(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、
（ａ）前記液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスと接触させる段階と、
（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質を、前記リガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階と、
（ｃ）免疫グロブリン含有タンパク質を吸着したマトリックスを洗浄する任意選択の段階と、
（ｄ）前記タンパク質を放出する溶出剤とマトリックスを接触させることによって前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階と
を含み、前記リガンドのそれぞれがブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）若しくはプロテインＺの１以上のドメイン（単量体）を含む点で改良されており、１以上の単量体の１以上において、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンがセリンで置換されており、前記リガンドが、非置換のリガンドと比較して溶出ｐＨの上昇をもたらすと共に、動的結合能及び収率が本質的に不変であるか又は改良されている、方法。
【請求項２】
プロテインＡ又はプロテインＺの前記１以上のドメインが、同一のドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺの２以上のコピーであるか、或いはプロテインＡ又はプロテインＺの前記１以上のドメインが、ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ又はプロテインＺから選択される２以上のドメインであるか、或いはプロテインＡ又はプロテインＺの前記１以上のドメインが、ドメインＢ、ドメインＣ又はプロテインＺから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、多量体リガンド中の単量体の１以上においてセリンで置換されている、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、免疫グロブリンのＦｃ部に対する親和性を有するが、免疫グロブリンのＦａｂ部に対する親和性を欠いている、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
プロテインＡのＢドメインの２９位に相当するグリシン残基がアラニンに変更されている、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、１個以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性となっている、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性が達成されているプロテインＺである、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）若しくはプロテインＺの１以上のドメイン（単量体）を含むリガンドであって、単量体の１以上において、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンがセリンで置換されている、リガンド。
【請求項９】
固体担体にカップリングされている、請求項８記載のリガンドを含むアフィニティー分離のためのマトリックス。
【請求項１０】
前記リガンドが、チオエーテル結合によってカップリングされている、請求項９記載のマトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、より詳細には、プロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺの１以上を含有するリガンドを含有する分離マトリックスであって、ドメイン（単量体）の１以上において、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが別のアミノ酸で置換されている分離マトリックスに関する。本発明はまた、前記マトリックスによって対象のタンパク質を分離する方法であって、上昇した溶出ｐＨという利点を有する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、世界中で製造及び開発されている最も普及している生物薬剤製品である。特にこの治療薬市場の商業ニーズ、したがって商業価値が高いため、製薬会社は、関連コストを抑えながら、それぞれのｍＡｂ製造プロセスの生産性を最大にすることに重きを置いてきた。
【０００３】
ほとんどの場合、これらの免疫グロブリン分子、例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の精製において重要な段階の１つとして、アフィニティークロマトグラフィーが使用されている。特に興味深い種類の親和性試薬は、免疫グロブリン分子の不変部に特異的に結合可能なタンパク質であり、このような相互作用は抗体の抗原結合特異性とは無関係である。このような試薬は、種々の試料、例えば、これらに限定するものではないが血清製剤若しくは血漿製剤又は細胞培養物に由来する供給原料から免疫グロブリンをアフィニティークロマトグラフィーによって回収するのに広く使用することができる。このようなタンパク質の一例は、種々の種に由来するＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ部分及びＦａｂ部分に結合可能なドメインを含有するブドウ球菌プロテインＡである。
【０００４】
ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）をベースとする試薬は、親和性及び選択性が高いため、バイオテクノロジーの分野において、例えば、抗体の捕捉及び精製並びに検出のためのアフィニティークロマトグラフィーに広範に用いられてきた。現時点で、ＳｐＡをベースとする親和性媒体が、細胞培養物に由来する工業的供給原料を含む種々の試料からモノクローナル抗体及びそれらの断片を単離するために最も広く使用されている親和性媒体であると思われる。したがって、プロテインＡリガンドを含む種々のマトリックスが市販されており、例えば、天然プロテインＡの形態のもの（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（スウェーデン、ウプサラ）））及びまた、組換えプロテインＡからなるもの（例えば、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社））などがある。より詳細には、市販の組換えプロテインＡ製品において実施されている遺伝子操作は、担体へのその付着を容易にすることを目的としたものである。
【０００５】
これらの用途では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途と同様に、夾雑物を確実に除去することに包括的な注意を払う必要がある。このような夾雑物は、例えば、クロマトグラフィー手順において固定相又はマトリックスに吸着される非溶出性の分子であり、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウイルスを含む望ましくない生体分子又は微生物などであり得る。マトリックスからのこのような夾雑物の除去は、マトリックスを再生してから引き続いて使用するために、所望の生成物の最初の溶出後に実施するのが普通である。このような除去には通常、定置清浄（cleaning-in-place；ＣＩＰ）として知られる手順が関与し、固定相から夾雑物を溶出可能である薬剤が使用される。よく使用されるこのような種類の薬剤の１つは、前記固定相上を流れるアルカリ溶液である。現時点で、最も広範に使用されている清浄消毒剤はＮａＯＨであり、その濃度は、夾雑の程度及び性質に応じて、０．１Ｍから例えば１Ｍまでの範囲であり得る。このストラテジーは、１３を超えるｐＨ値へのマトリックスの曝露を伴う。タンパク性の親和性リガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスにとって、このようなアルカリ性環境は非常に過酷な条件であり、関与する高いｐＨに対してリガンドが不安定性であるため、結果として能力が低下する。
【０００６】
そこで、アルカリ性のｐＨ値に耐える改善された能力を示す改変タンパク質リガンドの開発に集中して、多数の研究が行われてきた。例えば、Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８０  （２０００），  １６９−１７８）は、アルカリ性環境中における連鎖球菌アルブミン結合ドメイン（streptococcal albumin-binding domain；ＡＢＤ）の安定性特性を改善するために、タンパク質工学を提案した。Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌは、４つのアスパラギン残基全てがロイシン（１残基）、アスパラギン酸（２残基）及びリシン（１残基）で置き換えられているＡＢＤの突然変異体を作製した。さらに、Ｇｕｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌは、それらの突然変異体が、天然タンパク質と類似した標的タンパク質結合挙動を示すこと、及び改変リガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ性条件に繰り返し曝露した後に、親の非改変リガンドを用いて調製されたカラムよりも高い結合能を示すことを報告している。よって、この文献では、４つのアスパラギン残基全てが、構造及び機能に著しい影響を及ぼさずに置き換え可能であると結論づけられている。
【０００７】
最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）にさらに変更を加えることによって、類似の特性をもたらし得ることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させた場合に、このような突然変異は、親のＳｐＡ、例えばＳｐＡのＢ−ドメイン、又はＳｐＡのＢドメインに由来する合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５１４３８４４号）と比較して、約１３〜１４までのｐＨ値における化学的安定性を増大させることを開示している。著者らは、これらの突然変異タンパク質を親和性リガンドとして使用した場合、分離媒体は予想通りに、アルカリ剤を使用する清浄手順によりよく耐え得ることを示している。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、突然変異リガンドがプロテアーゼによりよく耐え、したがって分離プロセスにおけるリガンド漏出を低減し得ることを示している。別の特許出願である米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性を保持するように、アルカリ安定性ＳｐＡドメインを例えばＧ２９Ａ突然変異によってさらに修飾できることを示している。
【０００８】
歴史的には、５つのＩｇＧ結合ドメインを含有する天然のプロテインＡが、全てのプロテインＡ親和性媒体の製造に使用された。組換え技術を用いて多くのプロテインＡ構築物が製造されてきたが、これらは全て、４つ又は５つのＩｇＧ結合ドメインを含有していた。最近の研究は、二量体リガンドが、四量体リガンドと比較して類似した又は増大された結合能を有することを示している（国際公開第２０１０／０８００６５号）。
【０００９】
一部の抗体が、低ｐＨにおいて凝集する傾向があるか又は感受性である（例えば、活性を失う可能性がある）ことはよく知られている。抗体又は関連標的に対して上昇した溶出ｐＨを有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得ることが、この分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０８００６５号
【発明の概要】
【００１１】
本発明の１つの目的は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭなどの免疫グロブリンを、好ましくはそれらのＦｃ断片を介して結合可能なタンパク質リガンドを含むアフィニティー分離マトリックスを提供することである。これらのリガンドは、プロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺの単量体ドメインの１以上において、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンの置換を有し、したがって、置換のないリガンドと比較して高い溶出ｐＨを有する。好ましくは、リガンドは多量体である、即ち、プロテインＡ（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）及びプロテインＺから選択される２以上の単量体ドメインを含有する。
【００１２】
本発明の別の目的は、現在の親和性マトリックスを用いる、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質の分離方法を提供することである。置換のある親和性リガンドを使用することによって、この方法は意外にも、標的分子に対する上昇した溶出ｐＨを達成する。
【００１３】
したがって、本発明は、純粋な免疫グロブリン画分若しくは代替として免疫グロブリンが除去された液体などの精製物を製造するための方法、又は試料中の免疫グロブリンの存在を検出するための方法を提供する。本発明によるリガンドは、上昇した溶出ｐＨを示すので、コスト効率の良い大規模操作の魅力的な候補となる。
【００１４】
前記目的の１以上は、添付した特許請求の範囲に記載されたようにして達成できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プロテインＺのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。１８位のヒスチジンが太字で示され、セリン置換も示されている。
【図２】プロテインＡの５つのドメインのそれぞれのアミノ酸配列の配列比較を示す図である。プロテインＡのＢドメインのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが太字で示されている。３つのαヘリックスの位置も示されている（Ｇｒａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  ＰＮＡＳ  ２０００，  ９７  （１０）：  ５３９９−５４０４；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８１，  ２０  （９）：  ２３６１−２３７０）。
【図３】それぞれがＨ１８Ｓ置換を有するプロテインＺの４つのコピーを有する、実験的研究で使用した四量体リガンドのアミノ酸配列（配列番号９）を示す図である。
【図４】それぞれがＨ１８Ｓ置換を有するプロテインＺの２つのコピーを有する、実験的研究で使用された二量体リガンドのアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図５】動的結合能アッセイの代表的なクロマトグラムの結果のオーバーレイを示すグラフである。
【図６】図５に記載したＺ（Ｈ１８Ｓ）２に関する実験の画分についてのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す、代表的なクロマトグラムのオーバーレイを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
「タンパク質」という用語は、本明細書中において、タンパク質及びその断片を記載するのに使用する。よって、三次元構造を示すアミノ酸のあらゆる鎖が用語「タンパク質」に含まれ、したがってタンパク質断片も包含される。
【００１７】
タンパク質の「機能的変異体」という用語は、本明細書中において、本発明との関連で親和性及び安定性と定義される機能が本質的に保持されている変異体タンパク質を意味する。したがって、前記機能に関連しない１種以上のアミノ酸が、交換されていてもよい。
【００１８】
「親分子」という用語は、本明細書中において、本発明による突然変異が導入される前の形態である、対応するタンパク質に使用する。
【００１９】
「構造安定性」という用語は分子の３次元形態の完全性を指し、「化学的安定性」は化学分解に耐える能力を指す。
【００２０】
「Ｆｃ断片結合」タンパク質という用語は、タンパク質が免疫グロブリンのＦｃ断片に結合可能であることを意味する。ただし、Ｆｃ断片結合タンパク質が他の領域、例えば、免疫グロブリンのＦａｂ領域にさらに結合できることを除外しない。
【００２１】
本明細書中において、アミノ酸は、それらのフルネームで言及しない場合、従来の１文字又は３文字の記号で示される。
【００２２】
突然変異は、本明細書中において、野生型又は非突然変異アミノ酸の後に交換位置番号を付し、その後に突然変異アミノ酸を付すことによって定義する。したがって、例えば、２３位のアスパラギンのスレオニンへの突然変異は、Ｎ２３Ｔと示す。
【００２３】
本発明は一態様において、１種以上の免疫グロブリン含有タンパク質を液体から分離する方法であって、（ａ）前記液体を、担体に固定化されたリガンドを含む分離マトリックスと接触させる段階と、（ｂ）前記免疫グロブリン含有タンパク質を、リガンドとの相互作用によってマトリックスに吸着させる段階と、（ｃ）免疫グロブリン含有タンパク質を吸着したマトリックスを洗浄する任意選択の段階と、（ｄ）タンパク質を放出する溶出剤とマトリックスを接触させることによって前記免疫グロブリン含有タンパク質を回収する段階とを含む方法に関する。この方法は、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）若しくはプロテインＺ又はそれらの機能的変異体の１以上のドメイン（即ち、単量体）をそれぞれ含むリガンドを使用することによって免疫グロブリン分子の溶出ｐＨの上昇をもたらし、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンは任意の他のアミノ酸で置換されている。
【００２４】
免疫グロブリン結合タンパク質（即ち、リガンド）は、天然免疫グロブリン結合能を有する任意のタンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）若しくは連鎖球菌プロテインＧ（ＳｐＧ）又はこれらのタンパク質のＩｇＧ結合ドメインを含有する組換えタンパク質とすることができる。他のこのようなタンパク質の総説に関しては、例えば、Ｋｒｏｎｖａｌｌ，  Ｇ．，  Ｊｏｎｓｓｏｎ，  Ｋ．  Ｒｅｃｅｐｔｉｎｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｒｍ  ｆｏｒ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １９９９  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；  １２（１）：３８−４４を参照されたい。リガンドは、ＳｐＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメインの１以上を含むことができる。より好ましくは、リガンドは、プロテインＡのドメインＢ、プロテインＡのドメインＣ又は改変プロテインＺを含む。
【００２５】
いずれのプロテインＺ又はプロテインＡドメインも、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置にアスパラギン又はヒスチジンを含有する（例えば、図１、図２、及び配列番号１〜８参照）。
【００２６】
図２に示されるように、プロテインＡの５つのドメイン間の配列は、関連性が高い。欠失又は挿入はなく、置換の多くは保存的変化であり、タンパク質の構造又は機能の予測される変化は最小である。例えば、ＢドメインとＣドメインの間には、５８アミノ酸ポリペプチド全体にわたって４つの変化しかない。したがって、これらのドメインのそれぞれにおける、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンは、プロテインＡ又はそのドメインを含有するリガンドと同様な構造的／機能的寄与を有する。同様に、アスパラギン又はヒスチジンの変化は、このような変化を含有するリガンドの構造／機能に同様な効果をもたらす。
【００２７】
ある特定の実施形態では、アスパラギン又はヒスチジンは、ＩｇＧへの結合能を保持しながら、溶出ｐＨを増加させるアミノ酸で置換されている。好ましくは、置換はセリンに対するものである。
【００２８】
ある特定の好ましい実施形態では、親の分子配列は、配列番号１〜２、４〜８又はそれらの任意の機能的変異体によって定義される配列を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、多量体リガンド中の単量体ドメインの１以上における、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中の全ての単量体ドメインにおけるアスパラギン又はヒスチジン残基が、置換されている。
【００３０】
プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外にも、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／若しくはＩｇＭ又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の、ｐＨ勾配における溶出ｐＨを上昇させる。好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．２からｐＨ１．０超上昇する。より好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．３以上上昇し、最も好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．４以上上昇する。あるいは、溶出ｐＨは４．０超、好ましくはｐＨ４．２超まで上昇し、その一方で標的分子の収率は８０％以上又は好ましくは９５％超である。溶出ｐＨのこのような上昇の利点は、免疫グロブリンが凝集体を形成する傾向が大きく低減し得ることである。抗体凝集体は、免疫原性である可能性があり、免疫グロブリンを医薬として使用する前に除去する必要がある。これは、処理コストをかなり増加させる。
【００３１】
一実施形態では、リガンドはまた、例えば、ＳｐＡドメインＢ又はプロテインＺの単量体ドメインの１以上の１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性にする。前述のように、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させた場合に、このような突然変異が高ｐＨにおけるリガンドの化学安定性を増大させる（例えば、Ｎ２３Ｔ）ことを開示している。さらに、これらのリガンドを含む親和性媒体は、アルカリ剤を使用する清浄手順によりよく耐え得る。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、突然変異リガンドがプロテアーゼによりよく耐え、したがって分離プロセスにおけるリガンド漏出を低減し得ることも示している。これらの出願の開示全体を、参照によって本明細書中に組み込む。
【００３２】
別の実施形態では、こうして調製されたリガンド（複数可）は抗体のＦａｂ部に対する実質的な親和性を欠いているが、Ｆｃ部に対する親和性を有する。したがって、ある特定の実施形態では、リガンドの１以上のグリシンは、アラニンによって置き換えられている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性を保持するように、アルカリ安定性ドメインを例えばＧ２９Ａ突然変異によってさらに修飾できることを示している。この出願の開示全体を、参照によって本明細書中に組み込む。本明細書中で使用する、アミノ酸の番号付けは、当技術分野で通常使用されているものであり、プロテインＡのドメインＢ上の位置によって例示され、当業者ならば、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃの各ドメインに関して突然変異させる位置が容易にわかる。
【００３３】
有利な一実施形態では、リガンドはドメインＢの多量体コピーからなり、ドメインＢのアルカリ安定性が、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させる（例えば、Ｎ２３Ｔ）ことによって達成されており、リガンドは、アルカリ安定性ドメインＢの２９位のアミノ酸残基の突然変異、例えば、Ｇ２９Ａ突然変異を含む。
【００３４】
有利な一実施形態では、リガンドは、Ｈ１８のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｎｅ）残基が突然変異しているドメインＣ又はその機能的変異体の多量体コピーからなる。任意選択で、リガンドはまた、２９位にアミノ酸残基の突然変異、例えば、Ｇ２９Ａ突然変異を含む。
【００３５】
別の実施形態では、リガンドは、１以上のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによってアルカリ安定性が達成されているプロテインＺの多量体コピーからなる。有利な一実施形態では、アルカリ安定性は、少なくとも２３位のアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによって達成されている。
【００３６】
当業者ならば、１８位のアスパラギン又はヒスチジンの置換、突然変異によるアルカリ安定性の付与、及びＧ−Ａ突然変異を、従来の分子生物学技術を使用して任意の配列順序で実施できることが容易にわかるであろう。さらに、リガンドは、突然変異タンパク質リガンドをコードしている核酸配列を含有するベクターによって発現できる。別法として、リガンドは、タンパク質合成技術によっても作製することができる。所定の配列のペプチド及びタンパク質を合成するための方法は、当技術分野において周知であり、一般に入手可能である。
【００３７】
したがって、本発明において、「ブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定性ドメインＢ」という用語は、ＳｐＡのドメインＢをベースとするアルカリ安定化タンパク質、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号及び米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号に記載されている突然変異体タンパク質、並びに他の起源を有するが機能的に同等のアミノ酸配列を有する他のアルカリ安定性タンパク質を意味する。
【００３８】
当業者にはわかるように、発現されたタンパク質は、担体に固定化する前に適切な程度まで精製すべきである。このような精製方法は当分野でよく知られており、タンパク質をベースとするリガンドの担体への固定化は、標準的な方法を用いて容易に実施される。好適な方法及び担体について、以下により詳細に記載する。
【００３９】
したがって、一実施形態では、本発明による突然変異タンパク質は、配列番号１又は２で定義される配列の約７５％以上、例えば約８０％以上又は好ましくは約９５％以上を含むが、ただし、アスパラギン突然変異は２１位にない。
【００４０】
本明細書中において、配列番号１
Ａｌａ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ
Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ
Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ
は、ＳｐＡのＢ−ドメインのアミノ酸配列を定義し、配列番号２
Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ
Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ
Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ
Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ
は、プロテインＺとして知られているタンパク質を定義する。
【００４１】
プロテインＺは、２９位のグリシンがアラニンと交換されている、ＳｐＡのＢ−ドメインに由来する合成構築物である（例えば、Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ，  １９９９：  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ，  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．  Ｍ．Ｃ．  Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｗ．  Ｄｒｅｗ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ８−２２参照）。
【００４２】
一実施形態では、前記突然変異体タンパク質は、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のヒスチジンが置換されている、配列番号１、２若しくは８において定義されるアミノ酸配列から構成されるか又はその機能的変異体である。別の実施形態では、前記突然変異体タンパク質は、プロテインＡのＢドメインのＨ１８に相当する位置のアスパラギンが置換されている、配列番号４〜６において定義されるアミノ酸配列から構成されるか又はその機能的変異体である。これに関連して使用する「機能的変異体」という用語は、免疫グロブリンに対する突然変異体タンパク質の親和性に影響を及ぼさない、又はｐＨ値が上昇した環境における化学安定性を改善するアミノ酸位置の１以上のさらなるバリエーションを含む任意の同様な配列を包含する。
【００４３】
有利な一実施形態では、本発明のアスパラギン又はヒスチジンの置換は、アミノ酸、例えば、アルギニン、アスパラギン酸、イソロイシン、リシン、スレオニン、アラニン又はセリンからなる群から選択され、親分子は配列番号１〜２及び４〜８、又はそれらの任意の機能的変異体によって定義される配列を含む。より好ましくは、置換はセリンに対してである。前述のように、アルカリ条件下において長期間にわたって高い結合能を有する、リガンドとして有用な突然変異体タンパク質を獲得するために、２１位のアスパラギン残基の突然変異を回避する。一実施形態では、３位のアスパラギン残基は、突然変異していない。
【００４４】
プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外なことに、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／若しくはＩｇＭ又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の溶出ｐＨを上昇させる。好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．２からｐＨ１．０超上昇する。より好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．３以上上昇し、最も好ましくは、溶出ｐＨは、ｐＨ０．４以上上昇する。あるいは、溶出ｐＨは４．０超、好ましくはｐＨ４．２超まで上昇し、その一方で標的分子の収率は、８０％以上又は好ましくは９５％超である。
【００４５】
ある特定の実施形態では、多量体リガンド中の１以上の単量体のアスパラギン又はヒスチジン残基が置換されている。他の実施形態では、多量体リガンド中の全ての単量体のアスパラギン又はヒスチジン残基が置換されている。
【００４６】
有利な一実施形態では、ロイシン残基とグルタミン残基の間に位置するアスパラギン残基もまた、例えば、スレオニン残基に突然変異している。したがって、一実施形態では、配列番号２で定義される配列の２３位のアスパラギン残基は、例えばスレオニン残基に突然変異している。特定の一実施形態では、配列番号２で定義される配列の４３位のアスパラギン残基もまた、例えばグルタミン酸に突然変異している。アミノ酸番号４３が突然変異している実施形態では、それは最も有利には、１以上のさらなる突然変異、例えばＮ２３Ｔと組み合わされるようである。
【００４７】
したがって、本発明は、前述の単量体突然変異体タンパク質を包含する。ただし、このようなタンパク質単量体は、多量体リガンド、例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体などに組み合わせ得る。したがって、本発明の別の態様は、本発明による１種以上の突然変異タンパク質と２以上のさらなる単位とから構成される多量体であり、好ましくはこれもまた本発明による突然変異体タンパク質である。したがって、本発明は、例えば、２つの反復単位から構成される二量体、又は４つの反復単位から構成される四量体である。
【００４８】
ある特定の実施形態では、多量体リガンドは、プロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ若しくはプロテインＺ又は任意の機能的変異体の同一の単量体ドメインの２以上のコピーを含有する。
【００４９】
他の実施形態では、多量体リガンドは、プロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ若しくはプロテインＺ又は任意の機能的変異体から選択される２以上の異なる単量体ドメインを含有する。
【００５０】
一実施形態では、本発明による多量体は、好ましくは０〜１５個、例えば、０〜１０個又は５〜１０個の範囲の長さのアミノ酸によって連結された単量体単位を含む。このような連結の性質は、好ましくは、タンパク質単位の空間的コンフォメーションを不安定化すべきでない。さらに、前記連結は好ましくは、アルカリ性環境において、突然変異タンパク質単位の特性を損なわないように十分に安定でもあるべきである。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは、配列番号３
Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ
Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ
Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ
Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ
Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ
の配列を含む。
【００５２】
さらなる一実施形態では、本発明の四量体リガンドは、配列番号９
Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  ＬｙｓＬｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  ＳｅｒＬｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  ＧｌｎＳｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  ＬｙｓＬｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  ＬｅｕＡｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ
の配列を含む。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の二量体リガンドは、配列番号１０
Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  ＴｙｒＧｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  ＴｙｒＧｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ
の配列を含む。
【００５４】
本発明は、意外にも、リガンドの溶出ｐＨを比較すると、リガンドの単量体ドメインの１以上における、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンの置換が、非置換リガンドと比較して高い溶出ｐＨをもたらすことを見出した。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、固体担体にカップリングされた免疫グロブリン結合タンパク質を含むリガンドを含む、アフィニティー分離のためのマトリックスに関する。好ましくは、プロテインＡ（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺの単量体ドメインの１以上における、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジンが、別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、リガンドは多量体である、即ち、プロテインＡ（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）及びプロテインＺから選択される２以上の単量体ドメインを含有している。本発明のマトリックスは、置換のないマトリックスと比較して、上昇した溶出ｐＨを示す。突然変異タンパク質リガンドは好ましくは、Ｆｃ断片結合タンパク質であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＧの選択的結合に使用できる。
【００５６】
本発明によるマトリックスは、その任意の実施形態では前述した突然変異体タンパク質をリガンドとして含むことができる。最も好ましい実施形態では、固体担体上に存在するリガンドは、前述のような置換を含む。
【００５７】
本発明によるマトリックスの固体担体は、よく知られている任意の好適な種類のものであり得る。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合、有機性のものであり、使用される水性媒体に親水性表面を曝露する、即ち、外表面及び存在する場合にはさらに内表面のヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ２、場合によりＮ−置換された形態の）、アミノ（−ＮＨ２、場合により置換された形態の）、オリゴ−又はポリエチレンオキシ基を曝露するポリマーをベースとする。一実施形態では、ポリマーは例えば、有利には架橋されて、例えばビスエポキシド、エピハロヒドリン、１，２，３−トリハロ置換されている低級炭化水素で架橋されて好適な多孔度及び剛直性を提供する多糖、例えば、デキストラン、澱粉、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどをベースとすることができる。最も好ましい実施形態では、固体担体は多孔質アガロースビーズである。本発明において使用する担体は、逆懸濁ゲル化（inverse suspension gelation）などの標準的方法に従って容易に調製できる（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），  ３９３−３９８  （１９６４））。あるいは、ベースマトリックスは、市販製品、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）である。大規模な分離に特に有利な一実施形態では、担体は、その剛直性を増加させるように、したがってマトリックスが高流速により好適になるように構成されている。
【００５８】
あるいは、固体担体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどのような合成ポリマーをベースとする。疎水性ポリマー、例えば、ジビニル及びモノビニル置換ベンゼンをベースとするマトリックスの場合、マトリックスの表面は、前記で定義した親水基を周囲の水性液体に曝露するように親水化されることが多い。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造される（例えば、”Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”  （Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：  Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），  ７０−７５  （１９８８））参照）。あるいは、市販製品、例えば、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用する。
【００５９】
別の選択肢において、本発明による固体担体は、無機性の担体、例えば、シリカ、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００６０】
さらに別の実施形態では、固体担体は、表面、チップ、毛細管又はフィルターなどの別の形態である。
【００６１】
本発明によるマトリックスの形状に関しては、一実施形態では、マトリックスは、多孔質モノリスの形態である。代替的実施形態では、マトリックスは、ビーズ又は粒子の形態であり、多孔質又は非孔質のいずれであってもよい。ビーズ又は粒子の形態のマトリックスは、充填層として又は懸濁された形態で使用できる。懸濁された形態には、膨張層として知られるもの及び純粋な懸濁液が含まれ、それらにおいて粒子又はビーズは自由に移動できる。モノリス、充填層及び膨張層の場合、一般に、濃度勾配による従来のクロマトグラフィーの後に分離手順を行う。純粋な懸濁液の場合には、回分式方法を使用する。
【００６２】
リガンドは、リガンド中に存在する例えばアミノ基及び／又はカルボキシ基を利用する従来のカップリング技術によって担体に付着させ得る。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などが、よく知られているカップリング試薬である。リガンドの利用能を改善し且つ担体へのリガンドの化学カップリングを容易にする、スペーサーとして知られる分子を、担体とリガンドの間に導入し得る。あるいは、リガンドは、物理的吸着又は生物特異的吸着などの非共有結合的結合によって、担体に付着させることができる。マトリックスのリガンド含量は、例えば、５〜１５ｍｇ／ｍｌ（マトリックス）、有利には５〜１０ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００６３】
有利な一実施形態では、本発明のリガンドは、チオエーテル結合によって担体にカップリングされている。このようなカップリングを実施するための方法は、当分野で周知であり、当業者によって、標準的な技術及び装置を用いて容易に実施される。有利な一実施形態では、カップリングにおけるその後の使用のために、最初にリガンドに末端システイン残基を提供する。当業者ならばまた、適切な精製段階を容易に実施する。
【００６４】
本発明のある特定の実施形態では、吸着段階の条件は、任意の通常使用されている条件を、標的抗体の特性、例えば、そのｐＩに応じて適切に適合させたものであり得る。任意選択の洗浄段階を、ＰＢＳ緩衝液などの一般に使用されている緩衝液を使用して実施し得る。
【００６５】
溶出は、プロテインＡ媒体からの溶出に使用される任意の好適な溶液を使用して実施し得る。
【００６６】
本発明の方法は、標的抗体を捕捉するために、例えば、治療的使用又は診断的使用のための抗体の精製プロトコールにおける第１の段階において有用である。一実施形態では、７５％以上の抗体が回収される。有利な一実施形態では、８０％以上、例えば９０％以上、好ましくは９５％以上の抗体を、個々のリガンド系に好適なｐＨを有する溶出剤を使用して回収する。本発明の方法の後に、１以上の追加段階、例えば、他のクロマトグラフィー段階を実施し得る。したがって、特定の一実施形態では、約９８％を超える抗体が回収される。
【００６７】
ＳｐＡ（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺリガンドに関して前述したように、１以上のアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させた場合、これらの突然変異体リガンドを含む親和性媒体は、アルカリ剤を使用する清浄手順によりよく耐え得る（米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号）。この増大された安定性は、免疫グロブリンに対する突然変異タンパク質の初期親和性が、長期間にわたって本質的に保持されることを意味する。したがって、その結合能は、アルカリ性環境において、親分子よりゆっくり低下する。この環境はアルカリ性と定義でき、ｐＨ値の上昇した環境を意味する。これは、例えば、約１０を超える、例えば約１３又は１４までの、即ち、１０〜１３又は１０〜１４のｐＨであり、これは一般にアルカリ条件と表される。あるいは、これらの条件は、ＮａＯＨの濃度によって定義でき、その濃度は約１．０Ｍ以下、例えば、０．７Ｍ又は詳細には約０．５Ｍ、したがって０．７〜１．０Ｍの範囲とすることができる。
【００６８】
よって、前述のアスパラギン突然変異の存在下における免疫グロブリンに対する親和性、即ち、リガンドの結合特性、したがってマトリックスの能力は、アルカリ剤での処理によって経時的に本質的に変化しない。従来、アフィニティー分離マトリックスの定置清浄処理に使用されるアルカリ剤はＮａＯＨであり、その濃度は０．７５Ｍ以下、例えば０．５Ｍである。したがって、その結合能は、０．５Ｍ  ＮａＯＨで７．５時間処理した後に、約７０％未満に、好ましくは約５０％未満に、より好ましくは約３０％未満に、例えば、約２８％に低下するであろう。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるリガンド又はマトリックスを使用する、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭなどの免疫グロブリンを単離するための方法に関する。したがって、本発明は、１種以上の標的化合物を、前述のリガンド又はマトリックスに吸着させることによって液体から分離するクロマトグラフィーの方法を包含する。目的生成物は、分離される化合物又は液体であり得る。したがって、本発明のこの態様は、広範囲に使用されている周知の分離技術であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。簡潔に述べると、第１の段階において、標的化合物、好ましくは前述の抗体を含む溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドに標的化合物を吸着させる条件下で分離マトリックス上に流す。このような条件は、例えば、溶液のｐＨ及び／又は塩濃度、即ち、イオン強度によって制御する。マトリックスの能力を超えないように注意すべきである。即ち、フローは、満足できる吸着を行えるように十分に遅くすべきである。この段階において、溶液の他の成分は、原則的に妨げられずに通過する。任意選択で、マトリックスは次に、例えば水溶液によって洗浄することによって、保持されている及び／又は緩く結合している物質を除去する。本発明のマトリックスは最も有利には、溶媒、塩若しくは洗浄剤又はそれらの混合物などの添加剤を用いて中間洗浄段階に使用される。
【００７０】
次の段階において、溶出剤と称する第２の溶液を、標的化合物を脱着させる、即ち、放出させる条件下でマトリックス上に流す。このような条件は一般に、ｐＨ、塩濃度、即ち、イオン強度、疎水性などの変化によってもたらされる。勾配溶出及び段階的溶出などの種々の溶出スキームが知られている。溶出はまた、マトリックス上で目的とする抗体と置き換わる競合物質を含む第２の溶液によって実現できる。天然又は組換えプロテインＡをベースとする普通のプロテインＡ媒体（例えば、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）及びｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）は通常、主にそのＶＨ３結合に応じてｐＨ３．１〜４．０（ピーク頂点において測定）において溶出する（例えば、Ｇｈｏｓｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９２  ６６５−６７３  ［２００５］参照）。プロテインＡのＢ−ドメインに由来するアルカリ安定化製品ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ  ＳＵＲＥ（商標）は、ＶＨ３結合を本質的に欠いており、３．７〜４．０のより高い溶出ｐＨを生じる。アフィニティークロマトグラフィーの原理の一般的な総説に関しては、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｉｋｅｎ，  Ｉ．  ２０００．  Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４７：  １−６を参照されたい。
【００７１】
プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に相当する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は、意外なことに、免疫グロブリン又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の溶出ｐＨを上昇させる。したがって、この置換は、標的分子の収率が８０％以上又は好ましくは９５％超でありながら、ｐＨ４．０超、好ましくはｐＨ４．２超での溶出を可能にするリガンドを生じる。これにより、標的分子の凝集又は不活性化のリスクを最小限に抑える、より穏やかな溶出条件が得られる。
【００７２】
単量体からの凝集体分離は、抗体精製、特により高い分解能での抗体精製において課題となっている。本発明のリガンドは、単量体と凝集体との改良された分離を示し、これは、大規模であっても、捕捉段階における凝集体の除去の実行可能なアプローチとなる（図５及び図６参照）。
【実施例】
【００７３】
以下に、本発明を例によって説明する。これらの例は、単に例示を目的として記載するのであり、したがって添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解してはならない。以下及び本明細書中の他の場所に示した参考文献は全て、参照によって本明細書中に組み入れる。
【００７４】
タンパク質の突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、ヒスチジンの置き換えをコードするオリゴヌクレオチドを用いて２段階ＰＣＲによって実施した。鋳型として、Ｚ又はＣの単一ドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を、大腸菌発現ベクター（ｐＧＯ）にライゲーションさせた。ＤＮＡ配列決定を用いて、挿入断片の正確な配列を検証した。
【００７５】
Ｚ（Ｈ１８Ｓ）及びＣ（Ｈ１８Ｓ）の多量体を形成するために、アミノ酸ＶＤに対応する、Ｃ又はＺドメインの開始コドンに位置するＡｃｃＩ部位（ＧＴＡＧＡＣ）を使用した。ｐＧＯ  Ｚ（Ｈ１８Ｓ）１及びｐＧＯ  Ｃ（Ｈ１８Ｓ）１を、ＡｃｃＩを用いて切断し、ＣＩＰ処理した。各変異体に特異的なＡｃｃＩ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップＰＣＲ産物を各鋳型から作製した。ＰＣＲ産物を精製し、２％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を比較することによって濃度を推定した。等量の１対のＰＣＲ産物をライゲーション緩衝液中でハイブリダイズした（９０℃−＞２５℃、４５分間）。得られた産物は、約１／４までが、ＡｃｃＩ部位にライゲーションされる可能性がある断片からなる（正確なＰＣＲ断片及び／又は消化されたベクター）。ライゲーション及び形質変換の後、コロニーは、ＰＣＲによりスクリーニングして、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）４、Ｃ（Ｈ１８Ｓ）２及びＣ（Ｈ１８Ｓ）４を含有する構築物を同定した。陽性クローンを、ＤＮＡ塩基配列決定によって検証した。
【００７６】
構築物の発現及び精製
構築物を、標準培地中で大腸菌Ｋ１２を培養することによって細菌ペリプラズム内で発現させた。培養後、細胞を熱処理して、培地中にペリプラズムの内容物を放出させた。培地中に放出された構築物を、細孔径０．２μｍのメンブランを用いて精密濾過によって回収した。
【００７７】
その時点で濾過段階からの透過液中に存在する各構築物を、親和性によって精製した。透過液を、固定化ＩｇＧを含有するクロマトグラフィー媒体にロードした。ロードした産物を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを低下させることによって溶出させた。
【００７８】
溶出プールを中性のｐＨに調整し、ジチオスレイトールを添加することによって還元した。次いで、試料を陰イオン交換体にロードした。洗浄段階の後、構築物をＮａＣｌ勾配中で溶出させて、あらゆる夾雑物から構築物を分離した。溶出プールを、限外濾過によって４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【００７９】
精製されたリガンドを、ＬＣ−ＭＳによって分析して純度を求め、分子量が予想される値に一致する（アミノ酸配列に基づいて）ことを確認した。
【００８０】
活性化
使用したベースマトリックスは、ＵＳ６６０２９９０の方法に従って調製された、平均直径８５ミクロンの硬質な架橋アガロースビーズであり、細孔サイズは、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，  ｐｐ  ６−１３で記載された方法により、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランに対する逆相ゲル濾過クロマトグラフィーＫａｖ値０．７０に相当する。
【００８１】
固形物ベースマトリックス２５ｍＬ（ｇ）、蒸留水１０．０ｍＬ及びＮａＯＨ２．０２ｇを、１００ｍＬフラスコ中で２５℃において１０分間機械的に撹拌しながら混合した。エピクロロヒドリン４．０ｍＬを添加した。反応は２時間進行した。活性化されたゲルを、１０ゲル沈降体積（ｇｅｌ  ｓｅｄｉｍｅｎｔ  ｖｏｌｕｍｅ）（ＧＶ）の水で洗浄した。
【００８２】
カップリング
５０ｍｌファルコンチューブ内のリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）２０ｍＬに、ＮａＨＣＯ３  １６９ｍｇ、Ｎａ２ＣＯ３  ２１ｍｇ、ＮａＣｌ  １７５ｍｇ及びＥＤＴＡ  ７ｍｇを添加した。ファルコンチューブを、５〜１０分間、ローラーテーブル上に置き、次いでＤＴＥ  ７７ｍｇを添加した。還元が４５分間超にわたって進行した。次いで、リガンド溶液を、セファデックスＧ−２５を充填したＰＤ１０カラム上で脱塩した。脱塩された溶液中のリガンド含有量を、２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって求めた。
【００８３】
活性化されたゲルを３〜５ＧＶの｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．６｝で洗浄し、次いで、リガンドを、ＵＳ６３９９７５０に記載された方法に従ってカップリングさせた。実験で使用した緩衝液は全て、窒素ガスによって少なくとも５〜１０分間脱泡してある。
【００８４】
固定化後、ゲルは、３×ＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶの｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロールｐＨ８．６｝を混合し、チューブを振盪テーブル内に室温で終夜放置した。次いで、ゲルを３×ＧＶの｛０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．６｝及び０．５Ｍ  ＨＡｃで交互に洗浄してから、８〜１０×ＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル試料を、アミノ酸分析のために外部研究機関に送り、総アミノ酸含有量からリガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を算出した。
【００８５】
実施例１
プロトタイプ
突然変異体Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２（配列番号３）：それぞれＨ１８Ｓ置換を有するプロテインＺの２つのコピーを含有するリガンド二量体（Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２）（リガンド密度６．１ｍｇ／ｍｌ）。
【００８６】
Ｚ２（Ｈ１８がＳに置換されていない以外は配列番号３と同様）：プロテインＺの２つのコピーを含有するリガンド二量体（Ｚ２）（リガンド密度５．９ｍｇ／ｍｌ）。
【００８７】
突然変異体Ｚ（Ｈ１８Ｓ）４（配列番号９）：それぞれＨ１８Ｓ置換を含有するプロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体（Ｚ（Ｈ１８Ｓ）４）（リガンド密度９．６ｍｇ／ｍｌ）。
【００８８】
Ｚ４（Ｈ１８がＳに置換されない以外は配列番号９と同様）：プロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体（Ｚ４）（リガンド密度６ｍｇ／ｍｌ）。
【００８９】
樹脂２ｍｌをＴｒｉｃｏｒｎ  ５  １００カラムに充填。
【００９０】
突然変異体Ｃ（Ｈ１８Ｓ）２（配列番号１０）：それぞれＨ１８Ｓ置換を含有するＣドメインの２つのコピーを含有するリガンド二量体（Ｃ（Ｈ１８Ｓ）２）（リガンド密度６．５ｍｇ／ｍｌ）。
【００９１】
Ｃ２（Ｈ１８がＳに置換されていない以外は、配列番号１０と同様）：ドメインＣの２つのコピーを含有するリガンド二量体（Ｃ２）（リガンド密度６．９ｍｇ／ｍｌ）。
【００９２】
タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ  １６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）を、平衡化緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬに希釈。
【００９３】
平衡化緩衝液
ＡＰＢリン酸緩衝液２０ｍＭ＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏｍ  ＡＢ）
溶出緩衝液
クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ６。
【００９４】
クエン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ３。
【００９５】
ＣＩＰ
０．１Ｍ  ＮａＯＨ。
【００９６】
実験の詳細及び結果
ブレークスルー容量（破過容量）を、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ  １０システムを用いて滞留時間２．４分で決定した。安定なベースラインが得られるまで、平衡化緩衝液をバイパスカラムに流した。これは、自動ゼロ目盛り調整の前に行った。１００％のＵＶシグナルが得られるまで、試料をバイパスから適用した。次いで、安定なベースラインが得られるまで、平衡化緩衝液を再びカラムに適用した。最大吸光度の８５％のＵＶシグナルに達するまで、試料をカラムにロードした。次に、流速０．５ｍｌ／分において最大吸光度の２０％のＵＶシグナルまで、カラムを平衡化緩衝液で洗浄した。タンパク質を１０カラム容量にわたって流速０．５ｍｌ／分で、ｐＨ６．０で開始しｐＨ３．０で終了する直線勾配で溶出させた。次いで、カラムを、０．１Ｍ  ＮａＯＨで流速０．５ｍｌ／分で清浄にし、平衡化緩衝液で再平衡化してから、２０％エタノールを添加した。最後の段階は、試料濃度を調べることであり、１００％のＵＶシグナルが得られるまでバイパスカラムから試料をロードすることによって行った。
【００９７】
１０％におけるブレークスルー容量を算出するために、下記式を使用した。これは、即ち、カラム流出液中のＩｇＧの濃度が供給材料中のＩｇＧ濃度の１０％となるまで、カラムにロードされるＩｇＧの量である。
【００９８】
【数１】
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１０％ブレークスルーでの動的結合能（ＤＢＣ）を算出し、曲線の形を研究した。曲線は、結合、溶出及びＣＩＰピークに関しても研究した。動的結合能（ＤＢＣ）は、５％、１０％及び８０％のブレークスルーに関して算出した。一部の結果を表１に示す。Ｈ１８Ｓ置換を有するリガンドについても、親のＨ１８リガンド（Ｚ２又はＺ４）と比較して、同様な能力が観察された。
【００９９】
ヒトポリクローナルＩｇＧ及び異なるｍＡＢに関するＩｇＧの能力及び溶出の研究を、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）４、Ｚ２及びＺ４について行った。能力値は、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２とＺ２では異ならなかった。いくつかの例を表１に示す。
【０１００】
【表１】
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溶出研究は、リン酸緩衝液中の異なる細胞培養物上清（ｍＡｂ  Ｃ、ｍＡｂ  Ｄ）又はヒトポリクローナルＩｇＧについて行った。溶出ｐＨは、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２及びＺ（Ｈ１８Ｓ）４の場合、Ｚ２及びＺ４と比較して、０．４ｐＨ単位から１ｐＨ単位超まで上昇している。最大の差はポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）の場合に示され、ｍＡｂ  Ｄは最小の差を示している。これらの溶出研究においては、約１０ｍｇの細胞培養物上清（異なる細胞培養物上清を使用した、表２参照）をカラムにロードした。０．１Ｍクエン酸緩衝液を使用して、ｐＨ６からｐＨ３までの勾配溶出を行った。ピーク頂点のｐＨを記録した（表２参照）。
【０１０１】
【表２】
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Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２及びＺ（Ｈ１８Ｓ）４に関するより高い溶出ｐＨを除いて、それらはまた、Ｚ２及びＺ４よりも良好な分離特性を有するように思われる。図５において、例えば、３つの異なるプロトタイプ全てにおいてテーリングが見られるが、Ｚ（Ｈ１８Ｓ）２の場合には２つのピークが実際に分離している。平衡化緩衝液並びに流速０．２ｍｌ／分及び２１５ｎｍでのＵＶ検出（図６）を使用する、直列に連結された２つの３ｍｌ  ＴＲＩＣＯＲＮ（商標）５／１５０  ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより、主ピーク（Ｂ７）は検出可能な量の凝集体を含まないが、第２のピーク（Ｂ２）は主に凝集体を含むことが明らかであった。
【０１０２】
上記の例は、本発明の特定の態様を例示するのであって、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではなく、そのように解釈すべきでない。上記のような本発明の教示の恩恵を受ける当業者ならば、本発明に多数の修正を行い得る。これらの修正は、添付した特許請求の範囲に記載した本発明の範囲内に包含されるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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