(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料においてゲノムの１以上の核酸を定量及び／若しくは検出するための方法であって、
ａ．核酸が増幅され、かつ増幅される遺伝子座はゲノム中の多コピー遺伝子座であり、
ｂ．多コピー遺伝子座は少なくとも２つの異なる染色体上にコピーを有し、
ｃ．増副産物が検出及び／又は定量され、
ｄ．多コピー遺伝子座は反復要素ではない、並びに、
ｅ．前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項２】
試料においてヒトＤＮＡの可能性のある分解の状態を解析するための方法であって、
ａ．核酸が増幅され、かつ増幅される遺伝子座はゲノム中の多コピー遺伝子座であり、
ｂ．多コピー遺伝子座は少なくとも２つの異なる染色体上にコピーを有し、
ｃ．増副産物が検出及び／又は定量され、
ｄ．多コピー遺伝子座は反復要素ではない、並びに、
ｅ．前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項３】
試料においてコピー数多型（ＣＮＶ）を解析するための方法であって、
ａ．核酸が増幅され、かつ増幅される遺伝子座はゲノム中の多コピー遺伝子座であり、
ｂ．多コピー遺伝子座は少なくとも２つの異なる染色体上にコピーを有し、
ｃ．増副産物が検出及び／又は定量され、
ｄ．多コピー遺伝子座は反復要素ではない、並びに、
ｅ．前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、方法。
【請求項４】
多コピー遺伝子座の少なくとも４つの異なるコピーが増幅される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
増幅方法が非等温法又は等温法の何れかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
増幅方法が、定量リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、ヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）、スマート増幅プロセス（ＳＭＡＰ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、指数関数増幅反応（ＥＸＰＡＲ）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）及び核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）の群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
増幅方法がヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）又は定量リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増幅産物の長さが６０塩基対から２００塩基対である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
プライマーが増幅に用いられ、前記プライマーは、１８個のヌクレオチドの領域に渡り、配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１及び／又は１２と、１つのヌクレオチドを超えて異なることは無いヌクレオチド配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ゲノムの核酸を検出及び／若しくは定量するためのゲノム中の多コピー遺伝子座の使用であって、前記多コピー遺伝子座は少なくとも二つの異なる染色体上にコピーを有し、前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項１１】
ヒトＤＮＡの可能性のある分解の状態を解析するためのゲノム中の多コピー遺伝子座の使用であって、前記多コピー遺伝子座は少なくとも二つの異なる染色体上にコピーを有し、前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【請求項１２】
コピー数多型（ＣＮＶ）解析の基準遺伝子としてのゲノム中の多コピー遺伝子座の使用であって、前記多コピー遺伝子座は少なくとも二つの異なる染色体上にコピーを有し、前記遺伝子座が、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、診断の分野、より具体的には分析科学及び法医科学の分野に関する。本発明はさらに、核酸の増幅及び定量の分野、より具体的にはＤＮＡ定量の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
法医学試料及びその他試料から回収したＤＮＡ量を決定することは、ＤＮＡタイピング・プロセス全体においてのみならず、その他様々な科学分野におけるＤＮＡ検出においても重要な工程である。例えば多重ＤＮＡタイピング・キットで最適な結果を得るには、０．５〜２ｎｇと狭い範囲のＤＮＡを投入がしばしば必要である。そのため、陽性結果が陽性結果であること、及び／又はＤＮＡが含まれていないことによる陰性結果が陰性結果であることを確実にするためには、ＤＮＡの定量が絶対的に重要である。さらに、ＤＮＡを試験する法医学研究室のための品質基準としては、ヒト特異的ＤＮＡの定量が必要とされている。これは、ヒトＤＮＡ、並びに細菌及びその他外因性ＤＮＡを回収し得る単離技術によるものである。ヒト特異的ＤＮＡの定量を可能にする、多数の手段が開発されており、それらには、スタートブロット法（start-blot technique）、液体ベースのハイブリダイゼーション・アッセイ、及びリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）が含まれる。現在では、リアルタイムＰＣＲが、ダイナミックレンジが広いこと並びに自動化が容易なことから、主要な手法である。
【０００３】
最新のＳＴＲキットの感度は非常に高くなっており、少量のＤＮＡを用いても良好な結果を得ることができる。従って、濃度が低い試料であってもＤＮＡの精密な定量を可能にする、方法、キット、及び核酸領域の要求がある。一定の定量及び検出キットが既に利用可能であるが、これらのキットには重大な欠点がある。このようなキットの１つにはクオンチフィラー・ヒト・キット（Quantifiler Human Kit）（アプライドバイオシステムズ）があり、その他キットとしてはクオンチフィラー・デュオ・キット（Quantifiler Duo Kit）（アプライドバイオシステムズ）やプレクサーＨＹリアルタイムＰＣＲ定量キット（Plexor HY Real-Time ＰＣＲ Quantification Kit）（プロメガ）がある。クオンチフィラー・デュオ・キットとプレクサーＨＹキットは両方とも、ゲノム上の常染色体標的及び性染色体（Ｙ染色体）標的をターゲットとしている。
【０００４】
これらキットには以下のような欠点がある。ラ・サール（LaSalle）ら［フォレンジック・サイエンス・インターナショナル：ジェネティクス（Forensic Science International: Genetics）「リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ定量のための単コピー及び多コピー法の解析（Analysis of Single and Multi-copy Methods for DNA Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction）」］によれば、クオンチフィラー・キットはプレクサーＨＹよりも定量の面では正確であるが、ダイナミックレンジが狭い。プレクサーＨＹは多コピー標的を増幅するためダイナミックレンジは広いが、精度が低い。精度が低い原因は多コピー標的に起因し得る。例えば標的コピー数が不安定なために、ゲノムの２０コピー一式全てが増幅しない場合、常染色体標的及び性染色体（Ｙ）標的との間の増幅の比率が変化し得る。プレクサーＨＹキットのダイナミックレンジはその他キットのものより僅かに良い［ラ・サール（LaSalle）ら、フォレンジック・サイエンス・インターナショナル：ジェネティクス（Forensic Science International: Genetics）「リアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ定量のための単コピー及び多コピー法の解析（Analysis of Single and Multi-copy Methods for DNA Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction）」］。ラ・サールらは、これら２種類のキット間の有意差を統計比較で示した。
【０００５】
法医学において重要な別の指標は、解析されるＤＮＡの分解度である。クオンチフィラーヒト及びプレクサーＨＹのアンプリコン・サイズは６２〜１３３塩基対（ｂｐ）で変化するため、これらのキットを分解したＤＮＡに用いた場合、大きな有意差が予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記に特定した課題を解決し、以下に概要を示す解決手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一の態様において、本発明は、試料においてゲノムの１以上の核酸を定量及び／又は検出するための方法であって、
ａ．核酸が増幅され、かつ増幅される遺伝子座はゲノム中の多コピー遺伝子座であり、
ｂ．多コピー遺伝子座は少なくとも２つの異なる染色体上にコピーを有し、
ｃ．並びに、増副産物が検出及び／又は定量される
方法に関する。
【０００８】
この新規方法の実質的な利点は、既存の方法に比べてその感度が高いこと、並びに検出する標的の安定性が高いことである。これまでに知られている他の標的は、反復要素は数において変化する傾向があるため、個人個人で変化し得る［パベリッツら、ヒトU2 snRNA遺伝子は分裂中期に、持続的な開かれた転写状態及びプロモーターの分解を示す。モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー、2008, p.3573-3588（Pavelitz et al., Human U2 snRNA Genes Exhibit a Persistently Open Transcriptional State and Promoter Disassembly at Metaphase, Molecular and Cellular Biology, 2008, p. 3573-3588）；リアオら、ヒトU2 snRNA（RNU2遺伝子座）をコードするタンデム反復遺伝子の協調進化は、染色体間の均質化及び稀に起こる染色体間での遺伝子変換を伴う。エンボ・ジャーナル、第１６巻、第３番、588-598頁、1997（Liao et al., Concerted evolution of the tandemly repeated genes encoding human U2 snRNA (the RNU2 locus) involves rapid intrachromosomal homogenization and rare interchromosomal gene conversion, The EMBO Journal, Vol. 16, No. 3, pp. 588-598, 1997）；ヤシニスカら、ヒトトランスクリプトームを形成する復配列、フェブス・レターズ、567 (2004) 136-141（Jasinska et al., Repetitive sequences that shape the human transcriptome, FEBS Letters, 567 (2004) 136-141）］。
【０００９】
理想的には、遺伝子座は、短いタンデム反復、又は本質的に式（ＡwＣxＧyＴz）2-1000（但し、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚは０〜１０で変化してもよく、かつ、単位中に存在するヌクレオチドの数を示す。）の要素ではない。単位は２〜１０００回繰り返されていてもよい。別の反復要素には、テロメア中に通常含まれるサテライトＤＮＡがある。さらに適さらない反復要素には、短鎖散在反復配列（short interspersed nuclear elements、SINE）及び長鎖散在反復配列（long interspersed nuclear elements、LINE）がある。
【００１０】
さらに、本発明は、ゲノムの核酸を検出及び／又は定量するための、ゲノム中の多コピー遺伝子座の使用であって、前記多コピー遺伝子座は反復要素では無く、かつ少なくとも二つの異なる染色体上にコピーを有する、使用に関する。
【００１１】
また、本発明は、ヒト核酸を検出及び／又は定量するためのキットであって、前記キットは、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列と、ストリンジェントな条件下で結合するプライマーを含む、キットに関する。
【００１２】
本明細書においては、以下の略語が用いられる。（１）ＨＤＡ（ヘリカーゼ依存増幅；helicase dependent amplification）、（２）ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、（３）ｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、（４）ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン;6-carboxyfluorescein）、（５）ＳＮＰ（一塩基多型）、（６）ＮＴＣ（鋳型を含まない対照;no template control）、（７）ＢＨＱ（ブラックホール・クエンチャー；black hole quencher）、（８）ｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ）、（９）ＨＥＸ（６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセイン；6-carboxy-4,7,2',4',5',7'-hexachlorofluorescein）。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】同定したゲノム領域の一部を示す。
【図１−２】同定したゲノム領域の一部を示す。
【図２】ＨＤＡ反応のＰＡＧＥ解析の結果。レーン１：Ｏ−レンジルーラー１０ｂｐＤＮＡラダー（O-RangeRuler 10bp ＤＮＡ Ladder）（Fermentas；フェルメンタス）、レーン２及び３：別々のプライマーを用いたＨＤＡ反応、レーン４：ｈＴ−Ｆｏｒ２及びｈＴ−Ｒｅｖ２のプライマーを用いたが、ｇＤＮＡを含まないＨＤＡ、レーン５：ｈＴ−Ｆｏｒ２及びｈＴ−Ｒｅｖ２のプライマーを用い、かつ１０，０００ｃｐのヒトｇＤＮＡを用いたＨＤＡ。
【図３】図３は、リアルタイムＨＤＡ反応の結果を示す。破線：ヒトＤＮＡを含まない対照反応、実線：１０，０００コピーのヒトｇＤＮＡを用いた反応。
【図４】連続希釈（１０ｎｇ〜１０ｐｇのヒトｇＤＮＡ）のｑＰＣＲのデータを示す。
【図５】多コピーアッセイ（四角）及び単コピーアッセイ（丸）のＣｔ値を表す図。各反応当たり１０ｐｇ〜１０ｎｇのｇＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして加えた。
【図６−１】配列の概略。配列番号２及び３は、配列番号１の最初の下線部を増幅するプライマーである。配列番号１１及び１２は、配列番号１の２番目の下線部を増幅するスコーピオン・プライマーである。
【図６−２】配列の概略。配列番号２及び３は、配列番号１の最初の下線部を増幅するプライマーである。配列番号１１及び１２は、配列番号１の２番目の下線部を増幅するスコーピオン・プライマーである。
【図６−３】配列の概略。配列番号２及び３は、配列番号１の最初の下線部を増幅するプライマーである。配列番号１１及び１２は、配列番号１の２番目の下線部を増幅するスコーピオン・プライマーである。
【図６−４】配列の概略。配列番号２及び３は、配列番号１の最初の下線部を増幅するプライマーである。配列番号１１及び１２は、配列番号１の２番目の下線部を増幅するスコーピオン・プライマーである。
【図７−１】図７は、プライマー対１１及び１２、プライマー対５及び６、並びにプライマー対８及び９で増幅される領域を示す。
【図７−２】図７は、プライマー対１１及び１２、プライマー対５及び６、並びにプライマー対８及び９で増幅される領域を示す。
【図８】図８は、ヒトの分解されたＤＮＡの測定を示す。
【図９】図９は、ヒトの分解されたＤＮＡの測定結果を示す。
【図１０】図１０は、変動するコピー数の測定結果を示す。
【図１１】図１１Ａは、変動するコピー数の測定結果を示す。
【図１２】図１２は、変動するコピー数の測定結果を示す。
【本発明の詳細な説明】
【００１４】
試料においてゲノムの１以上の核酸を定量及び／又は検出するための方法であって、
ａ．核酸が増幅され、かつ増幅される遺伝子座はゲノム中の多コピー遺伝子座であり、
ｂ．多コピー遺伝子座は少なくとも２つの異なる染色体上にコピーを有し、
ｃ．並びに、増副産物が検出及び／又は定量される
方法。
【００１５】
驚くべきことに、発明者らは、反復要素ではない多コピー遺伝子座は、核酸の検出及び／又は定量に用いると、その他遺伝子座よりも優れていることを発見した。反復要素は、コピー数において個人個人で変化し得ることは周知である。従って、本発明は、好ましくは、多コピー遺伝子座が反復要素ではない、本明細書に記載の方法に関する。
【００１６】
一般に、これらの核酸は、原核、真核等、任意の起源を有し得る。好ましくは、核酸は、哺乳類起源、より好ましくはヒト起源である。何故ならば、本発明の大きな利点の１つは、法医学分野における用途であるからである。
【００１７】
そのような配列の１つを配列番号１に、もう１つを配列番号５２に示す。実際には、配列番号１は配列番号５２の一部である。驚くべきことに、発明者らは、この配列、及び／又はこの配列と配列類似性を有する配列がヒトゲノム中に高頻度で見出され得ることを発見した。従って、理想的には、これらの配列に結合するプライマー及び／又はプローブが用いられる。
【００１８】
【表１】
0005914490.tif 000002
0005914490.tif 000003
0005914490.tif 000004
【００１９】
ゲノム全体に渡って分布している配列は、全てが正確に同一と云う訳では無い。選択したプライマーが、ほぼ同一の配列にもまた結合することが重要である。従って、遺伝子座は、理想的には、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は配列番号５２の配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％又はさらに９５％若しくは９８％の配列同一性を有する。
【００２０】
２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）及びアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）の数値計算用アルゴリズム［米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）(1993) 90: 5873-5877］を用いて達成される。このアルゴリズムは、アルトシュルらのＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムの基礎となっている［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.）(1990) 215: 403-410］。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用い、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施し、ヌクレオチド配列間のパーセント同一性を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、スコア＝５０、ワード長＝３で実施し、アミノ酸配列間のパーセント同一性（％）を得る。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、アルトシュルら［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）(1997) 25: 3389-3402］に記載されている通り、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、それぞれのプログラムのデフォルト・パラメータが用いられる。
【００２１】
本発明の一態様では、多コピーが増幅される。理想的には、様々な染色体上の少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９コピーが増幅される。配列番号１、配列番号５２又はそれらに非常に類似する配列が、ヒトゲノム中に最大２９の頻度で存在する。このことは単に驚くべきものであると云うだけでなく、本発明の方法の能力を提供する。また、コピーは、様々な染色体、例えば第１、４、５、７、１１、１６番染色体に見出され得る。
【００２２】
増幅方法は非等温法又は等温法の何れかである。
【００２３】
非等温増幅法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、(1985)サイエンス（Science）230:1350］、定量リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）［ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら、(1988)サイエンス（Science）241:1077-1080］の群から選択してもよい。好ましくはポリメラーゼ連鎖反応である。
【００２４】
等温増幅法は、ヘリカーゼ依存増幅（helicase-dependent amplification;ＨＤＡ）［ビンチェント（Ｖｉｎｃｅｎｔ）ら、(2004)エンボリポート（EMBO rep）5(8):795-800］、熱安定ＨＤＡ（thermostable HAD；ｔＨＤＡ）［アン（Ａｎ）ら、(2005)ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（J Biol Chem）280(32):28952-28958］、鎖置換増幅（strand displacement amplification;ＳＤＡ）[ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、(1992)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res）20(7):1691-6]、多置換増幅（multiple displacement amplification；ＭＤＡ）［ディーン（Ｄｅａｎ）ら、(2002)米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）99(8): 5261-5266］、ローリングサークル増幅（rolling-circle amplification；ＲＣＡ）［リウ（Ｌｉｕ）ら、(1996)米国化学会誌（J Am Chem Soc）118:1587-1594］、制限酵素を使用したＲＣＡ(restriction aided RCA)［ワン（Ｗａｎｇ）ら、（２００４）ゲノム・リサーチ（Genome Res）14:2357-2366］、単一プライマー等温増幅（single primer isothermal amplification;ＳＰＩＡ）［ダフォーン（Ｄａｆｆｏｒｎ）ら、（２００４）バイオテクニークス（Biotechniques）37(5):854-7］、転写介在増幅（transcription mediated amplification;ＴＭＡ）［ブオリネン（Ｖｕｏｒｉｎｅｎ）ら、(1995)ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（J Clin Microbiol）33: 1856-1859］、ニッキング酵素増幅反応（nicking enzyme amplification reaction；ＮＥＡＲ）［メープルズ（Ｍａｐｌｅｓ）ら、米国特許第２００９０１７４５３号］、指数関数増幅反応（exponential amplification reaction;ＥＸＰＡＲ）［バネス（ＶａｎＮｅｓｓ）ら、(2003)米国科学アカデミー紀要（Proc Natl Acad Sci USA）100(8):4504-4509］、ループ介在等温増幅（loop mediated isothermal amplification；ＬＡＭＰ）［ノトミ（Ｎｏｔｏｍｉ）ら、(2000)ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res）28(12):e63］、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（recombinase polymerase amplification;ＲＰＡ）[パイペンバーグ（Ｐｉｅｐｅｎｂｕｒｇ）ら、(2006)PLOSバイオロジー（PloS Biol）4(7):1115-1120]、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence based amplification;ＮＡＳＢＡ）［キエヴィッツ（Ｋｉｅｖｉｔｓ）ら、（１９９１）ジャーナル・オブ・ビロロジカル・メソッズ（J Virol Methods）35:273-286］、スマート増幅プロセス（smart-amplification process;ＳＭＡＰ）［ミタニら、（２００７）ネイチャー・メソッズ（Nat Methods）4(3):257-62］の群から選択し得る。
【００２５】
本発明において「等温増幅反応」は、反応中に温度が有意に変化しないことを意味する。好ましい実施形態では、等温増幅反応の温度は、増幅が生じている主要な酵素反応工程の間、１０℃より大きく、好ましくは５℃より大きく、さらに好ましくは２℃より大きくは逸脱しない。
【００２６】
核酸の等温増幅方法によって、増幅反応には異なる酵素が必要となる。核酸を増幅するための既知の等温法を前述したが、これらの方法では、等温条件下で核酸を増幅するための少なくとも１種の中温性酵素が、ヘリカーゼ、中温性ポリメラーゼ、鎖置換活性を有する中温性ポリメラーゼ、ニッキング酵素、組換えタンパク質、リガーゼ、グリコシラーゼ及び／又はヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００２７】
「ヘリカーゼ」は当業者に知られている。これらは、核酸のホスホジエステル骨格に沿って方向性をもって移動するタンパク質であり、ＮＴＰ又はｄＮＴＰの加水分解に由来するエネルギーによって、２本のアニールしている核酸鎖（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）を分離する。定義されているヘリカーゼ・モチーフの存在に基づいて、ヘリカーゼ活性は与えられるタンパク質に起因するものであると考えることが可能である。当業者は、本発明の方法に用いるための、ヘリカーゼ活性を有する適切な酵素を選択することができる。好ましい実施形態においては、ヘリカーゼは、異なるファミリー由来のヘリカーゼ：スーパーファミリーＩヘリカーゼ（例えばｄｄａ、ｐｃｒＡ、Ｆ−プラスミドｔｒａＩタンパク質ヘリカーゼ、ｕｖｒＤ）、スーパーファミリーＩＩヘリカーゼ（例えばｒｅｃＱ、ＮＳ３−ヘリカーゼ）、スーパーファミリーＩＩＩヘリカーゼ（例えばAAV repヘリカーゼ）、ＤｎａＢ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼ（例えばＴ７ファージ・ヘリカーゼ）又はＲｈｏ様スーパーファミリー由来のヘリカーゼを含む群から選択される。
【００２８】
増幅法には、必要な酵素に加えて、緩衝液、ｄＮＴＰ又はＮＴＰが含まれる。
【００２９】
本明細書において、「ｄＮＴＰ」という用語は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を指す。そのようなｄＮＴＰの非限定的な例としては、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰが挙げられる。これらはまた、標識された誘導体の形で存在してもよく、このような標識には例えば、蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識が含まれる。修飾されたヌクレオチド塩基を有するｄＮＴＰも包含され、ヌクレオチド塩基は例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７−メチルグアニン、イノシン、キサントイノシン(xanthinosine)、７−メチルグアノシン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、５−メチルシチジンである。さらに、前述した分子のｄｄＮＴＰも本発明に包含される。
【００３０】
本明細書において、「ＮＴＰ」という用語は、リボヌクレオシド三リン酸を指す。そのようなＮＴＰの非限定的な例としては、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰがあり、これらはまた標識された誘導体の形態で存在してもよく、例えば蛍光標識、放射性標識、ビオチン標識が含まれる。
【００３１】
理想的には、核酸の検出にはヘリカーゼ依存増幅（ＨＤＡ）が用いられる。また核酸の定量には、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）が用いられる。
【００３２】
理想的には、増副産物の大きさは、８０ｂｐから２００ｂｐである。増副産物はさらに長くてもよく、即ち、３００ｂｐ、４００ｂｐ又はさらに長くてもよい。
【００３３】
増幅に理想的に用いられるプライマーは、１８個のヌクレオチドの領域に渡り配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１及び１２と、５つのヌクレオチドを超えて異なることは無いヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、任意の適した方法、例えばホスホトリエステル法及びホスホジエステル法、又はそれらを自動化した実施形態等によって調製し得る。そのような自動化した一実施形態では、出発材料としてジエチルホスホラミダイトが用いられ、ボーケイジ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら、（１９８１）テトラヒドロンレターズ（Tetrahedron Letters）22:1859-1862によって記載される通り、合成してもよい。修飾した固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する一方法が、米国特許第４，４５８，００６号に記載されている。生物資源から単離（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化）したプライマーを用いることも可能である。好ましいプライマーは、約６〜１００塩基、より好ましくは約２０〜５０塩基、最も好ましくは約２０〜４０塩基の長さを有する。
【００３５】
リアルタイムＰＣＲを用いたＤＮＡの定量
ＰＣＲの間、ＤＮＡ量は理論的にはサイクル毎に倍加する。各サイクルの後、ＤＮＡ量はそれ以前の２倍になる。
【００３６】
未知試料中のＤＮＡの絶対量は、好ましくは外部標準を用いて決定される。通常、標準は未知試料と非常に類似するものであり、標準のプライマー結合部位は標的配列中の結合部位と同一であるべきである。これにより、標準と未知試料との両方において標的が同等の効率で増幅されることが確実となり、この事が定量には必須である。
【００３７】
リアルタイムＰＣＲの手法を用いる場合には、リアルタイムＰＣＲのサーマルサイクラーにおいて蛍光を検出及び測定し、産物の指数関数的増加に相応する幾何的増加を用いて、各反応におけるＣｔ値（threshold cycle：閾値サイクル）を決定する。
【００３８】
未知試料及び各標準は別個のチューブ中で増幅させる。異なる希釈率の標準を用いて、標準曲線（標準の量の対数値に対するＣｔ値／交点のプロット）を生成する。未知試料のＣｔ値を標準曲線と比較することで、標的の初期量の計算が可能になる。定量する核酸の種類に適した標準を選択することが重要である。標準曲線を生成するためには、少なくとも５つの異なる量の標準を定量する必要があり、かつ、未知標的の量が標準曲線の範囲内に入らなければならない。従って、一実施形態では、前述の定量工程もまた実施される。
【００３９】
本発明はまた、ゲノムの核酸を検出及び／又は定量するための、ゲノム中の多コピー遺伝子座の使用であって、前記多コピー遺伝子座が、理想的には反復要素では無い、使用に関する。一実施形態では、前記多コピーの遺伝子座の使用は、本明細書に記載の方法により核酸を検出及び／又は定量するために、又はヒトＤＮＡの分解状態の解析するために意図される。
【００４０】
法医科学者達は、しばしば、異なる起源に由来するケースワーク試料を取り扱う。これらの試料は、環境ストレスなどの異なる要因によって分解し得る。
【００４１】
本発明はまた、現状の最新方法よりも感度及び精度が高い、ヒトＤＮＡの分解マーカーシステムに関する。
【００４２】
同じ反応容器中においてｑＰＣＲにより少なくとも２つ異なるゲノム領域を標的とすることによって、ＤＮＡの完全性を評価できることが、文献から知られている。これら２つの同時に増幅される標的の長さは異なっていなければならないが、分解していないＤＮＡを用いた増幅効率は等しい必要がある。従って、ＤＮＡが分解していない場合には、より短いＰＣＲシステムとより長いＰＣＲシステムは両方とも同じ効率で増幅される。解析するＤＮＡが損なわれている場合には、試料中に含まれるＤＮＡ断片の長さの平均は低下し、それによって増幅効率も低下する。統計的には、より長いシステムの鋳型ＤＮＡがより短いシステムの鋳型よりも損なわれているため、より長いＰＣＲシステムの増幅効率の方がより短いシステムと比較して低くなる。試料において平均断片長が減少すると、両方のＰＣＲシステム間での増幅効率のギャップが増加する。その結果、両ＰＣＲシステムの定量の比率から、解析するＤＮＡの分解状態に関する情報が得られる。
【００４３】
一例を以下の図８に示す。「スコーピオン・プローブ及びプライマー分解」（配列番号５３及び５４）を利用して、ロータージーンＱ（Rotor-gene Q）の赤色チャネルにおいてより長いＰＣＲシステムを行い、３６３ｂｐのＰＣＲ産物を得る。前記に概略したプライマー及びスコーピオンを利用して、同じ装置の緑色チャネルにおいてより短いＰＣＲシステムを行い、１４６ｂｐのＰＣＲ産物を得る。分解ＤＮＡ試料と比較した非損傷ＤＮＡ試料の定量（約５００ｂｐ、３００ｂｐ及び１５０ｂｐの平均断片長）を示す。量両ＰＣＲシステムを用いた定量を図９に示す。両定量の比率は、解析するＤＮＡの分解状態を表す可能な解決手段である。比率が高いほど、解析するＤＮＡの分解度が高いことを示している。図９も参照のこと。
【００４４】
好ましくは、遺伝子座は、８０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は５２に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。配列同一性は前記に概略した通り決定することができる。
【００４５】
本発明はまた、ヒト核酸を検出及び／又は定量するためのキットであって、前記キットは、５０塩基対の領域に渡り、配列番号１又は５２に記載の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列と、ストリンジェントな条件下で結合するプライマーを含む、キットに関する。結合条件は当業者に公知であり、「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ（John Wiley & Sons）、N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991に見出すことが出来る。ストリンジェントな条件とは、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、４５℃でのハイブリダイゼーション、並びにそれに次ぐ０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄に等しいものであると定義することが出来る。好ましい実施形態においては、キットは、本明細書に記載の方法により核酸を検出及び／又は定量するための用途が意図される。
【００４６】
好ましくは、キットにおける少なくとも１つのプライマーは、１８個のヌクレオチドの領域に渡り配列番号２、３、５、６、８、９、１０、１１及び１２と、５つのヌクレオチドを超えて異なることは無いヌクレオチド配列を有する。
【実施例】
【００４７】
本発明の大きな利点は、性別、人種又は地域的背景とは無関係に機能し、ＤＮＡの定量及び／又は検出を可能にする、プライマー及びプローブを作出することができることにある。このことが、既存の技術に対して大きな利点を提供する。
【００４８】
ヒトＤＮＡの増幅は、分子診断並びに法医学の様々な分野に関係している。法医学的方法では、ＤＮＡタイピングが、ＤＮＡの特定領域を増幅することによって実施される。これらは、しばしば、短いタンデム反復領域と呼ばれている。正しい結果を得るためには、特定の狭い濃度範囲にある鋳型ＤＮＡを適用することが不可欠である。反応に加えるＤＮＡの量を正確に知ることが重要になる、その他分野には、ＨＬＡタイピングや一塩基多型（ＳＮＰ）解析がある。ＨＬＡタイピングは、移植が拒絶されるか否かを解析するために実施される。ＳＮＰ解析は、特定の人物の遺伝的背景を解析することを目的としてしばしば用いられ、例えば遺伝性疾患を評価したり、並びに特定の人物が特定種の癌に対する素因があるかどうかを解析することを目的としてしばしば用いられる。
【００４９】
さらに本方法と類似する既存のいくつかの方法では、増幅される遺伝子座の複数のコピーは、タンデムに繰り返されるモチーフで１つの染色体上に位置し、かつ、その集団には異なる変異型が存在するため、異なる結果が誘導される。この事は、証明されてはいないが、既存の試験の欠点を説明する１つの仕方であると思われる。前記でも概略した一般的な増幅方法がＨＤＡ法である。米国特許第７，６６２，５９４号の図６には、過剰量のＤＮＡを用いた場合に得られる結果が示されている。このことから、幾つかの増幅方法においては、反応に加えるＤＮＡの正確な量を知ることが必要であり、それが反応を成功させるために不可欠であることは明白である。本方法の利点は次のような事実に基づく。すなわち、特に異なる染色体に由来する多コピーであって、遺伝子座はＸ染色体又はＹ染色体の何れにも位置しない、多コピーから再現可能な増幅を提供するゲノム領域を、文献を検索することによって最初に同定したが、それが役立たないことが判明し、次にデータベースを検索することによって同定したがやはりあまり有用ではなかったと云う事実に基づくものである。一般的な転写因子ＩＩＨサブユニット２遺伝子（ＧＴＦ２Ｈ２）から出発して、本発明者らは、この遺伝子の一部では無いさらなる配列を同定した。同定したＤＮＡ領域の大きさは、およそ２０００ｂｐであり、第１１番染色体に位置している（６９０００ｂｐ〜７１０００ｂｐの位置）。配列を、図６に配列番号１として示す。１１番染色体で同定された配列と高い配列同一性を有する、さらなる数々の配列がゲノム全体に見出され得る。
【００５０】
配列番号２
hT-For1 (5'-AGTGGGTCTGGAGAGGCCGACTTG-3')
配列番号３
hT-Rev1 (5'-TCAGGCCCATG GGGCTCATTCCT-3')
【００５１】
前記に特定したプライマーは、ヒトゲノム全体に分布する２９個の遺伝子座を増幅する増幅反応を達成する（図１を参照のこと）。さらなるオリゴヌクレオチドを、等温反応用にも、プライマー及びプローブとして合成した。本明細書で考案した多コピー標的と単コピー標的との間で定量ＰＣＲを比較するために、以下のプライマー及びプローブを作製した。
【００５２】
hT-For1及びhT-Rev1及びプローブhT-Pro1 (5'-FAM-TTCTGGGCCCGGAGAGGCCGC-BHQ1-3') (配列番号４)
【００５３】
本発明の方法とｃｍｙｃ遺伝子を用いた単コピー遺伝子の定量とを比較した。ｃｍｙｃとは対照的に、前述したオリゴヌクレオチドで増幅かつ探索できる２７の遺伝子座が存在する。反応には以下の成分が含まれた。
【００５４】
１×クオンチテクト・マルチプレックス・マスターミック
（QuantiTect Multiplex Mastermix）(キアゲン)
４００ｎＭ hT-For1 bzw. cmyc-fwd
４００ｎＭ hT-Rev1 bzw. cmyc-rev
２００ｎＭ hT-Pro1 bzw. cmyc-probe（プローブ）
0 bis 10,000コピーヒトゲノムＤＮＡ
【００５５】
ロータージーン６０００（キアゲン）を使用して、以下のＰＣＲプロファイルにより、反応を行った：９５℃で１０分の後、９５℃１０秒及び６０℃４５秒からなる各サイクルを４０サイクル実施。ＰＣＲ効率は、両方のプライマーシステムで同じであった。ｈＴ−Ｆｏｒ１／Ｒｅｖ１−ＰＣＲの正規化プローブ蛍光は、ｃｍｙｃ−ＰＣＲ反応のプローブ蛍光よりも、４．２±０．２サイクル早く所定の閾値に達した。これを鋳型濃度に逆算すると、ｈＴ−Ｆｏｒ１／Ｒｅｖ１−反応のＤＮＡ増幅の鋳型濃度はｃｍｙｃ反応の鋳型濃度よりも１８倍高いと計算された。この値は理論比の２７：１に等しくはないが、非常に近い。
【００５６】
等温増幅も、ＨＤＡ方法を用いて、多コピーの遺伝子座について実施した。等温増幅反応用に、多数の異なるフォワード・プライマー及びリバース・プライマーを作成した。最適な組み合わせは、ｈＴ−Ｆｏｒ２(5'-GCAGAAGGTGG GCCTGGAGAGTTTGAC-3';配列番号５)及びｈＴ−Ｒｅｖ２(5'-CCTTTTTTGGCCCAGTTCCTGTCCAGC-3';配列番号６)であった。反応産物の検出は、エンドポイント測定及びリアルタイム測定の両方で可能である。ＨＤＡ反応には以下の成分が含まれた。
【００５７】
20mM Tris/HCl pH 8.8
40mM NaCl
10mM KCl
400nM dNTPミックス
3mM dATP
4mM MgCl2
0.2×エバ・グリーン（EvaGreen）
1.75μＬ イソアンプ・エンザイムミックス（IsoAmp Enzymmix）(バイオへリックス；Biohelix)
100nM hT-For2
100nM hT-Rev2
0〜10,000コピーヒトゲノムＤＮＡ
【００５８】
この溶液を以下のプレミックスに分配した。
プレミックスＩ：１５μＬ容積 [hT-For2; hT-Rev2;エバ・グリーン（EvaGreen）;ヒトゲノムＤＮＡ;Ｈ2Ｏ]
プレミックスＩＩ：８μＬ容積 [Tris/HCl pH 8.8；NaCl；KCl；dNTPミックス；dATP；エンザイム・ミックス；Ｈ2Ｏ]
スターティング・ソリューション（start sol.）：２μＬ ５０ｍＭ ＭｇＣｌ2
【００５９】
反応は以下の通りに行った。
プレミックスＩ（１５μｌ）をＰＣＲサイクラー中、９５℃で２分間インキュベートした。その後反応液を４℃まで冷却し、ＥＳＥクアントチューブスキャナー（ESE Quant Tubescanner、キアゲン）を用いて６５℃に再加熱した。１分後、予め温めたプレミックスＩにプレミックスＩＩ（８μｌ）を加え、反応液を混合した。さらに１分後、ＨＤＡ反応を開始させ、６５℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションが終了した後、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いて結果物を解析し、このゲルを臭化エチジウムで染色した。図２に結果を示す。レーン４は約９０ｂｐの長さの非常に強いＤＮＡのバンドを示している。これは、計算される８８ｂｐのアンプリコン長に非常によく一致する。レーン３に陰性対照を示す。陰性対照では長さ約９０ｂｐの増副産物は見られない。反応が、さらなる蛍光で標識したオリゴヌクレオチドプローブｈＴ−Ｐｒｏ２(5'-FAM- GGAAGTTTTGGGCCTACATTGGCCGCCATG-BHQ1-3') (配列番号７)によって追跡しえることを示すさらなる実験を実施した。
【００６０】
図３は、前記に概略した反応と同様に実施したリアルタイムＨＤＡ反応を示す。唯一の違いは、６０ｎＭの標識プローブｈＴ−Ｐｒｏ２を加え、かつプライマーの濃度が異なっていた（ｈＴ−Ｆｏｒ２が４０ｎＭ、ｈＴ−Ｒｅｖ２が１２０ｎＭ）ことである。図３は、増幅の鋳型としてヒトゲノムＤＮＡを用いたＨＤＡ反応もよく機能したことを示している。およそ２５分後に、蛍光シグナルが高まった。これは、オリゴヌクレオチドプローブであるｈＴ−Ｐｒｏ２が増幅された標的に結合した結果である。
【００６１】
定量的リアルタイムＰＣＲ実験として、さらなる実験を実施した。
【００６２】
以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
hT-For3 (5'-AAGGTGGGCCTGGAG AGTTT-3') (配列番号８)
hT-Rev3 (5'-CCTTTTTTGGCCCAGTTCCTGT-3') (配列番号９)
hT-Pro3 (5'-HEX-AAG TTTTGGGCCTACATTGGCCGC-BHQ1-3') (配列番号１０)
【００６３】
これらのプライマー及びプローブは、ヒトゲノム中の１４遺伝子座にハイブリダイズし、それらを増幅する。
【００６４】
５人の男性及び５人の女性のＥＤＴＡ−血液から、キアアンプマキシキット（QiaAmp Maxi Kit、キアゲン）を使用して単離したゲノムＤＮＡを鋳型とした。
【００６５】
反応液には以下の成分を加えた。
１×クオンチテクト・マルチプレックスＲＯＸマスターミックス
（QuantiTect Multiplex ROX Mastermix）
４００ｎＭ ｈＴ−Ｆｏｒ３
４００ｎＭ ｈＴ−Ｒｅｖ３
２００ｎＭ ｈＴ−Ｐｒｏ３
反応当たり１０ｐｇ〜１０ｎｇのヒトｇＤＮＡ
【００６６】
ＰＣＲプロファイルは以下の通りである。最初に９５℃で１５分間インキュベートした後、９５℃で１分及び６０℃で１分からなる各サイクルを５０サイクル実施。図４にＰＣＲ増幅の蛍光曲線を示す。
【００６７】
同じ実験内において、本発明による多コピーアッセイが、先行技術の単コピー方法に対して利点を有するか否かを解析した。ＨＥＸチャネルにおけるｈＴ−Ｆｏｒ３／ｈＴ−Ｒｅｖ３／ｈＴ−プローブ３アッセイ（多コピー）の蛍光シグナルを、ＦＡＭチャネルにおけるｃｍｙｃアッセイ（単コピー）のシグナルと比較した。結果を図５に示す。多コピーアッセイの蛍光シグナルは、単コピーｃｍｙｃアッセイの蛍光シグナルよりも４．２±０．２サイクル早く閾値レベルと交差した。これは、多コピー標的の濃度が単コピー標的の濃度よりも１８倍高いと計算される。従って、多コピー遺伝子座アッセイの理論上１４個の異なる結合遺伝子座は、この実験によく反映された。
【００６８】
さらに、本発明並びに配列番号１及び５２の配列は、試料におけるヒトＤＮＡの分解の解析に使用してもよい。前記使用のを解析するために用いられ得る。当該用途の好ましいプローブ及びプライマーは、以下の通りである。
【００６９】
【表２】
0005914490.tif 000005
【００７０】
多コピー標的のその他の意外な用途には、コピー数多型（Copy Number Variation;ＣＮＶ）解析の基準遺伝子としての用途である。
【００７１】
コピー数多型（ＣＮＶ）、すなわちゲノム中でのＤＮＡコピー数の変化が、近年、ヒトゲノムのおよそ１０〜２０％に影響を及ぼす、広く存在する現象であることが示されている。ＣＮＶの発生は、自閉症、自己免疫疾患、及び癌等の様々な疾患と関連している。
【００７２】
ＣＮＶを発見するために最も一般的に用いられている分子生物学的ツールは、マイクロアレイ解析及び次世代シークエンシング（ＮＧＳ）である。これら２種類のハイスループット法によって、複数存在する可能性があるＣＮＶを発見することができが、発見したＣＮＶはその後独立した方法を用いて検証する必要がある。一旦検証されれば、多数の試料について確認されたＣＮＶを調査し、ＣＮＶと表現型との間で統計的に有意な関連性を特定することができる。
【００７３】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、しばしば、その使いやすさ、感度及び拡張性から、ＣＮＶの検証及び関連性試験の選択肢となる方法となる。相対的な定量の原理が、この用途に利用されており、比較する試料間でコピー数が一定であると推定される基準遺伝子を最初に定義しなければならない。次いで、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコピー数が、異なる試料間で、ＧＯＩ及び基準遺伝子のＣｑの差に基づいて計算される。
【００７４】
ｑＰＣＲに基づくＣＮＶの定量には、一定コピー数の基準遺伝子が必須であるため、我々は、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）等の一般的に用いられている単コピーの基準遺伝子の信頼性と、多コピー標的を用いた新しい方法を比較した。基準標的としての多コピー標的は、単コピー遺伝子よりも感度及び信頼性が高いＣＮＶ定量結果を提供する。
【００７５】
単コピー遺伝子は、コピー数の呼び出しには信頼性が低い基準である。ｑＰＣＲに基づくＣＮＶ検証のために基準遺伝子として一般的に用いられている単コピー遺伝子のＴＥＲＴは、それ自体がコピー数多型の対象である。図１０を参照のこと。
【００７６】
図は、第５番染色体上のＴＥＲＴ遺伝子及び５種類の既知ＣＮＶの位置を示す。ゲノム変異型に関するデータベース（Database of Genomic Variants、http://projects.tcag.ca/cgi-bin/variation/gbrowse/hg19/?name=chr5:1211340..1337106）からの情報に基づく。
【００７７】
加えて、ｄｂＳＮＰデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）に報告されている、５１７個のＴＥＲＴ一塩基多型（ＳＮＰ）が存在する。ｑＰＣＲプライマー又はプローブによって認識されるＣＮＶ基準遺伝子配列中のＳＮＰは、ｑＰＣＲの効率の低下、及び遅延したＣｑ値に繋がり、その結果、誤ったコピー数の呼び出しを引き起こし得る。
【００７８】
単コピー遺伝子を基準遺伝子としてΔΔＣｑ解析に使用する代わりに、ゲノム全体に分布している多コピー遺伝要素を用いることで、より信頼性のある、ｑＰＣＲに基づくコピー数定量を達成することができる。
【００７９】
下記の理論計算は、ＣＮＶ基準遺伝子の１コピーの喪失又は獲得が、基準のＣｑ値、及びＧＯＩのコピー数呼び出しに及ぼす影響を説明するものである。仮定として、基準及びＧＯＩのｑＰＣＲ効率は１００％であり、ＧＯＩは単コピーの遺伝子であり、試料中のそのコピー数は変化しない（ＮＣ）こととする。ＣＮＶ定量の基準は、１８コピーの遺伝要素又は単コピー遺伝子の何れかである。図１１を参照のこと。
【００８０】
単コピーの基準遺伝子の１コピーの喪失又は獲得は、誤ったＧＯＩのコピー数呼び出しを引き起こす。ＧＯＩのコピー数呼び出しは、多コピー基準の１コピーの喪失又は獲得によっては影響を受けない。
【００８１】
サイバーグリーン（SybrGreen）に基づくｑＰＣＲは、ＧＯＩ及び多コピー標的基準要素を正確に定量する。
【００８２】
この方法は、同じ実験で実行される、ＧＯＩ及び多コピー標的の両者に関するＣｑ値の比較に基づいている。これらの実験に用いたプライマーは、配列番号８及び配列番号９である。
【００８３】
プローブに基づくｑＰＣＲは、ＧＯＩ及び多コピー標的基準要素を同時に正確に定量する。この方法は、１つのｑＰＣＲ反応においてＧＯＩ及び多コピー標的の両方を正確に定量する、デュプレックスである、プローブに基づくｑＰＣＲ法に依拠するものである。
【００８４】
これらの実験に用いられるプライマー及びプローブは、配列番号８、配列番号９及び配列番号１０である。図１２もまた参照のこと。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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