(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象である化合物由来のイオンをイオントラップの内部空間に捕捉し、そのあとに質量分析器である該イオントラップ自体により又は該イオントラップからイオンを吐き出して外部の質量分析器によりイオンを質量電荷比に応じて分離し、分離されたイオンを検出器により検出する質量分析装置であって、Ｎ-結合型糖ペプチドを目的化合物として分析するための質量分析装置において、
a)前記目的化合物由来のイオンを前記イオントラップ内に捕捉した状態で、プリカーサイオン選択を行うことなく衝突誘起解離操作を実行することにより、該目的化合物由来のイオンのフラグメンテーションを促進するイオン非選択フラグメンテーション促進手段と、
b)前記目的化合物由来のイオンについて前記イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を行わずに前記質量分析器により質量分析を実行して第１のマススペクトルを取得する第１分析実行手段と、
c)前記目的化合物由来のイオンについて前記イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を行った後に前記質量分析器により質量分析を実行して第２のマススペクトルを取得する第２分析実行手段と、
d)前記目的化合物由来のイオンに対して取得された前記第１のマススペクトルと前記第２のマススペクトルとを比較し、Ｎ-結合型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピークを抽出することにより、前記目的化合物のピークの帰属を判断するデータ処理手段と、
e)前記目的化合物由来のイオンについて、前記データ処理手段により抽出されたトリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2分析を擬似的なＭＳ3分析として実行する擬似ＭＳ3分析実行手段と、
f)前記擬似ＭＳ3分析により得られたマススペクトルを利用して前記目的化合物を構成するペプチドを同定するペプチド同定手段と、
を備えることを特徴とする質量分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析装置であって、
前記イオン非選択フラグメンテーション促進手段は、前記イオン選択操作を伴わないフラグメンテーションの促進操作に加えて、前記イオントラップの内部空間に捕捉したイオンをクーリングするためのクーリングガスとして、脱離作用が相対的に大きな不活性ガスを前記イオントラップ内に導入することを特徴とする質量分析装置。
【請求項３】
請求項２に記載の質量分析装置であって、
前記脱離作用が相対的に大きな不活性ガスは、窒素、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノン又はそれら２種以上を混合したガスのいずれかであることを特徴とする質量分析装置。
【請求項４】
分析対象である化合物由来のイオンをイオントラップの内部空間に捕捉し、そのあとに質量分析器である該イオントラップ自体により又は該イオントラップからイオンを吐き出して外部の質量分析器によりイオンを質量電荷比に応じて分離し、分離されたイオンを検出器により検出する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、Ｎ-結合型糖ペプチドを目的化合物として分析する質量分析方法において、
a)前記目的化合物由来のイオンに対し前記質量分析器により質量分析を実行して第１のマススペクトルを取得する第１分析実行ステップと、
b)前記目的化合物由来のイオンを前記イオントラップ内に捕捉した状態で、プリカーサイオン選択を行うことなく衝突誘起解離操作を実行した後に、前記質量分析器により質量分析を実行して第２のマススペクトルを取得する第２分析実行ステップと、
c)前記目的化合物由来のイオンに対して取得された前記第１のマススペクトルと前記第２のマススペクトルとを比較し、Ｎ-結合型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピークを抽出することにより、前記目的化合物のピークの帰属を判断するデータ処理ステップと、
d)前記目的化合物由来のイオンについて、前記データ処理ステップにおいて抽出されたトリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2分析を擬似的なＭＳ3分析として実行する擬似ＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記擬似ＭＳ3分析により得られたマススペクトルを利用して前記目的化合物を構成するペプチドを同定するペプチド同定ステップと、
を有することを特徴とする質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析装置及び質量分析方法に関し、さらに詳しくは、糖ペプチドなどの高分子化合物の構造解析に有用な質量分析装置及び質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖やペプチドなどの高分子化合物の構造解析においては、ＭＡＬＤＩ（マトリクス支援レーザ脱離イオン化）イオン源と３次元四重極型イオントラップとを搭載したイオントラップ質量分析装置が広く用いられている。イオントラップに一時的に保持した各種イオンを質量分析する手法としては、イオントラップ自体の質量分離機能を利用する場合と、イオントラップからイオンを吐き出し、イオントラップ外部に設けた飛行時間型質量分析器によりイオンを質量分離して検出する場合とがあるが、以下の説明では、それらを包含してイオントラップ質量分析装置ということとする。
【０００３】
イオントラップ質量分析装置を用いた高分子化合物に対する一般的な分析手法は次の通りである。
【０００４】
分析対象の化合物をＭＡＬＤＩ法によりイオン化して得られた各種イオンをイオントラップ内に捕捉したあと、特定の質量電荷比m/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選択的にイオントラップ内に残し、他の不要なイオンをイオントラップ外部に排出するようなイオン選択操作を行う。その後、イオントラップ内に衝突誘起解離（Collision-Induced Dissociation：ＣＩＤ）ガスを導入し、プリカーサイオンを励振させてＣＩＤガスに衝突させることで解離を促す。１回のＣＩＤ操作だけで目的とする構造体が充分に解離しない場合には、プリカーサイオンの選択とＣＩＤ操作とを複数回繰り返すこともある。そうして分析対象の化合物由来のイオンに対し１回以上のＣＩＤ操作を行うことで細かく断片化させたプロダクトイオンについて、質量走査を伴うイオンの検出を実行してＭＳnスペクトルを取得し、このＭＳnスペクトルを解析して分析対象化合物の構造を推定する。
【０００５】
イオントラップ質量分析装置では一般に、検出感度や質量分解能の向上を目的として、捕捉しているイオンをイオントラップの捕捉空間中心付近に集めるために、クーリングと呼ばれる操作が行われる。即ち、不活性ガスであるヘリウム（Ｈｅ）等のクーリングガスをイオントラップ内に導入し、捕捉しているイオンをこれらガスと接触させることにより、イオンが持つ運動エネルギを減衰させる。運動エネルギの小さなイオンは捕捉電場の影響を受け易いため、捕捉空間内での拡がりが抑えられ、捕捉空間中心付近に集まり易くなる。一般的に上述したような質量分析のための一連の行程の中では、外部からイオントラップ内にイオンが導入された後にクーリングが行われ、またＣＩＤ操作によりプリカーサイオンが解離しそれにより生成されたプロダクトイオンが捕捉電場に捕捉された後にもクーリングが行われる。
【０００６】
ところで、上述したようなイオントラップ質量分析装置による分析対象である高分子化合物には、脱離し易い修飾物や官能基が含まれる場合がよくある。修飾物や官能基として代表的なものは、シアル酸、硫酸基、リン酸基などである。ＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ質量分析装置において、酸性糖の一種であるシアル酸が結合している糖鎖やシアル酸結合糖鎖が付加した糖ペプチドを低エネルギＣＩＤにより解離させると、シアル酸が優先的に脱離することが知られている。
【０００７】
しかしながら、こうしたシアル酸の脱離はＣＩＤの過程のみならず、インソース分解やクーリングガスとの衝突によって、さらに飛行時間型質量分析器を用いた場合にはポストソース分解によっても容易に生じる。そのため、ＣＩＤ操作を伴わない通常の質量分析でも、シアル酸の一部や全てが脱離したイオンのピークが観測される（非特許文献１など参照）。こうしたことから、特にＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ質量分析装置では、上記のような脱離し易い修飾物が結合した化合物が未知試料に含まれていると、マススペクトル上には、修飾物が脱離したイオンピークと該修飾物が脱離していないイオンピークとが混在して現れ、イオンピークの帰属の判定が困難になるという問題がある。
【０００８】
また、これら修飾物が結合した目的化合物を質量分析して得られたマススペクトルにおいて各ピーク間の質量電荷比差を利用してピークの帰属を決定する場合、目的化合物とは無関係であるものの脱離した修飾物の質量電荷比と偶然一致してしまうようなピーク（不純物ピークやノイズピークなど）が存在すると、ピークの帰属を誤ってしまい、目的化合物の同定が困難になったり誤同定を起こしたりするという問題もある。
【０００９】
また、イオントラップ質量分析装置を利用してＮ-結合型糖ペプチドの同定や構造解析を行う場合には、次のような問題もある。即ち、Ｎ-結合型糖ペプチドに対して得られるＭＳ2スペクトルには、所定の質量電荷比間隔で並ぶ３本のピーク（以下「トリプレットピーク」という）、具体的には、低質量電荷比側から、糖が全て脱離したペプチドイオン、糖HexNAcの環開裂により生じた0,2X（８３Da）付加ペプチドイオン、及びHexNAc（２０３Da）付加ペプチドイオン、に対応するトリプレットピーク、が特徴的に現れる。そこで一般的には、まずＭＳ2スペクトル上で糖のニュートラルロスを解析することによりトリプレットピークを見つけ、これらピークに対応するイオンをプリカーサイオンに設定してＭＳ3分析を行う。そして、その結果得られたＭＳ3スペクトルに基づいて、ペプチド及び糖鎖結合部位を同定する。
【００１０】
しかしながら、一般的にＭＳ2分析ではＣＩＤ操作を伴わない質量分析（ＭＳ1分析）に比べて検出されるイオン量がかなり少なくなるため、充分な信号強度のＭＳ2スペクトルを作成するためには信号の積算回数を多くする必要があり、それだけＭＳ2分析の繰り返し回数を増やす必要がある。そのため、ペプチドを同定するのに要する時間が長くなるのみならず、微量な生体由来試料を分析する際には分析実行中にサンプルが枯渇してしまいペプチドを同定できなくなるおそれもある。また、ＭＡＬＤＩ法において糖ペプチドのイオン化に適しているとされている2,5-ジヒドロキシ安息香酸（2,5-dhydroxybenzoic acid：DHB）をマトリクスとして用いた場合、真空雰囲気下での分析時中にマトリクスが昇華してしまうためにサンプルであるペプチドがイオン化しなくなることが知られている。このため、ペプチド同定に至るまでの時間を短縮化することが、Ｎ-結合型糖ペプチド解析の際の大きな課題の１つとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】関谷、飯田、「質量分析による糖鎖解析」、トレンズ・イン・グリコサイエンス・アンド・グリコテクノロジー（Trends in Glycoscience and Glycotechnology）、第20巻、第111号、2008年1月、p.55-65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記課題に鑑みて成されたものであり、その目的は、従来法に比べて信号の積算回数を減らし分析時間を短縮しながら糖ペプチドを構成するペプチドを同定することができる質量分析装置及び質量分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するために成された第１発明は、分析対象である化合物由来のイオンをイオントラップの内部空間に捕捉し、そのあとに質量分析器である該イオントラップ自体により又は該イオントラップからイオンを吐き出して外部の質量分析器によりイオンを質量電荷比に応じて分離し、分離されたイオンを検出器により検出する質量分析装置であって、Ｎ-結合型糖ペプチドを目的化合物として分析するための質量分析装置において、
a)前記目的化合物由来のイオンを前記イオントラップ内に捕捉した状態で、プリカーサイオン選択を行うことなく衝突誘起解離操作を実行することにより、該目的化合物由来のイオンのフラグメンテーションを促進するイオン非選択フラグメンテーション促進手段と、
b)前記目的化合物由来のイオンについて前記イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を行わずに前記質量分析器により質量分析を実行して第１のマススペクトルを取得する第１分析実行手段と、
c)前記目的化合物由来のイオンについて前記イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を行った後に前記質量分析器により質量分析を実行して第２のマススペクトルを取得する第２分析実行手段と、
d)前記目的化合物由来のイオンに対して取得された前記第１のマススペクトルと前記第２のマススペクトルとを比較し、Ｎ-結合型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピークを抽出することにより、前記目的化合物のピークの帰属を判断するデータ処理手段と、
e)前記目的化合物由来のイオンについて、前記データ処理手段により抽出されたトリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2分析を擬似的なＭＳ3分析として実行する擬似ＭＳ3分析実行手段と、
f)前記擬似ＭＳ3分析により得られたマススペクトルを利用して前記目的化合物を構成するペプチドを同定するペプチド同定手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１４】
また上記課題を解決するために成された第２発明は、分析対象である化合物由来のイオンをイオントラップの内部空間に捕捉し、そのあとに質量分析器である該イオントラップ自体により又は該イオントラップからイオンを吐き出して外部の質量分析器によりイオンを質量電荷比に応じて分離し、分離されたイオンを検出器により検出する質量分析装置を用いた質量分析方法であって、Ｎ-結合型糖ペプチドを目的化合物として分析する質量分析方法において、
a)前記目的化合物由来のイオンに対し前記質量分析器により質量分析を実行して第１のマススペクトルを取得する第１分析実行ステップと、
b)前記目的化合物由来のイオンを前記イオントラップ内に捕捉した状態で、プリカーサイオン選択を行うことなく衝突誘起解離操作を実行した後に、前記質量分析器により質量分析を実行して第２のマススペクトルを取得する第２分析実行ステップと、
c)前記目的化合物由来のイオンに対して取得された前記第１のマススペクトルと前記第２のマススペクトルとを比較し、Ｎ-結合型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピークを抽出することにより、前記目的化合物のピークの帰属を判断するデータ処理ステップと、
d)前記目的化合物由来のイオンについて、前記データ処理ステップにおいて抽出されたトリプレットピークをプリカーサイオンとしたＭＳ2分析を擬似的なＭＳ3分析として実行する擬似ＭＳ3分析実行ステップと、
e)前記擬似ＭＳ3分析により得られたマススペクトルを利用して前記目的化合物を構成するペプチドを同定するペプチド同定ステップと、
を有することを特徴としている。
【００１５】
なお、擬似的なＭＳ3分析又は擬似ＭＳ3分析（Pseudo-MS3）とは、プリカーサイオン選択とＣＩＤ操作とを組とした操作回数からいえば、つまり名目的にはＭＳ2分析であるものの、実質的にＭＳ3分析を行った場合と類似した結果を得ることができるという意味で与えられた呼称である。
【００１６】
遊離性の高い物質（修飾物や官能基）が基幹構造物に対し１乃至複数結合している目的化合物が試料に含まれている場合、該試料から生成されたイオンに対してイオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を行うと、基幹構造物から修飾物や官能基が盛んに脱離する。そのため、イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を経ない分析結果である第１のマススペクトルには、修飾物や官能基が残っている（未だ結合している）目的化合物由来のピークが充分な強度で現れるのに対し、イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を経た分析結果である第２のマススペクトルでは、修飾物や官能基が残っている化合物由来のピークの強度は大きく減少し、代わりに修飾物や官能基が全て脱離した目的化合物、つまりは該目的化合物の基幹構造物由来のピークが大きな強度で現れる。
【００１７】
分析しようとしている目的化合物がＮ-結合型糖ペプチドである場合、上述したようにマススペクトル上に特徴的なトリプレットピークが現れる。第１のマススペクトル上のトリプレットピークと、質量電荷比が同じ第２のマススペクトル上のトリプレットピークとを比較したとき、イオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作を経て得られる第２のマススペクトル上でイオン強度が増加しているトリプレットピークは信頼度の高いと推定できる。そこでデータ処理手段は、こうして擬似ＭＳ3分析対象であるトリプレットピークを抽出する。
【００１８】
イオン非選択フラグメンテーション促進手段では、衝突誘起解離操作に先立つプリカーサイオン選択を省略しているため、プリカーサイオン選択のための時間が不要になるほか、プリカーサイオン選択によるイオン量の減少が生じないため信号強度の積算回数を減らすことができる。
【００１９】
また擬似的なＭＳ3分析は本来のＭＳ3分析に比べるとプリカーサイオン選択操作回数が少ないので、分析の実行に要する時間が短くて済む。また上述したように、プリカーサイオン選択を経るとプリカーサイオン自体の量もかなり減ることになるが、プリカーサイオン選択操作回数が少ないことで検出されるイオン量も多くなり、信号の積算回数も少なくて済む。そのため、糖ペプチドを構成するペプチドを同定するための分析時間を短縮することができ、サンプルの消費量も抑えることができる。
【００２０】
なお、分析対象であるイオンを生成する手法には様々な方法があるが、特にＭＡＬＤＩイオン源で目的化合物をイオン化し、生成されたイオンをイオントラップに導入して捕捉してクーリングする場合に、目的化合物由来のイオンからの修飾物や官能基の脱離が起こり易い。したがって、本発明に係る質量分析装置及び質量分析方法は、ＭＡＬＤＩイオン源を用いたイオントラップ質量分析装置及び該装置を用いた質量分析方法に特に有用である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る質量分析装置及び方法によれば、従来の手法に比べて、より少ない分析回数及び信号の積算回数で以て糖ペプチドを構成するペプチドを同定することができる。これにより、分析時間を短縮することができるとともに、サンプル消費量を抑えることができ、従来よりも少ない量のサンプルで糖ペプチドの高精度の構造解析を行うことができる。
【００２２】
また、本発明に係る質量分析装置及び方法を用いて、糖ペプチドの糖鎖構造解析を行う前に該糖ペプチドを構成するペプチドを同定するようにすれば、文献（ネイチャー・プロトコルズ（Nature Protocols）、2011、6(3)、p.253-269）で紹介されている糖鎖データベース検索ソフトウエアを用いて糖鎖構造同定を行うことが可能となる。これにより、ニュートラルロス解析として従来よく用いられるデノボシーケンシングでは有用な結果が得られないようなフラグメントイオンの少ないマススペクトルであっても、既知の糖ペプチド情報を用いた糖鎖構造同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の参考例であるイオントラップ質量分析装置の全体構成図。
【図２】本参考例のイオントラップ質量分析装置を用いた特徴的な分析動作の処理手順を示すフローチャート。
【図３】分析対象物の一例である糖ペプチドの概略構造を示す図。
【図４】分析対象物の一例であるリン酸化ペプチドの概略構造を示す図。
【図５】分析対象物の一例である糖ペプチドの概略構造を示す図。
【図６】図３に示した糖ペプチドに対する実測のマススペクトルを示す図。
【図７】図４に示したリン酸化ペプチドに対する実測のマススペクトルを示す図。
【図８】図５に示した糖ペプチドに対する実測のマススペクトル及びＭＳ2スペクトルを示す図。
【図９】本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置の概略構成図。
【図１０】本実施例のイオントラップ質量分析装置を用いた糖ペプチド構造解析の処理手順を示すフローチャート。
【図１１】本実施例のイオントラップ質量分析装置におけるプレＣＩＤ実行後及び擬似ＭＳ2実行後のマススペクトルを示す図。
【図１２】本実施例のイオントラップ質量分析装置において実施されるプレＣＩＤによりトリプレットピークのイオン量が増加した実測例を示す図。
【図１３】図５に示した糖ペプチドに対しプレＣＩＤを実施したときの実測のＭＳ1スペクトル（ａ）、及びクーリングガスとしてアルゴンを使用し且つプレＣＩＤを実施したときの実測のＭＳ1スペクトルを示す図。
【図１４】本実施例のイオントラップ質量分析装置を用いた糖ペプチド構造解析においてクーリングガスとしてアルゴンを使用した場合の処理手順を示すフローチャート。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施例を説明する前に、本発明に関連する質量分析装置の一参考例であるイオントラップ質量分析装置と該装置により実施される特徴的な質量分析方法について、添付図面を参照して説明する。
【００２５】
図１はこの参考例のイオントラップ質量分析装置の全体構成図である。このイオントラップ質量分析装置は、目的試料をイオン化するイオン源１と、イオンを保持するとともに質量電荷比に応じて分離する３次元四重極型のイオントラップ２と、イオンを検出する検出部３と、を備える。
【００２６】
イオン源１はＭＡＬＤＩ法を用いたＭＡＬＤＩイオン源であり、パルス状のレーザ光を出射するレーザ照射部１１、目的化合物を含むサンプルＳが付着されたサンプルプレート１２、レーザ光の照射によってサンプルＳから放出されたイオンを引き出すとともにその引き出し方向を限定するアパーチャ１３、引き出されたイオンを案内するイオンレンズ１４、などを含む。
【００２７】
イオントラップ２は、円環状の１個のリング電極２１と、これを挟むように対向して配置された、入口側エンドキャップ電極２２及び出口側エンドキャップ電極２４と、からなり、これら３個の電極２１、２２、２４で囲まれた空間が捕捉領域となる。入口側エンドキャップ電極２２の略中央にはイオン入射口２３が穿設され、イオン源１から出射したイオンはイオン入射口２３を経てイオントラップ２内に導入される。一方、出口側エンドキャップ電極２４の略中央にはイオン出射口２５が穿設され、イオン出射口２５を経てイオントラップ２内から排出されたイオンは検出部３に到達して検出される。さらに、イオントラップ２には、ガス導入管４１、ガス選択バルブ４２、ヘリウム供給源４３、アルゴン供給源４４などを含むガス供給部４が付設されている。
【００２８】
検出部３は、イオンを電子に変換するコンバージョンダイノード３１と、コンバージョンダイノード３１から到来する電子を増倍して検出する二次電子増倍管３２とからなり、入射したイオンの量に応じた検出信号をデータ処理部５に送る。データ処理部５は、イオントラップ２において質量分離されつつ順次排出されるイオンに対して検出部３で得られる検出信号に基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成部５１のほか、特徴的なデータ処理を実行するニュートラルロス解析部５２、スペクトル比較処理部５３、ピーク帰属決定部５４などの機能ブロックを含む。
【００２９】
主電源部７は制御部６による制御の下に、イオントラップ２のリング電極２１にイオン捕捉用の矩形波電圧を印加するものである。イオン捕捉用矩形波電圧は例えば振幅が±百[V]〜１[kV]程度の範囲であり、また周波数ｆは通常数十[kHz]〜数[MHz]程度の範囲である。補助電源部８は、イオントラップ２に捕捉されているイオンを低エネルギＣＩＤする際に該当イオンを共鳴励振させたり、或いは、イオントラップ２からイオンを排出したりするために、エンドキャップ電極２２、２４にそれぞれ相違する矩形波低電圧を印加するものである。
【００３０】
制御部６は主電源部７、補助電源部８のほか、レーザ照射部１１、ガス選択バルブ４２、データ処理部５などの各部を制御する機能も有する。また制御部６は分析を実行するために測定の手順、つまり測定シーケンスを制御プログラムとして備えているが、この参考例の質量分析装置では、後述する質量分析方法を実施するための特徴的な測定シーケンスを制御プログラムの一部に含む。なお、制御部６及びデータ処理部５はパーソナルコンピュータに予めインストールされた専用の処理・制御ソフトウエアを実行することにより、後述する各機能を実施する構成とすることができる。
【００３１】
この参考例のイオントラップ質量分析装置を用いて、脱離し易い（遊離性の高い）修飾物や官能基を含む高分子化合物である未知の化合物を分析する場合、オペレータが図示しない入力部で所定の操作を行うことで、図２のフローチャートに示した各処理に従って特徴的な分析が実行される。脱離し易い修飾物や官能基としては例えば、シアル酸のほか、硫酸基、リン酸基などがあり、分析対象である化合物としては、シアル酸結合糖鎖、シアル酸結合糖鎖が付加した糖ペプチド、硫酸化糖鎖、硫酸化ペプチド、リン酸化糖鎖、リン酸化ペプチドなどが代表的なものである。ここでは、図３に示した構造のフェツイン糖ペプチド（bovine fetuin-GP3）を分析した場合を例に挙げる。図示するように、この糖ペプチドは基幹構造物の末端に３個のシアル酸が結合したものである。
【００３２】
分析が開始されると、まず、クーリングガスとしてヘリウムを用いた条件の下で目的試料に対する質量分析が実行され、その分析によって得られるデータに基づいてマススペクトルが作成される（ステップＳ１）。より詳しく説明すると、制御部６の制御の下にレーザ照射部１１は短時間レーザ光を出射する。このレーザ光はサンプル（目的試料）Ｓに照射され、サンプルＳ中のマトリクスは急速に加熱されて目的化合物を伴い気化する。この際に目的化合物がイオン化される。これとほぼ同時に又は先行して、ガス供給部４ではヘリウム供給源４３からのヘリウムがガス選択バルブ４２により選択され、ガス導入管４１を通してイオントラップ２内に供給される。レーザ照射により発生したイオンはイオンレンズ１４により形成される静電場によって収束され、イオン入射口２３を経てイオントラップ２内に導入される。そして、主電源部７から印加されるイオン捕捉用矩形波電圧に応じて形成される高周波電場によりイオントラップ２の内部空間に捕捉され、クーリングガスとして導入されているヘリウムに接触してクーリングされる。
【００３３】
図３に示した構造の糖ペプチドに結合しているシアル酸は脱離し易いため、一部のシアル酸はイオン化時やイオン源１からイオントラップ２にまでイオンが輸送される間に脱離する。また、クーリング時にイオンがヘリウムに接触することでも一部のシアル酸は脱離するが、ヘリウムの質量は小さいため、脱離を促進させる作用はそれほど大きくない。そのため、イオントラップ２内には、シアル酸が脱離していない目的化合物由来のイオン[Ｍ＋Ｈ]＋、１個のシアル酸が脱離したイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、２個のシアル酸が脱離したイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−２Sia、 ３個の（全ての）シアル酸が脱離したイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−３Sia、という目的化合物分子由来の４種のイオンが主として捕捉される。
【００３４】
所定時間クーリングを行うことによりイオンを捕捉空間の中央付近に集めた後に、制御部６は、イオントラップ２内から順次異なる質量電荷比を持つイオンが排出されるように、主電源部７及び補助電源部８から各電極２１、２２、２４に印加される電圧を制御する。データ処理部５は上記のような質量走査に伴って検出部３で得られるイオン強度信号を受け取り、マススペクトル作成部５１は所定の質量電荷比範囲に亘るマススペクトルを作成する。図６（ａ）は、クーリングガスとしてヘリウムを用いたときの実測で得られたマススペクトルの一例である。なお、この測定で使用したマトリクスはDHBである。図６（ａ）中で(1)、(2)、(3)、(4)はそれぞれ[Ｍ＋Ｈ]＋、[Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−２Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaに対応したピークであるが、目的化合物が不明である状況ではこれらピークの帰属は不明である。
【００３５】
次に、クーリングガスとしてアルゴンを用いた条件の下で同じ目的試料に対する質量分析が実行され、その分析によって得られるデータに基づいてマススペクトルが作成される（ステップＳ２）。このときの分析条件は、ガス供給部４においてアルゴン供給源４４からのアルゴンがガス選択バルブ４２により選択され、ガス導入管４１を通してイオントラップ２内に供給される以外は、ステップＳ１における分析時と同一である。
【００３６】
このとき、イオン化時やイオン源１からイオントラップ２にまでイオンが輸送される間に一部のシアル酸が脱離することはステップＳ１の分析時と同じである。一方、クーリングガスとしてイオントラップ２に導入されたアルゴンの質量はヘリウムに比べて格段に大きいため、修飾物の脱離やフラグメンテーションを促進させる作用もそれだけ大きい。そのため、イオントラップ２内に導入された目的化合物由来の、[Ｍ＋Ｈ]＋、[Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−２Siaといったイオンからはシアル酸の脱離が盛んに起こる。その結果、所定のクーリング時間が終了して時点でイオントラップ２に捕捉されている目的化合物由来イオンの中では、全てのシアル酸が脱離した[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaが圧倒的に多く、それ以外のイオンは少なくなる。
【００３７】
図６（ｂ）は、クーリングガスとしてアルゴンを用いたときの実測で得られたマススペクトルの一例である。図６（ｂ）で明らかなように、このときにはシアル酸脱離なしのイオン[Ｍ＋Ｈ]＋は観測されず、それ以外の３種のイオンは観測されるものの、全脱離のイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaの強度が極端に大きい。
【００３８】
異なるクーリングガスの下での２つのマススペクトルが得られると、データ処理部５においてニュートラルロス解析部５２及びスペクトル比較処理部５３は２つのマススペクトルのピークパターンを比較し、ピーク帰属に利用可能な情報を収集する（ステップＳ３）。
【００３９】
具体的には、ニュートラルロス解析部５２及びスペクトル比較処理部５３は例えば次のような処理を行う。遊離性の高い修飾物や官能基は限られておりそれらは既知であるので、１個の修飾物や官能基が脱離したときの質量差も既知である。そこで、ニュートラルロス解析部５２は、取得されたマススペクトルに現れる複数のピークの質量電荷比差、つまりはニュートラルロスの質量を計算し、既知の修飾物又は官能基の質量と比較することで、１つの化合物に由来し脱離の有無や脱離の個数の相違により同じ質量電荷比差で並ぶ複数のピークの集合、つまりピーク群を探索する。例えば図６（ａ）に示したマススペクトルでは、(1)、(2)、(3)、(4)のピークがシアル酸に対応した質量電荷比差で並んでいるため、これらが１つの集合、ピーク群として抽出される。
続いて、スペクトル比較処理部５３は、上記のようなニュートラルロスの解析により抽出されたピーク群に含まれる複数のピークの強度をそれぞれ求める。また、もう一方のマススペクトル上で、上記ピーク群に含まれる各ピークと同じ質量電荷比に現れるピークを抽出して、そのピークの強度もそれぞれ求める。
【００４０】
表１は、図６（ａ）、（ｂ）に示すマススペクトルについて得られるピーク群中の各ピークの強度をまとめたものである。また、表２はそれぞれのピーク群の中で質量電荷比が最小であるピークの強度を基準とし、他のピークの強度を比率で示した表である。
【表１】
0005915797.tif 000002
【表２】
0005915797.tif 000003
【００４１】
表２によれば、クーリングガスをヘリウムからアルゴンに変更したことにより、シアル酸が全て脱離した[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaのピーク強度に対してシアル酸が少なくとも１個付加しているイオン[Ｍ＋Ｈ]＋、[Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−２Siaのピーク強度比が激減していることが分かる。そこで、スペクトル比較処理部５３は、例えばこのピーク強度比の変化の大きさを所定の閾値と比較することで判断し、これが有意な変化であると判断されたならば、ピーク群の中で質量電荷比が最小であるピークはシアル酸が全て脱離したイオンのピークであると判断する。また、この場合には、シアル酸が全て脱離したイオンのピークから質量電荷比の増加方向に同じ質量差で現れる複数のピークは、それぞれ１個ずつシアル酸が増えたイオンであると判断できる。
【００４２】
一方、スペクトル比較処理部５３により、ピーク強度比の変化が脱離作用の差異を判断する上で有意な変化でないと判断された場合には、ピーク群の中で質量電荷比が最小であるピークはシアル酸が全て脱離したイオンでない可能性が高いといえる。したがって、この場合には、異なるピークの組み合わせによるピーク群を探す等の処理へ速やかに移行すればよい。
【００４３】
また、クーリングガスにヘリウムを用いて得られたマススペクトルから抽出したピーク群の中で質量電荷比が最小であるピークについて、クーリングガスにアルゴンを用いて得られたマススペクトル上で同一質量電荷比にピークが存在しない場合には、上記ピーク群の中で質量電荷比が最小であるピーク自体が目的化合物由来のピークでない可能性がきわめて高い。即ち、これは、不純物由来のピーク、目的化合物から偶然にシアル酸と質量が同一であるシアル酸以外の別の分子が脱離したイオンのピーク、或いはそれ以外の何らかのノイズによるピークである可能性が高いといえるから、ピーク群の中からこのピークを除外することで新たなピーク群を構成することにより、上記のようなピーク強度比に基づく処理を実行するとよい。
【００４４】
以上のようにしてピークの帰属を決める情報を収集することができたならば、ピーク帰属決定部５４がマススペクトルに現れているピークの帰属を決定する（ステップＳ４）。即ち、目的化合物由来で特定の修飾物や官能基の一部若しくは全部が脱離した又は全てが付加したイオンに対するピークである可能性が高いと判断されたものについては、それぞれ例えば[Ｍ＋Ｈ]＋、[Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−２Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaに帰属するものと決める。また、これらイオンに帰属していない又は帰属する可能性が低いとみなされたピークについては、帰属不明等の結果を出せばよい。これにより、ピーク帰属の精度が向上するため、未知である化合物の同定や目的化合物の構造解析の精度が向上する。
【００４５】
また、例えばピーク強度比の比較判定において単に正否を判断するのではなく、例えばクーリングガスの種類を変えたときの強度比の変化の大きさに従ってピーク帰属の可能性の信頼度を示すスコアを求め、帰属結果とスコアとを併せて出力するようにしてもよい。これにより、分析者はスコアに応じて自動的に実施されたピーク帰属の確からしさを認識し、それを同定や構造解析に利用することができる。
【００４６】
次に、上記参考例に関する別の実測例として、図４に示す構造を有するリン酸化ペプチドを測定した結果について説明する。このリン酸化ペプチドはセリン側鎖にリン酸基（-Ｈ3ＰＯ4）が結合したペプチドであり、当該リン酸基が脱離したものが本実測例の目的化合物に関する基幹構造物となる。
【００４７】
図７（ａ）はクーリングガスとしてヘリウムを用いたときの実測で得られたマススペクトル、図７（ｂ）はクーリングガスとしてアルゴンを用いたときの実測で得られたマススペクトルである。なお、マトリクスは上記実測例と同様にDHBである。図７（ａ）、（ｂ）から分かるように、クーリングガスがヘリウムであるときにもプロトン付加イオン[Ｍ＋Ｈ]＋のほかに該イオンからリン酸が脱離したイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−Ｈ3ＰＯ4、が観察されるが、クーリングガスをアルゴンにすると、リン酸が脱離したイオン[Ｍ＋Ｈ]＋−Ｈ3ＰＯ4、の強度が大きく増加する。これは、ヘリウムに比べてアルゴンのリン酸脱離作用が大きいことを示している。
【００４８】
表３は、図７（ａ）、（ｂ）に示すマススペクトルについて得られるピーク群中の各ピークの強度をまとめたものである。表４は、それぞれのピーク群の中で質量電荷比が最小であるピークの強度を基準とし、他のピークの強度を比率で示した表である。
【表３】
0005915797.tif 000004
【表４】
0005915797.tif 000005
【００４９】
表４によれば、この例においてもクーリングガスをヘリウムからアルゴンに変更したことにより、リン酸が脱離した[Ｍ＋Ｈ]＋−Ｈ3ＰＯ4、のピーク強度に対してリン酸が付加しているイオン[Ｍ＋Ｈ]＋のピーク強度比が激減していることが分かる。したがって、このようなリン酸化ペプチドについても、シアル化糖鎖が付加した糖ペプチドと同様に、クーリングガスの種類を変えて取得した複数のマススペクトルのピークパターンの比較により、目的化合物由来のピーク帰属の精度を高めることができる。
【００５０】
また、上記参考例に関する別の実測例として、図５に示す構造を有する糖ペプチドを測定した結果について説明する。この糖ペプチドは、図３に示したFetuin-GP3と同じ糖鎖を有しアミノ酸配列が異なる、フェツイン３分岐糖ペプチドGP1（bovine fetuine-GP1）である。また、使用したマトリクスは3AQ/CHCAである。
【００５１】
上記試料について、イオントラップ質量分析装置においてクーリングガスにヘリウムを用いて質量分析を行って得られたマススペクトルの一例を図８（ａ）に示す。なお、図８（及び後述の図１３）は、サンプルに対しレーザ光を照射して得られたデータを２５回積算した結果である。
図８（ａ）中のピーク(1)は、目的化合物がイオン化して得られるプロトン付加イオンピーク[Ｍ＋Ｈ]+である。ヘリウムによる弱い脱離促進作用によって、一部の糖は分析中に脱離する。図８（ａ）中の主要イオンピーク群(2)〜(5)は、目的化合物からの糖の脱離により生じたものであり、それぞれ [Ｍ＋Ｈ]＋−Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−２Sia、[Ｍ＋Ｈ]＋−３Sia、及びＮ-結合型糖ペプチドに特徴的な、糖が全て脱離したペプチドイオン、HexNAc環開裂付加ペプチドイオン、及びHexNAc付加ペプチドイオンで構成されるトリプレットピークである。当然、目的化合物が不明である状況では、これらのピークの帰属は不明である。
【００５２】
クーリングガスにアルゴンを用いた場合に実測で得られたマススペクトルの一例を図８（ｂ）に示す。アルゴンによる相対的に強い脱離促進作用により、図８（ａ）の(1)〜(3)に対応する各イオンのピーク強度が減少する一方、(4)、(5)に相当するイオンのピーク強度が増加していることが分かる。図８中に示すように、(1)〜(4)のピークの質量電荷比差がシアル酸のニュートラルロスとして生じる約２９１Da に一致することから、図８（ａ）の (2)〜(4)は、図６に示した結果と同様の理由で、イオントラップ内でシアル酸が全く脱離していないイオン[Ｍ＋Ｈ]+からシアル酸が脱離して生じたイオンである可能性が高いと判断できる。また(5)も同様に、イオントラップ内での脱離促進作用により[Ｍ＋Ｈ]+から新たに生成されたイオンであり、そのピーク群を構成するピークの質量電荷比差からＮ-結合型糖ペプチドに特徴的な上記トリプレットピークである可能性が高いと判断できる。
【００５３】
以上のように、アルゴンとヘリウムとの脱離促進作用の相違から、ＭＳ2分析で得られるＭＳ2スペクトルと同等の情報が得られ、この情報からピークの帰属が可能であることが分かる。図８（ｃ）は、図８（ａ）において(4)で示されるイオンピーク[Ｍ＋Ｈ]＋−３SiaをプリカーサイオンとしてＣＩＤ操作を伴うＭＳ2分析を行って得られたＭＳ2スペクトルである。[Ｍ＋Ｈ]＋−３Siaよりも低質量電荷比側において、図８（ｂ）と（ｃ）とで共通のイオンピークが確認される。このことから、図８（ｂ）は疑似的なＭＳ2スペクトルとみなせることが分かる。さらに、スペクトル全体として図８（ｂ）の方がイオンピーク強度が高く、優れていることが分かる。
【００５４】
なお、上記説明では、質量の小さなクーリングガスとしてヘリウム、質量の大きなクーリングガスとしてアルゴンを使用した場合について説明したが、使用可能なクーリングガスの種類はこれに限らない。
【００５５】
遊離性の修飾物や官能基を脱離する作用の差が大きな複数のクーリングガスの組み合わせを用いることが好ましいことは明らかであり、そのためには１つのガスとしては質量が最も小さく且つ入手が容易なヘリウムを用いるのが好ましい。もう一方のクーリングガスとしては大きな脱離作用を有するという点から言えば、アルゴンよりさらに質量の大きな不活性ガスであるクリプトン、キセノンでもよいが、これらはコスト等の点から採用しにくい。また、アルゴンよりも質量が小さなネオンもアルゴンに代えて用いることは可能であるが、アルゴンよりも高コストで且つ脱離作用の小さいネオンを用いることの利点は少ない。この点で、アルゴンに質量が近く且つ安価である窒素はアルゴンに代わるガスとして有用であると考えられる。
【００５６】
次に、本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置と該装置により実施される特徴的な質量分析方法について、添付図面を参照して説明する。本実施例のイオントラップ質量分析装置は、特に、遊離性の高い糖が付加した糖ペプチド（具体的にはＮ-結合型糖ペプチド）の構造解析を目的としたものであり、上記参考例とは、イオン選択操作を伴わないフラグメンテーション促進の方法が相違する。また、本実施例のイオントラップ質量分析装置では、単にマススペクトル上のピークの帰属を決定するのみならず、そのピーク帰属結果を利用してプリカーサイオンを決定し、さらにそのプリカーサイオンについてのＭＳ2分析（擬似ＭＳ3分析）を実行して得られたマススペクトルを用いて糖ペプチドを構成するペプチドの同定及び糖鎖構造解析も行っている。
【００５７】
図９は、本実施例によるイオントラップ質量分析装置の概略構成図である。この図９に示した構成で図１に示した構成と同じ又は相当する構成要素には同じ番号を付している。ただし、図９中ではイオン源１及び検出部３を簡略化して記載してあるが、図１に示したような構成を採ることが可能であることは言うまでもない。
【００５８】
図９に示すように、本実施例のイオントラップ質量分析装置において制御部６は、機能ブロックとしてプレＣＩＤ実行制御部６１を備える。通常のＣＩＤ操作では、ＣＩＤの対象となるプリカーサイオンの選択（分離）がまず実行され、選択的に残された特定の質量電荷比を有するイオンのフラグメンテーションがＣＩＤにより実施される。これに対し、本発明におけるイオン非選択フラグメンテーション促進手段によるフラグメンテーション促進操作に相当するプレＣＩＤ（preCID）では、実質的なＣＩＤに先立つプリカーサイオンの選択は行われず、特定の質量電荷比又は特定の質量電荷比範囲のイオンをターゲットとしたフラグメンテーションがＣＩＤにより実施される。プレＣＩＤは通常のＣＩＤと同様に、主電源部７及び補助電源部８がリング電極２１及びエンドキャップ電極２２、２４にそれぞれ所定の電圧を印加することで実行される。
【００５９】
また本実施例のイオントラップ質量分析装置においてデータ処理部５は、マススペクトル作成部５１、ニュートラルロス解析部５２、スペクトル比較処理部５３のほかに、擬似ＭＳ3分析のためのプリカーサイオンを選択するプリカーサイオン選択部５５と、マススペクトルに基づいてペプチドを同定するペプチド同定部５６と、糖鎖の構造を解析する糖鎖構造解析部５７と、を機能ブロックとして含む。
【００６０】
以下、この実施例のイオントラップ質量分析装置において糖ペプチドの構造解析を実施する際の制御・処理手順の一例を、図１０及び図１１を参照して説明する。図１０は本実施例のイオントラップ質量分析装置を用いた糖ペプチド構造解析処理手順を示すフローチャート、図１１はプレＣＩＤ実行後及び擬似ＭＳ3実行後のマススペクトルを示す図である。
【００６１】
分析者の指示に応じて制御部６の制御の下に分析が開始されると、まず試料中の目的化合物である糖ペプチドに対する質量分析（ＭＳ1分析）が実行され、マススペクトル作成部５１はその分析によって得られたデータに基づいてマス（ＭＳ1）スペクトルを作成する（ステップＳ１１）。これが本発明における第１のマススペクトルに相当する。例えば図１１（ａ）に示すようなマススペクトルが得られたものとする。
【００６２】
次に、ニュートラルロス解析部５２は、ＭＳ1分析により得られたマススペクトルについて各ピークの質量電荷比差、つまりニュートラルロスの質量と、既知の糖鎖（又は修飾物等）の質量とを比較することにより、糖鎖が脱離して生成されたフラグメントイオン（遊離性糖脱離イオン）を検出する（ステップＳ１２）。これは実質的に、上記参考例のステップＳ３で実施された処理の一部と共通する。例えば図１１（ａ）に示したマススペクトルには、質量電荷比差がシアル酸に相当する３本のピークが存在するから、その中で質量電荷比が最小であるピークが全ての糖鎖が脱離したフラグメントイオンであると判定される。
【００６３】
続いて、同じ目的化合物に対し、ステップＳ１２で求まった遊離性糖脱離イオンをターゲットとしたプレＣＩＤ操作を行い、該イオンのフラグメンテーションを促進させた上でＭＳ1分析を実行する。そして、マススペクトル作成部５１はそのＭＳ1分析で得られたデータに基づいてマススペクトルを作成する（ステップＳ１３）。遊離性糖脱離イオンだけでなく遊離性糖付加イオンをプレＣＩＤのターゲットに加えてもよい。即ち、図１１の例では、シアル酸（Sia）が脱離した質量電荷比m/zがＭ１であるイオンがターゲットとされるか、或いは、これに加えてシアル酸が付加した（脱離していない）質量電荷比m/zがＭ１＋Sia、Ｍ１＋２SiaであるイオンがターゲットとされてプレＣＩＤが実行される。ステップＳ１３で得られるマススペクトルはＭＳ1スペクトルであるが、目的化合物由来のイオンのフラグメンテーションがプレＣＩＤにより促進された後のマススペクトルであるため、擬似的なＭＳ2分析による擬似ＭＳ2スペクトルであるといえる。
【００６４】
図１１（ｃ）は、シアル酸脱離イオン及びシアル酸付加イオンがともにターゲットであるプレＣＩＤが実行された状態で得られたマス（擬似ＭＳ2）スペクトルである。プレＣＩＤによってシアル酸脱離イオン及びシアル酸付加イオンのフラグメンテーションが促進されるため、それらイオンのピークは殆ど現れず、フラグメントイオンの強度が増加する。また、プレＣＩＤでは通常のＣＩＤとは異なりプリカーサイオン選択が実行されないため、ターゲットであるイオンの量は充分に多く、これから生成されるフラグメントイオンの強度も充分に高い。
【００６５】
続いて、ニュートラルロス解析部５２は、上記擬似ＭＳ2スペクトル上で検出されるピークの質量電荷比差を調べ、Ｎ-結合型糖ペプチドのプロダクトイオンに特徴的である、糖が全て脱離したペプチドイオン、HexNAc環開裂付加ペプチドイオン、及びHexNAc付加ペプチドイオンで構成されるトリプレットピークの候補を抽出する。一般に、質量電荷比差のみから判定した場合、トリプレットピークの候補は複数抽出される。それから、スペクトル比較処理部５３は、上記抽出されたトリプレットピーク候補の中で、ステップＳ１１で得られたＭＳ1スペクトルと擬似ＭＳ2スペクトルとについて質量電荷比が同一であるピーク同士を比較し、プレＣＩＤによりイオン強度が最も増加したものを信頼度の高いトリプレットピーク候補であると推定する。そして、プリカーサイオン選択部５５は、高い信頼度で帰属されたトリプレットピークを構成するイオンを、擬似ＭＳ3分析のプリカーサイオンとして選択する（ステップＳ１４）。
【００６６】
図１２は、プレＣＩＤを行うことでＮ-結合型糖ペプチドに特徴的なトリプレットピークのイオン強度が増加した実測例である。これはトランスフェリン（Transferrin）の二分岐糖ペプチドから得られたマススペクトルであり、（ａ）がＭＳ1スペクトル、（ｂ）が通常のＭＳ2スペクトル、（ｃ）がプレＣＩＤ後のＭＳ1分析で得られた擬似ＭＳ2スペクトルである。いずれも２０回の信号積算を行って得られた結果であり、積算回数条件は同一である。なお、通常のＭＳ2スペクトルとは、図１１（ｂ）に示したように、遊離性糖脱離イオンをプリカーサイオンとして選択したあとにＣＩＤを行い、それにより生成されたプロダクトイオンを質量分析して得られたマススペクトルである。
【００６７】
図１２（ａ）に示した通常のＭＳ1スペクトル上でフラグメントイオンによるピークが観測された場合、それがイオントラップ２内での糖の脱離によって生じたものであるのか、或いはイオントラップ２にイオンが導入される前に既に存在していた（典型的にはインソース分解により生じた）ものであるのか、を判断することは困難である。しかしながら、イオントラップ２内でのプレＣＩＤによって強度が増加したイオンは、イオントラップ２内における糖の脱離によって生じたものであると考えるのが妥当である。
【００６８】
図１２に示した例では、実際に、図１２（ａ）中に(1)で示したシアル酸付加イオン及び(3)で示したシアル酸脱離イオンをターゲットとしてプレＣＩＤを行うことで擬似的なＭＳ2分析を行い、それにより得られた擬似ＭＳ2スペクトル（図１２（ｃ））上では、図１２（ａ）中に(2)で示した、ＭＳ1スペクトルで認められるトリプレットピークのイオン強度が増加することを確認することができた。また、図１２（ａ）中に(3)で示したシアル酸脱離イオンをプリカーサイオンとして得られた、図１２（ｂ）のＭＳ2スペクトルと比べて、擬似ＭＳ2スペクトルは全体にイオン強度が高く優れていることが確認できる。これは、参考例の実測例として説明した図８（ｂ）と（ｃ）との比較結果と同様である。
【００６９】
なお、ステップＳ１４でトリプレットピークが抽出された段階で、検索パラメータの１つであるプリカーサイオン質量電荷比にトリプレットピークに対応した質量電荷比を設定するとともに、他の検索パラメータである修飾条件にHexNAc又は環開裂HexNAcを指定した上で、擬似ＭＳ2スペクトルから収集されたピーク情報に対するタンパク質データベース検索を実行してもよい。このデータベース検索の結果、高い信頼度でペプチドが同定された場合には、擬似ＭＳ3分析を実行するまでもないので、以下のステップＳ１５、Ｓ１６の処理を省略することができる。
【００７０】
また、上記タンパク質データベース検索によってペプチドが一定以上の信頼度（相同性）で以てヒットした場合には、その検索に使用したトリプレットピークはより信頼度の高いトリプレットピーク候補であるとみなすことができる。また、トリプレットピークの中で質量電荷比が最大であるピークをプリカーサイオンであるとしてタンパク質データベース検索を行った結果、HexNAc付加ペプチドが１位（最上位）でヒットした場合、又は、トリプレットピークの中で２番目に大きな質量電荷比を持ったピークをプリカーサイオンとしてタンパク質データベース検索を行った結果、HexNAc環開裂付加ペプチドが１位でヒットした場合に、そのトリプレットピークが高い信頼度で以て帰属できたとみなすようにしてもよい。即ち、タンパク質データベース検索をペプチドの同定ではなく、トリプレットピークの信頼度の判定にのみ利用してもよい。
【００７１】
ステップＳ１４でプリカーサイオンが選択されたならば、その指示を受けた制御部６は、そのプリカーサイオンに対してＭＳ2分析を実行し、それにより得られたデータに基づいてマススペクトル作成部５１はマススペクトルを作成する。このマススペクトルは、実質的には２回のＣＩＤを経た擬似的なＭＳ3分析による擬似ＭＳ3スペクトルである（ステップＳ１５）。図１１（ｄ）は、図１１（ｃ）に示した擬似ＭＳ2スペクトル上で抽出されたトリプレットピーク中の１つのピークをプリカーサイオンとした擬似ＭＳ3分析で得られる擬似ＭＳ3スペクトルである。
【００７２】
擬似ＭＳ3スペクトルが得られたならば、ペプチド同定部５６は、この擬似ＭＳ3スペクトルから収集されるピーク情報に対しタンパク質データベース検索を実行することにより、ペプチドを同定する（ステップＳ１６）。上述したように擬似ＭＳ3分析では通常のＭＳ3分析に比べてプリカーサイオン選択操作が少ない分、フラグメントイオンの強度が全体的に高くなる。そのため、擬似ＭＳ3スペクトルから収集されたピーク情報に基づくタンパク質データベース検索ではペプチド同定の正確性が向上し、誤同定や同定漏れも少なくなる。
【００７３】
ステップＳ１６においてペプチドが同定された場合には、糖鎖構造解析部５７はＭＳ1スペクトル上で観測される遊離性糖付加イオン（又は遊離性糖脱離イオン）をＭＳ2分析のプリカーサイオンとして選択しＭＳ2分析を行い、得られたＭＳ2スペクトルから糖鎖構造解析を行う（ステップＳ１７）。糖鎖構造解析方法としては、例えばデノボシーケンシングや糖鎖構造データベース検索などの周知の方法を用いればよい。糖鎖構造データベース検索を行う際には、ステップＳ１６で同定されたペプチドを構造情報として与えればよい。ペプチドが既知である場合に利用可能な糖鎖構造データベース検索ソフトウエアとしては、例えば上記文献（ネイチャー・プロトコルズ）で紹介されている糖鎖構造データベース検索ソフトウエアなどがある。
【００７４】
上記実施例に関する別の実測例として、図５に示す構造を有する糖ペプチドを測定した結果について説明する。図１３（ａ）は、図８（ａ）に示すマススペクトルで観測されるイオンピーク(1)〜(4)をターゲットとしてプレＣＩＤを実施して得られたＭＳ1スペクトルである。プレＣＩＤを実行しない図８（ａ）の結果と比較すると、ピーク(4)よりも低質量電荷比側におけるイオンピークの強度、例えばトリプレットピークの強度、が全体的に増加していることが分かる。この増加したイオンは、イオントラップ２内における糖の脱離によって生じたものであると考えるのが妥当である。即ち、このプレＣＩＤは、上記参考例においてクーリングガスとしてアルゴンを用いたときと同様の、強い脱離促進作用を有することが理解できる。
【００７５】
以上のように、本実施例のイオントラップ質量分析装置によれば、本発明におけるイオン非選択フラグメンテーション促進手段の一形態であるプレＣＩＤを利用して、Ｎ-結合型糖ペプチドに特徴的であるトリプレットピークの帰属の信頼性を向上させ、さらにこれから精度の高いペプチド同定、糖鎖構造解析を実行することが可能となる。
【００７６】
もちろん、本実施例において、上記参考実施例におけるクーリングガスの種類の相違を利用したフラグメンテーション促進を併用してもよい。
【００７７】
図１４は、上記実施例のイオントラップ質量分析装置を用いた糖ペプチド構造解析においてクーリングガスとしてアルゴンを使用した場合の処理手順を示すフローチャートである。この図１４は図１０に示したフローチャートと殆ど共通であるが、図１０中のステップＳ１１に相当するステップＳ１１Ｂではクーリングガスとしてヘリウムが使用され、図１０中のステップＳ１３に相当するステップＳ１３Ｂではクーリングガスとしてアルゴンが使用されている。即ち、糖鎖の脱離を促進するために、クーリングガスとしてアルゴンが使用され、且つ、プレＣＩＤも実施されている。
【００７８】
このように、クーリングガスとしてアルゴンを用い、且つプレＣＩＤも実行した場合の実測例について説明する。図１３（ｂ）は、クーリングガスとしてアルゴンを使用し、しかも、図８（ａ）上のイオンピーク(1)〜(4)をターゲットとしてプレＣＩＤを実施して得られたＭＳ1スペクトルである。図８（ａ）と比較すると、ピーク(4)よりも低質量電荷比側におけるイオンピークの強度が全体的に増加していることが分かる。さらに、クーリングガスとしてアルゴンを使用しプレＣＩＤを実施しない場合（図８（ｂ））や、クーリングガスはヘリウムでプレＣＩＤを実施した場合（図１３（ａ））のいずれと比べても、上述したトリプレットピークの強度が増加していることが確認できる。このことから、ピークの帰属の精度向上や、さらには帰属されたピークをプリカーサイオンとする擬似ＭＳ3分析結果に基づく化合物同定精度の向上には、アルゴン等の脱離促進作用の高いクーリングガスの使用とプレＣＩＤの実行との併用が有効であることが分かる。
【００７９】
なお、上記実施例のイオントラップ質量分析装置では、矩形波電圧により駆動されるデジタルイオントラップを利用しているが、正弦波電圧により駆動される一般的なイオントラップを利用してもよい。また、イオントラップは３次元四重極型のイオントラップでなくてもリニア型のイオントラップでもよい。
【００８０】
さらにまた、上記実施例は本発明の一例にすぎないから、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００８１】
１…イオン源
１１…レーザ照射部
１２…サンプルプレート
１３…アパーチャ
１４…イオンレンズ
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２…入口側エンドキャップ電極
２３…イオン入射口
２４…出口側エンドキャップ電極
２５…イオン出射口
３…検出部
３１…コンバージョンダイノード
３２…二次電子増倍管
４…ガス供給部
４１…ガス導入管
４２…ガス選択バルブ
４３…ヘリウム供給源
４４…アルゴン供給源
５…データ処理部
５１…マススペクトル作成部
５２…ニュートラルロス解析部
５３…スペクトル比較処理部
５４…ピーク帰属決定部
５５…プリカーサイオン選択部
５６…ペプチド同定部
５７…糖鎖構造解析部
６…制御部
６１…プレＣＩＤ実行制御部
７…主電源部
８…補助電源部
【図１】
0005915797.tif 000006
【図２】
0005915797.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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