(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生に関連した眼の疾患又は病状を患っている被験者の血管新生を低減又は阻害するための医薬の製造におけるＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストの使用であって、
眼の疾患又は病状が糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、糖尿病黄斑浮腫(ＤＭＥ)、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(ＣＲＶＯ)、網膜静脈分枝閉塞症(ＢＲＶＯ)、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症(ＲＯＰ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択され、
ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストがＴＳＰＡＮ１２に対するｓｉＲＮＡである、使用。
【請求項２】
眼の疾患又は病状が、糖尿病性網膜症、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＣＲＶＯ、及びＢＲＶＯからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬が第２の抗血管新生剤と投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
第２の抗血管新生剤が、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニスト投与の前又は後に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
第２の抗血管新生剤が、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストと同時に投与される、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
第２の抗血管新生剤が、抗体、ノリン又はＶＥＧＦのポリペプチド断片、アンチセンス又はＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、小分子、リボザイム及び三重らせん体形成核酸分子からなる群から選択されるノリン又は血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)のアンタゴニストである、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
ノリンアンタゴニストが抗ノリン抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
所望しない血管新生に関連した眼の疾患又は病状を処置するための医薬の製造におけるＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストの使用であって、
眼の疾患又は病状が糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、糖尿病黄斑浮腫(ＤＭＥ)、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(ＣＲＶＯ)、網膜静脈分枝閉塞症(ＢＲＶＯ)、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症(ＲＯＰ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択され、
ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストがＴＳＰＡＮ１２に対するｓｉＲＮＡである、使用。
【請求項１１】
眼の疾患又は病状が、糖尿病性網膜症、ＡＭＤ、ＤＭＥ、ＣＲＶＯ、及びＢＲＶＯからなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
医薬が第２の抗血管新生剤と投与される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
第２の抗血管新生剤が、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニスト投与の前又は後に投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
第２の抗血管新生剤が、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストと同時に投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
第２の抗血管新生剤が、抗体、ノリン又はＶＥＧＦのポリペプチド断片、アンチセンス又はＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクト、ｓｉＲＮＡ、小分子、リボザイム及び三重らせん体形成核酸分子からなる群から選択されるノリン又はＶＥＧＦのアンタゴニストである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
ノリンアンタゴニストが抗ノリン抗体である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ＶＥＧＦアンタゴニストが抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１８】
抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストであるＴＳＰＡＮ１２に対するｓｉＲＮＡを含む、抗血管新生剤。
【請求項２０】
抗ノリン抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体をさらに含む、請求項１９に記載の抗血管新生剤。
【請求項２１】
抗ＶＥＧＦ抗体がラニビズマブである、請求項２０に記載の抗血管新生剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、その各内容を出典明示してここに援用する、２００８年９月１０日に出願された米国仮出願第６１／０９５７５７号；２００８年１０月７日に出願された米国仮出願第６１／１０３５０２号；及び２００９年８月１７日に出願された米国仮出願第６１／２３４５１９号に対して米国特許法第１１９条（ｅ）項の優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、一般に血管新生に関連した症状及び疾患の処置に有用な組成物及び方法に関する。特に、本発明は、テトラスパニン１２(ＴＳＰＡＮ１２)及びノリン(Norrin)のアンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生が様々な疾患の発病に対する重要な寄与因子であることは、今は確立されている。これらには、固形腫瘍及び転移、眼球内新生血管病、例えば増殖網膜症、例えば糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症(ＲＶＯ)、滲出型加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、血管新生緑内障、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶、及び関節リウマチが含まれる。Dudaら J. Clin. Oncology 25(26): 4033-42(2007); Kesisisら Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809(2007); Zhang & Ma Prog. Ret. & Eye Res. 26: 1-37(2007)。
【０００４】
網膜は、網膜血管からの血液供給を受け、網膜、及び脈絡膜血管の内部に供給され、外部に供給される。網膜血管のダメージは、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、及び中心及び分枝状の網膜静脈閉塞症(虚血性網膜症)を含む、いくつかの疾病過程で生じる。このダメージによる網膜虚血にて、所望しない血管新生が生じる。脈絡膜の血管新生は、ＡＭＤを含む多くの疾病課程で生じる。その一方、網膜の不完全な血管新生は、ある種の遺伝病、例えば家族性滲出性硝子体網膜症(ＦＥＶＲ)、ＷｎｔレセプターＦｒｉｚｚｌｅｄ４(Ｆｚｄ４）、コレセプターＬＲＰ５、又は分泌リガンドノリンの変異に起因するノリエ病を患っている患者の特徴である(Bergerら Nature Genet. 1:199-203(1992); Chenら Nature Genet. 1:204-208(1992); Robitailleら Nature Genet. 32:326-30(2002); Toomesら Am. J. Hum. Genet. 74:721-30(2004))。これらの遺伝病のモデルは、対応する相同遺伝子についてノックアウトされたマウスにおいて入手可能である。
【０００５】
眼の血管新生の分野における多くの利点にかかわらず、標的を同定し、現存する治療法の効果を補足又は向上可能な手段を開発することが、必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＴＳＰＡＮ１２が、ノリン-誘発性、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ-４-及びＬＲＰ５-媒介性のシグナル伝達経路のコンポーネントであり、病的血管新生の発症に必要であるという発見に、少なくとも部分的に基づく。よって、ノリン及びＴＳＰＡＮ１２は、ノリン、ＴＳＰＡＮ１２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ-４又はＬＲＰ５遺伝子における遺伝的変異を抱えない状態を含む、異常な眼の血管新生を阻害するための薬剤標的である。従って、本発明は、ノリン又はＴＳＰＡＮ１２の活性をブロックする試薬を使用する血管新生に関連した眼病を処置する、新規の方法を提供する。
【０００７】
一態様では、本発明は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストを被験者に投与することを含む、血管新生に関連した眼の疾患又は病状を患っている被験者における、血管新生を低減又は阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは抗ＴＳＰＡＮ１２抗体である。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは、第２の細胞外ループ等の細胞外ドメインを含む、ＴＳＰＡＮ１２のポリペプチド断片を含有する。いくつかの実施態様では、アンタゴニストは、免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ Ｆｃをさらに含有する。いくつかの実施態様では、眼の疾患又は病状は：糖尿病性網膜症、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、糖尿病黄斑浮腫(ＤＭＥ)、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(ＣＲＶＯ)、網膜静脈分枝閉塞症(ＢＲＶＯ)、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症(ＲＯＰ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択される。
【０００８】
いくつかの実施態様では、本方法は、第２の抗血管新生剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニスト投与の前又は後に投与される。他の実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストと同時に投与される。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、血管の内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)又はノリンのアンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ノリンアンタゴニスト又はＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ノリン抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体(例えば、ラニビズマブ)である。
【０００９】
他の態様では、 本発明は、ノリンアンタゴニストを被験者に投与することを含む、血管新生に関連した眼の疾患又は病状を患っている被験者における、血管新生を低減又は阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ノリンアンタゴニストは抗ノリン抗体である。いくつかの実施態様では、眼の疾患又は病状は：糖尿病性網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、ＤＭＥ、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施態様では、本方法は、第２の抗血管新生剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ノリンアンタゴニスト投与の前又は後に投与される。他の実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ノリンアンタゴニストと同時に投与される。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、特にラニビズマブである。
【００１１】
他の態様では、本発明は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストを被験者に投与することを含む、被験者における所望しない血管新生に関連した眼の疾患又は病状を処置する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは抗ＴＳＰＡＮ１２抗体である。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは、第２の細胞外ループ等の細胞外ドメインを含む、ＴＳＰＡＮ１２ポリペプチド断片を含有する。いくつかの実施態様では、アンタゴニストは、免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ Ｆｃをさらに含有する。いくつかの実施態様では、眼の疾患又は病状は、増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血-関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの実施態様では、本方法は、第２の抗血管新生剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニスト投与の前又は後に投与される。他の実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストと同時に投与される。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ又はノリンのアンタゴニストである。いくつかの実施態様では、ノリンアンタゴニスト又はＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ノリン抗体又は抗ＶＥＧＦ抗体(例えば、ラニビズマブ)である。
【００１３】
他の態様では、 本発明は、ノリンアンタゴニストを被験者に投与することを含む、被験者における所望しない血管新生に関連した眼の疾患又は病状を処置する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ノリンアンタゴニストは抗ノリン抗体である。いくつかの実施態様では、眼の疾患又は病状は：増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖網膜症、ＣＮＶ、ＡＭＤ、糖尿病及び他の虚血-関連網膜症、ＤＭＥ、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、ＣＲＶＯ、ＢＲＶＯ、角膜血管新生、網膜血管新生、ＲＯＰ、結膜下出血、及び高血圧性網膜症からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、本方法は、第２の抗血管新生剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ノリンアンタゴニスト投与の前又は後に投与される。他の実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ノリンアンタゴニストと同時に投与される。いくつかの実施態様では、第２の抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗ＶＥＧＦ抗体、特にラニビズマブである。
【００１５】
他の態様では、本発明は、本質的にアミノ酸ＣＲＲＥＰＧＴＤＱＭＭＳＬＫ(配列番号：５)からなるペプチドを使用する、抗体を生成する方法を提供する。いくつかの実施態様では、本方法は、ペプチドを用いて動物を免疫化することを含む。いくつかの実施態様では、本方法は、ペプチドに結合する抗体又は抗体断片を同定するために、ライブラリ(例えば、Ｆａｂライブラリ)をスクリーニングすることを含む。いくつかの実施態様では、本発明は、任意のこのような方法により生じた抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明は、任意のこのような抗体を使用する、ＴＳＰＡＮ１２を検出する方法を提供する。
【００１６】
他の態様では、本発明は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストを投与することを含む、ＦＺＤ４マルチマーの形成を阻害する、インビトロ又はインビボ方法を提供する。他の態様では、本発明は、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストを投与することを含む、ノリン-媒介性シグナル伝達を阻害する、インビトロ及びインビボ方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは抗ＴＳＰＡＮ１２抗体である。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２アンタゴニストは、第２の細胞外ループ等の細胞外ドメインを含む、ＴＳＰＡＮ１２ポリペプチド断片を含有する。いくつかの実施態様では、アンタゴニストは、免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ Ｆｃをさらに含有する。
【００１７】
他の態様では、本発明は、ＦＺＤ４マルチマー形成を高める薬剤を被験者に投与することを含む、任意のノリン、ＴＳＰＡＮ１２、ＦＺＤ４又はＬＲＰ５遺伝子における遺伝的変異に起因する、先天性の眼の疾患を患っている被験者を処置する方法を提供する。いくつかの実施態様では、疾患は、ＦＥＶＲ、ノリエ病、コート病(Coate's disease)である。いくつかの実施態様では、ＦＺＤ４マルチマー形成を増加させる薬剤は：ノリン、抗ＦＺＤ４抗体、抗ＬＲＰ５抗体、及び二重特異性抗ＦＺＤ４／抗ＬＲＰ５抗体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、遺伝的変異により、ＦＺＤ４-媒介性シグナル伝達が損なわれる。いくつかの実施態様では、被験者における遺伝的変異により：ノリン-Ｃ９５Ｒ、ＦＺＤ４-Ｍ１０５Ｖ及びＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖからなる群から選択される、被験者における異常なタンパク質生成物が生成される。いくつかの実施態様では、被験者における変異の存在性は、被験者を処置する前に検出される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、野生型(頂部)とＴＳＰＡＮ１２ノックアウト(ＫＯ)マウス(底部)についての、代表的な未熟児網膜症(ＲＯＰ)の網膜切片を示す。
【図２】図２は、野生型(ＷＴ；左)及びＴＳＰＡＮ１２ＫＯマウス(Ｈｏｍ；右)からの、ＲＯＰの網膜切片で観察された、新生血管核の数の定量的結果を示す。
【図３】図３は、ＴＳＰＡＮ１２が、Ｆｚｄ４／ＬＲＰ５により、ノリン-媒介性シグナル伝達を高めることを示す。
【図４】図４は、ノリン-媒介性シグナル伝達のＴＳＰＡＮ１２向上が、Ｆｚｄ４に対して特異的であることを示す。
【図５】図５は、ＴＳＰＡＮ１２が、Ｗｎｔ３ａ-媒介性シグナル伝達を高めないことを示す。
【図６】図６は、ノリンがＦｚｄ４に結合し、ＬＲＰ５又はＴＳＰＡＮ１２に結合しないことを示す。
【図７】図７は、ノリンがＦｚｄ４発現細胞に結合し、Ｆｚｄ５、ＬＲＰ５又はＴＳＰＡＮ１２発現細胞には結合せず、ノリンがＴＳＰＡＮ１２と免疫共沈降しないことを示す。
【図８】図８は、ＴＳＰＡＮ１２がＬＲＰ５と会合しないことを示す。
【図９】図９は、ＴＳＰＡＮ１２が、Ｆｚｄ４へのノリン結合性を高めないことを示す。
【図１０】図１０は、ＴＳＰＡＮ１２の同時発現が、細胞膜におけるＦｚｄ４の発現を変化させないことを示す。
【図１１】図１１は、野生型ノリン及びＣ９５Ｒ変異ノリンにより形成される高次構造を示す。
【図１２】図１２は、ＴＳＰＡＮ１２の過剰発現が、モノマーＣ９５Ｒノリンにおける障害を補償できることを示す。
【図１３】図１３は、ＴＳＰＡＮ１２が、シグナル伝達中のＦＺＤ４クラスター形成を調節することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
他に定められないならば、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する技術の当業者により、通常に理解されるような同様の意味を有する。例えば、Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版, J. Wiley & Sons(NewYork, NY 1994); Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor, NY 1989)。本発明の目的にとって、所定の用語を以下に定める。
【００２０】
ここで使用される場合、用語「ＴＳＰＡＮ１２」、「ＴＳＰＡＮ１２ポリペプチド」、「ノリン」、及び「ノリンポリペプチド」は、その調製方式及び種にかかわらず、天然から得られたＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドを称する。よって、このようなポリペプチドは、ヒト、マウス、又は任意の他の種からの、自然に生じるＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアミノ酸配列を有することができる。全長ヒトＴＳＰＡＮ１２アミノ酸配列は：
ＭＡＲＥＤＳＶＫＣＬＲＣＬＬＹＡＬＮＬＬＦＷＬＭＳＩＳＶＬＡＶＳＡＷＭＲＤＹＬＮＮＶＬＴＬＴＡＥＴＲＶＥＥＡＶＩＬＴＹＦＰＶＶＨＰＶＭＩＡＶＣＣＦＬＩＩＶＧＭＬＧＹＣＧＴＶＫＲＮＬＬＬＬＡＷＹＦＧＳＬＬＶＩＦＣＶＥＬＡＣＧＶＷＴＹＥＱＥＬＭＶＰＶＱＷＳＤＭＶＴＬＫＡＲＭＴＮＹＧＬＰＲＹＲＷＬＴＨＡＷＮＦＦＱＲＥＦＫＣＣＧＶＶＹＦＴＤＷＬＥＭＴＥＭＤＷＰＰＤＳＣＣＶＲＥＦＰＧＣＳＫＱＡＨＱＥＤＬＳＤＬＹＱＥＧＣＧＫＫＭＹＳＦＬＲＧＴＫＱＬＱＶＬＲＦＬＧＩＳＩＧＶＴＱＩＬＡＭＩＬＴＩＴＬＬＷＡＬＹＹＤＲＲＥＰＧＴＤＱＭＭＳＬＫＮＤＮＳＱＨＬＳＣＰＳＶＥＬＬＫＰＳＬＳＲＩＦＥＨＴＳＭＡＮＳＦＮＴＨＦＥＭＥＥＬ(配列番号：１)
である。
【００２１】
全長マウスＴＳＰＡＮ１２アミノ酸配列は：
ＭＡＲＥＤＳＶＫＣＬＲＣＬＬＹＡＬＮＬＬＦＷＬＭＳＩＳＶＬＡＶＳＡＷＭＲＤＹＬＮＮＶＬＴＬＴＡＥＴＲＶＥＥＡＶＩＬＴＹＦＰＶＶＨＰＶＭＩＡＶＣＣＦＬＩＩＶＧＭＬＧＹＣＧＴＶＫＲＮＬＬＬＬＡＷＹＦＧＴＬＬＶＩＦＣＶＥＬＡＣＧＶＷＴＹＥＱＥＶＭＶＰＶＱＷＳＤＭＶＴＬＫＡＲＭＴＮＹＧＬＰＲＹＲＷＬＴＨＡＷＮＹＦＱＲＥＧＣＧＫＫＭＹＳＦＬＲＧＴＫＱＬＱＶＬＲＦＬＧＩＳＩＧＶＴＱＩＬＡＭＩＬＴＩＴＬＬＷＡＬＹＹＤＲＲＥＰＧＴＤＱＭＬＳＬＫＮＤＴＳＱＨＬＳＣＨＳＶＥＬＬＫＰＳＬＳＲＩＦＥＨＴＳＭＡＮＳＦＮＴＨＦＥＭＥＥＬ(配列番号：２)
である。
【００２２】
全長ヒトノリンアミノ酸配列は：
ＭＲＫＨＶＬＡＡＳＦＳＭＬＳＬＬＶＩＭＧＤＴＤＳＫＴＤＳＳＦＩＭＤＳＤＰＲＲＣＭＲＨＨＹＶＤＳＩＳＨＰＬＹＫＣＳＳＫＭＶＬＬＡＲＣＥＧＨＣＳＱＡＳＲＳＥＰＬＶＳＦＳＴＶＬＫＱＰＦＲＳＳＣＨＣＣＲＰＱＴＳＫＬＫＡＬＲＬＲＣＳＧＧＭＲＬＴＡＴＹＲＹＩＬＳＣＨＣＥＥＣＮＳ(配列番号：３)
である。
【００２３】
全長マウスノリンアミノ酸配列は：
ＭＲＮＨＶＬＡＡＳＩＳＭＬＳＬＬＡＩＭＧＤＴＤＳＫＴＤＳＳＦＬＭＤＳＱＲＣＭＲＨＨＹＶＤＳＩＳＨＰＬＹＫＣＳＳＫＭＶＬＬＡＲＣＥＧＨＣＳＱＡＳＲＳＥＰＬＶＳＦＳＴＶＬＫＱＰＦＲＳＳＣＨＣＣＲＰＱＴＳＫＬＫＡＬＲＬＲＣＳＧＧＭＲＬＴＡＴＹＲＹＩＬＳＣＨＣＥＥＣＳＳ(配列番号：４)
である。
【００２４】
このようなＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドは、天然から単離することもできるし、組換え及び／又は合成手段により生成することもできる。
【００２５】
ポリペプチドに関して「単離された」とは、天然源から精製される、又は組換えもしくは合成方法により調製され、精製されることを意味する。「精製された」ポリペプチドは、他のポリペプチド又はペプチドを実質的には含有しない。ここで「実質的に含有しない」とは、他の供給源からのタンパク質の混成が、約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、さらに好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満であることを意味する。
【００２６】
用語「アンタゴニスト」は広義の意味で使用され、ポリペプチドの生物活性を部分的又は全体的にブロック、阻害、又は中和する任意の分子を含む。例えば、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、眼における病的な血管形成を可能にし、ノリン-誘発性のシグナル伝達を転換又は開始させる、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの能力を、部分的又は全体的にブロック、阻害、又は中和するであろう。適切なアンタゴニスト分子には、特にアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンコレセプター(類)の可溶性断片、アンチセンスＲＮＡｓ、リボザイム、ＲＮＡｉ、小有機分子等が含まれる。ＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドのアンタゴニストを同定する方法は、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドと、候補アンタゴニスト分子とを接触させ、通常ポリペプチドに関連する一又は複数の生物活性における検出可能な変化を測定することを含む。
【００２７】
ここでの目的において「活性な」及び「活性」とは、生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているＴＳＰＡＮ１２又はノリンの形態(類)を称し、ここで「生物学的」活性とは、抗体の生成を誘発する能力以外のＴＳＰＡＮ１２又はノリンによって生ずる生物学的機能を称し、「免疫学的」活性とは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンが有する抗原性エピトープに対して抗体の生成を誘発する能力を称する。ＴＳＰＡＮ１２及びノリンの主要な生物活性は、ノリン-誘発性のシグナル伝達を転換又は開始させ、眼における病的な血管形成を誘発させることである。
【００２８】
「ＴＳＰＡＮ１２コレセプター」又は「ノリンコレセプター」とは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンが結合し、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの生物活性を媒介する分子を称する。
【００２９】
ここで、用語「抗体」は最も広い意味において使用され、特に、ヒト、非ヒト(例えば、マウス)及びヒト化モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望する結合特異性を示す限りそれらの抗体断片を包含する。
【００３０】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００３１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
【００３２】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖と一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。
【００３３】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステイン(類)を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００３４】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
【００３５】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(イソ型)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００３６】
「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片が含まれる。
【００３７】
ここで使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature, 256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第4,816,567号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)及びMarksら, J. Mol. biol. 222: 581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３８】
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似するもの、並びに所望の生物学的活性を表す限り、このような抗体の断片である(米国特許第4,816,567号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
【００３９】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００４０】
ここで使用される場合、「処置」とは、有益な又は所望の臨床結果を得るための取り組みである。この発明の目的では、有益な又は所望の臨床結果は、限定するものではないが、検出可能であれ検出不可能であれ、徴候の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化(つまり悪化しない)状態、疾患進行の遅延又は緩徐化、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解(部分的又は完全)を含む。「処置」は、疾患の発症又は変化を予防する意図で実施される治療介入である。従って、「処置」は、治癒的処置、又は予防的もしくは防止的手段を称する。処置を必要とするものは、既に疾患を患っている者、並びに疾患が防止される者を含む。特に処置は、細胞変性又はダメージの病態、例えば癌の処置における腫瘍細胞の病態を直接防止、遅延化、そうでなければ減少させ、又は他の治療剤による処置に対して、細胞をより敏感にさせる。
【００４１】
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式で薬剤(類)を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを称する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処置である。
【００４２】
「眼球内新生血管病」は、眼の血管新生により特徴付けられる疾患である。眼球内新生血管病の例には、限定されるものではないが、増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖網膜症、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、糖尿病及び他の虚血-関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫(ＤＭＥ)、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(ＣＲＶＯ)、網膜静脈分枝閉塞症(ＢＲＶＯ)、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症(ＲＯＰ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症が含まれる。好ましくは、眼球内新生血管病は、任意のノリン、ＴＳＰＡＮ１２、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ-４又はＬＲＰ５遺伝子における、遺伝的変異に起因する病状を除外する。例えば、本発明の眼球内新生血管病は、好ましくはＦＥＶＲ及びノリエ病を除外する。
【００４３】
疾患の「病態」には、患者の幸福を損なう、全ての現象が含まれる。
【００４４】
一又は複数の治療薬と「組合せた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００４５】
ここで用いられる場合、「担体」とは、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール類；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばTWEENＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICSＴＭを含む。
【００４６】
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン以下の分子量を持つと定義される。
【００４７】
本発明を実施するための方法
ＴＳＰＡＮ１２又はノリン活性のアンタゴニストの調製及び同定
アンタゴニスト候補剤のスクリーニングアッセイは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又はそれらの活性及び／又は他の細胞性タンパク質との相互作用に干渉する化合物を同定するために設計される。
【００４８】
小分子は、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストとして作用する能力を有しており、よって治療的に有用である。このような小分子には、自然に生じる小分子、合成の有機又は無機化合物及びペプチド類が含まれる。しかしながら、本発明の小分子は、これらの形態に限定されるものではない。小分子の多くのライブラリが商業的に入手可能であり、多様なアッセイがここで考察され、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングすることは、当該技術でよく知られている。
【００４９】
いくつかの実施態様では、小分子ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの一又は複数の生物活性を阻害する、それらの能力によって同定される。よって、候補化合物と、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンとを接触させ、ついでＴＳＰＡＮ１２又はノリンの活性を評価する。一実施態様においては、ノリン-媒介性シグナル伝達を転換又は開始させる、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの能力が評価される。ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの生物活性が阻害された場合に、化合物はアンタゴニストとして同定される。
【００５０】
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストとして同定された化合物は、本発明の方法に使用することができる。例えば、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、眼球内新生血管病の処置に使用することができる。
【００５１】
多くのよく知られている動物モデル(例えば、未熟児網膜症及びレーザー誘起脈絡膜血管新生のモデルを含む；Ruiz-Edera & Verkman Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci. 48(10): 4802-10(2007), Yuら Invest. Ophthalmol. & Vis. Sci. 49(6):2599-605(2007))を、眼球内新生血管病の発症及び病理形成におけるＴＳＰＡＮ１２又はノリンの役割をさらに理解するために、また天然のＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドの抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む、治療候補剤の効能をテストするために使用することができる。このようなモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応予測をすることができる。
【００５２】
抗体結合研究
Ｗｎｔシグナル伝達レポーター細胞において、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンに結合する、又はその効果を阻害する抗体の能力をテストする。例示的方法を実施例２に提供するが、当業者にとっては、他の方法も容易に明らかであろう。例示的抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体、ここで記載されたものの調製物が含まれる。
【００５３】
抗体結合研究は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイで実施することができる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques(CRC Press, Inc., 1987), pp.147-158。
【００５４】
競合結合アッセイは、限定量の抗体との結合について、テスト用サンプル検体と競合する、標識された標準体の能力に依存する。テスト用サンプルにおける標的タンパク質の量は、抗体に結合する標準体の量に反比例する。結合する標準体の量の測定を容易にするために、抗体に結合する標準体と検体が、未結合の標準体及び検体から簡便に分離できるように、抗体は、好ましくは競合の前後に不溶性にされる。
【００５５】
サンドイッチアッセイは、検出されるタンパク質の異なる免疫原性部分、又はエピトープに結合可能な２つの抗体の使用に関与する。サンドイッチアッセイにおいて、テスト用サンプル検体は、固体状支持体に固定された第１の抗体により結合し、その後、第２の抗体が検体に結合し、よって、不溶性の３部分複合体が形成される。例えば米国特許第4,376,110号を参照。第２の抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識されるか(直接サンドイッチアッセイ)、又は検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定する(間接サンドイッチアッセイ)ことができる。例えば、サンドイッチアッセイの一つのタイプはＥＬＩＳＡアッセイであり、このケースで、検出可能な部分は酵素である。
【００５６】
免疫組織化学にとって、組織サンプルは新鮮又は凍結しているものであってよく、又はパラフィンに包埋され、ホルマリン等の防腐剤で固定化されていてもよい。
【００５７】
心血管、内皮、及び血管新生疾患の処置に有用な組成物には、限定されるものではないが、標的遺伝子産物の発現及び／又は活性を阻害する、抗体、有機及び無機の小分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びリボザイム分子、三重らせん体分子等が含まれる。
【００５８】
潜在的アンタゴニストのより特定の例には、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンに結合するポリペプチド、特に限定されるものではないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化バージョン、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体が含まれる。ＴＳＰＡＮ１２について、ある種の細胞外ドメイン(類)も、アンタゴニストとして提供することができる(例えば、Hoら J. Virol. 80(13): 6487-96(2006); Hemler Nature Rev. Drug Discovery 7: 747-58(2008)を参照)。また潜在的アンタゴニストは、密接に関連しているタンパク質、例えば何の影響も付与しないが、コレセプター(類)と相互作用する、よって、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの作用を競合的に阻害する、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの変異形態のものであってもよい。
【００５９】
他の潜在的なＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、ここで、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的とされるｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質の翻訳を予防することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス技術は、三重らせん体の形成、又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを介した遺伝子発現をコントロールするのに使用可能であり、その双方の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づいている。ここで、成熟したＴＳＰＡＮ１２及びノリンのポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の５'コード化部分は、約１０〜４０塩基長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に係る遺伝子の領域に相補的となるように設計され(三重らせん体−例えば、Leeら, Nucl. Acids Res. 6:3073(1979); Cooneyら, Science 241:456(1988); Dervanら, Science 251:1360(1991)を参照）、よって、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの転写及び生成が防止される。ここで称されるように、ＲＮＡの部分に対する配列「相補性」は、ＲＮＡとハイブリダイズ可能な程に十分な相補性を有し、安定した二本鎖を形成する配列を意味し；二重鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本の鎖が試験されるか、又は三重らせん体形成がアッセイされる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の度合い及び長さの双方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、それが含み得、なおも安定した二本鎖（又は場合によっては三本鎖）を形成するＲＮＡとの塩基のミスマッチが多くなる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために、標準的な手順を使用することにより、ミスマッチの許容度を確定することができる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＴＳＰＡＮ１２への翻訳がブロックされる(antisense - Okano, Neurochem. 56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression(CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)。
【００６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合物、又はその誘導体又は修飾体、単鎖又は二本鎖とすることができる。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、他の付加群、例えばペプチド(例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的とするため)、又は細胞膜を通っての輸送を容易にする薬剤(例えば、Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556(1989); Lemaitreら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652(1987); PCT出願WO88/09810, 1988年12月15日公開を参照)、又は血液脳関門(例えば、PCT出願WO89/10134, 1988年4月25日公開を参照)、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤(例えば、Krolら, BioTechniques 6:958-976(1988)を参照)、又は挿入剤(例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-549(1988)を参照)を含むことができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤等にコンジュゲート可能である。
【００６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-Ｄ-ガラクトシルクエオシン(queosine)、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、ベータ-Ｄ-マンノシルクエオシン、５'-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン(wybutoxosine)、擬似ウラシル、クエオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸(ｖ)、５-メチル-２-チオウラシル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、及び２,６-ジアミノプリンから選択される、少なくとも一の修飾された塩基部分を有し得る。
【００６２】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群から選択される、少なくとも一の修飾された糖部分を有し得る。
【００６３】
さらなる他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホラミドチオアート、ホスホラミダート、ホスホルジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はその類似体からなる群から選択される、少なくとも一の修飾されたリン酸骨格を有する。
【００６４】
さらなる他の実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはアノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のユニットに反して、ストランドが互いに平行に走っている、相補ＲＮＡと、特定の二重鎖ハイブリッドを形成する(Gautierら, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641(1987))。オリゴヌクレオチドは、２'-０-メチルリボヌクレオチド(Inoueら, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148(1987))、又はキメラＲＮＡ-ＤＮＡ類似体(Inoueら, FEBS Lett. 215:327-330(1987))である。
【００６５】
いくつかの実施態様では、アンタゴニストは、抑制二本鎖ＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等である。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成器(例えば、Biosearch, Applied Biosystems等から商業的に入手可能)を使用し、当該技術で公知の標準的な方法により合成することができる。例えば、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、Steinら(Nucl. Acids Res. 16:3209(1988))の方法により合成することができ、ホスホン酸メチルオリゴヌクレオチドは、制御された多孔質ガラスポリマー支持体を使用することにより調製することができる(Sarinら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451(1988))。
【００６７】
また、上述したオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現して、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの生成を阻害可能なように、細胞に送達させることができる。アンチセンスＤＮＡが使用される場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０の位置で誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００６８】
潜在的なアンタゴニストは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンに結合し、よってその活性をブロックする小分子をさらに含む。小分子の例には、限定されるものではないが、小ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成の非ペプチジル有機又は無機化合物が含まれる。
【００６９】
付加的な潜在的アンタゴニストはリボザイムであり、これは、ＲＮＡの特異的切断を触媒可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補標的ＲＮＡに対する、配列-特異性ハイブリダイゼーションにより作用し、続いてヌクレオチド鎖を切断する。潜在的なＲＮＡ標的の範囲内の特定のリボザイム切断部位は、公知の技術により同定することができる。さらなる詳細は、Rossi, Current Biology 4:469-471(1994)、及びPCT出願WO97/33551(1997年9月18日公開)を参照のこと。
【００７０】
部位特異性認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムは、標的遺伝子ｍＲＮＡを破壊するのに使用可能であるが、ハンマーヘッド型リボザイムを使用するのが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成する、隣接領域により決定される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の必要条件は、標的ｍＲＮＡが、２つの塩基の次の配列：５'-ＵＧ-３'を有していることである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び生成は当該技術でよく知られており、その全体が参照としてここに導入される、Myers,Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York(1995),(特に、図4, 833頁を参照)、及びHaseloff 及び Gerlach, Nature, 334:585-591(1988)に、さらに詳細に記載されている。
【００７１】
好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的遺伝子ｍＲＮＡの５'末端近傍に位置するように、すなわち無機能ｍＲＮＡ転写の細胞蓄積内が最小となり、効能が増加するように操作される。
【００７２】
本発明のリボザイムは、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ(以下、「Ｃｅｃｈ型リボザイム」)、例えばテトラヒメナ・サーモフィアにおいて自然に生じ(ＩＶＳ、又はＬ-１９ ＩＶＳ ＲＮＡとして公知)、Thomas Cech及び共同研究者(Zaugら, Science, 224:574-578(1984); Zaug 及び Cech, Science, 231:470-475(1986); Zaugら, Nature, 324:429-433(1986); University Patents Incによる国際特許出願WO88/04300 ; Been 及び Cech, Cell, 47:207-216(1986))に広く記載されているものが含まれる。Ｃｅｃｈ型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし、その後、標的ＲＮＡの切断が生じる、８つの塩基対活性部位を有する。本発明は、標的遺伝子に存在する８つの塩基対活性部位を標的とする、Ｃｅｃｈ型リボザイムを含む。
【００７３】
アンチセンスアプローチにおいては、リボザイムは、修飾されたオリゴヌクレオチド(例えば、安定性、標的性等を改善するため)からなり、インビボで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達法は、形質移入された細胞が十分量のリボザイムを生成し、内在性の標的遺伝子のメッセージを破壊し、翻訳を阻害するように、強構造のｐｏｌ ＩＩＩ又はｐｏｌ ＩＩプロモーターのコントロール下で、リボザイムを「コード化」するＤＮＡコンストラクトを使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒的であるために、効率のためには、細胞内濃度が低いことが要求される。
【００７４】
転写阻害に使用された三重らせん体形成における核酸分子は、単鎖であるべきであり、デオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に、二本鎖の一本の鎖におけるプリン又はピリミジンのかなり大きな伸長を必要とする、フーグスティーン塩基対則を介して三重らせん体の形成が促進されるように設計される。さらなる詳細は、例えばPCT出願WO97/33551，上掲を参照のこと。
【００７５】
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、限定されるものではないが、増殖性糖尿病性網膜症を含む増殖網膜症、脈絡膜血管新生(ＣＮＶ）、加齢黄斑変性症(ＡＭＤ)、糖尿病及び他の虚血-関連網膜症、糖尿病黄斑浮腫(ＤＭＥ)、病的近視、フォンヒッペルリンダウ病、眼のヒストプラスマ症、網膜中心静脈閉塞症(ＣＲＶＯ)、網膜静脈分枝閉塞症(ＢＲＶＯ)、角膜血管新生、網膜血管新生、未熟児網膜症(ＲＯＰ）、結膜下出血、及び高血圧性網膜症を含む、眼球内疾患の処置にも有用であり得る。
【００７６】
投与プロトコル、スケジュール、用量及び処方
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、上述にて説明したような種々の疾患及び疾病に対する予防剤及び治療剤として、製薬的に有用である。
アンタゴニストの治療用組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液の形態で、場合によっては製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Ｒemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, A. Osol, A.編(1980))と、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより、保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、亜鉛-タンパク質複合体)；及び／又はトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７７】
このような担体のさらなる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばホスファート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリカート、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、及びポリエチレングリコールを含む。アンタゴニストの局所用の担体又はゲルベースの形態は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノ-カプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、このようなビヒクルに処方されるであろう。
【００７８】
他の処方は、定型部材に、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストを導入することを含む。このような部材は、内皮細胞の成長及び血管新生の調節に使用することができる。さらに、腫瘍の浸潤及び転移を、これらの部材で調節することができる。
【００７９】
インビボ投与に使用されるＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。凍結乾燥形態にある場合、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、典型的には使用時に適当な希釈剤と再構成するために他の成分と組み合わせて処方される。液状処方物の例は、皮下注射用の１回投与バイアルに充填された無菌の、透明な、無色の保存料未添加(unpreserved)溶液である。繰り返し使用に適した保存用製薬用組成物は、例えば、主として兆候及びポリペプチドの種類に応じて：
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニスト；
溶液におけるポリペプチド又は他の分子の最大安定の範囲内のｐＨ、好ましくは約４-８を維持可能なバッファー；
攪拌誘発性凝集に対して、ポリペプチド又は分子を主として安定化させる洗浄剤／界面活性剤；
等張剤；
フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される防腐剤；及び
水；
を含有可能である。
【００８０】
使用される洗浄剤が非イオン性である場合、それは、例えばポリソルバート類(polysorbates)(例えば、ポリソルバートＴＭ(トゥイーンＴＭ)２０、８０等)、又はポロキサマー類(poloxamers)(例えば、ポロキサマーＴＭ１８８)であってよい。非イオン性界面活性剤の使用により、ポリペプチドの変性に起因しない剪断面応力に、処方物を暴露させることができる。さらに、このような界面活性剤を含有する処方物は、エアゾール装置、例えば肺投与に使用されるもの、及び針のないジェット注射ガンに使用することができる(例えば、欧州特許第257,956号を参照)。
【００８１】
等張剤は、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストの液状組成物を確実に等張にするために存在し、多価糖アルコール、好ましくは三価又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトールを含む。これらの糖アルコールは、単独で又は組合せて使用することができる。また塩化ナトリウム又は他の適切な無機塩を、溶液を等張にするのに使用することもできる。
【００８２】
バッファーは、所望するｐＨに応じて、アセタート、シタラート、スクシナート、又はホスファートバッファーとすることができる。この発明の一タイプの液状処方物のｐＨは、約４〜８、好ましくは生理学的ｐＨの範囲に緩衝される。
【００８３】
防腐剤であるフェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用可能な公知の抗菌剤である。
【００８４】
ここに記載の治療用ポリペプチド製組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルを有する容器に入れられる。処方物は、静脈内(ｉ.ｖ.)、皮下(ｓ.ｃ.)、又は筋肉内(ｉ.ｍ.)の繰り返し注射として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル処方物として投与可能である(肺内送達については、例えば欧州特許第257,956号参照)。処方物は、好ましくは硝子体内(ＩＶＴ)又は結膜下送達として投与される。
【００８５】
また、治療用ポリペプチドは、徐放性調製物の形態で投与することが可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら, J. Biomed. Mater. Res. 15：167-277(1981)及びLanger, Chem. Tech. 12：98-105(1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、欧州特許第58,481号)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー(Sidmanら,  Biopolymers 22：547-556(1983))、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langerら, 上掲)、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフェア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133,988号)が含まれる。
【００８６】
エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化されたタンパク質が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【００８７】
徐放性のＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニスト組成物は、リポソーム的に捕捉されたアンタゴニストを含有する。このようなリポソームはそれ自体公知の方法で調製される：独国特許第3,218,121号; Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034(1980)；欧州特許第52,322号；欧州特許第36,676号；欧州特許第88,046号；欧州特許第143,949号；欧州特許第142,641号；日本国特許出願第83-118008号；米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号；及び欧州特許第102,324号。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル以上の単層型の小体(約２００-８００オングストローム)のものである。コレステロール％の選択割合は、最適な治療がなされるように調節される。
【００８８】
もちろん、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストの治療的に有効な用量は、処置(予防を含む)される病状、投与方法、処置に使用される化合物の種類、関与する任意の併用治療、患者の年齢、体重、一般的な病状、病歴等、このような因子に応じて変化するであろうし、その決定は医者の技量の範囲内で十分である。従って、治療専門者にとっては、最大の治療効果を得るのに必要な場合は、用量を滴定し、投与経路を変更する必要もあるであろう。
【００８９】
上述した指針において、効果的な用量は、一般的に約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１-１．０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１-０．１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【００９０】
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストの投与経路は、公知の方法、例えば静脈内、筋肉内、大脳内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、眼球内(硝子体内を含む)、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、口腔、局所、又は吸入経路における注射又は注入により、又は記載したような徐放系によるものに一致する。
【００９１】
ペプチド又は小分子がアンタゴニストとして使用されるならば、液状又は固体状の形態で、哺乳動物に経口的又は非経口的に投与されることが好ましい。
【００９２】
塩を形成し、以下有用である分子の薬理学的に許容可能な塩の例は、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えば、ピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩)、及び有機酸の塩(例えば、酢酸塩、シュウ酸塩、ｐ-トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
【００９３】
併用治療
当該問題の疾患の予防又は処置における、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストの有効性は、活性化合物を、同じ組成物において、又は別個の組成物として、それらの目的にとって有効な他の薬剤と連続的に又は組合せて投与することにより改善することができる。
【００９４】
例えば、血管新生関連病、例えば眼病の処置に使用されるＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、他の薬剤と組合せることができる。特に、互いに、又は他の抗血管新生剤と組合せて、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストを使用することが所望されている。いくつかの実施態様では、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストは、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば抗体、特にラニビズマブと組合せて使用される。
【００９５】
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのアンタゴニストと組合せて投与される治療剤の有効量は、医者又は獣医の裁量となるであろう。用量の投与及び調節は、処置される病状の最大管理が達成されるようになされる。さらに、用量は、使用される治療剤の種類及び処置される特定の患者等の要因にも依存するであろう。典型的には、使用量は、付与される治療剤がＴＳＰＡＮ１２又はノリンなしに投与されるのならば、使用される場合と同じ用量となるであろう。
【００９６】
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの抗体
本発明の最も有望な薬剤候補のいくつかは、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンの生成を阻害し、及び／又はＴＳＰＡＮ１２又はノリンの活性を低減可能な抗体及び抗体断片である。
【００９７】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例には、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、又は合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９８】
モノクローナル抗体
あるいは、抗ＴＳＰＡＮ１２又は抗ノリン抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【００９９】
免疫化剤は、典型的にはＴＳＰＡＮ１２又はノリンのポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,(New York：Academic Press, 1986) pp. 59-103。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培養培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培養培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０１００】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやバージニア州マナッサスのAmerican Type Culture Collectionより入手可能である。また、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も記載されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)pp. 51-63。
【０１０１】
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＴＳＰＡＮ１２又はノリンのポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイできる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定される。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる。Goding, 上掲。この目的のための適当な培養培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
【０１０３】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析法はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地又は腹水液から単離又は精製することができる。
【０１０４】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な手順を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として供給される。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより(米国特許第4,816,567号；MorrisonＲ,上掲)、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１０５】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法もまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０６】
ヒト及びヒト化抗体
抗ＴＳＰＡＮ１２又は抗ノリン抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントのＣＤＲの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、好ましくは免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jonesら, Nature, 321:522-525(1986); Riechmannら, Nature, 332:323-329(1988); 及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)。
【０１０７】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的に、Winter及び共同研究者(Jonesら, Nature, 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327(1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536(1988))の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施できる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはいくつかのＣＤＲ残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１０８】
また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当該分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581(1991)。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる。Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同5,545,806号；同5,569,825号；同5,625,126号；同5,633,425号；及び同5,661,016号、及び次の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783(1992); Lonbergら, Nature 368 856-859(1994); Morrison, Nature 368, 812-13(1994); Fishwildら, Nature Biotechnology 14：845-851(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14：826(1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93(1995)に記載されている。
【０１０９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースにおいて、結合特異性の一方はＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原又はポリペプチドに対してである。
【０１１０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術において公知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生成は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539(1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開第93/08829号、及びTrauneckerら, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
【０１１１】
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するためのさらなる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０１１２】
ヘテロ結合抗体
ヘテロ結合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)、及びＨＩＶ感染の処置のために提案されている。国際公開第91/00360号; 国際公開第92/200373号; 欧州特許第03089号。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオラート及びメチル-４-メルカプトブチリミダート、及び例えば米国特許第4,676,980号に開示されているものが含まれる。
【０１１３】
免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして処方することができる。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwangら,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030(1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、当該技術で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１１４】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成可能である。リポソームは、所定の孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinら, J. Biol. Chem. 257: 286-288(1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結合され得る。化学治療剤(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484(1989)を参照。
【０１１５】
抗体の製薬組成物
ここで同定されるＴＳＰＡＮ１２又はノリンポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びにここに開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬用組成物の形態で投与することができる。
【０１１６】
ここでの処方物は、処置される特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を増強させる薬剤を含んでもよい。このような分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１１７】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Scienceに開示されている。
【０１１８】
インビボ投与に使用される処方物は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１１９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。徐放性マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１２０】
抗体を使用した処置方法
ＴＳＰＡＮ１２又はノリンに対する抗体は、上述にて記した種々の血管新生に関連した病状を処置するのに使用することができると考えられる。
抗体は、公知の方法に一致して、例えばボーラスとしての静脈内投与、又は長時間にわたる連続注入、硝子体内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、口腔、局所、又は吸入経路により、哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。抗体の硝子体内投与が好ましい。
【０１２１】
一実施態様では、病的な眼の血管新生は併用治療において攻撃される。抗ＴＳＰＡＮ１２及び／又は抗ノリン抗体及び他の抗体(例えば、抗ＶＥＧＦ)は、治療的有効量で患者に投与される。
例えば、疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、一又は複数の別個投与、又は連続注入にかかわらず、患者に投与する際の初期候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な毎日又は週当たりの用量は、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、又はそれ以上であってよい。条件に応じた、数日又はより長期にわたる繰り返し投与において、疾患の兆候の発生が所望程度に抑制されるまで、処置は繰り返されるか、又は持続される。しかしながら、他の投薬計画も有用である。この治療の進捗具合は、例えば腫瘍のＸ線画像を含む、従来からの技術及びアッセイにより、容易にモニターされる。
【０１２２】
次の実施例は、例証目的のためだけに提供されるものであり、いかなる方法においても、本発明の範囲を限定することを意図してるものではない。
本明細書に引用された全ての特許及び参考文献の開示は、それらの全体が参照によりここに導入される。
【実施例】
【０１２３】
実施例において言及される商業的に入手可能な試薬は、特に示さない限りは、製造者の使用説明書に従い使用した。ここに引用された全ての参考文献は、出典明示によりここに援用される。
実施例１．ＴＳＰＡＮ１２は正常又は病的な血管新生に関与している
ＴＳＰＡＮ１２のコード化領域は、ヒト及びマウスを含むいくつかの生物体において公知であるが(例えば、ＧｅｎＢａｎｋ(登録商標)受入番号、ｈＴＳＰＡＮ１２についてはＮＭ＿０１２３３８、及びｍＴＳＰＡＮ１２についてはＮＭ＿１７３００７)、それについての機能は同定されていない。その機能を明らかにし始めるために、従来からの方法を使用し、ＴＳＰＡＮ１２ノックアウト(ＫＯ)マウスを作製した。特に、標的コンストラクトを１２９／ＳｖＥｖＢｒｄ(Ｌｅｘ-２)ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、サウザンブロットアッセイを使用し、標的クローンを同定した。標的クローンからの細胞をＣ５７ＢＬ／６(アルビノ)胚盤胞に注射した。得られたキメラをＣ５７ＢＬ／６(アルビノ)メスと交配させ、変異に対してヘテロ接合性であるマウスを生じさせ、続いてＣ５７／ＢＬ６バックグラウンド(＞Ｎ３)において戻し交配させ、表現型分析及び他の実験に使用した。ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスは生存能力があり、繁殖能力もあった。
【０１２４】
ｃ-末端細胞内ペプチドＣＲＲＥＰＧＴＤＱＭＭＳＬＫ(配列番号：５)に対して、αＴＳＰＡＮ１２-Ａｎａｓｐｅｃ-Ｃと命名されたウサギポリクローナル血清を作製し、それを親和精製した。細菌において発現したアミノ酸１１６-２２１(ａａ１１６-２２１-Ｈｉｓ６)に相当するｈｉｓ-タグＴＳＰＡＮ１２断片に対して、α-ＴＳＰＡＮ１２-Ｊｏｓｍａｎ-Ｂと命名された第２のポリクローナル血清を生じさせ、精製した。変異マウスにおける標的を、αＴＳＰＡＮ１２-Ａｎａｓｐｅｃ-Ｃを使用する免疫沈降によりＴＳＰＡＮ１２に富むＰ１頭部の可溶化液から、サウザンブロット、ＰＣＲ及びウエスタンブロットにより確認した。
【０１２５】
まず、種々の組織におけるＴＳＰＡＮ１２の発現性を分析し、Ｐ１５での発達中の網膜血管系、及びＰ１で髄膜にて発現していることが見出された。非-ＣＮＳ血管系では、ほとんど又は全く発現は検出されなかった。しかしながら、公開されている手順に従いプロセシングされたＴＳＰＡＮ１２ ＫＯマウスからのイソレクチン染色された網膜全載調製物において、ＮＦＬ血管系に大規模な形態変化は観察されなかった(Gerhardtら, J. Cell. Biol. 161(6):1163-77(2003))。従って、種々の眼病モデルにおいて、表現型について、ＴＳＰＡＮ１２変異マウスを分析した。
【０１２６】
８つのＴＳＰＡＮ１２(Ｃ５７ＢＬ／６)ｈｅｔ ｘ ｈｅｔ交配からのマウスの子供を生じせしめ、未熟児網膜症(ＲＯＰ)のマウスモデルに使用した。６匹の子供を乳母と共に、Ｐ７で開始して５日間、７５％の酸素(過酸素症)に置いた。Ｐ１２にて、動物をエアコンの効いた部屋(酸素正常状態)に戻し、さらに５日間(Ｐ１７)保持した。尾部のバイオプシーを遺伝子型判定に使用し、３７の動物を次のようにして弱らせた：ホモ接合野生型ｎ＝８、ヘテロ接合型ｎ＝２１、ホモ接合変異型ｎ＝８。
【０１２７】
Ｐ１７に、右目を４％のＰＦＡに配し、左目をダビットソンの固定液に配した。パラフィン工程及び切片化のために、角膜とレンズを左目から取り除いた。眼杯を虹彩側が下になり、切開面が面するようにブロックに配した。１６ミクロン間隔の切片を得、特注の核アルゴリズムを具備するAperio ScanScope(登録商標)を使用し、血管新生について分析した。簡単には、神経線維層(ＮＦＬ)に密接に関連した新生血管房を、アルゴリズム定量化の関心ある領域として同定した。ケース毎に、新生血管核を含む最小３０切片を、網膜の血管新生の評価のために定量した。
【０１２８】
ＲＯＰモデルが作製されるように設定された条件下で飼育された野性型動物において、網膜／硝子体の界面で新生血管核が同定された(図１)。対照的に、ホモ接合型ＴＳＰＡＮ１２変異マウスは、ほとんど新生血管核を有さなかった(図２)。これらのデータにはＴＳＰＡＮ１２がこのＲＯＰモデルにおいては、病的な血管新生に必要であることが示された。
【０１２９】
ＲＯＰモデルにおけるこの表現型の観察後、我々はより微細なスケールで網膜血管系の発達を分析した。マウスの網膜において、ＮＦＬの表在性血管網は、出芽、遊走及び出産後Ｐ０-Ｐ１０の間の再構成の組合せを介して、視神経頭から確立される。その後、外網状層(ＯＰＬ)及び内網状層(ＩＰＬ)において、血管が出芽し、そこで２つの末梢血管床が確立され、３層血管構造に至る。Ｐ８までに、ＮＦＬ血管系の発達が、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスの網膜全載においてほとんど変化しないことが見出された。断面では、ＯＰＬにおける毛細血管の形成が、ＴＳＰＡＮ１２＋／＋マウスではＰ１１までに開始し、出芽がＴＳＰＡＮ１２−／−マウスでは完全に不在であることが見出された。ＴＳＰＡＮ１２発現が血管系では検出されたが、他の網膜組織では検出されないという事実は、網膜組織像がヘマトキシリン及びエオシン染色において正常であると思われた観察と共に、血管障害が原発性であることを示している。また、成体のＴＳＰＡＮ１２−／−マウスにおいて、ＯＰＬでは血管新生されず、障害が一過性ではないことが確認された。ＩＰＬにおける組織化された毛細血管床の代わりに、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスは、ＮＦＬとＩＰＬの間の空間に、幾分拡大した蛇行状の毛細血管を示した。ＴＳＰＡＮ１２−／−網膜における内側及び外側の顆粒層の厚みは、成体においては一貫して低減しているが、発育中のマウスにおいてはそうではなく、これは神経細胞が血管新生における障害によって二次的に影響を受けていることを示している。
【０１３０】
同時に、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスの表現型は、表在性血管網のかなりの正常な発達、及びＯＰＬにおける毛細血管の欠如、Ｆｚｄ４変異マウス(Xuら Cell 116: 883-95(2004))及びノリン変異マウス(Luhmannら Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46(9): 3372-82(2005))について報告されている表現型に非常に類似していると思われる表現型により特徴付けられる。よって、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスが、Ｆｚｄ４又はそのリガンドノリンの破壊に起因する付加的な特徴的特性を示すかどうかをテストした。ノリン変異マウスは、Ｐ１５で、ＮＦＬから内顆粒層の方へ広がる非常に特徴的な微小動脈瘤を示す。際だって、共焦点顕微鏡法によりＴＳＰＡＮ１２−／−マウスのＰ１６網膜を分析すると、ノリン変異マウスにおいて記載されたものに極めて類似した、微小動脈瘤様血管形成異常が明らかとなった。これらの高度に特徴的な形成異常の類似性は、ノリン変異マウスとＴＳＰＡＮ１２−／−マウスの双方において、形成異常が実質的同時期に発生したという事実により支持される。さらなる類似性には、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスの網膜血管におけるＭｅｃａ-３２の異常発現が含まれ、有窓血管についてのマーカーは、網膜血管系では通常発現しないが、Ｆｚｄ４変異マウスにおいてはアップレギュレートされる。ノリン及びＦｚｄ４は、コレセプターＬＲＰ５と共同して、カノニカルＷｎｔ-経路を活性化させ、細胞質β-カテニンの蓄積を促進させるリガンド／レセプター対であるため、ＴＳＰＡＮ１２−／−マウスの表現型的特徴は、ＴＳＰＡＮ１２がノリン／β-カテニンシグナル伝達に必要であり得ることが示された。
【０１３１】
実施例２．ＴＳＰＡＮ１２はＷｎｔシグナル伝達に関与している
ＴＳＰＡＮ１２、Ｆｚｄ４及びノリンＫＯマウスにおいて観察される表現型間の類似性に基づき、ＴＳＰＡＮ１２が、Ｆｚｄ４を介したノリン-誘発性β-カテニンＷｎｔシグナル伝達に関与しているかどうかを決定するために、Ｔｏｐｆｌａｓｈレポーターアッセイを実施した。Ｔｏｐｆｌａｓｈコンストラクトは、カノニカルβ-カテニンシグナル伝達に対して反応するＬＥＦ／ＴＣＦコンセンサス部位を含むプロモーター下、ホタルのルシフェラーゼからなる。構成的プロモーター下でウミシイタケルシフェラーゼを発現するコンストラクトが、内部対照体として使用される。レポーターコンストラクト及びレセプターで形質移入された細胞は、外来性ＴＳＰＡＮ１２又はベクター対照体の存在下、１０ｎＭの組換えノリンで活性化された。１６-１８時間後、レポーター活性(ホタル活性をウミシイタケ活性で割る)を決定した。ノリン-媒介性シグナル伝達は、対照細胞よりも、ＴＳＰＡＮ１２が過剰発現している細胞において、約４倍高かった(図３、左欄−右欄は、対照となるウミシイタケルシフェラーゼ発現が、全ての条件下で同じであることを示している)。野生型ＴＳＰＡＮ１２ ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡを使用して低減している(発現は対照レベルの５分の１のわずかに下だった)細胞において、同様の実験を実施し、ノリン-誘発性、Ｆｚｄ４／ＬＲＰ５-媒介性発現は、ＴＳＰＡＮ１２ノックダウン後に、かなり低減したことが見出された。
【０１３２】
ＴＳＰＡＮ１２効果の特異性をさらに証明するために、ｆｒｉｚｚｌｅｄコンストラクト及び／又はリガンドを変えた、いくつかの実験を実施した。まず、他のｆｒｉｚｚｌｅｄコンストラクト(Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ１０)、並びにＦｚｄ４を発現する同様のベクターで形質移入された細胞を使用する実験を実施した。図４に示すように、ノリン-媒介性Ｗｎｔ／β-カテニンのカノニカルシグナル変換における、ＴＳＰＡＮ１２の主要な影響は、Ｆｚｄ１０-媒介性シグナル伝達にあまり影響しないＦｚｄ４に対して特異的である。次に、シグナル伝達を誘発させるためのリガンドとしてＷｎｔ３ａを使用するこのアッセイにおいて、シグナル伝達を分析した。ここで、ＴＳＰＡＮ１２は、任意のＦＺＤ-媒介性シグナル伝達をあまり高めなかったことが見出された(図５)。リガンドとしてＷｎｔ５ａを使用しても同様の結果が観察された。
【０１３３】
実施例３．ＴＳＰＡＮ１２はＦｚｄ４-レセプター複合体の一部である
ＴＳＰＡＮ１２が、ノリン／β-カテニンシグナル伝達の開始の間に、実際に機能するならば、レセプター複合体の成分と共に共局在化し、相互作用することが予期される。この可能性をテストするために、ｆｌａｇ-Ｆｚｄ４(細胞外に位置するｆｌａｇ)とＨＡ-ＴＳＰＡＮ１２を用いてＨｅｌａ細胞を形質移入した。細胞膜Ｆｚｄ４を、氷上にて、非透過性の生存細胞において、ｆｌａｇ抗体を用いて検出し、固定化及び透過化の後に続いて、ＴＳＰＡＮ１２を検出した。この染色パラダイムにより、Ｈｅｌａ細胞の表面における多量のＦｚｄ４発現が明らかとなった。Ｆｚｄ４は細胞膜に均一に分散していないが、その代わり、多くの点状領域に凝縮していることが見出された。ＴＳＰＡＮ１２はＦｚｄ４ポジティブ点状体と共に広範囲に共局在化しており、さらに、抗ｆｌａｇ染色が細胞を透過することなく細胞表面で実施されるために、抗ｆｌａｇ抗体で染色されない細胞内構造体に生じる。対照的に、ＣＤ９とＦｚｄ４は共局在化しなかった。Ｆｚｄ４がＦｚｄ５で置き換えられ、ＴＳＰＡＮ１２と同時発現する場合、ＴＳＰＡＮ１２とＦｚｄ５が最も離間して局在化することが見出された(双方のタンパク質を強く発現したまれな細胞でのみ、分離が部分的に克服された)。
【０１３４】
ノリンのＮ末端アルカリホスファターゼ融合体(ＡＰ-ノリン)を含有する条件培地を使用し、ノリン-レセプター相互作用を研究する(Xuら 上掲)。Ｆｚｄ４、ＬＲＰ５又はＴＳＰＡＮ１２のいずれかを使用してＨｅＬａ細胞を形質移入させ、ｆｌａｇ-ＡＰ-ノリンを含有する条件培地で、これらの細胞を探索した。以前の報告と一致して、ｆｌａｇ-ＡＰ-ノリンは、Ｆｚｄ４を発現するが、ＬＲＰ５は発現しない細胞に、効果的に結合することを見出した。重要なことに、ノリンは、ＴＳＰＡＮ１２を単独で発現する細胞には結合しなかった(図６)。ＴＳＰＡＮ１２とレセプター複合体との相互作用を探索するために、２９３細胞において、Ｆｚｄ４、ＬＲＰ５及びＴＳＰＡＮ１２を同時発現させ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄの代替としてＦｚｄ５、テトラスパニンの代替としてＣＤ９を、それぞれの対照体に使用した。(内部移行事象を防止するために)氷上にて、ｆｌａｇ-ＡＰ-ノリンを含有する条件培地と共に、これらの細胞をインキュベートし、十分に洗浄した後、ノリン関連の膜タンパク質を穏やかに架橋させ、ついで抗ｆｌａｇ抗体により免疫沈降させた。ノリンはＦｚｄ４を効果的に沈殿させるが、Ｆｚｄ５はそうではなかった。さらに、ＴＳＰＡＮ１２は、ノリンにより、Ｆｚｄ４と共沈殿したが、Ｆｚｄ５とはせず、Ｆｒｉｚｚｌｅｄが存在しない場合は沈殿した。対照的に、ＣＤ９は、ＴＳＰＡＮ１２と同程度に発現したが、ノリンにより、Ｆｚｄ４と共沈殿しなかった(図７)。よって、ＴＳＰＡＮ１２は、Ｆｚｄ４レセプター複合体と物理的に結合する。また、架橋剤を使用しない場合、ＴＳＰＡＮ１２は、洗浄抽出物(１％のＮＰ-４０＋０．１％のＮ-ドデシル-ベータ-Ｄ-マルトシド)からＬＲＰ５の不在下において、ノリンによりＦｚｄ４と共沈殿した(図示せず)。ＴＳＰＡＮ１２とＬＲＰ５が同時発現し、ＴＳＰＡＮ１２が免疫沈降する場合、ＬＲＰ５との関連性は、何も検出されなかった(図８)。
【０１３５】
ＴＳＰＡＮ１２によりノリン／β-カテニンシグナル伝達が強力に高められることで、ＴＳＰＡＮ１２がＦｚｄ４に結合するノリンを増加可能であるかどうかを分析した。この目的のために、Ｈｅｌａ細胞をｆｌａｇ-Ｆｚｄ４、ＬＲＰ５、ＴＳＰＡＮ１２又はベクター対照体で形質移入し、続いて、ｆｌａｇ-ＡＰ-ノリン条件培地のいくつかの希釈液を用いて探索した。細胞へのｆｌａｇ-ＡＰ-ノリンの結合性は、テストした全てのノリン濃度で、ＴＳＰＡＮ１２の存在下又は不在下で同様であった(図９)。ＴＳＰＡＮ１２がＦｚｄ４発現レベルを低下させるが、同時にノリン結合性を増加させる可能性を排除するため、ｆｌａｇペプチドに対して指向するＨＲＰ-結合抗体を用い、Ｆｚｄ４の発現性を直接測定した。ＴＳＰＡＮ１２の同時発現は、細胞膜におけるＦｚｄ４の発現性を変化させなかった(図１０)。共に、ＴＳＰＡＮ１２がノリンと共免疫沈降せず(Ｆｚｄ４が存在しないならば)(図７)、Ｆｚｄ４に対するノリンの結合性を高めない(図９)という発見は、ＴＳＰＡＮ１２が固有の方式でシグナル伝達を高めていることを示す。これは、いくつかの他のテトラスパニン類の機能と一致しており、典型的には、リガンドに直接結合はしないが、その代わりに、包埋したレセプターのシグナル伝達を容易にするマイクロドメインを組織化すると考えられる。よって、次は、ＴＳＰＡＮ１２がレセプター複合体のコンポーネント間の相互作用を容易にする可能性を試験した。
【０１３６】
実施例４．モノマーノリンＣ９５Ｒの欠失はＴＳＰＡＮ１２により迂回される
ノリンは、分子間ジスルフィド結合を介してダイマーを形成するシステインノットタンパク質のサブグループに属し(Vittら Mol. Endocrinol. 15(5): 681-94(2001))、ノリンダイマーがさらに高分子量の構造体に組み立て可能であると示唆される。(Perez-Vilarら J. Biol. Chem. 272(52): 33410-15(1997))。ノリンは、ノリンがＡＰに縮合していないならば、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)に強く会合している(Xuら 上掲)。分子間ジスルフィド結合の還元を通して、ノリンはモノマーに完全に転換可能であり、又は９５位におけるシステインの変異により、分子間ジスルフィド結合が無効になると予測される。２９３細胞において、Ｖ５-タグされたノリンＣ９５Ｒ変異体及びＶ５-タグされた野生型ノリンを発現させ、ＥＣＭからノリン抽出した。還元条件下、ＳＤＳ ＰＡＧＥにより、実際に区別できない、野生型及び変異ノリンのモノマーが明らかになった。以前の報告と一致して、非還元条件下での分析では、野生型ノリンがダイマー、及びより高分子量のアセンブリを形成することが明らかとなった。対照的に、ノリン-Ｃ９５Ｒ変異体は、ほとんどがモノマーであり、大きなアセンブリは形成されなかった(図１１)。全ノリンＣ９５Ｒの小さなフラクションは、Ｃ９５以外の位置での分子間ジスルフィドにより、又は可能であれば非共有結合により、ダイマーを形成した。
【０１３７】
ノリンは、膜に近接近して多くのＦｚｄ４分子を連れてきて、ノリン／β-カテニンシグナル伝達を高める可能性を有するモノマーより、より大きく組み立てられるが、モノマーノリン-Ｃ９５Ｒはできないと予測される。この考えをテストするために、レセプターと共に、増大量の野生型ノリン又はノリンＣ９５Ｒ ｃＤＮＡを形質移入し、２９３細胞において、ＴＳＰＡＮ１２の存在下又は不在下において、Ｔｏｐｆｌａｓｈ活性を誘発させた。５-１００ｎｇのノリンプラスミドがＦＺＤ４及びＬＲＰ５と共に同時形質移入された場合、野生型ノリンの発現により、ノリン／β-カテニンシグナル伝達は効果的に誘発され、ＴＳＰＡＮ１２の添加により、この活性は強く高められる(図１２)。しかしながら、モノマーノリンＣ９５Ｒ変異体は、１００ｎｇのノリンプラスミドという最も高い用量でさえ、ＴＳＰＡＮ１２を過剰発現してない細胞においては、実際は不活性であった。ＴＳＰＡＮ１２はマイクロドメインにレセプターを連れてくることが可能で、互いに近接して配することができるという考えに一致して、ＴＳＰＡＮ１２は大規模な程度で、ノリンＣ９５Ｒ変異体のシグナル伝達欠失をレスキューする。さらに、ＴＳＰＡＮ１２の添加により、野生型ノリンのシグナル伝達が増加した(図１２)。共に、これらのデータには、ノリンマルチマー及びＴＳＰＡＮ１２がそれぞれ、近接近して、多数のＦＺＤ４分子を連れてくる種々の手段を提供し、これらのメカニズムは互いに作用して、最大シグナル伝達を導き出すことが示されている。
【０１３８】
実施例５．ＴＳＰＡＮ１２はレセプタークラスター化を高める
ノリン／β-カテニンシグナル伝達を強く損なわせるが、ノリンに結合する能力は維持している、上述した変異ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖを使用するレセプタークラスター化の生化学的分析を実施した(Xuら, 上掲)。構造的情報(Dannら Nature 412:86-90(2001))により補助すると、Ｍ１５７Ｖ変異は、ノリン誘発性ＦＺＤ４ダイマー化、及びその結果としてのマルチマー化(Dannら, 上掲；Toomesら, 上掲；Xuら, 上掲)に影響を与えることが提案されている。以前の報告(Xuら, 上掲)と一致して、ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖにより媒介されるシグナル伝達が、かなり損なわれていたことが見出された。興味あることに、ＴＳＰＡＮ１２同時発現は、ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖのシグナル伝達欠失を完全にレスキューした(図１３Ａ)。
【０１３９】
ついで、ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖを利用し、ＦＺＤ４マルチマー化におけるＴＳＰＡＮ１２の役割を直接調査した。２９３細胞をＴＳＰＡＮ１２又は対照ベクターで形質移入し、ＦＬＡＧＴＭ-ＦＺＤ４及びｇＤ-ＦＺＤ４、又はＦＬＡＧ-ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖ及びｇＤ-ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖで同時形質移入した。細胞を、ノリンを含有するか、又はリガンドを含有しない培地と共に、氷上でインキュベートした。細胞溶菌液を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降させ、ｇＤ-ＦＺＤ４の共免疫沈降について探索した。タンパク質-タンパク質の相互作用の定量を可能にするために、この実験では、架橋剤を使用しなかった。ｇＤ-ＦＺＤ４とＦＬＡＧ-ＦＺＤ４又はｇＤ-ＦＺＤ４-Ｍ１５７ＶとＦＬＡＧ-ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖとの間の会合性に、同様の基本レベルが検出された(図１３Ｂ、データは図示せず)。ノリンとＴＳＰＡＮ１２はそれぞれ、ＦＬＡＧ-ＦＺＤ４により低下するｇＤ-ＦＺＤ４の量を増加させ、ノリンとＴＳＰＡＮ１２とを組合せることで、ＦＺＤ４のクラスター化がさらに増加した(図１３Ｂ、左側パネル；１３Ｃ、白抜きバー)。重要なことに、Ｍ１５７Ｖ変異により、ＦＬＡＧ-ＦＺＤ４と共にｇＤ-ＦＺＤ４をクラスター化させるノリンの能力がかなり損なわれるが、ＴＳＰＡＮ１２の同時発現により、この欠失は相殺された(図１３Ｂ、右側パネル；１３Ｃ、黒棒)。共に、これらのデータは、ＴＳＰＡＮ１２とノリンの双方がＦＺＤ４のマルチマー化を促進することを示し、ノリン／β-カテニンシグナル伝達には、ｉ)ＦＺＤ４のマルチマー化を促進する因子とｉｉ)リガンド結合によるＦＺＤ４の活性化が必要であることが示唆される。
【０１４０】
次に、ＦＺＤ４レセプターのクラスター化を高める抗体の付加により、ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖの活性がレスキュー可能であるかどうかをテストした。２４-ウェルプレートにおいて、１．６ｘ１０５細胞／ウェルを、β-カテニンレセプター混合物(Topflash, ｐＲＬ-ＣＭＶ、及びｐＣａｎ-ｍｙｃ-ｌｅｆ-１)、ＬＲＰ５、及びＦＺＤ４又はＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖのいずれかを含有するＤＮＡ混合物で形質移入した。形質移入の２４時間後、指示ウェルに１μｇ／ｍｌの抗ＬＲＰ５／６抗体を受容させた。１時間後、１２５ｎｇ／ｍｌの組換えノリンを、指示したようにウェルに添加した。３７℃でインキュベートしてさらに１６時間後、細胞を溶解させ、Promega Dual-Glo(登録商標)試薬を使用し、ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ発現を測定した。ホタルのルシフェラーゼ値を、ウミホタル発現に対して標準化させた。結果を表１に示す。ＦＺＤ４を発現した細胞において、レポーター活性はノリンの存在下で〜６倍まで活性化する。ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖが発現した場合、ノリン活性は〜２倍のみ、かなり損なわれる。ＬＲＰ５抗体を添加することにより、約２倍まで、ＦＺＤ４-Ｍ１５７Ｖにおけるシグナル伝達欠失が部分的にレスキューされる。
【０１４１】
0005859307.tif 000002
【０１４２】
実施例６．抗ＴＳＰＡＮ１２及び抗ノリン抗体の生成
多くの方法を使用し、抗ＴＳＰＡＮ１２及び抗ノリン抗体を生成した。例えば、予防接種及びハイブリドーマ技術により抗体を生成した。また、重鎖及び軽鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)に多様性を導入することより、単一のフレームワーク(ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体、４Ｄ５)に作製される合成ファージ抗体ライブラリも使用する(Leeら J. Mol. Biol.340: 1073-93(2004); Liangら J. Biol. Chem. 281: 951-61(2006))。ナイーブなライブラリを用いたプレートパニングを、ＭａｘｉＳｏｒｐＴＭ免疫プレートに固定化されたＨｉｓ-タグヒトＴＳＰＡＮ１２に対して実施する。増菌の４ラウンド後、クローンをランダムに選定し、ファージＥＬＩＳＡを使用して、特定のバインダーを同定する。得られたｈＴＳＰＡＮ１２結合クローンを、Ｈｉｓ-タグマウスＴＳＰＡＮ１２タンパク質を用いてさらにスクリーニングし、異種間クローンを同定する。それぞれのポジティブファージクローンについて、重鎖及び軽鎖の可変領域を、全長ＩｇＧ鎖を発現するように設計されたｐＲＫ発現ベクターにサブクローンする。重鎖及び軽鎖のコンストラクトを、２９３又はＣＨＯ細胞に同時形質移入し、発現抗体を、プロテインＡアフィニティーカラムを使用し、無血清培地から精製する。精製された抗体を、組換えＴＳＰＡＮ１２又はノリンへの結合についてはＥＬＩＳＡにより、ＦＺＤ４と共に、全長ヒトＴＳＰＡＮ１２又はマウスＴＳＰＡＮ１２を発現する、もしくはヒト又はマウスノリンを発現する安定した株化細胞への結合についてはＦＡＣＳによりテストする。ついで、抗体を、ＴＳＰＡＮ１２(抗ＴＳＰＡＮ１２抗体)により、ノリン-媒介性、ＦＺＤ４／ＬＲＰ５-媒介性のＷｎｔレポーター活性の増強のブロック、又はノリン-誘発性シグナル伝達(抗ノリン抗体)のブロックについてテストする。親和成熟について、関心ある最初のクローンから誘導された３つの異なるＣＤＲループ(ＣＤＲ-Ｌ３、-Ｈ１、及び-Ｈ２)の組合せを有するファージライブラリを、各選択位置が、約５０：５０の頻度で、非野生型残基に変異するか、又は野生型として維持されるように、柔軟なランダム化法により実施する(Liangら, 2006, 上述)。ついで、高親和性のクローンを、漸次増加する緊縮性を有する、ヒト及びマウスの双方のＨｉｓ-タグＴＳＰＡＮ１２タンパク質に対して、４ラウンドの液相パニングを介して同定する。
【０１４３】
実施例７．眼病のマウスモデル
マウスモデルにおいて、抗体又はＴＳＰＡＮ１２ポリペプチドをテストする。マウスＲＯＰモデルについて、Ｐ７で開始して５日間、子供を７５％の酸素(過酸素症)に置く。Ｐ１２にて、動物をエアコンの効いた部屋(酸素正常状態)に戻し、さらに５日間(Ｐ１７)保持した。抗ＴＳＰＡＮ１２、抗ノリン抗体、又はＴＳＰＡＮ１２の大きな細胞外ループ(例えば、Hoら 上掲)を、Ｐ１２の動物の硝子体内に注射する。アンタゴニストの親和性及び安定性により決定される予測に基づき、複数の用量レベルと頻度で実施する。Ｐ１７に、右目を４％のＰＦＡに配し、左目をダビットソンの固定液に配した。パラフィン工程及び切片化のために、角膜とレンズを左目から取り除いた。眼杯を、虹彩側が下になり、切開面が面するようにブロックに配した。１６ミクロン間隔の切片を得、特注の核アルゴリズムを具備するAperio ScanScope(登録商標)を使用し、血管新生について分析した。ＮＦＬに密接に関連した新生血管房を、アルゴリズム定量化の関心ある領域として同定した。ケース毎に、新生血管核を含む最小３０切片を、網膜の血管新生の評価のために定量した。
マウスレーザー誘起脈絡膜血管新生モデルにおいても、抗体及びポリペプチドをテストする。
【０１４４】
上述した明細書で、当業者は本発明を十分に実施可能であると考えられる。しかしながら、ここに示され記載されるものに加えて、本発明の種々の修正点は、上述の記載から、当業者には明らかであり、添付する特許請求の範囲に入る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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