(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清アルブミンと結合することができるダイアボディ複合体であって、前記ダイアボディ複合体はそれぞれＮ末端とＣ末端を有する３つのポリペプチド鎖を含み、
（Ａ）第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖が共有結合により互いに連結し、それぞれ、Ｎ末端からＣ末端に向けて、軽鎖可変ドメインとそれに連結した重鎖可変ドメインを有し、
（１）前記第１のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメインと、前記第２のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメインとが会合して、第１のエピトープに特異的な結合部位を形成し、
（２）前記第２のポリペプチド鎖の前記軽鎖可変ドメインと、前記第１のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメインとが会合して、第２のエピトープに特異的な結合部位を形成し、
（Ｂ）前記第１のポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分を有し、前記ヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分は前記第１のポリペプチド鎖の前記重鎖可変ドメインのＣ末端側に位置するＥコイル又はＫコイルであり、前記ＥコイルはＥＶＡＡＬＥＫ（配列番号２９９）の４リピートヘプタマーであり、前記ＫコイルはＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号３００）の４リピートヘプタマーであり、
（Ｃ）前記第３のポリペプチド鎖は、前記血清アルブミンに結合できるタンパク質のポリペプチド部分と、次のヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分とを含み：
（１）前記第１のポリペプチド鎖がＫコイルを有する場合には、Ｅコイル、
（２）前記第１のポリペプチド鎖がＥコイルを有する場合には、Ｋコイル；
前記第１のポリペプチド鎖と第３のポリペプチド鎖の前記ヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分は、互いに複合体化して、前記ダイアボディ複合体を形成するとともに、前記ダイアボディ複合体は、前記第１のエピトープ、前記第２のエピトープ及び前記血清アルブミンに同時に結合することができる、
ダイアボディ複合体。
【請求項２】
前記血清アルブミンと結合することができる前記タンパク質の前記ポリペプチド部分が、前記ヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分のＮ末端に位置する、請求項１に記載のダイアボディ複合体。
【請求項３】
前記血清アルブミンと結合することができる前記タンパク質の前記ポリペプチド部分が、前記ヘテロ二量体形成促進ポリペプチド部分のＣ末端に位置する、請求項１に記載のダイアボディ複合体。
【請求項４】
前記血清アルブミンと結合することができる前記タンパク質が連鎖球菌Ｇタンパク質であり、前記タンパク質の前記ポリペプチド部分が前記連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のダイアボディ複合体。
【請求項５】
前記連鎖球菌Ｇタンパク質の前記アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）が連鎖球菌Ｇ１４８株のＧタンパク質のアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）である、請求項４に記載のダイアボディ複合体。
【請求項６】
前記ダイアボディが２時間より長いｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を示す、請求項１に記載のダイアボディ複合体。
【請求項７】
前記ダイアボディ複合体がナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインまたはハプテンと結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のダイアボディ複合体。
【請求項８】
前記ダイアボディ複合体が腫瘍関連抗原と付加的に結合する、請求項７に記載のダイアボディ複合体。
【請求項９】
前記腫瘍関連抗原が乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頚癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンリンパ腫関連抗原または慢性リンパ性白血病関連抗原である、請求項８に記載のダイアボディ複合体。
【請求項１０】
前記腫瘍関連抗原がＡ３３；ＡＤＡＭ−９；ＡＬＣＡＭ；Ｂ１；ＢＡＧＥ；β−カテニン；ＣＡ１２５；カルボキシペプチダーゼＭ；ＣＤ５；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ２３；ＣＤ２５；ＣＤ２７；ＣＤ２８；ＣＤ３２Ｂ；ＣＤ３６；ＣＤ４０；ＣＤ４５；ＣＤ４６；ＣＤ５６；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ１０３；ＣＤ１５４；ＣＤＫ４；ＣＥＡ；ＣＴＬＡ４；サイトケラチン８；ＥＧＦ−Ｒ；エフリン受容体；ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２；ＧＤ２；ＧＤ３；ＧＭ２；ｇｐ１００；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；ヒト乳頭腫ウイルス−Ｅ６；ヒト乳頭腫ウイルス−Ｅ７；インテグリンα−Ｖ−β−６；ＪＡＭ−３；ＫＩＤ３；ＫＩＤ３１；ＫＳＡ（１７−１Ａ）；ＬＵＣＡ−２；ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３；ＭＡＲＴ；ＭＵＣ−１；ＭＵＭ−１；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ；オンコスタチンＭ（オンコスタチン受容体β）；ｐ１５；ＰＩＰＡ；ＰＳＡ；ＰＳＭＡ；ＲＡＡＧ１０；ＲＯＲ１；ＳＡＲＴ；ｓＴｎ；ＴＥＳ７；ＴＮＦ−α受容体；ＴＮＦ−β受容体；ＴＮＦ−γ受容体；トランスフェリン受容体またはＶＥＧＦ受容体である、請求項９に記載のダイアボディ複合体。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原がＨＥＲ−２／ｎｅｕ又はＣＤ３２Ｂである、請求項１０に記載のダイアボディ複合体。
【請求項１２】
請求項７又は８に記載のダイアボディ複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
癌治療に使用される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記使用は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頚癌、膵癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、精巣癌、膠芽腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ性白血病の治療のための使用である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国特許出願公開第６１／３７０，０４６号（２０１０年８月２日出願；係属中）および米国特許出願公開第６０／６７１，６５７号（２００５年４月１５日出願；失効）；同第１１／４０９，３３９号（２００６年４月１７日出願；係属中）；ＰＣＴ／ＵＳ０６／０１４４８１（２００６年４月１７日出願；失効）；米国特許出願公開第６０／９４５，５２３号（２００７年６月２１日出願；失効）、同第６１／０１９，０５１号（２００８年１月４日出願；失効）；同第１２／１３８，８６７号（２００８年６月１３日出願、係属中）、ＰＣＴ／ＵＳ０８／０６６９５７（２００８年６月１３日出願、係属中）、米国特許出願公開第６１／１３９，３５２号（２００８年１２月１９日出願、係属中）、同第６１／１５６，０３５号（２００９年２月２７日出願、係属中）；同第６１／２５６，７７９号（２００９年１０月３０日出願；係属中）および同第１２／６４１，０９５号（２００９年１２月１７日出願；係属中）の利益を主張するものであり、これらは全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、ダイアボディ分子、別名「二重親和性再標的化試薬(dual affinity retargeting reagent)」（「ＤＡＲＴＳ」と呼ばれる）、ならびに免疫障害および癌を含む様々な疾患および障害の治療におけるそれらの使用を対象とする。本発明のダイアボディ分子は、会合して、同じまたは異なるエピトープを認識し得る少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する少なくとも２つのポリペプチド鎖を含む。さらに、該エピトープは同じ分子に由来しても異なる分子に由来してもよく、あるいは同じまたは異なる細胞に位置してもよい。該ダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、、限定されるものではないが、各ポリペプチド鎖内に位置するシステイン残基のジスルフィド結合などの、非ペプチド結合型共有結合を介して共有結合されていてよい。特定の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、該分子に抗体様機能をもたせるＦｃ領域をさらに含んでもよい。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
共有結合型ダイアボディの設計は一本鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）に基づいている（非特許文献１、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。完全な非修飾型ＩｇＧでは、ＶＬドメインおよびＶＨドメインが別々のポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ軽鎖と重鎖に位置している。抗体軽鎖と抗体重鎖の相互作用、特にＶＬドメインとＶＨドメインの相互作用により、該抗体のエピトープ結合部位の１つが形成される。これに対して、ｓｃＦｖ構築物は、１本のポリペプチド鎖に含まれている抗体のＶＬドメインとＶＨドメインを含み、これらのドメインは、これら２つのドメインに自己集合して機能的エピトープ結合部位を形成させるに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられている。リンカーの長さが不十分なため（約１２アミノ酸残基より短い）にこれらのドメインの自己集合ができない場合には、２つのｓｃＦｖ構築物が相互作用して二価の分子を形成する（一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと会合する）（非特許文献２に総説）。さらに、該構築物のＣ末端にシステイン残基を付加すると、これらのポリペプチド鎖のジスルフィド結合が可能となり、生じる二量体はその二価分子の結合特性を妨げることなく安定化することが示されている（例えば、非特許文献３参照）。さらに、特異性が異なるＶＬドメインおよびＶＨドメインが選択される場合には、二価だけでなく、二重特異性分子を構築することもできる。
【０００４】
二価ダイアボディは、療法および免疫診断を含む広範囲の用途を有する。二価にすると、様々な用途でのダイアボディの設計および遺伝子工学的操作が極めてフレキシブルとなり、多量体抗原に対する結合力の向上、異なる抗原の架橋、両標的抗原の存在に依存する特定の細胞種への指定ターゲッティングが得られる。それらの増大した結合価、低い解離速度、および（約５０ｋＤａ以下の、小型のダイアボディの場合は）循環からの速やかなクリアランスのため、当技術分野で知られたダイアボディ分子は腫瘍の画像化の分野においても特定の使用が示されている（非特許文献４）。異なる細胞の架橋、例えば細胞傷害性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋は特に重要である（非特許文献５および非特許文献６）。ダイアボディのエピトープ結合ドメインはまた、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または他の単核細胞上に発現されるＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２もしくはＣＤ６４などの免疫エフェクター細胞の表面決定基にも向けられる。多くの研究において、エフェクター細胞の決定基、例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）へのダイアボディの結合がエフェクター細胞を活性化させることも見出された（非特許文献６、非特許文献７）。通常、エフェクター細胞の活性化は、抗原と結合した抗体がＦｃ−ＦｃγＲの相互作用を介してエフェクター細胞に結合することによって誘発される。従って、これに関連して、本発明のダイアボディ分子は、それらがＦｃドメインを含むかどうかによらず、（例えば、当技術分野で公知のまたは本明細書に例示されたエフェクター機能アッセイ（例えば、ＡＤＣＣアッセイ）でアッセイした場合に）Ｉｇ様機能を示すことができる。腫瘍細胞とエフェクター細胞を架橋することによって、ダイアボディは腫瘍細胞の近傍にエフェクター細胞を引き寄せるだけでなく、腫瘍の効果的な死滅をもたらす（例えば、非特許文献８参照；参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【０００５】
２．１  エフェクター細胞受容体および免疫系におけるそれらの役割
伝統的な免疫機能では、抗体−抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害作用、肥満細胞の脱顆粒および食作用）から免疫調節シグナル（例えば、リンパ球増殖および抗体分泌の調節）に及ぶ幅広い一連の応答をもたらす。これらの相互作用は全て、抗体または免疫複合体のＦｃドメインが造血細胞上の特殊な細胞表面受容体と結合することにより開始される。抗体と免疫複合体により誘発される細胞応答の多様性は、Ｆｃ受容体の構造上の不均一性からもたらされる。Ｆｃ受容体は、細胞内シグナル伝達を媒介すると思われる構造的に関連した抗原結合ドメインを共有する。
【０００６】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリータンパク質のメンバーであるＦｃγ受容体は、免疫グロブリン分子のＦｃγ部分と結合することができる表面糖タンパク質である。このファミリーの各メンバーは、Ｆｃγ受容体のα鎖上の認識ドメインを介して１以上のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃγ受容体は免疫グロブリンサブタイプに対するそれらの特異性によって定義される。ＩｇＧに対するＦｃγ受容体はＦｃγＲと、ＩｇＥに対するものはＦｃεＲと、そしてＩｇＡに対するものはＦｃαＲと呼ばれる。様々なアクセサリー細胞が異なるアイソタイプの抗体に対するＦｃγ受容体を持ち、抗体のアイソタイプが所与の応答にどのアクセサリー細胞が関与するかを決定する（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４により総説されている）。種々のＦｃγ受容体、それらを発現する細胞、およびそれらのアイソタイプ特異性を表１にまとめる（非特許文献１５から引用）。
【０００７】
Ｆｃγ受容体
このファミリーの各メンバーは、免疫グロブリン関連ドメインのＣ２セット、１回膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質内ドメインに関係する細胞外ドメインを持つ内在性膜糖タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と呼ばれる３つの既知のＦｃγＲがある。これら３つの受容体は異なる遺伝子によりコードされているが、これら３つのファミリーメンバー間の広範な相同性は、これらが共通の祖先からおそらくは遺伝子重複により生じたことを示唆する。
【０００８】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）
ＦｃγＲＩＩタンパク質は４０ｋＤａの内在性膜糖タンパク質であり、モノマーＩｇに対する親和性が低い（１０6Ｍ-1）ために複合体を形成したＩｇＧとだけ結合する。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、肥満細胞および血小板を含む全ての造血細胞上に存在する最も広く発現されるＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは、その免疫グロブリン結合鎖中に免疫グロブリン様領域を２つだけ有することから、ＩｇＧに対してＦｃγＲＩよりも遥かに低い親和性を有する。３つのヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−ＢおよびＦｃγＲＩＩ−Ｃ）が存在し、それらは全て凝集体または免疫複合体のＩｇＧと結合する。
【０００９】
ＦｃγＲＩＩ−ＡとＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質内ドメイン内の明確な違いは、受容体ライゲーションに対して２つの機能的に異種の応答を作り出す。基本的な違いは、Ａアイソフォームが食作用および呼吸バーストなどの細胞の活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するのに対して、ＢアイソフォームはＢ細胞活性化の阻害などの阻害シグナルを誘発するというものである。
【００１０】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）
このクラス内の不均一性のため、ＦｃγＲＩＩＩのサイズはマウスおよびヒトで４０〜８０ｋＤａの範囲に及ぶ。２つのヒト遺伝子が、内在性膜糖タンパク質ＦｃγＲＩＩＩＡとグリコシルホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）結合型ＦｃγＲＩＩＩＢの２種の転写産物をコードしている。１つのマウス遺伝子が、膜貫通ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに相同なＦｃγＲＩＩＩをコードしている。ＦｃγＲＩＩＩは他の２つのＦｃγＲのそれぞれと構造上の特徴を共有する。ＦｃγＲＩＩと同様に、ＦｃγＲＩＩＩは低い親和性でＩｇＧと結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、肥満細胞で発現され、ＮＫ細胞では唯一のＦｃγＲである。ＧＰＩ結合型のＦｃγＲＩＩＩＢは、目下、ヒト好中球でのみ発現されることが知られている。
【００１１】
ＦｃγＲを介するシグナル伝達
活性化および阻害の両シグナルは、ライゲーション後にＦｃγＲを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造上の違いからもたらされる。受容体の細胞質内シグナル伝達ドメイン内の２つの異なるドメイン、すなわち、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）または免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）が、これらの異なる応答を説明する。これらの構造体への異なる細胞質酵素の動員が、ＦｃγＲ媒介細胞応答の結果を規定する。ＩＴＡＭ含有ＦｃγＲ複合体にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡが含まれるが、ＩＴＩＭ含有複合体にはＦｃγＲＩＩＢだけが含まれる。
【００１２】
ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介するＦｃγＲＩＩＡクラスター形成は、ＩＴＡＭを、ＩＴＡＭリン酸化を容易にする受容体関連キナーゼとともに凝集させる働きをする。ＩＴＡＭリン酸化はＳｙｋキナーゼに対するドッキング部位として働き、Ｓｙｋキナーゼの活性化は下流の基質（例えば、ＰＩ3Ｋ）の活性化をもたらす。細胞活性化は前炎症性メディエーターの放出をもたらす。
【００１３】
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上に発現され、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一であって、識別できない様式でＩｇＧ複合体と結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメイン中のＩＴＩＭの存在が、ＦｃγＲの阻害サブクラスを規定する。最近、この阻害の分子的基礎が確立された。活性化ＦｃγＲとともに連結されると、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化されて、イノシトールポリリン酸５’−ホスファターゼ（ＳＨＩＰ）のＳＨ２ドメインを引き付け、これがＩＴＡＭ含有ＦｃγＲにより媒介されるチロシンキナーゼの活性化の結果として放出されるホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、その結果、細胞内Ｃａ++の流入を阻害する。従って、ＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲライゲーションに対する活性化応答を消失させ、細胞応答性を阻害する。このようにしてＢ細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖および抗体の分泌が停止する。
【００１４】
【表１】
0005964300.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Holligerら(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448
【非特許文献２】Marvinら(2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658
【非特許文献３】Olafsenら(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27
【非特許文献４】Fitzgeraldら(1997) “Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221
【非特許文献５】Staerzら(1985) “Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631
【非特許文献６】Holligerら(1996) “Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305
【非特許文献７】Holligerら(1999) “Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916
【非特許文献８】Caoら(2003) “Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197
【非特許文献９】Ravetch J.V.ら(1991) “Fc Receptors,” Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92
【非特許文献１０】Gerber J.S.ら(2001) “Stimulatory And Inhibitory Signals Originating From The Macrophage Fcgamma Receptors,” Microbes and Infection, 3: 131-139
【非特許文献１１】Billadeau D.D.ら(2002), “ITAMs Versus ITIMs: Striking A Balance During Cell Regulation,” The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-168l
【非特許文献１２】Ravetch J.V.ら(2000) “Immune Inhibitory Receptors,” Science, 290: 84-89
【非特許文献１３】Ravetch J.V.ら, (2001) “IgG Fc Receptors,” Annu. Rev. Immunol. 19:275-90
【非特許文献１４】Ravetch J.V. (1994) “Fc Receptors: Rubor Redux,” Cell, 78(4): 553-60
【非特許文献１５】Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 第4版 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, New York
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
３．発明の概要
本発明は、共有結合型ダイアボディおよび／または共有結合型ダイアボディ分子、ならびに癌、自己免疫疾患、アレルギー性障害、および細菌、真菌もしくはウイルスにより引き起こされる感染性疾患を含む様々な疾患および障害の治療におけるそれらの使用に関する。好ましくは、本発明のダイアボディは２つの異なる細胞上の２つの異なるエピトープに結合することができ、この場合、第１のエピトープは第２のエピトープとは異なる細胞種に発現され、その結果、該ダイアボディはこれら２つの細胞を引き寄せることができる。
【００１７】
一実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディは第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および場合により（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および場合により（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディは第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第３のドメインと第４のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００１９】
特定の態様において、本発明はダイアボディ分子を対象とし、該分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２１】
さらに他の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成し；かつ、第２のダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ４）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ４）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、前記第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第４のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
【００２２】
本発明の特定の態様において、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適当であれば、第３のエピトープおよび第４のエピトープは同一であり得る。他の態様では、第１のエピトープ、第２のエピトープ、適当であれば、第３のエピトープおよび第４のエピトープが他とそれぞれ異なっていてもよい。第３のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第３のエピトープが同一であり得る。第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第１のエピトープと第４のエピトープが同一であり得る。第３のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープと第３のエピトープが同一であり得る。第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明の特定の態様では、第２のエピトープと第４のエピトープが同一であり得る。本発明の好ましい態様では、第１のエピトープと第２のエピトープは異なっている。第３のエピトープ結合ドメインと第４のエピトープ結合ドメインを含む本発明のさらに他の態様では、第３のエピトープと第４のエピトープは異なり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
【００２３】
本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインを同一の免疫グロブリンに由来するものであり得る。別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインを同一の免疫グロブリンに由来するものであり得る。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインを異なる免疫グロブリンに由来するものであり得る。さらに別の態様では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインを異なる免疫グロブリンに由来するものであり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
【００２４】
本発明の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖の間の共有結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基の間のジスルフィド結合を介するものであり得る。ジスルフィド結合に関与する第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１、第２、第３、第４、第５または第６のドメイン内を含む、ポリペプチド鎖上のどこに存在してもよい。特定の実施形態では、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第１のドメインに、そして第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は第５のドメインに存在する。第１、第２、第４および第５のドメインは結合に関与する可変領域に相当する。好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖の間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基は、それぞれ第３のドメインおよび第６のドメイン内に位置する。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列によりコードされ得るヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列によりコードされ得るヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。この実施形態のさらに別の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、配列番号７８のヌクレオチド配列によりコードされ得るヒトＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の別の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、配列番号７８のヌクレオチド配列によりコードされ得る、ヒトＩｇＧのヒンジドメイン由来のアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の特定の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態の他の態様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはヒンジドメインを含む。この実施形態のさらに他の態様では、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第６のドメインはＦｃドメインまたはその一部を含む。この実施形態のさらに他の���様では、第２のポリペプチド鎖の第６のドメインは、ヒトκ軽鎖のＣ末端の６個のアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、第１のポリペプチド鎖の第３のドメインはＦｃドメインまたはその一部を含む。
【００２５】
他の実施形態において、ジスルフィド結合に関与する第１または第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１のポリペプチド鎖上の第１、第２または第３のドメインの外側に、そして第２のポリペプチド鎖上の第４、第５または第６のドメインの外側に位置することができる。特に、第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第１のドメインのＮ末端にあっても、第１のドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第２のドメインのＮ末端にあっても、第２のドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第３のドメインのＮ末端にあっても、第３のドメインのＣ末端にあってもよい。さらに、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第４のドメインのＮ末端にあっても、第４のドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第５のドメインのＮ末端にあっても、第５のドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第２のポリペプチド鎖上のシステイン残基は、第６のドメインのＣ末端にあっても、第６のドメインのＮ末端にあってもよい。特定の態様では、ジスルフィド結合は、第１のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基と第２のポリペプチド鎖上の少なくとも２個のシステイン残基の間にあってよい。第３のドメインと第６のドメインがＦｃドメインまたはその一部を含まない特定の態様では、システイン残基は第１のポリペプチド鎖のＣ末端にあり、かつ第２のポリペプチド鎖のＣ末端にあり得る。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
【００２６】
上記の本発明の特定の実施形態において、本発明の共有結合型ダイアボディはダイアボディ分子の二量体を包含し、この場合、各ダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含む。この実施形態の特定の態様では、ダイアボディ分子同士が共有結合により連結されて二量体を形成し得るが、該共有結合はペプチド結合ではない。この実施形態の好ましい態様では、共有結合は二量体の各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基の間のジスルフィド結合である。本発明のさらにより好ましい態様では、共有結合は二量体を形成している各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖上にある少なくとも１個のシステイン残基の間のジスルフィド結合であるが、該少なくとも１個のシステイン残基は各第１のポリペプチド鎖の第３のドメインに位置する。
【００２７】
本発明の特定の態様において、第１のポリペプチド鎖上の第１のドメインは、第２のドメインのＮ末端にあっても、第２ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第１のドメインは第３ドメインのＮ末端にあっても、第３ドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第２のドメインは、第１のドメインのＮ末端にあっても、第１のドメインのＣ末端にあってもよい。さらに、第１のポリペプチド鎖上の第２のドメインは、第３のドメインのＮ末端にあっても、第３のドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインは、第１のドメインのＮ末端にあっても、第１のドメインのＣ末端にあってもよい。第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインは、第２のドメインのＮ末端にあっても、第２のドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖に関して、第４のドメインは、第５のドメインのＮ末端にあっても、第５のドメインのＣ末端にあってもよい。第４のドメインは、第６のドメインのＮ末端にあっても、第６のドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５のドメインは、第４のドメインのＮ末端にあっても、第４のドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第５のドメインは、第６のドメインのＮ末端にあっても、第６のドメインのＣ末端にあってもよい。これに応じて、第２のポリペプチド鎖上の第６のドメインは、第４のドメインのＮ末端にあっても、第４のドメインのＣ末端にあってもよい。第２のポリペプチド鎖上の第６のドメインは、第５のドメインのＮ末端にあっても、第５のドメインのＣ末端にあってもよい。前述の任意の組合せが本発明に包含されると理解すべきである。
【００２８】
特定の実施形態において、第１のドメインと第２のドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインのＣ末端に位置してもよいし、あるいは、第１のドメインと第２のドメインは第１のポリペプチド鎖上の第３のドメインのＮ末端に位置してもよい。第２のポリペプチド鎖に関して、第４のドメインと第５のドメインは第６のドメインのＣ末端に位置してもよいし、あるいは、第４のドメインと第５のドメインは第６のドメインのＮ末端に位置してもよい。この実施形態の特定の態様では、本発明は共有結合型二重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、各ダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第３のドメインは第１のドメインと第２のドメインの双方のＮ末端側に位置し；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；各ダイアボディ分子の第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；各ダイアボディ分子の第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；各ダイアボディ分子の第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成している。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は共有結合型四重特異性ダイアボディを対象とし、該ダイアボディはダイアボディ分子の二量体であり、第１のダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第１のエピトープに特異的な第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第２のエピトープに特異的な第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第３のドメインは第１のドメインと第２のドメインの双方のＮ末端側に位置し；第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第２の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第１の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；かつ、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第１のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ１）（ＶＨ１）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第２のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ２）（ＶＨ２）を形成し；かつ、第２のダイアボディ分子は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、（ｉ）第３のエピトープに特異的な第３の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ３）の結合領域を含む第１のドメイン、（ｉｉ）第４のエピトープに特異的な第４の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ４）の結合領域を含む第２のドメイン、および（ｉｉｉ）Ｆｃドメインまたはその一部を含む第３のドメインを含み、第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され、かつ、第３のドメインは第１のドメインと第２のドメインの双方のＮ末端に位置し；かつ、第２のポリペプチド鎖は、（ｉ）第４の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ４）の結合領域を含む第４のドメイン、（ｉｉ）第３の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ３）の結合領域を含む第５のドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１個のシステイン残基を含む第６のドメインを含み、第４のドメインと第５のドメインは、第４のドメインと第５のドメインが会合してエピトープ結合部位を形成することがないように、共有結合により連結され；かつ、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖は共有結合により連結されているが、該共有結合はペプチド結合ではなく；第１のドメインと第５のドメインは会合して、第３のエピトープと結合する第１の結合部位（ＶＬ３）（ＶＨ３）を形成し；第２のドメインと第４のドメインは会合して、第４のエピトープと結合する第２の結合部位（ＶＬ４）（ＶＨ４）を形成している。
【００３０】
上述のように、個々のポリペプチド鎖上のドメインは共有結合により連結されている。特定の態様では、第１のドメインと第２のドメインの間、第１のドメインと第３のドメインの間、第２のドメインと第３のドメインの間、第４のドメインと第５のドメインの間、第４のドメインと第６のドメインの間、および／または第５のドメインと第６のドメインの間の共有結合はペプチド結合であり得る。特に、第１のドメインと第２のドメイン、および第４のドメインと第５のドメインが会合して結合部位を形成することがない限り、第１のドメインと第２のドメイン、および第４のドメインと第５のドメインは、それぞれ第３のドメインと第６のドメインにより、または付加的なアミノ酸残基により隔てられていてもよい。アミノ酸残基の数は０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個であってよい。好ましい一態様では、ドメイン間のアミノ酸残基の数は８個である。
【００３１】
本発明の特定の態様では、Ｆｃドメインを含む第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のドメイン（すなわち、場合により、それぞれ第３のドメインおよび第６のドメイン）は、該ドメインがヒンジ−Ｆｃ領域を含むようにヒンジドメインをさらに含むことができる。別の実施形態では、第１のポリペプチド鎖または第２のポリペプチド鎖は、Ｆｃドメインを含まなくともヒンジドメインを含むことができる。本発明で用いる重鎖、軽鎖、ヒンジ領域、Ｆｃドメインおよび／またはヒンジ−Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを含む、どの免疫グロブリン種に由来するものであってもよい。好ましい一態様では、免疫グロブリン種はＩｇＧまたはそのいずれかのサブタイプ、すなわちＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3もしくはＩｇＧ4である。他の態様では、軽鎖および重鎖が由来する免疫グロブリンは、ヒト化またはキメラ化されている。
【００３２】
さらに、ダイアボディまたはダイアボディ分子が結合する第１のエピトープと第２のエピトープ、および適当であれば、第３のエピトープと第４エピトープは、同じ抗原に由来する異なるエピトープであっても、異なる抗原に由来する異なるエピトープであってもよい。抗原は、抗体を生成することができるいずれの分子であってもよく、例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などである。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞などの特定の細胞上の抗原に特異的である。
【００３３】
本実施形態の特定の態様において、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位はＦｃ受容体に特異的であり、該Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体または阻害型Ｆｃ受容体であり得る。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体であり、このＦｃγ受容体はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ受容体である。より好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）受容体であり、より好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）受容体である。別の好ましい態様では、ＦｃγＲＩＩ受容体はＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）受容体またはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体であり、より好ましくは、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）受容体である。特に好ましい一態様では、ダイアボディの一方の結合部位はＣＤ３２Ｂに特異的であり、他方の結合部位はＣＤ１６Ａに特異的である。本発明の特定の実施形態では、ダイアボディまたはダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位は活性化Ｆｃ受容体に特異的であり、少なくとも１つの他の部位が阻害型Ｆｃ受容体に特異的である。この実施形態の特定の態様では、活性化Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ａであり、阻害型Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。この実施形態の他の態様では、活性化Ｆｃ受容体はＢＣＲであり、阻害型Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。この実施形態のさらに他の態様では、活性化Ｆｃ受容体はＩｇＥＲＩであり、阻害型Ｆｃ受容体はＣＤ３２Ｂである。
【００３４】
１つのエピトープ結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である場合には、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、マウス抗体３Ｇ８（この配列はクローニングされており、本明細書に示されている）のＶＬドメインおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ａに特異的である他の場合には、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、マウス抗体ＩＶ．３のＶＬドメインおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。１つのエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であるさらに他の場合には、ＶＬドメインおよびＶＨドメインは、マウス抗体２Ｂ６（この配列はクローニングされており、本明細書に示されている）のＶＬドメインおよびＶＨドメインと同一であっても、類似していてもよい。３Ｇ８、２Ｂ６およびＩＶ．３抗体のＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれもが任意の組合せで使用可能であると理解すべきである。本発明はまた、第１のエピトープがＣＤ３２Ｂに特異的であり、第２のエピトープがＣＤ１６Ａに特異的である二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子も対象とする。
【００３５】
他の態様では、エピトープ結合部位は病原性抗原に特異的であり得る。本明細書で用いる場合、病原性抗原とは、癌、感染性疾患、自己免疫疾患を含む特定の病原性疾患に関与する抗原のことである。従って、病原性抗原は腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または自己免疫抗原であり得る。病原性抗原の例としては、限定されるものではないが、リポ多糖、ウイルス抗原（ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、呼吸器多核体ウイルス、西ナイルウイルス（例えば、Ｅ１６および／またはＥ５３抗原）、および肝炎ウイルスに由来するウイルス抗原からなる群から選択される）、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、およびコラーゲンであり得る。好ましくは、病原性抗原は中和抗原である。好ましい一態様において、一方のエピトープ結合部位がＣＤ１６ＡまたはＣＤ３２Ａに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は自己免疫抗原を除く病原性抗原に特異的である。さらに別の好ましい態様において、一方のエピトープ結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的である場合、他方のエピトープ結合部位は任意の病原性抗原に特異的である。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子は同一細胞上の２つの異なる抗原と結合し、例えば、一方の抗原結合部位は活性化Ｆｃ受容体に特異的であるが、他方は阻害型Ｆｃ受容体に特異的である。他の実施形態では、ダイアボディ分子は２つの異なるウイルス中和エピトープ、例えば、限定されるものではないが西ナイルウイルスのＥ１６およびＥ５３と結合する。
【００３６】
本発明のさらに別の実施形態において、本発明のダイアボディを用いて様々な疾患および障害を治療することができる。従って、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法を対象とし、この場合、少なくとも１つの結合部位が癌細胞の表面または細菌もしくはウイルス粒子の表面に発現される抗原のような病原性抗原に特異的であり、少なくとも１つの他の結合部位がＦｃ受容体、例えばＣＤ１６Ａに特異的である。
【００３７】
さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明のダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患または障害の治療方法を対象とし、この場合、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、少なくとも１つの他の結合部位がＣＤ１６Ａに特異的である。
【００３８】
さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、病原性抗原に対する免疫寛容の誘発方法を対象とし、この場合、少なくとも１つの結合部位がＣＤ３２Ｂに特異的であり、少なくとも１つの他の結合部位が該病原性抗原に特異的である。この実施形態の態様においては、病原性抗原はアレルゲンまたは免疫寛容が望まれる別の分子（例えば、移植した組織に発現されるタンパク質）であり得る。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明は、有効量の本発明の共有結合型ダイアボディまたはダイアボディ分子を、それを必要とする患者に投与することを含む解毒方法を対象とし、この場合、少なくとも１つの結合部位が細胞表面マーカーに特異的であり、少なくとも１つの他の結合部位が毒素に特異的である。特定の態様では、投与される本発明のダイアボディは、１つの結合部位がＦｃなどの細胞表面マーカーに特異的であり、他の結合部位が細菌毒素または薬物に特異的であるものである。一態様では、細胞表面マーカーは赤血球上に見られないものである。
【００４０】
３．１  定義
特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての技術用語、表記法、その他の科学用語または専門用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味を有するものとする。いくつかの場合には、通常理解される意味を有する用語であっても、明確さのためにおよび／または参考までに本明細書で定義されるが、このような定義を本明細書に含めたからといって、当技術分野で一般に理解されている意味に対する大きな相違を表すと必ずしも解釈されるべきでない。本発明の実施には、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の慣用技術を利用する。このような技術は文献、例えば、Current Protocols in Immunology (J. E. Coliganら編, 1999, 2001年の増刊を含む); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら編, 1987, 2001年の増刊を含む); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版(Sambrook and Russel, 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullisら編, 1994); The Immunoassay Handbook (D. Wild編, Stockton Press NY, 1994); Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson編, Academic Press, 1996); Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines編, Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999;およびBeaucageら編, Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000)に詳しく説明されている。
【００４１】
本明細書において「抗体」とは、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合二重特異性Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内発現抗体(intrabody)および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄおよび抗−抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを意味する。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性フラグメント、すなわち、抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、いずれのクラス（例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1およびＩｇＡ2）またはいずれのサブクラスであってもよい。
【００４２】
本明細書において「免疫特異的に結合する」、「免疫特異的に認識する」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」および類似の用語は、抗原（例えば、エピトープまたは免疫複合体）と特異的に結合するが、他の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより測定した場合に、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。好ましくは、抗原と特異的に結合する分子は他のタンパク質と交差反応しない。抗原と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当業者に公知の他の技術によって同定することができる。
【００４３】
本明細書において「免疫複合体」とは、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドが互いと結合して、より大きな分子量の複合体を形成した際に生じる構造体を意味する。免疫複合体の例は抗原−抗体複合体であり、これは可溶性であっても粒状（例えば、細胞表面上の抗原／抗体複合体）であってもよい。
【００４４】
本明細書において「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などの用語は、免疫学分野におけるそれらの通常の意味を有し、天然の免疫グロブリン中のドメインおよび合成（例えば、組換え）結合タンパク質（例えば、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体など）の対応するドメインを意味する。天然の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の基本的構造単位は、２本の軽鎖と２本の重鎖を有する四量体であり、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれを越えるアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定しており、軽鎖が１つの定常ドメインを有し、重鎖が通常３つの定常ドメインとヒンジ領域を有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶL−ＣL−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ−ＶH−ＣH1−Ｈ−ＣH2−ＣH3−ｃ（式中、Ｈはヒンジ領域）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触する残基を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）と、フレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、これが一般に構造を維持し、ＣＤＲループの位置を決定する（ただし、特定のフレームワーク残基が抗原と接触してもよい）。従って、ＶLドメインおよびＶHドメインは構造ｎ−ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４−ｃを有する。
【００４５】
結合タンパク質または抗体（本明細書では広範に定義される）に言及する場合、各ドメインへのアミノ酸の割り当てはＫａｂａｔ、Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年)の定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域由来のアミノ酸は、その鎖におけるアミノ酸の位置によって指定される。Ｋａｂａｔは多数の抗体アミノ酸配列を記載し、各サブグループに対してアミノ酸コンセンサス配列を同定し、各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Ｋａｂａｔのナンバリング方式は、問題の抗体を、保存されているアミノ酸を基準にしたＫａｂａｔのコンセンサス配列の１つとアラインすることにより、Ｋａｂａｔの一覧表には含まれない抗体にまで拡張することができる。残基番号を割り当てるこの方法は、当技術分野で標準的になってきており、キメラまたはヒト化変異体を含む種々の抗体において同じ位置のアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の５０番のアミノ酸は、マウス抗体軽鎖の５０番のアミノ酸と同じ位置を占めている。
【００４６】
本明細書において「重鎖」とは、ＩｇＧ抗体の重鎖を定義するために用いられる。完全な天然ＩｇＧでは、重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。本明細書全体を通して、ＩｇＧ重鎖中の残基の符番は、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service, NH1, MD (1991)（参照により本明細書に組み入れる）におけるようなＥＵインデックスの符番である。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の符番を意味する。ヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列の例を、以下に記載する図１Ａおよび１Ｂに示す。図１Ａおよび１Ｂには、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのアミノ酸配列も示される。ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプのアミノ酸配列は、それぞれのヒンジ領域において、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とアラインされる。ＩｇＧ２とＩｇＧ３のヒンジ領域については、全ての残基がＥＵインデックスにより符番されるわけではない。
【００４７】
「ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までにわたると定義される。ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列の例を図１Ａに示す（図１Ａのアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従って符番されている）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、図１Ａに示すように重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成している最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とアラインさせることができる。
【００４８】
本明細書において「Ｆｃ領域」、「Ｆｃドメイン」または類似の用語は、ＩｇＧ重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。ヒトＩｇＧ１を含むアミノ酸配列の例を図１Ｂに示す。Ｋａｂａｔシステムに従って符番した場合に、境界はわずかに変化し得るが、Ｆｃドメインはアミノ酸２３１からアミノ酸４４７にわたる（図１Ｂのアミノ酸残基はＫａｂａｔシステムに従って符番されている）。図１Ｂには、ＩｇＧアイソタイプＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列の例も示される。
【００４９】
ＩｇＧのＦｃ領域は、２つの定常ドメイン、すなわち、ＣＨ２とＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインは、通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによればアミノ酸２３１からアミノ酸３４１にわたる（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは、通常、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムによればアミノ酸３４２から４４７にわたる（図１Ｂ）。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は、それがもう１つのドメインと密接に対合していないという点でユニークである。それどころか、完全な天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメインの間には、２つのＮ結合分岐糖鎖が介在している。
【００５０】
本明細書において「ＦｃγＲ結合タンパク質」、「ＦｃγＲ抗体」および「抗ＦｃγＲ抗体」という用語は互換的に用いられ、様々な免疫グロブリン様タンパク質または免疫グロブリン由来タンパク質を意味する。「ＦｃγＲ結合タンパク質」は、ＶLドメインおよび／またはＶHドメインとの相互作用を介してＦｃγＲと結合する（Ｆｃγ媒介結合とは区別される）。ＦｃγＲ結合タンパク質の例としては、完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体（例えば、２本の重鎖と２本の軽鎖を含む）、そのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖフラグメント）、二機能性もしくは多機能性抗体（例えば、Lanzavecchiaら(1987) “The Use Of Hybrid Hybridomas To Target Human Cytotoxic T Lymphocytes,” Eur. J. Immunol. 17:105-111参照）、一本鎖抗体（例えば、Birdら(1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins,” Science 242:423-26参照）、融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ融合タンパク質）、「ミニボディ」（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号参照）、ならびにＶLドメインおよび／またはＶHドメインまたはそのフラグメントを含む他の抗原結合タンパク質が挙げられる。一態様において、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質は「四量体抗体」であり、すなわち、一般に天然ＩｇＧの構造を有し、かつ、可変ドメインと定常ドメインを含む（すなわち、ＶLドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む２本の軽鎖と、ＶHドメインおよび重鎖ヒンジおよび定常ドメインを含む２本の重鎖とを含む）。
【００５１】
本明細書において「ＦｃγＲアンタゴニスト」および類似の用語は、ＦｃγＲの少なくとも１つの生物学的活性に拮抗する（例えば、シグナル伝達を遮断する）タンパク質および非タンパク質性物質（小分子を含む）を意味する。例えば、本発明の分子はＩｇＧとＦｃγＲとの結合を遮断することによってシグナル伝達を遮断する。
【００５２】
本明細書において、ポリペプチドまたはタンパク質に関して「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を意味する。本明細書において「誘導体」とはまた、改変された、すなわち、ポリペプチドまたはタンパク質への任意の分子種の共有結合により改変されたポリペプチドまたはタンパク質を意味する。例えば、限定されるものではないが、抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞、抗原または他のタンパク質との結合などにより改変することができる。誘導体ポリペプチドまたはタンパク質は、限定されるものでないが、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含む、当業者に公知の技術を用いる化学修飾により作製することができる。さらに、誘導体ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質と同様のまたは同一の機能を保持する。
【００５３】
本明細書において、非タンパク質誘導体に関して「誘導体」とは、第１の有機または無機分子の構造に基づいて形成された第２の有機分子または無機分子を意味する。有機分子の誘導体は、限定されるものではないが、例えばヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシルまたはアミン基の付加または欠失により改変された分子を含む。有機分子はまた、エステル化、アルキル化および／またはリン酸化されてもよい。
【００５４】
本明細書において「ダイアボディ分子」とは、２本以上のポリペプチド鎖またはタンパク質の複合体であって、それぞれが少なくとも１つのＶＬドメインおよびＶＨドメインまたはそのフラグメントを含み、両ドメインが単一のポリペプチド鎖内に含まれている該複合体を意味する。特定の実施形態において、「ダイアボディ分子」には、Ｆｃまたはヒンジ−Ｆｃドメインを含む分子が含まれる。このような複合体の前述のポリペプチド鎖は同じでも異なっていてもよく、すなわち、ダイアボディ分子はホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよい。特定の態様では、「ダイアボディ分子」には二量体または四量体またはＶＬドメインとＶＨドメインの双方を含む前述のポリペプチド鎖が含まれる。多量体タンパク質を構成する個々のポリペプチド鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって多量体の少なくとも１つの他のペプチドと共有結合により連結されていてもよい。
【００５５】
本明細書において「障害」および「疾患」は互換的に用いられ、被験体の症状を意味する。特に、用語「自己免疫疾患」は用語「自己免疫障害」と互換的に用いられ、被験体自身の細胞、組織および／または器官に対する被験体の免疫反応に起因する細胞、組織および／または器官の損傷を特徴とする被験体の症状を意味する。用語「炎症性疾患」は用語「炎症性障害」と互換的に用いられ、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする被験体の症状を意味する。自己免疫障害は炎症を伴っても伴わなくてもよい。さらに、炎症は自己免疫障害に起因してもしなくてもよい。従って、特定の障害は自己免疫障害と炎症性障害の双方を特徴とする場合がある。
【００５６】
本明細書において「同一のポリペプチド鎖」とはまた、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を意味し、例えば、１以上のアミノ酸の相違を有するポリペプチド鎖、好ましくは２つのポリペプチド鎖の活性が有意に異ならないような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチド鎖が含まれる。
【００５７】
本明細書において「癌」とは、異常な無制御の細胞増殖から生じる新生物または腫瘍を意味する。本明細書において癌は、明確に白血病およびリンパ腫を含む。いくつかの実施形態では、癌は局在化したままの良性腫瘍を意味する。他の実施形態では、癌は、近傍の身体構造に侵入して破壊し、離れた部位に拡散する悪性腫瘍を意味する。いくつかの実施形態では、癌は特定の癌抗原を随伴する。
【００５８】
本明細書において「免疫調節剤」およびその変形は、宿主の免疫系を調節する薬剤を意味する。特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫抑制剤である。特定の他の実施形態では、免疫調節剤は免疫賦活剤である。免疫調節剤としては、限定されるものではないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、ミメティック剤および有機分子が挙げられる。
【００５９】
本明細書において「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性を有するポリペプチドまたはタンパク質または非タンパク質分子のフラグメントを意味する。免疫原性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントである。抗原性を有するエピトープは、当業者に周知の方法、例えばイムノアッセイにより確認されるような、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質のフラグメントである。抗原性エピトープは必ずしも免疫原性である必要はない。
【００６０】
本明細書において「フラグメント」とは、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、ポリペプチドのフラグメントは、そのポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【００６１】
本明細書において「核酸」および「ヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の組合せまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子の類似体を含む。このような類似体は、例えば、限定されるものではないが、イノシンまたはトリチル化塩基を含むヌクレオチド類似体を用いて作製することができる。このような類似体はまた、分子に例えばヌクレアーゼ耐性または細胞膜通過能の向上などの有益な属性を与える改変された骨格を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含み得る。核酸またはヌクレオチド配列は一本鎖または二本鎖であってもよいし、一本鎖部分と二本鎖部分の双方を含んでもよく、また、三本鎖部分を含んでもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６２】
本明細書において「治療上有効な量」とは、疾患または障害を治療または管理するのに十分な治療薬の量を意味する。治療上有効な量は、疾患の発症を遅延または最小化する、例えば、癌の拡散を遅延または最小化するのに十分な治療薬の量を意味する場合もある。治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える治療薬の量を意味する場合もある。さらに、本発明の治療薬に関して治療上有効な量は、疾患の治療または管理において治療上の利益を与える、単独でのまたは他の療法と組み合わせた治療薬の量を意味する。
【００６３】
本明細書において「予防薬」とは、障害の予防、または障害の再発もしくは拡散の予防に使用可能な薬剤を意味する。予防上有効な量は、過増殖性疾患、特に癌の再発または拡散、または患者（限定されるものではないが、過増殖性疾患の素因がある患者、例えば、遺伝的に癌の素因があるかまたは過去に発癌物質に曝された患者を含む）におけるそれらの発生を予防するのに十分な予防薬の量を意味する場合がある。予防上有効な量はまた、疾患の予防において予防上の利益を与える予防薬の量を意味する場合もある。さらに、本発明の予防薬に関して予防上有効な量は、疾患の予防において予防上の利益を与える、単独でのまたは他の薬剤と組み合わせた予防薬の量を意味する。
【００６４】
本明細書において「予防」とは、予防薬または治療薬の投与の結果としての、被験体における障害の１以上の症状の再発または発症の予防を意味する。
【００６５】
本明細書において「組み合わせて」は、２種以上の予防薬および／または治療薬の使用を意味する。用語「組み合わせて」の使用は、予防薬および／または治療薬を、障害のある被験体に投与する順序を制限するものではない。第１の予防薬または治療薬は、障害のある被験体に第２の予防薬または治療薬を投与する前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間または１２週間前）に、または第２の予防薬または治療薬の投与と同時に、または第２の予防薬または治療薬を投与した後（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間または１２週間後）に、投与することができる。
【００６６】
本明細書において「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域と、Ｆｃ受容体または抗原との相互作用によりもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity)（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用(antibody dependent cell mediated phagocytosis)（ＡＤＣＰ）、および補体依存性細胞傷害作用(complement dependent cytotoxicity)（ＣＤＣ）がある。エフェクター機能には、抗原の結合後に作用するものと、抗原結合とは無関係に作用するもの双方が含まれる。
【００６７】
本明細書において「エフェクター細胞」とは、１以上のＦｃ受容体を発現し、１以上のエフェクター機能を媒介する、免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞としては、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞があり、また、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むいずれの生物に由来してもよい。
【００６８】
本明細書において「免疫複合体と特異的に結合する」および類似の用語は、ある免疫複合体と特異的に結合するが、別の分子とは特異的に結合しない分子を意味する。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当技術分野で公知の他のアッセイにより測定した場合に、より低い親和性で他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅまたは当技術分野で公知の他の技術によって同定することができる。
【００６９】
本明細書において「安定な融合タンパク質」とは、当業者に公知の通常の生化学アッセイおよび機能アッセイを用いて評価した場合に、生産および／または保存中に受ける分解が最小限であるか検出可能なレベルではない融合タンパク質を意味し、生物学的活性（例えば、ＦｃγＲとの結合）の低下なく長期間保存することができる。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】ヒトＩｇＧ  ＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ領域のアミノ酸配列  図１Ａは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のヒンジドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１ヒンジドメイン（配列番号１）；ＩｇＧ２ヒンジドメイン（配列番号２）；ＩｇＧ３ヒンジドメイン（配列番号３）；ＩｇＧ４ヒンジドメイン（配列番号４））。図１Ａに示されるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ＥＵのナンバリングシステムに従って符番されている。アイソタイプ配列は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成している各ヒンジ領域の最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、ＩｇＧ１配列とアラインされる。
【図１Ｂ】ヒトＩｇＧ  ＣＨ１、ヒンジおよびＦｃ領域のアミノ酸配列  図１Ｂは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＦｃドメインのアミノ酸配列を示す（ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン（配列番号５）；ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（配列番号６）；ＩｇＧ３  Ｆｃドメイン（配列番号７）；ＩｇＧ４  Ｆｃドメイン（配列番号８））。図１Ｂに示されるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ＥＵのナンバリングシステムに従って符番されている。図１Ｂでは、ＣＨ２ドメイン中の残基を＋で示し、ＣＨ３ドメイン中の残基を〜で示す。
【図２】共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチド鎖の模式図  共有結合型二機能性ダイアボディのポリペプチドは、短いペプチドリンカーで隔てられた抗体ＶＬドメインと抗体ＶＨドメインからなる。８アミノ酸残基のリンカーは、一本鎖ポリペプチドが自己集合してｓｃＦｖ構築物となるのを妨げ、その代わりに、異なるポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインの間の相互作用が優先する。４つの構築物を作出した（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと記載されている）：構築物（１）（配列番号９）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み；構築物（２）（配列番号１１）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み；構築物（３）（配列番号１２）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含み；構築物（４）（配列番号１３）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣ）−ｃを含んだ。
【図３】アフィニティー精製されたダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  アフィニティー精製されたダイアボディに対して還元（レーン１〜３）または非還元（レーン４〜６）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。標準品のおよその分子量を（レーン３と４の間に）示す。レーン１および４はｈ３Ｇ８  ＣＭＤ；レーン２および５はｈ２Ｂ６  ＣＭＤ；レーン３および６はｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤを示す。
【図４Ａ】アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ分析  アフィニティー精製されたダイアボディに対してＳＥＣ分析を行った。既知の標準品、すなわち、全長ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）、ＩｇＧのＦａｂフラグメント（約５０ｋＤａ）およびｓｃＦｖ（約３０ｋＤａ）の溶出特性。
【図４Ｂ】アフィニティー精製されたダイアボディのＳＥＣ分析  アフィニティー精製されたダイアボディに対してＳＥＣ分析を行った。ｈ２ｂ６  ＣＭＤ、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの溶出特性。
【図５】ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合を、サンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ＣＤ１６Ａと結合するｈ３Ｇ８  ＣＭＤを対照として使用した。
【図６Ａ】ダイアボディの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ１６Ａ（陰性対照）に対する結合をＳＰＲ分析によりアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｓＣＤ１６に対する結合。ダイアボディは１００ＮＭの濃度で、ｓｃＦｖは２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍｌ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。
【図６Ｂ】ダイアボディの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ３２Ｂ（陰性対照）に対する結合をＳＰＲ分析によりアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｂ）ｓＣＤ３２Ｂに対する結合。ダイアボディは１００ＮＭの濃度で、ｓｃＦｖは２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍｌ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。
【図６Ｃ】ダイアボディの、ｓＣＤ３２Ａに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）に対する結合をＳＰＲ分析によりアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｃ）ｓＣＤ３２Ａに対する結合。ダイアボディは１００ＮＭの濃度で、ｓｃＦｖは２００ｎＭの濃度で、流速５０ｍｌ／分にて６０秒間、受容体表面に注入した。
【図７Ａ】ダイアボディの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合をＳＰＲ分析によってアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ａ）ｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合。ダイアボディは６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。
【図７Ｂ】ダイアボディの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤのｓＣＤ１６Ａに対する結合をＳＰＲ分析によってアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｂ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合。ダイアボディは６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。
【図７Ｃ】ダイアボディの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６  ＣＭＤの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合をＳＰＲ分析によってアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｃ）ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖの、ｓＣＤ１６Ａに対する結合。ダイアボディは６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。
【図７Ｄ】ダイアボディの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ３Ｇ８  ＣＭＤの、ｓＣＤ３２ＢＡに対する結合をＳＰＲ分析によってアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｄ）ｈ２Ｂ６  ＣＭＤの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合。ダイアボディは６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。
【図７Ｅ】ダイアボディの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析  ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合をＳＰＲ分析によってアッセイした。ｈ３Ｇ８  ｓｃＦｖも対照として試験した。（Ｅ）ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの、ｓＣＤ３２Ｂに対する結合。ダイアボディは６．２５〜２００ｎＭの濃度で、流速７０ｍｌ／分にて１８０秒間、受容体表面に注入した。
【図８】共有結合型二重特異性ダイアボディ分子を形成するための、ＶＬドメインとＶＨドメインを含むポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図  ＮＨ2およびＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖のＣ末端システイン残基を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖間を区別するためのものであり、特に前述のポリペプチド鎖のリンカー部分を表す。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図９】共有結合型二重特異性ダイアボディのＦｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図  本発明のダイアボディ分子のポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと記載されている）。構築物（５）（配列番号１４）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み；構築物（６）（配列番号１５）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−および第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端Ｆｃドメイン−ｃを含み；構築物（７）（配列番号１６）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端配列（ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ）（配列番号１７）−ｃを含み；構築物（８）（配列番号１８）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−および第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−およびヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン（アミノ酸置換Ａ２１５Ｖを有する）−ｃを含んだ。
【図１０】Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生されたものである：構築物１および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９とｐＭＧＸ６７４の同時トランスフェクション；構築物２および５をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６７とｐＭＧＸ６７６の同時トランスフェクション；構築物５および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７４とｐＭＧＸ６７６の同時トランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用いた。二次プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１１】二価の共有結合型ダイアボディを形成するために、それぞれ１つのＦｃドメインを含む、２つのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図  ＮＨ2およびＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Ｓは、各ポリペプチド鎖の第２のリンカー配列中のシステイン残基の間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖間を区別するためのものであり、特に前述のポリペプチド鎖の第１のリンカー部分を表す。ＣＨ２およびＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを表す。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１２】ヒンジ／Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、次の４つの組換え発現系により産生されたものである：構築物１および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４の同時トランスフェクション；構築物２および８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８の同時トランスフェクション；構築物７および６をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７４の同時トランスフェクション；構築物７および８をそれぞれ発現するｐＭＧＸ６７７＋ｐＭＧＸ６７８の同時トランスフェクション。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブは、ＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１３】四量体ダイアボディ分子を形成するためのポリペプチド鎖の相互作用を示す模式図  ＮＨ2およびＣＯＯＨは、それぞれ各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシ末端を表す。Ｓは、Ｆｃを持つ「重い」ポリペプチド鎖の第２のリンカー配列中のシステイン残基と、Ｆｃを持たない「軽い」ポリペプチド鎖のＣ末端配列中のシステイン残基との間の少なくとも１つのジスルフィド結合を表す。ＶＬおよびＶＨは、それぞれ軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを示す。点線および破線は、２つのポリペプチド鎖間を区別するためのものであり、特に前述の重鎖の第１のリンカー部分または前述の軽鎖のリンカーを表す。ＣＨ２およびＣＨ３は、ＦｃドメインのＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを表す。ｈ２Ｂ６  Ｆｖおよびｈ３Ｇ８  Ｆｖは、それぞれＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６に特異的なエピトープ結合部位を示す。
【図１４】共有結合型二重特異性ダイアボディを形成する、Ｆｃドメインを含むポリペプチド鎖の模式図  本発明のダイアボディ分子を形成するポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと記載されている）。構築物（９）（配列番号１９）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のヒンジ／Ｆｃドメイン−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−およびＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み；構築物（１０）（配列番号２０）は、ｎ−ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−およびＣ末端ＬＧＧＣ配列−ｃを含み；構築物（１１）（配列番号２１）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６（Ｇ１０５Ｃ）のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびアミノ酸置換Ａ２１５Ｖを有するヒトＩｇＧ１のＣ末端ヒンジ／Ｆｃドメイン−ｃを含み；構築物（１２）（配列番号２２）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６（Ｇ４４Ｃ）のＶＨドメイン−およびＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）配列−ｃを含んだ。
【図１５Ａ】親和性四量体ダイアボディのＳＤＳ−ＰＡＧＥ  構築物１０と１、構築物９と１、そして構築物１１と１２を発現するベクターで同時トランスフェクトされた組換え発現系によって産生されたダイアボディに対して、非還元的条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中のタンパク質はシンプリーブルーセーフステイン(Simply Blue Safestain)(Invitrogen)で可視化した。パネルでは、構築物１０と１、構築物９と１、そして構築物１１と１２Ａを含むダイアボディ分子がそれぞれレーン１、２および３である。
【図１５Ｂ】親和性四量体ダイアボディのウェスタンブロット分析  構築物１０と１、構築物９と１、そして構築物１１と１２を発現するベクターで同時トランスフェクトされた組換え発現系によって産生されたダイアボディに対して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｈ＋Ｌをプローブとして用いるウェスタンブロット分析を行った。パネルでは、構築物１０と１、構築物９と１、そして構築物１１と１２Ａを含むダイアボディ分子がそれぞれレーン１、２および３である。
【図１６】Ｆｃドメインと遺伝子工学的に作出された鎖間ジスルフィド結合を含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  Ｆｃドメインおよび、「軽い」ポリペプチド鎖と「重い」ポリペプチド鎖の間の、遺伝子工学的に作出されたジスルフィド結合を含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。アッセイしたダイアボディは、次の３つの組換え発現系により産生されたものである：構築物１と１０、構築物１と９、および構築物１１と１２をそれぞれ発現する系。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。ｈ３Ｇ８の結合を対照として用いた。
【図１７】ダイアボディ分子のポリタンパク質前駆体の模式図ならびにλ軽鎖および／またはヒンジドメインを含むポリペプチド鎖の模式図  本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチド構築物の模式図（各構築物は、構築物の左側のアミノ末端（「ｎ」）から図の右側のカルボキシ末端（「ｃ」）へと記載されている）。構築物（１３）（配列番号９５）は、ｎ−３Ｇ８のＶＬドメイン−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＬＧＧＣドメインを含んだ（配列番号９５をコードするヌクレオチド配列を配列番号９６に示す）。構築物（１４）（配列番号９７）は、ｎ−３Ｇ８のＶＬドメイン−第１のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−２．４Ｇ２ＶＨのＶＨドメイン−第２のリンカー（ＬＧＧＣ）−フューリン認識部位（ＲＡＫＲ（配列番号９３））−ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位−２．４Ｇ２のＶＬドメイン−第３のリンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１０）−３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＬＧＧＣドメインを含んだ（配列番号９７をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に示す）。構築物（１５）（配列番号９９）は、ｎ−Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ３Ｇ８のＶＨドメイン−およびＣ末端ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）ドメインを含んだ（配列番号９９をコードするヌクレオチド配列を配列番号１００に示す）。構築物（１６）（配列番号１０１）は、ｎ−Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン−リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０））−Ｈｕ２Ｂ６のＶＨドメイン−Ｃ末端ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）ドメインを含んだ（配列番号１０１をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０２に示す）。
【図１８】ポリタンパク質前駆体分子に由来するダイアボディ分子の、ｍＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  ポリタンパク質前駆体分子構築物１３（配列番号９５）に由来するダイアボディ分子の、マウスＣＤ３２Ｂ（ｍＣＤ３２Ｂ）および可溶性ＣＤ１６Ａ（ｓＣＤ１６Ａ）に対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイした。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブはビオチンコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。
【図１９】λ鎖および／またはヒンジドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合  ヒトλ軽鎖のＣ末端に由来するドメインおよび／またはＩｇＧのヒンジドメインを含むダイアボディ分子の、ｓＣＤ３２ＢおよびｓＣＤ１６Ａに対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡでアッセイし、構築物１および２を含むダイアボディ（図５）と比較した。アッセイしたダイアボディは、構築物１５および１６（それぞれ配列番号９９および配列番号１０１）を発現する組換え発現系により産生されたものである。ｓＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として使用した。二次プローブはＨＲＰコンジュゲートｓＣＤ１６Ａとした。小さな格子模様のバーは構築物１５／１６の組合せ物を表し、大きな格子模様のバーは構築物１／２の組合せ物を表す。
【図２０】細胞表面に位置するＣＤ３２Ｂおよびフルオレセインコンジュゲート分子に結合した２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴの模式図  この図は、ＤＡＲＴの「万能アダプター」である抗フルオレセインアームのフレキシビリティーならびにこの２Ｂ６アームの代わりに他の特異性を用いる可能性を示す。Ｖ領域を四角で示し、ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）リンカーを直線で示し、ジスルフィド結合を二本鎖の連結で示す。一方の鎖の構成要素を青色で示し、他方をピンク色で示す。Ｎはアミノ末端、Ｃはカルボキシ末端、ＦＬはフルオレセイン、ＶＬは軽鎖可変領域、ＶＨは重鎖可変領域である。
【図２１】（パネルＡおよびＢ）２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴはフルオレセインコンジュゲート分子に特異的に結合し、同時にＣＤ３２Ｂにも結合することができる  （Ａ）２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８を、ＦＩＴＣ−Ｓタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させた。２Ｂ６アームの結合および機能は、可溶性ＣＤ３２を結合させた後に、ＣＤ３２Ｂに特異的な抗体およびＨＲＰとコンジュゲートさせた検出用二次抗体を結合させることにより検出した。（Ｂ）２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８を、ＨｕＩｇＧまたはＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧ（フルオレセインコンジュゲート）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに結合させた。結合は、２Ｂ６  Ｆｖに特異的なポリクローナル血清と結合させた後に、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を結合させることにより検出した。
【図２２】（パネルＡおよびＢ）抗ヒトＣＤ７９Ｂ抗体を用いる、精製されたＢ細胞の活性化  精製されたＢ細胞は、漸増濃度のＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体ＣＢ３．１−ＦＩＴＣ（Ａ）またはＣＢ３．２−ＦＩＴＣ（Ｂ）とＦｃ特異的ＧＡＭ  ＩｇＧのＦ（ａｂ’）2フラグメント５０μｇ／ｍｌ（ｘ軸）を用いて活性化させた。Ｂ細胞は、ＰＢＳ（白いバー）または５μｇ／ｍｌのαＦＩＴＣαＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（黒いバー）もしくはαＣＤ１６αＣＤ３２ＢＤＡＲＴ（グレーのバー）の存在下で活性化させた。反応は３反復で行い、標準偏差を計算した。
【図２３】（パネルＡおよびＢ）精製されたＢ細胞の活性化  第２の健康ドナー由来の精製されたＢ細胞を、図２２パネルＢに記載したように活性化した。ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ７９ｂ抗体ＣＢ３．２−ＦＩＴＣの存在下で活性化された細胞において増殖指数（Ａ）を測定し、非標識ＣＢ３．２抗体の存在下で活性化された細胞の増殖指数（Ｂ）と比較した。
【図２４】（上のパネルおよび下のパネル）ＨＣＤ１６Ａ／ＢトランスジェニックマウスにおいてＭＧＤ２６１を用いるｉｎ  ｖｉｖｏマウスＢ細胞枯渇  ０、３、７、１０、１４および１７日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＭＧＤ２６１（１０、３、１もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ）または無関連抗体（１０ｍｇ／ｋｇのｈＥ１６）を静注した。１９日前（血液採取前）、４、１１、１８、２５および３２日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。週３回、動物の健康および活動を記録した。上のパネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８およびＷＮＶ  ｍＡｂ、下のパネル：ｈ２Ｂ６−３Ｇ８−ｈＣＤ１６Ａマウス、ｈ２Ｂ６−３Ｇ８−ｈＣＤ３２ＢマウスおよびＷＮＶ  ｍＡｂ−ｈＣＤ１６ＡマウスまたはＷＮＶ  ｍＡｂ−ｈＣＤ３２Ｂマウス。
【図２５】ｈＣＤ１６Ａ／Ｂトランスジェニックマウスにおいて２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢを用いるｉｎ  ｖｉｖｏマウスＢ細胞枯渇  ０、２、４、７、９、１１、１４、１６および１８日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスおよびｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ（７５μｇ／匹）またはＰＢＳをＩＰ（腹腔内）注射した。１０日前（血液採取前）、４、１１および１８日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。週３回、動物の健康および活動を記録した。
【図２６】ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉの静脈内（ＩＶ）モデルを用いるＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性の実証  ０日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーの１２〜２０週齢のｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５×１０6個のＲａｊｉ細胞を静注した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７および３０日目に、マウスにまた２５０、２５または２．５μｇのＭＧＤ２６１またはＰＢＳ（陰性対照）の腹腔内（ＩＰ）処置も行った。その後、マウスを毎日観察し、週２回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。
【図２７】非哺乳動物宿主におけるＤＡＲＴ発現  ＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、ａｍｐ耐性コロニーを培養液の播種に用いた。培養物が０．５ＯＤ６００単位に達したところで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。この培養物を３０℃で２時間増殖させ、無細胞培地を回収した。
【図２８】ＤＡＲＴ  ＥＬＩＳＡ  ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いて、ｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴ結合ＥＬＩＳＡを行った。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
【図２９】ＤＡＲＴにより誘導されるヒトＢ細胞の細胞死  ヒトＰＢＭＣを示した分子とともに一晩インキュベートした。アポトーシスは、ＦＡＣＳ分析により、ゲート設定されない総ＦＳＣ／ＳＳＣ細胞集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ+アネキシンＶ+集団のパーセンテージとしてアッセイした。
【図３０】８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ構築物  本発明を例示するために、複数種の８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ構築物を作製した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、構築物５および６、または６および７、または８および９、または９および１０によりコードされる発現プラスミドを、ＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトし、抗ｆｌａｇタグを伴うかまたは伴わない８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを発現させた。３日毎に３回、細胞馴化培地を回収した。その後、この細胞馴化培地を、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて精製した。
【図３１】８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ  ＥＬＩＳＡ  ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いて、８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ／ｃｈ８ｂ５競合ＥＬＩＳＡを行った。反応後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間のインキュベーション後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーおよびＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
【図３２】四価ＤＡＲＴ構造の模式図  ４本のポリペプチド鎖の集合により作製されたＤＡＲＴ種の一般構造を示す。Ｉｇ様ＤＡＲＴの４つの抗原結合ドメインを縞模様と濃い灰色の楕円で示す。
【図３３】Ｉｇ様四価ＤＡＲＴ  Ｉｇ様四価ＤＡＲＴのエピトープ結合部位の模式図を示す。
【図３４】ｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａ結合ＥＬＩＳＡ  実施例６．１０のＩｇ様四価ＤＡＲＴ種が、対照（ｃｈ−ｍＣＤ３２  ｍＡｂ）抗体または他のＤＡＲＴ種よりも大きな親和性で抗原と結合することを示すＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３５】Ｉｇ  ＤＡＲＴ分子の模式図  Ｉｇ  ＤＡＲＴ分子の模式図を示す。特異性を影付き、模様または白色の領域で示し、定常領域を黒色で示し、ジスルフィド結合を黒い点線で示す。全てのタンパク質鎖のＮ末端が図の上に向き、全てのタンパク質鎖のＣ末端が図の下に向いている。図Ａ〜Ｅは二重特異性であり、図Ｆ〜Ｊは三重特異性である。図ＡおよびＥは四価である。図Ｂ、Ｃ、Ｆ、ＩおよびＪは六価である。図Ｄ、ＧおよびＨは八価である。個々のドメインの詳細な説明については、図１、２、９、１４および１７ならびに第３．１節を参照。
【図３６】Ｈｕ２Ｂ６  ４．５−Ｈｕ３Ｇ８  ５．１二重特異性ダイアボディの結合能  図３６は、Ｈｕ２Ｂ６  ４．５−Ｈｕ３Ｇ８  ５．１二重特異性ダイアボディ（四角）の、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ１６ａに対する結合能をＨｕ２Ｂ６  ４．５またはＨｕ３Ｇ８  ５．１ダイアボディ（三角）と比較して示す。
【図３７】ＥコイルおよびＫコイルＤＡＲＴ誘導体の模式図  図３７は、ＥコイルおよびＫコイルＤＡＲＴ誘導体の一般コンフォメーションを示す。
【図３８】好ましいＥコイルおよびＫコイルセパレーターのヘリックス配置  図３８は、好ましい「Ｅコイル」配列（ＥＶＡＡＬＥＫ）4（配列番号２９９）および好ましい「Ｋコイル」配列（ＫＶＡＡＬＫＥ）4（配列番号３００）のヘリックス配置を示す。
【図３９】ＥコイルおよびＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体  図３９は、鎖交換によって形成され得るＥコイルおよびＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体の様々な種類を示す。
【図４０】ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦｃ含有誘導体に対するサイズ排除クロマトグラフィー  図４０は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦｃ含有誘導体に対するサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。このような分子のうち次の４種を分析したところ、全てがＥコイルとＫコイルを持っていた：ＥＫ（Ｆｃ領域不含）２．１ｍｇ；ＥＦｃ／Ｋ（ＦｃがＥコイルに連結されている）２．７ｍｇ；Ｅ／ＫＦｃ（ＦｃがＫコイルに連結されている）１．８ｍｇ；ＥＦｃ／ＫＦｃ（Ｆｃが同じＤＡＲＴのＫコイルおよびＥコイルに連結されている）２．０ｍｇ。
【図４１】産生した二量体分子の構造  図４１は、図４０のサイズ排除クロマトグラフィーで同定された、産生した二量体分子の考えられ得る構造を示す。
【図４２】ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦＣ含有誘導体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析  図４２は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦｃ含有誘導体のサイズ排除クロマトグラフィー（図４０）から得られた画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を示す。隣接レーン：分子マーカー対照；レーン１：ＥＫ（Ｆｃ領域不含）；レーン２：ＥＦｃ／Ｋ、凝集体画分；レーン３：ＥＦｃ／Ｋ、単量体画分；レーン４：Ｅ／ＫＦｃ、凝集体画分；レーン５：Ｅ／ＫＦｃ、単量体画分；レーン６：ＥＦｃ／ＫＦｃ、凝集体画分；レーン７：ＥＦｃ／ＫＦｃ、二量体画分；レーン８：ＥＦｃ／ＫＦｃ、単量体画分。
【図４３】二重特異的結合ＥＬＩＳＡ分析  図４３は、Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／ＫまたはＥ／ＫＦｃ）、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ、対照およびＥＦｃ／ＫＦｃ  ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体を比較する二重特異的結合ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４４】ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦＣ含有誘導体のＴ細胞増殖阻害能  図４４は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルおよび／またはＫコイルＦｃ含有誘導体のＴ細胞増殖阻害能を示す。
【図４５】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴ  図４５は、ｈＣＤ１６抗原とｈＣＤ３２Ｂ抗原と免疫反応性のある組換え二重特異性ＤＡＲＴと融合された連鎖球菌Ｇタンパク質のＡＢＤ３ドメインから構成される組換え抗体分子ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの模式図を示す。
【図４６Ａ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬ濃度のＣＤ１６抗原でコーティングした。２μｇ／ｍＬで始め、様々な濃度のｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）および対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ（○）を結合させた。ビオチン化ｓＣＤ３２Ｂ抗原をプレートに加えた後に、検出のためにＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを加えた。
【図４６Ｂ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍＬ濃度のヒト血清アルブミンでコーティングした。２μｇ／ｍＬで始め、様々な濃度のｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（■）および対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ（○）を結合させた。ビオチン化ｓＣＤ３２Ｂ抗原をプレートに加えた後に、検出のためにＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを加えた。
【図４６Ｃ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｃは、ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６ＡおよびＨＳＡに同時に結合できることを示す。
【図４６Ｄ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｄは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｅ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｅは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｆ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｆは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｇ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｇは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｈ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｈは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｉ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｉは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合誘導体が可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）と可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）に対して同等の結合を示すことが分かったことを示す。
【図４６Ｊ】ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの結合親和性  図４６Ｊは、ＤＡＲＴ  ＡＢＤ融合体がその親ＤＡＲＴの二重特異的結合性を保持し、ｓＣＤ１６ＡおよびＣＤ３２Ｂとの結合を示し、この結合がヒト血清アルブミンの存在によって影響を受けなかったことを示す。
【図４７Ａ】ＤＡＲＴタンパク質の細胞傷害性  図４７Ａは、ＰＢＭＣにより媒介される、ＤＡＲＴタンパク質の細胞傷害性を示す。ＡＤＣＣアッセイは、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣとともにインキュベートしたヒトＢ細胞株Ｄａｕｄｉを標的細胞として用いて行った。各アッセイは、エフェクター：標的比２０：１および一定の抗体価にて３反復で行った：ｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ（●）およびｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴ（■）。細胞媒介性細胞傷害性は、ＬＤＨ放出アッセイにより測定した。１０0において下に来る曲線がｈＣＤ１６Ａ−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴ（■）である。
【図４７Ｂ】ＤＡＲＴタンパク質の細胞傷害性  図４７Ｂは、ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴがＣＤ１６Ｂ発現エフェクター細胞と結合し、それにより、このような細胞を動員して、ＣＤ３２Ｂを発現する細胞を死に至らせる（再指向細胞死による）ことを示す。
【図４８】Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおけるｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの改良された薬物動態特性  マウス（ｎ＝３）に、５ｍｇ／ｋｇの（Ａ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴ（●）および（Ｂ）ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ（▲）の静注を１回行った。種々の時点でマウス血清を採取し、血清中のタンパク質濃度をＥＬＩＳＡにより定量した。薬物動態の計算はＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ５．１を用いて行った。
【図４９Ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＢＤ−ＤＡＲＴの生物活性  図４９Ａは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴがマウスへの投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生物活性を保持し発現することを示す。ＡＢＤ−ＤＡＲＴまたはその親ＤＡＲＴをＴｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスに１回投与すると、Ｔ細胞（図４９Ｂ）またはＰＭ細胞（図４９Ｃ）の密度に影響を及ぼさずに、Ｂ細胞（図４９Ａ）の密度を選択的に阻害することができることが分かった。
【図４９Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＢＤ−ＤＡＲＴの生物活性  図４９Ｂは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴがマウスへの投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生物活性を保持し発現することを示す。ＡＢＤ−ＤＡＲＴまたはその親ＤＡＲＴをＴｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスに１回投与すると、Ｔ細胞（図４９Ｂ）またはＰＭ細胞（図４９Ｃ）の密度に影響を及ぼさずに、Ｂ細胞（図４９Ａ）の密度を選択的に阻害することができることが分かった。
【図４９Ｃ】ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＢＤ−ＤＡＲＴの生物活性  図４９Ｃは、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴがマウスへの投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生物活性を保持し発現することを示す。ＡＢＤ−ＤＡＲＴまたはその親ＤＡＲＴをＴｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスに１回投与すると、Ｔ細胞（図４９Ｂ）またはＰＭ細胞（図４９Ｃ）の密度に影響を及ぼさずに、Ｂ細胞（図４９Ａ）の密度を選択的に阻害することができることが分かった。
【図５０Ａ】ＨＥＲ２低発現細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＴＣＲｂ  ＤＡＲＴの活性  Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の細胞傷害性媒介能を、低レベルのＨＥＲ２発現を示す（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による治療に不応である）と事前に同定されている複数の乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株で試験した。供試乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２  ２＋）である。
【図５０Ｂ】ＨＥＲ２低発現細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＴＣＲｂ  ＤＡＲＴの活性  Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の細胞傷害性媒介能を、低レベルのＨＥＲ２発現を示す（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による治療に不応である）と事前に同定されている複数の乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株で試験した。供試乳癌細胞株はＭＣＦ−７（ＨＥＲ２  １＋）である。
【図５０Ｃ】ＨＥＲ２低発現細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＴＣＲｂ  ＤＡＲＴの活性  Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の細胞傷害性媒介能を、低レベルのＨＥＲ２発現を示す（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による治療に不応である）と事前に同定されている複数の乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株で試験した。供試乳癌細胞株はＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）である。
【図５０Ｄ】ＨＥＲ２低発現細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＴＣＲｂ  ＤＡＲＴの活性  Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の細胞傷害性媒介能を、低レベルのＨＥＲ２発現を示す（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による治療に不応である）と事前に同定されている複数の乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株で試験した。供試非乳癌細胞株はＨＴ−２９（結腸癌細胞株）である。
【図５０Ｅ】ＨＥＲ２低発現細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２×ＴＣＲｂ  ＤＡＲＴの活性  Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の細胞傷害性媒介能を、低レベルのＨＥＲ２発現を示す（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による治療に不応である）と事前に同定されている複数の乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株で試験した。供試非乳癌細胞株はＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）である。
【図５１Ａ】ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイルポリペプチドおよび４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製  図５１Ａは、ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイルポリペプチドおよび４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製を示す。
【図５１Ｂ】ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイルポリペプチドおよび４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製  図５１Ｂは、ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイルポリペプチドおよび４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドの精製を示す。
【図５２】ＫＹＫ２−４４２０  ＶＦ  ＤＡＲＴの結合特異性  図５２は、ＫＹＫ２−４４２０  ＶＦ  ＤＡＲＴの結合特異性を示す。
【図５３】プラスミドｐＰＡＬ７  Ｋコイル−ＡＢＤの構築  図５３は、プラスミドｐＰＡＬ７  Ｋコイル−ＡＢＤの構築の模式図を示す。
【図５４】ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂により精製されたＫコイルＡＢＤタンパク質のウエスタンブロット分析  図５４は、ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂により（１０ｍｌ培養物から小スケールで）精製されたＫコイルＡＢＤタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。レーン１および５：未精製溶解液；レーン２および６：フロースルー画分；レーン３、４、８および９：精製タンパク質；レーン７：マーカー。一次抗体：ウサギポリクローナル抗ＥＫ抗体；二次抗体：抗ウサギＨＲＰ。
【図５５】ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂により精製されたＫコイルＡＢＤタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析  図５５は、ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂から溶出した画分に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。Ｌ：未精製大腸菌溶解液；ＦＴ：フロースルー画分；Ｗ：洗液；Ｍ：マーカー。
【図５６Ａ】デュアルアフィニティーＥＬＩＳＡによるＫＹＫ２  ４４２０  ＥＫ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴの結合  図５６Ａは、ＫＹＫ２−４４２０  ＶＦ  ＤＡＲＴがＫコイル−ＡＢＤ分子と複合体を形成して、改良された特性を有するＥコイル−ＫコイルＡＢＤ  ＤＡＲＴを形成することを示すＥＬＩＳＡ結果を示す。図５６Ａ：ＮＫＧ２Ｄ  Ｆｃで捕捉され、ビオチン化モノクローナル抗ＥＫ抗体で検出されたＤＡＲＴ。このＥＬＩＳＡ結果は、該複合体中の全てのドメインがそのリガンドに結合し得ることを示す。
【図５６Ｂ】デュアルアフィニティーＥＬＩＳＡによるＫＹＫ２  ４４２０  ＥＫ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴの結合  図５６Ｂは、ＫＹＫ２−４４２０  ＶＦ  ＤＡＲＴがＫコイル−ＡＢＤ分子と複合体を形成して、改良された特性を有するＥコイル−ＫコイルＡＢＤ  ＤＡＲＴを形成することを示すＥＬＩＳＡ結果を示す。図５６Ｂ：モノクローナル抗ＥＫ抗体で捕捉され、ＨＲＰ−ヒトアルブミンで検出されたＤＡＲＴ。このＥＬＩＳＡ結果は、該複合体中の全てのドメインがそのリガンドに結合し得ることを示す。
【図５６Ｃ】デュアルアフィニティーＥＬＩＳＡによるＫＹＫ２  ４４２０  ＥＫ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴの結合  図５６Ｃは、ＫＹＫ２−４４２０  ＶＦ  ＤＡＲＴがＫコイル−ＡＢＤ分子と複合体を形成して、改良された特性を有するＥコイル−ＫコイルＡＢＤ  ＤＡＲＴを形成することを示すＥＬＩＳＡ結果を示す。図５６Ｃ：ＮＫＧ２Ｄ  Ｆｃで捕捉され、ビオチン化抗ＦＩＴＣ抗体で検出されたＤＡＲＴ。このＥＬＩＳＡ結果は、該複合体中の全てのドメインがそのリガンドに結合し得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
５．好ましい実施形態の説明
ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖はＶＬドメインとＶＨドメインを含み、それらはドメインの自己集合が起こらないように共有結合により連結されている。これらのポリペプチド鎖の２つの相互作用により２つのＶＬ−ＶＨ対合が生じ、２つのエピトープ結合部位、すなわち、二価分子を形成する。ＶＨドメインまたはＶＬドメインはポリペプチド鎖内のどの位置にも拘束されず（すなわち、アミノ（Ｎ）末端またはカルボキシ（Ｃ）末端に制限されない）、また、そのドメインは互いの相対的位置に制限されることもない（すなわち、ＶＬドメインがＶＨドメインのＮ末端側にあってもよいし、その逆であってもよい）。唯一の制限は、機能的なダイアボディを形成するために、相補的ポリペプチド鎖が利用可能であるということである。ＶＬドメインとＶＨドメインが同じ抗体に由来する場合、この２本の相補的ポリペプチド鎖は同一であり得る。例えば、結合ドメインがエピトープＡに特異的な抗体に由来する場合（すなわち、結合ドメインがＶＬA−ＶＨA相互作用から形成される場合）には、各ポリペプチドはＶＨAおよびＶＬAを含む。抗体の２つのポリペプチド鎖のホモ二量体形成は２つのＶＬA−ＶＨA結合部位の形成をもたらし、その結果、二価の単一特異性抗体が生じる。ＶＬドメインとＶＨドメインが異なる抗原に特異的な抗体に由来する場合、機能的な二重特異性ダイアボディの形成には、異なる２本のポリペプチド鎖の相互作用、すなわち、ヘテロ二量体の形成が必要となる。例えば、二重特異性ダイアボディの場合、１本のポリペプチド鎖がＶＬAおよびＶＬBを含み、このポリペプチド鎖のホモ二量体形成が、結合がないまたは予測できない結合の、２つのＶＬA−ＶＨB結合部位の形成をもたらす。これに対して、２つの異なるポリペプチド鎖が、例えば組換え発現系において自由に相互作用できる場合、一方はＶＬAとＶＨBを含み、他方はＶＬBとＶＨAを含む、２つの異なる結合部位、すなわち、ＶＬA−ＶＨAおよびＶＬB−ＶＨBを形成する。全てのダイアボディポリペプチド鎖対に関して、２つのポリペプチド鎖のアライメントミスまたは結合ミス、すなわち、ＶＬ−ＶＬドメインまたはＶＨ−ＶＨドメインの相互作用の可能性があり得るが、機能的なダイアボディの精製は、当技術分野で公知のまたは本明細書で例示される方法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）に基づく親和性を用い、適切に二量体形成した結合部位の免疫特異性に基づいて容易に行うことができる。
【００７２】
他の実施形態では、ダイアボディの１以上のポリペプチド鎖はＦｃドメインを含む。ダイアボディ分子のポリペプチド鎖におけるＦｃドメインは優先的に二量体を形成し、その結果、免疫グロブリン様の特性（例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用）を示すダイアボディ分子の形成をもたらす。Ｆｃを含むダイアボディは、例えば、それぞれがＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびＦｃドメインを含む２本のポリペプチド鎖からなる二量体であり得る。前述のポリペプチド鎖の二量体形成により、非改変型二価抗体の構造とは異なる構造であるにもかかわらず、Ｆｃドメインを含む二価のダイアボディが生じる（図１１）。このようなダイアボディ分子は、野生型免疫グロブリンと比較すると、例えば、血清半減期や結合特性の変化といった表現型の変化を示す。他の実施形態では、Ｆｃドメインを含むダイアボディ分子は四量体であってもよい。このような四量体は、２本の「重い」ポリペプチド鎖、すなわち、ＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインを含むポリペプチド鎖と、２本の「軽い」ポリペプチド鎖、すなわち、ＶＬおよびＶＨを含むポリペプチド鎖とを含む。前述の軽い鎖および重い鎖は相互作用して単量体を形成し、これらの単量体は、それらの対合していないＦｃドメインを介して相互作用してＩｇＧ様分子を形成する。このようなＩｇ様ダイアボディは四価であり、単一特異性、二重特異性または四重特異性であり得る。
【００７３】
ダイアボディ分子の少なくとも２つの結合部位は、同じまたは異なるエピトープを認識できる。異なるエピトープは、同じ抗原に由来しても異なる抗原に由来してもよい。一実施形態では、エピトープは異なる細胞に由来する。別の実施形態では、エピトープは同じ細胞またはウイルス上の細胞表面抗原である。エピトープ結合部位は、抗体の生成が可能な抗原はいずれも認識できる。例えば、タンパク質、核酸、細菌毒素、細胞表面マーカー、自己免疫マーカー、ウイルスタンパク質、薬物などが挙げられる。特定の態様では、ダイアボディの少なくとも１つのエピトープ結合部位は、Ｂ細胞もしくはＴ細胞、貪食細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または樹状細胞などの特定の細胞上の抗原に対して特異的である。
【００７４】
ダイアボディのポリペプチド鎖の各ドメイン、すなわち、ＶＬ、ＶＨおよびＦCドメインはペプチドリンカーによって隔てられていてもよい。ペプチドリンカーは、０、１、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸であり得る。特定の実施形態では、アミノ酸リンカー配列は、核酸配列（配列番号７４）によりコードされているＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）である。
【００７５】
特定の実施形態では、ダイアボディ分子の各ポリペプチド鎖は少なくとも１個のシステイン残基を含むように操作され、このシステイン残基は、本発明の第２のポリペプチド鎖上の少なくとも１個のシステイン残基における対応物と相互作用して、鎖間ジスルフィド結合を形成する。該鎖間ジスルフィド結合はダイアボディ分子を安定化させる働きをし、組換え系における発現および回収を改善し、その結果、安定かつ一貫性のある調製物をもたらすとともに、単離および／または精製された産物のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を改善する。該少なくとも１個のシステイン残基は、単一のアミノ酸として、またはより長いアミノ酸配列（例えばヒンジドメイン）の一部として、ポリペプチド鎖の任意の部分に導入することができる。特定の実施形態では、該少なくとも１個のシステイン残基をポリペプチド鎖のＣ末端に存在するように操作される。いくつかの実施形態では、該少なくとも１個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖のアミノ酸配列ＬＧＧＣ内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、アミノ酸配列ＬＧＧＣを含む。別の実施形態では、該少なくとも１個のシステイン残基は、ポリペプチドの、例えば配列番号１または配列番号４の、ヒンジドメインを構成するアミノ酸配列内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、ＩｇＧのヒンジドメインのアミノ酸配列、例えば配列番号１を含む。別の実施形態では、本発明のダイアボディ分子のポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７８）によりコードされ得るアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含む。他の実施形態では、該少なくとも１個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖のヌクレオチド配列（配列番号７６）によりコードされ得るアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７６）によりコードされ得るアミノ酸配列ＬＧＧＣＦＮＲＧＥＣ（配列番号１７）を含む。さらに他の実施形態では、該少なくとも１個のシステイン残基は、ポリペプチド鎖の、ヌクレオチド配列（配列番号７５）によりコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）内に導入される。特定の実施形態では、本発明のダイアボディを構成するポリペプチド鎖のＣ末端は、ヌクレオチド配列（配列番号７５）によりコードされ得るアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含み、各ポリペプチド鎖はアミノ酸配列ＬＧＧＣを含み、かつ、前述のＬＧＧＣ配列中のシステイン残基間のジスルフィド結合により共有結合されている。別の特定の実施形態では、ダイアボディ分子は少なくとも２本のポリペプチド鎖を含み、そのうち１つは配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含み、他のものはヒンジドメイン（少なくとも１個のシステイン残基を含む）を含み、この場合、該少なくとも２本のポリペプチド鎖は、ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）中のシステイン残基とヒンジドメイン中のシステイン残基の間でジスルフィド結合によって共有結合されている。特定の態様では、ヒンジドメイン中に存在してジスルフィド結合に関与するシステイン残基はＣｙｓ−１２８（Ｋａｂａｔ  ＥＵによる符番；非改変型の完全ＩｇＧ重鎖のヒンジドメイン中に位置する）であり、配列番号２３中の対応するシステイン残基はＣｙｓ−２１４（Ｋａｂａｔ  ＥＵによる符番；非改変型の完全ＩｇＧ軽鎖のＣ末端に位置する）である（Elkabetzら(2005) “Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains,” J. Biol. Chem. 280:14402-14412;参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。さらに他の実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基を、アミノ酸鎖のＮ末端に存在するように操作する。さらに他の実施形態では、少なくとも１個のシステイン残基を、ダイアボディ分子のポリペプチド鎖のリンカー部分に存在するように操作する。さらなる実施形態では、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを、親ＶＨドメインまたはＶＬドメインと比較して少なくとも１個のアミノ酸の改変を含むように操作し、その結果、該アミノ酸改変は、親アミノ酸のシステインによる置換を含む。
【００７７】
本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部（例えば、ＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。Ｆｃドメインまたはその一部は、限定されるものではないがＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む、いずれの免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来してもよい。好ましい実施形態では、Ｆｃドメイン（またはその一部）はＩｇＧに由来する。特定の実施形態では、ＩｇＧアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらのアロタイプである。一実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃドメインを含み、該Ｆｃドメインは、任意の免疫グロブリンアイソタイプから独立に選択されるＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む（すなわち、ＦｃドメインはＩｇＧに由来するＣＨ２ドメインとＩｇＥに由来するＣＨ３ドメイン、またはＩｇＧ１に由来するＣＨ２ドメインとＩｇＧ２に由来するＣＨ３ドメインなどを含む）。該Ｆｃドメインは、本発明のダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖において、該ポリペプチド鎖の他のドメインまたは部分に対していずれの位置にも遺伝子工学的に導入することができる（例えば、Ｆｃドメインもしくはその一部が、ポリペプチド鎖のＶＬおよびＶＨの両ドメインのＣ末端にあってもよく、ＶＬおよびＶＨの両ドメインのＮ末端にあってもよく、または一方のドメインのＮ末端、他方のドメインのＣ末端に（すなわち、ポリペプチド鎖の２つのドメインの間に）あってもよい）。
【００７８】
本発明はまた、ヒンジドメインを含む分子も包含する。ヒンジドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む、いずれの免疫グロブリンのアイソタイプまたはアロタイプに由来してもよい。好ましい実施形態では、ヒンジドメインはＩｇＧに由来し、そのＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、またはそれらのアロタイプである。該ヒンジドメインは、ダイアボディ分子を構成するポリペプチド鎖にＦｃドメインとともに遺伝子工学的に導入することができ、その結果、該ダイアボディ分子はヒンジ−Ｆｃドメインを含む。特定の実施形態では、ヒンジおよびＦｃドメインは、当技術分野で公知のまたは本明細書で例示される任意の免疫グロブリンアイソタイプから独立に選択される。他の実施形態では、このヒンジとＦｃドメインは、ポリペプチド鎖の少なくとも１つの他のドメイン、例えば、ＶＬドメインにより隔てられている。ヒンジドメインまたは場合によりヒンジ−Ｆｃドメインを、本発明のポリペプチドにおいて、前述のポリペプチド鎖の他のドメインまたは一部に対していずれの位置にも遺伝子工学的に導入することができる。特定の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖はヒンジドメインを含み、このヒンジドメインは、Ｆｃドメインを含まないポリペプチド鎖のＣ末端に存在する。さらに他の実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のＣ末端に存在するヒンジ−Ｆｃドメインを含む。さらなる実施形態では、本発明のポリペプチド鎖は、ポリペプチド鎖のＮ末端に存在するヒンジ−Ｆｃドメインを含む。
【００７９】
上述のように、本発明は、各ポリペプチド鎖がＶＨドメインとＶＬドメインを含むポリペプチド鎖の多量体を包含する。特定の態様において、該多量体のポリペプチド鎖はＦｃドメインをさらに含む。Ｆｃドメインの二量体形成は、免疫グロブリン様機能、すなわち、Ｆｃ媒介機能（例えば、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、補体結合など）を示すダイアボディ分子の形成をもらたす。特定の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬおよびＶＨドメインは同じ特異性を有し、該ダイアボディ分子は二価であり、かつ、単一特異性である。他の実施形態では、各ポリペプチド鎖を構成するＶＬおよびＶＨドメインは異なる特異性を有し、該ダイアボディは二価であり、かつ、二重特異性である。
【００８０】
さらに他の実施形態において、本発明のダイアボディ分子は、各ポリペプチド鎖がＶＨドメインとＶＬドメインを含むポリペプチド鎖の四量体を包含する。特定の実施形態では、四量体の２つのポリペプチド鎖はさらにＦｃドメインを含む。従って、四量体は、それぞれがＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインを含む２本の「重い」ポリペプチド鎖と、ＶＬおよびＶＨドメインを含む２本の「軽い」ポリペプチド鎖を含む。重鎖と軽鎖の相互作用による二価単量体の形成は、重鎖のＦｃドメインによる該単量体の二量体形成と相まって、四価の免疫グロブリン様分子の形成をもたらす（実施例６．２および６．３に例示）。特定の態様では、これらの単量体は同一であり、四価のダイアボディ分子は単一特異性または二重特異性である。他の態様では、これらの単量体は異なり、四価の分子は二重特異性または四重特異性である。
【００８１】
上記の四重特異性ダイアボディ分子の形成は、４本の異なるポリペプチド鎖の相互作用を必要とする。そのような相互作用を単細胞組換え生産系で効率的に達成することは、鎖の潜在的な誤対合による多数の変異体のために困難である。誤対合の可能性の増大に対する１つの解決策は、所望のポリペプチド鎖対に「ノブ・イン・ホール(knobs-into-holes)」型突然変異を遺伝子工学的に導入することである。このような突然変異には、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成が好都合である。例えば、Ｆｃ−Ｆｃ相互作用に関して、アミノ酸置換（好ましくは、「ノブ」を形成する嵩高の側基を含むアミノ酸、例えばトリプトファンによる置換）をＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインに導入し、それにより、立体障害が類似の変異を有するドメインとの相互作用を妨げ、かつ、立体障害がその変異型ドメインを、相補的または適合する突然変異、すなわち、「ホール」（例えばグリシンによる置換）が遺伝子工学的に導入されたドメインと強制的に対合させるようにすることができる。このような突然変異のセットは、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれの対にも遺伝子工学的に導入することができ、さらに、そのような対のポリペプチド鎖のいずれの部分にも遺伝子工学的に導入することができる。ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成に有利なタンパク質操作の方法、特に免疫グロブリン様分子の操作については、当技術分野で周知であり、本明細書に包含される（例えば、Ridgwayら(1996) “'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621、Atwellら(1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35、およびXieら(2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101参照、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【００８２】
本発明はまた、変異型Ｆｃドメインもしくは変異型ヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ分子も包含し、この変異型Ｆｃドメインは、対応する野生型のＦｃドメインもしくはヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）と比較して、少なくとも１個のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、欠失）を含む。変異型のＦｃドメインもしくはヒンジ−Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む分子（例えば、抗体）は、野生型のＦｃドメインもしくはヒンジ−Ｆｃドメインまたはその一部を含む分子と比較して、通常は表現型の変化を示す。変異型の表現型は、ＮＫ依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされるような、血清半減期の変化、安定性の変化、細胞性酵素に対する感受性の変化、またはエフェクター機能の変化として発現される場合がある。エフェクター機能を変化させることが確認されたＦｃドメイン変異体は、国際公開第０４／０６３３５１号、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号、米国仮出願第６０／６２６，５１０号（２００４年１１月１０日出願）、同第６０／６３６，６６３号（２００４年１２月１５日出願）および同第６０／７８１，５６４号（２００６年３月１０日出願）、ならびに本発明者の同時出願である米国特許出願公開第１１／２７１，１４０号（２００５年１１月１０日出願）および同第１１／３０５，７８７号（２００５年１２月１５日出願）に開示されており、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
【００８３】
本発明の二重特異性ダイアボディは、２つの独立した、異なるエピトープに同時に結合することができる。特定の実施形態では、エピトープは同じ抗原に由来する。他の実施形態では、エピトープは異なる抗原に由来する。好ましい一実施形態では、少なくとも１つのエピトープ結合部位が、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または他の単核細胞で発現され、免疫エフェクター細胞上で発現される決定因子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４など）に特異的である。一実施形態において、ダイアボディ分子は、エフェクター細胞の決定因子に結合し、また該エフェクター細胞を活性化する。これに関して、本発明のダイアボディ分子は、それらがさらにＦｃドメインを含んでいるかどうかとは無関係に、Ｉｇ様機能を示すことができる（例えば、当技術分野で公知の、または本明細書に例示される任意のエフェクター機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）でアッセイされる）。特定の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディは、腫瘍細胞上の癌抗原とエファクター細胞の決定因子の双方に結合すると同時に該細胞を活性化させる。別の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は、上記（背景技術の節を参照）のように、同じ細胞上の活性化受容体と阻害型受容体に同時に結合し（例えば、ＣＤ３２ＡとＣＤ３２Ｂの双方、ＢＣＲとＣＤ３２Ｂの双方、またはＩｇＥＲＩとＣＤ３２Ｂの双方に結合する）、それらを連結することによって、標的（例えばエフェクター）細胞の活性化を阻害することができる。本実施形態のさらなる態様において、二重特異性ダイアボディは、ウイルス上の２つの中和エピトープ（例えば、ＲＳＶエピトープ；Ｅ１６およびＥ５３のようなＷＮＶエピトープ）に同時に結合することによって、抗ウイルス性を示すことができる。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明の二重特異性ダイアボディ分子は、特定の細胞種を標的とするための独特な機会を提供する。例えば、二重特異性ダイアボディまたはダイアボディ分子は、標的細胞種または標的組織種に独特な抗原のセットを認識するエピトープ結合部位の組合せを含むように操作することができる。さらに、個々の抗原の一方または双方が、他の組織種および／または細胞種においてそれぞれかなり一般的なものである場合には、低親和性結合ドメインを用いて、ダイアボディまたはダイアボディ分子を構築することができる。このような低親和性結合ドメインは、治療目的に十分な結合力で個々のエピトープまたは抗原に結合することはできないであろう。しかしながら、エピトープまたは抗原の双方が、単一の標的細胞または標的組織に存在する場合には、その細胞または組織に対するダイアボディまたはダイアボディ分子の結合力は、抗原１つだけを発現している細胞または組織の場合と比較して高くなり、従って、該細胞または組織は本発明によって効率的に標的化され得る。このような二重特異性分子は、１つの抗原に対して特異性を持つだけの単一特異性ダイアボディまたは抗体と比較して、前述の両抗原を発現する細胞上の一方または双方の標的抗原に対する結合の増強を示し得る。
【００８５】
好ましくは、本発明のダイアボディの結合特性は、結合活性および／または１以上のＦｃγＲメディエーターエフェクター細胞機能（Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を介して、またはＦｃγＲに対するダイアボディ分子の免疫特異的結合によって媒介される）を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイにより同定される（第５．４．２節および第５．４．３節参照）。ＦｃγＲに対する本発明の分子（例えば、ダイアボディ）の親和性および結合特性を、結合ドメイン−抗原またはＦｃ−ＦｃγＲの相互作用（すなわち、それぞれ結合ドメインに対する抗原の特異的結合、またはＦｃγＲに対するＦｃ領域の特異的結合）を測定するための当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（生化学または免疫学に基づくアッセイ）を用いて測定することができ、これらには、限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイが含まれる（第５．４．２節参照）。最も好ましい実施形態では、本発明の分子はｉｎ  ｖｉｖｏモデル（本明細書に記載され、開示されるものなど）において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに基づくアッセイにおけるものと同様の結合特性を有する。しかしながら、本発明はｉｎ  ｖｉｔｒｏに基づくアッセイでは所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、鋳型分子の対応する部分と比べて変化したグリコシル化パターンまたは変化したグリコフォームを含むように操作される。操作されたグリコフォームは、限定されるものではないが、エフェクター機能の増強を含む、様々な目的に有用であり得る。操作されたグリコフォームは、例えば、操作されたもしくは変異型の発現株の使用、１以上の酵素、例えばＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との同時発現、種々の生物もしくは種々の生物由来の細胞株における本発明のダイアボディの発現、またはダイアボディを発現させて精製した後の糖鎖を修飾によるなど、当業者に公知の任意の方法によって作製することができる。操作されたグリコフォームを作製する方法は当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、Umanaら(1999) “Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity,” Nat. Biotechnol 17:176-180; Daviesら(2001) “Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII,” Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shieldsら(2002) “Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity,” J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawaら(2003) “The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity,” J Biol Chem 278:3466-3473);米国特許第６，６０２，６８４号；米国特許出願公開第１０／２７７，３７０号；米国特許出願公開第１０／１１３，９２９号；国際公開第００／６１７３９Ａ１号；国際公開第０１／２９２２４６Ａ１号；国際公開第０２／３１１１４０Ａ１号；国際公開第０２／３０９５４Ａ１号に記載されているもの；Ｐｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔ（商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．ニュージャージー州プリンストン）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリング技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ、スイス、チューリッヒ）が含まれ、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。例えば、国際公開第０００６１７３９号；ＥＡ第０１２２９１２５号；ＵＳ第２００３０１１５６１４号；Okazakiら(2004) “Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA,” JMB, 336: 1239-49（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。
【００８７】
さらに本発明は、本発明のダイアボディを作製するために非天然アミノ酸を組み込むことを包含する。そのような方法は当業者には公知であり、例えば、天然の生合成機構を用いてタンパク質への非天然アミノ酸の組込みを可能にする方法などがある。例えば、Wangら(2002) “Expanding The Genetic Code,” Chem. Comm. 1: 1-11; Wangら(2001) “Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli,” Science, 292: 498-500; van Hestら(2001) “Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control," Chem. Comm. 19: 1897-1904（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。別法として、アミノアシルｔＲＮＡの生合成に関与する酵素に焦点を当てたものがある。例えば、Tangら(2001) “Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host,” J. Am. Chem. Soc. 123(44): 11089-11090; Kiickら(2001) “Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli,” FEBS Lett. 502(1-2):25-30（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加するまたは欠失させることによって、本発明の分子のＶＬ、ＶＨまたはＦｃドメインを改変する方法を包含する。タンパク質の糖鎖を改変する方法は、当技術分野で周知であり、本発明に包含される。例えば、米国特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０，３５９，０９６Ｂ１号；米国特許出願公開第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。
【００８９】
本発明のダイアボディ分子は、ナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体に対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することができる。このような結合リガンド、特に、正常細胞上では発現されないものとしては、組織適合性６０（Ｈ６０）分子、レチノイン酸早期誘導遺伝子−１(retinoic acid early inducible gene-1)（ＲＡＥ−１）の産物、およびマウスＵＬ１６−結合タンパク質様転写物１(murine UL16-binding proteinlike transcript 1)（ＭＵＬＴ１）が挙げられる(Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D.ら(2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells,” Blood 106:1711-1717)。ヒトＮＫＧ２Ｄと反応性のあるさらなるリガンドとしては、多型性ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ(Diefenbach, A.ら(1999) “Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In,” Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S.ら(1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) “MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved?,” Trends Immunol. 22:378-385)が挙げられる。
【００９０】
ＭＩＣＡの配列は配列番号３１１：
【化１】
0005964300.tif 000003
である。
【００９１】
ＭＩＣＢの配列は配列番号３１２：
【化２】
0005964300.tif 000004
である。
【００９２】
Ｔ細胞受容体と特異的に結合する抗体としては、抗ＴＣＲ抗体ＢＭＡ０３１(Kurrle, R.ら(1989) “BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B.ら(1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W.ら(1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W.ら(1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor,” J. Immunol. 147(12):4366-4373)が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄ受容体と特異的に結合する抗体としては、ＫＹＫ−２．０(Kwong, KYら(2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156;およびＰＣＴ／ＵＳ０９／５４９１１)が挙げられる。
【００９３】
このようなダイアボディの使用によって、標的細胞はこの場合、（ＮＫＧ２Ｄ）受容体が並んだ細胞が結合できる細胞となるように再指示される。ＮＫＧ２Ｄ受容体は、全てのヒト（および他の哺乳動物）のナチュラルキラー細胞上(Bauer, S.ら(1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA,” Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M.ら(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29)ならびに全てのＣＤ８+  Ｔ細胞上で発現される(Groh, V.ら(2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells,” Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M.ら(2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing,” Immunity 17(1):19-29)。
【００９４】
あるいは、本発明のダイアボディ分子は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に対する結合リガンドであるドメインを含むように構築することもできる。ＴＣＲはＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞により自然発現され、このような細胞に、抗原提示細胞のクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質によって結合され提示される抗原ペプチドを認識させる。ＴＣＲによりｐＭＨＣ（ペプチド−ＭＨＣ）複合体が認識されると、細胞性免疫応答の伝播が始まり、サイトカインの生産および抗原提示細胞の溶解がもたらされる（例えば、Armstrong, K.M.ら(2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes,” Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy,” Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C.ら(2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation,” Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R.ら(2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes,” Am. J. Ther. 12(6):534-550参照）。
【００９５】
このようなダイアボディ分子を、例えば標的細胞の表面に存在する受容体と結合することができる少なくとも１つのエピトープ結合ドメインをさらに含むように構築すると、このようなダイアボディ分子はＤＡＲＴ分子となり、そして標的細胞に結合することができるようになり、それにより、それらの標的細胞にナチュラルキラー群２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体またはＴＣＲに対する結合リガンド（どちらも標的細胞が結合したダイアボディ上に存在する）を提示させる（例えば、Germain, C.ら(2008) “Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein,” Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672参照）。
【００９６】
このようなダイアボディを使用して、標的細胞をＮＫ細胞媒介細胞溶解またはＴ細胞媒介細胞傷害性の標的である細胞へと向け直すことができる。一実施形態では、標的細胞の表面に存在する受容体に結合することができるダイアボディのエピトープ結合ドメインは、このような癌細胞をＮＫ細胞媒介細胞溶解またはＴ細胞媒介細胞傷害性の基質へと向け直すよう腫瘍関連抗原に結合するエピトープである。乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頚癌抗原、膵癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍関連抗原、多発性骨髄腫関連抗原、非ホジキンリンパ腫関連抗原または慢性リンパ性白血病関連抗原である腫瘍関連抗原が特に注目される。
【００９７】
このような使用のための好適な腫瘍関連抗原としては、Ａ３３（結腸直腸癌抗原；Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov;33(8):991-998)；Ｂ１(Egloff, A.M.ら2006, Cancer Res. 66(1):6-9)；ＢＡＧＥ(Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84)；β−カテニン(Prange W.ら2003 J Pathol. 201(2):250-9)；ＣＡ１２５(Bast, R.C. Jr.ら2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81)；ＣＤ５(Calin, G.A.ら2006 Semin Oncol. 33(2):167-73)；ＣＤ１９(Troussard, X.ら1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；ＣＤ２０(Thomas, D.A.ら2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36)；ＣＤ２２(Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51)；ＣＤ２３(Rosati, S.ら2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107)；ＣＤ２５(Troussard, X.ら1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；ＣＤ２７(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40)；ＣＤ２８(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40)；ＣＤ３６(Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7)；ＣＤ４０／ＣＤ１５４(Messmer, D.ら2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60)；ＣＤ４５(Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46)；ＣＤ５６(Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40)；ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ(Troussard, X.ら1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G.ら2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106)；ＣＤ１０３(Troussard, X.ら1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48)；ＣＤＫ４(Lee, Y.M.ら2006 Cell Cycle 5(18):2110-4)；ＣＥＡ（癌胎児性抗原；Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I.ら2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9）；ＣＴＬＡ４(Peggs, K.S.ら2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13)；ＥＧＦ−Ｒ（上皮細胞増殖因子受容体；Adenis, A.ら2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32）；Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４；Zhou, H.ら2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E.ら2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38）；ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２；Akcakanat, A.ら2006 Int J Cancer. 118(1):123-8）；ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２(Livingston, P.O.ら2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25)；ｇｐ１００(Lotem, M.ら2006 J Immunother. 29(6):616-27)；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ(Kumar, Pal Sら2006 Semin Oncol. 33(4):386-91)；ヒト乳頭腫ウイルス−Ｅ６／ヒト乳頭腫ウイルス−Ｅ７(DiMaio, D.ら2006 Adv Virus Res. 66:125-59)；ＫＳＡ（１７−１Ａ）(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80)；ＭＡＧＥ(ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３；Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；ＭＡＲＴ(Kounalakis, N.ら2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82）；ＭＵＣ−１(Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46)；ＭＵＭ−１(Castelli, C.ら2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31)；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34)；ｐ１５(Gil, J.ら2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77)；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原；Cracco, C.M.ら2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11）；ＰＳＭＡ(Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80)；ｓＴｎ(Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91)；ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体；またはＴＮＦ−γ受容体；van Horssen, R.ら2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M.ら2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64）；またはＶＥＧＦ受容体(O’Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8)が挙げられる。
【００９８】
このような使用のためのさらなる腫瘍関連抗原（およびこのような抗原に対して特異的に反応性のある抗体を開示する刊行物）としては、ＡＤＡＭ−９（米国特許出願公開第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国特許出願公開第２００６／０１６６２９１号）；ＣＤ４６（米国特許第７，１４８，０３８号；国際公開第０３／０３２８１４号）；サイトケラチン８（国際公開第０３／０２４１９１号）；エフリン受容体（特に、ＥｐｈＡ２（米国特許第７，５６９，６７２号；国際公開第０６／０８４２２６号）；インテグリンα−Ｖ−Β−６（国際公開第０３／０８７３４０号）；ＪＡＭ−３（国際公開第０６／０８４０７８号）；ＫＩＤ３（国際公開第０５／０２８４９８号）；ＫＩＤ３１（国際公開第０６／０７６５８４号）；ＬＵＣＡ−２（米国特許出願公開第２００６／０１７２３４９号；国際公開第０６／０８３８５２号）；オンコスタチンＭ（オンコスタチン受容体β）（米国特許第７，５７２，８９６号；国際公開第０６／０８４０９２号）；ＰＩＰＡ（米国特許第７，４０５，０６１号；国際公開第０４／０４３２３９号）；ＲＡＡＧ１０（米国特許第７，５２７，９６９号；国際公開第０４／００１３８１号）；ＲＯＲ１（米国特許第５，８４３，７４９号）；ＴＥＳ７（国際公開第０８／０６６６９１号）；およびトランスフェリン受容体（米国特許第７，５７２，８９５号；国際公開第０５／１２１１７９号）が挙げられる。
【００９９】
また、特定の病原体、例えば、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、インフルエンザ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、口蹄疫（コクサッキーウイルス）、狂犬病ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含むウイルス病原体；ならびにロタウイルス、アデノウイルス、カリシウイルス、アストロウイルスおよびノーウォークウイルスを含む胃腸炎の原因病原体；限定されるものではないが、大腸菌(E. coli)、ネズミチフス菌(Salmonella thyphimurium)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、ピロリ菌(Helicobacter pylori)、インフルエンザ菌(Hemophilus influenzae)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)および肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)を含む細菌病原体；真菌病原体およびジアルジア鞭毛虫(Giardi)などの寄生虫に特異的な抗原も注目される。
【０１００】
あるいは、このようなエピトープは、例えば急性単球性白血病細胞をＮＫ細胞媒介細胞溶解の基質に向け直すために、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩ）に結合させることができる。
【０１０１】
５．１．ダイアボディ結合ドメイン
本発明のダイアボディは、一般に免疫グロブリンまたは抗体に由来する抗原結合ドメインを含む。本発明の方法に使用される結合ドメインが由来する抗体は、鳥類および哺乳類（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含むいずれの動物起源からのものであってもよい。抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書において「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーもしくは合成ヒト免疫グロブリンコード配列のライブラリーから、またはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから、単離された抗体を含む。
【０１０２】
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染性疾患の治療および／または予防に関して当技術分野で公知の任意の抗体を、本発明のダイアボディの結合ドメイン源として使用することを企図する。既知の癌抗体の非限定的な例を第５．７．１節に示すとともに、列挙した標的抗原に特異的な他の抗体、および第５．６．１節に列挙した癌抗原に対する抗体も示し、また、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療および／または予防に関して既知の抗体の非限定的な例を第５．７．２節に示すとともに、列挙した標的抗原に対する抗体および第５．６．２節で列挙した抗原に対する抗体も示し、他の実施形態では、第５．６．３節に列挙した感染性疾患に関連するエピトープに対する抗体を使用することができる。特定の実施形態では、抗体は１以上のアミノ酸改変を含む変異型Ｆｃ領域を含み、これらの抗体は本発明の方法によって、付与されたエフェクター機能を持ち、かつ／または野生型Ｆｃ領域を含む匹敵する分子と比較してＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強され、また、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が低減されていることが確認された。本発明により遺伝子工学的に作製され得る炎症性障害の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表９に示し、自己免疫障害の治療または予防に使用される抗体の非限定的例を表１０に示す。
【０１０３】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含むいくつかの使用では、ヒト、キメラまたはヒト化抗体由来の可変ドメインを有するダイアボディを使用することが好ましい場合がある。完全ヒト抗体由来の可変領域は、ヒト被験者の治療処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびに国際公開第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６５４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号および同第９１／１０７４１号も参照（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【０１０４】
ヒト化抗体とは、所定の抗原に結合でき、かつヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲとを含む抗体、その変異体またはフラグメントである。ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことができ、該可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に相当し、また、フレームワーク領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域である。
【０１０５】
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親配列と正確に一致する必要はなく、例えば、ドナーＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、少なくとも１個の残基の置換、挿入もしくは欠失により変異誘発させて、その部位のＣＤＲまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたはドナー抗体に一致しないようにすることができる。しかしながら、そのような突然変異は広範囲に及ばないことが好ましい。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％、多くの場合には９０％を越え、最も好ましくは９５％を超える残基が、親のフレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列の残基と一致する。ヒト化抗体は当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製することができ、限定されるものではないが、ＣＤＲグラフト法（欧州特許第２３９，４００号、国際公開第９１／０９９６７号ならびに米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング(veneering)法またはリサーフェイシング(resurfacing)法（欧州特許第５９２，１０６号および同第５１９，５９６号；Padlan (1991) “A Possible Procedure For Reducing The Immunogenicity Of Antibody Variable Domains While Preserving Their Ligand-Binding Properties,” Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnickaら(1994) “Human-Engineered Monoclonal Antibodies Retain Full Specific Binding Activity By Preserving Non-CDR Complementarity-Modulating Residues,” Protein Engineering 7(6):805-814;およびRoguskaら(1994) “Humanization Of Murine Monoclonal Antibodies Through Variable Domain Resurfacing,” Proc Natl Acad Sci USA 91:969-973）、チェーンシャッフリング(chain shuffling)法（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに、例えば米国特許第６，４０７，２１３号、同第５，７６６，８８６号、同第５，５８５，０８９号、国際公開第９３１７１０５号、Tanら(2002) “’Superhumanized’ Antibodies: Reduction Of Immunogenic Potential By Complementarity-Determining Region Grafting With Human Germline Sequences: Application To An Anti-CD28,” J. Immunol. 169:1119-25、Caldasら(2000) “Design And Synthesis Of Germline-Based Hemi-Humanized Single-Chain Fv Against The CD18 Surface Antigen,” Protein Eng. 13:353-60、Moreaら(2000) “Antibody Modeling: Implications For Engineering And Design,” Methods 20:267-79、Bacaら(1997) “Antibody Humanization Using Monovalent Phage Display,” J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguskaら(1996) “A Comparison Of Two Murine Monoclonal Antibodies Humanized By CDR-Grafting And Variable Domain Resurfacing,” Protein Eng. 9:895-904、Coutoら(1995) “Designing Human Consensus Antibodies With Minimal Positional Templates,” Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Coutoら(1995) “Anti-BA46 Monoclonal Antibody Mc3: Humanization Using A Novel Positional Consensus And In Vivo And In Vitro Characterization,” Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu (1994) “A Rapid Procedure For The Humanization Of Monoclonal Antibodies,” Gene 150:409-10、Pedersenら(1994) “Comparison Of Surface Accessible Residues In Human And Murine Immunoglobulin Fv Domains. Implication For Humanization Of Murine Antibodies,” J. Mol. Biol. 235:959-973、Jonesら(1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525、Riechmannら(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327、およびPresta (1992) "Antibody Engineering," Curr. Op. Biotech. 3(4):394-398)が挙げられる。多くの場合、抗原結合性を変更する、好ましくは改善するためには、フレームワーク領域のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換する。こ��らのフレームワーク置換は、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによる抗原結合性に重要なフレームワーク残基の同定、および配列比較による特定の位置の通常でないフレームワーク残基の同定など、当技術分野で周知の方法により同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許出願公開第２００４／００４９０１４号および同第２００３／０２２９２０８号；米国特許第６，３５０，８６１号；同第６，１８０，３７０号；同第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号、ならびにRiechmannら(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327（全て、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。）
【０１０６】
最も好ましい実施形態では、ヒト化結合ドメインは、ドナーであるマウス抗体と同じエピトープに特異的に結合する。当業者ならば、本発明が一般に抗体のＣＤＲグラフト法を包含することが分かるであろう。従って、ドナー抗体およびアクセプター抗体は、同種の動物、さらには同じ抗体クラスまたは同じ抗体サブクラスに由来してもよい。しかしながら、より通常には、ドナー抗体およびアクセプター抗体は異種の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体は齧歯類のｍＡｂなどの非ヒト抗体であり、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ドナー抗体に由来する少なくとも１つのＣＤＲがヒト抗体にグラフトされる。他の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれの、少なくとも２つ、好ましくは３つ全てのＣＤＲがヒト抗体にグラフトされる。ＣＤＲはＫａｂａｔ  ＣＤＲ、構造的ループＣＤＲ、またはそれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲグラフト重鎖と少なくとも１つのＣＤＲグラフト軽鎖とを含むヒト化ＦｃγＲＩＩＢ抗体を包含する。
【０１０８】
本発明の方法で用いられるダイアボディには、修飾された、すなわち、任意の分子種のダイアボディへの共有結合により修飾された誘導体が含まれる。例えば、限定されるものではないが、ダイアボディ誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンドもしくは他のタンパク質との結合などによって改変されたダイアボディが含まれる。限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含む公知の技術によって、多数の化学修飾のうちいずれを行ってもよい。さらに、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【０１０９】
キメラ抗体とは、例えば非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体のように、そのキメラ抗体の部分によって異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体の作製方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison (1985) "Transfectomas Provide Novel Chimeric Antibodies," Science 229:1202-1207; Oiら(1986) "Chimeric Antibodies," BioTechniques 4:214-221; Gilliesら(1989) "High-Level Expression Of Chimeric Antibodies Using Adapted cDNA Variable Region Cassettes," J. Immunol. Methods 125:191-202；ならびに米国特許第６，３１１，４１５号、同第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号および同第４，８１６，３９７号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）を参照。
【０１１０】
多くの場合、抗原結合性を変更する、好ましくは改善するためには、フレームワーク領域のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリングによる抗原結合性に重要なフレームワーク残基の同定、および配列比較による特定の位置の通常でないフレームワーク残基の同定など、当技術分野で周知の方法により同定される。（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；およびRiechmannら(1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）を参照。）
【０１１１】
本発明のダイアボディのどの結合ドメインからのモノクローナル抗体も、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術、またはそれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の多様な技術を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られ、例えば、Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988); Hammerlingら, Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)（双方とも参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて作製することができる。本明細書において「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して作製された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を意味するものであって、それを生産する方法を意味するものではない。
【０１１２】
ハイブリドーマ技術を用いた特定の抗体の作製およびスクリーニング方法は慣例のものであり、当技術分野で周知である。非限定的例では、マウスを対象抗原またはそのような抗原を発現する細胞で免疫化することができる。例えば抗原特異的抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫応答が検出されれば、マウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。その後、脾細胞を周知技術によって任意の好適な骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを制限希釈によって選択しクローニングする。次に、これらのハイブリドーマクローンを当技術分野で公知の方法によって、抗原に結合できる抗体を分泌する細胞に関してアッセイする。マウスの腹腔内に陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって、一般に高レベルの抗体を含む腹水を得ることができる。対象抗原としては、限定されるものではないが、第５．８．１節に示した癌に関連する抗原、第５．８．２節に示した自己免疫疾患および炎症性疾患に関連する抗原、第５．８．３節に示した感染性疾患に関連する抗原、および第５．８．４節に示した毒素が挙げられる。
【０１１３】
抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、このようなファージを利用して、レパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメイン（例えば、ＦａｂおよびＦｖまたはジスルフィド結合安定化Ｆｖ）を提示させることができる。対象抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて（例えば、標識抗原、または固相表面もしくはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて）選択または同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、一般に、ｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。抗原結合ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えで融合されたタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの作製に使用可能なファージディスプレイ法の例としては、Brinkmannら(1995) “Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments,” J. Immunol. Methods, 182:41-50; Amesら(1995) “Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins,” J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleboroughら(1994) “Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments,” Eur. J. Immunol., 24:952-958; Persicら(1997) “An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries,” Gene, 187:9-18; Burtonら(1994) “Human Antibodies From Combinatorial Libraries,” Advances in Immunology, 57:191-280；国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開第９０／０２８０９号；同第９１／１０７３７号；同第９２／０１０４７号；同第９２／１８６１９号；同第９３／１１２３６号；同第９５／１５９８２号；同第９５／２０４０１号；ならびに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号に開示されているものが挙げられる（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【０１１４】
ファージディスプレイ技術を使用して、抗原に対する抗体の親和性を増強することができる。この技術は、高親和性抗体を得るのに有用である。この技術は、親和性成熟と呼ばれ、突然変異誘発、または同種抗原を用いたＣＤＲウォーキングおよび再選択を使用して、初期抗体もしくは親抗体と比較した場合に抗原に対してより高い親和性で結合する抗体を同定する（例えば、Glaserら(1992) “Dissection Of The Combining Site In A Humanized Anti-Tac Antibody,” J. Immunology 149:2607-2614参照）。単一ヌクレオチドではなくコドン全体に対する突然変異誘発は、アミノ酸変異の半ランダムなレパートリーをもたらす。変異型クローンのプールからなるライブラリーを構築することができ、その各変異型クローンは、１つのＣＤＲ中の一アミノ酸の改変によって異なっており、かつ、各ＣＤＲ残基に関してそれぞれ存在し得るアミノ酸置換を提示する変異体を含んでいる。抗原に対する結合親和性が増強されている突然変異体は、固定化した突然変異体を標識した抗原と接触させることによってスクリーニングすることができる。当技術分野で公知のいずれのスクリーニング方法も、抗原に対する結合力が増強された変異型抗体を同定するために使用可能である（例えば、ＥＬＩＳＡ）（Wuら(1998) “Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized mAb,” Proc Natl. Acad Sci. USA95:6037-6042; Yeltonら(1995) “Affinity Maturation Of The Br96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis,” J. Immunology 155:1994-2004参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングも可能である（Schierら(1996) “Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,” J. Mol. Bio. 263:551-567参照）。
【０１１５】
本発明はまた、フレームワークまたはＣＤＲ領域に突然変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）を持った、本明細書に記載のまたは当該分野で公知の任意の結合ドメインのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用を包含する。これらの結合ドメインにおける突然変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する、その結合ドメインの結合力および／または親和性を維持または増強することが好ましい。当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）を使用して、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１１６】
例えば、アミノ酸置換をもたらす、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲにより媒介される突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技術を使用して、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントと比較して、アミノ酸１５個未満の置換、アミノ酸１０個未満の置換、アミノ酸５個未満の置換、アミノ酸４個未満の置換、アミノ酸３個未満の置換、またはアミノ酸２個未満の置換を含むことが好ましい。好ましい一実施形態では、誘導体は、１以上の予測される非必須アミノ酸残基において生じた保存的アミノ酸置換を有する。
【０１１７】
５．１．１．ＦｃγＲＩＩＢと免疫特異的に結合するエピトープ結合部位を含むダイアボディ
特定の実施形態において、本発明のダイアボディの少なくとも１つの結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性に促進作用を示す。本発明の一実施形態では、前述の活性は、Ｂ細胞受容体媒介シグナル伝達の阻害である。他の実施形態では、結合ドメインはＢ細胞の活性化、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期の進行、またはＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１以上の下流シグナル伝達分子の活性を阻害する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化またはＳＨＩＰの動員を増強する。本発明のさらなる実施形態では、結合ドメインはＢ細胞受容体媒介シグナル伝達経路においてＭＡＰキナーゼの活性またはＡｋｔの動員を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に促進作用を示す。特定の実施形態では、前述の結合ドメインは、ＦｃεＲＩにより誘導されるマスト細胞の活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を阻害する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を刺激し、ＳＨＩＰの動員を刺激し、ＳＨＩＰのリン酸化およびそのＳｈｃとの会合を刺激し、またはＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８など）の活性化を阻害する。さらに別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化、ならびにそのＳＨＩＰおよびｒａｓＧＡＰとの会合を増強する。別の実施形態では、本発明の結合ドメインは、単球またはマクロファージにおいてＦｃγＲ媒介食作用を阻害する。
【０１１８】
別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢの少なくとも１つの活性に拮抗作用を示す。一実施形態では、前述の活性は、Ｂ細胞受容体媒介シグナル伝達の活性化である。特定の実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞活性、Ｂ細胞の増殖、抗体産生、細胞内カルシウム流入、またはＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路における１以上の下流シグナル伝達分子の活性を増強する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化またはＳＨＩＰの動員を減少させる。本発明のさらなる実施形態では、結合ドメインは、Ｂ細胞受容体媒介シグナル伝達経路においてＭＡＰキナーゼの活性またはＡｋｔの動員を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢにより媒介される阻害に拮抗作用を示す。特定の実施形態では、前述の結合ドメインは、ＦｃεＲＩにより誘導されるマスト細胞の活性化、カルシウム動員、脱顆粒、サイトカイン産生、またはセロトニン放出を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化を阻害し、ＳＨＩＰの動員を阻害し、ＳＨＩＰのリン酸化およびそのＳｈｃとの会合を阻害し、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバー（例えば、Ｅｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫ、ｐ３８など）の活性化を増強する。さらに別の実施形態では、結合ドメインは、ｐ６２ｄｏｋのチロシンリン酸化、ならびにそのＳＨＩＰおよびｒａｓＧＡＰとの会合を阻害する。別の実施形態では、結合ドメインは、単球またはマクロファージにおいてＦｃγＲ媒介食作用を増強する。別の実施形態では、結合ドメインは、脾臓マクロファージによるオプソニン化粒子の食作用、クリアランスを妨げる。
【０１１９】
他の実施形態では、少なくとも１つの結合ドメインを使用して、本発明のダイアボディをＦｃγＲＩＩＢ発現細胞にターゲティングすることができる。
【０１２０】
特定の一実施形態では、結合ドメインの１つは、クローン２Ｂ６または３Ｈ７（それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１およびＰＴＡ−４５９２を有する）により産生されるマウスモノクローナル抗体に由来する。２Ｂ６および３Ｈ７抗体を産生するハイブリドーマは、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定の下、２００２年８月１３日にAmerican Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)に寄託され、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４５９１（２Ｂ６を産生するハイブリドーマ）およびＰＴＡ−４５９２（３Ｈ７を産生するハイブリドーマ）が付与され、これらは参照により本明細書に組み入れる。好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト型であるか、またはヒト化されたものであり、好ましくは、クローン３Ｈ７または２Ｂ６により産生されるヒト化型の抗体に由来する。
【０１２１】
本発明はまた、ＦｃγＲＩＩＢ、好ましくはヒトＦｃγＲＩＩＢ、より好ましくは天然ヒトＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、限定されるものではないが、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１および１Ｆ２（それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５９５８、ＰＴＡ−５９６１、ＰＴＡ−５９６２、ＰＴＡ−５９６０およびＰＴＡ−５９５９を有する）を含むクローンに由来する他の抗体由来の結合ドメインを有するダイアボディも包含する。上記のクローンを産生するハイブリドーマは、ブダペスト条約の規定の下、２００４年５月７日にAmerican Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)に寄託され、これらは参照により本明細書に組み入れる。好ましい実施形態では、上記の抗体由来の結合ドメインはヒト化型である。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のダイアボディに使用される結合ドメインは、抗体またはその抗原結合フラグメント由来である（例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生される抗体の１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、好ましくは６つ全てＣＤＲを含む）。別の実施形態では、結合ドメインは、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２からそれぞれ産生されるマウスモノクローナル抗体と同じエピトープと結合し、かつ／または、例えばＥＬＩＳＡアッセイまたは他の適当な競合イムノアッセイにおいて測定した場合に、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２から産生されたマウスモノクローナル抗体と競合し、かつまた、その結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも強い親和性でＦｃγＲＩＩＢと結合する。
【０１２３】
本発明はまた、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディも包含する。本発明はさらに、抗体またはそのフラグメントがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である１以上のＣＤＲのアミノ酸配列を含む結合ドメインを有するダイアボディも包含する。２つのアミノ酸配列の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含む当業者に公知のいずれの方法によっても決定することができる。
【０１２４】
本発明はまた、結合ドメインがＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、ストリンジェント条件下でクローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるマウスモノクローナル抗体のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている結合ドメインを含むダイアボディの使用も包含する。好ましい実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるマウスモノクローナル抗体の可変軽鎖および／または可変重鎖のヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている可変軽鎖および／または可変重鎖を含む。別の好ましい実施形態では、結合ドメインは、ＦｃγＲＩＩＡよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合し、かつ、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるマウスモノクローナル抗体の１以上のＣＤＲのヌクレオチド配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされている１以上のＣＤＲを含む。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件としては、限定されるものではないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でフィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせた後、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、約５０〜６５℃で１回以上の洗浄、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのフィルターに結合させたＤＮＡとハイブリダイズさせた後、０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中、約６０℃での１回以上の洗浄といった高ストリンジェント条件、または、当業者に公知の他の任意のストリンジェントハイブリダイゼーション条件が挙げられる（例えば、Ausubel, F.M.ら編 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY 6.3.1〜6.3.6および2.10.3頁参照、参照により本明細書に組み入れる）。
【０１２５】
本発明はまた、フレームワークまたはＣＤＲ領域に突然変異（例えば、１以上のアミノ酸置換）を有する上記の結合ドメインのいずれかのアミノ酸配列を含む結合ドメインの使用も包含する。これらの結合ドメインにおける突然変異は、結合ドメインが免疫特異的に結合するＦｃγＲＩＩＢに対する結合ドメインの結合力および／または親和性を維持または増強することが好ましい。当業者に公知の標準的技術（例えば、イムノアッセイ）を用いて、特定の抗原に対する抗体の親和性をアッセイすることができる。
【０１２６】
例えば、アミノ酸置換をもたらす、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲにより媒介される突然変異誘発を含む、当業者に公知の標準的技術を用いて、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。誘導体は、元の抗体またはそのフラグメントに対してアミノ酸１５個未満の置換、アミノ酸１０個未満の置換、アミノ酸５個未満の置換、アミノ酸４個未満の置換、アミノ酸３個未満の置換、またはアミノ酸２個未満の置換を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、誘導体は、１以上の予測される非必須アミノ酸残基に生じた保存的アミノ酸置換を有する。
【０１２７】
好ましい実施形態では、結合ドメインはヒト化抗体に由来する。ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体は、少なくとも１つ、一般に２つの可変ドメインの実質的に全てを含んでいてもよく、この可変ドメインでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に相当し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である。
【０１２８】
本発明のダイアボディは、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なヒト化可変ドメインを含み、この可変ドメインでは、ヒト抗体（レシピエント抗体）の重鎖および／または軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲの１以上の領域が、ＦｃγＲＩＩＡよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するドナーモノクローナル抗体（例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるモノクローナル抗体）の１以上のＣＤＲの類似部分で置換されている。他の実施形態では、ヒト化抗体は、それぞれ２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２と同じエピトープと結合する。
【０１２９】
好ましい実施形態では、ヒト化ＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインのＣＤＲ領域は、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なマウス抗体に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体は、限定されるものではないが、アクセプター抗体（すなわち、ドナーモノクローナル抗体の結合特異性を保持するために必要なヒト重鎖および／または軽鎖可変ドメインフレームワーク領域）のアミノ酸欠失、挿入、修飾を含む改変を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のヒト化抗体のフレームワーク領域は、必ずしも天然ヒト抗体可変領域のフレームワーク領域の正確なアミノ酸配列からなる必要はなく、限定されるものではないが、ヒト化抗体の特性を変更する（例えば、マウスＦｃγＲＩＩＢ特異的抗体と同じ標的に特異的なヒト化抗体領域の結合特性を改善する）アミノ酸欠失、挿入、修飾を含む様々な改変を含む。最も好ましい実施形態では、非ヒトフレームワーク残基の大規模導入を避け、かつ、ヒトにおいてヒト化抗体の最小限の免疫原性を確保するために、フレームワーク領域に対して最少数の改変がなされる。ドナーモノクローナル抗体は、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２により産生されるモノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１３０】
特定の実施形態では、結合ドメインは、そのＣＤＲグラフト抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲグラフト抗体の可変ドメインを包含し、ここで、ＣＤＲグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基とを含む重鎖可変領域ドメインを含み、該ドナーモノクローナル抗体は、その抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する、例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２から産生されるモノクローナル抗体である。別の特定の実施形態では、本発明のダイアボディは、そのＣＤＲグラフト抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合するＣＤＲグラフト抗体由来の可変ドメインを含み、ここで、ＣＤＲグラフト抗体は、レシピエント抗体のフレームワーク残基と、ドナーモノクローナル抗体由来の残基とを含む軽鎖可変領域ドメインを含み、該ドナーモノクローナル抗体は、その抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する、例えば、クローン２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２から産生されるモノクローナル抗体である。
【０１３１】
本発明で用いられるヒト化抗ＦｃγＲＩＩＢ可変ドメインは、ＣＤＲ１（配列番号２４もしくは配列番号２５）および／またはＣＤＲ２（配列番号２６もしくは配列番号２７）および／またはＣＤＲ３（配列番号２８もしくは配列番号２９）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに／あるいはＣＤＲ１（配列番号３０もしくは配列番号３１）および／またはＣＤＲ２（配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４もしくは配列番号３５）および／またはＣＤＲ３（配列番号３６もしくは配列番号３７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有してよい。
【０１３２】
特定の一実施形態では、ダイアボディは、ヒト化２Ｂ６抗体由来の可変ドメインを含み、この場合、ＶＨ領域はヒト生殖細胞系ＶＨセグメントであるＶＨ１−１８(Matsudaら(1998) “The Complete Nucleotide Sequence Of The Human Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region Locus,” J. Exp. Med. 188:2151-2162)およびＪＨ６(Ravetchら(1981) “Structure Of The Human Immunoglobulin Mu Locus: Characterization Of Embryonic And Rearranged J And D Genes,” Cell 27(3 Pt. 2): 583-91)に由来するＦＲセグメントと、配列番号２４、配列番号２６または配列番号２８のアミノ酸配列を有する２Ｂ６  ＶＨの１以上のＣＤＲ領域とからなる。一実施形態では、２Ｂ６  ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、２Ｂ６  ＶＨドメインは、配列番号８５のＨｕ２Ｂ６ＶＨのアミノ酸配列を有し、配列番号８６のヌクレオチド配列によりコードされ得る。別の特定の実施形態では、ダイアボディはＶＬ領域をさらに含み、このＶＬ領域はヒト生殖細胞系ＶＬセグメントであるＶＫ−Ａ２６(Lautner-Rieskeら(1992) “The Human Immunoglobulin Kappa Locus. Characterization Of The Duplicated A Regions,” Eur. J. Immunol. 22:1023-1029)およびＪＫ４(Hieterら(1982) “Evolution Of Human Immunoglobulin Kappa J Region Genes,” J. Biol. Chem. 257:1516-22)のＦＲセグメントと、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３６のアミノ酸配列を有する、２Ｂ６  ＶＬの１以上のＣＤＲ領域とからなる。一実施形態では、２Ｂ６  ＶＬは、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、２Ｂ６  ＶＬは、配列番号８７のＨｕ２Ｂ６ＶＬのアミノ酸配列を有し、配列番号８８で示されるヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【０１３３】
別の特定の実施形態では、ダイアボディは、ヒト化３Ｈ７抗体由来の可変ドメインを有し、この場合、ＶＨ領域はヒト生殖細胞系ＶＨセグメント由来のＦＲセグメントと、配列番号３５のアミノ酸配列を有する３Ｈ７  ＶＨのＣＤＲ領域とからなる。別の特定の実施形態では、ヒト化３Ｈ７抗体はさらにＶＬ領域を含み、このＶＬ領域はヒト生殖細胞系ＶＬセグメントのＦＲセグメントと、配列番号４２のアミノ酸配列を有する３Ｈ７  ＶＬのＣＤＲ領域とからなる。
【０１３４】
特に、結合ドメインは、天然ヒトＦｃγＲＩＩＢの細胞外ドメインと免疫特異的に結合し、かつ、以下の組合せのいずれかで２Ｂ６、３Ｈ７、１Ｄ５、２Ｅ１、２Ｈ９、２Ｄ１１または１Ｆ２のＣＤＲ配列を含む（あるいは、からなる）：ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＨ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ１  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ１；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ２；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２およびＶＬ  ＣＤＲ３；または本明細書に開示されるＶＨ  ＣＤＲおよびＶＬ  ＣＤＲの任意の組合せ。
【０１３５】
本発明のダイアボディに含まれる結合ドメインの由来となる抗体は、ＦｃγＲＩＩＡと比較してＦｃγＲＩＩＢに最も強い特異性を有する抗体を選択できるようなエピトープマッピングによってさらに特性決定を行うことができる。抗体のエピトープマッピング法は当技術分野で周知であり、本発明の方法に包含される。特定の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＢの１以上の領域を含む融合タンパク質を、本発明の抗体のエピトープをマッピングする際に使用することができる。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２のＦｃ部分に融合された、ＦｃγＲＩＩＢの領域のアミノ酸配列を含む。各融合タンパク質は、下表２に示すようなアミノ酸置換および／または該受容体の特定領域の、相同受容体（例えばＦｃγＲＩＩＡ）の対応領域による置換をさらに含むことができる。ｐＭＧＸ１２５およびｐＭＧＸ１３２は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のＩｇＧ結合部位を含み、前者はＦｃγＲＩＩＢのＣ末端を有し、後者はＦｃγＲＩＩＡのＣ末端を有し、Ｃ末端の結合性を識別するために使用することができる。その他は、ＩｇＧ結合部位におけるＦｃγＲＩＩＡ置換、およびＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢのいずれかのＮ末端を有する。これらの分子は、抗体が結合する受容体分子の部分を決定するのに役立ち得る。
【０１３６】
表２はモノクローナル抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体のエピトープを調べるために使用可能な融合タンパク質の一覧。残基１７２〜１８０はＦｃγＲＩＩＡおよびＢのＩｇＧ結合部位に属す。ＦｃγＲＩＩＡ配列由来の特異的アミノ酸を太字で示す。
【表２】
0005964300.tif 000005
【０１３７】
融合タンパク質は、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体との結合を測定するためのいずれかの生化学的アッセイ、例えばＥＬＩＳＡで使用することができる。他の実施形態では、特定の残基をＦｃγＲＩＩＡ配列の残基で置換したペプチドを用いて、エピトープ特異性のさらなる確認を行うことができる。
【０１３８】
抗体は、本発明の抗体の機能、特にＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達を調節するための活性を同定するアッセイ法を用いて特性決定を行うことができる。例えば、本発明の特性決定アッセイは、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン残基のリン酸化を測定したり、またはＢ細胞受容体によって生じるカルシウム動員の阻害を測定したりすることができる。本発明の特性決定アッセイは、細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイであり得る。
【０１３９】
マスト細胞においては、ＦｃγＲＩＩＢと、高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩとの共凝集が、抗原誘導性脱顆粒、カルシウム動員、およびサイトカイン産生の阻害をもたらすことは当技術分野で十分に確認されている(Metcalfe D.D.ら(1997) “Mast Cells,” Physiol. Rev. 77:1033-1079; Long E.O. (1999) “Regulation Of Immune Responses Through Inhibitory Receptors,” Annu. Rev. Immunol. 17: 875-904)。このシグナル伝達経路の分子的詳細が最近解明された(Ott V. L. (2002) “Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling,” J. Immunol. 162(9):4430-4439)。ひとたびＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩＢは、そのＩＴＩＭモチーフ中のチロシン上ですぐにリン酸化され、その後、ＳＨ２ドメイン含有イノシトールポリホスフェート５−ホスファターゼであるＳｒｃホモロジー２含有イノシトール−５−ホスファターゼ(Src Homology-2 containing inositol-5-phosphatase：ＳＨＩＰ）を動員し、次に、リン酸化されて、Ｓｈｃおよびｐ６２dokと会合する。ｐ６２dokは、アダプター分子ファミリーのプロトタイプであり、アミノ末端プレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）のようなシグナル伝達ドメイン、ＰＴＢドメイン、およびＰＸＸＰモチーフと多数のリン酸化部位を含むカルボキシ末端領域を含む(Carpinoら(1997) “p62(dok): A Constitutively Tyrosine-Phosphorylated, GAP-Associated Protein In Chronic Myelogenous Leukemia Progenitor Cells,” Cell, 88: 197-204; Yamanshiら(1997) “Identification Of The Abl- And rasGAP-Associated 62 kDa Protein As A Docking Protein, Dok,” Cell, 88:205-211)。
【０１４０】
本発明で使用される抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、同様に、１以上のＩｇＥ媒介応答を調節する能力について特性決定を行うことができる。ＩｇＥに対して高親和性の受容体およびＦｃγＲＩＩＢに対して低親和性の受容体を同時発現する細胞株を、ＩｇＥ媒介応答の調節における抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の特性決定に用いることが好ましい。特定の実施形態では、全長ヒトＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病細胞株（ＲＢＬ−Ｈ２３；Barsumian E.L.ら(1981) “IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones,” Eur. J. Immunol.11:317-323、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）由来の細胞が使用される。ＲＢＬ−２Ｈ３は、十分に特性決定されたラット細胞株であり、ＩｇＥ媒介細胞活性化後のシグナル伝達機構を研究するのに広く使用されている。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞で発現され、ＦｃεＲＩと共凝集すると、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃεＲＩ誘導カルシウム動員、脱顆粒およびサイトカイン産生を阻害する(Malbecら(1998) “Fc Epsilon Receptor I-Associated Lyn-Dependent Phosphorylation Of Fc Gamma Receptor IIB During Negative Regulation Of Mast Cell Activation,” J. Immunol. 160:1647-1658; Daeronら(1995) "Regulation Of High-Affinity IgE Receptor-Mediated Mast Cell Activation By Murine Low-Affinity IgG Receptors," J. Clin. Invest. 95:577; Ott V. L. (2002) “Downstream Of Kinase, p62(dok), Is A Mediator Of FcgammaIIB Inhibition Of Fc Epsilon RI Signaling,” J. Immunol. 162(9):4430-4439)。
【０１４１】
本発明で使用される抗体は、ＦｃεＲＩ誘導型マスト細胞活性化の阻害についても特性決定を行うことができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトされたラット好塩基球性白血病細胞株（ＲＢＬ−Ｈ２３；Barsumian E.L.ら(1981) “IgE-Induced Histamine Release From Rat Basophilic Leukemia Cell Lines: Isolation Of Releasing And Nonreleasing Clones,” Eur. J. Immunol.11:317-323）由来の細胞にＩｇＥを感作させ、ＦｃεＲＩだけを凝集させるウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）2フラグメント、またはＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集させる完全ウサギ抗マウスＩｇＧで刺激する。この系では、感作および刺激した細胞に本発明の抗体を添加した際に、下流シグナル伝達分子の間接的な調節をアッセイすることができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化およびＳＨＩＰの動員とリン酸化、限定されるものではないがＥｒｋ１、Ｅｒｋ２、ＪＮＫまたはｐ３８を含むＭＡＰキナーゼファミリーメンバーの活性化、ならびにｐ６２dokのチロシンリン酸化およびそのＳＨＩＰおよびＲａｓＧＡＰとの会合をアッセイすることができる。
【０１４２】
本発明の抗体によりＦｃεＲＩ誘導型マスト細胞活性化の阻害を測定するための１つの例示的アッセイは、ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をヒトＦｃγＲＩＩＢでトランスフェクトすること；ＲＢＬ−Ｈ２３細胞にＩｇＥを感作させること；ＲＢＬ−Ｈ２３細胞をウサギ抗マウスＩｇＧのＦ（ａｂ’）2（対照として、ＦｃεＲＩのみを凝集させ、ＦｃεＲＩ媒介シグナル伝達を惹起させる）で刺激するか、またはＲＢＬ−Ｈ２３細胞を完全ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩを共凝集させ、ＦｃεＲＩ媒介シグナル伝達の阻害を生じさせる）で刺激することを含み得る。完全ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体で刺激した細胞をさらに本発明の抗体とともにプレインキュベートすることができる。本発明の抗体とともにプレインキュベートした細胞、および本発明の抗体とともにプレインキュベートしなかった細胞のＦｃεＲＩ依存性活性を測定し、これらの細胞におけるＦｃεＲＩ依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるＦｃεＲＩ依存性活性の調節が示される。
【０１４３】
上記の例示的アッセイを使用して、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体へのリガンド（ＩｇＧ）の結合を遮断し、かつ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を妨げることによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に拮抗作用を示す抗体を同定することができる。同様にこのアッセイは、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を増強し、かつ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃεＲＩの共凝集を促進することによってＦｃεＲＩシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に促進作用を示す抗体も同定する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、または当技術分野で既知の、同定された抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体のエピトープ結合ドメインを含む本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、好ましくは細胞系アッセイにおいて、マスト細胞もしくは好塩基球の脱顆粒をモニタリングかつ／または測定することにより、ＩｇＥ媒介応答の調節能について特性決定される。このようなアッセイで使用されるマスト細胞または好塩基球は、当業者に公知の標準的な組換え法を用いて、ヒトＦｃγＲＩＩＢを含むように操作されていることが好ましい。特定の実施形態では、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、細胞系のβヘキソサミニダーゼ（顆粒中に含まれる酵素）放出アッセイでＩｇＥ媒介応答の調節能について特性決定される。マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼの放出は、急性アレルギー症状および急性炎症症状の初期事象である(Aketaniら(2001) “Correlation Between Cytosolic Calcium Concentration And Degranulation In RBL-2H3 Cells In The Presence Of Various Concentrations Of Antigen-Specific IgEs,” Immunol. Lett. 75: 185-189; Aketaniら(2000) “A Screening Method For Antigen-Specific IgE Using Mast Cells Based On Intracellular Calcium Signaling,” Anal. Chem. 72: 2653-2658)。限定されるものではないが、セロトニンおよびヒスタミンを含む、の炎症性メディエーターの放出を本発明の方法に従ってアッセイし、ＩｇＥ媒介応答を測定することもできる。特定の作用機序に縛られるものではないが、マスト細胞および好塩基球からのβヘキソサミニダーゼ含有顆粒のような顆粒の放出は、ＦｃγＲＩと多価抗原との架橋によって開始される細胞内カルシウム濃度依存的プロセスである。
【０１４５】
ヒトマスト細胞の研究の可能性は、適切な長期ヒトマスト細胞培養物がないことで制限されている。最近になって、ＬＡＤ  １およびＬＡＤ  ２と呼ばれる２種の新規な幹細胞因子依存性のヒトマスト細胞株が、マスト細胞肉腫／白血病患者由来の骨髄液から確立された（Kirshenbaumら(2003) “Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI,” Leukemia research, 27:677-82、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。両細胞株とも、ＦｃεＲＩおよびいくつかのヒトマスト細胞マーカーを発現することが記載されている。ＬＡＤ  １細胞およびＬＡＤ  ２細胞は、ＩｇＥ媒介応答に対する本発明の抗体の効果を評価するために使用することができる。特定の実施形態では、上記のような細胞系のβヘキソサミニダーゼ放出アッセイをＬＡＤ細胞で使用して、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体によるＩｇＥ媒介応答のいずれの調節も測定することができる。例示的アッセイでは、例えば、ＬＡＤ  １などのヒトマスト細胞を、ヒトキメラＩｇＥ抗ニトロフェノール（ＮＰ）でプライムし、多価抗原ＢＳＡ−ＮＰで刺激し、細胞の脱顆粒を、上清中に放出されるβヘキソサミニダーゼを測定することによりモニタリングする（Kirshenbaumら(2003) “Characterization Of Novel Stem Cell Factor Responsive Human Mast Cell Lines LAD 1 And 2 Established From A Patient With Mast Cell Sarcoma/Leukemia; Activation Following Aggregation Of FcRI Or FcγRI,” Leukemia research, 27:677-82、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の標準的な方法、例えばＦＡＣＳ染色を用いて測定した場合に、ヒトマスト細胞の内因性ＦｃγＲＩＩＢの発現が低ければ、本発明の抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディにより媒介される阻害経路の活性化の差異をモニタリングおよび／または検出することは困難かもしれない。従って、本発明は、サイトカインおよび特定の増殖条件を用いてＦｃγＲＩＩＢの発現をアップレギュレートすることのできる別法を包含する。ＦｃγＲＩＩＢは、例えばＴＨＰ１およびＵ９３７などのヒト単球細胞株(Tridandapaniら(2002) “Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells,” J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089)、およびヒト初代単球(Pricopら(2001) “Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines,” J. of Immunol., 166: 531-537)において、ＩＬ−４によって著しくアップレギュレートされることが記載されている。ジブチリル環状ＡＭＰによるＵ９３７の分化は、ＦｃγＲＩＩの発現を増強することが記載されている(Cameronら(2002) “Differentiation Of The Human Monocyte Cell Line, U937, With Dibutyryl CyclicAMP Induces The Expression Of The Inhibitory Fc Receptor, FcgammaRIIB,” Immunology Letters 83, 171-179)。従って、検出感度を高めるために、本発明の方法で使用されるヒトマスト細胞での内因性ＦｃγＲＩＩＢの発現を、例えばＩＬ−４、ＩＬ−１３などのサイトカインを用いてアップレギュレートすることができる。
【０１４７】
また、抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディは、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）媒介シグナル伝達の阻害についてアッセイすることもできる。ＢＣＲ媒介シグナル伝達は、少なくとも１以上の下流の生物応答、例えばＢ細胞の活性化および増殖、抗体産生などを含み得る。ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集は、細胞周期の進行および細胞の生存の阻害をもたらす。さらに、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集は、ＢＣＲ媒介シグナル伝達の阻害をもたらす。
【０１４８】
特に、ＢＣＲ媒介シグナル伝達は、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態、ＳＨＩＰの動員、Ｂｔｋおよび／またはＰＬＣγの局在、ＭＡＰキナーゼ活性、Ａｋｔ（抗アポトーシスシグナル）の動員、カルシウム動員、細胞周期の進行、および細胞増殖のうち少なくとも１つ以上を含む。
【０１４９】
ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢにより媒介される阻害のエフェクター機能の多くはＳＨＩＰを介するものであるが、最近、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のリポ多糖（ＬＰＳ）活性化Ｂ細胞が、カルシウム動員、Ｉｎｓ（１，４，５）Ｐ3産生、ならびにＥｒｋおよびＡｋｔのリン酸化の顕著なＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害を示すことが実証された(Brauweilerら(2001) “Partially Distinct Molecular Mechanisms Mediate Inhibitory FcgammaRIIB Signaling In Resting And Activated B Cells,” Journal of Immunology, 167(1): 204-211)。従って、ＳＨＩＰ欠損マウス由来のｅｘ ｖｉｖｏ  Ｂ細胞を用いて、本発明の抗体の特性決定を行うことができる。本発明の抗体によるＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢにより媒介される阻害を測定するための例示的アッセイは、ＳＨＩＰ欠損マウスから脾臓Ｂ細胞を単離すること、前述の細胞をリポ多糖で活性化すること、および前述の細胞をＦ（ａｂ’）2抗ＩｇＭで刺激してＢＣＲを凝集させるか、または抗ＩｇＭで刺激してＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させることを含み得る。完全な抗ＩｇＭで刺激し、ＢＣＲをＦｃγＲＩＩＢと共凝集させた細胞を、さらに本発明の抗体とともにプレインキュベートすることができる。細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性活性は、当技術分野で公知の標準的技術によって測定することができる。抗体とともにプレインキュベートした細胞およびプレインキュベートしなかった細胞のＦｃγＲＩＩＢ依存性活性のレベルを比較することで、その抗体によるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の調節が示される。
【０１５０】
ＦｃγＲＩＩＢ依存性活性の測定は、例えば、フローサイトメトリーにより細胞内カルシウムの動員を測定すること、Ａｋｔおよび／もしくはＥｒｋのリン酸化を測定すること、ＰＩ（３，４，５）Ｐ3のＢＣＲ媒介蓄積を測定すること、またはＦｃγＲＩＩＢにより媒介されるＢ細胞の増殖を測定することを含み得る。
【０１５１】
アッセイを用いて、例えば、本発明で使用されるダイアボディまたは抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体（該ダイアボディまたは抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体に対するリガンド（ＩｇＧ）結合部位を遮断し、かつ、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集を妨げることによりＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に拮抗作用を示すことによって、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害を調節する）を同定することができる。また、アッセイを用いて、ＦｃγＲＩＩＢとＢＣＲの共凝集を増強し、かつ、ＢＣＲシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に促進作用を示す抗体を同定することもできる。
【０１５２】
抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、ヒト単球／マクロファージにおいてＦｃγＲＩＩ媒介シグナル伝達についてアッセイすることもできる。ＦｃγＲＩＩＢと免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif：ＩＴＡＭ）を有する受容体との共凝集は、ＳＨＩＰをエフェクターとして用いるＦｃγＲ媒介食作用をダウンレギュレートする働きをする(Tridandapaniら(2002) “Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells,” J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089)。ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、ＦｃγＲＩＩＢのＩＴＩＭモチーフ上のチロシン残基の迅速なリン酸化をもたらし、これはＳＨＩＰのリン酸化の増強、ＳＨＩＰとＳｈｃの会合、ならびに１２０ｋＤａおよび６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化に至る。さらに、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの共凝集は、細胞の調節に関与し、アポトーシスを抑制する働きをするセリン・トレオニンキナーゼであるＡｋｔのリン酸化のダウンレギュレーションをもたらす。
【０１５３】
抗ＦｃγＲＩＩＢダイアボディはまた、ヒト単球／マクロファージにおいてＦｃγＲ媒介食作用の阻害についてアッセイすることもできる。例えば、ヒト単球系細胞株ＴＨＰ−１由来の細胞を、ＦｃγＲＩＩに対するマウスモノクローナル抗体ＩＶ．３のＦａｂフラグメントとヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡのみを共凝集させる）か、完全ＩＶ．３マウスモノクローナル抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢを共凝集させる）ことができる。この系では、刺激した細胞に本発明の分子を付加した際に、下流シグナル伝達分子の調節、例えば、ＦｃγＲＩＩＢのチロシンリン酸化、ＳＨＩＰのリン酸化、ＳＨＩＰとＳｈｃの会合、Ａｋｔのリン酸化、ならびに１２０ｋＤａおよび６０〜６５ｋＤａの分子量を有するタンパク質のリン酸化などをアッセイすることができる。さらに、単球系細胞株のＦｃγＲＩＩＢ依存性食作用効率を、本発明の抗体の存在下および不在下で直接測定することもできる。
【０１５４】
本発明の抗体によるヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲ媒介食作用の阻害を測定するための別の例示的アッセイは、ＴＨＰ−１細胞をＩＶ．３マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体のＦａｂとヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡのみを凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ媒介シグナル伝達を惹起する）か、マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激する（ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢを共凝集させ、ＦｃγＲＩＩＡ媒介シグナル伝達を阻害する）ことを含み得る。マウス抗ＦｃγＲＩＩ抗体とヤギ抗マウス抗体で刺激した細胞を、さらに本発明の分子とともにプレインキュベートすることができる。本発明の分子とともにプレインキュベートした刺激済み細胞および本発明の分子とともにプレインキュベートしなかった細胞のＦｃγＲＩＩＡ依存性活性を測定すること、およびこれらの細胞におけるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性のレベルを比較することで、本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節を示される。
【０１５５】
記載された例示的アッセイを使用して、例えば、以下のような結合ドメイン、すなわち、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合を遮断し、かつ、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡの共凝集を妨げることによってＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に拮抗作用を示す結合ドメインを同定することができる。同様に、このアッセイで、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＡの共凝集を増強し、かつ、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に促進作用を示す結合ドメインを同定することができる。
【０１５６】
対象となるＦｃγＲＩＩＢ結合ドメインは、従前に記載されている方法(Tridandapaniら(2000) “The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells,” J. Biol. Chem. 275: 20480-7)により、フルオレセイン化ＩｇＧオプソニン化ヒツジ赤血球（sheep red blood cells：ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによりアッセイできる。例えば、食作用を測定するための例示的アッセイは、ＴＨＰ−１細胞を本発明の抗体でまたはＦｃγＲＩＩに結合しない対照抗体で処理すること、前述の細胞の活性レベルを比較することを含み、細胞の活性（例えば、ロゼット形成活性（ＩｇＧコーティングＳＲＢＣと結合しているＴＨＰ−１細胞の数）、付着活性（ＴＨＰ−１細胞に結合したＳＲＢＣの総数）、および食作用率）の差異が、本発明の抗体によるＦｃγＲＩＩＡ依存性活性の調節を示す。このアッセイを用いて、例えば、ＦｃγＲＩＩＢ受容体のリガンド結合を遮断し、かつ、食作用のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害に拮抗作用を示す抗体を同定することができる。このアッセイはまた、ＦｃγＲＩＩＡシグナル伝達のＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害を増強する抗体を同定することもできる。
【０１５７】
好ましい実施形態では、結合ドメインは、以下の方法：下流シグナル伝達分子の調節（例えば、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化状態の調節、ＳＨＩＰリン酸化の調節、ＳＨＩＰとＳｈｃの会合の調節、Ａｋｔのリン酸化の調節、１２０ｋＤａ前後および６０〜６５ｋＤａのさらなるタンパク質のリン酸化の調節）および食作用の調節のうち少なくとも１以上において、ヒト単球／マクロファージにおけるＦｃγＲＩＩＢ依存性活性を調節する。
【０１５８】
５．１．２  ＣＤ１６Ａ結合ドメイン
以下の節では、共有結合型ダイアボディの作製のための軽鎖および重鎖可変領域の供給源として使用することができるＣＤ１６Ａ結合タンパク質について述べる。本発明では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、抗ＣＤ１６Ａ抗体のＶＬドメインとＶＨドメインを含む分子を含み、このＶＨドメインおよびＶＬドメインが本発明のダイアボディの作製に使用される。
【０１５９】
様々なＣＤ１６Ａ結合タンパク質を、本発明に関連して用いることができる。好適なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、ならびにＣＤ１６Ａ結合抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖまたは一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、ミニボディ）、および軽鎖可変領域ドメイン、重鎖可変領域ドメインまたはその双方との相互作用を介してＣＤ１６Ａに結合する他の抗体様タンパク質を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明に従って使用されるＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、非ヒト抗ＣＤ１６Ａ抗体（例えば、マウス抗ＣＤ１６Ａ抗体）に由来する配列を有する１以上のＣＤＲと、１以上のヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列に由来する１以上のフレームワーク領域とを有する、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含む。ＣＤＲおよび他の配列を得ることのできる多数の非ヒト抗ＣＤ１６Ａモノクローナル抗体が知られている（例えば、Tammら(1996) “The Binding Epitopes Of Human CD16 (Fc gamma RIII) Monoclonal Antibodies. Implications For Ligand Binding,” J. Imm. 157:1576-81; Fleitら(1989) p.159; LEUKOCYTE TYPING II: HUMAN MYELOID AND HEMATOPOIETIC CELLS, Reinherzら編 New York: Springer-Verlag; (1986); LEUCOCYTE TYPING III: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS McMichael A J編, Oxford: Oxford University Press, 1986); LEUKOCYTE TYPING IV: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kappら編 Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING V: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Schlossmanら編 Oxford Univ. Press, Oxford; LEUKOCYTE TYPING VI: WHITE CELL DIFFERENTIATION ANTIGENS, Kishimoto編 Taylor & Francis参照）。さらに、実施例に示すように、細胞上で発現されるヒトＣＤ１６Ａを認識する新規なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、モノクローナル抗体または関連の結合タンパク質の作製および選択のための周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイなど）を用いて得ることができる。例えば、O'Connellら(2002) “Phage Versus Phagemid Libraries For Generation Of Human Monoclonal Antibodies,” J. Mol. Biol. 321:49-56; Hoogenboomら(2000) “Natural And Designer Binding Sites Made By Phage Display Technology,” Imm. Today 21:371078; Krebsら(2001) “High-Throughput Generation And Engineering Of Recombinant Human Antibodies,” J. Imm. Methods 254:67-84およびそこに引用されている他の参照文献を参照）。非ヒト種由来のモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の抗体のヒト化技術を用いてキメラ化またはヒト化することができる。
【０１６１】
あるいは、ＣＤ１６Ａに対する完全ヒト抗体は、ヒト免疫系の要素を有するトランスジェニック動物を用いて（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号および同第５，５４５，８０６号参照）、ヒト末梢血細胞を用いて(Casaliら(1986) “Human Monoclonals From Antigen-Specific Selection Of B Lymphocytes And Transformation By EBV,” Science 234:476-479)、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリーをHuseら(1989) “Generation Of A Large Combinatorial Library Of The Immunoglobulin Repertoire In Phage Lambda,” Science 246:1275-1281が概説している一般プロトコールに従ってスクリーニングすることにより、また、他の方法により、作製することができる。
【０１６２】
好ましい実施形態では、結合ドナーは、例えば、米国特許出願公開第２００４／００１０１２４号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に開示されているものなどの３Ｇ８抗体またはそのヒト化型に由来する。目的によっては、３Ｇ８が結合するエピトープと同じエピトープにおいて、または３Ｇ８による結合を遮断するために該エピトープに少なくとも十分に近接するエピトープにおいて、ＣＤ１６Ａ受容体と結合するＣＤ１６Ａ結合タンパク質を使用することが有利な場合がある。所望の結合特性を有する結合タンパク質を同定するためのエピトープマッピングおよび競合的結合実験の方法は、実験免疫学の熟練者には周知である。例えば、Harlow and Lane, 前掲; Stahliら(1983) “Distinction Of Epitopes By Monoclonal Antibodies,” Methods in Enzymology 92:242-253; Kirklandら(1986) “Analysis Of The Fine Specificity And Cross-Reactivity Of Monoclonal Anti-Lipid A Antibodies,” J. Immunol. 137:3614-3619; Morelら(1988) “Monoclonal Antibodies To Bovine Serum Albumin: Affinity And Specificity Determinations,” Molec. Immunol. 25:7-15; Cheungら(1990) “Epitope-Specific Antibody Response To The Surface Antigen Of Duck Hepatitis B Virus In Infected Ducks,” Virology 176:546-552;およびMoldenhauerら(1990) “Identity Of HML-1 Antigen On Intestinal Intraepithelial T Cells And Of B-ly7 Antigen On Hairy Cell Leukaemia,” Scand. J. Immunol. 32:77-82参照。例えば、２つの抗体が同じ部位に結合するかどうかは、一方の抗体を用いてＥＬＩＳＡプレート上に抗原を捕捉した後、捕捉された抗原に対する第２の抗体の結合能を測定することによって決定することができる。また、エピトープの比較は、第１の抗体を酵素、放射性核種または蛍光団で直接的または間接的に標識し、第１の抗体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上の抗原との結合を阻害する非標識の第２の抗体の能力を測定することによって達成することもできる。
【０１６３】
ＣＤ１６Ａ受容体とＥＬＩＳＡプレート上に形成された免疫複合体との結合を遮断する抗体の能力を測定することも可能である。このような免疫複合体は、まず、フルオレセインなどの抗原でプレートをコーティングし、次に、特異的な抗フルオレセイン抗体をプレートに適用することによって形成される。この免疫複合体は、その後、ｓＦｃＲＩＩＩａなどの可溶性Ｆｃ受容体のリガンドとして働く。あるいは、可溶性の免疫複合体を形成させて、酵素、放射性核種または蛍光団で直接的または間接的に標識することもできる。その後、これらの標識された免疫複合体と、細胞上の、溶液中のまたは固相上のＦｃ受容体との結合を阻害する抗体の能力を測定することができる。
【０１６４】
本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域を含んでいても含んでいなくてもよい。Ｆｃ領域は、例えば、ｓｃＦｖ結合タンパク質中には存在しない。Ｆｃ領域は、例えば、ヒトもしくはヒト化四量体モノクローナルＩｇＧ抗体に存在する。上記のように、本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、エフェクター機能が改変されている、例えば、非改変Ｆｃ領域（例えば、天然ＩｇＧ１タンパク質のＦｃ）と比較してＦｃ受容体または補体のＣ１成分などのエフェクターリガンドに対する親和性が低下したＦｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、２９７位に相当するＦｃ領域のアミノ酸がグリコシル化されていない。このような抗体はＦｃエフェクター機能を欠いている。
【０１６５】
従って、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、結合タンパク質中にＦｃドメインが存在しないために、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分などのエフェクターリガンドへのＦｃ媒介結合を示すことができず、他の場合では、結合またはエフェクター機能の欠如は抗体の定常領域の変化によるものである。
【０１６６】
５．１．２．１  ｍＡｂ  ３Ｇ８  ＣＤＲ配列に類似のＣＤＲ配列を含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質
本発明の実施に際して使用することができるＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体３Ｇ８のＣＤＲに由来する（すなわち、同一もしくは類似の配列を有する）ＣＤＲ配列を含むタンパク質を包含する。マウス３Ｇ８モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードする相補的ｃＤＮＡ（ＣＤＲをコードする配列を含む）を、記載のようにクローニングし配列決定した。３Ｇ８の核酸配列およびタンパク質配列を以下に示す。マウス可変領域およびＣＤＲ配列を用いて、３Ｇ８のＣＤＲに由来する相補性決定領域を含む多数のキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製し、それらの特性を分析した。ＣＤ１６Ａと高い親和性で結合し、さらに他の所望の特性を有するヒト化抗体を同定するために、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＨ領域を含む抗体重鎖を作製し、３Ｇ８由来のＣＤＲを有するＶＬ領域を含む抗体軽鎖と（同時発現により）組み合わせて、分析用の四量体抗体を作製した。得られた四量体抗体の特性を以下に記載のように測定した。以下に記載するように、３Ｇ８のＣＤＲを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質、例えば、本明細書に記載のヒト化抗体タンパク質を本発明に従って使用することができる。
【０１６７】
５．１．２．１．１  ＶＨ領域
一態様において、本発明のＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８重鎖の１つのＣＤＲ（より一般には３つ全てのＣＤＲ）の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分が実質的にヒト型である（ヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）、重鎖可変ドメインを含むことができる。
【０１６８】
一態様において、本発明は、実質的にヒトのフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体または抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲが、対応するマウス抗体３Ｇ８重鎖ＣＤＲと配列が異なる、上記抗体を提供する。例えば、一実施形態では、ＣＤＲは、当技術分野で公知のように、または表３および表４Ａ〜Ｈに開示されるように、３Ｇ８のＣＤ１６Ａへの結合に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている１以上のＣＤＲ置換を少なくとも有することで、３Ｇ８のＣＤＲ配列とは異なる。好適なＣＤ１６結合タンパク質は、これらの置換を０、１つ、２つ、３つまたは４つ、あるいはそれより多く含んでよく（多くの場合、これらの置換を１〜４つ有する）、所望により付加的置換も有することができる。
【０１６９】
【表３】
0005964300.tif 000006
【０１７０】
【表４Ａ】
0005964300.tif 000007
0005964300.tif 000008
【０１７１】
【表４Ｂ】
0005964300.tif 000009
0005964300.tif 000010
【０１７２】
【表４Ｃ】
0005964300.tif 000011
【０１７３】
【表４Ｄ】
0005964300.tif 000012
【０１７４】
【表４Ｅ】
0005964300.tif 000013
【０１７５】
【表４Ｆ】
0005964300.tif 000014
0005964300.tif 000015
0005964300.tif 000016
【０１７６】
【表４Ｇ】
0005964300.tif 000017
【０１７７】
【表４Ｈ】
0005964300.tif 000018
【０１７８】
一実施形態では、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１構築物（その配列は配列番号６８に示す）のＶＨドメインと同一または類似の重鎖可変ドメイン配列を含むことができる。例えば、本発明は、（１）表１に示される０、１または２以上のＣＤＲ置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号６８）のＶＨドメインとは異なり、（２）表１に示される０、１または２以上のフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインとは異なり、かつ、（３）残りの位置ではＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨ配列と少なくとも約８０％同一、多くの場合には少なくとも約９０％同一、場合により少なくとも約９５％同一、またはさらには少なくとも約９８％同一である、配列を有するＶＨドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
【０１７９】
本発明のＣＤ１６結合タンパク質の例示的ＶＨドメインは、３Ｇ８ＶＨ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５およびＨｕ３Ｇ８ＶＨ−２２の配列（それぞれ配列番号７９、配列番号６９および配列番号７０）を有する。３Ｇ８ＶＨおよびＨｕ３Ｇ８ＶＨ−５の配列（それぞれ配列番号７９および配列番号６９）をコードする例示的ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８０および配列番号８１に示す。
【０１８０】
ＶＨドメインは、表３に示される置換の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つによってＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１（配列番号６８）の配列と異なる配列を有することができる。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増強をもたらし、かつ／またはヒトに投与した際にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性を低減すると考えられている。特定の実施形態では、残りの位置のＨｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインとの配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％である。
【０１８１】
限定ではなく例示として、いくつかのＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＨドメインの配列を表４に示す。ヒトＣγ１定常領域と融合させたこれらの配列を含む重鎖を、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１軽鎖（以下に記載）と同時に発現させて四量体抗体を形成させ、ＣＤ１６Ａに対する該抗体の結合を測定して、アミノ酸置換の効果をｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１のＶＨドメインと比較して評価した。ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、２、３、４、５、８、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４２、４３、４４および４５の配列を有する構築物は高親和性結合を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−６およびｈｕ３Ｇ８ＶＨ−４０のＶＨドメインは中間の結合性を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５およびｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（それぞれ配列番号６９および配列番号７０）のＶＨドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に好ましい結合特性を有すると考えられる。
【０１８２】
５．１．２．２  ＶＬ領域
好ましい結合特性を有する軽鎖可変ドメイン配列を同定するために同様の研究を行った。一態様において、本発明は、少なくとも１つのＣＤＲ（通常は３つのＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体３Ｇ８軽鎖の１つのＣＤＲ（より一般には３つ全てのＣＤＲ）の配列を有し、該結合タンパク質の残りの部分は実質的にヒトの配列型である（ヒト抗体の重鎖可変領域に由来し、実質的にそれに類似する）軽鎖可変ドメインを含む、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
【０１８３】
一態様において、本発明は、実質的にヒトフレームワーク中に３Ｇ８抗体由来のＣＤＲを含むヒト化３Ｇ８抗体のフラグメントであって、軽鎖可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲがマウスモノクローナル抗体３Ｇ８の軽鎖ＣＤＲと配列が異なる、上記抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲにおける１以上のアミノ酸置換、例えば表２で示される１以上の置換（例えば、ＣＤＲ１の２４位のアルギニン；ＣＤＲ１の２５位のセリン；ＣＤＲ１の３２位のチロシン；ＣＤＲ１の３３位のロイシン；ＣＤＲ２の５０位のアスパラギン酸、トリプトファンもしくはセリン；ＣＤＲ２の５３位のセリン；ＣＤＲ２の５５位のアラニンもしくはグルタミン；ＣＤＲ２の５６位のトレオニン；ＣＤＲ３の９３位のセリン；および／またはＣＤＲ３の９４位のトレオニン）を少なくとも有することで、３Ｇ８配列と異なる。様々な実施形態において、可変ドメインは、このような置換を０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれより多く有し（多くの場合、１〜４つのこれらの置換）、所望により付加的置換も有することができる。
【０１８４】
一実施形態では、適当なＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）構築物のＶＬドメインと同一または類似の軽鎖可変ドメイン配列を含むことができ、この配列を表６に示す。例えば、本発明は、（１）表５に示される０、１またはそれより多いＣＤＲ置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）のＶＬドメインとは異なり、（２）表５に示される０、１またはそれより多いフレームワーク置換によりＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメインとは異なり、かつ、（３）残りの位置ではＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬ配列（配列番号７１）と少なくとも約８０％同一、多くの場合には少なくとも約９０％同一、場合により少なくとも約９５％同一、またはさらには少なくとも約９８％同一である、配列を有するＶＬドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質を提供する。
【０１８５】
【表５】
0005964300.tif 000019
【０１８６】
【表６Ａ】
0005964300.tif 000020
0005964300.tif 000021
【０１８７】
【表６Ｂ】
0005964300.tif 000022
【０１８８】
【表６Ｃ】
0005964300.tif 000023
0005964300.tif 000024
【０１８９】
【表６Ｄ】
0005964300.tif 000025
【０１９０】
【表６Ｅ】
0005964300.tif 000026
【０１９１】
【表６Ｆ】
0005964300.tif 000027
0005964300.tif 000028
【０１９２】
【表６Ｇ】
0005964300.tif 000029
【０１９３】
【表６Ｈ】
0005964300.tif 000030
【０１９４】
本発明のＣＤ１６結合タンパク質の例示的ＶＬドメインは、表５および６に示される３Ｇ８ＶＬ、Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１またはＨｕ３Ｇ８ＶＬ−４３の配列（それぞれ配列番号８２、配列番号７１および配列番号７２）を有する。３Ｇ８ＶＬ（配列番号８２）およびＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）をコードする例示的ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号８３および配列番号８４に示す。
【０１９５】
ＶＬドメインは、表２に示される置換の０、１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたは少なくとも９つによってＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）とは異なる配列を有することができる。これらの置換は、ＣＤ１６Ａに対する親和性の増強をもたらし、かつ／またはヒトに投与した際にＣＤ１６Ａ結合タンパク質の免疫原性を低減すると考えられている。特定の実施形態では、残りの位置の配列同一性の程度は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％である。
【０１９６】
限定ではなく例示として、いくつかのＣＤ１６Ａ結合タンパク質のＶＬドメインの配列を表６に示す。ヒトＣκ定常ドメインと融合させたこれらの配列を含む軽鎖を、Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ重鎖（上記）と同時に発現させて四量体抗体を形成させ、ＣＤ１６Ａに対する該抗体の結合を測定して、アミノ酸置換の効果をＨｕ３Ｇ８ＶＬ−１のＶＬドメイン（配列番号７１）と比較して評価した。ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、２、３、４、５、１０、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２７、２８、３２、３３、３４、３５、３６、３７および４２の配列を有する構築物は高親和結合を示し、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１５、１７、２０、２３、２５、２６、２９、３０、３１、３８、３９、４０および４１は中間の結合性を示した。ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２およびｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３のＶＬドメインを含むＣＤ１６Ａ結合タンパク質は、特に好ましい結合性質を有すると考えられる（それぞれ配列番号７１、配列番号７３および配列番号７２）。
【０１９７】
５．１．２．２．１  ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインの組合せ
当該分野で知られ、また本明細書の他所に記載されるように、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それらが会合してダイアボディを形成する条件下で、組換えにより発現させることができ、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのように組み合わせることができる。従って、本明細書に記載の３Ｇ８由来ＶＬドメインを本明細書に記載の３Ｇ８由来ＶＨドメインと組み合わせてＣＤ１６Ａ結合性ダイアボディを作製することができ、そのような組合せの全てが企図されることが分かるであろう。
【０１９８】
限定ではなく例示として、有用なＣＤ１６Ａダイアボディの例は、少なくとも１つのＶＨドメインと少なくとも１つのＶＬドメインを含むダイアボディであり、該ＶＨドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＨ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２またはｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（それぞれ配列番号６８、配列番号７０および配列番号６９）に由来し、該ＶＬドメインがｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２またはｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ配列番号７１、配列番号７３および配列番号４１）に由来する。特に、ｈｕ３Ｇ８ＶＨ−２２（配列番号２２）とｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１、ｈｕ３Ｇ８ＶＬ−２２もしくはｈｕ３Ｇ８ＶＬ−４３（それぞれ配列番号７１、配列番号７０および配列番号７２）のいずれか、またはｈｕ３Ｇ８ＶＨ−５（配列番号６９）とｈｕ３Ｇ８ＶＬ−１（配列番号７１）を含むヒト化抗体は好ましい特性を有する。
【０１９９】
当業者ならば、本明細書に記載のＶＬドメインおよびＶＨドメインの配列は、当技術分野で公知の方法、例えば親和性成熟（Schierら(1996) “Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-ErbB-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site,” J. Mol. Biol. 263:551-567; Daughertyら(1998) “Antibody Affinity Maturation Using Bacterial Surface Display,” Protein Eng.11:825-832; Boderら(1997) “Yeast Surface Display For Screening Combinatorial Polypeptide Libraries,” Nat. Biotechnol. 15:553-557; Boderら(2000) “Directed Evolution Of Antibody Fragments With Monovalent Femtomolar Antigen-Binding Affinity,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97:10701-10705; Hudsonら(2003) “Engineered Antibodies,” Nature Medicine 9:129-39参照）によってさらに改変できることが分かるであろう。例えば、ＣＤ１６Ａ結合タンパク質を、親和性成熟技術を用いて改変し、ＣＤ１６Ａに対する親和性が増強され、かつ／またはＣＤ１６Ｂに対する親和性が低減されたタンパク質を同定することができる。
【０２００】
１つの例示的ＣＤ１６結合タンパク質がマウス３Ｇ８抗体である。ヒト化３Ｇ８のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むアミノ酸配列を図２、９、１４に記載し、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１および配列番号７２に示す。
【０２０１】
５．２  Ｆｃ領域またはその一部を含むダイアボディ
本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部（例えば、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン）を含むダイアボディ分子を包含する。特定の実施形態では、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のＦｃ領域（例えば、ＣＨ２またはＣＨ３）の１以上の定常ドメインを含む。他の実施形態では、本発明は、Ｆｃドメインまたはその一部を含む分子を包含し、ここで、前述のＦｃドメインまたはその一部は、匹敵する野生型Ｆｃドメインまたはその一部に対して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。変異型Ｆｃドメインは当技術分野で周知であり、前述の変異型Ｆｃドメインを含む抗体の表現型（当技術分野で周知の結合活性解析法またはエフェクター機能アッセイのいずれか、例えばＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ解析もしくはＡＤＣＣでアッセイされる）を変更するのに主として用いられる。このような変異型Ｆｃドメインまたはその一部は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明のダイアボディ分子によって示されるエフェクター機能（例えばＮＫ依存的またはマクロファージ依存的アッセイで機能的にアッセイされる）を付与するまたは改変することにより、本発明において使用される。エフェクター機能を変更すると同定されたＦｃドメイン変異体は、国際公開第０４／０６３３５１号、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日出願の米国仮出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日出願の同第６０／６３６，６６３号および２００６年３月１０日出願の同第６０／７８１，５６４号、ならびに本発明者の同時出願である２００５年１１月１０日出願の米国特許出願第１１／２７１，１４０号および２００５年１２月１５日出願の同第１１／３０５，７８７号（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に開示されている。
【０２０２】
他の実施形態では、本発明は、当技術分野で公知のいずれのＦｃ変異体の使用も包含し、例えば、Duncanら(1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG,” Nature 332:563-564; Lundら(1991) “Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,” J. Immunol. 147:2657-2662; Lundら(1992) “Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII,” Mol. Immunol. 29:53-59; Alegreら(1994) “A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo,” Transplantation 57:1537-1543; Hutchinsら(1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H,” Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92:11980-11984; Jefferisら(1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation,” Immunol. Lett. 44:111-117; Lundら(1995) “Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,” FASEB J. 9:115-119; Jefferisら(1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,” Immunol. Lett. 54:101-104; Lundら(1996) “Multiple Interactions Of Igg With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,” J. Immunol. 157:4963-4969; Armourら(1999) “Recombinant Human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,” Eur. J. Immunol. 29:2613-2624; Idusogieら(2000) “Mapping Of The C1Q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG1 Fc,” J. Immunol. 164:4178-4184; Reddyら(2000) “Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4,” J. Immunol. 164:1925-1933; Xuら(2000) “In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26; Idusogieら(2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement,” J. Immunol. 166:2571-2575; Shieldsら(2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R,” J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Jefferisら(2002) “Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models,” Immunol. Lett. 82:57-65; Prestaら(2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,” Biochem. Soc. Trans. 30:487-490)；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；国際公開第００／４２０７２号；同第９９／５８５７２号（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）で開示されたものが挙げられる。
【０２０３】
特定の実施形態では、Ｆｃ領域のアミノ酸に対する前述の１以上の改変は、Ｆｃ領域の、従って、本発明のダイアボディ分子の、１以上のＦｃγＲ受容体に対する親和性および結合力を低減する。特定の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩＡである。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＡである。別の特定の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃ領域またはその一部を含むダイアボディを包含し、ここで、前述の変異型Ｆｃ領域は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、変異型Ｆｃ領域のみが１つのＦｃγＲと結合し、該ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＢである。特定の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む分子を包含し、ここで、前述の変異体は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている方法を用いて測定した場合に、Ｆｃドメインを含まない分子または野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、ＡＤＣＣ活性の増強および／またはＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）に対する結合の増強を付与または媒介する。別の実施形態では、本発明は変異型Ｆｃドメインを含む分子を包含し、ここで、前述の変異体は、当業者に公知であり、本明細書に記載されている方法を用いて測定した場合に、Ｆｃドメインを含まないまたは野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、ＡＤＣＣ活性（もしくは他のエフェクター機能）の低下および／またはＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）に対する結合の増強を付与または媒介する。
【０２０４】
本発明はまた、２以上のＩｇＧアイソタイプに由来するドメインまたは領域を含むＦｃドメインの使用も包含する。当技術分野で公知のように、Ｆｃ領域のアミノ酸改変は、Ｆｃ媒介エフェクター機能および／または結合活性に大きな影響を及ぼし得る。しかしながら、機能的特徴のこれらの改変は、選択されたＩｇＧアイソタイプに関して実施する場合には、さらに精密化され、かつ／または操作され得る。同様に、Ｆｃアイソタイプの天然の特徴は、１以上のアミノ酸改変により操作することができる。複数のＩｇＧアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）は、ヒンジおよび／またはＦｃドメインのアミノ酸配列の違いのために、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性およびエフェクター機能活性（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ）を含む異なる物理的および機能的特性を示す。特定の実施形態では、所望の特徴を有するダイアボディを設計するために、アミノ酸改変およびＩｇＧ  Ｆｃ領域は、それらのそれぞれの個別の結合性および／またはエフェクター機能活性に基づいて独立に選択される。ほとんどの実施形態では、前述のアミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１に関して本明細書に記載される、または当技術分野で公知の、結合性および／またはエフェクター機能活性に関して別々にアッセイされている。特定の実施形態では、前述のアミノ酸改変およびＩｇＧヒンジ／Ｆｃ領域は、ダイアボディ分子または他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）に関してＦｃγＲ結合性またはエフェクター機能について別々にアッセイした場合に、類似の機能性、例えば、ＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の増強を示す。前述のアミノ酸改変と選択されたＩｇＧ  Ｆｃ領域の組合せは、その後、相加的に、またはより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディ分子と比較して、本発明のダイアボディ分子の前述の機能性を改変する。他の実施形態では、前述のアミノ酸改変およびＩｇＧ  Ｆｃ領域は、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の、野生型Ｆｃ領域を含むダイアボディ分子または他のＦｃ含有分子（例えば、免疫グロブリン）に関してＦｃγＲ結合性および／またはエフェクター機能について別個にアッセイした場合に、相反する機能性、例えば、ＦｃγＲＩＩＡに対する親和性のそれぞれ増強および低下を示し、この「相反する」アミノ酸改変と選択されたＩｇＧ領域の組合せは、Ｆｃ領域を含まない、または同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域を含む本発明のダイアボディと比較して、本発明のダイアボディの特異的機能性を選択的に弱めるまたは低減する働きをする。あるいはまた、本発明は、新規の特性を示す、当技術分野で公知のアミノ酸改変と選択されたＩｇＧ領域との組合せを含む変異型Ｆｃ領域を包含し、このような特性は、前述の改変および／または領域を本明細書で記載したように独立にアッセイした場合には検出不能である。
【０２０５】
複数のＩｇＧアイソタイプおよびそのドメインの機能的特性は当技術分野で周知である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアミノ酸配列を図１Ａ〜１Ｂに示す。本発明の方法に使用される特定のＩｇＧアイソタイプに由来する２以上のドメインの選択および／または組合せは、ＦｃγＲに対する親和性を含む、親アイソタイプの任意の既知のパラメーターに基づくものであってよい（表７；Fleschら(2000) “Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G,” J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappelら(1993) “Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody,” J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappelら(1991) “Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9036-9040、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。例えば、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合が限定されているか、または全く示されないＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）に由来する領域またはドメインの使用は、活性化受容体に対する結合を最大にし、阻害受容体に対する結合を最小にするようにダイアボディを操作することが望まれる場合に特に有用であり得る。同様に、Ｃ１ｑまたはＦｃγＲＩＩＩＡと優先的に結合することが知られる、例えば、ＩｇＧ３(Bruggemannら(1987) “Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies,” J. Exp. Med. 166:1351-1361)などのＩｇＧアイソタイプに由来するＦｃ領域またはドメインの使用は、ＡＤＣＣを増強することが当技術分野で知られているＦｃアミノ酸改変と組み合わせて、エフェクター機能活性（例えば、補体の活性化またはＡＤＣＣ）が最大となるようにダイアボディ分子を操作することができる。
【０２０６】
【表７】
0005964300.tif 000031
【０２０７】
５．３  分子コンジュゲート
本発明のダイアボディ分子を、異種ポリペプチド（すなわち、無関連ポリペプチドまたはその一部、好ましくはそのポリペプチドの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個もしくは少なくとも１００個のアミノ酸）と、組換えにより融合させて、または化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合の双方を含む）させて、融合タンパク質を作製することができる。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じてもよい。
【０２０８】
さらに、本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）は、治療薬または所与の生物学的応答を改変する薬物成分とコンジュゲートさせてもよい。直接的なコンジュゲートに代わるものとして、本発明の多価（例えば、四価）のダイアボディ分子上の複数のエピトープ結合部位により、ダイアボディの少なくとも１つの結合領域は、ダイアボディの結合に影響を及ぼすことなく、治療薬または所望の薬物成分と結合するように設計することができる。
【０２０９】
治療薬または薬物成分は、古典的な化学治療薬であるとは限らない。例えば、薬物成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素（すなわち、ＰＥ−４０）またはジフテリア毒素などの毒素；リシン、ゲロニンおよびブタクサ抗ウイルスタンパク質；腫瘍壊死因子、インターフェロン（限定されるものではないが、αインターフェロン（ＩＦＮ−α）およびβインターフェロン（ＩＦＮ−β）を含む）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、アポトーシス剤（例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、国際公開第９７／３３８９９号に開示されているＡＩＭ  Ｉ）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開第９７／３４９１１号参照）、Ｆａｓリガンド、およびＶＥＧＩ（国際公開第９９／２３１０５号）などのタンパク質；血栓剤もしくは抗血管新生剤（例えば、アンギオスタチンもしくはエンドスタチン）；または例えばリンホカイン（例えば、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）および顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」））または成長因子（例えば、成長ホルモン（「ＧＨ」））といった生物応答修飾物質；プロテアーゼ；あるいはリボヌクレアーゼが挙げられる。
【０２１０】
本発明のダイアボディ分子（すなわち、ポリペプチド）を、精製を容易にするペプチドなどのマーカー配列と融合させることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、市販されている多くのものの中でも、ｐＱＥベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311)に提供されているタグである。Gentzら(1989) “Bioassay For Trans-Activation Using Purified Human Immunodeficiency Virus TAT-Encoded Protein: Trans-Activation Requires mRNA Synthesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-824に記載されているように、例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ(Wilsonら(1984) “The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein,” Cell, 37:767-778)および「Ｆｌａｇ」タグ(Knappikら(1994) “An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments,” Biotechniques, 17(4):754-761)が挙げられる。
【０２１１】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（「ＤＮＡシャッフリング」と総称される）の技術によって作製することができる。ＤＮＡシャッフリングを使用すれば、本発明の分子の活性を変更することができる（例えば、より高い親和性とより低い解離速度を有するエピトープ結合部位）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号；同第５，８１１，２３８号；同第５，８３０，７２１号；同第５，８３４，２５２号；および同第５，８３７，４５８号、ならびにPattenら(1997) “Applications Of DNA Shuffling To Pharmaceuticals And Vaccines,” Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-733; Harayama (1998) “Artificial Evolution By DNA Shuffling,” Trends Biotechnol. 16:76-82; Hanssonら(1999) “Evolution Of Differential Substrate Specificities In Mu Class Glutathione Transferases Probed By DNA Shuffling,” J. Mol. Biol. 287:265-276; and Lorenzoら(1998) “PCR-Based Method For The Introduction Of Mutations In Genes Cloned And Expressed In Vaccinia Virus,” BioTechniques 24:308-313参照（これらの特許および刊行物は参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のダイアボディ分子、または本発明の分子をコードする核酸は、組換え前に、エラープローン(error-prone)ＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法によるランダム突然変異誘発を施すことによってさらに改変することができる。本発明の分子をコードするポリヌクレオチドの１以上の部分を、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えることができる。
【０２１２】
また、本発明は、診断薬もしくは治療薬、または他のいずれかの分子（血清半減期の延長／短縮および／または特定の細胞サブセットへの標的化が望まれる分子）とコンジュゲートされるか、またはそれらを免疫特異的に認識する本発明のダイアボディ分子も包含する。本発明の分子を診断上使用して、例えば、疾患、障害または感染の発症または進行を臨床試験手順の一環としてモニタリングして、例えば所与の治療計画の有効性を測定することができる。本発明の分子を検出可能な物質と結合させることにより、または検出可能な物質を免疫特異的に認識する分子により、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、各種酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当技術分野で公知の技術を用い、本発明の分子と直接的に、または媒介物質（例えば、当技術分野で公知のリンカー）を介して間接的に、結合またはコンジュゲートすることができ、あるいは、該分子は検出可能な物質を免疫特異的に認識する（すなわち、前述の物質と免疫特異的に結合する）こともできる。例えば、本発明の診断薬として使用される抗体とコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照。このような診断および検出は、検出可能な物質を免疫特異的に認識するように分子をデザインするか、または本発明の分子を検出可能な物質、例えば、限定されるものではないが、各種酵素、限定されるものではないが、例えば、セイヨウワザビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族複合体、限定されるものではないが、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；蛍光物質、限定されるものではないが、例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン；発光物質、限定されるものではないが、例えば、ルミノール；生物発光物質、限定されるものではないが、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリン等；放射性物質、限定されるものではないが、例えば、ビスマス（213Ｂｉ）、炭素（14Ｃ）、クロム（51Ｃｒ）、コバルト（57Ｃｏ）、フッ素（18Ｆ）、ガドリニウム（153Ｇｄ、159Ｇｄ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、ゲルマニウム（68Ｇｅ）、ホルミウム（166Ｈｏ）、インジウム（115Ｉｎ、113Ｉｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、ランタン（140Ｌａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、マンガン（54Ｍｎ）、モリブデン（99Ｍｏ）、パラジウム（103Ｐｄ）、亜リン（32Ｐ）、プラセオジム（142Ｐｒ）、プロメチウム（149Ｐｍ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ロジウム（105Ｒｈ）、ルテニウム（97Ｒｕ）、サマリウム（153Ｓｍ）、スカンジウム（47Ｓｃ）、セレン（75Ｓｅ）、ストロンチウム（85Ｓｒ）、硫黄（35Ｓ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、スズ（113Ｓｎ、117Ｓｎ）、トリチウム（3Ｈ）、キセノン（133Ｘｅ）、イッテルビウム（169Ｙｂ、175Ｙｂ）、イットリウム（90Ｙ）、亜鉛（65Ｚｎ）；各種陽電子放射断層撮影で用いる陽電子放出金属；ならびに非放射性常磁性金属イオンと結合させることにより達成することができる。
【０２１３】
本発明のダイアボディ分子は、細胞毒素（例えば、細胞増殖抑制剤もしくは殺細胞剤）、治療薬、または放射性元素（例えば、α放射体、γ放射体など）のような治療成分を免疫特異的に認識するか、またはそれらとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害性薬剤は細胞に有害な任意の薬剤を含む。例として、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジハイドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらの類似体または同族体が挙げられる。治療薬としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（かつてのダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗体（例えば、ダクチノマイシン（かつてのアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ）、ならびに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０２１４】
さらに、本発明のダイアボディ分子は、治療成分、例えば放射性物質または放射性金属イオンとコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤と結合させることもできるし、あるいはそれらを免疫特異的に認識するように設計することもできる（放射性物質の例としては上記を参照）。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介してポリペプチドに結合させることのできる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。このようなリンカー分子は、当技術分野で通常知られており、Denardoら(1998) “Comparison Of 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'''-Tetraacetic Acid (DOTA)-Peptide-ChL6, A Novel Immunoconjugate With Catabolizable Linker, To 2-Iminothiolane-2-[p-(bromoacetamido)benzyl]-DOTA-ChL6 In Breast Cancer Xenografts,” Clin. Cancer Res. 4:2483-2490; Petersonら(1999) “Enzymatic Cleavage Of Peptide-Linked Radiolabels From Immunoconjugates,” Bioconjug. Chem. 10:553-; and Zimmermanら, (1999) “A Triglycine Linker Improves Tumor Uptake And Biodistributions Of 67-Cu-Labeled Anti-Neuroblastoma mAb chCE7 F(ab')2 Fragments,” Nucl. Med. Biol. 26:943-950（それぞれ参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）に記載されている。
【０２１５】
このような治療成分を、例えばＦｃドメインを含むポリペプチドにコンジュゲートさせる技術は周知である。例えば、Arnonら, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), 1985, pp. 243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstromら, “Antibodies For Drug Delivery”, Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc.); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), 1985, pp. 475-506); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), 1985, pp. 303-16, Academic Press; and Thorpeら(1982) “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates,” Immunol. Rev., 62:119-158参照。
【０２１６】
本発明のダイアボディ分子は、治療成分をコンジュゲートさせて投与してもコンジュゲートさせずに投与してもよく、単独で投与してもよいし、または治療処置として使用される細胞傷害性因子および／またはサイトカインと併用投与してもよい。単独で投与する場合、多価の、例えば四価のダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープを、治療薬、例えば細胞傷害性因子および／またはサイトカイン（本発明の分子と同時にまたは本発明の分子の後に投与することができる）を免疫特異的に認識するように設計することができる。このように、ダイアボディ分子は、直接的結合と類似の方法で治療薬を特異的に標的とすることができる。あるいは、本発明の分子を抗体とコンジュゲートさせて、Ｓｅｇａｌが米国特許第４，６７６，９８０号（参照によりその全内容を本発明に組み入れる）に記載しているように抗体ヘテロコンジュゲートを形成させることもできる。本発明のダイアボディ分子は、固相支持体に結合させることもでき、特に標的抗原のイムノアッセイまたは精製に有用である。このような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０２１７】
５．４  ダイアボディ分子の結合の特性決定
本発明のダイアボディ分子は、様々な方法で特性決定を行うことができる。特に、本発明の分子は、例えばＦｃＲＩＩＩＡもしくはＦｃＲＩＩＢなどの抗原と免疫特異的に結合する能力について、または該分子がＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む場合には、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわち、Ｆｃドメイン（もしくはその一部）のＦｃγＲへの特異的結合を示す能力について、アッセイすることができる。このようなアッセイは溶液中で（例えば、Houghten (1992) “The Use Of Synthetic Peptide Combinatorial Libraries For The Identification Of Bioactive Peptides,” BioTechniques, 13:412-421)、ビーズ上で(Lam (1991) “A New Type Of Synthetic Peptide Library For Identifying Ligand-Binding Activity,” Nature, 354:82-84)、チップ上で(Fodor (1993) “Multiplexed Biochemical Assays With Biological Chips,” Nature, 364:555-556)、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（米国特許第５，５７１，６９８号、同第５，４０３，４８４号および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で(Cullら(1992) “Screening For Receptor Ligands Using Large Libraries Of Peptides Linked To The C Terminus Of The Lac Repressor,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1865-1869)またはファージ上で(Scottら(1990) “Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library,” Science, 249:386-390; Devlin (1990) “Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules,” Science, 249:404-406; Cwirlaら(1990) “Peptides On Phage: A Vast Library Of Peptides For Identifying Ligands,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382;およびFelici (1991) “Selection Of Antibody Ligands From A Large Library Of Oligopeptides Expressed On A Multivalent Exposition Vector,” J. Mol. Biol., 222:301-310)行うことができる（これらの参照文献はそれぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。抗原、例えばＦｃγＲＩＩＩＡに免疫特異的に結合することが確認された分子は、その後、抗原に対する特異性および親和性についてアッセイすることができる。
【０２１８】
複数のエピトープ結合ドメインを含むように操作した本発明の分子は、１以上の抗原（例えば、癌抗原）に対する免疫特異的結合および他の抗原（例えば、ＦｃγＲ）との交差反応性について、またはその分子がＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む場合には、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用について、当技術分野で公知のいずれかの方法によってアッセイすることができる。免疫特異的結合、交差反応性およびＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を分析するために用いることができるイムノアッセイとしては、限定されるものではないが、数例を挙げると、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ、Ａタンパク質イムノアッセイなどの技術を用いた競合および非競合アッセイ系が含まれる。このようなアッセイは、当技術分野では慣例であり、周知である（例えば、Ausubelら編, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照）。
【０２１９】
抗原−結合ドメインの相互作用、またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の結合親和性および解離速度は、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例としてラジオイムノアッセイがあり、この方法は、標識された抗原、例えば四量体ＦｃγＲ（例えば、3Ｈまたは125Ｉ、第５．４．１節参照）と対象分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子）とを、四量体ＦｃγＲ（第５．４．１節参照）などの、漸増量の非標識エピトープの存在下でインキュベートし、標識抗原に結合した分子を検出することを含む。抗原に対する本発明の分子の親和性および結合解離速度は、スキャッチャード分析法により飽和率のデータから求めることができる。
【０２２０】
抗原またはＦｃγＲに対する本発明の分子の親和性および結合特性は、初めに抗原−結合ドメインまたはＦｃ−ＦｃγＲの相互作用について当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ（生化学または免疫学に基づくアッセイ）（限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴アッセイ、免疫沈降アッセイを含む）を用いて測定することができる。また、本発明の分子の結合特性を、第５．４．２節に記載したような１以上のＦｃγＲ媒介エフェクター細胞機能を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイによって特性決定を行うことが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明の分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系アッセイにおける結合特性と同様の結合特性をｉｎ  ｖｉｖｏモデル（例えば、本明細書に記載され開示されるもの）でも有する。しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系アッセイでは所望の表現型を示さないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは所望の表現型を示す本発明の分子を排除するものではない。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む分子のスクリーニングおよび同定は、機能に基づくアッセイを、好ましくはハイスループット方式で行う。機能に基づくアッセイは、例えば、本明細書の第５．４．２節および第５．４．３節に記載されているような、１以上のＦｃγＲ媒介エフェクター細胞機能の特性決定を行うための当技術分野で公知のいずれのアッセイであってもよい。本発明の方法に従って使用可能なエフェクター細胞機能の非限定的な例としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性食作用、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、および補体依存性細胞媒介性細胞傷害作用が挙げられる。
【０２２２】
好ましい実施形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析を使用して、抗原または／およびＦｃγＲに対する本発明の分子の結合速度および解離速度を測定する。ＢＩＡｃｏｒｅ動態分析は、抗原またはＦｃγＲの結合と解離を、固定した分子（例えば、それぞれエピトープ結合ドメインまたはＦｃドメイン（もしくはその一部）を含む分子）をその表面に担持したチップから分析することを含む。ＢＩＡｃｏｒｅ分析は第５．４．３節に記載する。
【０２２３】
本発明の分子の特性決定を行うための免疫学または機能に基づくアッセイには、当業者に公知のいずれかの方法を用いた蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting：ＦＡＣＳ）を使用することが好ましい。フローソーターは、本発明の分子が結合した、例えば本発明の分子によってオプソニン化された、多数の個々の細胞を迅速に調べることができる（例えば、１時間あたり１０００万〜１億個の細胞）(Shapiroら(1995) Practical Flow Cytometry)。さらに、ダイアボディの挙動を至適化するために使用される特定のパラメーターとしては、限定されるものではないが、抗原濃度（すなわち、ＦｃγＲ四量体複合体、第５．４．１節参照）、動態競合時間、またはＦＡＣＳストリンジェンシーが含まれ、これらをそれぞれ変化させて、特異的な結合特性（例えば、複数のエピトープへの同時結合）を示す本発明の分子を含むダイアボディ分子を選択することができる。生体細胞を選別して調べるフローサイトメーターは当技術分野では周知である。公知のフローサイトメーターは、例えば、米国特許第４，３４７，９３５号；同第５，４６４，５８１号；同第５，４８３，４６９号；同第５，６０２，０３９号；同第５，６４３，７９６号；および同第６，２１１，４７７号に記載されている（これらの文献の全内容を参照により本明細書に組み入れる）。他の公知のフローサイトメーターとしては、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ製のＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）システム、およびＵｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ製のＣＯＰＡＳ（商標）システムがある。
【０２２４】
標的抗原結合親和性またはＦｃ−ＦｃγＲ結合親和性の特性決定、および細胞表面の標的抗原またはＦｃγＲの密度の評価は、スキャッチャード分析法などの当技術分野で周知の方法によるか、または例えばＱｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（登録商標）（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、インディアナ州フィッシャーズ）などの製造者の説明書に従ったキットの使用によって行うことができる。１以上の機能アッセイは、当業者に公知のまたは本明細書に記載されている１以上のＦｃγＲ媒介エフェクター細胞機能の特性決定を行うために当技術分野で公知のいずれのアッセイであってもよい。特定の実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子は、１以上の標的抗原または１以上のＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ）に対する結合に関してＥＬＩＳＡアッセイでアッセイされ、その後、１以上のＡＤＣＣアッセイが行われる。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、さらに表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅを用いてアッセイされる。表面プラズモン共鳴に基づくアッセイは当技術分野で周知であり、第５．４．３節に詳しく述べ、本明細書の例えば実施例６．１で例示する。
【０２２５】
最も好ましい実施形態では、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子は、標的抗原（例えば、ＦｃγＲ）との相互作用またはＦｃ−ＦｃγＲ相互作用について動物モデルでさらに特性決定が行われる。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用をアッセイする場合、本発明の方法での使用に好ましい動物モデルは、例えば、ヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウス、例えば、米国特許第５，８７７，３９７号および同第６，６７６，９２７号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されているいずれかのマウスモデルである。さらに、このような方法で使用されるトランスジェニックマウスとしては、限定されるものではないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡノックアウトヌードマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡノックアウトヌードマウス、ならびにヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢを担持しているＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢノックアウトヌードマウスが挙げられる。
【０２２６】
５．４．１  ＦｃγＲを含む結合アッセイ
Ｆｃドメイン（またはその一部）を含み、かつ／またはＦｃγＲに特異的なエピトープ結合ドメインを含む分子によるＦｃγＲに対する結合の特性決定は、限定されるものではないが、ＦｃγＲの多型変異体を含む、いずれのＦｃγＲを使用して行ってもよい。いくつかの実施形態では、１５８位にフェニルアラニンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体が使用される。他の実施形態では、１５８位にバリンを含むＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体を用いて特性決定が行われる。ＦｃγＲＩＩＩＡ  １５８Ｖは、ＩｇＧ１に対して１５８Ｆよりも高い親和性、およびＡＤＣＣ活性の増強を示し（例えば、Koeneら(1997) “Fc gammaRIIIa-158V/F Polymorphism Influences The Binding Of IgG By Natural Killer Cell Fc gammaRIIIa, Independently Of The Fc gammaRIIIa-48L/R/H Phenotype,” Blood, 90:1109-14; Wuら(1997) “A Novel Polymorphism Of FcgammaRIIIa (CD16) Alters Receptor Function And Predisposes To Autoimmune Disease,” J. Clin. Invest. 100: 1059-70参照、双方とも参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）、この残基は実際に、ＩｇＧ１−ＦｃγＲＩＩＩＡの共結晶化研究によって最近示されたように、ＩｇＧ１の下方ヒンジ領域と直接相互作用する（例えば、Sondermannら(2000) “The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgG1 Fc Fragment-Fc gammaRIII complex,” Nature, 406(6793):267-273参照、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。研究により、いくつかのケースにおいて、治療用抗体はＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ同型接合患者において有効性の向上を示すことが示された。例えば、ヒト化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体リツキシマブは、ＦｃγＲＩＩＩＡ  １５８Ｆホモ接合患者と比較してＦｃγＲＩＩＩＡ  １５８Ｖ同型接合患者では治療上より有効であった（例えば、Cartronら(2002) “Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIA Gene,” Blood, 99(3): 754-758参照）。他の実施形態では、この領域を含む治療用分子はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＶおよびＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆに関して異型接合の患者において、ならびにＦｃγＲＩＩＡ−１３１Ｈを有する患者でも、より有効であり得る。特定の作用機序に縛られるものではないが、別のアロタイプを有する本発明の分子を選択すると、ひとたび治療用ダイアボディに遺伝子工学的に導入すれば、そのようなアロタイプについて同型接合性の患者に対して臨床上より有効となる変異体が得られる。
【０２２７】
ＦｃγＲ結合アッセイが、本発明の分子とＦｃγＲとの結合を測定するために、特に、ＦｃドメインとＦｃγＲとの結合を測定するために開発された。このアッセイにより、リガンドに対する受容体の親和性が本質的に弱くても、例えば、ＦｃγＲＩＩＢとＦｃγＲＩＩＩＡについてマイクロモルの範囲であっても、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の検出および定量が可能となった。前述の方法は、国際公開第０４／０６３３５１号および米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に詳細に記載されている。簡単に述べると、この方法は、当技術分野で公知のいずれかの標準的なイムノアッセイ、例えばＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴などで追跡することができるＦｃγＲ複合体の形成を含む。さらに、ＦｃγＲ複合体は、複合体を形成していないＦｃγＲと比較して、Ｆｃ領域に対して結合力の向上を示す。本発明によれば、好ましい分子複合体は、（ａ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）；（ｂ）ＦｃγＲの可溶性領域（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの可溶性領域）のＣ末端に機能し得る形で連結されたビオチン化１５アミノ酸ＡＶＩＴＡＧ配列（ＡＶＩＴＡＧ）；および（ｃ）ストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）を、四量体ＦｃγＲ複合体を形成するモル比で（好ましくは５：１のモル比で）含む四量体の免疫複合体である。この融合タンパク質は、例えばアミノ酸１５個のＡＶＩＴＡＧ配列中のリジン残基を特異的にビオチン化する大腸菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡ酵素を用いて、酵素的にビオチン化される。ビオチン化された可溶性ＦｃγＲタンパク質を、その後、ＳＡ−ＰＥと１×ＳＡ−ＰＥ：５×ビオチン化可溶性ＦｃγＲのモル比で混合して四量体ＦｃγＲ複合体を形成させる。
【０２２８】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、複合体を形成していない単量体ＦｃγＲよりも少なくとも８倍高い親和性で四量体ＦｃγＲ複合体と結合することが示されている。Ｆｃ領域を含むポリペプチドの四量体ＦｃγＲ複合体との結合性は、当業者に公知の標準的な技術、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡなどを用いて測定することができる。
【０２２９】
本発明は、細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイでＦｃ領域を含む分子の機能性を測定するための、上記方法により形成される本発明の分子を含む免疫複合体の使用を包含する。
【０２３０】
便宜上、試薬は、アッセイキットで、すなわち、Ｆｃ領域を含んだ分子の、ＦｃγＲ四量体複合体との結合能をアッセイするためにパッケージされた試薬の組合せで提供することができる。本発明の方法における使用には、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用の測定に、例えば、２００３年１月１３日出願の米国仮出願第６０／４３９，７０９号（参照としてその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されているように形成された融合タンパク質などの他の形態の分子複合体も企図される。
【０２３１】
５．４．２  変異型重鎖を有する分子の機能アッセイ
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子の、該分子のエフェクター細胞機能を同定するための当業者に公知のアッセイを用いた特性決定を包含する。特に、本発明は、本発明の分子を、ＦｃγＲ媒介エフェクター細胞機能について特性決定を行うことを包含する。さらに、本発明のダイアボディ分子の標的抗原の少なくとも１つがＦｃγＲである場合、ダイアボディ分子によるＦｃγＲの結合は、ＦｃγＲ−Ｆｃ結合により活性化される経路と類似したＦｃγＲ媒介経路を活性化するのに役立ち得る。従って、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインがＦｃγＲを認識する場合には、ダイアボディ分子は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含まなくても、またはＦｃ−ＦｃγＲ結合が付随しなくても、ＦｃγＲ媒介エフェクター細胞機能を誘発することができる。本発明に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞機能の例としては、限定されるものではないが、抗体依存性細胞傷害性、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞媒介性細胞傷害作用が挙げられる。エフェクター細胞機能活性を測定するために、当業者に公知のいずれの細胞系アッセイまたは無細胞系アッセイも使用可能である（エフェクター細胞アッセイについては、Perussiaら(2000) “Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC (Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells,” Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Baggioliniら(1988) “Cellular Models For The Detection And Evaluation Of Drugs That Modulate Human Phagocyte Activity,” Experientia, 44(10): 841-848; Lehmannら(2000) “Phagocytosis: Measurement By Flow Cytometry,” J. Immunol. Methods, 243(1-2): 229-42; Brown (1994) “In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction,” Methods Cell Biol., 45: 147-64; Munnら(1990) “Phagocytosis Of Tumor Cells By Human Monocytes Cultured In Recombinant Macrophage Colony-Stimulating Factor,” J. Exp. Med., 172: 231-237, Abdul-Majidら(2002) “Fc Receptors Are Critical For Autoimmune Inflammatory Damage To The Central Nervous System In Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,” Scand. J. Immunol. 55: 70-81; Dingら(1998) “Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids,” Immunity 8:403-411を参照、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【０２３２】
一実施形態では、本発明の分子をヒト単球でＦｃγＲ媒介食作用についてアッセイすることができる。あるいは、本発明の分子のＦｃγＲ媒介食作用をその他の食細胞、例えば、好中球（多形核白血球(polymorphonuclear leuckocytes)：ＰＭＮ）；ヒト末梢血単球、単球由来マクロファージでアッセイすることもでき、これらは当業者に公知の標準的手順を使用して取得することができる（例えば、Brown (1994) “In Vitro Assays Of Phagocytic Function Of Human Peripheral Blood Leukocytes: Receptor Modulation And Signal Transduction,” Methods Cell Biol., 45: 147-164参照）。一実施形態では、従前に記載されている方法(Tridandapaniら(2000) “The Adapter Protein LAT Enhances Fcgamma Receptor-Mediated Signal Transduction In Myeloid Cells,” J. Biol. Chem. 275: 20480-20487)により、フルオレセイン化ＩｇＧオプソニン化ヒツジ赤血球細胞（sheep red blood cells：ＳＲＢＣ）を貪食するＴＨＰ−１細胞の能力を測定することによって本発明の分子の機能の特性決定を行う。
【０２３３】
本発明の分子の食作用を測定するための別の例示的アッセイは、抗体依存性オプソニン食作用アッセイ（antibody-dependent opsonophagocytosis assay：ＡＤＣＰ）であり、このアッセイは、大腸菌(Escherichia coli)標識ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）または黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ＦＩＴＣなどの標的生体粒子を、（ｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰの対照抗体としての、フルオレセインに対する抗体である野生型４−４−２０抗体（Bedzykら(1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family,” J. Biol. Chem, 264(3): 1565-1569参照、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）で、または（ｉｉ）ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰのバックグラウンド対照としての、ＦｃγＲＩＩＩへの結合をノックアウトするＤ２６５Ａ突然変異を保有する４−４−２０抗体で、（ｉｉｉ）４−４−２０のエピトープ結合ドメインとＦｃドメインおよび／またはＦｃγＲＩＩＩに特異的なエピトープ結合ドメインとを含むダイアボディでコーティングすること；およびオプソニン化粒子を形成させること；記載したオプソニン化粒子（ｉ〜ｉｉｉ）のいずれかをＴＨＰ−１エフェクター細胞（ＡＴＣＣより入手可能な単球細胞株）に１：１、１０：１、３０：１、６０：１、７５：１または１００：１の比で添加して、ＦｃγＲ媒介食作用を生じさせること；好ましくは、該細胞と大腸菌−ＦＩＴＣ／抗体を３７℃で１．５時間インキュベートすること；インキュベーション後、細胞にトリパンブルーを添加して（好ましくは、室温で２〜３分）、内部移行されずに細胞表面の外側に付着した細菌の蛍光を消光させること；細胞をＦＡＣＳバッファー（例えば、ＰＢＳ中０．１％のＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中に移し、ＦＡＣＳ（例えば、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）を用いてＴＨＰ１細胞の蛍光を分析することを含む。好ましくは、このアッセイに用いられるＴＨＰ−１細胞を、ＦＡＣＳにより細胞表面上のＦｃγＲの発現について分析する。ＴＨＰ−１細胞はＣＤ３２ＡとＣＤ６４の双方を発現する。ＣＤ６４は、本発明の方法に従ってＡＤＣＰアッセイを行う際に遮断される高親和性ＦｃγＲである。ＴＨＰ−１細胞は、好ましくは１００μｇ／ｍＬの可溶性ＩｇＧ１または１０％ヒト血清で遮断する。ＡＤＣＰの程度を分析するため、ゲートを好ましくはＴＨＰ−１細胞に設定し、蛍光強度の中央値を測定する。個々の突然変異体についてのＡＤＣＰ活性を算出し、野生型ｃｈＭａｂ  ４−４−２０に対して得られた、正規化した数値として記録する。これらのオプソニン化粒子をＴＨＰ−１細胞に添加して、オプソニン化粒子とＴＨＰ−１細胞の比が３０：１または６０：１になるようにする。最も好ましい実施形態では、ＡＤＣＰアッセイを対照、例えば、培地中の大腸菌−ＦＩＴＣ、大腸菌−ＦＩＴＣとＴＨＰ−１細胞（ＦｃγＲ非依存性ＡＤＣＰ活性として）、大腸菌−ＦＩＴＣとＴＨＰ−１細胞と野生型４−４−２０抗体（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性として）、大腸菌−ＦＩＴＣとＴＨＰ−１細胞と４−４−２０  Ｄ２６５Ａ（ＦｃγＲ依存性ＡＤＣＰ活性についてのバックグラウンド対照として）を用いて行う。
【０２３４】
別の実施形態では、本発明の分子を、当業者に公知の標準的方法のいずれかを用いて、エフェクター細胞、例えばナチュラルキラー細胞で、ＦｃγＲ媒介ＡＤＣＣ活性についてアッセイすることができる（例えば、Perussiaら(2000) “Assays For Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity (ADCC) And Reverse ADCC(Redirected Cytotoxicity) In Human Natural Killer Cells,” Methods Mol. Biol. 121: 179-92; Wengら(2003) “Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma,” J. Clin. Oncol. 21:3940-3947; Dingら(1998) “Two Human T Cell Receptors Bind In A Similar Diagonal Mode To The HLA-A2/Tax Peptide Complex Using Different TCR Amino Acids,” Immunity 8:403-411参照）。本発明の分子のＡＤＣＣ活性を測定するための例示的アッセイは、標的細胞を［51Ｃｒ］Ｎａ2ＣｒＯ4で標識すること（この細胞膜透過性分子は細胞質タンパク質と結合し、それらの細胞から緩慢な速度で自然放出されるが、標的細胞の壊死の後に大量に放出されることから、この分子が標識用に慣用される）；その標的細胞を、変異型重鎖を含む本発明の分子でオプソニン化すること；オプソニン化した放射性標識標的細胞とエフェクター細胞とを、標的細胞とエフェクター細胞の適当な比で、マイクロタイタープレート内で混合すること；その細胞混合物を１６〜１８時間３７℃でインキュベートすること；上清を回収すること；および放射活性を分析することを含む51Ｃｒ放出アッセイに基づくものである。その後、本発明の分子の細胞傷害性を、例えば下式：
溶解％＝（試験ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）／（界面活性剤溶解ｃｐｍ−標的漏出ｃｐｍ）×１００％、あるいは、
溶解％＝（ＡＤＣＣ−ＡＩＣＣ）／（最大放出−自然放出）
を用いて算出することができる。比溶解は下式：
比溶解＝本発明の分子の存在下での溶解％−本発明の分子の不在下での溶解％
を用いて算出することができる。標的：エフェクター細胞の比または抗体濃度のいずれかを変更することによってグラフを作成することができる。
【０２３５】
好ましくは、本発明のＡＤＣＣアッセイで使用されるエフェクター細胞は末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells：ＰＢＭＣ）であり、これは好ましくは、当業者に公知の標準的方法、例えば、フィコール−パーク密度勾配遠心分離を用いて正常ヒト血液から精製される。本発明の方法における使用に好ましいエフェクター細胞は、異なるＦｃγＲ活性化受容体を発現する。本発明は、重鎖抗体突然変異体が、野生型ＩｇＧｌ抗体と比較して増強されたＡＤＣＣ活性および食作用を示すかどうかを判定するために、エフェクター細胞、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢを発現するＴＨＰ−１、ならびにＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの双方を発現する、ヒト全血に由来する単球由来初代マクロファージを包含する。
【０２３６】
ヒト単球細胞株ＴＨＰ−１は、高親和性受容体ＦｃγＲＩおよび低親和性受容体ＦｃγＲＩＩＡの発現を介して食作用を活性化する(Fleitら(1991) “The Human Monocyte-Like Cell Line THP-1 Expresses Fc Gamma RI And Fc Gamma RII,” J. Leuk. Biol. 49: 556-565)。ＴＨＰ−１細胞は、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢを構成的に発現しない。これらの細胞をサイトカインで刺激すると、ＦｃＲ発現パターンに影響を及ぼす(Pricopら(2001) “Differential Modulation Of Stimulatory And Inhibitory Fc Gamma Receptors On Human Monocytes By Th1 And Th2 Cytokines,” J. of Immunol., 166: 531-537)。ＴＨＰ−１細胞をサイトカインＩＬ４の存在下で増殖させるとＦｃγＲＩＩＢの発現が誘導され、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩ発現の低下が起こる。また、ＦｃγＲＩＩＢ発現は細胞密度の増加によっても増強され得る(Tridandapaniら(2002) “Regulated Expression And Inhibitory Function Of Fcgamma RIIB In Human Monocytic Cells,” J. Biol. Chem., 277(7): 5082-5089)。対照的に、ＩＦＮγはＦｃγＲＩＩＩＡの発現を導くことができると報告されている(Pearseら(1993) “Interferon Gamma-Induced Transcription Of The High-Affinity Fc Receptor For IgG Requires Assembly Of A Complex That Includes The 91-kDa Subunit Of Transcription Factor ISGF3,” Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 4314-4318)。細胞表面上の受容体の有無は、当業者に公知の一般的方法を用いて、ＦＡＣＳにより判定することができる。サイトカインにより誘導される細胞表面上でのＦｃγＲの発現は、ＦｃγＲＩＩＢの存在下で活性化および阻害の双方を試験する系を提供する。ＴＨＰ−１細胞がＦｃγＲＩＩＢを発現することができなければ、本発明は別のヒト単球細胞株Ｕ９３７をさらに包含する。これらの細胞は、ＩＦＮγおよびＴＮＦの存在下で、最終的にマクロファージへと分化することが示されている(Korenら(1979) “In Vitro Activation Of A Human Macrophage-Like Cell Line,” Nature 279: 328-331)。
【０２３７】
ＦｃγＲ依存性腫瘍細胞死は、マウス腫瘍モデルではマクロファージとＮＫ細胞により媒介される(Clynesら(1998) “Fc Receptors Are Required In Passive And Active Immunity To Melanoma,” Proc. Nat. Acad. Sci. USA95: 652-656)。本発明は、食作用およびＡＤＣＣアッセイの双方で、標的細胞の細胞傷害を誘発するＦｃ突然変異体の有効性を分析するため、ドナー由来の分離した(elutriated)単球の、エフェクター細胞としての使用を包含する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢの発現パターンは、増殖条件の違いによって影響を受ける。凍結させた分離単球、新鮮な分離単球、１０％ＦＢＳ中で維持した単球、ならびにＦＢＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ中および／またはヒト血清中で培養した単球からのＦｃγＲ発現は、当業者に公知の一般的方法を用いて測定することができる。例えば、細胞をＦｃγＲ特異的抗体で染色し、ＦＡＣＳにより分析してＦｃγＲプロフィールを決定することができる。その後、マクロファージのｉｎ  ｖｉｖｏ  ＦｃγＲ発現を最もよく模倣する条件を本発明の方法に使用する。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、特に、適正なＦｃγＲプロフィールを持つヒト細胞を取得することができない場合には、マウス細胞の使用を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡでトランスフェクトすることができるマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、および当技術分野で公知の方法を用いて単離された安定なトランスフェクタントを包含する（例えば、Ralphら(1977) “Antibody-Dependent Killing Of Erythrocyte And Tumor Targets By Macrophage-Related Cell Lines: Enhancement By PPD And LPS,” J. Immunol. 119: 950-4参照）。トランスフェクタントは、慣例の試験を用いたＦＡＣＳ分析によって、ＦｃγＲＩＩＩＡ発現について定量し、高発現体を本発明のＡＤＣＣアッセイに使用することができる。他の実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるものなどのノックアウトトランスジェニックマウスからの、ヒトＦｃγＲを発現する脾臓腹腔マクロファージの単離を包含する。
【０２３９】
リンパ球は、フィコール−パーク勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、ドナーの末梢血（ＰＢＭ）から回収することができる。単離された細胞の単核集団内では、大部分のＡＤＣＣ活性が、その表面にＦｃγＲＩＩＩＡを含むがＦｃγＲＩＩＢは含まないナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を介して生じる。これらの細胞での結果は、ＮＫ細胞ＡＤＣＣの誘発に対する突然変異体の有効性を示し、分離単球を用いて試験するための試薬を確立する。
【０２４０】
本発明のＡＤＣＣアッセイで使用される標的細胞としては、限定されるものではないが、乳癌細胞株、例えば、ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−３０）（例えば、Trempら(1976) “Human Breast Cancer In Culture,” Recent Results Cancer Res. 33-41参照）；Ｂリンパ球；バーキットリンパ腫由来細胞、例えば、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−８６）（例えば、Epsteinら(1965) “Characteristics And Mode Of Growth Of Tissue Culture Strain (EB1) Of Human Lymphoblasts From Burkitt's Lymphoma,” J. Natl. Cancer Inst. 34: 231-240参照）、およびＤａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２１３）（例えば、Kleinら(1968) “Surface IgM-Kappa Specificity On A Burkitt Lymphoma Cell In Vivo And In Derived Culture Lines,” Cancer Res. 28: 1300-1310参照）が挙げられる。標的細胞はアッセイするダイアボディ分子の抗原結合部位によって認識されなければならない。
【０２４１】
ＡＤＣＣアッセイは、アポトーシス経路によって細胞死を媒介するＮＫ細胞の能力に基づいている。ＮＫ細胞は、一部には、ＦｃγＲＩＩＩＡの、細胞表面の抗原に結合したＩｇＧ  Ｆｃドメインの認識によって、細胞死を媒介する。本発明の方法に従って使用されるＡＤＣＣアッセイは、放射性に基づくアッセイでも蛍光に基づくアッセイでもよい。変異型Ｆｃ領域を含む本発明の分子の特性決定を行うために使用されるＡＤＣＣアッセイは、標的細胞、例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ細胞を標識すること；標的細胞を、その抗原結合部位を介して標的細胞上の細胞表面受容体を認識する抗体でオプソニン化すること；標識されたオプソニン化標的細胞とエフェクター細胞とを適当な比（慣例の試験によって決定することができる）で混合すること；前述の細胞を回収すること；溶解した標的細胞の上清中の標識を、使用した標識に基づく適当な検出スキームを用いて検出することを含む。標的細胞は当技術分野で公知の標準的方法を用いて、放射性標識または蛍光標識のいずれかで標識することができる。例えば、標識としては、限定されるものではないが、［51Ｃｒ］Ｎａ2ＣｒＯ4；および蛍光増強リガンド２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボキシレート（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルが挙げられる。
【０２４２】
特定の好ましい実施形態では、蛍光増強リガンド２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボキシレート（ＴＤＡ）のアセトキシメチルエステルで標識した標的細胞に対するＡＤＣＣ活性を測定するために、時間分解蛍光測定アッセイを使用する。このような蛍光測定アッセイは当技術分野で公知である。例えば、Blombergら(1996) “Time-Resolved Fluorometric Assay For Natural Killer Activity Using Target Cells Labelled With A Fluorescence Enhancing Ligand,” Journal of Immunological Methods, 193: 199-206（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。簡単に述べると、標的細胞を膜透過性ＴＤＡアセトキシメチルジエステル（ビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−６−６’’−ジカルボキシレート（ＢＡＴＤＡ））で標識するが、これは生細胞の細胞膜を通過して迅速に拡散する。細胞内エステラーゼがエステル基を開裂させ、再生された膜非透過性ＴＤＡ分子は細胞内に捕捉される。エフェクター細胞および標的細胞を例えば少なくとも２時間、最大３．５時間、３７℃、５％ＣＯ2下でインキュベートした後、溶解した標的細胞から放出されたＴＤＡをＥｕ３＋でキレート化し、生成したユーロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を時間分解蛍光計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃｅ）で定量する。
【０２４３】
別の特定の実施形態では、複数のエピトープ結合部位と場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子の特性決定を行うために使用されるＡＤＣＣアッセイは以下を含む。好ましくは４〜５×１０6個の標的細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＯＶＣＡＲ３、Ｒａｊｉ細胞）をビス（アセトキシメチル）２，２’：６’，２’’−ターピリジン−ｔ−６’’−ジカルボキシレート（ＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で標識する。最適な標識効率のため、ＡＤＣＣアッセイで使用する標的細胞の数は好ましくは５×１０6個を超えないようにすべきである。これらの細胞にＢＡＴＤＡ試薬を添加し、混合物を３７℃、好ましくは５％ＣＯ2下で、少なくとも３０分間インキュベートする。次に、その細胞を生理学的バッファー（例えば、０．１２５ｍＭスルフィンピラゾンを含むＰＢＳ）、および０．１２５ｍＭスルフィンピラゾンを含有する培地で洗浄する。その後、標識された標的細胞を、ＥｃγＲＩＩＡに特異的なエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子でオプソニン化（コーティング）する。好ましい実施形態では、ＡＤＣＣアッセイで使用する分子はまた、細胞表面受容体、腫瘍抗原または癌抗原に特異的である。本発明のダイアボディ分子は、第５．６．１節に挙げられているものなどの癌または腫瘍抗原と特異的に結合することができる。ＡＤＣＣアッセイの標的細胞は、本発明のダイアボディが標的細胞の細胞表面受容体に特異的に結合するように、該ダイアボディに遺伝子工学的に導入されたエピトープ結合部位に応じて選択される。
【０２４４】
標的細胞をエフェクター細胞、例えばＰＢＭＣに、エフェクター：標的比が約１：１、１０：１、３０：１、５０：１、７５：１、または１００：１になるように添加する。これらのエフェクター細胞および標的細胞を少なくとも２時間、最大３．５時間、３７℃、５％ＣＯ2下でインキュベートする。細胞上清を回収し、酸性ユーロピウム溶液（例えば、ＤＥＬＦＩＡユーロピウム溶液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）に添加する。生成したユーロピウム−ＴＤＡキレートの蛍光を時間分解蛍光計（例えば、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｗａｌｌａｃ）で定量する。最大放出（ＭＲ）および自然放出（ＳＲ）は、標的細胞を、それぞれ１％ＴＸ−１００および培地単独とインキュベートすることによって測定する。抗体非依存性細胞傷害作用（ＡＩＣＣ）を、試験分子（例えば本発明のダイアボディ）の不在下で標的細胞およびエフェクター細胞をインキュベートすることによって測定する。各アッセイは好ましくは３反復で実施する。比溶解の平均パーセンテージを、
試験放出値（ＡＤＣＣ）−ＡＩＣＣ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００
のように算出する。
【０２４５】
本発明は、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子によるＣ１ｑの結合および補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の媒介の特性決定を行うための、当技術分野において公知であり本明細書に例示されるアッセイを包含する。Ｃ１ｑの結合を測定するために、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡを実施することができる。例示的アッセイは以下のステップを含み得る。アッセイプレートを、コーティングバッファー中、本発明の分子を含むポリペプチドまたは出発ポリペプチド（対照）で４℃にて一晩コーティングする。次に、これらのプレートを洗浄し、遮断する。洗浄後、ヒトＣ１ｑのアリコートを各ウェルに添加し、室温で２時間インキュベートする。さらに洗浄した後、１００μＬのヒツジ抗補体Ｃ１ｑペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。前述のプレートを再び洗浄バッファーで洗浄し、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ））を含有する１００μｌの基質バッファーを各ウェルに添加する。黄色の出現によって観察される酸化反応を３０分間進行させ、１００μｌの４．５ＮＨ2ＳＯ4の添加により反応を停止させる。その後、吸光度を（４９２〜４０５）ｎｍで読み取る。
【０２４６】
補体の活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを、例えば、Gazzano-Santoroら(1997) “A Non-Radioactive Complement-Dependent Cytotoxicity Assay For Anti-CD20 Monoclonal Antibody,” J. Immunol. Methods 202:163-171（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されているように実施することができる。簡単に述べると、（変異型）Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む分子およびヒト補体を様々な濃度にバッファーで希釈する。ダイアボディ分子が結合する抗原を発現する細胞は、約１×１０6細胞／ｍｌの密度に希釈する。（変異型）Ｆｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ分子と希釈したヒト補体と抗原を発現する細胞の混合物を平底組織培養９６ウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２時間インキュベートして補体媒介細胞溶解を促進させる。その後、５０μＬのアラマーブルー（Ａｃｃｕｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートする。吸光度を、９６ウェル蛍光光度計を用い、励起５３０ｎｍおよび発光５９０ｎｍで測定する。結果は相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表すことができる。サンプル濃度を標準曲線からコンピュータにより計算し、非変異型分子（すなわち、Ｆｃドメインを含まないかまたは非変異型Ｆｃドメインを含む分子）と比較した際の活性％を対象の変異体について報告する。
【０２４７】
５．４．３  その他のアッセイ
複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメインを含む本発明の分子は、抗原結合ドメインまたはＦｃ−ＦｃγＲ結合の速度論的パラメーターを特定するための、当技術分野で公知の、任意の表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）に基づくアッセイを用いてアッセイすることができる。限定されるものではないが、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）から入手可能なＢＩＡｃｏｒｅ装置；Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ（マサチューセッツ州フランクリン）から入手可能なＩＡｓｙｓ装置；Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（バークス、ＵＫ）から入手可能なＩＢＩＳシステム；日本レーザ電子（北海道、日本）から入手可能なＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム；およびＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから入手可能なＳＰＲ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｐｒｅｅｔａ（テキサス州ダラス）を含む市販のＳＰＲ装置が本発明において使用可能である。ＳＰＲに基づく技術の総説としては、Mulletら(2000) “Surface Plasmon Resonance-Based Immunoassays,” Methods 22: 77-91; Dongら(2002) “Some new aspects in biosensors,” Reviews in Mol. Biotech. 82: 303-23; Fivashら(1998) “BIAcore For Macromolecular Interaction,” Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Richら(2000) “Advances In Surface Plasmon Resonance Biosensor Analysis,” Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61（全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。さらに、米国特許第６，３７３，５７７号、同第６，２８９，２８６号、同第５，３２２，７９８号、同第５，３４１，２１５号、同第６，２６８，１２５号（全て参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されているタンパク質間相互作用を測定する任意のＳＰＲ装置およびＳＰＲに基づく方法も、本発明の方法において企図される。
【０２４８】
簡単に述べると、ＳＰＲに基づくアッセイは、結合対の一方を表面に固定化すること、および溶液中の結合対の他方との相互作用をリアルタイムでモニタリングすることを含む。ＳＰＲは、複合体の形成または解離時に生じる表面付近での溶媒の屈折率の変化を測定することに基づく。固定化を行う表面はセンサーチップであり、これがＳＰＲ技術の心臓部となる。これは金の薄層でコーティングされたガラス表面からなり、分子の表面への結合を至適化するように設計された特殊な表面の一領域の基礎を形成する。様々なセンサーチップが特に上記に挙げた会社から市販されており、全て本発明の方法において使用可能である。センサーチップの例としては、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｉｎｃ．から市販されているもの、例えば、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡおよびＨＰＡが挙げられる。本発明の分子は、限定されるものではないが、アミン基を介した直接共有結合、スルフヒドリル基を介した直接共有結合、アビジンコーティング表面へのビオチンの結合、糖鎖基へのアルデヒドの結合およびヒスチジンタグを介したＮＴＡチップとの結合を含む、当技術分野で公知の固定化法および固定化化学のいずれかを用いてセンサーチップの表面に固定化することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、複数のエピトープ結合部位と場合によりＦｃドメインを含む本発明の分子と、抗原またはＦｃγＲとの結合の速度論的パラメーターは、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置１０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて測定することができる。上記で述べたように（第５．４．１節参照）、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合部位がＦｃγＲを免疫特異的に認識する場合、および／またはダイアボディ分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含む場合、任意のＦｃγＲを使用して本発明の分子の結合を評価することができる。特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＩＡ、好ましくは可溶性の単量体ＦｃγＲＩＩＩＡである。例えば、一実施形態では、可溶性単量体ＦｃγＲＩＩＩＡは、リンカー−ＡＶＩＴＡＧ配列に連結されたＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域である（２００３年１月９日出願の米国仮出願第６０／４３９，４９８号および２００３年３月１９日出願の米国仮出願第６０／４５６，０４１号参照、参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）。別の特定の実施形態では、ＦｃγＲはＦｃγＲＩＩＢ、好ましくは可溶性の二量体ＦｃγＲＩＩＢである。例えば、一実施形態では、可溶性二量体ＦｃγＲＩＩＢタンパク質を２００３年１月１３日出願の米国仮出願第６０／４３９，７０９号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されている方法に従って作製する。
【０２５０】
全ての免疫学的アッセイにおいて、本発明の分子によるＦｃγＲの認識／結合は複数のドメインによって影響を受け得る。すなわち、ある特定の実施形態では、本発明の分子は複数のエピトープ結合ドメインのうちの１つを介してＦｃγＲを免疫特異的に認識し；本発明の分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含むさらに他の実施形態では、ダイアボディ分子はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を介してＦｃγＲを免疫特異的に認識することができ；本発明の分子がＦｃドメイン（またはその一部）とＦｃγＲを免疫特異的に認識するエピトープ結合部位の双方を含むさらなる実施形態では、ダイアボディ分子はエピトープ結合ドメインとＦｃドメイン（またはその一部）の一方または双方を介してＦｃγＲを認識することができる。複数のエピトープ結合部位と場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子の、抗原および／またはＦｃγＲに対する速度論的パラメーターを、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を用いて測定するための例示的アッセイは以下を含む。第１の抗原をセンサーチップ表面の４つのフローセルの１つに、好ましくはアミンカップリング化学を介して固定化し、それにより約５０００応答単位（ＲＵ）の第１の抗原が表面に固定化される。好適な表面が調製されたところで、第１の抗原を免疫特異的に認識する本発明の分子を、好ましくは２０μｇ／ｍＬ溶液を流速５μＬ／ｍＬで１分間注入することによって、前述の表面を通過させる。この段階で表面に結合した本発明の分子のレベルは、一般に４００〜７００ＲＵの間の範囲である。次に、ＨＢＳ−Ｐバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の第２の抗原（例えば、ＦｃγＲ）またはＦｃγＲ受容体の希釈系列を前述の表面に１００μＬ／分で注入する。異なる第２の抗原または受容体希釈物間での分子の再生は、好ましくは１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ3  ｐＨ９．４；３Ｍ  ＮａＣｌを５秒間の注入を１回行うことによって行われる。当技術分野で公知のいずれの再生技術も本発明の方法において企図される。
【０２５１】
全データセットが収集されたところで、ＳＰＲ装置製者、例えばＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって提供されているコンピュータアルゴリズムを用いて得られた結合曲線のグローバルフィッティングを行う。これらのアルゴリズムでは、ＫonおよびＫoffの双方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数Ｋdを、２つの速度定数の比（すなわち、Ｋoff／Ｋon）として推定する。個々の速度定数をどのようにして導くかについてのさらに詳細な処理法は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウエアハンドブック（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に見出すことができる。作成したデータの解析は、当技術分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよい。作成した速度論的データを解釈する各種方法の総説としては、Myszka (1997) “Kinetic Analysis Of Macromolecular Interactions Using Surface Plasmon Resonance Biosensors,” Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7; Fisherら(1994) “Surface Plasmon Resonance Based Methods For Measuring The Kinetics And Binding Affinities Of Biomolecular Interactions,” Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95; O’Shannessy (1994) “Determination Of Kinetic Rate And Equilibrium Binding Constants For Macromolecular Interactions: A Critique Of The Surface Plasmon Resonance Literature,” Current Opinion in Biotechnology, 5:65-71; Chaikenら(1992) “Analysis Of Macromolecular Interactions Using Immobilized Ligands,” Analytical Biochemistry, 201: 197-210; Mortonら(1995) “Interpreting Complex Binding Kinetics From Optical Biosensors: A Comparison Of Analysis By Linearization, The Integrated Rate Equation, And Numerical Integration,” Analytical Biochemistry 227: 176-85; O’Shannessyら, 1996, Analytical Biochemistry 236: 275-83（全て参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）を参照。
【０２５２】
好ましい実施形態では、ＳＰＲ分析、例えばＢＩＡｃｏｒｅを用いて測定した速度論的パラメーターは、本発明の分子が機能的アッセイ、例えばＡＤＣＣにおいて、どのように機能するかの予測指標として使用することができる。ＳＰＲ分析から取得した速度論的パラメーターに基づいて本発明の分子の有効性を予測するための例示的方法は、本発明の分子の（エピトープ結合ドメインおよび／またはＦｃドメイン（もしくはその一部）を介した）ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢとの結合についてのＫoff値を測定すること；ＡＤＣＣデータに対して、（１）ＦｃγＲＩＩＩＡの場合はＫoff（ｗｔ）／Ｋoff（ｍｕｔ）；（２）ＦｃγＲＩＩＢの場合はＫoff（ｍｕｔ）／Ｋoff（ｗｔ）をプロットすることを含み得る。１よりも高い数値は、野生型と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡの場合には低下した解離速度を、そしてＦｃγＲＩＩＢの場合には増大した解離速度を示し、ＡＤＣＣ機能の増強を有する。
【０２５３】
５．５  本発明のダイアボディ分子の製造方法
本発明のダイアボディ分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成および結合タンパク質をコードする核酸の組換え発現を含む、当技術分野で周知の様々な方法により製造することができる。所望の核酸配列は組換え法（例えば、所望のポリヌクレオチドの以前に作製された変異体のＰＣＲ突然変異誘発）により、または固相ＤＮＡ合成により作製することができる。通常は組換え発現が用いられる。一態様では、本発明はＣＤ１６Ａ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供し、別の態様では、本発明はＣＤ３２Ｂ  ＶＨおよび／またはＶＬをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。遺伝子コードの縮重のため、それぞれの免疫グロブリンアミノ酸配列を種々の核酸配列がコードしており、本発明は本明細書に記載の結合タンパク質をコードする全ての核酸を含む。
【０２５４】
５．５．１  本発明の分子をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の分子（ポリペプチドおよび抗体を含む）をコードするポリヌクレオチドも含む。当技術分野で公知のいずれの方法によって、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定してもよい。
【０２５５】
本発明の方法によって同定される分子のヌクレオチド配列が決定されれば、当技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを用いてそのヌクレオチド配列を操作し（例えば、Sambrookら, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY;およびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照、双方とも参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）、例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入を生じさせることによって、例えば異なるアミノ酸配列を有する抗体を作出することができる。
【０２５６】
一実施形態では、ヒトライブラリーまたは当技術分野で利用可能な他のいずれかのライブラリーを当技術分野で公知の標準的技術によってスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングすることができる。
【０２５７】
５．５．２  本発明の分子の組換え発現
本発明の分子（すなわち、抗体）をコードする核酸配列が得られれば、それらの分子を産生するためのベクターを、当技術分野で周知の技術を用い、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。当業者に周知の方法を使用して、本発明の分子のコード配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照）。
【０２５８】
本発明の方法により同定された分子のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクションおよびリン酸カルシウム沈降）により宿主細胞に導入し、次いで、トランスフェクト細胞を従来技術により培養して、本発明の分子を生産することができる。特定の実施形態では、本発明の分子の発現を構成的、誘導性または組織特異的プロモーターにより調節される。
【０２５９】
本発明の方法により同定された分子を発現させるために使用される宿主細胞は、大腸菌などの細菌細胞であるか、または好ましくは、特に完全な組換え免疫グロブリン分子を発現させるためには、真核細胞であり得る。特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Chinese hamster ovary cells：ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用する、免疫グロブリンのための有効な発現系である(Foeckingら(1986) “Powerful And Versatile Enhancer-Promoter Unit For Mammalian Expression Vectors,” Gene 45:101-106; Cockettら(1990) “High Level Expression Of Tissue Inhibitor Of Metalloproteinases In Chinese Hamster Ovary Cells Using Glutamine Synthetase Gene Amplification,” Biotechnology 8:662-667)。
【０２６０】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の方法により同定された分子を発現させることができる。このような宿主−発現系は、本発明の分子のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルに相当するが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされると本発明の分子をｉｎ  ｓｉｔｕで発現することができる細胞にも相当する。これらのものとしては、限定されるものではないが、例えば、本発明の方法により同定された分子のコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌および枯草菌(B. subtilis)）などの微生物；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；本発明の方法により同定された分子をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ球（米国特許第５，８０７，７１５号参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたヒト網膜細胞））が挙げられる。
【０２６１】
細菌系においては、発現される分子に対して意図される用途に応じて、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するためにこのようなタンパク質を大量産生させるべき場合には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベル発現を指令するベクターが望ましいものであり得る。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、抗体コード配列をベクター中にｌａｃ  Ｚコード領域とともにインフレームで個々に連結して融合タンパク質が産生されるようにする大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Rutherら(1983) “Easy Identification Of cDNA Clones,” EMBO J. 2:1791-1794)；ｐＩＮベクター(Inouyeら(1985) “Up-Promoter Mutations In The lpp Gene Of Escherichia Coli,” Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heekeら(1989) “Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia Coli,” J. Biol. Chem. 24:5503-5509)などが挙げられる。また、ｐＧＥＸベクターを用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させることもできる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへ吸着および結合させた後に遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、その結果、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ成分から遊離させることができる。
【０２６２】
昆虫系においては、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして使用される。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０２６３】
哺乳動物宿主細胞においては、多くのウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分節リーダー配列と連結させることができる。次に、このキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えにより挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、感染した宿主内で生存可能でありかつ免疫グロブリン分子を発現することができる組換えウイルスが得られる（例えば、Loganら(1984) “Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照）。また、挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルが必要とされる場合もある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を確実にするために、目的のコード配列のリーディングフレームと同じ位相になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のものであってよく、天然物でも合成物でもよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることにより増強させることができる（Bitterら(1987) “Expression And Secretion Vectors For Yeast,” Methods in Enzymol. 153:516-544参照）。
【０２６４】
さらに、挿入した配列の発現を変調したり、その遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾またはプロセシングしたりする宿主細胞株を選択してもよい。このようなタンパク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能にとって重要であり得る。例えば、特定の実施形態では、本発明のダイアボディ分子を含むポリペプチドは単一の遺伝子産物として（例えば、単一のポリペプチド鎖として、すなわち、ポリタンパク質前駆体として）発現させることができるが、これには本発明のダイアボディ分子の別個のポリペプチドを形成するために、天然型または組換え型の細胞機構によるタンパク質分解切断が必要となる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを含むポリタンパク質前駆体分子をコードする核酸配列（前述のポリタンパク質前駆体の翻訳後切断を指令することができるコード配列を含む）を遺伝子工学的に作製することを包含する。ポリタンパク質前駆体の翻訳後切断は、本発明のポリペプチドをもたらす。本発明のポリペプチドを含む前駆体分子の翻訳後切断はｉｎ  ｖｉｖｏで（すなわち、天然型または組換え型の細胞系／機構、例えば、適当な部位でのフューリンの切断により宿主細胞内で）起こってもよいし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、既知の活性のプロテアーゼもしくはペプチダーゼを含む組成物中および／または所望のタンパク質分解作用を促すことが知られている条件もしくは試薬を含む組成物中での前述のポリペプチド鎖のインキュベーション）で起こってもよい。組換えタンパク質の精製および修飾は当技術分野で周知であり、ポリタンパク質前駆体の設計には当業者が容易に理解するいくつかの実施形態が含まれる。記載の前駆体分子の修飾のためには当技術分野で公知のプロテアーゼまたはペプチダーゼのいずれを使用してもよく、例えば、トロンビン（アミノ酸配列ＬＶＰＲ＾ＧＳ（配列番号８９）を認識する）、またはＸａ因子（アミノ酸配列Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ＾（配列番号９０）を認識する（Nagaiら(1985) “Oxygen Binding Properties Of Human Mutant Hemoglobins Synthesized In Escherichia Coli,” Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:7252-7255、およびJennyら(2003) “A Critical Review Of The Methods For Cleavage Of Fusion Proteins With Thrombin And Factor Xa,” Protein Expr. Purif. 31:1-11の総説、それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）、エンテロキナーゼ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ＾（配列番号９１）を認識する（Collins-Racieら(1995) “Production Of Recombinant Bovine Enterokinase Catalytic Subunit In Escherichia Coli Using The Novel Secretory Fusion Partner DsbA,” Biotechnology 13:982-987、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）、フューリン（アミノ酸配列ＲＸＸＲ＾を認識し、ＲＸ（Ｋ／Ｒ）Ｒ＾（それぞれ配列番号９２および配列番号９３）を優先的に認識する（Ｐ６位の追加のＲは切断を促進すると思われる））、およびＡｃＴＥＶ（アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱ＾Ｇ（配列番号９４）を認識する（Parksら(1994) “Release Of Proteins And Peptides From Fusion Proteins Using A Recombinant Plant Virus Proteinase,” Anal. Biochem. 216:413-417、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）、ならびに口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３がある。例えば、第６．４節を参照。
【０２６５】
様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して特徴的かつ特異的な機構を有する。適当な細胞株または宿主系を選択することにより、発現される外来タンパク質の適正な修飾とプロセシングを確保することができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞を用いることができる。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられる。
【０２６６】
組換えタンパク質の長期、高収量産生のためには、安定した発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定に発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡを導入した後に、遺伝子操作細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させることができ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する耐性を付与し、細胞に安定してプラスミドをその染色体に組み込ませ、増殖させて細胞叢を形成させ、続いてクローニングおよび細胞株への拡大が可能である。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。このような遺伝子操作細胞株は、本発明の分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０２６７】
多くの選択系を利用することができ、限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら(1977) “Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells,” Cell 11: 223-232)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalskaら(1992) “Use Of The HPRT Gene And The HAT Selection Technique In DNA-Mediated Transformation Of Mammalian Cells: First Steps Toward Developing Hybridoma Techniques And Gene Therapy,” Bioessays 14: 495-500)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyら(1980) “Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster aprt Gene,” Cell 22: 817-823)遺伝子はそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質耐性は以下の遺伝子：メトトレキセート耐性を付与するｄｈｆｒ(Wiglerら(1980) “Transformation Of Mammalian Cells With An Amplifiable Dominant-Acting Gene,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570; O’Hareら(1981) “Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527-1531)；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ(Mulliganら(1981) “Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072-2076)；アミノグリコシドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ(Tolstoshev (1993) “Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions,” Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy,” Science 260:926-932;およびMorganら(1993) “Human Gene Therapy,” Ann. Rev. Biochem. 62:191-217)、ならびにハイグロマイシン耐性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerreら(1984) “Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells,” Gene 30:147-156)を選択するための基礎として使用することができる。組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られる、使用可能な方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY;および第12章と13章, Dracopoliら(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapinら(1981) “A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,” J. Mol. Biol. 150:1-14に記載されている。
【０２６８】
本発明の分子の発現レベルはベクターの増幅により増加させることができる（総説としては、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3, Academic Press, New York, 1987を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域はダイアボディ分子のポリペプチドのヌクレオチド配列と結びついているので、該ポリペプチドの産生も増加する(Crouseら(1983) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,” Mol. Cell. Biol. 3:257-266)。
【０２６９】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、ダイアボディ分子の第１のポリペプチドをコードする第１のベクターとダイアボディ分子の第２のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時にトランスフェクトすることができる。これら２つのベクターは、双方のポリペプチドの同等の発現を可能にする同じ選択マーカーを含有してもよい。あるいは、双方のポリペプチドをコードする単一のベクターを用いてもよい。本発明の分子のポリペプチドのコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２７０】
本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）が組換えにより発現されたならば、これをポリペプチド、ポリタンパク質またはダイアボディの精製のための当技術分野で公知の任意の方法（例えば、抗原選択性に基づく抗体精製スキームに類似）、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー（場合により、ダイアボディ分子がＦｃドメイン（またはその一部）を含む場合にはＡタンパク質選択の後に）、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、またはポリペプチド、ポリタンパク質もしくはダイアボディを精製するための他の任意の標準的技術によって精製することができる。
【０２７１】
５．６  予防および治療方法
本発明の分子は、ＦｃγＲにより媒介されるエフェクター細胞機能（例えば、ＡＤＣＣ）が望まれる疾患、障害または感染（例えば、癌、感染性疾患）を治療および／または予防するのに特に有用である。以上で述べたように、本発明のダイアボディは、Ｆｃドメインを含まないが、エフェクター機能の誘発に抗体様の機能性を示し得る。ＦｃγＲを免疫特異的に認識する少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含むことにより、該ダイアボディ分子はＦｃ−ＦｃγＲ相互作用に類似したＦｃγＲ結合および活性を示し得る。例えば、本発明の分子は、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）上の細胞表面抗原およびＦｃγＲ（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）と結合して、該細胞に対するエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、食作用、オプソニン化など）を刺激することができる。
【０２７２】
他の実施形態では、本発明のダイアボディ分子はＦｃドメイン（またはその一部）を含む。このような実施形態では、Ｆｃドメインは野生型Ｆｃドメイン（またはその一部）に対して少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含み、かつ／または１以上のＩｇＧアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）由来のドメインを含むことができる。変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子は、野生型Ｆｃドメインを含む分子と比較して、付加的なまたは変更された表現型、例えば、変更されたまたは付加的なエフェクター機能活性（例えば、ＮＫ依存性またはマクロファージ依存性アッセイでアッセイされる）を示し得る。前述の実施形態において、付加的なまたは変更されたエフェクター機能活性を有する本発明の分子は、エフェクター機能活性の有効性の増強が望まれる疾患、障害または感染の治療および／または予防に有用である。特定の実施形態では、Ｆｃドメイン（またはその一部）を含む本発明のダイアボディ分子が補体依存性カスケードを媒介する。エフェクター機能を変更することが確認されたＦｃドメイン変異体は、本発明者らの同時出願である、国際出願第０４／０６３３５１号、米国特許出願公開第２００５／００３７０００号および同第２００５／００６４５１４号、２００４年１１月１０日出願の米国仮出願第６０／６２６，５１０号、２００４年１２月１５日出願の同第６０／６３６，６６３号、および２００６年３月１０日出願の同第６０／７８１，５６４号、ならびに２００５年１１月１０日出願の米国特許出願公開第１１／２７１，１４０号、および２００５年１２月１５日出願の同第１１／３０５，７８７号（それぞれ参照により全内容を本明細書に組み入れる）に開示されている。
【０２７３】
本発明は、被験体に、治療上有効な量の１種類以上の分子（１以上のエピトープ結合部位と場合により、本発明に従って遺伝子操作されたＦｃドメイン（またはその一部）とを含み、該分子はさらに癌抗原と結合する）を投与することを含む、被験体の癌を治療、予防または管理するための方法ならびに組成物を包含する。本発明の分子は原発性腫瘍、癌細胞の転移および感染性疾患の予防、阻害、増殖の低減または退縮に特に有用である。特定の作用機序に縛られるものではないが、本発明の分子はエフェクター機能を媒介して腫瘍の消失、腫瘍の低減、またはその双方をもたらす。別の実施形態では、本発明のダイアボディは、細胞表面抗原および／もしくは受容体の架橋、ならびにアポトーシスもしくは負の増殖調節シグナル伝達の増強により治療活性を媒介する。
【０２７４】
特定の作用機序に縛られるものではないが、本発明のダイアボディ分子は当技術分野で公知の治療用抗体と比較して治療有効性の増強を示すが、これは一部には、例えばダイアボディ−エピトープ相互作用の結合力が向上しているために標的細胞上により長く留まれるダイアボディの能力によって、ダイアボディが、特定の抗原（例えば、ＦｃγＲ）の発現が低レベルである標的細胞とも免疫特異的に結合できるためである。
【０２７５】
抗原（例えば、ＦｃγＲ）に対する親和性および結合力が増強された本発明のダイアボディは、標的細胞集団でＦｃγＲの発現が低レベルである被験体における、癌または別の疾患もしくは障害の治療、予防または管理に特に有用である。本明細書において、細胞でのＦｃγＲ発現は、当業者に公知の通常の方法を用いて測定される、細胞あたりの該分子の密度によって定義される。複数のエピトープ結合部位と場合によりＦｃγＲ（またはその一部）を含む本発明の分子はまた、好ましくは、標的抗原、例えば癌抗原を３０，０００〜２０，０００分子／細胞の密度で、２０，０００〜１０，０００分子／細胞の密度で、１０，０００分子／細胞以下の密度で、５０００分子／細胞以下の密度で、または１０００分子／細胞以下の密度で発現する細胞において、結合力および親和性および／またはエフェクター機能が付与されているか、または増強されている。本発明の分子は、標的細胞集団で標的抗原の発現が低レベルである部分集団において、癌などの疾患または障害を治療、予防または管理するのに特に有用である。
【０２７６】
本発明の分子はまた、癌、自己免疫疾患、炎症性障害または感染性疾患などの疾患を治療または予防するための当技術分野で公知の他の治療薬と有利に併用することができる。特定の実施形態では、本発明の分子を、例えば該分子と相互作用して免疫応答を高めるエフェクター細胞の数または活性を増大させるのに役立つ、モノクローナルもしくはキメラ抗体、リンホカイン、または造血系増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７など）と併用してもよい。本発明の分子はまた、疾患、障害または感染を治療するために使用される１種類以上の薬物、例えば、抗癌薬、抗炎症薬または抗ウイルス薬と有利に併用することもできる（例えば、第５．７節に詳述）。
【０２７７】
５．６．１  癌
本発明は、被験体に複数のエピトープ結合ドメインを含む１種類以上の分子の治療上有効な量を投与することを含む、被験体の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＦｃγＲ多型を有する被験体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８ＶまたはＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ対立遺伝子について同型接合性の被験体）の癌を治療または予防するための方法および組成物を包含する。いくつかの実施形態では、本発明は、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｆ）と免疫特異的に結合するように操作することを包含する。他の実施形態では、本発明は、ダイアボディ分子の少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを、ＦｃγＲＩＩＩＡ（１５８Ｖ）と免疫特異的に結合するように操作することを包含する。
【０２７８】
標準的なモノクローナル抗体療法の有効性は、被験体のＦｃγＲ多型に依存する（Cartronら(2002) “Therapeutic Activity Of Humanized Anti-CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcRIIIa Gene,” Blood 99: 754-758; Wengら(2003) “Two Immunoglobulin G Fragment C Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma,” J Clin Oncol. 21(21):3940-3947、双方とも参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）。これらの受容体はエフェクター細胞の表面で発現され、ＡＤＣＣを媒介する。低親和性活性化受容体の高親和性対立遺伝子は、エフェクター細胞のＡＤＣＣ媒介能を改善する。Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用に頼ってエフェクター機能を果たすのとは対照的に、本発明の方法は、低親和性活性化受容体を免疫特異的に認識するように分子を操作して、該分子を特定の多型に合わせて設計可能とすることを包含する。その代わりに、またはそれに加えて、本発明の分子はエフェクター細胞上のＦｃγＲに対して（野生型Ｆｃドメインと比較して）増強された親和性を示す変異型Ｆｃドメインを含むように操作してもよい。本発明の操作された分子は、そのＦｃγＲ多型にかかわらず、患者に対してよりよい免疫療法試薬を提供する。
【０２７９】
本発明に従って操作されたダイアボディ分子は、培養細胞株または患者由来のＰＭＢＣ細胞のいずれかを用いたＡＤＣＣにより試験し、Ｆｃ変異体のＡＤＣＣ増強能を判定する。本明細書に開示された方法を用いて標準的ＡＤＣＣを実施する。フィコール−パーク勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて末梢血からリンパ球を回収する。標的細胞、すなわち、培養細胞株または患者由来の細胞にユーロピウム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を添加し、エフェクターとともに３７℃で４時間インキュベートする。蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ）を用いて、放出されたユーロピウムを検出する。得られたＡＤＣＣデータは、ＮＫ細胞媒介細胞傷害を誘発する本発明の分子の効力を示し、どの分子が患者サンプルおよび分離単球の双方を用いて試験可能であるかを確認する。その後、ＡＤＣＣ活性を誘発させる最大の能力を示すダイアボディ分子を、患者由来のＰＢＭＣを用いたＡＤＣＣアッセイで試験する。健康なドナー由来のＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いる。
【０２８０】
よって、本発明は、ダイアボディ分子を、癌抗原を免疫特異的に認識するように操作する（その結果、該ダイアボディ分子はそれ自体、細胞傷害性（アポトーシスまたは増殖性シグナルのダウンレギュレーションの増大をもたらす細胞表面受容体の架橋による）となり、かつ／または本発明に従ってＦｃドメインを含み、かつ／または１以上のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、食作用）を媒介するようになる）ことによって、癌抗原により特徴付けられる癌を予防または治療する方法を提供する。本発明に従って操作されたダイアボディは、細胞傷害活性（例えば、増強された腫瘍細胞死および／または増強された、例えばＡＤＣＣ活性もしくはＣＤＣ活性）を持つので、癌の予防または治療に有用である。
【０２８１】
癌抗原を伴う癌は、癌抗原に結合しかつ細胞傷害性であり、かつ／または本発明の方法に従ってエフェクター機能を示すように操作された、ダイアボディの投与によって治療または予防することができる。例えば、限定されるものではないが、以下の癌抗原を伴う癌を本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる：ＫＳ  １／４汎癌腫抗原(Perezら(1989) “Isolation And Characterization Of A Cdna Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker,” J. Immunol. 142:3662-3667; Mollerら(1991) “Bispecific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes,” Cancer Immunol. Immunother. 33(4):210-216)、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）(Yuら(1991) “Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants,” Cancer Res. 51(2):468-475)、前立腺酸性ホスファターゼ (Tailorら(1990) “Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone,” Nucl. Acids Res. 18(16):4928)、前立腺特異的抗原(Henttuら(1989) “cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes,” Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeliら(1993) “Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen,” Cancer Res. 53:227-230)、黒色腫関連抗原ｐ９７(Estinら(1989) “Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97,” J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454)、黒色腫抗原ｇｐ７５(Vijayasardahlら(1990) “The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product,” J. Exp. Med. 171(4):1375-1380)、高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）(Nataliら(1987) “Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance,” Cancer 59:55-63; Mittelmanら(1990) “Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Antiidiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies,” J. Clin. Invest. 86:2136-2144)）、前立腺特異的膜抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）(Foonら(1995) “Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine,” J. Clin. Invest. 96(1):334-42)、多型性上皮ムチン抗原、ヒト乳脂肪小球抗原、結腸直腸腫瘍関連抗原（例えば、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２(Yokotaら(1992) “Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms,” Cancer Res. 52:3402-3408)、ＣＯ１７−１Ａ(Ragnhammarら(1993) “Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced,” Int. J. Cancer 53:751-758)、ＧＩＣＡ  １９−９(Herlynら(1982) “Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma,” J. Clin. Immunol. 2:135-140)、ＣＴＡ−１およびＬＥＡ）、バーキットリンパ腫抗原−３８．１３、ＣＤ１９(Ghetieら(1994) “Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SCID Mice By Inducing Cell Cycle Arrest,” Blood 83:1329-1336)、ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０(Reffら(1994) “Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20,” Blood 83:435-445)、ＣＤ３３(Sgourosら(1993) “Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia,” J. Nucl. Med. 34:422-430)、黒色腫特異的抗原（例えば、ガングリオシドＧＤ２(Salehら(1993) “Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen,” J.Immunol., 151, 3390-3398)、ガングリオシドＧＤ３(Shitaraら(1993) “A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities,” Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380)、ガングリオシドＧＭ２(Livingstonら(1994) “Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside,” J. Clin. Oncol. 12:1036-1044)、ガングリオシドＧＭ３(Hoonら(1993) “Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers,” Cancer Res. 53:5244-5250)）、腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（tumor-specific transplantation type of cell-surface antigen：ＴＳＴＡ）（例えば、ＤＮＡ腫瘍ウイルスのＴ抗原およびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原を含むウイルス誘導腫瘍抗原など）、癌胎児性抗原−α−フェトプロテイン（例えば、結腸のＣＥＡ）、膀胱腫瘍癌胎児性抗原(Hellstromら(1985) “Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas,” Cancer. Res. 45:2210-2188)、分化抗原（例えば、ヒト肺癌抗原Ｌ６、Ｌ２０(Hellstromら(1986) “Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma,” Cancer Res. 46:3917-3923)、線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７(Bhattacharya-Chatterjeeら(1988) “Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2, and Ab3),” J. Immunol. 141:1398-1403)、新生糖タンパク質、スフィンゴ脂質、乳癌抗原（例えば、ＥＧＦＲ(Epidermal growth factor receptor)（上皮成長因子受容体））、ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５HER2）、多型上皮ムチン（polymorphic epithelial mucin：ＰＥＭ）(Hilkensら(1992) “Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property,” Trends in Biochem. Sci. 17:359-363)、悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１(Trauthら(1989) “Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis,” Science 245:301-304)、分化抗原(Feizi (1985) “Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens,” Nature 314:53-57)例えば、胎児赤血球および初期内胚葉に見られるＩ抗原、胃腺癌に見られるＩ（Ｍａ）、乳房上皮に見られるＭ１８およびＭ３９、骨髄細胞に見られるＳＳＥＡ−１、結腸直腸癌に見られるＶＥＰ８、ＶＥＰ９、Ｍｙｌ、ＶＩＭ−Ｄ５およびＤ1５６−２２、結腸腺癌に見られるＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）、Ｃ１４、肺腺癌に見られるＦ３、胃癌に見られるＡＨ６、胚性癌細胞に見られるＹハプテンＬｅy、Ａ４３１細胞に見られるＴＬ５（血液型Ａ）、ＥＧＦ受容体、膵癌に見られるＥ1系列（血液型Ｂ）、胚性癌細胞、胃腺癌に見られるＦＣ１０．２、腺癌に見られるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅa）、腺癌に見られるＮＳ−１０、結腸腺癌に見られるＣＯ−４３（血液型Ｌｅb）、Ｇ４９、ＥＧＦ受容体、（血液型ＡＬｅb／Ｌｅy）、結腸癌、胃癌ムチンに見られる１９．９、骨髄細胞に見られるＴ5Ａ7、黒色腫に見られるＲ24、胚性癌細胞に見られる４．２、ＧD3、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧM2、ＯＦＡ−２、ＧD2、Ｍ１：２２：２５：８、ならびに４〜８細胞期の胚に見られるＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４。別の実施形態では、抗原は皮膚Ｔ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体由来ペプチドである（Edelson (1998) “Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy,” Cancer J Sci Am. 4:62-71参照）。
【０２８２】
本発明の方法および組成物によって治療または予防することができる癌および関連の障害としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血球性白血病および脊髄形成異常症候群など）、慢性白血病（限定されるものではないが、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病など）を含む白血病；真性赤血球増加症；限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖病；限定されるものではないが、骨部肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管腫（血管肉腫）、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨および結合組織肉腫；限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；限定されるものではないが、腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、ページェット病および炎症性乳癌などの乳癌；限定されるものではないが、クロム親和性細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌；限定されるものではないが、乳頭状もしくは濾胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；限定されるものではないが、膵島細胞腫、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍およびカルチノイドもしくは膵島細胞腫瘍などの膵癌；限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症および尿崩症などの下垂体癌；限定されるものではないが、眼部黒色腫（例えば、虹彩黒色腫、脈絡膜黒色腫および毛様体黒色腫）および網膜芽腫などの眼の癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌および黒色腫などの膣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫およびページェット病などの外陰部癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌および腺癌などの子宮頚部癌；限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界性腫瘍、生殖細胞腫瘍および間質腫瘍などの卵巣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、形質細胞腫、疣状癌および燕麦細胞（小細胞）癌などの食道癌；限定されるものではないが、腺癌、菌状（ポリープ状）、潰瘍性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；直腸癌；限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝癌；限定されるものではないが、腺癌などの胆嚢癌；限定されるものではないが、乳頭状、結節性および拡散性などの胆管癌；限定されるものではないが、非小細胞肺癌、扁平上皮癌（表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌などの肺癌；限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化性、古典的（典型的）、精子細胞癌、非精上皮腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌（卵黄のう腫瘍）などの精巣癌；限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などの前立腺癌；陰茎癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌などの口腔癌；基底癌；限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌および疣状癌などの咽頭癌；限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮癌および黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌；限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行性細胞癌（腎骨盤および／または子宮）などの腎癌；ウィルムス腫瘍；限定されるものではないが、移行性細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原性癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる（このような障害の総説としては、Fishmanら(1985) Medicine, 第2版, J.B. Lippincott Co., Philadelphia;およびMurphyら(1997) Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照）。
【０２８３】
従って、本発明の方法および組成物は、限定されるものではないが、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、前立腺、子宮頚部、甲状腺および皮膚の癌を含む癌；扁平上皮癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫を含むリンパ造血系腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄造血系腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽腫および神経膠腫を含むその他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌を含むその他の腫瘍を含む多様な癌またはその他の異常増殖性疾患の治療または予防においても有用である。アポトーシスの異常により引き起こされる癌も、本発明の方法および組成物によって治療されることが企図される。このような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異を伴う癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに家族性腺腫様ポリープ症および脊髄形成異常症候群などの前癌性病変が挙げられる。特定の実施形態では、卵巣、膀胱、乳房、結腸、肺、皮膚、膵臓または子宮において、悪性腫瘍もしくは増殖異常変化（異形成および形成不全など）、または過剰増殖性疾患を、本発明の方法および組成物によって治療または予防する。他の特定の実施形態では、肉腫、黒色腫または白血病を本発明の方法および組成物によって治療または予防する。
【０２８４】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ）は、癌細胞の増殖を、本発明の該分子の不在下での癌細胞の増殖と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％阻害または低減する。
【０２８５】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含むダイアボディ）は、親分子よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％良好に細胞を死滅させるか、または癌細胞の増殖を阻害もしくは低減する。
【０２８６】
５．６．２  自己免疫疾患および炎症性疾患
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、本発明の方法に従って操作された、ＦｃγＲＩＩＢに特異的なエピトープ結合ドメインおよび／または変異型Ｆｃドメイン（またはその一部）を含み、該Ｆｃドメインは野生型Ｆｃドメインと比較して、ＦｃγＲＩＩＢに対してより大きな親和性とＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の低下を示す。そのような結合特性を有する本発明の分子は、免疫応答の調節、例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患に関連する免疫応答の阻害において有用である。いずれの作用機序にも縛られるものではないが、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性を有し、かつ／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強され、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低減されたＦｃドメインを含む本発明の分子は、ＦｃγＲに対する活性化応答の弱化および細胞応答性の阻害をもたらし、従って、自己免疫疾患の治療および／または予防に対して治療有効性を有すると考えられる。
【０２８７】
本発明はまた、被験体における炎症性障害に関連する１以上の症状を予防、治療または管理する方法を提供し、該方法は、１種類以上の抗炎症薬の治療上または予防上有効な量を該被験体に投与することをさらに含む。本発明はまた、自己免疫疾患に関連する１以上の症状を予防、治療または管理する方法も提供し、該方法は、１種類以上の免疫調節薬の治療上または予防上有効な量を該被験体に投与することをさらに含む。第５．７節に、抗炎症薬および免疫調節薬の非限定的な例を示す。
【０２８８】
本発明の分子を投与することにより治療可能な自己免疫障害の例としては、限定されるものでないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素病、クローン病、円板状狼蒼、本態性混合型寒冷グロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギラン−バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ神経障害、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合型結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎などの血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。本明細書の第２．２．２節に記載されているように、いくつかの自己免疫障害は炎症症状を伴っている。このように、自己免疫障害と考えられる障害と炎症性障害と考えられる障害との間には重複がある。従って、いくつかの自己免疫障害は炎症性障害としても特徴付けることができる。本発明の方法に従って予防、治療または管理可能な炎症性障害の例としては、限定されるものでないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性的ウイルスまたは細菌感染から生じる慢性炎症が挙げられる。
【０２８９】
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強され、かつ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が低減された変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子はまた、炎症性障害を有する動物、特に哺乳動物が受ける炎症を軽減するために使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の分子は動物の炎症を、前述の分子を投与されてない動物の炎症と比較して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％，または少なくとも１０％軽減する。
【０２９０】
ＦｃγＲＩＩＢに特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインおよび／またはＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が増強され、かつ、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が低減された変異型Ｆｃドメインを含む本発明の分子はまた、移植拒絶を防止するために使用することもできる。
【０２９１】
５．６．３  感染性疾患
本発明はまた、被験体における感染性疾患を治療または予防する方法も包含し、該方法は、感染性疾患と関連した感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む、１種類以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の分子は感染性病原体に対して有毒であり、前述の分子の不在下での免疫応答と比較して、前述の病原体に対する免疫応答を増強するか、または前述の病原体に対するエフェクター機能を増強する。本発明の分子によって治療または予防可能な感染性疾患は、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫およびウイルスを含む感染性病原体により引き起こされる。
【０２９２】
本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能なウイルス性疾患としては、限定されるものではないが、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウイルス、エコーウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、天然痘ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）、ＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ）、およびウイルス性髄膜炎、脳炎、デング熱または天然痘などのウイルス性疾患の病原体により引き起こされるものが挙げられる。
【０２９３】
本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な細菌性疾患としては、限定されるものではないが、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、肺炎球菌(S. pneumonia)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)（ライム病）、炭疽菌（炭疽病）、破傷風菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、マイコバクテリウム、破傷風菌、百日咳菌、コレラ菌、ペスト菌、ジフテリア菌、クラミジア、黄色ブドウ球菌(S. aureus)およびレジオネラ菌を含む細菌により引き起こされるものが挙げられる。
【０２９４】
本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な原虫性疾患としては、限定されるものではないが、リーシュマニア、コクシジウム、トリパノソーマまたはマラリア原虫を含む原虫により引き起こされるものが挙げられる。
【０２９５】
本発明の方法とともに本発明の分子を用いて治療または予防可能な寄生虫性疾患としては、限定されるものではないが、クラミジアおよびリケッチアを含む寄生虫により引き起こされるものが挙げられる。
【０２９６】
本発明の一態様によれば、感染性病原体に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む本発明の分子は、該病原体（例えば、病原性タンパク質）に対する抗体エフェクター機能を示す。感染性病原体の例としては、限定されるものではないが、細菌（例えば、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、大便連鎖球菌、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、スタフィロコッカス・ビリダンス(Staphylococcus viridans)および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)）；病原体（例えば、Ｂリンパ球向性パポバウイルス（ＬＰＶ）；ボルダテラ・ペルツッシス(Bordatella pertussis)；ボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）；ウシコロナウイルス；脈絡髄膜炎ウイルス；デング熱ウイルス；ウイルス、大腸菌；エボラ；エコーウイルス１；エコーウイルス１１（ＥＶ）；エンドトキシン（ＬＰＳ）；腸内細菌；腸内オーファンウイルス；腸内ウイルス；ネコ白血病ウイルス；口蹄疫ウイルス；テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）；グラム陰性細菌；ヘリコバクター・ピロリ(Heliocacter pylori)；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）；単純ヘルペスウイルス；ＨＩＶ−１；ヒトサイトメガロウイルス；ヒトコロナウイルス；インフルエンザＡ、ＢおよびＣ；レジオネラ菌；リーシュマニア・メキシカーナ(Leishmania mexicana)；リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；麻疹ウイルス(Measles virus)；髄膜炎菌；麻疹ウイルス(Morbilliviruses)；マウス肝炎ウイルス；マウス白血病ウイルス；マウスガンマヘルペスウイルス；マウスレトロウイルス；マウスコロナウイルス；マウス肝炎ウイルス；鳥結核菌Ｍ(Mycobacterium avium-M)；リン菌(Neisseria gonorrhoeae)；ニューカッスル病ウイルス；パルボウイルスＢ１９；熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)；ポックスウイルス；シュードモナス；ロタウイルス；ネズミチフス菌；赤痢菌；連鎖球菌；Ｔ細胞リンパ球ウイルス１；ワクシニアウイルスが挙げられる。
【０２９７】
５．６．４  解毒
本発明はまた、毒素（例えば、毒性薬物分子）に曝された被験体の解毒方法を包含し、該方法は、毒性薬物分子に特異的な少なくとも１つのエピトープ結合ドメインを含む１種類以上の本発明の分子の治療上または予防上有効な量を投与することを含む。特定の実施形態では、本発明の分子の毒素への結合は、該毒素の有害な生理学的作用を軽減または排除する。さらに他の実施形態では、本発明のダイアボディの毒素への結合は、該ダイアボディの不在下での毒素の除去、分解または中和と比較して、毒素の除去、分解または中和を増大または増強する。本発明の方法に従う免疫毒素療法は、限定されるものではないが、ジゴキシン、ＰＣＰ、コカイン、コルヒチン、三環式抗鬱薬を含む薬物の過剰投与または薬物への曝露を治療するために使用することができる。
【０２９８】
５．７  併用療法
本発明はさらに、本発明の分子を、限定されるものではないが、現行の標準的および試験的化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法または外科手術を含む、癌、自己免疫疾患、感染性疾患または中毒の治療または予防のための当業者に公知の他の療法と併用投与することを包含する。いくつかの実施形態では、本発明の分子を、治療上または予防上有効な量の１種類以上の薬剤、治療用抗体、または癌、自己免疫疾患、感染性疾患もしくは中毒の治療および／または予防のための当業者に公知の他の薬剤と併用投与することができる。
【０２９９】
特定の実施形態では、１種類以上の本発明の分子を、癌の治療に有用な他の１種類以上の治療薬と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」とは、予防薬または治療薬の厳密な同じ時点での投与に限定されるものではなく、むしろ本発明の分子と他の薬剤を哺乳動物に連続的かつ一定の時間間隔内に投与して、本発明の分子が他の薬剤とともに作用して、それらを別々に投与した場合よりも増大した利益を提供するようにすることを意味する。例えば、予防薬または治療薬（例えば、化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法）のそれぞれを、同じ時点に、または任意の順序で異なる時点で連続的に投与することができるが、同じ時点に投与されない場合には、所望の治療効果または予防効果が提供されるように十分近接した時点で投与すべきである。各治療薬は、任意の適当な形態で、かつ任意の好適な経路で、別々に投与することができる。種々の実施形態では、予防薬または治療薬を、１時間未満の間隔、約１時間の間隔、約１時間〜約２時間の間隔、約２時間〜約３時間の間隔、約３時間〜約４時間の間隔、約４時間〜約５時間の間隔、約５時間〜約６時間の間隔、約６時間〜約７時間の間隔、約７時間〜約８時間の間隔、約８時間〜約９時間の間隔、約９時間〜約１０時間の間隔、約１０時間〜約１１時間の間隔、約１１時間〜約１２時間の間隔、２４時間以下の間隔または４８時間以下の間隔で投与する。好ましい実施形態では、２種類以上の成分を患者の同一来診時に投与する。
【０３００】
他の実施形態では、予防薬または治療薬を、約２〜４日の間隔、約４〜６日の間隔、約１週間の間隔、約１〜２週間の間隔、または２週間以上の間隔で投与する。好ましい実施形態では、予防薬または治療薬を、両薬剤が活性を維持している時間枠内で投与する。当業者ならば、投与する薬剤の半減期を測定することによって、このような時間を決定することができる。
【０３０１】
特定の実施形態では、本発明の予防薬または治療薬を、被験体に周期的に投与する。周期的療法には、第１薬剤をある期間投与した後、第２薬剤および／または第３薬剤をある期間投与し、この連続投与を反復することを含む。周期的療法は、１種類以上の療法に対する耐性の進行を軽減し、一療法の副作用を回避または軽減し、かつ／または治療の有効性を向上させることができる。
【０３０２】
特定の実施形態では、予防薬または治療薬を、約３週間未満の周期で、約２週間毎に１回、約１０日毎に１回、または約１週間毎に１回投与する。１周期には、周期毎に約９０分間、周期毎に約１時間、周期毎に約４５分間かけて注入することによる治療薬または予防薬の投与を含むことができる。各周期は少なくとも１週間の休止、少なくとも２週間の休止、少なくとも３週間の休止を含むことができる。投与する周期の回数は約１〜約１２周期、より一般には約２〜約１０周期、より一般には約２〜約８周期である。
【０３０３】
さらに他の実施形態では、本発明の治療薬および予防薬を、メトロノーム的投与計画で、長期の休止期間を設けずに連続注入または高頻度投与のいずれかによって投与する。このようなメトロノーム的投与には、休止期間を設けない一定間隔での投与が含まれ得る。一般には、治療薬、特に細胞傷害性薬剤を低用量で使用する。このような投与計画には、長期間の比較的低用量の連日投与が含まれる。好ましい実施形態では、低用量の使用は、毒性副作用を最少にし、休止期間を排除することができる。特定の実施形態では、治療薬および予防薬は、約２４時間から約２日まで、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで、約１ヶ月まで、約２ヶ月まで、約３ヶ月まで、約４ヶ月まで、約５ヶ月まで、約６ヶ月までの範囲の連日低用量投与または連続注入によって送達される。このような投与計画のスケジュールは腫瘍専門家が至適化することができる
【０３０４】
他の実施形態では、複数の治療クールを哺乳動物に同時に投与する（すなわち、個別の用量の治療薬を、別々にではあるが、本発明の分子が他の薬剤とともに作用できるような時間間隔で投与する）。例えば、ある成分を１週間に１回投与し、それと組み合わせて、他の成分を２週間毎に１回、または３週間毎に１回投与してもよい。言い換えれば、治療薬の投与計画は、治療薬が同時にまたは患者の同一来診時に投与されない場合であっても、同時に実施される。
【０３０５】
他の予防薬および／または治療薬と併用する場合、本発明の分子と予防薬および／または治療薬は相加的に、より好ましくは相乗的に作用することができる。一実施形態では、本発明の分子を１種類以上の治療薬とともに同一の医薬組成物として同時に投与する。別の実施形態では、本発明の分子を１種類以上の治療薬とともに別々の医薬組成物として同時に投与する。さらに別の実施形態では、本発明の分子を、別の予防薬または治療薬の投与前または投与後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、例えば、経口経路と非経口経路による、本発明の分子と他の予防薬または治療薬との併用投与を企図する。特定の実施形態では、本発明の分子を、限定されるものではないが、毒性などの有害副作用をもたらす可能性がある別の予防薬または治療薬と同時に投与する場合には、予防薬または治療薬は、有害副作用が誘発される閾値より低い用量で投与することが有利であり得る。
【０３０６】
本明細書で提供される用量および投与頻度は、治療上有効なおよび予防上有効なという用語により包含されている。用量および頻度はさらに、一般には各患者に特有な因子に従って、投与する特定の治療薬または予防薬、癌の重篤度およびタイプ、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答性および過去の病歴に応じて異なる。好適な投与計画は、このような因子を考慮し、例えば文献に報告され、Physician’s Desk Reference（第５６版、２００２年）で推奨されている用量に従って当業者が選択可能である。
【０３０７】
５．７．１  抗癌薬
特定の実施形態では、本発明の方法は、１種類以上の本発明の分子を、癌の治療および／または予防のために使用される１種類以上の治療薬とともに投与することを包含する。一実施形態では、血管新生阻害薬を本発明の分子と併用投与することができる。本発明の方法および組成物において使用可能な血管新生阻害薬としては、限定されるものではないが、アンギオスタチン（プラスミノーゲンフラグメント）；抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ；アンギオザイム；ＡＢＴ−６２７；Ｂａｙ  １２−９５６６；ベネフィン；ベバシズマブ；ＢＭＳ−２７５２９１；軟骨由来阻害薬（ＣＤＩ）；ＣＡＩ；ＣＤ５９補体フラグメント；ＣＥＰ−７０５５；Ｃｏｌ  ３；コンブレタスタチンＡ−４；エンドスタチン（コラーゲンＸＶＩＩＩフラグメント）；フィブロネクチンフラグメント；Ｇｒｏ−β；ハロフギノン；ヘパリナーゼ；ヘパリンヘキササッカライドフラグメント；ＨＭＶ８３３；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；ＩＭ−８６２；インターフェロンα／β／γ；インターフェロン誘導性タンパク質（ＩＰ−１０）；インターロイキン−１２；クリングル５（プラスミノーゲンフラグメント）；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害薬（ＴＩＭＰ）；２−メトキシエストラジオール；ＭＭＩ２７０（ＣＧＳ  ２７０２３Ａ）；ＭｏＡｂ  ＩＭＣ−１Ｃ１１；ネオバスタット；ＮＭ−３；パンゼム；ＰＩ−８８；胎盤リボヌクレアーゼ阻害薬；プラスミノーゲン活性化因子阻害薬；血小板因子−４（ＰＦ４）；プリノマスタット；プロラクチン１６ｋＤａフラグメント；プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）；ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４；レチノイド；ソリマスタット；スクアラミン；ＳＳ３３０４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ＳＵ１１２４８；テトラヒドロコルチゾール−Ｓ；テトラチオモリブダート；サリドマイド；トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）；ＴＮＰ−４７０；トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−ｂ）；バスキュロスタチン；バソスタチン（カルレティキュリンフラグメント）；ＺＤ６１２６；ＺＤ６４７４；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬（ＦＴＩ）；およびビスホスホネートが挙げられる。
【０３０８】
本発明の医薬組成物および投与形およびキットを含む本発明の種々の実施形態において、本発明の分子と併用可能な抗癌薬としては、限定されるものではないが、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；二メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ジュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシ尿素；塩酸イダルビシン；イフォスファミド；イルモフォシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビンエピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗癌薬としては、限定されるものではないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗薬；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害薬；拮抗薬Ｄ；拮抗薬Ｇ；アンタレリクス；抗背方化形態発生タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌薬；抗エストロゲン薬；抗ネオプラストン薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；βアレチン；βクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害薬；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルフォキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害薬；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害薬（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シスポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クラムベシジン��１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；ジュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動薬；エストロゲン拮抗薬；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルビシン；ホルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害薬；ゲムシタビン；グルタチオン阻害薬；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害薬；インターフェロン作動薬；インターフェロン；インターロイキン；ヨードベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；三酢酸ラメラリン−Ｎ；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球αインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性ジサッカライドペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；テキサフィリンルテチウム；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害薬；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害薬；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害薬；多発性腫瘍抑制因子１に基づく療法；マスタード抗癌薬；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド抗酸化剤；ニトルリン；０６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導薬；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ぺグアスパラガーゼ；ペルデシン；ポリ硫酸ペントサンナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；パーホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニル；ホスファターゼ阻害薬；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーター阻害薬；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害薬；タンパク質Ａに基づく免疫調節薬；タンパク質キナーゼＣ阻害薬；タンパク質キナーゼＣ阻害薬類、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害薬；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害薬；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆ拮抗薬；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬；ｒａｓ阻害薬；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害薬；脱メチル化レテリプチン；エチドロン酸レニウムＲｅ１８６；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；
サルグラモスチム；Ｓｄｉ  １ミメティクス；セムスチン；老化誘導阻害薬１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害薬；シグナル伝達調節薬；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプタートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害薬；幹細胞分裂阻害薬；スチピアミド；ストロメリシン阻害薬；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチド拮抗薬；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害薬；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチンミメティック；チマルファシン；チモポエチン受容体作動薬；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害薬；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害薬；チルホスチン；ＵＢＣ阻害薬；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子治療；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。好ましい他の抗癌薬は、５−フルオロウラシルおよびロイコボリンである。
【０３０９】
本発明の方法に使用可能な治療用抗体の例としては、限定されるものではないが、ＺＥＮＡＰＡＸＳ（登録商標）（ダクリズマブ）（Ｒｏｃｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、スイス）（急性腎同種移植拒絶の予防のための免疫抑制性ヒト化抗ＣＤ２５モノクローナル抗体）；ＰＡＮＯＲＥＸ（商標）（マウス抗１７−ＩＡ細胞表面抗原ＩｇＧ２ａ抗体）（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ／Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）；ＢＥＣ２（マウス抗イディオタイプ（ＧＤ３エピトープ）ＩｇＧ抗体）（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ＩＭＣ−Ｃ２２５（キメラ抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体）（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）；ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（ヒト化抗αＶβ３インテグリン抗体）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ／ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）；Ｓｍａｒｔ  Ｍ１９５（ヒト化抗ＣＤ３３  ＩｇＧ抗体）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｋａｎｅｂｏ）；ＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（ヒト化抗ＣＤ２２  ＩｇＧ抗体）（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）；ＩＣＭ３（ヒト化抗ＩＣＡＭ３抗体）（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ）；ＩＤＥＣ−１１４（霊長類化抗ＣＤ８０抗体）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）；ＩＤＥＣ−１３１（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ抗体）（ＩＤＥＣ／Ｅｉｓａｉ）；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４抗体）（ＩＤＥＣ）；ＩＤＥＣ−１５２（霊長類化抗ＣＤ２３抗体）（ＩＤＥＣ／Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）；ＳＭＡＲＴ抗ＣＤ３（ヒト化抗ＣＤ３  ＩｇＧ）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）；５Ｇ１．１（ヒト化抗補体因子５（Ｃ５）抗体）（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ）；Ｄ２Ｅ７（ヒト化抗ＴＮＦ−α抗体）（ＣＡＴ／ＢＡＳＦ）；ＣＤＰ８７０（ヒト化抗ＴＮＦ−αＦａｂフラグメント）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＩＤＥＣ−１５１（霊長類化抗ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＭＤＸ−ＣＤ４（ヒト抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体）（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｅｉｓａｉ／Ｇｅｎｍａｂ）；ＣＤＰ５７１（ヒト化抗ＴＮＦ−α  ＩｇＧ４抗体）（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）；ＬＤＰ−０２（ヒト化抗α４β７抗体）（ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ＯｒｔｈｏＣｌｏｎｅ  ＯＫＴ４Ａ（ヒト化抗ＣＤ４  ＩｇＧ抗体）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）；ＡＮＴＯＶＡ（商標）（ヒト化抗ＣＤ４０Ｌ  ＩｇＧ抗体）（Ｂｉｏｇｅｎ）；ＡＮＴＥＧＲＥＮ（商標）（ヒト化抗ＶＬＡ−４  ＩｇＧ抗体）（Ｅｌａｎ）；およびＣＡＴ−１５２（ヒト抗ＴＧＦ−β2抗体）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｂ  Ｔｅｃｈ）が挙げられる。本発明に従って使用可能な治療用抗体の他の例を表８に示す。
【０３１０】
【表８】
0005964300.tif 000032
0005964300.tif 000033
0005964300.tif 000034
0005964300.tif 000035
【０３１１】
５．７．２  免疫調節薬および抗炎症薬
本発明は、本発明の分子を他の治療薬とともに投与することを含む、自己免疫疾患および炎症性疾患の治療方法を提供する。免疫調節薬の例としては、限定されるものではないが、メトトレキサート、エンブレル(ENBREL)、レミケード(REMICADE)（商標）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡおよびマクロライド抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロノニトリルアミド（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体調節薬およびサイトカイン受容体調節薬が挙げられる。
【０３１２】
抗炎症薬は、炎症性疾患および自己免疫疾患の治療において成功をおさめており、現在、このような障害のための共通かつ標準の治療薬となっている。当業者に周知のいずれの抗炎症薬も本発明の方法に使用することができる。抗炎症薬の非限定的な例としては、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症薬、β作動薬、抗コリン作動薬およびメチルキサンチンが挙げられる。ＮＳＡＩＤの例としては、限定されるものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトロラク（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、スリンダック（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））が挙げられる。このようなＮＳＡＩＤはシクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬の例としては、限定されるものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、ならびにエイコサノイド（例えば、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエン）が挙げられる。
【０３１３】
炎症性障害の治療または予防に本発明の分子と併用可能な抗体の非限定的な例を表９に示し、また、自己免疫障害の治療または予防に使用可能な抗体の非限定的な例を表１０に示す。
【０３１４】
【表９】
0005964300.tif 000036
0005964300.tif 000037
0005964300.tif 000038
0005964300.tif 000039
【０３１５】
【表１０】
0005964300.tif 000040
0005964300.tif 000041
【０３１６】
５．７．３  感染性疾患の治療に使用される薬剤
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、感染性疾患の治療および／または予防のための当業者に公知の１種類以上の付加的治療薬の治療上または予防上有効な量と併用投与することができる。本発明は、本発明の分子の、感染性疾患の治療および／または予防のための当業者に公知の抗生物質との併用を企図する。本発明の分子と併用可能な抗生物質としては、限定されるものではないが、マクロライド（例えば、トブラマイシン（Ｔｏｂｉ（登録商標）））、セファロスポリン（例えば、セファレキシン（Ｋｅｆｌｅｘ（登録商標））、セフラジン（Ｖｅｌｏｃｅｆ（登録商標））、セフロキシム（Ｃｅｆｔｉｎ（登録商標））、セフプロジル（Ｃｅｆｚｉｌ（登録商標））、セファクロール（Ｃｅｃｌｏｒ（登録商標））、セフィキシム（Ｓｕｐｒａｘ（登録商標））またはセファドロキシル（Ｄｕｒｉｃｅｆ（登録商標）））、クラリスロマイシン（例えば、クラリスロマイシン（Ｂｉａｘｉｎ（登録商標）））、エリスロマイシン（例えば、エリスロマイシン（ＥＭｙｃｉｎ（登録商標）））、ペニシリン（例えば、ペニシリンＶ（Ｖ−Ｃｉｌｌｉｎ  Ｋ（登録商標）またはＰｅｎ  Ｖｅｅ  Ｋ（登録商標）））またはキノロン（例えば、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ（登録商標））、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ（登録商標））またはノルフロキサシン（Ｎｏｒｏｘｉｎ（登録商標）））、アミノ配糖体系抗生物質（例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ネオマイシン、ネオマイシン、ウンデシレネート、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシンおよびスペクチノマイシン）、アムフェニコール系抗生物質（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアムフェニコール）、アンサマイシン系抗生物質（例えば、リファミドおよびリファンピン）、カルバセフェム系（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム系（例えば、ビアペネムおよびイミペネム）、セファロスポリン系（例えば、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミドおよびセフピロム）、セファマイシン系（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾールおよびセフミノクス）、モノバクタム系（例えば、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム）、オキサセフェム系（例えば、フロモキセフおよびモキサラクタム）、ペニシリン系（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン(penamecillin)、ヨウ化水素酸ペネタメート、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム）、リンコサミド系（例えば、クリンダマイシンおよびリンコマイシン）、アムホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンジュラシジン、エンビオマイシン、テトラサイクリン系（例えば、アピサイクリン、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリ���およびデメクロサイクリン）、２，４−ジアミノピリミジン系（例えば、ブロジモプリム）、ニトロフラン系（例えば、フラルタドンおよび塩化フラゾリウム）、キノロンおよびその類似体（例えば、シノキサシン、クリナフロキサシン、フルメキンおよびグレパフロキサシン）、スルホンアミド系（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、ノプリルスルファミド、フタリルスルファセタミド、スルファクリソイジンおよびスルファシチン）、スルホン系（例えば、ジアチモスルホン、グコスルホンナトリウム、およびソラスルホン）、サイクロセリン、ムピロシンおよびチュベリンが挙げられる。
【０３１７】
特定の実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の１種類以上の抗真菌薬と併用投与することができる。本発明の分子と併用可能な抗真菌薬としては、限定されるものではないが、アムフォテリシンＢ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、フルコナゾール、イントラセカル(intrathecal)、フルシトシン、ミコナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、ナイタチン、テルコナゾール、チオコナゾール、シクロピロクス、エコナゾール、ハロプログリン、ナフチフィン、テルビナフィン、ウンデシレネートおよびグリセオフルビンが挙げられる。
【０３１８】
いくつかの実施形態では、本発明の分子は、治療上または予防上有効な量の１種類以上の抗ウイルス薬と併用投与することができる。本発明の分子と併用可能な有効な抗ウイルス薬としては、限定されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびヌクレオシド類似体が挙げられる。抗ウイルス薬の例としては、限定されるものではないが、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジンおよびリバビリン、ならびにホスカルネット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、アンプレナビル、ロピナビル、リトナビル、αインターフェロン；アデホビル、クレブジン、エンテカビル、プレコナリルが挙げられる。
【０３１９】
５．８  ワクチン療法
本発明は、本発明の組成物を用いて、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答を誘発することをさらに包含し、該物質としては、限定されるものではないが、癌抗原および感染性疾患抗原（これらの例は後述する）が含まれる。本発明のワクチン組成物は、免疫応答が望まれる１種類以上の抗原性または免疫原性物質を含み、該１種類以上の抗原性または免疫原性物質が、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が増強されている本発明の変異型抗体でコーティングされる。本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質に対する免疫応答、好ましくは防御性免疫応答を誘発するのに特に有効である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物中の抗原性または免疫原性物質は、免疫応答が望まれるウイルスを含む。ウイルスは組換え体でもキメラでもよく、好ましくは弱毒化されている。組換え体、キメラおよび弱毒化ウイルスの産生は、当業者に公知の標準的な手法を用いて行うことができる。本発明は、本発明に従って製剤化される組換え生ウイルスワクチンまたは組換え不活化ウイルスワクチンを包含する。生ワクチンが好ましいが、これは宿主内での複製が自然感染の場合と同種かつ同程度の持続的刺激をもたらし、従って、実質的な長期免疫を付与するからである。このような組換え生ウイルスワクチン製剤の生産は、細胞培養物またはニワトリ胚尿膜中でのウイルス増殖と、その後の精製を含む従来法を用いて達成することができる。
【０３２１】
特定の実施形態では、組換えウイルスは、それが投与される被験体に対して非病原性である。これに関して、遺伝子操作ウイルスをワクチンとして使用するには、これらの株が弱毒性である必要がある。トランスフェクションに用いる鋳型に適当な突然変異（例えば欠失）を導入すると、弱毒性を有する新規ウイルスが得られる。例えば、温度感受性または寒冷適応に関連する特定のミスセンス突然変異を欠失突然変異に導入することができる。これらの突然変異は、寒冷または温度感受性変異体に関連する点突然変異よりも安定であるはずであり、復帰突然変異の頻度が極めて低いはずである。組換えウイルスを作製するための組換えＤＮＡ技術は当技術分野で公知であり、本発明に包含される。例えば、負鎖ＲＮＡウイルスの改変のための技術が当技術分野において公知である（例えば、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる米国特許第５，１６６，０５７号を参照）。
【０３２２】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスが、本発明の皮内ワクチン製剤での使用のために構築され得る。このようなウイルスは、宿主内でわずかに１〜数回の複製しか行うことがない。ワクチンとして使用する際には、組換えウイルスは限られた複製サイクルを行って十分なレベルの免疫応答を誘発するが、ヒト宿主中でさらに複製サイクルを行って疾病を引き起こすことはない。あるいは、不活化（死滅）ウイルスを本発明に従って製剤化することもできる。不活化ワクチン製剤は、キメラウイルスを「死滅させる」ための、従来法を用いて作製することができる。不活化ワクチンは、その感染性が破壊されているという意味で「死んでいる」。ウイルスの感染性がその免疫原性を損なうことなく破壊されることが理想的である。不活化ワクチンを作製するためには、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚尿膜中で増殖させ、ゾーン超遠心分離により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンにより不活化し、プールすればよい。
【０３２３】
特定の実施形態では、完全に外来のエピトープ（他のウイルス性または非ウイルス性病原体に由来する抗原を含む）に遺伝子操作を施して本発明の皮内ワクチン製剤に使用するためのウイルスとすることができる。例えば、ＨＩＶ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）などの無関連なウイルスの抗原、寄生虫抗原（例えばマラリア）、細菌もしくは真菌抗原または腫瘍抗原に遺伝子操作を施して弱毒化株とすることができる。
【０３２４】
事実上いずれの異種遺伝子配列でも、皮内ワクチン製剤に使用するための本発明のキメラウイルスへと構築が可能である。異種遺伝子配列は生物学的応答の改変因子として働く部分またはペプチドであることが好ましい。様々な病原体のいずれかに対して防御性免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原が、キメラウイルスによってまたはその一部として発現され得ることが好ましい。例えば、本発明のキメラウイルスへと構築可能な異種遺伝子配列としては、限定されるものではないが、インフルエンザおよびパラインフルエンザ血球凝集素ノイラミニダーゼおよび融合糖タンパク質（例えば、ヒトＰＩＶ３のＨＮおよびＦ遺伝子）が挙げられる。さらに別の実施形態では、操作によりキメラウイルスとすることができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。免疫調節タンパク質の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、Ｉ型インターフェロン、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、−２、−４、−５、−６、−１２、およびこれらの因子のアンタゴニストが含まれる。
【０３２５】
さらに他の実施形態では、本発明は、変異型抗体を表面で発現する病原性細胞またはウイルス、好ましくは弱毒化ウイルスを包含する。
【０３２６】
別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、抗原性または免疫原性物質がＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性が増強された本発明の変異型抗体と機能し得る形で連結されている、融合ポリペプチドを含む。本発明のワクチン組成物に使用するための融合ポリペプチドの操作は、慣例的な組換えＤＮＡ技術の方法を用いて行われ、通常の技能の範囲内である。
【０３２７】
本発明は、本発明の組成物を投与することにより、被験体において免疫寛容を誘発する方法をさらに包含する。好ましくは、被験体において免疫寛容を誘発するのに適した組成物は、本発明の変異型抗体でコーティングされた抗原性または免疫原性物質を含み、ここで、該変異型抗体はＦｃγＲＩＩＢに対してより高い親和性を有する。特定の作用機序に縛られるものではないが、このような組成物はＦｃγＲＩＩＢ媒介阻害経路を活性化することにより免疫寛容を誘発するのに有効である。
【０３２８】
５．９  組成物および投与方法
本発明は、複数のエピトープ結合ドメインと場合によりＦｃドメイン（またはその一部）を含む本発明の分子（すなわち、ダイアボディ）を含む方法および医薬組成物を提供する。本発明はまた、被験体に有効量の本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子、または本発明の融合タンパク質もしくはコンジュゲート分子を含む医薬組成物を投与することによる、疾患、障害または感染に関連する１以上の症状を治療、予防および改善する方法を提供する。好ましい態様では、抗体、融合タンパク質またはコンジュゲート分子は実質的に精製されている（すなわち、その効果を限定するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。特定の実施形態では、被験体は動物、好ましくは哺乳動物、例えば非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル、およびヒト）である。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は被験体と同種のものに由来する。
【０３２９】
様々な送達系が公知であり、本発明の分子を含む組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への封入、抗体または融合タンパク質を発現し得る組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Wuら(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。本発明の分子を投与する方法には、限定されるものではないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外および粘膜（例えば、鼻腔内および口腔経路）が含まれる。特定の実施形態では、本発明の分子を筋肉内、静脈内または皮下に投与する。組成物は任意の便宜な経路、例えば、注入またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）を介する吸収により投与してもよく、他の生物学的に活性な薬剤とともに投与してもよい。投与は全身投与であって局所投与であってもよい。さらに、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化剤を用いた製剤化により肺投与を採用することもできる。例えば、米国特許第６，０１９，９６８号；同第５，９８５，３２０号；同第５，９８５，３０９号；同第５，９３４，２７２号；同第５，８７４，０６４号；同第５，８５５，９１３号；同第５，２９０，５４０号；および同第４，８８０，０７８号；ならびに国際公開第９２／１９２４４号；同第９７／３２５７２号；同第９７／４４０１３号；同第９８／３１３４６号；および同第９９／６６９０３（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。
【０３３０】
本発明はまた、本発明の分子を密閉容器（例えば、アンプルまたはサシェ）中にパッケージして、抗体の量を表示したものを提供する。一実施形態では、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として密閉容器で供給し、例えば水または生理食塩水を用いて被験体に投与するのに適当な濃度に再構成することができる。好ましくは、本発明の分子を、乾燥した無菌凍結乾燥粉末として密閉容器にて、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇまたは少なくとも７５ｍｇの単位用量で供給する。凍結乾燥した本発明の分子はその元の容器内で２〜８℃の間で貯蔵しなければならず、また、該分子は、再構成した後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内または１時間以内に投与しなければならない。別の実施形態では、本発明の分子を、液体形態として密閉容器にて、該分子、融合タンパク質またはコンジュゲート分子の量および濃度を表示して供給する。好ましくは、本発明の分子の液体形態は、密閉容器にて、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌの分子で供給する。
【０３３１】
障害に関連する１以上の症状を治療、予防または改善するのに有効な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。製剤中で用いる正確な用量はまた、投与経路および病態の重篤度によっても異なり、医師の判断および各患者の状況によって決定されるべきである。有効な用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導いた用量応答曲線から推定することができる。
【０３３２】
本発明により包含されるダイアボディの場合、患者に投与される用量は、一般に、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましくは、患者に投与される用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇまたは０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ患者体重の間である。本発明のダイアボディ分子の用量と頻度は、例えば脂質化などの修飾によりダイアボディの取込みおよび組織浸透を増強することによって低減または変更することができる。
【０３３３】
一実施形態では、患者に投与される本発明の分子の用量は、単剤療法として用いる場合には０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／日であり得る。他の実施形態では、本発明の分子を他の治療用組成物と併用され、患者に投与される用量は、上記分子を単剤療法として用いる場合よりも低い。
【０３３４】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療の必要な部位に局所投与することが望ましい場合があり、これは、例えば、限定されるものではないが、局所注入、注射またはインプラント（該インプラントはシアラスチックメンブランなどのメンブランまたは繊維を含む、多孔質、非多孔質またはゼラチン状材料かである）の手段によって達成することができる。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、該分子が吸収されない材料を使用するように注意しなければならない。
【０３３５】
別の実施形態では、組成物を小胞、特にリポソームにて送達することができる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treatら, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (編), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, 同書, pp. 3 17-327参照；一般には前掲を参照）。
【０３３６】
さらに別の実施形態では、組成物を制御放出系または徐放系で送達することができる。本発明の１種類以上の分子を含む徐放性製剤を作製するために当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；同第９６／２０６９８号；Ningら(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-89, Songら(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleekら(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;およびLamら(1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。一実施形態では、ポンプを制御放出系で使用することができる（Langer, 前掲; Sefton, (1987) “Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwaldら(1980) “Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516;およびSaudekら(1989) “A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579参照）。別の実施形態では、抗体の制御放出を達成するためにポリマー材料を使用することができる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (編), Wiley, New York (1984); Levyら(1985) “Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192; Duringら(1989) “Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356; Howardら(1989) “Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；同第５，９１６，５９７号；同第５，９１２，０１５号；同第５，９８９，４６３号；同第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；および同第９９／２０２５３参照）。徐放性製剤に使用されるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルが挙げられる。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的（例えば、肺）の近位に配置することで、全身用量の一部しか必要としないようにすることができる（例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照）。別の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物が、Ｄｕｎｎら（米国特許第５，９４５，１５５号参照）に従って用いられる。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性物質のｉｎ  ｓｉｔｕ制御放出の治療効果に基づく。移植は一般に、治療処置を必要とする患者の体内のいずれの場所に行ってもよい。別の実施形態では、非ポリマー性の徐放系が使用され、被験体の体内の非ポリマー性インプラントが薬物送達系として使用される。体内に移植すると、インプラントの有機溶媒がその組成物から周囲組織液中に散逸、分散または浸出し、非ポリマー材料が徐々に凝集または沈降して、固体の微孔質マトリックスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。
【０３３７】
制御放出系は、Langer (1990, “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)による総説に述べられている。本発明の１種類以上の治療薬を含む徐放性製剤を作製するためには、当業者に公知のいずれの技術を用いてもよい。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号および同第９６／２０６９８号；Ningら(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleekら(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854;およびLamら(1997) “Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（それぞれ参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）参照。
【０３３８】
本発明の組成物が本発明のダイアボディをコードする核酸である特定の実施形態では、この核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、または直接注射、または微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングすること、または核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（Joliotら(1991) “Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照）などによって、これを投与して細胞内に存在させることにより、そのコードされているダイアボディの発現を促進するために該核酸をｉｎ  ｖｉｖｏ投与することができる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞のＤＮＡ内に相同的組換えにより組み込むことができる。
【０３３９】
治療上または予防上有効な量の本発明の分子を用いる被験体の治療は、単回の処置を含んでもよいが、好ましくは、一連の処置を含み得る。好ましい例では、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の本発明の分子で、週１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、いっそうより好ましくは約４、５または６週間、被験体を処置する。他の実施形態では、本発明の医薬組成物を１日１回、１日２回、または１日３回投与する。他の実施形態では、本医薬組成物を週１回、週２回、２週毎に１回、月１回、６週毎に１回、２ヶ月毎に１回、年２回または年１回投与する。また、治療に使用する分子の有効用量は特定の治療クールにおいて増減可能であることも分かるであろう。
【０３４０】
５．９．１  医薬組成物
本発明の組成物は、医薬組成物の製造に有用な原薬組成物（例えば、不純なまたは非滅菌の組成物）および単位投与形の調製に使用可能な医薬組成物（すなわち、被験体または患者に投与するのに適した組成物）を含む。このような組成物は、予防上または治療上有効な量の本明細書に開示される予防薬および／もしくは治療薬またはそれらの薬剤の組合せと、薬学上許容される担体とを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の１種類以上の本発明の分子と薬学上許容される担体とを含む。
【０３４１】
本発明はまた、本発明のダイアボディ分子と、特定の癌抗原に特異的な治療用抗体（例えば、腫瘍特異的モノクローナル抗体）と、薬学上許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。
【０３４２】
特定の実施形態において、「薬学上許容される」とは、動物、より詳しくはヒトでの使用について、連邦政府または州政府の規制当局により認可されていること、または米国薬局方もしくは他の一般的に認知されている薬局方に揚げられていることを意味する。「担体」とは、治療薬が一緒に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全および不完全））、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水および油（例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物または合成起源のものを含む）などの無菌液体であり得る。医薬組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。また、生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体担体として、特に注射液として使用可能である。好適な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、ドライスキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、組成物はまた、少量の湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの剤形をとり得る。
【０３４３】
一般に、本発明の組成物の成分は、別々にまたは一緒に混合して単位投与形で、例えば、乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、アンプルまたはサシェなどの密閉容器にて、有効薬剤の量を表示して供給される。組成物を注入により投与する場合には、医薬級の無菌の水または生理食塩水を含有する点滴ボトルを用いて分配することができる。組成物を注射により投与する場合には、無菌の注射水または生理食塩水のアンプルを提供し、それらの成分を投与前に混合することができる。
【０３４４】
本発明の組成物は、中性または塩形態として製剤化することもできる。薬学上許容される塩としては、限定されるものではないが、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどの陰イオンを伴って形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどの陽イオンを伴って形成される塩が含まれる。
【０３４５】
５．９．２  遺伝子療法
特定の実施形態では、本発明の分子をコードする配列を含む核酸を投与して、遺伝子療法により疾患、障害または感染に関連する１以上の症状を治療、予防または改善する。遺伝子療法とは、発現されるまたは発現可能な核酸を被験体に投与することにより行われる療法を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸が、治療効果または予防効果を媒介するそのコードされている抗体または融合タンパク質を産生する。
【０３４６】
当技術分野で利用可能な遺伝子療法の方法はいずれも、本発明に従って使用することができる。例示的な方法を以下に記載する。
【０３４７】
遺伝子療法の方法の一般的な総説としては、Goldspielら(1993) “Human Gene Therapy,” Clinical Pharmacy 12:488-505; Wuら(1991) “Delivery Systems For Gene Therapy,” Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) “Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions,” Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy,” Science 260:926-932;およびMorganら(1993) “Human Gene Therapy,” Ann. Rev. Biochem. 62:191-217を参照。使用可能な組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている方法は、Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)に記載されている。
【０３４８】
好ましい態様では、本発明の組成物は本発明のダイアボディをコードする核酸を含み、その核酸は好適な宿主内で該抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸は、抗体コード領域と機能し得る形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、そのプロモーターは誘導性または構成的、場合によっては組織特異的であり得る。別の特定の実施形態では、抗体コード配列および他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、これにより抗体をコードする核酸の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される(Kollerら(1989) “Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;およびZijlstraら(1989) “Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells,” Nature 342:435-438)。
【０３４９】
別の好ましい態様では、本発明の組成物は融合タンパク質をコードする核酸を含み、その核酸は好適な宿主において融合タンパク質を発現する発現ベクターの一部分である。特に、このような核酸は、融合タンパク質のコード領域と機能し得る形で連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、そのプロモーターは誘導性または構成的、場合によっては組織特異的であり得る。別の特定の実施形態では、融合タンパク質のコード配列および他の任意の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位での相同的組換えを促進する領域によって挟まれており、これにより融合タンパク質の染色体内発現をもたらすような核酸分子が使用される。
【０３５０】
核酸の被験体への送達は、直接的（この場合には、被験体は核酸または核酸担持ベクターに直接曝される）または間接的（この場合には、細胞は最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸で形質転換され、次いで被験体に移植される）のいずれであってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法として知られている。
【０３５１】
特定の実施形態では、核酸配列は直接ｉｎ  ｖｉｖｏ投与され、そこで発現されて、コードされている産物を産生する。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかにより、例えばそれらの核酸配列を適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、このベクターを投与して細胞内に存在させること（例えば、欠陥型もしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染による（米国特許第４，９８０，２８６号参照））によるか、または裸のＤＮＡの直接注入によるか、または微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）によるか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤のコーティングによるか、またはリポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル内への封入によるか、または核に侵入することが知られているペプチドと連結してそれらを投与することによるか、または受容体媒介エンドサイトーシスを受ける抗原と連結してそれを投与すること（例えば、Wuら(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,” J. Biol. Chem. 262:4429-4432）（この方法は受容体を特異的に発現する細胞種を標的とするために使用することができる）などによって実施することができる。別の実施形態では、核酸−抗原複合体（この場合、抗原が、エンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含む）を形成させて、核酸のリソソーム分解を回避させることができる。さらに別の実施形態では、核酸は、特異的受容体を標的とすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的な取込みおよび発現に関して標的化することができる（例えば、国際公開第９２／０６１８０号；同第９２／２２６３５号；同第９２／２０３１６号；同第９３／１４１８８号；同第９３／２０２２１号参照）。あるいは、核酸は、細胞内に導入し、相同的組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むこともできる(Kollerら(1989) “Inactivating The Beta 2-Microglobulin Locus In Mouse Embryonic Stem Cells By Homologous Recombination,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935;およびZijlstraら(1989) “Germ-Line Transmission Of A Disrupted Beta 2-Microglobulin Gene Produced By Homologous Recombination In Embryonic Stem Cells,” Nature 342:435-438)。
【０３５２】
特定の実施形態では、本発明の分子（例えば、ダイアボディまたは融合タンパク質）をコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Millerら(1993) “Use Of Retroviral Vectors For Gene Transfer And Expression,” Meth. Enzymol. 217:581-599参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡ中への組込みのために必要な成分を含有する。遺伝子療法に用いる抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を１以上のベクターにクローニングするが、これによりヌクレオチド配列の被験体への送達が容易となる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesenら(1993) “Circumvention Of Chemotherapy-Induced Myelosuppression By Transfer Of The Mdr1 Gene,” Biotherapy 6:291-302に見出すことができ、これには、化学療法に対してより耐性のある造血幹細胞を作出する目的でｍｄｒ  １遺伝子をこの幹細胞へ送達するためのレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献としては、Clowesら(1994) “Long-Term Biological Response Of Injured Rat Carotid Artery Seeded With Smooth Muscle Cells Expressing Retrovirally Introduced Human Genes,” J. Clin. Invest. 93:644-651; Keimら(1994) “Retrovirus-Mediated Gene Transduction Into Canine Peripheral Blood Repopulating Cells,” Blood 83:1467-1473; Salmonsら(1993) “Targeting Of Retroviral Vectors For Gene Therapy,” Human Gene Therapy 4:129-141;およびGrossmanら(1993) “Retroviruses: Delivery Vehicle To The Liver,” Curr. Opin. Genetics and Devel. 3:110-114がある。
【０３５３】
遺伝子療法に使用可能な他のウイルスベクターとしてアデノウイルスがある。アデノウイルスは、遺伝子を呼吸器上皮に送達するための特に注目されるビヒクルである。アデノウイルスは本来、呼吸器上皮に感染して軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスには非分裂細胞に感染し得るという利点がある。Kozarskyら(1993, “Gene Therapy: Adenovirus Vectors,” Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503)は、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を示している。Boutら(1994, “Lung Gene Therapy: In Vivo Adenovirus-Mediated Gene Transfer To Rhesus Monkey Airway Epithelium,” Human Gene Therapy, 5:3-10)は、遺伝子をアカゲザルの呼吸器上皮へ導入するためのアデノウイルスベクターの使用を示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldら(1991) “Adenovirus-Mediated Transfer Of A Recombinant Alpha 1-Antitrypsin Gene To The Lung Epithelium In Vivo,” Science 252:431-434; Rosenfeldら(1992) “In Vivo Transfer Of The Human Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene To The Airway Epithelium,” Cell 68:143-155; Mastrangeliら(1993) “Diversity Of Airway Epithelial Cell Targets For In Vivo Recombinant Adenovirus-Mediated Gene Transfer,” J. Clin. Invest. 91:225-234;国際公開第９４／１２６４９号;およびWangら(1995) “A Packaging Cell Line For Propagation Of Recombinant Adenovirus Vectors Containing Two Lethal Gene-Region Deletions,” Gene Therapy 2:775-783に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターが用いられる。
【０３５４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も遺伝子療法における使用が提案されている（例えば、Walshら(1993) “Gene Therapy For Human Hemoglobinopathies,” Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300および米国特許第５，４３６，１４６号参照）。
【０３５５】
遺伝子療法に対する他のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションまたはウイルス感染などの方法により、組織培養物中の細胞に遺伝子を導入することを含む。通常、導入の方法は、選択マーカーの細胞への導入を含む。次いで細胞を選択下に置き、採取された、導入遺伝子を発現している細胞を単離する。その後、それらの細胞を被験体に送達する。
【０３５６】
この実施形態では、核酸を細胞に導入した後、得られた組換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ投与する。このような導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小細胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含む当技術分野で公知のいずれかの方法によって実施することができる。外来遺伝子を細胞に導入するための多くの技術が当技術分野で公知であり（例えば、Loefflerら(1993) “Gene Transfer Into Primary And Established Mammalian Cell Lines With Lipopolyamine-Coated DNA,” Meth. Enzymol. 217:599-618, Cottenら(1993) “Receptor-Mediated Transport Of DNA Into Eukaryotic Cells,” Meth. Enzymol. 217:618-644参照）、レシピエント細胞の必要な発生的および生理的機能が破壊されない限り、本発明に従って使用することができる。その技術は、細胞への核酸の安定導入を提供し、それにより核酸が細胞により発現可能となり、好ましくは細胞の後代に遺伝して、その細胞後代に発現可能となるものでなければならない。
【０３５７】
得られた組換え細胞は、当技術分野で公知の様々な方法により被験体に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈投与される。意図される細胞の使用量は、所望の効果、患者の状態などによって異なり、当業者が決定することが可能である。
【０３５８】
遺伝子療法の目的で核酸が導入可能な細胞は、いずれの所望の入手可能な細胞種も包含し、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるものが挙げられる。
【０３５９】
好ましい実施形態では、遺伝子療法に使用される細胞は被験体自身のものである。
【０３６０】
組換え細胞を遺伝子療法に使用する実施形態では、抗体または融合タンパク質をコードする核酸配列を細胞に導入して、それらが該細胞またはその後代により発現可能となるようにし、その後、その組換え細胞を治療効果を得るためにｉｎ  ｖｉｖｏ投与する。特定の実施形態では、幹細胞または前駆細胞を用いる。単離可能でありかつｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持可能な幹細胞および／または前駆細胞はいずれも本発明のこの実施形態に従って使用できる可能性がある（例えば、国際公開第９４／０８５９８号；Stempleら(1992) “Isolation Of A Stem Cell For Neurons And Glia From The Mammalian Neural Crest,” Cell 7 1:973-985; Rheinwald (1980) “Serial Cultivation Of Normal Human Epidermal Keratinocytes,” Meth. Cell Bio. 21A:229-254;およびPittelkowら(1986) “New Techniques For The In Vitro Culture Of Human Skin Keratinocytes And Perspectives On Their Use For Grafting Of Patients With Extensive Burns,” Mayo Clinic Proc. 61:771-777参照）。
【０３６１】
特定の実施形態では、遺伝子療法の目的で導入される核酸は、コード領域と機能し得る形で連結された誘導プロモーターを含み、それにより適当な転写インデューサーの存在または不在を制御することによって核酸の発現が制御可能となる。
【０３６２】
５．９．３  キット
本発明は、本発明の分子を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、疾患の治療に有用な１種類以上の他の予防または治療薬を該医薬パックまたはキットに含んでもよい。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。場合によっては、このような容器に、医薬または生物製品の製造、使用または販売を規制する政府当局が指示した形式で、ヒト投与のための製造、使用または販売が行政当局により認可されていることを表す注意書きを添付してもよい。
【０３６３】
本発明は、上記の方法において使用可能なキットを提供する。一実施形態では、キットは１種類以上の本発明の分子を含む。他の実施形態では、キットはさらに、１以上の容器に、癌の治療に有用な１種類以上の他の予防薬または治療薬を含む。別の実施形態では、キットはさらに、癌に関連する１以上の癌抗原と結合する１種類以上の細胞傷害性抗体を含む。特定の実施形態では、他の予防薬または治療薬は化学療法薬である。他の実施形態では、予防薬または治療薬は生物学的治療薬またはホルモン治療薬である。
【０３６４】
５．１０  治療上の有用性の特徴付けおよび検証
本発明の医薬組成物、予防薬または治療薬のいくつかの態様は、ヒトに使用する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて細胞培養系および動物モデル生物、例えば、齧歯類動物モデル系で、所望の治療活性について試験することが好ましい。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを判定するために使用可能なアッセイとしては細胞培養アッセイを含み、該アッセイにおいては、患者の組織サンプルを培養増殖させ、本発明の医薬組成物に曝すかまたはそうでなければ接触させ、該組織サンプルに対する該組成物の効果を観察する。組織サンプルは患者から生検により得ることができる。この試験により、個々の患者に対して治療上最も有効な予防分子または治療分子を同定することができる。様々な特定の実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に関与する細胞種の代表的細胞（例えば、Ｔ細胞）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行い、本発明の医薬組成物がそのような細胞種に対して所望の効果を有するかどうかを判定することができる。
【０３６５】
予防薬および／または治療薬の組合せは、ヒトで使用する前に、適当な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどが挙げられる。当技術分野で周知のいずれの動物系を使用してもよい。本発明の特定の実施形態では、予防薬および／または治療薬の組合せはマウスモデル系で試験する。このようなモデル系は広く使用されており、当業者に周知である。予防薬および／または治療薬は反復投与することができる。手順のいくつかの態様は可変である。このような態様には、予防薬および／または治療薬の投与の時間的管理、およびこのような薬剤を別々に投与するのか混合物として投与するのかが含まれる。
【０３６６】
本発明の方法で使用するのに好ましい動物モデルは、例えば、マウスエフェクター細胞上でヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば、米国特許第５，８７７，３９６号（参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）に記載されているいずれのマウスモデルも本発明において使用可能である。本発明の方法に使用するトランスジェニックマウスとしては、限定されるものではないが、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢとヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス；ヒトＦｃγＲＩＩＢとヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウスが挙げられる。好ましくは、上記の機能アッセイにおいて最高レベルの活性を示した突然変異を、ヒトで使用する前に、動物モデル研究での使用について試験する。上記の方法を用いた動物モデルで使用するために十分な量の抗体は、調製することが可能であり、例えば本明細書に開示され例示される哺乳動物発現系および精製法を用いて作製することができる。
【０３６７】
マウス異種移植モデルを用いて、腫瘍特異的標的に対して作製されたマウス抗体の有効性を、本発明のダイアボディ分子のエピトープ結合ドメインの親和性と特異性、およびダイアボディの免疫応答誘発能に基づいて調べることができる(Wuら(2001) “Mouse Models For Multistep Tumorigenesis,” Trends Cell Biol. 11: S2-9)。マウスエフェクター細胞上でヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスは独特であり、ヒトＦｃ−ＦｃγＲ相互作用の有効性を試験するためのテーラーメイドの動物モデルである。Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｒａｖｅｔｃｈ博士の研究室で作出された（ロックフェラー大学とスローン・ケタリング癌センターとのライセンス契約による）ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡトランスジェニックマウス系統のペアが使用可能であり、例えば、下表１１に挙げられたものがある。
【０３６８】
【表１１】
0005964300.tif 000042
【０３６９】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、当技術分野で公知であり、Crofford L.J. and Wilder R.L.,  “Arthritis and Autoimmunity in Animals”, Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCartyら(編), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを用いて測定することができる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ疾患の実験的動物モデルおよび自然発生的動物モデルもまた、本発明の併用療法の抗炎症活性を評価するために使用可能である。以下は例として示されるいくつかのアッセイであり、これに限定されるものではない。
【０３７０】
当技術分野で公知であり、広く使用されている関節炎または炎症性疾患の主な動物モデルとしては、アジュバント誘発性関節炎ラットモデル、コラーゲン誘発性関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘発性関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルがあり、これらは全て、参照によりその全内容を本明細書に組み入れるCrofford L.J. and Wilder R.L., “Arthritis and Autoimmunity in Animals”,Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, McCartyら(編), Chapter 30 (Lee and Febiger, 1993)に記載されている。
【０３７１】
本発明の併用療法の抗炎症活性は、カラギーナン誘発性関節炎ラットモデルを用いて評価することができる。カラギーナン誘発性関節炎はまた、慢性関節炎または炎症の研究において、ウサギ、イヌおよびブタでも使用されている。定量的な組織形態計測的評価が治療有効性の決定に用いられる。このようなカラギーナン誘発性関節炎モデルを用いる方法は、Hansra P.ら(2000) “Carrageenan-Induced Arthritis In The Rat,” Inflammation, 24(2): 141-155に記載されている。また、当技術分野で公知であり、記載されているようにザイモサン誘発性炎症動物モデルも一般に使用されている。
【０３７２】
本発明の併用療法の抗炎症活性はまた、ラットのカラギーナン誘発性足浮腫の抑制を、Winter C. A.ら(1962) “Carrageenan-Induced Edema In Hind Paw Of The Rat As An Assay For Anti-Inflammatory Drugs” Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111, 544-547に記載されている方法の改変法を用いて測定することにより評価することもできる。このアッセイはほとんどのＮＳＡＩＤの抗炎症活性に対する一次ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングとして用いられており、ヒトでの有効性を予測すると考えられる。試験予防薬または治療薬の抗炎症活性は、ビヒクルを投与した対照群に対する試験群の後足重量増加の阻害パーセントとして表される。
【０３７３】
さらに、炎症性腸疾患の動物モデルを、本発明の併用療法の有効性を評価するために使用することもできる(Kimら(1992) “Experimental Colitis In Animal Models,” Scand. J. Gastroentrol. 27:529-537; Strober (1985) “Animal Models Of Inflammatory Bowel Disease--An Overview,” Dig. Dis. Sci. 30(12 Suppl):3S-10S)。潰瘍性大腸炎およびクローン病は、動物で誘発することができるヒト炎症性腸疾患である。硫酸化された多糖類（限定されるものではないが、アミロペクチン、カラギーン、硫酸アミロペクチンおよび硫酸デキストランを含む）または化学刺激剤（限定されるものではないが、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）および酢酸を含む）を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘発することができる。
【０３７４】
自己免疫障害の動物モデルもまた、本発明の併用療法の有効性を評価するために使用することができる。１型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性紅斑性狼瘡および糸球体腎炎などの自己免疫障害の動物モデルが開発されている(Flandersら(1999) “Prevention Of Type 1 Diabetes From Laboratory To Public Health,” Autoimmunity 29:235-246; Rasmussenら(1999) “Models To Study The Pathogenesis Of Thyroid Autoimmunity,” Biochimie 81:511-515; Foster (1999) “Relevance Of Systemic Lupus Erythematosus Nephritis Animal Models To Human Disease,” Semin. Nephrol. 19:12-24)。
【０３７５】
さらに、当業者に公知のアッセイはいずれも、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に対する、本明細書に開示されている併用療法の予防上および／または治療上の有用性を評価するために使用することができる。
【０３７６】
本発明の予防および／または治療プロトコールの毒性および有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法に、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ50（集団の５０％における治療有効量）を決定する手法により判定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50比として表すことができる。大きな治療指数を示す予防薬および／または治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬および／または治療薬を使用することもできるが、非感染細胞の損傷の可能性を最小限にし、それにより副作用を軽減するために、このような薬剤を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０３７７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用する予防薬および／または治療薬の用量範囲を設定するために使用することができる。このような薬剤の用量は、毒性がほとんどないかまたは全くないＥＤ50を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、用いる投与形および用いる投与経路によってこの範囲内で異なり得る。本発明の方法で使用されるいずれの薬剤に対しても、治療上有効な用量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養で決定したＩＣ50（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて設定することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【０３７８】
本発明に従って使用される療法の抗癌活性はまた、癌研究用の様々な実験動物モデル、例えばＳＣＩＤマウスモデルまたはトランスジェニックマウスまたはヒト異種移植片を有するヌードマウス、当技術分野で公知であり、Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development (1999, Fiebig and Burger編); Contributions to Oncology (1999, Karger); The Nude Mouse in Oncology Research (1991, Boven and Winograd編);およびAnticancer Drug Development Guide (1997 Teicher編)（参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる）に記載されている、ハムスター、ウサギなどの動物モデルを用いることにより決定することもできる。
【０３７９】
本発明の分子の治療有効性を決定するのに好ましい動物モデルは、マウス異種移植モデルである。異種移植腫瘍の供給源として使用可能な腫瘍細胞株としては、限定されるものではないが、ＳＫＢＲ３およびＭＣＦ７細胞を含み、それらは乳腺癌の患者に由来するものであり得る。これらの細胞は、ｅｒｂＢ２受容体とプロラクチン受容体の双方を有する。ＳＫＢＲ３細胞は、ＡＤＣＣおよび異種移植腫瘍モデルとして、当技術分野において通常用いられている。あるいは、ヒト卵巣腺癌に由来するＯＶＣＡＲ３細胞を異種移植腫瘍の供給源として使用することもできる。
【０３８０】
本発明のプロトコールと組成物は、ヒトで使用する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、次いでｉｎ  ｖｉｖｏで、所望の治療活性または予防活性について試験することが好ましい。治療薬および治療法は、腫瘍または悪性細胞系統の細胞を用いてスクリーニングすることができる。当技術分野において標準的な多くのアッセイを、このような生存および／または増殖を評価するために使用することができ、例えば、細胞増殖は3Ｈ−チミジンの取込みを測定することによるか、直接的細胞計数によるか、癌原遺伝子（例えば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）または細胞周期マーカーなどの既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによって評価することができ；細胞生存率はトリパンブルー染色により評価することができ；分化は形態の変化、軟寒天中での増殖および／もしくはコロニー形成の減少、または三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中の管状ネットワーク形成などに基づいて視覚的に評価することができる。
【０３８１】
療法に用いる化合物は、ヒトで試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含む好適な動物モデル系、例えば、上記の動物モデルで試験することができる。該化合物はその後、適当な臨床試験で使用することができる。
【０３８２】
さらに、当業者に公知のアッセイはいずれも、癌、炎症性障害または自己免疫疾患の治療または予防に対する、本明細書に開示されている併用療法の予防上および／または治療上の有用性を評価するために使用することができる。
【実施例】
【０３８３】
６．１  共有結合型二重特異性ダイアボディの設計および特性決定
単一特異性共有結合型ダイアボディおよび二重特異性共有結合型ダイアボディを構築し、それぞれの組換え体の生産、精製および結合特性を評価した。本明細書に記載した組換え発現系によって生産されたアフィニティー精製ダイアボディ分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ分析により単一の二量体種からなることが判明した。さらに、ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ分析により、共有結合型二重特異性ダイアボディは双方の標的抗原に親和性を示し、双方の抗原と同時に結合できることが明らかになった。
【０３８４】
材料および方法
ポリペプチド分子の構築および設計：
図２で図示した４つのポリペプチド構築物を生産するために核酸発現ベクターを設計した。構築物１（配列番号９）は、ＦｃγＲＩＩＢを認識するヒト化２Ｂ６抗体のＶＬドメインと、ＦｃγＲＩＩＩＡを認識するヒト化３Ｇ８抗体のＶＨドメインを含んだ。構築物２（配列番号１１）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメイン、およびＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含んだ。構築物３（配列番号１２）は、Ｈｕ３Ｇ８のＶＬドメインとＨｕ３Ｇ８のＶＨドメインを含んだ。構築物４（配列番号１３）は、Ｈｕ２Ｂ６のＶＬドメインとＨｕ２Ｂ６のＶＨドメインを含んだ。
【０３８５】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築：
ＶＬまたはＶＨドメインのコード配列を、第１のＰＣＲ産物が重複配列を含むように設計したフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて鋳型ＤＮＡから増幅し、これにより、重複ＰＣＲによって所望のポリペプチド構築物のコード配列を作製することが可能であった。
【０３８６】
鋳型ＤＮＡの第１のＰＣＲ増幅：
約３５ｎｇの鋳型ＤＮＡ（例えば、目的抗体の軽鎖および重鎖）、１μｌの１０μＭフォワードプライマーおよびリバースプライマー、２．５μｌの１０×ｐｆｕＵｌｔｒａバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌの２．５単位／μｌのｐｆｕＵｌｔｒａ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）および蒸留水（総量２５μｌとする）を微量遠心管内で静かに混合し、微量遠心機で短時間回転させて反応混合物を遠心管の底に集めた。ＰＣＲ反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で下記の設定：９４℃で２分間；９４℃で各１５秒間、５８℃で３０秒間および７２℃で１分間の２５サイクルを用いて行った。
【０３８７】
Ｈｕ２Ｂ６のＶＬは、Ｈｕ２Ｂ６の軽鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および５６）を用いて増幅した。Ｈｕ２Ｂ６のＶＨは、Ｈｕ２Ｂ６の重鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５７および５８）を用いて増幅した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＬは、Ｈｕ３Ｇ８の軽鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および５９）を用いて増幅した。Ｈｕ３Ｇ８のＶＨは、Ｈｕ３Ｇ８の重鎖から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号６０および６１）を用いて増幅した。
【０３８８】
ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルにて１２０ボルトで３０分間電気泳動した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【０３８９】
重複ＰＣＲ：
第１のＰＣＲ産物を下記のように組み合わせ、鋳型ＤＮＡの最初の増幅に関して記載したものと同じＰＣＲ条件を用いて増幅した。重複ＰＣＲの産物も上記のように精製した。
【０３９０】
構築物１をコードする核酸配列（配列番号９）（図２に図示）を、ＶＬ  Ｈｕ２Ｂ６およびＶＨ  Ｈｕ３Ｇ８のＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および６１）を合わせることで増幅した。構築物２をコードする核酸配列（配列番号１１）（図２に図示）を、ＶＬ  Ｈｕ３Ｇ８およびＶＨ  Ｈｕ２Ｂ６のＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および５８）を合わせることで増幅した。構築物３をコードする核酸配列（配列番号１２）（図２に図示）を、ＶＬ  Ｈｕ３Ｇ８およびＶＨ  Ｈｕ３Ｇ８のＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および６１）を合わせることで増幅した。構築物４をコードする核酸配列（配列番号１３）（図２に図示）を、ＶＬ  Ｈｕ２Ｂ６およびＶＨ  Ｈｕ２Ｂ６のＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および５８）を合わせることで増幅した。
【０３９１】
ＶＬドメインのフォワードプライマー（すなわち、配列番号５５）およびＶＨドメインのリバースプライマー（すなわち、配列番号５８および配列番号６１）は、発現ベクター内への最終産物のクローニングを可能にするユニークな制限部位を含んでいた。精製された重複ＰＣＲ産物を制限エンドヌクレアーゼＮｈｅ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉで消化し、ｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１２に示すように呼称した。
【０３９２】
【表１２】
0005964300.tif 000043
【０３９３】
ポリペプチド／ダイアボディの発現：
リポフェクタミン２０００を製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って用い、構築物１をコードするｐＭＧＸ０６６９を構築物２をコードするｐＭＧＸ０６６７とともに、ＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトした。これら２つのプラスミドの同時トランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に対して免疫特異的な共有結合型二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８ダイアボディ）の発現をもたらすように設計した。構築物３および４をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６６およびｐＭＧＸ０６６８を、それぞれＦｃγＲＩＩＩＡに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）（ｈ３Ｇ８ダイアボディ）およびＦｃγＲＩＩＢに対して免疫特異的な共有結合型単一特異性ダイアボディ（ＣＭＤ）（ｈ２Ｂ６ダイアボディ）の発現のために、ＨＥＫ−２９３細胞に個別にトランスフェクトした。培養３日後に、分泌された産物を細胞馴化培地から精製した。
【０３９４】
精製：
ダイアボディを細胞馴化培地から、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた関連抗原を用いて捕捉した。ローディング前にアフィニティーセファロース樹脂を２０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した。ローディング後、溶出前に、樹脂を平衡化バッファーで洗浄した。洗浄した樹脂から、５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）を用いてダイアボディを溶出させた。溶出したダイアボディをすぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、遠心分離型濃縮器を用いて濃縮した。濃縮したダイアボディをさらに、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【０３９５】
ＳＥＣ：
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、カラムから溶出したダイアボディのおよそのサイズとヘテロ性を分析した。ＳＥＣ分析は、ＰＢＳで平衡化したＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＨＲ  １０／３０カラムで行った。全長ＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）、Ｆａｂフラグメント（約５０ｋＤａ）および一本鎖Ｆｖ（約３０ｋＤａ）の溶出プロファイルとの比較を対照として用いた。
【０３９６】
ＥＬＩＳＡ：
溶出および精製されたダイアボディの結合性を、第５．４．２節に記載したようにＥＬＩＳＡアッセイにより特徴付けた。２μｇ／ｍｌのｓＣＤ３２Ｂ−Ｉｇ溶液５０μｌ／ウェルを、炭酸バッファー中、４℃で一晩、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。このプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、室温で３０分間、ＰＢＳ−Ｔ中０．５％のＢＳＡでブロッキングした。続いて、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤまたはｈ３Ｇ８  ＣＭＤを、ブロッキングバッファーで希釈して２倍希釈系列とし、０．５μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌの範囲のダイアボディ濃度を作製した。その後、このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．２μｇ／ｍｌのｓＣＤ１６Ａ−ビオチン５０μｌ／ウェルを各ウェルに加えた。このプレートを再び室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、１：５０００希釈のＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）５０μｌ／ウェルを検出のために用いた。ＨＲＰ−ストレプトアビジンを４５分間室温でインキュベートした。このプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色させた。１０分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4を加えることによって、ＨＲＰ−ＴＭＢ反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取り、結果をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ  ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
【０３９７】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ：
溶出および精製されたダイアボディの結合の動態パラメーターを、第５．４．３節に記載したように、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  １０００、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）および付属のソフトウェアを用いて分析した。
【０３９８】
ｓＣＤ１６Ａ、ｓＣＤ３２ＢまたはｓＣＤ３２Ａ（陰性対照）を、センサーチップ表面の４つのフローセルのうちの１つ（フローセル２）に、約１０００応答単位（ＲＵ）の各受容体が表面に固定されるように、アミン結合化学（ＮＨＳ／ＥＤＣの混合物を用いたカルボキシメチル基の修飾による）により固定化した。その後、未反応の活性エステルを、１ＭのＥｔ−ＮＨ2を注入して「キャップオフ(capped off)」した。好適な表面が調製されたら、共有結合型二重特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ）または共有結合型単一特異性ダイアボディ（ｈ２Ｂ６  ＣＭＤもしくはｈ３Ｇ８  ＣＭＢ）を、６．２５〜２００ｎＭ溶液を７０ｍＬ／分の流速で１８０秒間注入することにより、前述の表面に流した。比較のためにｈ３Ｇ８  ｓｃＦＶも供試した。
【０３９９】
全データセットを回収したところで、製造者であるＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により提供されるコンピュータアルゴリズムを用いて、得られた結合曲線のグローバルフィッティングを行った。これらのアルゴリズムでは、ＫonおよびＫoffの双方を算出し、これらから見かけの平衡結合定数ＫDを、２つの速度定数の比（すなわち、Ｋoff／Ｋon）として推定する。個々の速度定数をどのようにして導くかについてのさらに詳細な処理法は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウェアハンドブック（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に見出すことができる。
【０４００】
結合期および解離期は別々にフィッティングを行った。解離速度定数は１８０秒の解離期において３２〜３４秒間隔で得、結合期のフィットは１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルによって得、基底部のフィットは二重特異性ダイアボディとｓｃＦｖに関するＲmaxおよびカイ二乗法に基づいて選択し、二価分析物のフィットをＣＭＤ結合に使用した。
【０４０１】
結果
非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤ、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ発現系の精製産物は、それぞれ約５０ｋＤａの推定分子量を有する単一種であることが明らかとなった（図３のそれぞれレーン４、５および６）。還元条件下では、各ＣＭＤ発現系から精製された産物は、単一バンドとして移動したが（レーン１および２）、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤ系から精製された産物は、２つの別個のタンパク質であることが明らかとなった（図３のレーン３）。この発現系から精製され、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって可視化されたポリペプチドは全ておよそ２８ｋＤａの位置に移動した。
【０４０２】
各発現系産物のＳＥＣ分析でも、それらが単一分子種であり（図４Ｂ）、それぞれＩｇＧのＦａｂフラグメント（約５０ｋＤａ）とほぼ同時に溶出されること（図４Ａ）が明らかとなった。これらの結果は、アフィニティー精製した産物がＣＭＤ発現系の場合には均質な共有結合型ホモ二量体であり、またｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの場合には均質な共有結合型へテロ二量体であることを示している。
【０４０３】
ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイを使用して、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６Ａのいずれか一方または双方に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの結合特異性を試験した（図５）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として使用し、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして使用した。ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルが見られたことから、ヘテロ二量体であるｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。ｈ３Ｇ８  ＣＭＤ（ＣＤ３２Ｂに結合しないはずである）での同様の試験では、シグナルは見られなかった。
【０４０４】
ＳＰＲ分析により、ｈ３Ｇ８  ＣＭＤがｓＣＤ１６を免疫特異的に認識するがｓＣＤ３２Ｂは認識しないこと、ｈ２Ｂ６  ＣＭＤがｓＣＤ３２Ｂを免疫特異的に認識するがｓＣＤ１６は認識しないこと、そしてｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤがｓＣＤ１６とｓＣＤ３２Ｂの双方を免疫特異的に認識することが示された（図６Ａ〜Ｂ）。試験したダイアボディはいずれも、対照受容体ｓＣＤ３２Ａには結合しなかった（図６Ｃ）。
【０４０５】
また、ＳＰＲ分析を使用して、ｓＣＤ１６および／またはｓＣＤ３２Ｂに対するＣＭＤおよびｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤの速度定数および平衡定数を推定した。結果をｈ３Ｇ８  ｓｃＦＶについて算出した同じ定数と比較した。図７Ａ〜Ｅは、ＳＰＲ分析の結果をグラフで示したものである。図７に示す結果から算出された、結合速度および解離速度、ならびに平衡定数を表１３に示す。
【０４０６】
【表１３】
0005964300.tif 000044
【０４０７】
ＥＬＩＳＡ分析の結果と合わせると、これらの検討により、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８共有結合型へテロ二量体はＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６の双方に対する特異性を保持していること、および両抗原に同時に結合できることが確認される。この分子を図８に図示する。
【０４０８】
６．２  Ｆｃドメインを含む共有結合型二重特異性ダイアボディの設計と特性決定
ＩｇＧ様分子、すなわち、Ｆｃドメインを含む分子を作出するために、実施例６．１で示したヘテロ二量体ＣＢＤ分子を含むポリペプチドの１つを、Ｆｃドメインをさらに含むように改変した（抗体の重鎖および軽鎖に類似する「重い」鎖および「軽い」鎖を作出する）。従って、このヘテロ二量体二重特異性分子は同種の分子と二量体化するＦｃドメインを含むことで、四価の四量体ＩｇＧ様分子が形成される（すなわち、ヘテロ二量体二重特異性分子のＦｃドメインを介して二量体化することにより形成される）。興味深いことに、このような四量体分子は、例えば細胞馴化培地を標的抗原に対する免疫特異的結合に関して試験するなどの機能アッセイを用いても、組換え発現系の細胞馴化培地では検出されなかった。その代わりに、ＶＬ、ＶＨおよびＦｃドメインからなる単量体を含む二量体分子のみが、前述の機能アッセイで検出された。理論上の四量体構造が安定性の面で問題となるかどうかを試験するために、Ｆｃドメインを含むポリペプチドがヒンジ領域をさらに含むように操作し、一方、「軽い」鎖を含むポリペプチドは、ヒトκ軽鎖の定常ドメインの６個のＣ末端アミノ酸をさらに含むように操作した。このように再操作した「重い」鎖と「軽い」鎖を組換え発現系で同時に発現させた場合に、機能アッセイによって、標的抗原と抗Ｆｃ抗体の双方に免疫特異的に結合できるダイアボディ分子が検出された。
【０４０９】
材料および方法
ポリペプチド分子の構築および設計：
実施例６．１で示した構築物１および２の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物１および２をそれぞれＦｃドメインをさらに含むように操作することにより、構築物５（配列番号１４）および６（配列番号１５）を作出した。構築物１をそのＣ末端に配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）をさらに含むように操作することにより、構築物７（配列番号１６）を作出した。構築物２をヒンジ領域とＦｃドメイン（Ｖ２１５Ａ突然変異を含む）をさらに含むように操作することにより、構築物８（配列番号１８）を作出した。構築物５〜８の模式図を図９に示す。
【０４１０】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築：
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物の精製プロトコルは全て、実施例６．１に記載した通りである。プラスミドｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０６６７を、それぞれ構築物１および２のコード配列用の鋳型として用いた。ＨｕＩｇＧのＦｃドメインのコード配列および／またはヒンジドメインのコード配列はそれぞれ配列番号５または配列番号１および配列番号５であった。ＰＣＲ産物が重複配列を含み、重複ＰＣＲが所望の産物のコード配列を生成させるようなフォワードプライマーとリバースプライマーを用い、鋳型ＤＮＡのコード配列を増幅した。
【０４１１】
構築物１のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６９から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６２）を用いて増幅した。構築物２のコード配列は、ｐＭＧＸ０６６７から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６３）を用いて増幅した。ＨｕＩｇＧヒンジ−Ｆｃは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号６５および配列番号６６）を用いて増幅した。構築物７（配列番号１６）は、ｐＭＧＸ０６６９から、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６７）を用いて増幅した。
【０４１２】
重複ＰＣＲ：
第１ＰＣＲ産物を下記のように組み合わせ、実施例６．１で記載したように増幅および精製した。
【０４１３】
構築物５（配列番号１４）（図９に図示）をコードする核酸配列は、構築物１およびＨｕＩｇＧ  ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６４）を合わせることで増幅した。構築物６（配列番号１５）（図９に図示）をコードする核酸配列は、構築物２およびＨｕＩｇＧ  ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６６）を合わせることで増幅した。構築物８（配列番号１８）（図９に図示）をコードする核酸配列は、構築物２およびＨｕＩｇＧヒンジ−ＦｃのＰＣＲ増幅産物、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマー（それぞれ配列番号５５および配列番号６６）を合わせることで増幅した。
【０４１４】
最終産物を、前述のようにｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１４に示すように呼称した。
【０４１５】
【表１４】
0005964300.tif 000045
【０４１６】
ポリペプチド／ダイアボディの発現：
第６．１節で記載したように、リポフェクタミン２０００を用い、ＨＥＫ−２９３細胞に以下の４種類の異なる同時トランスフェクションを行った：構築物１および６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０６７４、構築物２および５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６７およびｐＭＧＸ０６７６、ならびに構築物７および８をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７７およびｐＭＧＸ０６７８。
【０４１７】
これらのプラスミドの同時トランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に免疫特異的な、ＩｇＧ様構造を有する四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）の発現をもたらすように設計した。構築物６および５をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６７４およびｐＭＧＸ０６７６の付加的同時トランスフェクションも行った。培養３日後、細胞馴化培地を回収した。細胞馴化培地中の分泌産物の量を、精製Ｆｃを標準として用いる抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡにより定量した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化サンプルを以降のアッセイに使用した。
【０４１８】
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記のようなサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。特に示さない場合には、ＣＤ３２Ｂをプレートのコーティングに（すなわち、標的タンパク質として）用い、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６をプローブとして用いた。
【０４１９】
結果
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、構築物１および６を含む組換え発現系（ｐＭＧＸ６６９−ｐＭＧＸ６７４）、構築物２および５を含む組換え発現系（ｐＭＧＸ６６７−ｐＮＧＸ６７６）、ならびに構築物５および６を含む組換え発現系（ｐＭＧＸ６７４−ｐＭＧＸ６７６）由来の正規化サンプルを、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａと同時に結合可能なダイアボディ分子の発現に関して試験した（図１０）。ＥＬＩＳＡデータは、構築物１および６を用いた同時トランスフェクション、または構築物２および５を用いた同時トランスフェクションでは、一方または双方の抗原に結合できる産物は生じないことを示した（図１０のそれぞれ□および▲）。しかしながら、構築物５および６の同時トランスフェクションは、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６の両抗原に結合できる産物の分泌をもたらした。後者の産物は構築物５および６の二量体であり、図１１に図示した構造を有し、各抗原につき１つの結合部位を含んでいる。
【０４２０】
ＩｇＧ様へテロ四量体構造の形成を促すために、６つの付加的アミノ酸のコード配列を構築物１のＣ末端に付加して、構築物７（配列番号１６；図９に図示）を作出した。６つの付加的６アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）は、κ軽鎖のＣ末端に由来し、通常ＩｇＧ分子内で重鎖の上部ヒンジドメインと相互作用する。そして、ヒンジドメインを構築物６に導入して構築物８（配列番号１８および図９）を作出した。構築物８は、さらに、上部ヒンジ領域中にアミノ酸変異Ａ２１５Ｖを含んだ。次に、構築物７および構築物８をコードする発現プラスミド（それぞれｐＭＧＸ６７７およびｐＭＧＸ６７８）を上記のようにＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトして発現させた。
【０４２１】
構築物７および８を含む組換え発現系（ｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７８）から産生されたダイアボディ分子を、ＥＬＩＳＡアッセイでＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａとの結合に関して、構築物１および６を含む発現系（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）、構築物２および８を含む発現系（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８）、ならびに構築物６および７を含む発現系（ｐＭＧＸ６６７＋ｐＭＧＸ６７４）から産生されたダイアボディ分子と比較した（図１２）。
【０４２２】
すでに述べたように、構築物１および６を含む発現系（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７４）によって産生された分子は、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６Ａのいずれにも結合できないことが分かった（図１０および図１２）。これに対して、構築物７および６の同時発現（ｐＭＧＸ０６７７＋ＭＧＸ０６７４）から、または構築物７および８の同時発現（ｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８）から得られる産物は、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６の双方と結合できた（図１２）。構築物７が、これがＣ末端配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むこと以外は構築物１と同様であること、および構築物８が、これがヒンジドメインおよび突然変異Ａ２１５Ｖを含むこと以外は構築物６と同様であることに留意されたい。このデータは、Ｃ−κ軽鎖のＣ末端に由来する６つの余分なアミノ酸（ＦＮＲＧＥＣ；配列番号２３）を、Ｆｃを持たない「軽い」鎖に付加することが、対応する重い鎖がヒンジドメインを含むかどうかにかかわらず（すなわち、図１２のｐＭＧＸ０６７７＋ｐＭＧＸ０６７４とｐＭＧＸ０６７７−ｐＭＧＸ０６７８）、四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の形成を安定化させるのに役立つことを示している。Ｆｃを有する「重い」ポリペプチドにヒンジドメインを付加しても、対応する「軽い」鎖へのＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）Ｃ末端配列の付加なしでは、明らかに同様の安定化を達成することができなかった（すなわち、構築物２および８の同時トランスフェクション（ｐＭＧＸ６６９＋ｐＭＧＸ６７８）の産物による結合が欠如）。四量体ダイアボディ分子の構造を図１３に図示する。
【０４２３】
６．３  四量体ＩｇＧ様ダイアボディの形成におけるドメインの順序および付加的ジスルフィド結合の影響
四量体ＩｇＧ様ダイアボディ分子の「軽い」ポリペプチド鎖と「重い」ポリペプチド鎖の間の付加的な安定化の影響を、ポリペプチド鎖上の選択された残基をシステインで置換することにより調べた。付加的なシステイン残基は、「重い」鎖と「軽い」鎖の間に付加的なジスルフィド結合を付与する。さらに、Ｆｃドメインまたはヒンジ−Ｆｃドメインをポリペプチド鎖のＣ末端からＮ末端へ移すことで、結合活性におけるドメインの順序を調べた。付加的なジスルフィド結合を含む分子の結合活性は、そのような結合を有する先に構築されていたダイアボディ分子と変わらなかったが、Ｆｃもしくはヒンジ−Ｆｃドメインを、ダイアボディを構成する「重い」ポリペプチド鎖のＮ末端へ移すと、その標的抗原の一方もしくは双方に対する二重特異性分子の結合親和性および／または結合力が驚くほど向上した。
【０４２４】
材料および方法
ポリペプチド分子の構築および設計：
実施例６．２で示した構築物５、６および８の改変型を作製するために、核酸発現ベクターを設計した。構築物９（配列番号１９）および構築物１０（配列番号２０）（いずれも図１３に図示）は、それぞれＦｃドメインまたはヒンジ−ＦｃドメインがポリペプチドのＣ末端からＮ末端へ移動していること以外は、構築物８および６と同様であった。さらに、使用したＦｃドメインは全て、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインであった。構築物１１（配列番号２１）（図１４に図示）は、Ｃ末端が配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）をさらに含むように設計されていること以外は、実施例６．１の構築物２と同様であった。構築物１２（配列番号２２）（図１４に図示）は、Ｆｃドメインがさらにヒンジ領域を含むこと以外は、実施例６．２の構築物５と同様であった。また、構築物１１および１２に関しては、２Ｂ６  ＶＬドメインおよび２Ｂ６  ＶＨドメインが、各ドメインのグリシンがシステインに置換するような一アミノ酸の改変（それぞれＧ１０５ＣおよびＧ４４Ｃ）を含んでいた。
【０４２５】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築：
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物精製のプロトコールは全て、実施例６．１および６．２に記載した通りである。
【０４２６】
重複ＰＣＲ：
実施例６．１および６．２に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
【０４２７】
最終産物を、前述のようにｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１５に示すように呼称した。
【０４２８】
【表１５】
0005964300.tif 000046
【０４２９】
ポリペプチド／ダイアボディの発現：
第６．１節で記載したように、リポフェクタアミン２０００を用い、ＨＥＫ−２９３細胞に以下の３種類の異なる同時トランスフェクションを行った：構築物１および９をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０７１９、構築物１および１０をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６６９およびｐＭＧＸ０７１８、ならびに構築物１１および１２をそれぞれコードするｐＭＧＸ０６１７およびｐＭＧＸ０７１７。これらのプラスミドの同時トランスフェクションは、ＦｃγＲＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＩＡの双方に免疫特異的な、ＩｇＧ様構造を有する四価の二重特異性ダイアボディ（ＣＢＤ）の発現をもたらすように設計した。培養３日後、細胞馴化培地を回収した。細胞馴化培地中の分泌産物の量を、精製Ｆｃを標準として用いる抗ＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡにより定量した。その後、サンプル中の産物の濃度を定量値に基づいて正規化し、この正規化サンプルを以降のアッセイに使用した。
【０４３０】
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記のようなサンドイッチＥＬＩＳＡによりアッセイした。特に示さない場合には、ＣＤ３２Ｂをプレートのコーティングに（すなわち、標的タンパク質として）用い、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６をプローブとして用いた。
【０４３１】
ウェスタンブロット：
上記の３種類の同時トランスフェクションからの細胞馴化培地約１５ｍｌを非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。１枚のゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、同じゲルを標準的な転写方法を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に転写した。転写後、メンブレンを１×ＰＢＳ中５％のドライスキムミルクでブロッキングした。その後、メンブレンを、２％ドライスキムミルク  １×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中、１：８０００希釈したＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｈ＋Ｌ抗体１０ｍｌ中で室温にて１時間静かに振盪しながらインキュベートした。１×ＰＢＳ／０．３％Ｔｗｅｅｎ２０で、各５分間２回洗浄した後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の説明書に従って用い、室温で２０分間、メンブレンを露光した。このフィルムをＸ線プロセッサで現像した。
【０４３２】
結果
構築物１および９、構築物１および１０、ならびに構築物１１および１２を含む組換え発現系由来の細胞馴化培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元条件下）分析およびウェスタンブロッティング（抗ＩｇＧをプローブとして使用）によって分析した。ウェスタンブロットにより、構築物１１および１２を含む系または構築物９および１を含む系由来の産物は、主に約１５０ｋＤａの単一分子種（それぞれ図１４のレーン３および２）を形成することが明らかとなった。これらの産物はいずれも、ダイアボディを構成する「軽い」鎖と「重い」鎖の間に内部ジスルフィド結合が導入されている。これに対し、「軽い」鎖と「重い」鎖の間に内部ジスルフィド結合が導入されていない、構築物１０および１から形成された分子は、分子量約７５ｋＤａと約１００ｋＤａ（図１４のレーン１）の少なくとも２つの分子種を形成した。
【０４３３】
ウェスタンブロットの結果にもかかわらず、３つの産物はそれぞれ、ＣＤ３２ＡおよびＣＤ１６の双方と結合できることが分かった（図１５）。驚くべきことに、Ｃ末端ヒンジ−Ｆｃドメインを含む産物（構築物１１および１２から形成される）と比較して、Ｆｃ（またはＦｃ−ヒンジ）ドメインが、Ｆｃ含有ポリペプチド鎖（すなわち「重い」鎖）のアミノ末端にある双方の系に由来する産物（構築物９＋１および構築物１０＋１）は、その標的ペプチド（すなわち、ＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６）の一方または双方に対する親和性および／または結合力の増強を示した。
【０４３４】
６．４  ポリタンパク質前駆体のプロセシングおよび共有結合型二重特異性ダイアボディの発現に対する内部／外部切断部位の効果；ヒトＩｇＧλ鎖およびヒンジドメインの部分を含む二重特異性ダイアボディの設計および特性決定
本明細書に記載されるように、本発明のダイアボディまたはダイアボディ分子の個々のポリペプチド鎖は、単一のポリタンパク質前駆体分子として発現させることができる。実施例６．１〜６．３で記載した組換え系の、ポリタンパク質前駆体から機能的なＣＢＤを適切にプロセシングして発現する能力は、内部切断部位（特にフューリン切断部位）によって隔てられた、ＣＢＤの第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の双方をコードする核酸を遺伝子工学的に作出することによって試験した。機能的ＣＢＤを、ポリタンパク質前駆体分子を含む組換え系から単離した。
【０４３５】
実施例６．３で述べたように、ヒトκ軽鎖由来の６つのＣ末端アミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を付加するとダイアボディ形成が安定化されることが分かったが、これはおそらく、配列番号２３を含むドメインと、Ｆｃドメインまたはヒンジ−Ｆｃドメインを含むドメインとの間で鎖間相互作用が増強されるためであると思われる。このλ鎖／Ｆｃ様相互作用の安定化効果を、どちらのポリペプチド鎖にもＦｃドメインを含まないＣＢＤで試験した。ダイアボディの一方のポリペプチド鎖をそのＣ末端に配列番号２３を含むように操作し、相手のポリペプチド鎖を、ＩｇＧのヒンジドメインに由来するアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含むように操作した。このＣＢＤと構築物１および２を含むＣＢＤ（実施例６．１由来）とを比較したところ、ヒンジドメインおよびλ鎖に由来するドメインを含むＣＢＤは、その標的エピトープの一方または双方に対してやや大きい親和性を示すことが明らかとなった。
【０４３６】
材料および方法
ポリペプチド分子の構築および設計：
ポリタンパク質前駆体：２つのポリタンパク質前駆体分子（双方とも図１７に図示）を作製するために核酸発現ベクターを設計した。構築物１３（配列番号９５）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側から順に、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、および３Ｇ８のＶＨドメインを含んでいた。構築物１３をコードするヌクレオチド配列を配列番号９６に示す。構築物１４（配列番号９７）（図１７）は、ポリペプチド鎖のＮ末端側から順に、３Ｇ８のＶＬドメイン、２．４Ｇ２のＶＨドメイン（ｍＣＤ３２Ｂに結合する）、フューリン切断部位、ＦＭＤ（口蹄疫ウイルスプロテアーゼＣ３）部位、２．４Ｇ２のＶＬドメイン、および３Ｇ８のＶＨドメインを含んでいた。構築物１４をコードするヌクレオチド配列を配列番号９８に示す。
【０４３７】
核酸発現ベクターを、実施例６．１で示した構築物１および２の改変型を作製するために設計した。構築物１５（配列番号９９）（図１７）は、構築物１５のＣ末端がアミノ酸配列ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）を含むこと以外は、実施例６．１で示した構築物１（配列番号９）と同様であった。構築物１５をコードする核酸配列を配列番号１００に示す。構築物１６（配列番号１０１）（図１７）は、構築物１６のＣ末端がアミノ酸配列ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）を含むこと以外は、実施例６．１で示した構築物２と同様であった。構築物１６をコードする核酸配列を配列番号１０２に示す。
【０４３８】
ＰＣＲおよび発現ベクターの構築：
ＰＣＲおよびＰＣＲ産物精製のプロトコールは全て、実施例６．１および６．２に記載した通りである。
【０４３９】
重複ＰＣＲ：
適当なプライマーとともに実施例６．１および実施例６．２に記載の方法を用いて、最終産物を構築し、増幅し、精製した。
【０４４０】
最終産物を、前述のようにｐＣＩｎｅｏ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。構築物をコードするプラスミドは表１６に示すように呼称した。
【０４４１】
【表１６】
0005964300.tif 000047
【０４４２】
ポリペプチド／ダイアボディの発現：
第６．１節で記載したように、リポフェクタミン２０００を用い、ＨＥＫ−２９３細胞に以下の１種類のトランスフェクションと１種類の同時トランスフェクションを行った：単独トランスフェクション：構築物１３をコードするｐＭＧＸ０７５０；同時トランスフェクション：構築物１５および１６をそれぞれコードするｐＭＧＸ０７５２およびｐＭＧＸ０７５３。培養３日後、細胞馴化培地を回収し、分泌された産物を上記のようにアフィニティー精製した。
【０４４３】
ＥＬＩＳＡ：
培地中に分泌されたダイアボディ分子の結合を、上記サンドイッチＥＬＩＳＡによってアッセイした。マウスＣＤ３２Ｂをプレートのコーティングに（すなわち、標的タンパク質として）用い、ＨＲＰコンジュゲートＣＤ１６Ａを、構築物１５および１６の同時トランスフェクション産物のプローブとして用いた。ｍＣＤ３２Ｂを標的タンパク質として用い、ビオチンコンジュゲートＣＤ１６Ａを構築物１３を含む組換え系のプローブとして用いた。
【０４４４】
結果
構築物１３を含む組換え発現系から得られた細胞馴化培地を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｍＣＤ３２Ｂおよび／またはＣＤ１６のいずれか一方または双方に対するＣＢＤの結合特異性を試験した（図１８）。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として使用し、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして使用した。ＥＬＩＳＡにおいて陽性シグナルが見られたことから、前述のポリタンパク質前駆体から産生されるヘテロ二量体であるｈ２．４Ｇ２−ｈ３Ｇ８  ＣＢＤは両抗原に対して特異性を有することが明らかとなった。
【０４４５】
同様に、構築物１５および１６をコードするベクターの同時トランスフェクションによって生じた精製産物をＥＬＩＳＡアッセイで試験し、構築物１および２からなる産物（実施例６．１）と比較した。ＣＤ３２Ｂを標的抗原として使用し、ＣＤ１６Ａを二次プローブとして使用した。構築物１および２からなる産物と同様に、構築物１５および１６の産物は、ＣＤ３２ＢおよびＣＤ１６Ａに同時に結合できることが分かった。実際に、構築物１５および１６の産物は、標的抗原、すなわちＣＤ３２ＢまたはＣＤ１６Ａの一方または双方に対してやや増強された親和性を示した。これは、おそらく構築物１および２からなる産物には存在しない、λ鎖領域ＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）とヒンジ領域ＶＥＰＫＳＣ（配列番号７７）の相互作用によって与えられる鎖間会合の安定性および／または忠実度の増大（野生型のＶＨ−ＶＬドメインの相互作用と比較して）によるものと思われる。
【０４４６】
６．５  複数の親和性を一緒に連結するための二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）の使用
本発明の一態様は、新規な二重親和性再標的化試薬（「ＤＡＲＴ」）、ならびに複数の親和性を一緒に連結する新規な方法に関する。「ＤＡＲＴ」は、単一特異性、二重特異性、三重特異性などであり得、これにより１個、２個、３個またはそれを越える異なるエピトープ（同じ抗原または異なる抗原のものであり得る）に同時に結合することができる。「ＤＡＲＴ」はさらに、一価、二価、三価、四価、五価、六価などであり得、これにより１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれを越える分子に同時に結合することができる。図３５に示すように、ＤＡＲＴのこれら２つの属性を組み合わせて、例えば、四価である二重特異性抗体などを作製することができる。
【０４４７】
１つの進歩は、原型の免疫受容体であるｈｕＣＤ３２Ｂに対する親和性ならびにハプテンであるフルオレセインに対する親和性を有するＤＡＲＴの開発である。「２Ｂ６／４４２０」と呼ばれるこのＤＡＲＴは、ｈｕＣＤ３２Ｂと、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とを同時に連結することができる万能アダプターとして働く。ＣＤ３２Ｂは、活性化シグナル伝達免疫複合体とのクラスター化によって活性化シグナルを抑制する能力を有するＦｃ受容体である。その最初の実装形態において、この技術は、新規なＤＡＲＴ構築物を作製する必要なく、ｈｕＣＤ３２Ｂとのクラスター化のための複数種の生物学的標的の迅速なスクリーニングを可能とする。２Ｂ６／４４２０は、細胞表面受容体に対するフルオレセイン化抗体と簡単に混合することができ、これにより、該受容体に対して親和性を有するＤＡＲＴの作用を模倣することができる（図２０）。さらに、この試薬は、容易に発現または産生されない親和性試薬の効率的な連結を可能とし、これにより、技術的な限界を克服することができる。２Ｂ６／４４２０含有ＤＡＲＴは、研究ツールとして、また、臨床候補としても有用であることが明らかである。ＨＥＫ２９３細胞から産生された２Ｂ６／４４２０は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ＣＤ３２Ｂおよびフルオレセインに同時に結合することができる。さらに、２Ｂ６／４４２０は、ＣＤ７９との同時連結によってＣＤ３２ＢをＢＣＲ複合体に動員することにより、細胞増殖を阻害することもできる。ＤＡＲＴの２Ｂ６アームは、異なる抗体配列で、または他の関連特異性を有する結合配列で置換することができる。
【０４４８】
材料および方法：
プラスミド構築物：
２Ｂ６／４４２０は、ヒト化２Ｂ６  ＭＡｂ（ｈｕ２Ｂ６、ＭＧＡ３２１）の配列と、キメラマウスＦｖ／ヒトＦｃ型の抗フルオレセインＭＡｂである４４２０の配列とに由来する。完全に構築されたＤＡＲＴは２つのポリペプチドからなり、その結果、２つのＦｖ領域の共有結合が起こる。第１のポリペプチドは、分泌シグナル配列と、それに続くアミノ酸残基ＧＧＧＳＧＧＧＧからなるリンカーにより隔てられた４４２０ＶＨとの融合タンパク質として産生されるｈｕ２Ｂ６ＶＬからなる。κ軽鎖のＣ末端に由来する配列ＦＮＲＧＥＣを、このポリペプチドのＣ末端に付加する。他のポリペプチドは、シグナル配列−４４２０ＶＬ−ＧＧＧＳＧＧＧＧ−ｈｕ２Ｂ６ＶＨからなり、ヒトＩｇＧ１  ＦｄフラグメントのＣ末端に由来する配列ＶＥＰＫＳＣをＣ末端に付加する。これら２鎖中のシステインがジスルフィド結合を形成し、その２つのポリペプチドが共有結合で連結される（図２０）。記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を既存のプラスミドからＰＣＲ増幅させ、重複ＰＣＲにより組み合わせ、ｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｈｅ  Ｉ部位とＥｃｏＲ  Ｉ部位の間にクローニングした。最後に、上記の方法と同様の方法を用いてすでに構築したｈｕＣＤ３２ＢとｈｕＣＤ１６に対する親和性を有するＤＡＲＴ（２Ｂ６／３Ｇ８）を対照として用いた。
【０４４９】
抗体：
抗ヒトＣＤ７９ｂマウスモノクローナル抗体であるＣＢ３．１およびＣＢ３．２（ハイブリドーマ）は、アラバマ州バーミンガム、アラバマ大学バーミンガム校のＣｏｏｐｅｒ  ＭＤ博士から入手した。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を製造者（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）の説明書に従って用い、ＣＢ３．１およびＣＢ３．２を標識した。Ｆｃフラグメント特異的なヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から入手した。抗ｈｕＣＤ３２ＢマウスＭＡｂである３Ｈ７は、自社で作製および精製した。ヤギ抗２Ｂ６Ｆｖは、ヤギにｈｕ２Ｂ６完全抗体を感作させ、ｈｕ２Ｂ６のＦｖ領域に対してアフィニティー精製することにより作製した。ｈｕＩｇＧ、ＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧおよびＨＲＰ−抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手した。ＨＲＰ−抗ヤギは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。
【０４５０】
ＤＡＲＴの発現：
リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って用い、各鎖をコードするプラスミドを２９３Ｈ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に同時トランスフェクトした。３日間隔で３〜４回、分泌されたタンパク質を回収し、固定化された可溶形態のＣＤ３２Ｂに対する液体クロマトグラフィーにより精製した。
【０４５１】
ＥＬＩＳＡ：
ＦＩＴＣ標識Ｓタンパク質（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ヒトＩｇＧまたはＦＩＴＣ−ｈｕＩｇＧでコーティングしたＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）上に、２Ｂ６／４４２０ＤＡＲＴまたは２Ｂ６／３Ｇ８ＤＡＲＴを捕捉した。検出は、可溶性ＣＤ３２Ｂエクトドメイン、次いで３Ｈ７（ＣＤ３２Ｂに特異的なマウスモノクローナル抗体）、最後に抗マウスＨＲＰと結合させることによって行った。あるいは、アフィニティー精製したヤギ抗２Ｂ６  Ｆｖポリクローナル抗血清、次いで抗ヤギ抗体−ＨＲＰと結合させることにより検出を行った。ＨＲＰ活性は、比色分析用ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ）を用いて検出し、ＶｅｒｓａＭａｘ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーで読み取った。
【０４５２】
Ｂ細胞の精製および増殖アッセイ：
健康なドナー由来の血液を用いるフィコール／パークプラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）勾配法により、末梢血単核細胞を分離した。Ｄｙｎａｌ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州）を製造者の説明書に従って用い、Ｂリンパ球を単離した。単離されたＢ細胞（ＣＤ２０+）の純度は、ＦＡＣＳ分析により推定したところ９０％を超えた。増殖アッセイでは、精製されたＢ細胞を、平底９６ウェルマイクロタイタープレートの完全ＲＰＭＩ  １６４０培地中に、最終容量２００μｌ中、１×１０5細胞／ウェルの細胞密度で播種し、５％のＣＯ2中３７℃の抗体およびダイアボディの存在下または不在下で４８時間インキュベートした。次いで、１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウェルズリー）を添加し、回収前にさらに１６〜１８時間インキュベーションを継続した。［3Ｈ］チミジンの取込みは、液体シンチレーションカウント法により測定した。
【０４５３】
結果
２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが活性を持ち、かつ特異的であることを証明するために、２つのＥＬＩＳＡ試験を実施した。まず、２Ｂ６／４４２０または２Ｂ６／３Ｇ８（陰性対照として）を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたフルオレセインコンジュゲートタンパク質（Ｓタンパク質）に結合させた。次に、ＤＡＲＴの２Ｂ６アームを可溶性ＣＤ３２ＢＮに結合させた。結合は、２Ｂ６のエピトープと重複しないエピトープを有するＣＤ３２Ｂに対する別の抗体と、その後のＨＲＰコンジュゲート二次抗体により検出した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴはフルオレセインとＣＤ３２Ｂに同時に結合することができるが、２Ｂ６／３Ｇ８にはその能力がない（図２１のパネルＡ）。可溶性ＣＤ３２Ｂでコーティングしたプレート上に該ＤＡＲＴが捕捉され、ｈｕ２Ｂ６  Ｆｖに特異的な抗体により結合を検出すると、両ＤＡＲＴとも良好な結合を示す。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴは、ヒトＩｇＧにコンジュゲートさせたフルオレセインと結合できること（これは本試薬の最初の実装形態に関するものであると考えられる）を証明するために、フルオレセインで標識しない、または標識したＨｕＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに結合させ、これを２Ｂ６／４４２０の捕捉に用いた。この場合にも、２Ｂ６／３Ｇ８を陰性対照として用いた。結合は、Ｈｕ２Ｂ６  Ｆｖに特異的な抗体を用いて検出した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴは、ＦＩＴＣ−ＨｕＩｇＧには明らかに結合するが、非標識ＨｕＩｇＧには結合せず、このことから、このＤＡＲＴは抗体にコンジュゲートされたフルオレセインと結合することができること、および抗体単独とは有意な結合が見られないことを示す。予測されたように、これらのいずれの場合にも、２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴによる結合は検出されなかった。
【０４５４】
２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが、細胞系アッセイの場合のシグナル伝達に対して効果を持ち得る二重親和性試薬として機能し得ることを証明するための試験を行った。ＣＤ３２ＢとＢＣＲの共凝集はＢ細胞の活性化を阻害することが示されている。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが、ＣＤ３２Ｂと、フルオレセインで標識されたαＣＤ７９ｂ抗体でコーティングされたＢＣＲとを同時結合させて細胞増殖の阻害を誘発する能力を調べた。Ｂ細胞はヒト血液から陰性選択し、漸増濃度のＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ７９ｂ抗体であるクローンＣＢ３．１およびＣＢ３．２で処理し、ＢＣＲを架橋する二次試薬としてのＦｃ特異的ＧＡＭのＦ（ａｂ’）2フラグメントを、固定濃度（５μｇ／ｍＬ）の２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴまたは、フルオレセインを標的としないことから対照として用いられる分子である同等量の２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴとともに添加することにより活性化させた。［3Ｈ］チミジンの取込みとして測定される細胞増殖は、該ＤＡＲＴの不在下または対照２Ｂ６／３Ｇ８  ＤＡＲＴの存在下で、モノクローナル抗ＣＤ７９ｂ抗体−ＦＩＴＣアクチベーターの濃度上昇とともに増大した。２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴの存在は、抗ヒトＣＤ７９ｂ−ＦＩＴＣの全ての濃度において、Ｂ細胞増殖の著しい低下をもたらした（図２２のパネルＡおよびＢ、ならびに図２３のパネルＡ）。
【０４５５】
非標識ＣＢ３．２でコーティングし、同じ試験条件を用いて活性化させたＢ細胞を２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴで処理しても増殖の阻害は見られなかったことから、その標的特異性が判明する（図２３、パネルＢ）。これらのデータは、２Ｂ６／４４２０  ＤＡＲＴが、ＣＤ３２ＢとＢＣＲとを架橋して抗原−受容体により誘導される細胞活性化を遮断し得る阻害シグナルを送達できることを示す。
【０４５６】
６．６  ＣＤ３２Ｂを発現するＢ細胞悪性腫瘍に対するＤＡＲＴ免疫療法薬
現行では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、リツキサン（登録商標）抗ＣＤ２０抗体を用いて治療されている。しかし、一部のＢ細胞悪性腫瘍はＣＤ２０を発現しないか、またはリツキサンに対して耐性となっている。本発明のＤＡＲＴは、リツキサン（登録商標）抗ＣＤ２０抗体に関連する問題を克服し得る代替免疫療法薬を提供する。
【０４５７】
ＭＧＤ２６１は、ｈＣＤ３２Ｂに（ｈ２Ｂ６抗体を介して）ならびにｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ１６Ｂに（ｈ３Ｇ８抗体を介して）結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
【０４５８】
ＭＧＤ２６１の有効性（Ｂ細胞枯渇）および安全性を、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、およびｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて試験した。この反復投与試験では、マウスに６回の静注（毎週２回、３週間）を行った。Ｂ細胞枯渇はＦＡＣＳによりモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。
【０４５９】
データは、ＭＧＤ２６１に、二重トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘発することなくＢ細胞を枯渇させる能力があることを示す。
【０４６０】
データ：
０、３、７、１０、１４および１７日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーのｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスおよびｍＣＤ３２−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ｂ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＭＧＤ２６１（１０、３、１もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ）または無関連抗体（１０ｍｇ／ｋｇのｈＥ１６）を静注した。１９日前（血液採取前）、４、１１、１８、２５および３２日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。週３回、動物の健康および活動を記録した。
【０４６１】
【表１７】
0005964300.tif 000048
【０４６２】
ＦＡＣＳ分析法：
ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８投与の１８日前、ならびに処置の４、１１、１８、２５および３２日後に全血液サンプルを採取した。ＦＡＣＳに基づくアッセイにより血液サンプルを分析し、Ｂ細胞総数に対するｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８の効果を決定した。Ｂｅｃｈｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから入手したＦｌｏｗＣｏｕｎｔビーズを用いることにより、Ｂ細胞総数、Ｔ細胞総数およびＰＭＮ総数には洗浄なしのプロトコールを用いた。分析で用いた抗体パネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、および全白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
【０４６３】
結果
ｈＥ１６またはＭＧＤ２６１（どの濃度でも）で処置したマウスは、試験期間中のどの時点でも不快感の徴候を見せなかった。
【０４６４】
ｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ３２Ｂの二重トランスジェニックマウスでは、Ｂ細胞枯渇が見られた。ダイアボディｈ２Ｂ６−３Ｇ８は、ｈＣＤ１６Ａ発現エフェクター細胞およびｈＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞に結合し、Ｂ細胞の死滅にはこれらの結合が必要であった。単一トランスジェニックマウスではＢ細胞枯渇は見られなかった（図２４）。試験中、Ｔ細胞レベルおよびＰＭＮレベルに有意な変化は見られなかった。
【０４６５】
本発明の代替的な免疫療法薬に対するさらなる実証として、「２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ」と呼ばれるＭＧＤ２６１のサロゲートを構築した。２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢは、ｍＣＤ３２Ｂに（２．４Ｇ２抗体を介して）、ならびにｈＣＤ１６ＡおよびｈＣＤ１６Ｂに（ｈ３Ｇ８抗体を介して）結合する二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）分子である。
【０４６６】
２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢの有効性（Ｂ細胞枯渇）および安全性を、ｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋マウス、およびｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスにおいて試験した。この反復投与試験では、マウスに９回の腹腔内注射（毎週３回、３週間）を行った。Ｂ細胞枯渇はＦＡＣＳによりモニタリングした。安全性はケージ越しの観察によりモニタリングした。
【０４６７】
データは、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢに、ｈＣＤ１６トランスジェニックマウスにおいて、顕著な副作用を誘発することなくＢ細胞を枯渇させる能力があることを示す。
【０４６８】
データ：
０、２、４、７、９、１１、１４、１６および１８日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーのｍＣＤ１６−／−マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ｂ＋マウス、およびｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスに、２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢ（７５μｇ／匹）またはＰＢＳを腹腔内注射した。１０日前（血液採取前）、４、１１および１８日目にＦＡＣＳ分析用に血液を採取した。毎週３回、動物の健康および活動を記録した。
【０４６９】
【表１８】
0005964300.tif 000049
【０４７０】
ＦＡＣＳ分析法：
２．４Ｇ２−３Ｇ８投与の１０日前、ならびに処置開始の４、１１および１８日後に、全血液サンプルを採取した。ＦＡＣＳに基づくアッセイにより血液サンプルを分析し、Ｂ細胞総数に対する２．４Ｇ２−３Ｇ８の効果を決定した。ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍから入手したＴｒｕＣＯＵＮＴチューブを用いることにより、Ｂ細胞総数、Ｔ細胞総数およびＰＭＮ総数には洗浄なしのプロトコールを用いた。分析で用いた抗体パネルは、ＰＭＮが１Ａ８−ＦＩＴＣ、Ｔ細胞がＣＤ３−ＰＥ、Ｂ細胞がＣＤ１９−ＡＰＣ、および全白血球がＣＤ４５−ＰｅｒＣＰであった。
【０４７１】
結果
ｈＥ１６または２．４Ｇ２−３Ｇ８  ＤＢで処置したマウスは、実験期間中のどの時点でも不快感の徴候を見せなかった。
【０４７２】
ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋マウスまたはｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ１６Ｂ＋マウスではＢ細胞枯渇が見られたが、ｍＣＤ１６−／−マウスでは見られなかった。これらのデータは、Ｂ細胞の死滅にはｈＣＤ１６Ａを担持するエフェクター細胞が必要であったことを示す（図２５）。試験中、Ｔ細胞レベルおよびＰＭＮレベルに有意な変化は見られなかった。
【０４７３】
静脈内（ＩＶ）モデル：
ヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉの静脈内（ＩＶ）モデルを用いて、ＭＧＤ２６１の抗腫瘍活性を試験した。Ｒａｊｉは、ｈＣＤ３２Ｂを発現するヒトバーキットリンパ腫細胞株である。ｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−マウスに静注すると、腫瘍細胞が脊椎に局在し、後肢麻痺が生じる。
【０４７４】
データは、ＭＧＤ２６１に、ｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＲａｊｉ腫瘍細胞増殖を遮断する能力があることを示す。データは、ＭＧＤ２６１がヒトにおけるＣＤ３２Ｂ発現Ｂ細胞悪性腫瘍の治療に使用可能であることを示す。
【０４７５】
データ：
０日目に、ＭａｒｃｏＧｅｎｉｃｓ繁殖コロニーの１２〜２０週齢のｍＣＤ１６−／−マウス、ｈＣＤ１６Ａ＋マウス、ＲＡＧ１−／−Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５×１０6個のＲａｊｉ細胞を静注した。６、９、１３、１６、２０、２３、２７および３０日目に、マウスにまた２５０、２５または２．５μｇのＭＧＤ２６１またはＰＢＳ（陰性対照）の腹腔内（ＩＰ）処置も施した。その後、マウスを毎日観察し、毎週２回体重を記録した。後肢麻痺を発症するマウスは安楽死させた。
【０４７６】
結果：
ＰＢＳで処置したマウスは、２５日目〜５０日目の間に死に至った。ＭＧＤ２６１で処置したマウスは、少なくとも第９０日目まで生存した（図２６）。この生存率の増加は統計学的に有意であった。ログランク検定を用いる生存曲線の比較により、９６．４６のχ2（ｄｆ＝９；Ｐ値＜０．０００１）が得られた。
【０４７７】
６．７  原核生物におけるＤＡＲＴの発現
非哺乳動物宿主においてもＤＡＲＴを作製できることを証明するために試験を行った。よって、大腸菌(Escherichia coli)をＤＡＲＴ発現プラスミドで形質転換し、ＤＡＲＴの現をモニタリングした。
【０４７８】
材料および方法：
プラスミドの構築：
３Ｇ８は、ＨｕＣＤ１６に対するヒト化モノクローナル抗体である。本明細書に記載されるＤＡＲＴは、その各々がＶＬの後にスペーサーを有し、次いで、ＶＨの後に対向鎖に対してジスルフィド結合を形成にするのに良好な関係でＣｙｓを有する、２本の共有結合鎖からなる。３Ｇ８ＶＬ−ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙ（配列番号１０）−３Ｇ８ＶＨ−ＬｅｕＧｌｙＧｌｙＣｙｓをコードするＤＡＲＴ配列を既存の真核細胞発現構築物からＰＣＲ増幅し、Ｎｃｏ  ＩおよびＥｃｏＲ  Ｉにより消化した。標的ベクターは、大腸菌内における分泌のためのｐｅｌＢリーダー配列を含むｐＥＴ２５ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）であった。３Ｇ８／３Ｇ８  ＤＡＲＴ配列の挿入前に、ベクターを次のように改変した。まず、たとえ低レベルであっても、その制御下にある可溶性のタンパク質発現に有利なように、Ｔ７プロモーターを、活性の低いｌａｃプロモーターに置き換えた。さらに、ｐｅｌＢリーダーの開始部に存在するＭｅｔでの開始に有利なように、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の開始部に存在する２個の内部Ｍｅｔコドンを除去するために２つの点突然変異を導入した。この構築物により作製されるＤＡＲＴは、同一の特異性、すなわち、ＨｕＣＤ１６を有する２本のＶ領域アームからなる。
【０４７９】
発現：
ＢＬ２１ＤＥ３細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）をｐＥＴ２５ｂ（＋）Ｔ７−ｌａｃ＋３Ｇ８／３Ｇ８プラスミドで形質転換し、ａｍｐ耐性コロニーを用いてブロス培養へ播種を行った。培養物がＯＤ６００  ０．５単位に達したところで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して発現を誘導した。３０℃で２時間培養物を増殖させ、無細胞培地を回収した。
【０４８０】
精製：
３Ｇ８／３Ｇ８  ＤＡＲＴを、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーを用いる２段階法で精製した。アフィニティークロマトグラフィーを用いて、細胞馴化培地からＤＡＲＴを捕捉した。特に、ＣＤ１６ＡをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に結合させた。ローディング前に、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でＣＤ１６Ａ−セファロース樹脂を平衡化した。ローディングが完了したところで、この樹脂を平衡化バッファーで洗浄した後、結合したＤＡＲＴを５０ｍＭグリシン（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出したＤＡＲＴは、すぐに１Ｍトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和化し、遠心分離型濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０、１０ｋ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ、ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）を用いて濃縮した。濃縮したＤＡＲＴをさらに、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【０４８１】
結果
大腸菌を培養した１．７リットルの細胞馴化培地をＣＤ１６Ａセファロースカラムで処理した。ＤＡＲＴの収量は０．１２ｍｇであった。精製したＤＡＲＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣにより分析したところ、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞）により発現された対照ＤＡＲＴとの同等性が示された（図２７）。
【０４８２】
大腸菌により発現されたｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴの結合ＥＬＩＳＡ：
大腸菌におけるｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴの発現を、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ抗ｈ３Ｇ８  Ｆｖ特異的抗体２Ｃ１１を、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、炭酸バッファー中、４℃にて一晩コーティングした。このプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いで、室温で３０分間、ＰＢＳ−Ｔ中０．５％のＢＳＡでブロッキングした後に供試ＤＡＲＴを添加した。ブロッキング中に大腸菌により発現されたｈ３Ｇ８−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴ、ｈ２Ｂ６−ｈ３Ｇ８  ＤＡＲＴ、およびｈ２Ｂ６−ｈ２Ｂ６  ＤＡＲＴ（陰性対照）を、ＰＢＳＴ／ＢＳＡで１μｇ／ｍｌおよび０．３μｇ／ｍｌに希釈した。５０μｌ／ウェルの希釈ＤＡＲＴを各ウェルに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの０．１μｇ／ｍｌビオチニル化ｓＣＤ１６−Ｆｃ融合体をプレートに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の１：５０００希釈液を検出に用い、室温で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした（図２８）。
【０４８３】
６．８  ＤＡＲＴにより誘導されるヒトＢ細胞死
ヒトＰＢＭＣを、ＣＤ１６−ＣＤ３２Ｂ−ｈｕ３Ｇ８−ｈｕ２ｂ６（上記）、ｃｈ２Ｂ６−ａｇｌｙｃ−非グリコシル化キメラ２Ｂ６抗体（参照により本明細書に組み入れるＵＳ２００５／０２６０２１３として公開された同時係属米国特許出願第１１／１０８，１３５号に記載）、およびＣＤ１６−ＣＤ７９とともに一晩インキュベートした。ＣＤ１６−ＣＤ７９のＤＮＡ配列およびコードされているタンパク質配列は以下の通りである。
【０４８４】
Ｈ３Ｇ８ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２６）：
【化３】
0005964300.tif 000050
【０４８５】
アミノ酸配列（配列番号２２７）：
【化４】
0005964300.tif 000051
【０４８６】
ＣＢ３．１ＶＬ−ｈ３Ｇ８ＶＨ
ヌクレオチド配列（配列番号２２８）：
【化５】
0005964300.tif 000052
【０４８７】
アミノ酸配列（配列番号２２９）：
【化６】
0005964300.tif 000053
【０４８８】
アポトーシスをＦＡＣＳ分析により、ゲート設定されないＦＳＣ／ＳＳＣ総細胞集団に対するＢ細胞（ＣＤ２０＋細胞）のＰＩ＋アネキシンＶ＋集団のパーセンテージとしてアッセイした（図２９）。
【０４８９】
６．９  ８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
８Ｂ５ＶＬは、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６３０Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｌｃを用いることにより増幅した。ＣＢ３．１ＶＨは、プライマーとしてｌｇｈ６２８Ｆおよびｌｇｈ６２９Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｈｃを用いることにより増幅した。リンカー配列は、プライマーｌｇｈ６３０Ｒおよびｌｇｈ６２８Ｆ内に組み込んだ。ｃ末端リンカーおよび停止コドンをｌｇｈ６２９Ｒプライマーに組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６３０Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９０】
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣ
ＣＢ３．１ＶＬは、プライマーとしてＨ９と、ＦＲ４において８Ｂ５ＶＬと同じ配列を共有するｌｇｈ６３０Ｒを、鋳型としてｃｈＣＢ３．１Ｌｃを用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＨは、プライマーとしてｌｇｈ６３１Ｆおよびｌｇｈ６４０Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｈｃを用いることにより増幅した。リンカー配列をプライマーｌｇｈ６３０Ｒおよびｌｇｈ６３１Ｆに組み込んだ。ｃ末端リンカーおよび停止コドンをｌｇｈ６４０Ｒプライマーに組み込んだ。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６４０Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９１】
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ
抗Ｆｌａｇタグは、重複ＰＣＲによりシグナル配列と８Ｂ５ＶＬとの間に挿入した。シグナル配列およびＦｌａｇタグは、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６４７Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｌｃを用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣは、プライマーとしてｌｇｈ６４７Ｆおよびｌｇｈ６２９Ｒを、鋳型として８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを用いることにより再増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６２９Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９２】
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣ構築物内に異なるＣ末端リンカーを作製するため、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６４６Ｒを用いることにより該構築物を再増幅した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４６Ｒプライマーに組み込んだ。次いで、このＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９３】
ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ
同じ戦略を用いて、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣを作出した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマーに組み込み、ＣＢ３．１ＶＬ−８Ｂ５ＶＨ−ＦＮＲＧＥＣを鋳型として用いた。次いで、このＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９４】
抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
また同じ戦略を用いて、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣも作出した。Ｃ末端ＬＧＧＣリンカーをｌｇｈ６４８Ｒプライマーに組み込み、抗Ｆｌａｇタグ−８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＶＥＰＫＳＣを鋳型として用いた。次いで、このＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０４９５】
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣヌクレオチド配列（配列番号２３０）：
【化７】
0005964300.tif 000054
【０４９６】
８Ｂ５−ＣＢ３．１−ＶＥＰＫＳＣアミノ酸配列（配列番号２３１）：
【化８】
0005964300.tif 000055
【０４９７】
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣヌクレオチド配列（配列番号２３２）：
【化９】
0005964300.tif 000056
【０４９８】
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＦＮＲＧＥＣアミノ酸配列（配列番号２３３）：
【化１０】
0005964300.tif 000057
【０４９９】
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣ
８Ｂ５ＶＬは、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ６９４Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｌｃを用いることにより増幅した。８Ｂ５ＶＨは、プライマーとしてｌｇｈ６９５Ｆおよびｌｇｈ６９６Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｈｃを用いることにより増幅した。リンカー配列をプライマーｌｇｈ６９４Ｒおよびｌｇｈ６９５Ｆに組み込んだ。ＨｕＩｇＧ１Ｆｃは、プライマーとしてｌｇｈ３５５Ｆおよびｌｇｈ３６６Ｒを、鋳型としてｃｈ８Ｂ５Ｈｃを用いることにより増幅した。これらのＰＣＲ産物をゲル精製し、等モル比で混合した後、プライマーとしてＨ９およびｌｇｈ３６６Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ｐＣＩｎｅｏベクターにクローニングした。
【０５００】
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３４）：
【化１１】
0005964300.tif 000058
【０５０１】
８Ｂ５ＶＬ−ＣＢ３．１ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３５）：
【化１２】
0005964300.tif 000059
【０５０２】
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣヌクレオチド配列（配列番号２３６）：
【化１３】
0005964300.tif 000060
【０５０３】
ＣＢ３．１−８Ｂ５−ＬＧＧＣアミノ酸配列（配列番号２３７）：
【化１４】
0005964300.tif 000061
【０５０４】
プライマー：
【化１５】
0005964300.tif 000062
【０５０５】
発現：
構築物５および６、または６および７、または８および９、または９および１０によりコードされる発現プラスミド（図３０）を、リポフェクタアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＨＥＫ−２９３細胞内に同時トランスフェクトし、抗ｆｌａｇタグを伴うまたは伴わない８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを発現させた。３日毎に３回、細胞馴化培地を回収した。次いで、この細胞馴化培地を、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて精製した。
【０５０６】
ＥＬＩＳＡ：
ＥＬＩＳＡは次のように実施した。５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ  ＣＤ３２Ｂ−Ｆｃを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、炭酸バッファー中、４℃にて一晩コーティングした。このプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いで、室温で３０分間、ＰＢＳ−Ｔ中０．５％のＢＳＡでブロッキングした後に供試単鎖Ｆｃ融合タンパク質を添加した。ブロッキングの際、８Ｂ５−ＣＢ３．１  ＤＡＲＴを希釈して、２μｇ／ｍｌで始まる２倍希釈系列とした。２５μｌ／ウェルの５０ｎｇ／ｍｌ  ｃｈ８Ｂ５と混合した２５μｌ／ウェルの希釈ＤＡＲＴを、希釈プレートからＥＬＩＳＡプレートに移した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの１：１０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）2ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加した。このプレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。このプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした（図３１）。
【０５０７】
６．１０  Ｉｇ様四価ＤＡＲＴの設計および特性決定
４本のポリペプチド鎖を用いて、四価の抗原結合部位を有するＩｇ様ＤＡＲＴ種を作出した（図３２、図３３）。このＩｇ様ＤＡＲＴ種は、そのドメインが同じエピトープと結合するように（従って、４つの同一の抗原分子に結合することができる四価の一エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）、または異なるエピトープもしくは抗原に結合するように設計することができることから、独特な特性を有する。例えば、そのドメインを、同じ抗原の２個のエピトープと結合するように（従って、四価の単一抗原特異的な二エピトープ特異的Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）、または異なる抗原分子のエピトープと結合するように（従って、第１の抗原に特異的な結合部位の対と、第２の抗原に特異的な第２の結合部位の対とを有する四価Ｉｇ様ＤＡＲＴを形成するように）設計することができる。このような属性の組合せを有するハイブリッド分子を容易に作出することができる。
【０５０８】
このようなＩｇ様ＤＡＲＴ種の特性を例示するため、ＣＤ３２に特異的な結合部位の対と、ＣＤ１６Ａに特異的な第２の結合部位の対とを有する、例示的な四価Ｉｇ様ＤＡＲＴ種を作出した。このＩｇ様ＤＡＲＴ種は、以下の４本のポリペプチド鎖を用いて作出した。
【０５０９】
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκヌクレオチド配列
（配列番号２４７）：
【化１６】
0005964300.tif 000063
【０５１０】
２．４Ｇ２−３Ｇ８−ｈκによりコードされるアミノ酸配列
（配列番号２４８）：
【化１７】
0005964300.tif 000064
【０５１１】
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１ヌクレオチド配列
（配列番号２４９）：
【化１８】
0005964300.tif 000065
【０５１２】
３Ｇ８−２．４Ｇ２−ｈＧ１によりコードされるアミノ酸配列
（配列番号２５０）：
【化１９】
0005964300.tif 000066
【０５１３】
上記配列を有するＩｇ様ＤＡＲＴ分子の調製物を異なるプラスミド単離物から得、「Ｉｇ  ＤＡＲＴ  １」および「Ｉｇ  ＤＡＲＴ  ２」と呼称した。ＥＬＩＳＡにおいてこれらのＩｇ様ＤＡＲＴ種がｍＣＤ３２−ｈＣＤ１６Ａと結合する能力を、培地単独、単一のＣＤ３２結合部位と単一のＣＤ１６Ａ結合部位とを有するＤＡＲＴ（「ＤＡＲＴ」）、および対照抗ｃｈ−ｍＣＤ３２  ｍＡｂの能力と比較した（図３４）。本発明のＩｇ様ＤＡＲＴは、ＤＡＲＴまたは対照抗体のいずれよりも遙かに大きな抗原結合親和性を有することが判明した。
【０５１４】
６．１１  ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１二重特異性ダイアボディおよびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２二重特異性ダイアボディの設計および特性決定
ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨ（配列１）、ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１（配列２）、およびＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２（配列３）をコードする遺伝子を、発現ベクターｐＥＥ１３にクローニングし、それぞれ、発現構築物１、２および３を得た。構築物１の発現プラスミドを、発現プラスミド２または３とともにＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトし、それぞれＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１二重特異性ダイアボディおよびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディを作製した。３日毎に３回、細胞馴化培地を回収した。次いで、この細胞馴化培地を、ＣＤ３２Ｂアフィニティーカラムを用いて精製した。
【０５１５】
ＥＬＩＳＡは次のように実施した。５０μｌ／ウェルの２μｇ／ｍｌ  ＣＤ３２Ｂ−Ｆｃを、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、炭酸バッファー中、４℃にて一晩コーティングした。このプレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、次いで、室温で３０分間、ＰＢＳ−Ｔ中０．５％のＢＳＡでブロッキングした後に供試単鎖Ｆｃ融合タンパク質を添加した。ブロッキングの際、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１二重特異性ダイアボディまたはＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディを希釈して、２μｇ／ｍｌで始まる２倍希釈系列とした。２５μｌ／ウェルの希釈二重特異性ダイアボディを、２５μｌ／ウェルの５０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３２Ｂ抗体と混合し、ＥＬＩＳＡプレートに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌ／ウェルの１：１０，０００希釈ＨＲＰコンジュゲートＦ（ａｂ’）2ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）2（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプレートに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、８０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質で発色させた。５分間インキュベートした後、４０μｌ／ウェルの１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。９６ウェルプレートリーダーとＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いてＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。この実験により、ＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−１二重特異性ダイアボディおよびＣＤ３２Ｂ−ＣＤ７９−２の二重特異性ダイアボディに、抗ＣＤ３２Ｂ対照抗体の親和性と同等の親和性でＣＤ３２−Ｆｃに免疫特異的に結合する能力があることが明らかになった。上記構築物のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を以下に示す。
【０５１６】
配列１−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨヌクレオチド配列
（配列番号２５１）：
【化２０】
0005964300.tif 000067
【０５１７】
配列２−ＣＤ７９ＶＬ−ＣＤ３２ＢＶＨアミノ酸配列
（配列番号２５２）：
【化２１】
0005964300.tif 000068
【０５１８】
配列３−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１ヌクレオチド配列
（配列番号２５３）：
【化２２】
0005964300.tif 000069
【０５１９】
配列４−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−１アミノ酸配列
（配列番号２５４）：
【化２３】
0005964300.tif 000070
【０５２０】
配列５−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２ヌクレオチド配列
（配列番号２５５）：
【化２４】
0005964300.tif 000071
【０５２１】
配列６−ＣＤ３２ＢＶＬ−ＣＤ７９ＶＨ−２アミノ酸配列
（配列番号２５６）：
【化２５】
0005964300.tif 000072
【０５２２】
６．１２  Ｈ８Ｂ５−ＨＢＣＲＣ生体機能性ダイアボディの構築物および至適化
ＣＤ３２およびＢ細胞受容体複合体(B-cell receptor complex)（「ＢＣＲＣ」）と結合することができる可変領域を含むダイアボディを構築した。
【０５２３】
クローニング
標準ＰＣＲ／重複ＰＣＲを用いて構築物を構築した。
ｈ８Ｂ５ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣ：
完全ヒト化８Ｂ５  ＶＬ（ＣＤ３２を認識する）は、プライマーとしてｌｇｈ３２１Ｆおよびｌｇｈ７８８Ｒを用いることにより増幅した。ｈＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉは、プライマーとしてｌｇｈ７８４Ｆおよびｌｇｈ３８６Ｒを用いることにより増幅した。これらのＰＣＲ産物をゲル精製して混合し、ｌｇｈ３２１Ｆおよびｌｇｈ３８６Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲフラグメントをｐＥＥ６のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。「Ｇ３ＳＧ４」は、配列：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）を有するリンカーである。
【０５２４】
ｈＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−Ｇ３ＳＧ４−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣ
ｈＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎは、プライマーとしてｌｇｈ３２１Ｆおよびｌｇｈ７８５Ｒを用いることにより増幅した。ｈ８Ｂ５ＶＨは、プライマーとしてｌｇｈ７８７Ｆおよびｌｇｈ７８６Ｒを用いることにより増幅した。これらのＰＣＲ産物をゲル精製して混合し、ｌｇｈ３２１Ｆおよびｌｇｈ７８６Ｒを用いることにより増幅した。次いで、この重複ＰＣＲフラグメントをｐＥＥ１３のＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【０５２５】
単一ベクターの構築
ｐＥＥ６ｈＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨをＢｇｌ  ＩＩ−Ｓａｌ  Ｉ部位で消化し、３．３ｋｂフラグメントを精製し、ｐＥＥ１３  ｈＨＢＣＲＣＶＬ  ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位に挿入した。Ｂｇｌ  ＩＩとＢａｍＨ  Ｉは適合する付着末端を共通に持つ。ＤＡＲＴの配列、同ＤＡＲＴの構築に用いたプライマーを以下に示す。
【０５２６】
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列
（配列番号２５７）：
【化２６】
0005964300.tif 000073
【０５２７】
ｈＨＢＣＲＣＶＬ．Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ−ＬＧＧＣアミノ酸配列
（配列番号２５８）：
【化２７】
0005964300.tif 000074
【０５２８】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＨＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣヌクレオチド配列
（配列番号２５９）：
【化２８】
0005964300.tif 000075
【０５２９】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ−ＬＧＧＣアミノ酸配列
（配列番号２６０）：
【化２９】
0005964300.tif 000076
【０５３０】
【化３０】
0005964300.tif 000077
【０５３１】
Ｈｕ３Ｇ８ＶＬ  １−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ  ４−ＬＧＧＣ発現プラスミドをＨｕ２Ｂ６ＶＬ  ５−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ  ５−ＬＧＧＣとともにＨＥＫ−２９３細胞に同時トランスフェクトし、ＣＤ３２およびＣＤ７９を認識するＨｕ２Ｂ６  ４．５−Ｈｕ３Ｇ８  ５．１生物分子特異的ダイアボディを作出した。同時に、Ｈｕ２Ｂ６ＶＬ  ５−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ２Ｂ６ＶＨ  ４−ＬＧＧＣおよびＨｕ３Ｇ８ＶＬ  １−Ｇ３ＳＧ４−Ｈｕ３Ｇ８ＶＨ  ５−ＬＧＧＣを個々にＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトし、Ｈｕ２Ｂ６  ４．５ダイアボディおよびＨｕ３Ｇ８  ５．１ダイアボディを作出した。培養３日後に細胞馴化培地を回収し、結合ＥＬＩＳＡにより特性決定を行った。この試験の結果を図３６に示す。
【０５３２】
試験計画：
１００ｎｇ／ウェルの可溶性ＦｃＲＩＩｂ−Ｇ２−Ａｇｌｙを９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、炭酸バッファー中、４０℃で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、次いで、室温で３０分間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中０．５％のＢＳＡでブロッキングした後、ダイアボディを添加した。生物分子特異的なＨｕ２Ｂ６  ４．５−Ｈｕ３Ｇ８  ５．１ダイアボディ、Ｈｕ２Ｂ６  ４．５ダイアボディ、およびｈｕ３Ｇ８  ５．１ダイアボディの細胞馴化培地の、２５ｎｇ／ウェルで始まる２倍希釈系列を各ウェルに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、１０ｎｇ／ウェルのＦｃＲＩＩＩａ−Ｇ２−ビオチンをプレートに添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、５０μｌのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）１：５０００希釈液を検出に用いた。室温で４５分間インキュベートした後、このプレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ＴＭＢ基質を用いて発色させた。１０分間インキュベートした後、１％Ｈ2ＳＯ4により反応を停止させた。ＳＯＦＴｍａｘプログラムによりＯＤ４５０ｎｍを読み取った。この読み取り結果を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ３．０３ソフトウェアを用いてプロットした。
【０５３３】
６．１３  ＩｇＤＡＲＴダイアボディの構築
ＣＤ３２およびＢ細胞受容体複合体（「ＢＣＲＣ」）と結合することができる可変領域を含むＩｇＤＡＲＴダイアボディを構築した。第１のダイアボディは、分子のＶＨ配列とＦｃ配列の間にＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）リンカーを用いた。第２のダイアボディは、配列ＬＥＩＫ（配列番号２６８）を有するＬＥＩＫリンカーまたは配列ＴＶＳＳ（配列番号２６９）を有するＴＶＳＳリンカーのいずれかを用いた。これらのダイアボディの鎖の配列およびコードポリヌクレオチドを以下に示す。
【０５３４】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ、Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ
（配列番号２７０）：
【化３１】
0005964300.tif 000078
【０５３５】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ配列は、１０８〜１１５位に位置するリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によってｈＢＣＲＣＶＨ配列に融合されている。ｈＢＣＲＣＶＨ配列は、２２９〜２３６位に位置するリンカーＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）によってＦｃ配列に融合されている（双方とも上記に下線で示す）。Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ｈＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ，Ｍ６２Ｋ＿ＬＧＧＣＧ３Ｓ＿ｈκ配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。
（配列番号２７１）：
【化３２】
0005964300.tif 000079
ここで、リンカー：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）およびＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）をコードする配列は、それぞれ３２２〜３４５位および６８５〜７０８に位置している（双方とも上記に下線で示す）。
【０５３６】
ＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧ１
（配列番号２７２）：
【化３３】
0005964300.tif 000080
【０５３７】
ｈＢＣＲＣＶＬ配列は、１１３〜１２０に位置するリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によってＨ８Ｂ５ＶＨ配列に融合されている。Ｈ８Ｂ５ＶＨ配列は、２３７〜２４４に位置するリンカーＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）によってＦｃ配列に融合されている（双方とも上記に下線で示す）。ＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿ＬＧＧＣＧＧＧＳ−ｈＧ１配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。
（配列番号２７３）：
【化３４】
0005964300.tif 000081
ここで、リンカー：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）およびＬＧＧＣＧＧＧＳ（配列番号２６７）をコードする配列は、それぞれ３３７〜３６０位および７０９〜７３２位に位置している（双方とも上記に下線で示す）。
【０５３８】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ，Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ
（配列番号２７４）：
【化３５】
0005964300.tif 000082
【０５３９】
Ｈ８Ｂ５ＶＬ配列は、１０８〜１１５位に位置するリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によってＨＢＣＲＣＶＨ配列に融合されている。ＨＢＣＲＣＶＨ配列は、２２５〜２２８位に位置するリンカーＬＥＩＫ（配列番号２６８）によってＦｃ配列に融合されている（双方とも上記に下線で示す）。Ｈ８Ｂ５ＶＬ−ＨＢＣＲＣＶＨ  Ｍ４８Ｉ，Ｍ６２Ｋ＿（−４）ＬＥＩＫ＿ｈκ配列をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。
（配列番号２７５）：
【化３６】
0005964300.tif 000083
ここで、リンカー：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）およびＬＥＩＫ（配列番号２６８）をコードする配列は、それぞれ３２２〜３４５位および６７３〜６８４位に位置している（双方とも上記に下線で示す）。
【０５４０】
ＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧ１＝ＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿−ｈＧ１
（配列番号２７６）：
【化３７】
0005964300.tif 000084
【０５４１】
ＨＢＣＲＣＶＬ配列は、１１３〜１２０位に位置するリンカーＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）によってｈ８Ｂ５ＶＨ配列に融合されている。ｈ８Ｂ５ＶＨ配列は、２３３〜２３６位に位置するリンカーＴＶＳＳ（配列番号２６９）によってＦｃ配列に融合されている（双方とも上記に下線で示す）。ＨＢＣＲＣＶＬ  Ｒ４５Ｎ−ｈ８Ｂ５ＶＨ＿（−４）ＴＶＳＳ−ｈＧ１をコードするポリヌクレオチドは下記の通りである。
（配列番号２７７）：
【化３８】
0005964300.tif 000085
ここで、リンカー：ＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１０）およびＴＶＳＳ（配列番号２６９）をコードする配列は、それぞれ３３７〜３６０位および６９７〜７０８位に位置している（双方とも上記に下線で示す）。
【０５４２】
６．１４  リンカーの至適化
上述のように、本発明のＩｇＤＡＲＴダイアボディは、その分子のＶＨ配列とＦｃ配列の間にリンカーを含むことが好ましい。収量および活性を最大にするためにリンカーを至適化する実験を行った。以下のリンカーを使用した。
【０５４３】
【表１９】
0005964300.tif 000086
種々の組合せのリンカーを有するＩｇＤＡＲＴダイアボディのセットを作製するために、上記のリンカーをプラスミドに導入した。
【０５４４】
【表２０】
0005964300.tif 000087
作製されたＩｇＤＡＲＴの凝集特性を調べた。
【０５４５】
【表２１】
0005964300.tif 000088
予期しないことに、データは、９０１Ａ／９０１Ｂ；９０３Ａ／９０３Ｂ；および９０８Ａ／９０８Ｂに用いられたものなどのリンカーを有する構築物が、９１０Ａ／９１１Ｂなどのリンカーを有する構築物よりも劇的に優れた結果（オリゴマー化が少なく、かつ／またはフラグメントの生成が少ない）をもたらすことを示した。
【０５４６】
６．１５  Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴ
以上のことから分かるように、二重特異性ＤＡＲＴの個々のポリペプチドは２種のホモ二量体と１種のヘテロ二量体を形成することができる。本発明の一実施形態では、荷電ポリペプチドを一方、またはより好ましくは双方のＤＡＲＴポリペプチドのＣ末端に付加することができる。二重特異性ＤＡＲＴの個々のポリペプチドに反対の電荷の荷電ポリペプチドを選択することにより、このような荷電ポリペプチドを含むことは、ヘテロ二量体の形成に有利であり、ホモ二量体の形成を少なくする。好ましくは、正電荷ポリペプチドは実質的含量のアルギニン、グルタミン、ヒスチジンおよび／またはリシン（またはこのようなアミノ酸の混合物）を含有し、負電荷ポリペプチドは実質的含量のアスパラギン酸またはグルタミン酸（またはこのようなアミノ酸の混合物）を含有する。実質的含量のリシンを含有する正電荷ポリペプチドおよび実質的含量のグルタミン酸を含有する負電荷ポリペプチドが特に好ましい。このような反対の電荷を有するポリペプチド間の静電気引力を最大とするためには、自発的にらせんコンフォメーションをとり得るポリペプチドを使用することが好ましい。
【０５４７】
よって、好ましい実施形態では、正電荷を有する「Ｅコイル」を二重特異性ＤＡＲＴを形成するために用いる一方のポリペプチドに付加し、負電荷を有する「Ｋコイル」を該ＤＡＲＴのもう一方のポリペプチドに付加する（図３７）。
【０５４８】
特に好ましいＥコイルは配列：（ＥＶＡＡＬＥＫ）4：
【化３９】
0005964300.tif 000089
を有する。
【０５４９】
特に好ましいＫコイルは配列：（ＫＶＡＡＬＫＥ）4：
【化４０】
0005964300.tif 000090
を有する。
【０５５０】
このようなＥコイルを有する好ましいＤＡＲＴポリペプチドは、一般配列：［ＶＬドメイン］-［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］-［ＶＨドメイン］-［（ＥＶＡＡＬＥＫ）4］-ＧＧＧＮＳを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの軽鎖可変Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの重鎖可変Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）4は配列番号２９９であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１である。このようなＫコイルを有する好ましいＤＡＲＴポリペプチドは、一般配列：［ＶＬドメイン］-［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］-［ＶＨドメイン］-［（ＫＶＡＡＬＫＥ）4］-ＧＧＧＮＳを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの軽鎖可変Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの重鎖可変Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）4は配列番号３００であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１である。
【０５５１】
６．１６  Ｅコイル／Ｋコイル  ＦＣ含有ＤＡＲＴ
さらなる実施形態では、Ｆｃ領域はＥコイルまたはＫコイルＤＡＲＴのＥコイルおよび／またはＫコイルに連結することができる。
【０５５２】
さらに、Ｆｃ含有ＤＡＲＴのＦｃ領域とＤＡＲＴ  ＶＨドメインがよく分離されずに配置されていると、このようなドメインとそれらの結合リガンドの間の相互作用がなくなるか、そうでなければＤＡＲＴの集合を妨害するような場合には、Ｆｃ含有ＤＡＲＴのＦｃ領域とＤＡＲＴ  ＶＨドメインとの間を離すことが望ましい。任意のアミノ酸配列のセパレーターを用いてもよいが、Ｆｃドメインを最大限延長させて可変ドメインから突き出るようにαヘリックスコイルを形成するセパレーターを用いるのが好ましい（図３７）。上記の、反対の電荷を有するコイル状のポリペプチドはヘテロ二量体の形成を促進する付加的機能も持つことから、このような分子は特に好ましいセパレーターである。このようなコイルを含むＦｃ−ＤＡＲＴ分子は、血清半減期の向上およびエフェクター機能の動員を含む、Ｆｃ−ＤＡＲＴの場合と同様の利益を提供する。上記のＥコイルおよびＫコイルポリペプチドはこの目的で特に好ましい。
【０５５３】
よって、好ましい実施形態では、ＥコイルＦｃ含有ＤＡＲＴは、一般配列：Ｄ２３４（Ｋａｂａｔのナンバリング）で始まる［ＶＬドメイン］-［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］-［ＶＨドメイン］-［（ＥＶＡＡＬＥＫ）4］-ＧＧＧ-Ｆｃドメインを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの軽鎖可変Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの重鎖可変Ｉｇドメインであり、（ＥＶＡＡＬＥＫ）4は配列番号２９９である。
【０５５４】
同様に、好ましい実施形態では、ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴは、一般配列：Ｄ２３４（Ｋａｂａｔのナンバリング）で始まる［ＶＬドメイン］-［ＧＧＧＳＧＧＧＧ］-［ＶＨドメイン］-［（ＫＶＡＡＬＫＥ）4］-ＧＧＧ-Ｆｃドメインを有し、ここで、ＶＬはＤＡＲＴの軽鎖可変Ｉｇドメインであり、ＧＧＧＳＧＧＧＧは配列番号１０であり、ＶＨはＤＡＲＴの重鎖可変Ｉｇドメインであり、（ＫＶＡＡＬＫＥ）4は配列番号３００である。
【０５５５】
上記で示したように、コイル含有ＤＡＲＴ分子またはコイル含有Ｆｃ含有ＤＡＲＴ分子はこのようなコイルセパレーターを１個だけ含んでもよいし、またはこのようなセパレーターを２個以上含んでもよい（例えば、２つのセパレーター、好ましくは反対の電荷のもの、そのうち１つはＤＡＲＴポリペプチドの各ＶＨドメインに連結されている）。Ｆｃ領域をこのようなセパレーター分子に連結することで、鎖の交換によりＦｃ−ＤＡＲＴ分子の二価型、四価型などの作製能が高まる（図３９）。図３９に示されるように、ＦｃドメインがＤＡＲＴ  ＶＨドメインの一方に連結されるか双方に連結されるかによって、単量体または二量体を形成するＦｃ−ＤＡＲＴ分子を作出することができる。
【０５５６】
６．１７  Ｅコイル／ＫコイルＦＣ含有ＤＡＲＴの機能活性
ＥコイルＦｃ−ＤＡＲＴ種および／またはＫコイルＦｃ−ＤＡＲＴ種を、（１）ＣＤ７９ｂ（ＢＣＲ複合体）反応性抗体ＣＢ３の軽鎖可変領域および重鎖可変領域と、（２）ＣＤ３２Ｂ反応性抗体２Ｂ６の低親和性変異体（「ＹＡ」変異体と呼称）の軽鎖可変領域および重鎖可変領域とを有する二重特異性ＤＡＲＴ分子から作出した。この抗体の軽鎖可変領域は、突然変異Ｎ５０ＹおよびＶ５１Ａを含有することで抗体２Ｂ６の軽鎖可変領域とは異なる。よって、抗体ＹＡ２Ｂ６は以下の軽鎖可変領域配列を有する。
【化４１】
0005964300.tif 000091
【０５５７】
この抗体の重鎖可変領域の配列は以下の通りである。
【化４２】
0005964300.tif 000092
【０５５８】
この低親和性抗体は、ＣＤ７９ｂを発現する細胞（Ｂ細胞）上のＣＤ３２Ｂとシスで優先的に結合することから選択された。従って、この構成は、他のＣＤ３２Ｂ発現細胞（単球、内皮細胞、肝臓）との相互作用ならびに望ましくないトランス相互作用をなくすことができる。
【０５５９】
このようなｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴのＥコイル誘導体および／またはＫコイル誘導体ならびにＥコイルＦｃ含有誘導体および／またはＫコイルＦｃ含有誘導体を作出した。サイズ排除クロマトグラフィーを用いておよそのサイズと産生された分子のヘテロ性を分析した。図４０に示されるように、二量体は、Ｋコイルドメインに連結されるとともに、Ｅコイルドメインに連結された単一の連結Ｆｃ領域を有するＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴとも連結された、単一の連結Ｆｃ領域を有するＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴから形成された。望ましい単量体分子ならびに二量体分子が、Ｆｃ領域が同じＤＡＲＴ分子のＥコイルとＫコイルの双方に連結された調製物から回収された（なお、この単量体は形成された主要産物であった）。図４１に、作出された二量体分子の考えられ得る構造を示す。
【０５６０】
これらのサイズ排除クロマトグラフィー画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いてさらに分析し、作出された分子の構造をさらに解析した（図４２）。Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴ誘導体（Ｆｃ領域不含）は、それぞれおよそ２８ｋＤの２つの主要バンド（ＫＦｃ含有ポリペプチドとやや短いＥＦｃ含有ポリペプチドに相当）と、およそ４９ｋＤの主要でないバンド（Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴに相当）として移動した。サイズ排除クロマトグラフィーから得られたＥコイル／ＫコイルＦｃ含有ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／ＫまたはＥ／ＫＦｃ）の単量体画分は、ＤＡＲＴがＫＦｃ含有ＤＡＲＴ（より大きな分子量のバンド）であるかＥＦｃ含有ＤＡＲＴ（より小さな分子量のバンド）であるかに応じておよそ２８ｋＤより大きい分子量か小さい分子量のいずれか一方のみを示した。物質は主としておよそ４９ｋＤに移動した（Ｅコイル／ＫコイルＤＡＲＴに相当）。著しく高い分子量のバンドも見られた。
【０５６１】
作出された分子の特性決定を行うために二重特異性結合ＥＬＩＳＡを行った。ＣＤ７９をＥＬＩＳＡプレートに入れた。次いで、このプレートにＤＡＲＴを結合させた。ｓＣＤ３２Ｂ−ビオチンを用いてＤＡＲＴ結合を検出した後、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにインキュベートした。図４３に示されるように、Ｅコイル／ＫコイルＦｃ含有ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体（ＥＦｃ／ＫまたはＥ／ＫＦｃ）は、ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体またはＥＦｃ／ＫＦｃ  ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体と比較して結合の有意な増強を示した。
【０５６２】
ＣＤ７９ｂと結合した抗体の架橋はＢ細胞の活性化をもたらす(Van Kooten, C.ら(1997) “Cross-Linking Of Antigen Receptor Via Ig-Β (B29, CD79b) Can Induce Both Positive And Negative Signals In CD40-Activated Human B Cells,” Clin. Exp. Immunol. 110:509-515)。ｈ２Ｂ６ＹＡｈＣＢ３  ＤＡＲＴ分子はＣＤ７９ｂおよびＣＤ３２Ｂ阻害受容体の双方に結合することができるので、それらはＣＤ７９ｂ結合部位にＣＤ３２Ｂを「動員」し、それによってＢ細胞の増殖を遮断することができる。この能力を証明するために、ＤＡＲＴＳを、結合した抗ＣＤ７９ｂ抗体を架橋することができる抗体に曝したＢ細胞とともにインキュベートした。この実験の結果を図４４に示す。結果は、ＣＤ７９ｂまたはＣＤ３２Ｂ単独に対する抗体（それぞれＣｈ２Ｂ６Ｎ２９７ＱおよびＣｈＣＢ３．１Ｎ２９７Ｑ）がＢ細胞の増殖を阻害できなかったことを示す。ＥＦｃ／ＫＦｃ  ｈ２Ｂ６ＹＡ誘導体×ｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体は、ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３  ＤＡＲＴ自体およびｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３  ＶＦ対照と同様に、Ｂ細胞の増殖の阻害に実質的により有効であった。単一の連結Ｆｃ領域のみを有するＥコイル／ＫコイルＤＡＲＴ（Ｅ／ＫＦｃ  ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体およびＥＦｃ／Ｋ  ｈ２Ｂ６ＹＡ×ｈＣＢ３  ＤＡＲＴ誘導体）は、Ｂ細胞の増殖に対して最大の阻害を示すことが分かった。
【０５６３】
６．１８  ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血清半減期を変更するためのＤＡＲＴの改変
上述のように、二重特異性単鎖分子（例えば、およそ５５ｋＤａの分子量を有するもの）などの組換え抗体小分子は、循環から急速に排除される。マウスにおけるＤＡＲＴ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態研究によれば、およそ２時間といった短い終末半減期が予想された。
【０５６４】
急性炎症病態の治療における場合などのいくつかの実施形態では、このような短い半減期が望まれるが、癌および慢性疾患および病態の治療の場合などの他の実施形態では、本発明のＤＡＲＴ分子が長い半減期を示すことが好ましい。
【０５６５】
このような用途のＤＡＲＴ分子のｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態特性を改善するために、ＤＡＲＴ分子を、ＤＡＲＴ分子の１以上の末端に血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含むように改変することができる。このような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、ＤＡＲＴ分子のＣ末端に導入するのが最も好ましい。この目的で特に好ましい血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌Ｇタンパク質由来のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）である。連鎖球菌Ｇ１４８株のＧタンパク質のアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）が特に好ましい。
【０５６６】
連鎖球菌Ｇ１４８株のＧタンパク質のアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定な三重らせん束を形成している４６個のアミノ酸残基からなり、広いアルブミン結合特異性を有する(Johansson, M.U.ら(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120)。アルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトでの半減期は１９日である。アルブミンは、他のタンパク質との非共有結合的結合を許容するいくつかの小分子結合部位を持っており、それにより血清半減期を延長する。
【０５６７】
血清タンパク質のポリペプチド部分の、ＤＡＲＴ半減期延長能を証明するために、連鎖球菌Ｇタンパク質のＡＢＤ３ドメインを組換え二重特異性ＤＡＲＴ（ｈＣＤ１６抗原およびｈＣＤ３２Ｂ抗原と免疫反応性がある）と融合させて組換え抗体分子ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴを作出した（図４５）。このＡＢＤ−ＤＡＲＴは、両抗原ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との特異的結合を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてエフェクター細胞を再標的化することができた。対照ＤＡＲＴと比較して、このＡＢＤ−ＤＡＲＴは、マウスにおいて血清半減期の著しい延長を示した。このアプローチは、ＤＡＲＴなどの潜在的に重要な医薬の半減期を９０分超、２時間超、５時間超、１０時間超、２０時間超、最も好ましくは、３０時間超に延長するための実行可能な経路として使用することができる。
【０５６８】
材料および方法：
ＡＢＤ  ＤＡＲＴの設計および構築：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ  ＤＡＲＴを、第１鎖として
ｈＣＤ１６ＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ３２ＢＶＨ−Ｋコイル［（ＫＶＡＡＬＫＥ）4］
（ここで、ＣＤ１６ＶＬは３Ｇ８  ＣＤ１６ＶＬを表し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を表し、ｈＣＤ３２ＢＶＨは２Ｂ６  ＣＤ３２ＢＶＨを表し、（ＫＶＡＡＬＫＥ）4は配列番号３００を表す）；および第２鎖として
ｈＣＤ３２ＢＶＬ−Ｇ３ＳＧ４−ｈＣＤ１６ＶＨ−ＧＧＣＧＧＧ−Ｅコイル［（ＥＶＡＡＬＥＫ）4］−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ
（ここで、ＣＤ３２ＢＶＬはＣＤ３２ＢＶＬを表し、Ｇ３ＳＧ４は配列番号１０を表し、ｈＣＤ１６ＶＨはＣＤ１６ＶＨであり、ＧＧＣＧＧＧは配列番号２６７の残基２〜７であり、Ｅコイル［（ＥＶＡＡＬＥＫ）4］は配列番号２９９であり、ＧＧＧＮＳは配列番号３０１を表し、ＡＢＤは、
【化４３】
0005964300.tif 000093
である）
を用いて作製した。
【０５６９】
よって、第１鎖（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ）の配列は下記の通りである。
【化４４】
0005964300.tif 000094
【０５７０】
第１鎖（ｈ３Ｇ８ＶＬ１−Ｇ３ＳＧ４−ｈ２Ｂ６ＶＨ４−Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ）をコードする好ましいポリヌクレオチドは下記の通りである。
【化４５】
0005964300.tif 000095
【０５７１】
よって、第２鎖（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ）の配列は下記の通りである。
【化４６】
0005964300.tif 000096
【０５７２】
第２鎖（ｈ２Ｂ６ＶＬ５−Ｇ３ＳＧ４−ｈ３Ｇ８ＶＨ５−Ｅコイル−ＧＧＧＮＳ−ＡＢＤ）をコードする好ましいポリヌクレオチドは下記の通りである。
【化４７】
0005964300.tif 000097
【０５７３】
ＶＬおよびＶＨの各セグメントを、鋳型としてｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴを用いてＰＣＲにより増幅した。第２鎖については、ＥコイルとＡＢＤを含有するヌクレオチド配列をプライマー二量体により形成した後、制限消化とライゲーションを用いてｈＣＤ１６のＶＨ領域のＣ末端にサブクローニングした。両鎖をｐＣＩｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ,ｉｎｃ．）のＮｈｅＩ−ＮｏｔＩＩ部位にクローニングした。次いで、ＮｇｏＭＩＶ−ＮｈｅＩにおいて消化された各第１鎖とＢｓｔＢＩ−ＰｍｅＩにおいて消化された第２鎖発現カセットとを担持する個々のプラスミドを、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションのための単一のプラスミドにクローニングし、安定細胞株を作出した。
【０５７４】
タンパク質の発現および精製：
安定なトランスフェクションのために、ＣＨＯ−Ｓ細胞をｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＥＫ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。ＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質を、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させた可溶型ＦｃＲＩＩＢ抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。この濃縮されたタンパク質を、スーパーデックス２００ＨＲ  １０／３０を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。
【０５７５】
ＥＬＩＳＡによる結合アッセイ：
ＣＤ−１６に基づく捕捉のために、プレートを４℃で一晩、２μｇ／ｍＬ濃度にてＦｃＲＩＩＢ抗原でコーティングした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔ中０．５％のペプトンでブロッキングした。精製されたタンパク質を希釈して２倍希釈系列とし、室温で１時間プレートに結合させた。最後に、ビオチン化ＣＤ３２Ｂ（５０ｎｇ／ｍＬ）、次いでＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（１／１０００、ＢＤ−Ｐｈａｒｍ）を用いて検出を行った。ＨＲＰ活性をＴＭＢの添加により測定し、プレートをプレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍで読み取った。
【０５７６】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の捕捉のために、プレートを４℃で一晩、２μｇ／ｍＬ濃度にてＨＳＡでコーティングした。その後、同じ手順に従ってデュアルアフィニティーＥＬＩＳＡを行った。
【０５７７】
末梢血単核細胞媒介ＡＤＣＣアッセイ：
細胞傷害性をＬＤＨ放出アッセイにより測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト全血（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ、メリーランド州ゲーサーズバーグ）から、製造者の説明書に従ってフィコール−ハイパーク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）密度勾配遠心分離によって精製した。２×１０4個の標的細胞を丸底９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種する。種々のＤＡＲＴまたは抗体分子の１〜４連続希釈液をプレート中の細胞に加える。その後、同じウェルに６×１０5個のＰＢＭＣを加える。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ2インキュベーターにて一晩インキュベートした。次に、このプレートを１２００ｒｐｍで５分間回転させ、５０μｌの上清を平底ＥＬＩＳＡプレートに移す。５０μｌのＬＤＨ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに加え、プレートを暗所、室温で３０分間インキュベートする。その後、５０μｌの停止溶液を各ウェルに加え、１時間以内にプレートを４９０ｎｍで読み取る。各ウェルの細胞傷害性パーセントは、Ｏ．Ｄ．読み取りの生データを用い、
（サンプル−ＡＩＣＣ）／（標的最大値−標的自発値）×１００
（式中、ＡＩＣＣは抗体非依存的細胞傷害性である）
として算出する。用量応答曲線はＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて作製する。
【０５７８】
薬物動態試験：
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ５ｍｇ／ｋｇの単回静注を施した。マウス血清を投与前、２分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間および７２時間に採取した。血清中のｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴ濃度を定量した。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴの薬物動態計算は薬物動態ソフトウエアパッケージＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ５．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）により行った。パラメーターをノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）により決定した。ノンコンパートメント分析は、薬物の静注を要求するモデル（モデル２０１）に基づいた。パラメーターの計算には線形台形法を用いた。
【０５７９】
結果
ＥＬＩＳＡによる発現および結合試験：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、哺乳動物ＣＨＯ−Ｓ細胞において６．５ｍｇ／ｌの濃度で効率的に発現された。精製されたＡＢＤ−ＤＡＲＴタンパク質の、個々の抗原に対する結合活性をＥＬＩＳＡにより評価した。結果は、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴが両抗原、すなわちＣＤ１６ならびにＣＤ３２Ｂと同時に結合することを示した（図４６Ａ）。結合特性は対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴタンパク質結合と一致している。精製されたｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性もＥＬＩＳＡにより示された（図４６Ｂ）。結果は、ＨＳＡに対するＡＢＤ融合ＤＡＲＴの強い結合が示されたが、対照ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴでは結合は見られなかった。ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６ＡおよびＨＳＡに同時に結合可能であったことを証明するために、ＨＳＡを固定化した表面にＡＢＤ−ＤＡＲＴを注入した後に、２００ｎＭのＣＤ３２Ｂおよび２００ｎＭのＣＤ１６Ａ（Ｆ１５８）の連続的注入を行った（図４６Ｃの実線）。対照実験（図４６Ｃの破線）では、抗原をバッファーに置き換えた。これらの結果は、ＡＢＤ−ＤＡＲＴ分子がＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６ＡおよびＨＳＡに同時に結合可能であったことを示す。
【０５８０】
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴおよびそのＡＢＤ融合物誘導体は、可溶性ＣＤ３２Ｂ（ｓＣＤ３２Ｂ）および可溶性ＣＤ１６Ａ（１５８Ｆ）（ｓＣＤ１６Ａ）と同等の結合性を示すことが分かったが、これらのＤＡＲＴはＤＡＲＴ  ＡＢＤ融合物の、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合能によって容易に識別することができた（図４６Ｄ〜４６Ｉ）。ＤＡＲＴをはＣＤ１６Ａコーティングプレート上でインキュベートし、３ｍｇ／ｍｌのＨＳＡの存在下または不在下でビオチン化ｓＣＤ３２Ｂを用いて結合を検出した（ブロキングはＰＢＳ−Ｔ中０．５％のペプトンを用いて行った）。ＤＡＲＴ  ＡＢＤ融合物は、親ＤＡＲＴの二重特異的結合を保持し、ｓＣＤ１６ＡおよびＣＤ３２Ｂとの結合を示し、この結合はヒト血清アルブミンの存在により影響を受けなかったことが分かった（図４６Ｊ）。
【０５８１】
ＡＢＤ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性：
この二重特異性ＡＢＤ−ＤＡＲＴの、２つの抗原（１つはエフェクター細胞上、もう１つは標的細胞上）との同時結合を証明するために、再指向細胞死アッセイを行った。ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として用いたところ、ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、ＣＤ３２Ｂ陽性Ｂ細胞株Ｄａｕｄｉに対して強力な用量依存的細胞傷害性を誘導した（図４７Ａ）。この結果は、ＡＢＤ−ＤＡＲＴの効力が親ＤＡＲＴの効力と同等であることを示した。ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴはＣＤ１６Ｂ発現エフェクター細胞と結合することができ、それにより、そのような細胞を動員して、ＣＤ３２Ｂを発現する細胞を（再指向細胞死を介して）死滅させることができる。従って、ＣＤ１６×ＣＤ３２Ｂ  ＤＡＲＴは、Ｒａｊｉ細胞に対して強力な致死性を示すことが分かった（図４７Ｂ）。
【０５８２】
ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴの薬物動態特性は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスへの単回用量のｉ．ｖ．注射の後に血清サンプルのＥＬＩＳＡにより分析した（図４８）。両タンパク質ＤＡＲＴおよびＡＢＤ−ＤＡＲＴは、循環からの二相排出を示した。ＡＢＤ−ＤＡＲＴのＰＫ試験は循環時間の延長を示し、通常のＤＡＲＴの１．２時間と比較して３５．１時間という終末半減期の延長を示した（図４８、表２２）。薬物動態特性の改善は、曲線下面積（ＡＵＣ）の比較によっても証明された。構築物ＡＢＤ−ＤＡＲＴについては、ＡＵＣはＡＢＤの融合後にほぼ３０倍に増大した（表２２）。
【０５８３】
【表２２】
0005964300.tif 000098
ＡＢＤ−ＤＡＲＴのｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性：
ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴがｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生物活性を保持していたことを証明するために、単回用量のＡＢＤ−ＤＡＲＴまたはその親ＤＡＲＴをＴｇ（ｍＣＤ１６−／−ｈＣＤ１６Ａ＋３２Ｂ＋）マウスに投与し、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＰＭ細胞の濃度をモニタリングした。これらの結果は、ＤＡＲＴがＢ細胞の濃度を抑えることができることを示し（図４９Ａ）、標的化された再指向Ｂ細胞死が、ＤＡＲＴがマウス循環から除去されるまでにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて達成されたことを示唆すると解釈される。Ｔ細胞の濃度（図４９Ｂ）およびＰＭ細胞の濃度（図４９Ｃ）はＤＡＲＴによって抑制されなかったが、このことによりそれらの特異性が確認される。
【０５８４】
要するに、アルブミン結合ドメインが融合したＤＡＲＴタンパク質（ＡＢＤ−ＤＡＲＴと呼称）の設計および産生は成功を収めた。ｈＣＤ１６−ｈＣＤ３２Ｂ  ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、認識されるその２つの抗原決定基ＣＤ１６およびＣＤ３２Ｂに対する特異性を保持していることが分かった。ＡＢＤ−ＤＡＲＴは、ヒト血清アルブミンと高い親和性を示すことが分かった。ＡＢＤを融合しても、生物活性（すなわち、再指向腫瘍細胞死に関するＤＡＲＴの効力）は低下しなかった。ＡＢＤにＤＡＲＴ分子を融合すると、そのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が実質的に改善し（延長し）、大きさを劇的に大きくすることなくこの目標を達成した。小型に保持できるということは、ＤＡＲＴの腫瘍組織への拡散能を助けることから、重要かつ有利なことである。
【０５８５】
６．１９  Ｈｅｒ２／Ｂ細胞受容体ＤＡＲＴ
Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）と結合することができる可変領域を含んだＩｇＤＡＲＴダイアボディを構築した。
【０５８６】
上述のように、ＴＣＲはＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞によって天然に発現され、このような細胞に、抗原提示細胞のクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質により結合および提示される抗原ペプチドを認識させる。ＴＣＲによるｐＭＨＣ（ペプチド−ＭＨＣ）複合体の認識は、サイトカインの産生および抗原提示細胞の溶解をもたらす細胞性免疫応答の伝達を開始させる。ＥｒｂＢファミリーの重要な一員であるＨＥＲ２／ｎｅｕは、数種のヒト癌腫および哺乳動物の発生におけるその役割のために鋭意検討されてきた(Hynes and Stern (1994) Biochim. et Biophys. Acta 1198:165-184;およびDougallら(1994) Oncogene 9:2109-2123; Leeら(1995) Nature 378:394-398)。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子およびＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質は、Sembaら(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82:6497-6501およびYamamotoら(1986) Nature 319:230-234に記載されており、その配列はＧｅｎＢａｎｋで受託番号Ｘ０３３６３として入手可能である。ＨＥＲ２／ｎｅｕは４つのドメイン、すなわち、リガンドが結合する細胞外ドメイン；親油性トランスメンブランドメイン；保存されている細胞内チロシンキナーゼドメイン；およびリン酸化され得る数個のチロシン残基を担持するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含む(Plowmanら(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:1746-1750)。ＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞外（ＥＣＤ）ドメインの配列は、Franklinら(2004) Cancer Cell. 5(4):317-328に記載され、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ  Ｒｅｃｏｒｄ  １Ｓ７８（２００４）で入手可能である。
【０５８７】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは増殖因子受容体として機能し、多くの場合、乳癌、結腸癌、膀胱細胞癌、卵巣癌および肺癌などの腫瘍によって発現される。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、ヒト乳癌および卵巣癌の２５〜３０％で過剰発現され、これらの患者における急速進行型の臨床進行および予後の悪さに関連している(Slamonら(1987) Science 235:177-182; Slamonら(1989) Science 244:707-712)。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても見出されている（例えば、Kingら(1985) Science 229:974; McCannら(1990) Cancer 65:88-92; Yonemuraら(1991) Cancer Research 51:1034参照）。
【０５８８】
ＨＥＲ−１またはＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とするいくつかのモノクローナル抗体および小分子チロシンキナーゼ阻害剤が開発されており、これには特に、ＨＥＲ２／ｎｅｕのシステインリッチＩＩドメイン（このタンパク質のトランスメンブラン領域に近接している）内の細胞外エピトープ（アミノ酸５２９〜６２７）を認識するマウスモノクローナル抗体のヒト化変異体（４Ｄ５（ハーセプチン（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）として知られる）が含まれる。研究によれば、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現する乳癌細胞において、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な抗体を化学療法薬（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソール）と組み合わせて処置すると、化学療法の単独処置よりも高い細胞傷害性応答を誘発することが示された(Hancockら(1991) Cancer Res. 51:4575-4580; Arteagaら(1994) Cancer 54:3758-3765; Pietrasら(1994) Oncogene 9:1829-1838)。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体が化学療法薬に対する応答を増強する１つの可能性のある機構は、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質発現の調節を介するものか、またはＤＮＡ修復の妨害によるものである(Stancovskiら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:8691-8695; Bacusら(1992) Cell Growth & Diff. 3:401-411; Bacusら(1993) Cancer Res. 53:5251-5261; Klapperら(1997) Oncogene 14:2099-2109; Klapperら(2000) Cancer Res. 60:3384-3388; Arteagaら(2001) J Clinical Oncology 19(18s):32s-40s）。ある特定の場合では、ハーセプチン（登録商標）などの抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は患者に治療上の利益を与えるが、大多数の乳癌その他の患者はこのような抗体に対して不応性を示す。これらの応答は、一部には、患者の癌細胞によるＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現の程度の違いを反映する。
【０５８９】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよびＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）と結合し得る可変領域を含む結果として、このＤＡＲＴはＨＥＲ２発現細胞と結合し、それによりこのような細胞に、Ｔ細胞受容体と結合し得るドメインを付加する能力を有する。このようなＴ細胞がこのドメインと結合すると、それらは活性化して、ＨＥＲ２発現細胞の死滅をもたらす免疫応答を誘発する。
【０５９０】
このようなＤＡＲＴのアミノ酸配列および核酸配列を以下に示すが、ＶＬ配列およびＶＨ配列はプレーンテキストで示し、ＶＬ−ＶＨリンカーは下線で示し、Ｃ末端ヘテロ二量体形成モチーフをコードする配列（配列番号３１３：ＧＦＮＲＧＥＣまたは配列番号３１４：ＧＶＥＰＫＳＣ）を太字斜体で示す。
【０５９１】
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨアミノ酸配列（配列番号３１５）
【化４８】
0005964300.tif 000099
【０５９２】
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨコード核酸配列（配列番号３１６）
【化４９】
0005964300.tif 000100
【０５９３】
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨアミノ酸配列（配列番号３１７）
【化５０】
0005964300.tif 000101
【０５９４】
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨコード核酸配列（配列番号３１８）
【化５１】
0005964300.tif 000102
【０５９５】
好ましい実施形態では、このような構築物は、ヘテロ二量体（すなわち、ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ×ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ二量体）の形成を促進するＥコイルドメインまたはＫコイルドメインを含むように改変される。このようなＤＡＲＴのアミノ酸配列および核酸配列を以下に示すが、ＶＬ配列およびＶＨ配列はプレーンテキストで示し、ＶＬ−ＶＨリンカーは下線で示し、二量体形成のためのＣｙｓ含有リンカー（ＧＧＣＧＧＧ；配列番号２６７の残基２〜７）をコードする配列は斜体で示す。ＥコイルまたはＫコイルヘテロ二量体形成ドメインは二重下線で示す（好ましい「Ｅコイル」配列はＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号２９９の４リピートヘプタマーであり、好ましい「Ｋコイル」配列はＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号３００）の４リピートヘプタマーである。ＥコイルまたはＫコイルに続く配列には割り当てられた機能はない。
【０５９６】
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルアミノ酸配列（配列番号３１９）
【化５２】
0005964300.tif 000103
【０５９７】
ＴＣＲＶＬ−ＨＥＲ２ＶＨ−Ｅコイルコード核酸配列（配列番号３２０）
【化５３】
0005964300.tif 000104
【０５９８】
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルアミノ酸配列（配列番号３２１）
【化５４】
0005964300.tif 000105
【０５９９】
ＨＥＲ２ＶＬ−ＴＣＲＶＨ−Ｋコイルコード核酸配列（配列番号３２２）
【化５５】
0005964300.tif 000106
【０６００】
Ｈｅｒ２結合ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合ドメインを有するＤＡＲＴ分子の、ＨＥＲ２発現レベルが低いと従前に特定されている（従って、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ハーセプチン（登録商標）による処置に不応である）多発性乳癌、結腸癌および膀胱癌細胞株における細胞傷害性の媒介能を試験した。供試乳癌細胞株はＺＲ７５−１（ＨＥＲ２  ２＋）（図５０Ａ）、ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２  １＋）（図５０Ｂ）およびＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＨＥＲ２−ｖｅ）（図５０Ｃ）である。供試した非乳癌細胞株はＨＴ−２９（結腸癌細胞株）（図５０Ｄ）およびＳＷ７８０（膀胱癌細胞株）（図５０Ｅ）である。図４９Ａ〜Ｅに示されるように、このようなＤＡＲＴ分子は、腫瘍由来細胞株の細胞傷害性を媒介する上で、同等の細胞傷害性を達成するのに要する濃度という点でも、見られる細胞傷害性の最大レベルという点でも、ハーセプチン（登録商標）よりも実質的に有効であった。
【０６０１】
６．２０  ＥコイルおよびＫコイルを介したＤＡＲＴとＡＢＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏ融合
上述のように、本発明のＤＡＲＴ分子は、ＮＫＧ２Ｄ受容体と、フルオレセインコンジュゲート結合パートナーと相互作用する分子とを同時に連結することができる万能アダプターとして働き得るように、ハプテンであるフルオレセインと親和性のあるＮＫＧ２Ｄ受容体と二重特異的結合を示すように設計することができる。さらにＡＢＤの使用を例示するために、下記のポリペプチド鎖を用いてＤＡＲＴを構築した。
（１）ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイル：
このポリペプチドは、上記のＫＹＫ２．０抗体(Kwong, KYら(2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156;およびPCT/US09/54911)のＶＬドメインと上記の抗フルオレセインＭＡｂ４４２０のＶＨドメインを用いて構築した。
（２）４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）：
このポリペプチドは、上記の抗フルオレセインＭＡｂ４４２０のＶＬドメインとＫＹＫ２．０抗体のＶＨドメインを用いて構築した。「Ｅコイル」は、ＥＶＡＡＬＥＫ；配列番号２９９の４リピートヘプタマーのＥコイルアミノ酸配列を表す。
【０６０２】
ＫＹＫ２ＶＬ−４４２０ＶＨ−ＧＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１３）−Ｅコイルおよび４４２０ＶＬ−ＫＹＫ２ＶＨ−ＧＶＥＰＫＳＣ（配列番号３１４）ポリペプチドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、「ＫＹＫ２  ４４２０  ＶＦ  Ｅコイル」と呼称するＤＡＲＴを発現させた。これらの分子の精製を図５１Ａおよび５１Ｂに示す。ＫＹＫ２  ４４２０  ＶＦ  ＥコイルＤＡＲＴの親和性は、ＤＡＲＴと捕捉されたＦＩＴＣ抗原との結合をＮＫＧ２Ｄ  Ｆｃ  ０１２２１０を用いて検出することにより判定した。この実験の結果は、ＤＡＲＴが両分子に結合可能であったことを示す（図５２）。
【０６０３】
さらに、Ｋコイル−ＧＧＧＮＳ（配列番号３０１）−ＡＢＤ融合物を作製した（ここで、「Ｋコイル」は、ＫＶＡＡＬＫＥ（配列番号３００）の４リピートヘプタマーのＫコイルアミノ酸配列を表す）。図５３はプラスミドｐＰＡＬ７の制限地図を示し、精製を容易にするためのＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カルフォルニア州ハーキュリーズ）タグを用いた、Ｋコイル−ＡＢＤ融合物を発現するプラスミドｐＰＡＬ７  ＫコイルＡＢＤの構築を表す。ｐＰＡＬ７  ＫコイルＡＢＤベクターを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３細胞に形質転換した。タグを有するＫコイルＡＢＤの発現は、２ｍＭのＩＰＴＧを４時間添加することによって誘導した。タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウエスタンブロットのいずれかによって確認した。簡単に述べれば、このＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）融合タグ系は、細胞の溶解を媒介すること、放出されたタンパク質を固定化スブチリシンプロテアーゼアフィニティーカラムに結合させること、このカラムを洗浄して結合していないタンパク質を溶出させること、フッ化物含有溶出バッファーを適用して、サブチリシンに融合タンパク質の切断認識配列の後でタグを迅速かつ正確に切断するように促し、このような切断の後にタグを含まないタンパク質をカラムから洗浄すること、および溶出されたタンパク質をＰＢＳ中で透析することを含む。図５４は、ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂（小規模、１０ｍｌ培養から）により精製されたＫコイルＡＢＤタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
【０６０４】
ＰＲＯＦＩＮＩＴＹ  ＥＸＡＣＴ（商標）精製樹脂から得られたＫコイル−ＡＦＤタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてさらに精製した（図５５）。２５０ｍｌの大腸菌培養物から６．５２３ｍｇの精製タンパク質が得られた（表２３）。
【０６０５】
【表２３】
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ＫＹＫ２  ４４２０  ＶＦ  ＥコイルＤＡＲＴおよびＫコイルＡＢＤタンパク質を室温で３０分間、ＰＢＳ中でインキュベートし、特性の向上したＥコイル−ＫコイルＡＢＤ  ＤＡＲＴを形成させた。ＥＬＩＳＡの結果は、これらの複合体において全てのドメインがそれらの個々のリガンドと結合できることを示す（図５６Ａ〜５６Ｃ）。所望により、ＫＹＫ２  ４４２０  ＶＦ  ＥコイルおよびＫ−ＡＢＤ複合体のさらなる精製は、抗ＥＫカラムを用いて達成することができる。
【０６０６】
この複合体の形成はＤＡＲＴの特定の結合ドメインに依存しないことから、上記の方法を用いて、他の結合特異性を有するＥコイル−ＫコイルＡＢＤ  ＤＡＲＴを（例えば、ＣＤ３２Ｂ（例えば、抗体２Ｂ６）／ＣＤ１６Ａ（例えば、抗体３Ｇ８）ＶＦ  Ｅ  ＤＡＲＴとＫコイルＡＢＤの複合体を形成させることにより）作出することもできる。
【０６０７】
よって、上記で示したように、本発明の一実施形態では、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの双方は、ヘテロ二量体の形成を促進する働きをする付加的配列（例えば、ＫコイルまたはＥコイル）を含むことができ、場合により、このようなポリペプチドの一方は、血清タンパク質と結合することができる血清結合タンパク質のポリペプチド部分を含んでもよい（例えば、図４５）。別の実施形態では、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドの一方、好ましくは一方だけがヘテロ二量体の形成を促すためのこのような付加的配列（例えば、ＫコイルまたはＥコイル）を含むことができ、ＤＡＲＴは、抗原結合部位を含まないが、ヘテロ二量体形成を促すための相補的配列（例えば、ＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがＥコイルを含む場合にはＫコイル；またはＤＡＲＴの抗原結合ドメイン含有ポリペプチドがＫコイルを含む場合にはＥコイル）と所望により血清タンパク質と結合することができる血清結合タンパク質のポリペプチド部分とを有するポリペプチドを含むさらなる（例えば、第３の）ポリペプチドとの複合体を含む。このようなさらなる（例えば、第３の）ポリペプチドのこのような血清結合タンパク質のポリペプチド部分は、このような相補的配列を有するポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置することができる。
【０６０８】
当業者には自明であるように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく多数の改変および変形を行うことができる。本明細書に記載した具体的な実施形態は、単に例として示すものであって、本発明は、添付の特許請求の範囲とともにそのような特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲によってのみ限定される。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあるものとする。本明細書に引用される全ての特許および非特許の参照文献は、個々の刊行物または特許または特許出願の全内容があらゆる目的で参照により組み入れられることが具体的かつ個々に示される場合と同程度に、その全内容があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
0005964300.tif 000114
【図６Ａ】
0005964300.tif 000115
【図６Ｂ】
0005964300.tif 000116
【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
0005964300.tif 000118
【図７Ｂ】
0005964300.tif 000119
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005964300.tif 000127
【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
0005964300.tif 000131
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
0005964300.tif 000139
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
0005964300.tif 000143
【図２８】
0005964300.tif 000144
【図２９】
0005964300.tif 000145
【図３０】
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【図３１】
0005964300.tif 000147
【図３２】
0005964300.tif 000148
【図３３】
0005964300.tif 000149
【図３４】
0005964300.tif 000150
【図３５】
0005964300.tif 000151
【図３６】
0005964300.tif 000152
【図３７】
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【図３８】
0005964300.tif 000154
【図３９】
0005964300.tif 000155
【図４０】
0005964300.tif 000156
【図４１】
0005964300.tif 000157
【図４２】
0005964300.tif 000158
【図４３】
0005964300.tif 000159
【図４４】
0005964300.tif 000160
【図４５】
0005964300.tif 000161
【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
0005964300.tif 000166
【図４６Ｆ】
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【図４６Ｇ】
0005964300.tif 000168
【図４６Ｈ】
0005964300.tif 000169
【図４６Ｉ】
0005964300.tif 000170
【図４６Ｊ】
0005964300.tif 000171
【図４７Ａ】
0005964300.tif 000172
【図４７Ｂ】
0005964300.tif 000173
【図４８】
0005964300.tif 000174
【図４９Ａ】
0005964300.tif 000175
【図４９Ｂ】
0005964300.tif 000176
【図４９Ｃ】
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【図５０Ａ】
0005964300.tif 000178
【図５０Ｂ】
0005964300.tif 000179
【図５０Ｃ】
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【図５０Ｄ】
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【図５０Ｅ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５６Ｃ】
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【配列表】
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