の実施形態では、この阻害剤は、エナラプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の拮抗剤である。
【００４５】
他の実施形態では、ＰＡＸ２発現または活性の阻害剤は、ＭＥＫ、ＥＲＫ１、またはＥＲＫ２の拮抗剤、例えば、Ｕ０１２６またはＰＤ９８０５９を含む。Ｕ０１２６は、化学的に合成された有機化合物であり、細胞ＡＰ−１拮抗剤と最初に認識されたものであり、そのすぐ上流にある活性化因子であるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１および２（ＭＥＫ１およびＭＥＫ２としても知られる、ＩＣ５０：それぞれ７０および６０ｎＭ）を阻害することによる、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの選択性の高い強力な阻害剤であることが分かっている。Ｕ０１２６は、不活性型ＭＥＫの活性化だけを阻害するＰＤ９８０５９とは異なり、活性型および不活性の両方のＭＥＫ１、２を阻害する。ＭＥＫ活性化の遮断は、ＡＰ−１複合体の成分であるｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎの上流誘導因子であるｐ６２ＴＣＦ（Ｅｌｋ−１）を含むいくつかの因子の下流リン酸化を妨げると考えられる。Ｕ０１２６によるＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害はまた、Ｈ−ＲａｓおよびＫ−Ｒａｓの発癌作用を妨げ、上流増殖因子の作用を阻害し、炎症性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼの産生を遮断することもできる。
【００４６】
ＰＤ９８０５９は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＭＥＫ１活性化およびＭＡＰキナーゼカスケードの選択性の高い阻害剤として働くことが示されている。ＰＤ９８０５９は、不活性型のＭＥＫ１と結合し、ｃ−Ｒａｆなどの上流活性化因子による活性化を妨げる。ＰＤ９８０５９はＭＥＫ１およびＭＥＫ２の活性化を、それぞれＩＣ５０値４μＭおよび５０μＭで阻害する。
【００４７】
他の実施形態では、ＰＡＸ２発現または活性の阻害剤は、ＡＭＰキナーゼ活性化剤である。好ましい実施形態では、ＡＭＰキナーゼ阻害剤は、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−４−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）を含む。
【００４８】
ＰＡＸ２発現は、ＡＴ１Ｒ、ＭＥＫ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、およびＡＭＰＫの下流標的であるシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ−３）によって調節されることが知られている（例えば、図２７参照）。よって、別の実施形態では、ＰＡＸ２発現または活性の阻害剤は、ロサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、テルミサルタン、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＡＩＣＡＲ、およびそれらの組合せなどのＳＴＡＴ−３拮抗剤を含み得る。
【００４９】
別の実施形態では、１種類以上の生理活性成分としては、前立腺組織への生理活性成分の送達を標的化するための標的化ドメインが含まれる。前記標的化部分は、前立腺細胞の表面に結合することができるアプタマー、ペプチド、抗体由来エピトープ結合ドメイン、ウイルス、または細胞リガンドを含み得る。前記標的化部分は一般に、ウイルスベクターもしくはリポソームなどの送達ビヒクル中に遺伝子操作により組み込んでもよいし、またはＭｅａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．，６０（４−５）：５３０−５３６，２００８に記載されているように、ｓｉＲＮＡなどの生理活性成分に化学的にコンジュゲートしてもよい。好ましい実施形態では、前記標的化部分は、癌性または前癌前立腺組織においてその発現がアップレギュレートされている細胞表面エピトープに結合する。
【００５０】
一実施形態では、前記標的化部分は、上記のようなアプタマーを含む。
【００５１】
別の実施形態では、前記標的化部分は、前立腺細胞に結合することが知られているペプチドを含む。例示的前立腺標的化ペプチドが記載される。一実施形態では、前記細胞結合ペプチドは、例えば、ファージディスプレーライブラリーから単離される。結合細胞表面分子または受容体向けに操作されたファージディスプレーライブラリーは当業者に周知である。
【００５２】
一実施形態では、前記ペプチドは、例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，６（３）：１８９−１９６，２００４およびＨｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５７：１９５−２０６，２００９に記載されているように、真核細胞膜を経た生理活性成分の侵入を促進するために、細胞内移行性ペプチド（細胞透過性ペプチド(cell penetrating peptide)（ＣＰＰ）またはタンパク質形質導入ドメイン(protein transduction domain)（ＰＴＤ）とも呼ばれる）を含む。本発明において使用するための例示的細胞内移行性ペプチドとしては、限定されるものではないが、ＨＩＶ  ＴＡＴ４９−５７ペプチド（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号７９）、ＨＩＶ  ＴＡＴ４８−６０ペプチド（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号８０）、低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）ペプチド（例えば、ＴＤＳＰ５、ＶＳＲＲＲＲＲＲＧＧＲＲＲＲ、配列番号８１、米国特許公開第２００７／００７１６７７号に記載）；ＰＥＰ−１(Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：１１７３−１１７６，２００１)としても知られるＣｈａｒｉｏｔＴＭ（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号８２）；Ａｎｔｐ４３−５８（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号８３）ペプチド、ＭＰＧ（ＨＩＶ  Ｇｐ４１−ＳＶ４０  ＮＬＳ、ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号８４）、ＳＡＰ（ＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰＶＲＬＰＰＰ、配列番号８５）、ＭＰＧ  Ｒ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ、配列番号８６）、ＭＡＰ（ＫＬＡＬＫＬＡＬＫＡＬＫＡＡＬＫＬＡ、配列番号８７；およびＫＡＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡ、配列番号８８）、Ｋ−ＦＧＦ（ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ、配列番号８９）、ペネトラチン(Penetratin)（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号９０）、ブフォリン(Buforin)ＩＩ（ＴＲＳＳＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＶＨＲＬＬＲＫ、配列番号９１）、トランスポータン(Transportan)（ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、配列番号９２）、Ｋｕ７０（ＶＰＭＬＫ、配列番号９３）、プリオン(Prion)（ＭＡＮＬＧＹＷＬＬＡＬＦＶＴＭＷＴＤＶＧＬＣＫＫＲＰＫＰ、配列番号９４）、およびｐＶＥＣ（ＬＬＩＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ、配列番号９５）、Ｐｅｐ−７（ＳＤＬＷＥＭＭＭＶＳＬＡＣＱＹ、配列番号９６）、ＨＮ−１（ＴＳＰＬＮＩＨＮＧＱＫＬ、配列番号９７）、およびＣＰ２６（ＫＷＫＳＦＩＫＫＬＴＳＡＡＫＫＶＶＴＴＡＫＰＬＩＳＳ（配列番号９８）が含まれる。
【００５３】
別の実施形態では、前記標的化部分は、ＩｇＧ抗体可変領域；単離されたＣＤＲ領域；２つのドメイン間の結合による抗原結合部位の形成を可能とするペプチドリンカーによって連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含む、一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二重特異性ｓｃＦｖ二量体；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる、ＣＨ３ドメイン、一本鎖ダイアボディーフラグメント、ｄＡｂフラグメントに連結されたｓｃＦｖを含むミニボディー；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体のヒンジ領域に由来する１以上のシステインを含む数個の残基が付加されていることでＦａｂフラグメントとは異なる、Ｆａｂ’フラグメント；定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’フラグメントである、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント；２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；それらの誘導体、および抗原結合機能を保持する他のいずれかの抗体フラグメントからなる群から選択される抗体由来エピトープ結合ドメインを含む。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはダイアボディー分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化させることができる。さらに、前記標的化部分は、Ｆｃ領域に少なくとも部分的に結合されてもよい。Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体を有するナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞の動員を促し、食作用細胞または細胞毒性性細胞を刺激して、抗体媒介性食作用または抗体依存性細胞媒介性細胞毒性作用により標的前立腺細胞を破壊することができる。さらに、抗体由来標的化薬剤を使用する場合、その中の標的化ドメインのいずれかもしくは全て、および／またはＦｃ領域は、当業者に周知の方法論を用いて「ヒト化」され得る。
【００５４】
特定の実施形態では、該方法は、前記対象に、ＤＥＦＢ１発現またはＤＥＦＢ１活性を増強する第３の薬剤を投与することをさらに含む。ＤＥＦＢ１発現またはＤＥＦＢ１活性を増強する薬剤の例としては、限定されるものではないが、ＤＥＦＢ１タンパク質、ＤＥＦＢ１  ｓａＲＮＡ、ＤＥＦＢ１  ｓａＲＮＡをコードする発現ベクター、ＤＥＦＢ１タンパク質をコードする発現ベクター、インターフェロン−γ、およびそれらの組合せが含まれる。
【００５５】
第１の薬剤、第２の薬剤および／または第３の薬剤は、単一の医薬組成物で同時に投与してもよいし、または個々に投与してもよい。一実施形態では、第１の薬剤、第２の薬剤および／または第３の薬剤は、対象の前立腺癌組織またはＰＩＮ組織に直接投与される。
【００５６】
別の態様では、本発明は、対象において前立腺癌またはＰＩＮを処置するための方法であって、前記対象にＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する有効量の第１の薬剤を投与すること、ならびに前記対象にＤＥＦＢ１発現および／またはＤＥＦＢ１活性を増強する有効量の第２の薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）またはｄｓＲＮＡ活性化因子は、それが「低分子ＲＮＡ誘導遺伝子活性化」またはＲＮＡａと呼ばれる機構によって遺伝子発現を活性化すること以外は、ｓｉＲＮＡと同様である。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡの内因性供給源として働く一群の低分子非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）種を含む。ＤＥＦＢ１  ｓａＲＮＡは、その遺伝子の非コード核酸配列に相補的なリボヌクレオチド鎖を含む。好ましい実施形態では、前記ＤＥＦＢ１  ｓａＲＮＡは、ＤＥＦＢ１プロモーターまたはエンハンサー配列を含むＤＥＦＢ１転写調節配列を標的とするリボ核酸配列を含む。ｄｓＲＮＡ活性化因子およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０３（４６）：１７３３７−１７３４２，２００６; Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ，．７（３）：６９８−７０３, ２００８に記載されているように、合成またはｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡとして構築することができる。
【００５８】
本出願の別の態様は、被験者において癌性、前癌性、または非癌性の前立腺病態をモニタリングまたは診断し、それらの結果に基づいて、前記対象の前立腺組織に、ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する有効量の薬剤、ならびにＰＡＸ２発現またはＰＡＸ２活性を阻害する第２の薬剤を投与するための方法に関する。
【００５９】
特定の実施形態では、被験者において癌性、前癌性、または非癌性病態をモニタリングまたは診断するための方法は、被験者から得られた細胞または体液においてＰＡＸ２とＤＥＦＢ１またはＥＮ２とＤＥＦＢ１の発現比を決定することを含み、この場合、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比またはＥＮ２とＤＥＦＢ１の発現比は、１以上の癌性、前癌性、または非癌性病態と相関している。
【００６０】
一実施形態では、対象において前立腺病態を処置するための方法は、（ａ）前記対象由来の罹患前立腺組織においてＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比を決定すること；および（ｂ）（ａ）の結果に基づき、前記対象の前立腺組織にＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する第１の生理活性成分、ならびにＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する第２の生理活性成分を投与することを含む。好ましい実施形態では、前記方法は、前記対象の前立腺組織にＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する第３の生理活性成分を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前立腺病態は、前立腺癌またはＰＩＮである。
【００６１】
別の実施形態では、対象において前立腺病態を処置するための方法は、（ａ）ＥＮ２、ＰＡＸ２およびＤＥＦＢ１の発現レベルを決定すること、（ｂ）前記対象由来の罹患前立腺組織においてＰＡＸ２とＤＥＦＢ１および／またはＥＮ２とＤＥＦＢ１の発現比を決定すること；および（ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果に基づき、前記対象に、（１）ＥＮ２発現を阻害する有効量の薬剤、および（２）ＰＡＸ２発現および／もしくはＰＡＸ２活性を阻害する薬剤、ならびに／またはＤＥＦＢ１発現および／もしくはＤＥＦＢ１活性を増強する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、前立腺病態は、前立腺癌またはＰＩＮである。
【００６２】
特定の実施形態では、前記決定工程は、内部対照遺伝子の発現レベルに対するＰＡＸ２遺伝子の発現レベルを決定すること、同じ対照遺伝子の発現レベルに対するＤＥＦＢ１遺伝子の発現レベルを決定すること、およびＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現レベルに基づいてＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比を決定することを含む。その発現が全ての細胞種で実質的に一定であることが分かっている限り、いずれの好適な内部対照遺伝子も使用可能である。例示的内部対照遺伝子としては、限定されるものではないが、β−アクチン遺伝子、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子などが含まれる。
【００６３】
一実施形態では、前立腺細胞からのＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比は、被験者において癌性、前癌性、および非癌性前立腺病態を識別するために使用される。一実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が１００：１以上であれば、対象に前立腺癌が存在することが示される。別の実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が４０：１以上、１００：１未満であれば、対象において前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）が存在することが示される。さらに別の実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が４０：１未満であれば、対象において正常な前立腺が示される。
【００６４】
他の実施形態では、前立腺細胞からのＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比は、被験者において癌性、前癌性、および非癌性前立腺病態を識別するために使用される。一実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が１００：１以上であれば、対象に前立腺癌が存在することが示される。別の実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が４０：１以上、１００：１未満であれば、対象において前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）が存在することが示される。本明細書で使用する場合、用語「前立腺上皮内新生物」には、小葉上皮内新生物および腺管上皮内新生物が含まれる。さらに別の実施形態では、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比が４０：１未満であれば、正常な前立腺状態が示される。
【００６５】
特定の実施形態では、被験者において癌性、前癌性、および非癌性病態をモニタリングまたは診断するための方法は、癌のリスクがあることが疑われる被験者の組織から得られた細胞または体液においてＰＡＸ２発現レベルを決定すること、癌のリスクがあることが疑われる被験者の組織から得られた細胞または体液においてＥＮ２発現レベルを決定すること、および被験者の組織からのＰＡＸ２およびＥＮ２発現レベルと、癌を含まない対照対象の同じ組織から得られた発現レベルを比較することを含み、この場合、対照対象に比べて、被験者のＰＡＸ２およびＥＮ２の発現レベルがそれぞれ少なくとも２倍高いことが、癌または癌を発症する高いリスクを示す。少なくとも５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％またはそれを超える発現レベルの上昇が見られる場合がある。これらの細胞は、癌においてＥＮ２およびＰＡＸ２がアップレギュレートされているいずれの組織から得てもよい。好ましい組織としては、前立腺および前立腺組織が含まれる。好ましい体液としては、血液、血漿、血清、および尿が含まれる。
【００６６】
特定の実施形態では、前記方法は、代わりにまたは加えて、被験者の組織から得られた細胞または体液において（ＥＮ２およびＰＡＸ２に加えて）ＤＥＦＢ１発現レベルを決定し、それらの発現レベルを対応する参照レベル（例えば、正常な対照対象の細胞または体液から得られた発現レベル）と比較する工程を含んでもよく、この場合、対照に比べての被験者におけるＥＮ２およびＰＡＸ２の発現レベルの上昇、および対照に比べての被験者におけるＤＥＦＢ１の発現レベルの低下が、癌または癌を発症するリスクを示す。
【００６７】
さらに、本明細書で開示される方法は、血液、尿、血漿、血清、涙、リンパ液、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水または硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門および膣分泌液、汗、精液、濾出液、浸出液、および滑液などの対象の体液中のＰＡＸ２、ＥＮ２、および／またはＤＥＦＢ１の測定を含む、検出を含み得る。
【００６８】
遺伝子発現レベルおよび遺伝子発現比は、ｍＲＮＡレベルで（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＴ−ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドアレイなどによる）またはタンパク質レベルで（例えば、ウエスタンブロット、抗体マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡなどによる）決定することができる。ｍＲＮＡ発現レベル（およびそれからの比）を決定するための好ましい方法論には、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＱＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、抗体マイクロアレイ、またはそれらの組合せが含まれる。タンパク質発現レベル（およびそれからの比）を決定するための好ましい方法論には、ＥＬＩＳＡおよび抗体マイクロアレイの使用が含まれる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、前記方法は、被験者から得られた前立腺細胞または体液においてアンドロゲン受容体（ＡＲ）の状態（すなわち、ホルモン感受性またはホルモン不応性）を決定することをさらに含む。この前立腺組織のＡＲの状態は、対照における前立腺病態を決定するために、同じ組織におけるＥＮ２とＤＥＦＢ１の比および／またはＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比と併用可能である。
【００７０】
他の実施形態では、前記方法は、前立腺病態を有する前立腺組織から得られた細胞または体液においてエストロゲン受容体／プロゲステロン受容体（ＥＲ／ＰＲ）の状態を決定することをさらに含む。この前立腺組織のＥＲ／ＰＲの状態は、対照における前立腺病態を決定するために、同じ組織におけるＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の比と併用可能である。
【００７１】
本発明のモニタリングおよび診断方法は、臨床医に発癌起始組織または前癌組織の予後因子を提供する。この検査の候補には、癌の高リスク患者（年齢、人種による）が含まれる。診断法として、陽性または陰性ＰＡＸ２、ＥＮ２、および／またはＤＥＦＢ１判定の後に、癌の状態を同定するためにバイオマーカーを用いたさらなるスクリーニングを行うことができる。さらに、これらの患者は、ＰＡＸ２／ＥＮ２／ＤＥＦＢ１調節剤による処置の候補となり得る。あるいは、これらの検査は、患者に対してそれらの癌療法の有効性をモニタリングするため、処置経過を調べるため、または癌の再発をモニタリングするために使用することができる。
【００７２】
別の例として、臨床医による直腸指診時の前立腺における結節の検出などの癌の潜在指標を呈する患者、またはＰＳＡの急上昇を受けている患者は、多くの場合、「待機療法(Watchful Waiting)」状況にある。これらの患者が癌を有するかどうか、または癌を発症するかどうかを確認することは難しい場合が多い。例えば、組織、血液、血漿、血清、および／または尿からの患者サンプルにおけるＰＡＸ２、ＥＮ２、ＤＥＦＢ１発現レベル、またはＰＡＸ２とＤＥＦＢ１および／もしくはＥＮ２とＤＥＦＢ１の発現比の分析は、前立腺癌の疑いのあるヒトにおいて生検をとる判断を補助するために使用することができ、このことにより、不必要な前立腺生検の数を減らし、疾患に対するより早期の介入を導くことができる。生検では、さらなる分析のために標的器官から小組織サンプルを取り出す。前立腺生検は一般に、ＰＳＡ血液検査からのスコアが前立腺癌の存在の可能性に関連するレベルにまで上昇した際に行われる。
【００７３】
血液タンパク質マーカーの同定はより正確またはより早期の癌診断を提供し、癌の治療および管理にプラスの影響を持ち得る。本明細書に開示されているように、異常なＰＡＸ２発現は、癌の進行の初期に見られ、腫瘍形成の起始事象である可能性がある。従って、ＰＡＸ２タンパク質または抗原の存在に関してスクリーニングするために採取した患者由来のサンプルを、癌の早期検出のために使用することができる。
【００７４】
さらに、ＰＡＸ２／ＥＮ２／ＤＥＦＢ１スクリーニングの組み込みは、臨床医に発癌起始組織または前癌組織の予後因子を提供し得る。この検査の候補には、癌の高リスク患者（年齢、人種による）が含まれる。診断法として、陽性ＰＡＸ２判定の後に、他のバイオマーカーを用いたさらなるスクリーニングを行うことができる。さらに、これらの患者は、それらの癌の化学予防法としてのＰＡＸ２阻害剤の候補でもあり得る。あるいは、この検査は、患者に対して、それらの癌療法の有効性の尺度として、または癌の再発をモニタリングするためにも使用可能である。
【００７５】
処置用組成物
さらなる態様において、本発明は、本明細書記載の方法に従って前立腺癌または前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）を処置するための組成物を提供する。一実施形態では、前記組成物は、ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する第１の薬剤、ＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する第２の薬剤、ならびに薬学上許容される担体を含む。前記組成物は、ＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する第３の薬剤をさらに含み得る。ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する薬剤、ＰＡＸ２発現および／またはＰＡＸ２活性を阻害する薬剤、ならびにＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する薬剤の例は、「処置方法」の節に記載されている。
【００７６】
「薬学上許容される」とは、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない材料を意味し、すなわち、前記材料は、望ましくない生体作用を引き起こさずに、またはそれが含まれている医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、核酸またはベクターとともに対象に投与され得る。当業者に周知のように、前記担体は当然のことながら有効成分の分解を最小限とするように、また、対象における有害な副作用を最小限とするように選択される。
【００７７】
別の実施形態では、前立腺癌またはＰＩＮを処置するための組成物は、ＥＮ２発現および／またはＥＮ２活性を阻害する第１の生理活性成分とＤＥＦＢ１の発現および／または活性を増強する第２の生理活性成分、ならびに薬学上許容される担体を含む。生理活性成分は、本明細書に記載されるような生理活性成分およびそれらの組成物のいずれを含んでもよい。
【００７８】
好適な担体およびそれらの製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載されている。一般に、製剤と等張性とするために適当な量の薬学上許容される塩が製剤に使用される。薬学上許容される担体の例としては、限定されるものではないが、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性剤形が含まれ、これらのマトリックスは成形品、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に応じてある特定の担体がより望ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【００７９】
医薬担体は当業者に公知である。これらは最も一般には、無菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液をはじめとする、ヒトへの薬物の投与に標準的な担体であろう。前記組成物は、筋肉内または皮下投与することができる。他の化合物は、当業者に使用されている標準的な手順に従って投与される。
【００８０】
医薬組成物は、選択された分子の他、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含み得る。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１以上の有効成分を含んでもよい。
【００８１】
非経口投与のための調剤には、無菌水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または硬化油が含まれる。静脈内ビヒクルとしては、補液および栄養補給剤、電解質補給剤（ブドウ糖加リンゲル液に基づくもの）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの、保存剤および他の添加剤も存在してよい。
【００８２】
局所投与用の製剤としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、水剤および散剤を含み得る。慣例の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要であるまたは望ましい場合がある。
【００８３】
経口投与用の組成物としては、散剤または顆粒剤、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００８４】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応により形成された薬学上許容される酸または塩基付加塩として投与される可能性がある。
【００８５】
前記材料は溶液、懸濁液中に存在してもよい（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれる）。これらは抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞種に標的化することができる。「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌への脂質媒介薬物ターゲティング）などのビヒクル、細胞特異的リガンドへのＤＮＡの受容体媒介ターゲティング、リンパ球指向性腫瘍ターゲティング、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるネズミ神経膠腫細胞の高特異性治療用レトロウイルスターゲティング。一般に、受容体は構成的またはリガンド誘導型のいずれかでエンドサイトーシス経路に関与する。これらの受容体はクラスリン被覆ピット内にクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞内に入り、酸性化エンドソームを通過し、そこで受容体が選別され、その後、細胞表面へと再循環するか、細胞内で貯蔵されるようになるか、またはリソソームで分解される。細胞内移行経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節などの多様な機能を果たす。多くの受容体は、細胞種、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンド価、およびリガンド濃度に応じて２つ以上の細胞内経路をたどる。
【００８６】
本明細書に記載の組成物は、開示される方法の実施または実施の補助に有用なキットとして、任意の好適な組合せで一緒に包装することができる。いくつかの実施形態では、前立腺癌またはＰＩＮなどの前立腺病態を処置するためのキットは、ＥＮ２発現もしくは活性の阻害剤、ＰＡＸ２発現もしくは活性の阻害剤、および／またはＤＥＦＢ１発現または活性の活性化剤を含む。これらの阻害剤または活性化剤は、上記の生理活性成分のいずれを含んでもよい。
【００８７】
本明細書に開示される組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかによって、および処置される領域によって、いくつかの方法で投与することができる。例えば、前記組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射）的に、吸入により、対外、局所（経皮、眼内、膣、直腸、鼻腔内を含む）などによって投与され得る。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「局所的鼻腔内投与」とは、一方または両方の鼻孔から鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、核酸またはベクターの噴霧機構もしくは滴下機構による、またはエアゾール化を介した送達を含み得る。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または滴下機構による送達を介した鼻または口を経たものであり得る。また、挿管によって呼吸器系のいずれの領域（例えば、肺）へも直接送達を行うことができる。
【００８９】
組成物の非経口投与は、使用する場合、一般に注射を特徴とする。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとしての、注射前に液体中の溶液もしくは懸濁液とするのに好適な固体形態、またはエマルションとしての慣例の形態で調製することができる。さらに最近改訂された非経口投与のアプローチは、一定の用量が維持されるように緩徐放出または徐放性系の使用を含む。
【００９０】
組成物の正確な必要量は、対象の種、齢、体重および健康状態、使用する特定の核酸またはベクター、その投与様式などに応じて対象ごとに異なる。適当な量は、当業者ならば、本明細書に教示が与えられているので、通常の実験だけを用いて決定することができる。従って、組成物を投与するために効果的な用量および計画は経験的に決定することができ、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。組成物の投与のための用量範囲は、症状傷害が影響を受ける所望の効果をもたらすために十分なものである。この用量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほどの大きさであるべきではない。一般に、用量は、患者の齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、またはその投与計画に他の薬物が含まれるかどうかによって異なり、当業者ならば決定することができる。用量は、いずれの禁忌の事象においても個々の医師によって調整可能である。用量は可変であり、１日１用量以上の投与で１日または数日間投与することができる。所与の医薬製剤種の適当な用量については文献に指針を見出すことができる。
【００９１】
例えば、開示されている組成物の、単独使用の場合の典型的な１日用量は、上述の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜大１００ｍｇ／ｋｇ体重以上／日の範囲であり得る。特定の実施形態では、処置方法は、罹患組織のＰＡＸ２とＤＥＦＢ１の発現比（Ｐ／Ｄ比）および／または前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の状態に基づいて調整することができる。従って、ＰＡＸ２発現レベルのモニタリングは、薬物の奏功または耐性を予測するため、ならびに抗ＥＮ２、抗ＰＡＸ２、および／またはＤＥＦＢ１療法の候補となり得る患者を特定するために使用可能である。用語「抗ＥＮ２療法」および「抗ＰＡＸ２療法」とは、ＥＮ２／ＰＡＸ２発現またはＥＮ２／ＰＡＸ２活性を阻害するための方法を意味する。用語「ＤＥＦＢ１療法」とは、ＤＥＦＢ１発現を増強するための方法を意味する。用語「ＤＥＦＢ１療法」は、ＥＮ２／ＰＡＸ２発現またはＥＮ２／ＰＡＸ２活性を阻害するための方法は含まないが、このような方法はＤＥＦＢ１発現の増強ももたらす場合がある。
【００９２】
他の阻害剤
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の薬剤は、１つ又は複数の従来の化学療法剤と併用される。本発明で使用される例示的な化学療法剤としては、以下のものが含まれる：フィナステリド、デュタステリド、ツロステリド、ベキスロステリド（bexlosteride）、イゾンステリド（izonsteride）、ＦＣＥ２８２６０、及びＳＫＦ１０５、１１１を含む５−アルファ−レダクターゼ阻害剤；ＱＬＴ−０２６７等のインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）阻害剤；分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−１（ｓＦＲＰ１）、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−２（ｓＦＲＰ２）、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−３（ｓＦＲＰ３／ＦＲＺＢ）、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−４（ｓＦＲＰ４）、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質−５（ＳＦＲＰ５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ＤＫＫ１）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−２（ＤＫＫ２）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−３（ＤＫＫ３）、Ｗｎｔ阻害因子−１（ＷＩＦ１）、ケルベロス、スクレロスチン、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−３、ＩＷＰ４、ピルビニウム、ＸＡＶ９３９、及び他のＷＮＴシグナル伝達経路阻害剤；ベバシズマブ（アバスチン）、カバジタキセル、ケトコナゾール、プレドニゾン、シプロイセル−Ｔ（ＡＰＣ８０１５、プロベンジ）、アルファラディン(Ａｌｐｈａｒａｄｉｎ)（塩化ラジウム−２２３）、ＭＤＶ３１００、オルテロネル（ＴＡＫ−７００）、ＰＲＯＳＴＶＡＣ、カボザンチニブ（ＸＬ−１８４）、ＤＭＡＰＴ；シクロパミン、ＩＰ−９２６、ビスモデギブ、及び他のヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路阻害剤；フルタミド、ルプロリド（luprolide）、タモキシフェン等の抗エストロゲン薬；ダウノルビシン、フロウロウラシル（flourouracil）、フロクスウリジン、インターフェロンアルファ、メトトレキサート、プリカマイシン、メカプトプリン（メカプトプリン）、チオグアニン、アドラマイシン（adramycin）、カルムスチン、ロムスチン、シタラビン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、エストラムスチン、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、ムタマイシン、ブスルファン、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、ストレプトゾシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、イダマイシン等の代謝拮抗剤及び細胞毒性剤、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、エトポシド、ポドフィロトキシン、ゴセレリン等のホルモン、メルファラン、クロラムブシル、メトロレタミン（methlorethamine）、チオテパ等のナイトロジェンマスタード誘導体、ベータメタゾン等のステロイド、及びウシ生菌マイコバクテリウム、ジカルバジン（dicarbazine）、アスパラギナーゼ、ロイコボリブン（leucovoribn）、ミトタン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テキソテル（texotere）、シドホスファミド（cydophosphamide）、アドリアマイシン、５−フロウロウラシル（5-flourouracil）、ヘキサメチルメラミン等の他の抗腫瘍剤、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクルクニン（acrqnine）；アドゾレシン（adozolesin）；アルデスロウキン（aldesloukin）；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルトイミド（aminogluthimide）；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート；ビセレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾミリン（duazomyrin）；エダトレキサート；エフロミチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロルファート（enprorfate）；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；ヨード化ケシ油エチルエステルＩ  １３１；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；金Ａｕ  １９８；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル（mitosper）；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィン��ール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムＳｒ８９；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テルロキシロノ（teroxirono）；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフェンクエン酸塩；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシナート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；酒石酸ビノレルビン；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン、アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アトルサクリン（atrsacrine）；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラフォリド；血管形成阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；ＤＨＥＡ；ブロミンエピアンドロステロン（bromineepiandrosterone）；エピアンドロステロン；アンタレリクス；抗神経化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン剤、前立腺癌；抗エストロゲン剤；抗腫瘍薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子修飾因子；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＳＡ、アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウルスポリン（benzoylstaursporine）；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジンジニルスペルミン（bisazindinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；ｃｉｓ−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロ���リマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントルキノン（cyclopentanthrequinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（dacliximab）；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキシホスファミド（dexifostamide）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカンニシンＳＡ（duocannycin SA）；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザルビン（fazarbine）；フェンレチニド（fenretinido）；フィルグラスチム；フルナステリド（frnasteride）；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルシン塩酸塩；トルフェニメキス（torfenimex）；ホルメスタン；フォストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活剤ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト、インターフェロン；インターロイキン；イオボングアン（iobonguane）；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４；トリノテカン（trinotecan）；ｉｒｏｐｌａｃｔ；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリ
コンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソールリアロゾール；直鎖ポリアミン類似体；リポフィリカジサッカリド（lipophilicadisaccharide）ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド−７；ロバプラチン、ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（lysofylline）；細胞溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；ミトマイシン類似体；ミトナフィド；ミトトキシン（mitotoxin）線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン；モノホスプリオリル（monophosplioryl）リピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子（genie）阻害剤；多腫瘍抑制因子１に基づく治療；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；ミコバクテリウム細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ｎａｐａｖｉｎ；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素合修飾因子；窒素酸化物酸化防止剤；ニトルリン（nitrullyn）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オルルダリセトロン（orldarisetron）；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；ネリドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガエペルガーゼ（pegaepergase）；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセタート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；ｐｌａｃｅｔｉｎ  Ａ；ｐｌａｃｅｔｉｎ  Ｂ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体（comprex）；白金化合物；白金−トリアミンコイル型ｉｐｌｅｘ；ポルフィマーナトリウム；ポルチロマイシン（portiromycin）；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫修飾因子；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類��ンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリノムクレオシドホスホリルアスト（purino mucleoside phosphorylast）阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質転写阻害剤；ｒａｓ阻害剤、；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤、レタリプチン脱メチル化（retalliptine demethylated）；エチドロン酸レニウムＲｅ１８６；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム、Ｓｄｉ１模倣剤；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達修飾因子；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプテイトナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフモニン（sulfmonine）；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ（suradista）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；サリドマイド；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣体；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トポテカン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来増殖阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、エリトロシット（erytrocyte）遺伝子治療；ベラレソール；毒液、抗毒液、ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；ジノスタチンスチマラマー、免疫刺激薬又は治療剤、それらの代謝産物、塩、及び誘導体、及びそれらの組み合わせ。
【００９３】
前立腺癌
前立腺癌は、多くの国々で重要な疾患となっており、西洋世界の人々において最も一般的に診断される悪性疾患であり、その発症は、年齢と共に著しく増加する。このように前立腺癌が増加し、近年多数の著名人が前立腺癌で死亡しているため、この癌に対処する必要性が強調されている。スクリーニングがより広範に利用可能なると、前立腺癌による死亡率を抑制できることが示唆されている。
【００９４】
現行の前立腺癌スクリーニングは、直腸診及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルの測定で構成されている。直腸内触診には、検査する人によってかなりのばらつきがあり、ＰＳＡレベルは、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺炎症、及び他の状態でも上昇する場合があるため、これらの方法には、特異性が欠如している。ＰＳＡには診断試験として大きな欠陥があることが、２２，０００人を超えるプロスペクティブ研究であるＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｔｕｄｙに含まれていた、前立腺癌を発症した３６６人の被験者で示された。研究の開始時に保管された血清中のＰＳＡレベルが測定され、その後４年以内に前立腺癌を発症した被験者の４７％のみが、高レベルであったことが見出された（Ｇａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，ＪＡＭＡ  ２７３，２８９−２９４，１９９５）。
【００９５】
前立腺癌は、当業者に周知のグリーソン方式を使用してスコア化することができる（Ｇｌｅａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｒｅｐ  ５０，１２５−１２８，１９６６）。グリーソン方式では、細胞学的特徴ではなく組織構造が使用される。１〜５の等級（良好〜不良に区別される）が使用され、最も高頻度でより重症な病変区域の総合スコアを組み合わせる。グリーソンスコアは、腫瘍の病期の評価（病期分類）に加えて、有益であり得る予後情報を提供する。２〜４及び８〜１０のグリーソンスコアは、良好な的中率を示すが、約４分の３の腫瘍は、中間の値を示す。
【００９６】
２つの主要な系が、前立腺癌の病期分類に使用されている：ＴＮＭ系及びＪｅｗｅｔｔ系（Ｂｅｎｓｏｎ  ＆  Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ，ｅｄ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｊ． Ｍ．ａｎｄ  Ｋｒａｎｅ  Ｒ．Ｊ．，ｐｐ２６１−２７２，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  １９８９）。病期分類は、腫瘍のあらゆる転移拡散を考慮に入れるものであり、局所リンパ節転移又は局所的浸潤のいずれであるかを評価するのは難しいため、困難である。また、腫瘍組織は、正常な前立腺組織と肉眼で区別することはできないため、及び前立腺は、別個の被膜を欠如しており、  繊維性脂肪組織の層に包まれているため、腫瘍サイズを測定するのが難しい。
【００９７】
Ｔ１〜Ｔ４の範囲の前立腺腫瘍の（Ｔ）病期は、４つのカテゴリにより記述される。Ｔ１の場合、癌は、微視的であり、単系であり、触知不能である。医師は、腫瘍を触知することができないか、又は経直腸超音波法等の画像法を用いて視認することができない。ＢＰＨを治療することにより、疾患を明らかにしてもよく、又はＰＳＡが高いために実施される針生検を使用することにより確認された。Ｔ２の場合、医師は、ＤＲＥで癌を触知することができる。疾患は、前立腺の一方又は両方の側の前立腺に限定されていると考えられる。Ｔ３の場合、癌は、前立腺のすぐ外側に進行している。Ｔ４の場合、癌は、身体の他の部位に拡散している。
【００９８】
したがって、現在のスクリーニング法は不十分である。ほとんどの患者の主要な死因である癌を診断するための又はその考え得る転移拡散を予測又は予防するための信頼できる方法は存在しない。
【００９９】
ＰＡＸ２
ＰＡＸ遺伝子は、核転写因子をコードする９つの発生調節遺伝子のファミリーである。ＰＡＸ遺伝子は、胚形成に重要な役割を果たし、非常に秩序付けられた時間的及び空間的パターンで発現される。それらは全て、進化の過程にわたって高度に保存されているＤＮＡ結合ドメインをコードする３８４塩基対の「ペアードボックス」領域を含有する（Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．，２８（２１９）−２３６，１９９４）。発生過程に対するＰＡＸ遺伝子の影響は、多数の天然マウス、及びＰＡＸ遺伝子のヘテロ接合体欠損の直接的原因でさえあり得るヒト症候群により実証されている。
【０１００】
ＰＡＸ２配列は、開示されている（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０９，７８７−７９５，１９９０）。ヒトＰＡＸ２タンパク質及びその変異体のアミノ酸配列並びに上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、配列番号３９〜５０に列挙されている（配列番号３９、ヒトＰＡＸ２遺伝子のエキソン１によりコードされるアミノ酸配列；配列番号４０、ヒトＰＡＸ２遺伝子プロモーター及びエキソン１；配列番号４１、ヒトＰＡＸ２のアミノ酸配列；配列番号４２、ヒトＰＡＸ２遺伝子；配列番号４３、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｂのアミノ酸配列；配列番号４４、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｂ；配列番号４５、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｃのアミノ酸配列；配列番号４６、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｃ；配列番号４７、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｄのアミノ酸配列；配列番号４８、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｄ；配列番号４９、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｅのアミノ酸配列；配列番号５０、ヒトＰＡＸ２遺伝子変異体ｅ）。
【０１０１】
ＰＡＸタンパク質は、「ペアードドメイン」と呼ばれるドメインを介して、及びある場合には「ホメオドメイン」を介して特定のＤＮＡ配列と結合する。ペアードドメイン（ＰＤ）は、ＰＡＸ２を含むＰＡＸタンパク質全てにより共有されているコンセンサス配列である。ＰＤは、α３−ヘリックスに位置するアミノ酸のＤＮＡ結合を指図して、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。
【０１０２】
ＰＡＸ２は、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスのすぐ上流の５’−ＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１）認識部位でＤＥＦＢ−１プロモーターと結合することにより（Ｂｏｓｅ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，４６：１１４０−８）、ＤＥＦＢ−１発現,抑制することが報告されている。ＰＡＸ２の場合、ペアードドメインのアミノ酸は、ＤＥＦＢ１プロモーターのＣＣＴＴＧ（配列番号１）ＤＮＡコア配列を特異的に認識及び相互作用する。この配列叉はその相補的配列を含む、長さが６４塩基までの及びそれを超えるオリゴヌクレオチドは、阻害剤であることが予想される。
ＰＡＸ２発現が検出されている癌の例は、表１に列挙されている。
【表１】
0005990274.tif 000002
【０１０３】
ＥＮ２
ＥＮ１及びＥＮ２遺伝子、マウス及びＥｎｇｒａｉｌｅｄショウジョウバエ分節遺伝子の相同体は、ホメオドメインドメイン転写因子をコードする（Ｊｏｙｎｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：１５〜２０、１９９６）。ＰＡＸ及びＥＮ遺伝子は、脳の発生を調節し、発生制御ヒエラルキーに重要な位置を占める遺伝子ネットワークの一部である（Ｊｏｙｎｅｒ，１９９６）。ツメガエルでの研究は、ＥＮ２及びＰＡＸ２が、ツメガエルｗｎｔ−１の発現に、及びｗｎｔ／β−カテニン経路によるシグナル伝達に不可欠であることを示唆している（Ｋｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．， Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３４０：３１８−３２８，２０１０）。
【０１０４】
ＥＮ２は、ヒト乳癌の癌遺伝子候補として特定されており（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２４：６８９０−９０１，２００５）、その発現は、小児脳腫瘍及び急性骨髄白血病（ＡＭＬ）では調節解除されることが見出されている（Ｋｏｚｍｉｋｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９２：５７０９−１３，１９９５；Ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ，４２：１７０−８，２００５）。他の研究では、ツメガエルＥＮ２が、真核生物開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）と結合し、ｅＩＦ４Ｅ及びｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質の迅速なリン酸化を開始させることが示されている（Ｂｒｕｎｅｔ，２００５）。ｅＩＦ４Ｅは、典型的には、翻訳機構に見出され、癌治療の標的である（Ｇｒａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６８（３）：６３１−６３４，２００８）。最近の研究では、ｅＩＦ４Ｅリン酸化が、腫瘍形成を促進し、前立腺癌進行に関連していることが示されている（Ｆｕｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．， ＰＮＡＳ，１０７（３２）：１４１３４−３９，２０１０）。
【０１０５】
ヒトＥＮ２タンパク質のアミノ酸配列、及びヒトＥＮ２  ｍＲＮＡ遺伝子配列は、それぞれ配列番号９９及び１００に示されている。
【０１０６】
ＤＥＦＢ１
β−デフェンシンは、上皮及び白血球の産物である、広域性抗菌活性を有する陽イオン性ペプチドである（Ｇａｎｚ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ， Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．， ３４（４）：３４３−５４， １９９７）。これらの２エキソンの単一遺伝子産物は、上皮表面で発現され、皮膚を含む部位で分泌される。現在まで、上皮由来の５つのβ−デフェンシン遺伝子が、ヒトで特定及び特徴付けられている：ＤＥＦＢ１（Ｂｅｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６８（２）：３３１−５，１９９５）、ＤＥＦＢ２（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４６（３）：４７２−５，１９９７）、ＤＥＦＢ３（Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７６（８）：５７０７−１３，２００１；Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ  Ｇｅｎｅ，２６３（１−２）：２１１−８，２００１）、ＤＥＦＢ４、及びＨＥ２／ＥＰ２。
【０１０７】
ヒトＤＥＦＢ１（又はｈＢＤ−１）のアミノ酸配列、及び転写開始部位の上流の６４４個ヌクレオチドを含む、ヒトＤＥＦＢ１遺伝子配列の５’調節配列は、それぞれ配列番号６３及び６４に示されている。各β−デフェンシン遺伝子産物の一次構造は、小型、６個システインモチーフ、高陽イオン電荷、及びこれらの特徴を超えた精巧な多様性を特徴とする。デフェンシンタンパク質の最も特徴的な特性は、３つのジスルフィド結合のネットワークを形成するそれらの６個システインモチーフである。β−デフェンシンタンパク質中の３つのジスルフィド結合は、Ｃ１−Ｃ５、Ｃ２−Ｃ４、及びＣ３−Ｃ６間である。隣接したシステイン残基間の最も一般的な間隔は、６、４、９、６、０である。β−デフェンシンタンパク質中のシステイン間の間隔は、カルボキシ末端に最も近いＣ５及びＣ６を除いて、アミノ酸１つ又は２つ分異なっている場合がある。全ての既知の脊椎動物β−デフェンシン遺伝子では、これらの２つのシステイン残基は互いに隣接している。
【０１０８】
β−デフェンシンタンパク質の第２の特徴は、小型であることである。各β−デフェンシン遺伝子は、サイズが５９〜８０個アミノ酸の範囲であり、平均サイズが６５個アミノ酸であるプレプロタンパク質をコードする。その後、この遺伝子産物は、未知の機序により切断されて、サイズが３６〜４７個アミノ酸の範囲であり、平均サイズが４５個アミノ酸の成熟ペプチドを生成する。これらの範囲の例外は、β−デフェンシンモチーフを含み、精巣上体で発現されるＥＰ２／ＨＥ２遺伝子産物である。
【０１０９】
β−デフェンシンタンパク質の第３の特徴は、高濃度の陽イオン性残基である。成熟ペプチド中の正荷電残基（アルギニン、リジン、ヒスチジン）の数は、６〜１４個の範囲であり、平均は９個である。
【０１１０】
β−デフェンシン遺伝子産物の更なる特徴は、それらの一次構造が多様であるにも関わらず、三次構造は明らかに保存されていることである。６個のシステイン以外は、どの位置のアミノ酸も、このタンパク質ファミリーの全ての既知メンバーで１つも保存されていない。しかしながら、二次及び三次構造並びに機能に重要であると考えられる、保存されている位置が存在する。
【０１１１】
β−デフェンシンタンパク質の一次アミノ酸配列に大きな多様性があるにも関わらず、限定的なデータではあるが、このタンパク質ファミリーの三次構造が保存されていることが示唆されている。構造コアは、ＢＮＢＤ−１２及びＤＥＦＢ２によりコードされるタンパク質に代表されるように、３つのストランドの逆平行βシートである。３つのβ−ストランドは、β−ターン及びα−ヘアピンループにより接続されており、また、２番目のβ−ストランドは、β−バルジを含んでいる。これらの構造は、正しい三次構造に折り畳まれると、陽イオン性及び疎水性残基の見かけ上の無作為配列が、球状タンパク質の２つの側に集中する。１つの側は、親水性であり、多くの正荷電側鎖を含み、他方は、疎水性である。溶液中で、ＤＥＦＢ２遺伝子によりコードされるＨＢＤ−２タンパク質は、Ｎ末端付近にα−ヘリックス区域を示した。これは、アルファ−デフェンシンの溶液構造又はβ−デフェンシンＢＮＢＤ−１２には以前に見出されていない。その側鎖がタンパク質表面に向いているアミノ酸は、β−デフェンシンタンパク質間であまり保存されないが、コアβ−シートの３つのβ−ストランドのアミノ酸残基は、より高度に保存されている。
【０１１２】
β−デフェンシンペプチドは、プレプロペプチドとして生成され、その後切断されてＣ末端活性ペプチド断片を放出する。しかしながら、気道上皮のヒトβ−デフェンシンペプチドの細胞内プロセシング、保存、及び放出の経路は、判明していない。
【０１１３】
ＤＥＦＢ１の遺伝子座（８ｐ２３．３）は、欠失のホットスポットであり、より不良な予後を示す患者と関連している。したがって、ＤＥＦＢ１（及び恐らくはＰＡＸ２）は、バイオマーカーとして、例えば、前立腺癌の早期検出用のスクリーニングに使用することができる。更に、提示されているデータは、その喪失が、早ければＰＩＮと共に（又はそれ以前でも）生じる場合があり、前立腺癌の発症の主な寄与要因である可能性を示す。
【０１１４】
ＰＡＸタンパク質は、進化中で保存されている転写因子のファミリーであり、「ペアードドメイン」及び「ホメオドメイン」と呼ばれるドメインを介して、特定のＤＮＡ配列に結合することができる。ペアードドメイン（ＰＤ）は、あるＰＡＸタンパク質（例えば、ＰＡＸ２及びＰＡＸ６）により共有されているコンセンサス配列である。ＰＤは、α３−ヘリックスに位置するアミノ酸のＤＮＡ結合を指図して、ＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ＰＡＸ２の場合、ＨＤのアミノ酸は、ＣＣＴＴＧ（配列番号１）ＤＮＡコア配列を特異的に認識及び相互作用する。この配列又はその相補体を含むオリゴヌクレオチドは、阻害剤であることが予想される。ＰＡＸ２タンパク結合用のＤＥＦＢ１プロモーターの重要なＤＮＡ領域は、ＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号１６）の配列を有する。
【０１１５】
１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｖ−ＣＣＴＴＧ−Ｗ（配列番号１７）の配列を有し、Ｖ及びＷは、１〜３５個ヌクレオチドのヌクレオチド配列である。ある実施形態では、Ｖ又はＷ又はその両方は、配列番号１６に示されいるＤＥＦＢ１プロモーターのＣＣＴＴＧ配列を通常は隣接する連続ヌクレオチド配列を含む。あるいは、Ｖ及び／又はＷのヌクレオチド配列は、ＰＡＸ２認識配列との干渉を回避するように、ＤＥＦＢ１プロモーターと無関係であってもよく、又は無作為に選択されていてもよい。
【０１１６】
ＤＥＦＢ１プロモーターに対するＰＡＸ２結合を阻害するオリゴヌクレオチドの他の例には、これらに限定されないが、以下の配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる（５’から３’方向）：
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１８）、
ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１９）、
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号２０）、
ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号２１）、
ＡＣＣＣＴＴＧＡＣ（配列番号１０１）、
ＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧ（配列番号１０２）、
ＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧ（配列番号１０３）、
ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ（配列番号２５）、
ＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣ（配列番号１０４）、
ＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴ（配列番号１０５）、
ＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ（配列番号２８）。
【０１１７】
アンチセンス分子は、標準的又は非標準的塩基対合のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計することができる。アンチセンス分子及び標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解により、標的分子の破壊を促進するように設計することができる。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製等の、標的分子で通常起こるはずのプロセシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近可能な領域を見出すことによりアンチセンス効率を最適化するための方法は、多数存在する。例示的な方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択実験並びにＤＭＳ及びＤＥＰＣを使用したＤＮＡ修飾研究であろう。アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、又は１０−１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子と結合することが好ましい。
【０１１８】
核酸送達
ＥＮ２／ＰＡＸ２発現又は活性の核酸に基づく阻害剤、並びにＤＥＦＢ１発現又は活性の核酸に基づく活性化因子は、当業者に周知の好適な発現ベクターを使用して、前立腺標的細胞に送達することができる。本明細書で使用される場合、用語「発現ベクター」は、核酸の発現を指図可能なあらゆる核酸を含む。そのため、用語「発現ベクター」は、ウイルスベクター及びプラスミドベクター等を含む。発現ベクターは、２つの主要な送達スキーム：ウイルスベクターを使用したウイルスに基づく送達系、及び例えばプラスミドベクターを使用した非ウイルスに基づく送達系を使用して、細胞に送達することができる。そのような方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載の組成物及び方法を用いた使用に容易に適応可能である。ある場合には、これらの方法を使用して、媒体に固有であるか又は媒体に操作された標的特徴を使用することにより、ある疾患及び細胞集団を標的とすることができる。
【０１１９】
細胞に送達される核酸は、ＥＮ２及びＰＡＸ２等の外来性遺伝子の発現を指図するためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含む１つ又は複数の転写調節エレメントを含む。プロモーターは、転写開始部位に対して比較的固定された位置から転写を開始するように機能するＤＮＡ配列を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメントを含有しており、他の上流エレメント及び応答エレメントと共に作用することができる。
【０１２０】
好ましいプロモーターは、前立腺細胞での発現、特に前立腺癌細胞で上方制御されている発現を指図することが可能なプロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーター（例えば、ＨＣＭＶ又はＳＶ４０）又は前立腺細胞又は前立腺癌細胞で優先的発現を示すものを含んでいてもよい。エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から離れて機能するＤＮＡ配列を指し、転写単位に対して５’又は３’のいずれにあってもよい。更に、エンハンサーは、イントロン内並びにコード配列内にあってもよい。それらは、通常は、長さが１０〜３００ｂｐであり、ｃｉｓで機能する。エンハンサーは、近くのプロモーターからの転写を増加及び／又は制御するように機能する。好ましいエンハンサーは、前立腺細胞、前立腺癌細胞で、及び／又はアンドロゲンシグナル伝達又はアンドロゲン欠乏に応答して、高レベル発現を指図するものである。
【０１２１】
プロモーター及び／又はエンハンサーは、光又は特定の化学的誘導剤のいずれかにより特異的に活性化されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、テトラサイクリン又はデキサメタゾンの投与により制御される誘導可能な発現系を使用してもよい。他の実施形態では、遺伝子発現は、ガンマ線照射及び外照射療法（ＥＢＲＴ）を含む放射線への曝露、又はアルキル化化学療法薬により増強することができる。
【０１２２】
前立腺特異性転写調節エレメント（ＴＲＥ）を発現ベクターに組み込んで、前癌性及び／又は癌性前立腺細胞における発現の転写標的化を可能にすることができる。例示的な前立腺特異性ＴＲＥには、米国特許出願公開第２００３／０２３５８７４号に記載の前立腺特異抗原（ＰＳＡ又はｈｋ３）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、プロバシン（ＰＢ）、腺性カリクレイン−２（ｈｋ２）遺伝子、オステオカルシン、キメラＰＳＡ−ＰＳＭＡ、又は（ＰＳＥ）に由来する１つ又は複数の調節エレメントを含む天然ＴＲＥ及びキメラ（chrimeric）ＴＲＥ、並びに既に存在いている可能性があるものに加えて、１つ又は複数の外因的に付加されたアンドロゲン応答性調節エレメントが含まれる。
【０１２３】
ＰＳＡ、プロバシン、及び腺性カリクレインＴＲＥは、アンドロゲン誘導可能であり、好ましくは、アンドロゲン感受性細胞でのセンスＤＥＦＢ１及び／又はＥＮ２／ＰＡＸ２のアンチセンス発現に使用される。逆に、ＰＭＳＡ  ＴＲＥは、アンドロゲン欠乏により特異的に誘導され、好ましくは、去勢耐性前立腺細胞での発現に使用される。
【０１２４】
１つの実施形態では、核酸の高レベル前立腺特異的発現は、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１５（８）：５８３−５９３，２００８及び米国特許出願公開第２００６／０２２３１４１号に記載の前立腺（prosate）特異２段階転写増幅（ＴＳＴＡ）系２段階増幅を使用して達成することができる。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２５】
発現ベクターは、一般的に、転写終結用の配列を含有しており、ｍＲＮＡ安定性に肯定的な影響を与える１つ又は複数のエレメントを更に含有していてもよい。発現ベクターは、感染細胞又は形質移入細胞中で共通のｍＲＮＡからの２つ以上のタンパク質の発現を容易にするために、隣接するタンパク質コード領域間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を更に含んでいてもよい。加えて、発現ベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を更に含んでいてもよい。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたか否かを判断するために使用され、送達されると発現される。好ましい標識遺伝子は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子であり、これは、β−ガラクトシダーゼ及び緑色蛍光タンパク質をコードする。
【０１２６】
ウイルスに基づく送達系
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の生物活性成分の阻害剤又は活性化因子は、ウイルス由来の発現ベクターを使用して、遺伝子操作ウイルスとして送達される。例示的なウイルスベクターには、以下のものが含まれていてもよく、又は以下のものに由来してもよい、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、シンドビス、及び他のＲＮＡウイルス等。また、これらのウイルスがベクターとしての使用に好適である特性を共有する任意のウイルスファミリーが好ましい。レトロウイルスには、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ＨＩＶ、及び他のレンチウイルスベクターが含まれる。アデノウイルスベクターは、比較的安定しており、作業が容易であり、高い力価を有し、エアゾル製剤で送達することができ、非分裂細胞を形質移入することができる。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有しており、熱安定性であり、室温で保管することができる。ウイルス送達系では、典型的には、１つ又は複数の遺伝子が取り除かれたか又は外来性遺伝子を有し、及び／又は取り除かれたウイルスＤＮＡの代わりに、遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノムに挿入されているウイルスベクターが使用される。取り除かれた遺伝子（複数可）の必要な機能は、初期遺伝子の遺伝子産物をｔｒａｎｓで発現するように操作された細胞系により供給することができる。
【０１２７】
前立腺特異的組織標的化及び／又は発現用のウイルスベクターは、記載されている。例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１６：８２０−８３１，２００９；Ｔｒｕｊｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１７（１１）：１３２５−１３３２，２０１０；Ｋｒａａｉｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ、６７（８）：８２９−８３９，２００７；米国特許出願公開第２００８／０２４７９９６号及び第２００９／０１３００６１号を参照されたい。これらの文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、非ウイルス送達系は、例えば、陽イオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）及び陰イオン性リポソーム等のリポソームを含む脂質製剤を使用した、プラスミドベクター又は他の非核酸生理活性薬剤の送達に使用される。リポソームは、必要に応じて、特定の細胞に対する標的化を容易にするために、１つ又は複数のタンパク質又はペプチドに更に結合されていてもよい。化合物及び陽イオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸入性の血液に投与してもよく、又は気道の細胞を標的とするために気道に吸入してもよい。更に、生理活性薬剤は、本明細書に記載の標的化部分（moities）を使用して前立腺癌細胞に標的化することができるか、又は所定の放出速度又は用量に従って１つ又は複数の生理活性薬剤を徐放するように設計することができるマイクロカプセル又はナノ粒子の成分として投与することができる。
【０１２９】
他の実施形態では、核酸は、エレクトロポレーションによりｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。そのための技術は、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．社（サンディエゴ、カリフォルニア州）から、並びにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ（商標）機器（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．社、ツーソン、アリゾナ州）により利用可能である。
【０１３０】
生理活性成分は、溶液又は懸濁液中にあってもよい（例えば、微粒子、リポソーム、又は細胞に組み込まれている）。これらは、抗体、受容体、又は受容体リガンドにより、特定の細胞タイプを標的とすることができる。「ステルス」及び他の抗体結合リポソーム（前立腺細胞を標的とする脂質媒介性薬物を含む）等の媒体、細胞特異性リガンドによるＤＮＡの受容体媒介性標的化、リンパ球依存性腫瘍標的化、及びマウス神経膠腫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ高特異性治療用レトロウイルス標的化。一般的に、受容体は、エンドサイトーシスの経路に関与し、構成的であるか又はリガンド誘導性であるかのいずれかである。これらの受容体は、クラスリン被覆ピットでクラスターを形成し、クラスリン被覆小胞を介して細胞に進入し、酸性エンドソームを通過し、そこで分類されて、その後細胞表面に再利用されるか、細胞内に保管されるか、又はリソソームで分解されるかのいずれかである。内部移行経路は、養分吸収、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルス及び毒素の日和見性進入、リガンドの解離及び分解、並びに受容体レベルの調節等の様々な機能に役割を果たす。多くの受容体は、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドのタイプ、リガンド原子価、及びリガンド濃度に応じて、複数の細胞内経路に従う。
【０１３１】
本発明は、以下の例により更に説明されるが、それらは限定と解釈されるべきでない。本出願の全体にわたって引用された全ての参考文献、特許、及び公開特許出願、並びに図及び表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１３２】
ヒトベータデフェンシン−１は、後期前立腺癌に細胞毒性であり、前立腺癌腫瘍免疫に役割を果たす。
この例では、ＤＥＦＢ１を、誘導可能な発現系にクローニングして、それが、正常な前立腺上皮細胞並びにアンドロゲン受容体陽性（ＡＲ＋）及びアンドロゲン受容体陰性（ＡＲ−）前立腺癌細胞系にどのような影響を及ぼすかを検査した。ＤＥＦＢ１発現の誘導は、ＡＲ−細胞ＤＵ１４５及びＰＣ３での細胞増殖の減少をもたらしたが、ＡＲ＋前立腺癌細胞ＬＮＣａＰの増殖には影響を示さなかった。また、ＤＥＦＢ１は、カスパーゼ媒介性アポトーシスの迅速誘導を引き起こした。示されたデータは、先天性腫瘍免疫におけるその役割の証拠を提供し、その喪失が、前立腺癌の腫瘍進行に寄与することを示す最初のデータである。
【０１３３】
１．１  物質及び方法
細胞系：細胞系ＤＵ１４５を、ＤＭＥＭ培地で培養し、ＰＣ３を、Ｆ１２培地で増殖し、ＬＮＣａＰを、ＲＰＭＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、グランドアイランド、ニューヨーク州）で増殖した。３系統全ての増殖培地は、１０％（容積／容積）のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）で補完されていた。ｈＰｒＥＣ細胞を、前立腺上皮細胞基本培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．社、ウォーカーズビル、メリーランド州）で培養した。細胞系は全て、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。
【０１３４】
組織試料及びレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：根治的前立腺摘除を受けた承諾患者から得られた前立腺組織を、施設内治験審査委員会認可プロトコールに従って、Ｈｏｌｌｉｎｇｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ腫瘍バンクから取得した。このプロトコールには、試料のプロセシング、切片化、組織学的特徴付け、ＲＮＡ精製、及びＰＣＲ増幅のためのガイドラインが含まれていた。凍結組織切片を病理学的に検査した後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）を実施して、アッセイする組織試料が、良性前立腺細胞の純粋な母集団で構成されていることを保証した。分析する各組織切片毎に、良性組織を含む３つの異なる領域でＬＣＭを実施し、その後収集した細胞をプールした。
【０１３５】
根治的前立腺摘除を受ける前にインフォームドコンセントを提供した患者から前立腺組織を得た。施設内治験審査委員会認可プロトコールに従って、Ｈｏｌｌｉｎｇｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ腫瘍バンクから、試料を得た。このプロトコールには、試料のプロセシング、切片化、組織学的特徴付け、ＲＮＡ精製、及びＰＣＲ増幅のためのガイドラインが含まれていた。外科医及び病理学者から受け取った前立腺標本を、ＯＣＴ化合物中で直ちに凍結した。各ＯＣＴブロックを切断して、連続切片を生成し、それらを染色及び検査した。良性細胞、前立腺上皮細胞内新生物（ＰＩＮ）、及び癌を含有する区域を識別し、Ａｒｃｔｕｒｕｓ社製ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩシステム（サニーベール、カリフォルニア州）を使用して未染色スライドから領域を選択するための指針に使用した。捕捉物質を含有するＣａｐを、Ａｒｃｔｕｒｕｓ社製Ｐｉｃｏ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ単離キットの２０μｌの溶解産物と接触させ、直ちにプロセシングした。ＲＮＡの量及び品質は、５’アンプリコンを生成するプライマーセットを使用して評価した。このセットには、リボソームタンパク質Ｌ３２（３’アンプリコン及び５’アンプリコンは、２９８塩基離れている）、グルコースリン酸イソメラーゼ（３９１塩基離れている）、及びグルコースリン酸イソメラーゼ（８４２塩基離れている）用のものが含まれる。様々な調製組織に由来する試料を使用して、これらのプライマーセットについて、０．９５〜０．８０の比率を日常的に得た。更なる腫瘍試料及び正常試料を、病理学者が全体的に解剖し、液体窒素で瞬間冷凍し、ｈＢＤ−１及びｃＭＹＣ発現を評価した。
【０１３６】
ＤＥＦＢ１遺伝子のクローニング：ＤＥＦＢ１  ｃＤＮＡを、逆転写ＰＣＲでＲＮＡから生成した。ＰＣＲプライマーを、ＣｌａＩ及びＫｐｎＩの制限部位を含有するように設計した。ＤＥＦＢ１  ＰＣＲ産物を、ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで制限消化し、ＴＡクローニングベクターにライゲーションした。その後、ＴＡ／ＤＥＦＢ１ベクターを、ヒートショックにより大腸菌に形質移入し、個々のクローンを選択し、増殖した。プラスミドを、ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ社、バレンシア、カリフォルニア州）で大腸菌培養から単離し、自動塩基配列決定により配列完全性を確認した。その後、ＤＥＦＢ１遺伝子断片を、ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２にライゲーションした。これは、方向性を確保するための中間ベクターとしての役目を果たした。その後、ｐＴＲＥ２／ＤＥＦＢ１構築体を、ＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化して、ＤＥＦＢ１インサートを切り出し、それを、これもＡｐａＩ及びＫｐｎＩで同時消化したエクジソン誘導可能な発現系のｐＩＮＤベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）にライゲーションした。この構築体を、再び大腸菌に形質移入し、個々のクローンを選択し、増殖した。プラスミドを単離し、ｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１の配列完全性を、自動配列決定により再び確認した。
【０１３７】
細胞形質移入：細胞（１×１０６個）を、１００ｍｍのペトリ皿に接種し、一晩増殖した。その後、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を使用し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、グランドアイランド、ニューヨーク州）中で、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現する１μｇのｐＶｇＲＸＲプラスミド、及び１μｇのｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１ベクター構築体又は空のｐＩＮＤ対照ベクターと共に同時形質移入した。
【０１３８】
ＲＮＡ単離及び量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＤＥＦＢ１構築体で形質移入した細胞でのＤＥＦＢ１タンパク質発現を確認するために、ポナステロンＡ（Ｐｏｎ  Ａ）での２４時間の誘導期間後に、ＲＮＡを収集した。簡潔に述べると、全ＲＮＡを、ＳＶ全ＲＮＡ単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して、トリプシン処理により回収したおよそ１×１０６個の細胞から単離した。細胞を溶解し、全ＲＮＡを、スピンカラムによる遠心分離により単離した。ＬＣＭにより収集した細胞の場合、製造業者のプロトコールに従って、ＰｉｃｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マウントビュー、カリフォルニア州）を使用して、全ＲＮＡを単離した。無作為プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、両供給源に由来する全ＲＮＡ（１反応当たり０．５μｇ）を逆転写してｃＤＮＡにした。製造業者のプロトコールに従って、ＡＭＶ逆転写酵素ＩＩ酵素（１反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、ファーストストランド合成に使用し、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（１反応当たり５００単位；Ｐｒｏｍｅｇａ社）を、セカンドストランド合成に使用した。各々の場合、その後の１ＰＣＲ反応当たり５０ｐｇのｃＤＮＡを使用した。ＴａｑＭａｎ逆転写系に由来するＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（Reverse Transcripatase）及びＳＹＢＲＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、生成したｃＤＮＡに対して２段階ＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１３９】
ＤＥＦＢ１用のプライマー対を、公開されているＤＥＦＢ１配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ５０９３０）から生成した。プライマー配列は、以下の通りである：
【表２】
0005990274.tif 000003
【０１４０】
４０サイクルのＰＣＲを、標準条件下で５６℃のアニーリング温度を使用して実施した。加えて、β−アクチン（表２）をハウスキーピング遺伝子として増幅して、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。ＤＥＦＢ１発現を、ＤＥＦＢ１とβ−アクチンとの相対的発現比率として計算し、ＤＥＦＢ１発現を誘導した及び誘導しなかった細胞系並びにＬＣＭ良性前立腺組織で比較した。陰性対照として、ｃＤＮＡテンプレートを用いないＱＲＴ−ＰＣＲ反応も実施した。反応は全て、三重反復で３回実行した。
【０１４１】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ：細胞増殖に対するＤＥＦＢ１の影響を検査するために、代謝性３−［４，５−ジメチルチアゾール−２イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを実施した。ｐＶｇＲＸＲプラスミド及びｐＩＮＤ／ＤＥＦＢ１構築体又は空ｐＩＮＤベクターで同時形質移入したＰＣ３、ＤＵ１４５、及びＬＮＣａＰ細胞を、９６ウエルプレートにウエル当たり１〜５×１０３細胞で播種した。播種した２４時間後に、１０μＭポナステロンＡを含有する新しい増殖培地を毎日添加して、２４時間、４８時間、及び７２時間ＤＥＦＢ１発現を誘導し，その後製造業者の説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従って、ＭＴＴアッセイを実施した。反応は全て、三重反復で３回実施した。
【０１４２】
フローサイトメトリ：ＤＥＦＢ１発現系を同時トランスフェクトしたＰＣ３及びＤＵ１４５細胞を６０ｍｍの皿で増殖し、１０μＭのポナステロンＡにより１２、２４、及び４８時間誘導した。各インキュベーション時間後、培地をプレートから収集して（あらゆる非付着細胞を保持し）、プレートを洗浄するのに使用したＰＢＳと合わせた。残りの付着細胞をトリプシン処理により回収し、非付着細胞及びＰＢＳと合わせた。次いで、細胞を４℃で５分間ペレット化し（５００×ｇ）、ＰＢＳで２回洗浄し、５μｌのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び５μｌのＰＩを含有する１００μｌの１×アネキシン結合緩衝液（ｐＨ７．４の０．１Ｍ  ヘペス／ＮａＯＨ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁させた。細胞を暗所で室温にて１５分間インキュベートし、次いで４００μｌの１×アネキシン結合緩衝液で希釈し、ＦＡＣｓｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、カリフォルニア州サンノゼ）で分析した。全ての反応を３回実施した。
【０１４３】
顕微鏡分析：細胞形態を位相差顕微鏡法により分析した。ベクターを含まないか、空のプラスミド又はＤＥＦＢ１プラスミドを含有するＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞を、６ウェル培養プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、米国）に播種した。翌日、１０μＭのポナステロンＡを含有する培地でプラスミド含有細胞を４８時間の間誘導し、一方で、対照細胞には新鮮な培地を与えた。次いで、細胞を倒立型Ｚｅｉｓｓ  ＩＭ  ３５顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）下で観察した。ＳＰＯＴ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  Ｍｏｓａｉｃ  ４．２カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国）を用いて、細胞の１視野の位相差写真を得た。倍率３２倍の位相差顕微鏡で細胞を検査し、デジタル画像を非圧縮ＴＩＦＦファイルとして保存し、かつ画像処理及びハードコピーの提示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）にエクスポートした。
【０１４４】
カスパーゼ検出：前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出は、ＡＰＯ  ＬＯＧＩＸ（登録商標）Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ  Ｃａｓｐａｓｅ検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて行った。活性カスパーゼに不可逆的に結合するＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ阻害剤の使用により、活性カスパーゼを検出した。簡潔に述べると、ＤＥＦＢ１発現系を含有するＤＵ１４５及びＰＣ３細胞（１．５−３×１０５個）を３５ｍｍのガラス底マイクロウェル皿（Ｍａｔｅｋ社、マサチューセッツ州アッシュランド）に播種し、培地のみ、又は前述のＰｏｎＡ含有培地で２４時間処理した。次に、カルボキシフルオレセイン標識ペプチドフルオロメチルケトン（ＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫ）の１０μｌの３０倍作用希釈液を３００μｌの培地に添加し、各３５ｍｍ皿に加えた。次いで、細胞を５％のＣＯ２下で３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、２ｍｌの１倍作用希釈液の洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄した。細胞を、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）下で、又は４８８ｎｍのレーザー励起下で観察した。蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）及び６３倍のＤＩＣ油浸レンズをＶａｒｉｏ  ２  ＲＧＢ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｏｄｕｌｅと共に用いて分析した。
【０１４５】
統計分析：統計的な差異は、対応のない数値に対するスチューデントのｔ検定を用いて評価した。両側計算によりＰ値を決定し、０．０５未満のＰ値を統計学的に有意であると見なした。
【０１４６】
１．２  結果
前立腺の組織及び細胞株におけるＤＥＦＢ１発現：良性及び悪性の前立腺組織、ｈＰｒＥＣ前立腺上皮細胞並びにＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１発現レベルを、ＱＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＤＥＦＢ１発現は良性臨床試料の全てにおいて検出された。ＤＥＦＢ１相対発現の平均量は０．００７３であった。さらに、ｈＰｒＥＣ細胞におけるＤＥＦＢ１相対発現は０．００８９であった。良性の前立腺組織試料及びｈＰｒＥＣにおいて検出されたＤＥＦＢ１発現において、統計的な差異はなかった（図１Ａ）。前立腺癌細胞株における相対ＤＥＦＢ１発現レベルの分析により、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰにおけるレベルが有意に低いことが明らかとなった。さらなる基準点として、患者番号１２１５からの前立腺組織の隣接悪性切片での相対ＤＥＦＢ１発現を測定した。３つの前立腺癌株で観察されたＤＥＦＢ１発現のレベルは、患者番号１２１５からの悪性前立腺組織と比較して有意差はなかった（図１Ｂ）。さらに、全ての４つの試料における発現レベルは、内因性ＤＥＦＢ１発現がほとんど又は全く確認されないテンプレートを含まない陰性対照に近かった（データ未記載）。ＤＥＦＢ１発現系をトランスフェクトした前立腺癌細胞株に対してもＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。２４時間の誘導時間後、相対発現レベルはＤＵ１４５において０．０１３６０、ＰＣ３において０．０１５０３、及びＬＮＣａＰにおいて０．１３８であった。増幅産物をゲル電気泳動により検証した。
【０１４７】
良性、ＰＩＮ及び癌を含有する領域を含む前立腺組織において、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションによるＱＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＤＥＦＢ１の相対発現は良性領域で０．０１４６であるのに対し、悪性領域では０．０００９であった（図１Ｃ）。これは９４％の減少に相当し、有意な発現のダウンレギュレーションを再度証明するものである。さらに、ＰＩＮの分析から、ＤＥＦＢ１の発現レベルは７０％の減少である０．０４４であることが明らかとなった。患者番号１４５７における発現を、他の６人の患者の良性領域で認められた平均発現レベルと比較すると（図１Ａ）、ほぼ２倍の発現に相当する１．９９７の比率が明らかとなった（図１Ｄ）。しかしながら、良性組織における平均発現レベルと比較した発現比率は、ＰＩＮにおいて０．０５９５であり、かつ悪性組織において０．１２５であった。
【０１４８】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性及びラフリングを引き起こす：前立腺癌細胞株におけるＤＥＦＢ１の誘導は、ＤＵ１４５及びＰＣ３の細胞数における有意な減少をもたらしたが、ＬＮＣａＰにおける細胞増殖には影響を及ぼさなかった（図２）。陰性対照として、空のプラスミドを含有する３つの全ての株において細胞増殖をモニタリングした。ＰｏｎＡ添加後のＤＵ１４５、ＰＣ３又はＬＮＣａＰ細胞における観察可能な細胞形態の変化はなかった。さらに、ＤＥＦＢ１誘導により、ＤＵ１４５及びＰＣ３の両方において形態学的変化がもたらされた。細胞の外観はより円形であり、かつ細胞死の指標である膜ラフリングを呈した。両株にはアポトーシス小体も存在していた。
【０１４９】
ＤＥＦＢ１発現は細胞生存率の低下をもたらす：ＭＴＴアッセイにより、ＰＣ３及びＤＵ１４５細胞においてＤＥＦＢ１による細胞生存率の低下が示されたが、ＬＮＣａＰ細胞に対する有意な効果は示されなかった（図３）。２４時間後の相対細胞生存率は、ＤＵ１４５において７２％及びＰＣ３において５６％であった。誘導から４８時間後の分析では、ＤＵ１４５における４９％の細胞生存率及びＰＣ３における３７％の細胞生存率が明らかとなった。ＤＥＦＢ１発現から７２時間後には、ＤＵ１４５及びＰＣ３それぞれにおいて４４％及び２９％の相対細胞生存率がもたらされた。
【０１５０】
ＤＥＦＢ１は後期前立腺癌細胞において迅速なカスパーゼ媒介アポトーシスを引き起こす：ＰＣ３及びＤＵ１４５に対するＤＥＦＢ１の作用が細胞増殖抑制性又は細胞毒性であるのかどうかを決定するために、ＦＡＣＳ分析を行った。通常の増殖条件下で、９０％を超えるＰＣ３及びＤＵ１４５の培養物が生存可能かつ非アポトーシス性（左下象限）であり、アネキシンＶ又はＰＩで染色されなかった。ＰＣ３細胞においてＤＥＦＢ１発現を誘導した後のアポトーシス細胞数（右下及び右上象限）は、合計して１２時間で１０％、２４時間で２０％、及び４８時間で４４％であった（図４Ｂ）。ＤＵ１４５細胞について、アポトーシス細胞数は合計で、誘導から１２時間後に１２％、２４時間後に３４％、及び４８時間後に５９％であった（図４Ａ）。ＰｏｎＡによる誘導後の空のプラスミドを含有する細胞において、アポトーシスの増加は認められなかった（データ未掲載）。
【０１５１】
共焦点レーザー顕微鏡分析によりカスパーゼ活性を決定した（図５）。ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞においてＤＥＦＢ１発現を誘導し、活発にアポトーシスを起こしている細胞において緑色蛍光を発するＦＡＭ−ＶＡＤ−ＦＭＫとカスパーゼとの結合に基づいて、活性をモニタリングした。ＤＩＣ下での細胞の分析から、０時間における生存対照のＤＵ１４５（パネルＡ）、ＰＣ３（パネルＥ）及びＬＮＣａＰ（パネルＩ）細胞の存在が示された。４８８ｎｍの共焦点レーザーによる励起からは検出可能な緑色染色は生じず、それはＤＵ１４５（パネルＢ）、ＰＣ３（パネルＦ）又はＬＮＣａＰ（パネルＪ）においてカスパーゼ活性がないことを示している。２４時間の誘導後、ＤＵ１４５（パネルＣ）、ＰＣ３（パネルＧ）及びＬＮＣａＰ（パネルＫ）細胞はＤＩＣ下で再度見ることができた。蛍光下での共焦点分析から、ＤＵ１４５（パネルＤ）及びＰＣ３（パネルＨ）細胞においてカスパーゼ活性を示す緑色染色が明らかとなった。しかしながら、ＬＮＣａＰ（パネルＬ）では緑色染色はなく、それはＤＥＦＢ１によりアポトーシスが誘導されないことを示した。
【０１５２】
結論として、本研究では前立腺癌におけるＤＥＦＢ１の機能的役割を提供する。さらに、これらの知見から、ＤＥＦＢ１が腫瘍免疫に関与する自然免疫系の一部であることが示される。提示するデータは、生理学的レベルで発現したＤＥＦＢ１は、ＡＲ−ホルモン抵抗性前立腺癌細胞に対して細胞毒性を示すが、ＡＲ＋ホルモン感受性前立腺癌細胞又は正常前立腺上皮細胞に対してはそうでないことを実証する。ＤＥＦＢ１が正常前立腺細胞において細胞毒性を有さずに構成的に発現されることを考えると、後期ＡＲ−前立腺癌細胞は自らをＤＥＦＢ１細胞毒性に対して感受性とする異なる表現型特性を有しているのかもしれない。したがって、ＤＥＦＢ１は後期前立腺癌の治療に対する有望な治療薬であり、また他の癌に対しても同様である可能性がある。
【実施例２】
【０１５３】
ＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンはｐ５３状態非依存性の前立腺癌細胞死をもたらす
本実施例では、ｐ５３遺伝子状態が異なる前立腺癌細胞におけるＲＮＡ干渉によるＰＡＸ２発現阻害の効果を検討する。結果から、ＰＡＸ２阻害によりｐ５３状態に関係なく細胞死がもたらされることが実証され、それは前立腺癌においてＰＡＸ２によって阻害されるさらなる腫瘍抑制遺伝子又は細胞死経路が存在することを示すものである。
【０１５４】
２．１  材料及び方法
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：効率的な遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトＰＡＸ２ｍＲＮＡ（アクセション番号ＮＭ＿００３９８９．１）を標的とする４つの相補的な低分子干渉リボヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）のプールを合成した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、米国コロラド州ラファイエット）。４つのｓｉＲＮＡの第２プールを内部標準として使用して、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの特異性を試験した。合成した配列のうちの２つはＧＬ２ルシフェラーゼｍＲＮＡ（アクセション番号Ｘ６５３２４）を標的とし、２つは非配列特異的であった（表３）。ｓｉＲＮＡのアニーリングについて、３５Ｍの１本鎖をアニーリング緩衝液（１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ  酢酸マグネシウム）中で９０℃にて１分間インキュベートし、続いて３７℃で１時間インキュベートした。
【表３】
0005990274.tif 000004
【０１５５】
ウェスタンブロット分析：簡潔に述べると、細胞をトリプシン処理により回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。溶解緩衝液を製造元の使用説明書（Ｓｉｇｍａ社）に従って調製し、次いで細胞に添加した。オービタルシェーカー上で４℃にて１５分間インキュベーションした後、細胞溶解物を次いで採取し、１２０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞破片をペレット化した。次いで、タンパク質含有上清を採取して定量した。次に、２５μｇのタンパク質抽出物を８−１６％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｎｏｖｅｘ）に装填した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、次いでＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）中５％脱脂粉乳液で１時間ブロッキングした。次いで、ブロットを１：２０００希釈のウサギ抗ＰＡＸ２一次抗体（Ｚｙｍｅｄ社、カリフォルニア州サンフランシスコ）でプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ抗体（１：５０００希釈、Ｓｉｇｍａ社）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００において化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（１：５０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で再プローブし、シグナル検出を再度可視化した。
【０１５６】
位相差顕微鏡法：ＰＡＸ２ノックダウンの細胞増殖に対する効果を位相差顕微鏡法により実施例１の記載に従って分析した。
【０１５７】
ＭＴＴ細胞毒性アッセイ：製造元のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従って、Ｃｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬を使用して、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞（１×１０５）に０．５μｇのＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡプール又は対照ｓｉＲＮＡプールをトランスフェクトした。次に、細胞懸濁液を希釈し、９６ウェルプレートにウェル当たり１〜５×１０３細胞で播種し、２、４又は６日間増殖させた。培養後、３−[４，５−ジメチルチアゾール−２イル]−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド、ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の着色ホルマザン生成物への変換を測定することにより細胞生存率を決定した。走査型マルチウェル分光光度計で５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
【０１５８】
汎カスパーゼ検出：前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を実施例１の記載に従って実施した。
【０１５９】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ：実施例１に記載したように定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施し、ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ処理後の遺伝子発現を確認した。ＧＡＰＤＨ（対照遺伝子）、ＢＡＸ、ＢＩＤ及びＢＡＤのプライマ対は以下の通りである：
【表４】
0005990274.tif 000005
【０１６０】
反応は、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）において行った。６０℃のアニーリング温度を使用して標準条件下で４０サイクルのＰＣＲを実施した。定量値は、指数的増幅が開始するサイクル数（閾値）により決定し、かつ３回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値との間には逆関係があった。さらに、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。遺伝子発現は、プロアポトーシス遺伝子とＧＡＰＤＨとの間の相対発現比率として計算した。全ての反応は３連で行った。
【０１６１】
２．２  結果
ＰＡＸ２タンパク質発現のｓｉＲＮＡ阻害：ｓｉＲＮＡが効果的にＰＡＸ２ｍＲＮＡを標的としていることを確認するために、ウェスタンブロット分析を実施して、６日間の処理期間にわたってＰＡＸ２タンパク質発現レベルをモニタリングした。細胞においてＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡプールによるトランスフェクションを１ラウンド実施した。結果から、ＤＵ１４５における４日目（図６、パネルＡ）及びＰＣ３における６日目（図６、パネルＢ）までにＰＡＸ２タンパク質のノックダウンが示されたことにより、ＰＡＸ２ｍＲＮＡの特異的標的化が確認された。
【０１６２】
ＰＸ２のノックダウンにより前立腺癌細胞の増殖が阻害される：培地のみ、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡによる６日間の処理期間後に細胞を分析した（図７）。ＤＵ１４５（パネルＡ）、ＰＣ３（パネルＤ）及びＬＮＣａＰ（パネルＧ）細胞は全て、培地のみを含有する培養皿中で少なくとも９０％のコンフルエントに達した。ＤＵ１４５（パネルＢ）、ＰＣ３（パネルＥ）及びＬＮＣａＰ（パネルＨ）を陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡで処理しても、細胞増殖に影響を及ぼさず、かつ細胞は再度６日後にコンフルエントに達した。しかしながら、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡでの処理により、細胞数における有意な減少がもたらされた。ＤＵ１４５細胞は約１５％コンフルエント（パネルＣ）であり、かつＰＣ３細胞はわずか１０％コンフルエント（パネルＦ）であった。ｓｉＲＮＡ処理後、ＬＮＣａＰ細胞は５％コンフルエントであった。
【０１６３】
細胞毒性アッセイ：２、４、及び６日間の曝露期間後に細胞生存率を測定し、かつ処理細胞の５７０−６３０ｎｍの吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比率として表す（図８）。２日間処理した後の相対細胞生存率は、ＬＮＣａＰにおいて７７％、ＤＵ１４５において８２％、及びＰＣ３において７８％であった。４日後、相対細胞生存率は、ＬＮＣａＰにおいて４６％、ＤＵ１４５において５３％、及びＰＣ３において６３％であった。６日間の処理後、相対細胞生存率は、ＬＮＣａＰにおいて３１％、ＰＣ３において３７％、及びＤＵ１４５において５３％まで低下した。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡ又はトランスフェクション試薬単独での６日間の処理期間後に細胞生存率を測定した。両方の条件において、通常の増殖培地と比較して細胞生存率における統計的に有意な変化はなかった。
【０１６４】
汎カスパーゼ検出：カスパーゼ活性を共焦点レーザー顕微鏡分析により検出した。ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、緑色蛍光を発する活発にアポトーシスを起こしている細胞のカスパーゼとＦＡＭ標識ペプチドとの結合に基づいて活性をモニタリングした。培地のみで処理した細胞のＤＩＣ下での分析は、０時間での生存可能なＤＵ１４５（Ａ）、ＰＣ３（Ｅ）及びＬＮＣａＰ（Ｉ）細胞の存在を示している（図９）。４８８ｎｍの共焦点レーザーによる励起からは検出可能な緑色染色は生じず、それは未処理ＤＵ１４５（Ｂ）、ＰＣ３（Ｆ）又はＬＮＣａＰ（Ｊ）においてカスパーゼ活性がないことを示している。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡでの４日間の処理後、ＤＵ１４５（Ｃ）、ＰＣ３（Ｇ）及びＬＮＣａＰ（Ｋ）細胞はＤＩＣ下で再度見ることができた。蛍光下では、処理されたＤＵ１４５（Ｄ）、ＰＣ３（Ｈ）及びＬＮＣａＰ（Ｌ）細胞は、カスパーゼ活性を示す緑色染色を呈した。
【０１６５】
ＰＡＸ２阻害がプロアポトーシス因子に及ぼす影響：ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで６日間処理し、ｐ５３転写調節依存性及び非依存性のプロアポトーシス遺伝子発現を測定し、細胞死経路をモニタリングした。ＢＡＸについては、ＬＮＣａＰにおいて１．８１倍の増加、ＤＵ１４５において２．７３倍の増加、及びＰＣ３において１．８７倍の増加があった（図１０、パネルＡ）。ＢＩＤの発現レベルは、ＬＮＣａＰにおいて１．３８倍及びＤＵ１４５において１．７７倍増加した（図１０、パネルＢ）。しかしながら、ＢＩＤ発現レベルは、ＰＣ３において処理後に１．４４分の１に低下した（図１０、パネルＣ）。ＢＡＤの解析により、ＬＮＣａＰにおける２．０倍の発現増加、ＤＵ１４５における１．３８倍の増加、かつＰＣ３における１．５８倍の増加が明らかとなった。
【０１６６】
これらの結果は、前立腺癌細胞の生存がＰＡＸ２発現に依存的であることを実証している。ｐ５３発現細胞株ＬＮＣａＰ、ｐ５３変異株ＤＵ１４５、及びｐ５３欠損株ＰＣ３におけるＰＡＸ２ノックダウンの結果としてｐ５３が活性化され、その後３つの全ての株においてカスパーゼ活性を検出し、それはプログラムされた細胞死の開始を示すものであった。ＢＡＸ発現は、ｐ５３状態に非依存的に全ての３つの細胞株においてアップレギュレートされた。プロアポトーシス因子ＢＡＤの発現もまた、ＰＡＸ２阻害に続いて全ての３つの株で増加した。ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理後、ＢＩＤ発現はＬＮＣａＰ及びＤＵ１４５において増加したが、実はＰＣ３において低下した。これらの結果から、前立腺癌において認められた細胞死はｐ５３発現に影響されるが、これに依存しないことが示される。ｐ５３状態に関係なく異なる細胞死経路を介した前立腺癌細胞におけるアポトーシスの開始により、ＰＡＸ２が他の腫瘍抑制因子を阻害することが示される。
【実施例３】
【０１６７】
ＰＡＸ２癌遺伝子の阻害は、前立腺癌細胞のＤＥＦＢ１媒介死をもたらす
新規癌治療薬の開発の標的としての役目を果たす腫瘍特異的分子の同定は、癌研究における主要な目標であると考えられている。実施例１では、前立腺癌において高頻度のＤＥＦＢ１発現の低下があること、及びＤＥＦＢ１発現の誘導はアンドロゲン受容体陰性ステージ前立腺癌における急速なアポトーシスをもたらすことが実証された。これらのデータは、ＤＥＦＢ１が前立腺腫瘍の抑制において役割を果たしていることを示している。さらに、ＤＥＦＢ１が正常な前立腺上皮の免疫系における自然発生的な成分であることを考えると、ＤＥＦＢ１は副作用がわずか、又は副作用がない有望な治療薬になると期待される。実施例２は、ＰＡＸ２発現を阻害することにより、ｐ５３非依存性の前立腺癌細胞死がもたらされることを実証した。これらのデータは、ＰＡＸ２により阻害されるさらなるプロアポトーシス因子又は腫瘍抑制因子があることを示している。さらに、データは、前立腺癌において過剰発現される発癌因子ＰＡＸ２が、ＤＥＦＢ１の転写リプレッサであることを示している。本研究の目的は、ＤＥＦＢ１発現の低下がＰＡＸ２癌遺伝子の異常発現によるものであるのか、及びＰＡＸ２の阻害によりＤＥＦＢ１発現及びＤＥＦＢ１媒介細胞死がもたらされるかどうかを決定することである（図１１）。
【０１６８】
３．１  材料及び方法
ＲＮＡの単離及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡの単離及びＤＥＦＢ１の定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施例１に記載の通りに実施した。
【０１６９】
ＤＥＦＢ１レポータ構築物の作製：ｐＧＬ３ルシフェラーゼレポータプラスミドを使用してＤＥＦＢ１レポータ活性をモニタリングした。ＤＥＦＢ１転写開始部位の１６０塩基上流の領域は、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスを含んだ。領域はまた、ＰＡＸ２結合に必要なＣＣＴＴＧ（配列番号：１）配列も含んだ。ＰＣＲプライマはＫｐｎＩ及びＮｈｅＩの制限部位を含むように設計した。ＤＥＦＢ１プロモータのＰＣＲ産物をＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで制限消化し、同様に制限消化したｐＧＬ３プラスミドにライゲーションした（図１２）。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。プラスミドを単離し、自動配列決定によりＤＥＦＢ１／ｐＧＬ３構築物の配列完全性を検証した。
【０１７０】
ルシフェラーゼレポータアッセイ：１μｇのＤＥＦＢ１レポータ構築物又は対照ｐＧＬ３プラスミドを、１×１０６個のＤＵ１４５細胞にトランスフェクトした。次に、０．５×１０３個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩増殖させた。その後、ＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡを含有する新鮮培地又は培地のみを添加し、細胞を４８時間インキュベートした。製造元のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従ってＢｒｉｇｈｔＧｌｏキットによりルシフェラーゼを検出し、プレートをＶｅｒｉｔａｓ社の自動９６ウェルルミノメータで読み取った。プロモータ活性を相対発光として表した。
【０１７１】
膜透過性分析：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施して、凝縮クロマチン染色によって細胞膜完全性の変化及びアポトーシス細胞を同定した。ＡＯは生存細胞だけでなく初期のアポトーシス細胞も染色し、一方でＥｔＢｒは膜透過性を失った後期アポトーシス細胞を染色する。簡潔に述べると、細胞を２穴チャンバ培養スライド（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、米国）に播種した。空のｐＩＮＤプラスミド／ｐｖｇＲＸＲ又はｐＩＮＤ  ＤＥＦＢ１／ｐｖｇＲＸＲでトランスフェクトした細胞を、１０μＭのポナステロンＡを含有する培地で２４又は４８時間誘導した。対照細胞には、２４時間及び４８時間で新鮮培地を供給した。ＰＡＸ２阻害が膜完全性に与える効果を決定するために、ＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰを含有する別個の培養スライドをＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで処理し、４日間インキュベートした。この後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＡＯ（Ｓｉｇｍａ社、米国）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、米国）との２ｍｌの混合溶液（１：１）（５μｇ/ｍｌ）で５分間染色した。染色後、細胞を再びＰＢＳで洗浄した。蛍光はＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ  Ｖａｒｉｏ  ２  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ  イェーナ）によって観察した。励起カラーホイールはＢＳ５０５−５３０（緑）及びＬＰ５６０（赤）のフィルタブロックを含み、それはＡＯから発光された緑色光を緑色チャネルに、かつＥｔＢｒからの赤色光を赤色チャネルに分離可能とした。それぞれ個々の実験内でのレーザー出力及び利得制御設定は、対照とＤＥＦＢ１誘導細胞との間で同一であった。ＡＯに対して５４３ｎｍ、及びＥｔＢｒに対して４８８ｎｍの波長でＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起を提供した。スライドを倍率４０倍で分析し、デジタル画像を非圧縮ＴＩＦＦファイルとして保存し、かつ画像処理及びハードコピーの提示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）にエクスポートした。
【０１７２】
ＰＡＸ２のＣｈＩＰ分析：クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により、転写因子によるプロモータのインビボ占有及び免疫沈降による転写因子結合クロマチンの濃縮に基づいて、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位の同定が可能となる。ＤＵ１４５及びＰＣ３細胞株はＰＡＸ２タンパク質を過剰発現するが、ＤＥＦＢ１を発現しない。細胞を１．０％のホルムアルデヒドを含有するＰＢＳで１０分間インキュベートして、タンパク質をＤＮＡに架橋させた。次いで、試料を超音波処理し、６００ｂｐの平均長のＤＮＡを得た。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで事前に清澄化した超音波処理クロマチンを、ＰＡＸ２特異抗体又は「無抗体」対照[アイソタイプ一致対照抗体]と共にインキュベートした。次いで、洗浄した免疫沈降物を収集した。架橋を元に戻した後、ＤＮＡをプロモータ特異的プライマを用いてＰＣＲにより分析し、ＤＥＦＢ１がＰＡＸ２免疫沈降試料に示されるかどうかを決定した。プライマは、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックス及び機能ＣＣＴＴＧ（配列番号：１）ＰＡＸ２認識部位を含むＤＥＦＢ１ｍＲＮＡ開始部位のすぐ上流の１６０ｂｐ領域を増幅するように設計した。これらの研究について、陽性対照に（免疫沈降前であるが、架橋は戻された）入力クロマチンの一定分量のＰＣＲを含めた。全てのステップは、プロテアーゼ阻害剤の存在下で実施した。
【０１７３】
３．２  結果
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１発現を増加させる：ｓｉＲＮＡ処理前のＤＥＦＢ１発現のＱＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＤＵ１４５において０．０００９７、ＰＣ３において０．００００１、及びＬＮＣａＰにおいて０．０００４の相対発現レベルが明らかとなった（図１３）。ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡノックダウンの後、相対発現は、ＤＵ１４５において０．０３２９４（３３８倍の増加）、ＰＣ３において０．０００２０（２２．２倍の増加）、及びＬＮＣａＰにおいて０．０００１９（４．９２倍の増加）であった。陰性対照として、ＰＡＸ２欠損株であるヒト前立腺上皮細胞株（ｈＰｒＥＣ）は、処理前に０．００６８７、及びｓｉＲＮＡ処理後に０．００６６１の発現レベルを明らかとし、これによりＤＥＦＢ１発現において統計的変化がないことが確認された。
【０１７４】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡ阻害はＤＥＦＢ１プロモータ活性を増加させる：図１４は、ＰＡＸ２阻害によりＤＥＦＢ１プロモータ活性の増加がもたらされることを示している。ＰＣ３プロモータ／ｐＧＬ３及びＤＵ１４５プロモータ／ｐＧＬ３構築物を作製し、ＰＣ３及びＤＵ１４５細胞それぞれにトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ処理によるＰＡＸ２阻害前後にプロモータ活性を比較した。ＤＥＦＢ１プロモータ活性は、処理後にＤＵ１４５において２．６５倍、及びＰＣ３において３．７８倍増加した。
【０１７５】
ＤＥＦＢ１は細胞膜透過性をもたらす：膜完全性を共焦点分析によりモニタリングした。図１５に示すように、膜透過性の無傷細胞はＡＯにより緑色に染色される。さらに、膜非透過性の形質膜障害を有する細胞はＥｔＢｒにより赤色に染色され得る。非誘導ＤＵ１４５（Ａ）及びＰＣ３（Ｄ）細胞はＡＯで陽性染色されて緑色発光したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。しかしながら、ＤＵ１４５（Ｂ）及びＰＣ３（Ｅ）両方でのＤＥＦＢ１誘導により、２４時間での赤色染色によって示される細胞質におけるＥｔＢｒの蓄積がもたらされた。４８時間後までに、ＤＵ１４５（Ｃ）及びＰＣ３（Ｆ）は凝縮核を有し、かつ見かけ上黄色となるが、これはＡＯ及びＥｔＢｒそれぞれの蓄積に起因する緑色と赤色の両方の染色の存在によるものであった。
【０１７６】
ＰＡＸ２阻害は膜透過性をもたらす：細胞をＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡで４日間処理し、膜完全性を共焦点分析により再度モニタリングした。図１６に示すように、ＤＵ１４５及びＰＣ３の両方は凝縮核を有し、かつ見かけ上黄色であった。しかしながら、ＬＮＣａＰ細胞の細胞質及び核は、ｓｉＲＮＡ処理後も緑色のままであった。また、細胞周囲の赤色染色は、細胞膜完全性の維持を示している。これらの知見は、ＰＡＸ２阻害は、ＤＵ１４５及びＰＣ３における特異的なＤＥＦＢ１媒介細胞死をもたらすが、ＬＮＣａＰ細胞においてはもたらさないことを示している。ＬＮＣａＰにおいて認められた死は、ＰＡＸ２阻害後のＬＮＣａＰにおける既存の野生型ｐ５３のトランス活性化によるものである。
【０１７７】
ＰＡＸ２はＤＥＦＢ１プロモータに結合する：ＣｈＩＰ分析をＤＵ１４５及びＰＣ３細胞において実施し、ＰＡＸ２転写リプレッサがＤＥＦＢ１プロモータに結合するかどうかを決定した（図１７）。図１７Ａでは、レーン１は分子量１００ｂｐのマーカーを含んでいる。レーン２は、架橋及び免疫沈降前にＤＵ１４５から増幅したＤＥＦＢ１プロモータの１６０ｂｐ領域を表す陽性対照である。レーン３は、ＤＮＡを用いずに実施したＰＣＲを表す陰性対照である。レーン４及び５は、架橋したＤＵ１４５及びＰＣ３それぞれに由来するＩｇＧを用いて実施した免疫沈降物からのＰＣＲを表す陰性対照である。架橋後に抗ＰＡＸ２抗体で免疫沈降した２５ｐｇのＤＮＡ（レーン６及び８）及び５０ｐｇのＤＮＡ（レーン７及び９）のＰＣＲ増幅は、ＤＵ１４５及びＰＣ３それぞれにおいて１６０ｂｐのプロモータ断片を示している。
【０１７８】
図１７Ｂでは、レーン１は分子量１００ｂｐのマーカーを含んでいる。レーン２は、架橋及び免疫沈降前にＤＵ１４５から増幅したＤＥＦＢ１プロモータの１６０ｂｐ領域を表す陽性対照である。レーン３は、ＤＮＡを用いずに実施したＰＣＲを表す陰性対照である。レーン４及び５は、架橋したＤＵ１４５及びＰＣ３それぞれに由来するＩｇＧを用いて実施した免疫沈降物からのＰＣＲを表す陰性対照である。架橋後に抗ＰＡＸ２抗体で免疫沈降した２５ｐｇのＤＮＡ（レーン６及び８）及び５０ｐｇのＤＮＡ（レーン７及び９）のＰＣＲ増幅は、ＤＵ１４５及びＰＣ３それぞれにおいて１６０ｂｐのプロモータ断片を示している。
【０１７９】
この実施例の結果は、発癌因子ＰＡＸ２がＤＥＦＢ１発現を抑制することを実証している。抑制は転写レベルで起こる。さらに、ＤＥＦＢ１プロモータのコンピュータ解析から、ＤＥＦＢ１  ＴＡＴＡボックスに隣接するＰＡＸ２転写リプレッサに対するＣＣＴＴＧ（配列番号１）ＤＮＡ結合部位の存在が明らかとなった（図１）。デフェンシン細胞毒性の顕著な特徴の１つは、膜完全性の破壊である。これらの結果は、前立腺癌細胞におけるＤＥＦＢ１の異所性発現は細胞膜障害による膜電位の消失をもたらすことを示している。同様の現象がＰＡＸ２タンパク質発現を阻害した後に認められる。従って、ＰＡＸ２の発現又は機能の抑制は、ＤＥＦＢ１発現の回復及びその後のＤＥＦＢ１媒介細胞死をもたらす。また、本結果から、自然免疫による前立腺癌治療、及び潜在的な他の癌治療のための直接療法としてＤＥＦＢ１の有用性が確立される。
【実施例４】
【０１８０】
移植腫瘍細胞におけるＤＥＦＢ１発現の効果
ＤＥＦＢ１を過剰発現する腫瘍細胞をヌードマウスに注射することによって、ＤＥＦＢ１の抗腫瘍能を評価する。両方向テトラサイクリン応答性プロモータを有するｐＢＩ−ＥＧＦＰベクターにＤＥＦＢ１をクローニングする。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ細胞株は、ｐＴｅｔ−ＯｆｆをＤＵ１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞にトランスフェクトし、かつＧ４１８で選択することにより作製される。ｐＢＩ−ＥＧＦＰ−ＤＥＦＢ１プラスミドを、ｐＴＫ−Ｈｙｇと共にＴｅｔ−Ｏｆｆ細胞株に同時トランスフェクトし、かつハイグロマイシンで選択する。生存率＞９０％の単一細胞懸濁液のみを使用する。各動物において、約５００，０００個の細胞を雌ヌードマウスの右脇腹に皮下投与する。ベクターのみのクローンを注射した対照群及びＤＥＦＢ１過剰発現クローンを注射した群の２群が存在する。統計学者による判定に従い、３５匹のマウスが各群に含まれる。動物を週２回計量し、腫瘍増殖をキャリパーでモニタリングし、かつ次の式を用いて腫瘍体積を決定する：体積＝０．５×（幅）２×長さ。腫瘍の大きさが２ｍｍ３に達したとき、又は移植から６ヶ月後に、全ての動物をＣＯ２過剰投与により屠殺する；腫瘍を切除し、計量し、中性緩衝ホルマリンに保存して病理学的検査を行う。群間の腫瘍増殖の差異を、要約統計量及びグラフ表示によって記述的に特徴付ける。統計的有意性はｔ検定又はノンパラメトリックな同等法のいずれかで評価する。
【実施例５】
【０１８１】
移植腫瘍細胞に対するＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡの影響
インビトロ試験で用いたヘアピンＰＡＸ２  ｓｉＲＮＡ鋳型オリゴヌクレオチドを用いて、インビボでＤＥＦＢ１発現のアップレギュレーションの影響を検討する。センス及びアンチセンス鎖（表３参照）をアニーリングし、ヒトＵ６  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータの制御下で、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１  Ｕ６  ｈｙｇｒｏ  ｓｉＲＮＡ発現ベクター（Ａｍｂｉｏｎ）にクローニングする。クローン化プラスミドを配列決定し、検証して、ＰＣ３、ＤＵ１４５及びＬＮＣａｐ細胞株にトランスフェクトする。スクランブルｓｈＲＮＡをクローニングし、本試験における陰性対照として用いる。ハイグロマイシン耐性コロニーを選択し、マウスに細胞を皮下導入し、かつ腫瘍増殖を上述の通りにモニタリングする。
【実施例６】
【０１８２】
ＤＥＦＢ１プロモータに結合するＰＡＸ２の小分子阻害剤の影響
ＰＡＸ２  ＤＮＡ結合ドメインに相補的な短鎖オリゴヌクレオチドが提供される。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、以下で提供されるＣＣＴＴＧ（配列番号１）認識配列を含む２０量体及び４０量体のオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらの鎖長は無作為に選択したが、他の鎖長は結合の遮断に有効であると予測される。陰性対照としてスクランブル配列（ＣＴＣＴＧ）（配列番号２２）を有するオリゴヌクレオチドを設計して特異性を検証した。オリゴヌクレオチドは、リポフェクタミン試薬又はＣｏｄｅｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって前立腺癌細胞及びＨＰｒＥｃ細胞にトランスフェクトする。ＤＮＡ−タンパク質相互作用を確認するために、２本鎖オリゴヌクレオチドを［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、電気泳動移動度シフトアッセイを実施する。オリゴヌクレオチドで処理した後に、ＱＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタン分析によりＤＥＦＢ１発現をモニタリング可能である。最後に、前述のようにＭＴＴアッセイ及びフローサイトメトリにより細胞死を検出し得る。
認識配列番号１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣ（配列番号１８）
認識配列番号２：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号１９）
スクランブル配列番号１：ＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣ（配列番号２３）
認識配列番号３：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号２０）
認識配列番号４：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号２１）
スクランブル配列番号２：ＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣ（配列番号２４）
本発明のオリゴヌクレオチドのさらなる例は以下のものを含む：
認識配列番号１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２５）
認識配列番号２：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２６）
スクランブル配列番号１：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴ−３’（配列番号２７）
認識配列番号３：５’−ＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２８）
認識配列番号４：５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号２９）
スクランブル配列番号２：５’−ＧＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号３０）
【０１８３】
この代替的な阻害性オリゴヌクレオチド集合は、ＤＥＦＢ１プロモータ（配列番号：２５及び２８）に由来するＰＡＸ２結合に対する認識配列を含む。ＰＡＸ２遺伝子は、前立腺を含む多様な癌細胞の増殖及び生存のために必要とされる。さらに、ＰＡＸ２発現の阻害によって自然免疫成分ＤＥＦＢ１により媒介される細胞死がもたらされる。ＤＥＦＢ１の発現及び活性の抑制は、ＰＡＸ２タンパク質がＤＥＦＢ１プロモータ内ＣＣＴＴＧ（配列番号１）認識部位を含む２本鎖オリゴヌクレオチドデコイの過剰量と結合することによって達成され得る。このようなオリゴヌクレオチドデコイの使用は、前立腺癌の治療に有望な治療標的を提供する。この方法では、オリゴヌクレオチドデコイとＰＡＸ２との結合により、ＰＡＸ２とＤＥＦＢ１プロモータとの結合が阻止又は低減され、それ故ＤＥＦＢ１発現が継続可能となる。上述のオリゴヌクレオチド配列及び実験は、さらなるＰＡＸ２阻害薬を設計するためのモデルを示した例である。
【実施例７】
【０１８４】
ＤＥＦＢ１発現の減少によって腫瘍形成が増加する
機能低下マウスの作製：Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムは、前立腺発癌の基盤をなす分子的機構の解明において有用となっている。前立腺内における誘導崩壊にＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯが用いられる。ＤＥＦＢ１  Ｃｒｅ条件付きＫＯは、ＤＥＦＢ１コードエクソンを挟むｌｏｘＰ部位を含有するターゲッティングベクターの作製、このベクターを有する標的ＥＳ細胞、及びこれらの標的ＥＳ細胞からの生殖細胞系列キメラマウスの作製を包含する。ヘテロ接合体を前立腺特異的Ｃｒｅトランスジェニック体と交配させ、ヘテロ接合体交雑雑種を用いて前立腺特異的ＤＥＦＢ１  ＫＯマウスを作製する。４つの遺伝毒性化学化合物がげっ歯類に前立腺癌を誘発することが確認されている：Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）、Ｎ−ニトロソビス２−オキソプロピルアミン（ＢＯＰ）、３，２Ｘ−ジメチル−４−アミノ−ビフェニル（ＭＡＢ）及び２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾール（ｐｈｅｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｗ）４，５−ビピリジン（ＰｈＩＰ）。前立腺の腺腫及び腺癌における誘発試験のために、これらの発癌化合物を胃内投与又は静脈内注射してＤＥＦＢ１−トランスジェニックマウスを処理する。組織学、免疫組織学、ｍＲＮＡ及びタンパク質の分析により、腫瘍増殖の差異及び遺伝子発現の変化について前立腺試料を試験する。
【０１８５】
ＧＯＦマウスの作製：ＰＡＸ２誘導可能ＧＯＦマウスについて、ＰＡＸ２  ＧＯＦ（バイトランスジェニック）及び野生型（モノトランスジェニック）の同腹仔に対し、５週齢よりドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を投与し、前立腺特異性ＰＡＸ２発現を誘発する。簡潔に述べると、ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡモノトランスジェニックマウス（ｔｅｔ依存性ｒｔＴＡ誘導物質の前立腺細胞特異的発現）を本発明者らのＰＡＸ２トランスジェニック応答動物系と交配する。バイトランスジェニックマウスには、誘導のために飲料水よりＤｏｘを給餌する（週２回、５００ｍｇ／Ｌを新たに調製）。バイトランスジェニックマウスにおけるトランスジェニックファウンダー系統を用い、初回の実験より低いバックグラウンドレベル、良好な誘導性並びにＰＡＸ２及びＥＧＦＰレポータの細胞型特異的発現を確認する。実験群のサイズについては、各群（野生型及びＧＯＦ）において年齢及び性別でマッチングした５〜７個体によって統計的有意性を考慮する。本試験における全動物について、分析及び比較のために、始めに前立腺組織を１週間間隔で採取して発癌時間パラメーターを決定する。
【０１８６】
ＰＣＲ遺伝子型決定、ＲＴ−ＰＣＲ及びｑＰＣＲ：以下のＰＣＲプライマ及び条件を用いて、ＰＲＯＢＡＳＩＮ−ｒｔＴＡトランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する：
ＰＲＯＢＡＳＩＮ５（フォワード）５’−ＡＣＴＧＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号：３１）；
ＲＴＴＡ３（リバース）５’−ＡＡＡＡＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：３２）；
【０１８７】
９５℃で５分間変性、その後９５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクル、その後７２℃で５分間伸長し、６００ｂｐの産物を得る。以下のＰＣＲプライマ及び条件を用いて、ＰＡＸ２誘導可能トランスジェニックマウスの遺伝子型を決定する：
ＰＡＸ２フォワード５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号：３３）；
リバース５’ＩＲＥＳ５’−ＴＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＣＡＡＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧ−３’（配列番号：３４）；
【０１８８】
９５℃で５分間変性、その後９５℃で３０秒、６３℃で３０秒、７２℃で３０秒の３４サイクル、その後７２℃で５分間伸長し、４６０ｂｐの産物を得る。
【０１８９】
以下のＰＣＲプライマ及び条件を用いて、Ｉｍｍｏｒｔｏｍｏｕｓｅヘミ接合体の遺伝子型を決定する：Ｉｍｍｏｌ１、５’−ＧＣＧＣＴＴＧＴＧＴＣＧＣＣＡＴＴＧＴＡＴＴＣ−３’（配列番号：３５）；Ｉｍｍｏｌ２，５’−ＧＴＣＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号：３６）；
【０１９０】
９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１分３０秒、３０サイクルで約１ｋｂの導入遺伝子バンドを得る。ＰＡＸ２ノックアウトマウスの遺伝子型を決定するために、以下のＰＣＲプライマ及び条件を用いる：
ＰＡＸ２フォワード５’−ＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＡＣＣＧＧＡＧ−３’（配列番号：３７）；
ＰＡＸ２リバース５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＧＡＴＧＣ−３’（配列番号：３８）；
【０１９１】
９４℃で１分、６５℃で１分、７２℃で３０秒、３６サイクルで２８０ｂｐのバンドを得る。
【０１９２】
ＤＥＦＢ１ペプチド動物試験：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社より購入した６週齢の雄胸腺欠損（ヌード）マウスの肩甲骨皮下に、１０６個の生存ＰＣ３細胞を注射する。注射から１週間後、動物を３群のうちの１群に無作為に割り付けする−Ｉ群：対照；ＩＩ群：ＤＥＦＢ１を１００μｇ／日、週５日、２〜１４週間腹腔内注射；ＩＩＩ群：ＤＥＦＢ１を１００μｇ／日、週５日、８〜１４週間腹腔内注射。動物は、１ケージにつき４匹として無菌飼育で維持し、毎日観察する。腫瘍を１０日間隔でキャリパーを用いて測定し、腫瘍の体積はＶ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて算出する。
【実施例８】
【０１９３】
上皮内の腫瘍及び癌の化学予防を目的としたＰＡＸ２発現の標的化
癌化学予防は、癌の予防、又は前癌状態若しくはさらにより早期における治療と定義される。侵襲性癌への進行期間が長いことは重要な科学的機会であるが、化学予防薬候補の臨床的利点を示すことに対しては経済的な障害でもある。したがって、近年の化学予防薬開発研究の重要な構成要素は、薬剤の臨床的利益又は癌発生率減少効果を正確に予測する（癌より）早期のエンドポイント又はバイオマーカーを特定することとなっている。多くの癌において、ＩＥＮは前立腺癌などの早期エンドポイントである。ＰＡＸ２／ＤＥＦＢ１経路がＩＥＮ中に、及びおそらくより早期の病理組織学的状態においても調節解除されることを考慮すれば、これは癌化学予防のための強力な予測的バイオマーカーかつ優れた標的となる。
【０１９４】
表１に示すように、ＰＡＸ２遺伝子は数多くの癌において発現される。さらに、数種類の癌が異常ＰＡＸ２発現を有することが示されている（図１８）。表４には、前立腺癌の化学予防剤としての有用性を有し得る、ＰＡＸ２を抑制し、かつＤＥＦＢ１発現を増加させる多数の化合物が示されている。アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）は、血圧及び心血管系恒常性の主な調節因子であり、かつ強力なマイトジェンとして認識されている。ＡｎｇＩＩは、Ｇ−タンパク質共役受容体スーパーファミリーに属するが、組織分布及び分子内シグナリング経路が異なる２つの受容体サブタイプ、アンジオテンシンＩ型受容体（ＡＴ１Ｒ）及びアンジオテンシンＩＩ型受容体（ＡＴ２Ｒ）と結合することより、その生物学的効果を媒介する。ＡｎｇＩＩは、その血圧に対する効果に加えて、創傷治癒などの組織再構築、心臓の肥大及び発生を包含する多様な病理的状況においてある役割を果たすことが示されている。実際に、前立腺を含む多様な癌の細胞及び組織におけるレニンーアンジオテンシン系（ＲＡＳ）のいくつかの成分の局所的発現が最近の研究で明らかになっている。ＡＴ１Ｒのアップレギュレーションは、アポトーシス及び増殖調節因子を回避することを「学習」した癌細胞に対して相当な利点をもたらす。今日、数多くの癌はＰＡＸ２を異常発現することが示されている。ＰＡＸ２発現標的による化学予防は、癌関連死に対して大きな影響を有し得る。
【０１９５】
８．１  材料及び方法
細胞培養：ｈＰｒＥＣ細胞、並びにＤＵ１４５、ＬｎＣａｐ及びＰＣ３細胞株を、実施例１の記載に従って培養した。
【０１９６】
試薬及び処理：５若しくは１０μＭのＡｎｇＩＩ、５μＭのＡＴ１Ｒ拮抗薬Ｌｏｓ、５μＭのＡＴ２Ｒ拮抗薬ＰＤ１２３３１９、２５μＭのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６、２０μＭのＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９又は２５０μＭのＡＭＰキナーゼ誘発物質ＡＩＣＡＲで細胞を処理した。
【０１９７】
ウェスタンブロット分析：ウェスタンブロット分析は実施例２の記載に従って実施した。そしてブロットを、１：１０００−２０００希釈の一次抗体（抗ＰＡＸ２、抗ホスホＰＡＸ２、抗ＪＮＫ、抗ホスホＪＮＫ、抗ＥＲＫ１／２又は抗ホスホＥＲＫ１／２）（Ｚｙｍｅｄ、カリフォルニア州サンフランシスコ）でプローブした。洗浄後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ウサギ抗体（１：５０００希釈；Ｓｉｇｍａ社）と共に膜をインキュベートし、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｆｌｕｏｒｃｈｅｍ  ８９００で化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてシグナル検出を可視化した。対照として、ブロットを剥離し、マウス抗βアクチン一次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で再プローブし、シグナル検出を再度可視化した。
【０１９８】
ＱＲＴ−ＰＣＲ分析：ＰＣ３及びＤＵ１４５前立腺癌細胞株並びにｈＰｒＥＣ正常前立腺上皮細胞におけるＰＡＸ２ノックダウン後の遺伝子発現における変化を確認するために、実施例１の記載に従って定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。６０℃のアニーリング温度を用いて、標準的な条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。定量値は、指数的増幅が開始するサイクル数（閾値）により決定し、かつ３回繰り返して得られた値を平均した。メッセージレベルと閾値の間には逆関係があった。さらに、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として用い、全ｃＤＮＡの初期含有量を正規化した。相対発現は、各遺伝子とＧＡＰＤＨとの間の比率として計算した。全ての反応は３連で行った。
【０１９９】
チミジン取り込み：細胞の増殖は、［３Ｈ］チミジンリボチド（［３Ｈ］ＴｄＲ）のＤＮＡへの取り込みによって決定した。０．５×１０６細胞／ウェルのＤＵ１４５細胞懸濁液をその適切な培地に播種した。細胞は、指示された濃度のＡｎｇＩＩの存在下又は非存在下で７２時間インキュベートした。細胞を同一培地中で３７ｋＢｑ／ｍｌ［メチル−３Ｈ］チミジンに６時間曝露させた。付着細胞を５％トリクロロ酢酸で固定し、ＳＤＳ／ＮａＯＨ溶解緩衝液で１晩溶解させた。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８０１液体シンチレーションカウンタ（カナダ）で放射能を測定した。懸濁細胞培養物を、セルハーベスタ（Ｐａｃｋａｒｄ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、コネティカット州メリデン）で回収し、かつ１４５０ｍｉｃｒｏｂｅｔａ液体シンチレーションカウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で放射能を測定した。
【０２００】
８．２  結果
ＤＵ１４５前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現に対するＡｎｇＩＩの影響を調査するために、ＡｎｇＩＩで３０分から４８時間にわたって処理した後にＰＡＸ２発現を検討した。図１９に示すように、ＰＡＸ２発現はＡｎｇＩＩ処理後に時間と共に徐々に増加した。
【０２０１】
ＬｏｓでＤＵ１４５を処理することでＲＡＳシグナリングを遮断すると、ＰＡＸ２発現は有意に低下した。図２０Ａに示すように、ＬｏｓでのＤＵ１４５細胞処理後、未処理対照ＤＵ１４５細胞と比較すると、ＰＡＸ２発現は４８時間後に３７％低下し、７２時間後では５０％低下した。
【０２０２】
ＡＴ２Ｒ受容体がＡＴ１Ｒの作用を妨害することは公知である。したがって、ＡＴ２Ｒ受容体の遮断がＰＡＸ２発現に与える影響を検討した。ＤＵ１４５をＡＴ２Ｒ遮断剤ＰＤ１２３３１９で処理することにより、ＰＡＸ２発現は処理から４８時間後に７倍増加、かつ９６時間後に８倍増加した（図２０Ｂ）。まとめると、これらの知見より、ＰＡＸ２発現はＡＴ１Ｒ受容体経路によって調節されていることが証明される。
【０２０３】
ＡｎｇＩＩはＡＴ１Ｒ媒介ＭＡＰＫ活性化及びＳＴＡＴ３リン酸化を経て前立腺癌細胞の増殖に直接影響することが公知である。ＤＵ１４５をＡｎｇＩＩで処理すると、増殖率は２〜３倍増加した（図２１）。しかしながら、Ｌｏｓで処理することによって増殖率は５０％低下した。さらに、Ｌｏｓで３０分間前処理することでＡＴ１Ｒ受容体を遮断したところ、ＡｎｇＩＩの増殖に対する影響が抑制された。
【０２０４】
ＰＡＸ２の発現及び活性化の調節におけるＡＴ１Ｒシグナリングの役割をさらに検討するために、多様なＭＡＰキナーゼシグナリング経路成分の遮断がＰＡＸ２発現に与える影響を検討した。ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６でＤＵ１４５細胞を処理したところ、ＰＡＸ２発現が有意に低下した（図２２）。さらに、ＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９で処理しても、ＰＡＸ２は低下した。ＤＵ１４５細胞のＬｏｓでの処理は、ＥＲＫタンパク質レベルには影響を及ぼさないが、ホスホＥＲＫの量は低下した（図２３Ａ）。しかしながら、ＤＵ１４５をＬｏｓで処理するとＰＡＸ２発現は有意に減少した。Ｕ０１２６及びＰＤ９８０５９での処理後に同様の結果が認められた（図２３Ｂ）。ＰＡＸ２発現は、ＥＲＫの下流の標的であるＳＴＡＴ３によって調節されることも公知である。ＤＵ１４５のＬｏｓ、Ｕ０１２６、及びＰＤ９８０５９での処理により、ホスホＳＴＡＴ３タンパク質レベルの低下がもたらされた（図２３Ｃ）。これらの結果は、前立腺癌細胞においてＰＡＸ２はＡＴ１Ｒを介して調節されることを実証する。
【０２０５】
さらに、ＡＴ１ＲシグナリングがＪＮＫによるＰＡＸ２活性化に及ぼす影響を検討した。ＤＵ１４５をＬｏｓ、Ｕ０１２６、及びＰＤ９８０５９で処理したところ、いずれもホスホＰＡＸ２タンパク質レベルが有意に低下するか又は抑制された（図２４Ａ）。しかしながら、Ｌｏｓ及びＵ０１２６はホスホＪＮＫタンパク質レベルを低下させなかった（図２４Ｂ）。したがって、ホスホＰＡＸ２の低下はＰＡＸ２レベルの低下よるものであって、リン酸化の低下によるものではないとみられる。
【０２０６】
５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−４−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）は、エネルギー恒常性及び代謝ストレスに対する応答を調節するＡＭＰキナーゼ活性化物質として幅広く用いられている。最近の報告では、薬剤又はＡＭＰＫ過剰発現を用いた活性化ＡＭＰＫの抗増殖及びプロアポトーシスの作用が示されている。ＡＭＰＫ活性化は、脂肪酸シンターゼ経路の阻害並びにストレスキナーゼ及びカスパーゼ３の誘導を含む多様な機構によって、ヒトの胃癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌、膵臓細胞及び肝臓癌細胞においてアポトーシスを誘導し、かつマウス神経芽細胞において酸化ストレス誘導アポトーシスを亢進させることが示されている。さらに、ＰＣ３前立腺癌細胞の処理により、ｐ２１、ｐ２７及びｐ５３タンパク質発現及びＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の阻害が増加した。これらの経路はいずれもＰＡＸ２によって直接的又は間接的に調節される。前立腺癌細胞をＡＩＣＡＲで処理したところ、ＰＡＸ２発現（図２３Ｂ）、並びにその活性化体のホスホＰＡＸ２（図２４Ａ）が抑制された。さらに、ＰＡＸ２発現を調節するホスホ−ＳＴＡＴ３も抑制された（図２３Ｃ）。
【０２０７】
最後に、ＰＡＸ２のアップレギュレーション及び過剰発現につながる異常ＲＡＳシグナリングは、ＤＥＦＢ１腫瘍抑制因子遺伝子の発現を抑制するという仮説を立てた。この可能性を調査するために、正常前立腺上皮一次培養物ｈＰｒＥＣをＡｎｇＩＩで処理し、かつＰＡＸ２及びＤＥＦＢ１の発現レベルを検討した。正常前立腺細胞対前立腺癌細胞において、ＤＥＦＢ１発現とＰＡＸ２発現との間の逆関係が発見された。図２５に示すように、未処理ｈＰｒＥＣは、ＰＣ３前立腺癌細胞におけるＰＡＸ２発現と比較して、１０％の相対ＰＡＸ２発現を示した。逆に、未処理ＰＣ３細胞は、未処理ｈＰｒＥＣ細胞におけるＤＥＦＢ１発現と比較して、わずか２％のＤＥＦＢ１発現を示した。ｈＰｒＥＣ細胞中で１０μＭのＡｎｇＩＩによる７２時間の処理後、未処理ｈＰｒＥＣ細胞と比較して、ＤＥＦＢ１発現は３５％低下し、かつＰＡＸ２発現は６６％増加した；９６時間後までに、未処理ｈＰｒＥＣ細胞と比較して、ＤＥＦＢ１発現は５０％低下し、かつＤＥＦＢ１は７９％増加した。さらに、ｈＰｒＥＣにおける７２時間後のＰＡＸ２発現の増加は、ＰＣ３前立腺癌細胞で認められたＰＡＸ２レベルの７７％となった。ＡｎｇＩＩ処理から９６時間後、ＰＡＸ２発現はＰＣ３細胞におけるＰＡＸ２発現の８９％となった。これらの結果から、調節解除されたＲＡＳシグナリングは、前立腺細胞においてＤＥＦＢ１発現を抑制し、かつＰＡＸ２発現を活性化することが実証される。
【０２０８】
アポトーシス阻害は、癌の発生に寄与する重要な病態生理学的因子である。癌治療の顕著な進歩にもかかわらず、進行性疾患の治療においてはほとんど進歩していない。発癌が多年にわたる多段階、多経路の進行疾患であることを考慮すると、この過程を阻害、遅延、又は逆行させるための医薬品又は他の薬剤の使用による化学予防は、癌研究において非常に有望な領域であると認識されている。前立腺癌の化学予防を目的とした薬物療法の成功には、癌発生を抑制するという全般的な目標を有し、宿主に対する臨床的影響を最小限に維持しながら、標的細胞に対する特異的効果を有する治療薬を用いることが必要とされる。したがって、早期段階の発癌の機構を理解することは、特定の治療法の有効性を判定する上で重要である。異常ＰＡＸ２発現及びそのアポトーシス抑止の重要性は、その後の腫瘍形成に対する寄与と共に、これが前立腺癌治療のための適切な標的となり得ることを示唆する。前立腺癌においてＰＡＸ２はＡＴ１Ｒにより調節される（図２６）。この場合、ＲＡＳシグナリングが調節解除されると、ＰＡＸ２癌遺伝子発現が増加し、かつＤＥＦＢ１腫瘍抑制因子の発現が減少する。したがって、ＡＴ１Ｒ拮抗薬の使用によりＰＡＸ２発現が低下し、かつＤＥＦＢ１の再発現を介した前立腺癌細胞死の増加がもたらされる（図２７）。これらの結果によって、レニン−アンジオテンシンシグナリング経路、ＡＭＰキナーゼ経路又はＰＡＸ２タンパク質の不活性化（すなわち抗ＰＡＸ２抗体接種）を包含する他の方法を介したＰＡＸ２発現のターゲティングは、癌予防にとって有望な標的を表すという新たな知見が提供される（表４）。
【表５】
0005990274.tif 000006
【０２０９】
この研究から、前立腺癌におけるＰＡＸ２癌遺伝子のアップレギュレーションはＲＡＳシグナリングの調節解除によるものであることが証明される。ＰＡＸ２発現は、アンジオテンシンＩ型受容体によって媒介されるＥＲＫ１／２シグナリング経路によって調節される。さらに、ロサルタン（Ｌｏｓ）によってＡＴ１Ｒを遮断することによりＰＡＸ２発現が抑制される。さらに、ＡＭＰＫ活性化物質であるＡＩＣＡＲも、潜在的なＰＡＸ２阻害剤として有望性を示している。まとめると、これらの試験から、これらの薬剤クラスが潜在的なＰＡＸ２発現抑制因子として関係付けられ、かつ最終的に新規化学予防剤として役立ち得ることが強く指摘される。
【実施例９】
【０２１０】
前立腺組織の等級付け手段及び前立腺癌発生の予測因子としてのＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現レベル
９．１  材料及び方法
ＱＲＴ−ＰＣＲ分析：根治的前立腺切除術を受けた患者から前立腺切片を採取した。病理検査後、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを実施して、正常、増殖性上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び癌の組織の領域を単離した。前述の方法によりＱＲＴ−ＰＣＲを実施して発現を評価した。各領域のＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２発現及びＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【０２１１】
採血及びＲＮＡ単離：製造元のプロトコルに従い、ＱＲＴ−ＰＣＲ用に各個人よりＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ試験管（ＱＩＡＧＥＮ社）に血液（２．５ｍｌ）を採取した。全血をＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）安定化剤と完全に混合し、ＲＮＡ抽出前に６時間室温で保存した。次いで、製造元の使用説明書（ＱＩＡＧＥＮ社）に従い、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキットを用いて全ＲＮＡを抽出した。汚染ゲノムＤＮＡを除去するために、ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍスピンカラムに吸着させた全ＲＮＡ試料を、ＤＮａｓｅ  Ｉ（ＱＩＡＧＥＮ社）と共に２５℃で２０分間インキュベートしてゲノムＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを溶離かつ定量し、ＰＡＸ２発現とＤＥＦＢ１発現との比率を比較するために前述の方法に従ってＱＲＴ−ＰＣＲを実施する。
【０２１２】
９．２  結果
図２８では、患者番号１２５５、１３４３、１４７７、及び１５１６からの前立腺組織切片のＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、０．００５を超える相対ＤＥＦＢ１発現レベルが示され、それはグリーソンスコア６と相関し、一方で、０．００５未満のＤＥＦＢ１発現レベルを有する患者番号１１８８及び１２１５は、グリーソンスコア７を有した。したがって、ＤＥＦＢ１発現とグリーソンスコアとの間には逆関係があり、それは図２９Ａにおいてさらに確認される。逆に、図２９Ｂに示すように、悪性前立腺組織及びＰＩＮにおけるＰＡＸ２発現とグリーソンスコアとの間には正の相関があった。
【０２１３】
図２９Ａ及び２９Ｂでは、別個の患者からの正常、ＰＩＮ及び癌の組織を、相対的なＤＥＦＢ１（図２９Ａ）及びＰＡＸ２（図２９Ｂ）の発現レベルについて試験及び比較した。全般的に、ＧＡＰＤＨ内部標準に対するＰＡＸ２発現レベルの範囲は、正常（良性）組織では０〜０．２の間、ＰＩＮにおいては０．２〜０．３の間、及び癌（悪性）組織においては０．３〜０．５の間であった（図２９Ｂ）。ＤＥＦＢ１については、ＰＡＸ２と比較して逆関係があった。ＧＡＰＤＨ内部標準に対するＤＥＦＢ１発現レベルの範囲は、正常（良性）組織では０．０６〜０．００５の間、ＰＩＮにおいて０．００５〜０．００３の間、及び癌（悪性）組織において０．００３〜０．００１の間であった。したがって、良性、前癌（ＰＩＮ）及び悪性の前立腺組織の予測因子としてＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比率を用いる、ドナルド予測因子（ＤＰＦ）と称される予測スケールを開示する。ＤＰＦに基づくＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が０〜３９の間である組織は、正常（病理学的に良性）前立腺組織に相当する。ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が４０〜９９の間の組織は、ＤＰＦスケールに基づきＰＩＮ（前癌）組織に相当する。最後に、ＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１比率が１００〜５００の間の組織は、悪性組織（低〜高悪性度の癌）に相当する。
【０２１４】
現在、前立腺癌発生の予測バイオマーカーに対する決定的なニーズがある。前立腺癌の発症が、ＰＳＡ検査又は直腸指診などの現行のスクリーニング法によって疾患が検出可能となるはるか以前に起こることは公知である。前立腺癌の進行及び早期発生のモニタリングが可能な信頼度の高い検査法であれば、より有効な疾患管理によって死亡率が大きく低下し得ると考えられる。本明細書には、医師が前立腺の病理学的状態を事前に十分に知ることを可能とする予測指標が開示される。ＤＰＦは、前立腺疾患の進行と関連するＰＡＸ２−ＤＥＦＢ１発現比率の低下を測定する。この強力な尺度は、患者が前立腺癌を発症する可能性を予測できるだけでなく、前悪性癌の初期発症も特定し得る。最終的に、この手段は、医師がより悪性度の高い疾患を有する患者をそうでない患者から識別することを可能とする。
【０２１５】
癌特異的マーカーの同定は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）の同定を助けるために用いられている。末梢血中に広まった腫瘍細胞を検出することにより、腫瘍のステージング、予後判定、及び補助療法の有効性を初期評価する代替的マーカーの同定のための臨床的に重要なデータを提供可能であることを証明する新たな証拠もある。さらに、全循環細胞の遺伝子発現プロファイリングを比較することにより、前立腺癌を早期検出するための予測因子として、それぞれ「免疫監視」及び「癌生存」において一役割を果たすＤＥＦＢ１及びＰＡＸ２遺伝子の発現を検討することができる。
【実施例１０】
【０２１６】
宿主防御ペプチドヒトβデフェンシン−１の機能分析：癌におけるその潜在的役割についての新たな洞察
１０．１  材料及び方法
細胞培養：ｈＰｒＥＣ細胞並びにＤＵ１４５、ＬｎＣａｐ、及びＰＣ３細胞株を、実施例１の記載に従って培養した。
【０２１７】
組織サンプル及びレーザーキャプチャーマイクロダイセクション：根治的前立腺切除術を受ける前にインフォームド・コンセントを提出した患者より前立腺組織を採取した。治験審査委員会が承認したプロトコルに従い、Ｈｏｌｌｉｎｇｓ癌センター腫瘍バンクよりサンプルを入手した。これにはサンプルの処理、切片化、組織学的特性評価、ＲＮＡ精製及びＰＣＲ増幅に対するガイドラインが含まれていた。外科医及び病理医より受け取った前立腺検体は、ＯＣＴコンパウンド中で速やかに凍結させた。各ＯＣＴブロックを切り出して連続切片を作製し、それを染色して検査した。良性細胞、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び癌を含む領域を同定し、本発明者らがＡｒｃｔｕｒｕｓ  ＰｉｘＣｅｌｌ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州、サニーベール）を用いて未染色スライドから領域を選択する際の指標とするために用いた。キャプチャーした材料を収容するカップを、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐｉｃｏ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔからの２０μｌの溶解物に曝露させ、速やかに処理した。ＲＮＡの量及び品質は、５’アンプリコンを生成するプライマーセットを用いて評価した。セットはリボソームタンパク質Ｌ３２用（３’アンプリコンと５’アンプリコンとの間隔は２９８塩基）、グルコースリン酸イソメラーゼ用（３９１塩基間隔）、及びグルコースリン酸イソメラーゼ用（８４２塩基間隔）のものを含む。通常、多様な調製組織からのサンプルを用いて、これらのプライマーセットについては０．９５〜０．８０の比率が得られた。病理医が肉眼で見て追加的な腫瘍及び正常なサンプルを切り出し、液体窒素で瞬間凍結させてｈＢＤ−１及びｃＭＹＣ発現について評価した。
【０２１８】
ｈＢＤ−１遺伝子のクローニング：ｈＢＤ−１  ｃＤＮＡは、公開ｈＢＤ−１配列（アクセション番号Ｕ５０９３０）から作製したプライマを用いて逆転写ＰＣＲによりＲＮＡから作製した（Ｇａｎｚ社、２００４）。ＰＣＲプライマはＣｌａＩ及びＫｐｎＩの制限部位を含むように設計した。ｈＢＤ−１  ＰＣＲ産物をＣｌａＩ及びＫｐｎＩで制限消化し、ＴＡクローニングベクターにライゲーションした。次いで、ＴＡ／ｈＢＤ１ベクターを熱ショックにより大腸菌のＸＬ−１  Ｂｌｕｅ株にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ社、カリフォルニア州バレンシア）でプラスミドを単離し、かつ配列完全性を自動配列決定により検証した。次いで、ｈＢＤ−１遺伝子フラグメントを、方向付けを目的とした中間ベクターとして役立つ、ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＴＲＥ２にライゲーションした。ｐＴＲＥ２／ｈＢＤ−１構築物をＡｐａＩ及びＫｐｎＩで消化させてｈＢＤ−１インサートを切り取った。インサートを、これもＡｐａＩ及びＫｐｎＩで二重消化したＥｃｄｙｓｏｎｅ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）のｐＩＮＤベクターにライゲーションした。構築物を大腸菌にトランスフェクトし、個々のクローンを選択して増殖させた。プラスミドを単離し、自動配列決定によりｐＩＮＤ／ｈＢＤ−１の配列完全性を再度検証した。
【０２１９】
細胞トランスフェクション：細胞（１×１０６）を、１００ｍｍペトリ皿に播種し、一晩培養した。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヘテロ二量体エクジソン受容体を発現するｐｖｇＲＸＲプラスミド１μｇ、およびｐＩＮＤ／ｈＢＤ-１ベクター構築物またはｐＩＮＤ／β-ガラクトシダーゼ（β-ｇａｌ）対照ベクター１μｇを、Ｏｐｔｉ-ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で細胞にコトランスフェクトした。ポナステロンＡ（Ｐｏｎ Ａ）でβ-ｇａｌ発現を誘導し、β-ガラクトシダーゼ検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を染色することにより、トランスフェクション効率を測定した。陽性染色（青色）コロニーを計数することによりトランスフェクション効率を評価したところ、細胞株で細胞の６０〜８５％がβ-ガラクトシダーゼを発現したことが実証された。
【０２２０】
免疫細胞化学：ｈＢＤ-１タンパク質発現を検証するために、２チャンバー培養スライド（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、米国）に、ＤＵ１４５およびｈＰｒＥＣ細胞を１．５〜２×１０４細胞／チャンバーで播種した。ｐｖｇＲＸＲ単独（対照）またはｈＢＤ-１プラスミドをトランスフェクトしたＤＵ１４５細胞は１０μＭ Ｐｏｎ Ａを加えた培地で１８時間誘導し、一方、トランスフェクトしない細胞には新鮮な増殖培地を加えた。誘導後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１時間室温にて固定した。それから、細胞を１×ＰＢＳで６回洗浄し、２％ＢＳＡ、０．８％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バーリンゲーム）および０．４％トリトンＸ-１００を加えた１×ＰＢＳで１時間室温にてブロックした。次に、ブロッキング溶液で１：１０００に希釈したウサギ抗ヒトＢＤ-１ポリクローナル一次抗体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ロッキーヒル）中で細胞を一晩インキュベートした。これに続いて、細胞をブロッキング溶液で６回洗浄し、ブロッキング溶液で１：１０００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体中で１時間室温にてインキュベートした。細胞をブロッキング溶液で６回洗浄した後、Ｇｅｌ Ｍｏｕｎｔ（Ｂｉｏｍｅｄａ、カリフォルニア州フォスターシティ）を用いてカバースリップをマウントした。最後に、細胞を微分干渉コントラスト法（ＤＩＣ）および４８８ｎｍのレーザー励起により観察した。共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ）で６３倍ＤＩＣ油浸レンズを使用し、Ｖａｒｉｏ ２ ＲＧＢレーザー走査モジュールを用いて蛍光シグナルを解析した。デジタル画像は、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０２２１】
ＲＮＡ単離と定量的ＲＴ-ＰＣＲ：ＱＲＴ-ＰＣＲはすでに記載されているように実施した（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７）。簡潔に述べると、組織切片の全ＲＮＡ（反応当たり０．５μｇ）を、ランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＴａｑＭａｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍのＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅおよびＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して作成したｃＤＮＡで２段階ＱＲＴ-ＰＣＲを実施した。公開配列からｈＢＤ-１およびｃＭＹＣのプライマー対を作成した（表５）。ｈＢＤ-１およびｃＭＹＣは５６．４℃、ＰＡＸ２は５５℃のアニーリング温度を用いて標準条件下でＰＣＲを４０サイクル実施した。さらに、ハウスキーピング遺伝子としてβ-アクチン（表５）を増幅し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。良性前立腺組織サンプルにおける遺伝子発現は、β-アクチンに対する発現比として計算した。誘導前後の悪性前立腺組織、ｈＰｒＥＣ前立腺初代培養物、および前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ-１発現レベルは、ｈＰｒＥＣ細胞におけるｈＢＤ-１発現の平均レベルに対して計算した。陰性対照として、ｃＤＮＡテンプレートを用いないＱＲＴ-ＰＣＲ反応も実施した。すべての反応を最低３回行った。
【表６】
0005990274.tif 000007
【０２２２】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ：細胞増殖に対するｈＢＤ-１の影響を調べるために、代謝３-［４，５-ジメチルチアゾール-２イル］-２，５-ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイを実施した。ｐｖｇＲＸＲプラスミドおよびｐＩＮＤ／ｈＢＤ-１構築物または対照ｐｖｇＲＸＲプラスミドでコトランスフェクトしたＤＵ１４５、ＬＮＣａＰ、ＰＣ３およびＰＣ３／ＡＲ＋細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１〜５×１０３細胞で播種した。播種２４時間後から、１０μＭ Ｐｏｎ Ａを加えた新鮮な増殖培地を毎日加え、ｈＢＤ-１発現を２４時間、４８時間、および７２時間誘導した後に、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってＭＴＴアッセイを実施した。反応は３連で３回実施した。
【０２２３】
膜完全性の解析：アクリジンオレンジ（ＡＯ）／臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）二重染色を実施し、細胞膜完全性の変化、および凝縮クロマチン染色によるアポトーシス細胞を確認した。ＡＯは生存細胞と初期アポトーシス細胞を染色するのに対し、ＥｔＢｒは、膜が損傷した後期アポトーシス細胞を染色する。簡潔に述べると、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞を２チャンバー培養スライド（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。空のプラスミドまたはｈＢＤ-１プラスミドをトランスフェクトした細胞を、１０μＭ Ｐｏｎ Ａを加えた培地で２４時間または４８時間誘導し、一方、対照細胞には各時点で新鮮な増殖培地を加えた。誘導後に、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＡＯ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）とＥｔＢｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（５μｇ／ｍＬ）の混液（１：１）２ｍＬで５分間染色し、再びＰＢＳで洗浄した。
【０２２４】
Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ５ Ｐａｓｃａｌ Ｖａｒｉｏ ２共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で蛍光を観察した。励起カラーホイールにはＢＳ５０５-５３０（緑色）とＬＰ５６０（赤色）フィルターブロックがあり、ＡＯからの緑色発光を緑色チャネルに、ＥｔＢｒからの赤色発光を赤色チャネルに分離することができた。個々の実験におけるレーザー出力と利得制御設定は、対照とｈＢＤ-１誘導細胞とで同一とした。ＡＯは５４３ｎｍ、ＥｔＢｒは４８８ｎｍの波長でＫｒ／Ａｒ混合ガスレーザーにより励起した。スライドを４０倍の倍率で解析し、デジタル画像を無圧縮デシタルＴＩＦＦファイルとして保存し、画像処理とハードコピー表示のためにＰｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）にエクスポートした。
【０２２５】
フローサイトメトリー：ｈＢＤ-１発現システムを用いてトランスフェクトしたＰＣ３およびＤＵ１４５細胞を６０ｍｍ皿で増殖させ、１０μＭ ＰｏｎＡで１２時間、２４時間、および４８時間誘導した。細胞を採取し、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーで解析した。
【０２２６】
カスパーゼ検出：前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を、実施例１に記載のように実施した。
【０２２７】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：ｓｉＲＮＡノックダウンと検証を、実施例２に記載のように実施した。
【０２２８】
１０．２  結果
前立腺組織におけるｈＢＤ-１発現：解析した前立腺癌凍結組織切片の８２％は、ｈＢＤ-１の発現をほとんど、またはまったく示さなかった（Ｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ｈＢＤ-１発現レベルを比較するために、ランダムに選択した悪性領域に隣接する正常前立腺組織の肉眼的切除またはＬＣＭにより得られた正常前立腺組織でＱＲＴ-ＰＣＲ解析を実施した。肉眼的に切除した正常臨床サンプルのすべてにおいて、発現レベルの約６．６倍の差に相当する発現範囲でｈＢＤ-１が検出された（図３１Ａ）。ＬＣＭにより捕捉した正常組織サンプルは３２倍の発現差に相当する範囲のレベルでｈＢＤ-１を発現した（図３１Ｂ）。対応する患者プロファイルにサンプル数を一致させると、ほとんどの場合、ｈＢＤ-１発現レベルはグリーソンスコア６の患者サンプルの方がグリーソンスコア７の患者サンプルよりも高いことが判明した。さらに、同一患者番号１３４３から肉眼的切除とＬＣＭにより得られた組織中のｈＢＤ-１発現レベルを比較すると、２種類の単離法の間で８５４倍の発現差があることが実証された。したがって、これらの結果から、ＬＣＭは前立腺組織におけるｈＢＤ-１発現を評価するための感度がより高い技術であることが示される。
【０２２９】
前立腺細胞株におけるｈＢＤ-１発現：前立腺癌細胞株におけるｈＢＤ-１のアップレギュレーションを検証するために、ポナステロンＡ（Ｐｏｎ Ａ）による誘導が可能なＤＥＦＢ１（ｈＢＤ-１）発現システムを用いてトランスフェクトした細胞でＱＲＴ-ＰＣＲを実施した。さらに、テンプレートなしの陰性対照も実施し、増幅産物をゲル電気泳動により検証した。図３２Ａは、ｈＢＤ-１誘導前後の前立腺癌細胞株におけるｈＰｒＥＣ細胞と比較したｈＢＤ-１の相対発現レベルを示す。ｈＢＤ-発現はｈＰｒＥＣ細胞と比較して前立腺癌細胞株で有意に低かった。２４時間の誘導時間後、ｈＢＤ-１誘導前の細胞株と比較してＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰでｈＢＤ-１の相対発現レベルは有意に増加した。図３２Ａの星印１つは、ｈＰｒＥＣと比較して発現レベルが有意に高いことを示す。星印２つは、ｈＢＤ-１誘導前の細胞株と比較して発現レベルが統計的に有意であることを示している（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【０２３０】
図３２Ｂは、ｈＢＤ-１をトランスフェクトし、Ｐｏｎ Ａにより誘導した陽性対照であるｈＰｒＥＣ細胞（パネルＡ：ＤＩＣ、パネルＢ：蛍光）およびＤＵ１４５細胞（パネルＣ：ＤＩＣ、パネルＤ：蛍光）におけるｈＢＤ-１発現の免疫細胞化学による検証を示す。ｈＢＤ-１に対する一次抗体で細胞を染色し、二次抗体の緑色蛍光に基づいてタンパク質発現をモニターした。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、緑色蛍光が発生し、ｈＰｒＥＣ陽性対照にｈＢＤ-１タンパク質が存在することが示された。対照ＤＵ１４５細胞または空のプラスミドにより誘導したＤＵ１４５細胞では検出可能な緑色蛍光は認められなかった（データは示さず）。しかしながら、ｈＢＤ-１発現を誘導したＤＵ１４５細胞の共焦点解析により緑色蛍光が判明し、Ｐｏｎ Ａによる誘導後にｈＢＤ-１タンパク質が存在することが示された（パネルＤ）。Ｓｉｚｅｂａｒ＝２０μＭ。
【０２３１】
ｈＢＤ-１の発現により細胞生存率が減少する：ＤＵ１４５、ＰＣ３、ＰＣ３／ＡＲ＋およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株における相対細胞生存率に対するｈＢＤ-１発現の影響を評価するためにＭＴＴアッセイを実施した。空のベクターのＭＴＴ解析では、細胞生存率に統計的に有意な変化は認められなかった。ｈＢＤ-１誘導の２４時間後では、相対細胞生存率はＤＵ１４５細胞で７２％、ＰＣ３細胞で５６％であり、４８時間後に細胞生存率はＤＵ１４５細胞で４９％、ＰＣ３細胞で３７％に減少した（図３３）。ｈＢＤ-１誘導の７２時間後には、相対細胞生存率はさらにＤＵ１４５で４４％、ＰＣ３細胞で２９％に減少した。逆に、ＬＮＣａＰ細胞の生存率には顕著な影響はなかった。ＬＮＣａＰに認められるｈＢＤ-１細胞毒性に対する耐性が、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在に起因するのか否かを評価するために、ＰＣ３細胞におけるｈＢＤ-１細胞毒性を異所性ＡＲ発現（ＰＣ３／ＡＲ＋）で調べた。ＰＣ３／ＡＲ＋細胞とＰＣ３細胞との間に差は認められなかった。したがって、データからは、ｈＢＤ-１は後期前立腺癌細胞に対し特異的に細胞毒性であることが示される。
【０２３２】
ＰＣ３およびＤＵ１４５に対するｈＢＤ-１の影響が細胞増殖抑制性または細胞毒性のいずれであるのかを確認するために、ＦＡＣＳ解析を実施し、細胞死を測定した。通常の増殖条件下で、ＰＣ３およびＤＵ１４５培養物の９０％超が生存可能で非アポトーシス性であり（左下象限）、アネキシンＶまたはＰＩで染色されなかった。ＰＣ３細胞におけるｈＢＤ-１発現の誘導後、初期アポトーシスと後期アポトーシス／壊死（それぞれ右下および右上象限）を生じた細胞数を合計すると、１２時間で１０％、２４時間で２０％、４８時間で４４％であった（図４Ｂ）。ＤＵ１４５細胞では、初期アポトーシスと後期アポトーシス／壊死を生じた細胞数を合計すると、誘導の１２時間後で１２％、２４時間で３４％、４８時間後で５９％であった（図４Ａ）。Ｐｏｎ Ａによる誘導後に、空のプラスミドを加えた細胞にアポトーシスの増加は認められなかった。アネキシンＶとヨウ化プロピジウムの取り込み試験から、ｈＢＤ-１はＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞に対して細胞傷害活性を有することが実証され、その結果からアポトーシスが細胞死のメカニズムであることが示される。
【０２３３】
ｈＢＤ-１は膜完全性とカスパーゼ活性化に変化をもたらす：ｈＢＤ-１誘導後に前立腺癌細胞で認められる細胞死がカスパーゼ介在性アポトーシスであるのか否かを調べた。ｈＢＤ-１発現に関与する細胞メカニズムをより深く理解するために、ｈＢＤ-１発現を誘導したＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞で共焦点レーザー顕微鏡解析を実施した（図５）。アポトーシスが活発に生じている細胞において、緑色蛍光性のＦＡＭ-ＶＡＤ-ＦＭＫのカスパーゼとの結合および開裂に基づいてパンカスパーゼ活性化をモニターした。ＤＩＣによる細胞の解析より、０時間では生存可能な対照ＤＵ１４５（パネルＡ）およびＬＮＣａＰ（パネルＥ）細胞の存在が示された。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、ＤＵ１４５（パネルＢ）またはＬＮＣａＰ（パネルＦ）対照細胞にカスパーゼ活性が存在しないことが示された。２４時間の誘導後、ＤＩＣによりＤＵ１４５（パネルＣ）およびＬＮＣａＰ（パネルＧ）細胞が再び確認された。蛍光下の共焦点解析から、ＤＵ１４５（パネルＤ）細胞ではｈＢＤ-１発現の誘導後にパンカスパーゼ活性を示す緑色染色が判明した。しかしながら、ｈＢＤ-１発現を誘導したＬＮＣａＰ（パネルＨ）細胞に緑色染色は生じなかった。したがって、ｈＢＤ-１の誘導後に認められる細胞死はカスパーゼ介在性アポトーシスである。
【０２３４】
ディフェンシンペプチドの抗菌活性のメカニズムは、孔形成による微生物膜の破壊であることが提示されている（Ｐａｐｏ ａｎｄ Ｓｈａｉ，２００５）。ｈＢＤ-１発現が膜完全性を変化させたか否かを確認するために、ＥｔＢｒ取り込みを共焦点解析により調べた。無傷の細胞は膜透過性であるＡＯにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞のみが、膜不透過性ＥｔＢｒの取り込みにより赤色に染色された。対照ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞はＡＯで陽性染色され、緑色を発生したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。しかしながら、ＤＵ１４５とＰＣ３ではいずれもｈＢＤ-１誘導の結果、２４時間で細胞質にＥｔＢｒが蓄積し、赤色染色が認められた。４８時間までに、ＤＵ１４５とＰＣ３では核が濃縮し、また、それぞれＡＯとＥｔＢｒによる緑色と赤色の染色の共局在により黄色に見えた。逆に、４８時間誘導後のＬＮＣａＰ細胞では膜完全性に変化は認められず、ＡＯによる陽性緑色蛍光が示されたが、赤色ＥｔＢｒ蛍光は発生しなかった。この知見から、ｈＢＤ-１発現に応答する膜完全性と透過性の変化は前立腺癌細胞の初期と後期とで異なることが示される。
【０２３５】
ｈＢＤ-１およびｃＭＹＣの発現レベルの比較：３人の患者からのＬＣＭ前立腺組織切片でＱＲＴ-ＰＣＲ解析を実施した（図３２）。患者番号１４５７では、ｈＢＤ-１発現は正常からＰＩＮまでの間に２．７倍の減少、ＰＩＮから腫瘍までの間に３．５倍の減少、正常から腫瘍までの間に９．３倍の減少を示した（図３４Ａ）。同様に、患者番号１４５７ではｃＭＹＣ発現も同様の発現パターンに従い、発現は正常からＰＩＮまでの間に１．７倍、ＰＩＮから腫瘍までの間に１．７倍、正常から腫瘍までの間に２．８倍減少した（図３４Ｂ）。さらに、他の２人の患者では、ｃＭＹＣ発現において統計的に有意な減少が認められた。患者番号１５６９では正常からＰＩＮまでの間に２．３倍減少したのに対し、患者番号１５８６では正常からＰＩＮまでの間に１．８倍減少し、ＰＩＮから腫瘍までの間に４．３倍減少し、正常から腫瘍までの間に７．９倍減少した。
【０２３６】
ＰＡＸ２阻害後のｈＢＤ-１発現の誘導：ｈＢＤ-１発現の調節におけるＰＡＸ２の役割をさらに調べるために、ｓｉＲＮＡを利用してＰＡＸ２発現をノックダウンし、ＱＲＴ-ＰＣＲを実施してｈＢＤ-１発現をモニターした。ｈＰｒＥＣ細胞をＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで処理してもｈＢＤ-１発現に影響はなかった（図３５）。しかしながら、ＰＡＸ２ノックダウンの結果、ｈＢＤ-１の発現は未処理細胞と比較してＬＮＣａＰでは４２倍増加し、ＰＣ３では３７倍増加し、ＤＵ１４５では１０２６倍増加した。陰性対照として、ｈＢＤ-１発現に顕著な影響のなかった非特異的ｓｉＲＮＡで細胞を処理した。図３５には、β-アクチンと比較した発現比としてｈＢＤ-１発現レベルを示す。星印は、ＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡ処理前の細胞株と比較した発現レベルが統計的に高いことを示している（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【実施例１１】
【０２３７】
ＰＡＸ２発現の阻害によりｐ５３状態の異なる前立腺癌細胞で代替細胞死経路が生じる。
１１．１  材料と方法
細胞株：ｐ５３突然変異状態がすべて異なっている（表６）癌細胞株ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰを、実施例１に記載のように培養した。前立腺上皮細胞株ｈＰｒＥＣはＣａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から入手し、前立腺上皮基礎培地で培養した。細胞は３７℃で５％ＣＯ２下に維持した。
【表７】
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【０２３８】
ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：ＰＡＸ２のｓｉＲＮＡサイレンシングを実施例２に記載のように実施した。
【０２３９】
ウェスタンブロット解析：ウェスタンブロット解析を実施例２に記載のように実施した。
【０２４０】
位相差顕微鏡解析：細胞数に対するＰＡＸ２ノックダウンの影響を実施例１に記載のように位相差顕微鏡により解析した。
【０２４１】
ＭＴＴ細胞毒性アッセイ：ＭＴＴ細胞毒性アッセイを実施例１に記載のように実施した。
【０２４２】
パンカスパーゼ検出：前立腺癌細胞株におけるカスパーゼ活性の検出を実施例１に記載のように実施した。
【０２４３】
定量的リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ：ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞株におけるＰＡＸ２ノックダウン後の遺伝子発現の変化を検証するために、定量的リアルタイムＲＴ-ＰＣＲを実施例１に記載のように実施した。公開配列からＢＡＸ、ＢＩＤ、ＢＣＬ-２、ＡＫＴおよびＢＡＤのプライマー対を作成した（表７）。ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で反応を実施した。６０℃のアニーリング温度を用いて標準条件下でＰＣＲを４０サイクルを実施した。指数関数的増幅が開始したサイクル数（閾値）により定量化を行い、３回反復から得られた値から平均した。メッセージレベルと閾値との間に逆関係が認められた。さらに、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として使用し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した。相対発現は各遺伝子とＧＡＰＤＨの比として計算した。すべての反応は３連で実施した。
【表８】
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【０２４４】
膜透過性アッセイ：膜透過性アッセイを実施例３に記載のように実施した。
【０２４５】
前立腺細胞におけるＰＡＸ２タンパク質発現の解析：ＰＡＸ２タンパク質発現を、ｈＰｒＥＣ前立腺初代培養物ならびにＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３前立腺癌細胞株でウェスタンブロット解析により調べた。すべての前立腺癌細胞株でＰＡＸ２タンパク質が検出された（図３６Ａ）。しかしながら、ｈＰｒＥＣではＰＡＸ２タンパク質は検出されなかった。ブロットを剥離し、内部対照としてβ-アクチンについてリプロービングして均等なロードを確保した。ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ前立腺癌細胞株におけるＰＡＸ２特異的ｓｉＲＮＡによる選択的標的化および阻害後のＰＡＸ２タンパク質発現もモニターした。６日間の処理期間にわたって、細胞にＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡのプールのトランスフェクションを１ラウンド実施した。ＰＡＸ２タンパク質は培地単独で処理した対照細胞で発現した。全３種類の細胞株でＰＡＸ２タンパク質のノックダウンが認められたことから、ＰＡＸ２ ｍＲＮＡの特異的標的化が確認された（図３６Ｂ）。
【０２４６】
前立腺癌細胞増殖に対するＰＡＸ２ノックダウンの影響：細胞数と細胞生存率に対するＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡの影響を光学顕微鏡とＭＴＴ解析により解析した。細胞数に対するＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡの影響を調べるため、ＰＣ３、ＤＵ１４５およびＬＮＣａＰ細胞株に培地単独、非特異的ｓｉＲＮＡまたはＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡを６日間トランスフェクトした。培地単独を加えた６０ｍｍ培養皿では各細胞株が８０〜９０％コンフルエントに達した。ｈＰｒＥＣ、ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞を非特異的ｓｉＲＮＡで処理すると、培地単独で処理した細胞と比較して細胞増殖にほとんど、またはまったく影響がないようであった（それぞれ図３７Ａ、３７Ｃ、および３７Ｅ）。ＰＡＸ２ヌル細胞株ｈＰｒＥＣをＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで処理すると、細胞増殖に有意な影響がないようであった（図３７Ｂ）。しかしながら、前立腺癌細胞株ＤＵ１４５、ＰＣ３およびＬＮＣａＰをＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで処理すると、細胞数は有意に減少した（それぞれ図３７Ｄ、３７Ｆおよび３７Ｈ）。
【０２４７】
前立腺癌細胞生存率に対するＰＡＸ２ノックダウンの影響：２日間、４日間または６日間曝露の後に細胞生存率を測定した。ＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで処理した細胞の５７０〜６３０ｎｍ吸光度を未処理対照細胞の吸光度で割った比として生存率百分率を計算した。陰性対照として、陰性対照非特異的ｓｉＲＮＡによる各処理時間後または試薬単独のトランスフェクション後に細胞生存率を測定した。ＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡ処理後の生存率百分率を非特異的ｓｉＲＮＡで処理後の生存率百分率で割ることにより相対細胞生存率を計算した（図３８）。２日間処理後に、相対生存率はＤＵ１４５で１１６％、ＰＣ３で８１％、ＬＮＣａＰで９８％であった。４日間処理後に、相対細胞生存率はＤＵ１４５で６９％、ＰＣ３で７９％、ＬＮＣａＰで８０％に減少した。最後に、６日までに相対生存率はＤＵ１４５で６３％、ＰＣ３で４３％、ＬＮＣａＰで４４％となった。さらに、トランスフェクション試薬単独での処理後にも細胞生存率を測定した。各細胞株は細胞生存率の有意な減少を示さなかった。
【０２４８】
パンカスパーゼ活性の検出：共焦点レーザー顕微鏡解析によりカスパーゼ活性を検出した。ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞をＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで処理し、アポトーシスが活発に生じている細胞でＦＡＭ標識ペプチドのカスパーゼとの結合に基づいて活性をモニターした。こうした細胞では緑色に蛍光発光する。培地単独を用いた細胞の解析から、それぞれ生存可能なＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞の存在が示される。４８８ｎｍで共焦点レーザーにより励起すると、検出可能な緑色染色は生じず、未処理細胞にカスパーゼ活性が存在しないことが示された（それぞれ図３９Ａ、３９Ｃおよび３９Ｅ）。ＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡで４日間処理後に、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞は蛍光下で緑色染色を生じ、カスパーゼ活性を示した（それぞれ図３９Ｂ、３９Ｄおよび３９Ｆ）。
【０２４９】
アポトーシス因子に対するＰＡＸ２阻害の影響：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞をＰＡＸ２に対するｓｉＲＮＡで４日間処理し、プロおよび抗アポトーシス因子の両方の発現をＱＲＴ-ＰＣＲにより測定した。ＰＡＸ２ノックダウン後にＢＡＤを解析すると、ＬＮＣａＰでは２倍、ＤＵ１４５では１．５８倍、ＰＣ３では１．３７５倍であることが判明した（図４０Ａ）。ＢＩＤの発現レベルはＬＮＣａＰで１．３８倍、ＤＵ１４５で１．７８倍に増加したが、ＰＡＸ２発現の抑制後にＰＣ３でＢＩＤに統計的有意差は認められなかった（図４０Ｂ）。抗アポトーシス因子ＡＫＴの解析から、処理後に発現はＬＮＣａＰで１．２５倍減少し、ＤＵ１４５では１．２８倍減少したことが判明したが、ＰＣ３では何の変化も認められなかった（図４０Ｃ）。
【０２５０】
膜完全性および壊死の解析：ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞で共焦点解析により膜完全性をモニターした。無傷の細胞は膜透過性であるＡＯにより緑色に染色され、原形質膜が損傷した細胞は膜不透過性ＥｔＢｒの細胞質への取り込みにより赤色に、また、核内におけるＡＯとＥｔＢｒの共局在により黄色に染色された。未処理ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５およびＰＣ３細胞はＡＯで陽性染色され、緑色を発生したが、ＥｔＢｒでは染色されなかった。ＰＡＸ２ノックダウン後、ＬＮＣａＰ細胞の膜完全性に変化は認められず、ＡＯによる陽性緑色蛍光が発生し、赤色ＥｔＢｒ蛍光は発生しなかった。これらの知見から、ＬＮＣａＰ細胞はＰＡＸ２ノックダウン後にアポトーシスを生じているが、壊死性細胞死は生じていない可能性があることがさらに示される。逆に、ＤＵ１４５とＰＣ３ではＰＡＸ２ノックダウンの結果、細胞質にＥｔＢｒが蓄積し、赤色染色が認められた。さらに、ＤＵ１４５とＰＣ３はいずれも核が濃縮し、それぞれＡＯとＥｔＢｒによる緑色と赤色の染色の共局在により黄色に見えた。これらの結果は、ＤＵ１４５とＰＣ３はＬＮＣａＰと比較して壊死性細胞死を伴う代替細胞死経路を経ていることを示している。
【実施例１２】
【０２５１】
前立腺癌の細胞増殖と生存におけるＥｎｇｒａｉｌｅｄ-２（ＥＮ２）の腫瘍形成の役割
細胞培養：ｈＰｒＥＣ細胞ならびにＤＵ１４５、ＬＮＣａＰおよびＰＣ３細胞株は、実施例１に記載のように培養した。ＰＡＸ２およびＥＮ２のｓｉＲＮＡサイレンシング：低分子干渉ＲＮＡノックダウンを、すでに記載されているように実施した（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２４８（２）：２５１-２６１，２００７）。簡潔に述べると、ヒトＰＡＸ２ ｍＲＮＡ（アクセッション番号ＮＭ００３９８９．１）を標的とする４個の相補的ｓｉＲＮＡのプールを合成して（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ、米国）、ＰＡＸ２発現をノックダウンした。ＥＮ２遺伝子サイレンシングを達成するために、ヒトＥＮ２ ｍＲＮＡ（アクセッション番号ＮＭ００１４２７．２）を標的とするｓｉＲＮＡ配列（配列番号：１０７、１０８、１１０、１１１、１１３、１１４）をＡｍｂｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。さらに、４個の非特異的ｓｉＲＮＡの第２のプールを陰性対照として使用した（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）。ｓｉＲＮＡ分子は、製造業者の指示に従ってＣｏｄｅ-Ｂｒｅａｋｅｒトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）を用いてトランスフェクトした。
【０２５２】
ＲＮＡ単離および定量的リアルタイムＰＣＲ：実施例１に記載のように、ＲＮＡを単離し、２段階ＱＲＴ-ＰＣＲを実施した。ヒトＰＡＸ２（Ｃａｔ．番号ＰＰＨ０６８８１-Ａ、配列番号３３および３４）とＥＮ２（Ｃａｔ．番号ＰＰＨ００９７５Ａ、フォワードプライマー５’-ＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴ-３’（配列番号１１５）、リバースプライマー５’-ＴＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＧ-３’（配列番号１１６））のためのプライマー対をＳｕｐｅｒ Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（米国メリーランド州）から購入した。すでに記載されているように、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として増幅し、全ｃＤＮＡの初期含量を正規化した（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２４８（２）：２５１-２６１，２００７）。
【０２５３】
細胞増殖アッセイ：細胞増殖率は、［３Ｈ］チミジンリボチド（［３Ｈ］ＴｄＲ）のＤＮＡへの取り込みにより測定した。適切な培地を加えた２４ウェルプレートに約２．５〜５×１０４個の細胞を播種した。指定濃度のｓｉＲＮＡの不在下または存在下で細胞を７２時間インキュベートした。細胞を同一培地中で３７ｋＢｑ／ｍＬ［メチル-３Ｈ］チミジンに６時間曝露した。接着細胞を５％トリクロロ酢酸で固定し、ＳＤＳ／ＮａＯＨ溶解用緩衝液で一晩溶解させた。Ｂｅｃｋｍａｎ ＬＳ３８０１液体シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定した。すべてのアッセイを３連で３回実施した。
【０２５４】
ウェスタンブロット解析：ウェスタンブロット解析を実施例２に記載のように実施した。
【０２５５】
統計解析：対応のないスチューデントのｔ検定を用いて統計解析を実施した。両側検定によりＰ値を求め、０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。統計学的差異がある場合は星印で示している。
【０２５６】
前立腺細胞におけるＥＮ２発現の解析：ＥＮ２発現を調べるために、前立腺癌細胞株およびｈＰｒＥＣ前立腺初代培養物でＱＲＴ-ＰＣＲを実施した。図４１Ａに示すように、ＥＮ２ ｍＲＮＡ発現は、ｈＰｒＥＣ細胞（レーン１）と比較して、ＤＵ１４５（レーン２）で２．１５倍高く、ＰＣ３（レーン３）で３０倍高く、ＬＮＣａＰ（レーン４）で７．８倍高かった。ＥＮ２タンパク質レベルのウェスタンブロット解析より、ｈＰｒＥＣ細胞（図４１Ｂ、レーン３）のＥＮ２タンパク質レベルが低いことが示された。しかしながら、すべての前立腺癌細胞株でＥＮ２が過剰発現した。ＥＮ２発現はＤＵ１４５で最低だったのに対し、ＰＣ３細胞で発現レベルが最高であった。ＥＮ２発現は、ｈＰｒＥＣ細胞と比較して、ＰＣ３（レーン１）で８倍高く、ＬＮＣａＰ（レーン２）で６倍高く、ＤＵ１４５（レーン４）前立腺癌細胞で４倍高かった。
【０２５７】
ＥＮ２の低分子干渉ＲＮＡ介在性抑制：配列番号：１０７、１０８、１１０、１１１、１１３または１１４を有するＥＮ２ ｓｉＲＮＡでの処理後に、ＰＣ３細胞におけるＥＮ２発現のＱＲＴ-ＰＣＲ解析をモニターした。この試験により、ＰＣ３のＥＮ２ ｓｉＲＮＡ処理の４８時間後に６３％、７２時間後に４３％、９６時間後に６０％に減少していることが判明した（図４２Ａ）。ウェスタンブロット解析を実施し、ＰＣ３前立腺癌細胞におけるＥＮ２特異的ｓｉＲＮＡによる選択的標的化および阻害後のＥＮ２タンパク質レベルをモニターした。ＰＣ３細胞の処理後、タンパク質発現は４８時間で７０％、７２時間で２０％、９６時間で２６％減少した（図４２Ｂ）。ＥＮ２ノックダウンの効率をＰＣ３（図４２Ｂ）およびＬＮＣａＰ細胞株（図４２Ｃ）で比較した。７２時間のｓｉＲＮＡ処理後に、未処理ＰＣ３（図４２Ｂ、レーン１）およびＬＮＣａＰ（図４２Ｃ、レーン３）細胞と比較すると、ＥＮ２タンパク質レベルはＰＣ３（図４２Ｂ、レーン２）で２５％、ＬＮＣａＰ（図４２Ｃ、レーン４）で６０％減少した。
【０２５８】
前立腺癌細胞増殖に対するＥＮ２ノックダウンの影響：前立腺癌細胞増殖率に対するＥＮ２発現の治療標的化と阻害の影響を調べるために、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞におけるＥＮ２に対するｓｉＲＮＡ処理の７２時間後にチミジン取り込みアッセイにより細胞増殖をモニターした。１５０ｎＭ ＥＮ２ ｓｉＲＮＡを用いてＰＣ３細胞を処理した結果、培地単独で処理した細胞と比較して細胞増殖率は２０％阻害された（図４３）。しかしながら、ＥＮ２ ｓｉＲＮＡを用いてＬＮＣａＰ細胞を処理した結果、非特異的ｓｉＲＮＡで処理した細胞と比較して増殖率は８１％減少した。陰性対照として、細胞を非特異的ｓｉＲＮＡで処理したところ、細胞生存率に有意な変化は認められなかった。
【０２５９】
前立腺癌におけるＥＮ２発現に対するＰＡＸ２ノックダウンの影響：前立腺癌におけるＥＮ２発現に対するＰＡＸ２の役割を調べるために、ＰＡＸ２を特異的に標的とするｓｉＲＮＡのプールを用いて、ＰＣ３およびＬＮＣａＰ細胞を３日間処理した。前立腺癌細胞株では早ければ２日でＰＡＸ２発現のｓｉＲＮＡノックダウンが生じることがすでに示されている（Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．，２４８（２）：２５１-２６１，２００７）。ＱＲＴ-ＰＣＲ解析から、ＥＮ２ ｍＲＮＡレベルは、培地単独で処理した対照細胞と比較して、ＰＣ３細胞株において９１％のダウンレギュレーションを生じたことが判明した（図４４Ａ）。さらに、ＬＮＣａＰ細胞のＥＮ２ ｍＲＮＡは、対照と比較して２３％抑制された。ＰＡＸ２ ｓｉＲＮＡの３日間処理後の前立腺癌細胞株におけるＥＮ２タンパク質発現のウェスタンブロット解析から、ＥＮ２発現は、ＰＣ３（レーン１）およびＬＮＣａＰ（レーン３）対照と比較して、ＰＣ３（レーン２）で７０％、ＬＮＣａＰ（レーン４）前立腺癌細胞株で２６％減少したことが示された。
【０２６０】
前立腺癌におけるＥＮ２ノックダウン後のＰＡＸ２発現の解析：ＥＮ２ ｓｉＲＮＡでの処理後のＬＮＣａＰ細胞においてＰＡＸ２のＱＲＴ-ＰＣＲ解析を実施し、ＥＮ２が前立腺癌においてＰＡＸ２発現を調整できるか否かを調べた。データから、ＬＮＣａＰ細胞において、ＰＡＸ２ ｍＲＮＡレベルは４８時間で９０％、７２時間で６７％、９６時間で９０％の有意な減少を示した（図４５Ａ）。さらに、タンパク質レベルでのＰＡＸ２とＥＮ２の相関を試験するために、ウェスタンブロット解析を実施した。ＰＡＸ２タンパク質レベルは、未処理細胞（レーン１）および非特異的ｓｉＲＮＡ処理細胞（レーン２）と比較して、ＥＮ２ ｓｉＲＮＡ処理後４８時間で５０％（レーン３）、７２時間で６６％（レーン４）、９６時間で７２％（レーン５）減少した（図４５Ｂ）。
【０２６１】
この実施例は、正常前立腺上皮細胞と比較してヒト前立腺癌細胞においてＥＮ２が過剰発現されることを実証している。調節解除されたＰＡＸ２およびＥＮ２の発現が、特に癌細胞の増殖と生存によって最終的に腫瘍進行を促進する可能性があるというのが妥当である。
【０２６２】
以上の説明は、本発明の実施方法を当業者に教示するためのものであり、本説明を読むことで熟練技能者には明らかとなるようなその明白な修正および変更のすべてを詳述することを意図するものではない。しかしながら、そうした明白な修正および変更のすべては、下記の請求項に規定する本発明の範囲内に含まれることが意図される。本請求項は、文脈に具体的に反対の表示がない限り、そこで意図される目的を達成するのに効果的である任意の配列における請求項に係る成分および手段を含むことが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４３】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４４】
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【図４５】
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