(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ２Ｘ７と特異的に結合できるナノボディであって、
該ナノボディは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とからなり、
該相補性決定領域は、
ＣＤＲ１が配列番号２３３、ＣＤＲ２が配列番号３９７、ＣＤＲ３が配列番号５６１と、
ＣＤＲ１が配列番号２４４、ＣＤＲ２が配列番号４０８、ＣＤＲ３が配列番号５７２と、
ＣＤＲ１が配列番号２４５、ＣＤＲ２が配列番号４０９、ＣＤＲ３が配列番号５７３と、
ＣＤＲ１が配列番号２５４、ＣＤＲ２が配列番号４１８、ＣＤＲ３が配列番号５８２と、
ＣＤＲ１が配列番号２５５、ＣＤＲ２が配列番号４１９、ＣＤＲ３が配列番号５８３と、
ＣＤＲ１が配列番号２６３、ＣＤＲ２が配列番号４２７、ＣＤＲ３が配列番号５９１と、
ＣＤＲ１が配列番号２７４、ＣＤＲ２が配列番号４３８、ＣＤＲ３が配列番号６０２と、
ＣＤＲ１が配列番号２７６、ＣＤＲ２が配列番号４４０、ＣＤＲ３が配列番号６０４と、
ＣＤＲ１が配列番号２７９、ＣＤＲ２が配列番号４４３、ＣＤＲ３が配列番号６０７と、
ＣＤＲ１が配列番号２８１、ＣＤＲ２が配列番号４４５、ＣＤＲ３が配列番号６０９とからなる群から選択される、
ナノボディ。
【請求項２】
請求項１記載のナノボディであって、
該ナノボディは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とからなり、
該相補性決定領域は、
ＣＤＲ１が配列番号２７９、ＣＤＲ２が配列番号４４３、ＣＤＲ３が配列番号６０７と、
ＣＤＲ１が配列番号２７４、ＣＤＲ２が配列番号４３８、ＣＤＲ３が配列番号６０２と、
ＣＤＲ１が配列番号２３３、ＣＤＲ２が配列番号３９７、ＣＤＲ３が配列番号５６１とからなる群から選択される、
請求項１記載のナノボディ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のナノボディであって、
該ナノボディは、Ｐ２Ｘ７と特異的に結合でき、
該ナノボディは、配列番号７３２、７４３、７４４、７５３、７５４、７６２、７７３、７７５、７７８及び７８０の少なくとも１つのナノボディと、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、
請求項１又は２記載のナノボディ。
【請求項４】
請求項１又は２記載のナノボディであって、
該ナノボディはＰ２Ｘ７と特異的に結合でき、
該ナノボディは、配列番号７３２、７７３及び７７８の少なくとも１つのナノボディと、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、
請求項１又は２記載のナノボディ。
【請求項５】
請求項１記載のナノボディであって、
カバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数が表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
請求項１記載のナノボディ。
【請求項６】
請求項３記載のナノボディであって、
前記ナノボディは、
配列番号７３２、７４３、７４４、７５３、７５４、７６２、７７３、７７５、７７８及び７８０からなる群から選択される、
Ｐ２Ｘ７と特異的に結合できる、請求項４記載のナノボディ。
【請求項７】
配列番号７３２、７７３及び７７８からなる群から選択される、
Ｐ２Ｘ７と特異的に結合できる請求項４記載のナノボディ。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか記載のナノボディを含む、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか記載のナノボディの少なくとも２つを含むポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号７８９〜７９１の１個以上と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号７９０、７８９及び７９１からなる群から選択される、請求項８ないし１０のいずれか記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞関連抗原、より具体的には膜に固定された抗原に対する免疫グロブリン配列を生成する方法に関する。本発明は、本発明の方法により取得可能な免疫グロブリン配列も提供する。具体的には本発明は、ＤＮＡワクチン接種の使用による免疫グロブリン配列の生成に関する。より具体的には本発明は、ＤＮＡワクチン接種による、好ましくは細胞関連抗原、特にＧＰＣＲ及びイオンチャネルを含む多重膜貫通ドメインを有する抗原に指向性を有する免疫グロブリン配列のラクダ科動物における生成に関する。さらには本発明は、細胞関連抗原、より具体的には例えばＧＰＣＲ及びイオンチャネル等の膜に固定された抗原、より好ましくはイオンチャネルに対する上記免疫グロブリン配列に関する。
【０００２】
細胞関連抗原、より具体的には単一又は複数の膜貫通ドメインを有する細胞関連抗原は、その未変性の（native）立体構造において精製するのが困難である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的の機能を変えることができる未変性エピトープに対する抗体（又はナノボディ等の抗体断片）を同定するためには、ラクダ科動物に標的抗原をその未変性の立体構造で投与することが極めて重要である（非特許文献１）。これらの細胞関連抗原の精製された未変性タンパク質がない場合、ほとんどの適用される免疫付与戦略は、選択した抗原を機能的に発現する全細胞の一定間隔での反復注射からなる。かかる免疫付与戦略が首尾よく実行されている（すなわちｉｎ  ｖｉｖｏで成熟した中和ナノボディの同定をもたらす）標的の例は特許文献１及び特許文献２）に記載されている。しかしながら、標的発現細胞の反復ブースター（booster）注射では多くの場合、特に標的の発現レベルが低く宿主細胞バックグラウンドが高度に免疫原性である場合には、標的特異的な免疫応答は弱くなるか又は検出不能となる。ラマに対する免疫原性が低いラクダ科動物起源の細胞株を使用することにより、標的に対する体液性応答にさらに焦点を当てることができる。それにもかかわらず（擬似（quasi））自己表面マーカーの反復注射であっても、ラクダ科動物の細胞株の表面マーカーに対する応答が起こる。
【０００３】
ＧＰＣＲ、イオンチャネル又は任意の他のタイプの多重貫通細胞表面マーカーに対する（中和）選択的抗体の同定は、ｉ）ほとんどの場合で、未変性タンパク質は免疫付与又はその後の抗体同定に利用可能ではなく、ｉｉ）多重貫通因子（multispanners）が多くの場合、低い免疫原性を示し（細胞外表面に曝されるアミノ酸残基の数がほとんどの単一の膜貫通受容体に比べて限定されるため）、ｉｉｉ）多重貫通表面分子が多くの場合、低い密度で発現するため、困難である（非特許文献２）。
【背景技術】
【０００４】
免疫グロブリン配列、例えばそれらに由来する抗体及び抗原結合断片は、調査及び治療用途においてそれぞれの抗原を特異的に標的化するのに広く用いられている。通常、抗体の生成は、実験動物の免疫付与、ハイブリドーマを作出するための抗体産生細胞の融合、及び所望の特異性に関するスクリーニングを含む。代替的に、抗体をナイーブ（naive）ライブラリ又は合成ライブラリのスクリーニングにより、例えばファージディスプレイにより生成することができる。
【０００５】
免疫グロブリン配列、例えばナノボディの生成は、様々な刊行物において広範に説明されており、その中でも特許文献３、非特許文献３及び非特許文献４を例として挙げることができる。これらの方法では、上記標的抗原に対する免疫応答を誘導するためにラクダ科動物に標的抗原を免疫付与する。標的抗原と結合するナノボディに関して、上記免疫付与により得られるナノボディのレパートリーをさらにスクリーニングする。
【０００６】
これらの例では、抗体の生成には、免疫付与及び／又はスクリーニングのために精製抗原が必要となる。抗原を天然の供給源から、又は組換え体産生の過程で精製することができる。
【０００７】
有望な治療標的の重要なクラスは、細胞関連抗原、例えば膜貫通抗原、特に多重膜貫通ドメインを有する膜貫通抗原である。しかしながら細胞関連抗原、特に膜結合抗原は、細胞膜内に包埋されているか又は細胞膜に固定されているため、その天然の立体構造において得るのが困難である。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在する、その天然の立体構造で存在するエピトープ、すなわち立体構造エピトープに対する免疫グロブリン配列を得るためには、正しい立体構造で標的抗原を免疫付与することが極めて重要である。かかる立体構造エピトープは、薬学的に活性のある免疫グロブリン配列を作出するのに最も重要である。例えば、イオンチャネルの孔領域と特異的に相互作用する免疫グロブリン配列はその伝導性に影響を与え、それにより薬理学的効果がもたらされる。
【０００８】
免疫付与及び／又は免疫グロブリン配列に関するスクリーニングを、かかる抗原のペプチド断片を用いて行うことができる。しかしながら、かかるアプローチは、短い合成ペプチドでは立体構造依存性エピトープを再産生することができないため、かかるエピトープに対する抗体をもたらさない。
【０００９】
そのため、これらの細胞関連抗原に関して、抗原を保有する全細胞による免疫付与、及びその後の細胞関連抗原と結合するナノボディに関するこのように誘導されたナノボディのレパートリーのスクリーニングは、任意のものである（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献４、特許文献５、特許文献６で行われたように）。しかしながら、かかる細胞が多くの抗原を発現し、これにより主として対象ではない抗原に対する抗体応答が生じる。したがって、このアプローチにより獲得可能な抗体応答は、低い特異性、特に生成する全ての抗体中における対象となる抗体の発生頻度が非常に低いことを特徴とする。そのためこのアプローチは、対象となる標的抗原に対する抗体の効率的な生成を妨げる。
【００１０】
したがって従来技術では、立体構造エピトープ、特に膜関連抗原の立体構造エピトープに対する好適な幅の特異的な抗体応答を生じる満足のいく方法は提示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第０５／０４４８５８号
【特許文献２】国際公開第０７／０４２２８９号
【特許文献３】国際公開第９４／０４６７８号
【特許文献４】国際公開第２００８／０７４８３９号
【特許文献５】国際公開第２００９／０６８６２５号
【特許文献６】国際公開第２００９／１３８５１９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Dormitz et al. （2008）. Trends in Biotechnology 26: 659-667
【非特許文献２】Michel et al. （2009）.Naunyn-Schmied Archives Pharmacology 379:385-388
【非特許文献３】Hamers-Casterman etal. 1993
【非特許文献４】Muyldermans et al.2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、当該技術分野のこれらの欠点を克服することである。特に本発明の目的は、立体構造エピトープを示す細胞関連抗原のような複雑な抗原に対する免疫グロブリン配列を作出する方法を提供することである。
【００１４】
上述の課題が本発明により克服される。遺伝子ワクチン接種が、その天然の立体構造の立体構造エピトープに対して、すなわち細胞関連抗原に対して良好な特異性及び許容可能な幅の抗体応答をもたらし得ることが見出されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は以下のことに関する：
細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を生成する方法であって、
ａ）非ヒト動物に、上記細胞関連抗原、又は上記細胞関連抗原のドメイン若しくは特定部分をコードする核酸を遺伝子ワクチン接種する工程、並びに
ｂ）任意で、細胞関連抗原を発現する天然細胞若しくはトランスフェクト細胞を含む細胞、細胞由来の膜抽出物、豊富な抗原を内包する小胞若しくは任意の他の膜誘導体、リポソーム、又は細胞関連抗原を発現するウイルス粒子から選択される天然の立体構造で上記抗原を動物に追加免疫する（boosting：ブーストする）工程、
ｃ）上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関して、上記非ヒト動物に由来する免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程、
を含む、方法。本発明の特定の実施の形態では、上記細胞関連抗原は、膜貫通抗原、多重貫通ドメインを有する膜貫通抗原、例えばＧＰＣＲ又はイオンチャネルから選択される。本発明によれば、上記非ヒト動物は、脊椎動物、サメ、哺乳動物、トカゲ、ラクダ科動物、ラマ、好ましくはラクダ科動物及びラマから選択され得る。
【００１６】
本発明の１つの実施の形態において、免疫グロブリン配列は、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり、より具体的には免疫グロブリン配列は、従来の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００１７】
本発明によれば、免疫グロブリン配列は、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であってもよく、好ましくはナノボディである。
【００１８】
本発明によれば、ワクチン接種を、無針ジェット注射により、バリスティック法（ballistic method）により、タトゥーのような針による注射（needle-mediatedinjections）により、パッチによる皮膚上へのＤＮＡの局所適用により、又は任意のこれらの投与方法、その後のｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションにより行うことができ、さらにＤＮＡの皮内投与、筋肉内投与又は皮下投与により行われるワクチン接種を含む。
【００１９】
免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリを、上記非ヒト哺乳動物の血液から得ることができる。
【００２０】
本発明では、上記細胞関連抗原を、その未変性の立体構造の抗原の発現を可能にする任意の細胞バックグラウンドで発現させることができる。かかる細胞バックグラウンドの例は、Ｃｈｏ、Ｃｏｓ７、Ｈｅｋ２９３、又はラクダ科動物起源の細胞である。好ましくは、上記細胞関連抗原は、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ４及びＰ２Ｘ７から選択される抗原を含むが、これらに限定されない膜貫通抗原である。
【００２１】
免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリを細胞又はウイルスのセット、コレクション又はサンプルで発現させることができ、細胞又はウイルスの上記セット、コレクション又はサンプルを上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞又はウイルスに関してスクリーニングし、より具体的には上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列を細胞又はウイルスから精製及び／又は単離した後、上記免疫グロブリン配列を発現させることができる。
【００２２】
本発明によれば、免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリを核酸配列のセット、コレクション又はライブラリによりコードすることができ、核酸配列の上記セット、コレクション又はライブラリを上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列に関してスクリーニングし、より具体的には上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列を精製及び／又は単離した後、上記免疫グロブリン配列を発現させることができる。
【００２３】
本発明によれば、上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を、精製及び／又は単離することができる。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載の方法により取得可能な免疫グロブリン、及び上記免疫グロブリン配列を含む組成物に、より具体的にはイオンチャネル及びＧＰＣＲに指向性を有する（本明細書で規定のように）免疫グロブリン配列にも関する。
【００２５】
特に本発明は、１つ又は複数のこのような免疫グロブリン配列を含むか又はこれから本質的になる、イオンチャネルに指向性を有する（本明細書で規定のように）免疫グロブリン配列に、並びに化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチド（それぞれ、本明細書で「本発明の免疫グロブリン配列」、「本発明の化合物」及び「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。本発明は、このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書で「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）に；このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドを調製する方法に；このような免疫グロブリン配列若しくはポリペプチドを発現する又は発現することが可能である宿主細胞に；このような免疫グロブリン配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に；並びに特に予防目的、治療目的又は診断目的、例えば本明細書で言及される予防目的、治療目的又は診断目的のための、このような免疫グロブリン配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１．１Ａ】ＰｉｇＪｅｔ（パネルＢ）又はタトゥー法（パネルＣ）による遺伝子ワクチン接種後のラマにおける体液性免疫応答の動態。血清は４００倍希釈で試験した。矢印はジェット免疫付与の瞬間を示し、タトゥー短間隔計画を星印によって示す。
【図１．１Ｂ】ＰｉｇＪｅｔ（パネルＢ）又はタトゥー法（パネルＣ）による遺伝子ワクチン接種後のラマにおける体液性免疫応答の動態。血清は４００倍希釈で試験した。矢印はジェット免疫付与の瞬間を示し、タトゥー短間隔計画を星印によって示す。
【図１．１Ｃ】ＰｉｇＪｅｔ（パネルＢ）又はタトゥー法（パネルＣ）による遺伝子ワクチン接種後のラマにおける体液性免疫応答の動態。血清は４００倍希釈で試験した。矢印はジェット免疫付与の瞬間を示し、タトゥー短間隔計画を星印によって示す。
【図１．２】単回ＨＢｓＡｇタンパク質追加免疫後にＤＮＡワクチン接種したラマにおいて観察された強い二次血清応答。
【図１．３】タンパク質免疫付与（ラマ３２及びラマ３３）に対する、「ＤＮＡ」初回刺激−「タンパク質」追加免疫プロトコル（ラマ１２４、ラマ１６０、ラマ１１７、ラマ２０３）によって得られた体液性免疫応答。
【図１．４】ＨＢｓＡｇ（ラマ１２４）に対する重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）媒介性抗体応答。
【図２．１】ｐＶＡＸ−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞、及びｐｃＤＮＡ３．１−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクション後のラクダ科動物細胞のＣＸＣＲ４特異的染色。
【図２．２Ａ】遺伝子免疫付与によるラマにおけるＣＸＣＲ４特異的血清変換。パネルＡ：「ＤＮＡ」初回刺激−「細胞」追加免疫プロトコル；パネルＢ：「細胞」追加免疫プロトコルのみ。
【図２．２Ｂ】遺伝子免疫付与によるラマにおけるＣＸＣＲ４特異的血清変換。パネルＡ：「ＤＮＡ」初回刺激−「細胞」追加免疫プロトコル；パネルＢ：「細胞」追加免疫プロトコルのみ。
【図２．３】「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー又は「細胞」レパートリーからのｈＣＸＣＲ４特異的ナノボディ発見効率（ライブラリの数）。
【図２．４】遺伝子免疫付与（ＤＮＡ）及び単回細胞追加免疫（ＰＢ）後に得られた相補的な標的特異的ナノボディレパートリー。レパートリー特異的ナノボディファミリーの数が示される。
【図２．５Ａ】遺伝子免疫付与の後（「ＤＮＡ」）、続く単回細胞追加免疫の後（「ＰＢ」）又は完全細胞免疫付与の後（「細胞」）に同定された、一次スクリーニング後のＣＸＣＲ４特異的ナノボディレパートリーのＦＡＣＳ（パネルＡ）又はＥＬＩＳＡ（パネルＢ）によって求められた平均結合効力（個々のナノボディの数）。
【図２．５Ｂ】遺伝子免疫付与の後（「ＤＮＡ」）、続く単回細胞追加免疫の後（「ＰＢ」）又は完全細胞免疫付与の後（「細胞」）に同定された、一次スクリーニング後のＣＸＣＲ４特異的ナノボディレパートリーのＦＡＣＳ（パネルＡ）又はＥＬＩＳＡ（パネルＢ）によって求められた平均結合効力（個々のナノボディの数）。
【図３．１】遺伝子免疫付与によるラマにおけるｍＰ２Ｘ７特異的血清変換。
【図３．２】ヒトｍＰ２Ｘ７及びマウスｍＰ２Ｘ７の配列アライメント。
【図３．３】遺伝子カクテル免疫付与によるラマにおけるｍＰ２Ｘ７特異的血清変換。
【図３．４Ａ】予め吸着させた免疫血清は遺伝子免疫付与後にｍＰ２Ｘ７特異的重鎖抗体を含有する。パネルＡ：抗ラマＩｇＧ−１；パネルＢ：抗ラマＩｇＧ−２／３。
【図３．４Ｂ】予め吸着させた免疫血清は遺伝子免疫付与後にｍＰ２Ｘ７特異的重鎖抗体を含有する。パネルＡ：抗ラマＩｇＧ−１；パネルＢ：抗ラマＩｇＧ−２／３。
【図３．５】「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー又は「細胞」レパートリーからのｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディ発見効率（ライブラリの数）。
【図３．６】ｍＰ２Ｘ７に対する一次スクリーニング後に同定されたナノボディの配列多様性。ＤＮＡ：ＤＮＡ免疫付与；ＰＢ：ＤＮＡ免疫付与、その後ポスト追加免疫（post boost：ポストブースト）。
【図３．７】ｍＰ２Ｘ７発現Ｈｅｋ２９３細胞及び対照のＷＴ  Ｈｅｋ２９３細胞との結合について抗Ｍｙｃ抗体とのプレインキュベーションを行った、及び行っていないクローン２Ｃ４及びクローン５Ａ１のペリプラズム抽出物の代表例。
【図３．８】ｍＰ２Ｘ７−Ｃｈｏ細胞との結合についての、２４個の異なるファミリーに由来するナノボディの滴定曲線。
【図３．９】ｍＰ２Ｘ７を発現するＹａｃ−１細胞に対するナノボディによるリガンド誘導性ＣＤ６２Ｌシェディング（shedding）の用量依存的阻害。
【図３．１０Ａ】固定濃度のナノボディ（２μＭ）でのｍＰ２Ｘ７媒介性ＣＤ６２Ｌ細胞外ドメインシェディングにおけるヌクレオチドの滴定。パネルＡ／パネルＢ：ナノボディ１４Ｄ５、１３Ｇ９、７Ｈ６、１３Ｂ５、ナノボディなし（no nb）、Ａｒｔ２．２ナノボディ；パネルＣ／パネルＤ：４Ｂ４、７Ｄ６、１３Ａ７、８Ｇ１１、８Ｆ５、８Ｇ１２、ナノボディなし、無関連ナノボディ、Ａｒｔ２．２ナノボディ。
【図３．１０Ｃ】固定濃度のナノボディ（２μＭ）でのｍＰ２Ｘ７媒介性ＣＤ６２Ｌ細胞外ドメインシェディングにおけるヌクレオチドの滴定。パネルＡ／パネルＢ：ナノボディ１４Ｄ５、１３Ｇ９、７Ｈ６、１３Ｂ５、ナノボディなし（no nb）、Ａｒｔ２．２ナノボディ；パネルＣ／パネルＤ：４Ｂ４、７Ｄ６、１３Ａ７、８Ｇ１１、８Ｆ５、８Ｇ１２、ナノボディなし、無関連ナノボディ、Ａｒｔ２．２ナノボディ。
【図３．１１Ａ】１３Ａ７（細胞）、８Ｇ１１（ＰＢ）及び１４Ｄ５（ＤＮＡ）の二価ナノボディは、ｍＰ２Ｘ７機能の遮断又は増強において効力の増強を示す。パネルＡ／パネルＢ：ナノボディ又はナノボディ構築物：８Ｇ１１、１３Ａ７−３５ＧＳ−１３Ａ７、１３Ａ７、８Ｇ１１−３５ＧＳ−８Ｇ１１、無関連ナノボディ；パネルＣ／パネルＤ：ナノボディ又はナノボディ構築物：１４Ｄ５、１４Ｄ５−３５ＧＳ−１４Ｄ５、無関連ナノボディ。
【図３．１１Ｃ】１３Ａ７（細胞）、８Ｇ１１（ＰＢ）及び１４Ｄ５（ＤＮＡ）の二価ナノボディは、ｍＰ２Ｘ７機能の遮断又は増強において効力の増強を示す。パネルＡ／パネルＢ：ナノボディ又はナノボディ構築物：８Ｇ１１、１３Ａ７−３５ＧＳ−１３Ａ７、１３Ａ７、８Ｇ１１−３５ＧＳ−８Ｇ１１、無関連ナノボディ；パネルＣ／パネルＤ：ナノボディ又はナノボディ構築物：１４Ｄ５、１４Ｄ５−３５ＧＳ−１４Ｄ５、無関連ナノボディ。
【図３．１２】遺伝子免疫付与の後（「ＤＮＡ」）、続く単回細胞追加免疫の後（「ＰＢ」）又は完全細胞免疫付与の後（「細胞」）に同定された、ｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディレパートリーのＥＬＩＳＡにより求められた平均結合効力（特有のナノボディの数）。
【図３．１３Ａ】ヒト生殖細胞系列配列ＶＨ３−２３／ＪＨ５に対する、８４個の非冗長ｍＰ２Ｘ７選択性ナノボディの配列アライメント。
【図３．１３Ｂ】ヒト生殖細胞系列配列ＶＨ３−２３／ＪＨ５に対する、８４個の非冗長ｍＰ２Ｘ７選択性ナノボディの配列アライメント。
【図４．１】遺伝子銃遺伝子免疫付与によるラマにおけるＣＸＣＲ７特異的血清変換。白色又は黒色のバーは、ＣＸＣＲ７トランスフェクト又は非トランスフェクトＨＥＫ２９３  ＷＴ細胞に対して得られたＭＣＦ値を表す。
【図４．２】「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー又は「細胞」レパートリーからのＣＸＣＲ７特異的ナノボディ発見効率（ライブラリの数）。
【図４．３】遺伝子免疫付与（ＤＮＡ）及び単回細胞追加免疫（ＰＢ）後に得られた相補的な標的特異的ナノボディレパートリー。レパートリー特異的ナノボディファミリーの数が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、添付の特許請求の範囲の主題を包含するが、これに限定されない。
【００２８】
Ａ）定義
特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）, Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）、F.Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th. Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed.Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al., "Immunobiology"（6thEd.）, Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York（2005））、並びに本明細書で言及される包括的な背景技術を参照する。
【００２９】
特に他に指示がなければ、「免疫グロブリン配列」という用語は、本明細書で重鎖抗体を表すのに使用されるのか又は通常の四本鎖抗体を表すのに使用されるかに関係なく、全長抗体、その個々の鎖、及びその全ての部分、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。「抗原結合分子」又は「抗原結合タンパク質」という用語は、免疫グロブリン配列と区別なく使用され、ナノボディを含む。
【００３０】
本発明の一実施形態では、免疫グロブリン配列は、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり、より具体的には免疫グロブリン配列は、通常の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００３１】
本発明によれば、免疫グロブリン配列は、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であってもよく、好ましくはナノボディである。
【００３２】
本発明で与えられる免疫グロブリン配列は、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるか、又は（本明細書で規定のように）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド（１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列を含むか又はこれから本質的になっていてもよく、任意でさらに１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン配列（全て任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結される）を含んでもよい）の一部を形成するのが好ましい。例えば、これに限定されないが、１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列は、全て本明細書に記載される一価、多価、又は多重特異性の本発明のポリペプチドをそれぞれ提供するように、このようなタンパク質又はポリペプチド（任意で（すなわち細胞関連抗原以外の１つ又は複数の他の標的に対する）結合単位としての役割を果たし得る１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン配列を含有し得る）における結合単位として使用してもよい。このようなタンパク質又はポリペプチドは、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態でもあり得る。
【００３３】
本発明は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト及びラクダ科動物の免疫グロブリン配列を含む異なる起源の免疫グロブリン配列を含む。本発明は、完全にヒトの、ヒト化した、又はキメラの免疫グロブリン配列も含む。例えば本発明は、ラクダ科動物の免疫グロブリン配列、及びヒト化したラクダ科動物の免疫グロブリン配列、又はラクダ化ドメイン抗体、例えばWard et al（例えば特許文献３及びDavies and Riechmann（1994 and 1996）を参照されたい）により記載されたようなラクダ化Ｄａｂを含む。さらに本発明は、例えば多価及び／又は多重特異性の構築物を形成する融合免疫グロブリン配列（１つ又は複数のＶＨＨドメインを含有する多価及び多重特異性のポリペプチド、並びにそれらの調製物に関しては、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001、並びに例えば国際公開第９６／３４１０３号及び国際公開第９９／２３２２１号も参照する）、及び本発明の免疫グロブリン配列から誘導される、タグ又は他の機能的部分、例えばトキシン、標識、放射性化学物質等を含む免疫グロブリン配列を含む。
【００３４】
免疫グロブリン配列及び免疫グロブリン配列、特にナノボディの構造は、これらに限定されないが、４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」（当該技術分野及び本明細書中でそれぞれ、「フレームワーク領域１」すなわち「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」すなわち「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」すなわち「ＦＲ３」及び「フレームワーク領域４」すなわち「ＦＲ４」と称される）から構成されると考えることができ、このフレームワーク領域の間には、３つの相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」（当該技術分野でそれぞれ、「相補性決定領域１」すなわち「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」すなわち「ＣＤＲ２」及び「相補性決定領域３」すなわち「ＣＤＲ３」と称される）が挿入される。
【００３５】
ナノボディにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０の範囲内であってもよく、好ましくは１１２〜１１５であり、及び最も好ましくは１１３である。しかし、ナノボディの部分、断片、類似体又は誘導体（本明細書中にさらに記載されたように）は、このような部分、断片、類似体又は誘導体が本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに関して特に限定されないことに留意すべきである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン配列」という用語は、免疫グロブリン分子をコードする核酸配列及び免疫グロブリンポリペプチド自体の両方を表す。任意のより限定的な意味は特定の文脈から明らかになる。
【００３７】
これらの分子は全て、「本発明のポリペプチド」とも称され、これは本発明の「免疫グロブリン配列」と同義である。
【００３８】
さらに、（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」のような用語における）「配列」という用語は本明細書で使用される場合、文脈からより限定的な解釈が要求されない限り、関連の免疫グロブリン配列及びこれをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列の両方を含むことが一般的に理解されるものとする。
【００３９】
以下において、本発明の「核酸分子」に対する言及は、特定の文脈から明らかなように、遺伝子ワクチン接種のための核酸、又は本発明の免疫グロブリン配列をコードする核酸、又はその両方のいずれかに関し得る。
【００４０】
特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施している。同様に例えば、標準的なハンドブック、及び本明細書で言及される包括的な背景技術、並びに本明細書で引用されるさらなる参考文献、並びに例えば以下のレビュー、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 （5-6）: 640-56、Levin and Weiss, Mol. Biosyst.2006, 2（1）: 49-57、Irving et al., J.Immunol. Methods, 2001, 248（1-2）, 31-45、Schmitzet al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12、Gonzaleset al., Tumour Biol., 2005, 26（1）, 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法、及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を記載している）を参照する。
【００４１】
本発明は、本明細書で規定のように抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関する。本発明との関連では、或る特定の抗原「と結合する及び／又はこれに対する親和性を有する」とは例えば抗体及びそれらのそれぞれの抗原との関連で理解されるような当該技術分野での通常の意味を有する。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、「と結合する及び／又はこれに対する親和性を有する」という用語は、免疫グロブリン配列が抗原と特異的に相互作用することを意味し、該用語は上記抗原「に対する」免疫グロブリン配列と区別なく使用される。
【００４３】
「特異性」という用語は、特定の免疫グロブリン配列、抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）が結合することができる、様々なタイプの抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合力の評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の評価基準である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。
【００４４】
典型的に、本発明の免疫グロブリン配列（例えば本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ及び／又はポリペプチド）が、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）それらの抗原と結合する、並びに／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）のｋｏｎ速度で本明細書に規定の細胞関連抗原と結合する、並びに／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）のｋｏｆｆ速度で本明細書に規定の細胞関連抗原と結合する。
【００４５】
１０−４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（すなわち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。
【００４６】
好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で所望の抗原と結合する。
【００４７】
抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
【００４８】
当業者にとって明らかなように、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書で言及される技法が含まれる。これに関して、１０−４モル／Ｌ又は１０−３モル／Ｌより大きい（例えば１０−２モル／Ｌの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかである。任意で、また当業者にとって明らかなように、（実際又は見掛けの）解離定数は、その関係性（ＫＤ＝１／ＫＡ）から（実際又は見掛けの）結合定数（ＫＡ）に基づき算出することができる。
【００４９】
親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤすなわち解離定数として与えられ、その単位はモル／Ｌ（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい結合定数ＫＡとも表すことができ、その単位は（モル／Ｌ）−１（又はＭ−１）である。本明細書では、２つの分子（例えば本発明の免疫グロブリン配列、免疫グロブリン配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的とする標的との）間の相互作用の安定性は主に、これらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を考慮して、ＫＤ値による分子相互作用の強さの特定を、対応するＫＡ値を算出するのに利用することもできることは、当業者にとって明らかである。ＫＤ値は、ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）の既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関連するので、熱力学的意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。
【００５０】
有意（例えば特異的）と見なされる、生物学的相互作用、例えば本発明の免疫グロブリン配列と本明細書に規定の細胞関連抗原との結合に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなれば、そのＫＤは低くなる。
【００５１】
ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと称される）と、その結合速度（ｋｏｎと称される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。結合速度（on-rate）ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。
【００５２】
本発明の免疫グロブリン配列に関して、結合速度は、二分子相互作用に関する拡散律速結合速度定数に近づきながら１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。本発明の免疫グロブリン配列の解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【００５３】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法（例えば既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えばOber et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照されたい）（ここで、１つの分子がバイオセンサーチップ上に固定化され、もう１つの分子が、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、及びしたがってＫＤ（又はＫＡ）値が得られるフロー条件下で固定化分子上を通る）で測定することができる。例えば、既知のビアコアの機器を使用してこれを実施することができる。
【００５４】
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関するアーチファクト（artefacts：人工産物）によって、示唆した分子の固有の結合親和性に幾らか影響を与える場合、測定されたＫＤは見掛けのＫＤに対応し得ることも、当業者にとって明らかであろう。また、１つの分子が、もう１つの分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下で、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性により影響され得る。
【００５５】
親和性を評価するのに使用することができる別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods, 77,305-19, 1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子の１つの吸着に関連すると考えられ得るアーチファクトが避けられる。
【００５６】
しかし、ＫＤの正確な測定はかなりの労力を要する可能性があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫した方法で（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書で、ＫＤ及び見掛けのＫＤは、等しい重要性又は関連性があるとして処理されるべきであることに留意すべきである。
【００５７】
最後に、多くの状況下で経験豊かな科学者は、幾つかの参照分子と比較して結合親和性を決定することが都合がよいと判断することができることに留意すべきである。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えば分子Ｂと結合することが知られており、かつＥＬＩＳＡ若しくはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするためのフルオロフォア基若しくはクロモフォア基、若しくは他の化学部分（例えばビオチン）、又は他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃは固定濃度に維持し、分子Ａの濃度は、分子Ｂの所定の濃度又は量に対して変化させる。結果として、分子Ａの非存在下で分子Ｃについて測定されたシグナルが半分になる分子Ａの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に対する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆの場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較される結合因子に関して一貫した方法で（例えばｃｒｅｆを固定して）実施されれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、この測定値は、本明細書を通してＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
【００５８】
本発明との関連では、「立体構造依存性エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、抗原の一次配列の単一の連続ストレッチ内にないアミノ酸を含むエピトープを示す。言い換えると、タンパク質標的の二次構造及び／又は三次構造のために、一次配列において離れた位置にあり得るアミノ酸が互いに近づくことにより、エピトープの形成に関与する。例えば抗原が３つのアミノ酸ループを含む場合、これらのループのそれぞれ１つにおける残基が単一のエピトープの形成に関与し得る。同じことが２つ以上のドメイン又はサブユニットを含む抗原にも当てはまる。この場合、エピトープは異なるドメイン又はサブユニット上のアミノ酸により形成され得る。また適切な条件によるタンパク質の完全な又は部分的な変性、すなわち二次構造及び／又は三次構造の部分的な又は完全な破壊が立体構造エピトープを部分的に又は完全に破壊する。当業者は、立体構造エピトープがタンパク質を変性させることにより破壊される正確な条件はタンパク質の性質及び特定の状況に応じて変わることを理解するだろう。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明は立体構造エピトープに対する免疫グロブリン配列に関する。特に本発明は、好ましくはラクダ科動物の免疫グロブリン配列（ナノボディを含む）であり得る、本明細書で規定のような細胞関連抗原上の立体構造エピトープに対する免疫グロブリン配列に関する。
【００６０】
本発明との関連では、「細胞関連抗原」は、細胞の膜（細胞内コンパートメント及びオルガネラの膜を含む）にしっかりと固定される、又は細胞の膜内に位置する抗原を意味し、単一又は複数の膜貫通領域を有する抗原を含む。言い換えると、この用語は、膜依存性の立体構造エピトープを示す抗原を表す。特にこの用語は、本明細書で規定のような立体構造エピトープを有する抗原を表す。この用語は、膜貫通抗原、ＧＰＣＲ又はイオンチャネル等の多重膜貫通ドメインを有する膜貫通抗原を包含する。これらの全ての抗原の中で、当業者には、本発明の好ましい細胞関連抗原を表す、広範な新薬開発のための（druggable）標的抗原が知られている。本発明は特に、立体構造依存性のエピトープが膜での正しい固定及び／又は位置に依存する細胞関連抗原に関する。このため本発明は、このような立体構造依存性のエピトープに対する免疫グロブリン配列を提供する。
【００６１】
好ましい実施形態では本発明は、１つ又はより好ましくは複数の膜貫通ドメインを有する内在性膜タンパク質である抗原に関する。これらの抗原は細胞の原形質膜、並びに／又は細胞内コンパートメント及びオルガネラの膜に存在するか、又はこれらの膜内で機能する。多くの膜貫通タンパク質、例えば膜貫通受容体は、互いに機能的に相互作用する、２つ以上のサブユニット又はドメインを含む。
【００６２】
内在性膜タンパク質は、３つの異なる部分又はドメイン、すなわち細胞外（又はコンパートメント外）ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内（又はコンパートメント内）ドメインを含む。複数の膜貫通ドメインを有するタンパク質は典型的に、複数の細胞／コンパートメント外及び細胞／コンパートメント内のドメインも有する。例えば、７回膜貫通受容体は７つの膜貫通ドメインを含む。
【００６３】
このため、細胞関連抗原という用語は本明細書で理解される場合、緩くしか結び付かない、すなわち膜にしっかりと固定されない又は膜内に位置しない抗原を排除することが意図される。抗原は膜の中と延びる少なくとも１つのドメイン又は部分を含む場合にしっかりと固定される。
【００６４】
一実施形態では本発明は、脂質尾部（lipid tail）を介する膜挿入部を有するが、膜貫通ドメインを有しない抗原を排除する。この場合、タンパク質の親水性部分又は親水性ドメインの立体構造は膜環境に依存しない。例えば、適切な立体構造にある、すなわち抗原が脂質尾部を介して膜と結び付く場合にも存在する立体構造エピトープを発現する、脂質尾部を欠いた組換えタンパク質を発現することが考え得る。同様に、緩くしか結び付かない任意の他のタンパク質が特定の実施形態で本発明から排除される。これに関連して「緩く結び付いた」タンパク質は、膜が存在しない場合であっても天然立体構造を示す、すなわち天然立体構造が膜との固定又は膜内での包埋（embedding）に依存しないタンパク質を意味する。さらに特定の実施形態では、本発明はＡＲＴ２．２を排除する。
【００６５】
本発明による細胞関連抗原の典型例は、７回膜貫通ドメイン受容体、例えばＧタンパク質共役受容体、例えばさらに本明細書で記載されるもの、アドレナリン受容体、嗅覚受容体、受容体チロシンキナーゼ、例えば上皮成長因子受容体、インスリン受容体、線維芽細胞成長因子受容体、高親和性のニューロトロフィン受容体、及びＥｐｈ受容体、インテグリン、低親和性の神経成長因子受容体、ＮＭＤＡ受容体、幾つかの免疫受容体、例えばトール様受容体、Ｔ細胞受容体及びＣＤ２８を含む。さらには、本発明による細胞関連抗原は、イオンチャネル、例えば本明細書にさらに記載されるもの、カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、２Ｐイオンチャネル、６−ＴＭイオンチャネル、電圧依存性イオンチャネル及び／又はカルシウム活性化カリウムチャネルも含む。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「細胞関連抗原」という用語は、上記細胞関連抗原の任意の部分、断片、サブユニット、又はドメインを含み、またこれを表すことが意図される。細胞関連抗原の任意のサブセクションは、対象となる立体構造エピトープを表す場合、本発明の範囲内にある。例えば対象となるエピトープが受容体の結合部位、又はイオンチャネルの孔に位置する場合、上記エピトープを形成することが可能な細胞関連抗原の任意の断片（複数可）が本発明に含まれる。好ましくは、これらの部分、ドメイン、断片又はサブユニットは、膜依存性の立体構造に関与する細胞関連抗原の部分である。例えばタンパク質が伸長（extended）細胞内ループにより連結した幾つかの膜貫通ドメインを含む場合、細胞外立体構造エピトープに影響することなく、かかるループが一部又は完全に省略されることが想定される。
【００６７】
特に本発明は、天然立体構造で細胞関連抗原に指向性を有する免疫グロブリン配列に関する。本発明との関連では、「天然立体構造」は、タンパク質がその二次構造及び／又は三次構造、特にその膜依存性の二次構造及び／又は三次構造を示すことを意味する。言い換えると、天然立体構造は、非変性形態のタンパク質を説明し、立体構造エピトープ、特に膜依存性の立体構造エピトープが存在する立体構造を説明する。具体的にタンパク質は、タンパク質が膜に組み込まれ、又は膜にしっかりと結合する場合に存在する立体構造を有する。抗原は、細胞関連抗原を発現する天然細胞若しくはトランスフェクト細胞を含む細胞、細胞由来の膜抽出物、抗原を内包する小胞若しくは任意の他の膜誘導体、リポソーム、又は細胞関連抗原を発現するウイルス粒子に存在する場合、天然立体構造で得ることができる。これらの実施形態のいずれかでは、抗原は好適な手段で濃縮することができる。上記細胞関連抗原を、Ｃｈｏ、Ｃｏｓ７、Ｈｅｋ２９３、又はラクダ科動物起源の細胞を包含するがこれらに限定されない、未変性又は天然の（native or natural）立体構造での抗原の発現を可能にする任意の好適な細胞で発現させることができる。
【００６８】
本発明の細胞関連抗原は、好ましくは新薬開発のための膜タンパク質、特に複数の膜貫通ドメインを有する新薬開発のための膜タンパク質である。本発明の一実施形態では、標的はＧＰＣＲ又はイオンチャネルである。
【００６９】
本発明による細胞関連抗原を表すイオンチャネルの具体的であるが非限定的な例が以下に与えられる。このようなイオンチャネルを特異的に認識する免疫グロブリン配列の治療効果も挙げている。
【００７０】
１．Ｔｗｏ−Ｐカリウムチャネル（Goldstein etal., Pharmacological Reviews, 57, 4, 527 （2005）を参照されたい）、例えばＫ２Ｐ１．１、Ｋ２Ｐ２．１、Ｋ２Ｐ３．１、Ｋ２Ｐ３．１、Ｋ２Ｐ４．１、Ｋ２Ｐ５．１、Ｋ２Ｐ６．１、Ｋ２Ｐ７．１、Ｋ２Ｐ９．１、Ｋ２Ｐ１０．１、Ｋ２Ｐ１２．１、Ｋ２Ｐ１３．１、Ｋ２Ｐ１５．１、Ｋ２Ｐ１６．１、Ｋ２Ｐ１７．１及びＫ２Ｐ１８．１（これらは全て、ＦＬＩＰＲ又はパッチ−クランプ等の電気生理学的アッセイを用いてスクリーニングすることができる）。
２．ＣａｔＳｐｅｒチャネル（Clapham and Garbers,Pharmacological Reviews, 57, 4, 451 （2005）を参照されたい）、例えばＣａｔＳｐｅｒ−１及びＣａｔＳｐｅｒ−２（両方とも受精能及び精子の運動性にかかわる）、ＣａｔＳｐｅｒ−３及びＣａｔＳｐｅｒ−４（これらは全て、ＦＬＩＰＲ、パッチ−クランプ、又はカルシウム画像化技法等の電気生理学的アッセイを用いてスクリーニングすることができる）。
３．二孔チャネル（Clapham and Garbers,Pharmacological Reviews, 57, 4, 451 （2005）を参照されたい）、例えばＴＰＣ１及びＴＰＣ２。
４．環状ヌクレオチド依存性チャネル（Hofman etal., Pharmacological Reviews, 57, 4, 455 （2005）を参照されたい）、例えばＣＮＧＡ−１、ＣＮＧＡ−２、ＣＮＧＡ−３、ＣＮＧＡ−４Ａ、ＣＮＧＢ１及びＣＮＧＢ３（これらはパッチ−クランプ及びカルシウム画像化等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
５．過分極活性化環状ヌクレオチド依存性チャネル（Hofmanet al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 455 （2005）を参照されたい）、例えばＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４（全て心不整脈及び虚血性心疾患のための薬剤開発のための有力な薬理学標的と考えられる）（これらは電圧固定等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
６．内向き整流型のカリウムチャネル（Kubo et al.,Pharmacological Reviews, 57, 4, 509 （2005）を参照されたい）、例えばＫｉｒ１．１、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．２、Ｋｉｒ２．３、Ｋｉｒ２．４、Ｋｉｒ３．１、Ｋｉｒ３．２、Ｋｉｒ３．３、Ｋｉｒ３．４、Ｋｉｒ３．４、Ｋｉｒ４．２、Ｋｉｒ５．１、Ｋｉｒ６．１（降圧薬及び冠拡張薬に関する標的）、Ｋｉｒ６．２（ペントラミンに関する標的；そのサブユニットＳＵＲ１は糖尿病及びＰＨＨＩの治療に関する標的である）及びＫｉｒ７．１（カルシウムチャネルブロッカーの副作用に関する可能性がある部位である）（これらは電圧固定等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
７．カルシウム活性化カリウムチャネル（Wei et al.,Pharmacological Reviews, 57, 4, 463 （2005）を参照されたい）、例えば
ＫＣａ１．１−脳卒中、癲癇、膀胱過反応性（bladder over-reactivity）、喘息、高血圧、胃の過剰運動性（gastrichypermotility）及び精神病の治療に有用であり得るオープナー；
ＫＣａ２．１−筋緊張性筋ジストロフィー、消化管運動障害、記憶障害、癲癇、ナルコレプシー及びアルコール依存症等の様々な疾患の治療に有用であり得るモジュレータ。ＫＣａ２．２のオープナーは小脳性運動失調症のために提唱されている；
ＫＣａ２．２−筋緊張性筋ジストロフィー、消化管運動障害、記憶障害、癲癇、ナルコレプシー及びアルコール依存症等の様々な疾患の治療に有用であり得るモジュレータ。Ｋｃａ２．２のオープナーは小脳性運動失調症のために提唱されている；
ＫＣａ２．２−筋緊張性筋ジストロフィー、消化管運動障害、記憶障害、癲癇、ナルコレプシー、高血圧及び尿失禁等の様々な疾患の治療に有用であり得るモジュレータ；
ＫＣａ３．１−鎌状赤血球貧血、糖尿病の治療に、免疫抑制剤として、ＥＡＥに、再狭窄及び血管形成の予防に、脳損傷の治療に、並びに脳浮腫の低減に有用であり得るブロッカー。ＫＣａ３．１のオープナーは嚢胞性線維症及びＣＯＰＤの治療のために提唱されている；
並びにＫＣａ４．１、ＫＣａ４．２及びＫＣａ５．１（それらは全て、電気生理学的技法又はパッチ−クランプ若しくは電圧固定等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
８．カリウムチャネル（Shieh et al.,Pharmacological Reviews, 57, 4, 557 （2005）及びGutman et al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 473 （2005）を参照されたい）、例えば
電圧依存性カルシウムチャネル、例えばＫｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６及びＫｖ．１７；
電圧依存性及びｃＧＭＰ依存性のカルシウムチャネル、例えばＫｖ１．１０；
Ｋｖチャネルのβ−サブユニット、例えばＫｖβ−１、Ｋｖβ−２及びＫｖβ−３；
Ｓｈａｂ様チャネル、例えばＫｖ２．１及びＫｖ２．２；
Ｓｈａｗ様チャネル、例えばＫｖ３．１、Ｋｖ３．２、Ｋｖ３．３及びＫｖ３．４；
Ｓｈａｌ様チャネル、例えばＫｖ４．１、Ｋｖ４．２、Ｋｖ４．３、Ｋｖ５．１、Ｋｖ６．１、Ｋｖ６．２、Ｋｖ８．１、Ｋｖ９．１、Ｋｖ９．２、Ｋｖ９．３、ＫＨ１及びＫＨ２；
ｅｔｈｅｒ−ａ−ｇｏ−ｇｏチャネル、例えばＥＡＧ、ＨＥＲＧ、ＢＥＣ１及びＢＥＣ２；
ＭｉｎＫ型チャネル、例えばＭｉｎＫ、ＭｉＲＰ１及びＭｉＲＰ２；
ＫｖＬＱＴ型チャネル、例えばＫｖＬＱＴ１、ＫｖＬＱＴ２、ＫｖＬＱＴ３、ＫｖＬＱＴ４、ＫｖＬＱＴ５；
内向き整流型カリウムチャネル、例えば上述のもの；
スルホニル尿素受容体、例えばスルホニル尿素受容体１及び２；
大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、例えばＳ／ｏ及びＢＫＣａのβ−サブユニット；
小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、例えばＳＫ１、ＳＫ２及びＳＫ３；
中間コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、例えばＩＫＣａ１；
二孔カリウムチャネル、例えばＴＷＩＫ１、ＴＲＥＫ、ＴＡＳＫ、ＴＡＳＫ２、ＴＷＩＫ２、ＴＯＳＳ、ＴＲＡＡＫ及びＣＴＢＡＫ１；
（それらは全て、電気生理学的技法又はパッチ−クランプ若しくは電圧固定等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。カリウムチャネルは、心疾患（例えば不整脈）、神経疾患、神経筋障害、聴覚及び前庭疾患、腎疾患、アルツハイマー病及び代謝性疾患等の多種多様な疾患及び障害にかかわり、これらの疾患における活性化合物の標的である。これらについても、Shieh et al.及びGutman et al.（及びそれらで言及されるさらなる従来技術）によるレビュー、並びに本明細書で言及されるさらなる引例を参照する。Shiehのレビューの表３及び表４は、様々なカリウムチャネルの多くの既知のオープナー及びブロッカーのそれぞれ、及びそれらが使用／提唱されている疾患適応症にも言及している。
９．電圧依存性カルシウムチャネル（Catterall etal., Pharmacological Reviews, 57, 4, 411 （2005）を参照されたい）、例えば
Ｃａｖ１．２−Ｃａ２＋アンタゴニストとして有用であるモジュレータ；
Ｃａｖ１．３−心拍数を調節するために、抗うつ剤として、及び聴覚障害用の薬剤として提唱されているモジュレータ；
Ｃａｖ２．１−炎症性疼痛用の鎮痛剤として提唱されているモジュレータ；
Ｃａｖ２．２−炎症性疼痛、術後疼痛、温熱性痛覚過敏、慢性疼痛及び機械的異痛等の疼痛用の鎮痛剤として提唱されているモジュレータ；
Ｃａｖ３．２−癲癇、高血圧及び狭心症のための標的として提唱されている；
Ｃａｖ３．３−視床振動（thalamicoscillations）の治療のための標的として提唱されている；
及びＣａｖ１．１、Ｃａｖ１．４、Ｃａｖ２．３、Ｃａｖ３．１（それらは全て、パッチ−クランプ、電圧固定及びカルシウム画像化等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
１０．一過性受容体電位（ＴＲＰ）チャネル（Clapham etal., Pharmacological Reviews, 57, 4, 427 （2005）を参照されたい）、例えば
ＴＲＰＣチャネル、例えばＴＲＰＣ１、ＴＲＰＣ２、ＴＲＰＣ３、ＴＲＰＣ４、ＴＲＰＣ５、ＴＲＰＣ６及びＴＲＰＣ７；
ＴＲＰＶチャネル、例えばＴＲＰＶ１、ＴＲＰＶ２、ＴＲＰＶ３、ＴＲＰＶ４、ＴＲＰＶ５及びＴＲＰＶ６；
ＴＲＰＭチャネル、例えばＴＲＰＭ１、ＴＲＰＭ２、ＴＲＰＭ３、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ５、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＭ７及びＴＲＰＭ８；
ＴＲＰＡ１；
ＴＲＰＰチャネル、例えばＰＫＤ１、ＰＫＤ２Ｌ１及びＰＫＤ２Ｌ２（これらは多発性嚢胞腎にかかわる）；
ＴＲＰＭＬチャネル、例えばムコリピン１、ムコリピン２及びムコリピン３；
（それらは、パッチ−クランプ又はカルシウム画像化等の技法を用いてスクリーニングすることができる）。
１１．電圧依存性ナトリウムチャネル（Catterall etal., Pharmacological Reviews, 57, 4, 397 （2005）を参照されたい）、例えば
Ｎａｖ１．１、Ｎａｖ１．２及びＮａｖ１．３−癲癇及び発作の予防及び治療用の薬剤のための標的である；
Ｎａｖ１．４−ミオトニーの治療用の局所麻酔のための標的である；
Ｎａｖ１．５−抗不整脈薬のための標的である；
Ｎａｖ１．６−抗癲癇薬及び鎮痛剤のための標的である；
Ｎａｖ１．７、Ｎａｖ１．８及びＮａｖ１．９−局所麻酔のための潜在的な標的である；
（それらは全て電圧固定又は電圧感受性色素を伴う技法を用いてスクリーニングすることができる）。
【００７１】
イオンチャネル、並びにそれらが関連する疾患及び障害が当該技術分野で既知である。例えば以下のレビュー：Goldstein et al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 527 （2005）；Yu et al., Pharmacological Reviews,57, 4, 387 （2005）；Clapham andGarbers, Pharmacological Reviews, 57, 4, 451 （2005）；Hoffmann et al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 455 （2005）；Kubo et al., Pharmacological Reviews,57, 4, 509 （2005）；Wei et al.,Pharmacological Reviews, 57, 4, 463 （2005）；Shieh et al, Pharmacological Reviews, 57, 4, 557 （2005）；Catterall et al, PharmacologicalReviews, 57, 4, 411 （2005）；Gutmanet al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 473 （2005）；Clapham et al., Pharmacological Reviews, 57, 4, 427 （2005）；及びCatterall et al., PharmacologicalReviews, 57, 4, 397 （2005）；並びにこれらのレビュー並びに以下の論文及びレビュー：Chandy et al., Trends in Pharmacological Sciences, May 2004, 280-289；Takana and Shigenobu, J. Pharmacol. Sci., 99, 214-200 （2005）；Padinjat and Andrews, Journal of CellScience, 117, 5707-5709 （2004）；Amiret al., The Journal of Pain, Vol. 7, No. 5, S1-S29 （2006）；Devor, The Journal of Pain, Vol. 7, No. 15, S3-S12 （2006）；Xie et al., Current Drug Discovery,April 2004, 31-33；Vianna-Jorge and Suarez-Kurtz,BioDrugs 2004, 18（5）, 329-41；Garcia and Kaczorowski, Sci STKE, 2005, 302；Gopalakrishnanand Shieh, Expert Opin. Ther. Targets, 2005, 8（5）, 437-58；Mannhold, Med. Res. Rev., 2004, 24（2）, 213-66；Sabido-Davidet al., Expert Opin. Investig. Drugs, 2004, 13（1）1249-61；及びChrist, Journal of Andrology,Vol. 23, No. 5, S10-S19 （2002）で言及されるさらなる引例を、並びにこれらで言及されたさらなる従来技術（全て参照により本明細書で援用される）を、並びに本願で言及される以下の表及びさらなる従来技術を参照する。
【００７２】
これらのレビュー及びこの従来技術から分かるように、イオンチャネルは一般的に、それらを通過することができるイオンに応じて（すなわちカルシウムチャネル、ナトリウムチャネル又はカリウムチャネル）、それらの組成及び構造に応じて（例えばサブユニット、孔及び膜貫通ドメインの数及び種類に応じて、例えば２Ｐイオンチャネル、６−ＴＭイオンチャネル等）、及び／又はそれらが活性化される様式に応じて（例えば電圧依存性イオンチャネル又はカルシウム活性化カリウムチャネル）分類される。
【００７３】
イオンチャネルは一般的に、細胞内ループと細胞外ループとの組合せにより連結された、多くの膜貫通ドメインサブユニットを含む。これらについても上記で言及された引例及び従来技術、並びにBenham, Nature Biotechnology, October 2005, 1234-1235、並びに本明細書で言及されるさらなる従来技術を参照する。
【００７４】
イオンチャネルが膜タンパク質であり、様々な疾患状態と既知の関連があるということにより、イオンチャネルが薬学的化合物及び獣医学的化合物のための（すなわち予防、治療又は診断のための）魅力的な分子標的となる。また、活性（アゴニスト、アンタゴニスト、ブロッカー及び／又はオープナーのいずれかとして）及び／又はイオンチャネル及びそれらの生物学的活性又は生理学的活性に関する選択性に関して潜在的な薬学的化合物又は獣医学的化合物をスクリーニングする方法が従来技術分野で既知である。関与するイオンチャネルに応じた好適な技法の幾つかの非限定的な例としては、パッチ−クランプ、電圧固定、イオン束の測定、ＦＬＩＰＲ、カルシウム画像化及び電気生理学的技法等の技法が挙げられる。
【００７５】
本発明による細胞関連抗原を表すＧＰＣＲの具体的であるが、非限定的な例が以下に与えられる。これらのＧＰＣＲに指向性を有する本発明の免疫グロブリン配列の幾つかの例示的な治療効果も挙げられている。
【００７６】
Ａ群ＧＰＣＲ
アセチルコリン受容体（アゴニスト）、
ムスカリン受容体（アゴニスト）、
ムスカリンＭ１受容体（アゴニスト）、
ムスカリンＭ２受容体（アゴニスト）、
ムスカリンＭ３受容体（アゴニスト）、
ムスカリンＭ４受容体（アゴニスト）、
ムスカリンＭ５受容体（アゴニスト）、
ムスカリン受容体（部分アゴニスト）、
アドレナリン受容体（アゴニスト）、
αアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α１アドレナリン受容体（アゴニスト）、
α１Ａアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α１Ｂアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α１Ｄアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α２アドレナリン受容体（アゴニスト）、
α２Ａアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α２Ｂアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α２Ｃアドレナリン受容体（アゴニスト）、
α２アドレナリン受容体（部分アゴニスト）、
α３アドレナリン受容体（アゴニスト）、
βアドレナリン受容体（アゴニスト）、
β１アドレナリン受容体（アゴニスト）、
β２アドレナリン受容体（アゴニスト）、
β３アドレナリン受容体（アゴニスト）、
ドーパミン受容体（アゴニスト）、
ドーパミンＤ５受容体（アゴニスト）、
ドーパミンＤ１受容体（アゴニスト）、
ドーパミンＤ２受容体（アゴニスト）、
ドーパミンＤ３受容体（アゴニスト）、
ドーパミンＤ４受容体（アゴニスト）、
ヒスタミン受容体（アゴニスト）、
ヒスタミンＨ１受容体（アゴニスト）、
ヒスタミンＨ２受容体（アゴニスト）、
ヒスタミンＨ３受容体（アゴニスト）、
ヒスタミンＨ４受容体（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ＧＰＣＲ（アゴニスト）、
５−ＨＴ  １（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ２（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ４（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ５ａ（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ５ｂ（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ６（アゴニスト）、
５−ＨＴ  ７（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−１（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−２（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−３（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−４（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−５（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−６（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−７（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−８（アゴニスト）、
微量アミン関連受容体−９（アゴニスト）、
アペリン受容体（アゴニスト）、
カンナビノイド受容体（アゴニスト）、
カンナビノイドＣＢ１受容体（アゴニスト）、
カンナビノイドＣＢ２受容体（アゴニスト）、
リゾスフィンゴ脂質受容体（アゴニスト）、
スフィンゴシン−１−リン酸受容体−１（アゴニスト）、
リゾホスファチジン酸−１受容体（アゴニスト）、
スフィンゴシン−１−リン酸受容体−３（アゴニスト）、
リゾホスファチジン酸−２受容体（アゴニスト）、
スフィンゴシン−１−リン酸受容体−２（アゴニスト）、
スフィンゴシン−１−リン酸受容体−４（アゴニスト）、
リゾホスファチジン酸−３受容体（アゴニスト）、
スフィンゴシン−１−リン酸受容体−５（アゴニスト）、
Ａ群ホルモンタンパク質ＧＰＣＲ（アゴニスト）、
ＦＳＨ（アゴニスト）、
黄体形成ホルモン受容体（アゴニスト）、
ＴＳＨ（アゴニスト）、
ロイコトリエン（アゴニスト）、
ロイコトリエンＢＬＴ受容体（アゴニスト）、
システイニルロイコトリエン受容体（アゴニスト）、
メラトニン（アゴニスト）、
メラトニンＭＴ１（アゴニスト）、
メラトニンＭＴ２（アゴニスト）、
メラトニンＭＴ３（アゴニスト）、
Ａ群ヌクレオチド様ＧＰＣＲ（アゴニスト）、
アデノシン受容体（アゴニスト）、
Ｐ２Ｙ受容体（アゴニスト）、
Ａ群オーファンＧＰＣＲ（アゴニスト）、
グレリン（アゴニスト）、
Ａ群ペプチドＧＰＣＲ（アゴニスト）、
アンジオテンシン受容体（アゴニスト）、
アンジオテンシンＩ受容体（アゴニスト）、
アンジオテンシンＩＩ受容体（アゴニスト）、
ボンベシン受容体（アゴニスト）、
ボンベシンＢＢ１受容体（アゴニスト）、
ボンベシンＢＢ２受容体（アゴニスト）、
ボンベシンｂｂ３受容体（アゴニスト）、
ガストリン放出ペプチドリガンド、
ニューロメディンＢリガンド、
ニューロメディンＣリガンド、
ブラジキニン受容体（アゴニスト）、
ブラジキニンＢ１受容体（アゴニスト）、
ブラジキニンＢ２受容体（アゴニスト）、
Ｃ３ａ受容体（アゴニスト）、
Ｃ５ａ（アゴニスト）、
ＣＣＫ受容体（アゴニスト）、
ＣＣＫ  １受容体（アゴニスト）、
ＣＣＫ  ２受容体（アゴニスト）、
ガストリン（アゴニスト）、
ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣケモカイン受容体（アゴニスト）、
ＣＣＲ１ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ２ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ３ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ４ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ５ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ６ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ７ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ８ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ９ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ１０ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＣＲ１１ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（アゴニスト）、
ＣＸ３ＣＲ１ケモカイン（アゴニスト）、
ＸＣＲ１ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＸＣケモカイン受容体（アゴニスト）、
ＣＸＣＲ１ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＸＣＲ３ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＸＣＲ４ケモカイン（アゴニスト）、
ＣＸＣＲ５ケモカイン（アゴニスト）、
アドレノメジュリン受容体（アゴニスト）、
エンドセリン（アゴニスト）、
エンドセリンＥＴ−Ａ（アゴニスト）、
エンドセリンＥＴ−Ｂ（アゴニスト）、
ガラニン（アゴニスト）、
ガラニンＧＡＬ１（アゴニスト）、
ガラニンＧＡＬ２（アゴニスト）、
ガラニンＧＡＬ３（アゴニスト）、
ＩＬ−９（アゴニスト）、
ＫｉＳＳ−１受容体（アゴニスト）、
メラニン凝集ホルモン（アゴニスト）、
ＭＣＨ受容体−１（アゴニスト）、
ＭＣＨ受容体−２（アゴニスト）、
メラノコルチン（アゴニスト）、
メラノコルチンＭＣ１（アゴニスト）、
ＡＣＴＨ受容体（アゴニスト）、
メラノコルチンＭＣ３（アゴニスト）、
メラノコルチンＭＣ４（アゴニスト）、
メラノコルチンＭＣ５（アゴニスト）、
ＮＫ（アゴニスト）、
ＮＫ１（アゴニスト）、
ＮＫ２（アゴニスト）、
ＮＫ３（アゴニスト）、薬剤：１
神経ペプチドＹ受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＹ１受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＹ２受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＹ４受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＹ５受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＹ６受容体（アゴニスト）、
ニューロテンシン受容体（アゴニスト）、
ニューロテンシンＮＴＳ１（アゴニスト）、
ニューロテンシンＮＴＳ２（アゴニスト）、
オレキシン及び神経ペプチドＦＦ受容体（アゴニスト）、
オレキシン（アゴニスト）、
オピオイド（アゴニスト）、
δオピオイド（アゴニスト）、
κオピオイド（アゴニスト）、
μオピオイド（アゴニスト）、
ＯＲＬ１受容体（アゴニスト）、
オピオイド（部分アゴニスト）、
σオピオイド（アゴニスト）、
オレキシン及び神経ペプチドＦＦ受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＦＦ受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＦＦ１受容体（アゴニスト）、
神経ペプチドＦＦ２受容体（アゴニスト）、
オレキシン（アゴニスト）、
オレキシン−１（アゴニスト）、
オレキシン−２（アゴニスト）、
プロテアーゼ活性化受容体（アゴニスト）、
プロテアーゼ活性化受容体−１（アゴニスト）、
プロテアーゼ活性化受容体−２（アゴニスト）、
プロテアーゼ活性化受容体−３（アゴニスト）、
プロテアーゼ活性化受容体−４（アゴニスト）、
プロキネチシン受容体（アゴニスト）、
プロキネチシン受容体−１（アゴニスト）、
プロキネチシン受容体−２（アゴニスト）、
ソマトスタチン（アゴニスト）、
ソマトスタチン１（アゴニスト）、
ソマトスタチン２（アゴニスト）、
ソマトスタチン３（アゴニスト）、
ソマトスタチン４（アゴニスト）、
ソマトスタチン５（アゴニスト）、
ウロテンシンＩＩ（アゴニスト）、
バソプレシン様受容体（アゴニスト）、
オキシトシン（アゴニスト）、
バソプレシン（アゴニスト）、
バソプレシンＶ１（アゴニスト）、
バソプレシンＶ２（アゴニスト）、
プロスタノイド受容体（アゴニスト）、
ＤＰプロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＤ２（アゴニスト）、
ＥＰ１プロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＥ２（アゴニスト）、
ＥＰ２プロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＥ２（アゴニスト）、
ＥＰ３プロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＥ２（アゴニスト）、
ＥＰ４プロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＥ２（アゴニスト）、
ＦＰプロスタノイド（アゴニスト）、
ＰＧＦ２α（アゴニスト）、
ＩＰプロスタノイド（アゴニスト）、
プロスタサイクリン（アゴニスト）、
プロスタノイド受容体（部分アゴニスト）、
ＴＰプロスタノイド（アゴニスト）、
トロンボキサンＡ２（アゴニスト）、
コハク酸受容体１（アゴニスト）、
ＴＲＨ（アゴニスト）、
ＴＲＨ１（アゴニスト）、
ＴＲＨ２（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体−１（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体−２（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体−３（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体−４（アゴニスト）、
１型鋤鼻受容体−５（アゴニスト）、
アペリン受容体（モジュレータ）、
カンナビノイド受容体（モジュレータ）、
ケモカイン受容体様１（モジュレータ）、
リゾスフィンゴ脂質受容体（モジュレータ）、
Ａ群ホルモンタンパク質ＧＰＣＲ（モジュレータ）、
ロイコトリエン受容体（モジュレータ）、
メラトニン受容体（モジュレータ）、
Ａ群ヌクレオチド様ＧＰＣＲ（モジュレータ）、
Ａ群オーファンＧＰＣＲ（モジュレータ）、
ＰＡＦ受容体（モジュレータ）、
Ａ群ペプチドＧＰＣＲ（モジュレータ）、
プロスタノイド受容体（モジュレータ）、
コハク酸受容体１（モジュレータ）、
ＴＲＨ受容体（モジュレータ）、
１型鋤鼻受容体（モジュレータ）
【００７７】
Ｂ群ＧＰＣＲ
Ｇタンパク質共役受容体−３（モジュレータ）、
Ｇタンパク質共役受容体−３（アゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−３（アンタゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−６（モジュレータ）、
Ｇタンパク質共役受容体−６（アゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−６（アンタゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−１２（モジュレータ）、
Ｇタンパク質共役受容体−１２（アゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−１２（アンタゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−１４（モジュレータ）、
Ｇタンパク質共役受容体−１４（アゴニスト）、
Ｇタンパク質共役受容体−１４（アンタゴニスト）、
Ｂ群ＧＰＣＲ（アゴニスト）、
ＣＲＦ−１受容体（アゴニスト）、
ＣＲＦ−２受容体（アゴニスト）、
カルシトニン受容体（モジュレータ）、
カルシトニン（アゴニスト）、
カルシトニン（アンタゴニスト）、
ＡＣＴＨ放出因子受容体（モジュレータ）、
ＣＲＦ−１受容体（モジュレータ）、
ＣＲＦ−１受容体（アゴニスト）、
ＣＲＦ−１受容体（アンタゴニスト）、
ＣＲＦ−２受容体（モジュレータ）、
ＣＲＦ−２受容体（アゴニスト）、
ＣＲＦ−２受容体（アンタゴニスト）、
ＡＣＴＨ放出因子（アゴニスト）、
ＣＲＦ−１受容体（アゴニスト）、
ＣＲＦ−２受容体（アゴニスト）、
ＡＣＴＨ放出因子（アンタゴニスト）、
ＣＲＦ−１受容体（アンタゴニスト）、
ＣＲＦ−２受容体（アンタゴニスト）、
グルカゴン様ペプチド受容体（モジュレータ）、
グルカゴン様ペプチド１受容体（モジュレータ）、
グルカゴン様ペプチド２受容体（モジュレータ）、
グルカゴン様ペプチド（アゴニスト）、
グルカゴン様ペプチド（アンタゴニスト）、
グルカゴン受容体（モジュレータ）、
グルカゴン（アゴニスト）、
グルカゴン（アンタゴニスト）、
ＧＨＲＨ受容体（モジュレータ）、
ＧＨＲＨ（アゴニスト）、
成長ホルモン放出因子（アンタゴニスト）、
Ｉ型ＰＡＣＡＰ受容体（モジュレータ）、
Ｉ型ＰＡＣＡＰ受容体（アゴニスト）、
Ｉ型ＰＡＣＡＰ受容体（アンタゴニスト）、
ＰＴＨ受容体（モジュレータ）、
ＰＴＨ−１受容体（モジュレータ）、
ＰＴＨ−２受容体（モジュレータ）、
ＰＴＨ（アゴニスト）、
ＰＴＨ（アンタゴニスト）、
セクレチン受容体（モジュレータ）、
セクレチン（アゴニスト）、
セクレチン（アンタゴニスト）、
ＶＩＰ受容体（モジュレータ）、
ＶＩＰ−１受容体（モジュレータ）、
ＶＩＰ−２受容体（モジュレータ）、
ＶＩＰ（アゴニスト）、
ＶＩＰ（アンタゴニスト）
【００７８】
Ｃ群ＧＰＣＲ
Ｃ群ＧＰＣＲ（モジュレータ）、
Ｃ群ＧＰＣＲ（アゴニスト）、
ＧＡＢＡ  Ｂ受容体（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体１（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体２（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体３（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体４（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体５（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体６（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体７（アゴニスト）、
代謝型グルタミン酸受容体８（アゴニスト）
【００７９】
好ましくは上記細胞関連抗原は、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルから選択される抗原を含むが、これに限定されない膜貫通抗原である。
【００８０】
当業者には、「天然立体構造」という用語により包含される異なる特定の三次元立体構造が存在し得ることが理解される。例えばタンパク質が膜環境にありながら、２つ以上の異なる立体構造を有する場合、これらの立体構造全てが「天然立体構造」であると考えられる。このことは活性化により立体構造が変化する受容体、例えば光により誘導されるロドプシンの様々な活性化状態、又は「閉塞（closed）」若しくは「開放（open）」立体構造を示すイオンチャネルで例示される。本発明はこれらの異なる天然立体構造のいずれか１つに対する、すなわち存在し得る異なる種類の立体構造エピトープに対する免疫グロブリン配列を包含する。
【００８１】
本発明の「核酸」は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態を取ることができ、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態をとる。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合しているコドンの使用を伴うＤＮＡ等）であってもよい。
【００８２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の核酸は、本明細書中に規定したように、本質的に単離形態である。
【００８３】
本発明の核酸は、例えばプラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクター（また本質的に単離形態であってもよい）の形態をとり、ベクター中に存在し、及び／又はベクターの一部であってもよい。
【００８４】
本発明の核酸は、本発明の細胞関連抗原若しくは免疫グロブリン配列に関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製されるか若しくは得ることができ、及び／又は好適な天然資源から単離することができる。類似体を得るためには、天然ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列に、例えば、部位特異的な突然変異誘発を起こして、上記類似体をコードする本発明の核酸を得ることができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えば、ナノボディをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を、好適な方法で連結することもできる。
【００８５】
本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば、自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の組合せ（combining）、切断された発現産物を発現させる突然変異の導入、（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を作製するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は例えば、天然ＧＰＣＲの配列を鋳型として使用した１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異の導入が挙げられ得るが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrook et al.及びAusubel et al.等の標準的なハンドブック、並びに以下の実施例を参照する。
【００８６】
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態をとり、遺伝子構築物中に存在し、及び／又は遺伝子構築物の一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、例えば、１つ又は複数の好適な調節要素（好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等）といった、１つ又は複数のそれ自体が既知の遺伝子構築物の要素に、任意で連結する少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
【００８７】
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、目的とする宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における独立した複製、維持及び／又は継代（inheritance）に好適な形態、又は遺伝子免疫付与に好適な形態をとり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態をとることができる。特に、ベクターは、発現ベクター、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現をもたらし得るベクターであってもよい。
【００８８】
好ましいが非限定的な一実施形態では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）ｂ）と作用可能に連結した少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｂ）プロモーター、及び任意で好適なターミネーター等の、１つ又は複数の調節要素と、任意でさらに
ｃ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に連結した」という用語は、当該技術分野における（本明細書中に詳述するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば、３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に好適なこれら及び他の要素は当業者にとって明らかであり、例えば、使用する構築物の種類、免疫付与の対象となる宿主細胞、宿主生物又は動物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換／ワクチン接種技法に応じて決定することができる。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の調節配列、プロモーター及びターミネーターを、本質的に類似の方法で使用してもよい。
【００８９】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記調節要素、及び任意で上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、これによりこれらは互いに機能的な関係にあることが通常意図されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写及び／又は発現を、開始又は別の形で制御／調節することができる場合（上記コード配列は、上記プロモーター「の制御下に」あるものとして理解されたい）、コード配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同一の配向（orientation）を有し、また通常同一リーディングフレーム内にある。また、必ずしも必要ではないこともあるが、これらは通常本質的に隣接している。
【００９０】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の調節要素及びさらなる要素は、目的とする宿主細胞又は宿主生物において意図される生物学的機能を付与することができるようなものである。
【００９１】
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、目的とする宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」であるとされ、このため（例えば）、上記プロモーターは、（本明細書で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコード配列）の転写及び／又は発現を、開始又は別の形で制御／調節することができるものであると意図される。
【００９２】
ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物に存在し／使用され得る、プロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー及びさらなる要素についての（さらなる）非限定的な幾つかの例については、上記のSambrook et al.及びAusubel et al.等の包括的なハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９６／２３８１０号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９５／２１１９１号、国際公開第９７／１１０９４号、国際公開第９７／４２３２０号、国際公開第９８／０６７３７号、国際公開第９８／２１３５５号、米国特許第６，２０７，４１０号、米国特許第５，６９３，４９２号及び欧州特許第１  ０８５  ０８９号に示された例を参照する。他の例は当業者にとって明らかであろう。上記の包括的な背景技術及び本明細書中にさらに引用した参考文献も参照する。
【００９３】
本発明の遺伝子構築物は、通常、例えば、上記のSambrooket al.及びAusubel et al.等の包括的なハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記さらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。
【００９４】
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的な幾つかの例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に言及したものである。
【００９５】
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞又は宿主生物を形質転換するため、すなわち本発明のナノボディ若しくはポリペプチドを発現及び／又は産生させるため、又は遺伝子ワクチン接種のために使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば、任意の好適な真菌、原核若しくは真核の細胞若しくは細胞株、又は任意の好適な真菌、原核若しくは真核の生物であり得る。
【００９６】
本発明の非限定的な一実施形態によれば、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化されている。本発明の別の非限定的な実施形態によれば、本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ又はポリペプチドはグリコシル化されていない。
【００９７】
本発明との関連で、「遺伝子ワクチン接種」は、核酸配列、例えばＤＮＡ配列を、上記核酸配列によりコードされたタンパク質に対する免疫応答を誘導するのに好適な標的動物に移入させる任意の既知の方法又は手段を含む。当業者にとって遺伝子ワクチン接種の標準方法は既知である。本発明によれば、遺伝子ワクチン接種を、無針ジェット注射により、バリスティック法により、タトゥーのような針による注射により、パッチによる皮膚上へのＤＮＡの局所適用により、又はこれらの投与方法のいずれかの後のｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションにより行うことができ、さらにＤＮＡの皮内投与、筋肉内投与又は皮下投与により行われるワクチン接種を含む。
【００９８】
遺伝子ワクチン接種に関して、「遺伝的」という用語は、例えば本明細書で規定のような任意の好適なタイプ又は種類の核酸分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、例えば修飾ヌクレオチド（例えばＰＮＡ）を含む核酸分子を表し、ここで上記核酸分子は本明細書で規定のように細胞関連抗原をコードし、免疫応答を生じることができるように非ヒト動物において発現を引き起こすのに好適である。
【００９９】
核酸分子の例には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、及びｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで例えば安定性を増大させる化学修飾を含む他の形態の核酸分子が含まれる。
【０１００】
核酸分子は発現ベクター、プラスミド、又は動物において抗原を発現するのに好適な任意の他の核酸分子若しくは遺伝的構築物の形態であり得る。好適な核酸分子が当業者にとって既知であり、市販の発現ベクター及びプラスミドを含む。具体的であるが、非限定的な例としては、市販のｐＶＡＸ１構築物、又はAldevronから取得可能なＢ型肝炎小型表面抗原（ＨＢＳＡｇ）をコードする真核生物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｈｂｓ（複数可）（これらは対象となる抗原を発現するルーチン手段により改変することができる）が挙げられる。
【０１０１】
哺乳動物細胞における使用のためのベクターの幾つかの非限定的な例としては、ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及び１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づく発現系等のウイルスに基づく発現系が挙げられる。
【０１０２】
遺伝子ワクチン接種は非ヒト動物において標的抗原を発現するのに好適な要素を含む、好適な核酸又は遺伝的構築物により行われる。このような要素は、対象となる立体構造エピトープが抗原の構造情報により表される場合、この構造情報をコードする要素、又はその一部を含む。遺伝的構築物は、発現の制御に関連する要素、例えば好適なプロモーター、エンハンサー、ターミネータ及び当業者にとって既知の他の制御配列も含み得る。具体的には本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション後の構成的発現を可能にするプロモーターの使用も包含する。好適なプロモーターの具体的であるが、非限定的な例は構成的なサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
【０１０３】
当業者には、哺乳動物細胞における発現のためのプロモーターを含むが、これらに限定されない多くのさらなる好適なプロモーターが既知である：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター；プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター；ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ  ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター；ヒト、チンパンジー、マウス又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーター。
【０１０４】
本発明は当該技術分野で既知の方法による好適な量の遺伝子ワクチン接種に必要とされる核酸分子の産生を包含する。例えば、エンドトキシン−低プラスミドＤＮＡを製造業者の取扱説明書に従ってエンドトキシンフリーＧｉｇａｐｒｅｐキット（Qiagen）を用いて産生することができる。
【０１０５】
遺伝子ワクチン接種のために、本明細書に記載の核酸分子を好適なやり方で配合することができる。例えば核酸分子、例えばベクター又はプラスミドをエンドトキシンフリーＨ２Ｏ、好ましくはＬＡＬ（カブトガニ血球抽出成分（limulus amaebocyte lysate））Ｈ２Ｏ（すなわちＬＡＬによりエンドトキシンに関して試験した水）中で若しくはＬＡＬ  Ｈ２Ｏ中のエンドトキシンフリーの０．９％  ＮａＣｌ中で、又は当業者にとって既知の別の好適なバッファー若しくは溶液中で最終的に再構成する。再構成された核酸分子を−２０℃の一定分量の溶液中に保管することができる、又は代替的に使用前の再構築のために凍結乾燥形態で保管することができる。
【０１０６】
核酸分子は、遺伝子ワクチン接種における使用に好適な希釈率に、例えば０．１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、具体的には１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、より具体的には１ｍｇ／ｍＬの濃度で希釈する。
【０１０７】
遺伝子ワクチン接種のために、核酸分子を本明細書で概説されるように好適なやり方で動物に投与する。ＤＮＡの好適な皮内適用方法の具体例には、無針ジェット注射（Ｐｉｇ−ｊｅｔ）、タトゥー法（Bins, et al., Nature Medicine 11:899-904）、Ｖａｃｃｉ−ｊｅｔを用いた無針ジェット注射（Robbins Instruments, USA）、ＤＮＡを投与するためのバリスティック法としてのパッチ又はヘリオス遺伝子銃（Biorad）による皮膚上へのＤＮＡの局所投与が含まれる。全てのＤＮＡ投与方法の後に、細胞トランスフェクション効率を高めるためにｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションを行うことができる。
【０１０８】
上記の方法のいずれかに関して、核酸は好適な担体と結び付けることができる。例えば、核酸は粒子（金粒子を含むが、これに限定されない）と結び付けることができる。当業者には核酸を好適な担体と結び付けるルーチン技法が既知である。
【０１０９】
本発明との関連で、「非ヒト動物」は、脊椎動物、サメ、哺乳動物、トカゲ、ラクダ科動物、ラマ、好ましくはラクダ科動物、最も好ましくはラマ又はアルパカを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
Ｂ）本発明の方法
本発明は本明細書で規定のように細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を生成する方法に関する。該方法は以下の工程を含むが、これらに限定されない：
ａ）非ヒト動物に、上記細胞関連抗原、又は上記細胞関連抗原のドメイン若しくは特定部分をコードする核酸、又は例えば免疫調節遺伝要素との遺伝子融合体としての上記細胞関連抗原のドメイン若しくは特定部分、又はラクダ科動物オーソログ配列上でグラフト化した上記細胞関連抗原のドメイン若しくは特定部分を遺伝子ワクチン接種する工程；並びに
ｂ）任意で、細胞関連抗原（又は上記抗原の抗原ドメイン若しくは特定部分）を発現する天然細胞又はトランスフェクト細胞を含む細胞、細胞由来の膜抽出物、豊富な抗原を内包する小胞若しくは任意の他の膜誘導体、リポソーム、又は細胞関連抗原を発現するウイルス粒子から選択される天然立体構造で上記抗原を動物に追加免疫する工程；
ｃ）上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関して、上記非ヒト動物に由来する免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程。
【０１１１】
そのため包括的には、本発明の方法は、本明細書で規定のような非ヒト動物の遺伝子ワクチン接種を含む。１つの特定の実施形態では、非ヒト動物はラクダ科動物である。
【０１１２】
本発明の特定の利点は、広範な抗原に広く適用可能である、免疫グロブリン配列を生成するロバストな方法が提供されることにある。本発明の方法はタンパク質抗原の接近可能性（accessibility）に限定されない。特に、精製された抗原を必要としない。有利なことに該方法は、遺伝子ワクチン接種を単に使用することにより該方法を行うことができることから、抗原が細胞で発現される又は膜環境に存在する必要がない。したがって、本発明の方法は上記で例示されるような抗原のいずれにも広く適用可能であるが、それに限定されない。特に本方法は、対応する核酸配列が既知である、又はルーチン手段により同定することができる抗原に適用可能である。
【０１１３】
そのため、本発明はこのようなロバストで広範な適用性を欠いた従来技術の方法と比べて有利である。特にラクダ科動物、特にラマ等の動物において免疫グロブリン配列を生成するこのようなロバストな方法に関して当該技術分野では教示がない。
【０１１４】
具体的には、本発明は細胞関連抗原に対する免疫グロブリン配列を生成する改善された方法を提供するが、該方法は、１つの特定の実施形態によればＤＮＡワクチン接種により免疫応答を誘導し、その後細胞関連抗原と結合することができる免疫グロブリン配列に関してスクリーニングすることにより精製タンパク質による追加免疫の必要がなくなる。さらに具体的には本発明は、細胞関連抗原に対する免疫グロブリン配列（ナノボディを含む）を生成する方法であって、
ａ）ラクダ科動物に上記細胞関連抗原（又は上記抗原の抗原ドメイン若しくは特定部分）をコードする核酸をワクチン接種する工程；並びに
ｂ）上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関して、上記ラクダ科動物に由来する免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程、
を含む、方法を提供する。
【０１１５】
驚くべきことに、血清抗体力価がタンパク質又は細胞に基づいた免疫付与と比較して、ＤＮＡワクチン接種後でより低くなった場合であっても、特異的な免疫グロブリン配列に関するスクリーニングにより、同程度のヒット率が与えられた、すなわち同程度の頻度の特異的な免疫グロブリン配列を得ることができることも見出されている。さらに、同定された結合因子の親和性は（本明細書で規定のように）高かった。このことは、より特異的な高親和性の免疫グロブリン応答をもたらし、特異的な免疫グロブリン配列のより効率的なスクリーニング及び単離を可能にするという本発明の特定の利点を明確に示している。特に免疫付与された動物が血清抗体力価に関してより低い免疫応答を示す場合、このような利点をＤＮＡワクチン接種により得ることができることは従来技術からは予測不可能であった。
【０１１６】
代替的な実施形態において、本発明は、細胞関連抗原に対する免疫グロブリン配列（ナノボディを含む）を生成する方法であって、
ａ）ラクダ科動物に上記細胞関連抗原（又は上記抗原の抗原ドメイン若しくは特定部分）をコードする核酸をワクチン接種する工程；
ｂ）例えば細胞関連抗原（又は上記抗原の抗原ドメイン若しくは特定部分）を発現するトランスフェクト細胞の使用により、細胞膜抽出物を用いて、又は細胞関連抗原を発現するウイルス粒子を用いて、天然立体構造で細胞関連抗原をラクダ科動物に追加免疫する工程；並びに
ｃ）上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関して、上記ラクダ科動物に由来する免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程、
を含む、方法を提供する。
【０１１７】
ワクチン接種
本発明の方法では、動物において免疫応答を誘導するのに好適な遺伝子ワクチン接種を行う。より具体的には、遺伝子ワクチン接種は動物における免疫グロブリン配列の生成に反映されるように免疫応答を誘導するのに好適でなければいけない。動物の血清中での抗体応答の検出は「血清変換（serum conversion）」とも称される。当業者はルーチン手段により抗体応答を決定することにより遺伝子ワクチン接種をモニタリングすることができる。このため当業者は、適切な抗体応答を誘導するのに必要となる適正な投与量及び頻度を容易に決定することができる。
【０１１８】
好ましくは、遺伝子ワクチン接種は適正な抗体力価を誘導する。抗体力価は、単離及び／又はスクリーニングによる免疫グロブリン配列の生成を可能にする特定の抗体産生細胞の数に相当する。しかしながら上記で指摘されるように、本発明の方法は、従来の方法と比較して低い血清抗体力価しかない場合であっても、高い親和性の免疫グロブリン配列の単離を成功させる。例えば、遺伝子ワクチン接種は、タンパク質の追加免疫後に得られる血清力価（従来のタンパク質免疫付与技法により取得可能な抗体力価と同程度である）と比較して、例えば３分の１の血清抗体力価で高親和性の免疫グロブリン配列の単離を成功させる。１つの特定の実施形態では、該血清抗体力価は５分の１、好ましくは１０分の１であり得る。血清力価を例えばＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳを含む従来方法により決定することができる。
【０１１９】
本発明に関する重要なさらなる態様は遺伝子ワクチン接種により得られる抗体レパートリーの幅である。特に抗体応答が直鎖エピトープ及び立体構造エピトープの両方に指向性を有し、重要なことに膜依存性の立体構造エピトープに指向性を有することが本発明の一態様である。
【０１２０】
このため本発明は、非ヒト動物において適正な力価及び幅の抗体応答を得るのに好適な遺伝子ワクチン接種に関する。
【０１２１】
一実施形態では本発明は、動物の１箇所又は複数箇所の部位での単回遺伝子ワクチン接種を伴い得る。例えば、ラクダ科動物は１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所又は複数箇所の部位（互いに隣接してもよく又は動物の全身の好適な位置に分散していてもよい）で注射することができる。具体例では、ラクダ科動物、例えばラマは頸部の最大５箇所の隣接部位で遺伝子ワクチン接種を受ける。遺伝子ワクチン接種の領域は清浄であり、毛がない方がよいことは自明である。そのため本発明は、好適な除毛手段、例えば剪毛、及び化学的手段、例えば脱毛クリーム、又はテープによる物理的除毛を包含する。
【０１２２】
本発明の一態様では、驚くべきことにＤＮＡワクチンを投与する位置が取得可能な免疫グロブリン配列に、特に多様性およびエピトープ選好に関して影響を与えることが見出されている。
【０１２３】
本発明は、反復遺伝子ワクチン接種、例えば好適な間隔で２連続、３連続、４連続又は５連続の遺伝子ワクチン接種を包含する。このような間隔は好ましくは数日〜数週間、例えば３日〜４週間、より好ましくは５日〜２週間である。好適な間隔は、０日目、３日目、７日目、２１日目、２４日目、２８日目、５６日目、５９日目及び６３日目、代替的には０日目、１４日目、２８日目及び５７日目、代替的には０日目、３日目、７日目、２１日目、２４日目、２８日目、５６日目、５９日目及び６３日目、代替的には０日目、１４日目、２８日目及び４２日目での遺伝子ワクチン接種を含む。
【０１２４】
１つの具体的な実施形態では、遺伝子ワクチン接種は適正な抗体応答が動物で誘起されるまで、毎週又は隔週で行われる。
【０１２５】
さらなる具体的な実施形態では、例えば無針注射による皮内投与は０日目、１４日目、２８日目及び５７日目に行われる。別の具体的な実施形態では、短間隔のタトゥー法、タトゥーイング（tattooing）は０日目、３日目、７日目、２１日目、２４日目、２８日目、５６日目、５９日目及び６３日目に行われる。さらなる具体例は、０日目、１４日目、２８日目及び４２日目での無針注射による免疫付与を含む。遺伝子ワクチン接種のバリスティック法では、用量は０日、１４日、２８日及び４２日の間隔で投与した、最大５００ｐｓｉ〜６００ｐｓｉの圧力設定での金１ｍｇ当たり１μｇのＤＮＡ  １２ショット（shots）であり得る。
【０１２６】
１つの特定の実施形態では、本発明は、好適なＤＮＡ投与技法、その後のｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションを用いた遺伝子ワクチン接種に関する。驚くべきことに遺伝子ワクチン接種の従来方法と比較してこの投与形式が有益であることが見出されている。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションはワクチン接種の有効性に関して有益である、すなわちより顕著で、及び／又はより信頼性のある免疫応答をもたらす。これに関して「より信頼性がある」とは、個々の動物間で観察される免疫応答、特にスクリーニングにより取得可能な「ヒット」の数の変動がより低いことを意味する。さらに、エレクトロポレーションの使用は、システムの設定を変えることにより、ワクチン接種プロトコルを要求される侵入深さに容易に適合させる、例えば皮内、皮下又は筋肉内のワクチン接種間で選択するのを可能にする。さらに、幾つかの動物、例えばラクダ科動物の比較的厚く頑丈な皮膚を考えると、エレクトロポレーションは良好なワクチン接種有効性、及び異なる皮膚特性を特徴とする、免疫付与の様々な異なる位置に対する即時の適合も可能にする。
【０１２７】
当業者は遺伝子ワクチン接種に好適な用量の核酸分子を選択することができる。例えば、０．１ｍｇ〜１０ｍｇの核酸、具体的には１ｍｇ〜５ｍｇ、より具体的には１ｍｇ〜２ｍｇ、又は１ｍｇの核酸を遺伝子ワクチン接種の１回の（例えば０日目での）適用に使用することができ、これにより反復遺伝子ワクチン接種の回数に応じた累積用量が得られる。
【０１２８】
好適な抗体応答が動物で確認される場合、本発明の一実施形態では免疫グロブリン配列は、本明細書で記載の方法により上記動物から直接、すなわちタンパク質の追加免疫を行わずに単離することができる。抗体応答の検出を、ルーチン手段、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、又は抗体を検出する任意の他の方法により行うことができる。
【０１２９】
タンパク質の追加免疫
代替的には該方法は、動物にタンパク質の好適な供給源を追加免疫することも含む。特に動物に本明細書で規定のような細胞関連抗原、特に膜貫通抗原を天然立体構造で含む組成物を追加免疫することが想定される。このような組成物は抗原を発現する細胞、又は細胞の断片若しくは誘導体、例えば膜画分、単離オルガネラ、又は他の好適な調製物を含み得る。ウイルス、リポソーム、ミセル、又は天然立体構造で細胞関連抗原を含有するのに好適な他のシステムも想定される。
【０１３０】
本発明の一態様では、抗原を同種細胞で発現させることができる。例えばラクダ科動物の免疫付与のために、抗原をラクダ科動物細胞で発現させることができる。ラクダ科動物の免疫系はラクダ科動物細胞に寛容である、すなわちこの細胞に含まれる抗原のほとんどに対して免疫応答を開始しない（mount）。しかしながら、異種抗原（本明細書で規定のような細胞関連抗原を含むが、これに限定されない）が上記細胞に人工的に導入される場合、動物の免疫系は上記抗原に特異的に指向性を有する免疫応答を開始する。これは免疫応答が主に対象となる抗原に指向性を有する、すなわちこの抗原に対する特異性の向上を特徴とするという利点を有する。当業者には、このアプローチを関連の種に使用することができることを理解されたい。例えば、密接な関連性を考慮してラクダ由来細胞をラマの免疫付与に使用することも、またその逆も可能である。
【０１３１】
免疫付与する動物と同種の任意の好適な細胞を使用することができる。例えば、ラクダ科動物細胞をラクダ科動物の免疫付与に使用することができる、例えばラマ細胞をラマの免疫付与に使用することができる。好適な細胞は自発的に不死化した細胞、例えば癌細胞、又は未分化細胞、例えば胚由来細胞を含むが、これらに限定されない。好適な細胞は既知の手段により人工的に不死化した細胞も包含する。
【０１３２】
細胞をｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖が低減又は排除されるように動物への投与前に有利に処理することができる。好適な処理は化学的処理及び物理的処理を含むが、これらに限定されない。好適な物理的処理の具体的な一例は細胞が増殖することのないようにするＸ線による照射である。
【０１３３】
上記の細胞のいずれかを本明細書で規定のような非ヒト動物を免疫付与するためにのみ、すなわちＤＮＡワクチン接種とは独立して使用することもできる。
【０１３４】
好ましくはタンパク質を、免疫応答を増強させるために上記の調製物のいずれかにおいて濃縮する。例えば、高効率プロモーターを用いた細胞における組換え発現を、細胞１個当たりの抗原の量を増大させるのに使用することができる。一実施形態では、非ヒト動物としてラクダ科動物を用いる場合、対象となる抗原を発現する細胞はラクダ科動物由来細胞、好ましくは不死化したラクダ科動物由来細胞であり得る。該細胞は上記抗原を発現するように遺伝子修飾する。
【０１３５】
さらに当業者には、本発明がワクチン接種に関して免疫応答を高めるために一般的に使用されるアジュバントの使用も包含することを理解されたい。タンパク質調製物は例えばゲル又はエマルション等の免疫応答を高める物理的形態でもあり得る。アジュバントの具体的であるが、非限定的な例としては、Ｓｔｉｍｕｎｅ又はＳｐｅｃｏｌ（CEDI Diagnostics, Lelystad, The Netherlands）、完全フロインドアジュバント、フロインド不完全アジュバント、ＴｉｔｅｒＭａｘ（金）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ａｌｕｍ、ＱｕｉｌＡ、ＣｐＧ  ＤＮＡが挙げられる。
【０１３６】
本発明は、天然立体構造でのタンパク質の上記供給源による単回又は複数回の追加免疫（任意でアジュバントを用いる）を含む。タンパク質の追加免疫を好適な間隔で行い、この間隔はルーチン手段により、例えば動物において免疫グロブリン応答をモニタリングすることにより決定することができる。
【０１３７】
追加免疫を皮内、皮下又は筋肉内の投与を含むが、これらに限定されない異なる投与経路により行うことができる。
【０１３８】
１つの特定の実施形態では、本発明は、好適な免疫応答を誘発するために動物において要求されるタンパク質の投与回数を低減することに関する。このため、遺伝子ワクチン接種−タンパク質追加免疫（「初回刺激−追加免疫（prime-boost）」とも称される）戦略が動物の反復タンパク質追加免疫の必要性を排除する。一例としてはこの戦略が動物に対する負担を軽減し、手順を容易にすると共に加速させ、免疫グロブリン配列を産生するのに必要となる抗原の量を減らす。このため、本発明の遺伝子ワクチン接種−タンパク質追加免疫戦略により、遺伝子ワクチン接種後にタンパク質の追加免疫を行わない又は１回だけ行う場合であっても、驚くべきことに動物の血液中で複数回のタンパク質の追加免疫を含む従来の方法と同じ抗体力価を得ることができる。
【０１３９】
追加免疫のための抗原源として細胞を用いた初回刺激−追加免疫戦略のさらなる特定の利点は、抗体応答が既知のアプローチと比べて特に高い特異性を特徴とすることにある。言い換えれば、ＤＮＡ初回刺激のために、細胞追加免疫（ｃｅｌｌ  ｂｏｏｓｔ）により誘起されるリコール（recall）免疫応答が主に対象となる抗原に指向性を有し、細胞上の任意の他の抗原決定基は免疫応答全体に有意な影響を与えない。このため、本発明によるＤＮＡ初回刺激−細胞追加免疫は特異性に関して特に有益であり、これによりスクリーニングの際の有益な「ヒット率」、すなわち多数の特異的免疫グロブリン配列が生じる。
【０１４０】
このためタンパク質の追加免疫を含む実施形態では、特定の技術的効果が免疫応答の向上を含む。さらに、同じＢ細胞系列に属する異なる機能的ナノボディの配列多様性が高まる。本発明による追加免疫が遺伝子免疫付与のみの後で同定された配列と比べてこれまでに同定されてないアミノ酸置換の導入を引き起こし、これは追加免疫媒介性のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟の指標である。
【０１４１】
免疫グロブリン配列のスクリーニング／単離
本明細書に記載の遺伝子ワクチン接種は動物において免疫応答を誘導する。それから、免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリを動物から単離する。「単離」は、ａ）例えば好適な組織をサンプリングすることによる動物からの配列の分離、及びｂ）例えばスクリーニング、すなわち特異的バインダーの「ヒット数」の単離による特異的配列からの選出を含む。
【０１４２】
当業者は免疫グロブリン配列の好適なセット、コレクション又はライブラリを確立する技法、及び対象となる配列に関してそれらをスクリーニングする技法に精通している。糖業者は例えば国際公開第０２／０８５９４５号及び国際公開第０４／０４９７９４号に記載の技法を一般的に参照することができる。国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第０１／９０１９０号、国際公開第０３／０２５０２０号及び国際公開第０３／０３５６９４号に記載の技法及び方法も参照することができる。代替的に、本発明に従って免疫付与した動物から得られる、例えばＶＨＨライブラリに由来する改良型の合成ライブラリ又は半合成ライブラリ（例えばランダム突然変異誘発及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば国際公開第００／４３５０７号に記載されているようなもの）等の技法によって、ＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ）を使用してもよい。
【０１４３】
本発明は免疫グロブリン配列を含む動物からの物質（例えば、これに限定されないが抗体産生細胞）の単離を含む。例えば、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を従来の手段により単離することができる。他の物質は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、末梢リンパ節、特に免疫付与部位、脾臓、骨髄のリンパを集めるリンパ節、又は他の免疫学的に関連がある物質を含む。
【０１４４】
具体的であるが、非限定的な一例では、Ｂ細胞含有血液試料を回収することができ、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を標準方法により精製することができる。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden）での濃度勾配遠心分離を製造業者の取扱説明書に従って用いることができる。
【０１４５】
例えば動物から単離されたＰＢＬを含む上記の物質のいずれかは多くの免疫グロブリン配列、すなわち免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリを含む。
【０１４６】
例えばＰＢＭＣで発現したこの多くの免疫グロブリン配列の中でも、所望の免疫グロブリンの特異性で、例えば細胞のイムノパニング（immunopanning）により直接単離することができる。
【０１４７】
代替的に、免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列を細胞又はウイルスのセット、コレクション又はサンプルで単離、移入及び発現させることができる。
【０１４８】
遺伝物質を所望の特異性を有する免疫グロブリン配列をコードするこのような配列を単離するのに好適な手段によりさらに単離及びプロセシングすることができる。このために、例えば上記の多くの免疫グロブリン配列をコードする核酸配列を好適な手段により該物質から抽出することができ、発現のためにレシピエント細胞又はウイルスに移入することができる。当業者は免疫グロブリン配列の抽出に好適な技法、及び発現のための、例えば細胞又はウイルスにおける発現ライブラリでのこれらの配列の操作に精通している。幾つかの非限定的な例は例えば大腸菌（E. coli）又はバクテリオファージにおける発現ライブラリの生成を含む。
【０１４９】
具体的であるが、非限定的な一例では、全ＲＮＡを上記物質から抽出することができる。全ＲＮＡを既知の手段によりｃＤＮＡに変換することができる。このｃＤＮＡを用いて、例えばナノボディレパートリー等の免疫グロブリン配列を例えばＰＣＲ又は当該技術分野で既知のネステッドＰＣＲ法（上記の参考特許文献を参照されたい）を含むルーチン手段により増幅することができる。
【０１５０】
免疫グロブリン配列を含む核酸分子を好適な制限酵素の使用により消化することができ、その後任意で例えばゲル電気泳動により精製する。消化した配列を好適な遺伝子構築物、例えばベクター又はプラスミドにおける対応する制限部位にライゲートすることができる。好適なベクターの非限定的な例としては、ファージディスプレイベクター、例えばｐＡＸ５０が挙げられる。ｐＡＸ５０はＬａｃＺプロモーター、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位（Ｓｆｉｌ制限部位及びＢｓｔＥＩＩ制限部位を内包する）、並びにｇｅｎｅ３及びエルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）ｐｅｌＢモチーフからなるキメラリーダー配列を含有する。このディスプレイベクターは、ｇｅｎｅＩＩＩ産物との融合タンパク質として個々のナノボディを発現する、ファージ粒子の産生を可能にする。
【０１５１】
ライゲートした核酸分子を大腸菌のような好適な宿主生物の形質転換によりライブラリを得るのに使用することができる。当業者には、好適な形質転換技法、例えば化学的方法、エレクトロポレーション等が既知である。このようにして、好適なサイズ、例えば１Ｅ７〜１Ｅ８個のライブラリを得ることができる。
【０１５２】
一実施形態では、ライブラリを、細菌を対数期（例えばＯＤ６００＝０．５）まで成長させることによりレスキューする（rescued）ことができ、その後ヘルパーファージを感染させ、ｐＩＩＩ融合タンパク質としてファージの先端上でクローニング免疫グロブリン配列のレパートリーを発現する組換えファージを得て、得られたファージを例えば４℃でさらなる使用のために例えば濾過滅菌後に保管することができる。
【０１５３】
細胞又はウイルスのセット、コレクション又はライブラリを、上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞又はウイルスに関してスクリーニングする、より具体的には上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列を細胞又はウイルスから精製及び／又は単離した後に、上記免疫グロブリン配列を発現させることができる。
【０１５４】
このため本発明は、非ヒト動物に存在する多くの配列から対象となる抗原に指向性を有する免疫グロブリン配列（又はこれをコードする核酸配列）を選択及び単離するのに好適なスクリーニング工程（複数可）も包含する。このようなスクリーニング方法は、対象となる免疫グロブリン配列に関連する、細胞、ウイルス、発現構築物、又は配列を選び出すのに好適な方法を全て包含する。当業者はファージディスプレイ、イムノパニング等を含む多くの好適な技法に精通している。当然のことながら本発明は、既知の方法の組合せにも関する。好適な組合せは当業者にとって明らかであろう。
【０１５５】
１つの特定の実施形態では、免疫グロブリン配列を発現するファージのライブラリを好適な細胞関連抗原源（対象となる抗原を含む（固定化）細胞又はリポソームを含むが、これらに限定されない）での１回又は複数回のパニングにより選択することができる。
【０１５６】
例えばイムノパニングによる１回の選択の後、アウトプット（output）をさらなる選択及び／又はプロセシングに好適な発現ベクターへプールとして再クローニングすることができる。
【０１５７】
本発明によれば、上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を精製及び／又は単離することができる。
【０１５８】
当業者は免疫グロブリンの産生に標準技法を使用することができる。このため対象となる免疫グロブリン配列をコードする細胞、ウイルス又は核酸配列をスクリーニング法により同定した後、上記免疫グロブリン配列を例えば組換え発現により産生することができる。この目的で、細胞若しくはウイルスを直接使用することができる、又は免疫グロブリン配列をコードする核酸を好適な宿主細胞を含む好適な発現系に移入することができる。宿主細胞としては、哺乳動物系、例えばＣＨＯ細胞、真核生物系、例えば昆虫細胞、又は例えばピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む真菌、及び原核生物系、例えば大腸菌が挙げられる。当業者には、これらの宿主系で免疫グロブリン配列を発現する際に使用するのに好適な発現ベクター及びツールが既知である。
【０１５９】
本発明の免疫グロブリン配列、ナノボディ及び核酸を、本明細書の記載から当業者にとって明らかなようにそれ自体既知のやり方で調製することができる。当業者には、どの具体例が遺伝子ワクチン接種に、免疫グロブリン配列のセット、コレクション若しくはライブラリの生成及び／又はスクリーニングに、又は抗原特異的配列の選択後の免疫グロブリン配列の産生に好適であるかを理解されたい。
【０１６０】
例えば、本発明のポリペプチドを、抗体の調製のために、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片を含むが、これらに限定されない）の調製のためにそれ自体が既知の任意のやり方で調製することができる。
【０１６１】
当業者にとって明らかであるように、本発明のポリペプチドを調製する特に有用な一方法は概して、
好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書で「本発明の宿主」とも称される）において、又は本発明の上記ナノボディ又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書で「本発明の核酸」とも称される。この用語は特定の文脈から明らかなように、ワクチン接種のための遺伝子構築物にも使用される）の別の好適な発現系において発現を行う工程、
任意でその後、このようにして得られた本発明のナノボディ又はポリペプチドを単離及び／又は精製する工程、
を含む。
【０１６２】
さらに、産生された免疫グロブリンを、沈殿（precipitation）、アフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、濾過及び他の既知の精製法を含む標準技法により精製することができる。さらに、免疫グロブリン配列は、例えばエピトープ特異性、結合反応速度等を決定するために、既知の方法によりさらに特徴付けることができる。
【０１６３】
免疫グロブリン配列
本発明は、本明細書に記載の方法により取得可能な免疫グロブリン配列、すなわちポリペプチド分子、上記免疫グロブリン配列を含む組成物にも関する。このような組成物は研究目的のための組成物、及び治療用の薬学的組成物を含む。当業者は、免疫グロブリン配列の治療適用のための標準技法及び配合物に精通している。このため一態様では、本発明の方法は薬学的組成物としての特定の免疫グロブリン配列及びそれらの配合物の精製を包含する。
【０１６４】
本発明は、本質的に単離した形態で、例えば少なくとも９０％純粋な、少なくとも９５％純度な、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも９９．９９％純粋な形態で免疫グロブリン配列を提供する。非限定的な一実施形態では、純粋であるとは調製物中に他の免疫グロブリンの配列が存在しないことを意味する。さらなる非限定的な実施形態では、純粋は産生生物由来の混入物（contaminants）が組成物中に存在しないことを意味する。
【０１６５】
本発明は、本明細書で開示の方法により取得可能な免疫グロブリン配列の誘導体である免疫グロブリン配列も包含する。例えば本発明は、当該技術分野で既知の方法により取得可能なヒト化免疫グロブリン配列を包含する。さらに本発明は、当該技術分野で既知の方法によっても取得可能なラクダ化免疫グロブリン配列を包含する。本発明は、免疫グロブリン配列の既知の構造変異体も包含する。
【０１６６】
Ｂ型肝炎小型表面抗原に指向性を有する免疫グロブリン配列
本発明は、（本明細書で規定のように）Ｂ型肝炎小型表面抗原に指向性を有する免疫グロブリン配列、並びに１つ又は複数のこのような免疫グロブリン配列を含むか又はこれから本質的になる、化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチド（それぞれ本明細書で「本発明の免疫グロブリン配列」、「本発明の化合物」及び「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。本発明は、このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書で「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）に；このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドを調製する方法に；このような免疫グロブリン配列若しくはポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞に；このような免疫グロブリン配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に；並びに特に予防目的、治療目的若しくは診断目的、例えば本明細書で言及される予防目的、治療目的若しくは診断目的のためのこのような免疫グロブリン配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。
【０１６７】
イオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列
本発明は、（本明細書で規定のように）イオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列に、並びに１つ又は複数のこのような免疫グロブリン配列を含むか又はこれから本質的になる、化合物又は構築物、特にタンパク質及びポリペプチド（本明細書ではそれぞれ、「本発明の免疫グロブリン配列」、「本発明の化合物」、及び「本発明のポリペプチド」とも称される）に関する。本発明は、このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」又は「本発明のヌクレオチド配列」とも称される）に；このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドを調製する方法に；このような免疫グロブリン配列又はポリペプチドを発現する又は発現することが可能な宿主細胞に；このような免疫グロブリン配列、ポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に；並びに特に予防目的、治療目的若しくは診断目的、例えば本明細書で言及される予防目的、治療目的若しくは診断目的のためのこのような免疫グロブリン配列若しくはポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。
【０１６８】
Xu et al., NatureBiotechnology, October 2005, 1289-1293 and Benham, Nature Biotechnology,October 2005, 1234-1235は、６回膜貫通ドメイン構造を有するイオンチャネルを遮断するアプローチを記載しており、ここでは特定の細胞外ループ、すなわち第３の細胞外領域（Ｅ３）に指向性を有する、ウサギで産生されるポリクローナル抗体が使用される。しかしながら、ウサギポリクローナル抗体はヒトにおける治療的使用に適さない。このため本発明の目的はイオンチャネルに、及び／又はイオンチャネルの生物学的及び／又は生理学的活性に関連する疾患及び障害の予防、治療又は診断に使用することができる治療的化合物を提供することである。本明細書で使用される場合、疾患又は障害の「予防」及び「治療」は一般的に、疾患又は障害を患う又はその危険性がある被験体に有益な任意の予防効果又は治療効果を含み、例えば疾患の１つ又は複数の症状を緩和又は予防すること、及び疾患の発症及び／又は（さらなる）進行を予防する又は遅らせることも含む。
【０１６９】
特に本発明の目的は、イオンチャネルを調節することが可能であるこのような治療的化合物を提供することである。「イオンチャネルの調節」とは概して本明細書では、イオンチャネルと接触する際、又はそうでなければ好適にはイオンチャネルと相互作用する際（すなわち好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細胞又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの条件下で及び／又は好適な動物モデルで；特に生理学的条件下で、すなわち被験体への好適な投与の際）、化合物がイオンチャネルに関して及び／又は上記イオンチャネルに関連する生物学的及び／又は生理学的機能に関して、アゴニスト効果又はアンタゴニスト効果を与えることを意味する。
【０１７０】
本発明の別の目的は、予防若しくは治療における（すなわち本明細書にさらに記載のようにこのような治療を必要とする被験体に１つ又は複数の化合物を投与することによる）、又は診断目的のための（これも本明細書にさらに記載のように）本明細書に記載の治療的化合物の使用によりそれぞれ治療、予防及び／又は診断することができる疾患及び障害の予防、治療及び／又は診断に使用することができる治療的化合物を提供することである。特に本発明の目的は、少なくとも１つのイオンチャネルを（本明細書で規定のように）調節することにより、それぞれ治療、予防及び／又は診断することができる疾患及び障害の予防、治療及び／又は診断に使用することができる治療的化合物を提供することである。さらなる目的は、ポリクローナル抗体の使用に、ウサギで産生された抗体の使用に、及び通常の四本鎖抗体の使用に関連する欠点を有しないこのような化合物を提供することである。本発明の目的は、このような化合物を容易に生成するのに使用することができる方法を提供することでもある。
【０１７１】
本発明の具体的であるが、非限定的な一目的は、イオンチャネルに指向性を有するタンパク質及び／又はポリペプチドを提供すること、及びXu et alにより記載された通常のポリクローナルウサギ抗体又はその断片と比較して改善した治療特性及び／又は薬理学特性及び／又は他の有益な特性（例えば調製しやすさの改善及び／又は製品コストの低減等）を有する、このようなタンパク質又はポリペプチド用の免疫グロブリン配列を提供することである。これらの改善した有益な特性は本明細書のさらなる記載から明らかになるであろう。上記の目的は概して、本明細書に記載の免疫グロブリン配列及び組成物（の使用）により達成される。
【０１７２】
本発明の免疫グロブリン配列、ポリペプチド及び組成物は概して、イオンチャネルの開放及び／又は閉塞（開放及び／又は閉塞の増進）を調節するのに、及び／又はイオンチャネルを介したイオンの流れを調節するのに（すなわち不可逆的であってもよいが、好ましくは可逆的に、このような流れを増大若しくは低減するのに、又はこのような流れを部分的に若しくは完全に遮断するのに）使用することができる。このため、本発明のポリペプチド及び組成物を、イオンチャネル及び／又はイオンチャネルを介したイオンの流れがかかわる生物学的な機能、経路、応答、効果、機構及び作用を調節するのに使用することができる。特に本発明のポリペプチド及び組成物を、イオンチャネルを介したイオンの流れを（すなわち完全に若しくは部分的に、不可逆的であってもよいが、好ましくは可逆的に）低減又は阻害するのに使用することができる。このため、本発明の免疫グロブリン配列、ポリペプチド及び組成物は概して、イオンチャネルの（完全又は部分）ブロッカーとして及び／又は（完全及び部分）オープナーとして（これも不可逆的であってもよいが、好ましくは可逆的に）、及び／又はイオンチャネルの、及び／又はイオンチャネル及び／又はイオンチャネルを介したイオンの流れがかかわる生物学的な機能、経路、応答、効果、機構及び作用のアゴニストとして又はアンタゴニストとして作用することができる。このため、本発明のポリペプチド及び組成物を、イオンチャネルに関連する疾患及び障害の予防及び治療（本明細書で規定のように）に使用することができる。一般的に、「イオンチャネルに関連する疾患及び障害」は、本発明の（特にその薬学的に活性のある量の）ポリペプチド又は組成物のいずれかを、及び／又はイオンチャネルに対して活性のある既知の活性成分を、それを必要とする（すなわち疾患若しくは障害若しくは少なくとも１つのそれらの症状を有する、及び／又は疾患若しくは障害を誘発若しくは発症する危険性がある）被験体に好適に投与することにより、それぞれ予防及び／又は治療することができる疾患及び障害として定義することができる。イオンチャネルに関連するこのような疾患及び障害の例は、本明細書の開示に基づき当業者にとって明らかであり、例えば本発明の免疫グロブリン配列又は化合物／ポリペプチドが指向性を有するイオンチャネル（複数可）に応じて、本明細書で挙げられる従来技術で言及された疾患及び障害を含む。したがってこれらに限定されないが、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドを、例えば現在イオンチャネルを調節することができる活性成分により予防又は治療されている全ての疾患及び障害、例えば上記の従来技術で言及されるものを予防及び／又は治療するのに使用することができる。また本発明のポリペプチドを、このような活性成分による治療が現在開発されている、提案されている、又は将来提案若しくは開発される全ての疾患及び障害を予防及び／又は治療するのに使用することができることも想定される。さらに、本明細書中にさらに記載のそれらの有利な特性のために、本発明のポリペプチドを、これらの既知の活性成分が使用されているか、又は提案若しくは開発される疾患及び障害以外の他の疾患及び障害の予防及び治療にも使用してもよいこと、及び／又は本発明のポリペプチドが本明細書に記載の疾患及び障害を治療するのに新規の方法及びレジメンを提供ことが想定される。
【０１７３】
本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドの他の用途及び使用は、本明細書のさらなる開示から当業者にとって明らかになる。概して本発明は、（本明細書に規定のように）イオンチャネルに指向性を有する、及び／又は（本明細書に規定のように）これと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列、並びにこのような免疫グロブリン配列を少なくとも１つ含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。より具体的には本発明は、本明細書に規定の（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される及び／又は表される）親和性でイオンチャネルと結合することができる免疫グロブリン配列、並びにこのような免疫グロブリン配列を少なくとも１つ含む化合物及び構築物、特にタンパク質及びポリペプチドを提供する。
【０１７４】
特に、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）イオンチャネルと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）のｋｏｎ速度でイオンチャネルと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）のｋｏｆｆ速度でイオンチャネルと結合するようなものであるのが好ましい。
【０１７５】
好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列を１つだけ含有するポリペプチド）が、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性でイオンチャネルと結合するようなものであるのが好ましい。本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドとイオンチャネルとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。イオンチャネルとの結合のために、本発明の免疫グロブリン配列は通常、その免疫グロブリン配列内に１つ又は複数のアミノ酸残基若しくは１つ又は複数のアミノ酸残基のストレッチ（すなわちそれぞれの「ストレッチ」が、（すなわち免疫グロブリン配列の一次構造又は三次構造で）互いに隣接しているか、又は互いに近接している２つ以上のアミノ酸残基を含む）を含有し、これを介して本発明の免疫グロブリン配列はイオンチャネルと結合することができ、このようにしてアミノ酸残基又はアミノ酸残基のストレッチは、イオンチャネルと結合する「部位」（本明細書で「抗原結合部位」とも称される）を形成する。
【０１７６】
本発明で与えられる免疫グロブリン配列は、（本明細書で規定のように）本質的に単離形態であるか、又は（本明細書で規定のように）本発明のタンパク質若しくはポリペプチド（１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列を含むか、又は本質的にこれからなってもよく、任意でさらに１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン配列（全て任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して連結される）を含んでもよい）の一部を形成するのが好ましい。例えば、これに限定されないが、１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列は、全て本明細書に記載される一価、多価又は多重特異性の本発明のポリペプチドをそれぞれ提供するように、このようなタンパク質又はポリペプチド（任意で（すなわちイオンチャネル以外の１つ又は複数の他の標的に対する）結合単位としての役割を果たし得る１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン配列を含有してもよい）における結合単位として使用してもよい。このようなタンパク質又はポリペプチドは、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態でもあり得る。
【０１７７】
本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチド自体が、ジスルフィド架橋を介して任意の他の免疫グロブリン配列又は免疫グロブリン鎖と連結しない（が、１つ又は複数の分子内ジスルフィド架橋を含有しても又は含有しなくてもよい（例えば本明細書中に記載のナノボディは、ＣＤＲ３とＣＤＲ１又はＦＲ２との間にジスルフィド架橋を含有し得ることもあることが知られている））単一のアミノ酸鎖から本質的になるのが好ましい。しかしながら、１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列は、互いに及び／又は他の免疫グロブリン配列と（例えばジスルフィド架橋を介して）連結し、本発明に有用でもあり得るペプチド構築物（例えばＦａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＳｃＦｖ構築物、「ダイアボディ」及び他の多重特異性の構築物）を提供し得ることに留意されたい。例えばHolliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23（9）: 1126-36によるレビューを参照する。概して、本発明の免疫グロブリン配列（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）が（例えば本明細書に記載の治療目的及び／又は診断目的のための）被験体への投与を目的とする場合、上記被験体において自然発生しない免疫グロブリン配列であるか、又は上記被験体において自然発生する場合は、（本明細書に規定のように）本質的に単離形態であるのが好ましい。
【０１７８】
薬学的用途の場合、本発明の免疫グロブリン配列（並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド）はヒトイオンチャネルに指向性を有するのが好ましく、一方で獣医学目的の場合は、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは治療する種由来のイオンチャネルに指向性を有するか、又は治療する種由来のイオンチャネルと少なくとも交差反応性を有するのが好ましいことも、当業者にとって明らかである。
【０１７９】
さらに、本発明の免疫グロブリン配列は、任意でかつイオンチャネルとの結合のための少なくとも１つの結合部位の他に、他の抗原、タンパク質又は標的との結合のための１つ又は複数のさらなる結合部位を含有し得る。
【０１８０】
関与する特定の疾患又は障害に応じて、それ自体が既知の任意の好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ及び／又は動物モデル、又はこれらの任意の組合せを使用して、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチド、並びにこれを含む組成物の有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは当業者に明らかであり、例えば本明細書に記載のレビュー及び従来技術で言及されるアッセイ及び動物モデルを含む。
【０１８１】
また本発明によれば、第１の種の温血動物由来のイオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の温血動物由来のイオンチャネルと交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。例えば、ヒトイオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の霊長類（例えば、これらに限定されないが、マウス、マカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット（Macacamulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus））由来のイオンチャネル、及び／又は疾患のための動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）、特にイオンチャネルに関連がある疾患及び障害のための動物モデルで使用されることが多い、１種又は複数種の動物（例えば本明細書で言及される種及び動物モデル）由来のイオンチャネルと交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。この観点では、このような疾患モデルでヒトイオンチャネルに対して免疫グロブリン配列及びポリペプチドを試験することが可能となるので、このような交差反応性が存在する場合、該反応性は薬剤開発の観点から都合がよいことがあることが当業者にとって明らかである。
【０１８２】
より一般的には、複数種の哺乳動物由来のイオンチャネルと交差反応性を有する本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、同じ免疫グロブリン配列又はポリペプチドを複数種にわたって使用することが可能であるので、通常、獣医学用途に使用するのに有利である。したがって、或る種の動物由来のイオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列及びポリペプチド（例えばヒトイオンチャネルに対する免疫グロブリン配列及びポリペプチド）は、免疫グロブリン配列及び／又はポリペプチドの使用によって治療する種において所望の効果がもたらされる限り、別の種の動物の治療に使用することができることも本発明の範囲内に包含される。
【０１８３】
本発明の免疫グロブリン配列（及びこれを含むポリペプチド）はイオンチャネルを（本明細書で規定のように）調節することが可能であるようなものが好ましい。特に本発明の免疫グロブリン配列（及びこれを含むポリペプチド）はイオンチャネルを（完全に又は部分的に）遮断することが可能であるようなものが好ましい。化合物によるイオンチャネルのそれぞれの「部分的な又は完全な遮断」とは、免疫グロブリン配列又はポリペプチドによるイオンチャネルの調節が、イオンチャネルが免疫グロブリン配列又はポリペプチドにより遮断される特定の機構にかかわらずそれぞれ、（すなわち本明細書に記載のような好適なアッセイにより決定されるように免疫グロブリン配列／ポリペプチドとイオンチャネルとの間に相互作用がない場合のイオンチャネルを介したイオンの流れと比較して）チャネルを介したイオンの流れの低減をもたらす、又はチャネルを介したイオンの流れが本質的になくなることを意味する。例えばこれに限定されないが、免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、チャネルを介したイオンの流れが（例えば立体障害又は立体相互作用により）完全若しくは部分的に遮断されるようにイオンチャネル（又はその少なくとも１つのサブユニット）のエピトープに結合することにより直接的に、又はイオンチャネルの１つ若しくは複数の細胞外の部分、領域、ドメイン若しくはループとの相互作用により、又はイオンチャネルの（可能性のある）立体構造（複数可）に影響を与えることにより、又はイオンチャネルが立体構造変化を受けることができる程度及び／又は速度を限定することにより間接的に、イオンチャネルを部分的に若しくは完全に遮断することができる。
【０１８４】
イオンチャネルのブロッカーである本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、本明細書で記載されるもののような、好適なアッセイにより決定されるように、免疫グロブリン配列／ポリペプチドとイオンチャネルとの間の相互作用がない場合のイオンチャネルを介したイオンの流れと比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば２５％以上、又はさらに５０％以上、及び最大で７５％、又はさらに９０％超、又はそれ以上チャネルを介したイオンの流れを低減するようなものが好ましい。
【０１８５】
イオンチャネルのオープナーである本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、本明細書で記載されるもののような、好適なアッセイにより決定されるように、免疫グロブリン配列／ポリペプチドとイオンチャネルとの間の相互作用がない場合のイオンチャネルを介したイオンの流れと比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば２５％以上、又はさらに５０％以上、及び最大で７５％、又はさらに９０％超、又はそれ以上チャネルを介したイオンの流れを増大するようなものが好ましい。
【０１８６】
イオンチャネル及び／又はそれらに関連する生物学的機能（複数可）又は応答（複数可）のアゴニストである本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、本明細書で記載されるもののような、好適なアッセイにより決定されるように、免疫グロブリン配列／ポリペプチドとイオンチャネルとの間の相互作用がない場合の生物学的機能又は応答と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば２５％以上、又はさらに５０％以上、及び最大で７５％、又はさらに９０％超、又はそれ以上所望の生物学的機能又は応答を増大するようなものが好ましい。
【０１８７】
イオンチャネル及び／又はそれらに関連する生物学的機能（複数可）又は応答（複数可）のアンタゴニストである本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、本明細書で記載されるもののような、好適なアッセイにより決定されるように、免疫グロブリン配列／ポリペプチドとイオンチャネルとの間の相互作用がない場合の生物学的機能又は応答と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、例えば２５％以上、又はさらに５０％以上、及び最大で７５％、又はさらに９０％超、又はそれ以上所望の生物学的機能又は応答を低減するようなものが好ましい。
【０１８８】
イオンチャネルのブロッカー又はオープナーである（又はブロッカー若しくはオープナーを増進する）及び／又はイオンチャネル、又はそれらに関連する生物学的機能（複数可）若しくは応答（複数可）のアゴニスト又はアンタゴニストである本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、不可逆的に所望の活性を提供することができるが、可逆的に活性を提供することができるのが好ましい。
【０１８９】
本発明はまたその最も広範な意味で、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが指向性を有するイオンチャネルの、特異的な抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造（適用可能な場合）によっては特に限定又は規定されない。
【０１９０】
本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、任意の所望のイオンチャネルに指向性を有してもよく、特に少なくとも１つの細胞外ドメインを有するイオンチャネルに指向性を有してもよい。これらに限定されないが、より具体的には、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、より具体的には少なくとも２つの膜貫通ドメイン、例えば少なくとも４つの膜貫通ドメイン（例えば４−ＴＭイオンチャネル）又は６つ以上の膜貫通ドメイン（例えば６−ＴＭイオンチャネル）を有する任意の所望のイオンチャネルに指向性を有してもよい。このようなイオンチャネルの例は、本明細書に挙げられた従来技術に基づき当業者にとって明らかであろう。例えば上記で挙げられたGoldstein et al.、Yu et al.、Clapham and Garbers、Hoffmann et al.、Kubo et al.、Wei et al.、Shieh et al.（例えば５５９頁の図２を参照されたい）、Catterall etal、Gutman et al.、Clapham et al.、Catterall et al.のレビューを参照する。本明細書にさらに記載のように、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは例えば、このような膜貫通ドメインの細胞外部分に、特にこのような膜貫通ドメインと連結する細胞外ループ／リピートに指向性を有し得る（例えばこれについてもShieh et al.の５５９頁の図２、及び２−ＴＭ、４−ＴＭ及び６−ＴＭイオンチャネルのこのような細胞外ループを概略的に示すXu et al（上掲）の１２９０頁の図１を参照する）。
【０１９１】
好ましいが、非限定的な一態様では、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、６−ＴＭイオンチャネル（例えばこれらに限定されないが、上述のＫｖ−イオンチャネル（例えばＫｖ１．１〜Ｋｖ９．３、ＫｖＬＱＴイオンチャネル、Ｓｌｏ及びＩＫＣａ１０））に、特にこのような６−ＴＭイオンチャネルの膜貫通ドメインと連結する細胞外ループ／リピートのうちの１つ、例えばＥ１、Ｅ２、特にＥ３ループ、又はリピート２、３及び４のＳ５とＳ６との間の領域に指向性を有する。
【０１９２】
しかしながら本発明の特定の一態様によれば、本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは細胞の表面上で発現するイオンチャネルに、及び／又はイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに（本明細書で規定のように）指向性を有し得る。
【０１９３】
特にこの態様によれば、本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、イオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに（本明細書で規定のように）指向性を有し、さらに本発明の上記免疫グロブリン配列又はポリペプチドが（本明細書で規定のように）上記イオンチャネルを調節することが可能であるようなものが好ましい。より具体的にはこの態様によれば、本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドが、イオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに（本明細書で規定のように）指向性を有し、さらに本発明の上記免疫グロブリン配列又はポリペプチドが（完全に又は部分的に）上記イオンチャネルを遮断することが可能であるようなものが好ましい。
【０１９４】
本発明のこの態様によれば、本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、任意の好適な細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに指向性を有し得るが、好ましくは膜貫通ドメインの細胞外部分の１つに又はより好ましくは膜貫通ドメインと連結する細胞外ループの１つに指向性を有する。より具体的には、イオンチャネルが６−ＴＭチャネルである場合、タンパク質又はポリペプチド（特にそこに存在する免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つ）は、膜貫通ドメインと連結する細胞外Ｅ３ループに指向性を有し得る（及び／又は細胞外Ｅ３ループに及び／又は細胞外Ｅ３ループの配列に由来する、又はこれに基づく合成又は半合成のペプチドに対して産生することができる）。
【０１９５】
他の好適な細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又はエピトープは、関連（pertinent）イオンチャネルの免疫グロブリン配列のＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ解析により、同じ（サブ）ファミリーに属するイオンチャネルをアライメントすると共に、様々な膜貫通ドメイン及び細胞外の部分、領域、ドメイン若しくはループ（Ｅ３ループを含む）を同定することにより、ＴＭＡＰ解析により、又はそれらの任意の好適な組合せにより得ることができる。本発明は、（本明細書でさらに規定されるような）このような細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又はエピトープに指向性を有する（及び／又はこのような細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくはエピトープを含む免疫グロブリン配列の部分若しくは断片に対して、及び／又はこのような細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくはエピトープに由来する若しくはこれらに基づく合成若しくは半合成のペプチドに対して産生された）免疫グロブリン配列にも関する。
【０１９６】
特に、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）（本明細書で記載のように）イオンチャネルの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）のｋｏｎ速度で（本明細書で記載のように）イオンチャネルの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）のｋｏｆｆ速度で（本明細書で記載のように）イオンチャネルの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープと結合するようなものであるのが好ましい。
【０１９７】
好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列を１つだけ含有するポリペプチド）が、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で（本明細書で記載のように）イオンチャネルの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープと結合するようなものであるのが好ましい。
【０１９８】
本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドと、イオンチャネルの細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（本明細書に記載のような）との結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０は、本明細書でのさらなる記載及び実施例から明らかであろう。
【０１９９】
またこの態様によれば、本発明の任意の（本明細書で規定されるような）多価又は多重特異性のポリペプチドは好適には、同一の抗原上の２つ以上の異なる細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープに、例えば２つの異なる細胞外ループに、膜貫通ドメインの２つの異なる細胞外部分に、又は１つの細胞外ループ（one extracellular loops）及び１つの細胞外ループにも指向性を有し得る。本発明のこのような多価又は多重特異性のポリペプチドは、所望のイオンチャネル、及び／又はこのような多価又は多重特異性のポリペプチドの使用により得ることができる任意の他の所望の特性又は所望の特性の組合せに対する増大した結合活性又は改善した選択性を有していてもよい（又はこれらに関して遺伝子操作されていても（engineered）及び／又は選択されていてもよい）。
【０２００】
本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、本発明のペプチド抗原自体（代わりに例えばより大きいタンパク質又はポリペプチドの一部である、例えば細胞表面上に存在するイオンチャネルの一部であるペプチド抗原）を用いて、ペプチド抗原に対する本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドの結合（すなわち全て本明細書に記載のようなこのような結合の特異性、親和性、ＫＤ、ＫＡ、ｋｏｎ又はｋｏｆｆ）を決定するのに標準的なアッセイにおいて上記ペプチド抗原自体に指向性を有する場合、（本明細書でさらに規定のように）ペプチド抗原「に指向性を有する」と言うこともできる。免疫グロブリン配列又はポリペプチドと小ペプチドとの結合を決定する技法は当業者にとって明らかであり、例えば本明細書に記載の技法を含む。
【０２０１】
本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは、上記ペプチド抗原に関してスクリーニングする、これを用いて選択する及び／又は（すなわち本明細書でさらに記載のように好適には哺乳動物に免疫付与することにより）これに対して産生される場合、（本明細書でさらに規定のように）ペプチド抗原「に指向性を有する」と言うこともできる。本発明のペプチド抗原に対して本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドを産生する技法、並びに本発明のペプチド抗原に結合する本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドをスクリーニング又は選択する技法は、例えば本明細書でのさらなる開示に基づき当業者にとって明らかであろう。
【０２０２】
概して、本発明のペプチド抗原自体に指向性を有する及び／又は本発明のペプチド抗原に対してスクリーニングした、これを用いて選択した及び／又はこれに対して産生された、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、細胞の表面上に存在するイオンチャネル（又は少なくとも１つのそのサブユニット）の一部を形成する本発明のペプチド抗原と結合する（特に本明細書で規定のように特異的に結合する）ことも可能であることが期待される。このため、本発明のペプチド抗原は（本明細書で規定のように）本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドを生成する方法に特定に使用することができ、このような方法及び使用は本発明のさらなる態様を形成する。
【０２０３】
例えば、このような方法が以下の工程の１つ又は以下の工程の両方の好適な組合せを含み得る：
ａ）所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）に対する免疫応答が惹起されるように、ラクダ科動物に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ（複数可）を含む好適な抗原を好適に免疫付与する工程。抗原は、所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）に対する免疫応答を惹起することが可能な任意の好適な抗原；例えばこれに限定されないが、その表面上に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）を有する全細胞；この細胞壁断片若しくはこのような細胞に由来する任意の他の好適な調製物；その表面上に所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）を有する小胞；所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ（複数可）を含む、イオンチャネルのサブユニット若しくはサブユニットの断片；又は所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ若しくは他の細胞外エピトープ（複数可）（の免疫グロブリン配列）を含む及び／又はこれに基づく合成若しくは半合成のペプチドであってもよく、及び／又は
ｂ）所望の細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）との親和性及び／又は結合に関してスクリーニングする工程。これは例えば、表面上で重鎖抗体を発現する細胞（例えば好適に免疫付与したラクダ科動物から得られたＢ細胞）のセット、コレクション若しくはライブラリをスクリーニングすることにより、ＶＨＨ配列若しくはナノボディ配列の（ナイーブ又は免疫）ライブラリのスクリーニングにより、又はＶＨＨ配列若しくはナノボディ配列をコードする核酸配列の（ナイーブ又は免疫）ライブラリのスクリーニングにより実施することができ、これらは全て本明細書で言及されるさらなる開示及び従来技術を参照して、それ自体が既知の方法で実施してもよく、
この方法はさらに任意でそれ自体が既知の１つ又は複数の他の好適な工程、例えばこれに限定されないが、親和性成熟工程、所望の免疫グロブリン配列を発現する工程、所望の抗原（この場合、イオンチャネル）との結合及び／又はこれに対する活性に関してスクリーニングする工程、所望の免疫グロブリン配列又はヌクレオチド配列を決定する工程、（例えば本明細書でさらに記載のように）１つ又は複数のヒト化置換を導入する工程、好適な多価及び／又は多重特異性フォーマットでフォーマットする工程、所望の生物学的及び／又は生理学的特性に関してスクリーニングする（すなわち本明細書で記載されるような好適なアッセイを使用する）工程、及び／又は１つ又は複数のこのような工程の任意の好適な組合せを１つ又は複数任意の好適な順番で含んでいてもよい。
【０２０４】
このような方法及びこのような方法で得られた免疫グロブリン配列、並びにこれらを含むか又はこれらから本質的になるタンパク質及びポリペプチドは、本発明のさらなる態様を形成する。
【０２０５】
好ましい一実施形態において、本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドは「モノクローナル」免疫グロブリン配列又はポリペプチドであり、これは上記タンパク質又はポリペプチドに存在するイオンチャネルに指向性を有する１つ又は複数の免疫グロブリン配列の少なくともそれぞれ（好ましくは上記タンパク質又はポリペプチドに存在する免疫グロブリン配列の全て）が当業者に一般的に理解されるような「モノクローナル」であることを意味する。しかしながらこの点において、本明細書でさらに記載のように、本発明は、同一のイオンチャネルの異なる部分、領域、ドメイン、ループ又はエピトープに、特に同一のイオンチャネルの異なる細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又はエピトープに指向性を有する免疫グロブリン配列（特にモノクローナル免疫グロブリン配列）を２つ以上含む、多価又は多重特異性のタンパク質を明確に包含することに留意すべきである。
【０２０６】
別の態様では本発明は、（本明細書で規定のように）イオンチャネルを調節することが可能な、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン配列、又は本発明の免疫グロブリン配列の少なくとも１つの部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体を含むか又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドに関する。好ましくは、上記タンパク質又はポリペプチドは（本明細書で規定のように）イオンチャネルを完全に又は部分的に遮断することが可能である。
【０２０７】
本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドは、好ましくは細胞の表面上で発現されるイオンチャネルに、及び／又はイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに、より好ましくはイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外ループに指向性を有する。具体的な一態様では、イオンチャネルが６つの膜貫通ドメイン（６−ＴＭ）を有するイオンチャネルである場合、タンパク質又はポリペプチドは細胞外Ｅ３ループに指向性を有するのが好ましい。本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドは本発明のペプチド抗原にも指向性を有し得る。
【０２０８】
具体的な一態様では、本発明は本発明の少なくとも１つの免疫グロブリン配列、又は本発明の免疫グロブリン配列の少なくとも１つの部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体を含むか又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドであって、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つ（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体のうちの少なくとも１つ）がイオンチャネルに指向性を有する、タンパク質又はポリペプチドに関する。好ましくはタンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つ（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体のうちの少なくとも１つ）がイオンチャネルを調節する、より好ましくはイオンチャネルを完全に又は部分的に遮断することが可能である。また好ましくは、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つ（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体のうちの少なくとも１つ）が、イオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに、具体的にはイオンチャネルの１つの細胞外ループに指向性を有する。具体的な一態様では、イオンチャネルが６つの膜貫通ドメイン（６−ＴＭ）を有するイオンチャネルである場合、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つが細胞外Ｅ３ループに指向性を有するのが好ましい。
【０２０９】
本明細書に記載のタンパク質又はポリペプチドは、本発明の単一の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）、又は任意で好適には（本明細書に記載のような）１つ若しくは複数の好適なリンカーを介して連結される、本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）のうちの少なくとも２つ（例えば２つ、３つ、４つ又はそれ以上）を含み得るか又はこれから本質的になり得る。このようなリンカーの好適な例は、例えば本明細書のさらなる開示に基づき当業者にとって明らかであろう。
【０２１０】
本発明の一態様では、タンパク質又はポリペプチドが少なくとも２つの本発明の免疫グロブリン配列を含む場合、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）のうちの少なくとも２つが同じイオンチャネルに指向性を有する。例えば、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）のうちの少なくとも２つが同じイオンチャネルの異なる細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに指向性を有し得る。しかしながら好ましくは、タンパク質又はポリペプチドに存在する本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）のうちの少なくとも１つ（又は少なくとも２つ）がイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外ループに指向性を有する。
【０２１１】
本発明のタンパク質又はポリペプチドが、少なくとも２つの本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）を含むか又はこれから本質的になる場合、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも２つの異なる本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）を含み得るか、及び／又は少なくとも２つの同一の本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）を含み得る。
【０２１２】
具体的な一態様では、本発明のタンパク質又はポリペプチドが、少なくとも２つの本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）を含むか又はこれから本質的になる場合、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、イオンチャネルとは異なるタンパク質、ポリペプチド又は他の抗原に指向性を有する、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン配列（又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体）を含み得る。
【０２１３】
別の態様では本発明は、イオンチャネルを調節することが可能な本発明の免疫グロブリン配列、又は本発明の免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、変異体若しくは誘導体に関する。好ましくは、上記本発明の免疫グロブリンは、（本明細書に規定のように）イオンチャネルを完全に又は部分的に遮断することが可能である。
【０２１４】
本明細書に記載の本発明の免疫グロブリン配列は、好ましくはイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外の領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープに、より好ましくはイオンチャネルの少なくとも１つの細胞外ループに指向性を有する。具体的な一態様では、イオンチャネルが６つの膜貫通ドメイン（６−ＴＭ）を有するイオンチャネルである場合、本発明の免疫グロブリン配列は細胞外Ｅ３ループに指向性を有するのが好ましい。
【０２１５】
適用可能な場合、本発明の免疫グロブリン配列が、イオンチャネルの２つ以上の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は立体構造と結合することができることも、本発明の範囲内である。このような場合、本発明の免疫グロブリン配列及び／又はポリペプチドが結合する、イオンチャネルの抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン又はサブユニットは、本質的に同じであり得るか（例えば、イオンチャネルが反復構造モチーフを含有するか、又は多量体形態で生じる場合）、又は異なり得る（後者の場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、同じであり得るか、若しくは異なり得る親和性及び／又は特異性で、イオンチャネルのこのような異なる抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットと結合し得る）。また、例えば、イオンチャネルが活性な立体構造及び不活性な立体構造で存在する場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、これらの立体構造のいずれか一方に結合してもよく、又はこれらの立体構造の両方に（すなわち、同じであり得る又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）結合してもよい。また、例えば、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、関連リガンドと結合するイオンチャネルの立体構造と結合してもよく、関連リガンドと結合していないイオンチャネルの立体構造と結合してもよく、又はこのような立体構造の両方と（また同じであり得る又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）結合してもよい。
【０２１６】
また、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは概して、イオンチャネルの天然又は合成の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片全て；又は少なくとも、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドがイオンチャネル（例えば野生型のイオンチャネル）で結合する抗原決定基（複数可）又はエピトープ（複数可）と本質的に同じである抗原決定基又はエピトープを１つ又は複数含有する、イオンチャネルのこれらの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片と少なくとも結合することが期待される。また、このような場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン配列が（野生型）イオンチャネルと結合する親和性及び特異性と同じか、又は異なる（すなわちこれより高いか、又は低い）親和性及び／又は特異性で、このような類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片と結合し得る。本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、イオンチャネルの類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片によっては結合するものもあれば、結合しないものもあることも、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１７】
イオンチャネルが単量体形態及び１つ又は複数の多量体形態で存在する場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、単量体形態のイオンチャネルのみと結合するか、多量体形態のイオンチャネルのみと結合するか、又は単量体及び多量体形態の両方のイオンチャネルと結合することは、本発明の範囲内である。同様に、このような場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン配列が多量体形態と結合する親和性及び特異性と同じか、又は異なる（すなわちこれより高いか、又は低い）親和性及び／又は特異性で単量体形態のイオンチャネルと結合し得る。
【０２１８】
また、イオンチャネルが、タンパク質複合体を形成するように他のタンパク質又はポリペプチドと（例えば複数のサブユニットと）会合することができる場合、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが、会合していない状態でイオンチャネルと結合するか、会合した状態でイオンチャネルと結合するか、又はその両方でイオンチャネルと結合することは、本発明の範囲内である。これら全ての場合で、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドが単量体状態及び非会合状態でイオンチャネルと結合する親和性及び／又は特異性と同じか、又は異なり得る（すなわちこれより高いか、又は低い）親和性及び／又は特異性でこのような多量体又は会合したタンパク質複合体と結合し得る。
【０２１９】
また、当業者にとって明らかなように、イオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドは、対応する単量体免疫グロブリン配列（複数可）よりも高い結合活性でイオンチャネルと結合し得る。例えば、これらに限定されないが、イオンチャネルの異なるエピトープに指向性を有する免疫グロブリン配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドは、異なる単量体それぞれよりも高い結合活性で結合することができ（通常結合し）、イオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列を２つ以上含有するタンパク質又はポリペプチドも、より高い結合活性でイオンチャネルの多量体と結合することができる（通常結合する）。
【０２２０】
概して、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドは、当業者にとって明らかなように、生物学的及び／又は治療的観点から最も関連がある形態のイオンチャネル（単量体、多量体及び会合している形態を含む）と少なくとも結合する。本明細書で想定される使用に好適である限り、本発明の免疫グロブリン配列及びポリペプチドの部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を使用すること、及び／又はこのような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を１つ又は複数含むか、又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は通常、イオンチャネルとの結合に関して機能的な抗原結合部位（の少なくとも一部）を含有し、より好ましくはイオンチャネルと特異的に結合することができ、さらにより好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でイオンチャネルと結合することができる。このような部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドの幾つかの非限定的な例は、本明細書のさらなる記載から明らかになる。また本発明のさらなる断片又はポリペプチドは、本明細書に記載の１つ又は複数の（より小さい）部分又は断片を好適に組み合わせることによって（すなわち連結又は遺伝子融合によって）提供され得る。
【０２２１】
本明細書でさらに記載される、本発明の具体的であるが非限定的な一態様において、このような類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体は、その元となる免疫グロブリン配列に比べて（本明細書にさらに記載されるように）増大した血清半減期を有する。例えば、本発明の免疫グロブリン配列は、本発明の免疫グロブリン配列の誘導体の半減期が増大するように、半減期を延長する１つ又は複数の基又は部分（例えばＰＥＧ）と（化学的に又は別の方法で）連結され得る。
【０２２２】
具体的ではあるが非限定的な一態様では、本発明の免疫グロブリン配列は、免疫グロブリンフォールドを含む免疫グロブリン配列であり得るか、又は好適な条件（例えば生理的条件）下で（すなわちフォールディングによって）免疫グロブリンフォールドを形成することができる免疫グロブリン配列であり得る。特にHalaby et al., J. （1999） Protein Eng. 12, 563-71によるレビューを参照する。好ましくは、免疫グロブリンフォールドを形成するように適切にフォールディングする場合、このような免疫グロブリン配列は、イオンチャネルと（本明細書に規定のように）特異的に結合することができ、より好ましくは本明細書に規定のように（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性でイオンチャネルと結合することができる。また、このような免疫グロブリン配列の部分、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体は、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することができるようなものであるのが好ましい。
【０２２３】
具体的であるが、非限定的に、本発明の免疫グロブリン配列は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になる免疫グロブリン配列、又はこのような免疫グロブリン配列の任意の好適な断片（したがって通常、本明細書でさらに記載されるように、ＣＤＲの少なくとも１つを形成するアミノ酸残基の少なくとも幾つかを含有する）であり得る。
【０２２４】
本発明のこのような免疫グロブリン配列において、フレームワーク配列は任意の好適なフレームワーク配列であり得るが、好適なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書において言及されるさらなる開示及び従来技術に基づき、当業者に明らかである。
【０２２５】
フレームワーク配列は、免疫グロブリンフレームワーク配列、又は（例えばヒト化又はラクダ化によって）免疫グロブリンフレームワーク配列から誘導されているフレームワーク配列（の好適な組合せ）であるのが好ましい。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）及び／又は重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されているフレームワーク配列であり得る。特に好ましい一態様では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列（該フレームワーク配列は任意で、部分又は完全ヒト化し得る）から誘導されているか、又は（本明細書に規定のように）ラクダ化した通常のＶＨ配列であるいずれかのフレームワーク配列である。
【０２２６】
フレームワーク配列は、本発明の免疫グロブリン配列が、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（商標）（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）であるようなものであるのが好ましい。同様に、好適なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる開示及び従来技術に基づいて当業者にとって明らかである。
【０２２７】
特に、本発明の免疫グロブリン配列に存在するフレームワーク配列は、本発明の免疫グロブリン配列がナノボディ（商標）であるように、（本明細書に規定の）特徴的な残基を１つ又は複数含有し得る。このようなフレームワーク配列（の好適な組合せ）の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示から明らかになる。
【０２２８】
同様に概して、本発明の免疫グロブリン配列に関して本明細書に記載のように、上記のいずれかの好適な断片（又は断片の組合せ）（例えば１つ又は複数のフレームワーク配列に好適に隣接した、及び／又はこれを介して連結した、１つ又は複数のＣＤＲ配列を（例えば、これらのＣＤＲ配列及びフレームワーク配列が、断片が誘導された完全長の（full-sized：フルサイズの）免疫グロブリン配列で発生し得るのと同じ順序（order）で）含有する断片）を使用することも可能である。このような断片は同様に、免疫グロブリンフォールドを含むか、若しくは形成することができるようなもの、又は代替的に免疫グロブリンフォールドを含まないか、若しくは形成することができないようなものであってもよい。
【０２２９】
特定の一態様において、このような断片は、本明細書に記載の単一ＣＤＲ配列（特にＣＤＲ３配列）を含み、フレームワーク配列（の一部）（特に断片が誘導される免疫グロブリン配列において上記ＣＤＲ配列に隣接するフレームワーク配列（複数可）の一部）が両側に隣接する。例えば、ＣＤＲ３配列は、ＦＲ３配列（の一部）の後にあり、ＦＲ４配列（の一部）の前にあり得る。このような断片はまた、ジスルフィド架橋、特にＣＤＲ配列の前後それぞれにある２つのフレームワーク領域を連結するジスルフィド架橋を含有してもよい（このようなジスルフィド架橋を形成するために、上記フレームワーク領域で自然発生するシステイン残基を使用するか、又は代替的にシステイン残基を上記フレームワーク領域に合成的に付加若しくは導入してもよい）。これらの「促進断片」のさらなる説明に関しては、同様に国際公開第０３／０５０５３１号、並びに国際公開第２００９／１２７６９１号を参照する。
【０２３０】
本発明の免疫グロブリン配列は、具体的に免疫グロブリン配列又はその好適な断片、より具体的には免疫グロブリン可変ドメイン配列又はその好適な断片（例えば軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）若しくはその好適な断片、又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）若しくはその好適な断片）であり得る。本発明の免疫グロブリン配列は、重鎖可変ドメイン配列である場合、通常の四本鎖抗体由来の重鎖可変ドメイン配列（例えば、これに限定されないが、ヒト抗体由来のＶＨ配列）又はいわゆる（本明細書に規定の）「重鎖抗体」由来のいわゆる（本明細書に規定の）ＶＨＨ配列であり得る。
【０２３１】
しかし本発明が、本発明の免疫グロブリン配列（又はこれを発現するのに使用される本発明のヌクレオチド配列）の起源に関しても、また本発明の免疫グロブリン配列又はヌクレオチド配列を生成又は入手する（又は生成若しくは入手した）方法に関しても限定されないことに留意すべきである。したがって本発明の免疫グロブリン配列は、（任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であり得る。本発明の具体的ではあるが非限定的な態様では、免疫グロブリン配列は（任意の好適な種由来の）天然免疫グロブリン配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であり、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」免疫グロブリン配列（例えば部分又は完全ヒト化マウス又はウサギ免疫グロブリン配列、特に部分又は完全ヒト化ＶＨＨ配列又はナノボディ）、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列、並びに親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組合せ、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られる免疫グロブリン配列が含まれる。例えば標準的なハンドブック、並びに本明細書に言及されるさらなる記載及び従来技術を参照する。
【０２３２】
同様に、本発明のヌクレオチド配列は、天然ヌクレオチド配列、又は合成若しくは半合成の配列であってもよく、例えばＰＣＲによって好適な天然鋳型（例えば細胞から単離されるＤＮＡ又はＲＮＡ）から単離される配列、ライブラリ（特に発現ライブラリ）から単離されたヌクレオチド配列、（それ自体が既知の任意の好適な技法（例えばミスマッチＰＣＲ）を使用して）天然ヌクレオチド配列に突然変異を導入することによって調製されたヌクレオチド配列、重複プライマーを使用してＰＣＲによって調製されたヌクレオチド配列、又はそれ自体が既知のＤＮＡ合成のための技法を使用して調製されたヌクレオチド配列であり得る。
【０２３３】
特に本発明の免疫グロブリン配列は、（本明細書で規定の）ナノボディ（商標）又はその好適な断片（備考：ナノボディ（商標）（NanobodyTM, NanobodiesTM）及びナノクローン（商標）は、Ablynx N. V.の商標である）であり得る。イオンチャネルに指向性を有するこのようなナノボディは、本明細書中で「本発明のナノボディ」とも称される。ナノボディの概説に関しては、以下のさらなる記載、及び本明細書で引用される従来技術を参照する。しかしこれに関して、本明細書及び従来技術は主に、いわゆる「ＶＨ３群」のナノボディ（すなわちＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のＶＨ３群のヒト生殖細胞系列の配列との高度な配列相同性を有するナノボディ）を説明し、このナノボディは本発明の好ましい態様を形成することに留意すべきである。しかし概して、本発明は最も広範な意味で、イオンチャネルに指向性を有する任意のタイプのナノボディを包含し、例えば２００６年４月１４日付けでAblynxN. V.により出願された"DP-78-like Nanobodies"と題する米国仮特許出願第６０／７９２，２７９号に記載されるように、例えばいわゆる「ＶＨ４群」に属するナノボディ（すなわちＤＰ−７８等のＶＨ４群のヒト生殖細胞系列の配列との高度な配列相同性を有するナノボディ）も包含することに留意すべきである。
【０２３４】
概して、ナノボディ（特にＶＨＨ配列及び部分ヒト化ナノボディ）は特に、（同様に本明細書にさらに記載される）１つ又は複数のフレームワーク配列における（本明細書に記載される）１つ又は複数の「特徴的な（Hallmark：ホールマーク）残基」の存在を特徴とし得る。したがって概して、ナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指し、１つ又は複数の特徴的な残基は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有する免疫グロブリン配列として定義することができる。
【０２３５】
具体的にナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指し、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有する免疫グロブリン配列であり得る。
【０２３６】
具体的にナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指し、フレームワーク配列は本明細書にさらに規定されるようなものである）を有する免疫グロブリン配列であり得る。
【０２３７】
より具体的に、ナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有する免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）好ましくは、カバットナンバリング（Kabat numbering）による１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数は、以下の表Ｂ−２で言及する特徴的な残基から選択され、
ｉｉ）上記免疫グロブリン配列は、配列番号１〜配列番号２２の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列番号１〜配列番号２２の配列においてＸで示す）は無視する）。
【０２３８】
これらのナノボディにおいて、ＣＤＲ配列は概して、本明細書中にさらに規定されるようなものである。
【０２３９】
したがって、本発明は、イオンチャネルと（本明細書に規定のように）結合することができる及び／又はこれに指向性を有するこのようなナノボディ、その好適な断片、並びにこのようなナノボディ及び／又は好適な断片を１つ又は複数含むか、又はこれらから本質的になるポリペプチドにも関する。
【０２４０】
配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）はイオンチャネルに対して惹起されている多くのＶＨＨ配列の免疫グロブリン配列を与える。
【０２４１】
表Ａ−１：好ましいＶＨＨ配列又はナノボディ配列（本明細書で特定の名称を有する配列又は配列番号Ｘ（ここでＸは関連の免疫グロブリン配列を表す番号である）としても表される）：
【表１】
0006034435.tif 000002
0006034435.tif 000003
0006034435.tif 000004
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【０２４２】
特に本発明は幾つかの特定の態様で以下のものを提供する：
（本明細書で規定のように）イオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、例えば９０％若しくは９５％、又はそれ以上の配列同一性を有する、免疫グロブリン配列。これらの免疫グロブリン配列はさらに同種リガンドとイオンチャネルとの結合を中和するようなもの；及び／又はイオンチャネルとの結合に関して同種リガンドと競合するもの；及び／又はイオンチャネル上の（本明細書で規定のような）相互作用部位（例えばリガンド結合部位）に指向性を有するものであり得る；
（本明細書で規定のように）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとイオンチャネルとの結合を交差遮断する、及び／又はイオンチャネルとの結合に関して配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つと競合する、免疫グロブリン配列。この場合も、これらの免疫グロブリン配列はさらに同種リガンドとイオンチャネルとの結合を中和するようなもの；及び／又はイオンチャネルとの結合に関して同種リガンドと競合するようなもの；及び／又はイオンチャネル上での（本明細書で規定のような）相互作用部位（例えばリガンド結合部位）に指向性を有するようなものであり得る；
この免疫グロブリン配列は、本明細書でさらに記載のようなもの（例えばナノボディであり得る）；並びにこのような免疫グロブリン配列を１つ又は複数含む本発明のポリペプチド（本明細書にさらに記載のようなものであってもよく、例えば本明細書に記載のような二重特異性及び／又は二重パラトピックポリペプチドであってもよい）、及びこのような免疫グロブリン配列及びポリペプチドをコードする核酸配列であり得る。このような免疫グロブリン配列及びポリペプチドは任意の天然リガンドを含まない。
【０２４３】
したがって本発明の特に好ましいナノボディの幾つかが、イオンチャネルと（本明細書でさらに規定されるように）結合することができ、及び／又はそれらに指向性を有し、
ｉ）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）（またこれに関しては、表Ｂ−１を参照するが、この図は配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディのフレームワーク１配列（配列番号１２６〜配列番号２０７）、フレームワーク２配列（配列番号２９０〜配列番号３７１）、フレームワーク３配列（配列番号４５４〜配列番号５３５）及びフレームワーク４配列（配列番号６１８〜配列番号６９９）を列挙する）（フレームワーク１配列の１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基に関しては、以下で為されるコメントも参照する。したがって、アミノ酸同一性の程度を決定するためにこれらのアミノ酸残基は無視するのが好ましい）、
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数が、以下の表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、ナノボディである。
【０２４４】
これらのナノボディにおいて、概してＣＤＲ配列は本明細書にさらに規定されるようなものである。
【０２４５】
この場合もこのようなナノボディは、任意で好適な方法で任意の好適な供給源から得られてもよく、例えば（すなわち好適な種のラクダ科動物由来の）天然ＶＨＨ配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列であってもよく、これにはこれらに限定されないが、（本明細書に規定の）「ヒト化」ナノボディ、（本明細書に規定の）「ラクダ化」免疫グロブリン配列（特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、並びに本明細書にさらに記載されるように、親和性成熟（例えば、合成、ランダム又は天然免疫グロブリン配列から開始する）、ＣＤＲグラフト化、ベニヤリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の結合、重複プライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、及び当業者に既知の免疫グロブリン配列を遺伝子操作する同様の技法、又は上記のいずれかの任意の好適な組合せ等の技法によって得られたナノボディが含まれる。また、ナノボディがＶＨＨ配列を含む場合、上記ナノボディは、１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、本明細書でさらに記載されるように好適にヒト化され得る。同様に、ナノボディが合成又は半合成の配列（例えば部分ヒト化配列）を含む場合、上記ナノボディは、同様に１つ又は複数の本発明のさらなる（部分又は完全）ヒト化ナノボディを提供するように、同様に本明細書で記載されるように任意でさらに好適にヒト化され得る。
【０２４６】
特にヒト化ナノボディは、概してこれまでの段落でナノボディに関して規定されたような免疫グロブリン配列であり得るが、この中に（本明細書に規定の）ヒト化置換である、及び／又はヒト化置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が（特にフレームワーク残基の少なくとも１つに）存在する。本明細書中の開示に基づいて、当業者にとって、幾つかの好ましいが非限定的なヒト化置換（及びその好適な組合せ）は明らかになる。付加的に又は代替的に、天然ＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連したヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後このようにして決定した潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）の１つ又は複数を上記ＶＨＨ配列に（それ自体が既知の任意の方法で、本明細書にさらに記載のように）導入することができ、得られたヒト化ＶＨＨ配列を、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性に関して試験することができる。このように、限定的な試行錯誤によって、本明細書中の開示に基づき、当業者は、他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を決定することができる。また上記に基づいて、ナノボディ（のフレームワーク領域）を部分ヒト化又は完全ヒト化してもよい。
【０２４７】
好ましいが非限定的な一態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とからなる、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに対する（本明細書中に規定の）ナノボディであって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択されるか、又はこのような免疫グロブリン配列の任意の好適な断片である、ナノボディに関する。
【０２４８】
特に、好ましいが非限定的なこの態様によれば、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とからなる、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに対する（本明細書中に規定の）ナノボディであって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択され、
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択され、
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択されるか、又はこのような免疫グロブリン配列の任意の好適な断片である、ナノボディに関する。
【０２４９】
本発明の免疫グロブリン配列に関して本明細書で包括的に言及するように、本発明のナノボディがｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲ１配列を１つ又は複数含有する場合、
ｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるこのようなＣＤＲにおいて任意のアミノ酸置換は、（本明細書で規定されるように）対応するａ）によるＣＤＲと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく；及び／又は
ｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲは、対応するａ）によるＣＤＲと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく；及び／又は
ｉｉｉ）ｂ）及び／又はｃ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってａ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
【０２５０】
同様に、本発明のナノボディがｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲ２配列を１つ又は複数含有する場合、
ｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるこのようなＣＤＲにおいて任意のアミノ酸置換は、（本明細書で規定されるように）対応するｄ）によるＣＤＲと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく；及び／又は
ｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲは、対応するｄ）によるＣＤＲと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく；及び／又は
ｉｉｉ）ｅ）及び／又はｆ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってｄ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
【０２５１】
また同様に、本発明のナノボディがｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲ３配列を１つ又は複数含有する場合、
ｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるこのようなＣＤＲにおいて任意のアミノ酸置換は、（本明細書で規定されるように）対応するｇ）によるＣＤＲと比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく；及び／又は
ｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲは、対応するｇ）によるＣＤＲと比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく；及び／又は
ｉｉｉ）ｈ）及び／又はｉ）によるＣＤＲは、それ自体が既知の１つ又は複数の親和性成熟技法を用いる親和性成熟によってｇ）によるＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
【０２５２】
直前の３段落は概して、それぞれｂ）、ｃ）、ｅ）、ｆ）、ｈ）又はｉ）によるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及び／又はＣＤＲ３配列を１つ又は複数含む、任意の本発明のナノボディに適用されると理解すべきである。
【０２５３】
本発明のナノボディのうち、具体的には上記で明示的に挙げられるＣＤＲを１つ又は複数含むナノボディが好ましい。より具体的には上記で明示的に挙げられるＣＤＲを２つ以上含むナノボディが好ましい。最も具体的には上記で明示的に挙げられるＣＤＲを３つ含むナノボディが好ましい。
【０２５４】
幾つかの特に好ましいが非限定的なＣＤＲ配列の組合せ、及びＣＤＲ配列とフレームワーク配列との好ましい組合せが以下の表Ｂ−１で言及され、これは多くの好ましい（が非限定的な）本発明のナノボディに存在するＣＤＲ配列及びフレームワーク配列を挙げている。当業者にとって明らかなように、同じクローンで現れるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せ（すなわち表Ｂ−１の同じ行で言及されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列）が通常好ましい（が、本発明はその最も広範な意味ではこれに限定されず、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列の他の好適な組合せも含む）。また、同じクローンで現れるＣＤＲ配列とフレームワーク配列との組合せ（すなわち表Ｂ−１の同じ行で言及されるＣＤＲ配列及びフレームワーク配列）が通常好ましい（が、本発明はその最も広範な意味ではこれに限定されず、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列とフレームワーク配列との他の好適な組合せ、並びに例えば本明細書でさらに記載されるようなこのようなＣＤＲ配列と他の好適なフレームワーク配列との組合せも含む）。
【０２５５】
また、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディにおいて、それぞれのＣＤＲを、言及されるＣＤＲとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択されるＣＤＲに置き換えることができ、ここで
ｉ）このようなＣＤＲにおいて任意のアミノ酸置換は、（本明細書で規定されるように）対応する表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく；及び／又は
ｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、対応する表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列と比較して、アミノ酸置換だけを含有し、アミノ酸欠失又は挿入は含有しないのが好ましく；及び／又は
ｉｉｉ）任意のこのようなＣＤＲ配列は、特に対応する表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列から、それ自体が既知の親和性成熟技法によって誘導されるＣＤＲである。
【０２５６】
しかし、当業者にとって明らかなように、表Ｂ−１で言及される、ＣＤＲ配列（の組合せ）、並びにＣＤＲ配列及びフレームワーク配列（の組合せ）が一般的に好ましい。
【０２５７】
表Ｂ−１：ＣＤＲ配列の好ましい組合せ、フレームワーク配列の好ましい組合せ、及びフレームワーク配列とＣＤＲ配列との好ましい組合せ。
（「番号」は本明細書で使用される配列番号を表す）
【表２】
0006034435.tif 000016
0006034435.tif 000017
0006034435.tif 000018
0006034435.tif 000019
0006034435.tif 000020
0006034435.tif 000021
0006034435.tif 000022
0006034435.tif 000023
0006034435.tif 000024
0006034435.tif 000025
0006034435.tif 000026
0006034435.tif 000027
0006034435.tif 000028
0006034435.tif 000029
0006034435.tif 000030
0006034435.tif 000031
0006034435.tif 000032
【０２５８】
このため、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から；又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の「配列同一性」（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみの「アミノ酸差異」（本明細書で規定）を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から好適に選択される。
【０２５９】
これに関して、「好適に選択される」とは、規定通りに、それぞれＣＤＲ１配列が好適なＣＤＲ１配列から（すなわち本明細書で規定のように）選択され、ＣＤＲ２配列が好適なＣＤＲ２配列から（すなわち本明細書で規定のように）選択され、ＣＤＲ３配列が好適なＣＤＲ３配列から（すなわち本明細書で規定のように）選択されることを意味する。より具体的には、ＣＤＲ配列は、本発明のナノボディが本明細書に規定のような（さらに本明細書に記載されるような（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度、又は代替的にＩＣ５０値として好適に測定される、及び／又は表される）親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するように選択されるのが好ましい。
【０２６０】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列からなる群から；又は表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群から；及び／又は表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択される。
【０２６１】
好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から；又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみの「アミノ酸差異」を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から好適に選択される。
【０２６２】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列からなる群から；又はそれぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択され；存在するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列からなる群から；又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群から好適に選択される。
【０２６３】
最も好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の３つ全てが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から；又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列それぞれからなる群から好適に選択される。
【０２６４】
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも１つが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在する他の２つのＣＤＲ配列の少なくとも１つ、又は好ましくは両方が、表Ｂ−１でそれぞれ挙げられる対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられる対応する配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択される。
【０２６５】
特に、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３からなる群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つ、及び好ましくは両方が、表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列との、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群から；及び／又は表Ｂ−１でそれぞれ挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列それぞれからなる群から好適に選択される。
【０２６６】
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の少なくとも２つが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択される。好ましくはこの態様では、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−１で挙げられる対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群から；及び／又は表Ｂ−１で挙げられる対応する配列の少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択される。
【０２６７】
特に、本発明のナノボディにおいて、ＣＤＲ３配列が少なくとも、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択され、ＣＤＲ１配列又はＣＤＲ２配列のいずれかが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列からなる群から好適に選択される。好ましくは、この態様において、存在する残りのＣＤＲ配列が、表Ｂ−１で挙げられる対応するＣＤＲ配列の少なくとも１つとの、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群から；及び／又は表Ｂ−１で挙げられる対応するＣＤＲ配列との、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択される。
【０２６８】
さらにより好ましくは、本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の３つ全てが、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列からなる群から好適に選択される。また概して、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲの組合せ（すなわち表Ｂ−１の同じ行で言及されるもの）が好ましい。このため概して、本発明のナノボディにおけるＣＤＲが、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ配列であるか、又は表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ配列との、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群から；及び／又は表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ配列との、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択される場合、他のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは両方が、表Ｂ−１における同じ組合せ（すなわち表Ｂ−１の同じ行で言及されるもの）に属するＣＤＲ配列から好適に選択されるか、又は同じ組合せに属するＣＤＲ配列（複数可）との、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤＲ配列からなる群から；及び／又は同じ組合せに属するＣＤＲ配列（複数可）との、３つ、２つ若しくは１つのみのアミノ酸差異を有するＣＤＲ配列からなる群から好適に選択されることが好ましい。上記の段落で示される他の好ましい実施形態（preferences）は、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲの組合せにも適用される。
【０２６９】
このため、非限定的な例により、本発明のナノボディは例えば、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列と、表Ｂ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ２配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列と、ＣＤＲ３配列とを含むことができる。
【０２７０】
幾つかの好ましい本発明のナノボディは例えば以下のものを含み得る：（１）表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列；表Ｂ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ２配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列；及び表Ｂ−１で言及される（が、異なる組合せに属する）ＣＤＲ３配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列；又は（２）表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列；ＣＤＲ２配列；及び表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列の１つ；又は（３）ＣＤＲ１配列；表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ２配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ２配列；及びＣＤＲ２配列と同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ３配列との、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ３配列。
【０２７１】
幾つかの特に好ましい本発明のナノボディは例えば以下のものを含み得る：（１）表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ２配列との、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列；及び同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ３配列との８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列；又は（２）ＣＤＲ１配列；表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ２；及び表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列（ここでＣＤＲ２配列とＣＤＲ３配列とは異なる組合せに属し得る）。
【０２７２】
幾つかのさらにより好ましい本発明のナノボディは例えば以下のものを含み得る：（１）表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列の１つとの８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ１配列；同じ組合せに属する、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ２配列；及び異なる組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ３配列；又は（２）表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列；同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ２配列との、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有するＣＤＲ２配列；及び同じ若しくは異なる組合せに属する、表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ３配列との８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ３配列。
【０２７３】
特に好ましい本発明のナノボディは例えば、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ１配列と、同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ２配列との８０％を超える配列同一性を有するＣＤＲ２配列と、同じ組合せに属する、表Ｂ−１で言及されるＣＤＲ３配列とを含み得る。最も好ましい本発明のナノボディにおいて、存在するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列が、それぞれ表Ｂ−１で挙げられるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せの１つから好適に選択される。
【０２７４】
別の好ましいが非限定的な本発明の態様によれば、（ａ）ＣＤＲ１は１個〜１２個のアミノ酸残基、通常２個〜９個のアミノ酸残基、例えば５個、６個又は７個のアミノ酸残基の長さを有し、及び／又は（ｂ）ＣＤＲ２は１３個〜２４個のアミノ酸残基、通常１５個〜２１個のアミノ酸残基、例えば１６個又は１７個のアミノ酸残基の長さを有し、及び／又は（ｃ）ＣＤＲ３は２個〜３５個のアミノ酸残基、通常３個〜３０個のアミノ酸残基、例えば６個〜２３個のアミノ酸残基の長さを有する。
【０２７５】
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明は、ＣＤＲ配列（本明細書で規定）が、配配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つのＣＤＲ配列との、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で規定）を有するナノボディに関する。
【０２７６】
概して、上記のＣＤＲ配列を有するナノボディが、本明細書でさらに記載されるようなものであり、好ましくは同様に本明細書でさらに記載されるようなものであるフレームワーク配列を有し得る。このため、例えば本明細書で言及されるようにこのようなナノボディは、（任意の好適な種由来の）天然のナノボディ、天然の（すなわち好適なラクダ科動物種由来の）ＶＨＨ配列、又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列若しくはナノボディ（部分ヒト化ナノボディ又はＶＨＨ配列、完全ヒト化ナノボディ又はＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列が挙げられるが、これらに限定されない）、及び本明細書で言及される技法により得られたナノボディであり得る。
【０２７７】
このため、具体的であるが非限定的な一態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とからなるヒト化ナノボディであって、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、上記ヒト化ナノボディが少なくとも１つのヒト化置換（本明細書で規定）、具体的にはそのフレームワーク配列（本明細書で規定）の少なくとも１つに少なくとも１つのヒト化置換を含む、ヒト化ナノボディに関する。
【０２７８】
別の好ましいが非限定的な態様において、本発明は、ＣＤＲ配列が、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列との、少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％若しくはそれ以上のアミノ酸同一性、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有するナノボディに関する。このアミノ酸同一性の程度は例えば、上記のナノボディと配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の配列の１つ又は複数との間のアミノ酸同一性の程度を（本明細書で記載のように）求めることにより決定することができる（ここでフレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する）。このようなナノボディは本明細書でさらに説明されるようなものであり得る。
【０２７９】
別の好ましいが非限定的な態様において、本発明は、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）からなる群から、又は配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で規定）を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択される免疫グロブリン配列を有するナノボディに関する。
【０２８０】
別の好ましいが非限定的な本発明の態様は、対応する天然ＶＨＨ配列と比較して、少なくとも１つのヒト化置換（本明細書で規定）、具体的にはそのフレームワーク配列（本明細書で規定）の少なくとも１つに少なくとも１つのヒト化置換を含む、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディのヒト化変異体に関する。
【０２８１】
本発明のポリペプチドは少なくとも１つの本発明のナノボディを含むか又はこれから本質的になる。本発明のポリペプチドの幾つかの好ましいが、非限定的な例は配列番号７８９〜配列番号７９１（表Ａ−３を参照されたい）で与えられる。
【０２８２】
表Ａ−３（適用される場合）：好ましいポリペプチド又は化合物の配列（本明細書で特定の名称を有する配列又は配列番号Ｘ（ここでＸは関連の免疫グロブリン配列を表す番号である）としても表される）：
【表３】
0006034435.tif 000033
【０２８３】
「好ましい」（又は「より好ましい」、「さらにより好ましい」等）と本明細書中で言及されるナノボディが、本明細書中に記載のポリペプチドで使用するのにも好ましい（又はより好ましい、又はさらにより好ましい等）ことは、当業者にとって明らかである。このように概して、１つ又は複数の「好ましい」本発明のナノボディを含むか又はこれから本質的になるポリペプチドが好ましく、概して１つ又は複数の「より好ましい」本発明のナノボディを含むか又はこれから本質的になるポリペプチドがより好ましい。
【０２８４】
概して、単一のナノボディ（本発明の単一のナノボディ等）を含むか又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドは、本明細書で「一価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上のナノボディ（少なくとも２つの本発明のナノボディ、又は少なくとも１つの本発明のナノボディ及び少なくとも１つの他のナノボディ等）を含むか又はこれから本質的になるタンパク質及びポリペプチドは、本明細書で「多価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多価構築物」と呼ばれ、これらは、対応する本発明の一価のナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このような多価構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０２８５】
具体的であるが、非限定的な一態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも２つの本発明のナノボディ、例えば２つ又は３つの本発明のナノボディを含むか又はこれから本質的になる。本明細書中にさらに記載のように、このような多価構築物は、本発明の単一ナノボディを含むか又はこれから本質的になるタンパク質又はポリペプチドに比べて、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに対する結合活性が大きく改善するというような、或る特定の利点を与えることができる。このような多価構築物は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、このような多価ナノボディ構築物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号７８９〜配列番号７９１の構築物である。
【０２８６】
具体的であるが、非限定的な別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のナノボディと、好ましくはナノボディでもある少なくとも１つの他の結合単位（すなわち別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに指向性を有する）とを含むか又は本質的にこれからなる。このようなタンパク質又はポリペプチドは、本明細書中で「多重特異性」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多重特異性構築物」とも称され、これらは、（好ましいが非限定的な幾つかの多重特異性構築物の本明細書中のさらなる考察から明らかになるように）対応する本発明の一価ナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このような多重特異性構築物は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、このような多重特異性ナノボディ構築物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、配列番号７８９〜配列番号７９１の構築物である。
【０２８７】
具体的であるが、非限定的なさらに別の態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のナノボディと、任意で１つ又は複数のさらなるナノボディと、本発明のナノボディに及び／又は得られた融合タンパク質に少なくとも１つの所望の特性を与える少なくとも１つの他の免疫グロブリン配列（タンパク質又はポリペプチド等）とを含むか又はこれから本質的になる。ここでも同様に、このような融合タンパク質は、対応する本発明の一価ナノボディに比べて或る特定の利点を与え得る。このような免疫グロブリン配列及びこのような融合構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０２８８】
例えば２つ以上の上記の態様を組合せて、２つの本発明のナノボディと、１つの他のナノボディと、任意で１つ又は複数の他の免疫グロブリン配列とを含む三価の二重特異性構築物を提供することも可能である。このような構築物、及び本発明の関連内で特に好ましい幾つかの構築物のさらなる非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０２８９】
上記の構築物において、１つ又は複数のナノボディ及び／又は他の免疫グロブリン配列は、互いに直接連結しても、及び／又は１つ又は複数のリンカー配列を介して互いに好適に連結してもよい。このようなリンカーの幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０２９０】
具体的な本発明の一態様において、本発明のナノボディ、又は本発明のナノボディを少なくとも１つ含む、本発明の化合物、構築物若しくはポリペプチドの半減期は、対応する本発明の免疫グロブリン配列に比べて増大し得る。このようなナノボディ、化合物及びポリペプチドの幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる開示に基づき、当業者にとって明らかになり、例えば（例えばペグ化によって）半減期が増大するように化学修飾した本発明のナノボディ配列又はポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミン等、例えば欧州特許第０３６８６８４号、４頁を参照されたい）との結合に関するさらなる結合部位を少なくとも１つ含む本発明の免疫グロブリン配列；又は本発明のナノボディの半減期を増大させる、少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つの免疫グロブリン配列）と連結する本発明のナノボディを少なくとも１つ含む本発明のポリペプチドを含む。このような半減期を延ばす部分又は免疫グロブリン配列を含む本発明のポリペプチドの例は、本明細書中のさらなる開示に基づき、当業者にとって明らかになり、例えば１つ又は複数の本発明のナノボディが、１つ又は複数の血清タンパク質若しくはその断片（血清アルブミン又はその好適な断片等）と、又は血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の結合単位（例えば血清アルブミン等の血清タンパク質、ＩｇＧ等の血清免疫グロブリン、又はトランスフェリンと結合することができるナノボディ又は（単一）ドメイン抗体等）と好適に連結するポリペプチド；本発明のナノボディがＦｃ部分（ヒトＦｃ等）又はその好適な部分若しくは断片と連結するポリペプチド；又は１つ若しくは複数の本発明のナノボディが、血清タンパク質と結合することができる、１つ又は複数の小タンパク質又はペプチド（例えば国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号、国際公開第０２／０７６４８９号、及び２００６年１２月５日付で出願したAblynx N.V.の"Peptides capable ofbinding to serum proteins"と題したAblynx N.V.の米国仮特許出願（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ／２００７／０６３３４８号も参照されたい）に記載のタンパク質及びペプチドであるが、これに限定されない）と好適に連結するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９１】
さらに、当業者にとって明らかなように、このようなナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、三重特異性又は多重特異性ナノボディ構築物を提供するように、１つ又は複数のさらなる基、残基、部位、又は結合単位（例えば１つ又は複数のさらなる免疫グロブリン配列、特に１つ又は複数のさらなる（すなわち例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有しない）ナノボディ）を含有し得る。
【０２９２】
概して、半減期が増大した本発明のナノボディ（又はこれを含む化合物、構築物若しくはポリペプチド）は、対応する本発明の免疫グロブリン配列自体の半減期の少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍（少なくとも５倍等）、例えば少なくとも１０倍又は２０倍を超える半減期を有するのが好ましい。例えば、半減期が増大した本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、対応する本発明の免疫グロブリン配列自体に比べて、半減期が１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて（１２時間等を超えて）、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大し得る。
【０２９３】
好ましいが非限定的な本発明の一態様において、このような本発明のナノボディ、化合物、構築物又はポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間又はそれ以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
【０２９４】
本発明の別の一態様では、本発明のポリペプチドは、得られる本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする１つ又は複数（例えば２つ及び好ましくは１つ）の免疫グロブリン配列に連結する（任意で１つ又は複数の好適なリンカー配列を介して）、１つ又は複数（例えば２つ又は好ましくは１つ）の本発明のナノボディを含む。特に、得られる本発明のポリペプチドが血液脳関門を横断するのを可能にする上記１つ又は複数の免疫グロブリン配列は、１つ又は複数の（例えば２つ及び好ましくは１つ）ナノボディ、例えば、国際公開第０２／０５７４４５号に記載のナノボディ（好ましい例は、ＦＣ４４（国際公開第０６／０４０１５３号の配列番号１８９）及びＦＣ５（国際公開第０６／０４０１５４号の配列番号１９０）である）であり得る。
【０２９５】
特に、本発明のナノボディを１つ又は複数含むポリペプチドは、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するようなもの、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）のｋｏｎ速度で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するようなもの、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）のｋｏｆｆ速度で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するようなものであるのが好ましい。
【０２９６】
好ましくは、本発明の免疫グロブリン配列を１つだけ含有するポリペプチドが、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するようなものであるのが好ましい。これに対して、本発明のナノボディを２つ以上含有するポリペプチドは、本発明の免疫グロブリン配列を１つだけ含有するポリペプチドに比べて、増大した結合活性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができることが当業者には明らかである。
【０２９７】
本発明の免疫グロブリン配列又はポリペプチドと例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合に関する幾つかの好ましいＩＣ５０値は、本明細書のさらなる記載及び実施例から明らかになる。
【０２９８】
本発明のこの好ましい態様による他のポリペプチドは例えば、配列番号７８９〜配列番号７９１（表Ａ−３を参照されたい）の免疫グロブリン配列のうちの１つ又は複数と８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％又はそれ以上の「配列同一性」（本明細書で規定のような）を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択されてもよく、ここで上記免疫グロブリン配列内に含まれるナノボディは本明細書にさらに規定のようなものが好ましい。
【０２９９】
本発明の別の態様は、本発明の免疫グロブリン配列（例えば本発明のナノボディ）又はこれを含む本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。さらに、本発明の核酸に関して本明細書中に概して記載するように、このような核酸は、本明細書中に規定のように遺伝子構築物の形態であり得る。
【０３００】
別の態様では本発明は、本発明の免疫グロブリン配列（例えばナノボディ）及び／又はこれを含む本発明のポリペプチドを発現するか、又は発現することができる、及び／又は本発明の核酸を含有する宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０３０１】
本発明の別の態様は、少なくとも１つの本発明の免疫グロブリン配列と、少なくとも１つの本発明のポリペプチド及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸と、任意で（すなわち組成物の使用目的に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる構成要素とを含有するか又は含む生成物又は組成物に関する。このような生成物又は組成物は例えば、（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（同様に本明細書に記載の）診断用途のための生成物若しくは組成物であり得る。このような生成物又は組成物の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０３０２】
本発明はさらに、本明細書中に記載の免疫グロブリン配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物を調製又は生成する方法に関する。このような方法の幾つかの好ましいが非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０３０３】
本発明はさらに、本明細書中に記載の免疫グロブリン配列、化合物、構築物、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の適用及び使用、並びに例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが非限定的な適用及び使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【０３０４】
また本発明の他の態様、実施形態、利点及び用途は、本明細書の以下のさらなる記載から明らかになる。概して、最も広範な意味で本明細書で使用されるナノボディという用語は、特定の生物学的供給源又は特定の調製方法に限定されないことに留意すべきである。例えば、以下でより詳細に考察されるように、本発明のナノボディは概して、国際公開第０８／０２００７９号の６１頁及び６２頁で言及された技法（１）〜（８）又はそれ自体が既知の任意の他の好適な技法のいずれかによって得ることができる。１つの好ましい群のナノボディは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する天然重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、このようなＶＨＨ配列は概して、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルをラクダ科動物種に好適に（すなわち免疫応答及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する重鎖抗体を誘起するように）免疫付与することによって、上記ラクダ科動物由来の好適な生体試料（例えば血液試料、血清試料又はＢ細胞の試料）を得ることによって、及びそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、上記試料から例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有するＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手することができる。このような技法は、当業者にとって明らかであり、及び／又は本明細書でさらに記載される。
【０３０５】
代替的に、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに対するこのような天然ＶＨＨドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨ配列のナイーブライブラリから、例えばそれ自体が既知の１つ又は複数のスクリーニング技法を用いて、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネル、又は少なくともその一部分、断片、抗原決定基若しくはエピトープを使用して、このようなライブラリをスクリーニングすることによって得ることができる。このようなライブラリ及び技法は例えば、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第０１／９０１９０号、国際公開第０３／０２５０２０号及び国際公開第０３／０３５６９４号に記載されている。代替的に、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の改良型の合成ライブラリ又は半合成ライブラリ（例えばランダム突然変異誘発及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば国際公開第００／４３５０７号に記載されているようなもの）等の技法によって、ナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ）を使用してもよい。
【０３０６】
このように、別の態様において、本発明は、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有するナノボディを生成する方法に関する。一態様では、上記方法は少なくとも、
ａ）ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができる、及び／又はこれに対する親和性を有するナノボディ配列に関して、上記のナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができる、及び／又はこれに対する親和性を有するナノボディ（単数又は複数）を単離する工程とを含む。
【０３０７】
このような方法では、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリは、ナノボディ配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリ、ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリ、及び／又は親和性成熟を受けているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
【０３０８】
この方法の好ましい一態様では、ナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネル、又はこれに基づく若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の部分、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ科動物種に由来している、ナノボディ配列の免疫セット、免疫コレクション又は免疫ライブラリ、特にＶＨＨ配列の免疫セット、免疫コレクション又は免疫ライブラリであり得る。特定の一態様では、上記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
【０３０９】
上記の方法において、ナノボディ配列又はＶＨＨ配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（酵母等）上に提示してもよい。ナノボディ配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。国際公開第０３／０５４０１６号及びNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによる総説も参照する。
【０３１０】
別の態様において、ナノボディ配列を生成する方法は、
ａ）免疫グロブリン配列を発現するラクダ科動物種由来の細胞のコレクション又は試料を準備する工程と、
ｂ）（ｉ）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができる、及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞、（ｉｉ）重鎖抗体を発現する細胞に関して上記細胞のコレクション又は試料をスクリーニングする工程であって、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができる及び／又はこれに対して親和性を有する重鎖抗体を発現する細胞を少なくとも１つ提供するように、本質的に単一のスクリーニング工程として、又は２つの別々のスクリーニング工程として任意の好適な順番で下位工程（ｉ）及び（ｉｉ）を実施することができる、スクリーニングする工程と、
ｃ）（ｉ）上記重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列を上記細胞から単離する工程、又は（ｉｉ）上記重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列をコードする核酸配列を上記細胞から単離した後、上記ＶＨＨドメインを発現する工程のいずれかとを少なくとも含む。
【０３１１】
この態様による方法において、細胞のコレクション又は試料は例えば、Ｂ細胞のコレクション又は試料であり得る。また、この方法では、細胞の試料は、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネル、又はこれに基づく若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の部分、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ科動物に由来し得る。特定の一態様では、上記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
【０３１２】
上記の方法は、当業者にとって明らかなように、任意の好適な方法で行われ得る。例えば欧州特許第０５４２８１０号、国際公開第０５／１９８２４号、国際公開第０４／０５１２６８号及び国際公開第０４／１０６３７７号を参照されたい。工程ｂ）のスクリーニングは、ＦＡＣＳ等のフローサイトメトリ法を使用して行うのが好ましい。これに関しては、例えばLieby et al., Blood, Vol. 97, No. 12, 3820を参照する。特に、Ablynx N.V.による国際出願である国際公開第０６／０７９３７２号で記載のいわゆる「ナノクローン（商標）」法を参照する。
【０３１３】
別の態様において、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列を生成する方法は、
ａ）重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを準備する工程と、
ｂ）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列に関して、上記核酸配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程と、
ｃ）上記核酸配列を単離し、その後それぞれ上記重鎖抗体に存在するＶＨＨ配列を発現するか、又は上記ナノボディ配列を発現する、単離する工程とを少なくとも含み得る。
【０３１４】
このような方法では、重鎖抗体又はナノボディ配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリは例えば、重鎖抗体又はＶＨＨ配列のナイーブセット、ナイーブコレクション又はナイーブライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；ナノボディ配列の合成又は半合成のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリ；及び／又は親和性成熟を受けているナノボディ配列のセット、コレクション又はライブラリをコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリであり得る。
【０３１５】
この方法の好ましい一態様では、免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネル、又はこれに基づく若しくはこれに由来する好適な抗原決定基（例えばその抗原の部分、断片、領域、ドメイン、ループ又は他のエピトープ）を好適に免疫付与したラクダ科動物由来の重鎖抗体又はＶＨＨ配列をコードする核酸配列の免疫セット、免疫コレクション又は免疫ライブラリであり得る。特定の一態様では、上記抗原決定基は、細胞外の部分、領域、ドメイン、ループ又は他の細胞外エピトープ（複数可）であり得る。
【０３１６】
上記の方法において、ヌクレオチド配列のセット、コレクション又はライブラリは、スクリーニングを容易にするように、ファージ、ファージミド、リボソーム又は好適な微生物（例えば酵母）上に提示してもよい。免疫グロブリン配列をコードするヌクレオチド配列（のセット、コレクション又はライブラリ）を提示及びスクリーニングするのに好適な方法、技法及び宿主生物は、例えば本明細書中のさらなる開示に基づいて当業者にとって明らかである。国際公開第０３／０５４０１６号及びNature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）におけるHoogenboomによるレビューも参照する。
【０３１７】
当業者にとって明らかなように、本明細書中に記載の方法のスクリーニング工程を選択工程として実施することもできる。したがって、本明細書で使用する「スクリーニング」という用語は、選択、スクリーニング、又は選択法及び／又はスクリーニング法の任意の好適な組合せを含むことができる。また、配列のセット、コレクション又はライブラリを使用する場合、これは、１個、２個、３個又は約５個、１０個、５０個、１００個、５００個、１０００個、５０００個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個以上の配列等の任意の好適な数の配列を含有し得る。
【０３１８】
また、上記の免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリにおける配列の１つ又は複数又は全ては、コンピュータモデリング法又は生物静力学法又はデータマイニング法等の合理的又は半経験的なアプローチで入手又は規定され得る。
【０３１９】
さらに、このようなセット、コレクション又はライブラリは、自然に多様化した配列（例えば免疫ライブラリ））の多様なセットに由来する複数の配列を含む（compromise）、（例えば、指定の点突然変異又はランダム化した位置を有する）互いの変異体である１つ、２つ以上の配列、又は任意の他の多様な配列源（例えばHoogenboom et al, Nat Biotechnol 23: 1105, 2005及びBinz et al, Nat Biotechnol 2005, 23: 1247に記載）を含み得る。配列のこのようなセット、コレクション又はライブラリは、ファージ粒子、リボソーム、細菌、酵母細胞、哺乳動物細胞の表面上に提示され、これらの担体内で免疫グロブリン配列をコードするヌクレオチド配列に連結することができる。このことが、このようなセット、コレクション又はライブラリを、所望の本発明の免疫グロブリン配列を単離する選択法に従わせる。より一般的には、配列が好適な宿主又は宿主細胞上に提示される場合、初めに上記宿主又は宿主細胞から所望の配列をコードするヌクレオチド配列を単離した後、好適な宿主生物で上記ヌクレオチド配列を好適に発現することによって所望の配列を得ることも可能である（慣習になっている）。さらに、当業者にとって明らかなように、それ自体が既知の任意の好適な方法でこれを実施することができる。
【０３２０】
例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有するＶＨＨ配列又はナノボディ配列を得るためのさらに別の技法は、（すなわち免疫応答及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する重鎖抗体を生じるように）重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物に好適に免疫付与すること、上記ＶＨＨ配列又はナノボディ配列（をコードする核酸配列）を含有する上記トランスジェニック哺乳動物由来の好適な生体試料（例えば血液試料、血清試料又はＢ細胞の試料）を得ること、及びこれからそれ自体が既知の任意の好適な技法（本明細書で記載の方法又はハイブリドーマ法のいずれか等）を使用して、上記試料から例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えばこのために、国際公開第０２／０８５９４５号、国際公開第０４／０４９７９４号、国際公開第０６／００８５４８号及びJanssens et al., Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2006 Oct 10;103（41）:15130-5に記載されている重鎖抗体発現マウス、並びにさらなる方法及び技法を使用することができる。例えば、このような重鎖抗体発現マウスは、天然源由来の（単一）可変ドメイン（例えばヒト（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物（単一）可変ドメイン又はサメ（単一）可変ドメイン）及び例えば合成又は半合成の（単一）可変ドメイン等の任意の好適な（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
【０３２１】
本発明は、上記方法、又は代替的に上記の方法の１つと、さらに上記ＶＨＨ配列又はナノボディ配列のヌクレオチド配列又は免疫グロブリン配列を決定する工程と、好適な宿主細胞若しくは宿主生物における発現又は化学合成のようなそれ自体が既知の方法で上記ＶＨＨ配列又はナノボディ配列を発現又は合成する工程とを少なくとも含む方法によって得られるＶＨＨ配列又はナノボディ配列にも関する。
【０３２２】
本明細書で言及されるように、特に好ましい群の本発明のナノボディは、国際公開第０８／０２００７９号の６３頁にさらに記載されるように、及び国際公開第０８／０２００７９号の６３頁で言及される技法を用いて、天然ＶＨＨドメインの免疫グロブリン配列に対応するが、すなわち上記天然ＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）の免疫グロブリン配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、（例えば上記の）ヒト由来の通常の四本鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ヒト化」した免疫グロブリン配列を有するナノボディを含む。別の特に好ましい群の本発明のナノボディは、国際公開第０８／０２００７９号の６３頁にさらに記載されるように、及び国際公開第０８／０２００７９号の６３頁で言及される技法を用いて、天然ＶＨドメインの免疫グロブリン配列に対応するが、すなわち通常の四本鎖抗体由来の天然ＶＨドメインの免疫グロブリン配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ラクダ化」した免疫グロブリン配列を有するナノボディを含む。
【０３２３】
天然ＶＨ配列又は好ましくはＶＨＨ配列を発端として本発明のナノボディ及び／又はこれをコードする核酸を得るのに好適な他の方法及び技法は当業者から明らかであり、例えば国際公開第０８／００２７９号の６４頁で言及された技法を含み得る。そこで言及されるように、ナノボディは特に、フレームワーク配列のうちの１つ又は複数における１つ又は複数の「特徴的な残基（Hallmark residues）」（本明細書に記載）の存在を特徴とし得る。
【０３２４】
したがって、好ましいが、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは概して、最も広範な意味で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、（本明細書に規定の）荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましい）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
【０３２５】
したがって好ましいが非限定的な第１の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸又はシステインであり、カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましく、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３２６】
特に、ナノボディは概して、最も広範な意味で
ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲである）、及び／又は
ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
【０３２７】
したがって好ましいが非限定的な一態様によれば、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３２８】
特に本発明による例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに対するナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択され、
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３２９】
特に、好ましいが、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは概して、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列を含むポリペプチドと定義することができ、
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌからなる群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱからなる群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣからなる群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲからなる群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳからなる群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＱであるか、又は
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱからなる群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣからなる群から選択され、好ましくはＬ及びＲからなる群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＱであり、かつ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３０】
したがって、好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌからなる群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱからなる群から選択され、
ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣからなる群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲからなる群から選択され、
ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳからなる群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、かつ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３１】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され、
ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、好ましくはＷであり、
ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＱであり、かつ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３２】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱからなる群から選択され、
ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣからなる群から選択され、好ましくはＬ及びＲからなる群から選択され、
ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳからなる群から選択され、特にＲ及びＳからなる群から選択され、
ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬからなる群から選択され、好ましくはＱであり、かつ
ｄ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３３】
２つの特に好ましいが非限定的な本発明のナノボディ群は、上記のａ）、上記の（ａ−１）〜（ａ−４）、上記のｂ）、上記の（ｂ−１）〜（ｂ−４）、上記の（ｃ）、及び／又は上記の（ｃ−１）〜（ｃ−４）によるものであり、
ｉ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｉｉ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又は配列ＫＱＲＥ（又は記載されるようなＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱである。
【０３３４】
したがって、好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、かつ
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３５】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又は配列ＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱであり、かつ
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３３６】
カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基が、配列ＫＥＲＥ又は配列ＫＱＲＥを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基がＦであるのが最も好ましい。カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基が、配列ＧＬＥＷを形成する、本発明のナノボディにおいて、３７位のアミノ酸残基は、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦからなる群から選択され、Ｖであるのが最も好ましい。
【０３３７】
したがって、決してこれらには限定されないが、上記で言及された位置に存在するアミノ酸残基に基づき、概して本発明のナノボディを以下の３つの群に基づいて分類することができる：
ｉ）「ＧＬＥＷ群」：カバットナンバリングによる４４位〜４７位に免疫グロブリン配列ＧＬＥＷ、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＶを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。ＧＬＥＷ群は、以下の表Ｂ−２で言及されるもののような幾つかのＧＬＥＷ様配列も含む。より包括的にはこれらに限定されないが、ＧＬＥＷ群に属するナノボディは４４位がＧ及び／又は４７位がＷであり、４６位が通常Ｅであり、好ましくは４５位が荷電アミノ酸残基及びシステインではないナノボディとして定義することができる。
ｉｉ）「ＫＥＲＥ群」：カバットナンバリングによる４３位〜４６位に免疫グロブリン配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又は別のＫＥＲＥ様配列）、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有するナノボディ。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディは通常、３７位にＦ、及び４７位にＬ又はＦを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。より包括的にはこれらに限定されないが、ＫＥＲＥ群に属するナノボディは４４位がＫ、Ｑ又はＲ（通常Ｋ）であり、４５位が荷電アミノ酸残基又はシステインであり、４７位が本明細書でさらに規定のようなものであるナノボディとして定義することができる。
ｉｉｉ）「１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群」：１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有するナノボディ。これらのナノボディは、カバットナンバリングによる４４位〜４７位に免疫グロブリン配列ＧＬＥＷ、又はカバットナンバリングによる４３位〜４６位に免疫グロブリン配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥのいずれかを有することができ（後者は、（ＫＥＲＥ群に関して規定のように）３７位のＦ、及び４７位のＬ又はＦと組合せるのが最も好ましい）、カバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有することができ、Ｑを有するのが好ましい。
【０３３８】
また必要に応じて、ナノボディは、２つ以上のこれらの群に属し得る（すなわちこれらの特徴を有し得る）。例えば、１つの特に好ましいナノボディ群は、４４位〜４７位にＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列、１０３位にＰ、Ｒ又はＳ（特にＲ）、及び１０８位にＱ（Ｌへとヒト化してもよい）を有する。
【０３３９】
より一般的には、上記に言及される定義が、未変性（すなわち非ヒト化）ＶＨＨ配列の形態のナノボディを説明し、またこれに当てはまること、及びこれらのナノボディのヒト化変異体は、上記のもの以外のアミノ酸残基（すなわち本明細書中に規定の１つ又は複数のヒト化置換）を含有し得ることに留意されたい。例えばこれに限定されないが、ＧＬＥＷ群又は１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群の幾つかのヒト化ナノボディにおいて、１０８位のＱは、１０８Ｌにヒト化し得る。本明細書中に既に言及されたように、他のヒト化置換（及びその好適な組合せ）は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであろう。付加的に又は代替的に、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ又は複数の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって、他の潜在的に有用なヒト化置換を確認することができ、その後（本明細書中にさらに記載のように、それ自体が既知の任意の方法で）このようにして求めた、潜在的に有用なヒト化置換（又はその組合せ）の１つ又は複数を上記ＶＨＨ配列に導入することができ、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル、及び／又は他の所望の特性に関して、得られたヒト化ＶＨＨ配列を試験することができる。このようにして、当業者は、限定的な試行錯誤によって、本明細書中の開示に基づき他の好適なヒト化置換（又はその好適な組合せ）を求めることができる。また、上記に基づき、ナノボディ（のフレームワーク領域）を部分ヒト化又は完全ヒト化してもよい。
【０３４０】
したがって、好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＧＬＥＷ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３４１】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）ＫＥＲＥ群に属するナノボディであってもよく、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３４２】
したがって、好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、（本明細書に規定のように）１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群に属するナノボディであってもよく、その中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は本明細書で規定されるようなものであり、好ましくは本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであり、より好ましくは本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものである。
【０３４３】
また、より一般的には、上記で言及された１０８Ｑ、４３Ｅ／４４Ｒ及び１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ残基の他に、本発明のナノボディは、通常のＶＨドメインでＶＨ／ＶＬ界面（の一部）が形成される１つ又は複数の位置で、対応する天然ＶＨ配列における同じ位置（複数可）で自然発生するアミノ酸残基よりも強く荷電する、１つ又は複数のアミノ酸残基、特に（国際出願の国際公開第０８／０２００７９号の４８頁の表Ａ−２で言及される）１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含有することができる。このような置換としては、これらに限定されないが、以下の表Ｂ−２で言及されるＧＬＥＷ様配列、及び例えば４４位〜４７位のＫＬＥＷと共に１０８位にＱを有するナノボディを得るために、いわゆる「ミクロボディ」に関して国際出願の国際公開第００／２９００４号で説明される置換が挙げられる。これらの位置での他の可能性のある置換は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかである。本発明のナノボディの一態様において、８３位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ及びＷからなる群から選択され、Ｌであるのが好ましい。また、本発明のナノボディの一態様において、８３位のアミノ酸残基は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｔ及びＱからなる群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｋ若しくはＥ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。一態様では、８４位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＶからなる群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディに関しては）Ｐ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディに関しては）Ｒであるのが最も好ましい。さらに本発明のナノボディの一態様において、１０４位のアミノ酸残基は、Ｇ及びＤからなる群から選択され、Ｇであるのが最も好ましい。
【０３４４】
まとめると、ナノボディにおいて上記で言及される、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基は、本明細書で「特徴的な残基」とも称される。特徴的な残基及び最も密接に関連したヒトＶＨドメイン（ＶＨ３）の対応する位置のアミノ酸残基を表Ｂ−２に要約する。
【０３４５】
天然ＶＨＨドメインで生じるこれらの特徴的な残基の幾つかの特に好ましいが非限定的な組合せを表Ｂ−３で言及する。比較のために、ＤＰ−４７と呼ばれるヒトＶＨ３の対応するアミノ酸残基をイタリック体で示している。
【０３４６】
表Ｂ−２：ナノボディにおける特徴的な残基
【表４】
0006034435.tif 000034
脚注：
（１）排他的ではないが、具体的には、４３位〜４６位のＫＥＲＥ又はＫＱＲＥとの組合せで。
（２）通常４４位〜４７位のＧＬＥＷとして。
（３）通常４３位〜４６位のＫＥＲＥ又はＫＱＲＥとして、例えば４３位〜４７位のＫＥＲＥＬ、ＫＥＲＥＦ、ＫＱＲＥＬ、ＫＱＲＥＦ、ＫＥＲＥＧ、ＫＱＲＥＷ又はＫＱＲＥＧとして。代替的に、ＴＥＲＥ（例えばＴＥＲＥＬ）、ＴＱＲＥ（例えばＴＱＲＥＬ）、ＫＥＣＥ（例えばＫＥＣＥＬ又はＫＥＣＥＲ）、ＫＱＣＥ（例えばＫＱＣＥＬ）、ＲＥＲＥ（例えばＲＥＲＥＧ）、ＲＱＲＥ（例えばＲＱＲＥＬ、ＲＱＲＥＦ又はＲＱＲＥＷ）、ＱＥＲＥ（例えばＱＥＲＥＧ）、ＱＱＲＥ（例えばＱＱＲＥＷ、ＱＱＲＥＬ又はＱＱＲＥＦ）、ＫＧＲＥ（例えばＫＧＲＥＧ）、ＫＤＲＥ（例えばＫＤＲＥＶ）等の配列も可能である。幾つかの他の可能であるがあまり好ましくない配列としては例えば、ＤＥＣＫＬ及びＮＶＣＥＬが挙げられる。
（４）４４位〜４７位にＧＬＥＷ、及び４３位〜４６位にＫＥＲＥ又はＫＱＲＥの両方を有する。
（５）多くの場合、天然ＶＨＨドメインの８３位、８４位のＫＰ又はＥＰとして。
（６）排他的ではないが、具体的には４４位〜４７位のＧＬＥＷとの組合せで。
（７）４４位〜４７位がＧＬＥＷである場合、また１０３位にＷを含有する（非ヒト化）ＶＨＨ配列における１０８位は常にＱであることが条件である。
（８）ＧＬＥＷ群は、４４位〜４７位にＧＬＥＷ様配列（例えばＧＶＥＷ、ＥＰＥＷ、ＧＬＥＲ、ＤＱＥＷ、ＤＬＥＷ、ＧＩＥＷ、ＥＬＥＷ、ＧＰＥＷ、ＥＷＬＰ、ＧＰＥＲ、ＧＬＥＲ及びＥＬＥＷ）も含有する。
【０３４７】
表Ｂ−３：天然ナノボディにおける特徴的な残基の幾つかの好ましいが非限定的な組合せ
これらの組合せのヒト化に関しては、明細書を参照する。
【表５】
0006034435.tif 000035
【０３４８】
ナノボディにおいて、特徴的な残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの（カバットナンバリングによる）対応する位置で自然発生する任意のアミノ酸残基であり得る。
【０３４９】
このようなアミノ酸残基は当業者にとって明らかである。表Ｂ−４〜表Ｂ−７は、天然ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の（カバットナンバリングによる）それぞれの位置に存在し得る幾つかの非限定的な残基を表す。それぞれの位置に関しては、天然ＶＨＨドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生する（ナノボディにおける上記位置に最も好ましいアミノ酸残基である）アミノ酸残基を太字で示し、それぞれの位置で好ましい他のアミノ酸残基を下線処理する（備考：天然ＶＨＨドメインの２６位〜３０位で見られるアミノ酸残基の数字は、これらの位置の残基が既にＣＤＲ１部分を形成しているというChothia（同上）によるナンバリングの基礎をなす仮説を支持する）。
【０３５０】
表Ｂ−４〜表Ｂ−７では、ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置に存在し得る非限定的な残基の幾つかも表している。また、それぞれの位置に関しては、天然ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生するアミノ酸残基を太字で示し、他の好ましいアミノ酸残基を下線処理する。
【０３５１】
参考のみのために、表Ｂ−４〜表Ｂ−７は、７７３２個のＶＨＨ配列の代表的な試料におけるそれぞれのアミノ酸位置でのＶＨＨエントロピー（「ＶＨＨ  Ｅｎｔ．」）及びＶＨＨ変動性（「ＶＨＨ  Ｖａｒ．」）に関するデータ（Utrecht UniversityのDavid Lutje Hulsing及びProf. Theo Verripsによって無償（kindly）提供されたａ．ｏ．データを含む）も含有する。ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性の値は、解析する７７３２個のＶＨＨ配列間のアミノ酸残基の変動性及び保存度に対する評価基準を与え、低い値（すなわち１未満、例えば０．５未満）は、アミノ酸残基が、ＶＨＨ配列間で強く保存される（すなわちほとんど変動性がない）ことを示す。例えば、９位のＧ及び３６位のＷがそれぞれ、０．０１及び０のＶＨＨエントロピー値を有し、これは（解析する７７３２個の配列全てにおいて３６位がＷである場合）これらの残基が強く保存され、ほとんど変動しないことを示す一方で、ＣＤＲ部分を形成する残基に関しては概して、１．５以上の値が見られる（データ図示せず）。以下で表すデータは、２７位〜３０位のアミノ酸残基、並びにおそらく９３位及び９４位のアミノ酸残基でさえも既にＣＤＲ部分を形成しているという仮説を支持することに留意されたい（しかしながら、本発明は任意の特定の仮説又は説明に限定されず、上記のように、本明細書ではカバットによるナンバリングを使用する）。配列エントロピー、配列変動性及びこれを決定する方法の一般的説明に関しては、Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52:544-552（2003）を参照されたい。
【０３５２】
表Ｂ−４：ＦＲ１におけるアミノ酸残基の非限定的な例（脚注に関しては、表Ｂ−２の脚注を参照する）
【表６】
0006034435.tif 000036
0006034435.tif 000037
【０３５３】
表Ｂ−５：ＦＲ２におけるアミノ酸残基の非限定的な例（脚注に関しては、表Ｂ−２の脚注を参照する）
【表７】
0006034435.tif 000038
【０３５４】
表Ｂ−６：ＦＲ３におけるアミノ酸残基の非限定的な例（脚注に関しては、表Ｂ−２の脚注を参照する）
【表８】
0006034435.tif 000039
0006034435.tif 000040
【０３５５】
表Ｂ−７：ＦＲ４におけるアミノ酸残基の非限定的な例（脚注に関しては、表Ｂ−２の脚注を参照する）
【表９】
0006034435.tif 000041
【０３５６】
このように、好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有する免疫グロブリン配列として規定することができ、ここで
ｉ）カバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択され、
ｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３５７】
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
【０３５８】
特に、本発明のナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有する免疫グロブリン配列である可能性があり、ここで
ｉ）カバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位の（好ましくは）アミノ酸残基の１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択され（ＶＨＨ配列が特徴的な残基を１つ又は複数含有すること、並びに部分ヒト化ナノボディが通常及び好ましくは［依然として］特徴的な残基を１つ又は複数含有すること［しかしながら、本発明に応じて好適であれば、１つ又は複数の他のアミノ酸残基ではなく、全ての特徴的な残基がヒト化した部分ヒト化ナノボディを提供することも本発明の範囲内である］、並びに本発明に応じて好適であれば、完全ヒト化ナノボディにおいて特徴的な残基の位置の全てのアミノ酸残基がヒトＶＨ３配列で発生するアミノ酸残基であることが理解される。本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかなように、このようなＶＨＨ配列、少なくとも１つの特徴的な残基を有するこのような部分ヒト化ナノボディ、特徴的な残基を有しないこのような部分ヒト化ナノボディ及びこのような完全ヒト化ナノボディは全て、本発明の態様を形成する）、
ｉｉ）上記免疫グロブリン配列が、配列番号１〜配列番号２２の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（アミノ酸同一性の程度を求めるために、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基（配列番号１〜配列番号２２の配列においてＸで示す）は無視する）、
ｉｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３５９】
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
【０３６０】
表Ｂ−８：ＫＥＲＥ、ＧＬＥＷ及びＰ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的な免疫グロブリン配列
ＣＤＲはＸＸＸＸで示す
【表１０】
0006034435.tif 000042
0006034435.tif 000043
0006034435.tif 000044
0006034435.tif 000045
【０３６１】
特に、ＫＥＲＥ群の本発明のナノボディは、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
を有する免疫グロブリン配列である可能性があり、ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸（本明細書中に規定）又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基は好ましくはＥであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３６２】
表Ｂ−９：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ１配列
【表１１】
0006034435.tif 000046
【０３６３】
ｉｉｉ）ＦＲ２は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３６４】
表Ｂ−１０：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ２配列
【表１２】
0006034435.tif 000047
【０３６５】
ｉｖ）ＦＲ３は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３６６】
表Ｂ−１１：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ３配列
【表１３】
0006034435.tif 000048
【０３６７】
ｖ）ＦＲ４は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３６８】
表Ｂ−１２：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ４配列
【表１４】
0006034435.tif 000049
【０３６９】
ｖｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３７０】
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
【０３７１】
また、上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、さらに本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
【０３７２】
フレームワーク１に関して、上記で概説の免疫グロブリン配列がヌクレオチド配列の発現によって生成する場合、上記核酸を生成するのに使用されているプライマー（複数可）によって、始めの４つの免疫グロブリン配列（すなわちカバットナンバリングによる１位〜４位のアミノ酸残基）が決まり得ることが多いことは、当業者にとって明らかである。このように、アミノ酸同一性の程度を求めるために、始めの４つのアミノ酸残基を無視するのが好ましい。
【０３７３】
また、フレームワーク１に関して、カバットナンバリングによる２７位〜３０位のアミノ酸位置は（ＣＤＲではなく）フレームワーク領域の一部であると考えられるが、１０００個を超えるＶＨＨ配列のデータベースの解析によって、２７位〜３０位のアミノ酸が、１位〜２６位のアミノ酸に対する変動性よりも非常に大きい変動性（ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性に関して表される、表Ｂ−４〜表Ｂ−７を参照されたい）を有することが見出されている。このため、アミノ酸同一性の程度を求めるために、２７位〜３０位のアミノ酸残基も無視するのが好ましい。
【０３７４】
これを考慮して、ＫＥＲＥ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸（本明細書中に規定）又はシステイン残基であり、４４位のアミノ酸残基は好ましくはＥであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３７５】
表Ｂ−１３：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ１配列（５位〜２６位のアミノ酸残基）
【表１５】
0006034435.tif 000050
【０３７６】
ｉｉｉ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、ＫＥＲＥ群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３７７】
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、この場合も本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
【０３７８】
ＧＬＥＷ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）好ましくは、ＧＬＥＷ群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３７９】
表Ｂ−１４：ＧＬＥＷ群のナノボディの代表的なＦＷ１配列
【表１６】
0006034435.tif 000051
【０３８０】
ｉｉｉ）ＦＲ２は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３８１】
表Ｂ−１５：ＧＬＥＷ群のナノボディの代表的なＦＷ２配列
【表１７】
0006034435.tif 000052
【０３８２】
ｉｖ）ＦＲ３は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３８３】
表Ｂ−１６：ＧＬＥＷ群のナノボディの代表的なＦＷ３配列
【表１８】
0006034435.tif 000053
【０３８４】
ｖ）ＦＲ４は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３８５】
表Ｂ−１７：ＧＬＥＷ群のナノボディの代表的なＦＷ４配列
【表１９】
0006034435.tif 000054
【０３８６】
ｖｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３８７】
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
【０３８８】
この場合もフレームワーク１に関して、アミノ酸同一性の程度を求めるために、１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基を無視するのが好ましいことは当業者にとって明らかである。
【０３８９】
これを考慮して、ＧＬＥＷ群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）好ましくは、ＧＬＥＷ群のナノボディが非ヒト化ナノボディである場合、１０８位のアミノ酸残基はＱであり、
ｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３９０】
表Ｂ−１８：ＫＥＲＥ群のナノボディの代表的なＦＷ１配列（５位〜２６位のアミノ酸残基）
【表２０】
0006034435.tif 000055
【０３９１】
ｉｉｉ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、ＧＬＥＷ群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０３９２】
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、この場合も本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
【０３９３】
Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＷではなく、
ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ又はＳであり、より好ましくはＲであり、
ｉｉｉ）ＦＲ１は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３９４】
表Ｂ−１９：Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的なＦＷ１配列
【表２１】
0006034435.tif 000056
【０３９５】
ｉｖ）ＦＲ２は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３９６】
表Ｂ−２０：Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的なＦＷ２配列
【表２２】
0006034435.tif 000057
【０３９７】
ｖ）ＦＲ３は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０３９８】
表Ｂ−２１：Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的なＦＷ３配列
【表２３】
0006034435.tif 000058
【０３９９】
ｖｉ）ＦＲ４は、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０４００】
表Ｂ−２２：Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的なＦＷ４配列
【表２４】
0006034435.tif 000059
【０４０１】
ｖｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０４０２】
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
【０４０３】
フレームワーク１に関して、アミノ酸同一性の程度を求めるために、１位〜４位及び２７位〜３０位のアミノ酸残基を無視するのが好ましいことはここでもまた当業者にとって明らかである。
【０４０４】
これを考慮して、Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディは、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から構成される免疫グロブリン配列であり得る；ここで
ｉ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＷではなく、
ｉｉ）好ましくは、カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ又はＳであり、より好ましくはＲであり、
ｉｉｉ）ＦＲ１は、カバットナンバリングによる５位〜２６位で、以下の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列であり、
【０４０５】
表Ｂ−２３：Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディの代表的なＦＷ１配列（５位〜２６位のアミノ酸残基）
【表２５】
0006034435.tif 000060
【０４０６】
ｉｖ）ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４は、Ｐ、Ｒ、Ｓ  １０３群のナノボディのＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４に関して本明細書中に言及されるようなものであり、
ｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、本明細書中で規定されるようなものであり、本明細書中の好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるものが好ましく、本明細書中のより好ましい態様の１つに従って規定されるようなものであるのがより好ましい。
【０４０７】
上記ナノボディは例えば、ＶＨＨ配列であっても、又はヒト化ナノボディであってもよい。上記ナノボディ配列がＶＨＨ配列である場合、これらは、本明細書中にさらに記載のように、好適にヒト化されていてもよい。ナノボディが部分ヒト化ナノボディである場合、これらは任意で、この場合も本明細書中に記載のようにさらに好適にヒト化してもよい。
【０４０８】
上記ナノボディにおいて、１つ又は複数のさらなる特徴的な残基は、（例えばこれらがＶＨＨ配列又は部分ヒト化ナノボディである場合）本明細書中に記載のようなものが好ましい。
【０４０９】
別の好ましいが非限定的な態様において本発明は、上記のようなナノボディであって、ＣＤＲ配列が、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列との少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（９５％以上のアミノ酸同一性等）、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、ナノボディに関する。このアミノ酸同一性の程度は例えば、上記ナノボディと、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の配列の１つ又は複数との間のアミノ酸同一性の程度を（本明細書に記載の方法で）求めることによって決定することができる（フレームワーク領域を形成するアミノ酸残基は無視する）。このようなナノボディは、本明細書にさらに記載されるようなものであり得る。
【０４１０】
本明細書で既に言及されているように、別の好ましいが非限定的な本発明の態様は、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）からなる群から、又は配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書で規定）を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択される免疫グロブリン配列を有するナノボディに関する。
【０４１１】
また上記のナノボディにおいて、
ｉ）任意のアミノ酸置換（本明細書で規定のようにヒト化置換でない場合）は、（本明細書で規定されるように）対応する配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列と比較して、保存的なアミノ酸置換であるのが好ましく；及び／又は
ｉｉ）その免疫グロブリン配列は、対応する配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列と比較して、アミノ酸置換だけ、又はそうでなければ好ましくはわずか５つ、好ましくはわずか３つ、より好ましくは１つ若しくは２つだけのアミノ酸欠失若しくは挿入を含有するのが好ましく；及び／又は
ｉｉｉ）ＣＤＲは、親和性成熟によって、例えば対応する配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）の免疫グロブリン配列のＣＤＲから誘導されるＣＤＲであり得る。
【０４１２】
好ましくは、本発明のナノボディにおけるＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、本発明のナノボディ（及びこれを含む本発明のポリペプチド）が、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、より好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、より好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに結合するようなものであり、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）のｋｏｎ速度で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに結合するようなものであり、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日のほぼ非可逆的な複合体を与える）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）のｋｏｆｆ速度で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに結合するようなものである。
【０４１３】
好ましくは、本発明のナノボディに存在するＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、本発明のナノボディが、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合するようなものである。
【０４１４】
本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有することが条件である。より具体的には、本発明の非限定的な一態様によれば、ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のヒトＶＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特にＤＰ−４７の対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有することが条件である。通常、ナノボディは、ＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つにおいて、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）において、天然のＶＨドメインとの少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
【０４１５】
また、本発明のヒト化ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、フレームワーク領域の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有することが条件である。より具体的には、本発明の非限定的な一態様によれば、ヒト化ナノボディは本明細書で規定されるようなものであり得るが、天然のＶＨＨドメインの対応するフレームワーク領域と比較して、特徴的な残基（例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）の少なくとも１つに少なくとも「１つのアミノ酸差異」（本明細書で規定される）を有することが条件である。通常、ヒト化ナノボディは、ＦＲ２及び／又はＦＲ４の少なくとも１つにおいて、特にＦＲ２及び／又はＦＲ４の特徴的な残基の少なくとも１つ（同様に、例えば１０８位、１０３位及び／又は４５位のもの）において、天然のＶＨＨドメインとの少なくとも１つのこのようなアミノ酸差異を有する。
【０４１６】
本明細書における開示より明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの天然又は合成の類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、ホモログ及びオーソログ（本明細書中でまとめて「類似体」と称される）、特に配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディの類似体の使用も本発明の範囲内である。したがって、本発明の一態様によれば、「本発明のナノボディ」という用語は最も広範な意味ではこのような類似体も包含する。
【０４１７】
概して、このような類似体では、本明細書で規定されるような本発明のナノボディと比較して、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。このような置換、挿入又は欠失はフレームワーク領域の１つ又は複数、及び／又はＣＤＲの１つ又は複数において起こってもよい。このような置換、挿入又は欠失がフレームワーク領域の１つ又は複数において起こる場合、特徴的な残基の１つ又は複数、及び／又はフレームワーク残基中の他の位置の１つ又は複数において起こってもよいが、特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は（これらが本明細書中で説明されるような適切なヒト化置換でない限り）一般にあまり好適ではない。
【０４１８】
非限定的な例によると、置換は例えば保存的置換（本明細書中で説明される）であってもよく、及び／又はアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置で自然発生する別のアミノ酸残基で置き換えられていてもよいが（このような置換の幾つかの非限定的な例については表Ｂ−４〜表Ｂ−７を参照されたい）、本発明は概してこれに限定されない。したがって、本発明のナノボディの特性を改善するか、又は少なくとも本発明のナノボディの所望の特性又は所望の特性のバランス若しくは組合せを過度に（すなわち、ナノボディがもはやその使用目的に適さなくなる程度まで）損なわない任意の１つ又は複数の置換、欠失若しくは挿入、又はその任意の組合せが本発明の範囲内に含まれる。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能な置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切な置換、欠失若しくは挿入、又はその適切な組合せを決定及び選択することが可能である。
【０４１９】
例えば当業者の能力の範囲内で、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、このような欠失及び／又は置換を、翻訳後修飾される１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去するように設計してもよい。代替的には、置換又は挿入を官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入して、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように設計してもよい。
【０４２０】
上記の表Ｂ−４〜表Ｂ−７に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は最も広範な意味ではこれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
【０４２１】
類似体は好ましくは、本発明のナノボディに関して本明細書で規定されるようなものである親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができるようなものである。
【０４２２】
類似体は好ましくは、本明細書中で説明されるようなナノボディの有利な特性を保持するものでもある。
【０４２３】
また、好適な一態様によれば、類似体は、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディの１つとの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％（少なくとも９５％等）又は９９％以上の程度の配列同一性を有し、及び／又は好ましくは多くとも２０個、好ましくは多くとも１０個、さらにより好ましくは多くとも５個、例えば４個、３個、２個又はただ１個のアミノ酸差異（本明細書で規定される）を有する。
【０４２４】
また、類似体のフレームワーク配列及びＣＤＲは好ましくは、本明細書で規定される好適な態様に従うものである。より一般には、本明細書中で説明されるように、類似体は（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ及び４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有する。
【０４２５】
本発明のナノボディの１つの好適な群の類似体は、ヒト化された（すなわち、本発明の天然のナノボディの配列と比較して）ナノボディを含む。本明細書中で引用される背景技術で述べられたように、このようなヒト化は一般に、ヒトＶＨドメイン、例えばヒトＶＨ３ドメインでの同じ位置に起こるアミノ酸残基での、天然のＶＨＨの配列における１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含む。可能なヒト化置換又はヒト化置換の組合せの例は、例えば本明細書中の表から、本明細書中で引用される背景技術で述べられた可能なヒト化置換から、及び／又はナノボディの配列と天然のヒトＶＨドメインの配列との比較から当業者に明らかである。
【０４２６】
ヒト化置換は、得られるヒト化ナノボディが、本明細書で規定されるようなナノボディの有利な特性を依然として保持するように、より好ましくは類似体に関して前述の段落に説明されるようなものであるように選択されるべきである。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なヒト化置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディの特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切なヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
【０４２７】
概して、ヒト化の結果として、本発明のナノボディは、本明細書中で説明されるような本発明のナノボディの有利な特性を依然として保持しながら、より「ヒト様」となり得る。結果として、このようなヒト化ナノボディは幾つかの利点、例えば対応する天然のＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性を有し得る。同様に、当業者は、本明細書における開示に基づいて、また任意に限られた日常実験の後、一方ではヒト化置換によりもたらされる有利な特性と、他方では天然のＶＨＨドメインの有利な特性との間の所望の又は適切なバランスを最適化又は達成するヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを選択することが可能である。
【０４２８】
本発明のナノボディは任意のフレームワーク残基（複数可）で、例えば１つ又は複数の特徴的な残基（本明細書で規定される）で又は１つ又は複数の他のフレームワーク残基（すなわち、非特徴的な残基）で又はこれらの任意の適切な組合せで適切にヒト化され得る。「Ｐ、Ｒ、Ｓ−１０３群」又は「ＫＥＲＥ群」のナノボディに関する１つの好適なヒト化置換は、Ｑ１０８からＬ１０８への置換である。「ＧＬＥＷ群」のナノボディもまた、他の特徴的な残基の少なくとも１つがラクダ化（camelid（camelizing））置換（本明細書で規定される）を含有するという条件で、Ｑ１０８からＬ１０８への置換によりヒト化され得る。例えば、上述したように、１つの特に好適な群のヒト化ナノボディは、ＧＬＥＷ又はＧＬＥＷ様配列を４４位〜４７位に、Ｐ、Ｒ又はＳ（特にＲ）を１０３位に、Ｌを１０８位に有する。
【０４２９】
ヒト化及び他の類似体、並びにこれをコードする核酸配列は、例えば国際公開第０８／０２００７９号の１０３頁及び１０４頁で言及される技法のうちの１つ又は複数を用いて、それ自体が既知の任意の方法で準備することができる。
【０４３０】
ここで言及されるように、本発明のナノボディ（その類似体を含む）を、例えばヒトＶＨ３配列、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のヒトＶＨ配列（すなわち、免疫グロブリン配列又は対応するヌクレオチド配列）から、すなわち、本発明のナノボディの配列を提供するために及び／又はこのようにして得られる配列にナノボディの有利な特性を付与するために、１つ又は複数のラクダ化置換を導入する（すなわち、上記ヒトＶＨドメインの免疫グロブリン配列中の１つ又は複数のアミノ酸残基を、ＶＨＨドメインの対応する位置で生じるアミノ酸残基に変化させる）ことにより、設計及び／又は準備することが可能であることも、当業者には明らかである。同様に、これは一般に、開始点としてヒトＶＨドメインに対する免疫グロブリン配列及び／又はヌクレオチド配列を使用し、前の段落で言及される多様な方法及び技法を用いて実行することができる。
【０４３１】
幾つかの好ましいが非限定的なラクダ化置換は、表Ｂ−４〜表Ｂ−７から導くことができる。特徴的な残基の１つ又は複数でのラクダ化置換は一般に、所望の特性に他のアミノ酸位置の１つ又は複数での置換よりも大きな影響を与えるが、その両方及び任意の適切な組合せが本発明の範囲内に含まれることも明らかである。例えば、既に少なくとも幾つかの所望の特性を付与している１つ又は複数のラクダ化置換を導入すること、及び次に上記特性をさらに改善するか、及び／又はさらなる有利な特性を付与するさらなるラクダ化置換を導入することが可能である。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なラクダ化置換を導入すること、及びナノボディの有利な特性が得られたか又は改善された（すなわち、元のＶＨドメインと比較して）か否かを求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切なラクダ化置換又は適切なラクダ化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
【０４３２】
しかしながら、一般にこのようなラクダ化置換は好ましくは、得られる免疫グロブリン配列が少なくとも（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基及びまた好ましくは４４位にＥ、より好ましくは４４位にＥ及び４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳ、並びに任意に１つ又は複数のさらなるラクダ化置換を含有するようなものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、本発明のナノボディ及び／又はその類似体（本明細書で規定される）、例えばヒト化類似体及び／又は好ましくは前述の段落に規定されるようなものである類似体をもたらすようなものである。
【０４３３】
ナノボディは自然状態で稀であるが、ＶＨドメインフォールドに構造的に適合する置換の組込みによりＶＨドメインから得ることもできる。例えばこれらに限定されないが、これらの置換は以下のうちの１つ又は複数を含み得る：３５位のＧｌｙ、３７位のＳｅｒ、Ｖａｌ又はＴｈｒ、３９位のＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕ、４５位のＧｌｕ又はＨｉｓ、４７位のＴｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ又はＧｌｕ、５０位のＳ又はＲ（Barthelemy et al. J Biol Chem. 2008 Feb 8;283（6）:3639-54. Epub 2007 Nov 28）。
【０４３４】
本明細書における開示から同様に明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディの部分若しくは断片、又は２つ以上の部分若しくは断片の組合せ、特に配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディの部分又は断片の使用もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の一態様によれば、「本発明のナノボディ」という用語は最も広範な意味ではこのような部分又は断片も包含する。
【０４３５】
概して、本発明のナノボディ（その類似体を含む）のこのような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディ（又はその類似体）の免疫グロブリン配列と比較して、Ｎ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、１つ又は複数の連続内部アミノ酸残基、又はその任意の組合せが欠失しているか、及び／又は除去された免疫グロブリン配列を有する。
【０４３６】
部分又は断片は好ましくは、本発明のナノボディに対して、本明細書で規定されるようなものである親和性（本明細書中でさらに記載されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができるようなものである。
【０４３７】
任意の部分又は断片は好ましくは、対応する本発明の全長ナノボディの免疫グロブリン配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むようなものである。
【０４３８】
また、任意の部分又は断片は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の少なくとも１つ又は少なくともその一部（特に少なくともＣＤＲ３又は少なくともその一部）を含むようなものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び少なくとも１つの他のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２）又は少なくともその一部を含むようなものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは同様に適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び残り２つのＣＤＲの少なくとも一部を含むようなものである。
【０４３９】
別の特に好ましいが非限定的な態様によれば、このような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディの少なくともＣＤＲ３、例えばＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む（すなわち、例えば国際出願の国際公開第０３／０５０５３１号（Lasters et al.）に説明される）。
【０４４０】
上記で既に述べたように、２つ以上のこのような部分又は断片（すなわち、同一の又は異なる本発明のナノボディに由来する）を組み合わせる、すなわち、本発明のナノボディの類似体（本明細書で規定される）を提供する及び／又はさらなる部分又は断片（本明細書で規定される）を提供することも可能である。例えば、本発明のナノボディの１つ又は複数の部分又は断片を、ヒトＶＨドメインの１つ又は複数の部分又は断片と組み合わせることもまた可能である。
【０４４１】
好適な一態様によれば、部分又は断片は、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３、又は配列番号７７８（表Ａ−１を参照されたい）のナノボディの１つとの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％（少なくとも９０％等）、９５％又は９９％以上の程度の配列同一性を有する。
【０４４２】
部分及び断片、並びにこれをコードする核酸配列は、任意のそれ自体が既知の方法で準備して任意に組み合わせることができる。例えば、このような部分又は断片は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸中に終止コドンを挿入すること、及び次にこのようにして得られる核酸をそれ自体が既知の方法（例えば本明細書中で説明される）で発現させることで得ることができる。代替的には、このような部分又は断片をコードする核酸は、完全長の本発明のナノボディをコードする核酸を適切に制限すること、又はこのような核酸をそれ自体が既知の方法で合成することにより得ることができる。部分又は断片はまた、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いて準備してもよい。
【０４４３】
本発明は最も広範な意味では本発明のナノボディの誘導体も含む。このような誘導体は概して、本発明のナノボディ及び／又は本発明のナノボディを形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾、特に化学的及び／又は生物学的（例えば酵素的）修飾により得ることができる。
【０４４４】
このような修飾の例、並びにこのような形（すなわち、タンパク質骨格、又は好ましくは側鎖のいずれか）で修飾することができるナノボディ配列内のアミノ酸残基の例、このような修飾の導入のために使用することができる方法及び技法、並びにこのような修飾の潜在的使用及び利点は当業者に明らかである。
【０４４５】
例えば、このような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能性を本発明のナノボディに付与する１つ又は複数の官能基、残基又は部分を本発明のナノボディ中に又はナノボディ上に（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基の例は当業者に明らかである。
【０４４６】
例えば、このような修飾は、本発明のナノボディの半減期、溶解性及び／又は吸収性を増大する、本発明のナノボディの免疫原性及び／又は毒性を低減する、本発明のナノボディの任意の望ましくない副作用を排除若しくは減衰する、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドに他の有益な特性を付与するか、及び／又は本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドの不要な特性を低減する、又は上記の２つ以上の任意の組合せである１つ又は複数の官能基を（例えば共有結合によるか、又は任意の他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基及びこれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、一般に、上記で引用される包括的な背景技術で述べた全ての官能基及び技法、並びに医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（例えばＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体）の修飾に関するそれ自体が既知の官能基及び技法を含み得る。これに関しては例えばRemington'sPharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA （1980）を参照する。同様に当業者に明らかなように、このような官能基は、例えば本発明のナノボディに直接（例えば共有結合的に）、又は任意に適切なリンカー若しくはスペーサーを介して結合し得る。
【０４４７】
半減期を増大するか、及び／又は医薬用タンパク質の免疫原性を低減するために最も広く使用される技法の１つは、適切な薬理学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）すなわちｍＰＥＧ）の結合を含む。概して、任意の適切な形のペグ化、例えば当該技術分野で抗体及び抗体断片（例えば、限定されるものではないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ）に対して使用されるペグ化を使用することができる。例えばChapman, Nat. Biotechnol.,54, 531-545 （2002）、Veronese andHarris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 （2003）、Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, （2003）及び国際公開第０４／０６０９６５号を参照する。タンパク質のペグ化に関する多様な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAより市販されている。
【０４４８】
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化を使用する（例えばYang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 （2003）を参照されたい）。例えば、そのために、本発明のナノボディにおいて自然発生するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよく、本発明のナノボディを、ＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入するように修飾してもよく、又はＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を含む免疫グロブリン配列を、本発明のナノボディのＮ末端及び／又はＣ末端と融合してもよい（全て、それ自体が当業者に既知であるタンパク質工学の技法を使用する）。
【０４４９】
好ましくは、ＰＥＧは、本発明のナノボディ及びタンパク質に対して５０００を超える（例えば１００００を超える）かつ２０００００未満（例えば１０００００未満）の分子量、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量で使用する。
【０４５０】
さらに、通常あまり好ましくない修飾は、一般的に翻訳時及び／又は翻訳後の修飾の一部として、本発明のナノボディ又はポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応
じてＮ結合型又はＯ結合型のグリコシル化を含む。
【０４５１】
さらに別の修飾は、標識したナノボディの用途に応じて、１つ又は複数の検出可能な標識、又は他のシグナル生成基若しくはシグナル生成部分の導入を含んでいてもよい。これらを結合、使用及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者にとって明らかであり、例としては、蛍光標識、リン光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性同位体、金属、金属キレート、金属カチオン、発色団及び酵素、例えば国際公開第０８／０２００７９号の１０９頁で言及されるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な標識は当業者にとって明らかであり、例としては、ＮＭＲ分光法又はＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が挙げられる。
【０４５２】
本発明のこのような標識したナノボディ及びポリペプチドは、例えば、特定の標識の選択に応じて、（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等のそれ自体が既知のイムノアッセイを含む）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｓｉｔｕアッセイに、並びにｉｎ  ｖｉｖｏ診断及びイメージングの目的で使用され得る。
【０４５３】
当業者にとって明らかであるように、別の修飾は、例えば、上記の金属又は金属カチオンの１つをキレート化するキレート基（chelating group）の導入を含んでいてもよい。例えば好適なキレート基としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５４】
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基は、本発明のナノボディを別のタンパク質、ポリペプチド、又は結合対の残り半分と結合する化合物に連結させるのに（すなわち、結合対の形成を介して）使用され得る。例えば、本発明のナノボディは、ビオチンと結合し、アビジン又はストレプトアビジンと結合した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物又は担体に連結し得る。例えば、このような結合ナノボディは、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合する診断系のレポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば、本発明のナノボディを、医薬目的に好適な担体を含む担体に結合させるのにも使用することができる。非限定的な一例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 （2000）によって記載のリポソーム製剤である。このような結合対はまた、本発明のナノボディと治療に有効な作用物質とを連結させるのに使用することができる。
【０４５５】
用途によっては、特に、（例えば、癌の治療において）本発明のナノボディが指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を低減するか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディは、毒素又は毒素残基若しくは毒素部分にも連結し得る。本発明のナノボディに連結して、例えば細胞毒性化合物をもたらし得る毒素部分、化合物又は残基の例は当業者にとって明らかであり、例えば、上記の従来技術に及び／又は本明細書中のさらなる説明に見ることができる。一例はいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である（国際公開第０３／０５５５２７号に記載）。
【０４５６】
他の可能な化学修飾及び酵素修飾は当業者にとって明らかであろう。このような修飾を、（例えば、機能−活性関係を研究するために）調査目的で導入してもよい。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 （1997）を参照する。
【０４５７】
好ましくは、この誘導体は、本発明のナノボディに関して本明細書で規定されるようなものである親和性（本明細書中でさらに説明されるように、（実際又は見掛けの）ＫＤ値、（実際又は見掛けの）ＫＡ値、ｋｏｎ速度及び／又はｋｏｆｆ速度として、又は代替的にはＩＣ５０値として適切に測定されるか、及び／又は表される）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができるようなものである。
【０４５８】
上述のように、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のナノボディから本質的になるか又はこれを含む、タンパク質又はポリペプチドに関する。「から本質的になる」とは、本発明のポリペプチドの免疫グロブリン配列が、本発明のナノボディの免疫グロブリン配列と厳密に同じであるか、又は、１個〜２０個のアミノ酸残基、例えば、１個〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは１個〜６個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基）等の限定数のアミノ酸残基をナノボディの免疫グロブリン配列のアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加させた本発明のナノボディの免疫グロブリン配列に対応するかどちらかであることを意味する。
【０４５９】
上記のアミノ酸残基は、ナノボディの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、又はさもなければこれに影響を与える場合もあり又は与えない場合もあり、ナノボディにさらなる官能性を付加する場合もあり又は付加しない場合もある。例えば、このようなアミノ酸残基は、
例えば、異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるＮ末端Ｍｅｔ残基を含み得る。
合成の際に宿主細胞からのナノボディの分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載される通りであり得る。通常、このようなリーダー配列は、ナノボディのＮ末端に連結されるが、本発明は最も広範な意味では、これに限定されるものではない。
ナノボディを、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び／又はこれらに侵入させるか若しくは入り込ませ、及び／又はナノボディを、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入させるか若しくはこれらに対して横断させる、配列又はシグナルを形成し得る。このような免疫グロブリン配列の例は当業者にとって明らかであり、国際公開第０８／０２００７９号の１１２頁のｃ）段落で言及されるものを含む。
「標識」、例えば、免疫グロブリン配列又は残基を対象とする親和性技法等を用いてナノボディの精製を可能にするか又は容易にする、上記の配列又は残基を形成し得る。その後、（例えば、化学的又は酵素学的な切断によって）上記の配列又は残基を除去して、ナノボディ配列をもたらし得る（この目的のために、標識は任意で、切断可能なリンカー配列を介してナノボディ配列に連結されてもよく、又は切断可能なモチーフを含有していてもよい）。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びｍｙｃ標識（例えば国際公開第０６／１２２８２号の配列番号３１を参照）である。
官能化し及び／又は官能基の結合のための部位として機能することができる１つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６０】
ラクダ科動物におけるＤＮＡワクチン接種
ＤＮＡワクチン接種は実験動物、例えばラット、マウス及びウサギにおいて免疫応答を誘導するのに広く使用されている（例えばTang et al., Nature, 1992；Nagata et al., J.Immunol. Methods, 2003；Bins et al., Nature Med. 2005；Bins et al, J. Immunol., 2007；Kilpatrick etal., Hybridoma, 1998を参照されたい）。しかしながら、より大型の動物のＤＮＡワクチン接種は不可能ではないにしても困難であると考えられている。特にラクダ科動物のＤＮＡワクチン接種に関するレポートは数少ない。Koch Nolte et al., 2007によるレポートは、さらに２回のタンパク質追加免疫と組合せた、６週〜１２週間隔での８回ものＤＮＡワクチン接種が要求される長期にわたる面倒な手順を説明している。本発明の目的の１つは、大型動物、特にラクダ科動物をＤＮＡワクチン接種する改善された方法を提供することである。
【０４６１】
ａ）タンパク質追加免疫を伴わない免疫グロブリン配列の生成
特定の実施形態では本発明は、非ヒト動物、具体的にはラクダ科動物、より具体的にはラマにおいてタンパク質追加免疫を伴わない遺伝子ワクチン接種により免疫グロブリン配列を生成する方法に関する。
【０４６２】
非ラクダ科動物において、例えばマウスにおいて、タンパク質抗原による追加免疫を伴わないＤＮＡワクチン接種後にポリクローナル血清抗体応答を得ることができることがこれまでに実証されている（例えばBins et al., Nature Medicine, 2005; Bins et al., J. Immunol. 2007）。しかしながら、このようなポリクローナル抗体応答は、抗原特異的モノクローナル抗体を効果的に生成するのに十分ではないことが知られている（Nagata et al., 2003）。著者らは、タンパク質追加免疫を行わないマウスにおける「ごくわずかな（almost negligible）」特異的なハイブリドーマ収率（１０Ｅ８個の脾臓細胞当たり０．０〜１．３）を報告している。
【０４６３】
より大型の動物、特にラクダ科動物の遺伝子ワクチン接種がマウスと比較して免疫応答を誘起する効率が極めて乏しいことが一般的に知られている。そのためラクダ科動物における遺伝子ワクチン接種の使用では免疫グロブリン配列の産生が不可能であると考えられる。
【０４６４】
Koch-Nolte et al. 2007は、ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＡＲＴ２．２に対する単一のドメイン抗体を得るＤＮＡ初回刺激−タンパク質追加免疫戦略によるラマの免疫付与を説明している。しかしながらこの手順は、低効率であり、広範な追加免疫が要求されることを特徴としていた。より具体的には、ラマは６週〜１２週の間隔でＡＲＴ２．２をコードする発現ベクターを用いた４回の皮内遺伝子銃による４回の免疫付与を受けた（３００ｐｓｉの圧力設定での金１ｍｇ当たり１μｇのＤＮＡ  １２ショット）。４回のその後の追加免疫ＤＮＡ免疫付与及びさらなる２回のタンパク質追加免疫には、満足のいく免疫応答を得るために組換えＡＲＴ２．２を用いることが要求された。全体としては、この手順は動物で好適な免疫応答を達成するまで７ヶ月におよび、複数回のタンパク質追加免疫が必要となる。
【０４６５】
この従来技術の教示を鑑みて、本明細書に記載の方法を使用することにより、タンパク質追加免疫を伴わず好適な免疫応答をラクダ科動物、特にラマで達成することができることは、本発明の驚くべき発見である。言い換えると、遺伝子ワクチン接種単独でも、その後のスクリーニングによる免疫グロブリン配列の生成に適正な免疫応答を誘導するのに十分であり得る。特に、血清抗体応答が従来の免疫付与戦略と比較して低かったとしても、良好な「ヒット率」を達成するのに、すなわち許容可能な頻度で抗原特異的な免疫グロブリン配列を得るのにＤＮＡワクチン接種単独で十分であることが見出されたのは驚くべきことである。
【０４６６】
ｂ）細胞関連抗原に対する抗体応答の生成
導入部で概説されたように、当該技術分野は、本明細書で規定のように細胞結合する抗原に対する、特に膜貫通抗原に対する抗体応答を生成するのに適正な手段を提供してはいない。
【０４６７】
本発明は、好適な非ヒト動物、特にラクダ科動物、好ましくはラマの遺伝子ワクチン接種により、従来技術の試みと比較してレパートリーの幅の改善及び特異性の改善を特徴とする抗体応答を生成することができるという驚くべき発見に基づいている。
【０４６８】
細胞関連抗原、より具体的には単一又は複数の膜貫通ドメインを有する抗原は、それらの天然立体構造で精製するのが困難である。未変性エピトープに対する、ナノボディを含む免疫グロブリン配列を得るために、標的抗原をその未変性の立体構造でラマに投与することが極めて重要である。これらの細胞関連抗原に関して、抗原を機能的に発現する全細胞による免疫付与が好ましい戦略である（例えば特許文献１、特許文献２、米国特許出願第６１／００４，３３２号で行われたようなもの）。全細胞の免疫付与の主な欠点は、多くの他の抗原（細胞表面マーカー）も動物の免疫系に対して提示され、これにより高度に希釈された標的特異的な免疫応答が起こることである。特異性を増大するために、精密かつ技術的に複雑な初回刺激−追加免疫戦略を考案する必要がある。これらの工程のいずれかが変性タンパク質又はペプチドの使用を含む範囲では、得られる抗体応答は立体構造エピトープの不利益となる。したがって、免疫グロブリン配列の取得可能なスペクトル幅は限定されるであろう。さらに、単に細胞に基づいたアプローチ、すなわち免疫付与のために標的抗原を発現する細胞を使用するアプローチは、対象となる免疫グロブリン配列の効率的な単離を不可能にする免疫グロブリン配列の低い特異性を特徴とする。
【０４６９】
Koch-Nolte et al. 2007は、ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＡＲＴ２．２に対する単一のドメイン抗体を得るためにＤＮＡ初回刺激−タンパク質追加免疫戦略を用いた或るラマの免疫付与を説明している。
【０４７０】
ｅｃｔｏ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼＡＲＴ２．２は、脂質尾部を介するが、膜貫通ドメインを伴わない膜挿入を特徴とするＧｐｉ固定タンパク質である。このタンパク質に関して、正確に折り畳まれた精製タンパク質を追加免疫のために調製することができる。そのため、精製タンパク質を用いて追加免疫を行うことができる。上記のように、膜内に固定された、又は膜に位置する細胞関連抗原の精製タンパク質はそれらの天然立体構造の精製形態では得ることができない。いかなる精製調製物も膜依存性の立体構造エピトープを欠くこととなる。そのため、これらの細胞関連抗原からの精製タンパク質による追加免疫は不可能である。
【０４７１】
膜貫通タンパク質、特に複数の膜貫通ドメインを有するタンパク質に関して、立体構造エピトープ、特に膜依存性の立体構造エピトープが免疫グロブリン配列に関する標的として特に興味深い。例えば、イオンチャネルの孔は治療的に最も重要な標的を表す。しかしながら、従来のアプローチの使用では、このような標的を認識する免疫グロブリン配列を生成することはほとんど不可能である。例えば、イオンチャネルの孔領域は複数の膜貫通ドメイン、さらに場合によってはチャネルの複数のサブユニットにより形成される。この孔領域と結合する免疫グロブリン配列の生成のためのペプチドを提供することはほぼ不可能である。さらに、該タンパク質が膜環境でしかその天然立体構造を示さないため、精製イオンチャネルタンパク質を免疫付与に使用することはできない。
【０４７２】
本発明は、このような種類の立体構造エピトープに対する免疫グロブリン配列の生成を提供し、精製タンパク質による追加免疫の必要性を排除する。
【０４７３】
本発明では、遺伝子ワクチン接種（免疫応答の必要となる特異性を提供する）後に、動物に例えば天然立体構造で、すなわち膜に包埋された／固定されたタンパク質を発現する細胞を追加免疫することができることが期待される。これらの細胞が多くの抗原を発現する場合であっても、免疫学的なリコール応答が遺伝子ワクチン接種により送達された抗原に対してのみ起こることとなる。このため遺伝子ワクチン接種による動物の初回刺激により、たとえ例えばタンパク質を発現するが、免疫グロブリン配列の高度に特異的なレパートリーが得られる細胞に関してタンパク質が精製されていないとしても、天然立体構造でのタンパク質による追加免疫が可能になる。
【０４７４】
好ましい実施形態では本発明は、ラクダ科動物、特にラマにおける免疫グロブリン配列の生成に関する。これらの動物の抗体応答は、標的抗原上の溝（grooves）又は隙間（crevices）に広がり、特異的に結合することができる免疫グロブリン配列の存在を特徴とする。これは、細胞関連抗原の立体構造エピトープの場合に特に重要かつ有益である。
【０４７５】
このため具体的な一実施形態では本発明は、細胞関連抗原、特に１つ又は複数の膜貫通ドメインを示す抗原の立体構造エピトープに対して免疫グロブリン配列を産生するためのラクダ科動物の遺伝子ワクチン接種の使用に関する。
【０４７６】
これより上記に記載のような本発明の一般原理を特定の好ましい態様、実施形態及び特許請求の範囲に関して例示する。しかしながら、本発明はこれらに限定されるものとは理解されない。
【０４７７】
本願を通して挙げられた全ての引例（参考文献、交付済み特許、公開済み特許出願及び同時係属特許出願を含む）の内容全体が参照により本明細書に明示的に援用されている。
【０４７８】
好ましい態様：
態様Ａ−１：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列。
態様Ａ−２：本質的に単離形態である、態様Ａ−１に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−３：被験体に投与するためのものであり、上記被験体では自然発生しない、態様Ａ−１又はＡ−２に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−４：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ａ−５：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ａ−６：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ａ−７：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ａ−８：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−９：免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン。
態様Ａ−１０：４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１１：免疫グロブリン配列である、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１２：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１３：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法により得られた免疫グロブリン配列である、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１４：軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１５：通常の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１６：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１７：ナノボディから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１８：
ｉ）配列番号１〜配列番号２２のＡｎ免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−１９：
ｉ）配列番号７８９〜配列番号７９１の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ポリペプチドから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−２０：
ｉ）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。態様Ａ−２１：ヒト化ナノボディから本質的になる、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ａ−２２：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合に関する少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的との結合に関する１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
【０４７９】
ＣＤＲベースの態様
態様Ｂ−１：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができ、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸残基のストレッチを１つ又は複数含む、免疫グロブリン配列：
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；又は
それらの任意の好適な組合せ。
このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ｂ−２：アミノ酸残基の上記ストレッチのうちの少なくとも１つが例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合に関する抗原結合部位の一部分を形成する、態様Ｂ−１に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｂ−３：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができ、（ｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがａ）、ｂ）若しくはｃ）による免疫グロブリン配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチはｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）による免疫グロブリン配列の１つに対応し；（ｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｄ）、ｅ）若しくはｆ）による免疫グロブリン配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチはａ）、ｂ）、ｃ）、ｇ）、ｈ）若しくはｉ）による免疫グロブリン配列の１つに対応し；又は（ｉｉｉ）アミノ酸残基の第１のストレッチがｇ）、ｈ）若しくはｉ）による免疫グロブリン配列の１つに対応する場合、アミノ酸残基の第２のストレッチはａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）若しくはｆ）による免疫グロブリン配列の１つに対応するように、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸残基のストレッチを２つ以上含む、免疫グロブリン配列：
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列。
このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２、Ｂ−１又はＢ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ｂ−４：アミノ酸残基の少なくとも２つのストレッチが例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合に関する抗原結合部位の一部分を形成する、態様Ｂ−３に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｂ−５：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができ、アミノ酸残基の第１のストレッチが、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
からなる群から選択され、
アミノ酸残基の第２のストレッチが、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列；
からなる群から選択され、
アミノ酸残基の第３のストレッチが、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの、３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択される、アミノ酸残基のストレッチを３つ以上含む、免疫グロブリン配列。
このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２及び／又はＢ−１〜Ｂ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ｂ−６：アミノ酸残基の少なくとも３つのストレッチが例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合に関する抗原結合部位の一部分を形成する、態様Ｂ−５に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｂ−７：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列であって、上記免疫グロブリン配列のＣＤＲ配列が、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列との少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性（９５％以上のアミノ酸同一性等）、又はさらに本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２及び／又はＢ−１〜Ｂ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ｃ−１：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つと、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合を交差遮断する免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の及び／又はＢ−１〜Ｂ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。また好ましくは、このような免疫グロブリン配列は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することが可能である。
態様Ｃ−２：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つにより、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合を交差遮断される免疫グロブリン配列。このような免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の及び／又はＢ−１〜Ｂ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。また好ましくは、このような免疫グロブリン配列は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することが可能である。
態様Ｃ−３：上記免疫グロブリン配列の交差遮断する又は交差遮断される能力をビアコアアッセイで検出する、態様Ｃ−１又はＣ−２に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｃ−４：上記免疫グロブリン配列の交差遮断する又は交差遮断される能力をＥＬＩＳＡアッセイで検出する、態様Ｃ−１〜Ｃ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−１：本質的に単離形態である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７又はＣ−１〜Ｃ−７のいずれ１つに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−２：被験体に投与するためのものであり、上記被験体では自然発生しない、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−３：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１又はＤ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−４：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１〜Ｄ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−５：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１〜Ｄ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−６：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１〜Ｄ−５のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｄ−１〜Ｄ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
態様Ｅ−１：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、及び／又はＤ−１〜Ｄ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−２：免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン。
態様Ｅ−３：免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＤ−１又はＤ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−４：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−５：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法により得られた免疫グロブリン配列である、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−６：軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−５のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−７：通常の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−６のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−８：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適なＡｎ免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−９：ナノボディから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−８のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−１０：
ｉ）配列番号１〜配列番号２２の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−９のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−１１：
ｉ）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８のＡｎ免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１０のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−１２：ヒト化ナノボディから本質的になる、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−１３：ＣＤＲ配列により形成される、結合に関する少なくとも１つの結合部位に加えて、他の抗原、タンパク質又は標的との結合に関する１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、態様Ｂ−１〜Ｂ−７、Ｃ−１〜Ｃ−７、Ｄ−１〜Ｄ−６、及び／又はＥ−１〜Ｅ−１１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｅ−１〜Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列は特に態様Ａ−１〜Ａ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列であり得る。
【０４８０】
フレームワーク＋ＣＤＲの態様
態様Ｆ−１：４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になる免疫グロブリン配列であって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択される、免疫グロブリン配列。
このような免疫グロブリン配列は好ましくは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列である。また、このような免疫グロブリン配列は好ましくは、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−７、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６及び／又は態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列である。
態様Ｆ−２：４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから本質的になる免疫グロブリン配列であって、
ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ又は１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択される、免疫グロブリン配列。
このような免疫グロブリン配列は好ましくは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列である。また、このような免疫グロブリン配列は好ましくは、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−７、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６及び／又は態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列である。
態様Ｆ−３：上記免疫グロブリン配列のＣＤＲ配列が、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列との少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、又はさらには本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、態様Ｆ−１及び態様Ｆ−２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
このような免疫グロブリン配列は好ましくは、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる免疫グロブリン配列である。また、このような免疫グロブリン配列は好ましくは、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−７、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６及び／又は態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列である。
態様Ｆ−４：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列の態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つの結合を交差遮断する、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−５：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つにより例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合を交差遮断される、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−６：上記免疫グロブリン配列の交差遮断する又は交差遮断される能力をビアコアアッセイで検出する、態様Ｆ−４又は態様Ｆ−５に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−７：上記免疫グロブリン配列の交差遮断する又は交差遮断される能力をＥＬＩＳＡアッセイで検出する、態様Ｆ−４又は態様Ｆ−５に記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−８：本質的に単離形態である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−７のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−９：被験体に投与するためのものであり、上記被験体では自然発生しない、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−８のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１０：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−９のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１１：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１０のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１２：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１３：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１４：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１５：免疫グロブリンフォールドを含むか、又は好適な条件下で免疫グロブリンフォールドを形成することが可能である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１６：免疫グロブリン配列である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１５のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１７：天然免疫グロブリン配列（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成の免疫グロブリン配列である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１６のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１８：ヒト化免疫グロブリン配列、ラクダ化免疫グロブリン配列、又は親和性成熟等の技法により得られた免疫グロブリン配列である、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１７のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−１９：軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）から本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１９のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２０：従来の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列から本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−１９のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２１：ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むが、これに限定されない）から本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２０のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２２：ナノボディから本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２３：
ｉ）配列番号１〜配列番号２２の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２２のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２４：
ｉ）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
ナノボディから本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２３のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｆ−２５：ヒト化ナノボディから本質的になる、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｇ−１：ＣＤＲ配列により形成される、結合に関する少なくとも１つの結合部位に加えて、別の抗原、タンパク質又は標的との結合に関する１つ又は複数のさらなる結合部位を含有する、これまでの態様のいずれかに記載の免疫グロブリン配列。
態様Ｈ−１：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する及び／又はこれと特異的に結合することができる、ナノボディ。
態様Ｈ−２：本質的に単離形態である、態様Ｈ−１に記載のナノボディ。
態様Ｈ−３：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｈ−１又は態様Ｈ−２に記載のナノボディ。
態様Ｈ−４：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−３のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−５：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−４のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−６：５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−５のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−７：天然ナノボディ（任意の好適な種由来）又は合成若しくは半合成のナノボディである、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−６のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−８：ＶＨＨ配列、部分ヒト化ＶＨＨ配列、完全ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化重鎖可変ドメイン、又は親和性成熟等の技法により得られたナノボディである、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−７のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−９：
ｉ）配列番号１〜配列番号２２のＡｎ免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
態様Ｈ−１〜態様Ｈ−８のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１０：
ｉ）配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５、又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８のＡｎ免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有し（ここでアミノ酸同一性の程度を決定するためにＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視する）；
ｉｉ）好ましくはカバットナンバリングによる１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数が、表Ｂ−２で言及される特徴的な残基から選択される、
態様Ｈ−１〜態様Ｈ−９のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１１：ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、及び／又は
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択される、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１０のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１２：ＣＤＲ１が、
ａ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列；
ｂ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｃ）配列番号２０８〜配列番号２８９の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、
ＣＤＲ２が、
ｄ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列；
ｅ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｆ）配列番号３７２〜配列番号４５３の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択され、
ＣＤＲ３が、
ｇ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列；
ｈ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する免疫グロブリン配列；
ｉ）配列番号５３６〜配列番号６１７の免疫グロブリン配列の少なくとも１つとの３つ、２つ若しくは１つのアミノ酸差異を有する免疫グロブリン配列
からなる群から選択される、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１１のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１３：ＣＤＲ配列が、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲ配列との少なくとも７０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸同一性、より好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸同一性、例えば９５％以上のアミノ酸同一性、又はさらには本質的に１００％のアミノ酸同一性を有する、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１２のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１４：部分ヒト化ナノボディである、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１３のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１５：完全ヒト化ナノボディである、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１４のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１６：配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５若しくは配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３若しくは配列番号７７８からなる群から、又は配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５若しくは配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３若しくは配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つとの８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、例えば９９％以上の配列同一性（本明細書中で規定される）を有する免疫グロブリン配列からなる群から選択される、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１５のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１７：ヒト化ナノボディである、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１６のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１８：配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３からなる群から選択される、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−１７のいずれかに記載のナノボディ。
態様Ｈ−１９：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つの、例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合を交差遮断する、ナノボディ。
態様Ｈ−２０：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有し、配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５又は配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３又は配列番号７７８の免疫グロブリン配列のうちの少なくとも１つにより例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルとの結合を交差遮断される、ナノボディ。
態様Ｈ−２１：上記ナノボディの交差遮断する又は交差遮断される能力をビアコアアッセイで検出する、態様Ｈ−１９又は態様Ｈ−２０に記載のナノボディ。
態様Ｈ−２２：上記ナノボディの交差遮断する又は交差遮断される能力をＥＬＩＳＡアッセイで検出する、態様Ｈ−１９〜態様Ｈ−２１のいずれかに記載のナノボディ。
【０４８１】
ポリペプチド
態様Ｋ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の１つ又は複数の免疫グロブリン配列、及び／又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つ又は複数のナノボディを含むか又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のペプチドリンカーをさらに含む、ポリペプチド。
態様Ｋ−２：上記１つ又は複数の結合単位が免疫グロブリン配列である、態様Ｋ−１に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−３：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｋ−１又は態様Ｋ−２に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−４：上記１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列が免疫グロブリン配列である、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−３のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−５：上記１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−４のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−６：態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つ又は複数のナノボディを含むか又はこれから本質的になり、上記１つ又は複数の他の結合単位がナノボディである、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−５のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−７：少なくとも１つの結合単位が多価構築物である、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−６のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−８：少なくとも１つの結合単位が多重パラトピック構築物である、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−８のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−９：少なくとも１つの結合単位が多重特異的構築物である、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−８のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１０：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体と比較して増大した半減期を有する、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−９のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１１：上記１つ又は複数の他の結合単位が、それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体と比較して増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす、態様Ｋ−１０に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１２：増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす上記１つ又は複数の他の結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質と結合することができる小タンパク質又は小ペプチドからなる群から選択される、態様Ｋ−１０又は態様Ｋ−１１に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１３：増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす上記１つ又は複数の他の結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片からなる群から選択される、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１２のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１４：増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす上記１つ又は複数の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができる結合単位からなる群から選択される、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１３のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１５：増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす上記１つ又は複数の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１４のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１６：増大した半減期を有するポリペプチドをもたらす上記１つ又は複数の他の結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディである、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１５に記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１７：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい血清半減期を有する、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１６のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１８：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらには２４時間超、４８時間超若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する、態様Ｋ−１０〜態様Ｋ−１７のいずれかに記載のポリペプチド。
態様Ｋ−１９：少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の；例えば、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の、ヒトにおける血清半減期を有する、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１８のいずれかに記載のポリペプチド。
【０４８２】
化合物又は構築物
態様Ｌ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の１つ又は複数の免疫グロブリン配列、及び／又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つ又は複数のナノボディを含むか又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結された１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
態様Ｌ−２：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、態様Ｌ−１に記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−３：上記１つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンカーが１つ又は複数の免疫グロブリン配列である、態様Ｌ−１又は態様Ｌ−２に記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−４：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−３のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−５：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−４のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−６：上記１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列が免疫グロブリン配列である、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−５のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−７：上記１つ又は複数の本発明の免疫グロブリン配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−６のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−８：態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つ又は複数のナノボディを含むか又はこれから本質的になり、上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位がナノボディである、化合物又は構築物。
態様Ｌ−９：多価構築物である、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−９のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１０：多重特異的構築物である、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−１０のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１１：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体と比較して増大した半減期を有する、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−１０のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１２：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２に記載のナノボディそれ自体と比較して増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−１１に記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１３：増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清タンパク質又はその断片、血清タンパク質と結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、及び血清タンパク質と結合することができる小タンパク質又は小ペプチドからなる群から選択される、態様Ｌ−１２に記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１４：増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、ヒト血清アルブミン又はその断片からなる群から選択される、態様Ｌ−１２又は態様Ｌ−１３に記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１５：増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができる結合単位からなる群から選択される、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１４のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１６：増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１４のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１７：増大した半減期を有する化合物又は構築物をもたらす上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）又は血清免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）と結合することができるナノボディである、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１４のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１８：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい血清半減期を有する、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１７のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−１９：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらには２４時間超、４８時間超若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１８のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−２０：少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の；例えば、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の、ヒトにおける血清半減期を有する、態様Ｌ−１２〜態様Ｌ−１９のいずれかに記載の化合物又は構築物。
態様Ｌ−２１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の１つの免疫グロブリン配列、及び／又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つのナノボディを含むか又はこれから本質的になる、一価構築物。
態様Ｌ−２２：上記本発明の免疫グロブリン配列が、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列、「ｄＡｂ」、ｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列、又はナノボディからなる群から選択される、態様Ｌ−２１に記載の一価構築物。
態様Ｌ−２３：態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載の１つのナノボディを含むか又はこれから本質的になる、一価構築物。
【０４８３】
核酸
態様Ｍ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５又は態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディをコードする、核酸配列又はヌクレオチド配列。
態様Ｍ−２：上記の態様のいずれかに記載の化合物又は構築物をコードする、核酸配列又はヌクレオチド配列。
【０４８４】
宿主細胞
態様Ｎ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物（これをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるようなものである）、若しくは態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を発現する若しくはこれを好適な状況下で発現することが可能である；及び／又は態様Ｍ−１に記載の核酸配列若しくはヌクレオチド配列、若しくは態様Ｍ−２に記載の遺伝子構築物を含む、宿主又は宿主細胞。
【０４８５】
組成物
態様Ｏ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物、又は態様Ｍ−１若しくは態様Ｍ−２に記載の核酸配列若しくはヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、組成物。
態様Ｏ−２：薬学的組成物である、態様Ｏ−１に記載の組成物。
態様Ｏ−３：薬学的組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤若しくは賦形剤及び／又はアジュバントをさらに含み、１つ又は複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチド及び／又は化合物を任意で含む、態様Ｏ−２に記載の組成物。
【０４８６】
本発明の作用物質及び組成物の製造
態様Ｐ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物（これをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるようなものである）、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を製造する方法であって、
ａ）好適な宿主細胞若しくは宿主生物において、又は別の好適な発現系において、態様Ｍ−１に記載の核酸配列若しくはヌクレオチド配列、又は態様Ｍ−２に記載の遺伝子構築物を発現させる工程、
任意でその後
ｂ）そのようにして得られた態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
態様Ｐ−２：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物（これをコードする核酸配列若しくはヌクレオチド配列の発現により得ることができるようなものである）、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を製造する方法であって、
ａ）態様．．．．に記載の宿主又は宿主細胞を培養及び／又は維持する工程であって、上記宿主又は上記宿主細胞が態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を少なくとも１つ発現及び／又は産生するような条件下で、培養及び／又は維持する工程、
任意でその後
ｂ）そのようにして得られた態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物を単離及び／又は精製する工程
を少なくとも含む、方法。
【０４８７】
スクリーニングの方法
態様Ｑ−１：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン配列をスクリーニングする方法であって、
ａ）免疫グロブリン配列をコードする核酸配列のセット、コレクション又はライブラリを用意する工程、
ｂ）例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと結合することができ及び／又はこれに対する親和性を有し、本発明のナノボディ、例えば配列番号７０５〜配列番号７８８、より好ましくは配列番号７２６〜配列番号７５０、配列番号７５３〜配列番号７５８、配列番号７６２〜配列番号７６４、配列番号７７２〜配列番号７７３、配列番号７７５若しくは配列番号７７８〜配列番号７８０、より好ましくは配列番号７３２、配列番号７７３若しくは配列番号７７８（表Ａ−１）、又は本発明のポリペプチド若しくは構築物、例えば配列番号７８９〜配列番号７９１（表Ａ−３を参照されたい）により交差遮断される又はこれを交差遮断する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列に関して、核酸配列の上記セット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程、並びに
ｃ）上記核酸配列を単離する工程であって、その後上記免疫グロブリン配列を発現させる、単離する工程
を少なくとも含む、方法。
【０４８８】
本発明の結合因子の使用
態様Ｒ−１：少なくとも１つの［疾患及び障害を挿入］を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３のいずれかに記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物を少なくとも１つ、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−２：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと、その生物学的活性若しくは薬理学的活性と、及び／又は例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルが関与する生物学的経路若しくはシグナル伝達に関連する少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物を少なくとも１つ、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−３：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物を少なくとも１つ、それを必要とする被験体に投与することにより予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、薬学的に活性のある量の、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物を少なくとも１つ、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−４：免疫療法のための方法であって、薬学的に活性のある量の、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物を少なくとも１つ、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
態様Ｒ−５：少なくとも１つの［疾患及び障害を挿入］の予防及び／若しくは治療のための薬学的組成物の調製における、並びに／又は態様Ｒ−１〜態様Ｒ−３に記載の方法の１つ又は複数における使用のための、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物の使用。
態様Ｒ−６：イオンチャネルが或る役割を果たす又はイオンチャネルが関与する少なくとも１つの疾患又は障害の予防及び／又は治療のための、態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディ、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２１のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、態様Ｌ−２２若しくは態様Ｌ−２３に記載の一価構築物；又は態様Ｏ−２若しくは態様Ｏ−３に記載の組成物。
【０４８９】
断片の態様
態様Ｓ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列の、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディの、部分又は断片。
態様Ｓ−２：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｓ−１に記載の部分又は断片。
態様Ｓ−３：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｓ−１又は態様Ｓ−２に記載の部分又は断片。
態様Ｓ−４：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｓ−１〜態様Ｓ−３のいずれかに記載の部分又は断片。
態様Ｓ−５：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｓ−１〜態様Ｓ−４のいずれかに記載の部分又は断片。
態様Ｓ−６：態様Ｓ−１〜態様Ｓ−４のいずれかに記載の１つ又は複数の部分又は断片を含むか又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結された１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
態様Ｓ−７：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、態様Ｓ−６に記載の化合物又は構築物。
態様Ｓ−８：上記１つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンカーが１つ又は複数の免疫グロブリン配列である、態様Ｓ−６又は態様Ｓ−７に記載の化合物又は構築物。
態様Ｓ−９：態様Ｓ−１〜態様Ｓ−７のいずれかに記載の部分若しくは断片、又は態様Ｓ−８に記載の化合物若しくは構築物をコードする、核酸配列又はヌクレオチド配列。
態様Ｓ−１０：態様Ｓ−１〜態様Ｓ−７のいずれかに記載の部分若しくは断片、態様Ｓ−６〜態様Ｓ−８のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｓ−９に記載の核酸配列若しくはヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、組成物。
【０４９０】
誘導体の態様
態様Ｔ−１：態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列の、又は態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディの、誘導体。
態様Ｔ−２：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−１に記載の誘導体。
態様Ｔ−３：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−１又は態様Ｔ−２に記載の誘導体。
態様Ｔ−４：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−３のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−５：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−４のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−６：態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、又は態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２３のいずれかに記載の化合物若しくは構築物の、誘導体。
態様Ｔ−７：例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−６に記載の誘導体。
態様Ｔ−８：１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−６又は態様Ｔ−７に記載の誘導体。
態様Ｔ−９：１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の結合速度（ｋｏｎ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−６〜態様Ｔ−８のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１０：１ｓ−１〜１０−６ｓ−１、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−６ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の解離速度（ｋｏｆｆ速度）で例えばＰ２Ｘ７等のイオンチャネルと特異的に結合することができる、態様Ｔ−６〜態様Ｔ−９のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１１：対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２２のいずれかに記載のナノボディそれ自体、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、又は態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２３のいずれかに記載の化合物若しくは構築物それ自体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、又は２０倍超大きい血清半減期を有する、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１０のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１２：それぞれ対応する態様Ａ−１〜態様Ａ−２２、態様Ｂ−１〜態様Ｂ−７、態様Ｃ−１〜態様Ｃ−４、態様Ｄ−１〜態様Ｄ−６、態様Ｅ−１〜態様Ｅ−１３、態様Ｆ−１〜態様Ｆ−２５若しくは態様Ｇ−１のいずれかに記載の免疫グロブリン配列それ自体、態様Ｈ−１〜態様Ｈ−２３のいずれかに記載のナノボディそれ自体、態様Ｋ−１〜態様Ｋ−１９のいずれかに記載のポリペプチド、又は態様Ｌ−１〜態様Ｌ−２３のいずれかに記載の化合物若しくは構築物それ自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらには２４時間超、４８時間超若しくは７２時間超増大した血清半減期を有する、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１１のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１３：少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上の；例えば、少なくとも５日（例えば約５日〜１０日）、好ましくは少なくとも９日（例えば約９日〜１４日）、より好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）、又は少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）、又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）の、ヒトにおける血清半減期を有する、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１２のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１４：ペグ化誘導体である、態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１３のいずれかに記載の誘導体。
態様Ｔ−１５：態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１４のいずれかに記載の１つ又は複数の誘導体を含むか又はこれから本質的になり、任意で１つ又は複数のリンカーを介して連結された１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位を任意でさらに含む、化合物又は構築物。
態様Ｔ−１６：上記１つ又は複数の他の基、残基、部分又は結合単位が免疫グロブリン配列である、態様Ｔ−１５に記載の化合物又は構築物。
態様Ｔ−１７：上記１つ又は複数のリンカーが存在する場合、該リンカーが１つ又は複数の免疫グロブリン配列である、態様Ｔ−１６に記載の化合物又は構築物。
態様Ｔ−１８：態様Ｔ−１６又は態様Ｔ−１７に記載の化合物又は構築物をコードする、核酸。
態様Ｔ−１９：態様Ｔ−１〜態様Ｔ−１４のいずれかに記載の誘導体、態様Ｔ−１５〜態様Ｔ−１７のいずれかに記載の化合物若しくは構築物、又は態様Ｔ−１８に記載の核酸配列若しくはヌクレオチド配列を少なくとも１つ含む、組成物。
【０４９１】
特に好ましい態様
１．細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を生成する方法であって、
ａ）非ヒト動物に、上記細胞関連抗原又は上記細胞関連抗原のドメイン若しくは特定部分をコードする核酸を遺伝子ワクチン接種する工程、並びに
ｂ）任意で、該細胞関連抗原を発現する天然細胞若しくはトランスフェクト細胞を含む細胞、細胞由来の膜抽出物、豊富な抗原を内包する小胞若しくは任意の他の膜誘導体、リポソーム、又は該細胞関連抗原を発現するウイルス粒子から選択される、その天然立体構造の上記抗原により該動物を追加免疫する工程、
ｃ）上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列に関して、上記非ヒト動物に由来する免疫グロブリン配列のセット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする工程
を含む、方法。
２．上記細胞関連抗原が、膜貫通抗原、例えばＧＰＣＲ又はイオンチャネルを含むがこれらに限定されない多重貫通ドメインを有する膜貫通抗原から選択される、態様１に記載の方法。
３．上記非ヒト動物が、脊椎動物、例えばサメ、トカゲ及び哺乳動物、より具体的にはラクダ科動物、例えばラマ及びアルパカから選択される、態様１又は２に記載の方法。
４．非ヒト動物がラクダ科動物又はラマである、態様１〜３のいずれか１つに記載の方法。
５．上記免疫グロブリン配列が軽鎖可変ドメイン配列又は重鎖可変ドメイン配列である、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．免疫グロブリン配列が、従来の四本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列である、態様５に記載の方法。
７．免疫グロブリン配列が、ドメイン抗体（又はドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、単一ドメイン抗体（又は単一ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン配列）、「ｄＡｂ」（又はｄＡｂとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）、又はナノボディ（ＶＨＨ配列を含むがこれに限定されない）（又はナノボディとしての使用に好適な免疫グロブリン配列）である、態様１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．免疫グロブリン配列がナノボディである、態様７に記載の方法。
９．ワクチン接種を、無針ジェット注射により、バリスティック法により、タトゥーのような針による注射により、局所適用により、又は任意のＤＮＡ投与法、その後のｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーションにより行う、態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ワクチン接種を、ＤＮＡの皮内投与、筋肉内投与又は皮下投与により行う、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．免疫グロブリン配列の該セット、コレクション又はライブラリを、上記非ヒト哺乳動物のこれらの免疫グロブリン配列をコードする細胞を内包する血液、リンパ節、脾臓、骨髄、又は任意の組織から得る、態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．上記細胞関連抗原を、その未変性の立体構造の標的の発現が可能である任意の細胞、例えばこれらに限定されないが、Ｃｈｏ、Ｃｏｓ７、Ｈｅｋ２９３、又はラクダ科動物由来細胞、例えばラマ由来細胞若しくはアルパカ由来細胞から選択される細胞で発現させる、態様１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．上記細胞関連抗原が、膜貫通抗原、例えばＧＰＣＲ及び／又はイオンチャネル等である、態様１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．上記抗原が、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＲ４及び／又はＰ２Ｘ７から選択される、態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．免疫グロブリン配列の該セット、コレクション又はライブラリを、細胞又はウイルスのセット、コレクション又はサンプルで発現させ、上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列を発現する細胞に関して、細胞の上記セット、コレクション又はサンプルをスクリーニングする、態様１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列を該細胞又は該ウイルスから精製及び／又は単離した後、上記免疫グロブリン配列を発現させる、態様１５に記載の方法。
１７．免疫グロブリン配列の該セット、コレクション又はライブラリが核酸配列のセット、コレクション又はライブラリによってコードされ、上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする核酸配列に関して、核酸配列の上記セット、コレクション又はライブラリをスクリーニングする、態様１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する免疫グロブリン配列をコードする該核酸配列を精製及び／又は単離した後、上記免疫グロブリン配列を発現させる、態様１７に記載の方法。
１９．上記細胞関連抗原と結合することができる及び／又はこれに対する親和性を有する該免疫グロブリン配列を精製及び／又は単離する、態様１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．態様１〜１９のいずれか１つの方法により取得可能な免疫グロブリン。
２１．態様１〜１９のいずれか１つの方法により取得可能な、イオンチャネルに指向性を有する免疫グロブリン。
２２．イオンチャネルのアンタゴニスト（部分又は完全）である、態様２１に記載の免疫グロブリン。
２３．イオンチャネルのアゴニスト（部分又は完全）である、態様２１に記載の免疫グロブリン。
２４．態様１〜１９のいずれか１つの方法により取得可能な、Ｐ２Ｘ７に指向性を有する免疫グロブリン。
２５．態様２０〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリン配列を含む組成物。
【０４９２】
図１．Ｐｉｇ−ｊｅｔ（パネルＡ）又はタトゥー法（パネルＢ）による遺伝子ワクチン接種後のラマにおける体液性免疫応答の動態を示す図である。
図２．ＤＮＡワクチン接種したラマでの単一のＨＢＳＡｇタンパク質追加免疫の効果を示す図である。グラフの注釈は図１と同じである。
図３．タンパク質免疫付与（ラマ３２及びラマ３３）に対する「ＤＮＡ」初回刺激（prime：プライム）−「タンパク質」追加免疫（boost：ブースト）プロトコル（ラマ１２４、ラマ１６０、ラマ１１７、ラマ２０３）で得られた体液性免疫応答を示す図である。
図４．ＨＢＳＡｇに対する重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）媒介性の抗体応答を示す図である。
【実施例】
【０４９３】
実施例１．ラマの遺伝子免疫付与、及びモデル抗原としてＢ型肝炎小型表面抗原を用いた免疫グロブリン配列の同定
標的特異的ラクダ科動物の免疫グロブリン配列を、ＤＮＡワクチン接種に続いて同定した。Ｂ型肝炎小型表面抗原をモデル抗原として選択した（このタンパク質は動物において遺伝子免疫付与後に体液性免疫応答を誘導するのに広く使用されているためである）。
【０４９４】
実施例１．１．遺伝子免疫付与のためのプラスミドの生成及び調製
Ｂ型肝炎小型表面抗原（ＨＢＳＡｇ）をコードする真核生物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−Ｈｂｓ（複数可）は、Aldevronから入手する。発現は構成的サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下である。得られた構築物の配列を配列解析によって検証した。
【０４９５】
プラスミドＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってエンドトキシンフリーＧｉｇａｐｒｅｐキット（Qiagen）を用いて作製する。ベクターＤＮＡを最後にエンドトキシンフリーＬＡＬ  Ｈ２Ｏ中、又はエンドトキシンフリー０．９％ＮａＣｌのＬＡＬ  Ｈ２Ｏ溶液中１ｍｇ／ｍＬの濃度で再構築する。プラスミドは−２０℃で一定分量で保管する。使用前にプラスミドＤＮＡ溶液を遠心分離して、可能な限り凝集物を除去する。
【０４９６】
実施例１．２．異なるＤＮＡ投与方法に続く遺伝子免疫付与によるラクダ科動物における体液性免疫応答の誘導
獣医学部倫理委員会（ゲント大学、Belgium）の認可の後、４頭のラマ（１２４、１６０、１１７及び２０３）に２つの遺伝子免疫付与法を用いて免疫付与し、抗原特異的体液性応答を誘導した。どちらの方法についてもＤＮＡは皮内（ＩＤ）適用した。第１のＤＮＡ投与方法は無針ジェット注射からなるものであり、第２のＤＮＡ投与方法はタトゥー法（Bins et al. 2005. Nature Medicine 11:899-904）に従うものであった。
【０４９７】
ＤＮＡ適用の前に、ラマの皮膚の肩甲骨より上のおよそ２００ｃｍ２〜２４０ｃｍ２の領域を剪毛し、皮膚を市販の脱毛クリーム（Veet）で２分間処理して、残った全ての毛及び角質層の一部を化学的に除去し、剪毛した領域を水ですすぐことによって十分に清浄にした。第１の方法については、ＤＮＡはＰｉｇ−ｊｅｔ装置（Endoscopic）を用いて皮膚内に投与する（ラマ１２４及びラマ１６０）。マルチノズルヘッドによって５つの隣接するスポットに同時に０．０４ｍｌずつＤＮＡ溶液を分散させるが、注射による水疱又は丘疹が皮膚に２時間ほど残る。したがって、（０日目、１４日目、２８日目及び５７日目に）ラマに与えられる各用量（１ｍｇのＤＮＡ）によって、２５個の注射による水疱が生じた。短間隔タトゥー法については、短間隔計画を使用した。ラマ１１７及びラマ２０３に麻酔をかけ、ＤＮＡ適用領域を０日目、３日目、７日目（間隔１）、２１日目、２４日目、２８日目（間隔２）、５６日目、５９日目及び６３日目（間隔３）にタトゥーイングする３つの部分に分けた。１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡの液滴を適用し、市販のタトゥー装置（ｍａｇｎｕｍ  ９  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｎｅｅｄｌｅ）を用いて皮膚内に０．５ｍｍの深さで、１期間につき少なくとも１０分間、およそ８０ｃｍ２の表面上にタトゥーを入れた。投与されるＤＮＡの用量は１．３３ｍｇ（間隔１及び間隔２）及び４ｍｇ（間隔３）である。全てのラマについて、免疫付与の間に一定間隔で小量の血液試料を回収し、ＥＬＩＳＡにより血清変換をモニタリングする。
【０４９８】
ＤＮＡワクチン接種後にラマがＨＢｓＡｇ特異的体液性免疫応答を誘導したか否かを検証するために、４００倍希釈の免疫前血清及び免疫血清を用いてＥＬＩＳＡを実行した。つまり、１μｇ／ｍｌの組み換えＨＢｓＡｇ（Aldevron）を９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc）に４℃で一晩固定化する。ウェルをカゼイン溶液（ＰＢＳ中１％）でブロッキングする。血清希釈物を添加した後、特異的に結合した免疫グロブリンを、ヤギ抗ラマＩｇＧセイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（Bethyl Lab. Inc.，Montgomery，TX）を用いて検出する。図１．１に示す結果から、両方のラマ（１２４及び１６０）に対するジェット注射法について、規模は様々であるが明らかな標的特異的血清変換が検出される（０日目対８０日目）ことが実証される（図１．１のパネルＡ、パネルＢ）。３回目にタトゥーを入れた後、応答の規模はジェット注射と比べると小さいが、同様の傾向がラマ１１７及びラマ２０３について実証される（図１．１のパネルＡ、パネルＣ）。
【０４９９】
実施例１．３．ＨＢｓＡｇタンパク質によるＤＮＡ初回刺激したラクダ科動物の追加免疫は、重鎖抗体媒介性応答を含む抗原特異的血清変換を増大させた
８５日目に、アジュバントとしてＳｔｉｍｕｎｅ（CEDIDiagnostics，Lelystad，TheNetherlands）を用いた５０μｇの精製ＨＢｓＡｇの単回追加免疫を、４頭全てのラマの頸部に筋内（ＩＭ）投与し、小量の血清試料を回収した。４頭全ての動物の免疫応答の評価を、先の実施例に記載されるようにＥＬＩＳＡによって行ったが、４頭全ての動物について単回ＨＢｓＡｇ追加免疫によって強い二次応答が誘導されることが示された（図１．２）。この「ＤＮＡ」初回刺激−「タンパク質」追加免疫アプローチの後、ＨＢｓＡｇタンパク質のみを注射した免疫付与法（ラマ３２及びラマ３３；毎週のＩＭ頸部注射を６回；Ｓｔｉｍｕｎｅをアジュバントとして用い、１回の注射当たり１００μｇ〜５０μｇのタンパク質という用量）と比べて、同様の抗原特異的血清力価が生じた。結果を図１．３に示す。結合したラマ免疫グロブリンが、ラマＩｇＧ１通常抗体、又は重鎖のみのラマＩｇＧ２抗体及びＩｇＧ３抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体で検出されたため、抗体応答は通常抗体及び重鎖抗体を発現するＢ細胞レパートリーのどちらによっても増加した（図１．４）（Daley et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Mar; 12（3）: 380-6）。
【０５００】
実施例１．４．ラクダ科動物におけるＤＮＡを用いたＨＢｓＡｇに対する免疫応答の初回刺激は、ｉｎ  ｖｉｖｏ成熟抗原特異的ナノボディを同定するのに十分である
Ｂ細胞を含有する１５０ｍＬの血液試料を、ラマ１２４及びラマ１１７（それぞれＰｉｇ−ｊｅｔ  ＤＮＡ適用及びタトゥーＤＮＡ適用の後に最も高い血清変換を示すラマ）から、最後のＤＮＡ投与とＨＢｓＡｇタンパク質追加免疫との間に回収した。続いて、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、製造業者の取扱説明書に従ったＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden）での密度勾配遠心分離法によって精製した。
【０５０１】
全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを調製して、以前に記載されている（例えば、国際公開第０２／０８５９４５号及び国際公開第０４／０４９７９４号）ようにネステッドＰＣＲによってナノボディレパートリーを増幅した。ＰＣＲ産物をＳｆｉｌ（ネステッドＰＣＲによってＦＲ１プライマー領域に導入した）及びＢｓｔＥＩＩ（ＦＲ４に自然発生する制限部位）で消化し、ゲル電気泳動の後、およそ３５０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから精製した。３３０ｎｇの増幅したナノボディレパートリーを、Ｓｆｉｌ−ＢｓｔＥＩＩで消化した１μｇのファージディスプレイベクター（ｐＡＸ５０）の対応する制限部位とライゲーションして、大腸菌ＴＧ１のエレクトロポレーションの後ライブラリを得た。ｐＡＸ５０はＬａｃＺプロモーター、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位（Ｓｆｉｌ制限部位及びＢｓｔＥＩＩ制限部位を内包する）、並びにｇｅｎｅ３及びエルウィニア・カロトボーラｐｅｌＢモチーフからなるキメラリーダー配列を含有する。このディスプレイベクターは、個々のナノボディをｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグ及びｇｅｎｅＩＩＩ産物との融合タンパク質として発現するファージ粒子の作製を可能にする。ラマ１２４及びラマ１１７の免疫組織に由来するライブラリのサイズは、それぞれ１×１０８ＣＦＵ及び３×１０７ＣＦＵであった。ライブラリの品質管理のため、各々のライブラリのランダムに選んだ２４個のコロニーに対するＭ１３リバースプライマー及びｇｅｎｅＩＩＩプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって、正確なサイズの挿入断片の割合がそれぞれ９１％及び１００％であると求められた。
【０５０２】
ライブラリを、細菌を対数期（ＯＤ６００＝０．５）まで培養することによってレスキューし、その後のヘルパーファージでの感染によって、クローニングナノボディのレパートリーをファージの先端でｐＩＩＩ融合タンパク質として発現する組み換えファージを得た。ファージを濾過滅菌後にさらなる使用のために４℃で保管した。
【０５０３】
ＨＢｓＡｇ特異的ナノボディを、以下のように単回のパニングの後選択した。組み換えＨＢｓＡｇ（Aldevron）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Nunc，Wiesbaden，Germany）に１ウェル当たり５００ｎｇ及び５０ｎｇで直接固定化した。ファージライブラリとの２時間のインキュベーション及び十分な洗浄の後、結合したファージをトリプシン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて室温で１５分間溶出させた。プロテアーゼ活性は、１００μｌのファージ溶出物に５μｌの１６ｍＭ  ＡＢＳＦプロテアーゼ阻害剤を添加することによって阻害された。全ての選択条件において、非ＨＢｓＡｇコーティングウェルから溶出した溶出ファージの数と比較して、ＨＢｓＡｇ固定化ウェルからより多数の溶出ファージが観察され、ＨＢｓＡｇ特異的ナノボディの濃縮が示される。各々の選択のアウトプットを、対数的に増殖した大腸菌ＴＧ１に３７℃で３０分間再感染させ、適切な希釈物を固形培地（２％グルコース及びアンピシリンを含有するＬＢ）上で一晩培養して、単一のコロニーを得た。個々のコロニーをＨＢｓＡｇ濃縮選択アウトプットから取り出し、９６ディープウェルプレート（１ｍｌ容）で培養して、ＩＰＴＧを添加することによってナノボディ発現を誘導した。ペリプラズム抽出物（ＰＥ）を標準的な方法に従って８０μｌの容量で調製した。
【０５０４】
合計１８８個の１０倍希釈のＰＥ（ラマ１２４に由来するＰＥが９４個及びラマ１１７に由来するＰＥが９４個）を、固相にコーティングしたＨＢｓＡｇとの特異的結合について、マウス抗Ｍｙｃモノクローナル抗体及び後続工程で抗マウスＨＲＰ結合検出抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。バックグラウンド（非コーティングウェル）の最低２倍のシグナルを示すペリプラズム抽出物を陽性とスコア付けし、対応するナノボディクローンをシークエンシングした。ライブラリ１２４及びライブラリ１１７については、クローンのそれぞれ６８％及び４％が陽性であるとスコア付けされた。配列解析によって、５個のＨＢｓＡｇ特異的ナノボディファミリーが同定され（ラマ１２４から３個及びラマ１１７から２個；配列番号は表１．１）、ファミリーの代表例は、ラマ１２４からＨＢＳＡＧＰＭＰ２Ｅ７（ファミリー１）、ＨＢＳＡＧＰＭＰ２Ｅ１２（ファミリー２）及びＨＢＳＡＧＰＭＰ２Ａ４（ファミリー３）、並びにラマ１１７からＨＢＳＡＧＰＭＰ１Ｃ６（ファミリー４）及びＨＢＳＡＧＰＭＰ１Ｅ１１（ファミリー５）である。
【０５０５】
実施例１．５．ＤＮＡワクチン接種したラマから単離したナノボディは、タンパク質免疫付与したラマから同定されたものと同様の解離速度を示す
血漿由来ＨＢｓＡｇ粒子（Biodesign）を、表面プラズモン共鳴ＣＭ５センサーチップ（BIAcore）に１１０００ＲＵの密度で固定化した。チップ表面の再生は、０．１Ｍ  ＨＣｌを４５μｌ／分の流速で５秒間流すことによって行った。ペリプラズムナノボディ抽出物を注入し、解離速度を評価した（Biacore）。データは参照チャネル、及びブランクの泳動バッファー注入の曲線を減算することによって二重参照した。処理した曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ１．１．１及びＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアｖ４．１において１：１解離モデルを結合曲線に適合することによって評価した。ＨＢＳＡＧＰＭＰ２Ｅ７、ＨＢＳＡＧＰＭＰ２Ｅ１２の解離速度は、それぞれ８．８Ｅ−４  ｓ−１及び１．３Ｅ−３  ｓ−１と算出された。これらの解離速度は、ラマ３２及びラマ３３から得られたライブラリに対する選択後に同定されたＨＢｓＡｇ特異的ナノボディについて得られたもの（解離速度６．０Ｅ−２  ｓ−１〜１．７Ｅ−３  ｓ−１）と同様であり（Serruys et al. 2009 Hepatology 49（1）:39-49）、遺伝子免疫付与によって得られたナノボディの親和性が、タンパク質免疫付与によって同定されたナノボディと異ならないことが示される。
【０５０６】
表１．１：配列：
【表２６】
0006034435.tif 000061
【０５０７】
実施例２．遺伝子免疫付与によるＧタンパク質共役受容体に対するナノボディの同定
複数の膜貫通ドメインを内包する膜結合標的に対する遺伝子免疫付与の実行可能性を実証するために、ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ４を第１の例として選択した。
【０５０８】
実施例２．１．遺伝子免疫付与に好適なＣＸＣＲ４をコードするベクターの生成
ヒトケモカイン受容体ＣＸＣＲ４をコードするｃＤＮＡ（ＮＭ＿００３４６７）をOpen Biosystemsから購入した。制限部位ＮｈｅＩ（５’末端）及びＸｈｏＩ（３’末端）のＰＣＲ媒介性導入の後、単位複製配列をｐＶＡＸ−１（Invitrogen）及びｐＣＤＮＡ３．１（Invitrogen）の対応する部位にクローニングした。得られたｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ４及びｐＣＤＮＡ３．１−ＣＸＣＲ４の配列完全性を配列解析によって検証した。ベクターｐＶＡＸ１は遺伝子免疫付与に使用するように設計されたものであり、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを内包する。ｐＶＡＸ１は大腸菌における高コピー数の複製、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、大抵の哺乳動物細胞における対象となるタンパク質の一時的な高レベルの発現を可能にする。ミリグラム量のエンドトキシンフリーｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ４プラスミドを作製し、ＬＡＬ  Ｈ２Ｏ中０．９％生理食塩水に２ｍｇ／ｍＬの濃度まで溶解し、−２０℃で保管した。
【０５０９】
実施例２．２．ｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞は、機能的ＣＸＣＲ４受容体を発現する
ヒトＣＸＣＲ４の機能的発現を検証するために、エンドトキシンフリーｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ４プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にＦｕｇｅｎｅ（Roche）を用いて一時的にトランスフェクトし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞外発現をフローサイトメトリーによってモニタリングした。ヒトＣＸＣＲ４特異的モノクローナル抗体１２Ｇ５（R&D SystemsのＭＡＢ１７０）、その後ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ検出抗体（Jackson ImmunoResearch Inc.、カタログ番号１１５−１１５−１６４）を検出抗体として使用した。この方法によって、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に比べて３８倍のトランスフェクトｐＶＡＸ１−ｈＣＸＣＲ４／ＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度シフトが示された（図２．１、パネルＡ）。細胞表面での機能的ＣＸＣＲ４の存在は、親ＨＥＫ２９３細胞ではなくＣＸＣＲ４トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞への、そのビオチン化リガンドＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１ａ（R&D Systems、Ｈｕｍａｎ  ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１α  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅ  Ｋｉｔ  ＮＮＳ００）の結合によって、製造業者の手順に従って確認した（図示せず）。
【０５１０】
実施例２．３．安定にトランスフェクトしたＣＸＣＲ４ラクダ科動物細胞の生成
安定なＣＸＣＲ４細胞株の生成のために、ｐＣＤＮＡ３．１−ｈＣＸＣＲ４プラスミドを、不死化ラクダ腎臓（ＣＡＫＩ）細胞にトランスフェクトした（Nguyen et al. 2001. Adv. Immunol. 79:261-296）。（実施例２．２に記載されるような）１２Ｇ５抗体での蛍光染色によって示される高い発現密度を示す個々のトランスフェクト細胞を、マイクロタイタープレートウェルにおける単一細胞の沈着によってクローニングした（ＡＣＤＵ付きのＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ、Becton Dickinson）。クローン細胞株を選択抗生物質を含有する培地中で増殖させ、（実施例２．２のように）フローサイトメトリーによってＣＸＣＲ４発現を確認した後、複数の均質で安定なＣＸＣＲ４  ＣＡＫＩトランスフェクタントが得られた。非トランスフェクトラクダ科動物細胞と比べて１１４倍の蛍光シフトを示す（高レベルのＣＸＣＲ４膜発現を示唆する）１つのクローンを、さらなる実験に選択した（図２．１、パネルＢ）。
【０５１１】
実施例２．４．ｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ４の皮内送達は、ラマにおいて検出可能な標的特異的体液性免疫応答を誘導するのに十分である
獣医学部倫理委員会（ゲント大学、Belgium）による認可の後、４頭のラマ（ラマ３８９、ラマ４０１、ラマ４０２及びラマ４０３）を遺伝子免疫付与に割り当てた。ＣＸＣＲ４をコードするＤＮＡの投与の直前に、ラマの肩甲骨を覆う２５０ｃｍ２の皮膚領域を剪毛し、実施例１．２に記載されるように市販の脱毛クリームを塗布することによって残った全ての毛組織を除去する。０．９％生理食塩水に溶解したＤＮＡを毛のない皮膚に、３ノズルヘッドを用いた自動ジェット式注射器（dermojet）Ｖａｃｃｉ−ｊｅｔ（Akra DermoJet France）を使用する無針ジェット注射によって投与した。４回のＤＮＡ投与（０日目、１４日目、２８日目及び４２日目）全てについて、ラマ１頭当たり２ｍｇのＤＮＡを適用し、複数の隣接するスポットに分散させた。ＤＮＡを含有する液体の皮内（ＩＤ）適用の成功は、皮膚上に液体を含有する表在性の水疱又は丘疹が２時間ほど形成されることによって示される。各々のラマから、１０ｍｌの免疫前血清試料及び遺伝子ワクチン接種手順中の異なる血清試料を回収し、抗原特異的体液性応答をモニタリングした。２５０倍〜５０００倍希釈の免疫前試料（０日目）及び免疫血清試料（５３日目；４回目のＤＮＡ適用後１１日目に回収した）中に存在するラマ免疫グロブリンの結合を、非トランスフェクトラクダ科動物細胞に対するＣＸＣＲ４トランスフェクト（tranfected）ラクダ科動物細胞の染色差について、フローサイトメトリーによってスコア付けした。ラマ全ＩｇＧ（通常抗体＋重鎖抗体）に結合した細胞を、ヤギ抗ラマＩｇＧ（カタログ番号Ａ１６０−１００；Bethyl）、その後のＰＥ結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（JacksonImmunoResearch Laboratories、カタログ番号１１５−１１５−１６４）での二次染色によって検出した。ラマ４０３を除いて、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＣＡＫＩ細胞の５３日目の免疫血清全てについて（最低でも試験した３つの希釈率について）、免疫前レベルと比べて明らかに増大した平均細胞蛍光（ＭＣＦ）が観察されたが、同様に染色した非トランスフェクトＣＡＫＩ細胞のＭＣＦ値は低いままであった（図２．２）。このことから、ＩＤ遺伝子免疫付与の後、４頭のうち３頭のラマが未変性の標的立体構造に対して特異的体液性応答を示すことが示唆された。
【０５１２】
実施例２．５．遺伝子免疫付与に続く単回細胞追加免疫は、ＣＸＣＲ４特異的血清変換を有意に増大させる
ヒト又は齧歯類の宿主細胞バックグラウンドと比べて高い全体的配列類似性による、ラマにおけるラクダ科動物細胞表面マーカーの免疫原性の減少を見込んで、ラクダ科動物細胞を免疫応答をＣＸＣＲ４に指向付ける免疫原細胞バックグラウンドとして選択した。培養したＣＸＣＲ４発現ラクダ科動物細胞（実施例２．３）を新たに採取し、Ｄ−ＰＢＳで２回洗浄して、全ての培養培地混入物を除去した。細胞を２ｍＬのＤ−ＰＢＳに再懸濁し、動物施設への移送の間氷上で保管した。ラマ３８９、ラマ４０１、ラマ４０２及びラマ４０３に、最後のＤＮＡ投与の最低３週間後に２Ｅ７個のｈＣＸＣＲ４トランスフェクトラクダ科動物細胞を皮下（ＳＣ）注射した。細胞追加免疫後１１日目に、免疫血液試料を各々のラマから回収し、ＣＸＣＲ４血清力価を実施例２．４に記載されるように求めた。４頭全てのラマ（２５０倍〜２２５０倍の血清希釈率）について、ＤＮＡ投与単独の後（５３日目）に得られた血清試料と比べて増大したＭＣＦ値がＣＸＣＲ４トランスフェクトラクダ科動物細胞で検出されたが、未トランスフェクトラクダ科動物細胞に結合した血清は、３頭の動物においてわずかにしか増大しなかった。これらの結果から、単回細胞追加免疫が４頭全てのラマについてＣＸＣＲ４応答の規模の増大をもたらしたことが示される（図２．２及び表２．１）。４頭の遺伝子免疫付与ラマと並行して、ラマ２１７及びラマ２１８から回収した６２日目試料について血清力価を求めた（図２．２及び表２．１）。これらのラマを、６回のＣＸＣＲ４−ＨＥＫ２９３細胞注射（１回の用量当たり１Ｅ７個〜４Ｅ７個の細胞）によって一週間の間隔で免疫付与した（特許文献６に記載）。２頭のうち１頭のラマ（２１８）のみが、未トランスフェクト対照細胞と比べて、ＣＸＣＲ４発現細胞に対して強い血清応答を示した（ｎ＝２；代表的な一例を示す）。検出されたＭＣＦ値から、実行した遺伝子免疫付与手順（ＤＮＡ＋細胞追加免疫）によって、完全細胞免疫付与と比べて同様の又はより良好な規模の標的特異的力価が生じることが示唆された。
【０５１３】
表２．１．ＣＸＣＲ４特異的ナノボディＢ細胞系列の発見概要
【表２７】
0006034435.tif 000062
【０５１４】
実施例２．６．遺伝子免疫付与はＣＸＣＲ４特異的ナノボディを同定するのに十分である
ラマ３８９、ラマ４０１、ラマ４０２、ラマ４０３から、４つの１５０ｍｌの血液試料を、最後のＤＮＡ投与後３日目及び９日目（それぞれＰＢＬ１及びＰＢＬ２として記号化される）、並びに細胞追加免疫後４日目及び８日目（それぞれＰＢＬ３及びＰＢＬ４）に回収した。さらに、細胞追加免疫後３日目〜４日目に、触知可能な弓リンパ節（bow lymph node）（ＬＮ）の生検材料を各々のラマから局所外科手術によって回収した。末梢血リンパ球をＰＢＬ１〜ＰＢＬ４試料から、実施例１．４に記載されるようにＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅでの密度勾配遠心分離法によって精製した。リンパ球を内包する免疫組織全てから、（実施例１．４に記載されるように）全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ調製の鋳型として使用した。遺伝子免疫付与したラマの各々から、２つの別個のライブラリを作成した（表２．２）：一方のライブラリはプールしたＰＢＬ１＋ＰＢＬ２のｃＤＮＡに由来し（「ＤＮＡ」ライブラリ）、もう一方はプールしたＰＢＬ３＋ＰＢＬ４及びＬＮに由来するものであった（ポスト追加免疫又は「ＰＢ」ライブラリ）。
【０５１５】
表２．２．親Ｖ生殖細胞系列配列に対する５個のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟ＣＸＣＲ４ナノボディファミリーの遺伝的距離
【表２８】
0006034435.tif 000063
１欠失又は付加を含むあらゆる変化が突然変異の数を算出する上で考慮される。
【０５１６】
フローサイトメトリーによって検出されたポリクローナル血清応答は、未変性ＣＸＣＲ４に対する標的特異的ラマ抗体の存在を示唆しているが、力価の規模は必ずしも、ｉ）抗ＣＸＣＲ４重鎖抗体媒介性クローン多様性、ｉｉ）標的に対するモノクローナルナノボディの親和性、及びｉｉｉ）応答幅（例えば個々のナノボディの対象となるＣＸＣＲ４エピトープ）を予測するものではない。これらをモノクローナルレベルで特性化するために、ＣＸＣＲ４特異的ナノボディをファージディスプレイによって同定した。並列選択を、８個のＤＮＡ及びＰＢライブラリ、並びに細胞免疫付与したラマから作成した２個のさらなるライブラリの各々に対して行った。ライブラリを、最後の細胞注射後４日目及び８日目に回収したＰＢＬ１＋ＰＢＬ２に由来するプールしたｃＤＮＡから同様にして（similarly in a similar manner）作成した。
【０５１７】
ＣＸＣＲ４特異的ナノボディを選択するために、実施例１．４に記載されるように１０個全てのライブラリから組み換えファージをレスキューした。１回目の選択では、ＣＸＣＲ４トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞に由来する、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc）に固定化した膜小胞１０単位を、低脂肪粉乳（ＰＢＳ中Ｍａｒｖｅｌｌ  ４％）でブロッキングした。レスキューしたファージとの２時間のインキュベーションの後、室温で１５分間トリプシン溶出（１ｍｇ／ｍｌ）を行い、続いてＰＢＳで１５回洗浄した。０．８ｍＭ  プロテアーゼ阻害剤ＡＢＳＦを適用することによってプロテアーゼ活性を即座に中和した。全てのファージアウトプットを、対数的に増殖した大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、個々のナノボディクローンの解析のために寒天プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ＋２％グルコース）にプレーティングした。１回目のファージアウトプットをレスキューし、プレートに固定化したＣＸＣＲ４膜小胞１０単位又は１単位に対して２回目の選択を行った。非トランスフェクトＨＥＫ２９３対照膜小胞から溶出したファージに対する、ＣＸＣＲ４膜小胞から溶出したファージの数の比率として濃縮係数を算出した。１０個のうち８個のライブラリについて、２回目のアウトプットが５を超える濃縮係数を示した（データは図示せず）。プレートに固定化したｈＣＸＣＲ４膜小胞１０単位又は１単位に対して選択した２回目のファージアウトプットを、ＴＧ１細胞に感染させ、寒天プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ＋２％グルコース）にプレーティングした。ＣＸＣＲ４膜小胞に対して選択した（１回目及び２回目）各々のアウトプットの４５個の個々のクローンを、１ｍｌの９６ディープウェルプレートにおいて培養し、実施例１．４に記載されるようにペリプラズム抽出物（ＰＥ）を調製した。
【０５１８】
ＣＸＣＲ４特異性を２つの異なる受容体フォーマットを用いる２回のスクリーニングアッセイによって決定した。第１の方法では、２単位のＣＸＣＲ４膜小胞を、４℃で一晩のコーティングによって９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに１ウェル毎に固定化した。ＰＢＳ中４％Ｍａｒｖｅｌでブロッキングした後、１０倍希釈のＰＥを添加し、結合したナノボディ（ｃ−Ｍｙｃタグを内包する）を、マウス抗Ｍｙｃ及びウサギ抗マウスＨＲＰでの逐次検出によって検出した。ｈＣＸＣＲ４膜小胞で対照膜小胞と比べて最低で５倍のＥＬＩＳＡシグナルの増大を示す５０１個のナノボディを、ＣＸＣＲ４特異的であると見なした。２種類の陰性対照ＰＥ（一方は無関連ナノボディを発現するＴＧ−１から、もう一方は空の発現ベクターを含有するＴＧ−１から生成した）の対応する平均比は、それぞれ１．１±０．８及び１．２±０．７であった。このスクリーニング法から、各々の選択アウトプットのヒット率を算出し、表２．１にまとめた。異なる免疫付与戦略に従う２回の選択アウトプット（１０Ｕの膜小胞）の平均ヒット率に基づくと、発見効率が「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー及び「細胞」レパートリーについて、それぞれ１４％、７１％及び９１％であると算出された（図２．３）。ＣＸＣＲ４に対する検出可能な重鎖抗体（ＨｃＡｂ）力価の非存在下であっても（表２．１）、ラマ４０３  ＤＮＡライブラリに対する１回目及び２回目の選択後のそれぞれ４％及び３１％のヒット率によって示されるように、標的特異的ナノボディが同定された。ヒット率から、単回細胞追加免疫後では、単回の選択が全てのＨｃＡｂラマレパートリーからＣＸＣＲ４特異的ナノボディを同定するのに十分であることが示唆される（表２．１中のヒット率４％〜３６％）。
【０５１９】
５０１個全てのＣＸＣＲ４特異的ナノボディをシークエンシングし、重複するナノボディ（同一のアミノ酸配列）を除外した。これにより、７０個の異なるナノボディＢ細胞系列に属する１７１個の特有の配列が同定された（表２．１）。ナノボディは、そのＣＤＲ３領域が高いアミノ酸配列類似性を示し、かつ同じ長さである場合、同じＢ細胞系列又はファミリーに属する。ＣＤＲ３は主に抗原相互作用に寄与すると予想され、結果として同じファミリーに属するナノボディは同じエピトープに結合すると推定される。１頭のラマにつき同定されたＣＸＣＲ４特異的ナノボディファミリーの平均数はそれぞれ、細胞免疫付与後は１２．５（２１７、２１８）、ＤＮＡ免疫付与によって１１．２（ＤＮＡ＋細胞追加免疫；３８９、４０１、４０２及び４０３）である。１つのナノボディファミリーに属するナノボディアミノ酸配列変異体（最低で１つのアミノ酸残基の突然変異）の数は、１個〜最大で１７個のファミリー変異体の範囲であった。
【０５２０】
ＣＸＣＲ４特異的結合を、ヒトＣＸＣＲ４を発現する細胞に結合するナノボディをフローサイトメトリーによって測定する二次スクリーニングアッセイにおいて確認した。ここで、５倍希釈のＰＥを、親の又はＣＸＣＲ４をトランスフェクトしたラクダ科動物細胞（２×１０５個の細胞）と共にインキュベートし、ナノボディ結合をマウス抗Ｍｙｃ（SerotecのＭＣＡ２２００）、続いて抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（JacksonImmunoResearch Laboratoriesの１１５−１１５−１６４）検出抗体によって測定した。全ての試料について、ＣＸＣＲ−４発現細胞に対するＭＣＦ値と、未トランスフェクト対照細胞に対するＭＣＦとの比率を算出した。無関連ナノボディが一貫して２．４未満の比率を示した一方で、６１個のナノボディファミリー（少なくとも１つのファミリー成員）について１０を超える比率が検出され、それにより未変性ＣＸＣＲ４に対するこれらのファミリーの特異性が確認された。残りの９個のナノボディファミリーのうち、単一の成員からなる７個のファミリー（７ファミリー）が、膜小胞でのＥＬＩＳＡにおいて測定された５倍〜１０倍の吸光度比にもかかわらず３未満の比率を示した。残りの２個のナノボディファミリー（２ファミリー；全ての単一成員のファミリー）については、吸光度比（ＥＬＩＳＡ）はそれぞれ１４４及び７０であり、ＭＣＦ比（ＦＡＣＳ）はそれぞれ２．２及び２．３であった。
【０５２１】
実施例２．７．免疫付与法としての皮内ＤＮＡ投与は、ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４受容体相互作用を調節するナノボディを同定するのに十分である
ＣＸＣＲ４特異性のスクリーニング（ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳによって決定した）に続いて、１７１個全てのＣＸＣＲ４特異的ナノボディ変異体を、（特許文献６に記載されるように）リガンドＳＤＦ−１とその受容体との相互作用を遮断するそれらの能力について試験し、受容体機能を調節するナノボディを同定した。つまり、４０ｐＭの［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１リガンド（自家（in-house）標識した）を、２μｇのｈＣＸＣＲ４／ＨＥＫ２９３膜抽出物と、ナノボディ競合相手の１０倍希釈のＰＥ（実施例１．４に記載されるように作製した）の存在下又は非存在下で結合させた。４℃で１時間のインキュベーションの後、膜抽出物を洗浄し、結合リガンドの１分当たりの放射能カウント（ｃｐｍ）の全量を求めた。膜抽出物への放射標識したリガンドの非特異的結合（非ＣＸＣＲ４関連）を、ＣＸＣＲ４受容体からの全ての放射性リガンドと競合する過剰の非標識ＳＤＦ−１（１００ｎＭ）の添加によって決定した。各々のプレートの非特異的結合値を、全結合（ナノボディの非存在下でのｃｐｍ）及び各々のナノボディについて得られたｃｐｍ値から減算し、ナノボディの存在下での残留［１２５Ｉ］ＳＤＦ−１結合率（％）（ＳＤＦｒｅｓ）を算出した。リガンドディスプレーサとしてスコア付けされたナノボディファミリーが多数同定され（表２．１）、リガンドと競合するナノボディが各々の免疫付与戦略（ＤＮＡレパートリー、ＰＢレパートリー及び細胞レパートリーを表す）から同定されたことが示される。
【０５２２】
実施例２．８．異なる免疫付与戦略後に同定されたナノボディのエピトープマッピング
各々の免疫付与戦略からの標的特異的ナノボディ（競合相手及び結合因子）の選択アウトプットを、さらなる特性化のために、Ｈｉｓ６及びＭｙｃタグと融合させた溶解性ナノボディの発現及び精製を可能にする発現ベクターに再クローニングした。発現はＩＰＴＧ誘導後に３７℃で大腸菌において行う。細胞培養物を遠心した（spinning）後、ペレットを凍結融解し、ｄＰＢＳに再懸濁することによってペリプラズム抽出物を調製する。この抽出物を固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）の出発材料として使用する。ナノボディを２５０ｍＭイミダゾールを用いてカラムから溶出させ、続いてｄＰＢＳで脱塩する。全てのナノボディの純度及び完全性をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検証する一方で、タグの存在をウェスタンブロット法によって検証する。
【０５２３】
ＤＮＡワクチン接種戦略（ＤＮＡのみ又はその後の細胞追加免疫）によって、細胞免疫付与戦略の後同定されたナノボディと比べて、異なるエピトープに対するナノボディが同定されるかを決定するために、多数のエピトープビニングアッセイを実施する。これらは、アミノ酸残基１〜１４に相当するＣＸＣＲ４のＮ末端ペプチドへの結合（ＥＬＩＳＡ）、Ｎ末端及び細胞外ループ領域内に点突然変異を導入したＣＸＣＲ４突然変異体の受容体への結合、又はＮ末端若しくは細胞外ループが関連ＧＰＣＲの配列によって個々に置き換わったＮ末端切断型ｈＣＸＣＲ４受容体若しくはＣＸＣＲ４キメラ等の突然変異ＣＸＣＲ４への結合である。代替的には、エピトープマッピングを本発明者らの精製ナノボディパネルと、ｉ）４Ｇ１０（Santa Cruz、ＳＣ５３５３４）等のエピトープが記載されている（Carnec etal. 2005, J. Vir. 1930-33）、直鎖状のＮ末端に結合するモノクローナル抗体又はＦａｂ断片、ｉｉ）アンタゴニストＡＭＤ３１００（SigmaのＡ５６０２）等の小分子阻害剤、及びｉｉｉ）蛍光マーカー又はビオチンで標識した他のナノボディを含む、異なるＣＸＣＲ４特異的化合物との競合実験を用いて行う。
【０５２４】
実施例２．９．遺伝子免疫付与に続く細胞追加免疫は、異なるナノボディレパートリーを生じる
ラマ３８９、ラマ４０１、ラマ４０２及びラマ４０３から、（シークエンシングした２２５個のうち）１２３個のナノボディ配列変異体からなる４５個のＣＸＣＲ４特異的ナノボディファミリーを同定した。これら１２３個の変異体を各々、「ＤＮＡ」ライブラリ又は「ＰＢ」ライブラリに割り当てた（同一のアミノ酸配列を有する変異体はどちらのライブラリからも得られない）。これら４５個のファミリーのうち５個（全ファミリー多様性の１１．１％）についてのみ、同じファミリーに属するナノボディ変異体が、同じ動物に由来する「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリから同定された（表２．２）。これら５個のファミリーは、非冗長クローンの３４％に相当する４２個の異なるナノボディ変異体を含む。残りのナノボディレパートリー（７６％）が、「ＤＮＡ」ライブラリ又は「ＰＢ」ライブラリのいずれかから同定され、遺伝子免疫付与に続く細胞追加免疫によって、遺伝子免疫付与のみの後作成したライブラリのパニングによって容易には同定されないナノボディレパートリーのｉｎ  ｖｉｖｏ成熟がもたらされることが示唆される（図２．４）。遺伝子免疫付与のみによって異なるナノボディレパートリーが得られ、細胞追加免疫の後レパートリーが失われる可能性があることが示唆される。
【０５２５】
実施例２．１０．「ＤＮＡ」レパートリーの平均効力は、「ＰＢ」レパートリー及び「細胞」レパートリーよりも低い
先の実施例によって、「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリの両方から限られた数のファミリーしか同定されないことが示される。このレパートリーサブセットに対する細胞追加免疫の効果を検証するために、ｉ）特定のナノボディファミリー内の各々の変異体について、親Ｖ遺伝子生殖細胞系列配列に対する遺伝的距離を算出すること（アミノ酸又はヌクレオチドの突然変異の数；ＣＤＲ３領域及びＦＲ４領域をコードするＤ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントを除外する）、及びｉｉ）ナノボディ変異体の効力を比較することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏ成熟をスコア付けした。遺伝的距離の算出については、全てのライブラリについて増幅エラーの比例的（proportional）導入を推定した（ＰＣＲによる増幅を含むナノボディレパートリークローニング法によって引き起こされる突然変異の数を制限するために、プルーフリーディングポリメラーゼが使用されている）。これら５個のファミリーのうち３個について、「ＰＢ」由来ナノボディは親Ｖ遺伝子生殖細胞系列配列に対して平均して１２個、１３個及び９個のアミノ酸突然変異（又は２６個、１９個及び１３個のヌクレオチド突然変異）を示した一方で、「ＤＮＡ」ライブラリに由来するナノボディについてはそれぞれ１０個、１２個及び５個（又はヌクレオチドレベルでは１９個、１７個及び５．５個）であり、「ＰＢ」由来ナノボディが「ＤＮＡ」由来ナノボディよりも親Ｖ遺伝子生殖細胞系列から離れている（したがってより成熟している）ことが示唆された。これら３個のファミリーについて、この「ＰＢ」ナノボディのより高い成熟度は、「ＰＢ」由来ナノボディ対「ＤＮＡ」由来ナノボディの平均結合効力（実施例２．６に記載されるようなＭＣＦ比）が３個のファミリーそれぞれについて、それぞれ５５３対４６、２６１対１０５、５５６対５０５であることにも反映されている（ＦＡＣＳの結果であるが傾向はＥＬＩＳＡにおいて確認した、表２．２を参照されたい）。
【０５２６】
ラマ３８９、ラマ４０１、ラマ４０２及びラマ４０３に由来する１２２個の特有のナノボディ（「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリに由来するそれぞれ２０個及び１０２個のナノボディ変異体）の全てについて濃度依存性標的結合を解析する場合、平均ＭＣＦ比（ＦＡＣＳ）は、「ＰＢ」ライブラリ及び「ＤＮＡ」ライブラリに由来するナノボディについて、それぞれ４２７及び１９６であった（図２．５）。「細胞」ライブラリ（ラマ２１７又はラマ２１８）に由来する４９個のナノボディ変異体から算出された、対応する数値は５３８である。この傾向をＥＬＩＳＡアッセイによって得られた数値により確認する：平均吸着比（実施例２．６に記載されるように算出した）は「ＰＢ」ライブラリ及び「ＤＮＡ」ライブラリに由来するナノボディについて、それぞれ３６．２及び２３であった。「細胞」ライブラリ（ラマ２１７又はラマ２１８）に由来する４９個のナノボディ変異体から算出された、対応する数値は２８である。このことから、「ＤＮＡ」ライブラリに由来するナノボディ変異体の平均遺伝的距離が、「ＰＢ」ライブラリから同定されたナノボディよりも密接に親生殖細胞系列配列に関連することが示唆され、したがってより成熟度が低いと考えられる。さらに、３つのレパートリーの平均結合効力を解析したところ、「ＤＮＡ」レパートリーは「ＰＢ」レパートリーよりも効力が低く、「ＰＢ」レパートリーは「細胞」レパートリーと同様の効力を有するようである（図２．５）。
【０５２７】
しかしながら、第４のファミリーについては驚くべきことに、「ＤＮＡ」ライブラリから得られた変異体が、「ＰＢ」ライブラリから同定されたナノボディと比べて、それ以上のｉｎ  ｖｉｖｏ成熟度を示した（表２．２）。このファミリーからの「ＤＮＡ」由来クローンは、Ｖ生殖系列と比べて１５個のアミノ酸（又は２１個のヌクレオチド）突然変異を示すが、「ＰＢ」由来ナノボディについての対応する平均値は１４．６（アミノ酸）又は２１．７（ヌクレオチド）である。このことは、「ＤＮＡ」ナノボディ及び「ＰＢ」ナノボディのＦＡＣＳアッセイにおける平均効力にも反映される（それぞれ７５５及び６７１である）。第５のファミリーについては、「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリの成熟は、４つの解析法（アミノ酸突然変異又はヌクレオチド突然変異、ＦＡＣＳ及びＥＬＩＳＡ）によると「ＤＮＡ」由来ナノボディと「ＰＢ」由来ナノボディとの間に一貫した順位が検出されないため、極めて同様であるとスコア付けされた。
【０５２８】
３つの異なるレパートリーの平均結合効力の間には統計的に有意な差は見られないが、「ＰＢ」レパートリーの平均効力は、「細胞」ライブラリから得られた平均効力と同様であり、これらは「ＤＮＡ」レパートリーの平均効力よりも高い。しかしながら、モノクローナルレベルでは、同様の結合効力を有するナノボディは、細胞追加免疫又は細胞免疫付与の後に同定された場合と比べると、遺伝子免疫付与のみの後に同定されている。
【０５２９】
実施例３．リガンド作動性イオンチャネルに対するナノボディの同定
複数の膜貫通ドメインを内包する膜結合標的に対する遺伝子免疫付与の実行可能性を実証する第２の例として、マウスプリン受容体Ｐ２Ｘ７を選択した。
【０５３０】
Ｐ２Ｘ７は、高濃度の外因性（exogeneous）ＡＴＰ、又はＮＡＤ依存性ＡＤＰリボシル化によって活性化される、リガンド依存性イオンチャネルである。この機能的チャネルは、各々が２つの膜貫通領域及び２８５個のアミノ酸残基の単一の細胞外ループからなる３つのＰ２Ｘ７タンパク質サブユニットによって形成される。プリン受容体の活性化は立体構造変化を誘導し、大きな非選択的な孔の形成をもたらし、最終的に膜のブレブ形成及びアポトーシスを引き起こす。
【０５３１】
Ｐ２Ｘ７による遺伝子免疫付与は、ウサギ及びラットにおいてポリクローナル及びモノクローナル抗Ｐ２Ｘ７抗体を首尾よく産生させることが以前に実証されている（Adriouch et al. 2005, Cell Immun 236, 72-77）。ここで、本発明者らは、遺伝子免疫付与に続いてリガンド誘導性Ｐ２Ｘ７活性化を調節するＰ２Ｘ７特異的ナノボディの同定を実証した。
【０５３２】
実施例３．１．バリスティック法を用いた遺伝子免疫付与によるラマにおけるｍＰ２Ｘ７に対する体液性応答の誘導
遺伝子銃免疫付与は、マウス、ウシ及びラマを含む様々な動物において体液性応答を誘導する皮内ＤＮＡ送達の効率的な方法であることが示されている（Koch-Nolte 2007, Faseb. J. 21, 3490-3499）。このバリスティック投与法では、高圧下でＤＮＡをコーティングした金微粒子を非常に免疫能力の高い皮膚組織に送達し、ランゲルハンス抗原提示細胞等の真皮中に存在する免疫エフェクター細胞を直接標的化し、トランスフェクトする。これによりｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクション効率の増大がもたらされ、結果として持続的な抗原提示が体液性免疫応答の誘導を刺激すると考えられる。
【０５３３】
３頭のラマ（４０７、４１４及び４１７）を、マウスＰ２Ｘ７（ｍＰ２Ｘ７）をコードするＤＮＡによって免疫付与した。ＤＮＡ送達に使用した装置は、ヘリオス遺伝子銃（Biorad）であった。エンドトキシンフリーｍＰ２Ｘ７発現プラスミドｐＣＤＮＡ６．１−ｍＰ２Ｘ７（Adriouch et al. 2005, Cell Immun 236, 72-77）を、１μｍの金粒子（Biorad、カタログ番号１６５２２６３）に製造業者の取扱説明書に従ってコーティングした。ラマの頸部領域の皮膚を実施例１．２のように準備した。各々のラマに２週間の投与間隔で４回の抗原投与を行った。１２ショットのプラスミド結合金粒子からなる各々の投与（１ショット当たり０．５ｍｇの金粒子に結合したＤＮＡ１μｇ）を、６００ｐｓｉに設定した圧力によって皮膚内に適用した。最後の遺伝子免疫付与の３週間後、全てのラマに２×１０７個のｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞の単回追加免疫を行った。一定間隔で血液試料を回収し、体液性免疫応答の誘導を経時的にモニタリングした。Ｂ細胞組織の単離のために、４回目のＤＮＡ免疫付与後３日目及び９日目（ＰＢＬ１及びＰＢＬ２）、並びに細胞追加免疫後４日目及び８日目（ＰＢＬ３及びＰＢＬ４）にこれらの動物から血液を回収した。弓領域の触知可能なリンパ節（ＬＮ）の生検材料を、細胞追加免疫後４日目に採取した。
【０５３４】
別の３頭のラマ（４１３、４１５及び４１６）を、２×１０７個の安定にトランスフェクトしたｍＰ２Ｘ７  Ｈｅｋ２９３細胞（Adriouch et al. 2005, Cell Immun 236, 72-77）によって２週間の間隔で４回、弓領域の皮下に免疫付与した。４回目の免疫付与後４日目及び８日目にこれらの動物から血液を回収し、４回目の免疫付与後４日目にＬＮ生検材料を採取した。
【０５３５】
実施例２．４に記載されるのと同様にして、未トランスフェクトＣＨＯ細胞及びｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＣＨＯ細胞を用いたフローサイトメトリーによって、血清応答をｍＰ２Ｘ７反応性についてモニタリングした。ＤＮＡ免疫付与したラマについては、ｍＰ２Ｘ７血清変換を免疫前血清試料（０日目）、最後のＤＮＡ免疫付与後に回収した血清試料（５１日目、ＰＢＬ２）及び細胞追加免疫後の血清試料（７１日目、ＰＢＬ４）の間で比較した。４回の細胞注射によって免疫付与したラマについては、ｍＰ２Ｘ７特異的力価を免疫前試料と、５２日目に回収した免疫試料との間で比較した。図３．１に、６頭全てのｍＰ２Ｘ７によって免疫付与したラマの全ＩｇＧ（通常抗体及び重鎖抗体）免疫応答を示す。ラマ４０７を除いて、免疫前レベル（最低で３つの希釈物を試験した）と比べて、細胞追加免疫後に回収した７１日目の免疫血清試料によって、ｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＣＨＯ細胞の平均細胞蛍光（ＭＣＦ）の明らかな増大が観察された。非トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＣＦ値は低いままである。遺伝子免疫付与手順（ＤＮＡ初回刺激、その後の単回細胞追加免疫）の後、３頭のうち２頭のラマが未変性標的立体構造に対する特異的体液性応答を示した。複数回の細胞注射を受けた３頭の動物は全て、検出可能なｍＰ２Ｘ７特異的血清力価を示す（５２日目）。無関連ＣＨＯ細胞表面抗原に対するバックグラウンド応答は、遺伝子免疫付与（ＤＮＡ＋細胞追加免疫）によって免疫付与した動物よりも、これらの動物において高い。
【０５３６】
実施例３．２：遺伝子銃を用いたヒト及びマウスのＰ２Ｘ７の遺伝子カクテル免疫付与
遺伝子免疫付与の利点の１つは、単に異なる標的をコードする遺伝子を同じ動物に投与することによって、複数の標的に対する免疫応答を生じる汎用性である。カクテル免疫付与は、免疫応答を特異的立体構造に偏らせるためにも使用することができる。カクテル免疫付与の例として、本発明者らは、図３．２に示されるような８０．５％の全体的配列同一性を共有するヒト（ｈ）Ｐ２Ｘ７及びｍＰ２Ｘ７オーソログを、ラマの遺伝子銃ＤＮＡ免疫付与に選択する。また、Ｐ２Ｘ７チャネルに対するそのオープン立体構造での免疫応答の誘導を可能にするために、実施例３．１に記載される免疫付与戦略に２つの変更を加えた。まず、カクテル免疫付与を、ｍＰ２Ｘ７及びｍＡｒｔ２．２（ＡＤＰリボシル化を媒介することによるＰ２Ｘ７の既知の活性化因子である）をコードするプラスミドの混合物によって適用した。次に、細胞追加免疫の前にＰ２Ｘ７トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞をＡＴＰで処理してチャネルを活性化した後、オープン立体構造を保存するためにパラホルムアルデヒドを用いて細胞を固定した。
【０５３７】
２頭のラマ（４０５及び４１８）を、遺伝子銃による遺伝子免疫付与を用いて、ｈＰ２Ｘ７及びｍＰ２Ｘ７の両方によって同時に免疫付与した。エンドトキシンフリーｐＣＤＮＡ６．１−ｍＰ２Ｘ７及びｐＣＤＮＡ６．１−ｍＡｒｔ２．２（１：１０比）の混合物を、１μｍの金粒子に結合させた。同様に、ｈＰ２Ｘ７をコードするｐＣＤＮＡ６．１−ｈＰ２Ｘ７プラスミドを１μｍの金粒子に結合させた。遺伝子免疫付与を実施例３．１に記載されるように行った（１μｇ／０．５ｍｇ／ショット）。頸部の左側面をｍＰ２Ｘ７／ｍＡｒｔ２．２複合体での免疫付与に使用し、右側面をｈＰ２Ｘ７複合体での免疫付与に使用した。４回目のＤＮＡ免疫付与の３週間後、両方のラマを２×１０７個のＡＴＰ処理した、固定したｍＰ２Ｘ７−Ｈｅｋ２９３細胞（左側）及びｈＰ２Ｘ７−Ｈｅｋ２９３細胞（右側）で同時に追加免疫した。３日後に、２回目の追加免疫を２×１０７個のＡＴＰ処理した、固定したｈＰ２Ｘ７−Ｈｅｋ２９３細胞を用いて行った。Ｂ細胞組織の単離については、４回目のＤＮＡ免疫付与後３日目及び９日目（ＰＢＬ１及びＰＢＬ２）、並びに１回目の細胞追加免疫後４日目及び８日目（ＰＢＬ３及びＰＢＬ４）にこれらの動物から血液を回収した。１回目の細胞追加免疫後３日目に、左側の弓領域からＬＮ生検材料を採取した。
【０５３８】
両方のラマのｍＰ２Ｘ７に対する全ＩｇＧ血清力価応答を、実施例３．１に記載されるように、未トランスフェクト細胞及びｍＰ２Ｘ７トランスフェクト細胞を用いたフローサイトメトリーによってモニタリングした。ここで、免疫前血清試料（０日目）を、ＤＮＡ免疫付与後（５１日目、ＰＢＬ２）及びそれぞれの細胞追加免疫後（７１日目、ＰＢＬ４）に採取した試料と比較した。ラマ４１８は、ＤＮＡ免疫付与後にｍＰ２Ｘ７に対する明らかな全ＩｇＧ免疫応答を示し、これは細胞追加免疫後にさらに増強されたが、ラマ４０５のみが細胞追加免疫後にｍＰ２Ｘ７反応性を示す（図３．３）。両方のラマについて、未トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＭＣＦ値は低いままである。ヒトＰ２Ｘ７に対する血清反応性は求めなかった。要するに、遺伝子免疫付与及び続く細胞追加免疫後に、５頭のうち４頭のラマが明らかなｍＰ２Ｘ７血清応答を示す。
【０５３９】
実施例３．３：遺伝子免疫付与後の重鎖抗体応答の誘導
また、重鎖抗体（ＨｃＡｂ）媒介性ｍＰ２Ｘ７特異的応答の誘導を、安定なＨｅｋ２９３−ｍＰ２Ｘ７トランスフェクタントに対するラマＩｇＧアイソタイプ特異的モノクローナル抗体を用いたＦＡＣＳによってモニタリングした。この設定を試験するために、ラマ血清の希釈物（ＤＮＡ免疫付与したラマについては２００倍、細胞免疫付与したラマについては１０００倍）を、１×１０７個のＷＴ  Ｈｅｋ２９３細胞に室温で１時間前吸着させて（pre-adsorbed）、細胞バックグラウンド抗体を枯渇させた。次に、５×１０５個のＨｅｋ２９３−ｍＰ２Ｘ７又は未トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞を、０．１ｍＬの前吸着させた血清と共に４℃で０．５時間インキュベートし（内在化を防ぐため）、その後結合したＨｃＡｂをマウス抗ラマＩｇＧ２及びＩｇＧ３抗体の混合物によって検出し（Daley et al. 2005. Clin Diagn Lab Immunol 12: 380-386）、続いて抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch）で染色した。通常ラマ抗体の結合は抗ラマＩｇＧ１を用いて検出した。ｍＰ２Ｘ７染色の対照として、ラットｍＡｂ  Ｈａｎｏ４３が挙げられる（Adriouch et al. 2005, Cell Immun 236, 72-77）。Ｈｅｋ２９３−ｍＰ２Ｘ７によって免疫付与したラマのｍＰ２Ｘ７特異的ＩｇＧ血清力価は、高レベルのＨｅｋ２９３細胞バックグラウンド結合のために求めることができなかったが、そのような高いバックグラウンドはＤＮＡ免疫付与したラマ４０７については観察されなかった。図３．４に、ｍＰ２Ｘ７（ラマ４１４及びラマ４１７）又はｍＰ２Ｘ７及びｈＰ２Ｘ７のカクテル（ラマ４０５及びラマ４１８）による遺伝子免疫付与後の通常抗体（パネルＡ）及びＨｃＡｂ（パネルＢ）媒介性血清応答を示す。ＤＮＡワクチン接種のみの後、ラマ４１４及びラマ４１８の血清は、通常Ａｂ媒介性応答について非トランスフェクトＷＴ  Ｈｅｋ２９３細胞に対し、ｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞の明らかなＭＣＦシフトを示し、（実施例３．１及び実施例３．２において）全ＩｇＧによって検出された血清変換が確認された。細胞追加免疫によって、非トランスフェクトＷＴ  Ｈｅｋ２９３細胞に対し、ｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞の中程度（ラマ４１７）から明らかな（ラマ４０５、ラマ４１４及びラマ４１８）通常Ａｂ媒介性ＭＣＦシフトが誘導された。中程度のＨｃＡｂ応答がラマ４１４及びラマ４１８について細胞追加免疫前に検出され、これはラマ４１４については細胞追加免疫によって増強された（７１日目及び６７日目の血清と比較）。対照的に、ラマ４０５及びラマ４１７については検出可能な重鎖血清応答はあったとしてもほとんど見られなかった（図３．４−Ｂ）。要するに、５頭のうち２頭のラマにおいて、遺伝子免疫付与によって細胞追加免疫後にｍＰ２Ｘ７に対する検出可能なＨｃＡｂ応答がもたらされた。
【０５４０】
実施例３．４．ライブラリ構築
末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを用いて、製造業者（Amersham Bioscience）の取扱説明書に従って血液試料から調製した。次に、これらの細胞及びＬＮ生検材料から全ＲＮＡを抽出し、ナノボディをコードする遺伝子断片（実施例１．４）を増幅するＲＴ−ＰＣＲの出発材料として使用した。５頭のＤＮＡ免疫付与したラマ４０５、４０７、４１４、４１７及び４１８については、ＤＮＡ免疫付与後にＰＢＬ１及びＰＢＬ２から得たｃＤＮＡのみを「ＤＮＡ」ライブラリの生成に使用したが、追加免疫後（ＰＢ）ライブラリの構築にはＰＢＬ３、ＰＢＬ４及びＬＮに由来するｃＤＮＡを使用した。Ｈｅｋ２９３−ｍＰ２Ｘ７細胞によって免疫付与したラマについては、ＰＢＬ１、ＰＢＬ２及びＬＮから得たｃＤＮＡをライブラリの生成に使用した。ＨｃＡｂレパートリーの可変ドメインに対応する断片を、ＬａｃＺプロモーター、大腸菌ファージｐＩＩＩタンパク質コード配列、アンピシリン又はカルベニシリンに対する抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位及びｇｅｎｅ３リーダー配列を含有する、ｐＵＣ１１９に由来するファージミドベクターにクローニングした。このベクターは、ナノボディコード配列とインフレームで、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（ＨｉＳ）６タグをコードする。合計１３個のファージライブラリを生成し、４０５−ＤＮＡ、４０５−ＰＢ、４０７−ＤＮＡ、４０７−ＰＢ、４１４−ＤＮＡ、４１４−ＰＢ、４１７−ＤＮＡ、４１７−ＰＢ、４１８−ＤＮＡ、４１８−ＰＢ、４１３−細胞、４１５−細胞及び４１６−細胞と指定した。得られたファージライブラリのサイズは、０．１２〜２．５×１０８個のクローンであり、挿入断片は８３％〜１００％であると推定された。ファージを標準的な方法に従って調製し、さらなる使用のために４℃で保管した。
【０５４１】
実施例３．５．ファージディスプレイを用いたｍＰ２Ｘ７発現細胞に対するナノボディ選択
ｍＰ２Ｘ７プリン受容体をその未変性立体構造で認識するナノボディを同定するために、ＤＮＡワクチン接種後の動物から生成した１０個全てのライブラリ、及び細胞免疫付与したラマから生成した３個のライブラリを用いて、ｍＰ２Ｘ７を発現する全細胞に対して選択を行った。種々の免疫付与法によって同定されたモノクローナルナノボディの特性を比較するため、全てのライブラリに対する選択を並行して行った。１回目の選択においては、ｍＰ２Ｘ７をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞又は未トランスフェクトＣＨＯ細胞（１つのライブラリにつき５×１０６個）を、ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び２％Ｍａｒｖｅｌ）で４℃で３０分間ブロッキングした。プレブロッキング工程として、全てのファージインプット（inputs）を、ブロッキングバッファー中、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をファージと共に４℃で低回転でインキュベートした後、遠沈して、ブロッキングバッファーで３回、ＰＢＳを用いてさらに２回洗浄した。細胞に結合したファージを、実施例１．４のようにトリプシンを用いて溶出させた。全てのファージアウトプットを対数的に増殖した大腸菌ＴＧ１細胞に感染させ、個々のナノボディクローンの解析のために寒天プレート（ＬＢ＋Ａｍｐ＋２％グルコース）にプレーティングした。並行選択において非トランスフェクトＣＨＯ細胞から溶出したファージに対する、ｍＰ２Ｘ７−ＣＨＯ細胞から溶出したファージの数の比率として濃縮係数を算出した。１回目の選択における３倍超の濃縮係数は４１３及び４１４のライブラリについてのみ観察することができ、４１４のＰＢライブラリについては２００倍超の濃縮係数も示すものであった。１回目のｍＰ２Ｘ７／ＣＨＯに対して選択されたファージアウトプットをレスキューし、ｍＰ２Ｘ７を内在的に発現するマウスＹａｃ−１細胞に対する２回目の選択に使用した。細胞バックグラウンドの変更を、無関連細胞バックグラウンドマーカーに結合するファージの選択を減少させるために行った。１回目と本質的に同じ手順に従った。この２回目の選択に利用可能な対照細胞はなかったため、１回目のアウトプットに対する２回目のアウトプットの比を取ることによって相対濃縮係数を算出した。ＤＮＡライブラリからは、４０７及び４１７についてのみ濃縮が検出された（比はそれぞれ６及び９７）。ＰＢレパートリーについては、５個のうち３個のライブラリが１０を超える濃縮係数を示したが、４０７については中程度の３倍の濃縮が観察された。ＰＢライブラリ４１４についてはさらなる濃縮は見られなかったが、これは１回目の選択中における既に高い抗原特異的ファージ濃縮によるものである可能性がある。細胞免疫付与したライブラリについては、４１３のみが中程度の３倍の濃縮を示した。各々の選択アウトプット（１回目及び２回目）の４５個〜４８個の個々のクローンを９６ウェルフォーマットで培養し、ファージを続くスクリーニングのために実施例１に記載されるように調製した。
【０５４２】
実施例３．６．ｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディに関するスクリーニング
初めに、Ｐ２Ｘ７特異性を、未トランスフェクトＣＨＯ細胞及びｍＰ２Ｘ７トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するファージＥＬＩＳＡによって決定した。細胞を９６ウェル培養プレートに、ペニシリン及びストレプトマイシン（それぞれ１００Ｕ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）を添加した１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地０．２ｍｌ中、１ウェル当たり４×１０４個の細胞という密度で播種し、５％ＣＯ２雰囲気において３７℃で２４時間インキュベートした。サブコンフルエントな細胞をＰＢＳですすぎ、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで２時間ブロッキングした。ブロッキングに続いて、ファージを含有する１０倍希釈の培養上清を添加し、１時間インキュベートした。細胞に結合したファージをマウス抗Ｍ１３−ＨＲＰ複合体（GE Healthcare、カタログ番号Ｅ２８８６）によって検出した。陽性対照としてラットｍＡｂ  Ｈａｎｏ４３を使用した。全ての回の選択に由来する１５０６個のうち５２３個のスクリーニングした個々のクローンが、対照ＣＨＯ細胞と比べてｍＰ２Ｘ７−ＣＨＯ細胞に対し、最低で２倍増大したＥＬＩＳＡシグナルを示した。ＤＮＡライブラリ、ＰＢライブラリ及び細胞ライブラリの一次スクリーニング後のヒット率を表３．１に示す。
【０５４３】
種々の免疫付与戦略（ＤＮＡ、ＰＢ、細胞）後に生成したレパートリーに対する１回目及び２回目の選択アウトプットの平均ヒット率に基づくと、発見効率は「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー及び「細胞」レパートリーについて、それぞれ４％、４０％及び１１％（１回目のアウトプット）又は３１％、７８％及び６０％（２回目のアウトプット）であると算出された（図３．５）。これにより、種々のレパートリーにおけるｍＰ２Ｘ７に結合するナノボディの割合は、「ＤＮＡ」よりも「ＰＢ」及び「細胞」について高いことが示された。ｃＤＮＡ免疫付与した動物については、２回の選択後の血清力価とヒット率との間の良好な相関が、ラマ４０５、ラマ４１８及びラマ４１４に由来するＰＢライブラリについて観察され、ヒット率は１回目の後に４８％超、２回目の後に９０％超という範囲であった。比較のために、細胞免疫付与に由来するライブラリで観察されたヒット率は、２回の選択後に４０％〜７３％の範囲であった。ＤＮＡ免疫付与後にラマ４０７及びラマ４１７において検出可能な血清力価が存在しないにもかかわらず（図３．１）、対応するＤＮＡライブラリのヒット率は、２回の選択後にそれぞれ２５％及び８７％であった。先にＣＸＣＲ４について示されたように、このことは、ＤＮＡワクチン接種が、検出可能な標的特異的血清変換の非存在下であっても、ｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディをファージディスプレイ技術によって同定するのに十分であることを示す。
【０５４４】
実施例３．７．ｍＰ２Ｘ７結合クローンの配列多様性
一次スクリーニングにおける全てのｍＰ２Ｘ７結合因子の配列を解析した。５２３個のナノボディクローンのうち、８４個の特有のクローンが同定され、これらは２９個の異なる配列ファミリーにカテゴリー化することができた（図３．１３）。同じファミリーに属するナノボディアミノ酸配列変異体の数を図３．６にまとめる。ＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ＋ＰＢ）及び細胞免疫付与の後、それぞれ１５個及び１４個のファミリーが同定され、ＤＮＡ＋細胞追加免疫免疫付与法後には３個、細胞免疫付与戦略後には４．７個のファミリーという平均多様性が得られた。ＤＮＡライブラリ及びＰＢライブラリの両方に由来するファミリー変異体、すなわちファミリー２、ファミリー１５、ファミリー２５及びファミリー５を含む４個のｍＰ２Ｘ７ファミリーが同定された（図３．５）。これらのクローンのうちの２個、１６Ｄ９（ファミリー１５、ラマ４１４）及び６Ａ１１（ファミリー５、ラマ４１８）は、ＤＮＡレパートリー及びＰＢレパートリーの両方から同定された。しかしながら、ＣＸＣＲ４について先に示されたように、大半のファミリーはもっぱら「ＤＮＡ」ライブラリ（１５個のうち４個のファミリー）又は「ＰＢ」ライブラリ（１５個のうち７個のファミリー）において同定された。このことは、遺伝子免疫付与に続く細胞追加免疫により、遺伝子免疫付与のみの後に生成したライブラリにおいては容易に同定されないナノボディレパートリーのｉｎ  ｖｉｖｏ成熟が引き起こされたことを示している（表３．１）。
【０５４５】
表３．１．ｍＰ２Ｘ７遺伝子及び細胞免疫付与の後のスクリーニングヒット率
【表２９】
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【０５４６】
実施例３．８．各々のファミリーの代表的なクローンの選択についてのｍＰ２Ｘ７結合クローンの特異性及び順位の確認
全ての非冗長ｍＰ２Ｘ７特異的クローンを、１ｍＬ容９６ディープウェルプレートでのＰＥの作製のために、実施例１に記載されるように９６ウェルプレートにおいて再整列した（re-arrayed）。固定した細胞への結合についてのスクリーニングの後同定されたｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディが、未変性ｍＰ２Ｘ７にも結合することができることを確認するために、全ての非冗長クローンのＰＥを、ｍＰ２Ｘ７−Ｈｅｋ２９３細胞への直接結合について、検出にｍｙｃタグを用いるＦＡＣＳにおいて解析した。１０倍希釈のＰＥを０．５μｇの抗ｍｙｃ  ＦＩＴＣ結合抗体（AbD Serotec、カタログ番号ＭＣＡ２２００Ｆ）（結合強度を増大させるために偽二価ナノボディを作製する）と共に、０．１ｍｌのＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中、４℃で４５分間プレインキュベートした。ＰＥ希釈物を、Ｈｅｋ２９３−ｍＰ２Ｘ７と未トランスフェクト細胞との混合物（各々５×１０５個）と共に４℃で０．５時間インキュベートした後、細胞をすすぎ、細胞結合蛍光をフローサイトメトリーによって検出した。代替的には、１０倍希釈のＰＥの抗ｍｙｃ  ＦＩＴＣ結合抗体による逐次染色を細胞とのインキュベーション後に行った。ナノボディファミリー１、２、４、５、２５（ＤＮＡ／ＰＢライブラリに由来）並びにナノボディファミリー１０及び１１（細胞免疫付与ライブラリに由来）の成員については、明らかな結合活性の利点が見られ、これらのナノボディのエピトープが、偽二量体化ナノボディにとって依然として容易に接近可能であることが示された。ナノボディ２Ｃ４（ファミリー１）及びナノボディ５Ａ１（ファミリー３）についてのプレインキュベーションの効果を図３．７に示す。各々のファミリーのうち、最良の結合因子をさらなる特性化のために選択した。ファミリー６、ファミリー２６〜ファミリー２９は、抗Ｍｙｃ抗体とのプレインキュベーション後であっても、ｍＰ２Ｘ７発現細胞への低い結合しか示さず、したがってさらなる特性化から除外された。ＤＮＡライブラリ及びＰＢライブラリの両方に由来する特有のクローンを有するファミリー（ファミリー２、ファミリー５、ファミリー１５及びファミリー２５）から、少なくとも２つの代表例を、ＤＮＡ由来クローンとＰＢ由来クローンとの比較を可能にするために選択した。この結果、それぞれのナノボディの効力及び親和性に対する細胞追加免疫の考え得る寄与の決定が可能となる。さらなる特性化のために選択したナノボディのパネルを図３．８及び表３．２に示す。
【０５４７】
表３．２．ｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディの特性化
【表３０】
0006034435.tif 000065
【０５４８】
実施例３．９．ｍＰ２Ｘ７特異的ナノボディの作製及び精製
選択したナノボディのコード配列を、（実施例２．８に記載されるように）ＬａｃＺプロモーター、カナマイシンに対する抵抗性遺伝子、マルチクローニング部位及びＯｍｐＡシグナルペプチド配列を含有するｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターに再クローニングした。このベクターはナノボディコード配列とインフレームで、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードするものであった。発現は大腸菌ＴＧ−１細胞中でｃ−ｍｙｃ、Ｈｉｓ６タグ付きタンパク質として、２５０ｍＬの培養容量で行った。１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって発現を誘導し、３７℃で３時間継続させた。細胞培養物を遠心した後、ペレットを凍結融解し、ｄＰＢＳに再懸濁することによってペリプラズム抽出物を調製した。これらの抽出物を、Ｈｉｓｔｒａｐ  ＦＦ粗カラム（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）を用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）に関する出発材料として使用した。ナノボディ（登録商標）を２５０ｍＭ  イミダゾールを用いてカラムから溶出させ、続いてｄＰＢＳで脱塩した。全てのナノボディの純度及び完全性をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検証し、一方でタグの存在を抗Ｈｉｓ抗体を検出に用いるウェスタンブロット法によって検証した。
【０５４９】
実施例３．１０．いずれのマウスＰ２Ｘ７ナノボディもヒトＰ２Ｘ７又はＰ２Ｘ４に対して交差反応性でない
精製ナノボディの濃度依存性ｍＰ２Ｘ７結合を、ＦＡＣＳにおいて安定なｍＰ２Ｘ７発現ＣＨＯ細胞を用いて解析した。１．２ｕＭ〜６．７ｐＭの範囲のナノボディの段階希釈物を調製し、１０％ＦＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）を添加した０．１ｍｌのｄＰＢＳ中で２×１０５個の細胞と共に、４℃で０．５時間インキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、結合したナノボディをマウス抗Ｍｙｃ（Serotec、ＭＣＡ２２００）を使用し、その後抗マウスＩｇＧ−ＰＥ（JacksonImmunoResearch Laboratories、１１５−１１５−１６４）で染色することによって検出した。陽性対照として、ラットＨａｎｏ４３抗体のハイブリドーマ上清を使用し、これを抗ラットＩｇＧ−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch Laboratories、１１２−１１６−１４３）によって可視化した。結果を図３．８に示す。無関連対照ナノボディによって得られる最大ＭＣＦ値は、３１４〜３５５（濃度は１．２μＭ〜６．７ｐＭ）の範囲であった。ナノボディ７Ｄ５（ファミリー１４）、ナノボディ１３Ａ７（ファミリー２２）及びナノボディ７Ｅ２（ファミリー３）については、ＥＣ５０値はそれぞれ３ｎＭ、３．４ｎＭ及び４．３ｎＭである。試験した他の全てのナノボディについては、Ｓ字状曲線は得られず、結果としてＥＣ５０値を求めることができなかった（図３．８）。注目すべきことに、最も強く結合するナノボディは全て、Ｈｅｋ２９３-Ｐ２Ｘ７細胞によって免疫付与した３頭のラマに由来していた。２Ｃ４、２０Ａ１１及び１３Ｆ６（６００を超えるＭＣＦ値が検出されなかった）以外の全てのナノボディについて特異的結合を確認した。
【０５５０】
次に、２４個全てのファミリーのナノボディの特異性を、Ｐ２Ｘ７のヒトオーソログを発現するＨｅｋ２９３細胞、及びＰ２Ｘプリン受容体ファミリーの別の成員であるｈＰ２Ｘ４を発現するＣＨＯ細胞に対する交差反応性結合の解析によって決定した（Moeller et la Purinergic Signal 3: 359-366, 2007）。各々のナノボディのうち、２５０ｎｇ（最終濃度１４７ｎＭ）を抗Ｍｙｃ−ＦＩＴＣ結合抗体と共に、未トランスフェクトＨｅｋ細胞を含まない以外は実施例３．７に記載されるのと同じ手順に従ってプレインキュベートした。陽性対照として抗体Ｌ４（ｈＰ２Ｘ７に特異的、Buell et al. Blood 15: 3521-3528）及びＣＲ２９（ｈＰ２Ｘ４に特異的、Moeller et la Purinergic Signal 3: 359-366, 2007）を使用し、一方で無関連ナノボディを陰性対照として加えた。いずれのナノボディも、ｈＰ２Ｘ７−Ｈｅｋ２９３又はｈＰ２Ｘ４を発現するＣＨＯ細胞に結合しないことが見出された。一部のナノボディをｈＰ２Ｘ７及びｍＰ２Ｘ７の両方によって免疫付与したラマから単離した（ファミリー５、ファミリー７、ファミリー１６ファミリー及びファミリー１７）という事実にもかかわらず、これらのいずれもｈＰ２Ｘ７に対し交差反応性ではなかった。
【０５５１】
実施例３．１１．ｍＰ２Ｘ７受容体機能を増強又は遮断するナノボディの同定
２４個の異なるファミリーからの全ての精製ナノボディを、ｍＰ２Ｘ７プリン受容体の機能的活性を調節するその能力について解析した。Ｐ２Ｘ７の活性化は、細胞外ＡＴＰ（直接的活性化）又はＮＡＤ依存性ＡＤＰリボシル化（間接的活性化）によって起こり、カルシウム放出、ホスファチジルセリンの曝露、及びＣＤ６２Ｌのシェディングをもたらし、最終的にアポトーシスを引き起こす（Scheuplein et al. 2009, J. Immun. 182（5）: 2898-908）。リガンド誘導性ＣＤ６２Ｌシェディングを用いて、ナノボディがｍＰ２Ｘ７機能を妨げることができるか否かを決定した。
【０５５２】
第１のアプローチにおいては、５×１０５個のＹａｃ−１細胞（ｍＰ２Ｘ７を内因的に発現する）を、単一濃度のナノボディ（５μｇ、最終濃度２μＭ）と共に、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中、室温で１５分間インキュベートした。続いて、ＡＴＰ（最終濃度１００μＭ）又はＮＡＤ（最終濃度２０μＭ）を添加することによってＰ２Ｘ７イオンチャネルを活性化させ、その後細胞懸濁液を３７℃で２０分間さらにインキュベートした。先の滴定実験から、これらのリガンド濃度によって最大のＣＤ６２Ｌ細胞外ドメイン切断が誘導されることが示された。細胞を洗浄し、細胞表面のＣＤ６２Ｌの存在を抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ結合抗体（BD Pharmingen、カタログ番号５５３１５１）を用いるＦＡＣＳにおいて検出した。ＣＤ６２Ｌ陽性染色細胞の割合を、Ｐ２Ｘ７機能調節の尺度として採用した。対照として、ナノボディなし又は無関連対照ナノボディを加えたが、これらはリガンド及び個々の実験に応じてＣＤ６２Ｌシェディングを細胞の８０％〜９８％でもたらした（すなわち細胞の２％〜２０％はＣＤ６２Ｌ陽性のままである）。ＣＤ６２Ｌ陽性のままである細胞の割合が、無関連ナノボディを用いて得られた値の３倍を超える場合、ナノボディをｍＰ２Ｘ７ブロッカーと見なした。７個のファミリー（ファミリー５、ファミリー７、ファミリー１１、ファミリー１６、ファミリー１９、ファミリー２２及びファミリー２３）を代表する１０個のナノボディは、ＡＴＰ及びＮＡＤ誘導性ＣＤ６２Ｌシェディングの両方を遮断したが、ファミリー７の２個のナノボディは閾値のすぐ上であった。さらに、ファミリー１６及びファミリー１９に属する２個のナノボディは、ＮＡＤ誘導性応答を遮断するが、ＡＴＰ誘導性応答は遮断しないようであり、これらがｍＰ２Ｘ７上のＮＡＤ依存性ＡＤＰリボシル化部位を選択的に標的とし得ることが示唆される（Adriouch et al. FASEB J 22: 861-869, 2008）。阻害能を確認するため、並びにＡＴＰ及びＮＡＤ媒介性ＣＤ６２Ｌシェディングアッセイにおけるナノボディの遮断効力を順位付けするために、これらの１０個のナノボディのうち９個を２回の並行実験において段階希釈で試験した。代表例を図３．９に示す。両方のリガンド媒介性アッセイにおいて、全てのブロッカーについてＰ２Ｘ７機能の阻害を確認することができたが、ＩＣ５０値を表３．２に示す。ファミリー１９のナノボディ１３Ｂ５について示唆されたＮＡＤ選択性（-selectively）は確認されなかった。ブロッキング効力に基づいて、ナノボディを以下の通りに順位付けすることができる：１３Ａ７＞８Ｇ１１、１３Ｇ９、８Ｇ１２＞７Ｈ６＞１３Ｂ５、８Ｆ５＞８Ｃ７、８Ｅ７。
【０５５３】
ナノボディが単独でｍＰ２Ｘ７チャネルを活性化することができるかを検証するために、細胞を同様に２μＭのナノボディと共に、その後のリガンド処理なしにインキュベートした。試験した一価ナノボディのいずれもｍＰ２Ｘ７を直接活性化することができなかった。しかしながら、或る特定のナノボディについては、ＣＤ６２Ｌ細胞外ドメインシェディングの増大がヌクレオチド処理後に観察され、これらのクローンがｍＰ２Ｘ７のゲーティングを促進し得ることが示唆された。ＡＴＰ及びＮＡＤ誘導性Ｐ２Ｘ７活性化の増強を、準最適リガンド濃度（ＡＴＰについては１００μＭ未満、ＮＡＤについては２０μＭ未満）を用いて検証した。Ｙａｃ−１細胞を固定濃度のナノボディ（２μＭ）で処理し、次いで漸増濃度のＡＴＰ（１μＭ〜２７００μＭ）又はＮＡＤ（１μＭ〜５４０μＭ）で刺激した。ＡＴＰの場合、３個のナノボディがＣＤ６２Ｌシェディングを以下の効力の順番で明らかに増強することが見出された：１４Ｄ５＞４Ｂ４＝７Ｄ６（図３．１０）。ＮＡＤについては増強はあまり明白でなかった。
【０５５４】
遮断ナノボディも同様に同じアッセイにおいて試験した（固定濃度のナノボディ対漸増濃度のリガンドで）。試験したＮＡＤの最も高い濃度（５４０μＭ）では、停滞状態（６０％前後の阻害）に達した１３Ｂ５及び８Ｆ５を除く大半のブロッカーは、依然として最大限に切断を阻害していた（図３．１０）。ＡＴＰを用いて得られた滴定曲線に基づいて、ブロッカーについて以下の順位を付けることができた；１３Ａ７、１３Ｇ９、７Ｈ６＞８Ｇ１１、８Ｇ１２＞８Ｆ５、１３Ｂ５（表３．２）。３個のファミリー５のナノボディを比較したところ、ＰＢライブラリに由来するクローン（８Ｇ１１及び８Ｇ１２）の両方が、ＤＮＡライブラリに由来するクローン（８Ｆ５）よりも優れたブロッカーであった。
【０５５５】
受容体調節ナノボディ（ブロッカー及びエンハンサー）を、３つ全てのレパートリー「ＤＮＡ」、「ＰＢ」又は「細胞」から同定したが、最も効力のあるブロッカーは「細胞」ライブラリから同定された１３Ａ７（ＡＴＰ及びＮＡＤアッセイにおけるＩＣ５０は、それぞれ６ｎＭ及び１１ｎＭ）であった。対照的に、最も効力のあるエンハンサーである１４Ｄ５は、「ＤＮＡ」ライブラリから同定された。
【０５５６】
実施例３．１２．受容体調節効力の改善した多価ナノボディ
３５アミノ酸ＧｌｙＳｅｒリンカーによって連結した２つの同一ナノボディ配列の頭−尾遺伝子融合体からなる二価ナノボディ構築物を、機能的遮断ナノボディ１３Ａ７（ファミリー２２、細胞）及び８Ｇ１１（ファミリー５、ＰＢ）、並びに部分アゴニスト１４Ｄ５（ファミリー１７、ＤＮＡ）から生成した。構築物を、特異的制限部位を含む種々のプライマーセットを用いた別個のＰＣＲ反応（一方はＮ末端ナノボディサブユニットに対し、一方はＣ末端ナノボディサブユニットに対する）によって作製した。ＬａｃＺプロモーター、カナマイシンに対する抵抗性遺伝子及びＯｍｐＡシグナルペプチド配列を含有する、ｐＵＣ１１９に由来する発現ベクターを使用した。シグナルペプチドのすぐ下流に、ナノボディ挿入のための多重クローニング部位、続いてＤＮＡ配列をコードする３５Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー、及び第２のナノボディ配列のクローニングのための第２の多重クローニング部位が存在する。このベクターは、得られるナノボディ−３５Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ナノボディコード配列とインフレームで、Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグ及び（Ｈｉｓ）６タグをコードするものであった。ヌクレオチド配列の検証の後、３つ全ての二価ｍＰ２Ｘ７ナノボディ構築物を発現させ、精製した。大腸菌ＴＧ１細胞中で作製を行い、続いて実施例３．９に本質的に記載されるように、ＩＭＡＣ及び脱塩によってペリプラズム画分からＨｉｓタグを用いて精製した。
【０５５７】
ｍＰ２Ｘ７活性の増強における一価及び二価１４Ｄ５の効力を、（実施例３．１１に記載されるように）Ｙａｃ−１細胞では細胞外ドメインシェディングが起こらない準最適ヌクレオチド濃度（ＡＴＰは３３μＭ、ＮＡＤは１．５μＭ）で、ＣＤ６２Ｌ細胞外ドメインシェディングの増強を測定することによって比較した。一価１４Ｄ５に対する二価１４Ｄ５の効力の増大は、ＡＴＰによって誘導されたシェディングについてはおよそ２２０倍（ＥＣ５０は２２．６ｎＭに対して０．１ｎＭ）、ＮＡＤによって誘導されたシェディングについては４０倍（ＥＣ５０は４．１ｎＭに対して０．０６ｎＭ）であった。リガンドの非存在下では、一価１４Ｄ５も二価１４Ｄ５もＰ２Ｘ７のゲーティングを誘導することができなかった。
【０５５８】
図３．１１に示されるように、２つの遮断ナノボディ１３Ａ７及び８Ｇ１１の効力を、１００μＭ  ＡＴＰ及び２０μＭ  ＮＡＤのそれぞれで求めた。二価ナノボディ（Bivalents）１３Ａ７及び８Ｇ１１は、ＡＴＰ及びＮＡＤの両方についてナノモル以下の範囲の効力を有していた。一価１３Ａ７に対する二価１３Ａ７の効力の増大は中程度でしかなく、ＮＡＤ誘導性シェディングの場合は２３倍の増大、ＡＴＰ誘導性シェディングの場合は９倍の増大であった（二価ナノボディのＩＣ５０はＡＴＰについては０．１ｎＭ、ＮＡＤについては０．３ｎＭ）。８Ｇ１１については、一価から二価への効力の増大ははるかに強く、１４６倍（ＮＡＤ）及び８４倍（ＡＴＰ）（二価ナノボディのＩＣ５０はＡＴＰについては０．２ｎＭ、ＮＡＤについては０．５２ｎＭ）であった。
【０５５９】
実施例３．１３．ｍＰ２Ｘ７三量体上の異なるエピトープに対するナノボディ地図
近年、ゼブラフィッシュプリン受容体Ｐ２Ｘ４の結晶構造が公表された（Kawate et al. 2009. Nature 460: 592-598）。利用可能なＰ２Ｘ４構造（ｐｄｂ３Ｉ５Ｄ及びｐｄｂ３Ｈ９Ｖ、分解能はそれぞれ３．５Å及び３．１Å）に基づき、ホモロジーモデリングソフトウェア（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Accelrys）に内蔵されたＭｏｄｅｌｅｒ）を用いてｍＰ２Ｘ７のモデルを構築した。ゼブラフィッシュＰ２Ｘ４とｍＰ２Ｘ７との配列同一性は、細胞外領域では４９％である。まず、マウスＰ２Ｘ７の配列を既知のＰ２Ｘ４構造の配列とアライメントした。配列アライメントでは、２つの配列間のギャップ及び保存されたジスルフィド結合の適切な位置決めを行うことに注意する。次に、既知のＰ２Ｘ４構造の３Ｄ座標を使用して、未知のｍＰ２Ｘ７の３Ｄ座標を予測した。確率密度関数（ｐｄｆ）は幾何学的特徴の制約を表し、３Ｄモデルを評価するために使用される。ｍＰ２Ｘ７  ＷＴと同様のレベルの細胞外ｍＰ２Ｘ７発現を示すｍＰ２Ｘ７アルギニン突然変異体の既存のパネルのうち、７個の突然変異体を選択した（Adriouch et al. 2008, FASEB J 22: 861-869、Schwarzet al. Purinergic Signal 5: 151-161, 2009）。生成したモデルによると、これら７個の突然変異体は、ｍＰ２Ｘ７分子上に構造的に分散した６つの領域を表す；突然変異体Ｒ１２５Ａ（部位Ｉ；ＮＡＤ媒介性リボシル化に重要なＲ１２５残基）、Ｒ２９４Ａ（部位Ｉ；ＡＴＰ結合に重要な溝に位置する残基）、Ｒ２０６Ａ（部位ＩＩ；２つのｍＰ２Ｘ７相互作用単量体の界面近くに位置する機能獲得型突然変異体）；Ｒ１５１Ａ（部位ＩＩＩ；抗ｍＰ２Ｘ７  ｍＡｂ  Ｈａｎｏ４４との結合に重要な残基；Adriouch et al. 2008, FASEB J 22: 861-869）；Ｒ１７８Ａ（部位ＩＶ）；Ｒ２３０Ａ（部位Ｖ）；Ｒ５３Ｋ（部位ＶＩ；２つのｍＰ２Ｘ７相互作用単量体の界面の膜貫通ドメイン近くに位置する残基）。ナノボディとｍＰ２Ｘ７との結合がこれらの置換によって影響され得るか否かを決定するために、種々のファミリーを代表する２４個の精製ナノボディを、非トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞、及びＷＴ又は突然変異ｍＰ２Ｘ７受容体で一時的にトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞との結合について評価した。フローサイトメトリーアッセイについては、ナノボディの検出は抗Ｍｙｃ、その後ヤギ抗マウス−ＰＥ複合体によって行ったが、Ｐ２Ｘ７発現密度の推定はラットモノクローナルＨａｎｏ４３、その後二次抗ラット−ＰＥ複合体での染色によって行った。Ｈｅｋ２９３細胞へのバックグラウンド結合の減算による、種々の一時的トランスフェクタント（ＷＴ  ｍＰ２Ｘ７及び７個の突然変異体）に対する発現密度の正規化の後、１μＭでの種々のナノボディの残存結合を算出した。
【０５６０】
９０％を超える結合の減少は、以下の６個のナノボディのみで検出された（全て突然変異体Ｒ１５１Ａに対する結合）：ナノボディ７Ｈ６（細胞、４１５、ファミリー１１）、７Ｄ５（細胞、４１５、ファミリー１４）、６Ｂ７（ＰＢ、４０５、ファミリー１６）、７Ｅ２（細胞、４１３、ファミリー３）、８Ｇ１１（ＰＢ、４１８、ファミリー５）、８Ｇ１２（ＰＢ、４１８、ファミリー５）。これによって、他の全てのナノボディが、それらが別個の領域に結合すること、又はこれらのナノボディがそのフットプリント内でＡｒｇ残基に結合しないことから、結合に関してＡｒｇ１５１に決定的には依存しないことが推論される。予想された通り、ｍＰ２Ｘ７特異的ラット抗体Ｈａｎｏ４４は、Ｒ１５１Ａ突然変異体に対していかなる結合も示さなかった。
【０５６１】
実施例３．１４．「ＤＮＡ」レパートリーの平均効力は、「ＰＢ」レパートリーと同程度であるが、「細胞」レパートリーよりも低い
４個のファミリーのみが「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリの両方から同定された。実施例２．１０のように、特定のナノボディファミリー内の各々の変異体について、最も近縁なラマＶ生殖細胞系列配列（ＦＲ１〜ＦＲ３を含む）に対するｉｎ  ｖｉｖｏ成熟をスコア付けし、ナノボディ変異体の効力を比較した（表３．３）。ファミリー２、ファミリー５、ファミリー１５及びファミリー２５について、「ＰＢ」由来ナノボディは親Ｖ遺伝子生殖細胞系列配列に対して、平均して１９．５個、１６．５個、１０個及び１４個のアミノ酸突然変異を示したが、「ＤＮＡ」ライブラリに由来するナノボディはそれぞれ１９．５個、１７個、１０．３個及び１５個であり、「ＤＮＡ」由来ナノボディと「ＰＢ」由来ナノボディとの等しい成熟が示される。ＤＮＡ及びＰＢに由来するファミリー成員のＣＤＲ３領域の配列を比較すると、ＤＮＡ配列に対するＰＢにおける多様性の増大がファミリー５及びファミリー２５のみで観察される。
【０５６２】
表３．３．親Ｖ生殖細胞系列配列に対するｉｎ  ｖｉｖｏ成熟ナノボディの遺伝的距離
【表３１】
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１欠失又は付加を含むいかなる変化も突然変異の数を算出する上で考慮される。
【０５６３】
「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー及び「細胞」レパートリーにそれぞれ由来する２０個、３７個及び２９個のナノボディ変異体の平均吸着比（ＥＬＩＳＡ）は、それぞれ１３、１３及び２６であり（図３．１２）、この標的に対する「細胞」由来ナノボディの優位性が示される。これらの観察結果は、最も効力のある結合因子（１３Ａ７、７Ｄ５及び７Ｅ２、実施例３．１０）及び最も効力のあるブロッカー（１３Ａ７）の両方が「細胞」レパートリーから同定されたことから、モノクローナルナノボディレベルでも示される。しかしながら、個々のファミリーを考える場合、ファミリー５については（他ではない）、ＤＮＡレパートリーに対するＰＢの平均効力の明らかな増大が観察される（吸着比は１８に対して２３、ＦＡＣＳによる平均蛍光強度は６６に対して９５）。このことから、このファミリーにおいては細胞追加免疫の結果として親和性成熟が起こったことが示唆される。他の３つのファミリーでは、細胞追加免疫によって効力は改善しなかった。しかしながら、機能的ナノボディの効力の順位では、最も効力のあるエンハンサー１４Ｄ５はＤＮＡレパートリーに由来するが、二番目に良好なブロッカーはＰＢレパートリーのファミリー５に由来するものであった。どちらのファミリーも、ＤＮＡ免疫付与後に最も強いＨｃＡｂ媒介性血清応答を示すラマである（図３．４Ｂ）ラマ４１８から同定された。
【０５６４】
実施例３．１５．標的カクテルによる遺伝子免疫付与は個々の標的の各々に特異的なナノボディの同定を可能にする
ラマ等の非近交系動物の免疫付与によって、個々の動物間で非常に多様な標的特異的体液性応答の規模（magnitudes）が生じた。この効果は、ＧＰＣＲ及びイオンチャネル等といった複数の膜貫通ドメインを含有する低免疫原性の細胞表面発現受容体による遺伝子免疫付与後にさらに顕著である（実施例２．４及び実施例３．１）。検出可能なＨｃＡｂ媒介性標的特異的応答は発見効率を少なくとも増大させることが予想される。したがって、任意の種類の標的カクテル（細胞結合分子及び非細胞結合分子）による非近交系動物の遺伝子免疫付与は有利であり得る。動物の数を増加させることによって、可用性に負担をかけることなく、より多くの（大規模（high magnitude）の）標的レスポンダー（responders）を同定する可能性が増大する。カクテルＤＮＡワクチン接種の一例として、本発明者らは２頭のラマ（４０５及び４１８）を、マウス及びヒト起源の２つのイオンチャネルＰ２Ｘ７によって実施例３．２に記載されるように免疫付与した。マウス及びヒトのＰ２Ｘ７間のアミノ酸同一性は十分に異なり（８０．５％の配列同一性）、同定された全てのマウスＰ２Ｘ７ナノボディはヒトＰ２Ｘ７との交差反応性を欠いている（実施例３．１０）ため、マウス及びヒトのＰ２Ｘ７を、カクテル遺伝子免疫付与アプローチを実証するための関連標的例として利用することができる。
【０５６５】
ｈＰ２Ｘ７特異的ナノボディを同定するために、実施例３に本質的に記載されるように、細胞に基づいた選択を行い、ｈＰ２Ｘ７特異的ナノボディを濃縮した。選択はラマ４０５及びラマ４１８の各々に由来するプールした「ＤＮＡ」（ＰＢＬ１＋ＰＢＬ２）及び「ＰＢ」（ＰＢＬ２＋ＰＢＬ３＋ＬＮ）ライブラリに対し、全ての多様性を維持し、ライブラリを動物毎に分けて行った。安定なｈＰ２Ｘ７トランスフェクトＹＡＣ−１細胞及びｈＰ２Ｘ７−Ａｒｔ２．２トランスフェクトＣＨＯ細胞を、それぞれ１回目及び２回目の選択に使用した。２回目の選択の後、濃縮係数を非トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する、ｈＰ２Ｘ７トランスフェクト細胞から溶出したファージの数の比として算出した。濃縮係数は、ラマ４０５及びラマ４１８に由来するライブラリについては、それぞれ１５倍及び７倍であり、ｈＰ２Ｘ７ナノボディの存在が示され、両方のイオンチャネルに対するナノボディの同定の成功が示唆された。
【０５６６】
ｈＰ２Ｘ７選択後のファージアウトプットによる大腸菌ＴＧ１の感染の後、個々のクローンを取り出し、ペリプラズム抽出物を実施例１．４のように調製した。このペリプラズム抽出物を使用して、マウスＰ２Ｘ７に対して行った場合（実施例３．５）と同様に、フローサイトメトリーによってヒトＰ２Ｘ７に対する特異性を決定する。ペリプラズム抽出物は、ｈＰ２Ｘ７トランスフェクト細胞株（ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３等）では明らかな染色を示すが、マウスＰ２Ｘ７をトランスフェクトした同一の親細胞株、又は同じ非トランスフェクトＷＴ細胞株ではバックグラウンドを超えず、ｈＰ２Ｘ７に特異的であると考えられる。ｈＰ２Ｘ７特異性は、ＥＣ５０を決定するのと同じ方法で精製ナノボディを用いて用量依存的に確認される。
【０５６７】
実施例４．１．ヘリオス遺伝子銃を用いたラマの遺伝子免疫付与に続く、体液性ＣＸＣＲ７特異的血清力価の誘導
遺伝子免疫付与後に標的特異的ナノボディを同定する第２のＧＰＣＲ例として、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ７を選択した。ヒトＣＸＣＲ７をコードするｃＤＮＡをｐＶＡＸ１にクローニングし、プラスミドＤＮＡを実施例２．１に記載されるように精製した。トランスフェクション後、実施例２．２に記載されるものと同様の検出法に従って、親ＷＴ細胞に対するＣＸＣＲ７トランスフェクトＷＴ細胞の染色差によって確認したところ、ｐＶＡＸ１−ＣＸＣＲ７構築物は細胞表面で未変性ＣＸＣＲ７の発現を示した（データは図示せず）。
【０５６８】
４頭のラマ（３９１、３９５、３９６及び３９７）を、実施例２．４に記載されるように皮内ジェット注射によって免疫付与した。単回の２×１０７個のＣＡＫＩ／ｈＣＸＣＲ７細胞の注射を４回目のＤＮＡ免疫付与後４２日目〜５６日目に投与した。３頭のラマ（３８５、３８７及び４０４）を、２×１０７個の安定にトランスフェクトしたＣＸＣＲ７／ＨＥＫ２９３細胞を１４日間隔で４回注射することによって免疫付与した。ＣＸＣＲ７特異的血清ＩｇＧ力価を、ＤＮＡワクチン接種及び単回細胞追加免疫後の免疫前血清試料及び免疫血清試料を用いて、実施例２．４と同様に求めた。７頭のラマのいずれもその２つの免疫付与計画の後、ＣＸＣＲ７特異的体液性応答を示さなかった。
【０５６９】
別の免疫付与実験において、４頭のラマ（４３４、４３９、４４１及び４４４）を、ヘリオス遺伝子銃を用いて、実施例３に記載されるように遺伝子免疫付与した。要するに、４回のＤＮＡ投与を２週間間隔で適用し（１回の投与当たり２４ショット）、その後ＣＡＫＩトランスフェクトＣＸＣＲ７細胞（２Ｅ７個の細胞）の単回細胞追加免疫を行った。４回目のＤＮＡ投与後８日目の免疫前血液試料、及び単回細胞追加免疫後８日目の最後の血液試料を各々のラマから回収し、標的特異的血清力価を実施例２．４に記載されるようにＦＡＣＳによって求めた。免疫付与した４頭のラマのうち、１頭のラマ（４４４）のみが、免疫前レベルと比べてＣＸＣＲ７トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞で、「ＤＮＡ」及び細胞追加免疫後血清試料について中程度ではあるが一貫して増大したＭＣＦを試験した全ての希釈率で示した（図４．１）。並行して、４頭のラマ（４３５、４３６、４３７、４４０）を、ＣＸＣＲ７トランスフェクトＣＡＫＩ細胞を２週間間隔で４回細胞注射すること（１回の注射につき２×１０７個の細胞）によって免疫付与した。ラマ４４４とは対照的に、後者の４頭のラマのいずれも検出可能なＣＸＣＲ７血清力価を示さなかった。
【０５７０】
実施例４．２．検出可能なＣＸＣＲ７特異的血清変換の非存在下での標的特異的ナノボディの同定
ラマ３９１、ラマ３９５、ラマ３９６及びラマ３９７の各々について、遺伝子免疫付与及び細胞追加免疫の後に回収した免疫組織からライブラリを構築した（それぞれＤＮＡレパートリー及びＰＢレパートリー）。３個のさらなるライブラリを、細胞免疫付与したラマ３８５、ラマ３８７及びラマ４０４から構築した。ライブラリの概要を表４．１にまとめる。１１個全てのライブラリについて、ファージディスプレイ選択を１０（１回目及び２回目の選択）及び１（２回目の選択）単位のＣＸＣＲ７膜小胞に対し、先に記載されるように（実施例２．６）行った。２回目の選択アウトプットの全てから、８５３個のクローンがスクリーニングされた（１個のライブラリにつき３１個〜１５５個の個々のクローン）。結果を表４．１にまとめる。ＣＸＣＲ７特異性を、２単位のＣＸＣＲ７膜小胞に対し、１ｍＬの培養物から調製したファージ上清の１０倍希釈物を適用して、ファージＥＬＩＳＡによって求めた。非トランスフェクト対照膜小胞と比べて、ｈＣＸＣＲ７膜小胞について最低で２倍増大したＥＬＩＳＡシグナルを示す２３４個のナノボディを、ＣＸＣＲ７特異的であると見なした。動物及びレパートリーについての２回目のヒット率を表４．１にまとめる（４％〜６１％の範囲）。種々の免疫付与戦略後の２回目の選択アウトプットに対する平均ヒット率に基づくと、発見効率は「ＤＮＡ」レパートリー、「ＰＢ」レパートリー及び「細胞」レパートリーについて、それぞれ２９％、２８％及び２６％であると算出された（図４．２）。ＣＸＣＲ７に対する検出可能なＨｃＡｂ力価の非存在下であっても、標的特異的ナノボディが全ての免疫付与戦略（ＤＮＡ、ＰＢ、細胞）から同定された。２３４個全てのＣＸＣＲ７特異的ナノボディをシークエンシングし、重複するナノボディ（同一のアミノ酸配列）を除外した。これにより、４６個の異なるナノボディＢ細胞系列に属する７８個の特有の配列が同定された（表４．１）。ファミリー内で同定された変異体（最低で１アミノ酸残基差）の数は１〜１２の範囲であった。１頭のラマにつき同定されたＣＸＣＲ７特異的ナノボディファミリーの平均数はそれぞれ、細胞免疫付与後に５．３（３８５、３８７、４０４）、ＤＮＡ免疫付与によって７．５（ＤＮＡ＋細胞追加免疫；３９１、３９５、３９６、３９７）であり、この標的について、遺伝子免疫付与（ＤＮＡ＋ＰＢ）が細胞免疫付与によって得られた多様性と比べて、より高いナノボディファミリー多様性をもたらしたことが示される。
【０５７１】
表４．１．ＣＸＣＲ７特異的ナノボディファミリーの発見概要
【表３２】
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【０５７２】
受容体機能調節ナノボディを同定するために、ＳＤＦ−１リガンド置換アッセイを、ＣＸＣＲ７／ＨＥＫ２９３膜抽出物を用いて、ＣＸＣＲ４について記載される場合（実施例２．７）と同様に行った。ＣＸＣＲ７／ＨＥＫ２９３膜抽出物への残存［１２５Ｉ］−ＳＤＦ−１結合の明らかな減少を示すナノボディを、リガンド競合相手であると見なした。リガンドディスプレーサであるとスコア付けされたナノボディファミリーの数を表４．１に示すが、リガンド競合ナノボディが免疫付与戦略（レパートリーＤＮＡ、レパートリーＰＢ及びレパートリー細胞によって表される）に関係なく同定されることが示される。
【０５７３】
実施例４．３．遺伝子免疫付与後の細胞追加免疫によって、異なるナノボディレパートリーが生成される
ラマ３９１、ラマ３９５、ラマ３９６及びラマ３９７から、（シークエンシングした２３４個のうち）５５個のナノボディ配列変異体からなる２９個のＣＸＣＲ７特異的ナノボディファミリーが同定された。実施例２（ＣＸＣＲ４）及び実施例３（Ｐ２Ｘ７）での所見とは対照的に、最低で１個の同一の変異体を含有する２個のファミリーを、ラマ３９６のＤＮＡレパートリー及びＰＢレパートリーの両方において同定することができた。これら２９個のファミリーのうち２個についてしか（全ファミリー多様性の７％）、同じファミリーに属するナノボディ変異体が「ＤＮＡ」ライブラリ及び「ＰＢ」ライブラリから同定されず（表４．１及び図４．３）、この場合もＤＮＡワクチン接種（ＤＮＡ）又は細胞追加免疫（ＰＢ）後のナノボディレパートリーが異なることが示唆される。遺伝子免疫付与のみによって異なるナノボディレパートリーがもたらされ、レパートリーの一部が細胞追加免疫後に同定されないか、又は失われることが示される。
【図１．１Ａ】
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【図１．１Ｂ】
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【図１．１Ｃ】
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【図１．２】
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【図１．３】
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【図１．４】
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【図２．１】
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【図２．２Ａ】
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【図２．２Ｂ】
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【図２．３】
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【図２．４】
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【図２．５Ａ】
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【図２．５Ｂ】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図３．４Ａ】
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【図３．４Ｂ】
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【図３．５】
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【図３．６】
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【図３．７】
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【図３．８】
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【図３．９】
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【図３．１０Ａ】
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【図３．１０Ｃ】
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【図３．１１Ａ】
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【図３．１１Ｃ】
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【図３．１２】
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【図３．１３Ａ】
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【図３．１３Ｂ】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【配列表】
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