(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気材料または磁化可能な材料、コロイド安定剤、治療用タンパク質、ならびに、１種以上のアニオン性脂質と１種以上の生体適合性多価カチオンとの間で形成される析出した複合体を含む治療用粒子であって、該治療用タンパク質が該析出した複合体の中に封入される、治療用粒子。
【請求項２】
前記磁気材料または前記磁化可能な材料が超常磁性材料である、請求項１に記載の治療用粒子。
【請求項３】
前記１種以上のアニオン性脂質がオレイン酸またはその塩を含む、請求項１に記載の治療用粒子。
【請求項４】
前記タンパク質が抗酸化酵素である、請求項１に記載の治療用粒子。
【請求項５】
前記抗酸化酵素がカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、請求項４に記載の治療用粒子。
【請求項６】
前記安定剤がビオチン化されている、請求項１に記載の治療用粒子。
【請求項７】
さらに、抗体を含む、請求項１に記載の治療用粒子。
【請求項８】
前記抗体が前記安定剤に連結されている、請求項７に記載の治療用粒子。
【請求項９】
前記抗体が、内皮細胞の表面上の抗原に特異的に結合し得るものである、請求項７に記載の治療用粒子。
【請求項１０】
細胞を酸化的損傷から保護するためのシステムであって、該システムは：
請求項１に記載の治療用粒子であって、前記治療用タンパク質が少なくとも１種類の抗酸化酵素を含む、治療用粒子；ならびに
該細胞に近位の該磁気材料または該磁化可能な材料を、該細胞が該粒子を内在化させることを可能にするのに充分な期間、磁化させ得る均一磁場を発生させるための磁場源
を含むシステム。
【請求項１１】
前記細胞が内皮細胞である、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記内皮細胞が血管内皮細胞である、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記少なくとも１種類の抗酸化酵素が、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
前記粒子が、さらに、前記細胞表面上の抗原に特異的に結合し得る抗体を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１５】
前記細胞が哺乳動物の体内に存在している、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１６】
治療用タンパク質を移植可能なデバイスへ磁気的に標的化させるためのシステムであって、該システムは：
（ａ）被験体内への移植のためのデバイス；
（ｂ）複数の請求項１に記載の治療用粒子；
（ｃ）磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場を発生させるための磁場源であって、該均一磁場は、該デバイスの近位に磁場勾配を発生させる、磁場源；ならびに
（ｄ）該デバイスに送達されなかった該複数の粒子のうちの１つ以上を該被験体から除去するための手段
を含み、ここで、
該デバイスが第２の磁気材料または磁化可能な材料を含み、
該勾配により、該複数の粒子の１つ以上が該デバイスに標的化される、
システム。
【請求項１７】
前記タンパク質が抗酸化酵素である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
前記抗酸化酵素が、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記複数の粒子の各々が請求項１に記載の粒子である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
前記デバイスがステントである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ステントが３０４ステンレス鋼で形成されている、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記磁場源が、前記均一磁場が発生するように動作可能な１対の電磁石を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２３】
前記磁場源が、前記均一磁場が発生するように動作可能な永久磁石を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２４】
前記第１の磁気材料または磁化可能な材料が超常磁性材料を含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２５】
前記複数の粒子が前記第１の磁気材料または磁化可能な材料およびパクリタキセルを含むものである、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２６】
さらに、パクリタキセルを含む、請求項１に記載の治療用粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の支援についての声明
開示された発明をもたらした研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、助成金第ＨＬ７２１０８号、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅおよびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、助成金第９９８４２７６号からの基金によって部分的に資金供与を受けた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般的に生物学的療法の分野に関する。より詳しくは、本発明は、磁化性の目的物の磁化を誘導するため、および磁場勾配を発生させるための均一磁場の使用に関する。得られた勾配は、被験体の体内での帯磁または磁化性のナノ粒子治療用薬剤の磁気による標的化のために使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
本明細書の至る箇所に種々の刊行物、例えば、特許、公開特許出願および学術論文を挙げている。これらの各刊行物は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
慣用的または非特異的様式で送達される治療用薬剤は、多くの場合、体内の指定していない領域に分布される。そのため、該薬剤は、例えば肝臓の初回通過代謝によって代謝され得、それによりバイオアベイラビリティの低下、ならびにコスト高および有害な副作用のリスクを伴う用量増大の可能性がもたらされ得る。また、治療用薬剤の非特異的分布により、投与対象の被験体において有害効果および不要な薬理学的応答がもたらされることがあり得る。その結果、特定の薬剤は、特定の被験体においてまたは特定の条件下では禁忌となり得る。
【０００５】
被験体内への医療用デバイスの移植には、例えば、感染の可能性を少なくするため、炎症を低減させるため、組織を修復させるため、またはさらなる局所組織の損傷を抑制するために、追跡化学療法が必要とされることがあり得る。薬物溶出デバイス（ステントなど）が、さまざまな生物医学的適用において、移植物の領域への薬物のターゲテッド（ｔａｒｇｅｔｅｄ）送達を達成するため、ますます使用されるようになってきている。しかしながら、現在までのところ、薬物含有移植物は、一般的にはほんの小用量の単一の治療用薬剤しか含んでおらず、したがって、移植型デバイスによって同じまたは異なる治療用薬剤が再投与される可能性がないため制限されている。
【０００６】
ナノ粒子およびマイクロ粒子は、さまざまな治療用薬剤、例えば、酵素補充療法のための酵素、ホルモン、細胞修飾剤および遺伝物質ならびにイメージングのための担体系としての可能性が示されている。部位特異的送達のためにナノ粒子およびマイクロ粒子を使用する最初の試みでは、一部において、必要とされる治療用薬剤の用量が少なくなるため、
投与対象の患者における有害効果が少なくなる可能性が示されている。
【０００７】
前述の論考は、担体系が、薬剤投与を最適化するための有望性、および場合によってはターゲテッド薬物送達のための媒体としての有望性を示すことを示す。しかしながら、かかる技術は、ターゲテッド送達の最適化が実際に達成できる可能性において限定的である。これに関連して、磁石による標的化が、薬剤、特に、ナノ粒子担体として処方されたもののターゲテッド送達の最適化を達成するための魅力的な方法であると考えられている。帯磁治療用薬剤または薬剤含有磁性担体を体内の特定の位置に送達する予備的な試みでは有望性が示されている（特許文献１参照）。しかしながら、この方法論は大きな欠点、すなわち、このアプローチは、体表面に近い標的に限られるという欠点を有する。
【０００８】
したがって、磁性担体を使用する最適化された有効な標的化の必要性が存在している。治療用システムにより、末梢ならびに局所投与が可能になること、および治療用システムにより、担当医が、患者において不要な効果が少なくなる用量の薬剤を投与することが可能になること、ならびに非特異的分布の可能性または高い必要用量のため他の方法では禁忌であり得る状況において患者への薬剤投与が可能になることが所望されている。さらに、患者に対する不要な効果の可能性をさらに低くするために、未使用または使用済の磁性担体を除去することができる必要性が存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，９２１，２４４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、治療用粒子を磁気的に標的化させるためのシステムを特長とするものである。一般的に、該システムは、少なくとも１種類の治療用薬剤および第１の磁気材料または磁化可能な材料を含む粒子、第２の磁気材料または磁化可能な材料を含む移植可能なデバイス（ステントなど）、ならびに第３の磁気材料または磁化可能な材料を含み、被験体に可逆的に取り付けられ得る回収（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）システムを含むものである。一部の態様では、該システムは、さらに、磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場が発生するように構成された少なくとも１つの磁場発生器を含む。均一磁場により、少なくとも１つの指向可能な（ｄｉｒｅｃｔａｂｌｅ）磁場勾配が発生し得る。該勾配により、該粒子が該デバイスに指向され得るとともに、使用済の粒子（あれば）または該デバイスに送達されなかった粒子が回収システムに指向され得る。磁場勾配は、該デバイスの近位および／または回収システム近位に発生し得る。治療用薬剤は、使用対象の治療目的に適した任意の薬剤であり得、とりわけ、医薬、生体分子または細胞を含むものであり得る。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、核酸（特に、調節核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）などの生体分子である。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、タンパク質（好ましくは酵素、より好ましくは抗酸化酵素）などの生体分子である。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、内皮細胞（特に、血管内皮細胞）などの細胞である。
【００１１】
また、本発明は、治療用粒子を移植型デバイス（ステントなど）に磁気的に標的化させることための方法を特長とするものである。一般的に、該方法は、移植型デバイスを有する被験体に、少なくとも１種類の治療用薬剤および第１の磁気材料または磁化可能な材料を含む粒子を投与すること、磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場を発生させること、および任意選択で、移植型デバイスに送達されなかった粒子を除去することを含むものであり得る。一部の態様では、均一磁場により、第２の磁気材料または磁化可能な材料を含む移植型デバイスの近位に磁場勾配が発生する。一部の態様では、該勾配により該粒子が、移植型デバイスに標的化される。該方法は、さらに、使用済の粒子を除去することを含んでいてもよい。治療用薬剤は、使用対象の治療目的に適した任意の薬剤であり得、とりわけ、医薬、生体分子または細胞を含むものであり得る。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、核酸（特に、調節核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）などの生体分子である。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、タンパク質（好ましくは酵素、より好ましくは抗酸化酵素）などの生体分子である。高度に好ましい一部の態様では、該薬剤は、内皮細胞（特に、血管内皮細胞）などの細胞である。
【００１２】
本発明の方法の一部の態様では、移植型デバイスに送達されなかった粒子の除去は、第３の磁気材料または磁化可能な材料を被験体に可逆的に取り付けること、および第３の磁気材料または磁化可能な材料の近位に第２の磁場勾配を発生させることを含む。第２の磁場勾配により該粒子が第３の磁気材料または磁化可能な材料に標的化され得る。第３の磁気材料または磁化可能な材料は、被験体の少なくとも１つの血管に可逆的に取り付けられることが高度に好ましい。他の態様では、移植型デバイスに送達されなかった粒子の除去には、被験体の血液を取り出すこと、該血液を第３の磁気材料または磁化可能な材料と接触させること、第３の磁気材料または磁化可能な材料の近位に第２の磁場勾配を発生させること、および該血液を該被験体に戻すことが含まれ得る。第２の磁場勾配により、該粒子が第３の磁気材料または磁化可能な材料に標的化され得る。好ましくは、戻された血液は該粒子を実質的に含有しておらず、より好ましくは該粒子を含有していない。
【００１３】
本発明の方法の一部の態様では、使用済の粒子の除去には、第３の磁気材料または磁化可能な材料を被験体に可逆的に取り付けること、および第３の磁気材料または磁化可能な材料の近位に第２の磁場勾配を発生させることが含まれ得る。第２の磁場勾配により、使用済の粒子が第３の磁気材料または磁化可能な材料に標的化される。他の態様では、使用済の粒子の除去には、被験体の血液を取り出すこと、該血液を第３の磁気材料または磁化可能な材料と接触させること、第３の磁気材料または磁化可能な材料の近位に第２の磁場勾配を発生させること、および該血液を該被験体に戻すことが含まれ得る。第２の磁場勾配により、使用済の粒子が第３の磁気材料または磁化可能な材料に標的化される。好ましくは、戻された血液は、使用済の粒子を実質的に含有していない。
【００１４】
また、本発明は、ナノ粒子の調製方法を特長とするものである。該方法は、モノカルボン酸脂肪酸の水溶性の塩または脂質一リン酸塩、安定剤（アルブミンまたはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（登録商標）など）、および少なくとも１種類の治療用薬剤を含む第１の水溶液を準備すること、ならびに第１の水溶液を、生体適合性の多価カチオン（カルシウムまたは亜鉛など）を含む第２の水溶液に添加することを含むものであり得る。治療用薬剤は、タキソールまたは全トランス型レチノイン酸であり得る。該脂肪酸の水溶性の塩または脂質一リン酸塩はオレイン酸ナトリウムであり得る。第１の水溶液は、さらに、磁性のナノ結晶を含んでいてもよい。第２の水溶液は、さらに、少なくとも１種類のカチオン性ポリペプチド（ポリ−Ｌ−アルギニンなど）を含んでいてもよい。一部の態様では、該方法は、さらに、第１の水溶液中において磁性のナノ結晶を形成させることを含む。
【００１５】
本発明は、さらに、治療用粒子を提供する。このような粒子は、安定剤、磁気材料または磁化可能な材料、脂肪酸またはその塩、およびタンパク質を含むものであり得る。磁気材料または磁化可能な材料は超常磁性材料であり得る。該脂肪酸は、任意の炭素数を含むものであり得、例えば、オレイン酸またはその塩、例えば、オレイン酸のカルシウム塩であり得る。タンパク質は酵素であり得、より好ましくは抗酸化酵素であり得る。抗酸化酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼであり得る。安定剤は、ビオチン化されたものであり得る。
【００１６】
治療用粒子は、さらに、１種類以上の抗体を含んでいてもよい。抗体により、特定の標的対象細胞または組織への該粒子のインビトロまたは好ましくはインビボでの送達が助長され得る。抗体は、該粒子内に直接組み込んでもよく、該粒子の表面上にコーティングしてもよい。抗体を、アビジンまたはストレプトアビジンに連結させ、該粒子内または該粒子上に、該粒子の１つ以上のビオチン化成分（例えば、ビオチン化安定剤）によって組み込んでもよい。抗体は、内皮細胞の表面上の抗原に特異的に結合するものであり得る。
【００１７】
また、本発明は、酸化的損傷、例えば、細胞が反応性の酸化性種に曝露されることによって引き起こされる酸化的損傷から細胞を保護するための方法を提供する。一般に、該方法は、細胞を、磁気材料または磁化可能な材料および少なくとも１種類の抗酸化酵素を含む粒子と接触させること、ならびに該磁気材料または磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場を、該細胞の近位に、該細胞が該粒子を内在化させることを可能にするのに充分な期間発生させることを含む。抗酸化酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼであり得る。該粒子は、さらに、該細胞表面上の抗原に特異的に結合する抗体を含んでいてもよい。該方法は、インビトロまたはインビボで行なわれ得る。細胞は、任意の細胞、例えば、上皮細胞または内皮細胞であり得る。好ましい細胞の一例は血管内皮細胞である。
【００１８】
本願は、一実施形態において、例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
磁気材料または磁化可能な材料、安定剤、脂肪酸またはその塩、およびタンパク質を含む治療用粒子。
（項目２）
前記磁気材料または前記磁化可能な材料が超常磁性材料である、項目１に記載の治療用粒子。
（項目３）
前記脂肪酸がオレイン酸またはその塩である、項目１に記載の治療用粒子。
（項目４）
前記タンパク質が抗酸化酵素である、項目１に記載の治療用粒子。
（項目５）
前記抗酸化酵素がカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、項目４に記載の治療用粒子。
（項目６）
前記安定剤がビオチン化されている、項目１に記載の治療用粒子。
（項目７）
さらに、抗体を含む、項目１に記載の治療用粒子。
（項目８）
前記抗体が前記安定剤に連結されている、項目７に記載の治療用粒子。
（項目９）
前記抗体が、内皮細胞の表面上の抗原に特異的に結合するものである、項目７に記載の治療用粒子。
（項目１０）
細胞を酸化的損傷から保護するためのシステムであって、該システムは：
磁気材料または磁化可能な材料および少なくとも１種類の抗酸化酵素を含む粒子；ならびに
該細胞に近位の該磁気材料または該磁化可能な材料を、該細胞が該粒子を内在化させることを可能にするのに充分な期間、磁化させ得る均一磁場を発生させるための磁場源
を含むシステム。
（項目１１）
前記細胞が内皮細胞である、項目１０に記載のシステム。
（項目１２）
前記内皮細胞が血管内皮細胞である、項目１１に記載のシステム。
（項目１３）
前記抗酸化酵素が、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、項目１０に記載のシステム。
（項目１４）
前記粒子が、さらに、前記細胞表面上の抗原に特異的に結合する抗体を含む、項目１０に記載のシステム。
（項目１５）
前記細胞が哺乳動物の体内に存在している、項目１０に記載のシステム。
（項目１６）
タンパク質を移植型デバイスへ磁気的に標的化させるためのシステムであって、該システムは：
（ａ）被験体内への移植のためのデバイス；
（ｂ）複数の粒子であって、各粒子は、第１の磁気材料または磁化可能な材料および該タンパク質を含む、複数の粒子；
（ｃ）磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場を発生させるための磁場源であって、該均一磁場は、該移植型デバイスの近位に磁場勾配を発生させる、磁場源；ならびに
（ｄ）該移植型デバイスに送達されなかった該複数の粒子のうちの１つ以上を該被験体から除去するための手段
を含み、ここで、
該移植型デバイスが第２の磁気材料または磁化可能な材料を含み、
該勾配により、該複数の粒子の１つ以上が該移植型デバイスに標的化される、
システム。
（項目１７）
前記タンパク質が抗酸化酵素である、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
前記抗酸化酵素が、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼである、項目１７に記載のシステム。
（項目１９）
前記複数の粒子の各々が項目１に記載の粒子である、項目１６に記載のシステム。
（項目２０）
前記移植型デバイスがステントである、項目１６に記載のシステム。
（項目２１）
前記ステントが３０４ステンレス鋼で形成されている、項目２０に記載のシステム。
（項目２２）
前記磁場源が、前記均一磁場が発生するように動作可能な１対の電磁石を含む、項目１６に記載のシステム。
（項目２３）
前記磁場源が、前記均一磁場が発生するように動作可能な永久磁石を含む、項目１６に記載のシステム。
（項目２４）
前記第１の磁気材料または磁化可能な材料が超常磁性材料を含む、項目１６に記載のシステム。
（項目２５）
前記複数の粒子が前記第１の磁気材料または磁化可能な材料およびパクリタキセルを含むものである、項目１６に記載のシステム。
（項目２６）
さらに、パクリタキセルを含む、項目１に記載の治療用粒子。
本特許または出願書類ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面を伴う本特許または特許出願公開公報の写しは、請求および手数料の支払いにより、米国特許より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａは、ナノ粒子（ＮＰ）粒径と安定剤の濃度との関係を示す。図１Ｂは、ナノ粒子（ＮＰ）の収率と安定剤の濃度との関係を示す。
【図２】図２は、ナノ粒子の量の関数としての、培養ラット大動脈平滑筋細胞増殖に対するタキソール負荷磁性ナノ粒子の効果を示す。
【図３−１】図３Ａは、ポリ−Ｌ−アルギニン処方物の量およびナノ粒子の用量の関数としての、培養ラット大動脈平滑筋細胞における導入遺伝子発現を示す。図３Ｂは、ポリ−Ｌ−アルギニン処方物の量およびナノ粒子の用量の関数としての、ウシ大動脈内皮細胞における導入遺伝子（緑色蛍光タンパク質，ＧＦＰ）発現を示す。
【図３−２】図３Ｃは、磁気曝露の関数としての、培養内皮細胞における導入遺伝子発現を示す。図３Ｄは、磁場ありまたはなしでの、２８５×１０６個のウイルス粒子／ウェルに相当する用量のポリ−Ｌ−アルギニン修飾ナノ粒子で処理した培養内皮細胞における導入遺伝子発現の動態を示す。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による例示的な磁気援用治療用システムを示す。
【図５】図５は、本発明の一実施形態による、治療用薬剤を移植型デバイスに投与するため、および移植型デバイスに局在化されなかった磁性担体ナノ粒子を回収するための例示的な方法を示すフローチャートを示す。
【図６】図６Ａは、赤色蛍光標識を有するアルブミン修飾磁性担体ナノ粒子を、血管内にスチールステントが移植されたラットに注射したという、磁気援用治療用システムの例示的な実施形態を要約したものである。図６Ｂは、移植型デバイス内への隔離に関する治療用薬剤の送達の結果を要約したものである。
【図７】図７は、心臓血管循環サイクルからの磁性担体ナノ粒子または細胞の回収をモデル設計するために使用される、図５に示した回収システムを模式的に要約したものである。
【図８】図８は、磁場勾配の影響下における担体ナノ粒子の指数関数的枯渇動態を要約したものである。
【図９】図９は、磁場勾配の影響下における担体細胞の指数関数的枯渇動態を要約したものである。
【図１０】図１０は、異なる磁性による隔離性立体配置が、図５に示す例示的な方法の実施で、どのように枯渇動態に影響を及ぼすかを要約したものである。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、アルブミン安定化超常磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）についての、透過電子顕微鏡検査および磁場に対する磁気モーメント（磁化曲線）の結果を要約したものである。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ＭＮＰ取込みの動態およびＭＮＰが負荷された細胞のバイアビリティに関するインビトロＭＮＰ細胞負荷試験を要約したものである。
【図１３−１】図１３Ａは、酸化鉄なしの大ナノ粒子（ＬＮＰ  Ｎｏｎ  Ｍａｇ，本明細書において対照として使用）と比べた、Ａ１０細胞における、ナノ粒子の量の関数としての、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（４８５ｎｍ／５３５ｎｍのλｅｍ／λｅｘでＧＦＰ蛍光として提示）をコードするＤＮＡとの組合せで、ポリエチレンイミンコートＭＮＰによって媒介されるレポーター遺伝子導入を示し、ここで、酸化鉄負荷ナノ粒子は、有機相において、０ｍｌのＴＨＦ（大ナノ粒子，ＬＮＰ）、３ｍｌのＴＨＦ（中ナノ粒子，ＭＮＰ）、または４．５ｍｌのＴＨＦ（小ナノ粒子，ＳＮＰ）を用いて調製した。図１３Ｂは、ＢＡＥＣ細胞における、ナノ粒子の量の関数としての４８５ｎｍ／５３５ｎｍで測定した相対蛍光を示す。
【図１３−２】図１３Ｃは、Ａ１０細胞における、ナノ粒子の量の関数としての６５０ｎｍ／６７０ｎｍで測定した相対蛍光で示した、蛍光（遠赤）標識ナノ粒子の内在化を示す。図１３Ｄは、ＢＡＥＣにおける、ナノ粒子の量の関数としての６５０ｎｍ／６７０ｎｍで測定した相対蛍光を示す。
【図１３−３】図１３Ｅは、Ａ１０細胞におけるナノ粒子の量の関数としての細胞の生存率を示す。図１３Ｆは、ＢＡＥＣ細胞におけるナノ粒子の量の関数としての細胞の生存率を示す。
【図１４】図１４は、磁場（５００Ｏｅ）の存在下で磁性ナノ粒子  により送達したｓｉＲＮＡによるレンチウイルス形質導入平滑筋細胞（Ａ１０）におけるｅＧＦＰ発現の抑制を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、３０４（左側のＹ軸）および３１６Ｌ（右側のＹ軸）グレードステンレス鋼ステントの磁化曲線を示す。３０４ステンレス鋼ステントは、わずかなヒステリシスと飽和磁化値の７％程度の残留磁気を示すほぼ超常磁気的挙動（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）を示す。比較すると、３１６Ｌステントが示す磁気応答はかなり低い。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、培養状態のＢＡＥＣの明視野での顕微鏡写真（倍率１００倍）、および９μｇ／ウェルのＭＮＰ適用用量での異なる時点における、細胞内に内在化されたＭＮＰの相対量を定性的に示す赤色蛍光画像を示す。緑色蛍光顕微鏡写真は、Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｇｒｅｅｎ染色で示した細胞バイアビリティを示す。
【図１６−１】図１６Ａは、１０００ガウスの均一磁場および３０ｍｌ／分の速度の非拍動流の存在下での、３０４グレードステンレス鋼ステントに対する磁気応答性ＢＡＥＣのインビトロ捕捉動態を示す。初期捕捉速度は１％細胞／分であると推定された。データは、内在化されたＭＮＰの蛍光を測定することにより取得した。図１６Ｂおよび１６Ｃは、それぞれ、内在化されたＭＮＰの赤色蛍光、または生細胞のＣａｌｃｅｉｎ  Ｇｒｅｅｎ染色で示された、３０４ステンレス鋼ステント上にインビトロで捕捉された磁気応答性ＢＡＥＣを示す。図１６Ｄは、ラット頚動脈内に留置した３０４ステンレス鋼ステント上にインビボで捕捉されたＭＮＰ負荷ＢＡＥＣを示す。蛍光ＭＮＰを予め負荷したＢＡＥＣを左心室（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃａｖｉｔｙ）に経胸腔注射した。動物を、１０００ガウスの磁場に５分間（注射期間を含む）曝露した。送達の５分後に動物を致死させ、外植したステントを蛍光顕微鏡検査によってすぐに検査した。図１６Ｅは、同一の手順に供した対照ラットを示し、この場合、磁場は使用しなかった。顕微鏡写真（ｂ〜ｅ）は倍率４０倍で取得した。
【図１６−２】図１６Ｆは、流れ停止条件下での、ラット頚動脈ステント留置モデルにおけるインビボでの磁性細胞局所送達を示す。カテーテルを外頚動脈から総頚動脈内に導入し、留置されたステントに対して遠位に配置した。細胞懸濁液は、孤立動脈セグメント内に１５秒間送達した。図１６Ｇは、非断続血流条件下でのインビボ細胞送達を示す。カテーテルを外頚動脈から総頚動脈内に導入し、ステントからさらに大動脈弓まで進めた。細胞を、この部位に１ｍｌ／分の速度で１分間注射した。両方の送達プロトコル（ｆおよびｇ）では、磁性群（Ｍａｇ＋）には、注射は、１０００ガウスの磁場に置いた動物に対して行ない、送達後、磁場を合計５分間維持した。対照ラット（Ｍａｇ−群）では、磁場を適用しなかった。どちらの設定でも、まず、ＢＡＥＣを培養状態でルシフェラーゼアデノウイルスにより形質導入し、次いで、ＭＮＰを負荷した。送達の４８時間、Ｐｌｕｒｏｎｉｃゲルと混和させたルシフェリンの血管周囲への局所投与によって動物をイメージングした。ルシフェラーゼの導入遺伝子発現によりステント留置動脈セグメントから放出されたシグナルは、磁場の存在下で該細胞を受けた動物（Ｍａｇ＋群）において有意に高かった。
【図１７】図１７は、ＭＲＩイメージング装置により、細胞標的化のための３１６Ｌスチールステントが磁化され得ることを示す。磁場の存在下（Ｍａｇ＋）では、赤色蛍光ポリ乳酸（ＰＬＡ）ＭＮＰを予め負荷したＢＡＥＣが帯磁スチールステントに局在していることが示されている。対照（Ｍａｇ−）では、ステントへの有意な局在は示されなかった。
【図１８−１】図１８Ａは、カタラーゼ負荷ＭＮＰのＴＥＭ画像である。図１８Ｂは、ＭＮＰの磁気的挙動を示すグラフである。
【図１８−２】図１８Ｃおよび１８Ｄは、ＭＮＰの粒径分布を示す棒グラフである。
【図１９】図１９Ａは、添加された質量に対する保持されたＳＯＤ活性の％を示す。図１９Ｂは、添加された質量に対する負荷ＳＯＤ質量の％を示す。図１９Ｃは、質量負荷に対する分子数／粒子の計算値を示す。
【図２０】図２０Ａは、１２５Ｉ−カタラーゼの放射性追跡によって測定したカタラーゼの添加に対する負荷を示す。図２０Ｂは、経時的な２４２ｎｍにおけるＨ２Ｏ２吸光度の低下によって測定した負荷カタラーゼの活性を示す。
【図２１】図２１Ａは、０．２ｗｔ％のＰｒｏｎａｓｅ（３７℃で１時間振盪）によるタンパク質分解から保護された質量に対するＭＮＰに添加されたカタラーゼの質量を示す。図２１Ｂは、３７℃で０．２ｗｔ％のＰｒｏｎａｓｅに曝露した時間に対する時間に対するＭＮＰ内に負荷したカタラーゼの（−●−）活性、および３７℃で０．２ｗｔ％のＰｒｏｎａｓｅに曝露した時間に対する時間に対する遊離カタラーゼの（−○−）活性を示す。
【図２２】図２２は、３７℃での経時的な血漿中におけるＭＮＰの安定性を示す。カタラーゼの放出は、１２５Ｉ−カタラーゼの放射性追跡によって測定した。ＭＮＰは、グルコース水溶液（５％）または血漿とともに３７℃で経時的にインキュベートした。カタラーゼの放出は、遊離カタラーゼを粒子から遠心分離し、マイクロ遠心機濃縮フィルター上に保持されたＭＮＰに対する上清み中の活性を測定することにより測定した。（−●−）グルコース溶液中で希釈したＭＮＰから放出されたカタラーゼ。（−○−）全ヘパリン化マウス血漿中で希釈したＭＮＰから放出されたカタラーゼ。
【図２３−１】図２３Ａは、１０分間のＭＮＰの磁性送達の位相差顕微鏡写真を示す。図２３Ｂは、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８標識カタラーゼを含む１０分間のＭＮＰの磁性送達の蛍光顕微鏡写真を示す。図２３Ｃは、５分間のＭＮＰ磁性送達を示す。
【図２３−２】図２３Ｄおよび２３Ｅは、磁場なしの１０分間のＭＮＰ送達を示す。図２３Ｆは、ＭＮＰなしの対照を示す。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、カタラーゼ負荷ＭＮＰの磁性送達による酸化的ストレスからのＨＵＶＥＣの保護を示す。
【図２５】図２５は、粒子の形成および合成を示す。
【図２６】図２６は、ビオチン化ＭＮＰの親和性を示す。
【図２７】図２７は、カタラーゼ負荷ＭＮＰの磁性送達による酸化的ストレスからのＨＵＶＥＣの保護、および抗体−ターゲテッド送達による酸化的ストレスからのＨＵＶＥＣの保護を示す。
【図２８】図２８は、マウスにおける尾静脈注射後のＡｂ６２修飾ＭＮＰと対照ＩｇＧ修飾ＭＮＰ（対比）の体内分布を示す。尾静脈注射された抗ＰＥＣＡＭ標識ＭＮＰは、肺内皮を特異的に標的化する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、本発明の方法および他の態様に関する種々の用語を使用している。かかる用語は、特に記載のない限り、当該技術分野において通常の意味を示すものとする。具体的に定義した他の用語は、本明細書に示した定義と整合するように解釈されたい。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文中にそうでないことを明示していない限り、複数の指示対象物を含む。したがって、例えば、「粒子（ａ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」に対する言及は、２種類以上の粒子の組合せなどを含む。
【００２２】
用語「約」は、測定可能な値（例えば、量、時間など）に言及する場合に本明細書で用いる場合、明示した値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意図する。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」とも称し、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであっても修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。ポリヌクレオチドとしては、限定されないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡ（これは、一本鎖であり得るか、またはより典型的には、二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域の混合物であり得る）を含むハイブリッド分子が挙げられる。また、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域をいう。また、ポリヌクレオチドという用語は、１つ以上の修飾塩基および安定性または他の理由で修飾された主鎖を有するＤＮＡまたはＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。修飾塩基としては、例えば、トリチル化塩基および非通常塩基（イノシン）が挙げられる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対して行なわれ得る；したがって、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態（自然界に典型的にみられるもの）、ならびにウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、ポリヌクレオチドは、多くの場合、オリゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００２４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合（すなわち、ペプチドイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ））によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質をいう。ポリペプチドは、短鎖（一般的に、ペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される）、および長鎖（一般的にタンパク質と称される）のどちらも示す。ポリペプチドは、２０種類の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含むものであってもよい。ポリペプチドには、天然のプロセス（翻訳後プロセッシングなど）または当該技術分野でよく知られた化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列が含まれる。かかる修飾は、基本的な教科書に充分に記載されており、特定分野の研究論文ならびに多くの研究文献に、より詳細に記載されている。修飾は、ポリペプチド内の任意の箇所、例えば、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノ末端またはカルボキシ末端に行なわれ得る。所与のポリペプチド内のいくつかの部位に同じ度合または種々の度合で、同じ型の修飾が存在していてもよいことは認識されよう。また、所与のポリペプチドに多くの型の修飾が含まれていてもよい。
【００２５】
注記されている場合を除き、「被験体」または「患者」は、互換的に用いており、任意の動物をいうが、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、ならびにコンパニオンアニマル、家畜または実験動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ブタ）などをいう。ヒトが最も好ましい。
【００２６】
「有効量」または「治療有効量」は、本明細書において互換的に用いており、具体的な生物学的結果、例えば限定されないが、本明細書において開示、記載または例示した生物学的結果（当該技術分野における適当な任意の手段によって測定）が達成されるのに有効な本明細書に記載の治療用薬剤の量をいう。
【００２７】
「薬学的に許容され得る」は、性質および／または物質が薬理学的／毒物学的観点から患者にとって、ならびに組成物、処方物、安定性、患者の許容性およびバイオアベイラビリティに関する物理的／化学的観点から製造担当の薬化学者にとって許容され得ることをいう。「薬学的に許容され得る担体」は、治療用薬剤（１種類または複数種）の生物学的活性の有効性を妨げず、投与対象の宿主に対して毒性でない媒体をいう。
【００２８】
本発明により、磁化性の目的物の磁化を誘導するため、および磁場勾配を発生させるために均一磁場を使用することによって、治療用薬剤が体内の特定の位置に標的化され得ることが見い出された。さらに、磁気による標的化は、任意の型の治療用薬剤に対して、例えば、医薬または化学物質の化合物、生体分子および細胞に対して利用され得ることが見いだされた。したがって、本発明は、治療用薬剤を体内の１箇所以上の所望の位置に、磁気的に標的化させるためのシステムおよび方法を特長とするものである。
【００２９】
一態様において、該システムは、治療用処方物の一部として供給される治療用薬剤を含むものである。治療用処方物は有効量の治療用薬剤と粒子を含むものであり得、該粒子は、磁気材料または磁化可能な材料を含むものであり得る。好ましくは、該粒子はナノ粒子である。関連する該粒子と該治療用薬剤は、本明細書において同義的に治療用粒子と称する。磁性ナノ粒子は、永久磁性である粒子、および外部磁場に曝露されると磁化性であるが、磁場を除くとその磁化が失われるものを包含する。磁場に曝露されると磁性または磁化性であり、磁場を除くとその磁性を失う物質を、本明細書において超常磁性材料と称する。該粒子の不可的逆な凝集が抑制される超常磁性粒子が好ましい。好適な超常磁性材料の例としては、限定されないが、鉄、混合型酸化鉄（マグネタイト）、またはガンマ酸化第二鉄（マグヘマイト）、ならびにさらなる元素（亜鉛など）を含む置換マグネタイトが挙げられる。好ましくは、超常磁性材料は、少なくとも１つの寸法が≦１００ｎｍである１種類以上のナノ結晶の形態、例えば、単一ドメインの結晶性の系である。ナノ結晶は、少なくとも１つの寸法が≦１００ｎｍであり、単一の結晶単位（ｃｒｕｓｔａｌ−ｕｎｉｔ）で形成されており、そのため、すべての要素がｃ軸およびａ軸の同一の結晶方位を有し、１つの単位として過剰成長している単結晶性（“ｓｉｎｇｌｅｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ”または“ｍｏｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ”）である任意のナノ材料である。結晶性の領域を示す粒子はいずれも、大きさに基づいてナノ粒子またはナノクラスターと称され得る。
【００３０】
強磁性の結晶は、ミクロンサイズの帯磁ドメインで構成されたものであり得る。超常磁性は、結晶サイズが強磁性ドメイン（約３０ｎｍ）よりも小さい場合に起こり得る。超常磁性は温度に依存性であり得る。一部の条件下では、温度により磁力が不安定化されることがあり得る。なんら特定の理論または作用機序に限定されることを意図しないが、熱エネルギーにより超常磁性材料に存在する磁気モーメントの整列が妨げられ得ると考えられる。適用した磁場を除いても、超常磁性材料の磁気モーメントは依然として存在しているが、高速運動状態であり、ランダムな向きまたは不規則な磁気モーメントが引き起こされ、したがって、正味の磁場はない。生物学的系およびＭＲイメージング装置の適用磁場の温度では、超常磁性材料は、その強磁性の対応物よりも磁性が低い。例えば、小さい超常磁性酸化鉄の磁力は高温で減少することが注目されている（Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚら（１９６８）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３９：１２６１）。
【００３１】
超常磁性のナノ結晶は、粒径がとりわけ、調製方法および媒体組成に応じて約１ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲であり得る。好ましくは、ナノ結晶は、物質の超常磁性を確保するため１０〜２０ｎｍより小さいものである。より好ましくは、ナノ結晶は約５ｎｍ〜約２０ｎｍである。
【００３２】
一部の態様では、該粒子は複合ナノ結晶である。複合ナノ結晶は、１種類より多くの個々の磁性または磁化性のナノ結晶と、結晶同士を保持する１種類以上の水不溶性生体適合性材料とを含むものであり得る。生体適合性材料は、生分解性であっても非生分解性であってもよいポリマーであり得る。かかるポリマーの非限定的な例としては、ポリ（ウレタン）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（スチレン）、ポリ（アミド）、ゴム、シリコーンゴム、ポリ（アクリロニトリル）、ポリ（アクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（エーテル−エステル）、ポリ（ラクトン）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（無水物）、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリ（ヒドロキシ酪酸）、ポリ（テトラフルオロエチレン）、ポリ（エチレンテレフタレート、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、その混合物ならびに対応するモノマーのコポリマーが挙げられる。
【００３３】
超常磁性のナノ結晶が組み込まれたポリマーナノ粒子は、当該技術分野において適当な任意の手段に従って調製され得る。例えば、該ナノ粒子は、超常磁性のナノ結晶を、該ポリマーおよび／または治療用薬剤が溶解されている有機溶媒に分散させること、有機相を適当な安定剤の存在下にて水中で乳化させること、ならびに最後に溶媒を除去して固化したナノ粒子を得ることにより調製され得る。ナノ粒子調製の条件は、結合させる治療用薬剤に対して損傷を与えないものであるのがよい。ナノ粒子調製のための温度は、好ましくは約２５℃〜約３７℃の範囲であるが、より高い温度またはより低い温度も使用され得る。生物学的適用のための超常磁性ナノ粒子の調製方法の非限定的な例は、米国特許第７，１７５，９１２号および同第７，１７５，９０９号、ならびに米国特許出願公開公報番号２００５０２７１７４５に記載されている。磁性ナノ粒子、磁性ナノ粒子の開発のための情報、および磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の調製のための試薬は市販されている。
【００３４】
該粒子は、アニオン脂質（例えば、脂肪酸または脂質リン酸塩）と生体適合性の多価カチオンの塩／複合体で構成されたものであってもよい。該粒子は、穏やかな条件でコロイド安定剤の存在下にてそれぞれの水溶液を合わせることによって形成され得、したがって、有機溶媒の使用が回避され、外部からの機械的エネルギー導入の必要がない。
【００３５】
一部の好ましい態様では、該粒子は、生体吸収性のナノ粒子、例えば、高エネルギー分散または有機溶媒の使用を伴うことなく調製されるものである。生体吸収性のナノ粒子は、少なくとも１種類のアニオン脂質の塩、少なくとも１種類の治療用薬剤、および少なくとも１種類の磁気材料または磁化可能な材料で構成されたものであり得る。
【００３６】
生体吸収性のナノ粒子を調製するために第１の水溶液を準備する。第１の水溶液は、ｉ）モノカルボン酸脂肪酸の水溶性の塩もしくはその塩、または脂質リン酸塩／ホスホン酸塩、ｉｉ）安定剤、およびｉｉｉ）治療用薬剤を含むものである。例示的な可溶性の塩としては、限定されないが、リチウム、ナトリウム、アンモニウム、およびカリウムの塩が挙げられる。脂肪酸塩の水溶液は、例えば、脂肪酸と塩基（水酸化ナトリウムなど）を水に添加し、該脂肪酸を溶解させることにより調製され得る。
【００３７】
使用され得る脂肪酸としては、８個以上の炭素原子、特に８〜３０個の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖、飽和および不飽和モノカルボン酸脂肪酸が挙げられる。典型的なモノカルボン酸脂肪酸としては、カプリル酸（オクタン酸）、２−エチルオクタン酸、カプリン酸（デカン酸）、２−エチル−デカン酸、１１−ウンデセン酸、ウンデカン酸、２−エチル−ドデカン酸、シス−５−ドデセン酸、ラウロレイン酸（シス−９−ドデカン酸）、トラウマチン酸（２−ドデセン酸）、ラウリン酸（ドデカン酸）、ブラシル酸（トリデカン酸）、２−エチル−テトラデカン酸、ミリストレイン酸（シス−９−テトラデカン酸）、ツズ酸（シス−４−テトラデセン酸）、ミリスチン酸（テトラデカン酸）、ペンタデカン酸、２−エチル−ヘキサデカン酸、パルミトレイン酸（シス−９−ヘキサデカン酸）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）、ヘプタデカン酸、マルガリン酸（ヘプタデカン酸）、ペトロセリン酸（シス−６−オクタデセン酸）、２−エチル−オクタデカン酸、オレイン酸（シス−９−オクタデセン酸）、エラジン（トランス−９−オクタデセン酸）、アスクレピン酸（シス−１１−オクタデセン酸）、バクセ酸（トランス−１１−オクタデセン酸）、タキソール酸（シス，シス−５，９−オクタデカジエン）、リノール酸（シス，シス−９，１２−オクタデカジエン酸）、リノレン酸（シス，シス，シス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）、ステアリン酸（オクタデカン酸）、ツベルクロステアリン酸（１０−メチルオクタデカン酸）、ノナデカン酸、２−エチル−エイコサン酸、アラキドン酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、シス−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、ガドレイン酸（シス−９−エイコセン酸）、ゴンド酸（シス−１１−エイコセン酸）、アラキン酸（エイコサン酸）、２−オクチルドデカン酸、エルカ酸（シス−１３−ドコセン酸）、ベヘン酸（ドコサン酸）、トリコサン酸、セラコレイン酸（シス−１５−テトラコサン酸）、リグノセリン酸（テトラコサン酸）、キシメン（ｘｉｍｅｎｉｃ）酸（シス−１７−ヘキサコセン酸）、およびヘキサコサン酸が挙げられる。特に好ましい脂肪酸はオレイン酸である。脂肪酸の塩、例えば、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の塩、ならびにアンモニウム塩なども使用され得る。
【００３８】
脂肪酸の択一例として、脂質リン酸塩、例えば、８個以上の炭素原子、より好ましくは８〜３０個の炭素原子を有するアルコールの水溶性一リン酸塩塩が使用され得る。かかるリン酸塩としては、α−トコフェロールリン酸二ナトリウム塩、オレイルリン酸二ナトリウム塩、および８個以上の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖、飽和および不飽和モノアルコールのリン酸エステルの二ナトリウム塩、例えば、ｎ−デカノール、ｎ−ドデカノール、ｎ−テトラデカノール、ｎ−ヘキサデカノール、およびｎ−オクタデカノールのリン酸エステルの二ナトリウム塩が挙げられる。
【００３９】
また、ヒドロキシ酸、例えば、１１−ヒドロキシ−ウンデカン酸、リシノール酸（１２−ヒドロキシ−シス−９−オクタデセン酸）、レスクエロール酸（１４−ヒドロキシ−シス−１１−エイコセン酸：２０：１−ＯＨ）、デンシポリン酸（１２−ヒドロキシ−シス，シス−９，１５−オクタデカジエン酸）アウリコール酸（１４−ヒドロキシ−シス，シス−１１，１７−エイコサジエン酸）、９，１０−ジヒドロキシオクタデカン酸、９，１４−ジヒドロキシオクタデカン酸、およびフェロン（ｐｈｅｌｌｏｎｉｃ）酸（２２−ヒドロキシドコサン酸）ならびにその塩も使用され得る。
【００４０】
また、脂質リン酸塩、例えば、８個以上の炭素原子、より好ましくは８〜３０個の炭素原子を有するアルコールの水溶性一リン酸塩塩も使用され得る。かかるリン酸としては、α−トコフェロールリン酸二ナトリウム塩、オレイルリン酸二ナトリウム塩、および８個以上の炭素原子を有する直鎖および分枝鎖、飽和および不飽和モノアルコールのリン酸エステルの二ナトリウム塩、例えば、ｎ−デカノール、ｎ−ドデカノール、ｎ−テトラデカノール、ｎ−ヘキサデカノール、およびｎ−オクタデカノールのリン酸エステルの二ナトリウム塩が挙げられる。
【００４１】
コロイド安定剤またはコロイド安定剤の混合物を、脂肪酸塩の水溶液またはポリカチオンを含む水溶液に添加してもよい。コロイド安定剤は、ナノ粒子上に吸着され、それにより該粒子が凝集するのを電荷的または立体的に保護すると考えられる物質である。好適な安定剤としては、二次コロイド（ゼラチン、アガー−アガー、デンプンなど）、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースなど）、ならびにタンパク質（アルブミンなど）が挙げられる。また、非イオン界面活性剤（ポリエチレンオキシド、エチレンオキシド／プロピレンオキシド  ブロックコポリマー、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤など）、およびソルビトールのエステルのエトキシル化脂肪酸エステル（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（ｓｔｅｒａｔｅ）（ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８５）など）も使用され得る。好ましい安定剤はアルブミンである。ＰＬＵＲＯＮＩＣは、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標であり、ＴＷＥＥＮはＣｒｏｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣの登録商標である。
【００４２】
この第１の水溶液に、生体適合性の多価の金属または有機カチオンの水溶性の塩を含む第２の水溶液が添加され得る。カチオンは、使用される量でレシピエントに対して無毒性である場合、また、レシピエント身体に対して有意な有害なまたは不要な効果が存在しない場合、生体適合性である。有用な生体適合性の多価カチオンとしては、限定されないが、Ａｌ＋３、Ｃａ＋２、Ｍｇ＋２、Ｚｎ＋２、Ｂａ＋２、Ｓｒ＋２、Ｆｅ＋２、およびＣｕ＋２、ポリアルギニン、プロタミンが挙げられる。好ましい生体適合性の多価カチオンとしては、Ｃａ＋２およびＺＮ＋２が挙げられる。
【００４３】
生体吸収性粒子の粒径は、安定剤、脂質の塩、および生体適合性の多価カチオンの量を調整することにより、容易に制御され得、具体的な適用に対して適合され得る。該粒子は一般的には親油性であり、疎水性の治療用薬剤に対して高い親和性を示すものであるが、粒子形成の過程において、水溶性のイオン性治療用薬剤をその水不溶性の塩／複合体として封入してもよい。脂質の塩および生体適合性の多価カチオンの性質および量は、得られる粒子の相対親油性を調整するため、変更されることがあり得る。
【００４４】
また、カチオン性ペプチド、カチオン性タンパク質、またはカチオン性ペプチドおよび／またはカチオン性タンパク質の混合物を、金属ポリカチオンを含む第２の水溶液に同時添加してもよい。好ましいカチオン性ペプチドは、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８５％の塩基性アミノ酸残基（アルギニン、リジン、およびグアニジンなど）を含んでおり、５個より多くの（ｍｏｒｅ  ｔｈｅｎ）アミノ酸残基、好ましくは約１０〜約１０００個の残基を含むものである。より好ましいカチオン性ペプチドとしては、ポリ−Ｌ−アルギニンなどのアルギニン高含有ポリペプチドが挙げられる。より好ましいペプチドは、プロタミンなどのアルギニン高含有タンパク質である。また、グアニジニウム高含有タンパク質も使用され得る。また、ポリエチレンイミンなどの合成有機ポリカチオン（ポリペプチド様物質）も使用され得る。
【００４５】
生体吸収性のナノ粒子は、その構造内に磁気応答性ナノ結晶が含まれることによって（例えば、該粒子の形成前に、かかる結晶の微細懸濁液（磁性流体）をアニオン脂質溶液と合わせることにより）磁性となり得る。磁性流体は、担体液（水など）に懸濁されたナノスケールの強磁性粒子で構成されたものである。かかるナノ粒子の調製は、１）アニオン脂質の存在下で磁性のナノ結晶の微細懸濁液（磁性流体）を作製すること、および２）安定剤と治療用薬剤の存在下でのアニオン脂質と多価カチオンとの制御析出によってナノ粒子を形成することからなる２工程プロセスである。一態様において、磁性ナノ粒子は、オレイン酸安定化磁性流体とＣａ＋２との制御凝集によって調製される。
【００４６】
磁性流体を調製するため、水溶性第二鉄（Ｆｅ＋３）塩（塩化第二鉄六水和物など）と水溶性第一鉄塩（Ｆｅ＋２）（塩化第一鉄四水和物など）を含む水溶液を、塩基（水酸化ナトリウム水溶液など）を用いて析出させ、磁性のナノ結晶を含むマグネタイト析出物を形成させる。脂肪酸の水溶性の塩（オレイン酸ナトリウムの水溶液など）を添加し、磁性のナノ結晶を、例えば不活性雰囲気中（アルゴン下など）で加熱することにより再懸濁させる。アルブミンなどの安定剤を治療用薬剤とともに、磁性のナノ結晶、安定剤、モノカルボン酸脂肪酸の水溶性の塩および治療用薬剤を含む第１の水溶液、または生体適合性の多価カチオンを含む第２の水溶液のいずれかに添加してもよい。次いで、第２の溶液が添加され、磁性ナノ粒子が形成される。
【００４７】
一部の態様では、治療用薬剤は、予備形成したナノ粒子の表面に結合またはテザーリングされ得る。該結合は、該薬剤が使用される治療適用に適した任意の手段によるもの、または該薬剤もしくはナノ粒子の化学的特性によるものであり得る。例えば、結合は、吸着、静電相互作用、電荷錯化（ｃｈａｒｇｅ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ）、または共有結合、例えば、生体分子テザーの使用によるものであり得る。治療用薬剤とナノ粒子との会合のための手順の非限定的な例は、米国特許第７，０８１，４８９号、同第６，０４８，５１５号、同第６，５７６，２２１号、および同第６，７６７，６３５号に記載されている。該結合は、連結分子によるものであってもよい。連結分子のペアの非限定的な一例としては、アビジンまたはストレプトアビジンとビオチン、チオールとスクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、あるいはその適当な改変体またはアイソフォーム、および葉酸化合物と葉酸受容体が挙げられる。
【００４８】
治療用薬剤と会合している磁性ナノ粒子は、粒径が約５０〜約５００ｎｍの範囲であり得る。粒径は、適切な可変部（あれば）に応じて異なり得る。好ましくは、ナノ粒子は、粒径が約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、より好ましくは約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲である。
【００４９】
該粒子は誘導体化してもよく、誘導体化が助長されるように該粒子の表面を修飾してもよい。例えば、該粒子は、チオール反応性光活性化性ポリマーでコーティングされ得る。放射線照射により、該表面へのポリマーの共有結合が助長され得、続いて、そのチオール反応性基が薬剤結合に使用され、血液循環中でのステルス特性および／または標的組織に対する特異的結合がもたらされ得る。バイオマテリアルの結合のための表面光化学的活性化は、米国特許出願公開公報番号２００６０１４７４１３に記載されている。
【００５０】
治療用薬剤と会合している粒子の循環時間の延長は、該粒子を生体適合性の親水性ポリマー（ポリエチレングリコールもしくはデキストランなど）でコーティングすることにより、または該粒子を、該粒子表面へのオプソニンの結合を阻害するアルブミンでコーティングすること被験体の免疫機構によるオプソニン作用およびクリアランスを抑制することにより達成され得る。
【００５１】
修飾粒子の調製は、当該技術分野において適当な任意の手段に従って進行され得る。例えば、磁気応答性の薬剤である酸化鉄が作製され得る。適当な有機溶媒での酸化鉄の微細懸濁液は、典型的には、以下のようにして得られる：塩化第二鉄と塩化第一鉄を含む水溶液を、水酸化ナトリウムの水溶液と混合する。析出物をオレイン酸で、エタノール中９０℃での短いインキュベーションによってコーティングする。析出物をエタノールで１回洗浄して遊離酸を除去し、クロロホルム中に分散させる。
【００５２】
得られたクロロホルム中の酸化鉄の有機分散液を用いて、生分解性のポリマー、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはそのポリエチレングリコールコンジュゲート（ＰＬＡ−ＰＥＧ）を溶解させ、したがって有機相を形成させる。この有機相をアルブミン水溶液（１％）中で、氷浴での超音波処理によって乳化させた後、有機溶媒をエバポレーションする。該粒子を未結合アルブミンから、磁性沈降／再懸濁の反復サイクルによって分離する。
【００５３】
択一的な態様では、形成後表面修飾が使用され得る。例えば、該粒子は、光反応性ポリマー（例えば、ＰＢＰＣ／ＰＢＭＣ、ポリアリルアミン−ベンゾフェノン−ピリジルジチオ／マレイミド−カルボキシレートポリマー）を安定剤として水相中で用いて形成され得る。続いて、短時間の紫外線照射により、磁性ナノ粒子への該ポリマーの共有結合を行なう。得られた粒子を懸濁状態でチオール化ポリエチレングリコールと反応させ、これにより、該粒子径および表面修飾の程度に対して、より良好な制御が可能である。
【００５４】
治療用薬剤としては、該粒子と会合することができ、本発明のシステムおよび方法において使用され得る任意の分子が挙げられる。該薬剤は、精製された分子、実質的に精製された分子、化合物の混合物の１種類以上の成分である分子、または化合物と任意の他の物質との混合物であり得る。該薬剤は、有機もしくは無機化学薬品、放射性同位体、医薬化合物、医薬用の塩、プロドラッグ、または生体分子、ならびにそのあらゆる断片、アナログ、ホモログ、コンジュゲートおよび誘導体であり得る。生体分子としては、限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質、多糖、単糖、ならびにそのあらゆる断片、アナログ、ホモログ、コンジュゲートおよび誘導体が挙げられる。また、該薬剤は、未知の構造の単離された生成物、いくつかの既知生成物の混合物、または１種類以上の化合物を含む未規定の組成物であってもよい。未規定の組成物の例としては、細胞抽出物および組織抽出物、原核生物細胞、真核生物細胞および古細菌細胞を培養した増殖培地、醗酵ブロス、タンパク質発現ライブラリーなどが挙げられる。また、該薬剤は、１種類以上の細胞（例えば、真核生物または原核生物の細胞）であってもよく、１種類以上のウイルスであってもよい。治療用薬剤を、担体（薬学的に許容され得る担体など）と会合させて、または別の様式で提供してもよい。
【００５５】
また、治療用薬剤としてはウイルスベクター系も挙げられ、これは遺伝子療法に使用される。開発中のいくつかのウイルスベクター系、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび単純疱疹ウイルス。対象遺伝子を適切な細胞株に導入する最も成功裡の方法の一例は、組換えアデノウイルスを使用するものである。アデノウイルスは、約７０ｎｍの直径を有する無エンベロープ粒子であり、およそ３６，０００塩基対の線形の二本鎖ＤＮＡを含むものである。これは、高い力価を有するものが容易に調製され、広範な細胞（例えば、非分裂細胞）に感染させることができる。また、組換えアデノウイルスは、免疫応答を誘起する遺伝子産物を発現させることによりワクチン接種にも使用され得る。
【００５６】
アデノ随伴ウイルスは２０ｎｍの粒子直径を有する。レトロウイルスは、約８０ｎｍ〜約１００ｎｍの直径の粒子直径を有する球形のエンベロープをもつ粒子である。レトロウイルスはＤＮＡ送達用のベクターとして広く使用されている。単純疱疹ウイルスは、約１００ｎｍの粒子直径を有し、エンベロープをもつおよそ１５０，０００塩基対の二本鎖ＤＮＡウイルスを含むものである。このウイルスは、外来遺伝子に対して大きな負荷能を有し、広範な細胞に感染することができる。また、このウイルスゲノムは、感染後もエピソーム性のままであり、したがって、宿主ゲノムの日和見性の悪性挿入性変異誘発の可能性が排除される。ヘルペスウイルスは、中枢神経系への特定の遺伝子導入の治験において利用されている。
【００５７】
多種類の薬剤を該粒子に含めてもよい。当業者は、例えば、処置対象の病状または具体的な被験体のニーズに基づいて、薬剤の具体的な組合せを決定することができよう。例えば、主薬剤の活性をモジュレートする、痛みを低減させる、治療用細胞の増殖を補助する、抗トロンボゲン形成剤、抗アポトーシス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤もしくは抗酸化剤である、または当該技術分野において対象の疾患を処置するために通常使用されている他の薬剤であるさらなる薬剤が使用され得る。
【００５８】
また、治療用薬剤は、徐放媒体中で、またはデポー調製物に処方され得る。例えば、該薬剤は、適当なポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば、許容され得る油での乳剤として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいはやや溶けにくい誘導体（例えば、やや溶けにくい塩）として処方され得る。リポソームおよび乳剤は、疎水性薬物用の担体としての使用に適したよく知られた例である。
【００５９】
一部の好ましい態様では、治療用薬剤は酵素である。例えば、抗酸化酵素が使用され得る。抗酸化酵素としては、限定されないが、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、およびグルタチオンペルオキシダーゼが挙げられる。タンパク質の他の例としては抗体が挙げられる。該粒子が使用される目的に適した任意の抗体を含めることができる。抗体は治療用薬剤であってもよく、標的化対象組織への該粒子の誘導を補助するために使用されるものであってもよい。
【００６０】
一部の好ましい態様では、治療用薬剤は調節核酸である。例えば、調節核酸は、転写後遺伝子サイレンシング（ＲＮＡサイレンシング）を助長するために使用され得る。ＲＮＡサイレンシングは、ＲＮａｓｅ  Ｈ系酵素による二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の２１〜２８ヌクレオチドの小断片へのプロセッシングを伴う。該切断産物はｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）またはｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）であり、これは、遺伝子発現を配列特異的様式で調節する。調節核酸は、例えば、転写およびプロセッシングされて調節ＲＮＡとなるＤＮＡとして投与されるプラスミドまたは他の適当なベクターの一部であってもよい。
【００６１】
したがって、ｓｉＲＮＡは、およそ１９ヌクレオチド長の二本鎖領域とともに、各鎖に１〜２ヌクレオチドの３’突出端を有し、全長がおよそ２１〜２３ヌクレオチドとなっているＲＮＡ分子を含むものであり得る。本明細書で用いる場合、ｓｉＲＮＡには、インビボでプロセッシングされるとかかる分子が生成され得る種々のＲＮＡ構造も含まれる。かかる構造としては、互いにハイブリダイズして幹部、ループ、および任意選択で突出端（好ましくは、３’突出端）を形成する２つの相補的な要素を含むＲＮＡ鎖が挙げられる。好ましくは、幹部はおよそ１９ｂｐ長であり、ループは約１〜２０、より好ましくは約４〜１０、最も好ましくは約６〜８ｎｔ長である、および／または突出端は約１〜２０、より好ましくは約２〜１５ｎｔ長である。本発明の一部の特定の実施形態では、幹部は最低限１９ヌクレオチド長であり、およそ２９ヌクレオチド長までであり得る。４ヌクレオチド以上のループは、それより短いループよりも立体拘束に供されにくく、したがって、好ましいものであり得る。突出端としては、５’ホスフェートおよび３’ヒドロキシルが挙げられ得る。突出端は、複数のＵ残基、例えば、１〜５個のＵ残基を含むものであり得るが、そうである必要はない。
【００６２】
ｍｉＲＮＡは、典型的にはおよそ２０〜２６ヌクレオチド長、例えば、２２ｎｔ長である。これは、スモール・テンポラル（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ）ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）として知られる大きな前駆体またはｍＲＮＡ前駆体（これは、典型的には、およそ７０ｎｔ長であり、およそ４〜１５ｎｔのループを有する）に由来するものであると考えられる。
【００６３】
また、細胞の細胞質内で低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセッシングされる低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするウイルスベクターまたはＤＮＡベクターも使用され得る。所望の特定のｓｉＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドが標的細胞に送達され、続いて、例えば、ウイルス媒介性感染によって内在化され得る。細胞内に入ると、該ＤＮＡ配列は、分子内塩基対合によってループ状になってヘアピン構造が形成されたＲＮＡ分子に連続的に転写される。このようなヘアピン構造は、細胞によってプロセッシングされると、トランスフェクトｓｉＲＮＡ分子に相当し、該細胞によって所望のタンパク質のＲＮＡｉを媒介するために使用される。ｓｈＲＮＡの使用は、ｓｉＲＮＡと比べて、前者では、安定で長期間のタンパク質発現の阻害がもたらされ得るという利点を有する。長期のタンパク質阻害が必要な場合、治療用薬剤としてｓｈＲＮＡが好ましい。
【００６４】
一部の好ましい態様では、治療用薬剤は１種類以上の細胞である。例えば、細胞は、幹細胞（分娩後由来細胞もしくは骨髄由来細胞など）であり得るか、または前駆細胞、血中派生内皮細胞（Ｂｌｏｏｄ  Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）（ＢＯＥＤ）、成人血液および臍帯血幹細胞（ＣＢＳＣ）、人工多能性幹細胞、例えば、少なくとも１つの内皮表現型を有する細胞に分化するさらなる可能性を有する多能性幹細胞に形質転換されるようにプログラムされた皮膚細胞であり得る。一部の例示的な態様では、細胞は血管内皮細胞などの血管細胞である。内皮細胞は、自己由来、異種、または血液、骨髄もしくは組織生検材料のいずれかに由来するものであり得る。組織生検を行なう内皮細胞は、動脈、静脈、脂肪組織、または内皮細胞もしくはその前駆細胞を含む可能性を有する任意の他の組織に由来するものであり得る。
【００６５】
一部の態様では、該システムは、移植可能なデバイスを含むものである。当該技術分野において既知であるか、または使用されている任意の移植可能なデバイスが本発明のシステムにおいて使用され得る。適当な移植可能なデバイスの非限定的な例としては、ステント、心臓弁、縫合針金、一時的人工関節および泌尿器拡張器、整形外科用移植物、例えば、関節プロテーゼ、ネジ、ステープル、クギ、ナット、ボルト、プレート、ロッド、ピン、ワイヤ、インサータ、オステオポート（ｏｓｔｅｏｐｏｒｔ）、ハロシステム（ｈａｌｏ  ｓｙｓｔｅｍ）ならびに脊椎および長骨骨折の安定化もしくは固定または関節離断術のために使用されている他の整形外科用デバイスが挙げられる。他のデバイスとしては、非整形外科用デバイス、一時的留置物および永久移植物、例えば、気管瘻孔形成術用デバイス、ドレナージ管、空腸造瘻術および胃造瘻術用チューブ、尿道内および他の尿生殖器用移植物、スタイレット、拡張器、血管用クリップおよびフィルター、ペースメーカー、皮下移植血管カテーテルのワイヤガイドおよびアクセスポート、電子チップ、送信／受信マイクロ電子移植物、移植可能な薬物送達マイクロデバイス、移植可能なバイオセンサー、移植可能なマイクロビデオデバイス、ならびに移植可能なマイクロバッテリーデバイスが挙げられる。高度に好ましい移植可能なデバイスはステントである。ステントは薬物溶出ステントであり得る。
【００６６】
好ましくは、移植可能なデバイスは磁気材料または磁化可能な材料を含むものである。より好ましくは、かかる磁気材料または磁化可能な材料は生体適合性である。生体適合性となるようにデバイスを修飾してもよい。例えば、生体適合性を改善するための金属支持体の表面修飾は、米国特許出願公開公報番号２００３／００４４４０８に記載されている。
【００６７】
ステンレス鋼、例えば、Ｇｒａｄｅ  ３０４  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌは、移植可能なデバイスに使用され得る材料の好ましい非限定的な一例である。他の例としては、２００−シリーズオーステナイトクロム−ニッケル−マンガン合金および３００−シリーズオーステナイトクロム−ニッケル合金が挙げられる。
【００６８】
該デバイスは、被験体の体内の任意の場所に移植され得る。一部の好ましい態様では、該デバイスは、被験体の血管系、例えば、静脈、動脈または毛細血管などの血管内に移植される。ステントが使用される場合、ステントは、任意の管内（肝管、胆管など）、消化系（食道、胃、腸、もしくは結腸など）の一部、呼吸器系（気管もしくは気管支など）の一部、または排出系（尿管、尿道、もしくは腎排出管など）の一部に移植され得る。他の移植物としては、眼球用移植物および放射性シードが挙げられる。
【００６９】
一部の態様では、該システムは、回収システムを含むものであり得る。一般に、回収システムは、標的部位に到達しなかった治療用粒子を捕捉して内包するため、および治療用薬剤が標的部位に送達された後の粒子（本明細書において、同義的に使用済の粒子と称する）を捕捉して内包するために使用され得る。未使用または使用済の粒子は、被験体の血中に進入または残留し得る、および被験体に不要な効果をもたらし得る。被験体に対するリスクを最小限にするため、かかる未使用および／または使用済の粒子を除去することが好ましい。回収システムは、好ましくは、身体または体内の特定の体液、器官、付属器などが使用済または未使用の粒子を実質的に含有しなくなるように、ほとんどの、より好ましくは実質的にすべての未使用および／または使用済の粒子を捕捉して内包する。
【００７０】
一部の好ましい態様では、回収システムは磁気材料または磁化可能な材料を含むものである。該材料は、当該技術分野において適当な任意の形態で備えられ得る。例えば、該材料は、ロッド、プレート、ビーズ、チューブ、ワイヤ、パネル、フィルター、スクリーン、メッシュなどであり得る。具体的な形態（幾何構造）は重要でなく、可変量（あれば）の数に応じて異なり得る。
【００７１】
回収システムは、好ましくは生体適合性である。回収システムを構成するために使用され得る好適な材質としては、限定されないが、３１６Ｌステンレス鋼などのステンレス鋼が挙げられる。また、４００−シリーズステンレス鋼（例えば、４３０−グレード）も、一部の場合で、例えば、回収システムの材質の長期的な腐食性の可能性が懸念されない短期使用の場合に使用され得る。
【００７２】
好ましくは、回収システムは、被験体に可逆的に取り付けられるように構成される。回収システムは被験体に、該システム全体が使用される治療的使用に応じた適当な身体上の任意の位置に可逆的に取り付けられ得る。例えば、回収システムは、体表面または特定の内部器官、骨もしくはシステムに可逆的に取り付けられ得る。好ましくは、回収システムは、少なくとも１つの血管、より好ましくは、血液が回収システム内に直接流入することが可能となるように血管内腔に可逆的に取り付けられる。循環系は流れが速くて充分に近接される系であり、したがって、回収システムの取り付けに高度に好ましい。
【００７３】
一部の態様では、回収システムは被験体に間接的に取り付けられる。例えば、被験体の生体液を取り出し、回収システムと接触させ得る。生体液としては、限定されないが、血液、脳脊髄液、腹水液、胆汁、羊水、乳汁、唾液、歯肉滲出液、尿、粘液、腎液などが挙げられ得る。該粒子を生体液から隔離した後、生体液は被験体に戻され得る。血液は特に好ましい生体液である。したがって、例えば、被験体の血液を身体から取り出し、回収システムと接触させ、輸血によって体内に戻し得る。血液は、分離してその成分に分けてもよく、全血のままであってもよい。
【００７４】
回収システムに指向された該粒子は、当該技術分野において適当な任意の手段に従って処理され得る。該粒子は、回収システムに指向された後、回収システムにより被験体から除去され得る。
【００７５】
少なくとも１種類の治療用薬剤および少なくとも１種類の磁気材料または磁化可能な材料を含む粒子は、磁場によって体内の１箇所以上の所望の位置に、例えば、体内の１つ以上の移植型デバイスに標的化される。したがって、本発明のシステムは磁場発生器を含むものであり得る。磁場発生器は、外部磁石を含むもの、例えば、磁気共鳴イメージングデバイスであり得る。一部の態様では、磁場発生器は、少なくとも１つの指向可能な磁場勾配が発生するように構成されたものである。磁場勾配により、該粒子が移植可能なデバイスに指向され得る。磁場勾配により、該デバイスに送達されなかった粒子が回収システムに指向され得るか、または使用済の粒子、すなわち、成功裡に送達され、治療用薬剤が枯渇した粒子が回収システムに指向され得る。単一の磁場勾配を、該粒子を移植可能なデバイスに指向させるために使用し、次いで、残存している未使用または使用済の粒子が回収システムに指向されるように再構成してもよい。あるいはまた、多数の勾配を発生させ、少なくとも１つの勾配を粒子の移植型デバイスへの指向に、少なくとも１つのさらなる勾配を粒子の回収システムへの指向に使用してもよい。該勾配は、該移植型デバイスの近位に発生され得、回収システムの近位にも発生され得る。
【００７６】
図４および５を参照すると、例示的な磁気援用治療用システム１００が示されている。治療用システム１００は、哺乳動物被験体（図示せず）に移植させたデバイス１０４、被験体に対して外部に、移植型デバイス１０４に対して近位に指向される磁場勾配が発生するように構成された磁場発生器１０６、および被験体に投与された治療用粒子１０２を含む。デバイス１０４は、哺乳動物被験体の血管系内に移植された血管用デバイスであり得る。
【００７７】
また、本発明により、被験体内または被験体上の１つ以上の所望の位置に治療用粒子を磁気的に標的化させるための方法が特長とされる。一部の好ましい態様では、該方法は、被験体に移植させたデバイスへの治療用粒子の磁気による標的化に適用可能である。
【００７８】
該方法は、少なくとも１種類の生体適合性の磁気材料または磁化可能な材料を含む移植型デバイスを有する被験体に、少なくとも１種類の治療用薬剤および少なくとも１種類の磁気材料または磁化可能な材料を含む治療用粒子を投与すること、該移植型デバイスの近位に磁場勾配を発生させること（ここで、該勾配により該粒子が該移植可能なデバイスに標的化される）、ならびに該移植可能なデバイスに送達されなかった粒子を除去することまたは使用済の粒子を除去することを含むものであり得る。
【００７９】
治療用薬剤は、本明細書において記載または例示した任意の分子、例えば限定されないが、医薬、生体分子または細胞であり得る。移植型デバイスは、当該技術分野において使用され、知られ、あるいは適した任意のデバイス（本明細書において記載または例示したものなど）であり得る。
【００８０】
一部の好ましい態様では、該方法は、特定の細胞または組織への治療用粒子の磁気による標的化に適用可能である。この方法は、インビトロで行なわれ得、好ましくはインビボで行なわれ得る。したがって、例えば、治療用粒子は、被験体の体内の特定の位置に磁気的に標的化され得る。該位置に移植型デバイスを有している必要はない。磁場が、該粒子を所望の位置に誘導するために使用され得、所望の位置の具体的な細胞による治療用粒子の内在化を助長するために使用され得る。
【００８１】
一部の詳細な態様では、この方法は、酸化的損傷から細胞を保護するために使用され得る。したがって、例えば、酸化的損傷から細胞を保護するための方法は、細胞を、磁気材料または磁化可能な材料および少なくとも１種類の抗酸化酵素を含む粒子と接触させること、ならびに該磁気材料または磁化可能な材料を磁化させ得る均一磁場を、該細胞の近位に、該細胞が該粒子を内在化させることを可能にするのに充分な期間発生させることを含む。細胞はインビトロであってもインビボであってもよい。細胞は、内皮細胞、例えば血管内皮細胞であり得る。抗酸化酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼであり得る。該粒子は、さらに、該細胞表面上の抗原に特異的に結合する抗体を含んでいてもよい。したがって、該抗体は、適正な標的細胞への標的化を助長するために使用され得る。
【００８２】
被験体への治療用粒子の投与は、注入または注射（静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内など）によるものであり得る。また、該粒子は、鼻腔内、膣内、直腸内、口腔内、経口または経皮投与され得る。好ましくは、該組成物は静脈内投与される。投与は医師の指示でなされ得る。該粒子は移植型デバイスの近位に投与しても遠位に投与してもよい。
【００８３】
口腔内投与のためには、該組成物には、慣用的な様式で処方される錠剤、トローチ剤またはロゼンジ剤の形態が採用され得る。経口または口腔内投与のための組成物は、該粒子の制御放出がもたらされるように処方され得る。かかる処方物には、当該技術分野で知られた１種類以上の徐放剤（グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアレートおよびワックスなど）が含まれ得る。
【００８４】
該粒子を経表面的に適用してもよい。かかる投与としては、表皮、口腔、目、耳および鼻への該粒子の外用が挙げられる。経表面投与における使用のための該粒子としては、例えば、皮膚からの浸透に適した液状またはゲル調製物、例えば、クリーム剤、リニメント剤、ローション剤、軟膏またはペースト剤、および目、耳または鼻への送達に適した滴剤が挙げられる。
【００８５】
種々の択一的な医薬送達システムが使用され得る。かかるシステムの非限定的な例としては、リポソームおよび乳剤が挙げられる。また、ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も使用され得る。さらに、該粒子は、治療用薬剤を含有する固形ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放システムを用いて送達され得る。利用可能な種々の徐放物質が当業者によく知られている。徐放カプセルでは、その化学的性質に応じて、該粒子は、数日間から数週間、数ヶ月にわたって放出され得る。
【００８６】
また、該粒子を処置対象の病状に対する具体的な有用性のために選択される他のよく知られた治療用薬剤と共投与してもよい。例えば、かかる治療用薬剤は、鎮痛薬、血液希釈剤／抗凝固剤、クロットバスター、胃の制酸薬、または該粒子の不要な効果が少なくなる化合物であり得る。
【００８７】
このようなさらなる化合物の投与は、該粒子の投与と同時であってもよく、必要に応じて該粒子の投与の前または後のいずれかで相前後して投与してもよい。併用療法に含められる種々の化合物が互いに数分以内、数時間以内、数日以内または数週間以内に投与される任意の適当なプロトコルが考案され得る。また、サイクルプロトコルでの反復投与も本発明の範囲に含まれることが想定される。
【００８８】
該粒子の投与後、移植型デバイスによる治療用粒子の捕捉が、ある期間行なわれる。磁性粒子の送達持続期間は、任意の数の可変量、例えば限定されないが、被験体の種、血統、体格、身長、体重、年齢、全体的な健康状態、治療用薬剤の型、該粒子の組成、投与の（ｏｒ）様式（ｍｏｄｅ／ｍａｎｎｅｒ）、または処置対象の病状の型もしくは重症度に依存性である。使用される該粒子の適切な有効量は、当業者によって、常套的な最適化技術ならびに実行者の技術および情報に基づく判断ならびに当業者に自明の他の要素を用いて常套的に決定され得る。好ましくは、本明細書に記載の粒子の治療有効用量は、被験体に対して実質的な毒性が引き起こされることなく、治療上の有益性がもたらされる用量である。
【００８９】
該粒子の治療レジメンは、該粒子の少ない投薬量から開始し、その後、処置過程において、その状況下で最適効果が達成されるまで投薬量が増大され得る。必要であれば、総日投薬量を分け、その日中に分割して投与してもよい。
【００９０】
具体的な病状の有効な処置のため、当業者には、処置対象の被験体に充分な投薬スケジュールおよび投薬量が推奨され得る。投与は、１日１回〜４回またはそれ以上で必要なだけ長期間行なわれることが好ましい場合があり得る。また、投薬スケジュールは活性薬剤の濃度に応じて異なり得、該濃度は被験体のニーズに依存し得る。
【００９１】
本発明の方法は、標的化治療薬に適した任意の病状を処置するために使用され得る。該方法は、血管の病状の処置、例えば、金属ステント血管形成術の追跡治療に特に良好に適している。
【００９２】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明するために示す。本実施例は、本発明を例示することを意図し、限定するものでない。
【実施例】
【００９３】
実施例１
アニオン脂質の塩で構成された非磁性および磁性の安定化ナノ粒子の調製
非磁性のオレイン酸カルシウム系ナノ粒子を調製するため、オレイン酸（１００ｍｇ）を１４．８ｍｇの水酸化ナトリウムを含有する５ｍｌの水溶液に、４０℃まで穏やかに加熱しながら溶解させることによりオレイン酸ナトリウムを形成した。この水性オレイン酸ナトリウムにアルブミン溶液（１０％、０．４ｍｌ）を添加した。塩化カルシウム水溶液（５ｍｌ中１１１ｍｇ）を滴下すると、チンダル効果による特徴的な青みがかったオパール色を示すナノ粒子形成がもたらされた。ナノ粒子径は、光子相関分光法により測定すると２３０±２０ｎｍであった。
【００９４】
磁性のオレイン酸カルシウム系ナノ粒子を２工程手順によって以下のようにして調製した。混合型酸化鉄（マグネタイト）の安定な水性懸濁液を調製するため、塩化第二鉄六水和物と塩化第一鉄四水和物（それぞれ、１００ｍｇおよび５０ｍｇ）を４ｍｌの脱イオン水に溶解させ、１．６ｍｌの水性水酸化ナトリウム（１Ｍ）により析出させる。次いで、得られた析出物にオレイン酸ナトリウム（５ｍｌの脱イオン水中１５０ｍｇ）を添加する。マグネタイト析出物をナノ結晶の形態で、アルゴン下で９０℃まで加熱し、超音波処理（各工程で５分ずつ）を２回繰り返して再懸濁させると磁性流体が形成される。オレイン塩安定化コロイド状マグネタイトを含有する１ｍｌの得られたオレイン酸ナトリウム溶液にウシ血清アルブミン（２００μｌ，１０％ｗ／ｖ）を安定剤として添加し、塩化カルシウム（３３．３ｍＭ，１．５ｍｌ）を滴下して穏やかに撹拌するとナノ粒子が形成される。該粒子を磁石上に沈降させることによって洗浄し、続いて水に再懸濁させる。また、該粒子を、抗凍結剤としての１０％ｗ／ｖのトレハロース溶液中でフリーズドライした後に凍結乾燥状態で保存してもよい。
【００９５】
図１Ａは、安定剤の濃度を変えることにより、得られるナノ粒子の粒径を調整できることを示す。図１Ｂは、安定剤の濃度を変えることにより、得られるナノ粒子の収率を調整できることを示す。
【００９６】
実施例２
磁性ナノ粒子への親油性の中性薬剤の組込み
この実施例は、タキソールなどの親油性の中性薬剤を、小容量の生体適合性の水混和性溶媒中のその濃縮溶液を、アニオン脂質と安定剤を含有する磁性流体に添加することによる、該薬剤の磁性ナノ粒子に組込むことを示す。
【００９７】
タキソール負荷ナノ粒子を実施例１の場合のようにして調製した。タキソール（１０μｌのジメチルホルムアミド中１．０ｍｇ）を、アニオン脂質と安定剤を含有する磁性流体に添加し、ナノ粒子を実施例１の場合のようにして単離した。
【００９８】
磁場（５００Ｇ）下で１５分間のインキュベーション後の培養ラット大動脈平滑筋細胞の増殖に対するタキソール負荷磁性ナノ粒子の効果を、薬物を含有していない同等用量のナノ粒子との比較において、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（λ励起＝５４０ｎｍ、λ発光＝５７５ｎｍ）を用いて調べた。細胞を９６ウェルプレートに１０％コンフルエンシーで播種し、３日後、薬物処方物の量の関数として細胞増殖を測定した。
【００９９】
図２は、ナノ粒子の量の関数としての培養ラット大動脈平滑筋細胞の増殖に対するタキソール負荷磁性ナノ粒子の効果を示す。この図からわかるように、対照ナノ粒子が有する平滑筋細胞の増殖に対する刺激効果は弱いが、タキソールナノ粒子で処理した細胞の増殖は用量依存的様式で阻害され、適用した最も高い用量で、未処理細胞と比べて約３０％減少した。
【０１００】
実施例３
全トランス型レチノイン酸負荷磁性ナノ粒子の調製
上記の処方方法は、イオン性化合物をその水不溶性複合体として含むことによるナノ粒子の調製に適している。抗癌剤である全トランス型レチノイン酸（ａｔＲＡ）ナトリウム塩は、カルシウムと容易に複合体を形成するアニオン脂質であり、ナノ粒子に組み込むことができるイオン性物質の一例を示す。
【０１０１】
ａｔＲＡ含有処方物を、以下の改良を伴って実施例２に記載のようにして調製した。マグネタイト水性分散液を、１００ｍｇのオレイン酸ナトリウムを含有する４ｍｌの水で調製した。全トランス型レチノイン酸（５０ｍｇ）を１ｍｌの水性水酸化ナトリウム（６．７ｍｇ）に溶解させ、マグネタイト分散液に添加した後、アルブミンの存在下で塩化カルシウムを滴下した。
【０１０２】
実施例４
アデノウイルス含有磁性ナノ粒子の調製
アデノウイルスが封入された磁性ナノ粒子は、ナノ粒子の形成工程前に、オレイン酸ナトリウム溶液含有磁性流体、またはＣａ２＋もしくはＺｎ２＋溶液のいずれかにアデノウイルスを添加することにより作製され得る。以下の実施例において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする５０μｌのアデノウイルス（５×１０１２粒子／ｍｌ）を磁性流体に添加し、該粒子内へのアデノウイルスの取込みを行なった。
【０１０３】
アデノウイルス含浸ナノ粒子を９６ウェルプレート上に６００〜２億８５００万個のウイルス粒子／ウェルに相当する用量で播種したコンフルエントな平滑筋細胞に、磁場ありまたはなしで３０分間適用した。処理の３日後、細胞内のＧＦＰ蛍光定量することにより（λ励起＝４８５ｎｍ、λ発光＝５３５ｎｍ）遺伝子発現をアッセイした。
【０１０４】
実施例５
カチオン性ペプチドの存在下での磁性ナノ粒子の形成
形質導入効率のさらなる改善は、１種類以上のカチオン性ペプチドまたはタンパク質、特に、アルギニン高含有ポリペプチドと、ポリ−Ｌ−アルギニンまたはプロタミンなどのタンパク質を、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛の溶液に共添加することによって達成され得る。このようなペプチドとタンパク質を用いたナノ粒子の修飾により、細胞内取込みが助長され、したがって、封入されたアデノウイルスのより効率的な内在化がもたらされ、導入遺伝子発現の増大がもたらされる。ポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩（分子量は約７０，０００Ｄａ）をナノ粒子に組み込むと、培養ラット大動脈平滑筋細胞およびウシ大動脈内皮細胞のどちらにおいても、アデノウイルス遺伝子導入の用量依存的増大がもたらされる。
【０１０５】
細胞をコンフルエンスで９６ウェルプレートに播種し、０〜２．２５ｍｇのポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩の添加により調製した漸増用量のアデノウイルス含浸ナノ粒子（２９０±２０ｎｍ）で、磁場の存在下で１５分間処理した。ＧＦＰの発現を、３日目に蛍光定量的に測定した。
【０１０６】
図３は、ポリ−Ｌ−アルギニン処方物の量およびナノ粒子の用量の関数としての、培養ラット大動脈平滑筋細胞およびウシ大動脈内皮細胞（それぞれ、図３Ａおよび図３Ｂ）における導入遺伝子の発現を示す。磁気曝露ありおよびなしでの培養内皮細胞における導入遺伝子の発現を図３Ｃに示す。磁場ありまたはなしで２８５×１０６ウイルス粒子／ウェルに相当する用量のポリ−Ｌ−アルギニン修飾ナノ粒子で処理した培養内皮細胞における導入遺伝子の発現の動態を図３Ｄに示す。ここに培養内皮細胞で示されるように（図３Ｃ）、磁場の非存在下では、かなり低い遺伝子導入速度が観察された。
【０１０７】
実施例６
ナノ粒子の磁気勾配標的化
赤色蛍光標識を有するアルブミン修飾磁性ナノ粒子を、６ｍｍ長のグレード３０４ステンレス鋼ステントを既に留置しておいたラットの尾静脈に注射した（図６Ａ）。Ｇｒａｄｅ  ３０４  Ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  Ｓｔｅｅｌ（「３０４スチール」）は、移植可能なデバイスにおける使用の歴史を有する。３０４スチールで作製された市販のステントはないが、ステント設計を行ない、医療用デバイスの企業と契約して実験における使用のための一連のこのようなステントが製作された。したがって、ここの報告する試験のすべてで、現在商業的に使用されているステントを用いたわけではなかった。
【０１０８】
このラット試験において、３０４ステントを、ステントに対して磁場ありおよびなしの両方で調べた。また、ステントなしでも磁性ナノ粒子を動物に注射し、ステント留置なしで局在が起こるかどうかを確認するために調べた。
【０１０９】
方法：パクリタキセルを、マグネタイト負荷ナノ粒子（ＭＮＰ）のポリ乳酸（ＰＬＡ）マトリックス中に分散させた。アデノウイルステザーリングＭＮＰを、光化学的表面活性化を用いて調製し、続いて、組換えアデノウイルス結合タンパク質Ｄ１に結合させた後、ナノ粒子−アデノウイルス複合体を形成させた。プラスミドベクターをＰＥＩ官能化ＭＮＰと電荷により会合させた（ｃｈａｒｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅ）。種々の磁場強度およびフロー条件下でのスチールメッシュおよびステント上へのＭＮＰの磁性トラップを、閉鎖回路のフローシステムにおいて試験した。磁性ナノ粒子と会合させた遺伝子ベクターを用いたトランスフェクション／形質導入を平滑筋（ＳＭＣ）および内皮細胞において試験した。レポーター遺伝子会合ＭＮＰおよび事前に留置したステント上のＭＮＰ負荷細胞の磁力駆動性の局在ならびにその結果の導入遺伝子の発現をラット頚動脈ステントモデルで試験した。
【０１１０】
プロトコル（図６Ａ）：４００μｌの磁気応答性蛍光標識ポリ乳酸系マグネタイト負荷ナノ粒子を、麻酔を導入した４８０〜５１０ｇのラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝６））に静脈内注射した（尾静脈から）。マグネタイト負荷ナノ粒子は３５０ｎｍであり、注射１回あたり７．２ｍｇで構成した。この注射は、動物の細網内皮系を飽和させて、肝臓および脾臓での２番目に主要な用量のナノ粒子の過剰な捕捉を抑制するために行なった。
【０１１１】
最初の注射の３０分以内に、３０４スチールステントを左の総頚動脈内に留置した。その直後、さらなる４００μｌ用量のナノ粒子を、動物の首に隣接して配置した２つの電磁石によって発生させた３００Ｇの磁場ありまたはなしのいずれかで静脈内注射した。注射後、磁場を５分間維持した後、動脈を回収した。ステントを除き、ステント上および動脈の管腔側面上のナノ粒子の堆積を蛍光顕微鏡検査によって調べた。それぞれの画像の取得後、ＢＯＤＩＰＹ標識（赤色蛍光）ＰＬＡをアセトニトリル中に抽出させ、その濃度を較正曲線から蛍光定量的に測定した。蛍光の対照／バックグラウンドの目的のため、もう１匹のラットではナノ粒子を注射せず、ステント留置動脈を取り出し、同様に処理してバックグラウンド蛍光値を得た。
【０１１２】
結果：閉鎖回路のフローシステムでは、ＭＮＰおよびＭＮＰ負荷細胞は磁性メッシュ上に指数関数的動態的にトラップされた。３１６Ｌステンレス鋼グリッド上で培養したラット大動脈ＳＭＣ（Ａ１０）では、ＭＮＰ−ＡｄＧＦＰに曝露した場合、対照と比べて遺伝子形質導入の１００倍の増大が示された。パクリタキセルＭＮＰでは、培養状態でのＡ１０細胞の増殖の阻害が示された。ラットへのＭＮＰの全身性の静脈内注射により、外部磁場（３００Ｇ）の存在下で行なった場合では、対照と比べて動脈内ステント上への７倍高いＭＮＰ局在がもたらされた。
【０１１３】
この試験の結果を図６Ｂ（蛍光定量，５４０／５７５ｎｍ）に示すとともに、蛍光顕微鏡検査により（図示せず）、留置３０４ステントへの磁性ナノ粒子の強い局在が示され、また、ステントに直接的に近位の動脈の壁への磁性ナノ粒子の局在も示された。また、特異的蛍光アッセイを使用し、この方法論を用いた静脈内注射後の磁性ナノ粒子の有意な局在を定量化した。
【０１１４】
結論：ステント留置動脈に対する高い磁場勾配を用いた薬物／遺伝子送達の磁性標的化
により、初期投与だけでなく、反復投与でもステント留置動脈壁へのベクターの磁場媒介性局在が利用できる可能性のため、大きな有望性がもたらされる。この結果は、電磁場とともに全身性の静脈内送達を行なった群では、「磁場なし」対照と比べてステント上および隣接動脈組織上へのナノ粒子の堆積が有意に高いことを明白に示す。非ステント留置動脈では、磁場ありまたはなしでナノ粒子の局在は示されなかった。
【０１１５】
実施例７
残留ナノ粒子および細胞の磁性トラップおよび除去
この実施例は、外部磁気応答性スチールフィルターでの残留ナノ粒子および細胞の除去を示す（「磁性トラップ」）。図７は、循環系からの磁性ナノ粒子または細胞の回収をモデル設計するために使用される回収システム１０８（図４）を模式的に要約したフローシステム４００を示す。図７に示すように、フローシステム４００は、磁性トラップ４０２（残留ナノ粒子を捕捉するための４３０ステンレス鋼メッシュを有するエッペンドルフ型）、磁場を発生させるための電磁石４０４、蠕動ポンプ４０６、撹拌器４０８、および流れをサイクルＡまたはサイクルＢに指向するための蛇口４１０を含む。適当な蠕動ポンプ４０６、撹拌器４０８および蛇口４１０（一般的には、アフェレーシス装置用のもの）は、本明細書の記載から当業者に理解されるであろう。
【０１１６】
以下の実験プロトコルを使用し、「磁性トラップ」装置を用いて、それぞれ磁性ナノ粒子および細胞の捕捉の動態を調べた。
【０１１７】
ＰＬＡ−ＰＥＧ系磁性ナノ粒子を５０ｍｌの５％グルコース溶液中で希釈し、均一な粒子径が確保されるように濾過した（５μｍカットオフ）。あるいはまた、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）をコンフルエンスまで培養し、強い磁場（５００ガウス）を発生させる細胞培養磁石（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｌｋ  Ｇｒｏｖｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＩＬ）上の蛍光標識磁性ナノ粒子とともに２４時間インキュベートした後、細胞を新鮮細胞培養培地中で洗浄し、再懸濁させた。未処理細胞を対照として使用した。
【０１１８】
フローシステム４００に、それぞれ５％グルコースまたは細胞培養培地をパージした（洗浄工程）後、ループＡの１サイクルのナノ粒子／細胞懸濁液を行ない、システムを平衡化した（プライミング工程）。次に、ナノ粒子／細胞懸濁液を、１ないし３つの４３０ステンレス鋼メッシュ片（それぞれ、総重量は０．３０±０．０１および０．８３±０．０５ｇ）が取り付けられたトラップデバイス４０２と２つのソレノイド電磁石４０４によって発生する８００ガウスの外部磁場とを含むループＢに再指向した。ｔ０試料を抜き取り、さらに参照として使用した（１００％のＮＰ／細胞）。それぞれ、ナノ粒子および細胞の回収実験の２．５時間および３５分間の間に、所定の時点でさらなる試料を収集した。磁場曝露の効果を、それぞれ、ナノ粒子および細胞の実験の最初の２５分および３分間（その後、磁場を適用した）に使用した「磁場なし」条件との比較において調べた。所与の時点で循環系に残留しているＮＰ／細胞の割合を、参照試料と関連させて蛍光定量的に（λｅｘ＝５４０ｎｍ、λｅｍ＝５７５ｎｍ）測定した。実験終了の直後および２４時間後に、メッシュ試料を蛍光顕微鏡下で赤色蛍光フィルターセット（５４０／５７５ｎｍ）を用いて可視化した。収集した細胞を３７℃で一晩インキュベートし、その形態構造を顕微鏡により調べた。
【０１１９】
図８および図９は、それぞれ、磁場の影響下での経時的なナノ粒子およびＢＡＥＣ細胞の指数関数的枯渇動態を示す。また、「磁場なし」条件では、ナノ粒子およびＢＡＥＣ細胞のどちらにおいても、観察される顕著な現象は有意に少ない。磁場曝露下では、ナノ粒子および細胞のどちらの枯渇動態も非常に高速であり、ナノ粒子および細胞の溶出ｔ９０％（すなわち、循環しているナノ粒子または細胞の９０％が排除されるのに必要とされる時間）は、それぞれ、７５分および１６分であった。細胞捕捉における５分の１のｔ９０％は、明らかに、より小径のＮＰと比べて多数のナノ粒子／細胞を含有する細胞によるその高い磁気応答のためである。
【０１２０】
図１０を参照すると、異なる磁性トラップ立体配置および対応する枯渇動態が示されている。「磁性トラップ」内の４３０ステンレス鋼の量および表面積を増大させると（０．３から０．８３ｇ）、ナノ粒子の循環ｔ１／２の有意な減少が引き起こされた（２７分対５０分）。したがって、「磁性トラップ」設計の最適化により、おそらく、ナノ粒子および細胞の回収動態が、その臨床的使用に充分に高速となり得る。また、細胞枯渇の測定のために細胞を循環系から取り出した場合、該細胞の拡延も示された。細胞を細胞培養プレートにおいて３７℃で５％のＣＯ２雰囲気中にて一晩培養した。実験後に撮影したメッシュの顕微鏡写真では、「磁性トラップ」上に堆積したナノ粒子が示された。
【０１２１】
また、実験終了時に捕捉された磁気応答性細胞および２４時間後の細胞の拡延も示された。細胞捕捉実験中に循環系から試料採取した細胞は、ＢＡＥＣに特徴的な通常の形態構造を示す。増殖条件は、３７℃および５％ＣＯ２での１０％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭである。捕捉された細胞の形態構造を評価するため、この実験での磁性トラップに使用したメッシュを、実験の直後および２４時間後に蛍光顕微鏡下で可視化した。多数の細胞が初期にメッシュの縁部で捕捉されることが示され、そのうち、メッシュ表面に最も隣接しているものが、２４時間後に、メッシュ枠の表面全体の一面にわたって均一に拡延した細胞の層を形成し、したがって、磁気的に標的化された細胞のバイアビリティが示される。実験終了時の磁性担体ナノ粒子の捕捉は、８００ガウスの磁場（「磁性トラップ」）下で４３０ステンレス鋼メッシュの表面に示されたのに対して、対照メッシュでは実験の開始時に磁場の適用前に示された。
【０１２２】
実施例８
アルブミン安定化磁性ナノ粒子のＴＥＭおよび磁化曲線
次に図１１Ａおよび１１Ｂを参照すると、それぞれ、実施例６に関して上記のアルブミン安定化磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）の透過電子顕微鏡検査の結果および磁化曲線（磁場に対する磁気モーメント）が示されている。小径で多数の個々のオレイン酸コートマグネタイト粒がＭＮＰポリマーマトリックス中に分布されていることに注目のこと（図１１Ａ）。ＭＮＰは、有意なヒステリシスは示されず、それぞれの示される残留磁気が飽和磁化値０．５％程度である超常磁気的挙動を示す（図１１Ｂ）。
【０１２３】
実施例９
ＭＮＰ細胞負荷
次に図１２Ａ〜１２Ｂを参照すると、インビトロＭＮＰ細胞負荷試験が示されている。特に、図１２Ａは、ＭＮＰ用量およびインキュベーション時間の関数としてのウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）によるＭＮＰ取込みの動態を示し；図１２Ｂは、ＭＮＰ用量およびインキュベーション時間の関数としての細胞バイアビリティを示し；図１２Ｃは、ＭＮＰ自体で観察されたような超常磁気的挙動を示すＭＮＰが負荷された細胞の磁化曲線を示す。ナノ粒子取込みは、内在化されたＭＮＰの蛍光によって測定した。細胞の生存率はＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイによって測定した。
【０１２４】
ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞）を、磁石上の種々の用量のＭＮＰとともにインキュベートした。図１２Ａに示すように、ＭＮＰ取込みは、種々の時点で内在化されたナノ粒子の蛍光によって測定した。内在化されたＭＮＰの量は、ナノ粒子の用量にほぼ線形に依存性であった。８時間後、およそ３０％の内在化が観察され、取込みは２４時間後に事実上完了したが、磁場の非存在下では、２４時間目で有意な取込みは達成されなかった。図１２Ｂに示されるように、種々の実験条件（インキュベーション時間およびＭＮＰ用量）での細胞バイアビリティは、ＭＮＰ負荷によって有害に影響されなかった。試験したすべてのＭＮＰ用量およびインキュベーション時間で、未処理細胞と比較して、８５％より高い細胞生存率が観察された。図１２Ｃに示されるように、ＭＮＰが負荷された細胞の磁化曲線は、有意なヒステリシスは示されず、それぞれの示される残留磁気が飽和磁化値０．５％程度である超常磁気的挙動を示す。
【０１２５】
実施例１０
遺伝子導入効率および細胞毒性
該粒子を、培養状態の細胞のトランスフェクションについて試験した。３種類の磁気応答性粒子を調製し、ＤＮＡと異なるＰＥＩ：ＤＮＡ比で複合体形成させた。実験ではすべて、ナノ粒子を０．２５μｇのＧＦＰコードＤＮＡプラスミド／ウェルと５％グルコース中で３０分間、複合体形成させ、次いで、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した細胞培養培地と１：４で混合し、磁場を伴って細胞に１０分間適用した。そのトランスフェクション効率、ならびにナノ粒子の取込みおよび毒性を、培養ラット大動脈平滑筋およびウシ大動脈内皮細胞（それぞれ、Ａ１０およびＢＡＥＣ）において、非磁性粒子を対照として用いて試験した。遺伝子発現、ＮＰ取込みおよび細胞の生存率を、２日目の時点で、それぞれ、蛍光を４８５／５３５ｎｍ、６２０／６７０ｎｍで測定することにより、およびＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（５４０／５７５ｎｍ）により測定した。結果を図１３Ａ〜Ｆに示す。磁気応答性処方物では、非磁性ナノ粒子とは対照的に（図１３Ａ〜Ｆ）、その細胞内取込みと相関して（図１３ＣおよびＤ）高レベルの遺伝子産物がもたらされた。すべての処方物で、調べた量範囲の細胞培養物において示された毒性は低かった（図１３およびＦ）。
【０１２６】
別の実験において、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を−１日目に播種した（２×１０４／ウェル，４つの２４ウェルプレート）。細胞は、トランスフェクション前の０日目に、１０％ＦＢＳ補充ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で２回（２×１時間）洗浄した。プラスミドＤＮＡを磁性ナノ粒子（錯化体）とともに種々の比率で５％ｗ／ｖグルコース溶液中で３０分間インキュベートし、ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１．２５倍に連続希釈して最終血清濃度を１０％または８０％にし、細胞に０．２５μｇ  ＤＮＡ／ウェルで適用した。細胞を３７℃でインキュベートし、このとき、プレートの１つをある時間、磁石上に置き（１５分）、別の１つを磁石から遠くに維持した。次いで、培地を、１０％ＦＢＳを補充した予備加温新鮮ＤＭＥＭと交換した。２４時間後、細胞をトランスフェクションについて観察した。
【０１２７】
外部磁場の使用なしで適用した場合、ナノ粒子とＰＥＩで示された緑色蛍光タンパク質コードＤＮＡでの培養ＢＡＥＣ細胞のトランスフェクションは同等であったが、永久磁石の存在下で適用した磁性ナノ粒子のトランスフェクションの有効性は、対照処方物および磁石の非存在下で適用した磁性ナノ粒子の両方と比べてかなり増大した。
【０１２８】
培養Ａ１０細胞でも、トランスフェクションの有効性に対して、同様の磁場の効果が観察された。
【０１２９】
注目すべきことに、１０％および８０％血清の存在下では、明らかにＤＮＡの酵素的分解に対するその保護効果のため、磁性ＮＰにより細胞が有効にトランスフェクトされ得たが、血清の存在下では、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を細胞に同じ期間添加した場合、事実上トランスフェクションはみられなかった。
【０１３０】
実施例１１
ｓｉＲＮＡ含有ナノ粒子の磁性標的化
磁性ナノ粒子を、以下プロトコルを用いて処方した：３００ｍｇのＦｅＣｌ３六水和物と１５０ｍｇのＦｅＣｌ２四水和物を含む５．５ｍｌの水溶液を、ＮａＯＨの４．７５ｍｌの水溶液（１．０Ｍ）とすばやく混合した。得られた析出物を磁石で分離した。オレイン酸（１５０ｍｇ）を滴下し、析出物を２ｍｌのエタノールに懸濁させ、混合物をアルゴン中で脱気した。内容物を９０℃まで水浴中で５分間、数回の撹拌を伴って加熱した。４ｍｌの水を滴下して穏やかに撹拌すると、オレイン酸コート酸化鉄が磁石上に析出され、液相を注意深く吸引した。析出物を４ｍｌのエタノールで洗浄して過剰のオレイン酸を除去し；磁石上への沈降後、エタノールを吸引した。この析出物を５ｍｌのクロロホルムに再懸濁させた。
【０１３１】
２００ｍｇのポリ乳酸（ＰＬＡ）（Ｄ，Ｌ−ＰＬＡ  ７０−１２０  Ｋ  Ｓｉｇｍａ）、１００ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（分枝ＰＥＩ，Ａｌｄｒｉｃｈ  ２５  Ｋ）または２００ｍｇの線状ＰＥＩ  ２００Ｋ（ｐＨ７）および１００ｍｇのオレイン酸をマグネタイトのクロロホルム懸濁液に溶解させたものからなる有機相を、氷浴中で予備冷却した１５ｍｌの脱イオン水に添加し、超音波処理によって混合物を乳化した。有機溶媒を、２５℃での回転式エバポレーションによって除去した。該粒子を１．０μｍガラス繊維フィルターに通して濾過し、脱イオン水に対して４℃で２４時間、数回の水の交換を伴って３００，０００Ｄａカットオフ透析膜を用いて透析した。得られたナノ粒子懸濁液にトレハロース（１０％ｗ／ｖ）を添加し、ナノ粒子を凍結乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０１３２】
本実施例で使用したＮＰ処方物（図１４）（直径３６０ｎｍ）は、有意なヒステリシスは示されず、示される残留磁気がそれぞれの飽和磁化値の０．５％程度である超常磁気的挙動を示した。磁気モーメントは、１０００Ｏｅまでほぼ線形に磁場に依存し、飽和値の６６〜６８％に達するが、磁場をさらに５０００Ｏｅまで増大しても、観察される磁化の増分は比較的少なかった（図１４）。ＮＰの比磁化率は、約５．０３＋０．０４ｅｍｕ／ｃｍ３×ｋＯｅであることがわかった。
【０１３３】
線状ＰＥＩを、Ｔｈｏｍａｓ，Ｍら（２００５）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：５６７９−８４に記載のようにして調製した、簡単には、完全脱アシル化線状ＰＥＩ  ２００Ｋを、市販の２００Ｋ  ＰＥＯＺポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の酸触媒型加水分解によって調製した。典型的には、３．０ｇのＰＥＯＺを１２０ｍｌの２４％（ｗ／ｖ）ＨＣｌに添加した後、９６時間還流した。最初の反応混合物は、反応の間中、白色析出物を含んでいた。ＰＥＯＺ結晶は約２時間で完全に溶解し、２−プロパノールで１回洗浄した。この粉末を２−プロパノールに２時間再度分散させ、濾過によって単離し、減圧乾燥した。得られた白色粉末は、１Ｈ−ＮＭＲによって純粋なＰＥＩ塩酸塩であると確認された。完全脱アシル化ＰＥＩ  ２００では、ＮＭＲによって、３．５７ｐｐｍに−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２＋に対応する一重項が示されたが、Ｎ−プロピオニル部分に対応するシグナル示されず、その複合体の除去が確認された。
【０１３４】
磁性ＮＰを用いたｓｉＲＮＡによるレンチウイルス形質導入平滑筋細胞でのｅＧＦＰ発現の抑制を、以下の実験において行なった：ラット大動脈平滑筋細胞（Ａ１０）を、ＧＦＰコードレンチウイルスで形質導入した後、培養して数回継代した。細胞は、１０５ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ培地中で培養した。凍結乾燥ＮＰを１００μｌの脱イオン水に再懸濁させ、三連で連続希釈し、以下のＮＰ量範囲：それぞれ、分枝および線状ＰＥＩ−ＮＰ／ウェル（９６ウェルプレート形式）で０〜１４μｇおよび２．２μｇにした。ｓｉＲＮＡを、ＮＰとともに種々の比率で５％ｗ／ｖグルコース溶液中で３０分間インキュベートし、血清補充ＤＭＥＭで５倍希釈した後、０．１５、０．２５、および０．３５μｇ  ＲＮＡ／ウェルで細胞に添加した後、磁場（５００ガウス，細胞培養磁石，Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｅｌｋ  Ｇｒｏｖｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＩＬによって発生）に２０分間曝露した。ＧＦＰ発現（λｅｍ／λｅｘ＝４８５ｎｍ／５３５ｎｍ）および細胞バイアビリティ（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイ［Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ  ＵＳＡ］，（λｅｍ／λｅｘ＝５４０ｎｍ／５７５ｎｍ）の蛍光定量による測定を、生細胞において、処理の５日後に行なった。
【０１３５】
分枝または線状いずれかのＰＥＩを用いて処方した磁性ＮＰを使用し、効率的なｅＧＦＰ抑制が達成された（図１４）。どちらの処方物型でも、ｅＧＦＰ抑制はＮＰ用量に直接的に依存し、最大２０〜４０％に達した（図１４）。しかしながら、線状ＰＥＩ処方物を用いて達成されたｅＧＦＰ抑制では、ＮＰ用量を増大すると飽和が示されたが、分枝ＰＥＩ−ＮＰ処方物では、ｅＧＦＰ抑制は、試験した全ＮＰ範囲でほぼ線形の用量依存性が示された。ｅＧＦＰの抑制は、線状ＰＥＩ処方物の場合は直接的にｓｉＲＮＡ用量依存性であり、分枝ＰＥＩ−ＮＰ処方物では逆依存性であり、それぞれ、０．３５および０．１５μｇのｓｉＲＮＡ用量の線状および分枝ＰＥＩ処方物で、３８および４０％の最大抑制がもたらされた（図１４ＡおよびＣ）。ＮＰ／ｓｉＲＮＡ処方物により細胞の生存率は有意に障害されず、処理の５日後、最大ＮＰ用量で９０％より多くの生存細胞が示された（図１４ＢおよびＤ）。
【０１３６】
実施例１２
スチールステント表面への磁性ナノ粒子負荷内皮細胞の高い磁場勾配での標的化
ナノ粒子の処方および特性評価。塩化第二鉄と塩化第一鉄（それぞれ、３００ｍｇおよび１５０ｍｇ）から水性水酸化ナトリウムでのアルカリ析出によって調製したマグネタイトを磁気により分離し、２ｍｌのエタノールに再懸濁させ、アルゴン下で９０℃まで水浴中にて５分間加熱することによりオレイン酸（２００ｍｇ）でコーティングした。４ｍｌの水の滴下によって過剰のオレイン酸を相分離し、脂質コートマグネタイトをエタノールで２回洗浄した。親油性マグネタイトを６ｍｌのクロロホルム中に分散させると、安定な磁性流体が形成された。得られた酸化鉄の有機分散液を用いてＰＬＡを溶解させ、かくして有機相を形成した。この有機相を、氷浴内での超音波処理によって水性アルブミン溶液（１％）中で乳化させた後、有機溶媒をエバポレーションした。該粒子を未結合アルブミンから反復磁性の沈降／再懸濁サイクルによって分離し、１０％（ｗ／ｖ）グルコースを抗凍結剤として用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥ＭＮＰを−２０℃で維持し、使用前に脱イオン水に再懸濁させた。
【０１３７】
粒子径の測定を、９０  Ｐｌｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｔｖｉｌｌｅ，ＮＹ  ＵＳＡ）を用いて行なった。ＭＮＰおよびＭＮＰが負荷された細胞の磁性を、ＭＮＰまたはＭＮＰ負荷細胞いずれか（５μｌの試料を４×４ｍｍ２のカバーガラススライド上で風乾，交互勾配磁気計（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用）のヒステリシス曲線から推定した。
【０１３８】
細胞の調製。細胞負荷および細胞バイアビリティの実験のために、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、透明な底の９６ウェルプレート上に１．５×１０４細胞／ウェルの密度で播種した（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭを使用）。細胞培養物をＭＮＰ取込みに関して同調させるため、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＭＮＰを細胞に異なる用量で添加し、細胞培養プレートに適合させた磁気選別機（５００ガウスの磁場源を使用）（ＬｉｆｅＳｅｐ（商標）  ９６Ｆ，Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｎｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、細胞培養物をインキュベートした。さらに、所定の時点で、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、内在化されたＭＮＰの量を蛍光定量的に測定した（λｅｍ／λｅｘ＝５４０／５７５ｎｍ）。すべての時点で、Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｇｒｅｅｎ染色およびＡｌａｍａｒＢｌｕｅアッセイを、製造業者（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ  ＵＳＡ）によって示されたとおりに用いて細胞バイアビリティを測定した。
【０１３９】
ステント上へのインビトロ細胞捕捉の試験のため、ＢＡＥＣを透明な底の１２ウェルプレート上に播種した。翌日、７２μｇのＭＮＰを、細胞（４．５±１．０）×１０４の各ウェルに添加した。細胞およびＭＮＰを磁気源（Ｌｉｆｅ  Ｓｅｐ（商標）  ９６Ｆ）において２４時間インキュベートし、ほぼ完全に（約９５％）ＭＮＰを内在化させた。次いで、細胞をトリプシン処理し、さらなる捕捉実験のために細胞培養培地に再懸濁させた。インビボ送達実験に使用した細胞を、まず、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）の制御下でルシフェラーゼを発現する複製欠陥型５（Ｅ１，Ｅ３欠失）アデノウイルス（Ａｄ  ｌｕｃ）で１０時間形質導入し（ＭＯＩ＝５００）、次いで、ＭＮＰに２４時間負荷した。
【０１４０】
インビトロおよびインビボ短期細胞捕捉実験。インビトロ細胞捕捉実験では、ＭＮＰ負荷ＢＡＥＣ（約２．５×１０６）を閉鎖ループ系内に、３０ｍｌ／分（ステント表面全体において０．０１５ｍ／秒の流体速度）の流速で循環させ、この間、１０００ガウスの均一な磁場を適用した。均一な磁場は、直列に接続したソレノイドコイル（鉄芯（４０ｍｍの直径）を有する）に電流を流すことにより発生させ、該コイルは、モデルループ循環系のフローチャンバ内に配置したステントまたは動物に留置されたのいずれかの両側に、電磁石の芯同士を４０ｍｍ離して配置した。ＨＰ  ６０３４Ａ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）電源によって２８Ｖの電圧を印加することにより、９．４Ａの電流を発生させた。磁場強度は、Ｈａｌｌ  Ｐｒｏｂｅ（Ｌａｋｅ  Ｓｈｏｒｅ  Ｃｒｙｏｔｒｏｎｉｃｓ（Ｗｅｓｔｅｒｖｉｌｌｅ，ＯＨ）から購入）によって測定した。ＭＮＰ蛍光を測定することにより細胞の枯渇をモニタリングし、結果を捕捉された細胞の割合で示した。
【０１４１】
インビボ細胞捕捉実験では、３０４グレードステンレス鋼ステントをラット頚動脈内に留置した。急性試験のため、蛍光ＭＮＰを予め負荷したＢＡＥＣ細胞を左心室内に経胸腔注射した。上記のシステムを使用し（注射期間を含む）、動物を１０００ガウスの磁場に５分間曝露した。対照ラットにも同一の手順を行なったが、この場合では磁場を使用しなかった。送達の５分後に動物を致死させ、外植ステントを蛍光顕微鏡検査によって調べた。
【０１４２】
血管形成術およびインビボ送達手順：４８時間試験。４５０〜５００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラットの左の総頚動脈を、Ｆｏｇａｒｔｙカテーテルを４回通すことによって損傷させた後、３０４グレードステンレス鋼製のマルチリンクステント（Ｃｉｒｃｌｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｌｏｓ  Ｇａｔｏｓ，ＣＡ）を留置した（１６気圧）。流れ停止条件下での細胞送達のモデル試験では、２３Ｇチューブを外頚動脈から総頚動脈内に導入し、留置ステントに対して遠位に配置した。したがって、この一時的な頚動脈血流の中断を伴う試験のため、ステント留置部位を含む総頚動脈の１５ｍｍセグメントを結紮によって孤立させた。細胞懸濁液（５０μｌ）を、この孤立させた動脈セグメントに１５秒間送達した後、動脈内に保持されなかった過剰の細胞を、シリンジでの回収によって除去した。血流の非中断下における細胞送達のモデル試験では、２６Ｇチューブを外頚動脈から総頚動脈内に導入し、ステントからさらに大動脈弓まで進めた（頚動脈の分岐部の近位から合計３．５ｃｍ）。細胞を１ｍｌ／分の速度で１分間注射した。どちらの送達プロトコルでも、Ｍａｇ＋群では、上記のような１０００ガウスの磁場に配置した動物に注射を行ない、送達後、磁場を合計５分間維持した。対照ラット（Ｍａｇ−群）では磁場を適用しなかった。送達の４８時間後、２５０μｌの２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（ＰＢＳ中に溶解）と混合した２．５ｍｇのルシフェリンを血管周囲に局所投与することによって動物をイメージングした。この処方物では、３０℃より高い温度で溶液とゲル間に相転移が起こり、したがって、組織と接触すると直ちに固化し、充分に規定された（２４）即放動態を有する薬物貯留部が形成された。イメージングは送達の５分後に開始した。積分時間は１０分間とした。ルシフェラーゼの免疫組織化学的検出のため、パラホルムアルデヒド固定低温包埋動脈切片を抗ルシフェラーゼマウスモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍａｃｕｌａ，ＣＡ，クローンｍＡｂ２１，１：１００）で、ペルオキシダーゼ／ＤＡＢ法を用いて染色した。
【０１４３】
統計学。実験データを平均±標準誤差（ＳＥ）で示した。結果を回帰解析によって評価した。スチューデントのｔ検定を使用し、データセットにおける差の有意性を解析した。差はｐ＜０．０５で有意と称した。
【０１４４】
結果。ポリラクチドＭＮＰは、オレイン酸塩コート酸化鉄ナノ結晶を組み込んで改良した乳化−溶媒エバポレーション方法論によって（Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏ  Ｄら（１９９８）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．２４：１１１３−２８）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を表面安定化剤として用いて調製した。アルブミン安定化ＭＮＰでは、平均直径が２９０±１５ｎｍの狭い粒径分布が示され（図１１Ａ）、有意なヒステリシスは示されず、示される残留磁気が飽和磁化値の０．５％程度である超常磁気的挙動が示された。使用されたステントの材質は３０４グレードステンレス鋼であり、これは、適当な磁性と水性環境に対する耐食性を兼ね備えているため選択された。また、３０４ステントでは、ほんのわずかの磁性のヒステリシスを示し、示される残留磁気が飽和磁化値の７％程度であるほぼ超常磁気的挙動が示された（図１５Ａ）。３１６Ｌステンレス鋼ステントも試験したが、磁気応答性が低いため標的化試験に含めなかった（図１５Ａ）。
【０１４５】
ポリ乳酸（ＰＬＡ）を用いてＭＮＰのサブセットを処方した。これは、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０で共有結合により修飾し、それにより、蛍光顕微鏡検査実験および蛍光定量に基づいた定量試験で使用され得るＭＮＰにしたものである（Ｃｈｏｒｎｙ  Ｍら（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３８２−９１）。この処方物を使用し、ＭＮＰ負荷細胞の動態を特性評価した。コンフルエントな細胞培養物のウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を、種々の用量のＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０−ＭＮＰとともに細胞培養磁石上でインキュベートした（材料および方法参照）。ＭＮＰ取込みを種々の時点で、内在化されたナノ粒子の蛍光を測定することにより測定した。内在化されたＭＮＰの量は、試験した範囲においてＭＮＰ用量に線形に依存性であった（図１２Ａ）。８時間後には、およそ３０％の内在化が観察され、取込みは２４時間後に本質的に完了した（図１２Ａおよび１５Ｂ）。細胞バイアビリティは、Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｇｒｅｅｎ染色およびＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイ（それぞれ、図１５Ｂおよび１２Ｂ）の結果によって評価されるように、内在化されたＭＮＰによって有害に影響されなかった。最も高いＭＮＰ適用用量である９μｇ／ウェル（０．３ｎｇ／細胞のＭＮＰ負荷に相当）および最大インキュベーション時間である２４時間では、未処理細胞と比べて８３±３％の細胞の生存率が観察された（図１２Ｂ）。このような結果に基づき、０．２ｎｇ／細胞のＭＮＰ用量を後続の実験のために選択した（９２±２％細胞の生存率，図１２Ｂでは５．８μｇ／ウェルの用量）。予測どおり、ＭＮＰが負荷されたＢＡＥＣでは、遊離（非細胞会合）ＭＮＰと類似したヒステリシス特性（すなわち、飽和値の１％未満の残留磁気）が示される超常磁気的挙動が示された（図１５Ａ）。
【０１４６】
３０４グレードステンレス鋼ステントへのＭＮＰ負荷内皮細胞標的化を、まず、モデルフロー−ループシステムにおいて試験した。外部から適用される均一磁場の非存在下では、ほとんど細胞捕捉は観察されなかった（図１６Ａ）。しかしながら、フローループシステム内においてステント全体に均一磁場を適用すると、ステントに有意な割合の循環細胞が捕捉され、１分間に捕捉される細胞は１％という初期速度を示す（図１６Ａ）。細胞捕捉の飽和は、磁場を適用した後、５０分以内に観察され、循環細胞の２０％（約０．５×１０６）の標的化がもたらされた。捕捉された細胞のおよそ５０％（約０．２５×１０６）は、最初の６分以内にステント表面上に蓄積された。図１６Ｂは、赤色ＭＮＰ蛍光顕微鏡検査の結果および捕捉された細胞のバイアビリティを示すＣａｌｃｅｉｎ  Ｇｒｅｅｎ染色によって示されるように（図１６Ｃ）、接着細胞でステントワイヤ表面が完全に覆われた実験終了時のステント表面を示す。
【０１４７】
急性ラット頚動脈ステント留置試験は、ステント留置領域の動脈全体における均一磁場（１０００ガウス）の存在下で、ＭＮＰを負荷したＢＡＥＣを左心室内に経胸腔注射することによって行なった（図１６ＤおよびＥ）。磁気による標的化の５分後に動物を安楽死させ、ステントを引き出すと、磁場の存在下での３０４グレードステンレス鋼ステント表面へのＭＮＰの標的化が示され（図１６Ｄ）、この場合も、ステントワイヤは蛍光ＭＮＰ含有細胞で完全に均一に覆われていた。しかしながら、磁場の非存在下では、検出可能なＭＮＰ負荷ＢＡＥＣは示され得なかった（図１６Ｅ）。したがって、このような短期インビボ結果は、インビトロ標的化試験（図１６Ｂ）と同等であった。
【０１４８】
次に、ＭＮＰの負荷とルシフェラーゼコード複製欠陥アデノウイルス（ＡｄＬｕｃ）での形質導入の両方を行なったＢＡＥＣを用いて実験を行なった。初期試験では、ＭＮＰ負荷Ｌｕｃ修飾ＢＡＥＣの磁気による標的化を、流れ停止状況での局所送達により（図１６Ｆ）、Ｌｕｃ導入遺伝子活性をエンドポイント（生体内生物発光イメージングにより検出（図１６Ｆ））として用いて調べた。インビトロでのＡｄＬｕｃ形質導入およびＭＮＰの事前負荷後、ＢＡＥＣを回収し、各ラットの頚動脈の孤立させたステント留置セグメントに、磁場の存在下または非存在下で局所送達した（図１６Ｆ）。ステント留置血管は一時的に両端を縛り（流れ停止送達手法）、この間、ＭＮＰ負荷ＢＡＥＣをステント留置セクションに、およそ１５秒という短期間送達した（図１６Ｆ）。次いで、動脈から細胞懸濁液を除去し、磁場をさらに５分間維持した後、循環を再開させた。動物を回復させ、４８時間後に試験すると、予測どおり、均一磁場の存在下でＭＮＰ負荷ＢＡＥＣを投与した動物では、磁性送達条件に供しなかった対照群と比べて有意に多くの導入遺伝子の発現（ｐ＝０．０４５）が示された（局所血管周囲ルシフェリン投与、続いて生物発光インビボ光学的イメージングを使用）（図１６Ｆ）。また、このような試験の動物の生物発光全身イメージングスキャンでは、ステント留置頚動脈セグメント内以外に導入遺伝子活性がないことが示された（データ示さず）ことは注目に値する。
【０１４９】
また、ステント留置頚動脈血流の中断なしでのＭＮＰ負荷ＢＡＥＣの磁気によるターゲテッド送達を、Ｌｕｃを１分間にわたって発現するＭＮＰ負荷ＢＡＥＣを、大動脈弓内に配置したカテーテルから、均一磁場への５分間の曝露を伴って注入することにより調べた（図１６Ｇ）。磁場の適用による留置ステントへの特異的標的化は４８時間後に、生物発光イメージングによって示され（図１６Ｇ）、検出可能なＬｕｃ活性は、磁場に曝露しなかったステント留置動脈セグメントに存在しなかった（ｐ＝０．００５）。さらに、この試験では、遠位部位にも同様に生物発光は存在しなかった（データ示さず）。Ｌｕｃ陽性免疫染色により、磁性の細胞標的化に曝露したステント留置動脈セグメントの最初および中間の領域に導入遺伝子活性の存在が確認された（データ示さず）。
【０１５０】
実施例１３
磁性ナノ粒子負荷細胞を３１６Ｌステントに標的化させるための均一なＭＲＩ磁場の使用
磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）を負荷した細胞のスチールステントへの標的化が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）システム内に存在する均一な磁場を用いて実現可能であることを実証するためのモデル実験を行なった。該イメージング装置内に存在する磁場は１．５テスラ（Ｔ）であり、これは、他の試験で使用される最も高い磁場（１０００ガウス、すなわち０．１テスラ）よりも１５倍大きい。さらに、先の試験では、３０４スチールステントを使用し、これは０．１テスラの磁場で磁化され、一方、３１６Ｌスチールステントはこのレベルの磁場強度では磁化されなかった。さらに、現在臨床使用されているスチールステントのほとんどは３１６Ｌスチールであることに注意されたく、したがって、このモデル実験は臨床的に特に重要である。
【０１５１】
実験は以下のようにして行なった：ウシ動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）に、上記のようにして調製した赤色蛍光ポリ乳酸（ＰＬＡ）ＭＮＰを、−１日目に予め負荷した。細胞をトリプシン処理し、実験の前に５ｍｌの細胞培養培地（１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）に再懸濁させ、半分に分けた。ステンレス鋼３１６グレードステント（Ｃｒｏｗｎ，Ｃｏｒｄｉｓ，Ｗａｒｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）を柔軟なポリ塩化ビニルチューブ内に留置し（動脈留置をシミュレーション）、シリンジに結合させた。細胞懸濁液をシリンジから、ステントを有するチューブを介して該ステント内に、１分間にわたって（細胞懸濁液は第２のシリンジ内に収集）、ＭＲＩイメージング装置内のコア内の均一な磁場（１．５テスラ）への曝露ありまたはなしで押し出した。チューブからのステントの取り出しの前および後の実験の直後、ステントを、倒立蛍光顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡検査によってイメージングした。図１７に示された結果は、１．５Ｔの磁場に曝露したステント試料のすべての３１６Ｌステントストラット上に存在する赤色蛍光細胞を示す。しかしながら、ステント留置ポリ塩化ビニルチューブから細胞（＋蛍光ＭＮＰ）を注入した対照ステントでは、赤色蛍光細胞は稀にしか示されなかった。したがって、この試験は、ＭＲＩイメージング装置内に存在する均一な磁場により、３１６Ｌステントが磁化され得、それにより磁性の細胞標的化が可能になることを示す。このような結果は、ＭＮＰの懸濁液を単純に注入すること（細胞に負荷しない）によるＭＮＰ標的化によっても、１．５Ｔの磁場において３１６Ｌステントに標的化され得ることを示す。
【０１５２】
実施例１４
超常磁性のポリマーナノ粒子は非ウイルス核酸送達を効率的に向上させる
治療目的のための核酸の非ウイルス送達は、主に、比較的低い有効性のために依然として難題である。本発明者らは、磁気による標的化特性を有する非ウイルス遺伝子担体を使用することにより、この課題に取り組んだ。核酸の磁力ターゲテッド送達が達成可能となることにより、有効で無毒性の遺伝子導入のための臨床的に実行可能な解決策がもたらされ得る。本発明者らの先の研究において、本発明者らは、分枝ポリエチレンイミン（ＰＥＩ  ２５Ｋ）で表面修飾した、ポリラクチド（ＰＬＡ）系の生分解性ナノ粒子（ＮＰ）の処方物を開発した。最近の科学文献により、線状ＰＥＩの市販の調製物を脱アシル化すると、プロトン化可能な窒素の数が増加し、これにより、おそらく、より密な核酸の凝縮およびＰＥＩ／核酸複合体のより良好なエンドソーム逸出がもたらされることにより遺伝子送達効率が劇的に刺激されることが示された。本発明の試験では、脱アシル化された線状ＰＥＩを用いて処方した超常磁性ＮＰ磁気駆動性送達によって、非ウイルス遺伝子導入が向上され得るという仮説を調べた。２００ｋＤａのポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）の酸触媒型加水分解によって合成してｐＨ７に調整した線状ＰＥＩを使用し、改良した乳化−溶媒エバポレーション方法論によって酸化鉄負荷ＮＰを処方した。重量基準で３５％の酸化鉄を含有するＮＰは、平均粒径３６０±２５ｎｍ、ゼータ電位４３±３ｍＶを有し、超常磁性（磁気飽和値の０．５％未満の残留磁気）を示すものであった。線状ＰＥＩ−ＮＰ処方物が核酸を送達する能力を、インビトロで、培養Ａ１０ラット大動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をレポーター遺伝子として用いて調べた。分枝ＰＥＩを用いて処方したＮＰを比較のために使用した。核酸と複合体形成させたＮＰを細胞に１５分間、磁場（５００Ｇ）下で血清含有細胞培養培地中にて適用した。ある組の実験では、ＧＦＰコードプラスミドＤＮＡを細胞に送達し、トランスフェクション効率を、処理の２、４および８日後に蛍光定量的に測定した。細胞内ＮＰレベルは、どちらのＰＥＩ処方物でも、調べたＮＰ濃度範囲において直接的に用量依存性であった。ＧＦＰ発現は、どちらのＰＥＩ処方物でも４日目に最大レベルに達し、線状ＰＥＩ−ＮＰ処方物でトランスフェクトした両方の細胞型で２．５〜３倍高いＧＦＰレベルがもたらされた。別の組の実験では、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞に送達し、レンチウイルス形質導入平滑筋細胞および内皮細胞におけるｅＧＦＰ発現の抑制ならびに細胞バイアビリティ（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅによる）を、処理の５日後に蛍光定量的に測定した。ＧＦＰサイレンシング実験では、分枝または線状いずれかのＰＥＩを用いて処方した磁性ＮＰを使用すると、効率的なｅＧＦＰ抑制が達成された。Ａ１０細胞におけるｅＧＦＰ抑制は、どちらの処方物型でも、ＮＰ用量に直接的に依存した。ｅＧＦＰの抑制は、線状ＰＥＩ−ＮＰの場合は直接ｓｉＲＮＡ用量依存性であり、分枝ＰＥＩ−ＮＰでは逆依存性であり、どちらのＮＰ型でも４０％の最大抑制がもたらされた。ＢＡＥＣでは、ｅＧＦＰ抑制は、分枝ＰＥＩ−ＮＰの場合のみＮＰ用量に直接的に依存した。どちらのＮＰ型でもｅＧＦＰ抑制はｓｉＲＮＡ用量に依存性でなく、どちらのＮＰ処方物でも５０％の最大抑制がもたらされた。試験したＮＰ／ｓｉＲＮＡ複合体により細胞の生存率は有意に障害されず、ＮＰおよび細胞型のどちらの場合も処理の５日後、最大ＮＰ用量で９０％より多くの生存細胞が示された。磁気応答性線状ＰＥＩ−ＮＰにより、分枝ＰＥＩ−ＮＰと比べてプラスミドＤＮＡの送達効率の増大が示され、一方、遺伝子サイレンシング実験では、どちらのＮＰ型でも遺伝子抑制能力に差は観察されなかったと結論付けられる。
【０１５３】
実施例１５
磁気により指向させたカタラーゼ含有オレイン酸カルシウムナノ粒子は、インビトロで酸化的ストレスから内皮細胞を効率的に保護する
大型の酵素ナノ担体の設計の考慮事項は数多くある。粒子の合成およびその後の精製の条件は、酵素活性を維持したままのタンパク質質量を効率的に負荷することが可能なものであるのがよい。カタラーゼなどの大型酵素のナノ担体が有効なターゲテッド抗酸化性治療薬であるためには、担体は、活性酵素を負荷する能力を有するだけでなく、タンパク質分解からの保護ももたらすものであるのがよい。有機溶媒または高剪断（ｓｈｅｅｒ）乳化法を伴わずにタンパク質が効率的に負荷され得る安定な生体適合性のナノ担体を考案することが望ましい。タンパク質の活性を保持させるため、水性媒体中でオレイン酸カルシウム系ＭＮＰが形成され得、剪断、溶媒曝露および油と水の界面による損傷へのタンパク質の曝露が排除され得る水溶性構成要素を使用した。
【０１５４】
この試験は、ＭＮＰが充分な活性酵素を負荷する能力を評価するため、ならびにカタラーゼ負荷ＭＮＰの性質に対する可変量（例えば、粒径、磁気的挙動、タンパク質負荷効率および官能性）の効果を特性評価するために行なった。タンパク質分解からの保護およびタンパク質の放出を経時的にインビトロで調べた。最後に、ＭＮＰの磁気誘導性の内在化、その抗酸化活性およびＲＯＳ媒介性細胞死の抑制能力を、細胞培養物において、非磁性対照または遊離カタラーゼと比較して試験した。
【０１５５】
試薬。塩化第二鉄六水和物、塩化第一鉄四水和物、オレイン酸ナトリウム（９９％純粋）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、キサンチン、キサンチンオキシダーゼ、およびプロナーゼはすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。酢酸ウラニルはＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製のものであった。カタラーゼおよびＣｕ、Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ともにウシ肝臓由来）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ＩｏｄｏｇｅｎおよびＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８はＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。他の試薬はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。
【０１５６】
酵素調製物およびヨード化。固形ウシ肝臓カタラーゼをＤＩ水に溶解させ、ナトリウム無含有リン酸バッファー中で透析した（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ）。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）をＰＢＳに所望の濃度まで溶解させた。最終のタンパク質濃度をＢＳＡの較正曲線から求めた（標準的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用，５９５ｎｍのＵＶ吸光度によって測定（Ｃａｒｙ  ５０  ＵＶ−ｖｉｓ，Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））。
【０１５７】
カタラーゼおよびＳＯＤをＮａ−１２５Ｉ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、Ｉｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）法を製造業者に示されたようにして用いて放射性標識し、ゲル透過クロマトグラフィー（Ｂｉｏｓｐｉｎ  ６  Ｃｏｌｕｍｎｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて未結合ヨウ素から精製した。ＳＯＤを標識するための１つの修飾が必要であった；該酵素はチロシン残基を２つしか含まず、したがって、ｐＨ７．４での放射性標識の程度は不充分である。ｐＨ８．４のＴｒｉｓバッファーを使用することによりヒスチジン残基をタグ化し（ｐＫＡ  ６．５）、放射性標識を４倍より大きく増大させた。両方のタンパク質について、標準的なトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）アッセイを用いて標識の程度および遊離ヨウ素の量を測定した。標識酵素の２μｌアリコート、１．０ｍｌの３％ＢＳＡおよび０．２ｍｌの１００％ＴＣＡをボルテックスし、室温で１５分間インキュベートした。析出したタンパク質を、遊離ヨウ素の上清みから遠心分離（１５分間，４℃，２１００ｇ）によって分離し、Ｗｉｚａｒｄ  １４７０ガンマ計数器（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて測定した。
【０１５８】
カタラーゼの蛍光標識は、製造業者に示されたようにして、反応性アシル化試薬が形成されるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル部分を用いたアミン反応性標識によって行なった。
【０１５９】
ＭＮＰ処方物および特性評価。同等量の水性水酸化ナトリウム（０．５Ｎ，５．０ｍｌ）を用いたエタノール溶液（２．５ｍｌ）からの塩化第一鉄および塩化第二鉄（それぞれ、６２．５ｍｇおよび１７０ｍｇ）の共析出によってナノ結晶性酸化鉄を調製した。酸化鉄を、９０℃で１分間インキュベートすることによって熟成させ、次いで、脱イオン（ＤＩ）水（Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ  ５  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて氷上の磁性のデカンテーションによって２回洗浄し、最後に、２２５ｍｇのオレイン酸ナトリウムを含有する５ｍｌの水溶液に、アルゴン下で９０℃まで加熱した後、浴超音波処理（各５分間）を２サイクル反復することにより再懸濁させた。得られた磁性流体を、５μｍカットオフを有する滅菌ＰＶＤＦ膜に通して濾過した。
【０１６０】
酵素負荷ＭＮＰを調製するため、タンパク質を、磁性流体に指定された量で添加した。磁性流体の制御凝集を、安定剤としてのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７（２０ｍｇ）の存在下での等容量の水性塩化カルシウム（０．１Ｍ）の滴下によって行なった。ＭＮＰを磁性のデカンテーションによって２回洗浄し、最後に、グルコース（５％ｗ／ｖ）の水溶液に再懸濁させた。ある割合の１２５Ｉ標識カタラーゼをタンパク質と混合した後、制御凝集工程を行なうことにより放射性標識処方物を調製した。対照として使用する酵素含浸非磁性ナノ粒子またはブランクＭＮＰの処方物を、それぞれ、酸化鉄または酵素の組込みなしで上記のようして調製した。
【０１６１】
粒子径、濃度および磁気的挙動。粒子径は、動的光散乱（ＤＬＳ，９０Ｐｌｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）および透過電子顕微鏡検査（ＪＥＯＬ  ＪＥＭ−１００ＣＸ  ＴＥＭ  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって測定した。２００〜４００倍に希釈した試料の粒径分布および平均流体力学的半径を、ストークス・アインシュタイン式の二次拡散係数から導いた。粒子数濃度は、実験により求めた試料溶液の密度、乾燥重量および粒子径の物質収支によって導いた。
【０１６２】
透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）のため、０．２μｍのＤＩ濾過水で２０倍に希釈した２〜５μｌのＭＮＰ試料を、個々のＴＥＭメッシュグリッド（Ｆｏｒｍｖａｒ  Ｆｉｌｍ  ２００メッシュ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）に添加し、過剰の試料を濾紙で吸い取った。グリッドを真空デシケータ内で少なくとも１時間乾燥させた後、８０ｋｅＶの加速電圧を用いてイメージングした。
【０１６３】
ＭＮＰの磁気的挙動を調べるため、５μｌの懸濁液をカバーガラススライド上で風乾させ、交互勾配磁気計（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．，ＮＪ）を用いてヒステリシスの測定を行なった。
【０１６４】
鉄濃度。該粒子に保持された鉄を三連の試料で、０．１〜２５．０ｍｇ／ｍｌの範囲の塩化第一鉄と塩化第二鉄の２：１モル混合物で作成した較正曲線から測定した。１０μｌの各希釈物を１．０ｍｌのＨＣｌ（６Ｍ）および１０μｌのＨ２Ｏ２（３ｗｔ％）に添加し、暗所で１時間反応させた。吸光度をの読取りを４１０ｎｍで行なった。
【０１６５】
酵素負荷．ＭＮＰ中へのタンパク質の組込みを、磁気により分離されたＭＮＰと外部水相間の放射性標識ＳＯＤまたはカタラーゼの分布をガンマ計数器を用いて測定することにより測定した。保持された割合は、最初の懸濁液の活性に対する最終試料における活性の商（容量変化を調整）と規定する。
【０１６６】
酵素活性。カタラーゼの活性は、標準的な過酸化水素分解アッセイを用いて測定した。５ｍＭのＰＢＳ緩衝Ｈ２Ｏ２溶液（９９０〜９９８μｌ）を石英キュベットに添加し、室温で２４２ｎｍにおける吸光度の読取りを行なった。カタラーゼ含有粒子を約０．０１〜０．５０μｇ／ｍｌ（崩壊曲線の傾きが添加されたカタラーゼの濃度に比例する較正プロットの線形領域に対応）の最終カタラーゼ濃度に希釈した。典型的には、２〜１０μｌのＭＮＰを総容量１．０ｍｌに希釈した。Ｈ２Ｏ２の濃度を時間に対してモニタリングし、カタラーゼの活性を崩壊曲線の傾きから計算した（ここで、１単位の活性＝２３（ΔＡｂｓ／ｔ））。
【０１６７】
ＳＯＤ活性は、フェリシトクロムＣアッセイを用いて測定した。シトクロムＣアッセイでは、ＳＯＤと競合する指標スカベンジャーとして、シトクロムＣ作用を有するスーパーオキシドアニオンを生成させるために、キサンチンおよびキサンチンオキシダーゼが使用される。５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）、０．１μＭのＥＤＴＡ、５０μＭのキサンチン、２０μＭのシトクロムＣおよび１０μｌの試料を含む溶液。１０μｌの０．２Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼの添加によって反応を開始した。吸光度を５５０ｎｍにおいてモニタリングした。１単位のＳＯＤは、ｐＨ７．８および２５℃においてシトクロムＣ還元速度を５０％阻害する酵素の量と規定する。
【０１６８】
ＭＮＰ封入カタラーゼの保護および活性。ＭＮＰがカタラーゼ負荷（ｃａｒｇｏ）を保護する能力を、タンパク質分解アッセイを用いて測定した。試料を、０．２ｗｔ％緩衝プロナーゼ（タンパク質を個々のアミノ酸に完全に消化するプロテイナーゼのロバストな混合物）中で、振盪しながら３７℃で６０分間インキュベートした。タンパク質分解後にＭＮＰに保持されたカタラーゼの量を、遠心分離（２０分間，４℃，１６．１ｇ）でのＭＮＰ分離後に、上記の放射能アッセイを用いて測定した。経時的に保持されたＭＮＰ結合カタラーゼの酵素活性を、遊離カタラーゼとの比較において測定した。
【０１６９】
ＭＮＰからのカタラーゼインビトロ放出。関連のある生理学的温度での生体液中におけるＭＮＰからのカタラーゼの放出動態を、放出媒体中の遊離カタラーゼを、放射能アッセイを用いてモニタリングすることにより測定した。等容量の粒子懸濁液およびマウス血漿を合わせ、３７℃の振盪浴内に入れた。４８時間にわたってアリコートを採取し、ＭＮＰを媒体から、０．２μｍ遠心フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）を用いて分離した。濾液中で測定されたＭＮＰの割合（＜１０％）に対する補正を行なった。フィルターに保持されたＭＮＰ結合カタラーゼの放射能を、培地中の遊離タンパク質をガンマ計数器を用いて測定した。
【０１７０】
細胞培養。ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）を得、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ，ＵＳＡ）中で培養した。ほぼコンフルエンスまで培養した初代ヒト臍静脈内皮細胞（４回目の継代）（ＨＵＶＥＣ，Ｃｌｏｎｅｃｔｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、１％ゼラチンコートした２４または９６ウェルプレート上で培養した。細胞を、１５％ウシ胎仔血清および１００ｕｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％内皮細胞増殖補充物（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、０．１μｇ／ｍｌ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、ならびに１．０  ％抗生物質−抗カビ剤（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中に維持した。
【０１７１】
ＢＡＥＣへのＭＮＰの磁気誘導性送達。９６ウェルプレート上にコンフルエンスで播種したＢＡＥＣをＭＮＰとともに５分間、高い勾配磁場の存在／非存在下でインキュベートした（磁場源として５．６  Ｔ２／ｍの平均断面力密度を有する９６ウェル磁気選別機（ＬｉｆｅＳｅｐＴＭ  ９６Ｆ，Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｎｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用）。次いで、細胞を２回洗浄し、新鮮細胞培養培地とともにインキュベートし、処理の４時間後、顕微鏡検査によりＭＮＰの内在化について調べた。
【０１７２】
ＭＮＰによる酸化的ストレスからのＨＵＶＥＣの磁気的に増強された保護。２４ウェルプレート上に播種したコンフルエントなＨＵＶＥＣをＭＮＰとともに３７℃で、磁気曝露ありまたはなしで１５分間インキュベートした。次いで、ＭＮＰを吸引し、細胞を新鮮細胞培養培地ですすぎ洗浄した。非磁性のカタラーゼ負荷ナノ粒子またはブランクＭＮＰ（カタラーゼなし）を対照として使用した。細胞培養物培地中で希釈した１０ｍＭのＨ２Ｏ２で細胞を５時間処理し、新鮮培地ですすぎ洗浄し、次いで、２μＭ溶液のＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）（ＰＢＳ中，Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を補充）を用いて１５分間染色した。洗浄後、生存細胞の蛍光を４８５ｎｍ／５３５ｎｍのλｅｍ／λｅｘで測定した。
【０１７３】
結果
ＭＮＰの物理化学的特性（粒子径）。多数のＴＥＭ画像（図１８Ａに例）のデジタル解析によって求めたカタラーゼ負荷ＭＮＰの粒子径では、３０３＋／−３８ｎｍの平均粒径が示された。同等の処方物の動的光散乱（ＤＬＳ）では、３４０＋／−２９ｎｍの平均粒子径が示された（図１８Ｃおよび１８Ｄ）。動的光散乱の測定自体では、ＳＯＤ負荷粒子は３５０＋／−１０ｎｍの流体力学的直径を有していた。
【０１７４】
ＭＮＰの物理化学的特性（磁気特性）。ＭＮＰの鉄濃度は、比色アッセイによって測定すると、約２１ｗｔ％であると測定された。ＭＮＰの磁気的挙動を図１８Ｂに示す。飽和時の磁気モーメント（Ｍｓ）は１４．３ｅｍｕ／ｇである。磁性の残留磁気（Ｍｒ）（磁場を除いた後に保持される磁化）は０．６５ｅｍｕ／ｇである。したがって、Ｍｒ／Ｍｓの割合としての磁化の保持は４．５％である。図１８Ｂの閉鎖ヒステリシスループは、磁場を除くと該粒子が直ちに平衡に戻ることを示す。
【０１７５】
酵素の質量および活性負荷。精製粒子によって保持された添加タンパク質の割合として、ＭＮＰ中のＳＯＤの負荷質量は、０．５および１．０ｍｇのタンパク質の添加で、それぞれ、３９＋／−１％、３４＋／−１％であった（図１９Ａ）。これは、粒子１個あたりおよそ７５００および１５０００個のＳＯＤ分子に相当する（負荷質量から計算）（図１９Ｂ）。異なる添加質量でのカタラーゼ負荷を表１に示す。
【０１７６】
【表１】
0005914350.tif 000002
誤差は標準偏差；ｎ≧３。粒径の差  ブランクＭＮＰと比較して＊ｐ＝０．０１４５，＊＊ｐ＝０．００１７  。
【０１７７】
両方の質量負荷でのＭＮＰにおけるＳＯＤの活性の保持は、平均で添加分の１７．２＋／−２％であり、これは、負荷質量の平均４７％の活性の保持に相当する（図１９Ｃ）。保持されたＭＮＰにおけるカタラーゼ活性は、４ｍｇの質量添加で最大約１２ｋ単位に達し（図１９Ｂ）、これは、約３４％の活性の保持に相当する（表１）。最小活性負荷の２０〜２９％範囲の他の質量添加が最大質量添加６ｍｇで見られた（表１）。
【０１７８】
ＭＮＰ保護カタラーゼの質量およびインビトロ活性。質量添加に対するタンパク質分解から保護されたカタラーゼの質量は、表１に示されるように、１２％〜２９％の範囲であった。カタラーゼの負荷質量と保護質量間の関係を図２１Ａに示す。ＭＮＰは、２４時間までのタンパク質分解性酵素への曝露で最初の活性の２０％を保持したのに対して、遊離酵素では３０分までにすべて失活した（図２１Ｂ）。
【０１７９】
血漿への曝露によるカタラーゼの保持によって規定されるＭＮＰの安定性を図２２に示す。該粒子は、４８時間の曝露でほぼ１５％までカタラーゼを血漿中に放出した（３７℃）のに対して、対照溶液ではほぼ同等の放出であった。
【０１８０】
インビトロでの内皮細胞への磁気駆動性ＭＮＰ送達。磁場に１０分間曝露した内皮細胞とともにインキュベートしたＭＮＰを図２３Ａおよび２３Ｂに示す。２３Ａの対照顕微鏡写真は、核周囲の内皮細胞の細胞質ゾル内のＭＮＰを示す。図２３Ｂの緑色蛍光は、細胞に送達された該粒子のタンパク質負荷を示す。図２３Ｃは、５分間の曝露を伴った細胞内のＭＮＰのカタラーゼを示す。ナノ担体と磁場への曝露なしの細胞との関係を図２３Ｄおよび２３Ｅに示す。
【０１８１】
酸化的ストレスからの内皮細胞の保護。蛍光強度を使用し、種々の処理による保護の割合を定量した（図２４Ａ）。ＭＮＰ内の磁性送達カタラーゼは、図２４Ｂに示されるように、１０ｍＭの過酸化水素に５時間曝露した場合、未処理細胞と比べて６２±１２％の細胞バイアビリティという保護効果を示した。磁性誘導なしのＭＮＰ、カタラーゼなしの担体、または遊離カタラーゼの添加を伴う担体の保護効果に統計的な差は示されなかった。
【０１８２】
まとめ。この試験は、ＳＯＤおよびカタラーゼの両方について、活性の過剰な低下なく活性酵素を効率的に負荷する特殊な生体適合性大型タンパク質ナノ担体系を示し、より大型でより不安定な酵素であり、したがって保護がより困難なカタラーゼ処方物においてタンパク質分解からの酵素活性の保護を示す。さらに、磁気による標的化により、該担体系では、インビトロで重度の酸化性傷害に対処する治療的潜在性が示された。ターゲテッド酵素送達に対するこの新規なアプローチは、他の治療薬、大分子、ペプチドおよびヌクレオチドへの適用に転換され得るだけでなく、ナノ担体が血漿中で負荷体を保持する能力によって示されるように、免疫標的化の可能性のための表面修飾に対する実現可能性およびロバストネスを示す。記載のこの担体系の寄与は、酸化的ストレスに関連する数多くの病態に転換され得る。
【０１８３】
実施例１６
インビトロおよびインビボでのカタラーゼ含有磁性ナノ粒子の抗体標的化
この試験は、このような磁性のナノ担体（ＭＮＰ）が、インビトロおよびインビボで、活性な抗酸化酵素を内皮標的に負荷および送達する能力を試験するために行なった。
【０１８４】
カタラーゼなどの抗酸化酵素は酸化的ストレスを緩和し得るが、インビボでの標的部位に対する固有親和性はほとんどなく、タンパク質分解および細網内皮（ＲＥＳ）クリアランスを受け易い。この問題を解決するため、カタラーゼ（ＭＷ約２５０ｋＤａ）を生体適合性オレイン酸カルシウム系磁性ナノ粒子内に、水相の制御析出を用いて実施例１５に詳述したようにして封入した（「ＭＮＰの処方および特性評価」参照）。ＭＮＰ処方の２工程プロセスを図２５に模式的に示す。
【０１８５】
カルシウムカチオンはオレイン酸アニオンと錯体形成し、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７界面活性剤によって表面安定化された粒子（平均直径約４００ｎｍ（ＤＬＳによる））が形成される。カタラーゼは、おそらく疎水性相互作用および電荷相互作用によって、形成中の複合体と会合する。ナノ粒子の磁気応答により、該粒子は、組み込まれていない物質から速やかに分離することが可能であり、それによりナノ粒子処方物の精製が助長される。負荷効率は２０〜３０％であり、その活性の８０％が保持される。およそ２０％のＭＮＰ負荷カタラーゼが、非特異的プロテアーゼの混合物であるプロナーゼによるタンパク質分解に対してインビトロで抵抗性であった。
【０１８６】
内皮細胞へのＭＮＰの標的化のため、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７界面活性剤を二重ビオチン化し、内皮抗原ＰＥＣＡＭ（Ａｂ６２）に対するストレプトアビジンコンジュゲート標的化抗体に組み込んだ（表２）。表面ビオチン化ＭＮＰに対するストレプトアビジン（ＳＡ）の親和性を、対照と対比して測定した（図２６Ａ）。
【０１８７】
【表２】
0005914350.tif 000003
標的化および治療的潜在性を試験するため、抗ＰＥＣＡＭおよびＩｇＧ（対比）修飾粒子を、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）とともにインキュベートした。同位体および蛍光の追跡により、抗ＰＥＣＡＭ（Ａｂ６２）／ＭＮＰはＨＵＶＥＣに結合するが、ＩｇＧ／ＭＮＰ（対照）は結合しないこと（図２６）、および過酸化水素誘発性酸化的ストレスから細胞を保護すること（５１Ｃｒの放出により測定すると７６％±５％保護）（図２７）が示された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、放射性標識抗ＰＥＣＡＭ（Ａｂ６２）／ＭＮＰの静脈内注射により抗ＰＥＣＡＭ／ＭＮＰの２８倍高い（２１２±２５％ＩＤ／ｇ、すなわち、ＩｇＧ／ＭＮＰより２７．６倍高い）肺内保持がもたらされ、血管内皮への効率的な標的化が示されたが、ＩｇＧ／ＭＮＰ（対照）ではもたらされなかった（図２８）。
【０１８８】
このようなデータは以下のことを示す：（１）オレイン酸カルシウム系の磁性のナノ担体は安定的に構成され、カタラーゼが組み込まれる；（２）磁性のナノ担体は、質量および活性に関してカタラーゼを負荷および保護する；（３）ビオチン化Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７を含めると、ＭＮＰに対するＳＡ−抗体結合が可能になる；（４）ＭＮＰＳに対する抗ＰＥＣＡＭ抗体での表面コーティングにより、ＥＣＳに対するＭＮＰのターゲテッド送達が可能になる；（５）抗ＰＥＣＡＭ抗体コートＭＮＰは、内皮細胞によって３７℃でエンドサイトーシスを受ける；（６）磁性誘導性および抗体誘導性のＭＮＰ送達ではともに、酸化的損傷からのＥＣの保護がもたらされる；ならびに（７）抗ＰＥＣＡＭ抗体コートＭＮＰは肺内皮を特異的に標的化する。このようなデータは、カタラーゼ含有オレイン酸カルシウム系ナノ粒子を用いた標的化用抗酸化酵素治療薬の高い潜在的有効性を示唆する。
【０１８９】
本発明は、上記に説明および例示した実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれる変形および改良が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１７】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図１５Ｂ】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１８−１】
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【図２４】
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