(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種真菌株であって、ＭＴＣＣ、ブタペスト条約の下で承認されている国際寄託機関に寄託されている真菌株。
【請求項２】
受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種に由来するプロテアーゼの調製方法であって、
ａ）０．１５〜８０％の炭素供給源と、０．１５〜８０％の窒素供給源と、発酵の誘導物質とを含む培地においてビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４を、５．０〜９．０の範囲のｐＨ、１５〜３２℃の間の範囲の温度、好気性条件下で、２〜７日間の範囲の期間培養する工程を含み、
ｂ）工程（ａ）において得られた培地を回収する工程と、
ｃ）工程（ｂ）において得られた回収物から遠心分離により上清を得て、該上清を硫酸アンモニウム沈殿させ、得られた硫酸アンモニウム沈殿物をＤＥＡＥ−セルロースカラムに供することによって前記プロテアーゼを分離／抽出する工程と、
を含む方法。
【請求項３】
ビューベリア種を培養する工程が、液内条件または固体状発酵下で行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記炭素供給源が、
グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースおよびアラビノースからなる群から選択される糖、
グリセロール、マンニトールおよびソルビトールからなる群から選択される糖アルコール、
デンプン、キシランおよびヘミセルロースからなる群から選択される多糖、
オリーブオイル、ヒマワリ油、大豆油、ゴマ油、カラシ油、ヒマシ油、ココナッツオイル、ラッカセイ油、トリブチリンの群から選択されるオイルおよび脂肪、ならびに
ラッカセイミール、フスマ、米ぬか、ジャガイモ廃棄物、トウモロコシ粉、大豆ミール、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、乳製品、家禽、食肉からなる群から選択される農業廃棄物、
食品加工段階における廃棄物、
毛髪または羽毛から選択されるケラチンを主成分とする廃棄物、
酸性の膨潤したキチンおよびキチン含有廃棄物
からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記窒素供給源が、ペプトン、トリプトン、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、大豆ミール、マスタードシードケーキ、綿実ミール、ソヤトース、ソヤペプトン、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、羽毛、フィッシュミールおよび毛髪からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼが、凍結乾燥、噴霧乾燥、または塩析法によって濃縮される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムおよび塩化マグネシウムからなる群から選択される無機塩を用いて部分精製され、濃縮される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記炭素供給源および前記窒素供給源の少なくとも一方が誘導物質である、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
分子量が２８．２ｋＤａであり、
Ｎ末端配列が、Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａであり、
等電点が９．３１である、請求項１に記載の真菌株由来のプロテアーゼ。
【請求項１０】
未精製形態、固定形態、細胞結合形態、純化形態、精製形態であり、噴霧乾燥、凍結乾燥、濾過、濃縮、純化および精製から選択される工程に付される、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１１】
前記酵素組成物が、真性コラーゲンに対して不活性である、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１２】
ｐＨ範囲５．５〜１２、３０〜７０℃の範囲の温度において活性であり、ｐＨ範囲３〜１１および最大５０℃の温度において安定である、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１３】
水混和性および水非混和性溶媒の両方において安定である、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１４】
フェニルメチルスルホニルフルオリドによって阻害される、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１５】
β−メルカプトエタノール、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び尿素から選択される変性剤の存在下で安定であり、Ｈｇ、ＣｕおよびＣｄから選択される有毒金属において活性である、請求項９に記載のプロテアーゼ。
【請求項１６】
ｐＨ範囲４〜９および２０〜６０℃の温度範囲において活性であるリパーゼを含む、受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種真菌株の培養物。
【請求項１７】
ｐＨ範囲４〜８および２０〜７０℃の温度範囲において活性であるアミラーゼを含む、受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種真菌株の培養物。
【請求項１８】
ｐＨ範囲４〜９および３０〜７０℃の温度範囲において活性であるキシラナーゼを含む、受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種真菌株の培養物。
【請求項１９】
皮革製造における前なめし操作、動物細胞培養、写真用フィルムからの銀の回収、ナノ粒子合成、有機溶媒におけるペプチド合成のための、および洗浄剤製剤における、請求項２に記載の方法によって調製されたプロテアーゼの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規真菌株ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４およびそれに由来する酵素の調製方法に関する。特に、本発明は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４に由来するプロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼを含む酵素の組成物に関する。さらに、本発明は、前記組成物の調製方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
工業用酵素の世界全体の販売高の現在の推定値は、１０億ドルである。工業用酵素のうち７５％は、加水分解性である。プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼを合わせると、総酵素販売高の約８５〜９０％をなし、そのうち、植物、動物および微生物供給源由来のプロテアーゼが約６０％を占める。
【０００３】
細菌プロテアーゼは、周知であり、プロテアーゼの真菌供給源は限られているが、有利である。さらに、その他の酵素と組み合わせたプロテアーゼの真菌供給源も限られている。
【０００４】
非特許文献１に公開される、Ｊ．Ｌｅｏｐｏｌｄらによる「ハチノスツヅリガ(greater wax moth)幼虫のクチクラに対するビューベリア・バシアナの酵素系の作用(Action of enzymatic systems of Beauveria bassiana on the cuticle of the greater wax moth larvae (Galleria mellonella)」と題された論文では、虫生真菌ビューベリア・バシアナ（Beauveria bassiana)（不完全菌類）が、栄養培地中に少なくとも３種の酵素、リパーゼ、プロテアーゼおよびキチナーゼの混合物を分泌し、それによって、真菌が、感染した昆虫のクチクラをとおって浸透することが可能となることが開示されている。
【０００５】
非特許文献２に開示されるＢ．Ｅ．ＵｒｔｚおよびＷ．Ｃ．Ｒｉｃｅによる「ビューベリア・バシアナ（Beauveria bassiana)由来新規細胞外プロテアーゼの精製および特性決定(Purification and characterization of a novel extracellular protease from Beauveria bassiana)」と題された論文では、Ｂ．バシアナ(bassiana)単離株から精製されたＢＢＰ(Beauveria bassiana Protease)と表される細胞外プロテアーゼが開示されている。基質特異性は、プロテアーゼが、エラスターゼ活性も同様に有することを示す。プロテアーゼは、２５℃で安定であり、アルカリ最適ｐＨを有していた（７．５〜９．５）。
【０００６】
非特許文献３に開示される、Ｄｅｅｐｔｉ  Ａｇｒａｗａｌらよる「ＳＳＦ条件下でのビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)の土壌単離株によるアルカリプロテアーゼ製造：パラメータ最適化およびダイズタンパク質加水分解への適用(Alkaline protease production by a soil isolate of Beauveria felina under SSF condition: parameter optimization and application to soy protein hydrolysis)」と題された論文では、ダイズタンパク質加水分解のためのビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)の土壌単離株のアルカリプロテアーゼ活性が論じられており、固体基質発酵（ＳＳＦ）条件下でコウジカビ(Aspergillus oryzae)ＮＣＩＭ６４９、公知のアルカリプロテアーゼ産生株と比較している。ＳＳＦ条件下でアルカリプロテアーゼ製造に影響を及ぼすパラメータが最適化された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、第１８巻、第３号、１９７１年１１月、３２２〜３３０頁
【非特許文献２】Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００年）、１０４：１８０〜１８６頁
【非特許文献３】Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４０巻、第３〜４号、２００５年３月、１１３１〜１１３６頁、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｒｏｃｂｉｏ．２００４．０３．００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、ビューベリア種による、アミラーゼ、ケラチナーゼおよびキシラナーゼの単独またはアルカリプロテアーゼと組み合わせた製造に関する先行技術はない。
【０００９】
バイオマス、未精製の、純化された、精製された形態または任意のこのような形態の中の酵素組成物のさらなる適用は、ビューベリア種からはこれまでに知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明の主目的は、種々の分野において適用され得る酵素組成物を提供できるビューベリアの種を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、以下の酵素：真菌供給源；ビューベリア種のこれまでに知られていない株に由来するプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼのうち少なくとも１種または複数を含む組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、本発明者らによって単離されたビューベリア属に属する真菌培養物を使用して、以下の酵素：プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼのうち少なくとも１種または複数を含有する酵素組成物の調製方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、広いｐＨ範囲で活性および安定であり、短い発酵周期のアルカリプロテアーゼの調製方法を提供することである。
【００１４】
本発明のなお別の目的は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびケラチナーゼを単独または組み合わせて製造するための経済的な方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、動物組織培養物、分析ツール、医薬、分子生物学、皮革、洗浄剤、食品、繊維製品およびこのような同様の工業における前記酵素の適用／使用を提供することである。
【００１６】
本明細書において、ビューベリアの新規種、すなわち、ビューベリアＭＴＣＣ−５１８４を開示する。前記真菌供給源から調製された、それだけには限らないが、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む組成物も開示する。前記酵素組成物の調製方法およびその適用/使用も記載する。
【００１７】
より詳しくは、本発明は、動物組織培養物、皮革、食品、洗浄剤およびその他の工業における適用の可能性を有する、広いｐＨ範囲にわたって活性であり、安定であり、種々の洗浄剤、有機溶媒、変性剤などの存在下で安定である、アルカリプロテアーゼ、リパーゼおよびカルボヒドラーゼに関する。
【００１８】
したがって、本発明は、受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有する真菌株ビューベリア種を提供し、ここで、前記株は、ＭＴＣＣ、ブタペスト条約の下で承認されている国際寄託機関に寄託されている。
【００１９】
本発明はさらに、受託番号ＭＴＣＣ５１８４を有するビューベリア種に由来する、それだけには限らないが、プロテアーゼ、カルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む酵素の調製方法を提供し、前記方法は、
［ａ］０．１５〜８０％の炭素供給源と、０．１５〜８０％の窒素供給源と誘導物質とを含む培地においてビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４を、５．０〜９．０の範囲のｐＨおよび１５℃〜３２℃の間の範囲の温度、好気性条件下で、２〜７日間の範囲の期間培養することと；
［ｂ］ステップ（ａ）で得られた培地を回収することと；
［ｃ］従来法によって液相中の酵素を分離／抽出すること、とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の内部転写領域(Internal transcribed space)（ＩＴＳ）配列の複数の配列アラインメントに基づく相同性を示す系統樹を示す図である。新規単離株のＩＴＳ配列は、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)配列と最大の相同性を示す。
【図２ａ】本発明のビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)（ＮＣ  １３１４）の形態を示す図である。
【図２ｂ】本発明の新規単離株の形態を示す図である。形態学において著しい相違、具体的には、新規単離株における直立した柄（分生子柄束）の存在がある。
【図３】本発明のビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４によるリパーゼの製造を示すプレートアッセイを示す図である。真菌によるリパーゼの分泌を示すトリブチリンを含有する培地上の増殖するビューベリアコロニーの周囲のクリアランス領域を示す図である。
【図４】本発明のビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４によるキチナーゼの製造を示すプレートアッセイを示す図である。真菌によるキチナーゼの分泌を示す、培養濾液をおいたスポットの周囲の酸性の膨潤したキチンプレート上のクリアランス領域を示す図である。
【図５ａ】本発明の１０％マルトデキストリンの存在下で噴霧乾燥させたプロテアーゼの安定性を表す図である。
【図５ｂ】本発明の１５％マルトデキストリンの存在下で噴霧乾燥させたプロテアーゼの安定性を表す図である。
【図６】本発明の銀染色後の単一のタンパク質バンド（６ａ）および活性染色後のゼラチンクリアランスを示す対応するバンド（６ｂ）を示す、精製プロテアーゼのカチオン性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示す図である。
【図７】本発明の分子量２８．２ｋＤａを有する主要なピークを示す精製プロテアーゼのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを示す図である。
【図８】本発明のビューベリアの新規株に由来する精製プロテアーゼのＮ末端配列の、その他の生物のタンパク質配列との複数の配列アラインメントを示す図であり、その他の生物に由来する少数のプロテアーゼとの部分配列類似性を示す。
【図９】本発明のフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）でのプロテアーゼの阻害の速度論を示す図である。阻害は、インキュベーション時間に対して直線性であり、ＰＭＳＦの濃度につれて増加する。
【図１０】本発明の水混和性溶媒の存在下、３７℃でのプロテアーゼの安定性を示す図である。プロテアーゼは、メタノールの存在下で最も安定であり（＞８０％初期活性を保持した）、エタノール、イソプロパノールおよびアセトンが続いたのに対し、コントロールは初期活性の約３０〜３５％を保持した。
【図１１】本発明の水非混和性溶媒中、３７℃でのプロテアーゼの安定性を示す図である。プロテアーゼは、すべての水非混和性溶媒中で安定であり、２４時間後に５０〜８０％の活性を保持した。
【図１２】本発明のプロテアーゼの安定性に対する尿素濃度の効果を示す図である。プロテアーゼは、尿素の存在下で安定であり、尿素の濃度が増大するにつれ安定性のわずかな増大を示した。
【図１３】本発明の３Ｍ  ＮａＣｌおよび６Ｍ尿素の存在下でのプロテアーゼの安定性を示す図である。２時間インキュベートした後、プロテアーゼは、初期活性の、６Ｍ尿素の存在下で８５％超の活性、３Ｍ  ＮａＣｌの存在下で７５％の活性、コントロールにおいて６７％を保持した。
【図１４】本発明のプロテアーゼの安定性に対するＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。プロテアーゼは、３Ｍ  ＮａＣｌの存在下で１００％の安定性を示した。
【図１５】本発明の溶液中の銀ナノ粒子の存在を示すＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す図である。２８０ｎｍおよび４００ｎｍ付近でのピークは、それぞれ、タンパク質および銀ナノ粒子の存在によるものである。
【図１６】本発明のプロテアーゼを用いる処理の前後での動物細胞のマイクロ写真である。細胞が、プロテアーゼの作用によって分離される。
【図１７】本発明の血痕の除去を示す図である。粗プロテアーゼは血餅とともに血痕を除去できたのに対し、市販の洗浄剤は、血痕しか除去できなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に従って、それだけには限らないが、真菌供給源、ビューベリア種のこれまでに知られていない株由来のプロテアーゼカルボヒドラーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む組成物が、本明細書に開示されている。
【００２２】
真菌株、ビューベリア種は、ウサギの糞から単離され、受託番号ＭＴＣＣ−５１８４（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ、Ｉｎｄｉａ）を有する。ビューベリアの供給源は、土壌、昆虫、動物の糞、木の枝、海洋生物などである。培養物は、ウサギの糞から単離した。糞のペレットを、ペトリプレート中で清潔な湿った濾紙上に置いた。プレートを湿潤チャンバー中で維持し、室温で２〜３週間インキュベートした。最初に、白色の真菌が増殖し、さらにインキュベートすると、小さい突起を示し、これが直立した柄に発達した。滅菌した先のとがったニードルで、これらの柄から胞子を注意深く持ち上げ、麦芽エキス、グルコース、酵母エキス、ペプトン（ＭＧＹＰ）寒天プレート上に広げた。単離されたコロニーを、ＭＧＹＰプレート上で継代培養を反復することによって精製し、単一コロニーをＭＧＹＰスラントに移した。このように得られた単離物を、１８Ｓ  ｒＤＮＡ  ＆  ＩＴＳ配列および形態的特徴を使用して特性決定し、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)と区別した。表１および表２における結果は、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列の最初の１０個のＢＬＡＳＴヒットを示す。１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列は、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)の種々の株と９９％の相同性を示した。図１は、その他の生物とのＩＴＳ遺伝子の配列相同性を示す。１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列相同性によれば、本発明の単離物は、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)に対して９８〜１００％の相同性を示す。しかし、図２に示されるように、その形態においては、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)（ＮＣＩＭ１３１４）と比較して大きな相違がある。ＭＴＣＣ５１８４、ビューベリア種の新規株の１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ遺伝子配列は、それぞれ、受託番号ＦＪ８９５３０５およびＦＪ８９５３０６でＮＣＢＩ遺伝子バンクに寄託されている
【００２３】
本発明の一実施形態では、組成物は、それだけには限らないが、プロテアーゼ、ケラチナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼおよびリパーゼから選択される酵素を単独またはいずれかの組合せで含む。
【００２４】
本発明の別の実施形態では、酵素組成物は、真性コラーゲンに対して不活性である。
【００２５】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の酵素組成物は、バイオマス、未精製形態、精製形態、純化形態、細胞結合形態または固定形態から選択される形態であるが、それに制限されない。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態では、酵素組成物は、酵素組成物に一般に適用される物理的処理、例えば、乾燥、濾過、濃縮、純化などに対して安定である。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明は、
ａ．真菌株ビューベリアＭＴＣＣ５１８４を、炭素供給源、窒素供給源および誘導物質を含む培地中、好気性条件下、５．０〜９．０の範囲のｐＨおよび１５℃〜３２℃の範囲の温度で、２〜７日の間の範囲の期間増殖させることと、
ｂ．培地を回収することと、
ｃ．従来法によって液相中の酵素を分離／抽出することと
を含む、ビューベリア種を使用する酵素組成物の調製方法を提供する。
【００２８】
本発明のなお別の実施形態では、生物を、１８０〜２２０ｒｐｍで振盪しながら液内培養で増殖させる。
【００２９】
さらに別の実施形態では、生物を、静置条件下で固体状発酵で増殖させる。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、炭素供給源は、単独またはそれらの組合せでの、糖、糖アルコール、多糖、オイル、脂肪、脂質、農産物／農業廃棄物などからなるが、それらに制限されない。糖として、グルコース、フルクトース、アラビノース、スクロース、ラクトースなどがある。糖アルコールとして、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどがある。多糖として、デンプン、キシランなどがあり、オイル／脂肪として、オリーブオイル、ヒマワリ油、大豆油、ゴマ油、カラシ油、ヒマシ油、ココナッツオイル、ラッカセイ油、トリブチリンなどがあり、農産物／農業廃棄物として、大豆粉、ジャガイモ廃棄物、トウモロコシ粉、大豆ミール、ラッカセイミール、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、フスマ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、米ぬかなど、カニ殻のようなキチン含有廃棄物などがある。
【００３１】
本発明のなお別の実施形態では、窒素供給源は、場合により、有機または無機であり、単独またはそれらの組合せである。無機窒素供給源は、それだけには限らないが、リン酸水素二アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムおよび尿素から選択される。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態では、有機窒素供給源は、それだけには限らないが、ペプトン、トリプトン、ソヤトース(soyatose)、ソヤペプトン(soyapeptone)、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、牛肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーおよび大豆粉、大豆カス、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、ラッカセイミールなどによって例示される窒素リッチマメ科基質、乳製品、家禽、食肉および食品加工からの廃棄物、毛髪、羽毛のようなケラチンリッチ廃棄物、漁業からの廃棄物およびその他の廃棄物から単独で、またはそれらの組合せで選択される。
【００３３】
本発明のなお別の実施形態では、酵素を分離する従来法は、濾過、遠心分離または水もしくは希釈界面活性剤での抽出である。
【００３４】
本発明のさらに別の実施形態では、誘導物質は、それだけには限らないが、ペプトン、トリプトン、ソヤトース(soyatose)、ソヤペプトン(soyapeptone)、カザミノ酸、カゼイン、肉エキス、牛肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカーおよび大豆粉、大豆カス、ヒヨコマメ粉、緑豆粉、マスタードシードケーキ、綿実ケーキ、ラッカセイミールなどによって例示される窒素リッチマメ科基質、ホエーのような乳製品、フィッシュミールおよびニワトリの羽、羽毛粉などによって例示される家禽、食品加工、食肉および魚からの廃棄物、油糧種子ケーキとして例示される農業廃棄物および廃棄穀物/穀類、フスマ、トウモロコシの穂軸、コーンミール、米ぬか、オイル、脂肪のような炭水化物廃棄物、フレッシング、トリミングおよびクロムシェービングのような皮革廃棄物、爪、ひづめ、毛髪のようなケラチンリッチ基質から、単独で、またはそれらの組合せで選択される。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態では、誘導物質は、炭素の供給源であり得る。別の実施形態では、誘導物質は、リパーゼ、プロテアーゼおよびカルボヒドラーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む酵素組成物を製造する方法のための窒素の供給源であり得る。
【００３６】
本発明の別の実施形態では、酵素の濃縮は、膜濾過によってか、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどの塩の添加、エタノール、アセトンなどの有機溶媒の添加による塩析によって、または凍結乾燥もしくは噴霧乾燥のいずれかによって達成された。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明のプロテアーゼは、３〜１１のｐＨ範囲、好ましくは、ｐＨ７において安定であり、洗浄剤、変性剤、水混和性および水非混和性有機溶媒に対して安定であり、５０℃まで安定である。プロテアーゼは、５．５〜１２のｐＨ範囲、キレート剤、金属イオンの存在下、３０〜７０℃の範囲の温度において、好ましくは、５０℃で活性である。
【００３８】
本発明のなお別の実施形態では、粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼは、アルブミン、ヘモグロビン、ケラチン、エラスチン−オルシン、アゾカゼイン、アゾコール(azocoll)およびゼラチンに対して活性を示す。
【００３９】
本発明のさらに別の実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって阻害された。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、アミラーゼは、４〜８のｐＨ範囲において、好ましくは、ｐＨ６および２０〜７０℃の範囲の温度において、好ましくは、４５℃で活性である。
【００４１】
本発明のさらに別の実施形態では、キシラナーゼは、４〜９のｐＨ範囲において、好ましくは、ｐＨ６および３０〜７０℃の温度範囲において、好ましくは、５０℃で活性である。
【００４２】
本発明のなお別の実施形態では、リパーゼは、４〜９のｐＨ範囲において、好ましくは、ｐＨ７および２０〜６０℃の温度範囲において、好ましくは、５０℃で活性である。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、酵素組成物は、真性コラーゲンに対して不活性である。
【００４４】
プロテアーゼ活性は、チロシン当量を単位として表した。反応混合物は、２ｍｌの総容量中に、適宜希釈された酵素溶液の一定分量と、０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中、１０ｍｇのハマーステイン(Hammerstein)カゼインとを含有していた。５０℃で１０分間インキュベートした後、５％トリクロロ酢酸（濃塩酸で酸性化された）３ｍｌを添加することによって反応を終結させた。室温で３０分間静置した後、形成された沈殿物を、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．ｌ濾紙を通して濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を、２８０ｎｍで測定した。生じたチロシンのマイクログラムを、予め較正した、チロシン濃度に対する２８０ｎｍでの吸光度のグラフから算出し、単位は、アッセイ条件下で１分あたりに放出されたチロシンのμモルとして表した。
【００４５】
キシラナーゼ活性は、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６中、１％可溶性キシランを使用して測定した。１ｍｌの総反応混合物は、適宜希釈された酵素０．５ｍｌと、基質０．５ｍｌとを含有しており、５０℃で３０分間インキュベートした。遊離された還元糖は、ジニトロサリチル酸法（Ｐ．Ｂｅｒｎｆｅｌｄ  １９５５年、Ａｍｙｌａｓｅ：α  ＆  β、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１巻、１４９頁）によって測定した。キシラナーゼ活性は、アッセイ条件下で１分あたりに生じた還元等のμモルとして（キシロース当量として）表した。
【００４６】
アミラーゼ活性は、５０ｍＭリン酸カリウムバッファーｐＨ６中、１％可溶性デンプンを使用して測定した。１ｍｌの総反応混合物は、適宜希釈された酵素０．５ｍｌと、基質０．５ｍｌとを含有しており、４５℃で３０分間インキュベートした。遊離された還元糖は、ジニトロサリチル酸法（Ｐ．Ｂｅｒｎｆｅｌｄ  １９５５年、Ａｍｙｌａｓｅ：α  ＆  β、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１巻、１４９頁）によって測定した。アミラーゼ活性は、アッセイ条件下で１分あたりに生じた還元糖のμモルとして（グルコース当量として）表した。
【００４７】
リパーゼ活性は、２つの異なる方法によって測定した。
ａ．基質としてｐ−ニトロフェノールパルミテート（ｐＮＰＰ）を使用する分光光度法アッセイ：一定に撹拌しながら、溶液Ｂ（９０ｍｌの蒸留水中、０．１ｇのアラビアガムおよび０．４ｇ  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）９ｍｌに、溶液Ａ（１０ｍｌのプロパン−２−オール中、３０ｍｇ  ｐＮＰＰ）１ｍｌを滴加することによって基質溶液を新しく調製した。エマルジョンは２時間安定なままであった。アッセイ混合物は、０．９ｍｌの基質と、０．１ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７と、０．１ｍｌの適宜希釈された酵素とを含有していた。アッセイ混合物は、２８℃で２０分間インキュベートし、２ｍｌの２％  Ｎａ２ＣＯ３を添加することによって終結させた。放出されたｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍで測定した。リパーゼ活性は、アッセイ条件下で１分間あたりに放出されるｐ−ニトロフェノールのμモルとして表されている。
【００４８】
ｂ．リパーゼの滴定分析。グラインダーミキサー中で１０分間、２０ｍｌのオリーブオイルと、１６５ｍｌの１０％アラビアガムと、１５ｇの氷とを混合することによって基質を調製し、ガラスウール上で濾過し、４℃で保存した。リパーゼアッセイのために、反応混合物は、２ｍｌのリン酸バッファー（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）と、５ｍｌの基質と、１ｍｌの粗培養ブロスとを含有しており、５０ｒｐｍで振盪しながら、５０℃で１時間インキュベートした。４ｍｌのアセトン：エタノール（１：１）を添加することによって反応を終結させた。ブランクでは、アセトン：エタノールによって反応を終結させた後に酵素を加えた。１０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて、放出された遊離脂肪酸を滴定した。リパーゼ活性は、アッセイ条件下で１分間あたりに放出された遊離脂肪酸のμモルとして表されている。
【００４９】
本発明の酵素組成物は、食品、医薬品、皮革、繊維製品工業をはじめ、酵素ベースの組成物が必要であるあらゆる分野において用途がある。プロテアーゼは、農業、皮革、繊維製品、シルクの脱ガム、乳製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、肥料、または、植物、動物、ペプチド合成からの培地成分およびタンパク質加水分解物の調製において、分子生物学、化粧品、廃棄物処理などにおいて適用される。リパーゼは、農業、皮革、繊維製品、乳製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、肥料、化粧品、廃棄物処理、ポリマー合成などにおいて適用される。アミラーゼは、農業、皮革、繊維製品、食品、飼料、洗浄剤、医薬品工業、培地成分の調製、廃棄物処理などにおいて適用される。キシラナーゼは、農業、紙パルプ、皮革、繊維製品、食品、飼料、医薬品、廃棄物処理、単細胞タンパク質、燃料、溶媒、または、オリゴサッカライドの合成や、大麻、ジュート、ラミー、亜麻などのような繊維の脱ガム、木の皮をはぐことなどにおいて適用される。伝統的に、ケラチナーゼは、羽毛粉、肥料および膠などの製造に使用されてきた。その適用範囲は、ゆっくりと広がっており、現在、洗浄剤製剤、化粧品、皮革、医薬および動物飼料などのその他の領域へと、ますます使用されるようになっている。より最近では、それらは、狂牛病の治療（プリオンの分解）、生分解性プラスチックおよび羽毛粉製造において適用されている。皮革製造における脱毛工程のために、軽度のエラスチン分解活性を有するが、コラーゲン分解性を欠くケラチナーゼの適用が検討されている。
【００５０】
皮革製造における脱毛のような前なめし操作、動物細胞培養、写真用フィルムからの銀の回収およびナノ粒子合成、有機溶媒におけるペプチド合成および洗浄剤組成物のための、それだけには限らないが、ビューベリア種由来のプロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、キチナーゼ、ケラチナーゼおよびリパーゼから選択される少なくとも１種の酵素を含む酵素組成物の使用。このような洗浄剤組成物は、染み抜きをできる。
【００５１】
脱毛工程の従来法は、高い有機窒素、生物学的酸素要求量（ＢＯＤ）、化学的酸素要求量（ＣＯＤ）および全固形分（ＴＤＳ）およびｐＨの上昇を有する廃液の排出をもたらし、これは、土壌ならびに地下水を汚染し、従って、生態系に対して不可逆的損害を引き起こす。アルカリプロテアーゼを用いる脱毛は、廃水の量および汚染負荷量両方の大幅な減少をもたらす。さらに、特に、プロテアーゼと組み合わせたアミラーゼは、ビームハウスのベーチング操作において有用である（米国特許第４，２７３，８７６号）。
【００５２】
本発明の酵素組成物は、種々の前なめし操作のために皮革工業にとって有用である。特に、本組成物は、前なめし操作単独において有用である。より詳しくは、本発明の酵素組成物は、本明細書に例示される皮革工業に、前なめし操作のための化学添加物を含まない選択肢を提供する。この環境への負担が小さい工程は、脱毛において石灰および硫化物を置き換え、その結果、廃液中のＢＯＤ、ＣＯＤおよびＴＤＳの低減をもたらすタンパク質分解酵素の使用を含む。これらの酵素は、６〜８のｐＨ範囲で皮革処理において使用できる。
【００５３】
固体硫化物および水酸化カルシウムの使用によって毛髪自体が全体的に破壊される従来法とは異なり、酵素法は、上皮層の除去をもたらし、その結果、毛髪が解けるか、その毛根から取り除かれる。
【実施例】
【００５４】
本発明を、実施例とともに、以下、本明細書に記載するが、それらは単に例示であり、いかなる形においても本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
［実施例１Ａ］
【００５５】
この実施例は、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法によるビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のゲノムＤＮＡの単離を示す。ＤＮＡを単離するために、真菌を、その組成（１リットルあたりのグラム）が、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である麦芽エキスグルコース酵母エキスペプトン（ＭＧＹＰ）培地中、液体フラスコ中で増殖させた。増殖は、７日培養ＭＧＹＰスラントから得た胞子を播種することによって開始させた。フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で４８時間インキュベートした。内容物を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、繰り返し洗浄して、培地成分を除去した。３〜５ｇの湿潤菌糸体を液体窒素中で粉砕し、続いて、８〜１０ｍｌの、０．２％のβ−メルカプトエタノールを含有するＣＴＡＢ抽出バッファーｐＨ８を添加し、その後、２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、６５℃で１時間インキュベートした。この後、２０μｌのリボヌクレアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、さらに、６５℃で１５分間インキュベートした。遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）後に回収した上清に、１０ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加えた。混合物を５分間振盪し、１０，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上清に、２容積のＣＴＡＢ沈殿バッファーを加え、室温で１時間維持した。遠心分離後に回収したペレットを５ｍｌの１．２Ｍ  ＮａＣｌに溶解し、５ｍｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を加えた。水層に２容積の無水アルコールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを巻き取って取り出し、７０％エタノールで洗浄し、５ｍｌの０．１ＭのＴｒｉｓエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）バッファーｐＨ８．０に溶解し、保存した。分光光度計で２６０ｎｍでサンプルの吸光度を測定することによってＤＮＡの定量化を行い、純度を０．８％アガロースゲル電気泳動で調べた。
［実施例１Ｂ］
【００５６】
この実施例は、１８Ｓ  ｒＤＮＡおよび内部転写スペーサー（ＩＴＳ）遺伝子のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を示す。真菌種の同定に使用したプライマーは、ユニバーサル真菌１８Ｓ  ｒＤＮＡプライマーＮＳ１−Ｆ（ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  Ｃ）、ＮＳ８−Ｒ（ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＡ）、ＩＴＳ１−Ｆ（ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  Ｇ）およびＩＴＳ４−Ｒ（ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣ）であった。ポリメラーゼ連鎖反応（２５μｌ）は、ゲノムＤＮＡを使用することによって１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ遺伝子を増幅するよう設定した。反応混合物は、通常、ゲノムＤＮＡ−０．７０μｌ、１０ＸＰＣＲバッファー−２．５０μｌ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ−２．５μｌ、フォワードおよびリバースプライマー１０〜２０ｐモル−各１．２５μｌ、蒸留水−１６．６０μｌおよび１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ−０．２０μｌを含有していた。１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ遺伝子増幅のためのＰＣＲ条件は、最初の変性９５℃で３分間、続いて、９４℃で１分間、５７℃で３０秒間、７２℃で２分間の３５サイクルおよび７２℃で１０分間の最後の伸長とした。上記のＰＣＲ増幅産物５μｌを使用して、１．０％アガロースゲル上で増幅を調べた。
［実施例１Ｃ］
【００５７】
この実施例は、ＰＣＲ増幅産物の精製を示す。２０μｌのＰＣＲ増幅産物に、１２μ１の２０％  ＰＥＧ−ＮａＣｌ（ポリエチレングリコール−ＮａＣｌ）溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって分離した。ペレットを乾燥させ、１０μｌの再蒸留水に溶解し、−２０℃で保存した。
［実施例１Ｄ］
【００５８】
この実施例は、精製ＰＣＲ産物の配列決定を示す。配列決定反応は、「ＡΒＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット」（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を製造業者のプロトコールにしたがって使用したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施した。このキットは、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒと呼ばれる異なる蛍光標識を有する４種のｄｄＮＴＰを含有する。２０μｌの配列決定反応において、２μｌのＰＣＲ産物および３ｐｍｏｌの配列決定プライマーを使用した。配列決定プライマーは、配列決定用（Ｗｈｉｔｅら、１９９０）のＮＳ１（ＧＴＡ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  Ｃ）、ＮＳ２（ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＧＣ）、ＮＳ３  （ＧＣＡ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＣＣ）、ＮＳ４（ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＡＧ）、ＮＳ５  （ＡＡＣ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＧＡＡ  ＴＴＧ  ＡＣＧ  ＧＡＡ  Ｇ）、ＮＳ６  （ＧＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＴＡＴ  ＴＧＣ  ＣＴＣ）、ＮＳ７（ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＣ）およびＮＳ８（ＴＣＣ  ＧＣＡ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＡ）、ＩＴＳ１（ＴＣＣ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＣＣＴ  ＧＣＧ  Ｇ）およびＩＴＳ４（ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣ）であった。配列決定反応ミックスに対し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒサーマルサイクラー９７００において２５サイクル施した。各サイクルは、９５℃で１０分、５０℃で５分および６０℃で４分からなっていた。ＤＮＡ塩基配列決定は、ＡＢＩ  １５００  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで実施した。
［実施例１Ｅ］
【００５９】
この実施例は、上記の実施例で得られた１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列に基づくビューベリア種の新規株ＭＴＣＣ５１８４の同定および系統発生関係を示す。得られた配列は、小さい断片中にあり、従って、配列を重ね合わせることによって適宜アラインした。ビューベリア種の新規株の相同性パーセンテージおよび系統発生関係は、ＮＣＢＩデータベース中の既存の配列を使用して行った。ＢＬＡＳＴプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｃｍ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を使用し、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いてヌクレオチド配列を分析した。表１および表２中の結果は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベース中の１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列の最初の１０個のＢＬＡＳＴヒットを示す。１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列は、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina)の種々の株と９９％の相同性を示した。図１は、その他の生物とのＩＴＳの配列相同性を示す。１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列相同性によれば、本株は、ビューベリア・フェリナ(Beauveria felina).に対して９８〜１００％の相同性を示す。しかし、図２に示されるように、その形態においては、ビューベリア・フェリナ（Beauveria felina）と比較して大きな相違がある。ＭＴＣＣ５１８４、ビューベリア種の新規株の１８Ｓ  ｒＤＮＡおよびＩＴＳ配列は、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに、それぞれ、受託番号ＦＪ８９５３０５およびＦＪ８９５３０６で寄託されている。
【００６０】
【表１】
0005931745.tif 000002
【００６１】
【表２】
0005931745.tif 000003
【００６２】
［実施例２］
【００６３】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、グルコース−１０；酵母エキス−３、マスタードシードケーキ−２０を含有する（リットルあたりのグラム）培地中、振盪フラスコ中で実施した。種培養を調製するために７日培養のスラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。フラスコを２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で９６時間インキュベートした。４日後の無細胞ブロスにおける活性は、１２〜１５ＩＵ／ｍｌであった。
［実施例３］
【００６４】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は：麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。種菌フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵を、誘導物質として２％フィッシュミールを有する、グルコース、１０；酵母エキス３を含有する（リットルあたりのグラム）グルコース酵母エキス培地中、振盪フラスコ中で実施し、２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で４８時間インキュベートした。３日後の無細胞ブロスにおける活性は、９．９〜１０．６ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
［実施例４］
【００６５】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるプロテアーゼの調製を示す。種培養を調製するために７日培養ＭＧＹＰスラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。種菌フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。プロテアーゼ製造のための固体状発酵は、７ｍｌの水と混合した、５ｇのフスマ；２０ｍｇの酵母エキス、１ｇの大豆ミールを含有する２５０ｍｌフラスコ中で実施した。固体発酵培地に３ｍｌの栄養種菌（vegetative inoculum)を加え、十分に混合し、静置条件下、３０℃でインキュベートした。９６時間インキュベートした後、半固体のカビの生えたコウジを５０ｍｌの０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を用い、２００ｒｐｍで１時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、０．１％  Ｔ−８０を用いてさらに２回の抽出を実施した。得られた酵素をアッセイし、９６時間で４５０〜５７０ＩＵ／大豆ミール１ｇの範囲の活性および７５〜９５ＩＵ／乾燥固体１ｇが得られた。
［実施例５］
【００６６】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるキシラナーゼの調製を示す。ＭＧＹＰ培地において種培養を調製するために１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は（リットルあたりのグラム）、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。種菌フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、組成（リットルあたりのグラム）が、３種の異なる誘導物質、すなわち、３％フスマ；１％キシランおよび２％トウモロコシの穂軸を含有する、グルコース、１．５；酵母エキス１．５；ペプトン５および牛肉エキス５であるＭｉｋａｍｉ培地中、振盪フラスコ中で実施した。振盪フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で４８時間インキュベートした。上記の誘導物質のすべてにおいて２日後の無細胞ブロスにおけるキシラナーゼ活性は、４〜５．５ＩＵ／ｍｌの間の範囲であった。
［実施例６］
【００６７】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼの調製を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成は（リットルあたりのグラム）、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。これを２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、１５ｍｌの、その組成（リットルあたりのグラム）が、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５であるＭｉｋａｍｉ培地と混合した９ｇフスマを含有する５００ｍｌフラスコ中で実施し、２８℃、静止条件下で最大４日間インキュベートした。
【００６８】
発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、１００ｍｌ  ０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を用い、２００ｒｐｍで１時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、５０ｍｌの０．０１％  Ｔ−８０を用いてさらに１回抽出を行った。３および４日目の最後でのキシラナーゼ活性は、それぞれ、６２．３３ＩＵ／ｇおよび９６．５４ＩＵ／ｇであった。
［実施例７］
【００６９】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるアミラーゼの調製を示す。Ｍｉｋａｍｉ培地において種培養を調製するために１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５である。種菌フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー上で２４時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、誘導物質として２％トウモロコシデンプンを含有するＭｉｋａｍｉ培地中、振盪フラスコ中で実施し、２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上でインキュベートした。４日後の無細胞ブロスにおける活性は、３．５〜４．５ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
［実施例８］
【００７０】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるリパーゼの調製を示す。種培養を調製するために７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。これを２８℃でロータリーシェーカー上で２４時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、ＮａＮＯ３−０．５；ＭｇＳＯ４−０．５；ＫＣｌ−０．５；ＫＨ２ＰＯ４−２；酵母エキス−１；バクトペプトン−５；グルコース−１０を含有する（リットルあたりのグラム）ｐＨ５．５に調整した培地中、振盪フラスコ中で実施した。１％濃度の以下のオイルを、リパーゼ製造のための誘導物質として使用した。フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー上で４〜５日間インキュベートした。無細胞ブロスにおける活性は、基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテートを使用して求めた。（アッセイプロトコールを示す）。リパーゼ活性は、０．１２〜０．１７ＩＵ／ｍｌ；ヒマシ油（０．１３ＩＵ／ｍｌ）、ラッカセイオイル（０．１３ＩＵ／ｍｌ）、ゴマ油（０．１７ＩＵ／ｍｌ）、オリーブオイル（０．１２ＩＵ／ｍｌ）の範囲であった。
［実施例９］
【００７１】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるリパーゼの調製を示す。Ｍｉｋａｍｉ種培養を調製するために、７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、ペプトン−５；牛肉エキス−５；酵母エキス−１．５；グルコース−１．５である。これを２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して、振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、ペプトン−５；牛肉エキス−５；酵母エキス−１．５；グルコース−１．５を含有する（リットルあたりのグラム）Ｍｉｋａｍｉ培地中、振盪フラスコ中で実施した。２％濃度のオリーブオイルおよびトリブチリンをリパーゼ製造のための誘導物質として使用した。培地は、ｐＨ７に調整した。３〜４日後の無細胞ブロスにおける活性は、滴定法によって求めた。オリーブオイルおよびトリブチリンにおけるリパーゼ活性は、３〜５ＩＵ／ｍｌの範囲であった。
［実施例１０］
【００７２】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるケラチナーゼの調製を示す。Ｍｉｋａｍｉ培地における種培養を調製するために、７日培養スラントから得られた胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５およびグルコース−１．５である。種菌フラスコを２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。発酵は、２種の異なる誘導物質として２％ニワトリ羽毛および２％毛髪を含有するＭｉｋａｍｉ培地中、振盪フラスコ中で実施した。振盪フラスコを、２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で７２時間インキュベートした。ケラチナーゼ活性は、Ｂｒｅｓｓｏｌｌｉｅｒら、（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６５巻（６）、２５７０〜２５７６頁、１９９９年）に従って求めた。酵素活性の１ユニットは、１分あたり５９５ｎｍでの吸光度の１．０の増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。羽毛および毛髪について、３日後の無細胞ブロスにおけるケラチナーゼ活性は、それぞれ、０．２６および０．３０Ｕ／ｍｌであった。
［実施例１１Ａ］
【００７３】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株によるプレートアッセイを使用するリパーゼ活性の検出を示す。酵素のプレートアッセイは、グルコース（リットルあたりのグラム）：１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５、寒天−２０および１％トリブチリンからなる２５ｍｌのＭｉｋａｍｉ培地を含有するディスポーザブルペトリプレートで実施した。種菌を調製するために７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用した。種菌培地の組成（リットルあたりのグラム）は、酵母エキス−３およびグルコース−１０であった。４８時間培養栄養種菌をプレートにスポット播種し、２８℃で７２時間インキュベートした。トリブチリンの分解による、増殖する真菌コロニーの周囲のクリアランス領域が観察され、これは、生物によるリパーゼの分泌を示す（図３）。
［実施例１１Ｂ］
【００７４】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株によるプレートアッセイを使用するキチナーゼ活性の検出を示す。プレートアッセイは、２５ｍｌの、０．０１％酸性膨潤キチンを含有する２％寒天中、ディスポーザブルペトリプレート中で実施した。７日培養スラントから得た胞子懸濁液を、その組成（リットルあたりのグラム）が酵母エキス−３、グルコース−１０および酸性膨潤キチン−０．１である培地に播種し、１８０〜２００ｒｐｍで振盪しながら２８℃でインキュベートした。９６時間後５０μｌの無細胞上清をプレート上にスポットし、３７℃で１時間インキュベートした。キチナーゼ活性の検出のために、プレートを、０．１％ラニパル(ranipal)を用いて１５分間満たし、続いて、蒸留水を用いて各３０分間２回洗浄した。プレートを、ＵＶ光下で観察した。キチン分解によって、サンプルスポットの周囲のライトブルーの透明な領域が観察され、これは、真菌株によるキチナーゼの分泌を示す（図４）。
［実施例１２］
【００７５】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵によるアミラーゼおよびプロテアーゼの同時調製を示す。種培養を調製するために、７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５、ペプトン−５、牛肉エキス−５である。これを２８℃でロータリーシェーカー上で２４時間インキュベートし、種菌の１０％（ｖ／ｖ）を使用して、実験フラスコに播種した。発酵は、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５、ペプトン−５、牛肉エキス−５、デンプン−２０を含有する（リットルあたりのグラム）ｐＨ７に調整した培地中、振盪フラスコ中で実施した。フラスコを２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上でインキュベートした。６日後の無細胞ブロスにおけるアミラーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、６〜７ＩＵ／ｍｌおよび３．０〜３．３ＩＵ／ｍｌであった。
［実施例１３］
【００７６】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼおよびプロテアーゼの調製を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために、１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス、３；酵母エキス、３；ペプトン、５およびグルコース１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、その組成が、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５である９ｍｌのＭｉｋａｍｉ培地と混合した９ｇフスマを含有する５００ｍｌフラスコ中で実施した。
【００７７】
発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、１００ｍｌの０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を用い、２００ｒｐｍで１時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、５０ｍｌの０．０１％  Ｔ−８０を用いてさらに１回の抽出を実施した。４日目の最後でのキシラナーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、１１６〜１３４ＩＵ／ｇおよび５０〜６２ＩＵ／ｇであった。
［実施例１４］
【００７８】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるリパーゼおよびプロテアーゼの調製を示す。固体状発酵は、１ｇのオリーブオイルおよびその組成（リットルあたりのグラム）が、ＮａＮＯ３−０．５；ＭｇＳＯ４−０．５；ＫＣｌ−０．５；ＫＨ２Ｐ０４−２；酵母エキス−１；バクトペプトン−５である、ｐＨ５．５に調整した２５ｍｌの基礎塩培地と混合した１０ｇのフスマを含有する培地中、２５０ｍｌフラスコ中で実施した。７日培養スラントから得た胞子懸濁液（１．７５Ｘ１０６個胞子／ｍｌ）の２ミリリットルを使用して、実験フラスコに播種し、静止条件下、２８℃でインキュベートした。発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、１００ｍｌの、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１％  ＮａＣｌを用い、２時間振盪しながら抽出し、続いて、２重のモスリン布を通して濾過し、４℃、１２０００ｒｐｍで遠心分離した。無細胞ブロスにおける活性は、基質としてｐ−ニトロフェニルパルミテートを使用して求めた。５および７日後のリパーゼ活性は、それぞれ、０．８ＩＵ／ｇおよび５．１１５ＩＵ／ｇであった。５日後のプロテアーゼ活性は、４５〜４８ＩＵ／ｇであった。
［実施例１５］
【００７９】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるキシラナーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼの同時調製を示す。酵素製造のための固体状発酵は、グルコース−１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５からなる（リットルあたりのグラム）１５ｍｌのＭｉｋａｍｉ培地と混合した、９ｇのフスマおよび３ｇのデンプンを含有する５００ｍｌフラスコ中で実施した。種培養を調製するために、１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。
【００８０】
１２０時間インキュベートした後、半固体のカビの生えたコウジを、１００ｍｌの０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を用い、２００ｒｐｍで１時間振盪することによって抽出した。固体基質からの酵素の完全な抽出を確実にするために、５０ｍｌの０．０１％  Ｔ−８０を用いてさらに１回の抽出を実施した。
【００８１】
５日目の最後での、フスマ１ｇあたりのキシラナーゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼ活性は、それぞれ、４８〜５２ＩＵ、４８〜５４ＩＵおよび３０〜３５ＩＵであった。
［実施例１６］
【００８２】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する液内発酵による１５〜３７℃の温度範囲におけるプロテアーゼ製造を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために、７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、ｐＨ６．５〜７に調整した、グルコース−１０；酵母エキス−３、マスタードシードケーキ−２０を含有する（リットルあたりのグラム）培地中、振盪フラスコ中で実施した。フラスコを、１５〜３７℃の範囲の温度で、ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で９６時間インキュベートした。プロテアーゼ製造が１５〜３２℃の温度範囲で観察され、最高活性は、２８℃で観察された（表３）。
【００８３】
【表３】
0005931745.tif 000004
【００８４】
［実施例１７］
【００８５】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用するｐＨ範囲５〜９における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために、７日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して振盪フラスコ実験を開始した。発酵は、グルコース−１０；酵母エキス−３、マスタードシードケーキ−２０を含有する（リットルあたりのグラム）培地中、振盪フラスコ中で実施した。培地ｐＨをｐＨ５〜９に変更した。振盪フラスコを２８℃でロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）上で９６時間インキュベートした。プロテアーゼ製造が、ｐＨ範囲５〜９において観察され、ｐＨ７で最高活性を有していた（表４）。
【００８６】
【表４】
0005931745.tif 000005
【００８７】
［実施例１８］
【００８８】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する、撹拌および通気の制御された条件下での機器を備えた発酵槽における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、グルコース−１０；酵母エキス−３、マスタードシードケーキ−２０を含有し（リットルあたりのグラム）、ｐＨ７に調整した培地中、４Ｌの作業容量を有する７．５Ｌ  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｉｎｓｗｉｃｋ発酵槽中で実施した。種菌は、ＭＧＹＰ培地中で２段階で発達させ、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０（ＭＧＹＰ）である。第１段階の種菌を調製するために、７日培養スラントから得られた胞子懸濁液を使用した。第１段階の種菌（２４時間）は、５０ｍｌのＭＧＹＰ培地を含有する２５０ｍｌフラスコ中で発達させた。第２段階の種菌（２４時間）は、２５０ｍｌのＭＧＹＰ培地を含有する１Ｌフラスコ中で発達された。７．５Ｌ発酵槽中の製造培地（４Ｌ）は、基礎培地としてグルコース−酵母エキス（ＧＹＥ）を含有していた。２４時間増殖させた後、誘導物質として２％の濃度のマスタードシードケーキを加えた。通気および撹拌機速度を、それぞれ、１分あたり３〜４リットル（１ｐｍ）および３５０〜４００ｒｐｍで維持し、温度を２６〜２８℃で維持した。無細胞ブロスを綿上での重力濾過によって集めた。５日後の無細胞ブロスにおける活性は、１２〜１５ＩＵ／ｍｌであった。
［実施例１９］
【００８９】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４株を使用する撹拌および通気の制御された条件下での機器を備えた発酵槽における液内発酵によるプロテアーゼの調製を示す。発酵は、ｐＨ７に調整し、グルコース−５；酵母エキス−３；マスタードシードケーキ−２０および０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を含有する（リットルあたりのグラム）培地中、８０Ｌの作業容量を有する１００Ｌ発酵槽中で実施した。種菌は２段階で発達させた。第１段階種菌は、１００ｍｌのＭＧＹＰ培地を含有する５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で発達させ、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である。７〜１０日培養ＭＧＹＰスラントから得た胞子を播種し、フラスコを１８０〜２２０ｒｐｍで振盪しながら２４時間維持した。第２段階種菌は、１％グルコースおよび０．３％酵母エキスを含有し、ｐＨを７に調整したＧＹＥ培地中、１０Ｌの作業容量を有する１４Ｌ発酵槽中で発達させた。発酵槽は、第１段階からの１０％（ｖ／ｖ）種菌を用いて播種した。通気および撹拌機速度は、それぞれ、０．５〜０．６ｖｖｍおよび３５０〜４００ｒｐｍで維持し、温度は２６〜２８℃で維持した。種菌の増殖は、約１２〜２４時間実施し、内容物を１００Ｌ発酵槽に移した。１００Ｌ発酵槽中の製造培地（８０Ｌ）は、グルコース−５；酵母エキス−３；Ｔｗｅｅｎ−８０−０．１％；マスタードシードケーキ−２０からなっていた（リットルあたりのグラム）。発酵は、１分当たり６０〜８０リットル（１ｐｍ）の通気を行って実施し、撹拌機速度は１００〜２５０ｒｐｍの間で調整した。発酵槽の温度は、最高収率を得るよう２６℃〜２８℃で維持した。発酵は３〜４日間実施し、その間、ｐＨは８〜８．３に増大し、酵素は培地中に分泌された。真菌バイオマスを、遠心分離によって分離し、４日後の無細胞ブロスにおける活性は、１２〜１５ＩＵ／ｍｌであった。
［実施例２０］
【００９０】
この実施例は、ビューベリアＭＴＣＣ５１８４株を使用する固体状発酵によるアミラーゼの製造および限外濾過によるその濃縮を示す。ＭＧＹＰ種培養を調製するために、１０日培養スラントから得た胞子懸濁液を使用し、その組成（リットルあたりのグラム）は、麦芽エキス−３；酵母エキス−３；ペプトン−５およびグルコース−１０である。これを、２８℃でロータリーシェーカー上で４８時間インキュベートし、これを使用して発酵を開始した。酵素製造のための固体状発酵は、１０ｍｌの１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、その組成（リットルあたりのグラム）がグルコース−１．５；酵母エキス−１．５；ペプトン−５；牛肉エキス−５である１０ｍｌのＭｉｋａｍｉ培地と混合した２０ｇのフスマを含有する１０００ｍｌフラスコ中で実施し、静止条件下２８℃で、最大５日間インキュベートした。
【００９１】
発酵の最後に、半固体のカビの生えたコウジを、１５０ｍｌの０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を用い、２００ｒｐｍで１時間振盪することによって抽出した。５日目の最後でのアミラーゼ活性は、５０ＩＵ／ｇであった。このように製造されたアミラーゼを１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、透明な上清を、Ａｍｉｃｏｎ膜濾過ユニットにおいて１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するＰＭ−１０メンブレン上で濃縮した。濾過後の回収は、９５〜９８％であった。
［実施例２１］
【００９２】
実施例１８において記載されるように製造した粗プロテアーゼを、添加剤として１０％および１５％マルトデキストリンを用い、１５０〜１６０℃の入口温度およびそれぞれ６０〜６５℃および７０〜８０℃の出口温度を用いて噴霧乾燥させ、７０〜８０％が回収された。噴霧乾燥されたプロテアーゼの安定性を、４℃〜３７℃の範囲の温度で調べた。サンプルをバイアルに分配し、４℃、２８℃および３７℃で保存した。各温度でインキュベートした１バイアルを一定間隔で取り出し、残存活性を調べた。噴霧乾燥されたプロテアーゼは、試験したすべての温度で最大１０ヶ月間（３０１日間）安定であり、９０〜９５％の活性を保持していた（図５ａおよび５ｂ）。
［実施例２２］
【００９３】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼの均一性への精製を示す。真菌を、実施例２に記載されるように２％マスタードシードケーキを含有するグルコース−酵母エキス培地で４日間増殖させ、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後に得られた透明な上清を、酵素の供給源として使用した。ブロスの分画硫酸アンモニウム沈殿を４℃で実施し、透析された硫酸アンモニウム沈殿物（４０〜７０％飽和）を、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０で平衡化したジエチルアミノエチルセルロース（ＤＥＡＥ−セルロース）カラム（２．５ｃｍ×２５ｃｍ）に載せた。吸着されない酵素は、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０を２０ｍｌ／ｈの流速で用いて溶出した。プロテアーゼ活性を示す画分をプールし、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃｃによって濃縮し、−２０℃で保存した。精製に含まれる工程は、添付の表５に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素調製物の純度は、カチオン性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で銀染色後にタンパク質バンドを、活性染色後にプロテアーゼバンドをＸ線フィルム上で可視化することによって調べた。カチオン性ＰＡＧＥで銀染色後に１つだけのタンパク質バンドが見られ、これは、Ｘ線フィルム上での活性バンドと対応する（図６）。
【００９４】
【表５】
0005931745.tif 000006
【００９５】
［実施例２３］
【００９６】
この実施例は、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー後に得られた非結合画分の純度を確認する。実施例１２に記載されるように、プールされ、濃縮されたサンプルを、ＨＰＬＣのＴＳＫ  Ｇ  ２０００  ＳＷプレパックドカラム（７．５ｍｍ×６００ｍｍ）に適用し、５０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７を、０．７ｍｌ／分の流速で用いて溶出したところ、４０分の保持時間で単一のピークを示した。
［実施例２４］
【００９７】
この実施例は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびマトリックス支援レーザー脱離法イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）による精製プロテアーゼの分子量の決定を示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量マーカーは、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、フマラーゼ（４８．５ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、ホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）およびβ−ガラクトシダーゼ（１１６ｋＤａ）からなっていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる酵素の分子量は、およそ２９ｋＤａであるとわかり、これは、炭酸脱水酵素の分子量に相当していた。
【００９８】
精製プロテアーゼの分子量はまた、３７−ｎｍ窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を使用することによっても決定した。精製された酵素を、等容量のアセトニトリル中のシナピン酸と混合し、分析のために２０μｌの調製されたサンプルをＭＡＬＤＩプレート上においた。精製された酵素は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて２８．２ｋＤａの分子量を示し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた２９ｋＤａという分子量とほぼ同様であった（図７）。
［実施例２５］
【００９９】
この実施例は、精製プロテアーゼのＮ末端配列の決定を示す。半乾燥エレクトロブロッティングユニットを使用して、精製された酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥからポリビニリジエンジフルオリドメンブレン（ＰＶＤＦ）に電気泳動的に移した。タンパク質を３−シクロヘキシルアミノ１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）バッファーｐＨ−１１中で移した。バンドを可視化するために、ＰＶＤＦメンブレンをポンソー（Ponsue）Ｓを用いて染色した。ＰＶＤＦメンブレン上のプロテアーゼバンドを含有する領域を切り出し、タンパク質Ｎ末端アミノ酸配列を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒシークエンサー、Ｐｒｏｃｉｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）でエドマン分解法によって調べた。プロテアーゼのＮ末端配列は、Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａであるとわかった。この配列は、プロテアーゼのいずれとも１００％の相同性を示さなかった。ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼのＮ末端配列中の１６個のアミノ酸のうち１０個のアミノ酸との最高の相同性は、スブチリシン様プロテアーゼに対して観察された。図８は、ビューベリア種の新規株由来のプロテアーゼのＮ末端アミノ酸の、その他のスブチリシン様プロテアーゼとの複数の配列アラインメントを示す。
［実施例２６］
【０１００】
この実施例は、精製プロテアーゼの、その同定のためのゲル内トリプシン消化およびペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を示す。精製プロテアーゼを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて染色した。染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドを切り出し、４００μｌの５０％アセトニトリルを用いて（各１５分の３回）バンドを洗浄し、ＣＢＢ染色を除去した。スポットを１００％アセトニトリルを使用して、スポットが乳白色に変わるまで１０〜１５分間脱水し、次いで、スピードバキュームを使用して乾燥させた。次いで、タンパク質バンドを１００μｌの１０ｍＭジチオトレイトール中、次いで、１００μｌの２５ｍＭヨードアセトアミド中に浸漬することによって還元し、アルカリ化した。次いで、このバンドを２５ｍＭの重炭酸アンモニウム溶液で洗浄し、配列決定等級のウシトリプシン（Ｓｉｇｍａ）溶液を用いて消化した。タンパク質対トリプシンのモル比は、１：１０で維持した。５０％アセトニトリルおよび５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物を用いて、一晩トリプシン消化した後のゲルからペプチドを抽出し、さらなる分析まで−２０℃で保存した。
【０１０１】
ペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）５μｌ中で再構成し、次いで、スポットし、９６×２テフロンコーティングプレート上で風乾した。
【０１０２】
予めスポットしておいたペプチドスポット上にマトリックスとしてＣＨＣＡ（γ−シアノヒドロキシ桂皮酸）を加えた。Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を使用してペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）を得た。８００〜４０００Ｄａの質量範囲でＭＡＬＤＩマススペクトルを記録した。トリプシン消化のペプチド質量相同性に基づいてＭＡＳＣＯＴデータベースを使用することによってタンパク質を同定した。分析のために取られた６７種の断片のうち、１１の断片しか、ミクロスポルム・カニス(Microsporum canis)由来のスブチリシン様プロテアーゼ3前駆体と対応しない。
［実施例２７］
【０１０３】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来の精製プロテアーゼの等電点（ｐｉ）の決定を示す。等電点電気泳動は、１００ｍＶで、ｐＨ８．０〜１０．０の範囲でアンフォラインを使用してガラス管中の１０％ポリアクリルアミドゲル中で１６時間かけて行った。２種のゲルを流し込み、各管に１００μｇの精製プロテアーゼを加えた。ゲルをガラス管から取り出し、ゲルの一方を、各１ｃｍの１３の画分に切断し、もう一方を銀染色を用いて染色した。画分のプロテアーゼ活性およびｐＨを調べた。プロテアーゼの等電点は、９．３１であるとわかった。
［実施例２８］
【０１０４】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のプロテアーゼ活性に対する阻害剤の効果を示す。以下の阻害剤：フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヨード酢酸、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびベンズアミジンを調べた。３００μｇの精製プロテアーゼを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）中で各阻害剤とともに１時間プレインキュベートし、残存するプロテアーゼ活性を５０℃、ｐＨ９．０で測定した。阻害剤を伴わないプロテアーゼは、コントロールとしての役割を果たした。プロテアーゼは、１ｍＭ  ＰＭＳＦによって完全に阻害され、このことは、それがセリンプロテアーゼであることを示した（表６）。
【０１０５】
【表６】
0005931745.tif 000007
【０１０６】
［実施例２９］
【０１０７】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のプロテアーゼ活性に対する金属イオンの効果を示す。精製プロテアーゼを、種々の金属の１ｍＭおよび１０ｍＭ塩化物塩とともに２８℃で３０分間インキュベートし、その後、残存する活性を調べた。Ｃａ＋２の存在下でプロテアーゼ活性の活性化はなく、このことは、酵素がその活性にカルシウムイオンを必要としないことを示す（表７）。Ｃｕ＋２およびＣｏ＋２は、プロテアーゼに対して阻害効果がなかったが、Ｃｄ＋２およびＨｇ＋２は、１０ｍＭ濃度で＜４０％の阻害を示した。ＣｄおよびＨｇは、１ｍＭ濃度で、３％および１０％阻害をそれぞれ示した。
【０１０８】
【表７】
0005931745.tif 000008
【０１０９】
［実施例３０］
【０１１０】
この実施例は、ＰＭＳＦによるプロテアーゼのセリン残基の修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０中、１０μΜのビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４の精製プロテアーゼを、０．００５〜０．０５ｍＭ  ＰＭＳＦとともに、２８℃で３０分間インキュベートし、残存活性を調べた（表８）。ＰＭＳＦを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。０．０２５ｍＭ  ＰＭＳＦで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するセリン残基の関与を示す。ＰＭＳＦの濃度および時間に関する阻害速度論を図９に示す。
【０１１１】
【表８】
0005931745.tif 000009
【０１１２】
［実施例３１］
【０１１３】
この実施例は、ウッドワード試薬（ＷＲＫ）によるプロテアーゼのアスパラギン酸残基の修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０中、１０μΜのビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４の精製プロテアーゼを、１〜１０ｍＭ  ＷＲＫとともに、２８℃で３０分間インキュベートし、残存活性を調べた。ＷＲＫを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。９ｍＭ  ＷＲＫで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するアスパラギン酸残基の関与を示す（表９）。
【０１１４】
【表９】
0005931745.tif 000010
【０１１５】
［実施例３２］
【０１１６】
この実施例は、Ｎ−ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）を用いるトリプトファンの修飾およびプロテアーゼ活性に対するその効果を示す。１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．０中、１０μΜのビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４の精製プロテアーゼを、０．０１〜０．１ｍＭ  ＮＢＳとともに、２８℃で３０分間インキュベートし、残存活性を調べた。ＮＢＳを伴わずにインキュベートしたプロテアーゼは、コントロールとして役割を果たした。０．０６ｍＭ  ＮＢＳで完全阻害が観察され、このことは、プロテアーゼの活性に対するトリプトファン残基の関与を示す（表１０）。
【０１１７】
【表１０】
0005931745.tif 000011
【０１１８】
［実施例３３］
【０１１９】
この実施例は、ＰＭＳＦ、ＷＲＫおよびＮＢＳによるビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼの阻害に対するカゼインによる基質保護の研究を示す。これは、１〜１０ｍｇのカゼインとともに１０μΜの精製プロテアーゼを、４℃で５分間プレインキュベートし、続いて、１０μΜ  ＰＭＳＦまたは５ｍＭ  ＷＲＫまたは１０μΜ  ＮＢＳを用いて３０分間処理することによって実施し、残存プロテアーゼ活性を調べた。カゼイン濃度を増大すると、両阻害剤による阻害が減少し、このことは、カゼインによる基質保護を示す（表１１）。これは、プロテアーゼの活性部位でのセリン、アスパラギン酸およびトリプトファンの存在を示す。
【０１２０】
【表１１】
0005931745.tif 000012
【０１２１】
［実施例３４］
【０１２２】
この実施例は、カゼイン、ヘモグロビンおよびウシ血清アルブミンに対する、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼの活性の測定を示す。反応混合物は、２ｍｌの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼ酵素の一定分量と、０．１Ｍ  炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中の１０ｍｇの基質とを含有していた。５０℃で１０分間インキュベートした後、３ｍｌの５％トリクロロ酢酸を添加すること（濃塩酸を用いる酸性化）によって反応を終結させた。室温で３０分間静置した後、形成された沈殿物を、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を通して濾過した。トリクロロ酢酸可溶性画分の吸光度を、２８０ｎｍで測定した。プロテアーゼは、上記の基質を種々の程度に分解できる（表１２）。
【０１２３】
【表１２】
0005931745.tif 000013
【０１２４】
［実施例３５］
【０１２５】
この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが活性であるｐＨ範囲を示す。プロテアーゼの最適ｐＨを決定するために、酵素を、５．５〜１２の範囲の異なるｐＨのバッファーで希釈し、アッセイした。以下のバッファーを使用した（０．１Ｍ）：クエン酸（ｐＨ４および５）クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６）、リン酸バッファー（ｐＨ７）、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）および炭酸重炭酸（ｐＨ９および１０）、リン酸ナトリウム−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．０）およびＫＣｌ−ＮａＯＨ（ｐＨ１２．０）。結果は、添付の表１３に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、ｐＨ５．５から１２の間で活性であるということが観察される。
【０１２６】
【表１３】
0005931745.tif 000014
【０１２７】
［実施例３６］
【０１２８】
この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を決定するために、３０〜７０℃の範囲の温度で炭酸重炭酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ９）を用いてプロテアーゼ活性を調べた。実験の結果は、添付の表１４に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、３０〜７０℃の間で活性であるということが観察される。
【０１２９】
【表１４】
0005931745.tif 000015
【０１３０】
［実施例３７］
【０１３１】
この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが安定であるｐＨ範囲を示す。酵素の安定性に対するｐＨの影響を検討し、ここでは、酵素のｐＨは以下のバッファー：（クエン酸−ｐＨ３、４および５；クエン酸リン酸バッファー−ｐＨ６；リン酸バッファー−ｐＨ７；Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー−ｐＨ８；炭酸重炭酸−ｐＨ９および１０ならびにリン酸ナトリウム−ＮａＯＨ  ｐＨ１１．０）を用いて調整され、２８℃で１時間インキュベートした。インキュベートした後の酵素の残存活性を、５０℃、ｐＨ９でアッセイした。結果は、表１５に示され、ここでは、酵素がｐＨ３〜１１の範囲で安定であり、ｐＨ７で最大の安定性を有することが観察される。
【０１３２】
【表１５】
0005931745.tif 000016
【０１３３】
［実施例３８］
【０１３４】
この実施例は、前記株によって分泌されるプロテアーゼが１時間安定である温度範囲を示す。温度安定性を調べるために、粗プロテアーゼを、４〜７０℃の範囲の温度で、０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファーｐＨ７．０中で１時間インキュベートし、残存活性を５０℃、ｐＨ９で測定した。結果は表１６に示されており、ここでは、酵素が５０℃まで安定であることが観察される。
【０１３５】
【表１６】
0005931745.tif 000017
【０１３６】
［実施例３９］
【０１３７】
前記プロテアーゼの安定性をまた、粗プロテアーゼを、炭酸重炭酸バッファーｐＨ９．０中、５０℃で最大２時間インキュベートすることによって、５０℃で時間に関して調べた。一定分量を１５分の一定間隔で取り出し、５０℃、ｐＨ９で残存活性を推定した。結果は、表１７に示されており、ここでは、５０℃でのプロテアーゼの半減期がおよそ２時間であるとわかった。
【０１３８】
【表１７】
0005931745.tif 000018
【０１３９】
［実施例４０］
【０１４０】
この実施例は、アゾコール(azocoll)に対するビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、２．５ｍｌの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量と、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーｐＨ８．０中の１０ｍｇのアゾコールとを含有していた。熱不活化酵素（１５分間煮沸することによる）をブランクとしてとった。３７℃で１０分間インキュベートした後、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙を通して濾過することによって反応を終結させた。５８０ｎｍで濾液の吸光度を測定した。酵素活性の１ユニットは、１分あたり５８０ｎｍでの吸光度の１ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例２に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、４．３１Ｕ／ｍｌのアゾコール(azocoll)活性を有していた。２０．７Ｕ／ｍｌのカゼオノリティック(caseonolytic)活性を有する実施例２２に記載される精製プロテアーゼは、１．８４Ｕ／ｍｌのアゾコール（azocoll)活性を示した。
［実施例４１］
【０１４１】
この実施例は、エラスチン-オルシンに対する、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、３ｍｌの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼ酵素の一定分量と、０．１Ｍ  炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中、２０ｍｇのエラスチン−オルシンとを含有していた。熱不活化酵素（１５分間煮沸することによる）をブランクとしてとった。５０℃で３０分間インキュベートした後、２ｍｌの０．７Ｍリン酸バッファーｐＨ６を添加することによって反応を終結させた。内容物を遠心分離し、上清の吸光度を５７８ｎｍで測定した。酵素活性の１ユニットは、１分で５８０ｎｍでの吸光度の１ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例２に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、０．０１２Ｕ／ｍｌの活性を示した。２０．７Ｕ／ｍｌのカゼオノリティック(caseonolytic)活性を有する実施例２２に記載される精製プロテアーゼは、エラスチン−オルシンに対して０．０１１Ｕ／ｍｌの活性を示した。
［実施例４２］
【０１４２】
この実施例は、アゾカゼインに対する、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、５００μｌの総容量中に、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量と、０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中、１ｍｇのアゾカゼインとを含有していた。熱不活化酵素（１５分間煮沸することによる）をブランクとしてとった。５０℃で３０分間インキュベートした後、５００μｌの１０％  ＴＣＡを添加することによって反応を終結させた。氷上で１５分間冷却した後、内容物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。８００μｌの上清に、２００μｌの１．８Ｍ  ＮａＯＨを加え、４２０ｎｍで吸光度を測定した。酵素活性の１ユニットは、１分あたり４２０ｎｍでの吸光度の１ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。実施例２に記載されるように増殖させた粗培養濾液は、１６．０５Ｕ／ｍｌの活性を示した。
［実施例４３］
【０１４３】
この実施例は、Ｎ−α−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＮＡ）に対する、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来の精製プロテアーゼの活性の決定を示す。反応混合物は、５００μｌの総容量中に、０．１Ｍ  炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中の、適宜希釈されたプロテアーゼの一定分量を含有していた。０．１Ｍ  炭酸ナトリウムバッファーｐＨ９．０中で調製された１．５ｍＭ  ＢＡＰＮＡ  ５００μｌを加え、５０℃で６０分間インキュベートした。２５０μｌの１０％酢酸を添加することによって反応を終結させた。４１０ｎｍでの上清の吸光度を測定した。活性の１ユニットは、１分で４１０ｎｍでの吸光度の１ユニットの増大を引き起こすのに必要な酵素の量として定義されている。２０．７Ｕ／ｍｌのカゼオノリティック(caseonolytic)活性を有する実施例２２に記載されるように精製されたプロテアーゼは、０．０１８Ｕ／ｍｌの活性を示した。
［実施例４４］
【０１４４】
この実施例は、ＮＭＩＴＬＩ−１およびコラゲナーゼ−１基質を使用する蛍光研究によって、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼの非コラゲナーゼ性を示す。最初に、ＮＭＩＴＬＩ−１基質に対して粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼを用いて蛍光実験を行った。蛍光実験は、トリエタノールアミンバッファー（ＴＥＡ）ｐＨ８中、室温で実施した。通常、アッセイは、１．８μΜのＮＭＩＴＬＩ−１基質濃度（１２μＭ保存溶液の１０μｌ）を有する、２９０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファーｐＨ８を含有していた。５μｌの酵素サンプルを添加することによって反応を開始した。励起波長は、３４０ｎｍとし、発光は、種々の時間間隔で４２５から６２５ｎｍでスキャンした。ＡＥＤＡＮＳ発色団の蛍光において３倍の増大があり（＋＋＋）、これは、酵素サンプルのタンパク質分解性を示す。
【０１４５】
ＮＭＩＴＬＩ−Ｉ
Dabcyl-Gaba-Arg-Pro-Leu-Gly-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-Gaba-Cys-Lys-NH2
｜
AEDANS 
【０１４６】
ＮＭＩＴＬＩ−１基質に対する活性を示す粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼサンプルをまた、コラゲナーゼ基質−Ｉを用いてコラゲナーゼ活性についてスクリーニングした。蛍光実験は、トリエタノールアミンバッファー（ＴＥＡ）ｐＨ８中、室温で実施した。通常、アッセイは、１．６μＭの基質(コラゲナーゼ基質−Ｉ）濃度（８０ｍＭ保存溶液の５μｌ）を有する、２９０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡバッファーｐＨ８で行った。５μｌの酵素サンプルを添加することによって反応を開始した。励起波長は３４０ｎｍとし、発光は、種々の時間間隔で４２５から６２５ｎｍでスキャンした。ＡＥＤＡＮＳ発色団の蛍光の増大はなく（−）、これは、コラゲナーゼ活性がないことを示す。
【０１４７】
コラゲナーゼ基質−Ｉ
Dabcyl-Gaba-Lys-Gly-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro-Gly-Gly-Cys-Lys-NH2
｜
AEDANS
［実施例４５］
【０１４８】
この実施例は、洗浄剤の存在下でのビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼの安定性を示す。粗プロテアーゼを、４０℃で洗浄剤（０．７ｍｇ／ｍｌ終濃度）とともに最大１時間インキュベートした。洗浄剤は、使用前に１００℃で１０分間加熱した。サンプルを１５分の間隔で回収し、残存活性を測定し、それぞれの洗浄剤について初期活性を１００％とした時のパーセンテージとして表した。プロテアーゼは、全ての洗浄剤の存在下で安定であり、洗浄剤に応じて１時間後に７５〜１００％の活性を保持した（表１８）。
【０１４９】
【表１８】
0005931745.tif 000019
【０１５０】
［実施例４６］
【０１５１】
この実施例は、２８℃での精製プロテアーゼの安定性に対する水混和性ならびに水非混和性有機溶媒の効果を示す。以下の有機溶媒を使用した：アセトン、１−ブタノール、ベンゼン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、エタノール、ヘキサン、イソプロパノールおよびメタノール。精製プロテアーゼを、２８℃、ｐＨ７で２５％（ｖ／ｖ）有機溶媒（有効濃度）とともにインキュベートした。サンプルを種々の時点で回収し、残存活性を推定した。有機溶媒を伴わないサンプルは、コントロールとして役割を果たした。それぞれの溶媒について初期活性を１００％とした（表１９）。プロテアーゼは、２４時間後にエタノール、イソプロパノール、メタノール、ブタノールおよびジメチルスルホキシドでは８０％超の活性が保持され、３０％未満の残存活性を示したアセトン、ベンゼン、クロロホルムおよびヘキサンを除く、有機溶媒の存在下で高度に安定であった（表１９）。溶媒を伴わないコントロールは、同一条件下で、約２６．６６％の残存活性を示した。
［実施例４８］
【０１５２】
この実施例は、３７℃での粗プロテアーゼの安定性に対する水非混和性有機溶媒の効果を示す。以下の有機溶媒を使用した：１−ブタノール、ベンゼン、クロロホルム、ジメチルスルホキシドおよびヘキサン。粗プロテアーゼを、３７℃、ｐＨ７で、２５％（ｖ／ｖ）有機溶媒（有効濃度）とともにインキュベートした。サンプルを種々の時点で回収し、残存活性を推定した。有機溶媒を伴わないサンプルは、コントロールとして役割を果たし、それぞれの溶媒の初期活性を１００％とした（図１１）。プロテアーゼは、水非混和性有機溶媒の存在下で高度に安定であり、安定性は、試験したすべての溶媒について多かれ少なかれ類似していた。１２時間後に８０％超の活性が保持され、２４時間インキュベートした後に５０〜８０％に低下したのに対し、コントロールは、２４時間後に４０％未満の活性しか保持していなかった。
［実施例４９］
【０１５３】
この実施例は、５０℃での精製プロテアーゼの安定性に対する水混和性ならびに水非混和性有機溶媒の効果を示す。以下の有機溶媒を使用した：アセトン、１−ブタノール、ベンゼン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、エタノール、ヘキサン、イソプロパノールおよびメタノール。精製プロテアーゼを、５０℃、ｐＨ７で、２５％（ｖ／ｖ）有機溶媒（有効濃度）とともにインキュベートした。サンプルを種々の時間間隔で回収し、残存活性を推定した。有機溶媒を伴わないサンプルは、コントロールとして役割を果たし、それぞれの溶媒の初期活性を１００％とした（表２０）。プロテアーゼは、すべての有機溶媒の存在下で最大１時間、高度に安定であり、残存活性は６０〜９０％の範囲であった。２時間後、安定性は、アセトンおよびＤＭＳＯにおいて最大であり、約７０％の残存活性を有していたのに対し、すべての他の溶媒においては、残存活性は約３０〜４０％であった。
【０１５４】
【表２０】
0005931745.tif 000020
【０１５５】
［実施例５０］
【０１５６】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のプロテアーゼ活性に対するβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の効果を示す。５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７中の１０μΜの精製プロテアーゼを、１〜１０％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、０．２〜２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とともに２８℃で３０分間プレインキュベートした。残存活性は、５０℃、ｐＨ９．０で測定し、全く変性剤を伴わない活性（コントロール）を１００％とした時のパーセンテージとして表した。ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼは、１０％ＢＭＥにおいて全活性を保持しており、これは、酵素中にジスルフィド結合がないことを示し、一方で、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下では８０％活性が保持された。
［実施例５１］
【０１５７】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のプロテアーゼ活性に対する尿素の効果を示す。２セットの条件下で安定性を調べた。ａ）５０ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ７中、１０μΜの精製プロテアーゼを、１〜６Ｍ尿素とともに２８℃で３０分間プレインキュベートした。ｂ）５０ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ７中、１０μΜの精製プロテアーゼを、６Ｍ尿素とともに、２８℃で最大２時間プレインキュベートした。サンプルを一定間隔で回収し、残存活性を５０℃、ｐＨ９．０で測定し、尿素を伴わない活性を１００％とした時のパーセンテージとして表した。ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼは、尿素の存在下で安定であり、６Ｍまでの尿素の濃度の増大につれてわずかな増大を示した（図１２）。６Ｍ尿素の存在下で、プロテアーゼは、最大２時間安定であり、初期活性の８５％超を保持していた（図１３）。
［実施例５２］
【０１５８】
この実施例は、ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４の精製プロテアーゼ活性に対するＮａＣｌの効果を示す。２セットの条件下で安定性を調べた。ａ）５０ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ７中、１０μΜの精製プロテアーゼを、０．５〜３ＭのＮａＣｌとともに、２８℃で３０分間プレインキュベートした。ｂ）５０ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ７中、１０μΜの精製プロテアーゼを、３Ｍ  ＮａＣｌとともに２８℃で最大２時間プレインキュベートした。サンプルを一定間隔で回収し、残存活性を５０℃、ｐＨ９．０で測定し、ＮａＣｌを伴わない活性を１００％とした時のパーセンテージとして表した。ビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４由来のプロテアーゼは、ＮａＣｌの存在下で安定であり、３ＭまでのＮａＣｌの濃度の増大につれてわずかな増大を示した(図１４)。３Ｍ  ＮａＣｌの存在下で、プロテアーゼは最大２時間安定であり、初期活性の約７５％を保持した（図１３）。
［実施例５３］
【０１５９】
この実施例は、前記株によって分泌されるキシラナーゼが活性であり、安定であるｐＨ範囲を示す。キシラナーゼの最適ｐＨを調べるために、酵素を以下のバッファー中に希釈し（０．０５Ｍ）、５０℃で３０分間アッセイした：クエン酸（ｐＨ３、４および５）クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６）、リン酸バッファー（ｐＨ７）、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）および炭酸重炭酸（ｐＨ９）。安定性研究のために、キシラナーゼを上記のバッファー中、室温で１時間プレインキュベートし、残存活性を５０℃、ｐＨ６で３０分間アッセイした。結果は、添付の表２１に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、ｐＨ４から９の間で活性であり、３から９のｐＨ範囲において安定であるということが観察される。
【０１６０】
【表２１】
0005931745.tif 000021
【０１６１】
［実施例５４］
【０１６２】
この実施例は、前記株によって分泌されるキシラナーゼが活性である温度範囲を示す。キシラナーゼの最適温度を調べるために、酵素をｐＨ６で、また３０〜７０℃の範囲の温度で推定した。実験の結果は、添付の表２２に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は３０〜７０℃の間で活性であるということが観察される。
【０１６３】
【表２２】
0005931745.tif 000022
【０１６４】
［実施例５５］
【０１６５】
この実施例は、前記株によって分泌されたアミラーゼが活性であり、安定であるｐＨ範囲を示す。アミラーゼの最適ｐＨを調べるために、酵素を以下のバッファー中に希釈し（０．０５Ｍ）、５０℃で３０分間アッセイした：クエン酸（ｐＨ３、４および５）クエン酸リン酸バッファー（ｐＨ６）、リン酸バッファー（ｐＨ７）、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）および炭酸重炭酸（ｐＨ９）。安定性研究のために、アミラーゼを、上記のバッファー中、室温で１時間プレインキュベートし、残存活性を５０℃、ｐＨ６で３０分間アッセイした。結果は、添付の表２３に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、ｐＨ４から８の間で活性であり、３から９のｐＨ範囲において安定であるということが観察される。
【０１６６】
【表２３】
0005931745.tif 000023
【０１６７】
［実施例５６］
【０１６８】
この実施例は、前記株によって分泌されるアミラーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を調べるために、アミラーゼをｐＨ６で、また２０〜７０℃の範囲の温度で推定した。実験の結果は、添付の表２４に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、２０〜７０℃の温度範囲において活性であるということが観察される。
【０１６９】
【表２４】
0005931745.tif 000024
【０１７０】
［実施例５７］
【０１７１】
この実施例は、前記株によって分泌されたリパーゼが活性であるｐＨ範囲を示す。リパーゼの最適ｐＨを調べるために、酵素を希釈し、滴定法によって５０℃、４〜９の範囲のｐＨでアッセイした。以下のバッファーを使用した：酢酸（ｐＨ４および５）クエン酸（ｐＨ６）、リン酸（ｐＨ７）、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８）および炭酸重炭酸（ｐＨ９）。結果は．添付の表２５に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、ｐＨ４から９の間で活性であるということが観察される。
【０１７２】
【表２５】
0005931745.tif 000025
【０１７３】
［実施例５８］
【０１７４】
この実施例は、前記株によって分泌されるリパーゼが活性である温度範囲を示す。最適温度を調べるために、リパーゼ活性を、ｐＨ７で、また２０〜６０℃の範囲の温度で滴定法によって調べた。実験の結果は、添付の表２６に示されており、本明細書の一部を形成する。酵素は、２０〜６０℃の間で活性であるということが観察される。
【０１７５】
【表２６】
0005931745.tif 000026
【０１７６】
［実施例５９］
【０１７７】
この実施例は、粗プロテアーゼおよび精製プロテアーゼならびにビューベリア種ＭＴＣＣ５１８４のバイオマス濾液を使用することによる、廃棄Ｘ線フィルムからの銀の回収および銀ナノ粒子の合成を示す。真菌を、組成（リットルあたりのグラム）が、麦芽エキス−３、酵母エキス−３、ペプトン−５、グルコース−１０であるＭＧＹＰブロス中、２８℃、２００ｒｐｍで４８時間、好気的に増殖させバイオマスを遠心分離によって回収し、続いて、蒸留水で十分に洗浄して、培地成分を除去した。１０ｇの洗浄されたバイオマス（湿潤重量）を、１００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ脱イオン水とともに、２８℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。２時間インキュベートした後、バイオマスをＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１濾紙上で濾過し、濾液を集めた。銀を回収し、銀ナノ粒子を合成するために、５ｇの、２ｃｍ×２ｃｍ片に切断した洗浄されたＸ線フィルムを、１００ｍｌの総容量で、粗プロテアーゼ、精製プロテアーゼおよびバイオマス濾液とともに、２８℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。銀含有タンパク質（ゼラチン）層の回収およびナノ粒子合成を、可視的にならびにＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって、最大４８時間モニタリングした。ナノ粒子の存在とともに浄化されたフィルムの同時出現を伴うゼラチン層の完全な回収が、２４時間内に観察された。銀ナノ粒子は、粗プロテアーゼならびに精製プロテアーゼによって、またバイオマス濾液によっても合成され得る。粗プロテアーゼは、混入物質として培地成分を含有し、精製プロテアーゼの使用は高価となるので、バイオマス濾液が好ましい。合成された銀ナノ粒子を、ＵＶ−可視分光法（図１５）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、単一ナノ粒子フーリエ変換赤外分光法の回折パターンおよびＸ線回折によって特性決定した。
［実施例６０］
【０１７８】
この実施例は、細胞の分離のための動物組織培養における精製プロテアーゼの適用を示す。細胞を内皮細胞用基礎培地−２（ＥＢＭ−２）上で増殖させた。４８時間増殖させた後、プレートから培地をファルコンチューブ中に回収した。プレートの底の付着細胞を２ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液で洗浄し、続いて、４ｍｌの１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液中、２００μｇのプロテアーゼを加え、３７℃で２分間インキュベートした。細胞を洗い出し、ファルコンチューブ中に集め、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを１ｍｌの新鮮培地中に再懸濁し、新しいペトリプレートに移した。顕微鏡観察によって、分離された細胞が示され、これは、プロテアーゼの作用によるものであった（図１６）。
［実施例６１］
【０１７９】
この実施例は、洗浄剤製剤におけるプロテアーゼの適用を記載する。白い布片を血液中に浸し、風乾した。血痕のついた布を各０．５ｇの４等分に切断し、４つの異なるペトリプレート中で２％ホルムアルデヒド中に２分間浸し、水ですすいで過剰のホルムアルデヒドを除去した。布片を３０ｍｌの反応混合物中に浸し、異なる条件下、２８〜３０℃で３０分間インキュベートした：（ａ）コントロール（水のみ）（ｂ）洗浄剤のみ（ｃ）粗プロテアーゼ（８．５Ｕ／ｍｌ）のみおよび（ｄ）洗浄剤＋粗プロテアーゼ（８．５Ｕ／ｍｌ）。布片を水道水で４回すすいだ。洗浄性能は、洗浄剤およびプロテアーゼが一緒に使用される場合に最高であった。血餅は、洗浄剤のみでは除去されなかったのに対し、プロテアーゼ単独では、血餅とともに血痕を除去できた（図１７）。
［実施例６２］
【０１８０】
この実施例は、粗ビューベリアＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼを使用するヤギおよびヒツジ皮膚の脱毛工程を示す。実施例６Ｂに記載されるように製造したプロテアーゼを硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に付し、脱毛研究に使用した。湿潤塩漬けヤギおよびヒツジ皮膚を取り出し、６時間浸漬した。浸漬後、皮膚の重量を書きとめた。浸漬された重量に基づいて３％プロテアーゼおよび１０％水のペーストを皮膚の内側に塗布し、５〜１０時間積み重ねた。対応する化学物質に基づく対照工程も、１０％石灰、３％硫化物および１５％水のペーストを使用して実施した。次いで、コントロールおよび実験皮膚の両方を脱毛し、実験皮膚の脱毛有効性は、８５〜１００％の範囲であり、これは、化学物質に基づくプロセスと同様であった。生皮は清潔で、かすり傷(scud)がなかった。脱毛された生皮をクラスト皮に加工し、クラスト皮の品質も評価した。引張強度、引裂強度およびしぼ破裂強度によって評価されるような皮革の品質は、石灰および硫化物脱毛法によって得られたものに匹敵していた。汚染負荷量の低減もまた、コントロールおよび実験工程両方の種々の廃棄流を分析することによって評価した。結果は、脱毛にプロテアーゼが使用された場合に、ＣＯＤおよび硫化物の大幅な低減を示し、０．６９のＢＯＤ／ＣＯＤ比を有し、これは、廃水の分解性および処理性能が、化学的プロセスシステムの廃水と比較してかなり良好であるということを示す。
［実施例６３］
【０１８１】
この実施例は、粗ビューベリアＭＴＣＣ５１８４プロテアーゼを使用するウシの皮の脱毛工程を示す。実施例６Ｂに記載されるように製造されたプロテアーゼを硫酸アンモニウム沈殿（９０％飽和）に付し、脱毛研究に使用した。湿潤塩漬けウシ皮を取り出し、８時間浸漬した。浸漬後、皮の重量を書きとめた。皮を、１５％水および４％酵素を使用してドラム缶中で処理した。対応する化学物質に基づく対照工程も、１５０％水、１０％石灰および３％硫酸ナトリウムを使用して実施した。翌日、皮膚を脱毛し、脱毛有効性は、７０〜１００％の範囲であった。生皮は清潔でかすり傷(scud)がなかった。脱毛された生皮をクラスト皮に加工し、クラスト皮の品質も評価した。引張強度、引裂強度およびしぼ破裂強度によって評価されるような皮革の品質は、石灰および硫化物脱毛法によって得られたものに匹敵していた。汚染負荷量の低減もまた、コントロールおよび実験工程両方の種々の廃棄流を分析することによって評価した。結果は、脱毛にプロテアーゼが使用された場合に、ＣＯＤおよび硫化物の大幅な低減を示し、０．７２のＢＯＤ／ＣＯＤ比を有し、これは、廃水の分解性および処理性能が、化学的プロセスシステムの廃水と比較してかなり良好であるということを示す。
【０１８２】
本発明の主な利点は、以下のとおりである：
・真菌株は新規単離株である。
・本発明において記載される真菌株は、プロテアーゼを単独で、またアミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼを使って製造できる。
・本発明において記載される真菌株は、プロテアーゼ  アミラーゼ、リパーゼおよびキシラナーゼを単独でまたは組み合わせて製造できる。
・酵素製造のために、液内発酵ならびに固体状発酵の両方とも使用できる。
・これらの酵素のカクテルは、皮革、繊維製品、洗浄剤および食品工業など、多数の工業的用途を有する。
・プロテアーゼは、皮革工業における前なめし操作におけるその適用についてすでに評価されている。
・粗プロテアーゼは、石灰および硫化物のような化学物質を全く添加する必要なく、動物皮膚／皮を脱毛できる。
・プロテアーゼは、内皮細胞を分離でき、動物細胞培養において使用できる。
・プロテアーゼは、ナノ粒子を合成できる。
・粗プロテアーゼ調製物は、広い基質特異性を有し、皮革および洗浄剤工業における適用に必要とされるようなアルブミン、ヘモグロビン、ゼラチン、ケラチンなど、種々のタンパク質を分解できる。
・プロテアーゼは、３〜１０の広いｐＨ範囲にわたって、また、洗浄剤の存在下で安定性を有し、このために、洗浄剤および同類の工業におけるその適用にとって適した候補となる。
・プロテアーゼは、種々の水混和性および水非混和性溶媒の存在下で安定であり、このために、有機溶媒における種々の分子の酵素的合成にとって適したものとなる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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