(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
補体活性化レベルを、補体関連障害のリスクがある個体の指標とする方法であって、
（ａ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより、該個体から得られた体液の試料の補体活性化レベルを測定する工程；
（ｂ）該試料の該補体活性化レベルと対照の基準レベルとを比較することにより、該試料の該補体活性化レベルと補体関連障害のリスクとを相関させる工程であって、該対照の該基準レベルと比較した該試料の補体活性化レベルの偏差は、該個体に補体関連障害のリスクがあることを示す、工程；
を含み、工程（ｂ）の相関が、該個体の処置の選択の指標である、方法。
【請求項２】
前記補体関連障害が、外傷、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染症、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記炎症性苦痛が、臓器不全、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症および肺炎からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記側方流動イムノアッセイが、前記試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の存在または不在を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記側方流動イムノアッセイが、リーダーによって読み取られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リーダーが、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の濃度を定量する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃ３の濃度が、前記対照の前記基準レベルと比較して減少している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉＣ３ｂの濃度が、前記対照の前記基準レベルと比較して上昇している、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記補体関連障害が、炎症性苦痛であり、前記インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の濃度が、炎症性苦痛の重症度と相関する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記処置が、前記個体に対する追加の検査を行うこと、人工呼吸器を最適化すること、または抗生物質、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より選択される治療薬を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加の検査が、前記個体から気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料を採取することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記補体インヒビターが、天然補体インヒビターおよびその誘導体、コンプスタチンおよびその類似体、抗膜侵襲複合体（ＭＡＣ）抗体、抗Ｃ３抗体、抗Ｃ５抗体、Ｃ３ａ受容体アンタゴニストおよびＣ５ａ受容体アンタゴニストからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイが、約３０分以下で前記試料中のインタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の量の測定値をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、
メンブレンストリップ；
該マーカーの第一エピトープを結合する検出抗体；
該マーカーの第二エピトープを結合する捕捉抗体を含む検査ライン；および
対照分析物を結合する抗体を含む対照ライン
を含み、
該マーカーは、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび全Ｃ３からなる群より選択される、側方流動イムノアッセイ。
【請求項１６】
前記検出抗体が、シグナルをもたらす標識を含む、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項１７】
前記マーカーがインタクトＣ３であり、前記第一エピトープがＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインが、インタクトＣ３上に存在し、かつＣ３の活性化に際して失われる、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項１８】
前記第二エピトープが、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項１９】
前記マーカーがｉＣ３ｂであり、前記第一エピトープがｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープが、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、かつｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２０】
前記第二エピトープが、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトー
プである、請求項１９に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２１】
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２２】
前記対照分析物が、ＩｇＧである、請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２３】
請求項１５に記載の側方流動イムノアッセイであって、前記体液試料中の補体が、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない、側方流動イムノアッセイ。
【請求項２４】
補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、
メンブレンストリップ；
インタクトＣ３の第一エピトープを結合する第一検出抗体；
インタクトＣ３の第二エピトープを結合する第一捕捉抗体を含む第一検査ライン；
ｉＣ３ｂの第一エピトープを結合する第二検出抗体；
ｉＣ３ｂの第二エピトープを結合する第二捕捉抗体を含む第二検査ライン；および
対照分析物を結合する抗体を含む少なくとも一つの対照ライン
を含む、側方流動イムノアッセイ。
【請求項２５】
前記第一検出抗体および前記第二検出抗体が、それぞれ、シグナルをもたらす標識を含む、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２６】
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液および脳脊髄液からなる群より選択される、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２７】
前記対照分析物が、ＩｇＧである、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項２８】
請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイであって、前記体液試料中の補体が、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない、側方流動イムノアッセイ。
【請求項２９】
前記インタクトＣ３の第一エピトープがＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインが、インタクトＣ３上に存在し、かつＣ３の活性化に際して失われる、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項３０】
前記インタクトＣ３の第二エピトープが、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項３１】
前記ｉＣ３ｂの第一エピトープがｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープが、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、かつｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項３２】
前記ｉＣ３ｂの第二エピトープが、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上のみに存在するネオエピトープである、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項３３】
インタクトＣ３を結合する前記抗体とｉＣ３ｂを結合する前記抗体とが、実質的に交差反応しない、請求項２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
【請求項３４】
補体活性化レベルを、生理的状態について処置を受けており、補体関連障害に罹患している個体についての処置の変更の指標とする方法であって、
（ａ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより、該個体からの体液の一連の試料のそれぞれの補体活性化レベルを測定する工程；
（ｂ）該一連の試料の該補体活性化レベルを比較して、補体活性化レベルの変化を経時的に検出する工程；
を含み、該個体の該処置が、工程（ｂ）の相関に基づき変更されることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１０年１１月２日に出願された米国仮出願第６１／４０９，２９７号への米国特許法１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張し、上記米国仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
ここに開示する主題は、補体活性化の測定のための側方流動イムノアッセイに関する。具体的には、ここに開示する主題は、試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの定量的測定のための側方流動イムノアッセイ、ならびに炎症性苦痛などの補体関連障害のリスクがある個体の評価および処置におけるその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、損傷、感染症および一定の疾患に対する血管新生組織の生理反応である。炎症プロセスは、外傷性損傷後の創傷治癒のために、および感染を取り除くために生物学的に必要なものである。しかし、炎症は、自己組織を傷つけることもある。このため、炎症は、諸刃の剣と見なされることが多い。
【０００４】
補体は、免疫系の最古来の武器であり、炎症プロセスに深く関わっている。補体タンパク質カスケードは、侵入微生物に対する防御の第一線であり、創傷治癒プロセスに極めて重要な役割を果たすものである。この補体カスケードは、３０を超える血清および細胞タンパク質を含み、先天免疫および適応免疫に重要な役割を果たす。補体活性化は、古典的経路、副経路およびレクチン経路という３つの主要経路によって起こり得る。補体活性化の三つの主要経路すべてが、中心的タンパク質補体成分３（Ｃ３）に収束する。Ｃ３は、炎症の中心的媒介因子であり、炎症を引き起こす大多数の要因によって活性化される。図１および２は、Ｃ３およびその活性化産物の概略概観図である。
【０００５】
補体、および特にＣ３は、急性および慢性両方の幾つかの疾患適応症に関連している。例としては、外傷、呼吸困難、敗血症、他の形態の感染症、感染性疾患（例えば、出血熱）、多臓器不全、加齢性黄斑変性、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎、虚血／再灌流障害、炎症性腸疾患、頭蓋内出血、心筋梗塞および心停止が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
重症外傷患者は、独特な臨床的難題を呈する。損傷重症度の的確な評価は、初期介入および患者安定化、ならびに（例えば、集団災害後の）患者トリアージにとっても重要である。ＩＣＵに入れられる患者は、初期安定化後であっても、生命を危うくする二次的合併症（数ある中でも、臓器機能不全、呼吸困難および敗血症を含む）のリスクが依然として高い。これらの状態の多くは、過剰炎症（ｈｙｐｅｒ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）イベントを含み、これは、急速にエスカレートして、臨床症状が検出される前に有意な損傷を引き起こし得る。一般に、これらのイベントに先行して、炎症反応の恒常性が次第に不安定になる。損傷後最も早い時点（ｅａｒｌｉｅｓｔ  ｔｉｍｅ  ｐｏｉｎｔ）で頻繁に（例えば、１または２時間ごとに）かつ確実に炎症をモニタリングできることは、きわめて大きな臨床的価値を有し、臨床ケア患者の臨床成績を向上させるだろう。
【０００７】
幾つかの報告により、補体活性化は損傷直後に起こり、損傷の重症度と相関することが示されている。ある研究において、外傷患者の補体タンパク質の循環レベルは患者転帰と相関することが判明した。非特許文献１を参照。この研究において、著者らは、損傷直後およびＩＣＵにおいて損傷後数日間、Ｃ３ａと全Ｃ３の両方の血漿濃度を測定した。彼らは、損傷後最も早い時点で補体Ｃ３活性化の証拠を検出した。しかし、最初の八時間は、生存者より非生存者のほうが補体活性化が顕著であった。最も早い時点でのＣ３活性化度は、患者転帰と相関した。Ｈｅｃｋｅらは、全補体に対する比として考えたときの、Ｃ３分割産物であるＣ３ａの比のほうが、Ｃ３ａ単独より良好な転帰予測因子であることも見出した。
【０００８】
Ｚｉｌｏｗらによる類似の研究（非特許文献２）により、頻繁な（６時間）間隔でのＣ３ａおよび全Ｃ３のモニタリングは、呼吸困難のリスクの高い患者または呼吸困難の早期にある患者の同定に有用であり得ることが遡及的に判明した。これらの研究者は、損傷２時間以内に第一の血漿試料を採り、最初の４８時間は６時間試料採取を繰り返し、その後は一日間隔で行った。Ｚｉｌｏｗらは、６および１２時間の時点でのＣ３ａレベルとＣ３ａ：全Ｃ３比との間に有意な相関関係を見出し、５日目からは外れることも見出した。
【０００９】
外傷ケアの分野では、損傷後最初の一時間は、時として、「ゴールデン・アワー」と呼ばれる。理論により拘束されることを望まないが、外傷性損傷後の最初の一時間以内の介入は、患者の転帰を大きく向上させると一般に考えられる。より早くもたらされるより良い診断情報は、処置を決定する際の救命救急診療専門家の洞察力の向上に役立つだろう。
【００１０】
これまで、処置の実行可能時間枠内で補体活性化を測定するためのポイント・オブ・ケア・アッセイは、当該技術分野において公知ではない。補体と疾患または外傷と間の関連性は、長きにわたり認識されているが、Ｃ３は、少数の疾患または状態でしかモニタリングされない。これらの場合でさえ、現行のアッセイ法には限界がある。先ず第一に、殆どの場合、旧来の補体アッセイは、（例えば、濁度アッセイおよびＥＬＩＳＡによる）標的分析物としての全Ｃ３に関する。全Ｃ３は、インタクト（または天然）Ｃ３ならびにＣ３活性化産物および非活性化産物の組み合わせである。これらの検査は、一般に、循環Ｃ３レベルの減少を検出する。したがって、減少した全Ｃ３レベルは、大量活性化に起因するＣ３枯渇の尺度にしかならない。しかし、他の要因（例えば食事または運動）が、Ｃ３の定常状態レベルを低下させることもある。全Ｃ３アッセイは、ターンオーバーを測定しないので、活性化の原因を区別することができない。さらに、全Ｃ３を測定する検査は、患者ケアの指示に有用であろう、Ｃ３活性化シグネチャーのリアルタイム変化をモニタリングすることができない。例えば、（減少したＣ３レベルによって特徴づけられる）外傷または全身性エリテマトーデスに罹患している患者は、改善されたＣ３活性化モニタリングの恩恵を受けるだろう。現在、全身性エリテマトーデスに有効な処置は、低下したＣ３レベルの正常レベルへの復帰によって測定される。しかし、医師は、基礎疾患プロセスが停止されたのか、または恒常性メカニズムに関して十分遅延されて、Ｃ３が生理的に正常なレベルに復帰しただけであるのかを見分けることが難しい。
【００１１】
現行のＣ３検査の第二の限界は、大多数のアッセイを行うために必要とされる時間である。補体活性化の検出のための典型的なＥＬＩＳＡアッセイは、実施に何時間も必要であり、検査技師および熟練した技師を容易に確保できることが求められる。したがって、バイオマーカーが大体数分で変化し、同様の時間尺度で臨床的介入が求められる炎症性機能不全の指摘には、このアッセイプラットフォームは有用でない。
【００１２】
現行のＣ３検査の第三の限界は、タンパク質カスケード自体の性質に存在する。補体は、細心の注意を要することで有名であり、標準的な分析手順（取り扱い、保管、および分析中にＣ３に接触する外来材料への曝露）によって活性化されることがある。補体は、侵入微生物の溶解、および損傷部位における創傷治癒反応の開始に非常に有効である。この有効性は、一部は、細菌細胞壁成分などの外来材料によって活性化されるＣ３の能力に起因する。この特性は、新たな外来病原体に対する免疫反応の指示に有用であるが、この同じ特性が、手に余る難題を実験および診断研究に提起する。試料取り扱いの際に使用されるプラスチックなどの材料、試料自体の操作、および不適切な保管条件も補体活性化を誘発することがある。所与のアッセイを行うために必要とされる処理および取り扱い工程が多いほど、そのアッセイ自体による補体の活性化に起因して偽陽性が多くなると予想できる。これらの偽陽性は、旧来の検査を複雑にし、現行検査方法を準リアルタイム（ｎｅａｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）で患者ケアの指示に用いるのに不適切なものにする。
【００１３】
補体活性化検査におけるさらなる考慮事項は、炎症反応のリアルタイム変化を検出するための最良のバイオマーカーの選択である。Ｃ３は、炎症に関するバイオマーカーとして幾つかの魅力的な資質を有する。第一に、補体系の中心的タンパク質としてのＣ３は、補体活性化を引き起こすこととなる大多数の刺激によって活性化される。第二に、Ｃ３は、損傷度または感染度に比例して活性化する。第三に、Ｃ３は、準リアルタイムで生理的傷害に反応する。反応に数時間または数日かかる他の急性期炎症マーカーとは対照的に、作用因子によって引き起こされるクリーゼに直接反応して補体活性化が起こる。この迅速に反応する特性は、診療所でよく使用される他のバイオマーカーには存在しない。
【００１４】
具体的には、インタクト（または天然）Ｃ３は、炎症状態の価値あるマーカーである。インタクトＣ３は、活性化に利用できるＣ３の量を表す。全Ｃ３は、インタクトＣ３、ならびにすべてのＣ３活性化産物も表す。現在、標準的な補体アッセイは、一般に、濁度アッセイまたはＥＬＩＳＡによって全Ｃ３を測定する。技術的に実施がより簡単であるが、全Ｃ３アッセイは、インタクトＣ３アッセイほど正確にＣ３枯渇を検出することができない。インタクトＣ３を特に経時的にモニタリングすることは、大量の補体活性化イベント、例えば、外傷および他の全身性補体活性化適応症の際に起こるものの追跡に有用である。インタクトＣ３を経時的にモニタリングすることにより、臨床医はＣ３の枯渇によって引き起こされる免疫抑制状態の開始を検出することができる。さらに、インタクトＣ３は、補体活性化指数（例えば、ＺｉｌｏｗおよびＨｅｃｋｅによって使用されたＣ３ａ：全Ｃ３比）を計算するときに、全Ｃ３より有用であり得る。インタクトＣ３アッセイは、一部には、インタクトＣ３が非常に不安定であり、正しく取り扱わないと変性または自己活性化し得るため、管理することもそれに依存することも難しいと歴史的に証明されている。
【００１５】
Ｃ３分割産物であるｉＣ３ｂも、炎症反応の価値あるマーカーである。ｉＣ３ｂは、３０から９０分の半減期を有し、（例えばＣ３ａと比較して）あまり不安定でないが、それでも迅速に反応するバイオマーカーとして役立つ。しかし、ｉＣ３ｂは、患者試料中にインタクトＣ３よりはるかに低レベルで存在する。インタクトＣ３タンパク質とｉＣ３ｂ特異的アッセイとの間のわずかな程度（例えば１％）のクロストークでさえ、正常な循環ｉＣ３ｂの二倍のレベルで偽陽性ｉＣ３ｂシグナルを生じさせる。それ故、望ましい炎症マーカーでありながら、これまでｉＣ３ｂは診断検査に大きな難題を提示していた。
【００１６】
２０１０年１１月２５日に発行されたＺｈａｎｇらの特許文献１は、バイオマーカーのインタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび全Ｃ３による補体活性化の評価方法に関する。しかし、Ｚｈａｎｇらのものは、検査室での処理および熟練した技師の専門技術を必要とする旧来のサンドイッチタイプのイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、に限定される。さらに、Ｚｈａｎｇらのアッセイおよび方法は、不安定なインタクトＣ３を活性化して偽陽性検査結果を生じさせ、その結果、インタクトＣ３を正確に測定する能力を妨げることとなることが公知である、試料調製、保管および取り扱い工程を必要とする。さらに、Ｚｈａｎｇらのアッセイおよび方法は、処理に数時間を必要とし、したがって、生理的クリーゼ後の最も早い時点で、患者ケアに影響し得る準リアルタイムデータをもたらすことができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３５７１７号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｈｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｕｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９７）２５（１２）：２０１５−２４
【非特許文献２】Ｚｉｌｏｗら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｃ３ａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｔ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９０）７９：１５１−５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
補体関連障害のリスクがある患者のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの測定のための迅速なポイント・オブ・ケア・アッセイであって、試料の取り扱いに起因する補体活性化を最小限にし、臨床医が準リアルタイムにおいて補体活性化レベルの変化に応じて行動することを可能にする、ポイント・オブ・ケア・アッセイが、患者処置を導くために、および炎症反応をモニタリングするために必要とされ続けている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、ここに、外傷性損傷または他の生理的クリーゼ直後の最も早い時点での患者ケアの指示に用いるのに好適なインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの定性的および定量的測定のためのポイント・オブ・ケア方法およびアッセイを開発した。干渉クロストークを避けられる捕捉抗体および検出抗体のペアを注意深く選択すること、およびこの技術を側方流動イムノアッセイプラットフォームに適用することにより、バイオマーカーのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂを検出および定量でき、その上、これらの分析物についてのより従来的な検査方法を悩ませてきた偽陽性結果を回避できることを、本発明者らは驚くべきことに発見した。
【００２１】
したがって、補体関連障害のリスクがある個体を処置するための方法であって、（ａ）前記個体から体液の試料を採取する工程；（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより前記試料の補体活性化レベルを測定する工程；（ｃ）前記試料の補体活性化レベルと対照の基準レベルとを比較することにより前記試料の補体活性化レベルと補体関連障害のリスクとを相関させる工程（この場合、前記対照の基準レベルと比較した前記試料の補体活性化レベルの偏差は、前記個体に補体関連障害のリスクがあることを示す）；（ｄ）工程（ｃ）の相関関係に基づき、前記個体の処置を選択する工程；および（ｅ）工程（ｄ）に従って選択した処置で前記個体を処置する工程を含む方法を提供する。
【００２２】
もう一つの実施形態では、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップと、前記マーカーの第一エピトープを結合する検出抗体と、前記マーカーの第二エピトープを結合する捕捉抗体を含む検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む対照ラインとを含み；前記マーカーが、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂからなる群より選択される、側方流動イムノアッセイを提供する。
【００２３】
さらにもう一つの実施形態は、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップ；インタクトＣ３の第一エピトープを結合する第一検出抗体と、インタクトＣ３の第二エピトープを結合する第一捕捉抗体を含む第一検査ラインと、ｉＣ３ｂの第一エピトープを結合する第二検出抗体と、ｉＣ３ｂの第二エピトープを結合する第二捕捉抗体を含む第二検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む少なくとも一つの対照ラインとを含む、側方流動イムノアッセイである。
【００２４】
もう一つの実施形態では、生理的状態について処置を受けており、補体関連障害に罹患している個体をモニタリングするための方法であって、（ａ）前記個体から体液の一連の試料を採取する工程；（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより前記各試料の補体活性化レベルを決定する工程；（ｃ）前記一連の試料の補体活性化レベルを比較して、補体活性化レベルの変化を経時的に検出する工程；および（ｄ）工程（ｃ）の相関関係に基づき、前記個体の処置を変更する工程を含む方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
補体関連障害のリスクがある個体を処置するための方法であって、
（ａ）該個体から体液の試料を採取する工程；
（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより該試料の補体活性化レベルを測定する工程；
（ｃ）該試料の該補体活性化レベルと対照の基準レベルとを比較することにより、該試料の該補体活性化レベルと補体関連障害のリスクとを相関させる工程であって、該対照の該基準レベルと比較した該試料の補体活性化レベルの偏差は、該個体に補体関連障害のリスクがあることを示す、工程；
（ｄ）工程（ｃ）の相関に基づき、該個体の処置を選択する工程；および
（ｅ）工程（ｄ）に従って選択した処置で該個体を処置する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記補体関連障害が、外傷、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染症、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記炎症性苦痛が、臓器不全、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症および肺炎からなる群より選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記側方流動イムノアッセイが、前記試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の存在または不在を検出する、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記側方流動イムノアッセイが、リーダーによって読み取られる、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記リーダーが、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の濃度を定量する、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ｃ３の濃度が、前記対照の前記基準レベルと比較して減少している、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ｉＣ３ｂの濃度が、前記対照の前記基準レベルと比較して上昇している、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記補体関連障害が、炎症性苦痛であり、前記インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の濃度が、炎症性苦痛の重症度と相関する、項目７に記載の方法。
（項目１１）
前記処置が、前記個体に対する追加の検査を行うこと、人工呼吸器を最適化すること、または抗生物質、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より選択される治療薬を投与することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記追加の検査が、前記個体から気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料を採取することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記補体インヒビターが、天然補体インヒビターおよびその誘導体、コンプスタチンおよびその類似体、抗膜侵襲複合体（ＭＡＣ）抗体、抗Ｃ３抗体、抗Ｃ５抗体、Ｃ３ａ受容体アンタゴニストおよびＣ５ａ受容体アンタゴニストからなる群より選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイが、約３０分以下で前記試料中のインタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の量の測定値をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１５）
補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、
メンブレンストリップ；
該マーカーの第一エピトープを結合する検出抗体；
該マーカーの第二エピトープを結合する捕捉抗体を含む検査ライン；および
対照分析物を結合する抗体を含む対照ライン
を含み、
該マーカーは、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび全Ｃ３からなる群より選択される、側方流動イムノアッセイ。
（項目１６）
前記検出抗体が、シグナルをもたらす標識を含む、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目１７）
前記マーカーがインタクトＣ３であり、前記第一エピトープがＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインが、インタクトＣ３上に存在し、かつＣ３の活性化に際して失われる、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目１８）
前記第二エピトープが、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目１９）
前記マーカーがｉＣ３ｂであり、前記第一エピトープがｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープが、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、かつｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２０）
前記第二エピトープが、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトープである、項目１９に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２１）
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２２）
前記対照分析物が、ＩｇＧである、項目１５に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２３）
項目１５に記載の側方流動イムノアッセイであって、前記体液試料中の補体が、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない、側方流動イムノアッセイ。
（項目２４）
補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、
メンブレンストリップ；
インタクトＣ３の第一エピトープを結合する第一検出抗体；
インタクトＣ３の第二エピトープを結合する第一捕捉抗体を含む第一検査ライン；
ｉＣ３ｂの第一エピトープを結合する第二検出抗体；
ｉＣ３ｂの第二エピトープを結合する第二捕捉抗体を含む第二検査ライン；および
対照分析物を結合する抗体を含む少なくとも一つの対照ライン
を含む、側方流動イムノアッセイ。
（項目２５）
前記第一検出抗体および前記第二検出抗体が、それぞれ、シグナルをもたらす標識を含む、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２６）
前記体液が、全血、血清、血漿、尿、涙液および脳脊髄液からなる群より選択される、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２７）
前記対照分析物が、ＩｇＧである、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目２８）
項目２４に記載の側方流動イムノアッセイであって、前記体液試料中の補体が、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない、側方流動イムノアッセイ。
（項目２９）
前記インタクトＣ３の第一エピトープがＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインが、インタクトＣ３上に存在し、かつＣ３の活性化に際して失われる、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目３０）
前記インタクトＣ３の第二エピトープが、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目３１）
前記ｉＣ３ｂの第一エピトープがｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープが、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、かつｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目３２）
前記ｉＣ３ｂの第二エピトープが、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上のみに存在するネオエピトープである、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目３３）
インタクトＣ３を結合する前記抗体とｉＣ３ｂを結合する前記抗体とが、実質的に交差反応しない、項目２４に記載の側方流動イムノアッセイ。
（項目３４）
生理的状態について処置を受けており、補体関連障害に罹患している個体をモニタリングするための方法であって、
（ａ）該個体から体液の一連の試料を採取する工程；
（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより該試料のそれぞれの補体活性化レベルを決定する工程；
（ｃ）該一連の試料の該補体活性化レベルを比較して、補体活性化レベルの変化を経時的に検出する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）の相関に基づき、該個体の処置を変更する工程
を含む、方法。
【００２５】
これらおよび他の目的、特徴、実施形態および利点は、後に続く詳細な説明および添付の特許請求の範囲を読むことで当業者には明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、補体系の概略概観図を提供するものである。補体は、３つの主要経路によって活性化され、これらの経路のすべてがインタクトＣ３の活性化に収束する。Ｃ３のタンパク質分解的活性化は、Ｃ３分割産物Ｃ３ａおよびＣ３ｂを生じさせる。Ｃ３ｂは、さらにタンパク質分解的に修飾されて、Ｃ３活性化についてのバイオマーカーであるｉＣ３ｂを形成する。インタクトＣ３およびｉＣ３ｂは、概略図において丸で囲まれている。
【図２】図２は、Ｃ３活性化および非活性化の略図を提供するものである。インタクトＣ３は、Ｃ３ａおよびＣ３ｂへとタンパク質分解的に活性化される。表面に共有結合で付いているＣ３分子もあり；水と反応し、循環内に留まるものもある。Ｃ３ｂは、プロテアーゼ因子１（Ｆａｃｔｏｒ  １）によって非活性化される。その第一の非活性化産物がｉＣ３ｂであり、これは、短鎖ペプチドであるＣ３ｆを除去する因子１の活性化によって形成される。ｉＣ３ｂは、Ｃ３ｃおよびＣ３ｄｇへとさらに分解され、そのＣ３ｄｇが最終的にＣ３ｄへと分解される。
【図３】図３は、抗体ペアによるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの特異的認識の略図である。（Ａ）インタクトＣ３は、二つの抗体によって認識される：第一抗体は、インタクトＣ３分子中にしか存在しないＣ３ａを認識する；第二抗体は、インタクトＣ３とｉＣ３ｂの両方に存在するＣ３ｄ中の領域を認識する。第二抗体は、Ｃ３およびその誘導体の他のタンパク質分子からの識別に関与するが、ｉＣ３ｂとインタクトＣ３の識別には関与しない。インタクトＣ３に対する抗体の代替ペアとしては、Ｃ３ａおよびＣ３ｆを認識する抗体が挙げられる。（Ｂ）ｉＣ３ｂタンパク質は、別の抗体ペアによって認識される。第一抗体は、前記タンパク質と、そのＣ３ｇ領域付近に位置すると考えられるネオエピトープで接触する。このエピトープは、因子１がＣ３ｆ断片を除去すると現れる。因子１がｉＣ３ｂをＣ３ｃおよびＣ３ｄｇへと分解すると、そのネオエピトープは妨げられる。第二抗体は、Ｃ３ｄエピトープを認識する。ｉＣ３ｂに対する代替ペアとしては、上述のｉＣ３ｂ抗体と、活性化されたＣ３ｄを認識する第二のもの（Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０）が挙げられる。
【図４】図４は、本発明の側方流動イムノアッセイの一つの実施形態の概略図である。
【図５】図５は、側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の略図である。（Ａ）は、単一分析物の検出のための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、並列メンブレンストリップで二つの別個の分析物（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。
【図６】図６は、単一分析物用側方流動イムノアッセイの三つの実施形態の描画である。（Ａ）は、全Ｃ３側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。（Ｂ）は、インタクトＣ３側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。（Ｃ）は、ｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイのための検査カセットを示す。
【図７】図７は、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂの評価のための、二分析物用側方流動イムノアッセイ検査カセットの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、試料ローディング用の二つの独立したポートと並の二つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを含む検査カセットを示す。（Ｂ）は、試料ローディング用の単一のポートと並列の二つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを備えている検査カセットを示す。
【図８】図８は、全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂの評価のための、三分析物用側方流動イムノアッセイ検査カセットの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、試料ローディング用の三つの独立したポートと並列の三つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを含む検査カセットを示す。（Ｂ）は、試料ローディング用の単一のポートと並列の三つのメンブレンストリップ（各分析物につき一つ）とを備えている検査カセットを示す。
【図９】図９は、側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の略図である。（Ａ）は、単一分析物の検出のための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に二つの別個の分析物（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。
【図１０】図１０は、直列での複数の分析物のための側方流動イムノアッセイの二つの実施形態の描画である。（Ａ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に二つの分析物および一つの対照を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。（Ｂ）は、同じメンブレンストリップ上で直列に三つの分析物および一つの対照を検出するための側方流動イムノアッセイを示す。前記分析物は、（Ａ）と（Ｂ）両方について、全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂから選択される。
【図１１】図１１は、本側方流動イムノアッセイの三つの実施形態についての感度、ダイナミックレンジ、検査間のばらつき、およびアッセイ時間の比較を示す図である。（Ａ）は、カセットケースなしでｉＣ３ｂを検出する検査ストリップについての側方流動の標準曲線グラフを示す。（Ｂ）は、検査試料容積のより制御された管理を可能にするカセットに検査ストリップを入れている、側方流動イムノアッセイの一つの実施形態の標準曲線グラフを示す。金コンジュゲーションに使用する抗体溶液の濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡを反応混合物に含める。（Ｃ）は、金コンジュゲーションに使用される抗体溶液の濃度が１ｍｇ／ｍＬであり、ＢＳＡを反応混合物から除去している、カセットに組み込まれた検査ストリップのもう一つの実施形態の標準曲線グラフを示す。このアッセイの感度は１０ｎｇ／ｍＬに達し、ダイナミックレンジは１０ｕｇ／ｍＬに及ぶ。
【図１２】図１２は、本明細書に記載するｉＣ３ｂ用の側方流動イムノアッセイの感度を示す図である。感度は、１０ｎｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬの範囲である。標準誤差は、２０分の時点で３％未満である。Ｒ二乗＝０．９８９２。値をＥＬＩＳＡによって検証した。
【図１３】図１３は、本明細書に記載するインタクトＣ３についての側方流動イムノアッセイの感度を示す図である。感度は、２０ｎｇ／ｍＬから１０ｕｇ／ｍＬの範囲である。標準誤差は、２０分の時点で３％未満である。Ｒ二乗＝０．９９６４。値をＥＬＩＳＡによって検証した。エラーバーを示すが、プロットした点よりそれらのほうが小さい。
【図１４】図１４は、側方流動イムノアッセイにおけるインタクトＣ３とｉＣ３ｂ抗体間のクロストークを示す図である。
【図１５】図１５は、本明細書に記載する側方流動イムノアッセイによってアッセイしたときの、一人の個体からの基礎涙液中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを１２時間間隔で示す図である。
【図１６】図１６は、正常健常個体からの全血中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す図である。結果は、健常ドナーからの全血中のｉＣ３ｂより、おおよそ２５００倍多いインタクトＣ３を示す。
【図１７】図１７は、健常個体からの全血中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す図である。結果は、健常ドナーからの全血中のｉＣ３ｂより、おおよそ３３３倍多いインタクトＣ３を示す。
【図１８】図１８は、重い運動（１００マイル自転車走行）の２時間後の正常個体のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを示す図である。結果は、運動後の健常個体からの全血中のｉＣ３ｂより、１０００倍多いインタクトＣ３を示す。
【図１９】図１９は、本明細書に開示するアッセイおよび方法での使用に好適な例示的体液の表である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
ここに開示する主題の一つ以上の実施形態の詳細を本明細書に示す。本明細書に提供する情報の研究後、本明細書に記載する実施形態に対する変形および他の実施形態が、当業者には明白となるだろう。
【００２８】
以下の用語は当業者によく理解されていると考えられるが、ここに開示する主題の説明を助長するために定義を示す。
【００２９】
別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての専門および科学用語は、ここに開示する主題が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。
【００３０】
別の指摘がない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いる成分の量および特性、例えば反応条件、などを表現するすべての数は、すべての場合、用語「約」によって修飾されていると解するべきである。したがって、相反する指摘がない限り、本明細書および特許請求の範囲に示す数値パラメータは、ここに開示する主題によって得ようと努める所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
【００３１】
本明細書において用いる場合、用語「約」は、質量、重量、時間、容積、濃度または百分率の値または量を指すとき、明記されている量から、一部の実施形態では±２０％、一部の実施形態では±１０％、一部の実施形態では±５％、一部の実施形態では±１％、一部の実施形態では±０．５％、および一部の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意図したものである。かかる変動は、開示する方法の実施に適切であるからである。
【００３２】
「分析物」は、評価されることとなる、例えばその量（例えば、濃度もしくは質量）、活性、組成または他の特性（単数もしくは複数）が検出、測定、定量、評価、分析などされることとなる、任意の実体、特に、化学的、生化学的または生物学的実体を意味する。「分析物」は、単一分子種である場合もあり、または多数の異なる分子種からなる場合もある。
【００３３】
「抗体」は、タイプＩｇＡ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＹのインタクトおよび／または完全長免疫グロブリン、完全免疫グロブリンの抗原結合断片または一本鎖（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、ｓｃＦｖ（一本鎖可変）およびｄＡｂ断片）、ならびに少なくとも一つの抗原結合免疫グロブリン可変領域を含む他のタンパク質、例えば、免疫グロブリン可変領域、例えば重（Ｈ）鎖可変領域（ＶＨ）および軽（Ｌ）鎖可変領域（ＶＬ）を含むタンパク質を包含する。抗体の軽鎖は、カッパタイプのものであることもあり、またはラムダタイプのものであることもある。抗体は、ポリクローナル抗体であることもあり、またはモノクローナル抗体であることもある。ポリクローナル抗体は、免疫グロブリン分子（複数）を含有し、該免疫グロブリン分子は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列が異なり、したがって典型的には抗原の異なるエピトープを認識する。多くの場合、ポリクローナル抗体は、異なる特異性を有する抗体をそれぞれが生産する多数の異なるＢ細胞系統に由来する。ポリクローナル抗体は、それぞれが個々のＢ細胞系統に由来する幾つかの抗体亜集団で主として構成されることもある。モノクローナル抗体は、個々の免疫グロブリン分子で構成され、該個々の免疫グロブリン分子は、同じ配列のＣＤＲを含み、したがって同じエピトープを認識する（すなわち、この抗体は、単一特異性である）。多くの場合、モノクローナル抗体は、単一Ｂ細胞系統またはハイブリドーマに由来する。抗体は、例えば、齧歯動物起源の可変ドメインがヒト起源の定常領域に融合されている「ヒト化」抗体、または相補性決定領域アミノ酸の一部もしくはすべてが、多くの場合一つ以上のフレームワークアミノ酸と一緒に、齧歯動物（例えばマウス）抗体からヒト抗体に「移植され」、それ故、齧歯動物抗体の特異性を保持する「ヒト化」抗体であることがある。
【００３４】
もう一つの実施形態において、捕捉剤および／または検出剤は、他のリガンド、例えば、活性化Ｃ３の天然受容体（例えば、補体受容体１、２および３）、アプタマー、ペプチド、他の小分子リガンドならびにこれらに類するものを含む。
【００３５】
本発明の一定の実施形態の態様は、捕捉剤および検出剤として使用するための抗体の選択である。本発明者らは、多くの発表され、市販されている抗体が、インタクトＣ３と様々なＣ３切断産物との間の、または異なるＣ３切断産物間のクロストークを示すことを発見した。例えば、ヒトＣ３ａに対する一定のモノクローナル抗体は、Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂとの有意な予想外の交差反応性を示す。一定の状況では交差反応性が不正確さの大きな原因となり得ることが分かった。検査したｉＣ３ｂ抗体の多くで観察されたインタクトＣ３とｉＣ３ｂとの間のクロストークは、ｉＣ３ｂ用のアッセイを開発する上で特に重要な事柄であった。さらなる検査により、これらの抗体の少なくとも一部に関してＣ３ｂとｉＣ３ｂとの間のクロストークがよりいっそう重要であることが明らかになった。これはｉＣ３ｂレベルが、患者試料においてインタクトＣ３よりはるかに低いレベルで存在すると予想されるため、重要であった。本発明の一定の実施形態の一つの態様は、かかるクロストークを最小限にするために、インタクトＣ３またはｉＣ３ｂに対して特異性を有する抗体を選択することである。一定の実施形態では、インタクトＣ３またはｉＣ３ｂに対して特異性を有する抗体は、実質的に交差反応性でない。この文脈で、「実質的に交差反応性でない」は、約０．１％未満の交差反応性を意味し、これは、１ｕｇ／ｍＬのＣ３溶液が約１ｎｇ／ｍＬ未満のｉＣ３ｂとして示されなければならないことを意味する。約０．１％閾値は、正常個体におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂの生理的レベルに基づく。正常ｉＣ３ｂレベルは、循環内の全Ｃ３のレベルのおおよそ０．５％である。補体活性アッセイにおいてＣ３クロストークがｉＣ３ｂシグナルに約２５％より大きく寄与すると、そのアッセイは、そのアッセイの有用性を無効にする偽陽性結果を生じさせることがある。
【００３６】
「体液」は、補体活性化についてアッセイすることができる体内の任意の流体を意味する。体液としては、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。
【００３７】
「補体活性化レベル」は、所与の時点で活性化されている補体（一般にＣ３）の量を意味する。インタクトＣ３、ｉＣ３ｂおよび／または全Ｃ３の量（すなわちレベル）を典型的には濃度によって表現するが、質量または重量によって表現することもある。濃度は、様々な様式で、例えば、モル濃度、重量モル濃度、モル分率、質量分率（全混合物の質量の分率としての混合物中の物質の質量）、単位容積あたりの質量などによって、表現することができる。本明細書での説明のために、濃度（例えば、単位容積あたりの質量）を一般に用いることとする。補体活性化レベルをｉＣ３ｂのインタクトまたは全Ｃ３に対する比として、またはＣ３ａの全Ｃ３に対する比として記載することもある。
【００３８】
「補体関連障害」は、本明細書において用いる場合、補体活性化の修飾を特徴とする障害または状態を指す。補体関連障害の例としては、外傷、例えば、外傷性脳損傷、脊髄損傷、外科手術、および頭蓋内圧；炎症性苦痛、例えば、重症アレルギー、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）；多臓器不全（ＭＯＦ）、急性または成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症ショック、およびショック；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）；腎疾患、例えば、糸球体腎炎、感染症、ループス腎炎、および臓器移植を必要とする腎疾患；自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス；虚血／再灌流障害；心疾患、例えば、心筋梗塞および心停止；妊娠（子癇前症および胎児低酸素症候群を含む）；眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性、ドライアイ症候群、および眼感染症；臓器移植（移植拒絶反応、切迫拒絶反応（ｉｍｍｉｎｅｎｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の検出、感染症の検出、および免疫抑制薬レジメンの調整のモニタリングを含む）；感染症（敗血症、肺炎、膀胱感染症、尿路感染症、および腎感染症を含む）；ならびに神経障害（多発性硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、統合失調症、および外傷後ストレス障害を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「対照」は、公知の基準補体活性化レベルを有する試料を指す。一部の実施形態において、対照は、補体関連障害を経験していない個体のものに匹敵する補体活性化レベルを有するので、対照と比較して偏差を有する補体活性化レベルを有する検査試料は補体関連障害を示す。一定の実施形態において、補体関連障害は、検査試料補体活性化レベルが対照と比較して統計学的に有意に偏差を有するときに示される。
【００４０】
「Ｃ３活性化シグネチャー」は、本明細書において用いる場合、Ｃ３活性化レベルの経時的変化を意味する。
【００４１】
「偏差を有する」および「偏差」は、本明細書において用いる場合、対照の基準レベルと比較して統計学的に有意な偏差を指す。アッセイされる分析物に依存して、偏差を有する検査試料レベルは、対照レベルを基準にして上昇することもあり、または減少することもある。
【００４２】
対照の基準レベルと比較して「減少する」は、統計学的に有意に減少することを意味する。急性炎症反応の場合、インタクトＣ３レベルは、Ｃ３がその活性化産物へと分解されるにつれて枯渇する。一定の実施形態において、インタクトＣ３レベルは、対照の基準レベルと比較して約１０％減少すると考えられる。
【００４３】
対照の基準レベルと比較して「上昇する」は、統計学的に有意に上昇することを意味する。急性炎症反応の場合、ｉＣ３ｂレベルは、Ｃ３がその活性化産物へと分解されるにつれて増加する。一定の実施形態において、０．００５の標準比と比較して上昇している、ｉＣ３ｂのインタクトＣ３に対する比は、Ｃ３活性化を示す。
【００４４】
「エピトープ」は、かかるエピトープに結合する抗体によって認識され、したがって、かかるエピトープに結合する抗体の免疫特異性を決める、分子の最小部分を指す。非抗体特異的結合剤によって認識される分子の最小部分を指すためにもこの用語を本明細書では用いる。別の指摘がない限り、補体タンパク質に結合する特異的結合剤は、天然タンパク質中に存在して結合に利用できるエピトープ（すなわち、該エピトープはネオエピトープではない）に結合することが本明細書において推測される。
【００４５】
「炎症性苦痛」または「炎症性機能不全」は、炎症反応がその炎症反応を誘導する刺激を解消または除去できないときに起こる。かかる急性症例では、そのプロセスに対する恒常性制御が減退するまで炎症反応は増加する。１つの実施形態において、本明細書に開示するアッセイおよび方法によって決定される補体活性化レベルは、個体が経験している炎症性苦痛の重症度と直接相関する。例えば、ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の約１〜２．５％であるとき、その患者の炎症性苦痛を少し重症であると言うことができる。ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の約２．５〜５％であるとき、その患者の炎症性苦痛を中等度に重症であると言うことができる。ｉＣ３ｂ濃度がインタクトＣ３の５％より上であるとき、その患者の炎症性苦痛を高度に重症であると言う。患者の炎症性苦痛の重症度の理解は、その個体に対する医師の処置法についての情報を与えることができる。例えば、個体が、本明細書に開示するアッセイおよび方法によって示されるような、高度に重症の炎症性苦痛レベルを呈する場合、医師は、炎症性苦痛の最も早い時点の中で救急医療処置を施して、炎症反応からの障害を最小限にすることができる。
【００４６】
「標識」は、それが付いている分子の直接的もしくは間接的検出および／または定量的もしくは相対的測定を助長する部分を指す。検出可能標識は、例えば、蛍光、化学発光、放射能、色、磁場、磁気共鳴などを検出する計器の使用により、または場合によっては目視検査により、検出可能となるシグナル、例えば蛍光、化学発光、放射能、色、磁性または常磁性性質などを、多くの場合、生じさせる。標識は、例えば、蛍光物質；色素；化学発光もしくは発光物質；着色物質；磁性体；または非磁性金属粒子、例えば金コロイドであり得る。具体的な実施形態では、本方法およびアッセイでの使用に好適な検出抗体を、色シグナルを生じさせるコロイド金標識にコンジュゲートさせる。
【００４７】
「ネオエピトープ」は、補体成分または切断産物のタンパク質分解性切断の結果として生成されるかまたは検出可能になるエピトープを指す。
【００４８】
本明細書に開示するアッセイおよび方法の一定の実施形態において、検査する体液試料中に存在する補体は、そのアッセイまたは方法自体によって実質的に活性化されない。この文脈で用いる場合の「実質的に活性化されない」は、側方流動イムノアッセイ結果に、検査方法および／または材料に起因するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化が実質的に含まれないことを意味する。このように、側方流動イムノアッセイは、迅速であり、試料操作が少なくてすみ、それ故、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ補体活性化の一因となる刺激の多くを避けられるので、補体活性化についての偽陽性検査結果を避けられる。
【００４９】
「ポイント・オブ・ケア」は、本明細書において用いる場合、ベッドサイドでまたは患者の損傷現場で使用または行うことができるデバイスまたは方法を指す。ポイント・オブ・ケア検査は、一般に、処理のために検査室に試料を輸送する必要がなく、また熟練した検査技師の専門技術を必要としない。本明細書に記載するポイント・オブ・ケア方法および検査は、臨床医が患者のベッドサイドで、または外傷損傷現場またはトリアージ現場で臨床情報を受け取ることを可能にし、それにより、補体活性化を誘発する生理的クリーゼ後の極めて重要な最初の短時間のうちに患者ケアを指示することができる。
【００５０】
「リーダー」は、標識によって生成されたシグナルの検出に好適な計器を指す。診断検査での標識シグナル検出用の様々な計器が当該技術分野において公知である。本発明の具体的な実施形態では、標識はコロイド金であり、リーダーは、標識によって生成される色シグナルの定性的および／または定量的検出に好適な計器である。好適なリーダーは、ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ（メリーランド州イジャムスヴィル）、Ｑｉａｇｅｎ（ドイツ国ヒルデン）からのＥＳＥ−Ｑｕａｎｔ、Ｅａｓｔｅｒｌｉｎｅ  ＬＲＥ（ドイツ国ネルトリンゲン）およびＤｅｔｅｋｔ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（テキサス州オースティン）をはじめとする様々な供給業者から市販されている。具体的な実施形態では、リーダーは、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の量または濃度を定量する手持ち式リーダーである。
【００５１】
「処置」は、本明細書において用いる場合、個体に施される任意の診断的、治療的、予防的または矯正処置を包含する。一部の実施形態において、処置は、個体に対する追加の診断検査の実施を包含する。他の実施形態において、処置は、治療的処置、例えば、個体への治療薬の投与を包含する。一定の実施形態において、前記治療薬は、抗生物質、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より選択される。他の実施形態において、処置は、個体が既に受けたかまたは現在受けている処置の変更を包含する。例えば、一つの実施形態において、人工呼吸器を用いる個体の処置は、その人工呼吸器の最適化を包含する。
【００５２】
補体系は、３０より多くの血清および細胞タンパク質を含み、先天免疫および適応免疫に重要な役割を果たす。三つの主要補体活性化経路がある。古典的経路は、主として、免疫複合体、特に、抗原に結合したＩｇＧ／ＩｇＭ抗体によって活性化される。他の活性化因子としては、リポ多糖類、ミエリン、ポリアニオン性化合物、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）ならびに微生物ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。レクチン経路は、遊離マンノース基を有する多糖類、ならびに真菌および細菌に共通である他の糖によって活性化される。副経路は、微生物細胞壁成分を多くの場合含む「外来」物質による直接Ｃ３活性化によって媒介される。補体活性化の三つの主要経路すべてが、中心的タンパク質補体成分３（Ｃ３）に収束する。Ｃ３は、中心的な炎症媒介因子であり、炎症を引き起こす大多数の要因によって活性化される。補体系の概略外観図について図１および２を参照のこと。
【００５３】
古典的経路は、ＩｇＭまたはＩｇＧアイソタイプに一般に属する抗体と結合している抗原の複合体である免疫複合体によって概して誘発される。次に、免疫複合体は補体成分Ｃ１に結合し、該Ｃ１は、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓから構成される。Ｃ１ｑの抗体−抗原複合体への結合は、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓの活性化を誘発する。活性化されたＣ１ｓが次に成分Ｃ４を切断して、Ｃ４ａおよびＣ４ｂを生じさせる。Ｃ４ｂは、細胞表面に共有結合で付くことができるが、そうできるのは約５パーセントに過ぎない。残りの９５％は、水と反応して可溶性の活性化Ｃ４ｂを形成する。すると成分２は、Ｃ４ｂと結合することができ、その後、Ｃ１ｓによってＣ２ａおよびＣ２ｂへと活性化される。Ｃ４ｂおよびＣ２ｂは組み合わされて、古典的経路（ＣＰ）Ｃ３コンバターゼであるＣ４ｂＣ２ａを形成する。
【００５４】
このＣＰコンバターゼは、Ｃ３を切断してＣ３ａおよびＣ３ｂを形成する。活性化Ｃ４ｂと同様に、Ｃ３ｂは、細胞表面に共有結合することができるか、またはＨ２Ｏと反応し、溶液中にとどまることができる。活性化Ｃ３ｂは、多数の役割を有する。単独で、Ｃ３ｂは、オプソニンとしての役割を果たして、より容易に食細胞に修飾細胞（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）または粒子を取り込ませることができる。加えて、Ｃ３ｂは、Ｃ４ｂＣ２ａ（ＣＰ  Ｃ３コンバターゼ）と結合してＣ５コンバターゼを形成することができる。Ｃ４ｂＣ２ａＣ３ｂと称するこの複合体をＣＰ  Ｃ５コンバターゼと言う。あるいは、Ｃ３ｂは、副経路（ＡＰ）Ｃ３コンバターゼと呼ばれる別のＣ３コンバターゼのコアを形成することができる。
【００５５】
副経路（ＡＰ）は、Ｃ３が活性化され得るもう一つのメカニズムである。典型的に、Ｃ３は、標的、例えば微生物表面ならびに様々な複雑な多糖類および他の材料によって活性化される。この副経路は、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）を形成する水分子によるＣ３中のチオエステル結合の切断により、自発的に開始されることもある。Ｃ３（Ｈ２Ｏ）はＢ因子に結合し、それによりＤ因子はＢ因子を切断してＢａおよびＢｂにすることができる。Ｂｂは、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）と結合したままＣ３（Ｈ２Ｏ）Ｂｂ複合体を形成し、この複合体がＣ３コンバターゼとして作用し、Ｃ３を切断し、結果としてＣ３ａおよびＣ３ｂが得られる。
【００５６】
このプロセスよって、または古典的もしくはレクチン経路によって形成されたＣ３ｂは、標的に（例えば細胞表面に）結合し、Ｂ因子と複合体を形成し、その後、このＢ因子がＤ因子によって切断され、Ｂｂになり、結果としてＣ３ｂＢｂが得られ、このＣ３ｂＢｂを副経路（ＡＰ）Ｃ３コンバターゼと言う。Ｃ３ｂの別の分子のＡＰ  Ｃ３コンバターゼへの結合はＣ３ｂＢｂＣ３ｂを生成し、このＣ３ｂＢｂＣ３ｂがＡＰ  Ｃ５コンバターゼである。
【００５７】
レクチン補体経路は、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）およびＭＢＬ結合セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）の炭水化物への結合によって開始される。ＭＢ１−１遺伝子（ヒトではＬＭＡＮ−１として公知）は、小胞体とゴルジ体との間の中間領域に局在する１型内在性膜タンパク質をコードする。ＭＢＬ−２遺伝子は、血清中で見られる可溶性マンノース結合タンパク質をコードする。ヒトレクチン経路では、ＭＡＳｐ−１およびＭＡＳＰ−２が、Ｃ３コンバターゼをもたらすＣ４およびＣ２のタンパク質分解に関与し、それが、ＣＰについて上で説明したように、Ｃ５コンバターゼの生産につながる。
【００５８】
上記三経路のいずれかによって生成されたＣ５コンバターゼは、Ｃ５を切断してＣ５ａおよびＣ５ｂを生じさせる。その後、Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７およびＣ８に結合し、これが、Ｃ９の重合を触媒し、Ｃ５ｂ−９膜侵襲複合体（ＭＡＣ）を形成する。アッセンブルしているＭＡＣは自身を標的細胞膜内に挿入し、その結果、Ｃ９分子の環によって輪郭が示される孔が形成される。ＭＡＣ形成は、侵入微生物の細胞溶解を引き起こし、宿主細胞上でのＭＡＣ形成も溶解を引き起こすことがあるが、必ずしも溶解を引き起こすとは限らない。細胞膜上の溶解量以下（ｓｕｂｌｙｔｉｃ  ａｍｏｕｎｔ）のＭＡＣは、様々な形で細胞機能に影響を及ぼし得る。小さな切断産物Ｃ３ａ、Ｃ４ａおよびＣ５ａは、アナフィラトキシンであり、急性炎症反応の多数の反応を媒介する。Ｃ３ａおよびＣ５ａは、好中球およびマクロファージなどの免疫系細胞をクリーゼ領域に誘引する強力な走化性因子でもある。
【００５９】
補体成分Ｃ３は、何らかの形態の生理的クリーゼ、例えば損傷、感染症または他の疾患プロセスに身体が反応していることの一般警告バイオマーカーとして有用である。補体は、狼瘡、関節炎、頭蓋内出血、糖尿病、多発性硬化症、心疾患および加齢性黄斑変性をはじめとする多種多様な疾患と関連づけられている。多くの場合、疾患の重症度は、補体活性化レベルと相関する。場合によっては、補体は、疾患病態に一定の役割を果たすことがある。これらの場合、身体は、炎症の原因を首尾よく制御することができず、炎症が局所性から全身性へと進む。補体活性化は、組織を直接傷つけることもあり、または細胞を過活性化し（ｏｖｅｒ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）、免疫細胞をリクルートし、その結果として組織破壊を生じさせることにより、間接的に組織を傷つけることもある。過活性化の例としては、アナフィラキシーショック、多臓器不全（ＭＯＦ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）が挙げられる。
【００６０】
外傷直後の期間および外傷後早期の補体活性化は十分に立証されており、幾つかの異なるメカニズムによって起こり、これらのメカニズムは三つの主要経路すべてを含む可能性が高い。タンパク質分解酵素の放出および活性化は、補体成分を直接活性化し得る。組織損傷および内皮内層の破壊は、宿主組織を通常保護する内因性補体阻害分子を欠く表面を露出させる。これらの表面は、Ｃ３ｂの沈着および副経路活性化を受けやすい。補体活性化は、外傷後虚血の後の組織の再灌流によっても誘発される。
【００６１】
補体活性化は、Ｉ／Ｒ損傷、ＡＲＤＳ、ＭＯＤＳ、二次的ＣＮＳ損傷および敗血症に有意に寄与する重症外傷の合併症の多くにおける重要な要因であることを、多数の系統の証拠が示唆している。第一に、補体活性化がヒト外傷被害者の外傷直後の期間によくあることであることは明白であり、また幾つかの研究により、補体活性化の程度と転帰不良とに正の相関関係があることを示唆する証拠が提供されている。第二に、補体活性化はヒト外傷被害者ばかりでなく外傷の動物モデルにおいてもＩ／Ｒ損傷の主因であるという証拠が、かなりの数ある。第三に、補体欠損または補体インヒビターの投与は、組織損傷を低減させ、出血、Ｉ／Ｒ損傷およびＣＮＳ損傷をはじめとする様々な実験モデルにおいて転帰を向上させることが、非常に多数の研究により証明されている。
【００６２】
幾つかの研究により、重症外傷後の逐次的な時点で外傷患者の補体活性化が測定され、補体活性化と損傷重症度との相関関係の存在が調査された。有害事象、例えばＡＲＤＳ、多臓器不全、敗血症および死亡も、補体活性化に関してモニタリングされた。一つの研究では、ＡＲＤＳのリスクがある外傷患者において１４日にわたって補体パラメータが決定された。すべての患者が最初の２４時間の間にＣ３、Ｃ４、Ｃ５のならびにインヒビターＣ１−ＩＮＨ、補体因子Ｈ（ＣＦＨ）および補体因子Ｉ（ＣＦＩ）の血清レベルの減少を見せ、これは、高レベルの補体活性化による消費を示していた。Ｃａｔａｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｕｍａ  ａｎｄ  ｓｈｏｃｋ、Ａｎｎ．Ａｃａｄ．Ｍｅｄ．Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  ２８：１２０−３２（１９９９）；Ｈｅｃｋｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｒａｕｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ−−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ，ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２５（１２）：  ２０１５−２４（１９９７）；Ｈｕｂｅｒ−Ｌａｎｇら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３２２３−３１（２００２）；Ｋａｎｇら、Ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎｊｕｒｙ、Ｊ．Ｂｕｒｎ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｈａｂｉｌ．２４：１４８−５３（２００３）；およびＹｏｕｎｇｅｒら、Ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０：４４１−４６（２００１）参照。
【００６３】
ここに開示するアッセイおよび方法は、当該技術分野において公知の以前の補体アッセイおよび方法に勝る幾つかの利点を提供する：第一に、本アッセイおよび方法は、ポイント・オブ・ケア使用に好適であり、数時間ではなく数分で結果を生じさせる。結果の迅速な返答により、臨床医は、準リアルタイムにおけるＣ３活性化の変化に基づいて行動して、外傷性損傷後の極めて重要な最初の短時間のうちに、または生理的クリーゼの開始に際して患者ケアを指示することができる。前記アッセイおよび方法は、使用が比較的簡単であり、外部検査室または熟練した検査技師を確保できることを求めない。第二に、本アッセイおよび方法は、取り扱い工程が少なくてすみ、それ故、偽陽性検査結果をもたらす取り扱いおよび処理に起因するインタクトＣ３活性化を最小限にする。第三に、本明細書に記載するアッセイおよび方法は、補体タンパク質インタクトＣ３および／またはｉＣ３ｂ（Ｃ３の主要な活性化バイオマーカー）の測定を可能にするように注意深く選択された抗体ペアを用いる。旧来の全Ｃ３アッセイと比較して、このより正確な補体活性化測定は、Ｃ３のターンオーバー、および残存し活性化に利用できるＣ３の正確な量の分析を可能にする。
【００６４】
一つの実施形態において、補体関連障害のリスクがある個体を処置するための方法であって、（ａ）前記個体から体液の試料を採取する工程；（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより前記試料の補体活性化レベルを測定する工程；（ｃ）前記試料の補体活性化レベルと対照の基準レベルとを比較することにより前記試料の補体活性化レベルと補体関連障害のリスクとを相関させる工程（この場合、前記対照の基準レベルと比較した前記試料の補体活性化レベルの偏差は、前記個体に補体関連障害のリスクがあることを示す）；（ｄ）工程（ｃ）の相関に基づき、前記個体の処置を選択する工程；および（ｅ）工程（ｄ）に従って選択した処置で前記個体を処置する工程を含む、方法を提供する。
【００６５】
前記方法のもう一つの実施形態において、前記補体関連障害は、外傷、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、感染症、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ）（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害からなる群より選択される。具体的な実施形態では、前記補体関連障害は炎症性苦痛である。炎症性苦痛は、炎症性機能不全としても公知であり、過度の炎症に関連した様々な疾患および状態を含む。炎症性苦痛に関連した疾患および状態の例としては、臓器不全、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症および肺炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
前記方法の一つの実施形態において、前記個体から採取される体液は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される。好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。具体的な実施形態では、前記体液は、補体活性化を誘発する生理的イベントの一時間以内に個体から採取される。もう一つの具体的な実施形態では、前記体液は全血である。
【００６７】
前記方法の一つの実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、前記試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の存在または不在を検出する。前記方法のもう一つの実施形態において、前記側方流動アッセイは、全Ｃ３の存在を検出する。もう一つの実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、リーダーによって読み取られる。より具体的な実施形態において、前記リーダーは、前記試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の濃度を定量する。もう一つの具体的な実施形態では、前記リーダーは、前記試料中の全Ｃ３の濃度を定量する。
【００６８】
対照の基準値からの偏差（個体の補体が活性化されていることを示す）に関して、補体活性化レベルを評価する。一定の実施形態において、検査試料中のｉＣ３ｂのレベルまたは濃度は対照と比較して上昇しており、これは、Ｃ３が活性化され、その活性化産物ｉＣ３ｂへとさらに分割されたことを示す。他の実施形態において、インタクトＣ３のレベルまたは濃度は対照と比較して減少しており、これは、インタクトＣ３がその分解または活性化産物に転換されたこと、それ故、その個体において枯渇していることを示す。
【００６９】
個体活性化レベルは、炎症性苦痛の重症度と相関する：補体活性化レベルが高いほど、炎症性苦痛発症のリスクが高く、および／または個体が経験する炎症性苦痛の重症度が高い。したがって、前記方法のもう一つの実施形態において、補体関連障害は炎症性苦痛であり、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の濃度が炎症性苦痛の重症度と相関する。
【００７０】
本方法によって決定される補体活性化レベルは、患者ケアを指示することができるポイント・オブ・ケア診断情報を提供する。工程（ｃ）において相関した補体関連障害のリスクに基づき、臨床医は、個体のための適切な処置を選択することができる。一つの実施形態において、前記処置は、炎症性苦痛の原因を決定するための追加の検査を個体に対して行うことを含む。例えば、呼吸のために人工呼吸器補助を必要とする重症外傷患者は、人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）または非感染性炎症性機能不全のいずれかに起因する急性呼吸困難のリスクがある。補体活性化のレベルは、呼吸クリーゼの臨床的徴候が呈示される前に活動性または切迫性炎症性機能不全を指摘することができる。本アッセイおよび方法は、個体がＶＡＰを経験しているのか、または非感染性呼吸苦痛を経験しているのかを指摘することができる。あるいは、本アッセイおよび方法は、現在の標準的実施より早い時点で追加の検査（例えば、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏａｌｖｅｏｌａｒ）洗浄（ＢＡＬ））を指摘することができる。個体がＶＡＰに罹患している場合、その処置は、治療薬、例えば抗生物質または抗生物質のセットの投与を含み得る。炎症性機能不全が、非感染性手段に起因する場合、人工呼吸器調整、抗炎症薬および補体インヒビターからなる群より治療法を選択することができる。
【００７１】
個体が外傷性脳損傷または頭蓋内出血に罹患している場合、前記追加の検査は、追加の分析のための脳脊髄液試料の採取を含み得る。個体が、非治癒性創傷を含めて、創傷に罹患している場合、前記さらなる検査は、追加の分析のための創傷滲出液の試料の採取を含み得る。
【００７２】
多くの補体インヒビターが当該技術分野において公知であり、本方法での使用に好適である。一つの実施形態において、補体インヒビターは、天然補体インヒビターおよびその誘導体、コンプスタチンおよびその類似体、抗膜侵襲複合体（ＭＡＣ）抗体、抗Ｃ３抗体、抗Ｃ５抗体、Ｃ３ａ受容体アンタゴニストおよびＣ５ａ受容体アンタゴニストからなる群より選択される。追加の補体インヒビターの例は、例えば、Ｅｍｌｅｎら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３６（６）：６６０−６８（２１０１）；Ｗａｇｎｅｒら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．９（１）：４３−５６（２１０１０）；およびＲｉｃｋｌｉｎら、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５（１１）：１２６５−７５（２００７）において見つけることができ、前記参考文献の内容はそれら全体が参照により本明細書に援用されている。
【００７３】
本方法の恩恵の一つは結果の迅速な返答であり、それにより、臨床医は準リアルタイムで補体活性化の変化に応じて患者ケアを指示することができる。当該技術分野において公知の以前の補体活性化アッセイは、十分な検査室、熟練した技師、そして完了に何時間も必要とするが、本方法およびアッセイは、それよりはるかに短い時間枠内で結果を提供する。一つの実施形態において、本方法は、前記試料中の補体活性化レベルの測定値を約３０分以下で提供する。より具体的な実施形態では、前記方法は、試料中の補体活性化レベルを約３０、約２５、約２０、約１５、約１０、約５または約３分以下で提供する。本方法の迅速性により、臨床医は、臨床的に重要な時間中に、補体活性化レベルを決定し、それに応じて適切な治療法を選択することができる。実際に、本方法は、ベッドサイドで、または外傷損傷現場においてさえ−例えば、救急車内または戦場での患者トリアージの際に−行うことができ、本アッセイおよび方法によって決定される補体活性化レベルは、外傷後の極めて重要な最初の１時間のうちに患者ケアを方向づけることができる。
【００７４】
本発明のもう一つの態様では、生理的状態について処置を受けたかまたは受けており、補体関連障害に罹患していることが公知の個体をモニタリングするための方法であって、（ａ）前記個体から体液の一連の試料を採取する工程；（ｂ）ポイント・オブ・ケア用側方流動イムノアッセイにより前記各試料の補体活性化レベルを決定する工程；（ｃ）前記一連の試料の補体活性化レベルを比較して、補体活性化レベルの変化を経時的に検出する工程；および（ｄ）工程（ｃ）の相関に基づき、前記個体の処置を変更する工程を含む、方法を提供する。一連の血液試料を集め、検査して、処置に対応する補体活性化レベルをモニタリングする。
【００７５】
一つの実施形態において、前記補体関連障害は、全身性エリテマトーデス、炎症性苦痛、自己免疫障害、頭蓋内出血、菌血症、移植拒絶反応、眼疾患、心疾患、虚血／再灌流障害、加齢性黄斑変性、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ｐａｒｏｘｙｓｍａｌ  ｎｏｃｔｕｒａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ）（ＰＮＨ）、遺伝性血管浮腫（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ａｎｇｉｏｄｅｍａ）、腎疾患、妊娠関連障害および神経障害、ならびに外傷（炎症性機能不全、例えば人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）、呼吸困難および多臓器不全のリスクがある患者を含む）からなる群より選択される。
【００７６】
本明細書に開示する他の方法のように、一定の実施形態において、前記体液は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞（ｂｒｏｎｃｈｅｏｌａｒ）洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される。一つの実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、前記試料中のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂのうちの一つ以上の存在または不在を検出する。もう一つの実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、インタクトＣ３、ｉＣ３ｂまたは全Ｃ３の濃度を定量することができるリーダーによって読み取られる。
【００７７】
一定の実施形態において、臨床医は、患者が受ける処置に応じた補体活性化の減少を検出する。それに応じて、臨床医は、投与する薬物、例えば抗炎症薬もしくは補体インヒビターの投薬を調整することにより、または補体レベルが正常（すなわち、補体関連障害を経験していない個体におけるレベル）に戻ったら処置を中止することにより、個体の処置を変更することとなる。他の実施形態では、臨床医は、患者が受けている処置に応じた補体活性化レベルの上昇を検出する。それに応じて臨床医は、補体活性化レベルの所望の安定化または減少が達成されるまで薬物、例えば抗炎症薬または補体インヒビターの投薬量を増加させることにより、個体の処置を変更する。補体活性化レベルの変化が検出されない場合、臨床医は、個体の処置を変更することも、補体活性化レベルの変化が観察されるまで個体の処置レジメンを維持することに決めることもできる。
【００７８】
図４を参照して、本明細書に記載する側方流動イムノアッセイは、セルロースメンブレンストリップ３によって構成され、該ストリップ上には、試料流体を吸収し、試料−および−粒子−コンジュゲート免疫複合体のゆるやかな移動を可能にする試料パッド１と、該ストリップの遠位端にあり、その液体試料およびコンジュゲート材料を吸収して、該セルロースメンブレンストリップ３を通り抜ける毛管移動を助長するウィック６と、標識に結合した検出抗体または検出コンジュゲートを含む粒子コンジュゲートパッド２が置かれている。前記セルロースメンブレンストリップ３は検査ゾーン領域であり、該ストリップ上には、検出コンジュゲートを捕捉するための縞状のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む検査ライン４と、対照分析物、例えばＩｇＧに結合し、検査が首尾よく実行されたことを使用者に知らせる抗体を含む対照ライン５とが置かれている。前記側方流動イムノアッセイは、前記セルロースメンブレンストリップ３に接着したポリエステルフィルムバッキング７と、感圧性ラミネートフィルムバッキング８とをさらに含む。各側方流動イムノアッセイをＭｙｌａｒ（登録商標）ｚｅｒｏ−ｖａｐｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｏｕｃｈの中にパッケージングする。
【００７９】
検査試料を試料パッド１に適用すると、試料は試料パッド１から粒子コンジュゲートパッド２まで移動し、そこで、存在する任意の標的分析物が検出抗体コンジュゲートに結合する。その後、試料は、検査ライン４に到達するまでメンブレン３を横断して移動し続け、該検査ライン４で、標的／コンジュゲート複合体は、固定されている抗体に結合して、該メンブレン上に可視ラインを生じさせる。その後、試料は、対照ライン５に到達するまでメンブレンストリップ３に沿ってさらに移動し、該対照ライン５で、前記検査ラインに結合しなかった過剰な抗体コンジュゲートが該対照ラインに結合し、該メンブレン上に第二の可視ラインを生じさせることとなる。対照ラインリガンドは、多くの場合、コンジュゲート抗体のＦｃ領域に対する抗体である。この対照ラインは、試料が意図したとおりにメンブレンを横断して移動したことを示す。
【００８０】
一定の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、単一の分析物の検出のための単一のメンブレンストリップを含む。他の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、二つ以上の分析物を検出する。前記側方流動イムノアッセイが二つ以上の分析物を検出するとき、並列に配置された多数のメンブレンストリップで検査を構成することも（例えば、図５（Ｂ）の略図参照）、単一のメンブレンストリップ上に直列に配列された多数の検査ラインで検査を構成することもできる（例えば、図９（Ｂ）の略図参照）。
【００８１】
図６を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイのメンブレンストリップは、検査試料を滴下するためのポート１０と検査結果を見るためのウインドウ１１とを有する検査カセット９に入れられている。図６の側方流動イムノアッセイは、単一分析物についてアッセイするように構成され、それぞれが一本の検査ライン４および一本の対照ライン５を含む。
【００８２】
図７を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで並行して二つの分析物について検査するように構成される。一部の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための二つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図７（Ａ）参照）。他の実施形態において、前記側方流動イムノアッセイは、試料を滴下するための一つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図７（Ｂ）参照）。
【００８３】
図８を参照して、一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで並行して三つの分析物について検査するように構成される。一部の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための三つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図８（Ａ）参照）。他の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、検査試料を滴下するための一つのポート１０と各分析物用の独立したメンブレンストリップ３とを含む（図８（Ｂ）参照）。
【００８４】
図１０を参照して、一定の実施形態では、前記側方流動イムノアッセイは、単一の検査カセットで直列に多数の分析物について検査するように構成される。図１０（Ａ）は、直列に配置された二本の検査ライン４と一本の対照ライン５とを備えているメンブレンストリップ３を含む検査カセットを示す図である。図１０（Ｂ）は、直列に配置された三本の検査ライン４と一本の対照ライン５とを備えているメンブレンストリップ３を含む検査カセットを示す図である。
【００８５】
ここに開示する側方流動イムノアッセイは、標的マーカーの定性的および／または定量的検出をもたらす。定性的には、前記メンブレン上の二本の明瞭なラインは陽性結果であり、これに対して対照ゾーンの単一ラインは陰性結果である。
【００８６】
一つの実施形態では、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップと、前記マーカーの第一エピトープを結合する検出抗体と、前記マーカーの第二エピトープを結合する捕捉抗体を含む検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む対照ラインとを含み、前記マーカーがインタクトＣ３およびｉＣ３ｂからなる群より選択される、側方流動イムノアッセイを提供する。
【００８７】
一つの実施形態において、前記検出抗体は、臨床医が視覚的に読み取ることができるか、または市販用リーダーによって電子的に読み取ることができるシグナルをもたらす標識を含む。様々な標識がここに開示するアッセイでの使用に好適である。具体的な実施形態では、前記標識はコロイド金である。
【００８８】
検出抗体と捕捉抗体とのペアは、Ｃ３とｉＣ３ｂとの間の干渉クロストークを避けるように注意深く選択しなければならない。主な懸念は、ｉＣ３ｂの検出のためのアッセイにおいてシグナルを生じさせるインタクトＣ３である。両方の分子が同じタンパク質分子に由来するので、クロストークは問題を提起し得る。正常個体ではＣ３がｉＣ３ｂより約２００倍高いレベルで存在するので、微々たる程度のクロストークでさえ、ｉＣ３ｂおよびＣ３活性化の正確な測定に大きな影響を及ぼすことがある。これは、不適当な取扱い、不適当な保管、およびさらには試薬自体がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃ３活性化の原因になり得るという事実によってさらに複雑化される。驚くべきことに、本出願人は、旧来のＥＬＩＳＡアッセイでの使用に好適なすべての抗体が本発明のアッセイでの使用に同等に好適というわけではないことを発見した。下の表１および２は、本発明のアッセイでの使用に好適な抗体ペアを同定することの難しさを示す。本発明者らは、インタクトＣ３イムノアッセイで１９の抗体ペアを、およびｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイで１８の抗体ペアを分析した。これらのペアのうち、Ｈｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２０７５とＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７は、インタクトＣ３側方流動イムノアッセイにおいて、交差反応がなく、最高の結果をもたらした。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７またはＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０のいずれかとＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９は、ｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイにおいて最高の結果をもたらした。興味深いことに、本発明者らは、旧来のＥＬＩＳＡアッセイでの使用に好適な抗体ペアが本明細書に記載する側方流動イムノアッセイでの使用に必ずしも同等に好適であるとは限らないことに注目した。例えば、Ｈｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２１９８は、約１％交差活性があり、検査間のばらつきが相当あるアッセイをもたらした。この交差反応性は、偽陽性ｉＣ３ｂシグナルを正常循環ｉＣ３ｂのものの２倍のレベルで生じさせた。ｉＣ３ｂレベルの実際の二倍化または三倍化は、大量補体活性化のサインとなるため、１％交差活性を伴う側方流動イムノアッセイには臨床的有用性がない。ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）（５５２３７）は、はるかに良好に機能して、臨床的有用性と適合性のある約０．５％未満（約０．０５％）の交差反応性しか生じさせなかった。しかし、両方の抗体が旧来のＥＬＩＳＡアッセイにおいて同様に良好に機能したことは注目に値する。
【００８９】
【表１】
0005859557.tif 000002
【００９０】
【表２】
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一つの実施形態において、前記マーカーはインタクトＣ３であり、前記検出抗体はインタクトＣ３の第一エピトープを結合し、該第一エピトープはインタクトＣ３上に存在するＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインはＣ３の活性化により失われる。さらなる実施形態において、前記マーカーはインタクトＣ３であり、前記捕捉抗体はＣ３上の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である。図３（Ａ）参照。
【００９１】
もう一つの実施形態において、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記検出抗体はｉＣ３ｂの第一エピトープを結合し、前記第一エピトープはｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープは、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、ｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる。さらなる実施形態において、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はｉＣ３ｂ上の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトープである。図３（Ｂ）参照。
【００９２】
非常に具体的な例では、前記マーカーはインタクトＣ３であり、前記捕捉抗体はＨｙｃｕｌｔ（登録商標）ＨＭ２０７５であり、前記検出抗体はＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７である。もう一つの非常に具体的な例では、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９であり、前記検出抗体はＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ（登録商標）５５２３７である。もう一つの非常に具体的な例では、前記マーカーはｉＣ３ｂであり、前記捕捉抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９であり、前記検出抗体はＱｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２５０である。
【００９３】
様々な体液が本発明の側方流動イムノアッセイおよび方法での使用に好適である。例えば、本明細書に記載するアッセイおよび方法での使用に好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。一つの実施形態において、前記体液は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される。具体的な実施形態において、前記体液は全血である。
【００９４】
様々な対照分析物が、本発明の側方流動イムノアッセイにおいて該アッセイが首尾よく完了したことを実証するために用いることに好適であることは、当業者には理解されるであろう。一つの実施形態において、前記対照分析物はＩｇＧである。
【００９５】
本側方流動イムノアッセイのもう一つの利点は、偽陽性結果をもたらすことがある、検査自体による試料の実質的補体活性化の回避である。Ｃ３が、試料の取り扱い、保管、および外来材料または物質との接触に起因して自己活性化し得る、細心の注意を要するタンパク質であることは周知である。それ故、Ｃ３の性質は、広範な試料取り扱いおよび多数の工程を含む補体活性化についての旧来のＥＬＩＳＡおよび濁度アッセイにおいて偽陽性をもたらし得る。本側方流動イムノアッセイは、試料調製および取扱い工程の低減および／または削除によって、かかる偽陽性を回避する。したがって、本側方流動アッセイの一つの実施形態では、体液試料中の補体は、実験的に該側方流動イムノアッセイによって実質的に活性化されない。
【００９６】
代替実施形態では、単一のアッセイで一つより多くの補体活性化マーカーを検出することができる側方流動イムノアッセイを有することが望ましい。例えば、体液の同じアリコート中のインタクトＣ３とｉＣ３ｂの両方を定性的かつ定量的に検出することができる二重側方流動イムノアッセイは、非常に望ましい。したがって、もう一つの実施形態では、補体タンパク質を含む体液試料中の補体活性化のマーカーについてのポイント・オブ・ケア検出のための側方流動イムノアッセイであって、メンブレンストリップと、インタクトＣ３の第一エピトープを結合する第一検出抗体と、インタクトＣ３の第二エピトープを結合する第一捕捉抗体を含む第一検査ラインと、ｉＣ３ｂの第一エピトープを結合する第二検出抗体と、ｉＣ３ｂの第二エピトープを結合する第二捕捉抗体を含む第二検査ラインと、対照分析物を結合する抗体を含む少なくとも一つの対照ラインを含む側方流動イムノアッセイを提供する。
【００９７】
一つの実施形態において、前記第一および第二検出抗体は、シグナルをもたらす標識を含む。様々な標識がここに開示するアッセイでの使用に好適である。一つの実施形態において、前記標識はコロイド金である。
【００９８】
様々な体液が本発明の側方流動イムノアッセイでの使用に好適である。例えば、好適な体液の非限定的リストについての図１９を参照のこと。一つの実施形態において、前記体液は、全血、血清、血漿、尿、涙液、唾液、創傷滲出液、気管支肺胞洗浄液および脳脊髄液からなる群より選択される。具体的な実施形態において、前記体液は全血である。
【００９９】
様々な対照分析物が、本発明の側方流動イムノアッセイにおいて該アッセイが首尾よく完了したことを実証するために用いることに好適であることは、当業者には理解されるであろう。一つの実施形態において、前記対照分析物はＩｇＧである。
【０１００】
もう一つの実施形態において、前記体液試料中の補体は、実験的に前記側方流動イムノアッセイ自体によって実質的に活性化されない。
【０１０１】
一つの実施形態において、前記第一検出抗体はインタクトＣ３の第一エピトープを結合し、該インタクトＣ３の第一エピトープは、インタクトＣ３上に存在するＣ３ａドメインであり、該Ｃ３ａドメインはＣ３の活性化によって失われる。
【０１０２】
もう一つの実施形態において、前記第一捕捉抗体はインタクトＣ３の第二エピトープを結合し、該第二エピトープは、インタクトＣ３、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄ上に存在するＣ３ｄドメイン内の領域である。
【０１０３】
もう一つの実施形態において、前記第二検出抗体はｉＣ３ｂの第一エピトープを結合し、該ｉＣ３ｂの第一エピトープはｉＣ３ｂ上のネオエピトープであり、該ネオエピトープは、Ｃ３ｂがｉＣ３ｂへと非活性化されると現れ、ｉＣ３ｂがＣ３ｃおよびＣ３ｄへとさらに分解されると妨げられる。
【０１０４】
さらにもう一つの実施形態において、前記第二捕捉抗体はｉＣ３ｂの第二エピトープを結合し、該ｉＣ３ｂの第二エピトープは、Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂおよびＣ３ｄｇ上にのみ存在するネオエピトープである。
【０１０５】
もう一つの実施形態において、インタクトＣ３を結合する抗体と、ｉＣ３ｂを結合する抗体は、実質的に交差反応しない。
【０１０６】
以下の実施例は、例証として与えるものであり、本発明の範囲を限定するためのものでは決してない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
患者トリアージ
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１０８】
この検査を用いて、損傷１５、３０または６０分以内に損傷重症度を計測する。これは、目視検査でははっきり分からない損傷を被っているかもしれない患者に最も有用である。動脈ライン（Ａライン）またはフィンガースティックのいずれかで一滴の血液を採集する。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、一体型インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ検査ストリップを含んでいる側方流動イムノアッセイカセット上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ側方流動アッセイカセットに適用することができる。１０分後、しかし４０分より前に、そのカセットを好ましくはリーダーによって電子的に読み取って結果を記録する。一回目の読み取りが、血液中５０μｇ／ｍＬより高いｉＣ３ｂレベル（または等価のｉＣ３ｂ：インタクトＣ３比）を有する場合、補体活性化および高度炎症の証拠が存在する。スタッフは、重症損傷を想定し、ＥＲスタッフの注意を喚起する（ａｌｅｒｔ）。そうでなければ、５分後に二回目の読み取りを行う。ｉＣ３ｂレベル（または等価のｉＣ３ｂ：インタクトＣ３比）が血液中５０μｇ／ｍＬより高いか、ｉＣ３ｂレベルが２５％より大きく増加されていた場合、患者が重症損傷を有すると想定し、ＥＲスタッフの注意を喚起する（ａｌｔｅｒ）。より少ない増加または無増加は、より重症度の低い損傷を示唆するが、決定的ではない。
【０１０９】
実施例２
外傷患者の軌跡モニタリング（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）
シフトの開始時に、ＩＣＵスタッフは、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１１０】
軌跡モニタリングの目的は、重症外傷後に安定した患者の炎症および免疫状態の変化を検出することである。この実施例では、肺炎または炎症性機能不全のいずれかによって引き起こされた呼吸困難を検出することができる。予想患者プロファイルは、１６以上の損傷重症度スコア（ＩＳＳ）を有し、呼吸のために人工呼吸器補助を必要とする者である。
【０１１１】
患者は、血糖値を検査する時点と同調する頻繁な間隔で補体検査を受ける。検査間のこの間隔は、通常、約二時間である。Ａラインまたはフィンガースティックいずれかによる血糖検査と同じ方法を用いて、血液を採集する。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、一体型インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ側方流動イムノアッセイカセットを含んでいるＬＦＡカセット（単数）上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立のインタクトＣ３およびｉＣ３ｂカセット（複数）に適用する。前記カセット（単数）またはカセット（複数）を患者のベッドサイドにあるリーダーの中に置く。２０分後に読み取りを行うようにリーダーを設定する。データを収集し、ｉＣ３ｂ、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ：（インタクトＣ３）値を各時点で記録する。
【０１１２】
インタクトＣ３もしくはｉＣ３ｂレベルの経時的変化、または変化率の変化は、炎症状態の変化を示し得る。インタクトＣ３の減少を随伴するｉＣ３ｂの急上昇は、切迫した呼吸困難を示す。次の行動方針として、臨床医は、患者に対して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行って、その患者がＶＡＰを経験しているか否かを決定する。細菌が１ｍＬ当たり１０４個以上のレベルで存在する場合、ＶＡＰを指摘し、その患者を抗生物質療法に付す。そうでなければ、非感染性炎症性機能不全を想定し、その患者を抗炎症薬および／または補体インヒビターで処置することができる。その患者は、人工呼吸器設定を調整してもらうこともできる。
【０１１３】
実施例３
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者における疾患重症度および処置の有効性の決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬおよび１０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１１４】
この検査を用いて、初期疾患重症度、および治療の有効性を計測する。ＳＬＥ患者に対して行う標準診断の一つは、全Ｃ３レベルの測定である。ＳＬＥ患者のＣ３レベルは、通常低下しており、処置が成功すると正常（＞１ｍｇ／ｍＬ）に戻る。しかし、Ｃ３活性化が抑止されたのか、または十分遅くなり、通常の補充メカニズムが可能になり、Ｃ３レベルが正常値へ回復しただけであるのかは、一般に分からない。
【０１１５】
各病院訪問時に、患者の血液を全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ検査のために採集する。３検査併せてたった一滴しか必要としない。血液は、他の検査のために採血していない限りフィンガースティックによって採集し、他の検査のために採血している場合には、その供給源から血液を得ることとなる。容量固定ピペットを使用して１０ｕＬ試料を吸い上げる。次いで試料を９９０ｕＬの試料緩衝液と混合する。血液と試料緩衝液を混合する。容量固定ピペットの球部を使用して、１００ｕＬを吸い上げ、全Ｃ３、インタクトＣ３およびｉＣ３ｂを測定する一体型側方流動カセットを含んでいるＬＦＡカセット（単数）上にピペットで置く。あるいは、１００ｕＬを独立の各アッセイ用のカセット（複数）に適用することができる。前記カセット（単数）またはカセット（複数）を病院のリーダーの中に置く。２０分後に読み取りを行うようにリーダーを設定する。
【０１１６】
各病院訪問時にデータを収集する。初回病院訪問時、ｉＣ３ｂおよびインタクトＣ３検査の追加により、専門医は、患者の状態の重症度について、現在可能であるものよりも、多くの情報が得られる。専門医が患者の状態が安定していると見なすときに新たな情報を利用できるようになる。この時点でのｉＣ３ｂおよびインタクトレベルは、残りの疾患プロセスの程度を示す。特にｉＣ３ｂレベルが正常値より高い（一般に、＞１％）場合、基礎疾患プロセスはまだ非常に活動性であり、専門医は、抗炎症薬用量を増加させること、または追加の薬物療法を加えることによる治療法のさらなる調整を選ぶことができる。
【０１１７】
実施例４
健常個体の基礎涙液中の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの２４時間にわたる決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬおよび３０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１１８】
健常個体の眼におけるインタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを決定するために、合計三回の読み取りを行った。時間＝０時間、１２時間および２４時間の試料を採集し、評価した。
【０１１９】
涙液回収のために、下瞼を引き寄せ、眼の下部にＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）を短時間、軽くあてる（ｄａｐ）。次いでＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）を素早く切断し、涙染みの周囲の二、三ミリメートルの乾いた端部を残して涙液を回収する。次いでそのＫｉｍｗｉｐｅ（登録商標）涙液試料を２２０ｕＬのＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒに入れ、十分に１０秒間ボルテックスにかける。一分間待った後、その試料を再び短時間ボルテックスにかける。次に、１００ｕＬの試料を各側方流動イムノアッセイ（インタクトＣ３およびｉＣ３ｂ）に移し、アッセイする。
【０１２０】
分析のために、各カセットをリーダーに挿入し、２０分後に読み取る。結果は、５０〜６０μ／ｍＬのインタクトＣ３および５〜８μ／ｍＬのｉＣ３ｂの範囲であった（図１５参照）。
【０１２１】
実施例５
一時点での二人の健常個体の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの決定
最初の検査試料をアッセイする前に、１０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬおよび３０００ｎｇ／ｍＬのインタクトＣ３およびｉＣ３ｂ標準物質を使用して標準曲線を完成する。側方流動イムノアッセイカセットを２０分後に電子リーダーで読み取る。
【０１２２】
安静時インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルを二人の健常ドナーから収集する。側方流動イムノアッセイリーダーのスイッチを入れる。アルコールスワブを使用して指を清浄にする。指にランセットを刺し、優しく押して、ＭＩＣＲＯＳＡＦＥ（登録商標）Ｔｕｂｅを使用して毛管作用により１０ｕＬの血液を採集する。９９０ｍＬの試料アッセイ緩衝液を満たしたチューブに血液試料を直接排出して蓋をし、６〜８回反転させることによって混合した。１００ｕＬ  Ｅｘａｃｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｉｐｅｔを使用して１００ｕＬの血液試料混合物をＣｏｍｐＡｃｔインタクトＣ３検査に移した。次いで新たな１００ｕＬ  Ｅｘａｃｔ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｐｉｐｅｔを使用して第二の１００ｕＬの血液試料混合物をＣｏｍｐＡｃｔ  ｉＣ３ｂ検査に移した。両方の検査について２０分後に読み取るようにタイマーを設定した。
【０１２３】
第一の患者からの結果は、インタクトＣ３についてはおおよそ５００μｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては２００ｎｇ／ｍＬであると決定された。これは、この個体に２５００のインタクトＣ３対ｉＣ３ｂ比が存在することを示す（図１６参照）。第二の個体の結果は、インタクトＣ３についてはおおよそ１０００μｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては３００ｎｇ／ｍＬであった（図１７参照）。これらの値の両方が予想正常範囲内である。ｉＣ３ｂ値は、正常と見なされるものより低い範囲内にあった。
【０１２４】
実施例６
激しい運動後の一時点での健常個体の基礎インタクトＣ３およびｉＣ３ｂレベルの決定
実施例５についての上記プロトコルを用いて、健常個体の一方を激しい運動後に再び検査した（図１８参照）。運動はｉＣ３ｂまたはＣ３レベルを有意に変えなかった。
【０１２５】
実施例７
側方流動イムノアッセイにおけるインタクトＣ３抗体とｉＣ３ｂ抗体との間のクロストーク
１ミリリットル容積中、５０ｎｇ／ｍＬのｉＣ３ｂを様々な量（０ｎｇ／ｍＬから１００，０００ｎｇ／ｍＬの範囲）のインタクトＣ３と混合した。試料を６〜８回反転させることによって混合し、その後、０．１ｍＬをピペットでカセットに置いた。２０分の時点で読み取りを行った。１０ｎｇ／ｍＬから１００，０００ｎｇ／ｍＬまで生成した標準曲線を使用してリーダーアウトプットをｉＣ３ｂ濃度に変換した。緩衝液のみを用いて実行したカセットからのバックグラウンドを差し引いた。各時点でのｉＣ３ｂの見かけの濃度から実際のｉＣ３ｂ濃度（Ｃ３を加えていないｉＣ３ｂ検査からのもの）を引き、その後、実際のｉＣ３ｂ濃度に対して正規化することによって、寄与率を計算した。図１４参照。Ｈ０８Ｋ−０１カセットについては、検査したＣ３の最高濃度で、ｉＣ３ｂシグナルの約半分はインタクトＣ３から生じ、半分は実際のｉＣ３ｂから生じた。Ｊ２４Ｋ−０３バージョンについては、インタクトＣ３クロストークから、実際のｉＣ３ｂからより４倍多いｉＣ３ｂシグナルが生じた。これらの抗体ペアは、ＥＬＩＳＡアッセイでは十分機能するが、側方流動イムノアッセイにおいて同じ分析物のために使用すると有意なクロストークを呈示する。生理的に妥当な２５０：１および５００：１比で、インタクトＣ３は、Ｊ２４Ｋ−０３ではｉＣ３ｂシグナルアウトプットにｉＣ３ｂ自体より大きく寄与する。
【０１２６】
Ｊ２４Ｋ−０３は、金コンジュゲート上にマウス抗Ｃ３ａモノクローナル、および検査ライン上にマウス抗Ｃ３ｄモノクローナルを備えているアッセイである。Ｈ０８Ｋ−０１は、金コンジュゲート上にマウス抗ｉＣ３ｂモノクローナル、および検査ライン上に抗Ｃ３ポリクローナルを有する。
【０１２７】
実施例８
側方流動イムノアッセイのためのｉＣ３ｂ標準曲線の生成
本発明の一つの実施形態は、カセットケースを伴わない側方流動アッセイストリップを含む。これらのストリップは、金にコンジュゲートした抗ｉＣ３ｂモノクローナル抗体（Ｑｕｉｄｅｌ（登録商標）Ａ２０９）およびストリップにコンジュゲートした抗Ｃ３抗体（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（登録商標）５５２３７）を有した。標準曲線を図１１（Ａ）に示す。これらの標準曲線は、約１０倍の線形範囲および約１００ｎｇ／ｍＬの感度を示した。本発明のもう一つの実施形態は、アッセイストリップへの試料の制御適用を可能にするカセットで使用するためのストリップを構成する。これは、アッセイへの時間依存性はまだ相当にあるが、アッセイ間の再現性を向上させた。標準曲線の結果を図１１（Ｂ）に示す。第三の実施形態は、金コンジュゲート上に適用する抗体濃度を０．５ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬに増加させ、吸収緩衝液からＢＳＡを除去する。標準曲線の結果を図１１（Ｃ）に示す。
【０１２８】
標準曲線は、下の実施例９において説明するように生成する。
【０１２９】
実施例９
側方流動イムノアッセイのためのｉＣ３ｂ標準曲線の生成
２ｍＬ蓋付チューブを使用して、十（１０）μＬのｉＣ３ｂ（濃度１ｍｇ／ｍＬ）ストックを９９０ｕｌの試料希釈緩衝液で希釈して１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作った。１０〜１２回ゆっくりと反転させることによってチューブを混合した。研究員は、別の２ｍＬ蓋付チューブの中で５００ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬストックを５００ｕＬ  ＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して５ｕｇ／ｍＬストックを作った。１０〜１２回チューブをゆっくりと反転させることによって混合を行った。上で説明したような１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに九回繰り返して、次の作業用ストックを作った：１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１３０】
標識し、三群に割り付けることにより、側方流動イムノアッセイ（ＬＦＡ）カセットを調製した。各希釈について、研究員は、１００ｕＬの第一の作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第１のＬＦＡの試料ポートにピペットで置いた。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第２のＬＦＡにローディングした。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ  １０１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を用いてカセットを１０、２０および３０分後に読み取り、データを記録した。
【０１３１】
実験完了後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータをプロットした。標準曲線は、３パラメータロジスティック方程式：Ｙ＝下限値＋（上限値−下限値）／（１＋ＥＣ５０／Ｘ）にフィットする。図１２参照。
【０１３２】
実施例１０
側方流動イムノアッセイのためのインタクトＣ３標準曲線の生成
２ｍＬ蓋付チューブを使用して、十（１０）μＬのインタクト（濃度１ｍｇ／ｍＬ）ストックを９９０ｕｌの試料希釈緩衝液で希釈して１０ｕｇ／ｍＬの作業用ストックを作った。１０〜１２回ゆっくりと反転させることによってチューブを混合した。研究員は、別の２ｍＬ蓋付チューブの中で５００ｕＬの１０ｕｇ／ｍＬストックを５００ｕＬ  ＢＡＷ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈して５ｕｇ／ｍＬストックを作った。１０〜１２回チューブをゆっくりと反転させることによって混合を行った。上で説明したような１：１希釈（５００ｕＬ：５００ｕＬ）をさらに九回繰り返して、次の作業用ストックを作った：１０ｕｇ／ｍＬ、５ｕｇ／ｍＬ、２．５ｕｇ／ｍＬ、１．２５ｕｇ／ｍＬ、６２５ｎｇ／ｍＬ、３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、７８ｎｇ／ｍＬ、３９ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ（緩衝液のみ）。
【０１３３】
標識し、三群に割り付けることにより、ＬＦＡカセットを調製した。各希釈について、研究員は、１００ｕＬの第一の作業用ストック（インタクトＣ３については１０ｕｇ／ｍＬ、およびｉＣ３ｂについては５ｕｇ／ｍＬ）を第１のＬＦＡの試料ポートにピペットで置いた。各濃度について、研究員は２０秒待ち、その後、１００ｕＬの同作業用ストックを第２のＬＦＡにローディングした。ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＦＤＲ  １０１（Ｆｏｒｓｉｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、検査ライン設定、続いて対照ライン設定を用いてカセットを１０、２０および３０分後に読み取り、データを記録した。
【０１３４】
実験完了後、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータをプロットした。標準曲線は、３パラメータロジスティック方程式：Ｙ＝下限値＋（上限値−下限値）／（１＋ＥＣ５０／Ｘ）にフィットする。図１３参照。
【０１３５】
引用したすべての文献は、参照により本明細書に援用されている；いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であるとの承認と見なしてはならない。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態を例証し、説明したが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な他の変更および変形をなすことができることは当業者には明らかなことであろう。したがって、本発明の範囲内であるすべてのかかる変更および変形は、添付の特許請求の範囲に包含されると解釈される。
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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