(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Ｆａｈ欠損性ブタにヒト肝細胞またはヒト肝細胞前駆細胞を移植する工程、および、該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖し、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタが、移植の前に、肝機能障害を予防するに十分な用量の２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を投与される、方法。
【請求項２】
前記ヒト肝細胞が、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間または少なくとも約８ヶ月間増殖させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｆａｈ欠損性ブタが、肝細胞移植後、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、または少なくとも６日間、ＮＴＢＣをさらに投与される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＴＢＣが、前記Ｆａｈ欠損性ブタに対して、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＮＴＢＣが、前記Ｆａｈ欠損性ブタに対して、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆａｈ欠損性ブタが免疫抑制状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫抑制が、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１または複数の免疫抑制剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記１または複数の免疫抑制剤が、ヒト肝細胞移植の少なくとも約２日前に、前記Ｆａｈ欠損性ブタに対して投与される、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒト肝細胞が、前記Ｆａｈ欠損性ブタの肝動脈、脾臓、門脈への注入によって移植される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆａｈ欠損性ブタが、Ｆａｈ遺伝子におけるホモ接合性の破壊を含み、該破壊が機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記破壊が、前記Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記破壊が挿入である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記挿入が終止コドンを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記挿入が選択マーカーを含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｆａｈ欠損性ブタに移植される前記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増殖させたヒト肝細胞を、前記Ｆａｈ欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、妊娠した雌ブタのＦａｈ欠損性ブタの胎仔にヒト肝細胞またはヒト肝細胞前駆細胞を移植する工程、および、該Ｆａｈ欠損性ブタの出生後に該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖し、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔を受胎している雌ブタが、ＮＴＢＣを投与される、方法。
【請求項２０】
前記ヒト肝細胞が、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間または少なくとも約８ヶ月間増殖させられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔が、前記ヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒト肝細胞が、前記ブタの妊娠から約３０日目〜約４０日目に移植される、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒト肝細胞が前記ブタの妊娠から約３５日目に移植される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒト肝細胞が、前記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔の臍静脈への注入によって移植される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
約１００，０００個〜約５００，０００個のヒト肝細胞が注入される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
約３００，０００個のヒト肝細胞が注入される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｆａｈ欠損性ブタが、生後約１日間〜約６日間、ＮＴＢＣを投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｆａｈ欠損性ブタが、生後約２週間〜約６ヶ月間、ＮＴＢＣを投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
ＮＴＢＣが、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＮＴＢＣが、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔に移植される前記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、請求項１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ブタの出生後に、前記Ｆａｈ欠損性ブタに追加のヒト肝細胞を移植する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増殖させたヒト肝細胞を、前記Ｆａｈ欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、請求項１９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、その結果、該破壊が、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらし、ここで、該ブタは肝機能の低下を示す、遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項３６】
前記破壊が、前記Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異である、請求項３５に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項３７】
前記破壊が挿入である、請求項３６に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項３８】
前記挿入が終止コドンを含む、請求項３７に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項３９】
前記挿入が選択マーカーを含む、請求項３７または請求項３８に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項４０】
前記ブタが移植されたヒト肝細胞を含む、請求項３５に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項４１】
前記ブタが免疫抑制状態である、請求項３５に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項４２】
前記免疫抑制が、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、請求項４１に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項４３】
前記１または複数の免疫抑制剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４２に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項４４】
ヒト肝疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）請求項３５に記載のＦａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程；および
（ｉｉ）該肝疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝疾患の１以上の徴候もしくは症状における改善は、該候補薬剤が該肝疾患の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記ヒト肝疾患がヒト肝臓病原体による感染である請求項４４に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタの該移植されたヒト肝細胞は、該肝臓病原体に感染している、工程；および
（ｉｉ）該肝臓感染症に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタにおける感染負荷量と比較した、該肝臓病原体の感染負荷量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の前記病原体の力価を測定することによって決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の病原体特異的な抗原を測定することによって決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記感染負荷量は、前記ブタから得たサンプル中の病原特異的な核酸分子を測定することによって決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記肝臓病原体が肝指向性ウイルスである、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記肝指向性ウイルスがＨＢＶまたはＨＣＶである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒト肝疾患が肝硬変である請求項４４に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタは、該ブタにおいて肝硬変の発症をもたらす用量でＮＴＢＣを投与されている、工程；ならびに
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおける少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少、または、アルブミンの増加は、該候補薬剤が、肝硬変の処置に有効であることを示す、工程を包含する、方法。
【請求項５２】
前記Ｆａｈ欠損性ブタにおいて肝硬変が発症した後に、該Ｆａｈ欠損性ブタに、肝硬変のさらなる進行を予防するために十分な用量のＮＴＢＣが投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒト肝疾患が肝細胞癌（ＨＣＣ）である請求項４４に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタは、該ブタにおいてＨＣＣの発症をもたらす用量でＮＴＢＣが投与されている、工程；および
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＨＣＣに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおける腫瘍増殖または腫瘍容積の減少は、該候補薬剤がＨＣＣの処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項５４】
インビボにおいてヒト肝細胞に対する外因性因子の効果を評価する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）請求項４０に記載のＦａｈ欠損性ブタに該外因性因子を投与する工程；ならびに
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおいて少なくとも１種の肝機能のマーカーを測定する工程であって、ここで、該少なくとも１種の肝機能のマーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該外因性因子の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼにおける増加、または、アルブミンにおける減少は、該外因性因子が毒性であることを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項５５】
前記外因性因子が、既知の毒素または疑わしい毒素である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊についてヘテロ接合性である、ブタ。
【請求項５７】
前記破壊が、Ｆａｈ遺伝子のエキソン５内にある、請求項５６に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項５８】
前記破壊が、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異である、請求項５６または請求項５７に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項５９】
前記破壊が挿入である、請求項５６〜５８のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項６０】
前記挿入が終止コドンを含む、請求項５９に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項６１】
前記挿入が選択マーカーを含む、請求項５９または請求項６０に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
【請求項６２】
遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタを作製する方法であって、該ブタのゲノムは、Ｆａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、該方法は、以下：
（ｉ）請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタを、別の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタと交配させる工程；および
（ｉｉ）該Ｆａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性の子孫を選択する工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｆａｈ欠損性ブタおよびその使用に関する。本開示はまた、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて他の種（ヒトが挙げられる）由来の肝細胞を増殖（ｅｘｐａｎｄ）する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は、生体異物化合物（医薬が挙げられる）の代謝に関する主要な部位である。多くの肝臓酵素は種特異的であるので、培養した初代ヒト肝細胞またはそのミクロソーム画分を使用して候補薬剤の代謝を評価することが必要である（非特許文献１；非特許文献２）。肝細胞のミクロソーム画分はいくつかの代謝機能を解明するために使用され得るが、他の試験は生きた肝細胞に依存する。例えば、いくつかの化合物は、肝臓酵素を誘導し、従って、それらの化合物の代謝は時間とともに変化する。酵素誘導を分析するために、肝細胞は、生きているだけではなく、完全に分化しかつ機能しなければならない。
【０００３】
ヒト肝細胞は、製薬産業によって前臨床薬物開発の間に広範に使用される。その使用は、薬物開発の一部としてＦＤＡ（米国食品医薬品局）により命じられている。薬物代謝および他の研究のために、肝細胞は、代表的には、臓器ドナー死体から単離され、試験が行われる場所へと輸送される。供給源死体由来の肝細胞の状態（生存能および分化状態）は非常に変化しやすく、多くの細胞調製物の品質は下限ぎりぎりである。高品質のヒト肝細胞の入手可能性は、それらが組織培養において顕著には増殖できないという事実によって、さらに妨害される（非特許文献３；非特許文献４）。プレーティングした後、それらの細胞は、生存するが分裂しない。容易に入手可能な哺乳動物種（例えば、マウス）に由来する肝細胞は、薬物試験には適していない。なぜなら、それらは、異なる代謝酵素の捕捉物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有し、誘導研究において異なる応答をするからである。不死化ヒト肝細胞（肝細胞癌）または胎児肝芽細胞（ｈｅｐａｔｏｂｌａｓｔ）もまた、完全に分化した成体細胞の十分な置換物質ではない。ヒト肝細胞はまた、微生物学分野の研究のためにも必要である。多くのヒトウイルス（例えば、肝炎を引き起こすウイルス）は、他のいかなる細胞型においても複製し得ない。
【０００４】
さらに、エキソビボで肝細胞を使用するバイオ人工（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）肝臓補助デバイスが、急性肝不全の患者を支援するために使用されている。さらに、いくつかの肝細胞移植臨床試験が実施されており、それらは、肝細胞移植が有益であり得るという、原理証明（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を提供した。現在、ヒト肝細胞は、培養において顕著には増殖され得ない。培養において幹細胞から誘導された肝細胞は、未熟であり、概して完全な機能を欠く。従って、現在使用されている肝細胞はすべて、ヒトドナー（死体であるかまたは手術標本のいずれか）に由来する。このことは、肝細胞の入手可能性を有意に制限する。もし十分なヒト肝細胞が入手可能であるならば、バイオ人工（ｂｉｏａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）肝臓補助デバイスは実用的な技術となり、ヒト肝細胞移植には広範な用途が見出され得るであろう。これらの制限事項を考慮すれば、初代ヒト肝細胞を増殖（ｅｘｐａｎｄ）する方法が、非常に望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒａｎｄｏｎら，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００３，１８９：２３３−２４６
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ−Ｌｅｃｈｏｎら，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．，２００３，４：２９２−３１２
【非特許文献３】Ｒｕｎｇｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０００，２７４：１−３
【非特許文献４】Ｃａｓｃｉｏ  Ｓ．Ｍ．，Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ，２００１，２５：５２９−５３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、初代ヒト肝細胞を増殖する方法を提供することを課題とする。本発明はまた、肝臓疾患の大型動物モデルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本明細書において、Ｆａｈ欠損性ブタが記載される。このＦａｈ欠損性ブタは、種々の目的のため（他の種（特にヒト）に由来する肝細胞の増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のため、および肝臓疾患（肝硬変、肝細胞癌、および肝臓感染症が挙げられる）の大型動物モデルとして、が挙げられる）の有用性を有する。
【０００８】
本明細書において、ヒト肝細胞をインビボにおいて増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる方法が提供される。いくつかの実施形態においては、その方法は、Ｆａｈ欠損性ブタ中にヒト肝細胞を移植する工程、およびそのヒト肝細胞を増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる工程、を包含する。いくつかの場合において、そのＦａｈ欠損性ブタは、免疫抑制状態である。あるいはまたはさらに、ヒト細胞が、ヒト細胞（肝細胞を含む）に対する免疫学的寛容を誘導するために、胸腺発生前のＦａｈ欠損性ブタ胎仔中に移植され得る。従って、いくつかの実施形態において、そののヒト肝細胞をインビボにおいて増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる方法は、ヒト肝細胞をＦａｈ欠損性ブタ胎仔中に移植する工程、およびそのＦａｈ欠損性ブタの出生後にそのヒト肝細胞を増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる工程、を包含する。いくつかの例において、そのＦａｈ欠損性ブタ胎仔は、そのヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚｅ）。
【０００９】
Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖（ｅｘｐａｎｄ）させられ収集された、単離された肝細胞（例えば、ヒト肝細胞）もまた、提供される。
【００１０】
また、遺伝子改変ブタも提供され、そのブタのゲノムは、機能的ＦＡＨタンパク質の発現の欠如（ｌｏｓｓ）をもたらすようになっているＦａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、そのブタは、肝機能の低下を示す。いくつかの例において、そのＦａｈ欠損性ブタは、移植されたヒト肝細胞をさらに含む。いくつかの例において、そのＦａｈ欠損性ブタは、免疫抑制状態である。いくつかの例において、そのＦａｈ欠損性ブタは、出生前にヒト細胞に対して寛容化されている。Ｆａｈ遺伝子における破壊についてヘテロ接合性である遺伝子改変ブタもまた、提供される。
【００１１】
また、ヒト肝疾患の処置のために有効な薬剤を選択するための方法も提供され、その方法は、候補薬剤をＦａｈ欠損性ブタに投与すること、およびその肝疾患に対するその候補薬剤の効果を評価すること、による。その肝疾患の１つまたはそれより多くの徴候または症状における改善は、その候補薬剤がその肝疾患の処置において有効であることを示す。
【００１２】
さらに、ヒト肝臓病原体による感染症の処置のために有効な薬剤を選択するための方法が提供され、その方法は、候補薬剤を、ヒト肝細胞を移植したＦａｈ欠損性ブタに投与すること（そのＦａｈ欠損性ブタにおける移植されたヒト肝細胞は、その肝臓病原体に感染させられる）、およびその肝臓感染症に対するその候補薬剤の効果を評価すること、による。
【００１３】
肝硬変の処置のために有効な薬剤を選択するための方法もまた提供され、その方法は、候補薬剤をＦａｈ欠損性ブタに投与すること、およびそのＦａｈ欠損性ブタにおける肝硬変の少なくとも１種の診断マーカーに対するその候補薬剤の効果を評価すること、による。この方法において、そのＦａｈ欠損性ブタには、そのブタにおいて肝硬変の発生をもたらす用量でＮＴＢＣ（または類似する化合物）が投与されている。さらに、肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置のために有効な薬剤を選択するための方法が提供され、その方法は、候補薬剤をＦａｈ欠損性ブタに投与すること、およびそのＦａｈ欠損性ブタにおける肝細胞癌（ＨＣＣ）に対するその候補薬剤の効果を評価すること、による。この方法において、そのＦａｈ欠損性ブタには、そのブタにおいて肝細胞癌（ＨＣＣ）の発生をもたらす用量でＮＴＢＣ（または類似する化合物）が投与されている。
【００１４】
ヒト肝細胞に対する外因性因子の効果をインビボで評価する方法もまた提供される。いくつかの実施形態において、その方法は、その外因性因子をＦａｈ欠損性ブタに投与する工程、およびそのＦａｈ欠損性ブタにおける肝機能の少なくとも１種のマーカーを測定する工程、を包含する。
【００１５】
さらに、肝臓用の遺伝子治療プロトコールおよびベクター（遺伝子発現ベクターおよび遺伝子ノックダウンベクターを包含する）；薬物代謝、薬物動態、効力、毒物学、および安全性；ならびにヒト遺伝性肝疾患を評価する方法が提供される。そのような方法は、ヒト肝細胞を移植したＦａｈ欠損性ブタ、またはＦａｈ欠損性ブタにおいて増殖され収集されたヒト肝細胞を、利用し得る。
【００１６】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）  インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Ｆａｈ欠損性ブタにヒト肝細胞を移植する工程、および、該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
（項目２）  上記ヒト肝細胞が、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間または少なくとも約８ヶ月間増殖させられる、項目１に記載の方法。
（項目３）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが、ヒト肝細胞移植の前に、肝機能障害を予防するに十分な用量の２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）を投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが、肝細胞移植後、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、または少なくとも６日間、ＮＴＢＣをさらに投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）  ＮＴＢＣが、上記Ｆａｈ欠損性ブタに対して、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）  ＮＴＢＣが、上記Ｆａｈ欠損性ブタに対して、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが免疫抑制状態である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）  上記免疫抑制が、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目９）  上記１または複数の免疫抑制剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）  上記１または複数の免疫抑制剤が、ヒト肝細胞移植の少なくとも約２日前に、上記Ｆａｈ欠損性ブタに対して投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）  上記ヒト肝細胞が、上記Ｆａｈ欠損性ブタの肝動脈、脾臓、門脈への注入によって移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが、Ｆａｈ遺伝子におけるホモ接合性の破壊を含み、該破壊が機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらす、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１３）  上記破壊が、上記Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくはは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）  上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）  上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）  上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）  上記Ｆａｈ欠損性ブタに移植される上記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）  上記増殖させたヒト肝細胞を、上記Ｆａｈ欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１９）  上記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）  上記項目のいずれかに記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
（項目２１）  インビボにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法であって、該方法は、Ｆａｈ欠損性ブタの胎仔にヒト肝細胞を移植する工程、および、該Ｆａｈ欠損性ブタの出生後に該ヒト肝細胞を増殖させる工程を包含し、それによって、該ヒト肝細胞を増殖する、方法。
（項目２２）  上記ヒト肝細胞が、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間または少なくとも約８ヶ月間増殖させられる、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）  上記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔が、上記ヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）  上記ヒト肝細胞が、上記ブタの妊娠から約３０日目〜約４０日目に移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）  上記ヒト肝細胞が上記ブタの妊娠から約３５日目に移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）  上記ヒト肝細胞が、上記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔の臍静脈への注入によって移植される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）  約１００，０００個〜約５００，０００個のヒト肝細胞が注入される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）  約３００，０００個のヒト肝細胞が注入される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）  上記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔を受胎している雌ブタが、ＮＴＢＣを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３０）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが、生後約１日間〜約６日間、ＮＴＢＣを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３１）  上記Ｆａｈ欠損性ブタが、生後約２週間〜約６ヶ月間、ＮＴＢＣを投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３２）  ＮＴＢＣが、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３３）  ＮＴＢＣが、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３４）  上記Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔に移植される上記ヒト肝細胞が、単離されたヒト肝細胞である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３５）  上記ブタの出生後に、上記Ｆａｈ欠損性ブタに追加のヒト肝細胞を移植する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３６）  上記増殖させたヒト肝細胞を、上記Ｆａｈ欠損性ブタから収集する工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）  上記収集したヒト肝細胞を継代移植によって増殖させる工程をさらに包含する、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３８）  上記項目のいずれかに記載の方法によって収集された、単離されたヒト肝細胞。
（項目３９）  遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、その結果、該破壊が、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらし、ここで、該ブタは肝機能の低下を示す、遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４０）  上記破壊が、上記Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくはは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４１）  上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４２）  上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４３）  上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４４）  上記ブタが移植されたヒト肝細胞を含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４５）  上記ブタが免疫抑制状態である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４６）  上記免疫抑制が、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４７）  上記１または複数の免疫抑制剤が、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリン、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目４８）  ヒト肝疾患の処置に有効な薬剤を選択するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）上記項目のいずれかに記載のＦａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程；および
（ｉｉ）該肝疾患に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該肝疾患の１以上の徴候もしくは症状における改善は、該候補薬剤が該肝疾患の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
（項目４９）  上記ヒト肝疾患がヒト肝臓病原体による感染である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタの該移植されたヒト肝細胞は、該肝臓病原体に感染している、工程；および
（ｉｉ）該肝臓感染症に対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタにおける感染負荷量と比較した、該肝臓病原体の感染負荷量の減少は、該候補薬剤が該肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
（項目５０）  上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の上記病原体の力価を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５１）  上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の病原体特異的な抗原を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５２）  上記感染負荷量は、上記ブタから得たサンプル中の病原特異的な核酸分子を測定することによって決定される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５３）  上記肝臓病原体が肝指向性ウイルスである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５４）  上記肝指向性ウイルスがＨＢＶまたはＨＣＶである、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５５）  上記ヒト肝疾患が肝硬変である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタは、該ブタにおいて肝硬変の発症をもたらす用量でＮＴＢＣを投与されている、工程；ならびに
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおける少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼの減少、または、アルブミンの増加は、該候補薬剤が、肝硬変の処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
（項目５６）  上記Ｆａｈ欠損性ブタにおいて肝硬変が発症した後に、該Ｆａｈ欠損性ブタに、肝硬変のさらなる進行を予防するために十分な用量のＮＴＢＣが投与される、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５７）  上記ヒト肝疾患が肝細胞癌（ＨＣＣ）である上記項目のいずれかに記載の方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、ここで、該Ｆａｈ欠損性ブタは、該ブタにおいてＨＣＣの発症をもたらす用量でＮＴＢＣが投与されている、工程；および
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＨＣＣに対する該候補薬剤の効果を評価する工程であって、ここで、該候補薬剤の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおける腫瘍増殖または腫瘍容積の減少は、該候補薬剤がＨＣＣの処置に有効であることを示す、工程
を包含する、方法。
（項目５８）  インビボにおいてヒト肝細胞に対する外因性因子の効果を評価する方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）項目４４に記載のＦａｈ欠損性ブタに該外因性因子を投与する工程；ならびに
（ｉｉ）該Ｆａｈ欠損性ブタにおいて少なくとも１種の肝機能のマーカーを測定する工程であって、ここで、該少なくとも１種の肝機能のマーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、そして、該外因性因子の投与前の該Ｆａｈ欠損性ブタと比較した、該Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼにおける増加、または、アルブミンにおける減少は、該外因性因子が毒性であることを示す、工程
を包含する、方法。
（項目５９）  上記外因性因子が、既知の毒素または疑わしい毒素である、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６０）  遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタであって、該ブタのゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊についてヘテロ接合性である、ブタ。
（項目６１）  上記破壊が、Ｆａｈ遺伝子のエキソン５内にある、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目６２）  上記破壊が、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目６３）  上記破壊が挿入である、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目６４）  上記挿入が終止コドンを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目６５）  上記挿入が選択マーカーを含む、上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタ。
（項目６６）  遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタを作製する方法であって、該ブタのゲノムは、Ｆａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性であり、該方法は、以下：
（ｉ）上記項目のいずれかに記載の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタを、別の遺伝子改変Ｆａｈ欠損性ブタと交配させる工程；および
（ｉｉ）該Ｆａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性の子孫を選択する工程
を包含する、方法。
【００１７】
（要旨）
相同組換えおよび体細胞核移植によるＦａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタの作製、ならびに、Ｆａｈ−／−ホモ接合性ブタを産生するための方法が本明細書中に記載される。本開示のＦａｈ欠損性ブタは、例えば、ヒト肝細胞の増殖のため、ならびに、遺伝性１型チロシン血症、肝硬変および肝細胞癌の大型動物モデルとして、など、多様な研究および治療の目的に使用され得る。
【００１８】
本発明の上記の目的、特徴、および利点、ならびに他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進行する以下の詳細な説明から、より明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｆａｈ欠損性ブタを作製するために使用される手順の模式的図解である。
【図２】図２は、ブタＦａｈ遺伝子破壊手順を示す一連の遺伝子構築物である：（Ａ）エキソン４、エキソン５、およびエキソン６を含む、ゲノムＦａｈ遺伝子座。（Ｂ）エキソン５に対して５’側にあるゲノム相同性アームおよびエキソン５に対して３’側にあるゲノム相同性アームを作製するためのＰＣＲ手順。その５’増幅用のエキソン５プライマーは、インフレームの終止コドン（ＴＧＡ）を含むテール、ならびにＰＧＫ−ｎｅｏ（ネオマイシン−ホスホトランスフェラーゼ耐性遺伝子）カセット中のクローニング用制限酵素部位を含む。同様に、３’フラグメント用のエキソン５プライマーもまた制限酵素部位を含む。（Ｃ）標的化カセット。（Ｄ）ＡＡＶ−ＤＪベクター中にクローニングされた標的化カセット。意図される組換え事象が示される。ＩＴＲループが示される。（Ｅ）組換え後の標的化された遺伝子座の構造。上記終止コドンおよびｎｅｏカセットが、エキソン５中に挿入されている。正しい組換えを検出するために使用されるＰＣＲプライマーが示される。重要なことには、一方のプライマーは、標的化ベクター内に含まれる相同性アームの外側に配置され、もう一方は、ＰＧＫ−ｎｅｏカセット内に配置される。
【図３】図３Ａは、Ｆａｈノックアウト標的化構築物の模式図である。図３Ｂは、ゲノム型決定構築物の模式図である。
【図４】図４Ａは、胎仔線維芽細胞株の標的化を確認するためのＰＣＲの結果を示すゲルの画像である。標的化された２つの線維芽細胞株が（１）および（２）として示される。野生型ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、成体ブタの肝臓組織から単離された。α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ）遺伝子を増幅するために設計されたＰＣＲプライマーが、細胞溶解およびＰＣＲが機能的であることを示すための内部コントロールとして役立った。２つの別々のプライマーセットが、上記構築物の５’末端または３’末端のいずれかを増幅するために使用された。一方のプライマーは、ＰＧＫ−ｎｅｏカセット中に配置され、もう一方は、１．５ｋｂ標的化相同性アームの外側であるがＦａｈ遺伝子の内側に配置されて、適切に標的化された線維芽細胞のみがＰＣＲ生成物を生じるようにされた。図４Ｂは、胎仔線維芽細胞株の標的化を確認するためのサザンブロットの結果を示す画像である。標的化された２つの例示的株が、野生型ｇＤＮＡとともに示される。下側のバンドは、ネイティブの野生型Ｆａｈ遺伝子座を示し、上側のバンドは、ゲノムＦａｈ遺伝子のエキソン５中への１．７ｋｂ挿入の結果である。サザンプローブは、Ｆａｈ遺伝子のイントロン４において見出される特有の配列を標的とするために作製されたＰＣＲテンプレートから作製された。
【図５】図５は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）技術の模式的な図解である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（詳細な説明）
（Ｉ．略語）
ＡＡＶ    アデノ随伴ウイルス
ＡＤＳＣ  脂肪組織由来幹細胞
ＡＬＴ    アラニンアミノトランスフェラーゼ
ＡＳＴ    アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＣＭＶ    サイトメガロウイルス
ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
ＥＳ      胚性幹
ＦＡＣＳ  蛍光活性化細胞分取
ＦＡＨ    フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ
ＦＳＨ    卵胞刺激ホルモン
ｇＤＮＡ  ゲノムＤＮＡ
ＨＢＶ    Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＧ    ヒト絨毛性ゴナドトロピン
ＨＣＶ    Ｃ型肝炎ウイルス
ｈＭＳＣ  ヒト間葉系幹細胞
ＨＴ１    遺伝性１型チロシン血症
ｉＰＳ    人工多能性幹
ＩＰＳＣ  人工多能性幹細胞
ＩＴＲ    逆方向末端反復
ＩＶＦ    体外授精
ＭＯＩ    感染多重度
ｍＴＯＲ  哺乳動物のラパマイシン標的
ＮＴＢＣ  ２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＡ      スクシニルアセトン
ＳＣＮＴ  体細胞核移植。
【００２１】
（ＩＩ．用語および方法）
別途記載のない限り、技術用語は、従来の用法に準拠して使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓより出版、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗら編，Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．より出版，１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．より出版、１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）において見出され得る。
【００２２】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の具体的な用語の説明が提供される。
【００２３】
投与：あらゆる有効な経路によって、治療剤のような薬剤を被験体に提供または与えること。例示的な投与経路としては、注射、注入（例えば、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内）、経口、腺管内（ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ）、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、経膣および吸入の経路が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
肝疾患の発症を阻害または予防する薬剤：Ｆａｈ欠損性動物に投与される場合、動物における肝疾患の発症を予防、遅延、または阻害する化合物または組成物。肝疾患または肝機能障害は、肝組織像の変化（例えば、壊死、炎症、線維化、異形成または肝臓癌）、肝臓特異的な酵素および他のタンパク質（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、およびアルブミン）のレベルの変化、血漿もしくは尿中のスクシニルアセトン（ＳＡ）、または汎発性肝不全が挙げられるが、これらに限定されない、多数の兆候または症状のうちのいずれか１つにより特徴付けられる。一実施形態において、肝疾患を阻害する薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。
【００２５】
抗体：免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされた１もしくは複数個のポリペプチドを含むタンパク質（またはタンパク質複合体）。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、同様に、各々ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの免疫グロブリンを規定する。
【００２６】
基本的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は、通常、テトラマーである。各々のテトラマーは、２つの同一のペアのポリペプチド鎖から成り、各々のペアは、１つの「軽い」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重い」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、主として抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれより多いアミノ酸の可変領域を規定する。「可変軽鎖」（ＶＬ）および「可変重鎖」（ＶＨ）という用語はそれぞれ、これらの軽鎖および重鎖を指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、ならびに多数のよく特徴付けられたフラグメントを含む。例えば、標的タンパク質（またはタンパク質または融合タンパク質内のエピトープ）に結合するＦａｂ、Ｆｖ、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、そのタンパク質（またはエピトープ）のための特異的結合因子でもある。これらの抗体フラグメントは、以下のように定義される：（１）Ｆａｂ、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部分を産生するために、酵素パパインによる全抗体の消化により生成された抗体分子の一価抗原結合フラグメントを含むフラグメント；（２）Ｆａｂ’、インタクトな軽鎖および重鎖の一部分を産生するために、ペプシンで全抗体を処理し、次いで、還元することにより得られる、抗体分子のフラグメント；（３）（Ｆａｂ’）２、後続の還元を伴わずに酵素ペプシンで全抗体を処理することにより得られる、抗体のフラグメント；（４）Ｆ（ａｂ’）２、２個のジスルフィド結合により２つのＦａｂ’フラグメントが一緒にされた二量体；（５）Ｆｖ、２本の鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子組換えフラグメント；ならびに（６）１本鎖抗体、遺伝的に融合された１本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーにより連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子組換え分子。これらのフラグメントを作製する方法は、慣用的である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）。
【００２８】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。単なる一例として、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎの古典的な方法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７，１９７５）またはその派生的な方法に従って、マウスハイブリドーマから調製することができる。モノクローナル抗体生成のための詳細な手順は、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９に記載されている。
【００２９】
抗原：動物に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物または物質。抗原は、特異的な体液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する。「病原体特異的抗原」は、被験体における免疫応答を誘発する、ウイルス、細菌または寄生虫のような病原体によって発現されるタンパク質のような抗原である。
【００３０】
アザチオプリン：細胞、特に白血球の増殖を阻害するプリン合成阻害剤である免疫抑制剤。この免疫抑制剤はしばしば、自己免疫疾患または臓器移植拒絶の処置に使用される。これは、体内で活性な代謝産物である６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）および６−チオイノシン酸に変換されるプロドラッグである。アザチオプリンは、多数のジェネリックメーカーによって、商標名（ＳａｌｉｘによるＡｚａｓａｎＴＭ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによるＩｍｕｒａｎＴＭ；ＡｚａｍｕｎＴＭ；およびＩｍｕｒｅｌＴＭ）として生産されている。
【００３１】
生体サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅ）：末梢血、血清、血漿、脳脊髄液、骨髄、尿、唾液、組織生検、外科標本および検死材料といった、被験体の細胞、組織または体液から得られるサンプル。本明細書中では、「サンプル」とも呼ばれる。
【００３２】
肝硬変：正常な微視的小葉構造の欠如と、最終的には器官を締め付け、不規則な小結節へと分割する結合組織の線維性の帯（ｆｉｂｒｏｕｓ  ｂａｎｄ）による壊死性実質組織の再生性の置換によって特徴付けられる、一群の慢性肝疾患をいう。肝硬変は、非常に長い潜伏期間を有し、通常は、突発性の腹部痛と、吐血、就下性水腫または黄疸をともなう腫脹がこれに続く。進行した段階では、腹水、顕著な黄疸、門脈圧亢進、拡張蛇行静脈、および最終的には肝性昏睡となり得る中枢神経系障害が存在し得る。
【００３３】
収集：本明細書中で使用される場合、増殖されたヒト肝細胞を「収集する（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ）」とは、単離されたヒト肝細胞を注入もしくは移植されている動物（またはレシピエント動物とも呼ばれる）から増殖された肝細胞を取り出すプロセスをさす。収集は、必要に応じて、肝細胞を他の細胞型から分離することを含む。一実施形態において、その増殖されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損性動物の肝臓から収集される。一部の例において、その増殖されたヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損性ブタの肝臓から収集される。
【００３４】
インターロイキン受容体の共通γ鎖（ｃｏｍｍｏｎ−g  ｃｈａｉｎ）（Ｉｌ２ｒｇ）：インターロイキン受容体の共通ガンマ鎖をコードする遺伝子。Ｉｌ２ｒｇは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５を含む、多数のインターロイキンに対する受容体の構成要素である（Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３７７−３８１，１９９５）。Ｉｌ２ｒｇを欠損した動物は、Ｂ細胞およびＴ細胞の減少を示し、ナチュラルキラー細胞が欠如する。インターロイキン−２受容体ガンマ鎖としても知られる。
【００３５】
凍結保存：本明細書中で使用される場合、「凍結保存」とは、７７Ｋすなわち−１９６℃（液体窒素の沸点）のような低い氷点下の温度まで冷却することにより保存または維持されている細胞（例えば、肝細胞）または組織を指す。これらの低温度では、細胞死をもたらす生化学的反応を含む、いかなる生物学的活性も、効果的に停止される。
【００３６】
シクロスポリンＡ：土壌真菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｎｉｖｅａによって産生される１１アミノ酸の非リボソーム環状ペプチドである免疫抑制化合物。シクロスポリンＡは、臓器移植および組織移植における移植片拒絶の予防に使用される。シクロスポリンＡはまた、シクロスポリンおよびシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）およびシクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）としても知られる。
【００３７】
肝機能の低下：肝臓の健康または機能を測定する多くのパラメーターのうちのいずれか１つの異常変化。肝機能の低下はまた、本明細書では、「肝機能障害」とも称される。肝機能は、肝組織像の検査および肝臓酵素または他のタンパク質の測定などであるがこれらに限定されない、当該分野で周知の多数の手段のうちのいずれか１つにより評価することができる。例えば、肝機能障害は、肝臓の壊死、炎症、酸化的損傷、または異形成によって示され得る。一部の例において、肝機能障害は、肝細胞癌のような肝臓癌によって示される。肝機能障害を評価するために試験され得る肝臓酵素およびタンパク質の例としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、およびアルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。肝機能障害はまた、汎発性肝不全をもたらし得る。肝機能を試験するための手順は、Ｇｒｏｍｐｅら（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）およびＭａｎｎｉｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１１９２８−１１９３３，１９９９）により教示されるもの等、当該分野で周知である。
【００３８】
欠損：本明細書中で使用される場合、「Ｆａｈ欠損性」または「Ｆａｈの欠損」とは、Ｆａｈ遺伝子の破壊（例えば、挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異）を含むブタなどの動物を指し、Ｆａｈ遺伝子の破壊は、Ｆａｈ  ｍＲＮＡの発現および／または機能的ＦＡＨタンパク質の実質的減少、またはその欠損をもたらす。本明細書中で使用される場合、機能的ＦＡＨタンパク質の「発現の欠如」という用語は、発現の完全な欠如だけを指すのではなく、機能的ＦＡＨタンパク質の発現の実質的減少（例えば、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の減少）も含む。一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性動物は、Ｆａｈ遺伝子におけるホモ接合性の挿入（例えば、インフレームの終止コドンを含む挿入）を含む。一部の実施形態において、挿入は、Ｆａｈのエキソン５内にある。一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性動物は、Ｆａｈ遺伝子におけるホモ接合性の欠失を含む。一例として、ホモ接合性欠失は、Ｆａｈのエキソン５内にある。別の実施形態において、Ｆａｈ欠損動物は、Ｆａｈ遺伝子の１もしくは数個の点変異を含む。適切なＦａｈ点変異の例は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｐｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１を参照のこと）。
【００３９】
欠乏する：減じるまたは除去すること。例えば、「マクロファージ欠乏」とは、動物におけるマクロファージを排除する、除去する、減じる、または殺滅するプロセスを指す。マクロファージが欠乏している動物は、必ずしもマクロファージが完全に欠如しているとは限らないが、少なくともマクロファージの数または活性の減少を示す。一実施形態において、マクロファージ欠乏は、機能的マクロファージの少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、または１００％の減少をもたらす。
【００４０】
破壊：本明細書中で使用される場合、遺伝子の「破壊」とは、あらゆる挿入、欠失もしくは点変異、または、これらの任意の組み合わせをいう。一部の実施形態において、破壊は、ｍＲＮＡおよび／または機能的タンパク質の発現の部分的もしくは完全な欠如をもたらす。
【００４１】
胚性幹（ＥＳ）細胞：発達途上の胚盤胞の内部細胞塊から単離された多能性細胞。ＥＳ細胞は、多能性細胞であり、それらが、体内に存在する全ての細胞（骨、筋肉、脳細胞など）を作製することができることを意味する。マウスＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第５，６７０，３７２号に見出され得る。ヒトＥＳ細胞を産生するための方法は、米国特許第６，０９０，６２２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／７００２１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／２７９９５号に見出され得る。また、本明細書中では、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、Ｋｌｆ４および／またはｃ−Ｍｙｃといった特定の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞から人工的に誘導された多能性幹細胞の一つの型である人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ｉＰＳ細胞）も企図される（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２，２００７）。今までのところ、マウス（Ｏｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４８（７１５１）：３１３−３１７，２００７）、ヒト（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２，２００７）、ラット（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（１）：１６−１９，２００９）、サル（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３（６）：５８７−５９０，２００８）およびブタ（Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｅｐｕｂ  Ａｐｒｉｌ  ２１，２００９）由来のｉＰＳ細胞が報告されている。
【００４２】
生着（ｅｎｇｒａｆｔ）：動物において細胞または組織を移植すること。本明細書中で使用される場合、レシピエント動物におけるヒト肝細胞の生着は、ヒト肝細胞が、注入後にレシピエント動物に移植されこととなるプロセスをいう。生着したヒト肝細胞は、レシピエント動物において増殖することができる。
【００４３】
増殖する：量を増加させること。本明細書中で使用される場合、ヒト肝細胞を「増殖させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」とは、ヒト肝細胞の数が増加するように、細胞分裂を生じさせるプロセスを指す。
【００４４】
胎仔：動物の、後胚期の胎内にある子孫。
【００４５】
ＦＫ５０６：タクロリムスまたはフジマイシン（ｆｕｊｉｍｙｃｉｎ）としても知られるＦＫ５０６は、免疫抑制薬である。ＦＫ５０６は、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓを含んだ日本の土壌サンプルの発酵培養液中で最初に発見された２３員のマクロライドラクトンである。この化合物は、しばしば、患者の免疫系の活性を低下させ、そして、臓器拒絶のリスクを低下させるために、同種異系の臓器移植の後に使用される。ＦＫ５０６は、Ｔ細胞およびインターロイキン−２の活性を低下させる。また、ＦＫ５０６は、重篤なアトピー性皮膚炎（湿疹）、骨髄移植後の重篤な難治性ブドウ膜炎、および皮膚状態の白斑（ｓｋｉｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｖｉｔｉｌｉｇｏ）の処置における局所用調製物に使用される。
【００４６】
フルダラビン：ＤＮＡ合成を阻害するプリンアナログ。フルダラビンは、しばしば、多様な血液学的悪性疾患の処置のための化学療法薬として使用される。
【００４７】
フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）：チロシン異化の最終段階を触媒する代謝酵素。Ｆａｈ遺伝子のホモ接合性欠失を有するマウスは、肝ｍＲＮＡ発現の変化および重篤な肝機能障害を示す（Ｇｒｏｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：２２９８−２３０７，１９９３）。Ｆａｈ遺伝子における点変異はまた、肝不全および出生後の致死を生じることも示されている（Ａｐｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８（２）：６４１−６４５，２００１）。Ｆａｈ欠損性のヒトは、肝疾患である遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）を発症し、そして、肝不全を発症する。Ｆａｈの欠損は、強力な酸化剤であるフマリルアセト酢酸の蓄積をもたらし、そして、これは最終的に、Ｆａｈ欠損性の肝細胞の細胞死をもたらす。このように、Ｆａｈ欠損性動物は、ヒトを含む他の種由来の肝細胞で再編成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）され得る。
【００４８】
妊娠：受胎（卵母細胞の授精）から出生までの発生期。ブタの妊娠期間は、（平均）１１２〜１１５日である。
【００４９】
肝病原体：肝臓の細胞を感染する任意の病原体（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生虫病原体）をいう。一部の実施形態において、肝病原体は、ＨＢＶまたはＨＣＶといった「肝指向性ウイルス（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ）」（肝臓を標的とするウイルス）である。
【００５０】
肝細胞癌（ＨＣＣ）：ＨＣＣは、肝炎ウイルス、肝毒素または肝硬変から生じる、代表的には炎症性の肝臓を持つ患者において生じる肝臓の原発性悪性疾患である。
【００５１】
肝細胞：肝臓の細胞質塊のうちの７０〜８０％を構成する細胞型。肝細胞は、タンパク質の合成、タンパク質の貯蔵、および炭水化物の形質転換、コレステロール、胆汁塩およびリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾および排泄に関与する。肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌も起こす。肝細胞は、血清アルブミン、フィブリノゲン、および凝固因子のプロトロンビン群を製造し、そして、リポタンパク質、セルロプラスミン、トランスフェリン、補体および糖タンパク質の合成のための主要な部位となる。さらに、肝細胞は、薬物および殺虫剤のような外因性化合物、ならびにステロイドのような内因性化合物を代謝、解毒、および不活性化する能力を有する。
【００５２】
遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）：チロシン血症は、身体がアミノ酸であるチロシンを有効に分解することができない、通常は先天性代謝異常である。ＨＴ１は、この障害の最も重篤な形態であり、ヒトの１５番染色体に見られる遺伝子Ｆａｈによってコードされる酵素フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（ＦＡＨ）の不足によって引き起こされる。ＦＡＨは、チロシンを分解するために必要とされる一連の５種の酵素のうち最後のものである。ＨＴ１の症状は通常、生命の最初の２〜３ヶ月に生じ、体重を増加することができないこと、および、予測される速度で成長できないこと（成長障害）、下痢、嘔吐、皮膚および眼の白い部分の黄ばみ（黄疸）、キャベツ様の臭気、ならびに、出血傾向の増加（特に、鼻血）が挙げられる。ＨＴ１は、肝不全および腎不全、神経系に影響する問題、ならびに、肝臓癌のリスクの増加をもたらし得る。
【００５３】
ヘテロ接合性：対応する染色体遺伝子座において異なる対立遺伝子を有すること。例えば、特定の遺伝子変異についてヘテロ接合性の動物は、遺伝子の一方の対立遺伝子に変異を有するが、もう一方の対立遺伝子には変異を有さない。
【００５４】
ホモ接合性：１つもしくは複数の遺伝子座において同一の対立遺伝子を有すること。本明細書中で使用される場合、「破壊についてホモ接合性」とは、１つの遺伝子の両方の対立遺伝子の破壊（例えば、欠失、点変異の挿入）を有する生物を指す。
【００５５】
免疫不全：免疫系の少なくとも１つの不可欠な機能を欠如すること。本明細書中で使用される場合、「免疫不全」動物とは、免疫系の特定の構成要素を欠如するか、または免疫系の特定の構成要素（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞など）の機能を欠如する動物である。一部の場合において、免疫不全動物は、マクロファージを欠如する。一部の実施形態において、免疫不全動物（例えば、Ｆａｈ欠損性ブタ）は、機能的な免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の発生を妨害もしくは阻害する１もしくは複数個の遺伝的変化を含む。一部の例において、遺伝的変化は、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２またはＩｌ２ｒｇ遺伝子内にある。すなわち、一部の場合において、免疫不全動物は、Ｒａｇ１−／−、Ｒａｇ２−／−またはＩｌ２ｒｇ−／−である。
【００５６】
免疫抑制薬：体液性もしくは細胞性の免疫系または補体系の構成要素のような免疫系の１または複数の局面の機能または活性を低下させるあらゆる化合物。免疫抑制薬はまた、「免疫抑制剤」とも呼ばれる。本開示の特定の実施形態において、免疫抑制薬は、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、プレドニゾン、ラパマイシンもしくはアザチオプリン、またはこれらの組み合わせである。
【００５７】
既知の免疫抑制薬としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（１）プリン合成阻害剤（例えば、アザチオプリンおよびミコフェノール酸）、ピリミジン合成阻害剤（例えば、レフルノミド（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）およびテリフルノミド（ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ））および葉酸拮抗物質（ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ）（例えば、メトトレキサート）のような代謝拮抗薬；（２）ＦＫ５０６、シクロスポリンＡおよびピメクロリムス（ｐｉｍｅｃｒｏｌｉｍｕｓ）のようなマクロライド系；（３）サリドマイドおよびレナリドマイド（ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）のようなＴＮＦ−α阻害剤；（４）アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）のようなＩＬ−１受容体アンタゴニスト；（５）ラパマイシン（シロリムス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））、デフォロリムス（ｄｅｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、エベロリムス（ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、テムシロリムス（ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、ゾタロリムス（ｚｏｔａｒｏｌｉｍｕｓ）およびビオリムスＡ９（ｂｉｏｌｉｍｕｓ  Ａ９）のような哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤；（６）プレドニゾンのようなコルチコステロイド；ならびに、（７）多数の細胞もしくは血清標的うちの１つに対する抗体。
【００５８】
例示的な細胞標的およびそのそれぞれの阻害化合物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：補体成分５（例えば、エクリズマブ（ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ））；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例えば、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴール（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）、アフェリモマブ（ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）およびゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ））；ＩＬ−５（例えば、メポリズマブ（ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ））；ＩｇＥ（例えば、オマリズマブ（ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））；ＢＡＹＸ（例えば、ネレリモマブ（ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ））；インターフェロン（例えば、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ））；ＩＬ−６（例えば、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ））；ＩＬ−１２およびＩＬ−１３（例えば、レブリキズマブ（ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）およびウステキヌマブ（ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ））；ＣＤ３（例えば、マクロモナブ−ＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、オテリキシズマブ（ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ビシリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ４（例えば、クレノリキシマブ（ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、ケリキシマブ（ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）およびザノリムマブ（ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＤ１１ａ（例えば、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ１８（例えば、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ２０（例えば、アフツズマブ（ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ２３（例えば、ルミリキシマブ（ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ））；ＣＤ４０（例えば、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチン（例えば、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＤ８０（例えば、ガリキシマブ（ｇａｌｉｘｉｍａｂ））；ＣＤ１４７／バシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）（例えば、ガビリモマブ（ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ））；ＣＤ１５４（例えば、ルプリズマブ（ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ））；ＢＬｙＳ（例えば、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＴＬＡ−４（例えば、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））；ＣＡＴ（例えば、ベルチリムマブ（ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ））；インテグリン（例えば、ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ））；ＩＬ−６受容体（例えば、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ））；ＬＦＡ−１（例えば、オヅリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ））；およびＩＬ−２受容体／ＣＤ２５（例えば、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、ダクリズマブ（ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、イノリモマブ（ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ））。
【００５９】
他の免疫抑制剤としては、以下が挙げられる：ゾリモマブアリトクス（ｚｏｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、アトロリムマブ（ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、ドリキシズマブ（ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ（ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マスリモマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ（ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトクス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベパリモマブ（ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン；ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、アバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ）、ベラタセプト（ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ））；アフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）；アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）；リロナセプト（ｒｉｌｏｎａｃｅｐｔ）；ならびにＴＮＦ阻害剤（例えば、エタネルセプト）。
【００６０】
免疫抑制：免疫系の活性または機能を低減させる行為をいう。免疫抑制は、免疫抑制化合物の投与によって達成され得るか、または、疾患もしくは障害の作用であり得る（例えば、ＨＩＶ感染から生じるか、もしくは、遺伝子欠陥に起因する免疫抑制）。一部の場合において、免疫抑制は、機能的免疫細胞の発生を妨害または阻害する遺伝子変異の結果として生じる。
【００６１】
人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）（ＩＰＳＣ）：特定の遺伝子の発現を誘導することによって、非多能性細胞、代表的には成体の体細胞から人工的に誘導される多能性肝細胞の一種。ＩＰＳＣは、哺乳動物のような任意の生物から誘導され得る。一部の実施形態において、ＩＰＳＣは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ブタ、ウシ、非ヒト霊長類またはヒトから生成される。ヒト由来のＩＰＳＣが典型的である。
【００６２】
ＩＰＳＣは、幹細胞の特定の遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍化時間、胚葉体の形成、奇形腫の形成、生存能のあるキメラの形成、ならびに、潜在能力（ｐｏｔｅｎｃｙ）および分化能のような多くの局面において、ＥＳ細胞と類似している。ＩＰＳＣを産生するための方法は当該分野で公知である。例えば、ＩＰＳＣは、代表的には、成体の線維芽細胞のような非多能性細胞への特定の幹細胞関連遺伝子（例えば、Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕｆ５１）およびＳｏｘ２）のトランスフェクションによって誘導される。トランスフェクションは、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスベクターによって達成され得る。例えば、細胞は、レトロウイルス系を用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを、または、レンチウイルス系を用いてＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧおよびＬＩＮ２８を、トランスフェクトされ得る。３〜４週間後、少数のトランスフェクト細胞が、形態学的および生化学的に多能性幹細胞と類似し始め、そして、代表的には、形態学的な選択、倍化時間によって、または、レポーター遺伝子および抗生物質による選択によって、単離される。一例では、成人ヒト細胞由来のＩＰＳＣは、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５４）：１２２４，２００７）またはＴａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−７２，２００７）の方法によって作製される。ＩＰＳＣはまた、ｉＰＳ細胞としても知られる。
【００６３】
感染負荷量（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｌｏａｄ）：被験体、または被験体由来のサンプル中の特定の病原体の量をいう。感染負荷量は当該分野で公知の多数の方法のうちのいずれか１つを用いて測定され得る。選択される方法は、検出される病原体の型および病原体の検出に利用可能な試薬に依存して変化する。感染負荷量はまた、例えば、病原体の力価を決定することによって測定され得、そのための方法は、検出される病原体に依存して変化する。例えば、一部のウイルスの力価は、プラークアッセイを実施することによって定量され得る。ある例では、感染負荷量は、サンプル中の病原体特異的抗原の量を定量することによって測定される。他の例では、感染負荷量は、サンプル中の病原体特異的核酸分子の量を定量することによって測定される。定量は、数値の決定を包含するか、または、相対値であり得る。
【００６４】
単離された：「単離された」生体成分（例えば、核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞小器官）とは、その成分が天然に存在する環境（例えば、細胞）における他の生体成分（すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞小器官）から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質としては、標準的な精製法によって精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに、化学合成された核酸を包含する。
【００６５】
「単離された肝細胞」とは、臓器ドナーのような特定の供給源から得られた肝細胞を指す。一部の実施形態において、「単離された肝細胞」は、ドナーの身体から取り出された肝細胞である。一部の実施形態において、「単離された肝細胞」は、懸濁物における肝細胞、または一片の組織内に含まれる肝細胞である。特定の例では、単離された肝細胞は、他の細胞型から実質的に分離もしくは精製されたか、または、脂肪組織もしくは線維性組織のような他の型の組織から精製されたものである。
【００６６】
哺乳動物のラパマイシン標的（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（ｍＴＯＲ）阻害剤：ｍＴＯＲの発現または活性を阻害する分子。ｍＴＯＲ阻害剤としては、低分子、抗体、ペプチドおよび核酸の阻害剤が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害するか、または、リガンドに対するｍＴＯＲの結合を阻害する分子であり得る。ｍＴＯＲの阻害剤はまた、ｍＴＯＲの発現をダウンレギュレートする分子を含む。多数のｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン（シロリムス）を含めて、当該分野で公知である。
【００６７】
ミコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）：同種同系移植の拒絶を予防するために代表的に使用される免疫抑制薬。この薬物は、一般に、経口投与または静脈内投与される。ミコフェノレートは、真菌Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍ由来である。そのプロドラッグ形態であるミコフェノレートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ）は、肝臓で、活性部分ミコフェノール酸へと代謝される。これは、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖において使用されるプリン合成のデノボ経路において、グアニン一リン酸の合成速度を制御する酵素であるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害する。ミコフェノール酸は、一般に、商品名ＣｅｌｌＣｅｐｔＴＭ（ミコフェノレートモフェチル；Ｒｏｃｈｅ）およびＭｙｆｏｒｔｉｃＴＭ（ミコフェノレートナトリウム；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の下、市販されている。
【００６８】
ＮＴＢＣ（（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン）：４−ヒドロキシ−フェニルピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＰＰＤ）の阻害剤。ＨＰＰＤは、チロシン異化の第２段階である、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸のホモゲンチシン酸への変換を触媒する。ＮＴＢＣでの処置は、チロシン異化経路をこの段階でブロックし、そして、Ｆａｈ欠損性のヒトおよび動物において蓄積する、疾病特有症候の代謝産物であるスクシニルアセトンの蓄積を予防する。
【００６９】
プレドニゾン：有効な免疫抑制薬である合成コルチコステロイド。これは、しばしば、特定の炎症性疾患、自己免疫疾患および癌の処置、ならびに、臓器移植拒絶の処置または予防に使用される。プレドニゾンは通常、経口摂取されるが、筋肉内注射または静脈内注射によって送達され得る。これは、肝臓によって、活性な薬物であり、そしてまたステロイドでもあるプレドニゾロンへと変換されるプロドラッグである。
【００７０】
ラパマイシン：既知の免疫抑制性かつ抗増殖性特性を持つ化合物。シロリムスとしても知られるラパマイシンは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの生成物として最初に発見されたマクロライドである。ラパマイシンは、ｍＴＯＲに結合し、ｍＴＯＲの活性を阻害する。
【００７１】
レシピエント：本明細書中で使用される場合、「レシピエント動物」とは、本明細書中に記載される単離されたヒト肝細胞を注入される動物（例えば、ブタ）である。代表的には、ヒト肝細胞の一部（割合は多様であり得る）が、レシピエント動物に生着する。一部の実施形態ではレシピエント動物は免疫抑制状態である。
【００７２】
リコンビナーゼ活性化遺伝子１（Ｒａｇ１）：免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊ組換えの活性化に関与する遺伝子。ＲＡＧ１タンパク質は、ＤＮＡ基質の認識に関与するが、安定な結合および切断の活性はまた、ＲＡＧ２を必要とする。
【００７３】
リコンビナーゼ活性化遺伝子２（Ｒａｇ２）：免疫グロブリン遺伝子座とＴ細胞受容体遺伝子座の組換えに関与する遺伝子。Ｒａｇ２遺伝子を欠損する動物は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを行うことができず、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の完全な欠如をもたらす（Ｓｈｉｎｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６８：８５５−８６７，１９９２）。
【００７４】
継代移植（ｓｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）：最初の動物において増殖させた肝細胞が収集され、そして、さらなる増殖のために二次動物へと注入などによって移植される、ヒト肝細胞をインビボで増殖するためのプロセス。継代移植は、三次、または四次、または追加次のマウスをさらに含むことができる（Ｏｖｅｒｔｕｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１０７８−９１０７，１９９７）。
【００７５】
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）：ドナーの核を持つ卵子を用いてクローン性の胚を作製するための実験技術。ＳＣＮＴでは、体細胞の核が取り出され、そして、細胞の残りが破棄される。同時に、卵細胞の核が取り出される。次に、体細胞の核が、除核された卵細胞へと挿入される。卵へと挿入された後、体細胞の核は、宿主細胞によってリプログラミングされる。この時点で体細胞の核を含んでいる卵は、ショックで刺激され、そして、分裂を開始する。培養における多数の有糸分裂の後、この単一の細胞は、元の生物とほぼ同一のＤＮＡを持つ胚盤胞を形成する。
【００７６】
雌ブタ（ｓｏｗ）：成体の雌性ブタ。
【００７７】
幹細胞：不変の娘細胞を生成する（自己再増殖（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）；親細胞と同一である少なくとも１つの娘細胞を生成する細胞分裂）、および特殊化細胞型を生じるための特異な能力（潜在能力）を有する細胞。幹細胞としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、生殖系列幹（ＧＳ）細胞、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、多能性成体生殖系列幹細胞（ｍａＧＳＣ）、および非制限体性幹細胞（ＵＳＳＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。インビボでの幹細胞の役割は、動物の正常な寿命の間に破壊される細胞を置換することである。通常、幹細胞は、無制限に分裂することができる。分裂後、幹細胞は、幹細胞として留まっても良いし、前駆細胞になっても良いし、末端分化に進行しても良い。前駆細胞は、少なくとも１つの所与の細胞型の十分に分化した機能的細胞を生成することができる細胞である。一般に、前駆細胞は分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞のままであっても良いし、末端分化に進行しても良い。一実施形態において、幹細胞は、肝細胞を生じる。
【００７８】
被験体：ヒト、および、ブタを含む非ヒト哺乳動物の両方を含むカテゴリーである、生きた多細胞の脊椎動物生物。
【００７９】
治療剤：被験体に対して適切に投与された際に、所望の治療効果もしくは予防効果を誘導することができる、アンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインもしくはサイトカインのような、化合物、低分子または他の組成物。本明細書中で使用される場合、「候補薬剤」は、特定の疾患または障害のための治療剤として機能し得るかどうかを決定するためのスクリーニングのために選択される化合物である。
【００８０】
力価：本開示の文脈において、力価は、サンプル中の特定の病原体の量をいう。
【００８１】
耐性または寛容（ｔｏｒｅｌａｎｃｅ）：被験体（例えば、ヒトまたは動物）が通常は応答性である特定の抗原または抗原の群に対して反応しない状態。免疫耐性は、免疫反応を抑制するが、単に免疫応答が存在しない状態ではない条件下で達成される。免疫耐性は、免疫系がまだ成熟していない、胎仔の生命または新生仔の期間における同じ抗原との事前接触；極めて高いもしくは低い用量の抗原との事前接触；免疫系を損ねる放射線、化学療法薬もしくは他の薬剤に対する曝露；免疫系の遺伝性の疾患；および、免疫系の後天性疾患を含む、多数の原因から生じ得る。
【００８２】
毒素：本開示の文脈において、「毒素」は、あらゆる化学的毒素または生物学的毒素を含む、あらゆる有毒性物質をいう。
【００８３】
導入遺伝子：細胞または生物のゲノムに導入される外因性核酸配列。
【００８４】
トランスジェニック動物：動物の細胞の一部において染色体外要素として存在するか、または動物の生殖細胞系ＤＮＡに（すなわち、その細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列に）安定的に組み込まれた、非内因性（異種）核酸配列を有する、非ヒト動物（通常は、哺乳動物）。異種核酸は、当該分野で周知の方法に従って、例えば、宿主動物の胚または胚性幹細胞の遺伝子操作により、このようなトランスジェニック動物の生殖細胞系に導入される。「導入遺伝子」は、このような異種核酸、例えば、（例えば「ノックイン」トランスジェニック動物の作製用の）発現構築物の形態をした異種核酸、または（例えば「ノックアウト」トランスジェニック動物の作製用の）標的遺伝子内またはその近傍に挿入されて標的遺伝子の発現低下を生じる異種核酸を意味する。遺伝子の「ノックアウト」とは、標的遺伝子の機能低下を生じる遺伝子の配列の変化を意味し、好ましくは、このような標的遺伝子の発現は検出されないか、または有意ではない。トランスジェニックのノックアウト動物は、標的遺伝子についてヘテロ接合性のノックアウト、または標的遺伝子についてホモ接合性のノックアウトを含み得る。「ノックアウト」はまた、コンディショナルノックアウト（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）も含み、この場合、標的遺伝子の変化は、例えば、標的遺伝子の変化を促進する物質に動物を曝露した際、標的遺伝子部位における組換えを促進する酵素（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）を導入した際、または標的遺伝子の変化を出生後に指令する他の方法で生じ得る。
【００８５】
移植または移植する：ある被験体由来の臓器、組織もしくは細胞を、別の被験体に、または、同じ被験体の別の領域に移植するプロセスをいう。
【００８６】
ベクター：宿主細胞において複製および／または組み込みを行うベクターの能力を破壊することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子ベクターは、複製起点のような、宿主細胞における複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、１または複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝的要素を含み得る。組み込みベクターは、宿主の核酸に自身を組み込むことが可能である。発現ベクターは、挿入された遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にするために必須の調節配列を含むベクターである。
【００８７】
そうでないと説明されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりとそうでないと示さない限り、複数の対象物を含む。同様に、語「または（もしくは、あるいは）」は、文脈がはっきりとそうでないと示さない限り、「および（ならびに）」を含むことが意図される。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、ＡまたはＢ、あるいは、ＡおよびＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに対して与えられる、全ての塩基のサイズまたはアミノ酸のサイズ、ならびに、全ての分子量または分子の質量の値は、近似値であり、説明のために提供されることが理解されるべきである。本明細書中に記載されるものと類似もしくは等価の方法および材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾が生じる場合には、用語の説明を含めて、本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は説明的なものに過ぎず、限定的であることは意図されない。
【００８８】
（ＩＩＩ．いくつかの実施形態の大要）
本明細書中には、胎仔ブタ線維芽細胞における相同組換えと、その後の体細胞核移植によるＦａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタの作製が開示される。また、Ｆａｈ−／−ホモ接合性ブタを産生するための方法も開示される。本開示のＦａｈ欠損性ブタは、例えば、他の種（例えば、ヒト）由来の肝細胞の増殖のため、ならびに、遺伝性１型チロシン血症、肝硬変、肝細胞癌および肝臓感染症を含む肝疾患の大型動物モデルとして、など、多様な研究および治療の目的に使用され得る。
【００８９】
本明細書中には、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて肝細胞を増殖するための２つの方法が記載される。ヒト肝細胞の増殖が例示されているが、本明細書中に開示される方法は、他の種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびアカゲザル））由来の肝細胞を増殖するために使用され得る。本明細書中に開示される第一の方法は、Ｆａｈ欠損性の仔ブタまたは成体ブタ（例えば、本明細書中に開示される方法によって作製された仔ブタまたはブタ）にヒト肝細胞を生後移植（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）することを含む。生後移植は、ヒト細胞の拒絶を予防するために１または複数の免疫抑制剤を用いて処置することを伴う。第二の方法は、ヒト肝細胞の胎仔期移植（ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）を含む。この方法では、ブタの胎仔が外科的に取り出され、そして、ヒト肝細胞が注入される。ヒト肝細胞に対する耐性が発生し、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタに免疫抑制薬を投与する必要性を排除する。
【００９０】
免疫抑制薬の使用が免疫欠損性動物の作製の一種として例示されるが、免疫系の特性の構成要素の欠如、または、免疫系の特定の構成要素の機能の欠如（例えば、機能的なＢ細胞、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の欠如）をもたらす遺伝的変化もまた企図される。一部の実施形態において、遺伝的変化は、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２またはＩｌ２ｒｇ遺伝子内にある。免疫系の特定の細胞（例えば、マクロファージまたはＮＫ細胞）もまた欠乏させ得る。特定の細胞型を欠乏させる方法は当該分野で公知である。
【００９１】
さらに、この２つの開示されるＦａｈ欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を増殖させる方法は組み合され得る。胎仔期移植は、ヒト肝細胞に対する耐性を誘導するために実施され、したがって、より多い量のヒト肝細胞の生後の投与を可能にし得る。
【００９２】
したがって、本明細書中には、Ｆａｈ欠損性ブタにヒト肝細胞を移植し、ヒト肝細胞を増殖させることによって、ヒト肝細胞を増殖する方法が提供される。肝細胞増殖のための時間の長さは多様であり得、最初に移植される肝細胞の数、増殖後に所望されるヒト肝細胞の数、および／または、所望されるヒト肝細胞での肝臓の再編成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の程度を含む多様な要因に依存する。一部の場合、これらの要因は、肝細胞の所望される使用、または、ヒト肝細胞が生着したＦａｈ欠損性ブタの所望される使用によって決定（ｄｉｃｔａｔｅ）される。一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約２週間、または、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、または、少なくとも約１１ヶ月間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。特定の例において、ヒト肝細胞は、少なくとも７日間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。他の例では、ヒト肝細胞は、少なくとも６ヶ月間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。一部の例では、ヒト肝細胞は、１２ヶ月以下、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。
【００９３】
一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタは、ブタにおける肝疾患の発症を阻害、遅延または予防する薬剤が投与される。このような薬剤の投与は、健康な（ＦＡＨを発現する）肝細胞での動物の再編成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の前に、肝機能障害および／または動物の死を予防するために必要である。薬剤は、肝疾患を阻害するための当該分野で公知の任意の化合物または組成物であり得る。１つのこのような薬剤は、２−（２−ニトロ−４−トリフルオロ−メチル−ベンゾイル）−１，３シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）である。ＮＴＢＣは、Ｆａｈ欠損性ブタにおける肝疾患の発症を調節するために投与される。投与の用量、投薬スケジュールおよび方法は、Ｆａｈ欠損性ブタにおける肝機能障害を予防するために必要に応じて調節され得る。一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタは、さらに、肝細胞移植の後、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、または少なくとも６日間、ＮＴＢＣを投与される。一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタは、さらに、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、または少なくとも約６ヶ月間、ＮＴＢＣを投与される。
【００９４】
Ｆａｈ欠損性ブタに投与されるＮＴＢＣの用量は多様であり得る。一部の実施形態では、用量は、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。特定の例では、ＮＴＢＣの用量は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、ＮＴＢＣは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の実施形態では、ＮＴＢＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日）の用量で投与される。
【００９５】
他の実施形態において、ブタは、肝防御特性または肝治療特性について検討される候補薬剤が投与される。この薬剤の保護効果を評価するために、ＮＴＢＣについて上述したものと同様の方法が使用され得る。
【００９６】
ＮＴＢＣは、任意の適切な手段（飲料水中、食品中、または注射などが挙げられるがこれらに限定されない）によって投与され得る。一実施形態において、飲料水中で投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌ（例えば、約１ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌまたは約８ｍｇ／Ｌ）である。別の実施形態において、飲料水中で投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ（例えば、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．２ｍｇ／Ｌ、約１．４ｍｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／Ｌ、約１．８ｍｇ／Ｌまたは約２．０ｍｇ／Ｌ）である。
【００９７】
この方法の一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタは、免疫抑制されている。一部の例では、免疫抑制は、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である。ブタにおいて免疫抑制を達成するために有効な任意の適切な免疫抑制薬または免疫抑制剤が使用され得る。免疫抑制剤の例としては、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリンが挙げられるがこれらに限定されない。免疫抑制剤の組合せもまた投与され得る。一部の実施形態において、１または複数の免疫抑制剤は、ヒト肝細胞移植の少なくとも約２日前にＦａｈ欠損性ブタに投与される。免疫抑制は、一定期間、例えば、ブタの全寿命の一部の間、継続され得る。
【００９８】
一部の実施形態において、ヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損性ブタの肝動脈、脾臓または門脈へと注射によって移植される。
【００９９】
一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタは、Ｆａｈ遺伝子にホモ接合性の破壊を含み、その結果、この破壊が、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらす。機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如は、必ずしも発現の完全な欠如ではない。一部の例では、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の発現の欠如である。
【０１００】
Ｆａｈ遺伝子の破壊は、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の有意な消失または完全な欠如をもたらすあらゆる改変であり得る。一部の実施形態において、破壊は、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異、あるいは、これらの任意の組合せである。特定の例では、破壊は挿入である。一部の例では、挿入は、インフレームの終止コドンを含む。挿入はまた、選択マーカーをコードする核酸のような追加の核酸配列を含み得る。
【０１０１】
一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタに移植されるヒト肝細胞は、単離されたヒト肝細胞である。一部の実施形態において、ヒト肝細胞は、肝組織移植片の一部として移植される。単離されたヒト肝細胞は、多数の多様な供給源のうちのいずれか１つから入手され得る。一実施形態において、ヒト肝細胞は、臓器ドナーの肝臓から単離される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、外科的切除物から単離される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、多能性成体前駆細胞、非制限体性幹細胞、または、肝臓自体、胆嚢、腸もしくは膵臓に見られ得る組織特異的肝性幹細胞のような幹細胞から誘導される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、単球または羊膜細胞（ａｍｎｉｏｃｙｔｅ）から誘導され、すなわち、幹細胞または前駆細胞は、肝細胞を生成するためにインビトロで入手される。別の実施形態では、ヒト肝細胞は、注入前に凍結保存される。
【０１０２】
一部の実施形態において、この方法はさらに、増殖させたヒト肝細胞をＦａｈ欠損性ブタから収集する工程を包含する。
【０１０３】
また、ヒト肝細胞をＦａｈ欠損性ブタ胎仔に移植し、Ｆａｈ欠損性ブタの出生後にヒト肝細胞を増殖させることによって、ヒト肝細胞をインビボで増殖させる方法が本明細書において提供される。生後の肝細胞の増殖の時間の長さは多様であり得、最初に移植される肝細胞の数、増殖後に所望されるヒト肝細胞の数、および／または、所望されるヒト肝細胞での肝臓の再編成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の程度を含む多様な要因に依存する。一部の場合、これらの要因は、肝細胞の所望される使用、または、ヒト肝細胞が生着したＦａｈ欠損性ブタの所望される使用によって決定（ｄｉｃｔａｔｅ）される。一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約２週間、または、少なくとも約４週間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、または、少なくとも約１１ヶ月間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。特定の例において、ヒト肝細胞は、少なくとも７日間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。他の例では、ヒト肝細胞は、少なくとも６ヶ月間、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。一部の例では、ヒト肝細胞は、１２ヶ月以下、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖される。
【０１０４】
一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔は、ヒト肝細胞を移植するために外科的に取り出される。ヒト肝細胞が注入されるブタ胎仔の在胎齢は多様であり得るが、一般には、胸腺が発生する前である。すなわち、一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、ブタの妊娠から約３０日目〜約４０日目の間のブタ胎仔へと注入される。特定の例では、ヒト肝細胞は、ブタの妊娠から３５日目に移植される。一部の実施形態では、ヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔の臍静脈への注入によって移植される。注入されるヒト肝細胞の数は多様であり得る。一部の実施形態において、約１００，０００個〜約５００，０００個のヒト肝細胞が注入される。特定の例では、約３００，０００個のヒト肝細胞が注入される。
【０１０５】
一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔を受胎している雌ブタは、ブタにおける肝疾患の発症を阻害、遅延または予防する薬剤を投与される。この薬剤は、ＮＴＢＣのような、肝疾患を阻害することが当該分野で公知のあらゆる化合物または組成物であり得る。一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性の仔ブタはまた、生後約１日間〜約６日間、ＮＴＢＣを投与される。一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性仔ブタはまた、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間または少なくとも６ヶ月間、ＮＴＢＣを投与される。一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性仔ブタはまた、無限にＮＴＢＣを投与される。
【０１０６】
投与の用量、投薬スケジュールおよび方法は、Ｆａｈ欠損性ブタにおける肝機能障害を予防するために必要に応じて調節され得る。Ｆａｈ欠損性ブタに投与されるＮＴＢＣの用量は多様であり得る。一部の実施形態では、用量は、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。特定の例では、ＮＴＢＣの用量は、１日あたり約１ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態では、ＮＴＢＣは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。別の実施形態では、ＮＴＢＣは、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば、０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日または約０．１０ｍｇ／ｋｇ／日）の用量で投与される。
【０１０７】
ＮＴＢＣは、任意の適切な手段（飲料水中、食品中、または注射などが挙げられるがこれらに限定されない）によって投与され得る。一実施形態において、飲料水中で投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約８ｍｇ／Ｌ（例えば、約１ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ、約７ｍｇ／Ｌまたは約８ｍｇ／Ｌ）である。別の実施形態において、飲料水中で投与されるＮＴＢＣの濃度は、約１ｍｇ／Ｌ〜約２ｍｇ／Ｌ（例えば、１．０ｍｇ／Ｌ、約１．２ｍｇ／Ｌ、約１．４ｍｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／Ｌ、約１．８ｍｇ／Ｌまたは約２．０ｍｇ／Ｌ）である。
【０１０８】
一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタに移植されるヒト肝細胞は、単離されたヒト肝細胞である。一部の実施形態において、ヒト肝細胞は、肝組織移植片の一部として移植される。単離されたヒト肝細胞は、多数の多様な供給源のうちのいずれか１つから入手され得る。一実施形態において、ヒト肝細胞は、臓器ドナーの肝臓から単離される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、外科的切除物から単離される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、多能性成体前駆細胞、非制限体性幹細胞、または、肝臓自体、胆嚢、腸もしくは膵臓に見られ得る組織特異的肝性幹細胞のような幹細胞から誘導される。別の実施形態において、ヒト肝細胞は、単球または羊膜細胞から誘導され、すなわち、幹細胞または前駆細胞は、肝細胞を生成するためにインビトロで入手される。別の実施形態では、ヒト肝細胞は、注入前に凍結保存される。
【０１０９】
一部の実施形態において、この方法はさらに、増殖させたヒト肝細胞をＦａｈ欠損性ブタから収集する工程を包含する。
【０１１０】
さらに、Ｆａｈ欠損性レシピエントブタにおけるヒト肝細胞（または別の種由来の肝細胞）の継代移植の方法が本明細書において提供される。この方法は、増殖させたヒト肝細胞を第一のレシピエントブタから収集し、そしてさらに、第二、第三、第四、またはさらなるレシピエントブタにおいて肝細胞を増殖させる工程を包含する。ヒト肝細胞は、多数の技術のうちのいずれか１つを用いてブタから収集され得る。例えば、肝細胞は、ブタの肝臓を灌流し、その後、丁寧に細かく切ることによって収集され得る。さらに、肝細胞は、周知の方法を用いて（例えば、ヒト細胞またはヒト肝細胞を特異的に認識する抗体を用いることによって）、他の細胞型、組織および／または細片から分離され得る。このような抗体としては、クラスＩ腫瘍組織適合遺伝子抗原に特異的に結合する抗体（例えば、抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ）が挙げられるがこれらに限定されない（Ｍａｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６：４５５−４６２，１９９７）。その後、抗体が結合した肝細胞が、パニング（固体マトリクスに結合させたモノクローナル抗体を利用する）、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気ビーズ分離などによって分離され得る。肝細胞を収集する代替的な方法は当該分野で周知である。動物において肝細胞を継代移植する方法は、例えば、ＰＣＴ公開第２００８／１５１２８３号に記載される。
【０１１１】
さらに、そのゲノムがＦａｈ遺伝子における破壊についてホモ接合性の遺伝子改変をされており、その結果、その破壊が、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如をもたらしているブタが本明細書において提供され、ここで、このブタは肝機能の低下を示す。機能的ＦＡＨタンパク質の発現の欠如は、必ずしも、発現の完全な欠如ではない。一部の例では、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の欠如は、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％の発現の欠如である。Ｆａｈ遺伝子の破壊は、機能的なＦＡＨタンパク質の発現の有意な消失または完全な欠如をもたらすあらゆる改変であり得る。一部の実施形態において、破壊は、Ｆａｈ遺伝子における挿入、欠失、または、１もしくは複数個の点変異、あるいは、これらの任意の組合せである。特定の例では、破壊は挿入である。一部の例では、挿入は、インフレームの終止コドンを含む。挿入はまた、選択マーカーをコードする核酸のような追加の核酸配列を含み得る。
【０１１２】
一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタは、移植されたヒト肝細胞を含む。一部の実施形態において、Ｆａｈ欠損性ブタは免疫抑制状態である。一部の例では、免疫抑制は、１または複数の免疫抑制剤の投与の結果である。ブタにおいて免疫抑制を達成するために有効な任意の適切な免疫抑制薬または免疫抑制剤が使用され得る。免疫抑制剤の例としては、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、フルダラビン、ミコフェノレート、プレドニゾン、ラパマイシンおよびアザチオプリンが挙げられるがこれらに限定されない。免疫抑制剤の組合せもまた投与され得る。一部の例において、免疫抑制は、機能的な免疫細胞の発生を阻害する１または複数の遺伝的変化の結果である。免疫抑制はまた、マクロファージまたはＮＫ細胞のような特定の免疫細胞の欠乏からも生じ得る。
【０１１３】
ヒト肝疾患の処置のために有効な薬剤を選択するための方法もまた提供される。一部の実施形態において、この方法は、Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与し、そして、肝疾患に対する候補薬剤の効果を評価する工程を包含し、ここで、肝疾患の１以上の徴候もしくは症状における改善は、その候補薬剤が肝疾患の処置に有効であることを示す。一部の実施形態では、肝疾患は、肝臓感染症、肝硬変またはＨＣＣである。
【０１１４】
また、ヒトの肝臓病原体による感染の処置に有効な薬剤を選択するための方法も本明細書中に提供される。一部の実施形態において、この方法は、（ｉ）ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、このＦａｈ欠損性ブタは、肝臓病原体に感染している、工程；および（ｉｉ）肝臓感染症に対する候補薬剤の効果を評価する工程を包含する。候補薬剤の投与前のＦａｈ欠損性ブタにおける感染負荷量と比較した、肝臓病原体の感染負荷量の減少は、その候補薬剤が、肝臓病原体による感染の処置に有効であることを示す。
【０１１５】
一部の実施形態では、感染負荷量は、ブタから得たサンプル中の病原体の力価を測定することによって決定される。一部の実施形態では、感染負荷量は、ブタから得たサンプル中の病原体特異的な抗原を測定することによって決定される。一部の実施形態では、感染負荷量は、ブタから得たサンプル中の病原特異的な核酸分子を測定することによって決定される。一部の実施形態では、肝臓病原体は、ＨＢＶまたはＨＣＶのような肝指向性ウイルス（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ）である。
【０１１６】
さらに、肝硬変の処置に有効な薬剤を選択するための方法が提供される。一部の実施形態では、この方法は、（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、このＦａｈ欠損性ブタは、ブタにおいて肝硬変の発症をもたらす用量でＮＴＢＣが投与されている、工程；および（ｉｉ）Ｆａｈ欠損性ブタにおける少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーに対する候補薬剤の効果を評価する工程を包含する。一部の実施形態では、少なくとも１種の肝硬変の診断マーカーは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、アルブミンまたは凝固因子から選択される。候補薬剤の投与前のＦａｈ欠損性ブタと比較した、Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼのうち少なくとも１種の減少、および／または、アルブミンの増加は、その候補薬剤が、肝硬変の処置に有効であることを示す。一部の実施形態では、一度Ｆａｈ欠損性ブタが肝硬変を発症すると、この動物は、肝硬変のさらなる進行を予防するために、最大用量のＮＴＢＣを投与される。肝硬変を評価するための他の診断マーカー（例えば、画像化または肝生検による）もまた、本開示の方法において使用され得る。
【０１１７】
また、肝細胞癌（ＨＣＣ）の処置に有効な薬剤を選択するための方法も提供される。一部の実施形態では、この方法は、（ｉ）Ｆａｈ欠損性ブタに候補薬剤を投与する工程であって、このＦａｈ欠損性ブタは、ブタにおいてＨＣＣの発症をもたらす用量でＮＴＢＣが投与されている、工程；および（ｉｉ）Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＨＣＣに対する候補薬剤の効果を評価する工程を包含する。候補薬剤の投与前のＦａｈ欠損性ブタと比較した、Ｆａｈ欠損性ブタにおける腫瘍増殖または腫瘍容積の減少は、その候補薬剤がＨＣＣの処置に有効であることを示す。
【０１１８】
さらに、インビボにおいてヒト肝細胞に対する外因性因子の効果を評価する方法が提供される。一部の実施形態において、この方法は、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタに外因性因子を投与する工程、および、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて少なくとも１種の肝機能のマーカーを測定する工程を包含する。一部の実施形態において、少なくとも１種の肝機能のマーカーは、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼおよびアルブミンから選択され、ここで、外因性因子の投与前のＦａｈ欠損性ブタと比較した、Ｆａｈ欠損性ブタにおけるＡＳＴ、ＡＬＴ、ビリルビンもしくはアルカリホスファターゼにおける増加、または、アルブミンにおける減少は、その外因性因子が毒性であることを示す。一部の実施形態では、外因性因子は、既知の毒素または疑わしい毒素である。
【０１１９】
（ＩＶ．Ｆａｈ欠損性ブタおよびその使用）
ブタの胎仔線維芽細胞においてＡＡＶ標的化構築物を用いた相同組換え、その後の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による、Ｆａｈ欠損性ブタの作製が本明細書中に開示される。ＳＣＮＴによって胎仔線維芽細胞からＦａｈ＋／−ブタを産生するために使用される手順は、図５に例示される。Ｆａｈ−／−ブタを産生するための方法の説明は図１に示される。以下により詳細に考察されるように、Ｆａｈ欠損性ブタは、多数の研究および治療の目的に有用である。
【０１２０】
Ｆａｈ＋／−ブタを作製する例示的な方法は、実施例１に記載され、そして、Ｆａｈ＋／−ブタを異種交配することによってホモ接合性のＦａｈ欠損性ブタを産生するための手順は、実施例２に記載される。しかしながら、本開示は、Ｆａｈ欠損性ブタを作製する１つの特定の方法に限定されず、Ｆａｈ−／−ブタを産生するための当該分野で公知のあらゆる方法を包含する。
【０１２１】
本明細書中に開示されるように、Ｆａｈ＋／−ブタは、胎仔ブタ線維芽細胞における相同組換えのためのＡＡＶ標的化構築物を作製することによって作製した。ＡＡＶ標的化構築物は、インフレームの終止コドン、ネオマイシン耐性カセット、ならびに、Ｆａｈ遺伝子のエキソン５における挿入のための構築物を標的とする５’および３’の相同性アームを含んだ。胎仔ブタ線維芽細胞に、ＡＡＶ標的化ベクターを感染させ、そして、ネオマイシン耐性について選択して、組み込まれたベクターを持つ個々の細胞クローンを単離した。細胞を増殖させ、そして、各クローンからのＤＮＡをＰＣＲによって評価し、適切な標的化を確認した。
【０１２２】
胎仔線維芽細胞からＦａｈ＋／−ブタを作製するために、ＳＣＮＴを使用した。雌ブタから成熟な卵母細胞を単離し、インビトロで培養し、除核し、そして、ドナーの線維芽細胞と融合させた。結果として生じた胚を、活性化されたレシピエントの若い雌ブタ（ｇｉｌｔ（ｙｏｕｎｇ  ｆｅｍａｌｅ  ｐｉｇ））内に移した。ＳＣＮＴから生じた仔ブタをＰＣＲによりスクリーニングし、そして、サザンブロットにより、そのＦａｈ＋／−の状態を確認する。
【０１２３】
Ｆａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタを異種交配させてＦａｈ−／−ホモ接合性ブタを作製することができる。生まれたばかりの仔ブタには、肝不全を予防するためにＮＴＢＣまたは類似の化合物が投与される。一旦ゲノム型決定が完了すると、全てのＦａｈ−／−ホモ接合性ブタにＮＴＢＣの投与が維持される。所望される場合、ＮＴＢＣの用量は、Ｆａｈ欠損性ブタにおける肝硬変もしくはＨＣＣを促進するために減じられ得るか、または、以下に考察されるように、ＮＴＢＣ処置は、一旦Ｆａｈ欠損性ブタにヒト肝細胞または別の種（例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマまたは非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジーおよびアカゲザル）など）由来の肝細胞を移植されると、排除され得る。
【０１２４】
（Ａ．ヒト肝細胞の増殖およびその医療的使用）
本開示は、レシピエントブタにおいて増殖させ、そしてレシピエントブタから収集されたヒト肝細胞の、肝臓の再形成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）治療を必要とする被験体において肝臓の再形成を行うためのヒト肝細胞の供給源としての使用を企図する。肝細胞の導入による患者における肝臓組織の再形成は、肝臓移植に先行する一時的な処置、または、孤立性代謝不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する患者の決定的な処置のいずれかとして、急性肝不全を有する患者にとって、可能性がある治療の選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：５３−６１，１９９８）。肝細胞の再形成は、例えば、遺伝子治療のために遺伝子改変された肝細胞を導入するため、あるいは、疾患、物理的もしくは化学的損傷、または悪性疾患の結果としての肝細胞の喪失を補うために使用され得る（米国特許第６，９９５，２９９号）。例えば、家族性高コレステロール血症を罹患する患者の遺伝子治療におけるトランスフェクトした肝細胞の使用が報告されている（Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６：３３５，１９９４）。さらに、増殖させたヒト肝細胞は、人工肝臓補助装置に定植させる（ｐｏｐｕｌａｔｅ）ために使用され得る。Ｆａｈ欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を移植および増殖させる特定の方法は、そしてまた増殖させたヒト肝細胞の医療的使用は、以下により詳細に記載される。
【０１２５】
（１．Ｆａｈ欠損性ブタの免疫前胎仔期移植）
Ｆａｈ欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を増殖させるための本明細書中に開示される１つの方法は、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔にヒト肝細胞を移植する工程を包含する。この方法では、Ｆａｈ−／−ブタが互いに交配され、ホモ接合性Ｆａｈノックアウトの子孫のみを生成する。およそ妊娠３５日目に、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔が外科的に取り出され、そして、臍静脈を介してヒト肝細胞が注入される。一部の実施形態において、ブタ胎仔は、およそ３００，０００個のヒト肝細胞を注入される。しかしながら、ヒト肝細胞の数は多様であり得、所望される使用に依存する。一部の例では、注入されるヒト肝細胞の数は、約１００，０００〜約５００，０００である。胎仔発生段階における免疫系の未熟な性質のおかげで、Ｆａｈ欠損性ブタ胎仔はヒト肝細胞に対する耐性を生じる。したがって、胎仔発生段階にヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタを免疫抑制剤で処置する必要はない。
【０１２６】
妊娠した雌ブタは、全妊娠期間にわたり肝機能障害を予防するためにＮＴＢＣの投与が維持される。ＮＴＢＣの用量は多様であり得る。一部の実施形態では、ＮＴＢＣの用量は、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例では、ＮＴＢＣの用量は、１日あたり約１．０ｍｇ／ｋｇである。ＮＴＢＣの用量は、Ｆａｈ欠損性動物における肝機能障害を予防するため、必要に応じて修正され得る。生後、ヒト肝細胞が生着したＦａｈ欠損性ブタは、ヒト肝細胞の増殖を可能にするために、ＮＴＢＣの投与が停止される。他の例では、ＮＴＢＣの用量は、約１日〜約６日にわたってなど、経時的に次第に減じられる。
【０１２７】
（２．Ｆａｈ欠損性ブタの生後移植）
Ｆａｈ欠損性ブタにおいてヒト肝細胞を増殖させる第二の方法は、Ｆａｈ欠損性ブタへのヒト肝細胞の生後移植を包含する。一部の実施形態において、生後直ちに（例えば、２日以内、または、１週間以内に）、Ｆａｈ欠損性仔ブタに移植される。他の実施形態では、より週齢の進んだＦａｈ欠損性ブタ（成体Ｆａｈ欠損性ブタを含む）に移植される。ヒト肝細胞は、一般に、肝動脈、脾臓内注射または門脈によって移植される。Ｆａｈ欠損性ブタは、肝機能障害を予防するために、ＮＴＢＣの投与が維持される。ヒト肝細胞の移植前に、Ｆａｈ欠損性ブタは、ヒト肝細胞の拒絶を予防するために１または複数の免疫抑制剤で処置される。代表的には、１または複数の免疫抑制剤は、ヒト肝細胞移植の約２日前に投与される；しかしながら、免疫抑制剤での処置を開始する時期は、必要に応じて最適な結果を達成するために多様にされ得る。免疫抑制剤の投与は、代表的には、ヒト肝細胞の拒絶を予防するために無限に継続される。
【０１２８】
一旦ヒト肝細胞の移植が完了すると、Ｆａｈ欠損性ブタは、ヒト肝細胞の増殖を可能にするためにＮＴＢＣの投与が停止される。ヒト肝細胞（Ｆａｈについて欠損性でない）の存在は、ＮＴＢＣの非存在下でも動物が健康なままであることを可能にする。一部の場合、ＮＴＢＣでの処置は、肝細胞移植後直ちに停止される。他の場合には、ＮＴＢＣは、約１日〜約６日にわたってなど、経時的に次第に減じられる。一部の実施形態では、ＮＴＢＣの用量は、Ｆａｈ欠損性ブタに投与される場合、１日あたり約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．０ｍｇ／ｋｇである。一部の例では、ＮＴＢＣの用量は、１日あたり約１．０ｍｇ／ｋｇである。ＮＴＢＣの用量は、Ｆａｈ欠損性動物における肝機能障害を予防するため、必要に応じて修正され得る。
【０１２９】
一部の場合、子宮内でヒト肝細胞に対して耐性にされた（ｔｏｌｅｒｉｚｅ）ブタにおいて、生後移植が使用される。
【０１３０】
（３．Ｆａｈ欠損性ブタへのヒト肝細胞の移植）
ヒト肝細胞、または、肝細胞前駆体／先祖のあらゆる適切な供給源が、Ｆａｈ欠損性ブタにおける移植のための本開示の方法において使用され得る。例えば、ヒト肝細胞は、死体のドナーもしくは肝臓の切除物から誘導され得るか、または、市販の供給源から入手され得る。Ｆａｈ欠損性ブタには、あらゆる年齢のドナーからのヒト肝細胞、または、凍結保存された肝細胞を移植することが可能であるものと期待される。ヒト肝細胞の単離と移植との間にはしばしば遅延（代表的には１〜２日）が存在し、これが、肝細胞の乏しい生存能をもたらし得る。しかしながら、Ｆａｈ欠損性ブタの系は、肝細胞の数が制限される場合でも、ヒト肝細胞を増殖する手段として機能し得る。
【０１３１】
ヒト肝細胞を単離する方法は当該分野で周知である。例えば、臓器ドナーまたは肝臓切除物からヒト肝細胞を単離する方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００４／００９７６６およびＷＯ  ２００５／０２８６４０、ならびに、米国特許第６，９９５，２９９号および同第６，５０９，５１４号に記載される。肝細胞は、経皮的に、または、腹部外科手術により採取された肝生検から入手され得る。レシピエント動物（例えば、Ｆａｈ欠損性舞台）に移植するためのヒト肝細胞は、当該分野で公知の任意の簡便な方法によって、ヒト肝臓組織から入手され得る。肝臓組織は、単一の細胞の懸濁物を提供するために機械的にまたは酵素により解離させられ得るか、あるいは、インタクトなヒトの肝臓組織の断片が使用され得る。例えば、肝細胞は、慣用的なコラゲナーゼ灌流（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３：２９，１９７６）とその後の低速での遠心分離によってドナー組織から単離され得る。ついで、肝細胞は、ステンレス鋼のメッシュを通して濾過され、その後、密度勾配遠心分離を行うことによって精製され得る。あるいは、例えば、蛍光活性化細胞分取、パニング、磁気ビーズ分離、遠心場における洗浄（ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｅｌｄ）、または、当該分野で周知の任意の他の方法のような、肝細胞を富化するための他の方法が使用され得る。同様の肝細胞単離法が、レシピエント動物の肝臓（例えば、Ｆａｈ欠損性ブタの肝臓）から増殖させたヒト肝細胞を収集するために使用され得る。
【０１３２】
あるいは、ヒト肝細胞は、Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．Ｒｅｐ．６：６２５−６２８，１９８２）によって記載された技術を用いて調製され得る。簡単に述べると、肝臓またはその一部が隔離され、そして、カニューレが門脈または門脈枝内に導入される。ついで、この肝臓組織は、カニューレを介して、３７℃にて、１分あたり３０〜７０ｍＬの流速において、ＨＥＰＥＳ緩衝液中の塩化カルシウム溶液（例えば、約０．０７５％塩化カルシウム）中にコラゲナーゼ（例えば、約０．０２５％コラゲナーゼ）を含有する酵素溶液で灌流される。灌流された肝臓組織は、小さな（例えば、約１ｍｍ３）片へと細かく切られる。酵素による消化は、細胞懸濁物を生成するために、３７℃にて穏やかに撹拌しながら約１０〜２０分間、上述のものと同じ緩衝液中で継続される。放出された肝細胞は、６０〜８０μｍのナイロンメッシュを通して細胞懸濁物を濾過することによって回収される。次いで、この回収した肝細胞は、コラゲナーゼおよび細胞片を除くために、低速の遠心分離を用いて、ｐＨ７．０の冷ＨＥＰＥＳ緩衝液中で洗浄され得る。非実質細胞は、メトリザマイド勾配遠心分離（米国特許第６，９９５，２９９号を参照）によって除去され得る。
【０１３３】
ヒト肝細胞は、新鮮な組織（例えば、死から数時間以内に得られた組織）、または、新鮮な状態で凍結された組織（例えば、凍結され、約０℃以下に維持された新鮮な組織）から入手され得る。一部の用途については、ヒト組織は検出可能な病原体を有さず、形態学および組織学的に正常であり、そして、本質的に疾患を有さないことが好ましい。生着のために使用される肝細胞は、新しく（例えば、２〜３時間以内に）単離され得るか、または、細胞が適切な保存培地中に維持されている場合には、より長い期間の後に移植され得る。１つのこのような培地は、ＶＩＡＳＰＡＮＴＭである（腹部内器官の保存のための万能な大動脈洗浄・低温保存溶液（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｏｒｔｉｃ  ｆｌｕｓｈ  ａｎｄ  ｃｏｌｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液またはＵＷとも呼ばれる）。肝細胞はまた、移植前に凍結保存され得る。肝細胞を凍結保存する方法は、当該分野で周知であり、例えば、米国特許第６，１３６，５２５号に記載される。
【０１３４】
臓器ドナーまたは肝臓切除物からヒト肝細胞を得ることに加えて、生着のために使用される細胞は、ヒト幹細胞または肝細胞前駆細胞であり得、これは、レシピエント動物への移植後に、増殖可能なヒト肝細胞へと発生または分化する。ＥＳ細胞の特性を持つヒト細胞は、胚盤胞の内部細胞塊（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，１９９８）および発生途上の生殖系列細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６−１３７３１，１９９８）から単離されており、そして、ヒト胚性幹細胞が生成されている（米国特許第６，２００，８０６号を参照）。米国特許第６，２００，８０６号に開示されるように、ＥＳ細胞は、ヒトおよび非ヒト霊長類から生成され得る。ヒトおよび非ヒト霊長類の細胞から誘導された人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞もまた入手され得る（例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０，２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３１（５）：８６１−８７２，２００７；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３（６）：５８７−５９０，２００８を参照）。一般に、霊長類のＥＳ細胞は、ＥＳ細胞培地の存在下でマウスの胚性線維芽細胞のコンフルエントな層の上で単離される。ＥＳ細胞培地は一般に、８０％  ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ピルビン酸なし、高グルコース処方、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ならびに、２０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）および１％非必須アミノ酸ストック（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から構成される。ＥＳ細胞を、成体に存在する拘束された「多能性」幹細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  “ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ”  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）と区別する特徴としては、培養物において無限に未分化状態を保つＥＳ細胞の能力、そして、ＥＳ細胞が全ての異なる細胞型に発生するであろう可能性が挙げられる。ヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞は、特異的なモノクローナル抗体によって認識される、糖脂質細胞表面抗原であるＳＳＥＡ−４を発現する（例えば、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２７１−２７８，２０００を参照）。
【０１３５】
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）由来のヒト肝細胞もまた、本明細書中に記載される方法において使用され得る。骨髄由来のｈＭＳＣの肝性因子への逐次的な曝露は、肝細胞の特性を持つ細胞への幹細胞の分化をもたらす（Ｓｎｙｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．７：２４，２００７；Ａｕｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ．５６（３）：４０５−１５，２００７を参照）。骨髄由来の間葉系幹細胞および脂肪組織由来幹細胞（ＡＤＳＣ）の肝性分化もまた記載されている（参考として本明細書中に援用されるＴａｌｅｎｓ−Ｖｉｓｃｏｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２（３６）：５８３４−４５，２００６を参照）。ヒト肝細胞はまた、単球からも生成され得る。Ｒｕｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７９（９）：１０９７−１０３，２００５）は、最終段階まで分化した末梢血単球からの肝細胞様（ＮｅｏＨｅｐ）細胞の作製を記載している。ＮｅｏＨｅｐ細胞は、形態構造、肝細胞マーカーの発現、多様な分泌および代謝の機能、ならびに、薬物解毒活性に関して、初代ヒト幹細胞と似ている。さらに、羊膜細胞由来のヒト肝細胞もまた、本明細書中に記載される方法において使用され得る。
【０１３６】
ヒトＥＳ細胞株が存在し、そして、本明細書中に開示される方法において使用され得る。ヒトＥＳ細胞はまた、体外授精（ＩＶＦ）した胚からの着床前の胚からも誘導され得る。未使用のヒトＩＶＦにより生成された胚についての実験は、胚が１４日齢未満である場合、多くの国（例えば、シンガポールおよび英国）において認められている。高品質の胚のみが、ＥＳ細胞の単離に適している。１細胞のヒト胚を拡大された胚盤胞へと培養するための培養条件は記載されている（例えば、Ｂｏｎｇｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．４：７０６−７１３，１９８９を参照）。ヒト卵管細胞とヒト胚との同時培養は、高品質の胚盤胞の生成をもたらす。細胞同時培養または改良型の限定培地（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）において増大させた、ＩＶＦ由来の拡大されたヒト胚盤胞は、ヒトＥＳ細胞の単離を可能にする（米国特許第６，２００，８０６を参照）。
【０１３７】
（４．Ｆａｈ欠損性ブタからのヒト肝細胞の収集）
ヒト肝細胞は、当該分野で公知の多数の技術のいずれかを用いてレシピエント動物から収集され得る。例えば、ブタは、麻酔をかけられ、そして、門脈または下大動脈にカテーテルがカニューレを通して挿入され得る。次いで、肝臓が適切な緩衝液（例えば、０．５ｍＭ  ＥＧＴＡおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳが補充されたカルシウムおよびマグネシウムを含まないＥＢＳＳ）で灌流され、その後、コラゲナーゼ処置（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＸＩおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉを補充したＥＢＳＳの溶液を用いる）が行われ得る。肝臓は、穏やかに細かく切られ、そして、ナイロンメッシュを通して濾過され（例えば、逐次的に、７０μｍおよび４０μｍのナイロンメッシュを通す）、その後、細胞の遠心分離および洗浄が行われ得る。
【０１３８】
レシピエント動物から収集されたヒト肝細胞は、当該分野で周知の任意の技術を用いて、非ヒト細胞または他の交雑物（例えば、組織または細胞片）から分離され得る。例えば、このような方法としては、ヒト肝細胞に選択的に結合する抗体の使用が挙げられる。このような抗体としては、クラスＩ主要組織適合遺伝子抗原に特異的に結合する抗体（例えば、抗ヒトＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ（Ｍａｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６：４５５−４６２，１９９７））またはＣＤ４６に特異的に結合する抗体が挙げられるがこれらに限定されない。ヒト細胞またはヒト肝細胞に特異的な抗体は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、パニングまたは磁気ビーズ分離を含む種々の多様な技術において使用され得る。あるいは、交雑したブタ細胞を除去し、それによって、ヒト肝細胞を富化するためにブタ細胞に選択的に結合する抗体が用いられ得る。ＦＡＣＳは、抗体によって結合された細胞を分離または選別するために、他のより洗練された検出レベルの中でも、複数の色チャネル、ローアングルおよび鈍角の光散乱検出チャネル（ｌｏｗ  ａｎｇｌｅ  ａｎｄ  ｏｂｔｕｓｅ  ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）、ならびに、インピーダンスチャネル、を利用する（米国特許第５，  ０６１，６２０号を参照）。磁気分離は、１）ヒト特異的抗体に結合体化されたか；２）ヒト特異的抗体に結合可能な検出抗体に結合体化されたか；または、３）ビオチン化抗体に結合できるアビジンに結合体化された、強磁性粒子の使用を包含する。パニングは、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空糸膜（ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）またはプラスチック製のペトリ皿のような固体マトリクスに結合させたモノクローナル抗体を必要とする。抗体によって結合される細胞は、単純に固体支持体をサンプルから物理的に分離することによって、サンプルから単離され得る。
【０１３９】
Ｆａｈ欠損性ブタから収集した肝細胞は、例えば、後の使用のために凍結保存され得るか、または、輸送および将来的な使用のために組織培養において平板培養（ｐｌａｔｅ）され得る。
【０１４０】
（５．ヒト肝臓の再形成）
Ｆａｈ欠損性ブタは、肝臓移植の代替として、または、肝臓移植の補助として、ヒトの肝臓を再形成するために使用され得るヒト肝細胞を増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）させるためのシステムを提供する。現在、肝疾患を罹患する患者は、移植に適した臓器が利用可能となるまでに、長期間待たなければならないかもしれない。移植後、患者は、ドナー肝臓の拒絶を回避するために、その寿命が続く間、免疫抑制剤で処置される必要がある。患者自身の細胞を増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）させるための方法は、生存状態を維持するために免疫抑制を必要としない機能的な肝臓組織の供給源を提供し得る。したがって、本明細書中に開示されるＦａｈ欠損性ブタは、その自身の肝細胞（患者の特定の幹細胞から生成されたもの、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させたものを含む）またはドナーからの肝細胞を用いて、肝疾患および／または肝不全を有する患者の肝臓を再形成するために使用され得る。
【０１４１】
肝細胞の導入（また、「肝細胞移植」とも呼ばれる）による患者における肝臓組織の再形成は、肝臓移植に先行する一時的な処置、または、孤立性代謝不全（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）を有する患者の決定的な処置のいずれかとして、急性肝不全を有する患者にとって、可能性がある治療の選択肢である（Ｂｕｍｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：５３−６１，１９９８）。治療的な肝臓の再形成を達成するための主要な障害は、（宿主とドナーの細胞が遺伝的に、そして、表現型的に異なる場合）「同種移植拒絶」と呼ばれる現象である、宿主による移植された肝細胞の免疫拒絶である。免疫抑制剤は、同種移植拒絶の予防において部分的に成功するのみである（Ｊａｖｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５：３５３−３６７，１９９６；Ｍａｋｏｗｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４２：５３７−５４１，１９８６）。
【０１４２】
Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させたヒト肝細胞はまた、遺伝子治療用途のためにも使用され得る。最も広い意味において、このような肝細胞は、遺伝的欠陥を修正するためにヒト宿主へと移植される。継代肝細胞は、必ずしも、元々移植のレシピエントとなる個体と同じ個体から誘導される必要はないが、元々移植のレシピエントとなる個体と同じ個体から誘導されることも可能である。
【０１４３】
一部の実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させたヒト肝細胞は、肝臓移植の準備として、または、肝臓移植の代替として、被験体において肝臓組織を再形成するために使用され得る。１つの非限定的な例として、例えば、アルコール中毒症の結果として肝臓の進行性の変性を罹患している被験体は、後にＦａｈ欠損性ブタにおいて増殖させる肝細胞のドナーとして機能し得る。肝細胞の数は、被験体から最初に得られ、Ｆａｈ欠損性ブタに移植された数と比較して増大する。増殖の後、ヒト肝細胞は、Ｆａｈ欠損性ブタから単離され得、そして、被験体の肝機能を再構成するために使用され得る。Ｆａｈ欠損性ブタにおける肝細胞の増殖は、肝細胞の数を増やすためだけではなく、感染性もしくは悪性の疾患に冒された肝細胞を選択的に取り除くためにも使用され得る。具体的には、被験体は、肝炎を罹患していてもよく、肝炎では、全てではないが一部の肝細胞が感染されており、感染された肝細胞は、細胞内または細胞表面上のウイルス抗原の存在によって同定され得る。このような場合、肝細胞が被験体から収集され得、そして、非感染細胞が、例えばＦＡＣＳによって、１または複数のＦａｈ欠損性ブタにおける増殖のために選択され得る。一方で、患者における感染を排除するための積極的な処置も取られ得る。処置の後、被験体の肝臓組織は、１または複数のＦａｈ欠損性ブタにおいて増殖させた肝細胞によって再形成され得る。同様の方法が、ＨＣＣのような肝臓の悪性疾患を罹患する患者から、非悪性細胞を選択的に継代するために使用され得る。
【０１４４】
（Ｂ．ＨＴ１のブタモデル）
遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）は、肝臓および腎臓を冒す重篤な常染色体劣性代謝疾患である。ＨＴ１は、ヒトの１５番染色体のｑ２３−ｑ２５およびマウスの７番染色体に位置するＦａｈ遺伝子における欠陥から生じる。ＨＴ１患者は、肝硬変に進行する幼児期からの肝臓の損傷；凝固因子の減少；低血糖症；血清血漿における高濃度のメチオニン、フェニルアラニンおよびアミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）；高い肝細胞癌のリスク；ならびに、尿細管および糸球体性の腎機能不全のような多様な臨床症状を呈する。その重篤な形態では、進行性の肝損傷のパターンが幼若乳児期（ｅａｒｌｙ  ｉｎｆａｎｃｙ）から始まる。その中等度の形態では、高いヘパトームの発生率を伴う慢性肝損傷が特徴的である。
【０１４５】
Ｆａｈ遺伝子破壊についてホモ接合性のマウスは、肝機能障害によって引き起こされる新生児期致死性の表現型を有する。これまでに、ＮＴＢＣによるＦａｈ欠損性マウスの処置が肝機能を修復し、そして、新生児期の致死性を無効にすることが実証されている（Ｇｒｏｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０：４５３−４６０，１９９５）。これらの動物の延長された寿命は、肝細胞癌および線維症の発症を含むヒトのＨＴ１に類似する表現型をもたらした。したがって、本明細書中に開示されるＦａｈ欠損性ブタは、ヒト疾患ＨＴ１の大型動物モデルを提供するものと予想される。
【０１４６】
現在、ＨＴ１の最も有効な治療は肝臓移植である。この処置は、かなりの合併症の発現頻度、死亡率および費用を伴う。したがって、改善された処置の方法（例えば、薬理学的な阻害または遺伝子治療）が必要とされている。本明細書中に開示されるＦａｈ欠損性ブタは、可能性あるＨＴ１処置の有効性を評価するための大型動物モデルを提供する。本明細書では、疾患を軽減する薬剤のスクリーニング、遺伝子治療（例であるが、Ｆａｈ欠損性ブタに移植されたヒト肝細胞への異種核酸配列の導入）の評価、および、食事変更の評価を含めて、多様な異なる型のＨＴ１治療を評価するためにＦａｈ欠損性ブタを使用することが企図される。
【０１４７】
（Ｃ．肝疾患モデル）
上で考察されたように、動物におけるＦａｈ欠損性は、ヒト疾患ＨＴ１に類似する疾患の表現型をもたらす。致死性を予防するために、Ｆａｈ欠損性動物は、肝機能障害を予防するためのＮＴＢＣ投与が維持されるが、ＨＣＣ、線維症および肝硬変を含むＨＴ１型表現型の発生を促進するために、ＮＴＢＣの用量の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）が使用され得る。したがって、本明細書中に開示されるＦａｈ欠損性ブタは、ＨＣＣおよび肝硬変を含む種々の肝疾患の研究に使用され得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、本明細書中に開示されるＦａｈ欠損性ブタは、ヒト肝疾患の大型動物モデルとして使用される。Ｆａｈ欠損性ブタは、例えば、毒素、感染性疾患または悪性疾患または遺伝的欠陥（すなわち、ＨＴ１につながるＦａｈ欠損性）に対する曝露から生じる肝疾患のモデルとして使用され得る。Ｆａｈ欠損性ブタがモデルとして機能し得るヒト遺伝性肝疾患の例としては、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿病、グリコーゲン蓄積症、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病）、および、あらゆる先天性代謝異常が挙げられるがこれらに限定されない。開示されるモデル系は、特定の肝疾患のより良い理解を得、そして、疾患のプロセスを予防、遅延または逆行させ得る薬剤を同定するために使用され得る。
【０１４９】
Ｆａｈ欠損性ブタが毒素によって引き起こされる肝疾患のモデルとして使用される場合、Ｆａｈ欠損性ブタは、肝機能障害を予防するためにＮＴＢＣの投与が維持される。対応するヒトの状態を最もそっくり模倣する結果を生じるために必要とされる毒性因子の量は、増加用量の毒性因子に曝露された多数のＦａｈ欠損性ブタを用いることによって決定され得る。毒性因子の例としては、エタノール、アセトアミノフェン、フェニトイン、メチルドパ、イソニアジド、四塩化炭素、黄リンおよびファロイジンが挙げられるがこれらに限定されない。一部の場合、ヒト肝細胞の存在しないＦａｈ欠損性ブタは、毒素の影響を評価するためのモデルとして使用される。他の例では、Ｆａｈ欠損性ブタは、ヒト肝細胞に対する毒素の影響を評価するために、ヒト肝細胞を移植される。これらの例では、Ｆａｈ欠損性ブタをＮＴＢＣ投与に維持する必要はない。代表的には、ヒト肝細胞の増殖は、Ｆａｈ欠損性ブタが毒性因子に曝露される前に、ヒト肝細胞集団の大きさが十分となる（例えば、最大に近づいている）点へと進むことを可能にする。
【０１５０】
Ｆａｈ欠損性ブタが悪性肝疾患（例えば、ＨＣＣまたはヘパトーム）のモデルとして使用される実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタは、肝機能障害に起因する不慮の死を防止するために十分に高い用量のＮＴＢＣが投与されるが、その用量は、ＨＣＣまたは他の肝臓悪性疾患の発症を可能にするに十分低い。あるいは、Ｆａｈ欠損性ブタは、あらゆる肝機能障害を予防する用量のＮＴＢＣに維持され得、そして、悪性疾患は、形質転換因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）への曝露によって、または、悪性細胞の導入によって、もたらされ得る。一部の例では、ヒト肝細胞が存在しないＦａｈ欠損性ブタは、悪性肝疾患のモデルとして使用される。他の例では、Ｆａｈ欠損性ブタは、ヒト細胞の悪性肝疾患を評価するためにヒト肝細胞を移植される。これらの例では、Ｆａｈ欠損性ブタをＮＴＢＣの投与に維持する必要はない。形質転換因子または悪性細胞は、ヒト肝細胞の最初のコロニー形成導入の時点、または、ヒト肝細胞が宿主動物内で増殖し始めた後に導入され得る。形質転換因子の場合、ヒト肝細胞が活発に増殖している時点で因子を投与することが好ましくあり得る。
【０１５１】
形質転換因子の例としては、アフラトキシン、ジメチルニトロソアミン、および０．０５〜０．１％ｗ／ｗのＤＬ−エチオニンを含有するコリン不足性の食餌（Ｆａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓａｒｍａ，１９８７，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｍａｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｐｐ．１８５−２２０）が挙げられる。このような形質転換因子は、動物に対して全身性に、または、肝臓自体に局所的に、のいずれかで投与され得る。悪性細胞は、肝臓へと直接接種され得る。
【０１５２】
（Ｄ．肝臓感染症のモデル）
Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖され、収集されたヒト肝細胞はまた、多様な微生物学的研究にも使用され得る。多数の病原体（例えば、細菌、ウイルスおよび寄生虫）は、ヒト宿主または初代ヒト肝細胞において複製するのみである。したがって、初代ヒト肝細胞の十分な供給源が存在することが、これらの病原体の研究にとって重要である。増殖させたヒト肝細胞は、ウイルスの感染および複製の研究のため、または、肝ウイルスの感染を調節する化合物を同定するための研究のために使用され得る。肝ウイルスの研究のために初代ヒト肝細胞を用いる方法は、例えば、欧州特許第１５５２７４０号、米国特許第６，５０９，５１４号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ００／１７３３８に記載される。肝ウイルスの例としては、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。肝臓に感染する寄生虫の例としては、例えば、マラリアの原因となる因子（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉを含む））およびリーシュマニア症の原因となる因子（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ、Ｌ．ｃｈａｇａｓｉ、Ｌ．ｍｅｘｉｃａｎａ、Ｌ．ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ、Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ；Ｌ．ｍａｊｏｒ；Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ、Ｌ．（Ｖ．）ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ．（Ｖ．）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ、Ｌ．（Ｖ．）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓおよびＬ．（Ｖ．）ｐｅｒｕｖｉａｎａを含む））が挙げられる。
【０１５３】
Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させたヒト肝細胞を微生物学的研究に用いることに加え、Ｆａｈ欠損性ブタ自体は、肝臓病原体感染症の動物モデルとして機能し得る。例えば、ヒト肝細胞で再編成された（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅｄ）Ｆａｈ欠損性ブタは、肝臓病原体に感染させられ、そして、感染の処置のための候補薬剤をスクリーニングするために使用され得る。候補薬剤は、低分子有機化合物のような多数の化学分類のうちのいずれか１つからの任意の化合物を包含する。候補薬剤はまた、例えば、核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボザイム、短いヘアピンＲＮＡ、発現ベクターなどを含む）、ペプチドおよび抗体、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造アナログまたは組合せのような生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を包含する。
【０１５４】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む広範な種々の供給源から入手され得る。例えば、広範な種々の有機化合物および生体分子のランダムな合成および制御された合成には、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、利用可能であるか、または、容易に生成される。さらに、天然または合成によって生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学、物理および生化学的手段によって容易に改変され、そして、コンビナトリアルライブラリーを生成するために使用され得る。構造アナログを生成するため、既知の薬理学的因子が、制御された化学修飾またはランダムな化学修飾（例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化など）に供され得る。
【０１５５】
ＨＣＶおよびＨＢＶの感染を研究するため、ならびに、これらの感染の処置のための候補薬剤を評価するためのＦａｈ欠損性ブタの使用が以下に考察される。しかしながら、この方法は、関心のあるあらゆる肝臓病原体に応用され得る。一実施形態では、Ｆａｈ欠損性ブタは、ウイルス感染を阻害するか、ウイルス複製を低下させるか、そして／または、ＨＢＶもしくはＨＣＶ感染によって引き起こされる１または複数の症状を軽減させる薬剤を同定するために使用される。一般に、候補薬剤は、Ｆａｈ欠損性ブタに投与され、そして、この候補薬剤の効果が、コントロールに対して評価される。例えば、候補薬剤は、ＨＣＶに感染したＦａｈ欠損性ブタに投与され得、処置された動物のウイルス力価（例えば、血清サンプルのＲＴ−ＰＣＲによって測定されるもの）が、処置前の動物のウイルス力価および／またはＨＣＶに感染した未処置の動物と比較され得る。候補薬剤での処置後の感染動物のウイルス力価における検出可能な減少は、その薬剤の抗ウイルス活性を示している。
【０１５６】
候補薬剤は、薬剤の送達に適した任意の適切な様式で投与され得る。例えば、候補薬剤は、注入（例えば、静脈内注入、筋肉内注入、皮下注入、または、標的組織への直接注入）、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、または、標的組織への直接注射）、経口、または、任意の他の所望される手段によって投与され得る。一部の場合、インビボスクリーニングは、多様な量および濃度の候補薬剤（薬剤なしから、動物に安全に送達され得る上限量に達する薬剤の量まで）を投与される多数のＦａｈ欠損性ブタを必要とし、そして、異なる処方物および経路における薬剤の送達を包含し得る。候補薬剤は、単独で、または、特に、薬剤の組合せの投与が相乗作用を生じ得る場合には、２種以上の組合せで投与され得る。
【０１５７】
候補薬剤の活性は、当該分野で公知の種々の手段のいずれか１つを用いて評価され得る。例えば、Ｆａｈ欠損性ブタが肝指向性病原体（例えば、ＨＢＶまたはＨＣＶ）に感染される場合、薬剤の効果は、病原体の存在について血清サンプルを（例えば、ウイルス力価を測定する）、または、病原体の存在に関連するマーカー（例えば、病原体特異的なタンパク質またはコードする核酸）を検査することによって評価され得る。ウイルス感染の存在および重篤度を検出および評価するための定性的および定量的な方法は当該分野で周知である。一実施形態では、ＨＢＶ感染に対する薬剤の活性は、ウイルス抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）またはＨＢＶコア抗原（ＨｂｃＡｇ））の存在について血清サンプルおよび／または組織切片を検査することによって評価され得る。別の実施形態では、ウイルス感染に対する薬剤の活性は、ウイルス核酸（例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡ）の存在について血清サンプルを検査することによって評価され得る。例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡは、例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合的ＲＴ−ＰＣＲもしくは分枝鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、ＲＴ−ＰＣＲによるネガティブ鎖ＲＮＡ（ＨＣＶの複製中間体）の検出、または、治療によるウイルスゲノムにおける変異／シフト（「類似種進化（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」）を検出するためのウイルスＲＮＡの配列決定を用いて検出され得る。あるいは、または加えて、宿主の肝臓が収集され、そして、組織切片におけるウイルス粒子の量のあらゆる定性的または定量的な変化を直接示すためにインサイチュＲＴ−ＰＣＲハイブリダイゼーションが行われ得る。あるいは、または加えて、宿主を安楽死させて、そして、肝臓が、感染および／または薬剤によって引き起こされる毒性の徴候について組織学的に検査され得る。
【０１５８】
Ｆａｈ欠損性ブタはまた、肝指向性病原体による感染を予防または改善する能力について、候補ワクチンをスクリーニングするためにも使用され得る。一般に、ワクチンは、投与後に、標的病原体に対する免疫応答の開始において宿主を助長する因子である。誘発される体液性、細胞性または体液／細胞性免疫応答は、その病原体に対するワクチンが開発された病原体による感染の阻害を促進し得る。本開示において特に関心があるのは、肝指向性病原体（例えば、微生物、ウイルスまたは寄生虫の病原体）、特に、ウイルス病原体（例えば、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ）による感染、および／または、その肝臓内での複製を阻害する免疫応答を誘発するワクチンである。
【０１５９】
候補ワクチンを評価するために、Ｆａｈ欠損性ブタは、ヒト肝細胞でブタの肝臓を再編成する（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）ためにヒト肝細胞を移植される。有効なワクチンのスクリーニングは、上記したスクリーニング法と類似している。一部の実施形態では、候補ワクチンは、肝指向性病原体を接種される前にＦａｈ欠損性ブタに投与される。一部の場合、候補ワクチンは、単回ボーラス（ｓｉｎｇｌｅ  ｂｏｌｕｓ）（例えば、腹腔内もしくは筋肉内の注射、局所投与または経口投与）を提供することによって投与され、その後、必要に応じて、１もしくはは複数回の追加免疫が行われる。免疫応答の誘導は、当該分野で周知の方法にしたがって、抗原／ワクチンに特異的なＢ細胞およびＴ細胞応答を検査することによって評価され得る。次いで、免疫されたＦａｈ欠損性ブタは、肝指向性病原体でチャレンジされる。代表的には、数匹の免疫した動物が増大する力価の病原体でチャレンジされる。次いで、これらの動物は、感染の発生について観察され、そして、感染の重篤度が評価される（例えば、存在する病原体の力価を評価するか、または、ヒト肝細胞機能のパラメーターを検査することによって）。病原体による感染の有意な減少および／またはチャレンジ後に生じる疾患の重篤度の有意な低下をもたらすワクチン候補は、実用的なワクチンとして同定される。
【０１６０】
（Ｅ．薬理学的、毒性学的、および遺伝子治療の研究）
Ｆａｈ欠損性ブタ、および／または、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞は、あらゆる薬理学的化合物（例えば、低分子、生物学的因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、環境的毒素もしくは生物学的毒素、または遺伝子送達系）による、ヒト肝細胞における遺伝子発現の変化を評価するために使用され得る。
【０１６１】
例えば、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞は、ヒト細胞における特定の化合物の毒性を評価するために使用され得る。単離された肝細胞において化合物の毒性を調べる方法は当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００７／０２２４１９に記載される。同様に、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタは、外因性因子の毒性を評価するために使用され得る。一部の実施形態では、外因性因子は、既知の毒素または疑わしい毒素である。
【０１６２】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタ（または、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞）は、薬物代謝および薬物動態の多数のパラメーターのいずれか１つを評価するために使用される。例えば、薬物代謝、インビボでの薬物／薬物相互作用、薬物の半減期、排泄／解毒の経路、尿、糞便、胆汁、血液もしくは他の体液中の代謝物、シトクロムｐ４５０の誘導、腸肝再循環、および、酵素／トランスポーターの誘導を評価するための研究が行われ得る。
【０１６３】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタ（または、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞）は、化合物（治療剤または候補薬剤（例えば、低分子または生物学的因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ））、環境的毒素もしくは生物学的毒素、または遺伝子送達系を含む）の毒性学および安全性を評価するために使用される。例えば、化合物への曝露後の癌のリスクを決定するなどのために、ヒト肝細胞における細胞周期増殖が評価され得る。肝細胞に対する毒性もまた、例えば、組織学、アポトーシス指数（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｅｘ）、肝機能検査などによって評価され得る。肝細胞代謝の解析（例えば、安定同位体前駆体の感染後の代謝の解析）もまた、実施され得る。
【０１６４】
特定の薬物の有効性もまた、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタにおいて評価され得る。このような薬物としては、例えば、高脂質血症／アテローム性動脈硬化症、肝炎およびマラリアを処置するための薬物が挙げられる。
【０１６５】
一部の実施形態では、ヒト肝細胞を移植されたＦａｈ欠損性ブタ（または、Ｆａｈ欠損性ブタにおいて増殖させ、収集されたヒト肝細胞）は、遺伝子治療のプロトコールおよびベクターを研究するために使用される。例えば、以下のパラメーターが評価され得る：ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む遺伝子送達ビヒクルの形質導入効率；遺伝子ペイロード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｙｌｏａｄ）の組込み頻度および位置（組込み部位の解析）；遺伝子ペイロードの機能性（遺伝子の発現レベル、遺伝子のノックアウト効率）；ならびに、遺伝子ペイロードの副作用（インビボでのヒト肝細胞における遺伝子発現またはプロテオミクスの解析）。
【０１６６】
以下の実施例は、特定の具体的な特徴および／または実施形態を説明するために提供される。これらの実施例は、記載される特定の特徴または実施形態に対する開示を制限するものと解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：Ｆａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタの作製
（標的化構築物の作製）
Ｆａｈ遺伝子ノックアウト構築物を、ブタゲノムＤＮＡから作製したＦａｈ遺伝子のエクソン５の２つの１．５ｋｂ相同性アームの間にインフレームの終止コドンおよび１．７ｋｂネオマイシン耐性カセット（ＰＧＫ−ｎｅｏ）を挿入することによって作製した。本明細書中に記載されるように、配列番号１は、ブタにおけるＦａｈ遺伝子のエクソン５周辺の２０ｋｂの配列のヌクレオチド配列を提供する。この配列は、配列コンティグ番号ｂＥ３８３Ａ３．００１７１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＣＵ４６８４９２）およびｂＥ１６Ｆ４．００６９６（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＣＵ４６７８９１）を用いて、予備ドラフト配列から導いた。
【０１６８】
上記ＰＧＫプロモーターは普遍的に活性であり、このプロモーターはブタ線維芽細胞において機能することが示された。この戦略は、ＣＦＴＲヌルのブタの作製（Ｗｅｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓ  Ａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｃｌｉｍａｔｏｌ  Ａｓｓｏｃ  １２０：１４９，２００９；Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１：１８３７，２００８）に類似している。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとの相同的組換えの頻度は、標的化事象が挿入であり、かつゲノム配列の欠失を含まない場合、顕著に高い。ＡＡＶキャプシドのパッケージング限界は４．７ｋｂであり、それゆえこの構築物は、図２に示されるように、各々１．５ｋｂの２つの相同性アームと、１．７ｋｂのＰＧＫ−ｎｅｏカセットとを含む（１．７＋１．５＋１．５＝４．７）。
【０１６９】
ゲノムＤＮＡから２つの１．５ｋｂの相同性アームを作製するために、ＰＣＲを使用してゲノムＤＮＡを増幅した。標的化ベクター作製のために使用した戦略を、図３Ａに図示する。エクソン５内に位置するＰＣＲプライマーは、終止コドンを導入したテイルと、ＰＧＫ−ｎｅｏ発現ベクターへの簡易ライゲーションを容易にした制限酵素部位とを含むように設計した。次いで、唯一の制限酵素部位を、５’および３’相同性アームについて使用した。標的化構築物を作製するためのこのＰＣＲベースの戦略は、単純（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）であった。以下のクライテリアに基づいて、エクソン５を挿入のために選択した：ａ）ＰＣＲプライマーを設計するために十分に高い質の隣接ゲノムＤＮＡからの配列が存在した、およびｂ）ゲノム配列のこの領域は、ヒトおよびマウスのＦａｈ遺伝子を比較した場合に高度に保存されている。さらに、本発明者らによって以前に作製されたマウスＦａｈノックアウトがエクソン５挿入であるため、エクソン５が好ましかった。標的化ベクターのための相同性アームを増幅するのに使用されたプライマー配列は、以下に提供される。
【０１７０】
上記標的化ベクターの左アームを増幅するためのプライマーは：
フォワードプライマー−ＧＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴＡＡＴＴＴＣＴＧＣ（配列番号２）
リバースプライマー−ＧＧＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＡＧＧＡＡＴＡＧＡＡＧＴ（配列番号３）
上記標的化ベクターの右アームを増幅するためのプライマーは：
フォワードプライマー−ＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＧＣＣＡＣＡＡＡＣＧＴＣＧＧＡＧＴ（配列番号４）
リバースプライマー−ＧＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＡＴ（配列番号５）
上記標的化ベクターの中央セグメント（ネオマイシンを含む）を増幅するためのプライマーは：
フォワードプライマー−ＧＴＡＧＣＧＡＡＴＴＣＴＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＧ（配列番号６）
リバースプライマー−ＧＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＴＣＧＡＧ（配列番号７）。
【０１７１】
いったん全長４．７ｋｂの標的化構築物が作製されると、それをＡＡＶ２骨格中にクローン化し、それによってウイルスパッケージングのために必要とされる逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列をこれに提供する（図３Ａ）。この最終的な標的化構築物を、正確性について確実にするために、最終ＡＡＶベクターの産生前に配列決定した。ＡＡＶ３３と命名されたこの標的化構築物のヌクレオチド配列は、本明細書中で配列番号８として記載される。
【０１７２】
（ＡＡＶベクターの産生）
本研究において使用されたＡＡＶパッケージングヘルパーは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５およびＡＡＶ８キャプシドタンパク質、ならびにＡＡＶ２  ｒｅｐタンパク質を含むハイブリッドキャプシドを発現する（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８２：５８８７，２００８）。ＡＡＶ−ＤＪ標的化ベクターを、標準的なリン酸カルシウムトリプルトランスフェクション法によって作製した。この方法は、ＨＥＫ２９３細胞の、等量の以下のプラスミドでの形質導入を含んだ：ＡＡＶ２ｒｅｐおよびＡＡＶ−ＤＪキャップ遺伝子を含むＡＡＶパッケージングヘルパー、アデノウイルスヘルパーｐｌａｄｅｎｏ５、ならびにＡＡＶ標的化構築物（図３Ａ）。全プロジェクトのために使用され得る多数のウイルス調製物（ｐｒｅｐ）（１０１３粒子）を作製するために、２９３細胞の１５０ｍｍプレート３０枚を調製した。３つ全てのプラスミドの細胞へのトランスフェクション後、粗ＡＡＶ粒子抽出物を、２９３細胞を凍結および溶解の複数ラウンドに供することによって調製した。ウイルス調製物の粗抽出物を、胎仔線維芽細胞に感染および標的化するために使用した。
【０１７３】
（ゲノム型決定構築物の作製）
正確に標的化された線維芽細胞クローンの迅速な検出は、頑強かつ迅速なスクリーニング法を必要とする。注意深く最適化されたＰＣＲベースのスクリーニング戦略を作製した。一方のプライマーをＰＧＫ−ｎｅｏカセット内に配置し、他方を１．５ｋｂの標的化相同部位の外側かつＦａｈ遺伝子の中に配置する（図３Ｂを参照のこと）。このスクリーニング法のために使用されたプライマー配列は、以下に提供される。
【０１７４】
５’末端における正確な標的化を判定するためのプライマーは：
フォワードプライマー−ＧＡＡＣＣＣＡＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＧＡＴＡＣＣ（配列番号９）
リバースプライマー−ＣＴＡＡＡＧＣＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＧＡＣ（配列番号１０）
３’末端における正確な標的化を判定するためのプライマーは：
フォワードプライマー−ＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号１１）
リバースプライマー−ＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＣＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣ（配列番号１２）。
【０１７５】
Ｆａｈ遺伝子座が相同的組換えによって正確に標的にされると、このプライマーの組み合せは、約１．６ｋｂフラグメントを与え、一方プラスミドが不規則に組み込まれると増幅は起こり得ない。このＰＣＲフラグメントは、少量のゲノムＤＮＡを用いて確実に作製され得る。
【０１７６】
上記スクリーニング戦略は、第一に、正確に標的化された遺伝子座と同じ配列を含むプラスミドを作製することによって、実証した。このプラスミド構築物を、カルシウム沈殿およびＧ４１８選抜を使用して、コントロールのブタ胎仔線維芽細胞のゲノムＤＮＡ内に挿入した。これらのコントロール細胞由来のＤＮＡを、次いで、ＰＣＲ条件を最適化するために使用した。コントロールプラスミドを構築するために、標的化構築物を作製するために使用されたものと非常に類似しているが、わずかにより大きな相同性アームを用いるＰＣＲ反応を行い、その結果、標的化相同性アームの外側のＤＮＡ配列が示される（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）。さらなる４００ｂｐのゲノム配列を含む、１．５ｋｂの代わりに１．９ｋｂのサイズの相同性アームを作製した。これらのより大きな相同性アームを、標的化構築物自体と同様にＰＧＫ−ｎｅｏカセット内にライゲーションした（図３）。いったん構築されると、プラスミドを化学的にブタ胎仔線維芽細胞株内に形質導入し、その後Ｇ４１８選抜によってＰＧＫ−ｎｅｏが組み込まれたクローンを単離した。数個のＧ４１８耐性クローンを拾い、増殖させ、そしてゲノムＤＮＡを単離した。次いで、このＤＮＡを使用して、強いシグナルを得ることができるまで、プライマーの組み合わせおよびＰＣＲサイクル条件を試験した。これらの正確な条件を、胎仔線維芽細胞にＡＡＶ−ＤＪ標的化ベクターを感染させることによって得られたＧ４１８耐性クローンをスクリーニングするために使用した。
【０１７７】
（胎仔線維芽細胞における遺伝子標的化およびスクリーニング）
このプロジェクトのクローニング工程における成功を確実にするためには、複数の独立した標的化雄性胎仔線維芽細胞株および雌性胎仔線維芽細胞株を作製することが必要であった。クローニング効率（核移植によって胚を生成する能力）は細胞株ごとに高度に変動し、予想できないことから、このことが必要であった。また、ブタの群れにおけるＦａｈ遺伝子の外側の遺伝的多様性を確立することが重要である。ＰＣＲおよびサザンブロットを使用して、本発明者らは、複数の雌性胎仔線維芽細胞株および雄性胎仔線維芽細胞株の正確な標的化を確認した（図４）。
【０１７８】
複数のモノクローナル線維芽細胞を、３５日齢のブタ胎仔（Ｅｘｅｍｐｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｏｗａ）から得た。全てのスクリーニング戦略を、これらの細胞株において実施した。これらの線維芽細胞についての培養条件は、低酸素（１％  Ｏ２）における標準的な培地（ＤＭＥＭ＋１５％胎仔子ウシ血清）を含んだ。低Ｏ２は、遺伝的損傷を最小限にし、かつクローニング能（ｃｌｏｎａｂｉｌｉｔｙ）を最大化するためである。Ｙ染色体特異的配列を探すためのＰＣＲを実施し、どの細胞株が雄性クローンを生成し、そしてどの細胞株が雌性クローンを生成するか同定した。
【０１７９】
ＡＡＶによる標的化効率は、代表的に、０．１％〜１％の範囲である。したがって、遺伝子標的化のために、個々の胎仔由来の１００万個の細胞を１００ｍｍ皿上で、５００の感染多重度（ＭＯＩ）で上記ＡＡＶ−ＤＪ標的化ベクターで感染させ、上記ＰＧＫ−ｎｅｏ構築物が安定に組み込まれた約１，０００個のｎｅｏ耐性クローンを得た。これらのうち、１〜１０クローンが、正しい標的化を有すると予測した。組換えノックアウト構築物を使用すると、標的化効率はずっと高く、１〜１０％の範囲であることを見出した。
【０１８０】
感染から６時間後、感染した細胞をトリプシン処理し、１００μｇ／ｍｌの濃度（ブタ胎仔線維芽細胞に対して最適濃度）でＧ４１８を含む培地において、１０枚の９６ウェルコラーゲンコーティングプレート（９６０ウェル）に分配した。ｎｅｏ耐性カセットを組み込んだ約１，０００個の胎仔線維芽細胞クローンの存在を前提とすると、約１／３の細胞がクローンを含み、増殖を示した。この低密度により、おそらく各ウェルが独立したクローンを含むことを確実にした。Ｇ４１８培地での１２〜１４日の増殖後、細胞増殖（Ｇ４１８耐性）を示す任意のウェルをトリプシン処理し、その含有物を３様に分けた：１）細胞の２０％を将来の使用のために速やかに凍結した（この早期継代ストックを増殖させ、クローニングに使用するためにＥｘｅｍｐｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓに送った）；２）細胞の７０％を、ＤＮＡ抽出、ＰＣＲ遺伝子型決定、および標的化の検出のために使用した；３）細胞の残りの１０％を、培養中での短期間（４〜７日）再増殖のために、新しいコラーゲンコーティング９６ウェルプレートに移した。次いで、これらの細胞を、サザンブロッティングによる遺伝子標的化の確認のために、１００ｍｍ皿上でさらに増殖させた。
【０１８１】
各クローンのＤＮＡを、上記のＰＣＲアッセイによってスクリーニングした。これらのクローンを短期間再増殖させながら、全ての線維芽細胞をスクリーニングした。これは、８００回〜２０００回のＰＣＲが実施され、非常に短時間で分析されたことを意味する。所定のウェルが陽性の結果を有した場合、対応する細胞を２４ウェルプレート、次いで６ウェルプレートに連続継代し、最後に１００ｍｍ皿に継代した。この細胞を回収し、アリコートを凍結して、残りをＤＮＡ用に処理した。次いで、そのＤＮＡのサザンブロッティングを使用して、Ｆａｈ遺伝子座の構造を試験し、正確な遺伝子標的化を確認した。いったん所定のクローンについて標的化が確認されると、上記速やかに凍結されたストックをクローニングのために確保した。この凍結細胞を、ブタのクローニングのためにＥｘｅｍｐｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｅｍｐｌａｒｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｃｏｍ／）に輸送した。
【０１８２】
（体細胞核移植技術（ＳＣＮＴ）によるトランスジェニック胎仔線維芽細胞由来の新生仔Ｆａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタの産生）
現在、ＳＣＮＴは、本明細書中に開示されるＦＡＨ欠損性ブタのようなトランスジェニックブタの産生のための最も効率的な技術である。図５において、このＳＣＮＴ手順が図示され、胎仔線維芽細胞から新生児Ｆａｈ＋／−ブタを作製するための概略がまとめられている。簡潔には、まず成熟卵母細胞を雌性ブタから単離した。次いで、これらの卵母細胞を、標的化された胎仔線維芽細胞との融合のすぐ直前の時間までインビトロで培養した。次いで、中期２において除核した卵母細胞を、ドナー線維芽細胞と融合させ、所望のノックアウト胚を作製した。次いで、これらの胚を、活性化された（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）レシピエントの雌ブタに移した。１５日のプロゲステロン治療および２日のＦＳＨ−ＨＣＧ（卵胞刺激ホルモン−ヒト絨毛性ゴナドトロピン）治療の後、レシピエントの雌ブタにおける排卵からおよそ４８時間後に、移植を調整した。約１１５日の妊娠期間後、ＳＣＮＴから生じた仔ブタが生まれた。全ての仔ブタにＰＣＲおよびサザンブロットスクリーニングを行い、そのＦａｈ＋／−の状態を確認した。結果は、５匹の仔ブタ中５匹が正確に標的化されたことを実証した。
【０１８３】
（実施例２：Ｆａｈ−／−ホモ接合性ブタを作製するためのＦａｈ＋／−ブタヘテロ接合性ブタの交配）
Ｆａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタを交配させて、遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）を効果的に有するＦａｈ−／−ホモ接合性ノックアウト動物を作製する。遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）は、ＦＡＨ（チロシン分解の最後の段階の触媒）欠損から生じる常染色体劣性先天性代謝異常である。遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）は、ヒトにおいて肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）の早期発症によって特徴付けられる（Ｒｕｓｓｏら，Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ４７：３１７，１９９０）。Ｆａｈ−／−ホモ接合性ノックアウトマウスは、以前に作製されている（Ｇｒｏｍｐｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ７：２２９８，１９９３）。これらの動物は、妊娠の間および出生直後にＮＴＢＣで処置しない限り、肝不全により死亡する（Ｇｒｏｍｐｅら，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １０：４５３，１９９５）。最適に及ばない（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）ＮＴＢＣ用量を与えた場合、Ｆａｈ−／−マウスは、肝細胞癌（ＨＣＣ）および線維症を発症する（Ａｌ−Ｄｈａｌｉｍｙら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  ７５：３８，２００２；Ｖｏｇｅｌら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９：４３３，２００４）。本明細書において開示されるヒト遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）のブタモデルは、顕著な進歩であり、肝硬変および肝細胞癌（ＨＣＣ）の研究のためのツールであると、予期される。このモデルは、これよりも十分ではない他のモデルにおいては達成し得ない、硬変性肝不全および肝細胞癌（ＨＣＣ）を処置するために使用される新規治療の開発および試験を可能にする。重要なことには、このモデルにおける肝損傷の程度は、ＮＴＢＣの用量およびその投与時期を用いて決定（ｔｉｔｒａｔｅ）し得る。このことは、この疾患を有するマウスおよびヒトにおいて示されている。いったん肝硬変または肝細胞癌（ＨＣＣ）が確立された後、その動物に、完全に治療用量のＮＴＢＣ（または類似化合物）を与えて、外科手術および他の介入のためにその動物の健康を安定させ得る。
【０１８４】
さらに、本明細書において開示される遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）のブタモデルは、ヒト肝細胞による再増殖が容易であり、従って、この重要な細胞型の大規模増殖の系を示すと、予期される。さらに、代替療法（例えば、子宮内細胞移植または出生後細胞移植）が、遺伝性代謝障害（例えば、遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１））の処置において依然として必要とされている。大型動物モデルが利用可能であることによって、これらの代替療法の開発が促進される。
【０１８５】
（Ｆａｈ＋／−ヘテロ接合性ブタを交配し、Ｆａｈ−／−ホモ接合性を同定する）
Ｆａｈ−／−ホモ接合性を作製するために、ＳＣＮＴ手順から得たヘテロ接合性ブタを交配させる。８匹のブタ（６匹の雌および２匹の雄）を使用して、Ｆａｈ−／−ブタの群れを確立する。まずこの群れを、ヘテロ接合性動物を交配させた後に遺伝的に離れたブタと交配させることによって拡大させ、この群れの遺伝的多様性を増加させかつホモ接合性Ｆａｈ−／−ブタをＮＴＢＣ治療において維持するコストを低減させる。この子孫のＦａｈ遺伝子の状態を、既に開発済みであるＰＣＲおよびサザンブロットをベースとする遺伝子型決定アッセイによって決定する。ヒトにおける観察事項（ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ）およびトランスジェニックＦａｈノックアウトマウスを用いる研究に基づけば、新たに作製されたＦａｈ−／−ホモ接合性ブタは、保護薬物であるＮＴＢＣを補充しなければ急性肝不全により早期に死亡すると、予期される。肝不全、肝細胞癌および肝硬変の発症を予防するために、用量１ｍｇ／ｋｇ／日をヒトおよびマウスにおいて使用する。Ｆａｈ−／−胎仔を受胎した妊娠雌ブタを、妊娠後半期に約５５日目から開始してＮＴＢＣ処置する。新生仔ブタはすべて用量１ｍｇ／ｋｇ／日のＮＴＢＣでその生を始め、遺伝子型決定が完了するまで続ける。いったん遺伝子型決定が完了した後は、ホモ接合性ブタを研究して、その表現型ならびに硬変性肝不全および肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を特徴づけ得る。
【０１８６】
（Ｆａｈ−／−ブタにおける肝不全、肝硬変、および肝細胞癌の発症に対するＮＴＢＣの用量応答を相関付ける）
いったん遺伝子型決定が完了した後、ブタにおけるＦａｈ−／−ホモ接合性表現型を適切に特徴付け得る。最適に及ばない（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）ＮＴＢＣ用量である０．２ｍｇ／ｋｇ／日によって、マウスは生存可能であるが、生存期間の最初の６ヶ月に５０％を超える高い浸透率（ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅ  ｒａｔｅ）で肝細胞癌を発症させる。これらの観察事項に基づけば、Ｆａｈ−／−ホモ接合性ノックアウトブタの表現型を、０ｍｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある用量のＮＴＢＣの影響下で評価する。肝硬変、肝細胞癌、または肝不全のエビデンスが１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で生じる場合には、それよりも大きなＮＴＢＣ用量を検討する。ブタを、０ｍｇ／ｋｇ／日〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜１．０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にある日用量のＮＴＢＣで処置する。適切なＮＴＢＣ用量は、血漿スクシニルアセトン（ＳＡ）または尿スクシニルアセトン（ＳＡ）をマーカーとして使用して、用量設定（ｔｉｔｒａｔｅ）し得る。スクシニルアセトン（ＳＡ）は、正常な体液においては見出されず、遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ１）について特有症候である（Ｇｒｏｍｐｅ，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  ２１：５６３，２００１）。チロシン血症の程度をモニターするために、血漿アミノ酸レベルを決定する。肝損傷のマーカーを追跡するために、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、アルカリホスファターゼレベル、およびビリルビンレベルを得る。血液凝固を測定して、合成肝不全（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｉｌｕｒｅ）の程度を決定する。さらに、α−フェトタンパク質レベルを、腫瘍発生（肝細胞癌）の尺度として得る。ホモ接合性研究用動物を、３ヶ月目、６ヶ月目、および９ヶ月目に屠殺し、その肝臓および他の内部器官を、剖検において原発性腫瘍および転移性腫瘍のエビデンスについて調べる（表１）。このモデルの適切な特徴付けは、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、遺伝性１型チロシン血症（ＨＴ−１）の研究においてＦａｈ−／−ホモ接合性ノックアウトブタを使用することを意図された将来の研究のために有益である。
【０１８７】
【表１】
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（ヒト肝細胞を用いる再増殖）
いったんＦａｈ−／−ブタが利用可能になりかつ適切なＮＴＢＣ用量を決定した後、ヒト肝細胞を用いてそのＦａｈ−／−肝臓を再増殖するための実験を行う。２つの一般的なアプローチ（（１）免疫前胎仔移植、および（２）免疫抑制を伴う出生後移植）を採用する。
【０１８８】
免疫前胎仔移植において、ＮＴＢＣを与えながらＦａｈ−／−ブタを互いに交配させて、完全にＦａｈ−／−胎仔からなる妊娠体（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）を生じる。妊娠３５日目に、それらの胎仔を外科的に外部に取り出し（ｅｘｔｅｒｎａｌｉｚｅ）、その臍静脈中に３００，０００個のヒト肝細胞を注射する。妊娠中のこの時点で、免疫系は未だ発生しておらず、ヒト細胞に対する寛容が生じる。免疫抑制薬物適用は必要ない。それらの妊娠体（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）には、ＮＴＢＣを与え続ける。出生後、生着した仔ブタからＮＴＢＣを打ち切り、ヒト肝細胞の増殖を可能にさせる。
【０１８９】
出生後移植において、出生後にＮＴＢＣを与えながら、肝動脈経由、脾臓内注射経由、または門脈経由で、Ｆａｈ−／−仔ブタにヒト肝細胞を移植する。免疫抑制薬物を与え、これは、移植の２日前に開始した後、無期限に継続する。その後、マウスでは成功した（Ａｚｕｍａら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２５：９０３，２００７；国際公開第２００８／１５１２８３号）通り、ＮＴＢＣを停止して、ブタ肝臓におけるヒト肝細胞の増殖を可能にさせる。
【０１９０】
開示された発明の原理が適用され得る可能性がある多くの実施形態を考慮すれば、示された実施形態は本発明の好ましい実施形態に過ぎず、そして本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことが、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。従って、本出願人は、これらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の内に生じるすべてを、本出願人の発明として主張する。
【配列表フリーテキスト】
【０１９１】
（配列表）
添付の配列表に列挙される核酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２規則（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２２）において規定されるように、ヌクレオチド塩基に関する標準的な略語文字を使用して示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、提示された鎖に対するあらゆる言及によって相補鎖が含まれると理解される。添付の配列表において、
配列番号１は、ブタＦａｈ遺伝子の２０ｋｂ領域のヌクレオチド配列である。
【０１９２】
配列番号２〜配列番号７は、Ｆａｈ遺伝子標的化構築物を作製するために使用されるＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
【０１９３】
配列番号８は、Ｆａｈ遺伝子標的化構築物ＡＡＶ３３のヌクレオチド配列である。
【０１９４】
配列番号９〜配列番号１２は、Ｆａｈ遺伝子座の適切な標的化についてスクリーニングするために使用されるＰＣＲプライマーのヌクレオチド配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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