(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲリジウムカーチラギネウム、カギイバラノリ、又はアスパラゴプシスアルマタの抽出物を有効成分として含有するＬＴＢＰ−４産生促進剤。
【請求項２】
請求項１記載のＬＴＢＰ−４産生促進剤を含有する、ＬＴＢＰ−４産生促進用組成物。
【請求項３】
前記抽出物を、全量に対して、乾燥重量換算として０．０００００１〜９９重量％含む、請求項２記載のＬＴＢＰ−４産生促進用組成物。
【請求項４】
化粧料である、請求項２または３記載のＬＴＢＰ−４産生促進用組成物。
【請求項５】
食品である、請求項２または３記載のＬＴＢＰ−４産生促進用組成物。
【請求項６】
クロレラ、ゲンチアナ、イギス、ゲリジウムカーチラギネウム、ペルベチアカナリクラタ、カギイバラノリ、イモセミル、アスパラゴプシスアルマタ、コンドルスクリスプス、又は月桃葉の抽出物およびＤＡＮＣＥ発現増強因子を含む、外用組成物（但し、コンドルスクリスプスの抽出物およびフィチン酸を含む外用組成物を除く）。
【請求項７】
前記ＤＡＮＣＥ発現増強因子として、ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸又はその生理学的に許容される塩、あるいはＬ−ヒドロキシプロリン又はその生理学的に許容される塩を含む、請求項６に記載の外用組成物（但し、コンドルスクリスプスの抽出物およびフィチン酸を含む外用組成物を除く）。
【請求項８】
前記外用組成物が、ＬＴＢＰ−４産生促進用である、請求項６または７記載の外用組成物。
【請求項９】
クロレラ、ゲンチアナ、イギス、ペルベチアカナリクラタ、カギイバラノリ、イモセミル、コンドルスクリスプス、又は月桃葉の抽出物を有効成分として含有する人工弾性線維形成促進剤。
【請求項１０】
クロレラ、ゲンチアナ、イギス、ゲリジウムカーチラギネウム、ペルベチアカナリクラタ、カギイバラノリ、イモセミル、アスパラゴプシスアルマタ、コンドルスクリスプス、又は月桃葉の抽出物を用いて、インビトロでＬＴＢＰ−４の産生を促進させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類抽出物または植物抽出物を含有するLTBP-4(Latent TGFβ-binding protein-4)産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
LTBP（Latent TGFβ-binding protein；トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質）ファミリーは、血液の凝固に関わる繊維状タンパク質のフィブリンと同じスーパーファミリーに属するタンパク質で、不活性なlatent  TGFβを結合することにより、TGFβをマトリックス内に不活性なまま貯蔵し、必要な時にそこからTGFβを動員できるようにする役割がある。
【０００３】
このようなタンパク質のうち、LTBP-4について、いくつかの疾患との関連や生体内での機能が知られている。すなわち、LTBP-4の発現と癌進行との間の関連（非特許文献１）の他、LTBP-4が、生体内外における弾性線維形成時のエラスチン沈着の働きを促進することなどが報告されている（特許文献１）。さらに、変異LTBP-4（LTBP4-/-）マウスに肺気腫が見られ、ヒトのＣＯＰＤとの関連で発症する遅発性肺気腫の特徴を獲得するという報告もある（非特許文献２および特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開第２０１１−２６２３６号公報
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０３／０１５５０５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bertucci F., et al. Oncogene. 23：1377-91, 2004
【非特許文献２】Sterner-Kock A., et al. Genes Dev. 16：2264-2273, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、このような生理活性を有する有用なタンパク質であるLTBP-4の産生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、藻類抽出物あるいは植物抽出物に、LTBP-4産生促進能があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち本発明は、藻類抽出物または植物抽出物を含有するLTBP-4産生促進剤に関する。
【０００９】
上記LTBP-4産生促進剤は、紅藻類、緑藻類、または褐藻類の抽出物を有効成分として含有し得る。
【００１０】
上記紅藻類は、アクロカエティウム目、チノリモ目、ウシケノリ目、ウミゾウメン目、エリスロペルティス目、オオイシソウ目、カクレイト目、サンゴモ目、ダルス目、テングサ目、ロドゴルゴン目、ベニマダラ目、カギノリ目、カギケノリ目、カワモズク目、 スギノリ目、オゴノリ目、マサゴシバリ目、イタニグサ目、およびイギス目に属する藻類からなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
【００１１】
前記緑藻類は、オオヒゲマワリ目、ヨコワミドロ目、サヤミドロ目、ケトフォラ目、ケトペルティス目、クロレラ目、ミクロタムニオン目、トレボウクシア目、カワノリ目、マミエラ目、モノマスティクス目、ドリコマスティクス目、スミレモ目、ウミイカダモ目、クロロデンドロン目、ドリコマスティクス目、ネフロセルミス目、ヒビミドロ目、アオサ目、シオグサ目、モツレグサ目、ミドリゲ目、イワヅタ目、ミル目、ハネモ目、およびカサノリ目に属する藻類からなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
【００１２】
前記褐藻類は、イソガワラ目、アミジグサ目、ナガマツモ目、カヤモノリ目、ムチモ目、ケヤリモ目、ウルシグサ目、コンブ目、 イシゲ目、およびヒバマタ目に属する藻類からなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
【００１３】
前記植物抽出物は、シソ科、マメ科、クロウメモドキ科、マタタビ科、タデ科、ブドウ科、キク科、リンドウ科、ムラサキ科、シロキクラゲ科、ハス科、アオイ科、ミカン科、ショウガ科、アカネ科などに属する植物からなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
【００１４】
本発明はまた、上記いずれかのLTBP-4産生促進剤を含有する、LTBP-4産生促進用組成物、に関する。
【００１５】
上記LTBP-4産生促進用組成物は、化粧料であり得る。
【００１６】
上記LTBP-4産生促進用組成物は、食品であり得る。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、藻類または植物の抽出物を有効成分とするLTBP-4産生促進剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】種類の異なる藻類または植物の抽出物を含有するLTBP-4産生促進剤（表１に対応）の効果を、コントロール（左）と比較して表わしたグラフである。
【図２】種類の異なる藻類または植物の抽出物を含有するLTBP-4産生促進剤（表２に対応）の効果を、コントロール（左）と比較して表わしたグラフである。
【図３】種類の異なる藻類または植物の抽出物を含有するLTBP-4産生促進剤（表３に対応）の効果を、コントロール（左）と比較して表わしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に用いられるLTBP-4は、配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５１３４４）若しくはそのオルソログ、またはこれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）に由来するポリペプチドをいう。LTBP-4のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウスなどが挙げられる。LTBP-4は分泌タンパク質であり、プロセシングによりシグナル配列が除去され得る。本発明の方法では、LTBP-4としては、シグナル配列が除去されたもの、シグナル配列が除去されていないもののいずれでも使用できるが、シグナル配列が除去されたものが好ましい。また、LTBP-4変異体は、特に限定されず、例えば、配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つLTBP-4をコードするＤＮＡに由来するポリペプチド、配列番号１に示される塩基配列がコードするポリペプチドのうち、１つから数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加した配列が挙げられる。
【００２０】
LTBP-4は、その発現と癌進行との間の関連の他、LTBP-4が、生体内外における弾性線維形成時のエラスチン沈着の働きを促進することなどが報告されている。さらに、肺気腫の治療、ヒトのＣＯＰＤとの関連で発症する遅発性肺気腫等への治療への可能性が示唆されている。
【００２１】
弾性線維は、引き伸ばしても元に戻る「弾性」性質を組織内で担う細胞外線維である。弾性は、体の多くの組織に見られ、肺・動脈・皮膚などのような伸縮性組織に富む組織の機能に必須の性質である。弾性線維は、ミクロフィブリルという線維の周りにエラスチンが沈着・架橋してできると考えられている。エラスチンは、疎水性の強い約７５０個のアミノ酸からなるタンパク質であり、エラスチン沈着には、その働きを促進するLTBP-4等のタンパク質の関与が知られている。
【００２２】
弾性線維は、加齢によって、または炎症細胞から分泌されるプロテアーゼ等の外的要因によって劣化・断裂するため、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患が種々存在する。弾性線維の再生が所望される状態又は疾患は、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの、皮膚のたるみ）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などである。
【００２３】
本発明は、このような弾性線維形成にも関与しているLTBP-4の産生を促進する物質に関するものであり、このようなLTBP-4産生促進作用が藻類または植物抽出物に見出され、藻類または植物抽出物を有効成分とするLTBP-4産生促進剤が提供される。
【００２４】
本発明でいう藻類エキスは、主には、褐藻類、紅藻類または緑藻類から、通常の方法で抽出されるエキスをいう。ここで、紅藻類とは、例えば、ウシケノリ目（ウシケノリ、フノリノウシゲ）、ウミゾウメン目（カモガシラノリ、ヒラガラガラ、フサノリ、ヒラフサノリ、ニセフサノリ、ガラガラ、ベニモヅク、ウミゾウメン）、カクレイト目（ムカデノリ）、サンゴモ目（エゾシコロ、モカサ、オオシコロ）、テングサ目（ユイキリ、シマテングサ、マクサ、オニクサ、オオブサ、オバクサ、ヒラクサ）、ベニマダラ目（ベニマダラ）、カギケノリ目（カギケノリ、タマイタダキ）、スギノリ目（イソダンツウ、ナミイワタケ、アカバ、ミチガエソウ、ハナフノリ、フクロフノリ、カイノリ、シキンノリ、スギノリ、コトジツノマタ、オオバツノマタ、ツノマタ、イボツノマタ、アカバギンナンソウ、イトフノリ、ヒロハノカクレイト、キントキ、フシキントキ、ムカデノリ、ニクムカデ、ウツロムカデ、ヒトツマツ、カタノリ、ナガキントキ、タンバノリ、フダラク、ヒラムカデ、ヒラキントキ、スジムカデ、オオバキントキ、ヒヂリメン、ツルツル、マツノリ、キョウノヒモ、マタボウ、コメノリ、ツノムカデ、トサカマツ、イバラノリ、コヒモイバラ、ホシガタイバラ、スジイバラノリ、カヅノイバラ、カギイバラノリ、サイダイバラ、タチイバラ、ヒロハノトサカモドキ、ホソバノトサカモドキ、ウスギヌ、イカノアシ、エツキイワノカワ、キジノオ、サイミ、オキツノリ、ハリガネ、ハスジグサ、マキユカリ、ユカリ、ホソバナミノハナ、ナミノハナ、アツバノリ、ベニスナゴ、トサカノリ、ミリン）、オゴノリ目（シラモ、ミゾオゴノリ、ベニオゴノリ、フシクレノリ、カバノリ、オゴノリ、マサゴシバリ目（ワツナギソウ、イソマツ、カイメンソウ、タオヤギソウ、フシツナギ、コスジフシツナギ、フクロツナギ、ニセイバラノリ、マサゴシバリ）、イギス目（フトイギス、エゴノリ、トゲイギス、ハネイギス、イギス、ハリイギス、ケイギス、カザシグサ、キヌイトカザシグサ、ニクサエダ、サエダ、ベニヒバ、ナガウブゲグサ、ランゲリア、ヤレウスバノリ、スジウスバノリ、カギウスバノリ、タチウスベニ、ハスジギヌ、トゲノリ、ツクシホウズキ、ベンテンモ、ユナ、ヤナギノリ、マクリ、ケハネグサ、クロソゾ、ニッポンソゾ、ウラソゾ、ミツデソゾ、パピラソゾ、ハネソゾ、マギレソゾ、コブソゾ、ジャバラノリ、フジマツモ、ショウジョウケノリ、イソムラサキ、コザネモ）、アクロカエティウム目、チノリモ目、エリスロペルティス目、オオイシソウ目、ダルス目、ロドゴルゴン目、カギノリ目、カワモズク目、イタニグサ目、などに属する藻類をいう。
【００２５】
緑藻類とは、ヒビミドロ目 （シワランソウモドキ、ランソウモドキ）、アオサ目（ナガアオサ、ボタンアオサ、リボンアオサ、ボウアオノリ、ウスバアオノリ、アナアオサ、アミアオサ、ヤブレグサ）、シオグサ目（ウキオリソウ、タルガタジュズモ、ホソジュズモ、ウスイロジュズモ、フトジュズモ、カイゴロモ、オオシオグサ、カタシオグサ、アサミドリシオグサ、チャシオグサ）、モツレグサ目（シリオミドロ）、ミドリゲ目（アオモグサ、マガタマモ、キッコウグサ、タマバロニア、タマゴバロニア、オオバロニア）、イワヅタ目（ヘライワヅタ、フジノハヅタ、フサイワヅタ、クサビガタハウチワ、イトゲノマユハキ、マユハキモ、ヒメイチョウ）、ミル目（ナンバンハイミル、ヒゲミル、ネザシミル、サキブトミル、ナガミル、ミル、モツレミル、ヒラミル、タマミル、コブシミル、クロミル）、ハネモ目（カタハノハネモ、オオハネモ、ナンカイハネモ）、カサノリ目（ミズタマ、フデノホ、リュウキュウガサ、カサノリ、イソスギナ）、オオヒゲマワリ目、ヨコワミドロ目、サヤミドロ目、ケトフォラ目、ケトペルティス目、クロレラ目、ミクロタムニオン目、トレボウクシア目、カワノリ目、マミエラ目、モノマスティクス目、ドリコマスティクス目、スミレモ目、ウミイカダモ目、クロロデンドロン目、ドリコマスティクス目、ネフロセルミス目、などに属する藻類をいう。
【００２６】
褐藻類とは、イソガワラ目（マツモ、キンイロハンモン）、アミジグサ目（エゾヤハズ、ヤハズグサ、ヘラヤハズ、シワヤハズ、アミジグサ、イトアミジ、フクリンアミジ、フタエオオギ、サナダグサ、ウミウチワ、コナウミウチワ、アツバコモングサ、コモングサ、シマオオギ）、ナガマツモ目（クロモ、フトモヅク、ネバリモ、シワノカワ）、カヤモノリ目（ワタモ、ホソクビワタモ、フクロノリ、カゴメノリ、イワヒゲ、ハバノリ、セイヨウハバノリ、カヤモドキ、カヤモノリ）、ムチモ目（ムチモ）、ケヤリモ目（イチメガサ）、ウルシグサ目（ウルシグサ、タバコグサ）、コンブ目（ワカメ、ツルモ、スジメ、カジメ、クロメ、アラメ、マコンブ、ホソメコンブ）、イシゲ目（イシゲ、イロロ）、ヒバマタ目（ウガノモク、ヤバネモク、ジョロモク、スナビキモク、フシスジモク、ホンダワラ、ヒジキ、オオバノコギリモク、イソモク、アカモク、ノコギリモク、タマハハキモク、ナラサモ、ヒラネジモク、ヤツマタモク、マメタワラ、オオバモク、ウミトラノオ、アズマネジモク、ヨレモクモドキ、エンドウモク、ラッパモク）などをいう。
【００２７】
本発明においては、このようなLTBP-4の産生を促進する作用が、藻類または植物の抽出物に見出された。藻類または植物からの抽出物は、1種を単独または2種以上を組み合わせて使用しても良い。このような藻類または植物としては、限定されず、また、抽出物とは、LTBP-4の産生促進作用が損なわれない限り、藻類または植物からの水可溶性成分、酸可溶性成分、アルカリ可溶性成分、有機溶媒可溶性成分などをいう。
【００２８】
本発明においては、このようなLTBP-4の産生を促進する作用を有する成分としては、藻類および植物から抽出されるのもあれば特に限定はない。例えば、褐藻類はフコイダンが、紅藻類はカラギーナンおよび/またはケイ素が、緑藻類はクロロフィルαおよび/またはβ等が含まれていても良い。
【００２９】
本発明におけるLTBP-4産生促進作用は、植物抽出物にも見出される。本明細書における「植物抽出物」には、植物から抽出した成分の他、植物から抽出した成分と例えば乳酸菌を共存させて得られるような植物抽出分発酵液も含まれる。植物としては、例えば、アオイ科、アカネ科、アケビ科、アブラナ科、アヤメ科、イネ科、イラクサ科、イワウメ科、 イワデンダ科、ウコギ科、ウマノスズクサ科、ウリ科、オオバコ科、オトギリソウ科、キク科、キキョウ科、キンポウゲ科、クスノキ科、クロウメモドキ科、クワ科、ケシ科、ゴマノハグサ科、コバノイシカグマ科、サトイモ科、サクラソウ科、シソ科、シラネアオイ科、シロキクラゲ科、ショウガ科、ジンチョウゲ科、スイカズラ科、スイレン科、スミレ科、セリ科、ゼンマイ科、タデ科、ツゲ科、ツツジ科、ツユクサ科、ドクダミ科、トチノキ科、ナス科、ナデシコ科、ハス科、バラ科、ヒガンバナ科、ヒルガオ科、フウロウソウ科、ブドウ科、ブナ科、ベンケイソウ科、ボタン科、マタタビ科、マツ科、マメ科、マンサク科、ミカン科、ミズキ科、ミツガシワ科、ムラサキ科、メギ科、ヤマノイモ科、ユキノシタ科、ユリ科、ラン科、リンドウ科、レンプクソウ科、ノウゼンカズラ科などに属する植物が挙げられる。
【００３０】
このような植物抽出物は、特に限定されないが、シソ科のオウゴンエキス、ノウゼンカズラ科のタベブイアインペチギノサ、マメ科のカンゾウ根エキス、クロウメモドキ科のナツメ果実エキス、マタタビ科のキウイ種子エキス、タデ科のアイ葉、キク科のアーチチョーク葉エキス、タベブイアインペチギノサ樹皮エキス、リンドウ科のゲンチアナ根エキス、ムラサキ科のシコンエキス、ムラサキ科のムラサキ根エキス、シロキクラゲ科のシロキクラゲ抽出物または多糖体含有シロキクラゲ抽出物、アオイ科のバオバブ葉エキスまたは加水分解バオバブ葉エキス、ミカン科のトウヒエキスまたはビターオレンジ果皮エキス、ミカン科のトウヒエキス/ビターオレンジ果皮エキス、ショウガ科の月桃葉エキス、およびアカネ科のアセンヤクエキスからなる群より選択される１種又は２種以上である。なお、上記植物の抽出物が商業的に入手できるものである場合には、簡便には、当該市販の植物抽出物を用いることもできる。
【００３１】
以下に、本発明の内容を詳細に説明する。
【００３２】
藻類または植物抽出物は、天然物からの抽出液の粗生成物をそのまま用いても、また、粗生成物を分離精製したものを用いてもよい。
【００３３】
藻類または植物の抽出物を得る方法としては、特に限定されず、通常の抽出法が採用される。粗抽出液は、例えば全藻または植物の全体あるいはそれらの特定の部位（根、茎、幹、樹皮、幼芽、葉、花、果実及び種子等の植物の一部）を裁断機・スライサー・カッター・ピーラーなどで細断したものを、水、熱水あるいは有機溶媒を単独あるいは組み合わせて得られる溶媒を用いて抽出することにより得ることができる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等のアルコール類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、アセトン等のケトン類、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシドなどを挙げることができる。
【００３４】
また、溶媒は、室温又は常温の溶媒を用いることもできるが、加熱溶媒や熱溶媒（溶媒を沸点付近に加熱したもの）を用いることもできる。
【００３５】
さらに、酸、アルカリの条件下で抽出する事もできる。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、又は、酢酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸などの有機酸が挙げられる。アルカリとしては、アルカリ無機塩が好ましく用いられ、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等を例示できる。
【００３６】
また、凍結乾燥粉末化法、高圧法や超高圧法を利用する事も可能である。高圧法においては１２０℃、４時間の高圧加熱処理することにより、当該藻類または植物中の細胞が加圧され破砕される。
【００３７】
粗抽出物の抽出条件の一例を挙げる。抽出溶媒が有機溶媒の場合、抽出温度は特に制限はないが、好ましくは１〜１００℃、より好ましくは２０〜１００℃の範囲で、１〜２４時間、好ましくは１時間〜１０時間撹拌しながら行う。また、抽出溶媒が水の場合、抽出時の温度は、溶媒の沸点以下であればよく特に限定されないが、加圧熱水による抽出方法を利用する場合もあるため、約０〜２００℃が好ましく、約２０〜１３０℃がより好ましい。また、反応時間も特に限定するものではないが、好ましくは数秒間〜数日間に設定すれば良く、更に好ましくはい３０分〜６時間に設定すれば良い。
【００３８】
反応温度及び反応時間は、溶媒の種類と濃度により適宜選択すれば良い。
【００３９】
このように抽出されたものであれば、LTBP‐4産生促進能を有する成分を十分に抽出することができる。
【００４０】
得られた抽出物を遠心分離してその上清を、抽出液として得る。かかる抽出液に水可溶性、酸性可溶性、アルカリ可溶性、あるいは有機溶媒可溶性の多糖画分が含まれる。
【００４１】
抽出物の粗生成物から藻類または植物抽出物を分離精製する方法としては、例えば、塩化セチルピリジニウムなどの４級アンモニウム塩を添加し、藻類または植物抽出物を沈殿させ、アルコール溶液で洗浄する方法やＤＥＡＥセルロースなどの陰イオン交換樹脂などを用いたクロマトグラフィーを用いる方法もある。
【００４２】
このように抽出、精製した藻類または植物抽出物溶液は、そのまま用いることもできる他、稀釈液で希釈したり、濃縮してエキスとして用いることもでき、さらには、凍結乾燥などにより乾燥粉末物としたり、ペースト状に調製して用いることもできる。
【００４３】
本発明の藻類または植物抽出物を有効成分とするLTBP-4産生促進剤は、LTBP-4の発現量が低下していることを原因とする疾患の治療に用いることができる。例えば、癌、肺気腫の治療、ヒトのＣＯＰＤとの関連で発症する遅発性肺気腫等への治療への可能性がある。また、LTBP-4産生が関わっているとされる弾性線維形成に関わる疾患の治療にも有用である。弾性線維形成に関わる疾患とは、弾性線維の再生が所望される状態又は疾患のことであり、例えば、肺気腫、血管損傷、皮膚弛緩症、創傷、弾性線維劣化（例えば、加齢又は紫外線により引き起こされるもの）、肌荒れ、動脈硬化、大動脈瘤、加齢黄斑変性症、会陰ヘルニア、肛門ヘルニア、脳底動脈瘤、消化管運動障害、褥瘡などを指す。さらには、皮膚のたるみやしわの予防や改善といった美容目的のためにも有用である。また、本発明のLTBP-4産生促進剤は、弾性線維の再生能を有する細胞の培養用試薬などとしても有用である。さらに、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に役立つ。さらに、十分解明されているとはいえないLTBP-4自体の研究への応用も考えられ、非常に広い範囲で有用であると考えられる。
【００４４】
本発明のLTBP-4産生促進剤は、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品などとして幅広く利用可能な任意の製剤または組成物の形態で提供され得るが、好ましくは、機能性食品または化粧品として利用可能な製剤または組成物である。
【００４５】
本発明のLTBP-4産生促進剤を含む組成物が、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品のいずれの形態を取る場合でも、藻類または植物の抽出物の含有量は、乾燥重量に換算して、例えば約０．０００００１〜９９重量％とすればよく、より好ましくは約０．００００１〜３０重量％、更に好ましくは約０．０００１〜１０重量％、特に好ましくは０．００１〜５重量％である。上記範囲であれば、医薬品、医薬部外品、食品、化粧品の使用で十分なLTBP-4産生促進作用がみられる。
【００４６】
本発明を医薬品または健康食品の用途に用いる場合の藻類または植物の抽出物の投与量は、乾燥重量にして、成人１日当り０．０００１〜５０００ｍｇ／ｋｇとすることができる。上記範囲であれば、LTBP‐4産生を必要とする疾患または状態の改善や予防が可能となる。
【００４７】
皮膚外用剤形態
【００４８】
本発明の藻類または植物の抽出物(粗抽出物または精製物)を有効成分とするLTBP-4産生促進剤は、化粧料又は医薬部外品の外用剤形態として公知の形態を採ることができる。このような形態として、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、パウダー剤、パップ剤、不織布等のシートに薬液を含浸させたシート剤、リップスティックのようなスティック剤などが挙げられる。中でも、好ましくは、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、ゲル剤の形態で用いられる。かかる形態とすることにより、弾性線維形成効果を十分に発揮することができる。皮膚外用剤には、藻類または植物の抽出物に加えて、本発明の効果を損なわない範囲で、外皮用剤(化粧料、医薬部外品、医薬品）に添加される公知の添加剤、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、保湿剤、増粘剤、保存剤（防腐剤）、酸化防止剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、分散剤、香料、着色剤、色素、パール光沢付与剤、血行促進成分、保湿成分、紫外線吸収成分、紫外線散乱成分、洗浄成分、抗菌成分、収斂成分、ビタミン類、アミノ酸類、老化防止成分、抗炎症成分、美白成分、角質柔軟成分、細胞賦活化成分、水等を配合することができる。添加剤は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４９】
また、化粧料組成物の具体的な用途は特に限定されず、化粧水、乳液、クリーム、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームのような基礎化粧料；洗顔料、メイク落とし、ボディーシャンプー、シャンプー、リンスのような洗浄用化粧料；ファンデーション、化粧下地、リップクリーム、口紅、チークカラーのようなメークアップ化粧料；入浴剤などが挙げられる。
【００５０】
＜基剤又は担体＞
基剤又は担体としては、流動パラフィン、スクワラン、ゲル化炭化水素（プラスチベースなど）、オゾケライト、α−オレフィンオリゴマー、軽質流動パラフィンのような炭化水素；メチルポリシロキサン、架橋型メチルポリシロキサン、高重合メチルポリシロキサン、環状シリコーン、アルキル変性シリコーン、架橋型アルキル変性シリコーン、アミノ変性シリコーン、ポリエーテル変性シリコーン、ポリグリセリン変性シリコーン、架橋型ポリエーテル変性シリコーン、架橋型アルキルポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリエーテル変性シリコーン、シリコーン・アルキル鎖共変性ポリグリセリン変性シリコーン、ポリエーテル変性分岐シリコーン、ポリグリセリン変性分岐シリコーン、アクリルシリコン、フェニル変性シリコーン、シリコーンレジンのようなシリコーン油；エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；カラギーナン；ポリビニルブチラート；ポリエチレングリコール；ジオキサン；ブチレングリコールアジピン酸ポリエステル；ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸セチル、イソノナン酸イソノニル、テトラ２−エチルヘキサン酸ペンタエリスリットのようなエステル類；デキストリン、マルトデキストリンのような多糖類；エタノール、イソプロパノールのような低級アルコール；エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノプロピルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールモノプロピルエーテル、ジプロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールモノプロピルエーテルのようなグリコールエーテル；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、グリセリン、イソプレングリコールなどの多価アルコール；水などの水系基剤などが挙げられる。
【００５１】
基剤又は担体は、１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００５２】
＜添加剤＞
本発明の外用組成物に含まれ得る酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ソルビン酸、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、エリソルビン酸、Ｌ−システイン塩酸塩などが挙げられる。
【００５３】
界面活性剤としては、例えば、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタンのようなソルビタン脂肪酸エステル類；モノステアリン酸プロピレングリコールのようなプロピレングリコール脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０（ＨＣＯ−４０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油８０などの硬化ヒマシ油誘導体；モノラウリル酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート２０）、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート６０）、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン（ポリソルベート８０）、イソステアリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのようなポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類；ポリオキシエチレンモノヤシ油脂肪酸グリセリル；グリセリンアルキルエーテル；アルキルグルコシド；ポリオキシエチレンセチルエーテルのようなポリオキシアルキレンアルキルエーテル；ステアリルアミン、オレイルアミンのようなアミン類；ポリオキシエチレン・メチルポリシロキサン共重合体、ラウリルＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコン、ＰＥＧ−９ポリジメチルシロキシエチルジメチコンのようなシリコーン系界面活性剤などが挙げられる。
【００５４】
増粘剤としては、例えば、グアーガム、ローカストビーンガム、カラギーナン、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アクリル酸メタクリル酸アルキル共重合体、ポリエチレングリコール、ベントナイト、（アクリル酸ヒドロキシエチル／アクリロイルジメチルタウリンＮａ）コポリマー、（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリドン）コポリマーなどが挙げられる。
【００５５】
保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸イソブチル、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ベンジル、パラオキシ安息香酸メチル、フェノキシエタノールなどが挙げられる。
【００５６】
ｐＨ調整剤としては、無機酸（塩酸、硫酸など）、有機酸（乳酸、乳酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、コハク酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなど）、有機塩基（トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミンなど）などが挙げられる。
キレート剤としては、ＥＤＴＡ・２ナトリウム塩、ＥＤＴＡ・カルシウム・２ナトリウム塩などが挙げられる。
【００５７】
安定化剤としては、ポリアクリル酸ナトリウム、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。
【００５８】
添加剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００５９】
＜その他の有効成分＞
本発明の外用組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含むことができる。有効成分の具体例としては、例えば、保湿成分、抗炎症成分、抗菌成分、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分、老化防止成分、血行促進成分などが挙げられる。
【００６０】
内服用形態
【００６１】
本発明の有効成分である藻類または植物の抽出物は、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの固形製剤;またはシロップ剤、注射剤などの液状製剤として経口または非経口的に投与することもできる。これらの製剤は、常法の添加剤を含んでいても良い。薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などとして配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００６２】
賦形剤の好適な例としては、例えばＤ−ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖アルコール、ブドウ糖、白糖、乳糖、果糖などの糖類、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、リン酸水素カルシウム、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、β−シクロデキストリン、軽質無水ケイ酸、酸化チタン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、タルク、カオリンなどが挙げられる。
【００６３】
結合剤の好適な例としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどが挙げられる。
【００６４】
崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプンなどが挙げられる。溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
【００６５】
滑沢剤の好適な例としては、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ポリオキシル、セタノール、タルク、硬化油、ショ糖脂肪酸エステル、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなどが挙げられる。
【００６６】
溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤;例えばポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。
【００６７】
等張化剤の好適な例としては、例えば塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤の好適な例としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００６８】
本発明の液状製剤または固形製剤を製造する方法としては、藻類または植物の抽出物を製剤原料と混合して液状製剤または固形製剤を製造する工程を含むものであれば特に限定はなく、公知の方法を使用することができる。
【００６９】
固形製剤調製例：
例えば、藻類または植物の抽出物と製剤原料を含む製剤組成物を練合し、スクリーンを通過させることで成型する押出造粒物を、粉砕し、整粒する方法、前記製剤組成物に練合水を加えバーチカルグラニュレーターによって成型する攪拌造粒の後に、コーミルを用いて粉砕・篩過する方法、及び前記製剤組成物をローラーコンパクターで圧縮した後、ロールグラニュレーターで粉砕し篩過する方法、撹拌造粒の後に、流動層乾燥する方法が例示される。
【００７０】
また、例えば、直打により製造する場合には、藻類または植物の抽出物と製剤原料を含む製剤組成物を混合した後、直接、打錠機に投入して打錠すればよい。
【００７１】
食品
【００７２】
本発明の藻類または植物の抽出物を含むLTBP-4産生促進剤は、食品または機能性食品に含有させて提供され得る。このような食品または機能性食品としては、米飯；そば、うどん、はるさめ、中華麺、即席麺、カップ麺を含む各種の麺類；清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等の飲料；カレールー、シチュー、各種スープ類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；飴、クッキー、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、その他の焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、ドレッシング、味噌、醤油、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、ふりかけ、漬物；その他種々の形態の健康・栄養補助食品などが例示される。
【００７３】
さらには、本発明のLTBP-4産生促進剤を含有するサプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）を調製してもよい。
【００７４】
また、ペットなどの動物用の餌に対して本発明のLTBP-4産生促進剤を含有させることもできる。
【００７５】
食品には、必要に応じて、添加物が加えられる。このような添加物としては、例えばブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、マンニット、デキストリン、クエン酸、クエン酸ソーダ、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＣ、ビタミンＢ類、ビタミンＥ、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、界面活性剤、色素、香料、保存剤などが挙げられる。
【００７６】
本発明の藻類または植物抽出物を含むLTBP-4産生促進剤を用いて、LTBP-4をインビトロで作成すること、LTBP-4自体や弾性線維の研究への応用に用いることも可能である。本発明のLTBP-4産生促進剤を用いて、インビトロでLTBP-4を産生させ、人工弾性線維の培養用試薬、人工皮膚、皮膚モデル、人工血管などの人工組織の作製に用いることもできる。このようなインビトロでの研究や実施への応用に用いる場合、藻類または植物抽出物をそのままの形で用いることも好ましい。
【００７７】
LTBP-4をインビトロで産生させるには、藻類または植物抽出物を抽出したそのまま、あるいは乾燥重量で１％〜７０％程度を含有する組成物を作成し、LTBP-4をインビトロで作成できる細胞と共存させる。このような組成物を、そのまま本発明のLTBP-4産生促進剤として用いることができる。LTBP-4を産生する具体的な方法としては、LTBP-4を産生することのできる細胞を、本発明のLTBP-4産生促進剤と接触させて培養することが含まれる。培養された細胞は、典型的には、細胞外にLTBP-4を分泌する。あるいは、インビボにおいて、LTBP-4の産生を促進させることもできる。用いられる細胞は、任意の動物に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物に由来するものである。このような細胞は、LTBP-4が存在する組織、例えば皮膚、血管、肺、子宮、心臓、腎臓、膵臓、精巣、卵巣、小腸、結腸、軟骨組織に由来する細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、内皮細胞などの細胞が例示される。好ましくは、皮膚線維芽細胞又は血管平滑筋細胞が用いられる。インビトロにおけるLTBP-4産生には、生体由来の初代培養細胞、確立された細胞株、幹細胞などの未分化細胞の培養によって得られる細胞も用いることができる。
【００７８】
LTBP-4を産生することのできる細胞としては、本来は、LTBP-4産生能を有さないか十分な量を発現することができない細胞であって、遺伝子導入によって、LTBP-4を産生するように操作された細胞も含まれる。LTBP-4遺伝子を発現し得るベクターを、細胞に導入することにより、LTBP-4産生能を獲得した細胞、あるいはLTBP-4産生能が改善された細胞が作製できる。
【００７９】
本発明の弾性線維形成促進剤は、さらに、DANCE（developmental arteries and neural crest epidermal growth factor(EGF)-like）発現増強因子（ＤＡＮＣＥ誘導因子）を含んでいてもよい。ＤＡＮＣＥ発現増強因子を用いることができ、例えば、ナンテンカズラエキス、シカクマメエキス、フィチン酸及びその生理学的に許容される塩、並びにＬ−ヒドロキシプロリン及びその生理学的に許容される塩等のＤＡＮＣＥ発現増強因子；ＤＡＮＣＥ発現ベクター、またはＤＡＮＣＥ誘導因子発現ベクターなどが挙げられる。
【実施例】
【００８０】
次に、試験例、実施例等により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８１】
〔実施例1〜２３、比較例1〜６〕（各種藻類および植物の抽出物）
表１〜３に示す市販の各種藻類および植物の抽出物を用いてそのままLTBP-4産生促進の評価試験に供した。
【００８２】
〔試験例１〕（LTBP-4産生促進の評価試験）
【００８３】
試験例１： 
直接吸着法（ダイレクトＥＬＩＳＡ法）を利用して試験を実施した。
まず、９６ウエルプレートにヒト線維芽細胞を１ウエルあたり３５００個播種し、継代用培地（ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入）、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシン）にて３７℃、５％ＣＯ2で４８時間培養した。さらに、血清を含まない培地、すなわち、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２ｍＭのグルタミン、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン、１００ｇ／ｍＬのストレプトマイシンを用い、この無血清培地に、実施例1〜２３および比較例１〜６で得た（表１〜３に記載）抽出物を０．００１重量％加えて、あるいは加えないで、３７℃、５％ＣＯ2で３日間培養した。培養した線維芽細胞の上清（または細胞溶解物）を９６ウエルに添加し、４℃で一晩静置し固定相とした。その後、ＰＢＳを用いてウエルを洗浄し、ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカルから購入）をＰＢＳで４倍に希釈した溶液をウエルに添加しブロッキングを行った後、抗LTBP-4抗体溶液（サンタクルズから購入  SC-30360）を各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた。さらに、ＰＢＳを用いてウエルを洗浄し、ＨＲＰ標識された二次抗体溶液（Zymed Laboratories.Inc.,から購入  ZyMax81-1620）を添加して室温で１時間反応させ、その後発色基質を１０分間反応させた。反応停止後の発色強度を吸光光度計（ＯＤ４５０nm）を用いて測定し、コントロールと比較して表わした数字を表1〜３に記載し、さらにグラフ化したものを図１〜３に示す。
【００８４】
【表１】
0006050573.tif 000002
【表２】
0006050573.tif 000003
【表３】
0006050573.tif 000004
藻類または植物の抽出物は、優れたLTBP-4産生促進作用を有していることが示された。特に、紅藻類または緑藻類から得られる抽出物、あるいは、植物のうちでも、茶花乾燥エキス、バオバブなどを始め、非常に優れた効果を有しているものが見出された。
【００８５】
〔組成物調製例１〕
化粧料組成物
以下の化粧料組成物の実施例中の数値の単位は「重量％」である。
【００８６】
【表４】
0006050573.tif 000005
【００８７】
【表５】
0006050573.tif 000006
【００８８】
[組成物調製例２]
内服組成物
以下の食品組成物の処方例において、藻類または植物の抽出物の重量は乾燥重量である。
食品組成物の全処方において、藻類または植物の抽出物としては、エタノール抽出物が好ましい。
【００８９】
【表６】
0006050573.tif 000007
【００９０】
この飲料は、１日３回の食事毎に１本摂取される。
【００９１】
【表７】
0006050573.tif 000008
【００９２】
この錠剤は、１日３回の食事毎に３錠摂取される。
【図１】
0006050573.tif 000009
【図２】
0006050573.tif 000010
【図３】
0006050573.tif 000011
【配列表】
0006050573000001.app