(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
増大した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性に関連付けられる疾病を治療または予防するための、ＣＤ３９抗体であって、
前記疾病は、癌および感染症からなる群から選択され、
前記抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖のＣＤＲを含む可変の軽鎖（ＶＬ）；およびCNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖のＣＤＲを含む可変の重鎖（ＶＨ）を含む、
ＣＤ３９抗体。
【請求項２】
前記抗体は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記疾病は、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肝臓癌、胃癌、リンパ腫、甲状腺癌、胃腸の癌、尿生殖路の癌、並びに、結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌、精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、および食道癌などの腺癌からなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記疾病は、ウイルスによる感染症、寄生虫による感染症、または細菌による感染症からなる群から選択される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項５】
前記疾病は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、熱帯熱マラリア原虫、または結核菌による感染症からなる群から選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、およびｓｃ（Ｆｖ）２からなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
増大した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性に関連付けられる疾病を治療または予防するための、請求項１から５、７のいずれか１項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含み、前記疾病は癌および感染症からなる群から選択される、薬学的組成物。
【請求項９】
CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖のＣＤＲを含む可変の軽鎖（ＶＬ）；およびCNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖のＣＤＲを含む可変の重鎖（ＶＨ）を含む、抗ＣＤ３９抗体。
【請求項１０】
前記抗体は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を阻害する、請求項９に記載の抗ＣＤ３９抗体。
【請求項１１】
前記抗体は、細胞表面のＣＤ３９の発現を抑制する、請求項９に記載の抗ＣＤ３９抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、ＣＤ３９の活性を阻害する、請求項９に記載の抗ＣＤ３９抗体。
【請求項１３】
請求項９から１２のいずれか１項に記載の抗体、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性を抑制するための、ヒトＣＤ３９に対する抗体に関する。
【０００２】
〔発明の背景〕
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、現在、それらの起源および抑制活性に応じて、２つの主要な部分集合に分類されている（Bluestone, J. A. & Abbas, A. K. Natural versusadaptive regulatory T cells. Nature Rev. Immunol. 3, 253-257 (2003)）。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）と、胸腺ストロマにおいて発現した抗原との高親和性の相互作用によって、胸腺において発生する。これら内在性Ｔｒｅｇ細胞は、従来から、インビトロで、エフェクターＴ細胞の増殖を、接触依存的、かつ、サイトカイン非依存的に、抑制するものとして説明されている。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、活性化リンパ球を特徴とする分子である、ＣＤ２５、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体（ＧＩＴＲ）およびＯＸ４０を構成的に発現する。しかしながら、少なくともマウス系では、転写因子ＦＯＸＰ３（フォークヘッドボックスｐ３）の高レベルの発現は、制御系統における最も際立ったマーカーである。今まで、不完全にしか特徴付けられていないが、内在性Ｔｒｅｇ細胞の抑制機構のネットワークは、ＣＴＬＡ４、膜結合性のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、および細胞周囲のアデノシンの産生といった表面分子を含む。
【０００３】
通常の宿主において自然発生のＴｒｅｇ細胞が減少すると、様々な自己免疫疾患が引き起こされる。これは、宿主免疫系が抑制されず、宿主の体の自己組織を攻撃するようになるからである。齧歯類では、ＣＤ２５＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞の減少または機能的変化が、甲状腺炎、胃炎、および１型糖尿病を含む様々な臓器特異的自己免疫疾患の自然発生を引き起こすことが示されている。制御性Ｔ細胞はまた、環境抗原に対する制御された応答にも重要な意味を持っており、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）およびアレルギーを予防することが示されている。
【０００４】
ここで、多数の系のＴｒｅｇについて説明する。Ｔｒｅｇは、自己（免疫）寛容を維持し、自己免疫疾患から保護するための主要な機構として発現するものである。Ｔｒｅｇは、自己免疫を制限する一方、これらはまた、抗腫瘍免疫および抗ウイルス免疫の効力を弱める。例えば、癌の場合、Ｔｒｅｇ細胞は、通常望まれる抗腫瘍免疫応答を妨げるため、悪影響を及ぼし得る。そして実際、癌患者は、その血中において、および腫瘍自体の内部において、増大した数の、腫瘍タンパク質に特有の活性Ｔｒｅｇ細胞を示すことを示唆する証拠も既にある。実際、ヒトにおける最近の幾つかの研究は、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肝臓癌、胃癌、およびリンパ腫を含む様々な癌において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の割合が増加していることを報告している。ウイルス感染の場合、慢性的にＣ型肝炎ウイルスやＢ型肝炎ウイルスに感染した個体、およびヒト免疫不全ウイルスに感染した患者において、Ｔｒｅｇ細胞の数がより多いことが報告されている。
【０００５】
従って、Ｔｒｅｇ活性を抑制または排除するための方法および組成物が、増大したＴｒｅｇ活性によって特徴付けられる疾病および疾患、例えば癌、感染病、および免疫応答の治療に役に立つであろう。
【０００６】
最新の研究では、ＣＤ３９が、Ｔｒｅｇ活性に関連付けられる疾病を治療するために有効な新規の治療法の開発の標的となり得ることが論証されている（Deaglio S, Dwyer KM, Gao W, Friedman D, Usheva A, Erat A, Chen JF, Enjyoji K, Linden J, Oukka M, Kuchroo VK, Strom TB, Robson SC. adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression. J Exp Med. 2007 Jun ll;204(6): 1257-65. Epub 2007 May 14）。この著者らは、実際、ＣＤ３９が、アデノシンの下流の産生によって免疫Ｔ細胞の抑制を制御し得るＦｏｘｐ３Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーであることを記載している。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明は、増大した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性に関連付けられる疾病を治療または予防するためのＣＤ３９抗体に関する。
【０００８】
特に、本発明は、癌および感染症を治療または予防するためのＣＤ３９抗体に関する。
【０００９】
本発明はまた、ＣＤ３９抗体を含む、増大した制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）活性に関連付けられる疾病を治療または予防するための薬学的組成物に関する。
【００１０】
〔発明の詳細な説明〕
定義
「ＣＤ３９」という語は、エクトヌクレオシド三リン酸塩ジホスホヒドロラーゼ−１（ＥＮＴＰＤｌ）とも呼ばれるＣＤ３９タンパク質を指す。ＣＤ３９は、ＡＴＰ／ＵＴＰおよびＡＤＰ／ＵＤＰを、それぞれ、ＡＭＰなどのヌクレオシドに加水分解する外酵素である。
【００１１】
「ＣＤ３９抗体」という語は、ヒトＣＤ３９に対する抗体を意味している。
【００１２】
本発明によれば、「抗体」または「免疫グロブリン」は、同じ意味を有しており、本発明では同等に用いられる。ここで用いられる「抗体」という語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に有効な部分、つまり、ある抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、抗体という語は、全ての抗体分子だけでなく、抗体フラグメント、並びに、抗体および抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）をも包含するものである。内在性抗体では、２つの重鎖が、ジスルフィド結合によって互いにつながっており、各重鎖は、ジスルフィド結合によって１つの軽鎖につながっている。２種類の軽鎖、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはイソタイプ）、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥが存在する。各鎖は、固有の配列ドメインを含んでいる。軽鎖は、２つのドメイン、すなわち、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含んでいる。重鎖は、４つのドメイン、すなわち、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨｌ、ＣＨ２、およびＣＨ３（これらは、集合的にＣＨと呼ばれる））を含んでいる。軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）は、結合認識を決定すると共に、抗原に対する特異性を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常領域ドメイン（ＣＨ）が、抗体の鎖会合、分泌、経胎盤移行、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合といった、重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ−末端部であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分から構成されている。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的補完性において存在している。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基から形成されている。時折、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、全体的なドメイン構成、従って結合部位に影響を及ぼすこともある。相補性決定領域すなわちＣＤＲは、自然免疫グロブリン結合部位の内在性Ｆｖ領域の結合親和力および特異性をともに規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖は、Ｌ−ＣＤＲｌ、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３と示される３つのＣＤＲを有し、免疫グロブリンの重鎖は、Ｈ−ＣＤＲｌ、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と示される３つのＣＤＲを有している。従って、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖の各Ｖ領域からのＣＤＲのセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）とは、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列のことを指す。
【００１３】
本発明によれば、「キメラ抗体」という語は、任意の種、好ましくはマウスからのＣＤ３９抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインと、ヒト抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインとを含む抗体のことを指す。
【００１４】
本発明によれば、「ヒト化抗体」という語は、ヒト抗体からの可変領域フレームワークおよび定常領域を有する抗体のことを指すが、任意の種、好ましくはマウスからのＣＤ３９抗体のＣＤＲを保持している。
【００１５】
「Ｆａｂ」という語は、分子量が約５０，０００であると共に抗原結合活性を有する抗体フラグメントを示している。ここで、ＩｇＧをプロテアーゼ、パパインで処理することによって得られるフラグメントのうち、Ｈ鎖のＮターミナルの約半分およびＬ鎖の全ては、ジスルフィド結合によって結合されている。
【００１６】
「Ｆ（ａｂ’）２」という語は、分子量が約１００，０００であると共に抗原結合活性を有する抗体フラグメントのことを指す。「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＩｇＧをプロテアーゼ、ペプシンで処理することによって得られるフラグメントのうち、ヒンジ部のジスルフィド結合によって結合されたＦａｂよりもわずかに大きい。
【００１７】
「Ｆａｂ’」という語は、分子量が約５０，０００であると共に抗原結合活性を有する抗体フラグメントのことを指す。「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ部のジスルフィド結合を切断することによって得られる。
【００１８】
単一の鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。このＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体は、通常、ペプチドエンコーディングリンカーによってつながれたＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合から発現する。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合によって安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価抗体フラグメントおよび多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖｓの会合によって自然発生的に形成されるか、または二価ｓｃ（Ｆｖ）２などのペプチドリンカーによって一価ｓｃＦｖｓを結合させることによって、生成可能である。
【００１９】
「二重特異性抗体」という語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントのことを指す。この抗体フラグメントは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を備えており、この重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）につながっている。短すぎて同じ鎖上の２つのドメインを対にすることができないリンカーを用いることによって、これらのドメインは、別の鎖の相補ドメインと、強制的に対にされ、このため、２つの抗原結合部位が生成される。
【００２０】
「精製された」および「単離された」という語は、これらがポリペプチド（つまり、本発明に係る抗体）またはヌクレオチド配列に関する場合、示される分子が、同じ種類の他の生体高分子がほとんど存在しない中に、存在していることを意味する。ここで用いられる「精製された」という語は、同じ種類の生体高分子が、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは少なくとも９５重量％、最も好ましくは少なくとも９８重量％で存在していることを意味している。特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、実質的に、ポリペプチドをコードしない他の核酸分子を有していない核酸分子のことを指す。しかしながら、この分子は、この組成の基本的特徴に悪影響を与えない幾つかのさらなる塩基または構成成分を含んでいてよい。
【００２１】
「増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病」という表現は、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる、増大したＴｒｅｇ活性によって引き起こされる、増大したＴｒｅｇ活性に起因する全ての疾患を包含する。
【００２２】
本発明の意味するところでは、ここに用いられるような「治療すること」または「治療」という表現は、この表現が適用される疾患または状態、あるいはこのような疾患または状態の１つまたは複数の症状の進行を逆行させる、緩和する、抑制すること、または、これを予防することを意味するものである。「治療的に有効な量」とは、治療上の利点を被験体に与えるために必要な、活性剤（例えばＣＤ３９抗体）の最小量のことである。例えば、哺乳類にとって「治療的に有効な量」とは、疾患で死亡することに関連付けられるか、またはこれに抵抗する、病態、疾病の増悪、または生理的状態の改善を誘導する、改善する、または前記改善を引き起こすような量である。
【００２３】
ここで用いるように、「予防」という語は、疾病または状態を有しているとまだ診断されていない被験体に、この疾病または状態が生じることを予防することを意味している。
【００２４】
ここで用いるように、「被験体」という語は、齧歯類、ネコ科動物、犬科動物、および霊長類といった哺乳類を指す。本発明に係る被験体はヒトであることが好ましい。
【００２５】
ここで用いるように、「癌」、「高増殖性」、および「悪性」という語は、自律的増殖性、つまり、急速な細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態または状況を有する細胞のことを指す。高増殖性疾患および悪性疾患の状態は、病的として、つまり病状を特徴付けるまたは構成するものとして分類されるか、または、非病的として、つまり標準状態からは外れているが病状とは関連付けられないものとして分類され得る。この語は、組織病理学的な種類または侵襲性のステージに関係なく、全ての種類の、癌性増殖または発癌プロセス、転移性組織、あるいは、悪性形質転換された細胞、組織、または臓器を含むことを意味している。「癌」または「新生物」という語は、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肺、胸、甲状腺、リンパ、胃腸、および尿生殖路を冒すような悪性腫瘍、および腺癌を含む。腺癌には、大部分の結腸癌、腎細胞癌、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸癌、および、食道癌といった悪性腫瘍が含まれる。
【００２６】
ＣＤ３９抗体の治療的使用
本願発明者は、ＢＹ４０と呼ばれるＣＤ３９抗体を含む、ＣＤ３９に対する抗体が、Ｔｒｅｇ活性を抑制することができることを証明した。ここに、本願発明者は、Ｔｒｅｇ活性を抑制するため、つまり、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病の治療または予防のための、ＣＤ３９抗体の使用を提案する。
【００２７】
従って、本発明の第１の態様は、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病を治療または予防する方法および薬学的組成物を提供する。
【００２８】
これにより本発明は、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病を治療または予防するためのＣＤ３９抗体に関する。
【００２９】
本発明はまた、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病を治療または予防する方法に関する。この方法は、前記疾病の治療または予防を必要としている被験体にＣＤ３９抗体を投与するステップを含む。
【００３０】
増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病の例には、癌および感染症が含まれるが、これらに限定されない。癌の例には、肺癌、乳癌、卵巣癌、黒色腫、肝臓癌、胃癌、およびリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。感染症には、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどのウイルスによる感染症、熱帯熱マラリア原虫（マラリアの病原因子）などの寄生虫による感染症、または結核菌などの細菌による感染症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
また、ＣＤ３９抗体は、癌を発症した患者に再投与する前に、腫瘍特異的細胞毒性のリンパ球が生体外で拡大する間に、制御性Ｔ細胞を抑制または減少させるために用いてもよい。つまり、Ｔｒｅｇの抑制を、養子細胞療法のために、抗原特異的Ｔ細胞を生体外で生成するための手法として用いる。
【００３２】
ＣＤ３９抗体は、ワクチン組成物の補助剤として用いてもよい。実際、ワクチン組成物は、癌または感染症の治療に適している。しかし、それらの治療効果は、Ｔｒｅｇが誘導されるため、制限され得る。従って、ＣＤ３９抗体の投与を、ワクチン組成物の投与と組み合わせて行うことは、前記ワクチン組成物の効率を高めるために有用であり得る。
【００３３】
本発明は、任意のＣＤ３９抗体、またはそのフラグメントの使用を想定するものである。この使用には、ＣＤ３９キメラ抗体（好ましくはキメラマウス抗体／ヒト抗体）またはヒト化ＣＤ３９抗体も、これらの抗体が、Ｔｒｅｇ活性を抑制すると仮定するならば、含まれる。
【００３４】
具体的な一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られたものであり得る。
【００３５】
他の一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖と、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖とを含んでいてよい。
【００３６】
他の一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、可変の軽鎖（ＶＬ）および可変の重鎖（ＶＨ）を含んでいてよい。前記可変の軽鎖（ＶＬ）は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖のＣＤＲを含んでおり、前記可変の重鎖（ＶＨ）は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖のＣＤＲを含んでいる。
【００３７】
他の一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、配列番号２に示される第１の重鎖ＣＤＲの配列、配列番号３に示される第２の重鎖ＣＤＲ配列、および配列番号４に示される第３の重鎖ＣＤＲ配列、並びに、配列番号６に示される第１の軽鎖ＣＤＲ配列、配列番号７に示される第２の軽鎖ＣＤＲ配列、および配列番号８に示される第３の軽鎖ＣＤＲ配列を含んでいてよい。具体的な一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体の重鎖可変ドメインは、SEQ IDNO: 1に示されるアミノ酸配列を有している、および／または、前記ＣＤ３９抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００３８】
具体的な一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である。
【００３９】
特に、上記キメラマウス／ヒト抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変ドメインを含んでいてよい。
【００４０】
他の一実施形態では、前記ＣＤ３９抗体は、ヒト化抗体である。
【００４１】
特に、前記ヒト化抗体では、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、および存在するならば適宜ヒト定常ドメイン、並びに、非ヒトドナーＣＤＲ（例えば、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のマウスＣＤＲ）を含む。
【００４２】
本発明は、前記ＣＤ３９抗体のフラグメントの使用を想定するものである。前記ＣＤ３９抗体のフラグメントには、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、および二重特異性抗体、並びに、抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
ＣＤ３９抗体は、従来から公知の任意の技術によって産生され得る。これらの技術の例は、任意の化学的技術、生物学的技術、遺伝子工学、または酵素による技術が挙げられ、これらの技術を単独で用いてもよいし、または組み合わせて用いてもよいが、これらに限定されない。
【００４４】
例えば、ＣＤ３９抗体を、公知の方法に従って、例えば、数ある中でも、豚、牛、馬、ウサギ、ヤギ、羊、およびマウスのうちから選択された宿主動物に、適切な抗原またはエピトープを投与することによって、上昇させることが可能である。
【００４５】
従来から公知の様々な補助剤を用いて、抗体産生を増進させることが可能である。本発明を実施するために有用な抗体は、ポリクローナル抗体であってよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ＣＤ３９に対するモノクローナル抗体は、培養液中の連続継代細胞系によって抗体分子の生成を行う任意の技術を用いて、調製および単離させることが可能である。
【００４６】
精製および単離させるための技術には、当初はKohlerおよびMilstein (1975)の「the human B-cell hybridoma technique (Cote et al., 1983)」および「the EBV- hybridoma technique (Cole et al. 1985) 」に記載されたハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
所望の抗体のアミノ酸配列を知ることによって、当業者は、ポリペプチドを産生するための標準的な技術によって、前記抗体を容易に産生することが可能である。例えば、ポリペプチドは合成可能であり、この合成は、公知の固相法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成装置（Applied Biosystems, Foster City, Californiaによって製造された装置）を用いると共に当該製造者の説明書に従って、行うことが可能である。あるいは、従来から公知の組み換えＤＮＡ技術によって、ＣＤ３９抗体を合成してもよい。例えば、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望の抗体を発現する好適な真核生物または原核生物の宿主に導入した後、抗体をＤＮＡ発現産物として得ることが可能である。この抗体は、後に、前記真核生物または原核生物の宿主から、公知の技術を用いて単離される。
【００４８】
特に、本発明はさらに、本発明の抗体を産生する方法に関する。本方法は、（ｉ）ＣＤ３９抗体を発現する細胞を、前記抗体の発現を可能にするために適した条件下で培養するステップと、（ｉｉ）発現された抗体を回復するステップとを含む。
【００４９】
他の具体的な一実施形態では、本方法は、
（ｉ）ＣＤ３９抗体を発現するハイブリドーマ（例えばCNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマ）を、抗体の発現を可能にするために適した条件下で培養するステップと、（ｉｉ）発現された抗体を回復するステップとを含む。
【００５０】
ＣＤ３９抗体は、従来の免疫グロブリン精製法によって、培地から分離されることが都合がよい。従来の免疫グロブリン精製法の例には、タンパク質Ａ−セファロース、水酸燐灰石クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法、または親和性クロマトグラフィーが挙げられる。
【００５１】
具体的な一実施形態では、ヒトキメラＣＤ３９抗体の発明は、上述のＶＬドメインおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得ることと、前記核酸配列を、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターの中に挿入することによってヒトキメラ抗体発現ベクターを構成することと、前記ヒトキメラ抗体発現ベクターを動物細胞の中に導入することによってコード配列を発現することとによって、産生可能である。
【００５２】
ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとして、これは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってよいが、ＩｇＧクラスの領域が好ましく、ＩｇＧクラスに属する下位クラスのいずれか１つ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を用いてもよい。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとして、これは、Ｉｇに属する任意の領域であってよく、カッパクラスまたはラムダクラスの領域を用いてよい。
【００５３】
キメラ抗体を産生する方法は、従来の組み換えＤＮＡ技術や遺伝子導入技術を含み、従来から公知である(Morrison SL. et al. (1984)、並びに特許文献である米国特許第5,202,238号明細書および米国特許第5,204, 244号明細書参照）。
【００５４】
ＣＤ３９ヒト化抗体は、上述のように、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得ることと、前記核酸配列を、（ｉ）ヒト抗体の重鎖定常領域と同一の重鎖定常領域、および（ｉｉ）ヒト抗体の軽鎖定常領域と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターの中に挿入することによってヒト化抗体発現ベクターを構成することと、前記ヒト化抗体発現ベクターを動物細胞の中に導入することによって前記遺伝子を発現することとによって、産生可能である。
【００５５】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が、別々のベクター上に存在している種類のものであってもよいし、または、これらの両遺伝子が、同一のベクター上に存在している種類のもの（タンデム式）であってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築が容易である点、動物細胞の中に導入することが容易である点、および、動物細胞内の抗体Ｈ鎖の発現量と抗体Ｌ鎖の発現量との間のバランスの点で、タンデム式のヒト化抗体発現ベクターが好ましい（Shitara K et al. 1994）。タンデム式のヒト化抗体発現ベクターの例には、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第 97/10354号パンフレット）、pEE18などが含まれる。
【００５６】
従来の組み換えＤＮＡ技術および遺伝子導入技術に基づいた、ヒト化抗体の産生方法が、従来から知られている（例えば、Riechmann L. et al. 1988、Neuberger MS. et al. 1985参照）。例えば、ＣＤＲグラフト法（欧州特許第239,400号明細書、国際公開第91/09967号パンフレット、米国特許第5,225,539号明細書、米国特許第5.530,101号明細書、および米国特許第5,585,089号明細書）、ベニアリング、または再表面化法(欧州特許第592,106号明細書、欧州特許第519,596号明細書、Padlan EA (1991)、Studnicka GM et al. (1994)、Roguska MA. et al. (1994))、および、鎖シャフリング法（米国特許第5,565,332号明細書）を含む、従来から知られた様々な技術を用いて、抗体をヒト化することが可能である。このような抗体を調製するための一般的な組み換えＤＮＡ技術も知られている（欧州特許出願第125023号および国際公開第96/02576号パンフレット参照）。
【００５７】
Ｆａｂは、ヒトＣＤ３９に特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、パパインで処理することによって得ることが可能である。また、このＦａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを、原核生物の発現系用または真核生物の発現系用のベクターに挿入して、前記ベクターを（相応しい方である）原核生物または真核生物の中に導入してＦａｂを発現することによって、産生可能である。
【００５８】
Ｆ（ａｂ’）２は、ヒトＣＤ３９に特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、ペプシンで処理することによって得ることが可能である。また、Ｆ（ａｂ’）２は、以下に説明するＦａｂ’を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合することによって産生可能である。
【００５９】
Ｆａｂ’は、ヒトＣＤ３９に特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤、ジチオスレイトールで処理することによって得ることが可能である。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを、原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターの中に挿入すると共に、このベクターを（相応しい方である）原核生物または真核生物の中に導入して、その発現を行うことによって、産生可能である。
【００６０】
ｓｃＦｖは、上述のＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得ること、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築すること、前記ＤＮＡを原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターの中に挿入すること、およびその後、この発現ベクターを（相応しい方である）原核生物または真核生物の中に導入して、ｓｃＦｖを発現することによって、産生可能である。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲグラフト法と呼ばれる公知の技術を用いてよい。この技術は、ドナーｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択して、これらの相補性決定領域（ＣＤＲ）を既知の３次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上にグラフトすることを含む（例えば、ＷＯ第９８／４５３２２号、ＷＯ第８７／０２６７１号、ＵＳ第５．８５９，２０５号、ＵＳ第５，５８５，０８９号、ＵＳ第４，８１６，５６７号、ＥＰ第０１７３４９４号参照）。
【００６１】
ここに記載する抗体のアミノ酸配列を修飾することも想定可能である。例えば、抗体の、結合親和力および／または他の生物学的特性を向上させることが望ましい。単に、人間でない動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬ内のＣＤＲだけをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲにおいてグラフトすることによって、ヒト化抗体を産生する場合、抗原結合活性は、元の、人間でない動物に由来する抗体の抗原結合活性よりも、減少することが知られている。非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの幾つかのアミノ酸残基が、ＣＤＲだけでなくＦＲにおいても、抗原結合活性に直接的または間接的に関連付けられていると考えられる。従って、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する別のアミノ酸残基と置き換えると、結合活性が低減されることになる。この問題を解決するために、ヒトＣＤＲでグラフトされた抗体において、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列から、抗体に結合することに直接関連するか、またはＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するか、または抗体の三次元構造を維持する１つのアミノ酸残基であって、抗原に結合することに直接関連付けられるアミノ酸残基を特定する試みが為された。特定されたアミノ酸を、元の、人間でない動物に由来する抗体のアミノ酸残基と置換することによって、抗原結合活性の低減をさらに助長することができた。
【００６２】
本発明の抗体の構造に、および、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列に、修飾および変異を行ってもよい。この修飾および変異によっても、依然として、所望の特徴を有する抗体をコードする機能分子が得られる。
【００６３】
アミノ酸配列の変異においては、アミノ酸のハイドロパシックインデックスが想定され得る。一般的に、相互作用的な生物学的機能をタンパク質に与える際に、ハイドロパシックアミノ酸インデックスが重要である点は、従来から理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシック特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に貢献することが認められる。この二次構造は、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を規定する。各アミノ酸には、それらの疎水性、および電荷特性に基づいて、１つのハイドロパシックインデックスが割当てられている。これらのアミノ酸は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸塩（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸塩（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００６４】
また、本発明のさらなる対象は、本発明の抗体の機能保存的変異体を含む。
【００６５】
「機能保存的変異体」とは、タンパク質または酵素内の所定のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的な構成および機能を変化させることなく、変異されている変異体である。この変異には、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、極性、水素結合性、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）を有するアミノ酸と置換することが含まれるが、これに限定されない。ここに示したアミノ酸以外の保存されたアミノ酸は、タンパク質において異なっており、そのため、機能が類似した任意の２つのタンパク質の間の、タンパク質配列相同性またはアミノ酸配列相同性の割合が異なり、クラスタ法によるようなアラインメント法に従って測定すると、例えば７０％から９９％までであり、類似性は、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいている。また、「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって測定すると、アミノ酸の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、およびより一層好ましくは少なくとも９５％が同一であるポリペプチドであって、比較される天然タンパク質または親タンパク質と同一または実質的に類似した特性または機能を有するポリペプチドを含む。
【００６６】
２つのアミノ酸配列は、より短い配列の全長さにわたって、アミノ酸の８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上が同一であるか、または約９０％以上、好ましくは９５％以上が類似している（機能的に同一である）場合に、「ほぼ相同」または「ほぼ類似」していることになる。好ましくは、類似配列または相同配列は、例えばＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin）パイルアッププログラム、またはＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの任意の配列比較アルゴリズムを用いたアラインメントによって、特定される。
【００６７】
例えば、感知できる活性損失なしに、タンパク質構造において、所定のアミノ酸を他のアミノ酸と置換することが可能である。タンパク質の相互作用性および性質が、タンパク質の生物学的機能活性を規定するため、所定のアミノ酸の置換は、タンパク質配列において、および当然ながらそのＤＮＡコード配列において行われ得るが、それにもかかわらず、同様の特性を有するタンパク質が得られる。従って、本発明の抗体配列において、または前記抗体をコードする、対応するＤＮＡ配列において、それらの、感知できる生物活性損失なしに、様々な変化を行うことが可能であると、想定される。
【００６８】
所定のアミノ酸を、類似のハイドロパシックインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸に置換してもよく、こうすることによっても、依然として、類似の生物活性を有するタンパク質が生じる、すなわち、生物学的機能が同一なタンパク質が得られることが、従来から知られている。
【００６９】
従って、以上にまとめたように、アミノ酸の置換は、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。当業者には、上述の様々な特徴を考慮した典型的な置換が知られており、これらの典型的な置換には、アルギニンとリジンとの置換、グルタミン酸とアスパラギン酸との置換、セリンとトレオニンとの置換、グルタミンとアスパラギンとの置換、および、バリン、ロイシンとイソロイシンとの置換が含まれる。
【００７０】
本発明の抗体の他の種類のアミノ酸修飾は、抗体の元のグリコシル化パターンを変異するために有効であり得る。
【００７１】
「変異する」という語は、抗体内にある１つまたは複数の糖質成分を取り除くこと、および／または、抗体内に存在しない１つまたは複数のグリコシル化部位を加えることを意味するものである。
【００７２】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型である。「Ｎ結合型」とは、糖質成分が、アスパラギン残基の側鎖に付着されていることを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここでＸは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、糖質成分をアスパラギン側鎖に酵素によって付着させるための認識配列である。従って、ポリペプチド内のこれらトリペプチド配列のいずれかの存在が、潜在的グリコシル化部位を生成する。グリコシル化部位を抗体に加えることは、従来、アミノ酸配列が、上述のトリペプチド配列のうちの（Ｎ結合型グリコシル化部位用の）１つまたは複数の配列を含むように、アミノ酸配列を変異することによって、実現される。
【００７３】
他の種類の共有結合修飾は、抗体に化学的または酵素的に結合されたグリコシドを含む。これらの手順は、これらが、宿主細胞において、Ｎ結合型またはＯ−結合型のグリコシル化のためのグリコシル化性を有する抗体を生成する必要がない点で、有利である。用いられる結合モードに応じて、糖が、（ａ）アルギニンおよびヒスチジンに、（ｂ）遊離カルボキシル基に、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えば、システイン基）に、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えばセリン基、トレオニン基、またはヒドロキシプロリン基）に、（ｅ）芳香族残基（例えば、フェニルアラニン残基、チロシン残基、またはトリプトファン残基）に、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着する。例えば、このような方法は、国際公開第87/05330号パンフレットに記載されている。
【００７４】
抗体上に存在する任意の糖質成分を取り除くことは、化学的または酵素的に行うことが可能である。化学的な脱グリコシル化では、抗体をトリフルオロメタンスルホン酸化合物または同等の化合物に曝す必要がある。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミン、または、Ｎ−アセチルガラクトサミン）を除く、ほとんどの糖または全ての糖を切断させる一方、抗体を無傷のまま残す。化学的な脱グリコシル化については、Sojahr H. et al. (1987)およびEdge, AS. et al. (1981)によって記載されている。抗体上の糖質成分の酵素による切断は、Thotakura, NR. et al. (1987)によって記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって実現可能である。
【００７５】
他の種類の、抗体の共有結合修飾は、米国特許第4,640, 835号明細書、米国特許第4,496, 689号明細書、米国特許第4,301, 144号明細書、米国特許第4,670,417号明細書、米国特許第4,791,192号明細書、または米国特許第4,179,337号明細書に説明されているような方法で、抗体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンといった様々な非タンパク性の高分子のうちの１つに結合することを含む。
【００７６】
本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば、抗体の抗原−依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を助長することも望ましい。これは、１つまたは複数のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域に導入することによって実現可能である。選択的または追加的に、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域において鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてもよい。このように生成されたホモ二量体の抗体は、改善された内在化性能および／または増大した補体媒介性細胞刹滅、および／または、抗体−依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有することが可能である(Caron PC. et al. 1992、およびShopes B. 1992)。
【００７７】
薬学的組成物
本発明はまた、増大したＴｒｅｇ活性に関連付けられる疾病を治療または予防するための、ＣＤ３９抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００７８】
従って、治療用組成物を形成するために、ＣＤ３９抗体を、薬学的に許容される賦形剤、および場合によっては、生分解性高分子などの持続放出性マトリクスと組み合わせることが可能である。
【００７９】
「薬学的」または「薬学的に許容される」という語は、必要に応じて、哺乳類、特にヒトに投与した場合に、アレルギー反応または他の有害反応といった副作用を生成しない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、無毒性の固体、ｓｅｍＩ−３８８９個体または液体のフィラー、希釈剤、封入材料、または任意の種類の製剤補助物を指す。
【００８０】
薬学的組成物の形態、投与ルート、投与量、および投薬計画は、当然ながら、治療される対象物の状態、疾病の重篤度、患者の年齢、体重、および性別に応じて決定される。
【００８１】
本発明の薬学的組成物は、局所性投与、経口投与、非経口的投与、経鼻投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、または、眼内投与などのために構築することが可能である。
【００８２】
この薬学的組成物は、注射可能な剤形の、薬学的に許容される媒介物を含むことが好ましい。これらは、特に、等張液、滅菌溶液、食塩水（リン酸１ナトリウム塩またはリン酸２ナトリウム塩、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、または塩化マグネシウムなど、あるいはこれらの塩の組み合わせ）か、または、乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってよく、場合によっては、滅菌水または生理食塩水を添加することによって、注射剤を構成することが可能である。
【００８３】
投与に用いる投与量は、様々なパラメータに応じて、特に、用いる投与の形態、関連する病状、あるいは、所望の治療持続時間に応じて、適応させることが可能である。
【００８４】
薬学的組成物を調製するために、有効な量の抗体を、薬学的に許容される担体または水媒体の中に溶解させるか、または分散させてよい。
【００８５】
注射としての使用に適した薬学的形態は、滅菌水溶液または滅菌水分散液と、ごま油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤と、注射可能な滅菌溶液または滅菌分散液を即時調整するための滅菌パウダーとを含む。いずれの場合にも、この形態は、滅菌されている必要があり、容易に注射可能である程度に流動性を有している必要がある。この形態は、産生状態および貯蔵状態では安定している必要があり、細菌および菌類といった微生物に汚染されないように保存される必要がある。
【００８６】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての、活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水において、調製可能である。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物において、並びに油においても調製可能である。通常の貯蔵状態および使用状態では、これらの調製液は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含む。
【００８７】
ＣＤ３９抗体を、中性または塩の形の組成物に構築することが可能である。薬学的に許容される塩は、（タンパク質の遊離アミノ基によって形成される）酸付加塩を含み、例えば、塩酸またはリン酸といった無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などといった有機酸によって形成される。遊離型のカルボキシル基によって形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄といった無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどといった有機塩基に由来していてよい。
【００８８】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、これらを好適に混合させたもの、および植物油脂を含む溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティング剤を用いることによって、分散液の場合に所要の粒径を維持することによって、および、界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することが可能である。微生物の作用は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどといった様々な抗菌剤および抗真菌薬によって予防することが可能である。多くの場合、等張剤、例えば、糖質または塩化ナトリウムが含まれていることが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、該組成物において、吸収を遅延させる媒体、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用することによって、実現可能である。
【００８９】
注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて、所要量の活性化合物を、上に列挙した他の様々な成分を有する適切な溶媒に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製される。概して、分散液は、滅菌された様々な有効成分を、塩基性分散媒および上に列挙した成分のうちの他の必要な成分を含む、滅菌媒介物の中に組み入れることによって、調製される。注射可能な滅菌溶液を調製するための滅菌パウダーの場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、この技術によって、有効成分に任意の所望のさらなる成分を加えたものであるパウダーが生成される。この所望のさらなる成分は、当該成分の予め滅菌して濾過させた溶液から、生成されるものである。
【００９０】
直接注射するためのより濃度が高い液、または高濃縮液を調製することも想定される。ここでは、高濃度の活性剤を極めて迅速に浸透させると共に、小さな腫瘍領域に運搬するために、ＤＭＳＯを溶媒として用いることも想定可能である。
【００９１】
製剤形成後、溶液は、剤形と適合するように、かつ、治療上効果のある量で、投与される。この製剤は、様々な剤形において（上述の注射剤の種類でもよいが、薬物放出カプセルなども用いることが可能である）、容易に投与される。
【００９２】
例えば、非経口的投与のための水溶液では、この水溶液は、必要ならば、適切に緩衝化されている必要があり、最初に、液体希釈剤を、十分な生理食塩水またはブドウ糖で等張にする必要がある。これらの特別な水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に特に適している。これに関して、用いられ得る滅菌された水媒体は、本開示を考慮すれば、当業者には公知であろう。例えば、１投与量を、１ｍｌのＮａＣｌ等張液の中に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入用の液体に加えるか、または計画される注入部位に注射する（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、頁1035-1038および頁1570-1580参照）。治療される被験体の状態によっては、投与量を幾分変更する必要が生じる。いずれにしても、投与担当者が、個々の被験体にとっての適切な投与量を決定する。
【００９３】
ＣＤ３９抗体が、治療用混合物内に、約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０含まれるように、あるいは、１回の投与につき約１０ミリグラム含まれるように、ＣＤ３９抗体を構築することが可能である。複数回投与を行うことも可能である。
【００９４】
静脈内注射または筋肉内注射といった非経口的投与のために構築された組成物に加えて、薬学的に許容される他の剤形には、例えば、経口投与のための錠剤または他の固形物、持続放出性カプセル、および、現在用いられている他の任意の剤形が含まれる。
【００９５】
特定の実施形態では、抗体を宿主細胞の中に導入するために、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用が検討されている。リポソームおよび／またはナノ粒子の構成および使用は、当業者に公知である。
【００９６】
ナノカプセルは、一般に、化合物を、安定しかつ再生可能なように封入していてよい。細胞内の高分子の過荷重による副作用を避けるために、このような超微粒子（サイズが約０．１μｍ）は、一般に、生体内で劣化し得る高分子を用いて構成される。これらの要件を満たす生体分解性のポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用には想定可能である。このような粒子は、容易に形成可能である。
【００９７】
リポソームは、リン脂質から形成される。このリン脂質は、水媒体内に分散され、多重膜集中二重層小胞体（多重膜小胞体（ＭＬＶｓ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは、概して、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有している。ＭＬＶを超音波処理することによって、核内に水溶液を含有する、２００〜５００Åの範囲の直径を有する小さな単層の小胞（ＳＵＶ）が形成される。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの存在に応じて異なっている。
【００９８】
本発明はまた、少なくとも１つのＣＤ３９抗体、特に本発明の抗体を含むキットを提供する。ＣＤ３９抗体を含有するキットは、治療用分析試料に用いるためのものである。
【００９９】
本発明の抗体およびポリペプチド
本発明は、ヒトＣＤ３９に対する、単離された抗体または該抗体のフラグメントを提供する。特に、本願発明者は、２００８年１月４日に、マウスの  ＣＤ３９抗体  （ＢＹ４０）を生成するハイブリドーマを、ブタペスト条約の条項に基づき、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に寄託した。寄託したハイブリドーマのＣＮＣＭ寄託番号は、I-3889である。
【０１００】
従って、本発明の他の一態様は、ＣＮＣＭ寄託番号I-3889の下で入手可能なハイブリドーマから得られる、マウスのＣＤ３９抗体（ＢＹ４０）に関する。
【０１０１】
他の一実施形態では、本発明の抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖のＣＤＲを含む可変の軽鎖（ＶＬ）と、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖のＣＤＲを含む可変の重鎖（ＶＨ）とを含む。
【０１０２】
他の一実施形態では、本発明の抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＬ鎖と、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体のＶＨ鎖とを含む。
【０１０３】
本願発明者は、上述のmAb BY40の軽鎖および重鎖の可変ドメインをクローン化して特徴付け、これによって、この抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメインを、表１のように割り出した。
【０１０４】
【表１】
0006041842.tif 000002
【０１０５】
本発明の一実施形態は、ＣＤ３９抗体に関する。ＣＤ３９抗体は、配列番号２に示される第１の重鎖ＣＤＲ配列、配列番号３に示される第２の重鎖ＣＤＲ配列、および配列番号４に示される第３の重鎖ＣＤＲ配列、並びに、配列番号６に示される第１の軽鎖ＣＤＲ配列、配列番号７に示される第２の軽鎖ＣＤＲ配列、および配列番号８に示される第３の軽鎖ＣＤＲ配列を含む。具体的な一実施形態では、前記抗体の重鎖の可変ドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、および／または、前記抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１０６】
本発明の抗体は、従来から公知の任意の技術を用いて産生可能である。特に、前記抗体は、以下に記載する技術によって産生される。
【０１０７】
他の一実施形態では、本発明の１つの抗体は、キメラ抗体、好ましくはキメラマウス／ヒト抗体である。特に、前記キメラマウス／ヒト抗体は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体の可変ドメインを含んでよい。
【０１０８】
本発明の一実施形態は、ＣＮＣＭ寄託番号I-3889の下で入手可能なハイブリドーマに関する。
【０１０９】
他の一実施形態では、本発明の１つの抗体は、ヒト化抗体である。特に、前記ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域と、存在するならば、任意のヒト定常ドメインと、上記において規定されたマウスＣＤＲといった非ヒトドナーＣＤＲとを含む。
【０１１０】
本発明はさらに、前記抗体のフラグメントを提供する。このフラグメントには、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、および二重特異性抗体、並びに、抗体フラグメントから形成された多特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
他の一態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から構成される群から選択された１つの配列を含むポリペプチドに関する。
【０１１２】
本発明のさらなる一対象は、本発明の抗体または該抗体のフラグメントをコードする核酸配列に関する。
【０１１３】
具体的な一実施形態では、本発明は、CNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体（ＢＹ４０）のＶＨドメイン、またはCNCM-I-3889として寄託されたハイブリドーマから得られる抗体（ＢＹ４０）のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【０１１４】
具体的な一実施形態では、本発明は、mAb BY40のＶＨドメイン、またはmAb BY40のＶＬドメインをコードする核酸配列に関する。
【０１１５】
【表２】
0006041842.tif 000003
【０１１６】
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージといった任意の好適なベクター、またはウイルスベクターの中に含まれていることが可能である。
【０１１７】
「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞の中に導入して、宿主を形質転換させると共に導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することが可能な媒介物のことを意味している。
【０１１８】
従って、本発明のさらなる一対象は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０１１９】
このようなベクターは、被験体に投与すると前記抗体を生じさせる、または直接発現させる、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどといった調節要素を含んでいてよい。動物細胞用の発現ベクターにおいて用いられるプロモーターおよびエンハンサーの例には、ＳＶ４０の早期プロモーターおよび早期エンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびＬＴＲエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason JO et al. 1985）、および、免疫グロブリンＨ鎖のエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などが含まれる。
【０１２０】
ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子が挿入され、発現可能である限り、動物細胞用の任意の発現ベクターを用いることが可能である。好適なベクターの例には、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ ｂｅｔａｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）などが含まれる。
【０１２１】
プラスミドの他の例には、複製起点を含む複製型プラスミド、または、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの統合型プラスミドが含まれる。
【０１２２】
ウイルスベクターの他の例には、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびＡＡＶベクターが含まれる。このような組み換えウイルスは、従来から公知の技術、例えば、パッケージング細胞をトランスフェクトする技術、またはヘルパープラスミドまたはヘルパーウイルスによる一過性トランスフェクト技術によって、産生可能である。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが含まれる。このような複製欠損組み換えウイルスを産生するための詳細な手順は、例えば、国際公開第95/14785号パンフレット、国際公開第96/22378号パンフレット、米国特許第5,882,877号明細書、米国特許第6,013,516号明細書、米国特許第4,861,719号明細書、米国特許第5,278,056号明細書、および国際公開第94/19478号パンフレットに記載されている。
【０１２３】
本発明のさらなる一対象は、本発明に係る核酸および／またはベクターによってトランスフェクトされた、感染された、または形質転換された細胞に関する。
【０１２４】
「形質転換」という語は、「外来の」（つまり外部または細胞外の）遺伝子であるＤＮＡまたはＲＮＡ配列を、宿主細胞に導入した結果、宿主細胞が、導入遺伝子または導入配列を発現し、所望の物質、典型的には、該導入遺伝子または導入配列によってコーディングされたタンパク質または酵素を産生することを意味している。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容すると共に発現する宿主細胞が、「形質転換」される。
【０１２５】
本発明の核酸は、本発明の抗体を、好適な発現系において産生するために用いられ得る。「発現系」という語は、例えば、タンパク質を発現するために適した条件下の、宿主細胞および適合可能なベクターを意味するものである。前記タンパク質は、前記ベクターによって運搬され、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによってコーディングされたものである。
【０１２６】
一般的な発現系には、大腸菌宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、哺乳類宿主細胞およびベクターが含まれる。宿主細胞の他の例には、原核生物の細胞（例えば細菌）および真核生物の細胞（例えばイースト菌、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれるが、これらに限定されない。特別な例には、大腸菌、クルイベロマイセス属、またはサッカロミセス属の酵母、哺乳類細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、および、（例えば、リンパ芽球細胞、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生された）一次または株化された哺乳類細胞培養が含まれる。マウスSP2/0-Agl4細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下では「ＤＨＦＲ遺伝子」と呼ぶ）が欠損したＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662（以下では「ＹＢ２／０細胞」と呼ぶ））なども例に含まれる。
【０１２７】
本発明はまた、本発明に係る抗体を発現する組み換え宿主細胞の産生方法に関する。前記産生方法は、（ｉ）組み換え核酸または上述のベクターを、生体内または生体外で、コンピテント宿主細胞の中に導入するステップと、（ｉｉ）得られた組み換え宿主細胞を生体内または生体外で培養するステップと、（ｉｉｉ）任意により、本発明に係る抗体を発現および／または分泌する細胞を選択するステップとを含む。このような組み換え宿主細胞を、本発明の抗体を産生するために用いることが可能である。
【０１２８】
上述のように、本発明の抗体は、従来から公知の任意の技術によって、産生および／または修飾することが可能である。
【０１２９】
〔図面〕
図１は、ＨＩＶ-対照群およびＨＩＶ+患者群からのＣＤ４+ＣＤ２５lowおよびＣＤ４+ＣＤ２５highＴ細胞上のＣＤ３９の発現を示す図である。
【０１３０】
ＨｌＶ-（□▽）対照群およびＨＩＶ+（塗りつぶされた□▽）患者群からの末梢血リンパ球が、抗ＣＤ３９ ＢＹ４０、抗ＣＤ４、および抗ＣＤ２５ ｍＡｂｓで染色されている。そして、ＣＤ４+ＣＤ２５lowおよびＣＤ４+ＣＤ２５high母集団内のＣＤ３９+細胞の割合（Ａ）、および、両部分母集団内のＣＤ３９発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（Ｂ）は、フローサイトメトリーによって算出されたものである。Ｃには、ＨＩＶ+ドナー（塗りつぶされていないヒストグラム）およびＨＩＶ-ドナー（塗りつぶされたヒストグラム）からのＣＤ４+ＣＤ２５low（左）およびＣＤ４+ＣＤ２５high（右）Ｔ細胞上のＣＤ３９発現レベルの比較を示す重ね合わせが示されている。ＡおよびＢには、ウイルコクソンおよびマンホイットニーのノンパラメトリック検定によって算定されたｐ値が示されている。
【０１３１】
図２は、ＣＤ３９ ｍＡｂ，ＢＹ４０が、ＣＤ４+ＣＤ２５high制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性に与える影響を示す図である。Ａは、ＨＩＶ+患者群からのＣＦＳＥと記されたＣＤ８Ｔ細胞を、固定化されたＣＤ３ ｍＡｂ （５μｇ／ｍｌ）およびＣＤ３９ ｍＡｂの存在下（上部のヒストグラム）で、または自己ＣＤ４+ＣＤ２５highＴｒｅｇ（ＣＤ８：Ｔｒｅｇの割合は４：１）の存在下（真中のヒストグラム）で、またはＣＤ３９ ｍＡｂで前培養された自己ＣＤ４+ＣＤ２５highＴｒｅｇの存在下（下部のヒストグラム）で培養したものである。７２時間後、分裂された細胞（ＣＦＳＥlow）の割合を、フローサイトメトリーによって算出した。Ｂは、自己ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の存在下での、ＣＤ８Ｔ細胞増殖の抑制の割合（上部のパネル）を、（自己ＣＤ４+ＣＤ２５high細胞の存在下でのＣＦＳＥlowＣＤ８+Ｔ細胞の％）×１００／（ＣＤ４+ＣＤ２５high細胞が存在しない中でのＣＦＳＥlowＣＤ８+Ｔ細胞の％）として、計算したものである。抗ＣＤ３９ｍＡｂの存在下でのＣＤ８Ｔ細胞増殖の回復の割合（下部のパネル）は、１００−（ＣＤ３９で前処理された自己ＣＤ４+ＣＤ２５high細胞の存在下でのＣＦＳＥlowＣＤ８+Ｔ細胞の％）ｘ１００／（自己ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞の存在下でのＣＦＳＥlowの％）として、計算されている。ウイルコクソンおよびマンホイットニーのノンパラメトリック検定によって算定されたｐ値が示されている。
【０１３２】
図３は、ＣＤ３９ ｍＡｂ，ＢＡ５４ｇが、ＣＤ４+ＣＤ２５high制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性に与える影響を示す図である。Ａは、ＨＩＶ+患者群のＣＦＳＥと記されたＣＤ８Ｔ細胞を、固定化されたＣＤ３ ｍＡｂ（５μｇ／ｍｉ）およびＢＡ５４ｇ ｍＡｂの存在下（上部のヒストグラム）で、または、自己ＣＤ４+ＣＤ２５highＴｒｅｇ（ＣＤ８：Ｔｒｅｇの割合は４：１）の存在下（真中のヒストグラム）で、または、ＢＡ５４ｇ ｍＡｂで前培養された自己ＣＤ４+ＣＤ２５highＴｒｅｇの存在下（下部のヒストグラム）で、培養したものである。７２時間後、分裂された細胞（ＣＦＳＥ ｌｏｗ）の割合を、フローサイトメトリーによって算出した。
【０１３３】
図４は、幾つかの抗ＣＤ３９ ｍＡｂｓによる、ＣＤ３９発現の修飾を示す図である。ＹＴ２Ｃ２ ＮＫ細胞（１ｘ１０6細胞／ｍｌ）を、９６ウェルプレート内で、ＢＹ１２、ＢＹ４０、ＢＡ５４ｇ、Ａ１（Biolegend）、ＢＵ６１（Santa Cruz Biotech）、またはＡＣ２（Immunotech）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、３７°Ｃにおいて２時間培養した。その後、細胞を洗浄し、前記培養に使用した同一の抗体（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、４°Ｃにおいて２０分間培養した。ＡＰＣが結合されたヤギの抗マウスＡｂによって、抗体固定が現れた。この抗体固定は、フローサイトメトリーによって算出されたものである。抗体固定の抑制の割合は、次の式に基づいて、算出したものである。１００−（ｍＡｂ処理された細胞のＭＦＩ／制御イソタイプ処理された細胞のＭＦＩ）*１００。
【０１３４】
〔実施例〕
ＨＩＶ−対照群およびＨＩＶ＋患者群からのＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ  Ｔ細胞上のＣＤ３９の発現；
最近、マウスおよびヒトＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞は、エクトヌクレオチダーゼであるＣＤ３９を構成的に発現することが報告されている。エクトヌクレオチダーゼは、免疫活性化サイトで生成された細胞外ＡＴＰを変換し、細胞増殖の阻害剤であるアデノシンの生成を導く。ここで、我々は、抗ＣＤ３９ｍＡｂ  ＢＹ４０を用いて、ＨＩＶ−対照群およびＨＩＶ＋患者群からのＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ末梢血リンパ球（ＰＢＬ）母集団におけるＣＤ３９の発現を検査した。図１からは、ＨＩＶ−およびＨＩＶ＋個体からのＰＢＬでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ部分母集団内のＣＤ３９＋細胞の割合が、ＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗ部分母集団内のＣＤ３９＋細胞の割合よりも、著しく高い（ｐ＜０．０１）ことが示されている（図１Ａ）。平均は、１６％対４６％（ＨＩＶ−）、および、１７％対４２％（ＨＩＶ＋）である。ＨＩＶ-およびＨＩＶ+の群の間の母集団の同一のＣＤ４＋のそれぞれ比較した場合に、ＣＤ３９＋細胞間の割合に、統計上の差異は確認されなかった。
【０１３５】
次に、我々は、ＨＩＶ＋の個体およびＨＩＶ−の個体からのＣＤ４＋細胞におけるＣＤ３９の発現レベルを分析した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。我々は、ＨＩＶ＋患者群のＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗおよびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈにおけるＣＤ３９発現が、ＨＩＶ−対照群の細胞におけるＣＤ３９発現レベルと比べて、著しく高いこと（それぞれの平均は、８４対４５、および、１３６対９３）を観察した。
【０１３６】
これらの結果は、ＣＤ３９に対し陽性染色されたＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈの割合が、ＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗ母集団と比べてより高いこと、および、ＨＩＶ＋患者群からのＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５１ｏｗ制御性Ｔ細胞が、より高いレベルのＣＤ３９を発現することを示している。
【０１３７】
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞におけるＣＤ３９の阻止が、それらの、自己ＣＤ８エフェクターＴ細胞に対する免疫抑制効果を元に戻す。
【０１３８】
ＨＩＶ＋患者群からのＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞が、高いレベルのＣＤ３９を発現することを証明した後、我々は、ＨＩＶ＋制御性Ｔ細胞を介したＣＤ８Ｔ細胞の増殖抑制における、ＣＤ３９の可能な役割を検査した。
【０１３９】
予期されたように、我々は、共培養実験において、治療されていない自己ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を効果的に抑制することを観察した。これは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞を、ＣＤ３９ ｍＡｂ ＢＹ４０の存在下で予め培養した時（図２Ａ、下部のヒストグラム）には観察されなかった効果である。ＣＤ３９ ｍＡｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖には直接影響しない（図２Ａ、上部のヒストグラム）。ＢＹ４０ ｍＡｂが、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞の免疫抑制効果に逆作用する性能は、ＨＩＶ＋患者群からのＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞に限定されない。類似の効果が、ＨＩＶ−個体からのＴ細胞で行われた共培養実験において、観察された。しかし、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性を抑制し、ＨＩＶ＋患者群の自己ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を回復するためには、ＢＹ４０ ｍＡｂがより有効であった（図２Ｂ）。
【０１４０】
これらの結果は、ＢＹ４０ｍＡｂを有するＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞においてＣＤ３９分子を誘発させることが、それらの免疫抑制活性を元に戻すと共に、ＣＤ３ｍＡｂによって引き起こされた自己ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を回復することが可能であることを示している。
【０１４１】
観察されたＢＹ４０ ｍＡｂによる効果は、別の抗ＣＤ３９、ＢＡ５４ｇ ｍＡｂに拡張された（図３）。
【０１４２】
ＣＤ３９ ｍＡｂｓによって引き起こされたＣＤ３９分子の下流制御。
【０１４３】
ＢＹ４０ｍＡｂおよびＢＡ５４ｇ ｍＡｂの作用の潜在的機構として、我々は、それらの、細胞表面上のＣＤ３９の発現を抑制的に調節する性能を測定した。図４に示すように、我々は、ＹＴ２Ｃ２細胞を、ＢＡ５４ｇ ｍＡｂまたはＢＹ４０ ｍＡｂの存在下で２時間培養することにより、ＣＤ３９発現が潜在的に抑制されることを証明した（＞７０％の抑制）。ＢＵ６１ ｍＡｂによる、ＣＤ３９発現の著しい修飾は確認されなかったが、ＢＹ１２、Ａ１、およびＡＣ２ ｍＡｂは、ＣＤ３９細胞表面発現の中程度の抑制的調節を引き起こした。
【０１４４】
ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ制御性Ｔ細胞をＢＹ４０ ｍＡｂによって前処理することは、部分的に、腫瘍特異的細胞毒性エフェクターＣＤ４Ｔ細胞の生成に対する、それらの免疫抑制効果に逆作用する。
【０１４５】
次に、我々は、ＢＹ４０ ｍＡｂの、エフェクター機能を有する腫瘍特異的Ｔ細胞の持続的な生成に対する性能を測定した。表３に示したように、ＰＢＬを、ＣＤ４+ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇおよび黒色腫細胞株ＨＭ１１によって共培養することによって、細胞傷害性エフェクターＣＤ４Ｔ細胞の低レベルの生成が導かれる。細胞傷害性エフェクターＣＤ４Ｔ細胞の生成は、脱顆粒特異的マーカーであるＣＤ１０７の発現を得ることによって明らかになる。予備的な実験は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇをＢＹ４０ ｍＡｂによって前処理することによって、ＣＤ４＋ＣＤ１０７＋エフェクターＴ細胞の割合がわずかに増大したことを示している（表３）。これは、ＢＹ４０ ｍＡｂが、部分的に、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を元に戻し、細胞傷害性Ｔ細胞の生成を可能にすることを示唆している。
【０１４６】
【表３】
0006041842.tif 000004
【０１４７】
表３：ＣＤ３９ ｍＡｂ ＢＹ４０が、腫瘍特異的細胞毒性ＣＤ４Ｔ細胞の生成に与える影響。２×１０5の末梢血単核細胞、および１ｘ１０5ＨＭ１１が照射された癌細胞（６０Ｇｒａｙ）に、予めＩｇＧ１対照またはＢＹ４０ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）で１時間培養し、精製された５ｘ１０4のＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ細胞（Ｔｒｅｇ）を補充し、６日間共培養した。この培養物に、４８時間ごとに、０．５μｇのＩｇＧ１対照またはＢＹ４０ｍＡｂを添加した。その後、リンパ球を集菌し、９６ウェルプレート内で、ＩｇＧ１対照またはＢＹ４０ ｍＡｂ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＨＭ１１細胞と共に培養した（割合は１／１）。腫瘍特異的エフェクター細胞傷害性ＣＤ４Ｔ細胞の割合を、モネンシン（２μＭ終末濃度）の存在下で、抗ＣＤ１０７ａ−ＰＣ５抗体をラベリングすることによって測定した。５％のＣＯ２、３７°Ｃで４時間後、細胞を洗浄し、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体で染色した。ＣＤ４およびＣＤ１０７ａの二重発現を、フローサイトメトリーによって測定した。ＣＤ１０７ａ発現の回復の割合を、次の式に基づいて測定した。（ＢＹ４０処理した後のＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の％）−（対照ＩｇＧ１処理後のＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の％）／対照ＩｇＧ１処理後のＣＤ４＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の％）*１００。
【０１４８】
ＢＡ５４ｇ ｍＡｂは、ヒトＰＢＭＣのＡＴＰａｓｅ活性を抑制する。
【０１４９】
ＣＤ３９については、既に、細胞周囲レベルのアデノシンの修飾によって少なくとも部分的に作用する、Ｔｒｅｇの抑制機構の構成要素として説明した。次に我々は、ＢＡ５４ｇ ＣＤ３９ ｍＡｂがヒトＰＢＭＣの自発的ＡＴＰａｓｅ活性に与える影響を分析した。ＢＡ５４ｇの存在下で２４時間培養した後のヒトＰＢＭＣの自発的ＡＴＰａｓｅ活性が、対照ＩｇＧ１の存在下で培養したＰＢＭＣと比べて、２９％減少したことが観察された（表４）。他のＣＤ３９ ｍＡｂおよび特にＢＹ４０の影響については、現在調査中である。
【０１５０】
【表４】
0006041842.tif 000005
【０１５１】
表４：ＣＤ３９ ｍＡｂ，ＢＡ５４ｇの、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＡＴＰａｓｅ活性に与える影響。４ｘ１０5のＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ完全培地において、ＢＡ５４ｇ ｍＡｂまたはＩｇＧ１対照（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。２４時間後、細胞を、無リンの緩衝液（１０ｍＭのブドウ糖、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＫＣＬ、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣ１２）中で３回洗浄し、２ｍＭのＡＴＰが補充された４００μｌの培養緩衝液において再懸濁させた。１０分後、３７°Ｃにおいて、細胞を、遠心分離機にかけ、マラカイトグリーン／ポリビニルアルコール／アンモニウムモリブデン酸塩の溶液を添加した後、浮遊物内のリン酸濃度を、分光測光器（６２０ｎＭ）によって２０分間測定した。
【０１５２】
〔参照〕
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【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ＨＩＶ-対照群およびＨＩＶ+患者群からのＣＤ４+ＣＤ２５lowおよびＣＤ４+ＣＤ２５high  Ｔ細胞上のＣＤ３９の発現を示す図である。
【図２】ＣＤ３９ ｍＡｂ，ＢＹ４０が、ＣＤ４+ＣＤ２５high制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性に与える影響を示す図である。
【図３】ＣＤ３９ ｍＡｂ，ＢＡ５４ｇが、ＣＤ４+ＣＤ２５high制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性に与える影響を示す図である。
【図４】幾つかの抗ＣＤ３９ ｍＡｂｓによる、ＣＤ３９発現の修飾を示す図である。
【受託番号】
【０１５４】
CNCM I-3889
【図１】
0006041842.tif 000006
【図２】
0006041842.tif 000007
【図３】
0006041842.tif 000008
【図４】
0006041842.tif 000009
【配列表】
0006041842000001.app