(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーキンソン病、ハンチントン病、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、双極性障害または急性躁病であるＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の濃度を増加するための薬物の製造におけるラキニモドまたはその薬学的に許容される塩の使用であって、ラキニモドまたはその薬学的に許容される塩が対象に対して定期的に投与するために製剤化されていることを含む使用。
【請求項２】
定期的な投与が、１日に１回投与を具備する請求項１に記載の使用。
【請求項３】
定期的な投与が、少なくとも３日間にわたり継続する請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ラキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、０．１ｍｇ／日〜４０．０ｍｇ／日の用量での投与のために製剤化されている請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ラキニモドまたはその薬学的に許容される塩の用量が、０．６ｍｇ／日である請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ラキニモドまたはその薬学的に許容される塩が経口投与のために製剤化されている請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ＢＤＮＦ関連疾患が、鬱病、癌患者における鬱病、パーキンソン病患者における鬱病、心筋梗塞後の鬱病、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）をもつ患者における鬱病、亜症候群性の症候性鬱病、不妊症の女性における鬱病、小児鬱病、大鬱病、単一エピソード鬱病、再発性鬱病、児童虐待に誘発される鬱病、産後鬱病、ＤＳＭ−ＩＶの大鬱病、治療抵抗性の大鬱病、重篤な鬱病、精神病性鬱病、脳卒中後の鬱病、神経障害性疼痛、混合エピソードを伴う躁鬱病および鬱病性のエピソードを伴う躁鬱病を含む躁鬱病、季節性情動障害、双極性鬱病ＢＰ  Ｉ、双極性鬱病ＢＰ  ＩＩ、および気分変調を伴う大鬱病からなる群
より選択される抑鬱障害である請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ＢＤＮＦ関連疾患が、全般性不安、パニック障害、恐怖症、心的外傷後ストレス障害、強迫性障害、分離不安および小児期不安からなる群より選択される不安障害である請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
第２のＢＤＮＦ増加剤を対象に対して定期的に投与することをさらに含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ラキニモドの薬学的に許容される塩がラキニモドナトリウムである請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
パーキンソン病、ハンチントン病、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、双極性障害または急性躁病であるＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象を治療するための薬物の製造におけるラキニモドまたはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項１２】
ＢＤＮＦ関連疾患がハンチントン病である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
ＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象を治療するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩およびリルゾールまたはフルオキセチンである第２のＢＤＮＦ増加剤を含む医薬製剤。
【請求項１４】
ＢＤＮＦ関連疾患がパーキンソン病、ハンチントン病、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、双極性障害または急性躁病である請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
ＢＤＮＦ関連疾患がハンチントン病である請求項１４に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【関連技術】
【０００１】
本願は、２００９年８月１０日に出願された米国仮出願第６１／２７３９２０号の優先権を主張し、その内容全体は、ここに参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本願の全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は全体として、本発明が関係する技術分野の水準をより十分に説明するために、参照することにより本願中に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
神経栄養因子は、自然に生じる細胞死、細胞分化および細胞突起成長などの、発生事象に重大な影響を有する（Ｓｎｉｄｅｒ、１９８９）。脳由来神経栄養因子（ＢＮＤＦ）は、成長因子のニューロトロフィンファミリーに属する神経栄養因子である。ＢＤＮＦは、中枢神経系（ＣＮＳ）および末梢神経系（ＰＮＳ）の特定のニューロンに作用して、既存のニューロンの生存を支援し、新しいニューロンおよびシナプスの成長および分化を促すのを助ける（Ａｃｈｅｓｏｎ、１９９５；Ｈｕａｎｇ、２００１）。ＢＤＮＦを増加することは、パーキンソン病、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、抑鬱障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害および急性躁病を含む多くの障害の治療と関連してきた。
【０００４】
パーキンソン病は、運動制御、言語および他の機能を損なう脳の慢性および進行性の変性疾患である。パーキンソン病の最も目立つ特徴の１つは、それが、主として、脳の中の限られたニューロン集団に影響を及ぼすことである。他のニューロンも影響を受けるが、黒質緻密部のドーパミン作動性ニューロンは、疾患の過程に対して最も脆弱である（Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ、２００３）。ＢＤＮＦは、中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存および形態に強い影響を有し、それらの生存を増大するので、これが失われると、パーキンソン病（ＰＤ）におけるこれらの細胞の死滅の原因になる可能性がある（Ｈｙｍａｎ、１９９１；Ｈｏｗｅｌｌ、２０００）。
【０００５】
ハンチントン病（ＨＤ）は、運動、認知および精神医学的な症状と、大脳皮質中の基底核におけるニューロンの進行性の変性とを特徴とする神経変性障害である。ＨＤを患う患者は、健常対照と比べて、血清中の著しく低いＢＤＮＦ濃度を有する（Ｃｉａｍｍｏｌａ、２００７）。
【０００６】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、皮質、延髄および脊髄の運動ニューロンの変性を含む慢性消耗性神経変性疾患である。リルゾール（２−アミノ−６−［トリフルオロメトキシ］ベンゾチアゾール）は、ＡＬＳにおける生存を延長するグルタミン酸作動性神経伝達のアンタゴニストである（Ｒｉｖｉｅｒｅ、１９９８）。リルゾールは、ラットの脳内におけるＢＤＮＦ濃度を著しく上昇することにより、前駆体の増殖を促進することも示されている（Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａ、２００２）。
【０００７】
鬱病は、ＢＤＮＦが効果を有することが示されている別の徴候である。多くの調査を包含するメタ分析において、鬱病患者は、健常対照対象より低いＢＤＮＦ濃度を有することが示され、抗鬱療法は、治療後の鬱病患者におけるＢＤＮＦ濃度を増加することが示されている（Ｓｅｎ、２００８）。
【０００８】
色素性網膜炎は、網膜の光受容細胞の損失と関連した疾患である。ヒトの常染色体劣性の色素性網膜炎において変異が認められている同じ遺伝子における変異を患うｒｄマウスからの網膜の外植片の培養により、ＢＤＮＦは、外側の顆粒層の中の光受容核の数の増加を示すことが示されている（Ｃａｆｆｅ  Ｒｏｍｅｏ、２００１）。このことは、色素性網膜炎を患うヒトにおいてＢＤＮＦ濃度を増加することにより、疾患の進行を遅くし得ることを示唆している。
【０００９】
勃起不全は、ＢＤＮＦと関連することが示されている別の疾患である。米国特許第７４８５３１１号、例３において、ＡＡＶ−ＢＤＮＦの海綿体注射を用いた、両側海綿体神経凍結モデルにおけるラットの処理が、両側海綿体神経の電気刺激に対する応答において最大陰茎海綿体圧を改善することが示された。
【００１０】
ＢＮＤＦはまた、学習および記憶に関連する。ＢＮＦノックアウトマウスの遺伝子組換えマウスのモデルにおいて、ＢＤＮＦ産生の機能障害は、成年期における、特に初期発生の間における学習および記憶の機能障害を引き起こすことが示されている（Ｍｏｎｔｅｇｇｉａ、２００７）。ラットのモデルにおいて、海馬の中の内因性ＢＤＮＦが記憶形成に関与していることが示された。機能阻害の抗ＢＤＮＦ抗体の注入は、恐怖に動機付けされた学習のモデルにおいて、短期および長期の記憶を傷害することが示された一方で、組換え型のヒトのＢＤＮＦの注入は、長期の記憶保持を促進した（Ａｌｏｎｓａ、２００５）。学習または記憶の改善を必要とするヒトの患者においてＢＤＮＦ濃度を増加することはまた、短期および長期の記憶を改善し得る。
【００１１】
レット症候群（ＲＴＴ）は、Ｘ連鎖の神経発生障害および女性における重篤な精神遅滞の主要な原因であり、世界中の出生の１：１００００〜１５０００に影響を与えている（Ａｍａｒａｌ、２００７）。この疾患は、遺伝子ＭｅＣＰ２における変異に関連している。ＭｅＣＰ２の標的の１つはＢＤＮＦ遺伝子である。これは、レット症候群におけるＢＤＮＦ発現の調節解除が、患者において観察される構造上の異常、特に、樹状突起の分岐の減少および樹状突起棘の損失の原因であり得ることを示唆している（Ａｍａｒａｌ、２００７）。これは、レット症候群においてＢＤＮＦ濃度を増加することが、この疾患の治療において実行可能な療法であり得ることを示唆している。
【００１２】
急性躁病を患う双極性障害の患者において、ＢＤＮＦの濃度は、患者が治療されているか治療されていないかに応じて、変化することが示された。既知の躁病治療での治療前では、ＢＤＮＦ濃度は健常対照よりも低いことが認められたが、治療時には、治療されている患者と対照とでの血清中のＢＤＮＦ濃度の違いは顕著ではなかった（Ｔｒａｍｏｎｔｉｎａ、２００９）。それを必要とする患者においてＢＤＮＦ濃度を増加することにより、急性躁病を治療することが可能であるかもしれない。
【００１３】
リルゾール、およびフルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））などの抗鬱剤を含むいくつかの薬剤は、ＢＤＮＦ濃度を増加することが確認されている。（Ｋａｔｏｈ−Ｓｅｍｂａ、２００２；Ｍｏｌｔｅｎｉ、２００６）
【発明の概要】
【００１４】
別の薬剤、すなわち、ヒトにおけるＢＤＮＦを増加することが示されているラキニモドが、本明細書において開示される。ラキニモドは、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）のための経口製剤として提案されている、高い経口バイオアベイラビリティをもつ新規な合成化合物である。ラキニモドとＢＤＮＦとの間に関連は報告されていない。ラキニモドは、その化学名がＮ−エチル−Ｎ−フェニール−１，２−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−５−クロロ−１−メチル−２−オキソキノリン−３−カルボキサミドであり、化学物質登録番号が２４８２８１−８２−７である化合物である。ラキニモドの合成方法、およびそのナトリウム塩の製造は、米国特許第６０７７８５１号において開示されている。ラキニモドのさらなる合成方法は、米国特許第６８７５８６９号において、および米国特許出願公開第２００７−００８８０５０において開示されている。ラキニモドナトリウムを含む医薬製剤は、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００５／０７４８９９号において、ならびに米国特許出願公開第２００７−０２９３５３７号および第２００９−０１６２４３２号において開示されている。
【００１５】
本願は、ヒト対象における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の血清濃度を増加する方法であって、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を、対象に定期的に投与することを含む方法を提供する。この方法は、ある量の第２のＢＤＮＦ増加剤を対象に定期的に投与することをさらに含んでよい。
【００１６】
本願はまた、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害および急性躁病からなる群から選択されるＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象を治療する方法であって、ヒト対象を治療するために有効な量で、ラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を定期的に投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための薬物の製造におけるラキニモドの使用を提供する。
【００１８】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドおよび第２のＢＤＮＦ増加剤を含む医薬製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ベースラインにおいて、プラセボの群とラキニモド０．６ｍｇの群とを比較したＢＤＮＦの一元配置分析を示す図。
【図２】１２週（Ｖ３）において、プラセボの群とラキニモド０．６ｍｇの群とを比較したＢＤＮＦの一元配置分析を示す図。
【図３】３６週（Ｖ９）において、プラセボの群とラキニモド０．６ｍｇの群とを比較したＢＤＮＦの一元配置分析を示す図。
【図４Ａ】例２．１において行った強制水泳試験の結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ  ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、１ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．の投与が最も活性であった。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの移動距離［ｃｍ］におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図４Ｂ】例２．１において行った強制水泳試験の結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、１ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．の投与が最も活性であった。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの速度（ｃｍ／ｓ）におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図４Ｃ】例２．１において行った強制水泳試験の結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、１ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．の投与が最も活性であった。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの移動（移動時間）におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図４Ｄ】例２．１において行った強制水泳試験の結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、１ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．の投与が最も活性であった。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの合計静止時間［１０％］におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ×４、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図５Ａ】例２．２において行った強制水泳試験の結果を示す図（対照に対する*ｐ＜０．０１）。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、５および２５ｍｇ／ｋｇの用量は、有意な抗鬱活性を誘導した。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの移動距離［ｃｍ］におけるラキニモド（０．５、１、５、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図５Ｂ】例２．２において行った強制水泳試験の結果を示す図（対照に対する*ｐ＜０．０１）。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、５および２５ｍｇ／ｋｇの用量は、有意な抗鬱活性を誘導した。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの速度におけるラキニモド（０．５、１、５、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図５Ｃ】例２．２において行った強制水泳試験の結果を示す図（対照に対する*ｐ＜０．０１）。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、５および２５ｍｇ／ｋｇの用量は、有意な抗鬱活性を誘導した。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの移動（合計時間）におけるラキニモド（０．５、１、５、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図５Ｄ】例２．２において行った強制水泳試験の結果を示す図（対照に対する*ｐ＜０．０１）。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、抗鬱活性を示し、５および２５ｍｇ／ｋｇの用量は、有意な抗鬱活性を誘導した。ＦＳＴにおけるＢａｌｂ  Ｃマウスの合計静止時間［１０％］におけるラキニモド（０．５、１、５、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．、−９０）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、−９０分、ｐ．ｏ．）の効果［４分］。
【図６Ａ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）はＢａｌｂ／ｃマウスによるオープンフィールドにおいて一般的な移動性のパラメータを改変することはなかった。オープンフィールド試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの移動距離［ｃｍ］におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）ならびに組合せの効果［２０分］。
【図６Ｂ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）はＢａｌｂ／ｃマウスによるオープンフィールドにおいて一般的な移動性のパラメータを改変することはなかった。オープンフィールド試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの平均速度［ｃｍ／ｓ］におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）ならびに組合せの効果［２０分］。
【図６Ｃ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）はＢａｌｂ／ｃマウスによるオープンフィールドにおいて一般的な移動性のパラメータを改変することはなかった。オープンフィールド試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの合計静止時間におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）ならびに組合せの効果［２０分］。
【図６Ｄ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）はＢａｌｂ／ｃマウスによるオープンフィールドにおいて一般的な移動性のパラメータを改変することはなかった。オープンフィールド試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの合計強移動性時間［秒］におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）ならびに組合せの効果［２０分］。
【図７Ａ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２）においてより活性であった。
【図７Ｂ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２）においてより活性であった。
【図７Ｃ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２）においてより活性であった。
【図７Ｄ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２）においてより活性であった。
【図８Ａ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であった。１ｍｇ／ｋｇが最も強い用量であることが示された。
【図８Ｂ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であった。１ｍｇ／ｋｇが最も強い用量であることが示された。
【図８Ｃ】例３．１において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。（Ｎ＝５匹／群）ラキニモド（１〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、不安を軽減する効果に向かう傾向を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であった。１ｍｇ／ｋｇが最も強い用量であることが示された。オープンフィールド試験におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの立ち上がり頻度におけるラキニモド（１、５、１０、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ、−９０分）ならびに組合せの効果［２０分］。
【図９Ａ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群、対照に対する*ｐ＜０．０５）ラキニモド（０．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのオープンフィールドにおける運動性（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）のわずかな増加を誘発した。
【図９Ｂ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群、対照に対する*ｐ＜０．０５）ラキニモド（０．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのオープンフィールドにおける運動性（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）のわずかな増加を誘発した。
【図９Ｃ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群、対照に対する*ｐ＜０．０５）ラキニモド（０．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのオープンフィールドにおける運動性（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）のわずかな増加を誘発した。
【図９Ｄ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−運動性のパラメータの結果を示す図。（Ｎ＝５匹／群、対照に対する*ｐ＜０．０５）ラキニモド（０．２５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスでのオープンフィールドにおける運動性（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）のわずかな増加を誘発した。
【図１０Ａ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であることを示した。フルオキセチンとラキニモド（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）の両方は、対照と対比して有意な不安を軽減する効果を示した。最も強い用量は、ラキニモド５ｍｇ／ｋｇであった。
【図１０Ｂ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であることを示した。フルオキセチンとラキニモド（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）の両方は、対照と対比して有意な不安を軽減する効果を示した。最も強い用量は、ラキニモド５ｍｇ／ｋｇであった。
【図１０Ｃ】例３．２において行ったオープンフィールド試験−不安のパラメータの結果（区域２＋３の中）を示す図。ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示し、動物は、中央（区域２＋３）においてより活性であることを示した。フルオキセチンとラキニモド（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）の両方は、対照と対比して有意な不安を軽減する効果を示した。最も強い用量は、ラキニモド５ｍｇ／ｋｇであった。
【図１１Ａ】例４．１において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図。ラキニモド（５および２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示した。ラキニモドは、オープンアームにおいて用量依存的な活性の増加を示した。用量２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．が、最も活性であった。
【図１１Ｂ】例４．１において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図。ラキニモド（５および２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示した。ラキニモドは、オープンアームにおいて用量依存的な活性の増加を示した。用量２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．が、最も活性であった。
【図１１Ｃ】例４．１において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図。ラキニモド（５および２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示した。ラキニモドは、オープンアームにおいて用量依存的な活性の増加を示した。用量２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．が、最も活性であった。
【図１１Ｄ】例４．１において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図。ラキニモド（５および２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、有意な不安軽減効果を示した。ラキニモドは、オープンアームにおいて用量依存的な活性の増加を示した。用量２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．が、最も活性であった。
【図１２Ａ】例４．２において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるオープンアームパラメータ−５分、Ｎ＝５匹／群）。ラキニモド（５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）が、有意な不安軽減効果を示した。
【図１２Ｂ】例４．２において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるオープンアームパラメータ−５分、Ｎ＝５匹／群）。ラキニモド（５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）が、有意な不安軽減効果を示した。
【図１２Ｃ】例４．２において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるオープンアームパラメータ−５分、Ｎ＝５匹／群）。ラキニモド（５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）が、有意な不安軽減効果を示した。
【図１２Ｄ】例４．２において行った高架式十字迷路モデルの結果を示す図（Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるオープンアームパラメータ−５分、Ｎ＝５匹／群）。ラキニモド（５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）が、有意な不安軽減効果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本願は、ヒト対象における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の血清濃度を増加する方法であって、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を対象に定期的に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
一実施形態において、その量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩の量は、１日に１回、ヒト対象に投与される。別の実施形態において、定期的な投与は、少なくとも３日間継続される。
【００２３】
一実施形態において、投与されるラキニモドの量は、０．１ｍｇ／日〜４０．０ｍｇ／日である。別の実施形態において、投与されるラキニモドの量は０．６ｍｇ／日である。別の実施形態において、その量のラキニモドは経口投与される。
【００２４】
一実施形態において、対象は、ＢＤＮＦ関連疾患を患っている。別の実施形態において、ＢＤＮＦ関連疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害または急性躁病である。
【００２５】
実施形態において、抑鬱障害は、鬱病、癌患者における鬱病、パーキンソン病患者における鬱病、心筋梗塞後の鬱病、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）をもつ患者における鬱病、亜症候群性の症候性鬱病、不妊症の女性における鬱病、小児鬱病、大鬱病、単一エピソード鬱病、再発性鬱病、児童虐待に誘発された鬱病、産後鬱病、ＤＳＭ−ＩＶの大鬱病、治療抵抗性の大鬱病、重篤な鬱病、精神病性鬱病、脳卒中後の鬱病、神経障害性疼痛、混合エピソードを伴う躁鬱病および鬱病性のエピソードを伴う躁鬱病を含む躁鬱病、季節性情動障害、双極性鬱病ＢＰ  Ｉ、双極性鬱病ＢＰ  ＩＩ、または気分変調を伴う大鬱病である。
【００２６】
別の実施形態において、不安障害は、全般性不安、パニック障害、恐怖症、心的外傷後ストレス障害、強迫性障害、分離不安または小児期不安である。
【００２７】
一実施形態において、その方法は、ある量の第２のＢＤＮＦ増加剤を対象に定期的に投与することをさらに含む。
【００２８】
一実施形態において、単独で服用したときの前記量の第２のＢＤＮＦ増加剤は、対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するために有効でない。
【００２９】
一実施形態において、ラキニモドの投与は、第２のＢＤＮＦ増加剤の投与に実質的に先行する。別の実施形態において、第２のＢＤＮＦ増加剤の投与は、ラキニモドの投与に実質的に先行する。
【００３０】
一実施形態において、対象に対する効果は、第２のＢＤＮＦ増加剤単独により治療された対象に対する効果よりも大きい。別の実施形態において、対象におけるＢＤＮＦ血清濃度の増加は、第２のＢＤＮＦ増加剤単独により治療された対象におけるＢＤＮＦ血清濃度の増加よりも大きい。
【００３１】
一実施形態において、ラキニモドの薬学的に許容される塩はラキニモドナトリウムである。
【００３２】
一実施形態において、投与前における対象の診断により、多発性硬化症、インスリン依存型糖尿病、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、乾癬、喘息、アテローム性動脈硬化症、脳卒中およびアルツハイマー病が除外された。
【００３３】
本願はまた、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害および急性躁病からなる群から選択されるＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象を治療する方法であって、ヒト対象を治療するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を定期的に投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための薬物の製造におけるラキニモドの使用を提供する。
【００３５】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドを含む医薬組成物を提供する。
【００３６】
本願はまた、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドおよび第２のＢＤＮＦ増加剤を含む医薬製剤を提供する。
【００３７】
前述の実施形態について、本明細書において開示されるそれぞれの実施形態は、他の開示された実施形態のそれぞれに対して適用可能であると考えられる。
【００３８】
用語
本明細書において用いられるとき、他に言及がない限り、以下の用語のそれぞれは以下に示される定義を有する。
【００３９】
本明細書において用いられるとき、「対象に投与すること」は、病的な状態を軽減または治癒するために、対象に薬物、薬剤または治療薬を与えること、調剤すること、または適用することを意味する。経口投与は、対象に当該化合物を投与する１つの方法である。
【００４０】
本明細書において用いられるとき、「ＢＤＮＦ」は、脳由来神経栄養因子を意味し、神経栄養因子は、成長因子のニューロトロフィンファミリーに属する。
【００４１】
本明細書において用いられるとき、「ＢＤＮＦ関連疾患」は、疾患を患う患者が、対応する健康な個体のＢＤＮＦ血清濃度より低いＢＤＮＦ血清濃度を有する疾患、および／またはその疾患を患う患者におけるＢＤＮＦの増加が、疾患もしくはその症状の回復に関連する疾患である。
【００４２】
本明細書において用いられるとき、「ＢＤＮＦ増加剤」は、対象におけるＢＤＮＦ濃度を、直接的または間接的に上昇させる任意の薬剤である。例えば、ＢＤＮＦ増加剤は、リルゾールまたはフルオキセチンなどの抗鬱剤であってよい。本明細書において用いられるとき、「剤」の用語は、任意の分子、化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、抗体もしくは薬剤、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００４３】
本明細書において用いられるとき、ラキニモドの「量」または「用量」は、ミリグラムで測定される際には、製剤の形態に関係なく、製剤中に存在するラキニモド酸のミリグラムを指す。例えば、ラキニモド０．６ｍｇは、製剤の形態に関係なく、製剤中におけるラキニモド酸の量が０．６ｍｇであることを意味する。したがって、塩、例えばラキニモドナトリウム塩の形態であるとき、ラキニモド０．６ｍｇの用量を提供するのに必要な塩の形態の重量は、追加の塩のイオンの存在により０．６ｍｇを超えるが、モル当量である。
【００４４】
本明細書において用いられるとき、目的を達成するための有効量であるときの「有効」は、本開示の様式で用いられるときに妥当な利益／リスクの比率と釣り合い、過度で有害な副作用（毒性、刺激またはアレルギー反応など）がない治療反応を示すために十分である成分量を意味する。例えば、過度で有害な副作用を引き起こすことなく、障害または疾患の症状を治療するための有効量。具体的な有効量は、治療される特定の状態、患者の身体的状態、治療される哺乳動物の種類、治療の期間、併用される治療（あるとすれば）の性質、ならびに用いられる具体的な処方、および化合物またはその誘導体の構造などの因子により変化する。
【００４５】
「塩」は、化合物の酸または塩基の塩を作製することにより改変されている当該化合物の塩である。この観点における「薬学的に許容される塩」の用語は、本発明の化合物の、比較的非毒性な無機および有機の酸または塩基の付加塩を指す。
【００４６】
ラキニモドの薬学的に許容される塩が使用されてもよい。本願において用いられるラキニモドの薬学的に許容される塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛、アルミニウムおよび鉄を含む。ラキニモドの塩の処方およびその製造方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５−０１９２３１５号およびＰＣＴ国際出願公開第２００５／０７４８９９号に記載されており、それらは、ここに参照することにより本願に組み込まれる。
【００４７】
本明細書において用いられるとき、「治療する」または「治療」は、例えば、障害および／または疾患の抑制、軽減または静止を誘発することを包含する。本明細書において用いられるとき、対象における病状進行または合併症の「抑制」は、対象における病状進行および／または合併症を防止または低減することを意味する。
【００４８】
本明細書において用いられるとき、「薬学的に許容される担体」は、妥当な利益／リスクの比率と釣り合い、過度で有害な副作用（毒性、刺激またはアレルギー反応など）がなく、ヒトおよび／または動物による使用に適した担体または賦形剤を指す。それは、対象に当該化合物を送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁剤または媒体であってよい。
【００４９】
本明細書において用いられるときの投与量単位は、単一の化合物、またはその化合物の混合物を含んでもよい。投与量単位は、錠剤、カプセル、丸薬、粉末および顆粒などの、経口投与の形態のために調製されてよい。
【００５０】
ラキニモドは、意図した投与形態の観点から適切に選択され、従来的な医薬の慣習と矛盾しない、適切な医薬の希釈剤、増量剤、賦形剤または担体（本明細書では薬学的に許容される担体と総称する）と混合して投与されてよい。この単位は、経口投与に適した形態にあってよい。ラキニモドは、単独で投与されてもよいが、一般に、薬学的に許容される担体と混合され、錠剤もしくはカプセルの形態で、リポソーム中で、または凝集された粉末として共投与される。適切な固体担体の例には、ラクトース、スクロース、ゼラチンおよび寒天を含む。カプセルまたは錠剤は、容易に処方することができ、嚥下または咀嚼が容易にできる；他の固体の形態には、顆粒および原薬粉末が挙げられる。錠剤は、適切な結合剤、潤滑剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香料、流動誘発剤および溶融剤を含有してもよい。
【００５１】
本発明の経口投与の形態を処方するために用いられ得る、技術、薬学的に許容される担体および賦形剤の具体例は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１９２３１５号、ＰＣＴ国際出願公開第ＷＯ２００５／０７４８９９、ＷＯ２００７／０４７８６３およびＷＯ／２００７／１４６２４８に記載されており、それらのそれぞれは、ここに参照することにより本願に組み込まれる。
【００５２】
本発明において有用な投与形態を作製するための一般的な技術および組成は、以下の参考文献、すなわち、７  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、９および１０章（Ｂａｎｋｅｒ  ＆  Ｒｈｏｄｅｓ編、１９７９）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ他、１９８１）；Ａｎｓｅｌ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  第２版（１９７６）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州、イーストン、１９８５）；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｄａｖｉｄ  Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ、Ｔｒｅｖｏｒ  Ｊｏｎｅｓ編、１９９２）；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第７巻（Ｄａｖｉｄ  Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ、Ｔｒｅｖｏｒ  Ｊｏｎｅｓ、Ｊａｍｅｓ  ＭｃＧｉｎｉｔｙ編、１９９５）；Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  ｆｏｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、シリーズ３６（Ｊａｍｅｓ  ＭｃＧｉｎｉｔｙ編、１９８９）；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第６１巻（Ａｌａｉｎ  Ｒｏｌｌａｎｄ編、１９９３）；Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ（Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｂｏｏｋｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ、Ｓ．Ｓ．Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｉｖｅ  Ｇ．Ｗｉｌｓｏｎ編）；Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４０巻（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編）に記載される。その全体にわたりこれらの参考文献は、ここに参照することにより本願に組み込まれる。
【００５３】
錠剤は、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、香料、流動誘発剤および溶融剤を含有してもよい。例えば、錠剤またはカプセルの投与単位の形態での経口投与のために、活性な薬剤成分は、ラクトース、ゼラチン、寒天、澱粉、スクロース、グルコース、メチルセルロース、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、マンニトール、ソルビトールおよび微結晶性セルロースなどの、経口の非毒性な薬学的に許容される不活性な担体と組み合わせてよい。適切な結合剤には、澱粉、ゼラチン、グルコースまたはベータ−ラクトースなどの天然糖、コーンスターチ、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然または人工のゴム、ポビドン、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびワックスなどを含む。これらの投与形態の中で用いられる潤滑剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ステアリン酸、フマル酸ステアリルナトリウムおよびタルクなどを含む。崩壊剤は、これらに限定するものではないが、澱粉、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、クロスカルメロースナトリウムおよび澱粉グリコール酸ナトリウムなどを含む。
【００５４】
パラメータの範囲が与えられるとき、その範囲内のすべての整数、およびその１０分の１の数値が、本発明により与えられると理解される。例えば、「０．１ｍｇ〜４０．０ｍｇ」は、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇなど４０．０ｍｇまでを含む。
【００５５】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することにより、より良く理解されるが、詳細に述べられる具体的な実験が、以下の特許請求の範囲においてより完全に説明される本発明の例示に過ぎないことは、当業者により容易に認識されるだろう。
【００５６】
実験の詳細
例１：再発寛解型多発性硬化症を患うヒト対象におけるＢＤＮＦ濃度に対するラキニモドの効果を示す臨床試験
１日当たり０．６ｍｇのラキニモドを、ナトリウム塩の形態で、経口で１日１回の錠剤の処方で用い、再発寛解型多発性硬化症（ＲＲＭＳ）の患者における試験を開始した。調査は、多国籍、多施設、無作為化、二重盲検、並行群間比較、プラセボ対照試験でありＲＲＭＳを有する対象における２用量のラキニモド投与の有効性、耐容性および安全性を評価した。適格な対象を、以下の３つの群に無作為化した：
１．１日１回の経口（ｐ．ｏ．）の０．６ｍｇのラキニモド；
２．１日１回の経口（ｐ．ｏ．）の０．３ｍｇのラキニモド；および
３．１日１回の経口（ｐ．ｏ．）の対応するプラセボ。
【００５７】
対象は、試験に含めるべき以下の試験対象患者基準を満たさなければならない；
１．マクドナルド基準により定義される確定されたＭＳの診断；
２．ＲＲＭＳ疾患の経過；
３．スクリーニング以前の１２か月に少なくとも１回の記録された再発数ｎ；
４．それらのＭＲＩスキャンスクリーニングにおいて少なくとも１つのガドリニウム増強のある病変；
５．Ｋｕｒｔｚｋｅ  ＥＤＳＳスコアが１．０〜５．０（変換済）であり歩行可能；
６．１８〜５０歳の間（両端を含む）の年齢；
７．スクリーニング時のＭＲＩスキャン以前の少なくとも３０日間に無再発、およびコルチコステロイドまたはＡＣＴＨ不使用；
８．スクリーニングから無作為化までの間に無再発、およびコルチコステロイド不使用；
９．受胎調節のための確かな方法が実施された出産可能な女性；
１０．調査期間中においてプロトコルの要件に従うことを厭わない、または従うことができる；および
１１．試験の開始前に、署名された書面でのインフォームドコンセントが可能である。
【００５８】
以下の臨床試験除外基準の何れかの１つを満たす対象を試験から除外した：
１．何れかの形態の進行性ＭＳを患っている；
２．スクリーニング来診以前の６か月以内の免疫抑制性または細胞毒性性治療の使用（アザチオプリン、シクロホスファミドおよびメトトレキサートを含む）；
３．スクリーニング以前の６か月以内の実験的薬物の使用および／または薬物臨床試験への参加；
４．スクリーニング以前の２か月以内の免疫調節剤（ＩＦＮ−β  １ａおよび１ｂ、酢酸ガラティラメル、ラキニモドならびにＩＶＩＧを含む）による先の治療；
５．ベースライン来診以前の２週間以内のＣＹＰ３Ａ４の強力阻害剤、例えば、経口のケトコナゾールおよびエリスロマイシンの使用；
６．アミオダロンの先の使用；
７．ベースライン来診以前の１か月におけるフルオキセチンの使用；
８．スクリーニング以前の２週間以内のテオフィリンおよびワルファリンなどのＣＹＰ１Ａ２の基質の使用；
９．スクリーニング来診以前の最近２年以内のクラドリビンによる先の治療；
１０．潜在的に免疫抑制が禁忌となる対象、例えば、Ｂ／Ｃ型肝炎またはＨＩＶ；
１１．先の全身放射線照射または全身リンパ組織放射線照射；
１２．スクリーニング以前の２カ月以内の長期のコルチコステロイド治療（３０日または３０日以上の継続）；
１３．妊娠または授乳中；
１４．病歴、身体検査、ＥＣＧ、アブノーマル臨床検査および胸部Ｘ線により決定されるような、安全且つ完全な試験の参加を不可能にする臨床上著しいまたは不安定な内科的または外科的状態を有する対象、
１５．インフォームドコンセントを与えることが不可能、もしくは試験の完了が不可能、または対象が任意の理由のために試験に不適切な候補者であると試験員にみなされた場合；
１６．Ｇｄに対する感受性の既知の病歴；または
１７．ＭＲＩスキャニングを無事に受けることが不可能。
【００５９】
試験期間は４０週であり、２つの期間からなった；４週のスクリーニング期間（−４週［スクリーニング］から０週［ベースライン］）、および３６週の二重盲検治療（０週［ベースライン］から３６週［終了］）。
【００６０】
対象を、−４、０、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、３２および３６週で試験場において評価した。炎症マーカーのための試料を、０から３６週ですべての来診時に収集した。
【００６１】
血清中のＢＤＮＦ濃度を、プラセボ群（１０２人の患者がその群中にいた）およびラキニモド０．６ｍｇ群（１０６人の患者がその群中にいた）の患者において、０週（Ｖ０）、１２週（ｖ３）および３６週（Ｖ９）で測定した。血漿中のＢＤＮＦ含有量の分析はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて行った。血清中のＢＤＮＦ濃度はｐｇ／ｍＬを単位として表す。
【００６２】
結果
以下の表中における結果は、ラキニモド０．６ｍｇ／日群とプラセボ群の両方における平均ＢＤＮＦ濃度を表す。
【００６３】
ベースラインの値（Ｖ０にて）
【表１】
0005859438.tif 000002
【表２】
0005859438.tif 000003
【００６４】
１２週の値（Ｖ３にて）
【表３】
0005859438.tif 000004
【表４】
0005859438.tif 000005
【００６５】
３６週の値（Ｖ９にて）
【表５】
0005859438.tif 000006
【表６】
0005859438.tif 000007
【００６６】
Ｖ３から開始して、プラセボ群とラキニモド０．６ｍｇ群との間で統計的に有意なＢＤＮＦの上昇がある（信頼水準９５％で）。その差はまた、Ｖ９でも統計的に有意であった。
【００６７】
ラキニモドは、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ａＥＡＥ）のモデルにおいて有効であり、現在、ＭＳの患者において試験されている（ＩＩＩ相の臨床試験において）ので、多発性硬化症（ＭＳ）の治療におけるその使用の可能性が示唆される。ラキニモドも、その患者におけるＢＤＮＦ濃度を上昇するのに有効である。
【００６８】
ＢＤＮＦ濃度を上昇するラキニモドの能力は予想外である。ＭＳの治療とＢＤＮＦ濃度の増大との間の関係自体は立証されていなかった。ＭＳを治療するのに有効であるすべての薬剤が、ＢＤＮＦ濃度を上昇するのに有効であるとは限らない。最近の研究は、インターフェロン−β１ａおよびイムノグロブリンによる治療が、１２ヵ月後でさえ、治療が有益であるＭＳ患者においてさえ、血漿ＢＤＮＦ濃度の増大を示さないことを示した（Ｓａｒｃｈｉｅｌｌｉ、２００７）。ラキニモドが、治療のわずか１２週後に患者におけるＢＤＮＦ濃度を上昇するという知見は予想外である。
【００６９】
例２：ラキニモドはマウスモデルにおける抗鬱活性を示す−強制水泳試験（ＦＳＴ）
鬱病および不安障害は、約７〜２０％の生涯有病率を有する厄介な疾患である。動物モデルは、新規な抗鬱剤を確認するための探索において不可欠な手段である。様々なパラダイムが開発されており、前臨床の設定において新規な化合物の抗鬱様の可能性を検出するために役立つ（Ｃｒｙａｎ、２００２；Ｇａｎｂａｒａｎａ、２００１）。
【００７０】
強制水泳試験（ＦＳＴ）は、前臨床的に抗鬱活性をスクリーニングするために最も広く用いられる手段の１つである。急性試験は、Ｐｏｒｓｏｌｔら（１９７７）により初めて記載された。
【００７１】
試験は、ラットおよびマウスが逃げ出せない水の円筒中に配置されたときに静止した姿勢を発現するという観察に基づく。この行動は、ストレス性の状態に対処する活動的な行動とは対照的に、行動上の諦めであるとみなされる。抗鬱剤は、齧歯動物の静止を減少し、動機づけされた行動を増加して、諦めの状態を回避する。これは、水泳時間、移動距離、速度および壁を登る試み（強移動性）の増加により証明される。
【００７２】
ＦＳＴは、高い信頼性と予測の妥当性のあるスクリーニング手段とみなされる。この試験は、マウスおよびラットで実施される。
【００７３】
以下に記載する例２．１および２．２において、ＦＳＴを、薬剤投与の３日後に最後の薬剤投与の９０分後に雄性マウス（Ｂａｌｌｂ／ｃ  Ｈａｒｌａｎ  イリノイ州）において行った。直径１８ｃｍおよび深さ２０ｃｍの丸いガラスの円筒を用いた。水温は２４〜２８℃であった。動機付けされた行動を、静止、水泳および強移動性により定義した。
【００７４】
動物における静止は、Ｎｏｌｄｕｓのシステムにより測定したときに、動物の重心の移動が１０％よりも小さい移動により定義された。水泳は、動物の距離および速度により定義され、登ることは、強移動性（３０％より大きい動物の重心の移動）と関係する。動物は、６分間にわたり円筒の中に放たれ、スコアリングは、２分の順応の後に最後の４分間に行った。
【００７５】
すべての結果は、動物の行動の分析のためのカメラとソフトウエアとを含むＮｏｌｄｕｓ（オランダ）のシステムにより分析された。
【００７６】
例２．１
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で、経口で１、５、１０および２５ｍｇ／ｋｇ）、フルオキセチン（陽性対照、経口で１０ｍｇ／ｋｇ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは強制水泳試験を受けた。行動はビデオ記録され、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。結果を図４に示す。
【００７７】
結論
結果は、ラキニモドは、１ｍｇ／ｋｇでの移動性の増大および静止の減少と、より多い用量（２５ｍｇ／ｋｇのラキニモド）での有意性への傾向とにより表わされるように有意な抗鬱活性を示したことを示す。この実験において、陽性対照のフルオキセチンは、おそらく時間および用量が不最適な条件であったことにより有意な効果を示さなかった。
【００７８】
例２．２
Ｂａｌｂ／ｃマウスを６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で０．５、１、５および２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、フルオキセチン（陽性対照、１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは強制水泳試験に曝された。行動はビデオ記録され、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。結果を図５に示す。
【００７９】
結論
結果は、ラキニモドが、５および２５ｍｇ／ｋｇで移動性の増加および静止の減少により表わされるように有意な抗鬱活性を示したことを示す。陽性対照のフルオキセチンは、同じ活性の傾向を示した。これは、おそらく時間および用量が不最適な条件であることによる。
【００８０】
例３：ラキニモドはマウスのモデルにおける抗鬱活性を示す−オープンフィールド試験
不安障害は、異常で病的な恐怖および不安のいくつかの異なる形態を包含する網羅的な用語である。現在の精神医学的な診断基準は、広く様々な不安障害を認めている。最近の調査により、１８％ものアメリカ人がそれらの１または１以上の影響を受け得ることが分かっている（Ｋｅｓｓｌｅｒ他）。この障害は、全般性不安、パニック障害、恐怖症、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、強迫性障害（ＯＣＤ）、分離不安および小児期不安を含むいくつかの分類に分けられる。
【００８１】
長期にわたり投与された抗鬱剤、特に選択的セロトニン（５−ＨＴ）再取込阻害剤（ＳＳＲＩ）は、心的外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）および強迫性障害（ＯＣＤ）を含むすべての不安障害の治療において臨床的に有効であるが、ベンゾジアゼピン（ＢＤＺ）などの従来の抗不安剤の臨床効果は、全般性不安障害または急性パニック発作に限定される（Ｂｏｒｓｉｎｉ他）。従って、抗鬱剤の潜在的な抗不安効果は非常に妥当である。
【００８２】
オープンフィールド試験−以下に記載する例３．１および３．２において用いられる探索的な自発運動活性は、動物の行動の評価において最も普及しているものの１つである。それは、運動性パラメータと不安の両方を試験する（Ｐｒｕｔら）。個々のマウスを、床が３つの数字の区域、すなわち、より外側の周辺の区域１、中間の区域２、および最も中央の区域３に分割された、新しい５０×５０ｃｍのプレキシガラスの活動領域の中に置く。オープンフィールドにおける動物の行動は、ビデオテープ記録により２０分間にわたり記録され、次に、動物の行動についてＮｏｌｄｕｓソフトウエアを用いてデジタル分析される。測定は、一般的な運動性（移動距離、速度および強移動性）および不安パラメータ（中央の領域への巡回の頻度、内側のフィールド内で過ごした時間、および中央における立ち上がり現象の回数を含む）を含む。動物がより多く中央に留まり行動するほど、その不安は少ない。
【００８３】
例３．１
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウスを、６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で１、５、１０および２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、フルオキセチン（陽性対照、１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは２０分間にわたりオープンフィールドに曝された。挙動はビデオ記録され、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。運動性パラメータに関する結果を図６に示す。不安パラメータに関する結果を図７および８に示す。
【００８４】
結論
運動性パラメータ    −ラキニモドおよびフルオキセチンは、このモデルにおけるフィールド内での運動性パラメータを有意に変更しなかった。
【００８５】
不安パラメータ（区域２）    −ラキニモドにより処理された動物およびフルオキセチンにより処理された動物は、頻度、消費時間、移動距離および立ち上がり回数の観点から、中央においてより多く行動する傾向があった。結果は、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇが最も強力であったことを示す。
【００８６】
不安のパラメータ（区域２および３）    −ラキニモドにより処理された動物は、消費時間、移動距離および立ち上がり回数から証明されるように、中央においてより多く行動する傾向があった。結果は、１ｍｇ／ｋｇがこの実験において最も強力なラキニモドの投与量であったことを示す。
【００８７】
このモデルは、ラキニモドが抗不安作用を示すことを示す。
【００８８】
例３．２
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウスを、６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で０．５、１、５および２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、フルオキセチン（陽性対照、１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは２０分間にわたりオープンフィールド試験に曝された。行動はビデオ記録され、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。運動性パラメータの結果を図９に示す。不安パラメータの結果を図１０に示す。
【００８９】
結論
運動性パラメータ    −ラキニモド（０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／ｄ×３ｄ、ｐｏ）は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるオープンフィールドでの運動性（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ）のわずかな増加を誘導した。
【００９０】
不安パラメータ    −ラキニモド（０．５〜５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）により処理された動物およびフルオキセチン（１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）により処理された動物は、頻度、消費時間および立ち上がり回数により判断されるように、中央において有意により多く行動した。５ｍｇ／ｋｇが最も強力であった。
【００９１】
このモデルは、ラキニモドが抗不安作用を示すことを示す。
【００９２】
例４：ラキニモドはマウスモデルにおいて抗不安活性を示す−高架式十字迷路（ＥＰＭ）
以下に記載される例４．１および４．２において用いられるＥＰＭモデルは、オープンな高い場所を避ける齧歯動物の生まれつきの恐怖を利用する。装置は、床より上に高くした、２つの囲壁アームと２つの対向するオープンアームとを有する十字迷路からなる。未処置の動物は、オープンアーム上で試験時間の約３０％のみを過ごすだけであるが、ベンゾジアゼピンによる処理は、オープンアームの探索を著しく増加する（Ｐｅｌｌｏｗら）。これは、不安様行動の影響を調査するために最も広く用いられるモデルの１つである。
【００９３】
迷路は、地上５０ｃｍのプラットフォーム上の２つの対向するオープンアーム（４０×１０ｃｍ）と、２つの対向するクローズドアーム（４０×１０ｃｍ、４０ｃｍの壁をもつ）とからなる。マウスは、オープンアームに面する中央四角（１０×１０ｃｍ）内に配置され、５分の探索の間、ビデオテープに記録される。アーム進入および所要時間は、４本すべての足がアームに進入したときにスコア化された。
【００９４】
例４．１
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウスを、６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で０．５、１、５および２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、フルオキセチン（陽性対照、１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは５分間にわたりＥＰＭに曝された。マウスは、オープンアームに面する中央四角（１０×１０ｃｍ）内に配置され、５分の探索の間、ビデオテープ記録された。通路の進入および所要時間は、４本すべての足がアームに進入したときにスコア化された。行動は、ビデオ記録されて、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。結果を図１１に示す。
【００９５】
結論
ラキニモドにより処理されたマウスは、用量依存的に抗不安効果を示す。最大の効果は、２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏの用量で得られた。
【００９６】
例４．２
Ｂａｌｂ／ｃ雄性マウスを、６つの群（５匹／群）に分けて、３日間にわたり毎日、ラキニモド（経管栄養によりラキニモドナトリウム溶液の形態で０．５、１、５および２５ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．）、フルオキセチン（陽性対照、１０ｍｇ／ｋｇ、ｐｏ）または媒体を投与した。３日目において投与後９０分に、マウスは５分間にわたりＥＰＭに曝された。行動はビデオ記録され、オープンアームパラメータが、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｎｏｌｄｕｓ、オランダ）を用いて分析された。結果を図１２に示す。
【００９７】
結論
ラキニモドにより処理されたマウスは、用量依存的に抗不安効果を示す。最大の効果は、５〜２５ｍｇ／ｋｇ、ｐｏで得られた。
［付記］
［１］  ヒト対象における脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の血清濃度を増加する方法であって、ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を対象に対して定期的に投与することを含む方法。
［２］  前記量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩が、１日に１回、ヒト対象に対して投与される前記［１］に記載の方法。
［３］  定期的な投与が、少なくとも３日間にわたり継続する前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］  投与されるラキニモドの量が、０．１ｍｇ／日〜４０．０ｍｇ／日である前記［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］  投与されるラキニモドの量が、０．６ｍｇ／日である前記［４］に記載の方法。
［６］  前記量のラキニモドが経口投与される前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］  対象が、ＢＤＮＦ関連疾患を患っている前記［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］  ＢＤＮＦ関連疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害または急性躁病である前記［７］に記載の方法。
［９］  抑鬱障害が、鬱病、癌患者における鬱病、パーキンソン病患者における鬱病、心筋梗塞後の鬱病、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）をもつ患者における鬱病、亜症候群性の症候性鬱病、不妊症の女性における鬱病、小児鬱病、大鬱病、単一エピソード鬱病、再発性鬱病、児童虐待に誘発される鬱病、産後鬱病、ＤＳＭ−ＩＶの大鬱病、治療抵抗性の大鬱病、重篤な鬱病、精神病性鬱病、脳卒中後の鬱病、神経障害性疼痛、混合エピソードを伴う躁鬱病および鬱病性のエピソードを伴う躁鬱病を含む躁鬱病、季節性情動障害、双極性鬱病ＢＰ  Ｉ、双極性鬱病ＢＰ  ＩＩ、または気分変調を伴う大鬱病である前記［８］に記載の方法。
［１０］  不安障害が、全般性不安、パニック障害、恐怖症、心的外傷後ストレス障害、強迫性障害、分離不安または小児期不安である前記［８］に記載の方法。
［１１］  ある量の第２のＢＤＮＦ増加剤を対象に対して定期的に投与することをさらに含む前記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］  単独で服用したときの前記量の第２のＢＤＮＦ増加剤が、対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するために有効ではない前記［１１］に記載の方法。
［１３］  ラキニモドの投与が、第２のＢＤＮＦ増加剤の投与に実質的に先行する前記［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］  第２のＢＤＮＦ増加剤の投与が、ラキニモドの投与に実質的に先行する、前記［１１］または［１２］に記載の方法。
［１５］  対象における効果が、第２のＢＤＮＦ増加剤単独で治療された対象における効果よりも大きい前記［１１］〜［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］  対象におけるＢＤＮＦ血清濃度の増加が、第２のＢＤＮＦ増加剤単独で治療された対象におけるＢＤＮＦ血清濃度の増加よりも大きい前記［１５］に記載の方法。
［１７］  ラキニモドの薬学的に許容される塩がラキニモドナトリウムである前記［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］  パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、抑鬱障害、不安障害、色素性網膜炎、勃起不全、記憶障害、レット症候群、アルツハイマー病、双極性障害および急性躁病からなる群から選択されるＢＤＮＦ関連疾患を患うヒト対象を治療する方法であって、ヒト対象を治療するために有効な量のラキニモドまたはその薬学的に許容される塩を定期的に投与することを含む方法。
［１９］  ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための薬物の製造におけるラキニモドの使用。
［２０］  ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドを含む医薬組成物。
［２１］  ヒト対象におけるＢＤＮＦ血清濃度を増加するための使用のために有効な量のラキニモドおよび第２のＢＤＮＦ増加剤を含む医薬製剤。
【参考文献】
【００９８】
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【図１】
0005859438.tif 000008
【図２】
0005859438.tif 000009
【図３】
0005859438.tif 000010
【図４Ａ】
0005859438.tif 000011
【図４Ｂ】
0005859438.tif 000012
【図４Ｃ】
0005859438.tif 000013
【図４Ｄ】
0005859438.tif 000014
【図５Ａ】
0005859438.tif 000015
【図５Ｂ】
0005859438.tif 000016
【図５Ｃ】
0005859438.tif 000017
【図５Ｄ】
0005859438.tif 000018
【図６Ａ】
0005859438.tif 000019
【図６Ｂ】
0005859438.tif 000020
【図６Ｃ】
0005859438.tif 000021
【図６Ｄ】
0005859438.tif 000022
【図７Ａ】
0005859438.tif 000023
【図７Ｂ】
0005859438.tif 000024
【図７Ｃ】
0005859438.tif 000025
【図７Ｄ】
0005859438.tif 000026
【図８Ａ】
0005859438.tif 000027
【図８Ｂ】
0005859438.tif 000028
【図８Ｃ】
0005859438.tif 000029
【図９Ａ】
0005859438.tif 000030
【図９Ｂ】
0005859438.tif 000031
【図９Ｃ】
0005859438.tif 000032
【図９Ｄ】
0005859438.tif 000033
【図１０Ａ】
0005859438.tif 000034
【図１０Ｂ】
0005859438.tif 000035
【図１０Ｃ】
0005859438.tif 000036
【図１１Ａ】
0005859438.tif 000037
【図１１Ｂ】
0005859438.tif 000038
【図１１Ｃ】
0005859438.tif 000039
【図１１Ｄ】
0005859438.tif 000040
【図１２Ａ】
0005859438.tif 000041
【図１２Ｂ】
0005859438.tif 000042
【図１２Ｃ】
0005859438.tif 000043
【図１２Ｄ】
0005859438.tif 000044