(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞における乳酸生産を低下させる方法であって、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【請求項２】
ＬＤＨがＬＤＨａである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培養細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養細胞が、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される請求項１、２、３、４、及び５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１、２、３、及び４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＬＤＨがＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫがＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫがＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫがＰＤＨＫ３である請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
培養細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項１〜１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
異種性ポリペプチドが抗体である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞の平均乳酸生産速度が、ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満である請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
培養細胞が、ＰＤＨＫ及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも７５％高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培養細胞が、３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
培養細胞が、ＰＤＨＫ及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも６８％高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
培養細胞が哺乳類細胞である請求項１〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
培養細胞における乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)転写をサイレンシング又は下方制御する方法であって、
ＬＤＨに特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されており、ｓｉＲＮＡが発現され、それによってＬＤＨ及びＰＤＨＫの遺伝子転写がサイレンシング又は下方制御される方法。
【請求項２０】
培養において低下された乳酸生産を呈する細胞を作成する方法であって、ＬＤＨに特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【請求項２１】
乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な第一低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的な第二ｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている、培養物中における細胞。
【請求項２２】
細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列が第三プロモーターに作動的に連結されている請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞が、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される請求項２１、２２、２３、及び２４の何れか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２１、２２、及び２３の何れか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される請求項２１又は２２に記載の細胞。
【請求項２８】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２１又は２２に記載の細胞。
【請求項２９】
ＰＤＨＫが、ＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される請求項２１又は２２に記載の細胞。
【請求項３０】
ＬＤＨがＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫがＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫがＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫがＰＤＨＫ３である請求項２３に記載の細胞。
【請求項３１】
細胞が異種性ポリペプチドを生産する請求項２１〜３０の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
異種性ポリペプチドが抗体である請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
細胞がネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満の平均乳酸生産率を有する請求項２１〜３２の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも７５％高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項２１〜３３の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
細胞が、３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する請求項２１〜３４の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫを含んでなる異種性核酸配列を持たない細胞より、少なくとも６８％高い異種性ポリペプチド生産性を有する請求項２１〜３３及び３５の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３７】
細胞が哺乳類細胞である請求項２１〜３６の何れか一項に記載の細胞。
【請求項３８】
乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されているベクター。
【請求項３９】
培養細胞における乳酸生産を低減させる方法であって、ａ)乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、及びｂ)ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含んでなる方法。
【請求項４０】
培養細胞が、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
培養細胞が、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
培養細胞が、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
培養細胞が、ＬＤＨ及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも６８％高いポリペプチド生産性を有する請求項３９〜４２の何れか一項に記載の方法。
【請求項４４】
培養細胞において異種性ポリペプチドを生産する方法であって、
前記培養細胞における乳酸の生産を減少させる工程を含んでなり、前記細胞は、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、２０１０年５月２８日に出願された米国仮出願第６１／３４９，７２７号の優先権を主張するものであり、その内容を出典明記によりその全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
(発明の分野)
この発明の分野は一般的に、培養細胞における乳酸生産を低下させ、ポリペプチド生産を増加させる方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
バイオ製剤市場は急速に成長しており、産業は２０１０年までに７００億ドルに達すると予想される。Genetic Engineering in Livestock: New Applications and Interdisciplinary Perspectives (Engelhard等, 2009) Springer Berlin Heidelbergを参照。治療用タンパク質における需要の増加と、企業間の市場シェアにおける競争の増加から、治療用タンパク質のより良い生産性を得るための技術の改善に対するニーズがある。この目的に対し、異なるアプローチ、例えば宿主細胞工学が研究されてきた。Kuystermans等, Cytotechnology 53(1-3):3-22 (2007); and O'Callaghan and James, Brief Funct. Genomic Proteomic 7(2):95-110 (2008)を参照。培養細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞が、治療用タンパク質の生産に広く使用されている。例えば、ｐＨコントロール流加（ｆｅｄ-ｂａｔｃｈ）バイオリアクター培養が組換えモノクローナル抗体を生産するために広く使用されてきた。Langheinrich and Nienow, Biotechnol. Bioeng. 66(3):171-9 (1999)。乳酸は、流加培養中の主な蓄積廃産物の一つであり、細胞増殖及びタンパク質生産を阻害することが示されている。Glacken等, Biotechnol. Bioeng. 32:491-506 (1988); and Lao and Toth, Biotechnol. Prog. 13:688-691 (1997)を参照。これは次いで、ｐＨをコントロールするために培養培地への添加を必要とされるアルカリの量における増加を導く。Dietl等, J. Immunol. 184(3):1200-9 (2010); Langheinrich and Nienow, Biotechnol. Bioeng, 66(3):171-9 (1999)。ｐＨを維持するための細胞培養培地へのアルカリの添加の増加はオスモル濃度の増加をもたらし、そしてこの増加は細胞増殖阻害を導き、抗体生産性を低下させうる。Cruz等, Enzyme Microb. Technol. 27(1-2):43-52 (2000); Iran等, Biotechnol. Bioeng. 66:238-246 (1999)。このように、乳酸レベルを低減させることが、ポリペプチドの開発又はより高い力価抗体生産プロセスのために所望される。
【０００４】
細胞培養物における乳酸生産に影響しうる多くの要因があり、例えばピルビン酸レベルのコントロールである。Liu等, J. Biol. Chem., 284(5):2811-22 (2009); and Samuvel等, J. of Immunol. 182(4):2476-84 (2009)を参照。ピルビン酸は、ピルビン酸脱水素酵素(ＰＤＨ)及び乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)の基質である。
【０００５】
ＰＤＨ複合体は、３つの触媒酵素Ｅ１、Ｅ２、及びＥ３から成る複合酵素ユニットである。Patel and Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001)。この複合体は、トリカルボン酸(ＴＣＡ)サイクルの入り口点である、ピルビン酸からアセチル-ＣｏＡへの変換における律速変換反応を触媒する。ＰＤＨの活性は、ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)及びピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼ(ＰＤＨＰ)によって制御される。ＰＤＨＫはＰＤＨをリン酸化してその酵素活性を抑制し、ＰＤＨＰは脱リン酸化し、従ってＰＤＨを活性化させる。Patel and Korotchkina, Exp. Mol. Med. 33(4):191-7 (2001); Roche and Hiromasa, Cell Mol. Life Sci. 64(7-8):830-49 (2007); Holness and Sugden, Biochemical Society Transactions, 31:1143-1151 (2003)を参照。哺乳類細胞には４つのＰＤＨＫのアイソタイプがあり(ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４)、組織特異的な分布を有する。Harris等, Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002); and Bowker-Kinley等, Biochem. J. 329(1):191-6 (1998)を参照。
【０００６】
ＬＤＨは、ピルビン酸及び乳酸の相互変換を、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋の同時相互変換と共に、直接触媒する。哺乳類細胞においてＬＤＨは、ＬＤＨａ及びＬＤＨｂ遺伝子にコードされるＡ及びＢサブユニット(又はそれぞれＨ及びＭサブユニット)から主に成るホモ-又はヘテロ四量体として、また時々ＬＤＨｃ遺伝子にコードされるＣサブユニットのホモ四量体として存在する。Baumgart等, J. Biol. Chem. 271(7):3846-55 (1996); Li等, J. Biol. Chem. 258(11):7029-32 (1983); Skory C.D., Appl. Environ. Microbiol. 66(6):2343-8 (2000); and Read等, Proteins 43(2):175-185 (2001)を参照。例えばＣＨＯ細胞では、ＬＤＨアイソタイプは、Ａ３Ｂ及びＡ２Ｂ２四量体の中間体であることが示されている。Jeong等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001)。過去の研究は、相同組換え(Chen等, Biotechnol. Bioeng. 72(1):55-61 (2001))、アンチセンス技術(Jeong等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 289(5):1141-9 (2001))、又は小又は短分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)(Kim and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007))による遺伝子の破壊によりＣＨＯ細胞におけるＬＤＨａを下方制御することが、乳酸レベルを低減できることを示しているが、タンパク質生産性における大きな改善を達成していない。例えば、ＬＤＨａ特異的ｓｉＲＮＡの場合、乳酸レベルにおける４５−７９％の低減が報告されたが、比生産性(Ｑｐ)及び産物(抗体)力価における顕著な改善はなく、ＣＨＯ細胞におけるＬＤＨａ単独のノックダウンは、Ｑｐ及び産物収率を効果的に改善するのに十分でないことを示唆する。従って、乳酸生産を低減させるより効果的な方法が、より良い治療用ポリペプチド生産を達成するために必要である。
【０００７】
ここに引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、及び特許出願が出典明記によって援用されるために具体的及び個々に示されるのと同程度に、出典明記によって本明細書中に援用される。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、培養細胞において乳酸生産を低下させ、ポリペプチド生産を増加させるための方法及び組成物を提供する。発明者は、ポリペプチド(例えば抗体)を発現する培養細胞における、ｓｉＲＮＡによるＬＤＨ及びＰＤＨＫの同時下方制御が、乳酸レベル、乳酸生産速度、及びオスモル濃度を低下させ、比ポリペプチド生産性(例えば比生産性)及びポリペプチド生産(例えば生産性)を増加させることを発見した。更に、下方制御されたＬＤＨ及びＰＤＨＫを有するこれらの培養細胞は、細胞増殖、細胞生存率、及び生産されるポリペプチドの質に負の影響を与えなかった。
【０００９】
一態様では、発明は、培養細胞における乳酸生産を低減させる方法であって、ａ)乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)、及びｂ)ビルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含んでなる方法を提供する。
【００１０】
別の態様では、発明は、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを含んでなる培養物中における細胞を提供する。
【００１１】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。
【００１２】
別の態様では、発明は、培養細胞における乳酸生産を低下させる方法であって、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びビルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、発明は、ＬＤＨに特異的な第一ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的な第二ｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている、培養物中における細胞を提供する。
【００１４】
幾つかの実施態様では、細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、細胞は、第五ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている。
【００１５】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨはＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃである。
【００１６】
幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。
【００１７】
幾つかの実施態様では、培養細胞における乳酸生産を低減させる方法は、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及び第一、第二、及び第三ＰＤＨＫに特異的な３つの異なるｓｉＲＮＡをコードする第二、第三、及び第四異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二、第三、及び第四プロモーターにそれぞれ作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、ＬＤＨはＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫはＰＤＨＫ３である。
【００１８】
幾つかの実施態様では、培養中における細胞は、ＬＤＨに特異的な第一ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及び第一、第二、及び第三ＰＤＨＫに特異的な３つの異なるｓｉＲＮＡをコードする第二、第三、及び第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二、第三、及び第四プロモーターにそれぞれ作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、ＬＤＨはＬＤＨａであり、第一ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１であり、第二ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２であり、第三ＰＤＨＫはＰＤＨＫ３である。
【００１９】
幾つかの実施態様では、培養細胞は異種性ポリペプチドを生産する。幾つかの実施態様では、異種性ポリペプチドは抗体である。
【００２０】
幾つかの実施態様では、培養細胞の乳酸合成速度は、乳酸消費速度より低い。幾つかの実施態様では、平均乳酸生産速度は、約ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日未満である。
【００２１】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨ及びＰＤＨＫ(一又は複数)に特異的なｓｉＲＮＡを有する培養細胞は、約３００ｍＯｓｍ未満のオスモル濃度を有する。
【００２２】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約７５％高い比生産性(Ｑｐ)を有する。
【００２３】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＬＤＨ及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも約７５％高い比生産性(Ｑｐ)を有する。
【００２４】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、約１０％〜約８００％高いポリペプチド生産性(例えば、ｇ／Ｌにおける抗体生産性又は生産性)を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、約５５％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約６８％高いポリペプチド生産性を有する。
【００２５】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、約１０％〜約８００％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、約５５％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも約６８％高いポリペプチド生産性を有する。
【００２６】
幾つかの実施態様では、培養細胞は哺乳類哺乳類である。幾つかの実施態様では、培養細胞は非哺乳類哺乳類である。
【００２７】
別の態様では、発明は、培養細胞におけるＬＤＨ及びＰＤＨＫ転写をサイレンシング又は下方制御する方法であって、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されており、ｓｉＲＮＡが発現され、それによってＬＤＨ及びＰＤＨＫの遺伝子転写がサイレンシング又は下方制御される方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、発明は、培養において低下された乳酸生産を呈する細胞を作成する方法であって、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法を提供する。
【００２９】
別の態様では、発明は、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)に特異的な低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)をコードする第一異種性核酸配列、及びビルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されているベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＬＤＨａ／ＰＤＨＫ１、２、３を標的にするｓｉＲＮＡコンストラクトを示す。ＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３を標的にするｓｉＲＮＡを、単一ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１ハイグロマイシンベクターにクローン化した。ＬＤＨａの標的配列はＵ６プロモーター制御下であり、ＰＤＨＫ１、２、及び３のｓｉＲＮＡはＨ１プロモーター制御下であった。
【図２】図２は、選択した１２のｓｉＲＮＡクローン(薄灰色で示す)における相対ＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、２、及び３のｍＲＮＡ発現レベルを示す。ＬＤＨａ及びＰＤＨＫの発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子ｂ-ミクログロブリンに正規化した。１２のｍｏｃｋクローンからの平均ｍＲＮＡ発現レベルを、暗灰色で示す。
【図３】図３は、流加振とうフラスコ評価における乳酸プロファイル、平均乳酸生産速度、及び１４日目のｐＨ値を示す。乳酸濃度を、１４日の振とうフラスコ評価中、３、７、１０及び１４日目に、Ｎｏｖａ分析計を使用して測定した。３Ａ)ｍｏｃｋ(暗灰色)及びｓｉＲＮＡ(薄灰色)クローンの乳酸プロファイル；３Ｂ)３及び１４日目の間の平均乳酸生産速度(ｍｇ／１０６細胞／日)；及び３Ｃ)１４日目のｐＨ値。流加振とうフラスコ実験を３回実施し、示すデータは１実験からである。
【図４】図４は、流加振とうフラスコ評価における力価、比生産性(Ｑｐ)及び細胞増殖プロファイルを示す。４Ａ)ｇ／Ｌにおける１４日目の力価(生産性)；４Ｂ)ｐｇ／細胞／日における比生産性；及び４Ｃ)１０８細胞／日／リットルにおける統合生細胞数(ＩＶＣＣ)により測定される細胞増殖。Ｍｏｃｋクローンは暗灰色であり、ｓｉＲＮＡクローンは薄灰色である。
【図５】図５は、２Ｌバイオリアクター評価における乳酸プロファイル、平均乳酸生産速度、及びオスモル濃度プロファイルを示す。５Ａ)乳酸プロファイル；５Ｂ)平均乳酸生産速度；及び５Ｃ)オスモル濃度プロファイル。
【図６】図６は、２Ｌバイオリアクター評価における、ｓｉＲＮＡ、ｍｏｃｋ、又は親株を有する培養細胞の生産性プロファイルを示す。
【００３１】
(発明の詳細な説明)
本発明は、培養細胞において乳酸生産を低下させポリペプチド生産を増加させるための方法及び組成物を提供する。発明者は、ポリペプチド(例えば抗体)を発現する培養細胞における、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)として知られるプロセスによるｓｉＲＮＡによるＬＤＨ及びＰＤＨＫの同時下方制御が、乳酸レベル、乳酸生産速度、及び細胞オスモル濃度を低下させ、比ポリペプチド生産性(例えば比生産性)及びポリペプチド生産(例えば生産性)を増加させることを発見した。更に、下方制御されたＬＤＨ及びＰＤＨＫを有するこれらの培養細胞は、細胞増殖、細胞生存率、及び生産されるポリペプチドの質にネガティブな影響を示さなかった。従って、理論に縛られることなく、ＬＤＨの発現のノックダウンよるピルビン酸-乳酸変換の低下、及び一又は複数のＰＤＨＫの発現のノックダウンによるトリカルボン酸サイクル(ＴＣＡ又はクレブスサイクル)へのピルビン酸の促進は、乳酸の低下及び細胞へのより多くのエネルギーと代謝中間体の提供において相乗効果をもたらしうる。これらの効果は次いで、培養細胞におけるポリペプチド(例えば抗体)の増加を導きうる。
【００３２】
従って、発明の一態様では、提供されるのは、培養細胞における乳酸生産を低減させる方法であって、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含んでなる方法である。
【００３３】
別の態様では、提供されるのは、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを含んでなる培養物中における細胞である。
【００３４】
別の態様では、発明は、培養細胞における乳酸生産を低下させる方法であって、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる細胞を培養することを含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法を提供する。
【００３５】
また別の態様では、発明は、ＬＤＨに特異的な第一ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的な第二ｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている、培養物中における細胞を提供する。
【００３６】
本発明のの実践では、他に示さない限り、当分野の技術の範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の一般的な技術を使用する。これらの技術は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook等, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel等, eds., 1987); PCR:  The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan等, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies:  a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies:  a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies:  a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献に十分に説明されている。
【００３７】
定義
ここで使用される場合、「培養物中における細胞」又は「培養細胞」なる用語は、細胞に一又は複数の細胞分裂を生じさせる溶液(例えば、細胞培地)中における２以上の細胞を示す。
【００３８】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」なる用語は、ここでは交互可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを示し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組込み可能な任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含みうる。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立の前又は後に付与されうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分を挟みうる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合化後、更に修飾されうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ」、類似体による自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電性結合(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダーゼ、カルバマート等)及び荷電性結合(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、介入物を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された結合を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されてもよく、もしくは固体状支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャッピング基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該技術で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ-又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオチド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基で置き換えてもよい。これらの代替の結合基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ.sub.２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ.sub.２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての架橋が同一である必要はない。先の記述において、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、ここで引用された全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３９】
「ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)」なる用語は、ｓｉＲＮＡにより媒介又は開始される配列特異的な転写遺伝子サイレンシング(例えば転写後遺伝子サイレンシング)のプロセスを示す。理論に縛られるものではないが、ＲＮＡｉの間、発明の方法の実施において、ｓｉＲＮＡは、ＬＤＨ及び一又は複数のＰＤＨＫの遺伝子発現の結果的な配列特異的阻害と共に、標的ｍＲＮＡの分解を誘発できる。
【００４０】
「異種性核酸」又は「異種性ポリペプチド」なる用語は、核酸又はポリペプチドであって、その配列が、同じ宿主細胞において天然に見られる他の核酸又はポリペプチドの配列と同一でない核酸又はポリペプチドを示す。
【００４１】
「低分子干渉ＲＮＡ」、「短分子干渉ＲＮＡ」、又は「ｓｉＲＮＡ」なる用語は、ヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖、又は幾つかの別の態様では、興味の核酸、例えばＬＤＨ又はＰＤＨＫ(一又は複数)を標的にするＲＮＡの単一分子を示す。ｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン・クリック塩基対相互作用によって共にアニーリングされているセンスＲＮＡ鎖及び相補アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。ＳｉＲＮＡは直接トランスフェクトされるか、又は培養細胞中で生成されることができる。
【００４２】
一バリエーションでは、センスＲＮＡ鎖及び相補アンチセンスＲＮＡ鎖はスペーサーによって結合され、低分子ヘアピン型ＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ)と呼ばれるステムループ又はヘアピン構造の発現を導く。ヘアピンは次いでエンドヌクレアーゼ(例えばＤｉｃｅｒ)によって切断され、ｓｉＲＮＡが生成される。別のバリエーションでは、ｓｈＲＮＡは、２つのステムループ構造から成る二機能性ｓｈＲＮＡであり、一ステムループ構造は、切断依存ＲＩＳＣ(ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体)ローディングによるｍＲＮＡ分解のためのＲＮＡ二本鎖を導く完全マッチド配列から成り、第二ステムループ構造は、切断非依存ＲＩＳＣローディングによるｍＲＮＡ隔離を通しｍＲＮＡの翻訳を阻害するミスマッチ鎖から成る。
【００４３】
ここで使用される場合、ＬＤＨ又はＰＤＨＫに「特異的な」ｓｉＲＮＡとは、興味の核酸(例えばＬＤＨ又はＰＤＨＫ(一又は複数))を標的にするｓｉＲＮＡを示し、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列は、標的遺伝子(例えばＬＤＨ又はＰＤＨＫ(一又は複数))のヌクレオチド配列に相補的である。
【００４４】
ここで使用される場合、「作動的に連結」とは、ここで使用される場合、２つ以上の核酸(例えばＤＮＡ)セグメント間の機能的関係を示す。典型的には、それは、転写配列に対する転写調節配列の機能的関係を示す。例えば、プロモーターは、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は修飾するなら、コード配列、例えば発明の核酸に作動的に連結されている。一般に、転写配列に作動的に連結されたプロモーター転写制御配列は、転写配列に物理的に近接し、すなわちそれらはシス作用性である。しかしながら、エンハンサーなどの幾つかの転写調節配列は、転写をそれらが増強するコード配列に必ずしも物理的に近接しないか又は近傍に位置しない。
【００４５】
ここで使用される場合、「プロモーター」なる用語は、培養細胞、例えば哺乳類細胞においてコード配列の転写を駆動可能な全ての配列を含む。従って、発明のコンストラクトにおいて使用されるプロモーターは、遺伝子(例えばＬＤＨ又はＰＤＨＫ(一又は複数))の転写のタイミング及び／又は割合の調整又は調節に関与するシス作用性転写コントロール要素及び制御配列を含む。例えば、プロモーターは、転写調製に関与するエンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’及び３’非翻訳領域、又はイントロン配列を含むシス作用性転写コントロール要素でありうる。これらのシス作用性配列は典型的には、転写を実行するために(オン／オフ、制御、調節等)、タンパク質又は他の生体分子と相互作用する。「構成的プロモーター」は、多くの環境条件及び発生又は細胞分化の状態下で、発現を構成的に駆動させるものである。「誘導型」又は「制御型」プロモーターは、環境条件又は発生条件の影響下で、発明の核酸の発現を指示する。誘導型プロモーターによる転写に影響しうる環境条件の例は、嫌気条件、上昇化温度、乾燥、又は光の存在を含む。
【００４６】
ここで使用される場合、「ベクター」とは、宿主細胞において興味の一又は複数の遺伝子又は配列を、送達、好ましくは発現できるコンストラクトを意味する。ベクターの例は、限定するものではないが、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、陽イオン縮合剤と関連するＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されたＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクター、及び産生細胞等の特定の真核生物細胞を含む。適切なベクターは、使用する宿主細胞と適合するものである。適切なベクターは、例えば細菌、ウィルス(例えばバクテリオファージＴ７又はＭ-１３由来ファージ)、コスミド、酵母、又は植物に由来しうる。このようなベクターの取得及び使用のプロトコルは当業者に知られている(例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照)。
【００４７】
ここで使用される場合、平均乳酸生産速度は、乳酸合成速度−乳酸消費速度として、ｍｇ／細胞／日において算出される。
【００４８】
ここで使用される場合、「比生産性」又は「Ｑｐ」とは、ｐｇ／細胞／日における、比タンパク質、例えば抗体生産速度を示す。比生産性は、タンパク質力価(ｐｇ／細胞／日)／ＩＶＣＣ(算出統合生細胞数；細胞／日)として算出される。
【００４９】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」なる用語はここでは互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合を示す。ポリマーは線状又は分岐状であり得、修飾されたアミノ酸を含み得、非アミノ酸を挟みうる。該用語はまた、天然又は介入；例えばジスルフィド結合の形成、糖鎖付加、脂質付加、アセチル化、リン酸化、又は何れかの他の操作又は修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーション；によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義に含まれるのは、例えば一又は複数のアミノ酸の類似体(例えば非天然アミノ酸などを含む)、並びに当分野で知られている他の修飾を有するポリペプチドである。
【００５０】
「抗体」なる用語は、最も広い意味で用いられ、モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び抗体断片を含む。
【００５１】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、及びＦｖ断片；単鎖抗体分子；ダイアボディ；線状抗体；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００５２】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量に存在しうる可能な天然に生じる変異体を除いて同一である。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む一般的な(ポリクローナル)抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を示すものであり、抗体が何か特定の方法による生産を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256: 495 (1975)よって記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作製されうる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)。「モノクローナル抗体」はまた例えばClackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用するファージ抗体ライブラリーから単離することもまたできる。
【００５３】
ここでの「モノクローナル抗体」は、特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は相同する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に一致するか又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００５４】
ここで使用される「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991))、及び／又は「高頻度可変ループ」由来のそれらの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５１(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)と、重鎖可変ドメインの２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia 及び Lesk J. Mol.Biol.196:901-917 (1987))とを含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義されている高頻度可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００５５】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００５６】
ここで使用される場合、「イムノアドヘシン」なる用語は、異種性「アドヘシン」タンパク質(例えば受容体、リガンド又は酵素)の「結合ドメイン」と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認識及び結合部位(抗原組合せ部位)以外である(すなわち「異種性」である)、所望の結合特異性を有するアドへシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合を含む。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は好ましくはｇ１、ｇ２、又はｇ４重鎖に由来し、これは、これらの領域を含んでなるイムノアドヘシンがプロテインＡクロマトグラフィーによって精製できることからである(Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。
【００５７】
ここに使用される「配位子結合ドメイン」という用語は、任意の天然細胞表面受容体あるいは任意の領域あるいは誘導体をしめし、それらは対応する天然受容体の定性的配位子結合を少なくとも1つ保持する。具体的な実施形態では、受容体は、免疫グロブリンのスーパー遺伝子群のメンバーに同族の、細胞外ドメインを持つ細胞表面ポリペプチドから出る。他の受容体、それらは免疫グロブリンのスーパー遺伝子群のメンバーではないが、それにもかかわらずこの定義によって特にカバーされる受容体は、サイトカイニン用の受容体、及び特にチロシン・キナーゼ活性(受容体チロシン・キナーゼ)を伴うの受容体、ヘマトポエチン(hematopoietin)のメンバー、及び神経成長因子受容体の上科、及び細胞付着分子(例えば(E、L-またP-)セレクチン(selectins))である。
【００５８】
「抗体結合ドメイン」という用語は、細胞付着分子を含む受容体用の任意の天然配位子、あるいは任意の領域、あるいは対応する天然配位子の少なくとも1つの定性受容体結合能力を保持する前記天然配位子の誘導体を指定するために使用する。この定義は、数ある中でも、特に、上述の受容体用配位子からの結合配列を含有する。
【００５９】
「抗体-イムノアドヘシン・キメラ」は、少なくとも一つの(本出願中で定義された)イムノアドヘシンをもつ(ここで定義された)抗体の少なくとも１つの結合ドメインを組み合わせる分子を含む。典型的な抗体-免疫付着因子キメラはBergらによるPNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) 及び Chamow らによる J. Immunol. 153:4268 (1994)に記載された二重特異性のＣＤ４-ＩｇＧキメラ類である。
【００６０】
「オスモル濃度」なる用語は、１リットルの溶液中に溶存する溶質粒子の数を指す。そのオスモル濃度を増加させるために培養培地に加えられうる溶質は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝ポリマー、ビタミン、イオン、塩(例えばナトリウム又はカリウム塩)、糖、代謝物、有機酸、脂質等を含む。ここで使用される場合、略記「ｍＯｓｍ」は「ミリオスモル／リットルＨ２Ｏ」を意味する。
【００６１】
ここで使用される場合、「宿主細胞」は、ポリペプチドを生産するための、ポリヌクレオチド挿入の組込みのためのベクター(一又は複数)又はｓｉＲＮＡ(一又は複数)のレシピエントでありうる又はレシピエントであった個々の細胞、培養細胞、又は培養物中における細胞を含む。宿主細胞は単一培養細胞の子孫を含み、子孫は、天然の、偶発的な、又は故意の変異により、元の親細胞と完全に同一である必要はない(形態学的、又はゲノムＤＮＡ相補性において)。
【００６２】
ここでの使用では、別段の定めがある場合を除き、「a」、「an」等の用語の使用は一又は複数を指す。
【００６３】
ここにおいて値又はパラメーターへの「約」の言及は、その値又はパラメーター自体に対する実施態様を含む(述べる)。例えば、「約Ｘ」を言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。数値範囲はその範囲を定める数を含む。
【００６４】
実施態様が、「を含んでなる」という言葉を用いてここに記載される場合、「から成る」及び／又は「から本質的に成る」により記載される他の類似な実施態様もまた提供されることが理解される。
【００６５】
発明の態様又は実施態様が、マーカッシュ群又は代替の他の分類によって記載されている場合、本発明は、全体として挙げられている全群だけでなく、群の各メンバーを個々に、主要群の全ての可能なサブグループ、一又は複数の群メンバーを欠く主要群を包含する。本発明はまた、請求する発明における一又は複数の任意の群メンバーの明確な除外も考えられる。
【００６６】
乳酸生産を低減させる方法
ここにおける方法は、ＲＮＡ干渉(ＲＮＡｉ)により乳酸生産を低減させるために、ＬＤＨ及び少なくとも一又は複数のＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。別の態様では、方法は、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。
【００６７】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。
【００６８】
別の態様では、方法は、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている。
【００６９】
別の態様では、提供されるのは、培養細胞におけるＬＤＨ及びＰＤＨＫ転写をサイレンシング又は下方制御する方法であって、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されており、ｓｉＲＮＡが発現され、それによってＬＤＨ及びＰＤＨＫの遺伝子転写がサイレンシング又は下方制御される方法である。
【００７０】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第五ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている。
【００７１】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨはＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃである。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ３から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ２及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ３及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。
【００７２】
幾つかの実施態様では、方法は、ａ)ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。幾つかの実施態様では、方法は、ａ)ＬＤＨｂに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。幾つかの実施態様では、方法は、ａ)ＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。
【００７３】
幾つかの実施態様では、方法は、ａ)ＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)２つのＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含み、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。例えば、方法は、ａ)ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する細胞を培養することを含む。
【００７４】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨ及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞と比較して、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する培養細胞では、ＬＤＨのｍＲＮＡ発現レベルは少なくとも約７５％低減され、ＰＤＨＫのｍＲＮＡ発現レベルは少なくとも約２５％低減される。幾つかの実施態様では、ＬＤＨは、ＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃであり、ＬＤＨのｍＲＮＡ発現レベルは、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、又はＰＤＨＫ３であり、ＰＤＨＫのｍＲＮＡ発現レベルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。
【００７５】
幾つかの実施態様では、ａ)ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡを発現する培養細胞では、ＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞と比較して、ＬＤＨａのｍＲＮＡ発現レベルは約９０％低減され、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３のｍＲＮＡ発現レベルはそれぞれ約３２％、８３％、及び７０％低減される。
【００７６】
幾つかの実施態様では、方法は、ＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている。
【００７７】
幾つかの実施態様では、方法は、ＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二及び第三異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結され、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。
【００７８】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる培養細胞では、ＬＤＨ及びＰＤＨＫを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞と比較して、ＬＤＨのｍＲＮＡ発現レベルが少なくとも約７５％低減され、ＰＤＨＫのｍＲＮＡ発現レベルが少なくとも約２５％低減され、ここで、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、ＬＤＨは、ＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃであり、ＬＤＨのｍＲＮＡ発現レベルは、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、又はＰＤＨＫ３であり、ＰＤＨＫのｍＲＮＡ発現レベルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。
【００７９】
幾つかの実施態様では、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含んでなり、第一異種性核酸配列が第一プロモーターに作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列が第二プロモーターに作動的に連結されている培養細胞では、ＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞と比較して、ＬＤＨａのｍＲＮＡ発現レベルが約９０％低減され、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３のｍＲＮＡ発現レベルがそれぞれ約３２％、８３％、及び７０％低減される。
【００８０】
ここに記載されている発明において使用されるｓｉＲＮＡは様々な供給源から得られるか又は作成され得、例えばインビトロ、エクスビボ又はインビボで、ここに記載されるように生成されうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、約１〜約２００のヌクレオチド、約５〜約１００のヌクレオチド、約１０〜約５０のヌクレオチド、約１５〜約３０のヌクレオチド、又は約１９〜約２５のヌクレオチドを含みうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの長さは３０ヌクレオチド未満である。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡの長さは３０ヌクレオチドより大きい。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９又はそれ未満のヌクレオチドの長さでありうる。
【００８１】
幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、化学合成によって、ポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって、又は長い二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)のエンドヌクレアーゼ(例えばＤｉｃｅｒ)消化によって生成されうる。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、全体又は一部が、合成ヌクレオチド、天然塩基又は修飾塩基から成りうる。
【００８２】
幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは細胞内で発現されうる。ｓｉＲＮＡは核酸配列にコードされ得、その核酸配列はまた一又は複数のプロモーターを含みうる。核酸配列はま、ポリアデニル化シグナルも含みうる。幾つかの実施態様では、ＲＮＡ二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖は２つの独立したプロモーターから生産され、培養細胞を用いてアニーリングされうる。幾つかの実施態様では、ＲＮＡ二本鎖のセンス及びアンチセンス鎖は、塩基対スペーサー(例えば、塩基対スペーサーは単一又は複数の塩基対を含みうる)又はステムループによって連結されｓｈＲＮＡを形成し、単一プロモーターによって発現されうる。幾つかの実施態様では、ｓｈＲＮＡは二機能性ｓｈＲＮＡでありうる。ヘアピンは、有効ｓｉＲＮＡ分子を生成するために、エンドヌクレアーゼ(例えばＤｉｃｅｒ)によって切断されうる。スペーサー又はステムループは、二本鎖を形成するセンス及びアンチセンス鎖間に位置する。ステムループは長さにおいて様々でありうる。幾つかの実施態様では、ステムループは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５又はそれより大のヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造はまた、３’又は５’突出部分を有しうる。幾つかの実施態様では、突出は、３’又は５’突出１、２、３、４又は５ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又は二機能性ｓｈＲＮＡによるＲＮＡ媒介遺伝子制御のための組成物及び方法は、例えば、U.S. Appl. No. 20090215860, Rutz and Scheffold, Arthritis Research & Therapy, 6(2):78-85 (2004), and Rao等, Advanced Drug Delivery Reviews 61:746-759 (2009)に記載されている。
【００８３】
幾つかの実施態様では、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、標的特異的反応を生じさせるために、本発明配列と完全な相同性を有し得る。幾つかの実施態様では、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、標的配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９２％、９１％、９０％、８８％、８６％、８４％、８２％、８０％、７８％、７６％、７４％、７２％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％の何れかの相同性を有する。一バリエーションでは、本発明において使用されるｓｉＲＮＡは、生理学的条件下で、核酸標的配列にハイブリダイズし得、例えばそれは細胞において、例えばインビボで標的配列に特異的にハイブリダイズしうる。他のバリエーションでは、ｓｉＲＮＡは、一以上の標的配列、標的マーカー又はレポーター遺伝子を標的にする。
【００８４】
標的核酸へのｓｉＲＮＡのインビボターゲティング(例えば生理学的条件下での、細胞中における標的配列へのｓｉＲＮＡの特異的結合)に必要な配列同一性(相同性)の度合いは、ルーチン的なスクリーニング条件下で、例えば細胞培養物などにおいて試験できる。
【００８５】
幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫ１のための標的配列はＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＧＡ(配列番号：２)である。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫ２のための標的配列はＣＡＴＴＣＡＧＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＡＣ(配列番号：３)である。幾つかの実施態様では、ＰＤＨＫ３のための標的配列はＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＡ(配列番号：４)である。
【００８６】
乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)は、ピルビン酸を乳酸に変換する。例示的ＬＤＨ(例えばＬＤＨａ、ＬＤＨｂ、又はＬＤＨｃ)ポリペプチド及び核酸の受入番号は、限定するものではないが、ＤＱ９１２６６１(ＣＨＯ細胞におけるＬＤＨａ)、ＢＣ０６７２２３(ヒトＬＤＨａ)、ＢＣ０８４６９８(ラットＬＤＨａ)、ＢＣ０９４４２８(マウスＬＤＨａ)、ＢＣ００２３６２(ヒトＬＤＨｂ)、ＮＭ_０１２５９５(ラットＬＤＨｂ)、ＮＭ_００８４９２(マウスＬＤＨｂ)、ＢＣ０９００４３(ヒトＬＤＨｃ)、ＮＭ_０１７２６６(ラットＬＤＨｃ)、及びＮＭ_０１３５８０(マウスＬＤＨｃ)を含む。当業者に知られている標準的方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物、インビボにおけるピルビン酸を乳酸に変換するポリペプチドの能力を測定することによって、ＬＤＨポリペプチドがＬＤＨ活性を有するか決定できる。
【００８７】
ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ(ＰＤＨＫ)は、アセチル-ＣｏＡへのピルビン酸の変換を阻害する。例示的ＰＤＨＫ１ポリペプチド及び核酸の受入番号は、限定するものではないが、Ｌ４２４５０(ヒト)、ＢＣ０８９７８３(ラット)、及びＮＭ_１７２６６５(マウス)を含む。例示的ＰＤＨＫ２ポリペプチド及び核酸の受入番号は、限定するものではないが、ＮＭ_００２６１１(ヒト)、ＮＭ_０３０８７２(ラット)、及びＮＭ_１３３６６７(マウス)を含む。例示的ＰＤＨＫ３ポリペプチド及び核酸の受入番号は、限定するものではないが、Ｌ４２４５２(ヒト)、ＢＣ１６９０７８(ラット)、及びＮＭ_１４５６３０(マウス)を含む。例示的ＰＤＨＫ４ポリペプチド及び核酸の受入番号は、限定するものではないが、ＮＭ_００２６１２(ヒト)、ＮＭ_０５３５５１(ラット)、及びＮＭ_０１３７４３(マウス)を含む。当業者に知られている標準的方法を使用して、インビトロ、細胞抽出物、インビボにおけるアセチル-ＣｏＡへのピルビン酸の変換を阻害する能力を測定することによって、ＰＤＨＫポリペプチドがＰＤＨＫ活性を有するか決定できる。
【００８８】
プロモーターは当分野でよく知られている。宿主細胞において機能する任意のプロモーターが、宿主細胞におけるＬＤＨ及び一又は複数のＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡの発現のために使用できる。実質的に、これらのｓｉＲＮＡを作動できる任意のプロモーターが本発明に適切であり、限定するものではないが、Ｕ６、Ｈ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、Ｔ７、ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びＥＦ１ａを含む。例えば、幾つかの実施態様では、方法は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーターＵ６に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーターＨ１に作動的に連結されている。一バリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｂに特異的である。他のバリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｃに特異的である。
【００８９】
別の態様では、提供されるのは、培養物において低下された乳酸生産を呈する細胞を作成する方法であって、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターを細胞に導入する工程を含んでなり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている方法である。
【００９０】
ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列は、様々な手順によってベクターに挿入できる。例えば、ＬＤＨ及びＰＤＨＫのｓｉＲＮＡ配列は、挿入物の消化後に、適切な制限エンドヌクレアーゼ、例えばＫａｓＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、又はＢｈＩＩＩを有するベクターを用いて、ベクター中における所望の位置にライゲーションされる。幾つかの実施態様では、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡ配列を有するベクターは、ＬＤＨａのｓｉＲＮＡ配列を、その５’末端へのＵ６プロモーターの付加と共にベクター(例えばｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１-Ｈ１ハイグロベクター)のＫａｓＩ部位に挿入することによって、ＰＤＨＫ１及びＰＤＨＫ２のｓｉＲＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にそれぞれ挿入することによｄって、ＰＤＨＫ３のｓｉＲＮＡ配列を、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３の５’末端へのＨ１プロモーターの付加と共にＢｇＩＩＩに挿入することによって構築した。そして低減された乳酸生産を発現する培養細胞は、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３のｓｉＲＮＡを有するベクターをトランスフェクトすることによって生成される。 
【００９１】
組成物
ここに記載されている方法によって生産される培養細胞も、本発明において提供される。本発明の組成物は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロで実践されうる。一態様では、提供されるのは、ａ)ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡ及びｂ)ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現する培養物中における細胞である。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、第四ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを更に発現する。
【００９２】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する。幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨｂに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する。幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３にそれぞれ特異的なｓｉＲＮＡを発現する。
【００９３】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)２つのＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現し、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨｂに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)２つのＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現し、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ａ)ＬＤＨｃに特異的なｓｉＲＮＡ、及びｂ)２つのＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡを発現し、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択される。
【００９４】
別の態様では、提供されるのは、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなる培養物中における細胞であり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、細胞は、第二ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を更に含み、第三異種性核酸配列は第三プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、細胞は、第三ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を更に含み、第四異種性核酸配列は第四プロモーターに作動的に連結されている。幾つかの実施態様では、細胞は、第五ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第五異種性核酸配列を更に含み、第五異種性核酸配列は第五プロモーターに作動的に連結されている。
【００９５】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されている。一バリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｂに特異的である。他のバリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｂに特異的である。
【００９６】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列を含み、ＰＤＨＫはＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＰＤＨＫ４から成る群から選択され、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二及び第三異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されている。一バリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｂに特異的である。他のバリエーションでは、ｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列は、ＬＤＨｃに特異的である。
【００９７】
幾つかの実施態様では、細胞培養物は、少なくとも約５、１０、１５、２０、５０、７５、１００、２００、５００、７５０、１，０００、５，０００、７，５００、１０，０００、１５，０００又はそれより多い細胞を含む。
【００９８】
別の態様では、提供されるのは、乳酸消費速度より低い乳酸合成速度を有する培養物中における細胞である。幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、約ネガティブ０．２ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．１ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．０８ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．０６ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．０４ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．０１ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．００８ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．００６ｍｇ／１０６細胞／日、ネガティブ０．００４ｍｇ／１０６細胞／日、又はネガティブ０．００２ｍｇ／１０６細胞／日の何れか未満の平均乳酸生産速度を有する。
【００９９】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されており、培養物中における細胞は、約ネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日の平均乳酸生産速度を有する。
【０１００】
別の態様では、提供されるのは、低減されたオスモル濃度を有するＬＤＨ及びＰＤＨＫ(一又は複数)に特異的なｓｉＲＮＡを有する培養物中における細胞である。幾つかの実施態様では、ＬＤＨ及びＰＤＨＫ(一又は複数)に特異的なｓｉＲＮＡを有する培養物中における細胞は、約５００ｍＯｓｍ、４５０ｍＯｓｍ、４００ｍＯｓｍ３５０ｍＯｓｍ、３００ｍＯｓｍ、２５０ｍＯｓｍ、２００ｍＯｓｍ、又は１５０ｍＯｓｍの何れか未満のオスモル濃度を有する。
【０１０１】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されており、培養物中における細胞は、約３００ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する。
【０１０２】
別の態様では、提供されるのは、増加された比生産性(Ｑｐ)を有する培養物中における細胞である。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約６０％高い、少なくとも約６５％高い、少なくとも約７０％高い、少なくとも約７５％高い、少なくとも約８０％高い、少なくとも約８５％高い、少なくとも約９０％高い、又は少なくとも約９５％高い比生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、約６７％高い、約６９％高い、約７１％高い、約７２％高い、約７３％高い、約７４％高い、約７５％高い、約７６％高い、約７７％高い、約７８％高い、約７９％高い、約８１％高い、約８３％高い、約８５％高い、約８７％高い、約８９％高い、約９１％高い、約９３％高い、約９５％高い、約９７％高い、又は約９９％高い比生産性を有する。
【０１０３】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されており、培養物中における細胞は約７５％高い比生産性を有する。
【０１０４】
別の態様では、提供されるのは、増加されたポリペプチド生産性(例えばｇ／Ｌにおける抗体生産性又は力価)を有する、ここにおける方法によって生産される培養細胞である。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、約１０％〜約８００％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、約１０％高い、約１５％高い、約２０％高い、約２５％高い、約３０％高い、約３５％高い、約４０％高い、約４５％高い、約５０％高い、約５５％高い、約５８％高い、約６０％高い、約６５％高い、約７０％高い、約７１％高い、約７５％高い、約８０％高い、約８５％高い、約９０％高い、約９５％高い、約１００％高い、約１２５％高い、約１５０％、約２００％高い、約２５０％高い、約３００％高い、約３５０％高い、約４００％高い、約４５０％高い、約５００高い、約５５０％高い、約６００％高い、約６５０％高い、約７００％高い、約７５０％高い、又は約８００％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より、少なくとも約５５％高い、少なくとも約６０％高い、少なくとも約６５％高い、少なくとも約６８％高い、少なくとも約７０％高い、少なくとも約８０％高い、少なくとも約８５％高い、又は少なくとも約９０％高いポリペプチド生産性を有する。
【０１０５】
幾つかの実施態様では、培養物中における細胞は、ＬＤＨａに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、ＰＤＨＫ１に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列、ＰＤＨＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第三異種性核酸配列、及びＰＤＨＫ３に特異的なｓｉＲＮＡをコードする第四異種性核酸配列を含み、第一異種性核酸配列は第一プロモーター(例えばＵ６)に作動的に連結され、第二、第三、及び第四異種性核酸配列は第二プロモーター(例えばＨ１)に作動的に連結されており、培養細胞は、ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＬＤＨａを含んでなる異種性核酸配列を持たない培養細胞より少なくとも約６８％高い抗体生産性(例えばｇ／Ｌ)を有する。
【０１０６】
幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、約１０％〜約８００％高いポリペプチド生産性を有する(幾つかの実施態様では、抗体)。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、約１０％高い、約１５％高い、約２０％高い、約２５％高い、約３０％高い、約３５％高い、約４０％高い、約４５％高い、約５０％高い、約５５％高い、約６０％高い、約６５％高い、約７０％高い、約７５％高い、約８０％高い、約８５％高い、約９０％高い、約９５％高い、約１００％高い、約１２５％高い、約１５０％、約２００％高い、約２５０％高い、約３００％高い、約３５０％高い、約４００％高い、約４５０％高い、約５００高い、約５５０％高い、約６００％高い、約６５０％高い、約７００％高い、約７５０％高い、又は約８００％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、培養細胞は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも約６５％高い、少なくとも約６８％高い、少なくとも約７０％高い、少なくとも約８０％高い、少なくとも約８５％高い、又は少なくとも約９０％高いポリペプチド生産性を有する。幾つかの実施態様では、抗体生産性は、ＰＤＨＫ(一又は複数)及びＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡを持たない培養細胞より、少なくとも約６８％高い。
【０１０７】
別の態様では、提供されるのは、ＬＤＨに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第一異種性核酸配列、及びＰＤＨＫに特異的なｓｉＲＮＡをコードする第二異種性核酸配列を含んでなるベクターであり、第一異種性核酸配列は第一プロモーターに作動的に連結され、第二異種性核酸配列は第二プロモーターに作動的に連結されている。
【０１０８】
幾つかの実施態様では、ベクターは、発現コントロール配列の制御下の核酸を有する。ここで使用される場合、「発現コントロール配列」とは、興味の核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現コントロール配列はプロモーター、例えば構成的又は誘導性プロモーター、又はエンハンサーでありうる。「誘導性プロモーター」とは、環境的又は発生的制御下で活性なプロモーターである。発現コントロール配列は、転写される核酸セグメントに作動的に連結されている。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、ベクターはまた終止配列を含む。終止コントロール領域は、宿主細胞に天然な様々な遺伝子に由来しうる。幾つかの実施態様では、終止配列及びプロモーター配列は同じ供給源に由来する。他の実施態様では、終止配列は宿主細胞に内因性である。場合によっては、終止部位が含まれうる。ポリペプチドの効果的な発現のために、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを通して選択発現コントロール領域に作動的に連結される。
【０１１０】
幾つかの実施態様では、ベクターは選択マーカーを有する。「選択マーカー」なる用語は、導入された核酸又はベクターを有する宿主細胞の選択を容易にさせる、宿主細胞において発現可能な核酸を指す。選択マーカーの例は、限定するものではないが、抗生物質耐性核酸(例えばカナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、又はクロラムフェニコール)及び／又は代謝性利点、例えば宿主細胞に対する栄養的利益を与える核酸を含む。幾つかの実施態様では、選択マーカーはハイグロマイシン核酸である。
【０１１１】
ポリペプチド
ここに記載されている方法及び培養細胞を使用して生産されるポリペプチド又はタンパク質は、限定するものではないが、抗体又はイムノアドヘシンを含む。このような分子を生成するための技術は以下で検討する。
【０１１２】
抗体
本発明の範囲である抗体は、限定するものではないが：抗ＣＤ２０抗体、例えば米国特許第５，７３６，１３７号に記載の抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」(ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標))；抗ＶＥＧＦ抗体、ヒト化及び／又は親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含み、例えばヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)(Kim等, Growth Factors, 7:53-64 (1992)，ＷＯ９６／３００４６、及びＷＯ９８／４５３３１、１９９８年１０月１５日公開)及びＶ３ＬＡ；抗ＭＵＣ１６抗体；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ-７４１２抗体(Choy等Arthritis Rheum.39(1):52-56 (1996))及びイバリズマブ(ＴＮＸ３５５)抗体；抗ＭＥＴ抗体、例えばワンアームド５Ｄ５抗Ｃ-Ｍｅｔ抗体；抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標))(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4285-4289 (1992), U.S. Pat.No. 5,725,856)及びヒト化２Ｃ４(ＷＯ０１／００２４５, Adams等)、米国特許第５，７２１，１０８Ｂ１号に記載の２Ｈ７抗体のキメラ又はヒト化変異体、又はトシツモマブ(ＢＥＸＸＡＲ(登録商標))；抗ＩＬ-８抗体(St John等, Chest, 103:932 (1993), and International Publication No. WO 95/23865)；抗前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)抗体(ＷＯ０１／４０３０９)；抗ＣＤ４０抗体、Ｓ２Ｃ６及びそのヒト化変異体(ＷＯ００／７５３４８)を含む；抗ＣＤ１抗体(米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ９８／２３７６１, Steppe等, Transplant Intl. 4:3-7 (1991), and Hourmant等, Transplantation 58:377-380 (1994))；抗ＣＤ１８ (１９９７年４月２２日発行の米国特許第５，６２２，７００号、又は１９９７年７月３１日公開のＷＯ９７／２６９１２);抗IgE抗体 (E25、E26及びE27を含む; １９９８、２月３日発行の米国特許第５，７１４，３３８号、又は１９９２年２月２５日発行の米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日公開のＷＯ９３／０４１７３、又は１９９８年６月３０日出願のＰＣＴ／ＵＳ９８／１３４１０、米国特許第５，７１４，３３８号, Presta等, J. Immunol.151:2623-2632 (1993),及び国際公開ＷＯ９５／１９１８１)；抗Ａｐｏ-２受容体抗体 (１９９８年１１月１９日公開のＷＯ  ９８／５１７９３)；抗ＴＮＦ-α抗体、ｃＡ２(ＲＥＭＩＣＡＤＥ(登録商標))、ＣＤＰ５７１及びＭＡＫ-１９５を含む(１９９７年９月３０日発行の米国特許第５，６７２，３４７号, Lorenz等J. Immunol.156(4):1646-1653(1996), and Dhainaut等Crit.Care Med.23(9):1461-1469 (1995)を参照)；抗組織因子(ＴＦ)抗体 (１９９４年１１月９日特許付与のＥＰ０４２０９３７Ｂ１)；抗ヒトα４β７インテグリン抗体 (１９９８年２月１９日公開のＷＯ９８／０６２４８)；抗上皮増殖因子受容体(ＥＧＦＲ)抗体 (例えば、キメラ又はヒト化２２５抗体、１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０２１０)；抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３(１９８５年５月７日発行の米国特許第４，５１５，８９３号)；抗ＣＤ２５又は抗Ｔａｃ抗体、例えばＣＨＩ−６２１(ＳＩＭＵＬＥＣＴ(登録商標)及びＺＥＮＡＰＡＸ(登録商標)(１９９７年１２月２日発行の米国特許第５，６９３，７６２号を参照)；抗ＣＤ５２抗体、例えばＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(Riechmann等Nature 332:323-337 (1988))；抗Ｆｃ受容体抗体、例えばＦｃｙ ＲＩに対するＭ２２抗体、Graziano等J. Immunol.155(10):4996-5002 (1995)；抗癌胎児抗原(ＣＥＡ)抗体、例えばｈＭＮ-１ ４(Sharkey等Cancer Res.55(23Suppl):5935s-5945s (1995)；乳房上皮細胞に対する抗体、ｈ��ＢｒＥ-３、ｈｕ-Ｍｃ ３及びＣＨＬ６を含む(Ceriani等Cancer Res.55(23):5852s-5856s (1995); and Richman等Cancer Res.55(23 Supp):5916s-5920s (1995))；結腸がん細胞に結合する抗体、例えばＣ２４２(Litton等Eur J Immunol.26(1):1-9 (1996))；抗ＣＤ３８抗体、例えばＡＴ １３／５(Ellis等J. Immunol.155(2):925-937 (1995))；抗ＣＤ３３抗体、例えばＨｕ Ｍ１９５(Jurcic等Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)及びＣＭＡ-６７６又はＣＤＰ７７１；抗ＣＤ２２抗体、例えばＬＬ２又はＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ(Juweid等Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995))；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば１７-１Ａ(ＰＡＮＯＲＥＸ(登録商標))；抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、例えばアブシキシマブ又はｃ７Ｅ３ Ｆａｂ(ＲＥＯＰＲＯ(登録商標))；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ-４９３(ＳＹＮＡＧＩＳ(登録商標))；抗ＣＭＶ抗体、例えばＰＲＯＴＯＶＩＲ(登録商標)；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば抗Ｈｅｐ Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ(登録商標)；抗ＣＡ １２５抗体、例えばＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗αｖβ３抗体、ＶＩＴＡＸＩＮ(登録商標)を含む；抗ヒト腎細胞がん抗体、例えばｃｈ-Ｇ２５０；ＩＮＧ-１；抗ヒト１７-１Ａ抗体(３６２２Ｗ９４)；抗ヒト直腸結腸腫瘍抗体(Ａ３３)；ＧＤ３ガングリオシドに対する抗ヒトメラノーマ抗体Ｒ２４；抗ヒト扁平上皮がん(ＳＦ−２５)；及び抗ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)抗体、例えばＳｍａｒｔ ＩＤ１０及び抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ(Ｌｙｍ-１)を含む。
【０１１３】
上記に具体的に記載した抗体の他に、技術者は、興味の抗原に対する抗体を、例えば下に記載される技術を使用して生成できる。
【０１１４】
(ｉ)抗原の選択及び調製
ここでの抗体は、興味ある抗原に対して指図される。好ましくは、抗原は、生物学上重要なポリペプチドであり、哺乳動物の治療の利益に帰着することができる疾病や疾患に苦しむ哺乳動物の抗体の管理者である。しかしながら、非ポリペプチド抗原(腫瘍関連糖脂質抗原のような；米国特許５，０９１，１７８参照)に対して方向性をもった抗体も熟考される。抗原がポリペプチドである場合、それは成長因子のような膜貫通型分子(例えば受容体)、あるいは配位子かもしれない。典型的な抗原は、下のセクション(ｉｉｉ)に記述されたタンパク質を含んでいる。本発明によって包含された抗体への典型的な分子ターゲットは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２及びＣＤ３４のようなＣＤタンパク質；ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３あるいはＨＥＲ４受容体のようなＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー；ＬＦＡ-１のような細胞付着分子、Ｍａｃ１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそこにαかβいずれかのサブユニット(例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８あるいは抗ＣＤ１１ｂ抗体)を含むαｖ／β３インテグリン；ＶＥＧＦのような成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満(ＯＢ)受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ，あるいはここに言及された以外の抗原のいずれか、を含む。
【０１１５】
他の分子に任意に結合した、可溶の抗原あるいはそれの破片は、抗体の生成のための免疫原として用いることができる。受容体のような膜貫通型分子については、これらの断片(例えば、受容体の分子外ドメイン)は免疫原として用いることができる。代替的に、膜貫通型分子を発現する細胞は免疫原として用いることができる。そのような細胞は、天然の出所(例えば癌細胞ライン)に由来することができるか、あるいは膜貫通型分子を発現するための組換え技術によって変異された細胞かもしれない。
【０１１６】
抗体を準備するのに役立つ他の抗原及びその形式は、技術的に明らかであろう。
【０１１７】
(ｉｉ)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートさせることが有用である。
【０１１８】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０の抗原又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。数日ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために適切に使用される。
【０１１９】
(ｉｉｉ)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
【０１２０】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫してもよい。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986))。
【０１２１】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培養培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１２２】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１２３】
ハイブリドーマ細胞が生育している培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
【０１２４】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal antibodies：Principles and Practice, pp.59-103(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培養培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１２５】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような従来からの免疫グロブリン精製法により、培養培地、腹水、又は血清から好適に分離される。好ましくは、ここに記載されているｐＨ勾配を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー手順が使用される。
【０１２６】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、従来からの手段を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源である。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成をなすことができる。
【０１２７】
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
【０１２８】
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１２９】
モノクローナル抗体はMcCaffertyらにより Nature, 348:552-554 (1990) に記載された技術を使用して生成された抗体ファージ・ライブラリから分離することができる。Clacksonら，Nature, 352:624-628 (1991)及びMarksら，J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991)には、それぞれファージ・ライブラリを使用して、ネズミ科の抗体とヒトの抗体の分離について記述している。後者の文献は、非常に大きなファージ・ライブラリ(Waterhouse ら， Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993))を構築するための戦略として組み合わせ伝染及び体内での組換えと同様にチェーン・シャッフリング(chain shuffling ：Marksら，Bio/Technology, 10:779-783 (1992))による高アフィニティー(nM範囲)のヒト抗体の産生について記載がある。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体分離用の従来のハイブリドーマ技術への、実行可能な代案である。
【０１３０】
(ｉｖ)ヒト化及びヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術に記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には供給源が非ヒトである一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、ヒト抗体の該当する配列を齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列で置換することによりWinterと共同研究者の方法(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536(1988))に本質的に従って実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３１】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用してよい(Carter等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:4285 (1992); Presta等, J. Immnol., 151:2623 (1993))。
【０１３２】
さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１３３】
あるいは、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(JＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993); Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993); and Duchosal等Nature 355:258 (1992).Human antibodies can also be derived from phage-display libraries (Hoogenboom等, J. Mol.Biol., 227:381 (1991); Marks等, J. Mol.Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan等Nature Biotech 14:309 (1996))を参照のこと。
【０１３４】
(ｖ)抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)も単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。
【０１３５】
(ｖｉ)多重特異性抗体
多重特異性抗体は少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。このような分子は通常２つの抗原にのみ結合するが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、更なる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体が、ここで使用される場合この発現に包含される。
【０１３６】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開93/08829号及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１３７】
Ｗ０９６／２７０１１に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１３８】
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された(ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、及びＥＰ０３０８９)。ヘテロコンジュゲート抗体は、あらゆる簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１３９】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science,229:81 (1985) は無傷な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１４０】
最近の進歩は、二重特異性抗体を形成するために化学的に連結することができる大腸菌(E. coli)からのFab'-SH断片の直接の回収を容易化している。Shalabyら，J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) は、完全ヒト化二重特異性抗体F(ab')2分子の産生について記載している。Fab’断片は、大腸菌から別々に分泌され、二重特異性抗体を形成するために生体外で配向された化学的な結合にさらされた。このように形成された二重特異性抗体は、ヒトの乳房腫瘍ターゲットに対するヒトの細胞傷害性リンパ球の細胞溶解作用を引き起こすことができたと同様に、ErbB2受容体や正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞へ結合することができた。
【０１４１】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。代替的に、抗体は、Zapataら，Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)の中に記載されるような「線形の抗体」であってもよい。簡潔にいうと、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成する一対のタンデム型Fd配列(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ及びＶＬ)を含む。線形抗体は二重特異性又は単一特異的になりえる。及び
【０１４２】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１４３】
イムノアドヘシン
最も単純で最も簡単であるイムノアドヘシン設計では、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域とＦｃ領域を持つ付着因子(例えば、受容体の細胞外ドメイン(ECD))の結合ドメインを組み合わせる。通常、本発明の免疫付着因子を準備する時、付着因子の結合ドメインをコードする核酸は、免疫グロブリン定数ドメイン配列のN-末端をコードする核酸にC-末端的に融合されるであろう。しかしながら、さらにN-末端融合は可能である。
【０１４４】
典型的には、そのようなコードされたキメラポリペプチドの融合では、免疫グロブリン重鎖の定常領域の、少なくとも機能的に活性なヒンジ・ドメイン、CH2ドメイン及びCH3ドメインを保持するであろう。融合も、定常ドメインのFc部分のC-末端へ、あるいは重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域へのN-末端へ、すぐにつくられる。融合が作られる正確な部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌あるいは結合特性を最適化するために選択されるであろう。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、付着因子配列が、免疫グロブリンG1(IgG1)のＦｃ領域のN-末端へ融合される。付着因子配列へ重鎖定数領域全体を融合させることは可能である。しかしながら、好ましくは、IgG Fcを化学的(つまり、残渣216：重鎖定常ドメインの第一の残渣が114である)に明らかにするパパイン分裂部位のちょうど上流にあるヒンジ領域で始まる配列、あるいは他の免疫グロブリンのアナログの部位に、融合の中で用いられる。幾つかの実施形態では、付着因子アミノ酸配列は(ａ)ヒンジ領域及び又はCH2及びCH3、又は(ｂ)IgG重鎖のCH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメイン、へ融合する。
【０１４６】
二重特異性イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは、マルチマー類(multimers)として、及び特にヘテロダイマー類(heterodimers)又はヘテロテトラマー類(heterotetramers)として組み立てられる。一般に、これらの組み立てられた免疫グロブリンは、ユニット構造として知られている。基本的な四本鎖構造のユニットは、IgG、IgD及びIgEが存在する形状である。4つのチェーン・ユニットはより高分子量免疫グロブリンの中で繰り返される；IgMは一般的には、ジスルフィド結合により一緒に置かれた4つの基本単位のペンタマー(五量体：pentamer)として一般に存在する。IgAグロブリン、そして時々IgGグロブリン、さらに血清中の多重結合の形状で存在してもよい。マルチマーの場合には、四つのユニットの各々が同じであっても、異なっていてもよい。
【０１４７】
範囲内の様々な典型的に組み立てられたイムノアドヘシンは、以下に概略的に示される：
(a) ACL - ACL；
(b) ACH - (ACH, ACL - ACH, ACL - VHCH, 又はVLCL - ACH)；
(c) ACL - ACH - (ACL - ACH, ACL - VHCH, VLCL - ACH, 又はVLCL - VHCH) 
(d) ACL - VHCH - (ACH, 又はACL - VHCH, 又はVLCL - ACH)；
(e) VLCL - ACH - (ACL - VHCH, 又は VLCL - ACH)； そして
(f) (A-Y)n - (VLCL-VHCH)2,
そこで各Ａは同一か異なる付着因子アミノ酸配列を表わす；
VLは免疫グロブリン軽鎖変数ドメインであり；
VHは免疫グロブリン重鎖変数ドメインであり；
CLは免疫グロブリン軽鎖定数ドメインであり；
CHは免疫グロブリン重鎖定数ドメインであり；
nは1を越える整数であり；
Yは、共有結合の架橋剤の残渣と定める。
手短に述べると、先の構造は重要な特徴のみを単に示す。すなわち、それらは連結する(J)あるいは免疫グロブリンの他のドメインを示さず、また、ジスルフィド結合も示さない。しかしながら、そのようなドメインが結合活性を必要とする場合、それらは、それらが免疫グロブリン分子の中で占める、通常の位置の中に存在するように構築されるものとする。
【０１４８】
代替的に、付着因子配列は、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖配列の間に挿入することができる。ここでの実施形態では、付着因子配列が、ヒンジとCH2ドメインの間あるいはCH2とCH3のドメイン間のいずれかの、免疫グロブリンの各腕の中の免疫グロブリン重鎖の3'端まで融合される。似た構造については、Hoogenboomら，Mol. Immunol. 28:1027-1037 (1991)によって報告された。
【０１４９】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明の免疫付着因子の中で要求されないが、免疫グロブリン軽鎖は付着因子-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドへ共有結合的に連結されるか、あるいは付着因子に直接融合されるかもしれない。前者の場合では、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは、典型的に付着因子-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAで同時発現される。分泌に際して、ハイブリッド重鎖及び軽鎖は、二つのジスルフィド連結された免疫グロブリン重鎖-軽鎖ペアを含む免疫グロブリン状の構造を提供するために共有結合的に連結させられるだろう。そのような構造の準備にふさわしい方法は、例えば、米国特許4,816,567(1989年3月28日公開)に公開された。
【０１５０】
イムノアドヘシンは、免疫グロブリンcDNA配列への付着因子部分をコードする配列をインフレーム(in-frame)で融合することによって、最も便利に構築される。しかしながら、遺伝子的免疫グロブリン断片への融合にも用いることができる(例えば、Aruffoら，Cell 61:1303-1313 (1990)；及び Stamenkovicら，Cell 66:1133-1144 (1991)を参照)。後者のタイプの融合は、発現のためのIg調節塩基配列の存在を要求する。IgG重鎖定常領域にコードされたcDNAは、ハイブリッド化あるいはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により、脾臓又は末梢血リンパ球に由来したｃＤＮＡライブラリから公表された配列に基づいて分離することができる。「付着因子」及びイムノアドヘシンの免疫グロブリン部分をコードするcDNAは、選ばれた宿主細胞中の効率的な発現を命令するプラスミド・ベクトルに縦並びに挿入される。
【０１５１】
ポリペプチドの発現
ここに記載されている方法を使用して生成されるポリペプチド(例えば抗体)は一般的に組換え技術を使用して生成される。
【０１５２】
ここで、ベクターにｓｉＲＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的に適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大量菌類、特に大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリ・スブチリス(B. subtilis)及びバシリ・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は説明のためであり、限定するものではない。
【０１５３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母のような真核微生物は、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は通常のパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、他の多くの属、種及び菌株、例えばシゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)；クルベロミセス・ホスツ(Kluveromyces hosts)、例えばケーラクチス(K. lactis)、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906)、ケーテルモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許出願公開第４０２２２６号)；ピッチャ・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許出願公開第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)(欧州特許出願公開第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(occidentalis)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)、及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌及びクロコウジカビも、ここでは一般的に入手可能で有用である。
【０１５４】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な培養細胞は多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルスの菌株及び変異体、宿主、例えばヨトウガ(イモムシ)、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウショウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコからの対応する許容的昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ-１変異体、及びカイコＮＰＶのＢｍ-５株も公に入手可能であり、このようなウイルスは、本発明では、特にヨウトガ細胞の形質移入用のウイルスとして使用されてよい。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養体も、宿主として利用可能である。
【０１５５】
しかしながら、脊椎動物細胞にも大きな興味があり、培養(組織培養)における脊椎動物細胞の増殖は、常套的な手順でなされる。有用な哺乳動物細胞株の例には、限定されるものではないが、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651)；ヒト胚腎臓細胞(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ベビーハムスター腎臓細胞(BHK, ATCC CCL 1０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL70)；アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587)；ヒト子宮頸癌細胞(HELA, ATCC CCL 2)；イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC CCL 34)；バッファロラット肝臓細胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)；ヒト肺細胞(W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍(MMT 060562, ATTC CCL51)；ＴＲＩ細胞(Matherら, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫(Hep G2)が含まれる。
【０１５６】
宿主細胞は、ポリペプチド生成用の上述した発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された従来からの栄養培地で培養される。
【０１５７】
この発明の方法において使用されるポリペプチドの生成に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養されてよい。商業的に入手可能な培地、例えばハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ)、Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM), (Sigma), or GIBCOR Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (Invitrogen)が、宿主細胞の培養に適している。さらに、 Hamら, Meth. Enz. 58:44(1979)、Barnesら, Anal. Biochem.102:255(1980)、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国特許第Ｒｅ．３０９８５号に記載されている任意の培地も、宿主細胞用の培養培地として使用されてよい。他の規定又は合成増殖培地も使用され得、特定の型の宿主細胞の増殖に適切な培地は、分子及び細胞生物学の分野の技術者に知られている。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えばＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ、ハイグロマイシン)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１５８】
標準的な細胞培養条件が、細胞を培養するために使用できる。細胞は、適切な温度、ガス混合物、及びｐＨ（例えば約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９の間のｐＨ）で増殖され維持される。幾つかの実施態様では、細胞は最初の４８時間、適切な細胞培地において３７℃で増殖され、次の１２日間３３℃にシフトされる。反応は、宿主細胞の必要に基づき、好気又は嫌気条件下で実施されうる。幾つかの実施態様では、細胞は、限定するものではないが、回分、流加又は連続的プロセスを含む任意の既知の方法を使用して増殖される。
【０１５９】
組換え技術を使用する場合、ポリペプチドは細胞膜周辺腔で細胞内で産生されるか、あるいは直接培地へ分泌されるかである。最初の段階として、ポリペプチドが、微粒子状破片、宿主細胞あるいは溶解された断片(例えば、ホモジナイズの結果)のいずれかから細胞内で産生されるなら、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。ポリペプチドが培地へ分泌される場合には、このような発現系からの上清は、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して一般的に濃縮されうる。
【０１６０】
キット
本発明はまた、組成物、及び発明の方法の説明を含んでなる使用の指示を含んでなるキットを提供する。キットは、培養細胞、ｓｉＲＮＡ、標的配列、トランスフェクト剤、本発明の方法の指示、又はその何れかの組合せを含みうる。
【０１６１】
以下の実施例は説明のために提供され、発明を限定するものではない。
【０１６２】
実施例
ここに記載されている実施例及び実施態様は、説明のみを目的とし、それらの考慮の下、様々な修飾又は変更が当業者に示唆され、この出願の精神及び範囲内に含まれる。
【０１６３】
実施例１：ＰＤＨＫ１、ＰＤＨＫ２、ＰＤＨＫ３、及びＬＤＨａのノックダウンは、乳酸生産を低減させ、抗体力価／生産性を増加させる
材料及び方法
ＬＤＨａ／ＰＤＨＫ１、２、３を標的にするベクターの構築
【０１６４】
ＬＤＨａの標的配列は、Kim及びLee等, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-159 (2007)によって過去に記載されるように選択され、ＬＤＨａのｓｉＲＮＡ配列はＣＴＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＡＴＣＴＧＡＴ(配列番号：１)である。ＰＤＨＫのｓｉＲＮＡ標的配列を設計するために、ＣＨＯ ＰＤＨＫ１、２、及び３の部分ｃＤＮＡ配列を、ＰＤＨＫの高度に保存された領域内に位置するプライマーを用い、逆転写のポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)によってクローン化した。部分的にクローン化された配列を、Elbashier等 (Methods 26:199-213 (2002))に記載される方法に従ってｓｉＲＮＡ配列設計のために使用した。 
【０１６５】
ＰＤＨＫ１標的(ｓｉＲＮＡ)配列:GCAGTTCCTGGACTTCGGA (配列番号：２)
ＰＤＨＫ２標的(ｓｉＲＮＡ)配列:CATTCAGTACTTCTTGGAC (配列番号：３)
ＰＤＨＫ３標的(ｓｉＲＮＡ)配列:TGTAGCTGATGTCGTGAAA (配列番号：４)
【０１６６】
ＬＤＨａ及びＰＤＨＫの標的配列を有する単一コンストラクトを、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１-Ｈ１ハイグロベクター(Cat#. AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)を使用して構築した。ＬＤＨａのｓｉＲＮＡを、その５’末端への、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．１からのＵ６プロモーターの付加により、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１のＫａｓＩ部位に挿入した。ＰＤＨＫ１及び２のｓｉＲＮＡのＳｉＲＮＡ配列を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にそれぞれ挿入した。ＢｇＩＩＩ部位を、ＰＤＨＫ２のｓｉＲＮＡの３’側に導入し、ＰＤＨＫ３のｓｉＲＮＡの挿入のために使用した。ネガティブコントロールとして、スクランブルｓｉＲＮＡ配列を有するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ３．１ベクターを使用した。
【０１６７】
細胞培養
ジヒドロ葉酸還元酵素を欠くＣＨＯ細胞を、３７ｏＣ及び５％ＣＯ２で、振とうフラスコにおいて、専有のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベース培地において培養した。細胞を３又は４日毎に継代した。
【０１６８】
安定性ｓｉＲＮＡ細胞株(ｓｉＲＮＡクローン)開発
２５ｎＭのメトトレキサート(ＭＴＸ)に耐性であり、組換えモノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞株を、製造者の推奨(Invitrogen, Carlsbad, CA)に従い、Lipofectamine 2000 CD (Cat#12566-014, Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用してトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を遠心分離し、２５ｎＭのＭＴＸ及び４００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン(Cat # 10687010, Invitrogen, Carlsbad, CA)を含有するＤＭＥＭ／Ｆ-１２ベース選択(グリシン-、ヒポキサンチン-及びチミジン-を含まない)培地に播種した。再懸濁細胞を９６-ウェルプレートにプレーティングし、個々のクローンを生成させた。ＳｉＲＮＡクローンは、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫの標的配列を有するｓｉＲＮＡプラスミドトランスフェクションに由来し、ｍｏｃｋクローンは、既知の遺伝子に大きな相同性を持たない、製造者によって設計されたスクランブル配列を有するｍｏｃｋプラスミド (Cat# AM5766, Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)トランスフェクションに由来した。
【０１６９】
定量的リアルタイムＰＣＲ(ｑＲＴ-ＰＣＲ又はＴａｑｍａｎ)分析
個々のクローンからの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ９６キット(Cat#74181, Qiagen)を使用して単離し、ＤＮａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ(Cat#79254, RNase free DNase set, Qiagen)で処理し、単離されたＲＮＡサンプル中におそらく存在する残留ＤＮＡを除去した。Ｔａｑｍａｎを製造者の指示に従い(Cat# 4309169, Applied Biosystems)、universal qRT-PCR master mixを使用して実施し、ＰＤＨＫ及びＬＤＨの発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子-ミクログロブリンに正規化した。
【０１７０】
Ｔａｑｍａｎ分析に使用したプライマー及びプローブ配列を次の通りである：
ＰＤＨＫ１順方向プライマー:GCCCATCTCATCGAAAACA (配列番号：5)
ＰＤＨＫ１逆方向プライマー:AGCCATCTTTAATGACTTCGACTAC (配列番号：６)
ＰＤＨＫ１プローブ:TCGCAGTTTGGATTTATGCTTCCAATG (配列番号：７)
ＰＤＨＫ２順方向プライマー:GATCTGTCCATCAAAATGAGTGA (配列番号：８)
ＰＤＨＫ２逆方向プライマー:TGTGGAGTACATGTAGCTGAAGAG (配列番号：９)
ＰＤＨＫ２プローブ:CTCTCAATCTTCCTCAAGGGGACACC (配列番号：１０)
ＰＤＨＫ３順方向プライマー:CAGCCTGGAGCCTACAAGA (配列番号：１１)
ＰＤＨＫ３逆方向プライマー:GGCATACAGTCGAGAAATTGG (配列番号：１２)
ＰＤＨＫ３プローブ:AAGCCATAACCAAATCCAGCCAAGG (配列番号：１３)
ＬＤＨａ順方向プライマー:GCCGAGAGCATAATGAAGAA (配列番号：１４)
ＬＤＨａ逆方向プライマー:CCATAGAGACCCTTAATCATGGTA (配列番号：１５)
ＬＤＨａプローブ:CTTAGGCGGGTGCATCCCATTT (配列番号：１６)
β-ミクログロブリン順方向プライマー:TCCTCTCAGTGGTCT GCT TGG(配列番号：１７)
β-ミクログロブリン逆方向プライマー:TGGCGTGTGTAGACTTGCACTT(配列番号：１８)
β-ミクログロブリンプローブ:TGCCATCCAGCGTCCCCCA (配列番号：１９)
【０１７１】
Ｆｅｄ-ｂａｔｃｈ振とうフラスコクローン評価
１２のｓｉＲＮＡクローン及び１２のｍｏｃｋクローンを、３日目に与えられる一ボーラス、及び２日目の３７℃から３３℃への温度シフト有する１４日流加培養プロセスを用い、ｐＨ７．１５の専有生産培地に播種した。細胞生存率及び生細胞数を、Vicell (Beckman Coulter)を使用して、トリパンブルー色素排除によりモニタした。乳酸濃度を、Nova Bioprofile分析計(Nova biomedical)を使用して、３、７、１０及び１４日目に測定した。平均細胞比乳酸生産速度、ｑＳを統合全細胞数のグラフの傾きとして算出し、生産される累積乳酸、［Ｓｔ−Ｓｏ］は、乳酸質量平衡等式に基づき、全培養体積に対して定式化した：
0006050226.tif 000002
ここで、Ｓｔは時間ｔでの培養体積（ｍｇ）における乳酸の全量であり、Ｓ０はｔ＝０での培養体積（ｍｇ）における乳酸の全量であり、Ｘは任意の時間ｔでの培養体積における細胞の全数であり、ｑＳはｍｇ／細胞／日における比乳酸生産速度である。上式はｔ＝０及びｔ＝ｔ間の時間間隔について記述されているため、ｑＳはこの時間間隔にわたる平均乳酸生産速度である。この作業において使用される慣習により、細胞に消費されるより多くの乳酸が生産されると、ｑＳの値は正である。
【０１７２】
バイオリアクター流加操作
バイオリアクター実験を、１．５Ｌの作動体積で操作される２Ｌの攪拌層バイオリアクター(Applikon, Foster City, CA)において実施した。播種後７２時間での濃縮栄養分の供給の後、１４日の流加の間、グルコースを必要に応じて加えた。溶存酸素及び攪拌を、それぞれ空気飽和の３０％及び２７５ｒｐｍの設定値に、バイオリアクター培養物中において維持した。培養ｐＨをＣＯ２ガス又は１ＭのＮａ２ＣＯ３の添加により７．０に制御した。培養温度を、最初の４８時間、３７℃に維持し、その後、３３℃にシフトさせた。各バイオリアクターにおけるプロセスコントロールを、B. Braun Biotech (Allentown, PA)からのDigital Control Unitを使用して得た。
【０１７３】
サンプル分析
抗体力価を、ＵＶ検出により、一般的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して決定した。Fahrner等, Biotechnol.Appl.Biochem.30:121-128 (1999)を参照。培養サンプルを、Ｖｉ-Ｃｅｌｌ ＡＳセルカウンター(Beckman Coulter, Fullerton, CA)により生細胞濃度及び生存率について、Bioprofile 400バイオアナライザー(Nova Biomedical, Waltham, MA)によりｐＨ及び乳酸について、multi-sample osmometer(Advanced Instruments, Norwood, MA)によりオスモル濃度について分析した。
【０１７４】
統計分析
両側スチューデントのｔ検定を、ＪＭＰソフトウェアを使用して実施した。
【０１７５】
結果
ＰＤＨＫ及びＬＤＨａを標的にするｓｉＲＮＡベクターの構築
哺乳類細胞では、Harris等 (Adv. Enzyme Regul. 42:249-59 (2002)に報告されている４つのＰＤＨＫ遺伝子がある。全ての４つのＰＤＨＫ遺伝子がＣＨＯ細胞に存在するか評価するために、４組のＲＴ-ＰＣＲプライマーを、ヒト及びマウスＰＤＨＫ配列間の保存領域に基づいて設計した。ＰＣＲの結果は、全ての４つのＰＤＨＫ ｍＲＮＡがＣＨＯ細胞において検出できることを示したが、ＰＤＨＫ４のｍＲＮＡレベルは最小限であり、ＤＨＦＲ欠如(ジヒドロ葉酸還元酵素欠如)ＣＨＯ細胞における他の３つのＰＤＨＫよりずっと低かった。このように、ＰＤＨＫ１、２、及び３遺伝子の発現のみが、ＬＤＨａ遺伝子によりノックダウンされた。ＬＤＨａ及び各ＰＤＨＫについて、３つのｓｉＲＮＡ配列を設計し、ＣＨＯ細胞において試験し、標的遺伝子のベストの下方制御を呈するｓｉＲＮＡ配列を選択した。ＬＤＨａについてのベストなｓｉＲＮＡ配列を、Kim and Lee. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)による発見に基づいて選択した。ＬＤＨａ及びＰＤＨＫのためのｓｉＲＮＡ配列を、単一ベクターにおいて構築し、ここで、ＬＤＨａのためのｓｉＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下であり、各ＰＤＨＫのｓｉＲＮＡは、Ｈ１プロモーターにより駆動された(図１)。
【０１７６】
ＰＤＨＫ１、２、３、及びＬＤＨａの低減発現を有する安定化クローンの生成
ＰＤＨＫ及びＬＤＨａを標的にするｓｉＲＮＡコンストラクトを、モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、ｓｉＲＮＡクローンと呼ばれる個々のクローンを得た。個々のｓｉＲＮＡクローンを、４つの遺伝子、ＰＤＨＫ１、２、３及びＬＤＨａのｍＲＮＡ発現について、Ｔａｑｍａｎ分析を使用してアッセイした。上記４つの遺伝子の最も低減された発現を呈する１２のｓｉＲＮＡクローンを、更なる分析のために同定した(図２)。スクランブル配列を有するｍｏｃｋベクターをまた、同じ抗体発現ベクターにトランスフェクトし、ｍｏｃｋクローンと呼ばれる個々のクローンを得た。１２のｍｏｃｋクローンをコントロールとしてランダムに選び、それらのＬＤＨａ及びＰＤＨＫ１、２、及び３遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをまた、Ｔａｑｍａｎにより分析した。平均で、選択した１２のｓｉＲＮＡクローンにおけるＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、２、クローン３のｍＲＮＡ発現レベルは、ｍｏｃｋクローンと比較して９０％、３２％、８３％、及び７０％それぞれ低減された(図２)。
【０１７７】
ｓｉＲＮＡ及びＭｏｃｋクローンの流加振とうフラスコ評価
(ａ)ｓｉＲＮＡクローンにおいて観察される培養培地における低下乳酸レベル及び高ｐＨ
乳酸生産に対する、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫのｓｉＲＮＡ媒介下方制御の効果を評価するために、１２のｓｉＲＮＡ及び１２のｍｏｃｋクローンを、１４日、流加、及び温度シフトプロセスを使用し、我々の専有培地において、振とうフラスコ容器において評価した。実験は３回繰り返し、類似な結果が観察された。１セットの実験からの結果を、図に代表として示す。結果は、ｍｏｃｋクローンと比較して、ｓｉＲＮＡクローンが一般的に低減された乳酸レベルを有することを示した(図３)。１４日目までに、ｓｉＲＮＡクローンは、ｍｏｃｋクローンより平均で９１％少ない乳酸を示した(ｐ＜０．０００１)(図３Ａ)。１４日の生産期間にわたるｓｉＲＮＡクローンにおける低乳酸レベルと一致して、ｓｉＲＮＡクローンの平均乳酸生産速度はネガティブ０．０２ｍｇ／１０６細胞／日であり、乳酸合成速度が消費速度より低いことを示唆する。対照的に、平均乳酸生産速度はｍｏｃｋクローンでは０．０１ｍｇ／１０６細胞／日であり、全体の乳酸合成速度が消費速度より高いことを示す。ｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋクローン間の乳酸生産速度におけるこの差は、統計的に有意である(ｐ＜０．００２)(図３Ｂ)。培地における乳酸レベルはｐＨにするため、１４日目までに、ｍｏｃｋクローンの平均ｐＨは６．５４に落ちたが、ｓｉＲＮＡクローンの平均ｐＨは７．０４だった(図３Ｃ)。観察された低平均ｐＨは、ｍｏｃｋクローンの高平均乳酸レベルと一致する。
【０１７８】
ｂ)ｓｉＲＮＡクローンにおいて観察される増加された抗体力価及び比生産性(Ｑｐ)
ＰＤＨＫ及びＬＤＨａのノックダウン遺伝子発現が抗体生産に影響するか調査するために、サンプルを３、７、１０及び１４日目の流加振とうフラスコ実験から収集し、プロテインＡクロマトグラフィーによって抗体力価を測定した。データは、平均で、ｓｉＲＮＡクローンがｍｏｃｋクローンより６８％多い抗体を生産し(図４Ａ，ｐ＜０．０２２)、ｓｉＲＮＡクローンについてｐｇ／細胞-日において測定された平均の細胞-比生産性(Ｑｐ)は、ｍｏｃｋクローンより７５％高い(図４Ｂ，ｐ＜０．００６)ことを示した。細胞増殖を評価するために、振とうフラスコサンプルを３、７、１０、及び１４日目に収集し、生細胞数及び生存率を測定し、統合生細胞数(ＩＶＣＣ)を算出した。抗体力価及びＱｐと対照的に、大きな細胞増殖差異は、２つのグループ間に観察されなかった(図４Ｃ)。グリカンプロファイル、荷電変異体及び凝集のパーセンテージを含む抗体産物の質特性は、ｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋクローン間で同等だった。
【０１７９】
ｓｉＲＮＡ Ｍｏｃｋクローンのバイオリアクター流加培養評価
ｐＨコントロールされた流加バイオリアクター培養は大規模製造に対する標準的な縮小モデルであるため、２Ｌバイオリアクターにおいて幾つかのｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋクローンの性能を更に調査した。バイオリアクターアベイラビリティ及び実験の複雑性における制限により、二つ組における１２のｓｉＲＮＡ及び１２ｍｏｃｋクローンは実行不可能性によりランしなかった。選択バイアスを最小化するために、代謝プロファイルが各グループの平均性能を最も良く表す２つの代表的なｓｉＲＮＡクローン及び２つの代表的なｍｏｃｋクローンを、ｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋプラスミドトランスフェクションに使用されている親株と共に、バイオリアクター評価のために選択した。細胞培養物サンプルを、乳酸、グルコース、オスモル濃度、及び力価分析のために毎日(６及び１３日目を除く)収集した。ｓｉＲＮＡクローンの乳酸レベルは一般的に横ばいであったが、ｍｏｃｋ及び親クローンの乳酸レベルは１４日の生産期間の間増加し続けた。１４日目に、２つのｓｉＲＮＡクローンは、ｍｏｃｋクローン又は親クローンより、培地において平均で８６％低い乳酸レベルを有し(図５Ａ)、ｍｏｃｋクローン及び親株より低い比乳酸生産を有した(図５Ｂ)。同様に、ｓｉＲＮＡクローンのオスモル濃度は約３００ｍＯｓｍを維持したが、ｍｏｃｋクローン又は親クローンのオスモル濃度は１４日の生産期間の間増加し続けた。１４日目に、２つのｓｉＲＮＡクローンの平均オスモル濃度は、ｍｏｃｋ及び親クローンのオスモル濃度より６０％低かった(図５Ｃ)。重要なことには、１４日目に、ｓｉＲＮＡクローンはｍｏｃｋクローンより平均で１２５％多い抗体を生産した(図６)。流加振とうフラスコ評価に観察されるように、ｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋクローンは、２Ｌバイオリアクターにおいて同等な生存率及び細胞増殖を有する。
【０１８０】
考察
過去の研究は、ＬＤＨａ遺伝子発現単独の下方制御が乳酸生産を低減できることを示した。Kim and Lee, Appl. Microbiol. Biotechnol. 74(1):152-9 (2007)。しかしながら、彼らの研究では、乳酸レベルにおける４５−７９％の低減にも関わらず、Ｑｐ及び産物力価における有意な改善は無く、ＣＨＯ細胞におけるＬＤＨａ単独のノックダウンは、Ｑｐ及び産物収率を効果的に改善するには十分でないことを示唆する。更に、ＣＨＯ細胞におけるＰＤＨＫ１、２、及び３の同時下方制御は、乳酸レベルの低減にも、抗体生産性の増加にも十分ではなかった。細胞が乳酸を生産する唯一の方法はピルビン酸の減少を通してであり、ピルビン酸はＬＤＨによって乳酸に変換されるだけでなく、ＰＤＨによってアセチル-ＣｏＡに変換され酸化のためにＴＣＡサイクルに入るため、ＬＤＨａ発現をノックダウンして乳酸生産を減少させ、ＰＤＨＫをノックダウンしてピルビン酸をＴＣＡサイクルに促進することは相乗効果を与え、乳酸レベルを低減し、細胞により多くのエネルギーとおそらく代謝中間体を与え、増加した抗体生産に導きうる。
【０１８１】
試験された全てのクローンにおいて、ＬＤＨａ、ＰＤＨＫ２、及びＰＤＨＫ３の発現は有意に低減され、ＰＤＨＫ１の発現は中程度に低減された。中程度の低減は試験された３つのＰＤＨＫ１ ｓｉＲＮＡに観察されたため、ＰＤＨＫ１発現における中程度の低減は、非最適ｓｉＲＮＡ標的配列におそらく起因する。各クローンは異なる発現レベルのＬＤＨａ及びＰＤＨＫを有し、ｍｏｃｋ及びｓｉＲＮＡクローンにおける乳酸生産及び抗体生産におけるバリエーションが観察された。しかしながら、１４日目までに、ｓｉＲＮＡグループにおける平均乳酸レベルはｍｏｃｋグループにおけるそれより低く、ｍｏｃｋクローンは、流加振とうフラスコ培養物においてｓｉＲＮＡクローンより低い平均ｐＨとなった。より重要なことには、低比乳酸生産速度に加え、ｓｉＲＮＡクローンの平均力価及びＱｐは、ｍｏｃｋクローンのそれと比較してそれぞれ６８％及び７５％増加され、ｓｉＲＮＡ及びｍｏｃｋクローン間で、細胞増殖及び産物の質に顕著な差異はなかった。興味深いことに、１４日目の力価対１４日目の乳酸レベルについては、ｍｏｃｋクローンの中で力価及び乳酸レベル間で良好な反比例関係があったが、ｓｉＲＮＡクローンの中では異なった。ｍｏｃｋクローンの中での力価及び乳酸レベルにおける観察された差異は、親株が単一クローンに由来しても、抗体生産性及び細胞代謝において不均一であるためであろう。クローンバリエーションを考慮するために、全部で１２のｍｏｃｋクローンを評価した。データは、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫを同時にノックダウンすることは、乳酸レベルを低減させ、ＣＨＯ細胞における抗体生産を改善させることを示す。このように、頑強な、生産的抗体生産プロセスの開発のために、ＬＤＨａ及びＰＤＨＫ双方の同時下方制御は効果的なアプローチを提供する。
【０１８２】
２Ｌバイオリアクターにおける２つのｍｏｃｋ及び２つのｓｉＲＮＡクローンの性能を２つ組みにおいて更に調査した。これらの４つのクローンは、流加振とうフラスコ評価に基づき、各グループにおける平均生産性を最も良く表すように選択した。振とうフラスコ実験からの観察と類似して、ｓｉＲＮＡクローンは、２Ｌバイオリアクター評価において、ｍｏｃｋクローンより低い乳酸レベル及び高い力価を有した。ｐＨが流加の２Ｌバイオリアクターにおいてコントロールされる場合、ｍｏｃｋ培養物はｓｉＲＮＡ培養物より増加したオスモル濃度を呈し、これはｍｏｃｋクローンにおける高乳酸レベルが設定値ｐＨを維持するために更なるアルカリの添加を必要としたためである。
【０１８３】
まとめると、流加振とうフラスコ及び２Ｌバイオリアクター評価からのデータは、ＣＨＯ細胞におけるＬＤＨａ、ＰＤＨＫ１、２、及び３の同時ノックダウンが、細胞増殖及び産物の質に影響与えることなく、乳酸レベルの低減及び抗体力価の増加に効果的であることを実証した。
【図１】
0006050226.tif 000003
【図２】
0006050226.tif 000004
【図３Ａ】
0006050226.tif 000005
【図３Ｂ】
0006050226.tif 000006
【図３Ｃ】
0006050226.tif 000007
【図４Ａ】
0006050226.tif 000008
【図４Ｂ】
0006050226.tif 000009
【図４Ｃ】
0006050226.tif 000010
【図５Ａ】
0006050226.tif 000011
【図５Ｂ】
0006050226.tif 000012
【図５Ｃ】
0006050226.tif 000013
【図６】
0006050226.tif 000014
【配列表】
0006050226000001.app