(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定する方法であって、
配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップを含み、
前記大環状ラクトンは、イベルメクチン、セラメクチン、ミルベマイシンオキシムまたはモキシデクチンである、前記方法。
【請求項２】
配列番号１の第１１位に相当する前記部位における遺伝子型ＧＧが、線虫が前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高いことを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫の前記Ｐ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
配列番号１の第６１８位に相当する前記部位における遺伝子型ＧＧが、線虫が前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高いことを示す、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
線虫のＰ糖タンパク質の核酸配列が、その全長にわたり配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有する、または線虫のＰ糖タンパク質の核酸配列が、その全長にわたり配列番号１と同一である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
線虫の遺伝子型が、ＤＮＡシーケンシング、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、マイクロアレイ解析またはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはｑＲＴ−ＰＣＲに基づいたアプローチによって決定される、あるいは線虫の遺伝子型が、オリゴヌクレオチドまたはプライマーを使用することによって決定される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ディロフィラリア属種（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定するために使用される、少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第１１位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）を含む配列番号１の断片からなるプローブ。
【請求項８】
ディロフィラリア属種線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定するために使用される、請求項７に記載のプローブおよび少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第６１８位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）を含む配列番号１の断片からなるプローブの組み合わせ。
【請求項９】
ディロフィラリア・イミティス線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定するためのキットであって、
配列番号１の第１１位に相当するディロフィラリア属種線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドまたはプライマー；または
配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するディロフィラリア属種線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定することができるオリゴヌクレオチドまたはプライマー
を含み、
前記大環状ラクトンは、イベルメクチン、セラメクチン、ミルベマイシンオキシムまたはモキシデクチンである、前記キット。
【請求項１０】
配列番号１の第１１位に相当する前記部位における遺伝子型ＧＧ、または
配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する前記部位における遺伝子型ＧＧ
が、線虫が前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高いことを示す、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ディロフィラリア属種線虫に感染した非ヒト動物を治療するための治療法を選択する、あるいは非ヒト動物がディロフィラリア属種線虫に感染するのを防ぐための予防法を選択する方法であって、
配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップ；および
前記線虫の遺伝子型に基づいて治療法または予防法を選択するステップ
を含む、前記方法。
【請求項１２】
治療法または予防法を選択するステップの前に、配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ディロフィラリア属種線虫がディロフィラリア・イミティスである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択された治療法で非ヒト動物を治療するステップをさらに含み、ここで線虫が、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、あるいは線虫が、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、前記治療法が、ヒ素に基づく療法、ジエチルカルバマジン、抗生物質、またはこれらのうち１種以上の組合せである、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
選択された予防法を非ヒト動物に提供するステップをさらに含み、ここで線虫が、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、あるいは線虫が、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、前記予防法がジエチルカルバマジンである、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込む、２０１０年４月１日に出願の米国仮特許出願第６１／３１９，９８２号の利益および優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、大環状ラクトン耐性のディロフィラリア属種（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｓｐｐ．）の検出に関する。
【背景技術】
【０００３】
ディロフィラリア症は、Ｄ．イミティス（Ｄ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、Ｄ．レペンス（Ｄ．ｒｅｐｅｎｓ）、Ｄ．テヌイス（Ｄ．ｔｅｎｕｉｓ）、Ｄ．ウルシ（Ｄ．ｕｒｓｉ）、Ｄ．サブデルマタ（Ｄ．ｓｕｂｄｅｒｍａｔａ）、Ｄ．ルトラエ（Ｄ．ｌｕｔｒａｅ）、Ｄ．ストリアタ（Ｄ．ｓｔｒｉａｔａ）およびＤスペクタンス（Ｄ  ｓｐｅｃｔａｎｓ）などのディロフィラリアの種による感染から生じ得る、動物の、ときにはヒトにおける、寄生性疾患である。
【０００４】
ディロフィラリア・イミティス（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）（イヌ糸状虫）は、一般に、イヌ、キツネ、オオカミ、コヨーテ、およびネコに感染する、寄生性の線虫である。イヌ糸状虫は、特に活動性の高い動物において、重篤な血管損傷を引き起こす可能性があり、致命的となり得る。
【０００５】
ディロフィラリア・イミティスの生活環は、よく知られている（ＭｃＣａｌｌら、Ａｄｖ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６６：１９３−２８５、２００８に総説されている）。簡単に説明すると、蚊が、感染している宿主（例えば、イヌ）から血液を吸うときに、感染し得る。蚊の中で、ミクロフィラリアは、感染性の幼虫期まで成長する。感染した蚊が摂食するときに、新しい宿主（例えば、別のイヌ）に幼虫を伝染させ得る。新しい宿主内で、幼虫は、８から１０週間成熟し続け、その後、肺の右側および肺動脈に移動して、そこで成虫になる。成虫は交尾して雌が卵を産み、それが子宮内で成長して、血流中に放出される長く薄い胚（ミクロフィラリア）になる。感染した宿主から血液を吸うときに循環しているミクロフィラリアを吸う蚊が、再びこの周期を開始させる。
【０００６】
ディロフィラリア・イミティスは、その媒介動物である蚊が見出される場所であればどこにでも見出され得る。一般に、ディロフィラリア・イミティスは、全世界的に見出され得るが、穏やかで温暖な気候の地域できわめてよく見出される。
【０００７】
大環状ラクトンは、獣医学的用途でディロフィラリア・イミティスを管理する際に治療薬または予防薬として処方されることが多い。しかし、大環状ラクトンに対する耐性は、多様な寄生性線虫において一般によくあることであり、Ｄ．イミティスにおいても生じているようである。糞便卵数減少試験、卵孵化試験、微小寒天幼虫発生試験およびベンゾイミダゾール耐性に基づいた分子的試験を含む、家畜およびウマの線虫における駆虫薬耐性の検出について、いくつかの試験が記載されている（Ｃｏｌｅｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １３６：１６７−１８５、２００６に総説されている）。Ｐｒｉｃｈａｒｄら（欧州特許ＥＰ０９７９２７８）は、寄生性線虫における大環状ラクトン耐性の診断に有用となり得る、ヘモンクス・コントルタス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）におけるＰ糖タンパク質配列を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第０９７９２７８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＭｃＣａｌｌら、Ａｄｖ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．６６：１９３−２８５、２００８
【非特許文献２】Ｃｏｌｅｓら、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １３６：１６７−１８５、２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、大環状ラクトンに耐性であるディロフィラリア・イミティス（イヌ糸状虫）を検出する方法は依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
一態様において、本発明は、ディロフィラリア属種線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定する方法に関し、前記方法は、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップを含む。この方法は、配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫の前記Ｐ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップをさらに含み得る。該線虫が配列番号１の第１１位に相当する部位において遺伝子型ＧＧを有するまたは配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位において遺伝子型ＧＧを有するという決定は、該線虫が前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高いことを示す。
【００１２】
他の一態様において、本発明は、その全長にわたり配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の第１１位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）を含む単離された核酸分子、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第１１位に相当する部位に前記Ｇヌクレオチドを含有する前記核酸分子の断片に関する。単離された核酸分子は、配列番号１の第６１８位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）をさらに含み得、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第６１８位に相当する部位に前記Ｇヌクレオチドを含有する前記核酸分子の断片である。
【００１３】
他の一態様において、本発明は、ディロフィラリア属種線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定するためのキットに関し、該キットは、配列番号１の第１１位に相当するディロフィラリア属種線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における該線虫の遺伝子型を決定することができるプローブ、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するディロフィラリア属種線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における該線虫の遺伝子型を決定することができるプローブを含む。
【００１４】
他の一態様において、本発明は、ディロフィラリア属種線虫に感染した動物を治療するための治療法を選択する方法に関し、この方法は、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップ、および前記線虫の該遺伝子型に基づいて治療法を選択するステップを含む。この方法は、配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップおよび／または選択された治療法で動物を治療するステップをさらに含んでもよく、ここで、該線虫が、配列番号１の第１１位に相当する該線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、または該線虫が、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、該治療法は、ヒ素に基づく療法、ジエチルカルバマジン、抗生物質、またはこれらのうち１種または複数の組合せである。
【００１５】
他の一態様において、本発明は、動物がディロフィラリア属種線虫によって感染するのを防ぐための予防法を選択する方法に関し、この方法は、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップ、および前記線虫の該遺伝子型に基づいて予防法を選択するステップを含む。この方法は、配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップおよび／または選択された予防法を動物に提供するステップをさらに含んでもよく、ここで、該線虫が、配列番号１の第１１位に相当する該線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、または該線虫が、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する該線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、該予防法は、ジエチルカルバマジンである。
【００１６】
さらなる一態様において、本発明は、配列番号１に示されている配列を含有する単離された核酸分子に関する。
【００１７】
本発明の方法は、線虫を含む試料を動物などの対象から得るステップ、試料から線虫を単離するステップ、線虫から核酸を単離するステップ、および線虫の遺伝子型を決定するステップの前に核酸を場合によって精製するステップをさらに含み得る。さらに、線虫の遺伝子型は、ＤＮＡシーケンシング、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、マイクロアレイ解析またはＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはｑＲＴ−ＰＣＲに基づいたアプローチなどの既知の技術を使用して決定され得る。
【００１８】
本発明の他の態様、利点および特徴は、添付の図面と併せて本発明の特定の実施形態についての以下の説明に目を通すことによって当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｐ糖タンパク質の部分的なコード配列を含むヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。ＳＮＰは、太字体で示されている。
【図２】Ｐ糖タンパク質遺伝子の第１１位におけるＳＮＰの遺伝子型頻度（＊＝ｐ値有意）を示すグラフである。
【図３】Ｐ糖タンパク質遺伝子の第１１位および第６１８位における組み合わされたＳＮＰの遺伝子型頻度（＊＝ｐ値有意）を示すグラフである。
【図４】群ＣのＰ糖タンパク質の第１１位および第６１８位における組み合わされたＳＮＰの遺伝子型頻度を示すグラフである。
【図５】ＩＶＭ−ＬＤ９５％に対するＰ糖タンパク質遺伝子型ＧＧ−ＧＧの線形回帰を示すグラフである。
【図６】以下の３遺伝子、β−チューブリン（ｔｕｂ）、熱ショックタンパク質６０（ｈｓｐ）、Ｐ糖タンパク質（ｐｇｐ）内の１０個のＳＮＰについてのＦ−係数、またはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の偏差を示すグラフである。Ｆ＝＋１、１００％ホモ接合型；Ｆ＝−１、１００％ヘテロ接合型。遺伝子の隣の番号は、解析したセグメント内のＳＮＰの部位に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
アベルメクチンおよびミルベマイシンを含むがこれらに限定されない大環状ラクトンは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する土壌微生物の産物、またはそれらの化学誘導体である。これらの分子は、何百もの種の内部寄生虫および外部寄生虫を広範囲にわたる宿主において治療するために広く使用される。商業的使用におけるアベルメクチンとしては、限定されるものではないが、イベルメクチン、アバメクチン、ドラメクチン、エプリノメクチンおよびセラメクチンなどが挙げられる。市販のミルベマイシンとしては、限定されるものではないが、ミルベマイシンオキシムおよびモキシデクチンなどが挙げられる。大環状ラクトンは、低用量レベルで強力な広い抗寄生虫性スペクトルを有する。これらは、多くの未成熟の（体内寄生幼虫（ｈｙｐｏｂｉｏｔｉｃ  ｌａｒｖａｅ）を含む）線虫および節足動物に対して活性がある。単回治療用量は、差し迫った線虫感染に対して有効であるために十分な濃度で治療後長期間持続し得る。
【００２１】
大環状ラクトン（ＭＬ）イヌ糸状虫予防薬は、成長中のＬ３／Ｌ４期を標的とすることによって成虫の感染の確立を防ぐために、まだ感染していないイヌおよびネコの処置用に開発された。大環状ラクトンは、ミクロフィラリア期（Ｌ１）においても効果を有する（Ｂｏｗｍａｎら、１９９２；Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、１９９８；ＭｃＣａｌｌら、１９９８）。イベルメクチン（ＩＶＭ）、ミルベマイシンオキシム（ＭＢＯ）、モキシデクチン（ＭＯＸ）およびセラメクチン（ＳＬＭ）などの大環状ラクトンエンドエクトシドは、伝染シーズンの間にイヌおよびネコにおけるイヌ糸状虫の化学的予防法のために使用される。しかし、近年、何名かの専門家は、大環状ラクトンが、成虫における生殖を抑制し、さらにミクロフィラリア（ｍｆ）期を除去するために月１回使用され、それによって伝染を減少させ、成虫の自然減少を徐々に引き起こし得たことを示唆している。感染を防ぎ、既存の感染を徐々に除去するために、成虫感染が確立していない動物をただ治療することは不必要であるだろう−“ｓａｆｅｔｙ  ｎｅｔ  ｓｔｏｒｙ  ａｂｏｕｔ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｌａｃｔｏｎｅ  ｈｅａｒｔｗｏｒｍ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅｓ”（ＭｃＣａｌｌ、２００５）。
【００２２】
成長中のＬ３／Ｌ４期のＤ．イミティスは、大環状ラクトンに非常に感受性であるのに対して、大環状ラクトンは、成虫の生殖する能力に影響を及ぼす蓄積性の損傷を引き起こし、最終的には、成虫およびミクロフィラリアの双方にとって致死的となり得るようである。しかし、大環状ラクトンがこの寄生虫の異なる期に対してどのように作用するかは知られていない。古典的見解は、大環状ラクトンが、グルタメート作動性またはＧＡＢＡ作動性の塩素イオンチャネルを開くことによって作用し、これが咽頭および／または体筋の麻痺をもたらし、結果として線虫が飢餓しまたは動けなくなり、これが胃腸管内での寄生虫に致死的であるというものである。これらの効果は、カエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）および毛様線虫科線虫寄生虫における知見に基づいており、比較的急性であって、かなり急速な麻痺および死をもたらす。Ｄ．イミティスなどのフィラリア線虫において、これらの急速な効果は生じず、少なくとも成虫およびミクロフィラリアにおいて生じず、致死性を引き起こすために反復の処置が必要とされる。ＩＶＭは、インビトロにおいて、成虫のフィラリアまたはミクロフィラリアを麻痺させず（Ｂｅｎｎｅｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｄａｖｅ、１９８８）、フィラリア線虫では咽頭が退化しており、表皮を通して栄養素の取り込みが生じると考えられている（Ｓｔｏｔｅ、Ｂｏｎｏｗ＆Ａｔｔａｈ、１９９６）。
【００２３】
反芻動物の線虫寄生虫における大環状ラクトン耐性についての多くの証拠があり（総説については、Ｋａｐｌａｎ、２００４；Ｗｏｌｓｔｅｎｈｏｌｍｅら、２００４；Ｇｅａｒｙ、２００５を参照されたい）、近年、シアトストムム（Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ）属種（Ｔｒａｗｆｏｒｄ、Ｂｕｒｄｅｎ＆Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ、２００５；Ｍｏｌｅｎｔｏ、ｐｅｒｓ．ｃｏｍｍ．）を含むウマの線虫寄生虫（Ｂｏｅｒｓｅｍａ、Ｅｙｓｋｅｒ＆Ｎａｓ、２００２；Ｈｅａｒｎ＆Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ、２００３）およびヒトのフィラリア線虫オンコセルカ・ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）（Ｏｓｅｉ−Ａｔｗｅｎｅｂｏａｎａら、２００７）におけるＩＶＭ耐性についての報告があった。残念ながら、近年、いくつかの場所において、Ｄ．イミティスに対して、大環状ラクトンイヌ糸状虫予防薬の効力の損失があるといういくつかの証拠が現在ある（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ、２００５）。
【００２４】
ヘモンクス・コントルタスおよびクーペリア・オンコフォラ（Ｃｏｏｐｅｒｉａ  ｏｎｃｏｐｈｏｒａ）などの大環状ラクトン耐性毛様線虫科寄生虫が大環状ラクトン感受性分離株と比較されたときに、グルタメート作動性塩素イオンチャネル（ＧｌｕＣｌ）サブユニット（Ｂｌａｃｋｈａｌｌら、１９９８ａ；Ｎｊｕｅら、２００４）、ＧＡＢＡ作動性塩素イオンチャネル（ＧＡＢＡ−Ｃｌ）サブユニット（Ｆｅｎｇら、２００２；Ｂｌａｃｋｈａｌｌら、２００３）、Ｐ糖タンパク質（Ｐｇｐ）ＡＢＣ輸送体（Ｂｌａｃｋｈａｌｌら、１９９８ｂ；Ｘｕら、１９９８；Ｌｅ  Ｊａｍｂｒｅら、１９９９；Ｓａｎｇｓｔｅｒら、１９９９）およびβ−チューブリン（Ｅｎｇら、２００６；Ｍｏｔｔｉｅｒ＆Ｐｒｉｃｈａｒｄ、２００８）における遺伝的変化が報告されている。自由生育の線虫Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において、３つのＧｌｕＣｌサブユニットの欠失は、結果としてＩＶＭに対する感受性の高レベルの損失になり（Ｄｅｎｔら、２０００）、これは、これらのＧｌｕＣｌｓがこの線虫に対するＩＶＭの作用に関与していることを示している。しかし、これは、寄生性線虫における大環状ラクトン耐性機構が必然的にＧｌｕＣｌｓにおける変化に関与することを暗示しているとは解釈され得ない。
【００２５】
上記のように、ＩＶＭ耐性（Ｏｓｅｉ−Ａｔｗｅｎｅｂｏａｎａら、２００７）およびＩＶＭに対する最適以下の反応（Ａｌｉら、２００２；Ａｗａｄｚｉら、２００４ａ、２００４ｂ）がヒトフィラリア寄生虫Ｏ．ボルブルス（Ｏ．ｖｏｌｖｕｌｕｓ）において現在報告されている。Ｏ．ボルブルスは、系統学的に毛様線虫科の寄生虫またはＣ．エレガンスよりもＤ．イミティスにかなり近いことに留意すべきである。Ｏ．ボルブルスにおいて発達しているＩＶＭ耐性と関連し得る遺伝的変化についての広範囲な調査が行われてきた。Ｅｎｇ＆Ｐｒｉｃｈａｒｄ（２００５）は、Ｏ．ボルブルスにおけるＩＶＭ耐性との関連について多数の候補遺伝子および非候補遺伝子を調査した。ＧｌｕＣｌまたはＧＡＢＡ−Ｃｌ遺伝子における選択についての証拠は発見されていないが、β−チューブリンおよびＰ糖タンパク質遺伝子における有意な選択が認められた。さらなる調査は、β−チューブリンにおける（Ｅｎｇら、２００６；Ｂｏｕｒｇｕｉｎａｔら、２００７）、Ｐ糖タンパク質遺伝子における、およびＯ．ボルブルスにおける他のＡＢＣ輸送体遺伝子（Ａｒｄｅｌｌｉ＆Ｐｒｉｃｈａｒｄ、２００４；Ａｒｄｅｌｌｉ＆Ｐｒｉｃｈａｒｄ、２００７；Ａｒｄｅｌｌｉら、２００５；２００６ａ；２００６ｂ；Ｂｏｕｒｇｕｉｎａｔら、２００８）における選択を確認した。ＩＶＭ選択のための一塩基多型（ＳＮＰ）は、Ｏ．ボルブルスについてβ−チューブリン（Ｅｎｇら、２００６）および半分の大きさのＡＢＣ輸送体、ＯｖＰＬＰ（Ｂｏｕｒｇｕｉｎａｔら、２００８）において同定されており、このフィラリア線虫における大環状ラクトン耐性についてのモニタリングのための有用なマーカーとなり得る。
【００２６】
大環状ラクトンイヌ糸状虫予防薬の効力の損失は、遺伝的原因を有する可能性があり、ディロフィラリア・イミティスにおいて発達中の薬剤耐性状況を示し得る。ＩＶＭは、Ｐ糖タンパク質の基質であり（Ｌｅｓｐｉｎｅら  ２００９）、Ｐ糖タンパク質は、アベルメクチン駆虫薬に対する耐性に関係していることが示されている（Ｘｕら  １９９８）。
【００２７】
本発明は、ディロフィラリア属種線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定するための方法およびキットならびに前記線虫の単離された核酸分子に関する。
【００２８】
核酸分子
一態様において、本発明は、その全長にわたり配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、配列番号１の第１１位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）を含む単離された核酸分子、または少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第１１位に相当する部位に前記Ｇヌクレオチドを含有する前記核酸分子の断片に関する。
【００２９】
本発明の一実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号１の第６１８位に相当する部位にヌクレオチドのグアニン（Ｇ）をさらに含み得る、または前記核酸分子の断片は、少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有し、配列番号１の第６１８位に相当する部位に前記Ｇヌクレオチドを含有する。
【００３０】
他の一態様において、本発明は、配列番号１に示されている配列を含有する、該配列からなる、または該配列から本質的になる、単離された核酸分子に関する。
【００３１】
本明細書において、「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「核酸分子」とは、一本鎖または二本鎖であり得る、場合によってＤＮＡまたはＲＮＡのポリマー中への組み込みが可能な合成の、非天然のまたは改変されたヌクレオチド塩基を含有する、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリマーを指し得る。「核酸」、「核酸配列」または「核酸分子」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）および遺伝子によってコードされるＲＮＡを包含し得る。核酸または核酸配列は、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００のヌクレオチドまたは塩基対を含有し得る。
【００３２】
「核酸」、「核酸配列」または「核酸分子」は、アルキル化剤、褐変糖などのようなあらゆる既知の化学物質との反応；リンカー基に対するコンジュゲーション（例えば、ＰＥＧ）；メチル化；酸化；電離放射線；または化学発癌物質の作用を含むがこれらに限定されない、当技術分野において知られているあらゆる化学的方法および／または生物学的方法によって改変され得る。こうした核酸改変は、合成中もしくは加工中にまたは当技術分野において知られている化学試薬での処理後に生じ得る。
【００３３】
本明細書において、「から本質的になる」または「から本質的になっている」とは、核酸配列が、配列内または配列の一方もしくは双方の末端を含む、１個または複数のヌクレオチド塩基を含み得るが、さらなるヌクレオチド塩基が、核酸配列の機能に実質的に影響を及ぼさないことを意味する。
【００３４】
本発明の核酸分子は、その長さにわたり配列番号１の配列に相当する配列を含み得る。本発明の実施形態において、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％同一であり得るが、配列番号１の第１１位に相当する部位に遺伝子型ＧＧを有するまたは配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位に遺伝子型ＧＧを有する線虫から単離されたものである。
【００３５】
「単離された核酸分子」とは、より大きなポリヌクレオチド配列の一部として自然界に存在しない核酸分子を指すこともあり、さらに／またはその自然環境において見出される他のいかなる核酸分子または他のいかなる夾雑物も実質的に含んでいないものであってもよい。本明細書において、「単離された核酸分子」は、組換えまたは合成によって作製された核酸分子も包含し得る。
【００３６】
「同一性」または「同一である」という用語は、２つのポリペプチド分子間またはポリヌクレオチド分子間の配列類似性を指す。同一性は、アライメントされた配列においてそれぞれの部位を比較することによって決定され得る。アミノ酸配列間または核酸配列間の同一性の程度は、例えば特定の領域にわたり、それらの配列によって共有されている部位における同一であるまたは整合しているアミノ酸または核酸の数の関数である。同一性を比較するための配列の最適なアライメントは、当技術分野において知られているように、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐにおいて利用可能なＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（商標）プログラム、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、１９８１、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所的相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性探索法、ならびに（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．中にあるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡのような）これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行などの、多様なアルゴリズムを使用して行われ得る。配列同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ）を（公表されている初期設定を用いて）使用して決定され得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して（インターネットを通してｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／において）利用可能である。一態様において、２つの配列は、ＮＣＢＩウェブサイトにおいて「Ｂｌａｓｔ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールを初期設定で使用してアライメントされ得る（ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１７４：２４７−２５０、１９９９）。他の一実施形態において、当業者は、任意の所定の配列をアラインメントして、単なる目視検査によって配列の同一性／相同性を導き出すことが容易におよび適切にできる。
【００３７】
本発明の核酸分子は、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位または第１１位および第６１８位に相当する部位において遺伝子型ＧＧを有するディロフィラリア・イミティス線虫に由来し得る。本明細書において、「に由来する」とは、天然の供給源、例えば、ディロフィラリア・イミティス線虫から単離された核酸分子を指し得る。これは、人工の、例えば、ディロフィラリア・イミティス線虫から単離された核酸分子に基づいて組換えによるまたは合成された核酸分子も指し得る。
【００３８】
本明細書において、「遺伝子型」とは、考察中の特定の性質に通常関して、細胞、生物、または個体の遺伝的構成（すなわち、個体の特定の対立遺伝子構造）を指す。本発明に関して、例えば、ＧＧ遺伝子型は、２つの対立遺伝子を有する遺伝子の特定の部位において、それぞれの対立遺伝子における同一部位のヌクレオチドがＧ（グアニン）であることを意味し得る。対立遺伝子は、同一の物理的座位における代替のＤＮＡ配列であり、これは、結果として異なる表現型の形質になり得るまたはなり得ない。各染色体について２つのコピーを有する、いかなる特定の二倍体の生物においても、各遺伝子の遺伝子型はこの座位に存在する対の対立遺伝子を含み、これらは、ホモ接合体において同一であり、ヘテロ接合体において異なる。
【００３９】
本明細書に記載の遺伝子解析は、大環状ラクトン耐性をＰ糖タンパク質の多型変異体と結びつけた。本明細書において、「多型部位」という用語は、個体群の多数の核酸試料において２つ以上の代替のヌクレオチド配列が認められる、核酸における領域を指す。長さが１ヌクレオチドである多型部位は、本明細書中で「一塩基多型」または「ＳＮＰ」と呼ばれ得る。
【００４０】
配列番号１に示されている配列は、ディロフィラリア・イミティスのＰ糖タンパク質の一部をコードしている。Ｐ糖タンパク質は、最初にチャイニーズハムスター卵巣細胞からクローニングされ、化学療法薬に対する耐性を発達させた癌細胞に多剤耐性表現型を与えるこの能力に基づいて特徴付けられた［Ｊｕｌｉａｎｏら  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４５５（１）：１５２−６２、１９７６］。
【００４１】
Ｐ糖タンパク質は、広範囲に分配され、例えば、腸上皮、肝細胞、腎近位尿細管細胞、副腎ならびに血液脳関門および血液精巣関門を含む毛細血管内皮細胞において発現され得る。
【００４２】
Ｐ糖タンパク質は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体のスーパーファミリーの一員である。特に、Ｐ糖タンパク質は、ＭＤＲ／ＴＡＰサブファミリーの一員であり、これらは多剤耐性に関与する。Ｐ糖タンパク質は、広範な基質特異性を有する、生体異物化合物のＡＴＰ依存性薬剤流出ポンプである。それは、多剤耐性細胞における薬剤蓄積の減少の原因となることもあり、薬剤に対する耐性の獲得を媒介することも多い。
【００４３】
当業者は、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において遺伝子型ＧＧを有するディロフィラリア・イミティス線虫に由来する核酸分子、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において遺伝子型ＧＧを有するディロフィラリア・イミティス線虫に由来する核酸分子が、大環状ラクトン感受性線虫のものとは異なるＰ糖タンパク質をコードし得ることを理解するはずである。例えば、こうしたＰ糖タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸改変を有し得る。非限定的なアミノ酸改変は、アミノ酸置換を含み得る。一実施形態において、アミノ酸置換は、保存的置換であり得る。本明細書において、「保存的置換」という用語は、ペプチド中の所定の部位における１つのアミノ酸から別のものへの置換を指し、ここで、該置換は、関連する機能の実質的な損失なしに行われ得る。こうした変化の作製において、アミノ酸残基のようなものの置換は、側鎖置換基の相対類似性、例えば、それらの大きさ、電荷、疎水性、親水性などに基づいて行われることが可能であり、こうした置換は、常法に従う試験によってペプチドの機能に対するそれらの効果について試験され得る。
【００４４】
保存的置換の特定の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：
【００４５】
【表１】
0005919257.tif 000002
【００４６】
他の一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸改変は、Ｐ糖タンパク質の機能に影響を及ぼす置換改変であってもよい。例えば、改変されたＰ糖タンパク質を発現しているディロフィラリア・イミティスは、例えば、大環状ラクトンに耐性または感受性であってもよい。
【００４７】
さらなる実施形態において、改変されたＰ糖タンパク質は、大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫のマーカーであってもよく、またはディロフィラリア・イミティス線虫における大環状ラクトン耐性に寄与していてもよい。
【００４８】
Ｄ．イミティスの大環状ラクトンに対する反応性を決定する方法
他の一態様において、本発明は、ディロフィラリア属種線虫の大環状ラクトンに対する反応性を決定する方法に関し、前記方法は、配列番号１の第１１位に相当する前記線虫のＰ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップを含む。
【００４９】
本発明の一実施形態において、該方法は、配列番号１の第６１８位に相当する前記線虫の前記Ｐ糖タンパク質遺伝子内の部位における前記線虫の遺伝子型を決定するステップをさらに含み得る。
【００５０】
本発明に関して、線虫が、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、該線虫は前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高い。一態様において、線虫が、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において遺伝子型ＧＧを有する場合、該線虫は前記大環状ラクトンに耐性である可能性が高い。
【００５１】
本明細書において、「反応性」という用語は、該線虫が大環状ラクトンに対する曝露後に反応することを意味し得る。本発明の実施形態において、線虫は、大環状ラクトンに感受性または耐性であることによって反応し得る。大環状ラクトンに対する感受性とは、大環状ラクトンが、曝露されたディロフィラリア・イミティス線虫に悪影響を与えることを意味する。例えば、大環状ラクトンは、ディロフィラリア・イミティス線虫にとって致死的または亜致死的であり得る、またはこの寿命を短縮し得る。耐性とは、疾患の治癒または患者の症状の改善における薬剤の有効性の低下である。ディロフィラリア・イミティス線虫は、それを死滅させるはずの薬剤が無効である場合、大環状ラクトン耐性であり得る。ディロフィラリア・イミティス線虫は、薬剤が、それを死滅させるはずである特定の用量において、低減された作用を有する場合にも、大環状ラクトン耐性であり得る。
【００５２】
本発明の実施形態において、線虫の大環状ラクトンに対する反応性は、インビボまたはインビトロで決定され得る。
【００５３】
一実施形態において、ＬＤ９５（９５％のディロフィラリア・イミティス線虫を死滅させたはずである薬剤の致死量または致死濃度）の用量または濃度の大環状ラクトンに対する曝露後に、約９３％未満、約９１％未満、約８９％未満、約８７％未満、約８５％未満、約８３％未満、約８１％未満、約７９％未満、約７７％未満、約７５％未満、約７３％未満、約７１％未満、約６９％未満、約６７％未満、約６５％未満、約６３％未満、約６１％未満、約５９％未満、約５７％未満、約５５％未満、約５３％未満、約５１％未満、約４９％未満、約４７％未満、約４５％未満、約４３％未満、約４１％未満、約３９％未満、約３７％未満、約３５％未満、約３３％未満、約３１％未満、約２９％未満、約２７％未満、約２５％未満、約２３％未満、約２１％未満、約１９％未満、約１７％未満、約１５％未満、約１３％未満、約１１％未満、約９％未満、約７％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満または０％の線虫が死滅した場合、ディロフィラリア・イミティス線虫は、大環状ラクトンに耐性であると言うことができる。
【００５４】
他の一実施形態において、ＬＤ９５（９５％のディロフィラリア・イミティス線虫を死滅させたはずである薬剤の致死量または致死濃度）の用量または濃度の大環状ラクトンに対する曝露後に、多くとも約５％、多くとも約４％、多くとも約３％、多くとも約２％、多くとも約１％または０％の線虫が生存していた場合、ディロフィラリア・イミティス線虫は、大環状ラクトンに感受性であると言うことができる。
【００５５】
核酸試料のプローブとの接触
ディロフィラリア・イミティス線虫を含む生体試料は、対象から得られ得る。対象は、限定されるものではないが、イヌ、キツネ、オオカミ、コヨーテまたはネコであり得る。本発明に関して、生体試料は、対象のいかなる試料（例えば、体液、排泄物、臓器、組織など）であってもよい。生体試料は、ディロフィラリア・イミティス線虫感染を有することが知られている、または有すると疑われる対象のものであってもよい。ディロフィラリア・イミティス線虫は、標準的な分離法および技術で生体試料から単離され得る。
【００５６】
核酸試料は、使用前にディロフィラリア・イミティス線虫から単離され得るまたは得られ得る。生物および組織から核酸を単離する方法は知られている。こうした方法は、プロテイナーゼＫ消化に次ぐフェノールクロロホルム抽出での伝統的なＤＮＡ抽出、水酸化ナトリウム抽出、および物理的破壊、その後の精製、例えば塩化セシウム遠心分離または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるもの；または市販のキット、例えば、ＱＩＡａｍｐ（商標）またはＤＮｅａｓｙ（商標）の使用を含み得るが、これらに限定されない。当業者は、成虫のディロフィラリア・イミティス線虫から核酸試料を単離するためにミクロフィラリアと比較して異なるアプローチが使用され得ることを理解するはずである。本発明の一実施形態において、核酸試料はゲノムＤＮＡを含有する。
【００５７】
核酸試料は、Ｐ糖タンパク質中の１つまたは複数の部位における線虫の遺伝子型を決定するためにプローブと接触され得る。好適なインキュベーション培地およびインキュベーション条件は、プローブおよび試料をインキュベートするために使用され得る。一実施形態において、プローブおよび核酸試料を、例えば接触によって、相互作用できるようにするために、プローブおよび核酸試料は、任意の培地中でインキュベートされ得る。例えば、インキュベーション培地は、ＰＢＳなどの緩衝液であってもよい。当業者は、インキュベーション培地の組成が、使用されるプローブおよび／または核酸試料の成分に依存し得ることを理解するはずである。
【００５８】
プローブ
本発明の方法およびキットは、Ｐ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を検出するためのプローブを含有し得る。本発明のプローブは、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を決定するために使用され得る。本発明の一実施形態において、プローブは、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を同時にまたは連続的に決定するために使用され得る。
【００５９】
本発明のプローブは、Ｐ糖タンパク質中の１つまたは複数の特定の部位における線虫の遺伝子型を決定するために核酸試料に結合することができる、または核酸試料と関連した１種または複数の分子であり得る。これに関して、プローブは、例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー、アプタマーまたは抗体であってもよい。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位における線虫の遺伝子型を対立遺伝子特異的に決定することができる。オリゴヌクレオチドは、本発明に関する使用に好適ないかなる大きさ、形状および組成物を含んでもよい。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、改変されたヌクレオチド、またはこれらのうち１種または複数の組合せを含み得る。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ロックド核酸および／またはペプチド核酸を含んでもよい。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、本発明の方法における使用に好適な任意の長さであり得る。一般に、１つの部位における線虫の遺伝子型を検出することができるオリゴヌクレオチドは、他の部位における検出と干渉しない。しかし、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｐ糖タンパク質中の２つの部位における（例えば、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位における）線虫の遺伝子型を同時に検出することができてもよい。本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、またはそれよりも多い一連のヌクレオチドを含み得る。
【００６２】
本発明の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、１種のプライマーまたは２種以上のプライマー、例えば、プライマー対、例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを包含し得る。
【００６３】
プライマーは、ＤＮＡ複製を開始するために使用され得るオリゴヌクレオチドであってもよい。典型的には、プライマーは、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００またはそれよりも多いヌクレオチドであり得る短いオリゴヌクレオチドである。
【００６４】
プライマーは、遺伝子の特定の部位における線虫の遺伝子型を検出するためのアプローチの一部として使用され得る。例えば、プライマーは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲによるような、ＤＮＡの増幅に、サザンブロット、シーケンシングまたはＳＳＣＰによるなどの、その後の解析に、有用であり得る。
【００６５】
本明細書において、「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸分子またはペプチド分子であり得る。例えば、溶液中で、ヌクレオチドの鎖は、アプタマーを折りたたんで複雑な三次元の形状にする分子内相互作用を形成し得る。このアプタマーの形状は、アプタマーが、この標的分子の表面に固く結合するのを可能にする。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列に対して存在する分子形状が多様なので、アプタマーは、核酸分子、酵素、膜タンパク質、ウイルスタンパク質、サイトカイン、成長因子、および免疫グロブリンなどが挙げられるが、これらに限定されない、広範囲にわたる一配列の分子標的に対して得られ得る。
【００６６】
本発明のアプタマーは、核酸分子であってもよい。前記アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、改変されたヌクレオチド、またはこれらのうち１種または複数の組合せを含んでいてもよい。核酸アプタマーは、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸アプタマーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、またはそれよりも多い一連のヌクレオチドを含み得る。好ましい核酸のアプタマーは、一本鎖核酸分子であってもよく、約１００未満の一連のヌクレオチドを含み得る。
【００６７】
本発明のアプタマーは、ペプチド分子であってもよい。ペプチドアプタマーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００またはそれよりも多い一連のアミノ酸残基を含み得る。好ましいペプチドアプタマーは、約１５から約７５の間の一連のアミノ酸残基を含み得る。
【００６８】
本明細書において、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換可能に使用される場合もあり、長さ（例えば、少なくとも５、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、４０、５０、１００またはそれよりも多いアミノ酸）もしくは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）または該ペプチドに共有結合によって結合されている例えば１個または複数の非アミノアシル基（例えば、糖、脂質など）の存在にかかわらず、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸（Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸いずれも）のいかなる鎖を包含していてもよく、例えば、天然タンパク質、合成または組換えのポリペプチドおよびペプチド、ハイブリッド分子、ペプトイド、ペプチド模倣体などを含む。ペプチドは、単量体または多量体であってもよい。ペプチドフラグメントは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、または少なくとも２５００の隣接した一範囲の連続したアミノ酸を含んでいてもよく、全長ペプチドの望ましい活性を維持していてもよい。
【００６９】
本明細書において、「抗体」は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単一ドメイン抗体および抗体フラグメントを含み得る。「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般にこの抗原結合領域または可変領域を含有する。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。「抗体」という用語は、キメラ抗体またはヒト化抗体も含み得る。
【００７０】
本発明のプローブは、当業者に知られている標準技術に従って調製され得る。例えば、プローブは、合成、組換えによって作製され得るまたは天然の供給源から単離され得る。一実施形態において、該供給源は、生物の供給源、例えば、微生物（例えば、細菌またはウイルス）、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、またはヒト）、または植物由来であり得る。
【００７１】
本発明に関して、「プローブ」とは、１種のプローブまたは２種以上のプローブを意味し得る。一実施形態において、単一のプローブは、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を検出するために使用され得る。当業者は、１種または複数のプローブが本発明に関して有用であり得ることおよび用いる遺伝子型同定アプローチに依存し得ることを理解するはずである。例えば、プライマーは、増幅反応において、対で、すなわちフォワードプライマーおよびリバースプライマーで使用されることが多い。増幅された産物は、次いで、特定の部位におけるヌクレオチドを同定するために解析され得る。
【００７２】
１種または複数の型のプローブは、本発明の方法において同時に使用され得る。一実施形態において、異なる型の２種のプローブは、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する線虫の部位の配列において同時に検出するために使用され得る。例えば、一方のプローブは、配列番号１の第１１位に相当する部位においてヌクレオチドを検出するためのオリゴヌクレオチドであってもよく、もう一方のプローブは、配列番号１の第６１８位に相当する部位においてヌクレオチドを検出するための抗体であってもよい。他の一実施形態において、２種のプローブは、同一の型の分子を含有していてもよい。
【００７３】
プローブの設計および作製は、当技術分野において知られている。一般に、プローブは、組換え、合成によって作製され得る、または天然の供給源、例えば、細胞、動物または植物から単離され得る。しかし、当業者は、プローブ作製は、問題になっているプローブの型に依存し得ることを理解するはずである。
【００７４】
当業者は、本発明のプローブが、ＧＧ／ＧＧ遺伝子型（すなわち、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位においてＧＧ遺伝子型を有する線虫）を、他のあり得る遺伝子型、例えば、ＡＡ／ＡＡ、ＡＧ／ＡＡ．．．．．．ＡＧ／ＡＧ．．．．ＡＡ／ＡＧなどから識別できることを必要とし得ることを理解するはずである。好ましいプローブは、フルオロフォア（ｆｌｕｏｒｏｆｌｏｒ）または色素を有するまたは有さない、核酸分子（例えば、プライマー）であり得る。プローブは、フルオロフォアを有し、クエンチャーまたは（例えば、ＦＲＥＴ解析用に）別のフルオロフォアを有するまたは有さない、直線状またはヘアピンの形態であり得る。それは、ＤＮＡ（またはタンパク質）配列を特異的に認識する抗体であってもよい。もう一方のプローブは、ＲＮＡ分子に基づいていてもよい。何が好ましいかは、安定性、費用、使用の容易性などの技術的な考慮点に依存し得る。
【００７５】
遺伝子型の決定
当業者は、Ｐ糖タンパク質中の１つまたは複数の部位における線虫の遺伝子型を決定するために常法に従うアプローチが使用され得ることを理解するはずである。本発明に関する使用に好適なアプローチは、限定されるものではないが、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を決定するための、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位における線虫の遺伝子型を決定するための、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＳＳＣＰ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、および抗体の使用を含み得る。他のアプローチは、ＤＮＡマイクロアレイまたはビーズに対する核酸ハイブリダイゼーション、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、末端制限断片長多型（ｔ−ＲＦＬＰ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、および多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）を含み得る。
【００７６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，１９５；４，６８３，２０２；および４，９６５，１８８）は、試料中の標的核酸配列の濃度を高めるために使用される方法である。この方法は、典型的には、標的配列を増幅するために、標的配列に相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの使用、ならびに変性、アニーリングおよび伸長を促進するための３つの温度のサイクルを必要とする。
【００７７】
定量ＲＴ−ＰＣＲは、相対量および絶対量の双方でｍＲＮＡを定量するために使用される。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲの原理に基づいているが、核酸配列の信頼性の高い検出および定量を可能にする。ＰＣＲ反応は、対数期、直線期および定常期の３つの区分に分けられ得る。理論的には、対数期の間に、初期の標的配列の量と任意の所定のサイクルにおけるＰＣＲ産物の量との間に量的な相関がある。対数期の範囲内で、リアルタイムＰＣＲ機器は２つの値を算出する。閾値線は、反応がバックグラウンドを超える蛍光強度に到達したときの検出のレベルである。試料がこのレベルに到達したときのＰＣＲサイクルは、サイクル閾値、Ｃｔと呼ばれる。Ｃｔ値は、定量または存在／非存在の検出解析において使用される。未知濃度の試料のＣｔ値を一連の標準と比較することによって、未知の反応物中の鋳型ＤＮＡの量が正確に決定され得る。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲは、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性および増幅産物に結合するレポーター分子の使用に依存する。一般的なレポーター分子は、限定されるものではないが、（１）二本鎖ＤＮＡとインターカレートする蛍光色素の使用、および（２）相補的なＤＮＡとハイブリダイゼーションしたときに蛍光を発する改変されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを含む。例えば、レポーター分子は、増幅される標的（鋳型）を結合する標識されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。標識されたオリゴヌクレオチドは、一方の末端に蛍光分子を、他方に蛍光分子の蛍光をクエンチするクエンチング分子を含有し得る。ポリメラーゼは鋳型を移動して、蛍光分子に到達し、標識されたオリゴヌクレオチドから蛍光分子を切断する。切断された蛍光分子の蛍光は、検出され得る。蛍光の量は、生成されたｐｃｒ産物当たりの鋳型の量に直接比例する。
【００７９】
増幅された核酸分子は、Ｐ糖タンパク質に関して線虫の遺伝子型を決定するためのアプローチと共に使用され得る。こうしたアプローチは、限定されるものではないが、ＤＮＡシーケンシング、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、サザンブロット解析、およびＳＳＣＰを含み得る。
【００８０】
一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）技術は、ＰＣＲ増幅産物における小さな変化を検出するための簡単で効率的な方法である。これは、わずかな核酸の変化が一本鎖ＤＮＡ断片の移動に影響を及ぼし、したがって、非変性ポリアクリルアミドゲルを通って認識可能な移動度のシフトが生じるという仮定に基づいている（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．、Ｉｗａｈａｎａ，Ｈ．、Ｋａｎａｚａｗａ，Ｈ．、Ｈａｙａｓｈｉ，Ｋ．、およびＳｅｋｉｙａ，Ｔ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ａｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６、２７６６−２７７０（１９８９））。
【００８１】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、多様な標的ＤＮＡの配列に相補的な短い断片の合成ＤＮＡである。これは、サザンブロットアッセイにおけるまたはドットブロットアッセイにおける標的の存在を検出するためのプローブとして作用し得る。ＡＳＯは、典型的には、長さが１５−２１ヌクレオチド塩基のオリゴヌクレオチドである。これは、試験されるＤＮＡの１つのみの型、または対立遺伝子に特異的になるように設計される。ＡＳＯの長さ、どちらの鎖が選択されるか、標的ＤＮＡに結合する（さらにそこから洗浄される）条件、すべてがこの特異性において役割を果たす。これらのプローブは、通常、一塩基多型（ＳＮＰ）のアッセイにおける基本的な能力である、標的の遺伝子配列におけるわずか１塩基の相違を検出するように設計され得る。標的に結合した後に検出されるように、ＡＳＯは、放射能、酵素、または蛍光タグで標識されていてもよい。例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ技術は、１塩基対の相違（チミン対シトシン）を検出するためにＡＳＯを利用して特定のＣｐＧ部位におけるメチル化を測定する。ＰＣＲが、ＡＳＯ解析と組み合わされることもある［Ｓａｉｋｉら  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４（６０９３）：１６３−１６６、１９８６］。
【００８２】
直接ＤＮＡシーケンシングおよび制限断片長多型（ＲＦＬＰ）に基づいた技術は、広く知られている。ＲＦＬＰは、制限エンドヌクレアーゼでＤＮＡ試料を消化し、その後サザンブロット解析を行い、結果として生じる多様な長さのＤＮＡ断片を解析する技術である。結果として生じたパターンは、多型の検出において使用され得る。ＤＮＡシーケンシングは、一般に、ＤＮＡの分子内のヌクレオチド塩基−アデニン、グアニン、シトシン、およびチミン−の順序を決定する方法を指す。
【００８３】
他の好適な遺伝子型同定の方法としては、限定されるものではないが、マイクロアレイ解析、ＳｍａｒｔＡｍｐ２増幅、ピロシーケンシング、質量分析法、分子ビーコン、およびＥＬＩＳＡ（例えば、ディップスティックＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。ＤＮＡマイクロアレイは、分子生物学および医学において使用される多重化技術である。これは、それぞれピコモル（１０−１２モル）の特定のＤＮＡ配列（プローブ）を含む、数千の顕微鏡的な点のＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列されたシリーズからなる。ＤＮＡマイクロアレイは、発現レベルにおける変化を測定するために、一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するために、所定の試料の変異ゲノム（使用および型の節を参照されたい）を遺伝子型同定または再シーケンスするために、使用され得る。
【００８４】
配列番号１の第１１位はＰ糖タンパク質のエキソン中にあり、配列番号１の第６１８位は非コード領域に該当する。大環状ラクトン耐性Ｄ．イミティスは、配列番号１の第１１位にまたは第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において遺伝子型ＧＧを有する。したがって、大環状ラクトン耐性Ｄ．イミティス線虫において発現されるＰ糖タンパク質は、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において線虫のＧＧ遺伝子型を間接的に検出するのに有用であり得る改変されたアミノ酸配列を有し得る。本発明の一実施形態において、配列番号１の第１１位に相当する部位にグアニンを含有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を検出することができる抗体は、Ｐ糖タンパク質に関して線虫のＧＧ遺伝子型を検出する際に有用であり得る。
【００８５】
配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位において、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位において遺伝子型ＧＧを有するディロフィラリア・イミティス線虫が同定されると、それは、結果を確認するのに有用であり得る。一実施形態において、機能的アッセイは、該線虫が大環状ラクトン耐性であることを確認するために使用され得る。例えば、ディロフィラリア・イミティス線虫は、ある用量の大環状ラクトン、例えば、ＬＤ９５用量の大環状ラクトン、すなわち、ディロフィラリア・イミティスの９５％に対して致死的である用量の化合物に曝露され得る。
【００８６】
キットおよび市販用パッケージ
本発明の実施形態において、本発明のプローブは、キットとして使用者に提供されてもよい。本発明のキットは、１種または複数の本発明のプローブを含み得る。例えば、キットは、配列番号１の第１１位に相当する線虫のＰ糖タンパク質中の部位における該線虫の遺伝子型を決定することができるプローブ、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する線虫のＰ糖タンパク質中の部位における該線虫の遺伝子型を決定することができるプローブを含有し得る。
【００８７】
キットは、１種または複数の試薬、緩衝液、パッケージング材、キットを使用するための説明書およびキットの構成要素を保持するための容器をさらに含み得る。
【００８８】
方法およびキットの使用
本発明の方法およびこの方法を行うためのキットは、研究、医学および産業上の用途を有し得る。本発明は、感染した動物におけるイヌ糸状虫の管理および地域における大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫の検出における広範な用途を見出している。本発明の代表的な、非限定的な用途としては、予防または療法のための大環状ラクトンの通常の用量に対して感受性でないディロフィラリア・イミティスの個体または個体群の存在の検出、定量および／または診断などが挙げられる。一実施形態において、核酸分子を検出および定量する本発明の能力は、配列番号１の第１１位に相当するＰ糖タンパク質中の部位においてＧＧ遺伝子型を有するディロフィラリア・イミティス線虫に感染した動物用の、または配列番号１の第１１位および第６１８位に相当するＰ糖タンパク質中の部位においてＧＧ遺伝子型を有するディロフィラリア・イミティス線虫に対する、化学療法レジメンを処方、および／または変更するように、開業獣医師に指示を与える限りにおいて有用である。こうした大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫の同定は、治癒を達成するためおよび／または耐性株の広がりを最小限に抑えるために、代替の薬剤、例えば、成虫駆除剤（例えば、ヒ素ベースの薬剤）、ジエチルカルバマジン、テトラサイクリンなどの抗生物質、およびこれらのうち１種または複数の組合せなどを含み得る療法を処方するように、および／または大環状ラクトン療法単独からこれらに切り換えるように、獣医師に指示を与え得る。代替的に、獣医師は、大環状ラクトン耐性線虫に感染した動物の治療において、大環状ラクトンの、および／または大環状ラクトンを使用した治療レジメンの、例外的な用量（例えば、通常よりも高い用量）を処方するまたは現行の用量を調整することができる。大環状ラクトン予防薬のための典型的な推奨される用量の割合としては、例えば、イベルメクチンについて６μｇ／ｋｇ；ミルベマイシンオキシムについて５００ｍｇ／ｋｇ；モキシデクチンについて３μｇ／ｋｇ（月１回）；およびセラメクチンについて６ｍｇ／ｋｇなどが挙げられる。獣医師は、ディロフィラリア属種線虫、例えば、大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫に感染した動物を治療するのに好適な任意の組合せで上記の治療法および療法のうちの１つまたは複数を組み合わせることもできる。例えば、獣医師は、こうした動物をヒ素ベースの薬剤などの成虫駆除剤で治療し、次いで、大環状ラクトンまたはジエチルカルバマジンなどのミクロフィラリア駆除剤を後続させることもできる。
【００８９】
一例において、ヒ素ベースの薬剤は、大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫に感染した動物を治療するために使用され得る。ヒ素ベースの薬剤は、メラルソミン二塩酸塩を含み得るが、これに限定されない。メラルソミン二塩酸塩は、例えば、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で、２４時間間隔で、２回使用され得る。これは、第１の治療に対する反応性ならびに動物の状態、年齢、および用途に依存して、４カ月間繰り返され得る。しかし、当業者は、投与量が、感染の重症度に依存して変化し得ることを理解するはずである。例えば、重症（クラス３）の疾患を有するイヌなどの感染した動物に、１用量を投与して、２、３カ月間回復させた後に、２用量の完全なセットを投与することもできる。
【００９０】
他の一例において、ジエチルカルバマジンは、大環状ラクトン耐性のディロフィラリア・イミティス線虫に感染した動物を治療するために使用され得る。ジエチルカルバマジンは、例えば、動物の１ポンドにつき２５から５０ｍｇの用量で使用され得る。投与の期間は、治療されている状態、投薬に対する反応性および何らかの有害作用の発生に依存し得る。
【００９１】
他の一例において、抗生物質は、大環状ラクトン耐性のディロフィラリア・イミティス線虫に感染した動物を治療するために使用され得る。前記抗生物質は、テトラサイクリンを含み得るが、これに限定されない。ディロフィラリア・イミティス中のウォルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）内部共生体を標的とする、ドキシサイクリンなどのテトラサイクリンは、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で４０日間使用され得る。
【００９２】
さらなる例において、他の抗寄生虫剤が使用され得る。こうした他の抗寄生虫剤は、アカシアシドを含み得るが、これに限定されない。アカシアシドは、例えば、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で７日間使用され得る。
【００９３】
他の一実施形態において、Ｐ糖タンパク質における上記の遺伝子型を用いたディロフィラリア・イミティス線虫個体群の検出は、感染しやすい動物、例えば、イヌを保護するための予防法として、ジエチルカルバマジンなどの代替の薬剤の使用を処方するように、獣医師に指示を与え得る。
【００９４】
一例において、ジエチルカルバマジンは、動物が、大環状ラクトン耐性のディロフィラリア・イミティス線虫に感染するのを防ぐために使用され得る。これに関して、ジエチルカルバマジンは、例えば、動物の１ポンドにつき３ｍｇの用量で１日１回使用され得る。
【００９５】
他の一実施形態において、本発明のキットは、市販の製品として、大環状ラクトン耐性ディロフィラリア・イミティス線虫の検出において有用となり得る。こうした製品は、限定されるものではないが、獣医師、医師、ペット所有者、農業家、動物園管理人、疫学者、またはそれを必要としている他の消費者による使用に好適であり得る。
【００９６】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【００９７】
［実施例１］
材料および方法
試料
４つの群の試料を入手することができた。群Ａは、大環状ラクトンにそれまで曝露されたことがなかった３９匹の未処置の個々の虫に該当する。群Ｂは、フロリダ、ルイジアナおよびテキサスにおいて大環状ラクトンに曝露された、またはそれらの祖先が曝露されたようである、３５匹の個々の虫に該当する。これらの試料について、イヌの治療歴は詳細ではないが、大環状ラクトンはこれらの地域において一般的に使用されている。群Ｃは、インビトロアッセイにおいてＩＶＭに対して低い感受性を示した１１７匹の個々のミクロフィラリアに該当する。群Ｄは、日本において大環状ラクトンに曝露された、またはそれらの祖先が曝露されたようである、３３匹の個々の虫に該当する。これらの試料について、イヌの治療歴は詳細ではないが、大環状ラクトンは日本において一般的に使用されている。
【００９８】
試験
Ｔｉｐ、ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｏｏｔｉｅと名づけられた３匹のイヌからミクロフィラリアを採取した。これらのミクロフィラリアは、群Ｃの同一群のものである。個々の各イヌからのこれらのミクロフィラリアにおけるインビトロアッセイを、未処置のミクロフィラリアの９５％がその用量において死滅するはずであることを意味するＩＶＭ９５％致死量（ＩＶＭ−ＬＤ９５）である１用量を用いて行った。死滅したミクロフィラリアを計数した。次いで、ミクロフィラリアを、ＩＶＭ−ＬＤ９５の２倍に相当する第２の用量のＩＶＭ中でインキュベートした。死滅したミクロフィラリアを計数した。
【００９９】
分子生物学
個々の成虫のゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）からのＤＮｅａｓｙ（商標）キットで抽出した。個々のミクロフィラリアのゲノムＤＮＡ抽出は、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡキットを使用して抽出し、その後、きわめて少量のＤＮＡから全ゲノムを増幅することを可能にする、ＱｉａｇｅｎからのＲｅｐｌｉ−ｇ（登録商標）スクリーニングキットを適用した。ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＤ．イミティスの配列はごくわずかなので、Ｏ．ボルブルス、Ｂ．マライ（Ｂ．ｍａｌａｙｉ）、Ｃ．エレガンスまたはＨ．コントルタス（Ｈ．ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）の配列に基づいて生物情報学研究を行い、Ｄ．イミティスのＰ糖タンパク質遺伝子の６２０ｂｐの領域を増幅できるようにした。この増幅は、以下のプライマーを使用してＰＣＲによって行った：Ｐｇｐ−１−ｓｅｎｓ  ５’  ｇｇａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｔｃｃ  ｇｇｔ  ｇｇｔ  ｃａ  ３’［配列番号２］およびＰｇｐ−１−ａｎｔｉｓｅｎｓ  ５’  ｔｃｇ  ｃａａ  ａｔｔ  ｔｃｃ  ｔｔｃ  ｃａｃ  ｔｔ  ３’［配列番号３］。変性を９４℃で４５秒間；アニーリングを５６℃で４５秒間；伸長を６８℃で２分間、３５サイクル行った。０．５μｇ／ｍｌエチジウムブロマイドを含有した１％アガロースゲルを用いた１００Ｖで４０分間のゲル電気泳動によってＰＣＲ増幅を確認した。３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｅｒシステム（ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ）を使用して、ＰＣＲ産物をシーケンスした。増幅中にエラーが入るのを避けるために、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｉｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＣＲ反応に使用した。個々のクロマトグラムを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）４．７ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｌ  ４８１０８、ＵＳＡ）で解析した。このプログラムは、各ヌクレオチドにおける識別およびクロマトグラム上の主なヌクレオチドピークの９０％を超えていた第２のピークのみについての選択を可能にした。この高レベルの識別能は、多型部位におけるホモ接合性およびヘテロ接合性を決定するのに信頼性を与えた。
【０１００】
統計解析
χ２検定およびＦｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて、群Ｃ（大環状ラクトン低応答動物）の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型頻度を、他の３群のＳＮＰの遺伝子型頻度と比較した。
【０１０１】
群ＣのミクロフィラリアのＰ糖タンパク質の遺伝子型と、それらに対応するイベルメクチン−ＬＤ９５％表現型との間に相関があるかどうかを評価するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍを使用して線形回帰を行った。
【０１０２】
結果
解析した断片において２個の共通のＳＮＰが見出された［図１；配列番号１］。１つ目は、解析した断片の第１１位（Ａ１１Ｇ）に位置しており、２つ目は、第６１８位（Ａ６１８Ｇ）であった。Ａ１１ＧのＳＮＰは、コード領域内の第２のＡＴＰ結合ドメインの直前にあり、結果としてリシンからアルギニンへのアミノ変更が生じていた。Ａ６１８ＧのＳＮＰは、非コード領域内に位置していた。Ｏ．ボルブルス、Ｂ．マライおよびＣ．エレガンスからの入手可能な配列に基づき、解析した断片は、アミノ酸配列のおよそ第１２００位から始まっていた。
【０１０３】
群Ａに遺伝子型同定された３７匹の成虫間で、第１１位におけるホモ接合体ＡＡ、ＧＧおよびヘテロ接合体ＡＧの遺伝子型頻度は、それぞれ８１．１％、０％および１８．９％であった。群Ｂに遺伝子型同定された３４匹の成虫間で、第１１位におけるホモ接合体ＡＡ、ＧＧおよびヘテロ接合体ＡＧの遺伝子型頻度は、それぞれ９１．２％、２．９％および５．９％であった。群Ｃに遺伝子型同定された９２匹のミクロフィラリア間で、第１１位におけるホモ接合体ＡＡ、ＧＧおよびヘテロ接合体ＡＧの遺伝子型頻度は、それぞれ５７．６％、３５．９％および６．５％であった。群Ｄに遺伝子型同定された３３匹の成虫間で、第１１位におけるホモ接合体ＡＡ、ＧＧおよびヘテロ接合体ＡＧの遺伝子型頻度は、それぞれ１００％、０％および０％であった［図２］。ホモ接合体ＡＡ遺伝子型頻度は、群Ａ（ｐ＝０．００８）、群Ｂ（ｐ＝０．０００１）および群Ｄ（ｐ＝０．０００００６）と比較して、群Ｃにおいて有意に低かった。ホモ接合体ＧＧ遺伝子型頻度は、群Ａ（ｐ＝０．０００００１）、群Ｂ（ｐ＝０．００００５）および群Ｄ（ｐ＝０．０００００６）と比較して、群Ｃにおいて有意に高かった［表１］。さらに、対立遺伝子Ａおよび対立遺伝子Ｇの頻度は、群Ａ（ｐ＝０．０００００２）、群Ｂ（ｐ＝０．００００００１）および群Ｄ（ｐ＝０．００００００００００１）と比較して、群Ｃにおいてそれぞれ有意に低かったおよび高かった［図示せず］。
【０１０４】
【表２】
0005919257.tif 000003
【０１０５】
第１１位および第６１８位におけるＳＮＰの遺伝子型を組み合わせた［図３］。例えば、ＡＡ−ＧＧ遺伝子型は、第１１位における遺伝子型ＡＡおよび第６１８位における遺伝子型ＧＧに相当した。考えられる９種の遺伝子型の組合せの中で、ＡＡ−ＡＡ、ＡＡ−ＧＧ、ＡＡ−ＡＧ、ＡＧ−ＧＧ、ＡＧ−ＡＧおよびＧＧ−ＧＧの６種の異なる遺伝子型のみが全試料群において見出された。群Ｄにおいて、遺伝子型ＡＡ−ＧＧのみが見出された。群ＡにおけるＧＧ−ＧＧ、群ＢにおけるＡＧ−ＡＧおよびＡＡ−ＡＡのように、いくつかの遺伝子型は、いくつかの群において見出されなかった。群Ｃは、６種の異なる遺伝子型すべてが見出された唯一の群であった。興味深いことに、遺伝子型ＧＧ−ＧＧは、群Ａ（ｐ＝０．０００００１）、群Ｂ（ｐ＝０．００００５）および群Ｄ（ｐ＝０．０００００６）と比較して、群Ｃにおいて有意に高く［表２］、群ＡおよびＤでは見出されなかった。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
群Ｃは、３匹のイヌ：Ｔｉｐ、ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｏｏｔｉｅから単離された個々のミクロフィラリアの群である。ＴｉｐおよびＫｅｎｄａｌｌのミクロフィラリアは、遺伝子型ＧＧ−ＧＧおよびＡＡ−ＧＧのみを有していたのに対して、Ｔｏｏｔｉｅのミクロフィラリアでは、６種の異なる遺伝子型がすべて見出された［図４］。遺伝子型ＧＧ−ＧＧの頻度は、Ｔｉｐ、ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｏｏｔｉｅから採取されたミクロフィラリアにおいてそれぞれ５１．３％、３０．７％および２０．７％であった。
【０１０８】
インビトロ試験［表３］より、９５％のミクロフィラリアが死滅するはずの用量であるＬＤ９５％での１用量のＩＶＭに対する曝露後に、Ｔｉｐのミクロフィラリアの８％および３９％のみが死滅したことが示された。２倍のＬＤ９５％でＴｉｐのミクロフィラリアを曝露することによって、２４．１％および５０．４％のみが死滅した。ＬＤ９５％での１用量のＩＶＭの後にＫｅｎｄａｌｌおよびＴｏｏｔｉｅのミクロフィラリアの５６％および７９％が死滅したが、２倍のＬＤ９５％の曝露後にはこの２匹のイヌのミクロフィラリアの９９．２％および１００％が死滅した。
【０１０９】
【表４】
0005919257.tif 000005
【０１１０】
Ｔｉｐ、ＫｅｎｄａｌｌおよびＴｏｏｔｉｅのミクロフィラリアのＧＧ−ＧＧ遺伝子型と、それらのＩＶＭ−ＬＤ９５％表現型との間に、有意な相関（適合度ｒ２＝０．９３；ｐ＝０．００８）［図５］が認められた。
【０１１１】
考察
獣医学的線虫における、およびより最近では、系統学的にＤ．イミティスとより密接に関連がある、Ｏ．ボルブルスにおける、様々な報告から、大環状ラクトン処置を繰り返すことによってＡＢＣ輸送体遺伝子において遺伝的選択が生じることが現在知られている。大環状ラクトンに対して低い反応性を有するイヌが新たに出現しているので、大環状ラクトン耐性の潜在的な蔓延に伴う遺伝子の変化を検出する信頼性の高い遺伝子マーカーを備えることが重要である。
【０１１２】
この試験は、異なる治療歴を有する異なる地域のＤ．イミティスの試料を比較しているので独特なものである。この点に関して、ＩＶＭにそれまで曝露されたことがなかった虫を、大環状ラクトンに曝露された試料およびＩＶＭに対する強い曝露の後にこの薬剤に対して低い反応性を示した試料と比較した。個々の試料を、ＧｅｎＢａｎｋにおいて入手不可能なＰ糖タンパク質遺伝子の特定の領域についてシーケンスした。
【０１１３】
このデータより、Ｄ．イミティスにおけるＰ糖タンパク質遺伝子についての大環状ラクトンの明らかな選択圧があることが示される。Ｐ糖タンパク質のＧＧ−ＧＧ遺伝子型は、当分野において、イヌ糸状虫に感染したイヌにおけるＩＶＭ／大環状ラクトン最適以下応答動物の広がりを把握するための遺伝子マーカーツールとして使用され得る。
【０１１４】
［実施例２］
実施例１において注目したように、Ｐ糖タンパク質（アクセッション番号：ＨＭ５９６８５３−配列番号６）におけるＧＧ−ＧＧ遺伝子型と、インビトロアッセイでのＤ．イミティスｍｆにおけるＩＶＭ非感受性表現型との間に、強い相関が認められた；ｍｆがＩＶＭに対してより非感受性であるほど、ＧＧ−ＧＧ遺伝子型の頻度が高かった。この実施例では、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ出身の、イヌ糸状虫陽性のイヌにおける治療に対する反応性を報告し、大環状ラクトン感受性の欠如に伴うＰｇｐ遺伝子型の頻度を決定した。
【０１１５】
材料および方法
症例：イヌは、２００６年２月生まれの雄の去勢されたラブラドールミックスであり、体重が約３１ｋｇであった。イヌは、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌｏｕｉｓｉａｎａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．の救助犬であり、Ｂｏｕｄｒｅａｕｘ  Ｒｅｓｃｕｅ  Ｃｒｅｗ、Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓによって集められ、その後、Ｃａｎａｄａに移され、そこで２００８年１月に採用された。
【０１１６】
診断：このイヌは、２００８年６月６日（１日目）に、Ｗｅｌｌａｎｄ、ＯｎｔａｒｉｏにあるＭａｉｎ  Ｗｅｓｔ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＷＡＨ）に検査のために連れてこられた。このイヌから採取された血液は、イヌ糸状虫抗原試験（ＰｅｔＣｈｅｋ（登録商標）ＰＦ（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ））で陽性反応を示し、Ｄ．イミティスのｍｆを含有していた。２００８年６月１１日（６日目）に、最初の検査（血液検査、胸部ラジオグラフ、身体検査、尿検査）を行った。聴診により、肺内の気管支肺胞音における軽度の増大およびグレードｌｌｌ−ＩＶ／ＶＩ心雑音が認められた。残りの身体検査では、特に異常はなかった。胸部ラジオグラフィーにより、右側の心臓の中程度の拡大および背尾側肺野における侵入性の肺パターンが認められた。これらの検査により、クラス２心糸状虫症の診断が示された。
【０１１７】
治療歴：２００８年６月１１日（６日目）に、２．５ｍｇ／ｋｇのＩＭ  メラルソミン二塩酸塩（Ｉｍｍｉｔｉｃｉｄｅ（登録商標）、Ｍｅｒｉａｌ  Ｉｎｃ．）を用いた成虫駆除剤処置を開始した。７月９日および７月１０日（３４日目、３５日目）に、２．５ｍｇ／ｋｇのメラルソミン二塩酸塩を用いた２回のＩＭ処置によって治療を続けた。その後９０日にわたり、循環しているｍｆを排除するために、イヌにミルベマイシンオキシム（ＭＯ）で１回、ＩＶＭで２回の治療を行った（表４を参照されたい）。成虫駆除剤の最終投与の４カ月後、１５９日目および１６０日目に、イヌに、２．５ｍｇ／ｋｇのメラルソミン二塩酸塩  ＩＭで再び治療を行った。その後の診断試験および殺マイクロフィラリア処置については、表４にまとめている。
【０１１８】
イヌ糸状虫抗原試験：イヌの治療期間中に、マイクロウェルＥＬＩＳＡ試験である、ＤｉｒｏＣｈｅｋ（登録商標）（Ｓｙｎｂｉｏｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＰｅｔＣｈｅｋ（登録商標）ＰＦ（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）、ならびに、診療所内での迅速な使用のために設計された膜形態の試験である、ＳＮＡＰ（登録商標）ＰＦ（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）を含む、数種類のイヌ糸状虫抗原試験を行った（表４を参照されたい）。
【０１１９】
Ｋｎｏｔｔの試験：９ｍｌの２％ホルマリンおよび（ＥＤＴＡ中に採取された）１ｍｌの血液を遠心管内で混合した。ＬＷ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＥＺ  Ｓｗｉｎｇ  ＳＫ遠心分離機内で３０００ｒｐｍ（６０４ｍ／ｓ２）で５分間遠心処理を行った。この上清液を捨てた。遠心管の底にあるペレットに０．１％のメチレンブルー溶液を１滴添加して、混合し、染色された混合物のうちの１滴を顕微鏡下でＤ．イミティスのｍｆについて検査した。表４は、この試験がいつ行われ、ミクロフィラリア血症のレベルがいつ決定されたかを示している。
【０１２０】
遺伝子解析：ｍｆの遺伝的調査のために、２０１０年５月１２日（７０６日目）に、ＥＤＴＡ中に血液試料（５ｍｌ）を採取した。血液は、高度にミクロフィラリア血症であった。５３匹の生存した個々のｍｆを血液試料から単離した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、個々のｍｆのゲノムＤＮＡを抽出し、その後、Ｒｅｐｌｉ−ｇ（登録商標）スクリーニングキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を用いて全ゲノムの増幅を行った。Ｐｇｐ−１−ｓｅｎｓｅ（５’  ｇｇａ  ｃａａ  ｔｔａ  ｔｃｃ  ｇｇｔ  ｇｇｔ  ｃａ  ３’）プライマー［配列番号２］およびＰｇｐ−１−ａｎｔｉｓｅｎｓｅ（５’  ｔｃｇ  ｃａａ  ａｔｔ  ｔｃｃ  ｔｔｃ  ｃａｃ  ｔｔ  ３’）［配列番号３］を使用して、Ｐ糖タンパク質（Ｐｇｐ）遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。本明細書に記載のように、Ｐ糖タンパク質中の配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位におけるＧＧの遺伝子型がＭＬに対する非感受性と相関しているのが認められた。変性を９４℃で４５秒間、アニーリングを５６℃で４５秒間、および伸長を６８℃で２分間、３５サイクル行った。増幅中にエラーが入るのを最小限に抑えるために、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）をＰＣＲ反応に使用した。１％アガロースゲルに通しての電気泳動によってＰＣＲ増幅を確認した。３７３０ＸＬ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｅｒシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を使用して、ＰＣＲ産物をシーケンスした。個々のクロマトグラムを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）４．７ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｌ）で解析した。
【０１２１】
Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の偏差：３つの遺伝子の合計１０個の異なる一塩基多型（ＳＮＰ）について、Ｗｒｉｇｈｔの階層的Ｆ−統計を計算した。上記で評価した、Ｐ糖タンパク質における２個のＳＮＰに加えて、さらなる８個のＳＮＰ（β−チューブリン遺伝子（アクセッション番号：ＨＭ５９６８５４−配列番号４）内の２個、および熱ショックタンパク質遺伝子（アクセッション番号：ＨＭ５９６８５１−配列番号５）内の６個）を、これらの部位で多型を示した、Ｄ．イミティスの遺伝子のベースライン情報を決定するために行われた以前の解析に基づいて調査した。
【０１２２】
統計解析：Ｆｉｓｈｅｒの正確確率検定を用いて遺伝子型頻度を比較した。
【０１２３】
結果
治療：２００８年７月におけるメラルソミン二塩酸塩の３用量の最終投与２日後（すなわち、３７日目）、イヌは、成虫のイヌ糸状虫の死と一致する一時的徴候（直腸温上昇、嗜眠、咳、肺音増大）を示した。４１日目に開始して、これらの徴候を、プレドニゾン（Ａｐｏ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ；Ａｐｏｔｅｘ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）、１．３ｍｇ／ｋｇ、１日２回で６日間管理した。
【０１２４】
７４日目に経口で０．７４ｍｇ／ｋｇのミルベマイシンオキシム（ＭＯ）、９５日目に経口で５０ｕｇ／ｋｇのＩＶＭ、および１２５日目に経口で２００ｕｇ／ｋｇ（４×通常のミクロフィラリア用量）のＩＶＭの投与後、このイヌは、断続的にミクロフィラリア血症のままであった。メラルソミン二塩酸塩の第２の治療レジメン（１５９日目および１６０日目）の６週間後、２０７日目に、Ｋｎｏｔｔの試験は依然として陽性であり、そのため、このイヌに、経口で２００μｇ／ｋｇのＩＶＭで再び治療を行った。１カ月後、２４２日目に、Ｄ．イミティス抗原試験は陰性であり、これにより、このイヌに成虫はいないことが確認された。しかし、このイヌは、依然としてミクロフィラリア血症であった。したがって、２４３日目に開始して、このイヌに、０．７４ｍｇ／ｋｇのＭＯを経口で２週間に１回、計４回投与した（表４を参照されたい）。これにもかかわらず、２９８日目に、このイヌはミクロフィラリア血症のままであった。したがって、２９８、３１２、３２６、３４０および３５４日目に、１．１ｍｇ／ｋｇのＭＯを経口で投与した。３５６日目に、このイヌから血液を採取して検査した：ｍｆは依然として存在しており、Ｄ．イミティス抗原試験は依然として陰性であった。３７５日目に、血液試料を、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｕｅｌｐｈ（ＡＨＬＵＧ）に送付した：ミクロフィラリア血症は、６５３０ｍｆ／ｍｌであり、抗原試験は依然として陰性であった（表４を参照されたい）。そのため、３８４日目に開始して、このイヌに、２．０ｍｇ／ｋｇのＭＯを経口で１回１日、７日間投与した。４２０日目に、このイヌは、３５５ｍｆ／ｍｌのミクロフィラリア血症を有していた。４２０日目に、このイヌに、経口で２．０ｍｇ／ｋｇのＭＯで再び治療を行い、これを１日１回、８日間継続した。この第２の高用量レジメンにもかかわらず、４８０日目に、依然としてイヌ糸状虫抗原試験で陰性反応を示したまま、このイヌは、１８１０ｍｆ／ｍｌのミクロフィラリア血症を有していた。
【０１２５】
遺伝子解析：７０６日目に、このイヌから血液を採取し、血液中のミクロフィラリアを遺伝子解析のために単離した。４２８日目および７０６日目の間、このイヌに、大環状ラクトンでの治療を行っていない。Ｐｇｐ遺伝子におけるＧＧ−ＧＧ遺伝子型の頻度は、血液試料から単離された生存しているｍｆにおいて４５．３％であった。ＧＧ−ＧＧ遺伝子型とは、配列番号１の第１１位および第６１８位に相当する部位におけるＰｇｐの遺伝子型を指す］
【０１２６】
Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の偏差：Ｆ係数は、異なるＳＮＰについて０．２３から１まで変化し、この個体群におけるホモ接合性の過剰性が示唆された（図６）。特に、ホモ接合性の過剰性は、ＰｇｐのＳＮＰではきわめて高かった（０．８８および１のＦ係数）。
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
考察
ＭＬに感受性であることが知られている、イヌのｍｆまたは成虫のＤ．イミティスは、０から１８．５％までの範囲に及ぶ、Ｐｇｐ遺伝子におけるＧＧ−ＧＧ遺伝子型の頻度を有していたのに対して、（インビトロアッセイにより）最もＩＶＭ耐性のｍｆは、５１．３％のＧＧ−ＧＧ頻度を有しており、この遺伝子型の頻度は、ＩＶＭに対する非感受性のレベルときわめて高く相関したことが見出された。ここに記載している症例のｍｆにおいて、ＧＧ−ＧＧ遺伝子型頻度は、４５．３％であった（感受性のイヌの感染のｍｆと比較してｐ＝０．００２、実施例１において報告したように、種々の感受性の感染の成虫と比較して、ｐ＝０．０００００６）。実施例１において見出された、Ｐｇｐ遺伝子型とＩＶＭ反応性表現型との間の相関は、インビボでの感受性を反映しているようであり、記載した症例のｍｆにおけるＩＶＭに対する高レベルの非感受性を示唆する。ＰｇｐのＳＮＰのホモ接合性についての高い過剰性は、薬剤の圧力の結果としての特定のＰｇｐ遺伝子型の選択と一致している。ＭＯおよびＩＶＭは、それぞれ５００μｇ／ｋｇおよび５０μｇ／ｋｇでｍｆを死滅させることが以前に示されている。しかし、この症例において使用した薬剤レジメンのうち、用量を増加させても、または複数の治療プロトコルを使用しても（例えば、２．０ｍｇ／ｋｇで８日間のＭＯ）、ｍｆを取り除けるものはなかった。ＭＬ非感受性と相関することが示された治療反応性表現型および遺伝子型により、このイヌにおけるＤ．イミティスのＭＬ耐性について結論づけることができる。
【０１２９】
２つの治療シナリオ、３．５カ月齢より上の成長期のＤ．イミティスを有するイヌに対するＭＬ予防薬の投与、およびミクロフィラリア血症のイヌに対するイヌ糸状虫予防薬の投与は、Ｄ．イミティスにおけるＭＬ耐性の発達をもたらす可能性があることが示唆されている。耐性は、伝染がより激しく、それ故に薬剤の圧力がより高い地域において生じるようである。予防は、薬剤が有効であるならば、イヌ糸状虫感染を制御するための確かに最良のツールのままである。というのは、ＭＬイヌ糸状虫予防薬に対する反応性の欠如についての散発的な報告があり、ＭＬ耐性のＤ．イミティスに感染したのは、ここに記載の症例のイヌだけではないであろうと考える根拠があるからである。したがって、ＭＬ耐性の蔓延についての調査が至急に必要とされている。これに関して、ここに、およびＢｏｕｒｇｕｉｎａｔらに記載の遺伝子型アッセイは、有用となり得る。ＭＬ耐性のＤ．イミティスを制御するために、新しい戦略が開発される必要があり得る。調査は、この遺伝子型が特異的に集中しているのか、またはより一般的なものなのかどうかを示すものでなければならない；そうした知識は、可能性のある代替制御戦略の開発および使用を導くために重要となり得る。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
本明細書に引用されているすべての刊行物および特許出願は、各個の刊行物または特許出願が参照により本明細書に組み込むものとして具体的に個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込む。いずれの刊行物の引用もその開示について出願日より前であり、本発明が従来の発明の効力によってこうした刊行物に先行する権利がないことを容認するものとして解釈されるべきではない。
【０１３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「該（ｔｈｅ）」は、文脈中にそうでないことが明確に示されていない限り、複数を含む。他で定義されていない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
【０１３３】
上記の発明は、明確な理解のために図および例を通していくらか詳細に記載されているが、本発明の教示に鑑み、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく特定の変更および改変がこれになされ得ることは当業者に容易に明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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