(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有するエンドリシン、および、該エンドリシンのN末端もしくはC末端、または両方の末端において融合される両親媒性ペプチドストレッチから構成される、融合タンパク質であって、該両親媒性ペプチドストレッチが、5〜100個のアミノ酸残基を含み、かつ両親媒性ペプチドストレッチが、SEQ ID NO: 7、1、3、4、9、11、および51からなる群より選択される、前記融合タンパク質。
【請求項２】
両親媒性ペプチドストレッチが、5〜50個のアミノ酸残基を含む、請求項1記載の融合タンパク質。
【請求項３】
両親媒性ペプチドストレッチが、天然に存在するペプチドである、請求項1または2記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質が、N末端に追加的なアミノ酸残基を含む、および／またはペプチドストレッチが、1個もしくは複数の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項５】
グラム陽性細菌が、バチルス（Bacilli）綱の細菌である、請求項1〜4のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項６】
グラム陽性細菌が、スタフィロコッカス（Staphylococcus）および／またはストレプトコッカス（Streptococcus）である、請求項5記載の融合タンパク質。
【請求項７】
エンドリシンが、SEQ ID NO: 59、57、58、60もしくは61に記載のアミノ酸を有するエンドリシンである、請求項1〜5のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記アミノ酸残基の少なくとも30％が、正に荷電したアミノ酸残基であるリジン、アルギニン、および／またはヒスチジンである、請求項1〜7のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項９】
融合タンパク質が、C末端および／またはN末端にタグまたは追加的なタンパク質を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
タグまたは追加的なタンパク質が、1個または複数の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結されている、請求項9記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
SEQ ID NO: 72、76、77、78、または81に記載のアミノ酸配列を示す、請求項1〜10のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項12記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項12記載の核酸分子、または請求項13記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項1〜11のいずれか一項記載の融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
医用薬剤、診断手段、または美容用物質として使用するための、請求項15記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
グラム陽性細菌感染症の処置または予防用の医用薬剤として使用するための、請求項15記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
殺菌剤として使用するための、請求項15記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
食材の、食品加工器具の、食品加工設備の、食材と接触する表面の、医療装置の、病院および手術室における表面（ただし、ヒト表面を除く）の、グラム陽性細菌汚染の処置または予防のための、請求項1〜11のいずれか一項記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２０】
医薬、食品もしくは飼料における診断手段または環境診断法として使用するための、請求項15記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グラム陽性細菌に対する抗微生物剤、とりわけ、グラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素、および該酵素のN末端またはC末端において融合される追加的なペプチドストレッチから構成される融合タンパク質に関連する。さらに、本発明は、融合タンパク質をコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、および該核酸分子または該ベクターのいずれかを含む宿主細胞に関連する。加えて、本発明は、医用薬剤としての、とりわけグラム陽性細菌感染症の処置もしくは予防のための、診断手段としての、または美容用物質としての、使用のための融合タンパク質に関連する。本発明はまた、食材の、食品加工器具の、食品加工設備の、食材と接触する表面の、医療装置の、病院および手術室における表面の、グラム陽性細菌汚染の処置または予防にも関連する。さらに、本発明は、融合タンパク質を含む薬学的組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌とは対照的に、グラム陽性細菌は外膜を所有しない。細胞質膜は、細胞壁を形成するペプチドグリカンの最大25 nmの厚い層（グラム陰性細菌については最大でも5 nmである）によって取り囲まれている。グラム陽性菌の細胞壁の主な目的は、細菌の形状を維持すること、および細菌内部の圧力を相殺することである。ペプチドグリカン、またはムレインは、糖およびアミノ酸からなるポリマーである。糖成分はβ-(1,4)結合型N-アセチルグルコサミンとN-アセチルムラミン酸残基との交互の残基からなり、糖成分を構成する。3〜5個のアミノ酸のペプチド鎖が、N-アセチルムラミン酸に付加される。ペプチド鎖は、別の鎖のペプチド鎖に架橋され、3D網目様の層を形成することができる。ペプチド鎖はD-アミノ酸残基およびL-アミノ酸残基を含有し得、かつ組成は異なる細菌について変動し得る。
【０００３】
特別の状況が、通常グラム陽性と考えられているマイコバクテリア（Mycobacteria）の場合において見出されている。マイコバクテリアは、外側の細胞膜を所有することが最近示された。すべてのマイコバクテリアは、疎水性で、蝋様で、かつミコール酸／ミコレートに富む特徴的な厚い細胞壁を共有する。細胞壁は、多糖類であるアラビノガラクタンによって結びつけられた疎水性ミコレート層およびペプチドグリカン層からなる。マイコバクテリアの厚い細胞壁を克服するために、新たな抗微生物剤の、多糖類層を破壊するためのキチナーゼまたは同様のタンパク質と組み合わせた作用が必要である可能性がある。
【０００４】
殺細菌または静細菌活性を有する種々のタイプの作用物質、例えば、抗生物質、エンドリシン、抗微生物ペプチド、およびデフェンシンが公知である。しかしながら、抗生物質に対する微生物の抵抗性が増加することによって、細菌によって引き起こされるますます多くの感染症を処置することが困難になっている。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、およびクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）のようなグラム陽性細菌によって引き起こされる感染症、特に、例えばメチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスおよびバンコマイシン耐性エンテロコッカス属で、特に困難が生じる。
【０００５】
エンドリシンは、バクテリオファージ（または細菌ウイルス）によってコードされるペプチドグリカンヒドロラーゼである。それらは、ファージ増殖の溶菌サイクルにおいて後期遺伝子発現の間に合成され、かつ細菌ペプチドグリカンの分解を通して感染した細胞からの子孫ウイルス粒子の放出を媒介する。それらは、β(1,4)-グリコシラーゼ（リゾチーム）、トランスグリコシラーゼ、アミダーゼ、またはエンドペプチダーゼのいずれかである。エンドリシンの抗微生物適用は、Gasson（GB2243611号（特許文献1））によって、既に1991年に示唆されていた。エンドリシンの殺傷能力は長期にわたって公知であったが、これらの酵素の抗細菌薬としての使用は、抗生物質の成功および支配のために無視されていた。多剤抗生物質耐性細菌の出現の後で初めて、エンドリシンでヒト病原体と戦うというこの単純な概念が関心を受けた。全く新たなクラスの抗細菌剤を開発するやむを得ない必要性が浮上し、「酵素」および「抗生物質」の混成用語である「エンザイビオティクス（enzybiotics）」として使用されるエンドリシンが、完全にこの必要性を満たした。2001年に、Fischettiおよび共同研究者は、A群連鎖球菌（streptococcus）に対するバクテリオファージC1エンドリシンの治療的可能性を初めて実証した（Nelson et al., 2001（非特許文献1））。それ以来、多くの刊行物によって、特にグラム陽性細菌による細菌感染症を制御するための魅力的かつ相補的な代替法としてのエンドリシンが確立されている。続いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（Loeffler et al., 2001（非特許文献2））、バチルス・アントラシス（Bacillus anthracis）（Schuch et al., 2002（非特許文献3））、S. アガラクチエ（S. agalactiae）（Cheng et al., 2005（非特許文献4））、およびスタフィロコッカス・アウレウス（Rashel et al, 2007（非特許文献5））などの他のグラム陽性病原体に対する様々なエンドリシンが、エンザイビオティクスとしてのそれらの効力を証明してきた。しかしながら、エンドリシンが、細菌内部の圧力が細胞の破裂をもたらすのに十分ではないいくつかの条件（例えば、高いイオン強度）の下で、安定なプロトプラストを作製できることもまた公知である。これらの条件の下では、細菌細胞壁は再生することができ、かつ細菌が生存すると考えられる。
【０００６】
抗微生物ペプチド（AMP）は、実質的にあらゆる生物において見出され得る、広範な、短く、カチオン性または両親媒性で、遺伝子にコードされたペプチド抗生物質を意味する。様々なAMPが様々な特性を示し、かつこのクラスの多くのペプチドは、抗生物質としてだけでなく、細胞貫通ペプチドのための鋳型としても集中的に研究されている。数個の共通の特徴（例えば、カチオン性、両親媒性、および短いサイズ）を共有するにもかかわらず、AMP配列は大きく変動し、かつ少なくとも4つの構造群（αへリックス、βシート、伸長型、およびループ型）が、観察されるAMP立体配座の多様性に対応するために提唱されている。同様に、抗生物質としての作用のいくつかの様式が提唱されており、例えば、これらのペプチドの多くの主要な標的は細胞膜であるが、他のペプチドについては主要な標的が細胞質侵入およびコアの代謝機能の破壊であることが示された。AMPは十分濃縮され得、特異的な標的結合が欠如しているにもかかわらず、例えば、大抵のAMPについてそうであるように、膜において孔を形成することによって、協同的活性を示す。しかしながら、この現象は模範的なリン脂質二重層においてのみ観察されており、いくつかの場合においては、6個のリン脂質分子当たり1個のペプチド分子のような、高い、膜におけるAMP濃度が、これらの事象が起きるために必要とされる。これらの濃度は、完全な膜飽和とまではいかなくても、それに近い。AMPについての最小阻止濃度（MIC）は典型的に低いマイクロモル範囲であるため、これらの閾値およびインビボでのそれらの重要性の関連性について当然のことながら懐疑論が生じている（Melo et al., Nature reviews, Microbiology, 2009, 245（非特許文献6））。
【０００７】
デフェンシンは、脊椎動物および無脊椎動物の両方において見出される、小さく、カチオン性で、システインおよびアルギニンに富んだ抗微生物ペプチドの大きなファミリーである。デフェンシンは、システインの間隔パターンに従って、植物、無脊椎動物、α-、β-、およびθ-デフェンシンの5つの群に分類される。後半の3つは主として哺乳動物において見出される。α-デフェンシンは、好中球および腸管上皮において見出されるタンパク質である。β-デフェンシンは最も広く分布し、かつ白血球および多くの種類の上皮細胞によって分泌される。θ-デフェンシンはこれまでのところまれに、例えばアカゲザル（Rhesus macaques）の白血球において見出されている。デフェンシンは、細菌、真菌、ならびに多くのエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスに対して活性を有する。しかしながら、細菌の効率的な殺傷に必要とされる濃度は主として高く、すなわちμモル範囲である。多くのペプチドの活性が、生理学的塩条件、二価カチオン、および血清の存在下において限定され得る。疎水性アミノ酸残基の含量に依存して、デフェンシンはまた溶血活性も示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】GB2243611号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nelson et al., 2001
【非特許文献２】Loeffler et al., 2001
【非特許文献３】Schuch et al., 2002
【非特許文献４】Cheng et al., 2005
【非特許文献５】Rashel et al, 2007
【非特許文献６】Melo et al., Nature reviews, Microbiology, 2009, 245
【発明の概要】
【００１０】
従って、グラム陽性菌に対する新たな抗微生物剤について必要性がある。
【００１１】
本目的は、添付の特許請求の範囲において定義される事項によって解決される。
[本発明1001]
グラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素、および、該酵素のN末端もしくはC末端、または両方の末端において融合されるペプチドストレッチから構成される、融合タンパク質。
[本発明1002]
N末端に追加的なアミノ酸残基を含む、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1003]
SEQ ID NO: 63〜90記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1001または1002の融合タンパク質。
[本発明1004]
C末端および／またはN末端にタグまたは追加的なタンパク質を含む、前記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1005]
タグまたは追加的なタンパク質が、1個または複数の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結されている、本発明1004の融合タンパク質。
[本発明1006]
ペプチドストレッチが、1個または複数の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結されている、前記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1007]
酵素が、エンドリシン、オートリシン、またはバクテリオシンである、本発明1001の融合タンパク質。
[本発明1008]
酵素が、SEQ ID NO: 57〜61記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1007の融合タンパク質。
[本発明1009]
グラム陽性細菌が、表1に列挙される細菌からなる群より選択される、前記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1010]
ペプチドストレッチが、カチオン性、より好ましくはポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシ（sushi）ペプチド、デフェンシン、疎水性ペプチド、または抗微生物ペプチドである、前記本発明のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1011]
スシペプチドが、SEQ ID NO: 54記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1012]
カチオン性ペプチドが、アルギニン、ヒスチジン、およびリジン残基からなる群より選択される少なくとも1個のアミノ酸残基を含む、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1013]
抗微生物ペプチドが、SEQ ID NO:1〜11、または48〜53記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1014]
疎水性ペプチドが、SEQ ID NO: 12、50、55、または56記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1015]
カチオン性ペプチドに含まれるアミノ酸残基の少なくとも約70％が、アルギニン、ヒスチジン、もしくはリジン残基のいずれかであるか、または、該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の少なくとも約70％が、アルギニンもしくはリジンのいずれかであるか、または、該ペプチドに含まれるアミノ酸残基が、アルギニンもしくはリジン残基のいずれかである、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1016]
カチオン性ペプチドが、SEQ ID NO: 13、または24〜44記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1015の融合タンパク質。
[本発明1017]
両親媒性ペプチドが、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、およびグリシン残基からなる群より選択される少なくとも1個の疎水性アミノ酸残基と組み合わせて、リジン、アルギニン、およびヒスチジン残基からなる群より選択される少なくとも1個の正に荷電したアミノ酸残基を含む、本発明1010の融合タンパク質。
[本発明1018]
両親媒性ペプチドにおけるアミノ酸残基の少なくとも約70％が、アルギニンまたはリジン残基のいずれかであり、かつ、該両親媒性ペプチドにおける該アミノ酸残基の少なくとも約30％が、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、またはグリシン残基である、本発明1017の融合タンパク質。
[本発明1019]
両親媒性ペプチドが、SEQ ID NO: 1〜5、23、48、または49記載のアミノ酸配列を呈する、本発明1018の融合タンパク質。
[本発明1020]
ペプチドストレッチが、約5〜約100個のアミノ酸残基、とりわけ約5〜50個のアミノ酸残基、とりわけ約5〜30個のアミノ酸残基を含む、本発明1001〜1019のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1021]
本発明1001〜1019のいずれかの融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
[本発明1022]
本発明1021の核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1023]
本発明1021の核酸分子、または本発明1122のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1024]
細菌細胞または酵母細胞である、本発明1023の宿主細胞。
[本発明1025]
酵母細胞が、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である、本発明1024の宿主細胞。
[本発明1026]
医用薬剤、診断手段、または美容用物質としての使用のための、本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1027]
グラム陽性細菌感染症の処置または予防用の医用薬剤としての使用のための、本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1028]
殺菌剤としての使用のための、本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1029]
食材の、食品加工器具の、食品加工設備の、食材と接触する表面の、医療装置の、病院および手術室における表面の、グラム陽性細菌汚染の処置または予防のための、本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質の使用。
[本発明1030]
医薬、食品、もしくは飼料における診断手段、または環境診断法としての、本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質の使用。
[本発明1031]
本発明1001〜1020のいずれかの融合タンパク質を含む、薬学的組成物。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、同義的に「ポリペプチド」という用語を指す。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、特定の配列においてペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の直線状ポリマーを指す。タンパク質のアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸などの種々の基の共有結合性付加によって改変されてもよい。ヘムまたは脂質などの他の物質がより緩やかにポリペプチド鎖と会合してもよく、本明細書において使用される「タンパク質」という用語にまた含まれる複合タンパク質を生じさせる。とりわけαへリックスおよびβプリーツシートの存在に関して、ポリペプチド鎖を折り畳む種々の様式が解明されている。本明細書において使用される「タンパク質」という用語は、すべてα、すべてβ、α／β、およびαプラスβであるすべての4つのクラスのタンパク質を指す。さらに、「タンパク質」という用語は複合体を指し、該複合体はホモマーを指す。
【００１３】
本明細書において使用される「融合タンパク質」という用語は、2つの核酸配列の融合によって生じる発現産物を指す。そのようなタンパク質は、例えば、組み換えDNA発現系において産生されてもよい。さらに、本明細書において使用される「融合タンパク質」という用語は、例えば酵素のような第1のアミノ酸配列の、第2のまたはさらなるアミノ酸配列との融合物を指す。第2のまたはさらなるアミノ酸配列は、ドメインまたは任意の種類のペプチドストレッチを定義してもよい。好ましくは、第2のおよび／またはさらなるアミノ酸配列は、第1のアミノ酸配列の任意のドメインに対して外来性であり、かつ第1のアミノ配列のいかなるドメインとも実質的に相同でない。
【００１４】
本明細書において使用される「ペプチドストレッチ」という用語は、酵素などのタンパク質に連結される任意の種類のペプチドを指す。
【００１５】
本明細書において使用される「ペプチド」という用語は、1つのアミノ酸残基のアミノ基が、ペプチド結合によって別のアミノ酸残基のカルボキシル基に連結されている、約2〜約100個のアミノ酸残基、より好ましくは約4〜約50個のアミノ酸残基、より好ましくは約5〜30個のアミノ酸残基からなる短いポリペプチドを指す。ペプチドは特定の機能を有してもよい。ペプチドは、天然に存在するペプチド、または合成的に設計されかつ産生されるペプチドであり得る。ペプチドは、例えば、酵素学的もしくは化学的切断によって天然のタンパク質に由来し得るかもしくは除去され得るか、または、従来のペプチド合成技術（例えば、固相合成）もしくは分子生物学技術（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい）を使用して調製され得る。天然に存在するペプチドの例は、抗微生物ペプチド、デフェンシン、スシ（sushi）ペプチドである。合成的に産生されるペプチドの例は、ポリカチオン性、両親媒性、または疎水性ペプチドである。本発明の意味におけるペプチドは、タンパク質を精製または配置するために使用されるHis-タグ、Strep-タグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（MBP）などを指さない。
【００１６】
本明細書において使用される「エンドリシン」という用語は、細菌の細胞壁を加水分解するのに適している酵素を指す。「エンドリシン」は、以下の活性の少なくとも1つを有する少なくとも1つの「酵素学的活性ドメイン」（EAD）を含む：エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、T4様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、N-アセチル-ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル-L-アラニン-アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（C）、溶解性トランスグリコシラーゼ（M）、N-アセチル-ムラミダーゼ、N-アセチル-グルコサミニダーゼ（リゾチーム）、または、例えばKZ144およびEL188などのトランスグリコシラーゼ。加えて、エンドリシンはまた、酵素学的に不活性であり、かつ宿主細菌の細胞壁に結合する領域である、いわゆるCBD（細胞壁結合ドメイン）を含有してもよい。
【００１７】
本明細書において使用される「CBD」という用語は、エンドリシンの細胞壁結合ドメインを指す。グラム陽性細菌に特異的であるエンドリシンにおいて、CBDはしばしばC末端に見出されるが、N末端またはタンパク質内のどこか別の場所に見出されてもまたよい。CBDドメインはしばしば、エンドリシンの細菌細胞壁への結合を媒介するが、細胞壁を加水分解する点においては酵素活性を有さない。
【００１８】
本明細書において使用される「EAD」という用語は、エンドリシンの酵素学的活性ドメインを指す。EADは、細菌のペプチドグリカンを加水分解することを担当する。それは、エンドリシンの少なくとも1つの酵素活性を呈する。EADはまた、1つより多い酵素学的活性モジュールから構成され得る。
【００１９】
「オートリシン」という用語は、エンドリシンに関連するが、細菌によってコードされ、かつ例えば細胞分裂に関与する酵素を指す。オートリシンの概要は、「Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86」において見出され得る。
【００２０】
本明細書において使用される「バクテリオシン」という用語は、他の細菌の増殖を阻害することができるタンパク質様、ポリペプチド様、またはペプチド様物質を指す。いくつかのバクテリオシンは、リゾスタフィン（スタフィロコッカス属（Staphylococcus）の細胞壁を分解する）、ムタノリシン（Mutanolysin）（ストレプトコッカス属の細胞壁を分解する）、およびエンテロリシン（Enterolysin）（エンテロコッカス属の細胞壁を分解する）のように細菌細胞壁を分解することができる。好ましくは、阻害は具体的には、バクテリオシンの特異的受容体への他の細菌の吸収による。一般に、バクテリオシンは微生物によって産生される。しかしながら、本明細書において使用される「バクテリオシン」という用語は、微生物によって産生され単離された形態、または合成的に産生された形態の両方を指し、かつまた、それらの親バクテリオシンの活性を実質的に保持するが、その配列が1つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または欠失によって変更されている変異体も指す。
【００２１】
本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」（AMP）という用語は、殺微生物（microbicidal）および／または静微生物（microbistatic）活性を有する任意のペプチドを指す。従って、本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」という用語は、とりわけ、抗細菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生生物、抗原生動物、抗ウイルス、抗感染性、抗伝染性、および／または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原生動物、殺原虫特性を有する任意のペプチドを指す。
【００２２】
本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト内に存在するペプチドを指し、デフェンシンは、感染性細菌および／または感染性ウイルスおよび／または真菌などの外来性物質の破壊のような先天性宿主防御系において役割を果たす。デフェンシンは、抗体でない殺微生物および／または殺腫瘍性タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。「デフェンシン」の例は、「哺乳動物デフェンシン」、α-デフェンシン、β-デフェンシン、インドリシジン、およびマガイニンである。本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物細胞から単離された形態、または合成的に産生された形態の両方を指し、かつまた、それらの親タンパク質の細胞傷害活性を実質的に保持するが、その配列が1つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または欠失によって変更されている変異体も指す。
【００２３】
本明細書において使用される「スシペプチド」という用語は、短いコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質（CCP）を指す。スシペプチドのスシモジュールは、多くの異なるタンパク質においてタンパク質-タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含有するペプチドは、抗微生物活性を有することが示されている。
【００２４】
本明細書において使用される際、「カチオン性ペプチド」という用語は、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドを指す。好ましくは、カチオン性ペプチドは、9.0またはそれより大きいpKa値を有する。典型的には、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも4個が正に荷電し得、例えば、リジンまたはアルギニンであり得る。「正に荷電した」とは、およその生理学的条件で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を指す。組み換えで産生され得る天然に存在するカチオン性ペプチドの例は、デフェンシン、マガイニン、メリチン、およびセクロピンである。
【００２５】
本明細書において使用される「ポリカチオン性ペプチド」という用語は、大部分リジンおよび／またはアルギニン残基から構成される、合成的に産生されたペプチドを指す。
【００２６】
本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性および疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。好ましくは、本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性および疎水性基の規定された配列を有するペプチドを指し、例えば、両親媒性ペプチドは、例えばαへリックス状であってもよく、主にヘリックスの1つの側に沿って非極性側鎖を、および残りの表面に沿って極性残基を有する。
【００２７】
本明細書において使用される「疎水性基」という用語は、実質的に水に不溶性であるが、油相において可溶性であり、油相における溶解性が水または水相における溶解性よりも高い、アミノ酸側鎖などの化学基を指す。水において、疎水性側鎖を有するアミノ酸は、互いに相互作用して非水性環境を生じる。疎水性側鎖を伴うアミノ酸の例は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびチロシンである。
【００２８】
本明細書において使用される「欠失」という用語は、それぞれの出発の配列からの、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のアミノ酸残基の除去を指す。
【００２９】
本明細書において使用される「挿入」または「付加」という用語は、それぞれの出発の配列への、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のアミノ酸残基の挿入または付加を指す。
【００３０】
本明細書において使用される「置換」という用語は、ある特定の位置に配置されたアミノ酸残基の、異なるアミノ酸残基との交換を指す。
【００３１】
本発明は、グラム陽性細菌に対する新たな抗細菌剤、とりわけ、グラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素、および、この酵素のN末端もしくはC末端、または両方の末端において融合される追加的なペプチドストレッチから構成される融合タンパク質に関連する。
【００３２】
本明細書による融合タンパク質は、安定なプロトプラストの再生を妨げることが可能で、および従って、排除されるべき細菌の生存を妨げるという利点を有する。細菌によるプロトプラストの再生は、細菌内部の圧力が細胞の破裂をもたらすのに十分でなく、かつ細菌の生存をもたらすいくつかの条件（例えば、高いイオン強度）の下で起きる。
【００３３】
本発明の1つの局面において、グラム陽性細菌の細胞壁を分解する活性を有する酵素は、エンドリシン、オートリシン、および／またはバクテリオシンである。
【００３４】
本発明の別の局面において、酵素はまた、酵素学的に不活性であり、かつ宿主細菌の細胞壁に結合する領域である、いわゆるCBD（細胞壁結合ドメイン）をさらに含んでもよい。
【００３５】
本発明による好ましい融合タンパク質は、SEQ ID NO:63〜90に示されている。SEQ ID NO:63〜90記載の融合タンパク質は、N末端に1つまたは複数の追加的なアミノ酸残基を含んでもよい。好ましくは、追加的なアミノ酸残基はメチオニンである。
【００３６】
好ましくは、エンドリシンは、以下の表に挙げたように、ヒトまたは動物にとって病原性である株を含むグラム陽性細菌の細菌群、科、属、または種などのグラム陽性細菌に特異的なバクテリオファージによってコードされる。
【００３７】
（表１）
I．門：放線菌門（Actinobacteria）
綱：放線菌綱（Actinobacteridae）
目：放線菌目（Actinomycetales）
科：
アクチノマイセス亜目（Actinomycineae）：アクチノマイセス科（Actinomycetaceae）（アクチノマイセス属（Actinomyces）、モビルンカス属（Mobiluncus））
コリネバクテリウム亜目（Corynebacterineae）：マイコバクテリウム科（Mycobacteriaceae）（マイコバクテリウム属（Mycobacterium））、ノカルディア科（Nocardiaceae）、コリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）
フランキア亜目（Frankineae）：フランキア科（Frankiaceae）
マイクロコッカス亜目（Micrococcineae）：ブレビバクテリウム科（Brevibacteriaceae）
プロピオニバクテリウム科（Propionibacteriaceae）（プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium））
目：ビフィドバクテリウム目（Bifidobacteriales）
科：
ビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）（ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ファルシビブリオ属（Falcivibrio）、ガードネレラ属（Gardnerella））
他の亜綱：アシドミクロビウム亜綱（Acidimicrobidae）、コリオバクター亜綱（Coriobacteridae）、ルブロバクター亜綱（Rubrobacteridae）、スフェロバクター亜綱（Sphaerobacteridae）
II．門：フィルミクテス門（Firmicutes）
綱：バチルス綱（Bacilli）
目：バチルス目（Bacillales）：
科：
バチルス科（Bacillaceae）（バチルス属（Bacillus））、リステリア科（Listeriaceae）（リステリア属（Listeria））、スタフィロコッカス科（Staphylococcaceae）（スタフィロコッカス属、ゲメラ属（Gemella）、ジェオトガリコッカス属（Jeotgalicoccus））
目：ラクトバチルス目（Lactobacillales）：
科：エンテロコッカス科（Enterococcaceae）（エンテロコッカス属）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）（ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ペディオコッカス属（Pediococcus））、ロイコノストック科（Leuconostocaceae）（ロイコノストック属（Leuconostoc））、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）（ラクトコッカス属（Lactococcus）、ストレプトコッカス属）
綱：クロストリジウム綱（Clostridia）
目：クロストリジウム目（Clostridiales）（クロストリジウム属（Clostridium）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、セレノモナス属（Selenomonas））
目：ハルアナエロビウム目（Halanaerobiales）
目：サーモアナエロバクター目（Thermoanaerobacterales）
綱：テネリクテス綱（Tenericutes）／モリクテス綱（Mollicutes）
目：マイコプラズマ目（Mycoplasmatales）（マイコプラズマ属（Mycoplasma、ウレアプラズマ属（Ureaplasma））
目：エントモプラズマ目（Entomoplasmatales）（スピロプラズマ属（Spiroplasma））
目：アナエロプラズマ目（Anaeroplasmatales）（エリジペロスリックス属（Erysipelothrix））
目：アコレプラズマ目（Acholeplasmatales）（アコレプラズマ属（Acholeplasma））
目：ハロプラズマ目（Haloplasmatales）（ハロプラズマ属（Haloplasma））
【００３８】
好ましくは、オートリシンは、表1に列挙されるような、ヒトまたは動物にとって病原性である株を含むグラム陽性細菌の細菌群、科、属、または種などのグラム陽性細菌によってコードされる。
【００３９】
好ましくは、バクテリオシンは、表1に列挙されるような、ヒトまたは動物にとって病原性である株を含むグラム陽性細菌の細菌群、科、属、または種などのグラム陽性細菌によってコードされる。
【００４０】
本発明による酵素は、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Corynebacterium diphteriae）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae）、アクチノマイセス属のような、ヒトまたは動物にとって病原性である株を含むグラム陽性細菌の細菌群、科、属、または種に対して細胞壁分解活性を有する。
【００４１】
好ましいエンドリシンは、リステリア属ファージのエンドリシンPlyA118、PlyA500、PlyPSA、PlyA511、PlyP35、PlyP40、スタフィロコッカス属（Staph）ファージPhi 11、Phi MR11、LysK、クロストリジウム・パーフリンジェンスPlyS6、Ply3626、クロストリジウム・ディフィシレ：CD27Lエンドリシン、ストレプトコッカス属：B30エンドリシン、ファージDp-1 Palアミダーゼ、C1エンドリシン、Cpl-1エンドリシン、PlyGBS、エンテロコッカス属：PlyV12、バチルス・アントラシス：ファージγエンドリシンPlyGである。
【００４２】
好ましいオートリシンは、Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. Vollmer W, Joris B, Charlier P, Foster S. FEMS Microbiol Rev. 2008 Mar;32(2):259-86. Epub 2008 Feb 11. Reviewにおいて記載されている。好ましいオートリシンの例は、AtlAオートリシンである。
【００４３】
好ましいバクテリオシンは、リゾスタフィン（スタフィロコッカス属の細胞壁を分解する）、ムタノリシン（ストレプトコッカス属の細胞壁を分解する）、およびエンテロリシン（エンテロコッカス属の細胞壁を分解する）である。
【００４４】
より好ましくは、エンドリシン部分は、SEQ ID NO:57記載のCpl-1、SEQ ID NO:58記載のPly511、SEQ ID NO:59記載のLysK、SEQ ID NO:60記載のリゾスタフィン、およびSEQ ID NO:61記載のPA6-gp20からなる群より選択される。
【００４５】
本発明の別の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質のエンドリシン、オートリシン、およびバクテリオシンは、アミノ酸配列の改変および／または変更を含む。そのような変更および／または改変は、欠失、挿入および付加、置換、もしくはその組み合わせなどの変異、ならびに／または、例えばビオチン化、アセチル化、ペグ化などのアミノ酸残基の化学的変化、アミノ基、SH基、もしくはカルボキシル基の化学的変化を含んでもよい。本発明による融合タンパク質のエンドリシン、オートリシン、およびバクテリオシンは、それぞれの野生型エンドリシンの溶解活性を呈する。しかしながら、活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性と同一であるか、より高いか、またはより低くあり得る。活性は、それぞれの野生型エンドリシンの活性の約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、もしくは約200％、またはさらにそれ以上であり得る。活性は、例えば、Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007)またはDonovan DM, Lardeo M, Foster-Frey J. FEMS Microbiol Lett. 2006 Dec;265(1)または同様の刊行物に記載されている、例えばプレート溶解アッセイまたは液体溶解アッセイなどの、当技術分野において当業者に周知であるアッセイによって測定され得る。
【００４６】
好ましくは、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチは、エンドリシンのN末端および／またはC末端に融合される。特に好ましい態様において、ペプチドストレッチは酵素のN末端にのみ融合される。別の好ましい態様において、ペプチドストレッチは酵素のC末端にのみ融合される。しかしながら、N末端およびC末端の両方にペプチドストレッチを有する改変された融合タンパク質もまた好ましい。N末端およびC末端のペプチドストレッチは、同一または別個のペプチドストレッチであり得る。ペプチドストレッチは、例えばクローニングの理由のために、追加的なアミノ酸残基によって酵素に連結され得る。好ましくは、ペプチドストレッチは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結され得る。好ましい態様において、ペプチドストレッチは、追加的なアミノ酸残基であるグリシンおよび／またはセリン（Gly-Ser）によって酵素に連結される。さらに、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチは、N末端に追加的なアミノ酸をさらに含む。好ましくは、ペプチドストレッチは、アミノ酸であるメチオニン（Met）、またはアラニン、メチオニンおよびグリシン（Ala-Met-Gly）を含む。
【００４７】
本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチは、好ましくは共有結合で酵素に結合される。好ましくは、ペプチドストレッチは、少なくとも5個、より好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99個、または少なくとも100個のアミノ酸残基からなる。特に、約5〜約100個のアミノ酸残基、約5〜約50個、または約5〜約30個のアミノ酸残基を含むペプチドストレッチが好ましい。約6〜約42個のアミノ酸残基、約6〜約39個のアミノ酸残基、約6〜約38個のアミノ酸残基、約6〜約31個のアミノ酸残基、約6〜約25個のアミノ酸残基、約6〜約24個のアミノ酸残基、約6〜約22個のアミノ酸残基、約6〜約21個のアミノ酸残基、約6〜約20個のアミノ酸残基、約6〜約19個のアミノ酸残基、約6〜約16個のアミノ酸残基、約6〜約14個のアミノ酸残基、約6〜約12個のアミノ酸残基、約6〜約10個のアミノ酸残基、または約6〜約9個のアミノ酸残基を含むペプチドストレッチがより好ましい。
【００４８】
好ましくは、ペプチドストレッチは、His6-タグ、Strep-タグ、Avi-タグ、Myc-タグ、Gst-タグ、JS-タグ、システイン-タグ、FLAG-タグ、または当技術分野において公知である他のタグなどのタグではなく、かつチオレドキシンまたはマルトース結合タンパク質（MBP）ではない。しかしながら、本発明によるペプチドストレッチおよび／またはエンドリシン、オートリシン、もしくはバクテリオシンは、そのようなタグまたは複数のタグを追加的に含んでもよい。
【００４９】
より好ましくは、ペプチドストレッチは、第1に、ペプチドグリカンを分解する、融合タンパク質のペプチドグリカン層との相互作用、および第2に、細胞質膜を不安定化する、融合タンパク質の細胞質膜との相互作用によって、細菌細胞の破裂を促進する機能を有する。
【００５０】
本発明の1つの局面において、融合されるペプチドストレッチはカチオン性ペプチドであり、より好ましくはポリカチオン性ペプチドである。好ましくは、カチオン性ペプチドは、1個または複数の、リジン、アルギニン、および／またはヒスチジンの正に荷電したアミノ酸残基を含む。好ましくは、ペプチドにおけるアミノ酸残基の約60、65、70、75、80、85、90、95％より多く、または約100％が、正に荷電したアミノ酸残基である。有利に、カチオン性ペプチドは、細胞壁分解活性を有する酵素のN末端側および／またはC末端側終端に融合され、それによって、本発明の融合タンパク質および／または抗微生物剤のカチオン性を増強する。本発明の別の態様において、酵素に融合されるカチオン性ペプチドは、少なくとも5個、より好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個のアミノ酸残基からなる。好ましくは、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約60、65、70、75、80、85、90、95％、または約100％が、アルギニンまたはリジンのいずれかである。本発明の別の態様において、カチオン性ペプチドは、約3〜約50個、より好ましくは約5〜約20個、例えば約5〜約15個のアミノ酸残基を含み、かつ該アミノ残基はアルギニンまたはリジン残基のいずれかである。好ましいカチオン性ペプチドは、SEQ ID NO:13および14に示されている。
【００５１】
少なくとも1個のSEQ ID NO: 62記載のモチーフ（KRKKRK）を含む、カチオン性および／またはポリカチオン性ペプチドストレッチが特に好ましい。とりわけ、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、または17個の、SEQ ID NO: 62記載のモチーフ（KRKKRK）を含むカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。少なくとも1個のKRKモチーフ（lys-arg-lys）、好ましくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、または33個のKRKモチーフを含むカチオン性ペプチドストレッチがより好ましい。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様において、カチオン性ペプチドストレッチは、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジンおよび／またはアルギニン残基に加えて、中性の電荷のアミノ酸残基、とりわけグリシンおよび／またはセリン残基を含む。約70％〜約100％、または約80％〜約95％、または約85％〜約90％の正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジン、アルギニン、および／またはヒスチジン残基、より好ましくはリジンおよび／またはアルギニン残基、ならびに、約0％〜約30％、または約5％〜約20％、または約10％〜約20％の中性の荷電のアミノ酸残基、とりわけグリシンおよび／またはセリン残基からなるカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。約4％〜約8％のセリン残基、約33％〜約36％のアルギニン残基、および約56％〜約63％のリジン残基からなるポリペプチドストレッチが好ましい。少なくとも1個の、Xがリジン、アルギニン、およびヒスチジン以外の任意のアミノ酸であるSEQ ID NO: 45記載のモチーフ（KRXKR）を含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも1個のSEQ ID NO: 46記載のモチーフ（KRSKR）を含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または約20個の、SEQ ID NO: 45記載のモチーフ（KRXKR）またはSEQ ID NO: 46記載のモチーフ（KRSKR）を含むカチオン性ストレッチがより好ましい。
【００５３】
約9〜約16％のグリシン残基、約4〜約11％のセリン残基、約26〜約32％のアルギニン残基、および約47〜約55％のリジン残基からなるポリペプチドストレッチもまた好ましい。少なくとも1個のSEQ ID NO: 47記載のモチーフ（KRGSG）を含むポリペプチドストレッチが特に好ましい。少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または約20個の、SEQ ID NO: 47記載のモチーフ（KRGSG）を含むカチオン性ストレッチがより好ましい。
【００５４】
本発明の別の好ましい態様において、カチオン性ペプチドストレッチは、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジンおよび／またはアルギニン残基に加えて、疎水性アミノ酸残基、とりわけバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、およびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、および／またはトリプトファン残基を含む。約70％〜約100％、または約80％〜約95％、または約85％〜約90％の正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリジンおよび／またはアルギニン残基、ならびに、約0％〜約30％、または約5％〜約20％、または約10％〜約20％の疎水性アミノ酸残基、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、およびグリシン残基、より好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、および／またはトリプトファン残基からなるカチオン性ペプチドストレッチが好ましい。
【００５５】
以下の配列からなる群より選択されるペプチドストレッチが特に好ましい。
【００５６】
（表２）
0006034188.tif 000002
【００５７】
本発明のさらなる局面において、融合されるペプチドストレッチは両親媒性ペプチドであり、1つまたは複数の、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、および／またはグリシンの疎水性アミノ酸残基に結合した、1つまたは複数の、リジン、アルギニン、および／またはヒスチジンの正に荷電したアミノ酸残基を含む。アミノ酸残基の側鎖は、カチオン性および疎水性表面がペプチドの反対側でクラスター形成するように配向される。好ましくは、ペプチドにおける約30、40、50、60、または70％より多いアミノ酸が、正に荷電したアミノ酸である。好ましくは、ペプチドにおける約30、40、50、60、または70％より多いアミノ酸残基が、疎水性アミノ酸残基である。有利に、両親媒性ペプチドが、細胞壁分解活性を有する酵素のN末端側および／またはC末端側終端に融合され、それによって後者のタンパク質の両親媒性を増強する。
【００５８】
本発明の別の態様において、酵素に融合される両親媒性ペプチドは、少なくとも5個、より好ましくは少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50個のアミノ酸残基からなる。好ましい態様において、両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約30、40、50、60、もしくは70％が、アルギニンもしくはリジン残基のいずれかであり、ならびに／または、両親媒性ペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約30、40、50、60、もしくは70％が、疎水性アミノ酸であるバリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、スレオニン、セリン、プロリン、および／もしくはグリシンである。
【００５９】
好ましい両親媒性ペプチドは、SEQ ID NO:1記載のプレウロシジン（Pleurocidin）、SEQ ID NO:2記載のセクロピンP1、SEQ ID NO:3記載のブフォリン（Buforin）II、SEQ ID NO:23記載のブフォリンI、およびSEQ ID NO:4記載のマガイニンである。さらなる好ましい両親媒性ペプチドは、カテリジシン（Cathelidicine）、例えば、SEQ ID NO:5記載のLL-37、SEQ ID NO:48記載のニグロシン（Nigrocine）2、およびSEQ ID NO:49記載のアスカフィン（Ascaphine）5である。
【００６０】
本発明のさらなる局面において、融合されるペプチドストレッチは抗微生物ペプチドであり、正味の正電荷および約50％の疎水性アミノ酸を含む。抗微生物ペプチドは、約12〜約50個のアミノ酸残基の長さで、両親媒性である。
【００６１】
抗微生物ペプチドの例を以下の表に列挙する。
【００６２】
（表３）
0006034188.tif 000003
【００６３】
本発明のさらなる局面において、融合されるペプチドストレッチは、Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteriaに記載されているスシペプチドである。SEQ ID NO:54記載のスシ1ペプチドが特に好ましい。
【００６４】
好ましいスシペプチドは、スシペプチドS1およびS3、ならびにその多数体（multiple）である；FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13。
【００６５】
本発明のさらなる局面において、融合されるペプチドストレッチは、デフェンシン、好ましくはカテリシジン（Cathelicidine）、セクロピンP1、セクロピンA、またはマガイニンIIである。
【００６６】
本発明のさらなる局面において、融合されるペプチドストレッチは、疎水性ペプチド、例えば、SEQ ID NO:50記載のアミノ酸配列を有するアピデシン、SEQ ID NO:55記載のアミノ酸配列を有するWLBU2-変異体、およびSEQ ID NO:56記載のアミノ酸配列を有するワルマフ（Walmagh）1である。アミノ酸配列Phe-Phe-Val-Ala-Pro（SEQ ID NO:12）を有する疎水性ペプチドは、本発明の部分ではない。
【００６７】
本発明の別の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチは、アミノ酸配列の改変および／または変更を含む。そのような変更および／または改変は、欠失、挿入および付加、置換、もしくはその組み合わせなどの変異、ならびに／または、例えばビオチン化、アセチル化、ペグ化などのアミノ酸残基の化学的変化、アミノ基、SH基、もしくはカルボキシル基の化学的変化を含んでもよい。
【００６８】
特に好ましいものは、SEQ ID NO:63〜90、および以下の融合タンパク質からなる群より選択される融合タンパク質である。
【００６９】
(表４)
0006034188.tif 000004
0006034188.tif 000005
【００７０】
本発明による融合タンパク質、および従って、とりわけ、SEQ ID NO:63〜90記載の特に好ましい融合タンパク質は、N末端にメチオニンを追加的に含んでもよい。
【００７１】
本発明による融合タンパク質、および従って、とりわけ、SEQ ID NO:63〜90記載の特に好ましい融合タンパク質は、例えば精製のためのタグを追加的に含んでもよい。好ましくは融合タンパク質のC末端の、His6-タグが好ましい。タグは、例えばクローニングの理由のために、追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結され得る。好ましくは、タグは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の追加的なアミノ酸残基によって融合タンパク質に連結され得る。好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるリジンおよびグリシン（Lys-Gly）、またはロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたC末端のHis6-タグを含む。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるリジンおよびグリシン（Lys-Gly）、またはロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含む。別のさらに好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含む。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたC末端のHis6-タグを含む。
【００７２】
より好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたC末端のHis6-タグを含み、かつ、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチが、追加的なアミノ酸残基であるグリシンおよびセリン（Gly-Ser）によって酵素のN末端に連結される。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるロイシンおよびグルタミン酸（Leu-Glu）によって融合タンパク質に連結されたC末端のHis6-タグを含み、かつ、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチが、追加的なアミノ酸残基であるグリシンおよびセリン（Gly-Ser）によって酵素のN末端に連結され、かつ、融合タンパク質は、N末端に追加的なアミノ酸残基であるメチオニン（Met）、またはメチオニンおよびグリシン（Met-Gly）、またはアラニン、メチオニン、およびグリシン（Ala-Met-Gly）を含む。好ましくは、融合タンパク質はSEQ ID NO: 108〜123記載である。
【００７３】
別の好ましい態様において、融合タンパク質は、N末端にHis6-タグを含み、His6-タグは、N末端に追加的なアミノ酸であるセリンおよびセリン（Ser-Ser）、またはメチオニンおよびグリシン（Met-Gly）、またはメチオニン、グリシン、セリン、およびセリン（Met-Gly-Ser-Ser）をさらに含む。
【００７４】
別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、およびヒスチジン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含む。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、ヒスチジン、およびメチオニン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含む。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、およびヒスチジン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His）、またはセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、ヒスチジン、およびメチオニン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含み、かつ、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチが、追加的なアミノ酸残基であるセリンによって酵素のC末端に連結される。別の好ましい態様において、融合タンパク質は、追加的なアミノ酸残基であるセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、およびヒスチジン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His）、またはセリン、セリン、グリシン、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、ヒスチジン、およびメチオニン（Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met）によって融合タンパク質に連結されたN末端のHis6-タグを含み、かつ、本発明による融合タンパク質のペプチドストレッチが、追加的なアミノ酸残基であるセリンによって酵素のC末端に連結され、かつ、His6-タグは、N末端に追加的なアミノ酸残基であるセリンおよびセリン（Ser-Ser）、またはメチオニン、グリシン、セリン、およびセリン（Met-Gly-Ser-Ser）、またはメチオニンおよびセリン（Met-Ser）を含む。好ましくは、融合タンパク質はSEQ ID NO: 122および123記載である。
【００７５】
融合タンパク質は、例えば、Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manualに記載されているような標準的なクローニング技術を使用して、少なくとも2つの核酸配列を連結することによって構築される。そのようなタンパク質は、例えば、組み換えDNA発現系において産生されてもよい。本発明によるそのような融合タンパク質は、エンドリシンおよびそれぞれのペプチドストレッチについての核酸を融合させることによって取得され得る。
【００７６】
本発明による融合タンパク質は、他の追加的なタンパク質に融合または連結されてもよい。この他の追加的なタンパク質の例はチオレドキシンである。
【００７７】
本発明はさらに、本発明による融合タンパク質をコードする、単離された核酸分子に関連する。本発明はさらに、本発明による核酸分子を含むベクターに関連する。ベクターは、本発明による融合タンパク質の構成性または誘導性の発現を提供してもよい。
【００７８】
本発明はまた、融合タンパク質を発現する遺伝学的に改変された適当な宿主細胞などの微生物から、該融合タンパク質を取得するための方法に関連する。宿主細胞は、細菌もしくは酵母などの微生物、または、例えば哺乳動物細胞、とりわけヒト細胞のような動物細胞であってもよい。本発明の1つの態様において、宿主細胞はピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である。宿主は、単なる生物工学的理由、例えば、収率、溶解性、費用などのために選択されてもよいが、医学的観点から、例えば、非病原性細菌または酵母、ヒト細胞から選択されてもまたよい。
【００７９】
本発明の別の局面は、融合タンパク質をコードする遺伝物質の宿主細胞中への導入によって宿主細胞が遺伝学的に改変され、本発明による融合タンパク質の発現を得るため、ならびに、当業者に周知である遺伝子工学法によってそれらの翻訳および発現を得るために、適当な宿主細胞を遺伝学的に形質転換する方法に関連する。
【００８０】
さらなる局面において、本発明は、本発明による融合タンパク質、および／または、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子もしくはベクターで形質転換された宿主を含む組成物、好ましくは薬学的組成物に関連する。
【００８１】
本発明はまた、医用薬剤としての使用のための、本発明による融合タンパク質、および／または、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主に関連する。さらなる局面において、本発明は、グラム陽性細菌に付随する障害、疾患、または状態の処置および／または予防のための医用薬剤の製造における、本発明による融合タンパク質、および／または、本発明による改変された融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主の使用に関連する。とりわけ、障害、疾患、または状態の処置および／または予防は、リステリア・モノサイトゲネス、スタフィロコッカス・アウレウス、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・エクイ、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・ボツリナム、クロストリジウム・テタニ、クロストリジウム・パーフリンジェンス、バチルス・アントラシス、バチルス・セレウス、プロピオニバクテリウム・アクネス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、コリネバクテリウム・ジフテリエ、マイコプラズマ・ニューモニエ、アクチノマイセス属のような、ヒトまたは動物にとって病原性である株を含むグラム陽性細菌の細菌群、科、属、または種によって引き起こされ得る。
【００８２】
本発明はさらに、本発明による融合タンパク質、および／または、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を含む医用薬剤に関連する。
【００８３】
さらなる局面において、本発明は、処置および／または予防を必要とする対象において障害、疾患、または状態を処置する方法であって、有効量の本発明による融合タンパク質、および／または、有効量の、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、または本発明による組成物を、該対象に投与する段階を含む方法に関連する。対象は、ヒトまたは動物であってもよい。
【００８４】
とりわけ、処置の方法は、グラム陽性細菌、とりわけ上記に列挙したグラム陽性細菌によって引き起こされる皮膚、軟組織、呼吸器系、肺、消化管、眼、耳、歯、鼻咽頭、口、骨、膣の感染症、菌血症の創傷、および／または心内膜炎の処置および／または予防のためであってもよい。
【００８５】
本発明による処置（または予防）の方法において使用される投与の用量および経路は、処置される特定の疾患／感染の部位に依存する。投与の経路は、例えば、経口的、局所的、鼻咽頭内、非経口的、静脈内、直腸内、または任意の他の投与の経路であってもよい。
【００８６】
本発明による融合タンパク質、および／または、有効量の、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、または本発明による組成物の、感染の部位（または感染する危険にさらされた部位）への適用のために、感染の部位へ到達するまで、プロテアーゼ、酸化、免疫応答などの環境の影響から活性化合物を保護する製剤が使用されてもよい。従って、製剤は、カプセル、糖剤、丸剤、粉末剤、坐剤、乳剤、懸濁剤、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、注射可能な溶液、シロップ、噴霧剤、吸入剤、または任意の他の医学的に妥当な生薬製剤であってもよい。好ましくは、生薬製剤は、適当な担体、安定剤、着香料、緩衝剤、または他の適当な試薬を含んでもよい。例えば、局所適用のために、製剤は、ローション、クリーム、ゲル、軟膏、または硬膏であってもよく、鼻咽頭適用のために、製剤は、噴霧器を介して鼻に適用される生理食塩水であってもよい。経口投与のために、特定の感染部位の、例えば腸における処置および／または予防の場合、感染の部位が到達するまで、本発明による融合タンパク質を胃腸管の苛酷な消化性環境から保護することが必要であり得る。従って、胃における消化の初期段階を生き延び、かつ後に本発明による融合タンパク質を腸環境中に分泌する細菌が、担体として使用され得る。
【００８７】
本発明の特定の態様において、リステリア・モノサイトゲネスによって引き起こされる障害、疾患、または状態、とりわけ乳児敗血症性肉芽腫症（新生児のリステリア症）、単核球症、結膜炎、髄膜炎、敗血症性肉芽腫症、および妊婦のリステリア症の処置および／または予防のための医用薬剤の製造における、本発明による融合タンパク質、および／または、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターで形質転換された宿主の使用。
【００８８】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、スタフィロコッカス・アウレウスによって引き起こされ、とりわけ膿皮症、特に毛嚢炎、フルンケル、カルブンケル、汗腺の膿瘍、および天疱瘡のような、ならびに鱗屑性皮膚症候群のような皮膚の感染症である。鱗屑性皮膚症候群は、剥脱性皮膚炎、水疱性膿痂疹、および猩紅熱様紅皮症の3つの臨床像において出現し得る。さらに、スタフィロコッカス・アウレウスによって引き起こされる障害、疾患、または状態は、スタフィロコッカス属肺炎、病院症、とりわけ手術創傷感染症、産褥性乳腺炎（mastitis puerperalis）、および腸炎、ならびに食中毒である。
【００８９】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、ストレプトコッカス・ピオゲネスによって引き起こされ、とりわけ扁桃炎、咽頭炎、猩紅熱（scarlet）、丹毒、リウマチ熱、および急性糸球体腎炎である。
【００９０】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、ストレプトコッカス・ニューモニエによって引き起こされ、とりわけ肺炎、匐行性角膜潰瘍、中耳炎、髄膜炎、腹膜炎、乳様突起炎、および骨髄炎である。
【００９１】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、クロストリジウム・パーフリンジェンスによって引き起こされ、とりわけガス壊疽、壊死性潰瘍性腸炎（enteritis necroticans ulcerosa）、および食中毒である。
【００９２】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、クロストリジウム・ボツリナムによって引き起こされ、とりわけボツリヌス中毒である。
【００９３】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、クロストリジウム・ディフィシレによって引き起こされ、とりわけ偽膜性腸炎である。
【００９４】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、バチルス・アントラシスによって引き起こされ、とりわけ皮膚炭疽、吸入炭疽、および胃腸炭疽である。
【００９５】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、エンテロコッカス・フェカリスまたはE. フェシウムによって引き起こされ、院内感染症、および心内膜炎などである。
【００９６】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、バチルス・セレウスによって引き起こされ、とりわけ食中毒、気管支肺炎、敗血症、および髄膜炎である。
【００９７】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・パラツベルクローシス（Mycobacterium paratuberculosis）、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシスによって引き起こされ、とりわけ結核症である。
【００９８】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、マイコプラズマ・ニューモニエによって引き起こされ、とりわけ肺炎、上気道の疾患、および鼓膜の炎症である。
【００９９】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、アクチノマイセス属によって引き起こされ、とりわけヒト、ウシ、ネコ、およびイヌにおける放線菌症である。
【０１００】
本発明の別の特定の態様において、障害、疾患、または状態は、コリネバクテリウム・ジフテリエによって引き起こされ、とりわけ扁桃腺、鼻、鼻咽頭、または中耳の限局性ジフテリア、喉頭、気管、および気管支の進行性ジフテリア、毒性または悪性ジフテリア、皮膚および創傷のジフテリアである。
【０１０１】
好ましくは、処置（または予防）される感染症が、多剤耐性細菌株、とりわけ1つまたは複数の以下の抗生物質：ストレプトマイシン、テトラサイクリン、セファロチン、ペニシリン、ゲンタマイシン、セフォタキシム、セファロスポリン、セフタジジム、またはイミペネムに対して耐性の株によって引き起こされる場合、本発明による融合タンパク質が医学的処置のために使用される。さらに、本発明による融合タンパク質は、抗生物質、ランチビオティック、バクテリオシン、またはエンドリシンなどの従来の抗細菌剤との組み合わせでそれを投与することによって、処置の方法において使用され得る。
【０１０２】
本発明はまた、1つまたは複数のコンパートメントを含み、少なくとも1つのコンパートメントが、1つもしくは複数の本発明による融合タンパク質、および／または、1つもしくは複数の、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主、または本発明による組成物を含む、薬学的パックに関連する。
【０１０３】
別の局面において、本発明は、1種もしくは複数種の本発明による融合タンパク質、および／または、1種もしくは複数種の、本発明による融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換された宿主を、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と混合する段階を含む、薬学的組成物の調製の工程に関連する。
【０１０４】
またさらなる局面において、本発明による組成物は、美容用組成物である。いくつかの細菌種は、皮膚などの患者の身体の、環境に曝露された表面上に刺激を引き起こし得る。そのような刺激を予防するため、または細菌性病原体の軽微な症状発現を排除するために、既に存在するか、または新しく定着する病原性グラム陽性細菌を分解するのに十分な量の本発明による融合タンパク質を含む、特別な美容用調製物が利用されてもよい。
【０１０５】
さらなる局面において、本発明は、医薬、食品、もしくは飼料における診断手段、または環境診断法として、とりわけ、グラム陽性細菌によってとりわけ引き起こされる細菌感染症の診断のための診断手段としての使用のための、本発明による融合タンパク質に関連する。この点において、本発明による融合タンパク質は、病原性細菌、とりわけグラム陽性病原性細菌を特異的に分解するための手段として使用されてもよい。本発明による融合タンパク質による細菌細胞の分解は、Triton X-100のような界面活性剤、またはポリミキシンBのような細菌細胞のエンベロープを弱める他の添加物の添加によって支持され得る。PCR、核酸ハイブリダイゼーション、もしくはNASBA（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）のような核酸ベースの方法、IMS、免疫蛍光法、もしくはELISA技術のような免疫学的方法、または、別個の細菌群もしくは種に特異的なタンパク質（例えば、腸内細菌についてβ-ガラクトシダーゼ、コアグラーゼ陽性株についてコアグラーゼ）を使用する酵素学的アッセイのような細菌細胞の細胞内容物に依拠する他の方法を使用する、その後の細菌の特異的な検出のための初期段階として、特異的な細胞分解が必要とされる。
【０１０６】
さらなる局面において、本発明は、食材の、食品加工器具の、食品加工設備の、棚および食品貯蔵領域などの食材と接触する表面の、ならびに、病原性細菌、通性病原性細菌、または他の望ましくない細菌が潜在的に食品材料に外寄生し得るすべての他の状況における、医療装置の、ならびに、病院および手術室におけるすべての種類の表面の、グラム陽性細菌汚染の処置、または予防のための、本発明による融合タンパク質の使用に関連する。
【０１０７】
とりわけ、本発明の融合タンパク質は、消毒剤として予防的に使用されてもよい。消毒剤は、手術の前もしくは後、または例えば血液透析の間に使用されてもよい。さらに、未熟児および易感染性の人、または補綴装置を必要とする対象が、本発明による融合タンパク質で処置されてもよい。処置は、予防的、または急性感染症の間のいずれかであってもよい。同一の文脈において、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェカリス、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム、ストレプトコッカス・ニューモニエ、プロピオニバクテリウム・アクネス、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスのような、抗生物質耐性株による院内感染症が、予防的にまたは急性期の間に、本発明の融合タンパク質で処置されてもよい。従って、本発明による融合タンパク質は、界面活性剤、テンシド、溶媒、抗生物質、ランチビオティック、またはバクテリオシンのような殺菌溶液において有用である、他の成分との組み合わせでもまた、殺菌剤として使用されてもよい。
【０１０８】
例えば、病院、歯科手術、獣医学、厨房、または浴室における殺菌剤としての本発明による融合タンパク質の使用のために、融合タンパク質は、例えば、液体、粉末、ゲル、または、ウェットワイプもしくは殺菌シート製品の成分の形態で組成物において調製され得る。組成物は追加的に、それぞれの使用および形態のために適当な担体、添加物、希釈剤、および／または賦形剤を含んでもよいが、EDTAのような抗微生物活性を支持する剤、または融合タンパク質の抗微生物活性を増強する剤もまた含んでもよい。融合タンパク質はまた、アルコール、アルデヒド、酸化剤、フェノール類、四級アンモニウム化合物、またはUV光のような、一般的な殺菌剤と共に使用されてもよい。例えば、表面、対象、および／または装置を殺菌するために、融合タンパク質は、該表面、対象、および／または装置に適用され得る。適用は、例えば、布地または布切れなどの任意の手段で殺菌組成物を湿らせることによって、噴霧すること、注ぐことによって起こってもよい。融合タンパク質は、それぞれの適用、および完全な抗微生物活性を得るように意図される「反応時間」に依存して変動する濃度において、使用されてもよい。
【０１０９】
本発明の適用性のさらなる範囲は、本明細書において以下に提供される詳細な説明から明らかになると考えられるが、本発明の趣旨および範囲内の種々の変化および改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになると考えられるため、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例証のみのために提供されることが理解されるべきである。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、両方とも例示的かつ説明的であるのみであり、ならびに、特許請求される本発明を限定するものではないことが理解されるべきである。
【０１１０】
以下の実施例は、本発明を説明するが、限定的であるとはみなされない。異なるように指示されない限り、例えば、Sambrock et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されているような分子生物学の標準的な方法が使用された。
【実施例】
【０１１１】
実施例1．N末端またはC末端に種々のペプチドストレッチを有する酵素、Cpl-1、Ply511、LysK、リゾスタフィン（Lss）、およびPA6-gp20のクローニング、発現、および精製
SEQ ID NO: 57記載のCpl-1は、ストレプトコッカス・ニューモニエ ファージCpl-1に由来するエンドリシンである。エンドリシンCpl-1は、SEQ ID NO: 91記載の核酸によってコードされる。SEQ ID NO: 91記載の核酸分子を、核酸分子の5'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にXho I (5'-CTC GAG-3')制限部位を伴って合成的に産生した。
【０１１２】
SEQ ID NO: 58記載のPly511は、リステリア・モノサイトゲネスのファージA511に由来するエンドリシンである。エンドリシンPly511は、SEQ ID NO: 92記載の核酸分子によってコードされる。SEQ ID NO: 92記載の核酸分子を、核酸分子の5'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にXho I (5'-CTC GAG-3')制限部位を伴って合成的に産生した。
【０１１３】
SEQ ID NO: 59記載のLysKは、スタフィロコッカス・アウレウスのファージKに由来するエンドリシンである。エンドリシンLysKは、SEQ ID NO: 93記載の核酸分子によってコードされる。SEQ ID NO: 93記載の核酸分子を、核酸分子の5'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にXho I (5'-CTC GAG-3')制限部位を伴って合成的に産生した。
【０１１４】
SEQ ID NO: 60記載のリゾスタフィン（Lss）は、スタフィロコッカス・シムランス（Staphylococcus simulans）に由来するバクテリオシンである。バクテリオシンLssは、SEQ ID NO: 94記載の核酸分子によってコードされる。SEQ ID NO: 94記載の核酸分子を、核酸分子の5'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にXho I (5'-CTC GAG-3')制限部位を伴って合成的に産生した。
【０１１５】
SEQ ID NO: 61記載のPA6-gp20は、プロピオニバクテリウム・アクネスのファージに由来するエンドリシンである。エンドリシンPA6-gp20は、SEQ ID NO: 123記載の核酸分子によってコードされる。SEQ ID NO: 123記載の核酸分子を、核酸分子の5'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にXho I (5'-CTC GAG-3')制限部位を伴って合成的に産生した。
【０１１６】
表5における以下のペプチドストレッチを、酵素Cpl-1、Ply511、LysK、リゾスタフィン（Lss）、およびPA6-gp20との融合タンパク質の産生に使用した。
【０１１７】
（表５）
0006034188.tif 000006
【０１１８】
それぞれのペプチドストレッチをコードする核酸分子は、バクテリオシンLssとライゲーションするためのPKおよびPK2をコードする核酸分子を除き、核酸分子の5'端にNde I (5'-CAT ATG-3')制限部位を、および核酸分子の3'端にBamH I (5'-GGA TCC-3')制限部位を伴って合成的に産生し、バクテリオシンLssとライゲーションするためのPKおよびPK2をコードする核酸分子は、核酸分子の5'端にNco I制限部位に加えて2個の追加的なヌクレオチド (5'-CCA TGG GC-3')を伴って産生した。
【０１１９】
融合タンパク質は、例えば、Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manualに記載されているような標準的なクローニング技術を使用して、少なくとも2つの核酸配列を連結することによって構築される。従って、ペプチドストレッチをコードする核酸分子を、それぞれの制限酵素Nde IおよびBamH Iでの消化において切断し、ならびにペプチドストレッチである、LssとライゲーションするためのPKおよびPK2をコードする核酸分子の場合は、消化を制限酵素Nco IおよびBamH Iで行った。続いて、ペプチドストレッチをコードする切断した核酸を、それ以前にそれぞれの制限酵素Nde IおよびBamH Iでの消化において同様に切断したpET21 b発現ベクター（Novagen, Darmstadt, Germany）中にライゲーションした。ペプチドストレッチである、LssとライゲーションするためのPKおよびPK2をコードする切断した核酸分子は、それ以前にそれぞれの制限酵素Nco IおよびBamH Iでの消化において同様に切断した、改変されたpET32 b発現ベクター（改変されていないベクターをNovagen, Darmstadt, Germanyから取得可能）中にライゲーションした。pET32b発現ベクターの改変とは、S-タグおよび中央のHis6-タグをコードする配列の欠失を指す。
【０１２０】
その後、酵素Cpl-1、Ply511、PA6-gp20、LysK、およびLssをコードする核酸分子を、制限酵素BamH IおよびXho Iでの消化において切断し、それ以前にそれぞれの制限酵素BamH IおよびXho Iでの消化において同様に切断した、pET21b発現ベクター（Novagen, Darmstadt, Germany）および改変されたpET32 b発現ベクター中に、エンドリシンがそれぞれライゲーションされ得るようにした。
【０１２１】
リゾスタフィンおよびLysKのC末端にライゲーションしたペプチドストレッチPKの場合、結果として生じた融合タンパク質は、N末端にHis6-タグを有し、His6-タグは、リンカーによってN末端に連結される。それぞれの核酸分子のクローニングのために、pET32 b発現ベクター（Novagen, Darmstadt, Germany）を使用した。
【０１２２】
こうして、ペプチドストレッチをコードする核酸分子を、それぞれの酵素をコードする核酸分子の5'端に、それぞれのベクター中にライゲーションする。さらに、それぞれの酵素をコードするこの核酸分子をそれぞれのプラスミド中にライゲーションし、6個のヒスチジン残基からなるHis6-タグをコードする核酸分子がエンドリシンをコードする核酸分子の3'端に結合するようにする。
【０１２３】
いくつかの融合タンパク質は、細菌における発現時に毒性であるか、またはタンパク質分解のために均質でないかのいずれかである可能性があるため、これらの融合タンパク質を他の追加的なタンパク質に融合または連結させて発現する戦略があり得る。これらの他の追加的なタンパク質の例は、大腸菌において毒性抗微生物ペプチドの発現を媒介することが示されたチオレドキシンである（TrxA mediating fusion expression of antimicrobial peptide CM4 from multiple joined genes in Escherichia coli. Zhou L, Zhao Z, Li B, Cai Y, Zhang S. Protein Expr Purif. 2009 Apr;64(2):225-230）。N末端のPKまたはPK2ペプチド、およびバクテリオシンLssからなる融合タンパク質の場合は、ペプチドを、改変されたpET32 b発現ベクター中にライゲーションし、追加的なチオレドキシンがペプチドの5'端に結合するようにする。チオレドキシンはエンテロキナーゼの使用によって発現させた融合タンパク質から除去することができ、従って、ペプチドをコードする核酸分子とチオレドキシンをコードする核酸分子との間にエンテロキナーゼ制限部位が導入される。
【０１２４】
エンドリシン-ペプチド-融合物の配列はDNA塩基配列決定によって制御し、タンパク質発現のために正確なクローンを大腸菌BL21(DE3)、および大腸菌BL21(DE3)pLysS細胞（Novagen, Darmstadt, Germany）中に形質転換した。
【０１２５】
SEQ ID NO: 107〜122および124記載の融合タンパク質の組み換え発現は、大腸菌BL21 (DE3) および大腸菌BL21 (DE3)pLysS細胞（Novagen, Darmstadt, Germany）において行う。0.5〜0.8のOD600nmの光学密度に達するまで細胞を増殖させた。その後、融合タンパク質の発現を1 mM IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）で誘導し、発現を37℃で4時間の間行った。
【０１２６】
大腸菌BL21細胞を20分間、6000gでの遠心分離によって収集し、氷上での超音波処理によって破壊した。大腸菌粗製抽出物の可溶性および不溶性分画を遠心分離（Sorvall, SS34, 30分, 15 000 rpm）によって分離した。すべてのタンパク質を、pET21bまたはpET32bベクターにコードされるC末端His6-タグを使用して、Ni2+親和性クロマトグラフィー（Akta FPLC, GE Healthcare）によって精製した。
【０１２７】
タンパク質のいくつかは、関心対象のタンパク質のN末端にチオレドキシンを融合する、改変されたpET32bベクター（S-タグおよび中央のHis6-タグを欠失したもの）を使用して、上述したように発現させた。ベクターはまた、関心対象のタンパク質の直前にエンテロキナーゼ切断部位を含有する。この部位は、チオレドキシンと関心対象のタンパク質との間のタンパク質分解性切断を可能にし、関心対象のタンパク質は残存するC末端のHis6-タグによって精製することができる。融合タンパク質の抗微生物機能のために、タンパク質分解性切断によってチオレドキシンを除去することが必要である可能性がある。従って、製造業者によって提供されるプロトコルに従い、チオレドキシンを除去するために2〜4単位／mg組み換えエンテロキナーゼ（Novagen, Darmstadt, Germany）で融合タンパク質を切断した。エンテロキナーゼ切断の後、下述するように、His6-タグ精製によって融合タンパク質を精製した。
【０１２８】
Ni2+親和性クロマトグラフィーを、すべて室温で、4つの次の段階において行う：
1．3〜5 ml／分の流速での、10カラム容量までの洗浄緩衝液（20 mMイミダゾール、1 M NaCl、および20 mM Hepes、pH7.4）でのHistrap FF 5 mlカラム（GE Healthcare）の平衡化。
2．3〜5 ml／分の流速での、Histrap FF 5 mlカラムへの全溶解物（求められる融合タンパク質を含む）のローディング。
3．3〜5 ml／分の流速での、結合していない試料を除去するための10カラム容量までの洗浄緩衝液でのカラムの洗浄、続いて10％溶出緩衝液（500 mMイミダゾール、0.5 M NaCl、および20 mM Hepes、pH7.4）での第2の洗浄段階。
4．3〜5 ml／分の流速での、4カラム容量の溶出緩衝液（500 mMイミダゾール、0.5 M NaCl、および20 mM Hepes、pH7.4）の100％への直線勾配での、結合した融合タンパク質のカラムからの溶出。
【０１２９】
溶出緩衝液（20 mM Hepes pH 7.4; 0.5 M NaCl; 500 mM イミダゾール）中の融合タンパク質の精製された保存溶液は、SDS-PAGEゲル上で視覚的に判定した際、少なくとも90％の純度であった（データは示していない）。
【０１３０】
実施例2：N末端を種々のペプチドストレッチで改変されたCpl-1酵素の抗微生物活性
N末端ペプチドストレッチのシュージン1、WLBU2-変異体、LL-37、インドリシジン、マガイニン、プレウロシジン、セクロピンA（ネッタイシマカ）、ブフォリンII、ザルコトキシンIA、およびPKを伴うCpl 1である融合タンパク質を、実施例1において記載したように産生した。ストレプトコッカス・ニューモニエDSMZ 11967およびストレプトコッカス・ニューモニエDSMZ 14378に対する融合タンパク質の抗微生物活性を、以下に記載するプレーティング試験を使用することによって試験した。測定した融合タンパク質の活性を表6に示す。
【０１３１】
表6に表された結果は、ストレプトコッカス・ニューモニエDSMZ 11967およびストレプトコッカス・ニューモニエDSMZ 14378に対する、すべての融合タンパク質の高い抗微生物活性を示す。
【０１３２】
プレーティングアッセイ：
例えば、ストレプトコッカス属、リステリア属、プロピオニバクテリウム属、またはスタフィロコッカス属の対数増殖期の細胞を取得し（1ml）、氷上で冷却し、蒸留水で洗浄した。細菌を20mMトリス pH 7.0、1 mM MgCl2、0.5 Mショ糖に再懸濁した。融合タンパク質を再懸濁緩衝液において希釈し、0.5 Mの最終濃度までショ糖を添加して、それぞれの細菌と共に60分間室温でインキュベーションした（融合タンパク質の最終濃度は約10μg/ml）。その後、0.5 Mショ糖を含有する適切な寒天プレート（例えば、ストレプトコッカス属：コロンビア血液寒天）上に細菌をプレーティングし、インキュベーション後に結果として生じたコロニーを計数した。
【０１３３】
37℃で一晩インキュベーション後、残留コロニーを計数した。計数した細胞数に基づいて、対数単位（＝log10N0/Ni、N0＝処置されていない細胞の数、およびNi＝処置された細胞の数）として抗細菌活性を計算した。すべての試料を少なくとも4重に反復実験した。
【０１３４】
（表６）
0006034188.tif 000007
略語：＋：1 log；＋＋：2〜3 log；＋＋＋：4以上のlog。
【０１３５】
実施例3：N末端をペンタペプチドで改変されたPly511酵素の抗微生物活性
SEQ ID NO: 12記載のN末端ペプチドストレッチのペンタペプチドを伴うPly511である融合タンパク質を、実施例1において記載したように産生した。リステリア・モノサイトゲネスDSMZ 15675およびリステリア・モノサイトゲネスDSMZ 20600に対する融合タンパク質の抗微生物活性を、実施例2において記載したプレーティング試験を使用することによって試験した。測定した融合タンパク質の活性を表7に示す。
【０１３６】
表7に表された結果は、リステリア・モノサイトゲネスDSMZ 15675およびリステリア・モノサイトゲネスDSMZ 20600に対する、融合タンパク質ペンタペプチド：Ply511の高い抗微生物活性を示す。
【０１３７】
（表７）
0006034188.tif 000008
略語：＋：1 log；＋＋：2〜3 log；＋＋＋：4以上のlog。
【０１３８】
実施例4：N末端またはC末端をポリカチオン性ペプチドで改変されたLssおよびLysK酵素の抗微生物活性
SEQ ID NO: 13記載のN末端ペプチドストレッチPKをそれぞれ伴うLssおよびLysKである融合タンパク質、SEQ ID NO:31記載のN末端ペプチドストレッチPK2を伴うLssである融合タンパク質、ならびに、C末端ペプチドストレッチPKをそれぞれ伴うLssおよびLysKである融合タンパク質を、実施例1において記載したように産生した。スタフィロコッカス・アウレウスDSMZ 346およびスタフィロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcus epidermidis）DSMZ 20041に対する融合タンパク質の抗微生物活性を、実施例2において記載したプレーティング試験を使用することによって、および以下に記載するような溶解試験を使用することによって試験した。
【０１３９】
溶解試験
これらの融合タンパク質の抗微生物効果を検討するために、改変されたLysKおよびリゾスタフィンについて溶解試験を使用した。
【０１４０】
スタフィロコッカス属の細胞をBHI培地において、0.7〜1の600nmでの光学密度に達し、対数増殖を示すまで増殖させた。細胞を遠心分離によって収集し、溶解緩衝液（20 mMトリス-HCl (pH 7.4), 60 mM NaCl, 2 mM CaCl2）に再懸濁した。細胞を1.0の600nmでの光学密度で再懸濁し、融合タンパク質と共にインキュベーションした。600nmで分光光度的に活性を測定した。
【０１４１】
測定した融合タンパク質の活性を表8に示す。
【０１４２】
表8に表された結果は、スタフィロコッカス・アウレウスDSMZ 346およびスタフィロコッカス・エペデルミディスDSMZ 20041に対する、N末端ペプチドPKまたはPK2を伴うLssである融合タンパク質の高い抗微生物活性を示す。しかし、他の融合タンパク質もまた、2つの試験した細菌株に対して抗微生物活性を示す。
【０１４３】
（表８）
0006034188.tif 000009
略語：＋：1 log；＋＋：2〜3 log；＋＋＋：4以上のlog。
【０１４４】
実施例5：疎水性ペプチドストレッチのワルマフ1で改変されたPA6-gp20酵素の抗微生物活性
SEQ ID NO: 56記載のN末端ペプチドストレッチのワルマフ1を伴うPA6-gp20である融合タンパク質を、実施例1において記載したように産生した。プロピオニバクテリウム・アクネスDSMZ 1897およびプロピオニバクテリウム・アクネスDSMZ 16379に対する融合タンパク質の抗微生物活性を、実施例2において記載したプレーティング試験を使用することによって試験した。測定した融合タンパク質の活性を表9に示す。
【０１４５】
表9に表された結果は、プロピオニバクテリウム・アクネスの両方の細菌株に対する融合タンパク質の抗微生物活性を示す。
【０１４６】
（表９）
0006034188.tif 000010
略語：＋＋：2〜3 log；
【０１４７】
いずれのタグおよびリンカーも有さない表6〜9における融合タンパク質もまた、上述した活性アッセイで試験した。それらはすべて、表6〜9において使用した細菌株に対して抗微生物活性を示した。
【配列表】
0006034188000001.app