(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物の培養培地であって、該培地は、
（ｉ）ＧＤＦ−９又はＧＤＦ−９のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＧＤＦ−９と同様の生化学的機能を有するバリアント、及び
（ｉｉ）ＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−１５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−１５と同様の生化学的機能を有するバリアントを含有し、
ＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬである培地。
【請求項２】
さらに、次の（ｉ）及び（ｉｉ）の内の１以上を含有する請求項１記載の培地。
（ｉ）１以上の付加的な裸化卵母細胞、及び
（ｉｉ）ＢＭＰ−６又はＢＭＰ−６のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−６と同様の生化学的機能を有するバリアント。
【請求項３】
さらに、４０ｍＭ〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ  ＫＣｌ及び０．１ｍＭ〜４０ｍＭグルコースの内の一以上を含有する、請求項１又は２記載の培地。
【請求項４】
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子の一以上を実質的に含有していない、請求項１〜３の何れか１項記載の培地。
【請求項５】
卵母細胞成熟培地である請求項１〜４の何れか１項記載の培地。
【請求項６】
インビトロ受精培地である請求項１〜４の何れか１項記載の培地。
【請求項７】
卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵丘卵母細胞複合体から産生した胚の発育能力を促進する方法であって、該方法は卵丘卵母細胞複合体を請求項１〜６の何れか１項記載の培地に曝露することを含む方法（ヒトに対する場合を除く）。
【請求項８】
卵丘卵母細胞複合体の成熟を促進する方法であって、該方法は卵丘卵母細胞複合体を請求項１〜６の何れか１項記載の培地に曝露することを含む方法（ヒトに対する場合を除く）。
【請求項９】
卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物を用いた補助生殖方法（ヒトに対する場合を除く）であって、該方法は卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物を請求項１〜６の何れか１項記載の培地に曝露することを含む方法。
【請求項１０】
補助生殖方法がインビトロ受精である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物の凍結融解方法であって、該方法は卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物を請求項１〜６の何れか１項記載の培地に凍結前及び／又は融解後に曝露することを含む方法（ヒトに対する場合を除く）。
【請求項１２】
さらに、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の内の１以上の段階を含む請求項７〜１１の何れか１項記載の方法（ヒトに対する場合を除く）。
（ｉ）卵丘卵母細胞複合体内及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達の活性を上昇させる、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達の活性を上昇させる、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達の活性を上昇させる。
【請求項１３】
卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物の培養培地を含む組合せ製品であって、該組合せ製品は、
（ｉ）ＧＤＦ−９又はＧＤＦ−９のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＧＤＦ−９と同様の生化学的機能を有するバリアント、及び
（ｉｉ）ＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−１５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−１５と同様の生化学的機能を有するバリアントを含有し、
ＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬである製品。
【請求項１４】
さらに、次の（ｉ）及び（ｉｉ）の内の１以上の成分を含有し、当該成分は培地に添加するための形態で提供される請求項１３記載の組み合せ製品。
（ｉ）１以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）ＢＭＰ−６又はＢＭＰ−６のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−６と同様の生化学的機能を有するバリアント。
【請求項１５】
卵丘卵母細胞複合体の発育能力を調節する方法及び／又は卵丘卵母細胞複合体から産生された胚の発育能力を調節する方法であって、該方法は卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞が曝露される、
（ｉ）ＧＤＦ−９又はＧＤＦ−９のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＧＤＦ−９と同様の生化学的機能を有するバリアントの濃度及び／又は活性を調節する段階、及び
（ｉｉ）ＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−１５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−１５と同様の生化学的機能を有するバリアントの濃度及び／又は活性を調節する段階、
を含み、
ＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬを添加する方法（ヒトに対する場合を除く）。
【請求項１６】
補助生殖方法（ヒトに対する場合を除く）であって、該方法は、卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物及び／又は卵丘卵母細胞複合体、卵母細胞切除複合体と裸化卵母細胞の混合物、又は卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞の混合物に関連する卵丘細胞が曝露される、
（ｉ）ＧＤＦ−９又はＧＤＦ−９のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＧＤＦ−９と同様の生化学的機能を有するバリアントの濃度及び／又は活性を調節する段階、及び
（ｉｉ）ＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−１５のアミノ酸配列の１以上のアミノ酸が相同性９０％超の範囲で置換又は欠失し、かつＢＭＰ−１５と同様の生化学的機能を有するバリアントの濃度及び／又は活性を調節する段階を含み、
ＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬ、ＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬを添加する方法。
【請求項１７】
さらに、次の（ｉ）〜（ｉｖ）の内の１以上の段階を含む請求項１５又は１６記載の方法（ヒトに対する場合を除く）。
（ｉ）卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞はＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、及び
（ｉｖ）卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵丘卵母細胞複合体に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は豪州特許仮出願第２００５９０３７８２号（２００５年７月１８日出願）の優先権を主張するものであり、ここに本明細書の一部を構成するものとして該豪州特許仮出願の内容を援用する。
【０００２】
本発明は顆粒膜細胞アポトーシスを調節するための方法と組成物に関する。
【０００３】
本発明はまた卵成熟を調節し、卵胞の閉鎖・発育・成熟を調節し、排卵率を調節し、雌性受胎能を調節するための方法と組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳類の未成熟卵（卵母細胞）は卵巣中の卵胞内で成長・発育する。未成熟卵母細胞の代謝は体性顆粒膜細胞と連動しており、体性顆粒膜細胞は卵母細胞を取り囲んで排卵まで卵母細胞の発育を助ける。卵母細胞は、その伴細胞である体性顆粒膜細胞との関連性に依存して、成長・発育がサポートされ、減数分裂の進行が規制される。
【０００５】
卵胞発育は増殖・分化・閉鎖間の複雑な相互作用により駆動される。卵巣の卵胞閉鎖は重要なプロセスであり、９９％を超える卵母細胞が失われる。インビボ及びインビトロ両方の研究で卵胞閉鎖はアポトーシスと称されるプログラムされた細胞死の能動的プロセスによることが実証されている。細胞レベルでは、アポトーシスは細胞質と核の断片化、クロマチン縮合、ＤＮＡの断片化、及びファゴサイトーシスを特徴とする。
【０００６】
アポトーシスは卵胞発育過程で少なくとも４個の異なる細胞コンパートメント中で（莢膜細胞、顆粒膜細胞、卵丘細胞、及び卵母細胞自身の中で）、開始させることができる。胞状卵胞における初期閉鎖段階では、最初は壁側顆粒膜細胞で後に莢膜細胞でのアポトーシスとして認められる閉鎖性変化により、卵丘細胞及び卵母細胞は外見上影響されないままである。卵母細胞と顆粒膜／卵丘細胞がアポトーシスを避けるために相互作用するメカニズムは殆んど解明されていない。
【０００７】
伝統的な考えでは、卵胞発育における卵母細胞の役割は受動的であり、卵胞発育とそれによる卵形成は外部ホルモンにより導かれるとされてきた。しかしながら、現在では卵母細胞も卵胞発育を促進する因子を分泌していると考えられている。卵母細胞パラクリン因子の発現変化が卵成熟・卵胞発育・受胎能に著しい影響を与え得るという事実が示すように、この卵母細胞による卵胞形成のコントロールは非常に重要であると思われる。
【０００８】
よって、卵母細胞は、卵胞顆粒膜細胞機能に対する根源的コントロール要素を規制するパラクリン因子の分泌により卵胞の成長を制御しその結果として卵胞発育及び受胎能を制御するのに積極的な役割を果たしている、ということが現在証拠によって示唆されている。
【０００９】
顆粒膜細胞の発育を規制するのにこのような卵母細胞により分泌される因子（以下、「卵母細胞分泌因子」という）が決定的に重要であるにも拘らず、卵母細胞によって分泌される顆粒膜細胞の発育にかかわる因子の同定、並びにこのような因子の発現が卵胞形成・卵成熟・受胎能をコントロールするのにどのように使われ得るかに関してこれまでのところ殆んど情報がない。
【００１０】
更に、インビトロ及びインビボ両方で卵胞形成・卵成熟・受胎能をコントロールする今日の方法は多くの理由により適切なものではない。従って、卵胞発育・卵成熟・受胎能をコントロールするために、顆粒膜細胞の発育をコントロールする新たな方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスがＢＭＰ−１５（骨形成タンパク質−１５としても知られている；ＧＤＦ−９Ｂ）及び／又はＢＭＰ−６（骨形成タンパク質−６）により調節されていることを見出したことによる。即ち、本発明は顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するための方法と組成物、及び卵成熟・卵胞発育・雌性受胎能を調節するための方法と組成物に関する。
【００１２】
ここに先行技術として言及した特許文献やその他の資料については、いずれの請求項に係る優先権主張日においても、それら文献や資料が公知であることやそこに包含される情報が共通の一般知識の一部であることを自認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する方法であって、該方法は次の各段階、（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１４】
また、本発明は、雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、卵母細胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、該方法は次の各段階、（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、卵胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、卵胞の閉鎖を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００１９】
また、本発明は、卵胞の発育を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００２０】
また、本発明は、雌性被験体の排卵率を調節する方法であって、該方法は次の各段階、（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００２１】
また、本発明は、雌性被験体の受胎能を調節する方法であって、該方法は次の各段階、（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００２２】
また、本発明は、凍結融解に起因する顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００２３】
また、本発明は、凍結融解に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減する方法であって、該方法は、卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣を
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上に曝露することを含む方法を提供するものである。
【００２４】
また、本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００２５】
また、本発明は、卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵胞を培養するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【００２６】
また、本発明は、次の各成分、
卵母細胞及び／又は胚の培養培地、
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はこれらのバリアント若しくはアナログ、及び／又は
顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤、及び／又は
顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤を含有し、
各成分は、培養培地に添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
【００２７】
また、本発明は、卵母細胞の成熟を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００２８】
また、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【００２９】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を調節するための組成物であって、該組成物は、（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３０】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を改善するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【００３１】
また、本発明は、雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３２】
また、本発明は、卵胞を培養するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３３】
また、本発明は、卵胞培養培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【００３４】
また、本発明は、卵胞の閉鎖を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３５】
本発明は、卵胞の発育を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３６】
また、本発明は、雌性被験体の排卵率を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３７】
また、本発明は、雌性被験体の卵巣周期又は月経周期の各周期において成熟する卵胞の数を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３８】
また、本発明は、雌性被験体の受胎能を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００３９】
また、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【００４０】
また、本発明は、卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵胞を培養するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【００４１】
また、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する前記一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【００４２】
また、本発明は、卵胞培養培地であって、該培地は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵胞内の一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵胞内の前記一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
該組成物は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【００４３】
また、本発明は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する組成物又は培地であって、
更に、４０ｍＭ〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．１ｍＭ〜４０ｍＭグルコースを含有する組成物又は培地を提供するものである。
【００４４】
また、本発明は、凍結融解に起因する顆粒膜細胞アポトーシスを低減するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）活性ＢＭＰ−１５及び／又は活性ＢＭＰ−６、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００４５】
また、本発明は、凍結に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）有効量の活性ＢＭＰ−１５及び／又は活性ＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【００４６】
また、本発明は、卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【００４７】
また、本発明は、卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞及び／又は胚を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【００４８】
また、本発明は、卵母細胞のインビトロ受精方法であって、該方法は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【００４９】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のアポトーシスの程度を決定する段階、及び
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内で見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階を含み、
アポトーシスのレベルの低下は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、アポトーシスのレベルの上昇は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【００５０】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性レベル、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性レベルの内の一以上を決定する段階と、
（ｉｉ）上の決定の結果を用いて卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の上昇、及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の低下、及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【００５１】
また、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価するための方法であって、該方法は、
（ｉ）卵母細胞内のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現レベルを決定する、及び／又は卵母細胞が分泌するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を決定する段階と、
（ｉｉ）卵母細胞の発育能力を評価する段階とを含み、
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１Ａ】ＴＵＮＥＬ（緑標識）によって検出した、卵丘細胞におけるＤＮＡ断片化に関する共焦点レーザ走査顕微鏡法の代表的な画像を示す。どの細胞核もヨウ化プロピジウムで染色されている（赤）。陽性対照ＤＮアーゼ１で処理したＯＯＸは非常に強いアポトーシス染色を示した（９９％）（Ａ）が、陰性対照では特異的な標識を示すアポトーシスシグナルが現れず（０％）（Ｂ）、また、ＣＯＣではアポトーシス標識の割合が低かった（９％）（Ｃ）が、これに対し、ＯＯＸではアポトーシス標識の割合が高かった（３５％）（Ｄ）。
【図１Ｂ】ＴＵＮＥＬ（緑標識）によって検出した、卵丘細胞におけるＤＮＡ断片化に関する共焦点レーザ走査顕微鏡法の代表的な画像を示す。どの細胞核もヨウ化プロピジウムで染色されている（赤）。陽性対照ＤＮアーゼ１で処理したＯＯＸは非常に強いアポトーシス染色を示した（９９％）（Ａ）が、陰性対照では特異的な標識を示すアポトーシスシグナルが現れず（０％）（Ｂ）、また、ＣＯＣではアポトーシス標識の割合が低かった（９％）（Ｃ）が、これに対し、ＯＯＸではアポトーシス標識の割合が高かった（３５％）（Ｄ）。
【図１Ｃ】ＴＵＮＥＬ（緑標識）によって検出した、卵丘細胞におけるＤＮＡ断片化に関する共焦点レーザ走査顕微鏡法の代表的な画像を示す。どの細胞核もヨウ化プロピジウムで染色されている（赤）。陽性対照ＤＮアーゼ１で処理したＯＯＸは非常に強いアポトーシス染色を示した（９９％）（Ａ）が、陰性対照では特異的な標識を示すアポトーシスシグナルが現れず（０％）（Ｂ）、また、ＣＯＣではアポトーシス標識の割合が低かった（９％）（Ｃ）が、これに対し、ＯＯＸではアポトーシス標識の割合が高かった（３５％）（Ｄ）。
【図１Ｄ】ＴＵＮＥＬ（緑標識）によって検出した、卵丘細胞におけるＤＮＡ断片化に関する共焦点レーザ走査顕微鏡法の代表的な画像を示す。どの細胞核もヨウ化プロピジウムで染色されている（赤）。陽性対照ＤＮアーゼ１で処理したＯＯＸは非常に強いアポトーシス染色を示した（９９％）（Ａ）が、陰性対照では特異的な標識を示すアポトーシスシグナルが現れず（０％）（Ｂ）、また、ＣＯＣではアポトーシス標識の割合が低かった（９％）（Ｃ）が、これに対し、ＯＯＸではアポトーシス標識の割合が高かった（３５％）（Ｄ）。
【図２Ａ】ＦＳＨの存在下（Ａ）又は非存在下（Ｂ）での卵丘細胞アポトーシスに対する卵母細胞分泌因子の用量応答について示す。卵母細胞切除複合体（ＯＯＸ）の培養を裸化卵母細胞（ＤＯ）の数を増加させながら行った結果、最大用量において、アポトーシスが対照ＣＯＣのレベルまで効果的に抑制された。各ポイントは、アポトーシス卵丘細胞の平均比率（平均±ＳＥＭ）を示す。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】ＦＳＨの存在下（Ａ）又は非存在下（Ｂ）での卵丘細胞アポトーシスに対する卵母細胞分泌因子の用量応答について示す。卵母細胞切除複合体（ＯＯＸ）の培養を裸化卵母細胞（ＤＯ）の数を増加させながら行った結果、最大用量において、アポトーシスが対照ＣＯＣのレベルまで効果的に抑制された。各ポイントは、アポトーシス卵丘細胞の平均比率（平均±ＳＥＭ）を示す。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図３Ａ】ＯＳＦ源の近接（proximity）に関する卵丘複合体内でのアポトーシスのパターンについて示す。ＣＯＣ及びＯＯＸの直径を共焦点顕微鏡法によって測定し、内層、中間層及び外層の３層に分割した（各層は半径の３３％に相当する）（Ａ）。アポトーシス発生率は、卵母細胞に最も近い層（［Ｃ］においてはＣＯＣ内層、これに対して［Ｄ］においてはＯＯＸ外層）において最も低く、卵母細胞からの距離が増大するに伴って上昇した（Ｂ）。＊処理×層数（Treatment×Layers）（２要因ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．０２６）。
【図３Ｂ】ＯＳＦ源の近接（proximity）に関する卵丘複合体内でのアポトーシスのパターンについて示す。ＣＯＣ及びＯＯＸの直径を共焦点顕微鏡法によって測定し、内層、中間層及び外層の３層に分割した（各層は半径の３３％に相当する）（Ａ）。アポトーシス発生率は、卵母細胞に最も近い層（［Ｃ］においてはＣＯＣ内層、これに対して［Ｄ］においてはＯＯＸ外層）において最も低く、卵母細胞からの距離が増大するに伴って上昇した（Ｂ）。＊処理×層数（Treatment×Layers）（２要因ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．０２６）。
【図３Ｃ】ＯＳＦ源の近接（proximity）に関する卵丘複合体内でのアポトーシスのパターンについて示す。ＣＯＣ及びＯＯＸの直径を共焦点顕微鏡法によって測定し、内層、中間層及び外層の３層に分割した（各層は半径の３３％に相当する）（Ａ）。アポトーシス発生率は、卵母細胞に最も近い層（［Ｃ］においてはＣＯＣ内層、これに対して［Ｄ］においてはＯＯＸ外層）において最も低く、卵母細胞からの距離が増大するに伴って上昇した（Ｂ）。＊処理×層数（Treatment×Layers）（２要因ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．０２６）。
【図３Ｄ】ＯＳＦ源の近接（proximity）に関する卵丘複合体内でのアポトーシスのパターンについて示す。ＣＯＣ及びＯＯＸの直径を共焦点顕微鏡法によって測定し、内層、中間層及び外層の３層に分割した（各層は半径の３３％に相当する）（Ａ）。アポトーシス発生率は、卵母細胞に最も近い層（［Ｃ］においてはＣＯＣ内層、これに対して［Ｄ］においてはＯＯＸ外層）において最も低く、卵母細胞からの距離が増大するに伴って上昇した（Ｂ）。＊処理×層数（Treatment×Layers）（２要因ＡＮＯＶＡ；ｐ＝０．０２６）。
【図４Ａ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図４Ｂ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図４Ｃ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図４Ｄ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図４Ｅ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図４Ｆ】卵丘細胞アポトーシスに対する推定卵母細胞分泌因子、即ち、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答について示す。ＦＳＨの非存在下（Ａ、Ｃ、Ｅ）又は存在下（Ｂ、Ｄ、Ｆ）で、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。卵丘細胞アポトーシスはＧＤＦ−９によっては影響を受けなかったが、ＢＭＰ−６によって用量依存的に抑制され、ＢＭＰ−１５ではより顕著であった。各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（Ａ〜Ｂ；ｐ＜０．００１）。＊は細胞分泌因子に関し、対照（ＯＯＸ）に対して有意差があることを示す（ｐ＜０．００１）（Ｃ〜Ｆ）。
【図５】ウェスタンブロット解析によって検討した、Ｂｃｌ−２及びＢａｘ蛋白質のＯＯＸ発現に対するＤＯ、ＧＤＦ−９及びＢＭＰ−１５の作用について示す。次の処理後、３５個のＯＯＸの群を各レーンにロードした。レーン１、１０％ｖ／ｖ２９３Ｈ（対照ならし培地）；レーン２、対照（ＯＯＸのみ）；レーン３、１３２ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９；レーン４、１０％ｖ／ｖＢＭＰ−１５；レーン５、０．７個（ＤＯ）／μＬ。デンシトメトリーによって定量したバンド強度を２９３Ｈ対照に対して示す（３回の反復実験による（平均±ＳＥＭ））。各群内で上付き文字が異なるバー（a-bＢｃｌ−２、y-zＢａｘ）については有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図６】ＤＯ、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５によるスタウロスポリン誘導アポトーシスからの卵丘細胞の保護について示す。ＯＯＸは単独で培養、或いは３５個のＤＯ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６又は１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５と共培養し、インキュベーションの最後の６時間、０．１μＭ又は１．０μＭのスタウロスポリン（ＳＴＳ）に曝露した。卵母細胞、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５は全て、スタウロスポリンによって誘導される卵丘細胞アポトーシスを防止した。＊は、ＯＯＸ平均がＯＯＸ対照に対して有意差がある（ｐ＜０．００１）ことを示す。
【図７Ａ】卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰのアンタゴニストの作用について示す。フォリスタチンの存在下、その用量を増加させながら（０〜１００μｇ／ｍＬ）、１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５と共にＯＯＸを培養し（Ａ）、一方、ＢＭＰ−６中和抗体（ＮＡｂ）の非存在下又は高中和用量（２０μｇ／ｍＬ）のＮＡｂの存在下で１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６と共にＯＯＸを培養した（Ｂ）。ＢＭＰ−１５による卵丘細胞アポトーシスの抑制はフォリスタチンによって拮抗された。ＮＡｂはＢＭＰ−６の抗アポトーシス作用に効果的に拮抗した。各ポイント及び各バーはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図７Ｂ】卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰのアンタゴニストの作用について示す。フォリスタチンの存在下、その用量を増加させながら（０〜１００μｇ／ｍＬ）、１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５と共にＯＯＸを培養し（Ａ）、一方、ＢＭＰ−６中和抗体（ＮＡｂ）の非存在下又は高中和用量（２０μｇ／ｍＬ）のＮＡｂの存在下で１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６と共にＯＯＸを培養した（Ｂ）。ＢＭＰ−１５による卵丘細胞アポトーシスの抑制はフォリスタチンによって拮抗された。ＮＡｂはＢＭＰ−６の抗アポトーシス作用に効果的に拮抗した。各ポイント及び各バーはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるポイントの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図８Ａ】卵丘細胞に対する卵母細胞の抗アポトーシス作用におけるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の役割について示す。裸化卵母細胞（２５個）と共培養したＯＯＸを５０μｇ／ｍＬのフォリスタチン、２０μｇ／ｍＬのＢＭＰ−６ＮＡｂ、又はこれら両方の組合せで処理した（Ａ）。フォリスタチン及びＢＭＰ−６ＮＡｂは両方とも卵母細胞の抗アポトーシス作用に一部拮抗する上では有効であったが、いずれも単独使用又は併用した場合にアポトーシスをＯＯＸのレベルまで完全に回復させることはなかった。ＯＯＸをＤＯと共培養、或いはＢＭＰ−１５単独又はＢＭＰ−６単独で処理することによって卵丘細胞アポトーシスは抑制された（Ｂ）。ＢＭＰ−６とＢＭＰ−１５を併用してＯＯＸを処理した場合、アポトーシスレベルがＢＭＰ−１５単独の場合を超えて更に低下することはなかったが、このことは、これら２種のＢＭＰに相加作用がないことを示唆する。各バーはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図８Ｂ】卵丘細胞に対する卵母細胞の抗アポトーシス作用におけるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の役割について示す。裸化卵母細胞（２５個）と共培養したＯＯＸを５０μｇ／ｍＬのフォリスタチン、２０μｇ／ｍＬのＢＭＰ−６ＮＡｂ、又はこれら両方の組合せで処理した（Ａ）。フォリスタチン及びＢＭＰ−６ＮＡｂは両方とも卵母細胞の抗アポトーシス作用に一部拮抗する上では有効であったが、いずれも単独使用又は併用した場合にアポトーシスをＯＯＸのレベルまで完全に回復させることはなかった。ＯＯＸをＤＯと共培養、或いはＢＭＰ−１５単独又はＢＭＰ−６単独で処理することによって卵丘細胞アポトーシスは抑制された（Ｂ）。ＢＭＰ−６とＢＭＰ−１５を併用してＯＯＸを処理した場合、アポトーシスレベルがＢＭＰ−１５単独の場合を超えて更に低下することはなかったが、このことは、これら２種のＢＭＰに相加作用がないことを示唆する。各バーはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図９Ａ】卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰ−７及びそのアンタゴニストであるグレムリンの作用について示す。グレムリンの存在下、その用量を増加させながら（０〜４０μｇ／ｍＬ）、１０％のＢＭＰ−１５と共にＯＯＸを培養した（Ａ）。また、２μｇ／ｍＬのグレムリンの存在下又は非存在下でＯＯＸを１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７及び／又は１０％のＢＭＰ−１５と共培養した（Ｂ）。グレムリンは卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰ−１５の抑制作用に拮抗しなかったが、ＢＭＰ−７の抑制作用には拮抗した。各バー及び各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図９Ｂ】卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰ−７及びそのアンタゴニストであるグレムリンの作用について示す。グレムリンの存在下、その用量を増加させながら（０〜４０μｇ／ｍＬ）、１０％のＢＭＰ−１５と共にＯＯＸを培養した（Ａ）。また、２μｇ／ｍＬのグレムリンの存在下又は非存在下でＯＯＸを１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７及び／又は１０％のＢＭＰ−１５と共培養した（Ｂ）。グレムリンは卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰ−１５の抑制作用に拮抗しなかったが、ＢＭＰ−７の抑制作用には拮抗した。各バー及び各ポイントはアポトーシス卵丘細胞の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図１０】ＩＶＭ時の裸化卵母細胞の存在下又は非存在下での卵丘卵母細胞複合体の共培養の結果を示す。ＩＶＭ後に複合体と卵母細胞を６処理群に分割した。裸化卵母細胞（Ａ）、卵丘卵母細胞複合体（Ｂ）、裸化卵母細胞と共培養した卵丘卵母細胞複合体（０時間）（Ｃ）、卵丘卵母細胞複合体と共培養した裸化卵母細胞（０時間）（Ｄ）、卵丘卵母細胞複合体として９時間、その後、ＩＶＭの最後の１５時間、裸化卵母細胞と共培養（Ｅ）、卵丘卵母細胞複合体として９時間、その後、裸化させた後、ＩＶＭの最後の１５時間、卵丘卵母細胞複合体と共培養（Ｆ）。
【図１１】ＩＶＭ時の無傷卵丘卵母細胞複合体と裸化卵母細胞との共培養又は無傷卵丘卵母細胞複合体の単独培養が後の卵母細胞発育の分裂率に及ぼす影響について示す。ＩＶＭ時に卵丘卵母細胞複合体を４処理群に無作為に割り当てた。ＩＶＭ後、全ての複合体及び卵母細胞を受精させ、２日目に分裂率について評価した。各バーは分裂率の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ、ｂ、ｃ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図１２】ＩＶＭ時の無傷ＣＯＣとＤＯとの共培養が後の胚の発育能力に及ぼす影響について示す。インビトロ成熟（ＩＶＭ）時に卵丘卵母細胞複合体を４処理群に無作為に割り当てた。ＩＶＭ後、全ての複合体及び卵母細胞を受精させ、８日目に形成胚盤胞の質について評価した。各バーは分裂率の平均比率を示す（平均±ＳＥＭ）。ラベル（ａ〜ｅ）が異なるバーの値には有意差がある（ｐ＜０．００１）。
【図１３】ＧＤＦ−９及び卵母細胞によって誘導される卵丘膨張に対するＡＬＫ４／５／７阻害剤の作用について示す。
【図１４Ａ】ＧＤＦ−９、ＴＧＦ−β１又は卵母細胞によって誘導されるＤＮＡ合成に対するＡＬＫ４／５／７阻害剤の作用について示す（パネルＡ）と共に、ＧＤＦ−９及び卵母細胞によって誘導されるＤＮＡ合成に対する様々な濃度の該阻害剤の作用について示す（パネルＢ）。
【図１４Ｂ】ＧＤＦ−９、ＴＧＦ−β１又は卵母細胞によって誘導されるＤＮＡ合成に対するＡＬＫ４／５／７阻害剤の作用について示す（パネルＡ）と共に、ＧＤＦ−９及び卵母細胞によって誘導されるＤＮＡ合成に対する様々な濃度の該阻害剤の作用について示す（パネルＢ）。
【図１５Ａ】ＴＧＦ−β１によって刺激されるＣＡＧＡルシフェラーゼ活性に対する様々な濃度のＡＬＫ４／５／７阻害剤の作用について示す。
【図１５Ｂ】ＴＧＦ−β１によって刺激されるＣＡＧＡルシフェラーゼ活性に対する様々な濃度のＡＬＫ４／５／７阻害剤の作用について示す。
【図１６Ａ】異なるサイズの卵胞由来の卵母細胞によるＧＤＦ９ｍＲＮＡの発現について示す。卵胞を手作業で切除し、洞周囲（periantral）卵胞、小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞の３種類のサイズに分類した。卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を各サイズの卵胞から採取し、その卵丘細胞（ＣＣ）を剥離した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｎｅａｓｙキットを用いて卵母細胞ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１６Ｂ】異なるサイズの卵胞由来の卵母細胞によるＧＤＦ９ｍＲＮＡの発現について示す。卵胞を手作業で切除し、洞周囲（periantral）卵胞、小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞の３種類のサイズに分類した。卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を各サイズの卵胞から採取し、その卵丘細胞（ＣＣ）を剥離した。Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏ  Ｒｎｅａｓｙキットを用いて卵母細胞ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１７Ａ】異なるサイズの卵胞由来の顆粒膜細胞（ＧＣ）による受容体／シグナル伝達ｍＲＮＡの発現について示す。各サイズの卵胞から１×１０5個のＧＣを採取し、全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＧＣＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１７Ｂ】異なるサイズの卵胞由来の顆粒膜細胞（ＧＣ）による受容体／シグナル伝達ｍＲＮＡの発現について示す。各サイズの卵胞から１×１０5個のＧＣを採取し、全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＧＣＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１７Ｃ】異なるサイズの卵胞由来の顆粒膜細胞（ＧＣ）による受容体／シグナル伝達ｍＲＮＡの発現について示す。各サイズの卵胞から１×１０5個のＧＣを採取し、全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＧＣＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１７Ｄ】異なるサイズの卵胞由来の顆粒膜細胞（ＧＣ）による受容体／シグナル伝達ｍＲＮＡの発現について示す。各サイズの卵胞から１×１０5個のＧＣを採取し、全ＲＮＡを抽出した。ランダムヘキサマーを用いてＧＣＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲによって増幅した。−ｖｅＲＴ：逆転写酵素なし、−ｖｅＰＣＲ：ＤＮＡポリメラーゼなし、＋ｖｅ：陽性組織サンプル（卵巣）。
【図１８Ａ】ＧＤＦ９及び卵母細胞によるＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化について示す。大型卵胞由来のＭＧＣにＳｍａｄ３応答性ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼレポーター構築物（Ａ）又はＳｍａｄ１応答性ＢＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物（Ｂ）を一過的に形質移入した。次に、細胞を未処理のままにするか、０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、８８〜２６５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９又は５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７で処理するか、或いは６０個のマウス卵母細胞と共培養した。細胞を４８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を細胞抽出物において測定した。各バーは、３回の反復実験によって得た平均＋／−ＳＥＭを対照に対する倍率変化（fold change）で示したものである。
【図１８Ｂ】ＧＤＦ９及び卵母細胞によるＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化について示す。大型卵胞由来のＭＧＣにＳｍａｄ３応答性ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼレポーター構築物（Ａ）又はＳｍａｄ１応答性ＢＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物（Ｂ）を一過的に形質移入した。次に、細胞を未処理のままにするか、０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、８８〜２６５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９又は５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７で処理するか、或いは６０個のマウス卵母細胞と共培養した。細胞を４８時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を細胞抽出物において測定した。各バーは、３回の反復実験によって得た平均＋／−ＳＥＭを対照に対する倍率変化（fold change）で示したものである。
【図１９】ＧＤＦ９によって刺激される壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成のＡＬＫ４／５／７キナーゼ阻害剤ＳＢ４３１５４２による阻害について示す。大型胞状卵胞由来の壁側ＧＣを２４時間培養し、チミジン取り込みを１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９で刺激した。ＡＬＫ４／５／７キナーゼ阻害剤ＳＢ−４３１５４２は、ＧＤＦ９によって刺激されるチミジン取り込みを用量依存的に阻害した。各バー／ポイントは、３回の反復実験によって得た平均＋／−ＳＥＭを対照に対する倍率変化で示したものである。
【図２０】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９及び卵胞サイズの影響について示す。１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９の存在下で洞周囲卵胞、小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞由来の壁側ＧＣを２４時間培養した。培養期間の最後に３Ｈ−チミジン取り込みを評価した。各バーは８回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【図２１】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９及び卵胞サイズの影響について示す。小型及び大型胞状卵胞由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９で用量を増加させながら（０〜３５０ｎｇ／ｍＬ）２４時間処理した。培養期間の最後に３Ｈ−チミジン取り込みを測定した。各ポイントは７回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【図２２Ａ】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９のＦＳＨ及び／又はＩＧＦ−１との併用の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＦＳＨ（５０ｍＩＵ／ｍＬ）及びＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）の組合せと共に２４時間培養した。各バーは７回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【図２２Ｂ】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９のＦＳＨ及び／又はＩＧＦ−１との併用の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＦＳＨ（５０ｍＩＵ／ｍＬ）及びＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）の組合せと共に２４時間培養した。各バーは７回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【図２３Ａ】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９＋／−ＢＭＰ１５の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ１５（１０％）の一方のみ、或いは両方の組合せと共に培養した。各バーは３回の反復実験の平均＋／−ＳＥを示す。
【図２３Ｂ】壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９＋／−ＢＭＰ１５の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ１５（１０％）の一方のみ、或いは両方の組合せと共に培養した。各バーは３回の反復実験の平均＋／−ＳＥを示す。
【図２４】ＩＶＭ時にＣＯＣを卵母細胞分泌因子（ＯＳＦ）に曝露する実験計画についての概略図を示す。ＩＶＭ時に、ＣＯＣを単独で培養、或いは裸化卵母細胞（濃度：０．５個（ＤＯ）／μＬ）と共培養（ＣＯＣ＋ＤＯｓ）した。次に、卵母細胞を受精させ、胚発育によって卵母細胞発育能力を評価した。
【図２５Ａ】ＩＶＭ時にＧＤＦ９のアンタゴニストであるＳＢ−４３１５４２の存在下又は非存在下で無傷ＣＯＣをＧＤＦ９で処理することによる、後の分裂（Ａ）及び発育能力（Ｂ）への影響について示す。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、２日目に分裂率について評価し、８日目に形成胚盤胞について評価した。２９３Ｈは非形質移入２９３Ｈ細胞由来の対照ならし培地である。各バーは比率（平均±ＳＥＭ）を示し、グラフ内のラベル（ａ〜ｄ）が異なるバー又はグループ化されたバーには有意差がある（ｐ＜０．０５）。分裂率はＳＢ−４３１５４２には影響を受けなかったが、２９３Ｈには影響を受けた。
【図２５Ｂ】ＩＶＭ時にＧＤＦ９のアンタゴニストであるＳＢ−４３１５４２の存在下又は非存在下で無傷ＣＯＣをＧＤＦ９で処理することによる、後の分裂（Ａ）及び発育能力（Ｂ）への影響について示す。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、２日目に分裂率について評価し、８日目に形成胚盤胞について評価した。２９３Ｈは非形質移入２９３Ｈ細胞由来の対照ならし培地である。各バーは比率（平均±ＳＥＭ）を示し、グラフ内のラベル（ａ〜ｄ）が異なるバー又はグループ化されたバーには有意差がある（ｐ＜０．０５）。分裂率はＳＢ−４３１５４２には影響を受けなかったが、２９３Ｈには影響を受けた。
【図２６Ａ】ＩＶＭ時にフォリスタチンの存在下又は非存在下で無傷ＣＯＣをＢＭＰ１５で処理することによる、後の分裂（Ａ）及び発育能力（Ｂ）への影響について示す。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、２日目に分裂率について評価し、８日目に形成胚盤胞について評価した。２９３Ｈは非形質移入２９３Ｈ細胞由来の対照ならし培地である。各バーは比率（平均±ＳＥＭ）を示し、グラフ内のラベル（ａ〜ｄ）が異なるバー又はグループ化されたバーには有意差がある（ｐ＜０．０５）。分裂率はフォリスタチン及び２９３Ｈによって悪影響を受けた。
【図２６Ｂ】ＩＶＭ時にフォリスタチンの存在下又は非存在下で無傷ＣＯＣをＢＭＰ１５で処理することによる、後の分裂（Ａ）及び発育能力（Ｂ）への影響について示す。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、２日目に分裂率について評価し、８日目に形成胚盤胞について評価した。２９３Ｈは非形質移入２９３Ｈ細胞由来の対照ならし培地である。各バーは比率（平均±ＳＥＭ）を示し、グラフ内のラベル（ａ〜ｄ）が異なるバー又はグループ化されたバーには有意差がある（ｐ＜０．０５）。分裂率はフォリスタチン及び２９３Ｈによって悪影響を受けた。
【図２７】本研究から得られる仮説モデルの概略図を示す。卵成熟時にＣＯＣを卵母細胞分泌因子（ＯＳＦ）に曝露すると、該因子がネイティブな形態、即ち、卵母細胞によって分泌される特徴付けされていない成長因子混合物であっても、外因性組換えＢＭＰ１５やＧＤＦ９であっても、後の卵母細胞発育能力は実質的に改善する（約４０％〜約６０％）。ＯＳＦは多くの卵丘細胞機能を制御することが知られており、このモデルでは、卵母細胞に戻り（太い矢印）、後の発育を改善する正の制御因子がＯＳＦに含まれ得ることが提案される。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明は、卵母細胞分泌因子の卵丘細胞アポトーシスに対する作用に関する研究から生じている。特に、卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）内の卵母細胞の存在が、低い卵丘細胞アポトーシスレベルの原因であり、卵丘卵母細胞複合体（卵母細胞切除複合体；ＯＯＸ）から卵母細胞を取り除くとアポトーシスが大きく増加することが見い出された。更に、卵母細胞分泌因子であるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６は、卵母細胞切除複合体における卵丘細胞のアポトーシスを阻害できる。
【００５４】
これらの知見は、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６が卵丘細胞のアポトーシスの制御において重要な役割を果たしていること、また、これら因子或いはこれら因子の制御下にあるシグナル伝達経路は、顆粒膜細胞のアポトーシスをインビトロ或いはインビボで制御することにより卵成熟や卵胞発育、排卵率、卵巣周期又は月経周期の各周期において成熟する卵胞数、受胎能を制御するために使用できることを示している。
【００５５】
本明細書で用いる各種用語は、当業者には十分理解できる意味を有するものである。しかし、参照し易いように、これらの用語の一部については次のように定義する。
【００５６】
本明細書で用いる用語「核酸」とは、如何なるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドをも意味するものと理解されたい。核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、一本鎖又は二本鎖であってもよい。核酸は、ゲノム起源の核酸やｃＤＮＡ起源（即ち、ｍＲＮＡ由来）の核酸、ウイルス由来の核酸、合成起源の核酸等、如何なる種類の核酸であってもよい。
【００５７】
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸を意味するものと理解されたい。同様に、用語「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列又は蛋白質配列、及びそのフラグメント又は一部を意味し、また、天然ポリペプチド、組換えポリペプチド、変異ポリペプチド又は合成ポリペプチドをも意味する。
【００５８】
本明細書で用いる用語「調節」とは、プロセスの如何なる阻害や増強をも意味し、また、特定の存在物（particular entity）の活性や機能、特性の如何なる阻害や増強をも意味するものと理解されたい。
【００５９】
これに関しては、本発明の様々な形態での顆粒膜細胞アポトーシスの調節は、細胞内でのアポトーシスの開始や進行の如何なる制御や変化の形態をも採る。例えば、アポトーシスの調節には、（ｉ）細胞がアポトーシスに入る能力の抑制又は促進、（ｉｉ）アポトーシス開始後の細胞内でのアポトーシスの進行の抑制又は促進、及び／又は（ｉｉｉ）特定の細胞がアポトーシスを開始又は進行する可能性の抑制又は促進を含み得る。
【００６０】
本明細書で用いる用語「卵胞発育」及びその派生語は、原始卵胞から排卵前卵胞のステージを経て黄体に至る卵巣卵胞の発達を意味するものと理解されたい。これに関しては、卵胞が雌性被験体個体（entire female subject）に存在し得るか、或いは、雌性被験体から単離した卵胞等、インビトロで存在し得ることは理解されるであろう。
【００６１】
本明細書で用いる用語「卵成熟」及びその派生語は、卵母細胞が減数分裂的に未成熟な（meiotically immature）状態（即ち、受精不能な状態）から減数分裂で成熟した卵母細胞（即ち、受精が可能で、生存可能な胚を産生することが可能な卵母細胞）に発達するプロセスを意味するものと理解されたい。また、この用語は、卵母細胞が受精後の胚発育を支持できるように卵母細胞質が成熟することも包含することは理解されるであろう。これに関しては、卵母細胞が雌性被験体個体に存在し得るか、或いは、雌性被験体から単離した卵母細胞等、インビトロで存在し得ることは理解されるであろう。
【００６２】
ある種の細胞が他種の細胞に関連することに関して本明細書で用いる用語「関連する」及びその派生語は、ある細胞が他種の細胞と直接接触している場合や、ある細胞が他種の細胞の存在下にあり、この他種細胞から分泌される因子に作用される場合を意味するものと理解されたい。例えば、卵母細胞が顆粒膜細胞に関連する場合には、卵母細胞が卵丘卵母細胞複合体の一部であることや、裸化卵母細胞が顆粒膜細胞、卵丘卵母細胞複合体又は卵母細胞切除複合体と同一培地内に存在すること等が包含されることは理解されるであろう。
【００６３】
ポリペプチド又は蛋白質に関して本明細書で用いる用語「バリアント」とは、１以上のアミノ酸で改変されたアミノ酸配列を意味するものと理解されたい。バリアントは、置換されたアミノ酸が元のアミノ酸と同様の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を有してもよい。また、バリアントは、「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）を有してもよく、１以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入を有してもよい。
【００６４】
また、バリアントは、全長蛋白質の生物活性フラグメント、即ち、全長ポリペプチドや全長蛋白質と同様の構造的、調節的又は生化学的機能を有するポリペプチドや蛋白質であってもよい。例えば、生物活性フラグメントは、蛋白質のアミノ末端又はカルボキシ末端の欠失や蛋白質の内部欠失であってもよく、また、このような欠失の如何なる組合せであってもよい。また、生物活性フラグメントは、１以上の他のアミノ酸と融合したこのような欠失のいずれをも包含する。
【００６５】
本明細書で用いる用語「抗体」とは、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体、及び、エピトープ決定基と結合可能な抗体分子のフラグメント（例えば、ＦａｂやＦ（ａｂ'）2、Ｆｖ）を意味するものと理解されたい。
【００６６】
特定の細胞に関して本明細書で用いる用語「単離した」とは、該細胞が同定され、その天然環境の１以上の成分から分離及び／又は回収されたことを意味するものと理解されたい。例えば、単離した卵母細胞は、１以上の卵丘細胞と関連していても卵丘卵母細胞複合体の一部として存在していてもよく、また、裸化卵母細胞であってもよい。
【００６７】
本明細書で用いる用語「雌性被験体」とは、ヒト女性や雌性哺乳動物、例えば、霊長類や家畜動物（例えば、ウマやウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、愛玩動物（例えば、イヌやネコ）、実験用試験動物（例えば、マウスやラット、モルモット）等を意味し、また、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の制御下で顆粒膜細胞のアポトーシスが起こる他の如何なる雌性動物をも意味するものと理解されたい。
【００６８】
本明細書で用いる用語「補助生殖」とは、単離した卵母細胞及び／又は単離した精子を用いるヒトや動物における如何なる受精技法をも意味し、例えば、インビトロで培養した卵母細胞や胚を用いた技法（例えば、卵母細胞のインビトロ成熟）やインビトロ受精（ＩＶＦ；卵母細胞の吸引、実験室内での受精、及びレシピエントへの胚の移植）、配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ；卵管内への卵母細胞と精子の挿入）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ；卵管内への受精した卵母細胞の挿入）、卵管内胚移植（ＴＥＴ；卵管内への分割胚の挿入）、腹膜内への卵母細胞及び精子の移植（ＰＯＳＴ；骨盤腔内への卵母細胞と精子の挿入）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）、精巣内精子採取（ＴＥＳＥ）、顕微鏡下精巣上体精子吸引術（ＭＥＳＡ）を意味するものと理解されたい。
【００６９】
上述のように、一形態においては、本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００７０】
本発明の本形態においては、顆粒膜細胞のアポトーシスは、（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する、及び／又は（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する、及び／又は（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより阻害或いは促進できる。
【００７１】
例えば、本発明の本形態の方法は、高濃度のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６に顆粒膜細胞を曝露することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害するために使用できる。これに替えて、顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を低下させることにより顆粒膜細胞のアポトーシスを促進できる。
【００７２】
この点に関して、ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６は両者とも、増殖因子及び分化因子の大きなファミリーを含むトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。これら蛋白質はプレプロペプチドとして合成され、切断後、処理されて二量体蛋白質になる。ＢＭＰ−１５はＡＬＫ−６及びＢＭＰＲ−ＩＩ受容体に結合し、ＢＭＰ−６はＡｃｔＲＩＩ及びＢＭＰＲ−ＩＩ受容体に結合する。
【００７３】
ＢＭＰ−１５は、ＧＤＦ−９とホモダイマーもヘテロダイマーも形成できる。
【００７４】
本発明は更に、本方法により産生される、アポトーシス或いはアポトーシスのポテンシャルが変化した顆粒膜細胞を提供するものである。顆粒膜細胞は例えば、単離した顆粒膜細胞、インビボで存在する顆粒膜細胞、インビボ或いはインビトロの卵胞内に存在する顆粒膜細胞、インビボ或いはインビトロの卵丘卵母細胞複合体の一部としての顆粒膜細胞、卵母細胞切除複合体の一部としての顆粒膜細胞とすることができる。
【００７５】
本発明は更に、顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療するのにも適している。
【００７６】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００７７】
例えば、本発明は雌性被験体の顆粒膜細胞腫瘍や多嚢胞性卵巣症候群を予防及び／又は治療するために使用できる。
【００７８】
本発明は更に、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵母細胞の成熟を調節するために適している。
【００７９】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００８０】
本発明は更に、本方法により産生される、成熟が変化した卵母細胞を提供するものである。卵母細胞は例えば、単離した卵母細胞、インビボで存在する卵母細胞、インビボ或いはインビトロの卵丘卵母細胞複合体の一部としての卵母細胞、インビボ或いはインビトロの卵胞の一部としての卵母細胞とすることができる。本発明は更に、この卵母細胞から作製される胚やヒト以外の動物も包含している。
【００８１】
この場合、本方法はインビトロにおいて卵母細胞の成熟を調節するのに特に適しているということが理解されるであろう。
【００８２】
本発明は更に、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵母細胞の発育能力を調節するのに適している。
【００８３】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００８４】
本発明は更に、本方法により産生される、発育能力が変化した卵母細胞を提供するものである。卵母細胞は例えば、インビボ或いはインビトロの卵丘卵母細胞複合体の一部としての卵母細胞や、卵胞内に存在する卵母細胞とすることができる。本発明は更に、この卵母細胞から作製される胚やヒト以外の動物も包含している。
【００８５】
この場合、本方法はインビトロにおいて卵母細胞の発育能力を調節するのに特に適しているということが理解されるであろう。
【００８６】
本発明は更に、卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵胞の成熟を調節するのに適している。
【００８７】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞の成熟を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００８８】
本発明は更に、本方法により産生される、成熟が変化した卵胞を提供するものである。卵胞は例えば、単離した卵胞、インビボで存在する卵胞とすることができる。本発明は更に、この卵胞から単離される卵母細胞、及びこの卵母細胞から作製される胚やヒト以外の動物も包含している。
【００８９】
この場合、本方法はインビトロにおいて卵胞の成熟を調節するのに特に適しているということが理解されるであろう。
【００９０】
本発明は更に、顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵胞の閉鎖を調節するのに適している。
【００９１】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞の閉鎖を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００９２】
本発明は更に、本方法により産生される、閉鎖が変化した卵胞を提供するものである。卵胞は例えば、単離した卵胞、インビボで存在する卵胞とすることができる。本発明は更に、この卵胞から単離される卵母細胞、及びこの卵母細胞から作製される胚やヒト以外の動物も包含している。
【００９３】
好ましい一形態においては、本発明は、雌性被験体の卵胞閉鎖の調節も提供するものである。
【００９４】
本発明は更に、卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵胞の発育を調節するのに適している。
【００９５】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞の発育を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内での顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００９６】
本発明は更に、本方法により産生される、発育或いは発育の可能性が変化した卵胞を提供するものである。卵胞は例えば、単離した卵胞、インビボで存在する卵胞とすることができる。本発明は更に、この卵胞から単離される卵母細胞、及びこの卵母細胞から作製される胚やヒト以外の動物も包含している。
【００９７】
本発明は更に、雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより被験体の排卵率を調節するのに適している。
【００９８】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の排卵率を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【００９９】
本技術分野においては、雌性被験体の排卵率を決定するための各種方法が知られている。
【０１００】
本発明は更に、雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより被験体の受胎能を調節するのに適している。
【０１０１】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の受胎能を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【０１０２】
本発明は受胎能を促進するために使用できる他、避妊方法としても使用できるということが理解されるであろう。
【０１０３】
本発明の各種形態における顆粒膜細胞は、インビトロ或いはインビボで存在する任意の顆粒膜細胞とすることができる。例えば、顆粒膜細胞は、細胞培養における単離顆粒膜細胞、細胞培養における一以上の他の細胞種に関連する顆粒膜細胞、卵丘卵母細胞複合体の一部である顆粒膜細胞、卵母細胞切除複合体の一部である顆粒膜細胞、インビトロの卵胞内に存在する顆粒膜細胞、或いは雌性哺乳類の卵胞の一部を形成するインビボで存在する顆粒膜細胞とすることができる。
【０１０４】
インビトロの顆粒膜細胞の場合、好ましくは、顆粒膜細胞は卵母細胞に関連したものである。より好ましくは、顆粒膜細胞は卵丘細胞である。更に好ましくは、顆粒膜細胞は、卵丘卵母細胞複合体内に存在する卵丘細胞である。
【０１０５】
本発明の各種形態における顆粒膜細胞は、前顆粒膜細胞、前胞状（preantral）顆粒膜細胞、壁側顆粒膜細胞、卵丘顆粒膜細胞、顆粒膜−ルテイン細胞、密な或いは膨張した（compact or expanded）卵丘顆粒膜細胞とすることもできる。
【０１０６】
インビボの顆粒膜細胞の場合、顆粒膜細胞は、例えば、雌性被験体の卵胞の一部を形成することもできる。
【０１０７】
本発明の各種形態におけるアポトーシスの調節は、顆粒膜細胞に関連するインビトロ或いはインビボの卵母細胞の受精前、受精中或いは受精後の任意の時点で行うことができるということが理解されるであろう。
【０１０８】
好ましくは、アポトーシスの調節は受精前に起こる。
【０１０９】
好ましくは、顆粒膜細胞は、雌性哺乳類から得た顆粒膜細胞、或いは雌性哺乳類内に存在する卵胞の一部を形成する顆粒膜細胞であり、例としては、ヒト顆粒膜細胞、非ヒト霊長目顆粒膜細胞、ヒツジ顆粒膜細胞、ウシ顆粒膜細胞、ブタ顆粒膜細胞、ウマ顆粒膜細胞、ヤギ顆粒膜細胞、ネコ顆粒膜細胞、げっ歯目顆粒膜細胞、イヌ顆粒膜細胞、マウス顆粒膜細胞が挙げられる。好ましくは、顆粒膜細胞は、ヒト顆粒膜細胞、ウシ顆粒膜細胞、ヒツジ顆粒膜細胞或いはウマ顆粒膜細胞である。
【０１１０】
インビトロで存在する顆粒膜細胞の場合、顆粒膜細胞は、本技術分野において知られている適切な方法によって、任意の卵胞形成段階の適切なドナーから或いは過排卵状態の適切なドナーから得ることができる。インビトロ用途のための顆粒膜細胞を得るための適切な方法は、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ  ＲＢら（２００１）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４０：２８９−２９８（マウス細胞用）、及びＧｉｌｃｈｒｉｓｔ  ＲＢら（２００３）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１：８７−９５（反芻動物細胞用）に記載されているような方法である。例えば、顆粒膜細胞は、ホルモン刺激された或いは無刺激の未熟な又は成熟した卵巣から単離でき、胞状卵胞や酵素消化した卵巣を穿刺或いは吸引した後、組織片除去及び遠心分離により顆粒膜細胞を精製／濃縮して回収できる。
【０１１１】
本発明の各種形態における顆粒膜細胞アポトーシスの程度は、本技術分野において知られた適切な方法により決定できる。例としては次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）が挙げられる。（ｉ）各種ＤＮＡ断片化アッセイ、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ仲介ｄＵＴＰニック末端標識法（ＴＵＮＥＬ）であるが、この方法は、アポトーシス中に発育するヌクレオソーム間の切断において露出したＤＮＡの３’−ＯＨ末端を検出するためのｉｎ  ｓｉｔｕ法であり、基本的にはＨｅｎｓｅｙ  Ｃ．及びＧａｕｔｉｅｒ  Ｊ．（１９９８）．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２０３．３６−４８；Ｖｅｅｎｓｔｒａ，ＧＪ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ−Ｍａｄｕｒｏ  Ｊ，Ｍａｔｈｕ  ＭＴ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ＰＣ，Ｄｅｓｔｒｅｅ  ＯＨＪ．（１９９８）．Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ  ５：７７４−８４に記載のように実施できる。（ｉｉ）アポトーシスに伴う形態学的変化の検出、基本的にはＣｏｍｐｔｏｎ  ＭＭ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ  １１：１０５−１１９，１９９２；Ｗｙｌｌｉｅ  ＡＨ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔ  Ｒｅｖ  １１：９５−１０３；Ｏｌｔｖａｉ  ＺＮ，Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ  ＳＪ  （１９９４）Ｃｅｌｌ  ７９：１８９−１９２、１９９４に記載のように実施される。（ｉｉｉ）アポトーシスを検出するためのフローサイトメトリー解析の使用、基本的には、Ｏｒｍｅｒｏｄ  ＭＧ、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＭＫＬ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−  Ｔａｒｄｕｃｈｙ  Ｇ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｄ（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  １５３：５７−６６；Ｊａｃｏｂｓ  ＤＰ、Ｐｉｐｈｏ  Ｃ（１９８３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ６２：１０１−１１０に記載のように実施される。
【０１１２】
インビボで存在する顆粒膜細胞の場合、顆粒膜細胞のアポトーシスの程度は、本技術分野において知られた適切な方法により決定できる。例えば、ウェスタン解析によって、プロアポトーシス蛋白質（Ｂａｘ等）や抗アポトーシス蛋白質（Ｂｃｌ−２等）の発現を測定できる。
【０１１３】
前述のように、本発明は雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療するために使用することもできる。例えば、本発明は、腫瘍形成性細胞におけるアポトーシスレベルを増加させることにより顆粒膜細胞腫瘍の予防及び／又は治療するために使用できる。これに替えて、本発明は、多嚢胞性卵巣症候群を予防及び／又は治療するために使用できる。
【０１１４】
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、及び／又は顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の被験体への投与は、疾病又は症状の発症前、発症中及び発症後のいずれか一時期において行うことができるということが理解されるであろう。
【０１１５】
更に、化学療法等の幾つかの治療は、卵胞閉鎖のレベルの上昇をもたらす。従って、本発明は、治療対象の被験体の顆粒膜細胞アポトーシスのレベルを低減することによりこのような症状を改善するために使用できる。この場合、被験体の顆粒膜細胞アポトーシスのレベルの低減は、閉鎖を低減するための治療前、治療中、及び治療後のいずれか一時期において使用できる。
【０１１６】
顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の調節は複数の各種方法を用いて達成できる。例えば、これら蛋白質の一方或いは両方の濃度を上昇させる場合、顆粒膜細胞を前記蛋白質に曝露する、即ち、接触させればよい。
【０１１７】
この点に関して、ＢＭＰ−１５という語で表される範囲には、目的顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するために適した種から得たＢＭＰ−１５（アポトーシスを調節する対象の顆粒膜細胞と同一種から得たＢＭＰ−１５の使用を含む）、ＢＭＰ−１５のバリアント（野生型ＢＭＰ−１５の一以上のアミノ酸を置換したＢＭＰ−１５等）、ＢＭＰ−１５の生物学的活性断片が含まれることが理解されるであろう。ＢＭＰ−１５は、単離蛋白質、組換え蛋白質、精製物又は半精製物、或いは蛋白質複合混合物を構成する一部（卵母細胞からのならし培地中に存在するもの等）とすることができる。
【０１１８】
同様に、ＢＭＰ−６という語で表される範囲には、目的顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するために適した種から得たＢＭＰ−６（アポトーシスを調節する対象の顆粒膜細胞と同一種から得たＢＭＰ−６の使用を含む）、ＢＭＰ−６のバリアント（野生型ＢＭＰ−６の一以上のアミノ酸を置換したＢＭＰ−６等）、ＢＭＰ−６の生物学的活性断片が含まれることが理解されるであろう。ＢＭＰ−６は、単離蛋白質、組換え蛋白質、精製物又は半精製物、或いは蛋白質複合混合物を構成する一部（卵母細胞からのならし培地中に存在するもの等）とすることができる。
【０１１９】
上述のように、これら蛋白質は、精製又は半精製蛋白質として、或いは卵母細胞ならし培地及び／又は卵母細胞分泌因子の形態で運ばれうる（delivered）。本技術分野においては、これら蛋白質を製造するための各種方法が知られている。例えば、これら蛋白質は、卵母細胞から分泌されたＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有するならし培地に顆粒膜細胞を曝露することにより、一以上の他の成分を含有する抽出物の形態で運ばれ得る。
【０１２０】
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を低下させる場合、活性の低下は、例えば、これら蛋白質の濃度を低下させた培地に顆粒膜細胞を曝露することにより、或いはこれら蛋白質のいずれかの中和抗体を用いて達成できる。これら蛋白質の濃度或いは活性を低下させる他の方法としては、ＡＬＫ６及び／又はＢＰＭＰＲＩＩ受容体のエクトドメイン（ectodomain）の使用が挙げられる。フォリスタチンは、ＢＭＰ−１５分子と不活性複合体を形成することによりＢＭＰ−１５の濃度を低下させるために使用できる。
【０１２１】
卵母細胞におけるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の発現を調節することにより卵母細胞が分泌したこれら蛋白質のレベルを調節するために、各種アンチセンス核酸技術やｓｉＲＮＡ技術も使用できる。従って、本発明は、一形態においては、卵胞におけるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現を低下させることにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの程度を増加させるために、卵母細胞にアンチセンス核酸或いはｓｉＲＮＡを添加することを包含している。アンチセンス核酸やｓｉＲＮＡの設計や投与するための各種方法は本技術分野において知られている。
【０１２２】
顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節するために、卵丘卵母細胞複合体におけるアポトーシスの制御に関与する卵母細胞分泌因子のグラジエント（gradient）を促進或いは妨害する剤も使用できることが理解されるであろう。
【０１２３】
顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを更に調節するために他の因子を使用できることも理解されるであろう。例えば、アポトーシスの発生を低減するために細胞のＦＳＨへの曝露を利用できる。
【０１２４】
好ましくは、ＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の調節は、ＡＬＫ６及び／又はＢＭＰＲＩＩ受容体シグナル伝達経路の調節である。
【０１２５】
この点に関して、ＡＬＫ６及び／又はＢＭＰＲＩＩシグナル伝達経路の調節により、細胞内のＳＭＡＤ１／５／８経路の調節がもたらされる。
【０１２６】
顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するためにＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマーの活性及び／又は濃度の調節も利用できる。このように、本発明の各種形態は、顆粒膜細胞が曝露されるＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマーの濃度の調節、及び／又は顆粒膜細胞内のＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマー依存性シグナル伝達経路の活性の調節も含まれる。
【０１２７】
例えば、一形態においては、本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマーの濃度を調節する段階、及び
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマー依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【０１２８】
本発明は、凍結融解に起因する損傷により誘起されるアポトーシスを低減するのに適していることも理解される。
【０１２９】
従って、別の一形態においては、本発明は、凍結融解に起因する顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【０１３０】
活性ＢＭＰ−１６及び／又は活性ＢＭＰ−６の濃度の調節、或いはＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の調節は、凍結前及び／又は凍結後に行うことができる。
【０１３１】
個々の卵丘卵母細胞複合体や全卵胞（whole follicles）、卵巣組織、全卵巣（whole ovaries）は、冷凍すると凍結／凍結融解のため通常死ぬ。従って、本発明は、凍結融解に起因するこれら細胞／組織の損傷を低減するのにも適している。
【０１３２】
従って、別の一形態においては、本発明は、凍結融解に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減する方法であって、該方法は、卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣を
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
（ｉｉｉ）細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣における顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上に曝露することを含む方法を提供するものである。
【０１３３】
活性ＢＭＰ−１６及び／又は活性ＢＭＰ−６の濃度の調節、或いはＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の調節は、凍結前及び／又は凍結融解後に行うことができる。
【０１３４】
好ましくは、本発明の各種形態におけるＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤は、これら経路の活性を促進して顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する。
【０１３５】
本発明の各種形態における顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性の調節は適切な方法によって達成できる。例えば、ＢＭＰＲＩＩ受容体の活性は、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−２の内の一以上に顆粒膜細胞を曝露することにより調節できる。
【０１３６】
顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の調節も適切な方法によって行うことができる。
【０１３７】
好ましくは、アポトーシスの調節は、有効量のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する組成物に顆粒膜細胞を曝露することにより、或いは顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６シグナル伝達経路を阻害或いは促進する剤を含有する組成物に顆粒膜細胞を曝露することにより行う。
【０１３８】
従って、好ましい一形態においては、本発明は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤の有効量、の内の一以上を含有する組成物も提供するものである。
【０１３９】
顆粒膜細胞はインビトロ又はインビボで存在するものとすることができる。例えば、顆粒膜細胞は、インビトロの卵丘卵母細胞複合体の一部として存在するものか、或いは雌性被験体の卵胞の一部としての顆粒膜細胞とすることができる。
【０１４０】
特に好ましい一形態においては、組成物は、インビトロにおいて卵胞及び／又は卵丘卵母細胞複合体の顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する培養培地である。
【０１４１】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵胞を培養するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【０１４２】
この場合の有効量とは、顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する量である。
【０１４３】
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、及び／又はＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤、及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤は、胚及び／又は卵母細胞のための培養培地サプリメントとしても使用できるということが理解されるであろう。
【０１４４】
従って、別の一形態においては、本発明は、次の各成分、
卵母細胞及び／又は胚の培養培地、
ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はこれらのバリアント若しくはアナログ、及び／又は
顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤、及び／又は
顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する剤を含有し、
各成分は、培養培地に添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
【０１４５】
本組合せ製品は、本明細書に記載した各用途のいずれにも使用できる。
【０１４６】
本発明の各種組合せ製品における培養培地やその他の各種成分は、マルチユース形態或いはユニット形態でアンプル、ボトル、バイアル等の（好ましくは殺菌された）適切な容器に別々に包装できる。容器は充填後に気密密閉できる。これら蛋白質成分は、単離された形態、或いは精製又は半精製された形態とすることができ、これら蛋白質の安定性及び／又は使用のための追加的添加物を含有できる。各種成分を包装するための各種方法は本技術分野において知られている。
【０１４７】
前記組成物は、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵母細胞の成熟を調節するためにも使用できる。
【０１４８】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の成熟を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１４９】
前述のように、前記組成物は、卵母細胞をインビトロで成熟するための培地の調製に特に適している。
【０１５０】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【０１５１】
この場合の有効量とは、顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する量である。
【０１５２】
前記組成物は、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵母細胞の発育能力を調節するためにも使用できる。
【０１５３】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１５４】
前記組成物は、インビトロにおいて卵母細胞の発育能力を改善するための培地の調製に特に適している。
【０１５５】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を改善するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【０１５６】
この場合の有効量とは、顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する量である。
【０１５７】
これに替えて、前記組成物は、雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療するために雌性被験体に投与できる。このような疾病や症状の例としては、顆粒膜細胞腫瘍や多嚢胞性卵巣症候群が挙げられる。
【０１５８】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の卵成熟及び／又は卵胞成熟に関連する疾病又は症状を予防及び／又は治療するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１５９】
前記組成物は、化学療法等の治療に起因する被験体への損傷を予防及び／又は治療するために被験体に投与することもできる。
【０１６０】
前記組成物は卵胞を培養するためにも使用できる。
【０１６１】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞を培養するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１６２】
前記組成物は、インビトロで卵胞を培養するための培地の調製に特に適している。
【０１６３】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞培養培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【０１６４】
この場合の有効量とは、顆粒膜細胞のアポトーシスを低減する量である。
【０１６５】
前記組成物は、卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵胞閉鎖を調節するためにも使用できる。
【０１６６】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞の閉鎖を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１６７】
この組成物は、インビトロ或いはインビボの卵胞に対して使用できる。インビトロの卵胞の場合、この組成物は、閉鎖を調節するための培地の形態とすることができる。
【０１６８】
この組成物は、卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより卵胞の発育を調節するためにも使用できる。
【０１６９】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞の発育を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより卵胞内の顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１７０】
この組成物は、インビトロ或いはインビボの卵胞に対して使用できる。インビトロの卵胞の場合、この組成物は、卵胞発育を調節するための培地の形態とすることができる。
【０１７１】
この組成物は、雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより雌性被験体の排卵率を調節するためにも使用できる。
【０１７２】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の排卵率を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１７３】
この組成物は、雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより雌性被験体の卵巣周期又は月経周期の各周期において成熟する卵胞の数を調節するためにも使用できる。
【０１７４】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の卵巣周期又は月経周期の各周期において成熟する卵胞の数を調節するための組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物も提供するものである。
【０１７５】
この組成物は、雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスレベルを調節することにより雌性被験体の受胎能を調節するためにも使用できる。
【０１７６】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の受胎能を調節するために使用される組成物であって、該組成物は、
（ｉ）被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の或る特定量、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより被験体における顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を有する剤の或る特定量、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０１７７】
本発明の各組成物は、受胎能を促進するために使用できる他、避妊薬としても使用できる。
【０１７８】
例えば、剤がアポトーシスを低減させる場合、組成物は、雌性被験体に投与すると雌性被験体の受胎能を上昇させるために使用できる。
【０１７９】
従って、別の一形態においては、本発明は、雌性被験体の受胎能を促進するための組成物であって、該組成物は、雌性被験体の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させることにより被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスを低減させる作用を有する剤の或る特定量、及び／又は顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させることにより雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスを低減させる作用を有する剤の或る特定量を含有する組成物を提供するものである。
【０１８０】
例えば、この剤はＢＭＰ−１５或いはＢＭＰ−６とすることができる。
【０１８１】
剤がアポトーシスを促進する場合、組成物は、雌性被験体に投与すると避妊薬組成物として使用できる。
【０１８２】
従って、別の一形態においては、本発明は、避妊薬組成物であって、該組成物は、雌性被験体の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を低下させることにより被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスを増加させる作用を有する剤の或る特定量、及び／又は顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を低下させることにより雌性被験体の顆粒膜細胞のアポトーシスを増加させる作用を有する剤の或る特定量を含有する組成物を提供するものである。
【０１８３】
例えば、剤は、ＢＭＰ−１５或いはＢＭＰ−６を標的とする適切なアンタゴニスト抗体、或いは溶解可能な形態のＢＭＰＲＩＩ受容体とすることができる。
【０１８４】
本発明の各種形態における剤がＢＭＰＲ−ＩＩ及び／又はＡＬＫ６受容体の活性を阻害する場合、剤は、受容体に結合する一種以上の卵母細胞分泌因子の濃度低減することにより受容体の活性を妨害してもよいし、受容体と結合しアンタゴニストとして作用することにより受容体の活性を妨害してもよいし、受容体の構造にコンフォメーション変化を惹き起こすことにより受容体の活性を妨害してもよいし、ＢＭＰＲ−ＩＩ受容体とＡＬＫ６受容体の間のヘテロダイマー形成を妨害してもよいし、受容体からの信号伝達に関与する一種以上の細胞内蛋白質のリン酸化を妨害してもよいし、受容体のシグナル伝達活性を妨害するように細胞内の一種以上の因子の濃度（受容体の発現を含む）を調節してもよい。
【０１８５】
剤が受容体の活性を阻害する場合、好ましくは、剤は、受容体が結合する一種以上の卵母細胞分泌因子の濃度を低下させることにより、或いは顆粒膜細胞におけるＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ５及び／又はＳｍａｄ８のリン酸化を低減させることにより活性を阻害する。
【０１８６】
剤が受容体の活性を促進する場合、剤は、受容体が結合する一種以上の卵母細胞分泌因子の結合を活性化、即ち促進してもよいし、受容体のアゴニストとして作用してもよいし、受容体の構造にコンフォメーション変化を惹き起こすことにより受容体の活性を促進してもよいし、ＢＭＰＲ−ＩＩ受容体とＡＬＫ６受容体の間のヘテロダイマー形成を促進してもよいし、受容体からの信号伝達に関与する一種以上の細胞内蛋白質のリン酸化を促進してもよいし、受容体のシグナル伝達活性を促進するように細胞内の一種以上の因子の濃度（受容体の発現を含む）を調節してもよい。
【０１８７】
ＢＭＰＲＩＩ及び／又はＡＬＫ６受容体の活性を調節できる剤の種類の例としては、蛋白質、抗体、アプタマー、アンチセンス核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ポリペプチド、ペプチド、小分子、薬物、多糖、糖蛋白質、脂質等が挙げられる。
【０１８８】
例えば、剤がＢＭＰＲ−ＩＩの活性を阻害する場合は、本発明の各種形態における剤は、（ｉ）膜結合受容体に結合することによりＢＭＰＲ−ＩＩ受容体と結合可能なものの濃度が低下してしまう一種以上の卵母細胞分泌因子に競合的に結合できる、溶解可能な形態のＢＭＰＲ−ＩＩ受容体、（ｉｉ）顆粒膜細胞の表面に発現するＢＭＰＲ−ＩＩの濃度を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰＲ−ＩＩ／タイプ−ＩヘテロダイマーによってＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ５及び／又はＳｍａｄ８のリン酸化を妨害する剤、或いは（ｖ）ＢＭＰＲ−ＩＩ受容体に競合的に結合して一以上の卵母細胞分泌成長因子の結合を低減させることができる抗体であって、ＢＭＰＲ−ＩＩの細胞外ドメインに対して樹立された抗体、とすることができる。
【０１８９】
剤がＢＭＰＲ−ＩＩ受容体及びＡＬＫ６受容体の一方或いは両方の活性を阻害する場合、好ましくは、剤はＢＭＰ−１５依存性刺激（ＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ヘテロダイマーによる刺激を含む）を阻害することにより、或いはＢＭＰ−６依存性刺激を阻害することにより前記活性を阻害する。
【０１９０】
特定の剤が顆粒膜細胞におけるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６のシグナル伝達を調節することの決定は、本技術分野において知られている適切な方法により行うことができる。
【０１９１】
好ましくは、剤は、顆粒膜細胞におけるＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ５及び／又はＳｍａｄ８のリン酸化を調節することによりＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する。
【０１９２】
特定の剤のＳｍａｄ１及び／又はＳｍａｄ５及び／又はＳｍａｄ８のリン酸化を調節する能力の決定は、本技術分野において知られている適切な方法により行うことができる。
【０１９３】
ＢＭＰＲ−ＩＩ或いはＡＬＫ６の活性を阻害する剤がＢＭＰＲ−ＩＩに対するアンチセンス核酸である場合、剤は、これら受容体のいずれかのヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的な核酸とすることができる。
【０１９４】
アンチセンス核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、又はこれらの修飾体若しくは誘導体から構成できる。アンチセンス核酸はオリゴヌクレオチド或いはポリヌクレオチドとすることができる。本発明の好ましい一形態においては、剤はＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１９５】
アンチセンス核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、或いはリン酸骨格において修飾されていてもよいし、アンチセンス核酸の機能を促進するための他のペンダントグループ（appending groups）を含んでいてもよい。
【０１９６】
オリゴヌクレオチドは構造上の任意の位置において修飾でき、その構成要素は本技術分野で一般に知られている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシルヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンから構成される群から選択される少なくとも一個の修飾塩基部分を含むことができる。
【０１９７】
また、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース及びヘキソースからなる群から選択される少なくとも一個の修飾糖部分を含むことができるが、修飾糖部分の例はこれらに限定されるものではない。更に、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、ホルムアセタール、或いはこれらの任意のアナログ等の少なくとも一個の修飾されたリン酸骨格を含むことができる。
【０１９８】
本発明の各種形態にかかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本技術分野において知られている標準的な方法によって合成できる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９に記載の方法によって合成できる。
【０１９９】
また、本発明の各種形態に係るアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写により細胞内で産生できる。例えば、ベクターを顆粒膜細胞に導入でき、その後、アンチセンスＲＮＡ核酸を転写により産生できる。この場合のベクターは、アンチセンス核酸をコードする配列と、本技術分野において知られている構成性或いは誘導性のプロモーターであってアンチセンス核酸を顆粒膜細胞内で発現させるための適切な構成性或いは誘導性のプロモーターとを含むであろうことは理解されるであろう。
【０２００】
このようなベクターは、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するために転写できるものであれば、エピソームのままとする或いは染色体に組込むことができる。本技術分野における標準的な組換えＤＮＡ技術方法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、ニューヨーク（１９８９）に全体が記載されている方法によって各種ベクターを構成できる。ベクターは、真核細胞での複製や発現に使用される、本技術分野において知られているプラスミド、ウィルス、その他のベクターとすることができる。
【０２０１】
本発明の各種形態における剤が抗体である場合、抗体は、本技術分野において知られている各種方法を用いて生成できる。このような抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されるフラグメントが含まれる。
【０２０２】
抗体産生のためには、各種免疫原性を有するポリペプペチドやその任意のフラグメントやオリゴペプチドを注入することによりヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等の各種宿主を免疫感作すればよい。宿主の種に応じて、免疫応答を増加させるために各種アジュバントを使用できる。このようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチンやプルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール等の表面活性物質等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０３】
モノクローナル抗体は、連続培養細胞系により抗体分子を産生するための任意の技法を用いて調製できる。これら技法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ら（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ，Ｒ．Ｊ．ら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０；或いはＣｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．ら（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０に記載のハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法、ＥＢＶハイブリドーマ技法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０４】
例えば、骨形成受容体タイプＩＩを調節する蛋白質に対するモノクローナル抗体を生成するためには、この蛋白質のペプチド配列を合成しＧｒｏｏｍｅとＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｍ（１９９１）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １０：３０９−３１６に記載のツベルクリンの精製蛋白質誘導体に結合できる。次に、Ｏｕｔｂｒｅｄ  Ｔｙｌｅｒ’ｓ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ（Ｔ／Ｏ）マウス（英国エセックス州サウスエンド・オン・シー（Southend on Sea））を４ヶ月間に亘って免疫感作する。次に、マウスを犠牲にして、Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓに記載のようにＳｐ２／０マウス骨髄腫細胞との融合のため脾臓を取り出す。
【０２０５】
ハイブリドーマ上清を最初にＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。これは、Ｇｒｏｏｍｅ  Ｎ．Ｐ．ら（１９９０）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ９：３１−４２に記載のように、Ｎｕｎｃイムノプレートにコートした該ペプチドに対して行う。次に、反応性クローンを限界希釈により増殖、リクローニングする。次に、これらを目的の蛋白質に対して再度スクリーニングし、最も反応するクローンを選択後、増殖、イソタイピングする。ＩｇＧ抗体は、評価前に、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ．とＬａｎｅ  Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹに記載のように、ハイソルトプロトコル（high salt protocol）を用いて蛋白質Ａカラムに付すことができる。
【０２０６】
更に、「キメラ抗体」を産生するために開発された各種技術、適切な抗原特異性及び生物学的活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを、例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８、Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４に記載のように使用できる。
【０２０７】
特定の結合部位を含む抗体フラグメントも作成できる。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ’）２フラグメントや、このＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることにより作成できるＦａｂフラグメントが挙げられる。これに替えて、例えばＨｕｓｅ、Ｗ．Ｄ．ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１２７５−１２８１に記載のように、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に且つ容易に特定するためにＦａｂ発現ライブラリーを構築できる。
【０２０８】
所望の特異性を有する抗体を特定するためのスクリーニングのために、各種イムノアッセイを使用できる。確立された特異性を有するポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いた競合結合やイムノラジオメトリックアッセイのための数多くのプロトコルが本技術分野において知られている。
【０２０９】
顆粒膜細胞に暴露させる剤の有効量は、顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する作用を示す量及び形態である限り、特に限定されない。
【０２１０】
この点に関して、剤の有効量は、調節対象の顆粒膜細胞アポトーシスの程度や、剤がインビボで投与されるか否か、被験体の年齢や体重、投与頻度、他の有効な剤の存在を考慮する必要があるか否かに応じて適切に選択できる。
【０２１１】
剤をインビトロで顆粒膜細胞に投与する場合、投与は、顆粒膜細胞を剤に直接曝露することにより行うことができる。
【０２１２】
前述のように、この場合、本発明は卵母細胞インビトロ成熟培地の調製に特に適している。
【０２１３】
従って、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地を提供するものである。
【０２１４】
好ましくは、顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害するのに有効なＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬである。
【０２１５】
好ましくは、顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害するのに有効なＢＭＰ−６の濃度は１〜２００ｎｇ／ｍＬである。
【０２１６】
この点に関して、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤の添加は、顆粒膜細胞のアポトーシスを低減するために、通常存在する添加物を含有しない組成物や培地を調製するために使用できるということが更に判明した。このような添加物としては、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ＩＧＦ（ＩＧＦ−１等）やＥＧＦ（アンフィレグリンやエピレグリン等）等の抗アポトーシス成長因子が挙げられる。
【０２１７】
従って、これに関連する各種形態においては、本発明は、上述の添加物を実質的に含有せず、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤を含有する組成物或いは培地を提供するものである。
【０２１８】
例えば、培地は卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵胞のための培養培地とすることができる。
【０２１９】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵丘卵母細胞複合体及び／又は卵胞を培養するための培地であって、該培地は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内又は卵胞内の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【０２２０】
例えば、この培地は、卵丘卵母細胞複合体の卵母細胞をインビトロで成熟させるために使用できる。
【０２２１】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞インビトロ成熟培地であって、該培地は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する前記一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【０２２２】
また、本発明は、卵胞を培養するための培地を調製するのに適しており、特に、卵胞発育を改善する或いは卵胞閉鎖を低減するのに適している。
【０２２３】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵胞培養培地であって、該培地は、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵胞内の一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵胞内の前記一以上の顆粒膜細胞のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有し、
該組成物は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び抗アポトーシス成長因子を実質的に含有していない培地を提供するものである。
【０２２４】
本発明は、各種形態において、顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤と、卵母細胞及び／又は卵胞の培養培地の調製のための他の添加物とを含有する組成物或いは培地も提供するものである。
【０２２５】
好ましくは、組成物或いは培地はＮａＣｌを含有する。より好ましくは、組成物或いは培地は４０ｍＭ〜４００ｍＭのＮａＣｌを含有する。
【０２２６】
好ましくは、組成物或いは培地はＫＣｌを含有する。より好ましくは、組成物或いは培地は０．１ｍＭ〜２０ｍＭのＫＣｌを含有する。
【０２２７】
好ましくは、組成物或いは培地はグルコースを含有する。より好ましくは、組成物或いは培地は０．１ｍＭ〜４０ｍＭのＫＣｌを含有する。
【０２２８】
従って、別の一形態においては、本発明は、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する組成物又は培地であって、
更に、４０ｍＭ〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ  ＫＣｌ、及び０．１ｍＭ〜４０ｍＭグルコースを含有する組成物又は培地を提供するものである。
【０２２９】
この組成物或いは培地は、卵母細胞のインビトロでの成熟のため或いは卵胞の培養のために使用できる。このような組成物或いは培地をこれら目的のために使用する各種方法が本技術分野において知られている。
【０２３０】
好ましくは、顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害するのに有効なＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬである。
【０２３１】
好ましくは、顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害するのに有効なＢＭＰ−６の濃度は１〜２００ｎｇ／ｍＬである。
【０２３２】
好ましくは、組成物中のＮａＣｌ濃度は１００ｍＭ〜１８０ｍＭである。最も好ましくは、ＮａＣｌ濃度は１４０ｍＭである。
【０２３３】
好ましくは、組成物中のＫＣｌ濃度は１ｍＭ〜８ｍＭである。最も好ましくは、ＫＣｌ濃度は４ｍＭである。
【０２３４】
好ましくは、組成物中のグルコース濃度は１ｍＭ〜２５ｍＭである。最も好ましくは、グルコース濃度は５．６ｍＭである。
【０２３５】
この組成物は一般に、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度範囲の炭酸水素ナトリウム緩衝液や両性イオン緩衝液やリン酸緩衝液等の適切な無機緩衝液も含有する。好ましくは、炭酸水素ナトリウムの濃度は２０ｍＭ〜４０ｍＭである。最も好ましくは、炭酸水素ナトリウムの濃度は２５ｍＭである。
【０２３６】
例えば、ＢＭＰ−１５を用いた適切な培地（ｇ／Ｌ）は次のような培地である。
ＢＭＰ−１５                                ０．０００５
ＣａＣｌ2．２Ｈ2０                          ０．２６５
ＭｇＳＯ4．６Ｈ2０                          ０．０９７６７
ＫＣｌ                                      ０．４
ＮａＣｌ                                    ６．８
ＮａＨ2ＰＯ4                                ０．１２２
Ｌ−アルギニン．ＨＣｌ                      ０．１２６
Ｌ−システイン．ＨＣｌ．一水和物            ０．０３１３
Ｌ−グルタミン                              ０．２９２
Ｌ−ヒスチジン．ＨＣｌ．一水和物            ０．０４２
Ｌ−イソロイシン                            ０．０５２
Ｌ−ロイシン                                ０．０５２
Ｌ−リジン．ＨＣｌ                          ０．０７２５
Ｌ−メチオニン                              ０．０１５
Ｌ−フェニルアラニン                        ０．０３２
Ｌ−スレオニン                              ０．０４８
Ｌ−トリプトファン                          ０．０１
Ｌ−チロシン．２Ｎａ．二水和物              ０．０５１９
Ｌ−バリン                                  ０．０４６
塩化コリン                                  ０．００１
葉酸                                        ０．００１
ｍｙｏ−イノシトール                        ０．００２
ナイアシナミド                              ０．００１
Ｄ−パントテン酸．ｌ／２Ｃａ                ０．００１
ピリドキサール．ＨＣｌ                      ０．００１
リボフラビン                                ０．０００１
チアミン．ＨＣｌ                            ０．００１
グルコース                                  １
フェノールレッド．Ｎａ                      ０．０１１
ＮａＨＣＯ3                                 ２．２
【０２３７】
ＢＭＰ−６を用いた適切な培地（ｇ／Ｌ）は次のような培地である。
ＢＭＰ−６                                  ０．０００１
ＣａＣｌ2．２Ｈ2０                          ０．２６５
ＭｇＳＯ4．６Ｈ2０                          ０．０９７６７
ＫＣｌ                                      ０．４
ＮａＣｌ                                    ６．８
ＮａＨ2ＰＯ4                                ０．１２２
Ｌ−アルギニン．ＨＣｌ                      ０．１２６
Ｌ−システイン．ＨＣｌ．一水和物            ０．０３１３
Ｌ−グルタミン                              ０．２９２
Ｌ−ヒスチジン．ＨＣｌ．一水和物            ０．０４２
Ｌ−イソロイシン                            ０．０５２
Ｌ−ロイシン                                ０．０５２
Ｌ−リジン．ＨＣｌ                          ０．０７２５
Ｌ−メチオニン                              ０．０１５
Ｌ−フェニルアラニン                        ０．０３２
Ｌ−スレオニン                              ０．０４８
Ｌ−トリプトファン                          ０．０１
Ｌ−チロシン．２Ｎａ．二水和物              ０．０５１９
Ｌ−バリン                                  ０．０４６
塩化コリン                                  ０．００１
葉酸                                        ０．００１
ｍｙｏ−イノシトール                        ０．００２
ナイアシナミド                              ０．００１
Ｄ−パントテン酸．ｌ／２Ｃａ                ０．００１
ピリドキサール．ＨＣｌ                      ０．００１
リボフラビン                                ０．０００１
チアミン．ＨＣｌ                            ０．００１
グルコース                                  １
フェノールレッド．Ｎａ                      ０．０１１
ＮａＨＣＯ3                                 ２．２
【０２３８】
上述のように、本発明は、凍結融解による損傷によりもたらされたるアポトーシスの低減にも適しているということも認められた。
【０２３９】
従って、別の一形態においては、本発明は、凍結融解に起因する顆粒膜細胞アポトーシスを低減するための組成物であって、
（ｉ）活性ＢＭＰ−１５及び／又は活性ＢＭＰ−６、
（ｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｉｉｉ）顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０２４０】
本組成物は、凍結前及び／又は融解後に使用できる。
【０２４１】
例えば、個別の卵丘卵母細胞複合体や全卵胞、卵巣組織、全卵巣は、冷凍すると凍結／凍結融解によって通常死ぬが、本組成物は、凍結融解後の細胞や組織の増殖能力を改善するために使用できる。
【０２４２】
従って、別の一形態においては、本発明は、凍結に起因する卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の損傷を低減するための組成物であって、
（ｉ）有効量の活性ＢＭＰ−１５及び／又は活性ＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる有効量の剤、
（ｉｉｉ）卵丘卵母細胞複合体、卵胞、卵巣組織又は卵巣の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる有効量の剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０２４３】
好ましい一形態においては、本組成物は培養培地である。
【０２４４】
本発明の組成物及び／又は培地は、補助生殖技法に使用される卵母細胞を培養するのに特に適している。補助生殖を実施するための各種方法が本技術分野で知られている。
【０２４５】
この点に関しては、本明細書を通して使用される「補助生殖」という用語は、単離卵母細胞及び／又は単離精子を用いたヒトや動物に対するあらゆる受精技術をいうと理解すべきである。このような受精技法の例としては、インビトロで培養した卵母細胞や胚を用いた技術（例えば、卵母細胞のインビトロ成熟）、インビトロ受精（ＩＶＦ；卵母細胞の吸引、実験室における受精、及びレシピエントへの胚の移植）、卵管内配偶子移植法（ＧＩＦＴ；卵管内への卵母細胞及び精子の配置）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ；卵管内への受精卵母細胞の配置）、卵管内胚移植（ＴＥＴ；卵管内への分割胚の配置）、腹腔内卵母細胞・精子移植（ＰＯＳＴ；骨盤腔内への卵母細胞及び精子の配置）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、精巣精子注出（ＴＥＳＥ）、顕微鏡下精巣上体精子吸引（ＭＥＳＡ）等が挙げられる。
【０２４６】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【０２４７】
例えば、本発明は、インビトロ受精技法において使用することが可能である。
【０２４８】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞のインビトロ受精方法あって、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【０２４９】
本発明は更に、卵母細胞を用いる補助生殖における使用のための組成物を提供するものである。
【０２５０】
本発明は、胚を形成するために受精する卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスを調節することによって、胚の発育能力を調節するのに適している。
【０２５１】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞から作製された胚の発育能力を調節するための組成物であって、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの調節におけるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することによる顆粒膜細胞のアポトーシスの調節における有効量の剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することによる顆粒膜細胞のアポトーシスの調節における有効量の剤、の内の一以上を含有する組成物を提供するものである。
【０２５２】
別の一形態においては、本発明は、卵母細胞から作製された胚の発育能力を調節する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより顆粒膜細胞のアポトーシスを調節する段階、
の内の一以上を含む方法を提供するものである。
【０２５３】
また、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖方法であって、次の各成分、
（ｉ）ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する一以上の顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節することにより前記一以上の顆粒膜細胞のアポトーシスを阻害する剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞及び／又は胚を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【０２５４】
本発明は更に、卵母細胞から作製された胚を用いる補助生殖における使用のための組成物を提供するものである。
【０２５５】
本発明の各種剤をインビボで投与する場合、剤は、所望の作用部位への剤を到達させ顆粒膜細胞アポトーシスを阻害する作用を示すのに適した形態及び濃度で運ぶことができる。
【０２５６】
剤の投与は、所望の顆粒膜細胞アポトーシス調節作用を生じさせるに適した任意の時間内に行うことができる。この点に関しては、本発明の各種関連形態における剤の顆粒膜細胞への投与は、顆粒膜細胞に関連するインビトロ又はインビボの卵母細胞の受精前、受精中、受精後の任意の時期に行うことができる。
【０２５７】
ヒトや動物の被験体に対して、剤は経口、非経口、局所、或いはその他任意の適切な手段により投与できるが、剤の通過時間を考慮しなければならない。
【０２５８】
本発明の各種形態における剤のインビボ投与には、投与する剤の具体的な物理的及び化学的特性を考慮に入れ、薬学的に許容できる塩や、アミノ酸、ポリペプチド、ポリマー、溶剤、緩衝剤、賦形剤、充填剤等の薬学的に許容できる一種以上の添加剤の使用も含まれる。
【０２５９】
例えば、剤は、水溶液、油性製剤、脂肪乳剤、乳剤、ゲル剤等の形態で種々の製剤に調製でき、これらの製剤は、筋肉内注射や皮下注射、或いは卵巣への注射、或いは埋込み製剤、鼻腔、直腸、子宮、膣、肺等に対する経粘膜製剤として投与できる。前記製剤は、経口用製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の固体製剤や、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤）の形態で投与できる。また、前記剤を含有する組成物は、保存剤や安定剤、分散剤、ｐＨ調整剤、等張剤も含有できる。適切な保存剤の例としては、グリセリン、プロピレングリコール、フェノール、ベンジルアルコールが挙げられる。適切な安定剤の例としては、デキストラン、ゼラチン、α−トコフェロールアセテート、アルファチオグリセリンが挙げられる。適切な分散剤の例としては、ポリオキシエチレン（２０）、ソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、セスキオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ  ３０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０が挙げられる。。適切なｐＨ調整剤の例としては、塩酸や水酸化ナトリウム等が挙げられる。適切な等張剤の例としては、グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールが挙げられる。
【０２６０】
本発明の各種形態における剤のインビボ投与は、投与する剤の具体的な物理的及び化学的特性を考慮に入れ、薬学的に許容できる担体や、希釈剤、賦形剤、懸濁剤、滑沢剤、補助薬、ビヒクル、送達システム、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存剤、界面活性剤、着色剤、風味剤、甘味剤を含有する組成物の形態で投与できる。
【０２６１】
これらの目的のため、本組成物は、経口、非経口、吸入スプレー、吸着法、生体吸収、局所、直腸内、経鼻、経頬、経膣、脳室内投与により或いは埋め込まれたリザーバーを介して、薬剤的に許容できる従来の無毒性担体を含有する投与製剤や他の任意の投与形態で投与できる。本明細書で用いられる非経口という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、クモ膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内への注射或いは注入（infusion）技法が含まれる。
【０２６２】
非経口投与の場合、本組成物は通常、単位用量の無菌注射可能な形態（溶液や懸濁剤、乳剤）であり、好ましくは、薬学的に許容できる担体によりレシピエントの血液と等しい浸透圧に調整される。このような無菌注射可能な形態の例としては、水性の無菌注射剤や油性懸濁剤が挙げられる。これら懸濁剤は、適切な分散剤或いは湿潤剤と懸濁化剤とを用いた、本技術分野で知られている各種技法で調製できる。無菌注射可能な形態は、例えば１，３−ブタンジオール溶液等の無毒性の非経口投与可能な希釈剤や溶剤を用いた、無菌注射可能な溶液或いは懸濁剤とすることができる。許容できるものの内、使用可能なビヒクル及び溶剤は、水、塩類、リンゲル液、デキストロース液、等張食塩液及びハンクス液である。更に、溶剤や懸濁媒として、無菌不揮発性油が従来使用されている。この目的のためには、合成モノグリセリド又は合成ジグリセリド、トウモロコシ油、綿実油、落花生油、胡麻油等、任意の非刺激性（bland）の不揮発性油を使用できる。オレイン酸エチルやイソプロピルミリステート、オレイン酸等の脂肪酸、及びそのグリセリド誘導体（オリーブ油やひまし油等）、特にこれらをポリオキシエチル化した形態のものは、注射剤の調製に有用である。また、これら油剤や懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤或いは分散剤を含有できる。
【０２６３】
担体は、溶解性や等張性、化学的安定性を改善する物質、例えば抗酸化剤や緩衝剤、保存剤等の添加剤を少量含有できる。
【０２６４】
経口投与の場合、組成物は通常、本技術分野で知られている従来の装置や技術を用いて、錠剤、カシェ剤、散剤、顆粒剤、ビーズ剤、咀嚼錠、カプセル剤、液剤、水性懸濁剤、溶液等の単位用量形態や、類似の投与形態に調製される。このような製剤は一般に、固体担体や半固体担体、液体担体を含有する。典型的な担体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオバター、カカオ油（oil of theobroma）、アルギネート、トラガカントゴム、ゼラチン、シロップ、メチルセルロース、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、オキシ安息香酸メチル、オキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。
【０２６５】
錠剤は、任意ではあるが一以上の補助成分と共に、活性成分を圧縮或いは成形することによって製造できる。圧縮錠剤は、散剤又は顆粒剤等の易流動性の形態の活性成分を、任意ではあるが結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤或いは分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製できる。成形錠剤は、粉末状の活性成分と適切な担体との混合物を不活性液体希釈剤で湿らせ、適切な機械で成形することにより製造できる。
【０２６６】
また、本発明の各形態における剤の投与には、放出制御技術も利用できる。剤は、徐放性医薬として投与することもできる。徐放作用を更に高めるために、本組成物は、植物油（例えば、大豆油、胡麻油、椿油、ひまし油、落花生油、菜種油等）、中脂肪酸トリグリセリド、オレイン酸エチル等の脂肪酸エステル、ポリシロキサン誘導体、或いは、ヒアルロン酸やその塩等の水溶性高分子量化合物（重量平均分子量：約８００００〜２００００００）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（重量平均分子量：約２００００〜４０００００）、ヒドロキシプロピルセルロース（２％水溶液粘度：３〜４０００ｃｐｓ）、粥状コラーゲン（重量平均分子量：約３０００００）、ポリエチレングリコール（重量平均分子量：約４００〜２００００）、ポリエチレンオキシド（重量平均分子量：約１０００００〜９００００００）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（１％水溶液粘度：４〜１０００００ｃＳｔ）、メチルセルロース（２％水溶液粘度：１５〜８０００ｃＳｔ）、ポリビニルアルコール（粘度：２〜１００ｃＳｔ）、ポリビニルピロリドン（重量平均分子量：２５０００〜１２０００００）等、各種添加剤成分と共に調製できる。
【０２６７】
これに替えて、前記剤は、数日に亘る放出制御のため疎水性ポリマーマトリックスに含有させることができる。更に、本発明の組成物は、頻回の再投与を必要とすることなく長期間に亘って剤の有効濃度を提供するのに適した固体植込錠或いは外用貼付剤に成形できる。このような徐放膜は本技術分野でよく知られている。この目的のために一般に使用され本発明において使用できるポリマーの他の例としては、外用又は内用に使用できる非分解性エチレン酢酸ビニル共重合体や分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。また、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）やポリ（ビニルアルコール）等の特定のヒドロゲルも、上に述べたような他のポリマー放出システムより放出サイクルが短いことを別にすれば、有用である。
【０２６８】
前記担体はまた、適切な時限放出（time release）特性及び放出動態を有する生分解性ポリマー同士の混合物や固体生分解性ポリマーとすることができる。更に、本組成物は、頻回の再投与を必要とすることなく長期間に亘り剤の有効濃度を提供するのに適した固体植込錠に成形できる。前記剤は、本技術分野において当業者に知られている任意の適切な方法により生分解性ポリマー或いはポリマー混合物に混合し、生分解性ポリマーと共に均質マトリックスを形成するか、或いは何らかの方法によりポリマー内に封入するか、或いは固体植込錠に成形できる。
【０２６９】
本発明は更に、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの程度を決定することにより卵母細胞の発育能力を評価する方法を提供するものである。
【０２７０】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は次の各段階、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞のアポトーシスの程度を決定する段階、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞において見られるアポトーシスの程度により卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、アポトーシスのレベルの低下は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、アポトーシスのレベルの上昇は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【０２７１】
この点に関しては、「発育能力」という用語は、卵母細胞が、移植可能な胚に発育する能力を意味すると考えるべきである。
【０２７２】
発育能力の改善は、顆粒膜細胞のアポトーシスレベルの低下と関連し、発育能力の低下は、顆粒膜細胞のアポトーシスのレベルの上昇と関連するということが理解されるであろう。
【０２７３】
発育能力の評価は、インビトロにおける卵母細胞又はインビボにおける卵母細胞に対して行うことができる。
【０２７４】
インビトロ或いはインビボでアポトーシスの程度を評価する方法は、前述した通りである。
【０２７５】
このように、本発明は、例えば、卵丘卵母細胞複合体の一部或いは卵胞の一部としてのインビトロの卵母細胞の発育能力の評価や、インビボの卵母細胞の発育能力の評価を包含するものである。
【０２７６】
本発明は更に、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、
（ｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性のレベル、
（ｉｉｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性のレベル、の内の一以上を決定することにより卵母細胞の発育能力を評価するのにも適している。
【０２７７】
この場合、発育能力の改善は、顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の上昇、或いは顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６シグナル伝達経路の活性の上昇に関連し、発育能力の低下は、顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の低下、顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６シグナル伝達経路の活性の低下、或いは顆粒膜細胞のアポトーシスのレベルの上昇に関連する。
【０２７８】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
（ｉ）卵母細胞に関連する顆粒膜細胞が曝露されるＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性レベル、卵母細胞に関連する顆粒膜細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性レベル、の内の一以上を決定する段階、及び
（ｉｉ）前記決定の結果を用いて卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の上昇、及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の低下、及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【０２７９】
ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の濃度又は活性を決定する方法や、適切なシグナル伝達経路の活性を決定する方法は本技術分野において知られている。
【０２８０】
本発明は更に、卵母細胞によるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の発現、産生及び分泌の内の一以上を決定することによって、卵母細胞の発育能力を評価する方法を提供するものである。
【０２８１】
例えば、ヒトＩＶＦにおいては、使用される卵母細胞は通常裸化されるが、受精前に卵母細胞を含有する培地内のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６レベルを決定することによって卵母細胞の発育能力を評価できる。ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６のレベルを決定するための適切な方法はＥＬＩＳＡである。
【０２８２】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、
（ｉ）卵母細胞内のＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現レベルを決定する、及び／又は卵母細胞が分泌するＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を決定する段階、及び（ｉｉ）卵母細胞の発育能力を評価する段階、
を含み、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、ＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【０２８３】
インビトロ成熟中に卵丘卵母細胞複合体を他の裸化卵母細胞と共培養することによって、卵丘卵母細胞複合体の受精の際に胚盤胞形成率が劇的に上昇するということも、これまでの研究において見出された（好ましい実施形態の説明における研究ＩＩを参照）。この結果は、卵母細胞分泌因子は卵母細胞発育能力に対して大きな影響を及ぼすことを示している。
【０２８４】
更に、卵母細胞発育能力の改善の原因となる卵母細胞分泌因子の少なくとも一部は、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５であることも見出された。従って、ＧＤＦ−９ホモダイマー、ＢＭＰ−１５ホモダイマー及びＧＤＦ−９／ＢＭＰ−１５ホモダイマーが関与していると考えられる。
【０２８５】
また、ＢＭＰ−６が、卵母細胞発育能力の改善を導く卵母細胞分泌因子の内の一種であろうと予想される。
【０２８６】
従って、卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０２８７】
この点に関して、卵母細胞や胚の発育或いは発育能力を調節或いは診断するための技法を新規に開発する必要があるということが次第に確実になってきている。
【０２８８】
また、ヒト及び動物の双方における補助生殖技法に関連して様々な問題点が文書化されている。特に、あらゆる年齢の女性の卵母細胞のインビトロ成熟を改善する必要と受精卵母細胞の発育能力を改善する必要がある。これは特に、４０歳超の女性に行うＩＶＦプログラムのために必要である。なぜなら、この年齢の女性のＩＶＦにおける妊娠成功率は３５歳未満の女性の約１／４であるためである。
【０２８９】
この点に関して、「補助生殖」とは、単離卵母細胞、単離胚及び／又は単離精子を用いたヒトや動物におけるあらゆる受精技法、或いは、核移植、単為生殖的活性化、全能細胞の使用等の、ヒト及び／又は動物において胚を作製するためのその他のインビトロ技法をいうと理解すべきである。受精技法の例としては、インビトロ培養した卵母細胞や胚を用いた技法（例えば、インビトロ成熟）、インビトロ受精（ＩＶＦ；卵母細胞の吸引、実験室における受精、及びレシピエントへの胚の移植）、卵管内配偶子移植法（ＧＩＦＴ；卵管内への卵母細胞及び精子の配置）、接合子卵管内移植（ＺＩＦＴ；卵管内への受精卵母細胞の配置）、卵管内胚移植（ＴＥＴ；卵管内への分割胚の配置）、腹腔内卵母細胞・精子移植（ＰＯＳＴ；骨盤腔内への卵母細胞及び精子の配置）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、精巣精子注出（ＴＥＳＥ）、顕微鏡下精巣上体精子吸引（ＭＥＳＡ）等が挙げられる。
【０２９０】
卵母細胞や胚に関連して用いられる「単離」という用語は、特定の時点で卵母細胞や胚がその生来の環境から（少なくとも部分的に）取り出される或いは精製されることをいうと理解すべきである。単離胚の例としては、補助生殖技法を用いてインビトロで作製された胚や、被験体から単離された胚が挙げられる。単離卵母細胞の例としては、卵胞、卵丘卵母細胞複合体或いは裸化卵母細胞の一部として被験体から単離された卵母細胞が挙げられる。
【０２９１】
「発育能力のある」という用語は、移植可能な胚を形成できる胚や卵母細胞をいうと理解すべきである。
【０２９２】
「発育能力」という用語は、卵母細胞や胚が、移植可能な胚に発育する能力を意味すると理解すべきである。発育能力が改善された卵母細胞や胚は、移植成功後、生きた動物やヒトに発育する確率が高くなるであろう。
【０２９３】
この方法はまた、受精後に発育中に進行する卵母細胞の能力を変えるために用いることもできる。
【０２９４】
例えば、（ｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性、（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性、の内の一以上を上昇させることにより、卵丘細胞複合体内の受精卵母細胞は、胚盤胞ステージや桑実胚ステージに発育する可能性が高くなる。
【０２９５】
一種以上の卵母細胞分泌因子の適切な原料（source）には、一以上の付加的な裸化卵母細胞への卵母細胞の曝露が含まれる。これに替えて、一以上の卵母細胞からのならし培地に卵母細胞を曝露してもよい。
【０２９６】
卵母細胞の発育能力の調節は、卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を調節することによって行うのが好ましい。
【０２９７】
この点に関しては、卵母細胞の発育能力は、卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を高めることにより改善できる。
【０２９８】
従って、好ましい一形態においては、卵母細胞の発育能力を調節する方法であって、卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を調節する段階を含む方法が提供される。
【０２９９】
上述の前記一以上の段階の調節は、卵母細胞の受精前、卵母細胞の受精と同時に、或いは卵母細胞の受精後に行うことができるということが理解されるであろう。
【０３００】
前記一以上の段階の調節は、卵母細胞の受精前に行うことが好ましい。例えば、本方法は、卵母細胞の受精前に卵母細胞の発育能力を改善するために用いることができる。
【０３０１】
また、本方法は、インビトロ又はインビボで卵母細胞の発育能力を調節するために使用できるということが理解されるであろう。
【０３０２】
例えば、本方法は、インビトロで卵母細胞の発育能力を調節するために用いることができる。この点に関しては、卵母細胞は、例えば、卵胞内に存在する卵母細胞や、卵丘卵母細胞複合体内に存在する卵母細胞、その卵丘細胞から裸化された卵母細胞、卵丘卵母細胞複合体内に存在するか或いは裸化された受精卵母細胞とすることができる。好ましくは、卵母細胞は卵丘卵母細胞複合体の一部である。
【０３０３】
本技術分野においては、適切なレシピエントの雌から卵母細胞や卵丘卵母細胞複合体を回収しインビトロで卵母細胞を受精させる各種方法が知られている。
【０３０４】
また、この点に関しては、本方法によって作製される、発育能力が変化した単離卵母細胞（インビトロの裸化卵母細胞、又はインビトロで存在する卵丘卵母細胞複合体の一部である卵母細胞等）や、この単離卵母細胞から作製される胚或いは非ヒト動物も提供される。
【０３０５】
インビトロで産生された、発育能力が変化した卵母細胞は、適切なレシピエント雌性被験体への移植等の補助生殖技法で使用でき、また、胚移植、ＩＶＦ及び／又は遺伝子操作に用いるために増殖能力を維持しつつインビトロで培養でき、また、胚移植や他の操作に先立って保存或いは凍結できる。更に、受精卵母細胞から作製された胚は、核移植用或いはＥＳ細胞作製用の胚細胞の原料として使用できる。
【０３０６】
従って、別の一形態においては、卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３０７】
例えば、本補助生殖方法は卵母細胞のインビトロ受精とすることができる。
【０３０８】
従って、別の一形態においては、卵母細胞のインビトロ受精方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３０９】
本発明は更に、卵母細胞を用いる補助生殖における使用のための組成物も提供するものである。
【０３１０】
また、別の一形態においては、卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖方法であって、該方法は、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３１１】
また、本発明は、卵母細胞から作製された胚を用いた補助生殖における使用のための組成物も提供するものである。
【０３１２】
また、好ましい一形態においては、卵母細胞の発育能力を改善するための組成物であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
【０３１３】
好ましい形態においては、本組成物は卵母細胞用の培養培地である。
【０３１４】
従って、卵母細胞培養培地であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地も提供される。
【０３１５】
本組成物や培地は、卵母細胞の発育能力を改善するために使用することが好ましい。
【０３１６】
別の一形態においては、卵母細胞を用いる補助生殖方法であって、
（ｉ）一以上の裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法が提供される。
【０３１７】
本培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及びＩＧＦ（例えばＩＧＦ−１）やＥＧＦ（アンフィレグリンやエピレグリン等）等の成長因子、の内の一以上を実質的に含有しないものとすることができる。
【０３１８】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を改善するため培地であって、該培地は、次の各成分、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有し、該培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び成長因子の内の一以上を実質的に含有しない培地を提供するものである。
【０３１９】
本培地は、本培地調製のための他の適切な添加剤を含有する。
【０３２０】
好ましくは、本培地はＮａＣｌを含有する。更に好ましくは、本培地は４０ｍＭ〜４００ｍＭのＮａＣｌを含有する。
【０３２１】
好ましくは、本培地はＫＣｌを含有する。更に好ましくは、本培地は０．１ｍＭ〜２０ｍＭのＫＣｌを含有する。
【０３２２】
好ましくは、本培地はグルコースを含有する。更に好ましくは、本培地は０．１ｍＭ〜４０ｍＭのグルコースを含有する。
【０３２３】
本発明は更に、卵母細胞を用いた補助生殖における使用のための組成物を提供するものである。
【０３２４】
一以上の裸化卵母細胞の有効量や、卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度は、必要な発育の改善の程度に基づいて選択できる。同様に、卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量も選択でき、卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量も選択できる。
【０３２５】
剤の例としては、薬物や小分子、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、蛋白質、酵素、多糖類、糖蛋白質、ホルモン類、受容体、受容体リガンド、補因子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、脂質、抗体又はその一部、アプタマー、ウイルスが挙げられる。
【０３２６】
好ましい一形態においては、卵母細胞の発育能力を改善するための組成物であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログを含有する組成物が提供される。
【０３２７】
特に好ましい一形態においては、本組成物は培地である。
【０３２８】
この点に関して、「バリアント」という用語は、一以上のアミノ酸によって変化したアミノ酸配列をいうと理解すべきである。バリアントは、置換後のアミノ酸の構造的或いは化学的特性が置換前のアミノ酸と同様である「保存的」変化（例えば、イソロイシンによるロイシンの置換）を含むことができる。バリアントは「非保存的」変化（例えば、トリプトファンによるグリシンの置換）や一以上のアミノ酸の欠失及び／又は挿入を含むこともできる。
【０３２９】
好ましくは、バリアントのアミノ酸レベルは未変性蛋白質に対し７５％超の相同性を有する。更に好ましくは、バリアントのアミノ酸レベルは未変性蛋白質に対し９０％超の相同性を有する。更に好ましくは、バリアントのアミノ酸レベルは未変性蛋白質に対し９５％超の相同性を有する。
【０３３０】
「アナログ」という用語は、比較対照分子と類似の構造機能、調節機能或いは生化学的機能を有する分子をいうと理解すべきであり、比較対照分子の生物学的活性断片を含む。
【０３３１】
卵母細胞が曝露されるＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
【０３３２】
卵母細胞が曝露されるＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
【０３３３】
卵母細胞が曝露されるＢＭＰ−６の濃度は１〜２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましい。
【０３３４】
本方法及び本組成物は、卵母細胞のインビトロ成熟及び卵母細胞の質の改善にも適している。
【０３３５】
従って、卵母細胞の成熟を調節する及び／又は卵母細胞の質を調節する方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３３６】
この点に関しては、本方法によって作製される成熟及び／又は質が変化した単離卵母細胞、並びに該卵母細胞から作製された胚及び非ヒト動物も提供される。
【０３３７】
別の一形態においては、卵母細胞のインビトロ成熟及び／又は卵母細胞の質を改善するための組成物であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
【０３３８】
好ましくは、本組成物は、卵母細胞を培養するための培地である。
【０３３９】
本培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及びＩＧＦ（例えばＩＧＦ−１）やＥＧＦ（アンフィレグリンやエピレグリン等）等の成長因子の内の一以上を実質的に含有しないものとすることができる。好ましくは、本培地は無血清培地である。
【０３４０】
好ましい一形態においては、本培地は、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する。従って、卵母細胞培養培地であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する培地も提供される。
【０３４１】
好ましい一形態においては、卵母細胞用インビトロ成熟培地であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する培地も提供される。
【０３４２】
この培地は、卵母細胞の質の改善及び卵母細胞の発育能力の改善に適している。従って、卵母細胞の質の改善及び／又は卵母細胞の発育能力の改善のための培地であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する培地も提供される。
【０３４３】
好適な培地の例としては、１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５及び／又は１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９及び／又は１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６を添加した、Ｃｏｏｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社のＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔ培地やＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｂｌａｓｔ培地が挙げられる。
【０３４４】
また、該組成物及び／又は該培地は、特に、補助生殖技法に使用する卵母細胞の培養にも適している。
【０３４５】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞を用いた補助生殖方法であって、（ｉ）一以上の裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【０３４６】
例えば、本発明はインビトロ受精技法に使用できる。
【０３４７】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞のインビトロ受精方法であって、（ｉ）一以上の裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において卵母細胞を培養する段階を含む方法を提供するものである。
【０３４８】
本発明は更に、卵母細胞を用いる補助生殖における使用のための組成物を提供するものである。
【０３４９】
本方法及び本組成物は、卵母細胞の受精によって作製された胚の発育或いは発育能力の調節にも適している。この点に関しては、卵母細胞は、受精前、受精中及び受精後の任意の時点で処理できる。
【０３５０】
従って、卵母細胞から作製された胚の発育又は発育能力を改善する方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３５１】
このように作製された胚は、胚盤胞ステージ或いは桑実胚ステージに発育する可能性が高く、胚移植後に子宮に着床する可能性が高い。
【０３５２】
また、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、及び／又は卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内若しくは胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び／又は卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内若しくは胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び／又は卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内若しくは胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達の活性を上昇させる剤も、胚及び／又は卵母細胞のための培養培地サプリメントとして使用できるということが理解されるであろう。
【０３５３】
従って、別の一形態においては、本発明は、次の各成分、
卵母細胞及び／又は胚培養培地、及び
ＧＤＦ―９及び／又はＢＭＰ―１５及び／又はＢＭＰ―６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、及び／又は
一以上の卵母細胞分泌因子、及び／又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び／又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内又は胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、及び／又は
卵母細胞内、卵母細胞に関連する卵丘細胞内又は胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、を含有し、各成分は、培養培地に各成分を添加するための形態で提供される組合せ製品を提供するものである。
【０３５４】
本組合せ製品は、本明細書に記載された上述の各用途のいずれにも使用できる。
【０３５５】
培養培地及び他の各種成分は、マルチユース形態或いはユニット形態で、アンプルやボトル、バイアル等の適切な容器（好ましくは、滅菌容器）に別々に包装できる。容器は、充填後に気密密閉できる。各蛋白質成分は、単離形態、精製又は半精製形態とすることができ、蛋白質の安定性及び／又は使用のための追加的な添加剤を含有できる。本技術分野においては、各成分を包装するための各種方法が知られている。
【０３５６】
また、胚の発育及び／又は発育能力を調節できることも包含されている。
【０３５７】
従って、胚の発育又は発育能力を改善する方法であって、次の各段階、
（ｉ）胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法も提供される。
【０３５８】
本方法はまた、胚の発育能及び／又は発育能力を変えるためにも使用できる。
【０３５９】
特に、この方法は、（ｉ）胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性、(ｉｉ)胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、（ｉｉｉ）胚内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性、の内の一以上を上昇させることにより、受精の時点から胚盤胞ステージの卵母細胞までの胚の発育を改善するために使用できる。
【０３６０】
このように、胚は、胚盤胞ステージ或いは桑実胚ステージに発育する可能性が高く、胚移植後に子宮に着床する可能性が高い。
【０３６１】
一種以上の卵母細胞分泌因子の適切な原料（source）には、一以上の付加的な裸化卵母細胞への胚の曝露が含まれる。これに替えて、一以上の卵母細胞からのならし培地に胚を曝露してもよい。
【０３６２】
胚の発育又は発育能力の調節は、胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を調節することによって行うのが好ましい。
【０３６３】
この点に関しては、胚の発育及び／又は発育能力は、胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を高めることにより改善できる。
【０３６４】
従って、好ましい一形態においては、胚の発育及び／又は発育能力を調節する方法であって、胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を調節する段階を含む方法が提供される。
【０３６５】
前記一以上の段階の調節は、卵母細胞の受精後の任意の時点で行うことができるということが理解されるであろう。
【０３６６】
また、本方法は、インビボ又はインビトロにおける胚の発育及び／又は発育能力を調節するために使用できる。好ましくは、胚は、インビトロにおける胚である。
【０３６７】
インビトロで胚を作製する方法は、本技術分野において各種知られている。
【０３６８】
また、これに関連して、本方法によって作製される発育又は発育能力が変化した単離胚、及びその胚から作製される非ヒト動物も提供される。
【０３６９】
インビトロで作製される発育又は発育能力が変化した胚は、適切なレシピエント雌性被験体への移植等の補助生殖技術法おいて使用でき、また、胚移植や遺伝子操作で使用するために増殖能力を維持しつつインビトロで培養でき、また、胚移植や他の操作に先立って保存或いは凍結できる。更に、この胚から作製される胚は、核移植やＥＳ細胞作製のための胚細胞の原料として使用できる。
【０３７０】
従って、別の一形態においては、胚を用いた補助生殖方法であって、
（ｉ）一以上の裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地において胚を培養する段階を含む方法が提供される。
【０３７１】
また、本発明は、胚を用いた補助生殖における使用のための組成物も提供するものである。
【０３７２】
好ましい一形態においては、胚の発育及び／又は発育能力を向上させる組成物であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
【０３７３】
好ましい形態においては、本組成物は胚の培養培地である。
【０３７４】
従って、胚の培養培地であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する培地が提供される。
【０３７５】
本培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及びＩＧＦ（例えばＩＧＦ−１）やＥＧＦ（アンフィレグリンやエピレグリン等）等の成長因子、の内の一以上を実質的に含有しないものとすることができる。
【０３７６】
従って、別の一形態においては、本発明は、胚の発育能力を向上させる培地であって、（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有し、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び成長因子、の内の一以上を実質的に含有しない培地を提供するものである。
【０３７７】
本培地は、本培地の調製に適した他の添加物を含有する。
【０３７８】
好ましくは、本培地はＮａＣｌを含有する。更に好ましくは、本培地は４０ｍＭ〜４００ｍＭのＮａＣｌを含有する。
【０３７９】
好ましくは、本培地はＫＣｌを含有する。更に好ましくは、本培地は０．１ｍＭ〜２０ｍＭのＫＣｌを含有する。
【０３８０】
好ましくは、本培地はグルコースを含有する。更に好ましくは、本培地は０．１ｍＭ〜４０ｍＭのグルコースを含有する。
【０３８１】
一以上の裸化卵母細胞の有効量、又は卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度は、必要な発育の改善の程度に基づいて選択できる。同様に、胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の有効量も選択でき、胚内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤の有効量も選択できる。
【０３８２】
剤の例としては、薬剤や低分子、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、蛋白質、酵素、多糖類、糖蛋白質、ホルモン類、受容体、受容体リガンド、補助因子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、脂質、抗体又はその一部、アプタマー、ウイルスが挙げられる。
【０３８３】
好ましい一形態においては、胚の発育又は発育能力を向上させるための組成物であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログを含有する組成物が提供される。
【０３８４】
特に好ましい一形態においては、本組成物は培地である。
【０３８５】
好ましくは、胚が曝露されるＧＤＦ−９の濃度は１〜１０００ｎｇ／ｍＬである。
【０３８６】
好ましくは、胚が曝露されるＢＭＰ−１５の濃度は１〜１５００ｎｇ／ｍＬである。
【０３８７】
好ましくは、胚が曝露されるＢＭＰ−６の濃度は１〜２００ｎｇ／ｍＬである。
【０３８８】
また、本方法及び本組成物は、胚が胚盤胞ステージに進行する可能性を高めるのにも適している。
【０３８９】
従って、胚が胚盤胞ステージに進行する可能性を高める方法であって、
（ｉ）胚が曝露される卵母細胞分泌因子の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉ）胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を調節する段階、
（ｉｉｉ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｉｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法が提供される。
【０３９０】
これに関連して、本方法によって作製される単離胚、及びその胚から作製される非ヒト動物も提供される。
【０３９１】
別の一形態においては、胚が胚盤胞ステージに進行する可能性を高める組成物であって、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する組成物も提供される。
【０３９２】
好ましくは、本組成物は胚を培養するための培地である。
【０３９３】
従って、
（ｉ）一以上の付加的な裸化卵母細胞、
（ｉｉ）一以上の卵母細胞分泌因子、
（ｉｉｉ）ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６、又はそれらのバリアント若しくはアナログ、
（ｉｖ）胚内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖ）胚内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、
（ｖｉ）胚内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を上昇させる剤、の内の一以上を含有する胚培養培地も提供される。
【０３９４】
好ましい一形態においては、本培地は、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する。従って、胚培養培地であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する培地も提供される。
【０３９５】
また、本培地は、胚の発育及び／又は発育能力を改善するのにも適している。従って、胚の発育及び／又は発育能力を改善する培地であって、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６を含有する培地も提供される。
【０３９６】
本培地は、血清、アルブミン、卵胞液、フェチュイン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、及びＩＧＦ（例えばＩＧＦ−Ｉ）やＥＧＦ（アンフィレグリンやエピレグリン等）等の成長因子、の内の一以上を実質的に含有しないものとすることができる。
【０３９７】
好ましくは、本培地は無血清培地である。
【０３９８】
適切な培地の例としては、１０％のＢＭＰ−１５及び／又は１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９及び／又は１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６を添加した、Ｃｏｏｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ社のＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔ培地やＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｂｌａｓｔ培地が挙げられる。
【０３９９】
ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の活性の調節、及び／又は胚内におけるそれらのシグナル伝達経路の活性の調節は、本技術分野において知られている方法で行うことができる。本技術分野においては、細胞内におけるこれらシグナル伝達経路の活性を決定する各種方法が知られている。
【０４００】
胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の調節は、各種異なる複数の方法によって達成できる。例えば、これら蛋白質の内のいずれか一方又は両方の濃度を上昇させる場合は、胚を蛋白質に曝露させる、即ち接触させればよい。
【０４０１】
この点に関して、ＢＭＰ−１５という語で表される範囲には、適切な種からのＢＭＰ−１５（卵母細胞や胚と同一種からのＢＭＰ−１５等）や、ＢＭＰ−１５のバリアント（例えば、野生型から一以上のアミノ酸に置換が生じたＢＭＰ−１５の形態）、ＢＭＰ−１５の生物学的活性断片が含まれることが理解されるであろう。ＢＭＰ−１５としては、単離蛋白質、組換え蛋白質、精製又は半精製物、或いは蛋白質複合混合物を構成する一部（卵母細胞からのならし培地中に存在するもの等）とすることができる。
【０４０２】
同様に、ＧＤＦ−９という語で表される範囲には、適切な種からのＧＤＦ−９（卵母細胞や胚と同一種からのＧＤＦ−９等）や、ＧＤＦ−９のバリアント（例えば、野生型から一以上のアミノ酸に置換が生じたＧＤＦ−９の形態）、ＧＤＦ−９の生物学的活性断片が含まれることが理解されるであろう。ＧＤＦ−９としては、単離蛋白質、組換え蛋白質、精製又は半精製物、或いは蛋白質複合混合物を構成する一部（卵母細胞からのならし培地中に存在するもの等）とすることができる。
【０４０３】
同様に、ＢＭＰ−６という語で表される範囲には、適切な種からのＢＭＰ−６（卵母細胞や胚と同一種からのＢＭＰ−６等）や、ＢＭＰ−６のバリアント（例えば、野生型から一以上のアミノ酸に置換が生じたＢＭＰ−６の形態）、ＢＭＰ−６の生物学的活性断片が含まれることが理解されるであろう。ＢＭＰ−６としては、単離蛋白質、組換え蛋白質、精製又は半精製物、或いは蛋白質複合混合物を構成する一部（卵母細胞からのならし培地中に存在するもの等）とすることができる。
【０４０４】
上述のように、これら蛋白質は、精製又は半精製蛋白質として運ばれうる（delivered）。本技術分野においては、これら蛋白質を製造するための各種方法が知られている。これに替えて、これら蛋白質は、一以上の他の成分を含有する抽出物の形態で運ばれ得る。
【０４０５】
また、卵母細胞又は胚が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度、及び／又は卵母細胞若しくは胚におけるこれら依存性シグナル伝達経路の活性を決定することによって、卵母細胞又は胚の発育能力を評価することも可能である。
【０４０６】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、該方法は、次の各段階、
（ｉ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性を決定する段階、及び／又は（ｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び／又は
（ｉｉｉ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−１５依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び／又は
（ｉｖ）卵母細胞内及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性を決定する段階、及び
（ｖ）卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性、及び／又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性により卵母細胞の発育能力を評価する段階、を含み、
卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の上昇、及び／又は卵母細胞内又は卵母細胞に関連する卵丘細胞内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、卵母細胞及び／又は卵母細胞に関連する卵丘細胞が曝露されるＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の低下、及び／又は卵母細胞又は卵母細胞に関連する卵丘細胞の中のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６依存性シグナル伝達経路の活性の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【０４０７】
この場合、発育能力の向上は、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度及び／又は活性の上昇、及び／又はＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５又はＢＭＰ−６シグナル伝達の活性の上昇に関連する。
【０４０８】
ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の濃度又は活性を決定する方法、及び適切なシグナル伝達経路の活性を測定する方法は、本技術分野において各種知られている。
【０４０９】
例えば、ヒトＩＶＦにおいて、使用する卵母細胞は通常裸化され、卵母細胞の発育能力は、受精の前に卵母細胞を含有する培地中のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６のレベルを決定することによって評価できる。ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６のレベルを決定する適切な方法は、ＥＬＩＳＡによるものである。
【０４１０】
従って、別の一形態においては、本発明は、卵母細胞の発育能力を評価する方法であって、
（ｉ）卵母細胞内のＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現レベル、及び／又は卵母細胞が分泌したＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の濃度を測定する段階、及び
（ｉｉ）卵母細胞の発育能力を評価する段階、を含み、
ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の上昇は、高い発育能力を有する卵母細胞であることを示し、ＧＤＦ−９及び／又はＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６の発現及び／又は濃度の低下は、低い発育能力を有する卵母細胞であることを示す方法を提供するものである。
【０４１１】
また、卵丘卵母細胞複合体の膨張を調節する方法であって、次の各段階、
（ｉ）卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性を調節する段階、及び
（ｉｉ）卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する段階、
の内の一以上を含む方法が提供される。
【０４１２】
卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性の調節は、例えば、卵丘卵母細胞複合体内の細胞内シグナル伝達分子Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の一方又は両方のレベル及び／又は活性を調節することによるものとすることができる。
【０４１３】
卵丘卵母細胞複合体の膨張の調節は、インビトロ又はインビボで行うことができる。
【０４１４】
好ましい一形態においては、卵丘膨張の調節は、（ｉ）卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性、並びに（ｉｉ）ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性の一方又は両方を調節する能力を有する剤に卵丘卵母細胞複合体を曝露することによって達成される。
【０４１５】
また、卵丘卵母細胞複合体の膨張を調節する組成物であって、このような剤を含有する組成物も提供される。
【０４１６】
また、本方法は、インビボの卵丘卵母細胞複合体の場合、雌性被験体の排卵を調節するのにも適している。例えば、雌性被験体は、霊長類、家畜動物（ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ等）、伴侶動物（イヌ、ネコ等）、実験動物（マウス、ラット、モルモット等）等の女性のヒトや雌の哺乳類とすることができる。
【０４１７】
従って、雌性被験体の排卵を調節する方法であって、
（ｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性を調節する剤、及び
（ｉｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法も提供される。
【０４１８】
また、雌性被験体の排卵を調節する組成物であって、（ｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性、並びに（ｉｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性、の一方又は両方を調節する能力を有する剤を含有する組成物も提供される。
【０４１９】
また、本方法は、雌性被験体の受胎能の調節にも適している。
【０４２０】
従って、雌性被験体の受胎能を調節する方法であって、
（ｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性を調節する剤、及び
（ｉｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性を調節する剤、の内の一以上を雌性被験体に投与する段階を含む方法も提供される。
【０４２１】
また、雌性被験体の受胎能を調節するための組成物であって、（ｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性、並びに（ｉｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性、の一方又は両方を調節する能力を有する剤を含有する組成物も提供される。
【０４２２】
例えば、本方法は、（ｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体が曝露されるＴＧＦ−β１、ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−１５及びアクチビンの内の一以上の濃度及び／又は活性、並びに（ｉｉ）雌性被験体の卵丘卵母細胞複合体内のＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７受容体の内の一以上により仲介されるシグナル伝達経路の活性、の一方又は両方を阻害する能力を有する剤を使用することにより、雌性被験体の受胎能を低下させることに適している。
【０４２３】
また、このような剤を含有する避妊薬組成物も提供される。
【実施例】
【０４２４】
好ましい実施形態の説明
次に、本発明の上述の一般的原理を具体化する実験について記載する。しかしながら、次の説明によって上述の一般性が限定されるものではないことを理解されたい。
【０４２５】
研究Ｉ  卵母細胞分泌因子は卵丘細胞アポトーシスを防止する
実施例１
ウシ卵母細胞の採取及び培養条件（ＣＯＣの採取及び調製）
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０４２６】
地元の食肉処理場にてウシ卵巣を採取し、温生理食塩水（３０〜３５℃）に入れて実験室に運んだ。５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（シグマ−アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）及び４ｍｇ／ｍＬの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）（ＩＣＰｂｉｏ社、ニュージーランド、オークランド）を添加した約２ｍＬの吸引培地（Ｈｅｐｅｓ緩衝組織培養培地−１９９：ＴＣＭ−１９９、ＩＣＮバイオケミカルズ社、米国カリフォルニア州アーヴィン）を含む１０ｍＬシリンジと１８ゲージ針とを用いて、胞状卵胞（直径２〜８ｍｍ）から卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を吸引した。５層の細胞層を超える密集した卵丘で覆われ、細胞質が均一に着色した無傷のＣＯＣを解剖顕微鏡下で選択し、Ｈｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９で２回洗浄し、対応する培養培地で１回洗浄した。複合体の培養は、予め平衡化し、ミネラルオイルを重層した培養培地（０．２３ｍｍｏｌのピルビン酸ナトリウム（Ｌ-1）及び０．３ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール（ＰＶＡ；シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を添加した重炭酸緩衝ＴＣＭ−１９９）の５０μｇドロップ中で０．１ＩＵ／ｍＬのＦＳＨ（オルガノン社、オランダ）を用いて又は用いずに行い、５％ＣＯ2の加湿空気中、３９℃で２４時間インキュベートした。
【０４２７】
実施例２
卵丘細胞の処理
（ｉ）卵母細胞切除複合体の生成
各卵母細胞の細胞質は、ブッチオネ（Buccione）ら（ブッチオネ（Buccione）ら、（１９９０）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３８、１６−２５）に記載のマイクロマニピュレータを用いて顕微手術的にＣＯＣから除去した（卵母細胞切除）。得られた卵母細胞切除複合体（ＯＯＸ）は、数層の無傷ＣＣ層で囲まれた中空透明帯から成る。
【０４２８】
（ｉｉ）裸化卵母細胞の生成
裸化卵母細胞（ＤＯ）は、２ｍＬのＨ−ＴＣＭ−１９９／ＢＳＡ中で約４分間回転攪拌させてＣＯＣからＣＣを除去することによって生成した。残ったＣＣは、Ｈ−ＴＣＭ−１９９／ＢＳＡ中で卵母細胞を微細径火仕上げ（fire-polished）ガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
【０４２９】
（ｉｉｉ）成長因子及び結合蛋白質
組換えマウスＧＤＦ−９及び組換えヒツジＢＭＰ−１５は、形質移入２９３ヒト胎児腎臓細胞株（２９３Ｈ）を用い、先に記載のように（カイヴォ−オジャ（Kaivo-Oja）ら（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８、７５５−６２；マクナッティ（McNatty）ら（２００５）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２９：４７３−４８０）室内で産生した。組換え蛋白質は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて一部精製した後、その濃度をウェスタンブロット（カイヴォ−オジャ（Kaivo-Oja）ら（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８：７５５−６２）によって推定した。また、非形質移入２９３Ｈ細胞から対照ならし培地（２９３Ｈ）も産生し、ＨＩＣによって精製した。組換えヒトＢＭＰ−６、組換えヒトＢＭＰ−７、ＢＭＰ−６中和抗体、及びグレムリンはＲ＆Ｄシステムズ社（ミネソタ州ミネアポリス）から入手した。
【０４３０】
実施例３
ＴＵＮＥＬによるＤＮＡ損傷の確認（ＴＵＮＥＬによる卵丘細胞内アポトーシスの評価）
ＣＣアポトーシスＤＮＡの検出は、ＴＵＮＥＬ（ロシュ・ダイアグノスティック社、ドイツ、ペンツバーグ）を用い、同社の指示に従って行った。即ち、培養後、ＣＯＣ及びＯＯＸ複合体を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に４℃で一晩固定し、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した後、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋコートカバーガラス（ベクトン・ディッキンソン・バイオサイエンス社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）上に載置した。次に、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の０．１％クエン酸ナトリウム中、室温で１時間、複合体を透過化（permeabilized）し、ＰＢＳ／ＢＳＡで３回洗浄した。次に、暗所にて、フルオレセイン結合ｄ
ＵＴＰ及び末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴＵＮＥＬ試薬、ロシュ社）中、複合体を３７℃で１時間インキュベートした。陽性対照は、全てのＤＮＡを切断するＤＮアーゼ１（０．００５Ｕ／□Ｌ）中、室温で２０分間インキュベートし、ＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄した後、ＴＵＮＥＬを行った。陰性対照は、ＴｄＴの非存在下、フルオレセイン−ｄＵＴＰ中でインキュベートした。ＴＵＮＥＬ終了後、複合体をＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄し、暗所にて室温で１時間、ヨウ化プロピジウム０．５μｇ／ｍＬ（ＰＩ）及びＲＮアーゼＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）で対比染色し、全ての核を標識した。次に、複合体をＰＢＳ／ＢＳＡで２回洗浄し、カバーガラスで軽く挟みながらＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄアンチブリーチング溶液（ベクターラボ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）に入れ、暗所にて４℃で保存し、共焦点解析に備えた。
【０４３１】
実施例４
共焦点顕微鏡法及び解析
共焦点顕微鏡法を用いてＣＯＣ及びＯＯＸにおけるアポトーシスを可視化し、定量した。ニコンＣ１共焦点スキャンヘッド及びニコンＴＥ２０００Ｅ顕微鏡（ニコン社、東京）を用いてＣＣからの二重蛍光発光を検出した。アポトーシスシグナル（フルオレセイン、レーザ励起：４８８ｎｍ、発光：５１０〜５３０ｎｍ）と核シグナル（ヨウ化プロピジウム、励起レーザ：５３２、発光：５９０〜６４０ｎｍ）との同時発光捕獲を行った。
【０４３２】
全ての複合体について総アポトーシス発生率の正確な値（representation）を得るため、各複合体の深さを一連のＺ面（Z series）で測定し、該複合体を２５％、５０％及び７５％にて３個のパーセンタイル（光学Ｚ面断面）に分割した。これらの光学断面画像を取得し、独立したカラーチャネル（緑：アポトーシス卵丘蛍光、赤：核卵丘蛍光）として保存した。次に、得られた画像をスキャナリティクスＩＰＬａｂソフトウェア  バージョン３．６（スキャナリティクス社、バージニア州フェアファックス）で処理した。（各カラーチャネルの）ＣＣ数の定量は、各光学断面パーセンタイル（複合体各々には３個の光学「ｚ」面断面）用の自動分割フィルタを用いたマクロスプリクトによって独立して行った。各スライスについてアポトーシス核の比率を求めた後、３個のパーセンタイル値を平均して複合体全体の総アポトーシス核比率の値を得た。これらのプロセスを各複合体に対して別々に繰り返した。
【０４３３】
実施例５
ウェスタンブロット解析
培養処理後、２５ｍＬのＲＩＰＡ溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＴｒｉｎｔｏｎＸ−１００）にＯＯＸ複合体を溶解し、−８０℃で保存し、高感度増強化学発光（ＥＣＬ）アドバンスシステム（アマシャム・バイオサイエンス社、カナダ、オンタリオ）を用いてアポトーシス蛋白質を検出した。融解したライセートを１００ｍＭジチオスレトール（ＤＴＴ）含有４×ローディングバッファーと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミドゲル）に付した。次に、２０％メタノール含有２５ｍＭＴｒｉｓ−１９２ｍＭグリシン中で蛋白質をニトロセルロース膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ、アマシャム・ライフサイエンス社、カナダ、オンタリオ）に電気移動させた（electrotransferred）。１３．７ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０及び２％ブロッキング剤（ＥＣＬアドバンスキットにて提供）を含有する２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）中、ブロットを室温で１時間ブロックした後、Ｂｃｌ−２又はＢａｘウサギポリクローナル抗体（０．３５μｇ／ｍＬ；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州）と共に４℃で一晩インキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（１：２０００００；Ｓｉｌｅｍｕｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、オーストラリア、メルボルン）と共にインキュベートした。次に、フラットベッドスキャナを用いて画像をスキャンし、各サンプルにおけるＢｃｌ−２及びＢａｘのバンド強度をＩｍａｇｅＪ  Ｉｍａｇｉｎｇシステムソフトウェア  バージョン１．３（米国国立衛生研究所）によって定量した。
【０４３４】
実施例６
卵母細胞切除の卵丘細胞アポトーシスへの影響
無傷ＣＯＣのアポトーシスレベルがＯＯＸと異なるかどうか確認するため、５個のＣＯＣ又はＯＯＸから成る群を５０μＬの培養培地ドロップ中で２４時間培養した後、アポトーシスを評価した。実験は６回反復して行った。
【０４３５】
ＴＵＮＥＬと共焦点走査顕微鏡法の併用は、ＣＣアポトーシスを可視化、定量する上で非常に効果的な手段であることが分かった。ＴＵＮＥＬの陽性対照及び陰性対照（図１Ａ及び１Ｂ；アポトーシスはそれぞれ９９％及び０％）は特異性を示した。ＣＯＣにおいてＣＣアポトーシスの発生率は低く（９％；図１Ｃ）、卵母細胞の除去によりＯＯＸにおいてアポトーシス発生率は３５％へと有意に上昇した（ｐ＜０．００１；図１Ｄ）。培地にＦＳＨを添加することによって、アポトーシス発生率は有意に低下した（ＯＯＸの場合は１０％低下、ＣＯＣの場合は６％低下）（ｐ＜０．００１；図２）。
【０４３６】
実施例７
卵母細胞分泌因子の卵丘細胞アポトーシスへの影響
無傷ＣＯＣにおけるＣＣアポトーシスの低発生率に対してＯＳＦが関与するかどうか確認するため、ＯＯＸの培養をＤＯ数を増加させながら行い、ＣＯＣと比較した。５個のＯＯＸを含有する５０μＬの培地ドロップに５個、２５個又は５０個のＤＯを添加した。実験は３回反復して行った。
【０４３７】
ＣＯＣアポトーシスの抑制に卵母細胞パラクリン因子が関与するかどうか確認するため、ＯＯＸとＤＯとの共培養をＤＯ濃度を上昇させながら行うことによって、ＯＯＸにおけるアポトーシスの発生率をＣＯＣのレベルまで低下させることを試みた。ＤＯ数を増加させながらＯＯＸをインキュベートすることによって、ＣＣアポトーシスは用量依存的に有意に抑制された（ｐ＜０．００１）。ＦＳＨの存在下又は非存在下に関わらず、ＤＯ数が最大の場合（５０個（ＤＯ）／ウェル）にＯＯＸにおけるアポトーシスレベルは完全にＣＯＣのレベルに回復した（図２）。これらの結果から、ＯＳＦがＣＣ内でのアポトーシスを防止することが分かる。
【０４３８】
実施例８
ＯＳＦ源の近接（proximity）に関するアポトーシスのパターン
ＣＣ複合体の卵母細胞への近接に関して該複合体内でのアポトーシスの分布を確認するため、ＣＯＣ（即ち、ＯＳＦの源がＣＣ複合体の中心にある）におけるアポトーシス発生率を定量する一方、ＤＯと共培養したＯＯＸ（即ち、ＯＳＦの源がＣＣ複合体の外側にある）におけるアポトーシス発生率を定量した。共焦点顕微鏡を用い、スキャナリティクスＩＰＬａｂソフトウェア  バージョン３．６によって卵母細胞領域の直径を差し引いた後、複合体の直径を測定した。次に、これを均等な３層、即ち、内部ＣＣ層、中央ＣＣ層及び外部ＣＣ層に分割し、卵母細胞の周囲に３個の環状ゾーンを形成した。各層は全半径の３３％に相当した。次に、アポトーシス発生率を各層で独立して解析した。
【０４３９】
共焦点画像の定性的観察によって、ＣＯＣ内のアポトーシス細胞は主に複合体の外層に分布している一方、ＯＯＸをＤＯと共培養した場合、アポトーシスは内部卵丘層で見られることが示唆された。従って本発明者らは、ＯＳＦによって抗アポトーシス形態形成勾配（morphogenic gradient）がＣＣ層内に構築されるという仮説を立てた。この仮説を検証するため本発明者らは、ＣＯＣ及びＯＯＸ複合体の直径を測定し、これらを３層、即ち、内層、中間層及び外層に分割した（図３Ａ）。無傷卵母細胞を含むＣＯＣ内では、アポトーシスの発生率は内層から外層に向かって有意に（ｐ＜０．０２６）上昇した（図３Ｂ及び３Ｃ）。逆に、ＯＯＸをＤＯと共培養した場合、アポトーシスの発生率は内層から外層（即ち、ＯＳＦの源に最も近い層）に向かって低下した（図３Ｂ及び３Ｄ）。この結果について更に説明すると、ＣＯＣの内層（即ち、卵母細胞に最も近く、アポトーシスの発生率が最も低い層）におけるアポトーシスの発生率は、該層に相対するＯＯＸ＋ＤＯ群の内層（即ち、アポトーシスの発生率が最も高く、ＤＯから最も遠い層）と比べて有意に（ｐ＜０．０２６）４倍低い（図３Ｂ）。
【０４４０】
実施例９
卵丘細胞アポトーシスに対するＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量応答
ＣＯＣで見られたアポトーシスの低発生率に対してどの推定ＯＳＦが寄与し得るか検討するため、ＦＳＨの非存在下又は存在下、ＯＯＸの培養を濃度上昇のＧＤＦ−９（０〜１７５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−６（０〜１００ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ−１５（０〜２０％ｖ／ｖ）と共に行った。また、ＯＯＸに対しては１０％（ｖ／ｖ）２９３Ｈを用いた処理も行ったが、２９３Ｈは親細胞株ならし培地陰性対照としてＧＤＦ−９に対して（１３２ｎｇ／ｍＬに相当）及びＢＭＰ−１５に対して（１０％（ｖ／ｖ）に相当）用いた。これらの実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して１０個のＯＯＸを用いた。
【０４４１】
これらの実験を行い、ＣＣアポトーシスの制御に対する上述の推定ＯＳＦの作用について確認した。ＧＤＦ−９、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の用量を増加させてＯＯＸ複合体を処理した。ＧＤＦ−９は、ＦＳＨの存在下又は非存在下でＣＣアポトーシスの発生率に対して有意な作用を示さず、ＧＤＦ−９の最高用量（１７５ｎｇ／ｍＬ）においても、アポトーシスは２９３Ｈ対照ならし培地群に対して有意差がなかった（図４Ａ、４Ｂ）。ＢＭＰ−６の場合は、ＦＳＨの存在下又は非存在下に関わらず、用量の増加に伴いＣＣアポトーシスは有意に抑制された（ｐ＜０．００１）（図４Ｃ、４Ｄ）。ＢＭＰ−１５の用量を増加させてＯＯＸを処理した場合、ＣＣアポトーシスは用量依存的に有意に抑制され（ｐ＜０．００１）、ＢＭＰ−１５が２０％の時に作用が最大となった（図４Ｅ）。ＢＭＰ−１５をＦＳＨと併用した場合にも同様の応答が見られた（図４Ｆ）。
【０４４２】
実施例１０
Ｂｃｌ−２及びＢａｘ蛋白質のＯＯＸ発現に対するＤＯ、ＧＤＦ−９及びＢＭＰ−１５の作用
本実験を行い、ＴＵＮＥＬによって評価されるＣＣアポトーシスに対する処理の影響が、細胞死や細胞生存を制御する主要蛋白質の発現の変化に付随することを確認した。ＯＯＸに対しては、未処理下での培養、１３２ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９又は１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５による処理下での培養、或いはＤＯ３５個／ウェル又は１０％２９３Ｈ（対照ならし培地）との共培養を２４時間行った後、ウェスタンブロットに付し、Ｂｃ１−２及びＢａｘの発現について解析した。
【０４４３】
本実験を行い、ＯＯＸ複合体のＣＣにおけるＢｃｌ−２及びＢａｘの発現パターンについて検討した。ＯＯＸをＤＯやＢＭＰ−１５と共培養した場合、未処理又はＧＤＦ−９による処理の場合と比べて、ＣＣにおけるＢｃｌ−２蛋白質の発現は有意に（ｐ＜０．００１）高かった（図５）。これに対し、ＣＣにおけるＢａｘ蛋白質の発現は、ＯＯＸをＤＯやＢＭＰ−１５と共培養した場合（この場合、Ｂａｘレベルは殆ど検出できなかった）に比べて、ＯＯＸが未処理であったりＧＤＦ−９と共培養した場合に有意に（ｐ＜０．００１）高くなることが分かった（図５）。これらの結果は、本発明者らによるＴＵＮＥＬの結果を支持する。即ち、ＤＯやＢＭＰ−１５はＣＣアポトーシスの防止に関連するがＧＤＦ−９は関連せず、また、ＤＯやＢＭＰ−１５は細胞生存を支持して（in favour of）Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比を変化させる（オルトヴァイ（Oltvai）ら、１９９３）が、ＧＤＦ−９はＢｃｌ−２／Ｂａｘ比に何ら影響を及ぼさないという結果を支持する。
【０４４４】
実施例１１
スタウロスポリンによって誘導される卵丘細胞アポトーシスに対するＤＯ、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５の作用
予備実験を行い、ウシＣＣに対するスタウロスポリンのアポトーシス作用を確認した（スタウロスポリンは用量依存的に（範囲：０．１〜１００μＭ）アポトーシスを誘導した（データは示さず））。本実験の目的は、ＯＳＦによってＣＣがスタウロスポリン誘導アポトーシスを受けないようにすることができるかどうか確認することであった。ＯＯＸは単独で培養、或いは３５個のＤＯ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６又は１０％（ｖ／ｖ）のＢＭＰ−１５と共培養した後、２４時間インキュベーションの最後の６時間、０．１μＭ又は１．０μＭのスタウロスポリンに曝露した。本実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して１０個のＯＯＸを用いた。
【０４４５】
本実験の目的は、卵母細胞がＣＣをアポトーシス誘導事象から保護することができるかどうか確認すること、また、そのような作用がＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６によって模倣できるかどうか確認することであった。０．１μＭ及び１．０μＭのスタウロスポリンで処理することによって、ＣＣアポトーシスの発生率は４１％からそれぞれ５１％及び７４％に有意に上昇した（ｐ＜０．００１）（図６）。スタウロスポリンで処理したＯＯＸをＤＯと共培養した場合、これら２用量のスタウロスポリンによるアポトーシス誘導作用は完全に否定され、アポトーシスはＣＯＣのレベルまで抑制された。また、ＯＯＸを１０％ＢＭＰ−１５又は１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６で処理し、上述の２用量のスタウロスポリンに曝露した場合、アポトーシスはそれぞれ１７％、２１％（０．１μＭ）及び２５％、３１％（１μＭ）に有意に抑制された（ｐ＜０．００１）。これらの結果から、ＯＳＦの抗アポトーシス作用によってＣＣをアポトーシス傷害から保護することができ、また、ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の両方ともこの作用を模倣することができることが分かる。
【０４４６】
実施例１２
卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰアンタゴニストの作用
フォリスタチンはＢＭＰ−１５及びアクチビンの両方に高親和性で結合し、これらの生物活性に拮抗する（リン（Lin）ら、２００３；オオツカ（Otsuka）ら、２００１）。グレムリンは壁側ＧＣ及びＣＣの両方で発現し、ＢＭＰ−４やＢＭＰ−７を選択的にブロックし（メリノ（Merino）ら、１９９９）、ＢＭＰ−１５に拮抗し得る。本実験の目的は、ＢＭＰ−６やＢＭＰ−１５によって防止されるＣＣアポトーシスに対するこれらのアンタゴニストの有効性について検討することであった。用量増加のフォリスタチン（０〜１００μｇ／ｍＬ）の存在下又は用量増加のグレムリン（０〜４０μｇ／ｍＬ）の存在下でＯＯＸを１０％（ｖ／ｖ）のＢＭＰ−１５と共に培養した。別の実験においては、高用量（２０μｇ／ｍＬ）のＢＭＰ−６モノクローナル中和抗体（ＮＡｂ）の非存在下又は存在下でＯＯＸを１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６で処理した。これらの実験の各々は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して１０個のＯＯＸを用いた。
【０４４７】
これらの実験を行い、ＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６のアンタゴニストがＣＣアポトーシスに対するＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６の抗アポトーシス作用を中和できるかどうか検討した。ＢＭＰ−１５処理ＯＯＸをフォリスタチンの濃度を上昇させながら培養した場合、アポトーシスは用量依存的に有意に（ｐ＜０．００１）増加した（図７Ａ）。１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６と共に培養したＯＯＸ複合体を高用量（２０μｇ／ｍＬ）のＢＭＰ−６中和抗体で処理した。図７Ｂは、ＢＭＰ−６のアンタゴニストが１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６の抗アポトーシス作用を有意に（ｐ＜０．００１）中和したことを示す。
【０４４８】
実施例１３
卵丘細胞に対する卵母細胞の抗アポトーシス作用におけるＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の役割
ＣＣに対する卵母細胞の抗アポトーシス生物活性を中和するため、５０μｇ／ｍＬのフォリスタチン又は２０μｇ／ｍＬのＢＭＰ−６ＮＡｂの存在下又は非存在下、或いはこれら両方のアンタゴニストの存在下でＯＯＸを２５個のＤＯと共培養した。別の実験を行い、ＯＯＸ＋ＤＯと比較してＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６の相加作用について検討した。ＯＯＸはＤＯで処理するか、或いは１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−６及び／又は１０％ｖ／ｖのＢＭＰ−１５で処理した。これらの実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して１０個のＯＯＸを用いた。
【０４４９】
ＣＣに対する卵母細胞の抗アポトーシス作用がＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の両方又はどちらか一方に起因し得るかどうか更に確認するため、ＢＭＰ−６ＮＡｂを用いて又は用いずにフォリスタチンを用いたＯＳＦの中和を試みた。図８Ａは、ＯＯＸを卵母細胞と共培養すると、ＯＯＸ単独の場合と比べてＣＣアポトーシスの発生率が低下し、ＣＯＣ対照の場合に匹敵したことを示す。フォリスタチン単独又はＢＭＰ−６ＮＡｂ単独の場合には、卵丘細胞に対する卵母細胞の抗アポトーシス作用の約５０％に有意に拮抗した（ｐ＜０．００１）。フォリスタチン及びＢＭＰ−６ＮＡｂを共存させた場合にアポトーシスレベルの更なる回復が見られなかったため、これらの作用は相加的ではなかった。
【０４５０】
図８Ａの結果から、卵母細胞分泌ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６はＣＣアポトーシスの防止に対して重複して作用しており、相加的には作用していないことが示唆された。実験を行いこの提案について検証した。ＯＯＸをＤＯと共培養した場合やＢＭＰ−１５単独で処理又はＢＭＰ−６単独で処理した場合には、ＣＣアポトーシスは有意に（ｐ＜０．００１）に抑制された（図８Ｂ）。ＢＭＰ−６とＢＭＰ−１５を併用してＯＯＸを処理した場合、アポトーシスレベルがＢＭＰ−１５単独の場合を超えて更に低下することはなかった（ｐ＞０．０５）が、このことは、これら２種のＢＭＰに相加作用がないことを示唆する。
【０４５１】
実施例１４
卵丘細胞アポトーシスに対するＢＭＰ−７及びそのアンタゴニストであるグレムリンの作用
ＣＣアポトーシスに対するＢＭＰ−７やそのアンタゴニストであるグレムリンの影響について検討するため、２μｇ／ｍＬのグレムリンの存在下又は非存在下でＯＯＸを１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７及び／又は１０％のＢＭＰ−１５で処理した。本実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して１０個のＯＯＸを用いた。
【０４５２】
本実験を行い、ＢＭＰ−１５の存在下でＣＣアポトーシスの制御に対するＢＭＰ−７やそのアンタゴニストであるグレムリンの添加の影響について確認した。ＢＭＰ−７やＢＭＰ−１５は卵丘細胞アポトーシスを有意に抑制した（ｐ＜０．００１；図９）。ＢＭＰ−１５処理ＯＯＸをグレムリンの用量を増加させて培養した場合、アポトーシスは有意に増加しなかった（図９Ａ）。逆に、２μｇ／ｍＬのグレムリンによって１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−７の阻害作用は有意に（ｐ＜０．００１）逆転したが、ＢＭＰ−１５が存在する場合にはそのようなことはなかった（図９Ｂ）。
【０４５３】
実施例１５
統計解析
卵丘細胞アポトーシスの頻度はＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウェア（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いたＡＮＯＶＡによって解析し、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって求め、複数の平均値を比較した。全ての細胞比率データは解析前にアークサイン変換した。ｐ＜０．０５の場合に差は統計的に有意であるとした。
【０４５４】
考察−研究Ｉ
本研究から、卵母細胞切除によってＣＯＣから卵母細胞を除去するとＣＣアポトーシスが実質的に増加することが分かる。しかし、ＯＯＸを卵母細胞と共培養することによってアポトーシスを低レベルに回復させることができ、卵母細胞は用量依存的にアポトーシスの発生率を低下させ、最大濃度（５０個（ＤＯ）／ウェル）で完全にＣＯＣのレベルまで回復する。これらの知見から、低レベルのＣＣアポトーシスは卵母細胞の存在に大きく依存することが分かる。また、このような作用が卵母細胞とＣＣとの直接的な接触のない共培養環境中で見られたことから、ＣＣアポトーシスの特徴的な低発生率は、卵母細胞のＣＣへのギャップ結合性シグナル伝達ではなく、卵母細胞からの可溶性パラクリンシグナルに特異的に起因し得るものである。
【０４５５】
本研究から、ＯＳＦの形態形成勾配を構築することによって卵母細胞がＣＣアポトーシスを積極的に防止することが分かる。第一に、ＣＣアポトーシスの抑制は２種類の方法、即ち、ＴＵＮＥＬ及び定量的共焦点顕微鏡法によって評価した。また、アポトーシスを制御する主要蛋白質の発現はウェスタンブロットによっても確認した。ＯＯＸを卵母細胞に曝露することによって、抗アポトーシスＢｃｌ−２の発現が劇的に誘導された。逆に、アポトーシス促進性のＢａｘの発現はＯＯＸ単独の場合に高く、ＯＳＦによって顕著に抑制された。これらの結果から、細胞生存を支持して（in favour of）Ｂａｘ／Ｂｃｌ−２比を変えることによって卵母細胞はＣＣ内のアポトーシスを防止することが分かる。第二に、卵母細胞の抗アポトーシス作用は卵母細胞位置からの勾配に追随した。無傷ＣＯＣの場合、アポトーシスの発生率はＣＣの最内層で最も低く、卵母細胞からの距離が増加するに伴って上昇した。逆に、ＯＯＸ＋ＤＯの場合、即ち、卵母細胞が複合体の外側にあってＯＯＸが中空である場合、卵母細胞に最も近いＣＣの外層においてアポトーシスレベルが最も低かった。これは、ＣＯＣにおいてＯＳＦの形態形成勾配が非常に局在化していることに関する最初の直接的証拠である。第三に、ＯＳＦはＣＣをアポトーシス傷害から保護することができた。スタウロスポリンは、無差別にＤＮＡ損傷を引き起こすのとは対照的に、（これまで特徴付けられていない）細胞シグナルカスケード経由でアポトーシスを誘導する。ＯＳＦはスタウロスポリンによって誘導されるアポトーシスを防止したが、これは、卵母細胞がＣＣをアポトーシス誘導事象から保護することができることを示す。これらの結果を総合すると、卵母細胞は非常に局所的に作用する強力な抗アポトーシス因子を分泌することが分かる。
【０４５６】
また、培地にＦＳＨを添加することによって、ＣＯＣ及びＯＯＸの両方においてＣＣアポトーシスの発生率が低下した。これは他の研究とも一致し、また、ＦＳＨが卵胞成長を司る不可欠なホルモンであり、卵胞閉鎖の主要因がＦＳＨへの不十分な曝露であるという見解とも一致する。
【０４５７】
ＧＤＦ−９は非常に強力なＧＣマイトジェンであるという事実にもかかわらず、ＧＤＦ−９はＣＣアポトーシスの発生率に対して有意な作用を示さなかった。その代わり、ＣＣアポトーシスは、一般に弱いマイトジェンであるＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７によって顕著に抑制された。本研究によって、ＣＣアポトーシスを防止するのはＧＤＦ−９シグナル伝達ではなくＢＭＰシグナル伝達であるということに関して多方面の証拠が得られた。即ち、１）試験した３種類のＢＭＰは全て、ＣＣアポトーシスの発生率を用量依存的に低下させた、２）ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−１５は両方ともＣＣをスタウロスポリン誘導アポトーシスから保護した、３）ＣＣ抗アポトーシスＢｃｌ−２の発現はＧＤＦ−９ではなくＢＭＰ−１５によって刺激された、一方、４）アポトーシス促進性Ｂａｘの発現はＧＤＦ−９ではなくＢＭＰ−１５によって阻害された。これらの知見は、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘ比が細胞の生死を決定し、ＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６がこの比を制御できるという考えを支持するものである。
【０４５８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーによって活性化される２種類のシグナル伝達経路、即ち、ＢＭＰ経路及びＴＧＦβ／アクチビン経路が存在する。ＧＤＦ−９はＡＬＫ５受容体を介してシグナル伝達し、ＳＭＡＤ２／３分子を活性化し、よって、ＴＧＦ−β様細胞内応答を誘発する。一方、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−６及びＢＭＰ−７はＡＬＫ６及びＢＭＰＲＩＩ受容体を介してシグナル伝達し、もう一方のＳＭＡＤ１／５／８経路を活性化する。従って、ウシＯＳＦはＣＣにおいて両方のシグナル伝達経路を同時に刺激すると思われる。即ち、卵母細胞の抗アポトーシス作用を伝達するＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６によるＳＭＡＤ１／５／８経路の活性化と、卵母細胞の分裂促進シグナルを伝達するＧＤＦ−９によるもう一方のＳＭＡＤ２／３経路の活性化である。
【０４５９】
本研究の更なる目的は、ＣＣアポトーシスを防止するネイティブＯＳＦの同定を試みることであった。従来、ＯＳＦを実際に精製することは不可能であると分かっているため、この同定は、ＣＣに対する卵母細胞の作用を実験的に中和することによって最も容易に行うことができる。フォリスタチンやグレムリン等の数種の高親和性結合蛋白質はＢＭＰの作用に拮抗する。フォリスタチンは卵胞の発育においてＧＣによって高度に発現するが、不活性な複合体を形成することによってアクチビンやＢＭＰ−１５の生物活性を阻害する。本研究においては、フォリスタチン及びＢＭＰ−６中和抗体はそれぞれ、ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６の抗アポトーシス作用に拮抗することができた。グレムリンはＧＣ及びＣＣにおいて発現し、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７のアンタゴニストとして知られているが、ＢＭＰ−１５の抗アポトーシス作用には拮抗しなかった。
【０４６０】
次に、ＢＭＰのアンタゴニストが卵母細胞の抗アポトーシス作用を中和する能力について検討した。フォリスタチンやＢＭＰ−６中和抗体は単独で卵母細胞の抗アポトーシス作用に一部拮抗することができたが、これは、ウシ卵母細胞によるこの作用がＢＭＰ−１５及び／又はＢＭＰ−６に一部起因し得ることを示唆する。このような知見は、これらの卵母細胞分泌分子についての全く新しい機能を説明するものである。ＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６は卵丘細胞アポトーシスの防止に重複して作用していると思われる。これらの組換え蛋白質は一緒に添加した際、アポトーシスに対する相加作用を示さず、また、ネイティブ卵母細胞のＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６を同時に中和した場合、一方のみを中和する作用が増大することはなかった。これらのデータから、内因性のＢＭＰ−１５及びＢＭＰ−６卵母細胞蛋白質が重要な抗アポトーシスＯＳＦであるという最初の直接的証拠が得られる。
【０４６１】
本研究においては、ＢＭＰ−７がＯＳＦではなく、卵胞内で卵胞膜によってのみ発現されるものであっても、ＣＣアポトーシスの防止においてＢＭＰ−７が卵母細胞分泌ＢＭＰ−１５やＢＭＰ−６の作用を模倣し得ることを示す。グレムリンはＢＭＰ−２やＢＭＰ−４の作用に対して非常に有効に拮抗することが知られているが、ＢＭＰ−７の抗アポトーシス作用を中和する一方、ＢＭＰ−１５に対して有効ではなかった。従って、内因性卵母細胞産物であるＢＭＰ−１５のＣＣに対する抗アポトーシス作用は、ＢＭＰ−７とグレムリンの共存によって影響を受けなかった。
【０４６２】
研究ＩＩ  裸化卵母細胞を用いた共培養系におけるウシ卵丘卵母細胞複合体の発育能力：卵母細胞分泌因子の役割
実施例１６
ウシ卵母細胞の採取及び培養条件
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
【０４６３】
地元の食肉処理場にてウシ卵巣を採取し、温生理食塩水（３０〜３５℃）に入れて実験室に運んだ。５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬのヘパリン及び４ｍｇ／ｍＬの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）（ＩＣＰｂｉｏ社、ニュージーランド、オークランド）を添加した約２ｍＬの吸引培地（Ｈｅｐｅｓ緩衝組織培養培地−１９９：ＴＣＭ−１９９、ＩＣＮバイオケミカルズ社、米国カリフォルニア州アーヴィン）を含む１０ｍＬシリンジと１８ゲージ針とを用いて、胞状卵胞（直径２〜８ｍｍ）から卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を吸引した。５層の細胞層を超える密集した卵丘で覆われ、細胞質が均一に着色した無傷のＣＯＣを解剖顕微鏡下で選択し、Ｈｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）を添加したＨｅｐｅｓ−ＴＣＭ１９９で１回洗浄した。卵成熟用基本培地としてはＢｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＭａｔ（クック・オーストラリア社、オーストラリア、クイーンズランド州エイトマイルプレイン）を用いたが、これはウシ卵胞液のイオン組成に基づく培地であり、更に１００μｍのグリシルグルタミン（Ｇｌｕｔａｍａｘ；ギブコ・インビトロジェン社、米国カリフォルニア州カールズバッド）、１００μｍのＮ−アセチル−１−システイン、１００μｍの２−メルカプトエチルアミン、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸（１００×；ギブコ・インビトロジェン社）、２％ｖ／ｖの必須アミノ酸（５０×；ギブコ・インビトロジェン社）、４ｍｇ／ｍＬの無脂肪酸ＢＳＡ、及び５．６ｍｍのグルコースを含有する培地である。全てのＩＶＭ処理には０．１ＩＵ／ｍＬのＦＳＨ（ピュレゴン、オルガノン社、オランダ、オッス）を添加した。複合体の培養は、予め平衡化し、ミネラルオイルを重層した５０ｍＬのドロップ中で行い、５％ＣＯ2の加湿空気中、３９℃で２４時間インキュベートした。
【０４６４】
実施例１７
卵丘卵母細胞複合体の処理
（ｉ）裸化卵母細胞の生成
裸化卵母細胞（ＤＯ）は、２ｍＬのＨ−ＴＣＭ−１９９／ＢＳＡ中で約４分間回転攪拌させてＣＯＣからＣＣを除去することによって生成した。残った卵丘細胞は、Ｈ−ＴＣＭ−１９９／ＢＳＡ中で卵母細胞を微細径火仕上げガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
【０４６５】
（ｉｉ）成長因子
組換えマウスＧＤＦ−９及び組換えヒツジＢＭＰ−１５は、形質移入２９３ヒト胎児腎臓細胞株（２９３Ｈ）を用い、先に記載のように（カイヴォ−オジャ（Kaivo-Oja）ら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８：７５５−７６２；マクナッティ（McNatty）ら（２００５）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  １２９：４７３−４８０）室内で産生した。組換え蛋白質は、最近記載のように（ヒッキー（Hickey）ら、（２００５）Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄオンライン）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて一部精製した後、その濃度をウェスタンブロット（カイヴォ−オジャ（Kaivo-Oja）ら、２００３  ３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８：７５５−７６２）によって推定した。また、非形質移入２９３Ｈ細胞から対照ならし培地（２９３Ｈ）も産生し、ＨＩＣによって精製した。
【０４６６】
（ｉｉｉ）インビトロ受精及び胚培養
全ての実験は、受胎能が示された同一の雄ウシ由来の凍結精液を用いて行った。即ち、液体窒素内で保存したストロー１本分の精液を水浴中で１分間急速に融解した。精液サンプルを不連続（４５％：９０％）パーコール勾配（アマシャム・バイオサイエンス社）の上に重層し、室温にて７００ｇで２０〜２５分間遠沈した。上清を除去し、精子ペレットを５００ｍＬのＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｗａｓｈ（クック・オーストラリア社、オーストラリア、クイーンズランド州エイトマイルプレインズ）で洗浄し、２００ｇで更に５分間遠沈した。精子をＩＶＦ培地（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔ、クック・オーストラリア社）で再懸濁させた後、受精培地ドロップ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｆｅｒｔ（クック・オーストラリア社）に０．０１ｍＭのヘパリン、０．２ｍＭのペニシラミン及び０．１ｍＭのヒポタウリンを添加）に添加し、精子の最終濃度を１×１０6個／ｍＬとした。ＣＯＣの授精はＣＯＣ当りＩＶＦ培地１０ｍＬの培地密度で６％ＣＯ2の加湿空気中、３９℃で２４時間行った。
【０４６７】
授精２３〜２４時間後、卵丘細胞をピペットで優しく除去し、予め平衡化したＣｏｏｋ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｃｌｅａｖｅ培地（改変ＳＯＦａａ、クック・オーストラリア社）の２０μＬドロップに５個の推定（presumptive）接合体を移し、ミネラルオイル下で７％Ｏ2及び６％ＣＯ2（残部Ｎ２）にて３８．５℃で５日間（１日目〜５日目）培養した。
【０４６８】
５日目に、ミネラルオイルを重層し３８．５℃で予め平衡化したＢｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ  Ｂｌａｓｔ（Ｃｏｏｋ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｂｌａｓｔ培地；クック・オーストラリア社）のドロップ（５−６〜２０ｍＬ）の群に胚を移し、８日目まで培養した。８日目に、国際胚移植学会のマニュアルに記載の定義に従って胚の質を評価したが、この評価は熟練したウシ胚培養士によって独立的且つ盲検的に行った。
【０４６９】
実施例１８
統計解析
統計解析はＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウェア（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いたＡＮＯＶＡによって行い、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって求め、複数の平均値を比較した。全ての比率データは解析前にアークサイン変換した。ｐ＜０．０５の場合に差は統計的に有意であるとした。
【０４７０】
実施例１９
ＩＶＭ時の無傷ＣＯＣとＤＯとの共培養が後の胚の発育能力に及ぼす影響
卵母細胞発育能力に対する卵母細胞分泌因子の作用について確認するため、インビトロ成熟（ＩＶＭ）時に卵丘卵母細胞複合体を４処理群に無作為に割り当てた。ＩＶＭ後、全ての複合体及び卵母細胞を受精させ、８日目に形成胚盤胞の質について評価した。
【０４７１】
処理（１）２００ｍＬのドロップ中で２０個の裸化卵母細胞を２４時間培養した（ＤＯ；図１Ａ）。処理（２）２００ｍＬのドロップ中で２０個の卵丘卵母細胞複合体を２４時間培養した（ＣＯＣ；図１Ｂ）。処理（３）２００ｍＬのドロップ中で２０個のＣＯＣを１００個の裸化卵母細胞と０時間から２４時間共培養し、この内、２０個の複合体（ＣＯＣ−０ｈ；図１Ｃ）及び２０個の裸化卵母細胞（ＤＯ−０ｈ；図１Ｄ）をＩＶＭ後に受精させた。処理４、２００ｍＬのＩＶＭ培地中で２０個のＣＯＣを無傷ＣＯＣとして最初の９時間成熟させた。これと並行して、１００個のＣＯＣを９時間成熟させた後に裸化させ、その後、１００個のＤＯを移して２０個のＣＯＣと共にＩＶＭの最後の１５時間成熟させた。処理３に関しては、その後、２０個の複合体（ＣＯＣ−９ｈ；図１Ｅ）及び２０個の裸化卵母細胞（ＤＯ−９ｈ；図１Ｆ）を上述のように受精させた。実験は７回反復して行った。
【０４７２】
１０ｍＬのドロップ中で５個のＤＯと共に１個のＣＯＣを培養すると濃度が０．５個（ＤＯ）／ｍＬドロップとなるが、これは、卵母細胞分泌因子の影響を検討するのに用いる典型的範囲内である。
【０４７３】
結果を表１、図１１及び図１２に示す。
【０４７４】
【表１】
0005841973.tif 000002
【０４７５】
以上のように、授精後胚盤胞ステージに達した卵母細胞の数は、ＣＯＣ単独培養の場合（４０％；図１２）と比べて、無傷卵丘卵母細胞複合体を裸化卵母細胞と共培養（０時間又は９時間）することによって有意に（ｐ＜０．００１；図１２）増加した（それぞれ５０％、６１％）が、これは、裸化卵母細胞から分泌されるパラクリン因子によってＣＯＣが胚盤胞ステージまで発育する能力が向上することを示す。また、裸化前のＩＶＭの最初の９時間、卵母細胞を無傷卵丘細胞と共に成熟させ、その後、ＩＶＭの最後の１５時間、複合体と共に培養することによって、８日目に胚盤胞の数が有意に増加していた。
【０４７６】
（隣接するＣＯＣ由来の）卵丘細胞の存在によってＤＯ（ＤＯ−０ｈ）の発育能力が向上することはなく、胚盤胞率はＤＯ単独培養（ＤＯ）の場合と同様であった（図１２）。ＩＶＭ前に卵丘細胞を除去した場合、授精後胚盤胞ステージに達した卵母細胞の数は無傷ＣＯＣの場合と比べて有意に（ｐ＜０．００１；図１２）減少した（それぞれ１２％、４０％）。胚盤胞率については、ＤＯ単独培養の場合と比べて、裸化前の最初の９時間、卵母細胞を無傷卵丘と共に成熟させた場合に有意に（ｐ＜０．００１；図１２）向上した（それぞれ１２％、２５％）。
【０４７７】
卵母細胞の分裂については、裸化卵母細胞処理間においても、卵丘卵母細胞複合体処理間においても有意差は見られなかった（図１１）が、概して、裸化によってその後の受精率は有意に低下した。しかし、多精子受精の発生率（ＤＮＡ蛍光Ｈ３３３４９で染色した卵母細胞の別々のコホートによって評価）については裸化卵母細胞と卵丘卵母細胞複合体との間で差はなかった（データは示さず）。
【０４７８】
実施例２０
卵母細胞発育能力に対するＧＤＦ−９やＢＭＰ−１５（単独使用及び併用）の作用
ＣＯＣで見られる発育能力に対してどの卵母細胞分泌因子が寄与し得るか検討するため、１０％の２９３Ｈ（対照ならし培地）、１０％のＢＭＰ−１５、１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９又はＢＭＰ−１５＋ＧＤＦ−９の存在下又は非存在下で上述のものと同一のＩＶＭ系を併用して複合体を２４時間培養した。これらの実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して２５個のＣＯＣを用いた。
【０４７９】
表２に示すように、ＢＭＰ１５の単独使用又はＧＤＦ９との併用は、ＣＯＣをＧＤＦ−９単独で処理した場合やＣＯＣをサプリメントの非存在下で成熟させた場合と比べて、授精後胚盤胞ステージに達した卵母細胞の数を増加させる上でより有効であった。
【０４８０】
【表２】
0005841973.tif 000003
【０４８１】
実施例２１
ＴＧＦ−βスーパーファミリー分子による卵丘細胞への卵母細胞パラクリンシグナル伝達は卵丘膨張に不可欠である。
ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、マウス卵丘膨張を可能にする因子（ＣＥＥＦ）の有力候補である。本研究を行い、卵丘膨張を制御するＴＧＦ−βスーパーファミリープロセスについて検討した。ｅＧＧ刺激マウスからＣＯＣを採取し、卵母細胞を顕微手術的に除去して卵母細胞切除（ＯＯＸ）複合体を生成した。確立したスコアリングシステムを用い、０（膨張なし）〜＋４（最大膨張）でＦＳＨ誘導卵丘膨張について評価した。ＦＳＨ単独で処理したＯＯＸ複合体は膨張しなかった（スコア：０）が、有意な（ｐ＜０．０５）膨張誘導がＧＤＦ９（スコア；平均±ＳＥＭ：３．７±０．１）、アクチビンＡ（２．６±０．１）又は卵母細胞との共培養（スコア３．２±０．２）によって生じた。ＧＤＦ９及びアクチビンのタイプＩ受容体はそれぞれＡＬＫ５及びＡＬＫ４である。ＡＬＫ４／５／７キナーゼ阻害剤が卵丘膨張を中和する能力について検証した。データを図１３〜１５に示す。
【０４８２】
図示のように、該阻害剤はＧＤＦ−９や卵母細胞によって誘導される卵丘膨張を完全に中和し（図１３）、また、該阻害剤はＧＤＦ−９や卵母細胞によって誘導される顆粒膜細胞ＤＮＡ合成も完全に抑制した（図１４）。
【０４８３】
また、ＣＡＧＡルシフェラーゼ活性の阻害からも明らかなように、該阻害剤はＴＧＦ−β１、ＧＤＦ９及び卵母細胞によって刺激されるＳｍａｄ２／３分子の活性化も完全に抑制した（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【０４８４】
アクチビンのアンタゴニストであるフォリスタチンもアクチビンに対するＯＯＸ複合体の応答（スコア：０）を中和する上で有効であったが、卵母細胞と共培養したＯＯＸ複合体の膨張（スコア：２．７±０．２）に対して有意な作用は示さなかった（ｐ＞０．０５）。本研究によって、アクチビンが唯一のＣＥＥＦではなく、ＡＬＫ４／５／７経路によるシグナル伝達がマウス卵丘膨張に不可欠であるという証拠が得られる。
【０４８５】
実施例２２
研究ＩＩＩ−マーモセットサル顆粒膜細胞増殖を制御する成長分化因子９シグナル伝達系導入＆目的：
卵母細胞は、隣接する顆粒膜細胞（ＧＣ）に作用するパラクリン成長因子を分泌することによって卵胞の成長や発育を制御する。ヒトや非ヒト霊長類においては、このような卵母細胞因子やそれらが用いるＧＣ受容体／シグナル伝達系の性質について殆ど知られていないが、その主な理由としては卵母細胞や非黄体化ＧＣが少ないことが挙げられる。本研究の目的は、卵母細胞分泌成長分化因子９（ＧＤＦ９）によって用いられる受容体／シグナル伝達系を同定し、コモンマーモセットサル（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）においてＧＣの成長を促進することであった。
【０４８６】
方法：
（ｉ）動物
本研究には７匹の成体雌性マーモセットを用い、クイーンエリザベス病院の動物棟（Animal House）にて飼育した。本研究は地元の動物倫理委員会によって承認され、研究動物のケアと使用についての指導原理に従って行った。
【０４８７】
ｈＦＳＨ（５０ＩＵ／日）を１日２回、６日間注射して雌性マーモセットを刺激し、卵胞期の７日目に全卵巣を摘出した。
【０４８８】
（ｉｉ）ＧＣ培養
卵胞を手作業で切除し、３種類のサイズの卵胞、即ち、洞周囲（periantral）卵胞（ＰＡ；０．４２〜０．６６ｍｍ）、小型胞状卵胞（ＳＡ；０．６６〜１．５ｍｍ）及び大型胞状卵胞（ＬＡ；＞１．５ｍｍ）に分類した。各サイズの卵胞からＧＣを採取しプールした後、０．３ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール（ＰＶＡ、シグマ社）を添加した重炭酸緩衝組織培養培地−１９９（Ｂ−ＴＣＭ）で２回洗浄した。個々の実験に応じて、壁側ＧＣ（１×１０5個（細胞）／ｍＬ）、ホルモン、阻害剤及び培地を９６ウェルプレート（ファルコン社）の各ウェルに添加し、最終体積を１２５μＬとした。各実験においては全ての処理を少なくとも２個のウェルにて行い、各実験は少なくとも３回繰り返した。細胞を３７℃の空気雰囲気（湿度９６％、５％ＣＯ2）中で１８時間培養した後、同一条件下で更に６時間、１５．４ｋＢｑのトリチウム標識チミジン（3Ｈ−チミジン、ＩＣＮ）のパルス標識を行った。培養後、壁側ＧＣを回収し、取り込まれた3Ｈ−チミジンをシンチレーションカウンタによって定量してＳ期の細胞比率の指標とすることにより、壁側ＧＣのＤＮＡ合成及び増殖のレベルが示された（３０）。
【０４８９】
（ｉｉｉ）ＲＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲ
リボソーム蛋白質−Ｌ１９（Ｌ１９）、骨形成蛋白質受容体タイプ２（ＢＭＰＲＩＩ）、アクチビン受容体様キナーゼ５（ＡＬＫ５）及びＳｍａｄ３ｍＲＮＡの発現に対し、顆粒膜細胞についてＲＴ−ＰＣＲによって検討した。ＭＧＣを上述のように採取した。各サイズの卵胞から１００，０００個の細胞を氷上でエッペンドルフチューブに移し、ＲＬＴバッファー（キアゲン社、オーストラリア、クリフトンヒル）に溶解し、液体窒素で急速凍結（snap frozen）した後、−８０℃で保存した。
【０４９０】
マイクロＲＮＡ単離キット（キアゲン社、オーストラリア、クリフトンヒル）を用いてＲＮＡを単離した。この単離においては、２０ｎｇのキャリアＲＮＡを各サンプルに添加した後に均質化を行い、全てのサンプルをＤＮアーゼで処理してゲノムＤＮＡの混入を排除した。
【０４９１】
ＲＮＡの定量は、リボグリーンＲＮＡ定量キット（モレキュラープローブ社、オレゴン州ユージーン）を用い、同社のプロトコルに従って行った。
【０４９２】
７０ｎｇのＲＮＡの逆転写は、ランダムプライマー（ベーリンガー・マンハイム社、ドイツ）及びスーパースクリプトＩＩＲＴキット（ライフテクノロジー社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用い、同社の指示に従って行った。ＲＮＡを水で置換した陰性ＲＴ対照も用いた。
【０４９３】
ＰＣＲ増幅には、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼキット（キアゲン社、オーストラリア、クリフトンヒル）で供給される試薬を用いた。各反応では、２．５μＬのキアゲン１０×バッファー、０．４ｍＭの各ｄＮＴＰ（アプライド・バイオシステムズ社、オーストラリア）、０．５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．５６μＭの各プライマー及び１μＬのｃＤＮＡ（１：４希釈）を用い、超純水（フィッシャー・バイオテック社、オーストラリア、パース）によって最終体積を２５μＬとした。各ＰＣＲ操作においては、ｃＤＮＡを水で置換した陰性ＰＣＲ対照も用いた。ポリメラーゼの最初の活性化を９５℃で５分間行った後、９５℃１分間、６０℃１分間及び７２℃１分間の増幅サイクルを４０回行い、最終伸張段階を７２℃で７分間行った。次に、産物を２％アガロースゲル上で泳動させ、産物の正確なサイズを確認した。最後に、各ＰＣＲ産物を配列決定によって同定した。
【０４９４】
マーモセット配列データが不足していたため、プライマーエクスプレスソフトウェア（ＰＥ、アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、ヒトＬ１９、ＢＭＰＲＩＩ、ＡＬＫ５及びＳｍａｄ３に対してプライマー対を設計し、Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ（オーストラリア、アデレード）によって合成した。全てのプライマー対はイントロンをブラケットするように設計した。本研究に用いたプライマーのオリゴヌクレオチド配列を表１に示す。
【０４９５】
（ｉｖ）ルシフェラーゼ
特定のリン酸化Ｓｍａｄに応答するルシフェラーゼレポーター構築物を用い、組換えＧＤＦ９による壁側ＧＣＳｍａｄ蛋白質の活性化を検出した。ＤＭＥＭ（ＭＰバイオメディカルズ社、オーストラリア、セブンヒルズ）＋２％ＦＣＳ（トレース・バイオサイエンス社、オーストラリア、キャッスルヒル）で細胞を最終洗浄した以外は、上述同様に壁側ＧＣを採取し処理した。最終洗浄後、細胞を９６ウェルプレート（ファルコン社）の個々のウェルに移し、１．６×１０5個（細胞）／ｍＬで培養した。４時間培養後、Ｆｕｇｅｎｅ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社、オーストラリア、キャッスルヒル）を用いて５０ｎｇのルシフェラーゼレポーター構築物ＤＮＡを細胞に一過的に形質移入した。形質移入１８時間後、培地を細胞から吸引し、０．１％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭで置換した。この時点で細胞に様々なリガンドを添加し（以下参照）、培養期間を更に４８時間延長した。ウェルから培地を除去し、プレートを−２０℃で凍結させることによって実験を終了させた。細胞を回収するため、１００μＬの溶解バッファーを各ウェルに添加し、プレートをロッキングプラットフォーム上で室温にて２０分間インキュベートした。２０μＬの細胞ライセートを用い、Ｇａｌａｘｙｓｔａｒルミノメーター（ＧＭＢラブテクノロジーズ社、ドイツ、オッフェンブルク）によってルシフェラーゼ活性を測定した。
【０４９６】
（ｖ）統計
７匹の成体雌性マーモセットをｈＦＳＨで６日間刺激し、７日目に全卵巣を除去し、卵胞を手作業で切除した後、３種類のサイズの卵胞、即ち、洞周囲（periantral）卵胞（ＰＡ；０．４２〜０．６６ｍｍ）、小型胞状卵胞（ＳＡ；０．６６〜１．５ｍｍ）及び大型胞状卵胞（ＬＡ；＞１．５ｍｍ）からＧＣを採取した。４種類のアプローチを用い、ＧＣにおけるＧＤＦ９の機能について検討した。卵母細胞、卵丘細胞（ＣＣ）及びＧＣからＲＮＡを抽出し、ヒトプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲに付し、他種においてＧＤＦ９シグナル伝達に関与することが示唆されている受容体／細胞内シグナル伝達分子の発現を確認した。ＧＤＦ９シグナル伝達経路について検討するため、ＬＡ卵胞由来の培養ＧＣにＣＡＧＡ−ルシフェラーゼレポーター構築物又はＢＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物を形質移入し、様々なＴＧＦ−βスーパーファミリー成長因子による処理、或いはマウス卵母細胞との共培養を行った。マーモセットＧＣ増殖に対するＧＤＦ９の作用について確認するため、ＧＣバイオアッセイを用い、２４時間後の3Ｈ−チミジンの取り込みをＤＮＡ合成及び細胞増殖の指標として評価した。様々な濃度のＧＤＦ９で細胞を処理したが、この処理はＧＤＦ９単独で、或いはＦＳＨ及び／又はＩＧＦ１と共に行った。他の実験においては、ＧＤＦ９＋／−ＩＧＦ１の存在下、ＧＣをＳＢ４３１５４２（アクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）４／５／７阻害剤）で用量を増加させながら処理した。
【０４９７】
結果：
実験１：卵母細胞によるＧＤＦ９ｍＲＮＡの発現
洞周囲卵胞、小型胞状卵胞又は大型胞状卵胞から回収した裸化卵母細胞由来のｃＤＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを行った。予想通り、どのサイズの卵胞由来の卵母細胞もＧＤＦ９ｍＲＮＡを発現した（図１６）。配列決定によってＰＣＲ産物を同定した。
【０４９８】
実験２：ＧＣによるＧＤＦ９シグナル伝達経路分子の発現
本実験を行い、小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞由来のＧＣが主要なＧＤＦ９シグナル伝達経路分子（即ち、骨形成蛋白質受容体ＩＩ、ＡＬＫ５及びＳｍａｄ３）のｍＲＮＡを発現するかどうか確認した。小型胞状卵胞及び大型胞状卵胞の両方に由来するＧＣにおいて、これら３種類の転写物全てのｍＲＮＡ発現が検出された（図１７）。全てのＰＣＲ産物の配列決定を行った結果、対応するヒト配列と相同性を示した。
【０４９９】
実験３：Ｓｍａｄ細胞内シグナル伝達経路の活性化
本実験を行い、大型胞状卵胞由来のＧＣがＴＧＦ−β及び／又はＢＭＰシグナルに応答することができるかどうか確認した。ＣＡＧＡ又はＢＲＥルシフェラーゼプラスミド構築物を細胞に形質移入した後、ＴＧＦ−β１、ＧＤＦ９、ＢＭＰ７又は卵母細胞で処理した。ＣＡＧＡ−ルシフェラーゼ活性は、ＴＧＦ−β１、卵母細胞及びＧＤＦ９によって対照レベルよりそれぞれ１９倍、６倍及び５倍刺激されたが、ＢＭＰ７によっては刺激されなかった（図１８Ａ）。逆に、ＢＲＥ−ルシフェラーゼ活性は、ＢＭＰ７によって対照レベルと比べて３１倍刺激されたが、ＴＧＦ−β１、ＧＤＦ９又は卵母細胞によっては活性化されなかった（図１９Ｂ）。
【０５００】
実験４：ＧＤＦ９はＴＧＦ−β／アクチビンシグナル伝達経路を介して顆粒膜細胞増殖を刺激する：
次に、ＡＬＫ４／５／７キナーゼ阻害剤を用い、ＧＤＦ９がＴＧＦ−β／アクチビンシグナル伝達経路を介してＧＣ増殖を促進するという別方面の証拠を得た。阻害剤ＳＢ４３１５４２はＡＬＫ６の活性に影響を及ぼすことなく、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７のキナーゼ活性に特異的に拮抗する（インマン（Inman）２００２）。マウスにおいてＳＢ４３１５４２はＴＧＦ−β１、ＧＤＦ９及び卵母細胞によって刺激される壁側ＧＣ成長を用量依存的に阻害することを先に示した。本研究においては、大型胞状卵胞由来のマーモセットＧＣを用い、ＧＤＦ９によって刺激されるＤＮＡ合成がＳＢ４３１５４２の存在下で用量依存的に阻害されることも示した（図１８）。このキナーゼ阻害剤は濃度１μＭでＧＤＦ９の刺激作用を完全に排除することができる。
【０５０１】
実験５：洞周囲卵胞由来の壁側顆粒膜細胞はより高い分裂促進指数（mitogenic index）を有する
本実験においては、異なるサイズの卵胞に由来する壁側顆粒膜細胞がＧＤＦ９の成長促進活性に応答する能力について検討した。概して、ＤＮＡ合成率は大型卵胞由来のＧＣにおいて最も低く（３９９ｃｐｍ／１２，５００個（細胞））、洞周囲卵胞由来のＧＣにおいて最も高かった（５９３６ｃｐｍ／１２，５００個（細胞））（図１９）。
【０５０２】
壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９及び卵胞サイズの影響：
図２０は、小型及び大型胞状卵胞由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９で用量を増加させながら（０〜３５０ｎｇ／ｍＬ）２４時間処理したことを示す。培養期間の最後に3Ｈ−チミジン取り込みを測定した。各ポイントは７回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【０５０３】
壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９のＦＳＨ及び／又はＩＧＦ１との併用の影響：
図２１は、壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９のＦＳＨ及び／又はＩＧＦ−１との併用の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）、ｒｈＦＳＨ（５０ｍＩＵ／ｍＬ）及びＩＧＦ−１（２５ｎｇ／ｍＬ）の組合せと共に２４時間培養した。各バーは７回の反復実験から得た平均ｃｐｍ／１２，５００個（細胞）＋／−ＳＥＭを示す。
【０５０４】
壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９＋／−ＢＭＰ１５の影響：
図２２は、壁側顆粒膜細胞ＤＮＡ合成に対するＧＤＦ９＋／−ＢＭＰ１５の影響を示す。小型胞状卵胞（Ａ）又は大型胞状卵胞（Ｂ）由来の壁側ＧＣをＧＤＦ９（１７５ｎｇ／ｍＬ）又はＢＭＰ１５（１０％）の一方のみ、或いは両方の組合せと共に培養した。各バーは３回の反復実験の平均＋／−ＳＥを示す。
【０５０５】
結論：
本研究によって、卵母細胞分泌因子ＧＤＦ９が霊長類顆粒膜細胞増殖を刺激する分子基盤が特徴付けられる。卵胞発育の初期から後期において、マーモセットのＣＣ及びＧＣはＧＤＦ９に対する応答に必要な分子成分を有する。実際、ＧＤＦ９はどのサイズの卵胞においてもＧＣＤＮＡ合成を刺激するが、小型卵胞において最も顕著であり、特にＩＧＦ１との相乗作用が顕著である。マーモセットＧＣは排卵前に分化するに従いＧＤＦ９に対して不応となる。ＧＤＦ９は、ＴＧＦ−βシグナル伝達系の成分を用い、ＴＧＦ−β様細胞内応答を誘導することによってマーモセットＧＣ増殖を調節する。
【０５０６】
実施例２３
研究ＩＶ−卵母細胞分泌因子は卵母細胞発育能力を高める
材料及び方法：
卵母細胞の採取及び培養条件
特に明記しない限り、全ての化学薬品及び試薬はシグマ社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。地元の食肉処理場にてウシ卵巣を採取し、温生理食塩水（３０〜３５℃）に入れて実験室に運んだ。５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬのヘパリン及び４ｍｇ／ｍＬの無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ；ＩＣＰｂｉｏ社、ニュージーランド、オークランド）を添加した約２ｍＬの吸引培地（Ｈｅｐｅｓ緩衝組織培養培地−１９９：ＴＣＭ−１９９、ＩＣＮバイオケミカルズ社、米国カリフォルニア州アーヴィン）を含む１０ｍＬシリンジと１８ゲージ針とを用いて、胞状卵胞（直径３〜８ｍｍ）からＣＯＣを吸引した。約５層の細胞層を超える密集した卵丘で覆われ、細胞質が均一に着色した無傷のＣＯＣを解剖顕微鏡下で選択し、Ｈｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９で２回洗浄し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）を添加したＨｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９で１回洗浄した。卵成熟用基本培地としてはＢｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＭａｔ（クック・オーストラリア社、オーストラリア、クイーンズランド州エイトマイルプレイン）、即ち、ウシ卵胞液のイオン組成に基づく培地を用いた。全てのＩＶＭ処理は０．１ＩＵ／ｍＬのＦＳＨ（ピュレゴン、オルガノン社、オランダ、オッス）を添加して行った。複合体の培養は、予め平衡化し、ミネラルオイルで重層した３００□Ｌのドロップ中で行い、５％ＣＯ2の加湿空気中、３９℃で２４時間インキュベートした。
【０５０７】
裸化卵母細胞の生成
裸化卵母細胞（ＤＯ）は、２ｍＬのＨｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９中で約４分間回転攪拌させてＣＯＣからＣＣを除去することによって生成した。残ったＣＣは、Ｈｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ−１９９中で卵母細胞を微細径火仕上げガラスピペットを繰り返し通過させることによって除去した。
【０５０８】
成長因子＆アンタゴニスト
組換えマウスＧＤＦ９及び組換えヒツジＢＭＰ１５は、Ｏ．リトヴォス（O．Ritvos）（ヘルシンキ大学）から当初提供された形質移入２９３ヒト胎児腎臓細胞株（２９３Ｈ）を用い、先に記載のように室内で産生し、一部精製した。非形質移入２９３Ｈ細胞から対照ならし培地（以下「２９３Ｈ」と称する）を産生し、ＧＤＦ９やＢＭＰ１５のならし培地と同様のクロマトグラフィー手順に付した。
【０５０９】
グラクソ・スミスクライン社（英国、スティーベネッジ）から十分に提供されたＳＢ−４３１５４２は競合的ＡＴＰ結合部位キナーゼ阻害剤として作用し、ＡＬＫ１、２、３又は６或いは他の細胞キナーゼの活性に影響を及ぼすことなく、アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）４、５及び７の活性に特異的に拮抗する。その結果、ＳＢ−４３１５４２はＢＭＰシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、ＡＬＫ４／５のリガンド、即ち、ＴＧＦ−β１、上述のアクチビン及びＧＤＦ９に強く拮抗する（インマン（Inman）ら、２００２；ギルクリスト（Gilchrist）ら、２００６）。最近、ＳＢ−４３１５４２が顆粒膜細胞に対するネイティブＯＳＦやＧＤＦ９の成長促進作用に完全に拮抗することを示した。Ｓ．シマサキ（米国カリフォルニア大学サンディエゴ校）からフォリスタチン−２８８が十分に提供されたが、この結合蛋白質がＣＣにおいてネイティブＯＳＦや組換えＢＭＰ１５の生物活性に拮抗することは先に示した。
【０５１０】
インビトロ受精及び胚培養
胚のインビトロ産生は所定の無血清培地（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｖｉｔｒｏ培地シリーズ、クック・オーストラリア社）を用いて行った。全ての実験においては、受胎能が示された単一の雄ウシ由来の凍結精液を用いた。即ち、融解精液を不連続（４５％：９０％）パーコール勾配（アマシャム・バイオサイエンス社）の上に重層し、室温（ＲＴ）にて７００ｇで２０〜２５分間遠沈した。上清を除去し、精子ペレットを５００μＬのＢｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＷａｓｈ（クック・オーストラリア社）で洗浄し、２００ｇで更に５分間遠沈した。精子をＩＶＦ培地（Ｂｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＦｅｒｔ、クック・オーストラリア社）で再懸濁させた後、受精培地ドロップ（Ｂｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＦｅｒｔに０．０１ｍＭのヘパリン、０．２ｍＭのペニシラミン及び０．１ｍＭのヒポタウリンを添加したもの）に添加し、精子の最終濃度を１×１０6個／ｍＬとした。ＣＯＣの授精はＣＯＣ当りＩＶＦ培地１０μＬの密度で６％ＣＯ2の加湿空気中、３９℃で２４時間行った。
【０５１１】
授精２３〜２４時間後、ＣＣをピペットで優しく除去し、予め平衡化したＣｏｏｋ  Ｂｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＣｌｅａｖｅ培地（クック・オーストラリア社）のドロップ（２０μＬ）に５個の推定接合体を移し、ミネラルオイル下で７％Ｏ2及び６％ＣＯ2（残部Ｎ2）にて３８．５℃で５日間（１日目〜５日目）培養した。
【０５１２】
５日目に、ミネラルオイルで重層し３８．５℃で予め平衡化したＢｏｖｉｎｅ  ＶｉｔｒｏＢｌａｓｔ（クック・オーストラリア社）のドロップ（５−６〜２０μＬ）の群に胚を移し、８日目まで培養した。８日目に、国際胚移植学会のマニュアル（ストリングフェロー（Stringfellow）、１９９８）に記載の定義に従って胚の質を評価したが、この評価は熟練したウシ胚培養士によって独立的且つ盲検的に行った。
【０５１３】
分染法
細胞計数は、（フォウラディ−ナシュタ（Fouladi-Nashta）ら、２００５）に記載の技法の修正版を用いて行った。即ち、膨張／孵化した胚盤胞を酸性タイロード液に入れて帯を除去した後、４ｍｇ／ｍＬのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）リン酸バッファー生理食塩水溶液（ＰＢＳ／ＰＶＡ）で簡単に洗浄した。次に、帯除去（Zona-free）胚を１０ｍＭのトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）ＰＢＳ／ＰＶＡ溶液中、４℃で１０分間インキュベートした。この後、胚を０．１ｍｇ／ｍＬの抗ジニトロフェノールＢＳＡ抗体（モレキュラープローブ社、米国オレゴン州ユージーン）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。モルモット補体を用いた補体媒介溶解後、胚を洗浄し、１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム中、３７℃で２０分間インキュベート（栄養外胚葉を染色）し、その後、４μｇ／ｍＬのビスベンズイミド（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２；シグマ−アルドリッチ社）１００％エタノール溶液中、４℃で一晩インキュベート（内部細胞塊（ＩＣＭ）及び栄養外胚葉の両方を染色）した。次に、顕微鏡スライド上で８０％グリセロールＰＢＳのドロップに胚を全載し、カバーガラスをマニキュア液でシールした。次に、ＵＶフィルタ及びデジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡（オリンパス社、東京）下（４００倍）で胚を観察し、全細胞数及びコンパートメント細胞数を求めた（内部細胞塊（ＩＣＭ）核は青く見え、栄養外胚葉（ＴＥ）核はピンクに染色された）。
【０５１４】
実験１：ＩＶＭ時の無傷ＣＯＣとＤＯとの共培養が後の発育能力に及ぼす影響
卵母細胞発育能力に対するネイティブＯＳＦの作用について確認するため、ＩＶＭ時にＣＯＣを２処理群に無作為に割り当てた。即ち、処理（１）においては、３０個のＣＯＣを３００μＬのドロップ中で２４時間培養し、処理（２）においては、３０個のＣＯＣを３００μＬのドロップ中、１５０個のＤＯと０〜２４時間共培養し、その後、３０個の複合体を除去し、受精させた（図２４）。処理２によって、１０μＬのドロップ中で５個のＤＯに対しＣＯＣは１個となり、濃度が０．５個（ＤＯ）／μＬとなるが、これは、ＯＳＦの影響を検討するのに必要な範囲内である。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、８日目に形成胚盤胞の数及び質について評価した。実験は６回反復して行った。
【０５１５】
実験２：卵母細胞発育能力に対するＩＶＭ時のＢＭＰ１５及び／又はＧＤＦ９の作用
本実験を行い、外因性組換えＯＳＦであるＧＤＦ９及び／又はＢＭＰ１５をＩＶＭ時に添加することによって後の卵母細胞発育能力が向上するかどうか確認した。上述の基本ＩＶＭ培地中でＣＯＣを２４時間培養しながら、更に以下の処理を行った。１）処理無し（対照）、２）１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９、３）１０％ｖ／ｖのＢＭＰ１５、４）１０％ｖ／ｖのＢＭＰ１５と１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−９、及び５）１０％ｖ／ｖの２９３Ｈ。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、８日目に形成胚盤胞について評価した。これらの実験は４回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して５０個のＣＯＣを用いた。
【０５１６】
実験３＆４：卵母細胞発育能力に対するＧＤＦ９やＢＭＰ１５のアンタゴニストの作用
本実験の目的は、（１）無傷ＣＯＣ内で卵母細胞によって分泌されるＧＤＦ９やＢＭＰ１５を阻害することの後の発育に及ぼす影響について検討することと、（２）組換えＯＳＦは純粋ではないため、ＣＯＣに対する該ＯＳＦの作用を特異的に中和することであった。４μＭのＳＢ−４３１５４２（ＧＤＦ９のアンタゴニスト）の存在下又は非存在下、ＣＯＣの培養を単独で、或いは１７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ９又は１０％ｖ／ｖの２９３Ｈと共に行った。別の実験においては、ＩＶＭ時に１０μｇ／ｍＬのフォリスタチン−２８８の存在下又は非存在下、ＣＯＣの培養を単独で、或いは１０％ｖ／ｖのＢＭＰ１５又は１０％ｖ／ｖの２９３Ｈと共に行った。ＩＶＭ後、全ての複合体を受精させ、８日目に形成胚盤胞について評価した。これらの実験は３回反復して行ったが、その際、１回の反復実験に付き１処理群に対して６０個のＣＯＣを用いた。
【０５１７】
統計解析
反復実験による発育比率データは全て解析前にアークサイン変換した。統計解析はＳｉｇｍａＳｔａｔソフトウェア（ＳＰＳＳ社、イリノイ州シカゴ）を用いたＡＮＯＶＡによって行い、平均値間の有意差はチューキー−クレーマーｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定によって求め、複数の平均値を比較した。ｐ＜０．０５の場合に差は統計的に有意であるとした。
【０５１８】
結果：
実験１：ＩＶＭ時の無傷ＣＯＣとＤＯとの共培養が後の発育能力に及ぼす影響
ＤＯ由来のネイティブＯＳＦに無傷ＣＯＣを曝露することによって、授精後胚盤胞ステージに達した卵母細胞の比率は、ＣＯＣを単独で培養した場合（３９％）に比べて有意に（ｐ＜０．００１）上昇した（５１％）。また、後に続く胚盤胞の細胞数は有意に（ｐ＜０．０５）増加し、総細胞数及び栄養外胚葉の細胞数は対照ＣＯＣと比べて増加した。しかし、卵母細胞の分裂はＩＶＭ時のＯＳＦへの曝露には有意に影響を受けなかった（ｐ＞０．０５）。
【０５１９】
実験２：卵母細胞発育能力に対するＩＶＭ時のＢＭＰ１５及び／又はＧＤＦ９の作用
成熟ＣＯＣへＢＭＰ１５を添加することによって、その胚盤胞ステージへの発育が劇的に高まり（ｐ＜０．０５）、対照ＣＯＣと比べて１６％、２９３Ｈ処理ＣＯＣと比べて３０％高まった。親２９３Ｈ細胞株由来のならし培地は卵母細胞発育ポテンシャルに悪影響を及ぼし、対照ＣＯＣと比べて胚盤胞率が１４％低下した（ｐ＜０．００１）。また、ＧＤＦ９によっても胚盤胞率が２９３Ｈ処理ＣＯＣと比べて上昇した（ｐ＜０．０５）が、ＣＯＣ単独培養と比べて上昇は見られなかった。胚盤胞率に対するＧＤＦ９の相加作用はＢＭＰ１５単独の場合を超えることはなかった。卵母細胞の分裂は処理群によって有意に影響を受けることはなかったが、２９３Ｈ対照ならし培地に曝露した卵母細胞においては分裂率が顕著に低かった。
【０５２０】
実験３＆４：卵母細胞発育能力に対するＧＤＦ９やＢＭＰ１５のアンタゴニストの作用
先の実験２で見られた、ＩＶＭ時の２９３Ｈ添加による分裂率への悪影響は、これらの両方の実験でも見られ、対照群からの差は有意であった（２要因ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５；図２５Ａ及び２６Ａ）。ＧＤＦ９のアンタゴニストであるＳＢ−４３１５４２（ＡＬＫ４／５／７阻害剤）は卵母細胞の分裂率に対して影響を及ぼさなかった（ｐ＞０．０５；図２５Ａ）。これに対し、ＣＯＣをフォリスタチンで処理した場合、ＢＭＰ１５処理に関わらず、卵母細胞の分裂率は有意に低下した（フォリスタチン、７１．８±１．３；対照、７６．２±１．３；ｐ＝０．００７；図２６Ａ）。実験２と合致するように、ＣＯＣをＧＤＦ９で処理した場合、対照と比べて分裂率が有意に変化することはなく、ＢＭＰ１５で処理した場合にもフォリスタチンの作用に関係無く有意な変化は見られなかった（図２５Ａ及び２６Ａ）。
【０５２１】
対照ＣＯＣをＳＢ−４３１５４２又はフォリスタチンで処理した場合、未処理ＣＯＣと比べて胚盤胞発育が有意に（ｐ＜０．０５）抑制されたが、これは、ＳＢ−４３１５４２又はフォリスタチンがそれぞれ、卵母細胞によって分泌された内因性ＧＤＦ９又はＢＭＰ１５の作用を少なくとも一部中和することができたことを示唆する（図２Ｂ＆３Ｂ）。実験２と合致するように、これらの実験においては、外因性のＧＤＦ９及びＢＭＰ１５の両方によって胚盤胞率が上昇した（ｐ＜０．０５）（図２５Ａ及び２６Ａ）が、それぞれのアンタゴニストを添加することによってこのような上昇はなくなった。ＳＢ−４３１５４２又はフォリスタチンを添加することによって、胚盤胞発育が未処理対照ＣＯＣと同様のレベルまで抑制されるだけでなく、胚盤胞率もアンタゴニストで処理した対照ＣＯＣのレベルまで低下した（図２５Ｂ＆２６Ｂ）。これは、卵母細胞発育能力に対する外因性及び内因性のＧＤＦ９やＢＭＰ１５の作用をＳＢ−４３１５４２やフォリスタチンが中和していることを示唆する。２９３Ｈと共に成熟させたＣＯＣからの胚盤胞発育率は、ＳＢ−４３１５４２やフォリスタチンの添加に関わらず実質的に低下した（ｐ＜０．０５）（図２５Ｂ＆２６Ｂ）。
【０５２２】
実施例２４
研究Ｖ−卵母細胞のインビトロ成熟時の外因性ＧＤＦ９は後の胚発育及び胎仔の結果（fetal outcome）を改善する
胚の増殖能力は、その発生源である卵母細胞の発育能力に依存する。最近、卵母細胞とその体細胞との間の双方向制御ループの存在及び必要性がますます明らかになっている。本研究の目的は、マウス卵母細胞インビトロ成熟（ＩＶＭ）時に添加する卵母細胞パラクリン因子である成長分化因子９（ＧＤＦ９）が後の胚や胎仔の発育に及ぼす作用について評価することであった。
【０５２３】
成熟期前（ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６ハイブリッド）マウスの胞状卵胞からｅＣＧ後４６時間でＣＯＣを吸引し、５０ｍＩＵ／ｍＬのＦＳＨ／１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、組換えマウスＧＤＦ９（２００ｎｇ／ｍＬ）又は等量ｖ／ｖの対照親細胞株２９３Ｈならし培地を用いて又は用いずに、ウェイマウス培地＋５％ＦＣＳ中、６％ＣＯ2及び５％Ｏ2にて３７℃で１７時間成熟させた。次に、卵母細胞（ｎ＝１１０６）を受精させ、Ｇ１．２／Ｇ２．２培地中、６％ＣＯ2及び５％Ｏ2にて３７℃で胚盤胞ステージまで培養した。胚盤胞をプールし、偽妊娠雌性Ｓｗｉｓｓマウスへの移植、或いは分染を行った。妊娠の結果は妊娠１５日目に評価した。
【０５２４】
ＧＤＦ９の作用はＦＳＨ／ＥＧＦの存在に依存した。ＦＳＨ／ＥＧＦを用いた場合、ＧＤＦ９によって卵丘膨張が増大した（卵丘膨張指数３．１±０．１ｖｓ２．４±０．１；ｐ＜０．０５）。ＧＤＦ９は受精、発育率又は胚盤胞率に対しては有意な作用を示さなかった（８３％ｖｓ７５％）が、ＧＤＦ９によって胚盤胞の総細胞数は有意に増加し（ｐ＝０．０５）、胚盤胞の内部細胞塊において（ｐ＝０．００３）栄養外胚葉の細胞数（ｐ＝０．０７）とは大きく異なった。従って、ＧＤＦ９の添加によって、着床は影響を受けなかった（８３％ｖｓ７７％）が、胎仔発育はほぼ２倍になった（３９％ｖｓ２１％；ｐ＝０．０４）。
【０５２５】
本研究から、ＦＳＨ／ＥＧＦの存在下、ＩＶＭ時の外因性ＧＤＦ９によって胚盤胞の質及び後の胎仔生存率（fetal viability）が改善されることが分かる。これらの知見は卵母細胞と体細胞との適切な相互作用の重要性を強調するものであり、更に、ＩＶＭ卵母細胞の発育能力の低下がＧＤＦ９の欠乏に一部起因し得るため、ＩＶＭ培養培地の開発に重要な影響をもたらすことにもなる。
【０５２６】
最後に、本発明の範囲や精神から逸脱することなく、本発明の上述の方法や組成物について様々な変更や変形がなされることが当業者には明らかであることはいうまでもない。本発明を具体的な好ましい実施形態に関して説明してきたが、当然のことながら、特許請求の範囲で請求された本発明はこのような具体的な実施形態に不当に限定されるものではない。実際、当業者には明らかな、本発明を実施するための上述の態様の様々な変更は本発明の範囲内にあるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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