(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中に０．１〜１．０質量％接種し、２５〜３５℃で８〜２４時間静置培養した時、上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産するラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌。
【請求項２】
単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．７質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する請求項１記載の乳酸菌。
【請求項３】
単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する請求項１又は２記載の乳酸菌。
【請求項４】
ラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０７）又はラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００２株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０８）である請求項１〜３のいずれか１項記載の乳酸菌。
【請求項５】
単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中に０．１〜１．０質量％接種し、２５〜３５℃で８〜２４時間静置培養した時、上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産するラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌を含有する、サイレージ調製用微生物製剤。
【請求項６】
乳酸菌が請求項２〜４のいずれかに記載の乳酸菌である請求項５記載のサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項７】
さらに、耐酸性を有する乳酸菌を含有する請求項５又は６記載のサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項８】
耐酸性を有する乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０９）である請求項７記載のサイレージ調製用微生物製剤。
【請求項９】
単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中に０．１〜１．０質量％接種し、２５〜３５℃で８〜２４時間静置培養した時、上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産するラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤を添加することを特徴とするサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
【請求項１０】
乳酸菌が、請求項２〜４のいずれか１項記載の乳酸菌である請求項９記載のサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
【請求項１１】
前記サイレージ調製用微生物製剤が、さらに耐酸性を有する乳酸菌を含有するものである請求項９又は１０記載のサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酪酸発酵を抑制し得る乳酸菌、それを含有する微生物製剤及び当該製剤を用いるサイレージ又は発酵飼料の調製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
家畜の主食となる牧草、飼料作物などを嫌気的条件下で乳酸発酵させたサイレージは、現在の酪農において必須の飼料であり、良質なサイレージを調製することは酪農家にとって極めて重要な技術である。この際、不良発酵と呼ばれる問題がしばしば起こるが、これはサイレージ中で乳酸菌よりも酪酸菌の増殖が優勢となり、結果的にサイレージ中の酪酸含量が高くなるという問題である。酪酸濃度が高くなったサイレージは、牛の嗜好性低下、採食量の減少だけでなく、ケトーシスなどの疾病にも繋がる問題となる。そこでこのような酪酸菌による腐敗を防止する一つの方法として、サイレージ調製時に乳酸菌を添加する技術が普及している。そこで用いられる乳酸菌として多くの報告があるが、その殆どが乳酸発酵を速やかに進行させてｐＨを低下させることで酪酸発酵を抑制するものである。しかしながら、これらの乳酸菌は、特に水分が高い、糖含量が少ない、あるいは土壌の混入が多いなどにより酪酸発酵しやすい条件下では、酪酸菌を十分に抑制できない場面があり、現在も酪酸発酵により腐敗したサイレージが調製されて問題になっている。【０００３】
サイレージに添加する乳酸菌が効果を現わす条件として、材料牧草中の可溶性糖類が最低でも乾物中５．０〜６．０％（原物中に換算すると１．０〜３．０％）以上は必要であるとされている（非特許文献１）。一方、糖含量が少ない牧草、飼料作物も多いことから、今まで報告されているサイレージ用の乳酸菌では効果が十分に発揮できずに、酪酸発酵するケースが多かった。【０００４】
ところで、乳酸菌の一部には、発酵あるいは培養により抗菌性タンパク質であるバクテリオシンを生産するものが知られている。その中でもナイシンは乳酸菌の一種であるラクトコッカス・ラクティスの一部の株が生産する３４個のアミノ酸から成り、分子内にランチオニン、３−メチルランチオニン、デヒドロアラニン、デヒドロブチリン、２−アミノ酪酸を含む抗菌性タンパク質である。ナイシンには、いくつかの類縁体が存在し、現在までに構造が決定している類縁体はナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱの３種類がある。また近年、ストレプトコッカス・ウベリスが生産するナイシンＵとラクトコッカス・ラクティスの生産するナイシンＦが報告されている。【０００５】
ナイシンは酪酸菌を含むグラム陽性菌を中心に幅広い抗菌スペクトルを有することから、サイレージに添加して酪酸菌を抑制できる可能性がある。実際、食品分野においては、ＷＨＯとＦＡＯに認可されて以来、類縁体の一つであるナイシンＡは、広く世界中でチーズや野菜缶詰などの食品保存料として利用されている。しかしながら、ナイシンを直接食品に添加する場合、乳酸菌の培養により高濃度のナイシンを生産させ、これを抽出、精製、乾燥させる工程が必要であり、一般的にコストがかかるという点が問題となる。また、ナイシンは即効性の抗菌作用を示すが、その効果は持続しにくく、添加対象の成分との相互作用によりその効果が低下することがある。【０００６】
そこでナイシン生産乳酸菌をチーズ、ザワークラウト、豆味噌、米味噌などの食品に添加する試みが検討されているが（非特許文献２〜５）、サイレージの原料となる牧草、飼料作物、食品製造副産物などには実用的に用いられていない。その理由として、これらサイレージ原料は食品素材に比べて、乳酸菌の生育に必須である糖を含めて栄養源が乏しく、食品素材に添加する場合のように殺菌工程がないために、他の微生物との競合も激しいことから、食品素材で効果のあるナイシン生産乳酸菌を添加しても十分な効果が得られないことが考えられる。このため、合成培地中で高濃度のナイシンを生産する乳酸菌や、発酵大麦エキス培地でのナイシン生産についても報告されているが（特許文献１、非特許文献６）、合成培地中や発酵大麦エキス培地で高濃度のナイシンを生産できても、栄養源が異なるサイレージ材料中で高濃度のナイシンを生産していることを示す先行文献はない。【０００７】
また、サイレージを対象とした場合においては、バクテリオシンを生産するラクトコッカス・ラクティスＲＯ５０株をサイレージ材料草に添加するサイレージ調製方法が報告されているが（特許文献２）、十分な発酵品質改善効果が得られていないケースも報告されていて、効果が不安定であり、さらにサイレージ中でバクテリオシンを生産するかどうかはまったく明らかにされていない（非特許文献７、８）。また、特許文献３では、ナイシン生産乳酸菌とナイシン耐性乳酸菌を添加したサイレージ調製方法についても報告されていて、サイレージ中で２００ＩＵ／ｇのナイシン活性が検出されているが、ナイシンを生産しない他の乳酸菌株添加区とｐＨ、有機酸含量、全窒素に対するアンモニア態窒素濃度などの発酵品質は変わりなかったことから、一般の乳酸菌でも良好な発酵が得られるような糖含量（乾物中５．０％以上、原物中１．０％以上）での結果であり、この乳酸菌の糖含量の少ない厳しい条件下での効果については明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】再表Ｗ０２００５／０８０５５０号公報
【特許文献２】特開２００４−４１０６４号公報
【特許文献３】ＥＰ１２７３２３７Ａ１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】増子孝義（１９９９）、サイレージ科学の進歩、デーリィ・ジャパン社、９９−１０１
【非特許文献２】Ｄｅｌｖｅｓ−Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（１９９６）６９：１９３−２０２
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）５８：１４８４−１５８９
【非特許文献４】Ｔａｋｅｏ  Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）６３：６４２−６４７
【非特許文献５】Ｔａｋｅｏ  Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５：３３０−３３７
【非特許文献６】Ｆｕｒｕｔａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００８）１０６：３９３−３９７
【非特許文献７】蔡  義民ら  畜産草地研究成果情報（２００２）Ｎｏ．２：５３−５４
【非特許文献８】小林寿美ら  日草誌（２０１０）５６：３９−４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、酪酸発酵が進行しやすい、サイレージの発酵条件においてもナイシンを高濃度生産する能力を有する乳酸菌を選抜し、この能力を有する乳酸菌を含む微生物製剤をサイレージに添加して高品質のサイレージや発酵飼料を安定的に調製する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、サイレージ環境で能力を発揮する乳酸菌を選抜するために、糖類を一切添加せず、単糖および二糖含量の極めて低い牧草の煮汁培地を作成し、これを用いて乳酸菌を培養して、ナイシンを生産する菌株をスクリーニングした。当該スクリーニングにより、牧草煮汁培地中で既知のナイシン生産株より強いナイシン活性を出す乳酸菌の選抜に成功し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１１］に係るものである。【００１３】
［１］単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌。
［２］単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．７質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する［１］記載の乳酸菌。
［３］単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する［１］又は［２］記載の乳酸菌。
［４］ラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０７）又はラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００２株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０８）である［１］〜［３］のいずれか１項記載の乳酸菌。
［５］単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌を含有する、サイレージ調製用微生物製剤。
［６］乳酸菌が［２］〜［４］のいずれかに記載の乳酸菌である請求項５記載のサイレージ調製用微生物製剤。
［７］さらに、耐酸性を有する乳酸菌を含有する［５］又は［６］記載のサイレージ調製用微生物製剤。
［８］耐酸性を有する乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０９）である［７］記載のサイレージ調製用微生物製剤。
［９］単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌を含有するサイレージ調製用微生物製剤を添加することを特徴とするサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
［１０］乳酸菌が、［２］〜［４］のいずれか１項記載の乳酸菌である［９］記載のサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
［１１］前記サイレージ調製用微生物製剤が、さらに耐酸性を有する乳酸菌を含有するものである［９］又は［１０］記載のサイレージ又は発酵飼料の調製方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、サイレージや発酵飼料の酪酸発酵で苦しむ酪農家が多い中で、実際のサイレージ発酵条件である糖含量が少ない材料中でもナイシンを生産する乳酸菌を提供することができる。また、前記乳酸菌に耐酸性を有する乳酸菌を加えることで、酪酸発酵を抑制し、かつ良質な乳酸発酵を可能とする微生物製剤を提供することができる。これらにより本発明は、安全性が高く家畜の採食性が良いサイレージ又は発酵飼料を製造することを可能とする。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のナイシン生産乳酸菌は、単糖および二糖の合計含有量が１．０質量％以下、好ましくは０．７質量％以下、より好ましくは０．４質量％以下の牧草煮汁培地中でナイシンを生産する乳酸菌を選抜することにより得られる。
【００１６】
本発明においてナイシン生産性乳酸菌の選抜に用いられる牧草煮汁培地で使用する牧草は、サイレージや発酵飼料に使われる牧草であれば特に限定されるものではないが、例えばアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラスなどの牧草が挙げられる。好ましくは、酪酸発酵しやすい条件を想定して、糖含量の少ないアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラスなどを使用するのが望ましい。牧草の形態としては、刈り取った生草の状態で使用しても良いが、冷蔵や冷凍保存したものでも良いし、通風乾燥、凍結乾燥した牧草を粉砕した乾燥粉末の状態で使用しても良い。また、飼料として流通しているルーサンペレットやヘイキューブを利用しても良い。
【００１７】
これらの牧草を熱水で浸出させた浸出液のみを栄養源とする培地を牧草煮汁培地として使用する。ここで熱水の温度は５０〜１００℃が好ましく、さらに７０〜１００℃がより好ましい。また、牧草を熱水に浸出させる時間は、１０〜１８０分が好ましく、さらに３０〜１２０分が好ましい。浸出液は、必要によりろ過して固形分を除いて用いるのが好ましい。糖含量が少ない条件でナイシンを生産する乳酸菌を選抜するために、牧草煮汁培地中の単糖および二糖の合計含有量を１．０質量％以下、好ましくは０．７質量％以下、さらに好ましくは０．４質量％以下に水で希釈調整して使用することが望ましい。また、好ましい単糖および二糖の合計含有量の下限は、０．１質量％であり、より好ましくは０．２質量％である。
【００１８】
本発明のナイシン生産乳酸菌の選抜のための培養条件は、通常の乳酸菌が生育する条件であればよく、例えば牧草煮汁培地中に０．１〜１．０質量％接種し、２５〜３５℃で８〜２４時間静置培養すればよい。
【００１９】
一般にナイシン生産株はナイシン耐性であるため、１次スクリーニングとしてナイシン添加培地で生育する株を選抜することができることは言うまでもない。この場合、選抜用の培地としてはナイシン１００〜１０００ＩＵ／ｍＬ含有するＭＲＳ培地などを用いることができる。さらに、本発明の目的に合致したナイシン生産菌の選抜は、培地上清中のナイシン濃度を測定するかナイシン活性を測定することにより行うことができる。ナイシン濃度は、例えば高速液体クロマトグラフィーなどによって測定することができる。また、ナイシン活性は、乳酸菌あるいは酪酸菌のナイシン感受性株に対する抗菌活性を指標として測定することが出来るが、例えば、ラクトバチルス・ブルガリカスに対する抗菌活性を測定することにより測定できる。ナイシン活性は、ナイシン含有量として測定するのが好ましい。培養液上清のナイシン含量は通常知られている方法によって測定することができるが、例えばその活性は、アガーウェル法によって測定することができる。すなわち、１．５％寒天ＭＲＳ培地の平板上にペニシリンカップ（直径８ｍｍ）を置き、ここに指示菌としてラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）ＪＣＭ１００２T株の培養液０．１％を混和した０．７５％寒天ＭＲＳ培地を重層する。寒天が固化した後、ペニシリンカップをはずし、抗菌試験用プレートとして用い、フィルター除菌した培養液上清をペニシリンカップであけたウェルに添加し、３７℃で２４時間嫌気培養した後、指示菌に対する阻止円の直径を測定する。スタンダードとしてナイシン製剤（シグマ社、ナイシン２．５％含有）を利用すれば、ナイシン１μｇあたりの活性値を４０ＩＵ（ナイシン製剤１μｇあたり１ＩＵ）として測定することができる。
【００２０】
本発明の乳酸菌は、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌である。
また、本発明の乳酸菌の好ましい態様は、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．７質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌である。より好ましくは、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり１００ＩＵ以上のナイシンを生産する乳酸菌である。
【００２１】
さらに、前記牧草煮汁培地の単糖および二糖の合計含有量は０．２〜０．４質量％であるのがさらに好ましい。この培地におけるナイシン生産量は、上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上であるが、１００ＩＵ以上が好ましく、さらに１００〜４００ＩＵであるのが好ましく、１００〜３００ＩＵであるのがさらに好ましい。
【００２２】
また、本発明の乳酸菌は、ｐＨが５という低ｐＨ条件でも、単糖および二糖の合計含有量が０．１〜０．４質量％の牧草煮汁培地中で上清１ｍＬあたり４０ＩＵ以上のナイシンを生産する能力を有する。このように低ｐＨ条件下でもナイシンを生産することは、本発明の乳酸菌がより長時間効果を発揮することを意味する。
【００２３】
上記のナイシン生産乳酸菌としては、ラクトコッカス属に属するものが好ましく、さらにラクトコッカス・ラクティスに属するものが好ましい。具体例としては、ラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０７）やラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００２株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０８）、ラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００４株、ラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００５株が挙げられるが、好ましくはラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０７）やラクトコッカス・ラクティスＳＢＳ−０００２株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０８）が挙げられる。
上記のＳＢＳ−０００１株及びＳＢＳ−０００２株は、(独)製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（寄託日：平成２３年０６月１５日）。
【００２４】
本発明の乳酸菌は、糖含量の低い牧草の存在下でも生育し、発酵する能力を有し、ナイシンを多量に生産するため、サイレージ調製用微生物製剤の成分として有用である。
【００２５】
上記の乳酸菌の培養は、通常の乳酸菌用の培地を用いて行うことができる。培地としては、乳酸菌の培養に用いられる培地であれば特に限定されないが、例えばＧＹＰ培地（小崎道雄ら（１９９２）、乳酸菌実験マニュアル、朝倉書店刊）、ＭＲＳ培地（ｄｅ  Ｍａｎ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９６０），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，１３０−１３５）を使用することができる。培養条件については特に限定されないが、通常、ｐＨ５．０〜７．０、２５〜４０℃、１０〜２４時間で培養することができる。培養した乳酸菌は、培養液あるいは菌体を濃縮した濃縮液の状態でサイレージまたは発酵飼料に添加することもできるが、これらの液を凍結品として使用しても良い。また培養した乳酸菌を適当な保護剤や基材とともに凍結乾燥、噴霧乾燥、流動層乾燥させた粉末の状態で使用しても良い。
【００２６】
本発明における微生物製剤には、本発明におけるナイシンを生産する乳酸菌株を単独あるいは複数含有することができる。また、別途他の乳酸菌を含有しても良い。特に耐酸性を有する乳酸菌を含有することによって、酪酸発酵抑制に加えて、良質な乳酸発酵を可能とする微生物製剤を提供することができる。この場合、他の乳酸菌はナイシン耐性が高い株が望ましいことはいうまでもない。耐酸性を有する乳酸菌としては特に限定されるものではないが、例えばラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ペディオコッカス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）などが挙げられ、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０９）、ラクトバチルス・ラムノーサスＳＢＴ−２３００株、ラクトバチルス・プランタラム畜草１号株が挙げられ、さらに好ましくはラクトバチルス・パラカゼイＳＢＳ−０００３株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１０９）が挙げられる。
上記のＳＢＳ−０００３株は、(独)製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託した（寄託日：平成２３年０６月１５日）。
【００２７】
前記微生物製剤中の本発明の乳酸菌と耐酸性を有する乳酸菌との含有比は、特に限定されないが、質量比で１：１００〜１００：１が好ましく、１：９〜９：１がより好ましく、３：７〜７：３がさらに好ましい。
【００２８】
また、本発明における微生物製剤に必要に応じて、酵素を含有しても良い。酵素の種類としてはセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどが挙げられる。
【００２９】
本発明における微生物製剤は、様々なサイレージや発酵飼料の調製に使用することができる。サイレージや発酵飼料の調製に用いられるサイレージや発酵飼料原料としては通常飼料として利用されている原料であれば特に限定されるものではないが、例えば牧草や飼料作物としてアルファルファ、クローバー、チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、トールフェスク、メドウフェスク、フェストロリウム、ケンタッキーブルーグラス、レッドトップ、ギニアグラス、ローズグラス、ネピアグラス、エンバク、オオムギ、ライムギ、ソルガム、スーダングラス、ヒエ、トウモロコシ、飼料イネなどが挙げられる。食品製造副産物としてビール粕、豆腐粕、茶粕、焼酎粕、ウィスキー粕、ビートパルプ、バカス、コーヒー粕、ジュース粕、ケール粕、デンプン粕などが挙げられる。農産副産物として稲ワラ、麦ワラ、規格外野菜などが挙げられる。また、食品製造副産物、サイレージ、農産副産物、乾草、濃厚飼料、ビタミン・ミネラル製剤などを混合して調製する発酵ＴＭＲにも添加することができる。これらのサイレージや発酵飼料原料は水分を４０〜９０質量％に調節して使用することが望ましい。
【００３０】
添加する方法としては、微生物製剤を水などに溶解・懸濁して原料に噴霧する方法や、粉状の微生物製剤を原料に散布・混合する方法などがある。
【００３１】
添加する菌数は、合計で原料１ｇあたり１０3〜１０7個、好ましくは１０4〜１０6個になるように添加することが望ましい。
【００３２】
サイレージや発酵飼料は、通常、嫌気条件下で発酵させる。発酵用の容器は、嫌気状態がある程度保持できるものであれば特に限定されないが、例えばバンカーサイロ、スタックサイロ、トレンチサイロ、タワーサイロ、地下サイロ、ブロックサイロ、カップサイロ、ロールベール、フレコンバックなどが挙げられる。通常は外気温（５〜３０℃程度）で１週間以上放置することで発酵させることができる。
【００３３】
本発明の微生物製剤を用いて得られるサイレージや発酵飼料は、酪酸発酵が効果的に抑制されているため、牛の嗜好性、採食量が良好であり、ケトーシスも生じない。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の技術範囲はこれらにより限定されるものではない。【００３５】
＜実施例１＞牧草煮汁培地中のナイシン活性
各乳酸菌を牧草煮汁培地で培養した時の培養液上清のナイシン活性を測定した。
牧草煮汁培地は、以下のように作成した。ルーサンペレット１００ｇに１リットルの蒸留水を加え、沸騰湯浴中で液温が９０℃に到達してから３０分間煮出した。ガーゼで濾して残渣を絞り、ろ液を遠心分離にかけてからろ紙でろ過した。このろ液を１リットルにメスアップして、試験管に分注し、オートクレーブ（１１５℃、２０分）で滅菌した。【００３６】
牧草煮汁培地中の糖含量は、以下のように測定した。培地３６０μｌにアセトニトリル８４０μｌを加えて混合し、室温で１５分間静置した。遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分）で沈殿を除去し、上清を０．２μｍのフィルターでろ過してＨＰＬＣで分析した。検出された単糖および二糖（キシロース、グルコース、フルクトース、スクロース）の含量を合計して、糖含量とした。【００３７】
表１に示した各乳酸菌をＭＲＳ液体培地で前培養し、この前培養液を遠心して培地を捨て、菌体に培地と同量の生理食塩水を加えた。この菌体懸濁液を牧草煮汁培地に１％接種し、３２℃で８時間静置培養して、培養液の吸光度（６６０ｎｍ）を測定した。この培養液を遠心し、０．２μｍのフィルターで菌体を除去した培養上清液のナイシン活性をアガーウェル法で測定した。【００３８】
【表１】
0005931064.tif 000002
【００３９】
アガーウェル法は、以下のように行った。１．５％寒天ＭＲＳ培地の平板上にペニシリンカップ（直径８ｍｍ）を置き、ここに指示菌としてラクトバチルス・ブルガリカスＪＣＭ１００２T株の培養液０．１％を混和した０．７５％寒天ＭＲＳ培地を重層した。寒天が固化した後、ペニシリンカップをはずし、抗菌試験用プレートとして用いた。フィルター除菌した培養液上清をペニシリンカップであけたウェルに添加し、３７℃で２４時間嫌気培養した後、指示菌に対する阻止円の直径を測定した。スタンダードとしてナイシン製剤（シグマ社、ナイシン２．５％含有）を利用し、ナイシン１μｇあたりの活性値を４０ＩＵ（ナイシン製剤１μｇあたり１ＩＵ）とした。【００４０】
【表２】
0005931064.tif 000003
【００４１】
【表３】
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【００４２】
【表４】
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【００４３】
【表５】
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【００４４】
表２、表３から分かるように、ナイシンＡの生産が知られているＡＴＣＣ１１４５４株、ナイシンＺの生産が知られているＪＣＭ７６３８株、バクテリオシンの生産が知られているＲＯ５０株は、糖含量が約０．３％の牧草煮汁培地中で、ＳＢＳ−０００１株やＳＢＳ−０００２株と同程度の生育（Ｏ．Ｄ．６６０）を示すものの、ナイシン活性は非常に弱かった。一方、ＳＢＳ−０００１株とＳＢＳ−０００２株は糖含量が約０．３％の牧草煮汁培地中で非常に高いナイシン活性を示した。【００４５】
また、表４から分かるように、ＳＢＳ−０００１株とＳＢＳ−０００２株は糖含量が約０．７％の牧草煮汁培地中では、糖含量が約０．３％の牧草煮汁培地中よりも生育、ナイシン活性ともに増加した。一方、ＪＣＭ７６３８株は、ＳＢＳ−０００１株やＳＢＳ−０００２株の半分以下の活性しか示さなかった。【００４６】
サイレージは発酵過程でｐＨが低下することから、より長時間効果を発揮するには、低ｐＨでもナイシンを生産することが望ましいが、ナイシン生産は、培養ｐＨを下げると減少することが知られている。表５から分かるように、牧草煮汁培地の初期ｐＨを５．０にした場合、各菌株とも全体的に培養上清中のナイシン活性は低下するが、ＲＯ５０株はナイシン活性が０であるのに対し、ＳＢＳ−０００１株とＳＢＳ−０００２株は４０ＩＵ／ｍＬ以上のナイシン活性を示した。【００４７】
＜実施例２＞サイレージ調製と発酵品質
各乳酸菌を牧草に添加してサイレージを調製し、発酵品質を調査した。
乳酸菌は、表６に示した菌株を以下のように作成した。ＧＹＰ液体培地に各菌株を接種し、３７℃で２４時間培養した。培養液を遠心（６，５００ｒｐｍ、１５分）して、上清を捨て、残った菌体に１０％トレハロース、１％グルタミン酸ナトリウム溶液を加えて懸濁し、凍結乾燥機で乾燥した。【００４８】
【表６】
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【００４９】
サイレージ調製は、以下のように行った。チモシー、オーチャードグラス、リードカナリーグラス、シバムギ、イタリアンライグラス、ライムギを出穂期で、アルファルファは開花期で刈り取り、約２ｃｍの長さに細断した。各乳酸菌の凍結乾燥粉末を水に溶解して、１株だけの場合は材料草１ｇあたり１．０×１０５ｃｆｕ、２株混合する場合はそれぞれ５．０×１０４ｃｆｕの菌数になるように材料草に添加、混合した。これらの材料草を１リットル容のポリエチレン製プラスチックボトルもしくはプラスチック製パウチ袋（ナイロンとポリエチレンの積層フィルム）に詰め込んだ。プラスチックボトルには材料草６００ｇを押し込み、蓋を閉めて密封し、パウチ袋には材料草１００ｇを入れて、市販の吸引密封機で袋内の空気を吸引して密封した。これらを２５℃で２ヶ月間発酵させた。得られたサイレージはｐＨをｐＨメーターで、有機酸含量をＨＰＬＣで分析した。【００５０】
【表７】
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【００５１】
【表８】
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【００５２】
【表９】
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【００５３】
【表１０】
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【００５４】
【表１１】
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【００５５】
【表１２】
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【００５６】
【表１３】
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【００５７】
【表１４】
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【００５８】
【表１５】
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【００５９】
表７、８から分かるように、サイレージ用乳酸菌として市販製品で使用されているＳＢＴ−２３００株では殆ど発酵品質が改善できない材料において、牧草煮汁培地中でのナイシン生産能が４０ＩＵ／ｍＬ以下であるＲＯ５０株を添加しても、発酵品質改善効果は殆どないか、酪酸の低減効果が弱いのに対し、牧草煮汁培地中でのナイシン生産能が高いＳＢＳ−０００１株を添加することで明らかに酪酸含量が低下し、サイレージの発酵品質が改善された。【００６０】
表９から分かるように、ＳＢＳ−０００３株はＳＢＴ−２３００株よりも乳酸発酵能が優れているが、ＳＢＴ−０００１株やＳＢＴ−０００２株を加えることで、さらに酪酸含量が低下した。【００６１】
表１０、１１から分かるように、ＳＢＴ−２３００株やＳＢＳ−０００３株では全く発酵品質改善効果が得られないような材料においても、ＳＢＳ−０００３株にＳＢＳ−０００１株やＳＢＳ−０００２株を加えることで、大幅に酪酸含量が低下して、発酵品質も大幅に改善された。【００６２】
表９、１０、１１、１２、１３、１４、１５から分かるように、無添加では発酵品質が悪く、ＳＢＴ−２３００でも十分な発酵品質改善効果が得られないような様々な材料において、ＳＢＳ−０００３株にＳＢＳ−０００１株やＳＢＳ−０００２株を加えることで、大幅に酪酸含量が低下して、発酵品質も大幅に改善された。