(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
富化腎臓細胞集団により産生されるヒト分泌小胞を含む組成物であって、該小胞がプラスミノーゲン活性化因子阻害物質−１（ＰＡＩ−１）を阻害するｍｉＲＮＡを含み、上記組成物のヒト被検体へのインビボ投与により該被検体における腎疾患を治療し、腎臓線維形成を低減させる方法における使用のための組成物。
【請求項２】
小胞が微小胞及び／又はエキソソームを含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
ｍｉＲＮＡが小胞外である、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
集団が、
（ａ）尿細管細胞の富化集団を含む第１細胞集団、Ｂ２；又は
（ｂ）第１細胞集団、Ｂ２及び第２細胞集団を含むヒト腎臓細胞の混合物；ここで、Ｂ２が尿細管細胞の富化集団を含み、第２細胞集団が１又は複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞及び血管細胞を含む、
を含む、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
（ａ）Ｂ２細胞集団が１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する；又は
（ｂ）第２細胞集団が１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である；又は
（ｃ）第２細胞集団が１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
混合物が第３細胞集団をさらに含み、第３細胞集団が１又は複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞を含む、請求項４に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
第３細胞集団が、
（ａ）１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有するＢ４細胞集団である；又は
（ｂ）１．０５２ｇ／ｍＬ〜１．０６３ｇ／ｍＬの密度を有するＢ３細胞集団である、
請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
富化腎臓細胞集団がネイティブ腎臓に対し非自己である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
富化腎臓細胞集団がネイティブ腎臓に対し自己である、請求項１に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、健康な個体に比べて細胞成分が欠けているが治療活性を維持している生理活性腎臓細胞集団または画分、およびそれを単離し培養する方法、ならびに、その細胞集団を必要としている対象を治療する方法に関する。さらに、本発明は、生理活性腎臓細胞集団を使ってネイティブ腎臓に対し再生効果を与える方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
慢性腎疾患（ＣＫＤ）は、１，９００万人を越える米国人が罹患しており、また、この疾患は、代謝障害の結果であることが多く、肥満症、糖尿病、および高血圧症を伴う。データ調査により、増加率は、高血圧症およびインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）（同じく世界中で増えつつある２つの疾患）に続発する腎不全の発生に起因することが示されている（米国腎臓データシステム（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｒｅｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｓｙｓｔｅｍ）：ＣＫＤとＥＳＲＤのコスト．ｅｄ．Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、国立衛生研究所、国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所、２００７  ｐｐ  ２２３−２３８）。肥満症、高血圧症、および血糖コントロール不良は、全て腎障害の独立したリスク因子であることが示され、糸球体および尿細管障害を生じ、蛋白尿および他の全身的に検出可能な腎臓濾過機能の変化の原因となる（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ、ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ、２６：２９５−３００、２００８；Ａｍａｎｎ、Ｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１３：１９５８−６６、１９９８）。進行の１〜３ステージのＣＫＤ患者は、生活様式の変更および根底にある病的状態の制御を目的とした薬理学的介入によって管理されるが、一方、４〜５ステージの患者は、透析および通常、降圧剤、赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）、鉄およびビタミンＤ補充を含む投薬計画により管理される。再生医療技術は、ＣＫＤに対する次世代の治療オプションを提供できる。国際公開第２０１０／０５６３２８号でＰｒｅｓｎｅｌｌ、等は、単離腎臓細胞について記載しているが、これには、尿細管とエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞集団、および、これらを単離、培養する方法、ならびに、その細胞集団を必要としている対象を治療する方法が含まれている。この患者集団に対し、本当の意味での、長続きのする腎臓機能の増強療法を提供し、進行を遅らせ、生活の質を改善するための新規治療パラダイムが必要である。
【発明の概要】
【０００３】
一態様では、本発明は、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与える方法を提供する。一実施形態では、この方法は、ネイティブ腎臓を腎臓細胞集団により分泌された産物とインビボで接触させるステップを含む。別の実施形態では、産物は、本明細書記載のように、構築物の一部ではない富化腎臓細胞集団、例えば、足場に播種されていない細胞集団、により分泌される。もう一つの実施形態では、産物は、足場上または足場中に直接播種された富化腎臓細胞集団を含む腎臓細胞構築物から分泌される。別の実施形態では、産物の分泌は酸素レベルに対し生物学的応答性である。分泌は、大気未満の酸素レベルにより誘導されうる。もう一つの実施形態では、より低い酸素レベルは、約５％酸素未満である。
【０００４】
一実施形態では、再生効果は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）の減少である。ＥＭＴの減少は、ＴＧＦ−βシグナル伝達および／またはプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）シグナル伝達の減弱により実現できる。別の実施形態では、再生効果は、腎臓線維形成の減少および／または腎臓炎症の減少である。一部の実施形態では、炎症の減少は、ＮＦκＢにより媒介されうる。もう一つの実施形態では、再生効果は、ネイティブ腎臓中の幹細胞マーカーの発現差異を特徴とする。発現は、非接触ネイティブ腎臓中の発現に比べて、インビボ接触ネイティブ腎臓中のマーカー発現の増加であってもよい。
【０００５】
一態様では、富化腎臓細胞集団は、本明細書記載の１つまたは複数の細胞集団を含み、すなわち、本明細書記載の細胞集団の混合物である。一実施形態では、集団は、尿細管細胞富化集団を含む第１細胞集団、Ｂ２を含む。別の実施形態では、集団は、第１細胞集団、Ｂ２、および１つまたは複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞を含む第２細胞集団を有するヒト腎臓細胞混合物を含む。もう一つの実施形態では、第２細胞集団は、Ｂ４細胞集団である。さらに別の実施形態では、第２細胞集団は、Ｂ３細胞集団である。
【０００６】
一実施形態では、混合物は、１つまたは複数のエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、糸球体細胞および血管細胞を有する第３細胞集団をさらに含む。別の実施形態では、第３細胞集団は、Ｂ４細胞集団である。もう一つの実施形態では、第３細胞集団は、Ｂ３細胞集団である。
【０００７】
全ての実施形態で、Ｂ２細胞集団は、約１．０４５ｇ／ｍＬ〜約１．０５２ｇ／ｍＬの密度を有する。全ての実施形態で、Ｂ４細胞集団は、約１．０６３ｇ／ｍＬ〜約１．０９１ｇ／ｍＬの密度を有する。全ての実施形態で、Ｂ３細胞集団は、約１．０５２ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌの密度を有する。
【０００８】
全ての実施形態で、富化腎臓細胞集団は、ネイティブ腎臓に対し非自己であってもよい。全ての実施形態で、富化腎臓細胞集団は、ネイティブ腎臓に対し自己でであってもよい。
【０００９】
全ての実施形態で、産物は、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、ＲＮＡ、小胞、微小胞、エキソソーム、およびそれらのいずれかの組み合わせを含む。もう一つの実施形態では、小胞は、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびＲＮＡからなる群より選択される１つまたは複数の分泌産物を含む。別の実施形態では、産物は、足場上または中に直接播種された富化腎臓細胞集団を含む腎臓細胞構築物から分泌される。
【００１０】
全ての実施形態で、足場は、生体適合性材料を含んでもよい。全ての実施形態で、生体適合性材料は、ヒドロゲルであってもよい。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、腎疾患（ＫＤ）患者が治療薬による処置に反応するか否かを評価する方法を提供する。この方法は、対照検体中の小胞の量と比較して、またはそれに対して、治療薬で処置したＫＤ患者から入手した試験検体中の小胞またはそれらの内腔含有物の量を測定または検出するステップを含んでもよい。この場合、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比較して、試験検体中の小胞またはその内腔含有物の多いまたは少ない量は、治療された患者の治療薬による処置に対する反応性を示す。小胞は、腎臓由来の小胞であってもよい。試験検体は、尿であってもよい。小胞は、バイオマーカーを含んでもよく、このバイオマーカーはｍｉＲＮＡであってもよい。治療薬が腎臓細胞富化集団を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】多層ステップ勾配技術（Ａ−左パネル図）または単層混合勾配技術（Ｂ−右パネル図）を使って新たに分離した腎臓組織由来のｅｐｏ産生細胞画分富化を示す。両方法とも、ｅｐｏバンド由来の非ｅｐｏ産生細胞成分（主に尿細管細胞）の部分的欠乏を生ずる。このバンドは、１．０２５ｇ／ｍＬおよび１．０３５ｇ／ｍＬの間に現れる。
【図２】別々に採取し、同じステップ勾配を並列に並べた「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）げっ歯類培養物のステップ勾配を示す。
【図３】別々に採取し、同じステップ勾配を並列に並べた「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素」（２％酸素）下のイヌの培養物のステップ勾配を示す。
【図４】ＨＫ１７およびＨＫ１９検体の病理組織学的特性を示す。
【図５】対象領域（ＲＯＩ）を規定するヒトＮＫＡ細胞中のアルブミン輸送のハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）を示す。
【図６】非ＣＫＤおよびＣＫＤ腎臓由来のＮＫＡ細胞中のアルブミン輸送の定量的比較を示す。
【図７】尿細管細胞富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間のマーカー発現の比較分析を示す。
【図８】尿細管細胞富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間のアルブミン輸送の比較機能分析を示す。
【図９】５／６ＮＸラットの処置後の宿主組織中のＳＯＸ２  ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１０】ＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＵＴＦ１、ＳＯＸ２、ＮＯＤＡＬおよびＬＥＦＴＹの発現の経時変化を示すウェスタンブロットである。
【図１１】再生応答指数（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＲＲＩ）の経時変化を示す。
【図１２】ＵＮＦＸ馴化培地の調整と分析模式図である。
【図１３Ａ】ＵＮＦＸ培養物由来の馴化培地が潜在的に再生結果と関連する複数のインビトロ細胞プロセスに影響することを示す。図１３Ａは、ＵＮＦＸ馴化培地がＮＦ−ｋＢのＴＮＦ−α媒介活性化を弱めることを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＵＮＦＸ馴化培地がＨＵＶＥＣ細胞培養の血管新生促進挙動を高めることを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＵＮＦＸ馴化培地が上皮細胞中の線維形成経路を弱めることを示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＴＧＦβ１およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）により構築される正のフィードバックループを示す。
【図１４】糸球体間質細胞中の線維形成経路の減弱化を立証するウェスタンブロット分析を示す。
【図１５Ａ】ＵＮＦＸ由来馴化培地が分泌小胞を含むことを示す。図１５Ａは、分泌小胞を示し、これは、細胞質由来内部成分（緑）を含む二相脂質（ｂｉｌｉｐｉｄ）構造（赤）である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂ〜Ｃは、ＦＡＣＳ選別を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｂ〜Ｃは、ＦＡＣＳ選別を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａは、総タンパク質を調製し、ＰＡＩ−１とβ−アクチンをアッセイしたウェスタンブロットを示す。図１６Ｂは、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを示す。
【図１７Ａ−Ｅ】図１７Ａ−Ｃは、腎摘出術を行った後の生理活性腎臓細胞の送達後のＬｅｗｉｓラット腎臓中のＰＡＩ−１の代表的免疫組織化学像である。図１７Ｄは、未処置で腎摘出ラット（赤い正方形）中、処置後の腎摘出ラット（青い菱形）、および対照動物（緑の三角形）の間のＰＡＩ−１発現の比較を示す。図１７Ｅは、処置後３および６ヶ月目に採取した腎臓検体の代表的ウェスタンブロット分析を示す。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、ＮＫＡ馴化培地に対する２時間暴露によりＮＦκＢｐ６５の核局在化が低減されるのを示す。
【図１７Ｇ】図１７Ｇは、ＴＮＦαによるＮＦｋＢ経路の標準的活性化を示す。
【図１８Ａ−Ｄ】（Ａ）５／６腎摘出術により開始された進行性ＣＫＤ、および（Ｂ）片側腎摘出術により開始された非進行性腎不全の動物中のＮＦｋＢｐ６５サブユニットの核局在化を示す。図１８Ｃ〜Ｄは、（Ｃ）５／６腎摘出術を行ったＬｅｗｉｓラット腎臓組織の抽出物中のＮＦｋＢ  ｐ６５のウェスタンブロット分析；および（Ｄ）抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）、を示す。
【図１８Ｅ】図１８Ｅは、ＮＫＡ（パネルＡ）または非生理活性腎臓細胞（パネルＢ）の腎臓内注射を受けた確定ＣＫＤのＬｅｗｉｓラットから採取した組織のＮＦκＢ  ｐ６５サブユニットの免疫組織化学検出を示す。
【図１９Ａ】移植後１週および４週目の生体材料のインビボ評価を示す。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図２０Ａ−Ｄ】Ａ〜Ｄは、ＮＫＡ構築物の生死染色を示す。
【図２０Ｅ】ＮＫＡ構築物のトランスクリプトームプロファイリングを示す。
【図２０Ｆ】同上。
【図２０Ｇ】同上。
【図２１Ａ】ＮＫＡ構築物のセクレトームプロファイリングを示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２２Ａ】ＮＫＡ構築物のプロテオミクスプロファイリングを示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３Ａ】ＮＫＡ構築物の共焦点顕微鏡像を示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２４Ａ】移植後１週と２週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２５】Ａ〜Ｄは、移植後８週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。
【図２６】ＮＫＡ構築物由来の馴化培地がＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴをインビトロで減弱化することを示す。
【図２７】処理中に低酸素中に細胞を暴露する工程を示す。
【図２８】２％酸素下の暴露時に、下記が観察されたことを示す：密度勾配全体にわたる細胞分布の変化、全体勾配後収率の改善。
【図２９Ａ】尿細管単層のインビトロ修復を観察するために開発されたアッセイを示す。
【図２９Ｂ】Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５  ＢｉｏＩｍａｇｅｒ）の結果を示す。
【図２９Ｃ】２％酸素により尿細管上皮単層修復能力が向上するように誘導された細胞を示す。
【図３０Ａ】尿細管単層のインビトロ修復を観察するために開発されたアッセイを示す。
【図３０Ｂ】非誘導（２１％酸素）に比較して、２％酸素による細胞の誘導により、誘導および創傷修復が強化されることを示す。
【図３０Ｃ】遊走時間に対する、遊走細胞％のプロットである。
【図３１Ａ】オステオポンチンが尿細管細胞により分泌され、傷害に応答して発現上昇する（オステオポンチン免疫細胞化学：Ｈｏｅｃｈｓｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｓｔａｉｎ（青）、オステオポンチン（赤）、１０ｘ）ことを示す。免疫蛍光（図３１Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図３１Ｂ）に示すように、オステオポンチンは、確定尿細管細胞単層中の傷害により発現上昇する。
【図３１Ｂ】同上。
【図３２Ａ】細胞の遊走応答が一部はオステオポンチン（緑＝遊走細胞（５ｘ））により媒介されることを示す。
【図３２Ｂ】オステオポンチンに対する中和抗体（ＮＡｂ）が腎臓細胞の遊走応答を５０％減らすことを示す。
【図３３】細胞の低酸素誘導により、組織リモデリング遺伝子発現が調節されることを示す。
【図３４】細胞の生理活性の低酸素下増強が腎臓再生をもたらす推定機序を示す。
【図３５】ウェスタンブロットによる微小胞の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、生理活性腎臓細胞（ＢＲＣ）の異種起源混合物、およびこれらを単離し培養する方法、ならびに本明細書記載のＢＲＣおよび／またはＢＲＣを播種した足場から形成したＢＲＣ含有構築物を必要としている対象を治療する方法に関する。生理活性腎臓細胞は、尿細管およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞含有単離腎臓細胞であってもよい。ＢＲＣ細胞集団は、富化尿細管およびＥＰＯ産生細胞集団を含んでもよい。ＢＲＣは、健康な個体由来腎臓細胞画分由来か、または画分それ自体であってもよい。さらに、本発明は、対応する健康な個体の腎臓細胞画分と比較して、特定の細胞成分が欠如している可能性があるが、それでも、治療特性を保持している不健康な個体から採取した腎臓細胞画分を提供する。本発明は、また、健康な個体に比較して細胞成分が欠けている治療的に活性な細胞集団を提供し、一実施形態では、この細胞集団は、種々の疾患状態の自己ソースから単離、増殖できる。
【００１４】
本発明は、また、ネイティブ腎臓を腎臓細胞による分泌産物とインビボで接触させることによりネイティブ腎臓に再生効果を与える方法、ならびに分泌産物を調製する方法に関する。本発明は、マーカーを使用して本明細書記載の方法による治療後の腎臓再生の存在の測定にさらに関する。
【００１５】
定義
特に断らなければ、本明細書で使われる技術的および科学的用語は、本発明の属する当業者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｒ  Ｌａｎｚａ、Ｒ  Ｌａｎｇｅｒ、＆  Ｊ  Ｖａｃａｎｔｉ）、２００７、は本出願で使われる多くの用語に対する一般的ガイドを当業者に提供する。当業者なら、本明細書記載のものと類似の、または等価な、本発明の実施に使用可能な多くの方法と材料に気付くであろう。実際、本発明は、記載されている方法と材料に限定されるものではない。
【００１６】
本明細書で使用される用語の「細胞集団」は、適切な組織ソース、通常は哺乳動物、から直接単離することにより得られいくつかの細胞を指す。単離細胞集団は、その後、インビトロで培養してもよい。当業者なら、本発明で使用可能な細胞集団を単離し培養する種々の方法および本発明で使用される細胞集団中の様々な数の細胞について解るであろう。細胞集団は、腎臓由来の未分画の、異種起源の細胞集団であってもよい。例えば、異種起源の細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から単離されてもよい。あるいは、異種起源の細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から構築された哺乳動物細胞のインビトロ培養物由来であってもよい。未分画異種起源の細胞集団は、また、非富化細胞集団と呼ぶこともできる。
【００１７】
用語の「ネイティブ腎臓」は、生体の腎臓を意味する。対象は、健康でも不健康でもよい。不健康対象は、腎疾患に罹患していてもよい。
【００１８】
用語の「再生効果」は、ネイティブ腎臓に対する利益を提供する効果を意味する。効果は、これらに制限されないが、ネイティブ腎臓に対する障害度の減少、またはネイティブ腎臓機能の改善、修復もしくは安定化を含んでもよい。腎損傷は、線維形成、炎症、糸球体肥大、等の形態であってもよく、対象の腎疾患に関連してもよい。
【００１９】
本明細書で使用される用語の「混合物」は、２つ以上の未分画、異種起源の細胞集団由来の単離された、富化細胞集団の組み合わせを指す。特定の実施形態では、本発明の細胞集団は、腎臓細胞集団である。
【００２０】
「富化」細胞集団または調製物は、出発集団中のその細胞型の割合よりも高い割合の特定細胞型を含む、出発腎臓細胞集団（例えば、未分画、異種起源の細胞集団）由来の細胞集団を指す。例えば、出発腎臓細胞集団は、第１、第２、第３、第４、第５、等の対象細胞集団用として富化してもよい。本明細書で使用される用語の「細胞集団」、「細胞調製物」および「細胞プロトタイプ」は、同義に使用される。
【００２１】
一態様では、本明細書で使用される用語の「富化」細胞集団は、出発集団中のＥＰＯ産生可能な細胞の割合よりも高い割合のＥＰＯ産生可能な細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団（例えば、腎生検または培養哺乳類腎臓細胞由来の細胞懸濁液）を指す。例えば、用語の「Ｂ４」は、出発集団に比べて、より大きな割合のＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。本発明の細胞集団は、１つまたは複数の細胞型を富化させ、１つまたは複数の他の細胞型を枯渇させてもよい。例えば、富化ＥＰＯ産生細胞集団は、間質性線維芽細胞を富化させ、尿細管細胞を枯渇させて、非富化細胞集団、すなわち、富化細胞集団が得られる出発細胞集団中の間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比べて、管上皮細胞を集合させることができる。ＥＰＯ富化または「Ｂ４」集団に言及している全ての実施形態において、富化細胞集団は、内在性ネイティブＥＰＯ遺伝子からの酸素で調節可能なＥＰＯ発現により示されるように、酸素調節手法でＥＰＯを産生出来る細胞を含む異種起源の細胞集団である。
【００２２】
別の態様では、出発集団の細胞型の割合より大きな割合の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む富化細胞集団は、また、健康な個体または対象由来の出発腎臓細胞集団に比べて、１つまたは複数の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が欠けているか、または不足していてもよい。例えば、一態様では、用語の「Ｂ４’」、すなわち「Ｂ４プライム」は、健康な個体に比較して、出発標本の疾患状態に応じて、１つまたは複数の細胞型、例えば、血管、糸球体または内分泌型が欠けているか、または不足している出発腎臓細胞集団由来の細胞集団である。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、慢性腎疾患の対象由来である。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の対象由来である。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、自己免疫性糸球体腎炎の対象由来である。別の態様では、Ｂ４’は、１つまたは複数の細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、枯渇するか、または不足する、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。さらに別の態様では、Ｂ４’は、１つまたは複数の特定細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞が、後で、富化される、全細胞型、例えば、血管、糸球体、または内分泌細胞を含む出発細胞集団由来の細胞集団である。例えば、一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管細胞が富化され、糸球体および／または内分泌細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体細胞が富化され、血管および／または内分泌細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、内分泌細胞が富化され、血管および／または糸球体細胞が枯渇してもよい。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管および内分泌細胞が富化され、糸球体細胞が枯渇してもよい。好ましい実施形態では、Ｂ４’細胞集団が、単独または別の富化細胞集団、例えば、Ｂ２および／またはＢ３と混合されて、治療特性を保持する。Ｂ４’細胞集団は、例えば、本明細書の実施例、例えば、実施例７〜９に記載されている。
【００２３】
別の態様では、富化細胞集団は、また、上で考察のように、出発集団中の１つまたは複数の尿細管細胞マーカー発現細胞の割合よりも大きな割合の１つまたは複数の尿細管細胞マーカー発現細胞を含む、出発腎臓細胞集団由来の細胞集団を指してもよい。例えば、用語「Ｂ２」は、出発集団に比較して、より大きな割合の尿細管細胞を含む出発腎臓細胞集団由来の細胞集団を指す。さらに、１つまたは複数の尿細管細胞マーカー（または「Ｂ２」）を発現する細胞を富化した細胞集団は、集合管系由来の一部の上皮細胞を含んでもよい。１つまたは複数の尿細管細胞マーカー（または「Ｂ２」）を発現する細胞を富化した細胞集団は、相対的に、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が枯渇しているが、富化集団は、出発集団に比べてより小さな割合のこれらの細胞（ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞）を含んでもよい。一般的に、異種起源の細胞集団は、１つまたは複数の細胞型が枯渇し、その結果、枯渇細胞集団は、枯渇前の異種起源の細胞集団に含まれる細胞型の割合に比較して、より小さい割合の細胞型を含む。枯渇する可能性のある細胞型は、腎臓細胞のいずれの型でもよい。例えば、特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、大きな粒度の集合管および尿細管系を有する細胞が含まれ、これは、密度が約１．０４５ｇ／ｍｌ未満で、「Ｂ１」と呼ばれる。他の特定の実施形態では、枯渇する可能性のある細胞型には、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞が含まれ、密度は約１．０９５ｇ／ｍｌ超で、「Ｂ５」と呼ばれる。一部の実施形態では、尿細管細胞を富化した細胞集団は、相対的に次の全てが枯渇している：「Ｂ１」、「Ｂ５」、酸素で調節可能なＥＰＯ発現細胞、糸球体細胞、および血管細胞。
【００２４】
本明細書で使用される用語の「低酸素性の」培養条件は、細胞が大気酸素レベル（約２１％）で培養される標準的培養条件に比較して、細胞が培養系で利用可能な酸素レベルの低下にさらされる培養条件を指す。非低酸素性条件は、本明細書では、正常、または正常酸素圧培養条件と呼ばれる。
【００２５】
本明細書で使用される用語の「酸素で調節可能な」は、細胞に利用可能な酸素量に基づいて、遺伝子発現を調節（上昇または低下）する細胞の能力を指す。「低酸素誘導可能」は、酸素圧力の減少に応答した遺伝子発現上昇を指す（前誘導または出発酸素圧力にかかわらず）。
【００２６】
本明細書で使われる用語の「生体材料」は、生きている組織中への導入に適した天然または合成生体適合性材料を指す。天然生体材料は、生体系により作られる材料である。合成生体材料は、生体系では作られない材料である。本明細書で開示の生体材料は、天然および合成生体適合性材料の組み合わせであってもよい。本明細書で使用される生体材料には、例えば、高分子マトリックスおよび足場が含まれる。当業者には、生体材料は、例えば、液体ヒドロゲル懸濁液、多孔性発泡体のような種々の形態に作られてもよく、１つまたは複数の天然または合成生体適合性材料を含んでもよいことは理解されるであろう。
【００２７】
本明細書で使用される用語の「貧血」は、対象のＥＰＯ産生細胞による機能性ＥＰＯタンパク質の不適切は産生、および／または全身循環へのＥＰＯタンパク質の不適切放出、および／または骨髄中の赤芽球がＥＰＯタンパク質に反応できないこと、による赤血球数および／またはヘモグロビンレベルの不足を指す。貧血の対象は、赤血球恒常性を維持できない。一般的に、腎臓機能の低下または喪失（例えば、慢性腎不全）による貧血、相対的ＥＰＯ欠乏に関連した貧血、うっ血性心不全に関連した貧血、化学療法または抗ウイルス療法（例えば、ＡＺＴ）等の骨髄抑制療法に関連した貧血、非骨髄性癌に関連した貧血、ＨＩＶ等のウイルス性感染症に関連した貧血、および自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ）等の慢性疾患、肝臓疾患、および多相器系不全の貧血が発生しうる。
【００２８】
用語の「ＥＰＯ欠乏」は、貧血を含む、エリスロポエチン受容体アゴニスト（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で治療可能な任意の状態または障害を指す。
【００２９】
本明細書で使用される用語の「腎疾患」は、腎臓の血液濾過および血液からの過剰体液、電解質、および廃棄物の除去機能の実行能力の低減を生ずる急性または慢性腎不全の任意の段階または程度に関連した障害を指す。腎疾患は、また内分泌機能異常、例えば、貧血（エリスロポエチン欠乏）、およびミネラル不均衡（ビタミンＤ欠乏）を含む。腎疾患は、腎臓が起源であるか、または心不全、高血圧症、糖尿病、自己免疫疾患、または肝臓疾患（これらに限定されない）を含む種々の状態に続発することもありうる。腎疾患は、腎臓に対する急性傷害後に発生する慢性腎不全の状態でありうる。例えば、虚血および／または毒物への暴露による腎臓に対する障害が、急性腎不全を引き起こす可能性がある；急性腎傷害後の不完全回復が慢性腎不全の発生をもたらす可能性がある。
【００３０】
用語の「処置」は、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に対する治療の処置および予防または防止手段の両方を指す。この場合、目的は、標的の障害を逆戻りさせるか、防ぐか、または減速させる（小さくする）ことである。処置を必要としている人には、既に、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下に罹患している人、ならびに腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下になりそうな人、または腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下を予防すべき人が含まれる。本明細書で使用される用語の「処置」は、腎臓機能の安定化および／または改善を含む。
【００３１】
本明細書で使用される用語の「インビボ接触」は、腎臓細胞富化集団により分泌された産物（または腎臓細胞／腎臓細胞画分を含む混合物または構築物）およびネイティブ腎臓間の直接インビボ接触を指す。直接インビボ接触は、本質的に、パラクリン、内分泌、またはジャクスタクラインであってもよい。分泌された産物は、本明細書記載の異なる産物の異種起源の集団であってもよい。
【００３２】
本明細書で使用される用語の「リボ核酸」または「ＲＮＡ」は、ヌクレオチドユニットの鎖を指し、各ユニットは、窒素性塩基、リボース糖、およびリン酸塩で構築されている。ＲＮＡは、単鎖型でも二重鎖型でもよい。ＲＮＡは、小胞の一部であっても、小胞内に存在しても、または小胞に関連するものでもよい。小胞は、エキソソームであってもよい。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小型ＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および非翻訳領域ＲＮＡが含まれるがこれらに限定されない。ＲＮＡは、ヒトＲＮＡが好ましい。
【００３３】
用語の「構築物」は、１つまたは複数の合成または天然生体適合性材料から作られた足場またはマトリックスの表面上またはその中に析出させた１つまたは複数の細胞集団を指す。１つまたは複数の細胞集団は、１つまたは複数の合成または天然生体適合性高分子、タンパク質、またはペプチドから作られた生体材料でコートするか、その上に析出させるか、その中に包埋するか、それに付着させるか、またはその中に封入してもよい。１つまたは複数の細胞集団は、生体材料または足場もしくはマトリックスとインビトロまたはインビボで組み合わせてもよい。一般的に、足場／生体材料を形成するために使用される１つまたは複数の生体適合性材料は、少なくとも１つの析出した細胞集団の多細胞３次元組織化を指示するか、促進するか、または許容するように選択される。構築物を生成するのに使用される１つまたは複数の生体材料は、内在性宿主組織を有する構築物または構築物の細胞成分の分散および／または一体化を指示するか、促進するか、または許容するか、または構築物もしくは構築物の細胞成分の生存、生着、耐性、または機能的性能を指示するか、促進するか、または許容するように選択できる。
【００３４】
用語の「マーカー」または「バイオマーカー」は、通常、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質ベース分子マーカーを指し、培養した細胞集団中でのそれらの発現または存在は、標準的な方法（または本明細書で開示の方法）により検出可能で、特定の細胞型である培養した細胞集団中の１つまたは複数の細胞と一致する。マーカーは、細胞により発現されたポリペプチドまたは特定可能な染色体上の物理的位置、例えば、遺伝子、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはネイティブ細胞により発現されるポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。マーカーは、「遺伝子発現マーカー」と呼ばれる遺伝子の発現領域、または既知のコード機能のない一部のＤＮＡセグメントであってもよい。バイオマーカーは、細胞由来の産物、例えば、分泌産物であってもよい。
【００３５】
用語の「発現差異遺伝子」、「遺伝子発現差異」およびそれらの同義語は、同義に使用され、第１細胞または細胞集団の発現が、第２細胞または細胞集団のその発現に比べて、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を指す。この用語は、また、第１または第２細胞の継代培養時間の間の異なる段階で、より高いまたはより低いレベルに活性化された遺伝子を含む。また、発現差異遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害されてもよく、または選択的スプライシングに供され、異なるポリペプチド産物を生じてもよいことは理解されよう。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベルの変化、表面発現、分泌またはポリペプチドのその他の区分け手法により立証できる。遺伝子発現差異には、２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはそれらの遺伝子産物間の発現比率の比較、またはさらに第１細胞と第２細胞の間で異なる別々に処理された２つの同じ遺伝子の産物の比較、を含んでもよい。発現差異には、例えば、第１細胞および第２細胞中の遺伝子またはその発現産物の時間的または細胞発現パターンにおける定量的、ならびに定性的差異の両方が含まれる。本発明の目的としては、第１細胞と第２細胞の間の所与の遺伝子の発現の差異がある場合に、「遺伝子発現差異」が存在すると考えられる。マーカーの発現差異は、投与後の患者由来の細胞（第２細胞）中の発現に比べて、細胞集団、混合物、または構築物（第１細胞）の投与前の患者由来の細胞中に存在してもよい。
【００３６】
用語の「阻害する」、「下方制御する」、「過小発現する（ｕｎｄｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓ）」および「減らす」は同義に使われ、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは１つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価ＲＮＡ分子のレベル、または１つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、１つまたは複数の対照、例えば、１つまたは複数の陽性および／または陰性対照に比べて低減することを意味する。過小発現は、投与後の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与前の患者由来の細胞中に存在してもよい。
【００３７】
用語の「上方制御する」または「過剰発現」は、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子もしくは１つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする等価ＲＮＡ分子のレベル、または１つまたは複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が、１つまたは複数の対照、例えば、１つまたは複数の陽性および／または陰性対照に比べて高められていることの意味に使用される。過剰発現は、投与前の患者由来の細胞に比べて、細胞集団、混合物、または構築物の投与後の患者由来の細胞中に存在してもよい。
【００３８】
用語の「対象」は、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の１つまたは複数の徴候、症状、または他の指標を経験しているか、または経験したことがある、治療適格患者を含む、任意の個々のヒトの対象を意味する。このような対象には、限定されないが、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏を新規に診断された、または以前に診断されたか、および現在これらの再発または再燃を経験しているか、またはこれらに罹患のリスクがある対象が、理由がなんであれ、含まれる。対象は、腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の治療を以前行っていても、また、そうでなくてもよい。
【００３９】
用語の「患者」は、任意の個々の動物、より好ましくは、治療が必要な哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類、等の非ヒト動物を含む）を指す。本明細書の患者は、ヒトが最も好ましい。
【００４０】
用語の「検体」または「患者検体」または「生物試料」は、通常、対象または患者、体液、体組織、細胞株、組織培養物、または他のソースから採取した任意の生物試料を意味する。この用語は、組織生検、例えば、腎生検を含む。この用語は、培養細胞、例えば、培養哺乳類腎臓細胞を含む。哺乳動物から組織生検および培養細胞を得る方法は、当技術分野でよく知られている。用語の「検体」が単独で使用される場合、「検体」は、依然として「生物試料」または「患者検体」を意味し、すなわち、これらの用語は、同義に使用される。
【００４１】
用語の「試験検体」は、本発明の方法で処置された対象由来の検体を指す。この試験検体は、限定されないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織、等を含む哺乳類対象の種々のソース由来であってもよい。
【００４２】
用語の「対照」または「対照検体」は、陰性または陽性の結果により、試験検体の結果の相関付けを支援することが期待される陰性または陽性対照を指す。本発明に適する対照には、限定されないが、正常な赤血球恒常性の指標特性を示すことが解っている検体、貧血の指標特性を示すことが解っている検体、貧血でないことが解っている対象から採取した検体、および貧血であると解っている対象から採取した検体が含まれる。本発明の方法に使用可能なさらなる対照には、限定されないが、赤血球生成を調節すると解っている薬剤（例えば、組換え型ＥＰＯまたはＥＰＯ類似体）で処置されたことがある対象由来の検体が含まれる。さらに、対照は、本発明の方法により処置される前に対象から採取した検体であってもよい。追加の適する対照は、いずれかの型または段階の腎疾患であると解っている対象から採取した試験検体、およびいずれの型または段階の腎疾患であるか解っていない対象から採取した検体であってもよい。対照は、正常で健康な調和の取れた対照であってもよい。当業者なら、本発明での使用に適した他の対照が解るであろう。
【００４３】
「再生予後（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、「再生予後（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）」、または「再生予後（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆｏｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」は、通常、本明細書記載の細胞集団、混合物または構築物の投与または移植の可能な再生経過または転帰の予見または予測を指す。予後に対して、予見または予測は、１つまたは複数の次記により知ることができる：移植または投与後の腎臓機能の改善、移植または投与後の機能的腎臓の発生、移植または投与後の改善腎臓機能または能力の発生、および移植または投与後のネイティブ腎臓による特定のマーカーの発現。
【００４４】
「再生腎臓」は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後のネイティブ腎臓を指す。再生腎臓は、限定されないが、ネイティブ腎臓中の機能または能力の発生、ネイティブ腎臓中の機能または能力の改善、およびネイティブ腎臓中の特定のマーカーの発現、を含む種々の指標を特徴とする。当業者なら、他の指標が、再生腎臓を特徴付けるのに適切である可能性があることを解るであろう。
【００４５】
細胞集団
腎疾患の処置に使用するための、すなわち、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を提供する、特異的生理活性成分または細胞型を富化した、および／または特異的不活性または望ましくない成分または細胞型を枯渇させた異種起源の単離腎臓細胞集団、およびそれらの混合物は、以前に、２００９年１１月１２日出願の米国特許出願第１２／６１７、７２１号に記載された。この特許の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、健康な個体に比べて、細胞成分を欠くが、依然として、治療特性を保持している、すなわち、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を行える単離腎臓細胞画分を提供する。本明細書記載の細胞集団、細胞画分、および／または細胞の混合物は、健康な個体、腎疾患の個体、または本明細書記載の対象由来であってもよい。
【００４６】
生理活性細胞集団
一態様では、本発明は、生理活性成分を富化させ、不活性または望ましくない成分を枯渇させた異種起源の腎臓細胞集団の特定の亜画分が、出発集団より優れた治療および再生結果を提供するという驚異的知見に基づいている。例えば、本発明の生理活性成分、例えば、不活性または望ましくない成分、例えば、Ｂ１およびＢ５が枯渇しているＢ２、Ｂ４、およびＢ３は、単独または混合して、予想外の腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の細胞型、例えば、血管、内分泌、または内皮細胞型が枯渇または不足している特異的亜画分であるＢ４、すなわち、Ｂ４’は、単独で、または他の生理活性亜画分、例えば、Ｂ２および／またはＢ３と混合した場合、治療特性、例えば、腎臓機能の安定化および／または改善および／または再生特性を保持しているという驚異的知見に基づいている。好ましい実施形態では、生理活性細胞集団はＢ２ある。特定の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ４またはＢ４’と混合される。他の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３と混合される。他の実施形態では、Ｂ２細胞集団は、Ｂ３とＢ４の両方、またはＢ３および／またはＢ４の特定細胞成分と混合される。
【００４８】
Ｂ２細胞集団は、１つまたは複数の下記からなる群より選択される尿細管細胞マーカーの発現を特徴とする：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、ｍｅｍｂｅｒＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質キャリアファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、ならびに集合管マーカーアクアポリン−４（Ａｑｐ４）。Ｂ２は、Ｂ３および／またはＢ４より大きく、より粒状化しており、従って、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０４５ｇ／ｍｌ〜１．０５２ｇ／ｍｌ（ヒト）、および約１．０４５ｇ／ｍｌ〜約１．０５８ｇ／ｍｌ（イヌの）の浮遊密度を有する。
【００４９】
Ｂ３細胞集団は、一部のＥＰＯ産生細胞を伴ったＢ２とＢ４に比べて中間的サイズと粒度の血管、糸球体および近位の尿細管マーカーの発現を特徴とする。従って、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０７３ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０５２ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（ヒト）、および約１．０５８ｇ／ｍｌ〜約１．０６３ｇ／ｍｌ（イヌの）の浮遊密度を有する。Ｂ３は、１つまたは複数の下記からなる群より選択されるマーカーの発現を特徴とする：アクアポリン７（Ａｑｐ７）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子２（Ｆｘｙｄ２）、溶質キャリアファミリー１７（リン酸ナトリウム）、ｍｅｍｂｅｒ  ３（Ｓｌｃ１７ａ３）、溶質キャリアファミリー３、ｍｅｍｂｅｒ  １（Ｓｌｃ３ａ１）、クローディン２（Ｃｌｄｎ２）、ｎａｐｓｉｎ  Ａアスパラギン酸ペプチダーゼ（Ｎａｐｓａ）、溶質キャリアファミリー２（促進性ブドウ糖輸送体）、ｍｅｍｂｅｒ  ２（Ｓｌｃ２ａ２）、アラニル（膜）アミノペプチダーゼ（Ａｎｐｅｐ）、膜貫通タンパク質２７（Ｔｍｅｍ２７）、アシルＣｏＡシンテターゼ中等度鎖ファミリーメンバー２（Ａｃｓｍ２）、グルタチオンペルオキシダーゼ３（Ｇｐｘ３）、果糖−１、６−ビホスファターゼ１（Ｆｂｐ１）、およびアラニン−グリオキシル酸アミノ基転移酵素２（Ａｇｘｔ２）。Ｂ３は、また、血管発現マーカー血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）および糸球体発現マーカーポドシン（Ｐｏｄｎ）を特徴とする。
【００５０】
Ｂ４細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６の内の１つまたは複数を含む血管マーカーセットの発現；ポドシン（Ｐｏｄｎ）、およびネフリン（Ｎｅｐｈ）の内の１つまたは複数を含む糸球体マーカーセットの発現；ならびに未分画（ＵＮＦＸ）、Ｂ２およびＢ３に比較して、酸素で調節可能なＥＰＯ富化集団、を特徴とする。Ｂ４は、また、１つまたは複数の下記マーカーの発現を特徴とする：ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（Ｃｘｃｒ４）、エンドセリン受容体Ｂ型（Ｅｄｎｒｂ）、コラーゲン、Ｖ型、アルファ２（Ｃｏｌ５ａ２）、カドヘリン５（Ｃｄｈ５）、プラスミノーゲン活性化因子、組織（Ｐｌａｔ）、アンジオポエチン２（Ａｎｇｐｔ２）、キナーゼ挿入ドメインタンパク質受容体（Ｋｄｒ）、分泌タンパク質、酸性の、システインリッチ（オステオネクチン）（Ｓｐａｒｃ）、セルグリシン（Ｓｒｇｎ）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤３（Ｔｉｍｐ３）、Ｗｉｌｍｓ腫瘍１（Ｗｔ１）、ウィングレス型ＭＭＴＶ統合部位ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ｗｎｔ４）、Ｇ−タンパク質シグナル伝達制御因子４（Ｒｇｓ４）、血小板内皮細胞接着分子（Ｐｅｃａｍ）、およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）。Ｂ４は、また、Ｂ２またはＢ３に比較して、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とする。また、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒトおよびイヌ）の浮遊密度を有する。 
【００５１】
Ｂ４’細胞集団は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの浮遊密度を有し、１つまたは複数の下記のマーカーを発現するとして定義される：ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ポドシン、ネフリン、ＥＰＯ、ＣＫ７、ＣＫ８／１８／１９。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａ、ＣＤ３１、ＣＤ１４６の内の１つまたは複数を含む血管マーカーセットを発現することを特徴とする。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、内分泌マーカーＥＰＯの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ポドシン（Ｐｏｄｎ）、およびネフリン（Ｎｅｐｈ）の内の１つまたは複数を含む糸球体マーカーセットの発現を特徴とする。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、ＰＥＣＡＭ、ｖＥＧＦ、ＫＤＲ、ＨＩＦ１ａの内の１つまたは複数を含む血管マーカーセットの発現、および内分泌マーカーＥＰＯの発現を特徴とする。別の実施形態では、Ｂ４’は、また、Ｂ２またはＢ３に比べて、より小さい、より少ない粒状化細胞を特徴とし、約１．０７３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍｌ（げっ歯類）、約１．０６３ｇ／ｍｌ〜約１．０９１ｇ／ｍＬ（ヒトおよびイヌの）の浮遊密度を有する。
【００５２】
一態様では、本発明は、１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の少なくとも１つのエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞を含む単離された、ヒト腎臓細胞富化Ｂ４’集団を提供する。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。一部の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
【００５３】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団を含まない。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【００５４】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団；集合管および尿細管系のより大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団；および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。一部の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。
【００５５】
一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇した約１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含むヒト腎臓細胞混合物を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度の大きな粒状化細胞を含むＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、細胞の混合物は、受容体媒介アルブミン取込が可能である。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種の産生可能な、および／または産生を刺激可能なＨＡＳ−２発現細胞を含む。全ての実施形態で、第１および第２細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。
【００５６】
一実施形態では、混合物は、インビボ送達時に再生刺激を与えることができる。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化し、または改善することができる。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。
【００５７】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞を含む１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の単離された、ヒト腎臓細胞富化Ｂ４’集団を提供する。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。発現しない糸球体マーカーは、ポドシンであってもよい（実施例７参照）。一部の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。
【００５８】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の尿細管細胞含有Ｂ２細胞集団を含まない。別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団を含まない。さらに別の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【００５９】
一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、尿細管細胞を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度のＢ２細胞集団；集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団；および低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。一部の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来であってもよい。
【００６０】
一態様では、本発明は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している約１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含むヒト腎臓細胞の混合物を提供する。この混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状化細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。特定の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体のマーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、Ｂ２は、集合管上皮細胞をさらに含む。一実施形態では、細胞の混合物は、受容体媒介アルブミン取込が可能である。別の実施形態では、細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。一実施形態では、混合物は、インビトロおよびインビボの両方で、ヒアルロン酸（ＨＡ）の高分子量種の産生および／または産生の刺激が可能なＨＡＳ−２発現細胞を含む。全ての実施形態で、第１および第２細胞集団は、腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。
【００６１】
一実施形態では、混合物は、インビボ送達時に再生刺激与えることができる。他の実施形態では、混合物は、インビボ送達時に、糸球体濾過、尿細管再吸収、尿産生、および／または内分泌機能の低下を減らし、これらを安定化または改善できる。一実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、腎疾患の対象由来である。
【００６２】
好ましい実施形態では、混合物は、Ｂ２を、Ｂ３および／またはＢ４と組み合わせて含む。別の好ましい実施形態では、混合物は、Ｂ２を、Ｂ３および／またはＢ４’と組み合わせて含む。他の好ましい実施形態では、混合物は、（ｉ）Ｂ２をＢ３および／またはＢ４と組み合わせて；または（ｉｉ）Ｂ２をＢ３および／またはＢ４’と組み合わせて構成されるか、または基本的に構成される。
【００６３】
Ｂ４’細胞集団を含む混合物は、また、不健康対象から採取したＢ２および／またはＢ３細胞集団を含んでもよい。不健康な対象は、Ｂ４’画分が得られたのと同じ対象であってもよい。Ｂ４’細胞集団とは対照的に、不健康対象から採取したＢ２およびＢ３細胞集団は、健康な個体由来の出発腎臓細胞集団に比べて、通常、１つまたは複数の特定細胞型が欠如していない。
【００６４】
Ｂ２およびＢ４によるヒアルロン酸産生
ヒアルロナン（ヒアルロン酸またはヒアルロン酸塩とも呼ばれる）は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であり、非硫酸化二糖ユニットの規則的反復配列、特にＮ−アセチルグルコサミンおよびグルクロン酸から構成される。その分子量は、４００ダルトン（二糖）から百万ダルトン超までの範囲に及ぶ。それは、皮膚、軟骨、および目等、の全組織中、ならびに、成人動物の、全てではないにしても、ほとんどの体液中に可変量として認められる。それは特に初期の胚中に豊富である。ヒアルロナンにより形成された空間、および実際にＧＡＧは、通常、細胞遊走、細胞付着中に、創傷修復、器官形成、免疫細胞接着、細胞内シグナル伝達の活性化、ならびに腫瘍転移の間に、それが何らかの役割を果たすことを可能とする。これらの役割は、ヒアルロナンへの特異的タンパク質およびプロテオグリカンの結合により媒介される。細胞の運動性および免疫細胞接着は、細胞表面受容体ＲＨＡＭＭ（ヒアルロナン媒介運動性のための受容体；Ｈａｒｄｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）およびＣＤ４４（Ｊａｌｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７；Ｍｉｙａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）により媒介される。ヒアルロナンは、細胞表面の内側膜で直接合成され、合成されるにつれ、成長するポリマーが膜を通して細胞の外側へ押し出される。合成は、遺伝子ファミリーが少なくとも３つのメンバーから構成される単一タンパク質酵素、ヒアルロナン合成酵素（ＨＡＳ）により媒介される。
【００６５】
最近、ヒアルロン酸がＣＤ４４と相互作用することが示されたが、このような相互作用は、多くの作用の中でも特に、非居住細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ））を傷害腎臓組織に補充することができ、腎臓再生を強化する（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（２００７）７２、４３０−４４１）。
【００６６】
意外にも、Ｂ２細胞集団中でより特異的に富化されているマーカーであるヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）の作用により、インビトロおよびインビボの両方で、Ｂ２およびＢ４細胞調製物が、より大きい分子量種のヒアルロン酸（ＨＡ）を発現可能であることが明らかとなった。５／６ＮｘモデルにおけるＢ２を使った処置が、強力なＨＡＳ−２インビボ発現および予期された処置組織内の高分子量ＨＡの産生と同時に、線維形成を減らすことが示された。特に、未処置で残された５／６Ｎｘモデルは、わずかのＨＡＳ−２の検出および極わずかな高分子量ＨＡの産生と共に、線維形成が生じた。理論に拘泥する意図はないが、Ｂ２により主として産生された（ある程度はＢ４による）このＨＡの抗炎症性高分子量種は、腎線維症の減少および腎臓再生の支援において、細胞調製物と相乗的に作用すると仮定される。従って、本発明は、ヒアルロン酸含有生体材料中の本発明の細胞プロトタイプの送達を含む。移植細胞を使った直接産生または産生の刺激による再生刺激生体材料成分の提供もまた本発明で意図されている。
【００６７】
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血および／またはＥＰＯ欠乏の処置に使われる、単離された、異種起源のＥＰＯ産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、細胞集団は、腎生検由来である。別の実施形態では、細胞集団は、全腎臓組織由来である。もう一つの実施形態では、細胞集団は、腎生検または全腎臓組織から構築された哺乳類腎臓細胞のインビトロ培養物由来である。全ての実施形態で、これらの集団は、未分画細胞集団であり、また、本明細書では非富化細胞集団と呼ばれる。
【００６８】
別の態様では、本発明は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生腎臓細胞がさらに富化され、それにより、出発または初期細胞集団中のＥＰＯ産生細胞の割合に比較して、富化亜集団中のＥＰＯ産生細胞の割合が大きくなった単離ＥＰＯ産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、富化ＥＰＯ産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる間質性線維芽細胞および尿細管細胞に比較して、より大きな割合の間質性線維芽細胞およびより小さな割合の尿細管細胞を含む。特定の実施形態では、富化ＥＰＯ産生細胞画分は、非富化初期集団に含まれる糸球体細胞、血管細胞および集合管細胞に比較して、より大きな割合の糸球体細胞および血管細胞およびより小さな割合の集合管細胞を含む。このような実施形態では、これらの集団は、本明細書では、「Ｂ４」細胞集団と呼ばれる。
【００６９】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の追加の腎臓細胞集団と混合されたＥＰＯ産生腎臓細胞集団を提供する。一実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞を富化した第１細胞集団、例えば、Ｂ４である。別の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞を富化していない第１細胞集団、例えば、Ｂ２である。別の実施形態では、第１細胞集団は、第２腎臓細胞集団と混合される。一部の実施形態では、第２細胞集団は、尿細管細胞が富化され、これは尿細管細胞表現型の存在により立証できる。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、１つの尿細管細胞マーカーの存在により示すことができる。別の実施形態では、尿細管細胞表現型は、１つまたは複数の尿細管細胞マーカーの存在により示すことができる。尿細管細胞マーカーには、限定されないが、メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、ｍｅｍｂｅｒ  ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質キャリアファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）、が含まれる。別の実施形態では、第１細胞集団は、限定されないが、下記を含むいくつかの型の内の少なくとも１つの腎臓細胞と混合される：間質由来細胞、尿細管細胞、集合管由来細胞、糸球体由来細胞、および／または血液または脈管構造由来細胞。ＥＰＯ産生腎臓細胞集団は、Ｂ２および／またはＢ３との混合物の形態の、または富化細胞集団、例えば、Ｂ２＋Ｂ３＋Ｂ４／Ｂ４’の形態のＢ４またはＢ４’を含んでもよい。
【００７０】
一態様では、本発明のＥＰＯ産生腎臓細胞集団は、ＥＰＯ発現および酸素に対する生物学的応答を特徴とし、培養系の酸素圧力の減少によりＥＰＯ発現が誘導される。一実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が富化される。一実施形態では、ＥＰＯ発現は、通常の雰囲気（約２１％）の利用可能酸素に比べて、利用可能な培養系の酸素レベルが減少している条件下で細胞集団を培養する場合に誘導される。一実施形態では、通常の酸素条件下で培養したＥＰＯ産生細胞に比べて、低酸素条件下で培養したＥＰＯ産生細胞は、より高いレベルのＥＰＯを発現する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素での細胞培養（低酸素性培養条件とも呼ばれる）は、低い酸素のレベルが、通常の雰囲気レベルの利用可能酸素（正常または正常酸素圧培養条件と呼ばれる）での細胞の培養に比べて、低下していることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件には、１％酸素未満、約２％酸素未満、約３％酸素未満、約４％酸素未満、または約５％酸素未満で細胞を培養することが含まれる。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件には、約１０％酸素、約１２％酸素、約１３％酸素、約１４％酸素、約１５％酸素、約１６％酸素、約１７％酸素、約１８％酸素、約１９％酸素、約２０％酸素、または約２１％酸素で細胞を培養することを含む。
【００７１】
もう一つの実施形態では、約５％未満の利用可能酸素で細胞を培養し、ＥＰＯ発現レベルを大気圧（約２１％）酸素下で培養した細胞と比較することにより、ＥＰＯの発現誘導または発現増加が得られ、また、観察できる。別の実施形態では、一定期間細胞の培養が大気中酸素（約２１％）下で行われる第１培養相および利用可能酸素レベルが低減され、約５％未満の利用可能酸素下で同じ細胞が培養される第２培養相を含む方法により、ＥＰＯの誘導は、ＥＰＯを発現できる細胞の培養中に得られる。別の実施形態では、低酸素性条件に応答するＥＰＯ発現は、ＨＩＦ１αにより調節されている。当業者なら、当技術分野で既知の他の酸素操作培養条件も本明細書記載の細胞の目的に使用可能であることを理解するであろう。
【００７２】
一態様では、ＥＰＯ産生哺乳動物細胞富化集団は、灌流条件に対する生物学的応答（例えば、ＥＰＯ発現）を特徴とする。一実施形態では、灌流条件は、一過性、間欠性、または連続の液体流動（灌流）を含む。一実施形態では、流動を介して動力を細胞に移す方式で、細胞培養用培地を間欠的にまたは連続的に循環させるか、または攪拌する場合に、ＥＰＯ発現が機械的に誘導される。一実施形態では、一過性、間欠性、または連続的液体流動に曝された細胞は、それらがフレームワークおよび／またはこのような３次元構造を形成する空間を提供する材料中または材料上の３次元構造体として存在する方式で培養される。一実施形態では、細胞は、多孔性ビーズ上で培養され、揺動プラットホーム、軌道周回プラットホーム、またはスピナーフラスコを用いて間欠性または連続的液体流動に曝される。別の実施形態では、細胞は、３次元足場上で培養され、装置中に置かれる。これにより、足場は固定され、液体は、足場を通る、または横切る方向へ流動する。当業者なら、当技術分野で既知の他の灌流培養条件を、本明細書記載の細胞用として使用可能であることを理解するであろう。
【００７３】
不活性細胞集団
本明細書で記載のように、本発明は、１つには、生理活性成分富化および不活性または望ましくない成分が枯渇している腎臓細胞の異種起源の集団の特定亜画分が、出発集団よりも優れた処置および再生の結果を提供するという驚くべき知見に基づいている。好ましい実施形態では、本発明の細胞集団は、Ｂ１および／またはＢ５細胞集団が枯渇している。例えば、下記は、Ｂ１および／またはＢ５を枯渇していてもよい：２つ以上のＢ２、Ｂ３、およびＢ４’の混合物；Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４’富化細胞集団。
【００７４】
Ｂ１細胞集団は、集合管および尿細管系の大きな、粒状細胞を含み、その集団の細胞は、約１．０４５ｇ／ｍ未満の浮遊密度を有する。Ｂ５細胞集団は、低粒度および低生存率の約１．０９１ｇ／ｍｌ超の浮遊密度を有する壊死組織片および小細胞から構成される。
【００７５】
細胞集団を単離・培養する方法
一態様では、本発明は、治療上の使用のために、腎臓細胞成分、例えば、富化細胞集団を分離し、単離する方法を提供し、この方法は、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、および糸球体濾過機能低下の処置を含む。一実施形態では、細胞集団は新たに消化された、すなわち、機械的に、もしくは酵素的に消化された腎臓組織から、または哺乳類腎臓細胞のインビトロ異種起源培養物から単離される。
【００７６】
意外にも、密度勾配による分離の前に低酸素性培養条件下で腎臓細胞の異種起源混合物を培養することにより、Ｂ４’を含むＢ４およびＢ２および／またはＢ３画分の両方が増強された分布と細胞組成が得られることが明らかになった。病気、および非疾患腎臓の両方から単離された腎臓細胞で、Ｂ２からＢ４への酸素依存性細胞の富化が認められた。理論に拘泥する意図はないが、これは、１つまたは複数の下記の事象に起因する可能性がある：１）低酸素性培養期間の間の特定細胞成分の選択的生存、死亡、または増殖；２）低酸素性培養に応答した細胞粒度および／またはサイズの変化と、それによる浮遊密度およびその後の密度勾配分離の間の局在化の変化への影響；および３）低酸素性培養期間に応答した細胞遺伝子／タンパク質発現の変化と、それによる所与のいずれかの勾配画分内の細胞の特性差異が生ずる。従って、一実施形態では、尿細管細胞富化細胞集団、例えば、Ｂ２は、低酸素耐性である。
【００７７】
本発明の細胞集団の分離と単離のための代表的技術には、対象集団に含まれる異なる細胞型の比重の差異に基づいた密度勾配による分離が含まれる。任意の所与の細胞型の比重は、細胞内の粒度、細胞内の水の容量、および他の因子に影響される可能性がある。一態様では、本発明は、限定されないが、ヒト、イヌ、およびげっ歯類を含む複数の種にわたる本発明細胞調製物、例えば、Ｂ２とＢ４’含有Ｂ４の単離のための最適勾配条件を提供する。好ましい実施形態では、密度勾配は、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規尿細管細胞画分富化集団、すなわち、Ｂ２細胞集団を得るために使用される。一実施形態では、密度勾配は、異種起源の腎臓細胞集団由来の新規ＥＰＯ産生細胞画分富化集団、すなわち、Ｂ４細胞集団を得るために使用される。他の実施形態では、密度勾配は、腎臓の尿細管細胞、糸球体細胞、および内皮細胞富化亜集団を得るために使用される。一実施形態では、ＥＰＯ産生および尿細管細胞の両方が、赤血球および細胞壊死組織片から分離される。一実施形態では、ＥＰＯ産生、糸球体、および血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、同時に他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離される。もう一つの実施形態では、内分泌、糸球体、および／または血管細胞が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から分離され、一方、尿細管細胞および集合管細胞亜集団が、他の細胞型ならびに赤血球および細胞壊死組織片から同時に分離される。
【００７８】
本発明の一部では、６０％非イオン性ヨウ素標識化合物イオジキサノール水溶液を含むＯＰＴＩＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配培地を使って、下記の重要な特定の特性に基づいて、新規細胞集団を産生した。しかし、当業者なら、本発明の細胞集団を分離するための必要な特性を含む、任意の密度勾配または他の手段、例えば、当技術分野で既知の細胞表面マーカーを使った免疫学分離、が本発明に従って使用可能であることが解るであろう。また、当業者なら、密度勾配（サイズと粒度）による細胞亜集団の分離に寄与する同じ細胞特性が開発され、フローサイトメトリー（前方散乱＝フローサイトメトリーによるサイズを反映、側方散乱＝粒度を反映）により細胞亜集団を分離できることも認識すべきである。重要なことは、密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないことである。密度勾配培地は、対象の特定細胞に対し低毒性でなければならないが、一方で、本発明では、対象の細胞の選択プロセスで、ある種の役割を果たす勾配培地の使用も意図している。理論に拘泥する意図はないが、投入と回収ステップの間でかなりの細胞減少があったので、イオジキサノール含有勾配により回収された本発明の細胞集団は、イオジキサノール抵抗性であるように思われ、勾配の条件下でのイオジキサノールへの暴露により、特定の細胞の排除に至ったことが示唆される。イオジキサノール勾配後の特異的バンドに出現する細胞は、イオジキサノールおよび／または密度勾配露出のいかなる不都合な作用にも抵抗性がある。従って、本発明は、また、本発明の細胞集団の単離および／または選択において、追加の軽度から中等度の腎毒素である造影剤の使用も意図されている。さらに、密度勾配培地は、また、ヒト血漿中のタンパク質と結合しても、また、対象細胞の重要な機能に悪影響を与えてもいけない。
【００７９】
別の態様では、本発明は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使った腎臓細胞型の富化方法および／または枯渇方法を提供する。一実施形態では、腎臓細胞型は、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（登録商標）または等価物を使って、富化および／または枯渇されてもよい。
【００８０】
別の態様では、本発明は、磁気細胞選別を使った腎臓細胞型の富化および／または枯渇方法を提供する。一実施形態では、腎臓細胞型は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳ（登録商標）システムまたは等価物を使って富化および／または枯渇されてもよい。
【００８１】
別の態様では、本発明は、腎臓細胞集団の３次元培養方法を提供する。一態様では、本発明は、連続灌流による細胞集団培養方法を提供する。一実施形態では、３次元培養および連続灌流により培養された細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高い細胞充実性およびインターコネクティビティを示す。別の実施形態では、３次元培養および連続および連続灌流により培養した細胞集団は、このような細胞集団の静的培養に比べて、より多いＥＰＯ発現、ならびに尿細管関連遺伝子、例えば、ｅ−カドヘリンの発現増加を示す。
【００８２】
さらに別の実施形態では、連続灌流により培養した細胞集団は、静的に培養した細胞集団に比べて、より高いレベルのブドウ糖およびグルタミンの消費を示す。
【００８３】
本明細書記載（実施例３を含む）のように、本発明の細胞集団を調製する方法で、低または低酸素性の酸素条件を使うことができる。しかし、本発明の方法は、低酸素条件付けのステップなしで使用可能である。一実施形態では、正常酸素圧条件を使ってもよい。
【００８４】
当業者なら、本明細書記載の細胞に対し、当技術分野で既知の他の単離と培養方法を使用できることを理解するであろう。
【００８５】
生体材料（ポリマーマトリックスまたは足場）
Ｂｅｒｔｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．の特許公開第２００７０２７６５０７号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、ポリマーマトリックスまたは足場は、任意の数の所望形状に成形して、任意の数の全体系、幾何学的配置または空間の制約を満たすことができる。一実施形態では、本発明のマトリックスまたは足場は、３次元であってもよく、また、成形されて、器官または組織構造の寸法と形状に適合されてもよい。例えば、腎疾患、貧血、ＥＰＯ欠乏、尿細管輸送機能欠損、または糸球体濾過機能低下の処置のためのポリマー足場の使用で、３次元（３−Ｄ）マトリックスを使用できる。種々の別々に成形された３−Ｄ足場を使用可能である。当然、ポリマーマトリックスは、異なるサイズと形状に成形して別々のサイズの患者に適合させることができる。ポリマーマトリックスは、また、別の方法で成型して、特殊ニーズの患者に適合させることができる。別の実施形態では、ポリマーマトリックスまたは足場は、生体適合性、多孔性ポリマー足場であってもよい。足場は、限定されないが、次記を含む種々の合性または天然材料から形成してもよい：連続気泡ポリ乳酸（ＯＰＬＡ（登録商標））、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ化ポリエチレン、フェノール、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミデイミド、ポリアクリラート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカルボナート、ポリシアノアリールエテル、ポリエステル、ポリエステルカルボナート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、ポリフッ化ビニリデン、再生セルロース、シリコーン、尿素−ホルムアルデヒド、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、絹、エラスチン、アルギナート、ヒアルロン酸、アガロース、またはそれらの共重合体もしくは物理的混合物。足場形状は、ソフト多孔性足場としての液体ヒドロゲル懸濁液から剛直、形状保持多孔性足場までの範囲が可能である。
【００８６】
ヒドロゲルは、種々のポリマー材料から形成でき、種々の生物医学的用途に有用である。ヒドロゲルは、親水性高分子の３次元ネットワークとして物理的に記述できる。ヒドロゲルのタイプに応じて、それらは、可変割合の水を含むが、水には全く溶解しない。高い水含量にも関わらず、ヒドロゲルは、親水性の残基の存在により、大容量の液体とさらなる結合が可能である。ヒドロゲルは、ゼラチン状の構造を変えることなく、大幅に膨潤する。ヒドロゲルの基本的物理特性は、使用されたポリマーおよび製品の特殊付加部分の特性に従って、特異的に改変できる。
【００８７】
好ましくは、ヒドロゲルは、ポリマー、生物由来材料、合成物由良材料またはそれらの組み合わせ、すなわち、生物学的に不活性で、生理学的に哺乳類組織と適合する材料で作られる。ヒドロゲル材料は、炎症反応を誘発しないのが好ましい。ヒドロゲルの形成に使われる他の材料の例には、（ａ）修飾アルギン酸塩、（ｂ）一価カチオンに暴露するとゲル化する多糖類（例えば、ジェランガムおよびカラゲナン）、（ｃ）非常に粘稠な液体で、チクソトロピックであり、構造の緩慢進化により時間をかけてゲルを形成する多糖類（例えば、ヒアルロン酸）、および（ｄ）ポリマーヒドロゲル前駆物質（例えば、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロック共重合体およびタンパク質）、が含まれる。米国特許第６，２２４，８９３Ｂ１号は、本発明に従ったヒドロゲルの作成に適した種々のポリマー、およびこのようなポリマーの化学特性の詳細説明を提供している。
【００８８】
足場または生体材料特性は、細胞を付着させ、足場または生体材料と相互作用させることができ、および／またはその中に細胞が捕捉されうる多孔性空隙を提供できる。一実施形態では、本発明の多孔性足場または生体材料は、多孔性足場として構成されている生体材料の上に（例えば、細胞の付着により）、および／または足場の気孔の中に（例えば、細胞の捕捉により）、１つまたは複数の細胞集団または混合物の付加または析出を可能とする。別の実施形態では、足場または生体材料は、足場内での細胞：細胞および／または細胞：生体材料の相互作用を可能とするか、または促進して、本明細書記載の構築物を形成する。
【００８９】
一実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ヒドロゲル型のヒアルロン酸（ＨＡ）からなり、５．１ｋＤＡから２ｘ１０６ｋＤａ超までの大きさの範囲のＨＡ分子を含む。別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、多孔質発泡体型のヒアルロン酸からなり、また、５．１ｋＤＡから２ｘ１０６ｋＤａ超の大きさの範囲のＨＡ分子を含む。さらに別の実施形態では、本発明に従って使用される生体材料は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）ベース発泡体からなり、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの孔径の連続気泡構造を有する。さらに別の実施形態では、好ましくはＢ２であるがＢ４でもよい特異的細胞集団は、特に腎臓内移植後に、ヒアルロン酸シンターゼ−２（ＨＡＳ−２）により高分子量ヒアルロン酸を直接的に合成する、および／または合成を刺激する。
【００９０】
当業者なら、当技術分野で既知の他の型の合成または天然材料が、本明細書記載の足場を形成するために使用可能であることを理解するであろう。
【００９１】
一態様では、本発明は、上で言及の足場または生体材料から作られる本明細書に記載の構築物を提供する。
【００９２】
構築物
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置のための１つまたは複数の本明細書記載の細胞集団を有する移植可能な構築物を提供する。一実施形態では、構築物は、１つまたは複数の合性または天然生体適合性材料からなる生体適合性材料または生体材料、足場またはマトリックス、および付着および／または捕捉により足場の表面上に析出したまたは内部に包埋された１つまたは複数の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られている。特定の実施形態では、構築物は、生体材料、および生体材料成分でコートされた、その上に析出させた、その中に析出させた、それに付着させた、その中に捕捉された、その中に包埋された、またはそれと組み合わされた、１つまたは複数の細胞集団または本明細書記載の細胞の混合物で作られている。富化細胞集団またはそれらの混合物を含むいずれかの本明細書記載の細胞集団は、マトリックスと組み合わせて使用して、構築物を形成することができる。
【００９３】
別の実施形態では、析出細胞集団または構築物の細胞成分は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞を富化した第１腎臓細胞集団である。別の実施形態では、第１腎臓細胞集団は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞に加えて、糸球体および血管細胞を含む。一実施形態では、第１腎臓細胞集団は、Ｂ４’細胞集団である。もう一つの実施形態では、析出細胞集団または構築物の細胞成分は、第１富化腎臓細胞集団および第２腎臓細胞集団の両方を含む。一部の実施形態では、第２細胞集団は、酸素で調節可能なＥＰＯ産生細胞が富化されていない。別の実施形態では、第２細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化されている。別の実施形態では、第２細胞集団は、腎臓尿細管細胞が富化され、集合管上皮細胞を含む。他の実施形態では、腎臓尿細管細胞は、１つまたは複数の尿細管細胞マーカーの発現を特徴とし、限定されないが、マーカーには下記を含んでもよい：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、ｍｅｍｂｅｒ  ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質キャリアファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、ｍｅｍｂｅｒＢ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。
【００９４】
一実施形態では、本発明の構築物を形成するために生体材料または足場上に析出した、またはそれと組み合わされた細胞集団は、種々のソース、例えば、自己ソース由来である。また、非自己ソースも、限定されないが、同種異系、または同種同系（自家遺伝子系または同遺伝子系）ソース、等が使用に適する。
【００９５】
当業者なら、細胞集団を析出させて、あるいは生体材料と組み合わせて構築物を形成するいくつかの適切な方法があることを理解するであろう。
【００９６】
一態様では、本発明の構築物は、本明細書記載の使用方法で使用するために適切である。一実施形態では、構築物は、全ての原因による腎疾患、貧血、または全ての原因によるＥＰＯ欠乏の治療を必要としている対象に対する投与に適している。他の実施形態では、構築物は、赤血球恒常性の改善または回復を必要としている対象への投与に適している。別の実施形態では、構築物は、腎臓機能の改善を必要としている対象への投与に適している。
【００９７】
さらに別の態様では、本発明は、腎臓機能改善を必要としている対象への移植のための構築物を提供し、この構築物は、
ａ）１つまたは複数の生体適合性合成高分子または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料；および
ｂ）腎疾患を有する対象由来の哺乳類腎臓細胞の混合物で、１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の単離された、尿細管細胞富化集団を含む第１細胞集団、Ｂ２、および、エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含み、これら細胞集団は、生体材料成分でコートされ、その上もしくはその中に析出し、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および／または別の方法でそれと組み合わされている。
【００９８】
特定の実施形態では、混合物は、集合管および尿細管系の大きな粒状細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。
【００９９】
一実施形態では、構築物は、血管マーカーの発現を特徴とするＢ４’細胞集団を含む。一部の実施形態では、Ｂ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。特定の実施形態では、混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現を可能とする。全ての実施形態で、混合物は、哺乳類腎臓組織または培養腎臓細胞由来であってもよい。
【０１００】
一実施形態では、構築物は、混合物の捕捉および／または付着に適切な３次元（３−Ｄ）多孔性生体材料として構成されている生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、哺乳動物細胞の包埋、付着、懸濁、またはコーティングに適した液体または半液体ゲルとして構成されている生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、主にヒドロゲル型のヒアルロン酸（ＨＡ）高分子量種からなるように構成されている生体材料を含む。別の実施形態では、構築物は、主に多孔性発泡体型のヒアルロン酸高分子量種からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、約５０ミクロン〜約３００ミクロンの気孔を有するポリ乳酸ベース発泡体からなる生体材料を含む。さらに別の実施形態では、構築物は、改善された腎臓機能を必要としている対象に対し自己である腎臓検体由来であってもよい１つまたは複数の細胞集団を含む。特定の実施形態では、検体は、腎生検である。一部の実施形態では、対象は、腎疾患を有する。さらに他の実施形態では、細胞集団は、非自己腎臓検体由来である。一実施形態では、構築物は、赤血球恒常性を提供する。
【０１０１】
分泌産物
もう一つの態様では、本発明は、本明細書記載の富化腎臓細胞集団または富化腎臓細胞集団の混合物からの分泌産物に関する。一実施形態では、産物は、１つまたは複数の下記を含む：パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、および小胞。小胞は、１つまたは複数の次の物を含んでもよい：パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、微小胞、エキソソーム、およびＲＮＡ。分泌産物は、また、微小胞内にない産物を含んでもよく、限定されないが、パラクリン因子、内分泌因子、ジャクスタクライン因子、およびＲＮＡが含まれる。例えば、細胞外のｍｉＲＮＡは、小胞外から検出されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１０、１−１２ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ６０１、Ｊｕｌｙ  ７、２０１０）。分泌産物は、また、細胞由来産物、例えば、細胞由来小胞、と呼ばれる。
【０１０２】
もう一つの実施形態では、分泌産物は腎臓細胞由来の小胞の一部であってもよい。小胞は、因子を他の目的地へ送達できる。一実施形態では、小胞は、分泌小胞である。いくつかの型の分泌小胞が意図され、これらには、限定されないが、エキソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エキソソーム様小胞、およびアポトーシス性小胞が含まれる（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：５８１−５９３）。一実施形態では、分泌小胞は、エキソソームである。もう一つの実施形態では、分泌小胞は、微小胞である。もう一つの実施形態では、分泌小胞は、１つまたは複数の細胞成分を含むか、またはそられからなる。成分は、１つまたは複数の以下の物であってもよい：膜脂質、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、細胞質成分、およびこれらの任意の組み合わせ。好ましい実施形態では、分泌小胞は、マイクロＲＮＡを含むか、それから構成されるか、または基本的にそれから構成される。好ましくは、ｍｉＲＮＡは、ヒトｍｉＲＮＡである。一実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、およびｍｉＲ−１５１からなる群より選択される。もう一つの実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、下記からなる群より選択できる：ｌｅｔ−７ａ−１；ｌｅｔ−７ａ−２；ｌｅｔ−７ａ−３；ｌｅｔ−７ｂ；ｌｅｔ−７ｃ；ｌｅｔ−７ｄ；ｌｅｔ−７ｅ；ｌｅｔ−７ｆ−１；ｌｅｔ−７ｆ−２；ｌｅｔ−７ｇ；ｌｅｔ−７ｉ；ｍｉｒ−１−１；ｍｉｒ−１−２；ｍｉｒ−７−１；ｍｉｒ−７−２；ｍｉｒ−７−３；ｍｉｒ−９−１；ｍｉｒ−９−２；ｍｉｒ−９−３；ｍｉｒ−１０ａ；ｍｉｒ−１０ｂ；ｍｉｒ−１５ａ；ｍｉｒ−１５ｂ；ｍｉｒ−１６−１；ｍｉｒ−１６−２；ｍｉｒ−１７；ｍｉｒ−１８ａ；ｍｉｒ−１８ｂ；ｍｉｒ−１９ａ；ｍｉｒ−１９ｂ−１；ｍｉｒ−１９ｂ−２；ｍｉｒ−２０ａ；ｍｉｒ−２０ｂ；ｍｉｒ−２１；ｍｉｒ−２２；ｍｉｒ−２３ａ；ｍｉｒ−２３ｂ；ｍｉｒ−２３ｃ；ｍｉｒ−２４−１；ｍｉｒ−２４−２；ｍｉｒ−２５；ｍｉｒ−２６ａ−１；ｍｉｒ−２６ａ−２；ｍｉｒ−２６ｂ；ｍｉｒ−２７ａ；ｍｉｒ−２７ｂ；ｍｉｒ−２８；ｍｉｒ−２９ａ；ｍｉｒ−２９ｂ−１；ｍｉｒ−２９ｂ−２；ｍｉｒ−２９ｃ；ｍｉｒ−３０ａ；ｍｉｒ−３０ｂ；ｍｉｒ−３０ｃ−１；ｍｉｒ−３０ｃ−２；ｍｉｒ−３０ｄ；ｍｉｒ−３０ｅ；ｍｉｒ−３１；ｍｉｒ−３２；ｍｉｒ−３３ａ；ｍｉｒ−３３ｂ；ｍｉｒ−３４ａ；ｍｉｒ−３４ｂ；ｍｉｒ−３４ｃ；ｍｉｒ−９２ａ−１；ｍｉｒ−９２ａ−２；ｍｉｒ−９２ｂ；ｍｉｒ−９３；ｍｉｒ−９５；ｍｉｒ−９６；ｍｉｒ−９８；ｍｉｒ−９９ａｍｉｒ−９９ｂ；ｍｉｒ−１００；ｍｉｒ−１０１−１；ｍｉｒ−１０１−２；ｍｉｒ−１０３−１；ｍｉｒ−１０３−１−ａｓ；ｍｉｒ−１０３−２；ｍｉｒ−１０３−２−ａｓ；ｍｉｒ−１０５−１；ｍｉｒ−１０５−２；ｍｉｒ−１０６ａ；ｍｉｒ−１０６ｂ；ｍｉｒ−１０７；ｍｉｒ−１２２；ｍｉｒ−１２４−１；ｍｉｒ−１２４−２；ｍｉｒ−１２４−３；ｍｉｒ−１２５ａ；ｍｉｒ−１２５ｂ−１；ｍ��ｒ−１２５ｂ−２；ｍｉｒ−１２６；ｍｉｒ−１２７；ｍｉｒ−１２８−１；ｍｉｒ−１２８−２；ｍｉｒ−１２９−１；ｍｉｒ−１２９−２；ｍｉｒ−１３０ａ；ｍｉｒ−１３０ｂ；ｍｉｒ−１３２；ｍｉｒ−１３２；ｍｉｒ−１３３ａ−１；ｍｉｒ−１３３ａ−２；ｍｉｒ−１３３ｂ；ｍｉｒ−１３４；ｍｉｒ−１３５ａ−１；ｍｉｒ−１３５ａ−２；ｍｉｒ−１３５ｂ；ｍｉｒ−１３６ＭＩ１０１３５１１２０；ｍｉｒ−１３７；ｍｉｒ−１３８−１；ｍｉｒ−１３８−２；ｍｉｒ−１３９；ｍｉｒ−１４０；ｍｉｒ−１４１；ｍｉｒ−１４２；ｍｉｒ−１４３；ｍｉｒ−１４４；ｍｉｒ−１４５；ｍｉｒ−１４６ａ；ｍｉｒ−１４６ｂ；ｍｉｒ−１４７；ｍｉｒ−１４７ｂ；ｍｉｒ−１４８ａ；ｍｉｒ−１４８ｂ；ｍｉｒ−１４９；ｍｉｒ−１５０；ｍｉｒ−１５１；ｍｉｒ−１５２；ｍｉｒ−１５３−１；ｍｉｒ−１５３−２；ｍｉｒ−１５４；ｍｉｒ−１５５；ｍｉｒ−１８１ａ−１；ｍｉｒ−１８１ａ−２；ｍｉｒ−１８１ｂ−１；ｍｉｒ−１８１ｂ−２；ｍｉｒ−１８１ｃ；ｍｉｒ−１８１ｄ；ｍｉｒ−１８２；ｍｉｒ−１８３；ｍｉｒ−１８４；ｍｉｒ−１８５；ｍｉｒ−１８６；ｍｉｒ−１８７；ｍｉｒ−１８８；ｍｉｒ−１９０；ｍｉｒ−１９０ｂ；ｍｉｒ−１９１；ｍｉｒ−１９２；ｍｉｒ−１９３ａ；ｍｉｒ−１９３ｂ；ｍｉｒ−１９４−１；ｍｉｒ−１９４−２；ｍｉｒ−１９５；ｍｉｒ−１９６ａ−１；ｍｉｒ−１９６ａ−２；ｍｉｒ−１９６ｂ；ｍｉｒ−１９７；ｍｉｒ−１９８；ｍｉｒ−１９９ａ−１；ｍｉｒ−１９９ａ−２；ｍｉｒ−１９９ｂ；ｍｉｒ−２００ａ；ｍｉｒ−２００ｂ；ｍｉｒ−２００ｃ；ｍｉｒ−２０２；ｍｉｒ−２０３；ｍｉｒ−２０４；ｍｉｒ−２０５；ｍｉｒ−２０６；ｍｉｒ−２０８ａ；ｍｉｒ−２０８ｂ；ｍｉｒ−２１０；ｍｉｒ−２１１；ｍｉｒ−２１２；ｍｉｒ−２１４；ｍｉｒ−２１５；ｍｉｒ−２１６ａ；ｍｉｒ−２１６ｂ；ｍｉｒ−２１７；ｍｉｒ−２１８−１；ｍｉｒ−２１８−２；ｍｉｒ−２１９−１；ｍｉｒ−２１９−２；ｍｉｒ−２２１；ｍｉｒ−２２２；ｍｉｒ−２２３；ｍｉｒ−２２４；ｍｉｒ−２９６；ｍｉｒ−２９７；ｍｉｒ−２９８；ｍｉｒ−２９９；ｍｉｒ−３００；ｍｉｒ−３０１ａ；ｍｉｒ−３０１ｂ；ｍｉｒ−３０２ａ；ｍｉｒ−３０２ｂ；ｍｉｒ−３０２ｃ；ｍｉｒ−３０２ｄ；ｍｉｒ−３０２ｅ；ｍｉｒ−３０２ｆ；ｍｉｒ−３２０ａ；ｍｉｒ−３２０ｂ−１；ｍｉｒ−３２０ｂ−２；ｍｉｒ−３２０ｃ−１；ｍｉｒ−３２０ｃ−２；ｍｉｒ−３２０ｄ−１；ｍｉｒ−３２０ｄ−２；ｍｉｒ−３２０ｅ；ｍｉｒ−３２３；ｍｉｒ−３２３ｂ；ｍｉｒ−３２４；ｍｉｒ−３２５；ｍｉｒ−３２６；ｍｉｒ−３２８；ｍｉｒ−３２９−１；ｍｉｒ−３２９−２；ｍｉｒ−３３０；ｍｉｒ−３３１；ｍｉｒ−３３５；ｍｉｒ−３３７；ｍｉｒ−３３８；ｍｉｒ−３３９；ｍｉｒ−３４０；ｍｉｒ−３４２；ｍｉｒ−３４５；ｍｉｒ−３４６；ｍｉｒ−３６１；ｍｉｒ−３６２；ｍｉｒ−３６３；ｍｉｒ−３６５−１；ｍｉｒ−３６５−２；ｍｉｒ−３６７；ｍｉｒ−３６９；ｍｉｒ−３７０；ｍｉｒ−３７；ｍｉｒ−３７２；ｍｉｒ−３７３；ｍｉｒ−３７４ａ；ｍｉｒ−３７４ｂ；ｍｉｒ−３７４ｃ；ｍｉｒ−３７５；ｍｉ��−３７６ａ−１；ｍｉｒ−３７６ａ−２；ｍｉｒ−３７６ｂ；ｍｉｒ−３７６ｃ；ｍｉｒ−３７７；ｍｉｒ−３７８；ｍｉｒ−３７８ｂ；ｍｉｒ−３７８ｃ；ｍｉｒ−３７９；ｍｉｒ−３８０；ｍｉｒ−３８１；ｍｉｒ−３８２；ｍｉｒ−３８３；ｍｉｒ−３８４；ｍｉｒ−４０９；ｍｉｒ−４１０；ｍｉｒ−４１１；ｍｉｒ−４１２；ｍｉｒ−４２１；ｍｉｒ−４２２ａ；ｍｉｒ−４２３；ｍｉｒ−４２４；ｍｉｒ−４２５；ｍｉｒ−４２９；ｍｉｒ−４３１；ｍｉｒ−４３２；ｍｉｒ−４３３；ｍｉｒ−４４８；ｍｉｒ−４４９ａ；ｍｉｒ−４４９ｂ；ｍｉｒ−４４９ｃ；ｍｉｒ−４５０ａ−１；ｍｉｒ−４５０ａ−２；ｍｉｒ−４５０ｂ；ｍｉｒ−４５１；ｍｉｒ−４５２；ｍｉｒ−４５４；ｍｉｒ−４５５；ｍｉｒ−４６６；ｍｉｒ−４８３；ｍｉｒ−４８４；ｍｉｒ−４８５；ｍｉｒ−４８６；ｍｉｒ−４８７ａ；ｍｉｒ−４８７ｂ；ｍｉｒ−４８８；ｍｉｒ−４８９；ｍｉｒ−４９０；ｍｉｒ−４９１；ｍｉｒ−４９２；ｍｉｒ−４９３；ｍｉｒ−４９４；ｍｉｒ−４９５；ｍｉｒ−４９６；ｍｉｒ−４９７；ｍｉｒ−４９８；ｍｉｒ−４９９；ｍｉｒ−５００ａ；ｍｉｒ−５００ｂ；ｍｉｒ−５０１；ｍｉｒ−５０２；ｍｉｒ−５０３；ｍｉｒ−５０４；ｍｉｒ−５０５；ｍｉｒ−５０６；ｍｉｒ−５０７；ｍｉｒ−５０８；ｍｉｒ−５０９−１；ｍｉｒ−５０９−２；ｍｉｒ−５０９−３；ｍｉｒ−５１０；ｍｉｒ−５１１−１；ｍｉｒ−５１１−２；ｍｉｒ−５１２−１；ｍｉｒ−５１２−２；ｍｉｒ−５１３ａ−１；ｍｉｒ−５１３ａ−２；ｍｉｒ−５１３ｂ；ｍｉｒ−５１３ｃ；ｍｉｒ−５１４−１；ｍｉｒ−５１４−２；ｍｉｒ−５１４−３；ｍｉｒ−５１４ｂ；ｍｉｒ−５１５−１；ｍｉｒ−５１５−２；ｍｉｒ−５１６ａ−１；ｍｉｒ−５１６ａ−２；ｍｉｒ−５１６ｂ−１；ｍｉｒ−５１６ｂ−２；ｍｉｒ−５１７ａ；ｍｉｒ−５１７ｂ；ｍｉｒ−５１７ｃ；ｍｉｒ−５１８ａ−１；ｍｉｒ−５１８ａ−２；ｍｉｒ−５１８ｂ；ｍｉｒ−５１８ｃ；ｍｉｒ−５１８ｄ；ｍｉｒ−５１８ｅ；ｍｉｒ−５１８ｆ；ｍｉｒ−５１９ａ−１；ｍｉｒ−５１９ａ−２；ｍｉｒ−５１９ｂ；ｍｉｒ−５１９ｃ；ｍｉｒ−５１９ｄ；ｍｉｒ−５１９ｅ；ｍｉｒ−５２０ａ；ｍｉｒ−５２０ｂ；ｍｉｒ−５２０ｃ；ｍｉｒ−５２０ｄ；ｍｉｒ−５２０ｅ；ｍｉｒ−５２０ｆ；ｍｉｒ−５２０ｇ；ｍｉｒ−５２０ｈ；ｍｉｒ−５２１−１；ｍｉｒ−５２１−２；ｍｉｒ−５２２；ｍｉｒ−５２３；ｍｉｒ−５２４；ｍｉｒ−５２５；ｍｉｒ−５２６ａ−１；ｍｉｒ−５２６ａ−２；ｍｉｒ−５２６ｂ；ｍｉｒ−５２７；ｍｉｒ−５３２；ｍｉｒ−５３９；ｍｉｒ−５４１；ｍｉｒ−５４２；ｍｉｒ−５４３；ｍｉｒ−５４４；ｍｉｒ−５４４ｂ；ｍｉｒ−５４５；ｍｉｒ−５４８ａ−１；ｍｉｒ−５４８ａ−２；ｍｉｒ−５４８ａ−３；ｍｉｒ−５４８ａａ−１；ｍｉｒ−５４８ａａ−２；ｍｉｒ−５４８ｂ；ｍｉｒ−５４８ｃ；ｍｉｒ−５４８ｄ−１；ｍｉｒ−５４８ｄ−２；ｍｉｒ−５４８ｅ；ｍｉｒ−５４８ｆ−１；ｍｉｒ−５４８ｆ−２；ｍｉｒ−５４８ｆ−３；ｍｉｒ−５４８ｆ−４；ｍｉｒ−５４８ｆ−５；ｍｉｒ−５４８ｇ；ｍｉｒ−５４８ｈ−１；ｍｉｒ−５４８ｈ−２；ｍｉｒ−５４８ｈ−３；ｍｉ��−５４８ｈ−４；ｍｉｒ−５４８ｉ−１；ｍｉｒ−５４８ｉ−２；ｍｉｒ−５４８ｉ−３；ｍｉｒ−５４８ｉ−４；ｍｉｒ−５４８ｊ；ｍｉｒ−５４８ｋ；ｍｉｒ−５４８ｌ；ｍｉｒ−５４８ｍ；ｍｉｒ−５４８ｎ；ｍｉｒ−５４８ｏ；ｍｉｒ−５４８ｐ；ｍｉｒ−５４８ｓ；ｍｉｒ−５４８ｔ；ｍｉｒ−５４８ｕ；ｍｉｒ−５４８ｖ；ｍｉｒ−５４８ｗ；ｍｉｒ−５４８ｘ；ｍｉｒ−５４８ｙ；ｍｉｒ−５４８ｚ；ｍｉｒ−５４９；ｍｉｒ−５５０ａ−１；ｍｉｒ−５５０ａ−２；ｍｉｒ−５５０ｂ−１；ｍｉｒ−５５０ｂ−２；ｍｉｒ−５５１ａ；ｍｉｒ−５５１ｂ；ｍｉｒ−５５２；ｍｉｒ−５５３；ｍｉｒ−５５４；ｍｉｒ−５５５；ｍｉｒ−５５６；ｍｉｒ−５５７；ｍｉｒ−５５８；ｍｉｒ−５５９；ｍｉｒ−５６１；ｍｉｒ−５６２；ｍｉｒ−５６３；ｍｉｒ−５６４；ｍｉｒ−５６６；ｍｉｒ−５６７；ｍｉｒ−５６８；ｍｉｒ−５６９；ｍｉｒ−５７０；ｍｉｒ−５７１；ｍｉｒ−５７２；ｍｉｒ−５７３；ｍｉｒ−５７４；ｍｉｒ−５７５；ｍｉｒ−５７６；ｍｉｒ−５７７；ｍｉｒ−５７８；ｍｉｒ−５７９；ｍｉｒ−５８０；ｍｉｒ−５８１；ｍｉｒ−５８２；ｍｉｒ−５８３；ｍｉｒ−５８４；ｍｉｒ−５８５；ｍｉｒ−５８６；ｍｉｒ−５８７；ｍｉｒ−５８８；ｍｉｒ−５８９；ｍｉｒ−５９０；ｍｉｒ−５９１；ｍｉｒ−５９２；ｍｉｒ−５９３；ｍｉｒ−５９５；ｍｉｒ−５９６；ｍｉｒ−５９７；ｍｉｒ−５９８；ｍｉｒ−５９９；ｍｉｒ−６００；ｍｉｒ−６０１；ｍｉｒ−６０２；ｍｉｒ−６０３；ｍｉｒ−６０４；ｍｉｒ−６０５；ｍｉｒ−６０６；ｍｉｒ−６０７；ｍｉｒ−６０８；ｍｉｒ−６０９；ｍｉｒ−６１０；ｍｉｒ−６１１；ｍｉｒ−６１２；ｍｉｒ−６１３；ｍｉｒ−６１４；ｍｉｒ−６１５；ｍｉｒ−６１６；ｍｉｒ−６１７；ｍｉｒ−６１８；ｍｉｒ−６１９；ｍｉｒ−６２０；ｍｉｒ−６２１；ｍｉｒ−６２２；ｍｉｒ−６２３；ｍｉｒ−６２４；ｍｉｒ−６２５；ｍｉｒ−６２６；ｍｉｒ−６２７；ｍｉｒ−６２８；ｍｉｒ−６２９；ｍｉｒ−６３０；ｍｉｒ−６３１；ｍｉｒ−６３２；ｍｉｒ−６３３；ｍｉｒ−６３４；ｍｉｒ−６３５；ｍｉｒ−６３６；ｍｉｒ−６３７；ｍｉｒ−６３８；ｍｉｒ−６３９；ｍｉｒ−６４０；ｍｉｒ−６４１；ｍｉｒ−６４２ａ；ｍｉｒ−６４２ｂ；ｍｉｒ−６４３；ｍｉｒ−６４４；ｍｉｒ−６４５；ｍｉｒ−６４６；ｍｉｒ−６４７；ｍｉｒ−６４８；ｍｉｒ−６
４９；ｍｉｒ−６５０；ｍｉｒ−６５１；ｍｉｒ−６５２；ｍｉｒ−６５３；ｍｉｒ−６５４；ｍｉｒ−６５５；ｍｉｒ−６５６；ｍｉｒ−６５７；ｍｉｒ−６５８；ｍｉｒ−６５９；ｍｉｒ−６６０；ｍｉｒ−６６１；ｍｉｒ−６６２；ｍｉｒ−６６３；ｍｉｒ−６６３ｂ；ｍｉｒ−６６４；ｍｉｒ−６６５；ｍｉｒ−６６８；ｍｉｒ−６７０；ｍｉｒ−６７１；ｍｉｒ−６７５；ｍｉｒ−６７６；ｍｉｒ−７０８；ｍｉｒ−７１１；ｍｉｒ−７１８；ｍｉｒ−７２０；ｍｉｒ−７４４；ｍｉｒ−７５８；ｍｉｒ−７５９；ｍｉｒ−７６０；ｍｉｒ−７６１；ｍｉｒ−７６２；ｍｉｒ−７６４；ｍｉｒ−７６５；ｍｉｒ−７６６；ｍｉｒ−７６７；ｍｉｒ−７６９；ｍｉｒ−７７０；ｍｉｒ−８０２；ｍｉｒ−８７３；ｍｉｒ−８７４；ｍｉｒ−８７５；ｍｉｒ−８７６；ｍｉｒ−８７７；ｍｉｒ−８８５；ｍｉｒ−８８７；ｍｉｒ−８８８；ｍｉｒ−８８９；ｍｉｒ−８９０；ｍｉｒ−８９１ａ；ｍｉｒ−８９１ｂ；ｍｉｒ−８９２ａ；ｍｉｒ−８９２ｂ；ｍｉｒ−９２０；ｍｉｒ−９２１；ｍｉｒ−９２２；ｍｉｒ−９２４；ｍｉｒ−９３３；ｍｉｒ−９３４；ｍｉｒ−９３５；ｍｉｒ−９３６；ｍｉｒ−９３７；ｍｉｒ−９３８；ｍｉｒ−９３９；ｍｉｒ−９４０；ｍｉｒ−９４１−１；ｍｉｒ−９４１−２；ｍｉｒ−９４１−３；ｍｉｒ−９４１−４；ｍｉｒ−９４２；ｍｉｒ−９４２；ｍｉｒ−９４３；ｍｉｒ−９４４；ｍｉｒ−１１７８；ｍｉｒ−１１７９；ｍｉｒ−１１８０；ｍｉｒ−１１８１；ｍｉｒ−１１８２；ｍｉｒ−１１８３；ｍｉｒ−１１８４−１；ｍｉｒ−１１８４−２；ｍｉｒ−１１８４−３；ｍｉｒ−１１８５−１；ｍｉｒ−１１８５−２；ｍｉｒ−１１９３；ｍｉｒ−１１９７；ｍｉｒ−１２００；ｍｉｒ−１２０２；ｍｉｒ−１２０３；ｍｉｒ−１２０４；ｍｉｒ−１２０５；ｍｉｒ−１２０６；ｍｉｒ−１２０７；ｍｉｒ−１２０８；ｍｉｒ−１２２４；ｍｉｒ−１２２５；ｍｉｒ−１２２６；ｍｉｒ−１２２７；ｍｉｒ−１２２８；ｍｉｒ−１２２９；ｍｉｒ−１２３１；ｍｉｒ−１２３３−１；ｍｉｒ−１２３３−２；ｍｉｒ−１２３４；ｍｉｒ−１２３６；ｍｉｒ−１２３７；ｍｉｒ−１２３８；ｍｉｒ−１２４３；ｍｉｒ−１２４４−１；ｍｉｒ−１２４４−２；ｍｉｒ−１２４４−３；ｍｉｒ−１２４５；ｍｉｒ−１２４６；ｍｉｒ−１２４７；ｍｉｒ−１２４８；ｍｉｒ−１２４９；ｍｉｒ−１２５０；ｍｉｒ−１２５１；ｍｉｒ−１２５２；ｍｉｒ−１２５３；ｍｉｒ−１２５４；ｍｉｒ−１２５５ａ；ｍｉｒ−１２５５ｂ−１；ｍｉｒ−１２５５ｂ−２；ｍｉｒ−１２５６；ｍｉｒ−１２５７；ｍｉｒ−１２５８；ｍｉｒ−１２６０；ｍｉｒ−１２６０ｂ；ｍｉｒ−１２６１；ｍｉｒ−１２６２；ｍｉｒ−１２６３；ｍｉｒ−１２６４；ｍｉｒ−１２６５；ｍｉｒ−１２６６；ｍｉｒ−１２６７；ｍｉｒ−１２６８；ｍｉｒ−１２６９；ｍｉｒ−１２７０−１；ｍｉｒ−１２７０−２；ｍｉｒ−１２７１；ｍｉｒ−１２７２；ｍｉｒ−１２７３；ｍｉｒ−１２７３ｃ；ｍｉｒ−１２７３ｄ；ｍｉｒ−１２７３ｅ；ｍｉｒ−１２７４ａ；ｍｉｒ−１２７４ｂ；ｍｉｒ−１２７５；ｍｉｒ−１２７６；ｍｉｒ−１２７７；ｍｉｒ−１２７８；ｍｉｒ−１２７９；ｍｉｒ−１２８０；ｍｉｒ−１２８１；ｍｉｒ−１２８２；ｍｉｒ−１２８３−１；ｍｉｒ−１２８３−２；ｍｉｒ−１２８４；ｍｉｒ−１２８５−１；ｍｉｒ−１２８５−２；ｍｉｒ−１２８６；ｍｉｒ−１２８７；ｍｉｒ−１２８８；ｍｉｒ−１２８９−１；ｍｉｒ−１２８９−２；ｍｉｒ−１２９０；ｍｉｒ−１２９１；ｍｉｒ−１２９２；ｍｉｒ−１２９３；ｍｉｒ−１２９４；ｍｉｒ−１２９５；ｍｉｒ−１２９６；ｍｉｒ−１２９７；ｍｉｒ−１２９８；ｍｉｒ−１２９９；ｍｉｒ−１３０１；ｍｉｒ−１３０２−１；ｍｉｒ−１３０２−１０；ｍｉｒ−１３０２−１１；ｍｉｒ−１３０２−２；ｍｉｒ−１３０２−３；ｍｉｒ−１３０２−４；ｍｉｒ−１３０２−５；ｍｉｒ−１３０２−６；ｍｉｒ−１３０２−７；ｍｉｒ−１３０２−８；ｍｉｒ−１３０２−９；ｍｉｒ−１３０３；ｍｉｒ−１３０４；ｍｉｒ−１３０５；ｍｉｒ−１３０６；ｍｉｒ−１３０７；ｍｉｒ−１３２１；ｍｉｒ−１３２２；ｍｉｒ−１３２３；ｍｉｒ−１３２４；ｍｉｒ−１４６８；ｍｉｒ−１４６９；ｍｉｒ−１４７０；ｍｉｒ−１４７１；ｍｉｒ−１５３７；ｍｉｒ−１５３８；ｍｉｒ−１５３９；ｍｉｒ−１８２５；ｍｉｒ−１８２７；ｍｉｒ−１９０８；ｍｉｒ−１９０９；ｍｉｒ−１９１０；ｍｉｒ−１９１１；ｍｉｒ−１９１２；ｍｉｒ−１９１３；ｍｉｒ−１９１４；ｍｉｒ−１９１５；ｍｉｒ−１９７２−１；ｍｉｒ−１９７２−２；ｍｉｒ−１９７３；ｍｉｒ−１９７６；ｍｉｒ−２０５２；ｍｉｒ−２０５３；ｍｉｒ−２０５４；ｍｉｒ−２１１０；ｍｉｒ−２１１３；ｍｉｒ−２１１４；ｍｉｒ−２１１５；ｍｉｒ−２１１６；ｍｉｒ−２１１７；ｍｉｒ−２２７６；ｍｉｒ−２２７７；ｍｉｒ−２２７８；ｍｉｒ−２３５５；ｍｉｒ−２８６１；ｍｉｒ−２９０９；ｍｉｒ−３０６５；ｍｉｒ−３０７４；ｍｉｒ−３１１５；ｍｉｒ−３１１６−１；ｍｉｒ−３１１６−２；ｍｉｒ−３１１７；ｍｉｒ−３１１８−１；ｍｉｒ−３１１８−２；ｍｉｒ−３１１８−３；ｍｉｒ−３１１８−４；ｍｉｒ−３１１８−５；ｍｉｒ−３１１８−６；ｍｉｒ−３１１９−１；ｍｉｒ−３１１９−２；ｍｉｒ−３１２０；ｍｉｒ−３１２１；ｍｉｒ−３１２２；ｍｉｒ−３１２３；ｍｉｒ−３１２４；ｍｉｒ−３１２５；ｍｉｒ−３１２６；ｍｉｒ−３１２７；ｍｉｒ−３１２８；ｍｉｒ−３１２９；ｍｉｒ−３１３０−１；ｍｉｒ−３１３０−２；ｍｉｒ−３１３１；ｍｉｒ−３１３２；ｍｉｒ−３１３３；ｍｉｒ−３１３４；ｍｉｒ−３１３５；ｍｉｒ−３１３６；ｍｉｒ−３１３７；ｍｉｒ−３１３８；ｍｉｒ−３１３９；ｍｉｒ−３１４０；ｍｉｒ−３１４１；ｍｉｒ−３１４２；ｍｉｒ−３１４３；ｍｉｒ−３１４４；ｍｉｒ−３１４５；ｍｉｒ−３１４６；ｍｉｒ−３１４７；ｍｉｒ−３１４８；ｍｉｒ−３１４９；ｍｉｒ−３１５０；ｍｉｒ−３１５１；ｍｉｒ−３１５２；ｍｉｒ−３１５３；ｍｉｒ−３１５４；ｍｉｒ−３１５５；ｍｉｒ−３１５６−１；ｍｉｒ−３１５６−２；ｍｉｒ−３１５６−３；ｍｉｒ−３１５７；ｍｉｒ−３１５８−１；ｍｉｒ−３１５８−２；ｍｉｒ−３１５９；ｍｉｒ−３１６０−１；ｍｉｒ−３１６０−２；ｍｉｒ−３１６１；ｍｉｒ−３１６２；ｍｉｒ−３１６３；ｍｉｒ−３１６４；ｍｉｒ−３１６５；ｍｉｒ−３１６６；ｍｉｒ−３１６７；ｍｉｒ−３１６８；ｍｉｒ−３１６９；ｍｉｒ−３１７０；ｍｉｒ−３１７１；ｍｉｒ−３１７３；ｍｉｒ−３１７４；ｍｉｒ−３１７５；ｍｉｒ−３１７６；ｍｉｒ−３１７７；ｍｉｒ−３１７８；ｍｉｒ−３１７９−１；ｍｉｒ−３１７９−２；ｍｉｒ−３１７９−３；ｍｉｒ−３１８０−１；ｍｉｒ−３１８０−２；ｍｉｒ−３１８０−３；ｍｉｒ−３１８０−４；ｍｉｒ−３１８０−５；ｍｉｒ−３１８１；ｍｉｒ−３１８２；ｍｉｒ−３１８３；ｍｉｒ−３１８４；ｍｉｒ−３１８５；ｍｉｒ−３１８６；ｍｉｒ−３１８７；ｍｉｒ−３１８８；ｍｉｒ−３１８９；ｍｉｒ−３１９０；ｍｉｒ−３１９１；ｍｉｒ−３１９２；ｍｉｒ−３１９３；ｍｉｒ−３１９４；ｍｉｒ−３１９５；ｍｉｒ−３１９６；ｍｉｒ−３１９７；ｍｉｒ−３１９８；ｍｉｒ−３１９９−１；ｍｉｒ−３１９９−２；ｍｉｒ−３２００；ｍｉｒ−３２０１；ｍｉｒ−３２０２−１；ｍｉｒ−３２０２−２；ｍｉｒ−３６０５；ｍｉｒ−３６０６；ｍｉｒ−３６０７；ｍｉｒ−３６０９；ｍｉｒ−３６１０；ｍｉｒ−３６１１；ｍｉｒ−３６１２；ｍｉｒ−３６１３；ｍｉｒ−３６１４；ｍｉｒ−３６１５；ｍｉｒ−３６１６；ｍｉｒ−３６１７；ｍｉｒ−３６１８；ｍｉｒ−３６１９；ｍｉｒ−３６２０；ｍｉｒ−３６２１；ｍｉｒ−３６２２ａ；ｍｉｒ−３６２２ｂ；ｍｉｒ−３６４６；ｍｉｒ−３６４７；ｍｉｒ−３６４８；ｍｉｒ−３６４９；ｍｉｒ−３６５０；ｍｉｒ−３６５１；ｍｉｒ−３６５２；ｍｉｒ−３６５３；ｍｉｒ−３６５４；ｍｉｒ−３６５５；ｍｉｒ−３６５６ｍｉｒ−３６５７；ｍｉｒ−３６５８；ｍｉｒ−３６５９；ｍｉｒ−３６６０；ｍｉｒ−３６６１；ｍｉｒ−３６６２；ｍｉｒ−３６６３；ｍｉｒ−３６６４；ｍｉｒ−３６６５；ｍｉｒ−３６６６；ｍｉｒ−３６６７；ｍｉｒ−３６６８；ｍｉｒ−３６６９；ｍｉｒ−３６７０；ｍｉｒ−３６７０；ｍｉｒ−３６７１；ｍｉｒ−３６７１；ｍｉｒ−３６７３；ｍｉｒ−３６７３；ｍｉｒ−３６７５；ｍｉｒ−３６７５；ｍｉｒ−３６７６；ｍｉｒ−３６６３；ｍｉｒ−３６７７；ｍｉｒ−３６７８；ｍｉｒ−３６７９；ｍｉｒ−３６８０；ｍｉｒ−３６８１；ｍｉｒ−３６８２；ｍｉｒ−３６８３；ｍｉｒ−３６８４；ｍｉｒ−３６８５；ｍｉｒ−３６８６；ｍｉｒ−３６８７；ｍｉｒ−３６８８；ｍｉｒ−３６８９ａ；ｍｉｒ−３６８９ｂ；ｍｉｒ−３６９０；ｍｉｒ−３６９１；ｍｉｒ−３６９２；ｍｉｒ−３７１３；ｍｉｒ−３７１４；ｍｉｒ−３９０７；ｍｉｒ−３９０８；ｍｉｒ−３９０９；ｍｉｒ−３９１０−１；ｍｉｒ−３９１０−２；ｍｉｒ−３９１１；ｍｉｒ−３９１２；ｍｉｒ−３９１３−１；ｍｉｒ−３９１３−２；ｍｉｒ−３９１４−１；ｍｉｒ−３９１４−２；ｍｉｒ−３９１５；ｍｉｒ−３９１６；ｍｉｒ−３９１７；ｍｉｒ−３９１８；ｍｉｒ−３９１９；ｍｉｒ−３９２０；ｍｉｒ−３９２１；ｍｉｒ−３９２２；ｍｉｒ−３９２３；ｍｉｒ−３９２４；ｍｉｒ−３９２５；ｍｉｒ−３９２６−１；ｍｉｒ−３９２６−２；ｍｉｒ−３９２７；ｍｉｒ−３９２８；ｍｉｒ−３９２９；ｍｉｒ−３９３４；ｍｉｒ−３９３５；ｍｉｒ−３９３６；ｍｉｒ−３９３７；ｍｉｒ−３９３８；ｍｉｒ−３９３９；ｍｉｒ−３９４０；ｍｉｒ−３９４１；ｍｉｒ−３９４２；ｍｉｒ−３９４３；ｍｉｒ−３９４４；ｍｉｒ−３９４５；ｍｉｒ−４２５１；ｍｉｒ−４２５２；ｍｉｒ−４２５３；ｍｉｒ−４２５４；ｍｉｒ−４２５５；ｍｉｒ−４２５６；ｍｉｒ−４２５７；ｍｉｒ−４２５８；ｍｉｒ−４２５９；ｍｉｒ−４２６０；ｍｉｒ−４２６１；ｍｉｒ−４２６２；ｍｉｒ−４２６３；ｍｉｒ−４２６４；ｍｉｒ−４２６５；ｍｉｒ−４２６６；ｍｉｒ−４２６７；ｍｉｒ−４２６８；ｍｉｒ−４２６９；ｍｉｒ−４２７０；ｍｉｒ−４２７１；ｍｉｒ−４２７２；ｍｉｒ−４２７３；ｍｉｒ−４２７４；ｍｉｒ−４２７５；ｍｉｒ−４２７６；ｍｉｒ−４２７７；ｍｉｒ−４２７８；ｍｉｒ−４２７９；ｍｉｒ−４２８０；ｍｉｒ−４２８１；ｍｉｒ−４２８２；ｍｉｒ−４２８３−１；ｍｉｒ−４２８３−２；ｍｉｒ−４２８４；ｍｉｒ−４２８５；ｍｉｒ−４２８６；ｍｉｒ−４２８７；ｍｉｒ−４２８８；ｍｉｒ−４２８９；ｍｉｒ−４２９０；ｍｉｒ−４２９１；ｍｉｒ−４２９２；ｍｉｒ−４２９３；ｍｉｒ−４２９４；ｍｉｒ−４２９５；ｍｉｒ−４２９６；ｍｉｒ−４２９７；ｍｉｒ−４２９８；ｍｉｒ−４２９９；ｍｉｒ−４３００；ｍｉｒ−４３０１；ｍｉｒ−４３０２；ｍｉｒ−４３０３；ｍｉｒ−４３０４；ｍｉｒ−４３０５；ｍｉｒ−４３０６；ｍｉｒ−４３０７；ｍｉｒ−４３０８；ｍｉｒ−４３０９；ｍｉｒ−４３１０；ｍｉｒ−４３１１；ｍｉｒ−４３１２；ｍｉｒ−４３１３；ｍｉｒ−４３１４；ｍｉｒ−４３１５−１；ｍｉｒ−４３１５−２；ｍｉｒ−４３１６；ｍｉｒ−４３１７；ｍｉｒ−４３１８；ｍｉｒ−４３１９；ｍｉｒ−４３２０；ｍｉｒ−４３２１；ｍｉｒ−４３２２；ｍｉｒ−４３２３；ｍｉｒ−４３２４；ｍｉｒ−４３２５；ｍｉｒ−４３２６；ｍｉｒ−４３２７；ｍｉｒ−４３２８；ｍｉｒ−４３２９；ｍｉｒ−４３２９；およびｍｉｒ−４３３０。
【０１０３】
本発明は、本明細書記載の細胞集団または構築物から得られる細胞由来または分泌ｍｉＲＮＡに関する。一実施形態では、１つまたは複数の個別ｍｉＲＮＡを使って、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与えることができる。個別ｍｉＲＮＡの組み合わせは、このような効果を与えるのに適切である可能性がある。代表的組み合わせには、２つ以上の次記のものが含まれる：ｍｉＲ−２１；ｍｉＲ−２３ａ；ｍｉＲ−３０ｃ；ｍｉＲ−１２２４；ｍｉＲ−２３ｂ；ｍｉＲ−９２ａ；ｍｉＲ−１００；ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−１９５；ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ；およびこれらの任意の組み合わせ。別の代表的組み合わせには、２つ以上の次記のものが含まれる：ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１５１、および来られの任意の組み合わせ。一実施形態では、ｍｉＲＮＡの組み合わせには、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の個別ｍｉＲＮＡを含んでもよい。当業者なら、他のｍｉＲＮＡおよびｍｉｒＲＮＡの組み合わせが、本発明での使用に適する可能性があることを理解するであろう。追加のｍｉＲＮＡのソースには、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇのｍｉＲＢａｓｅが含まれ、これは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている。
【０１０４】
一実施形態では、分泌産物は、パラクリン因子を含む。一般的に、パラクリン因子は、短い距離を拡散し、隣接細胞の変化、すなわち、パラクリン相互作用、を誘導するか、または起こさせることができる細胞により合成された分子である。拡散可能分子は、パラクリン因子と呼ばれる。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の単離された本明細書記載の腎臓細胞由来分泌小胞組成物に関する。当業者なら、分泌小胞を含む種々の型の組成物が適することを理解できるであろう。
【０１０６】
別の態様では、本発明は、腎臓細胞分泌産物、例えば、小胞を調製する方法を提供する。一実施形態では、方法は、１つまたは複数の富化腎臓細胞集団の混合物を含む腎臓細胞集団を用意するステップを含む。別の実施形態では、方法は、適切な条件下でその集団を培養するステップをさらに含む。その条件は、低酸素条件であってもよい。別の実施形態では、方法は、腎臓細胞集団から分泌産物を分離するステップをさらに含む。分泌小胞は、細胞集団の細胞培地から採取してもよい。もう一つの実施形態では、腎臓細胞は、酸素レベルに対する生物学的応答である小胞産生および／または分泌を特徴とし、その結果、培養系の酸素圧力の低下が小胞産生および／または分泌の誘導に繋がる。一実施形態では、通常の大気（〜２１％）レベルの利用可能酸素で培養した細胞集団に比べて、培養系の利用可能酸素レベルの低下した環境に曝される条件下で細胞集団が培養される場合に、小胞産生および／または分泌が誘導される。一実施形態では、より低酸素条件下で培養した細胞集団は、通常の酸素条件下で培養した細胞集団に比べて、より高いレベルの小胞を産生および／または分泌する。一般的に、低いレベルの利用可能酸素下（低酸素性培養条件とも呼ばれる）での細胞の培養は、低い酸素レベルが、通常の大気レベルの利用可能酸素（正常または正常酸素圧培養条件とも呼ばれる）下での細胞培養に比べて、減らされていることを意味する。一実施形態では、低酸素性細胞培養条件には、約１％酸素未満、約２％酸素未満、約３％酸素未満、約４％酸素未満、または約５％酸素未満での細胞の培養が含まれる。別の実施形態では、正常または正常酸素圧培養条件には、約１０％酸素、約１２％酸素、約１３％酸素、約１４％酸素、約１５％酸素、約１６％酸素、約１７％酸素、約１８％酸素、約１９％酸素、約２０％酸素、または約２１％酸素での細胞の培養が含まれる。好ましい実施形態では、方法は、腎臓細胞からエキソソームおよび／または微小胞の単離を提供する。
【０１０７】
一実施形態では、産物は、腎臓細胞から分泌される。産物は、足場上にない、例えば、細胞が本明細書記載の構築物の一部ではない、腎臓細胞から分泌されてもよい。
【０１０８】
別の実施形態では、産物は、足場上、例えば、構築物上に播種されている腎臓細胞により分泌される。構築物には、足場上またはその中に直接播種されている１つまたは複数の富化腎臓細胞集団またはそれらの混合物が含まれる。
【０１０９】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の富化腎臓細胞集団、および該集団を含む混合物または構築物のバイオセラピューティック効力を選別／最適化／モニタリングするためのインビトロの方法を提供する。一実施形態では、方法には、１つまたは複数の試験集団、試験混合物または試験構築物（「被検物質」）を用意するステップが含まれる。別の実施形態では方法には、本明細書記載の適切な条件下で被検物質を培養するステップが含まれる。もう一つの実施形態では、方法には、培養した被検物質から細胞培地を集めるステップが含まれる。この培地は、「馴化培地」と呼ぶことができ、被検物質の腎臓細胞により分泌された産物を含むことが予期される。
【０１１０】
もう一つの態様では、馴化培地を使って、１つまたは複数のインビトロアッセイを行いい、被検物質のバイオセラピューティック効力を試験することもできる。一実施形態では、馴化培地は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）アッセイに供される。アッセイは、ＴＧＦβ１により誘導されたＥＭＴを試験できる。実施例１５は、このアッセイ用の代表的プロトコルを提供する。
【０１１１】
別の実施形態では、馴化培地は、例えば、ＰＣＲベースアッセイによるＲＮＡの検出、および／または例えば、ＦＡＣＳによる小胞またはエキソソームの検出に供される。もう一つの実施形態では、馴化培地は、シグナル伝達経路アッセイ、例えば、免疫応答（例えば、ＮＦκＢ）、線維化反応（ＰＡＩ−１）、および血管新生アッセイに供される。実施例１２〜１４は、これらのアッセイ用の代表的プロトコルを提供する。
【０１１２】
使用方法
一態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏を本明細書記載の腎臓細胞集団および腎臓細胞の混合物により処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、ＥＰＯ産生細胞富化第１腎臓細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含む。別の実施形態では、第１細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、および血管細胞が富化されている。一実施形態では、第１腎臓細胞集団は、Ｂ４’細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の追加の腎臓細胞集団をさらに含んでもよい。一実施形態では、追加の細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない第２細胞集団である。別の実施形態では、追加の細胞集団は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体細胞、または血管細胞が富化されていない第２細胞集団である。別の実施形態では、組成物は、また、本明細書記載の疾患または障害の処置のために、生体材料中に析出して、その上に析出して、その中に包埋されて、それによりコートされて、またはその中に捕捉されて本明細書記載の移植可能な構築物を形成する腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む。一実施形態では、細胞集団は、単独または他の細胞または生体材料、例えば、ヒドロゲル、多孔性足場、またはネイティブもしくは合成ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて使用し、急性または慢性疾患状態の再生を刺激する。
【０１１３】
別の態様では、本発明の方法による対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の効果的処置は、赤血球生成および／または腎臓機能の種々の指標により観察可能である。一実施形態では、赤血球恒常性の指標には、限定されないが、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、ヘモグロビン（ＨＢ）、平均赤血球血色素量（ＭＣＨ）、赤血球数（ＲＢＣ）、網状赤血球数、網状赤血球％、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）が含まれる。もう一つの実施形態では、腎臓機能の指標には、限定されないが、血清アルブミン、グロブリン対アルブミン比率（Ａ／Ｇ比率）、血清亜リン酸、血清ナトリウム、腎臓の大きさ（超音波で測定）、血清カルシウム、亜リン酸：カルシウム比率、血清カリウム、蛋白尿、尿クレアチニン、血清クレアチニン、血中窒素尿素（ＢＵＮ）、コレステロールレベル、トリグリセリドレベルおよび糸球体濾過率（ＧＦＲ）が含まれる。さらに、総体的な健康および幸福のいくつかの指標には、限定されないが、体重増または減少、生存時間、血圧（平均体血圧、拡張期血圧、または収縮期血圧）、および持久力、が含まれる。
【０１１４】
別の実施形態では、有効な処置は、１つまたは複数の腎臓機能指標の安定化により立証される。腎臓機能の安定化は、本発明の方法により処置されていない対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証される。あるいは、腎臓機能の安定化は、処置前の同じ対象の同じ指標と比較して、本発明の方法により処置された対象の指標の変化の観察により立証できる。第１指標の変化は、値の増加でも減少でもよい。一実施形態では、本発明により提供される処置は、対象の血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察ＢＵＮレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。もう一つの実施形態では、処置は、血清クレアチニンレベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察血清クレアチニンレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より低い。別の実施形態では、処置は、対象のヘマトクリット（ＨＣＴ）レベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察ＨＣＴレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。別の実施形態では、処置は、対象の赤血球（ＲＢＣ）レベルの安定化を含んでもよく、この場合、対象の観察ＲＢＣレベルは、本発明の方法により処置されていない類似の疾患状態の対象と比較して、より高い。当業者には、１つまたは複数の本明細書記載のまたは当技術分野で既知の追加の指標で測定して対象の腎疾患の効果的な処置を判定できることは理解されよう。
【０１１５】
別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の赤血球恒常性を提供する方法に関する。一実施形態では、方法は、（ａ）対象に腎臓細胞集団、例えば、本明細書記載のＢ２もしくはＢ４’、または腎臓細胞混合物、例えば、Ｂ２／Ｂ４’および／またはＢ２／Ｂ３、を投与するステップ；および（ｂ）対象由来の生物試料において、対照の指標レベルに比べて、赤血球生成指標のレベルが異なり、指標レベルの差異が（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに反応していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）対象に本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞混合物を含む組成物を投与するステップ；および（ｂ）対象由来の生物試料において、対照の指標レベルに比べ赤血球生成指標が異なり、指標レベルの差異が、（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに反応していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。別の実施形態では、方法は、（ａ）生体材料または生体適合性高分子足場を用意するステップ；（ｂ）生体材料または足場の上または中に本発明の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を本明細書記載の方法で析出させ、移植可能な構築物を形成するステップ；（ｃ）構築物を対象に移植するステップ；および（ｄ）対象由来の生物試料で、赤血球生成指標のレベルが対照の指標レベルに比較して異なり、指標レベルの差異が（ｉ）対象が（ａ）の投与ステップに反応していることを示すか、または（ｉｉ）対象の赤血球恒常性を示すことを測定するステップを含む。
【０１１６】
別の態様では、本発明は、腎臓機能の安定化および赤血球恒常性の回復の両方を必要としている対象に提供する方法であって、前記対象が腎臓機能不足および貧血および／またはＥＰＯ欠乏の両方を有している場合の方法に関する。一実施形態では、方法は、少なくとも１つの下記の細胞型を含む本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物を投与するステップを含む：尿細管由来細胞、糸球体由来細胞、間質由来細胞、集合管由来細胞、間質組織由来細胞、または脈管構造由来細胞。別の実施形態では、集団または混合物は、ＥＰＯ産生細胞および尿細管上皮細胞の両方を含み、尿細管細胞は、少なくとも１つの下記のマーカーにより特定される：メガリン、キュビリン、ヒアルロン酸シンターゼ２（ＨＡＳ２）、ビタミンＤ３２５−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２Ｄ２５）、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、Ｅ−カドヘリン（Ｅｃａｄ）、アクアポリン−１（Ａｑｐ１）、アクアポリン−２（Ａｑｐ２）、ＲＡＢ１７、ｍｅｍｂｅｒ  ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（Ｒａｂ１７）、ＧＡＴＡ結合タンパク質３（Ｇａｔａ３）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子４（Ｆｘｙｄ４）、溶質キャリアファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ｓｌｃ９ａ４）、アルデヒド脱水素酵素３ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ１（Ａｌｄｈ３ｂ１）、アルデヒド脱水素酵素１ファミリー、ｍｅｍｂｅｒ  Ａ３（Ａｌｄｈ１ａ３）、およびカルパイン−８（Ｃａｐｎ８）。この実施形態では、対象の処置は、未処置対象または対象の処置前指標と比較して、少なくとも１つの赤血球生成指標の改善と同時に、少なくとも１つの腎臓機能の指標の改善により立証されるであろう。
【０１１７】
一態様では、本発明は、本明細書記載のＥＰＯ産生細胞富化腎臓細胞集団またはＥＰＯ産生細胞富化細胞集団を含む腎臓細胞の混合物を投与することにより（ｉ）腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置；（ｉｉ）腎臓機能の安定化、（ｉｉｉ）赤血球恒常性の回復、または（ｉｖ）これらのいずれかの組み合わせの方法を提供し、投与の薬効は、ＥＰＯ産生細胞が富化されていない細胞集団の投与の効果よりも大きい。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清中のタンパク質の保持を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、血清コレステロールおよび／またはトリグリセリドのレベルを改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、ビタミンＤのレベルを改善する。一実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、リン：カルシウム比率を改善する。別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、血清クレアチニンのレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘマトクリットのレベルを改善する。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球数（ＲＢＣ＃）のレベルを改善する。一実施形態では、改善レベルのヘマトクリットは、９５％正常な健康レベルに回復している。さらなる実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球数を改善する。他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、網状赤血球割合を改善する。さらに他の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、赤血球容量分布幅（ＲＤＷ）レベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、非富化細胞集団に比べて、ヘモグロビンレベルを改善する。さらに別の実施形態では、富化細胞集団は、骨髄での赤血球造血反応を提供し、それにより、骨髄細胞充実性は正常に近くなり、骨髄：赤血球比率はほぼ正常になる。
【０１１８】
別の態様では、本発明は、富化細胞集団を投与することにより、（ｉ）腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置；（ｉｉ）腎臓機能の安定化、（ｉｉｉ）赤血球恒常性の回復、または（ｉｖ）これらの任意の組み合わせの方法を提供し、本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の投与の薬効は、組換え型ＥＰＯ（ｒＥＰＯ）の投与による薬効に比較して、赤血球恒常性の改善を特徴とする。一実施形態では、必要としている対象に投与する場合、集団または混合物は、組換え型ＥＰＯタンパク質の投与に比較して、赤血球恒常性を改善する（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃で判定して）。一実施形態では、集団または混合物は、投与された場合、組換え型ＥＰＯに比較して、ヘマトクリット、ＲＢＣ、またはヘモグロビンレベルを改善し、対照のヘマトクリットより約１０％低いか、または高い程度である。さらなる実施形態では、投与する場合、集団または混合物の１回量または送達により、組換え型ＥＰＯタンパク質の１回量または送達により赤血球恒常性が改善される期間を大きく超える期間にわたり、処理対象の赤血球恒常性が改善される（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃の増加で判定して）。別の実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、同等の健康な対照の正常なレベルの約１１０％を越えるヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃を生じない。さらなる実施形態では、集団または混合物は、本明細書記載の用量で投与された場合、本明細書記載の用量で送達した組換え型ＥＰＯタンパク質に比べて、優れた赤血球恒常性を与える（ヘマトクリット、ヘモグロビン、またはＲＢＣ＃で判定して）。別の実施形態では、組換え型ＥＰＯが、約１００ＩＵ／ｋｇ、約２００ＩＵ／ｋｇ、約３００ＩＵ／ｋｇ、約４００ＩＵ／ｋｇ、または約５００ＩＵ／ｋｇの用量で送達される。当業者なら、当技術分野で既知の組換え型ＥＰＯの他の投与量も適する可能性があることを理解するであろう。
【０１１９】
別の本発明の実施形態は、少なくとも１つの細胞集団の使用に関する。細胞集団は、必要としている対象の腎疾患、貧血、またはＥＰＯ欠乏の処置に有用な薬物の調製、必要としている対象の赤血球恒常性の提供、必要としている対象の腎臓機能の改善、またはネイティブ腎臓に対する再生効果の提供のために、本明細書記載の富化細胞集団およびそれらの混合物、または本明細書記載の移植可能な構築物、または本明細書記載の分泌産物を含む。
【０１２０】
別の本発明の実施形態は、具体的に立証された治療特性に基づく特定細胞亜集団の選択を基準にした特定の病因の腎疾患の処置のための、特定の富化細胞集団（本明細書記載の）の使用に関する。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明は、必要としている対象の腎疾患の処置方法を提供し、この方法は、単離された、尿細管細胞富化集団を含む１．０４５ｇ／ｍＬ〜１．０５２ｇ／ｍＬの密度の第１細胞集団、Ｂ２、およびエリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞および血管細胞を含むが、糸球体細胞が枯渇している１．０６３ｇ／ｍＬ〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の第２細胞集団、Ｂ４’を含む哺乳類腎臓細胞の混合物を含む組成物を対象に投与することを含み、混合物は、大きな集合管および尿細管系粒状細胞を含む１．０４５ｇ／ｍｌ未満の密度のＢ１細胞集団、または低粒度および低生存率の壊死組織片および小細胞を含む１．０９１ｇ／ｍｌ超の密度のＢ５細胞集団を含まない。特定の実施形態では、方法は、腎臓機能指標レベルが、対照の指標レベルに比べて、異なり、指標レベルの差異が、対象の１つまたは複数の腎臓機能の低下の減少、安定化、または改善を示す対象由来の試験検体の測定を含む。一実施形態では、その方法で使用されるＢ４’細胞集団は、血管マーカーの発現を特徴とする。特定の実施形態では、その方法で使われるＢ４’細胞集団は、糸球体マーカーの発現を特徴としない。一実施形態では、その方法で使われる細胞の混合物は、酸素で調節可能なエリスロポエチン（ＥＰＯ）発現が可能である。特定の実施形態では、本発明の方法により処置される腎疾患は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）欠乏が付随する。特定の実施形態では、ＥＰＯ欠乏は、貧血である。一部の実施形態では、ＥＰＯ欠乏または貧血は、対象の腎不全に引き続いて発生する。一部の実施形態では、ＥＰＯ欠乏または貧血は、慢性腎不全、原発性ＥＰＯ欠乏、化学療法もしくは抗ウイルス療法、非骨髄性癌、ＨＩＶ感染症、肝臓疾患、心臓不全、関節リウマチ、または多臓器不全からなる群より選択される傷害に引き続いて起こる。特定の実施形態では、その方法で使用される組成物は、１つまたは複数の生体適合性合成高分子および／または天然タンパク質またはペプチドを含む生体材料をさらに含み、混合物は、生体材料でコートされ、その上にまたは中に析出し、その中に捕捉され、その中に懸濁され、その中に包埋され、および／または他の方法でそれと組み合わされる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される混合物は、哺乳類腎臓組織または培養哺乳類腎臓細胞由来である。他の実施形態では、混
合物は、必要としている対象に対し自己である腎臓検体由来である。一実施形態では、検体は、腎生検である。他の実施形態では、本発明の方法で使われる混合物は、非自己腎臓検体由来である。
【０１２２】
さらに別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象の腎疾患、貧血またはＥＰＯ欠乏の処置に有用である薬物の調製のための、本発明の細胞調製物およびそれらの混合物または移植可能な構築物の、使用を提供する。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、治療を必要としている対象のネイティブ腎臓の再生のための方法を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物を対象に投与または移植するステップを含む。再生ネイティブ腎臓は、ネイティブ腎臓の機能または能力の発生、ネイティブ腎臓の機能または能力の改善、および特定のネイティブ腎臓マーカーの発現（これらに限定されない）を含むいくつかの指標を特徴とすることができる。一実施形態では、機能または能力の発生または改善は、上述の赤血球恒常性および腎臓機能の種々の指標に基づいて観察してもよい。別の実施形態では、再生腎臓は、１つまたは複数の幹細胞マーカーの発現差異を特徴とする。幹細胞マーカーは、１つまたは複数の下記のものであってもよい：ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ２（Ｓｏｘ２）；未分化胚細胞転写因子（ＵＴＦ１）；マウス由来ＮｏｄａｌＨｏｍｏｌｏｇ（ＮＯＤＡＬ）；プロミニン１（ＰＲＯＭ１）またはＣＤ１３３（ＣＤ１３３）；ＣＤ２４；およびこれらの任意の組み合わせ。別の実施形態では、幹細胞マーカーの発現は、対照に比べ、発現上昇している。
【０１２４】
富化細胞集団およびそれらの混合物ならびに前記を含む構築物を含む本明細書記載の細胞集団を使用して、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与えることができる。効果は、細胞それ自体によって、および／または細胞からの分泌産物によって提供されてもよい。再生効果は、１つまたは複数の下記を特徴としてもよい：上皮間葉転換の減少（ＴＧＦ−βシグナル伝達の減弱を介してもよい）；腎臓線維形成の減少；腎臓炎症の減少；ネイティブ腎臓の幹細胞マーカーの発現差異；移植細胞および／またはネイティブ細胞の腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位への遊走、腎損傷部位、例えば、尿細管傷害部位での移植細胞の生着；１つまたは複数の腎臓機能指標の安定化（本明細書記載の）；赤血球恒常性の回復（本明細書記載の）；およびこれらの任意の組み合わせ。
【０１２５】
再生モニタリング方法
別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の対象への投与または移植後のネイティブ腎臓の再生をモニタリングするための予後徴候予測方法を提供する。一実施形態では、方法は、対象由来試験検体および対照検体中のマーカー発現レベルを検出するステップを含み、対照検体に比べてより高いレベルの試験検体中のマーカーの発現は、対象のネイティブ腎臓の再生の予後徴候となる。別の実施形態では、方法は、検体中の１つまたは複数の幹細胞マーカーの発現の検出を含む。幹細胞マーカーは、Ｓｏｘ２；ＵＴＦ１；ＮＯＤＡＬ；ＣＤ１３３；ＣＤ２４；およびこれらの任意の組み合わせから選択できる。検出ステップは、幹細胞マーカーの発現が発現上昇しているか、または対照検体に比べ試験検体中で高いことを測定することを含んでもよく、より高いレベルの発現は、対象のネイティブ腎臓再生の予後徴候となる。もう一つの実施形態では、幹細胞マーカーのｍＲＮＡ発現が検出される。他の実施形態では、ｍＲＮＡ発現の検出は、ＰＣＲベース方法、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲによってもよい。インサイツハイブリダイゼーションもまた、ｍＲＮＡ発現の検出に使用できる。
【０１２６】
もう一つの実施形態では、幹細胞マーカーのポリペプチド発現が検出される。別の実施形態では、ポリペプチド発現は、抗幹細胞マーカー試薬を使って検出される。もう一つの実施形態では、試薬は、マーカーに対する抗体である。別の実施形態では、幹細胞マーカーポリペプチド発現は、免疫組織化学またはウェスタンブロットを使って検出される。
【０１２７】
当業者なら、マーカーのｍＲＮＡおよび／またはポリペプチド発現を検出する他の方法が解るであろう。
【０１２８】
一実施形態では、検出ステップは、対象由来試験検体を採取するステップにより先行される。別の実施形態では、試験検体は、腎臓組織である。
【０１２９】
もう一つの態様では、本発明は、ネイティブ腎臓の再生のための代用マーカーとして、マーカー、例えば、幹細胞マーカーの使用を提供する。このようなマーカーは、機能または能力が発生しているか、または改善されているかどうか（例えば、赤血球恒常性および腎臓機能の指標）に基づいて、再生の評価と独立に、または連携して使用可能である。再生の経時変化に対する代用のマーカーのモニタリングは、また、再生の予後指標として役立つ可能性がある。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の患者の予後評価の方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ａ）前記対象から採取した試験検体のマーカー発現のレベルの検出ステップ；（ｂ）対照検体に対するマーカー発現のレベル（または制御基準値）に比べて試験検体中の発現レベルを測定するステップ；および（ｃ）マーカー発現レベルの測定に基づいて患者の再生予後徴候を予測するステップを含み、対照検体（または制御基準値）に比べて、試験検体のマーカーのより高いレベルの発現は、対象の再生に対する予後徴候である。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の患者の予後評価方法を提供する。一実施形態では、方法は、（ａ）患者生物試料を採取するステップ；および（ｂ）生物試料中の幹細胞マーカー発現を検出するステップを含み、幹細胞マーカー発現は、患者のネイティブ腎臓再生の予後徴候となる。一部の実施形態では、対照検体（または制御基準値）に比べて、患者の生物試料中の増加した幹細胞マーカー発現は、対象における再生に対する予後徴候となる。一部の実施形態では、対照検体（または制御基準値）に比べて、患者検体中の減少した幹細胞マーカー発現は、対象における再生に対する予後徴候となる。患者検体は、生検を含む試験検体であってもよい。患者検体は、体液、例えば、血液または尿であってもよい。
【０１３２】
もう一つの態様では、本発明は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の対象への投与または移植後のネイティブ腎臓の再生のモニタリングを使った非侵襲的方法による予後予測方法を提供する。組織生検の代替として、処置を受けている対象の再生結果は、体液、例えば、尿の検査から評価できる。対象由来尿ソースから採取した微小胞は、限定されないが、特異的タンパク質および本発明の細胞集団による処置により影響を受けた腎臓細胞集団から最終的に誘導されるｍｉＲＮＡ等の特定の成分を含むことが明らかになった。これらの成分は、幹細胞複製および分化、アポトーシス、炎症ならびに免疫調節に関与する因子を含んでもよい。微小胞関連ｍｉＲＮＡ／タンパク質発現パターンの経時的分析は、本発明の細胞集団、混合物、または構築物を受けている対象の腎臓内の再生結果の連続モニタリングを可能とする。実施例１７は、対象の尿の分析用の代表的プロトコルについて記載する。
【０１３３】
これらの対象の腎臓由来小胞および／または腎臓由来小胞の尿中流入内腔含有物は、再生結果を示すバイオマーカーにより分析してもよい。
【０１３４】
一実施形態では、本発明は、腎疾患（ＫＤ）患者が治療薬による処置に反応するかどうかを評価する方法を提供する。方法は、対照検体中の小胞の量と比較またはそれに対して、治療薬で処置したＫＤ患者由来の試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量の測定または検出するステップ、を含むことができ、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、より高いまたはより低い試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量は、処置患者の治療薬による処置に対する反応性を示す。
【０１３５】
また、本発明は、ＫＤ患者の治療薬による処置の効力のモニタリング方法を提供する。一実施形態では、方法は、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比べて、またはそれに対して、治療薬で処置したＫＤ患者由来の試験検体中の小胞の量を測定または検出するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量に比較して、より高いまたはより低い試験検体中の小胞またはその内腔含有物の量は、ＫＤ患者における治療薬による処置の効力の指標となる。
【０１３６】
本発明は、また、患者亜集団中の腎疾患（ＫＤ）の処置に対し治療効果のある試薬を特定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、試薬の効力と、対照検体由来の検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較した、患者亜集団由来の検体中の小胞の量の存在の間の相関を判定するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、患者亜集団由来検体中のより高いまたはより低い小胞またはその内腔含有物の量は、試薬が患者亜集団中のＫＤを処置するのに有効であるという指標となる。
【０１３７】
本発明は、試薬が腎疾患（ＫＤ）の処置に有効である患者亜集団を特定する方法を提供する。一実施形態では、方法は、試薬の効力と、対照検体由来の検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較した、患者亜集団由来の検体中の小胞の量の存在の間の相関を判定するステップを含み、対照検体中の小胞またはその内腔含有物の量と比較して、患者亜集団由来検体中のより高いまたはより低い小胞またはその内腔含有物の量は、試薬が患者亜集団中のＫＤを処置するのに有効であるという指標となる。
【０１３８】
測定または検出ステップは、試験検体中に存在する可能性のあるｍｉＲＮＡまたは他の分泌産物の量を分析することを含んでもよい（実施例１７参照）。
【０１３９】
非侵襲的予後推定方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の投与または移植前および／または後の対象由来尿検体を採取するステップを含んでもよい。小胞および他の分泌産物は、望ましくない壊死組織片を除去する遠心分離（これに限定されない）を含む標準的な方法を使って尿検体から単離できる（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．７４（５）：６１３−６２１；Ｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．米国特許公開第２０１１００５３１５７号：これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１４０】
本発明は、処置後の対象の再生結果を検出する非侵襲的方法に関する。方法は、処置対象由来の尿中の小胞またはその内腔含有物の検出を含む。内腔含有物は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡであってもよい。個別の組み合わせまたはパネルｍｉＲＮＡの検出は、このような予後推測方法に対し適切である可能性がある。代表的組み合わせには、次記の内の２つ以上の組み合わせが含まれる：ｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−１９５；ｍｉＲ−８７１；ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ；ｍｉＲ−１９ｂ；ｍｉＲ−９９ａ；ｍｉＲ−４２９；ｌｅｔ−７ｆ；ｍｉＲ−２００ａ；ｍｉＲ−３２４−５ｐ；ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ；およびこれらの任意の組み合わせ。一実施形態では、ｍｉＲＮＡの組み合わせには、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、またはそれ超の個別ｍｉＲＮＡを含んでもよい。当業者なら、他のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの組み合わせでも、このような予後推測方法の使用に適する可能性があることを解るであろう。さらなるｍｉＲＮＡのソースには、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇのｍｉＲＢａｓｅが含まれ、これは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている。
【０１４１】
当業者なら、この再生を検出する予後予測方法は、本明細書記載の細胞集団および構築物とは別に、当技術分野で既知の他の治療薬で処置された対象に適する可能性があることを解るであろう。
【０１４２】
一部の実施形態では、測定ステップは、（ｉ）試験検体および対照中のマーカー発現（または小胞／小胞含有物）の差異レベルの測定；および／または（ｉｉ）試験検体および対照中のマーカー発現の差異レベルの測定から得たデータの解析の目的のために、適切なプロセッサにより実行されるソフトウェアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェアおよびプロセッサは、当技術分野でよく知られており、市販品として利用可能である。プログラムは、有形的表現媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードディスク、ＤＶＤ、またはプロセッサに付属のメモリーに保存されたソフトウェア中に組み込まれてもよいが、当業者なら、全体プログラムまたはその一部は、プロセッサ以外の装置、および／またはファームウェア中に組み込まれた装置および／または専用ハードウェアを使って、よく知られた方法で、代替法として実行できることが容易に解るであろう。
【０１４３】
測定ステップ後、測定結果、所見、診断、予測および／または処置提案が、通常記録され、例えば、技師、医師および／または患者に連絡される。特定の実施形態では、コンピュータを使って、このよう情報を関係者、例えば、患者および／または主治医に連絡する。一部の実施形態では、診断結果が連絡される国または管轄区域とは異なる国または管轄区域で、アッセイが行われるか、またはアッセイ結果が解析される。
【０１４４】
好ましい実施形態では、マーカー発現レベルの差異を有する試験対象で測定されたマーカー発現のレベルに基づく予後、予測、および／または処置提案は、アッセイの完了および予後および／または予測生成後すぐに対象に連絡される。結果および／または関連情報は、対象の処置医師により対象に連絡してもよい。あるいは、結果は、文書、電子形式通信、例えば、電子メール、または電話、等の任意の連絡手段で試験対象に直接連絡してもよい。連絡は、例えば、電子メールコミュニケーションの場合のように、コンピュータを使って円滑化してもよい。特定の実施形態では、電気通信の専門家にはよく知られているコンピュータハードとソフトの組み合わせを使って、予後徴候試験結果および／または試験から得た結論および／または処置提案を含む連絡が自動的に生成され、対象に送付される。健康管理指向コミュニケーション系の一例が、米国特許第６，２８３，７６１号に記載されている。しかし、本発明は、この特定のコミュニケーション系を使う方法に限定されない。本発明の方法の特定の実施形態では、検体のアッセイ、再生の予後および／または予測、ならびにアッセイ結果または予後の連絡を含む全てまたは一部の方法のステップは、多様な（例えば、外国の）管轄区域で行うことができる。
【０１４５】
別の態様では、本明細書記載の予後予測方法は、移植または投与による再生の成功に関する情報を関係者に提供する。
【０１４６】
全ての実施形態では、本明細書記載の処置を必要としている対象に再生腎臓を提供する方法には、上述の移植後の再生予後評価のステップを含んでもよい。
【０１４７】
投与方法と経路
本発明の細胞調製物および／または構築物は、単独または他の生理活性成分と組み合わせて投与できる。
【０１４８】
本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団の治療有効量は、対象により安全に受け入れられる最大細胞数から、腎疾患の、例えば、安定化、減少率低下、または１つまたは複数の腎臓機能の改善に必要な最小細胞数の範囲にわたりうる。特定の実施形態では、本発明の方法では、本明細書記載の腎臓細胞集団または腎臓細胞の混合物集団を次の量で投与する：約１０，０００細胞／ｋｇ、約２０，０００細胞／ｋｇ、約３０，０００細胞／ｋｇ、約４０，０００細胞／ｋｇ、約５０，０００細胞／ｋｇ、約１００，０００細胞／ｋｇ、約２００，０００細胞／ｋｇ、約３００，０００細胞／ｋｇ、約４００，０００細胞／ｋｇ、約５００，０００細胞／ｋｇ、約６００，０００細胞／ｋｇ、約７００，０００細胞／ｋｇ、約８００，０００細胞／ｋｇ、約９００，０００細胞／ｋｇ、約１．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約１．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約２．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．１ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４．９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または約５ｘ１０６細胞／ｋｇ。別の実施形態では、対象に対する細胞の投与量は、単回投与量でも、単回投与量プラス追加の投与量であってもよい。他の実施形態では、投与量は、本明細書記載の構築物として提供されてもよい。他の実施形態では、対象に対する細胞の投与量は、推定腎臓量または機能的腎臓量に基づいて計算してもよい。
【０１４９】
本明細書記載の腎臓細胞集団またはその混合物の治療有効量は、薬学的に許容可能なキャリアーまたは賦形剤中に懸濁できる。このようなキャリアーには、限定されないが、基本培地プラス１％血清アルブミン、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、コラーゲン、アルギナート、ヒアルロン酸、フィブリン接着剤、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロースおよびこれらの組み合わせ、が含まれる。製剤は、投与方法に適合させなければならない。従って、本発明は、対象の腎疾患の処置用薬物の製造のための、単独のまたはＢ３および／またはＢ４またはＢ４’細胞集団と混合した腎臓細胞集団またはその混合物、例えば、Ｂ２細胞集団の使用を提供する。一部の実施形態では、薬物は、組換え型ポリペプチド、例えば、増殖因子、ケモカインまたはサイトカインをさらに含む。さらなる実施形態では、薬物は、ヒト腎臓由来細胞集団を含む。薬物製造に使われる細胞は、本明細書記載の方法として提供されたいずれかの変形方法を使って単離、誘導、富化できる。
【０１５０】
腎臓細胞調製物もしくはその混合物、または組成物は、ヒトに適合された医薬組成物として、常法により処方される。通常、静脈内投与、動脈内投与または腎被膜内投与用組成物は、例えば、無菌等張性水性緩衝液中の溶液である。また、必要に応じ、組成物は、注射部位での起こりうる疼痛を改善するために局所麻酔剤を含んでもよい。一般的に、成分は、別々に、または混合して一緒に、単位剤形、例えば、気密シール容器、例えば、活性試薬の量を表示したアンプル、に入れた凍結保存濃縮製剤として供給される。組成物が注入により投与される場合は、無菌の医薬品グレード水または食塩水を含む注入ボトルに分注できる。組成物が注射により投与される場合は、注射用無菌水または食塩水のアンプルが用意され、投与の前に成分を混合できる。
【０１５１】
薬学的に許容可能なキャリアーは、一部は、特定の投与組成物、ならびに組成物の投与に使われる特定の方法により規定される。従って、多種多様の適切な医薬組成物製剤が存在する（例えば、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、以前のレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｔｈ  ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２００３、を参照のこと。この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。医薬組成物は、一般的に、無菌で、実質的に等張性として処方され、米国食品医薬品局の医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＭＰ））に完全に準拠している。
【０１５２】
本発明の一態様は、本発明の腎臓細胞調製物、例えば、単独の、またはＢ３および／またはＢ４またはＢ４’細胞調製物と組み合わせたＢ２細胞調製物、および薬学的に許容可能なキャリアーを含む医薬製剤をさらに提供する。一部の実施形態では、製剤は、１０４〜１０９の哺乳類腎臓由来細胞を含む。
【０１５３】
一態様では、本発明は、本明細書記載の１つまたは複数の、混合物を含む細胞集団を、必要としている対象に与える方法を提供する。一実施形態では、細胞集団のソースは、自己または同種異系、同種同系（自家遺伝子系または同系遺伝子系）、およびそれらの任意の組み合わせでよい。ソースが自己でない場合、方法には、免疫抑制剤の投与を含んでもよい。適切な免疫抑制剤には、限定されないが、アザチオプリン、シクロホスファミド、ミゾリビン、シクロスポリン、タクロリムス水和物、クロランブシル、ロベンザリット二ナトリウム、オーラノフィン、アルプロスタジル、グスペリムス塩酸塩、ビオシンソルブ、ムロモナブ、アレファセプト、ペントスタチン、ダクリズマブ、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、レフロノミド、バシリキシマブ、ドルナーゼα、ビンダリド、クラドリビン、ピメクロリムス、イロデカキン、セデリズマブ、エファリズマブ、エベロリムス、アニスペリムス、ガビリモマブ、ファラリモマブ、クロファラビン、ラパマイシン、シプリズマブ、サイレイト、ＬＤＰ−０３、ＣＤ４、ＳＲ−４３５５１、ＳＫ＆Ｆ−１０６６１５、ＩＤＥＣ−１１４、ＩＤＥＣ−１３１、ＦＴＹ−７２０、ＴＳＫ−２０４、ＬＦ−０８０２９９、Ａ−８６２８１、Ａ−８０２７１５、ＧＶＨ−３１３、ＨＭＲ−１２７９、ＺＤ−７３４９、ＩＰＬ−４２３３２３、ＣＢＰ−１０１１、ＭＴ−１３４５、ＣＮＩ−１４９３、ＣＢＰ−２０１１、Ｊ−６９５、ＬＪＰ−９２０、Ｌ−７３２５３１、ＡＢＸ−ＲＢ２、ＡＰ−１９０３、ＩＤＰＳ、ＢＭＳ−２０５８２０、ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４−１ｇ、ＥＲ−４９８９０、ＥＲ−３８９２５、ＩＳＡｔｘ−２４７、ＲＤＰ−５８、ＰＮＵ−１５６８０４、ＬＪＰ−１０８２、ＴＭＣ−９５Ａ、ＴＶ−４７１０、ＰＴＲ−２６２−ＭＧ、およびＡＧＩ−１０９６（米国特許第７，５６３，８２２号参照）が含まれる。当業者なら、他の適切な免疫抑制剤を解るであろう。
【０１５４】
この発明の処置方法は、単離腎臓細胞集団、またはその混合物を個体に送達することを含む。一実施形態では、恩恵を意図する部位への細胞の直接投与が好ましい。一実施形態では、本発明の細胞調製物、またはその混合物は、送達媒体を用いて個体に送達される。
【０１５５】
治療を必要としている対象は、また、ネイティブ腎臓を、１つまたは複数の富化腎臓細胞集団および／または前記を含む混合物または構築物から分泌された産物とインビボで接触させることにより、処置可能である。ネイティブ腎臓を、インビボで分泌産物と接触させるステップは、細胞培地、例えば、馴化培地由来の分泌産物の集団の使用／投与、または富化細胞集団、および混合物、または産物をインビボで分泌できる構築物の移植により実現可能である。インビボ接触ステップは、ネイティブ腎臓に対し再生効果を与える。
【０１５６】
本明細書を考慮すると、細胞および／または分泌産物を対象に投与する種々の手段は、当業者には明らかであろう。このような方法には、対象標的部位への細胞の注射が含まれる。細胞および／または分泌産物は、送達装置または媒体中に装填でき、対象への注射または移植による導入が促進される。特定の実施形態では、送達媒体には、天然の物質を含んでもよい。他の特定の実施形態では、送達媒体には、合成物質を含んでもよい。一実施形態では、送達媒体は、器官の構造を模倣する、またはそれにうまく適合する構造を与える。他の実施形態では、送達媒体は、体液様の性質である。このような送達装置には、細胞と液体をレシピエント対象の身体の中に注入するためのチューブ、例えば、カテーテル、を含んでもよい。好ましい実施形態では、チューブは、針、例えば、シリンジをさらに有し、本発明の細胞がそれを通って対象の目的部位に導入されうる。一部の実施形態では、哺乳類腎臓由来細胞集団は、カテーテル経由で血管に投与されるように処方される（用語の「カテーテル」は、物質を血管に送達するための様々なチューブ様系のいずれかを含むことを意味する）。あるいは、細胞を、生体材料または足場中または上に挿入でき、生体材料または足場には、限定されないが、織物、例えば、敷布、ニット、ブレード、メッシュ、および不織布、有孔フィルム、スポンジおよび発泡体、ならびにビーズ、例えば、中実または多孔性ビーズ、微粒子、ナノ粒子、等（例えば、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓゼラチンビーズ−Ｓｉｇｍａ）が含まれる。細胞は、種々の異なる形で送達用に調製できる。例えば、細胞は、溶液またはゲル中に懸濁できる。細胞は、本発明の細胞が生存可能な、薬学的に許容可能なキャリアーまたは希釈剤と混合できる。薬学的に許容可能なキャリアーおよび希釈剤には、食塩水、水性緩衝液、溶剤および／または分散媒が含まれる。このようなキャリアーおよび希釈剤の使用は、当技術分野でよく知られている。溶液は、無菌の液体が好ましく、また、等張性であることが多い。溶液は、製造と貯蔵条件下で安定であり、また、微生物、例えば、細菌や真菌の汚染作用に対し、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等の使用により、保護されていることが好ましい。当業者なら、本発明の細胞集団およびその混合物の送達に使われる送達媒体は、上述の特性の組み合わせを含んでもよいことを解るであろう。
【０１５７】
単離された腎臓細胞集団、例えば、単独またはＢ４’および／またはＢ３と混合したＢ２細胞集団の投与方式には、限定されないが、全身性、腎臓内（例えば、実質）、静脈内または動脈内注射および目的作用部位の組織への直接注射、が含まれる。さらなる投与方式には、直接開腹手術経由の、直接腹腔鏡検査経由の、経腹腔的、または経皮的単回または複数回の注射が含まれる。また本発明で使われるさらなる投与方式には、例えば、逆行注入および腎盂尿管注入が含まれる。外科的投与手段には、一段手術、例えば、限定されないが、腎部分摘出術および構築物移植、腎部分摘出術、腎盂部分切除術、網±腹膜による血管新生、注射筒に取り付ける円錐形状または角錐形状の多源性生検注射痕、および、腎臓柱状置換、ならびに、例えば、再移植のためのオルガノイド内部バイオリアクター等の２段手術、が含まれる。一実施形態では、細胞の混合物は、同じ経路で、同じ時間に送達される。別の実施形態では、制御された混合物を含むそれぞれの細胞組成物は、別々に特異的部位に送達されるか、または特異的方法を経由して、同時にまたは時間経過制御方式で、１つまたは複数の本明細書記載の方法により、送達される。
【０１５８】
ヒトの適切な細胞移植投与量は、細胞の活性、例えば、ＥＰＯ産生、に関連する既存情報、または前臨床の試験で行った投薬試験から推定した情報から決定できる。インビトロ培養およびインビボ動物実験から、細胞の量が定量化でき、適切な移植材料投与量の計算に使用できる。従って、患者をモニターし、追加の移植ができるか、または移植材料をそれに応じて減らすことができるかどうかを決定できる。
【０１５９】
１つまたは複数の選択細胞外のマトリックス成分、例えば、１つまたは複数の当技術分野で既知の型のコラーゲンまたはヒアルロン酸、および／または増殖因子、多血小板血漿および薬剤等の他の成分を本発明の細胞集団およびその混合物に添加できる。
【０１６０】
当業者なら、本明細書記載の分泌産物に適した種々の処方および投与方法が解るであろう。
【０１６１】
キット
本発明は、本発明のポリマーマトリックスおよび足場および関連材料、および／または細胞培地および使用説明書を含むキットをさらに含む。使用説明書は、例えば、細胞の培養または細胞および／または細胞産物の投与に関するインストラクションを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、本明細書記載の足場およびインストラクションを含むキットを提供する。さらに別の実施形態では、キットは、マーカー発現検出用試薬、薬剤を使用するための試薬、および使用説明書を含む。このキットは、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物の移植または投与後の対象のネイティブ腎臓の再生予後の測定のために使うことができる。キットは、また、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物のバイオセラピューティック効力の測定に使用可能である。
【０１６２】
報告書
本発明の方法では、商業目的で実施する場合、一般的に、再生予後の報告書または要約を作成する。本発明の方法は、本明細書記載の細胞集団、混合物、または構築物のいずれかの投与または移植の前と後の可能なコースまたは再生結果の予測を含む報告を作成することになる。この報告は、予後に関連するいずれかの指標の情報を含んでもよい。本発明の方法および報告は、データベースに報告を保存することもさらに含んでもよい。あるいは、方法は、対象に対するデータベースに記録をさらに作成することができ、記録にデータを呼び込むことができる。一実施形態では、報告は、文書による報告書であり、別の実施形態では、報告は、聴覚による報告であり、別の実施形態では、報告は電子記録である。報告は、医師および／または患者に提供されることが意図されている。報告の受領は、データおよび報告を含むサーバーコンピュータにネットワーク連結を確立すること、およびサーバーコンピュータからデータおよび報告を要求することをさらに含む。本発明により提供される方法は、また、全体または一部が自動化されてもよい。
【０１６３】
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、および文献の参照は、参照によってその全体が組み込まれる。
【０１６４】
以下の実施例は、説明の目的のみのために提供されており、本発明の範囲を限定する意図は全くない。
【実施例】
【０１６５】
実施例１−生物学的応答性腎臓細胞の単離およびキャラクタリゼーション
成体雄ブタ（イノシシ）の貧血を伴う特発性進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）の症例から、同年齢の正常なブタ腎臓組織と直接比較して細胞組成物の評価とキャラクタリゼーションを行うための、新鮮な腎臓患部組織が提供された。採取時間での腎臓組織の組織学的検査により、重篤なびまん性慢性間質性線維症および多巣性線維形成を伴う半月体形成性糸球体腎炎を特徴とする腎疾患であると確認された。臨床化学により、高窒素血症（血中尿素窒素および血清クレアチニンの上昇）、および軽度の貧血（ヘマトクリットの軽度の減少および低下したヘモグロビンレベル）である事が確認された。病気および正常の両方の腎臓組織由来の細胞が単離され、増殖されて、特性が明らかにされた。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図１に示されるように、ゴモリのトリクローム染色により正常な腎臓組織に比較して腎臓患部組織中の線維形成が強調される（矢印で示す青色染色）。キュビリン：メガリンを発現し、受容体媒介アルブミン輸送ができる機能性尿細管細胞が、正常および病気両方の腎臓組織から増殖する。エリスロポエチン（ＥＰＯ）発現細胞は、また、培養物中に存在し、複数の継代中保持され、冷凍／解凍サイクルを受ける。さらに、分子分析により、正常および患部組織の両方由来のＥＰＯ発現細胞は、インビトロの低酸素性の条件に応答し、ＥＰＯおよびｖＥＧＦ等の他の低酸素調節遺伝子標的のＨＩＦ１α駆動型誘導が起こる。細胞は、コラゲナーゼ＋ディスパーゼの酵素消化によりブタ腎臓組織から単離され、また、単純な機械的消化および外植片培養を行うことにより、別の実験でも単離された。継代２で、ＥＰＯ発現細胞含有外植片由来細胞培養を大気（２１％）および可変の低酸素性（＜５％）培養の両方の条件に供し、低酸素への暴露が、ＥＰＯ遺伝子発現の上昇発現の結果をもたらすのかどうかを判定する。げっ歯類培養で述べるように（実施例３を参照）、正常なブタは、酸素依存性発現およびＥＰＯ遺伝子調節を示した。驚くべきことに、ＣＫＤブタの尿毒性／貧血状態（ヘマトクリット＜３４、クレアチニン＞９．０）にもかかわらず、ＥＰＯ発現細胞は、容易に単離され、組織から増殖し、ＥＰＯ遺伝子の発現は、低酸素に調節されたままであった（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開
第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図２に示すように）。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図３に示すように、増殖培養物中の細胞は、尿細管様構造へと自己組織化する能力を示した。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図４に示すように、培養細胞によるＦＩＴＣ複合化アルブミンの受容体媒介取込を観察することにより、培養物（継代３の）中の機能的尿細管細胞の存在が確認された。緑色ドット（細い白色の矢で示す）は、取り込まれたフルオレセイン複合化アルブミンを表し、これは、尿細管細胞特異的受容体、メガリンとキュビリンにより媒介され、機能的尿細管細胞によるタンパク質の再吸収を示す。青色染色（細い白色の矢で示す）は、Ｈｏｅｓｃｈｔ染色した核である。まとめると、これらのデータは、機能的尿細管および内分泌細胞は、ＣＫＤに激しく侵されている腎臓組織であっても、ブタ腎臓組織から単離、増殖できることを示唆している。さらに、これらの知見は、ＣＫＤの処置に対する自己細胞ベースの治療薬の進展を支援する。
【０１６６】
さらに、ＥＰＯ産生細胞は、正常なヒト成人腎臓から酵素を使って単離された（上述の実施例１のように）。単離手続きにより、初期組織の場合よりも、単離後、比較的多くのＥＰＯ発現がもたらされた。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６に示すように、培養中にヒトＥＰＯ産生細胞を維持し、ＥＰＯ遺伝子発現を保持することが可能である。ヒト細胞を組織培養物処置プレーンプラスチックまたは一部の細胞外のマトリックス、例えば、フィブロネクチンまたはコラーゲンコートプラスチック上で培養／増殖し、全てのものが経時ＥＰＯ発現を裏付けることが明らかになった。
【０１６７】
実施例２−特定生理活性腎臓細胞の単離および富化
腎臓細胞単離：簡単に述べると、１０、２週齢雄Ｌｅｗｉｓラット腎臓のバッチを市販品納入業者（Ｈｉｌｌｔｏｐ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｉｎｃ．）から入手し、約４℃のＶｉａｓｐａｎ保存培地中に入れ一晩輸送した。本明細書記載の全ステップは、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）中で行い、無菌を保った。腎臓を、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄してＶｉａｓｐａｎ保存培地を洗い流した。３回目の洗浄後、残っている腎臓カプセル剤、ならびに残っている全ての間質組織が除去された。また、主要腎杯を顕微解剖技術を使って取り出した。次に、腎臓を無菌のメスを使って細かく分割してスラリーにした。その後、スラリーを５０ｍｌの遠心分離機のコニカルチューブに移し、秤量した。小検体をＲＮＡ分析用に集め、無菌の無ＲＮアーゼ１．５ｍｌ微量遠心分離機チューブ中に入れ、液体窒素中で急速凍結した。凍結するとすぐに、−８０℃フリーザーに移し、分析まで保存した。１０個の若齢腎臓の組織重量は、約１グラムに相当する。バッチの重量に基づいて、消化培地を、１グラムの組織当たり２０ｍｌの消化培地になるように調節した。この手続き用消化緩衝液には、４ユニットのＨＢＳＳ中ディスパーゼ１（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２（シグマ）含有３００Ｕｎｉｔｓ／ｍｌのコラゲナーゼタイプＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を含めた。
【０１６８】
適切な容量の予熱した消化緩衝液をチューブに添加し、シールして、３７℃のインキュベーター中のロッカーに２０分間入れた。この第１消化ステップは、多くの赤血球を除き、残っている組織の消化を高める。２０分後、チューブを取り出し、ＢＳＣ中に入れた。組織をチューブの底に静置し、次に、上清を取り出した。残っている組織に、出発容量と等量の新しい消化緩衝液を補充した。追加の３０分間、３７℃インキュベーター中のロッカーにチューブを再度入れた。
【０１６９】
３０分後、消化混合物を７０μｍセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使って等容量の中和緩衝液中に分注し（ＤＭＥＭｗ／１０％ＦＢＳ）、消化反応を停止させた。その後、細胞懸濁液を３００ｘｇの遠心分離により５分間洗浄した。遠心分離後、ペレットをＫＳＦＭ培地に再懸濁し、トリパンブルー色素排除を使った細胞計数および生存率評価用に検体を採取した。細胞数を計算するとすぐに、百万個の細胞をＲＮＡ分析用に集め、ＰＢＳで洗浄し、急速液体窒素中で凍結した。残った細胞懸濁液をＫＳＦＭ培地で５０ｍｌにして、再度３００ｘｇの遠心分離により５分間洗浄した。洗浄後、ＫＳＦＭ  １ｍｌ当たり１千５百万細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁した。
【０１７０】
次に、５ｍｌの腎臓細胞懸濁液を１５ｍｌ遠心分離機コニカルチューブ（ＢＤＦａｌｃｏｎ）中の５ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に添加し、６回反転により混合した。これにより、１５％（ｗ／ｖ）のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の最終混合物が形成された。反転後、チューブを１ｍＬ  ＰＢＳで注意深く層状化した。チューブをブレーキなしで、８００ｘｇで１５分間遠心分離した。遠心分離後、チューブを取り出し、混合勾配の先端に細胞バンドを形成した。また、赤血球、死細胞、および少しの小さな顆粒状の少ない細胞、少しのＥＰＯ産生細胞、少しの尿細管細胞、および少しの内皮細胞、等の小集団の生細胞を含むペレットも存在した。バンドを、ピペットで注意深く取り出し、別の１５ｍｌコニカルチューブに移した。吸引により勾配培地を取り出し、ペレットを１ｍｌのＫＳＦＭ中へ再懸濁した。次に、バンド細胞およびペレット細胞を再度組み合わせて、ＫＳＦＭを使って少なくともの集めたバンド容量の３倍の希釈度にして再懸濁し、３００ｘｇの遠心分離で５分間洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭに再懸濁し、細胞計数用検体を集めた。トリパンブルー色素排除を使った細胞数の計数が終わるとすぐ、ＲＮＡ検体として百万個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。
【０１７１】
密度勾配分離を使って特定の生理活性腎臓細胞の生存率と培養能力を高めるための前培養「精製（Ｃｌｅａｎ−ｕｐ）」：不純物のない、生存可能な培養用細胞集団を得るために、「腎臓細胞単離」で上述のように、最初に細胞懸濁液を生成した。随意選択ステップとして、および初期調製物を精製する手段として、無菌の等張性緩衝液中に懸濁させた１億個もの全体細胞を、ストックの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノール（従って、最終的に１５％ｗ／ｖ  Ｏｐｔｉｐｒｅｐ溶液が得られる）から室温で調製した等容量の３０％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）で完全に１：１とし、６回の反転により完全に混ぜ合わせる。混合後、１ｍｌのＰＢＳ緩衝液を混合細胞懸濁液の上端に注意深く層状に加えた。その後、勾配チューブを注意深く遠心分離機に装填し、適性バランスを確保した。勾配チューブを８００ｘｇ、２５℃で１５分間、ブレーキなしで遠心分離した。精製細胞集団（生存可能で、かつ機能的集合管、尿細管、内分泌、糸球体、および血管細胞を含む）は、１．０２５〜１．０４５ｇ／ｍＬの間の密度に対応する６％と８％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）の間に分配された。他の細胞および壊死組織片は、チューブの底部にペレット化された。
【０１７２】
腎臓細胞培養：１つにまとめた細胞バンドとペレットを、次に、ＤＭＥＭ（高ブドウ糖）／｛５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、２．５μｇＥＧＦ、２５ｍｇＢＰＥ、抗生物質／抗真菌剤を含む１ＸＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地補助剤）を含むＫＳＦＭ｝の５０：５０混合物１５０ｍｌ中に３０、０００細胞／ｃｍ２の細胞濃度で、組織培養物処理トリプルフラスコ（Ｎｕｎｃ  Ｔ５００）または等価物中に播種した。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中で２〜３日培養し、２１％大気酸素レベルを細胞に与えた。２日後、培地を交換し、培養物をＣＯ２／窒素ガスマルチガス加湿インキュベーター（Ｓａｎｙｏ）から提供された２％酸素レベル環境中に２４時間置いた。２４時間のインキュベーション後、細胞を６０ｍｌの１Ｘ  ＰＢＳで洗浄し、４０ｍｌの０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で取り出した。取り出しに際し、細胞懸濁液を等容量の１０％ＦＢＳ含有ＫＳＦＭで中和した。その後、細胞を３００ｘｇの遠心分離で１０分間洗浄した。洗浄後、細胞を２０ｍｌのＫＳＦＭ中に再懸濁し、５０ｍｌコニカルチューブに移して、細胞計数用検体を集めた。生存可能な細胞数がトリパンブルー色素排除を使って決定されるとすぐに、ＲＮＡ検体として百万個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後、液体窒素中で急速凍結した。細胞をＰＢＳで再度洗浄し、３００ｘｇの遠心分離で５分間、集めた。洗浄した細胞ペレットをＫＳＦＭ中に３千７百５０万細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１７３】
密度ステップ勾配分離を使った特定の生理活性腎臓細胞の富化：、主に腎臓尿細管細胞からなるが、他の細胞型（集合管、糸球体、血管、および内分泌細胞）小亜集団を含む培養腎臓細胞を、複数の濃度ｗ／ｖのイオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から作られた密度ステップ勾配を使って、それらの成分亜集団に分離した。採取前に、培養物を低酸素性環境中に２４時間まで置き、勾配にかけた。無菌の１５ｍＬコニカルチューブ中で４つの異なる密度の培地を相互の上端の上に層状に導入することによりステップ勾配を形成し、最高密度の溶液を底部に配置し、最低密度溶液を上端に層状に導入した。細胞をステップ勾配の上端に加え、遠心分離し、これにより、集団をサイズと粒状性に基づき複数のバンドに分離させる結果を得た。
【０１７４】
簡単に述べると、ＫＦＳＭ培地を希釈剤として使用して、７、１１、１３、および１６％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）（６０％ｗ／ｖイオジキサノール）の密度を作った。例えば、５０ｍｌの７％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）に対し、５．８３ｍｌのストック６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノールを４４．１７ｍｌのＫＳＦＭ培地に添加し、反転により良く混合した。無菌の毛細血管に連結した無菌のＬ／Ｓ  １６タイゴンチューブを備えたぜん動ポンプ（Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｌｅｘ  Ｌ／Ｓ）を、２ｍｌ／分の流量に設定し、２ｍＬの各４つの溶液を、最初に１６％溶液、続いて１３％溶液、１１％溶液、そして７％溶液の順に、無菌のコニカル１５ｍＬチューブに加えた。最後に、７千５百万個の培養げっ歯類腎臓細胞含有２ｍＬ細胞懸濁液をステップ勾配の頂上に加えた（上述の「腎臓細胞培養」にあるようにして懸濁液が生成された）。重要なのは、ポンプが勾配溶液をチューブに送り始めると、液体が４５°の角度でチューブの側面をゆっくり流れ落ちるようにして、適正な界面が各勾配の層の間に確実に形成されるように注意することである。細胞を負荷されたステップ勾配は、次に、８００ｘｇで２０分間、ブレーキなしで遠心分離にかけられる。遠心分離後、チューブを各界面を乱さないように注意深く取り出した。５つの異なる細胞画分が得られた（４バンドおよびペレット）（Ｂ１〜Ｂ４、＋ペレット）（図１Ａ、左コニカルチューブ参照）。各画分を無菌のディスポーザブルバルブピペットまたは５ｍｌピペットを使って集め、表現型および機能性の観点から特徴付けした（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の実施例１０を参照）。げっ歯類腎臓細胞懸濁液をステップ勾配分画にかけると、尿細管細胞富化画分（および集合管由来の細胞を少し含む）は、１．０６２〜１．０８８ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培養後に密度勾配分離を行った場合、尿細管細胞富化画分（および集合管由来の細胞を少し含む）は、１．０５１〜１．０６２ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。同様に、単離直後に、げっ歯類腎臓細胞懸濁液がステップ勾配分画にかけられた場合、ＥＰＯ産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）富化画分は、１．０２５〜１．０３５ｇ／ｍＬの密度区分に分配された。対照的に、エクスビボ培
養後に、密度勾配分離を行った場合は、ＥＰＯ産生細胞、糸球体有足細胞、および血管細胞（「Ｂ４」）富化画分は、１．０７３〜１．０９１ｇ／ｍＬの密度の区分に分配された。重要なのは、培養物の低酸素性培養環境への暴露（約１時間〜約２４時間の間）により、培養後に細胞の「Ｂ２」および「Ｂ４」画分への分配が高められたことである（低酸素は、採取およびステップ勾配手続きの前で、２１％（大気）未満の酸素レベルとして定義される（バンド分布に対する低酸素効果についてのさらなる詳細は、実施例３で提供される））。
【０１７５】
各バンドを３ｘ容量のＫＳＦＭで希釈し、よく混合し、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより洗浄した。ペレットを２ｍｌのＫＳＦＭ中に再懸濁し、生存可能な細胞をトリパンブルー色素排除および血球計を使って計測した。百万個の細胞をＲＮＡ検体として集め、ＰＢＳで洗浄し、液体窒素中で急速凍結した。尿毒性および貧血雌ラットに対する移植調査のために、Ｂ２およびＢ４由来の細胞を使用した。これらのラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで２段ステップ５／６腎摘出術法により生成された。エリスロポエチンとｖＥＧＦの酸素調節発現、糸球体マーカーの発現（ネフリン、ポドシン）、および血管マーカーの発現（ＰＥＣＡＭ）を含むＢ４の特性は、定量リアルタイムＰＣＲにより確認された。「Ｂ２」画分の表現型は、Ｅ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、およびアクアポリン−２．の発現により確認された。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図４９ａと４９ｂを参照。
【０１７６】
従って、ステップ勾配戦略の使用は、ＥＰＯ産生細胞（Ｂ４）の希少な集団の富化のみでなく、機能的尿細管細胞（Ｂ２）が相対的に富化された画分を生成する手段も可能とする（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図５０と５１を参照）。ステップ勾配戦略は、また、ＥＰＯ産生および尿細管細胞の、赤血球、細胞壊死組織片、および他の潜在的に望ましくない細胞型、例えば、大きな細胞凝集物および特定の型の免疫細胞からの分離を可能とする。
【０１７７】
ステップ勾配手続きは、採用された特定の密度については、細胞成分の良好な分離を得るためにチューニングが必要な場合がある。好ましい勾配チューニング手法には、１）勾配の底の高密度（例えば、１６〜２１％Ｏｐｔｉｐｒｅｐ）から、勾配の上端の相対的に低密度（例えば、５〜１０％）までの連続的密度勾配を機能させることが含まれる。連続的勾配は、任意の標準的密度勾配溶液（フィコール、パーコール、ショ糖、イオジキサノール）を使って、標準的な方法（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ）に従って調製できる。対象の細胞を連続勾配に加え、８００ｘＧで２０分、ブレーキなしで遠心分離する。類似のサイズと粒度の細胞は、一緒に勾配中に分離する傾向があり、その結果、勾配の相対的位置が測定でき、さらに、その位置の溶液の比重も、測定できる。従って、その後で、特定条件下で密度勾配を全体にわたるその能力に基づいて、特定の細胞集団の単離に焦点を合わせた確定したステップ勾配を得ることができる。不健康−対−健康組織由来細胞を単離する場合、または、異なる種由来の特定細胞を単離する場合に、このような最適化が、採用される必要がありうる。例えば、最適化がイヌのおよびヒト両方の腎臓細胞培養物に対して行われ、ラットで同定された特異的Ｂ２およびＢ４亜集団を他の種から単離可能であることを確実にした。げっ歯類Ｂ２およびＢ４亜集団の単離用最適勾配は、７％、１１％、１３％、および１６％（ｗ／ｖ）Ｏｐｔｉｐｒｅｐから構成される。イヌのＢ２およびＢ４亜集団の単離用最適勾配は、７％、１０％、１１％、および１６％（ｗ／ｖ）から構成される。ヒトＢ２およびＢ４亜集団単離用最適勾配は、７％、９％、１１％、１６％（ｗ／ｖ）から構成される。この結果、培養げっ歯類、イヌ、およびヒト腎臓細胞のＢ２およびＢ４に対する局在化密度範囲は、表２．１に示される。
0005974215.tif 000002
【０１７８】
実施例３−勾配前の低酸素培養が、バンド分布、組成、および遺伝子発現に影響する
プロトタイプＢ２およびＢ４の分布および組成に与える酸素条件の効果を測定するために、勾配ステップの前に、異なる種由来の新規腎臓（ｎｅｏｋｉｄｎｅｙ）細胞調製物を種々の酸素条件に暴露した。ラット細胞単離および培養開始のための標準的手順を使って、上述のように、げっ歯類新規腎臓増強（ＮＫＡ）細胞調製物（ＲＫ０６９）を形成した。２１％（大気）酸素条件下で２〜３日間、全てのフラスコを培養した。培地を交換し、半分のフラスコを２％酸素に設定された酸素制御インキュベーターに再配置し、一方、残りのフラスコを追加の２４時間の間、２１％酸素条件に保持した。次に、上述の標準的な酵素による採取法を使って、各セットの条件から細胞を採取した。標準的手続きに従ってステップ勾配を調製し、「正常酸素圧」（２１％酸素）および「低酸素性の」（２％酸素）培養物を別々に採取し、並行してステップ勾配に適用した（図２）。両条件で４バンドおよびペレットが生成されたが、勾配全体の細胞の分布は、２１％と２％酸素培養バッチで異なっていた（表１）。特に、Ｂ２の収率は、低酸素で増加し、同時にＢ３が減少した。さらに、低酸素性培養細胞から生成された勾配中でＢ４特異的遺伝子（例えば、エリスロポエチン）の発現が増加した（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号の図７３を参照）。
【０１７９】
上述のように、イヌ細胞単離および培養に関する標準的手順（げっ歯類単離および培養手順に類似の）を使って、イヌのＮＫＡ細胞調製物（ＤＫ００８）を形成した。全てのフラスコを２１％（大気）酸素条件下で４日間培養した後、フラスコのサブセットを低酸素（２％）環境に２４時間移したが、一方、サブセットのフラスコを、２１％で維持した。続けて、各セットのフラスコから回収し、同じステップ勾配供した（図３）。ラットの結果（実施例１）と同様に、低酸素性培養イヌ細胞は、大気圧酸素培養イヌ細胞とは異なり、勾配全体に分配された（表３．１）。再度、Ｂ２の収率は、勾配の前の低酸素性暴露により増加し、同時にＢ３への分配は減少した。
0005974215.tif 000003
【０１８０】
上のデータは、勾配前の低酸素への暴露が、Ｂ２の成分ならびに特定の分化細胞（エリスロポエチン産生細胞、血管細胞、および糸球体細胞）のＢ４への分配を高めることを示す。従って、上述の低酸素性培養、それに続く密度勾配分離は、種全体にわたる「Ｂ２」と「Ｂ４」細胞集団の生成の有効な方法である。
【０１８１】
実施例４−ヒト腎臓からの尿細管／糸球体細胞の単離
全体にわたり記載されている酵素を使った単離方法により、正常なヒト腎臓組織から尿細管および糸球体細胞を単離し、増殖した。上述の勾配方法により、尿細管細胞画分を培養後、エクスビボで富化した。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６８に示すように、表現型特性は単離および増殖中、維持された。標識アルブミンの取込により評価された尿細管細胞機能は、また、繰り返された継代後も維持され、冷凍保存された。Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図６９は、尿細管富化および尿細管枯渇集団が３Ｄダイナミック培養により培養される場合、尿細管マーカー、カドヘリン発現の有意な増加が尿細管富化集団で認められた。このことにより、細胞が３Ｄダイナミック環境で培養される場合、尿細管細胞の富化が、初期の富化を越えて維持できることが確認される。
【０１８２】
実施例５−フローサイトメトリーによるＥＰＯ産生細胞のさらなる分離
上述の実施例２で記載の腎臓細胞の同じ培養集団をフローサイトメトリー分析に供し、前方散乱および側方散乱を調査した。小さくて、顆粒がより少ないＥＰＯ産生細胞集団は識別可能であり（８．１５％）、また、フローサイトメーターの選別能力を使って、小さくて、顆粒がより少ない集団のポジティブセレクションにより分離される（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図７０を参照））。
【０１８３】
実施例６−自己免疫糸球体腎炎患者検体から単離された腎臓細胞の未分画混合物のキャラクタリゼーション
腎臓細胞の未分画混合物を上述のように自己免疫性糸球体腎炎患者検体から単離した。腎臓組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。表６．１に示すように、ＨＫ２０は、自己免疫性糸球体腎炎患者検体である。表６．２は、ｑＲＴＰＣＲ測定の結果の基づき、ＨＫ２０から生成された細胞は、糸球体細胞が欠乏していることを示す。
【０１８４】
実施例７−巣状分節性糸球体硬化症の症例から単離された治療に適する腎臓生理活性細胞集団の遺伝的プロファイリング
腎臓組織から単離、増殖された腎臓細胞の特定亜集団の不偏の遺伝子型組成を決定するために、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑｒｔｐｃｒ）分析（Ｂｒｕｎｓｋｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）を採用し、細胞亜画分中の細胞型特異的および経路特異的遺伝子発現パターンの差異を特定した。糸球体の大部分が破壊されている巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）の症例由来の、ヒト調製物ＨＫ０２３をＢ４画分の糸球体細胞の存在に関し、採取時に評価した。簡単に述べると、未分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）、標準的生検方法を使って腎臓から採取した（４）コア生検をそれぞれ相互に独立に維持した。ＵＮＦＸエクスビボでの（２）継代後、細胞を採取し、密度勾配法（実施例８のように）に供し、げっ歯類、イヌ、および他のヒト検体で行った研究に基づいて、内分泌、血管、および糸球体細胞が富化されていると解っている亜画分Ｂ４を含む亜画分を生成した。
0005974215.tif 000004
0005974215.tif 000005
0005974215.tif 000006
0005974215.tif 000007
0005974215.tif 000008
【０１８５】
１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬの浮遊密度を有する細胞の異なるバンドと思われるＨＫ０２３の各独立ＵＮＦＸ検体からＢ４画分を別々に集めた。ＲＮＡを各検体から単離し、ポドシン（糸球体細胞マーカー）およびＰＥＣＡＭ（内皮細胞マーカー）の発現を定量リアルタイムＰＣＲにより調べた。重篤ＦＳＧＳの生検由来検体から予期されるように、画分中のポドシン（＋）糸球体細胞の存在に関し一貫性がなく、検体の２／４でポドシン検出不可であった。対照的に、ＰＥＣＡＭ＋血管細胞は、生検で惹起された培養物の４／４のＢ４画分で一貫して存在した。従って、Ｂ４画分は、重篤な疾患状態のヒト腎臓からの場合であっても、１．０６３〜１．０９１ｇ／ｍＬ密度範囲で単離できる。
0005974215.tif 000009
【０１８６】
さらに、表７．２に示すように、ヒト検体（ＨＫ０１８）は、密度勾配遠心分離後のｑＲＴＰＣＲでは、ポドシン（糸球体のマーカー）が検出されなかった。
0005974215.tif 000010
【０１８７】
実施例８−蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使った生存可能な腎臓細胞型の富化／枯渇
蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を使って、１つまたは複数の単離腎臓細胞を富化でき、および／または単離した１次腎臓組織から１つまたは複数の特定の腎臓細胞型を枯渇できる。
【０１８８】
試薬：７０％エタノール；洗浄緩衝液（ＰＢＳ）；５０：５０腎臓細胞培地（５０％ＤＭＥＭ（高グルコース））：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ；トリパンブルー０．４％；標的腎臓細胞集団、例えば、腎臓内皮細胞のためのＣＤ３１および腎臓糸球体細胞のためのネフリン、に対する一次抗体。対応するアイソタイプ特異的蛍光二次抗体；染色緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％ＢＳＡ）。
【０１８９】
方法：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を標準的手順で洗浄後、１次単離または培養細胞由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液をＴ５００Ｔ／Ｃ処理フラスコに取り出し、腎臓細胞培地に再懸濁させて、氷上に置く。次に、トリパンブルー色素排除法を使って細胞数と生存率を測定する。例えば、異種起源の集団からの糸球体細胞または内皮細胞の腎臓細胞富化／枯渇に対しては、１０〜５０ｅ６個の少なくとも７０％の生存率の生細胞を得る。腎臓細胞の異種起源の集団を、次に、出発濃度１μｇ／０．１ｍｌの染色緩衝液／１ｘ１０６細胞（必要に応じ力価）の、標的細胞型特異的一次抗体で染色した。標的抗体は、例えば、ＣＤ３１ＰＥ（腎臓内皮細胞特異的）と複合化できるが、例えば、ネフリン（腎臓糸球体細胞特異的）と複合化できない。
【０１９０】
その後、３０分間、光から保護された４℃の氷上で細胞を染色した。３０分のインキュベーション後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離して、洗浄した。次に、複合化アイソタイプ特異的二次抗体の必要性に応じ、ＰＢＳまたは染色緩衝液中にペレットを再懸濁した。細胞を蛍光色素複合化一次抗体で標識する場合は、１０ｅ７細胞当たり２ｍｌのＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ  ａｒｉａまたは等価な細胞選別機で処理する。細胞を蛍光色素複合化抗体で標識しない場合は、１μｇ／０．１ｍｌ／１ｅ６細胞の出発濃度のアイソタイプ特異的蛍光色素複合化二次抗体で細胞を標識する。
【０１９１】
次に、３０分間、光から保護された４℃の氷上で細胞を染色する。３０分のインキュベーション後、細胞を３００ｘｇで５分間遠心分離して、洗浄した。遠心分離後、ペレットを５ｅ６／ｍｌ（ＰＢＳ）の濃度でＰＢＳに再懸濁し、１２ｘ７５ｍｍ当たり４ｍｌを無菌のチューブに移す。
【０１９２】
ＦＡＣｓ  Ａｒｉａをメーカーのインストラクション（ＢＤＦＡＣｓ  Ａｒｉａユーザーマニュアル）に従って、生細胞無菌選別用に準備する。検体チューブをＦＡＣｓ  Ａｒｉａに装填し、データ取込開始後、ＰＭＴ電圧を調整する。ゲートを特定の波長を使った蛍光の強度により腎臓の特異的細胞型を選択するように設定する。別のゲートを、陰性集団を選択するように設定する。所望のゲートを陽性標的集団および陰性集団を包含するように設定するとすぐに、メーカーのインストラクションに従って、細胞が選別される。
【０１９３】
陽性の標的集団を、１つの１５ｍｌコニカルチューブの集め、陰性集団を１ｍｌの腎臓細胞培地を入れた別の１５ｍｌコニカルチューブに集める。収集後、各チューブからの検体を、フローサイトメトリーにより分析し、純度を測定する。集めた細胞を３００ｘｇで５分間の遠心分離により洗浄し、ペレットを腎臓細胞培地に再懸濁し、さらなる分析と実験に備える。
【０１９４】
実施例９−磁気細胞選別を使った腎臓細胞型の富化／枯渇
１つまたは複数の単離された腎臓細胞を富化でき、および／または１つまたは複数の特定の腎臓細胞型を単離１次腎臓組織から枯渇できる。
【０１９５】
試薬：７０％エタノール、洗浄緩衝液（ＰＢＳ）、５０：５０腎臓細胞培地（５０％ＤＭＥＭ（高グルコース））：５０％ケラチノサイト−ＳＦＭ、トリパンブルー０．４％、操作緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＢＳＡ）、リンス緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）、洗浄溶液（７０％ｖ／ｖエタノール）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＦＣＲブロッキング試薬、いずれかのＩｇＧアイソタイプに特異的なＭｉｌｔｅｎｙｉマイクロビーズ、標的抗体、例えば、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ）もしくはネフリン、または二次抗体。
【０１９６】
方法：生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）を標準的手順で洗浄後、１次単離または培養由来の腎臓細胞の単一細胞懸濁液を得て、腎臓細胞培地に再懸濁する。細胞数および生存率をトリパンブルー色素排除法により測定する。
【０１９７】
異種起源の集団から、例えば、糸球体細胞または内皮細胞腎臓細胞の富化／枯渇のためには、少なくとも７０％の生存率の少なくとも１０ｅ６〜４ｅ９個の生細胞が得られる。
【０１９８】
最良の分離を行える富化／枯渇手法は、対象標的細胞に基づいて決定される。１０％未満の標的出現頻度の細胞の富化、例えば、ネフリン抗体を使った糸球体細胞、に対しては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳのＰＯＳＳＥＬＤＳ（高感度モードのダブルポジティブ選択（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ））、または同等の計器プログラムが使われる。１０％超の標的出現頻度の細胞の枯渇に対しては、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ａｕｔｏＭＡＣＳのＤＥＰＬＥＴＥＳ（高感度モードの枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ））、または同等の計器プログラムが使われる。
【０１９９】
１５ｍｌのコニカル遠心分離チューブに０．０５％ＢＳＡを含む１μｇ／１０ｅ６細胞／０．１ｍｌ  ＰＢＳを加えることにより、生細胞を標的特異的一次抗体、例えば、糸球体細胞のためのネフリン腎生検ポリクローナル抗体、で標識し、続けて、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０２００】
標識後、細胞を洗浄して、１０ｅ７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、続けて、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。洗浄後、アイソタイプ特異的二次抗体、例えば、０．０５％ＢＳＡ含有１μｇ／１０ｅ６／０．１ｍｌ  ＰＢＳのニワトリ抗ウサギＰＥを添加し、続いて、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０２０１】
インキュベーション後、細胞を洗浄し、１０ｅ７細胞当たり１〜２ｍｌの緩衝液を加え、続けて、３００ｘｇで５分間遠心分離することにより非結合一次抗体を除去する。上清を取り出し、細胞ペレットを再懸濁した１０ｅ７全体細胞当たり６０μｌの緩衝液中に再検索後、１０ｅ７全体細胞当たり２０μｌのＦＣＲブロッキング試薬を添加し、これをよく混合する。
【０２０２】
２０μｌのダイレクトＭＡＣＳマイクロビーズ（例えば、抗ＰＥマイクロビーズ）を添加、混合し、４℃で１５分のインキュベーションを行う。
【０２０３】
インキュベーション後、標識容量の１０〜２０ｘの緩衝液を添加し、３００ｘｇで５分間、懸濁液を遠心分離することにより細胞を洗浄し、細胞ペレットを１０ｅ８細胞当たり５００μｌ〜２ｍｌの緩衝液に添加して再懸濁する。
【０２０４】
メーカーのインストラクションに従い、ａｕｔｏＭＡＣＳシステムを洗浄し、ａｕｔｏＭＡＣＳを使った磁気細胞分離のための準備をする。新規無菌収集チューブを出口の下に置く。ａｕｔｏＭＡＣＳ細胞分離プログラムを選択する。選別では、ＰＯＳＳＥＬＤＳプログラムを選ぶ。枯渇に対しては、ＤＥＰＬＥＴＥＳプログラムを選ぶ。
【０２０５】
標識細胞を取込ポートに挿入後、プログラムを開始する。
細胞選別または枯渇の後に、検体を集め、使用まで氷上に置く。
枯渇または選別された検体の純度をフローサイトメトリーで検証する。
【０２０６】
実施例１０−正常および慢性疾患腎臓組織から治療可能性のある細胞を単離、増殖できる
本調査の目的は、ハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）によりヒトＮＫＡ細胞の機能的特性解析を行うことにあった。ハイコンテントイメージング（ＨＣＩ）は、多くの検体全体に対し、２つ以上の蛍光プローブ（多重処理）を使って、複数の細胞下イベントの同時画像処理を提供する。ハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）は、ハイコンテントイメージングで捕捉された複数の細胞パラメーターの同時定量測定を提供する。簡単に述べると、未分画（ＵＮＦＸ）培養物を生成し（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８）、標準的生検手順を使って、進行性慢性腎疾患（ＣＫＤ）および３つの非ＣＫＤヒト腎臓を含む５つのヒト腎臓から採取したコア生検とは独立に維持する。ＵＮＦＸのエクスビボによる（２）継代後、細胞を採取し、密度勾配法（実施例２のように）に供し、亜画分Ｂ２、Ｂ３、および／またはＢ４を含む亜画分を生成する。
【０２０７】
表１０．１にまとめたように、ヒト腎臓組織を非ＣＫＤおよびＣＫＤヒトドナーから入手した。図４は、ＨＫ１７とＨＫ１９検体の病理組織学的特徴を示す。エクスビボ培養物を全ての非ＣＫＤ（３／３）およびＣＫＤ（５／５）腎臓から生成した。対象領域（ＲＯＩ）を規定するヒトＮＫＡ細胞のアルブミン輸送のハイコンテントアナリシス（ＨＣＡ）を図５（ヒトＮＫＡ細胞中のアルブミン輸送のＨＣＡ）に示す。非ＣＫＤおよびＣＫＤ腎臓由来ＮＫＡ細胞のアルブミン輸送の定量比較を図６に示す。図６で認められるように、アルブミン輸送は、ＣＫＤ由来ＮＫＡ培養物に易感染性ではない。尿細管富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間のマーカー発現の比較分析を図７（ＣＫ８／１８／１９）に示す。
0005974215.tif 000011
【０２０８】
尿細管富化Ｂ２および尿細管細胞枯渇Ｂ４亜画分の間の比較に基づくアルブミン輸送の機能分析を図８に示す。亜画分Ｂ２が近位の尿細管細胞中で富化され、その結果、アルブミン輸送機能の増加を示す。
【０２０９】
アルブミン取込：２４ウエル、コラーゲンＩＶプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ（登録商標））中で培養密度に成長させた細胞の培地を１８〜２４時間の間、フェノールレッド不含で、無血清の１Ｘ抗真菌性／抗生物質および２ｍＭグルタミン含有低グルコースＤＭＥＭ（ｐｒ−／ｓ−／ｌｇＤＭＥＭ）で置換した。アッセイ直前に、細胞を洗浄し、ｐｒ−／ｓ−／ｌｇＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭグルタミン、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を使って３０分間インキュベートした。細胞を２５μｇ／ｍＬローダミンコンジュゲート化ウシアルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に３０分間暴露し、  氷冷ＰＢＳで洗浄してエンドサイトーシスを停止させ、２５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ核染料含有２％パラホルムアルデヒドで直ちに固定した。阻害実験に対しては、１μＭ受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）（Ｒａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ  ＧＡ）をアルブミン添加の１０分前に添加した。ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ（登録商標）８５５ハイコンテントバイオイメージャー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて顕微鏡画像処理および分析を行った（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１０  Ｎｏｖ；２９９（５）：Ｆ１０２６−３９．Ｅｐｕｂ  Ｓｅｐ  ８、２０１０、を参照）。
【０２１０】
結論として、ＨＣＡは、細胞レベルデータを与え、他のアッセイでは検出できない集団動力学、すなわち遺伝子またはタンパク質発現を示すことができる。アルブミン輸送（ＨＣＡ−ＡＴ）機能の測定のための定量化可能なエクスビボＨＣＡアッセイを利用して、ヒト腎臓尿細管細胞をヒトＮＫＡプロトタイプの成分として特徴付けることができる。ＨＣＡ−ＡＴは、比較に基づく細胞機能の評価を可能とし、アルブミン輸送コンピテント細胞がヒトＣＫＤ腎臓由来ＮＫＡ培養物中に保持されることを示した。また、ＮＫＡ培養物、Ｂ２およびＢ４の特定の亜画分は、高められたアルブミン輸送活性を有する尿細管細胞富化画分であるＢ２とは、表現型と機能が異なることも示された。ヒトＣＫＤ由来Ｂ２細胞亜集団は、インビボでの効力を立証した（上述）げっ歯類Ｂ２細胞と表現型的に、また機能的に類似である。
【０２１１】
実施例１１−腎臓再生の予測因子としてのマーカー発現
この調査は、治療的生理活性１次腎臓細胞亜集団で処理した５／６腎摘出ラットにおける腎臓再生の予測因子としての幹細胞および前駆細胞マーカー発現に関する。根底にあるＮＫＡ処置が腎機能を改善するメカニズムは、特徴付けられつつある。ＮＫＡ処置の作用機序に関する我々の調査は、細胞−細胞シグナル伝達、生着、および線維化経路に関する。本調査は、ＮＫＡ処置が、−おそらく、動員腎臓幹細胞の動員による−器官固有の再生能力をどのようしてに高めることができるかについてに焦点を絞った。我々は、ＮＫＡ処置５／６ＮＸラットで観察された生存の延長および腎機能の改善は、特定の幹細胞マーカー分子の発現に関連していると仮定する。
【０２１２】
この調査では、ＣＫＤラット５／６腎摘出術モデルを使い、分子アッセイを採用して特定された、治療的生理活性１次腎臓細胞集団での直接注射に対し応答した、ラット５／６腎摘出腎臓内の常在性幹細胞および前駆細胞の動員を評価する。この細胞ベース治療は、主要幹細胞マーカーＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＵＴＦ１、ＳＯＸ２、ＬＥＦＴＹ１、およびＮＯＤＡＬの転写物およびタンパク質の両方のレベルの上方制御に特異的に関連していることが観察された。上方制御は、注射の１週間後までに検出され、注射後１２週までにピークに達した。幹細胞および前駆細胞マーカーの活性化は、未処理腎摘出対照に比べて、生存の増加と血清バイオマーカーの有意な改善に関連していた。
【０２１３】
材料および方法
ラット由来１次腎臓細胞集団の単離：前述のように、ラットから１次腎臓細胞集団の単離を行った（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２００８；Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００９  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２３：ＬＢ１４３）。
【０２１４】
インビボ調査の設計と分析：１次腎臓細胞集団の単離（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０  Ｏｃｔ  ２７．［印刷板に先行のＥｐｕｂ版］）および５／６腎摘出ＣＫＤげっ歯類モデルの１次腎臓細胞亜集団の生理活性を評価したインビボ調査（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前出、２０１０）の詳細記載。慢性腎疾患げっ歯類モデルにおいて、１次腎臓細胞の尿細管細胞富化亜集団が、生存を改善し、腎臓機能を強化することは、別のところで報告した。この調査では、ラット由来死体解剖時の組織を単離し、Ｂ２（ＮＫＡ＃１）またはＢ２＋Ｂ４混合物（ＮＫＡ＃２）で処置し、腎摘出（Ｎｘ）および疑似手術された非腎摘出ラット（対照）と比較した。図９および１１ならびに表１１．１では、ＮＫＡ＃１とＮＫＡ＃２処置ラット由来のデータをプールした。毎週および死体解剖前に調査ラットから採取した血液検体の分析により全身性データを得た。
【０２１５】
表１１．１は、疑似手術処置動物（対照）、ｎ＝３を示す；ｎｘ対照（Ｎｘ）、ｎ＋３；Ｂ２細胞（ＮＫＡ＃１）で処置した動物、ｎ＝７；Ｂ２＋Ｂ４細胞（ＮＫＡ＃２）；ｎ＝７、に対する生存データを示す。調査の終了時点（２３〜２４週）で、Ｎｘ動物のどれも残っていなかった。ＮＫＡ処置動物は、未処置Ｎｘ対照に比較して、優れた生存割合であった。
0005974215.tif 000012
【０２１６】
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成およびｑＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡを、最適切削温度（ＯＣＴ）凍結培地中に埋め込んだ組織から以下のようにして単離した：組織ブロックを室温下に置き、ＯＣＴ超過分を除き、次に、組織をＰＢＳ中に入れ、解凍させて、残されているＯＣＴを取り除き、組織をＰＢＳで３回洗浄した後、大まかに切断して、微量遠心チューブに分注した。次に、分注組織を乳棒を使って微粉砕し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使って、抽出した。ＲＮＡの健全性を分光光度計を使って測定し、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）を使って、１．４μｇに匹敵する多量のＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡ合成後、２００μｌのｄｉＨ２Ｏ（脱イオン水）を添加し、最終容量を２４０μｌにすることにより、各検体を１：６に希釈した。ＡＢＩのカタログにあるプライマーとプローブおよびＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を使って、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により標的転写物の発現レベルを調査した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ｃａｔ＃４３６９０１６）を使って増幅を行い、ペプチジルプロリル異性化酵素Ｂ（ＰＰＩＢ）を内在性対照として利用した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応：１０μｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）、１μｌプライマーおよびプローブ（２０Ｘ）、９μｌｃＤＮＡ、反応当たりの全容量：２０μｌ。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーおよびプローブを使って、各反応を以下のように設定した。
0005974215.tif 000013
【０２１７】
ウェスタンブロット：ＯＣＴ凍結培地に包埋した凍結全腎臓組織をタンパク質試料捕集に利用した。上述のようにＯＣＴを除き、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）を含む緩衝液に揺動を加えながら室温で全組織の溶解を１５分間行い、続けて、１３，０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離を行った。全上清液を集め、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。検体当たり３０μｇのタンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  １０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各ウエルに添加して、ＳＤＳＰＡＧＥ  Ｇｅｌを行った。ゲルを２００Ｖで４０分間、ＭＥＳ泳動バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で電気泳動を行った。その後、タンパク質をＩ−Ｂｌｏｔｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使ってニトロセルロース膜に移し、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）（シグマ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含有トリス緩衝食塩水中に溶解した１５ｍＬの４％ｗ／ｖ低脂肪乳を使い、室温で２時間ブロッキングした。下記の抗体（それぞれ、２％ｗ／ｖ低脂肪乳を含む５ｍＬ  ＴＢＳ−Ｔで希釈）で、膜を°室温下、一晩検出した：（抗ヒトＬｅｆｔｙ−Ａ  ＬｏｎｇおよびＳｈｏｒｔ  ｉｓｏｆｏｒｍ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ７４６１）；抗ヒト、マウスおよびラットＣＤ１３３（Ａｂｃａｍ  ＡＢ１９８９８）；抗ヒトおよびマウスＵＴＦ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ４３３７）；抗ヒトＮＯＤＡＬ（Ａｂｃａｍ  ＡＢ５５６７６）；抗ヒトおよびラットＣＤＨ１１（ＯＢカドヘリン）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＭＡ１−０６３０６）；抗ラットＣＤ２４（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））。膜を３回／各１０分ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、次に、２％ｗ／ｖ低脂肪乳（１：６０、０００）を含むＴＢＳ−Ｔで希釈した適切なＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ  ＰＩ−２０００；ＰＩ−１０００）を使って、室温で１．５時間検出した。膜をＴＢＳ−Ｔで３回／各１０分洗浄し、続けて、ｄｉＨ２Ｏで１０分の洗浄を２回行った。ブロットをＥＣＬ  Ａｄｖａｎｃｅ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使って発色させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標）ＸＲＳ分子イメージャーおよびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）を使って可視化した。
【０２１８】
結果：５／６ＮＸラットの常在性幹細胞および前駆細胞の動員を評価するための分子アッセイを開発、使用して、ＮＫＡ処置に対するこれらのマーカーの経時応答を調査した。主要幹細胞マーカーＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＵＴＦ−１、ＳＯＸ−２、ＬＥＦＴＹ、およびＮＯＤＡＬのｍＲＮＡ転写物およびタンパク質両方のレベルの上方制御に特異的に関連することが認められた。上方制御は、注射後１週までに検出され、注射後１２週までにピークに達した。幹細胞および前駆細胞マーカーの活性化は、未処置５／６ＮＸ対照動物に比べて、生存の増加と血清バイオマーカーの有意な改善（すなわち、腎臓濾過の改善）に関連していた。
【０２１９】
図９は、５／６ＮＸラットのＮＫＡによる処置後の宿主組織中のＳＯＸ２のｍＲＮＡの発現を示す。ＳＯＸ２ｍＲＮＡ発現の経時分析により、移植後１２週までに、ＮＫＡ処置群でＮｘ対照よりも１．８倍のＳＯＸ２  ｍＲＮＡの増加が認められた。移植後２４週までに、Ｎｘ対照に比べＮＫＡ処置群でＳＯＸ２  ｍＲＮＡ発現の２．７倍の増加が観察された。（１週：対照（疑似）、Ｎｘ（対照）、および処置ＮＫＡに対し各ｎ＝３）（１２週：対照（疑似）およびＮｘ（対照）に対しｎ＝１；処置ＮＫＡに対しｎ＝４）（２４週：対照（疑似）およびＮｘ（対照）に対しｎ＝１；処置ＮＫＡに対しｎ＝４）。* は、ｐ値＝０．０２３または０．０５未満を示す。
【０２２０】
図１０は、疑似対照（対照）、Ｎｘ対照（Ｎｘ）、およびラット処置ＮＫＡ＃１およびＮＫＡ＃２の処置後１、１２および２４週でのＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＵＴＦ１、ＳＯＸ２、ＮＯＤＡＬおよびＬＥＦＴＹの発現の経時変化を示すウェスタンブロットである。ＯＣＴ凍結培地に包埋した凍結全腎臓組織（各検体に対しＮ＝１）をタンパク質試料捕集のために利用した。負荷された全質量のタンパク質によりレーンを正規化した。ＮＫＡ処置組織中のＣＤ１３３、ＵＴＦ１、ＮＯＤＡＬ、ＬＥＦＴＹおよびＳＯＸ２タンパク質レベルを全ての時点で、対照またはＮｘラットに比較して、評価した。
【０２２１】
図１１は、再生応答指数（ＲＲＩ）の経時変化を示す。個別タンパク質発現の濃度測定分析（図１０）を使って、再生マーカータンパク質発現の定量的指数、または再生応答指数（ＲＲＩ）を生成した。バンド強度を各ウェスタンブロットから、ＩｍａｇｅＪｖ１．４ソフトウェア（ＮＩＨ）を使って計算し、値を各タンパク質の単位面積当たりに正規化した。各時点に対するウェスタンブロット分析に使用した５つのマーカーを集計して、疑似、Ｎｘ、およびＮＫＡ処置群に対し、平均強度を決定した。プロットは、１、１２、および２４週の時点から生成される平滑化ラインフィットと共にＸＹ散布図を示す。各群の平均強度を時間に対してプロットし、幹細胞マーカータンパク質発現の宿主組織応答における傾向を強調した。各検体に対し同じ分散を仮定して、標準的な両側スチューデントｔ−検定を使って統計的分析を行った。９５％の信頼区間（ｐ値＜０．０５）を使って、統計的有意性を求めた（処置ＮＫＡ群ｎ＝２；対照（疑似）群ｎ＝１；Ｎｘ（対照）群ｎ＝１）。疑似対照動物では、ＲＲＩは、９０．４７から処理後２４週の８１．８９まで、わずかな減少のみ示す。対照的に、５／６Ｎｘ対照由来の腎臓は、基本的に逆の応答を示し、処置後１週の８２．２６から動物の死亡時点である処置後１８週の１４０．５６までＲＲＩが増加する。ＮＫＡ処置動物では、ＲＲＩは、処置後１週の６２．８９から処置後１２週の１３５．６１に急速に増加し、処置後２４週までに１１２．６１まで低下する。
【０２２２】
ＮＫＡ処置は、幹細胞マーカーＣＤ２４、ＣＤ１３３、ＵＴＦ−１、ＳＯＸ−２およびＮＯＤＡＬの宿主組織中の転写物およびタンパク質の両方のレベルの上方制御に関連していることが観察された。上方制御は、処置後１週までに検出され、処置後１２週までにピークに達した。宿主組織中の幹細胞および前駆細胞マーカーの全体活性化は、未処置腎摘出対照に比べて、生存の増加（１）および臨床関連血清バイオマーカーの改善と関連していた。
【０２２３】
ＮＫＡ処置に応答した常在性幹細胞および前駆細胞集団の動員は、損傷腎臓組織および器官構造の再生による５／６ＮＸ動物の腎臓機能の回復に寄与する可能性がある。従って、この調査で使用した分子アッセイは、ＣＫＤに対する生体組織工学および再生医学療法を評価するための直接的で、迅速かつ予測的な再生結果アッセイを提供する可能性がある。
【０２２４】
実施例１２−マイクロＲＮＡ含有１次腎臓細胞由来エキソソーム
我々は、再生結果を得る機序を解明するためのインビボ調査の設計に繋げるために、特定のエキソソーム由来ｍｉＲＮＡと、標的細胞における機能的に関連した結果とをインビトロで関連付けるよう努めてきた。
【０２２５】
方法：馴化培地の再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に与える効果について、商業的に利用可能は細胞：ＨＫ−２（ヒト近位尿細管細胞株）、１次ヒト腎臓糸球体間質細胞（ＨＲＭＣ）、およびヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使って調査を行った。ヒトおよびラット１次腎臓細胞培養物（ＵＮＦＸ）由来馴化培地中のエキソソーム由来ＲＮＡ含有物を、既知ｍｉＲＮＡを検出するように設計したＰＣＲベースアレイにより選別した。低酸素は、エキソソーム排出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）に影響すると報告されている；そのため、培養群を、培地採集の前の２４時間の間、低酸素（２％Ｏ２）に暴露した。エキソソームをＦＡＣＳにより細胞性壊死組織片と分離した。
【０２２６】
図１２は、ＵＮＦＸ馴化培地の調製と分析に対する模式図を示す。
【０２２７】
結果：ＵＮＦＸ馴化培地は、再生治癒応答に関連したシグナル伝達経路に影響することが明らかになった；これらの応答は、非馴化培地を使った対照では観察されなかった。特に、ＮＦκＢ（免疫応答）および上皮間葉転換（線維化応答）がＨＫ−２細胞で低下し、ＰＡＩ−１（線維化応答）がＨＲＭＣ細胞で低下し、さらに、血管新生がＨＵＶＥＣで促進された。ＵＮＦＸ馴化培地由来エキソソーム含有物のＰＣＲアレイ選別による予備的データは、ＵＮＦＸがＵＮＦＸ馴化培地に対する観察された応答と一致するｍｉＲＮＡ配列を含むエキソソームを産生することを示している。
【０２２８】
図１３Ａ〜Ｃは、ＵＮＦＸ培養物由来馴化培地が、再生結果に関連する可能性のある複数の細胞プロセスにインビトロで影響することを示す。ＮＦｋＢシグナル伝達は、腎疾患のプロセスの主要炎症性メディエーターとして提案されており（Ｒａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９．Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １２：３４９６−３５２２；Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２１：１２５４−１２６２）、また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）により活性化されうる。ＨＫ−２細胞は、非馴化培地（左）またはＵＮＦＸ馴化培地（右）で、３７℃、１時間プレインキュベートされ、その後、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαのある場合とない場合で活性化が行われた。
【０２２９】
図１３Ａは、ＵＮＦＸ馴化培地がＮＦ−ｋＢのＴＮＦ−α媒介活性化を弱めることを示す。ＮＦｋＢ活性化は、ＲｅｌＡ／ｐ６５免疫蛍光染色（緑）により測定した。Ｈｏｅｃｈｓｔ対比染色核（青）およびファロイジン染色繊維状アクチン（赤）がＲｅｌＡ／ｐ６５核局在化（白色矢印）の評価を容易にする。
【０２３０】
図１３Ｂは、ＵＮＦＸ馴化培地が、ＨＵＶＥＣ細胞培養物の血管新生促進作用を増やすことを示す。ＨＵＶＥＣ細胞（ウエル当たり１００，０００個）を、０．５％ＢＳＡ添加培地２００中に入れた重合マトリゲルの上に重ねて入れた。非馴化培地（左）またはＵＮＦＸ馴化培地（右）を添加し、細胞組織化応答を、画像キャプチャを使って３〜６時間の間、目視によりモニターした。細胞遊走（白色矢頭）、整列化（黒色矢頭）、尿細管形成（赤色矢頭）、および閉じ多角形の形成（アスタリスク）の細胞組織化に対し印を付けた。ＵＮＦＸ馴化培地は、非馴化培地に比べて、より多くの尿細管および閉じ多角形を誘導し、培地中に血管新生促進因子が存在することを示唆している。
【０２３１】
図１３Ｃは、ＵＮＦＸ馴化培地が、上皮細胞中の線維形成経路を弱めることを示す。ＨＫ−２細胞は、インビトロで形質転換増殖因子（ＴＧＦ）に暴露した場合、上皮の特性を失い、間葉表現型を獲得し、腎臓の線維形成の進行に関連する上皮間葉転換（ＥＭＴ）を再現する（Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００３Ｎａｔ  Ｍｅｄ９：９６４−９６８）。ＨＫ−２細胞を、非馴化培地（ＣＴＲＬ）、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１（ＴＧＦβ１）含有非馴化培地、または１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１（ＴＧＦβ１＋ＣＭ）含有ＵＮＦＸ馴化培地中で７２時間培養した。細胞のＣＤＨ１（上皮のマーカー）、ＣＮＮ１（間葉マーカー）およびＭＹＨ１１（間葉マーカー）を定量ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。馴化培地は、ＣＤＨ１、ＣＮＮ１、およびＭＹＨ１１遺伝子発現により測定して、ＴＧＦβ１誘導ＥＭＴの程度を低減させる。エラーバーは、３回の反復実験の平均標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【０２３２】
図１３Ｄは、そのまま放置すれば、細胞外マトリックスタンパク質の進行性蓄積につながる可能性がある、ＴＧＦβ１およびプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）により形成される陽性のフィードバックループを示す（Ｓｅｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏ  ｌ３０：４８１−４９０）。
【０２３３】
図１４Ａ〜Ｂは、糸球体間質細胞における線維形成経路の減弱を示す。対照（ＣＴＲＬ）または５ｎｇ／ｍｌＴＧＦβ１の添加の有る場合（＋）と無い場合（−）のＵＮＦＸ馴化培地（ＵＮＦＸ  ＣＭ）中で、ＨＲＭＣを２４時間培養した。ＰＡＩ−１のウェスタンブロット分析は、ＵＮＦＸ  ＣＭが、ＴＧＦβ１誘導ＰＡＩ−１タンパク質レベルの増加を弱めることを示す。β−アクチンは、ローディング・コントロールとして示される。ヒト腎臓糸球体間質細胞（ＨＲＭＣ）は、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ１の存在下（＋）、増加したレベルのＰＡＩ−１を発現する。ヒト生理活性腎臓細胞由来馴化培地（ＣＭ）との共培養は、ＴＧＦｂ１誘導されたＰＡＩ−１タンパク質発現を低下させる。ｍＲＮＡレベルでのＰＡＩ−１発現のＣＭによる変化は生じない（データは示さず）。
【０２３４】
図１４Ｂは、ラット生理活性腎臓細胞由来ＣＭには、培養ＨＲＭＣ誘導（＋）および非誘導（−）に与える、ＴＧＦｂ１と類似の効果があったことを示す。遠心分離後採集したＣＭ上清（枯渇ラットＣＭ）は、ＰＡＩ−１発現の低下に関し有効性が低く、ＰＡＩ−１タンパク質の観察された減弱化の原因のＣＭ成分は、ラット生理活性腎臓細胞による小胞分泌に関連している可能性があることを示唆している。
【０２３５】
図１５は、ＵＮＦＸ由来馴化培地が、分泌小胞を含むことを示す。図１５Ａは、分泌小胞（エキソソームを含む）を示し、これは、細胞質由来内部成分（緑）を包含する二相脂質構造（赤）である。ホスファチジルセリン（青三角形）は、小胞生合成中に細胞外の空隙中に暴露される膜の成分である（Ｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：５８１−５９３）。
【０２３６】
ＰＫＨ２６およびＣＦＳＥは、それぞれ、分泌小胞の脂質膜および細胞質を標識し（Ａｌｉｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ３８：２３３−２４５）、一方、アネキシンＶはホスファチジルセリンに結合する。
【０２３７】
図１５Ｂ〜Ｃは、ＦＡＣＳ選別を示す。ＵＮＦＸ馴化培地をＰＫＨ２６、ＣＦＳＥ、およびＡＰＣコンジュゲートアネキシンＶで標識し、蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）により選別した。分泌小胞を表すトリプルポジティブ粒子を集め、トリゾール試薬を使って全体ＲＮＡを抽出した。市販の利用可能なＲＴ−ＰＣＲベースアレイを使って、既知の配列に対しマイクロＲＮＡ含量物を選別した。
【０２３８】
表１２．１は、治療結果が予想されるマイクロＲＮＡを含む分泌小胞を示す。ＵＮＦＸ細胞は、既知のｍｉＲＮＡ配列を含むエキソソームを放出する。ＵＮＦＸ馴化培地は、機能的に関連するヒト細胞株の再生応答に影響を与える。検出ｍｉＲＮＡと観察された再生応答の間の原因と効果の関係は、鋭意調査中であるが、現在までに得られた結果から、ＵＮＦＸ細胞が、ｍｉＲＮＡの標的細胞と組織へのエキソソーム媒介輸送による治療に関連するパラクリン効果をもたらす可能性があることが示唆される。
0005974215.tif 000014
【０２３９】
このデータは、生理活性腎臓細胞培養由来分泌小胞が、ＴＧＦｂ１／ＰＡＩ−１フィードバックループにより誘導されるＰＡＩ−１を弱める成分を含むという結論を支持する。
【０２４０】
マイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ分析：Ｌｅｗｉｓラット由来未分画（ＵＮＦＸ）生理活性腎臓細胞を、基本培地（ＤＭＥＭおよびＫＳＦＭの５０：５０混合物；血清または補充薬品なし）中で、低酸素条件（２％Ｏ２）下、２４時間培養した。馴化培地を集め、１００，０００ｘｇ、４℃、２時間の条件で超遠心分離を行い、分泌小胞（例えば、微小胞、エキソソーム）をペレット化した。得られたペレットから全体ＲＮＡを抽出し、既知マイクロＲＮＡ種に対し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした（ラットマイクロＲＮＡゲノムＶ２．０ＰＣＲアレイ；Ｑｉａｇｅｎ＃ＭＡＲ−１００Ａ）。下記のｍｉＲＮＡを検出可能である。
0005974215.tif 000015
0005974215.tif 000016
0005974215.tif 000017
【０２４１】
実施例１３−生理活性腎臓細胞由来パラクリン因子
この調査では、我々は、インビトロ細胞ベースアッセイを採用し、生理活性腎臓細胞がプラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）等のメディエーターにより線維形成を調節できると思われるパラクリン機序を調査した。
【０２４２】
材料と方法：馴化培地を、生理活性腎臓細胞（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２６、２９５、２００８；Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）のラットおよびヒトの血清と補充物質不含条件の培養物から集め、インビトロアッセイに利用した。インビトロアッセイでは、市販品として利用可能なラットおよびヒト由来糸球体間質細胞を宿主応答組織の代用試薬として使った。理由は、糸球体間質細胞は、傷害または病気の腎臓中のＰＡＩ−１産生のソースであるためである（Ｒｅｒｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５８、１８４１、２０００．）。ＰＡＩ−１遺伝子およびタンパク質発現を、それぞれ、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットでアッセイした。細胞により培地中に排出された小胞粒子（例えば、エキソソーム）を高速遠心分離により集め（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１０、１−１２ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ６０１、Ｊｕｌｙ  ７、２０１０）、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って全ＲＮＡをペレットから抽出した。小胞のＲＮＡ含有物を、既知のマイクロＲＮＡ配列のＰＣＲベースアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って選別した。
【０２４３】
結果：生理活性腎臓細胞培養由来の馴化培地は、ＴＧＦβ１誘導による糸球体間質細胞中のＰＡＩ−１定常状態タンパク質レベルの増加を弱めたが、定常状態ｍＲＮＡレベルに影響を与えなかった。これは、マイクロＲＮＡが標的遺伝子を調節するという機序と一致する観察であった。マイクロＲＮＡが細胞外の小胞輸送により細胞間を移動できるという仮説（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２０１０）に基づき、我々は、馴化培地のマイクロＲＮＡ含有物を分析し、ＰＡＩ−１阻害剤と推定されるマイクロＲＮＡ３０ｂ−５ｐ（ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ）の存在を確認した。
【０２４４】
ここに提示のデータは、生理活性腎臓細胞が、エキソソーム経由ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐの標的糸球体間質細胞への細胞間移動により線維形成を直接調整できることを示唆している。糸球体間質細胞によるｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ取込の結果として、定常状態ＰＡＩ−１タンパク質レベルでのＴＧＦβ１誘導増加を弱め、腎臓組織において、最終的に糸球体の空隙内の細胞外マトリックスの析出を減らす応答を弱める。現在、ＰＡＩ−１が実際にｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを直接に標的にすることを確認するための調査が進行中である。
【０２４５】
図１４Ａ〜Ｂは、対照（ＣＴＲＬ）またはＴＧＦβ１の培地への添加のある場合（＋）と無い場合（−）の生理活性腎臓細胞馴化培地（ＣＭ）で２４時間培養したヒト糸球体間質細胞中のＰＡＩ−１とα−アクチン（対照）タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。ＣＴＲＬ培養では、ＴＧＦβ１がＰＡＩ−１タンパク質発現を増加させた。ＣＭ培養では、ＴＧＦβ１−誘導応答が減弱した。
【０２４６】
分泌小胞について、ＰＡＩ−１の推定抑制因子であるマイクロＲＮＡを分析した。ヒトおよびラット生理活性腎臓細胞ＣＭ由来分泌小胞を高速遠心分離により集め、既知の配列のＰＣＲベースアレイを使って、マイクロＲＮＡ含有物をアッセイした。ｍｉＲ−４４９ａ、ＰＡＩ−１（６）の推定制御因子、を特定した。ＨＲＭＣは、一時的にｍｉＲ−４４９ａを形質移入したか、または形質移入しなかった（ＣＴＲＬ）。形質移入２４時間後に、細胞を、さらに２４時間、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦｂ１（＋）に暴露するか、または暴露しなかった（−）。
【０２４７】
図１６Ａは、総タンパク質を調製し、ＰＡＩ−１とβ−アクチンをアッセイしたウェスタンブロットを示す。ｍｉＲ−４４９ａは、定常状態ＰＡＩ−１タンパク質レベルを減らし（レーン１〜レーン３を比較）、ＰＡＩ−１タンパク質の誘導レベルもまた、ｍｉＲ−４４９ａ形質移入培養物で低下した（レーン２〜レーン４を比較）。このデータは、分泌小胞がｍｉＲ−４４９ａを含み、ｍｉＲ−４４９ａの糸球体間質細胞中への取込は、ＰＡＩ−１発現を低下させるという結論を支持する。
【０２４８】
図１６Ｂは、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−３０ｂ−５ｐを示し、これも、ＰＣＲベースアレイで特定され、予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ−ｍｉＲＢａｓｅは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている）に基づいたＰＡＩ−１の推定制御因子である。
【０２４９】
糸球体中のＰＡＩ−１タンパク質レベルを、５／６腎摘出術により生理活性腎臓細胞で誘導されたＣＫＤの処置後、インビボで調査した。
【０２５０】
図１７Ａ〜Ｃは、片側腎摘出術（Ａ）、５／６腎摘出術（Ｂ）、または５／６腎摘出術と生理活性腎臓細胞の腎臓内送達（Ｃ）を受けたＬｅｗｉｓラット腎臓のＰＡＩ−１の代表的免疫組織化学像（Ａ〜Ｃ）を示す。処置（Ｃ）の結果、５／６腎摘出術式（Ｂ）の結果としての糸球体（矢頭）中のＰＡＩ−１の蓄積が減少した。
【０２５１】
別の調査では、死体解剖時に採取した腎臓組織に対しｑＲＴ−ＰＣＲを行い、相対的遺伝子発現値を調査日数に対しプロットした。
【０２５２】
図１７Ｄは、５／６腎摘出ラット（赤正方形）が、生理活性腎臓細胞（青菱形）および偽手術された対照（緑三角形）で処置されたものに比べ、より強力なＰＡＩ−１の発現を立証したことを示す。
【０２５３】
図１７Ｅは、処置後３ヶ月および６ヶ月で採取された腎臓検体の代表的ウェスタンブロット分析を示す。５／６腎摘出ラット（Ｎｘ）の処置組織（Ｎｘ＋Ｔｘ）は、ＰＡＩ−１とフィブロネクチン（ＦＮ）タンパク質の蓄積が減少した（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）。
【０２５４】
このデータは、５／６腎摘出術により誘導されたＣＫＤの生理活性腎臓細胞による処置後、インビボで糸球体中のＰＡＩ−１タンパク質レベルが減少するという結論を支持する。
【０２５５】
まとめると、実施例１２〜１３は、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する１つの機序は、常在性腎臓細胞の線維化経路を調節する成分の細胞間移動を経由する可能性があるという仮説を支持する。
【０２５６】
実施例１４−生理活性腎臓細胞由来分泌因子がＮＦκＢシグナル伝達経路を弱める
この調査では、我々は、５／６腎摘出術モデルの疾患進行のＮＫＡ媒介減弱化におけるＮＦκＢ経路の役割を調査し、また、ＮＦκＢ活性化の直接調節による再生結果に対し寄与できる生理活性腎臓細胞の特性を特定することを検討した。図１７Ｇは、ＴＮＦαによるＮＦｋＢ経路の標準的活性化を示す。
【０２５７】
材料と方法：残遺物腎臓を、ＰＢＳ中のＢ２＋Ｂ４（ＮＫＡプロトタイプ）での処置の６週前に２段５／６腎摘出術式を行ったＬｅｗｉｓラットから採取した。ＮＫＡ処置（ＴＸ）または未処置（ＵＮＴＸ）組織に対し、免疫組織化学、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によりＮＦκＢ活性化をアッセイした。血清および補助剤不含培地中で成長させたエクスビボＮＫＡ細胞培養物から集めた馴化培地（ＣＭ）をインビトロ機能性アッセイ用に使った。ヒトの近位尿細管細胞株（ＨＫ−２）を、分子および免疫蛍光法ベースアッセイ読み取りのための標的細胞型として使用した。細胞により培地中に排出された小胞粒子（エキソソーム）を高速遠心分離により集めた。エキソソームから単離された全ＲＮＡを既知マイクロＲＮＡ配列のＰＣＲベースアレイ（Ｑｉａｇｅｎ）を使って選別した。
【０２５８】
結果：５／６腎摘出ラット由来残遺物腎臓中にＮＦκＢサブユニット、ＲｅｌＡ／ｐ６５の核局在化が観察され、ＵＮＴＸ組織中の炎症経路の活性化を示唆する。ＲＴ−ＰＣＲによるＴＸ組織との予備的比較により、ＲｅｌＡ遺伝子発現の現象が示され、ＮＫＡ処置がＲｅｌＡ／ｐ６５発現の抑制を介してＮＦκＢ経路活性化に影響する可能性があることが示唆された。この仮説は、ＣＭ腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に対する応答に比べ、暴露ＨＫ−２細胞中のＲｅｌＡ／ｐ６５の核局在化の低減（図１７Ｆ）からも明らかなように、ＣＭがＴＮＦα誘導ＮＦκＢ活性化をインビトロで弱める観察により支持される。進行中のＮＫＡエキソソームマイクロＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析では、ＮＦκＢ経路に影響することが既知の配列が存在するか否かを調査している。
【０２５９】
図１７Ｆは、免疫蛍光アッセイで、ＮＫＡＣＭに対する２時間暴露が、ＴＮＦαで前処置された対照培養物中に比べ、ＨＫ−２中のＮＦκＢｐ６５（緑）の核局在化を減らすことを示す。ＩｎＨＫ−２では、ＮＦｋＢｐ６５（緑）は、ＴＮＦα（対照培地）への暴露３０分後、核に局在化する。しかし、ＨＫ−２細胞のＮＫＡ馴化培地によるＴＮＦα添加の前の２時間の前処置が、ＮＦｋＢｐ６５核局在化応答を弱めた。核をＤＡＰＩ（青）で染色し、繊維状アクチンをＡｌｅｘａ５９４−ファロイジン（赤）で染色して、ＮＦκＢ核局在化の強さの定性的評価を支援する（組み合わせパネル中最下段のＴＮＦα処置対照細胞の少し薄くなったファロイジン境界に注意されたい）。対比染色は、組み合わせ画像中のＮＦｋＢ局在化に対する基準を与える。
【０２６０】
Ｌｅｗｉｓラットの腎臓組織中のＮＦｋＢｐ６５サブユニットの免疫組織化学は、５／６腎摘出術（パネルＢ）により惹起された進行性ＣＫＤの動物では、対照動物（パネルＡ）の片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べて、より強力なＮＦｋＢｐ６５サブユニットの核局在化が、特に尿細管上皮細胞（黒の矢頭）中で起こることを示す。腎摘出術後６週で採取した組織。倍率２００Ｘ。
【０２６１】
パネルＣ：５／６腎摘出術を受けたＬｅｗｉｓラット腎臓組織の細胞質（「Ｃ」）および核（「Ｎ」）タンパク質抽出物中のＮＦｋＢｐ６５のウェスタンブロット分析。チューブリンレベル（ローディング・コントロール）が相対的に一定である１週と１３週の比較では、核のＮＦｋＢｐ６５は、時間経過と共に増加し、免疫組織化学結果と一致する。
【０２６２】
パネルＤ：核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、５／６腎摘出術後に核に局在化するＮＦｋＢは、ＤＮＡ結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で２つの動物から調製された核抽出物を表す。
【０２６３】
ＮＦｋＢ経路は、慢性腎疾患の５／６腎摘出術モデルにおいて徐々に活性化される。Ｌｅｗｉｓラットの腎臓組織中のＮＦｋＢｐ６５サブユニットの免疫組織化学分析を行った。
【０２６４】
図１８Ａ〜Ｄは、５／６腎摘出術（パネルＢ）により惹起された進行性ＣＫＤの動物では、対照動物（パネルＡ）の片側腎摘出術により惹起された非進行性腎不全に比べ、ＮＦｋＢｐ６５サブユニットのより強い核局在化が、特に尿細管上皮細胞（黒色矢頭）中で、発生することを示す。腎摘出術後６週に採取した組織。倍率２００Ｘ。
【０２６５】
図１８Ｃは、５／６腎摘出術を受けたＬｅｗｉｓラット腎臓組織の細胞質（「Ｃ」）および核（「Ｎ」）タンパク質抽出物中のＮＦｋＢｐ６５のウェスタンブロット分析を示す。チューブリンレベル（ローディング・コントロール）が相対的に一定である１週と１３週を比較すると、核のＮＦｋＢｐ６５は、時間経過につれ増加し、免疫組織化学結果と一致する。
【０２６６】
図１８Ｄは、核抽出物の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を示し、５／６腎摘出術後に核に局在化するＮＦｋＢは、ＤＮＡ結合のために活性化されることが確認される。レーンは、各時点で２つの動物から調製された核抽出物を表す。１ｍｇの核タンパク質を５ｎｇのＮＦｋＢＤＮＡ結合部位と共にインキュベートし、６％ＤＮＡ遅延ゲルで電気泳動を行い、続けて臭化エチジウムで染色した。
【０２６７】
ＮＫＡ細胞の腎臓内送達がＮＦｋＢ核局在化を減らす：複数の確定腎臓細胞亜集団を単離し、ＣＫＤの５／６腎摘出術モデルの腎機能の改善におけるインビボで生理活性をアッセイした（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）。ＮＫＡ細胞は、生理活性を示したが、一方、他の亜集団は生理活性を示さなかった（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１０前出）。
【０２６８】
図１８Ｅは、ＮＫＡ（Ａ）または非生理活性腎臓細胞（Ｂ）の腎臓内注射を受けた確定ＣＫＤのＬｅｗｉｓラットを示す。確定ＣＫＤのＬｅｗｉｓラットは、ＮＫＡ（Ａ）または非生理活性腎臓細胞（Ｂ）の腎臓内注射を受けた。処置後６ヶ月で、組織を採取し、免疫組織化学によりＮＦｋＢｐ６５サブユニットをアッセイした。ＮＫＡ処置動物由来組織は、非生理活性腎臓細胞で処理した動物由来組織に比べ、より少ないＮＦｋＢｐ６５の核局在化を、特に近位尿細管中で示し、ＮＫＡ処置がインビボでＮＦｋＢ経路活性の低減に寄与したことを示唆する。
【０２６９】
ヒトおよびラットＮＫＡ馴化培地から高速遠心分離で単離された分泌小胞の既知配列のＰＣＲベースアレイを使ったマイクロＲＮＡ含有物の分析により、ＮＦｋＢを介して免疫応答に影響を与えることができるいくつかのマイクロＲＮＡ種を、文献の報告（Ｍａｒｑｕｅｚ  ＲＴ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９８：Ｇ５３５；Ｔａｇａｎｏｖ  ＫＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１２４８１）、または予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ−ｍｉＲＢａｓｅは、英国マンチェスター大学・生命工学部（Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で運営、維持されている）に基づいて特定した。
0005974215.tif 000018
【０２７０】
インビボおよびインビトロ知見は、どのようにして、生理活性腎臓細胞（ＮＫＡ）が、免疫応答経路、例えば、ＮＦｋＢ活性化により影響を受けた経路を調節することにより慢性疾患腎臓の腎機能を改善できるかに関する洞察を与える。活性化ＮＦｋＢ（ｐ６５核局在化、特に近位尿細管細胞中で）は、５／６腎摘出術げっ歯類モデルの慢性腎疾患の形成に関連し、ＮＫＡ処置により弱められる。近位尿細管細胞（ＨＫ−２）のＮＫＡ馴化培地に対するインビトロ応答は、ＮＫＡ処置に応答したＮＦｋＢ核局在化のインビボ減弱化を模倣する。ＮＦｋＢ活性化に対する細胞間抑制の推定メディエーター（マイクロＲＮＡ）がＮＫＡ馴化培地中で特定された。まとめると、これらのデータは、生理活性腎臓細胞の腎臓内送達が腎機能を改善する１つの機序は、常在性腎臓細胞の免疫応答を調節する成分、例えば、ＲＮＡの細胞間移動を経由している可能性があるという仮説を支持する。
【０２７１】
実施例１５−ＮＫＡ構築物の機能評価
ゼラチンまたはＨＡベースヒドロゲル上に播種した腎臓細胞集団は生存可能であり、トランスクリプトーム、プロテオミクス、セクレトームおよび共焦点免疫蛍光法アッセイにより測定して、３日間のインビトロ成熟の間、尿細管上皮機能性表現型を維持した。ＮＫＡ構築物が疾患状態に影響する可能性のある機序を調べるため、ＣＫＤ進行に付随する尿細管間質性線維形成に関係するＴＧＦ−βシグナル伝達経路に対する馴化培地の効果を評価した。馴化培地は、ヒト近位尿細管細胞株（ＨＫ２）中でのインビトロＴＧＦ−β−誘導上皮間葉転換（ＥＭＴ）を弱めることが観察された。
【０２７２】
材料と方法
生体材料：生体材料を、ビーズ（同種構成の球形状）として、または粒子（ギザギザの縁のある異種起源集団）として、調製した。Ｐｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｙｔｉｃａ（Åｓｔｏｒｐ、スエーデン）により製造されたゼラチンビーズ（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  ＳおよびＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ  ＧＬ）をそれぞれ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。架橋ＨＡおよびＨＡ／ゼラチン（Ｇｌｙｃｏｓａｎ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、ＵＴからのＨｙＳｔｅｍ（登録商標）およびＥｘｔｒａｃｅｌ（登録商標））粒子を、メーカーのインストラクションに従って作成した凍結乾燥スポンジから形成した。ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）粒子を架橋、凍結乾燥スポンジから形成した。
【０２７３】
ＰＣＬをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＰＬＧＡ５０：５０をＤｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐ．（Ｐｅｌｈａｍ、ＡＬ）から購入した。ＰＣＬおよびＰＬＧＡビーズを修飾二重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ）溶媒抽出法を使って調製した。ＰＬＧＡ粒子を、溶媒キャスト・孔物質溶出（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ  ｐｏｒｏｇｅｎ  ｌｅａｃｈｉｎｇ）技術を使って調製した。全ビーズおよび粒子は、ドライ状態で測定した場合、６５〜３５５μｍの間であった。
【０２７４】
細胞の単離、調製および培養：研究目的のためのヒト組織の使用を管理する全てのＮＩＨガイドラインを順守して、死体ヒト腎臓をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＤＲＩ）から入手した。イヌの腎臓を契約研究機関（Ｉｎｔｅｇｒａ）から入手した。ラット腎臓（２１日齢Ｌｅｗｉｓ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ（ＭＩ）から入手した。  １次腎臓細胞集団（ＵＮＦＸ）および全ラット、イヌおよびヒト腎臓由来の確定亜集団（Ｂ２）の調製については、以前記載した（Ａｂｏｕｓｈｗａｒｅｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  ２６（４）：２９５−３００；２００８；Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前出、２０１０；Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ／２０１０／０５６３２８）。簡単に述べると、腎臓組織を  ４．０ユニット／ｍＬディスパーゼ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）および３００ユニット／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ  ＮＪ）を含む緩衝液中で酵素により解離させ、次に、赤血球および壊死組織片を１５％イオジキサノール（Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）、Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ、Ｎｏｒｔｏｎ、ＭＡ）を使って遠心分離により取り除き、ＵＮＦＸを得た。ＵＮＦＸ細胞を組織培養物処理ポリスチレンプレート（ＮＵＮＣ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）上に播種し、５０：５０培地、高グルコースＤＭＥＭ：５％ＦＢＳ、２．５μｇＥＧＦ、２５ｍｇＢＰＥ、１Ｘ  ＩＴＳ（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウム培地補充剤）、および抗生物質／抗真菌剤（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡから入手）含有ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）の１：１混合物中で培養した。Ｂ２細胞を、ＵＮＦＸ培養物から遠心分離により、げっ歯類（１６％、１３％、１１％、および７％）、イヌ（１６％、１１％、１０％、および７％）、またはヒト（１６％、１１％、９％、および７％）用に特別に層別化した４段イオジキサノール（ＯｐｔｉＰｒｅｐ；非補充ＫＳＦＭ中６０％ｗ／ｖ）密度勾配を使って単離した（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号；Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．、前出、２０１０）。勾
配を８００ｘｇで２０分間、室温で遠心分離した（ブレーキ無し）。対象のバンドをピペットで取り出し、無菌の燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。
【０２７５】
細胞／生体材料複合体（ＮＫＡ構築物）：生体材料上での細胞機能のインビトロ分析のために、均一層の生体材料（上述のように調製された）を、６ウエル低接着性プレートの１つのウエル上に重ねた（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３４７１、Ｃｏｒｎｉｎｇ）。ヒトＵＮＦＸまたはＢ２細胞（ウエル当たり２．５ｘ１０５）を生体材料上に直接播種した。イヌの細胞の生体材料への付着性を調べるために、２．５ｘ１０６のＵＮＦＸ細胞を、非接着性２４ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃３４７３、Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の５０μｌの圧縮容積（ｐａｃｋｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）の生体材料に播種した。ロッキングプラットフォーム上で４時間経過後、イヌのＮＫＡ構築物を３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で一晩成熟させた。翌日、生死染色アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使い、メーカーのインストラクションに従って生死染色を行った。ラットＮＫＡ構築物を６０ｃｃシリンジ中で、ローラーボトル回転装置を使って１ＲＰＭの回転速度で調製した。
【０２７６】
下記のトランスクリプトーム、セクレトーム、およびプロテオミクス分析のために、ＮＫＡ構築物を３日間成熟させた。その後、細胞をトランスクリプトームまたはプロテオミクス分析用に採取し、馴化培地をセクレトームプロファイリング用に集めた。
【０２７７】
尿細管細胞関連酵素活性の機能分析：２４ウエルプレートに入れたイヌのＮＫＡ構築物（１０μｌの緩い圧縮容積）を前に報告の方法（Ｔａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏ  ｌ１１３：４００−４１９；１９８５）から改良したロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）活性用のアッセイを使って評価した。簡単に述べると、０．５ｍｌのＰＢＳ中の０．３ｍＭＬ−ロイシンｐ−ニトロアニリド（Ｓｉｇｍａ）を室温で１時間かけてＮＫＡ構築物に添加する。ウエルを二通りに検体採取し、４０５ｎｍの吸光度をＬＡＰ活性の測定値として記録した。ＬＬＣ−ＰＫ１細胞ライセート（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ））を陽性対照とした。
【０２７８】
トランスクリプトームプロファイリング：ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を使ってポリアデニル化ＲＮＡを抽出した。濃度と健全性をＵＶ分光光度法により測定した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って、１．４μｇの単離ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。市販品で利用可能なプライマーおよびプローブ（表１５．１）、ならびに、ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７３００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を使って、標的転写物の発現レベルを定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により調査した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ｃａｔ  ＃４３６９０１６）および内在性対照としての役目をするＴＡＴＡ  ボックス結合タンパク質遺伝子（ＴＢＰ）を使って、増幅を行った。各反応は、１０μｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）、１μｌ  プライマーおよびプローブ（２０Ｘ）ならびに、９μｌ  ｃＤＮＡから構成される。試料を３回反応させた。
0005974215.tif 000019
【０２７９】
セクレトームプロファイリング：ヒトＮＫＡ構築物由来馴化培地を集め、−８０℃で凍結した。検体のバイオマーカー濃度定量化による評価を行った。馴化培地中の所与のバイオマーカー濃度の結果を対照培養物（生体材料の無い場合の２Ｄ培養物）由来の馴化培地中の同じバイオマーカーの濃度に対して正規化し、単位のない比率として表した。
【０２８０】
プロテオミクスプロファイリング：３つの独立した複写物を細胞／生体材料複合体からタンパク質を抽出し、２Ｄゲル電気泳動法による分析用としてプールした。全試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。２００μｌのＺＯＯＭ  ２Ｄタンパク質溶解剤＃１（Ｃａｔ＃  ＺＳ１０００１）に再懸濁した３０μｇのタンパク質、ＺＯＯＭ両性電解質担体ｐＨ４〜７（Ｃａｔ＃  ＺＭ００２２）、および２Ｍ  ＤＴＴ（Ｃａｔ＃  １５５０８−０１３）をｐＨ４〜７  ＺＯＯＭ  ＩＥＦストリップ（Ｃａｔ＃  ＺＭ００１２）に加えて等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。５００Ｖで１８時間の電気泳動後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離のために、ＩＥＦストリップをＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＺＯＯＭ  ＩＰＧウエルゲル（Ｃａｔ＃  ＮＰ０３３０ＢＯＸ）にロードし、２００Ｖで４５分間、ＭＥＳ緩衝液（Ｃａｔ＃ＮＰ０００２）中で電気泳動を行った。タンパク質を、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色（Ｃａｔ＃  Ｓ−１２０００）を使い、メーカーのインストラクションに従って可視化した。
【０２８１】
共焦点顕微鏡観察：ヒトもしくはラットＵＮＦＸまたはＢ２細胞から調製したＮＫＡ構築物を３日間成熟させ、その後、２％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。固定されたＮＫＡ構築物をブロッキングし、Ｄ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋０．２％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）中の１０％ヤギ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間のインキュベーションにより透過処理した。免疫蛍光法に対しては、ＮＫＡ構築物を、室温下、５μｇ／ｍｌの最終濃度で一晩、一次抗体（表１５．２）で標識した。標識ＮＫＡ構築物を２％ヤギ血清／Ｄ−ＰＢＳ＋０／２％トリトンＸ−１００で２回洗浄し、５μｇ／ｍｌの濃度のヤギまたはウサギＴＲＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）二次抗体と共にインキュベートした。ＤＢＡ（ドリコス豆凝集素）によるに二重標識に対しては、ＮＫＡ構築物候補を、２％ヤギ血清／Ｄ−ＰＢＳ＋０．２％トリトンＸ−１００中で２ｍｇ／ｍｌの濃度に室温で２時間希釈したＦＩＴＣコンジュゲートＤＢＡ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共にさらにインキュベートした。
0005974215.tif 000020
【０２８２】
検体をＤ−ＰＢＳで２回洗浄し、ＬＳＭ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）またはＰａｔｈｗａｙ  ８５５共焦点顕微鏡（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用したＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査共焦点システム（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ、Ｗａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｂａｐｔｉｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）、を使って、光学的に薄片を作った。
【０２８３】
ＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β媒介ＥＭＴの分析：フィブロネクチンまたはコラーゲン（ＩＶ）コート培養皿（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れた５０：５０培地中でＨＫ２細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。ＥＭＴアッセイに対しては、５０：５０培地または２次元（２Ｄ）ヒトＵＮＦＸ培養物から、もしくは培地採取の前２日間熟成したヒトＵＮＦＸで作ったＮＫＡ構築物から集めた馴化培地と共に、ＨＫ２細胞を２４ウエルコラーゲン（ＩＶ）コートプレートに７０〜８０％の培養密度で播種した。ＥＭＴアッセイ用細胞からのＲＮＡの単離の前に、１０ｎｇ／ｍｌを３日間培地に加えることによりＴＧＦ−β誘導を惹起した。３日間のインキュベーション期間の終わりに、Ｅ−カドヘリンの相対的発現（上皮マーカー）およびカルポニン（間葉マーカー）をｑＲＴ−ＰＣＲで分析することにより、ＥＭＴをモニターした。採取したＨＫ２細胞から、ＴａｑＭａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析用ＲＮＡを上述のように調製した。各検体の等分散を仮定して、標準的両側スチューデントｔ検定を使って、統計的分析を行った。９５％（ｐ値＜０．０５）および９９％（ｐ値＜０．０１）の信頼区間を使用して統計的有意性を求めた。
【０２８４】
無細胞生体材料およびＮＫＡ構築物のインビボ移植：Ｌｅｗｉｓラット（６〜８週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ、ＭＩ）から購入した。全実験工程をＣａｒｏｌｉｎａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒのＰＨＳとＩＡＣＵＣガイドラインに従って、実施した。イソフルラン麻酔下で、雌Ｌｅｗｉｓラット（約２〜３月齢）に正中切開を行い、左腎臓を露出させた。３５μｌの圧縮生体材料（無細胞の生体材料またはＮＫＡ構築物）を微量注入により腎実質中に導入した。２つの注射経路を使用した：（ｉ）各極から皮質の方向へ（皮質注射と呼ぶ）、または（ｉｉ）腎臓正中から骨盤の方向へ（髄質注射と呼ぶ）。注射後１、４、または８週でラットを屠殺した。早期死は発生しなかった。無細胞移植調査の調査計画を表１５．３に示す（ＮＤ＝実施せず（ｎｏｔ  ｄｏｎｅ））。
【０２８５】
腎臓組織：代表的腎臓検体を集め、１０％緩衝液ホルマリン中に２４時間置いた。徐増濃度のエタノール中で切片を脱水し、パラフィン中に包埋した。切片（５μｍ）を切りだし、帯電スライド上に置き、標準的染色プロトコル（Ｐｒｏｐｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｍｅｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：組織工学における実験室的手法（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；１９９２）に従って、ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム染色および過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色処理を行った。Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｉｇｈｔ（ＤＳ−Ｕ１）カメラを備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ５０ｉ顕微鏡を使ってｘ４０、ｘ１００およびｘ４００の全倍率のディジタルマイクロ写真をキャプチャした。腎臓形態学変化を通常使われる（Ｓｈａｃｋｅｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ３０（１）：９３−９６；２００２）重症度グレード体系（グレード１、２、３、４）により評価し、これに対し、記述用の用語（最小、軽度、中等度、重度／重篤）を適用して、観察された糸球体硬化症、尿細管萎縮症および拡張症、尿細管円柱、および間質性線維症、ならびに炎症の程度を記載した。
0005974215.tif 000021
【０２８６】
結果
生体材料の腎実質中への注射に対する哺乳類腎臓組織の応答：健康なラット腎臓への直接注射により、生体材料の腎臓細胞／生体材料複合体としての使用の可能性を分析した（表１５．３）。組織応答を、注射後１および４週目の病理組織学パラメーター（炎症、線維形成、壊死、石灰化／鉱質化）および生体適合性パラメーター（生体材料分解、新血管新生、および新組織形成）の程度を測定することにより評価した。
【０２８７】
図１９Ａ〜Ｂは、移植後１週目の生体材料のインビボ評価を示す。トリクロームＸ１０：生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームＸ４０：生体材料凝集体の拡大像。Ｈ＆ＥＸ４００：細胞／組織浸潤の程度を評価するための生体材料凝集体高倍率像。材料と方法のところで記載するように、各腎臓の２つの部位で注射した。移植後１週目では、各試験生体材料により誘導された宿主組織応答は、通常、類似であったが、ゼラチンヒドロゲルは、より少ない程度の病理組織学的応答、およびより多い生体適合性応答を誘発するように思われた。
【０２８８】
図１９Ｃは、移植後４週目の生体材料のインビボ評価を示す。移植後４週目で、ＨＡまたはゼラチン粒子を注射した組織の病理組織学パラメーターの重症度は、移植後１週目に比べて、定性的に減少した。ゼラチン粒子は、ほぼ完全に再吸収され、ＨＡ粒子を受けた組織の場合より少ない巨細胞反応が観察された。大抵のケースで、生体材料が髄質注射経路で注射された場合（例えば、髄質／骨盤中へより深く）、水腎症の原因となる閉塞、より高い重症度の炎症反応、および梗塞の原因となる腎臓細動脈と毛細管微小塞栓、等の望ましくない結果が観察された（データは示さず）。
【０２８９】
治療に関連のある生体材料を含む腎臓細胞集団の機能表現型の評価：腎実質への直接注射後の慢性腎疾患のげっ歯類モデルで、生存を延長し、腎機能を高める治療に関連のある腎臓細胞集団（ＵＮＦＸ）を特徴づけ（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号；Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前出、２０１０）、それらの単離、キャラクタリゼーション、および増殖の方法を開発し、複数の種間へ適用した（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）。ＮＫＡ構築物に組み込まれた場合、優先的に尿細管、上皮表現型に付着するのか、生存可能なそれらのまま残るのか、およびそれらを保持するのかどうかを判断するために、ＵＮＦＸ細胞および種々の生体材料から産生したＮＫＡ構築物に対し、トランスクリプトーム、セクレトーム、プロテオミクス、および共焦点免疫蛍光法顕微鏡分析を行った。
【０２９０】
付着性および生存率：イヌの由来ＵＮＦＸ細胞をゼラチンビーズ、ＰＣＬビーズ、ＰＬＧＡビーズ、ＨＡ粒子、およびＨＡ／ゼラチン粒子と共に記載したように（生体材料当たり３ＮＫＡ構築物）播種した。播種の１日後、細胞分布および生存率を生死染色により評価した。
【０２９１】
図２０Ａ〜Ｄは、イヌのＵＮＦＸ細胞を播種したＮＫＡ構築物の生死染色を示す（Ａ＝ゼラチンビーズ；Ｂ＝ＰＣＬビーズ；Ｃ＝ＨＡ／ゼラチン粒子；Ｄ＝ＨＡ粒子）。緑は生細胞を示す；赤は死細胞を示す。（Ａ）ゼラチンビーズ；（Ｂ）ＰＣＬビーズ；（Ｃ）ＨＡ／ゼラチン粒子；および（Ｄ）ＨＡ粒子。生存可能な細胞は、全ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物で観察されうる。
【０２９２】
ＵＮＦＸ細胞は、天然由来ヒドロゲルベース生体材料、例えば、ゼラチンビーズおよびＨＡ／ゼラチン粒子（Ａ、Ｄの黒色矢印）に強く付着したが、合成ＰＣＬ（Ｂ）またはＰＬＧＡビーズには最小の付着性を示した（データは示さず）。細胞は、ＨＡ粒子（Ｃ）に付着しなかったが、生物学的応答の証拠（すなわち、スフェロイド形成）が認められた。ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物上での播種ＵＮＦＸ細胞の機能生存率をロイシンアミノペプチダーゼ、近位尿細管関連加水分解酵素をアッセイすることにより確認した（データは示さず）。
【０２９３】
トランスクリプトームプロファイリング：ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物（生体材料当たり３ＮＫＡ構築物）およびＵＮＦＸ細胞のパラレル２Ｄ培養物中でのヒトＵＮＦＸ細胞の遺伝子発現プロファイルを定量トランスクリプトーム分析により比較した。
【０２９４】
図２０Ｅ〜Ｇは、ＮＫＡ構築物のトランスクリプトームプロファイリングを示す。ＴＣ：２Ｄ培養した１次ヒトＵＮＦＸ細胞。ゼラチン：ヒトＵＮＦＸ細胞とゼラチンヒドロゲルから構成されるＮＫＡ構築物。ＨＡゲル：ヒトＵＮＦＸ細胞とＨＡ／ゼラチン粒子から構成されるＮＫＡ構築物。ｑＲＴ−ＰＣＲデータをグラフと表フォーマットで示した。調査した転写物は、４つの主要カテゴリーに分けられる：（ｉ）尿細管：アクアポリン２（ＡＱ２）、Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｎ−カドヘリン（ＮＣＡＤ）、チトクロムＰ４５０、ファミリー２４、サブファミリーＡ、ポリペプチド１−別名；ビタミンＤ２４−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ）、キュビリン、ネフリン；（ｉｉ）間葉：カルポニン（ＣＮＮ１）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭＭＨＣ）；（ｉｉｉ）内皮：血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板内皮細胞付着分子（ＰＥＣＡＭ）；および（ｉｖ）糸球体：ポドシン。全体として、尿細管マーカー発現は、ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物と２Ｄ  ＵＮＦＸ培養物の間で同程度であった。同様に、内皮マーカー（ＶＥＧＦとＰＥＣＡＭ）波動程度であった。対照的に、糸球体マーカーポドシンは、ＮＫＡ構築物の間で有意な差異を示した。ＨＡ／ゼラチンベースＮＫＡ構築物中のポドシンレベルは、２Ｄ  ＵＮＦＸ培養物で観察されたレベルに極めて類似していた。興味深いことには、間葉マーカー（ＣＮＮ１とＳＭＭＨＣ）発現は、２Ｄ  ＵＮＦＸ培養物に比べて、ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物中で、有意に下方制御され（ｐ＜０．０５）、腎臓培地配合物中のヒドロゲルベースＮＫＡ構築物の場合と同様に、ＵＮＦＸの線維芽細胞亜集団は増殖できないことが示唆される。
【０２９５】
セクレトームプロファイリング：ヒトＵＮＦＸおよびＢ２細胞ならびにゼラチンまたはＨＡ／ゼラチンヒドロゲルを使ってＮＫＡ構築物を産生した（細胞型当たり、生体材料当たり、１ＮＫＡ構築物＝全体で４ＮＫＡ構築物）。
【０２９６】
図２１Ａ〜Ｂは、ＮＫＡ構築物のセクレトームプロファイリングを示す。データは、３Ｄ：２Ｄ比率として提示している。材料と方法に記載のように、ヒトＵＮＦＸまたはＢ２細胞およびゼラチン（ヒドロゲル１）またはＨＡ／ゼラチン（ヒドロゲル２）ヒドロゲルからＮＫＡ構築物を産生した。セクレトームプロファイリングを、３日間熟成したＮＫＡ構築物由来馴化培地に対し行い、ＮＫＡ構築物（３次元、すなわち３Ｄ、培養）の分析物発現の２Ｄ培養物に対する比率（３Ｄ：２Ｄ比率）を計算することにより、ヒトＵＮＦＸまたはＢ２細胞のパラレル２Ｄ培養物と比較した。ＵＮＦＸ細胞で播種した３つのＮＫＡ構築物のそれぞれで、３Ｄ：２Ｄ比率は、１であるか、または１に近く、これらの生体材料上の播種工程および３日間の成熟は、ＵＮＦＸ細胞のセクレトームプロファイルに、ほとんど影響しなかったことを示唆している。Ｂ２細胞を播種したＮＫＡ構築物に対しては、３Ｄ：２Ｄ比率が１または１に近いという類似の結果が観察され、これらの生体材料上の播種工程および３日間の成熟は、治療に関連する腎臓細胞のセクレトームプロファイルには、ほとんど影響を与えなかったという追加の証明を提供する。
【０２９７】
プロテオミクスプロファイリング：所与の細胞または組織のプロテオミクスプロファイルが２Ｄゲル電気泳動法を使って全体細胞タンパク質を分離することにより作成され、腎疾患に関連する特異的バイオマーカーを特定するために使用されてきた（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｌｏｎｄ）１０９（５）：４２１−４３０；２００５）。
【０２９８】
図２２Ａ〜Ｂは、ＮＫＡ構築物のプロテオミクスプロファイリングを示す。ＮＫＡ構築物を、示したように、ヒトＵＮＦＸ細胞および生体材料を使って産生した。総タンパク質量抽出物中のタンパク質を、材料と方法に記載されるように、２Ｄゲル電気泳動法により分離した。この実験では、プロテオミクスプロファイリングを使って、ＮＫＡ構築物（ゼラチンまたはＨＡ／ゼラチンヒドロゲルベース、生体材料当たり３ＮＫＡ構築物）および２Ｄ組織培養物中のヒトＵＮＦＸ細胞におけるタンパク質発現を比較した。ＮＫＡ構築物またはＵＮＦＸ細胞の２Ｄ培養物から単離された総タンパク質量のプロテオームプロファイルは、基本的に、同じであり、これらの生体材料上の播種工程および３日間の成熟は、ＵＮＦＸ細胞により発現されたプロテオームには、ほとんど影響を与えなかったという追加の証明を提供する。
【０２９９】
共焦点顕微鏡観察：ＮＫＡ構築物中のラットおよびヒトＢ２細胞（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、前出）の尿細管上皮表現型の保持を、確立したバイオマーカーの共焦点画像処理により評価した：図２３Ａ〜Ｃは、ＮＫＡ構築物共焦点顕微鏡像を示す。ヒト（Ａ）またはラット（Ｂ、Ｃ）Ｂ２細胞およびゼラチンヒドロゲルを使って産生されたＮＫＡ構築物の共焦点顕微鏡像。（Ａ）Ｅ−カドヘリン（赤−中実白色矢印）、ＤＢＡ（緑−点線緑矢印）およびゼラチンヒドロゲルビーズは、ＤＩＣ光学を使って可視化される。（Ｂ）ＤＡＰＩ染色により可視化されたＤＮＡ（青−中実白色矢印）および次のそれぞれ緑色のマーカー（点線白色矢印）：ＩｇＧ対照、Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン８／１８／１８、ＤＢＡ。（Ｃ）マーカーの二重標識像および色表示。ヒトＮＫＡ構築物中のＥ−カドヘリンおよびＤＢＡ、ならびに、ラットＮＫＡ構築物中のＥ−カドヘリン、ＤＢＡ、Ｎ−カドヘリン、サイトケラチン８／１８／１９、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ−１）、およびメガリン。共焦点像の光学的切片作成により、また、播種および３日間の成熟後の生体材料中への細胞浸潤の程度の評価が可能となる。ヒトおよびラットＮＫＡ構築物中のＢ２細胞は、複数の尿細管上皮マーカーの発現を示した。光学的切片は、ヒドロゲル構築物の最小の細胞浸潤を示し、細胞は、通常生体材料の表面に限定されていた。
【０３００】
ＮＫＡ構築物プロトタイプの移植に対するインビボ応答：腎実質への生体材料の注射に対するインビボ応答、ならびに、上述のＮＫＡ構築物中のＵＮＦＸおよびＢ２細胞のインビトロ表現型および機能キャラクタリゼーションに基づいて、ゼラチンヒドロゲルを選択して、健康なＬｅｗｉｓラットにおける腎実質へのＮＫＡ構築物の注射に対するインビボ応答を評価した。ＮＫＡ構築物を同系Ｂ２細胞から産生し、２匹の動物へ移植した。これらの動物は、移植後１、４、および８週で屠殺した。全動物が腎臓組織切片の採取予定の死体解剖時まで生存し、切片作成を行って、トリクローム、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、ならびに過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した。
【０３０１】
図２４Ａ〜Ｂは、移植後１および４週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。トリクロームＸ１０：生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームＸ４０：生体材料凝集体の拡大像。Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳ  Ｘ４００：細胞／組織浸潤の程度を評価するための生体材料凝集体の高倍率像。各腎臓は、材料と方法で記載のように、２つの部位に注射された。
【０３０２】
図２４Ａは、移植後１週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。注射後１週目で、ゼラチンビーズは、好塩基性染色した球状で多孔性の材料の局所的凝集体として存在し（左パネル、丸で囲んだ領域）、多くの血管結合組織および食細胞の多核マクロファージや巨細胞に取り囲まれていた。血管結合組織を、ビーズ内に組み込み、新腎臓組織形成を示す尿細管上皮成分を提示した。さらに、尿細管および血管糸球体（ｖａｓｃｕｌｏｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ）構造を形態学により特定した（ＰＡＳパネル）。
【０３０３】
図２４Ｂは、移植後４週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。注射後４週までに、ヒドロゲルは完全に再吸収され、空隙は進行性腎臓再生および最小の線維形成を伴う修復により置換された（４週トリクロームパネル中の円で囲んだ領域内の多数の機能性尿細管に注意されたい）。
【０３０４】
図２５Ａ〜Ｄは、移植後８週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。トリクロームＸ１０：生体材料凝集体を示す腎臓断面の低倍率像。トリクロームＸ４０：生体材料凝集体の拡大像。Ｈ＆Ｅ／ＰＡＳＸ４００：細胞／組織浸潤の程度の評価のための生体材料凝集体高倍率像。（Ａ）中等度の慢性炎症（マクロファージ、血漿細胞およびリンパ球）、顕著な血管結合組織応答（Ｍａｓｓｏｎのトリクロームによる青色染色−黒色矢印）を伴う中程度の数のヘモジデリン沈着マクロファージ（注射による慢性出血）；（Ｂ）新腎臓組織形成と一致する再生応答誘導を示す（Ａ）のボックスで囲んだ領域のさらに高い倍率（トリクローム染色、ｘ４００）（Ｃ）近接（正常な）腎実質の代表例で、典型的皮質糸球体形態ＨＥを示す、ｘ４００）；（Ｄ）ＨＥ染色切片、ｘ４００  処置領域で観察された新糸球体形態ｖｓ．図１５４Ｃの比較。
【０３０５】
図２５Ａ〜Ｄは、移植後８週目のＮＫＡ構築物のインビボ評価を示す。移植後８週目で、腎形成における初期のイベントの誘導と同じ新腎臓様組織形成の証拠が観察された。再生誘導（Ｂ、Ｄ）の領域と近接皮質実質（Ｃ）の比較により、複数のＳ−形状体および新規形成糸球体の存在が示された。
【０３０６】
ＮＫＡ構築物由来馴化培地のＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴに与える効果：ＣＫＤの進行の間の尿細管間質性線維形成の発生は、尿細管上皮細胞のＴＧＦ−β媒介ＥＭＴと関連がある（Ｚｅｉｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６０（６）：２００１−２００８；２００２）。また、進行性ＣＫＤのげっ歯類モデルにおいて、ＴＧＦ−β経路の減弱化がインビボで観察され、ＵＮＦＸおよびＢ２細胞を使った処置により生存が延長され、腎機能が改善された（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号）。ヒト近位尿細管細胞株ＨＫ２は、ＴＧＦ−β誘導ＥＭＴに対する小分子またはタンパク質の刺激または阻害効果を試験するためのインビトロモデルシステムとして充分確立されている（Ｄｕｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２４（５）：１４０６−１４１６；２００９；Ｈｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９６（３）：Ｆ６１４−６２１；２００９）。移植後腎臓組織応答に対するＮＫＡ構築物の影響に関する可能な機序を検討するために、ＵＮＦＸ細胞とヒドロゲルから産生したＮＫＡ構築物から集めた馴化培地をＨＫ２ＥＭＴアッセイシステムで評価した。
【０３０７】
図２６は、ＮＫＡ構築物由来の馴化培地がＨＫ２細胞中のＴＧＦ−β誘導ＥＭＴをインビトロで弱めることを示す。ＥＣＡＤ（上皮）およびＣＮＮ１（間葉）マーカーの相対発現を定量化することによりＥＭＴをモニターした。表示のように、５０：５０培地（対照およびＴＧＦＢ対照検体）またはヒトＵＮＦＸ細胞（ＴＣ）もしくはヒトＵＮＦＸ細胞の２Ｄ培養物およびゼラチンもしくはＨＡ／ゼラチンから産生されたＮＫＡ構築物由来の馴化培地（ＣＭ）中でＨＫ２細胞を培養した。ＥＭＴを誘導するために、１０ｎｇ／ｍｌＴＧＦ−βをアッセイ前の３日間、各検体（対照を除く）に添加した。ＨＫ２細胞を５０：５０培地（対照）中で培養した場合、ＣＮＮ１（間葉マーカー）より高レベルでＥＣＡＤ（上皮マーカー）が発現した。ＴＧＦ−βを３日間、培地に添加する場合（ＴＧＦＢ対照）、ＥＣＡＤ発現は、ＣＮＮ１の上方制御と同時に、有意に下方制御され、ＥＭＴイベントの誘導と一致する。２Ｄ  ＵＮＦＸ細胞培養由来馴化培地は、ＨＫ２細胞のＴＧＦ−β（ＴＣ  ＣＭ）に対するＥＭＴ応答を有意に弱めた（ＥＣＡＤおよびＣＮＮ１の両方に対しｐ＜０．０５）。ＮＫＡ構築物（ゼラチンＣＭおよびＨＡ／ゼラチンＣＭ）由来の馴化培地も、また、ＴＧＦ−βに対するＥＭＴの応答を弱めた；しかし、全体的効果は、２Ｄ  ＵＮＦＸ細胞培養由来馴化培地で観察された効果より小さかった（両方のＮＫＡ構築物でのＥＣＡＤに対しては有意（ｐ＜０．０５）で、対照の方に近づく傾向があるが、ＣＮＮ１に対しては統計的に有意でない）。追加の間葉マーカーを選別し、類似の結果を得た（データは示さず）。これらのデータは、ＮＫＡ構築物が、細胞ベース処置（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第２０１０／０５６３２８号）で観察されたものと類似の形式で、尿細管間質性線維形成に関連するＴＧＦ−β経路にインビボで影響を与える可能性があることを示唆している。これらのデータは、また、インビボ応答がインビトロＥＭＴ応答と統計的に有意な関連性があり、それにより、時間のかかる、高価なインビボアッセイの必要性を低減可能性があることを立証できるなら、インビトロＥＭＴアッセイは、ＮＫＡ構築物のバイオセラピューティック効力の選別／最適化／モニタリング対する適用の可能性があることを示唆している。
【０３０８】
この調査は、合成および天然生体材料、無細胞および生理活性腎臓細胞／生体材料複合体（すなわち、ＮＫＡ構築物）の両方の移植に対する哺乳類腎実質の応答を検討した。インビトロ機能アッセイおよびインビボ再生結果の組み合わせを解析し、ＮＫＡ構築物プロトタイプ中への組み込みを可能にするために、候補生体材料を機能的に選別した。無細胞のヒドロゲルベース生体材料の腎実質への移植（図１９）は、通常、最少の線維形成または慢性炎症、および移植後４週まで壊死の形跡のないことに繋がっている。最少の残遺物生体材料と共に中等度の細胞／組織の内成長および新血管新生が観察された。これらのインビボデータに基づいて、ヒドロゲルベース生体材料を選択し、ＮＫＡ構築物を産生して、これを使ってインビトロ生体機能性およびインビボ再生可能性を評価した。材料生体適合性のインビトロでの確認をＮＫＡ構築物の生死分析により行った（図２０）。ゼラチン含有ヒドロゲルは、１次腎臓細胞集団の強い付着性に関連していた。生理活性１次腎臓細胞集団（ＵＮＦＸまたはＢ２）およびヒドロゲル生体材料から産生したＮＫＡ構築物の表現型および機能分析は、尿細管上皮細胞表現型の維持の継続と一致する。ＮＫＡ構築物のトランスクリプトーム、セクレトーム、プロテオミクス、および共焦点顕微鏡分析により、２Ｄ培養で播種した１次腎臓細胞に対する有意差が無いことが確認された。最終的に、ヒドロゲルベースＮＫＡ構築物の健康な生体げっ歯類の腎実質への移植は、最少の炎症性および線維化応答、ならびに移植後８週までの新腎臓様組織の再生に結びついていた。
【０３０９】
まとめると、これらのデータは、再生応答がＮＫＡ構築物によりインビボで誘導されたことを示唆する証拠を与える。これらの調査は、治療的に効果のある１次腎臓細胞／生体材料複合体の移植に対する哺乳類腎臓の生物学的応答の最初のインビボ腎臓内調査を意味する。観察結果は、ＮＫＡ構築物が、新腎臓組織の再生の促進、および非再生（例えば、修復治癒）応答の減弱化の両方に対する潜在能力を有することを示唆している。
【０３１０】
ポリマー材料の移植に対する哺乳類腎臓の生物学的応答：別の調査では、げっ歯類腎臓に関し、天然および合成生体材料の腎臓内注射に対する宿主組織応答を調査し、生理活性腎臓細胞集団との細胞／生体材料複合体の形成のための候補生体材料を評価した（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．前出、２０１０）。方法：天然生体材料には、ゼラチンおよびヒアルロン酸（ＨＡ）を含めた。合成生体材料には、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）および乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含めた。候補生体材料を２種の別々の物理形態：同種の球状ビーズまたは異種起源で非均一粒子、で評価した。ＰＣＬおよびＰＬＧＡビーズを修飾二重エマルジョン乳剤（水／オイル／水）溶媒抽出法を使って調製した。ゼラチンビーズは、購入した（Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ−Ｓ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。ＰＬＧＡ粒子を溶媒キャスト・孔物質溶出技術を使って調製した；ゼラチンおよびＨＡ粒子を架橋および凍結乾燥した発泡体から調製した。３５μｌの緩く圧縮充填した生体材料を２回の注射で３月齢Ｌｅｗｉｓラットの左腎実質に送達した。炎症、組織／細胞内成長、新血管新生、材料分解、および繊維と細胞の応答に関する０（無し）から４（重度）までの重症度の半定量分類スコアを使って、注射後１週および４週の腎臓組織のホルマリン固定切片の病理組織学的評価を行った。総合スコアは、％陰性応答に対する％陽性応答の比率として計算した（総合スコアが高いほど、優れた結果となる）。
【０３１１】
結果：生体材料候補に対する病理組織学的評価−移植１週後採取し、切片をＭａｓｓｏｎのトリクロームで染色した代表的な腎臓の４０Ｘ像（データは示さず）。天然起原、例えば、ゼラチンおよびＨＡのポリマーから構成される材料は、合成生体材料、例えば、ＰＬＧＡおよびＰＣＬ（器質性線維状被包形成）に比べて、より穏やかな繊維と細胞の応答および慢性炎症、ならびにより大きい細胞内成長、新血管新生、生体材料分解、ならびに組織治癒および組織集積に要求される必然的な炎症と関連していた。病理組織学的評価スコアリングの要約：スコアは、材料組成で平均化した（平均±ＳＤ）。合成材料（ＰＬＧＡおよびＰＣＬ）は最低スコアになり、ゼラチン材料は、通常、ＨＡ材料より高いスコアになった。この傾向は、４週の時点で最も際立っている。材料の注射に関係の無い要因のために、必ずしも全ての１週目の試験検体が４週目の分析に利用可能ではなかった。ゼラチン、ＨＡ、および合成群に含まれる標本数は、それぞれ、１週目で、３、４、３であり、４週目で２、３、１である。
【０３１２】
注射により組織応答を誘発した健康な腎実質に送達された天然起原の生体材料（例えば、ゼラチンまたはＨＡ）は、半定量病理組織学的評価により測定して、注射後４週目で、合成起原に比べ、病的な状態はより少なかった。
【０３１３】
実施例１６−培養ヒト腎臓細胞の低酸素暴露が細胞遊走および付着のメディエータを誘導し、尿細管細胞単層の修復をインビトロで促進する
慢性腎疾患（ＣＫＤ）モデルの立証された治療機能を有する腎臓上皮細胞選択集団（Ｂ２）の単離および機能における酸素圧力の役割を調査した。この調査では、処理中の低酸素暴露が選択されたヒトの選択腎臓細胞（ＳＲＣ）または生理活性腎臓細胞（ＢＲＣ）の組成および機能を変えるのか否かを調べた。２％酸素への暴露に際し、以下が観察された：密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化（Ｐｒｅｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第１０／０５６３２８号を参照；この特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、全体の勾配後収率の改善、酸素により調節される遺伝子発現（Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．前出、（２０１０）、で以前に報告）の調節、エリスロポエチン、ＶＥＧＦ、ＨＩＦ１アルファ、およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の発現増加。処理中の低酸素への暴露は、選択生理活性腎臓細胞の傷害性尿細管を修復／再生する能力を高める。
【０３１４】
図２７は、細胞を処理中に低酸素へ暴露する手順を示す。図２８は、２％酸素に暴露に際し、下記が観察されたことを示す：密度勾配全体にわたる細胞の分布の変化、全体の勾配後収率の改善。低酸素暴露（＜３％）は、大気酸素圧力（２１％）に比べて、培養ヒトＣＫＤ由来腎臓細胞のイオジキサノールベース密度勾配からの回収率を増加させ（９６％ｖｓ．７４％）、また、選択細胞（Ｂ２）の高密度（＞９％イオジキサノール）画分への相対的配分を増加させた（２１．６％ｖｓ．１１．２％）。
【０３１５】
競合的インビトロアッセイは、Ｂ２細胞の低酸素性条件への２４時間の事前暴露は、２１％酸素圧力で培養したＢ２細胞よりも、傷害性腎臓の近位尿細管単層培養物の修復に対しより高い能力を有し、傷害の２時間以内に修復の発生が５８．６％±３％であったことを示した。
【０３１６】
図２９Ａは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識する（２％酸素、２１％酸素、およびＨＫ２尿細管細胞）。２．尿細管細胞単層を作成し、創傷を与えた。３．酸素暴露標識細胞を添加（２％および２１％暴露細胞）。それらを、２０，０００／ｃｍ２で均等に播種する。培養は、無血清培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．創傷を修復する細胞を定量する。図２９Ｂ−定量画像解析（ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５  ＢｉｏＩｍａｇｅｒ）−赤色円＝２％Ｏ２で培養細胞、青色円＝２１％Ｏ２培養。図２９Ｃ−２％酸素誘導細胞がより急速に付着し（２時間）、２４時間わずかな優位性を持続することが観察された。２％酸素で誘導された細胞は、尿細管上皮単層の修復に対し、より大きな能力を有する。
【０３１７】
図３０Ａは、尿細管単層の修復をインビトロで観察するために開発されたアッセイを示す。１．細胞を蛍光染料で標識する。２．８μｍ孔径のトランスウエルインサートの底部に尿細管細胞単層を形成し、創傷を与えた。３．インサートを反転し、酸素暴露標識細胞を添加する（２％および２１％酸素暴露細胞）。それらに、５０，０００／ｃｍ２で均等に播種する。培養は、無血清培地中、５％Ｏ２で２４時間行う。４．創傷を修復する細胞を定量する。
【０３１８】
図３０Ｂは、２％酸素暴露細胞による誘導により、非誘導（２１％酸素）に比べ、遊走および創傷修復が強化されたことを示す。図３０Ｃは、遊走時間に対し遊走細胞の％をプロットしたものである。細胞の平均数および細胞の平均パーセンテージは、表１６．１に示されている。
【０３１９】
低酸素は、また、ＣＸＣＲ４、ＭＭＰ９、ＩＣＡＭ１、およびジストログリカンのｍＲＮＡ発現も誘導した；これらは、細胞遊走および付着を媒介する遺伝子である。ＭＭＰ９の局所的蓄積および細胞の細胞膜へのコネキシン４３凝集体の増加が免疫細胞化学手法により確認された。
【０３２０】
図３１Ａは、オステオポンチンが尿細管細胞により分泌され、傷害に対する応答で発現上昇することを示す（オステオポンチン免疫細胞化学：Ｈｏｅｃｈｓｔ核染色（青）、オステオポンチン（赤）、１０ｘ）。オステオポンチンは、分泌リン酸化糖タンパク質である（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９９）。オステオポンチンは、免疫蛍光（図３１Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図３１Ｂ）により示されるように、尿細管中で発現し、付着および遊走に関与する。オステオポンチンは、尿細管細胞単層中に形成された傷害により発現上昇する。
0005974215.tif 000022
【０３２１】
図３２Ａは、細胞の遊走応答が、一部は、オステオポンチンにより媒介されることを示す（緑＝遊走細胞（５ｘ））。図３２Ｂは、オステオポンチンに対する中和抗体（ＮＡｂ）が腎臓細胞遊走応答を５０％減らすことを示す。
【０３２２】
図３３は、細胞低酸素誘導が組織リモデリング遺伝子の発現を調節することを示す。カベオリン１は、インテグリンシグナル伝達の調節に関与する足場タンパク質である。ＭＭＰ９は、細胞外のマトリックス分解を介して遊走を促進するメタロプロテアーゼである。ＩＣＡＭ１は、上皮細胞運動性に関連する細胞間接着分子である。ＣＸＣＲ４は、細胞遊走を媒介するケモカイン表面受容体である。
【０３２３】
図３４は、腎臓再生に繋がる低酸素による細胞の生理活性増強に対する推定機序を示す。
【０３２４】
まとめると、これらの結果は、低酸素下暴露が尿細管傷害のインビトロ修復に対する立証された生理活性を有する特異的腎臓細胞亜集団の単離を促進し、その結果、これらの細胞のインビボ送達の後に患部組織へ遊走し生着する能力を潜在的に高めることができることを示唆する。ＳＲＣは、進行性ＣＫＤのげっ歯類モデルの腎機能を安定化させ、生存を延長する能力を立証した。低酸素レベル（２％Ｏ２）は、下記を提供した：選択再生細胞の培養後回収率の増加；尿細管傷害に応答した細胞付着および単層修復の強化；ならびに尿細管傷害に応答した細胞遊走の刺激。さらに、細胞遊走および付着は、一部は、オステオポンチンによりインビトロで媒介された。低酸素は、組織リモデリング、遊走、および細胞間情報伝達を媒介するインテグリン、分泌タンパク質、および細胞接着分子を発現上昇させた。
【０３２５】
実施例１７−尿由来微小胞
尿中に排出された腎臓由来微小胞の内腔含有物内に含まれるｍｉＲＮＡおよびタンパク質の分析を行い、再生結果を評価するためのバイオマーカーとして使用可能かどうかを判定した。過剰微小胞が細胞外の空隙に排出されるに従い、一部は隣接細胞と融合し、他のものは、尿中に分泌される（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．７４（５）：６１３−６２１）。これらの尿中の微小胞は、今度は、処置結果のより良い理解に向けたアッセイ開発のための優れたバイオマーカーになる。
【０３２６】
ＺＳＦ１慢性進行性腎不全の代謝疾患のげっ歯類モデルを使用した。Ｂ２＋Ｂ４細胞をＺＳＦ１動物の腎実質に注射した。健康な動物およびＰＢＳ溶媒を対照として使用した。尿由来小胞を、以下にまとめたように、種々の時点で分析した。
１：ＺＳＦ１動物−ＰＢＳ溶媒注射；注射後１９７日に尿採取
２：ＺＳＦ１動物−ＰＢＳ溶媒注射；注射後２５３日に尿採取
３：ＺＳＦ１動物−Ｂ２＋Ｂ４画分注射；注射後１９７日に尿採取
４：ＺＳＦ１動物−Ｂ２＋Ｂ４画分注射；注射後２５３日に尿採取
５．ＺＳＦ１動物−注射なし；調査の１９７日目に尿採取
６．ＺＳＦ１動物−注射なし；調査の２５３日目に尿採取
７．健康動物−注射なし；調査の１９７日目に尿採取
８．健康動物−注射なし；調査の２５３日目に尿採取
処置後１９７日目および約２５３日目に試験動物から尿を採取した。当技術分野で既知の標準的な方法により尿から微小胞を回収した（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．２００８  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；７４（５）：６１３−６２１、を参照）。図３５の標準的ウェスタンブロッティングで示されるように、処置動物の尿から回収された微小胞（レーン３〜４）は、溶媒処置（レーン１〜２）または未処置対照（レーン５〜８）に比較して、前駆細胞関連タンパク質（ＣＤ１３３およびＷＮＴ７Ａ）の増加を示した。実際、微小胞は、微小胞特異的タンパク質ＣＤ６３の発現（図３５）により示されるように、病気の動物の尿（レーン１〜６）のみから回収され、健康な対照（レーン７〜８）からは回収されなかった。ＣＤ１３３含有微小胞は、腎臓細胞から排出されたプロミノソーム（ｐｒｏｍｉｎｏｓｏｍｅ）であるように見える。ＣＤ１３３およびＷＮＴ７Ａの両方は、再生および幹細胞分裂に関連するとされてきた（Ｒｏｍａｇｎａｎｉ  Ｐ  ａｎｄ  Ｋａｌｌｕｒｉ  Ｒ．２００９．Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｐａｉｒ．２（１）：３；Ｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｎａｔｕｒｅ．４３７（７０６３）：１３７０−５；Ｗｉｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｎａｔｕｒｅ．４２３（６９３８）：４４８−５２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９７（６）：Ｆ１５２６−３３）。まとめると、このことは、再生をモニターするように設計されたアッセイ開発のために、微小胞中でバイオマーカーとして発現したタンパク質を標的とすることを支持する。
【０３２７】
ｍｉＲＮＡマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ：尿由来の小胞由来ｍｉＲＮＡのマイクロアレイおよびＲＴ−ＰＣＲ分析を当技術分野で既知の標準的な方法により行った（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．前出、２０１０、参照）。タンパク質に加えて、ｍｉＲＮＡは、単離された微小胞の含有物中にも見つかった。表１７．１は、処置により増加することが解ったｍｉＲＮＡの例を示す。
0005974215.tif 000023
【０３２８】
Ｂ２＋Ｂ４で処置したＺＳＦ１動物のｍｉＲＮＡの変化を経時的に分析した（１９７日目および２５３日目）。何倍というレベルの変化が以下のｍｉＲＮＡで観察された：
0005974215.tif 000024
0005974215.tif 000025
0005974215.tif 000026
【０３２９】
Ｂ２＋Ｂ４で処置したＺＳＦ１動物（２５３日目）のｍｉＲＮＡレベルを分析し、ＰＢＳ溶媒で処置したＺＳＦ１動物（２５３日目）のｍｉＲＮＡレベルと比較した。何倍というレベルの変化が以下のｍｉＲＮＡで観察された：
0005974215.tif 000027
0005974215.tif 000028
0005974215.tif 000029
【０３３０】
Ｂ２＋Ｂ４で処置したＺＳＦ１動物（１９７日目）のｍｉＲＮＡレベルを分析し、ＰＢＳ溶媒で処置したＺＳＦ１動物（１９７日目）のｍｉＲＮＡレベルと比較した。何倍というレベルの変化が以下のｍｉＲＮＡで観察された：
0005974215.tif 000030
0005974215.tif 000031
【０３３１】
表１７．１に挙げたｍｉＲＮＡは、組織再生に関連するプロセスに結びつけられているｍｉＲＮＡの例を提供する。ｍｉＲ−１５ｂは、ＢＣＬ−２およびカスパーゼ調節を介してアポトーシスの調節（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ．５０（４）：７６６−７８）、ならびにサイクリンの調節を介して細胞周期進行（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３８０（２）：２０５−１０）に結びつけられている。ｍｉＲ−２１は、生存経路ＭＡＰＫ／ＥＲＫを調節することによりアポトーシスを阻害することが示された。ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−３０ファミリーは、有足細胞構造および機能にとって重要で、増加が糸球体形成に必要である可能性があることを示唆している。ｍｉＲ−１４１、２００ａ、２００ｃおよび４２９は、全て、線維形成を減らす可能性のあるＴＧＦ−βシグナル伝達に対し応答した上皮から間葉への転換（ＥＭＴ）の調節に関与する（Ｓａａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．１８：３１７−３２３）。ｍｉＲ−１４６ａおよび１５１は、ＮＦκＢ調節に関係づけられ、従って、インビボで炎症反応を減らす可能性がある（Ｔａｇａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（３３）：１２４８１−６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６．ＮＡＲ．３４  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ：Ｄ１４０−Ｄ１４４）。まとめると、これらのｍｉＲＮＡは、成功している再生結果に関連するプロセスを調節する；従って、それらをアッセイ開発のための候補バイオマーカーとする。全体的に見て、このデータは、尿中の微小胞および／またはそれらの内腔含有物が再生アッセイ用の実行可能な標的であるという構想を支持する。理由は、それらが、処置のモニタリングの非侵襲的手段を開業医に提供することに加えて、ＴＧＦβ−１、ＮＦκＢ、アポトーシス、細胞分裂、および多分化能、等の複数の経路を調節することができるタンパク質およびｍｉＲＮＡを含むからである。
0005974215.tif 000032
【図１】
0005974215.tif 000033
【図２】
0005974215.tif 000034
【図３】
0005974215.tif 000035
【図４】
0005974215.tif 000036
【図５】
0005974215.tif 000037
【図６】
0005974215.tif 000038
【図７】
0005974215.tif 000039
【図８】
0005974215.tif 000040
【図９】
0005974215.tif 000041
【図１０】
0005974215.tif 000042
【図１１】
0005974215.tif 000043
【図１２】
0005974215.tif 000044
【図１３Ａ】
0005974215.tif 000045
【図１３Ｂ】
0005974215.tif 000046
【図１３Ｃ】
0005974215.tif 000047
【図１３Ｄ】
0005974215.tif 000048
【図１４】
0005974215.tif 000049
【図１５Ａ】
0005974215.tif 000050
【図１５Ｂ】
0005974215.tif 000051
【図１５Ｃ】
0005974215.tif 000052
【図１６Ａ−Ｂ】
0005974215.tif 000053
【図１７Ａ−Ｅ】
0005974215.tif 000054
【図１７Ｆ】
0005974215.tif 000055
【図１７Ｇ】
0005974215.tif 000056
【図１８Ａ−Ｄ】
0005974215.tif 000057
【図１８Ｅ】
0005974215.tif 000058
【図１９Ａ】
0005974215.tif 000059
【図１９Ｂ】
0005974215.tif 000060
【図１９Ｃ】
0005974215.tif 000061
【図２０Ａ−Ｄ】
0005974215.tif 000062
【図２０Ｅ】
0005974215.tif 000063
【図２０Ｆ】
0005974215.tif 000064
【図２０Ｇ】
0005974215.tif 000065
【図２１Ａ】
0005974215.tif 000066
【図２１Ｂ】
0005974215.tif 000067
【図２２Ａ】
0005974215.tif 000068
【図２２Ｂ】
0005974215.tif 000069
【図２３Ａ】
0005974215.tif 000070
【図２３Ｂ】
0005974215.tif 000071
【図２３Ｃ】
0005974215.tif 000072
【図２４Ａ】
0005974215.tif 000073
【図２４Ｂ】
0005974215.tif 000074
【図２５】
0005974215.tif 000075
【図２６】
0005974215.tif 000076
【図２７】
0005974215.tif 000077
【図２８】
0005974215.tif 000078
【図２９Ａ】
0005974215.tif 000079
【図２９Ｂ】
0005974215.tif 000080
【図２９Ｃ】
0005974215.tif 000081
【図３０Ａ】
0005974215.tif 000082
【図３０Ｂ】
0005974215.tif 000083
【図３０Ｃ】
0005974215.tif 000084
【図３１Ａ】
0005974215.tif 000085
【図３１Ｂ】
0005974215.tif 000086
【図３２Ａ】
0005974215.tif 000087
【図３２Ｂ】
0005974215.tif 000088
【図３３】
0005974215.tif 000089
【図３４】
0005974215.tif 000090
【図３５】
0005974215.tif 000091