(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌において、ｇｌｎＲ遺伝子の欠失又は不活性化によりｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強することを特徴とする、当該異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強方法。
【請求項２】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した枯草菌を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、ｇｌｎＲ遺伝子の欠失又は不活性化によりｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強することを特徴とする、前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
【請求項３】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である、請求項４又は５記載の製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強方法、及び当該方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品の醸造をはじめとして、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等の工業的生産など、多岐に渡って実施されている。またその用途も、食品をはじめとして、医薬、洗剤、化粧品等の日用品、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野に広がっている。
【０００３】
微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。
【０００４】
近年、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が成育に必須であることが報告されている（非特許文献１）。また、本出願人は、枯草菌の遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大領域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた変異株の創出に成功している（特許文献１）。
【０００５】
グルタミン及びグルタミン酸は、全ての生体物質への窒素ドナーとなることから、窒素代謝において極めて重要な化合物であると考えられている。一般的にグルタミン合成経路は、グルタミン合成酵素によって触媒されることが知られており、枯草菌ではＧｌｎＡがその役割を担っている（非特許文献２）。
【０００６】
ＧｌｎＡはｇｌｎＲＡオペロンの２番目の遺伝子によりコードされており、このオペロンの発現は、ｇｌｎＲＡオペロンの１番目の遺伝子ｇｌｎＲによりコードされる転写抑制因子ＧｌｎＲにより抑制される（非特許文献３）。ＧｌｎＲは窒素源が豊富にある条件下で、ｇｌｎＲＡオペロンの転写を抑制する因子である。一方、窒素源が枯渇した条件下では、枯草菌の窒素代謝におけるグローバルレギュレーターＴｎｒＡがｇｌｎＲＡオペロンの転写抑制因子として機能することが知られている。
【０００７】
また、Ｆｉｓｈｅｒらの報告によると、ＧｌｎＲ及びＴｎｒＡをコードする遺伝子が欠失した株では、それぞれ窒素豊富条件下及び窒素枯渇条件下でｇｌｎＡの発現量が向上することが判明している（非特許文献４）。
【０００８】
グルタミン合成酵素遺伝子の改変による、生物の機能改変に関する報告が数多くなされている。例えば、納豆菌のグルタミン合成酵素遺伝子を高発現させてアンモニア臭を低減する方法（特許文献２）、グルタミン合成酵素遺伝子の負の制御因子（グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ（ＧｌｎＥ蛋白質）及びグルタミンシンテターゼ調節蛋白質ＰＩＩ）を欠失させて、グルタミン製造能力を向上させる方法（特許文献３）、コリネ型細菌のグルタミン合成酵素遺伝子を変異させてグルタミン製造量を増加させる方法（特許文献４）、ＢＣＧ株にグルタミン合成酵素遺伝子を導入して、アラニン・セリンによる生育阻害を解消させる方法（特許文献５）、植物においてグルタミン合成酵素遺伝子を高発現させ、成長速度、乾燥重量を増加させる方法（特許文献６）、真核生物細胞（ＣＨＯ細胞等）の形質転換にグルタミン合成酵素遺伝子を利用する（グルタミン代謝欠損の是正をマーカーとして形質転換株を選抜する）方法（特許文献７）が報告されている。
【０００９】
しかしながら、遺伝子組換え体による組換えタンパク質又はペプチドの生産と、グルタミン合成酵素の発現量との間の関係については何ら報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００７−１３００１３号公報
【特許文献２】特開２００７−１４３４６７号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／００１３８０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／０７４８５７号パンフレット
【特許文献５】特表２００６−５０８６３３号公報
【特許文献６】特開２０１０−６８８０５号公報
【特許文献７】特表２００９−５０４１６０号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，４６７８−４６８３，２００３
【非特許文献２】Ｇｅｎｅ，３２，４２７（１９８４）
【非特許文献３】Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３２，２２３（１９９９）
【非特許文献４】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８８，２５７８（２００６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強方法、及び当該方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した宿主微生物において、ｇｌｎＡ遺伝子の発現量を増加させることにより、当該異種タンパク質又はポリペプチドの生産が顕著に向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、以下の（１）から（１４）に係るものである。
（１）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した宿主微生物において、ｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強することを特徴とする、当該異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現増強方法。
（２）  ｇｌｎＡ遺伝子の発現の増強が、ｇｌｎＡ遺伝子の転写抑制因子の欠失又は不活性化により行われる、前記（１）記載の方法。
（３）  前記転写抑制因子が、ＧｌｎＲ及び／又はＴｎｒＡである、前記（２）記載の方法。
（４）  宿主微生物がバチルス属に属する細菌である、前記（１）から（３）のいずれか１つに記載の遺伝子の発現増強方法。
（５）  前記バチルス属に属する細菌が枯草菌である、前記（４）記載の遺伝子の発現増強方法。
（６）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した宿主微生物を用いた、異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法であって、ｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強することを特徴とする、前記異種タンパク質又は異種ポリペプチドの製造方法。
（７）  ｇｌｎＡ遺伝子の発現の増強が、ｇｌｎＡ遺伝子の転写抑制因子の欠失又は不活性化により行われる、前記（６）記載の製造方法。
（８）  前記転写抑制因子が、ＧｌｎＲ及び／又はＴｎｒＡである、前記（７）記載の製造方法。
（９）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる１以上の領域が作動可能に連結されている、前記（６）から（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１０）  異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が作動可能に連結されている、前記（６）から（８）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１１）  前記分泌シグナル領域が、バチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、前記転写開始制御領域及び前記翻訳開始制御領域が、当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである、前記（９）又は（１０）記載の製造方法。
（１２）  前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片である、上記（１０）記載の製造方法。
（１３）  宿主微生物がバチルス属に属する細菌である、前記（６）から（１２）のいずれか１つに記載の製造方法。
（１４）  前記バチルス属に属する細菌が枯草菌である、前記（１３）記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本願発明の組換え枯草菌を用いれば、目的の異種タンパク質又は異種ポリペプチドを効率よく大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製、及び当該ＤＮＡ断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示した図。
【図２】１６８ΔｇｌｎＲ、１６８ΔｔｎｒＡ株、１６８ΔｇｌｎＲΔｔｎｒＡ株及び親株である枯草菌１６８株の培養後の、培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明で使用される宿主微生物としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌や、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌等のグラム陽性細菌が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）がより好ましい。
【００１８】
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）とは、好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する真正細菌の一種である。枯草菌は、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されており、またタンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有するため、本願発明にとり有用な微生物といえる。
【００１９】
本願発明において用いる枯草菌としては特に限定されないが、異種タンパク質又は異種ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量増強の観点から、具体的には、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）、又は当該株を基に、そのゲノムの大領域を欠失させて構築した枯草菌ＭＧＢ８７４株が挙げられる（特許文献１）。
【００２０】
ｇｌｎＡ遺伝子は、グルタミン酸とアンモニアからＡＴＰのエネルギーを利用してグルタミンを合成する酵素であるグルタミン合成酵素（ＧｌｎＡ）をコードする遺伝子である。ｇｌｎＡ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて多くの生物種由来の当該遺伝子が登録・公開されており、例えば枯草菌のｇｌｎＡ遺伝子は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＣ＿０００９６４として登録・公開されている。
【００２１】
本発明においては、配列番号１の塩基配列を有するｇｌｎＡ遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、グルタミン酸からのグルタミン合成活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、当該ｇｌｎＡ遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において発現増強されるｇｌｎＡ遺伝子に含まれるものとする。なお、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５））によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２２】
本発明において、ｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強する方法としては、宿主微生物細胞内のｇｌｎＡ遺伝子のコピー数を増加させることによって行っても良いが、ｇｌｎＡ遺伝子の発現を抑制する因子、例えば転写抑制因子の欠失又は不活性化により行っても良い。後者の場合、欠失又は不活性化される当該転写抑制因子としては、ＧｌｎＲ及びＴｎｒＡが挙げられ、いずれか一方を欠失又は不活性化してもよく、両方を欠失又は不活性化してもよい。
【００２３】
ＧｌｎＲとは、窒素源が豊富にある条件下でｇｌｎＲＡオペロンの転写を抑制する因子であり、一方ＴｎｒＡとは、窒素源が枯渇した条件下でｇｌｎＲＡオペロンの転写を抑制するグローバルレギュレーターである。ゆえに、窒素源が豊富にある条件においてはＧｌｎＲをコードするｇｌｎＲ遺伝子を欠失又は不活性化してｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強するのが好ましく、一方、窒素源が枯渇した条件においてはＴｎｒＡをコードするｔｎｒＡ遺伝子を欠失又は不活性化してｇｌｎＡ遺伝子の発現を増強するのが好ましい。
【００２４】
本発明においては、配列番号２の塩基配列を有するｇｌｎＲ遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、窒素源が豊富にある条件下でｇｌｎＲＡオペロンの転写を抑制する因子であるタンパク質をコードする遺伝子も、当該ｇｌｎＲ遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明においてｇｌｎＡ遺伝子の発現増強のために欠失又は不活性化する転写抑制因子の遺伝子に含まれる。
【００２５】
本発明においては、配列番号３の塩基配列を有するｔｎｒＡ遺伝子と塩基配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を有し、窒素源が枯渇した条件下でｇｌｎＲＡオペロンの転写を抑制するグローバルレギュレーターであるタンパク質をコードする遺伝子も、当該ｔｎｒＡ遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明においてｇｌｎＡ遺伝子の発現増強のために欠失又は不活性化する転写抑制因子の遺伝子に含まれる。
【００２６】
本発明における、ｇｌｎＲ及び／又はｔｎｒＡ遺伝子の削除又は不活性化の具体例として、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１（１９８９））によって調製される削除用ＤＮＡ断片を用いた二重交差法による削除方法について説明するが、本発明における遺伝子削除方法はこの方法に限定されるものではない。
【００２７】
本方法で用いる削除用ＤＮＡ断片は、削除対象遺伝子の上流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片と、同じく下流に隣接する約０．２〜３ｋｂ断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入して構築した断片である。まず、１回目のＰＣＲによって、削除対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側１０〜３０塩基対配列が付加されるようにデザインされたプライマーを用いる（図１）。
【００２８】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入されたＤＮＡ断片が得られる（図１）。
【００２９】
表１又は２に示したプライマーセットと適当な鋳型ＤＮＡを用い、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂ．Ａ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ２５１（１９９３）、Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９）等に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、各遺伝子の削除用ＤＮＡ断片が得られる。
【００３０】
かくして得られた削除用ＤＮＡ断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、削除対象遺伝子の上流及び下流の、上記削除用ＤＮＡ断片との相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、削除対象遺伝子が薬剤耐性遺伝子で置換された細胞を、薬剤耐性マーカーによる選抜により単離できる（図１）。即ち、表１又は２に示したプライマーセットを用いて調製した削除用ＤＮＡ断片を導入した場合、薬剤を含む寒天培地上に生育するコロニーを単離し、目的の遺伝子が削除されて薬剤耐性遺伝子と置換していることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認すればよい。
【００３１】
以上のようにして得られた、ｇｌｎＡ遺伝子の発現が増強された宿主微生物に、目的とする異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入し、当該異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を発現させた場合に、ｇｌｎＡ遺伝子の発現が増強されない宿主微生物と比較し、当該異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の発現が増強される。
【００３２】
なお、ポリペプチドとは一般に、直鎖状に連結したアミノ酸のポリマーを指し、タンパク質とは一般に、５０以上のアミノ酸からなる１つ以上のポリペプチドのことを指すが、本願においてはこれらの用語は交換可能に用いられるものとする。
【００３３】
異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を細胞内で発現させるためには、当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを宿主に導入して形質転換する必要がある。当該発現ベクターとしては、宿主微生物として枯草菌を用いる場合、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。あるいは、当該ＤＮＡ断片に宿主ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、宿主ゲノムに直接組み込むことによって組換え枯草菌を得てもよい。
【００３４】
当該組換え枯草菌を用いて異種タンパク質又はポリペプチドを製造する場合、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが望ましい。より具体的には、前記転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、又は当該塩基配列のいずれかと７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つ遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、上記の異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子と作動可能に連結していることが望ましい。ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。また、ここで、作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）とは、上記の制御配列が機能してコード配列によりコードされた目的タンパク質の発現が制御されうる位置関係で、当該制御配列と当該コード配列とが配置していることを指す。具体例としては、プロモーターとそれに隣接する目的遺伝子とが、当該プロモーターの方向に沿って、当該遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。また、ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％  ＳＤＳ、５×デンハート液及び１００ｍｇ／ｍＬ  ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブと共に６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３５】
本発明の組換え枯草菌を用いて生産する異種タンパク質又はポリペプチドとしては、例えば食品用、医薬用、化粧用、洗浄用、繊維処理用、検査用に用いられる各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００３６】
より具体的な例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、配列番号５又は６で示されるアミノ酸配列の１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、更には、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００３７】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼや、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、配列番号７で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりアミラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼや、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、配列番号８で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００３８】
上記の組換え枯草菌を用いた異種タンパク質又はポリペプチドの製造は、上記異種タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を上記のとおり宿主となる枯草菌変異株に導入して得られる菌株を、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってもよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から、目的の異種タンパク質又はポリペプチドを、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い抽出・精製することにより得ることができる。
【００３９】
以下の実施例において、本発明の方法について説明するが、本願発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたタンパク質の製造方法について具体的に説明する。
【００４１】
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲの反応液組成は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを２．５Ｕ添加して、反応液総量を５０μＬとした。ＰＣＲの反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させること、とした。
【００４２】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの３’側に続く領域を示す。
【００４３】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ  ＤＢ）でインターネット公開（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／、２００４年３月１０日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００４４】
枯草菌の形質転換はコンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３，１９２５（１９６７））にて行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０２％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．２５μＭ塩化マンガン、５０μｇ／ｍｌトリプトファン）において３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が１程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％硫酸アンモニウム、１．４０％リン酸水素二カリウム、０．６０％リン酸二水素カリウム、０．１０％クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％グルコース、０．０１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ）、５ｍＭ硫酸マグネシウム、０．４０μＭ塩化マンガン、５μｇ／ｍｌトリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が０．４程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００４５】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μｌに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μを添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。３７℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
【００４６】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え微生物によるタンパク質生産の際の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物）を用いた。
【００４７】
実施例１：ｇｌｎＲ欠失株の構築
ｇｌｎＲ（配列番号１）はｇｌｎＲ−ｇｌｎＡオペロンの先頭に位置する遺伝子であり、本遺伝子を欠失する際には、ｇｌｎＲの下流遺伝子であるｇｌｎＡ（配列番号２）の発現に影響を与えない形で欠失株の構築を行わなければならない。そこで、本研究では、ｇｌｎＲの構造遺伝子をネオマイシン耐性遺伝子のＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と置換する方法で欠失株を構築した。枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１に示したｇｌｎＲＦＷ１とｇｌｎＲ／ＮｍＲ、及びｇｌｎＲ／ＮｍＦとｇｌｎＲＲＶの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のｇｌｎＲ遺伝子の上流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ａ）、及び下流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。また、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３−１０３．（１９８６））を鋳型として、表１に示したｎｅｏｆ２及びｎｅｏｒ２のプライマーセットを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、ｇｌｎＲＦＷ２とｇｌｎＲＲＶ２のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、３断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法により枯草菌１６８株の形質転換を行い、ネオマイシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってｇｌｎＲ遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子と置換され、ｇｌｎＲ遺伝子欠失株となっていることを確認した。以上のようにして得られたｇｌｎＲ欠失株を１６８ΔｇｌｎＲ株とした。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
実施例２：ｔｎｒＡ欠失株の構築
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表２に示したｔｎｒＡＦＷ１とｔｎｒＡ／ｓｐＲ、及びｔｎｒＡ／ｓｐ  ＦとｔｎｒＡＲＶの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のｔｎｒＡ遺伝子（配列番号３）の上流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ａ）、及び下流に隣接する１．０ｋｂｐ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。また、スペクチノマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＤＧ１７２７（Ｇｅｎｅ，１６７，３３５，（１９９５））を鋳型として、表２に示すｓｐｆ及びｓｐｒのプライマーセットを用いて、スペクチノマイシン耐性遺伝子（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、ｔｎｒＡＦＷ２とｔｎｒＡＲＶ２のプライマーを用いてＰＣＲを行ない、３断片を（Ａ）−（Ｃ）−（Ｂ）の順になる様に結合させ、遺伝子欠失用のＤＮＡ断片を得た（図１参照）。このＤＮＡ断片を用いて、コンピテント法により枯草菌１６８株の形質転換を行い、スペクチノマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってｔｎｒＡ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換され、ｔｎｒＡ遺伝子欠失株となっていることを確認した。以上のようにして得られたｔｎｒＡ欠失株を１６８ΔｔｎｒＡ株とした。
【００５０】
【表２】
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【００５１】
実施例３  ｇｌｎＲ、ｔｎｒＡ２重欠失株の構築
実施例２で得た形質転換用ＤＮＡを用いて、実施例１にて得られた１６８ΔｇｌｎＲ株の形質転換をコンピテント法により行い、スペクチノマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによってｔｎｒＡ遺伝子がスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換され、ｔｎｒＡ遺伝子欠失株となっていることを確認した。以上のようにして得られた変異株を１６８ΔｇｌｎＲΔｔｎｒＡ株とした。
【００５２】
実施例４：セルラーゼ生産性評価
実施例１にて得られた１６８ΔｇｌｎＲ、１６８ΔｔｎｒＡ株、１６８ΔｇｌｎＲΔｔｎｒＡ株及び親株である枯草菌１６８株にアルカリセルラーゼ遺伝子を導入した。具体的には、バチルス属細菌  ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）（配列番号４）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号４の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表３に示されるプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆ及びプライマーＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築し、プロトプラスト形質転換法によって各菌株に導入した。
【００５３】
これによって得られた菌株を５ｍＬのＬＢ培地で３０℃において１５時間振盪培養を行い、更にこの培養液０．６ｍＬを３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った（この際、測定誤差を算出する目的で培養を３回行っている）。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。セルラーゼ活性測定については、１／７．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４、和光純薬）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ  ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業）を５０μＬ加えて混和し、３０℃にて反応を行った際に遊離するｐ−ニトロフェノール量を４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量した。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとし、生産性比較は、親株の生産性を１００％とする相対値により比較した（表４、表中の値は平均値±標準偏差（Ｎ＝３）を示す）。この結果、ｇｌｎＲを欠失した１６８ΔｇｌｎＲ株は親株と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた（図２）。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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