(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法であって、該分化誘導培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びレチノイン酸を含むものであり、幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞又は皮膚由来多能性前駆細胞である、方法。
【請求項２】
さらに、ＴＧＦｂ２およびインスリンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、分化誘導後期において、ｂＦＧＦ、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＧＳＫ３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
該分化誘導培地が無血清培地である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法であって、該分化誘導培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤及びレチノイン酸を含むものであり、幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞又は皮膚由来多能性前駆細胞である、方法。
【請求項１１】
該分化誘導培地が、さらにＴＧＦｂ２およびインスリンからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、分化誘導後期において、ｂＦＧＦ、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１４】
該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ＧＳＫ３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１６】
ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１７】
レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、請求項１０又は１１記載の方法。
【請求項１８】
該分化誘導培地が無血清培地である、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られた角膜内皮細胞、並びにそれを用いた医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に達することで認識される。つまり、角膜は、生体が視覚情報を得る際に光が通る通路の前面に位置する。したがって、損傷等により角膜に濁りが生じることは、視覚機能に重大な影響を及ぼす。【０００３】
角膜は、組織学的には、外表面側から、角膜上皮、角膜実質、及び角膜内皮の３層からなる構造を有する。角膜の透明性は、角膜内皮のＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅによるＮａ＋能動輸送（ポンプ機能）とバリア機能（ＺＯ−１等のタイトジャンクションタンパク質）により、含水率が一定に保たれることにより保持されている。【０００４】
角膜内皮細胞の減少などの角膜内皮の損傷により、上記の角膜内皮細胞の機能が損なわれ、角膜実質部に浮腫が生じる。これは角膜の透明性の低下を招き、視力を低下させる。このような状態は、水疱性角膜症と呼ばれている。一方で、ヒトの角膜内皮細胞は、一度障害を受けると再生する能力をほとんど持たないことが知られている。従って、なんらかの傷害により角膜内皮細胞が減少した場合、その治療は角膜移植が有効な、場合によって唯一の手段となる。実際、角膜移植適応例の約半数は角膜内皮機能不全による水疱性角膜症が占める。【０００５】
現在、角膜内皮損傷患者は、角膜の上皮、実質及び内皮の３層構造の全てを移植する全層角膜移植により処置されている。全層角膜移植は、確立された技術ではあるが、日本での角膜提供は不足しているのが現状であり、また、拒絶反応が問題となる。かかる問題点を解消するために、損傷を受けた組織のみを移植する「パーツ移植」が普及しつつある。角膜内皮を温存して、ドナーの上皮と実質のみを移植する深層層状角膜移植（Deep Lamellar Keratoplasty：ＤＬＫＰ）（非特許文献１および２）や内皮を含む一部の角膜だけを移植する角膜内皮移植（特許文献１および２、非特許文献３）等が知られている。しかしながら、例えば角膜内皮移植の場合、その移植材料の供給源となるのは依然として角膜内皮そのものであり、角膜の提供者が限られていることを鑑みれば、全層角膜移植同様、ドナー不足の問題点を克服することができない。さらに角膜内皮細胞は培養が難しく、移植に十分な数の培養細胞を調製することには時間的及び費用的な負担が大きい。【０００６】
近年、マウス角膜実質より幹細胞の特徴をもつ細胞の分離が報告されている（非特許文献４）。神経堤由来であるこの幹細胞は分化誘導培地を用いることで神経細胞や脂肪細胞などにも分化する能力を有する。【０００７】
組織幹細胞／前駆細胞を、ＴＧＦｂ２を添加した培地中で接着培養することにより、これらの細胞を角膜内皮細胞へと分化誘導し得ることが報告されているが（特許文献３）、角膜内皮細胞としての機能（例えばポンプ機能）の有無については示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−２４８５２号公報
【特許文献２】特開２００５−２２９８６９号公報
【特許文献３】特開２００９−２６８４３３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Aggarwal RK. Br J Ophthalmol 1997;81:178-179.
【非特許文献２】Shimmura S. et al., Cornea 2005;24(2):178-181.
【非特許文献３】Price FW Jr, Price MO. J Refract Surg. 2005;21(4):339-345.
【非特許文献４】Yoshida S. et al., Stem Cells. 2006;24(12):2714-2722.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、角膜内皮細胞をより効率的に製造する方法を提供することであり、より好ましくは幹細胞をより効率的に角膜内皮細胞へと分化誘導することによって角膜内皮細胞を多量に安定して製造することである。さらに本発明は、本発明の方法により得られた角膜内皮細胞を用いた医薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、幹細胞を、特定の分化誘導因子を含む培地中で培養することにより、効率的に角膜内皮細胞へと分化誘導させることが可能なことを見出し、さらに得られた角膜内皮細胞の機能を確認して本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法であって、該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含むものである、方法。
［１’］幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法であって、該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）及びレチノイン酸を含むものである、方法。
［１’’］該分化誘導培地が、さらにＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、上記［１’］記載の方法。
［２］該分化誘導培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびレチノイン酸を含むものである、上記［１’’］記載の方法。
［３］該分化誘導培地が、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１］記載の方法。
［３’］該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、分化誘導後期において、ｂＦＧＦ、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１’’］記載の方法。
［３’’］該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１’’］記載の方法。
［４］該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１］記載の方法。
［５］該分化誘導培地が、さらにｂＦＧＦを含む、上記［４］記載の方法。
［６］該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１’’］記載の方法。
［７］ＧＳＫ３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、上記［１］又は[１’’]記載の方法。
［８］ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、上記［１’’］記載の方法。
［９］レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、上記［１］又は[１’’]記載の方法。
［１０］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、上記［１］又は[１’’]記載の方法。
［１１］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞である、上記［１０］記載の方法。
［１２］さらに、ｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞を誘導する工程を含む、上記［１１］記載の方法。
［１３］幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、上記［１］又は[１’’]記載の方法。
［Ａ］該分化誘導培地が無血清培地である、上記［１］〜［１３］、［１’］、［１’’］、［３’］及び［３’’］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法であって、該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含むものである、方法。
［１４’］幹細胞を分化誘導培地で培養する工程を含む、幹細胞から角膜内皮細胞を分化誘導する方法であって、該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）及びレチノイン酸を含むものである、方法。
［１４’’］該分化誘導培地が、さらにＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む、上記［１４’］記載の方法。
［１５］該分化誘導培地が、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびレチノイン酸を含むものである、上記［１４’’］記載の方法。
［１６］該分化誘導培地が、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１４］記載の方法。
［１６’］該分化誘導培地が、分化誘導初期において、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含み、分化誘導後期において、ｂＦＧＦ、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１４’’］記載の方法。
［１６’’］該分化誘導培地が、分化誘導初期において、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびレチノイン酸を含み、分化誘導後期において、ＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１４’’］記載の方法。
［１７］該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１４］記載の方法。
［１８］該分化誘導培地が、さらにｂＦＧＦを含む、上記［１７］記載の方法。
［１９］該分化誘導培地が、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含むものである、上記［１４’’］記載の方法。
［２０］ＧＳＫ３阻害剤が、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である、上記［１４］又は［１４’’］記載の方法。
［２１］ＲＯＣＫ阻害剤が、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）である、上記［１４’’］記載の方法。
［２２］レチノイン酸が、全トランス−レチノイン酸である、上記［１４］又は［１４’’］記載の方法。
［２３］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞又は角膜実質由来神経堤幹細胞である、上記［１４］又は［１４’’］記載の方法。
［２４］幹細胞が、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞である、上記［２３］記載の方法。
［２５］さらに、生体外でｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞を誘導する工程を含む、上記［２４］記載の方法。
［２６］幹細胞が、皮膚由来多能性前駆細胞である、上記［１４］又は［１４’’］記載の方法。
［Ｂ］該分化誘導培地が無血清培地である、上記［１４］〜［２６］、［１４’］、［１４’’］、［１６’］及び［１６’’］のいずれか１項に記載の方法。
［２７］上記［１］〜［１３］、［１’］、［１’’］、［３’］、［３’’］及び［Ａ］のいずれか１項に記載の製造方法で得られた角膜内皮細胞を含む、医薬。
［２８］移植用である、上記［２７］記載の医薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の製造方法によれば、より効率的に幹細胞から角膜内皮細胞を製造することができる。該製造方法により得られた角膜内皮細胞は、角膜移植用の角膜シート等の角膜内皮細胞の機能不全により生じる疾患の治療用の医薬、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】角膜内皮機能と角膜内皮細胞マーカーの関係を模式的に示した図である。
【図２】マウス角膜実質由来神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）の分化誘導前後での角膜内皮細胞マーカーの発現を比較した結果を示す図である。誘導後全てのマーカーが発現していることが確認された。
【図３】ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞の分化誘導後の角膜内皮細胞マーカーの発現を調べた結果を示す図である。誘導後全てのマーカーが発現していることが確認された。
【図４】ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞誘導細胞、マウスＣＯＰｓ誘導細胞、マウス角膜内皮細胞、及び３Ｔ３細胞におけるポンプ機能を測定した結果を示す図である。１種以上の分化誘導因子を添加した培地で培養したヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞誘導細胞、及びマウスＣＯＰｓ誘導細胞において、顕著なポンプ機能の発現が確認された。
【図５】マウスＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞をウサギ角膜に移植した結果を示す図である。移植眼は、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が確認された。
【図６】ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞を分化誘導して得られた角膜内皮細胞をウサギ角膜に移植した結果を示す図である。移植眼は、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が確認された。
【図７】ヒトＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞シートの顕微鏡写真である。
【図８】ヒトＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞をウサギ角膜に移植した結果を示す図である。移植眼は、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が確認された。
【図９】マウスＳＫＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞シートの顕微鏡写真である。
【図１０】マウスＳＫＰｓから誘導した角膜内皮細胞、マウス培養角膜内皮細胞、３Ｔ３細胞、マウスＣＯＰｓ、及びマウスＣＯＰｓから誘導した角膜内皮細胞におけるポンプ機能を測定した結果を示す図である。
【図１１】マウスＳＫＰsを分化誘導して得られた角膜内皮細胞をウサギ角膜に移植した結果を示す図である。移植眼は、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が確認された。
【図１２】ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞の分化誘導後の角膜内皮細胞マーカーの発現を調べた結果を示す図である。誘導後全てのマーカーが発現していることが確認された。
【図１３】Collagen vitrigelをキャリアーとして、ヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞を無血清の分化誘導培地で分化誘導して得られた角膜内皮細胞シートの顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
本発明において「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成する複数系列の細胞に分化し得る細胞をいうが、中でも角膜内皮細胞に分化し得る細胞をいう。具体的には胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞）、体細胞由来人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells；ｉＰＳ細胞）、ヒトの体性幹細胞（組織幹細胞）が挙げられ、角膜内皮細胞への分化誘導が可能なものが挙げられる。より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞及び角膜実質由来の神経堤幹細胞である。神経堤幹細胞とは、自己複製能と多分化能を持つ多能性の幹細胞であり、脊椎動物の発生過程では、神経管の背側から体中に移動し、様々な組織の形成に寄与することが知られている。角膜内皮は角膜実質と同じく神経堤由来とされている。
【００１６】
ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ＥＳ細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等のＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、及びこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。各ＥＳ細胞は当分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
【００１７】
ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。好ましくはヒトに由来するものが使用できる。
具体的には、ｉＰＳ細胞としては、例えば、皮膚細胞等の体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｃ−Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子及びＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106）等が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Nature. 2008 Jul 31;454(7204):646-50）、低分子化合物を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 Jan 9;4(1):16-9、Cell Stem Cell. 2009 Nov 6;5(5):491-503）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Cell Stem Cell. 2009 May 8;4(5):381-4）など、ｉＰＳ細胞の作成法については技術的な改良が鋭意行なわれているが、作製されたｉＰＳ細胞の基本的な性質、すなわち多分化能を有するという点は作出方法によらず同等であり、いずれも本発明の方法に用い得る。
本発明では、より好ましくはｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を用いる。神経堤幹細胞を用いることで角膜内皮細胞への分化誘導が容易になる。ｉＰＳ細胞からの神経堤幹細胞の誘導は当分野で知られている手法に従って、あるいはそれに準じた方法で実施することができる。例えばNature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載された方法に準じて実施することができる。
【００１８】
体性幹細胞としては、ヒトに由来するものが使用できる。ここで体性幹細胞とは、角膜内皮細胞へと分化し得る細胞であり、例えば角膜実質に由来する神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells）、皮膚由来多能性前駆細胞（skin-derived precursors：ＳＫＰｓ）等が挙げられる。好ましくはＣＯＰｓ及びＳＫＰsである。ＣＯＰｓは、例えば非特許文献４に記載の方法によって調製することができる。具体的には、マウス角膜から上皮、内皮を取り除いた後の角膜実質をコラゲナーゼ処置し、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、Ｂ２７サプリメント、ＬＩＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で分離した細胞を培養することによってスフェア状の細胞塊を形成する細胞集団を得て調製する。ＳＫＰｓは、例えばNat Cell Biol., 2001 vol. 3, 778-784に記載された方法に準じて調製することができる。
【００１９】
１．細胞の製造方法（細胞の分化誘導方法）
本発明の製造方法は、幹細胞から角膜内皮細胞を製造する方法であるが、より未分化な状態にある細胞をより分化した状態へと分化誘導する方法でもある。
【００２０】
本発明は、幹細胞を、ＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含む培地（以下、本発明の分化誘導培地とも称する）で培養する工程、好ましくはＧＳＫ３阻害剤及びレチノイン酸を必須的に含む分化誘導培地で培養する工程を含む、角膜内皮細胞の製造方法を提供する。
本工程で用いる幹細胞は上述の通りであるが、好ましくは角膜内皮細胞への分化が運命付けられた細胞であり、具体的には、ｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞及び角膜実質由来神経堤幹細胞（ＣＯＰｓ）である。皮膚由来多能性前駆細胞（ＳＫＰｓ）を用いることもまた好ましい。例えばｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等のより未分化な幹細胞を用いる場合には上記工程の前に、神経堤幹細胞へと誘導する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。かかる工程は、例えば、Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載の方法、及びそれに準じた方法によって実施することができる。
【００２１】
セリン／スレオニンプロテインキナーゼであるＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３には異なる遺伝子にコードされアミノ酸レベルで高い相同性を有するＧＳＫ３αとＧＳＫ３βのアイソフォームが存在する。また、ＧＳＫ３βがＷｎｔシグナルにも関与し、ＧＳＫ３βを阻害することによりＷｎｔシグナルが活性化されることが知られている。ＧＳＫ３阻害剤として、ＧＳＫ３α阻害剤及びＧＳＫ３β阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３阻害剤として、具体的にはＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１、ケンパウロン（Kenpaullone）、ＡＲ−ＡＯ１４４−１８、ＴＤＺＤ−８、ＳＢ２１６７６３、ＢＩＯ、ＴＷＳ−１１９、ＳＢ４１５２８６、およびＲｏ３３０３５４４等が例示される。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本工程では、好ましくは、ＧＳＫ３β阻害剤が用いられ、特に好ましくは、ＢＩＯ（6-Bromoindirubin-3'-oxime）が用いられる。ＧＳＫ３阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＢＩＯの場合、通常０．５〜５μＭ、好ましくは１μＭ程度である。１種又は２種以上のＧＳＫ３阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２２】
本工程で用いるレチノイン酸としては、全トランス−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸、１１−シス−レチノイン酸、１３−シス−レチノイン酸などが例示される。これらはいずれも商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。本工程では、好ましくは、全トランス−レチノイン酸である。レチノイン酸の培地中の濃度は、用いるレチノイン酸の種類によって適宜設定されるが、全トランス−レチノイン酸の培地中の濃度は、通常０．５〜５μＭ、好ましくは１μＭ程度である。
【００２３】
ＴＧＦｂ２（形質転換成長因子β２）は、潜在タンパクとして分泌され、細胞表面と細胞外基質で貯えられるジスルフィド結合の二量体タンパクのスーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦｂ２は、細胞外基質の合成と沈着と同様に、細胞の増殖、成長、分化及び運動性を制御することが知られている。本発明で用いるＴＧＦｂ２の由来は、角膜内皮細胞への分化誘導に有効である限り、特に限定されないが、角膜移植への適用を考慮した場合、ヒト由来であることが好ましい。ＴＧＦｂ２は商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。例えば、既知の塩基配列、アミノ酸配列に基づいて合成することができる。ＴＧＦｂ２の培地中の濃度は、通常０．５〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５ｎｇ／ｍｌ程度である。
【００２４】
インスリンは、膵臓ランゲルハンス島のＢ細胞が分泌するペプチドホルモンで、各組織のインスリンレセプターに結合して、グルコースの取り込み促進、アミノ酸の取り込み促進、蛋白質、ＲＮＡ、ＤＮＡの合成促進、蛋白質分解の抑制等の広範な薬理作用を有していることが知られている。また、無血清培地への添加因子としても頻用されている。本発明で用いるインスリンの由来は、角膜内皮細胞への分化誘導に有効である限り、特に限定されないが、角膜移植への適用を考慮した場合、ヒト由来であることが好ましい。インスリンは商業的に入手可能であるか、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。例えば、既知の塩基配列、アミノ酸配列に基づいて合成することができる。インスリンの培地中の濃度は、通常０．５〜１０μＭ、好ましくは１μＭ程度である。
【００２５】
ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼの活性を阻害する物質をいう。Ｒｈｏキナーゼとは、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）の分解酵素であるＧＴＰアーゼの範疇に含まれる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（低分子量Ｇタンパク質）の１種で、アミノ末端にセリン／スレオニンキナーゼ領域、中央部にコイルドコイル領域およびカルボキシ末端にＲｈｏ相互作用領域を有する。
本工程で用いるＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−９）、Ｎ−［２−（ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ−１１５２）、（＋）−（Ｒ）−トランス−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩（Ｙ−２７６３２）が挙げられる。
これらはいずれも商業的に入手可能であり、なかでも特にＹ−２７６３２が好ましい。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いる阻害剤の種類によって適宜設定されるが、Ｙ−２７６３２の場合、通常５〜２０μＭ、好ましくは１０μＭ程度である。１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤を組み合わせて用いても良い。
【００２６】
上記した、ＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を総称して、本発明の分化誘導因子と称する。本発明では、分化誘導因子は少なくとも１種を分化誘導培地に含める。好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を分化誘導培地に含める。より好ましくは、ＧＳＫ３阻害剤およびレチノイン酸を分化誘導培地に含める。さらにより好ましくはＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸およびＲＯＣＫ阻害剤を分化誘導培地に含める。特に好ましくはＧＳＫ３阻害剤、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤全ての分化誘導因子を含む分化誘導培地を用いる。
レチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を分化誘導培地に含めることも好ましい。ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を分化誘導培地に含めることも又好ましく、この場合さらにｂＦＧＦを含めることがより好ましい。
【００２７】
本工程において、各分化誘導因子は、培地中に同時に添加されてもよく、また、幹細胞の角膜内皮細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。各分化誘導因子は培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。分化誘導が所望される細胞の種類によっては、分化誘導の初期（使用する幹細胞によって異なるが、例えば、誘導後０〜２日目；あるいは誘導後０〜４日目）と後期（使用する幹細胞によって異なるが、例えば、誘導後２日目以降；あるいは誘導後４日目以降）で、異なる分化誘導因子（あるいはその組合せ）が添加されてなる分化誘導培地を用いることが好ましい場合がある。
【００２８】
本工程で用いる培地は、上記のように各分化誘導因子を含有している限り特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下、便宜上、基礎培地とも称する）に各分化誘導因子を添加してなるものである。基礎培地としては、例えば、MEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、及びこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることができる培地であれば特に限定されない。これらの培地は、商業的に入手可能である。さらに本工程で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。好ましくは無血清培地である。本工程で用いられる培地が血清含有培地である場合には、ウシ血清（Bovine Serum）、ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）などの哺乳動物の血清が使用でき、該血清の培地中の濃度は０．１〜２０％、好ましくは１〜１０％である。
本工程で用いる基礎培地は、好ましくは、MEM培地である。
【００２９】
本工程で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレンなど）、増殖因子（ＥＧＦ、ｂＦＧＦ等）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などが挙げられる。これらの血清代替物もまた商業的に入手可能である。また、必要に応じてビタミン、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）等を含有できる。
【００３０】
本工程で用いる分化誘導培地の好適な一実施態様としては、分化誘導因子としてＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、レチノイン酸、ＴＧＦｂ２、インスリンおよびＲＯＣＫ阻害剤を含有する血清含有培地である。
【００３１】
本工程で用いる分化誘導培地の別の好適な一実施態様としては、分化誘導の初期（分化誘導後０〜２日目）には、分化誘導因子としてレチノイン酸、ＴＧＦｂ２およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する血清含有培地を用い、分化誘導の後期（分化誘導後２日目以降）には、分化誘導因子としてＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）、ｂＦＧＦおよびＲＯＣＫ阻害剤を含有する血清含有培地を用いる。
【００３２】
本工程で用いる分化誘導培地の別の好適な一実施態様としては、分化誘導因子としてレチノイン酸、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する無血清培地である。
【００３３】
本工程で用いる分化誘導培地の別の好適な一実施態様としては、分化誘導の初期（分化誘導後０〜４日目）には、分化誘導因子としてレチノイン酸、ＧＳＫ３阻害剤（好ましくはＧＳＫ３β阻害剤）およびＲＯＣＫ阻害剤を含有する無血清培地を用い、分化誘導の後期（分化誘導後４日目以降）には、分化誘導因子としてＲＯＣＫ阻害剤を含有する無血清培地を用いる。
【００３４】
本工程は、使用する幹細胞の培養に適した培養温度、通常３０〜４０℃、好ましくは３７℃程度で、角膜内皮細胞へと分化誘導するに十分な期間、１〜１０％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。幹細胞としてｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞またはＣＯＰｓ、あるいはＳＫＰｓを用いる場合には、好ましくは７〜１０日間培養する。必要に応じて適宜培地交換を行う（例、３日に１回）。上述のように必要に応じて、添加する分化誘導因子の種類（組合せ）を変えることができ、また好ましい。幹細胞としてより未分化な状態、すなわちｉＰＳ細胞を用いる場合には、本発明の方法の前にｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞へと分化誘導する工程をさらに行う（例えば、Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701に記載の方法、およびそれを改良した方法によって実施することができる）が、該工程には通常１カ月程度要する。角膜実質からＣＯＰｓへの分化誘導も同様に通常１カ月程度要する（該工程の詳細は非特許文献４及び実施例を参照）。神経堤幹細胞への分化誘導はＴｗｉｓｔ１（TWIST, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 1）、Ｓｏｘ９（ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ｂｏｘ９）等の神経堤幹細胞マーカーの発現を調べることによって確認することができる。
【００３５】
本工程において、幹細胞が角膜内皮細胞に分化誘導されたことの確認は、角膜内皮細胞としての機能を発揮するためのタンパク質やそれをコードする遺伝子（角膜内皮細胞マーカー）の発現の有無を評価することによって行うことができる。タンパク質の発現は抗原抗体反応を利用した方法等によって、遺伝子の発現はＲＴ−ＰＣＲを利用した方法等によって評価することができる。該マーカーとしては、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ＋，ＨＣＯ３−ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅＩＶ、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅＶＩＩＩ、ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅ、Ｋｅｒａｔｉｎ  ８、Ｋｅｒａｔｉｎ  １８、Ｐａｉｒｅｄ−ｌｉｋｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ２、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ  ３、Ｃｌａｕｄｉｎ  １０ｂ等が挙げられる。各マーカーの角膜内皮機能との関連性を模式的に図１に示す。
【００３６】
また、幹細胞が角膜内皮細胞に分化誘導されたことの確認は、細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を測定することによって評価することができる。細胞のＮａ＋，Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅポンプ機能は、例えばUssing chamberを用いてInvestigative Ophthlmology & Visual Science, 2010 vol. 51, No. 8, 3935-3942やCurrent Eye Research, 2009 vol. 34, 347-354に記載の方法に従って測定することができる。
【００３７】
簡便には、細胞形態を評価することによっても分化誘導を確認することができる。内皮細胞へと分化した細胞はモザイク状の増殖形態を示す。
【００３８】
本発明の製造方法では、幹細胞を角膜内皮細胞へ効率的に分化誘導することにより、角膜内皮細胞を大量に供給できる。得られた角膜内皮細胞は、角膜移植用の角膜内皮細胞シート等の医薬として利用することができる。
【００３９】
２．細胞を含む医薬
本発明は、上記した本発明の製造方法により製造された角膜内皮細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
角膜内皮細胞を含む医薬を、角膜内皮細胞シートとして製造する場合には、幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞、皮膚由来多能性前駆細胞）を培養基材上に播種し、本発明の分化誘導培地で培養することによって、該培養基材上で角膜内皮細胞への分化を誘導する。本発明において用いられる培養基材としては、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ラミニン等の天然物由来の高分子材料、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子材料、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の生分解性高分子材料、ハイドロキシアパタイト、羊膜等が挙げられる。好ましくは、移植の際に拒絶反応を引き起こさないようなものが、移植対象によって適宜設定される。
【００４０】
移植には、コンフルエントな状態になった角膜内皮細胞が用いられる。その為には、通常、幹細胞（好ましくはｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞、角膜実質由来神経堤幹細胞、皮膚由来多能性前駆細胞）の細胞数を、細胞シートを形成させることができる細胞密度となるよう設定して播種する。通常、播種される細胞密度は、１．０×１０４〜５．０×１０６細胞数／ｃｍ２、より好ましくは、１．０×１０５〜１．０×１０６細胞数／ｃｍ２である。
【００４１】
本発明によって得られる角膜内皮細胞シートは、角膜内皮の移植が必要な疾患、例えば水疱性角膜症、角膜浮腫、角膜白斑等の治療における移植片として用いることができる。
【００４２】
また、シート以外の別の態様としては、本発明の医薬は、得られた角膜内皮細胞をそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、グリセロール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、プロピレングリコール、アセトアミドなどの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、角膜内皮細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、使用する試薬及び材料は特に限定されない限り商業的に入手可能である。
本明細書中で用いた主な略語はそれぞれ以下の通り。
（略語一覧）
ｉＰＳ細胞：induced pluripotent stem cell：人工多能性幹細胞
ＣＯＰｓ：Corneal-derived progenitors：角膜実質由来神経堤幹細胞
ＳＫＰｓ：Skin-derived precursors：皮膚由来多能性前駆細胞
ＧＳＫ３：Glycogen synthase kinase 3
ＴＧＦｂ２：Transforming growth factor beta-2
ＥＧＦ：Epidermal Growth Factor
ＦＧＦ２：Fibroblast growth factor 2
ｂＦＧＦ：Basic fibroblast growth factor
ＬＩＦ：Leukemia Inhibitory Factor
ＤＭＥＭ：Dulbecco's Modified Eagle's Medium
ＢＭＥ：Basal Medium Eagle
ＭＥＭ：Minimum Essential Medium
ＩＭＤＭ：Iscove's Modified Dulbecco's Medium
ＲＰＭＩ：Roswell Park Memorial Institute medium
Ａｔｐ１ａ１（ＡＴＰ１Ａ１）：Na+,K+-ATPase α1-subunit
Ｓｌｃ４ａ４：Na+,HCO3-Co-transporter
Ｃａｒ２：Carbonic anhydrase
Ｋ８：Keratin 8
Ｋ１８：Keratin 18
Ｃｏｌ４ａ２：Collagen IV
Ｃｏｌ８ａ２：Collagen VIII
Ｐｉｔｘ２：Paired-like homeodomain transcription factor 2
Ｉｔｇａ３：Integrin alpha 3
Ｃｄｈ２：N-cadherin
Ｃｌｄｎ１０ｂ：Claudin 10b
Ｇａｐｄｈ：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase【００４４】
実施例１：マウスＣＯＰｓからの角膜内皮細胞への分化誘導
（材料と方法）
１．マウスＣＯＰｓの分離
既報（非特許文献４）に従ってマウスＣＯＰｓをマウス角膜から分離した。マウス（Ｃ５７ＢＬ/６マウス）から角膜実質のディスクを切り出し小片として０．０５％トリプシン(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で３７℃、３０分間消化した。続いて、７８Ｕ／ｍｌのコラゲナーゼ(Sigma-Aldrich)および３８Ｕ／ｍｌのヒアルロニダーゼ(Sigma-Aldrich)で３７℃、３０分間処理した。実質細胞を機械的に解離させ単一の細胞とし、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ(Sigma-Aldrich)、１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２(Sigma-Aldrich)、Ｂ２７サプリメント(Invitrogen, Carlsbad, CA)、および１０３Ｕ／ｍｌ  ＬＩＦ(Chemicon International, Temecula)を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２（１：１）培地中で培養した。播種密度１×１０５細胞／ｍｌで３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で培養した。最初の培養は３５ｍｍディッシュで行い、その後２５ｃｍ２培養フラスコで１４〜２１日間培養した。形成されたスフェア（球形の細胞の塊）をさらに７５ｃｍ２の培養フラスコで１４〜２１日間培養した。培地は５〜７日毎に交換した。スフェア形成に用いたディッシュおよびフラスコはコーティングしていないポリスチレン製のものを用いた（Asahi Techno Glass (Tokyo, Japan)）。かくしてＣＯＰｓが得られた。
２．分化誘導培地の調製
基礎培地として、ＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich）を用い、１％ウシ血清及び分化誘導因子を添加した。分化誘導因子としては以下のものを用いた。
(i) ＢＩＯ（ＧＳＫ３阻害剤）（濃度：１μＭ）入手先：Calbiochem
(ii) 全トランス−レチノイン酸（濃度：１μＭ）入手先：Sigma-Aldrich
(iii) ＴＧＦｂ２（濃度：５ｎｇ／ｍｌ）入手先：Peprotech
(iv) インスリン（濃度：１μＭ）入手先：Sigma-Aldrich
(v) Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
（結果）
マウス角膜実質より分離したＣＯＰｓを密度１．０×１０５細胞／ｍｌでゼラチンコートした３５ｍｍディッシュ（Asahi Techno Glass）に播種し、分化誘導培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間培養して分化誘導を行った。得られた細胞を位相差顕微鏡で観察したところ、細胞塊状であったＣＯＰｓは内皮細胞とよく似たモザイク状の増殖形態を示すようになった。【００４５】
実施例２：ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞からの角膜内皮細胞への分化誘導（１）
（材料と方法）
１．ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞の調製
既報（Nature Protocols, 2010 vol. 5, No.4, 688-701）に基づいてヒトｉＰＳ細胞から神経堤幹細胞を得た。本実施例では、ｉＰＳ細胞を培養する際にマトリゲルを用いず浮遊培養した点が上記既報とは異なっている。浮遊培養することによってより効率的に神経堤幹細胞へと分化誘導することができた。ヒトｉＰＳ細胞は、２０１Ｂ７（山中伸弥教授（京都大学）、岡野栄之教授（慶應大学）から供与された）を用いた。
２．分化誘導培地の調製
実施例１で用いた分化誘導培地と同様にして調製した。
（結果）
ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を密度１．０×１０５細胞／ｍｌでゼラチンコートした３５ｍｍディッシュ（Asahi Techno Glass）に播種し、分化誘導培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下で７日間培養して分化誘導を行った。得られた細胞を位相差顕微鏡で観察したところ、分化誘導培地中で培養した細胞は内皮細胞とよく似たモザイク状の増殖形態を示すようになった。【００４６】
実施例３：角膜内皮細胞の評価（角膜内皮細胞マーカー測定）
実施例１と同様にして調製された、ＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞と実施例２と同様にして得られた、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を分化誘導して得られた角膜内皮細胞とを用いて、角膜内皮細胞マーカーの発現状況をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。用いたプライマーを表１（マウス用）および表２（ヒト用）に示す。【００４７】
【表１】
0006041270.tif 000002
【００４８】
【表２】
0006041270.tif 000003
【００４９】
分化誘導前後でのＣＯＰｓにおける角膜内皮細胞マーカーの発現を比較した結果を図２に示す。
ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞の分化誘導後の細胞における、角膜内皮細胞マーカーの発現を調べた結果を図３に示す。
いずれも、分化誘導後、全てのマーカーが発現していることがわかる。【００５０】
実施例４：角膜内皮細胞の評価（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能測定）
実施例１で得られたＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮細胞と実施例２で得られたヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を分化誘導して得られた角膜内皮細胞とを用いて、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を測定した。
対照として、培養マウス角膜内皮細胞、３Ｔ３細胞、分化誘導前のＣＯＰｓ、１種の分化誘導因子（ＴＧＦｂ２、又はＧＳＫ３阻害剤）のみを含有する培地で培養したＣＯＰｓについてもポンプ機能を測定した。
各細胞を専用のポリエステルトランスウェル（Corning Incorporated）上でコンフルエントにした後、Ussing chamber（Physiological Instrument; EM-CSYS-2）に挿入してウェルの表裏のshort circuit current （ＳＣＣ）を測定し、１０μＭのウワバイン添加前後のＳＣＣの差よりＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を定量した。結果を図４に示す。
本発明の分化誘導培地を用いて得られた角膜内皮細胞は、優れたポンプ機能を有していることが示された。【００５１】
実施例５：角膜移植実験
（準備）
ＣＯＰｓあるいはヒトｉＰＳ細胞由来神経堤幹細胞を蛍光色素ＰＫＨ２６（赤色）（Sigma-Aldrich）で標識後、ゼラチンコートした１型コラーゲンシート上で実施例１で調製した分化誘導培地と同様の分化誘導培地で３７℃、５％ＣＯ２存在下、７日間培養し、コンフルエントの細胞シート（Ｉ）を作成した。
（手順）
１．ヒアルロン酸で前房を形成する。
２．ウサギの角膜を７．０ｍｍトレパンで打ち抜く。
３．購入したホスト角膜（フナコシ）を８．０ｍｍパンチで打ち抜き、デスメ膜をセッシで剥離する（ＩＩ）。
４．８．０ｍｍパンチでＩの細胞シートを打ち抜き、ＩＩの角膜後面にのせ、ＭＱＡスポンジで水分を吸収させ、数秒間自然乾燥させる（ＩＩＩ）。
５．ＩＩＩをもとのウサギの角膜に戻し、１０−０ナイロンで縫合した。
（測定）
角膜厚は角膜厚測定装置（トーメーコーポレーション；SP-100）を、眼圧は眼圧測定装置（ホワイトメディカル；AccuPen（ACCUTOME社製））を、それぞれ用いて測定した。
（結果）
ＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮シートを移植したウサギ眼を図５に、ヒトｉＰＳ細胞を分化誘導して得られた角膜内皮シートを移植したウサギ眼を図６に示す。いずれの角膜内皮シートも移植することで、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が認められた。【００５２】
実施例６：ヒトＣＯＰｓからの角膜内皮細胞への分化誘導
（材料と方法）
１．ヒトＣＯＰｓの分離
実施例１を一部改変することによりヒトからＣＯＰｓを得た。具体的には、ヒト角膜から上皮、内皮を取り除いた後の角膜実質をコラゲナーゼ処置し、ＥＧＦ、ＦＧＦ２、Ｂ２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ヘパリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で分離した細胞を培養することによってスフェア状の細胞塊を形成する細胞集団を得て調製した。
２．分化誘導培地の調製
基礎培地として、ＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich）を用い、１％ウシ血清及び分化誘導因子を添加した。分化誘導因子としては以下のものを用いた。
（分化誘導培地Ａ：分化誘導０〜２日目）
(i)全トランス−レチノイン酸（濃度：１μＭ）入手先：Sigma-Aldrich
(ii)ＴＧＦｂ２（濃度：１ｎｇ／ｍｌ）入手先：Peprotech
(iii)Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
（分化誘導培地Ｂ：分化誘導２日目以降）
(i)ＢＩＯ（ＧＳＫ３阻害剤）（濃度：１μＭ）入手先：Calbiochem
(ii)ｂＦＧＦ（濃度：４０ｎｇ／ｍｌ）入手先：Sigma Aldrich
(iii)Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
（結果）
実施例５と同様にして、ヒト角膜より分離したＣＯＰｓをゼラチンコートした１型コラーゲンシート上で分化誘導培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下、７日間培養し（０〜２日間は分化誘導培地Ａで、２日目以降は同シート上で培地を分化誘導培地Ｂに交換して培養した）、コンフルエントの細胞シートを作成した（図７）。ヒトＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮シートを実施例５と同様にしてウサギの角膜に移植した。角膜内皮シートを移植することで、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が認められた（図８）。【００５３】
実施例７：マウスＳＫＰｓからの角膜内皮細胞への分化誘導
（材料と方法）
１．マウスＳＫＰｓの分離
既報（Nat Cell Biol., 2001 vol. 3, 778-784）に従ってマウス皮膚からＳＫＰｓを得た。
２．分化誘導培地の調製
実施例１と同様にして分化誘導培地を調製した。
（結果）
実施例５と同様にして、マウス皮膚より分離したＳＫＰｓを蛍光色素ＰＫＨ２６（赤色）（Sigma-Aldrich）で標識後、ゼラチンコートした１型コラーゲンシート上で分化誘導培地中、３７℃、５％ＣＯ２存在下、７日間培養し、コンフルエントの細胞シートを作成した（図９）。
得られたＳＫＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮シートを用いて、実施例４と同様にしてＮａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅポンプ機能を測定した。対照として、培養マウス角膜内皮細胞、３Ｔ３細胞、分化誘導前のマウスＣＯＰｓ、実施例５で調製したマウスＣＯＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮シートについてもポンプ機能を測定した。結果を図１０に示す。
本発明の分化誘導培地を用いて得られた角膜内皮細胞は、優れたポンプ機能を有していることが示された。
さらに、マウスＳＫＰｓを分化誘導して得られた角膜内皮シートを実施例５と同様にしてウサギの角膜に移植した。角膜内皮シートを移植することで、内皮機能不全による角膜浮腫が改善され、さらに角膜厚においても改善効果が認められた（図１１）。【００５４】
実施例８：ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞からの角膜内皮細胞への分化誘導（２）
実施例２と同様にして得られた、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を分化誘導して得られた角膜内皮細胞を用いて、角膜内皮細胞マーカーの発現状況をＲＴ−ＰＣＲ法により調べた。用いたプライマーを表３に示す。【００５５】
【表３】
0006041270.tif 000004
【００５６】
本実施例では基礎培地として、ＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich）を用い、分化誘導因子を添加した無血清培地を分化誘導培地として用いた。分化誘導因子としては以下のものを用いた。
(i) ＢＩＯ（ＧＳＫ３阻害剤）（濃度：１μＭ）入手先：Calbiochem
(ii) 全トランス−レチノイン酸（濃度：１μＭ）入手先：Sigma-Aldrich
(iii)Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
結果を図１２に示す。いずれも、分化誘導後、全てのマーカーが発現していることがわかる。【００５７】
実施例９：ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞からの角膜内皮細胞への分化誘導（３）
（材料と方法）
１．ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞
実施例２と同様にしてヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞を調製した。
２．分化誘導培地の調製
基礎培地として、ＭＥＭ培地（Sigma-Aldrich）を用い、分化誘導因子を添加した。血清は添加しなかった（無血清培地）。分化誘導因子としては以下のものを用いた。
（分化誘導培地Ａ：分化誘導０〜４日目）
(i)全トランス−レチノイン酸（濃度：１μＭ）入手先：Sigma-Aldrich
(ii) ＢＩＯ（ＧＳＫ３阻害剤）（濃度：１μＭ）入手先：Calbiochem
(iii)Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
（分化誘導培地Ｂ：分化誘導４日目以降）
(i)Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）（濃度：１０μＭ）入手先：ナカライテスク
（結果）
実施例２と同様にして調製した、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経堤幹細胞をフィブロネクチンコートした１型コラーゲンシート上で分化誘導培地Ａ中、３７℃、５％ＣＯ２存在下、２日間培養した後、細胞をいったん回収した。回収した細胞を分化誘導培地Ａ中、ゼラチン及びラミニンでコートしたコラーゲンビトリゲル（Collagen vitrigel）上に播種し（５．０×１０５細胞／ｃｍ２）、３７℃、５％ＣＯ２存在下、２日間培養した。培地を分化誘導培地Ｂに交換して、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下、３日間培養し、コンフルエントの細胞シートを作成した（図１３）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の製造方法によれば、より効率的に幹細胞から角膜内皮細胞を製造することができる。該製造方法により得られた角膜内皮細胞は、角膜移植用の角膜シート等の角膜内皮細胞の機能不全により生じる疾患の治療用の医薬、そのような疾患を治療するための細胞医療に用いることができる。【００５９】
本出願は、日本で出願された特願２０１１−２２２１３８（出願日２０１１年１０月６日）及び特願２０１２−０７６０８０（出願日２０１２年３月２９日）を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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