(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をすでに発現できる組換えヒト宿主細胞を形質転換するための、有効なプロモーターの制御下でヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列及び選択可能なマーカーをコードするヌクレオチド配列を含み、配列番号１の配列を有する真核生物発現ベクターの使用であって、組換えヒト宿主細胞が、ＥＣＡＣＣに第０８０１１００１号で寄託されている組換え２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンである、使用。
【請求項２】
ベクターが直線化されている、請求項１記載のベクターの使用。
【請求項３】
請求項１に記載のベクターを使用してさらに形質転換されたＥＣＡＣＣに第０８０１１００１号で寄託されている組換え２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンである、ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を発現できる形質転換された組換えヒト細胞。
【請求項４】
Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｆｏｒ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＵＫに第０９０７２９０２号で寄託されている組換えＭＳ２４ＰＴＸクローンである、請求項３記載の形質転換された組換えヒト細胞。
【請求項５】
ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質の産生のための、請求項３または請求項４に記載の形質転換された組換えヒト細胞の使用。
【請求項６】
ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を産生するための方法であって：
ａ）組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞を、ヒト長ペントラキシン遺伝子がＣＭＶプロモーターの制御下にあるプラスミドでトランスフェクションし；
ｂ）トランスフェクションされた組換えヒト細胞を選択し、そして増殖させ；
ｃ）ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をトランスフェクションされた組換えヒト細胞の培地から精製することを含み、
組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞が、ＥＣＡＣＣに第０８０１１００１号で寄託されている組換え２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンである、方法。
【請求項７】
トランスフェクションされた組換えヒト細胞が、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｆｏｒ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＵＫに第０９０７２９０２号で寄託されているＭＳ２４ＰＴＸクローンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
精製ステップが少なくとも１つの以下のステップ：アニオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項６または請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高レベルのヒトペントラキシン３（ｈＰＴＸ３）タンパク質を発現できるヒト由来の細胞系、方法及び使用される材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト長ペントラキシン３、ＰＴＸ３又はｈＰＴＸ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＢＤ１３１７０１）は、ジスルフィド架橋によって連結された８つのサブユニットから構成される多量体糖タンパク質である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｆヒト細胞系におけるＰＴＸ３の産生のための発現系をすでに設計している。この系は、ＰＴＸ３遺伝子がヒトユビキチンＣプロモーター配列の制御下にある、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドに基づく。そのような系は、非ヒト起源の細胞系によるＰＴＸ３の内因性産生から誘導されるキメラＰＴＸ３の潜在的な形成を回避する。２Ｆ１２という名称の最良のプロデューサー単離クローンを得られたものから選択した。約２０ｍｇ／ＬのＰＴＸ３が産生されたが、これは商業生産ニーズに十分ではなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ＰＴＸ３発現レベルを増大させる目的で、本発明者らは、ＰＴＸ３遺伝子がＣＭＶプロモーター制御下にあるプラスミドを構築した。プラスミドを用いて、ＰＴＸ３発現ローン２Ｆ１２を再トランスフェクションした。新しい単離されたトランスフェクトーマにおいて検出される生産性レベルは、予想よりも高く、８０ｍｇ／Ｌ付近であった。
【０００５】
発明の説明
高レベルのヒトＰＴＸ３を発現するヒト起源のクローンを、以下のステップ：
ａ）ＣＭＶプロモーターの制御下でのヒトＰＴＸ３を有するプラスミド発現カセットの構築；
ｂ）ＰＴＸ３発現クローンＧ４１８耐性の再トランスフェクションから生じる安定なトランスフェクトーマを選択するための、前記プラスミド中へのハイグロマイシン耐性カセットの挿入；
ｃ）発現された組換えタンパク質の同一性及びレベルの検証；
ｄ）組換えｈＰＴＸ３の生化学的特性化
を含む実験法を用いて得た。
【０００６】
ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０９３７の内容は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【０００７】
本発明の１つの目的は、有効なプロモーターの制御下でヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をコード化するヌクレオチド配列及び選択可能なマーカーをコード化するヌクレオチド配列を含み、基本的に配列番号１の配列を有する真核生物発現ベクターである。
【０００８】
このベクターは、宿主細胞を形質転換するために優先的に使用され、この場合、好ましくは、宿主細胞はすでにヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を発現できる組換えヒト細胞であり、更に好ましくは、組換えヒト細胞はＥＣＡＣＣに第０８０１１００１号で寄託されている組換え２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンである。特定の態様では、ベクターを直線化する。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記開示のベクターによりコード化されるヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を発現できる組換え細胞であり、好ましくは、組換えＨＥＫ２９３Ｆ細胞系であり、更に好ましくは、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  Ｃｅｎｔｒｅ  Ｆｏｒ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ＵＫに第０９０７２９０２号で寄託されている組換えＭＳ２４ＰＴＸクローンである。
【００１０】
本発明の別の態様は、ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を産生するための前記開示の組換え細胞の使用である。
【００１１】
本発明の別の目的は：
ａ）組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質をすでに発現している組換えヒト細胞を、ヒト長ペントラキシン遺伝子がＣＭＶプロモーターの制御下にある選択可能なプラスミドでトランスフェクションし；
ｂ）トランスフェクションされた組換えヒト細胞を選択し、そして増殖させ；
ｃ）トランスフェクションされた組換えヒト細胞の培地からヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を精製することを含む、組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を産生するためのプロセスである。
【００１２】
好ましくは、組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を発現する組換えヒト細胞は、組換えＨＥＫ２９３Ｆ細胞系であり、更に好ましくは、第０８０１１００１号でＥＣＡＣＣに寄託されている組換え２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンである。
【００１３】
好ましい実施形態において、精製ステップは少なくとも１つの以下のステップを含む：アニオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー。
【００１４】
本発明の別の目的は：
ａ）本質的に配列番号１の配列を有する第１のベクター及び本質的に配列番号２の配列を有する第２のベクターでヒト細胞を一時的にまたは連続して同時トランスフェクションし；
ｂ）二重トランスフェクションされた細胞を選択し、増殖させ；
ｂ）二重トランスフェクションされた細胞の培地からヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を精製することを含む、組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を産生するためのプロセスである。
【００１５】
本発明の別の目的は、組換えＭＳ２４ＰＴＸクローンを増殖させ、ヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を培地から精製するステップを含む、組換えヒト長ペントラキシンＰＴＸ３タンパク質を産生するプロセスである。
【００１６】
本発明を非限定的例により、特に以下の図面を参照して説明する：
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３マップ及び主要特性の図。
【図２】（Ａ）ＭＳ２４ＰＴＸクローン及び（Ｂ）２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２クローンのスピナーフラスコ中での増殖、生存率及び生産性。
【図３】ＭＳ２４ＰＴＸクローンから精製された組換えヒトＰＴＸ３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配４〜１５％（Ａ）及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｂ）による特性化。
【図４】ｈＰＴＸ３クローン２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２及びｈＰＴＸ３クローンＭＳ２４ＰＴＸのＦＧＦ２結合能。
【図５】ｐＳＣ１−ｈＰＴＸ３マップ及び主要特性。
【実施例】
【００１８】
実施例１：クローン２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２
プラスミドｐＳＣ１−ＰＴＸ３の構築
【００１９】
１．ｐＳＧ／Ｕｂの構築
【００２０】
１．１ヒトユビキチンＣプロモーター配列の調製
ヒトユビキチンＣプロモーターを、ｐＵＢ／Ｂｓｄプラスミド（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ５１２−２０）から、ＰＣＲでの増殖により得る。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を両端で導入する。ＢｓａＡＩ部位を上流増幅プライマーにおいて構築し、ＥｃｏＲＩ部位を下流プライマーにおいて構築する。増幅された領域は、ｐＵＢ／Ｂｓｄの配列においてヌクレオチド１９４１〜３１６１に対応する。
オリゴヌクレオチドは次のように設計される：
５’ｐＵｂＣ：長さ：２６ｍｅｒ（配列番号３）ＡＴ  ＡＴＣＡＣＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＣＣＧ  ＣＧＣ  Ｃ  
３’ｐＵｂＣ：長さ：２３ｍｅｒ（配列番号４）ＧＧＡＡＴＴＣ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  Ａ
増幅のプロトコルは次のとおりである：１ｎｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭの各プライマー、１×で供給された緩衝液及び０．０４ｕ／ｍｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）；温度プロフィール：３分９４℃、３０回（３０秒  ９４℃、３０秒  ４６℃、２分  ７２℃）、５分  ７２℃、将来使用するまで４℃で冷却。
増幅産物（１２３８ｂｐ）をシリカ膜スピンカラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ，  Ｍａｃｈｅｒｙ−Ｎａｇｅｌ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．）により精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ  ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  ｎ．  Ａ１３６０）中でライゲートし、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＨＢ２１５１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に形質転換する。形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加したＬＢ培地上で増殖させることにより選択する。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを、Ｓｔｕｌ及びＳａｄ酵素での制限分析によりチェックする（予想：〜３６５０及び６００ｂｐフラグメント）。
正しい制限パターンを示すプラスミドを全挿入物の配列分析によりさらにチェックし、続いてＥｃｏＲＩ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）及びＢｓａＡＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）制限酵素で消化する。
ヒトユビキチンＣプロモーターを、アガロースゲル分離及びシリカ膜スピンカラム上での溶出により精製する。
【００２１】
１．２  ベクターフラグメントｐＳＧ５の精製
プラスミドｐＳＧ５（４０７６ｂｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）及びＢｓａＡＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で切断した；結果として得られたフラグメントは１４３２及び２６４４ｂｐの長さである。ｐＳＧ５の骨格を含む２６４４ｂｐフラグメントを調製し、アガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
【００２２】
１．３  ｐＳＧ／Ｕｂの調製
ステップ１．１及び１．２で調製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし、ＨＢ２１５１大腸菌細胞で形質変換させた。形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加したＬＢ培地上で増殖させることによって選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＳａｃＩＩ酵素での制限分析によりチェックした（予想：２６７０及び１１９２ｂｐフラグメント）。予想される制限パターンを有するプラスミドＤＮＡを、ｐＳＧ／Ｕｂとして設計した。
【００２３】
２．ｐＳＣ１の構築
【００２４】
２．１  ネオマイシン耐性カセット（ＮｅｏＲ）の調製
ネオマイシン耐性カセット（ＮｅｏＲ）をｐｃＤＮＡ３プラスミド（５４４６ｂｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得、これをＰＣＲにより増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼＡｆｌＩＩＩの認識配列を両端で導入した。増幅された領域は、ｐｃＤＮＡ３の配列におけるヌクレオチド１７８８〜３２５２に相当し、ＳＶ４０プロモーター及び複製起源、ネオマイシン耐性ＯＲＦ、及びＳＶ４０ｐｏｌｉＡシグナルを含む。
オリゴヌクレオチドを次のように設計する：
５’ＮｅｏＲ（配列番号５）ＡＴＡＴＡＣＡＴＧ  ＴＣＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＡＡ  
３’ＮｅｏＲ（配列番号６）ＡＴＡＴＡＣＡＴ  ＧＴＡＴ  ＡＣＡ  ＧＡＣ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＡＧ
増幅のためのプロトコルは以下のとおりであった：１ｎｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭの各プライマー、１×で供給された緩衝液及び０．０４ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）；温度プロフィール：３分  ９４℃、３０回（３０秒  ９４℃、３０秒  ４６℃、２分  ７２℃）、５分  ７２℃、将来使用するまで４℃で冷却。
増幅産物（１４８４ｂｐ）をシリカ膜スピンカラムにより精製し、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．  ｎ．  Ａ１３６０）中にライゲートし、大腸菌宿主株ＨＢ２１５１で形質転換した。
形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加したＬＢ培地上で増殖させることによって選択する。
アンピシリン耐性コロニーから単離したプラスミドＤＮＡを、ＳｍａＩ及びＳａｄ酵素での制限分析によってチェックする（予想：〜１２００及び３３００ｂｐフラグメント）。
正しい制限パターンを示すプラスミドを全挿入物の配列分析によりさらにチェックし、続いてＡｆｌＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）制限酵素で消化した。ＮｅｏＲカセット（１４７１ｂｐ）をアガロースゲル分離及びシリカ膜スピンカラム上での溶出により精製した。
【００２５】
２．２  ベクターフラグメントｐＳＧ／Ｕｂの調製
ステップ１．３で調製されたプラスミドｐＳＧ／ＵｂをＡｆｌＩＩＩ消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。
【００２６】
２．３  ｐＳＣ１の調製
ステップ２．１及び２．２で調製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートし、ＪＭ１０９大腸菌株（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で形質転換した。形質転換体を、５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加したＬＢ培地上で増殖させることによって選択した。
抗生物質耐性コロニーを、前述のように、５’ＮｅｏＲ及び３’ＮｅｏＲオリゴヌクレオチドでのＰＣＲ増幅により前もって分析し、続いて精製されたプラスミドを制限分析によってチェックした。この目的のために、ＳｍａＩ（位置６０２、ＮｅｏＲ配列の内側）及びＳａｃＩＩ（位置４１４２、ＵｂＣ配列の内側）酵素を使用した。予想される制限パターン（３５４０及び１７９３ｂｐフラグメント）を有するプラスミドＤＮＡをｐＳＣ１として設計した。
【００２７】
３．ｐＳＣ１−ＰＴＸ３の構築
【００２８】
３．１  ｈＰＴＸ３コーディング配列の調製
ｈＰＴＸ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＢＤ１３１７０１）配列を、ｐＳＧ５−ＰＴＸ３（ＷＯ９９／３２５１６「長ペントラキシンＰＴＸ３を含む医薬組成物」）からＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）消化により得た。ヒトＰＴＸ３フラグメント（１４６３ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
【００２９】
３．２  ベクターフラグメントｐＳＣ１の精製
ｐＳＣ１ベクターをＢａｍＨＩ消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。
【００３０】
３．３  ｐＳＣ１−ＰＴＸ３に関する構築及び検証
ステップ３．２及び３．３で調製されたＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてライゲートし、ＪＭ１０９大腸菌株で形質転換した。５０ｍｇ／ｌのアンピシリンを追加し、ＰＴＸ３配列に対して相補性の２つのオリゴヌクレオチドでのＰＣＲによりあらかじめスクリーニングしたＬＢ培地上で増殖させることによって、形質転換体を選択した。
オリゴヌクレオチド配列は次のとおりである：
５’ＰＴＸ（配列番号７）ＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＧＧＡＴＧＡＴＴ  ＡＴＧＡＴ
３’ＰＴＸ（配列番号８）ＴＧＡＡＡＣ  ＡＴＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡＴ
１０μｌの最終体積で、増幅用試薬は次のとおりであった：１μｌの沸騰コロニー（５０ｍｌの水中１コロニー）、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、３２０ｎＭの各プライマー、０．０６％のホルムアミド、１×で供給された緩衝液及び０．０８ｕ／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）；温度プロフィール：３分  ９６℃、３０回（３０秒  ９４℃、３０秒  ５８℃、２分  ７２℃）、５分  ７２℃、将来使用するまで４℃で冷却。
ＰＣＲスクリーニングに対して陽性であるコロニーから精製されたプラスミドを、ＳａｌＩ制限酵素（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で消化して、ｈＰＴＸ３挿入物の配向をチェックした。予想される制限パターン（６６１９及び１７７ｂｐ）を有するプラスミドを、ＵｂＣプロモーター、ＮｅｏＲカセット及びｈＰＴＸ３をコードする領域で配列決定し、ｐＳＣ１−ＰＴＸ３と同定した。
新規プラスミド（ｐＳＣ１−ＰＴＸ３）を次いで、ユビキチンプロモーター制御下に置かれたＰＴＸ３  ｃＤＮＡ配列及びＳＶ４０プロモーター制御下のネオマイシン耐性遺伝子を有するように構築し；すべての他の特性及びプラスミドマップを図１に示す。
ｐＳＣ１−ＰＴＸ３の完全配列は以下のとおりである（配列番号２）。ｐＳＣ１−ｈＰＴＸ３配列は、第１のＥｃｏＲＩ部位から始まって表示される（図５）。ｐＳＧ５含有ＰＴＸ３  ｃＤＮＡ由来の配列に下線を引いている。開始コドン（ＡＴＧ）及び終止コドンは太字で示す。
ｐＳＣ１−ＰＴＸ３（配列番号２）
【化１−１】
0005859963.tif 000002
【化１−２】
0005859963.tif 000003
【化１−３】
0005859963.tif 000004
【００３１】
ヒト細胞株（ＨＥＫ２９３Ｆ）を、懸濁液中並びに血清及びタンパク質を含まない培地中で増殖するその能力について選択した（Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｍ  Ｗｕｒｍ  “Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（１１）：１３９３−１３９８，  ２００４，  Ｙａｎ  ＳＣ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎ．Ｙ．）１９９０  Ｊｕｌ  ８（７）：６５５−６１．“Ｕｓｅ  ｏｆｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａｎ  ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ”  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｅｖａ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（１０  Ａｐｒｉｌｅ  ２００７）。ＨＥＫ２９３Ｆをトランスフェクションするために、ｐＳＣ１−ＰＴＸ３プラスミドを直線状（Ｐｖｕｌ消化）又は環状形態のいずれかで使用した。最良のトランスフェクション収率は、直線化プラスミドで得られ；クローン選択を生産性ベース及び増殖能力に関して実施した。数ラウンドサブクローニングした後、２Ｆ１２クローンを選択した。
ｈＰＴＸ３を発現するヒトクローン２Ｆ１２を、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ，  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，  Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ，  ＵＫ）に寄託番号０８０１１００１でブダペスト条約の規定に従って２００８年１月１０日に寄託した。実験の詳細を以下に記載する。
【００３２】
３．４  ｐＳＣ１−ＰＴＸ３から生成された組換え２９３Ｆ細胞
トランスフェクション及びサブクローニング
１０６細胞／ｍｌの２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｒ７９０−０７）をトランスフェクション当日に１２５ｍｌのスピナーフラスコ中、２８ｍｌの最終Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地体積中に播種した。ｐＳＣ１／ＰＴＸ３プラスミドを次いで製造業者のプロトコルにしたがって２９３フェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に吸着させた。
手短に説明すると、２つの別個の試験管中で、３０μｇのｐＳＣ１−ＰＴＸ３（環状）又はＰｖｕｌ（直線化）を１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）中で希釈し、４０μｌの２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＯｐｔｉｍｅｍで１ｍｌに希釈した。両溶液を５分間室温でインキュベートし、次いで混合し（最終体積２ｍｌ）、そして同じ条件で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ／脂質カクテルを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）インキュベートした。３６時間培養した後、培地を選択培地（２００ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地＋５００μｇ／ｍｌのＧ４１８）に変え、トランスフェクションされた細胞を１０個の９６ウェルプレート中に２００μｌ／ウェルで蒔いた。１５日後、最高のプロデューサー細胞プールをＥＬＩＳＡにより決定し、２４セル、６ウェル及びＴ２５フラスコ中で増殖させた。
得られた組換え細胞プールを、５０％の新しい培地及び５０％馴化培地中、９６ウェルプレート中１細胞／ウェルでサブクローニングした。
【００３３】
実施例２：クローンＭＳ２４ＰＴＸ
プラスミドｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３の構築
【００３４】
１．ｐＣＥＰｌｉｇｈｔΔの構築
多重クローニング部位及びＢａｍＨＩ制限部位の一部が遊離している（ｌｏｏｓｉｎｇ）、抗体軽鎖をあらかじめクローニングしたｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ．  ｎ．  Ｖ０４４−５０）を、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＣｌａＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で切断し；消化によって、染色体外複製を可能にするエプスタイン・バーウイルス複製起源（ｏｒｉＰ）及び核抗原（ＥＢＮＡ−１遺伝子によりコード化される）を含まないプラスミドを得ることができた。結果として得られたフラグメントは、６９１０及び４２８１ｂｐの長さであった。ｐＣＥＰの骨格を含む６９１０ｂｐフラグメントをアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。ＣｌａＩは付着末端を生成するので、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、以下のプロトコルでフラグメントを埋めた：１５０ｎｇのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＶ精製フラグメント（３８μｌ）、５μｌの１０×Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、４μｌのｄＮＴＰミックス２．５ｍＭ、３μｌのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ｌＵ／μｌ）。３７℃で１５分後、７０℃で５分間、次いで氷上で、反応を停止させた。フラグメントをシリカ膜スピンカラム上で精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、一晩室温でそれ自身にライゲートした。ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をライゲーション混合物で形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを追加したＬＢプレート上で増殖させることによって形質転換体を選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを、ｐＣＥＰｌｉｇｈｔΔとして設計した。
【００３５】
２．ハイグロマイシン耐性及びＣＭＶプロモーターを含むベクターフラグメントの調製
ハイグロマイシン耐性カセットをサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーターとともにｐＣＥＰｌｉｇｈｔΔから得、これをＰＣＲにより増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位を、ＣＭＶプロモーターの３’末端にアニールするオリゴヌクレオチド中に導入した。
約５５００ｂｐの増幅された領域は、ＣＭＶプロモーター、ＴＫプロモーターの制御下のハイグロマイシン遺伝子をＴＫ  ｐｏｌｙＡシグナルとともに含んでいた。
オリゴヌクレオチドを次のとおり設計する：
オリゴＣＭＶ（配列番号９）５’ＧＡＧＡＡＣＴＧＴＡＡＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧ  ３’
オリゴＨ（配列番号１０）５’ＧＴＧＴＡＣＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧ  ３’
増幅のプロトコルは次のとおりであった：２ｎｇのｐＣＥＰｌｉｇｈｔΔ、２００ｎＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×で供給された緩衝液、１．５μｌのＤＭＳＯ、０．５μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｕｓｉｏｎ）、最終体積５０μｌ；温度プロフィール：１分  ９８℃、３５回（１０秒  ９８℃、３０秒  ５５℃、３分  ７２℃）、１０分  ７２℃、将来使用するまで４℃で冷却。
増幅産物（〜５５００ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。精製されたフラグメントをそれ自体にライゲートし、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを制限及び配列分析によりチェックし、ｐＣＥＰΔＢａｍとして設計した。
【００３６】
３．ｈＰＴＸ３遺伝子の調製
ｈＰＴＸ３（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＢＤ１３１７０１）配列を前記のようにｐＳＣ１−ＰＴＸ３からＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）消化によって得た。ヒトＰＴＸ３フラグメント（１４６３ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
【００３７】
４．ｐＣＥＰΔＢａｍ−ｈＰＴＸ３の調製
ｐＣＥＰΔＢａｍベクターをＢａｍＨＩ消化により直線化し、シリカ膜スピンカラム上で精製した。直線化されたｐＣＥＰΔＢａｍ及びステップ３で調製されたｈＰＴＸ３遺伝子に対応するＤＮＡフラグメントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてライゲートし、ＴＯＰ１０大腸菌株を形質転換するために用いた。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを追加し、制限分析によってあらかじめスクリーニングしたＬＢ培地上で増殖させることによって形質転換体を選択し、ＰＴＸ３フラグメント配向を評価した。
【００３８】
５．ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの調製
ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナルをｐＣＥＰΔｌｉｇｈｔプラスミドから得、ＰＣＲによってこれを増幅した。クローニング法の一部として、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏｌの認識配列をそれぞれフラグメント両端で導入した。
オリゴヌクレオチドを以下のように設計した：
ＰＣＥＰＳＶＨ（配列番号１１）５’ＡＡＧＣＴＴ  ＡＧＡＣ  ＡＴＧＡＴ  ＡＡＧＡＴ  ＡＣ  ＡＴＴＧ  ３’  
ＰＣＥＰＳＶＸ（配列番号１２）５’ＣＴＣＧＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣ  ３’
増幅のプロトコルは以下のとおりであった：１ｎｇのｐＣＥＰｌｉｇｈｔΔ、２００ｎＭの各プライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１×で供給された緩衝液、２μｌのＭｇＣｌ２  ５０ｍＭ、０．５μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、最終体積５０μｌ；温度プロフィール：１分  ９４℃、３０回（３０秒  ９４℃、１分  ５５℃、１分  ７２℃）、１５分  ７２℃、将来使用するまで４℃で冷却。
増幅産物（〜４２０ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動及びシリカ膜スピンカラムにより精製した。
【００３９】
６．ｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３の調製
ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡシグナルに対応する精製されたフラグメント及びｐＣＥＰΔＢａｍ−ｈＰＴＸ３をＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏｌ制限酵素で消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてライゲートした。ライゲーション混合物を使用して、ＴＯＰ１０コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上で増殖させることによって形質転換体を選択した。
アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミドＤＮＡを制限及び配列分析によりチェックし、プラスミドをｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３と命名した。
ｐＳＡＳＳＩ−ＨＰＴＸ３の完全配列は以下のとおりである（配列番号１）。ｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３配列をＢａｍＨＩ部位から始めて表示する（図１）。ｈＰＴＸ３の配列を小文字で示す。開始コドン（ａｔｇ）及び終止コドン（ｔａａ）を太字で示す。
ｐＳＡＳＳＩ−ＨＰＴＸ３（配列番号１）。
【化２−１】
0005859963.tif 000005
【化２−２】
0005859963.tif 000006
【化２−３】
0005859963.tif 000007
【化２−４】
0005859963.tif 000008
【００４０】
実施例３
ｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３トランスフェクションによって生成した組換えＭＳ２４ＰＴＸクローン
【００４１】
１．トランスフェクション及びサブクローニング
１０６細胞／ｍｌの２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２を、トランスフェクション当日に、１２５ｍｌのスピナーフラスコ中、２８ｍｌの最終Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地体積中に播種した。ｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３プラスミドを次いで、製造業者のプロトコルにしたがって、２９３フェクチン試薬（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に吸着させた。
手短に説明すると、３０μｇのｐＳＡＳＳＩ−ｈＰＴＸ３  Ｎｒｕｌ（直線化）を１ｍｌのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）中で希釈し、４０μｌの２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＯｐｔｉｍｅｍで１ｍｌに希釈した。両溶液を５分間室温でインキュベートし、次いで混合し（最終体積２ｍｌ）、そして同じ条件で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ／脂質カクテルを細胞に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）インキュベートした。３６時間培養した後、培地を選択培地（２００ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地＋２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン）に変え、トランスフェクションされた細胞を１０個の９６ウェルプレート中に２００μｌ／ウェルで蒔いた。１５日後、最高のプロデューサー細胞プールをＥＬＩＳＡにより決定し、２４ウェル、６ウェル及びＴ２５フラスコ中で増幅させた。
得られた組換え細胞プールを、９６ウェルプレート中、５０％の新しい培地及び５０％の馴化培地中、１細胞／ウェルでサブクローニングした。
【００４２】
２．組換えｈＰＴＸ３のＥＬＩＳＡ検出
精製されたＰＴＸ３又は培地上清中に分泌されたＰＴＸ３を、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて滴定した。ＰＴＸ３を検出するために、９６ウェルＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，  Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）を一晩４℃にて、１５ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中、７００ｎｇ／ｍｌのラットモノクローナル抗体ＭＮＢ４抗ヒトＰＴＸ３（Ａｌｅｘｉｓ（商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｌａｕｓｅｎ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でコーティングした。ウェルをＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗ、洗浄液）で洗浄し、５％粉乳を含む３００μｌのＰＢＳ−Ｔｗで、２時間、室温にてブロックした。
細胞上清又は精製された組換えヒトＰＴＸ３をウェルに添加し、洗浄液及び１％のＢＳＡで希釈した。０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲のＣＨＯ細胞由来の精製された組換えヒトＰＴＸ３で作製された標準曲線を定量化に利用した。３７℃で１時間インキュベーションした後、結合したＰＴＸ３を、ビオチン複合ポリクローナルウサギ抗ＰＴＸ３抗体を用いて検出し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＵＳＡ）に共役させたストレプトアビジンとともにインキュベートした。最終的に、発色させるために、２，２’−アジノ−ビス３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．  ＵＳＡ）を添加し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０  ＥＩＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて４０５ｎｍでの光学密度を評価した。
【００４３】
実施例４
クローン２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２及びＭＳ２４ＰＴＸの増殖、生存率及び生産性の比較
１リットルのスピナーフラスコ中で、５００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３培地中１，０００，０００細胞／ｍｌ（生存率≧９０％）の密度で２つのクローン由来の細胞を播種した。細胞が死に始めるまで約１週間、増殖、生存率及び生産性をモニタリングした。
図２は、同じ播種及び増殖条件での、ＭＳ２４ＰＴＸ（パネルＡ）及び２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２（パネルＢ）クローンの増殖、生存率及び生産性を示す。図に示されるように、ＰＴＸ３発現クローン２９３Ｆ／ＰＴＸ３／２Ｆ１２を、ＰＴＸ３がＣＭＶプロモーターの制御下にある新規プラスミド（ＭＳ２４ＰＴＸクローン）で再トランスフェクションして、本発明者等はＰＴＸ３生産性において約４倍の増加を得ることができた。
【００４４】
実施例５
ＭＳ２４ＰＴＸクローンからの組換えヒトＰＴＸ３の精製
スピナーフラスコ中で増殖させた、ＭＳ２４ＰＴＸクローンからの培養上清を、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ＵＫ）充填カラム上にロードした。非線形勾配を用いて残留物質を溶出させた。ＰＴＸ３含有フラクションをセラミックハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）充填カラムに直接かけた。リン酸塩濃度を非線形的に増大させることによって、残留物質を溶出させた。ＰＴＸ３含有フラクションを濃縮し、緩衝液を限外ろ過膜（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ−Ｂｉｏｍａｘ  １００，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で変更し、次いでＢｉｏｓｅｐ  ＳＥＣ  Ｓ４０００（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性化した（図３）。
【００４５】
実施例６
ｈ−ＰＴＸ３のＦＧＦ２に対する結合
精製された組換えｈＰＴＸ３のＦＧＦ２に対する結合を、ＥＬＩＳＡシステムで評価した。９６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３９１２）をＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。ウェルをＰＢＳ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ−Ｔｒ、洗浄液）で洗浄し、３％ＢＳＡを含む２００μｌのＰＢＳ−Ｔｒ（ＰＢＳ−Ｂブロッキング及び希釈液）で２時間室温にてブロックした。洗浄後、０〜１２０ｎｇ／ｍｌの範囲のＰＴＸ３濃度でＰＢＳ−Ｂ中で希釈した１００μｌの試料を添加して結合を実施し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを１００μｌ／ウェルの１００ｎｇ／ｍｌのウサギ抗ＰＴＸ３ポリクローナル抗体（３７℃で１時間）とともにインキュベートし、再度洗浄し、そして１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＢＳ−Ｂ中１：１０００；３７℃で１時間）とともにインキュベートした。洗浄後、１００μｌの発色性基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、１０〜１５分後、１００μｌのＨＣｌ（１Ｍ）を添加して反応を停止させ、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０  ＥＩＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて吸収を測定した（図４）。
【表１−１】
0005859963.tif 000009
【表１−２】
0005859963.tif 000010
【図１】
0005859963.tif 000011
【図２】
0005859963.tif 000012
【図３】
0005859963.tif 000013
【図４】
0005859963.tif 000014
【図５】
0005859963.tif 000015
【配列表】
0005859963000001.app