(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ランタニドイオンキャリアキレートおよび第１認識エレメントを含み、該ランタニドイオンキャリアキレートがランタニドイオンキャリア配位子とランタニドイオンを含む第１のグループ；
アンテナ配位子および第２認識エレメントを含む第２のグループ
を用いる、検体を検出および／または定量するためのバイオアッセイ法であって、
該方法においては、該ランタニドイオンキャリア配位子が該ランタニドイオンに結合し、該ランタニドイオンキャリアキレートが、以下の構造ｆ）からｎ）：
【化１】
0005841525.tif 000003
（式中、Ｘは反応性基であり、Ａはリンカーまたはスペーサー基であり、そしてｎは１または２である。）
からなる群より選択されるイオン性大環状キレート構造を有し、該アンテナ配位子が単座、二座、三座または四座のいずれかであり、イオンキャリア配位子とアンテナ配位子との組み合わせが、配位子配位部位、すなわち座数の合計が９または１０であり、かつ
該第１のグループの該第１認識エレメントおよび該第２のグループの該第２認識エレメントによる検体の認識が、結果として、
ｉ）キレート相補性、すなわち該ランタニドイオンを担持する該ランタニドイオンキャリアキレートと該アンテナ配位子との相補性による混合ランタニドキレート錯体の形成、およびそれによる蛍光の増加を生じる
バイオアッセイ法。
【請求項２】
少なくとも１ｐｍｏｌ／ｌの濃度でランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が用いられる請求項１記載のバイオアッセイ法。
【請求項３】
ｉ）ｌｏｇＫLnL2は少なくとも１２であって、ＫLnL2は、イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体の溶液中での安定度定数を意味する；および
ii）ｌｏｇＫLnL3は少なくとも８であって、ＫLnL3は、前記錯化剤とランタニドイオンとの溶液中での安定度定数を意味する
を特徴とする請求項２記載のバイオアッセイ法。
【請求項４】
前記イオンキャリアキレートのランタニドイオンは、プラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ユーロピウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ツリウム（III）およびイッテルビウム（III）からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法。
【請求項５】
第１および第２認識エレメントが互いに独立してオリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、ハプテンおよびオリゴ糖からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法。
【請求項６】
ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が用いられる請求項２〜５のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法であって、該錯化剤がＣＤＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＴＨＡからなる群より選択されることを特徴とするバイオアッセイ法。
【請求項７】
ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が用いられる請求項２〜６のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法であって、該錯化剤が、アンテナ配位子よりも該ランタニドイオンの強力な結合剤、すなわちｌｏｇＫLnL3＞ｌｏｇＫLnL4であって、ＫLnL3は、該錯化剤と該ランタニドイオンとの溶液中での安定度定数を意味し、ＫLnL4は溶液中での該アンテナ配位子と該ランタニドイオンとの錯体の安定度定数を意味することを特徴とするバイオアッセイ法。
【請求項８】
前記錯化剤がイオンキャリア配位子よりも弱いランタニドイオンの結合剤、すなわちｌｏｇＫLnL3＜ｌｏｇＫLnL2であって、ＫLnL2は、イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体の溶液中での安定度定数を意味するであることを特徴とする請求項７記載のバイオアッセイ法。
【請求項９】
前記アンテナ配位子が、以下の構造ａ）〜ｚ）：
【化２】
0005841525.tif 000004
【化３】
0005841525.tif 000005
（式中、Ｘは反応性基であり、Ａはリンカーまたはスペーサー基であり、Ｌは以下の構造：
【化４】
0005841525.tif 000006
から独立して選択される化学的部分であり、Ｚは水素または以下の構造：
【化５】
0005841525.tif 000007
から独立して選択される化学的部分であり、Ｇは、−ＣＦ3、−ＣＦ2ＣＦ3、または−ＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3である。）
からなる群より選択される集光構造を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法であって、該蛍光が４００および１６００ｎｍの間の波長で測定されることを特徴とするバイオアッセイ法。
【請求項１１】
検出または定量される検体が、ストレプトアビジン、タンパク質、ハプテン、核酸配列、細胞、ウイルス、核酸増幅反応産物およびポリメラーゼ連鎖反応産物からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法であって、該蛍光が長い蛍光寿命、すなわち寿命が＞１μｓであることを特徴とするバイオアッセイ法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオアッセイ法であって、該蛍光がアップコンバージョン蛍光、すなわち発光が励起よりも短い波長で検出される抗−ストークフォトルミネッセンスであることを特徴とするバイオアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体を検出および／または定量するためのバイオアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景を説明するために本明細書中において使用される刊行物およびその他の文献、およびとりわけ実施に関する追加的な詳細を提供するケースは、参考文献として組み込まれる。
【０００３】
バイオアフィニティー結合反応または酵素的触媒反応に基づく多数のアッセイが、種々の生物学的試料または環境試験、産業処理および化合物ライブラリーにおける試料から生物学的に重要な化合物、またはそれらの活性またはそれらの生物学的作用、または種々の生物学的試料により誘導される活性や作用のモジュレーションを分析するために開発されている。これらのアッセイのいくつかは、特異的バイオアフィニティー認識反応にもとづいており、たとえば、天然の生物学的結合成分、人工的に生産された結合化合物または成型プラスチックインプリント（分子インプリンティング）が特異的結合アッセイを形成するための認識エレメントとして使用される。他のアッセイは、試料中に存在するかまたは反応中に添加される化合物（たとえば、生物学的に活性な酵素、生体分子に対する活性を有する化学的化合物、酵素基質、酵素活性化剤、酵素阻害剤、酵素モジュレーティング化合物）の活性またはその活性のモジュレーションなどに依存している。このようなアッセイは、一般に、たとえば認識および結合反応の後に形成される複合体を定量するためといった、シグナルを生み出す１つの標識または複数の標識の組み合わせに依存するものである。ヘテロジニアスアッセイにおいては、一般に、たとえば遊離の標識シグナルまたは結合した標識シグナルの画分が測定される前に、分離工程（沈殿および遠心のような分離、濾過、たとえば被覆アッセイチューブ、スライドもしくは微粒子などのプラスチック表面へのアフィニティー回収、溶媒抽出、ゲル濾過、または他のクロマトグラフィーシステムなど）が必要とされる。ホモジニアスアッセイにおいては、標識または複数の標識のシグナルが結合反応または酵素活性、または他の測定される作用によりモジュレートされるかまたは形成され、標識シグナルの測定前に分離工程は必要とされない。ヘテロジニアスおよびホモジニアスアッセイの両方において、遊離または結合した標識の画分からの標識シグナルの測定は、一般に試料中の検体または活性の直接的な計算または一般に未知の試料が比較される標準の使用を介した間接的計算を可能にする。種々の結合アッセイ法は、Principles and Practice of Immunoassay, 2nd ed., C. P. Price and D. J. Newman, eds., Palgrave Macmillan, Hampshire, UK, 2001；およびThe Immunoassay Handbook, 2nd ed. David Wild, ed., Nature Publishing Group, New York, NY, 2001に概説されている。
【０００４】
単純で感度が高くかつ定量的であり、好ましくはホモジニアスで多重な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの開発が、蛍光標識および検出技術の発展において重要な目標である。ホモジニアスな方法は、結合された標識と遊離の標識との煩わしい分離工程の必要がなく、また自動的にアッセイを行うために必要とされる機器の構造もかなり単純化されるため、より注目されている。さらに、ホモジニアスな方法は、たとえば核酸増幅反応のリアルタイムモニタリングに関係する技術にも必要である［Higuchi, R., et al. (1992) Biotechnology 10: 413-417; Higuchi R., et al. (1993) Biotechnology 11:1026-1030］。核酸ハイブリダイゼーションのホモジニアスで非分離モニタリングに好適な現在利用可能な標識テクノロジーは、なお試料マトリックスの干渉を受け、そのテクノロジーは、普遍的に用いられることができない。たとえば５’ヌクレアーゼアッセイ［米国特許第５，２１０，０１５号］には適しておらず、またそれらは必要とされる迅速な読み出しを用いて行われるのに充分な感度で単純には検出できず、また検出に必要とされる機器が複雑または高価過ぎて都合よく構築または小型化できない。
【０００５】
フォトルミネッセンスに基づくホモジニアスな検出技術は、幾つかの種類の物理的および化学的相互作用が特定の生体分子複合体の形成による光輝性標識の発光を調節するために採用できるので、さらに注目を集めている。よく用いられる方法は、放出光の偏光、または２つの光輝性化合物（ドナーおよびアクセプター）間または光輝性化合物と非−光輝性化合物（ドナーおよび消光剤）との間の非放射性エネルギー移動（共鳴エネルギー移動）に基づく［Hemmilae I, Clin Chem 1985;31:359-370］。
【０００６】
共鳴エネルギー移動
フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、近接して存在する２つの適当に選ばれた蛍光分子の間の強く距離に依存した（６乗に反比例する）非放射性エネルギー移動機構である［Foerster, T (1948) Ann Physik 2:55-75］。共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）は、ドナーとアクセプター蛍光団がFoerster半径（典型的な値は４〜７ｎｍ）内にあり、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルが重なるときに実用的効率となる。ＲＥＴは、通常、ドナーとアクセプターの近接から生じるドナー発光強度の減少またはアクセプター発光強度の増加（感作アクセプター発光として知られる）［Selvin, PR (1995) Biochem Spectroscopy 246: 300-334］のいずれかを測定することにより観測される。非蛍光アクセプター（消光剤として知られる）の場合、ドナー発光強度の変化が観測される。
【０００７】
ＦＲＥＴは、広く用いられており、多くの応用の基幹的な技術であるが、性能に重大な制限があり［Hemmilae, I (1985) Clin Chem 31: 359-370］、実際、ＲＥＴプローブは真の近接プローブとしての厳しい要件を満たすことはできない。近接プロービングは、２つの近接プローブの近接度（nearness）の検出を可能とする技術であり、そして種々の生体分子の特異的で繊細で迅速な検出に用いられる。近接プローブは通常、結合部分（認識エレメント）または他の認識部位（標的分子、すなわち検体に対する特異的親和性をもって）および標的分子で構成され、２つの類似したまたは異なる近接プローブを隣接位置に結合させることができる。プローブ間の近接とは、したがって２つのプローブが、たとえば標的分子上のそれら別々の結合部位に結合する場合に提供される。真の近接プローブの特徴は、プローブ対が標的分子によってすぐ近くに向けられない場合、それらはいかなる有意なシグナルも生み出さない（すなわち検出できない）が、標的分子の存在下における特異的認識事象によりプローブ対が検出可能な状態に切り換えられるということである。一価の近接プローブを用い、洗浄工程なしで溶液中にて行われる近接プロービングは、国際公開第０１／６１０３７号、Schallmeiner et al. (2006) Nature Methods 4:135-137および国際公開第２００３／０４４２３１号に記載されている。
【０００８】
従来のＦＲＥＴに基づくアッセイは、ｉ）アクセプターの直接励起（アクセプターは、ドナーが励起されるのと同じ波長で弱く励起される）、ii）ドナー発光のクロストーク（ドナーはアクセプター発光が測定されるのと同じ波長でいくらか発光する）、iii）かならずしも近接を必要としないアクセプター蛍光団によるドナー発光（光子）の吸収を介した放射性エネルギー移動（ほとんど距離に依存しない；２乗に反比例する）、およびiv）バックグラウンドシグナルを生じる散乱励起光および自己蛍光（試料、他のアッセイ成分、プラスチックおよび検出機器自体から）の影響を受ける。したがって、従来の蛍光団およびＲＥＴプローブは、近接プローブ結合原理に必要とされるシグナル発生における特異性を提供するものではない。さらに、個々のドナー−アクセプター対の広範なスペクトル範囲により、多様な（multiparametric）ＦＲＥＴに基づくアッセイにおいて２つよりも多いパラメータを同時に測定することは難しい。
【０００９】
時間分解蛍光測定法
従来の蛍光に基づく技術の検出感度は、生物学的試料マトリクスの自己蛍光、散乱励起光および吸収により制限され、アクセプターに基づく共鳴エネルギー移動に基づくアッセイにおいては、アクセプター特異的発光波長でのドナー発光のクロストークやドナー特異的励起波長でのアクセプターの直接励起によっても制限される。生物学的液体または血清に存在する多くの化合物やタンパク質は、もともと蛍光を発し、従来の蛍光団（fluorophore）の使用によりその感度が甚だしく制限される［Soini E and Hemmilae I (1979) Clin Chem 25: 353-361; Wu P and Brand L (1994) Anal Biochem 218:1-13］。強度測定に基づくホモジニアスな蛍光技術を使用した場合の別の主な問題は、内部フィルター効果および試料の光学特性のばらつきである。この欠点を是正するために試料希釈が使用されているが、常に分析感度が犠牲となる。分析応用における蛍光共鳴エネルギー移動の実行可能性は、長寿命発光と大きいストークシフトを有する蛍光ランタニドクリプタートおよびキレートが１９９０年代にドナーとして用いられると、著しく改善した［Mathis G (1993) Clin Chem 39:1953-1959; Wu P and Brand L (1994) Anal Biochem 218, 1-13; Selvin PR et al. (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91:10024-10028; Stenroos K et al. (1998) Cytokine 10:495-499；国際公開第９８／１５８３０号；米国特許第５，９９８，１４６号；国際公開第８７／０７９５５号; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45:855-61］。
【００１０】
ランタニドキレートおよびクリプタートは、伝統的な有機蛍光団と比較して検出能が増強されているため、最近は多様な生体分子の分析において広く使用されている。ランタニド（希土類元素、たとえば三価のユーロピウム、テルビウム、サマリウムおよびジスプロシウム）の発光キレートは、光輝性化合物の特別なグループである［Buenzli, JCG and Piguet, C (2005) Chem Soc Rev 34: 1048-1077］。ランタニドイオンは、それら自身は非常に低い吸収を示し、加えてランタニドの励起状態は、配位された水分子により効率よく消光される。したがって、それらの励起に対するただ１つの現実的な解決法は、本来発光性のランタニド（III）キレートにおいて有機アンテナ発光団などの集光性部分を含む配位子を使用することである。実際、効率的なアンテナ配位子にキレートしたランタニドイオンのフォトルミネッセンス効率（吸収係数と量子収率の積）は、全ての配位水分子を置換した場合、裸イオンと比較して１００，０００倍まで容易に増強することができる。さらに、ランタニドイオンに対する明確な発光バンド特性が４つまでの異なるランタニドを最小スペクトルクロストークで同時測定することを可能にする。ランタニドの発光特性は、生物学的材料由来のバックグラウンドノイズの効率的な分離をも可能にし、したがってアッセイの感度が上昇する［J. Yuan, G. Wang (2005) J Fluoresc. 15, 559］。
【００１１】
有機集光性アンテナ部分または発光団を含む適切なキレート基（たとえば、アミノポリカルボン酸）と錯体形成したランタニドイオンは、従来の蛍光団と比較して独特の蛍光特性を有する：大きなストークシフト（１５０〜３００ｎｍ）、ランタニドイオンに対する狭くて明確な発光バンド特性、および長い発光寿命（２０００マイクロ秒まで）。その並外れた蛍光寿命により、バックグラウンド蛍光（短命）が消えて崩壊し、ランタニド発光がまだ充分な強度である場合のみ検出が行なわれる、そういった時間的なゲート（典型的には数１００マイクロ秒）の選択による効率的なバックグラウンド分離を可能とする。さらに、大きなストークシフトおよび狭い発光バンドは、スペクトル的にランタニド発光を選択するための効率的な波長フィルタリングを可能とし、結果として高い感度のレポーター技術（酵素増幅化学発光と同レベルの性能）と多重パラメータ測定の可能性を生じる。その技術は、（マイクロ秒）時間分解蛍光測定法として知られる専用の検出法を利用する［Soini E and Kojola H (1983) Clin Chem 29: 65-68］。発光ランタニドキレートの長寿命蛍光は、典型的には紫外線または青色可視光で励起され［Yang C, et al. (2004) Angew Chem Intl Ed 43:5010-5013］、そして発光は緑色および赤色可視波長で検出される。エルビウム、ネオジムおよびイッテルビウムの場合、可視波長で励起することができ、可視または赤外波長で発光できる［Werts, M.H.V., et al. (1997). Chem Phys Lett 276: 196-201］。また、白金（III）およびパラジウム（III）も、ポルフィリンに錯化した場合、同様のスペクトル特性および時間特性を有することに注目すべきである［de Haas, R.R., et al. (1999) J Histochem Cytochem 47:183-196］。
【００１２】
有機集光性アンテナがエネルギー移動を介して放出性ランタニド（III）イオンを励起させるために使用されるようなランタニド（III）キレートの励起機構は、蛍光レポーターの中でも例外的なものである［Hemmilae, I. and Laitala, V. (2005) J Fluoresc 15: 529-542］。発光ランタニド（III）キレートは、反応性官能基、集光性アンテナおよびキレート基（groups）を含み、キレート基がランタニド（III）イオンを配位結合によりキレートする。有機集光性発光団は、最初に、光吸収により基底一重項状態（Ｓ0）から第一一重項状態（Ｓ1）に励起され、そして発光団は項間交差（ＩＳＣ）により三重項状態（Ｔ1）への遷移を受ける。アンテナ発光団の三重項状態は、励起エネルギーをランタニド（III）イオンの適切な４ｆエネルギーレベルに移動できる。その後、ランタニドイオンは、明確な発光バンドと禁制遷移の故に長い発光寿命とを有する特有のｆ−ｆ遷移発光を生み出す。
【００１３】
効率的な集光性アンテナを含有する安定なランタニドキレート構造の開発は、本来難しいものであった。この問題は、ヘテロジニアスアッセイにおいては、生体分子結合剤をイオンキャリアキレートで標識し、そのキャリアキレートからイオンを解離し、新しい強い蛍光を発するランタニド錯体を形成するために別のキレート化溶液（低ｐＨ）を用いることにより回避された。標識化に使用されたイオンキャリアキレートは、ランタニドイオンおよびキャリアキレート基に加えて共有結合（coupling）のための反応性官能基を含有する。
【００１４】
金属のキレート錯体（配位化合物）は、配位子（すなわち、キレート化分子）の金属イオンへの配位官能基を介した結合により形成される。配位子の中心金属への接合点（points of attachment）の総数が配位数と呼ばれる。配位子は、接合点により特徴付けることができ、単座、二座などとして挙げられ、歯（くぼみ）の概念が、キレートにおける金属中心に結合された原子の数を反映している。キレート（またはキレート錯体）は、少なくとも１つの単一の配位子であって少なくとも２つの歯（二座と呼ばれる）を有する配位子、およびその配位子によって結合される少なくとも１つの金属イオンを含む化合物である。溶液中のキレート錯体の安定性は、金属（カチオン）の配位子（中性またはアニオン性）への会合（association）に対する安定度（または生成）定数の大きさにより説明される。安定度（または生成）定数が大きくなるほど、配位子の存在下で錯体化される金属の占める割合が高くなる。多重配位子の結合に関しては、段階的な安定度定数を定義することができ、安定度定数は、その結果段階的な安定度定数の積となる。安定度定数は数１０変動するので、値は通常対数（log 10）として表される。多座配位子は単座配位子より強い金属イオン錯体を形成する。典型的には、安定度定数は配位子の配位座の数と共に増加するが、加えて配位子の構造も重要である。結合する配位子の立体配座の自由度を減じる輪状または環状構造もまた、しばしば高い安定度定数を結果として生じる。ユーロピウム（III）錯体に対する安定度定数の決定は、たとえばWu, SL and Horrocks, WD(1997) Journal of the Chemical Society-Dalton Transactions 1497-1502などに記載されている。典型的には、周期表の隣のランタニド（たとえば、Ｅｕ（III）とＧｄ（III））は、同じ配位子で非常に似通った安定度定数を有する。
【００１５】
安定度（または生成）定数は、配位子が完全に脱プロトン化され、プロトンが金属イオンへの結合と有意には競争しないアルカリ条件でのランタニドキレートの最大安定度を表す。ｐＨおよび配位子のプロトン化を考慮する、条件安定度定数（有効生成定数としても知られる）は、生理的ｐＨや典型的なバイオアッセイにおける（prevailing）条件などでの錯体の実際の安定性を説明するためにより適切である。用語「ユーロピウム（III）錯体に対する条件安定度定数の決定」の説明は、Siaugue, J.M. et al. (2003) J Photochem Photobiol A: Chem 156:23-29により記載されている。
【００１６】
安定度定数および生理的ｐＨでの条件付安定度定数の両方の例、ならびに動力学的安定性データは、Thomsen, H.S.およびWebb, J.A.W, Springer, Berlinによる第２改訂版2009のMedical Radiology, pp.155-160のMorcos, S.K. (2007) “Chelates and stability”に記載されている。安定度定数の多数のコレクションは、アカデミック ソフトウェア（Academic Software）、ヨーク、英国から市販されているＩＵＰＡＣ安定度定数データベースに蓄積されている。
【００１７】
イオンキャリアキレートおよび別のキレート化溶液に基づく技術は、分解増強ランタニド蛍光免疫測定（dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay）アッセイとしても知られていた［米国特許第４，５６５，７９０号；Hemmilae, I et al. (1984) Anal Biochem 137: 335-343; Soini, E and Loevgren, T (1987) CRC Crit Rev Anal Chem 18: 105-154; and Siitari, H et al. (1983) Nature 301: 258-260］。その技術は、ヘテロジニアス生体分子結合アッセイにおいて広く適用されており、後に、より低いｐＨでランタニド錯体を形成することができるアンテナ配位子を利用することにより分解の速度を上げるために改良されている［国際公開第２００３／０７６９３９号、米国特許第７，２１１，４４０号、米国特許７，３８１，５６７号および欧州特許出願１ ４８３ ５８２号］。増強に基づくアッセイは、通常やや強いアミノポリカルボキシレートに基づくランタニド（III）イオンキャリアキレート（ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡの誘導体など、米国特許第４，８２２，５９４号および米国特許第６，１９０，９２３号に説明されている）を標識試薬として利用し、増強溶液中のβ−ジケトンに基づくアンテナ配位子を利用し発光を生み出す。また、イオンキャリアキレートおよびＤＯＴＡおよびＴＥＴＡに基づく標識試薬も、示されている［Hemmilae, I. (1995) J. Alloys Comp 225: 480-485］。標識のための配位子を誘導体化するために、たとえばＤＯＴＡの１つのカルボン酸を生体分子に結合（attachment）するための官能基で置換することができる。しかしながら、分解増強のために使用されるランタニド（III）イオンキャリアキレートの安定性は中程度であり、分解速度は特に低ｐＨでかなり速くなければならず、そうでなければイオンは蛍光増強のために充分なほど速くは放出されない。一方、ガドリニウム（III）イオンのための非常に安定なキャリアキレートの開発は、磁気共鳴映像のための造影剤の開発に集中している［Bruecher, E. (2002) Topics in Current Chemistry 221: 103-122; Thomsen, H.S.およびWebb, J.A.W, Springer, Berlinによる第２改訂版2009のMedical Radiology, pp.155-160のMorcos, S.K. (2007) “Chelates and stability”;およびWoods, M. et al. (2006) Journal of Supramolecular Chemistry, Vol. 2. 1-15］。
【００１８】
数個の本来蛍光であるランタニドキレートが開発されている［Alpha, B et al. (1987) Angew Chem Int Ed Engl 26: 1266-1267; H. Takalo et al. Bioconjugate Chem. 1994, 5, 278; Takalo, H et al. (1997) Helv Chim Acta 80: 372-387; von Lode, P et al. (2003) Anal Chem 75: 3193-3201; Beeby, A. (2000) J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1281-1283; Hakala, H. et al. (2002) Inorg Chem Comm 5: 1059-1062; Li, M. and Selvin, P.R. (1995) JACS 117: 8132-8138；および国際公開第２００５／０２１５３８号］。これらの安定で発光性のランタニド錯体は、いくつかのランタニド［ユーロピウム（III）、テルビウム（III）、サマリウム（III）およびジスプロシウム（III）］に関するクリプタートおよび強い発光性のキレート（主にアミノポリカルボン酸に基づくキレート構造）の両方を含む。キレート配位子は、ランタニド（III）イオンと集光性部分のやや強いまたは強い結合を１つの同じ分子に兼ね備えるように設計され、そしてそれらはＦＲＥＴに基づくアッセイにおけるドナーとして使用することができる。ほとんどのキレートでは、集光性（エネルギー吸収）かつ仲介部は、誘導化ピリジンまたはピリジン多様体（manifold）から成っている。いくつかのアンテナ構造は、ピラゾールなどの他のヘテロ原子共役環構造を含む。ランタニドイオン、集光性有機部分およびキャリア配位子に加えて、標識化のために使用される本来発光性であるランタニド錯体は共有コンジュゲーションのための反応性官能基を含有する。
【００１９】
ランタニド発光収量は、同時発光に基づく増強により増強することができ、この同時発光に基づく増強は、追加的アンテナ配位子および非発光性ランタニドイオン［たとえば、イットリウム（III）またはガドリニウム（III）］を利用し、励起光を吸収し、三重項−三重項移動を介したエネルギーを、同じ自己組織化高分子ランタニド錯体にまたは同じミセル環境に存在する発光性ランタニドイオン［たとえば、ユーロピウム（III）］に配位したアンテナ配位子へ移動させる。分子間エネルギー移動は、発光ランタニドに対する有効な集光性アンテナの数を大いに増強し、ある発光ランタニドイオンの発光強度を１００倍またはさらにそれ以上に増強する結果となる［Xu, YY et al. (1991) Analyst 116: 1155-1158; Latva, M et al. (1995) J Chem Soc Perkin Trans 2 995-999］。
【００２０】
ランタニドに基づくＲＥＴ
異なる光輝性ランタニドに基づくレポーターを利用する２つの新しい共鳴エネルギー移動に基づく方法［Mathis, G (1993) Clin Chem 39: 1953-1959; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45: 855-861］が、従来のＦＲＥＴに基づくホモジニアスアッセイに関連した主要な問題を大幅に解決するために導入された。これらの方法は両方、従来の方法と比べて顕著な利点を提供するが、シグナル発生における特異性は、特に標識プローブが高濃度に存在する場合、放射性エネルギー移動（ドナー発光の吸収）によりなお制限される（たとえば、高ダイナミックレンジに達するか、または弱い相互作用の場合、結合を促進する）［H. Bazin, M. et al. (2001) Spectrochim. Acta, Part A, 57］。過剰な非結合アクセプターは、アクセプター特異的波長で放射性バックグラウンドシグナルのゆっくりとした減衰を生じるが、測定波長でのドナークロストークも、充分なスペクトル分解能が用いられない限り、バックグラウンドシグナルを増加できる。ランタニドキレートドナーと重複しないアクセプター（非重複ＦＲＥＴ）の利用は[Hemmilae, I. and Laitala, V. (2005) Anal. Chem. 77:1483-1487; Laitala, V. and Hemmilae I. (2005) Analytica Chimica Acta 551: 73-78]、ドナー発光の再吸収を通じて可能性のあるバックグラウンドをさらに排除することができる。
【００２１】
従来の短寿命蛍光アクセプターとの組合せでドナーとして長寿命蛍光ランタニドキレート（またはクリプタート）を使用した場合［Mathis, G (1993) Clin Chem 39: 1953-1959; Blomberg, K et al. (1999) Clin Chem 45: 855-861］、エネルギー移動励起アクセプター発光は、アクセプターの短寿命、直接励起蛍光およびバックグラウンド蛍光から時間的に分解することができる（時間分解蛍光測定法で）。ドナー発光のアクセプター発光波長へのクロストークも、ドナー発光の狭い「線様の」発光バンドのおかげでほぼ完全に回避される。同じ利点は、ドナーとしてアップコンバーティング（抗−ストーク光輝性）ランタニドドープ化合物［Heer, S et al. (2004) Adv Mater 16: 2102-2105; Kuningas, K et al. (2005) Anal Chem 77: 7348-7355］を、従来の蛍光アクセプターと組み合わせて使用し、ドナーの赤外線励起のもと、特に可視光波長でのエネルギー移動励起アクセプター発光を測定することにより得られる。赤外線照明は、従来の蛍光アクセプターを直接は励起せず、可視波長で自己蛍光はなにも生じず、狭いバンドのドナー発光が効率的に潜在的なクロストークを排除する。
【００２２】
アップコンバーティングランタニドドープナノ結晶の抗−ストーク発光は、赤外線励起よりより短い波長（可視波長）で生じ、大きな抗−ストークシフト（３００ｎｍ以上まで）および自己蛍光と散乱励起光（時間分解なしで）の可視波長での発光からの効率的なスペクトル分離を提供する［Soukka, T. et al. (2005) J Fluorescence 15: 513-528］。アップコンバージョンは、２光子同時吸収と比較して効率的に非常に増強された２つの赤外光子の連続的な同時ではない吸収を介して赤外線を可視光に変換できる特定のランタニドに基づく材料（いくつかの遷移金属を除いて）の固有の性質である。そのアップコンバージョンの機構は、１つの種類のランタニドイオンまたは２つの異なる近接したランタニドイオンのいずれかに基づいている。ランタニドドープイオンは、長寿命励起状態（発光状態に再度励起される基底状態から励起された準安定状態として作用する）、または別のランタニドイオンへの遷移エネルギーを有する。ランタニドに基づくアップコンバージョンは、観察されるフォトルミネッセンスバックグラウンドが、検出器の暗電流および感度によってのみ制限されるルミネッセンス計測において達成されるものと同程度なので、極端な検出能を提供することができる。
【００２３】
アップコンバーティングキレートは、米国特許第５，８９１，６５６号、Xiao, X. et al. (2002) Opt Lett. 30: 1674-1676；およびFaris GW and Hryndza M, Proc SPIE- Int Soc Opt Eng 2002; 4626: 449-452に説明されている。アップコンバーティングランタニドキレートにおいて、単一の希土類イオン［たとえば、Ｅｒ（III）、Ｔｍ（III）またはＨｏ（III）］または異なるランタニドイオンの組合せが、単核または多核錯化配位子または多数配位子（multiple ligands）にキレートされる［国際公開第２００４／０８６０４９号およびSoukka, T. et al. (2008) Annals of the New York Academy of Sciences 1130: 188-200］。配位子は、集光構造を含有しても含有しなくてもよい。個々のイオンと集光構造をもたないキレートされた配位子の光回収効率は乏しく、相対的に高い励起光強度を必要とする。したがって、アップコンバーティング希土類キレートは、集光性有機または無機構造を有する配位子を含むように考案することができ、たとえばＹｂ（III）などの別のイオンを組み込むことができる。２つ以上の光子の集めたエネルギーは、分子内非放射性プロセスにより有機構造の一重項から三重項状態へ、つぎに三重項状態から希土類イオンの放出レベルに連続的に次々に移され、特徴的な発光である単一光子を放出する。
【００２４】
ホモジニアスな蛍光に基づく核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、典型的には、消光プローブ（切断可能なオリゴヌクレオチドプローブ中のドナーおよび消光剤）［米国特許第５，５３８，８４８号］または２つのエネルギー移動プローブ（隣接した位置で隣同士にハイブリダイズする別々のドナーおよびアクセプター標識プローブ）のいずれかに基づく。図１は、エネルギー移動プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイを説明するものであり、ドナーおよびアクセプター蛍光団（それぞれ４および５）で標識された２つのオリゴヌクレオチドプローブ（１および２）は、相補的な標的配列（３）上の隣接した位置にハイブリダイズする（６）。アクセプターは、１つの波長（λ1）で励起され、ハイブリダイゼーション（７）に依存する（エネルギー移動励起）増感アクセプター発光（８）が、別の波長（λ2）で検出される。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、極めて多彩な技術であり、特にエネルギー移動プローブに基づくアッセイは、エネルギー移動効率により（相対的に低いシグナル）およびドナー発光の再吸収によるバックグラウンド（制限されたダイナミックレンジ）により限定される。さらに、消光プローブに基づくアッセイは、２つの異なる色素による特異的な標識を必要とし、単一のハイブリダイゼーション事象のみの特異性に依存する。
【００２５】
核酸増幅リアルタイムモニタリングにための種々の方法が、Koch, W.H (2004) NatureReviews Drug Discovery 3: 749-761に示されている。たとえば、プライマーに結合された１つの色素および隣接してハイブリダイズするプローブに結合されたもう１つの色素を用いるＦＲＥＴ対は、Lay, M. J. et al. (1997) Clinical Chemistry 43: 2262-2267に示され；２つの異なる標識された隣接してハイブリダイズするプローブを用いるＦＲＥＴ対は、Bernard, P.S., et al. (1998) American Journal of Pathology 153: 1055-1061に示され；そして相補的プローブで標識されたＦＲＥＴ対の競争ハイブリダイゼーションは、Kiviniemi, et al. (2005) Clinical Biochemistry 38: 1015-1022に示されている。
【００２６】
蛍光消光に基づくアッセイにおけるランタニド標識技術の可能性は、説明されてきている［Karvinen J et al. (2002) J Biomol Screen 7:223-231; Karvinen, J et al. (2004) Anal Chem. 76:1429-36; Karvinen, J et al. (2004) Anal Biochem. 325:317-25］。
【００２７】
蛍光ランタニド錯体のハイブリダイゼーションに依存した形成について２つのアプローチが示されている。１つ目のアプローチは、ハイブリダイゼーションに際して蛍光テルビウム（III）錯体を形成する１対のオリゴヌクレオチドに基づくものであり、一方のオリゴヌクレオチドがＤＴＰＡ−テルビウム（III）（非蛍光テルビウムキレート）で標識され、他方がエネルギードナーサリチル酸塩（集光性配位子）で標識されている［Oser A and Valet G (1990) Angew Chem Int Ed Engl 29: 1167-1169］。２つ目のアプローチは、蛍光ユーロピウム（III）錯体の同様な形成に基づくものであるが、ただ１つのプローブのハイブリダイゼーションが必要とされるものであり、オリゴヌクレオチドプローブが、ＥＤＴＡ−テルビウム（III）（非蛍光ユーロピウムキレート）で標識され、エネルギー−ドナー化合物が二本鎖ＤＮＡに結合することができる挿入剤にカップリングしている［Coates et al. (1994) J. Chem. Soc., Chem. Commun. 2311-2312; Mullins ST et al. (1996) J Chem Soc, Perkin Trans 1 1991:85-81; Coates J et al. J Chem Soc, Chem Commun 1995: 2311-2312;および国際公開第９５／０８６４２号］。１つ目のアプローチは、その後も使用されている［Wang et al. (2001) Analytical Biochemistry 299, 169-172; Yuan and Wang (2005) Journal of Fluorescence Vol. 15, No. 4, July, 559-568; Kitamura Y. et al. (2008) Journal of Inorganic Biochemistry Vol 102, No. 10, 1921-1931;およびKitamura, Y. et al. (2006) Nucleic Acids Symposium Series, No. 50, 105-106］。
【００２８】
ランタニド錯体に基づくセンサープローブは、金属イオンの検出に関して説明されている［たとえば、Leonard, J. P. and Gunnlaugsson, T. (2005) Journal of Fluorescence, 15:585-595およびViquier and Hulme (2006) Biology, J. Am. Chem. Soc. 128: 11370-11371］。金属陽イオンに対して、これらのセンサーは競争的に、そしてアンテナ効果を利用して働き、ランタニドイオンへのそのアンテナ配位子の結合は溶液中に存在する他の金属イオンにより阻止される。
【００２９】
定量的５’−ヌクレアーゼに基づくポリメラーゼ連鎖反応アッセイ（ＴａｑＭａｎ；アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、フォスターシティー、ＣＡ）は、蛍光部分と消光部分とを両方含有する一本鎖自己消光オリゴヌクレオチドプローブが、核酸増幅のあいだのハイブリダイゼーションに際して核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ作用により切断される核酸配列検出法である［Lie YS, Petropoulos CJ. (1998) Curr Opin Biotechnol. 9:43-48;およびOrlando C et al. (1998) Clin Chem Lab Med. 36:255-269］。
【００３０】
分子指標は、ステム・アンド・ループ構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである［Tan W et al. (2004) Curr Opin Chem Biol.; 8:547-553;およびTan W et al. (2000) Chemistry; 6: 1107-1111］。ループは、標的配列に相補的である核酸プローブ配列を含み、ステムは、プローブ配列の両側に位置する相補的アーム配列のアニーリングにより形成される。蛍光部分は、一方のアームの端に共有結合され、消光剤はもう一方のアームの端に共有結合される。蛍光部分と消光部分が近位であるため、分子指標は、それらが溶液中に遊離している場合、蛍光を発しない。しかしながら、それらが標的配列を含有する相補的核酸鎖にハイブリダイズした場合、それらは、蛍光部分と消光部分との間の距離が増加する立体配座の変化を受け、プローブが蛍光を発することができるようなる。相補的標的配列が存在しない場合は、指標プローブは閉じたままであり、分子内消光により蛍光は発しない。
【００３１】
自己消光蛍光プローブおよび分子指標は両方とも、サーマルサイクラーにおける核酸増幅プロセスをモニターするためにも使用される。たとえば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応において、任意の所定のサイクル、またはサイクルの後での蛍光の量は、特定の産物の量に依存する。プローブは、増幅の各サイクルを受けて増幅した標的に結合し、ハイブリダイゼーションの際（Taqmanプローブの場合は切断の際）に得られるシグナルは、増幅されたオリゴヌクレオチド配列の量に比例する。蛍光は、分子指標がその相補的標的に結合される場合は各アニーリング工程のあいだに、またTaqmanプローブが切断される場合は伸長工程の後に測定される。その後、情報は定量的ＰＣＲまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）実験のあいだに、限界サイクル数（threshold cycle number）にもとづき増幅された標的核酸配列の初期コピー数を定量するために使用される。終点分析のために、分子指標を含むＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応は、任意の９６ウェル  サーマル・サイクラー上で行なうことができ、その後蛍光リーダーで読み取られる。
【００３２】
タンパク質の高感度かつ特異的近接プローブに基づく分析および医学診断における可能性は、Gustafsdottir, S.M. (2005) Anal Biochem 345: 2-9により、２つのオリゴヌクレオチドプローブの近位ライゲーションを利用することが説明されている。
【発明の概要】
【００３３】
本発明の１つの目的は、検体を検出および／または定量するためのバイオアッセイ法を提供することである。
【００３４】
本発明は、ランタニドイオンキャリアキレートおよび第１認識エレメントを含み、該ランタニドイオンキャリアキレートがランタニドイオンキャリア配位子とランタニドイオンを含む第１のグループ；アンテナ配位子および第２認識エレメントを含む第２のグループを用いる、検体を検出および／または定量するためのバイオアッセイ法であって、
該方法においては、
ａ）該ランタニドイオンキャリア配位子は、該バイオアッセイ法の条件において該ランタニドに充分強く結合し、結果として、該バイオアッセイ法の条件において、遊離のランタニドイオンが本質的には存在しない、すなわち１ｎｍｏｌ／Ｌより少ない、好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌより少ない遊離のランタニドイオンが存在する、または
ｂ）該ランタニドイオンキャリア配位子は、該バイオアッセイ法の条件において該ランタニドに強く結合し、結果として、遊離のランタニドが本質的には存在しない、すなわち１ｎｍｏｌ／Ｌより少ない、好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌより少ない遊離のランタニドが存在し、かつ該ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が少なくとも１ｐｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに用いられる、そして
該アンテナ配位子は、該ランタニドイオンに弱く結合する、すなわち該アンテナ配位子は単座、二座、三座または四座のいずれかである；ならびに
該第１のグループの第１認識エレメントおよび該第２のグループの第２認識エレメントによる該検体の認識が、
ｉ）キレート相補性、すなわち該ランタニドを担持する該ランタニドイオンキャリアキレートと該アンテナ配位子との相補性による混合ランタニドキレート錯体の形成、およびそれによる蛍光の増加；または
ii）キレート脱相補性、すなわち該ランタニドを担持する該ランタニドイオンキャリアキレートが該アンテナ配位子から分離され、それによる蛍光の減少
のいずれかを生じる
バイオアッセイ法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】エネルギー移動プローブ対に基づくハイブリダイゼーションアッセイおよび、ハイブリダイゼーション後のドナーおよびアクセプター間のエネルギー移動の測定を説明する。プローブ対は互いに隣接する標的配列にハイブリダイズする。
【図２】標識部分が蛍光錯体を形成することを可能にする、標的配列において互いに隣接してハイブリダイズする２つの別々のプローブを用いる（近接プローブアプローチ）オリゴヌクレオチド依存性（oligonucleotide-directed）ランタニドキレート相補性アッセイを説明する。
【図３】標識部分が蛍光錯体を形成することを可能にする、標的配列において互いに隣接してハイブリダイズする末端を有する二重標識プローブ（南京錠型プローブ）を用いるオリゴヌクレオチド指向ランタニドキレート相補性アッセイを説明する。
【図４】標識部分が蛍光錯体を形成することを可能にする、互いにハイブリダイズする相補配列を有する末端を有する二重標識プローブ（分子指標型プローブ）を用いるオリゴヌクレオチド指向ランタニドキレート相補性アッセイを説明する。中央の配列は、標的配列にハイブリダイズし、結果として蛍光錯体を分析するプローブのコンフォメーションの変化を生じさせ、そして蛍光の減少という結果をもたらす。
【図５ｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能な集光性アンテナ配位子の概略化学構造の例を示す。略号ＬおよびＺは、化学構造の代替部分を表すために使用される。
【図５ｉｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能な集光性アンテナ配位子の概略化学構造の例を示す。略号ＬおよびＺは、化学構造の代替部分を表すために使用される。
【図５ｉｉｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能な集光性アンテナ配位子の概略化学構造の例を示す。略号ＬおよびＺは、化学構造の代替部分を表すために使用される。
【図５ｉｖ】ランタニドキレート相補性に適用可能な集光性アンテナ配位子の概略化学構造の例を示す。略号ＬおよびＺは、化学構造の代替部分を表すために使用される。
【図６】図５ｉ-図５ivに示される集光性アンテナの代替部分Ｌ（ａ−ｈ）およびＺ（ｊ−ｌ）に対する概略構造の例を示す。
【図７ｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能なランタニド（III）キャリアキレートの概略化学構造の例を示す。
【図７ｉｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能なランタニド（III）キャリアキレートの概略化学構造の例を示す。
【図７ｉｉｉ】ランタニドキレート相補性に適用可能なランタニド（III）キャリアキレートの概略化学構造の例を示す。
【図８ａ】参考例１、２、３、４および５において使用されたユーロピウム（III）キャリアキレートＮ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）（Ｅｕ3+−Ｎ１；イオンキャリアキレート）の概略構造を示す。
【図８ｂ】参考例１、２、３、４および５において使用された集光性アンテナ配位子４−（（イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−二カルボン酸（３ｄ−アンテナ）の概略構造を示す。
【図８ｃ】参考例２において用いられた本来蛍光であるユーロピウム（III）キレート｛２，２’，２’’，２’’’−｛［４−［（４−イソチオシアネートフェニル）エチニル］ピリジン−２，６−ジイル］−ビス（メチレンニトリロ）｝テトラキス（アセテート）｝ユーロピウム（III）（Ｅｕ3+−７ｄ；蛍光ランタニドキレート）の概略構造を示す。
【図８ｄ】実施例８において用いられたユーロピウム（III）キャリアキレート、２，２’，２’’−（１０−（３−イソチオシアネートベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）−三酢酸のユーロピウム（III）キレートの概略構造を示す。
【図９】参考例１に記載されたホモジニアスハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す。標的オリゴヌクレオチドの濃度の増加に伴う、標識されたプローブ対（１０ｎＭ：四角；５０ｎＭ：円）のハイブリダイゼーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓは、カウントを意味する。エラーバーは、平均の標準偏差を示す。
【図１０ａ】プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナと０ｎＭ（破線）および１０ｎＭ（太い実線）の標的オリゴヌクレオチドとから形成されるオリゴヌクレオチド指向錯体の蛍光発光スペクトルを説明する。プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナと１０ｎＭの標的オリゴヌクレオチドから形成される錯体の近似発光減衰スペクトルが挿入図に示されている。Ａ．ｕ．は、任意単位を意味する。
【図１０ｂ】参考例２において得られたプローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄの蛍光発光スペクトルを説明する。プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄの減衰スペクトルが挿入図に示されている。Ａ．ｕ．は、任意単位を意味する。
【図１１ａ】参考例４に記載されたヘテロジニアス近接プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイの結果を表す。ビオチン化された標的オリゴヌクレオチドの濃度増加に伴うプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−アンテナのインキュベーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓはカウントを意味する。
【図１１ｂ】参考例４に記載されたヘテロジニアス近接プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイの結果を表す。ビオチン化された標的オリゴヌクレオチドの濃度増加に伴うプローブＡ−Ｅｕ3+−７ｄのインキュベーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓはカウントを意味する。
【図１２ａ】参考例５におけるストレプトアビジンに対する近接プローブに基づくアッセイにおいて用いられたビオチンコンジュゲートを説明する。（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミン−３ｄ−アンテナ。
【図１２ｂ】参考例５におけるアビジンに対する近接プローブに基づくアッセイにおいて用いられたビオチンコンジュゲートを説明する。（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン−Ｅｕ3+−Ｎ１。
【図１３ａ】参考例５に記載されたストレプトアビジンアッセイの結果を示す。ストレプトアビジンの濃度増加を伴う（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミン−アンテナのインキュベーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓはカウントを意味する。
【図１３ｂ】参考例５に記載されたアビジンアッセイの結果を示す。アビジンの濃度増加を伴う（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン−Ｅｕ3+−Ｎ１のインキュベーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓはカウントを意味する。
【図１４ａ】参考例６および参考例７に用いられたテルビウム（III）キャリアキレートＮ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）テルビウム（III）（Ｔｂ3+−Ｎ１；キャリアキレート）の概略構造を示す。
【図１４ｂ】参考例６および参考例７に用いられたｂ）集光性アンテナ配位子４−（３−（４−イソチオシアネートフェネチル）−２，４，６−トリメトキシフェニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸（ＴＭＰ−アンテナ）の概略構造を示す。
【図１５】参考例６に記載されたホモジニアスハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す。標的オリゴヌクレオチドの濃度増加を伴う標識プローブ対（１０ｎＭ：四角；５０ｎＭ：円）のハイブリダイゼーション後の時間分解蛍光。Ｃｔｓはカウントを意味する。
【図１６】参考例７にて得られたプローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナと０ｎＭ（破線）および１０ｎＭ（太い実線）の標的オリゴヌクレオチドとから形成されるオリゴヌクレオチド指向錯体の蛍光発光スペクトルを示す。プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナと１０ｎＭの標的オリゴヌクレオチドから形成される錯体の近似発光減衰スペクトルが挿入図に示されている。
【図１７】実施例８に記載されたオリゴヌクレオチド指向キレート相補アッセイ（ＯＣＣＡ）の結果を示す。１０００００（◇）、１００００（＋）、１０００（△）、１００（□）および０（×）鋳型分子の増幅と検出。グラフは、１０サイクル目から開始して隔ＰＣＲサイクルに測定された蛍光シグナルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
近代の生物学的分析アッセイにおいて、検体の測定は生体分子認識および検出可能なレポーター部分；たとえば迅速な読み出しを可能とする蛍光標識などの使用に基づく。レポーターおよび検出技術の進歩の結果、レポーター自体は、もはや感度を制限するものではないが、しかし、標識された試薬の非特異的相互作用によりシグナルが生じた。これらの相互作用は、制御しにくい因子に依存ており、現実的には完全に回避することは不可能である。
【００３７】
「単コピー」検体検出が、シグナル生成における特異性の改善を可能とする最近の画期的な技術により証明された。シグナルの生成が２つのオリゴヌクレオチドプローブのライゲーションに依存する、近位ライゲーションアッセイなどのこれらの方法は、実用化にはまだ複雑過ぎる。２つの認識事象により誘導される全体的に暗い状態から明るい状態へのレポーターシグナルを正確にモジュレーションするという絶対的な要求は、なお単純レポーター技術により解決されていない課題である。分子接触に基づく完全な状態切り換え機構のみが、シグナル生成の充分な特異性を可能とするものであり、最良のフェルスター共鳴エネルギー移動に基づく近位検出法でさえ、この条件を満たしていない。
【００３８】
本発明者らは、ランタニド類が、ランタニドイオンキャリアと集光性アンテナ配位子とを異なるレポーター部分に分離することにより並外れたモジュレーションを伴うレポーター技術を現実のものとするための独自のアプローチを提供することを見出した。本発明者らは、先行技術における課題であった、レポーターの暗状態が蛍光を生成しない、切り換え可能な近接プローブに基づくレポーターシステムを構築するやり方を解き明かしている。提案されたアプローチは、ＦＲＥＴの限界を上回り、高い特異的活性の真の蛍光に基づく近位依存レポーター技術を可能とする。シグナル生成は、他の分子認識事象に誘導されるキレートの自己組織化および相補性（２つのレポーター部分のあいだの分子接触）に厳密に依存する。相補的であるランタニドに基づくレポーターシステムは、したがって、２つのレポーター部分、非発光イオンキャリアキレートおよび別のアンテナ配位子、ならびにそれらの部分を一緒に誘導する２つの同時認識事象を経た完全な長寿命発光キレート（正しい方向での分子接触）の自己組織化を利用することにより構築することができる。この長寿命ランタニド蛍光に基づくアプローチは、最先端以上の有意な利益をもたらし、さらにランタニドに基づくアップコンバージョンおよび抗ストークフォトルミネッセンスにまで拡大することができる。
【００３９】
本発明の１つの実施態様によれば、２つの別々の認識エレメントによる検体の認識が、ランタニドイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子を近接近させ、キレート相補、すなわち混合ランタニド錯体の形成を許し、結果として水溶液中のランタニド発光の強度を増加させる。
【００４０】
本発明の特徴は、暗状態（非発光状態）から明状態（発光状態）への（または逆も）ランタニド発光の完全な切換えを可能とするということであり、観察されるバックグラウンド蛍光のためにランタニド発光のモジュレーションが非常に制限される従来技術の方法とは対照的に、暗状態には有意な蛍光バックグラウンドは存在しない。
【００４１】
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションにより方向付けられるランタニドキレート相補性の原理は、図２に説明される。１つのオリゴヌクレオチオドプローブ（１）はランタニドイオンキャリアキレート（４）により標識され、もう１つのプローブ（２）は集光性アンテナ配位子（５）により標識される。その２つの標識プローブに隣接した相補的な配列を有する標的ヌクレオチド配列（３）が添加されると（６）、二本鎖核酸ハイブリッド（７）が混合キレートの自己組織化と強い蛍光錯体（８）の形成とを方向付けして形成される。プローブ配列（リンカーに対するコンジュゲーション部位を含む）およびリンカー（長さと組成、配向および剛直性を含む）は、レポーターの２つの部分、すなわちイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子が混合キレートの自己組織化を可能とする正しい方向で近接に提供されるように選択される。錯体が形成されると、蛍光がある波長（λ1）で励起され、発光が別の波長（λ2）で同時に、または時間分解蛍光分析法においては励起後の短い遅延後に測定される。本発明は、別々のオリゴヌクレオチドに結合されるランタニドキレートと配位子構造の組合せ、および改良されたオリゴヌクレオチド指向ランタニドキレート相補アッセイにおけるそれらの使用を含む。本発明者らは、オリゴヌクレオチド指向ランタニドキレート相補は、探求すべき非常に大きな可能性を提供する。以前に用いられたキレート、配位子および条件は、最高の知識を持って選択されているが、弱い性能しか提供していない（３倍シグナルモジュレーションより少ない）［Oser, A and Valet, G (1990) Angew Chem Int Ed Engl 29: 1167-1169; Wang, GL et al. (2001) Anal Biochem 299: 169-172；および米国特許第６，２４２，２６８号］。全ての以前の例において得られたモジュレーションの程度は、非常にささやかなもの（３倍より少ない）であり、つまりは、有意にそして容易に観察されるバックグラウンド蛍光により、ランタニド蛍光の切換えはレポーター系の暗状態から不完全であり、そしてその改良はここ数年のあいだ発表されていない。本発明者らは、今回、この蛍光モジュレーションが、集光性アンテナ配位子、イオンキャリアキレートおよび任意には付加的な錯化剤の適切な組合せの選択により１０００倍以上増強できることを見出した。これは、従来のＦＲＥＴ型ハイブリダイゼーションアッセイで得られる典型的な最高のモジュレーションが２０倍程度であり、これまで混合ランタニドキレート錯体の形成にもとづいて得られているのはたった３倍なので、非常に大きな改良である。ランタニドキレート相補アッセイにおいては、シグナル生成のためのキレート相補に極めて厳しい要件が利用されることにより高い程度のモジュレーションが達成される。その改良により、遊離のランタニドイオンは、複数のアンテナ配位子との蛍光錯体を形成するために利用可能な溶液中には本質的に存在しないことになる。本発明者らは、これらの改良が、高度なモジュレーションでのキレート相補アッセイを高い温度で、たとえばポリメラーゼ連鎖反応において用いられる条件で使用することができるようにするためにも必須であるということを見出した。
【００４２】
ランタニド励起の複雑な機構は、新規な相補ランタニドに基づくレポーターシステム：非蛍光ランタニド（III）キレート（イオンキャリアキレート）がキレート錯体を付加的な集光性アンテナ配位子と相補させることにより強い蛍光型に切り替えられる本発明のたたき台と見なすことができる。近接プローブ原理に基づくアッセイに対して、キャリアキレート（イオンを含む）およびアンテナ配位子は、溶液中において通常生物学的分析アッセイに使用される（マイクロモル以下）濃度で相互作用せず、したがって励起の際に蛍光は観察されない（レポーターは暗状態）２つの異なる生体分子結合プローブ（たとえば、オリゴヌクレオチド）に結合される。しかしながら、２つのプローブが、標的分子（たとえば、相補的核酸配列）の同時認識の結果として近接した位置にある場合、アンテナ配位子は、キャリアキレートにおけるランタニドイオンに配位され（混合キレートを形成する）、ランタニドイオンは、励起に際し強い蛍光を生み出す（レポーターは蛍光状態に切り替えられる）。キャリアキレートのアンテナ配位子との相補性には、アンテナ配位子と中心ランタニドイオンとの間に正しい方向での分子接触が必要とされる。このプロセスは、高い局地的有効濃度が、弱い配位相互作用であってもキャリアキレートおよびアンテナ配位子が共に近接して固定される場合に結合を支持するように、正確には自己組織化である。
【００４３】
本発明によれば、イオンキャリア配位子は、ランタニドイオンを強く結合するように、すなわち高い安定度定数を有する熱力学的にも動力学的にも安定な錯体を形成するように設計されるべきであり、好ましい配位度（配位数）は、ランタニドイオンの全９配位部位の５以上であり、好ましくはそれ以上６または７などであり、したがって、少なくとも１つ、好ましくは２つまたは３つ配位部位がアンテナ配位子の結合のために残される。配位子の安定性は、たとえば、順にＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯ３Ａ、ＤＯＴＡ（最も安定）と増加する。アンテナ配位子の非存在下では、ランタニドイオンの遊離の配位部位は、水分子によって占められ、残りのランタニド蛍光を効率的に消光する。しかしながら、アンテナ配位子は、弱い結合強度のみを有さなければならず、適切な配位度は、２つまたは３つ（二座または３座を意味する）のようであり、適切な構造は、たとえば、アザクラウンベース三重アンテナキレートの構築物に対して、最近の特許出願［国際公開第２００５／０２１５３８号］に記載されている個々の集光性配位子である。有機集光性配位子（三重項エネルギーレベル）の好ましい構造は、ランタニドに依存し、したがって、たとえばテルビウム（III）およびユーロピウム（III）イオンに対しては異なるアンテナ配位子が好ましい。
【００４４】
本発明によれば、シグナルはイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子の近さに厳密に依存し、キレート相補性の高い特異性を達成するために、遊離のランタニドイオンの濃度は、イオンキャリアキレートを適切に選択することにより、またはイオンキャリアキレートを含まない蛍光錯体が形成されるのを防ぐために、錯化剤を添加して遊離のランタニドイオンをキレートすることにより最小に保たれる。好ましくは、錯化剤は、ランタニドイオンに選択的であるように選択される。本発明者らは、集光性アンテナ配位子のイオンキャリアキレートへの結合（および錯化剤によりキレート化されたイオンへの結合も）は、遊離のイオンへの結合よりも困難であり、したがって、シグナルの発生を、厳密に特異的で、生体分子結合により制御されたキレート相補およびイオンキャリアキレートとアンテナ配位子との近さにのみ依存するようにするため、遊離のランタニドイオンの濃度を最小に保つことが必要不可欠である。
【００４５】
イオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子の組み合せは、イオンキャリア配位子が、少なくとも１つ（しかし好ましくは４以下）の非占有配位部位を残してランタニドイオンとの間に安定な（または非常に安定な）錯体を形成する多座配位子であるように選択され、したがって、アンテナ配位子の結合および錯体の形成を可能とし、好ましくは、ランタニドのすべての配位部位がいずれかの配位子により占有される、つまり配位された水分子が置き換えられる。その組み合わせは、アンテナ配位子の完全な結合が、任意にはキャリア配位子の単座または二座の置換であって、しかし好ましくはイオンキャリアキレートからのランタニドイオンの解離という結果にはならない置換を必要とし得るように選択することができる。
【００４６】
イオンキャリアキレートがあまり安定でない場合、ランタニドイオンのいくつかの解離がアッセイの条件において起こり得、本発明によれば、そのような場合、錯化剤が遊離のランタニドイオンを錯化するため溶液中に存在し、遊離のランタニドイオンおよびアンテナ配位子との間の蛍光錯体の形成を防止する。本発明者らは、これにより先行技術に対するアッセイ性能の大きな改善がもたらされるということを発見した。これは、たとえば、単一の遊離ランタニドイオンが３つまたは４つまでのアンテナ配位子に結合でき、ランタニドイオンキャリアキレートとアンテナ配位子とのキレート相補により形成される単一混合キレート錯体よりも有意に強い蛍光を発する錯体を産生する、アンテナ配位子とランタニドイオンとの間の強い蛍光を発する多重配位錯体の形成により説明することができる。本発明者らは、今回キレート相補によるランタニド蛍光の完全な切り替えの提供の仕方を発見し、先行技術の方法に存在するバックグラウンド蛍光というこの問題を本質的に解決する。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様によれば、ランタニドイオンキャリアキレートは、不活性錯体となるように選択され、すなわちランタニドイオンの錯体からの解離がアッセイの条件においてゆっくりであるべきである。水溶液中の他のイオンおよび錯化剤の存在ならびに温度の上昇は、典型的には配位錯体の解離の増加をもたらし、したがって、ある応用、たとえばポリメラーゼ連鎖反応のリアルタイムモニタリングなどに対しては、上昇した温度でさえゆっくりとした解離速度を提供する非常に安定なイオンキャリアキレートを選択することが必要不可欠である。典型的には、ランタニドイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子は、マイクロモル濃度以下で用いられ、さらに安定性、とりわけ錯体のゆっくりとした解離速度の重要性が増加する。１，４，７−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯ３Ａ）の誘導体などのイオン性大環状キレート構造を含むランタニドイオンキャリアキレート［Mishra, A. et al. (2005) Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med. 13: 2592］は、いくつかのバイオアッセイへの適用の間の支配する過激な条件でゆっくりとした解離速度［Morcos, S.K. (2007) The British Journal of Radiology 80: 73-76］を提供するために不活性なランタニドイオンキャリアキレートに対してはイオン性線状開鎖構造よりも好ましい。１つの実施態様によれば、ランタニドイオンキャリアキレートは、アッセイの条件において２時間以上、好ましくは１０時間以上そして最も好ましくは２４時間以上の解離半減期を有する動力学的安定性を提供するために選択され；たとえば、生理的条件下でのある大環状キレートの推定解離半減期は、数年であることができる［Schmitt-Willich, H. (2007) British Journal of Radiology 80: 581-582］。典型的なバイオアッセイ条件は、中性値に近いｐＨ、たとえば６．０〜９．０の間を有し、０．０１Ｍと１Ｍとの間のイオン強度を有する。典型的なバイオアッセイを支配する温度は、２０〜４０℃であるが、ある適用では、１００℃までの温度を要求する。大環状および開鎖ガドリニウム（III）キレートの熱力学的および動力学的安定性は、Prot M. et al. (2008) Biometals 21: 469-490に記載されている。ＤＯ３ＡおよびＤＯＴＡなどの大環状化合物は、ＤＴＰＡなどの開鎖キレートよりも有意にゆっくりとしたイオンの解離を示した。さらに、イオン性キレート（負の正味電荷）は、非イオン性のキレート（中性の正味電荷）よりもよい安定性を有する。
【００４８】
本発明のさらなる実施態様によれば、追加の、弱い結合消光配位子を、イオンキャリアキレートに存在するランタニドイオンから配位された水を置き換え、キレート相補性に関与していないランタニドイオンキャリアキレートの潜在的な残りの蛍光を消すためにバイオアッセイ溶液に添加することができる。消光配位子は、単座、二座または三座であり、迅速に生体分子結合事象によりすぐ近くにもたらされるアンテナ配位子により置き換えられるように選択される。
【００４９】
本発明のまた別の実施態様によれば、２つ以上の異なるアンテナ配位子が、同じランタニドをなお含む１つまたは複数のイオンキャリアキレートと組み合わせて用いられ、付加的なパラメータの測定を可能にするそれらの特徴的な蛍光寿命を生み出す種々の混合キレート対を生じる。
【００５０】
本発明のいくつかの好ましい実施態様によれば、ランタニドイオンキャリア配位子とランタニドイオンとにより形成される錯体とアンテナ配位子とランタニドイオンとにより形成される錯体の条件安定度定数の比は、検体測定の条件下で少なくとも１０4、好ましくは少なくとも１０5、そしてより好ましくは少なくとも１０6であり、すなわちランタニドイオンキャリア配位子とランタニドイオンとにより形成される錯体は有意により安定である。
【００５１】
定義
用語「蛍光」および「発光」は、マイクロ秒またはミリ秒蛍光寿命を有する遅延した蛍光、イオン性フォトルミネッセンス、アップコンバージョンに基づく抗−ストークフォトルミネッセンスおよびりん光などのフォトルミネッセンス、すなわち光により励起される発光、蛍光におよぶとして理解されるものとする。さらに、この用語は、電気発光および電気化学発光も対象とするものとする。
【００５２】
用語「ランタニド」および「ランタニドイオン」は、本明細書において、「希土類金属イオン」に相当し、単一の三価のランタニドイオンおよび、以下：ネオジム、プラセオジム、サマリウム、ユーロピウム、プロメチウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウムおよびイットリウム、特にエルビウム、プラセオジム、ツリウムおよびイッテルビウムからのいくつかの異なるランタニド元素の任意の組合せを含むと理解されるものとする。
【００５３】
本明細書において、用語「発光ランタニド錯体」、「発光ランタニドキレート」および「相補ランタニドキレート」は、ランタニドイオンキャリアキレートおよび相補的な集光性アンテナ配位子により形成される発光錯体を含むと理解されるものとする。そこではランタニドイオンは集光または他の励起可能な配位子構造を通して励起されるか、または非発光ランタニドイオンまたは増感ランタニドイオンである。相補ランタニドキレートは、イオンキャリアキレートおよび集光性アンテナ配位子を含む混合キレートの例である。
【００５４】
用語「ランタニドイオンキャリアキレート」、「イオンキャリアキレート」および「キャリアキレート」は、非発光ランタニドキレート錯体そのものおよびそれらの誘導体であって、キレート配位子、すなわちイオンキャリア配位子、および発光ランタニドイオンまたは活性化ランタニドイオンを含むが、ランタニド発光にとって絶対に必要な効果的な集光または他の励起可能な構造または増感ランタニドイオンを含まないもの、を含むと理解されるものとする。このキレートにおけるランタニドイオンは、１つの単一のランタニドイオンであっても、いくつかの同一のもしくは異なるランタニドイオンの組合せであってもよい。ランタニドイオンキャリアキレートの例は、好ましくは６配位と同じまたはより大きい、最適には７または８配位数を有するＥｕ（III）、Ｓｍ（III）、Ｔｂ（III）およびＤｙ（III）の環状または非環状アミノポリカルボン酸キレートであって、効果的な集光または他の励起可能な構造または増感ランタニドイオンを含まないものに代表される。
【００５５】
用語「増感剤」および「増感ランタニドイオン」は、光吸収に関与するランタニドイオン、およびエネルギーアクセプターとして作用する活性化ランタニドイオンへのエネルギードナーとして作用するランタニドイオンを意味すると理解されるものとする。増感剤の例は、三価のイッテルビウムおよびセリウムである。
【００５６】
用語「活性化剤」および「活性化ランタニドイオン」は、ルミネッセンス発光に関与し、かつエネルギードナーとして作用する増感ランタニドイオンからエネルギーを受け取るエネルギーアクセプターとして作用するイオンを意味すると理解されるものとする。活性化剤の例は、三価のエルビウム、ツリウム、ホルミウム、およびテルビウムである。
【００５７】
イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体（またはアンテナ配位子とランタニドイオンとの錯体；または錯化剤とランタニドイオンとの錯体）の水溶液中での「安定度定数」および「生成定数」は、配位子と金属イオンとのあいだの錯化反応についての平衡定数を意味すると理解されるものとする。この用語の詳細な説明は、定量化学分析（Quantitative Chemical Analysis）、D.C. Hrris, 1991, 3rd Edition, Freeman and Co., New Yorkの２７９〜３０４頁に見ることができる。その値は、ｌｏｇＫとして表され、Ｋは錯体の濃度を遊離配位子（典型的には完全脱プロトン化体）の濃度および遊離金属イオンの濃度の積で割ることにより計算することができ、すべて特定の温度およびイオン強度での平衡状態で有効である（all prevailing）。安定度定数が大きくなるにつれて、金属は配位子とより強く錯化する。これは、大きな安定度定数を有するランタニドイオンキャリアキレートは、小さな安定度定数を有するものよりもより安定であるということを意味する。典型的には、安定度定数は、室温（２０〜２５℃）で０．１Ｍのイオン強度で測定される。ランタニド（III）イオン錯体に関するｌｏｇＫ値の例は、Martell, A.E. and Smith, R.M., Critical stability constants, Vol 1, pp. 204-211, Plenum Press, New York, 1974; and Wu, SL and Horrocks, WD (1997) Journal of the Chemical Society-Dalton Transactions 1497-1502から見ることができる。
【００５８】
イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体（またはアンテナ配位子とランタニドイオンとの錯体）の水溶液中での「条件安定度定数」および「条件生成定数」および「有効生成定数」は、ｐＨ、イオン強度、温度および補助的な錯化種の濃度などの特定の決まった条件のセットの下での錯体の形成に対する平衡定数を意味すると理解されるものとする。この用語の詳細な説明は、定量化学分析（Quantitative Chemical Analysis）、D.C. Hrris, 1991, 3rd Edition, Freeman and Co., New Yorkの２７９〜３０４頁に見ることができる。
【００５９】
用語「相補配位子」、「集光性アンテナ」または「アンテナ配位子」は、ランタニドイオンを持たない集光または他の励起可能な配位子構造、または非発光ランタニドイオンもしくは増感ランタニドイオンのキレート錯体を含み、かつ光輝ランタニド錯体を形成するためにランタニドイオンキャリアキレートを相補することができる、それ自体非発光性のキレート配位子およびランタニドキレートおよびそれらの誘導体などを含むと理解されるものとする。任意にアンテナ配位子に含まれるランタニドイオンは、１つの単一のランタニドイオンであっても、いくつかの同一のもしくは異なるランタニドイオンの組合せであってもよい。共蛍光現象またはランタニドに基づくアップコンバージョンにおける光吸収または放出の強度を増強するために使用されるそのようなランタニドイオンの例は、たとえば、Ｇｄ（III）、Ｙ（III）およびＹｂ（III）である。アンテナ配位子［Latva, M. (1997) J. Lumin 75: 149-169］の例は、好ましくは４座以下、最適には３〜２座でランタニドイオンに配位することができる有機集光性構造であり、Ｅｕ（III）、Ｓｍ（III）、Ｔｂ（III）およびＤｙ（III）などの配位されたランタニドイオンに典型的には三重項状態を通してそれらの励起エネルギーを移動することができる。Ｙｂ（III)、Ｅｒ（III）およびＮｄ（III）などの近赤外発光ランタニドに好適なアンテナ配位子構造の例は、［Hofstraat, J.W. et al. (1998) J Fluorescence 8: 301-307］にも記載されている。
【００６０】
用語「非発光」および「非蛍光」は、励起され、そしてその励起状態から緩和する場合に、たとえば任意のまたは有意な量の長寿命発光などの望ましい型の発光を生成しないための光吸収化合物の性質として理解されるものとする。発光化合物とは対照的に、非発光化合物の励起状態エネルギーは、大部分は非放射性経路を経て緩和され、典型的には光の変わりに熱を、またはゆっくり減衰する発光の変わりに迅速な発光を生み出すか、または励起効率が弱い。非発光化合物のモル消光係数（extinction coefficient）またはモル吸収係数（absorptivity）は非常に低く、典型的には１０Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1であり、または非発光化合物の蛍光量子収率は非常に低く、典型的には５パーセントより低く、また長寿命発光の寿命は１マイクロ秒より短く、典型的には１００ナノ秒より少ない。非発光化合物の例は、それらの効率的な励起のための集光性アンテナ構造を持たないランタニドキレートである。
【００６１】
用語「ランタニド発光」および「発光」は、ランタニドイオンの電子遷移の放出性緩和から得られる発光（すなわち光放出）を意味すると理解されるものとする。ランタニド発光は、直接的なまたは間接的な光吸収による、または電気化学励起によるランタニドイオンの励起により生み出すことができる。
【００６２】
用語「キレート」は、１つの中心イオンが、少なくとも１つの配位子に少なくとも１つの配位結合（各々）で配位されている（または複数の中心イオンが配位されている）配位錯体として定義される。これらの錯体は、様々な原則により名付けられており、キレート、超分子化合物、錯体およびコンプレクソンなどの名前が使用されている。キレートの具体的な種類は、たとえば、ポリアミノカルボン酸、大環状錯体、クラウンエーテル、クリプタート、カリックスアレーンおよびポルフィリンなどを含む。用語「混合キレート」は、それぞれ少なくとも１つの配位結合で配位される少なくとも２つの異なる配位子を含むキレートとして理解されるものとする。
【００６３】
用語「時間分解ランタニド蛍光」、「時間分解蛍光」、「長寿命ランタニド蛍光」および「長寿命蛍光」は、本明細書において、発光化合物の発光寿命が１マイクロ秒と同じか長いランタニド発光として理解されるものとする（寿命は、発光放出強度が１／ｅ相対値、すなわち元の発光放出強度の約３７％に減衰する時間として計算される）。長寿命蛍光の可能な化合物の例としては、適切な集光性アンテナを含有するＥｕ（III）、Ｓｍ（III）、Ｔｂ（III）およびＤｙ（III）の本来蛍光であるキレート錯体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６４】
用語「光」、「励起光」および「放出光」は、２００ｎｍ〜１６００ｎｍの波長での電磁放射線を含めると理解されるものとする。これらの波長は、４００ｎｍより下の紫外線、３００〜４５０ｎｍの近紫外線、４００〜７５０ｎｍの可視光、７００〜１０００ｎｍの近赤外線および７００ｎｍより上の赤外線と呼ばれる。
【００６５】
用語「短寿命蛍光」および「短寿命蛍光化合物」は、１マイクロ秒より短い、好ましくは１００ナノ秒よりも短い蛍光寿命を有する蛍光および蛍光化合物を含めると理解されるものとする。
【００６６】
用語「ランタニドアップコンバージョン」、「アップコンバージョン」および「抗−ストークフォトルミネッセンス」は、本明細書において、発光ランタニド化合物からのフォトルミネッセンス放出が励起光の波長よりも短い波長で得られるランタニド発光として理解されるものとする。したがって、発光ランタニド化合物のアップコンバージョンは、より低いエネルギー入射光をより高いエネルギー放射光へ変換することができる。それは抗−ストーク蛍光または抗−ストークフォトルミネッセンスとも呼ばれる。そのような化合物の例は、赤外励起下で緑または赤放出を生成する活性化剤としてＥｒ（III）および増感剤としてＹｂ（III）を含む完全に無機またはハイブリッド材料である。
【００６７】
用語「電子発光」および「電気化学発光」は、本明細書において、電極を用い、かつその電極に電流または電圧をかけることによる電気化学励起により生成されるランタニド発光として理解されるものとする。発光を生成する電気化学反応が生じる電極に応じて、電気化学発光は陰極電気化学発光または陽極電気化学発光と呼ばれる。電気発光化合物は、陽極電気発光または陰極電気発光の可能な化合物である。そのような化合物の例は、緑の発光を生成する熱電子励起２，６−ビス［Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−アミノメチル］−４−ベンゾイルフェノールでキレートされたＴｂ（III）［Kulmala, S. and Haapakka, K. (1995) J Alloys Comp 225: 502-506］であるが、他の電気発光の可能なランタニド錯体も存在する［Kulmala, S. et al. (1998) Anal Chim Acta 359: 71-86; and Jiang, Q. et al. (2006) Anal Chim Acta 558: 302-309］。ランタニド錯体の電気発光は、検出限界を改善するために時間分解能を用いて測定することもできる。
【００６８】
本開示において、用語「バイオアッセイ」は、ランタニド発光にもとづきかつ反応性エレメントを利用する検体の検出および／または定量を意味すると理解されるものとする。検体は、典型的には試料または試料のアリコートから検出および／または測定される。その試料は、たとえば生物学的または環境試料または核酸増幅反応物である。
【００６９】
用語「ホモジニアスバイオアッセイ」は、分離工程を必要としないバイオアッセイを含めると理解されるものとする。単一または複数の各工程；試薬の添加、インキュベーションおよび測定は、必要とされる工程のみである。用語「分離工程」は、たとえばマイクロ粒子またはマイクロタイターウェルなどの固相上に結合した標識バイオアッセイ試薬が、非結合標識バイオアッセイ試薬から分離され、物理的に単離される工程、たとえばマイクロタイターウェルが洗浄され（液体が取り除かれ、分離が改善するために、追加の液体が添加され、そしてウェルが空の状態になる）、結果として固相上に結合されていない標識バイオアッセイ試薬からの固相結合標識バイオアッセイ試薬の分離となる工程であると理解されるものとする。
【００７０】
用語「検体」は、そのものまたはその効果がバイオアッセイにより測定されるべき目的の物質として理解されるものとする。検体は、たとえばタンパク質、細胞、細胞膜抗原、受容体、核酸、ハプテン、ホルモン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸増幅産物、分子の特定のコンフォメーション型、または構造の変化、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ活性による切断、または構造的サブユニットの多量体化、分子結合相互作用を通した２つの生体分子の結合またはそれらの解離であってもよい。
【００７１】
用語「ハプテン」は、タンパク質などの大分子に接着（attached）された場合にのみ免疫応答を生じることができる小分子を意味すると理解されるものとする。ハプテンの例は、ステロイドホルモン、ビタミン、ペプチド、糖、医薬および乱用薬物である。
【００７２】
用語「試料」および「生物学的試料」は、血清、血液、血漿、唾液、尿、糞便、精漿、汗、リカー、羊水、組織ホモジネート、腹水、環境試験からの試料（水および土壌試料）、産業処理からの試料（処理溶液）および化合物ライブラリー（有機化合物、無機化合物、天然物、抽出物または生物学的タンパク質、ペプチドまたは核酸などの生物学的起源の産物を含むかもしれないスクリーニングライブラリー）からの試料などの検体が検出される種々の液体または固体の生物学的試料を含めると理解されるものとする。試料は、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ反応などの酵素反応、または他の変換反応、ポリメラーゼ連鎖反応または他の核酸増幅反応であってもよい。
【００７３】
用語「認識エレメント」は、引用される状況に関連する任意の化合物に特異的であると見なすことができる任意の反応体を意味し、抗体、抗体断片、タンパク質スキャフォールド（たとえば、ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディー、モノボディー）、ぺプチド、アプタマー、天然のホルモン結合タンパク質、糖、レクチン、酵素、受容体、ストレプトアビジン、ビオチン、天然の核酸または人工の核酸（ロックド核酸またはペプチド核酸など）およびペプチド誘導体、そして、遺伝的または化学的に改変した抗体、または前記いずれかのキメラ組成物などの生物特異的結合反応体であって、検出すべき生体分子を非共有結合または共有結合できかつ認識できるものを含めると理解されるものとする。認識エレメントは、典型的にはイムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、リガンド−レクチンアッセイおよびリガンド−受容体アッセイにおける生物特異的結合反応体として用いられる。
【００７４】
用語「錯化剤」、「錯化する薬剤」および「キレート化剤」は、この文脈において、単一金属イオンとのいくつかの配位結合を形成することができる分子、すなわち多価配位子として理解されるものとする。最も一般的で最も汎用されている錯化剤は、酸素または窒素ドナー原子により、または両方により金属イオンに配位するものである。錯化剤の例は、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、シクロへキシル１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、Ｎ1Ｎ’−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）およびこれらのキレーターのいずれかの誘導体が挙げられる。
【００７５】
この文脈における用語「アップコンバーティングランタニド錯体」は、単一ランタニドイオンまたは種々の希土類イオンの組合せを含む混合キレートを意味する。アンテナ配位子は、増感ランタニドイオンおよび／または集光構造を含んでも含まなくても良い。
【００７６】
本発明の好ましい態様
本発明により検体を検出するため、および／または検体の濃度を定量するための典型的なバイオアッセイ法は、ランタニドイオンキャリアキレートおよび第１認識エレメントを含み、該ランタニドイオンキャリアキレートがランタニドイオンキャリア配位子およびランタニドイオンを含む第１のグループ；アンテナ配位子および第２認識エレメントを含む第２のグループを用い、
ａ）該ランタニドイオンキャリア配位子が、該バイオアッセイ法の条件において、該ランタニドに、遊離のランタニドイオンが本質的には存在しない、すなわち１ｎｍｏｌ／Ｌより少ない、好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌより少ない遊離のランタニドイオンが存在するという結果となるのに充分強く結合する；または
ｂ）該ランタニドイオンキャリア配位子は、該バイオアッセイ法の条件において、遊離のランタニドが本質的には存在しない、すなわち１ｎｍｏｌ／Ｌより少ない、好ましくは１０ｐｍｏｌ／Ｌより少ない遊離のランタニドが存在するという結果となるのに充分に強く該ランタニドに結合し、該ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が少なくとも１ｐｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに用いられる；そして
該アンテナ配位子は、該ランタニドイオンに弱く結合する、すなわち該アンテナ配位子は単座、二座、三座または四座のいずれかである；ならびに
該第１のグループの該第１認識エレメントおよび該第２のグループの第２認識エレメントによる該検体の認識が、
ｉ）キレート相補、すなわち該ランタニドを担持するランタニドイオンキャリアキレートの該アンテナ配位子との相補性による混合ランタニドキレート錯体の形成、およびそれによる蛍光の増加；または
ii）キレート脱相補、すなわち該ランタニドを担持する該ランタニドイオンキャリアキレートが該アンテナ配位子から分離され、それによる蛍光の減少
のいずれかの結果となる。
【００７７】
バイオアッセイの好ましい実施態様では、
ａ）ｌｏｇＫLnL1は少なくとも１２、好ましくは１８以上であって、ＫLnL1は、イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体の溶液中での安定度定数を意味する；または
ｂ）該ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤をさらに用いる場合、
ｉ）ｌｏｇＫLnL2は少なくとも１２であって、ＫLnL2は、イオンキャリア配位子とランタニドイオンとの錯体の溶液中での安定度定数を意味する；および
ii）ｌｏｇＫLnL3は少なくとも８であって、ＫLnL3は、該ランタニドイオンを錯化する該錯化剤とランタニドイオンとの溶液中での安定度定数を意味する。
【００７８】
本発明の典型的な実施態様において、イオンキャリアキレートは、五座、六座、七座または八座であり、好ましくは六座、七座または八座である。
【００７９】
イオンキャリアキレートのランタニドイオンは、好ましくはプラセオジム（III）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、ユーロピウム（III）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）、ツリウム（III）およびイッテルビウム（III）からなる群より選択される。
【００８０】
第１および第２認識エレメントは、好ましくは互いに独立して、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、ハプテン、オリゴ糖からなる群より選択される。
【００８１】
アンテナ配位子は、典型的には、四座、三座、二座または単座であり、好ましくは三座または二座である。
【００８２】
ｌｏｇＫLnL1は典型的には少なくとも２０、好ましくは２２以上である。
【００８３】
錯化剤は、好ましくはＣＤＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＧＴＡ、ＨＢＥＤ、ＨＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＴＡ、ＴＥＴＡおよびＴＴＨＡからなる群より選択される。
【００８４】
ランタニドイオンと非蛍光性錯体を形成する錯化剤が用いられる場合、該錯化剤は、典型的には、アンテナ配位子よりもより強い該ランタニドイオンの結合剤、すなわちｌｏｇＫLnL3＞ｌｏｇＫLnL4であって、ＫLnL4は、該アンテナ配位子と該ランタニドイオンとの錯体の溶液中での安定度定数を意味し；好ましくは、イオンキャリアキレートよりもより弱いランタニドイオンの結合剤、すなわちｌｏｇＫLnL3＜ｌｏｇＫLnL2である。
【００８５】
ランタニドイオンキャリア配位子は、典型的には、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＮＯＴＡまたはＤＯＴＡから誘導されるか、または図７ｉ、図７iiおよび図７iiiに示される構造ａ）からｐ）より選択される。
【００８６】
アンテナ配位子は、典型的には図５ｉ、図５ii、図５iiiおよび図５ivに説明される構造ａ）からｚ）よりなる群から選択される集光構造を含む。
【００８７】
検体の認識は、結果として蛍光の増加または減少を生じ、その蛍光は、典型的には４００と１６００ｎｍとのあいだの波長で測定される。
【００８８】
検出および／または定量される検体は、典型的には、ストレプトアビジン、タンパク質、ハプテン、核酸配列、細胞、ウイルスおよび核酸増幅反応の産物（たとえばポリメラーゼ連鎖反応の産物）からなる群より選択される。
【００８９】
検体の認識は、結果として蛍光の増加または減少を生じ、典型的にはその蛍光は、長い蛍光寿命、すなわち１μｓよりも長い寿命を有する。
【００９０】
検体の認識は、結果として蛍光の増加または減少を生じ、好ましくは、その蛍光はアップコンバージョン蛍光（すなわち、発光が励起よりも短い波長で検出される抗−ストークフォトルミネッセンス）である。
【００９１】
多くの好ましい実施態様では、条件は少なくとも４０℃またはそれ以上の温度を含む。
【００９２】
本発明の１つの実施態様によれば、ランタニドに基づくレポーター技術は、ハイブリダイゼーションアッセイおよび核酸増幅のリアルタイム「閉管」モニタリング；たとえばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応またはいくつかの等温核酸増幅手法に適用される［Gill, P. and Ghaemi, A. (2008) Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 27: 224-243］。生体分子結合剤は、たとえばオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）などのオリゴヌクレオチド類似体である。
【００９３】
ホモジニアス核酸ハイブリダイゼーションアッセイのためのオリゴヌクレオチド指向ランタニドキレート相補アッセイの原理は、図２に記載されており、この原理により、ＦＲＥＴを利用しないで行なわれる２つのプローブ（互いに隣接してハイブリダイズされる）に基づくアッセイが可能となる。そのプローブの１つは、非蛍光ランタニドキレート（４）で標識され、他方は好適な有機集光構造に結合された（coupled）相補アンテナ配位子（５）で標識され；そのキレートとその配位子を合わせて蛍光ランタニド錯体を形成することができる。本発明の他の実施態様によれば、方法は、図３および図４にそれぞれ示すような南京錠または分子指標型プローブにさらに拡張することができる。
【００９４】
図３において、南京錠型プローブは、リンカー（９）（たとえばオリゴヌクレオチド配列）に接続された２つの末端オリゴヌクレオチド配列からなり、一方の末端配列（１）はランタニドイオンキャリアキレート（４）で標識され、他方の末端配列（２）は集光性アンテナ配位子（５）で標識される。その２つの標識末端に隣接して相補的な配列を有する標的ヌクレオチド配列（３）が添加される（６）と、二本鎖核酸ハイブリッド（１０）が、混合キレートの自己組織化に向かって形成され、強い蛍光の錯体（８）が形成される。錯体の形成により、結果として、励起波長（λ1）で励起された発光波長（λ2）での蛍光の増加となる。
【００９５】
図４は、分子指標型プローブを利用したハイブリダイゼーションアッセイを説明するものであり、標識されたプローブは、検体特異的配列（１１ｂおよび１２ｂ）に加えて２つの相補的配列（１１ａおよび１２ａ）を有し、検体配列（３）が存在しない場合に、キレートの２つの部分、すなわちその相補配列の隣に結合させた（coupled）アンテナ配位子（５）およびイオンキャリアキレート（４）が近接するようにして、キレート相補および蛍光錯体（８）の形成を可能とする。検体配列（３）が溶液（１４）に供されると、検体特異的配列が、部分二本鎖デュプレックス（１３）を形成するそれらの相補配列を認識し、それにより混合キレートが分解し、結果として励起波長（λ1）で励起された発光波長（λ2）での蛍光の減少を生じる。
【００９６】
本発明の別の実施態様によれば、レポーター技術は、タンパク質検出およびタンパク質−タンパク質相互作用の測定に応用される。これらの応用では、２つのプローブ間の方向および距離の制御は、天然のリガンド、短い結合ペプチド、またはデノボ設計されたおよび／または部位特異的カップリングケミストリーにより分子結合ライブラリーから濃縮された人工の結合剤を利用することができる。本発明は、特に多量体タンパク質および多量化タンパク質複合体、たとえばウイルスキャプシドタンパク質および分子ハサミに関して説明されるようなＣ−反応性タンパク質などの検出に良く適している［Heyduk E, et al. (2008) Anal Chem. 80: 5152-5159］。
【００９７】
本発明の１つの実施態様によれば、方法は、イオン濃度の変化、または検体または抗生物質またはステロイドなどの小分子リガンドの存在により誘導されるタンパク質二量化（または多量化）の検出に適用できる。そのような事象の例は、カルシウムイオン依存タンパク質二量化である［Appelblom H, et al. (2007) J Biomol Screen 12: 842-8］。二量化は、ヘテロダイマーまたはホモダイマーの形成のいずれであってもよい。もう１つの例は、抗体可変ドメインの抗原依存性再会合を利用することが説明されている［Ueda, H. (2003) J Immunol Methods 279: 209-218］。
【００９８】
本発明によれば、キャリアキレートおよびアンテナ配位子は両方とも、たとえばヨードアセトアミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、マレイミドまたはイソチオシアネート活性剤などを使用する生体分子結合剤に共有結合で結合される。生体分子プローブの構築のために、レポーター部分は、たとえば、単一アミノ修飾塩基または末端アミノ修飾を含むオリゴヌクレオチド結合剤にコンジュゲートされる。いくつかのアミノ基（リジン残基）を含む組み換えタンパク質結合剤の場合、チオール基（付加的なシステイン）により、または「クリック−ケミストリー」アプローチにより、部位特異的コンジュゲートが得られる［Beatty, KE et al. (2005) J Am Chem Soc 127: 14150-14151; Hahn, ME and Muir, TW (2005) Trends Biochem Sci 30: 26-34］。キャリアキレートとアンテナ配位子との共有コンジュゲーションは、固層核酸またはペプチド合成において専用に設計された構成要素を利用することにより行うこともできる［Jaakkola et al. (2007) Solid-phase oligonucleotide labeling with DOTA. Current protocols in nucleic acid chemistry, Beaucage, S.L. et al編；Chapter 14: Unit 4.31; John Wiley & Sonsオンライン発行］。
【００９９】
本発明の好ましい態様によれば、イオンキャリアキレートまたはアンテナ配位子の生体分子結合剤コンジュゲートは、コンジュゲートされていない部分、特に反応性イオンキャリアキレート試薬に存在する可能性のある遊離のイオンの中から注意深く精製される。精製の有効な方法の例としては、逆相、アフィニティーおよびサイズ排除（またはゲルろ過）クロマトグラフィーおよび透析などを含む。遊離イオンの抽出は、精製前または精製と同時にプローブ溶液へ錯化剤を添加することにより改善することができる。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイにおいて、オリゴヌクレオチドプローブの相互距離、より詳細には、実際に標識された塩基の位置の相互距離、およびレポーター部分のコンジュゲーションのために使用されるカップリングリンカーの構造が、２つのプローブがハイブリダイズした後どのようにキャリアキレートおよびアンテナ配位子が空間的に位置するかを定義する。仮に二重らせん構造が堅く、２つのレポーター部分の塩基位置が離れすぎているか、または例えばカップリングリンカーの長さが短すぎると、相補性は妨げられ得る。カップリングリンカーの長さや構造および塩基位置に加えて、付加的な非ハイブリダイズ一本鎖配列を隣接したプローブ位置の間の鋳型オリゴヌクレオチドに導入することができる。これによりさらに混合キレートの動きの自由度と自己組織化との間のバランスをとることが可能となる。
【０１００】
本発明のなお他の実施態様によれば、レポーター技術は、レポーターの非特異的結合がアッセイ性能を決めるヘテロジニアスな固相近接プローブ原理に基づくアッセイにおいて用いられる。シグナル産生を検体結合プローブに存在するそれらのレポーターのみに限定することにより、また非特異的に固相に結合したレポーター（または実際にはプローブ）を無視することにより、現在の性能限界は解消される。固相アッセイは、たとえばホモジニアスアッセイにおいてと同じオリゴヌクレオチド配列と同じ標識化プローブとを含み、さらに、たとえばビオチン化鋳型核酸（検体）およびストレプトアビジン固相（好ましくはマイクロタイターウェル）などを結合した錯体を捕捉するために利用することができる。溶液からの蛍光を測定する代わりに、読み出しは、現在、洗浄工程（非結合プローブの分離）後の固相からである。アッセイは、固相近位ライゲーションアッセイを反映し［Fredriksson, S et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 473-477;およびGullberg, M et al. (2003) Curr Opin Biotechnol 14:82-86］、ホモジニアスモデルアッセイよりも鋳型オリゴヌクレオチドのさらにより感度の高い検出の可能性を提供することができる。
【０１０１】
タンパク質検出は、利用可能な結合剤自体が容易に予測可能な結合位置および方向を提供せず、したがって、相補されたキレートの自己組織化を制御することをより難しくしているので、より要求の厳しいアプローチである。本発明の１つの実施態様は、組換え抗体断片、タンパク質スキャフィールド（たとえばＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディー、モノボディー）、アプタマー、ペプチド結合剤、リガンドまたはハプテンを、ランタニドキレート相補性を利用するタンパク質の近接プローブに基づく分析を可能にする部位特異的標識化と組み合わせられる結合剤として利用する。タンパク質の高感度および特異的近接プローブに基づく分析や医学診断における将来性は、２つのオリゴヌクレオチドプローブの近接ライゲーションを利用する（Gustafsdottir, S.M. (2005) Anal Biochem 345: 2-9により説明されている）。
【０１０２】
本発明のさらに別の実施態様は、相補するランタニドに基づく蛍光レポーターのオリゴヌクレオチド支援自己組織化と組合せられたタンパク質、またはたとえばアプタマー指向生体分子認識を利用する。後者は、近位ライゲーションに基づく検出に利用されるアプローチと似ており、タンパク質またはアプタマー結合剤に付着されるオリゴヌクレオチド尾部が短い相補的オリゴヌクレオチドの存在下で連結される。結合剤タンパク質は、オリゴヌクレオチド尾部で誘導体化でき、より好ましくは、弱い相互作用のロイシンジッパー［Ohiro, Y et al. (2002) Anal Chem 74: 5786-5792］または分子ハサミに類似する他の相互作用結合対［Heyduk E, et al. (2008) Anal Chem. 80: 5152-5159］を有する組換え抗体フラグメントとして生産され、相補ランタニド−キレートに基づくレポーターシステムを有する。抗体上のランダムな化学的コンジュゲーションは、潜在的な問題であり、組換え抗体断片および「クリック−ケミストリー」アプローチは、部位特異的コンジュゲーションを可能にするために使用される。
【０１０３】
本発明のなお別の実施態様は、相補ランタニドに基づくレポーターの全体のタンパク質指向自己組織化であり、分子モデリングに基づく設計を要求するが、改良された性能を提供する。１つのアプローチは、検体駆動制御タンパク質会合および相補的ランタニドに基づくレポーターによる部位特異的標識化である。制御されたタンパク質会合は、元々抗体Ｆｖ断片重鎖および軽鎖ドメインとの酵素相補のために利用されてきた［Ueda, H et al. (2003) J Immunol Methods 279: 209-218］。重鎖および軽鎖とのあいだの相互作用は、その会合が抗原の存在に依存するように人工的に弱められる。部位特異的標識化は、ＦｖドメインのＣ−末端に導入された追加的なシステイン残基に向けることができる。このアプローチは、しかしながら、抗体構造に限定されるものではなく、なぜならリガンド誘導多量体化が、特にそれらの天然のリガンドに対する特異的なセンサーとして利用できる制御タンパク質で観察される一般的な事象であるからである。もう１つは、より興味深いアプローチでさえあるが、結合剤としてレポーターから誘導体化した相対的に短い合成ペプチドを利用することであり、それはたとえば多量体タンパク質検体上の隣接位置を認識する［Appelblom, H et al. (2007) J Biomol Screen 12: 842-848］。
【０１０４】
本発明のまた別の実施態様によれば、１つ以上の異なるランタニドイオンが、１つまたは複数の集光性アンテナ配位子と組み合わされた別々のイオンキャリアキレートに採用され、多重パラメータのアッセイデザインを可能とする。
【０１０５】
さらに別の実施態様によれば、ランタニドイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子は、アップコンバーティングランタニド錯体を形成することができる。２つまたはそれ以上の光子に集められたエネルギーは、分子内非放射性プロセスによりアンテナ配位子からキャリアキレート中のランタニドイオンに連続的に移動され、その後特徴的発光の単一光子を放出する。
【０１０６】
本発明の別の実施態様によれば、相補的ランタニドに基づくレポーターの蛍光強度は、潜在的に共発光現象を利用することにより増強することができる［Xu, YY et al. (1992) Analyst 117: 1061-1069; and Latva, M et al. (1995) J Chem Soc Perkin Trans 2 995-999］。
【０１０７】
集光構造を含む好ましい相補集光性アンテナ配位子の例は、図５ｉ−図５iv、ａ）−ｚ）に説明されている。これらの構造はさらに、弱い金属キレート配位子とイオンキャリアキレートと同様に分子結合剤へのコンジュゲートを可能とする任意のリンカー／スペーサーを有する反応基とを含む。略語Ｘは、ランタニド（III）イオンキャリアキレートの分子結合剤へのコンジュゲーションを可能にする記載された化学構造を意味し、略語−Ａ−は、化学的リンカーまたはスペーサー配列を意味し、略語Ｌは、図６、ａ）−ｈ）に説明されている概略構造から独立して選択される化学的部分を意味し、そして略語−Ｚは、図６、ｉ）−ｌ）から独立して選択される化学的部分を意味するかまたは−Ｚは存在しない（すなわち水素に置換えられる）。図５ii、ｉ）およびｊ）ならびに図６、ｌ）の構造に含まれるメトキシ（−ＯＭｅ）基は、エトキシ（−ＯＥｔ）基で置換えることができる。図５ｖ、ｗ）−ｚ）において、略語−Ｇは、−ＣＦ3、−ＣＦ2ＣＦ3または−ＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3のいずれかを意味する。典型的には、リンカーは１つまたは複数の短い脂肪族炭素鎖、エーテル、カルボニル、アミド、アミン、エステル、チオエーテルおよび／またはフェニレンから構成され、反応基は、化学的に官能性であり、限定されるものではないが、アルコール、チオール、カルボン酸、一級または二級アミン、ビニルスルホニル、アルデヒド、エポキシド、ヒドラジド、スクシンイミジルエステル、マレイミド、アルファ−ハロカルボニル部分（ヨードアセチルなど）、イソシアネート、イソチオシアネート、およびアジリジンであってよい。好ましくは、化学的官能性基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、イソチオシアネート、マレイミド、ヨードアセチルおよびジクロロトリアジンから選択される。イソチオシアネート活性化は、たとえばリジンアミノ酸、ペプチドの末端アミノ、またはオリゴヌクレオチドにおけるアミノ修飾などの一級アミノ基との不可逆性チオカルバミド結合を形成することができる。
【０１０８】
典型的には、アンテナ配位子は、単座、二座、三座または四座配位子であり、最も好ましくは二座または三座配位子である。有機集光構造は、芳香環またはヘテロ環を含み、集光構造は、イオンキャリアキレートに存在する三価のランタニドイオンに適した三重項状態エネルギーレベルを有する。適切な三重項状態エネルギーおよびランタニドイオンのための集光構造の例は、文献に示されている［Latva, M. et al. (1997) J Luminescence 75: 149-169］。本発明の１つの実施態様によれば、集光有機構造は、７−アミノ−４−メチル−２（１Ｈ）−キノリン（ｃｓ１２４）、キノリン様構造またはクマリン様構造に基づく［Li, M., and Selvin, P.R. (1997) Bioconj Chem 8. 127-132;および米国特許第５，６２２，８２１号］。
【０１０９】
相補アッセイに好適な非−蛍光ランタニド（III）イオンキャリアキレートにとって好ましい概略構造の例は、図７ｉ−図７iii、ａ）−ｐ）に説明されている。これらの構造は、金属、キレート配位子および、ペプチド、タンパク質または核酸などの分子結合剤に、たとえば一級アミノまたはチオール基を介するコンジュゲーションを可能とする任意のリンカー／スペーサーを有する反応基を含む。部位特異的クリック−ケミストリーコンジュゲーション法などの他のコンジュゲーション化学種も可能である。概略構造における略語Ｌｎ3+は、三価のランタニドイオンを意味し、−Ｘは、そのランタニド（III）イオンキャリアキレートの分子結合剤へのコンジュゲーションを可能とする反応基を意味する。図７ｉ−図７iii、ａ）−ｐ）において、略語−Ａ−は、１〜１２の炭素原子を含むアルキル鎖などのリンカーまたはスペーサーを意味し、−Ｘは、アミノ基、アミノオキシ基、ハロアセトアミド基（ハロゲン化物は臭化物またはヨウ化物である）、イソチオシアネート、３，５−ジクロロ−２，４，６−トリアジニルアミノ、マレイミド、チオエステルまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドなどのカルボン酸の活性エステルなどの反応基を意味する。図７ii、ｆ）−ｇ）において、ｎの値は１または２のいずれかである。オリゴヌクレオチドの標識化のためのイオンキャリアキレートの付加的な構造は、たとえば米国特許第６，９４９，６３９号に説明されている。
【０１１０】
本発明の１つの実施態様によれば、イオンキャリアキレートは、図７ｉ−図７iii、ａ）−ｒ）に説明されているように１つまたは複数のカルボン酸基を含む。また別の実施態様によれば、イオンキャリアキレートにおける１つまたは複数のカルボン酸基は、ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＲ1または−ＣＯＮＨＲ1Ｒ2（式中Ｒ1およびＲ2は、国際公開第２００７／０８２９９６号に記載されている同一または異なる化学構造である）などの中性のキレート基により置換えられる。
【０１１１】
好ましいイオンキャリア配位子構造は、たとえば、米国特許第５，４２８，１５４号、Carrera, C. et al. (2007) Dalton Trans. 4980-4987、Morcos, S.K. (2007) The British Journal of Radiology 80: 73-76、米国特許第５，６２２，６８８号および欧州特許出願第０ ４１６ ０３３号にも記載されているような、ランタニド（III）イオンと熱力学的にそして動力学的に安定な、または好ましくは非常に安定な錯体を形成することが可能な六座、七座または八座配位子である。好ましくは、イオンキャリア配位子におけるキレート化原子は、酸素および窒素であり、本発明の１つの実施態様によれば、キレート配位子は、複数のカルボン酸基を含有する。リンカーや反応基をコンジュゲートするためのＤＯＴＡ、ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡなどのキレート配位子の誘導体化方法は、Bruecher, E. (2002) Topics in Current Chemistry 221: 103-122; Michra, A. et al. (2005) Proc Intl Soc Mag Reson Med 13: 2592;および米国特許第６，１９０，９２３号に記載されている。たとえば、活性基（またはそれらの反応性非活性型）を有する好適な大環状ランタニドイオンキャリア配位子は、マクロサイクリクス社（Macrocyclics, Inc.）(ダラス、ＴＸ)から市販されており、たとえば、３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１］ペンタデカ−１（１５），１１，１３−トリエン−４−Ｓ−（４−イソチオシアネートベンジル）−３，６，９−三酢酸；１−オキサ−４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−５−Ｓ−（４−イソチオシアネートベンジル）−４，７，１０−三酢酸；［（Ｒ）−２−アミノ−３−（４−イソチオシアネートフェニル）プロピル］−トランス−（Ｓ，Ｓ）−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−五酢酸；および１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの構造がある。錯化剤を用いる場合、ランタニドイオンキャリアキレートは、バイオアッセイの条件において少なくともＥＤＴＡ錯体と同じかまたはＥＤＴＡ錯体より大きな条件生成定数を有するように選択することができる。錯化剤を使用しないことが好ましい場合、イオンキャリアキレートは、バイオアッセイの条件において少なくともＤＴＰＡと同じかまたはＤＴＰＡより大きな条件生成定数を有するように選択される。錯化剤が用いられない場合、イオンキャリアキレートは、バイオアッセイの条件において好ましくはＥＤＴＡ錯体の解離よりもゆっくりとした解離、より好ましくは、ＤＴＰＡ錯体の解離よりもゆっくりとした解離を有するように選択される。
【０１１２】
好ましくは、イオンキャリアキレートは、図７ｉ−図７iiiに説明されている概略構造から選択され、ランタニド（III）イオン（Ｌｎ3+）は、任意の三価のランタニドイオンであるが、時間分解蛍光分析法を利用する長寿命蛍光に基づくアッセイにはＳｍ3+、Ｅｕ3+、Ｔｂ3+およびＤｙ3+が好ましく、アップコンバージョン蛍光に基づくアッセイにはＥｒ3+およびＴｍ3+が好ましい。好ましくは、イオンキャリアキレートは、時間分解蛍光分析法の場合、ランタニドイオンに配位し、３００ｎｍ以上の波長範囲、好ましくは２８０ｎｍ以上の波長で吸収する集光構造は含まないように選択される。
【０１１３】
好ましくは、イオンキャリアキレートおよび集光性アンテナ配位子は共に水に可溶であり、かつそれらのバイオコンジュゲートが水に可溶である。
【０１１４】
本発明の１つの実施態様によれば、集光性配位子の可溶性は、可溶性促進置換基を構造に付加することにより、カルボン酸（−ＣＯＯＨ、−ＣＨ2ＣＯＯＨ）、スルホン酸、ホスホン酸または糖残基（たとえばα−ガラクトピラノキシ）を添加することにより改善される（欧州特許出願第１ ４４７ ６６６号および国際公開第２００８／０２０１１３号）。好ましくは、アンテナ配位子におけるキレート化原子は、酸素および窒素であり、本発明の１つの実施態様によれば、アンテナ配位子は、１つまたは２つのカルボン酸基を含有する。
【０１１５】
好ましくは、ランタニド（III）イオンキャリアキレートとアンテナ配位子の、共に蛍光ランタニド錯体を形成することができる最適な組合わせは、配位子配位部位（座数）の合計が９または１０のいずれかとなるように選択される。
【０１１６】
好ましくは、Ｅｕ3+およびＳｍ3+に対して、アンテナ配位子は、図５ｉ−図５ii、ａ）−ｊ）に説明されている概略図から選択され、Ｔｂ3+およびＤｙ3+については、図５ｉ−図５ii、ｅ）−ｊ）から選択される。
【０１１７】
相補ランタニドに基づく蛍光レポーター技術は、核酸およびタンパク質の定量的測定に適用可能である。シグナルが、一方はランタニドイオンキャリアキレートで標識され、他方は光吸収アンテナで標識された２つのプローブが標的分子に隣接して正確に結合された場合、そして標識成分が非常にしっかりと接触した場合のみに得られるので、シグナルの発生が非常に特異的である。ランタニド錯体の長発光寿命は、自己蛍光および非特異的結合に由来するバックグラウンドを取り除く時間分解測定を可能にする。このアプローチは、ランタニドキレートがそのような独自のスペクトル特性および時間特性を有するため、他のランタニドイオンキレートおよび好適な集光性配位子を用いることにより、同時にいくつかの検体をモニターする（複数検体アプローチ）ために使用することもできる。
【０１１８】
本発明の方法は、等温核酸増幅反応［Van Ness, J., et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:4504-4509］および熱サイクル核酸増幅反応［Saiki et al. (1988) Science 239: 487-491］の両方をモニターするために適している。ポリメラーゼ連鎖反応のモニターのためには、熱力学的および動力学的に非常に安定なイオンキャリアキレートを用いることが好ましい。
【０１１９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、種々の鎖の標的ＤＮＡに相補的な短いオリゴヌクレオチド（プライマー）により特定される二本鎖ＤＮＡの特異的配列（単位複製配列）のコピー数を増加させるための方法である。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ活性による単位複製配列コピー数の連続的、指数関数的増加に基づく。サイクル反応は、典型的には３つの主要な工程を含み、典型的には３０から４５サイクル繰り返される。これは、非常に短時間で反応混合物を加熱および冷却できる自動化サイクラーにおいてなされる。一般的な反応工程は次のとおりである。
【０１２０】
１．典型的には９０℃または９４℃などそれより高く１００℃より低い高温での変性。変性の間、二本鎖ＤＮＡは融解し、一本鎖ＤＮＡに開き、そしてすべての酵素反応が停止する（たとえば、前回のサイクルの伸張反応）。
【０１２１】
２．典型的には５０℃より高いが７５℃より低い、たとえば５４℃の温かい温度でのアニーリング。アニーリングの間、プライマーは相補的一本鎖標的ＤＮＡまたは単位複製配列に結合する。
【０１２２】
３．典型的には６０℃より高いが７５℃より低い、たとえば７２℃のある程度高い温度での伸張。塩基（鋳型に相補的な）は、３’側でプライマーに結合（coupled）（ポリメラーゼが、５’から３’にｄＮＴＰ’ｓを加え、３’から５’側に鋳型を読みながら、塩基が鋳型に相補的に加えられる）される。
【０１２３】
工程２および３は、工程２に類似するが両工程の機能を組み合わせた条件で単一工程に組み合わせることができる。
【０１２４】
典型的には、各工程は、数秒から数分かかり、一般的には数十秒から１または２分である。したがって、ＰＣＲ稼動の長さおよび温かく高い温度へ反応内容物を暴露する長さは、数分から数時間で変化する。典型的には、ＰＣＲの長さは、１５分と１時間３０分のあいだである。
【０１２５】
リアル−タイム定量ＰＣＲまたはホモジニアス  エンド−ポイントＰＣＲにおいて、コピー数または単位複製配列の存在の増加が、本発明の方法を用いて検出することができる。
【０１２６】
本発明の方法がＰＣＲ内で用いられる場合、そこでの条件、すなわち５０℃から９８℃まで、より一般的には６０℃から９８℃まで変化する温度が、イオンキャリアキレートの条件安定化にかなりな要求を課す。ランタニドイオンのイオンキャリアキレートからの解離は、全ＰＣＲ期間、すなわち少なくとも数分、典型的には１５分よりも長く２時間までの期間これらの条件において無視できるべきである。
【０１２７】
本発明の実施態様は、本発明の方法を用いて増幅されたＰＣＲ産物のリアル−タイムおよびエンド−ポイント検出の両方を可能とする安定性を提供する。配位子の金属キレートの条件安定度定数は、温度などの条件に依存する。典型的には、金属キレートの条件安定度定数は、温度の増加と共に減少する。これは、より高い温度で解離が増加することによる。したがって、そこでの条件、すなわち高い温度でも充分に大きい条件生成定数を有し、かつ動力学的に不活性である、すなわち高い温度でゆっくりとした解離を有する、そのようなイオンキャリアキレートのみがＰＣＲに適している。イオンキャリアキレートの充分に大きい条件定数は、イオンがＰＣＲのあいだキャリアキレートから解離しないという結果を生じる。
【０１２８】
近接プローブに基づく認識により形成された相補混合ランタニドキレートは、さらに発光（アクセプター）または非発光（消光剤）蛍光化合物との共鳴エネルギー移動におけるドナーとして利用することができる。アクセプターは、ドナー発光と重なるスペクトルをもたないように選択することもできる。
【実施例】
【０１２９】
参考例１
ホモジニアスな近接プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＧＣＡＡＴＧ−３’；配列番号１）、アミノ修飾プローブＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣ（Ｃ６ｄＴ）Ｃ−３’；配列番号２）およびアミノ修飾プローブＢオリゴヌクレオチド（５’−Ｔ（Ｃ２ｄＴ）ＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣ−３’；配列番号３）は、シグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ＭＩ）から購入した。プローブＡは、３’−端付近に位置する第一級アミノ基修飾で、Ｅｕ3+イオンキャリアキレート、（Ｎ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）［Mukkala, V.-M. et al., (1989) Anal. Biochem., 176: 319］、Ｅｕ3+−Ｎ１）により標識し、そしてプローブＢは、５’−端付近で、集光性アンテナ配位子（４−（（イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸、３ｄ−アンテナ）により標識した。プローブＡ（２５ｎｍｏｌ）を、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液中、ｐＨ９．８、＋３７℃で２０倍モル過剰のＥｕ3+−Ｎ１と一晩インキュベートした。標識化反応の全量は５０μＬであった。プローブＢの３ｄ−アンテナによる標識化については、３ｄ−アンテナをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（シグマ−アルドリッチ社）中に溶解し、水に溶解したオリゴヌクレオチドと混合し、そしてその後、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）を５０ｍＭの濃度まで添加した。標識化反応において、３ｄ−アンテナのモル過剰は全量１１０μＬで５０倍であった。反応物をゆっくりと回転させながら＋５０℃で一晩インキュベートした。
【０１３０】
標識されたプローブの精製はＨＰＬＣ（サーモ  エレクトロン社の機器、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）で行い、３ｄ−アンテナ標識プローブＢの精製にはサーモ  サイエンティフィック社（ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）のＯＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラムを用い、Ｅｕ3+−Ｎ１−標識プローブＡの精製にはフェノメネクス（Phenomenex）社（トランス、ＣＡ、ＵＳＡ）のＬｕｎａ  Ｃ１８（２）カラムを用いた。両カラムとも長さ１５０ｍｍ、内径（i.d.）４．６ｍｍであった。精製は、２１分で８６％Ａおよび１４％Ｂから７０％Ａおよび３０％Ｂまでの勾配を用いて、流速０．５ｍＬ／分で行った［Ａ、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸水溶液（ＴＥＡＡ；フルカ  バイオケミカ社、ブックス、スイス）；Ｂ、５０ｍＭＴＥＡＡ／アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．ベーカー、フィリップスバーグ、ＮＪ、ＵＳＡ）］。回収した画分から液体を真空中で蒸発させ（Ｈｅｔｏｖａｃ  ＶＲ−１、Ｈｅｔｏ−Ｈｏｌｔｅｎ  Ａ／Ｓ、アレレズ（Allerod）、デンマーク）、ついで再度１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌに溶解した。標識プローブは、２６０および３３０ｎｍの吸光度測定値を測定することにより特徴づけされ、総Ｅｕ3+濃度はＤＥＬＦＩＡ技術を用いて測定された（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ワラック、ツルク、フィンランド）。
【０１３１】
アッセイは、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、０．０５％のＮａＮ３、および３０μＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含有するアッセイ緩衝液において、Nunc（ロスキレ、デンマーク）から購入した低蛍光９６ウェルMaxisorpマイクロタイタープレートを用いることにより行なわれた。プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナ（１０または５０ｎＭ）および標的オリゴヌクレオチド（０〜５０ｎＭ）を混合して全量６０μＬとし、ウェルに加えた。プレートを、まず短時間ゆっくりと攪拌し、ついで攪拌しないで室温で１５分および６０分インキュベートした。時間分解蛍光測定は、３４０ｎｍ励起フィルター、６１５ｎｍ発光フィルター、４００μｓ遅延時間および４００μｓ測定時間を用い、１０００測定サイクル計測することにより、１４２０Victor Multilabel Counter（パーキン−エルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ツルク、フィンランド）で行なった。
【０１３２】
キレート相補アッセイ法の原理は、図１に示す。２つの１６−ｍｅｒプローブ、すなわち３’端の１ヌクレオチド内部に位置するアミノ修飾チミンで、ユーロピウム（III）イオンキャリアキレート（Ｎ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）［Mukkala et al. (1989)］Ｅｕ3+−Ｎ１、図８ａの概略構造）により標識されたプローブＡ、および５’端の１ヌクレオチド内部に位置するアミノ修飾チミンで、集光性アンテナ（４−（（イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸、３ｄ−アンテナ、図８ｂの概略構造）により標識されたプローブＢは、３２−ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチドに相補的であった。プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナのお互いへの親和性は最小であるため、相補的標的オリゴヌクレオチドの非存在下では蛍光を検出することはできない。標的オリゴヌクレオチドの存在下で、プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナは、標的オリゴヌクレオチド上の隣接した位置にハイブリダイズし、Ｅｕ3+−Ｎ１および３ｄ−アンテナは、大きなストークシフト、鋭い発光ピークおよび長い蛍光寿命を伴い特定の波長で蛍光を発する混合キレート錯体を形成する。
【０１３３】
実験の結果は、図９に説明され、プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナの標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後にＥ3+−特異的蛍光が現れる。四角が１０ｎＭ濃度のプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナでの反応の測定結果を表し、円が５０ｎＭ濃度の同じプローブでの反応の結果を表す。プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナの量は、標的オリゴヌクレオチドの量が増加するあいだ一定であった。検出限界は、バックグラウンドシグナルの三倍標準偏差に相当する濃度として規定され、プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナの量が５０ｎＭの場合１３ｐＭ（０．７８ｆｍｏｌ／アッセイ）である。本発明者らのアッセイにおける検出限界は、以前に報告されているもの［A. Oser, G. Valet (1990) Angew. Chem. 102, 1197; Angew. (1990) Chem. Int. Ed. Engl. 29, 1167］よりも良く、特に、シグナル対バックグラウンド比が１０００以上（１４００：１まで）であり、本発明者らのアッセイにおけるシグナルレベルは従来技術［Wang, G., Yuan, J., Matsumoto, K., and Hu, Z. (2001) Anal. Biochem. 299: 169］（３より低い比（３：１より低い）が示されている）と比較して飛び抜けていた。これは、適切に選択されたイオンキャリアキレート、アンテナ配位子、リンカー配列、オリゴヌクレオチド修飾を用いることにより、とりわけ溶液中に存在する任意の遊離ユーロピウム（III）イオンを実質的に錯体化するために錯化剤を添加することにより達成される。本発明者らのアッセイにおけるダイナミックレンジは４桁におよび、蛍光シグナルは、少なくとも１時間安定であった。
【０１３４】
ＤＴＰＡ濃度の驚くべき効果を表１に説明する。参考例において最適なＤＴＰＡ濃度は、３０μＭまたはそれ以上であった。ＤＴＰＡの非存在下では、１０ｎＭプローブ濃度でのシグナル−対−バックグラウンド比は、２よりも小さく、一方３０および１００μＭ ＤＴＰＡ濃度では、７０より大きい比が得られた。これは、バックグラウンドが明らかに観測可能であった従来技術に対して本発明により得られる有意な改善を説明している。結果は、そこでの条件で遊離のランタニドイオンの濃度は、錯化剤の非存在下で元々ナノモル濃度であるが、一方錯化剤の添加により、遊離イオンの濃度を少なくとも１００倍、潜在的には１０００倍より大きく、ピコモル濃度に、または１ピコモル濃度より低い濃度に減少させることができる。これは、アッセイバックグラウンドの劇的な減少および得られるシグナルのバックグラウンドに対する比率の有意な増加という結果を生じる。
【０１３５】
【表１】
0005841525.tif 000002
【０１３６】
参考例２
シグナル発生における特異性
非相補的標的ヌクレオチド（５’−ＣＴＧＣＴＣＴＡＴＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣ−３’；配列番号：４）は、Biomers.net社（ウルム、ドイツ）から購入した。参考例１に記載した実験を、標的オリゴヌクレオチドを非相補的標的オリゴヌクレオチドに代えて繰り返した。相補的標的オリゴヌクレオチドを可変濃度の非相補的３２−ｍｅｒオリゴヌクレオチドに置換したことにより、相補的標的オリゴヌクレオチドの非存在下におけるのと同じ蛍光シグナルを生じ；可変濃度の非相補的標的オリゴヌクレオチドの存在下ではゼロ濃度の標的オリゴヌクレオチド；すなわちブランク対照と比較して、検出可能なシグナル差は観察されなかった。これは、本発明のシグナル発生機序は、高度に特異的であり、かつ２つの同時に起こる生体分子認識事象に依存するということを示す。
【０１３７】
参考例３
発光スペクトルおよび蛍光寿命
追加的プローブ、アミノ修飾プローブＣオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣ（Ｃ２ｄＴ）Ｃ−３’；配列番号：５）は、シグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ＭＩ）から購入し、本来蛍光である２，２’，２’’，２’’’−［［４−［（４−イソチオシアネートフェニル）エチニル］ピリジン−２，６−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）（Ｅｕ3+−７ｄ；図８ｃに概略構造）により標識した。プローブＣ（５ｎｍｏｌ）を、２０倍モル過剰のＥｕ3+−７ｄと５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）中、＋３７℃で一晩インキュベートし、参考例１にＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１について記載したように精製した。
【０１３８】
本来蛍光であるＥｕ3+−キレート標識プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄ、ならびに別にプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナとの標的オリゴヌクレオチド指向錯体の蛍光スペクトルおよび発光寿命をVarian Cary Eclipse蛍光分光光度計（バリアン  サイエンティフィック  インスツルメント社、マルグレーブ、オーストラリア）により測定した。標的オリゴヌクレオチド（０または１０ｎＭ）をプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−３ｄ−アンテナ（５０ｎＭ）とアッセイ緩衝液中で混合し、測定前にＲＴで３０分間インキュベートした。０ｎＭ（細線）および１０ｎＭ（太線）の標的オリゴヌクレオチドによる蛍光スペクトルを図１０ａに説明する。錯体の蛍光特性を、本来蛍光であるＥｕ3+−キレートの蛍光特性と比較するために、プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄをアッセイ緩衝液中、５０ｎＭの濃度に希釈し、スペクトルを測定した。プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄの蛍光スペクトルは、図１０ｂに示す。標的オリゴヌクレオチドの存在下でプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１とプローブＢ−３ｄ−アンテナとから形成された錯体は、６１５ｎｍの主要発光ピークを有する本来蛍光であるプローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄと同様の蛍光スペクトルを生じた。標的オリゴヌクレオチドの非存在下では、プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１とプローブＢ−３ｄ−アンテナによる長寿命の蛍光発光は検出されず、結果として平らなスペクトルとなった。１０ｎＭ標的オリゴヌクレオチドの存在下でプローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１とプローブＢ−３ｄ−アンテナとから形成された錯体の蛍光減衰時間は、６１８μｓ（減衰スペクトルは図１０ａに挿入）であり、プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄの蛍光減衰時間は、３８０μｓ（図１０ｂに挿入）であった。これは、混合キレート錯体が、プローブＣ−Ｅｕ3+−７ｄの本来蛍光である七座（dentate）キレートにおけるイオンよりも水分子からより良く保護されることを示す。
【０１３９】
参考例４
ヘテロジニアスな近接プローブに基づくハイブリダイゼーションアッセイ
アミノ修飾プローブオリゴヌクレオチド（プローブＡ、５’−ＣＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣ（Ｃ６ｄＴ）Ｃ−３’；配列番号２、およびプローブＢ、５’−Ｔ（Ｃ２ｄＴ）ＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣ−３’；配列番号３）は、シグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ＭＩ）から購入した。プローブＡは、Ｎ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1、Ｎ2、Ｎ3、Ｎ3−テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）［V.-M. Mukkala et al. (1989) Anal. Biochem., 176: 319］（Ｅｕ3+−Ｎ１；図８ａに概略構造）および本来蛍光である２，２’，２’’，２’’’−［［４−［（４−イソチオシアネートフェニル）エチニル］ピリジン−２，６−ジイル］ビス（メチレンニトリロ）］テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）［H. Takalo et al. (1994) Bioconjugate Chem, 5, 278］（Ｅｕ3+−７ｄ；図８ｃに概略構造）で標識し、プローブＢは、４−（（イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸（アンテナ；図８ｂに概略構造）で標識した。プローブＡの２５ｎｍｏｌおよび５ｎｍｏｌを、それぞれ２０倍モル過剰のＥｕ3+−Ｎ１およびＥｕ3+−７ｄと５０ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）中、＋３７℃で一晩インキュベートした。標識化反応の全量は５０μｌであった。プローブＢのアンテナによる標識化については、アンテナをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（シグマ−アルドリッチ社）に溶解し、水に溶解したオリゴヌクレオチドと混合し、その後、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）を５０ｍＭの濃度まで加えた。標識化反応において、アンテナのモル過剰は全量１１０μｌで５０倍であった。反応物は＋５０℃でゆっくりと回転させながら一晩インキュベートした。
【０１４０】
標識されたプローブの精製はＨＰＬＣ（サーモ  エレクトロン社からの機器、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）で行い、アンテナ標識プローブＢの精製にはサーモ  サイエンティフィック社（ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）のＯＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラムを用い、Ｅｕ3+−Ｎ１およびＥｕ3+−７ｄ標識プローブＡの精製にはフェノメネクス社（トランス、ＣＡ、ＵＳＡ）のＬｕｎａ  Ｃ１８（２）カラムを用いた。精製は、２１分で８６％Ａおよび１４％Ｂから７０％Ａおよび３０％Ｂまでの勾配を用いて、流速０．５ｍＬ／分で行った［Ａ、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸水溶液（ＴＥＡＡ；フルカ  バイオケミカ社、ブックス、スイス）；Ｂ、５０ｍＭ ＴＥＡＡ／アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．ベーカー、フィリップスバーグ、ＮＪ、ＵＳＡ）］。回収した画分から液体を真空下で蒸発させ（Ｈｅｔｏｖａｃ  ＶＲ−１、Ｈｅｔｏ−Ｈｏｌｔｅｎ  Ａ／Ｓ、アレレズ、デンマーク）、ついで再度１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌに溶解した。標識されたプローブは、２６０および３３０ｎｍの吸光度測定値を測定することにより特徴付けされ、全Ｅｕ3+濃度はＤＥＬＦＩＡシステムを用いて測定した（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ワラック、ツルク、フィンランド）。
【０１４１】
ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（５’−ビオチン−ＴＴＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＧＣＡＡＴＧ−３’；配列番号６）は、Biomers.net社（ウルム、ドイツ）から購入した。アッセイは、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ、ピアス  バイオテクノロジー社、ロックフォード、ＩＬ）−活性化［J. Ylikotila et al. (2008) Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, doi:10. 1016/j. colsurfb. 2008. 12. 042］ストレプトアビジン（BioSpa、ミラン、イタリア）でスポットコートされた［L. Vaelimaa et al. (2008) Anal. Bioanal. Chem. 391, 2135］Ｃ８  Ｗｈｉｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc、ロスキレ、デンマーク）において行なった。すべての希釈は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、６００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3、１μＭ ジエチレントリアミン五酢酸を含むアッセイ緩衝液でなされた。ウェルは、ＮａＣｌを最終濃度が６００ｍＭとなるまで補足したＤＥＬＦＩＡ洗浄溶液（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ワラック）で１回事前洗浄した。ビオチン化標的オリゴヌクレオチド（０〜２００ｎＭ）を３０μｌ添加し、プレートを、プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−アンテナまたはプローブＡ−Ｅｕ3+−７ｄを３０μｌに２００ｎＭ添加する前に、ゆっくりと振とうしながら室温で３０分間インキュベートした。振とう３０分後、プレートを前述のように３回洗浄し、３４０ｎｍ励起フィルター、６１５ｎｍ発光フィルター、４００μｓ遅延時間および４００μｓ測定時間を用いることによる、１４２０Victor Multilabel Counter（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ツルク、フィンランド）による時間分解蛍光測定の前に室温で乾燥するまで静置した。
【０１４２】
プローブＡ−Ｅｕ3+−Ｎ１およびプローブＢ−アンテナを用い、ビオチン化された標的オリゴヌクレオチドの濃度を増加させながら得られた結果は、図１１ａに説明され、プローブＡ−Ｅｕ3+−７ｄを用いて得られた結果は、図１１ｂに示す。本発明に記載されている相補キレートアプローチによる近接プローブに基づくアッセイは、同じ蛍光シグナルでより低い蛍光バックグラウンドを可能とし、検出限界の改善という結果をもたらした。これは、本発明がヘテロジニアスアッセイに適用可能であり、アッセイ性能を改善するということを示している。シグナルの発生は、それらの形成に２つの隣接した生体分子認識事象を必要とする混合キレート錯体にのみ制限される。
【０１４３】
参考例５
ストレプトアビジンおよびアビジンのためのホモジニアスな近接プローブに基づくアッセイ
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミン）を、４−（（イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸（アンテナ）にカップリングした。カップリング反応の生成物の概略構造は、図１２ａに説明されている。カップリングのために、（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミンおよびアンテナをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ＭＯ）に溶解し、混合し、その後、炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）を５０ｍＭの濃度まで添加した。カップリング反応において、（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミンのモル過剰は、全量２７０μｌで３倍であった。反応物を＋５０℃でゆっくり回転させながら一晩インキュベートした。
【０１４４】
カップリング反応の精製は、サーモ  サイエンティック社（ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）のＯＤＳ  Ｃ１８ Hypersil columnおよびＨＰＬＣカラムオーブン２１５５（ファルマシア ＬＫＢ社、ウプサラ、スウェーデン）を用いてＨＰＬＣ（機器はサーモ  エレクトロン社、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）で行なった。精製は、３０分で８０％Ａおよび２０％Ｂから０％Ａおよび１００％Ｂまでの勾配を用いて、流速０．５ｍＬ／分、＋５０℃で行なった［Ａ、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸水溶液（ＴＥＡＡ；フルカ バイオケミカ社、ブックス、スイス）；Ｂ、５０ｍＭ ＴＥＡＡ／アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．ベーカー、フィリップスバーグ、ＮＪ、ＵＳＡ）］。回収した画分から液体を真空下（Hetovac VR-1, Heto-Holten A/S, アレレズ、デンマーク）で蒸発させ、ついで１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｗ／ｖ ＮａＮ3に再溶解した。溶解した画分を３３０ｎｍの吸光度測定値を測定することにより特徴付けた。
【０１４５】
Ｎ−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）−５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド（ピアス社、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ）（（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン）を、パーキン  エルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社（ワラックオユ、ツルク、フィンランド）から購入したＮ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）ユーロピウム（III）［Mukkala V.-M., et al. (1989) Anal. Biochem. 176, 319］（Ｅｕ3+1−Ｎ１）にコンジュゲートさせた。カップリング反応の生成物の概略構造は図１２ｂに説明されている。コンジュゲーション反応およびＨＰＬＣによる精製は、以前に記述されているように行なった［Kuningas, T. et al. (2005) Anal. Chem. 77, 2826］。
【０１４６】
アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０μＭジエチレントリアミン五酢酸を含むアッセイ緩衝液において、Nunc社（ロスキレ、デンマーク）から購入したＣ８ White Maxisorpマイクロタイタープレートで行なわれた。ウェルは、ストレプトアビジンまたはアビジンのウェル表面への非特異的結合を防ぐため、事前にウシ血清アルブミンでブロックした。BioSpa社（ミラン、イタリア）のストレプトアビジンまたはシグマのアビジン（０〜１００ｎＭ）および（＋）−ビオチニル−ヘキサンジアミン−アンテナ（コンジュゲートの概略構造は図１２ａ）および（＋）−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン−Ｅｕ3+−Ｎ１（コンジュゲートの概略構造は図１２ｂ）（２０ｎＭ）を混合して全量６０μｌとし、ウェルに添加した。プレートをまず短時間ゆっくりと振とうし、ついで振とうしないで室温で１５分および６０分インキュベートした。時間分解蛍光測定は、３４０ｎｍ励起フィルター、６１５ｎｍ発光フィルター、４００μｓ遅延時間および４００μｓ測定時間を用いることにより、１４２０Victor Multilabel Counter（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  ライフ  サイエンス社、ツルク、フィンランド）で行なった。
【０１４７】
ストレプトアビジンの濃度を増加させながら得られた結果は、図１３ａに示され、アビジンによる結果は図１３ｂに示されている。結果は、本発明が多量体タンパク質（ストレプトアビジンおよびアビジンは四量体タンパク質）の検出にも適用できるということを示している。標識部分、すなわちランタニドイオンキャリアキレートおよびアンテナ配位子は、適切な距離でタンパク質分子上の別々の結合部位を有するそのような生体分子認識エレメントにカップリングされる。参考例において、ビオチン結合部位は同一であり、ストレプトアビジンの各モノマーにそれらの１つが存在する。
【０１４８】
参考例６
テルビウム（III）イオンを用いるホモジニアスなハイブリダイゼーションアッセイ
合成標的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＴＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＧＴＡＧＣＡＡＴＧ−３’；配列番号１）およびアミノ修飾プローブＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＡＴＴＧＣＴＡＣＧＡＴＣＣ（Ｃ２ｄＴ）Ｃ−３’；配列番号２）は、シグマ−アルドリッチ社（セントルイス、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入し、アミノ修飾プローブＢオリゴヌクレオチド（５’−Ｔ（Ｃ２ｄＴ）ＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣ−３’；配列番号３）はサーモ  サイエンティフィック社（ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。プローブＡは、３’端付近に位置する第一級アミノ基修飾で、Ｔｂ3+イオンキャリアキレート、（Ｎ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）テルビウム（III）、Ｔｂ3+−Ｎ１）により標識し、そしてプローブＢは、５’端付近で、集光性アンテナ配位子（４−（３−（４−イソチオシアネートフェネチル）−２，４，６−トリメトキシフェニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸、ＴＭＰ−アンテナ）により標識した。プローブＡ（１０ｎｍｏｌ）を２０倍モル過剰のＴｂ3+−Ｎ１と、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）中、＋３７℃で一晩インキュベートした。標識化反応の全量は５０μＬであった。プローブＢのＴＭＰ−アンテナによる標識化については、ＴＭＰ−アンテナを７５％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（シグマ−アルドリッチ）中に溶解し、オリゴヌクレオチドと混合し、そしてその後、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）を５０ｍＭの濃度まで添加した。標識化反応において、ＴＭＰ−アンテナのモル過剰は全量７０μＬにおいて５０倍であった。反応物はゆっくりと回転させながら＋５０℃で一晩インキュベートした。
【０１４９】
コンジュゲーション反応からの標識されたプローブの精製は、まずＮＡＰ−５セファデックスカラム（ＧＥヘルスガレ社、バッキンガムシャー、英国）を用いてゲルろ過により行い、その後、ＨＰＬＣ（サーモ  エレクトロン社からの機器、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）で行い、ＴＭＰ−アンテナ標識プローブＢの精製にはサーモ  サイエンティフィック社のＯＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラムを用い、Ｔｂ3+−Ｎ１−標識プローブＡの精製にはフェノメネクス社（トランス、ＣＡ、ＵＳＡ）のＬｕｎａ  Ｃ１８（２）カラムを用いた。ゲルろ過からの溶出液は、真空下（Hetovac VR-1, Heto-Holten A/S, アレレズ、デンマーク）で蒸発させ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、ＨＰＬＣ精製に使用した。ＨＰＬＣ精製は、２１分で８６％Ａおよび１４％Ｂから７０％Ａおよび３０％Ｂまでの勾配を用いて、流速０．５ｍＬ／分で行った（Ａ、５０ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸水溶液（ＴＥＡＡ；フルカ  バイオケミカ、ブックス、スイス）；Ｂ、５０ｍＭ ＴＥＡＡ／アセトニトリル（Ｊ．Ｔ．ベーカー、フィリップスバーグ、ＮＪ、ＵＳＡ））。回収した画分から液体を真空下で蒸発させ、ついで再度１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌに溶解した。標識されたプローブは、２６０および３３０ｎｍの吸光度測定値を測定することにより特徴付けされ、全Ｔｂ3+濃度はＤＥＬＦＩＡ技術を用いて測定した（パーキンエルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  サイエンス社、ワラック、ツルク、フィンランド）。カップリング反応の精製は、精製効率を改善するために、２つの異なる方法を含めた。
【０１５０】
アッセイは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、600ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ ＮａＮ3、および３０μＭジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を含有するアッセイ緩衝液において、Nunc社（ロスキレ、デンマーク）から購入した低蛍光９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを用いることにより行なった。プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナ（１０または５０ｎＭ）および標的オリゴヌクレオチド（０〜５０ｎＭ）を混合して全量６０μＬとし、ウェルに加えた。プレートを、まず短時間ゆっくりと振とうし、ついで振とうしないで室温で４５分間インキュベートした。時間分解蛍光測定は、３４０ｎｍ励起フィルター、５４５ｎｍ発光フィルター、４００μｓ遅延時間および１２００μｓ測定時間を用い、２０００測定サイクル計測することにより、１４２０Victor Multilabel Counter（パーキン−エルマー  ライフ  アンド  アナリティカル  ライフ  サイエンス社、ツルク、フィンランド）で行なった。
【０１５１】
テルビウムキレート相補アッセイについて、３２−ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチドに相補的な２つの１６−ｍｅｒプローブを使用した：３’端の１ヌクレオチド内部に位置するアミノ修飾チミンで、テルビウムイオンキャリアキレート（Ｎ1−（４−イソチオシアネートベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−テトラキス（アセテート）テルビウム（III）、Ｔｂ3+−Ｎ１、図１４ａ）により標識されたプローブＡ、および５’端の１ヌクレオチド内部に位置するアミノ修飾チミンで、反応性集光性アンテナ（４−（３−（４−イソチオシアネートフェネチル）−２、４、６−トリメトキシフェニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸、ＴＭＰ−アンテナ図１４ｂ）により標識されたプローブＢ。プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナのお互いへの親和性は最小であるため、相補的標的オリゴヌクレオチドの非存在下では蛍光を検出することはできない。標的オリゴヌクレオチドの存在下で、プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナは、標的にハイブリダイズし、Ｔｂ3+−Ｎ１およびＴＭＰ−アンテナは、大きなストークシフト、鋭い発光ピークおよび長い蛍光寿命を伴い特定の波長で蛍光を発する錯体を形成する。
【０１５２】
プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナと標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後のＴｂ3+−特異的蛍光は、図１５に表す。プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナの量は、標的オリゴヌクレオチドの量が変化するあいだ一定（１０ｎＭ、四角で示される結果、または５０ｎＭ、円で示される結果のいずれも）であった。５４５ｎｍでの主要発光ピークで時間分解発光が測定された。検出限界は、標的オリゴヌクレオチドの１００ｐｍｏｌ／ｌ濃度よりも低く、本発明者らのアッセイにおけるダイナミックレンジは４桁までにおよんだ。ＤＴＰＡは、３０μＭ濃度で存在した。この結果により、本発明は適切な集光性アンテナ配位子を選択することにより他の蛍光ランタニドイオンに容易に移転できるということを示している。
【０１５３】
参考例７
テルビウム（III）イオンによる発光スペクトルおよび発光寿命
プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナの標的オリゴヌクレオチド指向錯体の蛍光スペクトルおよび発光寿命をVarian Cary Eclipse 蛍光分光光度計（バリアン  サイエンティフィック  インスツルメント社、マルグレーブ、オーストラリア）を用いて測定した。標的オリゴヌクレオチド（０または１０ｎＭ）をプローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１（５０ｎＭ）およびプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナ（５０ｎＭ）とアッセイ緩衝液中で混合し、測定前にＲＴで６０分間インキュベートした。
【０１５４】
標的オリゴヌクレオチドの存在下（図１６；太い線）でプローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１とプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナとから形成された錯体は、５４５ｎｍの主要発光ピークを有する蛍光スペクトルを生じた。標的オリゴヌクレオチドの非存在下（細い線）では、プローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１とプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナによる蛍光発光は検出されなかった。１０ｎＭ標的オリゴヌクレオチドの存在下でプローブＡ−Ｔｂ3+−Ｎ１とプローブＢ−ＴＭＰ−アンテナとから形成された錯体の蛍光減衰時間を測定した。発光寿命（減衰スペクトルは図１６に挿入）は、二重指数関数的（double exponential）であり、より短い成分が１０５μｓの寿命を有し、より長い成分は４００μｓを有した。これにより、カップリングリンカー（標識部分の距離と方向に影響を与える）は、たとえば、それらの構造次元が変化するので、生体分子認識事象により方向付けられるキレート相補性の効率に影響を与える種々のアンテナ配位子に対して、最適化されなければならない。
【０１５５】
実施例８
オリゴヌクレオチド指向キレート相補アッセイ（ＯＣＣＡ）
検出技術の性能は、閉管リアルタイムＰＣＲにおいて、合成鋳型（５’ＣＴＴＣＡＧＣＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＣＴＣＡＡＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧＡＧＡＡＡＣＧＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＧＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＧＡＴＡＣＧＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＡＴＣＴＴＴＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＣＴＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧ３’；配列番号７；サーモ  サイエンティフィック社、ＵＳＡ）の０〜１０5分子を増幅することにより調べた。リアルタイムＰＣＲは、光学キャップ（MicroAmp（登録商標）、光学８−キャップストリップ、アプライド バイオシステムズ社、ＵＳＡ）を閉めた９６ウェルＰＣＲプレート（Thermo-Fast（登録商標）96 Robotic PCR Plate、サーモ  サイエンティフィック社）を用いて行った。各４０μｌＰＣＲ反応は、５００ｎＭプライマー（５’プライマー  ５’ＣＴＧＴＡＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＡＧＣ３’；配列番号８および３’プライマー  ５’ＡＡＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＴＡＣＧＣＴＣＡＡＧＣ３’；配列番号９；サーモ  サイエンティフィック社）、（２，２’，２’’−（１０−（３−イソチオシアネートベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸；図８ｄ）の非蛍光Ｅｕ3+イオンキャリアキレートで標識されたプローブＡ（５’ＡＡＴＣＧＴＡＴＣＴＣＧＧＧＴＴＡＡＴＧ［ＡｍＣ７］；配列番号１０；サーモ  サイエンティフィック社）５０ｎＭ、集光性アンテナ配位子（４−（（４−イソチオシアネートフェニル）エチニル）ピリジン−２，６−ジカルボン酸）［U. Karhunen et al., Anal Chem, 82 (2010) 751］で標識されたプローブＢ（５’Ｔ（ＡｍＣ２ｄＴ）ＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＡ３’３’リン酸塩；配列番号１１；サーモ  サイエンティフィック社）５０ｎＭ、３０μＭ ＤＴＰＡ、４００μＭ ｄＮＴＰｓ、０．６μｌ ＰｈｉｒｅホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes社、フィンランド）Ｐｈｉｒｅ反応緩衝液（Finnzymes社）および各種量の合成一本鎖オリゴヌクレオチド鋳型を含む。熱サイクルは、９８℃で２分の初期変性およびポリメラーゼ活性化ステップ、その後、９８℃で１５秒、６０℃で２０秒および７２度で１５秒を８サイクル；９８℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で１５秒、９８℃で１５秒、６０℃で２０秒、７２℃で１５秒、９４℃で１５秒および３０℃で３０秒を１７サイクルから構成された。その熱サイクルは、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（ＭＪ リサーチ、ＵＳＡ）を用いて行われ、時間分解蛍光はサイクル９で開始して、３４０ｎｍ励起フィルター、６１５ｎｍ発光フィルター、４００μｓ遅延時間および４００μｓ測定時間を用い、１０００測定サイクル計測することにより、Victor１４２０Multilabel Counter（パーキンエルマー  ライフ  サイエンス社、フィンランド）で３０℃で測定した。各蛍光測定のために、ＰＣＲプレートは、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラーからVictor１４２０Multilabel Counterへ一時的に移された。
【０１５６】
各種量のオリゴヌクレオチド鋳型が増幅され、リアルタイムＰＣＴにおいて測定された。プローブＡおよびプローブＢと標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後のＥｕ3+特異的蛍光は、図１７に示す。増幅プロットは、ＰＣＲサイクル数の関数として各蛍光測定値をプロットすることにより作成した。
【０１５７】
他の好ましい態様
当然のことながら、本発明の方法は、多種多様な態様の形態で組み込まれることができ、本明細書に開示されているのはそのうちの数例のみである。他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱しないことは当業者には明らかである。したがって、記載された実施態様は、説明のためのものであり、制限的なものとして解釈されるべきものではない。
【図１】
0005841525.tif 000008
【図２】
0005841525.tif 000009
【図３】
0005841525.tif 000010
【図４】
0005841525.tif 000011
【図５−ｉ】
0005841525.tif 000012
【図５−ｉｉ】
0005841525.tif 000013
【図５−ｉｉｉ】
0005841525.tif 000014
【図５−ｉｖ】
0005841525.tif 000015
【図６】
0005841525.tif 000016
【図７−ｉ】
0005841525.tif 000017
【図７−ｉｉ】
0005841525.tif 000018
【図７−ｉｉｉ】
0005841525.tif 000019
【図８ａ】
0005841525.tif 000020
【図８ｂ】
0005841525.tif 000021
【図８ｃ】
0005841525.tif 000022
【図８ｄ】
0005841525.tif 000023
【図９】
0005841525.tif 000024
【図１０ａ】
0005841525.tif 000025
【図１０ｂ】
0005841525.tif 000026
【図１１ａ】
0005841525.tif 000027
【図１１ｂ】
0005841525.tif 000028
【図１２ａ】
0005841525.tif 000029
【図１２ｂ】
0005841525.tif 000030
【図１３ａ】
0005841525.tif 000031
【図１３ｂ】
0005841525.tif 000032
【図１４ａ】
0005841525.tif 000033
【図１４ｂ】
0005841525.tif 000034
【図１５】
0005841525.tif 000035
【図１６】
0005841525.tif 000036
【図１７】
0005841525.tif 000037
【配列表】
0005841525000001.app