(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍性疾患の治療的処置のための多能性または複能性成体幹細胞由来の微細小胞(ＭＶ)を含む、医薬。
【請求項２】
多能性または複能性成体幹細胞が間充織幹細胞および肝臓幹細胞からなる群より選択される、請求項１記載の医薬。
【請求項３】
多能性または複能性成体幹細胞が骨髄由来のヒト間充織幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）、脱糸球体嚢由来のヒト間充織幹細胞（Ｇｌ−ＭＳＣ）およびヒト非楕円形肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）からなる群より選択される、請求項２記載の医薬。
【請求項４】
腫瘍性疾患が肝臓腫瘍、上皮腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍および卵巣腫瘍からなる群より選択される、請求項１ないし３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
腫瘍性疾患の治療的処置が、その必要とする患者に、患者の体重１ｋｇ当たり０．１−２００マイクログラムの用量で微細小胞を投与することを含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
腫瘍性疾患の治療的処置が、その必要とする患者に、患者の体重１ｋｇ当たり１−１５０マイクログラムの用量で微細小胞を投与することを含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
腫瘍性疾患の治療的処置が、その必要とする患者に、患者の体重１ｋｇ当たり３−１２０マイクログラムの用量で微細小胞を投与することを含む、請求項１ないし４のいずれかに記載の医薬。
【請求項８】
局所的または全身的投与に適する医薬剤形の、請求項１ないし７のいずれかに記載の医薬。
【請求項９】
治療的処置が１または複数の細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性薬剤を投与することを含む、請求項１ないし８のいずれかに記載の医薬。
【請求項１０】
細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性薬剤が、パクリタキセル、レナリドミド、ポマリドミド、エピルビシン、５ＦＵ、スニチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、レナリドミド／デキサメタゾン、ポマリドミド／デキサメタゾン、カルボプラチン、ラパマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、ドキセタセル、ビノレルビン、ビンクリスチンおよびその組み合わせからなる群より選択される、請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性薬剤がドキソルビシンまたはビンクリスチンである、請求項１０記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は腫瘍性疾患の治療的処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞移植は、充実性腫瘍の患者にて腫瘍阻害作用を発揮し、ならびに転移性の乳癌、腎臓癌、卵巣癌、前立腺癌および膵臓癌にて抗腫瘍作用を発揮することが知られている。
【０００３】
ヒト骨髄間充織幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）は多種の器官の修復および組織の修復に寄与することが明らかにされ、実証研究はＭＳＣの移植が心臓、肝臓および腎臓を含むいくつかの器官の機能性および構造的回復に有益な効果のある可能性があることを示唆した。
【０００４】
幹細胞の微小環境は、増殖を阻害し、分化を促進するシグナルを提供することで発癌を防止するのに不可欠な役割を発揮するようである。
【０００５】
しかしながら、幹細胞の治療指標における使用は、かかる幹細胞療法の腫瘍形成能の危険性が報告されていることを考えれば、それほど望ましいものではない（Amariglio Nら、Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 2009 Feb 17;6（2））。
【０００６】
細胞由来の微細小胞（ＭＶ）は、特徴的な抗原を発現する細胞によって放出される小胞であって、その細胞から膜および細胞質成分を生成して担持し、細胞通信の新たな機構であると記載されている。最近になって、本願発明者らはヒト内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、ＢＭ−ＭＳＣおよび肝臓幹細胞から由来の微細小胞が、標的となる分化した細胞を内皮細胞、尿細管上皮細胞および肝細胞として再プログラム化し（Deregibus MCら、Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA. Blood. 2007 Oct 1;110（7）：2440-8；Bruno Sら、Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. J Am Soc Nephrol. 2009 May;20（5）：1053-67；Herrera MBら、Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats. J Cell Mol Med. 2009 Jul 24）、組織の再生および修復に貢献し得る、遺伝物質（ｍＲＮＡ）の移動のためのビヒクルとして供し得ることを明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
国際特許出願ＷＯ２００９／０８７３６１は、誘導物質を未分化細胞の第一集団に適用することで分化細胞を産生し、ついで微細小胞をその分化細胞より単離することを開示する。この点については、ＷＯ２００９／０８７３６１の３０頁の第１段落のすべてを参照のこと。未分化細胞の第１集団は、例えば、骨髄間充織幹細胞である。しかし、ＷＯ２００９／０８７３６１は未分化細胞より微細小胞を直接得ることを開示していない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、この度、成体幹細胞、好ましくは骨髄または糸球体間充識幹細胞より、あるいは非楕円形肝臓幹細胞より由来の微細小胞（ＭＶ）が、インビトロおよびインビボの両方で顕著な抗腫瘍活性を示し、それにより癌の治療的処置のための対応するすべての幹細胞にわたって別途利点を示しうることを見出した。本願発明の成体幹細胞より由来の微細小胞の抗腫瘍活性は、該微細小胞の、種々のヒト癌細胞株の増殖およびアポトーシスに対する効果、ならびにその毛細血管様構造の形成に対する効果を測定することによりインビボにて明らかにされた。微細小胞の抗腫瘍活性もまた、ＭＶ−処置の腫瘍増殖に対する効果を測定することでインビボのマウス実験にて確認された。
【０００９】
成体幹細胞より由来の微細小胞の抗腫瘍活性の観察は先行技術では全く予期せぬものである。間充織幹細胞（ＭＳＣ）の調製物は、実際、いくつかの組織にて再生作用を発揮することが知られている。例えば、骨髄由来のＭＳＣは、可溶性細胞外マトリックス糖蛋白、サイトカインおよび成長因子を含む、多くの栄養性分子を分泌することにより、自然と、血液生成を支持することが知られている。その上、内皮幹細胞より由来の微細小胞は、ＷＯ２００９／０５０７４２より、インビトロおよびインビボの両方で、血管形成およびアポトーシスに対する耐性を促進することが分かっている。ＷＯ２００９／０５７１６５では、幹細胞より由来の微細小胞は、損傷した組織または器官の内皮および上皮再生を誘発することが明らかにされた。
【００１０】
ＷＯ２００９／１０５０４４にて、間充織幹細胞より由来の微細小胞は、多数かつ多種の疾患の治療に用いるのに適すると推論している。癌の処置について、実験的証拠はなく、理論的説明もなく、具体的な方法も提供されていない。
【００１１】
かくして、本願発明の第１の態様は、腫瘍性疾患の治療的処置に用いるための成体幹細胞より由来の微細小胞である。
【００１２】
これに関連して、微細小胞は、それらを投与する同一患者より採取される成体幹細胞に由来する必要はないことを理解すべきである。むしろ、違う対象に由来して調製され、医薬の形態にて維持され、次にその必要とする患者に投与されてもよい。これはいわゆる同種アプローチである。
【００１３】
好ましい実施態様において、成体幹細胞はヒト間充織幹細胞またはヒト肝臓幹細胞である。好ましいヒト肝臓幹細胞は、ＷＯ２００６／１２６２１９に開示される間充織および胚幹細胞マーカーの両方を発現するヒト非楕円形肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）である。この細胞株は、成体幹細胞が、肝細胞マーカーを発現し、成熟肝細胞、インスリン産生細胞、骨形成原細胞および上皮細胞への分化能を有する、好ましくはアルブミン、α−フェト蛋白、ＣＫ１８、ＣＤ４４、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ９０からなる群より選択されるマーカーを発現し、好ましくはＣＤ１３３、ＣＤ１１７、ＣＫ１９、ＣＤ３４、チトクロムＰ４５０からなる群より選択されるマーカーを発現しない、成体組織より単離される、非楕円形ヒト肝臓多能性前駆細胞株である点で特に特徴付けられる。
【００１４】
もう一つ別の好ましい実施態様において、ヒト間充織幹細胞は、ヒト成体骨髄（ＢＭ−ＭＳＣ）より誘導される。もう一つ別の好ましい実施態様にて、ヒト間充織幹細胞は、欧州特許出願番号第０８４２５７０８．８に開示されるように、ヒト成体脱糸球体嚢（Ｇｌ−ＭＳＣ）より誘導される。これらの細胞はさらには、該細胞がＣＤ１３３陰性、ＣＤ１４６陽性およびＣＤ３４陰性であり、有足細胞、内皮細胞およびメサンギウム細胞への分可能を有し、好ましくはまたＣＤ２４、Ｐａｘ−２、ＣＤ３１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ナノグ、ムサシ、ビメンチン、ネスチンからなる群より選択されるマーカーを発現し、好ましくはα−ＳＭＡ、Ｏｃｔ−４、ＣＤ４５、サイトケラチン、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０からなる群より選択されるマーカーを発現しない点で特徴付けられる。
【００１５】
本願発明の一の実施態様によれば、腫瘍性疾患は、肝臓腫瘍（例、肝癌）、上皮腫瘍（例、カポシ肉腫）、乳房腫瘍（例、乳腺腺癌）、肺腫瘍、前立腺腫瘍、胃腫瘍、結腸腫瘍および卵巣腫瘍からなる群より選択される。
【００１６】
本願発明のもう一つ別の態様は、上記した腫瘍性疾患の治療的処置のための医薬の製造にて、上記の成体幹細胞より誘導される微細小胞を用いることである。
【００１７】
一の実施態様にて、該治療的処置は、一または複数の細胞傷害性または細胞増殖抑制性剤を投与することを含む。適当な細胞傷害性および細胞増殖抑制性剤として、例えば、パクリタセル（Paclitaxel）、レナリドミド（Lenalidomide）、ポマリドミド
（Pomalidomide）、エピルビシン（Epirubicin）、５ＦＵ、スニチニブ（Sunitinib）、ラ−パチニブ（La-patinib）、カネルチニブ（Canertinib）、シクロホスファミド
（cyclophosphamide）、ドキソルビシン（doxorubicin）、レナリドミデン／デキサメタゾン（Lenalidomiden/Dexamethason）、ポ−マリドミド（Po-malidomide）／デキサメタゾン、カルボプラチン（Carboplatin）、ラパマイシン（Rapamycin）、ミトキサントロン（mitoxantron）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ドキセタセル（docetaxel）、ビノレルビン（vinorelbin）、ビンクリスチン（vincristine）およびその組み合わせが挙げられる。ドキソルビシンおよび／またはビンクリスチンと、成体幹細胞より由来のＭＶとの組み合わせの投与が極めて好ましい。というのも、かかる組み合わせは相乗作用を発揮することが示されたからである（図１３を参照）。
【００１８】
微細小胞は、その必要とする患者に、局所または全身投与のいずれかで投与される。局所および全身投与の両方に適する医薬剤形は、例えば、注射可能な剤形である。一例として、微細小胞が、充実性腫瘍で局所的な腫瘍内（ｉ.ｔ.）注射にて、あるいは充実性腫瘍の場合と、転移癌の場合の両方で静脈内注射または注入にて投与される。投与されるべきＭＶの適当な用量は複数の因子に依存するが、一般に、受容者の体重１ｋｇ当たり０．１−２００μｇ、好ましくは受容者の体重１ｋｇ当たり１−１５０μｇ、さらにより好ましくは受容者の体重１ｋｇ当たり３−１２０μｇで構成される。
【００１９】
本願明細書にて用いられる「成体幹細胞より由来の微細小胞（ＭＶ）」なる語は、少なくとも部分的に成体幹細胞より誘導される、膜粒子に言及する。同様に、「成体幹細胞」なる語は、増殖能（自己再生能）および分化能（塑性能）を有し、それによってライフサイクルの終わりを迎える特化された細胞系統の成熟細胞に取って代わる、未分化または一部未分化の細胞を包含する。本願明細書にて用いられる「成体幹細胞」なる語は、無制限の自己再生能および多能性塑性を有する幹細胞、および複能性塑性を有し、ある場合には制限された自己再生能を有する前駆細胞の両方を包含する。好ましい実施態様において、「成体幹細胞」は、少なくとも２種の、より好ましくは少なくとも３種の異なる型の特化された、十分に分化された成熟細胞への分化能を有する、多能性または複能性塑性を有することを意味する。
【００２０】
本願明細書の文脈の中で、「成体幹細胞」なる語は、胚盤胞の内細胞塊より単離される「胚幹細胞」とは異なり、意図的に、成体組織より単離される幹細胞を意味する。成体幹細胞はまた、「体性幹細胞」としても知られている。
【００２１】
本願明細書の文脈の中で、「成体幹細胞より由来の微細小胞（ＭＶ）」なる表現は、意図的に、微細小胞が未分化の幹細胞より直接誘導されることを意味する。
【００２２】
本願明細書の文脈の中で、「直接」なる語は、微細小胞を得る前にいずれの分化工程がなされることも、生じることもなく、微細小胞が未分化の成体幹細胞より誘導されることを意味する。
【００２３】
本願発明にて使用される成体幹細胞より誘導される微細小胞は、一般に、形状が球体であり、１００ｎｍ〜５μｍ、より典型的には０．２〜１μｍの範囲の直径を有する。仮に粒子の形状が球体でない場合、上記した値は該粒子の最大の寸法に言及するものである。
【００２４】
本願発明にて使用される微細小胞をもたらす幹細胞は、本願明細書の実験のセクションにて記載されるように単離されてもよい。次に、微細小胞（ＭＶ）は、単離された幹細胞の上澄から、例えば本願明細書の実験のセクションに開示される超遠心分離により得られてもよい。ついで、その単離されたＭＶは、１または複数の抗凍結剤を配合した懸濁液中、超低温、例、−８０℃で凍らせることで使用するまで貯蔵されてもよい。適当な抗凍結剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびグリセロールである。ＤＭＳＯの細胞懸濁液の１容量％濃度での使用は、細胞の良好な保存および患者に再び注入された場合の毒性作用の制限を保証する。抗凍結剤として言及されてもよい他の物質は、いわゆる、密なバリアを細胞表面に形成し、細胞内脱水を減らすように作用する高分子量物質である。
【００２５】
本願発明のさらなる目的および利点は、単に例示として用いられる、以下の実施例からさらに明らかになるであろう。実施例において、以下の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１ＡおよびＢは、ＨｅｐＧ２細胞（図１Ａ）およびＫＳ細胞（図１Ｂ）を異なる量の微細小胞（ＭＶ）と一緒にインキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートされた対照となる細胞と比べて、増殖が顕著に阻害されることを示す。ＨｅｐＧ２およびＫＳ細胞の増殖は、異なる量のＢＭ−ＭＳＣからのＭＶ（１、１０および３０μｇ／ｍｌ）、またはＲＮａｓｅで前処理されている、もしくはされていないＧｌ−ＭＳＣからのＭＶと一緒にインキュベーションした４８時間後に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイで評価された。結果は３回の実験の平均値±ＳＤで表される。
【図２】図２ＡおよびＢは、ＨｅｐＧ２およびＫＳ細胞とＭＶとのインキュベーションが、ビヒクル単独でインキュベートされた対照と、同様にドキソルビシン刺激と比べて、アポトーシスを顕著に促進することを示す。ＨｅｐＧ２およびＫＳ細胞のアポトーシスは、ＢＭ−ＭＳＣ（ＲＮａｓｅで前処理されているか、されていない）またはＧｌ−ＭＳＣからの異なる量のＭＶと一緒にインキュベーションした２４時間および／または４８時間後のアポトーシス細胞の割合としてＴｕｎｅｌアッセイで評価された。結果は３回の平均値±ＳＤで表される。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＭＣＦ−７細胞（図３Ａ）およびＳＫＯＶ−３細胞（図３Ｂ）を、ＢＭ−ＭＳＣからの３０μｇ／ｍｌのＭＶと一緒に４８時間インキュベートすることで、ビヒクル単独でインキュベートされた対照細胞と比べて増殖が顕著に阻害されることを示す。ＭＣＦ−７およびＳＫＯＶ−３細胞の増殖をＢＭ−ＭＳＣからの、またはＧｌ−ＭＳＣからの３０μｇ／ｍｌのＭＶと一緒にインキュベートした４８時間後にＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価した。結果は３回の実験の平均値±ＳＤで表される。
【図４】ＢＭ−ＭＳＣからのＭＶが、特にＳＫＯＶ−３細胞のＧ０／Ｇ１フェーズにて細胞の増加を誘発することを示す。ＤＮＡ含量を、１０％ＦＣＳと共に、ＦＣＳを除き（飢餓）、３０μｇ／ｍｌのＭＶの存在下で２４時間培養したＳＫＯＶ−３細胞にて測定した。ＭＶの存在下、Ｇ０／Ｇ１フェーズにて細胞数の増加が観察される。
【図５】図５Ａおよび５ＢはＭＶのインビトロでの血管形成における作用を評価するのに実施された実験の結果を示す。ＨＵＶＥＣおよびＴＥＣのマトリゲル内での毛細血管様構造を形成する能力について評価した。
【図６】ＭＶのインビトロでのアポトーシスにおける作用を評価するのに実施された実験の結果を示す。ＨＵＶＥＣおよびＴＥＣのアポトーシスを、異なる量のＭＶと一緒にインキュベートした４８時間後のアポトーシス細胞の割合としてＴｕｎｅｌアッセイで評価した。
【図７】ＭＶのＴＥＣの増殖に対する作用を評価するのに実施された実験の結果を示す。ＴＥＣの増殖は、ＲＮａｓｅで前処理されているか、またはされていないＢＭ−ＭＳＣからの異なる量のＭＶ（１０および３０μｇ／ｍｌ）と一緒にインキュベートした４８時間後にＢｒｄＵ取り込みアッセイで評価した。結果は２回の実験の平均値±ＳＤとして表される。
【図８】ＨｅｐＧ２異種移植片のＳＣＩＤマウスに腫瘍内投与された、ＲＮａｓｅで処理されているか、またはされていないＭＶのインビボでの抗腫瘍活性を示す。腫瘍塊を毎週該移植片の２つの直交する寸法をキャリパーを用いて測定することにより決定した。結果は腫瘍塊の増大の割合として表され：第１処置（ＨｅｐＧ２注射の１週間後）の腫瘍塊を慣例により１００％値として固定する。
【図９】ＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶがインビボにて腫瘍増殖を減少させることを示す。Ａ）ＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶで処置されている（右図）または処理されていない（左図）ＨｅｐＧ２腫瘍の代表例；Ｂ）ＢＭ−ＭＳＣからのＭＶで処置されている（右図）または処理されていない（左図）切除されたＨｅｐＧ２腫瘍の代表例；Ｃ）ＢＭ−ＭＳＣからのＭＶで処置されている（右図）または処理されていない（左図）ＨｅｐＧ２腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色。
【図１０】ＭＶのＲＮａｓｅを用いる前処理がＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶの抗腫瘍活性を無効にすることを示す。Ａ）ＭＶ−ＲＮａｓｅで処置されている切除されたＨｅｐＧ２腫瘍の代表例；Ｂ）ＭＶ−ＲＮａｓｅで処置されているＨｅｐＧ２腫瘍のヘマトキシリンおよびエオシン染色。
【図１１】ＨｅｐＧ２上のＢｒｄＵをベースとする増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２をＤＭＥＭ単独中に、あるいは異なる量のＨＬＳＣより由来のＭＶを補足したＤＥＭＥにて培養した。３日後、ＨｅｐＧ２増殖がＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いて定量された。
【図１２】ＨｅｐＧ２細胞上のアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。ＨｅｐＧ２細胞は、ＤＭＥＭ単独中で、または１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で、ビンクリスチン（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＭＶ−ＨＬＳＣ（３０μｇ／ｍｌ）またはＭＶ−ＨＬＳＣ（ＲＮａｓｅで前処理されている、３０μｇ／ｍｌ）を補足して培養された。２４時間後に分析を行った。
【図１３】基底条件下のＨｅｐＧ２細胞、あるいはビトロネクチン、ドキソルビシン、ＭＶ−ＨＬＳＣまたはビトロネクチン＋ＭＶ−ＨＬＳＣおよびドキソルビシン＋ＭＶ−ＨＬＳＣで処理したＨｅｐＧ２細胞でのアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。
【図１４】ＭＶ−ＨＬＳＣ（ｎ＝３）、ビヒクル（ｎ＝２）またはＲＮａｓｅ処理のＭＶ−ＨＬＳＣ（ｎ＝３）でｉ．ｔ．処理された後で、マウスを殺した際の、回収されたＨｅｐＧ２腫瘍の体積を測定することで得られたデータを示すグラフである。腫瘍の体積は該移植片の２つの直交する寸法をキャリパーを用いて毎週測定することにより決定された。
【図１５】ＨＬＳＣ−ＭＶ処理によるインビボでの腫瘍増殖の阻害および腫瘍内アポトーシスの誘発を示す顕微鏡写真を図示する。Ａ）４週間後に回収されたＨｅｐＧ２腫瘍のアポトーシス、ＰＣＮＡおよびヘマトキシリン＆エオシン染色を示す代表的顕微鏡写真；Ｂ）ＭＶ−処理されたマウスから回収されたＨｅｐＧ２腫瘍のアポトーシス、ＰＣＮＡおよびヘマトキシリン＆エオシン染色を示す代表的顕微鏡写真；Ｃ）ＭＶ−ＲＮＡａｓｅ処理されたマウスから回収されたＨｅｐＧ２腫瘍のアポトーシス、ＰＣＮＡおよびヘマトキシリン＆エオシン染色を示す代表的顕微鏡写真。
【図１６】ＭＣＦ−７細胞を異なる濃度のＨＬＳＣ−ＭＶと共にインキュベートすることにより実施されたインビトロでの増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＭＣＦ−７細胞の増殖は、２、１０、１５および３０μｇ／ｍｌのＨＬＳＣ細胞から由来のＭＶと共に４８時間インキュベートした後に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価された。該実験を３回重複して行った。Ｐ＜０．０５。
【図１７】カポジ細胞（ＫＳ）を異なる濃度のＨＬＳＣ−ＭＶと共にインキュベートすることにより実施されたインビトロでの増殖アッセイの結果を示すグラフである。カポジ細胞の増殖は、２、１０、１５および３０μｇ／ｍｌのＨＬＳＣ細胞から由来のＭＶと共に４８時間インキュベートした後に、ＢｒｄＵ取り込みアッセイにより評価された。該実験を３回重複して行った。Ｐ＜０．０５。
【図１８】ＭＣＦ−７細胞およびカポジ細胞をＨＬＳＣ−ＭＶと共にインキュベートすることにより実施されたインビトロでのアポトーシスアッセイの結果を示すグラフである。アポトーシスは異なる量のＭＶ（２、１０、１５および３０μｌ／ｍｌ）および３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ処理されたＭＶと共にインキュベートされた４８時間後のアポトーシス細胞の割合としてＴＵＮＥＬアッセイにより評価された。アポトーシス誘発の陽性対照としてドキソルビシンを用いた。陰性対照にて、ＭＣＦ−７細胞およびカポジ細胞をビヒクル単独で処理した。該実験を３回重複して行った。Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
１．間充織幹細胞（ＭＳＣ）からの微細小胞（ＭＶ）
【００２８】
１．１  ＭＳＣの単離および特徴付け
【００２９】
骨髄細胞をフィコール（Ficoll）グラジエント（密度：１０２２ｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）上に積層させ、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離に付した。単核細胞を間充織幹細胞基底培地（ＭＳＣＢＭ、Lonza）の存在下で培養させた。５日間培養した後、培地を変換した。単離された細胞を拡張させるために、付着した単層を、第１継代について１５日目に、その後の継代については７日毎に３７℃で５分間トリプシン処理に付して分離した。細胞を１００００細胞／ｃｍ２の密度で播き、継代６より後の細胞は使用されなかった。
【００３０】
糸球体からのＭＳＣ集団（Ｇｌ−ＭＳＣ）が、Bruno Sら、Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 2009;18：867-880に記載されるように、手術で摘出された腎臓の皮質の正常な部分より得られた。皮質の切開した後で、糸球体の懸濁液を標準的な確立された方法を用いて集めた：一連の等級別のメッシュ（６０および１２０メッシュ）に通した後、最上部にある１２０メッシュのシーブで糸球体を集めた。次に、糸球体を自然沈降（室温で１０分間）により円錐管の底部で集め、ボーマン嚢の臓側板を、１０ｍｌのピペットを用いて吸引／排出を数回行うことで機械的に、かつコラゲナーゼＩ（Sigma, St.Louis, MO）を用いて２分間消化することで酵素的に除去した。ついで、細胞およびボーマン嚢を取り出すために、糸球体を自然沈降により円錐管の底部に集め、それをフィブロネクチンを被覆したＴ２５フラスコ（Falcon、BD Bioscience、Two Oak Park、Bedford、MA）に移した。糸球体を間充織幹細胞基礎培地（ＭＳＣＢＭ、Lonza）の存在下で培養した。細胞を放置し、継代前に集密とさせた：継代４になるまでの継代間の間隔は変動し（３−７日）、それからは約７日で確立された。
【００３１】
各継代の際に、細胞を計数し、細胞蛍光分析および免疫蛍光分析により免疫表現型について分析した。細胞蛍光分析は、次の抗体、すべてのフィコエリトリン（ＰＥ）またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合体：抗−ＣＤ１０５、−ＣＤ２９、−ＣＤ３１、−ＣＤ１４６、−ＣＤ４４、−ＣＤ９０（Dakocytomation、Copenhagen、Denmark）；−ＣＤ７３、−ＣＤ３４、−ＣＤ４５、−ＣＤ８０、−ＣＤ８６、−ＣＤ１６６、ＨＬＡ−Ｉ（Becton Dickinson Biosciences Pharmingen、San Jose、CA）；−ＣＤ１３３（Miltenyi Biotec、Auburn）；ＫＤＲ（R&D Systems、Abington、U.K.）；−ＨＬＡ−ＩＩ（Chemicon International Temecula、CA）、−ＣＤ４０（Immunotech、Beckman Coulter）、−ＣＤ１５４（Serotec、Raleigh、NC USA）モノクローナル抗体を用いて実施された。マウスＩｇＧ同形対照はDakocytomationからのものであった。インキュベーションはすべて、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する、１００μｌのリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）中、４℃で行われた。各サンプルについて、１００００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（BD Biosciences Pharmingen）で分析した。ゲーティングは陰性対照に基づいて構成され、行われたすべての分析にて補償対照が含められた。セルクエストソフトウェア（Cell Quest software）（BD Biosciences Pharmingen）を用いて各実験からゲート化された集団についての集団割合および数が生成された。
【００３２】
間接免疫蛍光を、チャンバースライド（Nalgen Nunc International、Rochester、NY、USA）上で培養され、２％シュークロースを含有し、必要ならば、ヘペス−トリトンＸ１００緩衝剤（Sigma、St. Louis、MO）で透過処理された、４％パラホルムアルデヒドに固定された、ＭＳＣについて行った。次の抗体：マウスモノクローナル抗ビネンチン（Sigma）およびウサギポリクローナル抗−フォン・ヴィレブランド因子（Dakocytomation）を用いた。一次抗体を省略したもの、または非免疫ウサギまたはマウスＩｇＧと置き換えられたものが、適当であるならば、対照として使用された。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗−ウサギおよび  抗−マウスＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Molecular Probes、Leiden、The Netherlands）が二次抗体として使用された。共焦点顕微鏡分析が、Zeiss LSM 5 Pascal Model Confocal Microscope（Carl Zeiss International、Germany）を用いて実施された。ヘキスト３３２５８染料（Sigma）が核染色のために添加された。
【００３３】
ＢＭ−ＭＳＣおよびＧＬ−ＭＳＣ調製物は、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ３４などの造血マーカーを発現しなかった。該調製物は副刺激性分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０）も内皮マーカー（ＣＤ３１、フォン・ヴィレブランド因子、KDR）も発現しなかった。異なる培養継代での細胞調製物はすべて典型的なＭＳＣマーカー：ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１６６およびＣＤ１４６を発現した。それらはまたＨＬＡクラスＩも発現した。
【００３４】
ＭＳＣの脂質生成、骨形成および軟骨形成の分化能は、Pittenger MF、Martin BJ、Mesenchymal and their potential as cardiac therapeutics. Circ. Res 2004；95：9-20に記載されるように測定された。簡単には、ＭＳＣをAdipogenic Medium（Lonza）で３週間培養した。分化を評価するのに、細胞を４％パラホルムアルデヒド中室温で２０分間固定し、メタノール（Sigma）中０．５％のOil Red O（Sigma）を用いて室温で２０分間染色した。
【００３５】
骨形成分化は、ＭＳＣをOsteogenic Medium（Lonza）で培養することにより評価された。培地を週に二回３週間変えた。分化を評価するのに、細胞を４％パラホルムアルデヒド中２０分間固定し、Alizarin Red（ｐＨ４．１）（Lonza）を用いて室温で２０分間染色した。
【００３６】
軟骨形成の分化では、２．５ｘ１０５のＭＳＣを１５ｍｌの円錐形ポリプロピレン管（Falcon BD Bioscience）中１５０ｇで５分間遠心分離に付し、ＤＭＥＭで２回洗浄した。該ペレットを１０ｎｇ／ｍｌのTransforming Growth Factor β3（Lonza）を補足した軟骨培地（Lonza）にて培養した。該培地を２８日間で３日毎に変えた。ペレットを４％パラホルムアルデヒド中に一夜固定し、パラフィン包埋切片を０．１％サフラニンＯ（Sigma）を用いてグリコサミノグリカンについて、および１％アルシャンブルーを用いて硫酸化プロテオグリカンについて染色した。
【００３７】
１．２  ＭＳＣから由来のＭＶの単離および特徴付け
【００３８】
ＦＣＳを除去し、０．５％のＢＳＡ（Sigma）を補足したＲＰＭＩにて培養された、上記のように得られたＢＭ−ＭＳＣまたはＧＬ−ＭＳＣの上澄から微細小胞（ＭＶ）を得た。２０００ｇで２０分間遠心分離に付して残骸を除去した後、無細胞上澄を１０００００ｇで超遠心分離器（Beckman Coulter Optima L-90K）を用いて４℃で１時間遠心分離に付し、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（Sigma）を含有する無血清培地１９９にて洗浄し、同条件下で第２の超遠心分離に供した。ＭＶのエンドトキシン汚染物を、Limulus試験により、製造業者の使用説明書（Charles River Laboratories、Inc.、Wilmington、MA、USA）に従って排除し、ＭＶを−８０℃で貯蔵した。
【００３９】
選択される実験においては、ＭＶを１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ambion Inc.、Austin、TX、USA）を用いて３７℃で１時間処理し、１０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion Inc.）を添加することで反応を停止させ、超遠心分離によりＭＶを洗浄した。
【００４０】
１．３  ＭＳＣから由来のＭＶを用いて行われるインビトロ実験
【００４１】
癌細胞株    ヒト肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）、ヒト乳腺腺癌細胞株（ＭＣＦ−７）およびヒト卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ−３）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Euroclone）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１％のグルタミン（すべて、Sigmaより入手）を含有する低グルコースＤＭＥＭ（Euroclone）中に培養し、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下でインキュベーターに維持した。カポジ肉腫細胞（ＫＳ細胞）の初代培養を、免疫抑制療法下にある、腎臓同種移植を受けた患者の皮膚病変より得、１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。
【００４２】
腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）：単離および培養    ＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotec、Auburn、CA、USA）を用いる磁気細胞分類により、磁気ビーズに結合した抗−ＣＤ１０５抗体を用いて、明細胞型腎細胞癌の試料よりＴＥＣを単離した。ＴＥＣ細胞株を確立し、上皮細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１ｍｇ／ｍｌ）、ウシ脳抽出物（すべて、Lonzaより入手）および１０％のＦＣＳを補足した内皮基底完全培地（ＥＢＭ）中に培養を維持した。ＴＥＣは形態学、ｖＷＦ抗原、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６および血管内皮カドヘリンに対して陽性染色を示し、サイトケラチンおよびデスミン（Bussolati Bら、Altered angiogenesis and survival in endothelial cells derived from renal carcinoma. FASEB J 2003;17：1159-1161）に対して陰性染色を示すことにより、内皮細胞として特徴付けられる。
【００４３】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）：単離および培養    ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、以前に記載されるように（Bussolati Bら、Vascular endothelial growth factor receptor-1 modulates vascular endothelial growth factor-mediated angiogenesis via nitric oxide. Am J Pathol. 2001Sep;159（3）：993-1008）、臍帯静脈より得、ＥＢＭおよび１０％ＦＣＳに維持された。実験は第２および第３継代のＨＵＶＥＣで行われた。
【００４４】
細胞増殖    ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、ＳＫＯＶ−３、ＫＳ細胞またはＨＵＶＥＣを、２０００または４０００細胞／ウェルで、ＦＣＳを除く、ＲＮａｓｅで前処理されている、または前処理されていない異なる濃度の微細小胞を有するＤＭＥＭ（Sigma）中の９６−ウェルに播種した。ＤＮＡ合成が、４８時間培養した後、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みとして検出された。ついで、細胞を０．５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと共にインキュベートし、該ＤＮＡを消化した。ＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みを抗−ＢｒｄＵペルオキシダーゼ接合のｍＡｂを用いて検出し、可溶性発色基質（Roche Applied Science、Mannheim、Germany）で可視化した。光学密度を４０５ｎｍの下でＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００４５】
細胞周期分析    ヒト癌細胞株を、３０μｇ／ｍｌの異なるＭＶの調製物を用いて２４時間刺激し、トリプシンにより分離し、冷８０％エタノール中に固定した。細胞を−２０℃に少なくとも２４時間維持し、次にＰＢＳで洗浄した。ついで、該細胞を室温でヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）（Sigma）と一緒に１時間インキュベートし、ＲＮａｓｅ（２００μｇ／ｍｌ）（Sigma）および０．５％のＮｏｎｉｄｅｔＰ４０（Sigma）含有の溶液中で該ＤＮＡを染色した。各サンプルについて、５００００個の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（BD Biosciences Pharmingen）で分析した。
【００４６】
アポトーシスアッセイ    ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、ＳＫＯＶ−３、ＫＳ細胞、ＨＵＶＥＣまたはＴＥＣが、８０００個の細胞／ウェルで、１０％ＦＣＳを含み、ドキソルビシン（１００ｎｇ／ｍｌ、Sigma）または異なる濃度（１０および３０μｇ／ｍｌ）のＲＮａｓｅで前処理されている、またはされていないＭＶの存在下で、ＤＭＥＭ（Sigma）中に配置された９６−ウェルに播種された。アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイ（ApopTag Oncor、Gaithersburg、MD、USA）により評価した。処理して２４または４８時間経過した後、該細胞をＰＢＳで洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）中に４℃で１５分間固定させ、ＰＢＳにて２回洗浄し、ついで予め冷却したエタノール−酢酸（２：１）に−２０℃で５分間ポスト固定させた。試料を酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）で処理した。ついで、該細胞をフルオレセインとの加熱した抗ジゴキシゲニン接合体で処理し、室温で３０分間インキュベートした。試料を１μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム含有の培地に取り込み、該細胞を免疫蛍光により分析した。結果は赤色蛍光発光性細胞（全細胞）に対する緑色蛍光発光性細胞（アポトーシスを起こした細胞）の割合として表される。
【００４７】
インビトロでの血管形成    ２４ウェルのプレートを成長因子を減少させるマトリゲル（BD Biosciences）を用いて４℃で被覆し、加湿雰囲気下、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートさせた。ＨＵＶＥＣまたはＴＥＣを、マトリゲル被覆のウェルの５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩまたはＥＢＭ中に、５ｘ１０４個細胞／ウェルの密度で、異なる濃度の、ＲＮａｓｅで処理されているか、処理されていないＭＶの存在または不在の下で播種させた。インキュベーションから６時間経過した後、該細胞をニコン倒立顕微鏡（Nikon）で観察し、実験結果を記録した。結果は、管の長さの平均として表され、MicroImage分析システム（Cast Imaging）で測定され、任意単位にて表され、３回の異なる実験からの２つの重複したウェルにて２０ｘの倍率で５個所の異なるフィールドにて評価された。
【００４８】
統計分析    異なる実験操作からのデータはすべて平均値±ＳＤとして表される。統計分析は、必要に応じて、Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓのマルチ比較試験を備えたＡＮＯＶＡで行われた。
【００４９】
１．４    インビトロ結果
【００５０】
１．４．１    ＢＭ−ＭＳＣおよびＧＬ−ＭＳＣより由来のＭＶの腫瘍細胞株に対するインビトロ生物学的効果
ヒトＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶの抗腫瘍活性を、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ−７、ＳＫＯＶ−３およびＫＳ細胞株に対してその増殖を阻害し、そのアポトーシスを誘発する能力を測定することによりインビトロにて評価した。
【００５１】
図１はＨｅｐＧ２細胞（図１Ａ）およびＫＳ細胞（図１Ｂ）を異なる量のＭＶと共に４８時間インキュベートすると、ビヒクル単独でインキュベートされた対照細胞と比べて増殖が顕著に阻害されることを示す。
【００５２】
図２はＨｅｐＧ２細胞（図２Ａ）およびＫＳ細胞（図２Ｂ）をＭＶと共に２４および４８時間インキュベートすると、ビヒクル単独でインキュベートされた対照細胞と比べて、ドキソルビシン刺激と同様に、アポトーシスが顕著に促進されることを示す。
【００５３】
ＭＶによりシャトルされるＲＮＡの完全な分解を誘発するようにＭＶをＲＮａｓｅと一緒にインキュベートした場合、ＭＶにより惹起されるＨｅｐＧ２およびＫＳ細胞に対するアンチ増殖およびプロアポトーシス作用は小さくなった（図１および２）。ＭＶのＲＮａｓｅ処理そのものはドキソルビシンにより誘発される癌細胞株のアポトーシスを干渉しなかった（図２）。
【００５４】
反対に、ＭＣＦ−７細胞およびＳＫＯＶ−３細胞と３０μｇ／ｍｌのＢＭ−ＭＳＣからのＭＶとの４８時間に及ぶインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートされた対照細胞と比べて増殖を顕著に阻害した（図３Ａおよび３Ｂ）が、アポトーシスを促進しなかった。これら２種の腫瘍細胞株にて、本願発明者らはまた、細胞がＧ０／Ｇ１フェーズにある割合を、細胞がＳおよびＧ２フェーズにある割合と比較して評価するために、細胞周期をヨウ化プロピジウム染色技法を用いて検討した。本願発明者らは、ＢｒｄＵの取り込みで観察される増殖の阻害を説明しうる、ＢＭ−ＭＳＣからのＭＶがＧ０／Ｇ１フェーズにある細胞、特にＳＫＯＶ−３細胞（図４）の増大を誘発することを観察した。
【００５５】
本願発明者らはまた、Ｇｌ−ＭＳＣから由来のＭＶの腫瘍細胞株の増殖およびアポトーシスに対する作用を試験した。Ｇｌ−ＭＳＣはＨｅｐＧ２細胞株の増殖およびアポトーシスに影響を与えなかった。反対に、Ｇｌ−ＭＳＣから由来のＭＶはＫＳ細胞の増殖を阻害し、そのアポトーシスを誘発した（図１および２）。その上、ＭＣＦ−７およびＳＫＯＶ−３細胞と３０μｇ／ｍｌのＧｌ−ＭＳＣから由来のＭＶとの４８時間に及ぶインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートした対照の細胞と比べて増殖を阻害した（図３）が、アポトーシスを促進しなかった。
【００５６】
１．４．２    ヒト線維芽細胞から由来のＭＶ
【００５７】
ヒト線維芽細胞から由来のＭＶは種々の癌細胞株の増殖を阻害せず、そのアポトーシスを誘発しなかった（図示せず）。
【００５８】
１．４．３    ＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶの内皮細胞に対するインビトロでの効果
【００５９】
本願発明者らはまた、ＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶのＨＵＶＥＣおよび腫瘍内皮細胞（ＴＥＣ）の増殖、アポトーシスおよび毛細血管様形成に対するインビトロ作用を検討した。
【００６０】
ＭＶ処理はＨＵＶＥＣの増殖に影響を及ぼさず（図示せず）、その毛細血管様形成能にも影響しなかった（図５Ａ）。加えて、ＨＵＶＥＣの種々の量のＭＶとの４８時間にわたるインキュベーションはアポトーシスを誘発しなかった（図６）。
【００６１】
反対に、ＴＥＣの種々の量のＭＶとの４８時間にわたるインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートした対照となる細胞と比べて、増殖を顕著に阻害し（図７）、アポトーシスを顕著に促進した（図６）。ＴＥＣの増殖は、ＲＮａｓｅで前処理されている、またはされていないＢＭ−ＭＳＣからの種々の量（１０および３０μｇ／ｍｌ）のＭＶと共にインキュベートして４８時間経過した後にＢｒｄＵの取り込みアッセイにより評価した。図７の結果は２回の実験の平均値±ＳＤとして表される。
【００６２】
ＭＶをＲＮａｓｅと共にインキュベートした場合、ＭＶにより惹起されるＴＥＣに対するアポトーシス作用は著しく減少した。マトリゲルに播種されたＴＥＣの種々の量のＭＶとのインキュベーションは、ＴＥＣの毛細血管様構造をインビトロにて形成する能力を著しく阻害した。ＭＶのＲＮａｓｅでの前処理は、ＭＶの細管形成に対する阻害作用を失効させた（図５Ｂ）。
【００６３】
１．５    ＭＳＣより由来のＭＶを用いるインビボ実験
【００６４】
腫瘍形成    ３ｘ１０６個のＨｅｐＧ２細胞を集め、ＳＣＩＤマウス（Charles River、Jackson Laboratories、Bar Harbor、ME）に皮下移植した。トリプシン−ＥＤＴＡを用いて収穫した培養細胞をＰＢＳで洗浄し、マイクロ血球計算器のチャンバーにて計数し、１００μｌのＤＭＥＭおよび１００μｌのマトリゲルマトリックス（Becton Dickinson）に再び懸濁させた。細胞を氷冷させ、１ｍｌのシリンジを用いる２６−ゲージ針を介してＳＣＩＤマウスの左背中に皮下注射した。動物を活動および健康状態について毎日モニター観察し、体重測定および腫瘍塊の測定を３日毎に行った。腫瘍塊は移植片の２つの直交する直径をキャリパー計測により測定し、式：１／２ａｘｂ２（式中、ａは長軸であり、ｂは短軸である）を用いて計算した（Hou Jら、Experimental therapy of hepatoma with artemisin and its derivatives：in vitro and in vivo activity、chemosensitization and mechanism of action. Clin Cancer Research. 2008;14：5519-5530））。１週間後、移植された腫瘍が約１５ｍｍ３の体積に達した時に、本願発明者らは、週に一度のＭＶの腫瘍内注射を開始した。最初の処理は１００μｇのＭＶ（ＲＮａｓｅで処理された、またはされていない）で、最大容量が２０μｌであり；その後の腫瘍内注射は５０μｇのＭＶ（ＲＮａｓｅで処理された、またはされていない）で、最大容量が２０μｌであった。対照となるマウスには、発明者らは同じ容量のビヒクルを単独で腫瘍内注射した。マウスをランダムに３つの処理群：ａ）ＭＶを腫瘍内注射した群（ｎ＝８）；ｂ）ＲＮａｓｅで処理されたＭＶを腫瘍内注射した群（ｎ＝８）；およびｃ）同じ容量のビヒクルを単独で注射した対照群（ｎ＝５）に分けた。マトリゲル注射から３週間後に、マウスを殺し、腫瘍を回収し、組織構造について加工処理した。
【００６５】
１．６  インビボ結果
【００６６】
１．６．１  ＢＭ−ＭＳＣから由来のＭＶのＨｅｐｇ２腫瘍増殖に対するインビボでの生物学的作用
【００６７】
腫瘍形成および増殖がＳＣＩＤマウスにてＢＭ−ＭＳＣより由来のＭＶにより阻害される。ＢＭ−ＭＳＣより由来のＭＶのインビボにおける腫瘍形成および増殖に対する効果を測定するために、ＳＣＩＤマウスに、マトリゲルの存在下にてＨｅｐＧ２を皮下注射した。注射した１週間後に、腫瘍の体積が約１５ｍｍ３であったならば、発明者らは週に一度のＭＶ（ＲＮａｓｅで処理された、またはされていない）の腫瘍内注射を、２０μｌの最大容量にて開始した。最初の処理は１００μｇのＭＶであり；その後の腫瘍内注射は５０μｇのＭＶであった。対照となるマウスには、発明者らは２０μｌのビヒクルを単独で腫瘍内注射した。
【００６８】
マトリゲル注射から３週間経過した後、すべての腫瘍を回収し、分析した。ＨｅｐＧ２異種移植片実験にて、ＭＶの腫瘍内注射は腫瘍増殖に対して阻害剤作用を示した（図８）。腫瘍の大きさおよび体積は、ＭＶで処理されたＳＣＩＤマウスにて有意に小さく（図９ＡおよびＢ）、組織学的分析はＭＶで処理されたＨｅｐＧ２腫瘍にて壊死の部分を示した（図９Ｃ）。ＲＮａｓｅで前処理されたＭＶを注射された腫瘍は、対照となる腫瘍と大きさおよび組織構造にて差異がなかった（図１０ＡおよびＢ）。
【００６９】
２．    肝臓幹細胞から由来の微細小胞（ＭＶ）
【００７０】
２．１    成体ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）の単離および特徴付け
【００７１】
ＨＬＳＣは、Ｌ−グルタミン（５ｍＭ）、ヘペス（１２ｍＭ、ｐＨ７．４）、ペニシリン（５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（すべて、Sigma、St. Louisより入手）、ＦＣＳ（１０％）を補足した、最小必須培地／内皮細胞基底培地−１（α−ＭＥＭ／ＥＢＭ）（３：１）（Gibco/Cambrex）にて培養された、Cambrex Bio Science Verviers S.p.r.l.（Verviers、Belgium）より入手の、低温保存された正常なヒト肝細胞より単離された。拡張した細胞をＴ−７５フラスコに移し、それらが集密に達した時に分析された。
【００７２】
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有のダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養させた。
【００７３】
２．２    ＨＬＳＣから由来のＭＶの単離
【００７４】
ＭＶを２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）補足のＭＥＭ−アルファにて培養されたＨＬＳＣの上澄より得た。血清無しで一夜インキュベートされた細胞の生存能をトリパンブルーの排除により検出した。２０００ｇで２０分間遠心分離に付し、残骸を取り除いた後、無細胞上澄を１０００００ｇ（Beckman Coulter Optima L-90K超遠心分離器）で４℃で１時間遠心分離に付し、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（Sigma）含有の無血清培地１９９で洗浄し、同じ条件下で第２の超遠心分離に供した。インビトロおよびインビボにて、蛍光顕微鏡法またはＦＡＣＳ分析によりＭＶを追跡するのに、幹細胞由来のＭＶが赤色蛍光脂肪族発色団を脂質二重層中に挿入するＰＫＨ２６色素（Sigma）で標識された。標識後、ＭＶを洗浄し、１００００ｇで１時間４℃で超遠心分離に供した。ＭＶペレットを培地１９９に懸濁させ、蛋白含量をブラッドフォード法（BioRad、Hercules、CA）により定量した。ＭＶの汚染エンドトキシンをリムルス試験により製造者の説明書（Charles River Laboratories、Inc.、Wilmington、MA）に従って排除し、ＭＶを−８０℃で貯蔵した。ヨウ化プロピジウムで染色した後のＭＶ懸濁液上でなされた形態学的分析はアポトーシス体の存在を明らかにしなかった。
【００７５】
選択された実験にて、ＨＬＳＣからのＭＶは１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ambion Inc.、Austin、TX）で１時間３７℃で処理され、１０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion Inc.）を添加することで反応を停止させ、ＭＶを超遠心分離で洗浄した。ＲＮａｓｅ処理の効果を、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてＲＮＡ抽出を行った後に、抽出された全ＲＮＡを分光光度計分析により評価した（未処理：１．３±０．２μｇ  ＲＮＡ／ｍｇの蛋白ＭＶ；ＲＮａｓｅ処理：＜０.２μｇ  ＲＮＡ／ｍｇの蛋白ＭＶ）。加えて、ＲＮＡａｓｅ処理および処理されていないＭＶより抽出されたＲＮＡをオリゴｄＴでなされるレトロトランスクリプションにより標識し、０．６％アガロース上で分析し、ＲＮａｓｅ処理によるＲＮＡの完全な分解を示した。対照として、ＭＶを１Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ（Ambion Inc.）で１時間３７℃で処理した。
【００７６】
２．３    ＨＬＳＣより単離されたＭＶを用いて実施されたインビトロ実験
【００７７】
増殖アッセイ    ＤＮＡ分析は、製造者の仕様説明書に従って酵素免役吸着測定キット（Chemicon、Temecula、CA）を用いる５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みとして検出された。簡単には、洗浄した後、細胞を１０モル／ｌのＢｒｄＵと一緒に６〜１０時間、３７℃で、５％ＣＯ２にて、加湿雰囲気下でインキュベートさせ、０．５モル／Ｌのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートし、ＤＮＡを消化した。ＤＮＡ中に取り込まれたＢｒｄＵを、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ接合モノクローナル抗体を用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。光学密度を酵素免疫吸着測定リーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。
【００７８】
アポトーシスアッセイ    アポトーシスを末端ｄＵＴＰニックエンド標識アッセイ（ApoTag；Oncor、Gaithersburg、MD）を用いて評価した。細胞（８ｘ１０３／ウェル）を９６ウェルプレートで培養し、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）に懸濁させ、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）にて１５分間、４℃で、つづいて予め冷却したエタノール／酢酸（２：１）で５分間−２０℃で固定させた。細胞を末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ酵素で処理し、加湿チャンバーにて１時間３７℃でインキュベートし、ついで加温したフルオレセインイソチオシアネート接合のアンチジゴキシゲニンで３０分間室温で処理した。洗浄した後、試料を１ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム含有の培地に固定し、細胞を免疫蛍光により分析した。
【００７９】
統計分析    種々の実験操作のデータはすべて平均±ＳＤとして表される。統計分析は、必要に応じて、ニューマン−クールズの多重比較試験のＡＮＯＶＡにより実施された。
【００８０】
２．４    インビトロ結果
【００８１】
２．４．１    ＨＬＳＣより由来のＭＶのＨｅｐＧ２肝癌細胞株の増殖に対する効果
【００８２】
本願発明者らはＨＬＳＣより由来のＭＶのＨｅｐＧ２肝癌細胞株の増殖に対する効果を評価した。簡単には、ＨｅｐＧ２細胞を種々の量の（１０、２０および３０μｇ／ｍｌ）のＨＬＳＣ由来のＭＶそのものと共にインキュベートするか、またはＲＮａｓｅで３日間処理した。インキュベーションの終わりに、ＨｅｐＧ２培養物を計数するか、０.５Ｍのエタノール／ＨＣｌに固定し、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートし、そのＤＮＡを消化した。該ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ接合モノクローナル抗体を用いて検出し、可溶性発色基質で可視化した。光学密度をＥＬＩＳＡリーダーを用いて４０５ｎｍで測定した。図１１に示されるように、ＨＬＳＣより由来のＭＶはＨｅｐＧ２増殖を顕著に阻害しうる。このことはまたＲＮａｓｅ処理のＭＶにも適用する。
【００８３】
２．４．２    ＨＬＳＣより由来のＭＶのＨｅｐＧ２肝癌細胞株のアポトーシスに対する効果
【００８４】
ＨＬＳＣ誘導のＭＶのＨｅｐＧ２のアポトーシス誘発能を評価した。簡単には、ＨｅｐＧ２を８０００細胞／ウェルの密度で９６−ウェルプレートの１０％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭに播種し、ＦＣＳの不在下で、癌の化学療法にて使用される２種の有糸分裂阻害剤である、ビンクリスチン（１００ｎｇ／ｍｌ）またはドキソルビシン（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理することにより、あるいはＭＶ処理（３０μｇ／ｍｌ）で培養してアポトーシスを誘発した。対照として、ＭＶをまた１Ｕ／ｍｌのＲＮase１８（Ambion、Austin、TX）で３７℃１時間処理し、癌細胞増殖の阻害への寄与がＭＶによって癌細胞にデリバリーされたｍＲＮＡの水平移動に依存するかどうかを評価した。アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイ分析を用いて２４および７２時間で評価した。図１２に示されるように、ＨＬＳＣより由来のＭＶは、ビンクリスチンにより誘発されるアポトーシスと比べて、ＨｅｐＧ２のアポトーシスを誘発することが可能であった。反対に、ＲＮａｓｅ処理はアポトーシスを誘発しなかった。加えて、ＨｅｐＧ２のビンクリスチン＋ＭＶ−ＨＬＳＣまたはドキソルビシン＋ＭＶ−ＨＬＳＣでの処理は図１３に示されるように相加作用をもたらす。
【００８５】
２．５    ＨＬＳＣより単離されるＭＶで行われるインビボ実験
【００８６】
細胞培養    ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＥＭＥで培養し、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気のインキュベーター中に維持した。
【００８７】
ヒト肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した、α−ＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）にて培養した。ＥＢＭはｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）、ヒドロコルチゾン、ＧＡ（ゲンタマイシン）、ＢＢＥ（ウシ脳抽出物）で復元された。
【００８８】
微細小胞（ＭＶ）のＨＬＳＣからの単離    ＭＶを２％ウシ胎仔血清を補足したα−ＭＥＭ培地にて培養したＨＬＳＣの上澄より得た。２０００ｇで２０分間遠心分離に付して残骸を除去した後、無細胞上澄を１０００００ｇで１時間４℃で遠心分離に付し、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含有する血清不含培地１９９で洗浄し、同じ条件下で第２の超遠心分離に供した。ＭＶペレットを０．１％のＤＭＳＯの培地１９９に懸濁させ、蛋白含量をブラッドフォード法を用いて定量した。
【００８９】
実験の設計    雄の４ないし５月齢のＳＣＩＤをCharles River laboratoriesより得た。すべてのマウスを無菌状態の檻に入れ、１週間保持して順応させた。０日目に、マトリゲル基底膜マトリックスを含む血清不含ＤＭＥＭに再び懸濁させた３ｘ１０６のＨｅｐＧ２腫瘍細胞を１：１の割合で２回注射して投与した。細胞懸濁液を合計０．２ｍｌの容量でＳＣＩＤマウスの左鼠径部に注射した。すべてのマウスを無作為に３つの処理群：２０μｌの腫瘍内（ｉ.ｔ.）ＭＶ注射（ｎ＝３）；２０μｌのｉ.ｔ.ＰＢＳ注射（ｎ＝２）および２０μｌのｉ．ｔ．ＭＶ−ＲＮａｓｅ処理の注射（ｎ＝３）に分けた。７日目に、腫瘍細胞移植後の処理を開始した。腫瘍は７日目より触診可能となり；０．１％のＤＭＳＯを補足したＭ１９９に懸濁させた、５０または１００μｇのＭＶを腫瘍移植の７、１２、１４および１８日後に注射した。腫瘍の体積が約１５ｍｍ３になった時に治療を開始した。動物を活性および健康状態について毎日モニター観察し、体重測定および腫瘍塊の測定を３日毎に行った。
【００９０】
腫瘍をキャリパーで測定した。腫瘍塊を、キャリパーにより移植片の２つの直交する直径を測定し、式：１／２ａ  ｘ  ｂ２（式中、ａは長軸であり、ｂは短軸である）を用いて計算した。２８日目に動物を殺し、さらなる分析のために腫瘍を集めた。
【００９１】
形態学研究    腫瘍を１０％緩衝化中性ホルマリンに固定し、慣用的に加工処理し、パラフィンに包埋し、５μｍの薄片にし、顕微鏡試験のためにＨ＆Ｅで染色した。増殖を検出するための免疫組織化学を抗ＰＣＮＡモノクローナル抗体を用いて行った。切片を抗マウスＨＲＰ二次抗体で遮断して標識化した（１：３００希釈）。一次抗体を省略したもの、または非免疫マウスＩｇＧと置き換えられたものが、対照として使用された。アポトーシスをＴＵＮＥＬによりパラフィン包埋組織の切片にて評価した。１０個の連続しない切片をアポトーシスの陽性腫瘍細胞について６３０の倍率で計数した。ヘキスト３３２５８色素を核染色のために添加した。
【００９２】
統計分析    種々の実験操作のデータはすべて平均±ＳＤとして表される。統計分析は、必要に応じて、ニューマン−クールズの多重比較試験のＡＮＯＶＡにより実施された。
【００９３】
２．６    インビボ結果
【００９４】
２．６．１    腫瘍の成長および増殖がＳＣＩＤマウスの肝癌異種移植片実験にてＨＬＳＣから由来のＭＶによって阻害された
【００９５】
ＨＬＳＣから由来のＭＶのインビボでの腫瘍増殖に対する効果を測定するために、ＳＣＩＤマウスに、ヒト肝細胞癌の細胞株ＨｅｐＧ２を皮下移植した。ＨｅｐＧ２注射の１および２週間後で、腫瘍の体積が約１５ｍｍ３であった際に、マウスにＭＶ（５０または１００μｇ）を最大２０μlの容量で腫瘍内注射して処理した。対照となるマウスにおいては、腫瘍に２０μlのビヒクルを単独で注射した。ＨｅｐＧ２の注射から３および４週間後に、すべての腫瘍を回収し、分析した。この異種移植片実験にて、ＭＶの腫瘍内注射（図１４）は腫瘍成長に対して阻害剤の効果を示した。加えて、組織学的分析はＭＶで処理された腫瘍にて壊死の領域を示し（図１５Ｂ）、抗増殖作用がＰＣＮＡ染色を用いて観察された（図１５Ｂ）。
【００９６】
２．６．２    ＨＬＳＣより由来のＭＶによるＳＣＩＤマウスにおける肝癌異種移植片実験でのアポトーシスの誘発
【００９７】
腫瘍内アポトーシスの効果を測定するために、ＭＶで処理された腫瘍からのパラフィン切片をＴＵＮＥＬで分析した。ＭＶ処理はビヒクル単独で処理された腫瘍と比べて腫瘍を誘発した（図１５Ａ）。
【００９８】
２．７    ＨＬＳＣから由来のＭＶの、ＭＣＦ−７乳腺腺癌およびカポジ肉腫（ＫＳ）細胞に対するインビトロでの生物学的効果
【００９９】
１．７．１    材料および方法
【０１００】
細胞培養    ヒト非楕円形肝臓幹細胞（ＨＬＳＣ）を、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した、α−ＭＥＭ／ＥＢＭ（３：１）にて培養した。ＥＢＭはｈＥＧＦ（ヒト上皮成長因子）、ヒドロコルチゾン、ＧＡ（ゲンタマイシン）、ＢＢＥ（ウシ脳抽出物）で復元された。
【０１０１】
ＭＣＦ−７乳腺腺癌細胞株をAmerican Type Culture Collection（Manassas、VA）より入手し、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した、ＤＭＥＭにて培養し、インキュベーター中、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。
【０１０２】
カポジ肉腫細胞（ＫＳ細胞）の初代培養を、免疫抑制療法を受けている腎同種移植片を有する患者の皮膚病変から入手し、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足した、ＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。
【０１０３】
ＭＶの単離    ２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補足した、ＭＥＭ−アルファにて１８時間培養したＨＬＳＣの上澄からＭＶを得た。選択された実験にて、ＭＶをＦＢＳの不在下で集めた。２％のＦＢＳおよび血清無しで一夜インキュベートされた細胞の生存能をトリパンブルーの排除により検出した（９０％より大きい、データは示さず）。２０００ｇで２０分間遠心分離に付し、残骸を取り除いた後、無細胞の上澄を１０００００ｇ（Beckman Coulter Optima L-90K超遠心分離器）で１時間４℃で遠心分離に付し、２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）含有の無血清培地１９９で洗浄し、同じ条件下で第２の超遠心分離に供した。ＭＶ細胞を培地１９９に懸濁させ、蛋白含量をブラッドフォード法で測定した。ＭＶを−８０℃で貯蔵した。ヨウ化プロピジウムで染色した後のＭＶ懸濁液上でなされた形態学的分析はアポトーシス体の存在を明らかにしなかった。
【０１０４】
ＲＮａｓｅ処理    選択された実験にて、ＨＬＳＣからのＭＶを１Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅで１時間３７℃で処理した。１０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤を添加することで反応を停止させ、ＭＶを超遠心分離により洗浄した。
【０１０５】
細胞増殖    ＨＬＳＣから由来のＭＶが種々の腫瘍に対してその抗腫瘍活性を発揮するかどうかを調べるために、ＭＣＦ−７乳腺腺癌細胞およびカポジ肉腫細胞から由来の細胞株を、各々、８０００細胞／ウェルの密度で、種々の濃度のＭＶ（２；１０；１５;および３０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ処理のＭＶ）を含む、９６−ウェルプレートのＤＭＥＭおよびＲＰＭＩに播種した。ＤＮＡ合成を、４８時間培養した後の、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みとして検出した。次に、細胞を０.５Ｍのエタノール／ＨＣｌで固定し、ヌクレアーゼと一緒にインキュベートし、ＤＮＡを消化させた。該ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを、抗−ＢｒｄＵペルオキシダーゼ接合ｍＡｂを用いて検出し、可溶性発色基質を用いて可視化した。光学密度は４０５ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定された。
【０１０６】
アポトーシスアッセイ    ＭＣＦ−７およびＫＳ細胞を８０００細胞／ウェルの密度で９６−ウェルの１０％ＦＣＳを含み、ドキソルビシン（１００ｎｇ／ｍｌ）または種々の濃度のＭＶ（２；１０；１５および３０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ処理されたＭＶ）の存在する低グルコースのＤＭＥＭに播種した。アポトーシスをＴＵＮＥＬアッセイを用いて評価した。
【０１０７】
２／７／２    結果：ＨＬＳＣより由来のＭＶはＭＣＦ−７細胞およびＫＳ細胞のインビトロでの増殖を阻害した
【０１０８】
ＭＣＦ−７乳腺腺癌細胞およびカポジ肉腫細胞と、２、１０、１５および３０μｇ／ｍｌのＨＬＳＣ−６Ｂから由来のＭＶ（図１６および１７）との４８時間に及ぶインキュベーションは、ビヒクル単独でインキュベートされた対照細胞と比べて、細胞増殖を顕著に阻害する。これらの結果は組織固有の幹細胞の抗腫瘍作用が同じ組織から形成される腫瘍に対して特異的ではないことを示す。その上、ＭＣＦ−７乳腺腺癌細胞およびカポジ肉腫細胞の４８時間にわたる２、１０、１５および３０μｇ／ｍｌの、ＨＬＳＣ−６Ｂ細胞から由来のＭＶ（図１８）が、ビヒクル単独でインキュベートされた対照となる細胞と比べて、アポトーシスを誘発し、その効果も化学療法薬であるドキソルビシンのアポトーシスの誘発と同じくらいである。このことはさらに、組織固有の幹細胞の抗腫瘍作用が同じ組織より生成される腫瘍に対して特異的でないことを確認するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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