(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳がんのウイルス療法用の薬剤であって、
乳がん細胞を特異的に殺し、正常細胞は殺さない遺伝子組み換えウイルスであり、ＮＳ１遺伝子を欠失させた腫瘍溶解性ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を含む
ことを特徴とする乳がんのウイルス療法用薬剤。
【請求項２】
ＮＳ１遺伝子を、逆遺伝学的ストラテジーにより欠失させたものである
請求項１に記載の乳がんのウイルス療法用薬剤。
【請求項３】
ベロ細胞において、ＮＳ１欠損ウイルスｃＤＮＡクローン、ウイルスＮ、Ｍ２−１、Ｐ及びＬタンパク質を含む形質転換プラスミドの５つのウイルス成分の共発現をする
請求項１に記載の乳がんのウイルス療法用薬剤。
【請求項４】
ＮＳ１遺伝子を、アンチゲノムｃＤＮＡからヌクレオチドを除去してＮＳ１の上流の非翻訳領域をＮＳ２の翻訳開始コドンに連結することによって欠失させたものである  請求項２に記載の乳がんのウイルス療法用薬剤。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍溶解性ウイルス療法に関する。本発明者は、ＮＳ１遺伝子を欠失させることによってＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ：ＲＳＶ）を作り出した。また、ＮＳ１遺伝子欠損ＲＳＶ（ΔＮＳ１  ＲＳＶ）は乳がん細胞を殺せるが正常ヒト細胞は殺さないことを発見した。
【背景技術】
【０００２】
乳がん：
乳がんは、女性で最も多いがんであり、毎年世界中で１００万を超える新しい症例が確認されている（非特許文献１）。米国では２００９年に推定１９２３７０人の患者が乳がんだと新たに診断され、約４０１７０人が乳がんで死亡した（非特許文献２）。診断時にリンパ節への転移がない女性の約２４〜３０％が再発する。リンパ節陽性の女性の再発率は５０〜６０％である（非特許文献３）。局所疾患及び転移性疾患と診断された患者の５年生存率はそれぞれ８０％及び２６％である（非特許文献３）。したがって、安全で効果的な治療が依然として絶対的に必要とされている。
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルス療法：
腫瘍溶解性ウイルス療法は、天然または遺伝子操作したウイルスを使用した新しいストラテジーであり、周りの非悪性細胞に害を与えることなく腫瘍細胞を選択的に標的とし、また破壊するためのものである（非特許文献４）。がん細胞の破壊は、複数回にわたるウイルス複製またはそれに続くアポトーシス誘導による直接的な溶解性の破裂を通じて起きる（非特許文献５）。ウイルス療法をうまく応用するためには、がん細胞を溶解させるウイルスの選択的かつ効率的な増幅が必要である。ＮＳ１遺伝子欠損ＲＳＶ（ΔＮＳ１  ＲＳＶ）は、乳がんに対する腫瘍溶解性ウイルスとしての機能を果たす。
【０００４】
ＲＳＶに関する生物学：
ＲＳＶは、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス亜科、ニューモウイルス属に属する。ウイルスＲＮＡのサイズは約１５キロベースであり、ゲノムの３’末端側にリーダー領域、５’末端側にトレーラー領域がある（図１）。ウイルスゲノムには、１０個のウイルスタンパク質についての個々の遺伝子が含まれている（非特許文献６）。ニューモウイルス属のメンバーに特有のＮＳ１遺伝子（非特許文献７）は、ウイルスゲノムの３’末端のプロモーター近くに位置し、そのｍＲＮＡは、直線的な開始／停止／再開モードのＲＳＶ転写物で最も多い（非特許文献８）。ＮＳ１タンパク質は非構造的であると言われるが、これはこのタンパク質がＲＳＶ粒子では検出されていないからである。ＮＳ１は、ＲＳＶに感染した細胞でのみ見られる。
本発明者のグループは、他のことに加えて、ＮＳ１が、ＲＳＶ感染時にタイプＩ−ＩＦＮのシグナル伝達を無効にできることを発見した（非特許文献９、１０）。これは、ＮＳ１が、宿主の自然免疫応答の阻害において直接的な役割を果たすことを意味している。
【０００５】
ＮＳ１遺伝子を変異させることによってＲＳＶを非病原性にすることができ、これによってＲＳＶはもうＩＦＮの放出を阻害しなくなり、正常細胞でのウイルス感染が抑えられる。しかしながら、これらの非病原性のＲＳＶ（ΔＮＳ１  ＲＳＶ）は依然として腫瘍溶解性である。これは腫瘍細胞がＩＦＮを産生したり、それに応答する能力を欠き、その結果、ΔＮＳ１  ＲＳＶの増殖を効率的に支援するからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Parkin, D.M., et al., Global cancer statistics, 2002. CA Cancer JClin, 2005. 55(2): p. 74-108.
【非特許文献２】Jemal, A., et al., Cancer statistics, 2009. CA Cancer J Clin, 2009.59(4): p. 225-49.
【非特許文献３】Donato, B.M., et al., Treatment patterns in patients with advancedbreast cancer who were exposed to an anthracycline, a taxane, and capecitabine:a descriptive report. Clin Ther. 32(3): p. 546-54.
【非特許文献４】Parato, K.A., et al., Recent progress in the battle betweenoncolytic viruses and tumours. Nat Rev Cancer, 2005. 5(12): p. 965-76.
【非特許文献５】Berry, L.J., et al., Potent oncolytic activity of humanenteroviruses against human prostate cancer. Prostate, 2008. 68(6): p. 577-87.
【非特許文献６】Collins, P.L., Y.T. Huang, and G.W. Wertz, Identification of a tenthmRNA of respiratory syncytial virus and assignment of polypeptides to the 10viral genes. J Virol, 1984. 49(2): p. 572-8.
【非特許文献７】Hacking, D. and J. Hull, Respiratory syncytial virus-viral biologyand the host response. J Infect, 2002. 45(1): p. 18-24.
【非特許文献８】Tran, K.C., P.L. Collins, and M.N. Teng, Effects of altering thetranscription termination signals of respiratory syncytial virus on viral geneexpression and growth in vitro and in vivo. J Virol, 2004. 78(2): p. 692-9.
【非特許文献９】Zhang, W., et al., Inhibition of respiratory syncytial virusinfection with intranasal siRNA nanoparticles targeting the viral NSl gene. NatMed, 2005. 11(1): p. 56-62.
【非特許文献１０】Spann, K.M., et al., Suppression of the induction of alpha, beta,and lambda interferons by the NSl and NS2 proteins of human respiratorysyncytial virus in human epithelial cells and macrophages [corrected]. J Virol,2004. 78(8): p. 4363-9.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、正常ヒト細胞を殺すことなく乳がん細胞を殺すのに利用できるＮＳ１遺伝子欠損ＲＳＶ（ΔＮＳ１  ＲＳＶ）を提供する。一実施形態において、逆遺伝学的アプローチを利用し、アンチゲノムｃＤＮＡから１２２〜６３０個のヌクレオチドを除去してＮＳ１の上流の非翻訳領域をＮＳ２の翻訳開始コドンに連結することによってＮＳＩ遺伝子を欠失させる。ΔＮＳ１  ＲＳＶは、ベロ細胞にＮＳ１欠損ＲＳＶ  ｃＤＮＡ及びＮ、Ｐ、Ｍ２−１、Ｌをエンコードする発現プラスミドを共導入することによって回収する。ＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質はタイプＩ−ＩＦＮアンタゴニストとして機能するが、ΔＮＳ１  ＲＳＶウイルス療法ではより多くのタイプＩ−ＩＦＮが産生され、これによって正常細胞でのウイルスの複製は防止され、また抗腫瘍作用が誘導される。
【０００８】
別の実施形態において、遺伝子組み換えウイルスは、タイプＩ−ＩＦＮアンタゴニストとしての関連するタンパク質をエンコードする遺伝子として機能するＮＳ１遺伝子を欠失させるための同様のストラテジーを有するいずれの他のウイルスにもなり得る。
【０００９】
別の実施形態において、ΔＮＳ１  ＲＳＶを、直接注射によりがんの部位に適用することができる。あるいは、ΔＮＳ１  ＲＳＶを、輸血によりがんの部位に送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＲＳＶゲノム並びにその転写及び複製産物の説明図
【図２Ａ】抗ＮＳ１抗体を使用した免疫ブロット法によるウイルスＮＳ１タンパク質の検証写真
【図２Ｂ】感染から２４時間後のウイルスに感染したＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＤ−１０５９ＳＫ細胞の形態写真
【図２Ｃ】感染から２４時間後のプラークアッセイ法で測定したウイルス力価のグラフ。３つの独立した実験の標準偏差をエラーバーで示す。
【図２Ｄ】インビボでの試験的ウイルス療法を示し、皮下ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに移植し、サイズを撮影した写真。コントロールのマウスには同量のビヒクルまたはＰＢＳを投与した。腫瘍のサイズを治療終了時に測定した。各データポイントは、６回の腫瘍測定値±標準偏差の平均を表す。
【図２Ｅ】腫瘍のサイズを測定した結果のグラフ。ウイルス療法をＸ軸下の矢印で示す。コントロールのマウスには同量のビヒクルまたはＰＢＳを投与した。腫瘍のサイズを治療終了時に測定した。各データポイントは、６回の腫瘍測定値±標準偏差の平均を表す。
【図２Ｆ】同じ実験動物から採取した異なる組織ホモジネートにおいて、ウイルス力価を測定して３日間のウイルス注射後のウイルス安全性を試験した結果のグラフ
【図２Ｇ】３日間のウイルス療法後の同じ個体の異なる臓器におけるウイルス安全性を試験するために、ウイルスＦ遺伝子発現（非特許文献９）をＲＴ−ＰＣＲで分析した結果の写真
【図３Ａ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＣＣＤ−１０５９ＳＫ細胞に指定のウイルス（ＭＯＩ＝５）を感染させ、アネキシンＶ結合及びＰＩ取り込みアッセイによるアポトーシス分析のために感染から２０時間後及び４８時間後に回収した結果のグラフ
【図３Ｂ】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にウイルス（ＭＯＩ＝３）を感染させ、ＩＦＮ−βに対する中和抗体（ＮＤ５０は約０．０５〜０．２μｇ／ｍｌ  ＰＢＬ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ社）を感染から１５分後に添加し、アポトーシスをアネキシンＶ結合及びＰＩ取り込みアッセイにより測定した結果のグラフ
【図３Ｃ】ベロ細胞に指定のウイルス（ＭＯＩ＝５）を感染させ、アポトーシスをアネキシンＶ結合及びＰＩ取り込みアッセイにより測定した結果のグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）を本研究において使用した。逆遺伝学的アプローチを利用し、アンチゲノムｃＤＮＡから１２２〜６３０個のヌクレオチドを除去してＮＳ１の上流の非翻訳領域をＮＳ２の翻訳開始コドンに連結することによってＮＳＩ遺伝子を欠失させた。ΔＮＳ１  ＲＳＶは、ベロ細胞にＮＳ１欠損ウイルスｃＤＮＡクローン及びＮ、Ｐ、Ｍ２−１、Ｌをエンコードする発現プラスミドを共導入することによって回収された。あるいは、遺伝子組み換えウイルスは、同様のＮＳ１遺伝子を欠失させたいずれの他のウイルスにもなり得る。
【００１２】
ΔＮＳ１  ＲＳＶがＮＳ１遺伝子を欠いているか否かを確認するために、発明者はベロ細胞（ＩＦＮ−β遺伝子欠損細胞）に野生株ＲＳＶ及びΔＮＳ１  ＲＳＶ（ＭＯＩ＝５）を感染させ、ＮＳ１タンパク質を免疫ブロット法によりＮＳ１特異性抗体を使用して試験した。図２Ａに示すように、ＮＳ１タンパク質は野生株ＲＳＶ感染ベロ細胞でのみ視覚化され、ΔＮＳ１  ＲＳＶ感染細胞では視覚化されず、これはΔＮＳ１  ＲＳＶがＮＳ１遺伝子を欠くことを示す。
【００１３】
ΔＮＳ１  ＲＳＶは、インビトロ及びインビボの両方において乳がん細胞を優先的に殺す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞及び正常ＣＣＤ−１０５９ＳＫ（ヒト正常乳房線維芽細胞）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の指示通りに培養し、次に野生株及びΔＮＳ１  ＲＳＶ（ＭＯＩ＝５）を感染させた。細胞形態の変化を観察し、ウイルス複製を測定した。
図２Ｂは、ΔＮＳ１  ＲＳＶが選択的に細胞変性効果（ＣＰＥ）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞において誘導することを示し、またΔＮＳ１  ＲＳＶが感染から２４時間後にＣＣＤ−１０５９ＳＫ細胞よりこの腫瘍細胞においてより高いウイルス力価を有することは（図２Ｃ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がΔＮＳ１  ＲＳＶの増殖を効率的に支援することを示唆している。ΔＮＳ１  ＲＳＶが他の乳がん細胞株も殺すか否かを試験するために、本発明者は、乳がん細胞株Ｔ−４７Ｄ及びＭＣＦ−７にΔＮＳ１  ＲＳＶ（ＭＯＩ＝５）を感染させた。ＣＰＥを感染から４８時間後に観察したところ（表１）、ΔＮＳ１  ＲＳＶが乳がん細胞を特異的に殺すことが示された。
【００１４】
ΔＮＳ１  ＲＳＶ感染が腫瘍成長の退行をインビボで誘導するか否かを解明するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞を生後４〜６週間のヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（１グループあたりｎ＝６）の左及び右脇腹に皮下注射し、得られた腫瘍を発達させた。ウイルス（１ｘ１０１０ｐｆｕ／ｍｌ）を３回にわたって腫瘍に局所注射し、腫瘍のサイズをデジタルノギスで測定した。図２Ｃ、Ｄは、ΔＮＳ１  ＲＳＶ感染が、コントロールと比較して腫瘍成長の退行を引き起こしたことを示す。局所投与したウイルスの安全性を試験するために、感染マウスの様々な臓器におけるウイルス力価をプラークアッセイ法及びＲＴ−ＰＣＲアッセイにより求めた。図２Ｅ、Ｆに示すように、ウイルスは腫瘍に特異的に局在する。
【００１５】
ΔＮＳ１  ＲＳＶ感染は腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導するが、正常ヒト乳房線維芽細胞ＣＣＤ−１０５９ＳＫ細胞では誘導しない。ΔＮＳ１  ＲＳＶ感染のアポトーシスに対する差別効果を試験するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞及び正常ＣＣＤ−１０５９ＳＫ細胞に指定のウイルス（ＭＯＩ＝５）を感染させ、アポトーシスをアネキシンＶ結合アッセイにより測定した。図３Ａは、コントロールで見られる細胞の自発的アポトーシスと比較すると、ΔＮＳ１  ＲＳＶが腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導することを示す。
【００１６】
ＲＳＶ  ＮＳ１遺伝子のノックダウンは、Ａ５４９細胞におけるより多くのＩＦＮ−βの産生を可能にする（非特許文献９）。乳がん細胞でのウイルス誘導性アポトーシスにおけるＩＦＮ−βの関与について更に調査するために、ＩＦＮ−βに対する中和抗体を使用してＩＦＮ活性を阻害したが、ウイルス感染によって誘導された乳がん細胞におけるアポトーシスを減弱させることはできなかった（図３Ｂ）。この発見を裏付けるために、本発明者は、ベロ細胞（ＩＦＮ−β遺伝子欠損細胞）にΔＮＳ１  ＲＳＶを感染させ、アポトーシスをアネキシンＶ結合アッセイにより測定した。図３Ｃは、コントロールと比較して、ΔＮＳ１  ＲＳＶが依然としてベロ細胞においてアポトーシスを誘導することを示し、これはＩＦＮがウイルス誘導性のアポトーシスに関与していない可能性を示唆している。
【００１７】
表１は、ΔＮＳ１  ＲＳＶがヒト乳がん細胞を選択的に殺すことを示す細胞変性効果（ＣＰＥ）試験である。
【００１８】
【表１】
0005964818.tif 000002
【図１】
0005964818.tif 000003
【図２Ａ】
0005964818.tif 000004
【図２Ｂ】
0005964818.tif 000005
【図２Ｃ】
0005964818.tif 000006
【図２Ｄ】
0005964818.tif 000007
【図２Ｅ】
0005964818.tif 000008
【図２Ｆ】
0005964818.tif 000009
【図２Ｇ】
0005964818.tif 000010
【図３Ａ】
0005964818.tif 000011
【図３Ｂ】
0005964818.tif 000012
【図３Ｃ】
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