(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸を宿主微生物に導入してなり、アルデヒドを基質として炭化水素を合成するアルデヒドデカルボニラーゼ活性を有する組換え微生物。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アシルCoからアルデヒド化合物を合成する活性を有するタンパク質
【請求項２】
上記宿主微生物が大腸菌、コリネ菌及び酵母からなる群から選ばれる微生物であることを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
【請求項３】
上記宿主微生物は、アルデヒドを基質として炭化水素を合成するアルデヒドデカルボニラーゼをコードする核酸を有することを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
【請求項４】
炭素数１３〜１５の炭素鎖を有する炭化水素を生成することを特徴とする請求項１記載の組換え微生物。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれか一項記載の組換え微生物を炭素源を含む培地にて培養する工程と、培養後の組換え微生物内から目的物質を回収する工程とを含む物質製造方法。
【請求項６】
上記目的物質は、脂肪族アルデヒド、当該脂肪族アルコール及び炭化水素からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項５記載の物質製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的物質の生産に関与する遺伝子を導入した組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルデヒドやアルコール、アルカン、アルケン及びアルキン等の炭化水素を合成できる微生物が知られている。特許文献１（特表２０１１−５２０４５５号公報）には、Synechococcus elongatus由来のアルカン合成酵素遺伝子やアルデヒド合成酵素遺伝子が開示されており、これらを利用してアルカンやアルデヒドを製造する方法が開示されている。
【０００３】
また、特許文献２（特開２００２−２２３７８８号公報）には、アシルレダクターゼ遺伝子が導入された形質転換植物を利用して、CoA及び／又はACPと結合した脂肪アシル基を基質としてアルコールを生産することが開示されている。なお、特許文献２は、緑藻からアシルレダクターゼ遺伝子を単離すると記載するものの、実際に形質転換植物を作出したことを開示するものではない。
【０００４】
さらに、特許文献３（特表２０１３−５２８０５７号公報）には、クロストリジウム・クルイベリ由来の脂肪酸アシルCoAリダクターゼを作製し、他の脂質合成関連遺伝子とともに大腸菌を形質転換したことが開示されている。
【０００５】
さらにまた、特許文献４（特表２０１２−５０６７１５号公報）には、カルボン酸をアルデヒドに還元する脂肪アルデヒド生合成ポリペプチドまたはその変異体をコードする遺伝子を宿主内で発現させて脂肪アルデヒドを合成し、脂肪アルデヒドからアルコールを製造する、脂肪アルコールの製造方法が開示されている。
【０００６】
さらにまた、特許文献５（特表２０１１−５１２８４８号公報）には、マロニル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＳ代謝経路およびアシル還元代謝経路を使用して第一級アルコールを生産できる微生物を遺伝子工学により作製するための方法が開示されている。
【０００７】
さらにまた、特許文献６（特表２０１０−５２８６２７号公報）には、クロレラ属の微細藻類に油脂産生に関与する遺伝子群を導入することで油成分を製造する方法が開示されている。
【０００８】
さらにまた、特許文献７（特表２０１２−５１１９２８号公報）には、スクシニル-CoA：3-ケト酸-CoAトランスフェラーゼ等のイソプロパノール経路酵素をコードする核酸を導入した微生物及び当該微生物を用いたイソプロパノールの製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２０１１−５２０４５５号公報
【特許文献２】特開２００２−２２３７８８号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２８０５７号公報
【特許文献４】特表２０１２−５０６７１５号公報
【特許文献５】特表２０１１−５１２８４８号公報
【特許文献６】特表２０１０−５２８６２７号公報
【特許文献７】特表２０１２−５１１９２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、微生物において、優れた活性を示すアシルCoAリダクターゼは知られておらず、脂肪酸アシルCoAを基質とした還元反応で生成するアルデヒド、当該アルデヒドを基質として生成するアルコールや炭化水素の生産性が低いといった問題があった。
【００１１】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、アシルCoAを基質とした還元反応について優れた活性を示すアシルCoAリダクターゼを導入した組換え微生物及び当該組換え微生物を用いた物質製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、特定のアルデヒドデヒドロゲナーゼが、アシルCoAからアルデヒド化合物を合成する活性を有することを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１３】
（１）  以下（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸を宿主微生物に導入してなる組換え微生物。
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、アシルCoからアルデヒド化合物を合成する活性を有するタンパク質
（２）  上記宿主微生物が大腸菌、コリネ菌及び酵母からなる群から選ばれる微生物であることを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（３）  アルデヒドを基質として炭化水素を合成するアルデヒドデカルボニラーゼ活性を有することを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（４）  上記宿主微生物は、アルデヒドを基質として炭化水素を合成するアルデヒドデカルボニラーゼをコードする核酸を有することを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（５）  炭素数１３〜１５の炭素鎖を有する炭化水素を生成することを特徴とする（１）記載の組換え微生物。
（６）  上記（１）乃至（５）いずれかに記載の組換え微生物を炭素源を含む培地にて培養する工程と、培養後の組換え微生物内から目的物質を回収する工程とを含む物質製造方法。
（７）  上記目的物質は、脂肪族アルデヒド、当該脂肪族アルコール及び炭化水素からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする（６）記載の物質製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る組換え微生物は、脂肪酸アシルCoAを基質とした還元反応について優れた活性を示すアシルCoAリダクターゼを発現することから、脂肪酸アシルCoAをアシルCoAリダクターゼにて還元した脂肪族アルデヒド、当該脂肪族アルデヒドからの脂肪族アルコール及び炭化水素の生産性に優れる。
【００１５】
本発明に係る物質製造方法は、脂肪酸アシルCoAをアシルCoAリダクターゼにて還元した脂肪族アルデヒド、当該脂肪族アルデヒドからの脂肪族アルコール及び炭化水素の生産性に優れる組換え微生物を利用するため、これら脂肪族アルデヒド、脂肪族アルコール及び炭化水素等の物質の生産性を大幅に向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例で作製した２つの発現ベクター（pCDFDuet-1及びpRSFDuet-1）の構成を概略的に示す図である。
【図２】実施例で作製した組換え大腸菌を破砕した懸濁液をGC/MS分析した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。
【００１８】
本発明に係る組換え微生物は、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸を導入したものである。本発明に係る組換え微生物は、当該アシルCoAリダクターゼを発現することで、脂肪酸とCoAとのチオエステル化合物であるアシルCoA（脂肪酸アシルCoAと称する場合もある）を還元してアルデヒド化合物を高生産できるといった特徴を有する。生産されたアルデヒド化合物は、当該微生物内の代謝反応により酸化されアルコールとなるか、炭化水素合成活性を有する酵素により炭化水素合成の基質として使用される。したがって、本発明に係る組換え微生物は、当該アシルCoAリダクターゼを発現することでアルデヒド化合物を高生産できるといった特徴に加え、当該アルデヒド化合物に基づくアルコールを高生産する、及び/又は当該アルデヒド化合物に基づく炭化水素を高生産するといった特徴を有する。
【００１９】
なお、核酸とは、DNA及びRNAといった天然に存在する核酸、PNA（ペプチド核酸）や塩基・糖・リン酸ジエステル部に化学修飾を加えた核酸分子などの人工核酸を含む意味である。また、アシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、ゲノムに存在する発現調節領域及びコーディング領域を含む領域、及びゲノムに存在するコーディング領域のみからなる領域の両者を含む意味である。
【００２０】
なお、アシルCoAは、宿主微生物内の代謝反応により糖から合成される。糖とはCn(H2O)mの化学式で表される物質で、多価アルコールのアルデヒド、ケトン誘導体、それらに近縁の誘導体や縮合体を含め、多糖・オリゴ糖（少糖）・二糖・単糖も含む意味である。単糖の具体的な例としては、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、ガラクトース、マンノース、キシロース、キシルロース、リボース、エリトロース、トレオース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトンなどが挙げられ、二糖の具体的な例としては、スクロース（サッカロース・蔗糖）、ラクトース（乳糖）、マルトース（麦芽糖）、トレハロース、セロビオースなどが挙げられる。
【００２１】
<アシルCoAリダクターゼ>
本発明に係る組換え微生物において、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸とは、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである。なお、配列番号２に示すアミノ酸配列は、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NBRC3321のゲノム解析において、公知のアルデヒドデヒドロゲナーゼ（AldDH）と類似する配列として同定することができる。但し、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質の機能等については未知である。
【００２２】
また、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、配列番号２に示したアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含み、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。
【００２３】
特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号２に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記アシルCoAリダクターゼをコードする核酸の塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。
【００２４】
また、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号２に示したアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)又は同一性（identity）が例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上であるアミノ酸配列を有し、且つ、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であっても良い。類似度及び同一性の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。
【００２５】
より具体的に、配列番号２に示したアミノ酸配列に基づいて、いわゆるBlast Searchプログラムを用いて、タンパク質のアミノ酸配列を格納したデータベースを検索した結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１に示すように、配列番号２に示したアミノ酸配列対して７５％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子として９種類の遺伝子を同定することができる。これら９種類の遺伝子は、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質に対して７５％以上といった極めて高い相同性を有するため、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するタンパク質と同様に、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードしている。
【００２８】
さらに、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号２に示したアミノ酸配列をコードする核酸（例えば配列番号１の塩基配列を有する核酸）に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を挙げることができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、45℃、6×SSC（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の50〜65℃、0.2〜1×SSC、0.1％SDSでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、65〜70℃、1×SSCでのハイブリダイゼーション、その後の65〜70℃、0.3×SSCでの洗浄を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００２９】
さらにまた、特定のアシルCoAリダクターゼをコードする核酸としては、例えば、配列番号２に示したアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、且つ、アシルCoAリダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸であっても良い。ここで、保存的なアミノ酸置換とは、以下のように定義することができる。すなわち、参考文献(1)（「マッキー生化学」第3版  5章アミノ酸・ペプチド・タンパク質  5.1アミノ酸、監修：市川厚、監訳：福岡伸一、発行者：曽根良介、発行所：(株)化学同人、ISBN4-7598-0944 -9）でも記載されているように、アミノ酸は同様の性質（化学的性質や物理的大きさ）を持つ側鎖に従って分類される事がよく知られる。また、タンパク質の活性を保持したまま、所定のグループに分類されるアミノ酸残基間における分子進化上の置換が頻度高く起こることがよく知られる。この考えを基に、参考文献(2)： Henikoff S., Henikoff J.G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919 (1992)中の、Fig.2でアミノ酸残基の置換変異のスコアマトリックス（BLOSUM）が提唱され、広く使用されている。参考文献(2)では、側鎖の化学的性質が似たもの同士のアミノ酸置換は、タンパク質全体に与える構造や機能変化が少なくなると言う知見に基づくものである。上記参考文献(1)及び(2)によれば、マルチプルアラインメントで考慮するアミノ酸の側鎖のグループは、化学的性質や物理的大きさなどの指標を基にして考えることができる。これは、参考文献(2)に開示されたスコアマトリックス（BLOSUM）において、スコアの0以上の値を持つアミノ酸、好ましくは1以上の値を持つアミノ酸のグループとして示される。代表的なグループとしては、下記の８つが上げられる。その他の細かいグループ分けは、当該スコアの値の0以上同士のアミノ酸グループ、好ましくは1以上同士のアミノ酸グループ、さらに好ましくは2以上のアミノ酸グループであれば良い。
【００３０】
１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）
このグループは、上記参考文献(1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪属性の疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり、V(Val、バリン)、L(Leu、ロイシン)、I(Ile、イソロイシン)及びM(Met、メチオニン)から構成される。参考文献(1)による中性非極性アミノ酸と分類されるもののうちFGACWPは以下理由で、この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。G(Gly、グリシン)やA(Ala、アラニン)はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。C(Cys、システイン)はS-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子と水素結合を形成する特性があるからである。F(Phe、フェニルアラニン)やW(Trp、トリプトファン)は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強いからである。P(Pro、プロリン)はイミノ酸効果が強く、ポリペプチドの主鎖の角度を固定してしまうからである。
【００３１】
２）ヒドロキシメチレン基をもつグループ（STグループ）
このグループは、中性極性アミノ酸のうちヒドロキシメチレン基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、S(Ser、セリン)とT(Thr、スレオニン)から構成される。SとTの側鎖に存在する水酸基は、糖の結合部位であるため、あるポリペプチド（タンパク質）が特定の活性を持つために重要な部位である場合が多い。
【００３２】
３）酸性アミノ酸（DEグループ）
このグループは、酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、D(Asp、アスパラギン酸)とE(Glu、グルタミン酸)から構成される。
【００３３】
４）塩基性アミノ酸（KRグループ）
このグループは、塩基性アミノ酸のグループであり、K(Lys、リジン)とR(Arg、アルギニン)から構成される。これらKとRは、pHの広い範囲で正に帯電し塩基性の性質をもつ。一方、塩基性アミノ酸に分類されるＨ(His、ヒスチジン)はpH7においてほとんどイオン化されないので、このグループには分類されない。
【００３４】
５）メチレン基＝極性基（DHNグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持ち、N(Asn、アスパラギン、極性基はアミド基)、D(Asp、アスパラギン酸、極性基はカルボキシル基)とH(His、ヒスチジン、極性基はイミダゾール基)から成る。 
【００３５】
６）ジメチレン基＝極性基（EKQRグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるジメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。E(Glu、グルタミン酸、極性基はカルボキシル基)、K(Lys、リジン、極性基はアミノ基)、Q(Gln、グルタミン、極性基はアミド基)、R(Arg、アルギニン、極性基はイミノ基とアミノ基)から成る。
【００３６】
７）芳香族（FYWグループ）
このグループには、側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、芳香族特有の化学的性質を特徴とする。F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、W(Trp、トリプトファン)から成る。
【００３７】
８）環状＆極性（HYグループ）
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、H(H、ヒスチジン、環状構造と極性基は共にイミダゾール基)、Y(Tyr、チロシン、環状構造はベンゼン核で極性基は水酸基)から成る。
【００３８】
上記のアミノ酸グループに基づき、ある機能を有するタンパク質のアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基を同一のグループに属するアミノ酸残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。たとえば上記「１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）」に基づき、ある機能を有するタンパク質のアミノ酸配列中のイソロイシン残基をロイシン残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。ある機能を有するタンパク質が複数ある場合には、コンセンサス配列としてアミノ酸配列を記載する場合もあるが、この場合でもあるアミノ酸残基を同一のグループに属するアミノ酸残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。たとえば、ある機能を有するタンパク質が複数あり、そこから算出されたコンセンサス配列中のアミノ酸残基がイソロイシンまたはロイシン（Ｌ／Ｉ）の時、上記「１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）」に基づき、イソロイシンまたはロイシン残基をメチオニンまたはバリン残基に置換しても同様の機能を有する新規タンパク質が得られることが容易に予想できる。
【００３９】
なお、所定の塩基配列からなる核酸が、上述したアシルCoAリダクターゼをコードしているかは、該核酸を適当なプロモーターとターミネーター等の間に組み込んだ発現ベクターを作製し、この発現ベクターを用いて適当な宿主を形質転換し、発現するタンパク質のアシルCoAリダクターゼ活性を測定すればよい。ここでアシルCoAリダクターゼ活性を測定するには、上記形質転換体を炭素源を含む培地にて培養し、合成されたアルデヒド化合物又はアルデヒド化合物に由来するアルコールをガスクロマトグラフィー/質量分析装置等によりにより測定すればよい。なお、形質転換体を培養する際には、培地にアシルCoAを添加しても良い。
【００４０】
<発現ベクター及び宿主微生物>
以上で説明したアシルCoAリダクターゼをコードする核酸は、適当な発現ベクターに組み込まれ、宿主微生物に導入される。ここで、宿主微生物としては、アシルCoAリダクターゼを発現できる微生物であれば特に限定されるものではない。宿主としては、例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などのエッシェリヒア属、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)などのコリネ菌、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などのバチルス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などのシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などのリゾビウム属に属する細菌が挙げられ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母、糸状菌などを含む真菌が挙げられる。
【００４１】
大腸菌などの細菌を宿主とする場合、発現ベクターは、該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、上述した遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、発現ベクターには、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４２】
大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリBL21(DE3)株、K12株、DH1株、JM109株など従来公知の如何なる菌株を使用することができる。大腸菌としては、特にK12株及びK12株から作製された株などの所謂K株を使用することができる。また、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス168株などが挙げられる。
【００４３】
プロモーターとしては、大腸菌などの宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの大腸菌由来のものやT7プロモーターなどのファージ由来のものが用いられる。さらに、tacプロモーターなどのように人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００４４】
発現ベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法[Cohen, S.N.,et al.:Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69:2110-2114 (1972)]、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００４５】
また、宿主として用いることができる酵母としては、特に限定するものではないがCandida Shehatae等のCandida属酵母、Pichia stipitis等のPichia属酵母、Pachysolen tannophilus等のPachysolen属酵母、Saccharomyces cerevisiae等のSaccharomyces属酵母及びSchizosaccharomyces pombe等のSchizosaccharomyces属酵母が挙げられ、特にSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。
【００４６】
また、上述したアシルCoAリダクターゼの発現を強化する際には、転写活性の高い適当なプロモーターを使用する。このようなプロモーターとしては、特に限定されないが、例えばグリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（TDH3）のプロモーター、3-ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（PGK1）のプロモーター、高浸透圧応答７遺伝子（HOR7）のプロモーターなどが利用可能である。なかでもピルビン酸脱炭酸酵素遺伝子（PDC1）のプロモーターが下流の目的遺伝子を高発現させる能力が高いために好ましい。その他にも、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、AOX1プロモーターなどを使用することで、下流の遺伝子を強発現させることができる。
【００４７】
また、上述した遺伝子を導入する方法としては、酵母の形質転換方法として知られている従来公知のいかなる手法をも適用することができる。具体的には、例えば、エレクトロポレーション法“Meth. Enzym., 194, p182 (1990)”、スフェロプラスト法“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)”、酢酸リチウム法“J.Bacteriology, 153, p163(1983)”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法で実施可能であるが、これに限定されない。
【００４８】
ところで、上述したアシルCoAリダクターゼをコードする核酸は、アルデヒド化合物を基質とした炭化水素合成能を有する微生物に導入されることが好ましい。この場合、上述したアシルCoAリダクターゼを発現する組換え微生物は、アルデヒド化合物から炭化水素を高生産することができる。例えば上述した微生物に対して、デカルボニラーゼ活性を有する酵素（脱CO酵素）をコードする核酸を導入することによって、アルデヒド化合物から炭化水素を合成する能力を有する組換え微生物を製造することができる。このように得られた組換え微生物或いは本来的にデカルボニラーゼ活性を有する微生物を宿主として、上述したアシルCoAリダクターゼを導入することで、非常に高収率で炭化水素を合成することができる。
【００４９】
デカルボニラーゼ活性を有する酵素としては、特に限定されず、従来公知の酵素を適用することができる。例えば、WO2006/109558に開示された、炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス・エリプソイディア（Pseudochoricystis ellipsoidea）や、シュードコリシスチス（Pseudochoricystis）属或いはコリシスチス（Choricystis）属に属する炭化水素生産能を有する微細藻類を培養することで、培養物から炭化水素を採取する方法が開示されている。これらの生物からデカルボニラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を単離して使用することができる。特開2010-528627号公報に開示されたアルデヒドをアルカンに転換する遺伝子、特表2011-520455号公報に開示されたSynechococcus elongatus由来のアルカン合成酵素遺伝子やアルデヒド合成酵素遺伝子を利用することもできる。さらにまた、特開平09-322780号公報に開示されたアラビドプシス・サリアナ由来の脂肪アルデヒドデカルボニラーゼ活性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を利用することもできる。
【００５０】
さらにまたWO2013/129393には、所定のモチーフ配列を含み、デカルボニラーゼ活性を有する酵素をコードする炭化水素合成遺伝子が開示されている。WO2013/129393に開示された炭化水素合成酵素遺伝子を利用することで、上述したような炭化水素の高生産が可能となる。
【００５１】
このように、デカルボニラーゼをコードする核酸を導入した組換え微生物、例えば組換え大腸菌、組換え酵母は、上記デカルボニラーゼが発現することによってアルデヒド化合物及びNADH等の補酵素が存在すれば、当該アルデヒド化合物から炭化水素を合成することができる。
【００５２】
ここで、合成可能な炭化水素は、鎖状構造からなる炭化水素（鎖式炭化水素）及び環構造からなる炭化水素（環式炭化水素）の両方である。なお、鎖状構造からなる炭化水素は、１以上の分岐を有する構造であってもよい。分岐としては、メチル基、エチル基、プロピル基及びブチル基（tert-ブチル基を含む）等のアルキル基、アルキニル基、アルケニル基等を挙げることができる。また、分岐としては、クロロメチル基、アセチル基、2-ピリジル基、ヒドロキシフェニル基、アミノアセチル基、メトキシ基、フェノキシ基、メチルチオ基、フェニルチオ基等を挙げることができる。さらに、合成対象の炭化水素は飽和炭化水素（アルカン）でもよいし、不飽和炭化水素（アルケン及びアルキン）でもよい。
【００５３】
一方、合成対象の炭化水素の炭素数としては、特に限定されないが、常温で液体である炭素数５〜２０程度であることが好ましい。また、合成対象の炭化水素としては、ディーゼル燃料としての用途を考慮して炭素数１０〜２０の飽和炭化水素が好ましく、特に炭素数１２〜１４の飽和炭化水素がより好ましく、特に炭素数１３の飽和炭化水素が最も好ましい。より具体的に、合成対象の炭化水素としは、炭素数１２のドデカン、炭素数１３のトリデカン及び炭素数１４のテトラデカンを挙げることができる。
【００５４】
<物質製造方法>
本発明に係る組換え微生物は、上述したように、アシルCoAを基質としてアルデヒド化合物を合成する活性に優れている。したがって、本発明に係る組換え微生物を利用することによって、アルデヒド化合物、アルデヒド化合物から合成されるアルコール及び炭化水素からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を製造することができる。
【００５５】
例えば、本発明に係る組換え微生物を、グルコース（ブドウ糖）、フルクトース（果糖）、ガラクトース、マンノース、キシロース、キシルロース、リボース、エリトロース、トレオース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、スクロース（サッカロース・蔗糖）、ラクトース（乳糖）、マルトース（麦芽糖）、トレハロース、セロビオースなどの炭素源を含む培地で培養することで、上述したアルデヒド化合物、アルコール及び炭化水素といった目的物質を製造することができる。
【００５６】
なお、本発明に係る組換え微生物は、in vitroにおける目的物質の製造方法に利用することもできる。一例として、本発明に係る組換え生物を破砕して得られる破砕溶液を用いて、in vitroにて目的物質を合成できる。すなわち、上記破砕溶液に対して基質となるアシルCoA（必要であればNADH等の補酵素）を添加することで、in vitroにて目的物質を合成できる。
【００５７】
なお、合成した炭化水素等の目的物質は定法にしたがって単離することができる。例えば、上述した組換え酵母を培地にて培養し、炭化水素を生産させる。合成された炭化水素は培地中に合成されるため、遠心分離等の手段によって培地から菌体を分離した後の上清画分から単離できる。上清画分から炭化水素を単離するには、例えば、上清画分に酢酸エチル及びメタノール等の有機溶媒を添加し、十分に撹拌する。水層と溶媒層とに分離し、溶媒層から炭化水素を抽出することができる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
〔実施例１〕
本実施例では、ラン藻（ノストク・パンクチフォルム（Nostoc punctiform））由来のアルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子（遺伝子ID:Npun R1711）を有する発現ベクターと、K. pneumoniae subsp. pneumoniae NBRC3321より単離した、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子（以下、アシルCoAリダクターゼ遺伝子）を有する発現ベクターとを大腸菌に導入し、得られた組換え大腸菌におけるアルカン生産能を評価した。
【００６０】
本実施例において、アシルCoAリダクターゼ遺伝子は以下のように全長配列を決定し、全長配列に基づいて人工的に合成した。先ず、K. pneumoniae subsp. pneumoniae NBRC3321の細胞抽出液を、アルデヒド合成活性を指標にカラムで分画し、アシルCoAリダクターゼタンパク質を精製した。次に、精製したタンパク質のN末端のアミノ酸配列を決定した。次に、決定したそのN末端アミノ酸配列を元にプライマーを設計し、当該プライマーを用いてＰＣＲによりアシルCoAリダクターゼ遺伝子の全長配列を決定した。
【００６１】
詳細には、菌体を超音波により破砕し、20,000×gで30分の遠心分離により得られた上清を無細胞抽出液とした。得られた無細胞抽出液を100,000×gで60分間の超遠心分離により上清として可溶性画分を得た。そして、得られた可溶性画分をHiload 20/60 Superdex 200 pgを用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィに供し、アシルCoAリダクターゼ酵素活性のある分画を集めた。その後、集めた分画をMonoQ 10/100 GLを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィに供し、アシルCoAリダクターゼ酵素活性のある分画を集めた。更に、集めた分画をSuperdex 200 10/300を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィに供し、アシルCoAリダクターゼ酵素活性のある分画を集めた。なお、アシルCoAリダクターゼ酵素活性を測定する際は、まず、1μmolのテトラデカノイルCoA、5μmolのNADH、5μmolのNADPH、10μmolの2-メルカプトエタノール、20μmolのリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）及び粗酵素液を混合し、37℃で16時間インキュベートした。その後、反応液に含まれるテトラデカナールをガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS）にて測定することで、粗酵素液のアシルCoAリダクターゼ酵素活性を評価した。そして、粗酵素液に含まれるタンパク質成分をSDS-PAGEを用いて展開し、Sequi-Blot PVDF膜にエレクトロブロットした。その後、酵素のN末端のアミノ酸配列を、PPSQ-33Aプロテインシーケンサを用いた自動エドマン分解法により決定した。
【００６２】
また、K. pneumoniae subsp. pneumoniae NBRC3321のゲノムDNAを以下のように調整した。すなわち、培養した菌体を6,500×gで10分間遠心分離することで集菌し、DNeassy Blood & Tissue Kit (QIAGEN社製)を用いてゲノムDNAを抽出した。
【００６３】
そして、アシルCoAリダクターゼ遺伝子は、得られたゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅し、pET-21b (+)ベクターにクローニングした。PCRには、表２のプライマーセットを使用した。表中下線部はNdeI認識配列である。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
なお、PCRの反応液は、10ngのゲノムDNAと、0.2mMの各dNTPと、0.25mMの各プライマーと、0.02units/μlのKOD FX neo DNAポリメラーゼ (TOYOBO社製)とした。PCR条件は、94℃で2分間の後、98℃で10秒間、68℃で1分間及び72℃で10分間を1サイクルとして30サイクル行うものとした。PCRの後、増幅断片をNdeI及びHindIIIで処理し、同制限酵素で処理したpET-21b(+)ベクターにライゲーションした。得られたベクターを用いてアシルCoAリダクターゼ遺伝子の全長塩基配列を決定した。
【００６６】
なお、本実施例で使用したアルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子はデータベースに格納された塩基配列情報に基づいて人工的に合成した。アルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子（遺伝子ID:Npun R1711）の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１４及び１５に示した。
【００６７】
上述のように単離したアシルCoAリダクターゼ遺伝子はpCDFDuet-1 vector (Novagen社製)のNdeI-XhoIサイトへ挿入し、人工合成したアルデヒドデカルボニラーゼ遺伝子はpRSFDuet-1 vector (Novagen社製)のPst1サイトへ挿入した（図１参照）。なお。アシルCoAリダクターゼ遺伝子を単離する際、５’末端にはNdeI認識配列を含むTACCATGGGCATACATATGGCCATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAAGGAGATATACG（配列番号１６）を、３’末端にはXhoI認識配列を含むTAATTAACCTAGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCTCGAGTCCGGCCGCATGCGGCCGCAT（配列番号１７）を付加した。
【００６８】
次に、作製した２種類の発現ベクターをE.coli BL21(DE3)株へ形質転換した。形質転換は、E.coli BL21(DE3)のコンピテントセルを調整し、Novagen社のUser Protocol TB009 Rev. F0104を参照して行った。
【００６９】
次に、得られた形質転換体を、0.5mlのLB培地（ストレプトマイシン30mg/ml及びカナマイシン50mg/mlを含む）で37℃、130rpmで一晩振とう培養した。この培養液を、2mlのM9培地（グルコース2%、Yeast extract0.1%、ストレプトマイシン30mg/ml及びカナマイシン50mg/mlを含む）に1%容量で接種し、37℃、130rpmで約4時間（最終吸光度OD600=0.4〜0.6）振とう培養した。この培養液に終濃度1mMになるようにIPTG（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）を添加し、37℃、130rpmで3日間培養した。
【００７０】
そして、培養液1mlを1.5mlエッペンドルフチューブに採取し、遠心機で集菌（6,000rpm，1分、室温）し、上清を取り除いた。ペレットに酢酸エチルを100ml添加し、約1分間ボルテックスで懸濁した。これを遠心分離（10,000rpm、1分、室温）し、この上清をGC/MS分析に供した。GC/MS分析の条件を表３に示した。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
本実施例で作製した組換え大腸菌についてGC/MS分析のチャートを図２に示した。図２に示すように、本実施例で作製した組換え大腸菌は、炭素数１４のアルコール、炭素数１６のアルコール、炭素数１３のアルカン及び炭素数１５のアルカンを生産できることが明らかとなった。これは、本実施例で作製した組換え大腸菌は、導入したアシルCoAリダクターゼ遺伝子により、アシルCoAからのアルデヒド化合物生成能が付与されたことを示す結果である。言い換えると、本実施例で作製した組換え大腸菌に導入したアシルCoAリダクターゼ遺伝子は、宿主微生物においてアシルCoAを還元してアルデヒド化合物を生成する活性を有するアシルCoAリダクターゼをコードしていることが示された。
【００７３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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