(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンを有効成分として含有することを特徴とする、多能性幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導剤。
【請求項２】
外胚葉系細胞が感覚器系細胞又は神経系細胞である、請求項１記載の分化誘導剤。
【請求項３】
感覚器系細胞が眼の構成細胞である、請求項２記載の分化誘導剤。
【請求項４】
眼の構成細胞が、網膜、水晶体、角膜上皮又は虹彩の細胞である、請求項３記載の分化誘導剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の分化誘導剤を含有することを特徴とする、眼疾患の治療用又は予防用の医薬品。
【請求項６】
フコイダンの存在下で多能性幹細胞を培養して外胚葉系細胞へ分化誘導することを特徴とする、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導方法。
【請求項７】
フコイダンの存在下で多能性幹細胞を培養して外胚葉系細胞へ分化誘導する工程を含む、外胚葉系細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導剤、該分化誘導剤を含む医薬品、医薬部外品及び飲食品並びに外胚葉系細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、様々な細胞に分化できる多分化能と、細胞分裂を経ても多分化能（未分化状態）を維持できる自己増殖能とを併せ持つ細胞である。なかでも、体性幹細胞は、生体内の各組織に存在しており、障害若しくは疾患又は老化等に伴って組織の細胞が失われた場合に、新たな細胞を供給することにより組織の恒常性を維持している。また、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞は、人工的につくり出された幹細胞であり、生体を構成する全ての細胞種に分化できる能力（多能性）と無限増殖性を有している。
【０００３】
近年、再生医療をはじめとする先端医療の分野において、これらの幹細胞の性質を臓器や組織の再生に応用する研究が活発に進められている（非特許文献１）。例えば、哺乳類の眼、特に網膜はいったん障害を受けると自然には再生しない。このため、網膜色素変性症等の網膜変性症には治療法がなく、失明に至ることから、幹細胞を利用した再生医療が期待されている。このような背景の中、近年の幹細胞技術の進歩により、マウスやヒトのＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から網膜（網膜色素上皮、神経網膜）や水晶体等の眼組織・細胞を誘導することが可能となっており、将来的にはこれらの誘導された眼組織・細胞の移植により従来有効な治療法がなかった眼疾患の治療が可能となることが期待されている（非特許文献２、３）。
【０００４】
また、日本には約１０万人の脊髄損傷患者が存在し、毎年新たに約５０００人の受傷者が生じていると言われている。重症の場合には手足がほとんど動かず、寝たきりや車椅子の生活を余儀なくされている。現在のところ、脊髄損傷によって失われた機能を回復するために有効な治療法は確立されていない。その理由としては、中枢神経系では損傷後の神経再生が非常に起こりにいことが挙げられる。このため、脊髄損傷にもやはり幹細胞による再生医療が期待されており、すでに幹細胞から中枢神経系への様々な分化誘導技術が確立されている（非特許文献４）。一方で、上記幹細胞を利用した再生医療を実現するためには、幹細胞から効率的に目的細胞への分化を制御する物質や技術の開発が必須である。
【０００５】
脊椎動物の初期胚の発生過程では胚葉形成と呼ばれる細胞の系統分化が起き、外胚葉、中胚葉、内胚葉の三種類の細胞集団が形成される。このうち、外胚葉は神経系細胞、感覚系細胞、表皮を生み出す。よって、幹細胞から外胚葉、さらには、外胚葉を由来とする細胞や組織を分化誘導することができれば、上記の眼疾患や脊髄損傷の治療への応用の可能性が広がる。
【０００６】
一方、フコイダンは、硫酸多糖の一種であり、コンブ、ワカメ、モズク等褐藻類の粘質物に多く含まれる食物繊維である。フコイダンは、主にＬ−フコースがα１−２、α１−４結合で数十から数十万個も繋がった化合物である。これまでに、このフコイダンに様々な生理活性機能が見出されている。例えば、特許文献１には、フコイダンがヒト皮膚線維芽細胞おいて、ｔｙｐｅＩ  ｐｒｏ−ｃｏｌｌａｇｅｎ産生増強作用及びＴＧＦ−β１産生増強作用を示すことが記載されている。また、特許文献２には、フコイダンが、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において、大腸上皮細胞におけるＩＬ−６の産生抑制作用を示し、大腸炎病変の改善効果を示すことが記載されている。しかしながら、これまでに、フコイダンが未分化の幹細胞に及ぼす影響については殆ど検討されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３１３１３１
【特許文献２】特開２００３−１４６８８８
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】西川伸一ら、実験医学増刊、２００８年、２６巻、第５号、ｐｐ．７４−８０
【非特許文献２】Ｅｉｒａｋｕ  Ｍ，  Ｔａｋａｔａ  Ｎ，  Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｈ，  Ｋａｗａｄａ  Ｍ，  Ｓａｋａｋｕｒａ  Ｅ，  Ｏｋｕｄａ  Ｓ，  Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ  Ｋ，  Ａｄａｃｈｉ  Ｔ，  Ｓａｓａｉ  Ｙ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  ７；  ４７２  （７３４１）：５１−６
【非特許文献３】Ｏｓａｋａｄａ  Ｆ，  Ｊｉｎ  ＺＢ，  Ｈｉｒａｍｉ  Ｙ，  Ｉｋｅｄａ  Ｈ，  Ｄａｎｊｙｏ  Ｔ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，  Ｓａｓａｉ  Ｙ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ．  （２００９）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １２２  （Ｐｔ  １７）：３１６９−７９
【非特許文献４】Ｕｅｎｏ  Ｍ，  Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｍ，  Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋ，  Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ，  Ｏｓａｋａｄａ  Ｆ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｓ，  Ｓａｓａｉ  Ｙ．  （２００６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０：９５５４−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本願発明の目的は、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導活性を有する物質を見出し、これまで治療が困難であった眼疾患や神経疾患を根本的に予防、改善又は治療するための医薬品や飲食品等の組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、フコイダンを幹細胞の培養系に添加することにより、幹細胞において外胚葉系細胞特異的マーカー遺伝子の発現が亢進することを見出すとともに、神経細胞又は眼様構造体への分化が促進されることを確認し、本願発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち、本願発明は以下の発明を包含する。
（１）フコイダンを有効成分として含有することを特徴とする、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導剤。
（２）外胚葉系細胞が感覚器系細胞又は神経系細胞である、（１）に記載の分化誘導剤。
（３）感覚器系細胞が眼の構成細胞である、（２）に記載の分化誘導剤。
（４）眼の構成細胞が、網膜、水晶体、角膜上皮又は虹彩の細胞である、（３）に記載の分化誘導剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載の分化誘導剤を含有することを特徴とする、医薬品又は飲食品。
（６）眼疾患又は神経疾患の治療用又は予防用の、（５）に記載の医薬品又は飲食品。
（７）フコイダンの存在下で幹細胞を培養して外胚葉系細胞へ分化誘導することを特徴とする、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導方法。
（８）フコイダンの存在下で幹細胞を培養して外胚葉系細胞へ分化誘導する工程を含む、外胚葉系細胞の製造方法。
（９）（８）に記載の方法により製造された外胚葉系細胞。
【発明の効果】
【００１２】
本願発明によれば、幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導剤が提供される。本願発明の分化誘導剤は、幹細胞から外胚葉系細胞、例えば水晶体や網膜等の眼の構成細胞、神経細胞への分化を誘導することができるので、白内障、緑内障、網膜剥離及びその他の眼疾患や脊髄損傷等の神経障害を根本的に予防、改善又は治療するための医薬品や飲食品として利用できる。また、本願発明の分化誘導剤を用いて幹細胞から分化誘導することにより作製された外胚葉系細胞は、眼や神経の損傷部位に移植してその機能を回復させる再生医療への応用が可能となる。さらに、本願発明の分化誘導剤は、水晶体及び網膜等の眼の構成細胞や神経細胞の分化の基礎研究用試薬としても利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本願発明について詳細に述べる。
本願発明の幹細胞から外胚葉系細胞への分化を誘導する分化誘導剤（以下、「外胚葉系細胞分化誘導剤」と称する場合がある）は、フコイダンを有効成分とする。
【００１４】
本願発明における「幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導」とは、生体レベルで又は培養レベルで幹細胞から外胚葉系細胞の分化を誘導及び促進し、外胚葉系細胞を増加させることをいう。
【００１５】
本願発明において「幹細胞」とは、外胚葉系細胞に分化しうる各種の幹細胞をいい、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、骨髄、皮膚、皮下脂肪、脳、網膜、鼻臭球、その他の組織に存在する未分化な状態の細胞（総称して、「体性幹細胞」という）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等を含む。ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立されたＥＳ細胞、及びそれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。このようなＥＳ細胞は、例えば、公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。また、これら幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞のいずれであってもよい。
【００１６】
本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、幹細胞の分化の方向性、及び、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。
【００１７】
外胚葉は、主に表層外胚葉と神経外胚葉に分けられるが、本願発明において、「外胚葉系細胞」とは、表層外胚葉性細胞と神経外胚葉性細胞の両者をいい、初期胚の細胞やＥＳ細胞等の多能性細胞から分化の初期段階で形成される外胚葉細胞（神経や皮膚の共通前駆細胞等）、さらには外胚葉から分化・発生する神経や感覚器を構成する細胞、皮膚の細胞等を含む概念である。外胚葉由来の細胞としては、感覚器系細胞（網膜や内耳の細胞等）、神経系細胞（神経幹細胞、神経細胞（例えば、前脳神経細胞、中脳神経細胞、小脳神経細胞、後脳神経細胞、脊髄神経細胞等）、神経管細胞、神経堤細胞等）、表皮系細胞（表皮細胞、水晶体上皮細胞等）等が挙げられる。
【００１８】
本願発明の分化誘導剤により分化誘導された細胞が、上記の外胚葉系細胞であるか否かは、例えば、各種の神経系細胞マーカーや感覚器系細胞マーカーの発現により確認できる。本願発明において用いることのできる神経系細胞マーカーや感覚器系細胞マーカーとしては、例えば、Ｏｔｘ２（外胚葉・神経細胞・眼の分化マーカー：Ｗ０２００５／１２３９０２、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２  Ａｕｇ  ２０；３５８（６３８８）：６８７−９０．  Ｎｅｓｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｒｏｓｔｒａｌ  ｂｒａｉｎ．  Ｓｉｍｅｏｎｅ  Ａ，  Ａｃａｍｐｏｒａ  Ｄ，  Ｇｕｌｉｓａｎｏ  Ｍ，  Ｓｔｏｒｎａｉｕｏｌｏ  Ａ，  Ｂｏｎｃｉｎｅｌｌｉ  Ｅ．  ＳｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，  ＣＮＲ，  Ｎａｐｌｅｓ，  Ｉｔａｌｙ．）、Ｓｏｘ１（神経細胞・眼の分化マーカー：Ｗ０２００５／１２３９０２）、Ｓｉｘ３（前脳領域・眼の分化マーカー：Ｃｅｒｅｂ  Ｃｏｒｔｅｘ．  ２００８  Ｍａｒ；１８（３）：５５３−６２．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｎ  １８．  Ｓｉｘ３  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＮＳ．  Ａｐｐｏｌｌｏｎｉ  Ｉ，  Ｃａｌｚｏｌａｒｉ  Ｆ，  Ｃｏｒｔｅ  Ｇ，  Ｐｅｒｒｉｓ  Ｒ，  Ｍａｌａｔｅｓｔａ  Ｐ．）、Ｐａｘ６（神経前駆細胞、眼の分化マーカー：Ｗ０２００５／１２３９０２）、Ｔｕｊ−１（神経細胞マーカー：Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００７  Ｊｕｌ；２０（７）：７４２−８．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ａｐｒ  ２７．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｘ２  ｉｎ  ｍａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒａｔｏｍａｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｐｈｉ  ＪＨ，  Ｐａｒｋ  ＳＨ，  Ｐａｅｋ  ＳＨ，  Ｋｉｍ  ＳＫ，  Ｌｅｅ  ＹＪ，  Ｐａｒｋ  ＣＫ，  Ｃｈｏ  ＢＫ，  Ｌｅｅ  ＤＨ，  Ｗａｎｇ  ＫＣ．）、Ｍａｐ２（成熟神経細胞マーカー：Ｗ０２００５／１２３９０２、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｎｏｖ  １；  ７０（３）：３２７−３４．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ＰＳＡ−ＮＣＡＭ，  ＣＲＭＰ−４  ａｎｄ  ＮｅｕｒｏＤ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｏｆ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  ａｇｅｄ  ｒｏｄｅｎｔｓ．  Ｓｅｋｉ  Ｔ．）、Ｃｒｙｓｔａｌｉｎ（水晶体、レンズマーカー）等が挙げられる。
【００１９】
本願発明に用いるフコイダンは、硫酸多糖の一種である。本願発明に使用できるフコイダンとしてより具体的には、Ｕ−フコイダン、Ｆ−フコイダン、Ｇ−フコイダン等が挙げられるがこれらに限定はされない。また、これらのフコイダンは市販品を用いてもよい。
【００２０】
本願発明において用いるフコイダンは、植物体から分離した上記のフコイダンであってもフコイダン含有物であってもよい。フコイダン含有物としては、モズク、クロメ、カジメ、アラメ等の昆布目、ひばまた目、ながもつも目等に属する藻類が挙げられる。また、棘皮動物由来のフコイダン、例えばウニ、ヒトデ、ナマコ等由来のフコイダンを使用してもよい。
【００２１】
フコイダンは、幹細胞から外胚葉系細胞への分化を培養レベル又は生体レベルで誘導する作用を有する。従って、本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、その有効量を添加した幹細胞分化誘導培地にて幹細胞を培養することによって、又は、ヒトを含む哺乳動物に投与することによって、幹細胞から外胚葉系細胞への分化を誘導することができる。
【００２２】
幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導を幹細胞の培養により行う場合、培地に上記外胚葉系細胞分化誘導剤を添加する以外は、培養方法の条件及び操作は、当該技術分野で常套的な条件及び操作に従って行うことができる。外胚葉系細胞分化誘導剤の培地への添加量は、フコイダンの濃度として１〜１０００μｇ／Ｌ、好ましくは５０〜２００μｇ／Ｌである。
【００２３】
幹細胞の培養には、幹細胞の維持又は分化誘導の目的に適する組成の培地を使用する。幹細胞分化誘導培地としては、具体的には、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地（例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｉｄｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ）、ハンクス液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、ＭＣＤＢ１５培地）に、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、白血球増殖因子（ＬＩＦ）等の増殖因子を少なくとも１種添加した培地が用いられる。また、当該培地には、細胞の増殖速度を増大させるために、必要に応じて、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント等を添加してもよく、また、抗生物質を添加してもよい。培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。
【００２４】
また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。
【００２５】
幹細胞の培養は、未分化状態を保つために、マイトマシンＣ処理したＭＥＦ細胞等をフィーダー細胞として用い、幹細胞維持用培地（基本培地にＬＩＦ、Ｌ−グルタミン酸等を添加した培地）にて行い、また、幹細胞の外胚葉系細胞への分化誘導は、未分化状態を維持し培養した幹細胞を、改めて別のフィーダー細胞上に播種し、分化を促すような種々の因子を加えて培養することにより行う。フィーダー細胞としては、特に限定されないがマウスストローマ細胞であるＳＴ２細胞やＰＡ６細胞が好ましい。分化を促すような種々の因子としては、ＤＥＸ（ＤＥＸＡＭＥＴＨＡＳＯＮＥ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＣＴ（Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ）、ＥＤＮ３（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−３）が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００２６】
幹細胞の培養及び幹細胞から外胚葉系細胞への分化誘導に使用する容器としては、使い捨てのシャーレが好ましい。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましいが、毎日行うことがより好ましい。また、幹細胞から角膜や水晶体（レンズ）及び網膜を含む眼組織への分化誘導は１２日以上行うのが好ましい。
【００２７】
本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、生体内にそのまま投与することも可能であるが、本願発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに医薬品、医薬部外品、飲食品等の組成物に配合して用いることができる。
【００２８】
本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤を医薬品として提供する場合は、フコイダンに、医薬品の製剤上許容され、かつ剤型に応じて適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤に調製すればよい。
【００２９】
経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、デキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、ハードファット等の基剤等を用いることができるが、これらに限定はされない。
【００３０】
非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調整剤等を用いることができるが、これらに限定はされない。
【００３１】
本願発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤等の経口剤、点眼剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤等の非経口剤等が挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。なお、本願発明の医薬品には、動物に用いる薬剤、即ち獣医薬も包含される。
【００３２】
上記製剤中のフコイダンの含有量は特に限定されないが、製剤全重量に対して、フコイダン固形分換算で、０．００１〜３０重量％の範囲が好ましく、０．０１〜１０重量％がより好ましい。
０．００１重量％未満では効果が得にくく、３０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくい。又、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。
【００３３】
上記医薬品の形態の中でも点眼剤の形態とすることが好ましい。フコイダンの含有量は適応疾患等に応じて適宜変更することができる。点眼剤には、通常点眼剤に配合され得る各種の添加剤を適宜配合することができる。添加剤としては、例えば、緩衝剤（ホウ酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤等）、等張化剤（ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン，ポリエチレングリコール，プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム等の塩類等）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、パラオキシ安息香酸メチル等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）、安定化剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、キレート剤等が挙げられる。
【００３４】
また、点眼剤は、公知の水溶液剤の製法に従い調製できる。例えば、医薬品の製剤上許容される溶媒（例：滅菌精製水、滅菌緩衝液等の水性溶媒）に、上記の各種添加剤を添加した後、フコイダンを溶解して均質な水溶液剤とする。点眼剤の調製は、無菌操作法により行うか、あるいは適当な製造工程で滅菌処理を施すことにより行われる。
【００３５】
本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、有効成分であるフコイダンが幹細胞から外胚葉系細胞への分化を促進する作用を有するので、眼疾患又は神経疾患を改善及び予防するための医薬として有効である。
【００３６】
眼疾患としては、水晶体、角膜、網膜、視神経の変性や損傷による疾患であれば特に限定はされないが、例えば、網膜疾患（網膜剥離、網脈絡膜炎、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、糖尿病性網膜症、高血圧網膜症、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、中心性漿液性網脈絡膜症等）、視神経疾患（緑内障、乳頭浮腫、視神経炎、視神経萎縮等）、角膜疾患（細菌性角膜潰瘍、角膜真菌症、角膜ヘルペス等）、白内障（老人性、糖尿病性、併発性、外傷性の白内障等）等が挙げられる。
【００３７】
神経疾患としては、神経系細胞の障害による疾患あれば特に限定はされないが、例えば、脊髄損傷、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、パーキンソン病、多発性硬化症、脳血管障害（脳梗塞、脳卒中、脳動脈瘤）、脳血管障害による痴呆症や運動障害、てんかん、脳外傷等が挙げられる。
【００３８】
本願発明の医薬品は、上記疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。
【００３９】
本願発明の医薬品を上記の疾患の予防及び／又は治療用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。
【００４０】
本願発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度に応じて適宜決定することができる。例えば、成人に経口投与する場合には、一日の投与量は、フコイダンとして１〜１０００ｍｇ、好ましくは５〜２００ｍｇである。
【００４１】
また、本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、飲食品にも配合できる。本願発明において、飲食品は、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、又は特定保健用食品を含む。さらに、本願発明の飲食品は、ヒト以外の哺乳動物を対象として使用されるペットフード、飼料を含む。特に、アルツハイマー病等の予防や神経損傷の治療等長期にわたって服用が必要となる場合に、日常的に摂取できる点で有利である。
【００４２】
飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。
【００４３】
飲食品の種類としては、具体的には、食パン、菓子パン等のパン類；そば、うどん、パスタ、中華麺、即席麺等の麺類；キャンディー、チューインガム、チョコレート、ビスケット・クッキー等の焼き菓子、ゼリー等の菓子類；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；加工乳、発酵乳、ヨーグルト、バター、チーズ等の乳製品；かまぼこ、ちくわ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；しょうゆ、ソース、酢、みりん等の調味料；清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）等が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００４４】
本願発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生上許容され得る添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、澱粉等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、防腐剤等が挙げられる。
【００４５】
本願発明の飲食品におけるフコイダンの配合量は、幹細胞から外胚葉系細胞への分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコスト等を考慮して適宜設定すればよい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により本願発明をさらに具体的に説明する。但し、本願発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）フコイダンによる幹細胞（マウスＥＳ細胞）の外胚葉系細胞への分化誘導
（１）ＥＳ細胞の調製
ゼラチンコート処理した３５ｍｍシャーレにＭＭＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）処理済みのＭＥＦ細胞（Ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）をコンフルエントの状態で培養し、その上にマウスＥＳ細胞を１０〜２０×１０４個播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで前培養した。培地はＤＭＥＭにｃｈｅｍｉｃｏｎ社製のＥＳ細胞用添加因子（Ｌ−グルタミン液、２−メルカプトエタノール液、ヌクレオシド液、非必須アミノ酸液、ＥＳＧＲＯ）を推奨濃度で添加した後、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）を１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）を１５％添加したＥＳ細胞未分化維持用培地（以下、「ＥＳ細胞用培地」という）を用いた。
【００４８】
上記の方法で培養したＥＳ細胞及びＭＥＦ細胞をトリプシン処理によりシャーレから剥がし、それらを再びゼラチンコート処理した３５ｍｍシャーレに播種した。播種後３０分間静置し、その後培地を別のチューブに回収した。このとき接着性の強いＭＥＦ細胞はシャーレに残り、ＥＳ細胞のみが回収される。このようにして回収した未分化のＥＳ細胞を用いて以下の実験を行った。
【００４９】
（２）フィーダー細胞を用いた培養系におけるフコイダンによる幹細胞の外胚葉系細胞への分化誘導
ＭＥＦから分離したＥＳ細胞を、２４ｗｅｌｌプレートで培養したＭＭＣ処理済のＭＥＦ細胞上に再び播種し（５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、ＥＳ細胞用培地からＬＩＦを除いた培地を用いて培養した。その際、市販のフコイダン（焼津水産化学工業株式会社製、フコイダンＹＳＫ（ＮＢ））を２５、５０、１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【００５０】
培養４日後にＥＳ細胞のみを回収し、細胞をＰＢＳ（−）にて２回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞からＲＮＡを抽出した。２−ＳＴＥＰリアルタイムＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写後、ＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、下記の各プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲ（９５℃：１５秒間、６０℃：３０秒間、４０ｃｙｃｌｅｓ）を実施し、Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー：Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２００７  Ｊａｎ；  １７（１）：４２−９．  Ｒｅｖｉｅｗ．  Ｎａｎｏｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｐａｎ  Ｇ，  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ．）、Ｏｔｘ２（外胚葉・神経細胞マーカー）、Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）、Ｓｉｘ３（前脳領域、眼の分化マーカー）の各マーカー遺伝子の発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って行った。
【００５１】
Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー）用プライマーセット：
ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣ（配列番号１）
ＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号２）
Ｏｔｘ２（外胚葉、神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡ（配列番号３）
ＧＣＧＧＣＡＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴ（配列番号４）
Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＧＣＣＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＣＡＴＧＴ（配列番号５）
ＴＧＴＡＡＴＣＣＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＡＴ（配列番号６）
Ｓｉｘ３（前脳領域）用プライマーセット：
ＣＣＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣ（配列番号７）
ＧＡＡＧＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡ（配列番号８）
ＧＡＰＤＨ（内部標準）用プライマーセット：
ＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＡＣＣＣＣＣＡＡＴ（配列番号９）
ＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴ（配列番号１０）
【００５２】
各細胞のマーカー遺伝子の発現については、フコイダンを添加せずに培養した細胞における各遺伝子ｍＲＮＡの発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量に対する割合として算出した相対発現量（各遺伝子の発現量／ＧＡＰＤＨ発現量）の値を１．０とし、これに対し、フコイダンを添加して分化誘導した各細胞における各遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。その結果を表１に示す。
【００５３】
【表１】
0006050033.tif 000002
【００５４】
表１に示されるように、未分化マーカーであるＮａｎｏｇはフコイダンの濃度依存的に発現が抑制された。一方で、外胚葉や神経細胞マーカーであるＯｔｘ２やＳｏｘ１に関してはその発現が促進されることが明らかとなった。また、外胚葉の中でも初期胚の発生過程で、前脳領域で発現が促進される遺伝子であるＳｉｘ３の発現も促進された。
【００５５】
（３）フィーダー細胞を用いない培養系におけるフコイダンによる幹細胞の外胚葉系細胞への分化誘導
ＭＥＦから分離した未分化のＥＳ細胞をゼラチンコート処理した２４ｗｅｌｌプレートに直接（ＭＥＦ細胞なしの状態で）播種し（５×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、上記方法と同様にＥＳ細胞用培地からＬＩＦを除いた培地を用いて培養し、各濃度のフコイダンを添加した。培養４日後にＲＮＡを回収し、Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー）、Ｏｔｘ２（外胚葉・神経細胞マーカー）、Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）、Ｓｉｘ３（前脳領域マーカー）の各マーカー遺伝子の発現を確認した。各マーカー遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。その結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
0006050033.tif 000003
【００５７】
表２に示されるように、（２）の場合と同様、Ｎａｎｏｇの発現抑制、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｉｘ３の発現促進が確認された。
【００５８】
（４）ＥＢを形成する培養系におけるフコイダンによる幹細胞の外胚葉系細胞への分化誘導
ＭＥＦから分離した未分化のマウスＥＳ細胞を、ＬＩＦを除いたＥＳ細胞用培地に懸濁し、２０００ｃｅｌｌｓ／２０μＬの細胞濃度でｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐを形成し、ＥＢ（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ）を作製した。その際、各濃度のフコイダンを添加し、培養４日後にＲＮＡを回収し、Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー）、Ｏｔｘ２（外胚葉・神経細胞マーカー）、Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）、Ｓｉｘ３（前脳領域マーカー）の各マーカー遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲにより解析した。その結果を表３に示す。
【００５９】
【表３】
0006050033.tif 000004
【００６０】
表３に示されるように、（２）の場合と同様、Ｎａｎｏｇの発現抑制、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｉｘ３の発現促進が確認された。
【００６１】
上記（表１〜３）のように、いずれの培養系（フィーダー細胞を用いた培養系、フィーダー細胞を用いない培養系、ＥＢを形成する培養系）においてもフコイダンはマウスＥＳ細胞の未分化維持を抑制し、一方で外胚葉系細胞への分化を促進した。
【００６２】
（実施例２）フコイダンによる幹細胞（マウスＥＳ細胞）の神経細胞への分化誘導
無血清培養下、ＥＳ細胞を各種のストローマ細胞と共培養することにより、成熟した神経系細胞を分化誘導する技術が確立されている（特許４２９４４８２号；  Ｋａｗａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｍｉｚｕｓｅｋｉ  Ｋ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ，  Ｋａｎｅｋｏ  Ｓ，  Ｋｕｗａｎａ  Ｙ，  Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｓ，  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ，  Ｓａｓａｉ  Ｙ．，  Ｎｅｕｒｏｎ  ２０００  Ｏｃｔ；２８（１）：３１−４０．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）。本神経分化誘導系にフコイダンを添加したところ、成熟した神経細胞への誘導が促進された。
【００６３】
ＭＥＦから分離したマウス未分化ＥＳ細胞を、２４ｗｅｌｌプレートでコンフルエントまで培養したＳＴ２細胞（マウス骨髄由来ストローマ細胞）上に５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、Ｇ−ＭＥＭに１０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔ．  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール液、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸液を添加した神経細胞分化誘導培地で培養した。その際、１００μｇ／ｍＬのフコイダンを添加した。
【００６４】
分化誘導１２日後にＳＴ２細胞及びＥＳ細胞を回収し、神経細胞分化マーカー遺伝子であるＰａｘ６（神経前駆細胞マーカー）、Ｔｕｊ−１（神経細胞マーカー）、Ｍａｐ２（成熟神経細胞マーカー）の各マーカー遺伝子の発現を下記の各プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した。
【００６５】
Ｐａｘ６（神経前駆細胞マーカー）用プライマーセット：
ＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣ（配列番号１１）
ＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号１２）
Ｔｕｊ−１（神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＣＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＡＣＣＴＴ（配列番号１３）
ＧＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴ（配列番号１４）
Ｍａｐ２（成熟神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＡＣＴＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣＴＣＡＴＣＴＴ（配列番号１５）
ＧＴＡＴＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＴＴＡ（配列番号１６）
【００６６】
リアルタイムＰＣＲによる各マーカー遺伝子の発現の解析結果を表４に示す。
【００６７】
【表４】
0006050033.tif 000005
【００６８】
表４に示されるように、フコイダン添加により、各神経細胞分化マーカーの発現が顕著に促進されることが確認された。以上のように、フコイダンはＥＳ細胞から神経細胞への分化を顕著に促進した。
【００６９】
（実施例３）フコイダンによる幹細胞（マウスＥＳ細胞）の眼様構造体への分化誘導
ＥＳ細胞をストローマ細胞であるＳＴ２細胞と共培養することにより、メラノサイトを分化誘導する系が確立されている（Ｙａｍａｎｅ  Ｔ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓ，  Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｈ，  Ｋｕｎｉｓａｄａ  Ｔ．，  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．  １９９９  Ｄｅｃ；２１６  （４−５）：４５０−８．  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．）。本分化誘導系では、メラノサイト以外にも、心筋細胞、血球系細胞等様々な細胞が分化してくることが知られている。このような様々な細胞が分化してくる系に、フコイダンを添加して、以下の分化誘導試験を行った。
【００７０】
ＭＥＦから分離したマウス未分化ＥＳ細胞を、２４ｗｅｌｌプレートでコンフルエントまで培養したＳＴ２細胞上に５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で播種し、α−ＭＥＭに１０％ＦＢＳ、１００ｎＭデキサメタゾン、２０ｐＭｂＦＧＦ、１０ｐＭコレラトキシン、１００ｎｇ／ｍＬエンドセリン３を含む分化誘導培地で分化を促した。その際、１００μｇ／ｍＬのフコイダンを添加した。
【００７１】
図１に上記分化誘導試験の結果を示す。フコイダン無添加群では、誘導１２日目には様々な形態をした細胞が現れ始めた。一方、フコイダン添加群では、誘導１２日目の時点でコロニーの周りに色素を有した構造体が多数出現し始めた。
【００７２】
ＥＳ細胞から網膜色素上皮細胞や水晶体（レンズ）を含む眼様構造体を誘導する系が確立されている（Ｈｉｒａｎｏ  Ｍ，  Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ａ，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｎ，  Ｔｏｋｕｎａｇａ  Ｔ，  Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ  Ｔ，  Ｉｓｈｉｚａｋｉ  Ｋ，  Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｈ，  Ｏｋａｚａｋｉ  Ｋ，  Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｈ，  Ｈａｙａｓｈｉ  Ｓ，  Ｋｕｎｉｓａｄａ  Ｔ．，  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ．  ２００３  Ｄｅｃ；２２８（４）：６６４−７１．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｌｅｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．）。上記コロニーの形態を顕微鏡観察すると、フコイダン添加により形成された構造体は、上記文献で報告される眼様構造体に酷似していた。
【００７３】
また、分化誘導１２日目において、細胞を回収し、眼の分化マーカー遺伝子であるＯｔｘ２（前脳領域、眼の分化マーカー）、Ｓｉｘ３（前脳領域、眼の分化マーカー）、Ｐａｘ６（眼の分化マーカー）、Ｃｒｙｓｔａｌｉｎ（水晶体マーカー）の各マーカー遺伝子の発現を下記の各プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した。
【００７４】
Ｏｔｘ２（前脳領域、眼の分化マーカー）用プライマーセット：
ＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＧＡＡＴＣＣＡ（配列番号３）
ＧＣＧＧＣＡＣＴＴＡＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴ（配列番号４）
Ｓｉｘ３（前脳領域、眼の分化マーカー）用プライマーセット：
ＣＣＣＴＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＴＴＣ（配列番号７）
ＧＡＡＧＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＡＧＡＡ（配列番号８）
Ｐａｘ６  （眼の分化マーカー）用プライマーセット：
ＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＧＣ（配列番号１１）
ＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧ（配列番号１２）
Ｃｒｙｓｔａｌｉｎ（水晶体マーカー）用プライマーセット：
ＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＣＴＡＴＧ（配列番号１７）
ＣＣＧＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＡＧＴＡ（配列番号１８）
【００７５】
リアルタイムＰＣＲによる各マーカー遺伝子の発現の解析結果を表５に示す。
【表５】
0006050033.tif 000006
【００７６】
表５に示すように、フコイダン添加により、眼の発生マーカー（Ｏｔｘ２，Ｓｉｘ３，Ｐａｘ６，Ｃｒｙｓｔａｌｉｎ）の発現が促進されることが確認された。
【００７７】
以上のように、フコイダンはＥＳ細胞から網膜色素上皮や水晶体等を含む眼様構造体への誘導を促進する。
【００７８】
（実施例４）フコイダンによる幹細胞（ヒトｉＰＳ細胞）の外胚葉系細胞への分化誘導
（１）ヒトｉＰＳ細胞の調製
ゼラチンコート処理した６０ｍｍシャーレにＭＭＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）処理済みのＭＥＦ細胞をコンフルエントの状態で培養し、その上に解凍したヒトｉＰＳ細胞の細胞塊を播種し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで前培養した。培地はカルディオ社製のｉＰＳｅｌｌｏｎに５ｎｇ／ｍＬの濃度でｂＦＧＦを添加したｉＰＳ細胞未分化維持用培地（以下、「ｉＰＳ細胞用培地」という）を用いた。
【００７９】
上記の方法で培養したｉＰＳ細胞をｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＥＺＰａｓｓａｇｅを用いてコロニーを切断し、回収した後、２４ｗｅｌｌプレートで培養したＭＭＣ処理済のＭＥＦ細胞上に再び播種し、ｉＰＳ細胞用培地からｂＦＧＦを除いた培地を用いて培養した。その際、フコイダンを１００μｇ／ｍＬの濃度で添加した。
【００８０】
培養４日後にＲＮＡを回収し、Ｎａｎｏｇ（未分化マーカー）、Ｏｔｘ２（外胚葉・神経細胞マーカー）、Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）の各マーカー遺伝子の発現を下記の各プライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲにより解析した。その結果を表６に示す。
【００８１】
Ｎａｎｏｇ  （未分化マーカー）用プライマーセット：
ＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＴ（配列番号１９）
ＡＡＧＴＧＧＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号２０）
Ｏｔｘ２（外胚葉、神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＣＧＣＡＧＣＴＡＧ（配列番号２１）
ＣＣＡＴＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＴＣＧＡＣＴＣ（配列番号２２）
Ｓｏｘ１（神経細胞マーカー）用プライマーセット：
ＧＧＴＣＡＡＡＣＧＧＣＣＣＡＴＧＡＡＣ（配列番号２３）
ＴＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＴＴＧＴＧＣＡＴＣＴＴ（配列番号２４）
Ｓｉｘ３（前脳領域）用プライマーセット：
ＧＴＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＣＣＣＣＴＡＧＡ（配列番号２５）
ＴＧＧＴＧＡＧＡＡＴＣＧＧＣＧＡＡＧＴＴ（配列番号２６）
ＧＡＰＤＨ（内部標準）用プライマーセット：
ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ（配列番号２７）
ＴＣＴＴＣＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＧＡＴＧ（配列番号２８）
【００８２】
【表６】
0006050033.tif 000007
【００８３】
表６に示されるように、マウスＥＳ細胞を用いた場合と同様、Ｎａｎｏｇの発現抑制、Ｏｔｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｉｘ３の発現促進が確認された。
【００８４】
以上のように、フコイダンはヒトｉＰＳ細胞に対しても外胚葉分化誘導促進効果を示す。
【００８５】
（実施例５）
ヒトやマウスの体性幹細胞から神経細胞を分化誘導する系が確立されている（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．  ２００８  Ｏｃｔ；１７（５）：９０９−１６．Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ａｎｇｈｉｌｅｒｉ  Ｅ，  Ｍａｒｃｏｎｉ  Ｓ，  Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉ  Ａ，  Ｃｉｆｅｌｌｉ  Ｐ，  Ｇａｌｉｅ  Ｍ，  Ｓｂａｒｂａｔｉ  Ａ，  Ｋｒａｍｐｅｒａ  Ｍ，  Ｂｅｌｌｕｚｚｉ  Ｏ，  Ｂｏｎｅｔｔｉ  Ｂ．ＳｏｕｒｃｅＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｒｏｎａ，  Ｖｅｒｏｎａ，  Ｉｔａｌｙ．）。これらの分化誘導系にフコイダンを添加したところ、神経細胞への分化が有意に促進され、フコイダンはＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を用いた場合と同様に、体性幹細胞に対しても外胚葉への分化を顕著に促進した。
【００８６】
また、フコイダンの代わりにフコイダンを含有することが知られる植物の抽出物を用いて実施例１〜５に記載の分化誘導試験を行ったところ、同様に幹細胞から外胚葉系細胞、眼の構成細胞、神経細胞への分化促進効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本願発明の外胚葉系細胞分化誘導剤は、幹細胞から眼の構成細胞や神経細胞等の外胚葉系細胞を効率的に分化誘導できる。分化誘導された眼様組織や神経細胞は、損傷部位への移植、人工神経・人工網膜としての利用等、再生医療分野において利用できる。また、白内障、緑内障、網膜剥離等の眼疾患や神経疾患の根本的治療を目的とした医薬品、医薬部外品、機能性食品やサプリメント等の飲食品の製造分野において利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、フコイダンによるＥＳ細胞から眼様構造体への分化誘導試験結果を示す（最上段：フコイダン無添加群の培養１２日後の培養シャーレの実体顕微鏡像、上から２段目：フコイダン無添加群の培養１２日後の培養シャーレの光学顕微鏡像（位相差（左）と明視野（右））、上から３段目：フコイダン添加群の培養１２日後の培養シャーレの実体顕微鏡像、最下段：フコイダン添加群の培養１２日後の培養シャーレの光学顕微鏡像（位相差（左）と明視野（右））。
【図１】
0006050033.tif 000008
【配列表】
0006050033000001.app