(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＦＸ１）：
【化４５】
0005896746.tif 000070
を有する化合物であって、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの０個、１個または２個がＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、またはＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの１つは、
【化４７】
0005896746.tif 000071
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群より選択され、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）であり、
Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９、ならびにＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちのその他のものは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、アリールスルホニル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
Ｒ３は、メトキシまたはアリルであり；
ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、
ＡはＯまたはＳであり、
Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｘは酸素であり、
Ｒ２は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、
化合物。
【請求項２】
式（ＦＸ１）を有する請求項１に記載の化合物であって、式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちのその他のものは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、アリールスルホニル基、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、それぞれ独立して水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルである、
化合物。
【請求項３】
Ｒ２は水素である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
式（ＦＸ１）：
【化４５】
0005896746.tif 000072
を有する化合物であって、式中、
Ｘ３はＣであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、またはＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル基、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、アリールスルホニル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
Ｒ１２は、
【化５３】
0005896746.tif 000073
であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群より選択され、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数であり、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、
ＡはＯまたはＳであり、
Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｘは酸素であり、
Ｒ２は、水素、またはＣ１〜Ｃ６アルキルである、
化合物。
【請求項５】
ＲａおよびＲｂはそれぞれ水素であり、ｑは０である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３はアリルであり、Ｒ２は水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３のうちの１つ、２つまたは３つはメトキシである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３はアリルであり、Ｒ２は水素である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項９】
癌細胞を処置するための組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含み、前記癌細胞が有効量の前記組成物に曝露され、前記癌細胞が該化合物での処置に対して感受性であることが同定されていることを特徴とする、組成物。
【請求項１０】
有効量の１つまたは複数の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬。
【請求項１１】
細胞のアポトーシスを誘導するための組成物であって、有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む、組成物。
【請求項１２】
前記化合物のｌｏｇＢＢが−０．４〜−２である、請求項９または１１に記載の組成物、または請求項１０に記載の医薬。
【請求項１３】
細胞を有効量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物と接触させる工程を含むｅｘ  ｖｉｖｏ法。
【請求項１４】
治療で用いるための組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１５】
癌処置のための組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を含む組成物。
【請求項１６】
癌処置のための医薬の製造における請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１７】
ＲａおよびＲｂがそれぞれ水素であり、ｑが０であり、Ｒ３がアリルであり、そしてＲ２が水素である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１８】
【化５９】
0005896746.tif 000074
である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１９】
前記癌が、乳癌、リンパ腫、副腎癌、腎臓癌、黒色腫、白血病、神経芽細胞種、肺癌または脳癌から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記癌が、白血病である、請求項１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２００９年２月９日にＨｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒらによって出願された米国仮特許出願第６１／１５１，０６４号（これは、その全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金援助を受けた研究または開発についての声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＲ０１−ＣＡ１２０４３９、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された１  Ｔ３２  ＧＭ０７０４２１、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＦ３１−ＣＡ１３０１３８０１Ｓ１の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アポトーシス（すなわち、プログラム細胞死）は、全ての多細胞生物の発生およびホメオスタシスで中心的役割を果たす（非特許文献１）。癌の顕著な特徴は、天然のアポトーシスシグナルへの耐性である。癌型に依存して、この耐性は、典型的には、アポトーシスカスケードにおける主要タンパク質の上方制御もしくは下方制御またはこれらのタンパク質をコードする遺伝子の変異に起因する。かかる変化は、内因性アポトーシス経路（ミトコンドリアおよびカスパーゼ−９によって集められる）および外因性アポトーシス経路（細胞死受容体およびカスパーゼ−８の作用を含む）の両方で起こる。例えば、適切なタンパク質（ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰ、およびその他多数のものなど）レベルの変化が癌で認められている。この変化により、アポトーシスカスケードが欠損し得る（上流アポトーシス促進性シグナルが執行カスパーゼ（カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７）を活性化するように適切に伝達されない）。図１は、アポトーシスカスケードの態様を示す。
【０００４】
ほとんどのアポトーシス経路が最終的にプロカスパーゼ−３の活性化を含むので、上流遺伝子異常により、アポトーシス回路が有効に「破壊され」、その結果、かかる細胞が非定型に増殖する。癌におけるアポトーシスの中心的役割を考慮して、アポトーシスカスケード中の特異的タンパク質をターゲティングする治療薬を開発するよう努力が払われている。例えば、カスケードメンバー（ｐ５３など）およびＢｃｌファミリーのタンパク質またはアポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）ファミリーに対するペプチド分子または小分子の結合剤は、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する化合物と同様のアポトーシス促進活性を有する。しかし、かかる化合物がアポトーシスカスケード上の初期（または中間から後期）の位置をターゲティングするので、これらのメンバーの下流のタンパク質が変異した癌は、依然としてこれらの化合物の起こり得る有益な作用に耐性を示し得る。
【０００５】
治療のために、アポトーシスカスケードの遥か下流のアポトーシス促進性タンパク質を直接活性化する小分子を同定することが有利であろう。本発明者らの発明に対するアプローチは、カスケード中のかかる比較的低位を含み、したがって、その上流アポトーシス機構が変異した細胞でさえも死滅させることが可能である。さらに、本明細書中に開示の治療ストラテジーは、アポトーシス促進性タンパク質が癌細胞中で上方制御された場合に成功の可能性がより高くなり得る。本発明では、本発明者らの小分子を同定する試みは、アポトーシスの有意な下流エフェクタータンパク質であるプロカスパーゼ−３のターゲティングから開始している。
【０００６】
プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への変換または活性化によって活性な「執行」カスパーゼ形態が生成され、これがその後に多数のタンパク質基質の加水分解を触媒する。活性なカスパーゼ−３はヘテロ二量体のホモ二量体であり、プロカスパーゼ−３のタンパク質分解によって産生される。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、このタンパク質分解活性化は、典型的には、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−９の作用を介して起こる。確実にプロ酵素または酵素原が未熟に活性化されないように、プロカスパーゼ−３は、タンパク質分解のＩＥＴＤ部位（アミノ酸配列ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ａｓｐ）への接近を遮断する１２アミノ酸の「安全装置」を有する。非特許文献２を参照のこと。
【０００７】
この安全装置により、プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−９による自己触媒的活性化およびタンパク質分解に耐性を示すことができる。変異研究は、３つの連続アスパラギン酸残基が安全装置の重要成分のようであるということを示す。安全装置の位置はｐＨに感受性を示し、したがって、細胞の酸性化の際に（アポトーシス中に起こる場合）、安全装置はタンパク質分解部位に接近可能となると考えられ、活性カスパーゼ−３を、カスパーゼ−９の活性化または自己活性化機構のいずれかによって産生することができる。
【０００８】
特定の癌では、プロカスパーゼ−３発現が上方制御される。２０人の結腸癌患者由来の初代分離菌の研究により、平均して、隣接する非癌組織と比較してかかる分離菌でプロカスパーゼ−３が６倍上方制御されたことが明らかとなった（非特許文献２）。さらに、プロカスパーゼ−３は、一定の神経芽細胞腫、リンパ腫、および肝臓癌で上方制御される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。さらに、国立癌研究所（ＮＣＩ）創薬プログラムによる癌スクリーニングのために使用された６０細胞株パネルにおいてプロカスパーゼ−３レベルの系統的評価を行った。この評価により、一定の肺癌、黒色腫、腎臓癌、および乳癌でプロカスパーゼ−３発現レベルが非常に増強されることが明らかになった（非特許文献６）。
【０００９】
アポトーシス実施における活性なカスパーゼ−３の役割、一定の癌細胞型における比較的高い発現レベルのプロカスパーゼ−３、およびその自己活性化の興味深い安全装置媒介性抑制のために、本発明者らは、プロカスパーゼ−３を直接改変する小分子を同定することができ、かかる分子が癌標的治療で高い適用性を有し得ると推論した。
【００１０】
本発明者らは、本明細書中で、とりわけ、細胞死を誘導することができる小分子を含む組成物および方法を開示する。実施形態では、組成物および方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（プロカスパーゼ−３など）と直接または間接的に相互作用することができる化合物を含む。実施形態では、本発明の組成物および方法は、プログラム細胞死経路のメンバー（プロカスパーゼ−３など）と直接または間接的に相互作用する他の化合物と比較して神経毒性が減少している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｈｉ  Ｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ（２００２）９：４５９−４７０
【非特許文献２】Ｒｏｙ，Ｓ．ら、；Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  “ｓａｆｅｔｙ  ｃａｔｃｈ”  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００１）９８，６１３２−６１３７
【非特許文献３】Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９７）５７：４５７８−４５８４
【非特許文献４】Ｉｚｂａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１４３９−１４４７
【非特許文献５】Ｐｅｒｓａｄ，Ｒ．ら、，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏ．１７：８６１−８６７
【非特許文献６】Ｓｖｉｎｇｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：６８０７−６８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
式（ＦＸ１）：
【化４５】
0005896746.tif 000002
を有する化合物であって、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、およびアリールスルホニル基からなる群より選択される極性基を含み、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちのその他のものは、水素、ハロゲン、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、アリールスルホニル基、アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、
ＡはＯまたはＳであり、
Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｘは酸素であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシである、
化合物。
（項目２）
式（ＦＸ１１）：
【化４６】
0005896746.tif 000003
を有する化合物であって、式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの１つは、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、およびアリールスルホニル基からなる群より選択される極性基を含み、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちのその他のものは、Ｈ、ハロゲン、−ＯＨ、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、アリールスルホニル基、およびアルコキシ基からなる群よりそれぞれ独立して選択され、
ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、
Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、
ＡはＯまたはＳであり、
Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルからそれぞれ独立して選択され、
Ｘは酸素であり、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシである、
化合物。
（項目３）
Ｒ２Ｘは−ＯＨである、項目１または２に記載の化合物。
（項目４）
Ｒ３はメトキシまたはアリルである、項目１または２に記載の化合物。
（項目５）
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、
【化４７】
0005896746.tif 000004
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）、および
【化４８】
0005896746.tif 000005
（式中、Ｒ１６およびＲ１７は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｐは０〜３の整数である）からなる群より選択される、項目１に記載の化合物。
（項目６）
Ｒ１０、Ｒ１１、またはＲ１２のうちの１つは、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、
【化４９】
0005896746.tif 000006
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）、および
【化５０】
0005896746.tif 000007
（式中、Ｒ１６およびＲ１７は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｐは０〜３の整数である）からなる群より選択される、項目２に記載の化合物。
（項目７）
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、
【化５１】
0005896746.tif 000008
であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である、項目１または２に記載の化合物。
（項目８）
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの１つは、
【化５２】
0005896746.tif 000009
であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である、項目２に記載の化合物。
（項目９）
Ｒ１２は、
【化５３】
0005896746.tif 000010
であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である、項目１または２に記載の化合物。
（項目１０）
ＲａおよびＲｂはそれぞれ水素であり、ｑは０である、項目９に記載の化合物。
（項目１１）
Ｒ３はアリルであり、ＸはＯであり、Ｒ２は水素である、項目９に記載の化合物。
（項目１２）
Ｒ１２は−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ２である、項目９に記載の化合物。
（項目１３）
Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はメトキシである、項目１または２に記載の化合物。
（項目１４）
Ｒ３はアリルであり、ＸはＯであり、Ｒ２は水素である、項目１または２に記載の化合物。
（項目１５）
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの１つまたは２つはＮである、項目１または２に記載の化合物。
（項目１６）
式（ＦＸ２）：
【化５４】
0005896746.tif 000011
を有する、項目１または２に記載の化合物。
（項目１７）
式（ＦＸ１２）：
【化５５】
0005896746.tif 000012
を有する、項目１または２に記載の化合物。
（項目１８）
式（ＦＸ３）、（ＦＸ４）、（ＦＸ５）、または（ＦＸ６）：
【化５６】
0005896746.tif 000013
を有する、項目１または２に記載の化合物。
（項目１９）
式（ＦＸ７）または（ＦＸ８）：
【化５７】
0005896746.tif 000014
を有する、項目１または２に記載の化合物。
（項目２０）
蛍光標識を含む、項目１または２に記載の化合物。
（項目２１）
構造（ＦＸ９）：
【化５８】
0005896746.tif 000015
を有する、項目２０に記載の化合物。
（項目２２）
癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、前記癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を改変することができる化合物を前記癌細胞に投与する工程を含み、前記化合物が項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物である、方法。
（項目２３）
癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、前記癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を改変することができる化合物を前記癌細胞に投与する工程を含み、前記化合物が項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物であり、前記癌細胞が処置を必要とする患者中に存在する、方法。
（項目２４）
癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼアクチベーター化合物での癌細胞処置に対する潜在的感受性を同定する工程、および（ｂ）前記癌細胞を有効量の前記プロカスパーゼアクチベーター化合物に曝露する工程を含み、前記プロカスパーゼアクチベーター化合物が項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物である、方法。
（項目２５）
癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼアクチベーター化合物での癌細胞処置に対する潜在的感受性を同定する工程、および（ｂ）前記癌細胞を有効量の前記プロカスパーゼアクチベーター化合物に曝露する工程を含み、前記プロカスパーゼアクチベーター化合物が項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物であり、前記プロカスパーゼアクチベーター化合物がプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の少なくとも１つを活性化することができる、方法。
（項目２６）
癌細胞の死滅を誘導する方法であって、前記癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を活性化することができる化合物を前記癌細胞に投与する工程を含み、前記化合物が項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物である、方法。
（項目２７）
有効量の１つまたは複数の項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬。
（項目２８）
１つまたは複数の項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物を含む、癌細胞処置のための医薬を作製する方法。
（項目２９）
細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、前記細胞に項目１〜２１のいずれか１項に記載の化合物を投与する工程を含む、方法。
（項目３０）
前記プロカスパーゼアクチベーター化合物のｌｏｇＢＢが−０．４〜−２である、項目２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記化合物は、患者において感知可能な神経毒性の影響を生じるような程度まで血液脳関門を通過しない、項目２２〜２９のいずれかに記載の方法。
（項目３２）
細胞を有効量の項目１〜２１に記載の化合物と接触させる工程を含むｅｘ  ｖｉｖｏ法。
（項目３３）
細胞を処置する方法であって、細胞を有効量の項目１〜２１に記載の化合物と接触させる工程を含む、方法。
（項目３４）
治療で用いるための項目１〜２１に記載の化合物。
（項目３５）
癌処置のための項目１〜２１に記載の化合物。
（項目３６）
癌処置のための医薬の製造における項目１〜２１に記載の化合物の使用。
発明の概要
本発明は、概して、化合物、組成物、および治療的処置方法を提供する。実施形態では、本発明は、種々の癌疾患および癌細胞型（乳房、リンパ腫、副腎、腎臓、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、肺、脳、および当該分野で公知の他のものなど）の文脈で適用可能である。
【００１３】
さらなる緒言として、癌細胞においてその不活性形態でしばしば過剰発現される酵素を活性化することができる化合物が発見された。この化合物は、癌細胞（プロカスパーゼ−３が上方制御された癌細胞が含まれる）のプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導する。多数の癌が、標準的な化学療法に抵抗性を示す。本発明の化合物は、癌細胞中で上方制御され得る生物学的標的を活用することができ、したがって、そのアポトーシス機構が欠損した細胞でさえも有効であることを立証することができる。低レベルのプロカスパーゼ−３を有する非癌細胞に対する副作用が比較的低い癌細胞の選択的死滅に有利であり得る場合、これらの化合物はまた、癌標的治療で功を奏し得る。これらの副作用には、毒性、特に神経毒性が含まれ得る。
【００１４】
特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明の化合物、組成物、および方法の実施形態は、アポトーシスまたはプログラム細胞死の調整機構を介して、癌細胞の処置で有効であるように作用することができると考えられる。好ましい実施形態では、アポトーシスの調整は、アポトーシスの誘導による調整である。別の実施形態では、アポトーシスの調整は、アポトーシスの阻害による調整である。
【００１５】
末端フェニル環に結合した少なくとも１つの極性基を有するＮ−アシルヒドラゾン亜鉛キレート化コアを有する化合物を提供する。末端フェニル環に結合した少なくとも１つの極性基を有するオルソ−ヒドロキシルＮ−アシルヒドラゾン亜鉛キレート化コアを有する化合物も提供する。
【００１６】
より具体的には、式（ＦＸ１）：
【００１７】
【化１】
0005896746.tif 000016
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、およびアリールスルホニル基からなる群より選択される極性基を含み、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちのその他のものは、水素、ハロゲン、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、アリールスルホニル基、アルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ２〜Ｃ６アルケニルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、ＡはＯまたはＳであり、Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｘは酸素であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシである）を有する化合物を提供する。
【００１８】
式（ＦＸ１１）：
【００１９】
【化２】
0005896746.tif 000017
（式中、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ独立してＣまたはＮであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５がＮである場合、対応するＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４は存在せず、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの１つは、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、およびアリールスルホニル基からなる群より選択される極性基を含み、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちのその他のものは、Ｈ、ハロゲン、スルホンアミド基、ニトロ基、アミノ基、カルボキシラート基、スルホニル基、アリールスルホニル基、およびアルコキシ基からなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｎおよびｍは、それぞれ独立して１〜３の整数であり、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立してＣＨまたはＮであり、ＡはＯまたはＳであり、Ｒ６は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルからそれぞれ独立して選択され、Ｘは酸素であり、Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシである）を有する化合物も提供する。
【００２０】
１つの実施形態では、本明細書中に提供した任意の式および構造では、Ｒ２Ｘは−ＯＨである。１つの実施形態では、本明細書中に提供した任意の式および構造において、Ｒ３はメトキシまたはアリルである。１つの実施形態では、式（ＦＸ１）において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、
【００２１】
【化３】
0005896746.tif 000018
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）、および
【００２２】
【化４】
0005896746.tif 000019
（式中、Ｒ１６およびＲ１７は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｐは０〜３の整数である）からなる群より選択される。
【００２３】
１つの実施形態では、式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）では、Ｒ１０、Ｒ１１、またはＲ１２のうちの１つは、−ＮＯ２、−ＣＯＯＨ、
【００２４】
【化５】
0005896746.tif 000020
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）、および
【００２５】
【化６】
0005896746.tif 000021
（式中、Ｒ１６およびＲ１７は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｐは０〜３の整数である）からなる群より選択される。
【００２６】
１つの実施形態では、式（ＦＸ１）では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９のうちの１つは、
【００２７】
【化７】
0005896746.tif 000022
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）である。
【００２８】
１つの実施形態では、式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの１つは、
【００２９】
【化８】
0005896746.tif 000023
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）である。
【００３０】
１つの実施形態では、式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）では、Ｒ１２は、
【００３１】
【化９】
0005896746.tif 000024
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜３の整数である）である。１つの実施形態では、Ｒ１２では、ＲａおよびＲｂはそれぞれ水素であり、ｑは０である。
【００３２】
１つの実施形態では、Ｒ３はアリルであり、ＸはＯであり、Ｒ２は水素である。１つの実施形態では、Ｒ１２は−Ｓ（＝Ｏ）２−ＮＨ２である。１つの実施形態では、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ３はアリルであり、ＸはＯであり、Ｒ２は水素である。１つの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５のうちの１つまたは２つはＮである。
【００３３】
式（ＦＸ２）：
【００３４】
【化１０】
0005896746.tif 000025
（式中、変数は、式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）について本明細書中の他の場所に記載の通りである）を有する式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。
【００３５】
式（ＦＸ１２）：
【００３６】
【化１１】
0005896746.tif 000026
（式中、変数は、式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）について本明細書中の他の場所に記載の通りである）を有する式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。
【００３７】
式（ＦＸ３）、（ＦＸ４）、（ＦＸ５）、または（ＦＸ６）：
【００３８】
【化１２】
0005896746.tif 000027
を有する式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。
【００３９】
式（ＦＸ７）または（ＦＸ８）：
【００４０】
【化１３】
0005896746.tif 000028
を有する式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。
【００４１】
蛍光標識を含む式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。構造（ＦＸ９）：
【００４２】
【化１４】
0005896746.tif 000029
を有する式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。
【００４３】
１つの実施形態では、癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を改変することができる化合物を癌細胞に投与する工程を含み、化合物は式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物である、方法も提供する。１つの実施形態では、癌細胞のアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を改変することができる化合物を癌細胞に投与する工程を含み、化合物は式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物であり，癌細胞が処置を必要とする患者中に存在する、方法も提供する。１つの実施形態では、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼアクチベーター化合物での癌細胞処置に対する潜在的感受性を同定する工程、および（ｂ）癌細胞を有効量のプロカスパーゼアクチベーター化合物に曝露する工程を含み、プロカスパーゼアクチベーター化合物は式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物である、方法も提供する。１つの実施形態では、癌細胞を処置する方法であって、（ａ）プロカスパーゼアクチベーター化合物での癌細胞処置に対する潜在的感受性を同定する工程、および（ｂ）癌細胞を有効量のプロカスパーゼアクチベーター化合物に曝露する工程を含み、プロカスパーゼアクチベーター化合物は式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物であり、プロカスパーゼアクチベーター化合物はプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７の少なくとも１つを活性化することができる、方法も提供する。１つの実施形態では、癌細胞の死滅を誘導する方法であって、癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を活性化することができる化合物を癌細胞に投与する工程を含み、化合物は式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物である、方法も提供する。１つの実施形態では、有効量の１つまたは複数の式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物を含む医薬も提供する。１つの実施形態では、１つまたは複数の式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物を含む、癌細胞処置のための医薬の作製方法も提供する。１つの実施形態では、細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、細胞に式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物を投与する工程を含む、方法も提供する。プロカスパーゼアクチベーター化合物のｌｏｇＢＢが−０．４〜−２である、本明細書中に記載の方法も提供する。式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物のｌｏｇＢＢが−０．４〜−２である、本明細書中に記載の方法も提供する。患者において感知可能な神経毒性の影響を生じるような程度まで血液脳関門を化合物が通過しない本明細書中に記載の方法も提供する。細胞を有効量の式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物に接触させる工程を含む、ｅｘ  ｖｉｖｏ法も提供する。細胞を処置する方法であって、細胞を有効量の式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物と接触させる工程を含む、方法も提供する。治療で用いる式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。癌処置用の式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物も提供する。癌処置用の医薬の製造における式（ＦＸ１）または（ＦＸ１１）の化合物の使用も提供する。
【００４４】
１つの態様では、本発明の化合物上の少なくとも１つの置換基は極性基である。１つの実施形態では、ＡはＯである。１つの実施形態では、Ｒ４およびＲ５は共にＮである。１つの実施形態では、ｍおよびｎは共に１である。１つの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は全てＣである。１つの実施形態では、Ｒ６はＨである。１つの実施形態では、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は全てＨである。１つの実施形態では、Ｒ３はアリルである。１つの実施形態では、Ｒ１０およびＲ１４はＨであり、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はそれぞれメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ２Ｘは−ＯＨである。１つの実施形態では、Ｒ３はメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９の１つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のうちの２つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ３、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９のうちの３つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４の１つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの２つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ１０およびＲ１３はメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの３つはメトキシである。１つの実施形態では、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの１つのみが水素ではない。１つの実施形態では、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４のうちの１つのみが水素ではない。１つの実施形態では、Ｒ１１もＲ１２も水素ではない。
【００４５】
本発明の１つの態様では、本明細書中に記載および表示の任意の式の化合物を、蛍光標識で標識する。本発明の化合物および方法と共に蛍光標識を使用することにより、当該分野で公知のように、所望の系で化合物を追跡し、化合物の濃度を決定し、他で使用することが可能である。特定の蛍光標識の同一性、使用、合成、および選択は、当業者の能力の範囲内である。特定の実施形態では、蛍光標識はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０である。他の蛍光標識は、これらの標識が個別に列挙されているかのように本明細書中に含まれ、開示されることを意図する。
【００４６】
本発明の１つの態様では、本発明の化合物は、処置の停止が必要である量の神経毒性または他の有害作用を生じるのに十分な量で血液脳関門を通過しない。本発明の１つの態様では、本発明の化合物のｌｏｇＢＢは、例えば、−０．４〜−２である。
【００４７】
本発明の１つの態様では、本発明の化合物は、癌細胞の細胞死を誘導する。本発明のこの態様の実施形態では、本発明の化合物は、リンパ腫、白血病、黒色腫、子宮頸癌、および乳癌の細胞の細胞死を誘導する。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、「極性基」は、この用語が当該分野で使用されるように、少なくとも部分的に極性を示す少なくとも１つの結合を含む。極性基は、双極子モーメントを有する少なくとも１つの結合を含む。「極性基」は、本明細書中で使用する場合、この用語が当該分野で使用されるように、全化学「基」の一部として極性基を含むことができる。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、スルホンアミド基は、構造：
【００５０】
【化１５】
0005896746.tif 000030
（式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、Ｒ１８およびＲ１９は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、ｑは０〜６の整数である）を有する。１つの実施形態では、ＲａおよびＲｂはそれぞれ水素である。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、スルホニル基は、構造：−ＳＯ２−を含む。１つの実施形態では、スルホニル基は、構造：
【００５２】
【化１６】
0005896746.tif 000031
（式中、Ｒ１６およびＲ１７は、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択され、アリール基は、環内で１つまたは複数のヘテロ原子に任意選択的に置換することができ、１つまたは複数のハロゲン原子、ニトロ基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシ基に任意選択的に置換することができ、ｐは０〜６の整数である）を有するアリールスルホニル基の一部である。スルホニル基を、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルなどの任意の適切な置換基によって末端化することができる。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、アリルは、アルケニル基−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２をいう。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、ニトロ基は構造：−ＮＯ２を含む。１つの実施形態では、ニトロ基は、アルキルニトロ基の末端基であってよく、１〜６個の任意選択的に置換されたメチレン基がニトロ官能基に先行する。本明細書中で使用する場合、カルボキシラート基は、構造：−ＣＯＯＨを含む。１つの実施形態では、カルボキシラート基は、水素の代わりにＣ１〜Ｃ６アルキル基によって末端化される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、プロカスパーゼ−３の小分子活性化のいくつかの態様を示す。
【図２】図２は、ＰＡＣ−１が種々の癌細胞を選択的に死滅させることを示す。
【図３】図３は、癌のマウス異種移植モデルにおける腫瘍成長のＰＡＣ−１による遅延を示す。
【図４】図４は、マウスにおける腫瘍成長のＰＡＣ−１による遅延を示す。
【図５】図５は、ＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３のＺｎ２＋阻害を軽減することを示す。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ基質の切断によって評価されるように、亜鉛がプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／  Ｄ１７５Ａ）変異体（Ｄ３Ａ、２．５μＭ）活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する能力は、ＰＡＣ−１（５０μＭ）の存在下で減少する。示したデータは３回の試験の代表である。
【図６】図６は、１０μＭ  ＺｎＳＯ４を含む緩衝液中でアッセイした場合にＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）（Ｄ３Ａ）変異体の活性を増強することを示す。
【図７】図７は、１０μＭ  ＺｎＳＯ４を含む緩衝液中でアッセイした場合にＰＡＣ−１−Ｉ−８がプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）（Ｄ３Ａ）変異体の活性を増強することを示す。
【図８】図８は、ＺｎＳＯ４のＰＡＣ−１溶液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＫＮＯ３、ｐＨ７．２緩衝液中５０μＭ）への滴定によってＰＡＣ−１の紫外可視スペクトルが変化することを示す。５μＭずつ増加する０〜７５μＭのＺｎＳＯ４濃度を示す。
【図９】図９は、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋結合相互作用の分析および連続変位法による化学量論を示す。ピーク値の位置に基づいて、化学量論は１：１と決定され、Ｋｄは４２ｎＭと決定された。エラーバーは平均からの標準偏差を示す。
【図１０】図１０は、ＺｎＳＯ４のＰＡＣ−１−Ｉ−８溶液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＫＮＯ３、ｐＨ７．２緩衝液中の５０μＭ）への滴定によってＰＡＣ−１−Ｉ−８の紫外可視スペクトルが変化しないことを示す。
【図１１】図１１は、種々の濃度のＰＡＣ−１−ＩＩ−７による％細胞死を示す。
【図１２】図１２は、種々の濃度のＰＡＣ−１−ＩＶ−３による％細胞死を示す。
【図１３】図１３は、ＰＡＣ−１−ＩＩ−６の亜鉛結合を示す。
【図１４】図１４は、共焦点顕微鏡法研究の結果を示す。
【図１５】図１５は、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋複合体の最低エネルギー配座異性体を示す。
【図１６−１】図１６は、Ｓ−ＰＡＣ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けを示す。Ａ）ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１の構造。Ｂ）Ｚｎ２＋：Ｓ−ＰＡＣ−１複合体の形成曲線。Ｓ−ＰＡＣ−１は亜鉛とＫｄ４６±５ｎＭで結合する。Ｃ）Ｓ−ＰＡＣ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロカスパーゼ−３  Ｄ３Ａを活性化させる。濃度１０μＭの非切断性プロカスパーゼ−３（Ｄ３Ａ）を、１５μＭの外因性亜鉛の存在下でインキュベートした。５０μＭ  Ｓ−ＰＡＣ−１の添加により、最初の５分間は活性が急速に増加し、その後６０分間にわたってゆっくり増加する。Ｄ）Ｓ−ＰＡＣ−１は、Ｕ−９３７細胞のアポトーシスを誘導する。Ｕ−９３７細胞を、５０μＭ  Ｓ−ＰＡＣ−１と１２時間インキュベートし、アネキシンＶ／ＰＩ染色によって分析した。
【図１６−２】図１６は、Ｓ−ＰＡＣ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴付けを示す。Ａ）ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１の構造。Ｂ）Ｚｎ２＋：Ｓ−ＰＡＣ−１複合体の形成曲線。Ｓ−ＰＡＣ−１は亜鉛とＫｄ４６±５ｎＭで結合する。Ｃ）Ｓ−ＰＡＣ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロカスパーゼ−３  Ｄ３Ａを活性化させる。濃度１０μＭの非切断性プロカスパーゼ−３（Ｄ３Ａ）を、１５μＭの外因性亜鉛の存在下でインキュベートした。５０μＭ  Ｓ−ＰＡＣ−１の添加により、最初の５分間は活性が急速に増加し、その後６０分間にわたってゆっくり増加する。Ｄ）Ｓ−ＰＡＣ−１は、Ｕ−９３７細胞のアポトーシスを誘導する。Ｕ−９３７細胞を、５０μＭ  Ｓ−ＰＡＣ−１と１２時間インキュベートし、アネキシンＶ／ＰＩ染色によって分析した。
【図１７−１】図１７は、Ｓ−ＰＡＣ−１の特徴を示す。Ａ）マウスにおけるｉ．ｐ．投与したＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学。Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ｉ．ｐ．投与によって２−ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリンに溶解した１２５ｍｇ／ｋｇのＳ−ＰＡＣ−１で処理した。マウスを種々の時間で屠殺し、採血した。血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣによって決定した。１２５ｍｇ／ｋｇ  Ｓ−ＰＡＣ−１のピーク血漿濃度は約１７０μＭであり、半減期は約１時間である。Ｂ）研究用猟犬における単回用量Ｓ−ＰＡＣ−１の薬物動態学。４匹の猟犬に静脈内単回用量のＳ−ＰＡＣ−１（２５ｍｇ／ｋｇを含む２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）を投与し、種々の時間で採血し、血清由来のＳ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣによって決定した。イヌのＳ−ＰＡＣ−１のピーク血漿濃度は約１５０μＭであり、半減期は約３時間である。Ｃ）３匹の健康な猟犬にＳ−ＰＡＣ−１を連続注入によって投与した。イヌに初回負荷量を１０分間にわたって投与し、その後に２４時間にわたって定速注入した。種々の時点で採血し、血漿Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣ分析によって決定した。イヌは、Ｓ−ＰＡＣ−１の連続注入に十分な耐性を示し、定常状態の血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度が首尾よく確立された。
【図１７−２】図１７は、Ｓ−ＰＡＣ−１の特徴を示す。Ａ）マウスにおけるｉ．ｐ．投与したＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学。Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ｉ．ｐ．投与によって２−ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリンに溶解した１２５ｍｇ／ｋｇのＳ−ＰＡＣ−１で処理した。マウスを種々の時間で屠殺し、採血した。血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣによって決定した。１２５ｍｇ／ｋｇ  Ｓ−ＰＡＣ−１のピーク血漿濃度は約１７０μＭであり、半減期は約１時間である。Ｂ）研究用猟犬における単回用量Ｓ−ＰＡＣ−１の薬物動態学。４匹の猟犬に静脈内単回用量のＳ−ＰＡＣ−１（２５ｍｇ／ｋｇを含む２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）を投与し、種々の時間で採血し、血清由来のＳ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣによって決定した。イヌのＳ−ＰＡＣ−１のピーク血漿濃度は約１５０μＭであり、半減期は約３時間である。Ｃ）３匹の健康な猟犬にＳ−ＰＡＣ−１を連続注入によって投与した。イヌに初回負荷量を１０分間にわたって投与し、その後に２４時間にわたって定速注入した。種々の時点で採血し、血漿Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣ分析によって決定した。イヌは、Ｓ−ＰＡＣ−１の連続注入に十分な耐性を示し、定常状態の血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度が首尾よく確立された。
【図１８−１】図１８は、リンパ腫保有イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学を示す。臨床試験に登録したイヌに、Ｓ−ＰＡＣ−１を７ｍｇ／ｋｇの負荷量および３ｍｇ／ｋｇ／時間の定速注入にて２４時間（Ａ〜Ｃ）または７２時間（Ｄ〜Ｅ）のいずれかで投与した。種々の時点で採血し、血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣ分析によって決定した。
【図１８−２】図１８は、リンパ腫保有イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学を示す。臨床試験に登録したイヌに、Ｓ−ＰＡＣ−１を７ｍｇ／ｋｇの負荷量および３ｍｇ／ｋｇ／時間の定速注入にて２４時間（Ａ〜Ｃ）または７２時間（Ｄ〜Ｅ）のいずれかで投与した。種々の時点で採血し、血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣ分析によって決定した。
【図１８−３】図１８は、リンパ腫保有イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学を示す。臨床試験に登録したイヌに、Ｓ−ＰＡＣ−１を７ｍｇ／ｋｇの負荷量および３ｍｇ／ｋｇ／時間の定速注入にて２４時間（Ａ〜Ｃ）または７２時間（Ｄ〜Ｅ）のいずれかで投与した。種々の時点で採血し、血清Ｓ−ＰＡＣ−１濃度をＬＣ分析によって決定した。
【図１９】図１９は、Ｓ−ＰＡＣ−１処置の抗腫瘍効果を示す。上）患者１の７週間にわたるＲＥＣＩＳＴスコア。矢印は処置日数を示す。処置中に患者１のＲＥＣＩＳＴスコアは２７％減少した。処置終了後、腫瘍サイズは急速に増加した（４２日目）。下）下顎リンパ節のＣＴスキャン（輪郭）は、処置前（０日目）およびＳ−ＰＡＣ−１投与１週間後（７日目）の腫瘍サイズの有意な減少を示す。
【図２０】図２０は、代表的なＥＧＴＡ蛍光滴定アッセイデータ（Ｓ−ＰＡＣ−１−Ｚｎ：ＫＤ＝４６±５ｎＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
一般に、本明細書中で使用される用語および句は、当業者に公知の標準的なテキスト、雑誌、および文脈を参照することによって見出すことができるその当該分野で認識された意味を有する。
【００５７】
以下の略語を適用可能である。ＩＡＰ、アポトーシスのインヒビター；ＰＡＣ−１、プロカスパーゼ活性化化合物１；ＰＡＲＰ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ。
【００５８】
本発明の文脈でのその特定の使用を明確にするために、定義を提供する。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「化学療法薬」は、癌細胞、癌細胞集団、腫瘍、または他の悪性組織の成長、増殖、または拡大を減少または防止することができる任意の物質をいう。この用語には、任意の抗腫瘍剤または抗癌剤が含まれることも意図する。
【００６０】
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」は、コンテクスト（薬学的有効量または治療有効量など）が含まれることを意図する。例えば、実施形態では、この量は、有益な状態、有益な結果、スクリーニングアッセイにおける機能活性、または臨床症状の改善を得ることができる。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、用語「癌細胞」には、当該分野で広く理解されている定義が含まれることを意図する。１つの実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物の癌の臨床症状に寄与し得る異常に制御された細胞をいう。１つの実施形態では、この用語は、ヒトまたは動物の身体内または身体に由来する培養細胞株または細胞をいうことができる。癌細胞は、当該分野で理解されるように、広範な種々の分化細胞、組織、または器官型の癌細胞であり得る。
【００６２】
用語「アルキル」は、好ましくは１〜２２個の炭素原子を有するモノラジカルな分岐または非分岐の飽和炭化水素鎖および３〜２２個の炭素原子を有する１つまたは複数の環を有するシクロアルキル基をいう。短鎖アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基であり、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、およびヘキシル基（その全ての異性体が含まれる）が含まれる。長鎖アルキル基は、８〜２２個の炭素原子、好ましくは１２〜２２個の炭素原子、および１２〜２０個および１６〜１８個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００６３】
用語「シクロアルキル」は、単環または多環式の縮合環を有する３〜２２個の炭素原子の環式アルキル基をいう。シクロアルキル基には、３〜８員環を有するシクロアルキル基および５および６員環を有するシクロアルキル基が含まれる。シクロアルキル基には、例として、単環構造（シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルなど）および多環構造（アダマンタンイルなど）などが含まれる。
【００６４】
用語「アルケニル」は、好ましくは２〜２２個の炭素原子を有する分岐または非分岐の不飽和炭化水素基のモノラジカルおよび３〜２２個の炭素原子を有する１つまたは複数の環を有し、少なくとも１つの環が二重結合を含む、シクロアルケニル基をいう。アルケニル基は、共役することができる１つまたは複数の二重結合（Ｃ＝Ｃ）を含むことができる。好ましいアルケニル基は、１つまたは２つの二重結合を有するアルケニル基である。短鎖アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基であり、エチレン（ビニル）プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、およびヘキシレン基（その全ての異性体が含まれる）が含まれる。長鎖アルケニル基は、８〜２２個の炭素原子、好ましくは１２〜２２個の炭素原子、ならびに１２〜２０個の炭素原子、および１６〜１８個の炭素原子を有するアルケニル基である。用語「シクロアルケニル」は、単環または多環式の縮合環を有し、少なくとも１つの環が二重結合（Ｃ＝Ｃ）を含む３〜２２個の炭素原子の環状アルケニル基をいう。シクロアルケニル基には、例として、単環構造（シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル（ｃｙｌｃｏｏｃｔａｄｉｅｎｙｌ）、およびシクロオクタトリエニルなど）が含まれる。用語アリルは、アルケニル基−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２をいう。
【００６５】
用語「アルキニル」は、好ましくは２〜２２個の炭素原子を有し、且つ１つまたは複数の三重結合（Ｃ≡Ｃ）を有する、不飽和炭化水素のモノラジカルをいう。アルキニル基には、エチニルおよびプロパルギルなどが含まれる。短鎖アルキニル基は、２〜６個の炭素原子（その全ての異性体が含まれる）を有するアルキニル基である。長鎖アルキニル基は、８〜２２個の炭素原子、好ましくは１２〜２２個の炭素原子、ならびに１２〜２０個の炭素原子、および１６〜１８個の炭素原子を有するアルキニル基である。
【００６６】
用語「アリール」は、少なくとも１つの環が芳香族である、単一の環（例えば、フェニル）、１つまたは複数の環（例えば、ビフェニル）、または複数の縮合（融合）環（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）を有する６〜２２個の炭素原子の不飽和の芳香族の炭素環基を含む基をいう。アリールには、フェニルおよびナフチルなどが含まれる。アリール基は、不飽和芳香環に加えてアルキル、アルケニル、またはアルキニル（ａｋｙｎｙｌ）である部分を含むことができる。用語「アルカリル」は、アルキル部分を含むアリール基（すなわち、−アルキレン−アリールおよび置換アルキレン−アリール（ａｒｙｌｙ））をいう。かかるアルカリル基の例は、ベンジル（−ＣＨ２−フェニル）およびフェネチルなどである。
【００６７】
アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基は、本明細書中に記載のように任意選択的に置換され（この用語には、置換バージョンが含まれ得る）、基内の炭素原子数および基の不飽和度に応じて１〜８個の非水素置換基を含むことができる。本明細書中に記載の全てのかかる変数は、非置換であり得るか（任意の変数において、水素であり得る基は水素である）、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素が含まれる）、Ｃ１〜Ｃ３ハロアルキル、ヒドロキシル（ＯＨ）、チオール（ＨＳ−）、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、フェニル、ベンジル、アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、アルキニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、−ＮＨ２、−ＮＲ’Ｈ、−ＮＲ’Ｒ”、Ｒ’ＣＯ−、Ｒ’Ｒ”ＮＣＯ−、Ｒ’ＣＯ−ＮＨ−、またはＲ’ＣＯ−ＮＲ’−（式中、Ｒ’およびＲ”は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、またはフェニルである）から選択される１つまたは複数の非水素置換基に置換することができる。
【００６８】
用語「アミノ基」は、−ＮＨ２基または−ＮＲ’Ｒ”基（式中、各Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、またはアリール基からなる群より独立して選択される）をいう。
【００６９】
アルコキシ基は、酸素への結合によって修飾されたアルキル基であり、式Ｒ−Ｏによって示すことができ、アルキルエーテル基ともいうことができる。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、およびヘプトキシが含まれるが、これらに限定されない。アルコキシ基には、基のアルキル（ａｌｋｙ）部分がアルキル基の説明に関して本明細書中に示すように置換された置換アルコキシ基が含まれる。本明細書中で使用する場合、ＭｅＯ−はＣＨ３Ｏ−をいう。
【００７０】
「ハロアルキル」は、本明細書中に定義の１つまたは複数のハロ基（同一でも異なっていてもよい）に置換された本明細書中に定義のアルキルをいう。代表的なハロアルキル基には、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、および３−ブロモ−６−クロロヘプチルなどが含まれる。
【００７１】
用語「ハロ」または「ハロゲン」は、ハロゲン基（フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、ヨード（−Ｉ）、またはアスタト（−Ａｔ）など）をいう。
【００７２】
用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの環（１つを超える環が存在する場合）内に酸素、窒素、および硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する２〜２２個の炭素原子の芳香族基をいう。ヘテロアリール基を任意選択的に置換することができる。ヘテロアリール基には、特に、５および６員環を有するヘテロアリール基および環内に１つまたは２つの窒素を有するヘテロアリール基、環内に１つまたは２つの酸素を有するヘテロアリール基、ならびに環内に１つまたは２つの硫黄を有するヘテロアリール基が含まれる。
【００７３】
用語「複素環」または「複素環の」は、単環または多環式の縮合環、２〜２２個の炭素原子、および少なくとも１つの環内に窒素、硫黄、リン、および／または酸素から選択される１〜６個のヘテロ原子、好ましくは１〜４個のヘテロ原子を有するモノラジカルな飽和または不飽和の基をいう。複素環基を置換することができる。環は、好ましくは、３〜１０員を有し、より具体的には、５または６員を有する。
【００７４】
用語「エステル」は、当該分野で理解されている化学物質をいい、特に、式（ＲＣＯ−）の基が含まれ得る。
【００７５】
１つまたは複数の置換基を含む任意の上記基に関して、かかる基が立体的に非実用的であり、そして／または合成的に実現不可能であるいかなる置換または置換パターンも含まないと理解される。本発明の化合物には、開示の化合物の置換から生じる全ての新規の立体化学異性体が含まれる。
【００７６】
当該分野で習慣的且つ周知のように、本明細書中に記載の式中の水素原子は、常に明確に示されているわけではない。例えば、芳香環および脂環式環の炭素原子に結合した水素原子は式中に常に明確に示しているわけではない。本明細書中（例えば、式の説明の文脈中）に提供した構造は、本発明の方法の化合物および組成物の化学組成を当業者に伝達することを意図し、当業者に理解されるように、提供した構造はこれらの化合物の原子間の特異的結合角を示さない。
【００７７】
本明細書中および添付の特許請求の範囲中で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈上そうでないと明確に示されない限り、複数形が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「ａ  ｃｅｌｌ」という言及には、複数のかかる細胞および当業者に公知のその等価物などが含まれる。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、および「少なくとも１つ」を、本明細書中で交換可能に使用することができる。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」を相互交換可能に使用することができることも留意すべきである。表現「請求項ＸＸからＹＹのいずれか」（ＸＸおよびＹＹは請求項番号を示す）は、別の形態の複数の従属クレームを提供することを意図し、いくつかの実施形態では、表現「請求項ＸＸからＹＹのいずれか１項」などと相互交換可能である。
【００７８】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般的に理解されている意味を有する。本明細書中に記載のものと類似するか等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるにもかかわらず、好ましい方法および材料をここに記載する。本発明が先行発明によってかかる開示に先行する権利が与えられないことを承認すると解釈されるべきではない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、リポソームまたはミセルを、組成物のキャリアまたはビヒクルとして使用することができる。
【００８０】
他で示さない限り、本明細書中に記載または例示の成分のあらゆる処方物または組み合わせを使用して本発明を実施することができる。
【００８１】
本発明の組成物、調製物、および処方物を、経腸投与、非経口投与、局所投与、エアロゾル投与、吸入投与、または皮膚投与のための診断組成物または治療組成物に処方することができる。組成物、調製物、および処方物の局所送達または皮膚送達には、エアロゾル処方物、クリーム、ゲル、溶液なども含まれ得る。本発明の組成物、調製物、および処方物を、所望の診断効果および／または治療効果を達成するのに有効な用量で投与する。かかる用量は、組成物中で使用した特定の組成、試験すべき器官または組織、臨床手順で使用した装置、および達成される処置の有効性などに応じて広範に変化し得る。これらの組成物、調製物、および処方物は、意図する投与型に適切な従来の薬学的キャリアおよび賦形剤と共に有効量の組成物を含む。これらの組成物、調製物、および処方物はまた、安定剤および皮膚浸透増強剤を任意選択的に含むことができる。本明細書中で等価に使用される「患者」または「被験体」は、動物をいう。特に、動物は、哺乳動物、好ましくはヒトをいう。被験体は、（１）本発明の化合物または組成物の投与によって診断可能、防止可能、および／または処置可能な容態を有し得るか、（２）本発明の化合物または組成物の投与によって診断可能、防止可能、および／または処置可能な容態の影響を受けやすい。
【００８２】
１つの実施形態では、本発明の組成物は化学療法薬である。
【００８３】
１つの実施形態では、本発明は、有効濃度（好ましくは、約１０ｎＭ〜約１００μＭ）の開示の構造式を含む化合物および方法を提供する。別の好ましい実施形態では、有効濃度は約２００ｎＭ〜約５μＭである。１つの実施形態では、有効濃度は、直接プロカスパーゼ活性化アッセイ、細胞アポトーシス誘導アッセイ、または動物臨床治療評価における５０％活性濃度などの値であると考えられる。好ましい実施形態では、かかる値は約２００μＭ未満である。好ましい実施形態では、値は約１０μＭ未満である。
【００８４】
本発明の化合物および本発明の方法で有用な化合物には、開示の式の化合物ならびにこれらの化合物の塩およびエステル（好ましくは、薬学的に許容可能な塩およびエステルが含まれる）が含まれる。
【００８５】
１つの実施形態では、本発明は、組成物のプロドラッグ形態を提供する。本発明の化合物のプロドラッグは、本発明の方法で有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏで生物学的、薬学的、または治療的に活性な本発明の化合物の形態に変換される任意の化合物はプロドラッグである。プロドラッグの種々の例および形態が当該分野で周知である。生体分子（前駆体タンパク質または前駆体核酸など）はプロドラッグであり得る。プロドラッグの例は、とりわけ、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，ａｔ  ｐｐ．３０９−３９６，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒ，ｅｔ．ａｌ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，”  ｂｙ  Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，ａｔ  ｐｐ．１１３−１９１，１９９１）；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１−３８（１９９２）；Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄら、，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．２８５（１９８８）；およびＮｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  ３８８−３９２）に見出される。
【００８６】
１つの実施形態では、本発明の組成物は、単離または精製された形態である。
【００８７】
本明細書中で考察または開示されている任意の機械的説明または仮説の最終的な正確さと無関係に、本発明の実施形態は有効且つ有用であり得ると認識される。
【００８８】
置換基を本明細書中に開示する場合、群の全ての個別のメンバーおよび全ての亜群（群員の任意の異性体および鏡像異性体が含まれる）が個別に開示されると理解される。マーカッシュグループまたは他のグループ化を本明細書中で使用する場合、群ならびに群の可能な全ての組み合わせおよびサブコンビネーションの全ての各メンバーは、開示で個別に含まれることが意図される。任意のマーカッシュグループまたは本明細書中に提供したリストの任意の１つまたは複数のメンバーを必要に応じて本発明から排除することができることを意図する。化合物の特定の異性体または鏡像異性体が、例えば、式または化学名で特定されないように本明細書中で化合物を記載する場合、その記載は、個別または任意の組み合わせで記載した化合物の各異性体および鏡像異性体が含まれることを意図する。さらに、他で特定しない限り、本明細書中に開示の化合物の全ての同位体バリアントが本開示によって含まれることが意図される。例えば、開示の分子中の任意の１つまたは複数の水素をジューテリウムまたはトリチウムに置換することができると理解されるであろう。分子の同位体バリアントは、一般に、分子のアッセイならびに分子またはその使用に関する化学的および生物学的研究における標準として有用である。化合物の特定の名称は例示を意図し、当業者に公知のように、同一の化合物に異なる名称を付与することができる。
【００８９】
本明細書中に開示の分子は、１つまたは複数のイオン性基（プロトンを除去することができる基（例えば、−ＯＨ、−ＣＯＯＨなど）または付加することができる基（例えば、アミン）、または四級化することができる基（例えば、アミン））を含むことができる。かかる分子およびその塩の全ての可能なイオン性形態は、本明細書中の開示に個別に含まれることが意図される。本明細書中の化合物の塩に関して、当業者は、広範な種々の利用可能な対イオンのうち、所与の適用のために本発明の塩の調製に適切な対イオンから選択することができる。例えば、一般に、任意の陰イオンを、本明細書中の化合物の塩の形成で使用することができる（例えば、ハライド、硫酸塩、カルボン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびサリチル酸塩など）。
【００９０】
本発明の化合物およびその塩またはエステルは、水素原子が分子の他の部分に輸送され、分子の原子間の化学結合が結果的に転位するその互変異性体の形態で存在することができる。全ての互変異性体の形態は、これらが存在し得る限り、本発明の範囲内に含まれると理解すべきである。さらに、化合物は、トランスおよびシス異性体を有することができ、１つまたは複数のキラル中心を含むことができる。したがって、鏡像異性体およびジアステレオマーの形態で存在する。本明細書中で別なふうに記載された場合を除いて、本発明は、全てのかかる異性体、各鏡像異性体、ならびにシス異性体とトランス異性体との混合物、ジアステレオマーの混合物、鏡像異性体（光学異性体）の非ラセミおよびラセミ混合物、および１つまたは複数の形態が富化された上記の混合物を含むことができる。化合物の（または不斉炭素の）立体配置（シス、トランスまたはＲもしくはＳ）について特に言及しない場合、異性体の任意の１つまたは１つを超える異性体の混合物が意図される。調製過程では、出発物質としてラセミ体、鏡像異性体、またはジアステレオマーを使用することができる。鏡像異性体またはジアステレオマーの生成物を調製する場合、これらを、従来の方法、例えば、クロマトグラフィまたは分別晶出によって分離することができる。本発明の化合物は、遊離形態または水和物形態であり得る。
【００９１】
他で示さない限り、本明細書中に記載または例示の成分のあらゆる処方物または組み合わせを使用して、本発明を実施することができる。
【００９２】
本出願に範囲（例えば、温度範囲、時間範囲、ｌｏｇＢＢ、または組成物もしくは濃度の範囲）を記載する場合はいつでも、全ての中間の範囲および部分的範囲ならびに所与の範囲内に含まれる全ての各値が本開示に含まれることを意図する。
【００９３】
本明細書中に開示の任意の引用文献中の情報は、ある場合には、最新技術（例えば、その有効出願日現在での特許書類）を示すことができ、かかる情報を本明細書中で使用して、必要に応じて、先行技術に存在することが実際に見出される特定の実施形態を排除することができることが意図される。例えば、化合物を開示し、そして／または特許請求の範囲に記載する場合、本発明に関して先行技術と見なされる化合物（文献中に開示され得る化合物が含まれる）が組成物クレームに含まれることを意図しないと理解すべきである。
【００９４】
本明細書中に提供したいくつかの文献は、本発明の出発物質、さらなる出発物質、さらなる試薬、さらなる合成方法、さらなる分析方法、およびさらなる使用の供給元に関する詳細を提供するために参考として援用される。当業者は、特に例示されたもの以外の出発物質、試薬、固体基質、合成方法、精製方法、および分析方法を、当該分野の知識に基づいて過度の実験に依存することなく本発明の実施で使用することができると認識するであろう。
【００９５】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに理解することができる。
【実施例】
【００９６】
実施例１．ＰＡＣ−１および個別化抗癌治療
本明細書中でさらに考察するように、アポトーシスは、多細胞生物に共通のプログラム細胞死型である。アポトーシスの回避は癌の特徴であり、多数の癌が天然のアポトーシスシグナルに耐性を示す。この耐性は、ほとんどの場合、アポトーシス促進性シグナルの下流システイン−アスパラギン酸プロテアーゼ（カスパーゼ）への適切な伝達を防止する上流アポトーシスタンパク質の異常な発現および変異に起因する。最終的に、執行カスパーゼ−３の活性化は、ほとんどのアポトーシス経路における重要な連携工程である。驚いたことに、プロカスパーゼ−３は多数の癌で上方制御されるが、上流アポトーシスカスケードの変化によってその活性化が防止される。
【００９７】
カスパーゼ−３の上流のアポトーシスタンパク質をターゲティングするためのアポトーシス促進性化合物が多数開発されている。しかし、上記障害物により、しばしば、これらの化合物の癌性細胞における所望のアポトーシス促進効果が阻止される。個別化され、且つより有効な抗癌ストラテジーは、カスケードの任意の障害物の下流のアポトーシス促進性タンパク質の直接活性化を含む。図１は、プロカスパーゼ−３の小分子活性化のいくつかの態様を示す。
【００９８】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび多数の癌細胞株においてプロカスパーゼ−３をカスパーゼ−３に直接活性化する（癌性細胞のアポトーシスの誘導）小分子としてＰＡＣ−１を報告している（Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６、２、５４３−５５０）。ＰＡＣ−１はまた、複数のマウス癌モデルにおいて有効性が示されている。
【００９９】
上流アポトーシスタンパク質の変異および異常発現は、アポトーシス促進性シグナルが下流エフェクターカスパーゼに到達するのを阻止する。重要な執行者であるプロカスパーゼ−３は、多数の癌で上方制御される。プロカスパーゼ−３を直接活性化することができる小分子を得るという目的のために多大な努力が捧げられている。この努力のいくつかを、本発明のさらなる背景として本明細書中に記載する。
【０１００】
スキーム１は、プロカスパーゼ−３アクチベーターの例示的な高処理スクリーニングの例を示す。
【０１０１】
【化１７】
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約２０，０００種の化合物を、プロカスパーゼ−３を活性カスパーゼ−３に活性化する能力について発色基質を使用してスクリーニングした。ＰＡＣ−１を、用量依存様式でプロカスパーゼ−３を活性化することができる化合物と同定した。ＰＡＣ−１−Ｉ−８は、活性を示さない構造的に関連する化合物である。
【０１０２】
【化１８】
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図２は、ＰＡＣ−１が癌細胞を選択的に死滅させることを示す。ＰＡＣ−１は、新たに切除した結腸腫瘍から単離した細胞の死滅を誘導する。新たに切除した原発性結腸腫瘍（隣接する非癌性組織と共に）を２３人から得て、癌性組織および非癌性組織を分離した。ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３の細胞濃度に比例する様式で細胞死を誘導する。円は、２３個の結腸腫瘍由来の初代癌性細胞を示す。黒三角は、種々の癌細胞株を示す。菱形は、以下の４つの非癌性細胞型である：Ｈｓ８８８Ｌｕ（肺線維芽細胞）、ＭＣＦ−１０Ａ（乳房線維芽細胞）、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（乳房上皮細胞）、および健康なドナーの骨髄から単離した白血球。四角は、２３人の腫瘍周縁部から単離した初代非癌性細胞である。
【０１０３】
図３および４は、マウス癌異種移植モデルにおける腫瘍成長のＰＡＣ−１遅延を示す（Ｐｕｔｔら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６，２，５４３−５５０）。図３について、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）細胞株を使用した皮下注射によってマウスに腫瘍を形成させた。この皮下注射は、各群あたり８匹のマウスを使用し、マウスあたり３つの腫瘍を形成させる。ＰＡＣ−１またはビヒクルを、１〜２１日目に経口栄養によって１日１回投与した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．である。図４について、マウスにＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株を注射した。（Ｐｕｔｔら、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６，２，５４３−５５０）に記載のプロトコールにしたがって、マウスを経口栄養によってＰＡＣ−１（１００ｍｇ／ｋｇ−１）で処置した。コントロールマウスの肺は、大量の灰色の腫瘍塊を有するのに対して、ＰＡＣ−１を投与したマウスは視覚可能な腫瘍がほとんど存在しない。
【０１０４】
亜鉛イオンはプロカスパーゼ−３を阻害することが公知である。ＰＡＣ−１は、亜鉛の存在下にて用量依存様式でプロカスパーゼ−３を活性化し、亜鉛阻害のＩＣ５０を移行することができる。ＰＡＣ−１−Ｉ−８はプロカスパーゼ−３を活性化することができるのではなく、高濃度で阻害を示す。図５、６、および７は、ＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３のＺｎ２＋阻害を軽減することを示す。カスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−３の酵素活性に及ぼす亜鉛濃度範囲の影響を試験した。全ての緩衝液をＣｈｅｌｅｘ（登録商標）樹脂で最初に処理して、いかなる微量金属夾雑物も除去した。プロカスパーゼ−３自体が活性なカスパーゼ−３にゆっくり自己タンパク質分解することが多いので、３つ全てのカスパーゼ切断部位が除去されたプロカスパーゼ−３の三重変異体（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）を作製した。文献中のデータと一致して、このプロカスパーゼ−３三重変異体はタンパク質分解に対して安定であり、活性はカスパーゼ−３の活性の約１／２００である（データ示さず）。亜鉛存在下での酵素アッセイは、この金属がカスパーゼ−３（データ示さず）、プロカスパーゼ−３（データ示さず）、およびプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）変異体（図５）を強力に阻害することを示す。図６は、１０μＭ  ＺｎＳＯ４を含む緩衝液中でアッセイした場合にＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）（Ｄ３Ａ）変異体活性を増強することを示す。示すように、ＰＡＣ−１は高化合物濃度でこれら３つの酵素を実際に阻害する。示したデータは、３つの試験の代表である。図７は、１０μＭ  ＺｎＳＯ４を含む緩衝液中でアッセイした場合にＰＡＣ−１−Ｉ−８がプロカスパーゼ−３（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ）（Ｄ３Ａ）変異体活性を増強することを示す。ＰＡＣ−１−Ｉ−８は、ＺｎＳＯ４の非存在下でさえも高化合物濃度でこの酵素を実際に阻害する。
【０１０５】
図８、９、および１０は、ＰＡＣ−１が金属キレート剤であることを示す。亜鉛の存在下では、ＰＡＣ−１は、４０５ｎｍの吸光度で特徴的な増加を示す。不活性誘導体は、高濃度の亜鉛でさえも吸光度はいかなる変化も示さない。この吸光度の移行を使用して、ＰＡＣ−１：Ｚｎ２＋複合体の結合定数を、連続変位法によって決定することができる。図８に示すように、漸増量のＺｎＳＯ４でのＰＡＣ−１の滴定により、この化合物の紫外可視スペクトルが変化する。Ｚｎ２＋結合の際のモル吸光係数のこの移行により、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋結合の化学量論およびこの相互作用の解離定数の両方を決定するための都合のよい方法が得られる。連続変位法の修正バージョンを、この決定で使用した。総濃度５０μＭのＺｎＳＯ４およびＰＡＣ−１の種々のモル分率についての４１０ｎｍの吸光度を得た。次いで、これらの値を、化学量論点（すなわち、全Ｚｎ２＋が過剰量のＰＡＣ−１によって結合する場合）で可能な極大吸収（１と設定した）に対して正規化した。図９のグラフ中の０．５モル分率でのピークによって証明されるように、連続変位法の適用により、１：１の化学量論比でＰＡＣ−１がＺｎ２＋に結合することが明らかとなった。この小分子−金属相互作用の非常に強い性質も図９から明らかである。化学量論比１：１で、ＰＡＣ−１はその吸収が亜鉛結合状態にほとんど完全に移行する（９６％のＰＡＣ−１は１：１の比でＺｎ２＋と結合してＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋になる）。この９６％の値および式ｌｏｇ  Ｋａ＝０．３０１０−ｌｏｇ  Ｍ＋ｌｏｇ  ｙｍａｘ−２ｌｏｇ（１−ｙｍａｘ）を使用して、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋相互作用についてＫｄ＝４２ｎＭが得られる。図８に示すように、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋相互作用のＫｄが４２ｎＭである一方で、吸光度の変化はマイクロモル濃度の亜鉛を使用して依然として認められる。これは、本実験においてＫｄと比較して高い総リガンド濃度（５０μＭ）に起因する。本実験で使用した亜鉛およびＰＡＣ−１の濃度に基づいて、Ａｄａｉｒの式は、約３０μＭ亜鉛でのＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋複合体の最大半量の集団平均部位占有率を予想し、これは得られたデータと一致している（図８）。紫外可視分光法によってモニタリングしたところ、ＺｎＳＯ４のＰＡＣ−１−Ｉ−８への滴定によってスペクトル変化は得られず、これは、ＰＡＣ−１−８がＺｎ２＋に結合しないという考えと一致していた。この結果を確認するために、第２の方法を使用してＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋解離定数を決定した。この実験では、予め形成されたＰＡＣ−１とＺｎ２＋との複合体を、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ′−四酢酸、Ｚｎ２＋に対して公知の親和性を有する金属結合剤）で滴定し、４１０ｎｍでの吸光度をモニタリングした。ＥＧＴＡ−Ｚｎ２＋結合定数についての文献に記載の値を使用して、ＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋解離定数を５５ｎＭと計算し、これは、連続変位法によって計算したＫｄ４２ｎＭと一般的に一致した。図１０は、ＺｎＳＯ４のＰＡＣ−１−Ｉ−８溶液（５０μＭを含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＫＮＯ３、ｐＨ７．２緩衝液）への滴定によってＰＡＣ−１−Ｉ−８の紫外可視スペクトルは変化しないこ���を示す。５μＭずつ増加する０〜７０μＭのＺｎＳＯ４濃度を示す。
【０１０６】
実施例２．ＰＡＣ−１および誘導体の合成
分子モデリングにより、図１５に示すＰＡＣ−１−Ｚｎ２＋複合体の最低エネルギー配座異性体を得た。この構造を、ＭＭＦＦ力場を使用した２３個の低エネルギー配座異性体の配座探索から得た。モデルにより、Ｎ−アシルヒドラゾン骨格（フェノールヒドロキシル）との相互作用およびベンジル環との陽イオンπ相互作用が示唆される。
【０１０７】
構造的に改変されたＰＡＣ−１誘導体のファミリーを合成して、これらの構造の構成要素および亜鉛結合におけるその役割ならびにこの化合物ファミリーの細胞傷害能を調査した。
【０１０８】
４つの誘導体クラスを合成して、フェノールの位置（クラスＩ）、ベンジル基（クラスＩＩ）、これらの環の組み合わせ（クラスＩＩＩ）、およびＮ−アシルヒドラゾン骨格（クラスＩＶ）を調査した。これらのクラスを、上記のスキーム２に示す。
【０１０９】
【化１９】
0005896746.tif 000034
これらの化合物およびクラスについてのさらなる情報は、以下に見出される：Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９，５２，５７２１−５７３１。クラスＩ〜ＩＩＩ化合物の大部分を、スキーム３Ａに記載のように適切なヒドラジドとアルデヒドとの縮合によって合成した。スキーム３Ａに示すように、この縮合物の収率は７２％と９５％との間であった。１ｇが例外であり、ジスルフィド二量体を自発的に形成し、それにより収率が減少した。かかる縮合反応により、１１種のクラスＩ誘導体（１ａ〜ｋ）、７種のクラスＩＩ誘導体（２ａ〜ｇ）、および１種のクラスＩＩＩ誘導体（３）が合成された。スキーム１中のヒドラジド構成要素を、種々の塩化ベンジルのピペラジンとの反応、得られた生成物のクロロ酢酸エチルでのアルキル化、その後の得られたエステルのヒドラジンとの反応によって合成した。アルデヒド構成要素を購入したか、簡単な出発物質から合成した。３種のクラスＩＶ誘導体を、類似の縮合反応によって合成することもできる。したがって、２個のピペラジン窒素のうちの１個を欠く化合物（４ａ〜ｃ）を、スキーム３の式１および２に記載の対応するヒドラジドおよびアルデヒドから合成した。しかし、クラスＩＶ中の多数の誘導体を類似の縮合反応によって合成することができず、別の合成経路を必要とした。したがって、化合物４ｄを、ＮａＣＮＢＨ３を使用したＰＡＣ−１中のヒドラゾンの還元によって合成した（スキーム４Ａ、式３）。化合物４ｅ〜ｇを、２７の適切なクロリドとの反応によって合成した（スキーム４Ａ、式４〜６）。これらのクラスは、これらの環系の電子および複合体に関与する配位ヘテロ原子を探索する。
【０１１０】
【化２０】
0005896746.tif 000035
置換によって両環が変化したクラスＩ〜ＩＩＩのＰＡＣ−１誘導体を、以下のスキーム３Ａに示す経路を使用して合成した：
【０１１１】
【化２１】
0005896746.tif 000036
スキーム３Ａ．「Ｒ」変数をこのスキームのために示し、その使用法は本開示の残部と必ずしも同一ではないことに留意のこと。本開示にわたる全てのかかるバリエーションは、当業者に容易に理解される。
【０１１２】
クラスＩＶ化合物を、以下に示すようにわずかに修正して合成した。
【０１１３】
【化２２】
0005896746.tif 000037
いくつかのさらなるクラスＩＶ化合物を、スキーム４Ａに示す方法を使用して合成した。
【０１１４】
【化２３】
0005896746.tif 000038
４クラスの化合物の合成方法を本明細書中に示す。材料−他に指示がない限り、全ての試薬をＦｉｓｈｅｒから入手した。全ての緩衝液をＭｉｌｌｉＱ精製水を使用して作製した。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡを合成した。Ｌｕｒｉａブロス（ＬＢ）をＥＭＤから入手した。エトポシドをＳｉｇｍａから入手した。カスパーゼ活性緩衝液は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）で処理している。Ｎｉ  ＮＴＡ結合緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭイミダゾールを含む。Ｎｉ  ＮＴＡ洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および２０ｍＭイミダゾールを含む。Ｎｉ  ＮＴＡ溶離緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、および５００ｍＭイミダゾールを含む。アネキシンＶ  結合緩衝液は、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡを含む。Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ化プロカスパーゼ−３タンパク質を、下記のように発現させた。
【０１１５】
細胞培養−Ｕ９３７ヒトリンパ腫細胞およびＳＫ−Ｍｅｌ−５ヒト黒色腫細胞をＡＴＣＣから入手した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを補足したＲＰＭＩ  １６４０成長培地中で培養した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。０．０５％トリプシン（Ｔｒｙｓｉｎ）−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）希釈物を使用した細胞単層のトリプシン処理によってＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞の継代培養を行い、上記のようにＦＢＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを補足したＲＰＭＩ  １６４０成長培地中でさらに培養した。
【０１１６】
細胞死アッセイ−Ｕ９３７ヒトリンパ腫細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを含む２００μＬのＲＰＭＩ  １６４０成長培地中に５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートのウェルにプレートした。０μＭと１００μＭとの間の化合物濃度で細胞が処理されるように、各ウェルに、２μＬの１００×化合物保存液を種々の濃度で含むＤＭＳＯを添加した。各濃度を五連で試験した。各プレート中の５ウェルにポジティブコントロールとしての１０μＭエトポシドを添加し、５ウェルにネガティブコントロールとしての２μＬのＤＭＳＯを添加した。次いで、プレートを、５％ＣＯ２中にて３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間のインキュベーション後、プレートを、前に記載のようにスルホローダミンＢアッセイを使用して分析した１。具体的には、プレートの各ウェルに、５０μＬの８０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ水溶液を添加し、プレートを４℃で一晩静置した。次いで、プレートを水蒸気にて５回穏やかに洗浄して、過剰量のＴＣＡおよび沈殿した血清タンパク質を除去した。次いで、プレートを風乾し、その後に１００μＬの０．０５７％（ｗ／ｖ）スルホローダミンＢを含む１％（ｖ／ｖ）酢酸溶液を各ウェルに添加し、室温で３０分間染色した。染色後、ウェルを１００μＬの１％（ｖ／ｖ）酢酸で５回穏やかに洗浄して、非結合色素を除去した。次いで、プレートを風乾した。次いで、２００μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基（ｐＨ１０．５）を各ウェルに添加し、プレートを、オービタルシェーカーに５分間おいた。次いで、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓプレートリーダーにて５１０ｎｍのＯＤを読み取り、細胞死滅率を計算し、ポジティブコントロール（１００％細胞死）およびネガティブコントロール（０％細胞死）に対して正規化した。細胞死滅率を各化合物濃度について平均化し、化合物濃度の関数としてプロットした。データを、Ｔａｂｌｅ  ｃｕｒｖｅ  ２Ｄを使用してロジスティックな用量応答曲線にフィッティングし、ＩＣ５０値を計算した。実験を３回繰り返し、計算したＩＣ５０値の平均を報告した。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を決定し、三連の実験について報告した。各用量−応答曲線は示さない。
【０１１７】
プロカスパーゼ−３／カスパーゼ−３の組換え発現および精製−プロカスパーゼ−３およびカスパーゼ−３を、前に記載のように正確に組換え発現および精製した。簡潔に述べれば、プロカスパーゼ−３およびカスパーゼ−３を、大腸菌のエレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）中でのｐＨＣ３３２発現プラスミドから発現させた。Ｃ末端６×Ｈｉｓタグ化タンパク質を、Ｎｉ  ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。タンパク質含有画分を回収し、プールした。次いで、Ｃｈｅｌｅｘ（登録商標）樹脂で処理したカスパーゼ活性緩衝液を充填したＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へのタンパク質の適用によって精製タンパク質をさらに精製して、いかなる夾雑亜鉛も除去した。得られた亜鉛を含まないタンパク質含有画分を含むカスパーゼ活性緩衝液をプールし、濃度を決定し、タンパク質溶液を液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保存した。
【０１１８】
カスパーゼ−３活性アッセイ−カスパーゼ−３（１μＭ）の無亜鉛保存液（２×）を、カスパーゼ活性緩衝液中で調製した。２００μＭ〜２００ｎＭの種々の濃度の化合物保存液を、カスパーゼ活性緩衝液にて作製した（２×）。ＺｎＳＯ４（２５μＭ）を含むカスパーゼ活性緩衝液の保存液（１０×）を調製した。３８４ウェルプレートの各ウェルに、２０μＬのカスパーゼ−３（最終濃度５００ｎＭ）、２０μＬの化合物保存液、および５μＬのＺｎＳＯ４（最終濃度２．５μＭ）、または緩衝液を添加した。各プレートは、ポジティブコントロールウェル（０μＭ亜鉛および化合物なし）およびネガティブコントロールウェル（２．５μＭ亜鉛および化合物なし）を含んでいた。プレートを、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートの各ウェルに、５μＬのＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ基質の２ｍＭ保存液を添加し、その直後に４０５ｎｍにおける吸光度をｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙ  Ｖａｌｅ，ＣＡ）にて１分毎に３０分間モニタリングした。各ウェルの勾配を使用して活性を決定し、ポジティブコントロールウェルおよびネガティブコントロールウェルに対して正規化してパーセント活性を得た。各化合物濃度（４ウェル）についてのデータを平均し、化合物濃度の関数としてパーセント活性をプロットした。データを、Ｔａｂｌｅ  Ｃｕｒｖｅ  ２Ｄを使用して分析し、ロジスティックな用量応答曲線にフィッティングした。化合物の大部分は、１０μＭで最大活性を達成した。１０μＭでのパーセント活性を各化合物について決定し、対応するＳＥＭを使用した３回の実験の平均として報告した。各用量−応答曲線は示していない。
【０１１９】
ＥＧＴＡ蛍光滴定アッセイ−この滴定アッセイは、公開されたプロトコールに基づく。滴定前に、キュベットにＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を１０分間充填し、その後に滅菌脱イオン水およびアセトンで洗浄していかなる夾雑金属イオンも除去した。ＰＡＣ−１または誘導体（６０μＭ）を、１０倍希釈（ＰＡＣ−１の最終濃度：６μＭ）が達成されるようにＥＧＴＡ（７．３ｍＭ）を有する緩衝液（Ｈｅｐｅｓ：５０ｍＭ、ＫＮＯ３：１００ｍＭ（ｐＨ７．２））を含むキュベットに添加した。Ｚｎ（ＯＴｆ）２（０〜１０ｍＭ）を漸増的に添加した。Ｚｎ−ＰＡＣ−１（または誘導体）複合体の形成を、蛍光強度（ｅｘ／ｅｍ：４１０ｎｍ／４７５ｎｍ）の増加によってモニタリングした。４７５ｎｍでの蛍光強度を、ＭａｘＣｈｅｌａｔｏｒプログラムを使用して計算した遊離Ｚｎ濃度（［Ｚｎ］ｆ／Ｍ）に対してプロットした。データをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈを使用して分析し、公開されたプロトコールによって誘導した以下の式Ｓ１に基づいて形成曲線にフィッティングした：
Ｉ＝（ＩｍｉｎＫＤ＋Ｉｍａｘ［Ｚｎ］ｆ）／（ＫＤ＋［Ｚｎ］ｆ）
（式中、ＩｍｉｎおよびＩｍａｘを、遊離プローブ（この場合、ＰＡＣ−１または誘導体）の蛍光強度およびＺｎ−プローブ複合体の蛍光強度とそれぞれ定義した）。
【０１２０】
免疫蛍光染色−ポリリジン溶液（Ｓｉｇｍａ）中でカバーガラスを１時間震盪し、次いで、ＭｉｌｌｉＱで洗浄することによって１８ｍｍの丸型ｎｏ．１ホウケイ酸カバーガラス（ＶＷＲ）にポリリジンをコーティングした。ＳＫ−Ｍｅｌ−５ヒト黒色腫細胞を、１２ウェルプレートの底部のポリリジンコーティングしたカバーガラス上で成長させた。密集度が約８０％になった時に、細胞をＤＭＳＯまたは１００μＭ  ＰＡＣ−１を含むＤＭＳＯ（総ＤＭＳＯは１％未満）のいずれかで１時間処置した。次いで、細胞を１ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中にて室温で１０〜１５分間固定した。次いで、細胞をＰＢＳで再度２回洗浄し、次いで、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで５分間透過処理した。次いで、細胞を３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１０分間ブロッキングし、５００倍希釈のウサギ抗プロカスパーゼ−３抗体と１時間インキュベートした。次いで、カバーガラスをＰＢＳで５回洗浄し、１０００倍希釈の抗ウサギＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７抱合二次抗体と遮光下で２０分間インキュベートした。カバーガラスをＰＢＳで５回再度洗浄し、ＭｉｌｌｉＱＨ２Ｏで１回洗浄した。次いで、Ｆｌｕｏｒｏｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してカバーガラスをスライドガラス上にマウントし、画像化まで暗所で保存した。細胞を、ＬｅｉｃａＳＰ２多光子共焦点顕微鏡にて画像化した。
【０１２１】
生細胞画像化−ＳＫ−Ｍｅｌ−５細胞を、ｎｏ．１ホウケイ酸グロースチャンバー（Ｎｕｎｃ）の底面上で密集度約８０％まで成長させた。次いで、細胞をＤＭＳＯ、２５μＭ  ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋを含むＤＭＳＯ、２５μＭ  ＡＦ３５０−ＰＡＣ−１を含むＤＭＳＯ、または２５μＭ  ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋおよび２５μＭ  ＡＦ３５０−ＰＡＣ−１の両方で同時に５％ＣＯ２下にて３７℃で１時間処置した。次いで、細胞を、フェノールレッドを欠くＲＰＭＩ  １６４０成長培地で５回洗浄した。次いで、細胞を、画像化前に３７℃で２時間さらにインキュベートした。核染色用のＳＹＢＲグリーンで染色した細胞について、１００，０００倍希釈のＳＹＢＲグリーンを含む培地を画像化直前に添加した。細胞を、ＬｅｉｃａＳＰ２  多光子共焦点顕微鏡にて画像化した。
【０１２２】
画像解析−画像を明瞭にするために輝度およびコントラストを調整した。画像について、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して、赤色チャンネルを１０と２８との間の線形強度勾配を反映するように調整した。緑色チャンネルについて、０と４４との間の線形強度勾配を反映するように画像を調整した。顕微鏡のオフセットを説明するために、赤色チャンネルを手動でｘ方向に５ピクセルオフセット指定し、緑色チャンネルを手動でｙ方向に６ピクセルオフセット指定した。半径１ピクセルのガウスぼかしを使用して画像をフルタリングし、信号対雑音比を改善した。ＩｍａｇｅＪプラグインＪＡＣｏＰを使用して、重複率をＭａｎｄｅｒｓ重複係数を使用して決定した。
【０１２３】
ＰＡＣ−１誘導体によるアポトーシスの誘導−最終濃度５０μＭが達成されるようにＵ９３７細胞（１ｍＬの１×１０６細胞／ｍＬ）を種々の化合物の５μＬエタノール保存液で処置した。細胞を３７℃で１２時間インキュベートした。細胞を遠心分離し（２００ｇで５分間）、ＰＢＳ（２ｍＬ）で洗浄し、５００μＬのアネキシンＶ結合緩衝液に再懸濁した。各サンプルに、１０μＬのＦＩＴＣ抱合アネキシンＶ染料（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）および１０μＬのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度５０μｇ／ｍＬまで添加した。細胞集団を、Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＬＳＲ  ＩＩ細胞フローサイトメーターで分析した。
【０１２４】
材料と方法
概要
無水条件が必要な全ての反応を、乾燥機で乾燥させたガラス製品中にて陽圧の窒素またはアルゴン雰囲気下で行った。標準的なシリンジ技術を、液体の無水添加のために使用した。乾燥テトラヒドロフランを、市販の溶媒精製システム（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における活性アルミナカラムまたは分子ふるいの通過によって得た。他に断らない限り、全ての出発物質、溶媒、および試薬を供給業者から入手し、さらに精製せずに使用した。フラッシュクロマトグラフィを、２３０〜４００メッシュシリカゲルを使用して行った。ヒドラジド５、ＰＡＣ−１、１ａ、１ｈ、３−アリルサリチルアルデヒド、２−メルカプトベンズアルデヒド、２３、３０、４４を、修正した文献に記載の方法にしたがって調製した。
【０１２５】
化合物分析
全てのＮＭＲ実験を、内部標準として残存非重水素化溶媒を用いたＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚ分光計にてＣＤＣｌ３（Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３ＯＤ（ｓｉｇｍａ）、またはアセトン−ｄ６（Ｓｉｇｍａ）のいずれかにおいて記録した。化学シフト、δ（ｐｐｍ）；結合定数、Ｊ（Ｈｚ）；多重性（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット）；および積分値を報告する。高分解能質量スペクトルデータを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆウルトラハイブリッド型四重極／飛行時間型ＥＳＩ質量分析計で記録した。全ての融点を補正していない。分析ＨＰＬＣをＡｌｔｉｍａＣ１８カラム（２．１×２０ｍｍ、移動相Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂは、０〜４５％Ｂを５分間、次いで４５〜５５％Ｂを５〜１０分間、次いで５５〜１００％Ｂを１０〜１５分間、１００％に保って１５〜２０分間、および１００〜０％を２０〜２５分間の勾配系を使用したアセトニトリルである）にて行った。ＬＣ−ＭＳを、Ｃ１８カラム（２．１×５ｍｍ、移動相Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂは、０％Ｂに保って０〜２分間、次いで０〜５０％Ｂを２〜５分間、次いで５０〜１００％Ｂを５〜７分間、１００％に保って７〜８分間、および１００〜０％を８〜１０分間の勾配系を使用したアセトニトリルである）にて行った。
【０１２６】
【化２４】
0005896746.tif 000039
【０１２７】
【化２５】
0005896746.tif 000040
【０１２８】
【化２６】
0005896746.tif 000041
実施例３．ＰＡＣ−１誘導体の評価
図１１は、化合物Ｉ−ＩＩ−７についての亜鉛媒介性カスパーゼ−３阻害の軽減を示す。図１２は、化合物Ｉ−ＩＶ−３についての亜鉛媒介性カスパーゼ−３阻害の軽減を示す。グラフは、３つの個別の用量応答実験を示す。エラーバーは、各データポイントについての平均値の標準誤差を示す。図１３は、亜鉛の使用または未使用時の化合物１−ＩＩ−６の吸収スペクトルを示す。
【０１２９】
ＰＡＣ−１誘導体を、癌細胞を死滅させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロカスパーゼ−３を活性化し、亜鉛に結合する能力について、細胞培養物中およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで評価した。プロカスパーゼ−３を活性化する化合物は、一般に、Ｕ９３７細胞においてＩＣ５０値が低い。例示的なデータを、以下の表１〜４に示す。
【０１３０】
細胞死の誘導を、Ｕ−９３７（ヒトリンパ腫）細胞株を使用して決定した。Ｕ−９３７細胞は、懸濁培養で成長する。これらの実験について、細胞を一連の濃度範囲の化合物に７２時間曝露し、細胞死をスルホローダミンＢアッセイによって定量し、ＩＣ５０値を、ロジスティックな用量−応答曲線から計算した。
【０１３１】
データから、以下が認められる。（１）亜鉛に結合できないＰＡＣ−１誘導体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでカスパーゼ−３を活性化せず、培養でＵ−９３７細胞の死滅をあまり誘導しない。この情報により、ＰＡＣ−１の亜鉛結合能力がその細胞死誘導特性に重要であることが示唆される。（２）オルト−ヒドロキシＮ−アシルヒドラゾンモチーフは亜鉛結合に重要である。（３）亜鉛に結合する実質的に全ての化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでカスパーゼ−３を活性化し、培養でＵ−９３７細胞の死滅を誘導する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏカスパーゼ−３活性化を示さないが、依然としてＵ−９３７細胞に毒性を示す唯一の化合物Ｉ−ＩＶ−１およびＩ−ＩＶ−２は、この傾向の例外である。興味深いことに、本発明者らは、これら２つの化合物（濃度１０μＭで）がカスパーゼ−３酵素活性の合理的に強力なインヒビターであることを見出している。したがって、化合物の任意の活性化効果を、この阻害によってマスキングすることができる。この阻害効果は、ＰＡＣ−１も高化合物濃度でプロカスパーゼ−３／カスパーゼ−３を阻害することを示す前のデータと一致する。
【０１３２】
【表１】
0005896746.tif 000042
【０１３３】
【表２】
0005896746.tif 000043
【０１３４】
【表３】
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【０１３５】
【表４】
0005896746.tif 000045
実施例４．共焦点顕微鏡法
Ｚｎ２＋への結合によってＰＡＣ−１が癌細胞を死滅させることを確認するために、蛍光ＰＡＣ−１を使用した共焦点顕微鏡法を行って、細胞中でのＰＡＣ−１の細胞内局在を調査した。スキーム５に示すように、ＰＡＣ−１の蛍光バージョンを、ＰＡＣ−１へのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０の「クリッキング」によって合成した。
【０１３６】
【化２７】
0005896746.tif 000046
上記の蛍光標識した化合物ＡＦ−ＰＡＣ−１は、これらのアッセイにおいてＰＡＣ−１に類似の活性を有する（ＩＣ５０対Ｕ−９３７細胞＝１４．８（３．２μＭ；１０μＭでのカスパーゼ−３活性化＝６．３（１．６％および５０μＭ＝２０（３％；亜鉛のＫｄ＝６１（９ｎＭ）。図１４は、共焦点顕微鏡法研究の結果を示す。ＡＦ−ＰＡＣ−１のカスパーゼ−３／−７酵素活性部位との共局在化。ＤＭＳＯで処置したＳＫ−ＭＥＬ−５細胞は、赤色および緑色チャンネルの両方においてバックグラウンドレベルの染色を示す（ここでは、モノクロ階調）。ＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋのみで処置した細胞は、いかなるバックグラウンドレベルを超える染色も示さない。ＡＦ−ＰＡＣ−１のみで処置した細胞は細胞質中に点状の染色を示し、この染色は５２０ｎｍでの励起で増加しない。ＡＦ−ＰＡＣ−１およびＦＡＭ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋで同時に処置した細胞は、強いカスパーゼ−３／−７活性のスポット（偽着色）およびＡＦ−ＰＡＣ−１の点状染色（偽染色）を示し、これは、重複画像における良好な共局在化を示す。
【０１３７】
実施例５．イヌを使用したＰＡＣ−１についての臨床試験
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを使用したＰＡＣ−１の処方物を、より高い用量で動物に投与した。イヌは、急性の神経毒性（運動失調症および癲癇）を経験した。マウスにおけるさらなる研究により、高用量で類似の症状が示された。ＰＡＣ−１が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、ＮＭＤＡ受容体で結合した阻害性亜鉛をキレート化すると考えられる。結果として、新規の化合物ＰＡＣ−ＩＩ−９を合成し、試験した。この化合物に関するさらなる情報を、本明細書中の他の場所に記載する。
【０１３８】
【表５】
0005896746.tif 000047
予備動物研究は、ＰＡＣ−１−ＩＩ−９が神経毒性問題の改善に有用であることを示していた。
【０１３９】
さらなる化合物およびＬｏｇＢＢデータを表６に示す。
【０１４０】
【表６−１】
0005896746.tif 000048
【０１４１】
【表６−２】
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実施例６．ＰＡＣ−ＩＩ−９（Ｓ−ＰＡＣ−１）は神経毒性を軽減する
アポトーシス細胞死の誘導は、有望な抗癌ストラテジーである。アポトーシスカスケードにおける重要な事象は、プロカスパーゼ酵素原の活性カスパーゼ（その後に多数の細胞基質を切断するシステインプロテアーゼ）へのタンパク質分解性活性化である。２００６年に、プロカスパーゼ−３の触媒活性を増強し、カスパーゼ−３への自己活性化を誘導する小分子が報告された。この化合物（ＰＡＣ−１と呼ばれる）は、癌細胞のアポトーシスを誘導し、脂質ベースの処方物として経口投与するかコレステロールペレットとして皮下に植え込んだ場合にマウス異種移植モデルにおいて抗腫瘍活性を示す。本明細書中にマウスにおけるＰＡＣ−１（静脈内ボーラスとして送達される）の評価を報告し、これらの研究により、高投薬量のＰＡＣ−１が神経毒性を誘導することが明らかとなっている。この所見および推定される神経毒性機構に基づいて、ＰＡＣ−１誘導体（Ｓ−ＰＡＣ−１と呼ばれる）をデザインし、合成し、評価した。ＰＡＣ−１と同様に、Ｓ−ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３を活性化し、癌細胞のアポトーシス死を誘導する。しかし、マウスおよびイヌで評価した場合、Ｓ−ＰＡＣ−１は神経毒性を誘導しない。イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１についての持続静脈内注入プロトコールを確立し、それにより、この化合物が２４時間で約１５μＭの定常状態血漿濃度に到達することが可能であった。リンパ腫の５匹の愛玩犬を、小規模臨床試験においてＳ−ＰＡＣ−１を使用して評価した。結果は、Ｓ−ＰＡＣ−１がこれらの患畜において十分に許容され、これらの処置によって５匹の患畜のうち４匹で部分的後退または疾患の安定化が誘導されたことを示す。
【０１４２】
この１０年で、個別化抗癌ストラテジーとしての標的治療の可能性が証明されている。これらのアプローチは、正常細胞に特異性を付与するために癌細胞中に存在する特異的タンパク質を活用する（１）。かかる「個別化」薬物は、染色体転座から生じる標的（２）（ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（３）のためのグリベック）、構成的活性化を起こすタンパク質の特異的変異形態（イレッサおよびＥＧＦＲ変異、（４）ＰＬＸ４０３２および変異ＢＲＡＦ（５，６））、または癌細胞で過剰発現されるタンパク質（以下にさらに説明する）に達する。癌の顕著な特徴の１つがアポトーシスに対する耐性であるので（７〜９）、アポトーシスタンパク質は、抗癌薬の創薬のための特に興味深い標的である（１０）。実際、抗癌活性は、アポトーシスタンパク質の調節不全発現をターゲティングする化合物（ｐ５３−ＭＤＭ２相互作用の小分子破壊因子（１１，１２）、Ｂｃｌ−２のインヒビター（１３）、およびＸＩＡＰのリガンド（１４，１５）が含まれる）を使用して証明されている。
【０１４３】
システインプロテアーゼのカスパーゼファミリーのメンバーは、アポトーシスの開始および実行の両方における重要なプレーヤーである。これらの酵素は、成熟した高活性酵素にタンパク質分解的に活性化される低活性酵素原（プロ酵素）として細胞中に存在する。プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３へのタンパク質分解性変換がアポトーシスに最も重要である。内因性および外因性のアポトーシス経路の両方がプロカスパーゼ−３を活性化するために集結し、カスパーゼ−３が１００種を超える細胞基質を有するので、プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への活性化はアポトーシスカスケードにおける極めて重要且つ関連の深い事象である。興味深いことに、プロカスパーゼ−３は、種々の腫瘍組織構造（乳癌（１６）、結腸癌（１７）、肺癌（１８）、リンパ腫（１９）、神経芽細胞腫（２０）、黒色腫（２１）、および肝臓癌（２２）が含まれる）中で過剰発現され、プロカスパーゼ−３を活性化する小分子は正常細胞と対比して癌細胞に選択性を有し得ると示唆される。２００６年に、本発明者らは、プロカスパーゼ−３活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強し、培養における癌細胞の死滅を誘導し、脂質ベースの処方物として経口投与するかコレステロールペレットとして皮下に植え込んだ場合に複数のマウス異種移植モデルにおいて有効性を有する小分子（ＰＡＣ−１と呼ばれる）の発見を報告した（２３）。ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害性亜鉛イオンのキレート化を介して活性化し（２４）、誘導体の合成および評価によってＰＡＣ−１の生物学的活性がインタクトなオルト−ヒドロキシＮ−アシルヒドラゾン亜鉛キレート化モチーフを有することに関連することが明らかとなった（２５）。大量のデータにより、ＰＡＣ−１が、プロカスパーゼ−３由来の亜鉛のキレート化、最も顕著には蛍光ＰＡＣ−１誘導体の細胞カスパーゼ−３活性部位との共局在化によって癌細胞のアポトーシス死を誘導することが示唆される（２５）。
【０１４４】
第１のプロカスパーゼ活性化化合物として、ＰＡＣ−１を用いた実験は、実行可能な抗癌ストラテジーとしてのプロカスパーゼ−３活性化の可能性を示す。患者における癌処置のための実験的治療としてのＰＡＣ−１をさらに開発するために、本発明者らは、静脈内投与され、より洗練されたｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデル系、具体的には、自然発生癌を有するイヌにおけるこの化合物の効果を特徴付けるよう試みた。癌を有する愛玩犬における実験的治療の評価により、マウス異種移植モデルを超える多数の利点が得られる（２６）。本明細書中に、本発明者らは、マウスにおける静脈内ＰＡＣ−１の毒性研究、および培養下で癌細胞株のアポトーシスを誘導し、マウスおよび研究用イヌで十分に許容され、自然発生リンパ腫を有するイヌ患畜の小規模試験で有効なＰＡＣ−１誘導体（Ｓ−ＰＡＣ−１と呼ばれる）の発見を報告する。
【０１４５】
ＰＡＣ−１の処方。ヒト癌患者の処置についてのプロカスパーゼ−３アクチベーターのトランスレーショナルな調査を円滑にするために、静脈内投与（従来の抗癌剤のための最も一般的な薬物送達経路）した場合のＰＡＣ−１の耐容性を評価した。この目的を達成するために、本発明者らは、水溶液中で高濃度のＰＡＣ−１（親油性薬物）を確実に維持する処方手順を最初に最適化した。水溶液中のＰＡＣ−１の溶解および維持が可能な溶解補助剤は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであった。２００ｍｇ／ｍＬの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン水溶液中で、ＰＡＣ−１は２０ｍｇ／ｍＬで溶解する。完全な溶解には水溶液をｐＨ１．５〜２に酸性化する必要があり、次いで、溶液をｐＨ５〜６に回復させる。この手順を使用して、ＰＡＣ−１は溶液中に維持され、４℃で保存した場合に少なくとも５日間安定である。
【０１４６】
ＰＡＣ−１の毒性。静脈内投与したＰＡＣ−１の実行可能性および耐容性を特徴付けるために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、１０、２０、３０、および５０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中に溶解）を外側尾静脈注射によって投与し、動物を２４時間観察した。１０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１では、毒性の臨床徴候は認められなかった。この様式で２０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１を投与したマウスは、軽度の神経学的症状（嗜眠が含まれる）および軽度の運動失調症を示した。これらの症状は注射後２０分間持続し、その時点でマウスを回復させ、さらなる毒性の徴候は認められなかった。３０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１を投与したマウスは、明白な神経毒性の徴候（攣縮（１／３）、運動失調症（３／３）、および平衡感覚障害（３／３）が含まれる）を示した。これは注射後５分以内に発生し、およそ１５分間持続した。５０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１を投与したマウスは、より明白な運動失調症および平衡感覚障害を伴う急性神経毒性症状を示した。この投薬量では、全てのマウスで筋攣縮が認められた。２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンビヒクルのみを投与したマウスは、毒性を示さなかった。マウスでこの神経毒性が認められたにもかかわらず、ＰＡＣ−１は、より低い用量でイヌに安全に投与された。この神経毒性が種特異性でなかったことを確認するために、６０ｍｇ／ｋｇのＰＡＣ−１を１匹の健康な研究用猟犬に１０分間にわたってｉ．ｖ．投与した。この高濃度のＰＡＣ−１の投与により、類似の神経毒性（運動失調症および攣縮が含まれる）が得られ、これは２０分間持続した。
【０１４７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける亜鉛に対するＰＡＣ−１の既知の親和性（２４）およびその証明された細胞亜鉛への結合能力（２５）を考慮すると、本発明者らは、ＰＡＣ−１を含む２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを投与したマウスおよびイヌで認められた神経毒性が処置したマウスの中枢神経系内のＮＭＤＡ受容体での細胞内亜鉛のキレート化に原因するとの仮説を立てた。この仮説は、ＰＡＣ−１で認められたものに類似の神経学的表現型を誘導する他の亜鉛キレーターのｉｎ  ｖｉｖｏ研究からのデータに一致する（２７，２８）。実際、血液脳関門（ＢＢＢ）２９を横切る分割を予想するためのＰＡＣ−１のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析は、ＰＡＣ−１のｌｏｇＢＢの計算値が−０．０７であることを示す。このｌｏｇＢＢは、血液と脳との間の分割比０．８５／１．０に相関するであろう。これにより、かなりの量のＰＡＣ−１が中枢神経系に侵入することができることが示唆される。いくつかの研究により、細胞内亜鉛貯蔵物のキレート化がＮＭＤＡ受容体の持続的抑制を軽減し、それにより、神経過興奮を引き起こすことが示されている（２８，３０）。
【０１４８】
【化２８】
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Ｓ−ＰＡＣ−１のデザイン。この神経毒性を克服するために、本発明者らは、神経毒性が減少し、より高い濃度を投与可能なＢＢＢの透過性がより低いＰＡＣ−１の誘導体を合成した。ＰＡＣ−１のベンジル環上に組み込まれた極性官能基は、親化合物の活性を維持しながら推定ｌｏｇＢＢを減少させるはずである。そのようなものとして、Ｓ−ＰＡＣ−１（ＰＡＣ−１のスルホンアミド誘導体）を、ＢＢＢを透過する能力が顕著に減少した（ｌｏｇＢＢ−１．２６）と予想される化合物としてデザインした。Ｓ−ＰＡＣ−１への合成経路をスキーム６に示す。この経路は、以前に報告されたＰＡＣ−１への合成経路の修正形態である（２３）。簡潔に述べれば、スルホンアミド１をピペラジン２とカップリングして高収率でエステル３を得る。次いで、エステルをヒドラジンと反応させてヒドラジド４を生成し、次いで、アルデヒド５と縮合してＳ−ＰＡＣ−１を生成する。この経路についての全ての実験の詳細ならびにＳ−ＰＡＣ−１および種々の中間体についてのスペクトルデータを、本明細書中の他の場所に見出すことができる。特に、反応順序は拡張性が高く、実際、スキーム６に列挙した収率は、４０グラムのＳ−ＰＡＣ−１の生成についての収率である。このスケールアップには、各中間体についての容易な精製プロトコールの開発が重要であった。したがって、化合物２をエタノールからの再結晶によって精製し、ヒドラジド３をメタノールからの再結晶によって精製し、最終生成物を、シリカゲルクロマトグラフィおよびメタノールからの再結晶によって精製する。この合成を４０グラムスケールで４回行うことにより、１６０ｇ超のＳ−ＰＡＣ−１が首尾よく生成された。より小さなスケールのＳ−ＰＡＣ−１の合成の詳細を、本明細書中の他の場所に見出すことができる。
【０１４９】
Ｓ−ＰＡＣ−１は亜鉛イオンに結合する。Ｓ−ＰＡＣ−１の活性を、いくつかの生化学アッセイで特徴付けた。ＥＧＴＡ競合滴定実験（３１）を使用して、Ｓ−ＰＡＣ−１：Ｚｎ２＋複合体の結合定数を決定した。この実験では、既知量のＥＧＴＡおよびＳ−ＰＡＣ−１を含む溶液を、漸増濃度のＺｎ２＋を使用して滴定し、Ｓ−ＰＡＣ−１の蛍光を４７５ｎｍでモニタリングした。Ｚｎ２＋存在下での蛍光の変化を使用して、形成曲線をプロットした（図１６ｂ）。ＥＧＴＡの既知の結合定数を使用して、遊離亜鉛濃度を計算し、これを使用してＳ−ＰＡＣ−１：Ｚｎ２＋複合体の結合定数を決定することができる。この複合体のＫｄは、ＰＡＣ−１：Ｚｎ２＋の５２±２ｎＭと比較して４６±５ｎＭである（２５）（図２０）。
【０１５０】
ＥＧＴＡ蛍光滴定アッセイ−この滴定アッセイは、公開されたプロトコールに基づく（Ｈｕａｎｇ，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００７，９，４９９９−５００２）。滴定前に、キュベットをＥＤＴＡ（１０ｍＭ）と１０分間インキュベートし、その後に滅菌脱イオン水およびアセトンで洗浄していかなる夾雑金属イオンも除去した。ＰＡＣ−１または誘導体（６０μＭ）を、１０倍希釈（ＰＡＣ−１の最終濃度：６μＭ）が達成されるようにＥＧＴＡ（７．３ｍＭ）を有する緩衝液（Ｈｅｐｅｓ：５０ｍＭ、ＫＮＯ３：１００ｍＭ（ｐＨ７．２））を含むキュベットに添加した。Ｚｎ（ＯＴｆ）２（０〜１０ｍＭ）を漸増的に添加した。Ｚｎ−ＰＡＣ−１（または誘導体）複合体の形成を、蛍光強度（ｅｘ／ｅｍ：４１０ｎｍ／４７５ｎｍ）の増加によってモニタリングした。４７５ｎｍでの蛍光強度を、ＭａｘＣｈｅｌａｔｏｒプログラムを使用して計算した遊離Ｚｎ濃度（［Ｚｎ］ｆ／Ｍ）に対してプロットした（Ｐａｔｔｏｎ，Ｃｅｌｌ  Ｃａｌｃｉｕｍ，２００４，３５，４２７−４３１）。データをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈを使用して分析し、公開されたプロトコールによって誘導した以下の式Ｓ１に基づいて形成曲線にフィッティングした：
Ｉ＝（ＩｍｉｎＫＤ＋Ｉｍａｘ［Ｚｎ］ｆ）／（ＫＤ＋［Ｚｎ］ｆ）    式Ｓ１
（式中、ＩｍｉｎおよびＩｍａｘを、遊離プローブ（この場合、ＰＡＣ−１または誘導体）の蛍光強度およびＺｎ−プローブ複合体の蛍光強度とそれぞれ定義した）。
【０１５１】
Ｓ−ＰＡＣ−１はプロカスパーゼ−３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて外因性亜鉛の存在下でＳ−ＰＡＣ−１が組換え発現したプロカスパーゼ−３を活性化する能力を評価した。確実にプロ酵素の活性をモニタリングするために、タンパク質分解的に切断不可能なプロカスパーゼ−３変異体（３つのアスパラギン酸切断部位の残基がアラニンに変異している（Ｄ９Ａ／Ｄ２８Ａ／Ｄ１７５Ａ））を使用した（２４，３２）。この組換え発現したタンパク質を１０μＭ亜鉛の存在下でインキュベートし、Ｓ−ＰＡＣ−１をサンプルに添加し、酵素活性を１５分間隔でモニタリングした。図１６ｃに示すように、Ｓ−ＰＡＣ−１は、亜鉛媒介阻害の軽減によってプロ酵素の酵素活性を迅速に（５分以内）増強する。
【０１５２】
Ｓ−ＰＡＣ−１は、培養下の複数の癌細胞株の細胞死を誘導する。Ｓ−ＰＡＣ−１が亜鉛とキレート化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロカスパーゼ−３を活性化することが確認されたので、一連のヒト、イヌ、およびマウスの癌細胞株に対するＳ−ＰＡＣ−１の抗癌活性を評価した。細胞を種々の濃度の化合物と７２時間インキュベートし、その後にスルホローダミンＢアッセイを使用して細胞死を評価した（３３）。ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１のＩＣ５０値を表１Ａに報告する。ＰＡＣ−１はＨｅＬａ細胞でより効力があるようであるにもかかわらず、ほとんどの場合、Ｓ−ＰＡＣ−１はＰＡＣ−１と等しい効力を有する。ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１は共に、起源となる種と無関係に、試験した全てのリンパ腫細胞株に対して効力があるようである。Ｕ−９３７細胞を使用したさらなる分析は、これらの細胞においてＳ−ＰＡＣ−１がアポトーシスを誘導することを示す。Ｕ−９３７細胞を、ＤＭＳＯ、５０μＭ  ＰＡＣ−１、または５０μＭ  Ｓ−ＰＡＣ−１で１２時間処置した。インキュベーション後、アポトーシスをアネキシンＶ／ＰＩ染色によって評価し、フローサイトメトリーによって分析した（図１６ｄ）。ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１の両方での処置により、アネキシンＶ染色を示す細胞集団が増加する。この実験では、Ｓ−ＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１と同一の程度（約４０％）までアポトーシスを誘導する。
【０１５３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳ−ＰＡＣ−１の評価のための適切な処置ストラテジーを決定するために、Ｓ−ＰＡＣ−１細胞傷害性の時間依存性を評価した。Ｕ−９３７細胞を、Ｓ−ＰＡＣ−１で種々の時間処置した。Ｓ−ＰＡＣ−１での処置後、細胞を洗浄して化合物を除去し、化合物を含まない成長培地中で培養した。７２時間で全ての処置時間についての細胞死を評価した。各曝露時間についてのＩＣ５０値を決定し、表１Ｂに報告した。３、６、および９時間で、ＩＣ５０値は試験した最高濃度よりも高かった。曝露１２時間で、ＩＣ５０値の急速な減少が認められる。曝露２４時間までに、ＩＣ５０値はほぼ最小であり、その後４８時間にわたってほとんど変化しない。これらの時間依存性実験により、癌細胞を化合物に少なくとも２４時間曝露した場合、Ｓ−ＰＡＣ−１がｉｎ  ｖｉｖｏで最も有効であると示唆される。
【０１５４】
Ｓ−ＰＡＣ−１は、マウスにおいて神経毒性効果を示さない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養でのＳ−ＰＡＣ−１の活性が確認されたので、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＳ−ＰＡＣ−１の毒性効果を評価した。ＰＡＣ−１の毒性決定に類似の様式で、Ｓ−ＰＡＣ−１（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを使用して可溶化）を、外側尾静脈注射によって１２．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、および３５０ｍｇ／ｋｇでＣ５７／ＢＬ６マウスに投与した。用量３５０ｍｇ／ｋｇでさえも神経毒性は認められなかった。
【０１５５】
マウス腫瘍モデルにおけるＳ−ＰＡＣ−１の最初の評価目的のために、マウスにおけるＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学を決定した。Ｓ−ＰＡＣ−１の血漿濃度が２４時間にわたって約１０μＭを超えるような様式でＳ−ＰＡＣ−１を投与することができる場合、処置は、腫瘍細胞におけるプロカスパーゼ−３の活性化およびアポトーシスの誘導に有効であり得る。これらの株を使用した処置ストラテジーを開発するために、Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、ｉ．ｐ．投与によって１２５ｍｇ／ｋｇのＳ−ＰＡＣ−１を含む２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで処置した。マウスを屠殺し、投与後の種々の時点で採血した。血液サンプルを遠心分離し、血清を回収し、液体クロマトグラフィによって分析して薬物濃度を決定した。Ｓ−ＰＡＣ−１についての時間に対する薬物濃度を図１７Ａに示す。この用量によって達成されたピーク血漿濃度は、注射３０分後の約１７０μＭである。次いで、Ｓ−ＰＡＣ−１の血漿濃度は急速に減少し、注射４時間後にはＳ−ＰＡＣ−１は残存しない。このデータの分析により、マウスにおけるＳ−ＰＡＣ−１の排出半減期は約１時間であることを示す。マウスにおける達成されたピーク血漿濃度およびＳ−ＰＡＣ−１の短い半減期に基づいて、マウスにおいて２４時間にわたって１０μＭの最小血漿濃度を達成および維持するために用量３５０ｍｇ／ｋｇのＳ−ＰＡＣ−１で２時間毎に処置する必要があると予想された。Ｓ−ＰＡＣ−１のこの頻繁な投与レジメン（ｉ．ｐ．にて２時間毎に２４時間）は技術的に実現可能であったにもかかわらず、マウス腫瘍モデルを使用した新規の治療薬としてのＳ−ＰＡＣ−１のさらなる評価は方法論的に実用的ではなかった。そのようなものとして、本発明者らは、Ｓ−ＰＡＣ−１の定常状態濃度を長期間維持するためのさらなる実用性を付与するより大きな哺乳動物実験系（特に、健康なイヌおよび自然発生癌を保有するイヌ）においてＳ−ＰＡＣ−１をさらに調査することを試みた。
【０１５６】
研究用イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の評価。健康な研究用猟犬を、Ｓ−ＰＡＣ−１の薬物動態学調査および毒性調査のために使用した。４匹の研究用猟犬を、ｉ．ｖ．注射にて１０分間にわたって２５ｍｇ／ｋｇのＳ−ＰＡＣ−１（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解）で処置した。イヌにおける静脈内投与したＳ−ＰＡＣ−１の薬物動態学的プロフィールを特徴付けるために、複数の血清サンプルを２４時間にわたって回収した。薬物動態分析に加えて、研究用イヌにおける単回用量の静脈内Ｓ−ＰＡＣ−１投与の血液学的および非血液学的な耐容性を、４週間にわたって毎週モニタリングした（表２Ａ）。図１７Ｂに示すように、この２５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｖ．ボーラス量に起因するピーク血漿濃度は約１５０μＭであった。これは、１２５ｍｇ／ｋｇのｉ．ｐ．用量で処置したマウスで達成されたピーク血漿濃度に類似していた。薬物動態学的プロフィールの分析から、イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の半減期は、３時間であると計算された。さらに、単回用量の静脈内Ｓ−ＰＡＣ−１処置は、４匹全ての研究用イヌにおいて十分に許容され、処置の結果として、これらの動物において短期または長期の有害事象は認められなかった。
【０１５７】
イヌにおける３時間の半減期がマウスにおけるＳ−ＰＡＣ−１の半減期より有意に改善されているにもかかわらず、薬物動態学的計算により、約１０μＭを超える血清レベルを維持するために薬物を１日の流れの中で数回投与する必要があると予想された。あるいは、持続注入を使用して、一連の処置の間に薬物が定常状態の血清濃度を維持することができる。持続注入ストラテジーは、他の化学療法薬（ダカルバジン（３４）、シトシンアラビノシド（３５）、およびゲムシタビン（３６）など）と共に９８時間までの注入時間で使用されている。さらに、ＹＭ１５５（より長い曝露時間で活性が増加するアポトーシス促進性の治験薬）が現在臨床試験中であり、これは、１６８時間の持続注入を利用する（３７）。
【０１５８】
３匹の健康な研究用イヌを使用して、持続注入レジメンによってＳ−ＰＡＣ−１を安全に投与することができるかどうかを決定し、約１０μＭを超える血漿濃度を維持するのに適切な投与レベルを決定した。各イヌに、ｉ．ｖ．注入によって１０分間にわたって初回負荷量を投与し、その後に注入ポンプによってさらに２４時間送達させて投薬量を維持した。各イヌをその２４時間の注入にわたって有害反応について観察し、間隔をおいて採血してＳ−ＰＡＣ−１処置の薬物動態学的プロフィールを評価した。さらに、Ｓ−ＰＡＣ−１注入の終了後、研究用イヌを、４週間にわたって毎週血液学的および非血液学的な毒性について評価した。
【０１５９】
２４時間持続注入として投与したＳ−ＰＡＣ−１を研究用イヌに安全に投与することができ、マイクロモルの定常状態の血漿濃度に容易に到達する。この様式でＳ−ＰＡＣ−１を投与したイヌについての薬物動態学的プロフィールは、定常状態の血漿濃度が用量漸増と相関することを示す（図１７Ｃ）。これらの結果に基づいて、７ｍｇ／ｋｇの負荷量および３ｍｇ／ｋｇ／時間の定速注入が約１０μＭの定常状態の血漿濃度を達成するために十分であろうと予想される。さらに、Ｓ−ＰＡＣ−１の定速注入は試験した全ての用量で十分に許容され、いかなる研究用イヌにおいても血液学的または非血液学的な毒性は認められなかった。
【０１６０】
Ｓ−ＰＡＣ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が確認され、化合物を定速注入によって安全に投与することができ、且つ１０μＭを超えるＳ−ＰＡＣ−１の定常状態の血漿濃度を２４時間持続して達成することができることが示されたので、自然発生リンパ腫を有するクライアント所有の愛玩犬の小規模（ｎ＝５）臨床試験を行った。愛玩犬における自然発生癌は、ヒト癌と多数の類似点がある（組織学的外観、腫瘍遺伝学、分子標的、生物学的および臨床的挙動、ならびに治療反応性が含まれる）（３８）。これらのイヌ自発発生癌のうち、多中心性リンパ腫は最も一般的であり、１００，０００匹のイヌあたり１３〜２４匹が発症する（３９）。多中心性Ｂ細胞またはＴ細胞性イヌリンパ腫の臨床的進行および処置は、ヒトの非ホジキンリンパ腫と同一の特徴を多数有する。イヌリンパ腫およびヒト非ホジキンリンパ腫の両方は、同一の細胞傷害性薬物（ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびシクロホスファミドなど）に対して臨床的に応答する。これらの薬物は、ＣＨＯＰ処置プロトコール（ヒトのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のためのファーストライン治療である）の構成要素である（４０）。イヌに投与した場合、ＣＨＯＰプロトコールは、リンパ腫と診断されたイヌのおよそ９０％で完全な臨床的寛解を誘導するであろう（４１，４２）。ヒト応答に類似して、ＣＨＯＰ治療を使用して寛解を達成するイヌの大部分が疾患再発を経験するであろう（４３）。ヒトリンパ腫とイヌリンパ腫との間の共通点を考慮して、イヌリンパ腫臨床試験におけるＳ−ＰＡＣ−１の評価により、新規のヒト治療としてのＳ−ＰＡＣ−１の開発のための重要なトランスレーショナルな情報が得られる。
【０１６１】
Ｓ−ＰＡＣ−１試験の選択規準。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ−Ｕｒｂａｎａ  Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｌｉｎｉｃに連れていかれたか付託されたイヌについて臨床試験の参加を考慮した。適格な患畜の選択規準は以下であった：多中心性リンパ腫が組織学的または細胞学的に確認されていること、全身腫瘍組織量が測定可能であること、好ましい活動状態、平均余命が４週間超であること、研究参加の３週間以内に化学療法の履歴がないこと、および有意な共存性の疾患（腎不全または肝不全が含まれる）、鬱血性心不全の病歴、または臨床的凝固障害を持たないこと。さらに、ペット所有者は、大学のガイドラインに従って、研究参加前にインフォームド・コンセントの書類に署名しなければならなかった。
【０１６２】
イヌリンパ腫患畜におけるＳ−ＰＡＣ−１の毒性および薬物動態学。５匹のイヌ患畜を、２つの処置レジメン（表７Ｃにまとめている）のうちの１つによってＳ−ＰＡＣ−１で処置した。第１の処置レジメンに参加した患畜に、４週間のサイクルで週１回Ｓ−ＰＡＣ−１の２４時間連続注入を行った。第２の処置レジメンに参加した患畜に、２処置サイクルで１週間おきにＳ−ＰＡＣ−１を７２時間連続注入した。各Ｓ−ＰＡＣ−１処置サイクルの間に薬物動態分析のために採血した。さらに、血液学的および非血液学的毒性を特徴付けるために、それぞれの計画された追跡調査来院時に全ての愛玩犬から採血した。投与の間に、動物共同腫瘍学グループの共通用語および有害事象の基準（ＶＣＯＧ＿ＣＴＣＡＥ）を遵守した胃腸毒性観察スコアのためにペット所有者が患畜をモニタリングした（４４）。処置レジメン１または２のいずれかに参加した全ての患畜では、いかなる臨床学的に有意な血液学的または非血液学的毒性も証明されなかった（表７ＣおよびＤ）。小さな有害事象（注入部位の自己限定性の局在化された刺激（ｎ＝３）、一過性の無食欲（ｎ＝１）、および軽度の下痢（ｎ＝２）など）のみがペット所有者によって報告された。全ての有害反応は、各処置サイクルの終了後４８時間以内に鎮静した。
【０１６３】
薬物動態分析により、図１８に示すように、全ての患畜が測定可能なＳ−ＰＡＣ−１の血清濃度を有することが示された。Ｓ−ＰＡＣ−１濃度は、注入開始から６時間以内に定常状態に到達した。健康な研究用イヌからの予想にしたがって、７ｍｇ／ｋｇの負荷量および３ｍｇ／ｋｇ／時間の定速注入を使用した注入は、ほとんどの処置において１０μＭを超える定常状態の血漿濃度を達成するのに十分であった。
【０１６４】
Ｓ−ＰＡＣ−１の抗腫瘍活性。全身腫瘍組織量の評価を、末梢リンパ節の累積カリパス測定および下顎リンパ節のＣＴスキャンによって一連の研究を通してモニタリングした。カリパス測定をＲＥＣＩＳＴ法にしたがって行った（４５）。簡潔に述べれば、４対の末梢リンパ節（下顎、肩甲骨全部、鼠径部、および膝窩）についての最長の直線の長さの測定値を記録し、これらの値のまとめからＲＥＣＩＳＴスコアを得た。４対全ての末梢リンパ節のカリパス測定に加えて、全ての患畜の下顎リンパ節のＣＴスキャンを行った。これにより、リンパ節の最大直線長の正確且つ客観的な測定が可能であった。処置した５匹の患畜のうち、１匹の患畜（患畜１）が、４週間の処置にわたるＲＥＣＩＳＴスコアおよびＣＴスキャンによる下顎リンパ節の測定値の両方が約３０％減少した部分的応答を示した（図１９ＡおよびＢ）。４つの処置サイクル後、薬物投与を停止し、イヌをその後２週間ＲＥＣＩＳＴによってモニタリングした。処置の非存在下では、このイヌについてのＲＥＣＩＳＴスコアは劇的に増加した（３６日目および４２日目）。この部分的応答に加えて、３匹の患畜は安定化疾患を示した一方で（患畜２〜４）、１匹の患畜は疾患の進行を示した（患畜５）。
【０１６５】
Ｓ−ＰＡＣ−１は、癌患畜の臨床試験で評価されるべきＰＡＣ−１クラスの第１の化合物（およびプロカスパーゼ−３の第１の小分子アクチベーター）である。そのようなものとして、このデータは、抗癌治療としてのプロカスパーゼ−３活性化ストラテジーに重要である。化合物の作用機構およびＢＢＢのその予想される透過性を考慮すると高用量のＰＡＣ−１が神経毒性を誘導することはおそらく驚くべきことではない。さらに、この神経毒性の発症の短期間の遅延（約５分間）により、認められた神経毒性がＰＡＣ−１の最初のピーク血漿濃度の結果ではなく、むしろ、ＢＢＢを横切るＰＡＣ−１の再分布の結果であると示唆される。亜鉛ホメオスタシスは中枢神経系で重要であり（４６）、ＮＭＤＡ受容体は、持続性阻害を得るために亜鉛に結合する必要がある（２８）。ＮＭＤＡ受容体は低親和性（Ｋｄ＝５．５μＭ）で亜鉛に結合し（４７）、それにより、亜鉛に対する親和性がより高い亜鉛キレーター（ＰＡＣ−１またはＳ−ＰＡＣ−１（それぞれＫｄ＝４６および５２ｎＭ）など）がこれらの受容体から亜鉛を首尾よく隔離することができるであろうと示唆される。いくつかの研究は、細胞内亜鉛キレート化によってこれらの受容体が過剰に励起され（２７）、それにより、非制御の筋肉の動きおよび痙攣などの症状を生じる（２８）ことを示している。実際、細胞透過性亜鉛キレーター（ＴＰＥＮ）は、マウスにおいて低濃度で重篤な神経毒性を誘導し、より高い濃度で急死を誘導することが示されている（４８）。
【０１６６】
ＢＢＢを経由する化合物の透過性に影響を及ぼす因子（極性、親油性、およびサイズが含まれる）がいくつか存在する（２９）。ＢＢＢへの化合物の透過性を減少させるための１つのストラテジーは、分子の極性を増加させることである。アリールスルホンアミドモチーフが多数の小分子治療で共通するので、スルホンアミド官能基の付加は、かかる極性の増大のための良好な候補である。アリールスルホンアミド官能基を含むＦＤＡ承認薬には、セレコキシブ（セレブレックス（登録商標））、タムスロシン（フロマックス（登録商標））、およびヒドロクロロチアジドが含まれる。
【０１６７】
リンパ腫を有する愛玩犬は、治験新薬調査のための重要なツールである（２６）。米国の愛玩犬のほぼ１／４が癌で死亡し（４９）、無処置での診断からの平均生存期間は４〜６週間である。リンパ腫を有するイヌの標準的なケアは、ＣＨＯＰ治療の適用である（２６）。この治療は、１９週間にわたる１６クールの薬物投与からなり、それにより、通常、完全に寛解する。ヒト疾患に類似して、寛解を達成する大部分のイヌは、しばしば薬物耐性を伴う再発を経験するであろう。そのようなものとして、原発性および再発性の両方のリンパ腫に取り組むための新規のファルマコフォアが必要である。表６Ｃに示すように、本研究に参加した１匹のイヌ（患畜１）はＣＨＯＰ治療後５ヶ月間寛解し、最近になって再発性リンパ腫と診断された。研究参加の際、このイヌは、Ｓ−ＰＡＣ−１処置に応答して腫瘍サイズが２７％減少した。比較的短い処置持続時間（Ｓ−ＰＡＣ−１についての４週間対ＣＨＯＰについての１９週間）を考慮すると、この部分的応答は有意である。イヌリンパ腫は、一般に、疾患診断後数週間以内に急速に悪化して末梢リンパ節が劇的に拡大するので、５匹の患畜のうちの４匹が４週間にわたって部分的応答または安定病態を達成したことは望ましいことである。これは、処置停止後の患畜１のリンパ節で認められる急速な拡大によってさらに説明される。
【０１６８】
ＰＡＣ−１クラスの化合物は、阻害性亜鉛イオンのキレート化によってプロカスパーゼ−３を活性化する（２５）。細胞内亜鉛は、主に、メタロプロテアーゼ（亜鉛フィンガードメイン）および他の金属結合タンパク質中の強固に結合した複合体中に見出される。しかし、約１０％の細胞亜鉛が弱く結合した不安定なプール中に存在すると考えられている（５０）。多数の研究により、内因性抗アポトーシス制御因子として不安定な亜鉛が関連すると見なされている（５１〜５４）。興味深いことに、弱く結合した亜鉛のプールのキレート化は、新規の抗癌ストラテジーである（２４，２５）。最近、別の小分子亜鉛キレーター（ＭＬ−１３３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび結腸癌のマウス異種移植モデルで抗癌性を有することが報告された（５５）。著者によって報告されていないが、ＭＬ−１３３は、ＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１に類似の様式（すなわち、プロカスパーゼ−３の活性化）で作用し得る。したがって、Ｓ−ＰＡＣ−１の評価はまた、抗癌ストラテジーとしての不安定性亜鉛プールのキレート化で有用である。
【０１６９】
結論として、Ｓ−ＰＡＣ−１は、親化合物ＰＡＣ−１に類似の活性を有する強力な細胞傷害性小分子である。高用量のＰＡＣ−１（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中で投与した場合）が神経毒性をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する一方で、Ｓ−ＰＡＣ−１はこの副作用を生じない。Ｓ−ＰＡＣ−１を、マウス、研究用イヌ、およびリンパ腫保有イヌに安全に投与することができ、この予備的単回投薬量評価において有望な臨床的効果を示す。Ｓ−ＰＡＣ−１を用いても神経毒性を示さないことを考慮して、ここで評価した用量よりも高い用量で安全であることが証明されると認識される。リンパ腫イヌにおけるＳ−ＰＡＣ−１の完全なイヌ臨床試験（用量漸増を含む）は、現在進行中である。
【０１７０】
表６．Ａ）種々の培養癌細胞株におけるＰＡＣ−１およびＳ−ＰＡＣ−１の細胞傷害性分析。Ｂ）Ｕ−９３７細胞におけるＳ−ＰＡＣ−１細胞傷害性の時間依存性。Ｃ）５匹のＳ−ＰＡＣ−１で処置したリンパ腫保有イヌの特徴付け。
【０１７１】
【表６−３】
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【０１７２】
【表６−４】
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表７．Ａ）単回用量のＳ−ＰＡＣ−１で処置した研究用イヌ、Ｃ）１週間毎に２４時間の定速注入の４回連続処置においてＳ−ＰＡＣ−１で処置したリンパ腫保有イヌ、およびＤ）１週間おきに７２時間の定速注入の２回連続処置においてＳ−ＰＡＣ−１で処置したリンパ腫保有イヌの選択された血液学的および非血液学的なパラメーター。
【０１７３】
【表７】
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材料と方法
概要
無水条件が必要な全ての反応を、乾燥機で乾燥させたガラス製品中にて陽圧の窒素またはアルゴン雰囲気下で行った。標準的なシリンジ技術を、液体の無水添加のために使用した。乾燥テトラヒドロフランを、市販の溶媒精製システム（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における活性アルミナカラムまたは分子ふるいの通過によって得た。他に断らない限り、全ての出発物質、溶媒、および試薬を供給業者から入手し、さらに精製せずに使用した。フラッシュクロマトグラフィを、２３０〜４００メッシュシリカゲルを使用して行った。化合物１、２、および５（Ｎａｇａｎａｗａ，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，２００６，１４，７１２１−７１３７）を、文献に記載の方法にしたがって調製した。
【０１７４】
化合物の分析
全てのＮＭＲ実験を、内部標準として残存非重水素化溶媒を用いたＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００ＭＨｚまたは５００ＭＨｚ分光計にてＤ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ３ＯＤ（ｓｉｇｍａ）、またはアセトン−ｄ６（Ｓｉｇｍａ）のいずれかにおいて記録した。化学シフト、δ（ｐｐｍ）；結合定数、Ｊ（Ｈｚ）；多重性（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット）；および積分値を報告する。高分解能質量スペクトルデータを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑ−Ｔｏｆウルトラハイブリッド型四重極／飛行時間型ＥＳＩ質量分析計で記録した。全ての融点を補正していない。ＬＣ−ＭＳを、Ｃ１８カラム（２．１×５ｍｍ、移動相Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、Ｂは、０％Ｂに保って０〜２分間、次いで０〜５０％Ｂを２〜５分間、次いで５０〜１００％Ｂを５〜７分間、１００％に保って７〜８分間、および１００〜０％を８〜１０分間の勾配系を使用したアセトニトリルである）にて行った。
【０１７５】
【化２９】
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【０１７６】
【化３０】
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エチル２−（４−（４−スルファモイルベンジル）ピペラジン−１−イル）アセタート（３）
【０１７７】
【化３１】
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１（１０８ｇ、４４０．７ｍｍｏｌ、１．４当量）およびＫ２ＣＯ３（１３２．４ｇ、９５８．２ｍｍｏｌ、３当量）を含む３：２のＴＨＦ／アセトン（総量２１９２ｍＬ）の撹拌混合物に、エチル２−（ピペラジン−１−イル）アセタート、２（７９．９ｇ、３１９．４ｍｍｏｌ、１当量））を添加した。反応物を、ＴＬＣによってモニタリングしながら２４時間還流した。溶液を濾過し、固体をアセトン（８０ｍＬ）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮し、次いで、エタノール中での再結晶によって精製して３（５７．４ｇ、６０％）を淡黄色固体として得た。ミリグラムスケールで、粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ（１：４  ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によって精製した。１Ｈ−ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  ７．８６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．０Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．１７  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２４  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５８  （ｂｒｏａｄ  ｄ，  Ｊ  ＝  ５０．４Ｈｚ，  ８Ｈ），  １．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１Ｈｚ，  ３Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １７０．４，  １４２．８，  １４２．４，  １２９．７，  １２６．０，  ６１．９，  ６０．６，  ５８．５，  ５２．５，  ５２．４，  １３．３．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：実測値：３４２．１４８７（Ｍ＋１）；Ｃ１５Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓの計算値：３４２．１４８８．融点：１５３．０〜１５４．５．ＩＲ（原液）：３３１９，１７３９，１１６０ｃｍ−１。
【０１７８】
４−（（４−（２−ヒドラジニル−２−オキソエチル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンゼンスルホンアミド（４）
【０１７９】
【化３２】
0005896746.tif 000057
３（１１０．９ｇ、３２４．８ｍｍｏｌ、１当量）を含む２：１のエタノール／メタノール（総量６５０ｍＬ、０．５  Ｍ）の撹拌溶液に、無水ヒドラジン（３０．６ｍＬ、９７４．５ｍｍｏｌ、３当量）を添加した。反応物を、ＴＬＣ（１：１  ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によってモニタリングしながら１６時間還流した。反応混合物を真空下で濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、水（１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。水層を、ＣＨ２Ｃｌ２（３×８０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（８０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。メタノール中での再結晶を使用した精製により、４（９６．３ｇ、９１％）を白色固体として得た。ミリグラムスケールで、反応物をエタノール中で運転した（０．０６Ｍ）。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  ７．８５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．０４  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５４  （ｂｒｏａｄ  ｓ，  ８Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）：  δ  １７０．２，  １４２．８，  １４２．４，  １２９．７，  １２６．０，  ６１．９，  ５９．８，  ５３．０，  ５２．６．  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：実測値：３２８．１４３６（Ｍ＋１）；Ｃ１３Ｈ２２Ｎ５Ｏ３Ｓの計算値：３２８．１４４３．融点：１９４．５〜１９６．０．ＩＲ（原液）：３３２０，１６７０，１１５８ｃｍ−１。
【０１８０】
（Ｅ）−４−（（４−（２−（２−（３−アリル−２−ヒドロキシベンジリデン）ヒドラジニル）−２−オキソエチル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンゼンスルホンアミド（Ｓ−ＰＡＣ−１）
【０１８１】
【化３３】
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５（２８．８ｇ、１７７．３ｍｍｏｌ、１当量）を含む１：２のアセトニトリル／メタノールの撹拌溶液（総量１１８０ｍＬ、０．１５Ｍ）に、４（９８．７ｇ、３０１．４ｍｍｏｌ、１．７当量）およびＨＣｌ（７ｍｏｌ％）を添加した。反応物を、ＴＬＣによってモニタリングしながら４８時間還流した。溶液を真空下で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ（１：４  ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）およびその後のメタノール中での再結晶によって精製して、Ｓ−ＰＡＣ−１（４５．９ｇ、５５％）をオフホワイト固体として得た。ミリグラムスケールで、反応物をエタノール（０．０２Ｍ）中で運転した。１Ｈ  ＮＭＲ  （５００  ＭＨｚ，  （ＣＤ３）２ＣＯ）：  δ  １１．８６  （ｓ，  １Ｈ），  １０．７９  （ｓ，  １Ｈ），  ８．５１  （ｓ，  １Ｈ），  ７．８５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．２Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．１９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．６Ｈｚ，  ２Ｈ），  ６．８６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６Ｈｚ，  １Ｈ），  ６．５６  （ｓ，  ２Ｈ），  ６．０２  （ｔｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝６．７Ｈｚ，  Ｊ＝１０．１Ｈｚ，  Ｊ＝１６．９Ｈｚ），  ５．０４  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．６０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．７Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．１８  （ｓ，  ２Ｈ）  ２．５７  （ｂｒｏａｄ  ｄ，  Ｊ  ＝  ４６．５Ｈｚ，  ８Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  （ＣＤ３）２ＣＯ）：  δ  １６５．７，  １５６．４，  １５０．０，  １４３．４，  １４３．２，  １３６．９，  １３１．８，  １２９．３２，  １２９．３０，  １２７．９，  １２６．２，  １１９．１，  １１７．８，  １１５．１，  ６２．０，  ６１．１，  ５３．７，  ５２．９，  ３３．８．  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：実測値：４７２．２０１４（Ｍ＋１）；Ｃ２３Ｈ３０Ｎ５Ｏ４Ｓの計算値：４７２．２０１９．融点：１０８．５〜１１１．０．ＩＲ（原液）：３２２７，１６８４，１６０６，１１５７ｃｍ−１．純度：＞９９．５％（ＬＣ−ＭＳ）。
【０１８２】
４−（ピペラジン−１−イルメチル）ベンゼンスルホンアミド（６）
【０１８３】
【化３４】
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無水ピペラジン（８６０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ、５当量）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に添加し、ピペラジンが完全に溶解するまで混合物を加熱還流した。溶液１（５００ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を、ＴＬＣによってモニタリングしながら２．５時間還流した。反応混合物を１Ｍ  ＫＯＨ溶液で中和し、次いで、真空下で濃縮した。シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィ（１：４  ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）での精製により、６（２５０ｍｇ、４９％）を淡黄色半固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  Ｄ２Ｏ／（ＣＤ３）２ＣＯ）：  δ  ７．８４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４Ｈｚ，  ２Ｈ），  ７．５１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．６９  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｍ，  ４Ｈ），  ２．７４  （ｍ，  ４Ｈ），  １．８７  （ａｐｐａｒｅｎｔ  ｓ，  １Ｈ）．  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２６  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  １４０．９３，  １４０．８７，  １３１．０，  １２６．３，  ６１．１，  ４９．０，  ４３．１３．  ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：実測値：２５６．１１１４（Ｍ＋１）；Ｃ１１Ｈ１８Ｎ３Ｏ２Ｓの計算値：２５６．１１２０．ＩＲ（原液）：３１４２，１１５８ｃｍ−１。
【０１８４】
実施例７．薬学的実施形態
以下は薬学的および薬理学的な実施形態に関する情報を記載し、当業者に利用可能な分野の情報をさらに補足する。正確な処方物、投与経路、および投薬量を、患者の状況を考慮して各医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ．ａｌ．，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０１８５】
担当医は、毒性または臓器不全などのために投与を終了するか、中断するか、調整する方法および時期を承知していることに留意すべきである。逆に、担当医はまた、臨床反応が適切ではなかった場合により高いレベルに処置を調整する（有毒局面を考慮するか排除する）ことを承知しているであろう。目的の障害の管理における投与量の規模は、処置すべき容態の重症度および投与経路によって変化し得る。容態の重症度を、例えば、標準的な予後評価法によって一部評価することができる。さらに、用量および（おそらく）投与頻度はまた、環境（例えば、各患者の年齢、体重、および応答）に応じて変化し得る。上記での考察に類似したプログラムも、獣医学で使用することができる。
【０１８６】
処置される特定の容態および選択されたターゲティング法に応じて、かかる薬剤を処方し、全身または局所に投与することができる。処方および投与の技術を、Ａｌｆｏｎｓｏ  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ（１９９５）および当該分野の他の場所に見出すことができる。適切な経路には、例えば、経口投与、直腸投与、経皮投与、膣投与、経粘膜投与、または腸投与、非経口送達（筋肉内注射、皮下注射、または髄内注射が含まれる）、ならびに眼内投与、髄腔内投与、静脈内投与、または腹腔内投与が含まれ得る。
【０１８７】
注射または他の経路について、本発明の薬剤を、水溶液、好ましくは生理学的に適合可能な緩衝液（ハンクス液、リンゲル液、注射用蒸留水、生理食塩水、または他の溶液など）中で処方することができる。経粘膜投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤を処方物中で使用することができる。かかる浸透剤は、当該分野で一般に公知である。
【０１８８】
本発明の実施のために本明細書中に開示の化合物を全身投与または他の投与に適切な投薬量に処方するための薬学的に許容可能なキャリアの使用は、本発明の範囲内である。キャリアの適切な選択および適切な製造の実施により、本発明の組成物、特に溶液として処方した組成物を、非経口（静脈内注射など）または他の経路で投与することができる。適切な化合物を、当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアを使用して、経口投与に適切な投薬量に容易に処方することができる。かかるキャリアにより、本発明の化合物を、例えば、処置されるべき患者による経口摂取のための錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、エリキシル、溶液、および懸濁液などとして処方することができる。他の経路のために、処方物を、クリーム、軟膏、およびローションなどのために調製することができる。
【０１８９】
細胞内投与が意図される薬剤を、当業者に周知の技術を使用して投与することができる。例えば、かかる薬剤を、リポソーム、他の膜輸送促進部分、または他のターゲティング部分にカプセル化し、次いで、上記のように投与することができる。リポソームには、水性内部を有する球状脂質二重層が含まれ得る。リポソーム形成時に水溶液中に存在する全ての分子を、水性内部に組み込むことができる。リポソーム内容物を、外部微小環境から保護すると同時に、リポソームが細胞膜に融合するので、細胞質に有効に送達させる。さらに、疎水性のために、有機小分子を、細胞内に直接投与することができる。
【０１９０】
本発明での使用に適切な薬学的組成物には、意図する目的を達成するのに有効な量の有効成分を含む組成物が含まれる。有効量の決定は、特に、本明細書中に提供した開示および当該分野の他の情報を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１９１】
有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の処理が容易になる賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。経口投与のために処方した調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル、または溶液の形態であり得る。この調製物には、遅延放出または医薬品が小腸または大腸に到達した場合にのみ放出するために処方した調製物が含まれる。
【０１９２】
本発明の薬学的組成物を、それ自体が公知の様式（例えば、従来の混合、溶解、懸濁、顆粒化、糖衣錠作製、浮揚、乳化、カプセル化、封入、凍結乾燥、および他の過程によって）で製造することができる。
【０１９３】
非経口投与のための薬学的処方物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液を、必要に応じて、油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなど）、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質（カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなど）を含むことができる。任意選択的に、懸濁液はまた、適切な安定剤または高度に濃縮された溶液の調製が可能なように化合物の溶解度を増大させる薬剤を含むことができる。
【０１９４】
経口用の薬学的調製物を、活性化合物を固体賦形剤と合わせ、任意選択的に得られた混合物を粉砕し、顆粒混合物を、必要に応じて適切な助剤を添加後、錠剤または糖衣錠のコアを得るために処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤（糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールが含まれる）、セルロース調製物（例えば、メイズデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）など）である。必要に応じて、崩壊剤（架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）など）を添加することができる。
【０１９５】
糖衣錠コアを、任意選択的に、適切なコーティングを使用して得る。この目的のために、糖濃縮液を使用することができ、糖濃縮液は、任意選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。活性化合物用量の異なる組み合わせの識別または特徴付けのために、染料または色素を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加することができる。
【０１９６】
経口で使用することができる薬学的調製物には、ゼラチンで作製したプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）で作製した軟質の密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、および／または潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および必要に応じて安定剤と混合した有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物を、適切な液体（脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。
【０１９７】
本出願は、全ての目的のために以下の各出願全体を参考として援用する：米国特許仮出願第６０／６８４，８０７号、２００５年５月２６日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ，Ｇｒａｃｅ  Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ［代理人事件整理番号４７−０５Ｐ］；米国特許仮出願第６０／７４３，８７８号、２００６年３月２８日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ，Ｇｒａｃｅ  Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ［代理人事件整理番号４７−０５Ｐ１］；米国特許出願第１１／４２０，４２５号、２００６年５月２５日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ，Ｇｒａｃｅ  Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ［代理人事件整理番号４７−０５ＵＳ］；ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ  ０６／０２０９１０号、２００６年５月２６日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ，Ｇｒａｃｅ  Ｗ．Ｃｈｅｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｍ．Ｐｅａｒｓｏｎ  ［代理人事件整理番号４７−０５ＷＯ］；ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６１５１０号、２００８年４月２５日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ．Ｓａｎｄｈｏｒｓｔ，Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ａｎｄ  Ｖａｌｅｒｉｅ  Ｆａｋｏ  ［代理人事件整理番号７３−０７  ＷＯ］；  米国特許仮出願第６０／９１４，５９２号、２００７年４月２７日出願、発明者Ｐａｕｌ  Ｊ．Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ；Ｋａｒｓｏｎ  Ｓ．Ｐｕｔｔ；Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ．Ｓａｎｄｈｏｒｓｔ；Ｑｕｉｎｎ  Ｐ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ；Ｖａｌｅｒｉｅ  Ｆａｋｏ  ［代理人事件整理番号７３−０７Ｐ］。米国特許出願第１２／５９７，２８７号、２００９年１０月２３日出願  ［代理人事件整理番号７３−０７  ＵＳ］。本出願と同一の発明者を有する本明細書中に列挙した特許出願中の組成物として特許請求の範囲に記載の化合物は、本出願中の組成物として特許請求の範囲に記載されることを意図せず、個別または組み合わせた特許請求の範囲由来の各化合物を排除することができるように本出願中に十分に開示することを意図する。
【０１９８】
参照による引用および変形形態の記述
本出願を通して、全てのリファレンス（例えば、特許書類（発行または登録された特許またはその等価物が含まれる）、特許出願公開、非公開特許出願、および非特許文献または他の原資料）は、各リファレンスが本出願中の開示と少なくとも部分的に不一致である程度まで個別に参考として援用されるように、その全体が本明細書中で参考として援用される（例えば、部分的に不一致のリファレンスは、リファレンスの部分的に不一致の部分を除いて参考として援用される）。
【０１９９】
本明細書中に添付の任意の付属書類は、明細書および／または図面の一部として参考として援用される。
【０２００】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を本明細書中で使用する場合、これらは、記述の特徴、整数、工程、またはこれらで言及した成分の存在を特定すると解釈されるが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、成分、またはその群の存在または付加を排除するわけではない。個別の本発明の実施形態を含むことも意図し、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」または「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、これらの用語、文法上の同義語（例えば、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ））」または「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）と任意選択的に置換され、それにより、必ずしも同延ではないさらなる実施形態が説明される。明確にするために、本明細書中で使用する場合、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「〜によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義語であり、さらなる引用していない要素または方法の工程を含むか、無制限であり、且つ排除しない。本明細書中で使用する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、クレームエレメント中に特定されない任意の要素、工程、構成要素、または成分を排除する。本明細書中で使用する場合、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、クレームの基本的且つ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない（例えば、有効成分に影響を及ぼさない）材料または工程を排除しない。本明細書中の各例では、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のいずれかを、他の２つの用語のいずれかと置換することができる。本明細書中に例示として記載の発明を、本明細書中に具体的に開示されていない任意の要素または制限の非存在下で適切に実施することができる。
【０２０１】
本発明は、種々の特定且つ好ましい実施形態および技術を参照して記載している。しかし、本発明の精神および範囲内にとどめながら、多数の変更形態および修正形態を得ることができると理解すべきである。本明細書中に具体的に記載のもの以外の組成物、方法、デバイス、デバイスエレメント、材料、選択的特徴、手順、および技術を、過度の実験に頼ることなく本明細書中に広く開示の本発明の実施に適用することができることが当業者によって認識されるであろう。本明細書中に記載の組成物、方法、デバイス、デバイスエレメント、材料、手順、および技術の全ての当該分野で公知の機能的等価物およびその一部は、本発明に含まれることが意図される。範囲を開示する時は常に、全ての部分的範囲および各値が含まれることが意図される。本発明は、開示の実施形態（図面に示されるか、明細書中に例示された任意の実施形態が含まれる）に制限されず、実施形態は、例示または例証のために提供し、本発明を制限しない。本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって制限されるものとする。
【０２０２】
参考文献
米国特許仮出願第６０／６８４，８０７号、２００５年５月２６日出願；米国特許仮出願第６０７４３８７８号、２００６年３月２８日出願；米国特許出願第１１／４２０，４２５号、２００６年５月２５日出願（２００７年３月１日にＵＳ２００７００４９６０２号として公開）；ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０６／０２０９１０号、２００６年５月２６日出願（２００６年１１月３０日にＷＯ２００６／１２８１７３号として公開）（本明細書中で参考として援用される）は、本発明の構成要件に関する。
【０２０３】
これらの出願は、特にその全体が参考として援用される：米国特許仮出願第６０／５１６５５６号、Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら、２００３年１０月３０日出願；米国特許仮出願第６０／６０３２４６号、Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら、２００４年８月２０日出願；Ｕ．Ｓ．１０／９７６，１８６号、Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒら、２００４年１０月２７日出願。
【０２０４】
米国特許仮出願第６０／６８４，８０７号、２００５年５月２６日出願；米国特許仮出願第６０７４３８７８号、２００６年３月２８日出願；米国特許出願第１１／４２０，４２５号、２００６年５月２５日出願；ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０６／０２０９１０号、２００６年５月２６日出願；米国特許仮出願第６０／９１４，５９２号、２００７年４月２７日出願。
【０２０５】
ＵＳ６，７６２，０４５号、膜由来カスパーゼ−３、これを含む組成物、およびその使用方法；ＵＳ６，５３４，２６７号、カスパーゼのアクチベーターをコードするポリヌクレオチド；ＵＳ６，４０３，７６５号、短縮Ａｐａｆ−１およびその使用方法；ＵＳ６，３０３，３２９号；６，８７８，７４３号、Ｃｈｏｏｎｇら、、２００５年４月１２日発行；ＵＳ２００４００７７５４２号、Ｗａｎｇ，Ｘｉａｏｄｏｎｇ；ら、、２００４年４月２２日公開；ＵＳ２００４０１８０８２８号、Ｓｈｉ，Ｙｉｇｏｎｇ、２００４年９月１６日公開。
【０２０６】
【化３５】
0005896746.tif 000060
【０２０７】
【化３６】
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【０２０８】
【化３７】
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【０２０９】
【化３８】
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【０２１０】
【化３９】
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【０２１１】
【化４０】
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【０２１２】
【化４１】
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【０２１３】
【化４２】
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【０２１４】
【化４３】
0005896746.tif 000068
【０２１５】
【化４４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005896746.tif 000084
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
0005896746.tif 000090
【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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