(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の表１：
【表１】
0005859543.tif 000013
で示される各種成分の全て、ならびに電解質、有機酸および糖質を含む、胚培養用組成物。
【請求項２】
ｐＨ指示薬、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、抗生物質、ビタミン類、微量金属元素、キレート剤、ホルモン、細胞成長因子、脂質またはその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分、還元物質、およびポリマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１に記載の胚培養用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養用組成物に関する。より具体的には、本発明は、胚培養用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
体外受精、胚培養および胚移植などは、経済価値の高い動物の改良および生産、ならびに再生医療、生殖医療など幅広い分野において重要な技術である。体外受精および胚培養では、生体外で配偶子または胚を取扱うことになる。現在まで様々な胚培養用培地、例えば胚発生中の周辺体液環境の変化を模倣した逐次培養培地、血清が添加された血清培地および取扱いが容易な無血清の単一培地が開発されてきた。単一培地であれば、逐次培養培地のように胚の発生段階に合わせた培地交換の必要がない。無血清培地であれば、血清培地のように生体由来産物故の品質のばらつきやウイルス汚染などの危険性を低減できる。【０００３】
無血清単一培地のひとつに、ＫＳＯＭ培地が知られている（非特許文献１および２）。ＫＳＯＭ培地で培養された胚は、ＫＳＯＭの登場以前の培地で培養された胚と比べて、胚盤胞の細胞数が増加したが（非特許文献３）、生体内で発生した胚盤胞の細胞数には至っていなかった（非特許文献４および５）。【０００４】
アミノ酸は、生合成の前駆体、エネルギー源、有機性浸透圧調節物質、細胞内ｐＨ緩衝物質、抗酸化物質、キレート物質等の作用があり、アミノ酸の胚培養用培地への添加は胚発生に有効に作用することが知られている(非特許文献６)。ＫＳＯＭ培地は、開発当初、アミノ酸としてグルタミンのみを含む培地であったが、ＫＳＯＭ培地に２０種類のアミノ酸を加えることで、胚盤胞到達率、ハッチング率、および胚盤胞の細胞数が向上することが明らかになった（非特許文献７）。【０００５】
ヒト着床前胚の培養用の培地を開発するにあたって、マウス胚を用いた研究が推奨されている（非特許文献８および９）。ＫＳＯＭ培地または２０種類のアミノ酸を加えたＫＳＯＭａａ培地は、マウス胚を用いて研究されたが（非特許文献４および７）、ヒトの胚だけでなく、ウシ、ウサギ、アカゲザル、ブタ、ラットなど様々な動物胚の培養に適している事が確認されており、現在広く使用されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104(36): 14289-14293.
【非特許文献２】マウス胚の操作マニュアル第3版 2005; 149-193.
【非特許文献３】Fertil Steril 2006; 86: 1252-1265.
【非特許文献４】Biol Reprod 1994; 50: 1027-1033.
【非特許文献５】Reproduction 2009; 137: 271-283.
【非特許文献６】Semin Reprod Med 2000; 18(2): 205-218.
【非特許文献７】Mol Reprod Dev 1995; 41(2): 232-238.
【非特許文献８】Human Reproduction 1998; 13(4): 173-183.
【非特許文献９】Human Reproduction Update 2003; 9(6): 557-582.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
培養用培地中の各成分の効果は他の成分の濃度に依存するため（非特許文献９）、２０種類のアミノ酸をそれぞれ組合せて胚発生に適した濃度に設定するには、膨大な数の検討が必要である。加えて、着床前期胚の研究においては、そのサンプルの希少性のために、そのような大規模な解析は困難であった。このため、ＫＳＯＭａａ培地をはじめ、胚培養用の培地に加えられているアミノ酸濃度は、その多くが体細胞の増殖能を指標に決定された濃度であり、胚発生に最適化されていない。【０００８】
例えば、ＫＳＯＭａａ培地に加えられているアミノ酸濃度は、Ｅａｇｌｅらが体細胞の栄養要求性を指標に定めた特定濃度の必須アミノ酸グループに属する１３種類（Science 1959; 130, 432-437）とその他の非必須アミノ酸グループに属する７種類とを、それぞれ１／２の濃度に設定しているだけである。また、ヒト胚培養用に開発された培養液Ｇ１またはＧ２においても、加えられているアミノ酸濃度は、Ｅａｇｌｅが体細胞の栄養要求性を指標に定めた濃度がそのまま用いられている。
そのため、生体外での胚培養に適したアミノ酸濃度を有する培養用培地の開発が依然として望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、かかる要望に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、胚培養に適したアミノ酸濃度を見いだした。【００１０】
本発明の態様は、以下のテーブルＡ：
【表１】
0005859543.tif 000002
で示される組成を含む、胚培養用組成物を提供する。【００１１】
本発明の１つの実施形態は、上記のテーブルＡで示される組成に、電解質、有機酸、糖質、ｐＨ指示薬、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、抗生物質、ビタミン類、微量金属元素、キレート剤、ホルモン、細胞成長因子、脂質またはその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分、還元物質、およびポリマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分をさらに含む胚培養用組成物を提供する。【００１２】
本発明の１つの実施形態は、上記のテーブルＡで示される組成および電解質を含む胚培養用組成物を提供する。本発明の別の実施形態は、上記のテーブルＡで示される組成、電解質、および有機酸および／または糖質を含む胚培養用組成物を提供する。本発明の他の実施形態は、上記のテーブルＡで示される組成、電解質、および有機酸および／または糖質を含み、さらにｐＨ指示薬、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、抗生物質、ビタミン類、微量金属元素、キレート剤、ホルモン、細胞成長因子、脂質またはその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分、還元物質、およびポリマーからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含む、胚培養用組成物もまた提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で用いる用語「胚培養用組成物」は、配偶子または胚を取り扱うための組成物を意味する。本発明の１つの実施形態において、胚培養用組成物は、受精卵または卵割球を胚盤胞まで、あるいは胚盤胞がハッチングするまで培養することができる。「胚盤胞まで培養することができる」は、限定するものではないが、例えば受精卵または卵割球を２〜８細胞期胚または桑実胚まで培養することを含む。
【００１４】
本発明の１つの実施形態にかかる胚培養用組成物は、精子または卵細胞の採取、成熟、維持または洗浄に、あるいは卵細胞を体外で受精させる際に使用することもできる。本発明の１つの実施形態にかかる胚培養用組成物は、限定するものではないが、胚培養の間に、新鮮な本発明の実施形態にかかる胚培養用組成物に交換してもよい。
【００１５】
「配偶子」は、精子または卵を意味する。本明細書において「胚」は、受精卵、初期胚および核移植胚などの再構築胚を含み、限定するものではないが、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、アカゲザル、ブタ、ラットなどの哺乳動物に由来する胚を含む。「哺乳動物」は、限定するものではないが、ヒト、マウス、ウシ、ウサギ、アカゲザル、ブタまたはラットであってよい。
【００１６】
胚盤胞は、哺乳動物の初期発生において卵割期の終わった胚を表す。胚盤胞は、透明帯（受精膜）に囲まれた内部細胞塊、胞胚腔および栄養外胚葉からなる。胚盤胞のハッチングは、胚が透明帯を脱出する過程を表し、胚が着床に至るために必須の過程である。
【００１７】
胚の構造や生理機能に異常がある培養胚は、ハッチングが遅延するか、またはハッチングしないことが知られている(Reprod Biomed Online 2003; 7: 228-234)。一方、所定の期間内にハッチングした胚盤胞は、所定の期間内にハッチングしない胚盤胞と比較して、着床率が高いこと(Fertil Steril 2000; 74: 163-165)などが知られている。
胚盤胞の細胞数は、胎児発生率と正に相関すること(J Reprod Fertil 1997; 109: 153-164)、および染色体の正常率と正に相関することが知られている(Hum Reprod; 2010: 1916-1926)。
【００１８】
培養胚の品質の評価方法としては、顕微鏡を用いて胚の形態学的特徴、例えば発生速度、胚盤胞到達率、透明帯からの脱出率（ハッチング率）等を評価する方法や、核染色を用いて胚盤胞の細胞数を計測する評価方法などがある。
これらの評価方法のうち、ハッチングに基づく評価方法は、良質の培養胚を選抜するための好適な評価方法の１つである。胚盤胞の細胞数もまた、培養胚の品質を評価する重要な評価方法の１つである。
【００１９】
本発明の１つの実施形態にかかる胚培養用組成物が含有するアミノ酸は、遊離形または薬理学的に許容される塩の形であってよい。本発明の他の実施形態にかかる胚培養用組成物が含有するアミノ酸は、加水分解などにより分解されて遊離アミノ酸に変換され得るものであってもよい。そのようなアミノ酸は、例えば、エステル体、Ｎ−アシル体、オリゴペプチドなどであってもよい。
【００２０】
例えば、グルタミンは、グリシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−ロイシル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−バリル−Ｌ−グルタミン、またはＬ−イソロイシル−Ｌ−グルタミン等のグルタミン誘導体であってもよい。これらのグルタミン誘導体は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。本発明の１つの実施形態において、グルタミン誘導体は、例えば、グリシル−Ｌ−グルタミンまたはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンである。本発明の別の実施形態において、グルタミン誘導体は、グリシル−Ｌ−グルタミンである。本発明の別の実施形態において、グルタミン誘導体は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンである。
別には、例えば、シスチンは、その一部または全部がシステインであってもよい。
【００２１】
本発明の１つの実施形態において、胚培養用組成物が含有するタウリンは、遊離形または薬理学的に許容される塩の形であってよい。本発明の他の実施形態において、胚培養用組成物が含有するタウリンは、脱水素反応などによりタウリンに変換され得るものであってもよい。例えば、そのようなタウリンは、ヒポタウリンであってもよい。
【００２２】
本発明の１つの実施形態にかかる胚培養用組成物は、必要に応じて、電解質、有機酸、糖質、ｐＨ指示薬、ｐＨ調整剤、ｐＨ緩衝剤、抗生物質、ビタミン類、微量金属元素、キレート剤、ホルモン、細胞成長因子、脂質またはその構成成分、担体蛋白質、細胞外基質成分、還元物質、およびポリマーなどからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含んでいてもよい。
【００２３】
電解質としては、限定するものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化カルシウム二水和物、硫酸マグネシウム七水和物、炭酸水素ナトリウム、塩化カルシウム、グルコン酸カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、およびリン酸水素二カリウムなどが挙げられる。これらの電解質は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２４】
有機酸としては、限定するものではないが、ピルビン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、α−ケトグルタル酸、フマル酸、オキサロ酢酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、酒石酸、アジピン酸、乳酸及びこれらの塩が挙げられる。これらの有機酸は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２５】
糖質としては、限定するものではないが、グルコース、マルトース、フルクトース、キシリトール、ソルビトールおよびトレハロースなどが挙げられる。これらの糖質は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２６】
ｐＨ指示薬としては、限定するものではないが、フェノールレッドなどが挙げられる。
【００２７】
ｐＨ調整剤としては、限定するものではないが、塩酸、酢酸、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【００２８】
ｐＨ緩衝剤としては、限定するものではないが、ＨＥＰＥＳ(Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸)、ＭＯＰＳ（３−モノホリノプロパンスルホン酸）、トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−２−アミノエタンスルホン酸などが挙げられる。これらのｐＨ緩衝剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００２９】
抗生物質としては、限定するものではないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、アンホテリシンＢ、ナイスタチンなどが挙げられる。これらの抗生物質は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３０】
ビタミン類としては、限定するものではないが、ビタミンＡ、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ニコチン酸、ビオチン、葉酸などが挙げられる。これらのビタミン類は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３１】
微量金属元素としては、限定するものではないが、亜鉛、鉄、マンガン、銅、ヨウ素、セレン、コバルトが挙げられる。これらの微量金属元素は、限定するものではないが、遊離形で用いてもよいし、またはこれらの微量金属元素を含有する薬理学的に許容される化合物として用いてもよい。これらの微量金属元素は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３２】
キレート剤としては、限定するものではないが、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＤＤＡ（エチレンジアミン二酢酸）、およびＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）などが挙げられる。これらのキレート剤は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３３】
ホルモンとしては、限定するものではないが、インスリン、ハイドロコーチゾン、デキサメタゾン、トリヨードサイロニン、ゴナトトロピン、エストロゲン、プロゲステロンなどが挙げられる。これらのホルモンは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３４】
細胞成長因子としては、限定するものではないが、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、成長ホルモンなどが挙げられる。これらの細胞成長因子は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３５】
脂質またはその構成成分としては、限定するものではないが、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、パルミチン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸などの脂肪酸およびこれらの塩、またはコレステロール、エタノールアミン、コリン、スフィンゴミエリン、カルジオリピンなどが挙げられる。これらの脂質またはその構成成分は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３６】
担体蛋白質としては、限定するものではないが、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミンなどが挙げられる。これらの担体蛋白質は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。アルブミンとしては、限定するものではないが、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、組換えウシ血清アルブミン、または組換えヒト血清アルブミン、もしくはこれらの混合物であってよい。
【００３７】
細胞外基質成分としては、限定するものではないが、フィブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナンなどが挙げられる。これらの細胞外基質成分は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３８】
還元物質としては、限定するものではないが、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、還元型グルタチオンなどが挙げられる。これらの還元物質は、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００３９】
ポリマーとしては、限定するものではないが、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、デキストランなどが挙げられる。これらのポリマーは、１種単独で用いてもよいし、２種以上を組合せて用いてもよい。
【００４０】
本発明の実施形態にかかる胚培養用組成物は、常法により構成成分を配合することで製造することができる。例えば、胚培養用組成物は、常法により無菌溶液の形態、希釈型の無菌濃縮液の形態、または溶解型の無菌凍結乾燥剤の形態で製造または供給され得る。
したがって、本発明の実施形態にかかる胚培養用組成物は、無菌溶液の形態、無菌濃縮液の形態、または無菌凍結乾燥剤の形態であってよい。本発明の実施形態にかかる胚培養用組成物が前記の無菌濃縮液の形態または無菌凍結乾燥剤の形態である場合、限定するものではないが、使用前に滅菌水を用いて希釈または溶解して、無菌溶液の形態の胚培養用組成物にすることができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１
培地組成
表２は、左欄から培地が含有する成分名、その分子量（Ｍ．Ｗ．）および含有量を、対照区としてのＫＳＯＭａａ培地（比較例１）の組成、および実施例１の培地の組成に関して示す。【００４２】
【表２】
0005859543.tif 000003
【００４３】
精子の回収
ＩＣＲ系雄性マウス（日本ＳＬＣ）を屠殺後、精巣上体尾部を切り出した。その精巣上体尾部中央の精巣上体管を切開して得られた精子塊を、ミネラルオイル下に作製した０．４％ウシ血清アルブミン含有ＴＹＨ培地３００μＬ中に採取した。採取した精子塊を３７℃、６％ＣＯ２条件下で１時間、前培養した。【００４４】
卵子の回収
ＩＣＲ系雌性マウス（日本ＳＬＣ）に、ＰＭＳＧ（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、あすか製薬、セロトロピン（商標））を７．５国際単位腹腔内に投与した４８時間後に、ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、あすか製薬、ゴナトロピン（商標））を７．５国際単位腹腔内に投与し、過排卵を誘発させ、ｈＣＧ投与の１５時間後に当該マウスを屠殺した。屠殺後すぐに卵管を切り出した。その卵管の卵管膨大部から卵子−卵丘細胞集合体を、ミネラルオイル下に作製した０．４％ウシ血清アルブミン含有ＴＹＨ培地３００μＬ中に採取した。採取した卵子−卵丘細胞集合体を、体外受精まで３７℃、６％ＣＯ２条件下で培養した。【００４５】
体外受精
採取した卵子−卵丘細胞集合体を含むＴＹＨ培地中に、前培養した精子を１５０匹／μＬとなるように加えた。３７℃、６％ＣＯ２の条件下で６時間、体外受精した後、第２極体および雌雄前核が観察できた卵を受精卵と判定し、直ちに以下の実験に供した。【００４６】
胚培養試験
実施例１の培地および比較例１の培地につき、６０ｍｍ径の培養皿にて、０．１％ウシ血清アルブミンを加えた各培地の１００μＬドロップをミネラルオイル下に作製し、３７℃、５％Ｏ２、６％ＣＯ２の条件下で一晩放置して、平衡化した。【００４７】
平衡化後の各培地のドロップに受精卵を移した。受精卵を、複数のドロップ中を移動させることにより洗浄した。洗浄した受精卵を、新鮮な各培地のドロップに移し、３７℃、５％Ｏ２、６％ＣＯ２の条件下で４日間培養した。培養４日目の胚を顕微鏡で観察し、受精卵から胚盤胞もしくはハッチング段階に達した胚の割合を算出した。得られた結果を表３に示す。【００４８】
【表３】
0005859543.tif 000004
平均値±標準誤差
＊比較例１の培地と比較して有意差あり（p=0.0065、Wilcoxon検定)【００４９】
培養４日目に得られた胚盤胞を、ＤＡＰＩ（4’,6-Diamidine-2’-phenylindole dihydrochloride）（Roche社）を用いて蛍光染色し、胚盤胞の細胞数を計測した。得られた結果を表４に示す。【００５０】
【表４】
0005859543.tif 000005
平均値±標準誤差
＊＊比較例１の培地と比較して有意差あり(p=0.0003、Wilcoxon検定)【００５１】
表３、表４のごとく、比較例１の培地で培養した群と比較して、実施例１の培地で培養した群では、ハッチング率が有意に向上し、かつ胚盤胞の細胞数が有意に増加した。この結果は、本発明の１つの実施の形態に係る実施例１の培地が、比較例１の培地より胚発生の促進作用および質的向上をもたらし得る点で優れていることを示す。【００５２】
実施例２
前記表２で示した比較例１の培地が含有するアミノ酸組成を、表２で示した実施例１の培地が含有するタウリンを含むアミノ酸組成に置き換えた培地（実施例２）を作製した（表５）。【００５３】
【表５】
0005859543.tif 000006
【００５４】
比較例１の培地および実施例２の培地を用いて、胚培養試験を実施例１に記載の胚培養試験と同様の条件で行った。得られた結果を表６に示す。【００５５】
【表６】
0005859543.tif 000007
平均値±標準誤差
＊比較例１の培地と比較して有意差あり（p=0.0467、wilcoxon検定）【００５６】
表６のごとく、比較例１で培養した群と比較して、本発明の１つの実施の形態に係る実施例２の培地で培養した群では、胚盤胞の細胞数が有意に増加した。このように、本発明の実施の形態に係る胚培養用組成物が含有するタウリンを含むアミノ酸組成は、前記の組成以外の培地組成にかかわらず、胚の発生を促進する作用を有している。【００５７】
実施例３および４
表２で示した実施例１の培地が含有するタウリンを含むアミノ酸組成の濃度を、０．７倍にした組成を含む培地（実施例３）および１．３倍にした組成を含む培地（実施例４）を作製した（表７）。【００５８】
【表７】
0005859543.tif 000008
表７中、特に記載がない限り、各成分の濃度の単位はｍＭである。【００５９】
実施例１の培地、実施例３の培地および実施例４の培地を用いて、胚培養試験を実施例１に記載の胚培養試験と同様の条件で行った。得られた結果を表８および表９に示す。【００６０】
【表８】
0005859543.tif 000009
平均値±標準誤差
各群間で有意差なし（Steel-Dwass検定）【００６１】
【表９】
0005859543.tif 000010
平均値±標準誤差
各群間で有意差なし（Steel-Dwass検定）【００６２】
表８、表９のごとく、実施例１の培地が含有するタウリンを含むアミノ酸組成の濃度を、０．７倍に変化させた組成を含む培地（実施例３）であっても、１．３倍に変化させた組成を含む培地（実施例４）であっても、その有効性に有意な差は認められなかった。このことより、本実施の形態に係る胚培養用組成物である実施例１の培地が含有するタウリンを含むアミノ酸組成の有効性は、少なくとも０．７倍から１．３倍の濃度範囲で損なわれることはないことが明らかである。【００６３】
実施例５
ヒト胚培養試験
表１０は、左欄から培地が含有する成分名、その分子量（Ｍ．Ｗ．）および含有量を、実施例５の培地の組成に関して示す。【００６４】
【表１０】
0005859543.tif 000011
【００６５】
実施例５の培地に０．０５％遺伝子組換えヒトアルブミンを加えた培地の２０μＬドロップを、３５ｍｍ径の培養皿のミネラルオイル下に作製し、３７℃、４％Ｏ２、６％ＣＯ２の条件下で一晩放置して平衡化した。【００６６】
ヒト受精卵は、今後治療に用いる意思がなく、研究使用への同意が得られた凍結融解後の受精卵を用いた。凍結溶解後のヒト受精卵を１個ずつ、平衡化後の各培地に移した。次いで、ヒト受精卵を、複数のドロップ中を移動させることにより洗浄した。洗浄した受精卵を、新鮮な各培地のドロップに移し、３７℃、４％Ｏ２、６％ＣＯ２の条件下で５〜６日間培養した。培養開始２日目から連日胚を顕微鏡で観察し、胚の発生ステージを観察した。得られた代表的な結果を表１１に示す。【００６７】
【表１１】
0005859543.tif 000012
表１１のごとく、本発明の１つの実施の形態に係る実施例５の培地が、良好なヒト胚の培養培地であることが明らかである。