(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚性幹（ＥＳ）細胞を作製する方法であって、単離された割球を、該割球由来のＥＳ細胞を含むＥＳ細胞コロニーを形成するまで、ＥＳ細胞と一緒に培養するステップを含む方法（ここで該割球を単離された胚が生存し続ける）。
【請求項２】
割球を培養してＥＳ細胞を作製するステップ中に、組換えＯｃｔ−４が割球中に導入されるか、又は内因性Ｏｃｔ−４が割球内で活性化される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
割球が、細胞分裂を起こし、１つの子孫細胞が、遺伝子検査に使用され、異なる子孫細胞が、ＥＳ細胞を作製するのに使用される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
結果として生じたＥＳ細胞の核型を評価するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）少なくとも１つの単離された哺乳類の割球、あるいは該少なくとも１つの割球の多能性あるいは分化した子孫細胞；及び
（ｂ）少なくとも１つのＥＳ細胞
を含む組成物（ここで該割球を単離された胚が生存し続ける）。
【請求項６】
少なくとも１つの単離された割球と少なくとも１つのＥＳ細胞を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＥＳ細胞が、割球とａｕｔｏｌｏｇｏｕｓである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥＳ細胞が、すでに樹立された系からのＥＳ細胞である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
単一の割球を含む、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮出願、２００４年１１月４日に出願された第６０／６２４，８２７号；２００５年３月１５日に出願された第６０／６６２，４８９号；２００５年６月３日に出願された第６０／６８７，１５８号；２００５年１０月３日に出願された第６０／７２３，０６６号及び２００５年１０月１４日に出願された第６０／７２６，７７５号の利益を主張するものである。これらの出願の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、一般的に、胚性幹細胞、それらの細胞及び細胞系を誘導するための新規な方法、並びに治療及び研究目的のための細胞の使用に関する。また、本発明は、例えば、体外受精などの介助生殖技術と連動して、胚の着床に先立って自己幹細胞系を樹立及び保存する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ほとんど例外なく、胚性幹細胞は、胚盤胞期（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ−ｓｔａｇｅ）胚からのみ培養されてきた。従来、ＥＳ細胞系は、胚盤胞の内部細胞塊及び少数の例では卵割期胚から単離されている。これらの細胞を作製するのに使用される技法にはいくつかの欠点がある。技法の観点からすると、胚の胎盤胞への培養は、比較的低い成功率であることがたまにある。一部の人々は、胚性幹（ＥＳ）細胞研究が、ＥＳ細胞誘導は完全なヒトへと成長するあらゆる可能性を着床前期胚から奪ってしまうという事実に根差しているという根本的な反対を表明している。以下の発明は、研究及び医学で使用するために胚性幹細胞系及び他の胚由来細胞を誘導する新規且つ予想外な方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、胚性幹細胞、それらの細胞及び細胞系を誘導するための新規な方法、並びに治療及び研究目的のための胚性の幹細胞及び細胞系の用途に関する。また、本発明は、例えば、体外受精（「ＩＶＦ」）などの介助生殖技術と連動して、胚の着床に先立って取り出される割球から自己幹細胞系を樹立及び保存する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、胚性幹細胞を作製する方法であって、胚から得られる割球（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ）を培養するステップであり、胚が生存し続けるステップを含む方法を提供する。一実施形態において、割球は、桑実胚のコンパクション（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）に先立って胚から得られる。別の実施形態において、胚は、胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌ）の形成前に得られる。割球は、胚を取り囲む透明帯の部分的又は完全な除去によって得ることができる。胚は、着床又は冷凍保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅ）することができる。
【０００６】
胚から得られる割球を、任意の適当な細胞と一緒に培養し、ＥＳ細胞を作製する。割球を培養するのに適している細胞には、すでに樹立された系からなどの胚性幹細胞、胚癌細胞、マウス胚線維芽細胞、他の胚様細胞、胚起源の細胞又は胚に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されるものではなく、それらの多くは、当技術分野において知られており、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ、及び他の供給源から入手可能である。また、割球を、ＥＳ細胞の分化を阻害する因子と一緒に培養することができる。一実施形態において、割球は、ヘパリンの存在下で培養される。別の実施形態において、Ｏｃｔ−４が割球に導入されるか、或いは、内因性Ｏｃｔ−４の発現が割球において誘発される。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、ＥＳ細胞を作製する方法であって、胚から割球を得るステップであり、胚が生存し続けるステップと、割球をＥＳ細胞と一緒に凝集させるステップと、凝集した割球及びＥＳ細胞を、割球がＥＳ細胞の特性を示すまで培養するステップと、割球に由来するＥＳ細胞を単離するステップとを含む方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、胚から得られる割球は、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）フィーダー細胞と一緒に培養され、フィーダー細胞は、割球を体細胞に分化させる条件下で同じ胚から得られる割球を培養して自己フィーダー細胞を作製することにより作製される。
【０００９】
他の実施形態において、胚から得られる割球は、細胞分裂を起こし、一方の子孫細胞は、遺伝子検査に使用され、もう一方の子孫細胞は、ＥＳ細胞を作製するのに使用される。
【００１０】
一実施形態において、ＥＳ細胞又はＥＳ細胞系を作製する方法は、生検により割球を得ること、透明帯を除去すること、胚盤胞を２つの断片に分離すること、ＥＳ細胞又はＥＳ細胞系を作製するために１つの胚盤胞断片を培養すること、及び胚盤胞の残部を着床又は冷凍保存することを含む。別の実施形態において、方法は、着床に先立って及び胞胚腔の形成前に単一割球を得るステップと、割球を培養するステップと、すでに樹立された系からのＥＳ細胞を加えるステップと、ＥＳ細胞を、割球がＥＳ細胞成長を示すまで割球の周りに集塊させるステップと、治療目的のため、得られたＥＳ細胞を収集するステップとを含む。さらに別の実施形態において、方法は、桑実胚のコンパクション前に単一割球を得るステップと、標準培養条件で割球を培養するステップと、ＥＳ細胞が生成し始めるまで、すでに樹立された系からの分裂不活性化ＥＳ細胞を加えるステップと、得られたＥＳ細胞を収集又は冷凍保存するステップとを含む。他の実施形態において、方法は、着床に先立って及び胞胚腔の形成前に単一割球を得るステップと、割球を培養するステップと、すでに樹立された系からのＥＳ細胞を加えるステップと、組換えＯｃｔ−４を割球に導入するか、内因性Ｏｃｔ−４を活性化するステップとを含む。
【００１１】
割球から作製されるＥＳ細胞は、多能性又は全能性であってよい。ＥＳ細胞の多能性又は全能性は、ＥＳ細胞マーカータンパク質についてアッセイすることにより決定することができる。そのようなタンパク質には、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−１、Ｎａｎｏｇ、アルカリホスファターゼ及びＲｅｓ−１が含まれる。
【００１２】
本発明の方法は、哺乳類、例えば、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、霊長類及びヒトで行うことができる。一実施形態において、哺乳類は、非ヒト哺乳類である。別の実施形態において、哺乳類は、ヒトである。
【００１３】
また、本発明は、本発明の方法により作製されるＥＳ細胞を分化させる方法を提供する。ＥＳ細胞は、中胚葉、内胚葉及び外胚葉起源の細胞タイプを含む任意の細胞タイプに分化させることができる。
【００１４】
割球からＥＳ細胞を始めに作製することなく、胚から得られる割球を、分化した細胞タイプ、例えば、中胚葉、内胚葉及び外胚葉に分化させる方法も企図されている。
【００１５】
また、本発明は、ＥＳ細胞又は細胞系に由来する分化した細胞と同様に、本発明の方法によって作製されるＥＳ細胞、これらのＥＳ細胞に由来するＥＳ細胞系を包含する。
【００１６】
本発明により提供されるＥＳ細胞又はＥＳ細胞に由来する細胞は、細胞治療に適している疾患を治療するのに有用である。薬学的に許容できる媒体又は担体と一緒にこれらの細胞を含む医薬組成物も提供される。
【００１７】
栄養芽層幹（ＴＳ）細胞を作製する方法であって、胚から得られる割球を培養するステップであり、胚が生存し続けるステップを含む方法も提供される。一実施形態において、割球は、桑実胚のコンパクションに先立って胚から得られる。別の実施形態において、割球は、胞胚腔の形成前に得られる。割球は、胚を取り囲む透明帯の部分的又は完全な除去によって得ることができる。
【００１８】
胚から得られる割球を、任意の適当な細胞と一緒に培養し、ＴＳ細胞を作製する。割球を培養するのに適している細胞には、すでに樹立された系からなどの胚性幹細胞、胚癌細胞、マウス胚線維芽細胞、他の胚様細胞、胚起源の細胞又は胚に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されるものではなく、それらの多くは、当技術分野において知られており、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ、及び他の供給源から入手可能である。また、割球を、ＥＳ細胞の分化を誘発する因子と一緒に培養することができる。一実施形態において、割球は、ＦＧＦ−４の存在下で培養される。
【００１９】
本発明の方法により作製されるＴＳ細胞は、ＴＳ細胞マーカー、例えば、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、ｃｄｘ−２を発現することができる。また、ＴＳ細胞は、Ｏｃｔ−４又はα−フェトプロテインの発現を欠くことがある。また、ＴＳ細胞を培養してＴＳ細胞系を作製するか、或いは分化させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、幹細胞を、胚の生存度に影響を及ぼすことなく胚から作製することができるという発見に部分的に基づいている。一実施形態において、これらの方法は、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）において現在使用されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ技法を利用する。本明細書で明らかにされるように、多能性胚性幹（ＥＳ）細胞系を、出生までの胚の正常な発育を妨害することなく、胚から摘出される単一割球から作製することができる。
【００２１】
割球の摘出
割球は、桑実胚のコンパクション前、桑実胚のコンパクション中、胞胚腔の形成前又は胚盤胞期中を含むがこれらに限定されない、着床に先立つ様々な発育段階において胚から摘出することができる。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、胚性幹細胞を生じるはずの胚盤胞を生検するための方法を提供し、胚盤胞の残部は、着床されて妊娠及び後の出産をもたらす。この一例において、透明帯は、当業者に知られている任意の手段によって胚盤胞から除去され（この場合、酸性タイロード液ｐＨ２．４を用いて）、無タンパク質培地（ＣＺＢ無タンパク質培地ｐＨ７．４を使用するが、他の無タンパク質培地を使用してもよい）と一緒に培養器上に置かれ、接着し、次いで、胚盤胞は生検される。これは、ピペットに取り付けられているかみそりの刃の小断片を用いて行い、一度切断して胚盤胞を２つの断片に分離したが、胚盤胞の３０％、２０％、１０％又は５％未満が生検されることが好ましい。次いで、血清を培地に添加して胚盤胞を解離させ、生検された断片を用い、当業者によく知られている手段（例えば、生検体を、胚線維芽細胞上、フィーダー非含有マトリックス上などで成長させる）により胚性幹細胞又は胚由来細胞を誘導し、一方、胚盤胞の残部は、着床させるか冷凍保存する。
【００２３】
別の実施形態において、胚性幹細胞の誘導に関する論争は、好ましくは桑実胚のコンパクション前に胚から単一割球を摘出する着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）において使用される技法と同様の技法を用いることにより回避される。これらの方法は、胚の継続する発育に影響を及ぼすことなく胚から１つ又は複数の細胞を摘出するため本発明で使用するように適応させることができる。一実施形態において、生検された割球に細胞分裂を起こさせ、１つの子孫細胞を遺伝子検査に使用し、残りの細胞を使用して幹細胞を作製する。生検された胚は、胚盤胞期に着床させるか、或いはその後の着床のために冷凍することができる。
【００２４】
生検は、２段階からなる。第１段階は、胚を取り囲む透明帯に穴を開けるか、或いは、場合によっては、透明帯を完全に除去することである。いったん穴が開いたら、細胞（好ましくは、１つ又は２つ）を胚から摘出することができる。特定の好ましい実施形態において、方法は、透明帯を除去するか、或いは透明帯に抽出穴を作製するものであり、物理的操作、化学的処理及び酵素消化からなる群から選択される１つ又は複数の技法により行うことができる。使用することができる例示的技法には、
・透明帯部分切開法（ＰＺＤ）：マイクロピペットを用いる透明帯の部分切開；
・透明帯開孔法：タイロード酸による部分消化を介する透明帯の化学的開口；
・透明帯開孔法：プロナーゼ又は他のプロテアーゼによる部分消化を介する透明帯の酵素的開口；
・透明帯菲薄化法：タイロード酸又はレーザーによる透明帯の菲薄化；
・レーザーによる透明帯の点状開口；
・ピエゾマイクロマニピュレーターによる透明帯の点状機械的開口が含まれる。
【００２５】
一実施形態を簡単に説明すると、手順は、胚が約６〜８細胞期である胚発生の３日目に行われる。胚を、ホールディングピペットで保持することにより、鉱油下の１滴の生検培地に入れる。アシスタントハッチングピペットを介して酸性化タイロード液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．６３１７８）を放出することにより、透明帯を局所的に消化する。いったん穴が開いたら、穴を通して細胞（割球）を吸引することができる。
【００２６】
別の実施形態を説明すると、胚盤胞の透明帯を、プロナーゼなどの１つ若しくは複数の酵素又は酵素の混合物で処理することにより少なくとも部分的に消化することができる。透明帯が無傷である胚盤胞の短時間のプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）処理は、透明体の除去をもたらす。プロナーゼと同じか類似のプロテアーゼ活性のある他のタイプのプロテアーゼも使用することができる。
【００２７】
割球の培養
単離された割球は、すでに樹立された系からなどの胚性幹細胞、胚癌細胞、マウス胚線維芽細胞、他の胚様細胞、胚起源の細胞又は胚に由来する細胞が含まれるがこれらに限定されない任意の適当な細胞と一緒に標準培養条件で培地と一緒に培養器具上（例えば、マイクロウエル中）に置くことにより培養することができ、それらの多くは、当技術分野において知られており、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ、及び他の供給源から入手可能である。これらの細胞は、割球の周りに集塊又は凝集する。マイクロウエルマイクロビーズを用いる方法若しくは懸滴法、又は当技術分野において知られているその他の凝集法を含む他の凝集法を使用することができる。特定の理論に束縛されたいわけではないが、数日又は数週間にわたり、培養された割球は、おそらく割球と共培養された胚細胞の間の細胞間相互作用の結果として、又は割球と胚細胞により分泌される因子の間の相互作用からＥＳ細胞成長を示すと考えられる。
【００２８】
１つ又は複数の割球を、残りの胚と一緒に共培養することができる。一実施形態において、割球は、細胞間、細胞分泌因子間及び／又は細胞マトリックス間の接触を可能にする微液滴培養システム又は当技術分野において知られている他の培養システムで残りの胚細胞と一緒に共培養される。微液滴の体積を例えば５０マイクロリットルから約５マイクロリットルまで減らし、シグナルを強めて細胞間相互作用を促進することができる。
【００２９】
特定の実施形態において、割球培養条件には、細胞の分化を阻害するか、さもなければ強化する、例えば、細胞の非ＥＳ細胞、栄養外胚葉又は他の細胞タイプへの分化を防ぐことができる因子と細胞を接触させることが含まれてもよい。そのような条件には、培養細胞をヘパリンと接触させること又は細胞にＯｃｔ−４を導入すること（培地にＯｃｔ−４を含めることによるなど）又は細胞中の内因性Ｏｃｔ−４を活性化することが含まれてよい。
【００３０】
自己フィーダー細胞
また、本発明は、早期に胚盤胞前期胚をプレーティングして自己フィーダー細胞上に幹細胞を作製する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、（ａ）胚盤胞前期胚を分割すること、（ｂ）体細胞に直接分化させる条件下で組織培養液中に一方の部分をプレーティングし、フィーダー細胞を作製すること及び（ｃ）胚盤胞前期胚の他の部分を自己フィーダー細胞上にプレーティングすることを含む。別の実施形態において、自己フィーダー細胞及びＥＳ細胞は、胚盤胞前期胚から摘出された割球から作製されるため、胚の着床される能力を保存する。
【００３１】
ＥＳ細胞の多能性
本発明の方法により作製されるＥＳ細胞の多能性は、ＥＳ細胞マーカータンパク質の発現を検出することにより決定することができる。そのようなタンパク質の例には、八量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ−４）、発生段階特異的胚抗原（ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｍｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＳＳＥＡ）−１、Ｎａｎｏｇ、アルカリホスファターゼ及びＲｅｓ−１が含まれるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、推定上のＥＳ細胞系は、１３、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００を超える継代後に多能性を維持する。また、ＥＳ細胞を、正常な核型の維持についてアッセイすることができる。
【００３２】
ＴＳ細胞の作製
また、本発明は、割球増殖体をＦＧＦ−４と接触させることにより、形態学的に栄養芽層及び／又は胚外内胚葉と似ているが、ＥＳ細胞と似ていない栄養芽層幹（「ＴＳ」）細胞を作製する方法を提供する。例えば、増殖体の培養培地にＦＧＦ−４を加える。ＴＳ細胞は、当技術分野において標準的な手順を用い、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ−１、及びＣｄｘ−２などのタンパク質の発現をアッセイすることにより検出することができる。また、ＴＳ細胞同定は、Ｏｃｔ−４及びα−フェトプロテインなどであるがこれらの限定されないタンパク質の発現がないことにより証明することができる。
【００３３】
ＥＳ細胞の治療用途
本発明は、細胞治療に適している障害を治療する方法であって、治療有効量の本発明のＥＳ細胞を罹患対象に投与することを含む方法を提供する。本発明のＥＳ細胞は、ＥＳ細胞が有用であるいかなる使用にも適している。
【００３４】
一実施形態において、本発明の方法を用い、胚の着床に先立って割球を摘出し、その胚から生じる子供が、将来、例えば、疾患治療、組織修復、移植、細胞衰弱の治療、又は細胞機能障害の治療を必要とする場合には、細胞治療を用いる治療的用途のために胚性幹細胞を誘導及び保存するためその後、割球を前述のように培養する。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、割球、コンパクション前の桑実胚、コンパクションを起こしている桑実胚、又は区分化胚盤胞に由来する細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで直接分化させ、胚性幹細胞系を作製することなく、分化しているか、分化した細胞を作製する。これらの胚由来細胞は、胚性幹細胞と同様、医学的及び生物学的研究において並びに細胞治療、例えば、同種（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）細胞治療において使用するための細胞を提供することによる疾患の治療において有用である。
【００３６】
上述の新規な技法によって作製される胚性幹細胞及び胚由来細胞は、細胞生物学、薬物発見に関する研究において、並びに血液障害、血管障害、心臓疾患、癌の治療、及び創傷治癒のための造血細胞及び血管芽細胞、糖尿病の治療に有用な膵臓β細胞、網膜色素変性症及び黄斑変性症などの網膜疾患の治療に有用な神経細胞及び網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、パーキンソン病、アルツハイマー病、慢性疼痛、脳卒中、精神障害、及び脊髄損傷を治療するのに有用なニューロン、心不全などの心臓疾患を治療するのに有用な心筋細胞、傷跡を残さない創傷修復のために創傷、火傷を治療するのに、創傷修復を促進するのに、及び皮膚の老化を治療するのに有用な皮膚細胞、硬変肝疾患などの肝疾患の治療のための肝細胞、腎不全などの腎疾患の治療のための腎細胞、関節炎の治療のための軟骨、肺疾患の治療のための肺細胞並びに骨粗鬆症などの骨障害の治療に有用な骨細胞の作製を含むがこれらに限定されない細胞治療において利用される。
【００３７】
そのような細胞治療法は、増殖因子、系列−コミットメント因子（ｌｉｎｅａｇｅ−ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）、又は当該遺伝子若しくはタンパク質と組み合わせて本発明のＥＳ細胞を使用するものである。治療法には、組織がｉｎ  ｖｉｖｏで再生される場合には直接移植するために幹細胞又は適切な前駆体細胞を提供することが、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで望ましい組織を再生し、次いで罹患対象にその組織を提供することが含まれてよい。
【００３８】
特段の規定がない限り、本明細書において使用されるすべての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。相違する場合は、本明細書が、定義を含め、管理するはずである。さらに、文脈により特に必要でない限り、単数形の用語には、複数であることが含まれるものとし、複数形の用語には、単数形が含まれるものとする。一般的に、本明細書に記載されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、発生生物学、細胞生物学に関連して使用される命名法、及びそれらの技法は、当技術分野においてよく知られており一般に使用されている命名法及び技法である。例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載されている方法及び材料に類似した又はそれらと等価な方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用することができる。
【００３９】
本明細書に記述されているすべての刊行物及び他の参考文献は、参照により全体として組み込まれるものとする。本明細書には多くの文書が引用されているが、この引用は、これらの文書が、当技術分野における共通一般知識の一部を形成していることを認めるものではない。この明細書及び特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、その他の整数若しくは整数の群の排除ではなく、記述された整数又は整数の群の包含を意味すると理解すべきである。
【実施例】
【００４０】
本発明をより一層理解できるように、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示のみを目的とし、決して本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【００４１】
（実施例１）
実施例１：ＥＳ細胞系の作製
単一割球は、ピエゾパルスを用いて開けた透明帯の穴を介する生検か、或いはＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有ＰＢＳ中で透明帯剥離胚を１０分間脱凝集することのどちらかにより、８細胞期１２９／Ｓｖ−ＲＯＳＡ２６：ＬａｃＺマウス胚から単離した。生検された（７細胞）胚を、性交後日数（ｄ．ｐ．ｃ．）１．５の同期化代理母の卵管に移し、各々の分離割球を、プラスチックの組織培養プレートの底に凝集針を押しつけることにより作成した３００μｍの凹み内で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）陽性１２９Ｓｖ／ＣＤ−１マウスＥＳ（ｍＥＳ）細胞の小さな集塊（約１００細胞）と一緒に凝集させた。２４〜４８時間のインキュベーション後に、ＧＦＰ−ｍＥＳクラスターの大部分の（６０％）側面でＧＦＰ陰性細胞の増殖する「芽」が観察された（図４Ａ、Ｂを参照）。細胞集塊を、マイトマイシンＣ処理マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上にプレーティングし、ノックアウトＤＭＥＭ（１５％ＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ、β−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、ＬＩＦ［２０００Ｕ／ｍｌ］、及びＭＥＫ１阻害剤［５０μＭ］（ｍＥＳ培養培地））中で培養した。例えば、Ｈｏｇａｎ他「マウス胚の操作：実験室マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第２版、１９９４を参照されたい。割球の大部分（５４／９１）は、増殖する細胞集塊を４日以内に形成し、それらを、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ陽性ｍＥＳ細胞から分離した。細胞を、機械的解離又はトリプシン処理により広げ、ＥＳ細胞と形態学的に似ているコロニーを選択し、すべてのＧＦＰ陽性細胞を排除した（図４、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）。
【００４２】
５０を超える継代後に正常な核型（図８Ｄ）及び多能性のマーカーを維持するＬａｃＺ陽性ＥＳ様細胞のいくつかの系を作製した（表１、図６Ｃ）。各系は、八量体結合タンパク質４（Ｏｃｔ−４）、発生段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）−１、Ｎａｎｏｇ、及びアルカリホスファターゼを発現した（図２及び図６Ｅ、Ｇ、Ｉ）。ＥＳ細胞タンパク質マーカーに対する間接的免疫蛍光染色を、４ウエル組織培養プレート上で増殖している細胞に対して行った。例えば、Ｌａｎｚａ  Ｒ、他編、幹細胞ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）Ｖｏｌ．１：胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、２００４）；Ｅｖａｎｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍ．Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ２９２、１５４（１９８１）；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ他、２８２、１１４５（１９９８）；Ｃｏｗａｎ  Ｃ．Ａ．他、Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ．Ｍｅｄ．３５０、１３５３（２００４）を参照されたい。以下の一次抗体、すなわちＯｃｔ−４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｓ、ＣＡ）、ＳＳＥＡ−１（Ｓｏｌｔｅｒ及びＫｎｏｗｌｅｓにより開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡのＤＳＨＢを通じて入手した）、Ｔｒｏｍａ−１（Ｂｒｕｌｅｔ及びＫｅｍｌｅｒにより産生され、ＤＳＨＢを通じて入手した）、α−フェトプロテイン（ＤＡＣＯ）、βＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ．）及び筋肉アクチン（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用した。アルカリホスファターゼ染色は、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄキットを用いて行った。
【００４３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析は、これらの細胞におけるＧＦＰではなくＬａｃＺ遺伝子配列の存在を示し（図５Ａ、Ｂ）、系が、凝集のために使用されたＥＳ細胞ではなく割球に由来することを裏付けた。手短に言えば、ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてＥＳ及びＴＳ細胞から単離し、１反応あたり１００ｎｇを、ＧＦＰとＬａｃＺ双方の遺伝子増幅に使用した。我々は、９５℃で９分間（１サイクル）及び９４℃で４５秒間、５９℃で１分間、７２℃で１．５分間の３７サイクルという反応パラメーターでＧＦＰ遺伝子についてフォワード（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣ−３’）（配列番号１）及びリバース（５’−ＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ−３’）（配列番号２）プライマーを使用した。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。ＬａｃＺ遺伝子の遺伝子型分析は、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）により推奨されているプライマー及びＰＣＲパラメーターで行った。
【００４４】
２つの対照実験では、８細胞胚から単離された個々の割球（ｎ＝４４）を、ｍＥＳ細胞培養培地を含有する２０〜１００μｌの液滴中にプレーティングした。割球の大部分は、１０日間の培養の間に分裂できなかったが、９個（２０％）は、２〜６細胞期で静止する前に分化した栄養芽層様巨大細胞の小さなクラスターを生成した（図４Ｇ、Ｈ）。このことは、細胞の共培養すなわちＥＳ細胞により分泌される物質への割球の暴露が、この方法の成功に極めて重要であることを示唆している。
【００４５】
（実施例２）
実施例２：ＥＳ細胞の分化
ＥＳ様細胞培養物を過剰増殖させた場合、筋肉アクチン（中胚葉）、βＩＩＩチューブリン（外胚葉）、及びα−フェトプロテイン（原始内胚葉）に対する抗体による免疫染色から明らかなように、３つすべての胚層の細胞に自然発生的に分化した（図３Ｂ〜Ｄ及び図８Ａ〜Ｃ）。拍動する心筋、胚外内胚葉及び複数の神経細胞タイプも、分化している培養液においてごく普通に観察された。誘導されたＥＳ細胞の多能性をさらに立証するため、ＥＳ細胞系を、ＣＤ−１マウス胚盤胞に注入するか、或いは前述のような（Ｈｏｇａｎ他、前掲書）８細胞期桑実胚と一緒に凝集させ、レシピエントの雌に移した。得られたキメラ胎児のＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）染色は、ＥＳ細胞系が、心臓、腎臓、肝臓、肺、腸、脳、血液、皮膚及び性隆起などのすべての器官に寄与していることを示した（図３Ａ）。胎児のうちの２４匹（８３％）はキメラであり（図８Ｆ、Ｇ）、９匹の仔のうちの８匹（８９％）はキメラであった（図８Ｈ）（後者は、配偶子中にＬａｃＺ遺伝子を有し（ＰＣＲ分析により裏付けられた；図９）、ＣＤ−１と交配された場合にＬａｃＺ＋子孫を生じ、生殖系列に対する割球由来ＥＳ細胞の寄与を裏付けた）。
【００４６】
ＥＳ細胞の多能性をさらに分析するため、ＥＳ細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注入し、様々な細胞タイプに分化するそれらの能力について調べた。手短に言うと、約１００万個のＥＳ細胞を、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの後大腿部に注入した。約２ヶ月後、マウスを致死せしめ、奇形腫を切除し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンに包埋し、切断した。奇形腫は、とりわけ骨及び軟骨（中胚葉）、神経ロゼット（外胚葉）、並びに繊毛性呼吸上皮（内胚葉）を含む３つすべての胚層由来の組織を含んでいた（図８Ｅ）。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
割球生検胚は、発育能力の低下もなく発育出産した（対照非生検胚の５１％［３８／７５］に比べて４９％［２３／４７］の生存仔体（カイ二乗検定、ｐ＝０．８５））。これらの結果は、ヒトデータと一致しており、正常な胚及びＰＧＤ生検胚が、同程度の効率で胚盤胞へと成長することを示している。９１個の割球のうちの２５個のみ（２７％）が、内部細胞塊（ＩＣＭ）様増殖体を生成し、ほんのわずかな安定ＥＳ幹細胞系がこの研究で得られたが、我々は、この成功率を、割球増殖体の最も早い段階にもっと着目すること、並びに多能性細胞の栄養外肺葉及び他の細胞タイプへの自然発生的分化を阻害又は影響する様々な手段の使用により増加させることができると考えている。
【００４９】
これらのデータは、胚を破壊することなくＥＳ細胞系を誘導することができることを示している。
【００５０】
（実施例３）
実施例３：ＴＳ細胞系の作製
ＥＳ細胞ではなく栄養芽層及び胚外内胚葉と形態学的に似ている割球増殖体を、これらの条件下に維持されトリプシンと一緒に継代されたＦＧＦ−４産生栄養芽層幹（ＴＳ）様細胞５０ｎｇ／ｍｌと一緒にｍＥＳ細胞培地中でさらに培養した。７つの推定上のＴＳ系が樹立され、それらは、正常な核型を維持し、ＴＳ細胞のマーカーを発現した（図６Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｊ）。これらの細胞は、Ｏｃｔ−４（図６Ｈ）及びα−フェトプロテインについて陰性であった。推定上のＴＳ細胞は、ＬａｃＺ＋ＴＳ細胞との凝集によって作製されるキメラ胎児中の胚外系列に寄与していた（図７）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、これらの細胞が、Ｏｃｔ−４ではなくＣｄｘ−２を発現することを裏付けた（図５Ｃ及びＦ）。Ｎａｎｏｇ及びＲｅｘ−１は、推定上のＴＳ細胞系とＥＳ細胞系の双方で発現された（図５Ｄ及びＥ）。
【００５１】
手短に言うと、ＲＴ−ＰＣＲ分析は以下の通り行った。全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＥＳ及びＴＳ細胞から単離し、ＲＮＡ１μｇを、ＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用い、オリゴ（ｄＴ）プライマーによる第１鎖ｃＤＮＡ合成にかけた。ＲＴ反応のうち１０分の１をＰＣＲ増幅にかけた。すべての遺伝子についてのＰＣＲ条件は、６４℃にてアニールさせたα−チューブリン遺伝子を除き、２ｍＭ  Ｍｇ＋＋濃度で９５℃で９分間（１サイクル）、９４℃で４５秒間、６２℃で１分間及び７２℃で１．５分間とした。使用したプライマーは、Ｏｃｔ−４遺伝子、フォワード５’−ＣＴＧＡＧＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧ−３’（配列番号３）、リバース５’−ＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧＧＣＡＣＴＴ−３’（４８４ｂｐ）（配列番号４）；Ｎａｎｏｇ遺伝子、フォワード５’−ＧＧＧＴＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣＴＧ−３’（配列番号５）、リバース５’−ＣＡＡＣＣＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＧ−３（３６３ｂｐ）（配列番号６）；Ｃｄｘ２遺伝子、フォワード５’−ＧＧＣＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＧＡＧＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡ−３’（配列番号７）、リバース５’−ＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＴＣＡＧＡＣＣ−３（４９２ｂｐ）（配列番号８）；Ｒｅｘ−１遺伝子、フォワード５’−ＡＧＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＡＴＡ−３’（配列番号９）、リバース５’−ＧＡＧＧＡＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＡＣＡＣＣＡＣ−３’（４２３ｂｐ）（配列番号１０）；及びα−チューブリン遺伝子、フォワード５’−ＣＡＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴ−３’（配列番号１１）、リバース５’−ＣＡＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣ−３’（５２７ｂｐ）（配列番号１２）とした。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】自己フィーダーとして使用するために増殖させることができるＥＳコロニーに由来する線維芽細胞様細胞を示している。
【図２】Ｓｉｇｍａ製キットを用いてＬａｃ−Ｚについて染色された割球由来ｍＥＳ細胞を示している（Ａ）。図２Ｂ〜２Ｄは、Ｏｃｔ−４（２Ｂ）とＬａｃ−Ｚ（２Ｃ）の双方を発現する同じ細胞についての免疫染色を示している。図２Ｄは、ＤＡＰＩによる対比染色を示している。バー、１００μｍ。
【図３】ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの割球由来ｍＥＳ細胞の分化を示している。図３Ａは、２％グルタルアルデヒド、４％パラホルムアルデヒド中で一夜固定され、Ｓｉｇｍａ製のキットを用いてＬａｃ−Ｚについて染色されたマウス胚を示している。図３Ｂ〜３Ｄは、原始内胚葉（α−フェトプロテイン、３Ｂ）、外胚葉（βＩＩＩチューブリン、３Ｃ）及び中胚葉（筋肉アクチン、３Ｄ）の分子マーカーについての免疫蛍光染色を示している。バー、１００μｍ。
【図４】ｍＥＳ細胞の存在下（４Ａ〜４Ｆ）又は非存在下（４Ｇ、４Ｈ）における単一割球増殖の段階を図示している。図４Ａ（緑色蛍光）及び図４Ｂ（ホフマンモジュレーションオプティクス）は、単一割球との凝集から４８時間後のＧＦＰｍＥＳ細胞の凝集体を可視化している。図４Ｂにおける矢印は、図４Ａでは見えないＧＦＰ陰性細胞の突出クラスターを示している。図４Ｃ（緑色蛍光）及び図４Ｄ（位相差）は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上にプレーティングされた後の、ＧＦＰ＋ｍＥＳ細胞と一緒に凝集されたＧＦＰ陰性細胞の増殖体を示している。図４Ｃ及び４Ｄにおける矢印は、ＧＦＰ陰性細胞を指している。図４Ｅ（緑色蛍光）及び図４Ｆ（位相差）は、ＧＦＰ＋ｍＥＳ細胞及び初期増殖体の機械的解離後に単一割球から生じた細胞の増殖を示している。図４Ｅ及び４Ｆにおける矢印は、残存するＧＦＰ＋ｍＥＳ細胞を指している。図４Ｇは、ＥＳ細胞なしに４日間、ＭＥＦのみの上で増殖された単一割球に由来し、栄養芽細胞を標識するＴｒｏｍａｌで染色された細胞を示している。図４Ｈは、図Ｇと同じであるが、ＤＡＰＩで染色されて３つの核を示す細胞を示している。スケールバー、１００μｍ。
【図５】胚性幹細胞系及び栄養芽層幹（「ＴＳ」）細胞系におけるＬａｃＺ、ＧＦＰ、及び幹細胞マーカー遺伝子のＰＣＲ分析を示している。図５Ａは、ＬａｃＺ特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析を提供しており、ＥＳ及びＴＳ細胞系におけるＬａｃＺ遺伝子の存在を示している。図５Ｂは、ＧＦＰ特異的プライマーについてのＰＣＲ分析を示しており、ヘルパーＥＳ細胞（ＧＦＰ陽性）混入のないことを示している。図５Ｃにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＥＳ細胞系におけるＯｃｔ−４遺伝子の強い発現（５Ｃ）、ＴＳ細胞系におけるかなり低いレベルを示している。ＴＳ細胞系は、予想フラグメントの他に大きなＰＣＲ産物を示した。図５Ｄは、Ｎａｎｏｇ遺伝子の分析を示しており、ＥＳ細胞系における中レベルから高レベルの発現、及びＴＳ細胞系における中レベルを示している。図５Ｅは、ＥＳ及びＴＳ細胞系における同レベルのＲｅｘ−１遺伝子発現を示している。図５Ｆは、ＴＳ細胞系における高レベルの栄養芽層マーカーＣｄｘ−２遺伝子発現、及びＥＳ細胞系における低レベルから無視できるレベルを示している。図５Ｇは、ＲＮＡ試料の入力のために対照として使用されるα−チューブリンを示している。図５に含まれる略語は、以下の通りである。Ｍ、分子量マーカー；ＬａｃＺ、１２９／Ｓｖ−ＲＯＳＡ２６：ＬａｃＺマウス断尾から単離されたゲノムＤＮＡ；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）陽性１２９ｖ／ＣＤ−１マウスＥＳ細胞から単離されたゲノムＤＮＡ；ＣＤ−１、ＣＤ−１マウス断尾から単離されたゲノムＤＮＡ；Ｈ、Ｈ２Ｏ対照。ＰＬ、マウス胎盤ＲＮＡ、Ｍ、分子量マーカー；Ｈ、Ｈ２Ｏ対照。
【図６】単一割球に由来する推定上のＥＳ（左欄）細胞系とＴＳ（右欄）細胞系の比較を図示している。図６Ａ及び６Ｂは、典型的なコロニーの位相差写真を示している。図６Ｃ及び６Ｄは、Ｌａｃ−Ｚ染色コロニーを示しており、それらの単一割球起源を示している。図６Ｅ及び６Ｆは、アルカリホスファターゼ染色を示している。図６Ｇ及び６Ｈは、Ｏｃｔ−４に対する抗体による間接免疫蛍光を示している。図６Ｉは、ＳＳＥＡ−１に対する抗体で染色された推定上のＥＳ細胞を示している。図６Ｊは、推定上のＴＳ細胞のＴＲＯＭＡ−１抗体染色を示している（図６Ｈと同じ視野）。スケールバー、２００μｍ。
【図７】単一割球由来ＴＳ細胞の寄与を示す１０．５日キメラのＬａｃＺ染色胎盤を示している。胎盤の母体部分は剥がされている。この図において、示されている胚部分は、ディスクの遠位側から撮影されており、直径は約４ｍｍである。
【図８】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの割球由来ｍＥＳ細胞の分化を示している。図８Ａ〜８Ｃは、中胚葉（筋肉アクチン、図８Ａ）、原始内胚葉（α−フェトプロテイン、図８Ｂ）、及び外胚葉（βＩＩＩチューブリン、図８Ｃ）の分子マーカーの免疫蛍光分析を示している。図８Ｄは、２つの単一割球由来ｍＥＳ細胞系の代表的染色体スプレッドを示している。Ｇバンド核型分析は、系Ｙ１（上）及びＹ７（下）が、それぞれＸＹ及びＸＸ核型を有することを示している。図８Ｅは、奇形腫によるヘマトキシリン及びエオシン染色切片を示しており、３つすべての胚層からの組織の例を示している。Ｂｎ、骨（中胚葉）；ｎｔ、神経組織（外胚葉）；ｃｒｅ、繊毛性呼吸上皮（内胚葉）。図８Ｅの挿入は、繊毛性呼吸上皮の拡大領域である。図８Ｆは、推定上のＥＳ細胞系のうちの３つから作製された１１．５日キメラ胚を示しており、その各々は、頻繁に観察される高度のキメラ現象を示している。図８Ｇは、推定上のＥＳ系Ｊ−１５からのＬａｃＺ染色キメラのクローズアップ写真である。矢印は、胎盤迷路層を指しており、これも、キメラであり、栄養外胚葉ではなく胚外中胚葉に由来する。図８Ｈは、割球由来（１２９／Ｓｖ）ＥＳ細胞（系Ｊ１５及びＹ１）をＣＤ−１マウス胚と凝集させることにより作製されるキメラ仔を示している。スケールバー：Ａ〜Ｄ−−２００μｍ、Ｆ−１０ｍｍ、Ｇ−２ｍｍ。
【図９】２つの異なる割球由来ＥＳ細胞系から作製されたキメラマウスからの精製精子におけるＬａｃＺ遺伝子の存在を示すＰＣＲ分析を示している。図９に含まれる略語は、以下の通り解釈されるものとする。Ｍ、分子量マーカー；Ｈ、Ｈ２Ｏ対照；ＥＳ、キメラ動物を作製するのに使用されたマウスＥＳ細胞からのＤＮＡ；ＣＤ−１、ＣＤ−１マウスからのＤＮＡ；ＳＰ−１、キメラマウスＮｏ．１の精子からのＤＮＡ；ＳＰ−２、キメラマウスＮｏ．２の精子からのＤＮＡ。
【図１】
0005841926.tif 000003
【図２】
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【図３】
0005841926.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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