(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)の化合物、又はその塩:
【化１】
0005974083.tif 000033
[式中、Tは結合又はリンカーであり、R2及びR3は有機残基であり、Xは、
【化２】
0005974083.tif 000034
(式中、R1は有機残基である)
からなる群から選択される]。
【請求項２】
以下の構造:
【化３】
0005974083.tif 000035
を有する、請求項1に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
R1が、セファロスポリン系抗生物質の7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する置換基であるか;又は
R1がY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素である、
請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
R2及びR3が、水素、C3〜C7シクロアルキル、C3〜C7シクロアルケニル、(CH2)pOC(O)PhOC(O)C1〜C6アルキル、(CH2)pOC(O)APhC1〜C6アルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C20アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C20アルケニル、分枝鎖又は直鎖C2〜C20アルキニルから独立に選択され、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、S、NH、NH2+から選択される1以上の基/ヘテロ原子によって場合により中断されていてよく、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、ハロゲン、シアノ、COOH、(CH2)pC(O)OC1〜C6アルキル、C(O)OC1〜C6アルケニル、SO3H、SO2ハロゲン、SO2NH2、NH2、NH3+、OH、SH、OC1〜C6アルキル、OC2〜C6アルケニル、OC2〜C6アルキニル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2、3、4、5又は6個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい4、5、6、7又は8員環を形成し、前記4、5、6、7又は8員環は、-C(O)C1〜C3アルキレン-ナフチル-OC1〜C6アルキル、-C(O)C1〜C3アルキレン-Ph-C(O)-Ph、-C(O)CH2O(CH2)pOCH3、-C(O)OPhNO2、-C(O)OPhNH2、-C(O)O(CH2)pCハロゲン3、-C(O)O(CH2O)pCH3、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)C1〜C6アルキレンCOOC1〜C6アルキル、-C(O)C1〜C3アルキレンPhC1〜C6アルキル、-C(O)O-ピロリジニル-2,5-ジオン、-C(O)C1〜C3アルキレンPhC1〜C6アルキル、-C(O)(CH2)pOC1〜C6アルキル、-C(O)O(CH2)pハロゲン、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、-SO2ナフチル-NC1〜C6アルキル、-C(O)ONC1〜C6アルキル、-(CH2)pOH、-C(O)PhOAc、-C(O)(CH2)pNHC(O)C1〜C6アルキル、-C(O)NH2、-C(O)M、-C(O)NR4R5、-(CH2)pCH(OH)CHOH、ハロゲン、シアノ、-COOH、-C(O)O(CH2)pPh、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)SC1〜C6アルキル、-C(O)SC2〜C6アルケニル、-C(O)SC2〜C6アルキニル、-C(O)C1〜C6アルキル、SO3H、SO2ハロゲン、SO2フェニル、SO2NH2、SO2NR4R5、SO2PhNHCOC1〜C6アルキル、NH2、OH、SH、OC1〜C6アルキル、OC2〜C6アルケニル、OC2〜C6アルキニル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、Aは、1から4個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素基であり、pは、0から4の間の数字であり、R4及びR5は、独立に、C1〜C6アルキルを表し、Mは、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、フェニル又はトリアジニルであるか;或いは
R2及びR3が、水素、C5〜C7シクロアルキル、(CH2)pOC(O)PhOC(O)C1〜C6アルキル、(CH2)pOC(O)APhC1〜C6アルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C10アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルケニル及び分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルキニルから独立に選択され、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、S、NH及びNH2+から選択される1から3個の間の基/ヘテロ原子によって場合により中断されていてよく、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、ハロゲン、フェニル、エトキシ、メトキシ、プロポキシ、COOH、(CH2)pCOOC1〜C4アルキル、NH2、NH3+、OH及びSHからなる群から選択される1から6個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、Aは、1又は2個の炭素原子を有する二価の炭化水素基であり、pは、0、1又は2であるか;或いは
R2及びR3が、水素、C5〜C7シクロアルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C10アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルケニル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルキニルから独立に選択され、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、NH及びNH2+から選択される1から3個の間の基によって場合により中断されていてよく、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、ハロゲン、フェニル、メトキシ、COOH、CH2COOC1〜C4アルキル、NH2及びNH3+からなる群から選択される1から4個の間の置換基によって場合により置換されていてよいか;或いは
R2及びR3が、水素、シクロヘキシル、分枝鎖若しくは直鎖C1〜C10アルキル又は分枝鎖若しくは直鎖C2〜C10アルケニルから独立に選択され、前記アルキル又はアルケニル鎖は、NH及びNH2+から選択される1又は2個の基によって場合により中断されていてよく、前記アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、フェニル、メトキシ、COOH、NH2及びNH3+からなる群から選択される1から3個の間の置換基によって場合により置換されていてよいか;或いは
R2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2、3、4又は5個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい4、5、6又は7員環を形成し、前記4、5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO3H、SO2ハロゲン、SO2NH2、-C(O)O(CH2)pPh、-C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ナフチル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、ハロゲン、SO2PhNHCOC1〜C6アルキル、NH2、SH、OC1〜C6アルキルからなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、pは0から2の間の数字であるか;或いは
R2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2又は3個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい5、6又は7員環を形成し、前記5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO2NH2、-COO(CH2)pPh-C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、ハロゲン、NH2、SH、OC1〜C6アルキルからなる群から選択される1から4個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、pは、0から2の間の数字であるか;或いは
R2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2又は3個の追加の窒素原子を場合により含有してよい飽和5、6又は7員環を形成し、前記5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO2NH2、-C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、ハロゲン、NH2、SH、OC1〜C6アルキルからなる群から選択される1から3個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、pは、0から2の間の数字であるか;或いは
R2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化４】
0005974083.tif 000036
0005974083.tif 000037
0005974083.tif 000038
からなる群から選択される構造を形成するか;或いは
R2及びR3が、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員環を形成するか;或いは
R2及びR3が、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、ピリミジニル及びフェニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成するか;或いは
R2及びR3が、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化５】
0005974083.tif 000039
からなる群から選択される構造を形成する、請求項1から3のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が、以下：
【化６】
0005974083.tif 000040
からなる群から選択される構造を有する、請求項1又は請求項2に記載の化合物及びその塩。
【請求項６】
前記R2及び/又はR3置換基を介して結合した抗生物質化合物をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記抗生物質が、シプロフロキサシン又はN-デスメチルレボフロキサシンである、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
バイオフィルムからの微生物の分散を促進するため;又はバイオフィルムの形成及び/若しくは発達を阻害するため;又はバイオフィルムを形成することができる微生物によって感染症が引き起こされている対象において、バイオフィルム関連感染症、疾患又は障害を治療する又は予防するための組成物の製造のための、請求項1から7のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項９】
前記化合物又は組成物が、バイオフィルム形成を受けやすい表面又は界面にコーティングされ、含浸され、又は接触している、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
前記表面が、埋め込み型医療デバイス、装具又は医療若しくは手術用機器の表面である、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
前記バイオフィルム形成微生物がβ-ラクタマーゼ又はトランスペプチダーゼを発現する、請求項8から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記β-ラクタマーゼがペニシリナーゼである、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物が、前記化合物又は組成物への暴露の前に又はそれと同時にβ-ラクタム抗生物質に暴露される、請求項8に記載の使用。
【請求項１４】
前記バイオフィルムが、対象の体表面上、前記対象の内部又は外部において形成され、前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物の前記化合物又は組成物への暴露が、前記対象への前記化合物又は組成物の投与を介するものである、請求項8から13のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
バイオフィルムからの微生物の分散を促進するステップ、又はバイオフィルムの形成を防止するステップが、分散につながるバイオフィルム内の微生物における分化事象を誘導するステップを含む、又はバイオフィルム形成につながる微生物における分化事象の誘導を防止するステップを含むか;或いは、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するステップ、又はバイオフィルムの形成を防止するステップが、抗菌剤に対する微生物の感受性を増大させるステップを含む、請求項8から14のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物が、有効量の前記化合物又は組成物に暴露され、それにより、放出され、故に前記バイオフィルム又は微生物に暴露される酸化窒素供与体又は酸化窒素の濃度は、前記バイオフィルム又は微生物が存在する環境又は対象に対して非毒性である、請求項8から15のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記バイオフィルムが、対象の体表又は体内にあり、前記対象が罹患している疾患又は障害に関連する、請求項8から16のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記疾患又は障害が、嚢胞性線維症、細菌性心内膜炎、中耳炎、在郷軍人病、結核及び腎臓結石からなる群から選択される、請求項17に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、バイオフィルム形成微生物付近での酸化窒素の放出を調節して微生物におけるプログラム細胞死を調節し、それにより、バイオフィルムからの微生物の分散を促進し且つ/又はバイオフィルム形成若しくは発達を阻害するための方法及び化合物に関する。より詳細には、本発明は、酸化窒素放出に対する空間的及び時間的制御を提供するための化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムは、微生物群落及びそれらが産生する細胞外マトリックスを含む三次元微生物増殖形態である。バイオフィルムは天然に普遍的であり、水若しくは好適な流体が利用可能である任意の表面上若しくは任意の界面に、又は例えば綿状物若しくは顆粒として懸濁液中に形成される。
【０００３】
バイオフィルムは、いくつかの疾患の病原因子であり、ヒトにおける様々な慢性感染症に関連し、体内の様々な表面上に、例えば、気道及び肺内の表面上(嚢胞性線維症及び在郷軍人病に関連する)、耳の表面上(中耳炎に関連する)、並びに心臓及び心臓弁の表面上(細菌性心内膜炎に関連する)に形成される。バイオフィルムは、例えば、浮遊細胞と比較して実質的に増大した抗生物質への耐性及び食作用への耐性の形態で、生息微生物(microorganism inhabitants)に対する保護の強化を提示し、これにより、バイオフィルムを根絶することが非常に困難となり、バイオフィルムの持続性の重大度及び高レベル並びにバイオフィルムによって生成される感染症に関連する疾病率を説明している。例えば、嚢胞性線維症の事例において、呼吸器感染症の主要原因は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)であり、嚢胞性線維症罹患者における肺の表面上の緑膿菌バイオフィルムは、より高度な抗生物質耐性及び宿主の免疫防御に対する耐性を付与する。その結果として、嚢胞性線維症罹患者における慢性肺感染症の、並びに同じく疾病率及び死亡率の主な原因は、バイオフィルム関連緑膿菌である。
【０００４】
バイオフィルムは、カテーテル及びカニューレ等の医療機器上、並びにステント及びコンタクトレンズを含む埋め込み型医療デバイス上にも容易に形成される。実際に、多くの長期カテーテル挿入患者は、バイオフィルム形成細菌によって引き起こされる感染症を獲得し、より一般的には、バイオフィルムは、保険制度に多大の費用を加算する広範な院内感染の原因となる。
【０００５】
公衆衛生の観点から、バイオフィルムは、飲料水、貯水池、パイプ及び空調用ダクト等の水システムにおける病原体の重要な保有宿主である。バイオフィルムは、重大な産業的損害も引き起こし、例えば、水分配及び処理システム、パルプ及び紙製造システム、熱交換システム並びに冷却塔等の流体プロセスにおける付着（fouling）及び腐食を引き起こし、且つパイプライン及び貯水池における油の酸性化に寄与する。
【０００６】
バイオフィルムは、本質的に多細胞微生物群落であり、その形成及び発達は、細胞-細胞シグナル伝達等、メンバー生物の種々の多細胞形質に依存する。クオラムセンシング等の細胞外シグナル伝達システムは、細胞密度を評価し、シグナル伝達分子が十分な濃度に達した際に、遺伝子発現及び表現型の変化を開始させるために、細菌によって使用される。これは、例えば毒性因子及び/又は防御機構の誘導につながる識別的（differential）遺伝子発現、並びにバイオフィルム関連細胞が浮遊細胞から高度に分化するような細胞分化に関連する。
【０００７】
バイオフィルム内の細胞が分化しバイオフィルムが成熟するにつれて、代謝率の低下、防御機構の細胞発現及び抗菌剤のバイオフィルムに浸透する能力の低下が抗菌薬耐性の増大をもたらし、バイオフィルムの根絶を特に困難にしている。現在のバイオフィルム制御戦略は、典型的には、バイオフィルム発達の初期段階を標的とし、毒性抗菌剤の使用を伴うものである。しかしながら、そのような毒性作用物質は、例えば、工業的に使用される場合に、環境への放出により、それら自体の下流側の問題を提起し得る。バイオフィルム制御のための改良された戦略が明らかに必要とされている。
【０００８】
廃水処理プロセスにおける、緑膿菌及び他のモデルバイオフィルム形成細菌、混合種口腔バイオフィルム、並びに混合種粒状バイオフィルムの研究は、プログラム細胞死が、バイオフィルムからの細胞の脱離及び分散を誘導し(例えば、Hopeら、2002及びWebbら、2003を参照)、バイオフィルム発達の一般的な特色であることを示した。本発明の発明者らは、バイオフィルムにおけるプログラム細胞死が、バイオフィルム形成生物内の反応性酸素及び窒素種(RONS)の蓄積に関係していること、並びにプログラム細胞死及びバイオフィルムから浮遊細胞への細胞の分散が、低い非毒性濃度の酸化窒素発生剤又は供与体を使用して誘導され得ることを、以前に見出していた(同時係属WO2006/125262を参照、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2006/125262
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Hopeら、2002、Determining the spatial distribution of viable and non viable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling, J. Appl. Microbiol., 1993: 448-455.
【非特許文献２】Webbら、2003、Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development, J. Bact., 185: 4585-4592.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この所見の実施は、バイオフィルムを酸化窒素に暴露して細胞の分散を誘導することによる医療、工業及びバイオプロセシングを含む、幅広い環境及び状況におけるバイオフィルムの除去のための新規技術の可能性を提示するものである。しかしながら、いくつかの状況において、特にヒトの健康及び医療への応用において、酸化窒素の制御されていない及び広範囲への放出は、許容されない副作用及び毒性レベルに関連し得る。溶液中における酸化窒素供与体の安定性を改良することも、難題をもたらす。
【００１２】
したがって、酸化窒素の放出を、この放出がバイオフィルム付近に局在化され、それによって他の場所における副作用及び毒性を最小化することができるように、空間的に且つ/又は時間的に調節するための、有効な機構の開発が必要である。
【００１３】
本明細書において提供されるのは、酸化窒素の放出を時間的に且つ空間的に調節し、今度は、バイオフィルムからの細胞の分散を促進し、バイオフィルム発達を調節するための新規機構を提供するための、化合物、方法及び組成物である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第一の態様において、本発明は、式(I)の化合物、又はその塩:
【化１】
0005974083.tif 000002
【００１５】
[式中、Tは結合又はリンカーであり、R2及びR3は有機残基であり、Xは、
【化２】
0005974083.tif 000003
【００１６】
(式中、R1は有機残基である)
からなる群から選択される]を提供する。
【００１７】
一実施形態において、式(I)の化合物は、下記の構造:
【化３】
0005974083.tif 000004
【００１８】
[式中、R1、R2、R3及びTは、上記で定義した通りである]
を有する。
【００１９】
Tは、1から6個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素であるリンカー、例えば、-CH2-、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-又は-CH2CH2CH2CH2-であってよい。一実施形態において、TはCH2である。
【００２０】
R1は、セファロスポリン系抗生物質の7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する置換基であってよい。
【００２１】
一実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、Yは、1から4個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素である。アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニルからなる群から選択されてよく、ヘテロアリール基は5又は6員環であってよく、ここで、1から4個の間の炭素原子は、窒素及び/又は硫黄原子で置き換えられている。
【００２２】
ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル及びピロリルから選択され得る。
【００２３】
一実施形態において、R1は、-CH2-フェニル、-CH2-チエニル及び-CH2-テトラゾリルからなる群から選択される。
【００２４】
R2及びR3は、C1〜C10アルキルからなる群から独立に選択されてよく、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員環を形成し得る。
【００２５】
代替的な実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、ピリミジニル及びフェニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【００２６】
別の実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化４】
0005974083.tif 000005
【００２７】
からなる群から選択される構造を形成する。
【００２８】
一実施形態において、式(I)の化合物は、
【化５】
0005974083.tif 000006
【化６】
0005974083.tif 000007
【００２９】
からなる群から選択される構造を有する。
【００３０】
式(I)の化合物は、R2及び/又はR3置換基を介して結合した抗生物質化合物をさらに含み得る。抗生物質は、例えば、シプロフロキサシン又はN-デスメチルレボフロキサシンであってよい。
【００３１】
第二の態様において、本発明は、バイオフィルムからの微生物の分散を促進する、又はバイオフィルムの形成及び/若しくは発達を阻害するための組成物であって、第一の態様による化合物を含む組成物を提供する。
【００３２】
組成物は、1以上の追加の抗生物質又は抗菌剤をさらに含み得る。例示的な実施形態において、1以上の追加の抗生物質は、セフタジジム、トブラマイシン及びシプロフロキサシンから選択され得る。
【００３３】
第三の態様において、本発明は、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するための方法であって、バイオフィルムを、有効量の第一の態様の化合物又は第二の態様の組成物に暴露するステップを含む方法を提供する。
【００３４】
第四の態様において、本発明は、バイオフィルム形成及び/又は発達を阻害するための方法であって、バイオフィルム形成微生物を、有効量の第一の態様の化合物又は第二の態様の組成物に暴露するステップを含む方法を提供する。
【００３５】
第四の態様によれば、化合物又はそれを含む組成物は、バイオフィルム形成を受けやすい表面又は界面にコーティングされ、含浸され、又は接触していてよい。一実施形態において、表面は、埋め込み型医療デバイス、装具又は医療若しくは手術用機器の表面であってよい。
【００３６】
第三及び第四の態様の方法によれば、バイオフィルム含有又はバイオフィルム形成微生物は、典型的には、β-ラクタマーゼ又はトランスペプチダーゼを発現する。β-ラクタマーゼは染色体上に又は染色体外にコードされていてよく、発現は構成的であっても誘導的であってもよい。特定の実施形態において、β-ラクタマーゼはペニシリナーゼである。バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は、化合物又は組成物への暴露の前に又はそれと同時にβ-ラクタム抗生物質に暴露され得る。β-ラクタム抗生物質は、前記バイオフィルム形成微生物における細胞外β-ラクタマーゼの産生を誘導し得る。β-ラクタム抗生物質は、亜阻止、静菌又は殺菌濃度で提供され得る。特定の実施形態において、β-ラクタム抗生物質はイミペネムである。
【００３７】
第三及び第四の態様の特定の実施形態において、バイオフィルムは、対象の体表面上、対象の内部又は外部にあってよく、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物の化合物又は組成物への暴露は、対象への化合物又は組成物の投与を介するものであってよい。投与は、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物の性質及び場所に応じて、任意の好適な経路を介するものであってよい。
【００３８】
バイオフィルムの分散を促進する又は形成を防止するための方法は、分散につながるバイオフィルム内の微生物における分化事象を誘導するステップを含み得る、又はバイオフィルム形成につながる微生物における分化事象の誘導を防止するステップを含み得る。その代わりに、又はそれに加えて、方法は、抗菌剤に対する微生物の感受性を増大させるステップを含み得る。
【００３９】
上記の態様及び実施形態によれば、バイオフィルムは、表面に会合又は懸濁されていてよい。懸濁されたバイオフィルムは、綿状物又は顆粒の形態であってよい。
【００４０】
典型的には、上記の態様及び実施形態によれば、バイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物は、有効量の本明細書において定義されている通りの化合物又は組成物に暴露され、それにより、放出され、故にバイオフィルム又は微生物に暴露される酸化窒素供与体又は酸化窒素の濃度は、バイオフィルム又は微生物(microrgansims)が存在する環境又は対象に対して非毒性である。例えば、酸化窒素の濃度は、ナノモル濃度、マイクロモル濃度又はミリモル濃度範囲内であってよい。酸化窒素濃度は、例えば、約1nMから約500μMまでであってよい。
【００４１】
バイオフィルム中に存在する微生物は、単一種又は複数種のものであってよい。バイオフィルム内の、又はバイオフィルムを形成することができる微生物は、例えば、シュードモナス属種(Pseudomonas spp.)、シュードアルテロモナス属種(Pseudoalieromonas spp.)、ブドウ球菌属種(Staphylococcus spp.)、連鎖球菌属種(Streptococcus spp.)、赤痢菌属種(Shigella spp.)、マイコバクテリウム属種(Mycobacterium spp.)、エンテロコッカス属種(Enterococcus spp.)、エシェリキア属種(Escherichia spp.)、サルモネラ属種(Salmonella spp.)、レジオネラ属種(Legionella spp.)、ヘモフィラス属種(Haemophilus spp.)、バチルス属種(Bacillus spp.)、デスルフォビブリオ属種(Desulfovibrio spp.)、シュワネラ属種(Shewanella spp.)、ジオバクター属種(Geobacter spp.)、クレブシエラ属種(Klebsiella spp.)、プロテウス属種(Proteus spp.)、アエロモナス属種(Aeromonas spp.)、アルスロバクター属種(Arthrobacter spp.)、マイクロコッカス属種(Micrococcus spp.)、バークホルデリア属種(Burkholderia spp.)、セラチア属種(Serratia spp.)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas spp.)、フソバクテリウム属種(Fusobacterium spp.)及びビブリオ属種(Vibrio spp.)から選択される1以上の種を含み得る。特定の実施形態において、微生物は、緑膿菌、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バークホルデリア・セノセパシア(Burkholderia cenocepacia)、霊菌(Serratia marcescens)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)又はコレラ菌(Vibrio cholerae)であってよい。
【００４２】
特定の実施形態において、バイオフィルムは、対象の体表又は体内にあり、対象が罹患している疾患又は障害に関連していてよい。該疾患又は障害は、例えば、嚢胞性線維症、細菌性心内膜炎、中耳炎、在郷軍人病、結核又は腎臓結石であってよい。
【００４３】
したがって、第五の態様において、バイオフィルムを形成することができる微生物によって感染症が引きおこされている対象において、バイオフィルム関連感染症、疾患又は障害を治療する又は予防するための方法であって、該対象に、有効量の第一の態様の化合物又は第二の態様の組成物を投与するステップを含む方法が提供される。
【００４４】
本発明は、バイオフィルムからの微生物の分散を促進する際に使用するため又はバイオフィルムの形成若しくは発達を阻害するための組成物の製造のための、第一の態様の化合物の使用も提供する。
【００４５】
本発明は、バイオフィルムを形成することができる微生物によって感染症が引き起こされている対象において、バイオフィルム関連感染症、疾患又は障害を治療する又は予防するための医薬の製造のための、第一の態様の化合物の使用も提供する。
【００４６】
ここで、非限定的な例としてのみ下記の図面を参照して、本発明の実施形態を記述する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート遊離酸からの酸化窒素放出の電流測定による特徴付けの図である(化合物14から19)。矢印は、10mLのpH7.0のトリス緩衝液を含有する反応バイアルへの、下記の添加を示す:(a)10μLの100mMセファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート、(b)10μlの1U/μlペニシリナーゼ、(c)20μlの1U/μlペニシリナーゼ、(d)80μLの10mMフリーラジカルスカベンジャーPTIO。
【図２】化合物15からの酸化窒素放出の電流測定による特徴付けの図である。(a)様々なpHのペニシリナーゼの存在下における酸化窒素放出。矢印は、10mLのpH9.0(太線)、7.0(破線)又は5.0(点線)のトリス緩衝液を含有する反応バイアルへの、下記の添加を示す:(i)10μLの150mM化合物15、(ii)5μLの0.1U/μLペニシリナーゼ、(iii)10μLの0.1U/μLペニシリナーゼ、(iv)80μLの10mMフリーラジカルスカベンジャーPTIO。(b)β-ラクタマーゼ発現緑膿菌(太線)又は非β-ラクタマーゼ発現大腸菌(点線)細胞抽出物の存在下における酸化窒素放出。矢印は、10mLのpH7.0のトリス緩衝液を含有する反応バイアルへの、下記の添加を示す:(i)10μLの150mM化合物15、(ii)100μLの細胞抽出物、(iii)200μLの細胞抽出物、(iv)PTIO。酸化窒素は、ペニシリナーゼ(1U/mL)、又はセファロスポリンセファロチン(150μM)を単独で若しくはセファロチン/ペニシリナーゼ混合物から放出する代表的な非酸化窒素の存在下では検出不能であった(データは示されていない)。データは、少なくとも三つの独立した実験を代表するものである。(c)抗生物質の非存在下で5時間増殖させ、次いで、細胞外β-ラクタマーゼ誘導イミペネム0.5μg/ml(太線)又はアンピシリン100μg/ml(点線)で1時間処理した緑膿菌培養物の上清の存在下における酸化窒素放出。矢印は、10mLのpH7.0のトリス緩衝液を含有する反応バイアルへの、下記の添加を示す:(i)10μLの150mM化合物15、(ii)500μLの上清、(iii)500μLの上清、(iv)PTIO。イミペネムで処理した細胞上清を加えたバイアルへの500μlの100μg/mlアンピシリン添加は、化合物15からの酸化窒素放出を阻害しなかった(データは示されていない)。
【図３】化合物21が、緑膿菌NSGFPレポーター株において酸化窒素依存性遺伝子応答を誘導するのを示す図である。亜阻止アンピシリン(50μg/mL)を加えて又は加えずに増殖させたNSGFP細胞を、自然発生の酸化窒素供与体ニトロプルシドナトリウム(150μM)、化合物21(150μM)、化合物21(150μM)+ペニシリナーゼ(0.2U/mL)、代表的な非酸化窒素放出セファロスポリンセファロチン(150μM)又はペニシリナーゼ(0.2U/mL)に暴露した、或いは未処理のまま放置した。
【図４】化合物21(図において「DEA-CP」として表示されている)が、緑膿菌バイオフィルムにおいて迅速な分散を誘導するのを示す図である。事前準備されたバイオフィルムの化合物21への10分間の暴露は、バイオフィルムバイオマスの同時減少(暗灰色のバー)及び浮遊バイオマスの増大(淡灰白のバー)を誘導する。エラーバーは、標準誤差;n=6を表す。
【図５】化合物21(図において「DEA-CP」として表示されている)が、緑膿菌バイオフィルムにおいて用量依存様式で迅速な分散を誘導するのを示す図である(A)。24時間増殖させた緑膿菌CF分離株のバイオフィルムも、化合物21への10分間の暴露後(淡灰白のバー)、未処理のまま放置したバイオフィルム(暗灰色のバー)と比較して分散する(B)。エラーバーは、標準誤差、n=2を表す。
【図６】化合物21(a)及び23(b)による緑膿菌バイオフィルムの用量依存性分散の図である。緑膿菌バイオフィルムを、マイクロタイタープレート中、37℃で振とうしながら増殖させ、イミペネム(0.5μg/mL)で1時間予め処理した後、種々の濃度の化合物に15分間暴露した。残りのバイオフィルム塊をクリスタルバイオレット染色によって定量化した。
【図７】β-ラクタマーゼとの反応時に、化合物21が緑膿菌バイオフィルムにおいて迅速な分散応答を誘導することを示す図である。(A)バイオフィルムをクリスタルバイオレット染色によって定量化した。(B)クリスタルバイオレットで染色したバイオフィルムの写真。(C)浮遊細胞を上清のOD600測定によって定量化した。エラーバーは標準誤差(n=2)を示す。これらの実験において、バイオフィルム分散は、バイオフィルムのクリスタルバイオレット染色の減少に対応する浮遊OD測定値の増大によって裏付けられる。
【図８】化合物21が、種々のグラム陰性細菌:(A)大腸菌、(B)コレラ菌、(C)霊菌;及びグラム陽性細菌:(D)黄色ブドウ球菌のバイオフィルムにおいて迅速な分散(処理後10分)を誘導することを示す図である。
【図９】化合物21が、連続流条件下、ガラスマイクロ発酵槽内で増殖させた緑膿菌PAO1バイオフィルムの分散を誘導することを示す図である。24時間増殖後、バイオフィルム流出物のOD600測定は、化合物21の添加後に放出された細胞の実質的な増大を示したのに対し、未処理のバイオフィルムから放出された細胞の量は不変のままであった。矢印は、化合物の添加を示す。データは、二つの独立した実験を代表するものである。
【図１０】野生型緑膿菌における、セファロチン、DEA及び化合物21(図において「DEA-CP」として表示されている)による浮遊増殖阻害。グラフは、4mM及び16mMの濃度についてのデータのみ示しており、それより低い濃度では効果がなく、それより高い濃度では三つすべての化合物について増殖を完全に阻害した。エラーバーは標準誤差;n=2を示す。
【図１１】化合物21(図において「DEA-CP」として表示されている)抗生物質の併用処理の、緑膿菌バイオフィルム及び浮遊細胞の生存能力に対する効果の図である。マイクロタイタープレートのウェル中で増殖させた、事前準備されたバイオフィルムを、化合物21の存在下又は非存在下で、セフタジジムに暴露した、又は未処理のまま放置した。1時間(A、B)又は2時間(C、D)の処理後、上清を収集し、浮遊CFUを計数し(B、D);バイオフィルム細菌を緩衝液に再懸濁し、バイオフィルムCFUを計数した(A、C)。エラーバーは標準誤差;n=2を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
冠詞「a」及び「an」（「ある」）は、本明細書において、該冠詞の文法的目的語の一つ又は二つ以上(すなわち、少なくとも一つ)を指すために使用される。例として、「an element(「要素」又は「ある要素」)」は、一つの要素又は二つ以上の要素を意味する。
【００４９】
本明細書の文脈において、用語「約」は、当業者が、同じ機能又は結果を達成するという文脈において記載されている値と同等であるとみなすであろう数値の範囲を指すと理解される。
【００５０】
本明細書及び次の特許請求の範囲全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語「を含む(comprise)」並びに「を含む(comprises)」及び「を含む(comprising)」等の変化形は、記載されている整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の包含を暗示するが任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群の除外を暗示するものではないと理解される。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「抗菌剤」は、単独で、又は抗生物質等の別の作用物質と組み合わせて、微生物の1以上の種を死滅させる又はその増殖を阻害することができる任意の作用物質を指す。
【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「バイオフィルム」は、多細胞の特徴を見せる任意の三次元のマトリックスに包まれた微生物群落を指す。したがって、本明細書において使用される場合、用語バイオフィルムは、表面に会合されているバイオフィルム、並びに綿状物及び顆粒等の懸濁液中のバイオフィルムを含む。バイオフィルムは、単一微生物種を含んでもよく、又は混合種の複合体であってもよく、細菌、及び真菌、藻類、原生動物若しくは他の微生物を含み得る。
【００５３】
用語「バイオフィルム形成微生物」は、単一種又は混合種バイオフィルムのいずれかであるバイオフィルムを形成することができる任意の微生物を指す。
【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「分散」は、バイオフィルム及びバイオフィルムを構成している微生物に関するものである場合、細胞の脱離及び分離のプロセス並びに分散細胞の浮遊表現型又は挙動に戻ることを意味する。
【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、その意味内に、非毒性であるが所望の効果を提供するために十分な作用物質の量を含む。必要とされる正確な量は、処理されている微生物の種、処理されているバイオフィルムの程度、重大度及び/又は年数、バイオフィルムが表面に会合されているか懸濁されているか、投与されている特定の作用物質(複数可)並びに投与モード等の要因に応じて、対象により変動することになる。故に、正確な「有効量」を明記することは不可能である。しかしながら、任意の所与の事例では、適切な「有効量」は、日常実験のみを使用して当業者により決定され得る。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「暴露すること」は、概して、接触させることを意味する。典型的には、直接暴露は、処理される微生物又はバイオフィルムへの作用物質の投与、或いは微生物又はバイオフィルムを作用物質自体と別様に接触させることを指す。典型的には、間接暴露は、活性剤の、或いは、単独で又は他の化合物若しくは分子と反応してのいずれかで、活性剤を生み出すことができる化合物若しくは分子の前駆体の、微生物又はバイオフィルムへの投与、或いは微生物又はバイオフィルムを別様に接触させることを指す。故に、微生物又はバイオフィルムを、本明細書で定義されている通りの化合物又は組成物に、直接的に又は間接的に暴露してよい。さらに、微生物又はバイオフィルムを、化合物から放出された酸化窒素に、直接的に又は間接的に暴露してよい。本開示の文脈において、バイオフィルム又は微生物を本明細書で定義されている通りの化合物又は組成物に間接的に「暴露すること」は、その内部又は表面にバイオフィルム又は微生物がある対象への、化合物又は組成物の投与も含む。故に、本開示において、用語「暴露すること」、「投与すること」及び「送達すること」並びにそれらの変化形は、同じ文脈において、交換可能に使用され得る。
【００５７】
用語「阻害すること」並びに「阻害」及び「阻害する」等のその変化形は、本明細書においてバイオフィルムに関して使用される場合、バイオフィルム形成及び/又は発達の完全又は部分阻害を意味し、その範囲内に、バイオフィルム発達の逆転又はバイオフィルム形成及び/若しくは発達に関連するプロセスも含む。さらに、阻害は、永続的であっても一時的であってもよい。阻害は、所望の効果を生成するために十分な程度(大きさ及び/又は空間的に)、及び/又は期間にわたるものであってよい。阻害は、バイオフィルム形成又は発達の防止、遅滞、低下又は別様の妨害であってよい。そのような阻害は、大きいものであってよく、且つ/又は時間的若しくは空間的な性質であってよい。さらに、そのような阻害は、直接的であっても間接的であってもよい。間接阻害が意味するのは、作用物質が分子の発現又は活性に作用し、これが今度はバイオフィルム形成又は発達を調節し得ることである。
【００５８】
本明細書において使用される場合、用語「プログラム細胞死」は、定義された段階で起こり、特定の表現型を持つ細胞の亜集団の自己消化、細胞分化及び発達を引き起こす、バイオフィルム内における発達事象を意味する。
【００５９】
同様に、用語「促進すること」並びに「促進」及び「促進する」等のその変化形は、バイオフィルムからの微生物の分散を促進するという文脈において本明細書において使用される場合、所望の効果を生成するのに十分な程度(大きさ及び/又は空間的に)、及び/又は期間にわたり、永続的であっても一時的であってもよい、分散の完全又は部分促進も含む。そのような促進は、直接的であっても間接的であってもよい。
【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「表面」は、生体表面及び非生体表面の両方を含む。生体表面は、典型的には、生物の内部(臓器、組織、細胞、骨及び膜等)及び外部(皮膚、毛髪、表皮付属器官、種子、植物の葉等)両方の表面を含む。生体表面は、木又は繊維等の他の自然表面も含む。非生体表面は、バイオフィルムの確立及び発達を支持する任意の組成物の任意の人工表面であってよい。そのような表面は、工業用プラント及び機器中に存在し得、医療及び手術用機器、並びに埋め込み型及び非埋め込み型両方の医療デバイスを含み得る。さらに、本開示の目的のために、表面は、多孔質(膜等)であっても非多孔質であってもよく、剛性であっても柔軟性であってもよい。
【００６１】
本明細書において使用される場合、用語「治療すること」、「治療」、「予防すること」及び「予防」は、いかなる手法であっても、状態又は症状を回復させ、状態又は疾患の確立を予防し、或いは別様に、状態若しくは疾患又は他の望ましくない症状の進行を予防し、妨げ、遅滞させ又は逆転させる、ありとあらゆる使用を指す。故に、用語「治療すること」及び「予防すること」等は、最も広い文脈で考えるべきである。例えば、治療は、患者が完全回復まで治療されることを必ずしも暗示しない。
【００６２】
本明細書の文脈において、用語「C1〜C20アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、secブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等の、1から20個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖の一価飽和炭化水素基を含むと解される。
【００６３】
本明細書の文脈において、用語「C1〜C10アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、secブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等の、1から10個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖の一価飽和炭化水素基を含むと解される。
【００６４】
本明細書の文脈において、用語「C1〜C6アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル等の、1から6個の炭素原子を有する直鎖及び分枝鎖の一価飽和炭化水素基を含むと解される。
【００６５】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C20アルケニル」は、ビニル、プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、ウンデセニル等の、2から20個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００６６】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C10アルケニル」は、ビニル、プロペニル、2-メチル-2-プロペニル、ブテニル、ペンテニル等の、2から10個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００６７】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C6アルケニル」は、ビニル、プロペニル、2-メチル-2-プロペニル等の、2から6個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００６８】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C20アルキニル」は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ウンデシニル等の、2から20個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００６９】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C10アルキニル」は、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等の、2から10個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００７０】
本明細書の文脈において、用語「C2〜C6アルキニル」は、エチニル、プロピニル、ブチニル等の、2から6個の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖及び分枝鎖の一価炭化水素基を含むと解される。
【００７１】
本明細書の文脈において、用語「アリール」は、6から30個の間の炭素原子を有する一価芳香族基、例えば、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル等を含むと解される。
【００７２】
本明細書の文脈において、用語「ヘテロアリール」は、4から25個の間の原子を有し、ここで、1から6個、又は1から5個、又は1から4個、又は1から3個、又は1若しくは2個の原子は、窒素、酸素及び硫黄から選択されるヘテロ原子である一価芳香族基、例えば、フラニル、キナゾリニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾピラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、キノリジニル、ピラニル、イソチアゾリル、チアゾリル、チエニル、イミダゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、イソチアゾリル、ピリジル、トリアゾリル、ベンゾチエニル、ピロリル、ベンゾチアゾリル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾフリル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、トリアジニル等を含むと解される。
【００７３】
本明細書の文脈において、用語「ハロ」及び「ハロゲン」は交換可能に使用され得、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを含むと解される。
【００７４】
本明細書の文脈において、用語「C3〜C7シクロアルキル」は、3から7個の間の炭素原子を有する環式アルキル基、例えば、シクロブチル、シクロヘキシル等を含むと解される。
【００７５】
本明細書の文脈において、用語「C5〜C7シクロアルキル」は、5から7個の間の炭素原子を有する環式アルキル基、例えばシクロペンチル等を含むと解される。
【００７６】
本明細書の文脈において、用語「C3〜C7シクロアルケニル」は、3から7個の間の炭素原子及び少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する環式炭化水素基、例えば、シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル等を含むと解される。
【００７７】
本明細書の文脈において、用語「C1〜C3アルキレン」は、1から3個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素基、例えばメチレン及びエチレンを含むと解される。
【００７８】
β-ラクタマーゼは、β-ラクタム抗生物質に対する防御において細菌によって産生される酵素である。緑膿菌等の多くのバイオフィルム形成微生物は、β-ラクタマーゼを産生することができ、バイオフィルム形成中、バイオフィルム内に大量のこれらの酵素を産生して、バイオフィルムを根絶する際に、β-ラクタム抗生物質を無効にするのを支援する。本明細書において記述され例示されている通り、本発明者らは今や、β-ラクタム抗生物質又はβ-ラクタム抗生物質若しくは抗菌剤のβ-ラクタム環含有コアと、酸化窒素供与体化合物とのカップリングが、有効濃度の酸化窒素の標的化送達、並びにバイオフィルム及びバイオフィルム形成微生物への暴露時における酸化窒素放出に対する空間的及び時間的制御を可能にして、バイオフィルムからの微生物の分散を促進することを見出した。本明細書において例示されている通り、本開示のコンジュゲート（conjugate）化合物は、溶液中で安定であり、バイオフィルム中の微生物に酸化窒素を有効に利用可能にし、マイクロモル範囲内の濃度での10分間のみの暴露後に、緑膿菌バイオフィルムの迅速な分散を誘導することが実証されている。
【００７９】
したがって、本明細書において提供されるのは、コンジュゲート化合物、それを含む組成物、及びそれらの使用であり、ここで、該コンジュゲートは、酸化窒素供与体化合物と複合体化したβ-ラクタム抗生物質若しくはβ-ラクタム環含有抗菌剤、又はその誘導体を含む。そのようなコンジュゲートは、溶液中で安定であり、低い非毒性濃度の酸化窒素を所望の部位へ送達することができる酸化窒素プロドラッグとして作用して、バイオフィルムからの微生物の分散を促進し、バイオフィルムの形成及び/又は発達を阻害する。
【００８０】
一態様において、本発明は、式(I)の化合物、又はその塩:
【化７】
0005974083.tif 000008
【００８１】
[式中、Tは結合又はリンカーであり、R2及びR3は有機残基であり、Xは、
【化８】
0005974083.tif 000009
【００８２】
(式中、R1は有機残基である)
からなる群から選択される]を提供する。
【００８３】
式(I)の化合物は、1以上のキラル中心を有し得る。本発明は、すべての鏡像異性体及びジアステレオ異性体、並びに任意の割合でのそれらの混合物を含む。本発明は、単離された鏡像異性体又は鏡像異性体の対にまでも及ぶ。本発明の実施形態において、Xは、
【化９】
0005974083.tif 000010
【００８４】
からなる群から選択される。
【００８５】
薬学的に許容される塩を含む塩も、式(I)の化合物の範囲内である。式(I)の化合物の塩は、当業者に公知である従来の方法によって調製され得る。例えば、塩基付加塩は、式(I)の化合物を好適な塩基と反応させることによって調製され得る。そのような塩の例は、リチウム、カリウム及びナトリウム等のアルカリ金属塩、並びにカルシウム、マグネシウム及びバリウム等のアルカリ土類金属塩を含む。追加の塩基性塩は、アンモニウム、銅、鉄、マンガン及び亜鉛塩を含むがこれらに限定されない。酸付加塩は、式(I)の化合物を有機酸又は無機酸と反応させることによって調製され得る。そのような塩の例は、HCl、HBr及びHI塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の他の鉱酸の塩、エタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩及びベンゼンスルホン酸塩等のアルキル及びモノアリールスルホン酸塩、並びに酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩等の他の有機酸の塩を含む。式(I)の化合物を、ハロゲン化(C1〜C4)アルキル、例えば、ハロゲン化メチル、エチル、イソプロピル及びブチル等の化合物との反応によって四級化してもよい。
【００８６】
Tは、1から20個の間の炭素原子を有する二価のリンカーであってよい。一実施形態において、Tは、1から20個の間の炭素原子、1から15個の間の炭素原子、又は1から10個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素リンカーである。別の実施形態において、Tは、-CH2-、-CH2CH2-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH2-及び-CH2CH2CH2CH2-からなる群から選択される。
【００８７】
R1は、セファロスポリン系抗生物質の7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する置換基であってよい。例えば、R1は、下記のいずれかの7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する置換基であってよい:セフマチレン、セファロラム(cephaloram)、セファゾリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファゼドン、セファザフル、セフラジン、セフロキシジン(cefroxidine)、セフテゾール、セファクロル(cefachlor)、セファマンドール、セフミノックス、セフォニシド、セフォラニド、セフォチアム、セフプロジル、セフブペラゾン、セフロキシム、セフゾナム、セファマイシン、セフォテタン、セフメタゾール、フロモキセフ、セフィキシム、セフトリアキソン、セフタジジン(ceftazidine)、セフォペラゾン、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトラン(cefditoran)、セフェタメト、セフメノキシム、セフォジジム、セフォタキシム、セフピミゾール、セフピリミド(cefpirimide)、セフポドキシム、セフスロジン、セフテラム、セフチブテン、セフチオレン、セフチゾキシム、ラタモキセフ、セフェピン(cefepine)、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、セフトビプロール、セフタロリン  フォサミル及びセフチオフル。R1は、任意の臨床的に有用なセファロスポリン系抗生物質の7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する置換基であってよいことに留意されたい。
【００８８】
一実施形態において、R1は、
【化１０】
0005974083.tif 000011
0005974083.tif 000012
【００８９】
からなる群から選択される。
【００９０】
上述の基は、上記で記載した特定のセファロスポリン系抗生物質の7-NHC(O)-基に結合した置換基に対応する。
【００９１】
代替的な実施形態において、R1は、式-Y-アリールのものであり、ここで、Yは、1から6個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素である。一実施形態において、Yは、1から4個の間の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖炭化水素であり、アリールはフェニル又はナフチルである。
【００９２】
別の実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール及びヘテロアリールは場合により置換されている。
【００９３】
さらなる実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニルから選択され、ヘテロアリール基は5又は6員環であり、ここで、1から4個の間の炭素原子は、窒素及び/又は硫黄原子で置き換えられており、アリール及びヘテロアリール基は、C1〜6アルキル、ハロ、アミノ、ヒドロキシル、メトキシ及びエトキシから選択される1以上の置換基で場合により置換されていてよい。
【００９４】
さらなる実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニルから選択され、ヘテロアリール基は5又は6員環であり、ここで、1から4個の間の炭素原子は、窒素及び/又は硫黄原子で置き換えられている。
【００９５】
さらなる実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から3個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択される。
【００９６】
さらなる実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1又は2個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択される。
【００９７】
さらなる実施形態において、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは-CH2-であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択される。
【００９８】
一実施形態において、R1は、-CH2-フェニル、-CH2-チエニル及び-CH2-テトラゾリルからなる群から選択される。
【００９９】
R2及びR3は、水素、C3〜C7シクロアルキル、C3〜C7シクロアルケニル、(CH2)pOC(O)PhOC(O)C1〜C6アルキル、(CH2)pOC(O)APhC1〜C6アルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C20アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C20アルケニル、分枝鎖又は直鎖C2〜C20アルキニルから独立に選択されてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、S、NH、NH2+から選択される1以上の基/ヘテロ原子によって場合により中断されていてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル基は、ハロゲン、シアノ、COOH、(CH2)pC(O)OC1〜C6アルキル、C(O)OC1〜C6アルケニル、SO3H、SO2ハロゲン、SO2NH2、NH2、NH3+、OH、SH、OC1〜C6アルキル、OC2〜C6アルケニル、OC2〜C6アルキニル、アリール及びヘテロアリールからなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2、3、4、5又は6個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい4、5、6、7又は8員環を形成し、該4、5、6、7又は8員環は、-C(O)C1〜C3アルキレン-ナフチル-OC1〜C6アルキル、-C(O)C1〜C3アルキレン-Ph-C(O)-Ph、-C(O)CH2O(CH2)pOCH3、-C(O)OPhNO2、-C(O)OPhNH2、-C(O)O(CH2)pCハロゲン3、-C(O)O(CH2O)pCH3、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)C1〜C6アルキレンCOOC1〜C6アルキル、-C(O)C1〜C3アルキレンPhC1〜C6アルキル、-C(O)O-ピロリジニル-2,5-ジオン、-C(O)C1〜C3アルキレンPhC1〜C6アルキル、-C(O)(CH2)pOC1〜C6アルキル、-C(O)O(CH2)pハロゲン、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、-SO2ナフチル-NC1〜C6アルキル、-C(O)ONC1〜C6アルキル、-(CH2)pOH、-C(O)PhOAc、-C(O)(CH2)pNHC(O)C1〜C6アルキル、-C(O)NH2、-C(O)M、-C(O)NR4R5、-(CH2)pCH(OH)CHOH、ハロゲン、シアノ、-COOH、-C(O)O(CH2)pPh、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)SC1〜C6アルキル、-C(O)SC2〜C6アルケニル、-C(O)SC2〜C6アルキニル、-C(O)C1〜C6アルキル、SO3H、SO2ハロゲン、SO2フェニル、SO2NH2、SO2NR4R5、SO2PhNHCOC1〜C6アルキル、NH2、OH、SH、OC1〜C6アルキル、OC2〜C6アルケニル、OC2〜C6アルキニル、アリール及びヘテロアリール、からなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、Aは、1から4個の間の炭素原子を有する二価の炭化水素基であり、pは、0から4の間の数字であり、R4及びR5は、独立に、C1〜C6アルキルを表し、Mは、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、フェニル又はトリアジニルである。
【０１００】
代替的な実施形態において、R2及びR3は、水素、C5〜C7シクロアルキル、(CH2)pOC(O)PhOC(O)C1〜C6アルキル、(CH2)pOC(O)APhC1〜C6アルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C10アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルケニル及び分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルキニルから独立に選択されてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、S、NH及びNH2+から選択される1から3個の間の基/ヘテロ原子によって場合により中断されていてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、ハロゲン、フェニル、エトキシ、メトキシ、プロポキシ、COOH、(CH2)pCOOC1〜C4アルキル、NH2、NH3+、OH及びSHからなる群から選択される1から6個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、Aは、1又は2個の炭素原子を有する二価の炭化水素基であり、pは、0、1又は2である。
【０１０１】
別の実施形態において、R2及びR3は、水素、C5〜C7シクロアルキル、分枝鎖又は直鎖C1〜C10アルキル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルケニル、分枝鎖又は直鎖C2〜C10アルキニルから独立に選択されてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、O、NH及びNH2+から選択される1から3個の間の基によって場合により中断されていてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、ハロゲン、フェニル、メトキシ、COOH、CH2COOC1〜C4アルキル、NH2及びNH3+からなる群から選択される1から4個の間の置換基によって場合により置換されていてよい。
【０１０２】
また別の実施形態において、R2及びR3は、水素、シクロヘキシル、分枝鎖若しくは直鎖C1〜C10アルキル又は分枝鎖若しくは直鎖C2〜C10アルケニルから独立に選択されてよく、該アルキル又はアルケニル鎖は、NH及びNH2+から選択される1又は2個の基によって場合により中断されていてよく、該アルキル、アルケニル又はアルキニル鎖は、フェニル、メトキシ、COOH、NH2及びNH3+からなる群から選択される1から3個の間の置換基によって場合により置換されていてよい。
【０１０３】
またさらなる実施形態において、R2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2、3、4又は5個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい4、5、6又は7員環を形成し、該4、5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO3H、SO2ハロゲン、SO2NH2、-C(O)O(CH2)pPh、-C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ナフチル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、ハロゲン、SO2PhNHCOC1〜C6アルキル、NH2、SH、OC1〜C6アルキル、からなる群から選択される1以上の置換基によって場合により置換されていてよく、ここで、pは0から2の間の数字である。
【０１０４】
別の実施形態において、R2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2又は3個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、飽和、不飽和又は部分不飽和であってよい5、6又は7員環を形成し、該5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO2NH2、-COO(CH2)pPh -C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、C2〜C6アルキニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、-C(O)OC2〜C6アルキニル、-C(O)O(CH2)pPh、-(CH2)pSH、ハロゲン、NH2、SH、OC1〜C6アルキル、からなる群から選択される1から4個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、pは0から2の間の数字である。
【０１０５】
さらなる実施形態において、R2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1、2又は3個の追加の窒素原子を場合により含有してよい飽和5、6又は7員環を形成し、該5、6又は7員環は、SO2NMe2、SO2NH2、-C(O)Me、-C(O)ピリジル、-(CH2)pOH、-C(O)NH2、-COOH、-C(O)NMe2、-C(O)NEt2、フェニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、ピロリジニル、イミダゾリル、C1〜C6-アルキル、C2〜C6アルケニル、-C(O)OC1〜C6アルキル、-C(O)OC2〜C6アルケニル、ハロゲン、NH2、SH、OC1〜C6アルキル、からなる群から選択される1から3個の間の置換基によって場合により置換されていてよく、pは0から2の間の数字である。
【０１０６】
さらなる実施形態において、R2及びR3は、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員環を形成する。
【０１０７】
さらなる実施形態において、R2及びR3は、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員の飽和環を形成する。
【０１０８】
別の実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1又は2個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、ピリミジニル、ナフチル、フェニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル及びピロリルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１０９】
別の実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、ピリミジニル、ナフチル、フェニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル及びピロリルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１１０】
別の実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、ピリミジニル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１１１】
また別の実施形態において、R2及びR3は、メチル、エチル又はプロピルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、追加の窒素上で、ピリミジニル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１１２】
またさらなる実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化１１】
0005974083.tif 000013
【０１１３】
からなる群から選択される構造を形成する。
【０１１４】
さらなる実施形態において、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択される。
【０１１５】
また別の実施形態において、R2及びR3は、メチル、エチル、プロピル及びイソプロピルからなる群から独立に選択される。
【０１１６】
特定の実施形態において、R2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、下記の構造:
【化１２】
0005974083.tif 000014
0005974083.tif 000015
0005974083.tif 000016
0005974083.tif 000017
【０１１７】
を形成する。
【０１１８】
代替的な実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール及びヘテロアリールは、C1〜C6アルキル、ハロ、アミノ及びOC1〜C6アルキルからなる群から選択される1から3個の間の置換基で場合により置換されており、R2及びR3は、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員環を形成する。
【０１１９】
代替的な実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール及びヘテロアリールは、場合により置換されており、R2及びR3は、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員環を形成する。
【０１２０】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニルから選択され、ヘテロアリール基は5又は6員環であり、ここで、1から4個の間の炭素原子は、窒素及び/又は硫黄原子で置き換えられており、アリール及びヘテロアリール基は、C1〜6アルキル、ハロ、アミノ、ヒドロキシル、メトキシ及びエトキシから選択される1以上の置換基で場合により置換されていてよく、R2及びR3は、C1〜C10アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1から3個の間の追加の窒素原子を場合により含有してよく、アリール又はヘテロアリール基で場合により置換されていてよい5又は6員の飽和環を形成する。
【０１２１】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から4個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニル及びフェナントレニルから選択され、ヘテロアリール基は5又は6員環であり、ここで、1から4個の間の炭素原子は、窒素及び/又は硫黄原子で置き換えられており、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1又は2個の追加の窒素原子を場合により含有してよく、ピリミジニル、ナフチル、フェニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル及びピロリルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２２】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1から3個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、ピリミジニル、ナフチル、フェニル、ピラジニル、トリアジニル、トリアゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル及びピロリルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２３】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは、1又は2個の炭素原子を有する二価の炭化水素であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、ピリミジニル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２４】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは-CH2-であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、ピリミジニル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２５】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは-CH2-であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル及びピロリルから選択され、R2及びR3は、メチル、エチル及びプロピルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、追加の窒素上で、ピリミジニル、ナフチル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２６】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは-CH2-であり、アリール基は、フェニル、ビフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル及びピロリルから選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、追加の窒素上で、ピリミジニル、フェニル、ピラジニル及びトリアジニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２７】
さらなる実施形態において、TはCH2であり、R1はY-アリール又はY-ヘテロアリールであり、ここで、Yは-CH2-であり、アリール基はフェニル及びナフチルから選択され、ヘテロアリール基は、チエニル、テトラゾリル、イミダゾリル及びトリアゾリルから選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、1個の追加の窒素原子を場合により含有し、追加の窒素上で、ピリミジニル及びフェニルからなる群から選択される置換基で場合により置換されていてよい飽和5又は6員環を形成する。
【０１２８】
一実施形態において、TはCH2であり、R1は、-CH2-フェニル、-CH2-チエニル及び-CH2-テトラゾリルからなる群から選択され、R2及びR3は、C1〜C6アルキルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化１３】
0005974083.tif 000018
【０１２９】
からなる群から選択される構造を形成する。
【０１３０】
またさらなる実施形態において、TはCH2であり、R1は、-CH2-フェニル、-CH2-チエニル及び-CH2-テトラゾリルからなる群から選択され、R2及びR3は、メチル、エチル及びプロピルから独立に選択されるか、或いはR2及びR3は、それらが結合した窒素と一緒になって、
【化１４】
0005974083.tif 000019
【０１３１】
からなる群から選択される構造を形成する。
【０１３２】
式(I)の化合物は、下記の構造:
【化１５】
0005974083.tif 000020
【０１３３】
[式中、R1、R2、R3及びTは、上記及び本明細書で定義されている通りである]
を有し得る。
【０１３４】
β-ラクタマーゼ又はトランスペプチダーゼに暴露された場合、式(I)の化合物は、酸化窒素の遊離をもたらす脱離反応を最終的に受ける。したがって、式(I)の化合物は、酸化窒素プロドラッグを表す。酸化窒素が式(I)の化合物から遊離される機構を以下のスキーム1において示す。脱離反応は、細菌に特有の酵素であるβ-ラクタマーゼ又はトランスペプチダーゼへの暴露によって推進されるため、式(I)の化合物からの酸化窒素の放出はバイオフィルム付近に局在化され得、それにより、酸化窒素の制御されていない放出に関連し得る他の場所における副作用及び毒性を最小化することができる。
【化１６】
0005974083.tif 000021
【０１３５】
式(I)の化合物からの酸化窒素の放出の速度は、R2及び/又はR3置換基を改変することによって変調され得る。数秒前後の放出時間は、R2及びR3が、それらが結合した窒素と一緒になって、ピロリジニル環を形成する場合に達成され得るのに対し、数分前後の放出時間は、R2及びR3が例えばエチル等の低級アルキル基である場合に可能である。約3から20時間前後の放出時間は、R2及びR3が、末端アミノ置換基を有する低級アルキル基である場合に達成され得る。したがって、意図される用途に依存する式(I)の化合物からの酸化窒素の適切な放出速度は、適切なR2及びR3置換基を選択することによって達成可能である。したがって、当業者であれば、R2及びR3は所望の放出時間に応じて幅広い有機残基の中から選択され得ることを認識するであろう。
【０１３６】
β-ラクタム環及びジアゼニウムジオレートから遠く離れていることにより、置換基R1は、β-ラクタマーゼと式(I)の化合物との反応及びその後の酸化窒素の脱離に対して最小限の効果しか発揮しない。したがって、当業者であれば、R1は本明細書で定義されている特定の置換基に限定されるのではなく、むしろ任意の有機残基を表し得ることを認識するであろう。
【０１３７】
特定の実施形態において、本開示の化合物は、ジアゼニウムジオレートと連結しているセファロスポリンコア又は核を含む。さらなる特定の実施形態において、セファロスポリンはセファロラムである。本開示によって提供される式Iの一つの例示的な化合物は、下記の構造を有する。遊離カルボン酸及びカルボン酸塩(例えばK+塩)の両方が企図されている。
【化１７】
0005974083.tif 000022
【０１３８】
追加の実施形態において、R2及び/又はR3置換基は、酸化窒素と一緒に式(I)の化合物から遊離される抗生物質をさらに含み得る。酸化窒素及び抗生物質の同時放出は、共同して作用してバイオフィルム微生物をより有効に死滅させることができ、酸化窒素はバイオフィルムからの微生物の分散を誘導及び促進し、抗生物質は分散細胞に作用する。当業者であれば、任意の好適な抗生物質が本明細書で定義されている化合物のR2及び/又はR3置換基と連結していてよく、適切な抗生物質の選択は、バイオフィルム形成微生物の同定、バイオフィルムの程度及びバイオフィルムが位置している環境等の要因によって決まることが分かるであろう。抗生物質は、抗生物質ジアゼニウムジオレートコンジュゲート体の形成を容易にするためのNH基を含む抗生物質であってよい。一実施形態において、抗生物質は、シプロフロキサシン、又はN-デスメチルレボフロキサシン等の関連抗生物質である。
【０１３９】
本開示の化合物は、-O-N=N+(O-)-N(R2)(R3)部分をXと、リンカー又は直接結合のいずれかを介してカップリングすることによって調製され得る。一実施形態において、式(I)の例示的な化合物は、スキーム2に従って調製され得る。
【化１８】
0005974083.tif 000023
【０１４０】
式(I)の化合物[式中、R2及び/又はR3置換基は、抗生物質をさらに含む]は、スキーム3において描写されている方法によって調製され得る。
【化１９】
0005974083.tif 000024
【０１４１】
方法において描写されている抗生物質はシプロフロキサシンであるが、当業者であれば、該方法はジアゼニウムジオレート誘導体に変換され得る他の抗生物質に適用可能であることが分かるであろう。
【０１４２】
典型的には、本明細書において記述されている実施形態に従って処理されるバイオフィルムは、β-ラクタマーゼ又はトランスペプチダーゼ等の酵素を発現する、又は発現するように誘導され得る微生物を含む。β-ラクタマーゼの発現の誘導は、好適なβ-ラクタム抗生物質による微生物若しくはバイオフィルムの前処理、又は式(I)の化合物の投与と一緒にした好適なβ-ラクタム抗生物質の投与によって達成され得る。β-ラクタム抗生物質は、前記バイオフィルム形成微生物における細胞外β-ラクタマーゼの産生を誘導し得る。β-ラクタム抗生物質は、亜阻止、静菌又は殺菌濃度であってよい任意の好適な濃度で投与され得る。β-ラクタマーゼは、β-ラクタム環を認識し開裂させることができるものである。したがって、必要ならばβ-ラクタマーゼ発現を誘導するのに使用するための好適なβ-ラクタム抗生物質は、式(I)の化合物が送達される微生物に応じて変動し得る。当業者であれば、用いられる適切なβ-ラクタム抗生物質を容易に決定することができるであろう。
【０１４３】
したがって、本開示の化合物、組成物及び方法は、酸化窒素放出の空間的及び時間的制御を可能にし、それにより、バイオフィルムを含む、又はバイオフィルムを形成し得る所望の部位への、酸化窒素発生剤又は放出剤の標的化送達又は投与、及び特定の用途に適切な反応速度論での酸化窒素の放出を容易にする。
【０１４４】
当業者であれば、本開示の実施形態は、単一種又は混合種バイオフィルムに適用可能であることが分かるであろう。本発明が関係する細菌種は、バイオフィルムを形成するか又はバイオフィルムに寄与することができ、β-ラクタマーゼを産生するか又は産生するように誘導され得る任意の種であってよい。種は、緑膿菌等のシュードモナス属種、シュードアルテロモナス・チュニカータ(P. tunicata)等のシュードアルテロモナス属種(Pseudoalteromonas spp.)、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌属種、連鎖球菌属種、大腸菌等のエシェリキア属種、赤痢菌属種、マイコバクテリウム属種、エンテロコッカス属種、サルモネラ属種、レジオネラ属種、ヘモフィラス属種、バチルス属種、デスルフォビブリオ属種、シュワネラ属種、ジオバクター属種、クレブシエラ・ニューモニエ(K. pneumoniae)等のクレブシエラ属種、プロテウス・ミラビリス等のプロテウス属種、霊菌等のセラチア属種、ポルフィロモナス(Porhyromonas)属種、フソバクテリウム属種、プロテウス属種、アエロモナス属種、アルスロバクター属種、マイクロコッカス属種、並びにバークホルデリア属種を含み得るがこれらに限定されない。代替として、当業者であれば、本発明のいくつかの用途において、処理されるバイオフィルムの混合群落における特定の種の同定が未決定であり、本発明の適用性には重大でないことが分かるであろう。
【０１４５】
本明細書において開示されている実施形態によれば、式(I)の化合物は、典型的には、低い非毒性濃度の酸化窒素がバイオフィルム又はバイオフィルム形成微生物付近で放出されるような量で使用される。濃度は、ナノモル濃度、マイクロモル濃度又はミリモル濃度範囲であってよい。特定の実施形態において、濃度は、約1nMから約100mMの間、約10nMから約50mMの間、約25nMから約50mMの間、約50nMから約25mMの間、約100nMから約10mMの間、約200nMから約1mMの間、約500nMから500μMの間、約500nMから100μMの間、又は約1μMから約50μMの間であってよい。所望の効果を達成するために最も好適な濃度は、いくつかの要因によって決まることになり、日常実験を使用して当業者によって決定され得る。そのような要因は、酸化窒素放出に使用される特定の化合物、化合物の投与の手段又は経路、バイオフィルムの性質、構造及び年数、処理される微生物の種等を含むがこれらに限定されない。
【０１４６】
本開示の化合物、組成物及び方法を、少なくとも一つの追加の抗生物質又は抗菌剤と組み合わせて用いてよい。以上に記述した通り、本開示の化合物は、R2及び/又はR3置換基と連結している抗生物質を組み込んでよい。その代わりに、又はそれに加えて、本開示の化合物は、同時に又は順次にのいずれかで、1以上の抗生物質又は抗菌剤と併せて投与又は送達され得る。順次適用では、抗生物質又は抗菌剤は、本開示の化合物と同じ組成物中に配合され得る。ほんの一例として、好適な抗生物質は、β-ラクタム、モノペネム、カルボキシペネム、アミノグリコシド、キノロン、マクロライド、リンコザミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、グリコペプチド、リファマイシン(rifamicins)、スルホンアミド  クロラムフェニコール、ナリジクス酸、アゾール含有化合物及びペプチド抗生物質を含むがこれらに限定されない。例示的な抗生物質は、セフタジジム及びテトラサイクリンを含む。好適な抗菌剤は、洗剤、界面活性剤、酸化的ストレスを誘導する作用物質、バクテリオシン及び抗菌性酵素、ペプチド並びにファージを含むがこれらに限定されない。抗菌性酵素は、リパーゼ、プロナーゼ、リアーゼ(例えばアルギン酸リアーゼ)並びに種々の他のタンパク質分解酵素及びヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない。抗生物質及び抗菌剤は、天然であっても合成であってもよい。用いられる抗生物質又は抗菌剤は、個々の場合に応じて本発明の特定の用途のために選択され得、当業者であれば、本発明の範囲は特定の抗菌剤の性質又は同定によって限定されるものではないことが分かるであろう。
【０１４７】
本明細書において開示されている化合物、組成物及び方法は、幅広い環境及び状況において用途を見出している。下記は、いくつかの一般的な領域の用途の簡潔な解説である。しかしながら、当業者であれば、バイオフィルム発達が問題となる、又は微生物増殖を阻害することが望ましい任意の環境又は状況が潜在的に好適となることが容易に分かるであろう。
【０１４８】
本開示の化合物、組成物及び方法は、感染性疾患の、並びにバイオフィルム及びバイオフィルム形成微生物に関連する、それらを特徴とする又はそれらによって引き起こされる疾患及び障害の、治療、予防及び継続的管理において特定の用途を見出している。例えば、嚢胞性線維症、中耳炎、細菌性心内膜炎、腎臓結石、在郷軍人病、尿路感染症、肺感染症、歯垢、虫歯、及び外科的処置又は熱傷に関連する感染症等、バイオフィルム形成に関連する様々な細菌感染症を、本発明の方法及び組成物で治療することができる。したがって、本発明の組成物は、医薬組成物として製剤化されてもよいし、例えば、包帯、洗口剤、練り歯磨き又は生理食塩溶液の成分を形成してもよい。
【０１４９】
本開示の化合物及び組成物は、医薬、化粧料、皮膚科又は局所送達組成物に、不要な微生物の増殖及び/又はコロニー形成を阻害する又は防止するための保存剤として含まれてよい。したがって、本発明の組成物は、腐敗を防止するために、それ故、それらが添加される任意の種類の医薬、化粧料、皮膚科又は局所送達組成物の使用可能時間を増大させるために有用である。本開示の化合物又は組成物は、好都合なことに、その製造中、或いは製造後に、任意の固体又は液体の医薬、化粧料、皮膚科又は局所送達組成物に含まれ得る。用語「化粧料組成物」は、例えば、体を保護すること、香りをつけること、清潔にすること、維持すること(すなわち、潤いを与えること(mositurising)又は剥離すること)、美化すること、その外観を改変すること、又はその匂いを改変することを目的として、口腔の粘膜、歯、毛髪及び爪を含む、動物の体の任意の外側部分と接触して配置することが意図されている組成物を意味すると理解される。化粧料組成物の例は、ネイルケア製品、メイクアップ、唇への塗布が意図されている製品、フェイスマスク及びスクラブ、ヘアティント、染料及びブリーチ剤、毛髪にウェーブをかける、真っすぐにする及び整えるための製品、ローション、パウダー及びシャンプー等のクレンジング製品、ローション、クリーム、オイル等のコンディショニング製品、ローション及びラッカー等の整髪製品、練り歯磨き、洗口剤、舌洗浄剤、歯のブリーチ剤/漂白剤及び入れ歯洗浄剤を含む歯及び口のケアのための製品、香水、化粧水、オーデコロン、女性の生理用品、消臭剤、制汗剤、化粧せっけん、消臭せっけん、収斂剤及び皮膚洗浄液等の洗浄剤、クリーム、フォーム及びローション等のひげそり用製品、塩、フォーム、オイル、ジェル等の入浴及びシャワー用調製物、除毛剤、アフターバスパウダー、ハイジェニックパウダー、クリーム、ローション、ジェル及びフォーム等の保湿製品、日光浴製品(SPFなし又はSPF4未満)、抗シワ製品(SPFなし)並びに抗老化製品(SPFなし)を含むがこれらに限定されない。
【０１５０】
本開示の化合物、組成物及び方法は、医療及び手術用機器、並びに種々のカテーテル、ドレナージカテーテル(例えば尿道カテーテル)、ステント、ペースメーカー、コンタクトレンズ、補聴器、経皮グルコースセンサー、透析機器、薬ポンプに関係する送達カニューレ、人工関節、心臓、心臓弁又は他の臓器等の装具、医療固定デバイス(例えば、ロッド、スクリュー、ピン、プレート等)を含むがこれらに限定されない埋め込み型医療デバイスを含む、医療デバイスをコーティングする際にも使用され得る。さらに、本開示の実施形態は、例えば、化合物及びそれを含む組成物が、縫合糸及び絆創膏等の創傷包帯に含浸又はコーティングされ得るように、創傷修復における用途を見出している。
【０１５１】
本開示の化合物、組成物及び方法は、水道用貯水池及び送給パイプ、排水パイプ(家庭又は工業規模)、例えば、冷却塔、水処理工場、乳加工工場、食品加工工場、化学製造工場、医薬品又は生物医薬品製造工場の加工設備、油送管及び製油所設備、並びにパルプ及び製紙工場を含むがこれらに限定されない広範な工業及び家庭用途においても用途を見出している。他の適した環境及び状況は、例えば、船体、水産養殖設備、漁網又は他の水中構造物を処理する際における海洋防汚塗料又はコーティングとしてのものを含む。
【０１５２】
本開示による組成物は、任意の好適な形態であってよい。典型的には、形態は、必要とされている部位への投与又は送達に最も好適であるものによって決まり、故に、異なる医療、工業及び家庭用途によって変動することになる。例えば、組成物は、液体、懸濁剤、鼻腔用スプレー、点眼剤、散剤、錠剤、カプセル剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤又はローション剤の形態等で、インビボ投与用に製剤化され得る。工業及び家庭用途では、組成物は、塗料、ワックス、他のコーティング、エマルション、液剤、ゲル、懸濁剤、ビーズ、パウダー、顆粒、ペレット、フレーク又はスプレーとして配合され得る。当業者であれば、適切な製剤は特定の用途及び提案されている送達経路によって決まることも認識するであろう。インビボ適用に好適な投与経路は、例えば、経口、経鼻、非経口(例えば、静脈内、局所、動脈内、筋肉内、眼内)、経皮及び皮下投与を含む。
【０１５３】
本発明の組成物は、典型的には、担体、希釈剤又は賦形剤も含む。好適な担体、希釈剤及び賦形剤は、当業者に公知である。希釈剤、アジュバント及び賦形剤は、組成物の他の有効成分に適合するという観点から「許容される」ものでなくてはならず、医薬組成物の事例においては、そのレシピエントに無害でなくてはならない。担体は液体であっても固体であってもよい。液体担体の事例において、液体は水性又は非水性溶媒であってよい。
【０１５４】
本開示の化合物自体によって提供される酸化窒素の制御放出に加えて、さらなるレベルの制御放出が望ましい場合があり、組成物への化合物の配合によって付与され得る。薬学的用途では、いくつかの好適な制御放出システムが当技術分野において公知である。例えば、リザーバー及びマトリックスデバイスの形態のポリマー性コロイド状粒子又はマイクロカプセル(微粒子、ミクロスフェア又はナノ粒子)を用いてよく、或いは作用物質は、多孔質デバイス、又は薬物放出が浸透圧的に「制御」され得るデバイス(リザーバー及びマトリックスデバイス両方)を得るために、親水性及び/又は浸出可能な添加物、例えば、第二のポリマー、界面活性剤又は可塑剤等を含有するポリマーによって含有されていてよい。C60バックミンスターフラーレン(「バッキーボール」)又は超分岐(スターバースト)デンドリマー等の大型のかご状分子を使用してもよい。
【０１５５】
典型的には、防汚及び他の工業用途では、例えば塗料又は他の表面コーティングの形態の組成物は、活性剤の制御放出を時間的に且つ/又は空間的に可能にする担体を用いる。生物活性剤の制御放出を達成するための様々な方法が当業者に公知であり、例えば、好適なポリマー又はポリマーベースの製品への活性剤の封入を含み得る。ポリマーは、有機又は無機ポリマー、例えば、ポリオレフィン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン又はポリペプチドであってよい。制御放出を提供するための好適なポリマーは当業者に公知であり、例えば米国特許第6,610,282号において開示されている通りであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
典型的には、物質の放出速度は、ポリマー自体の特性及び環境要因(pH、温度等)によって決定される。制御放出システムは、物質を最大で数年にわたってゆっくり且つ連続的に送達することができる。当業者であれば、いくつかの制御放出システムが本発明による作用物質を送達するのに適用可能であることが分かるであろう。ほんの一例として、放出は、拡散制御、化学的制御又は溶媒活性化されたものであってよい。
【０１５７】
拡散制御システムにおいて、ポリマーマトリックス内に捕捉された作用物質の拡散は、全体の放出速度のための速度決定要因である。拡散制御システムの一種は、作用物質が不活性拡散障壁によって取り囲まれたコアを形成するリザーバーデバイスを用いる。これらのシステムは、膜、カプセル、マイクロカプセル、リポソーム及び中空糸を含む。代替として、デバイスは、活性剤が不活性ポリマーに分散又は溶解されているモノリシックデバイスであってよい。ポリマーマトリックスを通しての拡散は律速ステップであり、放出速度は、部分的には、ポリマーの選択、並びに放出される作用物質の拡散及び分配係数に対するその結果として生じる効果によって決定される。
【０１５８】
典型的な化学的制御システムにおいて、ポリマーは経時的に分解し、作用物質を漸進的な浸食に比例する量で放出する。化学的制御は、生体内分解性又はペンダント鎖を使用して達成され得る。生体内分解性システムにおいて、作用物質は、理想的には、モノリシック拡散システムと同じ手法でポリマー全体を通して均一に分配される。作用物質を取り囲んでいるポリマーが浸食されると、作用物質が離脱する。ペンダント鎖システムにおいて、作用物質は、ポリマーと共有結合し、水又は酵素による結合切断によって放出される。
【０１５９】
典型的な溶媒活性化制御システムにおいて、活性剤はポリマー性マトリックス内で溶解又は分散され、そのマトリックスを通して拡散することができない。浸透圧は、作用物質の放出のための駆動力として使用される。一種の溶媒制御システムにおいて、環境流体(例えば水)がマトリックスに浸透すると、ポリマー(例えばヒドロゲル)が膨張し、そのガラス転移温度が環境(宿主)温度未満に低下する。故に、膨張したポリマーはゴム状態であり、中に含有される薬物が封入材を通して拡散することを可能にする。
【０１６０】
生物活性剤とポリマーとの化学結合は、予め形成されたポリマーに対する反応;天然に存在するポリマーに対する反応;活性成分を含有するビニルモノマーの重合;及び逐次重合を含む、当業者に周知である異なる合成方法をベースとする数種の一般的な手法で遂行され得る。生物活性剤がポリマーと化学的に結合している場合、該結合は、化学反応-典型的には、酵素、加水分解、熱又は光化学反応によって開裂されなくてはならない。不安定な骨格の性質、スペーサー基の長さ、分子量、親水性、隣接基の影響、環境要因、並びに物理的形態及び寸法を含む様々な化学的及び物理的変数が、結合開裂及びその後のポリマーからの化学的に結合した材料の放出の速度に影響を及ぼし得る。
【０１６１】
防汚用途では、自己研磨防汚コーティングが当技術分野において公知である。そのようなコーティングは、典型的には、メタクリル酸トリブチルスズ、メタクリル酸メチルのポリマー、及びアクリル酸2-エチルヘキシル等のフィルム軟化モノマーをベースとするものである。有機スズポリマーは、典型的には、塗料結合剤として作用する。そのような塗料は、酸化第一銅又はトリ有機スズ化合物等の毒性添加物も含有し得る。加えて、顔料、チキソトロピック剤等の通常の塗料添加物が存在してもよい。通常アルカリ性の海水中では、ポリマー性有機スズ結合剤は次第に加水分解され、トリブチルスズは活性防汚剤である形態で遊離される。形成された加水分解ポリマーは水溶性又は水膨潤性であり、海水を移動させて塗料の新たな表面を露出させることによって表面から簡単に浸食される。
【０１６２】
当業者であれば、上述した送達システム及び方法が本発明において用いられ得る好適な方法及びシステムの例にすぎないことが容易に分かるであろう。任意の他の好適な担体及び送達システムを用いて、本発明の実施形態による作用物質の所望の適用手段を達成することができる。
【０１６３】
薬学的に許容される希釈剤の例は、脱塩又は蒸留水;生理食塩溶液;ピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油等の植物ベースの油、例えばピーナッツ油、サフラワー油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、ラッカセイ油又はココナッツ油;メチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリソルポキサン(polysolpoxane)等のポリシロキサンを含むシリコーン油;揮発性シリコーン;流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアラン等の鉱油;メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体;低級アルカノール、例えばエタノール又はイソ-プロパノール;低級アラルカノール(aralkanols);低級ポリアルキレングリコール又は低級アルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール又はグリセリン;パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル等の脂肪酸エステル;ポリビニルピリドン;寒天;カラギーナン;トラガカントゴム又はアカシアゴム、及びワセリンである。典型的には、担体(1以上)は、組成物の1から99.9重量%までを形成することになる。
【０１６４】
薬学的用途では、組成物は、任意の経路、例えば経口、局所、腔内、膀胱内、筋肉内、動脈内、静脈内又は皮下経路による送達のために製剤化され得る。
【０１６５】
当業者であれば、本明細書において記述されている態様及び実施形態は、具体的に記述されているもの以外の変形及び改変を受けることができることが分かるであろう。本開示は、そのような変形及び改変のすべてを含むことを理解されたい。本開示は、本明細書において個々に又はまとめて言及又は示されているステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びに前記ステップ又は特徴の任意の二つ以上のありとあらゆる組合せも含む。
【０１６６】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本願の「先行技術」として利用可能であることの認可として解釈されるべきものではない。さらに、本明細書における任意の先行刊行物(又はそれに由来する情報)、又は公知である任意の事柄への言及は、その先行刊行物(又はそれに由来する情報)又は公知の事柄が、本明細書が関係する試みの分野において共通の一般知識の一部を形成することの承認若しくは認可又は任意の形態の示唆として解釈されず、且つ解釈されるべきものではない。
【０１６７】
下記の非限定的な例を参照して、本開示をさらに記述する。
【実施例】
【０１６８】
[実施例1]
化合物の合成
下記の式(I)の代表的な化合物を合成した:
【化２０】
0005974083.tif 000025
0005974083.tif 000026
【０１６９】
化合物は、スキーム4に従って合成した:
【化２１】
0005974083.tif 000027
【０１７０】
化合物14から25の合成における第一ステップは、以下に示す通りの、適切に官能化されたPMBで保護されたセファロスポリン1、4及び5と、適切に官能化されたジアゼニウムジオレート2及び6から8との反応による、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート3及び9〜13の調製を伴うものであった:
【化２２】
0005974083.tif 000028
【０１７１】
化合物3は、下記の方法を利用して調製した。
【０１７２】
ヨウ化ナトリウム(0.912g、6.08mmol)を、N2下、無水アセトン(25mL)中のPMBで保護されたセファロスポリンエステル1(3.00g、6.08mmol)の懸濁液に添加し、混合物を、暗所、室温で1時間撹拌した。次いで、ナトリウム(Z)-1-(N,N-ジエチルアミノ)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート2(0.944g、6.08mmol)を一度に添加し、混合物を室温でさらに1.5時間撹拌した(TLC分析;石油精:EtOAc 7:3)。溶媒を減圧下で除去し、残留物をCH2Cl2(75mL)で希釈し、10%チオ硫酸ナトリウム水溶液(2×40mL)及び水(1×40mL)で洗浄した。有機画分を無水MgSO4で乾燥させ、真空濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油精:EtOAc、7:3)によって精製し、EtOH又はMeOHから再結晶させて、3(3.04g、85%)を淡黄色粉末として得た。1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.32(d, 2H, J=8.5Hz), 7.26(d, 1H, J=5Hz), 7.00-6.96(m, 2H), 6.89(d, 2H, J=8.5Hz), 6.34(d, 1H, J=9Hz), 5.81(dd, 1H, J=10, 4.5Hz), 5.34及び4.99(ABq, 2H, J=14.5Hz), 5.18(s, 2H), 4.90(d, 1H, J=5Hz), 3.84(s, 2H), 3.80(s, 3H), 3.52及び3.44(ABq, 2H, J=18.5Hz), 3.11(q, 4H, J=7.5Hz), 1.05(t, 6H, J=7.5Hz). 13C NMR(500MHz, CDCl3): δ 169.8, 164.4, 161.2, 159.9, 134.6, 130.6, 127.8, 127.5, 126.6, 126.4, 126.0, 125.4, 113.9, 71.9, 68.1, 59.2, 57.4, 55.2, 48.3, 37.1, 25.9 11.5. FTIR(cm-1, neat): 3275, 1754, 1706, 1648, 1517, 1362, 1248, 1177, 1096, 1027, 822. M.P 166℃. [α]D(c=1.0, CHCl3)=+39.0. ESI-HRMS(m/z) 計算値: 588.1592 [M-H]- C26H30N5O7S2-, 実測値: 588.1550.
化合物9から13は、この同じ方法を使用して、適切に官能化されたPMBで保護されたセファロスポリン及びジアゼニウムジオレートを選択することにより、調製した。化合物9から13についての分光分析データを以下に提示する。
【０１７３】
化合物9
1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.36-7.24(m, 7H), 6.88(d, 2H, J=9Hz), 6.08(d, 1H, J=10Hz), 5.81(dd, 1H, J=10, 4.5Hz), 5.33及び4.98(ABq, 2H, J=14Hz), 5.17(s, 2H), 4.88(d, 1H, J=5Hz), 3.79(s, 3H), 3.67及び3.62(ABq, 2H, J=9Hz), 3.44及び3.42(ABq, 2H, J=18Hz), 3.10(q, 4H, J=7Hz), 1.05(m, 6H, J=7Hz). 13C NMR(500MHz, CDCl3): 171.1, 164.6, 161.2, 159.9, 133.6, 130.7, 129.4, 129.2, 127.8, 126.7, 126.4, 125.5, 114.0, 72.0, 68.1, 59.2, 57.5, 55.2, 48.4, 43.3, 26.0, 11.5. FTIR(cm-1, neat): 3284, 1778, 1726, 1660, 1519, 1352, 1228, 1187, 1030, 982, 818, 716, 699, 679. M.P 126-128℃, [α]D(c=1.0, CH2Cl2)=+76.9, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 584.2179 [M+H]+ C28H34N5O7S, 実測値: 584.2205.
化合物10
1H NMR(500MHz, CD3OCD3): δ 8.90(s, 1H), 8.26(d, 1H, J=6Hz), 7.30(d, 2H, J=8.5Hz), 6.86(d, 2H, J=8.5Hz), 5.78(q, 1H, J=5Hz), 5.32及び5.27(ABq, 2H, J=16.5Hz), 5.18(s, 2H), 5.17及び5.02(ABq, 2H, J=13Hz), 4.95(d, 1H, J=5Hz), 3.78(s, 3H), 3.56及び3.51(ABq, 2H, J=19Hz), 3.14(q, 4H, J=7Hz), 1.05(t, 6H, J=7Hz). 13C NMR(125MHz, CD3OD): δ 166.3, 164.4, 161.5, 160.2, 144.5, 130.0, 126.8, 126.6, 126.3, 114.2, 72.1, 68.5, 59.7, 57.5, 55.5, 50.1, 48.4, 26.5, 11.7. FTIR(cm-1, neat): 3290, 3137, 2973, 2902, 1771, 1702, 1662, 1556, 1378, 1233, 1170, 1094, 1049, 801. M.P 171℃, [α]D(c=1.0, アセトン)=-51.9, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 574.1838 [M-H]- C23H28N9O7S-, 実測値: 574.1830.
化合物11
1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.36(m, 2H), 7.32(d, 2H, J=8.5Hz), 7.26(m, 3H), 6.88(d, 1H, J=8.5Hz), 6.05(d, 1H, J=9Hz), 5.82及び5.80(dd, 1H, J=4.5, 5Hz), 5.21-5.15(m, 3H), 4.91(d, 1H, J=4.4Hz), 4.87(d, 1H, J=13.5Hz), 3.80(s, 3H), 3.68及び3.62(ABq, 2H, J=16Hz), 3.52及び3.43(ABq, 2H, J=18.5Hz), 3.46(t, 4H, J=7Hz), 1.91(t, 4H, J=7Hz). 13C NMR(125MHz, CDCl3): 171.0, 164.7, 161.3, 159.9, 133.5, 130.6, 129.4, 129.2, 127.8, 126.8, 126.7, 125.3, 114.0, 71.4, 68.0, 59.1, 57.4, 55.2, 50.7, 43.3, 26.1, 22.8. FTIR(cm-1, neat): 3265, 2965, 2162, 2030, 1756, 1714, 1652, 1612, 1536, 1486, 1446, 1392, 1266, 1244, 1217, 1180, 1013, 986. M.P 157℃. [α]D(c=1.0, MeOH)=+20.6. ESI-HRMS(m/z) 計算値: 580.1871 [M-H]- C28H30N5O7S-, 実測値: 580.1895.
化合物12
1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 8.33(d, 2H, J=4.5Hz), 7.39-7.26(m, 5H), 7.32(d, 2H, J=7.5Hz), 6.88(d, 2H, J=7.5Hz), 6.56(t, 1H, J=2Hz), 6.18(d, 1H, J=9Hz), 5.82(q, 1H, J=5Hz), 5.24及び4.95(ABq, 2H, J=13.5Hz), 5.18(d, 2H, J=2.5Hz), 4.91(d, 1H, J=4.5Hz), 3.98(t, 4H, J=4.5Hz), 3.78(s, 3H), 3.66及び3.61(ABq, 2H, J=16Hz), 3.53及び3.40(ABq, 2H, J=18.5Hz), 3.41(t, 4H, J=4.5Hz). 13C NMR(500MHz, CDCl3): δ 171.0, 164.7, 161.3, 159.9, 157.8, 133.6, 130.7, 129.4, 129.2, 127.7, 126.6, 125.8, 125.7, 113.9, 110.7, 71.8, 68.1, 59.2, 57.4, 55.2, 50.9, 43.3, 42.3, 26.1. FTIR(cm-1, neat): 3286, 3137, 2976, 2908, 2904, 1772, 1702, 1662, 1557, 1411, 1377, 1232, 1049. [α]D(c=1.0, MeOH)=+39.5. ESI-HRMS(m/z) 計算値: 675.2344 [M+H]+ C32H35N8O7S+, 実測値: 675.2373. M.P 136℃.
化合物13
1H NMR(500MHz, CDCl3): δ 7.36-7.24(m, 6H), 6.93-6.91(m, 2H), 6.88(d, 2H, J=9Hz), 6.16(m, 1H), 5.81(q, 1H, J=5Hz), 5.24(d, 1H, J=2.5Hz), 5.21(s, 2H), 5.17及び4.96(ABq, 2H, J=12Hz), 4.91(d, 2H, J=2.5Hz), 3.78(s, 3H), 3.67及び3.58(ABq, 2H, J=16Hz), 3.53及び3.40(ABq, 2H, J=18.5Hz), 3.51(m, 4H), 3.29(m, 4H). 13C NMR(125MHz, CDCl3): δ 171.3, 164.9, 161.5, 160.2, 150.4, 133.8, 130.9, 129.6, 129.5, 129.4, 127.9, 126.9, 126.0, 121.0, 116.8, 114.2, 72.0, 68.4, 59.4, 57.7, 55.4, 51.1, 48.4, 43.5, 26.1. FTIR(cm-1, neat): 3389, 3286, 3197, 3030, 2897, 1756, 1647, 1607, 1546, 1492, 1448, 1384, 1351, 1224, 1004. [α]D(c=1.0, MeOH)=+54.3, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 673.2439 [M+H]+ C34H37N6O7S+, 実測値: 673.2409. M.P 106℃.
次いで、未希釈のトリフルオロ酢酸を使用して、PMBで保護されたセファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート(3及び9から13)を脱保護して、遊離カルボン酸を得た。
【化２３】
0005974083.tif 000029
【０１７４】
化合物14は、下記の方法を利用して調製した。
【０１７５】
PMBで保護されたセファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート3(1.00g、1.69mmol)及び無水アニソール(0.55g、5.09mmol)を、トリフルオロ酢酸(4.0mL)とともに0℃で30分間撹拌し、その後、混合物をクラッシュアイス(約100g)上にゆっくり注いだ。溶融したら、水性混合物をCH2Cl2(3×70mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を無水MgSO4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(EtOAc:MeOH:H2O、85:15:0.5)によって精製して、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート遊離酸14(0.285g、36%)を淡黄色粉末として提供した。1H NMR(500MHz, CD3OD): δ 7.26(s, 1H, J=1Hz), 6.96-6.92(m, 2H), 5.73(d, 1H, J=5,Hz), 5.29及び5.07(ABq, 2H, J=12.9Hz), 5.05(d, 1H, J=4.8Hz), 3.83及び3.79(ABq, 2H, J=15Hz), 3.62及び3.53(ABq, 2H, J=18Hz), 3.16(q, 4H, J=7.0Hz), 1.04(t, 6H, J=7.0Hz). 13C NMR(500MHz, CD3OD): δ 173.3, 166.1, 164.5, 137.4, 130.2, 128.4, 127.7, 126.9, 125.8, 73.0, 60.8, 59.0, 49.0, 37.1, 27.1, 11.7. FTIR(cm-1, neat): 3275, 2156, 1754, 1661, 1656, 1522, 1320, 1235, 1065, 995. M.P 87℃, [α]D(c=1.0, MeOH)=+84.4, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 468.1017 [M-H]- C18H22N5O6S2-, 実測値: 468.0996.
化合物15から19は、この同じ方法を使用して調製した。化合物15から19についての分光分析データを以下に提示する。
【０１７６】
化合物15
1H NMR(500MHz, CD3OD): δ 7.35-7.26(m, 5H), 5.75(d, 1H, J=4.8,Hz), 5.36及び5.07(ABq, 2H, J=12.9Hz), 5.05(d, 1H, J=4.8Hz), 5.03(m, 1H), 3.68-3.45(m, 4H), 3.19(q, 4H, J=7.0Hz), 1.07(t, 6H, J=7.0Hz). 13C NMR(500MHz, CD3OD): δ 175.4, 167.3, 166.6, 137.2, 132.1, 131.0, 130.4, 128.8, 123.0, 74.6, 61.5, 59.8, 50.1, 44.0, 27.7, 12.6. FTIR(cm-1, neat): 3287, 1780, 1663, 1505, 1337, 1223, 998, 618. M.P 84-86℃, [α]D(c=1.0, CH2Cl2)=+19.4, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 462.1453(C20H24N5O6S) [M-H]-, 実測値: 462.1465.
化合物16
1H NMR(300MHz, CD3OCD3): δ 9.40(d, 1H, J=6Hz), 9.11(s, 1H), 5.72(d, 2H, J=8Hz), 5.29(s, 2H), 5.22及び4.99(ABq, 2H, J=22Hz), 5.01(s, 1H), 3.52及び3.49(ABq, 2H, J=19Hz), 3.10(q, 4H, J=7Hz), 0.95(t, 6H, J=7Hz). 13C NMR(125MHz, CD3OD): δ 167.4, 165.8, 164.4, 146.0, 128.1, 127.5, 72.9, 60.6, 58.7, 50.3, 49.3, 27.1, 11.7. FTIR(cm-1, neat): 3282, 3136, 2975, 2875, 1773, 1703, 1662, 1559, 1414, 1227, 1170, 1026, 800. M.P 156℃. [α]D(c=1.0, MeOH)=+117.3, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 454.1263 [M-H]- C15H20N9O6S-, 実測値: 454.1266.
化合物17
1H NMR(500MHz, CD3OD): δ 7.30-7.22(m, 5H), 5.72(d, 1H, J=7.5Hz), 5.23及び4.97(ABq, 2H, J=22.5Hz), 5.07(d, 1H, J=8Hz), 3.64-3.50(m, 4H), 3.50(t, 4H, J=7Hz), 1.93(t, 4H, J=7Hz). 13C NMR(125MHz, CDCl3): 174.5, 166.2, 164.5, 136.4, 130.4, 129.5, 127.9, 127.6, 72.5, 60.7, 59.1, 51.5, 43.1, 27.2, 23.7. FTIR(cm-1, neat): 3296, 1756, 1729, 1642, 1530, 1469, 1429, 1388, 1318, 1141, 1028, 944. [α]D(c=1.0, MeOH)=122.8, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 484.1261 [M+Na]+ C20H23N5NaO6S+, 実測値: 484.1281. M.P 146℃.
化合物18
1H NMR(300MHz, CD3OCD3): δ 8.37(s, 2H), 7.34-7.23(m, 5H), 6.65(s, 1H), 5.84(s, 1H), 5.24及び4.97(ABq, 2H, J=7.8Hz), 5.14(s, 1H), 3.97(s, 4H), 3.69-3.41(m, 4H), 3.46(s, 4H). 13C NMR(75MHz, CDCl3): 172.1, 166.4, 164.0, 163.0, 159.5, 137.5, 130.9, 129.9, 128.0, 126.7, 111.9, 72.8, 61.5, 58.2, 52.0, 43.3, 42.3, 26.1. FTIR(cm-1, neat): 3286, 3137, 2976, 2908, 2904, 1772, 1702, 1662, 1557, 1411, 1232, 1049. [α]D(c=1.0, MeOH)=+36.6, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 555.1769 [M+H]+ C24H27N8O6S+, 実測値: 555.1799. M.P 116℃.
化合物19
1H NMR(500MHz, CD3COCD3): δ 8.05(d, 1H, J=8.5Hz), 7.36-7.23(m, 8H), 7.02(d, 2H, J=7.5Hz), 6.84(t, 1H, J=7.5), 5.85(q, 1H, J=5Hz), 5.25及び5.01(ABq, 2H, J=13.5Hz), 5.14(d, 1H, J=4.5Hz), 3.70及び3.58(m, 4H), 3.55(m, 4H), 3.35(m, 4H). 13C NMR(500MHz, CD3COCD3): 171.6, 165.8, 163.1, 151.5, 136.5, 130.0, 129.8, 129.1, 127.4, 125.9, 120.7, 117.2, 72.2, 60.3, 58.5, 51.6, 48.7, 42.9, 26.7. FTIR(cm-1, neat): 3397, 3286, 3197, 3028, 2897, 1755, 1647, 1607, 1548, 1492, 1448, 1383, 1351, 1225, 1004, 985. [α]D(c=1.0, MeOH)=+57.7 ESI-HRMS(m/z) 計算値: 553.1864 [M+H]+ C26H29N6O6S+, 実測値: 553.1847. M.P 96℃.
次いで、化合物14、15、17及び18をそれらのカリウム塩に変換した。化合物20は、下記の方法を利用して調製した。
【０１７７】
セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート遊離酸14(0.20g、0.42mmol)を0℃のH2O(1.0ml)に懸濁し、次いでこれにKOHの氷冷水溶液(100μLのH2O中0.023g、0.42mmol)を添加した。淡黄色溶液が迅速に形成され、撹拌を0℃でさらに20分間続けた。水溶液をCH2Cl2(2×2mL)で洗浄し、次いで冷凍及び凍結乾燥して、カリウムセファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートカルボン酸塩20(0.21g、99%)を淡黄色粉末として提供した。1H NMR(300MHz, D2O): δ 7.21(d, 1H, J=10Hz), 6.89-6.88(s, 2H), 5.49(d, 1H, J=4.5,Hz), 5.08及び4.85(ABq, 2H, J=12.6Hz), 4.96(d, 1H, J=4.8Hz), 3.81及び3.74(ABq, 2H, J=15Hz), 3.46及び3.25(ABq, 2H, J=18Hz), 2.96(q, 4H, J=7.0Hz), 0.85(t, 6H, J=7.0Hz). 13C NMR(125MHz, D2O): δ 174.4, 168.3, 164.7, 135.8, 132.9, 127.6, 127.5, 125.9, 115.4, 73.9, 59.4, 57.7, 49.0, 36.2, 25.5, 10.7. FTIR(cm-1, neat): 3395, 3326, 3210, 2883, 2816, 1600, 1369, 1233, 1034. [α]D(c=1.0, MeOH)=+90.9, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 508.0721 [M+H]+ C18H23N5O6S2K+, 実測値: 508.0742.
化合物21、23及び24は、この同じ方法を使用して調製した。化合物21、23及び24についての分光分析データを以下に提示する。
【０１７８】
化合物21
1H NMR(500MHz, CD3OD): δ 7.30-7.20(m, 5H,), 5.65(d, 1H, J=4.8,Hz), 5.35及び4.85(ABq, 2H, J=12.0Hz), 4.98(d, 1H, J=4.8,Hz), 3.60及び3.55(ABq, 2H, J=14Hz), 3.57及び3.37(ABq, 2H, J=18Hz), 3.15(q, 4H, J=7.0Hz), 1.04(t, 6H, J=7.0Hz). 13C NMR(500MHz, CD3OD): δ 174.6, 168.7, 165.3, 136.5, 134.5, 130.2, 129.6, 128.0, 116.9, 74.7, 60.4, 58.9, 49.4, 43.1, 26.8, 11.8. IR(cm-1, neat): 3395, 1765, 1609, 1495, 1345, 1248, 997, 679. M.P 35-37℃. [α]D(c=1.0, CH2Cl2)=+ 19.0, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 502.1157 C20H25KN5O6S  [M+H]+, 実測値: 502.1163.
化合物23
1H NMR(500MHz, D2O): δ 7.35-7.2(m, 5H), 5.53(d, 1H, J=4Hz), 5.05及び4.72(ABq, 2H, J=12Hz), 4.99(d, 1H, J=4Hz), 3.62-3.58(m, 2H), 3.50及び3.30(ABq, 2H, J=13Hz), 3.4(m, 4H), 1.82(m, 4H). 13C NMR(125MHz, D2O): δ 175.5, 168.4, 164.9, 135.0, 132.3, 129.3, 129.1, 127.9, 116.5, 72.9, 59.2, 58.0, 51.6, 42.3, 25.8, 22.5. FTIR(cm-1, neat): 3399, 3283, 3194, 2976, 2980, 2897, 1758, 1648, 1609, 1542, 1492, 1451, 1386, 1351, 1224, 1001. [α]D(c=1.0, MeOH)=-390.3. ESI-HRMS(m/z) 計算値: 500.1001 [M+H]+ C20H23KN5O6S+, 実測値: 500.1015.
化合物24
1H NMR(300MHz, CD3OD): δ 8.33(s, 2H), 7.39-7.26(m, 5H), 7.32(d, 1H, J=7.5Hz), 6.56(t, 1H, J=2Hz), 5.63(d, 1H, J=5Hz), 5.24及び4.95(ABq, 2H, J=13.5Hz), 5.18(d, 2H, J=2.5Hz), 4.91(d, 1H, J=4.5Hz), 3.98(m, 4H, J=4.5Hz), 3.66及び3.61(ABq, 2H, J=16Hz), 3.53及び3.40(ABq, 2H, J=18.5Hz), 3.41(t, 4H, J=4.5Hz). 13C NMR(125MHz, CD3OD): 171.0, 164.7, 161.3, 159.9, 157.8, 133.6, 130.7, 129.4, 129.2, 127.7, 126.6, 125.8, 125.7, 113.9, 110.7, 71.8, 68.1, 59.2, 57.4, 55.2, 50.9, 43.3, 42.3, 26.1. FTIR(cm-1, neat): 3394, 3282, 3190, 3034, 2980, 2894, 1756, 1645, 1609, 1543, 1492, 1448, 1352, 1224, 994. [α]D(c=1.0, MeOH)=-190.6, ESI-HRMS(m/z) 計算値: 593.1328 [M+H]+ C24H26KN8O6S+, 実測値: 593.1366.
ジアゼニウムジオレート2及び6から8は、文献の手順に従って調製され得る。例として、化合物2は次の通りに調製した。
【化２４】
0005974083.tif 000030
【０１７９】
(参考文献: K. R. A. Abdellatifら/ Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) 6796〜6801)。
【０１８０】
ジエチルアミン(7.3g、0.1mol)を、NaOMeの溶液(0.1mol、24mLのMeOH中25%w/v溶液)及びジエチルエーテル(300mL)に、25℃で撹拌しながら添加した。この混合物を乾燥アルゴンで5分間パージし、次いで反応物を酸化窒素の雰囲気(40psi内圧)下、25℃で5時間撹拌しながら加圧した。微細な白色粉末として沈殿した生成物を、濾過によって単離し、ジエチルエーテル(100mL)に懸濁し、15分間撹拌した。懸濁液を濾過し、収集された固体を、減圧下、25℃で一定重量が取得されるまで乾燥させた。O2-ナトリウム1-(N,N-ジエチルアミノ)ジアゼン-1-イウム-1,2-ジオレート(DEA NONOエート)が微細な白色粉末(4.0g、26%)として生じた。生成物を、琥珀色のボトル内、-20℃、アルゴン雰囲気下で貯蔵し、さらに精製することなく使用した。1H NMR(D2O) δ 1.12(t, J=7.3Hz, 6H, N(CH2CH3)2), 2.93 [q, J=7.3Hz, 4H, N(CH2CH3)2]. m.p. 200-202 0C.
[実施例2]
インビトロ及び緑膿菌抽出物による化合物14から19からの酸化窒素放出
化合物14から19からの酸化窒素放出は、Apollo 4000分析機を用いる酸化窒素特異的プローブISO-NOP(World Precision Instruments)を使用して検出した。酸化窒素プローブは、SNAPの溶液を使用し、メーカーの指示に従って新たに較正し、pH 7.0のトリス緩衝液を含有するバイアル中に浸漬し、室温で連続的に撹拌した。酸化窒素レベルをモニターしながら、種々の試薬を首尾よく添加した。
【０１８１】
図1を参照すると、水性緩衝液(pH7)中、市販のβ-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ、Sigma Aldrich)に暴露した場合、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレート遊離酸14から19のすべてから低μM濃度の酸化窒素が放出されたことが示された。セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートなしで酵素を添加した場合、酸化窒素放出を検出することはできなかった(データは示されていない)。同様に、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートの代わりにセファロチンを単独で(セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートのβ-ラクタム抗生物質骨格に密接に関係する)使用した場合、ペニシリナーゼの存在下でも非存在下でも酸化窒素の放出は観察されなかった(データは示されていない)。
【０１８２】
化合物15の開裂による酸化窒素の放出について、β-ラクタマーゼ産生緑膿菌抽出物をさらに使用して研究した。緑膿菌細胞を、亜阻止(subinhitory)濃度のアンピシリン(50μg/ml)の存在下で増殖させて、β-ラクタマーゼ活性を誘導した。次いで、β-ラクタマーゼ産生緑膿菌細胞を、CelLytic試薬(Sigma)を使用して溶解させ、酸化窒素電極を使用して、酸化窒素生成をモニターしながら細胞抽出物を化合物15の10ml溶液に添加した。図2aは、ペニシリナーゼによって誘発される化合物15からの酸化窒素の放出は、pH5から7の間ではわずかに変動するが、pH9では酸化窒素放出が大幅に低減されることを示す。図2bは、酸化窒素はβ-ラクタマーゼ発現緑膿菌細胞抽出物で処理した後で化合物15から放出されること、及び化合物15からの酸化窒素の小さいが測定可能な放出は非β-ラクタマーゼ発現大腸菌細胞での処理時に起こることを示す。これは、β-ラクタマーゼを発現しないバイオフィルム形成細菌も、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートが、おそらく、殺菌性セファロスポリン系抗生物質の主要な標的であるトランスペプチダーゼとの反応を介して酸化窒素を放出するように誘発することによって分散するように誘導され得ることを示唆している。
【０１８３】
セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートは、より典型的には細胞のペリプラズム空間に局在化されているβ-ラクタマーゼを発現することとは対照的に、標的化されているバイオフィルム細菌が細胞外β-ラクタマーゼを分泌するのであれば、酸化窒素をより良好に放出することが期待され得、このことが、バイオフィルムにおいて酵素を化合物に対して潜在的に近づき難いものにするであろう。図2cは、緑膿菌が、β-ラクタム抗生物質イミペネムで前処理することによって化合物15からの酸化窒素の放出を誘発する細胞外β-ラクタマーゼを発現するように誘導され得ることを示す。同じ細胞外β-ラクタマーゼの誘導は、アンピシリンが発現の誘導に失敗したことによって図2cにおいて証明されている通り、すべてのβ-ラクタム抗生物質で明白なわけではでない。故に、イミペネム前処理は、細胞外β-ラクタマーゼ発現を生じさせ、これがその後、セファロスポリン-3'-ジアゼニウムジオレートからの酸化窒素放出増大につながる。
【０１８４】
[実施例3]
緑膿菌細胞における化合物21からの酸化窒素放出の誘導
緑膿菌の無傷細胞における酸化窒素放出を研究するために、緑膿菌NSGFPレポーター株を使用した(Barraudら、2009)。この株は、酸化窒素誘導的nirS遺伝子が発現されている場合に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する遺伝子レポーター構築物を有する。緑膿菌NSGFP細胞を、亜阻止濃度のアンピシリン(50μg/ml)を加えて又は加えずに増殖させて、β-ラクタマーゼ活性を誘導した。次いで、3ml細菌培養物のアリコートを、化合物21、公知の酸化窒素供与体ニトロプルシドナトリウム(SNP)、セファロチン(Sigma参照番号C4520)又はペニシリナーゼとともに2時間インキュベートした後、NSGFP細胞のGFP蛍光を測定した。
【０１８５】
図3に示す通り、化合物21(150μM)単独では、β-ラクタマーゼ活性の事前活性化あり又はなしで緑膿菌細胞中のSNPによって誘発された応答よりも大きいGFP応答を誘導した。その上、化合物21の開裂及び細菌に対する酸化窒素のアベイラビリティーは、亜阻止濃度のアンピシリンでの処理によって緑膿菌β-ラクタマーゼが誘導された場合に強化された。強化された応答は、アンピシリンの非存在下で増殖させた細胞に化合物21をペニシリナーゼと共投与した場合に観察されたものと同等であった。ペニシリナーゼ単独又はセファロチンからなる制御処理は、NSGFPレポーターアッセイにおいて、GFP蛍光に対して効果を有さなかった。
【０１８６】
[実施例4]
化合物21からの酸化窒素の放出はバイオフィルム分散を誘導する
緑膿菌PAO1野生型ATCC及びMA67株、緑膿菌FRD1、粘液状、嚢胞性線維症(CF)分離株(Ohman及びChakrabarty、1981)、並びにタスマニア州において慢性的に感染した個体のCF喀痰試料から単離した臨床株緑膿菌18A(Kirovら、2007)を、バイオフィルム分散アッセイに使用した。バイオフィルムを、M9最少培地(48mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、9mM NaCl、19mM NH4Cl、pH7.2、2mM MgSO4、20mMグルコース及び100μM CaCl2を含有する)中、24ウェルプレートバッチ培養にて、37℃、200rpmで振とうしながら増殖させた。PAO1野生型バイオフィルムについては6時間のインキュベーション後、又はFRD1及び18Aバイオフィルムについては24時間のインキュベーション後、各ウェルにプレート当たり1分未満で処理物を添加し、プレートを、37℃、200rpmで振とうしながらさらに10分間インキュベートした。浮遊バイオマスを上清のOD600の直接測定によって定量化し、残りのバイオフィルムバイオマスをクリスタルバイオレット染色(O'Toole及びKolter、1998)によって定量化した。
【０１８７】
図4に示す通り、化合物21(「DEA-CP」として表示される)は、緑膿菌の事前準備されたバイオフィルムの分散を誘導する上で強力である。10分間の暴露後、バイオフィルムバイオマスは、CV染色を用いて測定した通り、55%低減されたのに対し、浮遊バイオマスは、上清のOD600nmの測定によって測定した通り、未処理のまま放置した対照と比較して同時に20%増大した(P<0.01、一方向ANOVA及びターキーの多重比較検定)。対照的に、セファロチン単独では、顕著な分散事象を誘導しなかった。
【０１８８】
次いで、化合物21を、緑膿菌PAO1野生型バイオフィルムに対して広範な濃度で試験した。図5に示す通り、化合物21(「DEA-CP」として表示される)は、10〜100μMの範囲内において用量依存様式で分散を誘導する(図5A)。化合物21を、24時間増殖させた緑膿菌CF分離株FRD1及び18Aのバイオフィルムに対しても試験した。100μMの化合物21への10分間にわたる暴露は、CV染色によって測定した通り、FRD1及び18Aバイオフィルムにおいてそれぞれ30%及び35%の分散を誘導した(図5B)。
【０１８９】
化合物21及びその類似体(化合物23)による事前準備された緑膿菌バイオフィルム(上述した実験において使用した株よりも良好なバイオフィルムを形成する株MA67を使用)の分散をさらに評価し、用量依存であることが示された(図6参照)。
【０１９０】
化合物21を用いたさらなる実験は、強化されたバイオフィルム分散が、イミペネムによるバイオフィルムの前処理による細胞外β-ラクタマーゼ発現の誘導後に、緑膿菌において作用することを実証した(図7を参照)。これらの実験において、事前準備された緑膿菌バイオフィルムを、マイクロタイタープレート内、37℃で振とうしながら増殖させ、ペニシリナーゼ(0.1U/mL)の存在下又は非存在下、10μM及び100μMの化合物21で15分間処理した、或いは未処理のまま放置した。0.5μg/mLのイミペネムで1時間予め処理して細胞外β-ラクタマーゼの放出を誘導した、事前準備された緑膿菌を、次いで10μM及び100μMの化合物21に15分間暴露した。
【０１９１】
次いで、本発明者らは、他のグラム陰性細菌種(大腸菌、コレラ菌及び霊菌)及びグラム陽性種黄色ブドウ球菌からのバイオフィルムの分散を誘導する化合物21の能力を調査した。図8に示す通り、化合物21は、これらの種のバイオフィルムにおいて迅速な分散(処理後10分)を誘導する。
【０１９２】
連続流バイオフィルム培養アッセイを使用して、化合物21のバイオフィルム分散特性をさらに調査した。緑膿菌PAO1バイオフィルムは、新たなM9最少培地の連続流を受けながら、ガラスマイクロ発酵槽内で準備した。化合物21(100μM)を加えた又は加えない新鮮培地を含有するベッセルに注入口を切り替え、流出物のOD600測定をした。化合物21の添加後に、放出された細胞の迅速且つ顕著な増大が観察されたが、未処理のバイオフィルムから放出された細胞の量は不変のままであった(図9)。
【０１９３】
[実施例5]
化合物21の最小発育阻止濃度
緑膿菌PAO1野生型細胞を、96ウェルプレート内のM9最少培地中、静止状態で、広範な濃度の化合物21ジエチルアミンジアゼニウムジオレート(DEA;化合物21の合成に使用される酸化窒素供与体)、並びに/又は抗生物質セファロチン、セフタジジム及びテトラサイクリンの存在下、37℃で増殖させた。浮遊増殖を、種々の時点で、上清のOD600の直接測定によって定量化した。抗生物質処理の最小発育阻止濃度(MIC)を、20時間の増殖後に35%以下のOD600nmをもたらす抗生物質の濃度として定義した。バイオフィルム生存能力実験では、緑膿菌(P. aerugionsa)バイオフィルムを、24ウェルマイクロタイタープレート中で上述した通りに(実施例4を参照)7時間増殖させた後、指示されている最終濃度の化合物21及び抗生物質の処理を追加し、通常の培養条件下でもう1時間又は2時間インキュベートした。各時点について、浮遊細菌を収集し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で連続希釈し、LB寒天プレート上に広げた。バイオフィルムをPBSで一回優しくすすぎ、滅菌綿棒を使用して壁及び底部ウェル表面(全表面積=4.4cm2)から再懸濁した。細菌凝集体を音波破砕浴内で10分間さらに粉砕させた。次いで、バイオフィルム細菌を連続希釈し、LB寒天プレート上に広げた。37℃で1日間インキュベーション後、コロニー形成単位(CFU)を決定した。
【０１９４】
化合物21単独では4mMのMICであり、いずれも16mMのMICを有することが分かったセファロチン又はDEAと比較して、緑膿菌浮遊増殖を阻害する上でより強力であることが分かった(図10-「DEA-CP」として表示される化合物21)。化合物21の増殖阻害効果は、毒性レベルの酸化窒素による可能性が高く、DEAと比較して増大したその毒性は、細菌内における酸化窒素の標的化放出の結果であると示唆される。
【０１９５】
[実施例6]
化合物21及び抗生物質を伴う組合せ処理
バイオフィルム及び分散された細胞の生存能力に対する化合物21及び抗生物質の効果を評価するために、化合物21とセフタジジムとの組合せ処理を、マイクロタイタープレート中で増殖させたバイオフィルムに対して行い(実施例5において上述した通り)、バイオフィルムCFU及び浮遊CFUの両方を決定した。結果は、ウェル当たり1.9×108から1.3×108CFUまでのバイオフィルムCFUにおける同時減少、及び化合物21 100μM単独での1時間の処理後、ウェル当たり4.8×108から11×108CFUまでの浮遊CFUにおける増大を実証しており(図11A及び11Bを参照)、これは以前に取得されたOD及びCV測定値と一致する(実施例4;図4を参照)。さらに、バイオフィルム及び浮遊細菌の両方に対する10μMセフタジジムの効能は、化合物21の存在下で1時間インキュベートした場合に、セフタジジム単独で処理されたバイオフィルム及び浮遊細菌と比較して増大した(図8A及び8B)。バイオフィルム細菌に対するセフタジジムの効能も、化合物21の存在下、2時間の処理後、化合物21なしで処理されたバイオフィルムと比較して2.3倍増大した(図11C)。
【０１９６】
本発明者らは、化合物21が、臨床的に用いられる抗生物質トブラマイシン及びシプロフロキサシンの抗バイオフィルム効能を増強することをさらに見出した(表1)。マイクロタイタープレート内、37℃で振とうさせながら増殖させた、準備された緑膿菌バイオフィルムを、亜阻止イミペネム(10μg/mL)で1時間予め処理して、細胞外β-ラクタマーゼの放出を誘導した。次いで、トブラマイシン又はシプロフロキサシンを、化合物21を加えて又は加えずにのいずれかで添加するか、或いはバイオフィルムを未処理のまま放置した(対照)。バイオフィルム細菌をさらに1時間インキュベートした後、再懸濁及びcfuの計数をした。値は、対照バイオフィルムと比較したcfuにおける対数倍の低下を表し、二つの独立した実験の平均(±  SEM)である。上清中の細菌は、抗生物質単独又は化合物21と組み合わせた抗生物質のいずれかで処理後、完全に根絶された(検出限界未満;10cfu/mL)。
【表１】
0005974083.tif 000031
【０１９７】
浮遊緑膿菌に対するテトラサイクリンとの組合せ処理において、化合物21は、6μMテトラサイクリンの阻害効果を45%、及び25μMテトラサイクリンの阻害効果を60%、増大させた(データは示されていない)。
【０１９８】
参考文献
0005974083.tif 000032
【図１】
0005974083.tif 000041
【図２】
0005974083.tif 000042
【図３】
0005974083.tif 000043
【図４】
0005974083.tif 000044
【図５】
0005974083.tif 000045
【図６】
0005974083.tif 000046
【図７】
0005974083.tif 000047
【図８】
0005974083.tif 000048
【図９】
0005974083.tif 000049
【図１０】
0005974083.tif 000050
【図１１】
0005974083.tif 000051