(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド複合体において、ペプチドは、３次元構造で構造化され、次の一般構造式により記載されることを特徴とするペプチド複合体。
0005990324.tif 000005
ここで、
Ｘ１は、Ｇｌｎ；
Ｒ１は、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−；
Ｒ２は、−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ。
【請求項２】
インターフェロン合成誘導物質の特性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド複合体。
【請求項３】
抗ウイルス活性特性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド複合体 。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節及び抗ウイルス活性を有するタンパク質及び生理活性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ウイルス剤として医療用で使用されるペプチド、ポリペプチド及びタンパク質系化合物が知られている。Ｉ型インターフェロン誘導物質(Ｉ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ、ＩＦＩ)のうちには、高分子化合物[Ｆ. Ｉ. Ｙｅｒｓｈｏｖ, Ｏ. Ｉ. Ｋｏｓｅｌｅｖ. Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｄｕｃｅｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒｕｇ −, Ｍ.: Ｐｕｂｌ. Ｈｏｕｓｅ. Ｇｅｏｔａｒ &#8211; Ｍｅｄｉａ, ２００５ − Ｐ. ３５６], [Ｂｅｒｇ Ｋ., Ｂｏｌｔ Ｇ., Ａｎｄｅｒｓｅｎ Ｈ., Ｏｗｅｎ ＴＣ. Ｚｉｎｋ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ ｔｅｎｆｏｌｄ. Ｊ.ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＣｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ, ２００１, Ｊｕｌ; ２１(７):４７１−４]及び低分子誘導物質が知られている。後者では、韓国薬物のシクロフェロン(ｃｙｃｌｏｆｅｒｏｎ)及び米国薬物のイミキモド(ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ)が主に注目される。これら薬物は、各々アクリドン(ａｃｒｉｄｏｎｅ)及びベンズイミダゾール(ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅ)誘導体を言う。イミキモド及び類似な誘導体に対して、トル様受容体(ｔｏｌｌｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ)が知られており、これは、このような群の薬物と相互作用して多様な細胞内でＩＦＮ−α合成を誘導する[Ｆ.Ｉ. Ｙｅｒｓｈｏｖ., Ｏ.Ｉ. Ｋｉｓｅｌｅｖ. Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｄｕｃｅｒｓ(ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒｕｇ)Ｍ.: Ｐｕｂｌ. Ｈｏｕｓｅ. Ｇｅｏｔａｒ &#8211; Ｍｅｄｉａ, ２００５.− Ｐ. ３５６]。
【０００３】
低分子ペプチドの生体活性は、広く知られている。まず、これは抗菌活性を有する動物及び植物起源ペプチドを言う[Ｂｏｍａｎ Ｈ. Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒｒｏｌｅ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ. Ａｎｕ. Ｒｅｖ. ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ., １９９５,Ｖｏｌ.１３, ｐ.６１−９２]。しかし、直接的な抗ウイルス及び抗腫瘍活性を有する多様なペプチドが開示されている[Ａｋｉｙａｍａ Ｎ.,Ｈｉｊｉｋａｔａ Ｍ., Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ａ., ＹａｍｏｒｉＴ., Ｔｓｕｒｕｏ Ｔ., Ｎａｔｏｒｉ Ｓ. Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎ−β−ａｌａｎｙｌ−５−Ｓ−ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｙｌｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ (５−Ｓ−ＧＡＤ) ａｎｏｖｅｌ ａｎｔｉ-ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ.Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, ２０００, Ｖｏｌ. ２０, ｐ. ３５７−３６２]。
【０００４】
両生類と昆虫類のペプチドは、ここで特別な位置を占める[Ｂｕｌｅｔ Ｐ., Ｈｅｔｒｕ Ｃ., Ｄｉａｍａｒｃｑ Ｊ., Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｄ. Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎ ｉｎｓｅｃｔｓ: ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ. Ｄｅｖｅｌ. Ｃｏｍｐ. Ｉｍｍｕｎｏｌ., １９９９, Ｖｏｌ.２３, ｐ.３２９−３４４, Ｃｈｉｎｃｈａｒ Ｖ.Ｇ., Ｗａｎｇ Ｊ., Ｍｕｒｔｉ Ｇ.,Ｃａｒｅｙ Ｃ., Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｓｍｉｔｈ Ｌ. Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆ ｆｒｏｇ ｖｉｒｕｓ ３ ａｎｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎ−２Ｐ ａｎｄ ｒａｎａｔｕｅｒｉｎ−２Ｐ, ｔｗｏ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｏｇ ｓｋｉｎ. Ｖｉｒｏｌｏｇｙ, ２００１, Ｖｏｌ.２８８, ｐ.３５１−３５７]。
【０００５】
免疫調節ペプチド − アロフェロン(ａｌｌｏｆｅｒｏｎ)が知られている(ロシア連邦(ＲＦ)特許第 ２１７２３２２号)。ウイルス感染の治療は、アロフェロンの主要応用領域である。アロフェロンは、化学構造及び作用機構と関連して本発明の一番近い類似体である。
【０００６】
ロシア連邦特許第 ２１７２３２２号の発明者らは、一次アロフェロン構造の変形のみを考慮し、ヒスチジン残基分布に対しては核心価値を置かなかったことに注目しなければならない。
【０００７】
また、アロフェロンは、非常に「弱い」インターフェロン誘導物質で指称される必要があり、これは、これらの活性をシクロフェロンと比較すると明らかである。
【０００８】
同時に、アロフェロン構造は、規則的なヒスチジン残基の配列と反復的なグリシン残基を有している点が目立つ。アロフェロン構造の改善は、３次構造成分を付与することにおり、例えば、金属イオンを導入することにより可能である。
【０００９】
また、亜鉛(Ｚｎ)、銅(Ｃｕ)、鉄(Ｆｅ)、マンガン(Ｍｎ)が使われることができる金属イオンを含むウイルス撲滅及び抗ウイルス活性を有するヘミンペプチド(ｈｅｍｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ)及びその薬学的に許容可能な塩が知られている(ロシア連邦特許第 ２２９６１３１号)。しかし、この化合物は、ペプチドの他の部類のペプチドを言い、免疫調節剤ではない。
【００１０】
３次構造で構造化された成分及び第１類型のインターフェロン誘導物質の活性を有すると共にＺｎ＋＋イオンを含むペプチド複合体は、文献に開示されていない。
【００１１】
次のような理由でＺｎ＋＋イオンを有するヒスチジン含有ペプチドの変形が必要である：
【００１２】
１．生理活性の短いペプチドは、不可避にその生理活性、他の巨大分子との相互作用及び代謝安全性を減少させる２次構造の解体された類型を有する。
【００１３】
２．ペプチドの生物学的及び薬理学籍活性は、大きく細胞への輸送効率性に依存する。ペプチド構造を緻密にすることにより、細胞膜を通じた転座(ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ)の効率性、そして、これによって薬理学的活性を増加させる[Ｌｅｎｇ Ｑ., Ｍｉｘｓｏｎ Ｊ. Ｍｏｄｉｆｉｅｄｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｔａｉｌ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ. Ｎｕｃｌ. Ａｃｉｄｓ. Ｒｅｓ., ２００５, Ｖｏｌ. ３３, ｅ４０ ]。
【００１４】
３．Ｚｎ＋＋イオンを有するヒスチジン含有ペプチド複合体の形成は、ペプチドの特性の根本的な変化を誘発することにより、ウイルス及び細胞の転写活性因子のドメインと同一に作る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、３次元構造で構造化されたペプチド複合体を提供することにある。設計された複合体は、他の分子との高い結合能力を有し、Ｉ型インターフェロン誘導を含む薬理学的作用の幅広い効能を示し、多様な水準の細胞機能に作用することにより、これを根拠としたウイルス感染の予防及び治療のための新しい薬物を製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
ヒスチジン残基が豊かな公知されたペプチド、知られた機能を有するタンパク質ドメインのＺｎ−フィンガー(Ｚｎ−ｆｉｎｇｅｒ)を原型で使用するアロフェロン及びこれらの類似体を根拠として新しい系列の生理活性ペプチドが開発された。アロフェロンは、６〜３５個のアミノ酸残基長さのペプチド基質として使用される。このように設計されたペプチドは、Ｚｎ＋＋イオンを有する複合体を形成し、オリゴマーと会合体(ａｇｇｒｅｇａｔｅ)を生成し、構造的及び生物学的特性に対してこれらは免疫調節剤の要件を満たす。
【００１７】
提示されたペプチド複合体は 、３次元構造を有し、次の構造式で示す。：
0005990324.tif 000002
【００１８】
ここで、Ｘ１は、存在しないかまたは少なくとも１個のアミノ酸を有し、Ｒ１及びＲ２は、アミノ酸残基を含み、転移金属イオンと相互作用ができるペプチド鎖として、Ｒ１は、最大５個のアミノ酸残基を有するかまたは存在しないで、Ｒ２は、最大３個のアミノ酸残基を有するかまたは存在しない。
【００１９】
金属イオンと結合するヒスチジンリッチ天然ペプチドの能力は、多くの研究で立証された[ＨｕａＺｈａｏ Ｈ., ａｎｄ Ｗａｉｔｅ Ｊ. Ｈ. Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｌｏａｄ−Ｂｅａｒｉｎｇ Ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ: ＴｈｅＨｉｓｔｉｄｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｍｅｔａｌ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｍｕｓｓｅｌ Ｂｙｓｓｕｓ, Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ. ２００６, ４５(４７)：１４２２３−１４２３１]。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の特徴は、次の図面に示されたデータを有して説明される。：
【００２１】
【図１−１】アロフェロン系列のペプチッドの共通序列分析を示した図である。
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図２】Ａ１ポリペプチドのコンピュータモデルを示した図である。
【図３】Ｚｎ＋＋イオンを有するＡ１複合体の構造に対する理論上可能な変形を示した図である。
【図４】光散乱法(ｌｉｇｈｔ−ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｍｅｔｈｏｄ)によるＺｎ＋＋と結合するアロフェロンＡ１の動力学を示した図である。
【図５】Ｎｉ＋＋で平衡させたＨｉＴｒａｐ吸着剤とのペプチドＡ１の結合力に対する分析結果を示した図である。
【図６】Ｉ型インターフェロン誘導を示した図である。
【図７】ラットの致命的なインフルエンザ感染で研究された薬物の保護効果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の開発時に表２に示したアロフェロン１(序列番号１)ペプチドが基本構造で使用された。アロフェロン１を固相(ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ)合成法により合成し、提示されたペプチドの生理活性を研究するために使用した。この研究を通じて、このペプチドが転移金属で複合体を形成する能力を有しており、インターフェロン誘導物質であり、抗ウイルス活性を有していることを立証した。この研究の結果は、下記実施例に示している。
【００２３】
タンパク質とペプチドの構造及び特性に対するデータベースのコンピュータ分析を通じて、この化合物が新しい系列の生理活性ペプチドであることを確認した。導入された金属イオンを有するヒスチジンとグリシンリッチポリペプチドは、免疫調節及び抗ウイルス活性を有し、亜鉛イオンは、これらの生理活性を可能にする。提示された序列のペプチドの合成は、フェニルアセトアミドメチル(ＰＡＭ)高分子のＢｏｃ/Ｂｚｌ合成法を利用する固相ペプチド合成で実行した。Ｃｏｕｐｌｅｒ−２５０及びＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチッド合成器を利用してペプチドを分離した。
【００２４】
ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基は、トリフルオロ酢酸を使用して除去されたα−アミノ基の一時的な保護のために使用された。三官能性(ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ)アミノ酸の側鎖を保護するために、次のようなベンジル及びアシル類型の保護基を使用した。：ヒスチジンのためのジニトロフェニル、アルギニンのためのメシチレンスルホニル、リシンのための２−クロロベンジルオキシカルボニル、トリプトファンのためのポルミル、チロシンのための２,６−ジクロロベンジル、トレオニンとセリンのためのＯ−ベンジルエーテル。メチオニンをスルホキシ誘導体形態で凝縮段階に導入した。
【００２５】
一時的な保護基の除去は、非希釈トリフルオロ酢酸を利用して実行し、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルエチルアミンを凝縮段階で反応混合物に直接添加して中和した。
【００２６】
０.２ｍｍｏｌの高分子に対してアシルアミノ酸の全体含量を基準でぺプチジル−高分子鎖を延長する間一つのアミノ酸残基の添加のためのプログラムが表に示されている。カルボキシル基成分の事前活性化をヒドロキシベンゾトリアゾール(ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ)とジイソプロピルカルボジイミド(ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ)を使用して３０分内で実行した。このような合成条件下で、ペプチド切片の序列に該当する必要な数のアミノ酸残基を添加した後、すべての場合で満足なペブチジル−高分子の増加に到逹した。
【００２７】
側鎖保護基の除去及び樹脂(ｒｅｓｉｎ)でのペプチドの分離を、主にｍ−クレソールであるスカベンジャー(ｓｃａｖｅｎｇｅｒ)の存在下で無水弗化水素の作用で実行した。このような処理を実行するうちに、すべての側鎖保護基を除去し、ペプチドを高分子マトリックスから分離した。放出時間は、１時間から１時間半まで多様であった。
【００２８】
メチオニン含有ペプチド合成時の副反応(特に、ペプチド鎖延長時のｔ−ブチルラジカルとの硫黄アルキル化反応及びその部分的な酸化反応)を防止するため、メチオニン残基をスルホキシド誘導体の形態でぺプチジル高分子−序列に柔らかに添加した。これは、ペプチド放出の最後段階でメチオニンに還元される。この還元反応は、ヨード化アンモニウムまたは完全放出されたペプチドの作用によって、またはペプチドが相変らず樹脂に存在する段階で満足な結果が発生する。
【００２９】
一つのアミノ酸残基の添加のためのプログラム
【表１】
0005990324.tif 000003
* 凝縮は、ニンヒドリンテスト(ｎｉｎｈｙｄｒｉｎｔｅｓｔ)が肯定的な場合に繰り返された。
【００３０】
合成されたすべてのペプチド薬物をＤｙｎａｍａｘ ６０ Ａカラム(Ｇｉｂｓｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ)で調剤用逆相液体クロマトグラフィーを利用して精製し、トリプタミンの存在下でメタンスルホン酸を利用して加水分解以した後、加水分解物であるペプチドのアミノ酸分析(アミノ酸分析機、Ａｌｐｈａ Ｐｌｕｓ、ＬＫＢ、Ｓｗｅｄｅｎ)で確認した。
【００３１】
次の実施例は、本発明の目的を達成することができる可能性を立証する。
【００３２】
実施例１：アロフェロン系列のペプチドの構造及び共通序列分析
アロフェロン系列のペプチドの共通序列分析のために、ＢｉｏＥｄｉｔ ｖ.７.０９ Ｉｂｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ(ＵＳ)ソフトウェアを使用した。アロフェロンアミノ酸の序列相同性を表２に示した。
【００３３】
アロフェロン序列相同性 
【表２−１】
0005990324.tif 000004
【００３４】
ロシア連邦特許第２１７２３２２号は、共同序列の提示なしにアロフェロン序列を例示した。これは、ペプチドの核心部を正確に推定できないで、実質的な変形を無意味な変形と区分できないようにする。
【００３５】
分析の結果、アロフェロン系列は、共同序列を有する次の３個の系列に分けることができる：
【００３６】
ＳＧＨＧＱ−ＨＧＶ、ＶＳＧＨＧＱ−ＨＧＶ、ＳＧＨＧＱ−ＨＧＶ、これはアロフェロン系列のペプチド序列の与えられたコンピューター推定(図１)で立証される。
【００３７】
実施例２：ペプチドＡ１のコンピュータモデリング(３次構造分析)
短いペプチドの構造を理解するため、ペプチド構造の全体及びその各々の領域を確認することができるようにするコンピュータモデリングを利用することができる。特に、Ｚｎ＋＋イオンで複合体を形成するペプチドの可能性を確認する必要がある。このために、次のような構造を有するＡ１ペプチドのコンピュータモデリングを実行した：Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ(Ａ１)。Ｚｎ＋＋イオンでＡ１の単純な複合体を形成することは、Ｚｎ＋＋イオンとのヒスチジン残基の二重結合により安定化されたペプチドループ(ｌｏｏｐ)の形成を立証することができる。
【００３８】
Ａ１ペプチドのコンピュータモデリング(図２)は、短いペプチドが緩いループを形成することを示した。このループ内でＺｎ＋＋イオンは、反応時に接近できるヒスチジン残基と反応することができる。この場合、一般的なポリペプチド構造は、１、６及び９番位置で少なくとも三つのヒスチジン残基でＺｎ＋＋イオン複合体を形成することができる可能性に適合である。
【００３９】
単純化モデル(図３)Ａｎ−Ａ１は、グリシン残基の相当部分が分子のＮ−末端部位に位置することを示す。これは、ベータ層類型の二次構造に該当する。Ｃ−末端部位は、Ｚｎ＋＋イオンとの反応時に接近できるヒスチジンのイミダゾールリングの内部に露出されたアルファ鎖構造(ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ)を有する。
【００４０】
図面は、Ｚｎ＋＋の例を示す。Ｚｎ＋＋は、ほとんど全ての位置に配置されることができる。
【００４１】
Ａ：ループ形態で構造化された分子内複合体Ｚｎ−Ａ１。
【００４２】
Ｂ：二量体形態で構造化された分子内複合体Ｚｎ−Ａ１。[ａ]または[ｂ]領域でまたは線形ポリペプチドの中央でのＺｎ＋＋イオンの分子内注入により、６及び９番位置でＺｎ＋＋とヒスチジン残基との反応と共に新しいＡ１分子を添加することにより凝集が実行される。
【００４３】
Ａ１構造を分析すると、ヒスチジン残基の高い含量と規則的な配列を注目するようになる。図２は、Ａ１ポリペプチドがほとんど完璧な鞍状構造(ｓａｄｄｌｅ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ)を形成することを示す。このような確認で、ヒスチジン残基１、６及び９は、Ｚｎ＋＋イオンとの反応で一番接近しやすい。
【００４４】
この場合、Ｚｎ＋＋に比べて過剰のペプチドを利用した複合体形成は、分子内凝集体の形成を誘発することができるという重要な結論を下すことができる(図２の(Ｂ))。このような構造的転移は、根本的にペプチドの特性を変化させることによりこれらの構造を生理活性に必要な緻密な構造に形成するようにし、これは多数の研究で立証された[Ｒｙｄｅｎｇａｒｄ Ｖ., Ｎｏｒｄａｈｌ Ｅ. Ａ., Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ Ａ.Ｚｉｎｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｇａｉｎｓｔＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ. ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ., ２００６, Ｖｏｌ. ２７３, ｐ. ２３９９−２４０６]。
【００４５】
実施例３：アロフェロン及びそれに一番類似な類似体は、Ｚｎ＋＋結合ペプチドである。
アロフェロン１(Ａ１)及びその類似体と結合するＺｎ＋＋イオンを[Ｓｈｉ Ｙ., Ｂｅｇｅｒ Ｒ.Ｄ., Ｂｅｒｇ Ｊ.Ｍ. Ｍｅｔａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ: ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｂａｌｔ(ＩＩ) ａｓ ａ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｐｒｏｂ. Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｊ., １９９３, Ｖｏｌ.６４, ｐ.７４９−７５３]に開示された方法によって研究した。Ａ１ペプチドと結合するＺｎ＋＋イオンを４００ｎｍ及び励起光３９８ｎｍでＩＬ蛍光計(ＩＳＳ、Ｃａｍｐａｉｇｎ)を利用した光散乱法で確認した。
【００４６】
図４は、Ａ１ペプチドと反応するＺｎ＋＋イオンをグラフで示す。
【００４７】
分析条件は、Ｓｈｉ Ｙ. など(１９９３)を参照する。
【００４８】
Ａ：(オープンサークル)Ａ１とＺｎ(ＮＯ３)２の反応。ペプチドに対するＺｎ＋＋イオンのモール超過量は、１：１０であった。実線：ペプチドＺｎ＋イオンの飽和。完全飽和時に大部分のペプチドが凝集体に変わった。ＥＤＴＡを凝集体に添加した。ＥＤＴＡの添加以後、複合体は迅速に分解され、ペプチド(アロフェロン)は水溶性相に変わった。
【００４９】
図４は、Ｚｎ＋＋Ｚｎ(Ｎ０３)２が Ａ１ペプチドと反応することにより、光散乱の急激な増加を誘発し以後、最大５６〜６０ｎｍ直径の多分酸ナノ粒子形態のペプチド凝集体及び荒い凝集体懸濁液の形成を誘発したことを示す。ＥＤＴＡキレート試薬を添加すれば、凝集体とＡ１ペプチド複合体は分解される。
【００５０】
したがって、Ａ１ペプチドは、Ｚｎ＋＋イオンと反応して一番目の段階で水溶性複合体を形成することができる。
【００５１】
実施例４：Ｚｎ＋＋と反応したペプチドは、ニッケル吸着剤との高い親和性を示す。
ＨｉＴｒａｐカラムでのクロマトグラフィーは、Ａ１がオリゴヒスチジンとして作用して提示された吸着剤と非常に高い親和性を有し、イミダゾール溶液に完全に溶出されることを示す。溶出は、濃度勾配のリン酸塩緩衝液(０.５Ｍイミダゾール)で実行した(図５)。
【００５２】
実施例 ５：Ｉ型インターフェロンの誘導
Ｉ型インターフェロンの誘導を以前に公開された方法により確認した[Ｆ.Ｉ. Ｙｅｒｓｈｏｖ., Ｏ.Ｉ. Ｋｉｓｅｌｅｖ. Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｄｕｃｅｒｓ(ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｒｕｇ)Ｍ.：Ｐｕｂｌ. Ｈｏｕｓｅ. Ｇｅｏｔａｒ − Ｍｅｄｉａ,２００５− Ｐ. ３５６, Ｃｈｅｒｎｙｓｈ ｅｔ ａｌ. ２００２]。図６は、Ｉ型インターフェロンを誘導する薬物の能力をテストした結果を示す。与えられたデータからＺｎ−Ａ１が最大のインターフェロン誘導活性を有することが分かる。Ｚｎ−Ａ２ペプチドは、多少低かった。変形されないＡ１ペプチドは、非常に高い水準のインターフェロン誘導能力を示したが、Ｚｎ＋＋イオンと結合した誘導体に比べてよほど低く、シクロフェロンの活性と一致した。
【００５３】
実施例６は、このようなデータがラットにおいて致命的なインフルエンザウイルス感染の場合で薬物の保護効果と一致することを示す。
【００５４】
実施例６：インフルエンザウイルスＡ１に誘導されたホワイトラットの致命的なインフルエンザ肺炎の実験モデルでの抗ウイルス活性
ペプチド複合体の抗ウイルス活性をテストするために、Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ飼育場で得た体重１０〜１２ｇの雌雄ホワイトラットの致命的なインフルエンザ感染モデルを使用した。高い病原性を示す実験室条件で、ホワイトラットに適合なＡ/Ａｉｃｈｉ/２/６８(Ｈ３Ｎ２)インフルエンザ菌株を使用して、ウイルス投与量によって５〜１０日以内に肺炎感染と致命的な結果を誘導した。
【００５５】
感染させる前に、６時間及び１２時間に一回ずつペプチド及びその誘導体を動物体重の１〜２μg/kgの量で腹腔内に投与した。同一な量のＮＳＳまたはリン酸塩衝液を対照動物群の偽薬で使用した。
【００５６】
ウイルスをあらかじめ動物に滴定してラットに対する致死濃度を決定した。実験のために、動物を０.２〜５ＬＤ５０の投与量で弱いエーテル痲酔とともにウイルスを鼻腔内に投与した。各々の群は、１０匹のラットで構成した。動物を１５日間、すなわち、実験インフルエンザで１００％の動物死亡が観察される期間の間観察した。動物の体重と死亡を対照群及び実験群で毎日記録した。記録された死亡データを根拠として、各々の群での死亡率(各々の群で感染された動物の総対比１５日間死亡した動物の数の比)、保護指数を計算した。その結果を図７に示した。結果の分析は、ラットに対して病原性であるインフルエンザＡウイルスに対する研究された薬物Ａ１の効果が参照薬物(ウイルス １ＬＤ５０の投与量の８０〜８７％)の保護効果の效率と比較できることが分かる。Ｚｎ−Ａ１複合体の高い保護効果は、Ａ１を利用したＺｎ＋＋複合体の形成がＡ１型ペプチドの活性を非常に増加させることを立証する。このような場合で使用されたテスト方法は、保護効果が主にインターフェロンの誘導によることであることを示す。予防対策で使用される時、薬物は最大の活性を示した。
【００５７】
図７は、ラットの致命的なインフルエンザ感染の場合に研究された薬物の保護効果を示す。
【００５８】
上述のように、設計されたペプチドは、請求された全ての特性を有する。
【００５９】
ヒスチジンリッチペプチド複合体、主に、Ｚｎ＋＋イオンを有するアロフェロン系列のペプチドは、直接的な作用機構を有する薬物を生成することができるようにし、ペプチドの特性と組成及び薬物の標的構造に対する理解によって、これら薬物を設計することができるようにする。
【図３】
0005990324.tif 000006
【図４】
0005990324.tif 000007
【図５】
0005990324.tif 000008
【図６】
0005990324.tif 000009
【図１−１】
0005990324.tif 000010
【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図７】
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【配列表】
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