(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲ−１５５および少なくとも１つのさらなる組成物を含む組成物であって、アンチセンスｍｉＲ−１５５は少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質を下方制御することが可能なｍｉＲ−１５５に対してアンチセンスであり、
ここで当該少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質は：ｈＭＳＨ２；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１からなる群より選択され、そして、
アンチセンスｍｉＲ−１５５と少なくとも１つのさらなる組成物の組合せが、結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、および／または尿道上皮癌を治療するのに有用である、前記組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのさらなる組成物が：化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ；エルロチニブ；セツキシマブ；パニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ）；ザルツママブ（ｚａｌｕｔｕｍａｍａｂ）；ニモツザマブ（ｎｉｍｏｔｕｚａｍａｂ）；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アンチセンスｍｉＲ−１５５が、ｍｉＲ−１５５を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
試験試料中のＭＭＲ機能不全細胞を同定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを対照のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと比較する工程を含み、
ここで、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが対照と比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが、試験試料をＭＭＲ機能不全細胞を含有するものとして同定する、
ここでＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記方法。
【請求項５】
被験体がＭＭＲ機能不全細胞を有すること、または発展させるリスクがあることの指標となるｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを測定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを対照のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと比較する工程、および試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが対照と比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを被験体がＭＭＲ機能不全細胞を有すること、または発展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを評価する工程を含む、
ここで、ＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記方法。
【請求項６】
被験体がリンチ症候群を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを測定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを対照のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと比較する工程、および試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが対照と比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと被験体がリンチ症候群を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
【請求項７】
被験体が遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを測定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを対照のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと比較する工程、および試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが対照と比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと被験体が遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
被験体が結腸直腸癌および／またはＭＳＩ腫瘍を有すること、または進展させるリスクがあることの指標となるｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを測定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを対照のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと比較する工程、および試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルが対照と比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルと被験体が結腸直腸癌および／またはＭＳＩ腫瘍を有すること、または進展させるリスクがあることとの相関において試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを評価する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
ＭＭＲ機能不全細胞の治療が必要な患者においてＭＭＲ機能不全細胞を治療するための医薬組成物であって、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲ−１５５および少なくとも１つのさらなる組成物を含み、ここで当該アンチセンスｍｉＲ−１５５は少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質を下方制御することが可能なｍｉＲ−１５５に対してアンチセンスであり、ここで少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質は：ｈＭＳＨ２；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１からなる群より選択され；そしてここで少なくとも１つの医薬組成物はＭＭＲ機能不全細胞を治療するのに有用であり、
ここでＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記組成物。
【請求項１０】
ＭＭＲ機能不全細胞が：神経芽細胞腫；肺癌；胆管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；リンパ腫；上咽頭癌；卵巣癌；頭頸部扁平上皮癌；扁平細胞子宮頸癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；胆嚢癌；前立腺癌；乳癌；精巣胚細胞腫瘍；大細胞リンパ腫；濾胞性リンパ腫；結腸直腸癌；悪性胸膜中皮腫；神経膠腫；甲状腺癌；基底細胞癌；Ｔ細胞リンパ腫；ｔ（８；１７）前リンパ球性（ｐｒｏｌｙｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病；骨髄異形成症候群；膵臓癌；ｔ（５；１４）（ｑ３５．１；ｑ３２．２）白血病；悪性線維性組織球腫；胃腸間質腫瘍；および肝芽腫；に由来する細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ＭＭＲ機能不全細胞が：結腸直腸癌；子宮内膜癌；卵巣癌；胃癌；および尿路上皮癌；に由来する細胞からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１つのさらなる組成物が、化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ；エルロチニブ；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される化合物を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
ＭＭＲ機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための医薬組成物であって、請求項１に記載の組成物を含む、ここで当該ＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記医薬組成物。
【請求項１４】
ＭＭＲ機能不全細胞のアポトーシスを誘導するため医薬組成物であって、アンチセンスｍｉＲＮＡを含み、アンチセンスｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１５５に対してアンチセンスである、ここで当該ＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、前記医薬組成物。
【請求項１５】
細胞が、少なくとも１つの下方制御されたコアＭＭＲタンパク質のために機能不全であり、該タンパク質が：ｈＭＳＨ２；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１からなる群より選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細胞がマイクロサテライト不安定性のために機能不全である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ；エルロチニブ；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つのコアミスマッチ修復（ＭＭＲ）タンパク質の発現を回復することを必要とする細胞における少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質の望まれる発現を回復するための医薬組成物であって、ヒトＭｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ヒトＭｕｔＳホモログ６（ＭＳＨ６）およびヒトＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）から選択される１またはそれより多くのコアＭＭＲタンパク質の発現を増加させるのに十分な量で、少なくともアンチｍｉＲ−１５５を含む、前記医薬組成物。
【請求項１９】
細胞が癌細胞である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌が、結腸直腸癌である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アンチｍｉＲ−１５５が、ｍｉＲ−１５５を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つのミスマッチ修復ＭＭＲ遺伝子の再発現が必要な細胞において、少なくとも１つのミスマッチ修飾ＭＭＲ遺伝子の再発現を誘導するための医薬組成物であって、ヒトＭｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ヒトＭｕｔＳホモログ６（ＭＳＨ６）およびヒトＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）の１またはそれより多くから選択されるＭＭＲ遺伝子発現を誘導するのに十分な量でアンチｍｉＲ−１５５を含む、前記医薬組成物。
【請求項２３】
細胞が癌細胞である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌が結腸直腸癌である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
アンチｍｉＲ−１５５が、ｍｉＲ−１５５を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ミスマッチ修復（ＭＭＲ）タンパク質の発現を増加させることが必要な細胞において、ＭＭＲタンパク質の発現を増加させるための方法であって、ここで当該方法はヒト細胞において行われるものではなく、そして当該方法は、細胞をヒトアンチｍｉＲ−１５５核酸構築物で、ヒトＭｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ヒトＭｕｔＳホモログ６（ＭＳＨ６）およびヒトＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）から選択される１またはそれより多くのＭＭＲタンパク質の発現を増加させるのに有効な量で、トランスフェクトすることを含む、前記方法。
【請求項２７】
細胞が癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌が結腸直腸癌である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
アンチｍｉＲ−１５５核酸構築物が、ｍｉＲ−１５５を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
細胞において少なくとも１つのミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子を上方制御する方法であって、ここで当該方法はヒト細胞において行われるものではなく、そして当該細胞に少なくともｍｉＲ−１５５に対するｍｉＲ特異的阻害剤をＭＭＲ遺伝子によってコードされる１またはそれより多くのタンパク質の発現パターンを変更するのに十分な有効量で導入することを含む、当該ミスマッチ修復（ＭＭＲ）タンパク質は、ヒトＭｕｔＳホモログ２（ＭＳＨ２）、ヒトＭｕｔＳホモログ６（ＭＳＨ６）およびヒトＭｕｔＬホモログ１（ＭＬＨ１）から選択される、前記方法。
【請求項３１】
細胞が癌細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌が結腸直腸癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｍｉＲ特異的阻害剤がアンチセンスｍｉＲ−１５５である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
アンチセンスｍｉＲ−１５５が、ｍｉＲ−１５５を標的とするロックト核酸修飾オリゴヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
試験試料中のミスマッチ修復（ＭＭＲ）機能不全細胞を同定する方法であって、ここでＭＭＲ機能不全細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここでＭＭＲ機能不全細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されておらず、そして当該方法は、
細胞から核酸含有試験試料を得る、ここで当該細胞はｈＭＳＨ２遺伝子中に変異を有さず、ｈＭＳＨ６遺伝子に変異を有さず、そしてここで当該細胞のｈＭＬＨ１プロモーターはメチル化により不活化されていない、
実験室的なアッセイにより、試験試料中のｍｉＲ−１５５のレベルを測定する、
試験試料中のｍｉＲ−１５５のレベルと対照のｍｉＲ−１５５のレベルを比較する、
試験試料中のｍｉＲ−１５５のレベルが対照における対応するｍｉＲ−１５５のレベルと比較して２〜４倍高く示差的に発現されたｍｉＲＮＡ−１５５のレベルを試験試料が有する場合、当該試料をＭＭＲ機能不全細胞を有するものとして同定する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３６】
ＭＭＲ機能不全細胞は、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６およびｈＭＬＨ１からなる群より選択される少なくとも１つの機能不全コアＭＭＲタンパク質を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が結腸直腸組織に由来する、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関するクロスリファレンス
[0001]本出願は、２０１０年３月２６日出願の米国仮出願第６１／３１８，０４２号の優先権を請求し、その全開示は、参照により本明細書に明確に援用される。
【０００２】
連邦政府に支援された研究に関する言及
[0002]本発明は、米国衛生研究所により授与された助成金第ＧＭ０８０１７６号、第ＣＡ０６７００７号、第ＣＡ１２４５４１号および第ＣＡ１３５０３０号のもとに、政府の援助で行われなかった。米国政府は、本発明に特定の権利を有する可能性がある。
【０００３】
配列表
[0003]本出願は、ＥＦＳ−ウェブを通じて提出され、そしてその全体が参照により本明細書に援用される配列表を含有する。２０１１年３月２１日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、６０４＿５１７５４＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＯＳＵ−１０１２６．ｔｘｔと名付けられ、そしてそのサイズは５，６２７バイトである。
【０００４】
技術分野
[0004]本発明は、一般的に、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は癌関連技術に関する。本発明の特定の側面には、ｍｉＲ−１５５関連障害の診断学、治療学、および予後学における適用が含まれる。
【背景技術】
【０００５】
[0005]ミスマッチ・ヌクレオチドは、ポリメラーゼの誤取り込みエラー、ヘテロ対立遺伝子性（ｈｅｔｅｒｏａｌｌｅｌｉｃ）親染色体間の組換え、またはＤＮＡの化学的および物理的損傷から生じうる。ＭｕｔＳ相同体（ＭＳＨ）およびＭｕｔＬ相同体（ＭＬＨ／ＰＭＳ）は、高く保存されたタンパク質であり、そしてＭＭＲ除去反応に必須である。ヒト細胞において、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１は、ＭＭＲの基本的な構成要素である。ｈＭＳＨ２タンパク質は、ｈＭＳＨ３またはｈＭＳＨ６とヘテロ二量体を形成し、そしてミスマッチ／損傷認識に必要である一方、ｈＭＬＨ１タンパク質は、ｈＭＬＨ３またはｈＰＭＳ２とヘテロ二量体を形成し、そしてＭＳＨヘテロ二量体と三元複合体を形成して、除去修復反応を完了する。ヒト細胞は、単一のヌクレオチドおよび小さな挿入欠失ループ（ＩＤＬ）ミスマッチを修復するｈＭＳＨ２−ｈＭＳＨ６／ｈＭＬＨ１−ｈＰＭＳ２複合体を、大きなＩＤＬミスマッチを主に修復するｈＭＳＨ２−ｈＭＳＨ３／ｈＭＬＨ１−ｈＭＬＨ３複合体よりも少なくとも１０倍多く含有する。ＭＭＲに加えて、ｈＭＳＨ２−ｈＭＳＨ６／ｈＭＬＨ１−ｈＰＭＳ２構成要素は、ＤＮＡにおける損傷を認識し、そして細胞周期抑止およびアポトーシスのシグナルを伝達することが独自に示されている。
【０００６】
[0006]ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、ｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ２コアＭＭＲ遺伝子における突然変異は、ＬＳ／ＨＮＰＣＣと関連付けられている。ＭＳＨおよびＭＬＨ／ＰＭＳ遺伝子における欠損は細胞突然変異率を有意に増加させ、これが次いで、癌で見られる多くの癌原遺伝子および腫瘍抑制因子遺伝子の突然変異の進展を駆動する可能性があるため、これらの観察はミューテーター仮説に相当な裏付けを提供している。ミューテーター表現型の１つの特徴は、単純な反復配列またはマイクロサテライトＤＮＡの不安定性である（マイクロサテライト不安定性またはＭＳＩ）。実質的にすべてのＬＳ／ＨＮＰＣＣ腫瘍は、コアＭＭＲ遺伝子の突然変異または遺伝性のエピジェネティックな不活性化の結果であるＭＳＩを示す。ＭＳＩを示す孤発性ＣＲＣ、子宮内膜腫瘍、卵巣腫瘍、胃腫瘍および尿路上皮腫瘍の１０〜４０％の大部分は、後天性のｈＭＬＨ１プロモーターのメチル化の結果である。ＭＳＩ腫瘍のおよそ９５％は、少なくとも部分的に、コアＭＭＲ構成要素の突然変異および／またはエピジェネティックな不活性化によって説明可能である。残りの５％ならびに２対立遺伝子ＭＭＲ不活性化機構のかなりの割合はほとんど理解されないままである。
【０００７】
[0007]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、発生、細胞分化、アポトーシスおよび増殖を含む、非常に重要な生物学的プロセスを制御するヒト遺伝子の３０％より多くのものの転写後制御において役割を果たす非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲ１５５の過剰発現は、ＣＲＣで観察されており、そしてマイクロサテライト安定（ＭＳＳ）腫瘍に比較して、ＭＳＩ  ＣＲＣでより頻繁なようである。
【０００８】
[0008]このセクションに開示される背景参考文献が先行技術を法的に構成することは、承認されるものではない。
[0009]ＭＭＲ機能不全に関連する疾患にはかなりの研究が行われているにもかかわらず、これらは効率的に診断し、そして治療することが困難なままであり、そして患者において観察される死亡率は、これらの疾患の診断、治療および予防における改善が必要であることを示す。
【発明の概要】
【０００９】
[0010]本発明は、以下の情報および発見に基づく：ミスマッチ修復（ＭＭＲ）の不活性化は、一般的な癌素因障害リンチ症候群（ＬＳ；または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌、ＨＮＰＣＣ）、ならびに１０〜４０％の孤発性結腸直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、胃癌、および尿路上皮癌の原因である。単純反復不安定性（マイクロサテライト不安定性またはＭＳＩ）を含む突然変異率の上昇（ミューテーター表現型）は、ＭＭＲ欠損の特徴である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、発生および癌に関与する非常に重要な細胞経路の制御に関連付けられている。本明細書において、本発明者らは、ｍｉＲ−１５５の過剰発現が、コアＭＭＲタンパク質、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、およびｈＭＬＨ１を有意に下方制御させて、ミューテーター表現型およびＭＳＩを誘導することを示す。ｍｉＲ−１５５の発現およびＭＬＨ１またはＭＳＨ２タンパク質の発現の間の逆相関が、ヒト結腸直腸癌（ＣＲＣ）において見出された。最後に、ＭＭＲ不活性化の原因が未知である多くのＭＳＩ腫瘍は、ｍｉＲ−１５５過剰発現を示す。これらのデータは、ＭＭＲのｍｉＲ−１５５調節が癌病因の新規機構であることの裏付けを提供する。
【００１０】
[0011]本発明の多様な目的および利点は、付随する図を踏まえて読んだ際、好ましい態様の以下の詳細な説明から当業者には明らかとなるであろう。
[0012]本発明は、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲＮＡおよび少なくとも１つのさらなる組成物を含む、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｔｅｒ）であって、アンチセンスｍｉＲＮＡが、少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質を下方制御することが可能なｍｉＲＮＡに対してアンチセンスであり、そして少なくとも１つのさらなる組成物がＭＭＲ関連疾患を治療するのに有用である、前記組成物を提供する。好ましくは、少なくとも１つのさらなる組成物は：化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ（ｐａｎｉｔｕｍａｂ）；ザルツママブ（ｚａｌｕｔｕｍａｍａｂ）；ニモツザマブ（ｎｉｍｏｔｕｚａｍａｂ）；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される。好ましくは、アンチセンスｍｉＲＮＡはｍｉＲＮＡ−１５５であり、そして／または少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質は：ｈＭＳＨ１；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１からなる群より選択される。
【００１１】
[0013]試験試料中のＭＭＲ機能不全細胞を同定する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが示差的に発現されると、試験試料がＭＭＲ機能不全細胞を含有すると同定される、前記方法もまた提供する。
【００１２】
[0014]被験体が、ＭＭＲ突然変異細胞を有するか、または発展させるリスクがあるかを診断する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが示差的に発現されると、被験体が、ＭＭＲ突然変異細胞を有するか、または発展させるリスクがあるかのいずれかであると診断される、前記方法もまた提供する。
【００１３】
[0015]被験体が、リンチ症候群を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが示差的に発現されると、被験体が、リンチ症候群を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであると診断される、前記方法もまた提供する。
【００１４】
[0016]被験体が、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが示差的に発現されると、被験体が、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであると診断される、前記方法もまた提供する。
【００１５】
[0017]被験体が、癌を有するか、または進展させるリスクがあるかを診断する方法であって、試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが示差的に発現されると、被験体が、癌を有するか、または進展させるリスクがあるかのいずれかであると診断され、癌が：結腸直腸癌；子宮内膜癌；卵巣癌；胃癌；および尿道上皮癌からなる群より選択される、前記方法もまた提供する。
【００１６】
[0018]患者において予後診断を提供する方法であって：試験試料中のｍｉＲＮＡ−１５５レベルを、対照のｍｉＲＮＡ−１５５レベルと比較する工程を含み、ｍｉＲＮＡ−１５５レベルが下方制御されていると、劣った予後であることを示す、前記方法もまた提供する。
【００１７】
[0019]ＭＭＲ機能不全の治療が必要な患者においてＭＭＲ機能不全を治療する方法であって、本明細書の組成物の薬学的有効量を投与する工程を含む、前記方法もまた提供する。好ましいのは、ＭＭＲ機能不全が：神経芽細胞腫；肺癌；胆管癌；非小細胞肺癌；肝細胞癌；リンパ腫；上咽頭癌；卵巣癌；頭頸部扁平上皮癌；扁平細胞子宮頸癌；胃癌；結腸癌；子宮頸癌；胆嚢癌；前立腺癌；乳癌；精巣胚細胞腫瘍；大細胞リンパ腫；濾胞性リンパ腫；結腸直腸癌；悪性胸膜中皮腫；神経膠腫；甲状腺癌；基底細胞癌；Ｔ細胞リンパ腫；ｔ（８；１７）前リンパ球性（ｐｒｏｌｙｐｈｏｃｙｔｉｃ）白血病；骨髄異形成症候群；膵臓癌；ｔ（５；１４）（ｑ３５．１；ｑ３２．２）白血病；悪性線維性組織球腫；胃腸間質腫瘍；および肝芽腫からなる群より選択される方法である。また好ましいのは、治療される癌が：結腸直腸癌；子宮内膜癌；卵巣癌；胃癌；および尿路上皮癌からなる群より選択される方法である。
【００１８】
[0020]癌の治療を必要とするＭＭＲ機能不全患者において癌を治療する方法であって、アンチセンスｍｉＲＮＡの薬学的有効量を投与する工程を含み、アンチセンスｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１５５に対してアンチセンスである、前記方法もまた提供する。好ましいのは、治療される癌が：結腸直腸癌；子宮内膜癌；卵巣癌；胃癌；および尿路上皮癌からなる群より選択される方法である。また好ましいのは、アジュバントを投与する工程をさらに含む方法である。より好ましいのは、化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される化合物からなる群より選択される化合物を投与する工程をさらに含む方法である。
【００１９】
[0021]ＭＭＲ機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、本明細書記載の組成物のアポトーシス有効量を導入する工程を含む、前記方法もまた提供する。
[0022]ＭＭＲ機能不全細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、アンチセンスｍｉＲＮＡのアポトーシス有効量を導入する工程を含み、アンチセンスｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ−１５５に対してアンチセンスである、前記方法もまた提供する。好ましいのは、細胞が、少なくとも１つの下方制御されたコアＭＭＲタンパク質のために機能不全であり、該タンパク質が：ｈＭＳＨ２；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１からなる群より選択される方法である。また好ましいのは、細胞がマイクロサテライト不安定性のために機能不全である方法である。また好ましいのは：化学療法薬剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））；セツキシマブ；パニツマブ；ザルツママブ；ニモツザマブ；マツズマブ；およびラパチニブからなる群より選択される化合物からなる群より選択される化合物を導入する工程をさらに含む方法である。
【００２０】
[0023]薬学的に有用な組成物を同定するための方法であって、ＭＭＲ機能不全細胞培養に、アンチセンスｍｉＲＮＡ−１５５を導入し；ＭＭＲ機能不全細胞培養に、試験組成物を導入し；そしてアポトーシスを誘導する試験組成物を、薬学的に有用な組成物として同定する工程を含む、前記方法もまた提供する。
【００２１】
[0024]ＭＭＲ機能不全疾患と診断された患者の臨床転帰を予測する方法であって、患者から得られたＭＭＲ機能不全疾患細胞試料において、ｍｉＲ−１５５の発現レベルを検出する工程を含み、ＭＭＲ機能不全状態と組み合わせて、対照に比較してｍｉＲ−１５５レベルが１．５倍またはそれより高く増加している場合、生存の減少が予測される、前記方法もまた提供する。
【００２２】
[0025]ＭＭＲ機能不全疾患の治療のための療法剤を同定する方法であって、候補剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングして、ｍｉＲ−１５５の発現を減少させる剤を選択し、それによってＭＭＲ機能不全疾患の治療のための剤を同定する工程を含む、前記方法もまた提供する。
【００２３】
[0026]ＭＭＲ機能不全疾患において、示差的に発現されるｍｉＲ−１５５を同定するためのキットであって、ｍｉＲ−１５５の少なくとも１つの分子同定因子を含む、前記キットもまた提供する。
【００２４】
[0027]肺癌において、示差的に発現されるｍｉＲ−１５５を同定するためのキットであって、ｍｉＲ−１５５の少なくとも１つの分子同定因子を含み、前記分子同定因子が：プローブ；プライマー；抗体；または小分子からなる群より選択される、前記キットもまた提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
[0028]特許または出願ファイルは、カラーで作成された１またはそれより多い図および／または１またはそれより多い写真を含有しうる。カラーの図（単数または複数）および／または写真（単数または複数）を含む本特許または特許出願刊行物のコピーは、特許庁に依頼し、そして必要な料金を支払うことにより提供されるであろう。
【図１】[0029]図１Ａ−１Ｂ。ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６は、ｍｉＲ−１５５の直接のターゲットである。  [0030]図１Ａ。表示された遺伝子の３’ＵＴＲおよび／またはＣＤＳ中のｍｉＲ−１５５のターゲット部位の位置を示す（図６もまた参照されたい）。塩基の位置を、ＣＤＳ中の最初のヌクレオチドからカウントする。  [0031]図１Ｂ。Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、対照としてｐｈＲＬ−ＳＶ４０構築物、およびルシフェラーゼ構築物のＷＴまたはＭＵＴ−１５５のいずれかで、そしてプレｍｉＲ−１５５またはプレｍｉＲ対照でトランスフェクションした。２４時間後、二重ルシフェラーゼアッセイを行った。＊プレｍｉＲ対照に対してｐ＜０．００５。
【図２】[0032]図２Ａ−２Ｃ。ｍｉＲ−１５５の過剰発現は、ＣＲＣ細胞において、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現を減少させる。Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、プレｍｉＲ−１５５、プレｍｉＲ対照または選択した遺伝子に対するｓｉＲＮＡで４８時間トランスフェクションした。  [0033]図２Ａ。リアルタイムＰＣＲによってトランスフェクション効率を確認した。ｍｉＲ−１５５発現をＲＮＵ４４のものに対して標準化した。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．に相当する。＊ｐ＜０．００１（Ｎ＝３）。  [0034]図２Ｂ。ｍｉＲ−１５５は、ＭＭＲコアタンパク質に対して転写後効果を発揮する。示す遺伝子のｍＲＮＡ発現をビンキュリンのものに対して標準化した。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．に相当する。＊対照プレｍｉＲに比較してｐ＜０．０５（Ｎ＝３）。  [0035]図２Ｃ。３つの独立の実験の平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を伴う、ウェスタンブロッティング分析の代表的なブロットを示す。＊対照プレｍｉＲに比較してｐ＜０．００５。
【図３】[0036]図３Ａ−３Ｄ。ｍｉＲ−１５５が過剰発現されている安定クローン。結腸癌細胞株に対するｍｉＲ−１５５過剰発現の機能的影響。ＭＭＲ能を持つＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、ｍｉＲ−１５５を過剰発現するレンチウイルスベクター（Ｃｏｌｏ−１５５）または空ベクター（Ｃｏｌｏ空）で安定感染させた。  [0037]図３Ａ。３つの独立の実験の平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を伴う、代表的なウェスタン分析を示す。＊対照に対してｐ＜０．０５。  [0038]図３Ｂ。リアルタイムＰＣＲによって評価した、選択した遺伝子のｍＲＮＡ発現（ビンキュリンに対して標準化）。エラーバーは、Ｓ．Ｅ．Ｍ．に相当する。＊ｐ＜０．０５（Ｎ＝３）。  [0039]図３Ｃ。ノーザン分析によって、ｍｉＲ−１５５発現を評価した（ＭＶ−４１１細胞を陽性対照として用いた）。  [0040]図３Ｄ。ＢＡＴ−２６およびＢＡＴ２５（モノヌクレオチド反復）ならびにＤ１７Ｓ２５０（ジヌクレオチド反復）マーカーを用いた、Ｃｏｌｏ−１５５およびＣｏｌｏ−空細胞のマイクロサテライト分析。サイズマーカーを上部に示す。
【図４】[0041]図４Ａ−４Ｂ。ｍｉＲ−１５５発現は、ＣＲＣ組織において、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２と逆に関連する。  [0042]図４Ａ。パラフィン包埋ホルマリン固定ＣＲＣ組織を、ＬＮＡプローブ・アンチｍｉＲ−１５５またはスクランブル・プローブ、ならびにＭＳＨ２およびＭＬＨ１に対するＩＨＣ抗体とインキュベーションした。ｍｉＲ−１５５とＭＳＨ２またはＭＬＨ１との両方に関して陽性に染色された代表的な写真を、Ｎｕａｎｃｅシステム・ソフトウェアで取り込んだ。青色および赤色染色は、それぞれ、ｍｉＲ−１５５およびターゲットタンパク質を同定する。同じ細胞巣におけるｍｉＲ−１５５およびＭＬＨ１またはＭＳＨ２の同時局在は観察されない。  [0043]図４Ｂ。新鮮凍結ヒト結腸直腸組織から抽出されたＲＮＡおよびタンパク質。リアルタイムＰＣＲによってｍｉＲ−１５５発現を評価し、そしてウェスタン分析によって、ＭＭＲタンパク質発現を評価した。ｍｉＲ−１５５発現が上方制御され（＞２倍）、そしてＭＭＲタンパク質発現が下方制御されたＣＲＣを示す。ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２発現の喪失、ならびに隣接する正常組織に比較して腫瘍中で３倍を超えて増加したｍｉＲ−１５５発現の間の強い相関が観察された（赤線）。３倍未満のｍｉＲ−１５５癌／正常比を伴う試料は、ＭＭＲ発現に対する不確かな影響を示した。
【図５】[0044]図５Ａ−５Ｂ。ｈＭＬＨ１陰性腫瘍におけるｍｉＲ−１５５発現。ｍｉＲ−１５５発現を、パラフィン包埋組織に対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって評価した。  [0045]図５Ａ。ＣＲ−７８癌組織（ＭＬＨ１喪失の原因が未知）は、強いｍｉＲ−１５５発現（大きな矢印）を示し、一方、間質（小さい矢印）は、ｍｉＲ−１５５発現に関して陰性である。  [0046]図５Ｂ。ＣＲ−７９組織（プロモーターメチル化によるＭＬＨ１喪失）は、炎症細胞のみで、わずかなｍｉＲ−１５５発現を示す（大きな矢印）。癌組織においてはシグナルは検出されない（小さい矢印）。
【図６】[0047]図６Ａ−６Ｃ。ｍｉＲ−１５５の予測される結合部位。ＭＬＨ１（出現順に、それぞれ、配列番号２１〜２２、２３および２２）（図６Ａ）、ＭＳＨ２（出現順に、それぞれ、配列番号２４および２２）（図６Ｂ）およびＭＳＨ６（出現順に、それぞれ、配列番号２５および２２）（図６Ｃ）遺伝子におけるｍｉＲ−１５５の予測される結合部位を例示する。
【図７】[0048]図７。ＣＲＣ組織におけるｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質発現。ｍｉＲ−１５５は、ＭＬＨ１およびＭＳＨ６の外因性発現を制御する。ＭＬＨ１およびＭＳＨ６をそれぞれ欠如する、ＨＣＴ−１１６およびＤＬＤ−１細胞株を、ＭＬＨ１またはＭＳＨ６タンパク質をコードするプラスミド、およびｍｉＲ−１５５発現ベクターまたはスクランブル・ベクターで同時トランスフェクションした。ｍｉＲ−１５５との同時トランスフェクションは、ＭＬＨ１およびＭＳＨ６タンパク質発現の減少を誘導した。ＭＬＨ１およびＭＳＨ６のＣＤＳ中の結合部位を破壊すると、一部切除タンパク質（それぞれ７３ＫＤおよび１５０ＫＤ）の発現が生じた。ＭＬＨ１およびＭＳＨ６に対するＮ末端抗体を用いて、ＷＴおよび一部切除タンパク質の両方を検出した。ＭＳＨ６の場合のタンパク質サイズにおけるシフトは、より大きな分子量および４−２０勾配ゲル使用のため、あまり検出できるものではない。一部切除タンパク質の存在下であっても、３’ＵＴＲ結合部位が保存されるため、ＭＬＨ１の制御解除はなお存在した。ＭＬＨ１シード領域両方の破壊は、ｍｉＲ−１５５活性の喪失を生じた。３つの異なる実験の標準化を伴う代表的なブロットを示す。バーは平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。＊空ベクターに対してｐ＜０．００５。
【図８】[0049]図８Ａ−８Ｃ。ｍｉＲ−１５５の阻害は、ＭＭＲタンパク質の発現を増加させる。ＭＶ４−１１細胞を、アンチｍｉＲ−１５５またはアンチｍｉＲ対照で、４８時間トランスフェクションし（図８Ａ）、リアルタイムＰＣＲによってｍｉＲ−１５５発現を評価した（ＲＮＵ６に対して標準化）。バーは３つの反復実験の平均およびＳ．Ｅ．Ｍ．を示す。＊Ｐ：０．００３。  [0050]図８Ｂ。ノーザンブロッティング分析によるｍｉＲ−１５５の評価。  [0051]図８Ｃ。トランスフェクション４８時間後、細胞溶解物を得て、そして表示された抗体でイムノブロットした。３つの実験の定量化とともに、代表的なブロットを示す。＊ｐ＜０．００５。
【図９−１】[0052]図９Ａ−９Ｃ。ＣＲＣ組織におけるｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質発現。  [0053]図９Ａ。ｍｉＲ−１５５に関する陽性染色を伴う炎症硬変組織を陽性対照として用いた。  [0054]図９Ｂ。パラフィン包埋ホルマリン固定ＣＲＣ組織を、ＬＮＡプローブ・アンチｍｉＲ−１５５またはスクランブル・プローブ、ならびにＭＳＨ２およびＭＬＨ１に対するＩＨＣ抗体とインキュベーションした。検出可能な発現を伴う細胞の割合に基づいて、ｍｉＲ−１５５発現をスコア付けした。ＬＮＡアンチｍｉＲＮＡまたはＬＮＡスクランブル・プローブで染色した３つの異なるコアの表示。ｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質は、それぞれ、細胞の＞１５％および＞５％で検出された際に陽性とスコア付けした。
【図９−２】[0055]図９Ｃ。ｍｉＲ−１５５およびＭＬＨ１またはＭＳＨ２に関する陽性または陰性染色を伴う症例の比率の要約データおよびグラフ提示を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[0056]本発明は、したがって、これらの新規発見に関する材料および方法を提供する。特に、本明細書に記載するような、そして当業者に知られているであろうような、こうした障害を治療するのに有用な組成物を提供する。治療に有用なさらなる組成物を同定する方法、診断法、予後診断を提供する方法、アポトーシスを誘導する方法等もまた提供する。これらの発見に関連する研究ツール、特にキット等もまた提供する。
【００２７】
[0057]定義
[0058]ＤＮＡ  デオキシリボ核酸
[0059]ｍＲＮＡ  メッセンジャーＲＮＡ
[0060]ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
[0061]プレｍｉＲＮＡ  前駆体マイクロＲＮＡ
[0062]ｑＲＴ−ＰＣＲ  定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
[0063]ＲＮＡ  リボ核酸
[0064]前述の一般的な説明および以下の詳細な説明のどちらも例示および説明のためのみであり、そして本解説の範囲を限定することは意図されないことが理解されるべきである。本出願において、単数形の使用には、別に言及しない限り、複数形が含まれる。
【００２８】
[0065]単語「ａ」または「ａｎ」の使用は、請求項および／または明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わされて用いられる場合、「１」を意味することも可能であるが、「１またはそれより多く」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１より多い」の意味とも一致する。
【００２９】
[0066]また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、または例えば限定されるわけではないが、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｅｄ」および「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などのこれらの根となる語の修飾の使用は、限定的であると意図されていない。用語「および／または」は、前および後の用語が、ともに用いられてもまたは別個に用いられてもよいことを意味する。限定としてではなく、例示のため、「Ｘおよび／またはＹ」は、「Ｘ」または「Ｙ」または「ＸおよびＹ」を意味することも可能である。
【００３０】
[0067]ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。これに関連して、用語「遺伝子」は、簡単にするために、所定のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指すよう用いられる。しかし、本発明の態様は、その発現に関与するｍｉＲＮＡのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含むことも可能である。
【００３１】
[0068]用語「ｍｉＲＮＡ」は、一般的に、一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において実施される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域に対して、または別の核酸に対して、部分的に（鎖の長さに渡って１０〜５０％相補的な）、実質的に（鎖の長さに渡って５０％を超えるが１００％未満相補的な）、または完全に相補的な領域またはさらなる鎖もまた含むであろう。したがって、核酸は、分子を含む特定の配列の相補的または自己相補的鎖（単数または複数）あるいは「相補体（単数または複数）」を１またはそれより多く含む分子を含んでもよい。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは、最大１００％相補的な自己相補性領域を有してもよく、本発明のｍｉＲＮＡプローブは、ターゲットに対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的であることも可能である。
【００３２】
[0069]用語「その組み合わせ」は、本明細書において、該用語に先行して列挙される項目のすべての順列および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはその組み合わせ」は：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、そして特定の背景において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＢＡの少なくとも１つを含むよう意図される。
【００３３】
[0070]別に示さない限り、技術用語は、慣用的な用法にしたがって用いられる。分子生物学の一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗら（監修），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．発行，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（監修），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．発行，  １９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出されうる。
【００３４】
[0071]本開示の多様な態様の概観を容易にするため、以下に特定の用語の説明を提供する：
[0072]補助療法：一次治療の効果を改善するため、一次治療と組み合わせて用いる治療。
【００３５】
[0073]臨床転帰：疾患または障害の治療後、あるいは治療の非存在下での、患者の健康状態を指す。臨床転帰には、限定されるわけではないが、死亡までの時間の長さの増加、死亡までの時間の長さの減少、生存可能性の増加、死亡リスクの増加、生存、無病生存率、慢性疾患、転移、進行性または侵襲性疾患、疾患再発、死亡、および療法に対する好ましいまたは劣った反応が含まれる。
【００３６】
[0074]対照：「対照」は、実験試料、例えば患者から得た腫瘍試料と比較するために用いられる試料または標準を指す。
[0075]サイトカイン：他の細胞の挙動に影響を及ぼす、非常に多様な造血細胞および非造血細胞によって産生される、タンパク質。サイトカインは、自然および適応免疫反応の両方に重要である。
【００３７】
[0076]生存減少：本明細書において、「生存減少」は、患者の死亡までの時間の長さの減少、または患者の死亡リスクの増加を指す。
[0077]発現レベルの検出：例えば「ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ発現レベルの検出」は、試料に存在するｍｉＲまたはｍｉＲＮＡの量を定量化することを指す。特異的ｍｉＲ、または任意のマイクロＲＮＡの発現の検出は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載する任意の方法を用いて、例えばｑＲＴ−ＰＣＲによって、達成可能である。ｍｉＲ発現の検出には、ｍｉＲＮＡの成熟型またはｍｉＲＮＡ発現と相関する前駆体型のいずれかの発現を検出することが含まれる。典型的には、ｍｉＲＮＡ検出法は、配列特異的検出、例えばＲＴ−ＰＣＲによるものを含む。当該技術分野において公知であり、そして配列番号にあるように本明細書において提供される前駆体および成熟ｍｉＲ核酸配列を用いて、ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブを設計することも可能である。
【００３８】
[0078]マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）:遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは、一般的に、長さ２１〜２３ヌクレオチドである。マイクロＲＮＡは、プリｍｉＲＮＡとして知られる一次転写物から、前駆体（プレ）ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造にプロセシングされ、そして最終的に、機能性の成熟マイクロＲＮＡにプロセシングされる。成熟マイクロＲＮＡ分子は、１またはそれより多いメッセンジャーＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、そしてその主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。マイクロＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を通じて、遺伝子発現を制御する。
【００３９】
[0079]ｍｉＲ発現：本明細書において、「低いｍｉＲ発現」および「高いｍｉＲ発現」は、試料中に見られるｍｉＲＮＡのレベルを指す、相対的用語である。いくつかの態様において、低いおよび高いｍｉＲ発現は、対照試料および試験試料の群におけるｍｉＲＮＡレベルの比較によって決定される。低発現および高発現は、次いで、試料中のｍｉの発現が、平均または中央値ｍｉＲ発現レベルより上（高い）または下（低い）であるかに基づいて、各試料に割り当てられることも可能である。個々の試料に関して、高いまたは低いｍｉＲ発現は、高発現または低発現を有することが知られる対照または参照試料に対して試料を比較することによって、あるいは標準値に対して比較することによって、決定可能である。低いおよび高いｍｉＲ発現には、ｍｉＲＮＡの前駆体または成熟型いずれか、あるいは両方の発現が含まれてもよい。
【００４０】
[0080]患者：本明細書において、用語「患者」には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。治療に好ましい患者はヒトである。「患者」および「被験体」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００４１】
[0081]薬学的に許容されうるビヒクル：本開示において有用な薬学的に許容されうるキャリアー（ビヒクル）は、慣用的である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  第１５版（１９７５）は、１またはそれより多い療法化合物、分子または剤の薬学的送達に適した組成物および配合物を記載する。
【００４２】
[0082]一般的に、キャリアーの性質は、使用する投与の特定の様式に応じるであろう。例えば、非経口配合物は、通常、薬学的および生理学的に許容されうる液体、例えば水、生理学的食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロール等をビヒクルとして含む、注射可能液体を含む。固形組成物（例えば粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル型）に関しては、慣用的な非毒性固形キャリアーには、例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれることも可能である。生物学的に中性のキャリアーに加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば湿潤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【００４３】
[0083]疾患の予防、治療または寛解：疾患の「予防」は、疾患の完全な進展を阻害することを指す。「治療」は、疾患が進展し始めた後、疾患の徴候または症状、あるいは病的状態を寛解させる療法的介入を指す。「寛解」は、疾患の徴候または症状の数または重症度の減少を指す。
【００４４】
[0084]スクリーニング：本明細書において、「スクリーニング」は、こうした疾患に影響を及ぼす候補剤を評価し、そして同定するために用いられるプロセスを指す。当該技術分野において公知であり、そして本明細書に記載する多くの技術のいずれか１つを用いて、例えばマイクロアレイ分析によって、またはｑＲＴ−ＰＣＲによって、マイクロＲＮＡの発現を定量化してもよい。
【００４５】
[0085]小分子：典型的には、約１０００ダルトン未満、またはいくつかの態様において約５００ダルトン未満の分子量を持つ、ターゲット分子の活性を何らかの測定可能な度合いに調節することが可能な分子。
【００４６】
[0086]療法：診断および治療の両方を含む一般的な用語。
[0087]療法剤：被験体に適切に投与された際、所望の療法的または予防的効果を誘導することが可能な、化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
【００４７】
[0088]本明細書において、「候補剤」は、療法剤として機能可能であるかどうかを決定するスクリーニングのために選択された化合物である。「インキュベーションする」には、剤が細胞または組織と相互作用するのに十分な長さの時間が含まれる。「接触させる」には、固形または液体型の剤を細胞または組織とインキュベーションすることが含まれる。細胞または組織を剤で「治療する」には、剤を細胞または組織と接触させるかまたはインキュベーションすることが含まれる。
【００４８】
[0089]療法的有効量：剤で治療している被験体において、または細胞において、所望の効果を達成するのに十分な、規定の医薬または療法剤の量。剤の有効量は、限定されるわけではないが、治療される被験体または細胞、および療法組成物の投与方式を含む、いくつかの要因に応じるであろう。
【００４９】
[0090]本発明の方法のいくつかの態様において、対照の使用が望ましい。これに関連して、対照は、同じ患者から得られる非癌性組織試料、または健康な被験体、例えば健康な組織ドナーから得られる組織試料であってもよい。別の例において、対照は、歴史的な値から計算される標準である。腫瘍試料および非癌性組織試料は、当該技術分野において公知の任意の方法にしたがって得られうる。例えば、腫瘍および非癌性試料は、切除を受けている癌患者から得られうるし、またはこれらは、皮下注射を用いた抽出によって、顕微解剖によって、またはレーザーキャプチャーによって得られうる。対照（非癌性）試料は、例えば、屍体ドナーからまたは健康なドナーから得られうる。
【００５０】
[0091]いくつかの態様において、スクリーニングは、細胞と候補剤とを接触させることを含む。細胞は、患者から得られる初代細胞であってもよいし、あるいは細胞は不死化または形質転換細胞であってもよい。
【００５１】
[0092]候補剤は、任意のタイプの剤、例えばタンパク質、ペプチド、小分子、抗体または核酸であってもよい。いくつかの態様において、候補剤はサイトカインである。いくつかの態様において、候補剤は小分子である。スクリーニングには、ハイスループットスクリーニング、および個々の候補剤または候補剤の小群をスクリーニングすることの両方が含まれる。
【００５２】
[0093]マイクロＲＮＡ検出
[0094]本明細書のいくつかの方法において、試料中に存在するｍｉＲＮＡを同定することが望ましい。
【００５３】
[0095]前駆体マイクロＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡの配列は、例えばＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによってオンラインで利用可能なｍｉＲＢａｓｅデータベースを通じて公的に入手可能である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３６：Ｄ１５４−Ｄ１５８，  ２００８；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３４：Ｄ１４０−Ｄ１４４，  ２００６；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：Ｄ１０９−Ｄ１１１，  ２００４を参照されたい）。現在開示される好ましいファミリーメンバーの前駆体および成熟型の配列を本明細書に提供する。
【００５４】
[0096]ＲＮＡ発現の検出および定量化は、当該技術分野において周知であり（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願公報第２００６／０２１１０００号および第２００７／０２９９０３０号を参照されたい）、そして以下に記載する多くの方法の任意の１つによって達成可能である。ＲＮＡファミリーメンバーに関する既知の配列を用いて、特異的プローブおよびプライマーを、以下に記載する検出法で使用するために必要に応じて設計することができる。
【００５５】
[0097]いくつかの場合、ＲＮＡ検出法は、試料、例えば細胞または組織試料からの核酸の単離を必要とする。当該技術分野において公知の任意の適切な技術を用いて、ＲＮＡおよび特にｍｉＲＮＡを含む核酸を単離することも可能である。例えば、ＲＮＡの単離には、フェノールに基づく抽出が一般的な方法である。フェノールに基づく試薬は、細胞および組織破壊ならびにそれに続く混入物質からのＲＮＡの分離のため、変性剤およびＲＮアーゼ阻害剤の組み合わせを含有する。フェノールに基づく単離法は、１０〜２００ヌクレオチドの範囲で、ＲＮＡ種（例えば前駆体および成熟ｍｉＲＮＡ、５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、およびＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ））を回収することも可能である。さらに、ＴＲＩＺＯＬＴＭまたはＴＲＩ試薬ＴＭを用いるものなどの抽出法は、高分子および低分子のすべてのＲＮＡを精製するであろうし、そしてｍｉＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含有する生物学的試料から総ＲＮＡを単離するのに有効な方法である。
【００５６】
[0098]いくつかの態様において、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、複雑な生化学的試料の平行分析を可能にする、核酸、タンパク質、小分子、細胞または他の物質の顕微鏡レベルの秩序だったアレイである。ＤＮＡマイクロアレイは、マイクロチップ、ガラススライドまたは微小球体サイズのビーズであってもよい固体支持体に化学的に付着した捕捉プローブとして知られる、異なる核酸プローブからなる。マイクロアレイは、例えば、多数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定するために使用可能である。
【００５７】
[0099]細かい先端のピンを用いたガラススライド上へのプリンティング、あらかじめ作製されたマスクを用いたフォトリソグラフィ、ダイナミックマイクロミラーデバイスを用いたフォトリソグラフィ、インクジェットプリンティング、または微小電極アレイ上の電気化学を含む、多様な技術を用いて、マイクロアレイを製造してもよい。
【００５８】
[00100]例えば、ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析（これらの方法は、任意のＲＮＡ分析のため、修飾型で使用可能であるが）は、当該技術分野において公知の任意の方法にしたがって達成可能である（例えば、各々、参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ公報第ＷＯ２００８／０５４８２８号；  Ｙｅら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（４）：４１６−４２３，  ２００３；  Ｃａｌｉｎら，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５３（１７）：１７９３−１８０１，  ２００５を参照されたい）。一例において、細胞または組織試料からＲＮＡを抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、総ＲＮＡから低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドのＲＮＡ）をサイズ選択する。低分子ＲＮＡの５’端および３’端にオリゴヌクレオチドリンカーを付着させ、そして生じた連結産物を、増幅１０周期のＲＴ−ＰＣＲ反応のテンプレートとして用いる。センス鎖ＰＣＲプライマーは、その５’端に付着したフルオロフォアを有し、それによって、ＰＣＲ産物のセンス鎖を蛍光標識する。ＰＣＲ産物を変性させ、そして次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的である、ターゲット核酸と称されるＰＣＲ産物が、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。次いで、マイクロアレイ・レーザースキャナーを用いて励起された際、スポットが蛍光を生じるであろう。次いで、いくつかの陽性および陰性対照、ならびにアレイデータ標準化法を用いて、特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して、各スポットの蛍光強度を評価して、これによって、特定のｍｉＲＮＡの発現レベルの評価が得られるであろう。
【００５９】
[00101]別の方法において、細胞または組織試料から抽出した、低分子ＲＮＡ分画（ｍｉＲＮＡを含む）を含有する総ＲＮＡを、低分子ＲＮＡのサイズ選択なしに直接用いて、そしてＴ４  ＲＮＡリガーゼおよびいずれかに蛍光標識された短いＲＮＡリンカーを用いて３’端標識する。３０℃で２時間インキュベーションすることによって、ＲＮＡ試料を標識した後、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを８０℃で５分間熱不活性化する。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的である、フルオロフォア標識されたｍｉＲＮＡは、塩基対形成を通じて、捕捉プローブが固定されたスポットにハイブリダイズするであろう。マイクロアレイ・スキャニングおよびデータプロセシングを上述のように行う。
【００６０】
[00102]スポット型オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、既製型オリゴヌクレオチドマイクロアレイおよびスポット型長鎖オリゴヌクレオチドアレイを含む、使用可能ないくつかのマイクロアレイがある。スポット型オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、捕捉プローブは、ｍｉＲＮＡ配列に相補的なオリゴヌクレオチドである。このタイプのアレイを、典型的には、２つの異なるフルオロフォアで標識された、比較しようとする２つの試料（例えば非癌性組織および癌性または試料組織）由来のサイズ選択された低分子ＲＮＡの増幅されたＰＣＲ産物とハイブリダイズさせる。あるいは、低分子ＲＮＡ分画（ｍｉＲＮＡを含む）を含有する総ＲＮＡを２つの試料から抽出し、そして低分子ＲＮＡのサイズ選択なしに直接用いて、そしてＴ４  ＲＮＡリガーゼおよび２つの異なるフルオロフォアで標識された短いＲＮＡリンカーを用いて３’端標識する。試料を混合し、そして１つの単一マイクロアレイにハイブリダイズさせ、これを次いでスキャンし、１つのアレイにおいて、上方制御されたおよび下方制御されたｍｉＲＮＡ遺伝子の視覚化を可能にすることも可能である。
【００６１】
[00103]既製型のオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは単一チャネルマイクロアレイにおいて、プローブは、既知のまたは予測されるｍｉＲＮＡの配列にマッチするよう設計される。完全ゲノムをカバーする、商業的に入手可能な設計がある（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔから入手可能）。これらのマイクロアレイは、遺伝子発現の絶対値の概算を提供し、そしてしたがって、２つの条件の比較には、２つの別個のマイクロアレイの使用が必要である。
【００６２】
[00104]スポット型長鎖オリゴヌクレオチドアレイは、５０〜７０量体のオリゴヌクレオチド捕捉プローブで構成され、そしてインクジェットまたはロボットプリンティングのいずれかによって製造される。短鎖オリゴヌクレオチドアレイは、２０〜２５量体オリゴヌクレオチドプローブで構成され、そしてフォトリソグラフィ合成（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって、またはロボットプリンティングによって製造される。
【００６３】
[00105]いくつかの態様において、定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の量を迅速に測定するために用いられるポリメラーゼ連鎖反応の修飾法である。ｑＲＴ−ＰＣＲは、一般的に、遺伝子配列、例えばｍｉＲが試料中に存在するかどうか、そして存在する場合、試料中のコピー数を決定する目的のために用いられる。ｍｉＲＮＡを含む核酸分子の発現を決定可能なＰＣＲの任意の方法が、本開示の範囲内に属する。当該技術分野において公知のｑＲＴ−ＰＣＲ法のいくつかの変型があり、このうち３つを以下に記載する。
【００６４】
[00106]定量的ポリメラーゼ連鎖反応のための方法には、限定されるわけではないが、アガロースゲル電気泳動、ＳＹＢＲグリーン（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、および蛍光レポータープローブの使用を通じたものが含まれる。後の２つは、リアルタイムで分析可能である。
【００６５】
[00107]アガロースゲル電気泳動を用いる場合、濃度が既知である類似サイズの増幅用ターゲットＤＮＡの部分とともに、未知の試料および既知の試料が調製される。両方の反応を、同一条件で、同じ時間、泳動する（好ましくは、同じプライマー、または少なくとも類似のアニーリング温度のプライマーを用いて）。アガロースゲル電気泳動を用いて、元来のＤＮＡおよび残ったプライマーから反応産物を分離する。既知のおよび未知の試料の相対量を測定して、未知の量を決定する。
【００６６】
[00108]ＳＹＢＲグリーン色素の使用は、アガロースゲル法よりも正確であり、そしてリアルタイムで結果を生じることも可能である。ＤＮＡ結合色素は、すべての新規合成二本鎖ＤＮＡに結合し、そして蛍光強度の増加を測定し、こうして、最初の濃度の決定を可能にする。しかし、ＳＹＢＲグリーンは、いかなる予期されぬＰＣＲ産物も、ならびにプライマー二量体も含む、すべての二本鎖ＤＮＡを標識し、複雑な事態およびアーチファクトを導く可能性がある。蛍光二本鎖ＤＮＡ色素を添加して、反応を通常通り調製する。反応を実行し、そして蛍光レベルを監視する（色素は、二本鎖ＤＮＡに結合した際にのみ蛍光を生じる）。標準試料または標準曲線を参照すると、ＰＣＲ中の二本鎖ＤＮＡ濃度が決定可能である。
【００６７】
[00109]蛍光レポータープローブ法は、プローブ配列のみの定量化、およびすべての二本鎖ＤＮＡの定量化を行わないように、配列特異的核酸に基づくプローブを用いる。これは一般的に、蛍光レポーターおよび隣接する位置に保持される消光剤を伴うＤＮＡに基づくプローブ（いわゆる二重標識プローブ）で実行される。レポーターが消光剤に非常に近接していると、蛍光が妨げられ；プローブが破壊された際にのみ、蛍光が検出される。このプロセスは、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性に依存する。
【００６８】
[00110]リアルタイム定量的ＰＣＲ反応は、二重標識プローブを添加して調製される。二本鎖ＤＮＡテンプレートが変性すると、プローブは、テンプレートＤＮＡの目的の領域において、プローブの相補配列に結合することができる。ＰＣＲ反応混合物を加熱してポリメラーゼを活性化させると、ポリメラーゼは、プライミングされた一本鎖テンプレートＤＮＡに対する相補鎖を合成し始める。重合が続くにつれて、ポリメラーゼは相補配列に結合したプローブに到達し、次いで、ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のためプローブが加水分解されて、それによって、蛍光レポーターおよび消光剤分子が分離される。この結果、蛍光が増加し、これを検出する。リアルタイムＰＣＲ反応の熱サイクリング中、各ＰＣＲ周期中に加水分解された二重標識プローブから放出された蛍光の増加を監視し、これによって、最終の、そしてしたがって最初のＤＮＡ量の正確な決定が可能になる。
【００６９】
[00111]いくつかの態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの使用が望ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸ハイブリダイゼーション技術を単細胞レベルに適用および外挿し、そして細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学と組み合わされて、形態の維持ならびに細胞マーカーの維持および同定を可能にし、そして集団、例えば組織および血液試料内の特定の細胞に対する配列の位置決定を可能にする。ＩＳＨは、相補核酸を用いて、組織の一部または切片において（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、あるいは組織が十分に小さい場合は全組織において（ホールマウントＩＳＨ）、１またはそれより多い特定の核酸配列を位置決定するタイプのハイブリダイゼーションである。ＲＮＡ  ＩＳＨを用いて、組織における発現パターン、例えばｍｉＲＮＡの発現をアッセイすることも可能である。
【００７０】
[00112]試料細胞または組織を処理して、浸透性を増加させ、プローブ、例えばｍｉＲＮＡ特異的プローブが細胞に進入するのを可能にする。処理した細胞にプローブを添加して、適切な温度でハイブリダイズを可能にし、そして過剰なプローブを洗い流す。相補プローブを放射性、蛍光または抗原性タグで標識し、これによって、オートラジオグラフィ、蛍光顕微鏡またはイムノアッセイを用いて、組織におけるプローブの位置および量を決定することも可能である。試料は、本明細書に記載するような任意の試料、例えば非癌性または癌性組織試料であってもよい。ｍｉＲ−１５５ファミリーメンバーの配列は公知であるため、プローブがｍｉＲ−１５５に特異的に結合するように、それに応じてｍｉＲ−１５５プローブを設計することも可能である。
【００７１】
[00113]いくつかの態様において、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの使用が望ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、ＩＳＨ前の、ターゲット核酸配列のＰＣＲに基づく増幅である。ＲＮＡの検出のため、細胞内逆転写工程を導入して、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前にＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡを生成する。これによって、低コピーＲＮＡ配列の検出が可能になる。
【００７２】
[00114]ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、そして透過処理して、形態を保持し、そして増幅しようとする細胞内配列へのＰＣＲ試薬のアクセスを可能にする。次に、懸濁液中に保持された無傷細胞において、あるいは直接、細胞遠心分離調製物またはガラススライド上の組織切片においてのいずれかで、ターゲット配列のＰＣＲ増幅を行う。前者のアプローチでは、慣用的なサーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応混合物中に懸濁された固定細胞を熱サイクリングする。ＰＣＲ後、細胞をガラススライド上に細胞遠心分離して、ＩＳＨまたは免疫組織化学によって細胞内ＰＣＲ産物を視覚化する。ガラススライド上のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、カバースリップ下で、試料にＰＣＲ混合物を重層して、これを次いで密封して、反応混合物の蒸発を防止することによって行われる。ガラススライドを慣用的なまたは特別に設計されたサーマルサイクラーのいずれかの加熱ブロック上に直接置くことによって、あるいは熱サイクリングオーブンを用いることによって、熱サイクリングを達成する。
【００７３】
[00115]細胞内ＰＣＲ産物の検出は、一般的に、２つの異なる技術、ＰＣＲ産物特異的プローブを用いたＩＳＨによる間接的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、または熱サイクリング中にＰＣＲ産物内に取り込まれている標識ヌクレオチド（例えばジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰ）の直接検出を通じた、ＩＳＨを伴わない直接的ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの一方によって達成される。
【００７４】
[00116]予後の予測マーカーとしての、および療法剤の同定のための、示差発現ｍｉＲおよびｍｉＲＮＡの使用。本明細書において、状態の指標を伴う、ｍｉＲ−１５５の特定の発現パターンは、特定の患者における生存予後の予測因子であることを開示する。本明細書において、「劣った予後」は、一般的に、生存の減少、あるいは言い換えると、死亡リスクの増加または死亡までの時間の減少を指す。劣った予後はまた、疾患の重症度の増加、例えば他の臓器への癌の蔓延（転移）の増加を指すことも可能である。１つの態様において、それぞれのマーカーは、対照に比較して少なくとも１．５倍の発現の増加または減少を示す。他の態様において、劣った予後は、野生型腫瘍対照値に比較して、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍のマーカーの増加または減少によって示される。
【００７５】
[00117]疾患の治療のための療法剤を同定する、候補剤のスクリーニング法が当該技術分野において周知である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを検出する方法が当該技術分野において公知であり、そして本明細書に記載され、これらは例えば、限定されるわけではないが、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲを含む）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、およびノーザンブロット分析である。１つの態様において、スクリーニングは、ハイスループットスクリーンを含む。別の態様において、候補剤は、個々にスクリーニングされる。
【００７６】
[00118]候補剤は任意のタイプの分子であってもよく、例えば限定されるわけではないが、癌疾患状態（単数または複数）を直接的または間接的のいずれかで改善しうる、核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、小分子、化学薬品、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、または任意の他のタイプの分子であってもよい。
【００７７】
[00119]典型的には、内因性遺伝子、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは、細胞内で調節される。特定の態様において、核酸配列は、表１に列挙する１またはそれより多いｍｉＲＮＡ配列に対して、核酸配列が少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％同一である、少なくとも１つのセグメントを含む。内因性遺伝子、ｍｉＲＮＡ、またはｍＲＮＡの発現またはプロセシングの調節は、ｍＲＮＡのプロセシングの調節を通じてであってもよく、こうしたプロセシングには、細胞内での転写、輸送および／または翻訳が含まれる。調節はまた、細胞、組織、または臓器内でのｍｉＲＮＡ活性の阻害または増進によっても達成可能である。こうしたプロセシングは、コードされた産物の発現またはｍＲＮＡの安定性をもたらす可能性がある。さらに他の態様において、核酸配列は、修飾核酸配列を含んでもよい。特定の側面において、１またはそれより多いｍｉＲＮＡ配列は、修飾された核酸塩基または核酸配列を含んでもよい。
【００７８】
[00120]本発明の方法において、ひとたび細胞内に入ったら、対応するｍｉＲＮＡとして機能する核酸分子を細胞または生物に投与することによって、細胞または他の生物学的物質、例えば生物（患者を含む）に、ｍｉＲＮＡまたは特定のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ分子を提供できることが理解されるであろう。細胞に提供する分子の形態は、細胞内に入るとすぐにｍｉＲＮＡとして作用する形態でなくてもよい。したがって、いくつかの態様において、合成ｍｉＲＮＡまたは非合成ｍｉＲＮＡ、例えば細胞のｍｉＲＮＡプロセシング機構にアクセスした時点で、成熟型の、そして活性型のｍｉＲＮＡにプロセシングされるものを、生物学的物質に提供することが予期される。特定の態様において、生物学的物質に提供されるｍｉＲＮＡ分子が、成熟ｍｉＲＮＡ分子ではなく、ｍｉＲＮＡプロセシング機構にアクセス可能になった際に、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされうる核酸分子であることが特に予期される。用語「非合成」は、ｍｉＲＮＡの背景において、本明細書に定義するように、ｍｉＲＮＡが「合成」ではないことを示す。さらに、合成ｍｉＲＮＡの使用に関する本発明の態様において、対応する非合成ｍｉＲＮＡの使用もまた、本発明の側面であると見なされ、そしてその逆もまた当てはまることが予期される。剤を「提供する」という用語は、患者に剤を「投与する」ことを含むよう用いられる。
【００７９】
[00121]特定の態様において、方法にはまた、細胞または生物においてｍｉＲＮＡを標的化して調節することもまた含まれる。用語「ｍｉＲＮＡを標的化して調節する」とは、選択されたｍｉＲＮＡを調節するために本発明の核酸が使用されるであろうことを意味する。いくつかの態様において、標的化ｍｉＲＮＡを細胞または生物に効果的に提供する、標的化ｍｉＲＮＡに対応する合成または非合成ｍｉＲＮＡを用いて、調節が達成される（陽性調節）。他の態様において、標的化ｍｉＲＮＡを細胞または生物において有効に阻害するｍｉＲＮＡ阻害剤を用いて、調節が達成される（陰性調節）。
【００８０】
[00122]いくつかの態様において、標的化されて調節されるｍｉＲＮＡは、疾患、状態、または経路に影響を及ぼすｍｉＲＮＡである。特定の態様において、標的化ｍｉＲＮＡの陰性調節によって治療が提供可能であるため、ｍｉＲＮＡは標的化される。他の態様において、標的化ｍｉＲＮＡの陽性調節によって治療が提供可能であるため、ｍｉＲＮＡは標的化される。
【００８１】
[00123]本発明の特定の方法において、選択されるｍｉＲＮＡ調節因子を、標的化ｍｉＲＮＡの調節に関連する治療が必要とされるか、あるいは本明細書に論じる生理学的または生物学的結果（例えば特定の細胞経路に関するもの、または細胞生存減少のような結果）が必要とされる、細胞、組織、臓器または生物（集合的に「生物学的物質」）に投与するさらなる工程がある。その結果、本発明のいくつかの方法において、ｍｉＲＮＡ調節因子（単数または複数）によって提供可能な治療が必要な患者を同定する工程がある。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ調節因子の有効量を投与してもよいことが予期される。特定の態様において、生物学的物質に与えられる療法的利点があり、ここで、「療法的利点」は、疾患または状態に関連する１またはそれより多い状態または症状の改善、あるいは疾患に関連する予後、期間、または状態の改善を指す。療法的利点には、限定されるわけではないが、疼痛の減少、死亡率の減少、症状の減少が含まれると予期される。例えば、癌に関して、療法的利点は、腫瘍増殖の阻害、転移の防止、転移数の減少、癌細胞増殖の阻害、癌細胞増殖の阻害、癌細胞における細胞死の誘導、癌細胞近傍の血管新生の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、疼痛の減少、再発リスクの減少、癌細胞における化学感受性または放射感受性の誘導、寿命の延長、および／または癌に直接または間接的に関連する死亡の遅延でありうることが予期される。
【００８２】
[00124]さらに、伝統的な療法または予防剤と組み合わせて、患者に、療法の一部として、ｍｉＲＮＡ組成物を提供してもよいことが予期される。さらに、療法の背景で論じられる任意の方法を、特に、潜在的に療法が必要とされるか、あるいは療法が必要とされる状態または疾患のリスクがあると同定される患者において、予防として適用してもよいことが予期される。
【００８３】
[00125]さらに、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡに対応する１またはそれより多い核酸および療法薬剤を使用することに関する。核酸は、薬剤の効果または有効性を増進させ、いずれかの副作用または毒性を減少させ、薬剤の生物学的利用能を修飾し、そして／または必要な投薬量または頻度を減少させることも可能である。特定の態様において、療法薬剤は、癌療法剤である。その結果、いくつかの態様において、患者において癌を治療する方法であって、癌療法剤、および癌療法剤の有効性を改善するかまたは非癌細胞を保護する、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子の有効量を患者に投与する工程を含む、前記方法がある。癌療法にはまた、化学薬品および放射線に基づく治療の両方を含む多様な併用療法も含まれる。併用化学療法には、限定されるわけではないが、例えば、ベバシズマブ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、ＥＧＦＲ阻害剤（ゲフィチニブおよびセツキシマブ）、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ）、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、タキソテール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、あるいは前述のものの任意の類似体または誘導変異体が含まれる。
【００８４】
[00126]一般的に、ｍｉＲＮＡの阻害剤を提供して、成熟ｍｉＲＮＡに対応する核酸分子が提供された際と比較して反対の効果を達成することも可能である。同様に、成熟ｍｉＲＮＡに対応する核酸分子を提供して、ｍｉＲＮＡの阻害剤が提供された際と比較して反対の効果を達成することも可能である。例えば、細胞増殖を増加させるｍｉＲＮＡ分子を細胞に提供して、増殖を増加させることも可能であるし、またはこうした分子の阻害剤を細胞に提供して、細胞増殖を減少させることも可能である。本発明は、本明細書に開示する異なるｍｉＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ阻害剤で観察される、異なる生理学的効果の背景における、これらの態様を予期する。これらには、限定されるわけではないが、以下の生理学的効果が含まれる：細胞増殖の増加および減少、アポトーシスの増加または減少、形質転換の増加、細胞生存度の増加または減少、生存細胞数の減少または増加、ならびに細胞周期の特定の期の細胞数の増加または減少。本発明の方法は、一般的に、１またはそれより多い異なるｍｉＲＮＡ分子に対応する１またはそれより多い異なる核酸分子を提供するかまたは導入する工程を含むことが予期される。以下の、少なくとも以下の、または最大で以下の数の異なる核酸分子を提供するかまたは導入してもよいことが予期される：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、またはそこから導き出される任意の範囲。これはまた、細胞内に提供または導入可能な異なるｍｉＲ分子の数にも当てはまる。
【００８５】
[00127]ｍｉＲＮＡ−１５５
[00128]ＭＭＲ機能不全から生じるミューテーター表現型は、癌進行を促進する、さらなる遺伝子突然変異の獲得を誘導する。生殖系列突然変異に加えて、コアＭＭＲタンパク質発現の減少または非存在を生じる多くの病原性事象があり、それにはプロモーターメチル化、およびヒストンアセチル化減少、ならびに炎症および低酸素などの微小環境要因が含まれる。本発明者らの結果は、ｍｉＲ−１５５が、コアＭＭＲヘテロ二量体タンパク質ＭＳＨ２−ＭＳＨ６およびＭＬＨ１−ＰＭＳ２の下方調節を引き起こすことによって、この多要因制御において役割を果たすことを示す。ｍｉＲ−１５５によって、これらの必須のＭＭＲ構成要素を同時に阻害すると、突然変異誘発表現型が引き起こされる。
【００８６】
[00129]いかなる特定の理論にも束縛されることなく、全ＭＭＲ系にｍｉＲ−１５５が発揮する驚くべき効果は、２つの異なる現象の結果のようである。第一に、ＭＭＲタンパク質安定性は、これらがヘテロ二量体を形成する能力に関連する；したがって、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１タンパク質の喪失は、それぞれのヘテロ二量体複合タンパク質の不安定化を生じる。第二に、ｍｉＲ−１５５は、コアＭＭＲタンパク質の下方制御を標的とするようである。これらの制御および安定性の変化は、一緒に、突然変異率の有意な増加を生じる。本発明者らは、ｍｉＲ１５５が他の関連ＤＮＡ修復タンパク質に影響を及ぼし、関連しないゲノムプロセスによるＭＭＲ欠損の表現型効果を増進する可能性を排除することは不可能である。
【００８７】
[00130]ｍｉＲ−１５５によるＭＭＲタンパク質の不完全抑制は、癌における腫瘍抑制遺伝子に特有ではない。大腸腺腫症（ＡＰＣ）遺伝子の１つの対立遺伝子の発現の部分的な（５０％）減少は、結腸直腸癌の進展に関連付けられている。さらに、トランスフォーミング増殖因子β受容体Ｉ（ＴＧＦＢＲ１）遺伝子の単一の対立遺伝子の発現減少がＣＲＣに関連付けられている。マイクロＲＮＡは、近年、対立遺伝子および遺伝子の発現制御に関与するトランス活性化要素として提唱されている。本発明者らの結果は、ＭＭＲ遺伝子の非メンデル制御におけるｍｉＲＮＡの役割を強く裏付ける。
【００８８】
[00131]ｍｉＲＮＡ制御の複雑性は、組織特異性によって、そしてターゲット配列において可能性のある多型によって増加する。例えば、ｈＭＬＨ１の３’ＵＴＲにおける後天性突然変異は、急性骨髄性白血病患者における疾患再発と関連付けられている。本発明者らは、ＭＭＲターゲット遺伝子の３’ＵＴＲにおける後天性突然変異と組み合わされたｍｉＲ−１５５の過剰発現が、これらの選択された患者におけるＭＳＩの進展にさらに寄与している可能性を排除することは不可能である。さらに、ＭＭＲ遺伝子のよく定義された突然変異および／またはエピジェネティックな不活性化は、ＭＳＩ腫瘍の特定のサブセット、例えば炎症性腸疾患に関連するＣＲＣおよびＨＩＶ感染に関連する非ホジキンリンパ腫では、あまり頻繁でないようである。コアＭＭＲ遺伝子の下方制御を立証する本発明者らの研究によって、これらの癌に関する潜在的な代替発病機構は、ｍｉＲ−１５５の過剰発現でありうることが示唆される。
【００８９】
[00132]本発明者らは、ＣＲＣにおいてｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質の発現の間の逆相関を観察したが、ｍｉＲ−１５５発現が増加したすべての腫瘍が、ＭＳＩによって特徴付けられるわけではない。ヒト細胞において、ｍｉＲＮＡおよび遺伝子発現の細かいチューニングに関与する閾値発現効果またはサベージ・ループ（ｓａｖａｇｅ  ｌｏｏｐ）を含む、ｍｉＲ−１５５によるコアＭＭＲタンパク質の異なる制御に、いくつかの因子が寄与している可能性もある。
【００９０】
[00133]ＭＭＲ不全腫瘍の患者は、大部分が、優れた予後によって特徴付けられるが、ＭＭＲ能がある腫瘍の患者と比較した場合、５−フルオロウラシル・アジュバント化学療法後の生存利益はより低い。コアＭＭＲタンパク質の下方制御に寄与するｍｉＲ−１５５の役割によって、ｍｉＲ−１５５が、癌患者の予後診断および療法において、重要な層化因子である可能性もあることが示唆される。ｍｉＲ−１５５発現は、標準的な試験が確証的な診断を提供しないＭＳＩ腫瘍の病因学において、さらなる分析試験となることも可能である。
【００９１】
[00134]本開示全体を通じて、多様な刊行物、特許および公開特許明細書が、同定する引用によって参照とされる。これらの刊行物、特許および公開特許明細書は、本発明が属する技術分野の状態をより詳細に記載するために、参照により本開示に援用される。
【００９２】
[00135]本発明は、続く実施例においてさらに定義され、この中で、別に言及しない限り、すべての部分および割合は重量により、そして度は摂氏度である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示目的のみのために提供されることが理解されるべきである。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を解明することができ、そして本発明の精神およびその範囲から逸脱することなく、多様な用法および条件に適応させるために、本発明の多様な改変および修飾を行うことも可能である。
【実施例】
【００９３】
[00136]実施例
[00137]実施例１．
[00138]用いた材料および方法
[00139]細胞培養およびトランスフェクション
[00140]Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ、ＨＣＴ−１１６およびＤＬＤ−１結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＡＴＣＣ  バージニア州マナサス）を、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールスバッド）中で培養し、ＭＶ４−１１  Ｂ骨髄単球性白血病細胞（ＡＴＣＣ  バージニア州マナサス）およびパッケージング細胞２９３ＴＮ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カリフォルニア州カールスバッド）中で増殖させた。すべての細胞に、抗生物質を加えた１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を補充した。マイコプラズマ混入に関して、細胞を定期的に、そして機能実験の前にチェックし、そして常に陰性であることが見出された。製造者のプロトコルにしたがってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いることによって、細胞を６ウェルプレート中でトランスフェクションした。過剰発現研究のため、特異的ｍｉＲＮＡまたは対照前駆体オリゴヌクレオチドをＡｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）から購入し、そして１００ｎＭで用いた。サイレンシング実験のため、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡＴＭアンチｍｉＲ−１５５または対照ｍｉＲＣＵＲＹノックダウンプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ、デンマーク・ベドベッグ）を１００ｎＭで用いた。以下に記載するように、定量的リアルタイムＰＣＲによって、４８時間後、ｍｉＲＮＡ発現を検証した。全長ＭＬＨ１およびＭＳＨ６  ｃＤＮＡをコードするプラスミドをＯｒｉｇｅｎｅから購入した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、ｍｉＲ−１５５シード領域に関するＭＬＨ１およびＭＳＨ６突然変異体を調製した。０．３ｘ１０６細胞を６ウェルプレートに植え付け、そして１μｇのＷＴまたは突然変異ｃＤＮＡコーディングプラスミドおよび１μｇのｍｉＲ−１５５コーディングベクターまたは空ベクターを用いて、２４時間後にトランスフェクションし、３６時間後に細胞を採取して、そしてウェスタンブロッティングによって溶解物を分析した。
【００９４】
[00141]ルシフェラーゼアッセイ
[00142]ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６の３’−ＵＴＲおよび／またはＣＤＳ中の予測されるｍｉＲＮＡ結合部位を、以下のように、ホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）・ルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。特異的プライマー（以下の表２）を用いたＰＣＲによって、ＳＷ−４８０細胞から、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を増幅した。
【００９５】
[00143]次いで、産物をＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  マサチューセッツ州イプスウィッチ）で消化し、そしてホタル・ルシフェラーゼ遺伝子の停止コドンのすぐ下流にＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩ部位を有するように先に修飾したｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）内に挿入した。各単一遺伝子に関して、突然変異ｍｉＲＮＡ認識配列を含むレポーター構築物を構築した（ＭＵＴ−１５５）。ｈＭＳＨ２  ３’ＵＴＲおよびｈＭＬＨ１  ３’ＵＴＲ結合部位に関して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、ｍｉＲ−１５５のシードに相補的な配列を欠失させた。すべての他のｍｉＲ−１５５シード領域に関しては、シード領域相補部位を排除するため、予測されるｍｉＲＮＡ結合部位の上流または下流に位置するプライマーを用いて、突然変異構築物を得た。プライマー配列を表２に提示する。
【００９６】
[00144]Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、１２ウェルプレート中、１μｇのｐＧＬ３ホタル・ルシフェラーゼ・レポーター対照ベクター、０．１μｇのｐｈＲＬ−ＳＶ４０対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）、および１００ｎＭ  ｍｉＲＮＡまたは対照前駆体で同時トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いることによって、ホタルおよびウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）・ルシフェラーゼ活性を続いて測定した。
【００９７】
[00145]ウェスタンブロッティング
[00146]イムノブロッティング分析のため、プロテアーゼ阻害剤を加えた氷冷細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．  マサチューセッツ州ダンバース）で細胞を溶解した。等量のタンパク質を分離し、そして４Ｘ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合し、４％−２０％および７．５％直線勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で電気泳動し、そしてニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にトランスファーした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中の５％脱脂粉乳で膜をブロッキングし、そして製造者の指示にしたがって、一次および二次抗体とインキュベーションした。以下の一次抗体を用いた：マウス・モノクローナル抗ＭＳＨ２（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウス・モノクローナル抗ＭＳＨ６（１：５００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カリフォルニア州サンノゼ）、マウス・モノクローナル抗ＭＬＨ１（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ウサギ・ポリクローナル抗ＭＬＨ１（マウス実験のために用いられる１：２００  ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カリフォルニア州サンタクルーズ）、マウス・モノクローナル抗アクチン（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）、マウス・モノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（１：１０００、ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。ＭＬＨ１およびＭＳＨ６に対するＮ末端一次抗体（１／５００  Ｓｉｇｍａ）。
【００９８】
[00147]成熟ｍｉＲＮＡおよび遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲ
[00148]Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で総ＲＮＡを単離した。一試験管ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイによって成熟ｍｉＲＮＡを評価し、一方、目的のｍＲＮＡの発現を、以下のプローブを用いた遺伝子発現アッセイによって評価した：ｈＭＬＨ１＝Ｈｓ００９７９９２３＿ｍ１、ｈＭＳＨ２＝Ｈｓ００９５３５２３＿ｍ１、ｈＭＳＨ６＝Ｈｓ００９４３００１＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）。ｍｉＲＮＡ発現を、ヒトにおいてはＲＮＵ４４およびＲＮＵ４８、そしてマウス細胞においてはｓｎｏＲ−１３５のものに対して標準化した。遺伝子発現をビンキュリンに対して標準化した。テンプレート不含対照およびＲＴを除いた対照を含めて、すべてのレトロトランスクリプターゼ（ＲＴ）反応をＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において行った。別に明記しない限り、各試料を３つ組で試験した。
【００９９】
[00149]ノーザンブロッティング
[00150]成熟ｍｉＲＮＡ検出のため、先に記載されているようにアクリルアミド・ノーザンブロッティングを行った。
【０１００】
[00151]ｍｉＲ−１５５を過剰発現する安定クローンの生成
[00152]Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、２つの異なるプロモーターの制御下で全長ｍｉＲ−１５５およびＧＦＰ遺伝子を含有するｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｍｉＲＮＡ発現プラスミドに安定感染させた（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州マウンテンビュー）。空ベクターを対照として用いた。プレｍｉＲ−１５５発現および対照構築物を、２９３ＴＮパッケージング細胞株中、ｐＰＡＣＫＨ１レンチベクター・パッケージングプラスミド混合物（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でパッケージングした。ＰＥＧ−ｉｔＴＭウイルス沈殿溶液を用いてウイルスを濃縮し、そしてＵｌｔｒａＲａｐｉｄレンチウイルス力価キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、力価を分析した。ＦＡＣＳ分析によって、感染細胞を選択した（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。蛍光顕微法によって＞９０％の感染効率を検証し、そしてｍｉＲ−１５５発現に関するリアルタイムＰＣＲによって、さらに確認した。
【０１０１】
[00153]組織病理評価
[00154]腫瘍タイプ（腺癌および粘液性腺癌）および分化等級をＷＨＯ基準にしたがって決定した。顕著な固形増殖パターンおよび穏やかなまたは中程度の核多形性を持つ癌を髄様腺癌３と分類した。
【０１０２】
[00155]免疫組織化学分析
[00156]先に記載されている分析法にしたがって、ＭＬＨ１およびＰＭＳ２発現の免疫組織化学分析を行った。核内ＭＬＨ１またはＭＳＨ２発現の完全な喪失を示す腫瘍を、ＭＬＨ１陰性またはＭＳＨ２陰性と分類した。正常上皮細胞、リンパ球、および間質細胞の核免疫染色は、各場合で、内部陽性対照として働いた。臨床データおよびＭＳＩ状態の知識を持たない２人の病理学者によって、すべての腫瘍を独立に評価した。
【０１０３】
[00157]組織収集
[00158]倫理委員会の認可後、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｏ  Ｒｏｍａｇｎｏｌｏ  ｐｅｒ  ｌｏ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｅ  ｌａ  Ｃｕｒａ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ、イタリア・メルドラで、ＣＲＣの８３の連続症例由来の腫瘍および正常隣接組織から、新鮮凍結組織を収集した。タンパク質およびＲＮＡ抽出のための細胞溶解物を上述のように抽出した。
【０１０４】
[00159]レーザーキャプチャー顕微解剖（ＬＣＭ）
[00160]ＯＳＵ  Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで、ＬＣＭを行った。
【０１０５】
[00161]ＭＬＨ１およびＰＭＳ２配列決定
[00162]ＣＲＣ患者由来のＤＮＡを増幅し、そして配列決定した。３７３０  ＤＮＡ分析装置およびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅターミネーター・サイクル配列決定キット、バージョン３．１を配列決定分析に用いた。データ収集ソフトウェアｖ３．０および配列決定分析ソフトウェアｖ５．２を用いた。施設倫理委員会の認可後、患者情報および組織を収集した。
【０１０６】
[00163]実施例２
[00164]トランスフェクション
[00165]Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いることによって、Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ、ＨＣＴ−１１６、およびＤＬＤ１細胞をトランスフェクションし、一方、製造者の指示にしたがって、ｍｉＲ−１５５過剰発現のためのＭＶ４−１１レンチウイルスベクターおよび空ベクターをＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州マウンテンビュー）によって生成した。診断プライマーを用いた遺伝子型決定分析によって、マイクロサテライト不安定性を評価した。ＭＳＩ患者由来のゲノムＤＮＡを配列決定した。統計分析：別に示さない限り、結果を平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表す。両側スチューデントｔ検定を用いて、群間の比較を行った。ｐが０．０５より小さい場合、有意と認めた。Ｐｅａｒｓｏｎ相関に関しては、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）分析を用いた。
【０１０７】
[00166]実施例３
[00167]ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６は、ｍｉＲ−１５５のターゲットである。
【０１０８】
[00168]本発明者らは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測モデルを用いて、コアＭＭＲ遺伝子のｍＲＮＡにおけるｍｉＲ−１５５に関する潜在的な結合部位を同定した。ＲＮＡｈｙｂｒｉｄを用いて、ｈＭＬＨ１中に２つの推定上の部位が見出され（ＢｉＢｉＳｅｒｖ、ドイツ；ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００２４９．２）、一方は（ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００２４９．２）の３’−ＵＴＲ中であり、そしてもう一方は、コーディング領域（ＣＤＳ）中であり；ＴａｒｇｅｔＳｃａｎを用いてｈＭＳＨ２の３’−ＵＴＲ中に１つの部位が見出され（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＭＩＴ；  ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００２５１．１）；そしてＲＮＡｈｙｂｒｉｄを用いて、ｈＭＳＨ６のＣＤＳ中に１つの部位が見出された（ＢｉＢｉＳｅｒｖ、ドイツ；ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００１７９．２）（図１Ａ；図６）。
【０１０９】
[00169]機能性スクリーンとして、本発明者らは、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の予測されるｍｉＲ−１５５シード領域を含むコーディング領域および３’領域を、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にサブクローニングし、そしてルシフェラーゼ・タンパク質活性を記録した。本発明者らは、これらの研究のため、ＭＭＲ能があるｃｏｌｏ−３２０ＤＭ  ＣＲＣ細胞を使用したが、これは、該細胞がｍｉＲ−１５５の低い基底レベルを含有するためである。Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、ルシフェラーゼ・レポーター構築物で、そしてｍｉＲ−１５５前駆体（プレｍｉＲ−１５５）または対照前駆体（プレｍｉＲ対照）でトランスフェクションした。
【０１１０】
[00170]本発明者らは、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６のｍｉＲ−１５５シード領域を含有する構築物を用いて、プレｍｉＲ−１５５の存在下、それぞれルシフェラーゼ活性の３７％、３８％および２４％の減少を観察した（ｐ＜０．００１；図１Ｂｂ；各々に関するＷＴを参照されたい）。構築物がｍｉＲ１５５シード領域の欠失を含有する場合には、ルシフェラーゼ活性において変化は見られなかった（図１Ｂ；各構築物に関するＭＵＴ−１５５を参照されたい）。興味深いことに、ｈＭＬＨ１遺伝子中の個々のｍｉＲ−１５５結合部位の影響は相加的であるようであった（図１Ｂ；ｈＭＬＨ１  ＭＵＴ−１５５  ３’−ＵＴＲおよびＭＵＴ−１５５  ＣＤＳをＷＴに比較されたい）。
【０１１１】
[00171]リボソームは、ＣＤＳターゲット部位からｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ複合体を外す。
[00172]このプロセスの結果、マイクロＲＮＡがターゲットタンパク質を調節することが不可能になる。ＭＬＨ１およびＭＳＨ６はどちらもＣＤＳシード領域を含有する（図１；図６）。
【０１１２】
[00173]ｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣ置換の可能性を調べるため、本発明者らは、ＭＬＨ１を欠如する細胞株（ＨＣＴ１１６）またはＭＳＨ６を欠如する細胞株（ＤＬＤ１）を、ｍｉＲ−１５５前駆体を伴いまたは伴わず、対応する全長ｃＤＮＡを含有する哺乳動物発現ベクターで同時トランスフェクションし、そしてタンパク質発現を調べた（図７）。
【０１１３】
[00174]本発明者らは、ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ６  ｃＤＮＡ配列中のＣＤＳ  ｍｉＲ−１５５ターゲット部位を欠失させて、発現がｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣリボソーム置換によって影響を受けるかどうかを決定した。ＣＤＳ  ｍｉＲ−１５５シード配列のインフレーム欠失は、一部切除ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ６タンパク質を生じた（図７；１６０ｋＤ  ｈＭＳＨ６のサイズ減少は、より長いゲル泳動においてのみ検出可能である）。ＭＭＲ  ｃＤＮＡとｍｉＲ−１５５発現ベクターを同時トランスフェクションすると、ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ６タンパク質の下方制御が生じた（図７；ｈＭＬＨ１  ＷＴおよびｈＭＳＨ６  ＷＴを参照されたい）。ｃＤＮＡからＣＤＳ  ｍｉＲ−１５５シード配列を欠失させると、ｈＭＬＨ１発現の部分的回復が生じ（図７；ｈＭＬＨ１  ＭＵＴ  ＣＤＳを参照されたい）、そしてｈＭＳＨ６発現の完全な回復が生じた（図７；ｈＭＳＨ６  ＭＵＴを参照されたい）。ｈＭＬＨ１  ＣＤＳおよび３’−ＵＴＲシード配列の両方の突然変異は、ｈＭＬＨ１タンパク質発現の完全な回復を生じた（図７；ｈＭＬＨ１二重突然変異体を参照されたい）。これらの結果は、ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ６由来のｍｉＲ−１５５シード配列を含有するルシフェラーゼに基づく系（図１Ｂ）と定性的に同様であり、そしてｍｉＲＮＡ−ＲＩＳＣリボソーム置換がＭＭＲタンパク質のｍｉＲ−１５５調節において問題である可能性が低いことを示す。
【０１１４】
[00175]内因性ＭＭＲ遺伝子およびタンパク質発現に対するｍｉＲ−１５５の影響をｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞において調べた（図２）。トランスフェクションされたｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞に関して、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、スクランブル・プレｍｉＲ対照に比較したプレｍｉＲ−１５５の一貫した増加を決定した（図２Ａ）。
【０１１５】
[00176]本発明者らは、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６のｍＲＮＡ発現が、プレｍｉＲ−１５５過剰発現によって影響を受けないことを見出した（図２Ｂ、白色および青色バーを比較されたい）。対称的に、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６タンパク質は、プレｍｉＲ−１５５でトランスフェクションされた細胞において、それぞれ、５３±１４％（ｐ＝０．０２）、３７±１０％（ｐ＝０．０１）および３２±７．４％（ｐ＝０．００４）減少した（図２Ｃ；左のパネル、右のパネルの白色および青色バーを比較されたい）。
【０１１６】
[00177]本発明者らがｍＲＮＡ発現における変化を検出可能であることを保証するため、ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞において、ｓｉＲＮＡノックダウン研究を行った（図２Ｂおよび２Ｃ）。本発明者らは、予期されるように、ｍＲＮＡ発現のｓｉＲＮＡ  ＭＭＲ遺伝子特異的減少を見出した（図２Ｂ；左斜線、薄青色、右斜線のバー）。ｍＲＮＡの減少は、対応するＭＭＲタンパク質の減少に置き換えられた（図２Ｃ；左斜線、薄青色、右斜線のバー）。さらに、本発明者らは、ｈＭＳＨ６タンパク質の安定性が、ｈＭＳＨ２タンパク質の発現と関連することを見出した。これらの結果は、ｍｉＲ−１５５が翻訳後阻害によって、ＭＭＲタンパク質に対する最大の影響を発揮することを示す。
【０１１７】
[00178]ｍｉＲ−１５５によるＭＭＲタンパク質の調節を確認するため、本発明者らは、ｍｉＲ−１５５を過剰発現するＭＶ４−１１細胞を調べた（図８）。これらの研究において、ＭＶ４−１１細胞を、ｍｉＲ−１５５ノックダウンをターゲットとする配列特異的ロックト核酸（ＬＮＡ）修飾オリゴヌクレオチド（アンチｍｉＲ−１５５；  Ａｍｂｉｏｎ）ならびに対照ＬＮＡアンチｍｉＲＮＡでトランスフェクションした。ＬＮＡアンチｍｉＲ−１５５オリゴヌクレオチドでトランスフェクションした際、非特異的ＬＮＡアンチｍｉＲ対照に比較して、ｑＰＣＲによって、ｍｉＲ−１５５の６．７倍の減少が観察され（図１Ａ）、これをノーザンブロット分析によって確認した（図６Ｂ）。
【０１１８】
[00179]本発明者らはまた、ウェスタンブロット分析によって、ＬＮＡアンチｍｉＲ対照トランスフェクションに比較して、ＬＮＡアンチｍｉＲ−１５５でトランスフェクションしたＭＶ４−１１細胞では、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、およびｈＭＳＨ６タンパク質が増加することも観察した（図８）。ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ  ｍｉＲ−１５５過剰発現データと合わせて、これらの結果は、細胞ｍｉＲ１５５レベルが、コアＭＭＲタンパク質の発現に対して直接影響を有することを示唆する。
【０１１９】
[00180]実施例４
[00181]ｍｉＲ−１５５の過剰発現は、ミューテーター表現型を誘導する。
[00182]ＭＭＲ制御に対するｍｉＲ−１５５の生物学的役割を評価するため、本発明者らは、ｍｉＲ−１５５を過剰発現するＣｏｌｏ−３２０ＤＭ  ＣＲＣ細胞の作製済み安定クローンに対するレンチウイルスベクター系を用いた（図３）。本発明者らは、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６タンパク質発現が、空ベクターを発現する細胞（Ｃｏｌｏ−空；図３Ｂ）に比較して、ｍｉＲ−１５５を過剰発現するＣｏｌｏ−１５５ＤＭ細胞（Ｃｏｌｏ−１５５）において、それぞれ、７２％、４２％および６９％減少することを見出した。本発明者らはまた、ＭＳＨ６  ｍＲＮＡの減少も観察した（図３Ｃ）。転写に対する直接の影響の可能性は低いため、これらの結果は、ｍｉＲ１５５がＭＳＨ６プロモーターからの転写に影響を及ぼす他の制御因子をターゲットとする可能性があることを示す。
【０１２０】
[00183]単純反復配列の長さの変動（マイクロサテライト不安定性またはＭＳＩ）は、ＭＭＲ欠損の診断指標である。本発明者らは、ｍｉＲ−１５５を過剰発現しているＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞におけるＭＳＩを調べた（図３Ｄ）。特徴の３つすべてを調べた（図３Ｄ）。これらの結果は、ｍｉＲ−１５５過剰発現が、減少したまたは欠如したコアＭＭＲ機能と一致した複製エラーを誘導することを示す。
【０１２１】
[00184]実施例５
[00185]ｍｉＲ−１５５発現は、ＣＲＣ組織において、ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２と逆相関する。
【０１２２】
[00186]本発明者らは、ＣＲＣの７０の任意抽出症例および５つの良性腸病変を含有する組織マイクロアレイにおいて、ｍｉＲ−１５５、ＭＬＨ１およびＭＳＨ２の発現を調べた。ＬＮＡアンチｍｉＲ−１５５または非特異的ＬＮＡアンチｍｉＲ対照をｈＭＬＨ１またはｈＭＳＨ２に対する免疫組織化学（ＩＨＣ）抗体と組み合わせる同時標識法を用いた。ｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質発現は、それぞれ細胞の＞１５％または＞５％で検出された際に陽性とスコア付けされた（図９Ａおよび図９Ｂ）。
【０１２３】
[00187]ＣＲＣの５０％より多くは、ｍｉＲ−１５５の発現上昇を示した（図９Ｃ）。ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１発現の減少は、それぞれ、ＣＲＣの２８％および２２％で観察された（図９Ｃ）。ｍｉＲ−１５５とＭＳＨ２またはＭＬＨ１との同時発現は、逆相関を示し、ｒ値はＭＳＨ２に関して−０．７４（ｐ＜０．００１）であり、そしてＭＬＨ１に関して−０．６（ｐ＜０．００１）であった。ｍｉＲ−１５５は、ＣＲＣ組織の６７％でｈＭＳＨ２と、そしてＣＲＣ組織の５０％でｈＭＬＨ１と、同時発現されなかった。分析をｍｉＲ−１５５陽性ＣＲＣ組織でのみ行うと、ｈＭＬＨ１（ｐ＝０．０００３）およびｈＭＳＨ２（ｐ＝０．００１）の両方に関して、有意な逆相関がなお明らかであった。５０％より高いｍｉＲ−１５５発現を有する組織の下位群において、なお逆相関があり、ｒ値は、ＭＳＨ２に関して−０．７（ｐ＜０．０００２）であり、そしてＭＬＨ１に関して−０．５５（ｐ＜０．００５）であった。興味深いことに、ｍｉＲ−１５５およびｈＭＳＨ２またはｈＭＬＨ１のいずれかに関して陽性であるＣＲＣ組織において、同じ癌巣における同時発現は決して観察されなかった（図９Ａ）。
【０１２４】
[00188]本発明者らは、癌および正常隣接組織が入手可能である、８３の新鮮凍結腫瘍のコホートにおけるｍｉＲ−１５５およびＭＭＲタンパク質発現を調べた（図９Ｂ）。本発明者らは、ｑＰＣＲ分析によって腫瘍および関連正常組織を調べ、そしてｍｉＲ−１５５発現が、標本のうち１８（２２％）で２倍より多く増加したことを見出した。これらの試料のうち１８に関して、腫瘍および関連正常組織において、ウェスタンブロット分析によって、ｈＭＬＨ１およびＭＳＨ２タンパク質の発現を決定した。ｈＭＬＨ１発現の明らかな減少が１２（６７％）で観察され、一方、ｈＭＳＨ２発現の明らかな減少は標本のうち１１（６１％）で観察された（図９Ｂ）。
【０１２５】
[00189]ＭＭＲ発現に対する明らかでない影響の閾値は、ｍｉＲ−１５５発現レベルが関連する正常組織に比較して３倍の増加より低下した際に生じるようであった（図９Ｂ；赤線）。一般的に、この閾値より高いｍｉＲ−１５５発現は、ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２の両方の発現を下方制御させるようであった。組織アレイ研究と組み合わせると、これらの結果は、ヒト腫瘍におけるｍｉＲ−１５５過剰発現が、コアＭＭＲタンパク質ｈＭＬＨ１およびｈＭＳＨ２の下方制御を生じることを強く示す。
【０１２６】
[00190]実施例６
[00191]ＭＳＩ腫瘍におけるＭＭＲ制御解除の原因としてのｍｉＲ−１５５発現
[00192]ＭＳＩは、コアＭＭＲ遺伝子の１つの両対立遺伝子の不活性化後に獲得される。ＬＳ／ＨＮＰＣＣキャリアーにおいて、突然変異の大部分が、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１遺伝子中に見られる。ＬＳ／ＨＮＰＣＣ患者においてＭＳＩ腫瘍を導く「第二のヒット」は、大部分が、影響を受けない対立遺伝子のヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）または体細胞突然変異の結果である。ＣＲＣにおいて、ＬＳ／ＨＮＰＣＣは、ＭＳＩ腫瘍の２〜５％を占める。孤発性ＣＲＣ腫瘍のおよそ１０〜１５％がＭＳＩを示し、これは大部分（９０％）が、ｈＭＬＨ１プロモーターの２対立遺伝子不活性化の結果である。任意抽出の一連の１０６６のＣＲＣ患者において、１３５（１２．７％）がＭＳＩを示すことが見出された。これらのうち２３（５．９％）がコアＭＭＲ遺伝子の１つに生殖系列突然変異を有すると決定され、そして１０６（７８．５％）がｈＭＬＨ１プロモーターのメチル化を含有することが見出された。これらのＭＳＩ腫瘍のおよそ５％が、コアＭＭＲタンパク質の少なくとも１つの発現喪失を示し、明らかな遺伝子またはエピジェネティック上の原因はなかった。
【０１２７】
[00193]本発明者らは、ＭＳＩ、ならびに少なくともｈＭＬＨ１およびｈＰＭＳ２のＩＨＣ発現喪失を示す一連の４０のＣＲＣ腫瘍を遡及的に調べた。これらのＣＲＣ腫瘍のうち３４が、ｈＭＬＨ１遺伝子配列における突然変異またはｈＭＬＨ１プロモーターのメチル化を有することが見出された。本発明者らは、腫瘍および隣接正常組織のレーザーキャプチャー顕微解剖に続くｑＰＣＲによるｍｉＲ−１５５発現分析に十分な試料を保有する、６つの標本を調べた（表１）。
【０１２８】
[00194]１つの標本は非常にわずかな組織しか含有しなかったため、本発明者らはｉｎ  ｓｉｔｕおよびＩＨＣ分析によって、ｍｉＲ−１５５およびｈＭＬＨ１発現を調べた（図５）。残りのＭＳＩ腫瘍６つはすべて、隣接正常組織に比較して、少なくとも２倍のｍｉＲ−１５５発現増加を示した（表１）。
【０１２９】
[00195]これらの標本におけるｍｉＲ−１５５の過剰発現は、腫瘍等級または病期とは相関しなかった。試料のうち３つは、一般的にｈＭＬＨ１および／またはｈＭＳＨ２の発現減少を生じる３倍の閾値を超えるｍｉＲ−１５５の増加を有した。さらに、ＣＲ７８は、腫瘍組織の＞５０％でｍｉＲ−１５５の発現上昇、および対応するｈＭＬＨ１の発現喪失を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの結果は、未知のＭＭＲ欠損を伴うＭＳＩ腫瘍が、ｍｉＲ−１５５過剰発現の結果として生じる可能性があるという結論と一致する。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
[00196]表１：ＭＳＩ−Ｈ、ＭＬＨ１／ＰＭＳ２突然変異陰性およびＭＬＨ１プロモーターメチル化陰性ＣＲＣの特徴。臨床病理特性：腺＝腺癌ＮＡＳ；管−粘液＝粘液構成要素を伴う腺癌＜５０％：粘液＝粘液性腺癌、粘液構成要素＞５０％；髄様＝髄様腺癌。レーザーキャプチャー顕微解剖による材料収集後、腫瘍対隣接正常組織におけるｍｉＲ−１５５発現比として、ｍｉＲ−１５５倍変化を計算した。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
[00197]実施例７
[00198]療法／予防法および組成物
[00199]本発明は、有効量の療法剤、すなわち本発明のモノクローナル（またはポリクローナル）抗体、ウイルスベクター、Ｔｃｌ１模倣体またはＴｃｌ１アンタゴニストを被験体に投与することによる、治療法および予防法を提供する。好ましい側面において、療法剤は実質的に精製される。被験体は、好ましくは動物であり、限定されるわけではないが、ウシ、ブタ、ニワトリ等の動物が含まれ、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ましくはヒトである。
【０１３４】
[00200]多様な送達系、例えばリポソーム中の被包、微小粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築等が知られ、そしてこれらを用いて、本発明の療法剤を投与する。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、および経口経路が含まれる。化合物は、任意の好適な経路によって、例えば注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜裏打ち（例えば口腔粘膜、結腸および腸粘膜等）を通じた吸収によって投与され、そして他の生物学的活性剤とともに投与されてもよい。投与は全身または局所であってもよい。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内およびクモ膜下腔内注射を含む、任意の適切な経路によって中枢神経系内に導入することが望ましい可能性もあり；脳室内注射は、例えばオマヤ・リザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易にされうる。
【０１３５】
[00201]特定の態様において、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい可能性もあり；これは、限定ではなく例として、手術中の局所注入、局部適用、例えば手術後の創傷ドレッシング材と組み合わせたものによって、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、または移植物によって達成可能であり、移植物は、シラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜等の膜またはファイバーを含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料のものである。１つの態様において、投与は悪性腫瘍または新生物または新生物発生前の組織の部位（または以前の部位）での直接注射による。
【０１３６】
[00202]療法剤がタンパク質療法剤をコードする核酸である特定の態様において、核酸を、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして細胞内になるように投与するか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすることによって、あるいは核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、そのコードされるタンパク質の発現を促進する。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入し、そして発現させるために相同組換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に組み込ませてもよい。
【０１３７】
[00203]本発明はまた、医薬組成物も提供する。こうした組成物は、療法的有効量の療法剤、および薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤を含む。こうしたキャリアーには、限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせが含まれる。キャリアーおよび組成物は無菌であってもよい。配合物は、投与様式に適しているであろう。
【０１３８】
[00204]組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有してもよい。組成物は、液体溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、徐放配合物、または粉末であってもよい。組成物は、伝統的な結合剤およびキャリアー、例えばトリグリセリドとともに、座薬として配合されてもよい。経口配合物には、標準的キャリアー、例えば薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれてもよい。
【０１３９】
[00205]好ましい態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、ルーチンの方法にしたがって配合される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物にはまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるための局所麻酔剤、例えばリグノカインも含まれる。一般的に、成分は、別個に、または単位投薬型中でともに混合されてのいずれかで、例えば気密性密封容器、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ中で、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入瓶を用いて分配される。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルが提供される。
【０１４０】
[00206]本発明の療法剤は、中性または塩型として配合される。薬学的に許容されうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの未結合アミノ基で形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、エタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの未結合カルボキシル基で形成されるものが含まれる。
【０１４１】
[00207]特定の障害または状態の治療に有効であろう本発明の療法剤の量は、障害または状態の性質に依存するであろうし、そして標準的臨床技術によって決定される。さらに、場合によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適な投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物中で使用すべき正確な用量は、また、投与経路、および疾患または障害の深刻さにも応じるであろうし、そして医師の判断および各患者の状況にしたがって決定される。しかし、静脈内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、キログラム体重あたり、活性化合物約２０〜５００マイクログラムである。鼻内投与に適した投薬量範囲は、一般的に、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系に由来する用量−反応曲線から外挿可能である。
【０１４２】
[00208]本発明はまた、本発明の医薬組成物の１またはそれより多い成分を充填した１またはそれより多い容器を含む薬学的パックまたはキットも提供する。場合によって、こうした容器（単数または複数）には、薬剤または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形式の通知が付随し、該通知は、ヒト投与のための製造、使用または販売の政府機関による認可を反映する。
【０１４３】
[00209]実施例８
[00210]癌患者を治療する方法
[00211]本実施例は、本明細書の組成物での治療に好ましい反応を有する可能性が高い患者を選択し、そして治療する方法を記載する。
【０１４４】
[00212]癌と診断された患者は、通常、まず、治癒を目指して組織切除を受ける。腫瘍試料は、患者から除去された組織の部分から得られる。次いで、当該技術分野に周知の低分子ＲＮＡ抽出に適した任意の方法を用いて、例えばＴＲＩＺＯＬＴＭを用いることによって、ＲＮＡを組織試料から単離する。次いで、場合によって遺伝子分析と組み合わせて、ｍｉＲ２１または開示されている他の示差的に発現されるｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いて、精製ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供する。これらのアッセイを実行して、腫瘍中の関連ＲＮＡの発現レベルを決定する。示差的に発現されるｍｉＲの発現パターンが決定された場合、特に、突然変異状態が確認された場合、患者は、本明細書の組成物での治療の候補である。
【０１４５】
[00213]したがって、当該技術分野において公知の方法にしたがって、患者を組成物の療法的有効量で治療する。組成物の用量および投薬措置は、多様な要因、例えば患者の健康状態および癌の病期に応じて変化するであろう。典型的には、治療は、長期に渡る多くの投薬で投与される。
【０１４６】
[00214]実施例９：
[00215]癌患者を診断する方法
[00216]１つの特定の側面において、本明細書において、被験体が、癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有するかどうかを診断する方法を提供する。該方法には、一般的に、対照に比較してｍｉＲ−１５５の示差的ｍｉＲ発現パターンを測定する工程が含まれる。示差的ｍｉＲ発現パターンが確認された場合、結果は、被験体が癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有することの指標となる。特定の態様において、ノーザンブロット分析を用いて、少なくとも１つの遺伝子産物のレベルを測定する。また、特定の態様において、試験試料中の少なくとも１つの遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより低く、そして／または試験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルより高い。
【０１４７】
[00217]実施例１０：
[00218]ｍｉＲ遺伝子産物の測定
[00219]被験体から得られた試験試料由来のＲＮＡを逆転写して、１組のターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドを提供し；ｍｉＲＮＡ特異的プローブ・オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーション・プロファイルを提供し；そして対照試料から作成されたハイブリダイゼーション・プロファイルに、試験試料ハイブリダイゼーション・プロファイルを比較することによって、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定してもよい。少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、被験体が、肺癌、特にＥＧＦＲ突然変異肺癌を有するか、または該癌を進展させるリスクを有するかいずれかであることの指標となる。
【０１４８】
[00220]実施例１１：
[00221]診断および療法適用
[00222]別の側面において、本明細書において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが、対照試料から生成されるシグナルに比較して、制御解除されている（例えば下方制御されているおよび／または上方制御されている）場合、被験体において癌を治療する方法を提供する。
【０１４９】
[00223]また本明細書おいて、被験体から得られる試験試料からＲＮＡを逆転写して、１組のターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドを提供し；ｍｉＲＮＡ特異的プローブ・オリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにターゲット・オリゴデオキシヌクレオチドをハイブリダイズさせて、試験試料に関するハイブリダイゼーション・プロファイルを提供し；そして対照試料から作成されたハイブリダイゼーション・プロファイルに、試験試料ハイブリダイゼーション・プロファイルを比較することによって、被験体が、被験体における１またはそれより多い不都合な予後マーカーに関連する癌を有するかまたは癌を進展させるリスクを有するかを診断する方法も提供する。シグナルの変化は、被験体が、癌を有するか、または癌を進展させるリスクを有するかいずれかであることの指標となる。
【０１５０】
[00224]実施例１２：
[00225]キット
[00226]本明細書に記載する組成物はいずれも、キット中に含まれてもよい。限定されない例において、ｍｉＲＮＡを単離し、ｍｉＲＮＡを標識し、そして／またはアレイを用いてｍｉＲＮＡ集団を評価するための試薬がキット中に含まれる。該キットにはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを生成するかまたは合成するための試薬も含まれてもよい。したがって、キットは、適切な容器手段中に、標識ヌクレオチドまたは続いて標識される非標識ヌクレオチドを取り込むことによってｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含むであろう。キットにはまた、１またはそれより多い緩衝剤、例えば反応緩衝剤、標識緩衝剤、洗浄緩衝剤、またはハイブリダイゼーション緩衝剤、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための構成要素も含まれてもよい。他のキットには、ｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素が含まれてもよく、そしてしたがって、例えば固体支持体が含まれてもよい。
【０１５１】
[00227]アレイを含む任意のキット態様に関して、本明細書中の配列いずれかのすべてまたは一部に同一であるかまたは相補的である配列を含有する核酸分子が存在してもよい。
【０１５２】
[00228]キットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥型のいずれかでパッケージングされてもよい。キットの容器手段には、一般的に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が含まれるであろうし、この中に構成要素を入れることも可能であり、そして好ましくは適切にアリコットすることも可能である。キット中に１より多い構成要素がある場合（標識試薬および標識を一緒にパッケージングしてもよい）、キットはまた、一般的に、第二、第三のまたは他のさらなる容器も含有するであろうし、その中にさらなる構成要素を別個に入れてもよい。しかし、構成要素の多様な組み合わせがバイアル中に含まれてもよい。本発明のキットにはまた、典型的には、核酸を含有するための手段、および商業的に販売するために緊密に閉じ込められたあらゆる他の試薬容器も含まれるであろう。こうした容器には、所望のバイアルを中に保持する、インジェクションまたは吹き込み成形プラスチック容器が含まれてもよい。
【０１５３】
[00229]キットの構成要素を１および／またはそれより多い液体溶液中に提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が１つの好ましい溶液である。キット中に含まれてもよい他の溶液は、混合試料からｍｉＲＮＡを単離し、そして／または濃縮する際に関与する溶液である。
【０１５４】
[00230]しかし、キットの構成要素は、乾燥粉末（単数または複数）として提供されてもよい。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、適切な溶媒の添加によって粉末を元に戻すことができる。溶媒がまた、別の容器手段中でも提供可能であることが想定される。キットにはまた、標識ｍｉＲＮＡの単離を容易にする構成要素も含まれてもよい。キットにはまた、ｍｉＲＮＡを保存または維持する、あるいは分解に対して保護する構成要素も含まれてもよい。構成要素は、ＲＮアーゼ不含であってもよいし、またはＲＮアーゼに対して保護してもよい。
【０１５５】
[00231]また、キットは、一般的に、適切な手段中に、各個々の試薬または溶液のための別個の容器を含んでもよい。キットにはまた、キット構成要素とともに、キット中に含まれていない任意の他の試薬を使用するための指示書も含まれてもよい。指示書には、実行可能な変動が含まれてもよい。こうした試薬は本発明のキットの態様であることが予期される。また、キットは、上記に同定された特定の項目に限定されず、そしてキットには、ｍｉＲＮＡの操作または性質決定に用いる任意の試薬が含まれてもよい。
【０１５６】
[00232]本発明のスクリーニングまたはプロファイリング法またはキットにおいて、ｍｉＲＮＡアレイの背景で論じられる任意の態様をより一般的に使用してもよいこともまた予期される。言い換えると、特定のアレイ中に含まれてもよいものを記載する任意の態様を、より一般的にｍｉＲＮＡプロファイリングの背景で実施してもよく、そしてアレイ自体を伴う必要はない。
【０１５７】
[00233]任意のキット、アレイまたは他の検出技術またはツール、あるいは任意の方法が、これらのｍｉＲＮＡのいずれかに関するプロファイリングに関与できることもまた予期される。また、ｍｉＲＮＡアレイの背景で論じられる任意の態様を、本発明の方法において、アレイ形式を伴ってまたは伴わずに実行することも可能であることが予期される；言い換えると、ｍｉＲＮＡアレイ中の任意のｍｉＲＮＡを、当業者に知られている任意の技術にしたがって、本発明の任意の方法において、スクリーニングまたは評価することも可能である。アレイ形式は、実行しようとするスクリーニング法および診断法に必要ではない。
【０１５８】
[00234]療法、予後診断、または診断適用のためにｍｉＲＮＡアレイを用いるためのキットおよびこうした使用が、本明細書において、本発明者らに予期される。キットには、ｍｉＲＮＡアレイ、ならびに、アレイ上のｍｉＲＮＡに関する標準または規準化ｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報が含まれてもよい。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡがキットに含まれてもよい。対照ＲＮＡは、標識および／またはアレイ分析のための陽性対照として使用可能なｍｉＲＮＡであってもよい。
【０１５９】
[00235]本解説の方法およびキットは、本明細書において、広くそして一般的に記載されている。一般的な開示に属するより狭い種および下位のグループ分けの各々もまた、本解説の一部を形成する。排除される物質が具体的に本明細書に列挙されるかどうかにかかわらず、条件付で、または属から任意の主題を除く負の限定付きで、これには、本解説の一般的な説明が含まれる。
【０１６０】
[00236]実施例１３
[00237]アレイ調製およびスクリーニング
[00238]本明細書においてはまた、ｍｉＲＮＡアレイの調製および使用も提供され、該ｍｉＲＮＡアレイは、複数のｍｉＲＮＡ分子または前駆体ｍｉＲＮＡ分子に完全にまたはほぼ相補的であるかまたは同一であり、そして空間的に分離された構成で、支持体物質上に配置された、核酸分子（プローブ）の秩序だったマクロアレイまたは該核酸分子のマイクロアレイである。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、最大１０，０００の核酸分子が、典型的には１〜４平方センチメートルの領域内に適合可能であるように、核酸プローブをより密に配置する。
【０１６１】
[00239]マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド等を、支持体上にスポットするか、または支持体上のその場でオリゴヌクレオチド配列を製造することによって製造することも可能である。スポットまたは製造される核酸分子は、平方センチメートルあたり最大約３０の非同一核酸分子、またはより高密度で、例えば平方センチメートルあたり最大約１００またはさらに１０００の高密度マトリックスパターンに適用可能である。マイクロアレイは、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対称的に、典型的には、固体支持体としてコーティングガラスを用いる。ｍｉＲＮＡ相補核酸試料の秩序だったアレイを有することによって、各試料の位置をトラッキングし、そして元来の試料に関連付けることも可能である。
【０１６２】
[00240]複数の別個の核酸プローブが固体支持体表面に安定して付随する、多様な異なるアレイデバイスが当業者に知られている。アレイのための有用な支持体には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。アレイは、平均プローブ長、配列またはプローブのタイプ、プローブおよびアレイ表面間の結合の性質、例えば共有または非共有等を含む、多くの異なる点で多様であることも可能である。本明細書記載の標識法およびスクリーニング法、ならびにアレイは、プローブがｍｉＲＮＡを検出することを除いて、任意のパラメータに関して有用性が限定されるわけでなく；その結果、ｍｉＲＮＡアレイの多様な異なるタイプとともに、方法および組成物を使用することも可能である。
【０１６３】
[00241]本発明者らの発明の原理を適用可能な多くのありうる態様を考慮して、例示される態様は、本発明の好ましい例であるのみであり、そして本発明の範囲に対する限定として解釈すべきでないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、これらの請求項の範囲および精神内に属するものすべてを請求する。
【０１６４】
[00242]本発明は多様なおよび好ましい態様に言及して記載されているが、多様な改変が実施されてもよく、そして本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、同等物がその要素に対して代用されてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。さらに、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の解説に適合させるように、多くの修飾が行われてもよい。したがって、本発明は、本発明を実行するために予期される本明細書に開示された特定の態様に限定されるものでなく、本発明は、特許請求の範囲内に属するすべての態様を含むであろうことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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