(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３４０を含む野生型成熟ヒトＧＤＦ８に特異的に結合するか、又はその生物学的活性を遮断するが、成熟ヒトＧＤＦ８のアミノ酸４８〜７２がＴＧＦβ１の対応するアミノ酸配列と置き換えられているキメラＧＤＦ８／ＴＧＦβ１構築物に結合しないか又はその生物学的活性を遮断しない、単離されたヒト抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ここで該キメラＧＤＦ８／ＴＧＦβ１構築物が配列番号３５２のアミノ酸配列を含み、
そして、ここで該抗体又は抗原結合フラグメントは：（ａ）重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）からの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）、ここで該ＨＣＶＲは配列番号３６２／３６４／３６６のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含み；並びに（ｂ）軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）からの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）、ここで該ＬＣＶＲは配列番号３７０／３７２／３７４のＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み；を含む、
上記単離されたヒト抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体又は抗原結合フラグメントが：（ａ）配列番号３６０のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲからの重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）；並びに（ｂ）配列番号３６８のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲからの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む、請求項１に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
野生型成熟ＧＤＦ８（配列番号３４０）内の線状エピトープに結合しない、請求項１又は２に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号３４０のアミノ酸１〜１４、１〜１８、１７〜４２、４８〜６５、４８〜６９、４８〜７２、５２〜６５、５２〜７２、５６〜６５、５６〜７２、６５〜７２、７３〜９０、７５〜１０５及び９１〜１０５のアミノ酸配列を有する単離されたＧＤＦ８ペプチドに結合しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント、及び薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項６】
医療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント、又は請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＧＤＦ８活性を阻害することにより処置可能な疾患若しくは障害に罹患しているか、それらの疾患若しくは障害と診断されたか、又はそれらの疾患若しくは障害に罹患する危険性がある患者の処置における使用のための、請求項６に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は医薬組成物。
【請求項８】
ＧＤＦ８活性を阻害することにより処置可能である疾患又は障害が、筋肉減少症、悪液質、及び不活動又は不動に起因する筋萎縮からなる群より選択される疾患又は障害である、請求項７に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は医薬組成物。
【請求項９】
ＧＤＦ８活性を阻害することにより処置可能な疾患若しくは障害に罹患しているか、それらの疾患若しくは障害と診断されたか、又はそれらの疾患若しくは障害に罹患する危険性がある患者の処置における使用のための医薬の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体若しくは抗原結合フラグメント、又は請求項５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０】
ＧＤＦ８活性を阻害することにより処置可能な疾患又は障害が、筋肉減少症、悪液質、筋消耗、筋委縮症、癌、関節炎、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、骨粗しょう症、変形性関節症、骨減少症、股関節骨折を含む骨折、代謝症候群、グルコース恒常性及びインスリン感受性からなる群より選択される疾患又は障害である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
悪液質が、特発性か又は他の状態に対して二次的である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
筋消耗又は委縮症が、不活動、不動、床上安静、外傷、医療処置若しくは外科的処置により引き起こされるか又はそれらに伴う、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
代謝症候群が、糖尿病、肥満、栄養障害、器官萎縮症、慢性閉塞性肺疾患及び食欲不振からなる群より選択される、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、増殖分化因子−８（ＧＤＦ８）に特異的である抗体及びその抗原結合フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
増殖分化因子−８（ＧＤＦ８）（ミオスタチンとしても知られる）は、増殖因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＧＤＦ８は、成長中及び成体の骨格筋において高度に発現される、骨格筋量の負の調節因子である。
【０００３】
ＧＤＦ８は種の間で高度に保存されており、そしてマウス及びヒトＧＤＦ８のアミノ酸配列は同一である（配列番号３３８〜３３９に示されるヒトＧＤＦ８核酸配列及びアミノ酸配列）（非特許文献１）。
【０００４】
多数のヒト疾患が筋肉組織の減少又は障害に関連しており（例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋消耗症候群、筋肉減少症及び悪液質）、そしてＧＤＦ８の阻害剤は、これらの疾患又は障害の処置に適用可能である。
【０００５】
ＧＤＦ８に対する抗体及び治療方法は、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７及び特許文献８において開示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ  ６，０９６，５０６
【特許文献２】ＵＳ  ７，３２０，７８９
【特許文献３】ＵＳ  ７，８０７，１５９
【特許文献４】ＷＯ  ２００７／０４７１１２
【特許文献５】ＷＯ  ２００５／０９４４４６
【特許文献６】ＵＳ  ２００７／００８７０００
【特許文献７】ＵＳ  ７，２６１，８９３
【特許文献８】ＷＯ  ２０１０／０７００９４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９７７  Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ヒト増殖分化因子８（ＧＤＦ８）に特異的に結合する、ヒト又はヒト化抗体及びヒト又はヒト化抗体の抗原結合フラグメントを提供する。これらの抗体は、ＧＤＦ８に高親和性で結合すること及びＧＤＦ８活性を中和することを特徴とする。本抗体は、全長（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であっても、抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖフラグメント）のみを含んでいてもよく、そして機能に影響を及ぼすように、例えば残りのエフェクター機能を排除するように改変されていてもよい（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４：１９２５−１９３３）。
【０００９】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８、２７４、２９０、３０６、３６０、及び３７６、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
【００１０】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２６６、２８２、２９８、３１４、３２２、３６８、及び３８４又はその実質的に同一の配列からなる群より選択される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列を含む。
【００１１】
一実施態様において、本発明の抗体はＨＣＶＲアミノ酸配列及びＬＣＶＲアミノ酸配列を含み、ここでＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ対の配列は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、１１４／３２２、３６０／３６８、及び３７６／３８４からなる群より選択される。
【００１２】
本発明はまた、重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列（ＬＣＤＲ３）を含むヒト抗体若しくはヒト化抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを特徴とし、ここでＨＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、２８０、２９６、３１２、３６６、及び３８２、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択され、そしてＬＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、３０４、３２０、３２８、３７４、及び３９０、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択される。別の実施態様において、抗体又はそのフラグメントは、配列番号８／１６、２４／３２、４０／４８、５６／６４、７２／８０、８８／９６、１０４／１１２、１２０／１２８、１３６／１４４、１５２／１６０、１６８／１７６、１８４／１９２、２００／２０８、２１６／２２４、２３２／２４０、２４８／２５６、２６４／２７２、２８０／２８８、２９６／３０４、３１２／３２０、１２０／３２８、３６６／３７４、及び３８２／３９０からなる群より選択されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む。
【００１３】
関連する実施態様において、抗体又はそのフラグメントは、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）及びＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列並びに軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）及びＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）アミノ酸配列をさらに含み、ここでＨＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、２７６、２９２、３０８、３６２、及び３７８、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択され；ＨＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、２７８、２９４、３１０、３６４、及び３８０、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択され；ＬＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、３００、３１６、３２４、３７０、及び３８６、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択され；そしてＬＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、３０２、３１８、３２６、３７２、及び３８８、又はその実質的に同一の配列からなる群より選択される。別の実施態様において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、配列番号３６／３８／４０、１１６／１１８／１２０、２２８／２３０／２３２、３６２／３６４／３６６、及び３７８／３８０／３８２からなる群より選択され；そしてＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、配列番号４４／４６／４８、１２４／１２６／１２８、２３６／２３８／２４０、３７０／３７２／３７４、及び３８６／３８８／３９０からなる群より選択される。さらに別の実施態様において、重鎖及び軽鎖ＣＤＲは、配列番号３６／３８／４０／４４／４６／４８（例えば２１−Ｅ５）、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８（例えば８Ｄ１２）、２２８／２３０／２３２／２３６／２３８／２４０（例えば１Ａ２）、３６２／３６４／３６６／３７０／３７２／３７４（例えばＨ４Ｈ１６５７Ｎ２）、及び３７８／３８０／３８２／３８６／３８８／３９０（例えばＨ４Ｈ１６６９Ｐ）からなる群より選択される。
【００１４】
関連する実施態様において、本発明は、ＧＤＦ８に特異的に結合する抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを包含し、ここで該抗体又はフラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、１１４／３２２、３６０／３６８、及び３７６／３８４からなる群より選択される重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列内に含有される重鎖及び軽鎖ＣＤＲドメインを含む。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法及び技術は当該分野で周知であり、そして本明細書において開示される特定のＨＣＶＲ及び／又はＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するために使用され得る。ＣＤＲの境界を同定するために使用され得る例となる伝統的手法としては、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、及びＡｂＭ定義が挙げられる。一般的な用語で、Ｋａｂａｔ定義は配列多様性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造的ループ領域の位置に基づき、そしてＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａのアプローチの折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８（１９９７）；及びＭａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９２６８−９２７２（１９８９）を参照のこと。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために公開データベースも利用可能である。
【００１５】
本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸分子も提供する。本発明の抗体をコードする核酸を有する組み換え発現ベクター、及びこのようなベクターが導入されている宿主細胞も本発明により包含され、本発明の宿主細胞を培養することによる本発明の抗体の製造方法も同様である。
【００１６】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号１、１７、３３、４９、６５、８１、９７、１１３、１２９、１４５、１６１、１７７、１９３、２０９、２２５、２４１、２５７、２７３、２８９、３０５、３５９、及び３７５、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるＨＣＶＲを含む。
【００１７】
一実施態様において、本発明の抗体は、配列番号９、２５、４１、５７、７３、８９、１０５、１２１、１３７、１５３、１６９、１８５、２０１、２１７、２３３、２４９、２６５、２８１、２９７、３１３、３２１、３６７、及び３８３又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＣＶＲを含む。
【００１８】
一実施態様において、本発明の抗体は、ＨＣＶ／ＬＣＶＲ対配列が、配列番号  １／９、１７／２５、３３／４１、４９／５７、６５／７３、８１／８９、９７／１０５、１１３／１２１、１２９／１３７、１４５／１５３、１６１／１６９、１７７／１８５、１９３／２０１、２０９／２１７、２２５／２３３、２４１／２４９、２５７／２６５、２７３／２８１、２８９／２９７、３０５／３１３、１１３／３２１、３５９／３６７、及び３７５／３８３からなる群より選択される核酸分子対によりコードされる、ＨＣＶＲアミノ酸配列及びＬＣＶＲアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、配列番号７、２３、３９、５５、７１、８７、１０３、１１９、１３５、１５１、１６７、１８３、１９９、２１５、２３１、２４７、２６３、２７９、２９５、３１１、３６５、及び３８１、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるＨＣＤＲ３、並びに配列番号１５、３１、４７、６３、７９、９５、１１１、１２７、１４３、１５９、１７５、１９１、２０７、２２３、２３９、２５５、２７１、２８７、３０３、３１９、３２７、３７３、及び３８９、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＣＤＲ３を含むヒト抗体若しくはヒト化抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。一実施態様において、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３セットは、配列番号７／１５、２３／３１、３９／４７、５５／６３、７１／７９、８７／９５、１０３／１１１、１１９／１２７、１３５／１４３、１５１／１５９、１６７／１７５、１８３／１９１、１９９／２０７、２１５／２２３、２３１／２３９、２４７／２５５、２６３／２７１、２７９／２８７、２９５／３０３、３１１／３１９、１１９／３２７、３６５／３７３、及び３８１／３８９からなる群より選択されるヌクレオチド配列対によりコードされる。
【００２０】
関連する実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、ＨＣＤＲ１が、配列番号３、１９、３５、５１、６７、８３、９９、１１５、１３１、１４７、１６３、１７９、１９５、２１１、２２７、２４３、２５９、２７５、２９１、３０７、３６１、及び３７７、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされ、ＨＣＤＲ２が、配列番号５、２１、３７、５３、６９、８５、１０１、１１７、１３３、１４９、１６５、１８１、１９７、２１３、２２９、２４５、２６１、２７７、２９３、３０９、３６３、及び３７９、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされ、ＬＣＤＲ１が、配列番号１１、２７、４３、５９、７５、９１、１０７、１２３、１３９、１５５、１７１、１８７、２０３、２１９、２３５、２５１、２６７、２８３、２９９、３１５、３２３、３６９、及び３８５  又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされ、そしてＬＣＤＲ２が、配列番号１３、２９、４５、６１、７７、９３、１０９、１２５、１４１、１５７、１７３、１８９、２０５、２２１、２３７、２５３、２６９、２８５、３０１、３１７、３２５、３７１、及び３８７、又は少なくとも９５％の相同性を有するその実質的に類似した配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列によりコードされる、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２、並びにＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２をさらに含む。一実施態様において、抗体又は抗体フラグメントは、配列番号３５／３７／３９／４３／４５／４７、１１５／１１７／１１９／１２３／１２５／１２７、２２７／２２９／２３１／２３５／２３７／２３９、３６１／３６３／３６５／３６９／３７１／３７３、又は３７７／３７９／３８１／３８５／３８７／３８９の核酸配列セットによりコードされる重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。
【００２１】
本発明はまた、ＧＤＦ８に特異的に結合する単離された抗体又は抗体フラグメントを特徴とし、該抗体又は抗体フラグメントは、（ａ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号３２９）［式中、Ｘ1はＧｌｙであり；Ｘ2はＰｈｅであり；Ｘ3はＴｈｒであり；Ｘ4はＰｈｅであり；Ｘ5はＳｅｒであり；Ｘ6はＡｌａ又はＳｅｒであり；Ｘ7はＰｈｅ又はＴｙｒであり；Ｘ8はＧｌｙ又はＡｌａである］のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8（配列番号３３０）［式中、Ｘ1はＩｌｅであり；Ｘ2はＧｌｙ又はＳｅｒであり；Ｘ3はＴｙｒ又はＧｌｙであり；Ｘ4はＳｅｒ又はＡｓｐであり；Ｘ5はＧｌｙであり；Ｘ6はＧｌｙであり；Ｘ7はＳｅｒ又はＡｓｎであり；そしてＸ8はＡｌａ又はＧｌｕである］のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；（ｃ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9−Ｘ10−Ｘ11−Ｘ12−Ｘ13−Ｘ14（配列番号３３１）［式中、Ｘ1はＳｅｒ又はＡｌａであり；Ｘ2はＴｈｒ又はＬｙｓであり；Ｘ3はＡｓｐ又はＩｌｅであり；Ｘ4はＧｌｙ又はＳｅｒであり；Ｘ5はＡｌａ又はＨｉｓであり；Ｘ6はＴｒｐ又はＴｙｒであり；Ｘ7はＬｙｓ又はＡｓｐであり；Ｘ8はＭｅｔ又はＩｌｅであり；Ｘ9はＳｅｒ又はＬｅｕであり；Ｘ10はＧｌｙ又はＳｅｒであり；Ｘ11はＬｅｕ又はＧｌｙであり；Ｘ12はＡｓｐ又はＭｅｔであり；Ｘ13はＶａｌ又はＡｓｐであり；Ｘ14はＶａｌであるか又は存在しない］のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；（ｄ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6（配列番号３３２）［式中、Ｘ1はＧｌｎであり；Ｘ2はＡｓｐ又はＧｌｙであり；Ｘ3はＩｌｅであり；Ｘ4はＳｅｒであり；Ｘ5はＡｓｐ又はＡｓｎであり；そしてＸ6はＴｙｒ又はＴｒｐである］のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｅ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3（配列番号３３３）［式中、Ｘ1はＴｈｒ又はＡｌａであり；Ｘ2はＴｈｒ又はＡｌａであり；そしてＸ3はＳｅｒである］のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｆ）式Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8−Ｘ9（配列番号３３４）［式中、Ｘ1はＧｌｎであり；Ｘ2はＬｙｓ又はＧｌｎであり；Ｘ3はＡｌａ又はＴｙｒであり；Ｘ4はＡｓｐ又はＡｓｎであり；Ｘ5はＳｅｒであり；Ｘ6はＡｌａ又はＰｈｅであり；Ｘ7はＰｒｏであり；Ｘ8はＬｅｕであり；そしてＸ9はＴｈｒである］のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３領域からなる群より選択される重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む。
【００２２】
上述のコンセンサス配列（配列番号３２９〜３３４）を誘導する方法論は図４Ａ及び４Ｂにおいて説明される。
【００２３】
本発明はまた、表面プラズモン共鳴アッセイ（例えばＢＩＡＣＯＲＥTM）により測定して約１ｎＭ又はそれ以下の親和性（解離定数「ＫD」として表される）でＧＤＦ８に結合する、完全ヒト抗体若しくはヒト化抗体又は抗体フラグメントを特徴とする。特定の実施態様において、本発明の抗体は、約７００ｐＭ若しくはそれ以下；約５００ｐＭ若しくはそれ以下；約３２０ｐＭ若しくはそれ以下；約１６０ｐＭ若しくはそれ以下；約１００ｐＭ若しくはそれ以下；約５０ｐＭ若しくはそれ以下；約１０ｐＭ若しくはそれ以下；又は約５ｐＭ若しくはそれ以下のＫDを示す。
【００２４】
一実施態様において、本発明は、ヒトＧＤＦ８に特異的に結合して阻害し、そしてＧＤＦ８誘導性ルシフェラーゼアッセイにより測定して、約１０ｎＭに等しいか若しくはそれ以下；約５ｎＭ若しくはそれ以下；約３ｎＭ若しくはそれ以下；約２ｎＭ若しくはそれ以下；約１ｎＭ若しくはそれ以下；約５００ｐＭ若しくはそれ以下；又は約２００ｐＭ若しくはそれ以下のＩＣ50を示す、完全ヒト又はヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を提供する。以下の実験の項において示されるように、本発明の抗ＧＤＦ８抗体のいくつかは、密接な関係があるタンパク質、例えばＧＤＦ１１の活性を、ルシフェラーゼバイオアッセイにおいてＧＤＦ８よりもかなり高いＩＣ50で遮断する。一実施態様において、本発明は、ＧＤＦ１１活性の遮断に関してＧＤＦ８と比較して、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、又は少なくとも約１５００倍高いＩＣ50を示す抗体又は抗体の抗原結合フラグメントを提供する。
【００２５】
本発明は、変更されたグリコシル化パターンを有する抗ＧＤＦ８抗体を包含する。いくつかの適用において、望ましくないグリコシル化部位を除去する変更、又は例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠損した抗体（Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ  ２７７：２６７３３を参照のこと）が有用であり得る。他の適用において、ガラクトシル化の変更が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を変更するために行われ得る。
【００２６】
本発明は、ＧＤＦ８の特定のエピトープに結合し、そしてＧＤＦ８の生物学的活性を遮断することができる抗ＧＤＦ８抗体を含む。第一の実施態様において、本発明の抗体は、成熟ＧＤＦ８タンパク質（配列番号３４０）のアミノ酸約１〜約１０９；約１〜約５４；約１〜約４４；約１〜約３４；約１〜約２４；及び約１〜約１４内のエピトープに結合する。第二の実施態様において、本発明の抗体は、成熟ＧＤＦ８タンパク質（配列番号３４０）のアミノ酸約３５〜約１０９；約４５〜約１０９；約５５〜約１０９；約６５〜約１０９；約７５〜約１０９；約８５〜約１０９；約９２〜約１０９；又は約９５〜約１０９内のエピトープの１つ又はそれ以上に結合する。第三の実施態様において、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントは、成熟ヒトＧＤＦ８タンパク質のアミノ酸残基約４８〜約７２；約４８〜約６９；約４８〜約６５；約５２〜約７２；約５２〜約６５；又は約５６〜約６５のエピトープ内で結合する。
【００２７】
関連する実施態様において、本発明は、配列番号３６／３８／４０／４４／４６／４８、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８、２２８／２３０／２３２／２３６／２３８／２４０、３６２／３６４／３６６／３７０／３７２／３７４、又は３７８／３８０／３８２／３８６／３８８／３９０のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列の組み合わせを含む別の抗体と、ＧＤＦ８への特異的結合について競合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、１１４／３２２、３６０／３６８、又は３７６／３８４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む別の抗体とＧＤＦ８への特異的結合について競合する。さらに別の関連する実施態様において、本発明は、配列番号３６／３８／４０／４４／４６／４８、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８、２２８／２３０／２３２／２３６／２３８／２４０、３６２／３６４／３６６／３７０／３７２／３７４、又は３７８／３８０／３８２／３８６／３８８／３９０のＨＣＤＲ／ＬＣＤＲのアミノ酸配列の組み合わせを含む別の抗体により認識されるＧＤＦ８上のエピトープを認識する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施態様において、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１８６、１９４／２０２、２１０／２１８、２２６／２３４、２４２／２５０、２５８／２６６、２７４／２８２、２９０／２９８、３０６／３１４、１１４／３２２、３６０／３６８、又は３７６／３８４のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対を含む別の抗体により認識されるＧＤＦ８上のエピトープを認識する。
【００２８】
本発明はまた、組み換えヒト又はヒト化抗ヒトＧＤＦ８抗体及び許容しうる担体を含む組成物を特徴とする。本発明のヒト抗ＧＤＦ８抗体をコードする核酸分子を含有するベクター及びベクターを含む宿主細胞、さらにはこれらの新規な抗体を製造する方法が本発明にさらに含まれ、該方法は、本発明の抗ＧＤＦ８抗体又は抗体フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を、タンパク質の産生を可能にする条件下で増殖させ、そしてそのようにして産生されたタンパク質を回収することを含む。
【００２９】
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分を使用してＧＤＦ８活性を阻害するための方法を特徴とする。一実施態様において、この方法は、本発明の抗体又は抗体フラグメントを、ＧＤＦ８活性の阻害により寛解される障害に罹患したヒト被験体に投与することを含む。好ましい実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントを用いて処置されるヒト被験体は、グルコース恒常性の改善、体脂肪量の減少、インスリン感受性の増加、腎機能の改善及び／又は脂肪蓄積の減少を必要としている。本発明の抗体又は抗体フラグメントは、骨粗しょう症、骨減少症、変形性関節症及び骨折を含む骨減少を特徴とする疾患又は状態を処置、予防、又は抑制するため、代謝症候群を処置するため、グルココルチコイド若しくはステロイドホルモンの持続投与からの筋消耗又は筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋消耗症候群、筋肉減少症及び悪液質に関連する筋力低下に対抗するために有用である。
【００３０】
他の目的及び利点は、以下の詳細な説明を検討することにより明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】プロテイナーゼＫを用いたヒトＧＤＦ８の限定加水分解の免疫ブロット。ゲルは非還元１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、０．２μｇ  ＧＤＦ８を各レーンにロードし、そして２μｇ／ｍｌの抗体、コントロールＩ（Ａ）、１Ａ２（Ｂ）又は２１−Ｅ９（Ｃ）のいずれかであった。レーン１：消化時間１０分、１μｇ  ＧＤＦ８、０μｇプロテイナーゼＫ；レーン２：消化時間１０分、ＧＤＦ８  １μｇ、１μｇプロテイナーゼＫ；レーン３：消化時間１０分、１μｇ  ＧＤＦ８、６μｇプロテイナーゼＫ；レーン４：消化時間４５分、１μｇ  ＧＤＦ８、０μｇプロテイナーゼＫ；レーン５：消化時間４５分、ＧＤＦ８  １μｇ、１μｇプロテイナーゼＫ；レーン６：消化時間４５分、１μｇ  ＧＤＦ８、６μｇプロテイナーゼＫ。
【図２】高用量のプロテイナーゼＫを用いたヒトＧＤＦ８の限定加水分解の免疫ブロット。ゲルは非還元１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、０又は４μｇ  ＧＤＦ８を各レーンにロードし、そして２μｇ／ｍｌのコントロールＩ（Ａ）又は１Ａ２（Ｂ）のいずれかであった。レーン１：消化時間１６時間、０μｇ  ＧＤＦ８、９６μｇプロテイナーゼＫ；レーン２：消化時間１６時間、ＧＤＦ８  ４μｇ、０μｇプロテイナーゼＫ；レーン３：消化時間１６時間、４μｇ  ＧＤＦ８、２４μｇプロテイナーゼＫ；レーン４：消化時間１６時間、４μｇ  ＧＤＦ８、９６μｇプロテイナーゼＫ；レーン５：消化時間１時間、ＧＤＦ８  ４μｇ、２４μｇプロテイナーゼＫ；レーン６：消化時間１時間、４μｇ  ＧＤＦ８、９６μｇプロテイナーゼＫ；レーン７：消化時間１０分、ＧＤＦ８  ４μｇ、０μｇプロテイナーゼＫ；レーン８：消化時間１０分、４μｇ  ＧＤＦ８、２４μｇプロテイナーゼＫ。
【図３Ａ】抗体処置の前のインスリン耐性試験を受けたマウスにおける開始グルコースレベルパーセントを経時的に示すグラフ。
【図３Ｂ】抗体処置の後のインスリン耐性試験を受けたマウスにおける開始グルコースレベルパーセントを経時的に示すグラフ。
【図４Ａ】例示の抗ＧＤＦ８抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９Ｐからの重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列比較であり、これらの配列間で共有されるコンセンサス配列を示す。
【図４Ｂ】例示の抗ＧＤＦ８抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９Ｐからの軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列比較であり、これらの配列間で共有されるコンセンサス配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
本発明の方法を記載する前に、当然のことながら、記載される特定の方法、及び実験条件は変化し得るので、本発明はこのような方法及び条件に限定されない。これも当然ことながら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明する目的のみのためであり、限定することを意図されない。
【００３３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数系「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうではないと指示していなければ、複数の言及を含む。従って、例えば「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は１つ若しくはそれ以上の、方法及び／又は本明細書において記載され、かつ／若しくは本開示を読むと当業者に明らかとなる工程を含む。
【００３４】
別の定義がなければ、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において使用される用語「約」は、特定の列挙された数値に関して使用される場合、列挙された値から１％以下だけ変化し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される表現「約１００」は９９及び１０１を含み、そしてその間の全ての数値を含む（例えば９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）。
【００３５】
本明細書において記載される方法及び材料と類似するか又は等価ないずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料をここで記載する。
【００３６】
定義
「ヒト増殖分化因子−８」、「ＧＤＦ８」及び「ミオスタチン」は、配列番号３３８の核酸配列によりコードされるタンパク質並びに配列番号３３９（プロペプチド）及び３４０（成熟タンパク質）のアミノ酸配列を有するタンパク質を指すように交換可能に使用される。
【００３７】
本明細書において使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合により相互連結された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、さらにはそれらのマルチマー（例えばＩｇＭ）を指すことを意図される。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶHと略される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣH１、ＣH２及びＣH３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶLと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣL１）を含む。ＶH及びＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、これらはフレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域に組み入れられている。各ＶH及びＶLは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。本発明の異なる実施態様において、抗ＧＤＦ８抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲはヒト生殖系列配列と同一であり得、又は天然若しくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲの比較分析（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいて定義され得る。
【００３８】
本明細書において使用される用語「抗体」はまた、全長抗体分子の抗原結合フラグメントも含む。本明細書において使用される用語抗体の「抗原結合部分」、「抗原結合フラグメント」などは、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在するか、酵素的に得られるか、合成又は遺伝子的に操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば全長抗体分子からいずれかの適切な標準的な技術、例えばタンパク質分解消化、又は抗体の可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子操作技術を使用して誘導され得る。このようなＤＮＡは公知であり、かつ／又は商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ−抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、又は合成することができる。ＤＮＡは配列決定され得、そして化学的に操作され得るか、又は例えば１つ若しくはそれ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを適切な構成に配置するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を修飾、付加若しくは欠失させるなどの分子生物学的技術を使用することにより操作され得る。
【００３９】
抗原結合フラグメントの非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）2フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。他の操作された分子、例えば二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）もまた、本明細書において使用される表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
【００４０】
抗体の抗原結合フラグメントは、典型的には少なくとも１つの可変ドメインを含む。可変ドメインは任意のサイズ又はアミノ酸組成のものであり得、一般的には１つ又はそれ以上のフレームワーク配列と隣接するかインフレームである少なくとも１つのＣＤＲを含む。ＶLドメインに伴ってＶＨドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶH及びＶLドメインは互いに対していずれかの適切な配置で位置し得る。例えば、可変領域はダイマーであり得、ＶH−ＶH、ＶH−ＶL又はＶL−ＶLダイマーを含み得る。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、モノマーのＶH又はＶLドメインを含有し得る。
【００４１】
特定の実施態様において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合で連結された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見られ得る可変ドメイン及び定常ドメインの非限定的な例示の構成としては：（ｉ）  ＶH−ＣH１；（ｉｉ）  ＶH−ＣH２；（ｉｉｉ）  ＶH−ＣH３；（ｉｖ）  ＶH−ＣH１−ＣH２；（ｖ）  ＶH−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｖｉ）  ＶH−ＣH２−ＣH３；（ｖｉｉ）  ＶH−ＣL；（ｖｉｉｉ）  ＶL−ＣH１；（ｉｘ）  ＶL−ＣH２；（ｘ）  ＶL−ＣH３；（ｘｉ）  ＶL−ＣH１−ＣH２；（ｘｉｉ）  ＶL−ＣH１−ＣH２−ＣH３；（ｘｉｉｉ）  ＶL−ＣH２−ＣH３；及び（ｘｉｖ）  ＶL−ＣLが挙げられる。上に列挙した例示の構成のいずれかを含む可変ドメイン及び定常ドメインのいずれかの構成において、可変ドメイン及び定常ドメインは、互いに直接連結されていても、完全又は部分的なヒンジ又はリンカーの領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば５、１０、１５、２０、４０、６０又はそれ以上）のアミノ酸からなり得、これらは単一のポリペプチド分子中の隣接する可変ドメイン及び／又は定常ドメインの間の可動性又は半可動性の連結を生じる。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは互いにかつ／又は１つ若しくはそれ以上のモノマーＶＨ若しくはＶＬドメインと非共有結合で結合した（例えばジスルフィド結合（単数又は複数）により）、上で列挙した可変及び定常ドメイン構成のいずれかのホモダイマー又はヘテロダイマー（又は他のマルチマー）を含み得る。
【００４２】
全長抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは単一特異的でも多重特異的（例えば二重特異的）であってもよい。抗体の多重特異的抗原結合フラグメントは、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、ここで各可変ドメインは、別の抗原に特異的に結合することができるか、同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができる。本明細書において開示される例示の二重特異的抗体形式を含むいずれかの多重特異的抗体形式は、当該分野で利用可能な所定の技術を使用して本発明の抗体の抗原結合フラグメントの状況における使用のために適合され得る。
【００４３】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により機能し得る。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下での本発明の抗体による、抗原を発現している細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、そしてそれにより標的細胞の溶解をもたらす、細胞媒介性の反応を指す。ＣＤＣ及びＡＤＣＣは、当該分野で周知でありかつ利用可能なアッセイを使用して測定され得る。（例えば、米国特許第５，５００，３６２号及び同第５，８２１，３３７号、及びＣｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ９５：６５２−６５６（１９９８）を参照のこと）。
【００４４】
用語「特異的に結合する」又は同様のものは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、１ｘ１０-6Ｍ又はそれ以下の解離定数により特徴付けられ得る。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定するための方法は当該分野で周知であり、これらとしては、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。例えば、本発明の文脈においてヒトＧＤＦ８に「特異的に結合する」抗体には、ヒトＧＤＦ８又はその部分（例えば、配列番号３４０の少なくとも６つの連続したアミノ酸を含むペプチド）に、表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定して、約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満又は約０．５ｎＭ未満のＫDで結合する抗体が含まれる。（例えば本明細書の実施例３を参照のこと）。しかし、ヒトＧＤＦ８に特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＧＤＦ８分子に対して交差反応性を有し得る。
【００４５】
用語「高親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡＣＯＲＥTM）又は溶液アフィニティーＥＬＩＳＡにより測定して、約１０-8Ｍ若しくはそれ以下、約１０-9Ｍ若しくはそれ以下、約１０-10Ｍ若しくはそれ以下、約１０-11Ｍ若しくはそれ以下、又は約１０-12Ｍ若しくはそれ以下の解離定数（ＫD）でＧＤＦ８に結合することができる抗体を指す。
【００４６】
用語「遅い解離速度（ｓｌｏｗ  ｏｆｆ  ｒａｔｅ）」又は「Ｋｏｆｆ」は、表面プラズモン共鳴（例えばＢＩＡＣＯＲＥTM）で測定して、１ｘ１０-3ｓ-1又はそれ以下、好ましくは１ｘ１０-4ｓ-1又はそれ以下の速度定数でＧＤＦ８から解離する抗体を意味する。
【００４７】
「中和」又は「遮断」抗体は、ＧＤＦ８へのその結合がＧＤＦ８の生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すように意図される。ＧＤＦ８の生物学的活性のこの阻害は、ＧＤＦ８の生物学的活性の１つ又はそれ以上の指標を測定することにより評価され得る。ＧＤＦ８の生物学的活性のこれらの指標は、当該分野で公知のインビトロ又はインビボでのいくつかの標準的なアッセイの１つ又はそれ以上により評価され得る（以下の実施例を参照のこと）。
【００４８】
本明細書において開示される完全ヒト抗ＧＤＦ８抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖及び軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域において１つ又はそれ以上のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含み得る。このような変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を例えば公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより容易に確認され得る。本発明は、本明細書において開示されるアミノ酸配列のいずれかから誘導され、１つ又はそれ以上のフレームワーク領域及び／又はＣＤＲ領域内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が、対応する生殖系列残基（単数又は複数）に復帰変異されているか、又は対応する生殖系列残基（単数又は複数）の保存的アミノ酸置換（天然又は非天然）に復帰変異されている（このような配列変化は本明細書で「生殖系列復帰変異」と呼ばれる）、抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。当業者は、本明細書において開示される重鎖及び軽鎖可変領域配列から開始して、１つ又はそれ以上の個々の生殖系列復帰変異又はその組み合わせを含む多数の抗体及び抗原結合フラグメントを容易に製造することができる。特定の実施態様において、ＶH及び／又はＶLドメイン内のフレームワーク及び／又はＣＤＲ残基は全て、生殖系列配列に復帰変異される。他の実施態様において、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内若しくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内に見られる変異した残基のみ、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２若しくはＣＤＲ３内に見られる変異した残基のみが、生殖系列配列に復帰変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワーク及び／又はＣＤＲ領域内の２つ又はそれ以上の生殖系列復帰変異のいずれかの組み合わせを含有し得、すなわち、ここで特定の個々の残基が生殖系列配列に復帰変異される一方で、生殖系列配列と異なる特定の他の残基は維持される。一旦得られると、１つ又はそれ以上の生殖系列復帰変異を含有する抗体及び抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の所望の特性、例えば改善された結合特異性、増加した結合親和性、改善されたか又は増強されたアンタゴニスト又はアゴニスト生物学的特性（場合によって）、減少した免疫原性などについて容易に試験され得る。この一般的な方法で得られる抗体及び抗原結合フラグメントは、本発明内に包含される。
【００４９】
本発明はまた、１つ又はそれ以上の保存的置換を有する本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む抗ＧＤＦ８抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書において開示されるＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比較して、例えば１０又はそれ以下、８又はそれ以下、６又はそれ以下、４又はそれ以下などの保存的アミノ酸置換を含むＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、及び／又はＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＧＤＦ８抗体を含む。一実施態様において、抗体は、８又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６０及び３７６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、６又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６０及び３７６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、４又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６０及び３７６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、２又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６０及び３７６から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む。一実施態様において、抗体は、８又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６８及び３８４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、６又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６８及び３８４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、４又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６８及び３８４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。別の実施態様において、抗体は、２又はそれ以下の保存的アミノ酸置換を含む配列番号３６８及び３８４から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【００５０】
特定の実施態様において、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、治療的部分、例えば細胞毒、化学療法薬、及び免疫抑制剤又は放射性同位体に結合され得る（「免疫複合体」）。
【００５１】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、その天然環境の少なくとも１つの成分から同定され、そして分離及び／又は回収された抗体を意味する。例えば抗体が天然で存在するか又は天然で産生される生物、組織又は細胞の少なくとも１つの成分から分離されたか又は取り出された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体はまた、組み換え細胞内の原位置の抗体、さらには少なくとも１つの精製若しくは単離工程にかけられた抗体を含む。特定の実施態様によれば、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００５２】
本明細書で使用される用語「表面プラズモン共鳴」は、例えばＢＩＡＣＯＲＥTMシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出により実時間で生体分子特異的な相互作用の分析を可能にする光学的現象を指す。
【００５３】
本明細書で使用される用語「ＫD」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指すように意図される。
【００５４】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体へ特異的に結合することができるいずれかの決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様において、エピトープ決定基は、分子の化学的活性表面の分類、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基を含み、そして特定の実施態様では、特定の３次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。特定の実施態様において、抗体がタンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中のその標的抗原を優先的に認識する場合に、その抗体が抗原に特異的に結合すると言われる。例えば、抗体は、ＫDが１０-8Ｍ若しくはそれ以下、又は１０-9Ｍ若しくはそれ以下、又は１０-10Ｍ若しくはそれ以下である場合に抗原に特異的に結合すると言われる。
【００５５】
タンパク質又はポリペプチドは、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一種のポリペプチドを示す場合に「実質的に純粋」であるか、「実質的に均一」であるか又は「実質的に精製」されている。ポリペプチド又はタンパク質は、モノマーでもマルチマーでもよい。実質的に純粋なポリペプチド又はタンパク質は、典型的にはタンパク質サンプルの約５０％、６０、７０％、８０％又は９０％質量／質量を構成し、通常は純度約９５％、そして好ましくは純度９９％を超える。タンパク質の純度又は均一性は、当該分野で周知の多数の手段、例えばタンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、続いて当該分野で周知の染色剤でゲルを染色して単一のポリペプチドバンドを可視化することにより示され得る。特定の目的のために、ＨＰＬＣ又は精製のための当該分野で周知の他の手段を使用することにより、より高分解能が得られ得る。
【００５６】
本明細書で使用される用語「ポリペプチドアナログ又は変異体」は、アミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、かつ以下の特性の少なくとも１つを有する少なくとも２５のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを指す：（１）適切な結合条件下でのＧＤＦ８への特異的結合、又は（２）ＧＤＦ８の生物学的活性を遮断する能力。典型的には、ポリペプチドアナログ又は変異体は、天然に存在する配列に対して保存的アミノ酸置換（又は挿入若しくは欠失）を含む。アナログは典型的には少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００アミノ酸長又はそれ以上であり、そしてしばしば全長の天然に存在するポリペプチドと同程度の長さであり得る。
【００５７】
好ましいアミノ酸置換は：（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させ、（２）酸化に対する感受性を減少させ、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更し、（４）結合親和性を変更し、そして（４）このようなアナログの他の物理化学的又は機能的特性を付与するか又は変更するものである。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異を含み得る。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（好ましくは分子間接触を形成するドメインの外側の部分において）行われ得る。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を実質的に変化させるべきではない（例えば、アミノ酸の置き換えは、親配列に存在するらせんを破壊する傾向を有するべきなく、親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を崩壊させるべきでもない）。当該分野で認識されたポリペプチド二次構造及び三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  １９８４  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  （Ｂｒａｎｄｅｎ  ＆  Ｔｏｏｚｅ、ｅｄｓ．、１９９１、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ＮＹ）；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｔ．  １９９１  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５において記載される。
【００５８】
非ペプチドアナログは、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を有する薬物として製薬業界において一般的に使用される。これらの種類の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣薬」又は「ペプチドミメティクス」と称される（例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６）  Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；及びＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９を参照のこと）。コンセンサス配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸を同じ型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）で系統的に置換することもまた、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を含むコンストレインド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）ペプチドは、当該分野で公知の方法により（Ｒｉｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を加えることにより生成され得る。
【００５９】
核酸配列の文脈における用語「配列同一性パーセント」は、最大対応について整列された場合に同じものである、２つの配列における残基を指す。配列同一性比較の長さは、一続きの少なくとも約９ヌクレオチド長より長くてもよく、通常は少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも約３６、４８又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多数の様々なアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、ＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができ、これらはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  （ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓにおけるプログラムである。ＦＡＳＴＡ（例えばプログラムＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３を含む）は、問い合わせ配列と検索配列との間のベストオーバーラップの領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ  （１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８及び（２０００）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９）。そうではないと明記されていなければ、特定のプログラム又はアルゴリズムについてのデフォルトパラメーターを使用する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、ＦＡＳＴＡを使用してそのデフォルトパラーメーター（ワードサイズ６、及びスコアリングマトリックスについてＮＯＰＡＭファクター）用いるか、又はＧａｐ使用してＧＣＧバージョン６．１に提供されるようなそのデフォルトパラーメーターを用いて決定され得る。
【００６０】
核酸配列に対する言及は、そうではないと明記されていなければ、その補体を包含する。従って、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的な配列とともに、その相補鎖を包含すると理解されるべきである。一般に、当該分野は用語「配列同一性パーセント」、「配列類似性パーセント」及び「配列相同性パーセント」を交換可能に使用する。本出願において、これらの用語は核酸配列に関して同じ意味を有するものとする。
【００６１】
核酸又はそのフラグメントに言及する場合の用語「実質的な類似性」又は「実質的な配列類似性」は、適切なヌクレオチドの挿入又は欠失を有する別の核酸（又はその相補鎖）と最適に整列された場合に、上で考察したようないずれかの周知の配列同一性アルゴリズム（例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ又はＧａｐ）により測定して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％のヌクレオチド塩基においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００６２】
ポリペプチドに適用される用語「実質的な同一性」又は「実質的に同一」は、２つのペプチド配列が、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによりデフォルトギャップ重みを使用して最適に整列された場合に、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。２つ又はそれ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似性度は、その置換の保存的性質を補正するように上方調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  （１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照のこと。類似した化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸のグループの例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリン及びスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギン及びグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、及びヒスチジン；が挙げられ、そして６）硫黄含有側鎖はシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的な置換は、Ｇｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を有するいずれかの変化である。
【００６３】
ポリペプチドについての配列類似性（配列同一性とも呼ばれる）は、典型的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失及び他の変更に帰属される類似性の尺度を使用して類似した配列を対応させる。例えば、ＧＣＧは「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含み、これらはデフォルトパラメーターを使用して、密接に関連したポリペプチド、例えば異なる生物種由来の相同ポリペプチドの間、又は野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性又は配列同一性を決定するために使用され得る。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照のこと。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムであるＦＡＳＴＡを使用してデフォルト又は推奨のパラメーターを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、問い合わせ配列と検索配列との間のベストオーバーラップの領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ  （２０００）、前出）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合に好ましい別のアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する、コンピュータープログムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９  ４０２を参照のこと。
【００６４】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的には少なくとも約１６アミノ酸残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約２４残基、少なくとも約２８残基、又は少なくとも約３５残基である。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【００６５】
用語「有効量」は、特定の決められた目的の達成をもたらす、抗体又は抗体の抗原結合フラグメントの濃度又は量である。抗ＧＤＦ８抗体又はその抗体の抗原結合フラグメントの「有効量」は実験的に決定され得る。さらに、「治療有効量」は、決められた治療効果を達成するために有効な、抗ＧＤＦ８抗体又はその抗原結合フラグメントの濃度又は量である。この量もまた実験的に決定され得る。
【００６６】
ヒト抗体の製造
完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は当該分野で公知である。いずれかのこのような公知の方法を、ＧＤＦ８に特異的に結合するヒト抗体を作製するために本発明の状況において使用することができる。
【００６７】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥTM技術又はモノクローナル抗体を生成するためのいずれかの他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する、ＧＤＦ８に対する高親和性キメラ抗体を最初に単離する。以下の実験の項におけるように、抗体は親和性、選択性、エピトープなどを含む所望の特徴を有し、それらについて選択される。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型又は改変されたＩｇＧ１又はＩｇＧ４を生成するために所望のヒト定常領域と置き換えられる。選択される定常領域は特定の用途によって変わり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は可変領域に属する。
【００６８】
一般に、本発明の抗体は、非常に高い親和性を有し、固相に固定されているか又は溶液相中のいずれかの抗原への結合により測定した場合、典型的には約１０-12〜約１０-9ＭのＫDを有する。マウス定常領域は、本発明の完全ヒト抗体、例えば野生型ＩｇＧ１（配列番号３３５）若しくはＩｇＧ４（配列番号３３６）、又は改変されたＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４（例えば配列番号３３７）を生成するために所望のヒト定常領域と置き換えられる。選択される定常領域は特定の用途によって変わり得るが、高親和性抗原結合及び標的特異性の特徴は可変領域に属する。
【００６９】
生物学的同等物（Ｂｉｏｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）
本発明の抗ＧＤＦ８抗体及び抗体フラグメントは、記載される抗体のアミノ酸配列から変化したアミノ酸配列を有するがヒトＧＤＦ８に結合する能力は保持しているタンパク質を包含する。このような変異体抗体及び抗体フラグメントは、親配列と比較した場合にアミノ酸の１つ又はそれ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、記載される抗体の生物学的活性と本質的に同等の生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ＧＤＦ８抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較してヌクレオチドの１つ又はそれ以上の付加、欠失又は置換を含むが、本発明の抗ＧＤＦ８抗体又は抗体フラグメントと本質的に生物学的に同等である抗ＧＤＦ８抗体又は抗体フラグメントをコードする配列を包含する。このような変異体アミノ酸及びＤＮＡ配列の例は上で考察されている。
【００７０】
２つの抗原結合タンパク質、又は抗体は、例えばそれらが、その吸収の速度及び程度が、単回用量又は複数回用量のいずれかで同様の実験条件下で同じモル用量で投与された場合に有意な差異を示さない薬学的等価物又は薬学的代替物である場合に、生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体は、それらの吸収の程度において等価であるがそれらの吸収速度は等価でない場合に等価物又は薬学的代替物とみなされ、そしてさらに吸収速度におけるこのような差異が意図的でかつ標識化で反映され、例えば慢性的使用で有効な身体薬物濃度の達成に本質的ではなく、そして研究される特定の製剤については医学的に重要でないと考えられるので、生物学的に同等とみなされ得る。
【００７１】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、及び効力において臨床的に意味のある差異がない場合に生物学的に同等である。
【００７２】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、参照製品との交換を行わずに継続された治療と比較して、有害作用（免疫原性の臨床的に有意な変化、又は減少した有効性を含む）の危険性の予期される増加を伴わずに、参照製品と生物学的製品とを１回又はそれ以上交換することができる場合、生物学的に同等である。
【００７３】
一実施態様において、２つの抗原結合タンパク質は、それらが両方とも使用の条件（単数又は複数）について共通の作用機構（単数又は複数）により、このような機構が知られている程度まで作用する場合に生物学的同等である。
【００７４】
生物学的同等性はインビボ及びインビトロの方法で実証され得る。生物学的同等性の測定としては、例えば、（ａ）抗体又はその代謝物の濃度が血液、血漿、血清又は他の生体液において時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボでの試験；（ｂ）ヒトインビボバイオアベイラビリティーデータと相関しており、かつヒトインビボバイオアベイラビリティーデータを合理的に予測するインビボでの試験；（ｃ）抗体（又はその標的）の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定される、ヒト又は他の哺乳動物におけるインビボでの試験；及び（ｄ）抗体の安全性、有効性、又はバイオアベイラビリティー若しくは生物学的同等性を確立する十分に制御された臨床試験におけるものが挙げられる。
【００７５】
本発明の抗ＧＤＦ８抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば残基若しくは配列の様々な置換を行うことにより、又は生物学的活性に必要のない末端若しくは内部残基若しくは配列を欠失させることにより構築され得る。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、再生の際に不必要か又は不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するために欠失され得るか又は他のアミノ酸と置き換えられ得る。他の状況において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を変更するアミノ酸変化、例えばグリコシル化を排除又は除去する変異を含む抗ＧＤＦ８抗体変異体を含み得る。
【００７６】
エピトープマッピング及び関連する技術
特定のエピトープに結合する抗体（例えば、ＩｇＥのその高親和性受容体への結合を遮断するもの）をスクリーニングするために、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９０）（前出）に記載されるような慣用の交差遮断アッセイが行われ得る。他の方法としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８：４４３−６３）、又はペプチド切断分析が挙げられる。さらに、エピトープ切除、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾のような方法を使用することができる（Ｔｏｍｅｒ  （２０００）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９：４８７−４９６）。
【００７７】
用語「エピトープ」は、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次折り畳みにより並置される連続していないアミノ酸の両方から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的には変性溶媒に対してさらされた状態で保持され、一方で三次折り畳みにより形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは典型的には少なくとも３、そしてより通常では少なくとも５又は８〜１０のアミノ酸を独特の空間配置で含む。
【００７８】
改変補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＭＡＰ）（抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（ＡＳＡＰ）としても知られる）は、同じ抗原に対して特異的な多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、化学的又は酵素的に改変された抗原表面への各抗体の結合プロフィールの類似性にしたがって分類する方法である（ＵＳ２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープと明らかに異なるか、又は部分的に重複する独特のエピトープを示し得る。この技術は、遺伝的に同一の抗体の速いフィルタリングを可能にし、その結果特徴付けを遺伝的に異なる抗体に集中させることができる。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、ＭＡＰは所望の特徴を有するｍＡｂを産生する微量のハイブリドーマクローンの同定を容易にし得る。ＭＡＰは、本発明の抗ＧＤＦ８抗体を、異なるエピトープに結合する抗体のグループに分類するために使用され得る。
【００７９】
本発明は、ヒトＧＤＦ８（配列番号３４０）の特定のエピトープに結合し、そしてＧＤＦ８の生物学的活性を遮断することができる抗ＧＤＦ８抗体及び抗体の抗原結合フラグメントを含む。一実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基１〜１０９；１〜５４；１〜４４；１〜３４；１〜２４；及び１〜１４を含むエピトープ内に結合する。別の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基６５〜７２；３５〜１０９；４５〜１０９；５５〜１０９；６５〜１０９；７５〜１０９；８５〜１０９；９２〜１０９；又は９５〜１０９から構成されるエピトープ内に結合する。別の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基４８〜７２；４８〜６９；４８〜６５；５２〜７２；５２〜６５；又は５６〜６５を含むエピトープ内に結合する。特定の実施態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、２つ又はそれ以上のエピトープ内に結合し得る。
【００８０】
本発明はまた、野生型成熟ＧＤＦ８（配列番号３４０）に結合するが、配列番号３４０の全長アミノ酸配列よりも少ない単離されたペプチドには結合しない、抗体及びその抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、野生型成熟ＧＤＦ８（配列番号３４０）に結合するが、配列番号３４０の１０〜４０の連続したアミノ酸配列からなる単離されたペプチドには結合しない抗ＧＤＦ８抗体を含む。本発明はまた、野生型成熟ＧＤＦ８内のいずれの線状エピトープにも結合しない抗ＧＤＦ８抗体を含む。本発明の特定の実施態様において、抗ＧＤＦ８抗体は、配列番号３４０を含む野生型成熟ヒトＧＤＦ８に結合するが、配列番号３４０のアミノ酸１〜１４、１〜１８、１７〜４２、４８〜６５、４８〜６９、４８〜７２、５２〜６５、５２〜７２、５６〜６５、５６〜７２、６５〜７２、７３〜９０、７５〜１０５及び９１〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する１つ又はそれ以上の単離されたＧＤＦ８ペプチドには結合しない。特定の実施態様において、抗ＧＤＦ８抗体は、上述のＧＤＦ８ペプチドのいずれにも結合しない。所定の抗体が特定のＧＤＦ８ペプチドに結合することができるかどうかを決定する方法は、当業者に公知である。１つの例となる方法は本明細書において実施例７で説明されており、その方法ではＧＤＦ８ペプチドをミクロスフェアに結合し、抗体をそのペプチド結合ミクロスフェアに加え、そして洗浄工程に続いて、抗体が結合したミクロスフェアを検出する。結合した抗体が存在しないことは、その抗体が試験された特定のペプチドに結合しないことを示す。
【００８１】
本発明はまた、野生型成熟ヒトＧＤＦ８（例えば、配列番号３４０を含むタンパク質又はポリペプチド）に特異的に結合するが、ＧＤＦ８の特定のアミノ酸が、非同一であるが関連するタンパク質（例えばＴＧＦβ−１）からの対応するアミノ酸配列で置き換えられているキメラＧＤＦ８構築物に結合しない単離されたヒト抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。一例において、キメラ構築物は、成熟ＧＤＦ８のアミノ酸４８〜７２がＴＧＦβ−１の対応するアミノ酸配列（例えば、ＴＧＦβ−１のアミノ酸４９〜７６）で置き換えられているＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１キメラである。１つのこのようなキメラの例は配列番号３５２で表される（本明細書中の実施例４及び６を参照のこと）。従って、特定の実施態様において、本発明の抗体は、野生型成熟ヒトＧＤＦ８（配列番号３４０）に特異的に結合するが、配列番号３５２のキメラＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１構築物には結合せず、このことは、上記抗体が結合するエピトープが、配列番号３４０の残基４８〜７２内に位置するアミノ酸を含むか又は包含するこということを示す。本明細書の実施例４において記載されるアッセイのようなブロッキングアッセイもまた、抗体が野生型成熟ヒトＧＤＦ８（配列番号３４０）に結合し、かつキメラＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１構築物（例えば配列番号３５２の構築物）に結合しないかどうかを間接的に確認するために使用され得る。例えば、野生型成熟ヒトＧＤＦ８の生物学的活性を遮断するが、キメラＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１の生物学的活性は遮断しない抗体は、キメラ構築物中の対応するＴＧＦβ−１配列により置き換えられているＧＤＦ８の部分に結合するとみなされる。
【００８２】
同様に、本発明はまた、バイオアッセイにおいて野生型成熟ＧＤＦ８媒介活性を遮断するが、キメラＧＤＦ８構築物（例えば、成熟ＧＤＦ８のアミノ酸４８〜７２がＴＧＦβ−１の対応するアミノ酸配列で置き換えられているＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１キメラ（例えば配列番号３５２））の活性を遮断しない、単離されたヒト抗体又はその抗原結合フラグメントも含む。本発明のこの局面の状況において使用され得る例となるＧＤＦ８バイオアッセイは、本明細書において実施例４で記載されるＧＤＦ８誘導性ルシフェラーゼアッセイであるが、ＧＤＦ８の細胞活性を測定することができる他の類似したバイオアッセイも同様に本明細書において考慮される。
【００８３】
本発明は、本明細書において記載される特定の例となる抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＧＤＦ８抗体を含む。同様に、本発明はまた、ＧＤＦ８又はＧＤＦ８フラグメントへの結合について、本明細書に記載される特定の例となる抗体のいずれかと交差競合する抗ＧＤＦ８抗体も含む。
【００８４】
抗体が参照抗ＧＤＦ８抗体と同じエピトープに結合するかどうか、又は参照抗ＧＤＦ８抗体との結合について競合するかどうかは当該分野で公知の所定の方法を使用することにより容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗ＧＤＦ８抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でＧＤＦ８タンパク質又はペプチドに結合させる。次に、ＧＤＦ８分子に結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗ＧＤＦ８抗体との飽和結合後にＧＤＦ８に結合することができる場合、その試験抗体は参照抗ＧＤＦ８抗体と異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。他方で、試験抗体が参照抗ＧＤＦ８抗体との飽和結合の後にＧＤＦ８分子に結合することができない場合、その試験抗体は本発明の参照抗ＧＤＦ８抗体により結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。次いでさらなる所定の実験（例えば、ペプチド変異及び結合分析）を行って、試験抗体が結合しないと観察されたことが実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、又は立体的な遮断（又は別の現象）が観察された結合しないことの原因であるのかどうかを確認し得る。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー又は当該分野で利用可能ないずれかの他の定量的若しくは定性的な抗体結合アッセイを使用して行われ得る。本発明の特定の実施態様によれば、同じ（又は重複する）エピトープに結合する２つの抗体は、例えば１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰である一方の抗体が、競合結合アッセイにおいて測定して、他方の結合を少なくとも５０％阻害するが、好ましくは７５％、９０％又は９９％も阻害する場合に、同じ（又は重複する）エピトープに結合する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０：５０：１４９５−１５０２を参照のこと）。あるいは、一方の抗体の結合を減少させるか又は排除する、抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合するとみなされる。一方の抗体の結合を減少させるか又は排除するアミノ酸変異の一部のみが他方の結合を減少させるか又は排除する場合、２つの抗体は「重複するエピトープ」を有するとみなされる。
【００８５】
抗体が参照抗ＧＤＦ８抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論が２つの方向性で行われる：第一の方向性では、参照抗体を飽和条件下でＧＤＦ８分子に結合させて、続いて試験抗体のＧＤＦ８分子への結合を評価する。第二の方向性において、試験抗体を飽和条件下でＧＤＦ８分子に結合させて、続いて参照抗体のＧＤＦ８分子への結合を評価する。両方の方向性において、第一の（飽和）抗体のみがＧＤＦ８分子に結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体はＧＤＦ８への結合について競合すると結論づけられる。当業者には当然のことながら、参照抗体と結合について競合する抗体は、参照抗体と同じエピトープに必ずしも結合しないかもしれないが、重複するか又は隣接するエピトープを結合することにより参照抗体の結合を立体的にブロックするかもしれない。
【００８６】
種選択性及び種交差反応性
本発明の特定の実施態様によれば、抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合するが他の種由来のＧＤＦ８には結合しない。あるいは、本発明の抗ＧＤＦ８抗体は、特定の実施態様において、ヒトＧＤＦ８に結合し、かつ１つ又はそれ以上の非ヒト種由来のＧＤＦ８に結合する。例えば、本発明の抗ＧＤＦ８抗体は、ヒトＧＤＦ８に結合し得、そして場合によっては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マーモセット、アカゲザル又はチンパンジーのＧＤＦ８のうち１つ又はそれ以上に結合してもしなくてもよい。
【００８７】
免疫複合体
本発明は、治療的部分（例えば、細胞毒素、化学療法薬、免疫抑制剤又は放射性同位体）に結合したヒト又はヒト化抗ＧＤＦ８モノクローナル抗体（免疫複合体）を包含する。細胞毒素剤は、細胞に有害な薬剤を含む。免疫複合体を形成するために適した細胞毒素剤及び化学療法薬の例は当該分野で公知であり、例えばＷＯ０５／１０３０８１を参照のこと。
【００８８】
多重特異的抗体
本発明の抗体は、単一特異的、二重特異的、又は多重特異的であり得る。多重特異的抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得るか、又は１つより多くの標的ポリペプチドに対して特異的な抗原結合ドメインを含み得る。例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４を参照のこと。本発明の抗ＧＤＦ８抗体は、別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質に連結されても、それらと同時発現されてもよい。例えば、抗体又はそのフラグメントは、第二の結合特異性を有する二重特異的又は多重特異的な抗体を製造するために、１つ又はそれ以上の他の分子実体、例えば別の抗体又は抗体フラグメントに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他の方法により）機能的に連結され得る。例えば、本発明は、免疫グロブリンの１つのアームがヒトＧＤＦ８又はそのフラグメントに特異的であり、そして免疫グロブリンの他のアームが第二の治療標的に特異的であるか又は治療的部分に結合されている二重特異的抗体を含む。
【００８９】
本発明の状況において使用され得る例となる二重特異的抗体の形式は、第一の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメイン及び第二のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用を含み、ここで第一及び第二のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸により互いに異なり、そしてここで少なくとも１つのアミノ酸の差異が、そのアミノ酸の差異がない二重特異的抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異的抗体の結合を減少させる。一実施態様において、第一のＩｇ  ＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、そして第二のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡ結合を減少させるか又は消滅させる変異（例えばＨ９５Ｒ変更（ＩＭＧＴエキソン番号付けによる；ＥＵ番号付けではＨ４３５Ｒ））を含む。第二のＣＨ３はＹ９６Ｆ変更（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＹ４３６Ｆ）をさらに含み得る。第二ＣＨ３内で見られ得るさらなる変更としては以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、及びＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵではＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、及びＶ４２２Ｉ）；並びにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、及びＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵではＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、及びＶ４２２Ｉ）。上記の二重特異的抗体の形式に対する変形は本発明の範囲内で検討される。
【００９０】
治療的投与及び製剤
本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む治療用組成物を提供する。本発明に従う治療用組成物の投与は、適切な担体、添加剤及び製剤中に組み込まれて改善された輸送、送達、耐性などをもたらす他の薬剤と共に投与される。多数の適切な製剤が全ての薬剤師に公知の処方集において見られ得る：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ。これらの製剤としては、例えば散剤、ペースト剤、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM）、ＤＮＡ結合体、無水吸収ペースト、水中油及び油中水型乳剤、乳剤ｃａｒｂｏｗａｘ（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固形ゲル、並びにｃａｒｂｏｗａｘを含有する半固形混合物が挙げられる。前述の混合物のいずれも、製剤中の活性成分がその製剤により不活性化されず、かつ製剤が生理学的に適合性であり投与経路で許容できるものであるならば、本発明に従う処置及び治療において適切であり得る。Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２：２３８−３１１も参照のこと。
【００９１】
用量は、投与しようとする被験体の年齢及び大きさ、対象の疾患、状態、投与経路などに依存して変わり得る。本発明の抗体がＧＤＦ８に関連する様々な状態及び疾患、例えば筋ジストロフィー、筋萎縮症、筋消耗症候群、筋肉減少症及び悪液質の処置のために成人患者において使用される場合、本発明の抗体を、通常は約０．０１〜約２０ｍｇ／体重ｋｇ、約０．１〜約１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は約０．１〜約５ｍｇ／体重ｋｇの単回用量で静脈内投与することが有利である。状態の重症度によって、処置の頻度及び期間は調整され得る。他の非経口投与及び経口投与において、抗体は上で示した用量に相当する用量で投与され得る。状態が特に重症である場合、用量は、状態によって、存在する場合は重大な副作用を引き起こす量まで増加され得る。
【００９２】
様々な送達系が公知であり、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る、例えば、リポソーム封入、微小粒子、マイクロカプセル、変異ウイルスを発現することができる組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２を参照のこと）。導入方法としては、限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口の経路が挙げられる。組成物は、いずれかの都合の良い経路により、例えば注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜の内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜など）を通る吸収により投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身的でも局所でもよい。
【００９３】
医薬組成物はまた、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３を参照のこと）。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、標準的な針及びシリンジで皮下又は静脈内に送達され得る。さらに、皮下送達に関して、ペン型送達デバイスは本発明の医薬組成物の送達において容易に有用性を有する。このようなペン型送達デバイスは再使用可能でも使い捨てでもよい。再使用可能なペン型送達装置は、一般的に医薬組成物を含有する交換式カートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与されてカートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄して、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。その後ペン型送達デバイスを再使用することができる。使い捨てのペン型送達デバイスには交換式カートリッジはない。むしろ、使い捨てペン型送達デバイスは、デバイス内のレザバー中に保持された医薬組成物で予め充填（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ）される。レザバーの医薬組成物が空になると、デバイス全体を廃棄する。
【００９５】
多数の再使用可能なペン型及び自動注入送達デバイスが、本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する。例としては、限定されないが、少し名前を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮTM（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣTMペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｒｇｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５TMペン、ＨＵＭＡＬＯＧTMペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０TMペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮTM  Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲTM  （Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤTMペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮTM、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯTM、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴTM、並びにＯＰＴＩＣＬＩＫTM  （ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。本発明の医薬組成物の皮下送達において有用性を有する使い捨てペン型送達デバイスの例としては、限定されないが、少し名前を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲTMペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮTM（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮTM（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫTM自動注入装置（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴTM  （Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ  （Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡTMペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられる。
【００９６】
特定の状況において、医薬組成物は、制御放出系で、例えばポンプ又はポリマー材料を使用して送達され得る。別の実施態様において、制御放出系を組成物の標的の近位に配置することができ、従って全身用量のほんの一部しか必要とされない。
【００９７】
経口投与用の組成物の例としては、固形又は液状の投薬形態、具体的には、錠剤（糖剤及びフィルムコート錠を含む）、丸剤、顆粒剤、粉末状製剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。このような組成物は、公知の方法により製造され、そして製剤分野で従来使用されるビヒクル、希釈剤又は添加剤を含有する。錠剤用のビヒクル又は添加剤の例は、ラクトース、デンプン、スクロース、ステアリン酸マグネシウムなどである。
【００９８】
注射用製剤は、静脈内、皮下、皮内、及び筋内注射、点滴などのための投薬形態を含み得る。これらの注射用製剤は公知の方法により製造され得る。例えば、注射用製剤は、例えば上記の抗体又はその塩を、注射に従来使用される滅菌水性媒体又は油性媒体中に溶解、懸濁又は乳化させることにより製造され得る。注射用の水性媒体としては、例えば生理食塩水、グルコース及び他の補助剤などを含有する等張液があり、これらは適切な可溶化剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］などと組み合わせて使用され得る。油性媒体としては、例えばゴマ油、大豆油などが使用され、これらは可溶化剤、例えば安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと組み合わせて使用され得る。このようにして製造された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。
【００９９】
上記の経口又は非経口用途のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合させるために適した単位用量の投薬形態へと有利に製造される。このような単位用量の投薬形態としては、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される前記の抗体の量は、一般的には単位用量の投薬形態あたり約５〜５００ｍｇであり；特に注射の形態では、前記抗体は、他の投薬形態について約５〜１００ｍｇ及び約１０〜２５０ｍｇで含まれることが好ましい。
【０１００】
抗体の治療的使用
本発明の抗体は、とりわけ、ＧＤＦ８活性に関連するいずれかの疾患又は障害の処置、予防及び／又は寛解のために有用である。より詳細には、本発明の抗体は、個体における筋肉の強度／筋力及び／若しくは筋肉量及び／若しくは筋肉機能を増加させることにより、又はＧＤＦ８活性を遮断することにより代謝（炭水化物、脂質及びタンパク質プロセシング）を有利に変更することにより改善され得るいずれかの状態又は障害の処置のために有用である。本発明の抗ＧＤＦ８抗体を用いて処置され得る例となる疾患、障害及び状態としては、限定されないが、筋肉減少症、悪液質（特発性か又は他の状態、例えば癌、慢性腎不全若しくは慢性閉塞性肺疾患に対して二次的のいずれか）、筋損傷、筋消耗及び筋萎縮症、例えば不活動、不動、床上安静、外傷、医療処置若しくは外科的処置（例えば、股関節骨折、人工股関節置換、人工膝関節置換など）により引き起こされるか若しくはそれらに伴うか、又は人工呼吸の必要による筋萎縮又は筋消耗が挙げられる。本発明の抗ＧＤＦ８抗体はまた、癌、肥満、糖尿病、関節炎、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、骨粗しょう症、変形性関節症、骨減少症、代謝症候群（糖尿病、肥満、栄養障害、器官萎縮症（ｏｒｇａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）、慢性閉塞性肺疾患及び、及び食欲不振が挙げられるがこれらに限定されない）のような疾患を処置、予防又は寛解させるために使用され得る。
【０１０１】
本発明は、本発明の抗ＧＤＦ８抗体を、少なくとも１つのさらなる治療的に活性な成分と組み合わせて投与することを含む治療投与計画を含む。このようなさらなる治療的に活性な成分の非限定的な例としては、他のＧＤＦ８抗体（例えば、ＧＤＦ８の小分子阻害剤又は他のＧＤＦ８抗体若しくは結合分子）、増殖因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、及び細胞傷害性／細胞増殖抑制剤が挙げられる。さらなる治療的に活性な成分（単数又は複数）は、本発明の抗ＧＤＦ８抗体の投与の前に、投与と同時に、又は投与後に投与され得る。
【０１０２】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＧＤＦ８抗体はまた、例えば診断目的のために、サンプル中のＧＤＦ８を検出及び／又は測定するために使用され得る。例えば、抗ＧＤＦ８抗体又はそのフラグメントは、ＧＤＦ８の異常な発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現しないことなど）を特徴とする状態又は疾患を診断するために使用され得る。ＧＤＦ８についての例となる診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを本発明の抗ＧＤＦ８抗体と接触させることを含み得、ここでこの抗ＧＤＦ８抗体は、検出可能な標識又はレポーター分子で標識されている。あるいは、非標識抗ＧＤＦ８抗体を、それ自体検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識又はレポーター分子は、放射性同位体、例えば3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、若しくは125Ｉ；蛍光性若しくは化学発光性の部分、例えばフルオレセインイソチオシアネート、若しくはローダミン；又は酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはルシフェラーゼであり得る。サンプル中のＧＤＦ８を検出又は測定するために使用され得る特定の例となるアッセイとしては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１０３】
本発明に従ってＧＤＦ８診断アッセイにおいて使用され得るサンプルは、正常又は病的状態下の患者から得られ、検出可能な量のＧＤＦ８タンパク質又はそのフラグメントを含有するいずれかの組織又は体液サンプルがを含む。一般的に、健常患者（例えば異常なＧＤＦ８のレベル又は活性に関連する疾患又は状態に罹患していない患者）から得られる特定のサンプル中のＧＤＦ８のレベルが、ＧＤＦ８のベースライン又は標準レベルを最初に確立するために測定される。次いでこのＧＤＦ８のベースラインレベルを、ＧＤＦ８関連疾患又は状態を有することが疑われる個体から得られたサンプルにおいて測定されたＧＤＦ８レベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０１０４】
実施例１．  ヒトＧＤＦ８に対するヒト抗体の生成
マウスを当該分野で公知のいずれかの方法により免疫し得る（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、前出を参照のこと）。一実施態様において、ＧＤＦ８抗原を、免疫応答を賦活するためのアジュバントを用いて、ヒトＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ(R)マウスに直接投与した。適切なアジュバントとしては、完全及び不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント系（Ｓｉｇｍａ）、又はＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）（Ｏ’Ｈａｇａｎ  ２０００  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ、ｂｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔａｗａ、ＮＪを参照のこと）が挙げられる。抗体免疫応答を、標準的な抗原特異的イムノアッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答が得られたら、一実施態様において、抗体発現Ｂ細胞を採取し、そしてマウス骨髄腫細胞と融合させてそれらの生存能を保ち、そしてハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし、そして抗原特異的抗体を産生する細胞株を同定するために選択した。
【０１０５】
あるいは、抗原特異的ハイブリドーマ細胞を、フローサイトメトリーにより単離してもよい。手短には、骨髄腫細胞への融合後に、プールしたハイブリドーマ細胞を１０日間ＨＡＴ培地で増殖させる。次いで細胞を採取し、そしてビオチン標識ＧＤＦ８  ２μｇ／ｍｌで１時間染色し、続いてフィコエリトリン−ストレプトアビジンを加える。蛍光標識細胞をフローサイトメトリーで分別し（ハイブリドーマ成長培地を含有する９６ウェルプレート中に１ウェルあたり単一の細胞）、８〜１０日間培養し、そして機能的に望ましいモノクローナル抗体の存在について馴化培地スクリーニングする。
【０１０６】
別の実施態様において、抗ＧＤＦ８抗体を脾細胞の直接単離により生成した。抗原特異的抗体を、Ｕ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、抗原免疫Ｂ細胞から骨髄腫細胞への融合なしに直接的に単離した。安定な組み換え抗体発現ＣＨＯ細胞株を単離した適切な組換え体から樹立した。
【０１０７】
実施例２．  遺伝子利用分析
産生される抗体の構造を分析するために、抗体可変領域をコードする核酸をクローンし、そして配列解析した。核酸配列及び抗体の推定アミノ酸配列から、遺伝子利用を、各抗体鎖について同定した。表１は、本発明に従う選択された抗体についての遺伝子利用を示す。抗体識別子（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）：２１−Ｅ５（配列番号３４／４２）；２１−Ｂ９（配列番号１８／２６）；２１−Ｅ９（配列番号９８／１０６）；２１−Ａ２（配列番号２／１０）；２２−Ｄ３（配列番号５０／５８）；２２−Ｅ６（配列番号６６／７４）；２２−Ｇ１０（配列番号８２／９０）；１Ａ２（配列番号２２６／２３４）；２０Ｂ１２（配列番号２７４／２８２）；５８Ｃ８（配列番号２４２／２５０）；１９Ｆ２（配列番号２５８／２６６）；８Ｄ１２−１（配列番号１１４／１２２）；４Ｅ３−７（配列番号１９４／２０２）；９Ｂ１１−１２（配列番号１６２／１７０）；４Ｂ９（配列番号２２６／２３４）；１Ｈ４−５（配列番号２１０／２１８）；９Ｂ４−３（配列番号１７８／１８６）；３Ｅ２−１（配列番号２９０／２９８）；４Ｇ３−２５（配列番号３０６／３１４）；４Ｂ６−６（配列番号１３０／１３８）；Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２（配列番号３６０／３６８）；Ｈ４Ｈ１６６９Ｐ（配列番号３７６／３８４）。
【０１０８】
【表１】
0005896993.tif 000002
【０１０９】
以下の実施例において使用されるコントロール構築物
様々なコントロール構築物（抗ＧＤＦ８抗体及び他のＧＤＦ８アンタゴニスト）を、比較の目的のために以下の実験に含めた。コントロール構築物を以下のように指定した：コントロールＩ：ＵＳ７，２６１，８９３において記載される「Ｍｙｏ２９」  の対応するドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１６及び１８）を有する重鎖及び軽鎖可変領域を含むヒト抗ＧＤＦ８抗体；コントロールＩＩ：ＵＳ  ２００６／０２６３３５４において記載される「２＿１１２＿Ｋ」の対応するドメインのアミノ酸配列（すなわち、配列番号１１８及び１２０）を有する重鎖及び軽鎖可変領域を含むヒト抗ＧＤＦ８抗体；コントロールＩＩＩ：配列番号３９１のアミノ酸配列を有するＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合構築物；並びにコントロールＩＶ：配列番号３９１の６４位のアラニン［Ａ６４］がアルギニンで置き換えられている［Ｒ６４］こと以外はコントロールＩＩＩと同一の変異ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合構築物（全てのコントロール構築物を全ての実施例で使用したわけではない）。
【０１１０】
実施例３．  抗原結合親和性決定
選択された抗体に対する抗原結合についての平衡解離定数（ＫD値）を、実時間バイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡＣＯＲＥTM２０００）を使用して表面動力学により決定した。各々の選択された抗体を、ＢＩＡＣＯＲＥTMチップへの直接的化学カップリングにより生成したヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体表面又はヤギ抗ｈＦｃポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ）表面のいずれかに捕捉して、捕捉抗体表面を形成した。ヒトＧＤＦ８ホモダイマー、ｈＧＤＦ１１ホモダイマー、又はｈＧＤＦ５ホモダイマーを２５ｎＭで捕捉抗体表面上に注入し、そして抗原−抗体結合及び解離を実時間で室温にてモニタリングした。動力学的分析を行ってＫD、解離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）及び抗原／抗体複合体解離の半減期を計算した（表２）。
【０１１１】
【表２】
0005896993.tif 000003
【０１１２】
前述の実験を、候補抗体Ｈ４Ｈ１６６９Ｐ又はＨ４Ｈ１６５７Ｎ２の捕捉抗体表面上に適用されたＧＤＦ８でも行った。予備的データは、両方の抗体について非常に遅い解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を示し、１〜２ｐＭ又はそれ以下のＫDが示唆された。
【０１１３】
選択された抗体に対する抗原結合についてのＫD値もまた、ＢＳＡを含有しない改変ランニングバッファを用いて上記のように決定した。
【０１１４】
【表３】
0005896993.tif 000004
【０１１５】
さらなる抗原結合実験を行い、ここではＧＤＦ８及びＧＤＦ１１を選択された抗ＧＤＦ８抗体及びコントロール抗体の表面上に２５℃及び３７℃で適用した。選択された抗体に対する抗原結合についての平衡解離定数（ＫD値）を、実時間バイオセンサー表面プラズモン共鳴アッセイ（ＢＩＡＣＯＲＥTMＴ１００）を使用して表面動力学により決定した。各々の選択された抗体又はコントロールを、ＢＩＡＣＯＲＥTM  ＣＭ５センサーチップへの直接的化学カップリングにより作製されたヤギ抗ｈＦｃポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ  Ｃａｔ＃１０９−００５−０９８）表面上に捕捉して捕捉抗体表面を形成した。様々な濃度（２．５〜０．６２５ｎＭ、２倍希釈）のｈＧＤＦ８ホモダイマー又はｈＧＤＦ１１ホモダイマー（又はいくつかの実験ではアクチビンＡ）を捕捉抗体表面上に注入し、そして抗原−抗体結合及び解離を実時間でモニタリングした。動力学的分析を行って、ＫD、解離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）及び抗原／抗体複合体解離の半減期を計算した。結果を表４にまとめる。（ＮＢ＝結合は観察されなかった）。
【０１１６】
【表４】
0005896993.tif 000005
【０１１７】
上で示したように、本発明の抗体Ｈ４Ｈ１６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２、及び１Ａ２−ｈＩｇＧは、全てＧＤＦ８への強い結合を示したが、ＧＤＦ１１の結合は示さなかった。それに反して、コントロール分子はＧＤＦ８及びＧＤＦ１１の両方への結合を示した。
【０１１８】
実施例４．  Ｓｍａｄ２／ルシフェラーゼ応答の抗体遮断
ＧＤＦ８誘導性ルシフェラーゼアッセイ。  ＧＤＦ８又はＧＤＦ１１応答性プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現を含む操作されたＡ２０４細胞株（ヒト横紋筋肉腫細胞、ＡＴＣＣ）を使用して、選択された抗ＧＤＦ８抗体がＧＤＦ８媒介又はＧＤＦ１１媒介細胞機能をインビトロで中和する能力を決定するためにのバイオアッセイを開発した。ＧＤＦ８又はＧＤＦ１１誘導性ルシフェラーゼ活性の阻害を以下のように決定した：細胞を９６ウェルプレート上に培地中２ｘ１０4細胞／ウェルで播種し、そして終夜３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。抗体タンパク質（細胞培地中２５ｎＭから始まる段階希釈）を２つのプレートでＡ２０４／Ｓｍａｄ２細胞のウェルに三連で加えた；ＧＤＦ８又はＧＤＦ１１（０．８ｎＭ）を各ウェルに加えた。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ2で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ(R)基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることにより決定し、そしてＩＣ50値を決定した（表５）。
【０１１９】
【表５】
0005896993.tif 000006
【０１２０】
選択された抗ＧＤＦ８抗体の、ＧＤＦ８媒介又はＧＤＦ１１媒介細胞機能を中和する能力を、多様な濃度のＧＤＦ８又はＧＤＦ１１を用いて上記のようにさらに分析した（表６）。（ｎｄ＝測定していない；ＮＢ＝結合はない）。
【０１２１】
【表６】
0005896993.tif 000007
【０１２２】
上記のバイオアッセイを、活性化ペプチドとしてＧＤＦ８／ＴＧＦβ−１キメラ構築物を使用して繰り返した。詳細には、アミノ酸４８〜７２がＴＧＦβ−１  の対応するアミノ酸で置き換えられた成熟ＧＤＦ８からなるキメラをこの実験で使用した（配列番号３５２、本明細書では「ＧＤＦ８／ＴＧＦβ［４８−７２］」とも呼ばれる）。これを、ヒトＴＧＦβ−１配列が対応するＧＤＦ８配列と置き換わる完全ヒトＧＤＦ８前駆体をコードする発現構築物から製造した。生物活性を、ＧＤＦ８／ＴＧＦβ［４８−７２］構築物のＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションにより生じた馴化培地でアッセイした。発現及びプロセシングをウェスタンブロットにより評価した。馴化培地を２０倍に濃縮し、８０℃に５分間加熱して結合したＧＤＦ８プロペプチドを不活性化し、そしてバイオアッセイにおいて段階希釈で活性について評価した。キメラタンパク質の正確な濃度はこれらの実験では決定されていないが、典型的な濃度は濃縮前で１〜１０ｕｇ／ｍｌであった。上記のように、ＧＤＦ８応答性プロモーター駆動ルシフェラーゼ発現を含む細胞を９６ウェルプレートに播種した。選択された抗体（細胞培地中１００ｎＭで始まる段階希釈）を、最大の応答を生じると決定された量のＧＤＦ８／ＴＧＦβ［４８−７２］キメラタンパク質馴化培地に加えた。この混合物を４５分間プレインキュベートし、そしてレポーター細胞に加えた。ルシフェラーゼ活性を測定し、そして以下の表７において示されるように、およそのＩＣ50値を計算した（ＮＢ＝遮断なし）。
【０１２３】
【表７】
0005896993.tif 000008
【０１２４】
ＧＤＦ８／ＴＧＦβ［４８−７２］キメラ構築物は、このアッセイにおいてルシフェラーゼ発現を活性化することができ、そして１Ａ２−ｈＦｃ及びコントロールＩは、この構築物の生物活性を遮断することができた。しかし、抗体Ｈ２Ｍ１６５７Ｎ２及びＨ１Ｈ１６６９Ｐは、ＧＤＦ８／ＴＧＦβ［４８−７２］キメラ構築物の生物活性を遮断することができなかった。これらの２つの抗体は、このアッセイ系において野生型ＧＤＦ８の生物活性を遮断することが示されたので（表６を参照のこと）、Ｈ２Ｍ１６５７Ｎ２及びＨ１Ｈ１６６９ＰがＧＤＦ８のアミノ酸４８〜７２内のエピトープとの相互作用によりそれらの生物学的効果を及ぼす可能性が高いと結論づけることができる。
【０１２５】
実施例５．  プロテイナーゼＫ消化により生成されたｈＧＤＦ８フラグメントの免疫ブロット
ウェスタンブロット分析を使用して、プロテイナーゼＫでタンパク質分解消化された試験及びコントロールのｍＡｂヒトＧＤＦ８の免疫反応性を決定した。１μｇヒトＧＤＦ８及び０、１又は６μｇプロテイナーゼＫを含有する酵素反応系を消化緩衝液中で１０又は４５分間インキュベートした。反応混合物（２００ｎｇ）中に存在するＧＤＦ８の２０％の量を含有する等しいアリコートを３つの別々の１８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元ゲルにロードし、そしてＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）。各々の膜を２μｇ／ｍｌで一次抗体とともにインキュベートし、続いてＨＲＰに結合された適切な二次抗体とともにインキュベートした。コントロールｍＡｂ  Ｉ、１Ａ２  ｍＡｂ及び２１−Ｅ９  ｍＡｂについてそれぞれ検出された得られた免疫反応性を図１Ａ〜Ｃに示す。結果は、レーン３及び６におけるコントロールｍＡｂ（Ａ）についてＧＤＦ８反応性の喪失を示す。著しく対照的に、抗体１Ａ２は約１７〜１９ｋＤの分子量のより小さなＧＤＦ８フラグメントに対して免疫反応性を保持している（図１Ｂ）。
【０１２６】
１０分、１時間又は１６時間の消化時間で、ＧＤＦ８  ０又は４μｇ、及び０、２４又は９６μｇプロテイナーゼＫの存在下で実験を繰り返した。結果（図２Ａ−Ｂ）は、プロテイナーゼＫが存在しない場合に、コントロール及び１Ａ２  ｍＡｂの両方が全長成熟（未消化）ＧＤＦ８と免疫反応性であるということを示す（図２Ａ−Ｂ、レーン２及び７を参照のこと）。プロテイナーゼＫの存在下で、コントロールＩ  ｍＡｂについて全ての時点で免疫反応性は失われた。著しく対照的に、１Ａ２  ｍＡｂは消化されたヒトＧＤＦ８フラグメントと免疫反応性のままであった（図２Ｂ、レーン３〜６及び８）。これらの結果は、１Ａ２  ｍＡｂが、プロテイナーゼＫの存在下でインタクトなままであるＧＤＦ８のより小さなフラグメントと免疫反応性であるが、コントロールｍＡｂはより小さなフラグメント（１７〜１９ｋＤ）に対する免疫反応性を失うということを示す。
【０１２７】
修正ウェスタンブロット分析を使用して、選択された抗ＧＤＦ８抗体についてのｈＧＤＦ８エピトープをさらに決定した。修正点は、ｈＧＤＦ８特異的一次抗体を膜と共にインキュベートする前に、各抗ｈＧＤＦ８抗体を、１０００倍又は５０倍モル過剰の、１〜１４アミノ酸、１７〜４２アミノ酸、４８〜７２アミノ酸、又は７５〜１０５アミノ酸のｈＧＤＦ８ペプチドフラグメントと共にプレインキュベートしたことであった。結果は、５０倍モル過剰でのペプチドフラグメント４８〜７２アミノ酸のプレインキュベートは、抗体８Ｄ１２のｈＧＤＦ８に対する結合を遮断することができるということを示す。
【０１２８】
実施例６．  ＧＤＦ８キメラに対する抗体結合
１２のキメラＧＤＦ８プロタンパク質を作製した。表８は成熟キメラＧＤＦ８タンパク質構造を示す。キメラＧＤＦ８タンパク質は２つのセットを含んでおり：一方のセットはＧＤＦ８配列のＢＭＰ２配列での様々な置換を有しており、他方のセットはＧＤＦ８配列のＴＧＦβ１配列での様々な置換を有していた。これらのキメラタンパク質を使用して抗体結合を試験し位置を特定した。
【０１２９】
【表８】
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【０１３０】
様々なキメラＧＤＦ８プロタンパク質を、操作された安定なＣＨＯ．ｈＦｕｒｉｎ細胞株において一過性トランスフェクトした。上記と同様のウェスタンブロット分析を使用して様々な抗ｈＧＤＦ８抗体の各々のキメラＧＤＦ８への結合を検出した。手短には、ＣＨＯ上清１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元又は還元）ゲルの各レーン上にロードし、そしてＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットした。次いでこの膜を抗ＧＤＦ８抗体とともに２μｇ／ｍｌでインキュベートし、続いてＨＲＰに結合された適切な二次抗体に曝露した。表９に示されるように、抗体８Ｄ１２はＢ４８又はＴ４８のいずれにも結合することができなかった。この結果は、成熟ＧＤＦ８のアミノ酸４８〜７２が抗体８Ｄ１２のＧＤＦ８への結合に関与するこということを示した。
【０１３１】
【表９】
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【０１３２】
実施例７．  ｈＧＤＦ８ペプチドに対する抗体結合
１４のペプチド（表１０）を成熟ｈＧＤＦ８（配列番号３４０）から生成した。未改変ペプチド、Ｎ−末端ビオチン化ペプチド（Ｎ−ｔｅｒｍ）、又はＣ末端ビオチン化ペプチド（Ｃ−ｔｅｒｍ）を使用して抗体結合を試験しそして位置を特定した。全長ｈＧＤＦ８、ｈＧＤＦ１１及び未改変ペプチドをそれぞれ個々にｘＭＡＰ(R)  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＣＯＯＨミクロスフェア（又はビーズ）にアミンカップリングした。ビオチン化ペプチドをそれぞれｘＭＡＰ(R)  Ｍｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＬｕｍＡｖｉｄｉｎミクロスフェアに結合させた。次いでペプチド結合ビーズ懸濁液を等体積のブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％アジ化ナトリウム）と混合し、次いで９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（Ｒ）  ＢＶ）に分配した。次いでコントロール及び試験抗ｈＧＤＦ８抗体を、２．５μｇ／ｍｌでペプチド結合ビーズ懸濁液に加え、そして室温にて終夜ビーズに結合させた。次いで抗体とインキュベートしたビーズをＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合抗ｈＦＣ又はＰＥ結合抗ｍＦＣ抗体のいずれかと共に室温で４５分間インキュベートした。ビーズを再び洗浄し、そして様々なペプチドに対する抗体結合シグナルをＬＵＭＩＮＥＸ（Ｒ）１００TM又は２００TM機器のいずれかを用いて検出した。表１０に示されるように、抗ｈＧＤＦ８抗体８Ｄ１２はペプチド４、５、６、７、８、及び９に結合することができる。それに反して、抗ｈＧＤＦ８抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２はいずれのペプチドにも結合しなかった）データは示していない）。
【０１３３】
【表１０】
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【０１３４】
実施例８．ヒト抗ＧＤＦ８抗体のアクチビンＲＩＩＢへのＧＤＦ８結合に対する効果
成熟ｈＧＤＦ８を最初にＬｕｍｉｎｅｘ(R)ビーズにアミンカップリングした。次いで
ｈＧＤＦ８被覆Ｌｕｍｉｎｅｘ(R)ビーズを様々な抗ｈＧＤＦ８抗体と共に１．２５μｇ／ｍｌで２時間室温にてインキュベートした。次いでヒトアクチビンＲＩＩＢ−ｍＦｃをビーズ−抗体混合物に加え、そしてさらに２時間室温にてインキュベートした。次いでビーズを洗浄し、そしてＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）結合抗ｍＦｃポリクローナル抗体で染色し、そして平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定した。表１１において示されるように、コントロールｍＡｂ  Ｉ及び抗体２１−Ｅ５は両方ともｈＧＤＦ８とｈアクチビンＲＩＩＢとの間の結合を遮断することができたが、コントロールｍＡｂ  ＩＩは結合を部分的にしか遮断することができなかった。抗体１Ａ２は、ｈＧＤＦ８のその受容体アクチビンＲＩＩＢへの結合を遮断することができなかった（表１１、ｎ＝３）。
【０１３５】
【表１１】
0005896993.tif 000012
【０１３６】
実施例９．  抗体８Ｄ１２変異体
改変されたＬＣＶＲを有する抗体８Ｄ１２変異体を、８Ｄ１２のＬＣＶＲの以下のアミノ酸の１つ又はそれ以上を改変することにより生成した：Ａ７Ｓ又はＴ、Ａ８Ｐ、Ｐ９Ｌ、Ｓ１８Ｐ、Ｖ１９Ａ、Ｍ２１Ｉ、Ｋ２７Ｑ、Ｆ４１Ｙ、Ｖ４２Ｌ、Ｒ４４Ｋ、Ｒ５５Ｌ又はＴ、Ｍ５６Ｇ又はＬ、Ｎ５８Ｙ、Ｌ５９Ｒ、Ａ７５Ｄ、Ｒ７９Ｋ、Ａ１０５Ｇ、Ｌ１０９Ｖ、及びＬ１１１Ｉ。
【０１３７】
抗体変異体のｈＧＤＦ８に関する結合親和性（ＫD）を、ＢＳＡを含有しない改変ランニングバッファ中で上記の実時間バイオセンサー表面プラズマ（ｐｌａｓｍａ）共鳴アッセイ（ＢＩＡｃｏｒｅTM３０００）を使用して決定した（表１２）。
【０１３８】
【表１２】
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【０１３９】
抗体変異体とｈＧＤＦ８ペプチドとの間の結合もまた、実施例７において上で記載されるように試験した。抗体変異体８Ｄ１２−ｖ２及び８Ｄ１２−ｖ３は、Ｃ末端ビオチン化ペプチド４、５、７、及び１０に対して強い結合を示した。
【０１４０】
実施例１０．  抗ＧＤＦ８抗体の骨格筋量に対する効果
選択された抗ＧＤＦ８  ｍＡｂの骨格筋肥大の誘導に関する有効性をインビボで決定した。手短には、２０匹の雄性ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（約９週齢）を体重によって４つのグループに均等に分けた。選択されたｍＡｂ（コントロールＩ、１Ａ２、２１−Ｅ５、８Ｄ１２、１Ａ２−ｈＩｇＧ、又はコントロールＩＩ）を、３つの増加する用量２．５ｍｇ／ｋｇ／用量、５ｍｇ／ｋｇ／用量、及び１０ｍｇ／ｋｇ／用量で注射した。ヒトＩｇＧのＦｃフラグメントをネガティブコントロールとして使用した。抗体を最初の週に２回、そしてその後３週間は週に１回腹腔内投与した。２８日目にマウスを安楽死させて体重を量り、そして前脛骨（ＴＡ）筋、腓腹（ＧＡ）筋、及び四頭（Ｑｕａｄ）筋、心臓、脾臓、及び腎臓を切開して重さを量った。組織を開始体重に対して正規化し、そしてネガティブコントロールに対する重量のパーセント変化を計算した。６つの別々の実験を抗体：コントロールＩ、１Ａ２、２１−Ｅ５、８Ｄ１２、１Ａ２−ｈＩｇＧ、及びコントロールＩＩを用いて繰り返した（表１３〜１８）。さらにまた実験を、増加するより高用量のコントロールＩ抗体を１０ｍｇ／ｋｇ／用量、３０ｍｇ／ｋｇ／用量、及び５０ｍｇ／ｋｇ／用量で用いて繰り返した（表１９）。結果をネガティブコントロールに対する増加パーセント±標準偏差として表す。
【０１４１】
【表１３】
0005896993.tif 000014
【０１４２】
【表１４】
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【０１４３】
【表１５】
0005896993.tif 000016
【０１４４】
【表１６】
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【０１４５】
【表１７】
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【０１４６】
【表１８】
0005896993.tif 000019
【０１４７】
【表１９】
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【０１４８】
同様の実験を、ＳＣＩＤマウスに投与した抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９Ｐ並びにコントロールを使用して行った。詳細には、１０週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに、以下の投薬スケジュールにしたがって抗体を１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した：１週目に２ｘ、そして２週目及び３週目に１ｘ／週。合計処置期間は２８日であった。この実験のために、５匹のマウスにアイソタイプネガティブコントロール抗体を投与し；５匹のマウスにコントロールＩ（Ｍｙｏ２９）を投与し；６匹のマウスにＨ４Ｈ１６５７Ｎ２を投与し；そして６匹のマウスにＨ４Ｈ１６６９Ｐを投与した。結果を表２０にまとめ、ネガティブコントロールに対する増加パーセント±標準偏差として表す。
【０１４９】
【表２０】
0005896993.tif 000021
【０１５０】
同様の実験をまた、Ｃ５７マウスに投与した抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９Ｐ並びにコントロールを使用して行った。詳細には、１０週齢の雄性Ｃ５７マウスに、以下の投薬スケジュールにしたがって抗体を１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。この実験のために、５匹のマウスにアイソタイプネガティブコントロール抗体を投与し；５匹のマウスにコントロールＩ（Ｍｙｏ２９）を投与し；５匹のマウスにＨ４Ｈ１６５７Ｎ２を投与し；そして６匹のマウスにＨ４Ｈ１６６９Ｐを投与した。結果を表２１にまとめ、ネガティブコントロールに対する増加パーセント±標準偏差として表す。
【０１５１】
【表２１】
0005896993.tif 000022
【０１５２】
次に、用量応答実験を、抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９ＰをＳＣＩＤマウスにおいて使用して行った。詳細には、１０週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに、以下の投薬スケジュールにしたがってコントロール抗体を３０ｍｇ／ｋｇで、そしてＨ４Ｈ１６５７Ｎ２又はＨ４Ｈ１６６９Ｐを２．５、１０又は３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した：１週目は週に２ｘ、そしてその後は週に１ｘ。結果を表２２及び２３にまとめ、ネガティブコントロールに対する増加パーセント±標準偏差として表す。
【０１５３】
【表２２】
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【０１５４】
【表２３】
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【０１５５】
別の実験において、１０週齢の６匹の雄性ＳＣＩＤマウスの５つのグループに、以下の投薬スケジュールにしたがって、アイソタイプネガティブコントロール抗体を１０ｍｇ／ｋｇで、そしてＨ４Ｈ１６５７Ｎ２を０．１、０．７５、２．５、又は１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した：合計２８日の処置の間、１週目は週に２ｘ、そしてその後は週に１ｘ。結果を表２４にまとめ、ネガティブコントロールに対する増加パーセント±標準偏差として表す。
【０１５６】
【表２４】
0005896993.tif 000025
【０１５７】
この実施例において示されるように、抗体Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２及びＨ４Ｈ１６６９Ｐは、様々な範囲の用量でマウスに投与された場合に、筋肉量において有意な増加を生じた。
【０１５８】
実施例１１．  グルコース恒常性に対する抗ＧＤＦ８抗体の効果
本発明の抗ＧＤＦ８抗体を、それらのグルコース恒常性及びインスリン感受性に対する効果について食事性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおいて試験した。この実験において、ＤＩＯマウスを、Ｃ５７ＢＬ６マウスに高脂肪餌（４５％ｋｃａｌ脂肪）を９週齢から開始して７週間与えることにより得た。８週目から開始して、抗体を２週間又はそれ以上の間、週に２回３０ｍｇ／ｋｇ投与し、そしてこの試験を１週後に終了した（処置後２１日）。この実験で使用した抗体はＨ４Ｈ１６６９Ｐ及びＨ４Ｈ１６５７Ｎ２に加えてアイソタイプネガティブコントロール抗体及びコントロールＩ（Ｍｙｏ２９に対応する抗体ＧＤＦ８抗体）であった。インスリン耐性試験を、抗体処置の前後に行った。インスリン（２ＩＵ／ｋｇ）を４時間の絶食後に腹腔内投与し、そしてグルコースレベルを測定した。結果を図３Ａ（抗体処置前）及び３Ｂ（抗体処置後）において説明する。
【０１５９】
この実験において実証されたように、抗ＧＤＦ８抗体の投与によるミオスタチン阻害は、ＤＩＯマウスにおけるグルコース恒常性を改善した。インスリンボーラスに応じたグルコースの低下における有意な差異が、抗ＧＤＦ８抗体グループ（Ｈ４Ｈ１６６９Ｐ、Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２又はコントロールＩ）とアイソタイプコントロール抗体グループの間で見られた。
【０１６０】
実施例１２．  Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２の投与による、筋萎縮のインビボでの遮断
Ｃ５７マウスを使用して、ギプス包帯（ｃａｓｔｉｎｇ）／固定及びデキサメタゾン投与により誘発される筋萎縮の予防におけるＨ４Ｈ１６５７Ｎ２のインビボでの特性を決定した。
【０１６１】
ギプス包帯実施例において、８匹のＣ５７マウスの３つのグループを麻酔し、そして足首関節を９０°の角度でギプス材料を用いて１４日間固定した。第４のグループは平静な（ｕｎｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）ままにし、そして非固定グループコントロールとして使用した。固定した１４日間の間、マウスにアイソタイプネガティブコントロール抗体；コントロールＩ（Ｍｙｏ２９）；又はＨ４Ｈ１６５７Ｎ２を投与した。これら３つのグループに抗体を３０ｍｇ／ｋｇで、固定の時点で開始して週に２回２週間皮下投与した。結果を表２５にまとめ、ネガティブコントロールに対する変化パーセント±標準偏差として表す。これらの結果は、固定の１４日後に、Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２抗体処置を受けたグループがアイソタイプコントロールグループに対して骨格筋喪失の有意な減少を示すということを示した。
【０１６２】
【表２５】
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【０１６３】
デキサメタゾン実施例において、５匹のＣ５７マウスの２つのグループを麻酔し、そして浸透圧ポンプを皮下に移植し、これは１μｇ／ｇ／日のデキサメタゾンを送達した。２つのさらなるグループに食塩水を送達する浸透圧ポンプを移植し、そしてコントロールとして使用した。１４日間の処置の間、マウスの２つのグループ（１つは食塩水、及び１つはデキサメタゾン）にアイソタイプネガティブコントロール抗体を投与し；そしてマウスの２つのグループ（１つは食塩水、及び１つはデキサメタゾン）にＨ４Ｈ１６５７Ｎ２抗体を投与した。抗体を３０ｍｇ／ｋｇで週に２回２週間皮下注射した。抗体処置はポンプ移植の時点で開始した。結果を表２６にまとめ、ネガティブコントロールに対する変化パーセント±標準偏差として表す。Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２抗体を投与されたデキサメタゾングループとアイソタイプコントロールを投与されたグループとの比較は、Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２抗体での処置がデキサメタゾン処置により誘発される筋肉量喪失を防止することを示した。
【０１６４】
【表２６】
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【０１６５】
実施例１３．  インビボでのＨ４Ｈ１６５７Ｎ２の特異性
Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２のインビボでの特異性を調べるために、Ｃ５７ＢＬ６マウスに薬物を注射し、そして処置されたマウスからの血清を、質量分析に基づくリガンド「フィッシング（ｆｉｓｈｉｎｇ）実験」にかけた。手短には、薬物（Ｈ４Ｈ１６５７Ｎ２、コントロールＩＶ又はアイソタイプネガティブコントロール）をＣ５７ＢＬ６マウスに１４日の期間にわたって複数回（０日目、３日目（Ｄ３）、７日目（Ｄ７）、１０日目（Ｄ１０））注射した。動物を１４日目に屠殺し、そして血清を抗ヒトＦｃビーズとともにインキュベートした。ビーズを洗浄し、そして結合した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファで溶出した。溶出された物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて５〜２０ｋＤａの範囲の分子量に対応するゲルスライスを切り取った。サンプルを、標準的な還元、アルキル化及びトリプシン処理条件を使用して質量の分析のために処理した。消化物をナノＣ１８カラムで分離し、そして自動的にＢｒｕｋｅｒ  Ａｎｃｈｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｓにスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）分析（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ）を自動化した方法でＬＣ−ＷＡＲＰ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して行った。質量スペクトルをＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して検索し、そして結果をアイソタイプコントロールに対して評価した。溶出されたタンパク質は表２７に列挙される。
【０１６６】
【表２７】
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【０１６７】
表２７に示されるように、マウスＧＤＦ８のみがこの実験によりＨ４Ｈ１６５７Ｎ２についての結合パートナーであること同定された。（マウス及びヒトＧＤＦ８の配列は同一である。）これに反して、コントロールＩＶはＧＤＦ８に加えてＴＧＦベータリガンドファミリーのいくつかの他のメンバー（とりわけＧＤＦ１１を含む）に結合した。この実験により、ＧＤＦ８に対するＨ４Ｈ１６５７Ｎ２の特異性がインビボの状況で確認された。
【０１６８】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施態様による範囲に限定されるべきではない。実際に、本明細書に記載されるものに加えて本発明の様々な改変が、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内であることを意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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