(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価のウイルス様粒子ベクターであって、共有結合された低分子量治療用物質の少なくとも２コピーを伴い、アデノウイルスのペントン又はアデノウイルスのペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子を構成し、前記治療用物質が増殖抑制剤であって、糖ペプチドの、抗癌剤である、化学式ＩＩのブレオマイシンＡ５
【化１】
0005841045.tif 000009
であり、
アデノウイルス十二面体が哺乳類である人のウイルスに由来し、
前記粒子は、十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体を含有し、
Ｄｄと共に送達されるＢＬＭの細胞傷害効果を生じさせる濃度が、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも５０倍低いことを特徴とするウイルス様粒子ベクター。
【請求項２】
低分子量治療用物質が、多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子に、カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いたホモもしくはヘテロの二官能基化合物との架橋によって多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子へ共有結合されるか、前記十二面体のアミン基又はシステイン残基へ共有結合されるか、及び、前記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端において共有結合されるか、のうちの少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項３】
前記粒子が十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体を含み、ペントン基部タンパク質モノマーが０〜２個のＢＬＭ粒子を担持し、６０個の基部タンパク質モノマーを含む１個のＤｄ分子が少なくとも３０個のＢＬＭ残基を担持する、請求項２に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項４】
共有結合される低分子量治療用物質が、抗癌剤のブレオマイシンである、請求項１に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項５】
アデノウイルス十二面体が、保管時に又は哺乳類の血清中あるいは真核生物の細胞内酵素の存在下で不安定な低分子量治療用物質を担持する、請求項１に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項６】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体との結合が、非結合形態の治療用物質に対し、前記治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものである、請求項１に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項７】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体との結合が、副作用に寄与する治療用物質を含む非結合形態の治療用物質に対し、前記治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることを特徴とする、請求項１に記載のウイルス様粒子ベクター。
【請求項８】
ウイルス様粒子ベクターの製造方法であって、哺乳類である人のウイルスに由来する遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子が昆虫細胞内で産生され、続いてショ糖濃度勾配中で超遠心分離し、続いてイオン交換カラムを用いて精製して、低分子量治療用物質の少なくとも２コピーが化学的架橋によって共有結合されたペントン又はペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体を含む、純粋な遺伝子組み換え十二面体粒子（ｒＤｄ）画分を入手する工程を含み、
前記治療用物質は増殖抑制剤であり、
前記粒子が十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体を含み、
Ｄｄと共に送達されるＢＬＭの細胞傷害効果を生じさせる濃度が、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも５０倍低いことを特徴とする、ウイルス様粒子ベクターの製造方法。
【請求項９】
結合される低分子量治療用物質が、カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてホモもしくはヘテロの二官能基化合物との化学的架橋によってベクターに結合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
低分子量治療用物質が、前記十二面体のアミン基又はシステイン残基、又は前記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端の少なくとも一つに結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のウイルス様粒子ベクターの使用であって、治療薬を組織内に送達するために、低分子量治療用物質である抗癌剤を、人を除く哺乳類の癌組織に送達するための、ウイルス様粒子ベクターの使用。
【請求項１２】
医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子である、ウイルス様粒子ベクターを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、癌細胞の増殖を抑制するＤｄ−ＢＬＭ複合体を含有することを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達の分野に関する。より詳細には、本発明は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター、その製造方法、ウイルス様粒子ベクターの使用、及びウイルス様粒子ベクターを含む医薬組成物を含む。より正確には、本発明は、結合された治療用物質とともにアデノウイルス十二面体を構成するウイルス様粒子ベクターに関し、該ベクターは、治療薬を哺乳類の組織へ、特に低分子量の薬剤、とりわけ低分子量の抗癌剤を動物の癌組織へ送達することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
アデノウイルス（Ａｄ）は、非エンベロープタイプの中型のＤＮＡウイルスであり、ヒト及び動物に感染する。感染初期におけるウイルスの侵入には、アデノウイルスの２つのカプシドタンパク質が寄与する。これらは、ウイルスの宿主細胞表面への結合に寄与する三量体線維タンパク質、及びビリオンの内部移行に関与する五量体ペントン基部タンパク質を含む。この２つのタンパク質は、下図に示すペントンと称する非共有結合複合体を形成する。
0005841045.tif 000002
【０００３】
バキュロウイルスシステムにおける２つのペントンタンパク質の過剰発現の結果、１２個のペントンを包含する対称の十二面体ナノ粒子が自発的に形成される。同時に、１２個のペントン基部タンパク質のみを包含する十二面体ウイルス様粒子を同様の方法で形成することができる。いずれのタイプの十二面体（Ｄｄ）も、その構成要素の機能を保持し、非常に強い細胞侵入能力を示す（Ｆｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｆｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００４】
上記十二面体は、２種類の受容体を認識する。上記十二面体は、一方でαｖインテグリンを認識するペントン基部タンパク質の特異性を保持しつつ、癌組織に血液を供給する新生血管中でレベルが上昇するαｖインテグリンに対し親和性を示す。同時に、上記十二面体は、すべての上皮細胞の表面にあるヘパリン硫酸塩に対して強い親和性を有する（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００５】
ブレオマイシン（ＢＬＭ）は、各種の癌の治療に使用される糖ペプチド抗生物質である（Ｌａｚｏ  ａｎｄ  Ｓｅｂｔｉ，１９９９）。この抗生物質は、細胞核内のＤＮＡを切断することによって細胞分裂を阻害する作用を持つ（Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ブレオマイシンは、細胞核内にある時に並はずれて細胞傷害性が強い（Ｐｏｄｄｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
しかしながら、この粒子は親水性で、細胞膜の透過能力が低く、細胞膜上の受容体が少なく、きわめて急速に細胞質内でのタンパク質分解をこうむるため、この抗生物質の活性は限定される（Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌａｚｏ，１９９６；Ｔｏｕｎｅｋｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。そのため、非常に大量の抗生物質が投与され、それが肺線維症という重篤な副作用を引き起こす。これまで、癌組織へのＢＬＭの侵入を促すには電気穿孔法が使用されており、これによってブレオマイシンの抗癌効果が上昇した（Ｇｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。ヒトの癌
治療においては、１９９１年からブレオマイシン電気化学療法を使用して臨床試験が始まっている（Ｇｏｔｈｅｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。これは主として皮膚又は皮下の腫瘍に適用されたが、頭部及び頸部の腫瘍にも適用された。ブレオマイシンは腫瘍に対し、直接に、又は静脈を通して、電気ショックと同時に投与された。こうした療法により、癌組織内に多様なレベルの壊死性変化を誘起して腫瘍の成長を止めることが可能になる。
腫瘍の位置に応じ、電気穿孔中に、さらにストレスの加わる処置である全身麻酔又は局所麻酔が使用された。
【０００６】
ＦＲ２７４７６８１号（１９９７年１０月２４日公開）及びＦＲ２７４１０８７号（１９９７年５月１６日公開）において、１つのタンパク質複合体（ペントン基部タンパク質及び任意選択で線維タンパク質を含むアデノウイルス十二面体）が開示された。上記アデノウイルスタンパク質複合体（Ａ）は、（ａ）それぞれ少なくとも１個のペントン基部（Ｐｂ）と１個の線維タンパク質（Ｆ）とを含み、その内部でペントンがＰｂを通して結合され、タンパク質分解に対する抵抗性を有する分子量４．８〜６．６ＭＤの十二面体構造を形成する１２個のペントン（Ｐ）、又は、（ｂ）上記と同じく１２個のＰｂが十二面体を形成するが分子量は３．２〜４ＭＤのいずれかを含む。（Ａ）はその他のアデノウイルス構成要素を含まず、またＦとＰｂはアデノウイルス（Ａｄ）の血清型が同じ場合も異なる場合もある。
【０００７】
ＵＳ６０８３７２０号（２０００年７月４日公開）、ＥＰ０８６１３２９号（２０００年７月４日公開）、ＷＯ９７１８３１７号（２００６年２月１６日公開）において、タンパク質複合体、上記複合体を含む組成物、及びその使用であるアデノウイルス十二面体が開示された。野生型の、又は遺伝子組み換え型のアデノウイルスタンパク質複合体は、ヒト及び動物の疾病の治療及び予防に使用される。開示された複合体は１２個のペントンを含み、その個々が、その他のアデノウイルスの要素を除いた少なくとも１個の線維タンパク質とペントン基部を含み、前記線維タンパク質は、１つ又は複数のアデノウイルス血清
型に由来し、上記ペントン基部タンパク質は相互に結合し、タンパク質分解に対して抵抗性を有する安定した十二面体構造を形成する。
【０００８】
特許出願ＣＡ２６１９２７８号（２００７年２月２日公開）に、治療用物質の被包のための方法が提供されている。この発明は、治療活性のある物質を特殊な被覆を有するナノ粒子の内側に被包するための、ナノ粒子を含む組成物及びその使用に関する。上記粒子は、化学的に高レベルの細胞内吸収を防止するように形成される。被包には、ナノ粒子と治療活性物質の間の直接の結合が必要である。該医薬組成物は、癌細胞への親和性が高いナノ粒子を含み、例としてブレオマイシンを含む群から選択された少なくとも１つの治療用物質を含む。
【０００９】
治療薬の体内への供給方法の改善を主眼とする上述の発明にも関わらず、アデノウイルス十二面体を用いた新規の効率の良い送達療法提供へのニーズは持続している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、十二面体ウイルス様粒子ベクターの治療目的での使用を可能にする条件の作成であり、またヒトの治療に使用される低分子量治療用物質を運搬するベクターを含む医薬組成物の調製及び特性決定である。上記十二面体は、癌細胞に特異的な多価のベクターである可能性がある。該ベクターはアデノウイルスのエンドソーム活性を有し、そのため細胞の細胞質ゾルへ容易に侵入する。上述のとおり、Ｄｄは、αｖインテグリンに対して高い親和性を有する。該インテグリンはＲＧＤモチーフ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を認識する。６０個のＲＧＤモチーフを持つアデノウイルス十二面体は、αｖインテグリンにとって、おそらく最も特異的なリガンドである。αｖインテグリンのレベルは悪性腫瘍の内皮において上昇することが知られており、本出願人は、Ｄｄが治療薬を選択的に、新生腫瘍血管の内皮細胞の内側へ供給することができると想定している。このため本出願人は、標的治療用Ｄｄ複合体の使用が低分子量薬物のバイオアベイラビリティを高め、副作用を低減することを期待して、上記ウイルス様粒子を、ブレオマイシン等の抗癌性抗生物質を含む、特に増殖抑制因子、とりわけ糖ペプチド型の低分子量治療薬の移入に使用することを決定した。
【００１１】
この目的の達成、及び低分子量薬物のバイオアベイラビリティを高め、副作用を低減して低分子量治療薬の送達を可能にする発明の開発に関係する技術分野における課題の克服は本発明に含まれる。
【００１２】
本出願人は、その作業の中で、遺伝子組み換え十二面体（ｒＤｄ）を得、上記十二面体が十二面体の由来であるアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）より高い効率で細胞に侵入することを実証した。すなわち、ｒＤｄは細胞培養中の１００％の細胞を形質導入し、Ａｄ３では許容されない細胞についても形質導入を行う能力を有する。これは、Ｄｄの機能獲得、とりわけ細胞膜の共通構成要素であり、Ｄｄの由来になった３型アデノウイルスが認識しないヘパリン硫酸塩（ＨＳ）プロテオグリカンとの相互作用の結果である（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＨＳは正電荷を帯びたタンパク質片と相互に作用し、また該タンパク質片は、ＶＬＰ内の複数ペントン基部タンパク質の近接によってＤｄ内に形成されるもようである。したがって、十二面体の侵入は、ウイルス受容体経由のみならず、遍在するヘパリン硫酸塩を通しても発生する。
【００１３】
遺伝子組み換え十二面体（ｒＤｄ）は、バキュロウイルスシステムの昆虫細胞で大量に得られる。この産出量は、細胞培養系で１００ｍＬ当たりｒＤｄ１０ｍｇで、最も効率の高い細菌によるタンパク質発現系について記述される量と同等である。これまでｒＤｄは、ショ糖勾配超遠心法によって精製されていた。これによって細胞のタンパク質は排除できるが、ＶＬＰ表面に結合している可能性の高い核酸は排除できない。
【００１４】
本発明は、被包された又は共有結合された少なくとも２コピーの低分子量の治療用物質とともに、アデノウイルスのペントン又はアデノウイルスペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子を構成し、上記治療用物質は増殖抑制剤、好ましくは抗癌剤であり、また、上記アデノウイルス十二面体は哺乳類のウイルス、特にヒトのウイルスに由来するという特徴を有する多価のウイルス様粒子ベクターに関する。好ましくは、送達される低分子量治療用物質は、増殖抑制剤、好ましくは糖ペプチド、とりわけ抗癌剤であり、好ましくは化学式Ｉによるブレオマイシンファミリーに属するものであり、
【化１】
0005841045.tif 000003
好ましくは化学式ＩＩによるブレオマイシンＡ５である。
【化２】
0005841045.tif 000004
【００１５】
低分子量治療用物質が、多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子に被包されるか、又は、好ましくはカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いたホモもしくはヘテロの二官能基化合物との架橋によって多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子へ共有結合されるか、前記十二面体のアミン基又はシステイン残基へ共有結合されるか、又は、前記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端において共有結合されることが好ましい。
【００１６】
上記十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体において、ペントン基部タンパク質モノマーは０〜２個のＢＬＭ粒子を担持し、うち有意に多数のモノマーは１個のＢＬＭ分子を担持し、６０個の基部タンパク質モノマーを含む１個のＤｄ分子は少なくとも３０個のＢＬＭ残基を担持することが好ましい。
【００１７】
好ましくは、結合され、又は被包された低分子量治療用物質は、好ましくはブレオマイシンである抗癌剤（医学は治療の技術−ウィキペディア）、好ましくは３，４−ジヒドロキシフェニル−ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）である神経変性疾患治療薬、好ましくはイソニアジドである抗結核薬及び抗細胞間寄生生物薬、好ましくはサルブタモールである抗喘息薬、好ましくはチオペンタールである静脈内麻酔薬、好ましくは抗トキソプラズマ薬、抗リーシュマニア薬、抗トリパノソーマ病薬、及び抗リケッチア症薬である抗病原体薬などの不安定な薬物である。
【００１８】
上記アデノウイルス十二面体は、保管時又は哺乳類の血清中あるいは真核細胞の細胞内酵素の存在下で不安定な低分子量治療用物質を担持することが好ましい。
【００１９】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体の結合は、治療用物質、とりわけ抗病原体薬のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００２０】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体の結合は、治療用物質、とりわけ重篤な副作用に寄与する治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００２１】
Ｄｄとともに送達される細胞傷害効果を有するＢＬＭ濃度は、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも５０倍低いことが好ましい。
【００２２】
本発明の別の主題となる実施形態は、上記遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子が哺乳類、特にヒトのウイルスに由来することと、上記十二面体が昆虫細胞内で産生され、続いてショ糖濃度勾配超遠心法、続いてイオン交換カラムを用いて精製された純粋なｒＤｄ画分を入手し、続いて、このようにしてできた、ペントン又はペントン基部タンパク質を含む遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体に対し、少なくとも２コピーの低分子量治療用物質が化学的架橋によって被包され、又は共有結合され、上記治療用物質は、好ましくは抗癌剤である増殖抑制剤であることを特徴とするウイルス様粒子ベクターの製造方法である。
【００２３】
上記低分子量治療用物質は、増殖抑制剤、好ましくは糖ペプチド、とりわけ抗癌剤であり、好ましくは化学式Ｉによるブレオマイシンファミリーに属するものであり、より好ましくは化学式ＩＩによるブレオマイシンＡ５である。
【００２４】
結合される低分子量治療用物質は、カプセル化によってベクター内に置かれる（被包）か、又は、好ましくはカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてホモもしくはヘテロの二官能基化合物との化学的架橋によってベクター表面に結合されることが好ましい。
【００２５】
低分子量治療用物質は、上記十二面体のアミン基又はシステイン残基に、あるいは上記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合されることが好ましい。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、ペントン又はペントン基部タンパク質から形成される遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子と、被包されるか、又は共有結合された少なくとも２コピーの低分子量治療用物質との複合体を構成する遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体であるウイルス様粒子ベクターの使用であり、上記治療用物質は好ましくは抗癌剤である増殖抑制剤であり、アデノウイルス十二面体粒子は、治療薬を組織内に送達するため、好ましくは低分子量治療用物質、好ましくは抗癌剤を哺乳類の癌組織に送達するために、哺乳類、特にヒトのウイルスに由来する。
【００２７】
好ましくは、結合される低分子量治療用物質は増殖抑制剤、好ましくは糖ペプチド、とりわけ抗癌剤であり、好ましくは化学式Ｉによるブレオマイシンファミリーに属するものであり、
【化３】
0005841045.tif 000005
好ましくは化学式ＩＩによるブレオマイシンＡ５である。
【化４】
0005841045.tif 000006
【００２８】
少なくとも２コピーの低分子量治療用物質は、遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子に被包されるか、又は、好ましくはカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いたホモもしくはヘテロの二官能基化合物との架橋によって遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子に共有結合されるか、又は、上記十二面体のアミン基又はシステイン残基に、あるいは上記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合されることが好ましい。
【００２９】
上記十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体において、ペントン基部タンパク質モノマーは０〜２個のＢＬＭ粒子を担持し、うち有意に多数のモノマーは１個のＢＬＭ分子を担持し、好ましくは６０個の基部タンパク質モノマーを含む複合体内の１個のＤｄ分子は少なくとも３０個のＢＬＭ残基を担持する。
【００３０】
好ましくは、送達される低分子量治療用物質は、好ましくはブレオマイシンである抗癌剤、好ましくは３，４−ジヒドロキシフェニル−ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）である神経変性疾患治療薬、好ましくはイソニアジドである抗結核薬及び抗細胞間寄生生物薬、好ましくはサルブタモールである抗喘息薬、好ましくはチオペンタールである静脈内麻酔薬、好ましくは抗トキソプラズマ薬、抗アメーバ薬、抗リーシュマニア薬、抗トリパノソーマ病薬、及び抗リケッチア症薬である抗病原体薬などの不安定な薬物である。
【００３１】
送達される治療用物質は、保管時、哺乳類の血清中あるいは真核生物の細胞内酵素の存在下での不安定なものであることが好ましい。
【００３２】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体との結合は、治療薬、とりわけ抗病原体薬のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００３３】
低分子量治療用物質とアデノウイルス十二面体の結合は、治療用物質、とりわけ重篤な副作用に寄与する治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００３４】
Ｄｄとともに送達されるＢＬＭの細胞傷害効果を生じさせる濃度は、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも５０倍低いことが好ましい。
【００３５】
本発明の別の実施形態は、少なくとも２コピーの低分子量治療用物質を担持する、ペントン又はペントン基部タンパク質から形成された多価の遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体粒子を含み、上記治療用物質は、好ましくは抗癌剤である増殖抑制剤であり、上記アデノウイルス十二面体は、哺乳類の、とりわけヒトのウイルスに由来することを特徴とする医薬組成物である。
【００３６】
好ましくは、送達される低分子量治療用物質は、増殖抑制剤、好ましくは糖ペプチド、とりわけ抗癌剤であり、好ましくは化学式Ｉによるブレオマイシンファミリーに属するものであり、
【化５】
0005841045.tif 000007
好ましくは化学式ＩＩによるブレオマイシンＡ５である。
【化６】
0005841045.tif 000008
【００３７】
少なくとも２コピーの低分子量治療用物質が、遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体に被包されるか、又は、好ましくはカルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてホモもしくはヘテロの二官能基化合物との架橋によって遺伝子組み換えアデノウイルス十二面体に共有結合されるか、上記十二面体のアミン基又はシステイン残基に、あるいは上記十二面体内のペントン基部タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合されることが好ましい。
【００３８】
上記十二面体−ブレオマイシン（Ｄｄ−ＢＬＭ）複合体において、ペントン基部タンパク質モノマーは０〜２個のＢＬＭ粒子を担持し、うち有意に多数のモノマーは１個のＢＬＭ分子を含み、好ましくは６０個の基部タンパク質モノマーを含む１個のＤｄ分子は少なくとも３０個のＢＬＭ残基を担持することが好ましい。
【００３９】
好ましくは、結合される低分子量治療用物質は、好ましくはブレオマイシンである抗癌剤、好ましくは３，４−ジヒドロキシフェニル−ｌ−アラニン（Ｌ−ドーパ）である神経変性疾患治療薬、好ましくはイソニアジドである抗結核薬及び抗細胞間寄生生物薬、好ましくはサルブタモールである抗喘息薬、好ましくはチオペンタールである静脈内麻酔薬、好ましくは抗トキソプラズマ薬、抗アメーバ薬、抗リーシュマニア薬、抗トリパノソーマ病薬、及び抗リケッチア症薬である抗病原体薬などの不安定な分子である。
【００４０】
上記アデノウイルス十二面体は、保管時に、哺乳類の血清中あるいは真核細胞の細胞内酵素の存在下の遊離状態で不安定な低分子量治療用物質を送達することが好ましい。
【００４１】
低分子量治療用物質のアデノウイルス十二面体への結合は、治療用物質、とりわけ抗病原体薬のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００４２】
低分子量治療用物質のアデノウイルス十二面体への結合は、治療用物質、とりわけ重篤な副作用に寄与する治療用物質のバイオアベイラビリティの向上を確保するものであることが好ましい。
【００４３】
Ｄｄ−ＢＬＭ複合体は、癌細胞の増殖を抑制することが好ましい。
【００４４】
Ｄｄとともに送達されるＢＬＭの細胞傷害効果を生じさせる濃度は、遊離したブレオマイシンの場合より少なくとも５０倍低いことが好ましい。
【００４５】
添付の図面は、本発明の性質をより良く説明するための助けとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】アデノウイルス、ペントン、及び２個の十二面体（Ｄｄ）の説明図を示す。
【図２】動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて分析したＤｄの安定性を示す。Ｄｄの温度安定性はｐＨとイオン強度に依存する。１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＤｄについて、ＤＬＳ法を用い、ｐＨ値を様々に変えて、温度１２〜６５℃の温度帯について２分ごとに２℃昇温させて試験した。（Ｂ）Ｄｄと五量体基部（Ｐｂ）について、ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９）中と炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）中でそれぞれ電気泳動分析を行った。数件の試料は、ＤＬＳの条件を模した温度変化の影響を受けたものである（ＤＬＳと記されたもの）。（Ｃ）様々なイオン強度条件のＰＢＳ中にあるＤｄ試料を用いてＤＬＳ分析を実施した。３組の装置の記録の平均値を示す。
【図３】ＨｅＬａ細胞内及びヒト血清中での凍結乾燥中のＤｄの安定性、並びに遊離ペントン基部（Ｐｂ）タンパク質からのＤｄ再形成を示す。（Ａ）精製したＤｄを、水又は１５０ｍＭの硫酸アンモニウム水溶液を中で、４℃で一晩透析した。「凍結防止剤＋」と記した試料には、マンニトール（０．４％）とショ糖（０．４％）を添加した。Ｄｄの試料は−８０℃で凍結させるか、又は遠心濃縮を伴って乾燥させる、もしくは凍結乾燥させた。乾燥した試料は、当初の水量まで還元した。試料は１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離をかけ、上澄みのタンパク質の状態を、アガロースゲル電気泳動を用いて分析した。（Ｂ）培養されているＨｅＬａ細胞中でのＤｄ安定性。精製したＤｄ試料（２μｇ／１００μＬ）を細胞数２×１０４個のＨｅＬａ細胞に侵入させた。侵入から所定時間経過後、細胞を溶解させ、得られた細胞溶解物を、変性条件下のポリアクリルアミドゲル上（左手のパネル）、又は非変性条件下のアガロースゲル上（右手の２枚のパネル）により分離した。いずれの場合においても、抗Ｄｄ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。対照のＤｄ試料はタンパク質３０ｎｇを含み、五量体基部（Ｐｂ）の試料はタンパク質１０ｎｇを含む。（Ｃ）ヒト血清中のＤｄ安定性。マイクロコン（ミリポア社）を用いた限外濾過によって濃縮されたＤｄ試料（１試料あたり５μｇ）は、ヒト血清（ＨＳ）中で、４℃で２時間（４レーン）、又は３７℃で１５分間もしくは２時間（それぞれ５レーン、６レーン）インキュベートした。試料は非変性条件下のアガロースゲル上で分離し、その後、Ｄｄを認識する抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。上段は導入後に残留したタンパク質をクーマシー染色したゲルで、下段はウェスタンブロットの結果である。１レーンと７レーンは、血清を含まず、それぞれ無処理又は３７℃で２時間インキュベートされたＤｄ試料に対応する。２レーンと３レーンは、それぞれ４℃又は３７℃で２時間インキュベートされたヒト血清に対応する。（Ｄ）精製されたＰｂを、４℃で７５０ｍＭのリン酸アンモニウムを含むｐＨ６．６のリン酸緩衝液５０ｍＭ（左手のパネル）、又は３７℃でｐＨ７．５のリン酸緩衝液１００ｍＭ（右手のパネル）のいずれかによって透析した。試料を１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み中のタンパク質を、非変性条件下でアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。１レーンはＤｄ再形成に使用された開始時のＰｂ標本を含む。２レーンは、再形成前に遊離Ｐｂに７５０ｍＭのリン酸アンモニウムを加えたものに対応する。３レーンは２時間透析した後の遊離五量体基部を含む（透析緩衝液を２回交換）。４レーンと６レーンは、それぞれ４℃と３７℃で４日間の透析中に再形成されたＤｄに対応する。７レーンと８レーンはＤｄに対応し、８レーンの試料は再形成前に７５０ｍＭのリン酸アンモニウムを加えたものである。
【図４】Ｄｄによって送達されたブレオマイシンの細胞傷害性を示す。ブレオマイシンは、化学的にＤｄに結合されている（実施例ＩＶに示すとおり）。（Ａ）質量分析法を用いたＤｄ−ＢＬＭ複合体の分析。（Ｂ）動的光散乱法を用いたＤｄ−ＢＬＭ複合体の分析。（Ｃ）ＭＴＴ細胞傷害性試験。実施例ＩＶにより、ＨｅＬａ細胞を、遊離ＢＬＭ（０．１３μＭ）、Ｄｄ（１μｇ）及びＤｄ−ＢＬＭ（１μｇ：これは０．０８μＭのＢＬＭを送達する）で処理した。
【図５Ａ】Ｄｄ−ＢＬＭ活性のＨｅＬａ細胞への効果を示す。（Ａ）Ｄｄ又はＤｄ−ＢＬＭで処理された細胞（試料１μｇ）を、Ｄｄを認識する抗体（赤シグナル、白黒写真上で白／グレー）を用いて共焦点顕微鏡下で分析した。細胞核はＤＡＰＩ溶液で染色した。最下行は、核染色をせずに５０時間処理した後の細胞を示す。スケールバーは２０μｍに相当する。
【図５Ｂ】Ｄｄ−ＢＬＭ活性のＨｅＬａ細胞への効果を示す。（Ｂ）Ｄｄ、遊離ブレオマイシン又はＤｄ−ＢＬＭで処理された細胞を、所定の時間経過後に、抗γ−Ｈ２ＡＸ（細胞核内で赤色のシグナル、白黒写真上でグレー）と抗チューブリン（細胞質内で緑色のシグナル、白黒写真上で白／グレー）の２つの抗体を用いて共焦点顕微鏡下で分析した。スケールバーは１０μｍに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
上に定義した発明を説明する実施例を以下に示す。
【００４８】
本出願人は、アデノウイルス十二面体に関連する独自の研究を開始した。当研究は、十二面体の過剰発現、精製及び特徴付け、並びにベクターとの化学的結合による低分子量薬物の細胞間送達へのその用途に関係する。当研究には下記の事項が含まれる。
−均質性を得るために精製した十二面体の高品質試料の調製。できあがった試料は、Ｄｄ過剰発現の発生した細胞由来のタンパク質、核酸及びタンパク質分解酵素を欠く。
−ベクターの安定性条件の試験。ｐＨ、イオン強度及び温度などの要因がＤｄの結合性に影響することが判明した。様々な条件でのＤｄ試料の保管、輸送及び使用のための境界条件を規定し、熱帯条件下での使用が可能であることを示唆した。
−遊離ペントン基部タンパク質からのＤｄ再形成条件の試験。低分子量治療薬の被包の可能性に備え、試験管内で十二面体ベクターの遊離した構成要素から十二面体ベクターを得るための生物理学的条件を作成した。
−治療薬と上記十二面体ベクターとの共有結合による十二面体（Ｄｄ）と低分子量治療薬、特にブレオマイシン（ＢＬＭ）などとの複合体の構築。
−組織培養物中でのＤｄ−ＢＬＭ複合体の使用と、遊離ブレオマイシンに対しての複合体のバイオアベイラビリティの顕著な向上の実証。
【００４９】
本発明によって開発されたウイルス様粒子ベクターは、親水性の増殖抑制治療薬、特に抗癌性抗生物質、とりわけブレオマイシンなどの糖ペプチドの細胞膜通過による侵入改善の達成を可能にすると思われる。治療薬の送達のためのＤｄの使用は、おそらく同時に、上記薬剤が、新生腫瘍へ栄養を供給する新生血管を特異的に標的にすることを意味する。ＲＧＤモチーフは、癌組織へ血液を供給する新生血管を構成する内皮細胞においてのみレベルが上昇するαｖインテグリンと、相互に影響し合うことが知られている（Ｃｈｅｎ，２００６）。このモチーフは、Ｄｄを構成するペントン基部タンパク質内に存在し、そのため６０個のＲＧＤモチーフを含むＤｄは、αｖインテグリンにとって高度に特異的なリガンドであり、また同時に、そのエンドソーム活性とヘパリン硫酸塩に対する親和性のゆえに強力な細胞侵入能力を有する。
【実施例】
【００５０】
低分子量治療薬であるブレオマイシン（ＢＬＭ）抗生物質の送達用ベクターとしてのＤｄの使用
多数の抗生物質のコピーを担持するＤｄ−ＢＬＭ試料の生物学的（細胞傷害性）作用を、試験管内で培養されたヒトの癌細胞で試験した。当該ベクターとＢＬＭとの間の化学的結合反応は、細胞侵入能力を低下させなかったと見られる。さらに、当該抗生物質の細胞傷害活性は保持された。すなわちＤｄ−ＢＬＭは、遊離ブレオマイシン同様、試験管内で培養中のヒトＨｅＬａ細胞内へ侵入する際に細胞核のＤＮＡを分解した。Ｄｄによって送達される抗生物質の細胞傷害効果を生じる濃度は、遊離ＢＬＭで使用される濃度より約１００倍低いことが証明された。試験管内培養中の６０％超のヒト癌細胞（ＨｅＬａ）はＤｄ−ＢＬＭ複合体の投与後に破壊され、このことはＭＴＴ細胞傷害性試験を用いて証明された（図４Ｃ）。細胞傷害効果は、十二面体、又はＤｄ−ＢＬＭ複合体に担持した量と同等用量の遊離ブレオマイシンの投与の場合には、いずれも観察されなかった。
【００５１】
Ｄｄ−ＢＬＭは、Ｄｄ又はＢＬＭのいずれかを認識する受容体を用いて細胞膜を通過し、効率的に侵入する。おそらくは、上記ベクターはヒトＨｅＬａ細胞の細胞質内で徐々にタンパク質分解を受け、その結果、結合したブレオマイシンとともにペプチドが放出され、そこでＢＬＭ−ペプチドが細胞核内へ侵入し、細胞核内で抗生物質（この場合はブレオマイシン）が活性を発揮する。
【００５２】
細胞傷害性に関するＢＬＭ活性はＤＮＡ損傷の結果生じることが知られている。より高等な真核細胞におけるＨ２ＡＸヒストンのＣ末端領域のリン酸化反応は、二重鎖ＤＮＡの破壊に応答したクロマチン修飾の１つである。リン酸化されたＨ２ＡＸヒストンを認識する特異的な抗体を、ＤＮＡの損傷を検知するためのプローブとして使用した。Ｄｄ−ＢＬＭは、試験管内培養中のヒトの癌細胞内へ侵入する際に、遊離ブレオマイシン同様、細胞核ＤＮＡを分解する。
【００５３】
本発明の過程で、遺伝子組み換えタンパク質（ｒＤｄ）であるＤｄは、バキュロウイルスシステムの昆虫細胞で非常に大量に得られる。過剰発現は、細胞浮遊物１００ｍＬ当たりｒＤｄ１０ｍｇである。この過剰発現産出量は、最も効率の高い細菌のシステムで得られる量と同等である（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これまでｒＤｄは、ショ糖勾配超遠心法によって精製されていた。この段階によって低分子量及び中分子量の細胞タンパク質は排除できるが、ｒＤｄ表面に結合している可能性の高い核酸は排除できない。Ｄｄの治療への使用が計画されているため、より精製度が高く、より均質な産物を調製する必要があり、そのために２段階のタンパク質精製法が行われる。ショ糖勾配法による１回目のＤｄ精製の後、イオン交換クロマトグラフ法が用いられた。純粋なｒＤｄ画分が得られ（純度９５％超）、このことは、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動法を用い、また電子顕微鏡を用いた分析によって確認された。
【００５４】
生物化学的及び生物物理学的試験が実施され（電子顕微鏡法、非変性条件下のアガロースゲルにおいて、及び変性条件下でのポリアクリルアミドゲルの電気泳動法、並びに動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いた測定）、上記ｒＤｄが、生理的ＮａＣｌ濃度（１５０ｍＭ）において、広範なｐＨ域において最高４０℃まで、またｐＨ７〜８において最高約５０℃まで安定であることが証明された。ｒＤｄは当時、最高温度６０℃まで変性されなかったため、イオン強度が高い条件では総じてその構造が安定することが示された（図２）。遠心濃縮による乾燥中並びに凍結防止剤の存在下での凍結乾燥中における凍結及び解凍後、透析中にベクター粒子は結合性を維持した（図３Ａ）。ベクター安定性が高いため、ｒＤｄの取り扱いと保管は一段と容易になる。さらに、上記ｒＤｄは、生体内での使用を模した条件で、結合性を維持することが判明した。すなわち、ｒＤｄは３７℃のヒト血清中で少なくとも２時間は安定であった（図３Ｂ）。この結果、ｒＤｄは、多様な用途のベクターとして、また多様な環境条件下で使用できる。
【００５５】
質量分析法を用いて実施した分析により、本出願人が作成した、抗癌性抗生物質と上記十二面体との複合体において、１個のウイルス様粒子は平均して６０個の薬剤分子を担持することが証明され（図４Ａ）、このことで使用された上記ベクターの多価性が確認される。ベクター表面への結合の他にも、上記ウイルス様粒子の内側に低分子量化合物を被包することによって、そのバイオアベイラビリティの向上が達成できる。本出願人は、十二面体が五量体基部であるその構成要素から関連づけられる条件を作成した（図３Ｄ）。低分子量化合物存在下での十二面体の試験管内再形成によって、被包された治療用物質を含むウイルス様粒子の入手が可能である。
【００５６】
本出願人によると、上記Ｄｄの性質は、上記ナノ粒子が治療薬の人体組織への送達用ベクターとして使用できる可能性を示唆する。第１の例は、抗癌性抗生物質のブレオマイシンに関係する。
【００５７】
本出願人は、Ｄｄのベクターとしての使用によって抗生物質のバイオアベイラビリティが向上したことを発見した。このことは、抗生物質の投与量を減らしての使用を可能にし、その結果、抗生物質の活性による副作用を低減するはずである。組織培養で実施された試験段階の後、マウス癌モデルで試験が実施される。ヒトの脳腫瘍を移植されたマウスなどのモデル系で使用されるＤｄ−ＢＬＭ試料が、少なくとも以前に使用された電気化学療法によるＢＬＭ送達と同等の効率を有すると証明された場合、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体のヒトの抗癌剤治療への使用を勧めることが可能になる。したがって、抗癌剤治療におけるブレオマイシンの使用は、往々にして全身麻酔が必要になる電気ショックの使用を必要としないＤｄ−ＢＬＭ試料の投与に限定されることもあり得る。
【００５８】
実施例Ｉ
アデノウイルス十二面体の作成方法
ｒＤｄの治療への使用が計画されているため、より精製度が高く、より均質な産物の調製が必要とされ、このニーズは、従前の手順に第２のタンパク質精製段階を追加することよって達成される。すなわち、ショ糖勾配法による１回目のｒＤｄ精製の後、低圧イオン交換クロマトグラフ法が用いられ、これによって純粋なｒＤｄ画分が産出された。
【００５９】
Ｄｄの発現には、ヒトアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）のペントン基部タンパク質遺伝子を有する遺伝子組み換えバキュロウイルスが使用された（Ｆｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。上記基部タンパク質遺伝子を組み込まれた遺伝子組み換えバキュロウイルスの増幅は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）の単層細胞培養で実施された。該細胞は、５％のウシ胎仔血清（インビトロジェン社）を含むＴＣ１００培養液中で培養された。遺伝子組み換えＤｄは、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とアムホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／Ｌ）存在下のエクスプレスファイブＳＦＭ（インビトロジェン社）培養液中で浮遊培養されたＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＨＦとしても知られる）中で過剰発現させた。Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞は、１細胞当たり感染単位ＭＯＩ（多重感染度）４で遺伝子組み換えバキュロウイルスを感染させた。感染から４８時間後に、上記細胞を回収し、凍結と解凍を３回繰り返して溶解させた。溶解物の清澄後に入手した上澄みを１５〜４０％のショ糖勾配中で遠心分離した（Ｆｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。３０〜４０％ショ糖中で回収したＶＬＰ産物には、細胞タンパク質及び核酸が混入していた。最終的なＤｄ精製は、イオン交換カラムを用いたクロマトグラフ法によって行われ、その結果、十二面体は、均質な画分として調製された。上記粒子のオリゴマー状態及び生成産物の純度は、ネイティブのアガロースゲル中で電子顕微鏡を用い、また変性ポリアクリルアミドゲル中で分析された。
【００６０】
実施例ＩＩ
アデノウイルス十二面体の寿命及び安定性の試験
精製されたＤｄ粒子の安定性及び溶解性を試験した。このために、精製ｒＤｄを様々な緩衝液で透析し（それぞれ３回交換）、その後、３０℃又は３７℃でインキュベートした。インキュベート後、試料を遠心分離し、上澄み中のタンパク質をアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。Ｄｄは、ＮａＣｌ  １５０ｍＭの存在下で、４℃、ｐＨ４．０〜１０．９において溶解状態を維持した。ＮａＣｌがない場合、Ｄｄは溶液中に残らず、遠心分離中に上澄み中から消失する。したがって、生理的濃度のＮａＣｌはＤｄを変性から保護する。
【００６１】
Ｄｄの温度による変性に対する耐性を試験するために動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用し、これにより、タンパク質の変性又は凝集を観察した。タンパク質の試料（０．２ｍｇ／ｍＬ）を適当な緩衝液で透析し、塵の粒子を取り除くために孔径０．４５μｍのフィルタで濾過した。次いで、試料をキュベット（４５μＬ、グライナー社、ドイツ、フリケンハウゼン）中に入れ、ＺＳナノゼータサイザー機（マルベルン社、英国、ウースターシャー）を用いて自動粒径測定を実施した。温度勾配は、１２℃から６５℃の間で２分ごとに２℃ずつ変化させた。データは累積法を用いて評価した。
【００６２】
ｐＨ４〜９において、十二面体粒子の粒径は４０℃まで一定であった（図２Ａ）。この温度を超えると、粒径は温度の上昇につれて指数関数的に上昇したが、これは変性と凝集を示す。Ｄｄの変性／凝集は、ｐＨ４〜５では、ｐＨ７〜８より低めの約１０℃で開始する。ｐＨ９（ＣＡＰＳ緩衝液）とｐＨ１０（炭酸塩緩衝液）では、小さな粒径変化が起きた。ネイティブのアガロースゲル中でのタンパク質分析により、Ｄｄは、ｐＨ１０で解離して遊離五量体基部になり、ｐＨ９（ＣＡＰＳ緩衝液）で、おそらく凝集によりタンパク質が消失することが証明された（図２Ｂ）。ＣＡＰＳは有機緩衝液であり、表面の疎水性断片と相互に影響して凝集を起こす可能性があることに注意を要する。７５０ｍＬのＮａＣｌをＰＢＳに添加すると、Ｄｄの融解温度（Ｔｍ）が上昇するが、これは構造的安定を示す（図２Ｃ）。しかしながら、最も顕著なＴｍ値上昇は硫酸アンモニウムの添加によるもので、約１２℃上昇した（図２Ｃ）。
【００６３】
完了した試験は、上記ベクター粒子が、１５０ｍＭの硫酸アンモニウムの存在下で、透析中、凍結及び融解後、並びに遠心濃縮による乾燥中も結合性を維持することを証明した。凍結乾燥中は、Ｄｄの構造を保つために凍結防止剤が必要である（図３Ａ）。培養細胞中のベクターの寿命を、ＨｅＬａ細胞内で、Ｄｄの添加後の様々な時点で試験した。精製Ｄｄ（４μｇ／１００μＬ、１０．８ｎＭ）を、ＦＢＳを含有しない培養液中で、２４ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞（細胞２×１０４個／ウェル）に添加した。該細胞を培養器内で３７℃で培養した。Ｄｄ添加の３時間後、培養液にＦＢＳを最終濃度１０％になるまで添加した。該細胞を所定の時点で回収し（図３Ｂ）、低張緩衝液中で溶解させた。細胞の半分に相当する試料を変性条件下のポリアクリルアミドゲル中で分析し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、また残りの半分を非変性条件下のアガロースゲル中で分析し、その後、両方について抗Ｄｄ抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析した。
【００６４】
細胞内のＤｄの量は、形質導入後３２時間までは増加した。同時に、Ｄｄの部分的なタンパク質分解が発生し、そのため４日後には、細胞中の基部タンパク質の一部分のみが残った（図３Ｂ、左手のパネル）。ネイティブのアガロースゲルについての分析で、移行から９６時間後、細胞内ベクターの大半はＤｄと五量体基部（Ｐｂ）の間に移動しており、これは、分子の結合性の保持とともに外部のＤｄループが除去されたことを示唆する（図３Ｂ、右手のパネル）。
【００６５】
ヒト血清中でインキュベーション中のＤｄの安定性
マイクロコン（ミリポア社）を用いた限外濾過によって濃縮されたＤｄ試料（１試料あたり５μｇ）を、４℃で２時間、及び３７℃で１５分間又は２時間、ヒト血清（ＳＬ）中でインキュベートした。Ｄｄは、生体内での使用を模した条件で結合性を保持した。すなわち、Ｄｄは、新鮮なヒト血清中で、３７℃で少なくとも２時間安定している（図３Ｃ）。
【００６６】
実施例ＩＩＩ
十二面体の構成要素（五量体基部）からの十二面体再形成
遊離五量体基部（Ｐｂ）の均質な画分は、イオン交換カラムでの精製中に得られた。精製されたｒＰｂを、７５０ｍＭのリン酸アンモニウムを含むｐＨ６．６又はｐＨ７．５のリン酸緩衝液５０ｍＭによって透析し、緩衝液を数回交換した。透析終了後、試料を遠心分離し、上澄み中のオリゴマー状態のタンパク質を、アガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。４℃又は３７℃での４日間の透析中におけるイオン強度が高い条件下で、五量体基部からの十二面体の結合が発生する。低分子量化合物存在下での十二面体の構成要素からの試験管内再形成によって、ウイルス様粒子内に被包された治療用物質を含むベクターの入手が可能である。
【００６７】
得られた結果は、Ｄｄが便宜的に保管及び輸送され、試験管内でその構成要素から再形成され得ることを示唆する。すなわち、この結果は、Ｄｄが多様な治療目的で、多様な構成において、また多様な環境条件下で使用できることを証明する。
【００６８】
実施例ＩＶ
ブレオマイシンのベクターとなるアデノウイルス十二面体粒子の調製方法
カルボジイミド（ＥＤＣ）と琥珀酸エステル（ｓ−ＮＨＳ）（ピアース社、米国イリノイ州ロックフォード）を用いた２段階の結合手順によって、ブレオマイシンＡ５塩酸塩（杭州シャンユエン社、中国）をすでに精製されていたｒＤｄ粒子に化学的に結合させた。濃度２７ｎＭの十二面体を、０．３１ｍＭのＥＤＣと５ｍＭのｓ−ＮＨＳの存在下で、０．５ＭのＮａＣｌを含む０．１Ｍ、ｐＨ６．０のＭＥＳ緩衝液中で活性化した。ブレオマイシン（２３ｍＭ）との結合は、室温で２時間、静かに撹拌しながら実施された。最終濃度１０ｍＭとなるようにヒドロキシルアミンを添加することによって、反応を終了させた。使用した試薬と非結合ブレオマイシンは、２４時間の透析中に、１５０ｍＭのＮａＣｌと５％のグリセロールを含む２０ｍＭ、ｐＨ７．５のトリス緩衝液を４回交換することにより排除された。
【００６９】
Ｄｄに結合されたブレオマイシンの量は、質量分析法を用いて決定された。分析は、パーセプティブバイオシステムズ社の質量分析機（マサチューセッツ州フラミンガム）を用い、波長３３７ｎｍのパルス窒素レーザーによって実施された。試料はＺｉｐＴｉｐＣ４（ミリポア社）で濃縮され、製造者の指示に従って０．３％のトリフルオロ酢酸を含む含水アセトニトリル８０％混合物（容積比）として調製された飽和シナピン酸溶液で抽出された。溶離剤混合物は、鋼製プレート上へ移し、空気乾燥させた。装置は分子量６６４３１Ｄａのウシアルブミン（バイオシステム社）を用いて校正した。
【００７０】
Ｄｄ−ＢＬＭ複合体において、ペントン基部タンパク質モノマー（Ｄｄはそれを含む）は０〜２個のＢＬＭ粒子（ＢＬＭの分子量は１４００）を担持し、うち有意に多数のモノマーは１個のＢＬＭ分子を含む（図４Ａ）。データによれば、６０個の基部タンパク質モノマーを含む１個のＤｄ分子は平均して６０個のＢＬＭ残基を担持する。動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いた試験では、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体の融解温度は当初の十二面体に非常に近いことが証明されており、このことは、結合反応が上記ベクターの生物理学的性質を変えないことを示す。研究結果は、１個のＤｄ粒子は治療用物質の複数のコピーを提供することができるというベクターの多価性をはっきりと示す。
【００７１】
実施例Ｖ
ブレオマイシンを伴うアデノウイルス十二面体粒子の生物学的検定法
ＨｅＬａヒト癌細胞を、本発明によって調製したＤｄ−ＢＬＭ複合体によって処理した。遊離ブレオマイシンと同様、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体は癌細胞の増殖を抑制に導いた。最も重要なのは、Ｄｄによって送達される細胞傷害作用を生じるＢＬＭの濃度は遊離ブレオマイシンの場合より１００倍低かったことである。
【００７２】
Ｄｄ−ＢＬＭの細胞傷害活性は、ＭＴＴ試験（ＭＴＴ、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−ｙｌ）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を用いて試験管内で定量的に評価した。該試験においては、生存細胞の活性により、可溶性で黄色のテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）を還元して青色のホルマザン結晶を生成させることを用いる。９６ウェルプレート（細胞１０４個／ウェル）で、ＨｅＬａ細胞を、ａ）様々な量のＤｄ（１μｇは２．７ｎＭに相当）、ｂ）Ｄｄ−ＢＬＭ（１μｇは２．７ｎＭのＤｄと０．０８μＭのＢＬＭに相当）、又はｃ）遊離ブレオマイシン（それぞれ０．１３μＭ、１μＭ及び８μＭ）を含むＥＭＥＭ培養液１００μＬ中で、３７℃で３時間培養した。３時間後、ウシ胎仔血清を最終濃度１０％となるように添加した。３７℃で様々な培養時間の経過後、培養液を取り除き、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（シグマ社）を含むＥＭＥＭ１００μＬを添加した。上記プレートを、製造元の指示に従って培養した。そして、ＨＴｉリーダー（バイオテック社、米国バーモント州ウィノースキー）を用いて吸光度測定を実施した。生存細胞数は、手順に従って計算した（Ｍｏｓｍａｎｎ，１９８３）。
【００７３】
試験管内で培養中の６０％超のヒト細胞は、Ｄｄ−ＢＬＭ処理後に破壊された。使用した試料中に含まれる抗生物質の量と同等用量で遊離ブレオマイシンを投与した場合には、細胞傷害効果は観察されなかった。ＢＬＭを０．０８μＭ含むＤｄ−ＢＬＭ試料は細胞傷害性が強いことが証明されたが、同量の遊離ＢＬＭを添加した場合には細胞傷害効果はなかった（図４）。８μＭの遊離ＢＬＭ溶液（結果は表示せず）を添加した場合、すなわちＤｄによって送達されるブレオマイシンの場合より１００倍多い場合に限り、同様の細胞死亡率が観察された。
【００７４】
続いて、Ｄｄ−ＢＬＭ処理を受けたヒト癌細胞の顕微鏡試験を行った。共焦点顕微鏡用の標本を調製するために、ＨｅＬａ細胞（５×１０４）を特別なカバーガラスの上においた。翌日、様々な量の純粋Ｄｄ、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体、又は遊離ブレオマイシンを細胞に添加した。そして、すべての試料を無血清ＥＭＥＭ培養液中に懸濁した。３時間の培養後、ウシ胎仔血清を最終濃度１０％になるまで添加した。培養終了後、細胞を低温のＰＢＳで洗浄し、その後、低温の１００％メチルアルコール中で１０分間固定と透過処理をした。このようにして得られた標本を、抗体（Ａｂ）を加えて１時間インキュベートした。ここで用いた抗体は、Ｄｄを認識するポリクローナルＡｂ、チューブリンを認識するモノクローナルＡｂ（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）及び抗γ−Ｈ２ＡＸポリクローナルＡｂ（カルビオケム社、ドイツ、ダルムシュタット）である。ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した後、テキサスレッド（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社、米国ペンシルバニア州ウエストグローブ）又はＦＩＴＣ（緑色）（サンタクルーズバイオテクノロジー社、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）といった色素を結合させた二次抗体を添加した。細胞核のラベリングにはＤＡＰＩ溶液を使用した（アプリケム社）。
【００７５】
共焦点顕微鏡観察に使用できるブレオマイシンを認識する抗体は存在しないため、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体の検出に抗ＤｄのＡｂを使用した。Ｄｄ、及びＢＬＭと共有結合されたＤｄ試料も、試験管内で培養中の１００％の細胞内に侵入することがわかった。これは、試料の添加から１時間後に観察される、細胞質内の抗Ｄｄ抗体からの赤色のシグナルによって証明される（図５Ａ、１時間、Ｄｄ及びＤｄ−ＢＬＭ）。遊離Ｄｄの添加から５０時間後に、ベクターの量（細胞質内の視認可能なもののみ）は、短時間培養のものに比して著しく減少した（赤色のシグナル、図５Ａ）が、これはタンパク質分解と細胞からのベクターの排泄を示す。Ｄｄ−ＢＬＭ複合体は細胞肥大の発生を誘起し、それは複合体の添加から３０時間後に視認できるが、後日現れることも多い。Ｄｄ−ＢＬＭの添加から５０時間後に、Ｄｄのシグナルは細胞全体に現れるが、これは核膜の完全性が破壊されたことを示す（細胞死の症候の１つ）。
【００７６】
ＢＬＭの細胞傷害活性は、ＤＮＡの損傷に由来することが知られている（Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。より高等な真核細胞におけるＨ２ＡＸヒストンのＣ末端領域のリン酸化は、二重鎖ＤＮＡの破壊に応答したクロマチン修飾の１つである（Ｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。リン酸化されたヒストンの形態を認識する特異的な抗体（抗γ−Ｈ２ＡＸ、カルビオケム社、ドイツ、ダルムシュタット）をＤＮＡの損傷を検知するためのプローブとして使用した。対照のＨｅＬａ細胞内及び純粋十二面体で処理した細胞内では、抗γ−Ｈ２ＡＸ抗体からの赤色のシグナルがないことから、ＤＮＡの損傷は認められなかった（図５Ｂ、ＨｅＬａ及びＤｄの列）。逆に言えば、Ｄｄ−ＢＬＭ複合体は細胞内へ侵入する際に細胞核ＤＮＡを分解するが、それは特異的な抗体からのシグナルの存在で示される。遊離ブレオマイシンの添加は同様の効果を有する（図５Ｂ、ＢＬＭの列）。０．０８μＭのＢＬＭを含有する複合体の作用の効果は、遊離ＢＬＭが８μＭの濃度で引き起こす損傷より強く、従って１００倍強いことになる（図５Ｂ、Ｄｄ−ＢＬＭとＢＬＭの列）。
【００７７】
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９．
【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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