(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、フラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）のアミノ酸配列において、
Ａ２９８I、Ａ２９８Ｖ、Ｓ２７２Ｔ＋Ａ２９８Ｖ＋Ａ３６９Ｔ、Ｖ３３８Ｍ、Ｖ３３８Ｍ＋Ｑ３８２Ｈ、Ｓ３４０Ｇ、Ｓ３４０Ｎ、Ｓ３４０Ｖ、Ｓ３４０Ｗ、Ｌ２５０Ｖ＋Ｓ３４０Ｇ＋Ｄ３９９Ｎ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｅ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｎ、Ｈ３４１Ｐ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｒ、Ｈ３４１Ｓ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｈ３４１Ｙ、Ｈ３４１Ｒ＋Ｇ４９９Ｓ、Ｄ３４３Ａ、Ｄ３４３Ｅ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｈ、Ｄ３４３Ｉ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｍ、Ｄ３４３Ｎ、Ｄ３４３Ｑ、Ｄ３４３Ｒ、Ｄ３４３Ｓ、Ｄ３４３Ｗ、Ｄ３４３Ｙ、Ｄ３４３Ｖ、Ｄ３４３Ｅ＋Ｌ５６２Ｈ、Ｒ２５０Ｌ＋Ｄ３４３Ｅ＋Ｋ４９４Ｅ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｓ４９０Ｓ、Ｇ３５２Ａ、Ｇ３５２Ｃ、Ｇ３５２Ｄ、Ｇ３５２Ｅ、Ｇ３５２Ｆ、Ｇ３５２Ｉ、Ｇ３５２Ｋ、Ｇ３５２Ｌ、Ｇ３５２Ｍ、Ｇ３５２Ｎ、Ｇ３５２Ｐ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｒ、Ｇ３５２Ｓ、Ｇ３５２Ｔ、Ｇ３５２Ｖ、Ｇ３５２Ｗ、Ｇ３５２Ｙ、Ｋ３５４Ａ、Ｋ３５４Ｃ、Ｋ３５４Ｄ、Ｋ３５４Ｅ、Ｋ３５４Ｆ、Ｋ３５４Ｇ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｍ、Ｋ３５４Ｎ、Ｋ３５４Ｐ、Ｋ３５４Ｑ、Ｋ３５４Ｙ、Ｋ３５４Ｒ、Ｋ３５４Ｓ、Ｍ３４２Ｌ＋Ｋ３５４Ｎ、Ｇ４２６Ａ、Ｇ４２６Ｃ、Ｇ４２６Ｄ、Ｇ４２６Ｅ、Ｇ４２６Ｆ、Ｇ４２６Ｈ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｍ、Ｇ４２６Ｎ、Ｇ４２６Ｐ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４２６Ｓ、Ｇ４２６Ｔ、Ｇ４２６Ｗ、Ｇ４２６Ｙ、Ｇ４２６Ｖ、Ｇ４２６Ｓ＋Ａ５７８Ｖ、Ｖ４３１Ｆ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｍ、Ｆ４３２Ｑ、Ｆ４３２Ｒ、Ｆ４３２Ｔ、及びＦ４３２Ｖから成る群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含み（但し、上記アミノ酸配列が配列番号１でない場合には、Ｆ４３２Ｉ及びＦ４３２Ｖは除く）、且つ、配列番号１で示される野生型GLDと比較して阻害剤である1,10-フェナントロリンに対する感受性が低下した改変型GLD。
【請求項２】
フラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）のアミノ酸配列が配列番号１で示される、請求項１記載の改変型GLD。
【請求項３】
阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ85.4%以上の相対活性を示す、請求項１又は２記載の改変型GLD。
【請求項４】
阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ90%以上の相対活性を示す、請求項３記載の改変型GLD。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の改変型GLDをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号２に示される塩基配列を有する、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを用いることによって作製された形質転換細胞。
【請求項９】
大腸菌、酵母、又は糸状菌である、請求項８記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項８又は９の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型GLDを採取することを特徴とする、改変型GLDの製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の改変型GLD又は請求項１０記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコースの測定方法。
【請求項１２】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の改変型GLD又は請求項１０記載の製造方法で得られた改変型GLDを含有することを特徴とする、グルコース測定試薬組成物。
【請求項１３】
請求項１ないし４のいずれか一項に記載の変型GLD又は請求項１０記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコース測定用のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を補酵素とし、グルコースの１位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒する、フラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）等に関する。より詳細には、1,10-フェナントロリンに対する感受性が低減した改変型GLDポリペプチド及び改変型GLDをコードするポリヌクレオチド、該酵素の製造方法、該酵素を使用することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物、並びにグルコース測定用のバイオセンサ等に関する。尚、本明細書において、特に断りがない限り、グルコース等の単糖類はＤ−体を意味する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度は糖尿病の重要なマーカーである。従来、血中グルコース濃度の測定にはグルコース酸化酵素が用いられてきたが、グルコース酸化酵素は溶存酸素濃度の影響を受け、計測値に誤差が生じるため、近年、酸素の影響を受けないグルコース脱水素酵素も広く使用されている。
【０００３】
酸素の影響を受けない市販のグルコース脱水素酵素として、ピロロキノリンキノン（PQQ）を補酵素とするグルコース脱水素酵素（PQQ-GDH）が知られているが、従来のPQQ-GDHは、マルトースやガラクトース等、グルコース以外の糖類にも反応してしまうという欠点を有している。
【０００４】
これに対して、本発明者のグループは、フラビンを補酵素とする、新規な可溶性のグルコース脱水素酵素（GLD）をアスペルギルス・テレウスから見出し（特許文献１）、遺伝子のクローニングに成功した（特許文献２）。これらのGLDは、溶存酸素の影響を受けず、グルコースの１位の水酸基を酸化し、マルトースやガラクトースに対する作用性（酵素活性）が低い、というこれまでに無い優れた特性を有するものである。
【０００５】
一方、特許文献３には糖尿病患者、特に2型糖尿病患者を対象に1,10-フェナントロリンなどを投与することで、冠動脈疾患のリスクを低減させる治療法について記載されており、特許文献４には血液循環促進・血栓形成阻止因子であるADAM8を阻害することで止血する方法もしくは亢進することで血液の凝固を阻害する方法について記載されている。その中でADAM8の阻害剤として1,10-フェナントロリンが記載されている。特許文献５には血液検体中のタンパク質が分解されることを防ぐ為に1,10-フェナントロリンなどを含むことを特徴とする採血管の発明が記載されている。従って、特許文献３又は４に記載の治療を受けた糖尿病患者の血液を測定試料として用いる場合、又は、特許文献５に記載の採血管に保管された血液を用いて血中グルコース濃度を測定する際に血糖測定器のグルコース測定用酵素が1,10-フェナントロリンの影響を受ける場合には、血中に含まれる1,10-フェナントロリンにより本来の血糖値ではない値が計測され、その結果、測定者が誤った処置を取る可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2004/058958号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2006/101239号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2003/077901号パンフレット
【特許文献４】特開２０１０−２７５２１６号公報
【特許文献５】特許第4496407号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、従来のGLDは、1,10-フェナントロリン等の阻害剤の影響を受けてしまうため、阻害剤によってより阻害されにくいGLDが求められており、これを提供することが本発明の解決すべき課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
即ち、本発明は、上記課題を解決し、1,10-フェナントロリン等の阻害剤によって阻害されにくいという優れた特性を有する改変型GLDをコードする新規な遺伝子（ポリヌクレオチド）及び酵素(ポリペプチド)、該遺伝子により組換えられた形質転換細胞を用いる該酵素の製造方法、並びに、得られた該酵素を使用することを特徴とするグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物、及びグルコース測定用のバイオセンサ等を提供することを目的とする。
【０００９】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
【００１０】
［態様１］
配列番号１で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）アミノ酸配列において、２９８、３３８、３４０、３４１、３４３、３５２、３５４、４２４、４２６、４３１、及び４３２位のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含み、且つ、野生型GLDと比較して阻害剤に対する感受性が低下した改変型GLD。
［態様２］
阻害剤が終濃度1mMの条件で共存した測定系において、阻害剤が共存しない場合と比べ40%以上の相対活性を示す、態様１記載の改変型GLD。
［態様３］
アミノ酸置換が、Ａ２９８I、Ａ２９８Ｖ、Ｖ３３８Ｍ、Ｓ３４０Ｇ、Ｓ３４０Ｎ、Ｓ３４０Ｖ、Ｓ３４０Ｗ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｅ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｎ、Ｈ３４１Ｐ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｒ、Ｈ３４１Ｓ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｈ３４１Ｙ、Ｄ３４３Ａ、Ｄ３４３Ｅ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｈ、Ｄ３４３Ｉ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｍ、Ｄ３４３Ｎ、Ｄ３４３Ｑ、Ｄ３４３Ｒ、Ｄ３４３Ｓ、Ｄ３４３Ｗ、Ｄ３４３Ｙ、Ｄ３４３Ｖ、Ｇ３５２Ａ、Ｇ３５２Ｃ、Ｇ３５２Ｄ、Ｇ３５２Ｅ、Ｇ３５２Ｆ、Ｇ３５２Ｉ、Ｇ３５２Ｋ、Ｇ３５２Ｌ、Ｇ３５２Ｍ、Ｇ３５２Ｎ、Ｇ３５２Ｐ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｒ、Ｇ３５２Ｓ、Ｇ３５２Ｔ、Ｇ３５２Ｖ、Ｇ３５２Ｗ、Ｇ３５２Ｙ、Ｋ３５４Ａ、Ｋ３５４Ｃ、Ｋ３５４Ｄ、Ｋ３５４Ｅ、Ｋ３５４Ｆ、Ｋ３５４Ｇ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｍ、Ｋ３５４Ｎ、Ｋ３５４Ｐ、Ｋ３５４Ｑ、Ｋ３５４Ｙ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｒ、Ｋ３５４Ｓ、Ｙ４２４Ｃ、Ｙ４２４Ｄ、Ｙ４２４Ｅ、Ｙ４２４Ｋ、Ｙ４２４Ｎ、Ｙ４２４Ｑ、Ｙ４２４Ｒ、Ｙ４２４Ｓ、Ｙ４２４Ｔ、Ｙ４２４Ｖ、Ｇ４２６Ａ、Ｇ４２６Ｃ、Ｇ４２６Ｄ、Ｇ４２６Ｅ、Ｇ４２６Ｆ、Ｇ４２６Ｈ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｍ、Ｇ４２６Ｎ、Ｇ４２６Ｐ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４２６Ｓ、Ｇ４２６Ｔ、Ｇ４２６Ｗ、Ｇ４２６Ｙ、Ｇ４２６Ｖ、Ｖ４３１Ｆ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｍ、Ｆ４３２Ｑ、Ｆ４３２Ｒ、Ｆ４３２Ｔ、及びＦ４３２Ｖ、並びに、これらの任意の組み合わせから成る群から選択される、態様１又は２記載の改変型GLD。
［態様４］阻害剤が1,10-フェナントロリンである、態様１ないし３のいずれか一項に記載の改変型GLD。
［態様５］
配列番号１で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）アミノ酸配列において、Ａ２９８I、Ｓ２７２Ｔ＋Ａ２９８Ｖ＋Ａ３６９Ｔ、Ｖ３３８Ｍ＋Ｑ３８２Ｈ、Ｌ２５０Ｖ＋Ｓ３４０Ｇ＋Ｄ３９９Ｎ、Ｓ３４０Ｎ、Ｓ３４０Ｖ、Ｓ３４０Ｗ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｅ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｎ、Ｈ３４１Ｐ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｒ＋Ｇ４９９Ｓ、Ｈ３４１Ｓ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｈ３４１Ｙ、Ｄ３４３Ａ、Ｄ３４３Ｅ＋Ｌ５６２Ｈ、Ｒ２５０Ｌ＋Ｄ３４３Ｅ＋Ｋ４９４Ｅ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｈ、Ｄ３４３Ｉ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｍ、Ｄ３４３Ｎ＋Ｓ４９０Ｓ、Ｄ３４３Ｑ、Ｄ３４３Ｒ、Ｄ３４３Ｓ、Ｄ３４３Ｗ、Ｄ３４３Ｙ、Ｄ３４３Ｖ、Ｇ３５２Ａ、Ｇ３５２Ｃ、Ｇ３５２Ｄ、Ｇ３５２Ｅ、Ｇ３５２Ｆ、Ｇ３５２Ｉ、Ｇ３５２Ｋ、Ｇ３５２Ｌ、Ｇ３５２Ｍ、Ｇ３５２Ｎ、Ｇ３５２Ｐ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｒ、Ｇ３５２Ｓ、Ｇ３５２Ｔ、Ｇ３５２Ｖ、Ｇ３５２Ｗ、Ｇ３５２Ｙ、Ｋ３５４Ａ、Ｋ３５４Ｃ、Ｋ３５４Ｄ、Ｋ３５４Ｅ、Ｋ３５４Ｆ、Ｋ３５４Ｇ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｍ、Ｍ３４２Ｌ＋Ｋ３５４Ｎ、Ｋ３５４Ｐ、Ｋ３５４Ｑ、Ｋ３５４Ｙ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｒ、Ｋ３５４Ｓ、Ｙ４２４Ｃ、Ｙ４２４Ｄ、Ｙ４２４Ｅ、Ｙ４２４Ｋ、Ｙ４２４Ｎ、Ｙ４２４Ｑ、Ｙ４２４Ｒ、Ｙ４２４Ｓ、Ｙ４２４Ｔ、Ｙ４２４Ｖ、Ｇ４２６Ａ、Ｇ４２６Ｃ、Ｇ４２６Ｄ、Ｇ４２６Ｅ、Ｇ４２６Ｆ、Ｇ４２６Ｈ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｍ、Ｇ４２６Ｎ、Ｇ４２６Ｐ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４２６Ｓ＋Ａ５７８Ｖ、Ｇ４２６Ｔ、Ｇ４２６Ｗ、Ｇ４２６Ｙ、Ｇ４２６Ｖ、Ｖ４３１Ｆ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｍ、Ｆ４３２Ｑ、Ｆ４３２Ｒ、Ｆ４３２Ｔ、及びＦ４３２Ｖ、並びに、これらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を有する改変型GLD。
［態様６］
態様１ないし５のいずれか一項に記載の改変型GLDをコードするポリヌクレオチド。
［態様７］
配列番号１で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号２に示される塩基配列を有する、態様６記載のポリヌクレオチド。
［態様８］
態様６又は７記載のポリヌクレオチドを保有する組換えベクター。
［態様９］
態様８記載の組換えベクターを用いることによって作製された形質転換細胞。
［態様１０］
大腸菌、酵母、又は糸状菌である、態様９記載の形質転換細胞。
［態様１１］
態様９又は１０の形質転換細胞を培養し、得られた培養物から改変型GLDを採取することを特徴とする、改変型GLDの製造方法。
［態様１２］
態様１ないし５のいずれか一項に記載の改変型GLD又は態様１１記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコースの測定方法。
［態様１３］
態様１ないし５のいずれか一項に記載の改変型GLD又は態様１１記載の製造方法で得られた改変型GLDを含有することを特徴とする、グルコース測定試薬組成物。
［態様１４］
態様１ないし５のいずれか一項に記載の変型GLD又は態様１１記載の製造方法で得られた改変型GLDを使用することを特徴とする、グルコース測定用のバイオセンサ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリヌクレオチドを利用することにより、阻害剤に対する感受性が低下した改変型GLDを、例えば遺伝子組換え技術等により均質かつ大量に生産することが可能となり、加えて該GLDを用いたより正確な血糖測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明の改変型GLD  H341Wを用いて得られたグルコース測定のための検量線(x軸：基質濃度[mg/dL]、y軸：相対活性[%])を示す。
【図１Ｂ】本発明の改変型GLD  H341Wを用いて得られたグルコース測定のための検量線(x軸：1/基質濃度  [mM]、y軸：1/反応速度)を示す。
【図１Ｃ】本発明の改変型GLD  F432Lを用いて得られたグルコース測定のための検量線(x軸：基質濃度[mg/dL]、y軸：相対活性[%])を示す。
【図１Ｄ】本発明の改変型GLD  F432Lを用いて得られたグルコース測定のための検量線(x軸：1/基質濃度  [mM]、y軸：1/反応速度) を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書ではアミノ酸残基を1文字略号で表現しており、グリシンはＧ、アラニンはＡ、バリンはＶ、ロイシンはＬ、イソロイシンはＩ、フェニルアラニンはＦ、チロシンはＹ、トリプトファンはＷ、セリンはＳ、スレオニンはＴ、システインはＣ、メチオニンはＭ、アスパラギン酸はＤ、グルタミン酸はＥ、アスパラギンはＮ、グルタミンはＱ、リジンはＫ、アルギニンはＲ、ヒスチジンはＨ、プロリンはＰで表される。更に、「Ｓ２７２Ｔ」などの表現は特定のアミノ酸配列の開始アミノ酸であるメチオニン（Ｍ）を１番目として、２７２番目のセリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）に置換することを意味する。更に、「Ｓ２７２Ｔ＋Ａ２９８Ｖ＋Ａ３６９Ｔ」は２７２番目、２９８番目、３６９番目のアミノ酸に対する置換を同時に行うことを意味している。
【００１４】
本発明の改変型GLDは、配列番号１（シグナルペプチドを含む）で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）アミノ酸配列において、２９８、３３８、３４０、３４１、３４３、３５２、３５４、４２４、４２６、４３１及び４３２番目のアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基における置換を含み、且つ野生型GLDに対して阻害剤に対する感受性が低下していることを特徴とする。
【００１５】
上記のアミノ酸残基における置換の代表的な例として、Ａ２９８I、Ａ２９８Ｖ、Ｖ３３８Ｍ、Ｓ３４０Ｇ、Ｓ３４０Ｎ、Ｓ３４０Ｖ、Ｓ３４０Ｗ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｅ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｎ、Ｈ３４１Ｐ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｒ、Ｈ３４１Ｓ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｈ３４１Ｙ、Ｄ３４３Ａ、Ｄ３４３Ｅ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｈ、Ｄ３４３Ｉ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｍ、Ｄ３４３Ｎ、Ｄ３４３Ｑ、Ｄ３４３Ｒ、Ｄ３４３Ｓ、Ｄ３４３Ｗ、Ｄ３４３Ｙ、Ｄ３４３Ｖ、Ｇ３５２Ａ、Ｇ３５２Ｃ、Ｇ３５２Ｄ、Ｇ３５２Ｅ、Ｇ３５２Ｆ、Ｇ３５２Ｉ、Ｇ３５２Ｋ、Ｇ３５２Ｌ、Ｇ３５２Ｍ、Ｇ３５２Ｎ、Ｇ３５２Ｐ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｒ、Ｇ３５２Ｓ、Ｇ３５２Ｔ、Ｇ３５２Ｖ、Ｇ３５２Ｗ、Ｇ３５２Ｙ、Ｋ３５４Ａ、Ｋ３５４Ｃ、Ｋ３５４Ｄ、Ｋ３５４Ｅ、Ｋ３５４Ｆ、Ｋ３５４Ｇ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｍ、Ｋ３５４Ｎ、Ｋ３５４Ｐ、Ｋ３５４Ｑ、Ｋ３５４Ｙ、Ｋ３５４Ｈ、Ｋ３５４Ｒ、Ｋ３５４Ｓ、Ｙ４２４Ｃ、Ｙ４２４Ｄ、Ｙ４２４Ｅ、Ｙ４２４Ｋ、Ｙ４２４Ｎ、Ｙ４２４Ｑ、Ｙ４２４Ｒ、Ｙ４２４Ｓ、Ｙ４２４Ｔ、Ｙ４２４Ｖ、Ｇ４２６Ａ、Ｇ４２６Ｃ、Ｇ４２６Ｄ、Ｇ４２６Ｅ、Ｇ４２６Ｆ、Ｇ４２６Ｈ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｍ、Ｇ４２６Ｎ、Ｇ４２６Ｐ、Ｇ４２６Ｒ、Ｇ４２６Ｓ、Ｇ４２６Ｔ、Ｇ４２６Ｗ、Ｇ４２６Ｙ、Ｇ４２６Ｖ、Ｖ４３１Ｆ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｍ、Ｆ４３２Ｑ、Ｆ４３２Ｒ、Ｆ４３２Ｔ、及びＦ４３２Ｖからなる群から選択されるアミノ酸置換を挙げることが出来る。
【００１６】
本明細書中で定義される「感受性」は、当該化合物共存下及び非共存下での「相対活性」によって評価され、「相対活性」は、本明細書に記載する酵素活性測定において、阻害剤を添加しない場合の酵素活性（ブランク値）を１００％とした場合の阻害剤添加時の酵素活性（サンプル値）の相対値（％）から導かれる。従って、相対活性が高ければ阻害剤に対する感受性は低下したことになる。逆に相対活性が低い場合は感受性が増加したことになる。
【００１７】
好ましくは、本発明の改変型GLDは野生型GLDと比較して、阻害剤の終濃度（測定時の測定系における阻害剤の濃度）が１ｍＭの場合に、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相対活性を有すものである。尚、阻害剤への感受性は形質転換体の培養条件及び酵素活性の測定条件等によって変動する場合があるので、同一の条件下で野生型GLDと改変型GLDについて相対活性を測定して比較する必要がある。
【００１８】
本発明において「阻害剤」とは、配列番号１（シグナルペプチドを含む）で示される野生型のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（GLD）の酵素活性を阻害する活性を有する化合物を意味し特に化合物の種類は問わない。例えば、1,10-フェナントロリン及びプロフラビン塩酸塩、並びに、これら化合物に化学構造又は物理化学的性質が類似しており上記酵素を実質的に阻害する活性を有する物質等を含む。
【００１９】
従って、本発明の改変型GLDの好適例は、実施例に具体的に記載されているように、配列番号１で示される野生型のGLDアミノ酸配列において、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｓ、Ｄ３４３Ｍ、Ｇ３５２Ｅ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｙ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｖ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、及び、Ｆ４３２Ｒなる群から選択されるアミノ酸置換を有する改変型GLD（以上、野生型GLDと比較して、阻害剤の終濃度が１ｍＭの場合に、９０％〜９５％の相対活性を有するもの）、並びに、Ｓ３４０Ｗ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｖ、及びＤ３４３Ｙなる群から選択されるアミノ酸置換を有する改変型GLD（以上、野生型GLDと比較して、阻害剤の終濃度が１ｍＭの場合に、９５％より高い相対活性を有するもの）である。
【００２０】
尚、上記の変換位置は、フラビン結合型グルコース脱水素酵素で、配列番号１と好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、特に好ましくは少なくとも９０％、９５％以上、又は９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列において同等の位置であっても良い。本発明における相同性とは、比較対象となる基準配列の全長にわたり、所定の同一性を有する各配列をいう。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発株式会社製）等を用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【００２１】
本発明の改変型GLDは、上記のアミノ酸置換に加えて、上記のように野生型GLDに対して阻害剤に対する感受性が低下している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、更に１個〜数個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個）のアミノ酸が置換、欠失又は付加されていても良い。
【００２２】
本発明の改変型GLDをコードするポリヌクレオチドの一例として、配列番号１で示される野生型GLDのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとして配列番号２に示される塩基配列を有するものを挙げることが出来る。その他、同一のアミノ酸をコードする限り別のコドンが使用されていても良い。例えば、ポリヌクレオチドで形質転換させる宿主細胞の種類等に応じて使用コドンを適宜最適化することが出来る。
【００２３】
尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ-Ｎ-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）；又はｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸））が１００個以上結合した分子を言い、具体的には本発明の改変型GLDをコードする染色体ＤＮＡ（イントロンを含むＤＮＡ）、染色体ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ及び、それらを鋳型としてＰＣＲ増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」とはヌクレオチドが２-９９個連結した分子を言う。また「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）又は非天然の残基連結によって互いに結合した３０個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、さらには、これらに糖鎖が付加したものや、人工的に化学的修飾がなされたもの等も含む。又、本発明のポリヌクレオチドには、改変型GLDのシグナル配列をコードする塩基配列を形質転換細胞の種類等に応じて適宜含むことも出来る。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドは、当業者の公知の任意の方法で容易に調製することが可能である。例えば、本明細書の実施例に具体的に記載されているように、配列番号２に示された塩基配列を有するポリヌクレオチドを含むプラスミドから野生型GLD遺伝子を単離し、これに基づき、適当なオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）のセットを用いた当業者に公知の各種ＰＣＲ法を利用してランダム変異又は部位特異的変異を導入することにより、本発明の改変型GLDをコードするポリヌクレオチドを調製することができる。
【００２５】
更に、文献（例えばCarruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380;Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859;  米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
【００２６】
本発明の組換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用して、当業者に公知の任意の方法で作製することができる。例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとして本発明の改変型GLDを生産する場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
【００２７】
本発明の形質転換細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、アスペルギルス・オリゼ等の糸状菌（カビ）、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。これら細胞は、改変型GLDの糖鎖の要、不要、その他のペプチド修飾の必要性に応じて、適宜宿主は選択することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など当業者に公知の任意の方法によって組換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組換えベクターと、このベクターによる形質転換大腸菌及び形質転換カビが挙げられる。
【００２８】
本発明の改変型GLDを大腸菌などの微生物でＤＮＡを発現させて生産させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター配列等を有する発現ベクターに前記のポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作成し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、改変型GLDを微生物で大量生産することができる。この際、任意の翻訳領域の前後に開始コドンと停止コドンを付加して発現させれば、任意の領域を含む改変型GLD断片を得ることもできる。あるいは、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させることもできる。この融合蛋白質を適当なプロテアーゼで切断することによっても目的とする改変型GLDを取得することができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム、ｐＣｏｌｄ発現システムなどが例示できる。
【００２９】
或いは、本発明の改変型GLDを真核細胞で発現させて製造する場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、改変型GLDを真核細胞で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ-ＣＭＶ、ｐＢＫ-ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５-Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ-ＣＭＶ-２、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１、ｐＥＧＦＰ-Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてFAD結合型グルコース脱水素酵素ポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ-７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、本発明の改変型GLDを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
【００３０】
特に、本発明の改変型GLDをコードするポリヌクレオチドを保有するアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来の組換えベクターで、適当なアスペルギルス・オリゼ株を形質転換するクローニングが好適である。
【００３１】
本発明の改変型GLDを原核細胞や真核細胞で発現させた後、培養物（菌体、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等）から目的蛋白質を採取、即ち、単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、ｐＨ処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法及び改変型GLDに特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。このような方法で、本発明の改変型GLDを大量に製造することができる。
【００３２】
また、本発明の改変型GLDは、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又はその翻訳領域）を有するベクターからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで製造することができる。
【００３３】
改変型GLDをｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現させて製造する場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、改変型GLDをｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
【００３４】
以上に記載された方法で製造することができる本発明の改変型GLDは、電子受容体存在下でグルコースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中のグルコースの測定及び測定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床分野への使用が可能であり、補酵素結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産においても使用可能である。
【００３５】
本発明のグルコース脱水素酵素は、グルコース測定試薬に用いることができる。該測定試薬は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる熱安定化剤、又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を該測定試薬に含ませることができる。
【００３６】
本発明のグルコース脱水素酵素は、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサとしてのバイオセンサに用いることができる。
本発明のバイオセンサは、酵素として本発明のグルコース脱水素酵素を反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。
【００３７】
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた物質を用いることができる。電子の授受能に優れた物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質やタンパク質性の電子メディエータであり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２−５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。
【００３８】
更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及びグルコース酸化還元酵素又は上記の融合体を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
【００３９】
［酵素活性測定法］
分光光度計(日本分光社製  V-660)を用いて測定する場合は次の手順に従い測定を行った。
０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍＬ、１．０Ｍ  Ｄ−グルコース１．０ｍＬ、３ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ、３ｍＭ  １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト(以下１−ｍ−ＰＭＳという)０．２ｍＬ、メタノール０．０６ｍL、蒸留水０．５５ｍLを３ｍＬ石英セル（光路長１ｃｍ）に添加し、恒温セルホルダー付き分光光度計にセットして３７℃で１０分間インキュベート後、酵素溶液０．０５ｍＬを添加後、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する。ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数を１６．３×１０3ｃｍ-1Ｍ-1とし、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性が実質的に該酵素活性１ｕｎｉｔと等価であることから、吸光度変化より該酵素活性を式1に従って求めた。実施例８においては上記の試薬組成中のメタノールを蒸留水に置きかえ測定を行った。
【００４０】
また、実施例３および６にて実施したようなプレートリーダー(日本モレキュラーデバイス社製  SpectraMax Plus384)を用いて酵素活性を測定する場合は次の手順に従った。
予め適当な希釈倍率に希釈しておいた培養上清を１ウェルあたり１００μｌずつ９６マイクロプレートに添加した。そこに１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１．０Ｍ  Ｄ−グルコース、３ｍＭ  ＤＣＩＰ、３ｍＭ  １−ｍ−ＰＭＳそしてメタノールの容積比がそれぞれ０．１：１：０．１４：０．２：０．０６からなる酵素活性測定試薬を1ウェルあたり１００μｌずつ添加し、ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける吸光度変化（ΔＡＢＳ／ｍｉｎ）を測定する。分光光度計を用いた活性測定手順により酵素活性が既知となっている酵素溶液の吸光度変化との間で比例換算を行うことにより、酵素溶液の酵素活性を算出することができる。
また、以下の実施例において、分光光度計、プレートリーダーのいずれで測定した場合も上記試薬組成にて測定した酵素活性値をブランク値とし、上記試薬組成中のメタノールを阻害剤である1,10-フェナントロリン濃度またはプロフラビン塩酸塩濃度が５０ｍＭのメタノール溶液に置き換えて（阻害剤の終濃度：１ｍＭ）測定した値をサンプル値とする。
【００４１】
【数１】
0005896375.tif 000002
【００４２】
尚、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法又はそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００４３】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。
【実施例１】
【００４４】
（プラスミドpAFF4の構築）
特許文献１に公開されているアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）FERM BP-08578株由来のGLD遺伝子を通常の方法により単離し、シグナル配列（配列番号１における１〜１９番目のアミノ酸配列）をコードする部位を除いた(以下野生型GLD遺伝子と言う)。野生型GLD遺伝子を鋳型とし、配列番号３および４に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーDNA(F)、プライマーDNA(R)としPCRを行った。このとき、プライマーDNA(F)は予めリン酸化しておいた。得られたPCR産物をSalIで処理した後に、予めNaeI、SalIで処理し、Nae1の切断部位は脱リン酸化しておいたプラスミドpAFF2(独立行政法人産業技術総合研究所より分譲)に対して導入し、プラスミドpAFF3GLDを取得した。続いて、野生型GLD遺伝子を鋳型とし、配列番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーDNA(F)、プライマーDNA(R)としてPCRを行い、得られたPCR産物をBglIIおよびSphIで処理し、予めBglIIとSphIで処理しておいたpAFF3GLDに対し導入しプラスミドpAFF4GLDを取得した。以下の実験にはpAFF4GLDを用いた。
【００４５】
プライマーDNA（F）：5’ ggcagatcttccaactccacgtccgccaaatatgattat 3’（配列番号３）
プライマーDNA（R）：5’ ctgcaggtcgacgcatgcctaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’（配列番号４）
プライマーDNA（F）：5’ ggcagatcttccaactccacgtccgccaaatatgattat 3’（配列番号５）
プライマーDNA（R）：5’ acatgcatgctctagactaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’（配列番号６）
【実施例２】
【００４６】
（ランダム変異を導入した改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体の取得）
野生型GLD遺伝子にランダム変異を導入するために、下記のようなオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。なお、プライマーDNA（F）は制限酵素BglII切断部位を有し、プライマーDNA（R）は制限酵素XbaI切断部位を有する。
プライマーDNA（F）：5’ggcagatcttccaactccacgtccgccaaatatgattat 3’（配列番号７）
プライマーDNA（R）：5’acatgcatgctctagactaacgacgaccagcatcggccttgatgag 3’（配列番号８）
【００４７】
実施例１で取得した野生型GLD遺伝子（配列番号２）を含むプラスミドpAFF04GLDと、本実施例で合成した配列番号７記載のプライマーDNA（F）、及び配列番号８記載のプライマーDNA（R）を用い、GeneMorph II Random Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、キットに添付されている実験手順に従ってランダム変異を導入したプラスミドを取得した。宿主としてE. coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）を形質転換した後、選択マーカーであるアンピシリンナトリウム（和光純薬社製）を50μg/ｍL濃度含有するLB寒天プレートにまき、37℃で一晩培養して、形質転換体を取得した。取得した大腸菌形質転換体からillustra plasmid mini spin kit(GEヘルスケア社製)を用いてランダム変異を導入したプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをSaccharomyces cerevisiae  BY4741（例えば  OpenBiosystems社製  品番YSC1048）に導入した。導入にはFrozen-EZ Yeast Transformation II Kit(ZYMO RESERACH社製)を用いた。
【実施例３】
【００４８】
（ランダム変異を導入した改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体のGLD酵素活性評価）  
96マイクロウェルプレート（Nunc社製）の各ウェルに125μLのイーストエクストラクト（BD社製）1.0％、トリプトン(BD社製)  2.0%、グルコース(和光純薬製)  2.0%からなるYPD培地を分注し、実施例２で取得した酵母の形質転換体を１コロニーずつ植菌し、30℃、1,000rpmで24時間振とう培養した。培養後、遠心して上清を回収した。前述の酵素活性測定法に従い、プレートリーダーを用いてブランク値およびサンプル値を測定し、サンプル値をブランク値にて除した値を相対活性（％）とした。野生株と比べて相対活性が優位に増加した変異株を選別し、遺伝子解析を実施した結果、表1の通りだった。
【００４９】
【表１】
0005896375.tif 000003
【実施例４】
【００５０】
（部位特異的な置換変異を導入した改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体の取得：その１）
GLD遺伝子に部位特異的な置換変異を導入するために、下記のようなオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
尚、オリゴヌクレオチド中の「NNN」には置換変異のアミノ酸をコードする任意の塩基配列（コドン）が該当する。例えば、置換変異のアミノ酸が、アラニン(A)の場合はGCC、システイン(C)の場合はTGC、アスパラギン酸(D)の場合はGAC、グルタミン酸(E)の場合はGAG、フェニルアラニン(F)の場合はTTC、グリシン(G)の場合はGGC、ヒスチジン(H)の場合はCAC、イソロイシン(I)の場合はATC、リジン(K)の場合はAAG、ロイシン(L)の場合はCTT、メチオニン(M)の場合はATG、アスパラギン(N)の場合はAAC、プロリン(P)の場合はCCC、グルタミン(Q)の場合はCAG、アルギニン(R)の場合はCGT、セリン(S)の場合はTCC、スレオニン(T)の場合はACT、バリン(V)の場合はGTC、トリプトファン(W)の場合はTGG、チロシン(Y)の場合はTATが該当する。またこれらの塩基配列は配列番号２に記載の塩基配列を元に決定した。
【００５１】
配列番号1のアミノ酸配列の298番目のアラニン(A)を任意のアミノ酸と置換変異させるプライマーを配列番号９とし、同様に、その他の位置のアミノ酸の置換用のプライマーを配列番号１０〜１７とした。
プライマーDNA（A298）：5’ tgtctctgccggtnnnttgaagtccccggc 3’  （配列番号９）
プライマーDNA（S340）：5’ aggaccaagtgaacnnncacatggatgcat 3’  （配列番号１０）
プライマーDNA（H341）：5’ ccaagtgaacagcnnnatggatgcatcggg 3’  （配列番号１１）
プライマーDNA（D343）：5’ gaacagccacatgnnngcatcgggcaacac 3’  （配列番号１２）
プライマーDNA（G352）：5’ cacttccatctctnnnaccaaggcagtctc 3’  （配列番号１３）
プライマーDNA（K354）：5’ catctctggaaccnnngcagtctcctaccc 3’  （配列番号１４）
プライマーDNA（Y424）：5’ tgaagtcctgaacnnnccgggcagcgcgac 3’  （配列番号１５）
プライマーDNA（V431）：5’ cagcgcgacgtccnnntttgcagaattctg 3’  （配列番号１６）
プライマーDNA（F432）：5’ cgcgacgtccgtgnnngcagaattctgggc 3’  （配列番号１７）
【実施例５】
【００５２】
実施例１で取得した野生型GLD遺伝子を含むプラスミドpAFF4GLDと、実施例４で合成した配列番号９のプライマーDNA、及びプライマーDNAと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用い、QuikChangeII  Site-Directed  Mutagenesis  Kit（STRATAGENE社製）を用いて、キットに添付されている実験手順に従って置換変異を導入したプラスミドを取得した。宿主として、 coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）を形質転換した後、選択マーカーであるアンピシリンナトリウム（和光純薬社製）を50μg/mL含有するLB寒天（BD社製）プレートにまき、37℃で一晩培養して、野生型GLDのアミノ酸配列の298位のアラニンが各アミノ酸に置換された改変型GLDをコードする改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体を取得した。上記方法と同様にして、野生型GLD遺伝子を含むプラスミドpAFF04GLDと、実施例４で合成した配列番号１０から１７に記載の各プライマーDNA、及び各プライマーDNAと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、各々の置換変異を導入したプラスミドを取得した。形質転換も上記同様に行い、野生型GLDのアミノ酸配列の一部が置換された各々の改変型GLDをコードする改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体を取得した。
更に、実施例２と同様に、こうして取得した大腸菌形質転換体からillustra plasmid mini spin kit(GEヘルスケア社製)を用いて部位特異的な置換変異を導入したプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドをSaccharomyces cerevisiae  BY4741に導入した。
【実施例６】
【００５３】
（部位特異的な置換変異を導入した改変型GLD遺伝子を持つ形質転換体のGLD酵素活性評価
：その１）
実施例５により取得した酵母の形質転換体について、実施例３に記載の手順と同様にして相対活性が野生株と比較して顕著に増加した変異株を選別した。それら変異株の相対活性の測定結果を表２〜４に示す。また、Ａ２９８Ｖ、Ｖ３３８Ｍ、Ｓ３４０Ｇ、Ｓ３４０Ｎ、Ｓ３４０Ｖ、Ｓ３４０Ｗ、Ｈ３４１Ａ、Ｈ３４１Ｃ、Ｈ３４１Ｄ、Ｈ３４１Ｆ、Ｈ３４１Ｇ、Ｈ３４１Ｉ、Ｈ３４１Ｋ、Ｈ３４１Ｌ、Ｈ３４１Ｍ、Ｈ３４１Ｎ、Ｈ３４１Ｑ、Ｈ３４１Ｒ、Ｈ３４１Ｓ、Ｈ３４１Ｖ、Ｈ３４１Ｗ、Ｈ３４１Ｙ、Ｄ３４３Ａ、Ｄ３４３Ｅ、Ｄ３４３Ｆ、Ｄ３４３Ｈ、Ｄ３４３Ｉ、Ｄ３４３Ｋ、Ｄ３４３Ｌ、Ｄ３４３Ｍ、Ｄ３４３Ｎ、Ｄ３４３Ｑ、Ｄ３４３Ｓ、Ｄ３４３Ｗ、Ｄ３４３Ｙ、Ｄ３４３Ｖ、Ｇ３５２Ａ、Ｇ３５２Ｆ、Ｇ３５２Ｉ、Ｇ３５２Ｍ、Ｇ３５２Ｎ、Ｇ３５２Ｐ、Ｇ３５２Ｑ、Ｇ３５２Ｒ、Ｇ３５２Ｓ、Ｇ３５２Ｗ、Ｇ３５２Ｙ、Ｙ４２４Ｃ、Ｙ４２４Ｋ、Ｙ４２４Ｎ、Ｙ４２４Ｑ、Ｙ４２４Ｒ、Ｙ４２４Ｓ、Ｙ４２４Ｖ、Ｇ４２６Ａ、Ｇ４２６Ｃ、Ｇ４２６Ｆ、Ｇ４２６Ｈ、Ｇ４２６Ｉ、Ｇ４２６Ｋ、Ｇ４２６Ｌ、Ｇ４２６Ｍ、Ｇ４２６Ｎ、Ｇ４２６Ｓ、Ｇ４２６Ｔ、Ｇ４２６Ｗ、Ｇ４２６Ｙ、Ｇ４２６Ｖ、Ｖ４３１Ｆ、Ｆ４３２Ｉ、Ｆ４３２Ｋ、Ｆ４３２Ｌ、Ｆ４３２Ｍ、Ｆ４３２Ｑ、Ｆ４３２Ｒ、Ｆ４３２Ｔ、Ｆ４３２Ｖにおいては、1,10-フェナントロリンと併せてプロフラビン塩酸塩に対する感受性も優位に低下（プロフラビン塩酸塩による阻害に対する相対活性４５％以上）していた。
【００５４】
【表２】
0005896375.tif 000004
【００５５】
【表３】
0005896375.tif 000005
【００５６】
【表４】
0005896375.tif 000006
【実施例７】
【００５７】
(精製酵素を用いた1,10-フェナントロリン及びプロフラビン塩酸塩感受性の評価)
500mL容坂口フラスコにYPD培地を150mL入れ、実施例５にて取得した341位のヒスチジンがトリプトファンに置換した改変株および432位のフェニルアラニンがロイシンに置換した変異株を植菌し、30℃、120rpm、48時間の条件で培養した。
培養液を3,000×gで5分間遠心し、上澄み液を10μmメンブレンフィルターにてろ過した。ろ液をViva spin 20-10k(GEヘルスケア社製)等を用いて濃縮し、透過液の電気伝導度が10μS/cm以下になるまで脱塩を行った。
得られた酵素溶液を1mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で平衡化させておいたDEAEセルファイン A-500-mカラム(直径  1.0cm×高さ  6.0cm)に通液し酵素を吸着させた。同緩衝液で洗浄し、さらに10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を通液した。得られた活性画分を集めViva spin2-10k(GEヘルスケア社製)にて濃縮し精製酵素とした。
得られた精製酵素溶液を適切な濃度に希釈後、前述の酵素活性測定法に倣い分光光度計を用いてサンプル値及びブランク値を測定した。
測定の結果を表５に示す。精製酵素においても1,10-フェナントロリンおよびプロフラビン塩酸塩の感受性が大きく低下していることが判った。
【００５８】
【表５】
0005896375.tif 000007
【実施例８】
【００５９】
(高濃度の阻害剤による感受性の評価)
実施例３および６に記載の手順と同様にして高濃度の阻害剤の共存下で相対活性を測定した。その結果（表６）から、阻害剤の終濃度１〜２０ｍＭにおいて、野生型と比較して本発明の改変型GLDの相対活性は顕著に増加していることが判明した。
【００６０】
【表６】
0005896375.tif 000008
【実施例９】
【００６１】
（改変型GLDを用いたD-グルコースの定量）
実施例7で得た、341位のヒスチジンがトリプトファンに置換した改変株および432位のフェニルアラニンがロイシンに置換した改変株から得た改変型GLDを使用し、前述の酵素活性測定法に倣い分光光度計を用いてD-グルコースの定量を行った。反応測定系において、終濃度が0.3、5.0、15、25、50ｍＭとなるようD-グルコースを添加し、600nmにおけるDCIPの吸光度変化（ΔAbs/min）を測定した。この吸光度変化を既知のグルコース濃度（0.3、5.0、15、25、50ｍＭ）に対してプロットしたところ、検量線が作成できた（図１Ａ〜図１Ｄ）。これより本発明の改変型GLDを用いてグルコースの定量が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のポリヌクレオチドにてコードされる改変型GLDは、1,10-フェナントロリンの影響を受けにくいことから、より高精度な自己血糖測定(SMBG)装置にも利用することができ、糖尿病患者の自己管理及び治療に大きく資する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【配列表】
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