(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体の生物学的製剤をガラス化する方法であって、以下のステップ：
（ａ）少なくとも１種の活性のある生物学的原料と、少なくとも１種の安定剤とを組み合わせることにより、液体の生物学的製剤を調製するステップであって、前記安定剤が、アスパラギン酸と、デキストランからなる増量剤と、以下の糖の組み合わせ：
グルコース＋ラフィノース、
グルコース＋フルクトース、
グルコース＋ガラクトース、又は
グルコース＋スクロース
の１つとを含むステップ、
（ｂ）前記製剤を圧力及び温度における制御された変化に供して前記製剤の含水率を約５質量％未満まで低下させることによって、前記液体の生物学的製剤をガラス化するステップであって、
前記液体の生物学的製剤を、下記（１）〜（３）の圧力低下：
（１）圧力を約１５〜３０ミリバールから約５ミリバールへと約５〜１５分間かけて低下させ、次いで圧力を約５ミリバールで約４０〜５０分間維持する、
（２）圧力を約５ミリバールから約３ミリバールへと約５〜１０分間かけて低下させ、次いで圧力を約３ミリバールで約１０〜４０分間維持する、
（３）圧力を約３ミリバールから約１．５〜２．５ミリバールへと約５〜１０分間かけて低下させ、次いで圧力を約１〜２ミリバールで約５〜１６０分間維持する、
に（１）〜（３）の順で供するステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
ガラス化された生物学的製剤を製造する方法であって、以下のステップ：
（ａ）活性のある生物学的原料に、前記生物学的原料を極低温保存手段に供することで引き起こされる損傷を軽減又は排除する安定剤を添加し、任意で１種以上のアジュバントを添加することによって、生物学的製剤を製造するするステップであって、前記安定剤が、アスパラギン酸と、以下の糖の組み合わせ：
グルコース＋ラフィノース、
グルコース＋フルクトース、
グルコース＋ガラクトース、又は
グルコース＋スクロース
の１つとを含むステップ、
（ｂ）バイアルにステップ（ａ）の前記生物学的製剤を充填するステップ、
（ｃ）バイアルを温度制御されたコンテナに入れるステップ、ここで温度は−１５〜１０℃であり、
（ｄ）前記温度制御されたコンテナの気圧を、１５〜３０ミリバールの範囲内の圧力が得られるまで低下させるステップ、
（ｅ）ステップ（ｄ）で得られた圧力を５〜２０分間にわたって維持することで前記生物学的製剤の温度を安定させ且つ揮発性ガスを前記生物学的製剤から放出させるステップであって、このステップの間、コンテナ温度は約４〜約６℃を維持するステップ、
（ｆ）前記コンテナの気圧を約４〜約７ミリバールへと約５〜約２０分間にわたって低下させるステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）の圧力を約３０〜約６０分間にわたって維持するステップであって、これによって前記生物学的製剤はより濃縮されるステップ、
（ｈ）前記コンテナの温度をマイナス温度からプラス温度へと４５〜８５分間の過程をかけて上昇させ、圧力を、約１０〜約２０℃に達するまで一定に保つステップ、
（ｉ）コンテナの気圧を、濃縮を加速させるために及びコンテナ温度が約３０℃に達してそれを約３０〜約９０分間にわたって維持するまで約１．５〜約４ミリバールまで低下させるステップ、
（ｊ）圧力を約０．５〜約４．０ミリバールまで更に低下させ、発泡が完了するまで一定の圧力を維持するステップ、
（ｋ）圧力を約５μバール〜約１００μバールまで更に低下させ、同時に温度を約３０℃で約４００〜約２４００分以上にわたって、約０．５〜約１５％の所望の水分が得られるまで維持するステップ、
（ｌ）前記凍結乾燥コンテナ内にある間に前記バイアルに栓をすることによってガラス化法を完了するステップ
を含む、方法。
【請求項３】
前記活性のある生物学的原料が、免疫原、ポリペプチド、ヌクレオチド、ウイルス生体、細菌生体、原生生物生体又はある疾患若しくは障害の原因である病原体に起源を有するサブユニットである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性な生物学的原料が弱毒化生ウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスがイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌパラインフルエンザウイルス２型（ＰＩ２）又はこれらの組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記弱毒化ウイルスがカナリア痘、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）又はネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌がアビバクテリウムである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記製剤が少なくとも１種のアジュバントを含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ガラス化された生物学的製剤が、少なくとも１年間にわたって４℃で安定である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ガラス化された生物学的製剤が、少なくとも１年間にわたって−２０〜−８０℃で安定である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は２０１１年５月２７日に出願の米国仮特許出願第６１／４９０９８７号の優先権を主張するものであり、この文献は参照により全て本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は概して免疫学及びワクチン技術の分野に関する。より具体的には、本発明は、とりわけイヌパラミクソウイルスを含み得る凍結乾燥生体弱毒化免疫原性及び／又はワクチン組成物のための安定剤に関する。本発明は更に、これらの安定剤を含有し得る、例えばイヌパラミクソウイルスの安定化された凍結乾燥生体弱毒化免疫原性及び／又はワクチン組成物に関する。本発明の他の態様は以下の開示に記載されている、又は、以下の開示から明らかであり、本発明の範囲に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
生物学的原料、例えばウイルス、細菌、寄生虫、真菌、タンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、特には弱毒化された微生物生体を含む免疫原性組成物及びワクチン組成物は、その調製、配合及び保存条件に極めて敏感である。
【０００４】
このような生物学的原料は化学反応（例えば、加水分解、脱アミノ化、メイラード反応）によって修飾及び分解することができ、その多くは水を介して行われる。液体の水が分子の移動を可能にし、結果的に生物学的原料を含む組成物においてタンパク質構造が変化し得る。水との接触を制限する又は水を除去することによって、修飾及び分解の主要な要因が抑制される。生物学的原料に安定性を付与するための従来の方法では主に、水を凍結させるか又は凍結乾燥により水を除去していた。
【０００５】
凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）又は凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）工程は、乾燥製品を調製する際に一般に用いられる水分除去技法である。一般に、水性組成物の「凍結乾燥」は３つのステップを経る。第一に、水性組成物を低温条件下で凍結させる。第二に、この凍結した水を、減圧及び低温条件下での昇華により除去する。この段階で、組成物は通常約１５％の水分を含有している。第三に、減圧及び高温条件下での脱着により残った水分を更に除去する。凍結乾燥工程を終えると、「パスティーユ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）」又は「ケーク（ｃａｋｅ）」とも称される凍結乾燥製品が得られる。この凍結乾燥製品は極少量の残留水分（約０．５〜約５％質量／質量）及びアモルファス形態の乾燥物を含有する。この特定の状態を「ガラス様」とする。
【０００６】
しかしながら、免疫原性組成物及びワクチン組成物の凍結乾燥前、凍結乾燥中等の調製段階、また保管中に生物学的原料の免疫原性活性がかなり失われてしまうことが観察されている。免疫原性組成物及びワクチン組成物の免疫効率を確実に保持するためには、生物学的原料の完全性を保護しなくてはならない。生物学的原料の免疫原性活性は、宿主又は対象に投与した際に免疫応答を誘導及び刺激する能力によって測定される。
【０００７】
対象に施す処置及び投与回数を制限するために、多価免疫原性組成物又はワクチン組成物を得ることが当該分野で強く必要とされている。定義では、多価免疫原性組成物又はワクチン組成物は、少なくとも２種の異なる病原体に起源を有する又は由来する２種以上の活性免疫原性成分を含む。異なる属のウイルスの凍結乾燥ステップ及びそれに続く保管期間における安定性は異なり得て、その結果、生存能又は感染力が失われる場合がある。イヌパラミクソウイルス等のウイルスの場合、一般に投与される活性免疫原性成分は弱毒化生ウイルスである。免疫系を効率的に刺激するためには、弱毒化生ウイルスが、免疫を付与する対象において複製されなければならない。生存能又は感染力の喪失は、多価免疫原性組成物若しくはワクチン組成物の凍結乾燥工程中、組成物の保管中、又は再構成後の組成物を投与する前に起こり得る。そのため、これまでこのような凍結乾燥組成物には安定剤を添加していた。しかしながら、感染力及び／又は生存能を保持する多価免疫原性組成物又はワクチン組成物を得るためには、異なる弱毒化病原体生体の生存能及び感染力を存続させることができる共通安定剤が特に有利となる。
【０００８】
乾燥形態にある生物学的原料の安定化は、典型的には、抗毒素、抗原及び細菌の保存を伴う（Ｆｌｏｓｏｄｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ（１９３５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，３８９）。しかしながら、この方法には、周囲温度で含水状態から乾燥させるとタンパク質が部分的に変性してしまう等の制約があった。凍結状態からの乾燥は変性の軽減に役立ち、また細菌、ウイルスを含めた生物学的原料は不完全ではあるもののより良好に保存された（Ｓｔａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９４７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１，２５１、Ｒｉｇｈｔｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９６７）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３，４２３、Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８，２５１）。
【０００９】
より最近では、ウイルスの凍結乾燥に先立って、スクロース、ラフィノース、トレハロース等の糖類を安定剤として様々な組み合わせで添加している。数多くの化合物を、弱毒化された生物学的生体原料、特にはウイルスを含有する異なるワクチンを安定化させる能力について試験した。このような化合物には、ＳＰＧＡ（スクロース、ホスフェート、グルタメート及びアルブミン、Ｂｏｖａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９５０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５９，５０９−５２２、米国特許第４０００２５６号明細書）、ウシ又はヒト血清アルブミン、グルタミン酸のアルカリ金属塩、アルミニウム塩、スクロース、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ソルビトール、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、カゼイン加水分解物、ラクトビオン酸ナトリウム及びカリウム並びに一金属原子性又は二金属原子性のアルカリ金属ホスフェートが含まれる。他の化合物には、例えばＳＰＧ−ＮＺアミン（例えば、米国特許第３７８３０９８号明細書）及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）混合物（例えば、米国特許第３９１５７９４号明細書）が含まれる。近年、弱毒化生フラビウイルスは、ソルビトール、スクロース、任意のトレハロース及び／又は他の二糖類又は三糖類、尿素並びに特定の組み合わせのアミノ酸を含めた複数の化合物の複雑な混合物を用いて安定化されている（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒの米国特許出願公開第２０１０／００１５１８０Ａ１号）。
【００１０】
ワクチン及び免疫原性組成物は、多種多様な毒性病原体を原因とする罹病率及び死亡率を低下させることで公衆衛生に多大な影響を及ぼしてきた。しかしながら、免疫原性組成物及びワクチン組成物中の添加剤から生じる想定外の副作用は潜在的なリスクが常にあり、この潜在的なリスクは免疫原性組成物及びワクチン組成物の予防的及び治療的な特性を上回り得る。
【００１１】
米国でワクチンに用いられることが多い形態において、ゼラチンは２００万回の投与につき約１回の割合で重篤なアレルギー反応を引き起こし得る。これまではアルブミン（卵タンパク質）に起因すると考えられていたアレルギー反応だが、同じワクチン中のゼラチンによって引き起こされる可能性のほうが高い。ヒト血清アルブミンの場合、これまでワクチン中のヒト血清アルブミンと関連付けられた疾患はなかったものの、ヒトの血液に由来するこのタンパク質を介してウイルスが伝播する可能性はある。
【００１２】
ウシアルブミン、ゼラチン等のウシ由来製品は、ワクチン製造で使用されるウシの血液及び結合組織産物を介してＣＪＤ（クロイツフェルト・ヤコブ病、「狂牛病」としても知られる）を伝染させる危険性を孕む。しかしながら、血液又は結合組織産物を介してＣＪＤが伝染したという症例がこれまでに報告されたことはなく、ＣＪＤを引き起こすプリオンが血液又は結合組織で発見されたことはなく、狂牛病の症例がある国から輸入されたウシから得たウシ由来製品の使用は禁止されている。それでもなお、これらのリスクを考慮して、望ましくない免疫作用を引き出すと観察されているそのような製品を免疫原性組成物で使用せずに済むようにと努力が重ねられてきた。
【００１３】
Ｄｅ  Ｒｉｚｚｏ（ｄｅ  Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｂｕｌｌ．Ｐａｎ．Ａｍ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．２３（３），２９９−３０５）は、ソルビトール／ゼラチン又はグルタミン酸／ラクトース溶液を含有する凍結乾燥麻疹ウイルス製剤について報告している。これらの製剤は−２０℃で保管され、そのウイルス力価を２１ヶ月の保管期間にわたって測定した。得られたデータは、安定剤を含有しない凍結乾燥ウイルスは、−２０℃で保管した場合、２１ヶ月間にわたって安定していることを示した。更に、−２０℃で保管した場合に凍結乾燥麻疹ウイルスが安定した状態にあり且つ効力を事実上喪失することなく何年にもわたって保持可能であることは周知である（Ｇｒａｙ  Ａ．，（１９７８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１，２６５−２６６）。しかしながら、これらの結果は、凍結乾燥麻疹ウイルスが安定する−２０℃で得られたものであり、付加的な安定化作用を実証してはいない。これらの結果は、ソルビトール／ゼラチン又はグルタミン酸／ラクトース溶液が、−２０℃で保管された凍結乾燥形態の麻疹ウイルスの安定性に負の作用を及ぼさないことを示すにすぎない。
【００１４】
Ｐｒｅｃａｕｓｔａ（Ｐｒｅｃａｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（４），４８３−４８９）は、残留水分及び密封雰囲気が、凍結乾燥後のイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）及び伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）の感染価に及ぼす影響について調べた。ラクトース溶液をＣＤＶの調製物に最終濃度が７５ｍｇ／ｍｌとなるまで添加し、ＩＢＶワクチンには１ｍｌあたり４０ｍｇのマンニトールを含有させた。凍結乾燥前のＣＤＶの感染価を凍結乾燥後及び６℃での１２ヶ月間にわたる保管後の感染価と比較したところ、ＣＤＶの感染価は、１０1.6ＣＣＩＤ50／ｍｌから１０2.0ＣＣＩＤ50／ｍｌに低下した。これはＣＤＶの感染価における極めて著しい低下を反映している。
【００１５】
生物学的製剤の保存を目的とした幾つかの水分除去法が当該分野で公知である。用語「噴霧急速凍結乾燥（ｓｐｒａｙ−ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）」は、極低温環境での流体の噴霧とそれに続く得られた凍結粒子の凍結乾燥を意味すると理解される。「発泡乾燥（ｆｏａｍ−ｄｒｙｉｎｇ）」は、水の蒸発による、濃縮溶液のガラス質発泡体形態での乾燥を意味すると理解される。また、「凍結発泡乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｆｏａｍ−ｄｒｙｉｎｇ）」は、凍結前溶液の、ガラス転移温度及びマトリックス圧潰温度（ｍａｔｒｉｘ  ｃｏｌｌａｐｓｅ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）未満の温度での、氷の昇華によるガラス質発泡体形態での乾燥を意味すると意図される。
【００１６】
従って、凍結乾燥形態にある生物学的原料の生存能及び感染力を保存するための、安全且つ対象への注入に適し、また良好な様相を呈する新規な安定剤及び方法が必要とされている。
【００１７】
本願におけるいかなる文献の引用又は特定も、そのような文献が本発明の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
【発明の概要】
【００１８】
本発明はとりわけ、タンパク質、ペプチド、抗体、細菌、ウイルス、単細胞寄生虫又はヒト若しくはヒト以外の動物の組織を含めた生物由来原料（biologics）のガラス化製剤を製造するための新規な方法を提供することによって、当該分野におけるこのニーズに取り込むものである。ウイルスは、弱毒化生イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌパラインフルエンザ２型（ｃＰｉ２）、イヌアデノウイルス、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病又はニューカッスル病を含み得る。細菌は、パスツレラ種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）又はアビバクテリウム種（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を含み得て、生物由来原料はリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）のＫＳＡＣポリペプチドを含み得る。
【００１９】
ある実施形態において、一般化したガラス化法（vitrification method）は、以下のステップ：
（１）生物学的製剤を調製し、この調製は活性のある生物学的原料（biologic ingredient）を添加し、生物学的原料をプリル化（prilling）、ガラス化及び凍結乾燥を含めた極低温（cryogenic）保存手段に供することで引き起こされる損傷を軽減又は排除する安定剤を添加し、任意で免疫用製剤の場合に生物由来原料の免疫原性を上昇させる１種以上のアジュバントを添加するステップを含み、
（２）バイアルにステップ（１）の生物学的製剤を充填し、
（３）バイアルを温度制御されたコンテナ（container）に入れ、ここで温度は−１５〜１０℃、特には−１０〜５℃、更に特定すると約５℃であり、
（４）温度制御されたコンテナの気圧（air pressure）を、１５〜３０ミリバールの範囲内の圧力が得られるまで低下させ、
（５）ステップ（４）で得られた圧力を５〜２０分間、特には１０〜１５分間にわたって維持することで製品の温度を安定させ且つカーボネートを含めた揮発性ガスを生物学的製剤から放出させ、このステップの間、コンテナ温度は約４〜約６℃又は約５℃を維持し、
（６）コンテナの気圧を約４〜約７ミリバール又は約５ミリバールへと約５〜約２０分間にわたって低下させ、
（７）ステップ（６）の圧力を約３０〜約６０分間にわたって維持し、これによって生物学的製剤はより濃縮され、
（８）コンテナの温度をマイナス温度からプラス温度（約３０〜約５０℃）へと４５〜８５分又は約６０分の間に上昇させ、圧力を、約１０〜約２０℃又は約１５℃に達するまで一定に保ち、
（９）コンテナの気圧を、濃縮を加速させるために及びコンテナ温度が約３０℃に達してそれを約３０〜約９０分又は６０分間にわたって維持するまで約１．５〜約４ミリバール又は約３ミリバールまで低下させ、
（１０）圧力を約０．５〜約４．０ミリバール又は約１ミリバールまで更に低下させ、発泡が完了するまで一定の圧力を維持し、
（１１）圧力を約５μバール〜約１００μバール又は約２５μバールまで更に低下させ、同時に温度を約３０℃で約４００〜約２４００分以上にわたって、約０．５〜約１５％又は約１〜約４％の所望の水分が得られるまで維持し、
（１２）凍結乾燥コンテナ内にある間にバイアルに栓をすることによってガラス化法を完了する
を含む。
【００２０】
当業者ならば、本発明の方法を、公知又はこれから開発される適切な乾燥装置のいずれを使用しても行い得る。適切な乾燥装置の非限定的な例には、（１）小型乾燥機（一段、バイアル処理能力：２００ｘ３ｃｃ）、（２）パイロット乾燥機（２段、バイアル処理能力：３０００ｘ３ｃｃ）又は大型ＢＥＲＬＩＮ乾燥機（３段、１００００ｘ３ｃｃ）が含まれる。凍結乾燥機がその通常の範囲より広い範囲で動作するように、乾燥装置圧力調節ループには定石的な改良を施し得る。
【００２１】
多種多様な実施形態を開示する又はこれらの実施形態は以下の「発明を実施するための形態」から明らかであり且つその範囲に含まれる。
例として挙げるものであって記載の特定の実施形態に本発明を限定することを意図してはいない以下の「発明を実施するための形態」は、添付の図面（参照により本明細書に組み込まれる）を併せることで理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】綿菓子的な様相を呈するガラス化した塊の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」等の語句は米国特許法においてそれらに帰属する意味を有し得て、また「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）等を意味し得る。また、「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ、ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は同様に、米国特許法においてそれらに帰属する意味をもち、用語に制約はなく、詳述されたものより多くのものの存在によって詳述されたものの基本的な又は新規な特徴が変化しない限りは、詳述されたものよりも多くのものの存在を認めるものである。ただし、先行技術の実施形態は除外する。
【００２４】
本発明の文脈において「対象」は、脊椎動物、例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、より有利にはヒト、ペット又は家畜化された動物、食料生産動物又は飼料生産動物、家畜、狩猟対象動物、競争又はスポーツ用の動物、例えば、以下に限定するものではないがウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリになり得る。好ましくは、脊椎動物はイヌである。
【００２５】
本明細書で使用の用語「組み換え」とは、合成された若しくは別のやり方でインビトロで処理された核酸（例えば、「組み換え核酸」）、組み換え核酸を使用して遺伝子産物を細胞、対象若しくは他の生物系で生産する方法又は組み換え核酸でコードされたポリペプチド（「組み換えタンパク質」）のことである。「組み換え手段」は、例えば核酸コード配列の誘導性又は構成的発現のための、様々なソースからの多様なコード領域、ドメイン又はプロモーター配列を有する核酸の切除及び発現カセット又はベクターへのライゲーションもその範囲に含む。
【００２６】
本明細書で使用の表現「作用可能な状態で連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、記載の成分が意図された形で機能することを可能にする関係にあることを意味する。
【００２７】
用語「異種」は、核酸との関連で使用される場合、その核酸が、自然界では通常見られない細胞、ウイルス、対象又は細菌中にあること、あるいは核酸が２個以上の核酸配列を含み、これらの配列が自然界で通常見られるようなものと同じ相互関係にはない、あるいはその発現レベル又は細胞、対象、構造体における他の核酸若しくは他の分子に対する物理的関係が、自然界では通常見られないものとなるように工学的に組み換えられることを示す。例えば、自然界では見られない形で配置された、無関係の遺伝子に由来する２個以上の配列を有する異種核酸、例えばポックスウイルス又はアデノウイルスベクターに挿入されたプロモーター配列に作用可能な状態で連結されたイヌ遺伝子を組み換えにより作製し得る。例を挙げると、目的とする異種核酸は免疫原性遺伝子産物をコードし得て、ベクターに取り込まれたこの目的とする異種核酸を、免疫原性組成物又はワクチン組成物として治療又は予防を目的として投与する。異種配列は様々な組み合わせのプロモーター及び配列を含み得て、多数の例が本明細書において詳述されている。
【００２８】
本明細書で使用の「ベクター」とは、ある環境から別の環境への独立体の運搬を可能にする又は促進するツールである。例を挙げると、組み換え核酸技術で使用するベクターの幾つかは、核酸セグメント等（異種核酸セグメント等、異種ｃＤＮＡセグメント等）の独立体の標的細胞への運搬を可能にする。本明細書では、「発現ベクター」という用語も使用する。本発明は、ウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクター、原虫ベクター、プラスミドベクター又はそれらの組み換え体を含み得るがこれらに限定されない組み換えベクターをその範囲に含む。
【００２９】
ベクター内で発現させる（例えば、目的とするエピトープ及び／又は抗原及び／又は免疫原及び／又は治療用物質をコードする）異種核酸及びそのような異種核酸を提供する文献、また核酸分子の発現を高めるための転写及び／又は翻訳因子の発現、また「目的とするエピトープ」、「治療用物質」、「免疫応答」、「免疫学的応答（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、「防御免疫応答」、「免疫学的組成物」、「免疫原性組成物」及び「ワクチン組成物」等の用語に関しては、とりわけ１９９９年１１月２３日に発行された米国特許第５９９００９１号明細書、国際公開第９８／００１６６号パンフレット、国際公開第９９／６０１６４号パンフレット、これらの文献で引用されている文献、これらの特許及びＰＣＴ出願の手続き中に記録された文献を参照しており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。従って、本発明を実施する際は、米国特許第５９９００９１号明細書、国際公開第９８／００１６６号パンフレット、国際公開第９９／６０１６４号パンフレット及びこれらの文献で引用されている文献並びにこれらの特許及びＰＣＴ出願の手続き中に記録された文献及び本明細書で引用される又は他の形で参照により本明細書に組み込まれる他の文献を参考にすることができる。また、本発明を実施する際は、これらの文献で引用されている全ての異種核酸分子、プロモーター及びベクターを使用し得る。これに関しては、米国特許第６７０６６９３号明細書、米国特許第６７１６８２３号明細書、米国特許第６３４８４５０号明細書、米国特許出願第１０／４２４４０９号明細書、米国特許出願第１０／０５２３２３号明細書、米国特許出願第１０／１１６９６３号明細書、米国特許出願第１０／３４６０２１号明細書及び１９９９年２月２５日に公開された、ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６７３９号に由来する国際公開第９９／０８７１３号パンフレットにも言及する。
【００３０】
「抗原」とは、免疫系により認識され且つ免疫応答を誘導する物質である。抗原は、死滅させられた、弱毒化された若しくは生存している有機体全体；有機体のサブユニット若しくは一部；免疫原性を有するインサートを含有する組み換えベクター；宿主動物で提示されると免疫応答を誘導可能な核酸片若しくはフラグメント；タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖タンパク質、エピトープ、ハプテン、炭水化物、糖又はこれらの組み合わせを含み得る。あるいは、抗原は、毒素又は抗毒素を含み得る。これに関連して交換可能に用いられる類語が「免疫原」である。「病原体」とは、細菌、真菌、原虫、寄生虫又はウイルス等の疾患の特定の原因物質のことである。
【００３１】
本明細書で使用の用語「ガラス化（ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、液体の生物学的製剤を、特定の時間及び特定の温度範囲で行われる制御下での一連の圧力低下により、低水分量（例えば、約４％未満）の「綿菓子」的な様相にまで乾燥させることを意味する。ガラス化は、気圧及び温度を本開示で提示する範囲内におさまるように調節することができる、凍結乾燥機を含めたいずれのチャンバ又はコンテナでも行い得る。用語「ガラス化組成物」及び「ガラス化製剤」は同じ意味で使用され得て、本明細書においては、本明細書で開示のガラス化法に供された組成物、製剤又は配合物を意味する。
【００３２】
本明細書で使用の用語「免疫原性組成物」、「免疫学的組成物」及び「免疫原性又は免疫学的組成物」は、ベクターから発現した目的とする抗原又は免疫原に対する免疫応答を引き出す全ての組成物、例えば対象への投与後に標的免疫原又は目的とする抗原に対する免疫応答を引き出す全ての組成物をその範囲に含む。用語「ワクチン組成物（ｖａｃｃｉｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、ｖａｃｃｉｎｅ、  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」、「ワクチン」は、目的とする抗原に対する防御免疫応答を誘導する又は抗原に対して効果的な防御を行う全ての組成物、例えば対象への投与若しくは注射後に標的抗原若しくは免疫原に対する防御免疫応答を引き出す全ての組成物又はベクターから発現した抗原若しくは免疫原に対して効果的な防御を行う全ての組成物をその範囲に含む。
【００３３】
本明細書で使用の用語「多価」は、２つ以上の抗原を含有する免疫原性組成物若しくはワクチン組成物（同一の種に由来するか異なる種に由来するかは問わない）又は異なる属に由来する抗原の組み合わせを含有する免疫原性組成物若しくはワクチン組成物を意味する。
【００３４】
本発明の文脈における「活性免疫原性成分」には弱毒化された病原体生体、例えば弱毒化生ウイルス、弱毒化細菌、真菌又は寄生虫生体が含まれる。活性免疫原性成分が本発明の多価弱毒化生ＣＤＶ及びｃＰｉ２免疫原性組成物、懸濁液又は溶液の一部である場合、活性免疫原性成分は、有利には、パラミクソウイルス以外の病原体に由来し得る。本明細書に記載の１種以上の病原体に由来する又は起源を有する組み換え異種免疫原又は抗原も本発明の範囲に含まれ、とりわけウイルスベクター、細菌ベクター、真菌ベクター及びプラスミドベクターに取り込ませ、発現させることができる。本発明は、１種以上の病原体に由来する異種免疫原又は抗原のエピトープ、サイトカイン等の免疫調節物質、治療薬、毒素、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、アジュバント又は他の種、例えば中でもアンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡもその範囲に含む。
【００３５】
用語「動物用組成物（ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）等の治療用タンパク質又は例えばインターフェロン（ＩＦＮ）等の免疫調節性タンパク質を発現する、獣医学用のベクターを含む全ての組成物を意味する。同様に、用語「医薬組成物」は、治療用タンパク質を発現させるためのベクターを含む全ての組成物を意味する。
【００３６】
本発明の組成物及び方法は、全ての生物学的な物質／剤又は生物学的な物質／剤とヒト用医薬品／動物用医薬品との組み合わせの安定化及びガラス化に適宜適用し得る。「生物由来原料（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）」には、以下に限定するものではないが、サイトカイン等の免疫調節物質、治療薬、毒素、抗体、抗体の抗原結合性フラグメント、アジュバント又は他の種、例えば中でもアンチセンスＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡが含まれる。ガラス化材料／物質の再構成後、これらの化合物を予防的な免疫化として疾患予防に使用し得る。あるいは、これらの化合物は、治療的な免疫化として疾患の症状を緩和し得る。
【００３７】
本発明は生体弱毒化免疫原性組成物のガラス化法をその範囲に含み、組成物は少なくとも１種の安定剤、例えば非還元糖又は抗酸化化合物を含み得る。幾つかの実施形態において、ガラス化安定剤は任意で少なくとも１種の非還元オリゴ糖及び／又は少なくとも１種の増量剤及び／又は少なくとも１種の糖アルコールを含み得る。これらの安定剤は、以下に限定するものではないが、中でもウイルス、細菌、真菌、寄生虫、タンパク質、ポリペプチドを含めた生物学的原料の免疫原性、感染力及び生存能を保存する又はその保持を支援することができる。本発明のガラス化法で使用する安定剤は、例えば均一な形状及び色を含めた良好な様相を呈し得て、また対象に投与しても安全である。
【００３８】
「還元単糖」とは電子を供与可能な糖であり、従って酸化−還元反応中に他の化合物を還元することができる。概して、還元単糖は、その構造中にアルデヒド又はケトン基を有する。還元糖の同定にはフェーリング試薬試験等の比色試験が利用でき、フェーリング試薬試験においては、還元糖の存在下、銅イオン試薬が金属銅に還元されるにつれて深い青色から赤へと色が変化する。本発明において、還元単糖は好ましくは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、ソルボース又はこれらの組み合わせを含む。本発明の一実施形態においては、少なくとも２種の還元単糖の組み合わせが提供されている。還元単糖は、凍結乾燥工程中、特には昇華ステップ（すなわち、第一及び第二乾燥ステップ）における、組成物、特にはタンパク質及び弱毒化病原体生体の組成物の保護にとって重要であり、昇華ステップにおいて、還元単糖は昇華水分と置き換わり、生物学的構造体の凝集力を維持する。
【００３９】
任意で、糖アルコール及び／又は非還元オリゴ糖を添加することによって、本発明に従ってガラス化した製剤を安定化し得る。還元単糖と糖アルコールとの組み合わせ、還元単糖と非還元オリゴ糖との組み合わせ及び還元単糖と糖アルコールと非還元オリゴ糖との組み合わせが本開示から考えられる。糖アルコールは、非限定的な例を挙げると、ソルビトール、マンニトール、キシリトール又はマルチトールになり得る。組み合わせ
【００４０】
本発明の文脈における「非還元オリゴ糖」とは、２〜１０個のサッカリド単位を含み且つ酸化−還元反応中に他の化合物を還元することができない糖である。本発明において、非還元オリゴ糖は、有利にはトレハロース、スクロース又はラフィノースを含む、非還元二糖又は非還元三糖になり得る。本発明の安定剤は、少なくとも２種の非還元オリゴ糖の混合物も含み得る。
【００４１】
「酸性抗酸化」化合物は、酸化剤、フリーラジカル（すなわち、不対電子を有する分子）又はフリーラジカルを放出する化学物質と反応してそれらを中和する化合物であると定義される。本発明の分脈において、抗酸化化合物は酸性形態になり得る。酸性抗酸化剤には、以下に限定するものではないが、アスコルビン酸及び／又は酸性アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸が含まれる。２種以上の酸性抗酸化化合物の組み合わせが、本開示の方法に従ってガラス化される製剤の適切な成分である。
【００４２】
増量剤もまた、本開示に従ってガラス化される組成物の適切な成分である。増量剤は薬学的又は獣医学的に許容可能なポリマー、例えば、以下に限定するものではないが、デキストラン、マルトデキストリン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、クロスポビドン、ヒドロキシエチルデンプンになり得る。デンプン誘導体の他の非限定的な例には、微結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれる。増量剤は生物学的組成物のＴ’ｇ値を上昇させ、凍結時により高い温度を用いることを可能にする。「Ｔ’ｇ値」はガラス転移温度と定義され、凍結した組成物がガラス質にならない温度に対応する。増量剤は本開示のガラス化塊で観察される良好な様相の付与を支援し得て、この塊は全体的に軽くてふわふわとした綿菓子様の外見を有する。
【００４３】
デキストランを増量剤として使用する場合、その分子量は約５０００〜約７００００Ｄａ、好ましくは約１００００〜約４００００Ｄａになり得る。ＰＶＰを増量剤として使用する場合、その分子量は約８０００〜約３６００００Ｄａ、特には約１００００〜約６００００Ｄａになり得る。
【００４４】
マルトデキストリンを増量剤として使用する場合、そのデキストロース当量値（ＤＥ、デンプンポリマー加水分解度の定量的尺度）は、約３〜約２０、好ましくは約５〜約１８、より好ましくは約１０〜約１５になり得る。ヒドロキシエチルデンプンを増量剤として使用する場合、その分子量は約７００００〜約４５００００Ｄａ、好ましくは約１３００００〜約２０００００Ｄａになり得る。ヒドロキシエチルデンプンの置換度は約０．４〜約０．７、特には約０．４〜約０．６になり得る。置換度は、１グルコース単位当たりのヒドロキシエチル基の数と定義される。
【００４５】
生物学的製剤の、安定剤を含めた幾つかの成分が易溶性ではないこともある。しかしながら、可溶性の安定剤を得ることを目的として、（例えば、より可溶性の高い成分を選択することにより）類似成分と適切に置き換える及び／又は安定剤中に存在する不溶性成分の量を適合させることは、十分に当業者の技量の範囲内である。成分の溶解度は、目視による溶解度試験で容易に確認することができる。溶解度試験は、安定剤の全成分を約５５℃で添加し、約３０分間にわたって混合するステップを含む。約２４時間後に、室温の全く攪拌しない状態で、沈殿物の出現について安定剤を目視により確認することができる。安定剤が透明又は澄明であるならば、安定剤の全成分は可溶性である。
【００４６】
本開示に従ってガラス化された生物学的製剤は、安定剤をその数を問わず含有し得る。表１では幾つかの例を挙げる。「デキストラン」は、分子量４００００Ｄａを有するデキストラン−４００００を含む。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
本開示ではガラス化免疫原性組成物も提供し、このガラス化免疫原性組成物は、まず弱毒化生ウイルス、例えば、以下に限定するものではないが、パラミクソウイルスを含む免疫原性懸濁液又は溶液を調製し、続いてこれを本開示の方法に従ってガラス化することで製造される。イヌパラミクソウイルスは、とりわけイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）及びイヌパラインフルエンザ２型ウイルス（ｃＰｉ２）を、いずれも弱毒化生ウイルスの形態で含み得る。
【００４９】
ある実施形態において、本開示は、ガラス化弱毒化生パラミクソウイルス、特にはイヌパラミクソウイルスをその範囲に含む。イヌパラミクソウイルスはパラミクソウイルス科のウイルスであり、パラミクソウイルス科にはイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）及びイヌパラインフルエンザ２型ウイルス（ｃＰｉ２）が含まれる。イヌパラミクソウイルスは、多くの肉食動物種、特にはイヌ等の家畜又はフェレット、ライオン、トラ、ヒョウ等の非家畜における多岐にわたる疾患に関与している。
【００５０】
本開示の文脈において、用語「バルクワクチン組成物」とは、抗原製造の最終段階を精製されて又は精製されずに一価で又は多価混合後に抜ける組成物を意味する。用語「乾燥ワクチン組成物」とは残留含水量が約４％又は約３％以下である組成物を意味し、ワクチンとして使用するために水溶液ですぐに再構成することができる又は直接、乾燥した粒子形態で使用される。また、乾燥ワクチン組成物を粉砕し、バインダを含めた適当な賦形剤を配合することで経口投与に適した投与単位、例えば錠剤、丸薬を製造し得る。
【００５１】
本発明は、１種以上の弱毒化生パラミクソウイルスを安定化させる方法にも関する。弱毒化生パラミクソウイルス製造の最終段階において（例えば、１つ以上のステップにおける細胞上での培養、感染及びウイルスの培養とそれに続く精製）、弱毒化生パラミクソウイルスを含む精製されたウイルス収穫物、又は未精製の濃縮又は未濃縮のウイルス収穫物を安定剤の添加により希釈し、続いてガラス化する。
【００５２】
弱毒化生ワクチン又は免疫原性組成物は以下の利点を有する：特にそれが自己複製性であるならば、低用量での投与が可能である；対象において天然／野生型の感染に酷似している；考えられ得る全ての免疫学的に重要な抗原を同時、すなわち一回の投与で対象に提供する。
【００５３】
弱毒化された微生物生体をベースとした免疫原性組成物又はワクチン組成物が、高効果型の免疫応答を誘導する能力を有することは一般に認められている。このような免疫原性組成物又はワクチン組成物には、宿主動物が一旦免疫化されると、宿主内への病原体の進入によって初期の細胞性又は体液性免疫の加速度的な呼び戻しが誘導され、この呼び戻された免疫が、感染が臨床的に問題があるものとなる前に有機体の更なる増殖を制御することができるという利点がある。概して、当該分野においては、死滅させた病原体をベースとした免疫原性組成物又はワクチン組成物（死菌ワクチン）ではこのタイプの応答が得られない又はこのタイプの応答を達成しにくいと認められている。しかしながら、病原体生体を含有する免疫原性組成物又はワクチン組成物には、弱毒化の程度によっては、免疫化された宿主が、免疫化時に、予防しようとする病気に罹ってしまうかもしれないという危険性がある。従って、病原体生体の免疫化特性を有しているものの対象への投与時に望ましくない副作用を引き起こすことがない免疫原性組成物又はワクチン組成物が極めて望ましい。
【００５４】
単一ヌクレオチド変化、部位特異的突然変異、挿入、置換、欠失又は再編成を含めた幅広い範囲の突然変異を組み込むことによって、弱毒化病原体生体を作り出し得る。これらの突然変異は病原体ゲノムの小さなセグメント（例えば、１５〜３０個のヌクレオチド）又は病原体ゲノムの大きなセグメント（例えば、５０〜１０００個のヌクレオチド）に影響し得て、その突然変異の性質に左右される。例えば、病原体の非コード調節領域又は要素の上流又は下流に突然変異を導入することで病原体の活性を除去して又は減じさせて弱毒化された表現型とすることができる。
【００５５】
病原体遺伝子の複製の下方制御及び／又は病原体遺伝子の転写の下方制御につながり得る病原体ゲノムの非コード調節領域の突然変異は、毎回の複製における、不完全な病原体、すなわち完全な感染力を有する病原体に必要とされる全ゲノム領域又はセグメント数に足りていない病原体の作製に帰結し得る。このため、この変容した病原体は弱毒化された特性を示し、この病原体は毎回の複製で野生型の病原体より不完全な病原体を生み出す。しかしながら、一回で合成されるタンパク質、抗原又は免疫原の量は野生型病原体でも不完全な病原体でも同様であることから、このような弱毒化病原体が対象において良好な免疫応答を誘導可能である可能性は高い。
【００５６】
病原体の遺伝子が構造タンパク質をコードする場合、例えばウイルス、カプシド、マトリックス、表面又はエンベロープタンパク質等の病原体の場合、複製中に作製される粒子の数は減少するため、突然変異した病原体は弱毒化された特性、例えば無症状のレベルの感染に至る力価を示す。例えば、ウイルスカプシドの発現が減少すると複製中にパッケージングされるヌクレオカプシドの数が減少し、エンベロープタンパク質の発現が減少すると子孫ビリオンの数及び／又は感染力が低下し得る。あるいは、複製に必要なウイルス酵素、例えばポリメラーゼ、レプリカーゼ、ヘリカーゼ等の発現が減少すると、複製中に作製される子孫ゲノムの数が減少する。複製中に作製される感染粒子の数が減少するため、変容したウイルスは弱毒化された特性を示す。しかしながら、作製される抗原性ウイルス粒子の数は概して、対象において活発な免疫応答を誘導するには十分なものとなる。
【００５７】
弱毒化病原体を工学的に作り出す別のやり方では突然変異の導入を行い、これには、以下に限定するものではないが、病原体のタンパク質の１つ以上への１つ以上のアミノ酸残基及び／又はエピトープの挿入、欠失又は置換が含まれる。これは、適当な突然変異を病原体の対応する遺伝子配列に工学的に組み込むことにより容易に達成し得る。複製において変更又は減少が起きるように病原体のタンパク質の活性を変えてしまう全ての変化が、本発明の範囲に含まれる。
【００５８】
例えば、弱毒化ウイルスとの関連において、宿主細胞受容体へのウイルスの付着及び後に続く感染を妨げるものの完全に無にするわけではない突然変異を、弱毒化株を作製するための処理に関わるウイルス表面抗原又はウイルスプロテアーゼに工学的に組み込み得る。ウイルス表面抗原又は病原性因子を修飾して、宿主細胞受容体へのウイルス抗原の結合親和力に干渉する又はその親和力を低下させる１つ以上のアミノ酸又はエピトープの挿入、置換又は欠失を含ませ得る。このアプローチは、異質又は異種エピトープを発現し且つ弱毒化された特性も示すキメラウイルスを作製することができるという付加的な利点を有する。このようなウイルスは、組み換え生ワクチンとしての使用に理想的な候補である。
【００５９】
ウイルス酵素に工学的に組み込む突然変異には、以下に限定するものではないが、酵素の活性部位のアミノ酸配列における挿入、欠失及び置換が含まれる。例を挙げると、基質に対する結合親和力が低下するように酵素の結合部位を変化させ得て、結果的にその酵素の特異性及び／又は効率は低下する。例えば、選択する標的はウイルスポリメラーゼ複合体である。全てのポリメラーゼタンパク質に温度感受性突然変異が存在するからである。従って、そのような温度感受性に関係するアミノ酸位置に導入する変更をウイルスポリメラーゼ遺伝子に工学的に組み込んで弱毒化ウイルス株を作製し得る。
【００６０】
ＣＤＶは、直径約１００〜３００ｎｍでモルビリウイルス属に属する、エンベロープを有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＣＤＶビリオンのコアは、ウイルスＲＮＡと密接に関連する核タンパク質（ＮＰ）ペプチドを含有する。第二のコアペプチドはリンタンパク質（Ｐ）である。ＣＤＶのエンベロープは、３種のペプチド、すなわちＭタンパク質（マトリックスタンパク質）及び２種の糖タンパク質を含有する。糖タンパク質はヘマグルチニン糖タンパク質（Ｈ）及び融合（Ｆ）糖タンパク質である。融合糖タンパク質は、Ｆ1、Ｆ2と称されるより小さなサブユニットに分解される。Ｈタンパク質は主に標的細胞へのウイルス吸着に関与し、融合糖タンパク質は細胞間融合に関与する。これまで、公知のジステンパーウイルス分離株は全て、これらの共通ウイルスポリペプチドを含有している。イヌへの感染経路は感染性エアロゾル液滴によるものであり、ウイルスの伝染は咳、くしゃみ及び暖かく湿った閉鎖環境に閉じ込められることで促進される。ウイルス感染は、まず上部口鼻管の呼吸上皮で始まり、続いて深部肺実質へと広がることが研究により示唆されている（Ｇｏｒｈａｍ”Ｃａｎｉｎｅ  Ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ”，（１９６０）Ａｄｖａｎｃｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒａｎｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇｈｅｒ  Ｅｄｉｔｏｒｓ，６：２８８−３１５）。
【００６１】
扁桃腺の呼吸上皮内又はそれに沿って位置する組織マクロファージ及び単球は、ＣＤＶを取り込んで複製する最初の細胞型であると考えらえる。次に、ウイルスは血流に入り、遠くのリンパ細網組織へと広がっていく。これはウイルス血症によって達成され、最初の感染から２〜４日後のいずれかの時点で起きる。感染から８〜９日の間に、ウイルスはリンパ細網組織を超えて広がり、上皮及び間葉組織にまで及ぶ（Ａｐｐｅｌ，（１９６９）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３０，１１６７−１１８２）。ウイルス抗原に対する特異的な宿主免疫応答が疾患の転帰に影響するのは、ウイルス感染のこの段階である。疾患の急性且つ致命的な形は、ウイルスが制限されることなく体内の事実上全ての組織に広がることを特徴とする。感染した対象の全ての排泄物及び分泌物でウイルスを見つけることができ、免疫蛍光法又は抗原追跡技法を用いることでイヌの体内の事実上全ての細胞型で、抗原の存在を観察することができる。このような動物の大多数にとって、最も可能性が高い死因は劇症型で致死性の神経学的合併症及び／又は脳炎である。
【００６２】
ＣＤＶに感染したイヌには、疾患の進行が臨床的に遅れているものと穏やかに回復する免疫応答を示すものがある。臨床徴候がある場合、それは疾患初期にはかすかなものであり、中枢神経系（ＣＮＳ）でのウイルスの存続を反映している。ＣＮＳ疾患のその後の展開は様々である。ＣＤＶに感染したイヌの多くは基本的に疾患の顕性な臨床徴候を示さず、回復期にある臨床的に正常なイヌと認識される。最終的にはＣＤＶ感染から回復する活動性感染のイヌでは、感染から６日若しくは７日目に又はその前後に自由に循環する抗ウイルス抗体が認められることが判明している（Ｋｒａｋｏｗｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３２，３８４−３９２）。力価は、初期の回復期に高いレベルまで急上昇する。
【００６３】
ＣＤＶに急性感染したイヌは、様々な程度の抑うつ、食欲不振及び発熱を示す。皮膚では、水分不足、乾燥による荒れ、弾力性の喪失が様々な程度で起き得る。このような動物の一部は、羞明及び粘液膿性の眼漏／鼻汁のエビデンスを示す。共通する臨床徴候は断続的な下痢である。疾患のこの急性ウイルス血症期に、ウイルスはあらゆる分泌物及び排泄物中に流れ出す。疾患が進行するにつれて、多くは二次的な細菌の侵入により、肺炎を発症し得る。疾患のこの段階にあるイヌは、二次感染の程度又は量に応じて、中程度から重度のリンパ球減少を示す。急性感染したイヌは事実上全ての組み合わせの神経学的徴候を示し得るが、最も一般的には小発作又は大発作を起こす。これらの痙攣エピソードは時間の経過と共に、頻度を増しながら発生する。
【００６４】
イヌジステンパーの第二の神経学的形態は、老犬脳炎（ＯＤＥ）と共に生じるもの又は不顕性感染と見かけの回復の後に生じるものである。ＣＮＳの徴候は実に様々な形で現れ得て、脳腫瘍、頭部外傷、細菌性髄膜炎、水頭症及び脊髄椎間板疾患と誤診される場合がある。イヌにおけるＣＤＶ感染の主な非神経性の徴候は、ＣＤＶ関連性の免疫抑制である（Ｋｒａｋｏｗｋａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４１，２８４−２９２）。イヌジステンパーウイルス感染症の徴候の多くは、この衰弱した動物の体内で同時に起きている二次感染過程に起因している。
【００６５】
イヌにおけるこの疾患は肺炎を引き起こす細菌種等の細菌性病原体にも関係し得て、以下に限定するものではないが、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種及びストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種が含まれる。これらの細菌は、ＣＤＶに感染したイヌにおいて臨床的に認められる化膿性結膜炎、鼻炎、気管支肺炎に関与している。主として呼吸器型の混合ウイルス感染も一般的である。イヌアデノウイルス２型感染に加え、レオウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス及びおそらくはイヌヘルペスウイルス等の他のウイルスは全て、二重又は多重混合感染に関与し得る。
【００６６】
ｃＰｉ２は、イヌで最も一般的に見られるウイルス性疾患の１つである呼吸器疾患を誘発するＲＮＡウイルスである。パラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルス２型及び細菌ボルデテラ・ブロンキセプチカの組み合わせが同時発症すると「ケンネルコフ」となる。ｃＰｉ２は気管気管支炎も引き起こし、気管気管支炎から滲出性肺炎になる動物もいる。咳の徴候は、ウイルスに曝露されてから７〜９日で現れる。二次感染が起きない限り臨床徴候は穏やかなものとなり、持続する期間も短い。
【００６７】
ｃＰｉ２は平均直径１５０〜２００ｎｍの球状のエンベロープを有するウイルスであり、糖タンパク質のスパイクで覆われた脂質二重層に囲まれたらせん状のヌクレオカプシドを備える。各ウイルス粒子は、核タンパク質（ＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）及び巨大（Ｌ）タンパク質を備えた、一本鎖でセグメントのないネガティブセンスＲＮＡゲノムを含有する。ｃＰｉ２の感染は、感染した呼吸器飛沫核の吸入により起きる。鼻及び鼻咽頭が感染の原発部位である。宿主細胞中のノイラミン酸受容体に特異的に結合するヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質を介してウイルスが第一にこれらの領域の繊毛上皮細胞に付着することで感染が始まる。続いて、ウイルスは、Ｆ１及びＦ２受容体の媒介による細胞膜との融合を通じて細胞内に進入する。ウイルスは増殖し、細胞内及び細胞外から他の細胞に侵入する。ウイルスの増殖は気管気管支組織全体で起き、粘液の産生増大を引き起こす。
【００６８】
喉頭気管炎は喉頭及び気管の炎症であり、イヌが発症した場合には一般に「ケンネルコフ」として知られているものである。主な症状は咳であって、短くて乾いた「空咳」又は一連のそのような咳が認められる。最も重篤な状態になると咳が発作性のものになり得て、感染は気道全体に及び、肺炎を起こすことが多い。深く、持続的で乾性咳嗽であることを特徴とする咳もあり、流涙及び鼻漏を伴うのが一般的である。体温は平熱の場合もあるが、通常は上昇する。疾患の発症は突発的に前兆なく起き得る。この疾患は伝染性が極めて強いことから、感染したイヌを隔離して集団全体への感染を防止すべきである。この疾患は犬舎の所有者に大きな経済的損失を与え、通常は致死性ではないものの、イヌを大きく衰弱させるため他の疾患からの影響が深刻なものとなり得る。
【００６９】
生ｃＰｉ２ウイルスとＣＤＶ、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）及びイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）等の他のウイルスとを、両方のウイルスが非病原性となるまで、すなわちウイルスが不活化又は弱毒化されるまで、動物組織培養物中で増殖させ得る。ｃＰｉ２ウイルスは、例えばニワトリ胚、アヒル胚、ブタ腎臓、ブタ精巣、ウシ胎仔腎臓、ネコ腎臓、イヌ腎臓及びサル腎臓等の多種多様な組織培養系で、また例えばメイディン・ダービーウシ腎臓（ＭＤＢＫ）、メイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）及びＳｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社のウサギ角膜（ＳＩＲＣ）等の樹立細胞株で増殖可能である。
【００７０】
例えばイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）の増殖には、腎臓組織培養物、特にはウシ及びイヌに由来するものが好ましい。ＣＡＶ２は、他の動物の組織培養系ではｃＰｉ２ウイルスほど順調に複製を行わないからである。各ウイルスの弱毒化は標準的な連続継代により成し遂げることができ、ウイルスが免疫原性を喪失することなく非病原性となるまで感受性組織培養物において十分な数の継代を行い得る限界希釈継代技法（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｐａｓｓａｇｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）が含まれる。そこから調製される免疫原、免疫原性組成物又は免疫原性懸濁液若しくは溶液は、通常は毒性がある物質を原因とする臨床症状を有意な程度までは生じさせることなく、疾患に感受性があるイヌにおいて免疫応答を刺激し得る。増殖は、上記のものと同じ組織又は異なる組織において行い得る。
【００７１】
継代間隔は継代と継代との間でウイルスが十分に複製可能なものであるべきであり、インキュベーション温度は好ましくは約３０〜約３８℃で維持される。最適な継代間隔は、用いる具体的な培養系及び温度に依存する。いずれの場合も、ウイルスの十分な複製が行われたか否かは、ｃＰｉ２ウイルスに特に有用な、Ｓｈｅｌｏｋｏｖ，Ａ．（１９５８）Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．９７，８０２に記載の赤血球吸着法等の標準的な技法により、あるいは細胞変性の観察、例えばインキュベーション継続中に著しい細胞変性作用が観察できる時点より前のある特定の継代中にウイルスを増殖させることで容易に確認し得る。
【００７２】
有利な増殖方法では、イヌ腎臓細胞、特には連続ＭＤＣＫ細胞株を利用する。例えば、免疫原性又はワクチンを目的として、ウイルスのイヌ腎臓組織培養物を介した単離から少なくとも約１５回、好ましくは約２０〜約４５回の継代を、約３日の間隔でインキュベーション温度約３０〜約３８℃で行い得る。高継代材料を使うことが好ましい。好ましい免疫応答を、それを必要とする対象において生起させるのに役立つからである。
【００７３】
免疫原性組成物又はワクチン組成物の調製においては、毒性があるＣＤＶを、培養した哺乳動物細胞において、慣用のウイルス増殖条件下で増殖させ得る。宿主細胞は、細胞植え付け時にウイルスと共に又は細胞単層のコンフルエンスが９０〜１００％の場合に交換用のＣＤＶ含有培地と共に播種し得る。感染多重度（ＭＯＩ）比は約０．００１〜約０．０５、好ましくは約０．０１になり得る。ウイルスを作製するために、ウシ胎仔血清、仔ウシ血清、ウマ血清、イヌ血清等の動物血清を約０〜約１０％、Ｌ−グルタミン並びに他の必須及び非必須アミノ酸等の栄養補助剤、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、イーグル塩類溶液、ピルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、インスリン、トランスフェリン並びに抗生物質及び抗真菌剤、例えば、以下に限定するものではないが、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ポリミキシンＢ、アンフォテリシン及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）を含有するいずれの適当な哺乳動物細胞増殖培地、例えば、以下に限定するものではないが、イーグル最小必須培地、ダルベッコ変法イーグル培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１２培地、Ｆ１５培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地も使用し得る。無血清細胞培養培地も本発明の範囲に含まれる。
【００７４】
播種後、感染細胞培養物を約３５〜約４０℃の温度範囲で約２〜７日間にわたって維持してからウイルスを回収し得る。感染培養物を細胞増殖培地でインキュベートし得て、２〜５日間にわたる更なるインキュベーション後に回収し得る。ウイルス液を滅菌容器に回収し、濾過により清澄化し得る。排除限界となる粒径が１０5ダルトンのフィルタを使用した慣用の限外濾過技法（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）によりウイルス液を更に濃縮し得る。
【００７５】
本発明の安定剤と混合可能な他の弱毒化生ウイルスには、以下に限定するものではないが、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、アデノウイルス、例えばイヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）、ＲＳウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ライノウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ブタポックスウイルス、ラクーンポックスウイルス、トリポックスウイルス、例えば鶏痘、カナリア痘、ダヴポックス、ピジョンポックス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ヘルペスウイルス（ヒト及び動物）、単純ヘルペスウイルス、パルボウイルス、例えばイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、例えばイヌ伝染性肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、アルファウイルス、例えばセムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ロスリバーウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、オニョンニョンウイルス、フラビウイルス、例えばデング熱ウイルス、西ナイルウイルス、ブニヤウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス、ヘパドナウイルス、例えばオルトヘパドナウイルス、アビヘパドナウイルス、フィロウイルス、レトロウイルス、例えばブタ内在性レトロウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＦｅＬＶ、ＢＬＶ、ＭＬＶ、ＭＭＳＶ、メイソン・ファイザーサルウイルス、レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ネコカリシウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ＴＧＥウイルス（ブタ）及び口蹄疫ウイルスが含まれる。
【００７６】
例えばイヌパラミクソウイルスを含む免疫原性組成物又は懸濁液又は溶液を安定剤と混合し、本開示の方法を用いてガラス化する。１容量のイヌパラミクソウイルス懸濁液又は溶液を、１容量の安定剤と混合し得る。
【００７７】
本開示の方法を用いてガラス化し得る適切な製剤は、イヌパラミクソウイルス免疫原性懸濁液又は溶液とパラミクソウイルス以外の病原体に起源を有する又は由来する少なくとも１つの活性免疫原性成分とを含む。本明細書で定義されるような活性免疫原性成分には弱毒化病原体生体、例えば弱毒化生ウイルス、弱毒化細菌生体、弱毒化真菌生体又は弱毒化寄生虫生体が含まれ得る。しかしながら、活性免疫原性成分には、死滅ウイルス、組み換え異種免疫原、抗原、免疫原性サブユニット（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、エピトープ、ハプテン）又は本明細書に記載の１種以上の病原体に由来する若しくは起源を有する免疫原若しくは抗原のエピトープも含まれ得て、これらをウイルスベクター、細菌ベクター、プラスミドベクター等から発現させ得る。
【００７８】
本発明の活性免疫原性成分は、狂犬病ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス、レプトスピラ・カニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｇｉａｅ）、レプトスピラ・グリッポチフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）等及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されないイヌ病原体から選択される１種以上の免疫原を含み得る。
【００７９】
活性免疫原性成分は、中でもＣＤＶ由来のＨＡ、Ｆ、ＮＰ遺伝子、ＣＰＶ由来のカプシド遺伝子、イヌコロナウイルス由来のスパイク、Ｍ、Ｎ遺伝子、ｃＰｉ２由来のＨＮ及びＦ遺伝子、レプトスピラ属由来の遺伝子、ボルデテラ属由来の遺伝子、ボレリア属由来の遺伝子及びイヌヘルペスウイルス由来のｇＢ、ｇＣ及びｇＤ遺伝子を含み得る。これらの成分は、これらの病原体によって引き起こされる疾患からイヌを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として有用となり得る。
【００８０】
イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ２）は広く分布し、イヌへの伝染性が高く、風邪に似た症状を呈する。一般に、この伝染病の最初の徴候は発熱であり、この発熱は通常は１〜２日で収まる。罹患したイヌに扁桃炎、腹部圧痛、肝臓肥大、嘔吐及び下痢が見られる場合もある。急性疾患は通常、致死的である。ＣＡＶ２を不活化又は弱毒化し、ＣＤＶ（及び／又はｃＰｉ２）と組み合わせて多価ワクチンを作製し得る。あるいは、ＣＡＶ２の免疫原若しくは抗原又はＣＡＶ２免疫原のエピトープ、例えばカプシド、マトリックス又はヘキソンタンパク質を使用し得る。
【００８１】
イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、若齢のイヌにおいて嘔吐、下痢、胃腸炎、心筋炎及び肝炎を引き起こし得る一般的な腸内ウイルスである。イヌの間で蔓延していることが判明している。ＣＰＶは、本発明の免疫原性組成物、懸濁液又は溶液中に、不活化ＣＰＶ、弱毒化生ＣＰＶ、ＣＰＶ免疫原、ＣＰＶ抗原又はＣＰＶ免疫原のエピトープ、例えばＶＰ１、ＶＰ２（カプシド）遺伝子産物として存在し得る。
【００８２】
イヌによく見られる２種の細菌感染症を、本発明の安定化された免疫原性組成物、懸濁液又は溶液中においてその弱毒化形態で組み合わせ得る。このよく見られる２種の細菌感染症は、レプトスピラ・カニコーラ及びレプトスピラ・イクテロヘモラジアである。レプト感染症はイヌ、特にはＣＤＶ、ｃＰｉ２又はジステンパー若しくはケンネルコフに罹患したイヌに多く観察されるようなウイルスの組み合わせに感染しているイヌによく見られ、このため、本発明の安定化された免疫原性組成物、懸濁液又は溶液にこれらを含めることは極めて有用である。
【００８３】
本発明の組成物及び方法に有用な他の活性免疫原性成分は、サルモネラ・チフィリウム、サルモネラ・エンテリティディス、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、軟卵症候群ウイルス（ＥＤＳ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、七面鳥ウイルス、鳥インフルエンザウイルス、マレック病ウイルス、ヘルペスウイルス、例えば伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ伝染性気管支炎ウイルス、トリレオウイルス、鶏痘、カナリア痘、ピジョンポックス、ウズラポックス及びダヴポックスを含めたポックスウイルス、トリポリオーマウイルス、トリニューモウイルス、トリ鼻気管炎ウイルス、トリ細網内皮症ウイルス、トリレトロウイルス、トリ内在性ウイルス、トリ赤芽球症ウイルス、トリ肝炎ウイルス、トリ貧血ウイルス、トリ腸炎ウイルス、パチェコ氏病ウイルス、トリ白血病ウイルス、トリパルボウイルス、トリロタウイルス、トリ白血症ウイルス、トリ筋腱膜線維肉腫ウイルス、トリ骨髄芽球症ウイルス、トリ骨髄芽球症関連ウイルス、トリ骨髄球腫症ウイルス、トリ肉腫ウイルス、トリ脾臓壊死ウイルス並びにこれらの組み合わせを含むがこれらに限定するものではないトリ病原体から選択される１種以上の免疫原を含み得る。
【００８４】
具体的な免疫原に関し、活性免疫原性成分は、ニューカッスル病ウイルスのＨＮ及びＦ遺伝子、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス由来のポリタンパク質及びＶＰ２遺伝子、伝染性気管支炎ウイルス由来のＳ及びＮ遺伝子並びにマレック病ウイルス由来のｇＢ及びｇＤ遺伝子にもなり得る。これらの病原体によって引き起こされる疾患からトリを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として、これらの成分を使用し得る。
【００８５】
あるいは、活性免疫原性成分は、ネコ病原体、例えば、以下に限定するものではないが、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス等及びこれらの組み合わせの１種以上の免疫原を含む。
【００８６】
活性免疫原性成分は、ネコヘルペスウイルス由来のｇＢ、ｇＣ及びｇＤ遺伝子、ＦｅＬＶ由来のｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｒｏ遺伝子、ＦＩＶウイルス由来のｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｔａｔ遺伝子、ネコカリシウイルス由来のカプシド遺伝子、Ｓ修飾遺伝子、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス由来のＭ及びＮ遺伝子並びにネコパルボウイルス由来のＶＰ２遺伝子も含み得る。これらの成分は、これらの病原体によって引き起こされる疾患からネコを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として有用となり得る。
【００８７】
活性免疫原性成分は、ウマ病原体、例えばウマヘルペスウイルス（１型又は４型）、ウマインフルエンザウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＥＥＶ）、破傷風、西ナイルウイルス等又はこれらの組み合わせの１種以上の免疫原を含み得る。
【００８８】
活性免疫原性成分は、ウマヘルペスウイルス１型由来のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及び前初期遺伝子、ウマヘルペスウイルス４型由来のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及び前初期遺伝子、ウマインフルエンザウイルス由来のＨＡ、ＮＡ、Ｍ及びＮＰ遺伝子、東部ウマ脳炎ウイルス由来の遺伝子、西部ウマ脳炎ウイルス由来の遺伝子、ベネズエラウマ脳炎ウイルス由来の遺伝子、西ナイルウイルス由来のｐｒＭ―Ｍ−Ｅ遺伝子並びにウマ動脈炎ウイルス由来の遺伝子も含み得るが、これらの配列に限定されない。これらの成分は、これらの病原体によって引き起こされる疾患からウマを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として有用となり得る。
【００８９】
活性免疫原性成分は、ウシ病原体、例えば狂犬病ウイルス、ウシロタウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ｂＣＰＩ２−３）、ウシコロナウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウシＲＳウイルス（ＢＲＳＶ）、伝染性ウシ鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、大腸菌、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）等及びこれらの組み合わせの１種以上の免疫原を含み得る。
【００９０】
活性免疫原性成分を、ウシヘルペスウイルス１型由来のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及び前初期遺伝子、ＢＲＳＶ由来のＦ及びＧ遺伝子、ＢＶＤＶ由来のポリタンパク質、Ｅ１、Ｅ２遺伝子、ＰＩ３ウイルス由来のＨＮ及びＦ遺伝子又はロタウイルス由来の遺伝子からも選択し得る。これらの成分は、これらの病原体によって引き起こされる疾患からウシを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として有用となり得る。
【００９１】
更に、活性免疫原性成分は、ブタ病原体、例えば、以下に限定するものではないが、ブタインフルエンザウイルス（ＳＩＶ）、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）、ブタ繁殖呼吸器障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）、ＦＭＤＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、大腸菌等及びこれらの組み合わせの１種以上の免疫原を含み得る。
【００９２】
活性免疫原性成分は、ＰＲＶ由来のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ及び前初期遺伝子、ブタインフルエンザウイルス由来のＨＡ、ＮＡ、Ｍ及びＮＰ遺伝子、ブタコレラウイルス由来のポリタンパク質、Ｅ１、Ｅ２、ＰＣＶ２ウイルス由来のＯＲＦ１及びＯＲＦ２遺伝子、ＰＲＲＳＶウイルス由来のＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６若しくはＯＲＦ７又はマイコプラズマ・ハイオニューモニエ由来の遺伝子も含み得る。これらの成分は、これらの病原体によって引き起こされる疾患からブタを守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として有用となり得る。
【００９３】
活性免疫原性成分は病原体内で発現するタンパク質をコードする配列を含み得て、例えば中でもＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ハンタウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラッサウイルス及びインフルエンザウイルス、出血性腸炎ウイルス（ＨＥＶ）、伝染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲＶ）等のＲＮＡ又はＤＮＡウイルスを含み得る。このような免疫原を有利には、これらの病原体によって引き起こされる疾患からヒト等の対象を守るための免疫原性組成物又はワクチン組成物として使用し得る。
【００９４】
活性免疫原性成分は、例えば以下の病原性細菌及びそれらの抗原、中でもアクチノバチルス種、例えばアクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・パラパータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、ボルデテラ・アビウム（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ａｖｉｕｍ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、クレブシエラ種、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ａ群ストレプトコッカス、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、緑色連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、エリシペロスリクス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、バシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、サルモネラ・アゴナ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ａｇｏｎａ）、サルモネラ・ブロックリー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｌｏｃｋｌｅｙ）、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、サルモネラ・ハダー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｈａｄａｒ）、サルモネラ・ハイデルベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、サルモネラ・モンテヴィデオ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）、サルモネラ・ゼンフテンベルグ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｅｎｆｔｅｎｂｅｒｇ）、サルモネラ・コレラエスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ヘリコバクター・フェリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、���ステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、レジオネラ・ニューモニエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、ボレリア・ブルグドルフェリ、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ペスト菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｅｓｔｉｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）種、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ヘモフィルス・インフルエンザエ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、エーリキア（Ｅｒｌｉｃｈｈｉａ）種のいずれの由来にもなり得る。
【００９５】
活性免疫原性成分は真菌又はカビ、例えばアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｉｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、カンジダ種、例えばカンジダ・トリコフィトン（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、カンジダ・パラシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・ドゥブリニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、リゾープス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種、クリプトコッカス種、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトコッカス・グルビイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒｕｂｉｉ）、クリプトコッカス・ガッティ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｔｔｉｉ）、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）並びに他の真菌及びカビにも由来し得る。
【００９６】
活性免疫原性成分は、以下に限定するものではないが、中でもプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ）種、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）種、ウシマダニ（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）種、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、シストソーマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）種、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）種、ファシーダ（Ｆａｓｃｉｄａ）種、ディロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）種、ウケレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）種、オンコセルカ（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｅａ）種、トレポネーマ種、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）種、クリプトコッカス種、コクシジウム（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）種、ヒストモナシス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎｉａｓｉｓ）種、ヘキサミチアシス（Ｈｅｘａｍｉｔｉａｓｉｓ）種、ジアルジア種、中でもアスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）種、トリキネラ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ）種等を含めた線虫、蠕虫、例えば吸虫、条虫及び他の同様の病原性生物を含めた寄生性種に由来する寄生虫抗原からも選択し得る。ウイルス、細菌、真菌、カビ、原虫、線虫及び蠕虫に由来する免疫原の調製方法は、当該分野において公知である。
【００９７】
他の有用な免疫原は、例えば、毒素、細胞毒等の分泌抗原病原性因子精製物になり得る。修飾により解毒された毒素抗原（トキソイド）を水酸化アルミニウム等のアジュバントと組み合わせて投与し得て、また毒素中和抗体の形成を刺激するのに使用し得る。免疫原として使用し得る毒素の例には、細菌内毒素及び外毒素、例えばリポ多糖、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、耐熱性エンテロトキシン（ＳＴ）を含めたエンテロトキシン、ベロ毒素（ＶＴ）等が含まれる。細菌外毒素免疫原は周辺媒質へと分泌され、また例えばジフテリア毒素（ココリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、破傷風毒素（クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ））、スタフィロコッカス・アウレウスが分泌するエンテロトキシン、ボツリヌス毒素（クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ））、藻類が産生する毒素、例えば神経毒等を含む。細菌の自己融解によって放出される耐熱性エンドトキシンには、例えばグラム陰性コレラ菌が放出するコレラ毒素、大腸菌等の腸内細菌が産生するコリシン（バクテリオシン）が含まれる。
【００９８】
ウイルス、細菌、真菌等に由来する又は起源を有する免疫原を、適当な培養培地又は宿主細胞株を使用したインビトロでの培養方法及び当業者に周知の慣用の方法で作製し得る。例えば、ＰＲＲＳＶを、ＭＡ−１０４細胞株等の適当な細胞株で培養し得る（中でも、米国特許第５５８７１６４号明細書、米国特許第５８６６４０１号明細書、米国特許第５８４０５６３号明細書、米国特許第６２５１４０４号明細書を参照のこと）。同様に、ＰＣＶ−２をＰＫ−１５細胞株を使用して培養し得て（米国特許第６３９１３１４号明細書を参照のこと）、ＳＩＶは卵上で培養し得て（米国特許第６０４８５３７号明細書）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエを適当な培養培地で培養し得る（米国特許第５９６８５２５号明細書、米国特許第５３３８５４３号明細書、Ｒｏｓｓ  Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４５：１８９９−１９０５）。有利には、米国特許第５１７８８６２号明細書に記載のもののように、ＣＤＶをミンク肺細胞において培養し得る。ウイルス由来の免疫原の他の調製技法は当該分野において公知であり、例えばＵｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５（１９９３）、Ｍａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１４．１−１４．１５，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８９）に記載されている。
【００９９】
抗原ペプチド配列を模倣する免疫原性合成ペプチドも有用である。このような免疫原を、例えばＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ８５：２１４９−２１５４（１９６３）に記載の固相法を用いて合成、精製、また任意でムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体タンパク質に、グルタルアルデヒド等の二官能性カップリング剤等を使用してカップリングさせ得る。
【０１００】
定義には合成抗原も含まれ、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ及び他の組み換え又は合成による抗原である。例えば、Ｂｅｒｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，２７７７−２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７，３２４２−３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７５，４０２−４０８；Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）１２ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｊｕｎ．２８−Ｊｕｌ．３，１９９８を参照のこと。本発明の目的上、免疫原性フラグメントは通常、その分子の少なくとも約３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜１５個のアミノ酸、最も好ましくは２５個以上のアミノ酸を含み得る。フラグメントの長さに決定的な上限はなく、完全長に近いタンパク質配列、更にはこのタンパク質の２つ以上又は少なくとも１つのエピトープを含む融合タンパク質さえ含み得る。
【０１０１】
従って、エピトープを発現する核酸の最小構造は、タンパク質又はポリタンパク質のエピトープ、免疫原又は抗原をコードするヌクレオチドを含み得る。全タンパク質又はポリタンパク質のフラグメントをコードする核酸は、より有利には、この全タンパク質又はポリタンパク質をコードする配列の最少で約２１個のヌクレオチド、有利には少なくとも約４２個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約５７個、約８７個又は約１５０個の連続又は隣接ヌクレオチドを含むか本質的にこれらから成る、又は、これらから成る。例えばオーバーラッピングペプチドライブラリー（Ｈｅｍｍｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９（４），１６３−１６８）の作製、ペプスキャン法（Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，３９９８−４００２、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，１７８−１８２、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９，４３−４７、Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．，（１９９０）Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ２１，５２３−５３３、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ（登録商標）ペプチド合成キット、Ｃｈｉｒｏｎ社）及びアルゴリズム（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，５３３−５６１）、またＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２２６０５号明細書（これらの文献は全て参照により本明細書に組み込まれる）におけるエピトープ同定手順を、過度な実験を行うことなく本発明を実施する際に使用することができる。免疫原又は抗原のエピトープ、ひいてはそのようなエピトープをコードする核酸分子を同定する方法に関しては、本明細書で引用の及び本明細書に組み込まれた他の文献も参考にし得る。
【０１０２】
本発明において、活性免疫原性成分は、治療薬、サイトカイン、毒素、免疫調節物質、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、アジュバント又はＤＮＡによるコードが可能であり且つ動物若しくは動物細胞若しくは動物組織への送達に望ましい他の分子も含み得る。
【０１０３】
本発明では、アンチセンスＲＮＡ種、触媒ＲＮＡ種又は低分子干渉ＲＮＡ種を本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物に含ませることも考えられ、受容細胞内に存在する又は受容細胞内に存在する可能性が高い全ての分子を標的とすることができる。これらには、以下に限定するものではないが、インターロイキン−６等の細胞調節分子をコードするＲＮＡ種、ヒトパピローマウイルス等の癌の原因物質、酵素、ウイルスＲＮＡ及びＨＩＶ−１ＲＮＡ等の病原体由来ＲＮＡが含まれる。ＲＮＡの標的は非転写ＤＮＡ配列、例えばプロモーター、エンハンサー領域又は受容細胞中に存在する他の分子、例えば、以下に限定するものではないが、ＤＮＡ合成に関与する酵素又はｔＲＮＡ分子になり得る。
【０１０４】
加えて、サイトカン及び免疫調節物質を、本発明の免疫原性組成物及びワクチン組成物において共発現させることができる。例には、以下に限定するものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＧＦ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γが含まれる。
【０１０５】
特異的な配列モチーフ、例えばＲＧＤモチーフをウイルスベクター又はプラスミドベクターのＨ−Ｉループに挿入してその感染力を高め得る。この配列はある種の細胞外マトリックスとインテグリンと称される細胞表面受容体のスーパーファミリーを有する接着タンパク質との相互作用に不可欠であると判明している。ＲＧＤモチーフの挿入は、有利には、免疫不全の対象において有用となり得る。組み換えベクターは、特異的抗原若しくは免疫原又はそのフラグメントを、本明細書に記載されているようなベクターのいずれかにクローニングすることで構築し得る。組み換えベクターを使用して、免疫化剤として使用するために脊椎動物の細胞に形質導入を行い得る（例えば、参照により組み込まれる米国特許出願第１０／４２４４０９号明細書を参照のこと）。
【０１０６】
好ましくは、活性免疫原性成分、例えば抗原、免疫原及びエピトープをコードするコドンは「最適化された」コドンであり、すなわちこれらのコドンは例えばＣＤＶ又はｃＰｉ２によって使用されることが多いコドンではなく、イヌ遺伝子によく出現する、すなわちイヌ遺伝子に高く発現するコドンである。このようなコドンの使用によって、細胞において活性免疫原性成分が効率的に発現する。他の実施形態においては、例えば活性免疫原性成分が細菌、酵母又は他の発現系で発現する場合、コドン使用頻度パターンは変化し、抗原又は免疫原が発現している有機体内で高発現する遺伝子に偏ったコドンバイアスを示す。コドン使用頻度パターンは、数多くの種の高発現遺伝子について、文献から公知である（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，１９９８、ＭｃＥｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【０１０７】
場合によっては、適切な方向で制御配列に結合されるようにコード配列を修飾する、すなわち正しいリーディングフレームを維持することが必要になり得る。所望の活性免疫原性成分の突然変異体又は類似体を作製することが望ましい場合もある。突然変異体又は類似体は、タンパク質をコードしている配列の一部の欠失、配列の挿入及び／又は配列中の１つ以上のヌクレオチドの置換により作製し得る。ヌクレオチド配列を修飾する技法、例えば部位特異的突然変異誘発は、例えば上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記のＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記のＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎに記載されている。
【０１０８】
内包性ベクター（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ）が本発明の活性免疫原性成分として有用な免疫原となり得る。このようなベクターには、以下に限定するものではないが、インビボ組み換え発現ベクター、例えば核酸ベクター又はプラスミド（欧州特許出願公開第１００１０２５号明細書、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  Ｐ，（２００１）Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．７０，２５５−６）、ウイルスベクター、例えば、以下に限定するものではないが、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、例えば鶏痘（米国特許第５１７４９９３号明細書、米国特許第５５０５９４１号明細書、米国特許第５７６６５９９号明細書）、カナリア痘ベクター（米国特許第５７５６１０３号明細書）、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アルファウイルスをベースとしたベクター、真菌ベクター又は細菌ベクター（大腸菌又はサルモネラ種）が含まれる。本発明において有用なベクターの具体例は、本明細書に記載されている。
【０１０９】
ベクターは、ウイルスベクター、有利には少なくとも１種の活性免疫原性成分又はそのエピトープ又はそのフラグメントを含有するトリポックスベクターになり得る。特に有利な実施形態において、トリポックスベクターはカナリアポックスベクター、有利にはＡＬＶＡＣ等の弱毒化カナリアポックスベクターである。弱毒化カナリアポックスウイルスは、米国特許第５７５６１０３号明細書（ＡＬＶＡＣ）及び国際公開第０１／０５９３４号パンフレットに記載されている。トリポックスベクターは鶏痘ベクター、有利にはＴＲＯＶＡＣ等の弱毒化鶏痘ベクターになり得る。弱毒化鶏痘株ＴＲＯＶＡＣに関する米国特許第５７６６５９９号明細書も挙げる。これに関し、ＶＲ−１１１というアクセス番号でＡＴＣＣから入手可能なカナリア痘を挙げる。数多くの鶏痘ウイルス免疫化株も入手可能であり、例えばＭｅｒｉａｌ社が販売しているＤＩＦＴＯＳＥＣ  ＣＴ株、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ社が販売しているＮＯＢＩＬＩＳ  ＶＡＲＩＯＬＥワクチンであり、弱毒化鶏痘株ＴＲＯＶＡＣに関する米国特許第５７６６５９９号明細書も挙げる。
【０１１０】
活性免疫原性成分の送達にも有用なウイルスベクターには、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス又は弱毒化ワクシニアウイルス（例えば、ＭＶＡ、ニワトリ胚線維芽細胞上でのアンカラワクチン株の５７０回を超える継代を経て得られる修飾アンカラ株（Ｓｔｉｃｋｌ＆Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，（１９７１）Ｍｕｎｃｈ．Ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．１１３，１１４９−１１５３、Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９，１０８４７−１０８５１を参照のこと、ＡＴＣＣＶＲ−１５０８として入手可能）、又はＮＹＶＡＣ（米国特許第５４９４８０７号明細書、例えばＮＹＶＡＣの構築、コペンハーゲン株ワクシニアウイルスゲノムから付加的なＯＲＦを欠失させたＮＹＶＡＣの変異体、この組み換え体の部位への異種核酸コード配列の挿入、また適合するプロモーターの使用について論じている米国特許第５４９４８０７号明細書の実施例１〜６を参照のこと、又、国際公開第９６／４０２４１号パンフレットも参照のこと））、トリポックスウイルス又は弱毒化トリポックスウイルス（例えば、カナリア痘、鶏痘、ダブポックス、牛痘、ピジョンポックス、ウズラポックス、ＡＬＶＡＣ又はＴＲＯＶＡＣ（例えば、米国特許第５５０５９４１号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書を参照のこと））、ブタ痘、ラクーンポックス、ラクダ痘又は粘液腫ウイルスが含まれる。
【０１１１】
これらの組み換え体を作製する方法及びこれらの組み換え体を投与する方法に関する情報に関し、当業者は本明細書で引用の文献及び国際公開第９０／１２８８２号パンフレットを参照することができ、例えばワクシニアウイルスに関しては、とりわけ米国特許第４７６９３３０号明細書、米国特許第４７２２８４８号明細書、米国特許第４６０３１１２号明細書、米国特許第５１１０５８７号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書及び米国特許第５７６２９３８号明細書を挙げる。鶏痘に関しては、とりわけ米国特許第５１７４９９３号明細書、米国特許第５５０５９４１号明細書及び米国特許第５７６６５９９号明細書を挙げる。カナリア痘に関しては、とりわけ米国特許第５７５６１０３号明細書を挙げる。ブタ痘に関しては、とりわけ米国特許第５３８２４２５号明細書を挙げる。ラクーンポックスに関しては、とりわけ国際公開第００／０３０３０号パンフレットを挙げる。
【０１１２】
発現ベクターがワクシニアウイルスの場合、免疫原、抗原、エピトープ等の活性免疫原性成分をコードする核酸を発現させるための挿入部位は、有利にはチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子又は挿入部位、ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子又は挿入部位、Ａ型の封入体（ＡＴＩ）をコードする領域である。本明細書で引用の文献、特にはワクシニアウイルスに関するものも参照のこと。カナリア痘の場合、有利には、挿入部位はＯＲＦのＣ３、Ｃ５及び／又はＣ６である。本明細書で引用の文献、特にはカナリア痘ウイルスに関するものも参照のこと。鶏痘の場合、有利には、挿入部位はＯＲＦのＦ７及び／又はＦ８である。本明細書で引用の文献、特には鶏痘ウイルスに関するものも参照のこと。ＭＶＡウイルスの挿入部位は、有利には、Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｍ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｖａｃｃｉｎｅ  １５（４），３８７−３９４、Ｓｔｉｔｔｅｌａａｒ  Ｋ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４（９），４２３６−４２４３、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２（１１），１０３２−１０４０を含めた各種刊行物の通りである。なお、これに関しては、完全ＭＶＡゲノムがＡｎｔｏｉｎｅ  Ｇ．，（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４４，３６５−３９６に記載されているため、当業者は他の挿入部位又は他のプロモーターも使用できる。
【０１１３】
有利には、発現させる核酸を特異的なポックスウイルスプロモーターの制御下で挿入し得て、例えばとりわけワクシニアプロモーター７．５ｋＤａ（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５４，３０−３５）、ワクシニアプロモーターＩ３Ｌ（Ｒｉｖｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６６，３４２４−３４３４）、ワクシニアプロモーターＨＡ（Ｓｈｉｄａ，（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５０，４５１−４５７）、ワクシニアプロモーター４２Ｋ（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．３７（１），２８４−９４）、牛痘プロモーターＡＴＩ（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９，３５−４７）、ワクシニア１１Ｋプロモーター（米国特許第５０１７４８７号明細書）、ワクシニアプロモーターＨ６（Ｔａｙｌｏｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｖａｃｃｉｎｅ  ６，５０４−５０８、Ｇｕｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，４１８９−４１９８、Ｐｅｒｋｕｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，３８２９−３８３６）若しくは合成ワクシニア又はポックスウイルスプロモーターである。
【０１１４】
有利には、哺乳動物の免疫化に関し、発現ベクターはカナリア痘又は鶏痘ベクターになり得る。このようにして、増殖的複製が限定された又はゼロの異種タンパク質の発現がおこり得る。
【０１１５】
活性免疫原性成分の送達及び発現に有用な別のウイルスベクターはアデノウイルスである。アデノウイルスは、エンベロープを有さないＤＮＡウイルスである。アデノウイルス由来のベクターは多数の特徴を有し、そうした特徴がこのベクターを遺伝子導入に特に有用なものとしている。組み換えアデノウイルスベクターは、１つ以上の異種ヌクレオチド配列（例えば、２、３、４、５個又はそれ以上の異種ヌクレオチド配列）を有するアデノウイルスベクターである。例えば、アデノウイルスの生態は詳細には以下を特徴とする：アデノウイルスは、そのＤＮＡを宿主細胞に導入するにあたって極めて効率的である；アデノウイルスは多種多様な細胞に感染することができ、また幅広い宿主を有し、アデノアデノウイルスは比較的容易に大量生産でき、ウイルスゲノムの初期領域１（Ｅ１）における欠失により、アデノウイルスを複製欠損性にすることができる。
【０１１６】
例えば、レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスは宿主細胞のゲノムに組み込まれず、非分裂細胞への感染が可能であり、また組み換え遺伝子のインビボでの効率的な導入が可能である（Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。これらの特徴が、アデノウイルスを、例えば目的とする異種核酸の、それを必要としている細胞、組織又は対象へのインビボでの遺伝子導入における魅力的な候補物質としている。
【０１１７】
複数の欠失を含有するアデノウイルスベクターは、ベクターの運搬能力を増大させ、また複製能を有するアデノウイルス（ＲＣＡ）の作製につながる組み換えの可能性を低下させることが好ましい。アデノウイルスが複数の欠失を含有する場合、それぞれの欠失が、例えば単独で存在する場合に、複製欠損性アデノウイルスに至る必要はない。欠失の１つによりアデノウイルスが複製欠損性になる限り、その追加の欠失を、別の目的、例えば異種ヌクレオチド配列用にアデノウイルスゲノムの運搬能力を向上させるために含め得る。好ましくは、２つ以上の欠失によって機能性タンパク質の発現は妨げられ、アデノウイルスが複製欠損性になる。より好ましくは、全ての欠失が、アデノウイルスを複製欠損性にする欠失である。
【０１１８】
アデノウイルス組み換え体を利用する本発明の実施形態は、Ｅ１欠損若しくは欠失、Ｅ３欠損若しくは欠失及び／又はＥ４欠損若しくは欠失アデノウイルスベクター、あるいは全てのウイルス遺伝子を欠失している「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」アデノウイルスベクターを含み得る。このアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ３又はＥ４遺伝子に突然変異を、あるいはこれらの遺伝子又は全てのアデノウイルス遺伝子に欠失を含み得る。Ｅ１の突然変異はベクターの安全域を引き上げる。これはＥ１欠損アデノウイルス突然変異体は、非許容細胞においては複製欠損性であるとされているからであり、また少なくとも高度に弱毒化されているからである。Ｅ３の突然変異は、アデノウイルスがＭＨＣクラスＩ分子を下方制御する機序を混乱させることで抗原の免疫原性を高める。Ｅ４の突然変異は、後期遺伝子発現を抑制することでアデノウイルスベクターの免疫原性を低下させ、これによって同ベクターを利用した再免疫化の繰り返しが可能になり得る。本発明は、Ｅ１、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ１及びＥ３並びにＥ１及びＥ４において欠失又は突然変異が生じている全てのセロタイプ又はセログループのアデノウイルスベクターをその範囲に含む。
【０１１９】
「ガットレス」アデノウイルスベクターはアデノウイルスベクターファミリーの最新モデルであり、ヒトアデノウイルス配列に由来する。その複製は、ヘルパーウイルスと、Ｅ１ａ及びＣｒｅの両方を発現する特別なヒト２９３細胞株と、自然環境には存在しない条件とを必要とする。このベクターは全てのウイルス遺伝子を失っているため、ワクチン担体としてのこのベクターは非免疫原性であり、また再免疫化のために複数回にわたって接種され得る。この「ガットレス」アデノウイルスベクターは、目的とする異種核酸を収容するための３６ｋｂの空間も有し、これによって多数の抗原又は免疫原の細胞内への共送達が可能になる。
【０１２０】
従って、本発明のベクターはいずれの適切な組み換えウイルス又はウイルスベクターにもなり得て、以下に限定するものでないが、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、トリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルス、ラクーンポックスウイルス、ブタ痘ウイルス等）、アデノウイルス（例えば、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（参照により本明細書に組み込まれる文献にあるように）が含まれ、あるいはベクターはプラスミドになり得る。本明細書で引用され且つ参照により本明細書に組み込まれる文献は、本発明の実施において有用なベクターの例を提供することに加えて、本発明の安定化された免疫原性組成物、懸濁液又は溶液においてベクターによって発現する、あるいは本発明の安定化された免疫原性組成物、懸濁液又は溶液中に含まれる、他の活性免疫原性成分の供給源も提供し得る。
【０１２１】
活性免疫原性成分を発現させるための要素は、有利には、プラスミドベクター中に存在し得る。用語プラスミドは、本発明の核酸及び所望の宿主又は標的の細胞におけるインビボでのその発現に必要な要素を含むいかなるＤＮＡ転写単位をもその範囲に含む。これに関しては、直線形態のものだけではなくスーパーコイル又は非スーパーコイルの環状プラスミドも本発明の範囲内にあるとする。
【０１２２】
最低でも、抗原、免疫原、エピトープ等の活性免疫原性成分の発現は、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン及びプロモーター、また任意でプラスミド等のある種のベクター及びある種のウイルスベクター（例えば、ポックスウイルス以外のウイルスベクター）のためのポリアデニル化配列を含む。核酸がベクターにおいてポリタンパク質フラグメントをコードする場合、ＡＴＧはリーディングフレームの５’末端に位置し、停止コドンは３’末端に位置する。タンパク質の発現、修飾及び分泌を可能にするエンハンサー配列、安定化列（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及びシグナル配列等の、発現を制御するための他の要素が存在し得る。
【０１２３】
核酸「コード配列」又は特定のタンパク質を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節要素の制御下に置かれた場合に、インビトロ又はインビボでポリペプチドに転写及び翻訳されるＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’末端の開始コドン及び３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、以下に限定するものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、更には合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終止配列は通常、コード配列の３’側に位置する。
【０１２４】
核酸「制御要素」とは集合的に、免疫原、抗原又はエピトープ等の活性免疫原性成分のコード配列に含有され得る場合又は含有され得ないプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル）、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハンサー、複製起点（細菌に起源を有するものになり得て、例えばｐＢＲ３２２等の細菌ベクターに由来し、あるいは真核生物に起源を有するものになり得て、例えば自己複製配列（ＡＲＳ））、パッケージングシグナル、リーダー配列のことを指す。シグナル配列が含まれる場合、未変性の相同配列又は異種配列になり得る。リーダー配列は、翻訳後プロセッシングにおいて宿主によって除去され得る。例えば、宿主細胞におけるコード配列の転写及び翻訳を集合的に提供している米国特許第４４３１７３９号明細書、米国特許第４４２５４３７号明細書、米国特許第４３３８３９７号明細書等を参照のこと。
【０１２５】
所望の遺伝子の転写及び翻訳が可能な限り、これらの制御配列の全てが常に組み換えベクター中に存在する必要はない。プロモーター等の制御要素は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合してコード配列をｍＲＮＡに転写する際に、細胞内のコード配列の「転写を指揮する」。得られたｍＲＮＡは続いて、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【０１２６】
所望のレベル及び組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサー要素を使用し得る。プロモーターは、所望の発現パターンに応じて、構成的又は誘導性プロモーター（例えば、中でもメタロチオネインプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター）になり得る。プロモーターは未変性又は異種になり得て、また天然又は合成配列になり得る。この場合の「異種」とは、転写開始領域を導入する野生型宿主では見られない転写開始領域のことである。目的とする標的細胞又は組織においてプロモーターが機能するようにプロモーターを選択する。本発明では、脳特異的、肝臓特異的及び筋肉特異的（骨格筋、心筋、平滑筋及び／又は横隔膜特異的なものを含む）プロモーターが考えられる。哺乳類及び鳥類のプロモーター、特にはイヌのプロモーターも好ましい。
【０１２７】
プロモーターは、有利には、「初期」プロモーターになり得る。「初期」プロモーターは当該分野において公知であり、タンパク質がデノボ合成されない場合に急速且つ一時的に発現する遺伝子の発現を引き起こすプロモーターであると定義される。プロモーターはまた、「強い」又は「弱い」プロモーターになり得る。「強いプロモーター」及び「弱いプロモーター」という表現は当該分野において公知であり、プロモーターでの転写開始の相対度数（１分当たりの回数）と定義することができる。「強い」又は「弱い」プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに対するその親和性によっても定義することができる。
【０１２８】
異種遺伝子を、プロモーター、（細菌発現用の）リボソーム結合部位及び任意でエンハンサー又はオペレーターの制御下に置き得て、その結果、活性免疫原性成分を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞又は対象において、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列がＲＮＡに転写される。
【０１２９】
ベクター、例えば上記のクローニングベクターへの挿入に先立って、制御要素及び他の調節配列をコード配列にライゲートし得る。あるいは、コード配列を、既に制御配列及び適当な制限部位を含有する発現ベクターに直接クローニングし得る。
【０１３０】
より好ましくは、抗原又は免疫原は、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、β−アクチンプロモーター、アルブミンプロモーター、伸長因子１−α（ＥＦ１−α）プロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター又はラウス肉腫ウイルスプロモーターと作用可能な状態で結合する。他の発現制御配列には、イムノグロビン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）遺伝子、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、ヘルペスウイルス等に由来するプロモーターが含まれる。イヌのウイルスプロモーターに加えて、いずれの哺乳動物のウイルスプロモーターも、本発明を実施する際に使用し得る。ウイルスを起源とするイヌのプロモーターの中でも、伝染性イヌヘルペスウイルスの前初期遺伝子のプロモーター、初期（すなわち、チミジンキナーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ）又は後期プロモーターを、本発明の方法及びベクターに使用し得る。他のプロモーターには、イヌアデノウイルスのＥ１プロモーター、またイヌ主要組織適合性複合体Ｉプロモーターが含まれる。更に、過度の実験を行うことなく、抗原又は免疫原に対する免疫原性応答を誘導する又は引き出すために、十分に高いレベルで目的とする抗原又は免疫原を発現させる適切なプロモーターを選択することは十分に当業者の範囲内である。
【０１３１】
これまで、ＣＭＶプロモーターを使用して異種ヌクレオチドの転写を引き起こすことは、免疫能が正常な動物における発現の下方制御につながり得ると考えられてきた（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照のこと）。従って、抗原又は免疫原配列を、例えばこの抗原又は免疫原の発現の下方制御につながらない修飾ＣＭＶプロモーターと作用可能な状態で結合させることも好ましい。
【０１３２】
本発明のベクターはポリリンカー又は多重クローニング部位（ＭＣＳ）も含み得て、これらは有利にはプロモーターの下流に位置し得る。ポリリンカーは、プロモーター配列と「インフレーム」である抗原又は免疫原分子を挿入するための部位を提供することから、プロモーター配列が目的とする抗原又は免疫原に「作用可能な状態で連結される」。多重クローニング部位及びポリリンカーは当業者に周知である。
【０１３３】
本明細書に記載のベクターは抗生物質抵抗性遺伝子も含み得る。本発明のベクターに組み込むことができるこのような抗生物質抵抗性遺伝子の例には、以下に限定するものではないが、中でもアンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン、ゼオシン、カナマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールが含まれる。
【０１３４】
２種以上の抗原又は免疫原が存在する実施形態において、抗原又は免疫原配列は、単一の上流プロモーター及び１つ以上の下流配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（例えば、ピコルナウイルスＥＭＣＩＲＥＳ配列）と作用可能な状態で結合し得る。ＩＲＥＳ配列は、単一のｍＲＮＡ配列に由来する２つ以上のコード配列の多シストロン性翻訳を可能にする。
【０１３５】
次に、本発明のベクターを、適当な宿主細胞又は対象の形質転換に使用し得る。多数の哺乳動物細胞株が当該分野で公知であり、その中にはアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株が含まれており、例えば、以下に限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、メイディン・ダービー・ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞その他である。同様に、細胞宿主、例えば大腸菌、バシラス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ種、シゲラ種及びストレプトコッカス種は、本発明において使用され得る。本発明において有用な酵母宿主には、とりわけサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ピチア・ギリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が含まれる。本発明において有用な昆虫宿主には、以下に限定するものではないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞が含まれる。
【０１３６】
あるいは、培養中の細胞に感染させて所望の遺伝子産物を発現させる、例えば目的とするタンパク質又はペプチドを作製するためにベクターを使用し得る。好ましくは、タンパク質又はペプチドを培地中に分泌させ、そこから当該分野で公知の定石的な技法を用いて精製し得る。タンパク質の細胞外分泌を指揮するシグナルペプチド配列は当該分野において公知であり、それをコードするヌクレオチド配列を、当該分野で公知の定石的な技法により、目的とするペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用可能な状態で連結し得る。あるいは、細胞を溶解させ得て、その細胞溶解物から、発現した組み換えタンパク質を精製し得る。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞である。
【０１３７】
本発明の遺伝子の遺伝子産物をインビボ又はインビトロで発現させるためのベクター又は組み換え体又はプラスミドを作製及び／又は投与する方法は、所望のいずれの方法にもなり得て、例えば、米国特許第４６０３１１２号明細書、米国特許第４７６９３３０号明細書、米国特許第４３９４４４８号明細書、米国特許第４７２２８４８号明細書、米国特許第４７４５０５１号明細書、米国特許第４７６９３３１号明細書、米国特許第４９４５０５０号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書、米国特許第５５１４３７５号明細書、米国特許第５７４４１４０号明細書、米国特許第５７４４１４１号明細書、米国特許第５７５６１０３号明細書、米国特許第５７６２９３８号明細書、米国特許第５７６６５９９号明細書、米国特許第５９９００９１号明細書、米国特許第５１７４９９３号明細書、米国特許第５５０５９４１号明細書、米国特許第５３３８６８３号明細書、米国特許第５４９４８０７号明細書、米国特許第５５９１６３９号明細書、米国特許第５５８９４６６号明細書、米国特許第５６７７１７８号明細書、米国特許第５５９１４３９号明細書、米国特許第５５５２１４３号明細書、米国特許第５５８０８５９号明細書、米国特許第６１３００６６号明細書、米国特許第６００４７７７号明細書、米国特許第６１３００６６号明細書、米国特許第６４９７８８３号明細書、米国特許第６４６４９８４号明細書、米国特許第６４５１７７０号明細書、米国特許第６３９１３１４号明細書、米国特許第６３８７３７６号明細書、米国特許第６３７６４７３号明細書、米国特許第６３６８６０３号明細書、米国特許第６３４８１９６号明細書、米国特許第６３０６４００号明細書、米国特許第６２２８８４６号明細書、米国特許第６２２１３６２号明細書、米国特許第６２１７８８３号明細書、米国特許第６２０７１６６号明細書、米国特許第６２０７１６５号明細書、米国特許第６１５９４７７号明細書、米国特許第６１５３１９９号明細書、米国特許第６０９０３９３号明細書、米国特許第６０７４６４９号明細書、米国特許第６０４５８０３号明細書、米国特許第６０３３６７０号明細書、米国特許第６４８５７２９号明細書、米国特許第６１０３５２６号明細書、米国特許第６２２４８８２号明細書、米国特許第６３１２６８２号明細書、米国特許第６３４８４５０号明細書、米国特許第６３１２６８３号明細書、１９８６年１０月１６日に出願の米国特許出願第９２０１９７号明細書、国際公開第９０／０１５４３号パンフレット、国際公開第９１／１１５２５号パンフレット、国際公開第９４／１６７１６号パンフレット、国際公開第９６／３９４９１号パンフレット、国際公開第９８／３３５１０号パンフレット、欧州特許第２６５７８５号明細書、欧州特許第０３７０５７３号明細書、Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３１３−１１３１８、Ｂａｌｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．４，３８６１−６５、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０−２５６１、Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３��１−１１３７７、Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，８５−８７、Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｅｍ．Ｖｉｒｏｌ．３，２３７−５２、Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１，７３６−７３９、Ｋｉｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，３０６８−３０７５、ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１４１４−１１４２０、Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３４１−１１３４８、Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｅ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３４９−１１３５３、Ｐｅｎｎｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，３９９−４０６、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｅｄ），（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９，“Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２１５６−２１６５、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３３４−１１３４０、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，２７１及びＲｏｉｚｍａｎ，Ｂ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１１３０７−１１３１２において又はこれらの文献で引用の文献において開示された方法、あるいはそのような方法に類似した方法になり得る。
【０１３８】
対象における異種配列の発現は、対象における抗原又は免疫原の発現産物に対する免疫応答につながり得る。このため、本発明の活性免疫原性成分を免疫原性組成物又はワクチン組成物に使用して、防御になり得るがそうである必要はない免疫応答を誘導する手段にし得る。本発明で用いる分子生物学的技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）に記載されている。
【０１３９】
更に別の案又は追加の案としては、本発明がその範囲に含む免疫原性組成物又はワクチン組成物において、抗原又は免疫原をコードするヌクレオチド配列から、膜貫通ドメインをコードする部分を欠失させ得る。更に別の案又は追加の案としては、ベクター又は免疫原性組成物は更に、異種ｔＰＡシグナル配列、例えば哺乳動物ｔＰＡ及び／又は安定化イントロン、例えばウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンＩＩをコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内に含有し、宿主細胞内で発現させ得る。
【０１４０】
ベクターは、遺伝子産物（例えば、エピトープ、抗原、治療用物質及び／又は抗体）組成物について記された量を達成する量で対象に投与され得る。本発明では、本明細書で例示のものより少ない及び多い用量を想定しており、対象に投与される組成物で、その成分を含めた全ての組成物に関し、また全ての特定の投与方法に関し、適切な対象において例えば５０％細胞培養感染量（ＣＣＩＤ50）、致死量（ＬＤ）及びＬＤ50を求めることで毒性を決定することが好ましい。また、適切な応答を引き出す組成物の用量、その中の成分の濃度及び組成物を投与するタイミングを、例えば血清の滴定及びその分析、例えばＥＬＩＳＡ及び／又は血清中和分析により決定することが好ましい。当業者の知識、本発明の開示内容及び本明細書で引用の文献から、そのような確認に過度の実験は不要である。
【０１４１】
弱毒化生ＣＡＶ２、弱毒化生ＣＤＶ、弱毒化生ｃＰｉ２及び弱毒化生ＣＰＶを含み且つ本発明の安定剤を含む多価免疫原性組成物及び／又はワクチン組成物及び／又は免疫原性懸濁液若しくは溶液を、本明細書の実施例において試験した。これらの多価ワクチンは、ＣＤＶ、ｃＰｉ２、ＣＡＶ２及びＣＰＶに関して良好な安定性を示した。これは、本発明の安定剤が、ＣＤＶ、ｃＰｉ２、ＣＡＶ２及びＣＰＶの生存能及び感染力を保存可能であることを実証している。本発明の安定剤が、イヌパラミクソウイルス以外の様々なウイルス、特にはイヌパルボウイルス及びイヌアデノウイルスの生存能及び感染力を保存可能であることも実証している。本発明の安定剤を、ＣＡＶ、ＣＰＶ、ＣＤＶ又はｃＰｉ２を含む、一価免疫原性組成物又はワクチン組成物としても使用し得る。
【０１４２】
冷却ステップ（ｂ）は、約−４０℃未満の温度で行い得る（水分凍結ステップ）。安定化された免疫原性懸濁液又は溶液の、低圧での氷の昇華による乾燥（ｃ）は、例えば約２００μバール以下の圧力で行い得て、一方、約１００μバール以下の圧力で更に減圧を行い得る。最後に、過剰な残留水分を除去する際（ｄ）の、安定化された免疫原性懸濁液又は溶液の温度は、例えば約２０〜約３０℃である。
【０１４３】
凍結乾燥の工程を、弱毒化生イヌパラミクソウイルス及びパラミクソウイルス以外の病原体に由来する少なくとも１種の活性免疫原性成分を含む免疫原性懸濁液又は溶液を使用しても行い得て、この懸濁液又は溶液は本発明の安定剤と混合され、凍結乾燥させた安定化多価免疫原性組成物又はワクチン組成物が得られる。
【０１４４】
ガラス化された材料の含水率（moisture content）は、約０．５〜約５％質量／質量、好ましくは約０．５〜約３％質量／質量、より好ましくは約１．０〜約２．６％質量／質量になり得る。
【０１４５】
対象でのその使用及び対象へのその投与のために、ガラス化された安定化免疫原性組成物又はワクチン組成物を、溶媒での再水和により再構成し得る。この溶媒は典型的には水、例えば脱塩水又は蒸留水、注射用水であるが、生理的食塩水若しくは緩衝液、例えばリン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はアジュバントも含み得て、アジュバントには、以下に限定するものではないが、油中水乳剤、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）、水酸化アルミニウム、グルカン、硫酸デキストラン、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクト−アジュバント（Ｂａｃｔｏ−Ａｄｊｕｖａｎｔ）、ある種の合成ポリマー、例えばポリアミノ酸及びアミノ酸のコポリマー、サポニン、「ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ」（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ社、ジョージア州アセンズ）、「ＡＶＲＩＤＩＮＥ」（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチエル）−プロパンジアミン）、パラフィン油、ムラミルジペプチド等が含まれる。アジュバント及びアジュバント組成物の他の具体例は、本明細書で詳述されている。
【０１４６】
適切なアジュバントには、ｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン；米国特許第６０１７５３７号明細書）及び／又はアクリル酸若しくはメタクリル酸ポリマー及び／又は無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーが含まれる。アクリル酸又はメタクリル酸ポリマーは、例えば糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋し得る。これらの化合物は、「カルボマー」という名で公知である（Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２，Ｊｕｎｅ  １９９６）。当業者は、米国特許第２９０９４６２号明細書（参照により組み込まれる）も参照し得て、この特許では、少なくとも３個のヒドロキシル基を含有するポリヒドロキシル化化合物で架橋したそのようなアクリルポリマーについて論じている。ポリヒドロキシル化化合物は、８個以下のヒドロキシル基を含有する。別の例としては、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を含有する不飽和脂肪族ラジカルで置換されている。ラジカルは、約２〜約４個の炭素原子、例えばビニル、アリル及び他のエチレン不飽和基を含有し得る。不飽和ラジカルは、それ自体が、メチル等の他の置換基を含有し得る。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（Ｎｏｖｅｏｎ社、オハイオ州、米国）の名で販売されている製品は、アジュバントとしての使用に特に適している。これらはアリルスクロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋され、これに関しては、製品Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを挙げる。
【０１４７】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーに関しては、ＥＭＡ（登録商標）という製品（Ｍｏｎｓａｎｔｏ社）が挙げられ、無水マレイン酸とエチレンとのコポリマーであり、線状になり得て又は架橋され得て、例えばジビニルエーテルで架橋され得る。また、米国特許第６７１３０６８号明細書及びＲｅｇｅｌｓｏｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９６０を参照し得る（参照により組み込まれる）。
【０１４８】
第４級アンモニウム塩を含有するカチオン性脂質は米国特許第６７１３０６８号明細書（その内容は参照により組み込まれる）に記載されており、本発明の方法及び組成物に用い得る。これらのカチオン性脂質の中でも、中性脂質、有利にはＤＯＰＥ（ジオレイル−ホスファチジルエタノールアミン、Ｂｅｈｒ  Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ，１９９４）と有利には会合してＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成するＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアンモニウム、国際公開第９６／３４１０９号パンフレット）が好ましい。
【０１４９】
再構成されてすぐに注射できる状態にある本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物の全成分量を用いて、等張濃度、例えば約１００〜６００ｍＯｓｍの範囲内、一般的には約２５０〜４５０ｍＯｓｍの範囲内、好ましくは約３３０ｍＯｓｍで注射を行い得る。
【０１５０】
凍結乾燥させた安定化免疫原性組成物若しくはワクチン組成物又は再構成されてすぐに注射できる状態にある免疫原性組成物若しくはワクチン組成物中の弱毒化された病原体生体、特にはＣＤＶ及びｃＰｉ２の用量は、約１０2〜約１０7ＣＣＩＤ50／用量になり得る。凍結乾燥させた安定化多価免疫原性組成物若しくはワクチン組成物又は再構成されてすぐに注射できる状態にある多価免疫原性組成物若しくはワクチン組成物中のタンパク質、ポリペプチド又は糖タンパク質に関しては、不活化前の同等力価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｉｔｅｒ）において、１用量当たり約１０5〜約１０9ＣＣＩＤ50、好ましくは１用量当たり約１０6〜約１０8ＣＣＩＤ50になり得る。
【０１５１】
再構成されてすぐに注射できる状態にある免疫原性組成物又はワクチン組成物を、非経口的な又は粘膜経路の注射、好ましくは筋肉内注射及び皮下注射により動物に投与し得る。しかしながら、このような再構成されてすぐに注射できる状態にある免疫原性組成物又はワクチン組成物の投与は、鼻腔内投与、皮膚上投与、局所投与又は経口投与も含み得る。注射１回分の体積は、約０．１〜約２．０ｍｌ、好ましくは約１．０ｍｌになり得る。
【０１５２】
ここで本発明について、以下の非限定的な実施例により更に説明する。実施例は本発明の様々な実施形態を例示するためのものであって、いかなる形でも本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：ガラス化工程−生物学的材料（総合的に説明してから具体的に説明する）
生物学的組成物を、以下の共通ステップ：
（１）生物学的製剤を調製し、この調製は活性のある生物学的原料を添加し、生物学的原料をプリル化、ガラス化及び凍結乾燥を含めた極低温保存手段に供することで引き起こされる損傷を軽減又は排除する安定剤を添加し、任意で免疫用製剤の場合に生物由来原料の免疫原性を上昇させる１種以上のアジュバントを添加するステップを含み、
（２）バイアルにステップ（１）の生物学的製剤を充填し、
（３）バイアルを温度制御されたコンテナに入れ、ここで温度は−１５〜１０℃、特には−１０〜５℃、更に特定すると約５℃であり、
（４）温度制御されたコンテナの気圧を、１５〜３０ミリバールの範囲内の圧力が得られるまで低下させ、
（５）ステップ（４）で得られた圧力を５〜２０分間、特には１０〜１５分間にわたって維持することで製品の温度を安定させ且つカーボネートを含めた揮発性ガスを生物学的製剤から放出させ、このステップの間、コンテナ温度は約４〜約６℃又は約５℃を維持し、
（６）コンテナの気圧を約４〜約７ミリバール又は約５ミリバールへと約５〜約２０分間にわたって低下させ、
（７）ステップ（６）の圧力を約３０〜約６０分間にわたって維持し、これによって生物学的製剤はより濃縮され、
（８）コンテナの温度をマイナス温度からプラス温度（約３０〜約５０℃）へと４５〜８５分又は約６０分の間に上昇させ、圧力を、約１０〜約２０℃又は約１５℃に達するまで一定に保ち、
（９）コンテナの気圧を、濃縮を加速させるために及びコンテナ温度が約３０℃に達してそれを約３０〜約９０分又は６０分間にわたって維持するまで約１．５〜約４ミリバール又は約３ミリバールまで低下させ、
（１０）圧力を約０．５〜約４．０ミリバール又は約１ミリバールまで更に低下させ、発泡が完了するまで一定の圧力を維持し、
（１１）圧力を約５μバール〜約１００μバール又は約２５μバールまで更に低下させ、同時に温度を約３０℃で約４００〜約２４００分以上にわたって、約０．５〜約１５％又は約１〜約４％の所望の水分が得られるまで維持し、
（１２）凍結乾燥コンテナ内にある間にバイアルに栓をすることによってガラス化法を完了する
に従ってガラス化した。
【０１５４】
【表２】
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【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
【表５】
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【０１５８】
【表６】
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【０１５９】
【表７】
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【０１６０】
【表８】
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【０１６１】
【表９】
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【０１６２】
【表１０】
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【０１６３】
【表１１】
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【０１６４】
【表１２】
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【０１６５】
【表１３】
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【０１６６】
【表１４】
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【０１６７】
実施例２：凍結乾燥後の安定性調査
ＥＵＲＩＣＡＮ（ＣＤＶ＆ＰＩ２）を凍結乾燥、ガラス化（上で開示の方法に準拠する）又はプリル化に供した。表は、試験した免疫用製剤に関する詳細をまとめたものである。
【０１６８】
【表１５】
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【０１６９】
【表１６】
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【０１７０】
【表１７】
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【０１７１】
【表１８】
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【０１７２】
【表１９】
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【０１７３】
伝染性ファブリキウス嚢病（コロナウイルス）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、リーシュマニアＫＳＡＣポリペプチド及びニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞も、本開示の方法に従って成功裡にガラス化した。
【０１７４】
実施例４：イヌにおけるワクチン試験
実施例１に記載のガラス化ワクチンを、滅菌注射用水での再水和後にイヌに投与する。月齢３〜５ヶ月の特定病原体未感染（ＳＰＦ）のイヌ４頭及び月齢３〜５ヶ月の通常のイヌ４頭を２頭ずつの４つのグループに無作為に分け、各グループはＳＰＦのイヌ１頭と通常のイヌ１頭から成る。各グループについて、２倍の用量（２ｍｌ）に対応するガラス化／安定化ワクチンで、０日目に２頭のイヌを皮下投与で免疫化する。１４日目に、１用量（１ｍｌ）の同じ安定化ワクチンで、イヌを皮下投与で免疫化する。即時型局所反応及び即時型全身反応、直腸温度、局所反応、全身反応並びに臨床症状を観察する。投与後に局所又は全身反応は観察されない。従って、ガラス化／安定化ワクチンの安全性は高いと考えられる。
【０１７５】
このように本発明の好ましい実施形態について詳述してきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく数多くの明白な変型が可能であることから、添付の請求項によって定義される本発明は上に記載の特定の詳細事項によって限定されないことを理解されたい。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕生物学的材料をガラス化する方法であって、
液体の生物学的製剤を調製し、前記製剤を圧力及び温度における制御された変化に供して前記製剤の含水率を約５質量％未満まで低下させることによって、生物学的材料をガラス化するステップを含む
ことを特徴とする方法。
〔２〕（ａ）前記液体製剤に活性のある生物学的原料、生物学的原料をプリル化、ガラス化及び凍結乾燥を含めた極低温保存手段に供することで引き起こされる損傷を軽減又は排除する安定剤を添加し、任意で１種以上のアジュバントを添加し、
（ｂ）バイアルにステップ（ａ）の前記生物学的製剤を充填し、
（ｃ）バイアルを温度制御されたコンテナに入れ、ここで温度は−１５〜１０℃、特には−１０〜５℃、更に特定すると約５℃であり、
（ｄ）前記温度制御されたコンテナの気圧を、１５〜３０ミリバールの範囲内の圧力が得られるまで低下させ、
（ｅ）ステップ（４）で得られた圧力を５〜２０分間、特には１０〜１５分間にわたって維持することで製品の温度を安定させ且つカーボネートを含めた揮発性ガスを前記生物学的製剤から放出させ、このステップの間、コンテナ温度は約４〜約６℃又は約５℃を維持し、
（ｆ）前記コンテナの気圧を約４〜約７ミリバール又は約５ミリバールへと約５〜約２０分間にわたって低下させ、
（ｇ）ステップ（６）の圧力を約３０〜約６０分間にわたって維持し、これによって前記生物学的製剤はより濃縮され、
（ｈ）前記コンテナの温度をマイナス温度からプラス温度（約３０〜約５０℃）へと４５〜８５分又は約６０分の間に上昇させ、圧力を、約１０〜約２０℃又は約１５℃に達するまで一定に保ち、
（ｉ）コンテナの気圧を、濃縮を加速させるために及びコンテナ温度が約３０℃に達してそれを約３０〜約９０分又は６０分間にわたって維持するまで約１．５〜約４ミリバール又は約３ミリバールまで低下させ、
（ｊ）圧力を約０．５〜約４．０ミリバール又は約１ミリバールまで更に低下させ、発泡が完了するまで一定の圧力を維持し、
（ｋ）圧力を約５μバール〜約１００μバール又は約２５μバールまで更に低下させ、同時に温度を約３０℃で約４００〜約２４００分以上にわたって、約０．５〜約１５％又は約１〜約４％の所望の水分が得られるまで維持し、
（ｌ）前記凍結乾燥コンテナ内にある間に前記バイアルに栓をすることによってガラス化法を完了する
ステップを更に含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記活性のある生物由来原料が、免疫原、ポリペプチド、ヌクレオチド、ウイルス生体、細菌生体、原生生物生体又はある疾患若しくは障害の原因である病原体に起源を有するサブユニットである、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記活性な生物由来原料が弱毒化生ウイルスである、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕前記ウイルスがイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、イヌパラインフルエンザウイルス２型（ＰＩ２）又はこれらの組み合わせである、前記〔４〕に記載の方法。
〔６〕前記弱毒化ウイルスがカナリア痘、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）又はネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）である、前記〔４〕に記載の方法。
〔７〕前記細菌がアビバクテリウムである、前記〔３〕に記載の方法。
〔８〕前記製剤が少なくとも１種のアジュバントを含有する、先行の態様のいずれかに記載の方法。
〔９〕前記ガラス化された生物学的材料が、少なくとも１年間にわたって４℃で安定である、先行の態様のいずれかに記載の方法。
〔１０〕前記ガラス化された生物学的材料が、少なくとも１年間にわたって−２０〜−８０℃で安定である、先行の態様のいずれかに記載の方法。
〔１１〕組成物であって、
先行の態様のいずれかに記載の方法を用いて製造されるガラス化された生物学的材料を含む
ことを特徴とする組成物。
【図１】
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