(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの異種タンパク質の発現が内因性調節系により調節されるように、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を細胞の染色体内にインテグレートするための方法であって、該方法が：
ａ）（ｉ）少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的配列に結合することができ、かつアクチン、チューブリン、またはラミンから選択される内因性タンパク質をコードする標的とされる染色体配列における切断部位を切断することができるものである；および（ｉｉ）異種タンパク質コード配列を形成するために２Ａペプチドをコードする配列に連結される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を含み、該異種タンパク質コード配列が切断部位の両側と実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれるものである、少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入すること；および
ｂ）標的エンドヌクレアーゼにより標的とされる染色体配列内に導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチドにおける異種タンパク質コード配列が、標的とされる染色体配列内にインフレームでインテグレートされ、それにより少なくとも一つの異種タンパク質の発現が、該内因性タンパク質の発現を調節する内因性調節系により調節されるように、相同性指向修復過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、
を含む方法。
【請求項２】
標的エンドヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２Ａペプチドをコードする配列が異種タンパク質をコードする配列に５’または３’で連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
異種タンパク質コード配列が、標的とされる染色体配列のタンパク質コード配列の開始付近または終止付近にインテグレートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの異種タンパク質が抗体の重鎖または軽鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞がヒト細胞またはほ乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的エンドヌクレアーゼが、配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号５および６、または配列番号７および８と少なくとも８０％の配列同一性を有する一対の配列に結合する一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
配列同一性が８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、標的とされる染色体配列がアクチンタンパク質をコードし、かつジンクフィンガーヌクレアーゼが配列番号７および配列番号８から選択される配列に結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含み、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列が、少なくとも一つの異種タンパク質の発現が、アクチン、チューブリン、またはラミンから選択される内因性タンパク質の発現と協調的に制御されるように、該内因性タンパク質をコードする染色体配列とインフレームでインテグレートされるものである、細胞。
【請求項１１】
内因性タンパク質および異種タンパク質のそれぞれが個別の構成要素として生成される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
少なくとも一つの異種タンパク質の発現を調節するために、内因性調節系を使用するための方法であって、該方法が：
（ａ）２Ａペプチドをコードする配列に連結された少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含み、異種タンパク質および２Ａペプチドをコードする配列が、アクチン、チューブリン、またはラミンから選択される内因性タンパク質をコードする染色体配列とインフレームでインテグレートされるものである、細胞を提供すること；および
（ｂ）内因性調節系の活性化が、異種タンパク質、２Ａペプチド、および内因性タンパク質をコードする１つの転写産物を生成し、ここに２Ａペプチドが、異種タンパク質および内因性タンパク質のそれぞれが個別の構成要素として生産されるように翻訳を分断させるものであるような条件下で、細胞を維持すること、
を含む方法。
【請求項１３】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であり、染色体配列がアクチンタンパク質をコードし、かつ異種タンパク質が抗体の重鎖または軽鎖である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７０２号、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７１９号、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，６９８号、２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３６７，０１７号、２０１０年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３９０，６６８号、２０１０年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４０８，８５６号、および２０１１年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４３１，９５７号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、異種タンパク質の発現を調節するための、内因性転写制御経路の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ほ乳類細胞内で組換えタンパク質を発現することにはいくつかの課題がある。第一に、異種ＤＮＡがほ乳類ゲノム内に安定に組み込まれる必要がある。ウイルス性および非ウイルス性トランスフェクション法などの多数の方法は、ＤＮＡをランダムにゲノムにインテグレートし、オフターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）および発現のばらつき（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を作りだす。組換えをベースとする戦略（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰまたはＦｌｐ−ＦＲＴ）は、確定した位置への異種ＤＮＡの挿入を可能にするが、第一に、特定の組換え部位を含む細胞株を作りだし、特徴付けなければならない。これは時間のかかる過程であるだけでなく、リコンビナーゼ部位がランダムに配置されるものである。第二に、異種ＤＮＡが強力なプロモーターに連結される必要がある。一般に、ウイルス起源のプロモーターが用いられるが、これらはサイレンシングの影響を受けやすい。異種ＤＮＡを、それが強力な内因性プロモーターから発現されるように、ほ乳類ゲノム内へ正確に標的化およびインテグレートできることが望ましいだろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、内因性調節系が異種タンパク質の発現を調節するように、ゲノムにおいて標的とされる位置内へ異種タンパク質をコードする配列をインテグレートするための方法が提供される。
【０００５】
本開示の一つの態様は、少なくとも一つの異種タンパク質の発現が内因性調節系により調節されるように、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を細胞の染色体にインテグレートするための方法を包含する。該方法は、（ｉ）少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、ここに該標的エンドヌクレアーゼは標的配列に結合することができ、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列における切断部位を切断することができるものである；および（ｉｉ）異種タンパク質コード配列を形成するために２Ａペプチドをコードする配列に連結される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を含む、少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドにおける異種タンパク質コード配列は、染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれる。該方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼにより染色体配列内に導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチドにおける異種タンパク質コード配列が、標的とされる染色体配列内にインフレームでインテグレートされ、それにより少なくとも一つの異種タンパク質の発現が、内因性タンパク質の発現を調節する内因性調節系により調節されるように、相同性指向修復過程（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｃｅｓｓ）により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、を含む。
【０００６】
別の態様では、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列が内因性タンパク質をコードする染色体配列とインフレームでインテグレートされる、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞を提供する。少なくとも一つの異種タンパク質の発現は、細胞において内因性タンパク質の発現と協調的に制御される。
【０００７】
本開示のまた別の態様はドナーポリヌクレオチドを包含する。該ドナーポリヌクレオチドは、異種タンパク質コード配列を形成するために２Ａペプチドをコードする配列に連結される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を含む。さらに、該ドナーポリヌクレオチドにおける異種タンパク質コード配列は、標的細胞の染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有する上流配列および下流配列に挟まれる。
【０００８】
さらなる態様は、内因性タンパク質をコードする染色体配列内に、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列をインテグレートするためのキットを提供する。該キットは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも一つの核酸を含み、ここに該ジンクフィンガーヌクレアーゼは標的配列に結合することができ、かつ染色体配列における切断部位を切断することができるものである。該キットはさらに、少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを含む。該ドナーポリヌクレオチドは、異種タンパク質コード配列を形成するために２Ａペプチドをコードする配列に連結される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を含み、ここに該異種タンパク質配列は、細胞の染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を有する上流配列および下流配列に挟まれるものである。
【０００９】
また別の態様は、少なくとも一つの異種タンパク質の発現を調節するために、内因性調節系を使用するための方法を提供する。該方法は、２Ａペプチドをコードする配列に連結された少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞を提供することを含み、ここに異種タンパク質および２Ａペプチドをコードする配列は内因性タンパク質をコードする染色体配列とインフレームでインテグレートされるものである。該方法はさらに、内因性調節系の活性化が、異種タンパク質、２Ａペプチド、および内因性タンパク質をコードする１つの転写産物を生成し、ここに２Ａペプチドが、異種および内因性タンパク質のそれぞれが個別の構成要素（ｄｉｓｃｒｅｔｅ  ｅｎｔｉｔｙ）として生産されるように翻訳を分断させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）ものであるような条件下で、細胞を維持すること、を含む。
【００１０】
本開示の他の態様および特徴は、以下に、より詳細に記載される。
【００１１】
カラー図面の参照
本願は、カラーで制作された少なくとも一つの写真を含む。カラー写真付きの本特許出願公報の写しは、請求および必要手数料の支払いにより、特許庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ヒトＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）での標的化インテグレーションを表す。（Ａ）は、異種コード配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位（囲まれた領域）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびインテグレーション部位（緑色の矢印）での染色体配列（配列番号９）を示す概略図である。インテグレーション部位は切断部位の７ｂｐ下流であった。（Ｂ）は、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座、インテグレーション部位、ＳＨ２バイオセンサーの設計、およびインテグレーション成功後に発現されるタンパク質の概略図を示す。
【００１３】
【図２】図２は、標的領域でＴＵＢＡ１Ａ配列に挟まれるＳＨ２バイオセンサー配列を含むドナープラスミドのマップを表す。
【００１４】
【図３】図３は、野生型および標的化インテグレーションを備える細胞のウェスタンブロットの画像を示す。
【００１５】
【図４】図４は、ＧＦＰ−２ｘＳＨ２（Ｇｒｂ２）−２Ａタンパク質を発現する、個々の単離された細胞クローンの微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像を示す。蛍光画像は、１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦへの暴露後のバイオセンサー移行（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）の時間経過を示す。
【００１６】
【図５】図５は、ヒトＡＣＴＢ遺伝子座での標的化インテグレーションを表す。異種コード配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域におけるＺＦＮ結合部位（黄色の配列）、ＺＦＮ切断部位（上部、黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（下部、緑／黄色の矢印）での染色体配列（配列番号１０）が示される。
【００１７】
【図６】図６は、標的領域でＡＣＴＢ配列に挟まれるＳＨ２バイオセンサー配列を含むドナープラスミドのマップを表す。
【００１８】
【図７】図７は、ＧＦＰ−２ｘＳＨ２（Ｇｒｂ２）−２Ａ（上部パネル）およびＲＦＰ−β−アクチン（下部パネル）を発現する個々の単離された細胞クローンの蛍光顕微鏡画像を表す。１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦへの暴露後の時間経過が示される。
【００１９】
【図８】図８は、ＬＭＮＢ１遺伝子座での標的化インテグレーションを表す。異種コード配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域におけるＺＦＮ結合部位（黄色の配列）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（緑色の矢印）での染色体配列（配列番号１１）が示される。
【００２０】
【図９】図９は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のＡＣＴＢ遺伝子座における標的化インテグレーションの部位を示す。異種コード配列のインテグレーションのための標的領域、ＺＦＮ結合部位（囲まれた領域）、ＺＦＮ切断部位、および標的化インテグレーション部位での染色体配列（配列番号１２）が示される。
【００２１】
【図１０】図１０は、ＺＦＮ切断部位の上流および下流の、ＣＨＯのＡＣＴＢ配列に挟まれるＳＥＡＰ−２Ａ−ＧＦＰ配列を含むドナープラスミドのマップを表す。
【００２２】
【図１１】図１１は、ＣＨＯ細胞のＡＣＴＢ遺伝子座内へのＳＥＡＰ−２Ａ−ＧＦＰ配列の標的化インテグレーションのジャンクションＰＣＲ解析を表す。増幅された断片は予想されるサイズである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
異種タンパク質の発現が内因性転写制御系により調節されるように、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列を、細胞染色体において標的とされる位置内にインテグレートするための方法が、本明細書で開示される様々な態様のうちの一つである。それゆえ、外因性（例えば、ウイルス性）プロモーターを使用するよりも、プロモーター配列だけでなく、転写開始部位の上流および下流に位置する他のシス調節因子（ｃｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む内因性の系により、発現が調節される。有利なことに、内因性の系はサイレンシング効果の影響を受けにくい。さらに、２Ａペプチドコード配列に異種コード配列を連結することにより、翻訳の間、個々の異種タンパク質および内因性タンパク質が作られる。異種タンパク質をコードする配列は、標的エンドヌクレアーゼゲノム改変（ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ）過程により、標的とされる染色体位置内にインテグレートされる。本明細書では、内因性調節系に作動可能なように連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞、および異種タンパク質を発現するために内因性調節系を用いるための方法もまた提供される。
【００２４】
（Ｉ）発現が内因性調節系により調節される異種配列を含む細胞
本開示の一つの態様は、発現が内因性調節系により調節される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞を包含する。特に、異種タンパク質をコードする配列が、内因性タンパク質をコードする内因性染色体配列とインフレームでインテグレートされる。標的エンドヌクレアーゼゲノム改変を介する過程を用いて、異種コード配列を対象の内因性染色体配列に標的化およびインテグレートさせる。さらに、異種コード配列は２Ａペプチドコード配列に連結される。転写の活性化により、異種および内因性配列は単一の転写産物として転写される。翻訳の間、異種タンパク質が内因性タンパク質から「切断」され、それによって１つのオープンリーディングフレームから二以上のタンパク質の協調した合成を可能にするように、２Ａペプチドが翻訳を分断させる。
【００２５】
（ａ）異種配列
異種タンパク質（単数または複数）の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は変化でき、変化するであろう。一般的に、任意のタンパク質をコードする配列が、標的とされる染色体位置内にインテグレートされてもよい。異種タンパク質は、天然に存在するタンパク質またはそれらの断片、組換えタンパク質、融合タンパク質、レポータータンパク質、タグ付きタンパク質、野生型タンパク質、治療用タンパク質、診断用タンパク質、抗体などであってもよい。例えば、異種タンパク質は抗体の重鎖あるいは軽鎖とすることができる。異種タンパク質は、種々の供給源に由来することができ、例えば、ほ乳類、脊椎動物、無脊椎動物、植物、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、細菌、および原始細菌が挙げられる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、二以上の異種タンパク質をコードする配列が染色体配列内へインテグレートされ得る。例えば、２、３、４、またはそれより多い異種タンパク質をコードする配列が、内因性調節系が２、３、４、またはそれより多い異種タンパク質の発現を調節するように、染色体配列内へインテグレートされてもよい。
【００２７】
一般的に、異種タンパク質をコードする配列は、対象の細胞における最適な発現のために最適化されたコドンであるだろう。異種タンパク質をコードする配列は、エキソンの（あるいはタンパク質をコードする）配列を含んでもよい。あるいは、エキソンの配列と同様にイントロンの配列を含んでもよい。
【００２８】
上述のように、異種タンパク質をコードする配列は２Ａペプチドに連結される。本明細書で用いる場合、用語「２Ａペプチド」とは、任意の２Ａペプチドもしくはそれらの断片、任意の２Ａ様ペプチドもしくはそれらの断片、または必要なアミノ酸を含む人工ペプチドをさす。２Ａペプチドは当初、翻訳の間に成熟した個々のタンパク質へ「切断」されるポリタンパク質を生成する、プラス鎖ＲＮＡウイルスにおいて特徴づけられた。より具体的には、２Ａペプチド領域（〜２０アミノ酸）は、ポリタンパク質の２Ｂ領域からそれ自身を放出するために、それ自身のＣ末端での切断を介在する。２Ａペプチド配列は、グリシンおよびプロリン残基で終結する。２Ａペプチドの翻訳の間、リボソームはグリシン残基の後で一時停止し、新生ポリペプチド鎖の放出をもたらす。下流タンパク質の第一アミノ酸となる２Ａ配列のプロリン残基を備え、翻訳が再開する。
【００２９】
異種コード配列に連結する２Ａペプチドコード配列は、全長２Ａペプチドをコードしてもよい。あるいは、２ＡペプチドのＣ末端断片をコードしてもよい。該Ｃ末端断片は、Ｃ末端終端の約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４アミノ酸を含み得る。
【００３０】
２Ａペプチドをコードする配列は、異種タンパク質をコードする配列の５’末端または３’末端に連結され得る。異種配列が内因性コード配列の開始付近にインテグレートされる実施形態では、２Ａペプチド配列は異種タンパク質をコードする配列の３’末端に連結されるだろう。従って、結果として得られたｍＲＮＡは以下の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）：５’−（異種タンパク質−２Ａペプチド）ｎ−内因性タンパク質−３’、ここにｎは異種タンパク質の数を表すものである、を有する。異種配列が内因性コード配列の終止付近にインテグレートされる実施形態では、２Ａペプチド配列は異種タンパク質をコードする配列の５’末端に連結されるだろう。それゆえ、結果として得られたｍＲＮＡは以下の配向：５’内因性タンパク質−（２Ａペプチド−異種タンパク質）ｎ−３’、ここにｎは上記に定義される通りのものである、を有する。
【００３１】
（ｂ）内因性調節系
一般的に、異種配列のインテグレーションのために選ばれる内因性染色体配列は、所望の発現特性（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｙ）に依存する。本明細書で用いる場合、用語「内因性調節系」とは、染色体配列（すなわち、プロモーター、エンハンサー等の転写制御因子）、および、染色体配列の転写を調節するために共に働く、調節制御タンパク質（すなわち、一般的および特異的な転写因子）をさす。標的配列は、転写制御配列因子（例えば、プロモーターおよび他の制御因子）、ならびに、転写される染色体配列（すなわち、非翻訳および翻訳配列）を含む。タンパク質コード配列の発現は種々の配列因子により制御され得るが、以下、議論しやすいように用語「プロモーター」が用いられる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、構成的プロモーターを利用する内因性標的配列を標的とすることが望ましい。構成的プロモーターは、多くの種類の細胞で活性である傾向にある。適した構成的プロモーターの非限定的な例には、α−チューブリン、β−チューブリン、アルファ−アクチン、ベータ−アクチン等の、細胞骨格タンパク質；ヒストンタンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、転写因子、細胞周期タンパク質、プロテアソームタンパク質等の、ユビキタスな細胞タンパク質；アミノ酸、糖質、または脂質代謝、クエン酸回路、ミトコンドリア機能等に関連する酵素の発現を調節するものが挙げられる。いくつかの構成的プロモーターはまた、その活性化が高レベルの遺伝子産物をもたらすという点で、強力なプロモーターと称することができる。
【００３３】
他の実施形態では、発現が、例えば、筋肉細胞、神経細胞、肝細胞、膵ベータ細胞、心臓細胞、乳腺細胞等の特定の細胞型にあるのが望ましい。当業者は、細胞特異的あるいは組織特異的な発現のため用いることができる、適切な細胞特異的プロモーターを熟知している。また別の実施形態では、調節可能または誘導性の発現が望ましい。適した誘導性プロモーターには、ステロイドホルモン、成長因子、金属イオン、熱ショックなどにより調節されるものが挙げられる。
【００３４】
ヒトまたはほ乳類の発現調節系の非限定的な例には、チューブリン、アクチン、またはラミンタンパク質の発現をコードし、調節するものが挙げられる。
【００３５】
一般的に、異種タンパク質をコードする配列は、対象のタンパク質をコードする内因性配列とインフレームでインテグレートされる。該異種配列は、内因性コード配列の開始コドンの後にインフレームでインテグレートされてもよい。あるいは、該異種配列は、内因性コード配列の終止コドンの前にインフレームでインテグレートされてもよい。
【００３６】
（ｃ）細胞
上述の、異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞の種類は、変化でき、変化するであろう。一般的に、細胞は真核細胞であろう。場合によっては、該細胞は初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）、培養細胞、または不死化細胞株細胞とすることができる。適した細胞には、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの、真菌または酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９細胞もしくはドロソフィア・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＳ２細胞などの、昆虫細胞；マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、もしくはヒト細胞などの、動物細胞が挙げられる。例示的な細胞はほ乳類である。ほ乳類細胞は、初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）であってもよい。一般的に、二本鎖切断に感受性である任意の初代細胞を用いることができる。細胞は、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴもしくはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞など、様々な細胞型であってもよい。
【００３７】
ほ乳類細胞株が用いられる場合、細胞株は任意の樹立された細胞株、またはまだ記載されていない初代細胞株であってもよい。細胞株は接着性もしくは非接着性であってもよく、あるいは、細胞株は、当業者に知られた標準的な技術を使用して、接着性、非接着性もしくは器官型の生育を促す条件下で成長させてもよい。適したほ乳類細胞株の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ７）、ヒト胎児腎臓株２９３、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳癌細胞（ＭＭＴ）、ラット肝臓癌細胞（ＨＴＣ）、ＨＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞株、ヒトＡ５４９細胞株、ヒトＫ５６２細胞株、ヒトＨＥＫ２９３細胞株、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株、およびＴＲＩ細胞が挙げられる。ほ乳類細胞株の広範なリストに関して、当業者は、アメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ（ＡＴＣＣ登録商標、Ｍａｍａｓｓａｓ、ＶＡ）を参照することができる。
【００３８】
さらに他の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。適した幹細胞には、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、人工多能性幹細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
さらなる実施形態では、細胞は一細胞胚（ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏ）であってもよい。胚は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。適した脊椎動物には、ほ乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられる。適したほ乳類の例には、齧歯類、コンパニオンアニマル、家畜、および非霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。齧歯類の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびモルモットが挙げられる。適したコンパニオンアニマルには、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。家畜の非限定的な例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマおよびアルパカが挙げられる。適した非霊長類には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびオナガザルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鳥類の非限定的な例には、鶏、七面鳥、アヒルおよびガチョウが挙げられる。あるいは、動物は、昆虫、線虫等などの無脊椎動物であってもよい。昆虫の非限定的な例には、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および蚊が挙げられる。
【００４０】
（ＩＩ）異種コード配列をインテグレートするための方法
本開示の別の態様は、異種タンパク質の発現が内因性調節系により制御されるように、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする核酸を、細胞染色体において標的とされる位置内へインテグレートするための方法を提供する。該方法は、内因性コード配列とのインフレームでの異種コード配列のインテグレーションを介在するために、標的エンドヌクレアーゼを用いることを含む。より具体的には、該方法は、少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および異種コード配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含む。該方法はさらに、該標的エンドヌクレアーゼにより内因性染色体配列内に導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチドにおける異種配列が、標的とされる染色体配列のコード配列とインフレームでインテグレートされ、それによって異種コード配列を内因性調節系に連結するように、相同性指向修復過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、を含む。該方法の構成要素は、以下に詳述される。
【００４１】
（ａ）標的エンドヌクレアーゼ
本方法は、一つには、少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または人工タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼとすることができる。他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化物質様エフェクター（ＴＡＬＥ）−ヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼとすることができる。典型的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下に記載される、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含む。
【００４２】
（ｉ）ジンクフィンガー結合ドメイン
ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の最適な核酸配列を認識し、結合するように操作されてもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：７０２−７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質に比べて、新規の結合特異性を有してもよい。操作方法は、合理的設計および様々な型の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、二重鎖、三重鎖、および／または四重鎖ヌクレオチド配列ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含み、ここに各二重鎖、三重鎖、および／または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの一以上のアミノ酸配列と会合されるものである、データベースを使用することが挙げられる。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。例として、米国特許第６，４５３，２４２号において記載されるアルゴリズムを使用して、事前に選択された配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。また、非縮重認識コード表を使用する合理的設計などの代替方法を使用して、特定の配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列における標的部位候補を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、公的に利用可能なウェブをベースとするツールが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇおよびｈｔｔｐ：／／ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／  にそれぞれ見つかり得る（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５）。
【００４３】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長、または約８から約１９ヌクレオチド長の範囲であるＤＮＡ配列を認識し、結合するように設計することができる。一般的に、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を含む。一つの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは４つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは５つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。また別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは６つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適した標的ＤＮＡ配列に結合するように設計されてもよい。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６０７，８８２号、同第６，５３４，２６１号および同第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【００４４】
ジンクフィンガー認識領域を選択するための例示的な方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムが挙げられ、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに、国際公開第９８／３７１８６号；国際公開第９８／５３０５７号；国際公開第００／２７８７８号；国際公開第０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。さらに、ジンクフィンガー認識領域に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号に記載される。
【００４５】
ジンクフィンガー結合ドメイン、ならびに融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に知られており、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳しく記載される。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチ−フィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む、適したリンカー配列を使用して、共に結合することができる。６以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的な例に関して、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーの組み合わせを含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはさらに核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。ＮＬＳは、染色体における標的配列で二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化させることを促進する、アミノ酸配列である。核局在化シグナルは当分野において知られている。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７を参照されたい。
【００４７】
例示的なジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１、２、３、４、５、６、８および９から選択される配列と、少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を認識し、結合する。他の実施形態では、配列同一性は、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってもよい。
【００４８】
（ｉｉ）切断ドメイン
ジンクフィンガーヌクレアーゼは切断ドメインも含有する。本明細書で開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８またはｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍを参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マング・ビーン・ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカス・ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３も参照されたい。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）の一以上を、切断ドメインの供給源として使用してもよい。
【００４９】
切断ドメインはまた、上述のような、切断活性のために二両体化を必要とする、酵素またはその部分であってもよい。２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体の単量体を含む各ヌクレアーゼとして、切断のために必要とされてもよい。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体を構築するための両方の単量体を含んでもよい。本明細書で用いる場合、「活性酵素二量体」とは核酸分子を切断することができる酵素二量体である。２つの切断単量体が同一のエンドヌクレアーゼ（あるいはその機能的な断片）に由来してもよく、または、各単量体が異なるエンドヌクレアーゼ（あるいはその機能的な断片）に由来してもよい。
【００５０】
２つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、それら各々の認識部位との２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば二量体化によって、切断単量体に活性酵素二両体を形成させる、互いに対する空間的配向で切断単量体を設置するように、配置されるのが好ましい。結果として、認識部位の近端は、約５から約１８ヌクレオチドにより分離され得る。例えば、近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドにより分離され得る。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの認識部位の間に介入し得ることが認識される（例えば、約２から約５０ヌクレオチド対以上）。例えば、本明細書で詳細に記載されるものなど、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６ヌクレオチドにより分離され得る。一般的に、切断部位は認識部位の間に位置する。
【００５１】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多数の種に存在し、かつ、ＤＮＡに配列特異的に（認識部位で）結合し、結合部位またはその付近で、ＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から移動した部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、他方のその認識部位から１３ヌクレオチドのところで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，  ９７８−３１，  ９８２を参照されたい。それゆえ、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されてもされなくてもよいが、少なくとも一つのタイプＩＩＳ制限酵素由来の切断ドメインおよび一以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができる。例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、国際公開第０７／０１４，２７５号に記載される。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらもまた本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００５２】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  １０，  ５７０−１０，  ５７５）。したがって、本開示の目的のため、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体であるとみなされる。それゆえ、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的化二本鎖切断のために、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子が用いられてもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、各々の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ、一以上の操作された切断単量体を含むことができる。非限定的な例として、ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。強制的なヘテロ二量体を形成する、例示的なＦｏｋＩの操作された切断単量体には、第一の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位での変異を含み、第二の切断単量体がアミノ酸残基４８６位および４９９位での変異を含むものである、ペアが挙げられる。
【００５４】
それゆえ、一つの実施形態では、アミノ酸４９０位での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；アミノ酸５３８位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；アミノ酸４８６位での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し；かつ、アミノ酸４９９位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。特に、操作された切断単量体は、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」で示される操作された切断単量体を生成するために、一つの切断単量体において、４９０位をＥからＫへ、５３８位をＩからＫへ変異させること、および、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」で示される操作された切断単量体を生成するために、別の切断単量体において、４８６位をＱからＥへ、４９９位をＩからＬへ変異させることにより、調製され得る。上述の操作された切断単量体は、異常な切断が最小化または撤廃された、強制されたヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号に記載されるような、野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、適した方法を用いて調製されてもよい（実施例５を参照されたい）。
【００５５】
上述のジンクフィンガーヌクレアーゼは、インテグレーションの標的化部位で二本鎖切断を導入するように操作されてもよい。二本鎖切断はインテグレーションの標的化部位であってもよく、インテグレーションの部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、または１０００ヌクレオチド離れてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ヌクレオチド離れてもよい。他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド離れてもよい。さらに他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大５０、１００、または１０００ヌクレオチド離れてもよい。
【００５６】
（ｉｉｉ）標的化切断のためのさらなる方法
染色体配列における標的部位を有する任意のヌクレアーゼが、本明細書に開示される方法において用いられてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは非常に長い認識配列を有し、そのうちのいくつかは、統計的に、ヒトサイズのゲノムにおいて一度ぐらい、存在する可能性がある。細胞内ゲノムにおいて固有の標的部位を有する任意のこのようなヌクレアーゼを、細胞染色体の標的化切断のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、または、加えて、使用してもよい。
【００５７】
ホーミングエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩｌおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの酵素の認識配列は当分野において知られている。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
【００５８】
ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性は、それらの認識部位に対して絶対的ではないが、その部位は、ほ乳類サイズのゲノムあたり単一の切断事象が、単コピーのその認識部位を含有する細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより得られる、十分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を、非天然標的部位に結合するよう操作してもよいということもまた、報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６を参照されたい。
【００５９】
（ｉｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入されてもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。一つの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡとすることができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼコード配列を含むプラスミドＤＮＡが、細胞内に導入されてもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡである場合、該ｍＲＮＡ分子は５’キャップされてもよい。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡである場合、該ｍＲＮＡ分子はポリアデニル化されてもよい。それゆえ、本方法による核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする、キャップされ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡとすることができる。ｍＲＮＡをキャップする方法およびポリアデニル化する方法は当分野において知られている。
【００６０】
（ｂ）ドナーポリヌクレオチド
標的とされる染色体配列内に異種コード配列をインテグレートするための方法は、異種コード配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、上記（Ｉ）（ａ）節に詳述されるように異種コード配列を含むだけでなく、上流配列および下流配列も含む。該上流および下流配列は、ドナーポリヌクレオチドにおいて異種コード配列を挟む。さらに、該上流および下流配列は、染色体におけるインテグレーション部位の両側と実質的な配列同一性を共有する。
【００６１】
ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列およびドナーポリヌクレオチドの間の組換えを促進するように選択される。上流配列とは、本明細書で用いられる場合、インテグレーションの標的化部位の上流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。同様に、下流配列とは、インテグレーションの標的化部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有してもよい。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有してもよい。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約９９％または１００％配列同一性を有してもよい。
【００６２】
上流または下流配列は、約２０ｂｐから約２５００ｂｐを含んでもよい。一つの実施形態では、上流または下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含んでもよい。例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐから約２０００ｂｐ、約６００ｂｐから約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐから約１０００ｂｐを含んでもよい。
【００６３】
典型的には、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであるだろう。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状断片（ｌｉｎｅａｒ  ｐｉｅｃｅ）ＤＮＡ、ＰＣＲ断片、ネイキッドな（ｎａｋｅｄ）核酸、またはリポソームあるいはポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）などの送達媒体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）と複合体化された核酸であってもよい。一つの実施形態では、異種コード配列を含むドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミドとすることができる。別の実施形態では、異種コード配列を含むドナーポリヌクレオチドは、ＢＡＣとすることができる。
【００６４】
当業者は、周知の標準的な組換え技術を使用して、本明細書に記載されるようなドナーポリヌクレオチドを構築できるであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６を参照されたい）。
【００６５】
（ｃ）細胞への送達
上記（ＩＩ）（ａ）節および（ＩＩ）（ｂ）節に詳述される、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸、およびドナーポリヌクレオチドは細胞内に導入される。適した送達方法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、オプティカルトランスフェクション（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、専売薬剤（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ａｇｅｎｔ）で促進された核酸の取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、あるいは人工ビリオンを介する送達、が挙げられる。一つの実施形態では、分子はヌクレオフェクションにより細胞内に導入することができる。別の実施形態では、分子はマイクロインジェクションにより細胞内に導入することができる。分子は、細胞の核内あるいは細胞質内にマイクロインジェクションすることができる。
【００６６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸に対する、異種コード配列を含むドナーポリヌクレオチドの割合は、変化でき、変化するであろう。一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約１：１０から約１０：１の範囲であってもよい。様々な実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であってもよい。一つの実施形態では、割合は約１：１であってもよい。
【００６７】
二以上のジンクフィンガーヌクレアーゼ分子および二以上のドナーポリヌクレオチドが細胞内に導入される実施形態では、分子は同時にあるいは順に導入されてもよい。例えば、各々異なる認識配列に特異的であるジンクフィンガーヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを、同時に導入してもよい。あるいは、各ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを順に導入してもよい。
【００６８】
（ｄ）細胞培養
本方法はさらに、ジンクフィンガーヌクレアーゼ介在インテグレーションが起こり得るような、適切な条件下で細胞を維持することを含む。必要であれば、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能とする標準手順を使用して、培養することができる。標準的な細胞培養技術は、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１；およびＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当分野において知られ、かつ、細胞型によって変化でき、変化するであろうことを十分理解している。いかなる場合でも、特定の細胞型のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。
【００６９】
細胞が一細胞胚である実施形態では、胚をインビトロで培養することができる（例えば、細胞培養）。典型的には、胚は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能とする、必須のＯ２／ＣＯ２比を備える、適切な温度かつ適切な培地で培養される。培地の適した非限定的な例には、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣ、およびＨＴＦ培地が挙げられる。当業者は、培養条件が、胚の種類によって変化でき、変化するであろうことを十分理解しているであろう。いかなる場合でも、特定の胚の種類のための最良の培養条件を決定するために、所定の最適化を用いることができる。場合によっては、胚は、メス宿主の子宮内に胚を移植する（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ことにより、インビボで培養することができる。一般的に言えば、メス宿主は、胚と同種または類似種に由来する。好ましくは、メス宿主は偽妊娠である。偽妊娠メス宿主の調製方法は当分野において知られている。さらに、胚をメス宿主に移植する方法も知られている。インビボで胚を培養することは胚の発生（ｄｅｖｅｌｏｐ）をもたらし、その胚に由来する動物の生児出生（ｌｉｖｅ  ｂｉｒｔｈ）を引き起こす。
【００７０】
過程のこの段階の間、（場合によっては、導入された核酸から発現した）ジンクフィンガーヌクレアーゼは、染色体内の標的配列を認識し、結合し、切断する。ジンクフィンガーヌクレアーゼにより導入された二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドの異種コード配列が染色体位置内にインフレームでインテグレートされるように、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを介して、修復される。ドナーポリヌクレオチドは物理的に（ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ）インテグレートされてもよく、またあるいは、染色体内へのドナーポリヌクレオチドの異種コード配列ならびに上流および下流配列の全部または一部のインテグレーションを引き起こす、切断の修復のための鋳型として、ドナーポリヌクレオチドを使用してもよい。
【００７１】
（ＩＩＩ）異種タンパク質の発現を調節するために内因性調節系を使用するための方法
また別の態様は、異種タンパク質の発現を調節するために内因性調節系を使用するための方法を提供する。該方法は、上記（Ｉ）節に詳述される、少なくとも一つの異種タンパク質をコードする、染色体にインテグレートされた配列を含む細胞を利用すること、または、上記（ＩＩ）節に詳述されるような、標的とされる染色体位置内に少なくとも一つの異種タンパク質をコードする配列をインテグレートすること、を含む。該方法はさらに、内因性調節系が活性化され、内因性および異種コード配列が単一の転写産物へと転写されるような条件下で、細胞を維持することを含む。分離した内因性および異種タンパク質が、２Ａペプチドの存在のため、翻訳の間に生成される。それゆえ、異種タンパク質の発現は、内因性転写調節機構により制御される。
【００７２】
（ＩＶ）応用
本明細書において開示される方法は、様々な商業的用途、研究用途および臨床用途のために用いることができる。内因性および異種配列が一つのオープンリーディングフレームで転写産物へと転写されるので、生成される各タンパク質の量は実質的に同様である。それゆえ、細胞内で生成された異種タンパク質のレベルは、適した内因性調節系を選択することにより制御することができる。またさらに、内因性調節系がそれらの発現を調節するために用いられるので、異種配列は典型的にサイレンシング効果に供されない。
【００７３】
本明細書において提供される方法および細胞を使用して、様々な商業的適用を有する大量の組換えタンパク質を生成することができる。該組換えタンパク質は、抗体、抗体の断片、モノクローナル抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、糖タンパク質、酵素、治療用タンパク質、栄養補給タンパク質、ワクチン、および血液因子、血栓溶解剤、抗凝血剤、ホルモン、成長因子、インターフェロンまたはインターロイキンとして機能するタンパク質とすることができる。さらに、本明細書において開示される方法および細胞を使用して、細胞が適したレベルで継続的に治療用タンパク質を生成するように、治療用タンパク質を細胞へ送達することができる。
【００７４】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、この発明の属する分野における当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、この発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書で用いられる場合、特に指定がない限り、以下の用語はそれらに与えられた意味を有する。
【００７５】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、一以上の要素が存在するということを意味することを目的としている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、記載された要素以外のさらなる要素が存在してもよいということを意味することを目的としている。
【００７６】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、遺伝子産物をコードする（エキソンおよびイントロンを含む）ＤＮＡ領域、ならびに、そのような調節配列が、コード配列および／または転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子産物の生成を調節する、全てのＤＮＡ領域をさす。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメント（ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、複製起点、マトリックス付着部位（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００７７】
「異種タンパク質」とは、対象の細胞または生命体に対して天然でない（例えば、外来性の）タンパク質である。
【００７８】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、線状または環状構造で、かつ、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをさす。本開示のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関する制限と解釈されることはない。該用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに、塩基、糖、および／またはリン酸部分において修飾された（例えば、ホスホロチオエート骨格）ヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対合特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対合するであろう。
【００７９】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをさすために区別しないで用いられる。
【００８０】
用語「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間での、遺伝情報の交換過程をさす。本開示のため、「相同組換え」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の間で起こる、そのような交換の特殊な形態をさす。この過程は、２つのポリヌクレオチド間の配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復に対し「ドナー」または「交換」分子を使用し、かつ、「非クロスオーバー（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として、さまざまに知られている、というのも、ドナーから標的への遺伝情報の移動を導くからである。特定の理論に拘束されるつもりはないが、このような移動は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部分となる遺伝情報の再合成のためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」、および／または関連過程を伴うことができる。そのような特殊な相同組換えは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子配列の変更をもたらす。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、用語「標的部位」または「標的配列」は、改変（ｅｄｉｔ）される染色体配列の部分を定義する核酸配列であって、結合のために十分な条件が存在するという条件で、ジンクフィンガーヌクレアーゼが認識かつ結合するために操作されるものをさす。
【００８２】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は当分野において知られている。典型的にそのような技術には、ある遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／または、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較すること、が含まれる。ゲノム配列もまたこのような方法で決定され、比較され得る。一般的に同一性とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をさす。二以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかを問わず、２つの整列された配列間の正確な合致数をより短い方の配列の長さで割り、１００をかけたものである。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３−３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，より開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により規格化されたスコアリング行列を用いて、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施態様は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションによって提供されている。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の適したプログラムは、当分野において広く知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ用いて使用することができる：遺伝コード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待数（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類方法（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋウェブサイト上に見出すことができる。本明細書に記載する配列に関��て、望ましい配列同一性の度合の範囲は約８０％から１００％およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０−７５％、好ましくは８０−８２％、より好ましくは８５−９０％、さらに好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【００８３】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の度合いは、配列類似性の度合いを共有する領域間で安定な二重鎖を形成させるような条件下での、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、ならびに消化された断片のサイズ決定により、決定することができる。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を用いて決定して、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約７０％−７５％、好ましくは８０％−８２％、より好ましくは８５％−９０％、さらに好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合に、実質的に互いに相同である。本明細書で用いる場合、実質的に相同というのはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をさす。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系に対して規定されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当分野の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  （１９８５）  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００８４】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の度合いは、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響する。部分的に同一な核酸配列は、少なくとも部分的に、標的分子への完全に同一な配列のハイブリダイゼーションを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野においてよく知られたハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。そのようなアッセイは、さまざまな度合いの選択性を使用して、例えば低から高ストリンジェンシーへと変化する条件を使用して実施することができる。低ストリンジェンシー条件を使用する場合、非特異的結合が存在しないことは、部分的な度合いの配列同一性さえ失った第２プローブ（例えば標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価することができ、そのため、非特異的結合事象が存在しないと、第２プローブは標的にハイブリダイズしない。
【００８５】
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用する場合は、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に適当な条件を選択することにより、プローブと参照配列とが互いに選択的にハイブリダイズし、または結合し、二本鎖分子を形成する。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの長さを有する標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約９０−９５％を上回る配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに役立つハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび参照配列が特定の配列同一性の度合いを有する場合、当分野で公知であるように決定することができる（例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  ＳＪ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （１９８５）  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ハイブリダイゼーションのための条件は当業者には周知である。
【００８６】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う度合いをさし、より高いストリンジェンシーはミスマッチしたハイブリッドに対する許容度がより低いことと相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者によく知られており、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増大する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、さまざまな配列の塩基組成、塩類および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータを変化させると共に、洗浄条件を変化させることにより、数多くの等価な条件を使用して、ある特定のストリンジェンシーを確立することができることが、当分野においてよく知られている。特定のハイブリダイゼーション条件の組の選択は、当分野の標準的方法に従って選択することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、本発明を説明するために含まれる。
【実施例１】
【００８８】
異種タンパク質を発現するためのＴＵＢＡ１Ｂプロモーターの使用
以下の実施例は、異種タンパク質の発現を調節するためのチューブリンプロモーターの使用を詳述する。チューブリンアルファ−１Ｂをコードする、ＴＵＢＡ１Ｂが、標的染色体配列として選択された。一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が、ヒトＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座における位置を標的とするように設計された。ＺＦＮおよび染色体領域を改変するための使用方法に関してのより詳細については、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４３１６７を参照されたい。一方のＺＦＮは配列５’  ＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＴＣ  ３’（配列番号１）に結合するように設計され、他方のＺＦＮは配列５’  ＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＧＴＡＡ  ３’（配列番号２）に結合するように設計された（図１Ａ）。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、２つのＺＦＮ認識配列間に位置する配列５’  ＣＣＴＡＧＣ  ３’において二本鎖切断を導入する。ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡは公知の分子生物学的手法を用いて生成された。
【００８９】
対象の遺伝子（すなわち、ＳＨ２バイオセンサー）は、２つのＳＨ２ドメイン（Ｇｒｂ２アダプタータンパク質由来）および２Ａペプチドドメインに連結されたＧＦＰをコードする配列を含んだ（図１Ｂを参照されたい）。ヒト細胞株のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＳＨ２バイオセンサー配列の標的化インテグレーションのためのドナーポリヌクレオチドとして供給する（ｓｅｒｖｅ）ために、プラスミド（図２）が構築された。該プラスミドは、１Ｋｂおよび７００ｂｐの、ＺＦＮペアにより導入される切断部位の上流および下流のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座配列に挟まれる、ＳＨ２バイオセンサーコード配列を含んだ。該プラスミドは、ＳＨ２バイオセンサーコード配列がチューブリン開始コドンのちょうど下流の内因性配列とインフレームでインテグレートされるように、設計された。ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座の活性化により、図１Ｂに表されるように、２つの分離したタンパク質が作られる。
【００９０】
ドナープラスミドおよびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は次いで標準的な条件下で培養された。個々の細胞クローンの解析で、異種バイオセンサーの発現を示すＧＦＰ蛍光が明らかとなった。ウェスタン解析で、α−チューブリンの発現が標的化インテグレーションにより影響を受けなかったことを確認した（図３）。
【００９１】
ＳＨ２（Ｇｒｂ２）含有バイオセンサーは、ＥＧＦにより活性化され、核移行（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を受ける。Ａ５４９細胞は該核酸でトランスフェクトされ、インテグレーションおよびＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座の発現を可能とするように培養された。細胞は１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦにさらされ、撮像された。図４は、ＳＨ２バイオセンサーの核移行の時間経過を示す。
【実施例２】
【００９２】
異種タンパク質を発現するためのＡＣＴＢプロモーターの使用
以下の実施例は、より強力なプロモーターの使用を試験するために設計された。よく知られた強力なプロモーターは、β−アクチンをコードするＡＣＴＢ遺伝子座内にある。一対のＺＦＮが、ヒトＡＣＴＢ遺伝子座を標的とするように設計された（図５）。一方のＺＦＮは配列５’  ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣ  ３’（配列番号３）に結合するように設計され、他方のＺＦＮは配列５’  ＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＧＧ  ３’（配列番号４）に結合するように設計された。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、２つのＺＦＮ認識配列間に位置する配列５’  ＧＧＣＡＴＧ  ３’において二本鎖切断を導入した。
【００９３】
ドナープラスミドは、ＳＨ２バイオセンサー配列ならびにタグ、内因性に生成されるβ−アクチン（すなわち、ＧＦＰ−２ｘ−ＳＨ２（Ｇｒｂ２）−２Ａ−ＲＦＰ）を提供するように設計された（図６）。該核酸は細胞内に導入され、２つの蛍光タンパク質が作られた（すなわち、ＧＦＰ−ＳＨ２バイオセンサーおよびＲＦＰ−アクチン）。各タンパク質の蛍光は蛍光顕微鏡を用いて観察された。
【００９４】
Ａ５４９細胞は該核酸でトランスフェクトされ、インテグレーションおよびＡＣＴＢ遺伝子座の発現を可能とするように培養された。細胞は１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦにさらされ、撮像された。図７は、ＧＦＰ−Ｇｒｂ２バイオセンサーの移行およびＲＦＰ−アクチンの位置の時間経過を示す。生成されたバイオセンサーの量は非常に高く、高レベルの非結合性または「遊離の」バイオセンサーが存在し、それによりバックグラウンドの蛍光の量が大幅に増加した。
【実施例３】
【００９５】
異種タンパク質を発現するためのＬＭＮＢ１プロモーターの使用
ラミンＢ１タンパク質をコードする、ＬＭＮＢ１遺伝子座を標的とするために、別のＺＦＮのペアが作製された（図８）。一方のＺＦＮは配列５’  ＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴ  ３’（配列番号５）に結合するように設計され、他方のＺＦＮは配列５’  ＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧ  ３’（配列番号６）に結合するように設計された。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、２つの認識配列間に位置する配列５’  ＧＴＣＴＣＣ  ３’において二本鎖切断を導入する。
【００９６】
ドナープラスミドは、ＺＦＮ切断部位の上流および下流のＬＭＮＢ１配列に挟まれる異種タンパク質をコードする配列を含むように構築することができる。ＺＦＮをコードする核酸およびドナープラスミドは細胞内に導入することができ、該細胞は上記に詳述されるように観察することができる。
【実施例４】
【００９７】
２つの異種タンパク質を発現するためのＡＣＴＢプロモーターの使用
本実施例は、２つの異種タンパク質が同一の内因性プロモーターから同時に発現され得るかどうかを決定するために設計された。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：〜５６ｋＤ）およびＧＦＰ（〜２７ｋＤ）をコードする配列のインテグレーションのため、ＡＣＴＢ遺伝子座が選択された。抗体の軽鎖および重鎖とほぼ同じ大きさであるので、これらのタンパク質が選択された。
【００９８】
ＺＦＮが、異種配列が開始コドンのちょうど下流でインテグレートされるように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のＡＣＴＢ遺伝子座を標的とするように設計された（図９を参照されたい）。一方のＺＦＮは配列５’  ＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＣＴＧＡＴＡ  ３’（配列番号７）に結合するように設計され、他方のＺＦＮは配列５’  ＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＡＴＣ  ３’（配列番号８）に結合するように設計された。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、２つの認識配列間に位置する配列５’  ＴＡＧＴＴＣ  ３’において二本鎖切断を導入した。ＺＦＮ切断部位の上流および下流のＣＨＯのＡＣＴＢ配列に挟まれる、インテグレートされる予定の配列（すなわち、ＳＥＡＰ−２Ａ−ＧＦＰ）を含むドナープラスミドが構築された（図１０）。ＺＦＮをコードする核酸および（低濃度あるいは高濃度の）ドナープラスミドをＣＨＯ細胞内へヌクレオトランスフェクトし、上記に詳述されるように細胞が維持された。標的化インテグレーションは、ＨＡｄｅｔ＋２プライマーおよびＳＥＡＰ−５００プライマーを用いる、ジャンクションＰＣＲ解析により確認され、予想通り１２３２塩基対の断片を増幅した（図１１）。
【００９９】
ＣＨＯ細胞の特徴は、ドナーＤＮＡのランダムインテグレーションの比率（ｒａｔｅ）が高いことである。これを検証するために、ＧＦＰを使用して、ランダム挿入に対する標的化挿入を追跡した。ＡＣＴＢ遺伝子座での標的化インテグレーションは、緑色のマイクロフィラメントとして細胞内で視覚化できる、ＧＦＰ−アクチンタンパク質を生じさせた。ランダムインテグレーションは、局在したＧＦＰタンパク質が無く、均一に緑色の細胞を生じさせた。Ｕ２ＯＳ細胞のＡＣＴＢ遺伝子座内へのＳＥＡＰおよびＧＦＰをコードする配列のインテグレーションは（上記実施例２に詳述されるように）、しかしながら、ランダムインテグレーションに対する標的化インテグレーションのより高い比率をもたらした。
【０１００】
ドナープラスミドに自殺遺伝子を組み込むことにより、ＣＨＯにおけるランダムインテグレーションを除去することが可能であろう。自殺遺伝子の組み込みは、ランダムインテグレーションによってのみ起こるだろう。自殺遺伝子の活性に起因して、ランダムインテグレーションの場合、生存細胞は存在しないだろう。結果的に、標的化組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）クローンが単離され得る。
【実施例５】
【０１０１】
抗体を発現するためのＡＣＴＢプロモーターの使用
ＣＨＯ細胞は抗体などの治療用タンパク質の生成のために頻繁に使用される。上記に詳述されるＣＨＯドナープラスミドにおけるＳＥＡＰコード配列は、抗体の軽鎖および重鎖をコードする配列と交換されてもよい。該ドナープラスミドにおける配列は、上記に詳述されるように、ＣＨＯ細胞のＡＣＴＢ遺伝子座内にインテグレートすることができる。発現された抗体分子は、標準的な手法を用いてＣＨＯ細胞から精製することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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