(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ１６０抗体を含む調製物及び抗ＶＥＧＦ抗体を含む調製物を含む、組み合わせた調製物。
【請求項２】
該抗ＣＤ１６０抗体が、抗ＣＤ１６０抗体モノクローナル抗体、そのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、及びｄＡｂ、並びに、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、及び、頭部から尾部で結合した少なくとも２つのＦａｂを含む抗体から選択される化合物である、請求項１に記載の組み合わせた調製物。
【請求項３】
該抗ＣＤ１６０抗体が、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体、そのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、及びｄＡｂ、並びに、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ＣＬ１−Ｒ２に由来し、Ｆｃフラグメントに結合した多量体ｓｃＦｖ、共に結合して凝集型を達成する全ＣＬ１−Ｒ２抗体、及び、頭部から尾部で結合した少なくとも２つのＦａｂを含む抗体から選択される化合物である、請求項１又は２に記載の組み合わせた調製物。
【請求項４】
血管新生眼疾患を治療及び／もしくは予防するための同時使用、個別使用又は逐次使用のための、請求項１〜３のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項５】
血管新生眼疾患が、
・  角膜血管新生のすべての形態；
・  網膜症のすべての形態；
・  ノリエ病；
・  脈絡膜血管新生、ポリープ状網脈絡膜血管症、近視及びソースビージストロフィーに関連するレトロフォビーオラー脈絡膜血管新生のすべての形態；
・  ブドウ膜メラノーマ；ならびに
・  虹彩ルベオーシス及び血管新生緑内障
から選択されることを特徴とする、請求項４記載の組み合わせた調製物。
【請求項６】
血管新生眼疾患が、
・  角膜移植、及び／又は、角膜感染症、及び／又は、病原体感染症及び化学火傷から選択される角膜環境障害の合併症として発症する血管新生；
・  糖尿病虚血性及び浮腫性網膜症、早期糖尿病性網膜症、非増殖型及び増殖型網膜症、類嚢胞黄斑浮腫、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のすべての形態、ベスト病；フォン・ヒッペル・リンドウ病のような眼血管腫；イールズ病；コーツ病を含むすべての卵黄様黄斑変性症；
・  ノリエ病；
・  脈絡膜血管新生、ポリープ状網脈絡膜血管症、近視及びソースビージストロフィーに関連するレトロフォビーオラー脈絡膜血管新生のすべての形態；
・  脈絡膜メラノーマ及びそれらの転移；ならびに
・  虹彩ルベオーシス及び血管新生緑内障
から選択されることを特徴とする、請求項５記載の組み合わせた調製物。
【請求項７】
抗ＶＥＧＦ治療に抵抗性である被験体における血管新生眼疾患を治療及び／又は予防するために使用するための、請求項１〜６のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項８】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を治療するために使用するための、請求項１〜７のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項９】
化合物が、モノクローナル抗体ＣＬ１−Ｒ２であることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項１０】
化合物が、ＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２及びｄＡｂから選択されるＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメントであることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項１１】
化合物が、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ＣＬ１−Ｒ２に由来し、Fcフラグメントに隔合した多量体ｓｃＦｖ、共に結合して凝集型となるＣＬ１−Ｒ２全抗体、及び、頭部から尾部で結合した少なくとも２つのＦａｂを含む抗体から選択されるＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体であることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項記載の組み合わせた調製物。
【請求項１２】
保存的誘導体が、一価又は多価のｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１１に記載の組み合わせた調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生眼疾患を治療及び／又は予防するための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体、好ましくは、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体（これは、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４によって得られ得る）、その保存的フラグメントならびにその保存的誘導体から選択される化合物の使用に関する。
【０００２】
世界における失明の主な原因である眼血管新生は、眼の２つの主な部分：網膜及び角膜において起こる。
【０００３】
血管新生異常に関与する網膜疾患は、富裕国及び貧困国の両方において、発生率が増加している。富裕国において、新血管異常によって併発される糖尿病性網膜症、未熟網膜症及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、世界中で、大きな経済的負担、ならびに、視力低下及び法的盲の２つの主な原因である。
【０００４】
労働力及び通常の社会的ネットワークにおいて、処置費用及び罹患患者の特性統合の両方の点から、角膜感染症を併発する角膜血管新生異常又は角膜移植（遺伝性角膜ジストロフィー又は環境障害に罹患している患者において実施される）も、重要な健康保険負担である。加齢黄斑変性症及び糖尿病性網膜症に関する市場の大きさは、巨大である。競争市場の条件は重要だが、持続的な発展の調査研究によれば、病的角膜血管新生は、トランスペアレントな角膜移植の維持を妨げるか、又は角膜移植を実施する可能性さえ妨げる疾患の重大なアンサンブルにも対応する。
【０００５】
網膜血管新生の病因は複雑であり、その理解は依然として不十分である。最近の研究は、低酸素状態、炎症及びＡＭＤなどの血管疾患の成熟の影響に注目している。
【０００６】
この疾患は、暗点による視力低下、変形視症及び読解不能を特徴とする。それは、一部には、その形態（委縮性又は湿性）に関係なく生じる新血管の形成と診断されている。
【０００７】
現在のところ、ＡＭＤに対する治療法又は予防法といった処置は、委縮型に対するものである。ここ数年、抗ＶＥＧＦヒト化モノクローナル抗体治療（bevacizumab（Avastin（登録商標））又はranibizumab（Lucentis（登録商標）））は、血管新生型ＡＭＤ及び浮腫性糖尿病性網膜症を予防又は阻害するのに既に広く使用されている。しかしながら、効果は、湿性ＡＭＤに限定されており、この治療は、様々な病的角膜血管新生を遮断するのには未だ使用されていない。また、ＶＥＧＦは、唯一の前血管新生因子ではないので、抵抗が予想される。
【０００８】
さらに、特にラニビツマブ（ranibizumab）による処置中に、多くの好ましくない副作用が現れる。実際、ranibizumabによる処置は、結膜出血、眼の痛み、眼圧の増加、虹彩炎又はブドウ膜炎、及び、目のかすみを誘導する。約１０％の湿性ＡＭＤ型は、Avastin（登録商標）又はLucentis（登録商標）処置に対して受容的ではない（又はわずかである）。湿性ＡＭＤ型に罹患している多数の患者で適切な結果を得るために、これらの患者は、２年間に最大２４回のアバスチン（Avastin（登録商標））又はルセンティス（Lucentis（登録商標））硝子体内注射で処置され得るが、これは、有害事象のリスクを増加させる。
【０００９】
従って、血管新生眼疾患の処置において、副作用が少ない効果的な治療剤が必要である。
【００１０】
従って、本発明は、血管新生眼疾患を処置及び／又は予防するための薬物の調製のための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体、好ましくは、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体（これは、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４によって得られ得る）、その保存的フラグメントならびにその保存的誘導体から選択される化合物の使用に関する。
【００１１】
本発明は、血管新生眼疾患を処置及び／又は予防するための使用のための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体、好ましくは、活性化増殖性内皮細胞の細胞死を誘導する少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体に関する。
【００１２】
本発明は、血管新生眼疾患を処置及び／又は予防するための使用のための、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体（これは、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４によって得られ得る）、その保存的フラグメントならびにその保存的誘導体から選択される化合物にも関する。
【００１３】
好ましくは、前記少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体は、活性化増殖性内皮細胞の細胞死を誘導する。
【００１４】
本発明は、血管新生眼疾患を処置及び／もしくは予防するための同時使用、個別使用又は逐次使用のための併用調製物としての、抗ＣＤ１６０抗体ならびに抗ＶＥＧＦ抗体にも関する。
【００１５】
抗ＣＤ１６０抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体は、異なるターゲット及び生物学的経路に作用するので、抗ＣＤ１６０抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体の組み合わせは、血管新生眼疾患を処置するための治療戦略の成功の機会を向上させる。
【００１６】
本発明は、抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である被験体における血管新生眼疾患を処置及び／又は予防するための使用のための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体にも関する。
【００１７】
本発明は、被験体、好ましくはヒトにおける血管新生眼疾患を処置するための方法であって、治療有効量の抗ＣＤ１６０抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２、その保存的フラグメント又はその保存的誘導体が、前記被験体に投与される、方法にさらに関する。
【００１８】
「ＣＤ１６０抗体」又は「抗ＣＤ１６０抗体」という用語は、ヒトＣＤ１６０に結合する任意の抗体を意味する。従って、この用語は、ＣＤ１６０に対する免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部（すなわち、ＣＤ１６０に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む、ペプチドを含む分子）を包含する。そのため、この用語抗体は、全抗体分子だけでなく、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も意味する。本発明の目的を達成するために、ＣＤ１６０の異なるエピトープに対するいくつかの抗ＣＤ１６０抗体が、逐次使用又は同時使用され得る。本発明による抗ＣＤ１６０抗体は、抗ＣＤ１６０モノクローナル抗体、それらの保存的フラグメント及びそれらの保存的誘導体から選択される化合物であり得る。
【００１９】
本発明の文脈において、前記抗体は、活性化増殖性内皮細胞の細胞死を誘導し、ＶＥＧＦに対して直接的に作用しない。
【００２０】
前記抗ＣＤ１６０抗体は、ＣＬ１−Ｒ２、その保存的フラグメント及びその保存的誘導体から選択され得る。
【００２１】
ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体は、２００４年４月２８日のブタペスト条約に従って、National Collection of Cultures of Microorganisms CNCM Institut Pasteurに寄託されたハイブリドーマ株から得られ得る（Institute Pasteur CNCM, 25 rue du Docteur Roux F -75724 Paris Cedex 15、フランス）。寄託されたハイブリドーマは、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４を有する。
【００２２】
ＣＤ１６０は、免疫グロブリンのファミリーに属する。ヒトＣＤ１６０のｃＤＮＡは、WO 98/21240（DANA-FARBER CANCER INSTITUTE）に記載される配列番号１（１３６１bp）に対応する。
【００２３】
ヒトＣＤ１６０ｍＲＮＡは、アクセッションナンバーＡＦ０６０９８１でGenBankにおいて利用可能であり、マウスＣＤ１６０ｍＲＮＡは、アクセッションナンバーＡＦ０６０９８２でGenBankにおいて利用可能である。
【００２４】
ヒトＣＤ１６０タンパク質配列は、WO 98/21240に記載される配列番号２に対応し、アクセッションナンバーＡＡＣ７２３０２（１８１aa）でGenBankにおいて利用可能である。ヒトＣＤ１６０は、内皮細胞の表面に特に存在する２７kDaの糖タンパク質である。
【００２５】
ＣＬ１−Ｒ２ターゲット（すなわち、ＣＤ１６０レセプター）は、静止内皮細胞によってではなく、活性化増殖性内皮細胞によって発現される。活性化増殖性内皮細胞は、新血管形成、及び、特に眼疾患において存在する新血管の原因である。
【００２６】
ＣＬ１−Ｒ２は、Avastin（登録商標）又はLucentis（登録商標）と異なる作用機構を有する：それは、活性化増殖性内皮細胞の細胞死を誘導するのみであり、ＶＥＧＦに対して直接的に作用しない。それは、血管新生新血管に対する非常に高い特異性も有する。従って、驚くべきことに、この抗体は、抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である患者に、良い治療可能性を提供する。従って、本発明者らは、抗ＶＥＧＦ処置によって処置され得ない血管新生眼疾患に罹患している被験体における血管新生眼疾患を処置するための非常に有望な戦略を開発する責任を果たした。
【００２７】
従って、本発明は、抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である被験体における血管新生眼疾患を処置及び／又は予防するための使用のための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体にも関する。好ましくは、前記抗ＣＤ１６０抗体は、活性化増殖性内皮細胞の細胞死を誘導する。
【００２８】
好ましくは、前記抗体は、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体（これは、ハイブリドーマＣＮＣＭ  Ｉ−３２０４によって得られ得る）、その保存的フラグメント及びその保存的誘導体から選択される。
【００２９】
本明細書において使用される「抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である被験体」という表現は、前記抗ＶＥＧＦ抗体に対して非応答者である被験体に適用する。「非応答者」は、被験体が、抗ＶＥＧＦ抗体によって被験体の状態を回復、改善又は安定化しないことを意味する。例えば、抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である被験体は、抗ＶＥＧＦ抗体による処置が失敗した被験体、又は、抗ＶＥＧＦ抗体に基づく処置に対してうまく応答できないことが公知の被験体である。血管新生眼疾患に罹患しており、抗ＶＥＧＦ処置に抵抗性である被験体の処置の新たな戦略を提供することによって、本発明は、長期間求められていた要求を満たす。
【００３０】
この抗体は、ヒト、ウサギ、マウス及びマカクザルのような多くの種間で共通するエピトープも認識する；これは、動物実験を容易に可能にする。
【００３１】
本発明によれば、ＣＬ１−Ｒ２又はその保存的フラグメント又はその保存的誘導体は、眼血管新生疾患を処置及び／又は予防するのに使用され得る。
【００３２】
「眼血管新生疾患」又は「血管新生眼疾患」は、角膜、網膜及び脈絡膜のすべての血管新生疾患を含むすべての血管新生眼疾患を意味する。
【００３３】
これらの疾患は：
・  角膜移植、及び／又は、角膜感染症、又は、病原体感染症（ヘルペスのような）及び化学火傷を含む角膜環境障害の合併症として発症する血管新生を含む、角膜血管新生のすべての形態（その原因は何でもよい）；
・  糖尿病虚血性及び浮腫性の形態、早期糖尿病性網膜症、非増殖型及び増殖型の形態、類嚢胞黄斑浮腫、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のすべての形態、ベスト病（それらが網膜及び／又は脈絡膜の新血管に関連するどのような場合も）フォン・ヒッペル・リンドウ病のような眼血管腫；イールズ病；コーツ病を含むすべての卵黄様黄斑変性症を含む、網膜症のすべての形態；
・  ノリエ病（先天性滲出性硝子体網膜症（congenital exsudative vitreoretinopathy））；
・  脈絡膜血管新生、ポリープ状網脈絡膜血管症（それらの臨床所見は何でもよい）、近視、ソースビージストロフィー（これは、脈絡膜血管新生異常にほぼ常に関連する）に関連するレトロフォビーオラー（retrofoveolar）脈絡膜血管新生のすべての形態；
・  脈絡膜メラノーマを含むブドウ膜メラノーマ及びそれらの転移；ならびに
・  虹彩ルベオーシス（iridal rbeosis）及び血管新生緑内障
を含む。
【００３４】
しかしながら、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体、その保存的フラグメント及びその保存的誘導体によってターゲティングされる血管新生眼疾患の範囲は、より広範であり得る。
【００３５】
好ましくは、眼血管新生疾患（又は、血管新生眼疾患）は：
・  角膜移植、及び／又は、角膜感染症、及び／又は、病原体感染症（ヘルペスのような）及び化学火傷から選択される角膜環境障害の合併症として発症する血管新生を含む、角膜血管新生のすべての形態；
・  糖尿病虚血性及び浮腫性の形態、早期糖尿病性網膜症、非増殖型及び増殖型の形態、類嚢胞黄斑浮腫、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のすべての形態、ベスト病；フォン・ヒッペル・リンドウ病のような眼血管腫；イールズ病；コーツ病を含むすべての卵黄様黄斑変性症を含む、網膜症のすべての形態；
・  ノリエ病；
・  脈絡膜血管新生、ポリープ状網脈絡膜血管症、近視、ソースビージストロフィーに関連するレトロフォビーオラー脈絡膜血管新生のすべての形態；
・  脈絡膜メラノーマを含むブドウ膜メラノーマ及びそれらの転移；ならびに
・  虹彩ルベオーシス及び血管新生緑内障
からなる群より選択される。
【００３６】
好ましくは、本発明は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）のすべての形態を処置及び／又は予防するための、少なくとも１つの抗ＣＤ１６０抗体、好ましくは、ＣＬ１−Ｒ２モノクローナル抗体、その保存的フラグメントならびにその保存的誘導体から選択される抗体に関する。
【００３７】
「疾患を予防する」は、その疾患であるとまだ判定されていない被験体、特にヒトにおける疾患の発症を予防することを意味する。
【００３８】
「疾患を処置する」は、疾患の進行を減少させるか、もしくは疾患を阻害すること（すなわち、その進行を止めること）、疾患の症状及び予後の後退もしくは消失、又は、疾患の原因の停止を意味する。
【００３９】
本発明によれば、モノクローナル抗体ＣＬ１−Ｒ２と、その保存的誘導体及びその保存的フラグメントも、眼血管新生疾患を予防及び／又は処置するのに使用され得る。
【００４０】
抗ＣＤ１６０抗体の「保存的フラグメント」及び「保存的誘導体」は、前記抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２の、ＣＤ１６０に対する結合親和性及び特異性を保持するフラグメントならびに誘導体をそれぞれ意味する。このような保存的フラグメント及び保存的誘導体は、前記抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２の機能的等価物である。それらは、前記抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２と実質的に同じエピトープに結合し、及び／又は、ＣＤ１６０への結合に関して前記抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２と競合することができ、及び、それらは、ＣＤ１６０に対する結合特異性を保持するので、それらは、「保存的」である。この結合特異性は十分なので、保存的フラグメント又は保存的誘導体は、ＣＤ１６０以外のＨＬＡレセプターに結合しない。
【００４１】
抗ＣＤ１６０抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２の「フラグメント」は、重鎖、軽鎖、ＶＬ、ＶＨ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２又はｄＡｂのような抗体の一部と、ＣＤＲ（ＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、ＣＤＲ３Ｈ、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ、ＣＤＲ３Ｌ）などの超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる任意の最小単位も意味する。本発明の抗ＣＤ１６０抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２のフラグメントは、保存的である。
【００４２】
抗体の一部（すなわち、可変領域）のみが、抗体のそのエピトープへの結合に関与する。抗体の定常領域は、免疫エフェクター、食細胞又はキラー細胞及び補体を活性化し、これらの定常領域は、抗原への結合に関与しない。ヒンジ領域を保存するために酵素的に分解された定常領域（Ｆｃ）を有する抗体は、フラグメントＦ（ａｂ’）２として設計され、抗原への２つの結合部位を保有する。
【００４３】
同様に、ヒンジ領域を含む定常領域が酵素的に分解されたか、又はこの領域なしで製造された抗体は、Ｆａｂフラグメントとして設計され、抗原への２つの結合部位の１つのみを保有する。Ｆａｂフラグメントは、Ｆｄと称される重鎖の一部に共有結合した軽鎖からなる。
【００４４】
可変領域には、超可変領域としても公知の相補性決定領域（ＣＤＲ、Complementary determining region）があり、これが、抗原と直接的に相互作用する。従って、ＣＤＲの改変は、抗体の親和性を変化させるのに役立ち得る。可変領域には、フレームワーク領域（ＦＲ、frameworks）と称される第二のタイプの領域があり、これが、ＣＤＲの三次構造を維持する。これらのフレームワーク領域は、抗体が産生された種に完全に特異的である。重鎖及び軽鎖のＦｄフラグメントにおいて、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜３）によってそれぞれ隔てられた４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜４）がある。
【００４５】
本発明の保存的フラグメントは、ｄＡｂも含む。ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）は、抗体の正常構造の２つのドメインの１つに由来する１つのタンパク質鎖のみを含む抗体である。実際、ある場合において、抗体の半分は、野生型抗体の親和性と同程度の親和性で、そのターゲット抗原に結合できる。
【００４６】
本発明による抗ＣＤ１６０抗体、好ましくはＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメントは、当技術分野において周知の方法を使用して製造され得る。このようなフラグメントは、タンパク分解（例えば、Ｆ（ａｂ’）２を生成させるペプシン分解；Ｆａｂを生成させるパパインによる分解）などの通常の方法によって得られ得る。
【００４７】
好ましくは、ＣＬ１−Ｒ２の保存的フラグメントは、ＣＬ１−Ｒ２のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２及びｄＡｂから選択される。
【００４８】
ＣＬ１−Ｒ２の「保存的誘導体」は、好ましくは、天然配列と異なる少なくとも１つの配列（例えば、別の種のリンカー配列・・・）に結合した少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＤＲ、好ましくは少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２のＣＤＲ３を含むＣＬ１−Ｒ２のフラグメント、ならびに、ＣＬ１−Ｒ２のものと同程度のＣＤ１６０に対する結合親和性及びＣＬ１−Ｒ２のものと類似のＣＤ１６０結合特異性を有する前記誘導体を意味する。
【００４９】
保存的誘導体は、合成及び／又は遺伝子工学によって、当業者の一般的な知識に従って得られ得る。
【００５０】
本発明の保存的誘導体は、一価（単一の結合部位ＣＤ１６０）又は多価（ＣＤ１６０に対する少なくとも２つの結合部位）であり得る。好ましい保存的多価誘導体は、保存的四価誘導体を含む。
【００５１】
保存的誘導体は、ＣＬ１−Ｒ２の少なくとも１つのＦｖフラグメントを、別の抗体に由来するＦｃフラグメントに移植することによって得られ得るキメラ抗体を含む。Ｆｃフラグメントは、好ましくは、それが投与される被験体にとって可能な限り免疫反応性が少ないように選択される。例えば、抗体がヒトに投与されることを目的とする場合、前記Ｆｃフラグメントは、好ましくは、ヒトＦｃフラグメントである。
【００５２】
本発明の保存的誘導体は、少なくとも１つのＣＬ１−Ｒ２又はその一部を、ヒトフレームワークフラグメント（ｈＦＲ）に移植することによって得られ得るヒト化抗体も含む。もう一度、目的は、それが投与される体にとって可能な限り免疫原性が少ない抗体を得ることである。
【００５３】
本発明の保存的誘導体は、単一鎖可変フラグメントＦｖも含む：それらは、ｓｃＦｖと称される。単一鎖可変フラグメントｓｃＦｖは、約２５アミノ酸の短いリンカーによって結合された軽鎖ＶＬ及び重鎖ＶＨの可変領域を含む融合タンパク質である。適切なリンカーは、ＶＨ及びＶＬドメインが、全抗体ＣＬ１−Ｒ２の本来の構造と同じように構造的にコンフォメーションされ、従って、結合特異性を維持することを可能にするものである。このようなリンカーは、例えば、出願WO 88/01649（GENEX Corp.）において当業者に公知である。ｓｃＦｖは、一価又は多価であり得る。
【００５４】
本発明の保存的誘導体は、ｓｃＦｖの二量体である（ｓｃＦｖ）２も含む。
【００５５】
本発明の保存的誘導体は、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に対する２つの結合部位を含む。それらは、少なくとも、１つの抗原に対するＶＨ及びＶＬドメイン、ならびに、別の抗原に対するＶＨ及びＶＬドメインを含む。好ましくは、本発明による二重特異性抗体は、ＣＤ１６０に対する１つの結合部位、及び、ＶＥＧＦに対する１つの結合部位を含む。
【００５６】
本発明の保存的誘導体は、ダイアボディも含む。
【００５７】
ダイアボディは、新たなクラスの二価の小さな二重特異性抗体フラグメントである。それらは、同じ鎖上の２つのドメインの間のペアリングを可能にするには短すぎるペプチドリンカーによって結合された、同じポリペプチド鎖上のＶＬドメインに結合したＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＬ）を含む。これは、別の鎖の相補的ドメインとのペアリングを強制し、二量体分子の２つの機能的抗原結合部位との会合を促進する。二重特異性ダイアボディを構築するために、抗体Ａ及び抗体ＢのＶ−ドメインは結合されて、２つの鎖ＶＨＡ−ＶＬＢ、ＶＨＢ−ＶＬＡを形成する。各鎖は、抗原に結合するのに不活性であるが、他の鎖とペアリングして、抗体Ａ及び抗体Ｂの機能的抗原結合部位を再形成する。
【００５８】
例えば、ＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ペプチドリンカーＬによってＣＬ１−Ｒ２の少なくとも１つのＶＬ領域に結合した、ＣＬ１−Ｒ２の少なくとも１つのＶＨ領域を含むｓｃＦｖを含む；このｓｃＦｖは、特異的ＶＬ−Ｌ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬ−Ｌ指向性を有し得る。
【００５９】
ＣＬ１−Ｒ２の別の保存的誘導体は、Ｆｃフラグメントに結合したＣＬ１−Ｒ２に由来するｓｃＦｖ多量体を含む。
【００６０】
ＣＬ１−Ｒ２の別の保存的誘導体は、ＣＬ１−Ｒ２の１つ以上のＦａｂ誘導体を、全ＣＬ１−Ｒ２の各重鎖ＨのＣ末端に付加することによって得られる。
【００６１】
ＣＬ１−Ｒ２の別の保存的誘導体は、全ＣＬ１−Ｒ２抗体を共に共有結合して、凝集型を達成することによって得られる。
【００６２】
ＣＬ１−Ｒ２の別の保存的誘導体は、２つ以上のＦａｂを、頭部から尾部（face-to-tail）で結合することによって得られる。
【００６３】
本発明の多価のｓｃＦｖは、少なくとも２つのｓｃＦｖを共に結合することによって得られ得る（例えば、（ｓｃＦｖ）２）。この結合は、共有又は非共有であり得る。例として、ｓｃＦｖ四量体（４つの結合部位ＣＤ１６０）が挙げられ得る。多価のｓｃＦｖの利点は、ＣＤ１６０に対するいくつかの結合部位の存在であり、これが、抗原への結合能力を増加させる。
【００６４】
多量体ｓｃＦｖは、単一特異的であり得る（すなわち、それらの結合部位すべてが、ＣＤ１６０をターゲティングする）。
【００６５】
あるいは、多量体ｓｃＦｖは、ＣＤ１６０に対する１つ以上の結合部位、及び、ＣＤ１６０とは別の抗原に対する１つ以上の結合部位を含み得る。例えば、このような抗原は、ＶＥＧＦであり得る。
【００６６】
多量体ｓｃＦｖを製造するための方法は、当技術分野、例えば、WO 94/13806（The Dow Chemical Company）又はWO 93/11161（Enzon Inc.）において公知である。
【００６７】
好ましくは、本発明によるＣＬ１−Ｒ２の保存的誘導体は、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ダイアボディ、ＣＬ１−Ｒ２に由来し、Ｆｃフラグメントに結合した多量体ｓｃＦｖ、共に結合して凝集型を達成する全ＣＬ１−Ｒ２抗体、及び、頭部から尾部で結合した少なくとも２つのＦａｂを含む抗体の形態から選択される。
【００６８】
ＣＬ１−Ｒ２抗体、その保存的フラグメントの１つ又はその保存的誘導体の１つは、医薬組成物又は薬物中に存在し得る。医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容しうるビヒクルを含む。「薬学的に許容しうる」という用語は、細胞、細胞培養、組織又は生物などの生物系に適合し、組成物の他の有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない無毒物質を意味する。ビヒクル特性は、投与の様式に依存する。
【００６９】
医薬組成物又は薬物は、患者に投与可能な任意の形態であり得、溶液、懸濁液、凍結乾燥粉末剤、カプセル剤及び錠剤を含む。
【００７０】
医薬組成物又は薬物は、注射（すなわち、局所注射、粘膜を通じた投与、吸入、経口投与、及びより一般的には、意図した目的に好適な任意の製剤）に合う任意の形態で提示され得る。好ましくは、医薬組成物又は薬物は、結膜下投与、テノン嚢下投与（sub-tenonal）、硝子体内投与、網膜下投与、眼窩内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与又は、眼内投与に合う形態で提示される。
【００７１】
本発明は、被験体、好ましくはヒトにおける血管新生眼疾患を処置するための方法であって、治療有効量のＣＬ１−Ｒ２、その保存的フラグメント又はその保存的誘導体が、前記被験体に投与される、方法にさらに関する。ＣＬ１−Ｒ２抗体、その保存的フラグメント又はその保存的誘導体は、治療有効量で投与される。治療有効量は、ターゲティングされた血管新生眼疾患を予防及び／又は処置するのに十分な量を表す。この量は、被験体の年齢、性別及び疾患の段階によって変化し得、当業者によって決定されるであろう。治療有効量は、好ましくは、１ヶ月あたり１回の投与で、０．０１mg/kg〜５０mg/kgの間、好ましくは０．１mg/kg〜２０mg/kgの間、及び、より好ましくは０．１mg/kg〜２mg/kgの間で変化し得る。投与の様式は、注射又は段階的な注入によるものであり得る。注射は、好ましくは、硝子体内的である。
【００７２】
硝子体内投与のための調製物は、水性もしくは非水性の滅菌懸濁液又は乳液を含み得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、又は、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性ビヒクルは、水、アルコール／水溶液、乳液又は懸濁液を含む。
【００７３】
本発明のＣＬ１−Ｒ２、その保存的フラグメントの１つ又はその保存的誘導体の１つは、別の成分も含み得る。例えば、ＣＬ１−Ｒ２、その保存的フラグメント又はその保存的誘導体は、ラベルされ得る。マーカーの例は、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物及び生物発光化合物を含む。マーカーを抗体に結合させるための方法は、当業者に周知である。
【００７４】
別のラベル技術は、抗体を低分子量のハプテンにカップリングさせることからなる；これらのハプテンは、第二の反応によって特異的に改変され得る。ハプテンの例は、アビジンと反応するビオチン、又は、特異的抗ハプテンと反応できるジニトロフェノール、ピリドキサールもしくはフルオレセインである。
【００７５】
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、蛍光分子、放射性分子、もしくは、当技術分野において公知の任意の他のラベルなどの検出可能な分子又は物質でラベルされ得る。ラベルは、一般的には、シグナルを（直接的又は間接的に）提供することが、当技術分野において公知である。
【００７６】
抗体に関して、本明細書において使用される「ラベルされる」という用語は、放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））などの検出可能な物質を、抗体にカップリングすること（すなわち、物理的に結合させること）による抗体の直接的なラベル、及び、検出可能な物質との反応性による抗体の間接的なラベルを包含することを意図する。
【００７７】
本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって、放射性分子でラベルされ得る。例えば、放射性分子は、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８などのシンチグラフ検査用の放射性原子を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−Ｉｌｌ、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄などの核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても公知である）用のスピンラベルでもラベルされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１：ＣＬ１−Ｒ２は、ＦＧＦ２誘導性ウサギ角膜血管新生を阻害する。コントロールＩｇＧ１（Ｃｔｒｌ）及びＣＬ１−Ｒ２処置角膜における血管新生の定量的分析。値は、４つの別個の実験から得られた平均±ＳＥＭであり、各実験に関して、グループあたりｎ＝５匹のウサギ。＊＊＊Ｐ＜０．０００１（マンホイットニー検定）。ＦＧＦ２含有移植物の角膜移植後８日に、血管新生を評価した。移植後２４及び７２時間に、ＣＬ１−Ｒ２又はＩｇＧ１  Ｃｔｒｌの結膜下注射を実施し、角膜輪部からＦＧＦ２含有移植物までの新たに形成された血管の長さに基づいて、４段階のスケールをスコア化した。
【図２Ａ】図２Ａ及びＢ：ＣＬ１−Ｒ２は、酸素誘導性網膜症のマウスモデルにおける網膜血管新生を減少させる。注射（「モック」、ｎ＝６）なしか、又はコントロールＩｇＧ１（Ｃｔｒｌ、５μg、ｎ＝９）もしくはＣＬ１−Ｒ２（５μg、ｎ＝１１）で硝子体内注射し、過酸素条件に曝露したマウスに由来する網膜血管新生の定量的評価（組織学、網膜切片カウント）。内皮細胞（ＥＣ）核（Ａ）及び血管腔（Ｂ）の平均数。＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ｂ】図２Ａ及びＢ：ＣＬ１−Ｒ２は、酸素誘導性網膜症のマウスモデルにおける網膜血管新生を減少させる。注射（「モック」、ｎ＝６）なしか、又はコントロールＩｇＧ１（Ｃｔｒｌ、５μg、ｎ＝９）もしくはＣＬ１−Ｒ２（５μg、ｎ＝１１）で硝子体内注射し、過酸素条件に曝露したマウスに由来する網膜血管新生の定量的評価（組織学、網膜切片カウント）。内皮細胞（ＥＣ）核（Ａ）及び血管腔（Ｂ）の平均数。＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ａ】図３Ａ及びＢ：ＣＬ１−Ｒ２及びベバシズマブ（Bevacizumab）／アバスチン（Avastin）（登録商標）の、細胞誘導性網膜症のマウスモデルにおける網膜血管新生を減少させる各能力の比較。網膜血管化の定量的評価。クラスター化されたデータ用のポアソン回帰モデルを使用して、内皮細胞核（Ａ）及び血管腔（Ｂ）の平均数を測定した。平均数評価の９５％信頼区間を、エラーバーとして示す。ボンフェローニ法による事後群比較のために、Ｐ値を修正した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ】図３Ａ及びＢ：ＣＬ１−Ｒ２及びBevacizumab／Avastin（登録商標）の、細胞誘導性網膜症のマウスモデルにおける網膜血管新生を減少させる各能力の比較。網膜血管化の定量的評価。クラスター化されたデータ用のポアソン回帰モデルを使用して、内皮細胞核（Ａ）及び血管腔（Ｂ）の平均数を測定した。平均数評価の９５％信頼区間を、エラーバーとして示す。ボンフェローニ法による事後群比較のために、Ｐ値を修正した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】図４：血管新生の阻害に対するＣＬ１Ｒ２及び抗ＶＥＧＦ抗体の相乗効果。−ＩｇＧ１単独（２５μgの注射）；−Avastin（登録商標）単独（２５μgの２回注射）；−ＣＬ１−Ｒ２単独（２５、５０又は１００μgの２回注射）；−ＩｇＧ１と組み合わせたAvastin（登録商標）；及び−ＣＬ１−Ｒ２と組み合わせたAvastin（登録商標）を投与したウサギいくつかのグループにおいて得られた結果。段階は、新血管の長さに対応する。
【図５】図５：ＣＬ１−Ｒ２の完全型とＦａｂ’２型におけるＣＬ１−Ｒ２の効果。図は、角膜血管新生に対する完全型ＣＬ１−Ｒ２の効果、Ｆａｂ’２型ＣＬ１−Ｒ２の効果、及び、コントロールＩｇＧ１によって提供される効果を示す。段階は、新血管の長さに対応する。
【図６】図６：ＡＭＤ（レーザー誘導性ＣＮＶ）のマウスモデルにおけるマウス及びキメラ抗ＣＤ１６０ｍＡｂの効果。−マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール；−Kenacort retard 40（登録商標）；−ＣＮＸ４６．３（eBioscience製のラット抗マウスＣＤ１６０ｍＡｂ）；−マウス抗ヒトＣＤ１６０  Ｆａｂ’２；−マウス抗ヒトＣＤ１６０  ＩｇＧ１；及び−キメラ抗ヒトＣＤ１６０  ＩｇＧ１を投与したマウスいくつかのグループにおいて得られた結果。新生血管領域表面の平均数を測定する。
【００７９】
実施例１：
材料と方法
マウス抗ＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ。本発明者らの研究室において、マウス抗ＣＤ１６０  ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ（ＩｇＧ１）を開発し、7th Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshop中に、抗ＣＤ１６０ｍＡｂとして評価した（２６）。本発明者らは、高密度細胞システムCeLLine（VALDEA Biosciences）を使用することによって、特異的分泌ハイブリドーマ細胞株からＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂを製造した。マウスをＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）で免疫することによって、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールモノクローナル抗体Ｈｅ６を開発した。AKTA（商標）purifier systemにおいて、HiTrap（商標）protein G column（GE Healthcare）上でのアフィニティークロマトグラフィーによって、ＣＬ１−Ｒ２及びＩｇＧ１アイソタイプコントロールの両方を同様に精製し、ＰＢＳ  ｐＨ７．０に対して透析し、濃縮し、０．２２−μmフィルターを通じてろ過した。
【００８０】
動物。本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＮＭＲＩ−ｎｕ（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウス（Janvier Laboratories）を使用した。マウスは、網膜症実験に使用したものが７日齢であった以外は、７〜１０週齢であった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統に関するJackson研究室によって決定されるように、動物を、従来の恒温室（２１℃）で飼育し、１日１２時間の明暗期に暴露し、バランスの取れた食事で自由に食餌させた。本発明者らは、Institut National de la Recherche Agronomique（Castanet-Tolosan）製の雌のニュージーランドアルビノウサギを使用した。マウス網膜実験に関して、倫理委員会及びARVO Statement for use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchによって承認されたプロトコールを使用して、institutional animal care committeeのガイドラインに従って、動物を取り扱った。欧州連合ガイドラインに従って、すべての他の動物実験を実施し、地域倫理委員会（Midi-Pyrenees、フランス）によって承認された。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｖｏウサギ角膜血管新生アッセイ。本研究に使用した角膜ポケットアッセイは、以前に説明した（２８）。本発明者らは、麻酔したウサギにおいて、角膜の上側であって角膜輪部から２mmを切開した。ＦＧＦ２処置した移植物（５００ng、R&D Systems）を、このポケットに挿入した。角膜移植後２４及び７２時間に、ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧ１（３０μlのＰＢＳ中に１００μg）の結膜下注射を、角膜輪部の上側に施した。移植後８日に、角膜血管新生を測定し、角膜輪部からＦＧＦ２含有移植物までの新たに形成された血管の長さに基づいて、４段階のスケールでスコア化した（２８）。
【００８２】
酸素誘導性網膜症のマウスモデル及び硝子体内注射。酸素誘導性網膜症のよく確立された再現可能なモデルを使用して、仔マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊにおいて、網膜血管新生を誘導した（３２）。つまり、マウス（７日齢、Ｐ７）及びそれらの母個体を、密閉インキュベーターに置き、７５±２％酸素大気に５日間曝露した。PROOX oxygen analyzer（モデル１１０、BioSpherix）を用いて、酸素レベルを継続的にモニタリングした。Ｐ１２にマウスを取り出し、酸素正常条件（室内空気）においてＰ１７まで維持した。手術用顕微鏡下で、マウスを硝子体内注射した。非注射グループを除いて、各仔は、Ｐ１２に、硝子体内注射を左右の眼に受けた。つまり、仔マウスを、ケタミン（１００mg/kg体重）及びキシラジン（１０mg/kg体重）の筋肉内注射で麻酔した。マイクロはさみを用いて瞼裂を開き、局所１０％フェニレフリン及び０．５％トロピカミドで瞳孔を拡大させた。５μlハミルトン注射器に取り付けた１０mm、３３ゲージ鋼針の先端を、角膜輪部の後ろ１mmにある強膜を通じて、硝子体に押し付けた。約１μlのＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ（５μg/μl）、bevacizumab（２５μg/μl、Roche）又はＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ（５μg/μl）を、硝子体腔に注射した。
【００８３】
網膜血管新生の定性的及び定量的評価。Ｐ１７にマウスを屠殺して、組織学及び定量的測定によって血管新生を分析した。何匹かのマウスは、フルオレセイン−デキストランを用いた網膜血管造影を受けた。この定性的評価のために、本発明者らは、以前に説明したように仔マウスを麻酔し、５分間、１０．０００rpmの遠心分離によってクリアにした５０mg/mlフルオレセインラベル化デキストラン（２ｘ１０６平均分子量、Sigma）を含む１mlのＰＢＳを用いて、左心室を通じて、心臓をかん流させた。眼を評価し、４％パラホルムアルデヒド中に３時間固定した。角膜及び水晶体を取り除き、眼杯から網膜を切開した。網膜を四分円状に切断し、Vectashieldにおいて、蛍光顕微鏡検査法による検査用のカバースリップの下に平らに載せた。各処置からの少なくとも１２個の眼を検査した。組織学的分析のために、仔マウスを屠殺し、それらの眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中に４℃で少なくとも１６時間固定し、パラフィンに包埋した。本発明者らは、HM355、MICROM MICROTECミクロトームを用いて、５−μmの矢状断面を調製し、過ヨウ素酸シッフ試薬で染色し、H&Eで対比染色した。本発明者らは、視神経の各側面に５〜８個の切片をカウントした。経験のある調査員２人が、無傷の切片における新生血管内皮細胞、及び、網膜サンプル全体を横断する血管腔の数を、ｘ１００倍率で盲目的にカウントした。クラスター化されたデータ用のポアソン回帰モデルを使用して、内皮細胞核の平均数及び血管数を測定した；平均数評価の９５％信頼区間を、エラーバーとして図示する。ボンフェローニ法による事後群比較のために、Ｐ値を修正した。
【００８４】
統計。マウス及びウサギモデル実験のために、GraphPad Prism 4又はPrism 5 programsを用いて、定量的データ（平均±ＳＥＭとして提示される）を分析した。各動物に関して、各血管の変数（生体顕微鏡検査及び組織学的分析）に関する平均値を決定し、各実験グループにおいて、これらの値を、すべての動物に関する全体平均を計算するのに使用した。統計試験を実施する前に、本発明者らは、データが正規分布するか否かを決定し、それらの分散を評価した。次いで、本発明者らは、示すように、適切な試験を実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏ経時的実験に関して、本発明者らは、二元配置ANOVA分析又はスチューデントｔ−検定を使用した。本発明者らは、各試験に関する実際のＰ値を報告する。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。網膜のカウントに関して、同じ眼及び同じマウスに関する組織切片の間には２つのネストレベルの依存があるので、SAS statistical package v9.1.3（Sas Institute）のproc GLIMMIXを用いたポアソン一般化線型混合モデル（５９）によって、細胞核及び血管腔のカウントを分析した。本発明者らは、実験処置グループを固定影響要因として、及び、個々の眼をランダム効果として考えた。上限において、マウスをクラスターとして定義することによって、固定影響評価（６０）のロバスト経験的分散を計算した。Ｐ＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。
【００８５】
結果
ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂは、ウサギ角膜及びマウスモデルにおける酸素誘導性網膜症における眼血管新生を阻害する。２つの異なる眼血管新生動物モデルを使用することによって、ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂの抗血管新生特性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。これらの研究にとって、脊椎動物の眼は、免疫特権部位（３１）であると考えられ、従って、ＣＬ１−Ｒ２に結合し得る免疫細胞をおそらく欠いているという利点を有する。本発明者らは、最初に、ウサギ角膜ポケットアッセイ（２８）を使用して、ＣＬ１−Ｒ２が線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）誘導性角膜血管新生を阻害するか否かを決定した。角膜は、通常、血管及びリンパ管の両方を欠いており、この無血管状態を積極的に維持する（３１）。このモデルにおいて、新血管は、角膜輪部から誘導される。ＦＧＦ２を含む角膜移植物を移植し、１００μgのＣＬ１−Ｒ２又はコントロールＩｇＧ１を２回結膜下注射した後８日に、血管新生を評価した。コントロールＩｇＧ１処置したウサギと比較した場合、ＣＬ１−Ｒ２による処置は、角膜血管新生を顕著に減少させた（図１）。これらの知見は、ＣＬ１−Ｒ２処置が、成長因子誘導性角膜血管新生を阻害することを示している。次に、早産新生仔マウス（Ｐ７〜Ｐ１２）を高酸素レベルに曝露することによって、ヒト未熟網膜症のマウスモデルにおいて、ＣＬ１−Ｒ２の効果を調査した（３２、３３）。これらのマウスの１００％において、酸素正常条件への復帰は、網膜虚血及びＶＥＧＦ依存性前網膜血管新生を誘導した（３２）。ＣＬ１−Ｒ２又はコントロールＩｇＧ１の硝子体内注射後に、平らに載せたＦＩＴＣ−デキストランかん流全網膜上で、網膜血管系の定性的評価を最初に実施した（データは示さない）。未処置正常動物に由来する網膜は、正常な血管新生（すなわち、視神経から周辺部に広がった表面及び深部血管層の両方）を示した。血管は、表面網膜層において放射分枝パターンを、深部網膜層において多角形網状パターンを形成した。眼内注射をしていないか（「モック」）、又はコントロールＩｇＧ１（「コントロール」）を眼内注射した酸素処置動物に由来する網膜は、フルオレセインを放出し、蛇行性放射状血管及び中心無血管帯を有する新生血管網を示したが、これは、このモデルの過去の記述と一致している（３２、３３）。ＣＬ１−Ｒ２の眼内注射後に、無血管野は大きさが劇的に減少し、網膜に含まれる新生血管網及び蛇行性放射状拡張血管は少なかったが（データは示さない）、これは、中心血管におけるより良いかん流効率を示している。さらに、組織学によって、様々な未処置又は酸素処置動物に由来する眼を分析した。眼組織の連続切片を過ヨウ素酸シッフ試薬で染色して、内皮細胞の核を可視化した（データは示さない）。酸素正常環境におけるマウスに由来する網膜（正常網膜）とは異なり、モック処置マウスの網膜は、典型的には、硝子体腔及び内網膜ならびに内皮細胞核において、縦方向及び横方向に迷入した様々な大きさの微小血管を豊富に含んでいた。コントロールＩｇＧ１処置動物に由来する網膜は、豊富な迷入微小血管及び内皮細胞核を伴う同様の血管新生を示した。対照的に、ＣＬ１−Ｒ２で注射したマウスに由来する網膜は、迷入血管が顕著に少なく、これら���、特に硝子体腔における大きさが非常に縮小しており、網膜内では、内皮細胞核が少なかった。網膜血管新生を定量化するために、抗血管新生処置又はコントロール処置を施す前及び施した後に、多数のサンプルにおいて、内皮細胞核及び新血管腔をカウントした（図２Ａ及びＢ）。これらは、あらゆる網膜抗血管新生効果を正確に評価するための重要なパラメーターである。ＣＬ１−Ｒ２の硝子体内注射は、コントロールＩｇＧ１を注射した動物と比較して、神経節細胞及び内顆粒層の両方において、切片あたりの内皮細胞核の平均数を顕著に減少させた（Ｐ＜０．００１；図２Ａ）。さらに、ＣＬ１−Ｒ２の眼内注射は、モック処置（Ｐ＜０．００１）又はＩｇＧ１処置コントロールマウス（Ｐ＜０．００１）と比較した場合、切片あたりの血管腔の平均数を、それぞれ、〜５０％及び〜３０％減少させた（図２Ｂ）。次いで、マウスＶＥＧＦ−Ａを中和するbevacizumabの特異性に関しては議論があるものの（３４）、同じマウスモデルにおいて、ＣＬ１−Ｒ２処置の効果を、広く使用されているｍＡｂであるbevacizumabのものと比較した。実際、マウス、ラット、モルモット及びウサギによって産生されるＶＥＧＦ−Ａに対するbevacizumabの親和性は弱いにもかかわらず、bevacizumabが、これらの動物において実験的に誘導された角膜血管新生を処置するのに有効であることを、いくつかの報告は決定的に実証している（３５〜３９）。さらに、最近の研究は、bevacizumabが、酸素誘導性網膜症マウスモデルにおける網膜血管新生に対して、非常に顕著な阻害効果を有することを明確に示した。これらの後者の結果は、本発明者らのものと全く一致している。bevacizumabの眼内投与後に、ＣＬ１−Ｒ２処置に得られたものと同程度の標準網膜血管新生が平らに載せた網膜上で認められた（データは示さない）。定量的分析は、bevacizumab注射マウスにおける切片あたりの血管腔の平均数が、ＩｇＧ１処置コントロールマウスよりも少なく、ＣＬ１−Ｒ２処置及びbevacizumab処置マウスの間に有意差がないことを示していた（図３、Ｐ＝０．９３）。全体的には、これらのデータは、ＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂ単独療法が、ウサギ角膜及び未熟網膜症モデルのマウスにおける病的血管新生を効率的に抑制していることを示している。
【００８６】
実施例２：血管新生の阻害に対するＣＬ１Ｒ２及び抗ＶＥＧＦ抗体の相乗効果
本発明者らは、実施例１におけるＦＧＦ２処置移植物を有する角膜血管新生モデルを使用することによって、抗ＶＥＧＦ抗体（Avastin（登録商標））と組み合わせたＣＬ１−Ｒ２ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ抗血管新生特性を評価した。
【００８７】
この目的のために、本発明者らは、
−  ＩｇＧ１単独（２５μgの注射）；
−  Avastin（登録商標）単独（２５μgの２回注射）；
−  ＣＬ１−Ｒ２単独（２５、５０又は１００μgの２回注射）；
−  ＩｇＧ１と組み合わせたAvastin（登録商標）；及び
−  ＣＬ１−Ｒ２と組み合わせたAvastin（登録商標）
を投与したいくつかのグループのウサギにおける結果を比較した。
【００８８】
各グループは、４匹のウサギを含む。段階は、新血管の長さに対応する。結果を図４に示す。本発明者らは、ＣＬ１−Ｒ２を抗ＶＥＧＦ抗体と共に使用することが、眼血管新生モデルにおける血管新生の阻害において、より良い結果を提供することを証明した。
【００８９】
この結果は、ＣＬ１−Ｒ２及び抗ＶＥＧＦの組み合わせは、血管新生の相乗的な阻害を提供するので、血管新生眼疾患を処置するために、ＣＬ１−Ｒ２及び抗ＶＥＧＦが、組み合わせて非常に有用であることを示している。
【００９０】
実施例３：ＣＬ１−Ｒ２の完全型とＦａｂ’２型におけるＣＬ１−Ｒ２の効果
本発明者らは、角膜血管新生に対する完全型ＣＬ１−Ｒ２の効果とＦａｂ’２型ＣＬ１−Ｒ２の効果を比較した。この目的のために、本発明者らは、コントロールＩｇＧ１を使用した。
【００９１】
結果を図５に開示する。段階は、新血管の長さに対応する。本発明者らは、完全型ＣＬ１−Ｒ２が、コントロールＩｇＧ１によって提供される効果と比較して、血管新生の阻害に対してより良い結果を提供することを示した。本発明者らは、Ｆａｂ’２型が、完全型ＣＬ１−Ｒ２及びコントロールＩｇＧ１と比較して、より良い結果を提供するので、阻害血管新生に非常に適合していることをさらに証明した。
【００９２】
実施例４：ＡＭＤのマウスモデルにおけるマウス及びキメラ抗ＣＤ１６０ｍＡｂの効果
本研究の目的は、ＡＭＤの多くの特徴を再現する脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のマウスモデルにおいて、病的眼血管新生を阻害することに関して、マウス及びキメラ抗ＣＤ１６０ｍＡｂ両方の治療効果を評価することであった。クリプトンレーザー衝撃を施すことによって、脈絡膜血管新生を誘導した。ｉｎ  ｖｉｖｏ血管造影によって定性的に、及び、平らに載せた脈絡膜上のＣＮＶ領域の直接測定によって定量的に、ＣＮＶを評価した。
【００９３】
材料と方法
動物
Janvier Laboratories（Lassalle, QC）から、雌のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（６週齢）を得た。１日１２時間明期である従来の恒温室（２１℃）において、動物を飼育した。Jackson研究室によって推奨されるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス系統用のバランスの取れた食事で、動物を自由に食餌させた。施設内倫理委員会によって承認されたプロトコールを使用するinstitutional animal care committeeのガイドラインに従って、及び、ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに従って、動物を取り扱った。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験全体を通じて、体重、食物摂取及び行動を含むマウスの一般的な状態をモニタリングした。
【００９４】
レーザー誘導性ＣＮＶのマウスモデル
以前に説明したように（Tobe et al., 1998, Edelman Jl 2000; Montezuma SR et al 2009）、ブルッフ膜のクリプトンレーザー誘導性破裂によって、ＣＮＶを生じさせた。１００mg/kgケタミン（Ketamine 1000（登録商標）、Virbac France、Carros、フランス）及び１０mg/kgキシラジン（Rompun 2%（登録商標）、Bayer Pharma、Puteaux、フランス）の混合物の筋肉内注射によって、マウスを麻酔した。０．４％オキシブプロカイン塩酸塩（Cebesine（登録商標）、Chauvin Laboratory、Montpellier、フランス）で、マウス角膜を麻酔し、１０％フェニレフリン（Neosynephrine Faure 10%（登録商標）、Pharmaster、Erstein、フランス）及び０．５％トロピカミド（Mydriaticum（登録商標）、Farmila、Thea Farmaceutici、Settimo Milanese、イタリア）点眼薬で、瞳孔を拡大させた。
【００９５】
ブルッフ膜の崩壊、及び、脈絡毛細管枝及びから生じる第二の脈絡膜血管新生を作り出すために注意深く測定したクリプトンレーザー（スポットサイズ５０μm；電力４００mW、曝露時間１００ms、Ophthalas、Biophysics Medical、Clermont Ferrand、フランス）ならびにコンタクトレンズを用いて、マウス１匹あたり１個の眼において、３回のレーザー衝撃により誘導した（視神経付近で、通常、９、１２及び３時の位置）。本研究に含まれる処置した眼のすべてにおいて、レーザー処置後に、反応性かつ外傷性の泡が網膜表面に認められたが、これは、適切な焦点調節の証拠、及び、ブルッフ膜破裂の暗示を提供している。
【００９６】
硝子体内注射プロトコール
手術用顕微鏡下ですべての手順を実施し、クリプトンレーザー施行後１日に、各動物は、硝子体内注射を眼に受けた。
【００９７】
マウス（６週齢）を６個のグループに割り当てた：
グループ１：キメラ抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂ処置マウス（ＣＬ１−Ｒ２  ｃｈｉｍ．、ｎ＝１５）；
グループ２：マウス抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂ処置マウス（ＣＬ１−Ｒ２、ｎ＝１７）；
グループ３：マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ処置マウス（ＨＥ６、ｎ＝１５）；
グループ４：ラット抗マウスＣＤ１６０ｍＡｂ処置マウス（ＣＮＸ４６−３、ｎ＝１４）；
グループ５：マウス抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂのＦａｂ’２フラグメント処置マウス（Ｆａｂ’２、ｎ＝１５）；
グループ６：Kenacort retard 40（登録商標）処置マウス（Kenacort、ｎ＝１５）。
【００９８】
ケタミン（１００mg/k）及びキシラジン（１０mg/kg）の混合物の筋肉内注射によって、マウスを麻酔した。局所１０％フェニレフリン及び０．５％トロピカミドで、瞳孔を拡大させた。５μlハミルトン注射器に取り付けた１０mm、３３ゲージ鋼針の先端を、強膜を通じて、硝子体における角膜輪部の後ろ１mmの位置に押し付けた。各産物に関して、１μlを硝子体腔に注射した：
＊  キメラ抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂ（１０μg/μl、batch 29120-00、MAT biopharma）、
＊  マウス抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂ（１０μg/μl、batch 280910-00、MAT Biopharma）、
＊  マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロールｍＡｂ（１０μg/μl、batch 191110-00、MAT Biopharma）、
＊  ラット抗マウスＣＤ１６０ｍＡｂ（１０μg/μl、eBioscience）、
＊  マウス抗ヒトＣＤ１６０ｍＡｂのＦａｂ’２フラグメント（１０μg/μl、batch 191110-00、MAT Biopharma）
＊  Kenacort retard 40（登録商標）（４０mg/ml、Bristol Myers Squibb、フランス）。
【００９９】
ＣＮＶの定性的及び定量的評価
脈絡膜血管新生の定性的評価のために、クリプトンレーザー施行後１４日及び２１日に、マウスをフルオレセイン血管造影した。平らに載せた脈絡膜の定量的分析のために、クリプトンレーザー施行後２１日に、マウスを屠殺した。
【０１００】
ｉｎ  ｖｉｖｏ血管造影−レーザー誘導性衝撃の誘導後１４日及び２１日に、フルオレセイン血管造影を実施した。以前に説明したように、マウスを麻酔し、１０％フルオレセインナトリウム（10% Faure（登録商標）、Novartis Pharma、Rueil-Malmaison、フランス）０．５mlの腹腔内注射後に、眼底写真（Canon CF-60UVi、Haag-Streit、Chambery、フランス）を撮影した。新たに形成された異常透過性血管からのフルオレセインの漏出は、クリプトンレーザー衝撃誘導性損傷部位において、超蛍光斑点の発達をもたらし、これは、正常網膜及び脈絡膜血管系を明確に区別した。
【０１０１】
平らに載せた脈絡膜−レーザー処置後２１日に、５分間、１００００rpm（１１１０ｘｇ）の遠心分離によって浄化した、ＰＢＳに溶解させたフルオレセインラベル化デキストランの５０mg/ml溶液（fluorescein isothiocyanate-dextran, 2x106 mean molecular weight、Sigma、フランス）３００μlを用いて、左心室を通じて心かん流を実施した。レーザー処置した眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒド中４℃で少なくとも１６時間インキュベーションすることによって、すぐに固定した。角膜及び水晶体を取り出し、網膜全体を眼杯から注意深く切開した。４〜５回の放射状切開によって、網膜色素上皮−脈絡膜−強膜眼杯を切開し、Vectashieldでスライド上に平らに載せ、ｘ１０対物による蛍光顕微鏡検査法用のカバースリップ（Axioplan 2、Zeiss、Le Pecq、フランス）で被せた。測定した画像も得た。Image J Softwareを用いて、脈絡膜血管新生によって影響を受けた領域（μm2単位）を測定した。複数の損傷に関して得られた新血管領域の測定を、個々の眼及び個々の動物に関して平均化した。
【０１０２】
統計的分析
データを、平均±標準誤差として提示する。グループ間の有意差の検出のために、パラメトリック検定（分散ＡＮＯＶＡの分析及びＰＬＳＤフィッシャー検定−Statview Software, version 5）を使用して、統計的分析を実施した。Ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であると考えた。
【０１０３】
結果
実験中、グループにおける死亡率は、類似していた：グループ２において３／１７（５．８％）、グループ３において２／１５（１３％）、グループ４において１／１４（７．１％）、グループ５において２／１５（１３．３％）及びグループ１及び６においては死亡なし。死亡は、レーザー光凝固術もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ血管造影のための麻酔中又は麻酔後に起こった。
【０１０４】
６個のグループのマウスの間で、体重増加の有意差は、実質的に認められなかった。
【０１０５】
以前に説明したように（Edelman and Castro, 2000）、平らに載せた脈絡膜上の脈絡膜血管新生を示す領域を直接的に測定することによって、処置の効果を定量化した。
【０１０６】
パラメトリック検定（分散ＡＮＯＶＡの分析及びＰＬＳＤフィッシャー検定）を使用して、ＣＮＶを示す領域の分析を実施した。結果を図６に示す。マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール処置マウス（グループ３）よりも、ＣＬ１−Ｒ２（グループ２、Ｐ＜０．０００１）及びＦａｂ’２処置マウス（グループ５、Ｐ＝０．０００１）において、ＣＮＶ領域は、顕著に類似していた。陽性コントロールとして使用したKenacort（登録商標）（グループ６、Ｐ＜０．０００１）処置及びＣＮＸ４６−３（グループ４、Ｐ＜０．０００１）は、アイソタイプコントロールグループと比較して、類似の効果を示した。ＣＬ１−Ｒ２キメラ抗体による処置は、マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール処置マウスにおいて測定したものと比較して、ＣＮＶ領域を顕著に減少させた（Ｐ＜０．０００１）。ＣＬ１−Ｒ２及びＣＬ１−Ｒ２キメラ処置の間（Ｐ＝０．９８８８）、ならびに、Ｆａｂ’２及びＣＬ１−Ｒ２又はＣＬ１−Ｒ２キメラ処置の間（それぞれ、Ｐ＝０．０９５１及びＰ＝０．０９２５）で類似の効果が認められたことは、注目に値する。
【０１０７】
血管新生の定量的分析は、クリプトンレーザー誘導性ＣＮＶ及び陽性コントロール（Kenacort（登録商標））のよく確立されたマウスモデルにおいて、ＣＬ１−Ｒ２、ＣＬ１−Ｒ２キメラ、Ｆａｂ’２処置及びＣＮＸ４６−３が、（ｉ）マウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール処置と比較して、ＣＮＶによって影響を受けた領域を減少させ、（ｉｉ）脈絡膜血管新生を防いだことを示唆した。
【０１０８】
【表１】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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