(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のアンチセンスｍｉＲ−２１を含む、結腸直腸癌を伴う患者を治療するための医薬組成物であって、患者は対照と比較して低下したｈＭＳＨ２発現を有し、低下したｈＭＳＨ２発現を有する患者がアンチセンスｍｉＲ−２１で処置されたのちにピリミジンアナログを投与されるように用いられることを特徴とし、ピリミジンアナログは５−フルオロウラシルである、医薬組成物。
【請求項２】
アンチセンスｍｉＲ−２１がロックト核酸（ＬＮＡ）をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
患者が、一次のピリミジンアナログ耐性である結腸直腸癌、獲得性のピリミジンアナログ耐性である結腸直腸癌、ミスマッチ修復タンパク質の欠損、ＩＩ期の結腸直腸癌、およびＩＩＩ期の結腸直腸癌からなる群から選択される少なくとも一つの状態を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
結腸直腸癌を治療するためのキットであって、癌は低下したｈＭＳＨ２タンパク質発現によって特徴づけられ、
ｈＭＳＨ２発現状態を同定するための手段、ならびに
医薬的に許容できる担体中の有効量のｍｉＲ−２１のアンタゴニストおよび有効量の５−フルオロウラシル
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Carlo M. Croce, Nicola Valeri
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、2010年11月12日に出願されたUnited States Provisional Application No. 61/413,180の利益を主張し、その開示内容を本明細書に援用する。本出願は、      に出願されたPCT Application No. の利益を主張し、その開示内容を本明細書に援用する。
【０００２】
配列リスト
[0002]  本出願は、ASCIIフォーマットでEFS-Webを介して提出した配列リストを含み、その全体を本明細書に援用する。2011年11月7日に作成した前記ASCIIコピーは53-52535_SEQ_LIST_OSURF 11085.txtという名称であり、3,139バイトのサイズのものである。
【０００３】
発明の分野
[0003]  本発明は一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は癌関連技術に関する。本発明の特定の観点には、ｍｉＲ−２１関連結腸直腸癌の診断、療法および予後における適用が含まれる。特に、ｍｉＲ２１、ミスマッチ修復、および結腸直腸癌について本明細書中で考察する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  結腸直腸癌（ＣＲＣ）は米国で最も発症頻度の高い癌のひとつであり、１４０，０００を超える新たな症例および約５０，０００人の死亡が２０１に起きると予想される。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に基づく化学療法は、アジュバント設定および転移設定の両方においてＣＲＣ処置のためのゴールドスタンダードである。しかし、ピリミジンアナログ処置に対する一次耐性または獲得耐性は、ＣＲＣ患者の管理における共通の問題である。これらの所見は、耐性機構のより良い理解およびより有効な療法の必要性を強調する。
【０００５】
[0005]  マイクロＲＮＡは、遺伝子発現および細胞恒常性の転写後調節因子として作用する一群の低分子非コードＲＮＡである。ｍｉＲ−２１の過剰発現は多くの固形悪性腫瘍および血液悪性腫瘍の共通の特色である。ｍｉＲ−２１の過剰発現は、ＣＲＣに罹患している患者からの血液および大便試料に見出されている。さらに、ｍｉＲ−２１の過剰発現は、ＩＩおよびＩＩＩ期ＣＲＣにおける５−ＦＵアジュバント化学療法による有益性が低いことと関連する。
【０００６】
[0006]  ミスマッチ修復（ＭＭＲ）系は、ＤＮＡ損傷の認識と修復に関与する。ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１はコアＭＭＲタンパク質として機能し、それぞれタンパク質ホモログｈＭＳＨ３またはｈＭＳＨ６およびｈＭＬＨ３またはｈＰＭＳ２とのヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体形成はＤＮＡ損傷認識のための基本であり、ＭＭＲタンパク質ホモログの安定性にとってきわめて重要な段階である。ＭＭＲタンパク質の欠損は、臨床試験において５−ＦＵアジュバント化学療法からの有益性が低いかまたは存在しないことと関連づけられている。ＭＭＲの障害は、５−ＦＵ代謝産物のＤＮＡへの取り込みを減少させて、５−ＦＵ処置後のＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを減少させることにつながると思われる。
【０００７】
[0007]  ｍｉＲ−２１の過剰発現は結腸直腸癌を含めた多数のヒト腫瘍に関連し、その際、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＴＧＦβＲＩＩおよびＢａｘを含めた腫瘍抑制遺伝子の発現が調節されると思われる。
【発明の概要】
【０００８】
[0008]  本発明は、ｍｉＲ−２１がコア−ミスマッチ修復（ＭＭＲ）認識タンパク質複合体ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６を標的として下方調節することを立証する。高レベルのｍｉＲ−２１を発現する結腸直腸腫瘍は、ｈＭＳＨ２タンパク質発現の低下を示す。ｍｉＲ−２１を過剰発現する細胞は、コアＭＭＲ構成要素欠損の特徴である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）誘導によるＧ２／Ｍ損傷停止およびアポトーシスの著しい低下を示す。さらに、異種移植研究は、ｍｉＲ−２１過剰発現が５−ＦＵの療法効果を劇的に低下させることを立証する。本研究は、ｍｉＲ−２１過剰発現に関連するＭＭＲミューテーター遺伝子の下方調節が結腸直腸癌における療法効果の重要な臨床指標となる可能性があることを示す。
【０００９】
[0009]  本発明は、少なくとも１つのアンチセンスｍｉＲＮＡおよび少なくとも１つの追加組成物を含む組成物を提供し、その際、アンチセンスｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２１であり、少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質を下方調節することができ、少なくとも１つの追加組成物はＭＭＲ関連疾患を処置するのに有用である。好ましくは、少なくとも１つの追加組成物は下記のものからなる群から選択される：化学療法剤；幹細胞；ＡＧ１４７８；ゲフィチニブ(gefitinib) (Iressa）；エルロチニブ(erlotinib) (Tarceva）；セツキシマブ(cetuximab）；パニツマブ(panitumab）；ザルツママブ(zalutumamab）；ニモツザマブ(nimotuzamab）；マツズマブ(matuzumab）；およびラパチニブ(lapatinib)。好ましくは、少なくとも１つのコアＭＭＲタンパク質は下記のものからなる群から選択される：ｈＭＳＨ１；ｈＭＳＨ６；およびｈＭＬＨ１。
【００１０】
[0010]  したがって本発明は、アンチセンスｍｉＲ−２１および５−フルオロウラシル、またはその医薬的に許容できる製剤を含む組成物を提供する。
[0011]  アンチセンスｍｉＲ−２１、およびヒトＭｕｔＳホモログ２を増加させるための手段、またはその医薬的に許容できる製剤を含む組成物も提供される。
【００１１】
[0012]  アンチセンスｍｉＲ−２１、および結腸直腸癌を処置する化合物、またはその医薬的に許容できる製剤を含む組成物も提供される。
[0013]  センスまたはアンチセンスｍｉＲ−２１およびピリミジンアナログを含む組成物も提供される。
【００１２】
[0014]  ピリミジンアナログが５−フルオロウラシルである組成物も提供される。
[0015]  本発明は、請求項４に記載の組成物を含むキットを提供する。
[0016]  ｈＭＳＨ２発現状態を同定するための手段をさらに含むものも提供される。
【００１３】
[0017]  ｈＭＳＨ２発現状態を同定するための手段が抗体であるキットも提供される。
[0018]  可能性のある結腸直腸癌処置剤として被験化合物をスクリーニングするための指示をさらに含むキットも提供される。
【００１４】
[0019]  本発明は、ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞に、過少発現を低減する量のアンチセンスｍｉＲ−２１を導入することを含む、少なくとも１つのヒト細胞に影響を及ぼす方法を提供する。
【００１５】
[0020]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞が少なくとも１つの結腸直腸癌細胞である方法も提供される。
[0021]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞がインビトロに存在する方法も提供される。
【００１６】
[0022]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞がインサイチュに存在する方法も提供される。
[0023]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞がインビボに存在する方法も提供される。
【００１７】
[0024]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞のアポトーシスを生じさせる方法も提供される。
[0025]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞が、腫瘍を形成する多数の細胞である方法も提供される。
【００１８】
[0026]  アンチセンスｍｉＲ−２１を導入した後に腫瘍のサイズが縮小する方法も提供される。
[0027]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞に５−フルオロウラシルを導入することをさらに含む方法も提供される。
【００１９】
[0028]  ｈＭｕｔＳＨ２を過少発現する少なくとも１つの細胞に５−フルオロウラシルを導入することをさらに含む方法も提供される。
[0029]  本発明は、一次または獲得性のピリミジンアナログ耐性である結腸直腸癌を伴う患者にアンチセンスｍｉＲ−２１を投与することを含む、一次または獲得性のピリミジンアナログ耐性である結腸直腸癌を伴う患者を処置する方法を提供する。
【００２０】
[0030]  患者のｈＭＳＨ２が下方調節されている方法も提供される。
[0031]  追加の結腸直腸癌アジュバントまたは処置を患者に施すことをさらに含む方法も提供される。
【００２１】
[0032]  ５−フルオロウラシルを患者に投与することをさらに含む方法も提供される。
[0033]  ＩＩ期またはＩＩＩ期の結腸直腸癌を伴う患者にアンチセンスｍｉＲ−２１を投与することを含む、ＩＩ期またはＩＩＩ期の結腸直腸癌を伴う患者を処置する方法も提供される。
【００２２】
[0034]  患者のｈＭＳＨ２が下方調節されている方法も提供される。
[0035]  追加の結腸直腸癌アジュバントまたは処置を患者に施すことをさらに含む方法も提供される。
【００２３】
[0036]  ５−フルオロウラシルを患者に投与することをさらに含む方法も提供される。
[0037]  本発明は、ａ）結腸直腸癌を伴う患者のｈＭＳＨ２発現が低下しているかどうかを同定すること、およびｂ）患者のｈＭＳＨ２発現が低下している場合には、その患者をアンチセンスｍｉＲ−２１で処置することを含む、結腸直腸癌を伴う患者を処置する方法を提供する。
【００２４】
[0038]  本発明は、ａ）結腸直腸癌を伴う患者のｈＭＳＨ２発現が対照と比較して低下しているかどうかを同定すること、およびｂ）患者のｈＭＳＨ２発現が低下している場合には、その患者をアンチセンスｍｉＲ−２１で処置することを含む、結腸直腸癌を伴う患者を処置する方法を提供する。
【００２５】
[0039]  本発明は、ａ）結腸直腸癌を伴う患者のｈＭＳＨ２発現が対照と比較して低下しているかどうかを同定すること、ｂ）結腸直腸癌を伴う患者のｍｉＲ−２１発現が対照と比較して増大しているかどうかを同定すること、およびｃ）対照と比較して患者のｍｉＲ−２１発現が増大している場合および患者のｈＭＳＨ２発現が低下している場合には、その患者をアンチセンスｍｉＲ−２１で処置することを含む、結腸直腸癌を伴う患者を処置する方法を提供する。
【００２６】
[0040]  本発明は、ａ）被験化合物ならびにアンチセンスおよび／またはセンスｍｉＲ−２１をｈＭＳＨ２発現細胞に導入すること、およびｂ）ｈＭＳＨ２発現細胞に影響を及ぼすのに有用な被験化合物を同定することを含む、有用な化合物を同定する方法を提供する。
【００２７】
[0041]  本発明は、ａ）細胞被験試料におけるｈＭＳＨ２およびｍｉＲ−２１の状態を対照と関連付けること、およびｂ）癌細胞試料の状態を同定することを含む、癌細胞試料の状態を同定する方法を提供する。
【００２８】
[0042]  本発明は、ａ）結腸直腸癌細胞を含む被験試料におけるｈＭＳＨ２およびｍｉＲ−２１の状態を対照と関連付けること、およびｂ）結腸直腸癌細胞試料の状態を予測することを含む、結腸直腸癌細胞試料の状態を予測する方法を提供する。
【００２９】
[0043]  本発明は、ａ）生物由来の被験試料におけるｈＭＳＨ２およびｍｉＲ−２１状態を対照と関連付けること、およびｂ）生物の状態を同定することを含む、生物の癌の状態を同定する方法を提供する。
【００３０】
[0044]  本発明は、ａ）生物由来の被験試料におけるｈＭＳＨ２およびｍｉＲ−２１の状態を対照と関連付けること、およびｂ）生物の結腸直腸癌の状態を同定することを含む、生物の結腸直腸癌の状態を予測する方法を提供する。
【００３１】
[0045]  本発明は、５−フルオロウラシル耐性である結腸直腸癌細胞にＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを阻害する量のアンチセンスｍｉＲ−２１を導入することを含む、５−フルオロウラシル耐性である結腸直腸癌細胞におけるＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを阻害する方法を提供する。
【００３２】
[0046]  本発明は、５−フルオロウラシル耐性である結腸直腸癌細胞に炎症を阻害する量のアンチセンスｍｉＲ−２１を導入することを含む、５−フルオロウラシル耐性である結腸直腸癌細胞における炎症を阻害する方法を提供する。
【００３３】
[0047]  添付の図面を考慮して読むと、以下の好ましい態様の詳細な記述から、当業者には本発明の種々の観点が明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
[0048]  この特許または出願のファイルは、着色した１以上の図面および／または１以上の写真を含みうる。着色した図面（複数可）および／または写真（複数可）を含むこの特許または特許出願の公開明細書のコピーは、申請し必要な手数料を支払えば特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１−１】[0049]  図１Ａ〜１Ｄ．  ＭＳＨ２およびＭＳＨ６はｍｉＲ−２１の直接の標的である。  [0050]  図１Ａ：ｈＭＳＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびｈＭＳＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）３’ＵＴＲのｍｉＲ−２１推定シード領域(seed region)（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２および１４）を示す。
【図１−２】[0051]  図１Ｂ：Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ６２０を、ｍｉＲ−２１、スクランブルｍｉＲ(scrambled-miR)、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２または抗−ＭＳＨ６で４８時間、一過性トランスフェクションした。ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲにより分析した。
【図１−３】[0052]  図１Ｃ：ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６両方のｍｉＲ−２１依存性下方調節のウェスタンブロット分析。トランスフェクションは（図１Ｂ）と同様であった。  [0053]  図１Ｄ：高い内因レベルのｍｉＲ−２１を含むＨＣＴ−１１６、ＳＷ４８０およびＲＫＯ細胞を、ＬＮＡ  抗−ｍｉＲ−２１または抗−ｍｉＲ対照で４８時間トランスフェクションし、続いてｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６プロテインをウェスタンブロット分析した。
【図１−４】Ｅ：それぞれ、ルシフェラーゼ遺伝子の下流にｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ３’ＵＴＲをサブクローニングし（それぞれ、ＭＳＨ２−Ｌｕｃ−ＷＴおよびＭＳＨ６−Ｌｕｃ−ＷＴ）、同様に、ｍｉＲ−２１標的部位を欠失したｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ３’ＵＴＲをサブクローニングし（ＭＳＨ２−Ｌｕｃ−変異体およびＭＳＨ６−Ｌｕｃ−変異体）、ｍｉＲ−２１またはスクランブルｍｉＲと共トランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を２４時間後に記録した。データは、４つの独立したトランスフェクションからの少なくとも３つの測定値の平均およびＳ．Ｄ．を表わす。＊  ｐ＜０．０１。
【図２−１】[0054]  図２Ａ．ＭＭＲコアタンパク質ｈＭＳＨ２の発現はＣＲＣ試料中のｍｉｒ−２１発現と逆相関する。  [0055]  図２Ａ：パラフィン包埋、ホルマリン固定したＣＲＣ組織を、ＬＮＡ−プローブ抗−ｍｉＲ−２１またはスクランブルプローブ、およびｈＭＳＨ２に対するＩＨＣ抗体と共にインキュベートした。代表的な写真をＮｕａｎｃｅシステムソフトウェアで撮影した。ｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２の両方について染色が陽性であったＣＲＣ試料を示す。青および赤の染色は、それぞれｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２タンパク質を同定する。
【図２−２】[0056]図２Ｂ：新鮮凍結ヒト結腸直腸組織からＲＮＡおよびタンパク質を抽出した。一連のヒトＣＲＣにおいて、ｍｉＲ−２１発現をノーザンブロット法により評価し、ＭＭＲタンパク質発現をウェスタンブロット法により評価した。
【図３−１】[0057]  図３．  ｍｉＲ−２１は５−ＦＵ誘導によるアポトーシスをインビトロで阻害する。  [0058]  ＳＷ６２０およびＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、４８時間の血清飢餓によりＧ０−Ｇ１に同期化した。次いで細胞をトリプシン処理し、計数し、スクランブルｍｉＲ、ｍｉＲ−２１、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２またはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクションし、１０％のＦＢＳを含有する培地に再播種した。解除後１６時間（Ｓ期に入る直前であるがｐ５３仲介Ｇ１−Ｓ細胞周期チェックポイント後の時点に対応する）で、５−ＦＵを添加した。５−ＦＵ投与の４８時間後に、細胞周期を分析した。Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシス（準Ｇ１）細胞の割合の定量結果を示し、３つの独立したトランスフェクションからの３つの測定値の平均およびＳ．Ｄ．を表示する。＊  ｐ＜０．００１。
【図３−２】[0057]  図３．  ｍｉＲ−２１は５−ＦＵ誘導によるアポトーシスをインビトロで阻害する。  [0058]  ＳＷ６２０およびＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、４８時間の血清飢餓によりＧ０−Ｇ１に同期化した。次いで細胞をトリプシン処理し、計数し、スクランブルｍｉＲ、ｍｉＲ−２１、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２またはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクションし、１０％のＦＢＳを含有する培地に再播種した。解除後１６時間（Ｓ期に入る直前であるがｐ５３仲介Ｇ１−Ｓ細胞周期チェックポイント後の時点に対応する）で、５−ＦＵを添加した。５−ＦＵ投与の４８時間後に、細胞周期を分析した。Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシス（準Ｇ１）細胞の割合の定量結果を示し、３つの独立したトランスフェクションからの３つの測定値の平均およびＳ．Ｄ．を表示する。＊  ｐ＜０．００１。
【図４−１】[0059]  図４．  ｍｉＲ−２１仲介５−ＦＵ耐性は、ｈＭＳＨ２ダウンモジュレーションに依存する。  [0060]  Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞を４８時間の血清飢餓によりＧ０−Ｇ１に同期化し、ｍｉＲ−対照、ｍｉＲ−２１、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２、ｓｉＲＮＡ−対照を全長ｈＭＳＨ２  ｃＤＮＡ（ｍｉＲ−２１シード領域を含むものまたは含まないもの）をコードするベクターと共にトランスフェクションした。５−ＦＵ投与の４８時間後に細胞周期を分析した。Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞（青色棒）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞（桃色棒）両方のＧ２／Ｍ停止およびアポトーシス（準Ｇ１）細胞の割合の定量結果を示し、３つの独立した実験からの２つの測定値の平均およびＳ．Ｄ．を表示する（＊  ｐ＜０．００１）。
【図４−２】[0059]  図４．  ｍｉＲ−２１仲介５−ＦＵ耐性は、ｈＭＳＨ２ダウンモジュレーションに依存する。  [0060]  Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞を４８時間の血清飢餓によりＧ０−Ｇ１に同期化し、ｍｉＲ−対照、ｍｉＲ−２１、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２、ｓｉＲＮＡ−対照を全長ｈＭＳＨ２  ｃＤＮＡ（ｍｉＲ−２１シード領域を含むものまたは含まないもの）をコードするベクターと共にトランスフェクションした。５−ＦＵ投与の４８時間後に細胞周期を分析した。Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞（青色棒）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞（桃色棒）両方のＧ２／Ｍ停止およびアポトーシス（準Ｇ１）細胞の割合の定量結果を示し、３つの独立した実験からの２つの測定値の平均およびＳ．Ｄ．を表示する（＊  ｐ＜０．００１）。
【図５−１】[0061]  図５Ａ〜５Ｃ．  ｍｉＲ−２１はインビボで５−ＦＵに対する耐性を引き起こす。  [0062]  Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞を、ｍｉＲ−２１またはｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで安定感染させた。対照として、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞に空のベクターを感染させた。ヌードマウスにＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−空（ｎ＝６）、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−ｍｉＲ−２１（ｎ＝６）、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−抗−ＭＳＨ２（ｎ＝６）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）−空（ｎ＝６）を注射した。異種移植体が触知可能な体積になった時点で、５−ＦＵを週に連続５日間、２週間、腹腔内注射により投与した（灰色領域）。腫瘍体積を処置前、次いで週１回、測定した。個々の相対腫瘍体積(relative tumor volume)（ＲＴＶ）を下記に従って計算した：ＲＴＶ＝Ｖｘ／Ｖ１、ここでＶｘは所定の時点の体積（立法ミリメートル）であり、Ｖ１は処置開始時点の体積である。結果を各グループのマウスについて腫瘍体積の変化の平均パーセントとしてＳ．Ｄ．と共に表示する。  [0063]  図５Ａ：摘出した腫瘍におけるｈＭＳＨ２タンパク質発現のウェスタン分析。  [0064]  図５Ｂ：６週目の代表的な腫瘍異種移植片。  [0065]  図５Ｃ：５−ＦＵ処理中および処理後の腫瘍増殖。
【図５−２】[0061]  図５Ａ〜５Ｃ．  ｍｉＲ−２１はインビボで５−ＦＵに対する耐性を引き起こす。  [0062]  Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞を、ｍｉＲ−２１またはｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２のいずれかをコードするレンチウイルスベクターで安定感染させた。対照として、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞に空のベクターを感染させた。ヌードマウスにＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−空（ｎ＝６）、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−ｍｉＲ−２１（ｎ＝６）、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−抗−ＭＳＨ２（ｎ＝６）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）−空（ｎ＝６）を注射した。異種移植体が触知可能な体積になった時点で、５−ＦＵを週に連続５日間、２週間、腹腔内注射により投与した（灰色領域）。腫瘍体積を処置前、次いで週１回、測定した。個々の相対腫瘍体積(relative tumor volume)（ＲＴＶ）を下記に従って計算した：ＲＴＶ＝Ｖｘ／Ｖ１、ここでＶｘは所定の時点の体積（立法ミリメートル）であり、Ｖ１は処置開始時点の体積である。結果を各グループのマウスについて腫瘍体積の変化の平均パーセントとしてＳ．Ｄ．と共に表示する。  [0063]  図５Ａ：摘出した腫瘍におけるｈＭＳＨ２タンパク質発現のウェスタン分析。  [0064]  図５Ｂ：６週目の代表的な腫瘍異種移植片。  [0065]  図５Ｃ：５−ＦＵ処理中および処理後の腫瘍増殖。
【図６−１】[0066]  図６Ａ〜６Ｂ  [0067]  図６Ａ：Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ６２０を、ｍｉＲ−２１、スクランブルｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２または抗−ＭＳＨ６で４８時間、一過性トランスフェクションした。ｍｉＲ−２１発現をリアルタイムＰＣＲにより評価した。  [0068]  図６Ｂ：タンパク質発現をデンシトメトリー分析により測定した。棒は３回の実験の平均およびＳ．Ｄ．を示す。＊  Ｐ＜０．０５。
【図６−２】[0066]  図６Ａ〜６Ｂ  [0067]  図６Ａ：Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ６２０を、ｍｉＲ−２１、スクランブルｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２または抗−ＭＳＨ６で４８時間、一過性トランスフェクションした。ｍｉＲ−２１発現をリアルタイムＰＣＲにより評価した。  [0068]  図６Ｂ：タンパク質発現をデンシトメトリー分析により測定した。棒は３回の実験の平均およびＳ．Ｄ．を示す。＊  Ｐ＜０．０５。
【図７−１】[0069]  図７Ａ−７Ｃ  [0070]  ＨＣＴ−１１６、ＳＷ４８０およびＲＫＯ細胞を、ｍｉＲ−２１に対するＬＮＡ（抗−ｍｉＲ−２１）またはＬＮＡ対照でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡおよびタンパク質を採取した。  [0071]  図７Ａ：対照と比較した抗−ｍｉＲ−２１トランスフェクションした細胞におけるリアルタイムＰＣＲにより分析したｍｉＲ−２１発現。  [0072]  図７Ｂ：タンパク質発現をデンシトメトリー分析により測定した。  [0073]  図７Ｃ：ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析。棒は３回の実験の平均およびＳ．Ｄ．を示す。＊  Ｐ＜０．０５。
【図７−２】[0069]  図７Ａ−７Ｃ  [0070]  ＨＣＴ−１１６、ＳＷ４８０およびＲＫＯ細胞を、ｍｉＲ−２１に対するＬＮＡ（抗−ｍｉＲ−２１）またはＬＮＡ対照でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡおよびタンパク質を採取した。  [0071]  図７Ａ：対照と比較した抗−ｍｉＲ−２１トランスフェクションした細胞におけるリアルタイムＰＣＲにより分析したｍｉＲ−２１発現。  [0072]  図７Ｂ：タンパク質発現をデンシトメトリー分析により測定した。  [0073]  図７Ｃ：ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析。棒は３回の実験の平均およびＳ．Ｄ．を示す。＊  Ｐ＜０．０５。
【図８】[0074]  図８  [0075]  高いｍｉＲ−２１発現および低いｈＭＳＨ２発現を示す例の散乱プロットおよび回帰曲線＋信頼区間（赤色）。  [0076]  腫瘍組織および正常な隣接組織において、ｍｉＲ−２１をノーザンブロット法により分析し、ｈＭＳＨ２をウェスタンブロット分析により分析した。グラフにはｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２を腫瘍組織と正常組織の比として表わす。相関性は−０．８１である。９５％信頼区間：−０．９６〜−０．２５、ｐ＜０．０２。
【図９】[0077]  図９  [0078]  ＳＷ６２０およびＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、４８時間の血清飢餓によりＧ０−Ｇ１に同期化した。次いで細胞をトリプシン処理し、計数し、スクランブルｍｉＲ、ｍｉＲ−２１、ｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２またはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクションし、１０％のＦＢＳを含有する培地に再播種した。解除後１６時間（Ｓ期に入る直前であるがｐ５３仲介Ｇ１−Ｓ細胞周期チェックポイント後の時点に対応する）で、５−ＦＵ（５０ｕｇ／ｍｌ）を添加した。４８時間後に、ＦＡＣＳ分析によりアポトーシス細胞の割合を分析し、続いてヨウ化プロピジウムおよびＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色した。図はＧ２／Ｍ停止およびアポトーシス（準Ｇ１）細胞の割合を示す。データは、少なくとも３つの独立した実験からの平均およびＳ．Ｄ．を表わす。＊  ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
配列リストの簡単な記述
[0079]  本出願は、EFS-webを介して提出した配列リストを含み、その全体を本明細書に援用する。2011年11月7日に作成したそのASCIIコピーは53-52535_SEQ_LIST_OSURF 11085.txtという名称であり、3,139バイトのサイズのものである。
【００３６】
【表１】
0005931897.tif 000002
【００３７】
発明の詳細な説明
[0080]  ＭｉＲ−２１は、一般に結腸直腸癌を含めた多数のヒト腫瘍に過剰発現する。近年、癌の進行を促進する可能性のある幾つかのｍｉＲ−２１腫瘍抑制標的が同定されている。本発明者らは、ｍｉＲ−２１を過剰発現する結腸直腸腫瘍細胞とｈＭＳＨ２腫瘍抑制タンパク質を発現するものとの間の逆相関性をここに見出した。さらに本発明者らは、ｍｉＲ−２１はｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６両方のｍＲＮＡの３’−ＵＴＲを直接標的として、タンパク質発現の著しい下方調節をもたらすと思われると決定した。
【００３８】
[0081]  結腸直腸癌の療法処置の技術水準には、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）が含まれる。５−ＦＵは、フルオロヌクレオチドのＲＮＡおよびＤＮＡへの誤った取り込み、またチミジル酸シンセターゼ（ＴＳ）酵素を標的とすることによりヌクレオチド合成を阻害することにより、その細胞毒性効果を発揮する。ＴＳ過剰発現、５−ＦＵ代謝の欠損、ＴＰ５３変異、およびＭＭＲ系の障害はすべて、５−ＦＵ耐性の特徴であり、臨床転帰の予測因子である。より最近になって、マイクロＲＮＡおよび遺伝子発現の両方の分析によって、アジュバント化学療法を受けたＩＩおよびＩＩＩ期ＣＲＣ患者における５−ＦＵの有益性を予測する際の、より高いレベルの複雑さが解明された。事実、５−ＦＵアナログで処置したＩＩおよびＩＩＩ期ＣＲＣ患者の後向き分析は、高いｍｉＲ−２１発現を伴う患者の生存率が低いことを示した。同じ所見はＩＩＩ期ＣＲＣ患者のみのサブグループで確認されたが、ＩＩ期ＣＲＣ患者は統計的に有意な相関性を示さなかった。少ない患者数が、この後者の結果を説明する可能性がある。ＭＭＲ機構の遺伝的またはエピジェネティックなな欠損をもつ細胞は、Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシスの欠損の結果として５−ＦＵ代謝産物に耐性であると思われる。
【００３９】
[0082]  本発明は、細胞モデルおよび異種移植腫瘍モデルの両方においてｍｉＲ−２１によるｈＭＳＨ２の下方調節が５−ＦＵ耐性を誘導することを示す。合わせて考えると、本発明の結果は、ｍｉＲ−２１腫瘍状態は５−ＦＵ治療効果の重要な指標となる可能性があることを示す。
【００４０】
[0083]  ｍｉＲ−２１は多数の細胞周期および腫瘍抑制遺伝子を調節すると思われる。本発明はまた、ｈＭＳＨ２の下方調節が５−ＦＵ耐性の発現において中心的役割を果たすことを示す。事実、５−ＦＵ誘導によるアポトーシスおよびＧ２／Ｍ停止のｍｉＲ−２１による阻害は、ｓｉＲＮＡ仲介による選択的なｈＭＳＨ２阻害により引き起こされるものに匹敵していた。さらに、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞をｍｉＲ−２１でトランスフェクションしても細胞周期停止またはアポトーシスは変化せず、これはｍｉＲ−２１誘導による効果がｈＭＳＨ２発現に依存することを立証する。合わせて考えると、本発明の結果は、ｍｉＲ−２１の阻害が５−ＦＵ耐性を克服するための相乗的処置であることを示す。
【００４１】
[0084]  本発明はまた、ｍｉＲ−２１依存性のｈＭＳＨ２−ｈＭＳＨ６下方調節は一次または獲得性の両方の５−ＦＵ耐性に関与することを示す。臨床試験において、５−ＦＵは通常は４８時間にわたる連続注入として投与される。興味深いことに、ｍｉＲ−２１発現は５−ＦＵに連続曝露された細胞株において増大するように思われる。本発明を考慮して、本発明者らは、この過剰発現は二次的な耐性機構の可能性があり、細胞は５−ＦＵの細胞毒性を克服するためにｍｉＲ−２１過剰発現を獲得すると主張する。大腸癌および卵巣癌において５−ＦＵまたはシスプラチンを含めた一次化学療法の後にｈＭＳＨ２が下方調節される頻度が高いことを考慮すれば、さらに臨床的な関連性が存在する。
【００４２】
[0085]  要約すると、本発明者らは、結腸直腸腫瘍におけるｍｉＲ−２１の過剰発現による５−ＦＵ薬物耐性が、コアＭＭＲタンパク質ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６を直接に下方調節し、最終的に損傷誘導性のＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスの欠損に導くことを示した。
【００４３】
[0086]  定義および略号
[0087]  ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
[0088]  ｍＲＮＡ    メッセンジャーＲＮＡ
[0089]  ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
[0090]  ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ    マイクロＲＮＡ前駆体
[0091]  ｑＲＴ−ＰＣＲ    定量逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
[0092]  ＲＮＡ    リボ核酸
[0093]  上記の全般的な記述および以下の詳細な記述は共に例示および説明にすぎず、本発明の教示の範囲を限定するためのものではないことを理解すべきである。本願において、単数形の使用は、具体的に別に記載しない限り複数形を含む。
【００４４】
[0094]  別に明記しない限り、技術用語は一般的な使用に従って用いられる。分子生物学における一般的用語の定義は下記にある：Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)。
【００４５】
[0095]  本発明の種々の態様の概説を容易にするために、下記の特定の用語の説明を提示する。
[0096]  補助療法：一次処置の効果を向上させるために一次処置と組み合わせて用いられる処置。
【００４６】
[0097]  臨床転帰：疾患もしくは障害に対する処置後または無処置における患者の健康状態を表わす。臨床転帰には、死亡までの時間の長さの延長、死亡までの時間の長さの短縮、生存の見込みの増大、死亡のリスクの増大、生存率、無病生存率、慢性疾患、転移、進行したかまたは侵攻性の疾患、疾患再発、死亡、および療法に対する応答の良好または不良が含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
[0098]  生存率の低下：本明細書中で用いる場合、“生存率の低下”は、患者が死亡するまでの期間の短縮、または患者が死亡するリスクの増大を表わす。
[0099]  発現レベルの検出：たとえば、“ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ発現のレベルを検出すること”は、試料中に存在するｍｉＲまたはｍｉＲＮＡの量を定量することを表わす。特定のｍｉＲまたはいずれかのマイクロＲＮＡの発現の検出は、当技術分野で既知であるかまたは本明細書に記載するいずれかの方法を使用して、たとえばｑＲＴ−ＰＣＲにより、達成できる。ｍｉＲの発現の検出は、成熟形態のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ発現と相関する前駆体形態のいずれかの発現の検出を含む。一般に、ｍｉＲＮＡ検出方法は、配列特異的検出、たとえばＲＴ−ＰＣＲによるものを伴う。当技術分野で既知であり、本明細書中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯに提示される、前駆体および成熟ｍｉＲ核酸配列を用いて、ｍｉＲ特異的なプライマーおよびプローブを設計することができる。
【００４８】
[00100]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：遺伝子発現を調節する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは一般に２１〜２３ヌクレオチドの長さである。マイクロＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写体からプロセシングされて、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる短いステム−ループ構造体になり、最後に機能性成熟マイクロＲＮＡになる。成熟マイクロＲＮＡは１以上のメッセンジャーＲＮＡ分子に対して部分的に相補的であり、それらの主機能は遺伝子発現を下方調節することである。マイクロＲＮＡはＲＮＡｉ経路により遺伝子発現を調節する。
【００４９】
[00101]  ｍｉＲ発現：本明細書中で用いる場合、“低いｍｉＲ発現”および“高いｍｉＲ発現”は、試料中にみられるｍｉＲＮＡのレベルを表わす相対的用語である。ある態様において、低いおよび高いｍｉＲ発現は、対照試料と被験試料のグループにおけるｍｉＲＮＡレベルの比較により決定される。その際、試料中のｍｉの発現が平均または中央ｍｉＲ発現レベルより上である（高い）かまたは下である（低い）かどうかに基づいて、各試料に低い発現および高い発現を割り当てることができる。個々の試料について、高いまたは低いｍｉＲ発現は、試料を高いまたは低い発現をもつことが知られている対照または基準試料と比較することにより、あるいは標準値と比較することにより決定できる。低いおよび高いｍｉＲ発現には、前駆体形態もしくは成熟形態のいずれかのｍｉＲＮＡ、または両方の発現を含めることができる。
【００５０】
[00102]  患者：本明細書中で用いる場合、用語“患者”には、ヒトおよび非ヒト動物が含まれる。処置のための好ましい患者はヒトである。“患者”および“対象”は本明細書中で互換的に用いられる。
【００５１】
[00103]  医薬的に許容できるビヒクル：本発明に有用な医薬的に許容できる担体（ビヒクル）は一般的なものである。Remington' s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)に、１つ以上の療法用の化合物、分子または薬剤の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００５２】
[00104]  一般に、担体の性質は、採用する特定の投与様式に依存するであろう。たとえば、非経口製剤には通常は、医薬的および生理的に許容できる流体、たとえば水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどをビヒクルとして含む注射用流体が含まれる。固体組成物（たとえば、散剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）については、一般的な無毒性固体担体には、たとえば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含めることができる。生物学的に中性である担体のほかに、投与される医薬組成物は少量の無毒性補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、たとえば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。
【００５３】
[00105]  疾患を予防、処置または改善すること：疾患を“予防すること”は、疾患の完全発症を阻止することを表わす。“処置すること”は、疾患が発症し始めた後にその徴候もしくは症状または病的状態を改善する療法介入を表わす。“改善すること”は、疾患の徴候もしくは症状の数または重症度を軽減することを表わす。
【００５４】
[00106]  スクリーニング：本明細書中で用いる場合、“スクリーニング”は、そのような疾患に作用する候補薬剤を評価および同定するために用いるプロセスを表わす。当技術分野で既知であり、本明細書中に記載される多数の技術のいずれか１つを用いて、たとえばマイクロアレイ分析により、またはｑＲＴ−ＰＣＲにより、マイクロＲＮＡの発現を定量することができる。
【００５５】
[00107]  低分子：一般に約１０００ダルトン未満、またはある態様においては約５００ダルトン未満の分子量をもつ分子であって、標的分子の活性を測定可能なある程度で調節できる分子。
【００５６】
[00108]  治療的（Therapeutic）：診断と処置の両方を含む一般用語。
[00109]  治療剤：対象に適正に投与された際に、所望の治療的効果または予防効果を誘導できる化合物、低分子、または他の組成物、たとえばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
【００５７】
[00110]  本明細書中で用いる場合、“候補薬剤”または“被験化合物”は、それが治療剤として機能できるかどうかを決定するスクリーニングのために選択される化合物である。“インキュベートすること”は、ある薬剤が細胞または組織と相互作用するのに十分な時間を含む。“接触させること”は、固体または液体の形態の薬剤を細胞または組織と共にインキュベートすることを含む。細胞または組織をある薬剤で“処置すること”は、その薬剤を細胞または組織と接触させるか、またはそれらと共にインキュベートすることを含む。
【００５８】
[00111]  治療的有効量：特定した医薬または治療剤で処置される対象または細胞において所望の効果を達成するのに十分な薬剤量。薬剤の有効量は幾つかの要因に依存し、それには処置される対象または細胞、および治療的組成物の投与様式が含まれるが、それらに限定されない。
【００５９】
[00112]  本発明方法のある態様において、対照を用いることが望ましい。それに関して、対照は同一患者から得た非癌組織試料、または健康な対象、たとえば健康な組織ドナーから得た組織試料であってもよい。別の例において、対照は歴史的な値から計算された培養した標準品である。腫瘍試料および非癌組織試料は、当技術分野で既知であるいずれかの方法に従って得ることができる。たとえば、腫瘍試料および非癌試料は切除術を受けた癌患者から得ることができ、あるいはそれらは皮下注射針を用いる摘出により、顕微手術により、またはレーザー捕捉により得ることができる。対照（非癌）試料は、たとえば屍体ドナーから、または健康なドナーから得ることができる。
【００６０】
[00113]  ある態様において、スクリーニングは候補薬剤／被験化合物を細胞と接触させることを含む。細胞は患者から得た初代細胞であってもよく、あるいは細胞は不死化またはトランスフォームした細胞であってもよい。
【００６１】
[00114]  候補薬剤／被験化合物は、いずれかのタイプの薬剤、たとえばタンパク質、ペプチド、低分子、抗体または核酸であってもよい。ある態様において、候補薬剤はサイトカインである。ある態様において、候補薬剤は低分子である。スクリーニングには、ハイスループットスクリーニング、および個別または小グループの候補薬剤のスクリーニングの両方が含まれる。
【００６２】
[00115]  マイクロＲＮＡの検出
[00116]  本発明のある方法において、試料中に存在するｍｉＲＮＡを同定することが望ましい。
【００６３】
[00117]  マイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ）および成熟ｍｉＲＮＡの配列は、たとえばｍｉＲＢａｓｅデータベースにより公開されており、Sanger Instituteによりオンラインで入手できる(参照：Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res. 36: D154-D158, 2008; Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Res. 34: D140-D144, 2006;およびGriffiths-Jones, Nucleic Acids Res. 32: D109-D111, 2004)。本発明に開示する好ましいファミリーメンバーの前駆体および成熟形態の配列は本明細書に提示されている。
【００６４】
[00118]  ＲＮＡ発現の検出および定量は、当技術分野で周知である多数の方法(たとえば、U.S. Patent Application Publication No. 2006/0211000および2007/0299030を参照；本明細書に援用する)および以下に記載する方法のいずれか１つにより達成できる。ＲＮＡファミリーメンバーの既知の配列を用いて、以下に記載する検出方法に用いるための特異的なプローブおよびプライマーを適宜設計することができる。
【００６５】
[00119]  ある場合には、ＲＮＡ検出方法は、核酸を試料、たとえば細胞または組織試料から単離することを必要とする。ＲＮＡ、具体的にはｍｉＲＮＡを含めた核酸を、当技術分野で既知のいずれか適切な手法で単離することができる。たとえば、フェノールを基本とする抽出は、ＲＮＡを単離するための一般的方法である。フェノールを基本とする試薬は、細胞および組織の破壊ならびにその後の夾雑物からのＲＮＡ分離のための、変性剤およびＲＮａｓｅ阻害剤の組合わせを含有する。フェノールを基本とする単離方法は、１０〜２００ヌクレオチドの範囲のＲＮＡ種（たとえば、前駆体および成熟ｍｉＲＮＡ、５Ｓおよび５．８ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ならびにＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ））を回収することができる。さらに、抽出法（ＴＲＩＺＯＬＴＭまたはＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴＴＭを用いるものなど）はすべての高分子および低分子ＲＮＡを精製し、ｍｉＲＮＡおよび低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含有する生物試料から全ＲＮＡを単離するための効率的な方法である。
【００６６】
[00120]  ある態様において、マイクロアレイの使用が望ましい。マイクロアレイは、核酸、タンパク質、低分子、細胞または他の物質の顕微的な規則的アレイであって、複雑な生化学的試料の並行分析を可能にするものである。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体に化学的に付着された、捕捉プローブとして知られる種々の核酸プローブから構成され、支持体はマイクロチップ、スライドガラス、またはマイクロスフェアサイズのビーズであってもよい。マイクロアレイは、たとえば多数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）および／またはｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に測定するために使用できる。
【００６７】
[00121]  マイクロアレイは、先の細いピンでスライドガラス上にプリントすること、予め作製したマスクを用いるフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラー装置を用いるフォトリソグラフィー、インクジェットプリンティング、または微小電極アレイ上での電気化学を含めた多様な技術を用いて作製できる。
【００６８】
[00122]  ｍｉＲＮＡのマイクロアレイ分析は、たとえば（これらの方法は、改変した形でいずれのＲＮＡ分析にも使用できるが）当技術分野で既知のいずれかの方法に従って達成できる（たとえば、PCT Publication No. WO 2008/054828; Ye et al., Nat. Med. 9(4): 416-423, 2003; Calin et al., N. Engl. J. Med. 353(17): 1793-1801, 2005を参照；これらのそれぞれを本明細書に援用する）。一例において、ＲＮＡを細胞または組織試料から抽出し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて低分子ＲＮＡ（１８〜２６ヌクレオチドのＲＮＡ）を全ＲＮＡからサイズ選択する。オリゴヌクレオチドリンカーを低分子ＲＮＡの５’および３’末端に付加し、得られたライゲーション生成物をＲＴ−ＰＣＲ反応の鋳型として用いて１０サイクルの増幅を行なう。センス鎖ＰＣＲプライマーはその５’末端に付加された発蛍光団をもち、これによりＰＣＲ生成物のセンス鎖を蛍光標識する。ＰＣＲ生成物を変性させ、次いでマイクロアレイにハイブリダイズさせる。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に対して相補的な、標的核酸と呼ばれるＰＣＲ生成物は、その捕捉プローブが固定されているスポットに塩基対合によりハイブリダイズするであろう。次いで、マイクロアレイレーザースキャナーを用いて励起すると、そのスポットは蛍光を発するであろう。次いで、特定のｍｉＲＮＡのコピー数に関して、多数の陽性および陰性対照ならびにアレイデータ正規化方法を用いて各スポットの蛍光強度を評価し、その結果特定のｍｉＲＮＡの発現レベルが評価されるであろう。
【００６９】
[00123]  別態様において、細胞または組織試料から抽出した低分子ＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡを含む）を含む全ＲＮＡを低分子ＲＮＡのサイズ選択なしにそのまま使用し、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび蛍光標識した短いＲＮＡリンカーを用いて３’末端を標識する。ＲＮＡ試料を３０℃で２時間のインキュベーションにより標識し、続いてＴ４  ＲＮＡリガーゼを８０℃で５分間、熱不活性化する。アレイ上の対応するｍｉＲＮＡ捕捉プローブ配列に対して相補的な蛍光標識ｍｉＲＮＡは、捕捉プローブが固定されているスポットに塩基対合によりハイブリダイズするであろう。マイクロアレイのスキャンおよびデータ処理を前記に従って実施する。
【００７０】
[00124]  使用できる幾つかのタイプのマイクロアレイがあり、これにはスポッテッド−オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、プレファブリケーテッド−オリゴヌクレオチドマイクロアレイ、およびスポッテッド−長鎖オリゴヌクレオチドアレイが含まれる。スポッテッド−オリゴヌクレオチドマイクロアレイにおいて、捕捉プローブはｍｉＲＮＡ配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドである。このタイプのアレイは一般に、２つの異なる発蛍光団で標識した比較すべき２試料（たとえば、非癌組織、および癌組織または試料組織）からのサイズ選択した低分子ＲＮＡの増幅ＰＣＲ生成物とハイブリダイズする。あるいは、低分子ＲＮＡ画分（ｍｉＲＮＡを含む）を含む全ＲＮＡを２試料から抽出し、低分子ＲＮＡのサイズ選択なしにそのまま使用し、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび２つの異なる発蛍光団で標識した短いＲＮＡリンカーを用いて３’末端を標識する。試料を混合し、単一のマイクロアレイにハイブリダイズさせ、次いでそれをスキャンし、上方調節および下方調節されたｍｉＲＮＡ遺伝子を１回のアッセイで視覚化することができる。
【００７１】
[00125]  プレファブリケーテッド−オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたは単チャネル−マイクロアレイにおいて、プローブは既知または推定ｍｉＲＮＡの配列に一致するように設計される。完全ゲノムを網羅する市販の設計がある（たとえば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔから）。これらのマイクロアレイは遺伝子発現の絶対値の推定を与え、したがって２条件の比較には２つの別個のマイクロアレイの使用が必要である。
【００７２】
[00126]  スポッテッド−長鎖オリゴヌクレオチドアレイは５０〜７０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド捕捉プローブから構成され、インクジェットまたはロボット式プリンティングにより作製される。短鎖オリゴヌクレオチドアレイは２０〜２５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブから構成され、フォトリソグラフィー合成（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）またはロボット式プリンティングにより作製される。
【００７３】
[00127]  ある態様において、定量ＲＴ−ＰＣＲの使用が望ましい。定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）はポリメラーゼ連鎖反応の改変であり、ポリメラーゼ連鎖反応の生成物の量を迅速に測定するために用いられる。ｑＲＴ−ＰＣＲは一般に、ｍｉＲなどの遺伝子配列が試料中に存在するかどうかを決定し、もしそれが存在するならば試料中のコピー数を決定する目的で用いられる。ｍｉＲＮＡを含めた核酸分子の発現を決定できるＰＣＲ法はいずれも本発明の範囲に含まれる。ｑＲＴ−ＰＣＲ法の幾つかの変法が当技術分野で知られており、それらのうち３つを以下に記載する。
【００７４】
[00128]  定量ポリメラーゼ連鎖反応の方法には、アガロースゲル電気泳動、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（二本鎖ＤＮＡ色素）の使用、および蛍光レポータープローブの使用によるものが含まれるが、これらに限定されない。後２つはリアルタイムで分析できる。
【００７５】
[00129]  アガロースゲル電気泳動について、未知試料、および既知濃度の類似サイズの増幅用標的ＤＮＡ断片を含む既知試料を調製する。両反応を同じ長さの時間、同一条件で行なう（好ましくは、同じプライマー、または少なくとも同様なアニーリング温度のプライマーを使用）。アガロースゲル電気泳動を用いて、反応の生成物をそれらの元のＤＮＡおよび余分なプライマーから分離する。既知試料と未知試料の相対量を測定して、未知試料の量を決定する。
【００７６】
[00130]  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素の使用はアガロースゲル法より正確であり、結果をリアルタイムで得ることができる。ＤＮＡ結合色素はすべての新たに合成された二本鎖ＤＮＡを結合し、蛍光強度の増大が測定されるので、初期濃度を決定できる。しかし、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎは何らかの予期せぬＰＣＲ生成物およびプライマー二量体を含めてすべての二本鎖ＤＮＡを標識し、その結果、混乱およびアーチファクトの可能性が生じる。この反応は、蛍光性二本鎖ＤＮＡ色素を添加して通常どおり調製される。反応を実施し、蛍光レベルをモニターする（この色素は二本鎖ＤＮＡに結合した場合にのみ蛍光を発する）。標準試料または標準曲線を基準として、ＰＣＲにおける二本鎖ＤＮＡ濃度を決定することができる。
【００７７】
[00131]  蛍光レポータープローブ法は、すべての二本鎖ＤＮＡではなくプローブ配列のみを定量するために、配列特異的な核酸に基づくプローブを使用する。それは一般に、隣接位置に保持された蛍光レポーターおよびクエンチャーを含むＤＮＡに基づくプローブ（いわゆる二重標識プローブ）を用いて実施される。レポーターがクエンチャーに近接していると、その蛍光発生が阻止される；蛍光が検出されるのはプローブが分解した際のみである。このプロセスは、関与するポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。
【００７８】
[00132]  リアルタイム定量ＰＣＲ反応は、二重標識プローブを添加して調製される。二本鎖ＤＮＡ鋳型が変性すると、プローブは鋳型ＤＮＡの目的領域内のその相補配列に結合できる。ＰＣＲ反応混合物を加熱してポリメラーゼを活性化すると、ポリメラーゼはプライミングされた一本鎖鋳型ＤＮＡに対する相補鎖を合成し始める。重合が継続するのに伴って、それはその相補配列に結合しているプローブに到達し、次いでポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性のため加水分解され、これにより蛍光レポーター分子とクエンチャー分子が分離する。その結果、蛍光が増大し、それを検出する。リアルタイムＰＣＲ反応の温度サイクリングに際して、各ＰＣＲサイクル中に加水分解された二重標識プローブから放出される蛍光の増大をモニターし、これによってＤＮＡの最終量、したがって初期量の精確な決定が可能になる。
【００７９】
[00133]  ある態様において、インサイチュハイブリダイゼーションの使用が望ましい。インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸ハイブリダイゼーションの技術を単細胞レベルに適用して外挿し、細胞化学、免疫細胞化学および免疫組織化学の技術と組み合わせて、維持および同定すべき形態の維持および細胞マーカーの同定を行なうことができ、配列を集団、たとえば組織および血液試料内の特定の細胞に位置決定することができる。ＩＳＨは、相補的核酸を用いて、１以上の特定の核酸配列を組織の一部または切片に（インサイチュ）、あるいは組織が十分に小さければ全組織に（全マウントＩＳＨ）位置決定するタイプのハイブリダイゼーションである。ＲＮＡ  ＩＳＨを用いて、組織における発現パターン、たとえばｍｉＲＮＡの発現をアッセイすることができる。
【００８０】
[00134]  試料細胞または組織を処理してそれらの透過性を高め、プローブ、たとえばｍｉＲＮＡ特異的プローブが細胞に侵入できるようにする。処理した細胞にプローブを添加し、適切な温度でハイブリダイズさせ、過剰のプローブを洗浄除去する。相補的プローブを放射性、蛍光性または抗原性タグで標識し、これにより、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡検査またはイムノアッセイを用いて組織中のプローブの位置および量を決定することができる。試料は本明細書に記載するいずれかの試料、たとえば非癌組織試料または癌組織試料であってもよい。ｍｉＲ−１５５ファミリーメンバーの配列は既知であるので、プローブがｍｉＲ−１５５を特異的に結合するようにｍｉＲ−１５５プローブを設計できる。
【００８１】
[00135]  ある態様において、インサイチュＰＣＲの使用が望ましい。インサイチュＰＣＲはＩＳＨ前の標的核酸配列のＰＣＲに基づく増幅である。ＲＮＡの検出のために、インサイチュＰＣＲの前に細胞内逆転写段階を導入してＲＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡを作製する。これによって低コピーのＲＮＡ配列の検出が可能になる。
【００８２】
[00136]  インサイチュＰＣＲの前に、細胞または組織試料を固定し、透過処理して、形態を保存しかつＰＣＲ試薬が細胞内の増幅すべき配列に到達できるようにする。次いで、懸濁状態に保持した無傷細胞において、または直接に細胞遠心調製物もしくはスライドガラス上の組織切片において、標的配列のＰＣＲ増幅を実施する。前者の方法では、ＰＣＲ反応混合物中に懸濁した固定された細胞を、一般的なサーマルサイクラーを用いて温度サイクリングする。ＰＣＲの後、細胞をスライドガラス上に細胞遠心し、細胞内ＰＣＲ生成物をＩＳＨまたは免疫組織化学により視覚化する。スライドガラス上でのインサイチュＰＣＲは、試料にカバーガラス下でＰＣＲ混合物を積層し、次いで反応混合物の蒸発を阻止するためにこれをシールすることにより実施される。温度サイクリングは、一般的または特別に設計されたサーマルサイクラーの加熱ブロック上に直接にスライドガラスを置くことにより、あるいは温度サイクリングオーブンを用いることにより、達成できる。
【００８３】
[00137]  細胞内ＰＣＲ生成物の検出は、一般に２つの異なる手法のうちの一方により達成される；ＰＣＲ生成物特異的プローブを用いるＩＳＨによる間接インサイチュＰＣＲ、またはＩＳＨを用いずに温度サイクリングに際してＰＣＲ生成物に取り込まれた標識ヌクレオチド（たとえば、ジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、３Ｈ−ＣＴＰまたはビオチン−１６−ｄＵＴＰ）の直接検出による直接インサイチュＰＣＲ。
【００８４】
[00138]  予後の予測マーカーとしての、および治療剤同定のための、差示発現するｍｉＲおよびｍｉＲＮＡの使用。本明細書に、ｍｉＲ−１５５の特定の発現パターンが、状態指標と共に、特定の患者の生存予後の予測因子であることを開示する。本明細書中で用いる場合、“予後不良”は、一般に生存率の低下、または言い換えると死亡のリスクの増大または死亡までの期間の短縮を表わす。予後不良は、疾患の重症度の増大、たとえば他の臓器への癌の拡散（転移）の増大を表わすこともできる。他の態様において、各マーカーは対照と比較して少なくとも１．５倍の発現増大または低下を示す。１態様において、予後不良は野生型腫瘍対照像と比較して少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、または少なくとも４倍のマーカーの増加または減少によって示される。
【００８５】
[00139]  候補薬剤をスクリーニングして疾患を処置するための治療剤を同定する方法は当技術分野で周知である。ＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを検出する方法は当技術分野で既知であり、本明細書に記載されており、たとえばマイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲを含む）、インサイチュハイブリダイゼーション、インサイチュＰＣＲ、およびノーザンブロット分析であるが、これらに限定されない。１態様において、スクリーニングにはハイスループットスクリーニングが含まれる。別の態様において、候補薬剤は個別にスクリーニングされる。
【００８６】
[00140]  候補薬剤は、いずれかのタイプの分子、たとえば核酸分子、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、低分子、化学物質、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、または癌の疾患状態（複数可）を直接または間接的に変化させることができる他のいずれのタイプの分子であってもよいが、これらに限定されない。
【００８７】
[00141]  一般に、内因性遺伝子、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡは細胞において調節される。特定の態様において、核酸配列は表１に挙げる１以上のｍｉＲＮＡ配列に対して核酸配列が少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％同一である少なくとも１つのセグメントを含む。内因性遺伝子、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡの発現またはプロセシングの調節は、ｍＲＮＡのプロセシングの調節による可能性があり、そのようなプロセシングには細胞内での転写、輸送および／または翻訳が含まれる。調節は、細胞、組織または臓器についてのｍｉＲＮＡ活性の阻害または増強により行なわれる可能性もある。そのようなプロセシングは、コードされる生成物の発現またはｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす可能性がある。さらに他の態様において、核酸配列は修飾された核酸配列を含むことができる。特定の観点において、１以上のｍｉＲＮＡ配列は修飾された核酸塩基または核酸配列を含む（include or comprise）ことができる。
【００８８】
[00142]  本発明の方法において、細胞または他の生物体、たとえば生物（患者を含む）に、細胞内に入った時点で対応するｍｉＲＮＡとして機能する核酸分子を投与することにより、ｍｉＲＮＡ、または特定のｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ分子をその細胞または生物に供給できることは理解されるであろう。細胞に供給される分子の形態は、細胞内に入った時点でｍｉＲＮＡとして作用する形態でなくてもよい。したがって、ある態様において、生物体に合成ｍｉＲＮＡまたは非合成ｍｉＲＮＡ、たとえば細胞のｍｉＲＮＡプロセシング機構に到達した時点でプロセシングされて成熟した活性ｍｉＲＮＡになるものを供給することが考慮される。特定の態様において、具体的には、生物体に供給されたｍｉＲＮＡ分子が成熟ｍｉＲＮＡ分子ではなく、ｍｉＲＮＡプロセシング機構に到達できる状態になった時点でプロセシングされて成熟ｍｉＲＮＡになることができる核酸分子であることが考慮される。ｍｉＲＮＡに関して、用語“非合成”は、そのｍｉＲＮＡが本明細書中で定める“合成されたもの”ではないことを意味する。さらに、合成ｍｉＲＮＡの使用に関する本発明の態様において、対応する非合成ｍｉＲＮＡの使用も本発明の観点として考慮され、逆も成り立つと考えられる。ある薬剤を“供給すること”という用語が薬剤を患者に“投与すること”を含めて用いられることは理解されるであろう。
【００８９】
[00143]  特定の態様において、方法には細胞または生物においてｍｉＲＮＡを標的として調節することも含まれる。用語“ｍｉＲＮＡを標的として調節すること”は、選択したｍｉＲＮＡを調節するために本発明の核酸が用いられることを意味する。ある態様において、調節は、標的としたｍｉＲＮＡに対応する合成または非合成ｍｉＲＮＡを用いて達成され、これにより、標的としたｍｉＲＮＡを細胞または生物に効果的に供給する（正の調節）。他の態様において、調節はｍｉＲＮＡ阻害剤を用いて達成され、これにより、細胞または生物において標的としたｍｉＲＮＡを効果的に阻害する（負の調節）。
【００９０】
[00144]  ある態様において、標的とされ調節されるｍｉＲＮＡは疾患、状態または経路に影響を及ぼすｍｉＲＮＡである。特定の態様において、そのｍｉＲＮＡが標的とされるのは、標的とされしたｍｉＲＮＡの負の調節により処置を提供できるからである。他の態様において、そのｍｉＲＮＡが標的とされるのは、標的とされしたｍｉＲＮＡの正の調節により処置を提供できるからである。
【００９１】
[00145]  本発明の特定の方法には、標的としたｍｉＲＮＡの調節に関連する処置を必要とするかあるいは本明細書中に述べた生理的または生物学的結果（たとえば、細胞生存性の低下のような特定の細胞経路または結果に関連するもの）を必要とする細胞、組織、臓器または生物（“生物体”と総称）に、選択したｍｉＲＮＡ調節剤を投与するというさらなる工程がある。したがって、本発明のある方法には、ｍｉＲＮＡ調節剤（複数可）により提供できる処置を必要とする患者を同定する工程がある。ある態様において、有効量のｍｉＲＮＡ調節剤を投与できると考えられる。特定の態様において、生物体に付与される治療的利益があり、ここで、“治療的利益”は、疾患または状態に関連する１以上の状態または症状の改善、あるいは疾患に関する予後、持続時間、または状態の改善を表わす。治療的利益には痛みの軽減、罹患率の低下、症状の軽減が含まれるが、これらに限定されないと考えられる。たとえば、癌に関して、治療的利益は下記であってもよいと考えられる：腫瘍増殖の阻害、転移の阻止、転移数の低減、癌細胞増殖の阻害、癌細胞増殖の阻害、癌細胞における細胞死の誘導、癌細胞付近の血管新生の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、痛みの軽減、再発のリスクの軽減、癌細胞の化学物質感受性もしくは放射線感受性の誘導、寿命の延長、および／または癌と直接もしくは間接的に関連する死亡の遅延。
【００９２】
[00146]  さらに、ｍｉＲＮＡ組成物を療法の一部として、伝統的な療法または予防剤と併せて、患者に供給できると考えられる。さらに、療法に関して述べたいずれかの方法を、特に、潜在的にその療法を必要とするかまたは療法を必要とする状態もしくは疾患のリスクがあると同定された患者に予防的に適用できると考えられる。
【００９３】
[00147]  さらに、本発明の方法は、ｍｉＲＮＡに対応する１以上の核酸、および治療薬を使用することに関する。その核酸は、薬の効果もしくは有効性を増強し、いずれかの副作用もしくは毒性を軽減し、その生物学的利用能を改変し、および／または必要な投与量もしくは頻度を減らすことができる。特定の態様において、治療薬は癌療法剤である。したがって、ある態様において、患者の癌を処置する方法であって、癌療法剤、および癌療法剤の有効性を改善するかまたは非癌細胞を保護する有効量の少なくとも１つのｍｉＲＮＡ分子を患者に投与することを含む方法がある。癌療法は、化学物質および放射線の両方に基づく処置との多様な併用療法も含む。併用化学療法にはたとえば下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ベバシズマブ(bevacizumab)、シスプラチン(cisplatin) (CDDP)、カルボプラチン(carboplatin)、ＥＧＦＲ阻害剤(ゲフィチニブ(gefitinib)およびセツキシマブ(cetuximab))、プロカルバジン(procarbazine)、メクロレタミン(mechlorethamine)、シクロホスファミド(cyclophosphamide)、カンプトテシン(camptothecin)、COX-2阻害剤(たとえばセレコキシブ(celecoxib))、イホスファミド(ifosfamide)、メルファラン(melphalan)、クロラムブシル(chlorambucil)、ブスルファン(busulfan)、ニトロソウレア(nitrosurea)、ダクチノマイシン(dactinomycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、ドキソルビシン(doxorubicin)(アドリアマイシン(adriamycin))、ブレオマイシン(bleomycin)、プリコマイシン(plicomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、エトポシド(etoposide) (VP16)、タモキシフェン(tamoxifen)、ラロキシフェン(raloxifene）、エストロゲン受容体結合剤、タキソール(taxol)、タキソテール(taxotere)、ゲムシタビエン(gemcitabien)、ナベルビン(navelbine)、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチン(transplatinum)、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン(vincristin)、ビンブラスチン(vinblastin)およびメトトレキセート(methotrexate)、または以上のいずれかの類似体もしくは誘導バリアント。
【００９４】
[00148]  一般に、ｍｉＲＮＡの阻害剤を投与して、成熟ｍｉＲＮＡに対応する核酸分子を投与した場合と比較して反対の効果を達成することができる。同様に、成熟ｍｉＲＮＡに対応する核酸分子を投与して、ｍｉＲＮＡ阻害剤を投与した場合と比較して反対の効果を達成することができる。たとえば、細胞増殖を増大させるｍｉＲＮＡ分子を細胞に供給して増殖を増大させることができ、あるいはそのような分子の阻害剤を細胞に供給して細胞増殖を低下させることができる。本発明は、本明細書に開示する種々のｍｉＲＮＡ分子およびｍｉＲＮＡ阻害剤についてみられる種々の生理的効果に関して、これらの態様を考慮する。これらには下記の生理的効果が含まれるが、それらに限定されない：細胞増殖の増大または低下、アポトーシスの増大または低下、トランスフォーメーションの増大、細胞生存性の増大または低下、生存細胞数の減少または増加、ならびに細胞周期の特定の時期における細胞数の増加または減少。本発明方法は一般に、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ分子に対応する１つ以上の異なる核酸分子を供給または導入することを含むと考えられる。下記の、少なくとも下記の、または最大で下記の数の異なる核酸分子を供給または導入することができると考えられる: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはその中で派生できるいずれかの範囲。これは、細胞に供給または導入することができる異なるｍｉＲＮＡ分子数にも適用される。
【００９５】
[00149]  本発明の原理および実施様式をその好ましい態様において説明および例示した。ただし、本発明はその範囲から逸脱することなく、具体的に説明および例示したものとは別の形で実施できることが理解されなければならない。
【実施例】
【００９６】
[00150]  実施例
[00151]  実施例１
[00152]  材料および方法
[00153]  細胞培養およびトランスフェクション
[00154]  Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ、ＳＷ６２０、ＳＷ４８０、ＨＣＴ−１１６およびＲＫＯ結腸直腸癌（ＣＲＣ）細胞（American Type Culture Collection  ＡＴＣＣ，バージニア州マナッサス）をＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ，カリフォルニア州カールズバッド）中で培養し、パッケージング細胞２９３ＴＮ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州マウンテンビュー）をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，カリフォルニア州カールズバッド）中で増殖させた。Ｌｏｖｏ＋ｃｈｒ２ｈＭＳＨ２＋／２およびＬｏｖｏ（ＤＴ４０．２）−４−１ｈＭＳＨ２２／２  １を、７００ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ，カリフォルニア州カールズバッド）中で増殖させた。すべての細胞に１０％のウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）＋抗生物質を補充した。細胞をマイコプラズマ汚染について定期的に検査し、常に陰性であった。細胞を６ウェルプレート内でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を用いて製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクションした。過剰発現試験のために、特異的ｍｉＲＮＡまたは対照オリゴヌクレオチド前駆体をＡｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）から購入し、５０ｎＭで用いた。ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６に対するオンターゲット−プラスｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，ＣＯ）を対照として用いた。サイレンシング実験のために、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡＴＭ抗−ｍｉＲ−２１または対照ｍｉＲＣＵＲＹノックダウンプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ，デンマーク、Ｖｅｄｂａｅｋ）を５０ｎＭで用いた。ｍｉＲＮＡ発現を、４８時間後に、以下に記載する定量リアルタイムＰＣＲにより確認した。全長ＭＳＨ２  ｃＤＮＡをコードするプラスミドをＯｒｉｇｅｎｅから購入した。ｍｉＲ−２１シード領域に対するｈＭＳＨ２変異体をＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州サンディエゴ）により調製した（表２）。
【００９７】
【表２】
0005931897.tif 000003
【００９８】
[00155]  ルシフェラーゼアッセイ
[00156]  ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６の３’−ＵＴＲ内の推定ｍｉＲＮＡ結合部位を、以下のようにホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングした。ＳＷ−４８０細胞に由来する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡを、それぞれｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６クローニングのための特異的プライマー（表２）を用いるＰＣＲにより増幅した。次いで生成物をＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチュセッツ州イプスウィッチ）で消化し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の終止コドンの直下流にＳｐｅＩおよびＳａｃＩＩ部位を有するように予め改変したｐＧＬ３対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ワイオミング州マディソン）に挿入した。変異ｍｉＲＮＡ認識配列を含むレポーター構築体をそれぞれの単一遺伝子について構築した（ＭＵＴ−２１）。ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６の両方のｍｉＲ−２１のシード領域について、シード領域相補的部位を除外するために推定ｍｉＲＮＡ結合部位の上流または下流に配置したプライマーを用いて、変異構築体を得た。
【００９９】
[00157]  Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ４８０細胞を、１２ウェルプレートにおいて、１μｇのｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼレポーター対照ベクター、０．１μｇのｐｈＲＬ−ＳＶ４０対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ワイオミング州マディソン）、および５０ｎＭのｍｉＲＮＡ、対照前駆体、ｍｉＲ−２１に対するＬＮＡ、またはＬＮＡ対照で、共トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてホタルおよびウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ活性を連続測定した。
【０１００】
[00158]  ウェスタンブロット法
[00159]  イムノブロット分析のために、氷冷した細胞溶解用緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，マサチュセッツ州ダンバース）で細胞を溶解した。等量のタンパク質を、４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液に溶解して混合し、４％−２０％および７．５％直線勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で電気泳動し、ニトロセルロース膜またはＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。膜をＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水，ｐＨ７．４（０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含有）中の５％脱脂粉乳でブロッキングし、製造業者の指示に従って一次および二次抗体と共にインキュベートした。下記の一次抗体を用いた：マウスモノクローナル抗−ＭＳＨ２（１：２００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マウスモノクローナル抗−ＭＳＨ６（１：５００，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州サンノゼ）、マウスモノクローナル抗アクチン（１：５０００，Ｓｉｇｍａ）、マウスモノクローナル抗−ＧＡＰＤＨ（１：１０００，ＳａｎｔａＣｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１０１】
[00160]  成熟ｍｉＲＮＡおよび遺伝子についてのリアルタイムＰＣＲ
[00161]  全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離した。成熟ｍｉＲＮＡを単一チューブＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡアッセイにより評価し、一方、目的とするｍＲＮＡの発現を遺伝子発現アッセイにより下記のプローブを用いて評価した：ｈＭＳＨ２＝Ｈｓ００９５３５２３＿ｍ１、ｈＭＳＨ６＝Ｈｓ００９４３００１＿ｍ１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティー）。ｍｉＲＮＡ発現をＲＮＵ４４およびＲＮＵ４８の発現に対して正規化した。遺伝子発現をビンキュリン(vinculin)に対して正規化した。すべてのレトロトランスクリプターゼ（ＲＴ）反応（鋳型なし対照およびＲＴマイナス対照を含む）を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内で実施した。別に明記しない限り、各試料を三連で試験した。
【０１０２】
[00162]  ノーザンブロット法
[00163]  成熟ｍｉＲＮＡ検出のために、前記２のようにアクリルアミドノーザンブロット法を実施した。
【０１０３】
[00164]  ホルマリン固定、パラフィン包埋した組織切片のｍｉＲＮＡロックト核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）インサイチュハイブリダイゼーション
[00165]  ５０の正常および癌の大腸コアを含む大腸癌組織アレイ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＢＣ０５１１８）上で、前記３のようにインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によりマイクロＲＮＡ検出を二連で実施した。陰性対照はプローブの除外およびスクランブルＬＮＡプローブの使用を含んだ。ｍｉＲＮＡについてのインサイチュハイブリダイゼーションの後、ｈＭＳＨ２（Ｖｅｎｔａｎａ  ｃａｔ  ＃７６０−４２６５）に最適な条件を用いてスライドを免疫組織化学分析した。免疫組織化学のために、本発明者らはＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（アリゾナ州タクソン）のＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄシステムを用いた。代表的スポットの写真をＮｕａｎｃｅシステム（Ｖｅｎｔａｎａ）で撮影した。癌のコアを、コア内の陽性細胞数に基づいてｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２タンパク質の発現について採点した。
【０１０４】
[00166]  組織採取
[00167]  ８３の一連のＣＲＣ症例からの腫瘍組織および正常隣接組織に由来する新鮮凍結組織を、Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori（イタリア、Meldola）において倫理委員会の承認後に採集した。タンパク質およびＲＮＡ抽出のための細胞溶解物を上記のように抽出した。
【０１０５】
[00168]  細胞周期分析およびアポトーシス分析
[00169]  ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色：細胞をトリプシンで剥離させ、冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−５％  ＦＣＳで洗浄し、次いで７０％エタノール中で２４時間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１ｇ／ｍｌのＰＩと共に２５℃で３時間インキュベートした後、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，カリフォルニア州フラートン）によりＦＡＣＳ分析した。細胞のＤＮＡ含量が＜２Ｎである場合にはそれらをアポトーシスとみなした。アネキシンＶ染色：細胞をトリプシンで剥離させ、ＰＢＳ−５％  ＦＣＳで洗浄し、次いで０．１４ＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣ１２および０．０１ＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ｐＨ７．４）を含有する結合用緩衝液に入れ、これに７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）およびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）を添加した後、ＦＡＣＳ分析した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ陽性および７−ＡＡＤ陰性である場合には、細胞をアポトーシスとみなした。
【０１０６】
[00170]  同期実験を以下のように実施した：Ｌｏｖｏ−ＭＳＨ２陽性、Ｌｏｖｏ−ＭＳＨ２陰性、ＳＷ６２０およびＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞を、集密化および４８時間４の低血清処理によってＧ０−Ｇ１に停止させることにより同期し、次いで細胞をトリプシンで解離させ、計数し、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−対照、Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１、ｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−対照、および全長ＭＳＨ２  ｃＤＮＡをコードするベクター（ｍｉＲ−２１シード領域を含むもの、または含まないもの）で、Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ  ＭＥ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、製造業者の指示に従ってトランスフェクションし、１０％のＦＢＳを含有する培地に再播種した。解除後１６時間目（Ｓ期進入直前であるがｐ５３仲介Ｇ１−Ｓ細胞周期チェックポイント後の時点に相当する）に５−フルオロウラシル（５０ｕｇ／ｍｌ  ５）添加を行なった。
【０１０７】
[00171]  ｍｉＲ−２１を過剰発現する安定クローンの作製
[00172]  Ｌｏｖｏ−ＭＳＨ２陽性およびＬｏｖｏ−ＭＳＨ２陰性細胞に、２つの異なるプロモーターの制御下にある全長ｍｉＲ−２１およびＧＦＰ遺伝子を含むｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｍｉＲＮＡ発現プラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州マウンテンビュー）を安定感染させた。空のベクターを対照として用いた。Ｐｒｅ−ｍｉＲ−２１発現構築体および対照構築体を、ｐＰＡＣＫＨ１  Ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒパッケージングプラスミドミックス（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２９３−ＴＮパッケージング細胞株にパッケージした。ＰＥＧ−ｉｔＴＭウイルス沈降溶液を用いてウイルスを濃縮し、ＵｌｔｒａＲａｐｉｄレンチウイルス力価測定キット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて力価を分析した。感染細胞をＦＡＣＳ分析（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により選択した。感染効率＞９０％を蛍光顕微鏡検査により証明し、さらにリアルタイムＰＣＲによりｍｉＲ−２１発現を確認した。
【０１０８】
[00173]  異種移植試験
[00174]  施設のガイドラインに従って動物試験を実施した。ｍｉＲ−２１、ｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡ、または対照としての空のベクターのいずれかをコードするレンチウイルスベクターを感染させたＬｏｖｏ  ＭＳＨ２陽性細胞、および空のウイルスを感染させたＬｏｖｏ  ｈＭＳＨ２陰性細胞を、ヌードマウスの腹部に注入した（５×１０６）。異種移植片（各グループにつき６匹の動物）が触知可能な体積に達した時点で、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を週５日連続、２週間の腹腔内注射により投与した。腫瘍体積を処置開始時、次いで週１回測定した。推定腫瘍体積（Ｖ）を次式により計算した：Ｖ＝Ｗ２×Ｌ×０．５；ここで、Ｗは最大の腫瘍直径（センチメートル）を表わし、Ｌは次の最大の腫瘍直径を表わす。個々の相対腫瘍体積(relative tumor volume)（ＲＴＶ）を以下のように計算した：ＲＴＶ＝Ｖｘ／Ｖ１；ここで、Ｖｘは所定の時点での体積（立方ミリメートル）であり、Ｖ１は処置開始時の体積である。
【０１０９】
[00175]  実施例２
[00176]  ＭｉＲ−２１はｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６タンパク質発現を直接標的とする
[00177]  インシリコ分析により、ｍｉＲ−２１がｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡを標的とする可能性があることが示された（ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＭＩＴ，図１Ａ）。本発明者らは、ｈＭＳＨ２（ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００２４９．２）およびｈＭＳＨ６（ＮＣＢＩ  ＮＭ＿０００１７９．２）３’−ＵＴＲの両方において、ｍｉＲ−２１に対する推定結合部位を同定した。本発明者らは、ｍｉＲ−２１発現が内因性ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡ発現に及ぼす影響をＣＲＣ  Ｃｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞およびＳＷ６２０細胞において調べた。両細胞株は低い基礎ｍｉＲ−２１発現を示す。本発明者らはこれらの細胞株をｍｉＲ−２１前駆体（ｍｉＲ−２１）またはスクランブルｍｉＲ前駆体対照でトランスフェクションした（図６）。ｈＭＳＨ２（抗−ＭＳＨ２）またはｈＭＳＨ６（抗−ＭＳＨ６）に対する特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の過剰発現は、ｍｉＲ−２１のレベルに影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６のｍＲＮＡレベルは、ｍｉＲ−２１の過剰発現によって影響を受けなかった（図１Ｂ）。これに対し、抗−ＭＳＨ２および抗−ＭＳＨ６  ｓｉＲＮＡは、それぞれｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡの発現を特異的に低下させた（図１Ｂ）。本発明者らは、ｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡ発現が抗−ＭＳＨ２  ｓｉＲＮＡによって一貫して低下することを認める。この低下は抗−ＭＳＨ２  ｓｉＲＮＡのｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡとの縮重ハイブリダイゼーション、またはヘテロ二量体タンパク質パートナーｈＭＳＨ２の減少から起きるｈＭＳＨ６  ｍＲＮＡの安定性低下の結果である可能性がある。この結果は、ｍｉＲ−２１過剰発現がｈＭＳＨ２またはｈＭＳＨ６のｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさないことを示す。
【０１１０】
[00178]  本発明者らは、ｍｉＲ−２１をＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞およびＳＷ６２０細胞にトランスフェクションした後のｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６のタンパク質レベルをウェスタンブロット分析により調べた（図１Ｃ，図６Ｂ）。ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６タンパク質は、スクランブルｍｉＲと比較してｍｉＲ−２１を過剰発現する細胞において有意に減少した。抗−ＭＳＨ２および抗−ＭＳＨ６  ｓｉＲＮＡを、これらの細胞株に並行してトランスフェクションした。本発明者らは、ｍｉＲ−２１でトランスフェクションした細胞が、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞に匹敵すると思われるｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６の下方調節を示すことを観察した。逆に、本発明者らは、高レベルの内因性ｍｉＲ−２１を含むＣＲＣ  ＳＷ４８０、ＨＣＴ１１６およびＲＫＯ細胞を、ｍｉＲ−２１に対するロックト核酸（ＬＮＡ）（抗−ｍｉＲ−２１）またはスクランブルＬＮＡ（抗−ｍｉＲ対照）でトランスフェクションした。本発明者らは、抗−ｍｉＲ−２１でトランスフェクションした細胞がｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６両方のタンパク質発現の増加を示し（図１Ｄ；図７Ｂ）、一方、ｍＲＮＡレベルには変化がみられない（図７Ｃ）ことを見出した。
【０１１１】
[00179]  ｈＭＳＨ２またはｈＭＳＨ６の３’ＵＴＲ全体をルシフェラーゼ遺伝子の下流にサブクローニングした。次いで、このルシフェラーゼレポーター構築体をｍｉＲ−２１前駆体（ｍｉＲ−２１）またはスクランブルｍｉＲと共にＣｏｌｏ−３２０ＤＭ細胞にトランスフェクションした。本発明者らは、それぞれｈＭＳＨ２またはｈＭＳＨ６に対するｍｉＲ−２１シード領域を含む構築体について、５０％および３７％のルシフェラーゼ活性低下を観察した（ｐ＜０．００１；図１Ｅ）。ｍｉＲ−２１シード領域を欠失させると、ｈＭＳＨ２またはｈＭＳＨ６を含む両ベクターについてルシフェラーゼ活性が回復した（図１Ｅ）。本発明者らは、高レベルのｍｉＲ−２１発現を示すＳＷ４８０細胞を、野生型（ＷＴ）または変異（変異体）ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ３’−ＵＴＲシード領域を含むルシフェラーゼレポーターベクターでトランスフェクションした（図１Ｆ）。予想どおり、本発明者らは、ｍｉＲ−２１結合部位を除去すると、ｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６ベクターでトランスフェクションした細胞は両方ともルシフェラーゼ活性が増大することを見出した。これらの所見を確認するために、ＳＷ４８０細胞をｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ３’−ＵＴＲルシフェラーゼレポーター＋ＬＮＡ  抗−ｍｉＲ−２１または抗−ｍｉＲ対照で共トランスフェクションした。ｍｉＲ−２１のＬＮＡサイレンシングはルシフェラーゼ活性の増大を誘導した（図１Ｆ）。全体として考慮すると、この結果は、ｍｉＲ−２１がｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６  ３’−ＵＴＲに直接作用を及ぼし、それが最終的にｈＭＳＨ２およびｈＭＳＨ６タンパク質発現を調節することを示す。ｈＭＳＨ２タンパク質状態はｈＭＳＨ６タンパク質の安定性および発現に影響を及ぼす可能性があるので（９）、本発明者らはｍｉＲ−２１調節およびｈＭＳＨ２タンパク質損失がｈＭＳＨ６下方調節に寄与するという可能性を除外できない。
【０１１２】
[00180]  実施例３
[00181]  ｍｉＲ−２１はＣＲＣ組織におけるＭＭＲコアタンパク質ｈＭＳＨ２に逆相関する
[00182]  本発明者らは、２つの異なるＣＲＣコホートにおけるｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２発現を調べた（図２）。５０の未選択ＣＲＣ症例および対となる正常隣接組織を含む組織マイクロアレイを、ｈＭＳＨ２タンパク質に対する免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色と組み合わせて、ＬＮＡ  抗−ｍｉＲ−２１または非特異的ＬＮＡ  抗−ｍｉＲ対照とハイブリダイズさせた（図２Ａ）。ｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２タンパク質両方の発現についてのスコアを、コア内の陽性細胞の割合によって求めた。５０のコアのうち４２を、腫瘍および対となる正常組織の整合分析のために利用できた。本発明者らは、腫瘍を対となる正常組織と比較した場合にこれらの症例のうち２８（６６％）においてｍｉＲ−２１が上方調節されていることを見出した。４２（３３％）のうち１４の症例は、正常組織と比較して腫瘍においてｈＭＳＨ２の強い下方調節を伴っていた。これらすべての症例においてｍｉＲ−２１は上方調節されていることが見出された。このサブグループの患者におけるＰａｒｓｏｎ相関分析は、−０．８２（ｐ＜０．００１）のｒ値を示した。全コホートの症例についての相関分析は、−０．６３のｒ値を示した。ｍｉＲ−２１およびｈＭＳＨ２の両方について陽性のスコアを示したＣＲＣ組織は、同じ癌巣において共発現を示さなかった（参照：図２Ａ，共標識）。
【０１１３】
[00183]  本発明者らは、癌と正常な隣接組織を得ることができた第２コホートのＣＲＣ試料に由来する新鮮凍結腫瘍を調べた（図２Ｂ）。ｍｉＲ−２１発現をノーザン分析およびＲＴ−ＰＣＲにより決定し、一方、ｈＭＳＨ２タンパク質発現をウェスタン分析により決定した。２６の症例が、正常な隣接組織と比較して腫瘍においてｈＭＳＨ２下方調節を示した。腫瘍を正常な隣接組織と比較した場合、これらの症例のうち２４（９０％）においてｍｉＲ−２１発現が増大していることを見出した。ｍｉＲ−１５５はｈＭＳＨ２および他のＭＭＲタンパク質の発現に影響を及ぼす可能性があるので、本発明者らはｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−２１の同時過剰発現を示す症例（１６症例）をこの分析から除外した。残り８症例において逆相関（ｒ＝−０．８１，ｐ＜０．０２）がなお顕著であり、これは、ＣＲＣ腫瘍におけるｍｉＲ−２１過剰発現とｈＭＳＨ２下方調節の逆相関を強調する（図２Ｂ：図８）。
【０１１４】
[00184]  実施例４
[00185]  ｍｉＲ−２１は５−フルオロウラシル曝露後のＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを低下させる
[00186]  ＭＭＲ欠損細胞株は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を含めたさまざまな治療薬に対して耐性を示す。本研究はは、耐性はＤＮＡへの５−ＦＵ代謝産物の取込みが欠損して損傷依存性のＧ２／Ｍ停止およびそれに続くアポトーシスの低下を生じる結果であることを証明した。本発明者らは、ｍｉＲ−２１トランスフェクション後のＣｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ６２０細胞において、５−ＦＵにより誘導される細胞周期停止およびアポトーシスを調べた。本発明者らは、スクランブルｍｉＲを対照として用い、これらの結果をｓｉＲＮＡ  抗−ＭＳＨ２を用いた同様のトランスフェクションと比較した（図３）。本発明者らは、ｍｉＲ−２１過剰発現が５−ＦＵで処置した後の準Ｇ１（アポトーシス）およびＧ２／Ｍ細胞の割合を低下させることを見出した。ｍｉＲ−２１でトランスフェクションした細胞は、ｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞と同様に、Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシスの低下を示した（図３）。５−ＦＵ仲介アポトーシスに対するｍｉＲ−２１発現の影響を、さらにＣｏｌｏ−３２０ＤＭおよびＳＷ６２０においてアネキシンＶ染色で確認した（図９）。類似の応答が同質遺伝子型のＬｏｖｏ細胞においてみられ、この場合はｈＭＳＨ２変異［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２−）］が第２染色体の導入で相補された［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）］（図４）。ｍｉＲ−２１過剰発現は、ｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡと同様に、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞における準Ｇ１およびＧ２／Ｍ蓄積を低下させ、一方、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞では影響がみられなかった（図４）。Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）およびＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞を、全長ｈＭＳＨ２  ｃＤＮＡをコードするプラスミドで共トランスフェクションすると、５−ＦＵにより誘導されるアポトーシスおよび細胞周期停止が促進された。同じプラスミドをｍｉＲ−２１と共トランスフェクションすると、Ｇ２／Ｍ停止およびアポトーシスが顕著に低下した（図４）。さらに、ｈＭＳＨ２  ｃＤＮＡ中の標的部位を欠失させると、メッセージがｍｉＲ−２１調節に対して不感受性になり、細胞は損傷により誘導される正常なＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを保持した。全体として考慮すると、この結果は、ｍｉＲ−２１によるｈＭＳＨ２発現の下方調節は５−ＦＵに対する細胞耐性を生じるという結論と一致する。
【０１１５】
[00187]  実施例５
[00188]  結腸直腸癌異種移植モデルにおいてｍｉＲ−２１の過剰発現は５−ＦＵ耐性を誘導する
[00189]  この細胞研究は、ｍｉＲ−２１がｈＭＳＨ２発現を低下させることによって５−ＦＵによって誘導されるＧ２／Ｍ停止およびアポトーシスを阻害することを示した。本発明者らは、異種移植大腸癌腫モデルを開発した；その際、本発明者らは、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）細胞の、ｍｉＲ−２１を過剰発現する安定クローン［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−ｍｉＲ−２１］またはｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡを過剰発現する安定クローン［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−抗−ＭＳＨ２］を、レンチウイルス発現系を使用して作製した。Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２−）細胞および空のベクターの安定挿入を含むＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）を対照として用いた。安定なレンチウイルス発現を含む細胞をヌードマウスの腹部に注入した（５×１０６細胞）。異種移植片が触知可能な体積に達した時点で、５−ＦＵ（５０ｍｇ／ｋｇ／日）を週５日連続、２週間の腹腔内注射により投与した。本発明者らは、空のベクターと比較してｍｉＲ−２１または抗−ＭＳＨ２  ｓｉＲＮＡを発現するＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）腫瘍異種移植片においてｈＭＳＨ２の発現が劇的に低下することを確認した（図４Ａ）。
【０１１６】
【表３】
0005931897.tif 000004
【０１１７】
[00190]  ５−ＦＵ処置はＬｏｖｏ（ＭＳＨ２−）腫瘍異種移植片と比較してＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）腫瘍異種移植片についてより有効であることが証明された（図５；表１）。この結果は、ＭＭＲ能をもつ(MMR-proficient)細胞はより良好に５−ＦＵ療法に応答することを示す。重要なことに、ｍｉＲ−２１の安定過剰発現［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−ｍｉＲ−２１］は、結果的に５−ＦＵに対する応答を低下させ、ｈＭＳＨ２に対するｓｉＲＮＡを感染させたＬｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）腫瘍細胞［Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−抗−ＭＳＨ２］のものに匹敵する腫瘍増殖速度をもたらした（図５；表１）。さらに、５−ＦＵ中断（２週間）の後、Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−ｍｉＲ−２１感染細胞の腫瘍増殖は対照と比較して有意に大きいように思われた；これは、ｍｉＲ−２１の過剰発現が癌の進行を促進したことを示す。合わせると、これらの結果は、５−ＦＵ耐性においてｍｉＲ−２１依存性のｈＭＳＨ２−ｈＭＳＨ６ヘテロ二量体ＭＭＲタンパク質の下方調節が中心的役割をもつことを支持する。
【０１１８】
[00191]  Ｐ値を示す；これらは、Ｔ−検定分析を用いて各グループを対照グループ（Ｌｏｖｏ（ＭＳＨ２＋）−空）と比較することにより計算した。
[00192]  実施例６
[00193]  治療／予防方法および組成物
[00194]  本発明は、有効量の本発明の治療的アンチセンスｍｉＲ−２１を併用療法と共にまたは併用療法なしに対象に投与することによる治療および予防の方法を提供する。好ましい観点において、療法剤は実質的に精製されている。対象は、好ましくは動物であり、ウシ、ブタ、ニワトリなどの動物が挙げられるが、これらに限定されず、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１１９】
[00195]  多様な送達システムが知られており、本発明の療法剤を投与するために使用される；たとえば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内への封入、組換え細胞による発現、受容体仲介エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての治療的核酸の構築など。導入方法には皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。前記化合物はいずれかの都合のよい経路により、たとえば注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは粘膜皮膚内層（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）を介した吸収により投与され、他の生物活性薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身または局所であってよい。さらに、脳室内およびクモ膜下注射を含めたいずれか適切な経路で本発明の医薬組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合がある；脳室内注射は、たとえばＯｍｍａｙａリザバーなどのリザバーに接続した脳室内カテーテルによって容易に行なうことができる。
【０１２０】
[00196]  特定の態様において、処置を必要とする領域に本発明の医薬組成物を局所投与することが望ましい場合がある；これは、たとえば、限定ではなく、下記により達成できる：外科処置中の局所注入、たとえば外科処置後の創傷包帯と併せた局所適用、注射によるもの、カテーテルによるもの、坐剤によるもの、またはインプラントによるものであって、インプラントは多孔質、非孔質、またはゲル状材料のものであり、膜、たとえばシラスティック(sialastic)膜、または繊維を含む。１態様において、投与は悪性腫瘍または新生組織もしくは前新生組織の部位（または以前の部位）に直接注射することによる。
【０１２１】
[00197]  療法剤がタンパク質療法剤をコードする核酸である特定の態様において、その核酸を下記によりインビボ投与して、それがコードするタンパク質の発現を促進する：それを適宜な核酸発現ベクターの一部として構築してそれが細胞内になるように投与するか、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でコーティングすること、あるいはそれを核に侵入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与すること。あるいは、核酸療法剤を細胞内に導入し、相同組換えにより発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。
【０１２２】
[00198]  本発明はまた、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、治療的有効量の治療剤、および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む。そのような担体には生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。担体および組成物は無菌でありうる。その製剤は投与様式に適切なものであろう。
【０１２３】
[00199]  組成物は、所望により少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤をも含有することができる。組成物は、液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってもよい。組成物は、伝統的な結合剤および担体、たとえばトリグリセリドを含む坐剤として製剤化することができる。経口製剤は標準的な担体、たとえば医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含むことができる。
【０１２４】
[00200]  好ましい態様において、組成物はルーティンな操作に従って、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として製剤化される。一般に、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔剤、たとえばリグノカインも含む。一般に、成分を個別に、または互いに混合して単位剤形で、たとえば凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、有効薬剤の量を指示した密封容器、たとえばアンプルまたはサッシェに入れて提供する。組成物を注入により投与する場合、無菌の医薬グレードの水または生理食塩水を収容した注入ボトルで分配すべきである。組成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合するために無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供する。
【０１２５】
[00201]  本発明の療法剤は、中性または塩の形で製剤化される。医薬的に許容できる塩類には、遊離アミノ基により形成されるもの、たとえば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの、および遊離カルボキシル基により形成されるもの、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄（ＩＩＩ）、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものが含まれる。
【０１２６】
[00202]  特定の障害または状態の処置に有効な本発明の療法剤の量は、その障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床手法により決定される。さらに、最適用量範囲の同定を補助するために、場合によりインビトロアッセイを使用できる。製剤中に使用すべき厳密な用量は、投与経路および疾患または障害の重症度にも依存し、担当医の判断および各患者の状況に従って決定される。しかし、静脈内投与に適した用量範囲は、一般に活性化合物約２０〜５００マイクログラム／ｋｇ体重である。鼻腔内投与に適した用量範囲は、一般に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量応答曲線から外挿できる。
【０１２７】
[00203]  本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。場合によりそのような容器（複数可）は、医薬製品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する当局が指示した形の注意書を伴ない、その注意書はヒトに投与するための製造、使用または販売の当局による承認を反映する。
【０１２８】
[00204]  実施例７
[00205]  癌患者を処置する方法
[00206]  この実施例は、本発明の組成物による処置に対して好ましい応答を示す可能性が高い患者を選択および処置する方法を記載する。
【０１２９】
[00207]  癌を伴うと診断された患者は、通常はまず治癒を目的とした組織切除を受ける。患者から摘出した組織の一部から腫瘍試料を得る。次いで、低分子ＲＮＡを抽出するのに適した当技術分野で周知の任意の方法を用いて、たとえばＴＲＩＺＯＬＴＭの使用により、組織試料からＲＮＡを単離する。次いで、精製ＲＮＡを、場合により遺伝子分析と併せて、ｍｉＲ２１または開示した他の差示発現するｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲに供する。これらのアッセイを実施して、腫瘍に関係するＲＮＡの発現レベルを決定する。差示発現するｍｉＲ発現パターンが決定された場合、特に変異体状態が確認された場合、その患者は本発明の組成物による処置の候補である。
【０１３０】
[00208]  したがって、その患者は、治療的有効量の本発明組成物で、当技術分野において既知の方法に従って処置される。組成物の用量および投与計画は、さまざまな要因、たとえば患者の健康状態および癌の病期に応じて異なるであろう。一般に処置は経時的に多数回施される。
【０１３１】
[00209]  実施例８
[00210]  癌患者の診断方法
[00211]  特定の１観点において、ある対象が癌を有するかまたは発症するリスクがあるかを診断する方法が本明細書中に提供される。この方法は、一般に、ｍｉＲ−２１のｍｉＲ差示発現パターンおよび／またはＭＭＲタンパク質発現を対照と比較して測定することを含む。ｍｉＲ／ＭＭＲタンパク質の差示発現パターンが確認された場合、それらの結果は結腸直腸癌を有するかまたは発症するリスクがある対象の指標である。特定の態様において、少なくとも１つの遺伝子生成物のレベルをノーザンブロット分析により測定する。また、特定の態様において、被験試料中の少なくとも１つの遺伝子生成物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子生成物および／またはＭＭＲタンパク質の発現レベルより低く、ならびに／あるいは被験試料中の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子生成物および／またはＭＭＲタンパク質の発現レベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子生成物および／またはＭＭＲタンパク質の発現レベルより高い。
【０１３２】
[00212]  実施例９
[00213]  ｍｉＲ遺伝子生成物の測定
[00214]  少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子生成物のレベルは、下記により測定できる：対象から得た被験試料に由来するＲＮＡを逆転写して、一組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを得ること；これらの標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、被験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを得ること；そして、被験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から作成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較すること。少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルの変調は、その対象が結腸直腸癌を有するかまたは発症するリスクがあることの指標である。
【０１３３】
[00215]  実施例１０
[00216]  診断および治療用途
[00217]  別の観点において、少なくとも１つのｍｉＲＮＡのシグナルが対照試料から発生するシグナルと対比して調節解除（たとえば、下方調節および／または上方調節）されている場合に、対象の癌を処置する方法が本明細書中に提供される。
【０１３４】
[00218]  また、ある対象が、１以上の予後不良マーカーに関連する癌を有するかまたは発症するリスクがあるかどうかを対象において下記により診断する方法が、本明細書中に提供される：対象から得た被験試料に由来するＲＮＡを逆転写して、一組の標的オリゴデオキシヌクレオチドを得ること；これらの標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて、被験試料についてのハイブリダイゼーションプロファイルを得ること；そして、被験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から作成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較すること。シグナルの変調は、その対象が癌を有するかまたは発症するリスクがあることの指標である。
【０１３５】
[00219]  実施例１１
[00220]  キット
[00221]  本明細書に記載する組成物はいずれもキットに含まれうる。非限定例において、ｍｉＲＮＡを単離し、ｍｉＲＮＡを標識し、および／またはアレイを用いてｍｉＲＮＡ集団を評価するための試薬が、キットに含まれる。キットはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製または合成するための試薬を含みうる。したがってキットは、適切な容器手段内に、標識ヌクレオチドを取り込ませることによるかまたは非標識ヌクレオチドを取り込ませて後に標識することによりｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含む。キットは、１つ以上の緩衝液、たとえば反応用緩衝液、標識用緩衝液、洗浄用緩衝液、またはハイブリダイゼーション用緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための構成要素も含むことができる。他のキットは、ｍｉＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素を含むことができ、したがって、たとえば固体支持体を含むことができる。
【０１３６】
[00222]  アレイを含めたいずれのキット態様についても、本発明の配列のいずれかの全部または一部と同一または相補的である配列を含む核酸分子があってもよい。
[00223]  キットの構成要素を、水性媒体中または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージすることができる。キットの容器手段は、一般に少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器手段を含み、その中に構成要素を入れ、好ましくは適切に小分配することができる。キット内に１より多い構成要素がある場合（標識試薬と標識を一緒にパッケージできる）、キットは一般に第２、第３または他の追加の容器も含み、それに追加の構成要素を個別に入れることができる。しかし、多様な組合わせの構成要素が１つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットは、一般に核酸を収容するための手段、および市販のために密封した（in close confinement）他のいずれかの試薬容器も含むであろう。そのような容器には、所望のバイアルを保持する射出成形または吹込み成形したプラスチック容器を含めることができる。
【０１３７】
[00224]  キットの構成要素を１以上の液体溶液で提供する場合、液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が好ましい溶液である。キットに含めることができる他の溶液は、ｍｉＲＮＡを混合試料から単離および／または濃縮することに関与する溶液である。
【０１３８】
[00225]  しかし、キットの構成要素を乾燥粉末（単数または複数）として提供することができる。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、粉末を適切な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒を別の容器手段に入れて提供することも考えられる。キットは標識ｍｉＲＮＡの単離を促進する構成要素も含むことができる。それは、ｍｉＲＮＡを保存もしくは維持する構成要素またはそれを分解に対して保護する構成要素も含むことができる。それらの構成要素はＲＮＡｓｅを含まないか、あるいはＲＮＡｓｅに対して保護されていてもよい。
【０１３９】
[00226]  キットは、一般に適宜な手段において、個々の試薬または溶液につき個別の容器を含むこともできる。キットは、キット構成要素を使用するための、またキットに含まれていない他のいずれかの試薬を使用するための指示も含むことができる。指示は、実行できる変更を含むことができる。そのような試薬は本発明のキットの態様であるものとする。また、キットは前記に述べた特定のものに限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特性分析に用いられるいずれかの試薬を含むことができる。
【０１４０】
[00227]  また、ｍｉＲＮＡアレイに関して述べたいずれかの態様を、より全般的に本発明のスクリーニングまたはプロファイリングの方法またはキットに使用できるものとする。言い換えると、特定のアレイに含めることができるものを記載したいずれかの態様を、より全般的にｍｉＲＮＡプロファイリングに関して実施することができ、アレイ自体を伴う必要はない。
【０１４１】
[00228]  また、いずれかのキット、アレイ、または他の検出法もしくはツール、またはいずれかの方法が、これらのｍｉＲＮＡのいずれかについてのプロファイリングを伴うことができるものとする。また、ｍｉＲＮＡアレイに関して述べたいずれかの態様を、本発明の方法においてアレイ形式を用いてまたは用いずに実行できるものとする；言い換えると、ｍｉＲＮＡアレイ中のいずれかのｍｉＲＮＡを、本発明のいずれかの方法において、当業者に既知のいずれかの手法に従ってスクリーニングまたは評価することができる。スクリーニングおよび診断方法を実行するために、アレイ形式は必要ない。
【０１４２】
[00229]  ｍｉＲＮＡを治療、予後判定、または診断の用途に使用するためのキット、およびそのような使用が、本明細書において本発明者らによって意図される。キットは、ｍｉＲＮＡアレイ、およびアレイ上のｍｉＲＮＡについての標準または正規化ｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報を含むことができる。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡをキットに含めることができる。対照ＲＮＡは、標識化および／またはアレイ分析のための陽性対照として使用できるｍｉＲＮＡであってもよい。
【０１４３】
[00230]  本発明により教示される方法およびキットを本明細書に幅広く一般的に記載した。この一般的な開示内容に含まれるより狭い種および下位グループのそれぞれも本発明の教示の一部を形成する。これには、除外されるものが本明細書に具体的に列挙されているか否かに関係なく、属からいずれかの主題を除去するただし書または消極的限定を含む、本発明の教示の一般的記載が含まれる。
【０１４４】
[00231]  実施例１２
[00232]  アレイの作製およびスクリーニング
[00233]  本明細書中、ｍｉＲＮＡアレイの作製および使用も提供され、これらは、複数のｍｉＲＮＡ分子またはｍｉＲＮＡ前駆体分子と完全またはほぼ完全に相補的または同一であって支持体材料上に空間的に分離された組織化状態で配置されている核酸分子（プローブ）の規則的マクロアレイまたはマイクロアレイである。マイクロアレイは、一般に、その上にプローブがスポットされたニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイには、１０，０００までの核酸分子を一般には１〜４平方センチメートルの領域内に配置することができるようにより密に核酸プローブが配置される。
【０１４５】
[00234]  マイクロアレイは、核酸分子、たとえば遺伝子、オリゴヌクレオチドなどを基材上にスポットすることにより、あるいはオリゴヌクレオチド配列を基材上にインサイチュで作製することにより作製できる。スポットまたは作製した核酸分子を、平方センチメートル当たり約３０まで、またはそれ以上まで、たとえば平方センチメートル当たり約１００、さらには１０００までの同一ではない核酸分子の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは一般に、フィルターアレイのニトロセルロース系材料とは対照的に、コーティングされたガラスを固体支持体として用いる。ｍｉＲＮＡに相補的な核酸試料の規則的アレイを用いることにより、各試料の位置をトラッキングして元の試料に関連づけることができる。
【０１４６】
[00235]  複数の異なる核酸プローブが固体支持体表面と安定に結合している多様なアレイデバイスが当業者に知られている。アレイに有用な基材には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。アレイは、平均プローブ長、プローブの配列またはタイプ、プローブとアレイ表面の間の結合の性質、たとえば共有結合または非共有結合などを含めて、多種多様に変更できる。本明細書に記載する標識およびスクリーニングの方法ならびにアレイは、それらのプローブがｍｉＲＮＡを検出すること以外は、いずれのパラメーターに関してもその有用性が制限されることはない；したがって、方法および組成物を多様なタイプのｍｉＲＮＡアレイについて使用できる。
【０１４７】
[00236]  本発明の原理を適用できる多数の可能な態様からみて、例示した態様は本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲に対する限定と解釈すべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲により定められる。したがって本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および精神に含まれるすべてを本発明として主張する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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