(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分と少なくとも１種の宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）を含有するサンプル混合物から、ＨＣＰ低減抗ＩＬ−１３抗体調製物又はその抗原結合部分調製物を生成する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプル混合物を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させ、前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂を、２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を有する緩衝液、次いで２０ｍＭクエン酸ナトリウム／クエン酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を有する緩衝液、その後に２５ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を有する緩衝液で洗浄して、アフィニティークロマトグラフィーサンプルを捕集する工程と；
（ｂ）前記アフィニティークロマトグラフィーサンプルのｐＨを低下させ、３〜４のｐＨをもつｐＨ低下サンプルを形成する工程と；
（ｃ）前記ｐＨ低下サンプルのｐＨを、４．５〜８．５のｐＨに調整し、前記ｐＨ調整サンプルをイオン交換材料と接触させ、イオン交換サンプルを捕集する工程と；
（ｄ）前記イオン交換サンプルを疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料と接触させ、前記ＨＣＰ低減抗体調製物又はその抗原結合部分調製物を含有するＨＩＣサンプルを捕集する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）のｐＨ低下が、適切な酸を前記サンプル混合物と混合することにより実施され、前記適切な酸が、クエン酸、酢酸、カプリル酸及びリン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテインＡ樹脂が、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）プロテインＡ樹脂又はＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）プロテインＡ樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イオン交換材料が、アニオン交換材料又はカチオン交換材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換材料が、カチオン交換材料である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン交換材料が、ＳＯ３−、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）及びスルホン酸（Ｓ）からなる群から選択される置換基を有するカチオン交換樹脂である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＨ低下サンプルのｐＨが、工程（ｃ）において、ｐＨ４．５〜６．５に調整される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記カチオン交換樹脂が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記イオン交換材料が、アニオン交換材料である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記アニオン交換材料が、Ｑセファロース、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）及び第四級アミン（Ｑ）基からなる群から選択される置換基を有するアニオン交換樹脂である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アニオン交換材料が、Ｑセファロースである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アニオン交換材料が、第四級アミンメンブレン（Ｑメンブレン）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｐＨ低下サンプルのｐＨが、工程（ｃ）においてｐＨ８に調整される、請求項９から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記イオン交換工程が、第１イオン交換工程と第２イオン交換工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＩＣ材料が置換されたマトリックスを有し、前記置換基が１種以上の疎水基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種以上の疎水基が、アルキル基、アリール基及びその組合せからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換されたマトリックスが、フェニル基で置換されたアガロースである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記置換されたマトリックスが、フェニルセファロース、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）高性能、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤプロピル、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤフェニル、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）メチル、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ｔ−ブチル担体、ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（登録商標）、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）エーテル、フェニル又はブチルからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記フェニルセファロースが、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ファストフロー又はＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）高性能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
更に濾過工程を含み、前記ＨＩＣサンプルを濾過に供してウイルス粒子を除去し、バッファー交換を容易にする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分が、ヒト化抗体、キメラ抗体又は多価抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分が、ヒト化抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記調製物が、ＨＣＰを実質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
更に深層濾過工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）において、前記アフィニティークロマトグラフィーサンプルのｐＨをｐＨ３．５に低下させ、
工程（ｃ）において、前記ｐＨ低下サンプルのｐＨをｐＨ８に調整し、前記イオン交換材料がＱメンブレンであり、
工程（ｄ）において、前記ＨＩＣ材料がフェニル基で置換されたアガロースである、
請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｂ）において、前記アフィニティークロマトグラフィーサンプルのｐＨを、リン酸を用いてｐＨ３．５に低下させる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトＩＬ−１３は、活性化Ｔ細胞からクローニングされた１７ｋＤａ糖蛋白質であり、Ｔｈ２系統の活性化Ｔ細胞、Ｔｈ０及びＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに数種の非Ｔ細胞集団（例えば肥満細胞）により産生される（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，１９９４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，１５，１９−２６）。ＩＬ−１３はヒトＢ細胞においてＩｇＥへの免疫グロブリンアイソタイプスイッチを促進し（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ａｖｅｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０  ３７３０−４）、ヒト及びマウスの両者において炎症性サイトカイン産生を抑制する（ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１，６３７０−８１；Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１，７１５１−６０）。ＩＬ−１３はその細胞表面受容体であるＩＬ−１３Ｒα１及びＩＬ−１３Ｒα２と結合する。ＩＬ−１３Ｒα１は低親和性（ＫＤ〜１０ｎＭ）でＩＬ−１３と相互作用した後、ＩＬ−４Ｒを動員し、高親和性（ＫＤ〜０．４ｎＭ）シグナル伝達ヘテロ二量体受容体複合体を形成する（Ａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１，２９２６５−７０；Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３，４９７−５０１）。ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒα１複合体はＢ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞及び気道平滑筋細胞等の多数の細胞種で発現される（Ｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８，４２８６−９８；Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０，１１０３−１０；Ａｋａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１３，７５−８４）。ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒ受容体複合体のライゲーションの結果、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ６）及びインスリン受容体基質−２（ＩＲＳ−２）経路を含む各種シグナル伝達経路が活性化される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ，８６４２１８−２７；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７，３２２０−２）。ＩＬ−１３Ｒα２鎖自体はＩＬ−１３に対する親和性が高く（ＫＤ〜０．２５〜０．４ｎＭ）、ＩＬ−１３との結合を負に制御するデコイ受容体として機能する（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１，２３１７−２４）と同時に、マクロファージと恐らく他の細胞種でＡＰ−１経路を介してＴＧＦ−β合成及び線維化を誘導するシグナル伝達受容体としても機能する（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２  ９９−１０６）。
【０００２】
喘息の前臨床動物モデルで実施された数件の試験によると、ＩＬ−１３は、喘息において重要な役割を果たすことが分かっている。これらのデータによると、ＩＬ−１３ノックアウトマウスは、喘息にかかりにくいことや、喘息表現型は、各種マウスモデルでＩＬ−１３アンタゴニスト（可溶性ＩＬ−１３受容体、抗ＩＬ−１３ｍＡｂ等）により阻害されることが立証されている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ａｎｄ  Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅ，２００３，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｕｌｍ  Ｍｅｄ，９  ２１−７；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ，２０２  １７５−９０）。組換えＩＬ−１３をマウスとモルモットの肺に薬理投与すると、気道粘液過剰分泌、好酸球増加及び気道過敏反応（「ＡＨＲ」；Ｇｒｕｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２６１−３；Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２５８−６１；Ｋｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６７，５０−６；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８４，Ｌ２６０−９；Ｖａｒｇａｆｔｉｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８，４１０−９）を誘発することは複数の研究で実証されている。ＩＬ−１３のこれらの作用はＩＬ−１３を構成的又は誘導的に発現させたトランスジェニックマウスシステムで再現される（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３，７７９−８８；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６４，Ｓ６７−７０；Ｌａｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１０４６３−７４）。ＩＬ−１３の慢性トランスジェニック過剰発現は、上皮下線維化及び気腫も誘発する。ＩＬ−１３（及びＩＬ−４）シグナル伝達分子ＳＴＡＴ６を欠損するマウスはアレルゲンにより誘発されるＡＨＲ及び粘液過剰産生を発現することができない（Ｋｕｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，８，８８５−９）。可溶性ＩＬ−１３受容体融合蛋白質（ｓＩＬ−１３Ｒα２Ｆｃ）を使用した試験によると、このサイトカインはアレルゲンであるオボアルブミン（ＯＶＡ）により実験的に誘発した気道疾患において中枢的役割を果たすことが判明した（Ｇｒｕｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２６１−３；Ｗｉｌｉｓ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２５８−６１；Ｔａｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９，６４８２−９）。抗ＩＬ−１３治療が有効であることもマウス喘息の慢性モデルで実証された。粘液過剰分泌及びＡＨＲの特徴を示すことに加え、慢性喘息のこのモデルは急性度の高いモデルには認められないヒト疾患の数種の特徴を示す。これらの特徴としては、上皮細胞間スペースに位置する肺組織の好酸球増加と、コラーゲン沈着の増加により確認される平滑筋線維化が挙げられる。慢性喘息モデルはＯＶＡ感作マウスに週１回ずつ合計４週間ＯＶＡを反復エアゾール攻撃することにより誘導される。ＯＶＡ攻撃の最後の２週間に抗ＩＬ−１３抗体を投与する（３６日目から投与して５３日目の試験日に効力計測値を測定する）と、ＡＨＲ、肺炎症、杯細胞異常増殖、粘液過剰分泌及び気道線維化を有意に阻害した（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，３１３，８−１５）。喘息患者の肺で高濃度のＩＬ−１３  ｍＲＮＡ及び蛋白質が検出されており、疾患の重篤度に相関することから、ＩＬ−１３はヒト喘息の病因に関与していると考えられている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，２６８８−９４）。更に、高濃度ＩＬ−１３に繋がるヒトＩＬ−３遺伝子多型が同定され、喘息とアトピーに関係があるとされ（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，９，５４９−５９；Ｈｏｅｒａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ，４，３７−４２；Ｖｅｒｃｅｌｌｉ，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２，３８９−９３；Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１２，７３５−９；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１４，５５３−６０；Ｖｌａｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１５，７４７−５４）、喘息患者の肺で高濃度のＩＬ−１３が検出されている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，２６８８−９４；Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０９，９８０−７；Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１４，１１０６−９）。血漿ＩＬ−１３濃度の上昇に繋がるＩＬ−１３遺伝子の多型を示す個体はアトピーと喘息の危険が高いことから、ＩＬ−１３と喘息の遺伝的連鎖も立証されている（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，２０００，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ，１，１９−２３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，１９９４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，１５，１９−２６
【非特許文献２】Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ａｖｅｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０  ３７３０−４
【非特許文献３】ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１，６３７０−８１
【非特許文献４】Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１，７１５１−６０
【非特許文献５】Ａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１，２９２６５−７０
【非特許文献６】Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９３，４９７−５０１
【非特許文献７】Ｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８，４２８６−９８
【非特許文献８】Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０，１１０３−１０
【非特許文献９】Ａｋａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，１３，７５−８４
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｌｏｏｄ，８６４２１８−２７
【非特許文献１１】Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５７，３２２０−２
【非特許文献１２】Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６１，２３１７−２４
【非特許文献１３】Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２  ９９−１０６
【非特許文献１４】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ａｎｄ  Ｃｈｉａｒａｍｏｎｔｅ，２００３，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｕｌｍ  Ｍｅｄ，９  ２１−７
【非特許文献１５】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ，２０２  １７５−９０
【非特許文献１６】Ｇｒｕｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２６１−３
【非特許文献１７】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２５８−６１
【非特許文献１８】Ｋｉｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６７，５０−６
【非特許文献１９】Ｖａｒｇａｆｔｉｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２８４，Ｌ２６０−９
【非特許文献２０】Ｖａｒｇａｆｔｉｇ  ａｎｄ  Ｓｉｎｇｅｒ，２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８，４１０−９
【非特許文献２１】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３，７７９−８８
【非特許文献２２】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６４，Ｓ６７−７０
【非特許文献２３】Ｌａｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１０４６３−７４
【非特許文献２４】Ｋｕｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，８，８８５−９
【非特許文献２５】Ｔａｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９，６４８２−９
【非特許文献２６】Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，３１３，８−１５
【非特許文献２７】Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５５，２６８８−９４
【非特許文献２８】Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，９，５４９−５９
【非特許文献２９】Ｈｏｅｒａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ，４，３７−４２
【非特許文献３０】Ｖｅｒｃｅｌｌｉ，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２，３８９−９３
【非特許文献３１】Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１２，７３５−９
【非特許文献３２】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１４，５５３−６０
【非特許文献３３】Ｖｌａｄｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１５，７４７−５４
【非特許文献３４】Ａｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１０９，９８０−７
【非特許文献３５】Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１４，１１０６−９
【非特許文献３６】Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，２０００，Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ，１，１９−２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒトＩＬ−１３は、様々なヒトの障害に関与しているため、ＩＬ−１３活性を阻害又は抑制するための治療方法が設計されてきた。特に、ＩＬ−１３活性を阻害するための手段として、ＩＬ−１３と結合してこれを中和する抗体が求められてきた。しかし、医薬用としてのこのような抗体を製造・精製する改良型の方法が当分野で必要とされている。本発明はこの必要に対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある実施形態においては、本発明はＩＬ−１３と結合する精製・単離抗体及び抗体フラグメントと、このような抗体及びフラグメントを含有する医薬組成物に関する。ある実施形態においては、本発明はヒトＩＬ−１３と結合する単離抗体又はその抗原結合部分に関する。本発明の単離抗ＩＬ−１３抗体は臨床環境及び研究・開発で使用することができる。ある実施形態においては、本発明は、図１に示す重鎖及び軽鎖配列を含む抗ＩＬ−１３抗体に関する。
【０００６】
本発明のある実施形態は、抗体が宿主細胞蛋白質（「ＨＣＰ」）と浸出したプロテインＡを実質的に含まないように抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分をサンプルマトリックスから精製する方法に関する。ある態様において、サンプルマトリックス（又は単に「サンプル」）は本発明の抗ＩＬ−１３抗体を産生させるために利用される細胞株を含む。特定の態様において、サンプルはヒト抗ＩＬ−１３抗体を産生させるために利用される細胞株を含む。
【０００７】
ある実施形態において、本発明は、特に細胞及び細胞破片を除去するための一次回収工程を含むＩＬ−１３抗体の精製方法を提供する。前記方法のある実施形態において、一次回収工程は、１以上の遠心又は深層濾過工程を含む。限定するものではないが、例えば、このような遠心工程は、約７０００×ｇ〜約１１，０００×ｇで実施することができる。更に、上記方法のある実施形態は、デリピッド深層濾過工程等の深層濾過工程を含む。
【０００８】
ある実施形態では、一次回収サンプルをアフィニティークロマトグラフィー工程に供する。アフィニティークロマトグラフィー工程は適切なアフィニティークロマトグラフィー担体を含むカラムに一次回収サンプルを供する段階を含む。このようなクロマトグラフィー担体の非限定的な例としては、限定されないが、プロテインＡ樹脂、プロテインＧ樹脂、目的抗体に特異的な抗原を含むアフィニティー担体、及びＦｃ結合蛋白質を含むアフィニティー担体が挙げられる。プロテインＡ樹脂は抗体（ＩｇＧ）のアフィニティー精製・単離に有用である。ある態様では、サンプルをロードする前にプロテインＡカラムを適切な緩衝液で平衡化させる。適切な緩衝液の１例はｐＨ約７．２のトリス／ＮａＣｌバッファーである。平衡化後、サンプルをカラムにロードすることができる。カラムにロードした後、例えば平衡化バッファーを使用してカラムを１回以上洗浄することができる。カラムから溶出させる前に、別の緩衝液を利用する洗浄を含む他の洗浄を使用することができる。その後、適当な溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから溶出させることができる。適切な溶出バッファーの１例はｐＨ約３．５の酢酸／ＮａＣｌバッファーである。当業者に周知の技術を使用して溶出液をモニターすることができる。例えば、ＯＤ２８０の吸光度を追跡することができる。次に、後続処理に備えて目的溶出フラクションを調製することができる。
【０００９】
本発明のある実施形態では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後に低ｐＨ調整工程を行う。このような態様では、推定抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分を含有するプロテインＡ溶出液を約３〜約４のｐＨへのｐＨ調整に供する。ある態様では、ｐＨを約３．５に調整する。特に、低いｐＨはサンプルを汚染している可能性のあるｐＨ感受性ウイルスの低減及び／又は不活性化を促進する。適切な時間後、ｐＨを約４．５〜約６．０（限定されないが、例えば約５．０）に調整し、サンプルを後続精製工程に供する。
【００１０】
ある実施形態では、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー又は低ｐＨ調整工程後にイオン交換工程を実施する。このイオン交換工程は、カチオン交換でもアニオン交換でもよいし、両者の順次併用でもよい。この工程は単一のイオン交換法でもよいし、カチオン交換工程後にアニオン交換工程又はアニオン交換工程後にカチオン交換工程を実施する等の複数のイオン交換工程でもよい。ある態様において、イオン交換工程は１段階法である。別の態様において、イオン交換工程は２段階イオン交換法である。適切なカチオン交換カラムは固定相にアニオン基を含むカラムである。このようなカラムの１例はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３−である。このイオン交換捕集液クロマトグラフィー工程はサンプルからの抗体の単離を容易にする。適切なアニオン交換カラム固定相にカチオン基を含むカラムである。このようなカラムの１例はＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムである。別の例はＰａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑメンブレンカートリッジである。１以上のイオン交換工程は宿主細胞蛋白質及びＤＮＡや、適用可能な場合には、アフィニティーマトリックス蛋白質等の不純物を低減することにより更に抗体を単離する。このアニオン交換法は目的抗体がアニオン交換樹脂（ないし固相）と相互作用又は結合しないフロースルーモードのクロマトグラフィーである。しかし、多くの不純物はアニオン交換樹脂と相互作用し、結合する。特定の態様において、イオン交換工程はアニオン交換クロマトグラフィーである。
【００１１】
サンプル緩衝液のｐＨ及びイオン強度を調整することにより、アフィニティークロマトグラフィー溶出液をイオン交換クロマトグラフィーに備えて調製する。例えば、アフィニティー溶出液を１Ｍトリスバッファーで約４．５〜約８．５のｐＨに調整することができる。サンプル（アフィニティー溶出液）をイオン交換カラムにロードした後、適切な緩衝液を使用してカラムを平衡化することができる。適切な緩衝液の１例はｐＨ約４．５〜約８のトリス／ＮａＣｌバッファーである。平衡化後、カラムにアフィニティー溶出液をロードすることができる。ロード後、カラムを適切な緩衝液で１回以上洗浄することができる。適切な緩衝液の１例は平衡化バッファー自体である。例えば吸光度（ＯＤ２８０）が約０．２ＡＵよりも上昇すると、フロースルー捕集を開始することができる。
【００１２】
ある実施形態では、一次回収後又はアフィニティークロマトグラフィー工程の不在下に第１及び第２イオン交換工程を実施する。このような態様の所定のものでは、第１イオン交換工程の前、２回のイオン交換工程の間、又はその両方にイオン交換サンプルを中間濾過工程に供する。ある態様において、この濾過工程は捕集液限外濾過／透析濾過（「ＵＦ／ＤＦ」）を含む。特に、このような濾過は抗ＩＬ−１３抗体及びその抗原結合部分の濃縮と緩衝液交換を容易にする。
【００１３】
本発明のある実施形態は、１以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）工程を含む方法を提供する。適切なＨＩＣカラムは固定相に疎水基を含むカラムである。このようなカラムの非限定的な１例はＰｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラムである。ある状況においては、抗ＩＬ−１３抗体は単離／精製工程中に凝集物を形成する。１以上のＨＩＣ工程を含むことにより、このような凝集物を低減又は排除し易くする。ＨＩＣは更に不純物の除去にも役立つ。ある実施形態においては、ＨＩＣ工程は抗ＩＬ−１３抗体（又はその凝集物）と疎水性カラムの相互作用を促進するために高塩濃度緩衝液を利用する。その後、低濃度塩を使用して抗ＩＬ−１３抗体を溶出させることができる。
【００１４】
ある実施形態では、限定されないが、Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（登録商標）フィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，Ｎ．Ｙ．）等のウイルス除去フィルターを使用してＨＩＣ溶出液を濾過する。このような態様ではＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）；Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（登録商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．）；及びＰｌａｎｏｖａ（登録商標）フィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｈａｒｍａ，Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．）等の他のフィルターも使用することができる。
【００１５】
ある実施形態においては、本発明は単離抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分と許容可能な担体を含有する１種以上の医薬組成物に関する。ある態様において、組成物は抗ＩＬ−１３抗体以外に、更に１種以上の抗体又はその抗原結合部分を含有する。別の態様において、組成物は更に１種以上の薬剤を含有する。
【００１６】
得られたサンプル生成物中の目的抗体の純度は、当業者に周知の方法（例えばサイズ排除クロマトグラフィー、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）Ａ  ＨＰＬＣアッセイ、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ、プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析）を使用して分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗ＩＬ−１３抗体の非限定的な１例の重鎖及び軽鎖可変領域配列を示す。
【図２−１】設定点、インプロセス制御試験及び作用限界を含む典型的細胞培養工程流れ図を示す。
【図２−２】設定点、インプロセス制御試験及び作用限界を含む典型的細胞培養工程流れ図を示す。
【図３】代替細胞培養工程フローストラテジーの比較を示す。
【図４】設定点、インプロセス制御試験及び作用限界を含む一次回収・捕集クロマトグラフィー工程流れ図を示す。
【図５】代替一次回収・捕集フローストラテジーの比較を示す。
【図６−１】設定点、インプロセス制御試験及び作用限界を含む精密精製工程流れ図を示す。
【図６−２】設定点、インプロセス制御試験及び作用限界を含む精密精製工程流れ図を示す。
【図７】代替精密精製フローストラテジーの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＩＬ−１３と結合する抗体に関する。ある態様において、本発明は、ヒトＩＬ−１３と結合する単離抗体又はその抗原結合部分に関する。本発明の単離抗ＩＬ−１３抗体は、臨床環境及び研究・開発で使用することができる。本発明は、抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分の精製方法にも関する。本発明の関連で精製することができる適切な抗ＩＬ−１３抗体はその開示内容全体を本願に援用するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１９６６０号に開示されており、その後、ＡＢＴ−３０８として同定された抗体を含む。典型的な抗ＩＬ−１３抗体重鎖及び軽鎖配列を図１に示す。本発明は、本願に記載する抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分を含有する医薬組成物にも関する。
【００１９】
限定するものではないが、分かり易くするために、以下の詳細な説明は次の項目に分けて説明する。
１．定義；
２．抗体作製；
３．抗体産生；
４．抗体精製；
５．サンプル純度の検定方法；
６．付加的修飾；
７．医薬組成物；及び
８．抗体使用。
【００２０】
１．定義；
本発明を理解し易くするために、先ず所定の用語を定義する。
【００２１】
「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合により相互に結合された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子を包含する。各重鎖は、重鎖可変領域（本願ではＨＣＶＲ又はＶＨと略称する）と重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインから構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本願ではＬＣＶＲ又はＶＬと略称する）と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメインＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は更に相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存度の高い領域に区分される。各ＶＨ及びＶＬはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。
【００２２】
抗体の「抗原結合部分」（又は抗体部分」）なる用語は、抗原（例えばｈＩＬ−１３）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１個以上のフラグメントを包含する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントにより実施可能であることが分かっている。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される１価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合された２個のＦａｂフラグメントから構成される２価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨ１ドメインから構成されるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインとＶＨドメインから構成されるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから構成されるｄＡｂフラグメント（その教示内容全体を本願に援用するＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。更に、Ｆｖフラグメントの２個のドメインＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して１価分子を形成する１本の蛋白鎖（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と言う；例えばその教示内容全体を本願に援用するＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）としての作製を可能にする合成リンカーにより組換え法を使用して結合することができる。このような１本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。ダイアボディ等の他の形態の１本鎖抗体も含む。ダイアボディは、ＶＨ領域とＶＬ領域が１本のポリペプチド鎖で発現される２価の二重特異性抗体であるが、非常に短いリンカーを使用するため、同一鎖の２領域間で対合することができず、これらの領域は別の鎖の相補性領域と対合し、２個の抗原結合部位を形成する（例えばその教示内容全体を本願に援用するＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。更に、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と１種以上の他の蛋白質又はペプチドの共有的又は非共有的結合により形成される大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としては、ストレプトアビジンコア領域を使用した四量体ｓｃＦｖ分子の作製（その教示内容全体を本願に援用するＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）や、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用した２価ビオチン化ｓｃＦｖ分子の作製（その教示内容全体を本願に援用するＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が挙げられる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体���分は、夫々全長抗体のパパイン又はペプシン消化等の慣用技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は本願に記載するように、標準組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。ある態様において、抗原結合部分は競合領域又は競合領域対である。
【００２３】
本願で使用する「ヒトインターロイキン１３」（本願ではｈＩＬ−１３又はＩＬ−１３と略称する）なる用語は、活性化Ｔ細胞（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，１９９４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５  １９−２６）からクローニングされ、Ｔｈ２系統の活性化Ｔ細胞により産生される１７ｋＤａ糖蛋白質を意味する。Ｔｈ０及びＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、並びに数種の非Ｔ細胞集団（例えば肥満細胞）もＩＬ−１３を産生する（Ｚｕｒａｗｓｋｉ  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，１９９４  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５  １９−２６）。ＩＬ−１３の機能としてとしては、ヒトＢ細胞におけるＩｇＥへの免疫グロブリンアイソタイプスイッチの促進（Ｐｕｎｎｏｎｅｎ，Ａｖｅｒｓａ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９０  ３７３０−４）と、ヒト及びマウスの両者における炎症性サイトカイン産生の抑制（ｄｅ  Ｗａａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１  ６３７０−８１；Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１  ７１５１−６０）が挙げられる。ＩＬ−１３はＩＬ−１３Ｒα１及びＩＬ−１３Ｒα２と呼ばれる細胞表面受容体と結合する。ＩＬ−１３Ｒα１受容体は低親和性（ＫＤ〜１０ｎＭ）でＩＬ−１３と相互作用した後、ＩＬ−４Ｒを動員し、高親和性（ＫＤ〜０．４ｎＭ）シグナル伝達ヘテロ二量体受容体複合体を形成する（Ａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１  ２９２６５−７０；Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３  ４９７−５０１）。ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒα１複合体はＢ細胞、単球／マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、線維芽細胞、内皮細胞、気道上皮細胞及び気道平滑筋細胞等の多数の細胞種で発現される（Ｇｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９８  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８  ４２８６−９８；Ｍｕｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０  １１０３−１０；Ａｋａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １３  ７５−８４）。ＩＬ−１３Ｒα１／ＩＬ−４Ｒ受容体複合体のライゲーションの結果、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ６）及びインスリン受容体基質−２（ＩＲＳ−２）経路を含む各種シグナル伝達経路が活性化される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５  Ｂｌｏｏｄ  ８６４２１８−２７；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７  ３２２０−２）。ＩＬ−１３Ｒα２鎖自体はＩＬ−１３に対する親和性が高く（ＫＤ〜０．２５〜０．４ｎＭ）、ＩＬ−１３との結合を負に制御するデコイ受容体として機能する（Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｗｈｉｔｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．１  ９８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１  ２３１７−２４）と同時に、マクロファージと恐らく他の細胞種でＡＰ−１経路を介してＴＧＦ−ｂ合成及び線維化を誘導するシグナル伝達受容体としても機能する（Ｆｉｃｈｔｎｅｒ−Ｆｅｉｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２  ９９−１０６）。ＩＬ−１３をコードする核酸はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００２１８８として入手可能であり、ポリ���プチド配列はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００２１７９として入手可能である。ヒトＩＬ−１３なる用語は、標準組換え発現法により作製することができる組換えヒトＩＬ−１３（ｒｈ  ＩＬ−１３）を包含するものとする。
【００２４】
「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔ定義」及び「Ｋａｂａｔラベリング」なる用語は、本願では同義に使用する。これらの用語は、当分野で認識されている通り、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも可変性（即ち超可変性）のアミノ酸残基のナンバリングシステムを意味する（その教示内容全体を本願に援用するＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．１９０：３８２−３９１及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。重鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１がアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２がアミノ酸５０〜６５位、ＣＤＲ３がアミノ酸９５〜１０２位に位置する。軽鎖可変領域では、超可変領域はＣＤＲ１がアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２がアミノ酸５０〜５６位、ＣＤＲ３がアミノ酸８９〜９７位に位置する。
【００２５】
「ヒト抗体」なる用語は、Ｋａｂａｔらに記載されているように、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域と定常領域をもつ抗体を包含する（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えばランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によりインビトロ又は体細胞突然変異によりインビボで導入される突然変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含むことができる。突然変異は、「選択的突然変異誘発アプローチ」を使用して導入することができる。ヒト抗体は少なくとも１カ所をアミノ酸残基（例えばヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされない活性強化アミノ酸残基）で置換することができる。ヒト抗体は２０カ所までをヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に含まれないアミノ酸残基で置換することができる。他の態様では、１０カ所まで、５カ所まで、３カ所まで又は２カ所までが置換されている。１態様において、これらの置換はＣＤＲ領域内に存在する。他方、本願で使用する「ヒト抗体」なる用語は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列に移植した抗体を包含するものではない。
【００２６】
「選択的突然変異誘発アプローチ」なる用語は、少なくとも１カ所の適切な選択的突然変異誘発位置、超変異位置及び／又は接触位置のＣＤＲアミノ酸を選択し、個々に突然変異させることにより、抗体の活性を改善する方法を包含する。「選択的に突然変異された」ヒト抗体とは、選択的突然変異誘発アプローチを使用して選択された位置に突然変異を含む抗体である。別の態様において、選択的突然変異誘発アプローチは抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（以下、夫々Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と言う）、又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３（以下、夫々Ｌ１、Ｌ２及びＬ３と言う）における選択された個々のアミノ酸残基を優先的に突然変異させる方法を提供するものとする。アミノ酸残基は、選択的突然変異誘発位置、接触位置又は超変異位置から選択することができる。個々のアミノ酸は、軽鎖又は重鎖可変領域におけるそれらの位置に基づいて選択される。当然のことながら、超変異位置は接触位置でもよい。ある態様において、選択的突然変異誘発アプローチは「標的アプローチ」である。「標的アプローチ」なる用語は、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３における選択された個々のアミノ酸残基を標的として突然変異させる方法（例えば「グループ標的アプローチ」又は「ＣＤＲ標的アプローチ」）を包含するものとする。「グループ標的アプローチ」では、標的の優先順にグループＩ（Ｌ３及びＨ３を含む）、ＩＩ（Ｈ２及びＬ１を含む）及びＩＩＩ（Ｌ２及びＨ１を含む）を含む選択的突然変異の標的として特定グループにおける個々のアミノ酸残基を選択する。「ＣＤＲ標的アプローチ」では、Ｈ３、Ｌ３、Ｈ２、Ｌ１、Ｈ１及びＬ２の標的の優先順で特定ＣＤＲにおける個々のアミノ酸残基を選択的突然変異の標的として選択する。選択されたアミノ酸残基を例えば少なくとも２個の他のアミノ酸残基に突然変異させ、抗体の活性に及ぼす突然変異の影響を判定する。活性は、抗体の結合特異性／親和性、及び／又は抗体の中和力価の変化として測定される。当然のことながら、選択的突然変異誘発アプローチは、ファージディスプレイ、ヒトＩｇＧ生殖細胞系列遺伝子をもつトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離されたヒト抗体を含む任意起源に由来する任意抗体の最適化に使用することができる。選択的突然変異誘発アプローチは、ファージディスプレイ技術を使用してそれ以上最適化することができない抗体で使用することができる。当然のことながら、ファージディスプレイ、ヒトＩｇＧ生殖細胞系列遺伝子をもつトランスジェニック動物、ヒトＢ細胞から単離されたヒト抗体を含む任意起源に由来する抗体を選択的突然変異誘発アプローチの前又は後に復帰突然変異に供することができる。
【００２７】
「組換えヒト抗体」なる用語は、組換え手段により作製、発現、創製又は単離したヒト抗体を包含し、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離した抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離した抗体（例えばその教示内容全体を本願に援用するＴａｙｌｏｒ，Ｌ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５参照）、あるいはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライスする操作を含む他の任意手段により作製、発現、創製又は単離した抗体が挙げられる。このような組換えヒト抗体は、可変領域と定常領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）。しかし、ある実施形態では、このような組換えヒト抗体をインビトロ突然変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列を導入したトランスジェニック動物を使用する場合には、インビボ体細胞突然変異誘発）に供するため、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列に由来し、これらの配列に近縁であるが、天然にヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで存在していなくてもよい配列である。他方、ある実施形態において、このような組換え抗体は選択的突然変異誘発アプローチ又は復帰突然変異又は両者の産物である。
【００２８】
「単離抗体」とは、異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を包含する（例えばｈＩＬ−１３と特異的に結合する単離抗体はｈＩＬ−１３以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ｈＩＬ−１３と特異的に結合する単離抗体は他の種に由来するＩＬ−１３分子と結合する場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００２９】
「中和抗体」（又は「ｈＩＬ−１３活性を中和した抗体」）とは、ｈＩＬ−１３と結合する結果としてｈＩＬ−１３の生物活性を阻害する抗体を包含する。ｈＩＬ−１３の生物活性のこの阻害はＩＬ−１３生物活性の１種以上の指標を測定することにより判定することができる。ｈＩＬ−１３生物活性のこれらの指標は、当分野で公知の数種の標準インビトロ又はインビボアッセイの１種以上により判定することができる。
【００３０】
「活性」なる用語は、抗原に対する抗体（例えばＩＬ−１３抗原と結合する抗ｈＩＬ−１３抗体）の結合特異性／親和性及び／又は抗体（例えばｈＩＬ−１３と結合してｈＩＬ−１３の生物活性を阻害する抗ｈＩＬ−１３抗体）の中和力価等の活性を包含する。
【００３１】
「表面プラズモン共鳴」なる用語は、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ及びＰｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用してバイオセンサーマトリックス内の蛋白質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を意味する。更に詳細については、その教示内容全体を本願に援用するＪｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：６２０−６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｌ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５−１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８−２７７参照。
【００３２】
本願で使用する「Ｋｏｆｆ」なる用語は、抗体／抗原複合体から抗体が解離する解離速度定数を意味する。
【００３３】
本願で使用する「Ｋｄ」なる用語は、特定抗体−抗原相互作用の解離定数を意味する。
【００３４】
「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子を包含する。核酸分子は１本鎖でも２本鎖でもよいが、ある態様では２本鎖ＤＮＡである。
【００３５】
抗体又は抗体部分（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）（例えばｈＩＬ−１３と結合するもの）をコードする核酸に関して本願で使用する「単離核酸分子」なる用語は、抗体又は抗体部分をコードするヌクレオチド配列がｈＩＬ−１３以外の抗原と結合する抗体又は抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を包含し、前記他の配列は、天然でヒトゲノムＤＮＡにおいて前記核酸のフランキング配列であり得る。従って、例えば、抗ｈＩＬ−１３抗体のＶＨ領域をコードする単離核酸は例えばｈＩＬ−１３以外の抗原と結合する他のＶＨ領域をコードする他の配列を含まない。「単離核酸分子」なる用語は、ＶＨ領域とＶＬ領域がダイアボディの配列以外の他の配列を含まないダイアボディ等の２価の二重特異性抗体をコードする配列も包含するものとする。
【００３６】
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）なる用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を包含する。当然のことながら、このような用語は特定対象細胞のみならず、このような細胞の子孫も意味するものとする。後続世代には、突然変異又は環境影響により所定の変異が生じる場合があるので、このような子孫は実際に親細胞と一致しない場合もあるが、本願で使用する「宿主細胞」の用語の範囲に含まれる。
【００３７】
本願で使用する「改変」なる用語は、抗体又はその抗原結合部分の１個以上のアミノ酸を変異させることを意味する。変異は１以上の位置でアミノ酸を付加、置換又は欠失させることにより生じさせることができる。変異はＰＣＲ突然変異誘発法等の公知技術を使用して生じさせることができる。
【００３８】
本願で使用する「約」なる用語は、指定値の前後約１０〜２０％の範囲を意味する。所定状況では、当業者に自明の通り、指定値の種類により、「約」なる用語は指定値から１０〜２０％を上回る偏差又は下回る偏差を意味する場合もある。
【００３９】
本願で使用する「ウイルス低減／不活性化」なる用語は、特定サンプルにおけるウイルス粒子数の低下（「低減」）と、特定サンプルにおけるウイルス粒子の活性（限定されないが、例えば感染性又は複製能）の低下（「不活性化」）を意味する。このようなウイルス粒子数及び／又は活性の低下は、約１％〜約９９％のオーダーとすることができ、例えば約２０％〜約９９％、例えば約３０％〜約９９％、例えば約４０％〜約９９％、例えば約５０％〜約９９％、例えば約６０％〜約９９％、例えば約７０％〜約９９％、例えば約８０％〜９９％、例えば約９０％〜約９９％が挙げられる。所定の非限定的な態様において、精製抗体産物中にウイルスが存在する場合、その量はこのウイルスのＩＤ５０（対象集団の５０％に感染するウイルスの量）未満であり、このウイルスのＩＤ５０の最大で１０分の１、又はこのウイルスのＩＤ５０の最大で１００分の１、又はこのウイルスのＩＤ５０の最大で１０００分の１である。
【００４０】
「接触位置」なる用語は、２６種類の公知抗体−抗原構造の１種において抗原と接触するアミノ酸が抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３において占めるアミノ酸位置を包含する。抗体−抗原複合体の２６種類の公知解明構造のいずれかにおけるＣＤＲアミノ酸が抗原と接触するならば、このアミノ酸は接触位置を占めるとみなすことができる。接触位置は非接触位置よりも抗原と接触するアミノ酸により占められる確率が高い。ある態様において、接触位置は２６種類の構造のうちの４種類以上（＞１．５％）で抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である。別の態様において、接触位置は２５種類の構造のうちの９種類以上（＞３２％）で抗原と接触するアミノ酸を含むＣＤＲ位置である。
【００４１】
２．抗体作製
本セクションで使用する「抗体」なる用語は、無傷抗体又はその抗原結合フラグメントを意味する。
【００４２】
本発明の抗体は、各種技術により作製することができ、例えば、動物に目的抗原を免疫した後、従来のモノクローナル抗体法（例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準体細胞ハイブリダイゼーション法）を実施すればよい。原則として、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、他のモノクローナル抗体作製技術（例えばＢリンパ球のウイルス性又は発癌性形質転換）も利用できる。
【００４３】
ハイブリドーマを作製するための動物システムの１例はマウスシステムである。ハイブリドーマ作製は非常によく知られた方法である。免疫プロトコルと融合用免疫脾細胞の単離技術は当分野で公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）と融合手順も公知である。
【００４４】
抗体はヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体とすることができる。本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は上記のように作製した非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。目的の非ヒトハイブリドーマから重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡを取得し、標準分子生物学技術を使用して非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように組換えることができる。例えば、キメラ抗体を創製するためには、当分野で公知の方法を使用してマウス可変領域をヒト定常領域と連結すればよい（例えばＣａｂｉｌｌｙらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を創製するためには、当分野で公知の方法を使用してマウスＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入すればよい（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、並びにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、５，６９３，７６２号及び６，１８０，３７０号参照）。
【００４５】
非限定的な１態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＩＬ−１３に対するこのようなヒトモノクローナル抗体はマウス免疫系ではなくヒト免疫系の部分を導入したトランスジェニックマウス又はトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックマウス及びトランスクロモソミックマウスとしては、本願でＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）、ＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）及びＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）と呼ぶマウスが挙げられる。
【００４６】
更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモソミック動物システムも当分野で入手可能であり、本発明の抗体（例えば抗ＩＬ−１３抗体）を産生させるために使用することができる。例えば、ヒト重鎖トランスクロモソームとヒト軽鎖トランスクロモソームを併有するマウス（「ＴＣ  マウス」と呼ぶ）を使用することができ、このようなマウスはＴｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７２２−７２７に記載されている。更に、ヒト重鎖及び軽鎖トランスクロモソームを導入したウシも当分野で記載されており（例えばＫｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４及びＰＣＴ出願第ＷＯ２００２／０９２８１２号）、本発明の抗ＩＬ−１３抗体を産生させるために使用することができる。
【００４７】
本発明の組換えヒト抗体としては、限定されないが、本願に開示する抗ＩＬ−１３抗体、その抗原結合部分又は抗ＩＬ−１３関連抗体が挙げられ、例えばヒトリンパ球に由来するｍＲＮＡから作製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して作製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えばｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー）のスクリーニングにより単離することができる。このようなライブラリーの作製及びスクリーニング方法は当分野で公知である。このようなライブラリーの作製及びスクリーニング方法は当分野で公知である。ファージディスプレイライブラリーの作製用市販キット（例えばその教示内容全体を本願に援用するＰｈａｒｍａｃｉａ組換えファージ抗体システム，カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＴＭファージディスプレイキット，カタログ番号２４０６１２参照）に加え、抗体ディスプレイライブラリーを作製及びスクリーニングするために特に使用可能な方法及び試薬の例は例えばＬａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号；ＫａｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号；ＤｏｗｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７２７１号；ＷｉｎｔｅｒらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２０７９１号；ＭａｒｋｌａｎｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１５６７９号；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇらのＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０１２８８号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０１０４７号；ＧａｒｒａｒｄらのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されており、その教示内容全体を本願に援用する。
【００４８】
本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫後にヒト抗体応答を生じることができるようにヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを使用して作製することもできる。このようなマウスは例えばＷｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号及び５，６９８，７６７号に記載されている。
【００４９】
ある実施形態においては、本発明の方法は、抗ＩＬ−１３抗体及び抗体部分、抗ＩＬ−１３関連抗体及び抗体部分、並びに抗ＩＬ−１３抗体と同等の性質（例えば低い解離速度と高い中和能でｈＩＬ−１３と高親和性結合する性質）をもつヒト抗体及び抗体部分を包含する。ある態様において、本発明はいずれも表面プラズモン共鳴法により測定した場合に約１×１０−８Ｍ以下のＫｄと１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数でｈＩＬ−１３から解離する単離ヒト抗体又はその抗原結合部分による治療法を提供する。非限定的な特定態様において、本発明に従って精製した抗ＩＬ−１３抗体は生理的条件下でＡＢＴ−３０８とＩＬ−１３の結合を競合的に阻害する。
【００５０】
本発明の更に別の態様では、少なくとも１種の定常領域介在性生物エフェクター機能を非改変抗体に比較して低下させるように抗体の定常領域を改変させるように、抗体又はそのフラグメント（限定されないが、例えば抗ＩＬ−１３抗体又はそのフラグメント）を改変させることができる。Ｆｃ受容体との結合の低下を示すように本発明の抗体を改変させるためには、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）相互作用に必要な特定領域で抗体の免疫グロブリン定常領域セグメントを突然変異させればよい（例えばその教示内容全体を本願に援用するＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１；及びＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７−２６６２参照）。抗体のＦｃＲ結合能の低下はＦｃＲ相互作用に依存する他のエフェクター機能（例えばオプソニン化及び貪食作用及び抗原依存性細胞傷害作用）も低下させる可能性がある。
【００５１】
３．抗体産生
３．１  一般産生ストラテジー
本発明の抗体を発現させるためには、遺伝子を転写及び翻訳制御配列と機能的に連結するように、部分又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを１以上の発現ベクターに挿入する（例えばその教示内容全体を本願に援用する米国特許第６，９１４，１２８号参照）。この関連で「機能的に連結」なる用語はベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写と翻訳を制御するというその所期機能を発揮するように抗体遺伝子をベクターにライゲーションすることを意味する。発現ベクターと発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合可能となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入してもよいが、より典型的には、両方の遺伝子を同一発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は、標準方法（例えば抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位のライゲーション又は制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。抗体又は抗体関連軽鎖及び重鎖配列を挿入する前に、発現ベクターに予め定常領域配列を保持させてもよい。例えば、抗ＩＬ−１３抗体又は抗ＩＬ−１３抗体関連ＶＨ及びＶＬ配列から全長抗体遺伝子を作製する１つのアプローチはＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントと機能的に連結し、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントと機能的に連結するように、夫々重鎖定常領域と軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターにこれらの配列を挿入する方法である。上記に加え、又は上記の代わりに、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を助長するシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドを抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結するように抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（即ち、非免疫グロブリン蛋白質に由来するシグナルペプチド）とすることができる。
【００５２】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する１個以上の調節配列を保持することができる。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御する他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を包含するものとする。このような調節配列は、例えばその教示内容全体を本願に援用するＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。当業者に自明の通り、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望される蛋白質発現レベル等の因子により異なる。哺乳動物宿主細胞発現に適した調節配列としては、哺乳動物細胞で高レベルの蛋白質発現を誘導するウイルスエレメントが挙げられ、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメントとその配列に関する更に詳細な説明については、例えばその教示内容全体を本願に援用するＳｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号、Ｂｅｌｌらの米国特許第４，５１０，２４５号、及びＳｃｈａｆｆｎｅｒらの米国特許第４，９６８，６１５号参照。
【００５３】
抗体鎖遺伝子と調節配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、１個以上の他の配列（例えば宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）及び／又は選択マーカー遺伝子）を保持することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞の選択を容易にする（例えばその教示内容全体を本願に援用するいずれもＡｘｅｌらの米国特許第４，３９９，２１６号、４，６３４，６６５号及び５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的には選択マーカー遺伝子はベクターを導入した宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサート等の薬剤に対する耐性を付与する。適切な選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅下にｄｈｆｒ−宿主細胞で使用）とｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【００５４】
本発明の抗体又は抗体部分は、宿主細胞で免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子を組換え発現させることにより作製することができる。抗体を組換え発現させるためには、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を宿主細胞で発現させ、宿主細胞を培養する培地中に分泌させるように、前記軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを保持する１以上の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、培地から抗体を回収することができる。標準組換えＤＮＡ法を使用して抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに導入し、その教示内容全体を本願に援用するＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）、並びに米国特許第４，８１６，３９７号及び６，９１４，１２８号に記載されているもの等の宿主細胞にベクターを導入する。
【００５５】
軽鎖と重鎖を発現させるためには、重鎖と軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。各種語形の「トランスフェクション」なる用語は外来ＤＮＡを原核又は真核宿主細胞に導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものとし、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等が挙げられる。理論的には、原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも本発明の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞は適正に折り畳まれた免疫活性抗体を組立てて分泌する可能性が原核細胞よりも高いため、哺乳動物宿主細胞等の真核細胞で抗体を発現させると適切である。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性な抗体の高収率産生には有効でないと報告されている（その教示内容全体を本願に援用するＢｏｓｓ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄ（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【００５６】
本願のベクターでＤＮＡをクローニング又は発現させるのに適した宿主細胞は上記原核細胞、酵母細胞又は高等真核細胞である。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性菌やグラム陽性菌等の真正細菌が挙げられ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば大腸菌）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）及びＳｈｉｇｅｌｌａ等の腸内細菌や、桿菌（例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば１９８９年４月１２日発行のＤＤ  ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。適切な大腸菌クローニング宿主の１例は大腸菌２９４株（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ株、大腸菌Ｘ１７７６株（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７，３２５）等の他の株も適切である。これらの例は例示であり、非限定的である。
【００５７】
原核生物に加え、糸状菌や酵母等の真核微生物もポリペプチドをコードするベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。下等真核宿主微生物としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅないしパン酵母が最も広く使用されている。この他、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（例えばＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；Ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；及び糸状菌（例えばＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒ））等の多数の他の属、種及び株も広く入手可能であり、本願で有用である。
【００５８】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては植物細胞と昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異株と、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（果実蝿）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ等の宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用の各種ウイルス株（例えばＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−ｌ変異株及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株）が公共入手可能であり、このようなウイルスを特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクション用として、本発明に従って本願のウイルスとして使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用できる。
【００５９】
本発明の組換え抗体の発現に適した哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばその教示内容全体を本願に援用するＵｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようにＤＨＦＲ選択マーカーと併用する）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞で抗体を発現させるため又は宿主細胞を増殖させる培養培地に抗体を分泌させるために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を産生させる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例はＳＶ４０で形質転換させたサル腎細胞ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎細胞株（２９３又は懸濁培養増殖用にサブクローニングした２９３細胞，Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ：３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）であり、上記文献はその教示内容全体を本願に援用する。
【００６０】
宿主細胞を上記抗体産生用発現又はクローニングベクターで形質転換させ、プロモーターの誘導、形質転換細胞の選択又は所望配列をコードする遺伝子の増幅の必要に応じて改変した慣用栄養培地で培養する。
【００６１】
抗体を産生させるために使用する宿主細胞は、各種培地で培養することができる。ハムＦ１０（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）、最少必須培地Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）等の市販培地が宿主細胞を培養するのに適している。更に、その教示内容全体を本願に援用するＨａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号、４，６５７，８６６号、４，９２７，７６２号、４，５６０，６５５号もしくは５，１２２，４６９号、ＷＯ９０／０３４３０、ＷＯ８７／００１９５、又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載されている培地の任意のものを宿主細胞の培養培地として使用することができる。必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン又は上皮成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン薬物）、（通常ではマイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）微量元素、及びグルコース又は同等のエネルギー源をこれらの培地の任意のものに添加することができる。当業者に公知の任意の他の必要な助剤も適当な濃度で添加することができる。温度、ｐＨ等の培養条件は発現に選択される宿主細胞で従来使用されている条件であり、当業者に容易に理解されよう。
【００６２】
無傷の抗体の部分（例えばＦａｂフラグメントやｓｃＦｖ分子）を作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も本発明の範囲内である。例えば、ある実施形態では、本発明の抗体の軽鎖又は重鎖の（両方ではなく）いずれかをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。ＩＬ−１３、特にｈＩＬ−１３との結合に不要な軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去するために組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような短縮型ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に含まれる。更に、本発明の抗体を標準化学架橋法により第２の抗体と架橋することにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖及び軽鎖がＩＬ−１３以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することができる。
【００６３】
本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現に適したシステムでは、抗体重鎖及び抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクターの内側で、遺伝子の高レベルの転写を誘導するように、抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと機能的に連結する。組換え発現ベクターは更にメトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子を保持する。選択した形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷抗体を培養培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収する。
【００６４】
組換え技術を使用する場合には、抗体をペリプラズム空間で細胞内産生させることもできるし、培地に直接分泌させることもできる。ある態様において、抗体を細胞内産生させる場合には、第１段階として、宿主細胞又は（例えば均質化による）溶解細胞のいずれかであるかに関係なく、粒状破片を例えば遠心又は限外濾過により除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合には、市販蛋白質濃縮フィルター（例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過ユニット）を使用して、先ずこのような発現システムからの上清を濃縮することができる。
【００６５】
本発明の方法の前に、細胞破片から抗体を精製する手順は、まず第１に抗体の発現部位によって異なる。抗体によっては細胞から周囲の増殖培地に直接分泌させることもできるし、細胞内に産生するものもある。後者抗体では、精製工程の第１段階は典型的には細胞の溶解を含み、これは機械的剪断、浸透圧ショック法又は酵素処理を含む各種方法により実施できる。このような破砕により細胞の全内容物はホモジネート中に放出され、更に、寸法が小さいために除去しにくい細胞以下のフラグメントが生成される。これらは一般に分画遠心法又は濾過により除去される。抗体が分泌される場合には、一般に先ず市販蛋白質濃縮フィルター（例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過ユニット）を使用してこのような発現システムからの上清を濃縮する。抗体が培地中に分泌される場合には、組換え宿主細胞も、例えば、タンジェンシャルフロー濾過により細胞培養培地から分離することができる。本発明の抗体精製法を使用して抗体を更に培養培地から回収することができる。
【００６６】
３．２．典型的産生ストラテジー
ある実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体産生の初期工程は、スピナーフラスコとバイオウェーブバッグの操作を使用し、抗ＩＬ−１３抗体を発現するＣＨＯ細胞を凍結バイアル１本から１１０Ｌシードバイオリアクターの接種に望ましいバイオマスまで増殖させる。マスターセルバンクＣＨＯ細胞の凍結バイアルを解凍し、増殖培地（ＳＲ−５１２）に加え、遠心する。細胞を増殖培地に再懸濁し、容積を増加させながら使い捨てスピナーフラスコ、振盪フラスコ及び／又はバイオウェーブバッグで３７℃及び５％  ＣＯ２にて増殖させる。シードバイオリアクターに接種する前に２０Ｌウェーブバッグ２個を使用して最終細胞塊増殖を最大にする。両方の２０Ｌウェーブバッグからの細胞密度が約１５〜１７日目に生存細胞≧２．０×１０６個／ｍＬに達したら、更に増殖させるために、増殖培地ＳＲ−５２０を充填した１１０シードバイオリアクターに培養液を移す。接種後、目標温度を３７℃とし、ｐＨを７．１の目標値に設定し、ＮａＯＨの添加とＣＯ２スパージングにより制御する。空気と酸素のスパージングによりバイオリアクター内の溶存酸素（ＤＯ）を４０％の目標値に制御する。約２〜４日後に細胞密度が生存細胞≧２．６×１０６個／ｍＬに達したら、培養液を３０００Ｌ産生用バイオリアクターに移す。
【００６７】
ある実施形態では、３０００Ｌ産生用バイオリアクターの部分フィルを使用して細胞培養物を更に増殖させる。先ず、リアクターに増殖培地（ＳＲ−５２０）を仕込み、１１０Ｌシードバイオリアクターからのバッチを接種する。このショートフィル段階中は、温度、溶存酸素及びｐＨを夫々３７℃、４０％及び７．１に制御する。培養ｐＨはＣＯ２スパージングとＮａＯＨ添加により制御する。典型的には、細胞は生存細胞≧１．６×１０６個／ｍＬの産生段階密度に達する前に２〜４日間増殖する。
【００６８】
産生培地ＳＲ−５２１（１９５０Ｌ）を３０００Ｌバイオリアクター内の細胞培養液に加え、産生段階を開始する。消泡剤Ｃを加え、発泡を抑える。ＣＯ２スパージングとＮａＯＨ添加のオンオフにより培養ｐＨを６．９の目標値に制御する。温度と溶存酸素を夫々３５℃及び４０％の目標値に制御する。バイオリアクター内のＤＯは先ず空気スパージングにより所望値に制御し、必要に応じて純酸素を補充する。ある実施形態では、生存細胞密度が≧３．０×１０６個／ｍＬに達したら、温度を３３℃の目標値まで下げ、ｐＨとＤＯを夫々６．９と４０％の目標値に維持するが、他の態様では、３５℃の目標値に維持する。必要に応じてグルコース（ＳＲ−３３４）を添加する。細胞生存率が≦５０％まで低下したら、培養液を回収し、以下に概説するように精製する。
【００６９】
４．抗体精製
４．１  抗体精製概論
本発明は、抗体と少なくとも１種のＨＣＰを含有する混合物から精製（ないし「ＨＣＰ低減」）抗体調製物を生成する方法を提供する。本発明は、最終精製調製物の浸出プロテインＡを低減する方法も提供する。本発明の精製工程は、上記方法及び当分野の慣用方法を使用して抗体が産生された時点で分離工程から開始する。表１は精製スキームの１態様を要約する。このスキームの変形も考えられ、限定されないが、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程を省略したり、イオン交換工程の順序を逆にした変形が考えられ、本発明の範囲に含まれる。
【００７０】
【表１】
0005914342.tif 000002
【００７１】
抗体を含有する清澄化溶液又は混合物が得られたら、イオン交換分離工程と疎水性相互作用分離工程を含む異なる精製技術の組み合わせを使用し、細胞により産生された他の蛋白質（例えばＨＣＰ）からの抗体の分離を実施する。分離工程は蛋白質の電荷、疎水度又は寸法に基づいて蛋白質混合物を分離する。本発明のある態様では、カチオン、アニオン及び疎水性相互作用を含むクロマトグラフィーを使用して分離を実施する。これらの技術の各々に数種の異なるクロマトグラフィー樹脂が利用可能であり、該当する特定蛋白質に合わせて精製スキームを正確に適応させることができる。分離方法の各々の要点は、蛋白質を異なる速度でカラムに流し、更にカラムを通過するにつれて増加する物理的分離を達成すること、又は蛋白質を選択的に分離媒体に接着させた後、異なる溶媒により分画溶出させることである。場合により、不純物がカラムと特異的に接着し、抗体が接着しない場合、即ち抗体がフロースルー中に存在する場合には、抗体を不純物から分離する。
【００７２】
上記のように、精製スキームの正確な適応は、精製しようとする蛋白質の要件に依存する。ある実施形態では、１種以上のＨＣＰから抗体を分離するために本発明の分離工程を利用する。本願に記載する方法を使用して有効に精製することができる抗体としては、限定されないが、ヒトＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＭ抗体が挙げられる。ある実施形態において、本発明の精製ストラテジーはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの使用を除外し、例えばＩｇＧ３抗体はプロテインＡと効率的に結合しないので、ＩｇＧ３抗体の精製がこれに該当する。精製スキームを個別に適応させる他の因子としては、限定されないが、プロテインＡはＦｃ領域と結合するので（例えばそのＦａｂフラグメントに対する全長抗体のコンテキストにおける）Ｆｃ領域の有無、目的抗体の作製に利用される特定生殖細胞系列配列、及び抗体のアミノ酸組成（例えば抗体の一次配列と分子の総電荷／疎水度）が挙げられる。１種以上の特徴を共有する抗体はこの特徴を利用するように適応させた精製ストラテジーを使用して精製することができる。
【００７３】
４．２  一次回収
本発明の精製方法の初期工程は、サンプルマトリックスからの抗体の第１段階の清澄化及び一次回収を含む。更に、一次回収工程はサンプルマトリックスに存在する可能性のあるウイルスを低減又は不活性化する点でもあり得る。例えば、熱不活性化（低温殺菌）、ｐＨ不活性化、溶媒／デタージェント処理、ＵＶ及びγ線照射、並びに所定の化学不活性化剤（例えばβ−プロピオラクトン又は例えばその教示内容全体を本願に援用する米国特許第４，５３４，９７２号におけるように銅フェナントロリン）の添加を含む各種ウイルス低減／不活性化方法の任意の１種以上を精製の一次回収段階中に使用することができる。本発明のある実施形態では、一次回収段階中にサンプルマトリックスをｐＨウイルス低減／不活性化に供する。
【００７４】
ｐＨウイルス低減／不活性化方法としては、限定されないが、混合物を低ｐＨで所定時間インキュベートした後、ｐＨを中和させ、粒状物を濾過により除去する。ある実施形態では、混合物を約２〜５のｐＨ、約３〜４のｐＨ、限定されないが、例えば約３．５のｐＨでインキュベートする。サンプル混合物のｐＨは任意の適切な酸により低下させることができ、限定されないが、クエン酸、酢酸、カプリル酸又は他の適切な酸が挙げられる。ｐＨレベルの選択は抗体産物と緩衝液成分の安定性プロファイルに大きく依存する。低ｐＨウイルス低減／不活性化中の目的抗体の品質がｐＨと低ｐＨインキュベーション時間に影響されることは知られている。ある実施形態において、低ｐＨインキュベーション時間は０．５時間〜２時間となり、限定されないが、例えば０．５時間〜１．５時間、限定されないが、例えば約１時間が挙げられる。ウイルス低減／不活性化は蛋白質濃度に依存し、高濃度の低減／不活性化が制限される可能性があるが、その他にこれらの同一パラメーターにも依存する。従って、所望レベルのウイルス低減／不活性化を達成するように蛋白質濃度、ｐＨ及び低減／不活性化時間の適正なパラメーターを選択することができる。
【００７５】
ある実施形態では、適切なフィルターの使用によりウイルス低減／不活性化を達成することができる。適切なフィルターの非限定的な１例はＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品であるＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（登録商標）フィルターである。本発明のある実施形態は、一次回収段階中にこのような濾過を利用するが、他の態様では、精製工程の他の段階（例えば最後から２番目又は最終精製工程）に利用する。ある実施形態では、別のフィルターをウイルス低減／不活性化に利用し、限定されないが、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（登録商標）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓ．）；Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ  ＶＲ（登録商標）フィルター（ＣＵＮＯ；Ｍｅｒｉｄｅｎ，Ｃｏｎｎ．）；及びＰｌａｎｏｖａ（登録商標）フィルター（Ａｓａｈｉ  Ｋａｓｅｉ  Ｐｈａｒｍａ，Ｐｌａｎｏｖａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．）が挙げられる。
【００７６】
ウイルス低減／不活性化を利用する態様では、必要に応じて後続精製工程に備えてサンプル混合物を調整することができる。例えば、低ｐＨウイルス低減／不活性化後に、精製工程を続ける前にサンプル混合物のｐＨを典型的にはより中性のｐＨ（例えば約４．５〜約８．５、限定されないが、例えば約４．９）に調整する。更に、所望の導電率を得るように混合物を注射用水（ＷＦＩ）でフラッシュしてもよい。
【００７７】
ある実施形態においては、一次回収はサンプルマトリックスを更に清澄化することにより、抗ＩＬ−１３抗体を精製し易くするための１以上の遠心工程を含む。サンプルの遠心は限定されないが、例えば７，０００×ｇ〜約１２，７５０×ｇで実施することができる。大規模精製の場合には、このような遠心は限定されないが、例えば得られる上清中で１５０ＮＴＵの濁度レベルを達成するように設定された流速を使用してオンラインで実施することができる。次に後続精製に備えてこのような上清を採取することができる。
【００７８】
ある実施形態においては、一次回収は、サンプルマトリックスを更に清澄化することにより、本発明の抗体を精製し易くするための１以上の深層濾過工程の使用を含む。デプスフィルターは段階的密度の濾過媒体を含む。このような段階的密度により、フィルターの表面付近に大きい粒子をトラップすると共に、フィルターの表面の広い開口領域を通過する小さい粒子のみをフィルターの中心に近い狭い開口にトラップすることができる。ある実施形態において、深層濾過工程はデリピッド深層濾過工程とすることができる。ある実施形態では、一次回収段階中のみに深層濾過工程を利用するが、他の態様は、１以上の他の精製段階中にもデリピッドデプスフィルター等のデプスフィルターを利用する。本発明に関連して使用することができるデプスフィルターの非限定的な例としては、Ｃｕｎｏ（登録商標）モデル３０／６０ＺＡデプスフィルター（３Ｍ  Ｃｏｒｐ．）と、０．４５／０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）二重層フィルターカートリッジが挙げられる。
【００７９】
４．３  アフィニティークロマトグラフィー
ある実施形態では、一次回収サンプルをアフィニティークロマトグラフィーに供し、更に目的抗体をＨＣＰから精製する。ある実施形態において、クロマトグラフィー材料は目的抗体と選択的又は特異的に結合することが可能である。このようなクロマトグラフィー材料の非限定的な例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、目的抗体と結合する抗原を含むクロマトグラフィー材料、及びＦｃ結合蛋白質を含むクロマトグラフィー材料が挙げられる。特定態様において、アフィニティークロマトグラフィー工程は適切なプロテインＡ樹脂を充填したカラムに一次回収サンプルを供する段階を含む。プロテインＡ樹脂は各種抗体、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアフィニティー精製・単離に有用である。プロテインＡは主にそのＦｃ領域を介して哺乳動物ＩｇＧと結合する細菌細胞壁蛋白質である。その天然状態において、プロテインＡは５個のＩｇＧ結合ドメインと機能の不明な他のドメインをもつ。
【００８０】
プロテインＡ樹脂には、数種類の市販品が存在する。適切な樹脂としては、限定されないが、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製品であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）とＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製品であるＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）が挙げられる。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）を充填した適切なカラムの非限定的な１例は直径約１．０ｃｍ×長さ約２１．６ｃｍ（ベッドボリューム〜１７ｍＬ）のカラムである。このサイズのカラムは小規模精製に使用することができ、大規模化に使用される他のカラムと比較することができる。例えば、より大規模の精製にはベッドボリューム約６．６Ｌの２０ｃｍ×２１ｃｍカラムを使用することができる。カラムに関係なく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）やＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）等の適切な樹脂を使用してカラムに充填することができる。
【００８１】
ある実施形態では、精製を特定の目的抗体に適応させるために、プロテインＡ樹脂の動的結合容量（ＤＢＣ）を測定すると有利であろう。例えば、限定されないが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）又はＰｒｏＳｅｐｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）カラムのＤＢＣは一段階流速ロード又は二段階流速ロードストラテジーにより測定することができる。一段階流速ロードは全ロード時間を通して約３００ｃｍ／時の速度で評価することができる。二段階流速ロードストラテジーは樹脂１ｍＬ当たり蛋白質約３５ｍｇまでを約３００ｃｍ／時の線速度でカラムにロードした後、ロードの最後の部分の滞留時間を長くするように線速度を半減させることにより測定することができる。
【００８２】
ある実施形態では、サンプルロードの前に適切な緩衝液でプロテインＡカラムを平衡化することができる。適切な緩衝液の非限定的な１例はｐＨ約７．２のトリス／ＮａＣｌバッファーである。適切な平衡化条件の非限定的な１例は２５ｍＭトリス，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ約７．２である。この平衡化後、サンプルをカラムにロードすることができる。カラムにロードした後、例えば平衡化バッファーを使用してカラムを１回以上洗浄することができる。カラムから溶出させる前に、別の緩衝液を利用する洗浄を含む他の洗浄を使用することができる。例えば、１カラム体積以上の２０ｍＭクエン酸／クエン酸ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ約６．０を使用してカラムを洗浄することができる。この洗浄後、場合により平衡化バッファーを使用して１回以上洗浄してもよい。その後、適当な溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから溶出させることができる。適切な溶出バッファーの非限定的な１例はｐＨ約３．５の酢酸／ＮａＣｌバッファーである。適切な条件は例えば０．１Ｍ酢酸，ｐＨ約３．５である。当業者に周知の技術を使用して溶出液をモニターすることができる。例えば、ＯＤ２８０の吸光度を追跡することができる。約０．５ＡＵの初期偏光から出発して溶出ピークの立下りの約０．５ＡＵの読取値までカラム溶出液を採取することができる。次に、後続処理に備えて目的の溶出画分を調製することができる。例えば、採取したサンプルをｐＨ約１０のトリス（例えば１．０Ｍ）で約５．０のｐＨまで滴定することができる。場合により、この滴定後のサンプルを濾過し、更に処理してもよい。
【００８３】
４．４  イオン交換クロマトグラフィー
ある実施形態においては、本発明は抗体を含有する溶出液が得られるように、抗体と少なくとも１種のＨＣＰを含有する混合物を少なくとも１種のイオン交換分離工程に供することにより、前記混合物からＨＣＰ低減抗体調製物を生成する方法を提供する。イオン交換分離としては、２種類の物質を夫々のイオン電荷の差に基づいて分離する任意方法が挙げられ、カチオン交換材料又はアニオン交換材料を利用することができる。
【００８４】
カチオン交換材料とアニオン交換材料のどちらを使用するかは蛋白質の総電荷による。従って、カチオン交換工程を使用する前にアニオン交換工程を使用することも、アニオン交換工程を使用する前にカチオン交換工程を使用することも本発明の範囲に含まれる。更に、カチオン交換工程のみを使用することも、アニオン交換工程のみを使用することも、両者の任意の順次併用も本発明の範囲に含まれる。
【００８５】
分離を実施するには、各種技術のいずれかを使用（例えばバッチ精製技術やクロマトグラフィー技術を使用）することにより、初期抗体混合物をイオン交換材料と接触させればよい。
【００８６】
例えば、バッチ精製の場合には、所望の出発バッファー中でイオン交換材料を調製又は平衡化する。調製又は平衡化後、イオン交換材料のスラリーが得られる。抗体溶液をスラリーと接触させ、分離しようとする抗体をイオン交換材料に吸着させる。例えばスラリーを沈殿させ、上清を除去することにより、イオン交換材料と結合しないＨＣＰを含有する溶液をスラリーから分離する。スラリーを１回以上の洗浄工程に供することができる。必要に応じて、スラリーを高導電率の溶液と接触させ、イオン交換材料と結合したＨＣＰを脱着させてもよい。結合したポリペプチドを溶出させるためには、緩衝液の塩濃度を上げればよい。
【００８７】
イオン交換分離法としてイオン交換クロマトグラフィーを使用してもよい。イオン交換クロマトグラフィーは分子の総電荷の差に基づいて分子を分離する。抗体の精製では、抗体はイオン交換材料（例えば樹脂）に付加した官能基と結合するためにこの官能基に対して逆電荷でなければならない。例えば、そのｐＩ未満のｐＨの緩衝液中で一般に総電荷がプラスの抗体は負電荷の官能基を含むカチオン交換材料と結合する。
【００８８】
イオン交換クロマトグラフィーでは、周囲の緩衝液のイオン強度が低いならば、溶質の表面の帯電パッチはクロマトグラフィーマトリックスに付加した逆電荷により吸引される。溶出は一般にイオン交換マトリックスの帯電部位について溶質と競合するように緩衝液のイオン強度（即ち導電率）を上げることにより行われる。溶質の溶出を行う別の方法はｐＨを変化させることにより、溶質の電荷を変化させる方法である。導電率又はｐＨの変化は漸次（グラジエント溶出）でも段階的（ステップワイズ溶出）でもよい。
【００８９】
クロマトグラフィーのアニオン性又はカチオン性担体を形成するためにはアニオン性又はカチオン性置換基をマトリックスに付加すればよい。アニオン交換置換基の非限定的な例としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、第四級アミノエチル（ＱＡＥ）及び第四級アミン（Ｑ）基が挙げられる。カチオン置換基としては、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、リン酸（Ｐ）及びスルホン酸（Ｓ）が挙げられる。ＤＥ２３（登録商標）、ＤＥ３２（登録商標）、ＤＥ５２（登録商標）、ＣＭ−２３（登録商標）、ＣＭ−３２（登録商標）及びＣＭ−５２（登録商標）等のセルロースイオン交換樹脂がＷｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，Ｕ．Ｋ．から市販されている。ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）系架橋結合イオン交換体も知られている。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−及びＳＰ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）、ＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−及びＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、並びにＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ファストフローがいずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  ＡＢから市販されている。更に、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＤＥＡＥ−６５０Ｓ又はＭ及びＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＣＭ−６５０Ｓ又はＭ等のＤＥＡＥ及びＣＭの両者で誘導体化したエチレングリコール−メタクリレートコポリマーもＴｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａから市販されている。ある実施形態では、Ｐａｌｌ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑメンブレンカートリッジを使用してアニオン交換工程を実施する。
【００９０】
抗体と不純物（例えばＨＣＰ）を含有する混合物をイオン交換カラム（例えばカチオン交換カラム）にロードする。例えば、限定されないが、使用するカラムに応じて蛋白質約８０ｇ／Ｌ樹脂のロード率で混合物をロードすることができる。適切なカチオン交換カラムの１例は直径８０ｃｍ×長さ２３ｃｍ、ベッドボリューム約１１６Ｌのカラムである。このカチオンカラムにロードした混合物を次に洗浄バッファー（平衡化バッファー）で洗浄することができる。その後、抗体をカラムから溶出させ、第１の溶出液を得る。
【００９１】
このイオン交換工程は、ＨＣＰ等の不純物を低減しながら目的抗体の捕集を容易にする。ある態様において、イオン交換カラムはカチオン交換カラムである。例えば、限定されないが、このようなカチオン交換カラムに適した樹脂はＣＭ  ＨｙｐｅｒＤＦ（登録商標）樹脂である。これらの樹脂はＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ等の業者から入手可能である。このカチオン交換法は室温又は室温付近で実施することができる。
【００９２】
４．５  限外濾過／透析濾過
本発明のある実施形態では抗体サンプルを更に精製・濃縮するために限外濾過及び／又は透析濾過工程を利用する。限外濾過はＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌ．Ｚｅｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｚｙｄｎｅｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）及びＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｍｕｎｉｒ  Ｃｈｅｒｙａｎ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９８６；ＩＳＢＮ  Ｎｏ．８７７６２−４５６−９）に詳細に記載されている。濾過工程の１例は表題“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ”
のＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ１７７〜２０２頁（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．，１９９５／９６）に記載されているようなタンジェンシャルフロー濾過である。限外濾過は一般に０．１μｍ未満の細孔サイズのフィルターを使用する濾過を意味するとみなされる。このような細孔サイズの小さいフィルターを利用することにより、抗体をフィルターに保持しながら、サンプルバッファーをフィルターに透過させることによりサンプルの体積を減少させることができる。
【００９３】
透析濾過は、塩、糖及び非水性溶媒を除去及び交換するため、遊離種を結合種から分離するため、低分子量材料を除去するため、並びに／又はイオン及び／もしくはｐＨ環境の迅速な変化を誘導するために限外濾過フィルターを使用する方法である。限外濾過中の溶液に溶媒を限外濾過速度とほぼ等しい速度で加えることにより、微小溶質は最も効率的に除去される。こうして微小種が一定流量で溶液から洗い流され、保持された抗体が有効に精製される。本発明のある実施形態では、場合により後続クロマトグラフィー又は他の精製工程の前に本発明に関連して使用される各種緩衝液を交換するため、あるいは抗体調製物から不純物を除去するために透析濾過工程を利用する。
【００９４】
４．６  疎水性相互作用クロマトグラフィー
本発明は、抗体と少なくとも１種のＨＣＰを含有する混合物からＨＣＰ低減抗体調製物を生成する方法であって、更に疎水性相互作用分離工程を含む方法にも関する。例えば、ＨＣＰ濃度の低下した第２の溶出液が得られるように、イオン交換カラムから得られた第１の溶出液を疎水性相互作用材料に供することができる。本願に記載する工程等の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を一般に実施し、抗体凝集物等の蛋白質凝集物と工程関連不純物を除去する。
【００９５】
分離を実施するには、例えばバッチ精製技術又はカラムを使用してサンプル混合物をＨＩＣ材料と接触させる。ＨＩＣ精製の前に、例えば混合物をプレカラムに通すことにより、カオトロピック剤又は超疎水性物質を除去することが望ましい場合もある。
【００９６】
例えば、バッチ精製の場合には、所望平衡化バッファー中でＨＩＣ材料を調製又は平衡化する。ＨＩＣ材料のスラリーが得られる。抗体溶液をスラリーと接触させ、分離しようとする抗体をＨＩＣ材料に吸着させる。例えばスラリーを沈殿させ、上清を除去することにより、ＨＩＣ材料と結合しないＨＣＰを含有する溶液をスラリーから分離する。スラリーを１回以上の洗浄工程に供することができる。必要に応じて、スラリーを導電率の低い溶液と接触させ、ＨＩＣ材料と結合した抗体を脱着させてもよい。結合した抗体を溶出させるためには、塩濃度を下げればよい。
【００９７】
イオン交換クロマトグラフィーは、抗体を単離するために抗体の電荷に依存し、疎水性相互作用クロマトグラフィーは抗体の疎水性を利用する。抗体上の疎水基がカラム上の疎水基と相互作用する。疎水度が高いほど、蛋白質はカラムと強く相互作用する。従って、ＨＩＣ工程は宿主細胞に由来する不純物（例えばＤＮＡと他の高分子量及び低分子量産物関連種）を除去する。
【００９８】
疎水性相互作用は、イオン強度が高いときに最強であるため、この型の分離は塩沈殿法又はイオン交換法に従って適切に実施される。ＨＩＣカラムへの抗体の吸着は高い塩濃度により助長されるが、実際の濃度は抗体の種類と選択される特定ＨＩＣリガンドに応じて広い範囲を取ることができる。疎水性相互作用を促進する（塩析効果）か又は水の構造を破壊する（カオトロピック効果）かに応じて所謂疎溶媒性系列に各種イオンを配置し、疎水性相互作用を弱化させることができる。カチオンを塩析効果の昇順に並べると、Ｂａ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４＋であり、アニオンをカオトロピック効果の昇順に並べると、ＰＯ−−−、ＳＯ４−−、ＣＨ３ＣＯ３−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、Ｉ−、ＳＣＮ−となる。
【００９９】
一般に、硫酸Ｎａ、硫酸Ｋ又は、硫酸ＮＨ４はＨＩＣにおいてリガンド−蛋白質相互作用を有効に促進する。この相互作用の強度に影響を与える塩を体系化すると、以下の関係：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮにより示すことができる。一般に、約０．７５〜約２Ｍ硫酸アンモニウム又は約１〜４Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度が有用である。
【０１００】
ＨＩＣカラムは、通例では疎水性リガンド（例えばアルキル又はアリール基）をカップリングさせる塩基マトリックス（例えば架橋アガロース又は合成コポリマー材料）を含む。適切なＨＩＣカラムは、フェニル基で置換されたアガロース樹脂を含む（例えばＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム）。多数のＨＩＣカラムが市販されている。例としては、限定されないが、低置換度又は高置換度のＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ファストフローカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤプロピル又はＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤフェニルカラム（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）メチル又はＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）ｔ−ブチル担体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ＷＰ  ＨＩ−Ｐｒｏｐｙｌ（Ｃ３）（登録商標）カラム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）エーテル、フェニル又はブチルカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，ＰＡ）が挙げられる。
【０１０１】
４．７  典型的精製ストラテジー
ある実施形態では、一次回収の前に先ず遠心及び濾過工程を利用して産生用バイオリアクター回収液から細胞及び細胞破片（ＨＣＰを含む）を除去する。例えば、非限定的な例として、抗体と培地と細胞を含む培養液を約７０００×ｇ〜約１１，０００×ｇで遠心することができる。ある実施形態では、得られたサンプル上清を次に複数のデプスフィルターを含むフィルター列に通す。ある実施形態においては、フィルター列は、１２個前後の１６インチＣｕｎｏ（登録商標）モデル３０／６０ＺＡデプスフィルター（３Ｍ  Ｃｏｒｐ．）と、３個の３０インチ０．４５／０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２フィルターカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を装着した３個前後のフィルターハウジングから構成される。清澄化した上清を予め滅菌した回収液容器等の容器に採取し、約８℃に維持する。この温度を次に、以下に概説する１以上の捕集クロマトグラフィー工程の前に約２０℃に調整する。当然のことながら、当業者は上記条件を変更することができ、このような変更も本発明の範囲内に含まれる。
【０１０２】
ある実施形態では、一次回収後に、プロテインＡ樹脂を使用してアフィニティークロマトグラフィーを行う。プロテインＡ樹脂は数件の業者から市販されている。適切な樹脂の１例は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製品であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）である。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）を充填した適切なカラムの１例は直径約１．０ｃｍ×長さ約２１．６ｃｍ（ベッドボリューム〜１７ｍＬ）のカラムである。このサイズのカラムはベンチスケール用に使用することができる。これを大規模化に使用される他のカラムと比較することができる。例えば、商業的生産にはベッドボリューム約６．６Ｌの２０ｃｍ×２１ｃｍカラムを使用することができる。カラムに関係なく、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）等の適切な樹脂を使用してカラムに充填することができる。
【０１０３】
ある態様では、サンプルをロードする前に、プロテインＡカラムを適切な緩衝液で平衡化することができる。適切な緩衝液の１例は、ｐＨ約６〜８のトリス／ＮａＣｌバッファーであり、限定されないが、約７．２が挙げられる。適切な条件の特定例は、２５ｍＭトリス，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２である。この平衡化後、サンプルをカラムにロードすることができる。カラムにロードした後、例えば平衡化バッファーを使用してカラムを１回以上洗浄することができる。カラムから溶出させる前に、別の緩衝液を利用する洗浄を含む他の洗浄を使用することができる。例えば、１カラム体積以上の２０ｍＭクエン酸／クエン酸ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ約６．０を使用してカラムを洗浄することができる。この洗浄後、場合により平衡化バッファーを使用して１回以上洗浄してもよい。その後、適切な溶出バッファーを使用してプロテインＡカラムから溶出させることができる。適切な溶出バッファーの１例はｐＨ約３．５の酢酸／ＮａＣｌバッファーである。適切な条件は例えば０．１Ｍ酢酸，ｐＨ３．５である。当業者に周知の技術を使用して溶出液をモニターすることができる。例えば、ＯＤ２８０の吸光度を追跡することができる。約０．５ＡＵの初期偏光から出発して溶出ピークの立下りの約０．５ＡＵの読取値までカラム溶出液を採取することができる。次に、後続処理に備えて目的の溶出画分を調製することができる。例えば、採取したサンプルをｐＨ約１０のトリス（例えば１．０Ｍ）で約５．０のｐＨまで滴定することができる。場合により、この滴定後のサンプルを濾過し、更に処理してもよい。
【０１０４】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）カラムの動的結合容量（ＤＢＣ）は、一段階流速ロード又は二段階流速ロードストラテジーにより測定することができる。一段階流速ロードは、全ロード時間を通して約３００ｃｍ／時の速度で評価することができる。二段階流速ロードストラテジーは樹脂１ｍＬ当たり蛋白質約３５ｍｇまでを約３００ｃｍ／時の線速度でカラムにロードした後、ロードの最後の部分の滞留時間を長くするように線速度を半減させることにより測定することができる。
【０１０５】
次に、ｐＨ介在ウイルス低減／不活性化工程を利用することによりプロテインＡ溶出液を更に精製することができる。ある実施形態において、この工程は溶出液のｐＨを約３〜約５（限定されないが、例えば約３．５）に約１時間調整する。クエン酸（例えば３Ｍクエン酸）等の公知酸調製物を使用してｐＨ低下を助長することができる。酸性ｐＨに暴露すると、ｐＨ感受性ウイルス汚染物質は完全には除去されないとしても、低減し、多少の培地／細胞汚染物質が沈殿する。このウイルス低減／不活性化工程後、水酸化ナトリウム（例えば３Ｍ水酸化ナトリウム）等の塩基を使用して約２０〜約４０分間ｐＨを約４．９又は５．０に調整する。この調整は約２０℃で実施することができる。
【０１０６】
ある実施形態では、ｐＨを調整した培地をアニオン交換カラムで更に精製する。この工程に適したカラムの非限定的な１例は、直径６０ｃｍ×長さ３０ｃｍ、ベッドボリューム約８５Ｌのカラムである。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製品であるＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファストフロー等のアニオン交換樹脂をカラムに充填する。約７カラム体積の適切な緩衝液（例えばトリス／塩化ナトリウム）を使用してカラムを平衡化することができる。適切な条件の１例は、２５ｍＭトリス，５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ８．０である。当業者は上記条件を変更することができ、このような変更も本発明の範囲内に含まれる。上記に概説したプロテインＡ精製工程から採取したサンプルをカラムにロードする。別の側面では、カチオン交換中に採取した溶出液からカラムにロードする。カラムにロードした後、カラムを平衡化バッファー（例えばトリス／塩化ナトリウムバッファー）で洗浄する。ＯＤ２８０ｎｍでＵＶ分光光度計を使用して抗体を含有するフロースルーをモニターすることができる。このアニオン交換工程は工程関連不純物（例えばＤＮＡ等の核酸や宿主細胞蛋白質）を低減させる。目的抗体は、カラムの固相（例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））と実質的に相互作用も結合もしないが、多くの不純物は、カラムの固相と相互作用し、結合するので、分離が行われる。アニオン交換は約１２℃で実施することができる。
【０１０７】
ある実施形態では、ｐＨを調整した培地をカチオン交換カラムで更に精製する。ある実施形態においては、カチオン交換カラムで使用される平衡化バッファーは、ｐＨ約５．０の緩衝液である。適切な緩衝液の１例は約２１０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０である。平衡化後、上記一次回収工程から調製したサンプルをカラムにロードする。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製品であるＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファストフロー等のカチオン交換樹脂をカラムに充填する。次に、平衡化バッファーを使用してカラムを洗浄する。次に、平衡化又は洗浄バッファーに比較してイオン強度の高い緩衝液を使用する溶出工程にカラムを供する。例えば、適切な溶出バッファーとしては、約７９０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５．０が挙げられる。抗体を溶出させ、ＯＤ２８０ｎｍに設定したＵＶ分光光度計を使用してモニターすることができる。特定例において、溶出液採取は、上側３ＯＤ２８０ｎｍから下側８ＯＤ２８０ｎｍまでとすることができる。当然のことながら、当業者は上記条件を変更することができ、このような変更も本発明の範囲内に含まれる。
【０１０８】
ある実施形態では、ｐＨを調整した培地、カチオン交換溶出液又はアニオン交換溶出液を例えば１６インチＣｕｎｏ（登録商標）デリピッドフィルターで濾過する。デリピッドフィルターを使用するこの濾過後、例えば３０インチ０．４５／０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）二重層フィルターカートリッジで濾過することができる。イオン交換溶出バッファーを使用してフィルターに残留している残量分をフラッシュし、限外濾過／透析濾過に備えることができる。
【０１０９】
限外濾過／透析濾過工程を実施するためには、適切な緩衝液（例えば２０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）で濾過媒体を調製する。イオン強度を増すために塩化ナトリウム（例えば１００ｍＭ塩化ナトリウム）等の塩を加えることができる。この限外濾過／透析濾過工程は抗ＩＬ−１３抗体を濃縮し、酢酸ナトリウムを除去し、ｐＨを調整するように機能する。この工程を実施するには市販フィルターが利用可能である。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅは３０ｋＤ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）セルロース限外濾過膜カセットを製造している。この濾過法は室温又は室温付近で実施することができる。
【０１１０】
ある実施形態では、上記捕集濾過工程からのサンプルを第２のイオン交換分離工程に供する。この第２のイオン交換分離はある実施形態においては、第１のイオン交換分離の逆電荷に基づく分離を含む。例えば、一次回収後にアニオン交換工程を利用する場合には、第２のイオン交換クロマトグラフィー工程をカチオン交換工程とすることができる。逆に、一次回収工程後にカチオン交換工程を行う場合には、この工程後にアニオン交換工程を実施する。ある実施形態では、第１のイオン交換溶出液を第２のイオン交換クロマトグラフィー工程に直接供することができ、第１のイオン交換溶出液を適切な緩衝液条件に調整する。適切なアニオン及びカチオン分離材料及び条件は上記の通りである。
【０１１１】
本発明のある実施形態では、抗体を含有するサンプルを疎水性相互作用分離工程で更に処理する。このような工程に適したカラムの非限定的な１例は、直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍ、ベッドボリューム約７５Ｌのカラムであり、ＨＩＣに使用するのに適した樹脂（限定されないが、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ製品であるＰｈｅｎｙｌ  ＨＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））を充填する。前のアニオン交換クロマトグラフィー工程から得られた目的抗体を含有するフロースルーサンプルを等体積の約１．７Ｍ硫酸アンモニウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０で希釈することができる。その後、０．４５／０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２二重層フィルター又は同等手段を使用してこれを濾過することができる。ある実施形態においては、疎水性クロマトグラフィー法は２サイクル以上を含む。
【０１１２】
ある実施形態では、先ず適切な緩衝液を使用してＨＩＣカラムを平衡化する。適切な緩衝液の非限定的な１例は０．８５Ｍ硫酸アンモニウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０である。当業者は、緩衝剤の濃度を変更及び／又は同等の緩衝液に置換することにより平衡化バッファーを変更することができ、このような変更も本発明の範囲内である。ある実施形態では、次にカラムにアニオン交換フロースルーサンプルをロードし、硫酸アンモニウム／リン酸ナトリウム等の適切な緩衝液系で複数回（例えば３回）洗浄する。適切な緩衝液の１例としては、ｐＨ約７．０の１．１Ｍ硫酸アンモニウム，５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーが挙げられる。場合により、カラムを更に洗浄サイクルに供することができる。例えば、第２の洗浄サイクルでは、適切な緩衝液系を使用してカラムを複数回（例えば１〜７回）洗浄することができる。適切な緩衝液系の非限定的な１例としては、０．８５Ｍ硫酸アンモニウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．０が挙げられる。ある態様では、ロードしたカラムに対して適切な緩衝液系を使用して３回目の洗浄を行う。ｐＨ約７．０の１．１Ｍ硫酸アンモニウム，５０ｍＭリン酸ナトリウム等の適切な緩衝液系を使用してカラムを複数回（例えば１〜３回）洗浄することができる。この場合も、当業者は緩衝条件を変更することができ、このような変更も本発明の範囲内に含まれる。
【０１１３】
適当な溶出バッファーを使用してカラムから溶出させる。このような溶出バッファーの適切な１例は、ｐＨ約７．０の０．５Ｍ硫酸アンモニウム，１５ｍＭリン酸ナトリウムである。従来の分光光度計を使用して３ＯＤ２８０ｎｍの上側から３ＯＤ２８０ｎｍのピークの下側まで目的抗体を検出・採取することができる。
【０１１４】
本発明のある態様では、無傷ウイルスを含むウイルス粒子が残存する場合にはこれを除去するために疎水性クロマトグラフィー工程からの溶出液を濾過する。適切なフィルターの非限定的な１例は、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品であるＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（登録商標）フィルターである。他のウイルスフィルターもこの濾過工程で使用することができ、当業者に周知である。予め湿潤させた約０．１μｍのフィルターと２×３０インチＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ５０（登録商標）フィルター列に約３４ｐｓｉｇでＨＩＣ溶出液を通す。ある実施形態では、濾過工程後に、フィルターハウジングに抗体が保持されている場合にはこれを除去するために例えばＨＩＣ溶出バッファーを使用してフィルターを洗浄する。予め滅菌した容器に濾液を約１２℃で保存することができる。
【０１１５】
ある実施形態では、上記からの濾液を再び限外濾過／透析濾過に供する。実施者の最終目的が例えば医薬製剤中で抗体を使用することである場合にはこの工程が重要である。この工程を利用する場合には、抗体の濃縮、先に使用した緩衝塩の除去及び特定の製剤化バッファーとの交換を容易にすることができる。ある実施形態では、複数倍容量（例えば２倍容量）の製剤化バッファーを使用して連続透析濾過を実施する。適切な製剤化バッファーの非限定的な１例は５ｍＭメチオニン，２％マンニトール，０．５％スクロース，ｐＨ５．９バッファー（Ｔｗｅｅｎ不含）である。このダイアボリューム交換が完了したら、抗体を濃縮する。所定の抗体濃度に達したら、実施者は約０．００５％（ｖ／ｖ）の最終Ｔｗｅｅｎ濃度に達するために加えるべき１０％  Ｔｗｅｅｎの量を計算することができる。
【０１１６】
本発明のある実施形態は、付加的な精製工程を含む。イオン交換クロマトグラフィー法の前、その間、又はその後に実施することができる付加的な精製法の例としては、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）クロマトグラフィー、付加的なアニオン交換クロマトグラフィー及び／又は付加的なカチオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析濾過、並びに（例えば捕集試薬としてプロテインＧ、抗体、特異的基質、リガンド又は抗原を使用する）アフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０１１７】
本発明のある実施形態においては、抗ＩＬ−１３抗体は図１にまとめた重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭアイソタイプ抗体である。ある実施形態においては、抗ＩＬ−１３抗体は図１にまとめた重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。
【０１１８】
５．サンプル純度検定方法
５．１  宿主細胞蛋白質の検定
本発明は、単離／精製抗体組成物中の残留レベルの宿主細胞蛋白質（ＨＣＰ）濃度の測定方法も提供する。上記のように、最終目的物質（例えば抗ＩＬ−１３抗体）からＨＣＰを排除することが望ましい。典型的なＨＣＰとしては、抗体産生源に由来する蛋白質が挙げられる。目的抗体からＨＣＰを同定し、十分に除去することができないと、効力低下及び／又は有害な対象反応に繋がる恐れがある。
【０１１９】
本願で使用する「ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ」なる用語は、アッセイで使用される第２の抗体が抗体（例えば抗ＩＬ−１３抗体）を作製するために使用される細胞（例えばＣＨＯ細胞）から産生されるＨＣＰに特異的であるＥＬＩＳＡを意味する。第２の抗体は当業者に公知の従来方法に従って産生させることができる。例えば、第２の抗体はｓｈａｍ産生及び精製試験で得られるＨＣＰを使用して産生させることができ、即ち目的抗体を産生させるために使用されると同一の細胞株を使用するが、細胞株には抗体ＤＮＡをトランスフェクトしない。典型的な態様では、選択細胞発現系、即ち目的抗体を産生させるために使用される細胞発現系で発現されると同様のＨＰＣを使用して第２の抗体を産生させる。
【０１２０】
一般に、ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡはＨＣＰを含有する液体サンプルを２層の抗体、即ち第１の抗体と第２の抗体の間にサンドイッチする。サンプルをインキュベートすると、その間にサンプル内のＨＣＰは第１の抗体（限定されないが、例えばアフィニティー精製したヤギ抗ＣＨＯ（Ｃｙｇｎｕｓ））により捕集される。抗体を作製するために使用される細胞から産生されるＨＣＰに特異的な第２の標識抗体又は抗体ブレンド（例えばビオチン化抗ＣＨＯ  ＨＣＰ）を加えると、サンプル内のＨＣＰと結合する。ある実施形態においては、第１の抗体と第２の抗体はポリクローナル抗体である。ある態様においては、第１の抗体と第２の抗体はＨＣＰに対するポリクローナル抗体のブレンドであり、限定されないが、例えばビオチン化ヤギ抗宿主細胞蛋白質混合物５９９／６２６／７４８である。第２の抗体のラベルに基づく適切な試験を使用してサンプルに含まれるＨＣＰの量を測定する。
【０１２１】
ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡは、上記方法を使用して得られる溶出液又はフロースルー等の抗体組成物中のＨＣＰ濃度を測定するために使用することができる。本発明は、抗体を含有する組成物も提供し、前記組成物はＨＣＰ酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）により測定した場合に検出可能な濃度のＨＣＰを含有しない。
【０１２２】
５．２  アフィニティークロマトグラフィー材料の検定
ある実施形態においては、本発明は、単離／精製抗体組成物中のアフィニティークロマトグラフィー材料の残留濃度の測定方法も提供する。所定状況において、このような材料は精製工程中に抗体組成物中に浸出する。ある実施形態では、単離／精製抗体組成物中のプロテインＡ濃度を測定するアッセイを利用する。本願で使用する「プロテインＡ  ＥＬＩＳＡ」なる用語はアッセイで使用される第２の抗体が目的抗体（例えば抗ＩＬ−１３抗体）を精製するために利用されるプロテインＡに特異的であるＥＬＩＳＡを意味する。第２の抗体は、当業者に公知の従来方法に従って産生させることができる。例えば、第２の抗体は従来の抗体作製及び産生方法のコンテキストで天然又は組換えプロテインＡを使用して産生させることができる。
【０１２３】
一般に、プロテインＡ  ＥＬＩＳＡはプロテインＡを含有する（又はプロテインＡを含有すると予想される）液体サンプルを２層の抗プロテインＡ抗体、即ち第１の抗プロテインＡ抗体と第２の抗プロテインＡ抗体の間にサンドイッチする。サンプルを第１層の抗プロテインＡ抗体（限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体又はポリクローナル抗体のブレンド）に暴露し、サンプル内のプロテインＡが第１の抗体により捕集されるために十分な時間インキュベートする。次にプロテインＡに特異的な第２の標識抗体（限定されないが、例えば、ポリクローナル抗体又はポリクローナル抗体のブレンド）を加えると、サンプル内の捕集されたプロテインＡと結合する。本発明に関連して有用な抗プロテインＡ抗体の他の非限定的な例としては、ニワトリ抗プロテインＡ抗体とビオチン化抗プロテインＡ抗体が挙げられる。第２の抗体のラベルに基づく適切な試験を使用してサンプルに含まれるプロテインＡの量を測定する。別のアフィニティークロマトグラフィー材料の濃度を測定するために同様のアッセイを利用することができる。
【０１２４】
プロテインＡ  ＥＬＩＳＡは、上記方法を使用して得られる溶出液又はフロースルー等の抗体組成物中のプロテインＡ濃度を測定するために使用することができる。本発明は抗体を含有する組成物も提供し、前記組成物はプロテインＡ酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）により測定した場合に検出可能な濃度のプロテインＡを含有しない。
【０１２５】
６．付加的修飾
本発明の抗体は、修飾することができる。ある実施形態では、所望効果を提供するために抗体又はその抗原結合フラグメントを化学的に修飾する。例えば、本発明の抗体又は抗体フラグメントのペグ化は例えば各々その開示内容全体を本願に援用するＦｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０  １５４  ３１６；及びＥＰ０  ４０１  ３８４に記載されているような当分野で公知のペグ化反応のいずれかにより実施することができる。ある態様において、ペグ化は反応性ポリエチレングリコール分子（又は同様の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応により実施される。本発明の抗体及び抗体フラグメントのペグ化に適した水溶性ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本願で使用する「ポリエチレングリコール」とは、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール等の他の蛋白質を誘導体化するために従来から使用されている型のＰＥＧの任意のものを包含する。
【０１２６】
本発明のペグ化抗体及び抗体フラグメントの作製方法は、一般に、（ａ）抗体又は抗体フラグメントが１個以上のＰＥＧ基と結合する適切な条件下で抗体又は抗体フラグメントをポリエチレングリコール（例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体）と反応させる段階と、（ｂ）反応生成物を得る段階を含む。公知パラメーターと所望結果に基づいて最適反応条件又はアシル化反応を選択することは当業者に容易に理解されよう。
【０１２７】
本願に記載する抗ＩＬ−１３抗体及び抗体フラグメントの投与により、本発明のＩＬ−１３関連障害を治療するためには、一般に、ＩＬ−１３に特異的なペグ化抗体及び抗体フラグメントを使用することができる。一般に、ペグ化抗体及び抗体フラグメントは非ペグ化抗体及び抗体フラグメントに比較して半減期が長い。ペグ化抗体及び抗体フラグメントは単独で使用してもよいし、一緒に使用してもよいし、他の医薬組成物と併用してもよい。
【０１２８】
本発明の抗体又は抗体部分は、誘導体化又は別の機能分子（例えば別のペプチド又は蛋白質）と連結することができる。従って、本発明の抗体及び抗体部分は免疫接着分子を含めて本願に記載するヒト抗ｈＩＬ−１３抗体の誘導体化及び他の修飾形態を包含するものとする。例えば、別の抗体（例えば二重特異性抗体又はダイアボディ）、検出可能な物質、細胞傷害性物質、薬剤、及び／又は抗体もしくは抗体部分と別の分子（例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ）との結合に介在することができる蛋白質もしくはペプチド等の１個以上の他の分子体と本発明の抗体又は抗体部分を（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有的結合又は他の方法により）機能的に連結することができる。
【０１２９】
ある種の誘導体化抗体は、（例えば二重特異性抗体を創製するために同一型又は異なる型の）２個以上の抗体を架橋することにより作製される。適切な架橋剤としては、適当なスペーサーにより分離された２個の非常に反応性の基をもつヘテロ二価性架橋剤（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）又はホモ二価性架橋剤（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。このようなリンカーはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販されている。
【０１３０】
本発明の抗体又は抗体部分を誘導体化することができる有用な検出可能な物質としては、蛍光化合物が挙げられる。検出可能な蛍光物質の例としてはフルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリスリン等が挙げられる。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の検出可能な酵素で抗体を誘導体化することもできる。検出可能な酵素で抗体を誘導体化する場合には、検出可能な反応生成物を生成するために酵素により使用される他の試薬を加えることにより抗体を検出する。例えば、検出可能な物質である西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素とジアミノベンジジンを加えると、検出可能な着色反応生成物が得られる。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジン結合の間接測定により検出することもできる。
【０１３１】
７．医薬組成物
本発明の抗体及び抗体部分は、対象に投与するのに適した医薬組成物に配合することができる。典型的には、医薬組成物は本発明の抗体又は抗体部分と、医薬的に許容可能な担体を含有する。本願で使用する「医薬的に許容可能な担体」とは、生理的に適合可能な全溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等を包含する。医薬的に許容可能な担体の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１種以上とその組み合わせが挙げられる。多くの場合には、例えば糖、多価アルコール（例えばマンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に加えることが望ましい。医薬的に許容可能な担体としては更に抗体又は抗体部分の保存期間又は効力を増す微量の助剤（例えば湿潤剤、乳化剤、防腐剤又は緩衝剤）も挙げられる。
【０１３２】
本発明の抗体及び抗体部分は、非経口投与に適した医薬組成物に配合することができる。例えば抗体０．１〜２５０ｍｇ／ｍｌを含有する注射溶液として抗体又は抗体部分を製造することができる。注射溶液はフリントもしくはアンバーバイアル、アンプル又はプレフィルドシリンジに収容した液体又は凍結乾燥剤形から構成することができる。緩衝液はＬ−ヒスチジン約１〜５０ｍＭ（最適値５〜１０ｍＭ），ｐＨ５．０〜７．０（最適値ｐＨ６．０）とすることができる。他の適切な緩衝液としては限定されないが、琥珀酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウムが挙げられる。溶液の毒性を緩和するためには濃度０〜３００ｍＭ（液体剤形には１５０ｍＭが最適）の塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥剤形には凍結保護剤、主に０〜１０％スクロース（最適値０．５〜１．０％）を添加することができる。他の適切な凍結保護剤としてはトレハロースとラクトースが挙げられる。凍結乾燥剤形にはバルク剤、主に１〜１０％マンニトール（最適値２〜４％）を添加することができる。液体及び凍結乾燥剤形の両者で安定剤、主に１〜５０ｍＭ  Ｌ−メチオニン（最適値５〜１０ｍＭ）を使用することができる。他の適切なバルク剤としてはグリシン、アルギニンが挙げられ、０〜０．０５％ポリソルベート８０（最適値０．００５〜０．０１％）として界面活性剤も添加することができる。その他の界面活性剤としては限定されないが、ポリソルベート２０及びＢＲＩＪ界面活性剤が挙げられる。
【０１３３】
ある態様において、医薬組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体を含有する。別の態様において、抗体の用量としては、約１ｍｇ／ｋｇの隔週投与や、約０．３ｍｇ／ｋｇの毎週投与が挙げられる。当業者は適正な用量と対象への投与レジメンを決定することができる。
【０１３４】
本発明の組成物は、各種形態を取ることができる。これらの形態としては、例えば液体、半固体及び固体剤形が挙げられ、例えば溶液（例えば注射溶液及び輸液溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、ピル、散剤、リポソーム及び座剤が挙げられる。剤形は例えば所期投与方法及び治療用途により異なる。典型的な組成物は他の抗体をヒトに受動免疫するために使用されるものと同様の組成物等の注射溶液又は輸液溶液の形態である。投与方法の１例は非経口（例えば静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内）である。ある態様では、静脈内輸液又は注射により抗体を投与する。別の側面では、筋肉内又は皮下注射により抗体を投与する。
【０１３５】
治療用組成物は、典型的には製造及び保存条件下で無菌・安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソーム、又は高薬剤濃度に適した他の注文構造として製剤化することができる。滅菌注射溶液は必要量の活性化合物（即ち抗体又は抗体部分）を必要に応じて上記成分の１種又はその組み合わせと共に適切な溶媒に加えた後に濾過滅菌することにより製造することができる。一般に、分散液は塩基性分散媒と上記から選択される必要な他の成分を含有する滅菌担体に活性化合物を加えることにより製造される。滅菌注射溶液の調製用滅菌凍結乾燥粉末の場合には、製造方法は滅菌濾過溶液から活性成分と任意の他の所望成分の粉末を生成する真空乾燥と噴霧乾燥である。例えばレシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒度の維持及び界面活性剤の使用により、溶液の適正な流動性を維持することができる。吸収を遅らせる物質（例えばモノステアリン酸塩やゼラチン）を組成物に加えることにより、注射用組成物の長期吸収を実現することができる。
【０１３６】
本発明の抗体及び抗体部分は、当分野で公知の各種方法により投与することができるが、投与経路／方法の１例は皮下注射、静脈内注射又は輸液である。当業者に自明の通り、投与経路及び／又は方法は所望結果により異なる。ある実施形態では、制御放出製剤のように、化合物の迅速な放出を防止する担体を活性化合物に配合することができ、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル送達システムが挙げられる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の多数の製造方法が特許登録されており、あるいは一般に当業者に公知である。例えば、その教示内容全体を本願に援用するＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０１３７】
ある態様では、本発明の抗体又は抗体部分を例えば不活性希釈剤又は同化可食性担体と共に経口投与することができる。化合物（及び必要に応じて他の成分）をハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよいし、錠剤に圧縮してもよいし、対象の食事に直接配合してもよい。経口治療投与には、化合物に賦形剤を添加し、内服錠、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハース剤等の形態で使用することができる。本発明の化合物を非経口投与以外の方法で投与するためには、その不活性化を防止するための材料を化合物にコーティングしたり、化合物と併用投与することが必要な場合がある。
【０１３８】
補助活性化合物も組成物に配合することができる。ある態様では、ＩＬ−１３活性が有害である障害の治療に有用な１種以上の他の治療剤と本発明の抗体又は抗体部分を合剤化及び／又は併用投与する。例えば、他のターゲットと結合する１種以上の他の抗体（例えば他のサイトカインと結合する抗体又は細胞表面分子と結合する抗体）と本発明の抗ｈＩＬ−１３抗体又は抗体部分を合剤化及び／又は併用投与することができる。更に、１種以上の本発明の抗体を上記治療剤の２種以上と併用することもできる。このような併用療法は治療剤の投与用量を減らし、各種単独療法に伴う可能性のある毒性や合併症を避けることができるという利点がある。熟練した実施者には自明のことながら、本発明の抗体を併用療法の一部として使用する場合には、抗体を単独で対象に投与する場合よりも抗体の用量を減らすことが望ましいと思われる（例えば併用療法の使用により相乗治療効果を達成することができ、その結果、低用量の抗体を使用して所望の治療効果を達成することが可能になる）。
【０１３９】
当然のことながら、本発明の抗体又はその抗原結合部分は単独で使用してもよいし、別の物質（例えば治療剤）と併用してもよく、前記別の物質はその所期目的に合わせて当業者により選択される。例えば、別の物質は本発明の抗体により治療される疾患又は病態を治療するために有用であると当分野で認められている治療剤とすることができる。別の物質は治療用組成物に有益な属性を付与する物質（例えば組成物の粘性に作用する物質）でもよい。
【０１４０】
更に当然のことながら、本発明に含まれる併用剤は、その所期目的に有用な併用剤である。以下に挙げる物質は例示であり、限定的ではない。本発明に含まれる併用剤は本発明の抗体と下記から選択される少なくとも１種の他の物質から構成することができる。形成される組成物がその所期機能を実施できるような併用剤であるならば、併用剤は２種以上の他の物質、例えば２種又は３種の他の物質を含有することもできる。
【０１４１】
所定の併用剤は、非ステロイド性抗炎症薬（別称ＮＳＡＩＤＳ）であり、イブプロフェン等の薬剤を含む。他の併用剤はプレドニゾロン等のコルチコステロイドであり、本発明の抗体と併用して患者を治療する際に必要なステロイド用量を徐々に減らすことによりステロイド使用の周知副作用を低減又は解消することさえできる。本発明の抗体又は抗体部分と併用することができる関節リウマチ治療剤の非限定的な例としては、サイトカイン抑制性抗炎症薬（ＣＳＡＩＤ）；他のヒトサイトカイン又は成長因子（例えばＴＮＦ、ＬＴ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＥＭＡＰ−ＩＩ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ及びＰＤＧＦ）の抗体又はアンタゴニストが挙げられる。本発明の抗体又はその抗原結合部分はＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ９０等の細胞表面分子又はそのリガンド（例えばＣＤ１５４（ｇｐ３９又はＣＤ４０Ｌ））に対する抗体と併用することができる。
【０１４２】
治療剤の組合せによっては、自己免疫とそれに続く炎症カスケードにおける種々の点に介入する場合があり、例としては、キメラ、ヒト化又はヒトＴＮＦ抗体、Ｄ２Ｅ７（その教示内容全体を本願に援用する１９９６年２月９日出願米国出願第０８／５９９，２２６号）、ｃＡ２（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、ＣＤＰ５７１、抗ＴＮＦ抗体フラグメント（例えばＣＤＰ８７０）、及び可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦ受容体、その誘導体（ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））又はｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（レネルセプト）、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３）、並びにＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤等のＴＮＦアンタゴニストが挙げられ、同様にＩＬ−１阻害剤（例えばＶｘ７４０又はＩＬ−１ＲＡ等のインターロイキン−１変換酵素阻害剤）も同じ理由から有効であると思われる。他の併用剤としては、インターロイキン１１、抗Ｐ７及びｐ−セレクチン糖蛋白質リガンド（ＰＳＧＬ）が挙げられる。更に他の併用剤としては、ＩＬ−１３機能と平行、依存又は協調して作用し得る自己免疫反応の他の主要素が挙げられる。更に別の併用剤としては、非枯渇性抗ＣＤ４阻害剤が挙げられる。更に他の併用剤としては、抗体、可溶性受容体又はアンタゴニストリガンドを含む共刺激経路ＣＤ８０（Ｂ７．１）又はＣＤ８６（Ｂ７．２）のアンタゴニストが挙げられる。
【０１４３】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、メトトレキサート、６−ＭＰ、アザチオプリンスルファサラジン、メサラジン、オルサラジンクロロキン／ヒドロキシクロロキン、ペニシラミン、金チオリンゴ酸塩（筋肉内及び経口）、アザチオプリン、コルヒチン、コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注射）、β２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）、キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）、クロモグリケート、ネドクロミル、ケトチフェン、イプラトロピウム及びオキシトロピウム、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸モフェチル、レフルノミド、ＮＳＡＩＤ（例えばイブプロフェン）、コルチコステロイド（例えばプレドニゾロン）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アデノシンアゴニスト、抗血栓剤、補体阻害剤、アドレナリン作動薬、炎症誘発性サイトカイン（例えばＴＮＦα又はＩＬ−１）によるシグナル伝達を妨害する物質（例えばＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）、ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（例えばＶｘ７４０）、抗Ｐ７、ｐ−セレクチン糖蛋白質リガンド（ＰＳＧＬ）、ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）阻害剤、Ｔ細胞シグナル伝達阻害剤（例えばキナーゼ阻害剤）、メタロプロテイナーゼ阻害剤、スルファサラジン、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、可溶性サイトカイン受容体とその誘導体（例えば可溶性ｐ５５又はｐ７５  ＴＮＦ受容体と誘導体ｐ７５ＴＮＦＲＩｇＧ（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））及びｐ５５ＴＮＦＲＩｇＧ（レネルセプト）、ｓＩＬ−１ＲＩ、ｓＩＬ−１ＲＩＩ、ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性ＩＬ−１３受容体（ｓＩＬ−１３））、並びに抗炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３及びＴＧＦ）等の物質と併用することもできる。所定の併用剤はメトトレキサート又はレフルノミドを含み、中等度又は重度関節リウマチの場合にはシクロスポリンを含む。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明の抗体又は抗体部分を含有することができる。「治療有効量」とは必要な用量と期間で所望治療結果を達成するために有効な量を意味する。抗体又は抗体部分の治療有効量は個体の疾患状態、年齢、性別及び体重や、抗体又は抗体合部分が個体に所望応答を誘発する能力等の因子により異なる。治療有効量は抗体又は抗体部分の有益な治療作用が毒性又は有害作用を上回る量でもある。「予防有効量」とは必要な用量と期間で所望予防結果を達成するために有効な量を意味する。典型的には、予防用量は初期疾患ステージ又はそれ以前の対象で使用するので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
【０１４５】
最適所望応答（例えば治療又は予防応答）が得られるように投与レジメンを調節することができる。例えば、単回ボーラスを投与してもよいし、時間をかけて用量を数回に分けて投与してもよいし、治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に増減してもよい。ある実施形態では、投与し易く、用量を均一にするために非経口組成物を用量単位形態に製剤化すると特に有利である。本願で使用する用量単位形態とは治療する哺乳動物対象に単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を必要な医薬担体と共に含有する。本発明の用量単位形態の仕様は（ａ）活性化合物の固有特性及び達成すべき特定治療又は予防効果と、（ｂ）個体の過敏症の治療用としてこのような活性化合物を配合する技術に内在する問題により決定され、これらの因子に直接依存する。
【０１４６】
本発明の抗体又は抗体部分の治療有効量又は予防有効量の非限定的な範囲の例は０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇ、又は０．３〜１ｍｇ／ｋｇである。なお、用量値は緩和しようとする病態の種類と重篤度により異なる。更に、当然のことながら、任意特定対象の特定投与レジメンは個体の必要と組成物の投与者又は投与監理者の専門的判断に従って時間と共に調節すべきであり、本願に記載する用量範囲は例示に過ぎず、特許請求の範囲に記載する組成物の範囲又は実施を制限するものではない。
【０１４７】
８．本発明の抗体の使用
８．１  抗ＩＬ−１３抗体の使用概論
本発明の抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分は、ＩＬ−１３と結合することができるため、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）又は組織免疫組織化学等の従来のイムノアッセイを使用して（例えばサンプルマトリックス中、ある態様では血清や血漿等の生体サンプル中で）ＩＬ−１３、ある態様ではｈＩＬ−１３を検出するために使用することができる。本発明は生体サンプル中のＩＬ−１３の検出方法として、サンプルを本発明の抗体又は抗体部分と接触させる段階と、ＩＬ−１３と結合した抗体又は未結合抗体を検出することにより、サンプル中のＩＬ−１３を検出する段階を含む方法を提供する。結合した抗体又は未結合抗体の検出を容易にするために検出可能な物質で抗体を直接又は間接的に標識する。適切な検出可能な物質としては各種酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料及び放射性材料が挙げられる。適切な酵素の例としては西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としてはストレプトアビジン／ビオチンとアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光材料の例としてはウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンが挙げられ、発光材料の１例としてはルミノールが挙げられ、適切な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが挙げられる。診断関連、例えばＩＬ−１３の上昇を伴う病態の診断にはサンプル中のＩＬ−１３の検出が有用であると思われ、及び／又は抗ＩＬ−１３抗体による治療が有効であり得る対象を同定するのに有用であると思われる。
【０１４８】
標識抗ＩＬ−１３抗体を利用する検出アッセイの代法として、例えば検出可能な物質で標識したｒｈＩＬ−１３標準と未標識抗ＩＬ−１３抗体（例えば抗ｈＩＬ−１３抗体）を利用する競合イムノアッセイによりサンプル中のＩＬ−１３を検出することができる。このアッセイでは、サンプルと、標識ｒｈＩＬ−１３標準と、抗ｈＩＬ−１３抗体を混合し、未標識抗体に結合した標識ｒｈＩＬ−１３標準の量を測定する。サンプル中のｈＩＬ−１３の量は抗ｈＩＬ−１３抗体と結合した標識ｒｈＩＬ−１３標準の量に反比例する。
【０１４９】
本発明の抗体及び抗体部分は、ＩＬ−１３活性、ある態様ではｈＩＬ−１３活性をインビトロ及びインビボで中和することができる。従って、本発明の抗体及び抗体部分は例えばＩＬ−１３を含有する細胞培養液や、本発明の抗体と交差反応するＩＬ−１３をもつヒト対象又は他の哺乳動物対象（例えばヒヒ、カニクイザル及びアカゲザル等の霊長類）においてＩＬ−１３活性を阻害するために使用することができる。ある態様において、本発明はヒトＩＬ−１３と、ヒヒＩＬ−１３、マーモセットＩＬ−１３、チンパンジーＩＬ−１３、カニクイザルＩＬ−１３及びアカゲザルＩＬ−１３から構成される群から選択される少なくとも１種の他の霊長類ＩＬ−１３の活性を中和し且つマウスＩＬ−１３の活性を阻害しない単離ヒト抗体又はその抗原結合部分を提供する。ある態様において、ＩＬ−１３はヒトＩＬ−１３である。例えば、ｈＩＬ−１３を含有する細胞培養液又は含有する疑いのある細胞培養液において、本発明の抗体又は抗体部分を培養培地に加え、培養液中のｈＩＬ−１３活性を阻害することができる。
【０１５０】
別の態様において、本発明はＩＬ−１３活性が有害である障害に罹患した対象におけるＩＬ−１３活性の阻害方法を提供する。本願で使用する「ＩＬ−１３活性が有害である障害」なる用語はこの障害に罹患した対象におけるＩＬ−１３の存在が障害の病態生理の原因であるか又は障害の増悪に寄与する因子であることが分かっているか又はその疑いのある疾患及び他の障害を包含するものとする。従って、ＩＬ−１３活性が有害である障害は、ＩＬ−１３活性の阻害が障害の症状及び／又は進行を緩和すると予想される障害である。このような障害は例えば障害に罹患した対象の体液中のＩＬ−１３濃度の上昇（例えば対象の血清、血漿、滑液等におけるＩＬ−１３濃度の上昇）により判断することができ、例えば上記のような抗ＩＬ−１３抗体を使用して検出することができる。ある態様において、抗体又はその抗原結合部分は本願に記載する疾患又は障害を治療するための療法で使用することができる。別の態様において、抗体又はその抗原結合部分は本願に記載する疾患又は障害の治療用医薬を製造するために使用することができる。ＩＬ−１３活性が有害である障害としては多数の例が挙げられる。例えば、ＩＬ−１３は免疫及び炎症要素を伴う各種疾患（限定されないが、例えば喘息や慢性閉塞性肺疾患等の呼吸器障害）に関連する病理に重要な役割を果たす。その他のＩＬ−１３関連障害としては、限定されないが、アトピー性障害（例えばアトピー性皮膚炎及びアレルギー性鼻炎）；皮膚、胃腸臓器（例えば潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病等の炎症性腸疾患（ＩＢＤ））、及び肝臓（例えば肝硬変、線維症）の炎症性及び／又は自己免疫性病態；強皮症；腫瘍又は癌（例えばホジキンリンパ腫）が挙げられる。
【０１５１】
従って、抗ＩＬ−１３抗体もしくはその抗原結合部分又はこれらをインビボ発現するベクターはＩＬ−１３の異常発現の結果としてＩＬ−１３の過剰を生じる疾患（例えば喘息又は他の炎症性及び／又は自己免疫性病態）の治療又は体外から投与したＩＬ−１３に起因する合併症の場合に処方される。
【０１５２】
８．２  呼吸器障害における抗ＩＬ−１３抗体の使用
本発明のある実施形態において、抗ＩＬ−１３抗体又はその抗原結合部分は１種以上のＩＬ−１３関連障害の治療に利用され、このような障害としては、限定されないが、呼吸器障害（例えば喘息（例えばアレルギー性及び非アレルギー性喘息（例えば、例えば幼児における例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染に起因する喘息））、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、並びに気道炎症、好酸球増加、線維化及び粘液過剰産生を伴う他の病態（例えば嚢胞性線維症及び肺線維症））が挙げられる。
【０１５３】
ある実施形態において、本願は呼吸器障害、例えば喘息（例えばアレルギー性及び非アレルギー性喘息）；アレルギー；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道炎症、好酸球増加、線維化及び粘液過剰産生を伴う病態（例えば嚢胞性線維症及び肺線維症）に関連する１種以上の症状の治療（例えば抑制、改善）又は予防方法を提供する。例えば、喘息の症状としては、限定されないが、喘鳴、息切れ、気道狭窄、気道過敏、肺活量低下、線維化、気道炎症及び粘液産生が挙げられる。前記方法は１種以上の症状を治療（例えば抑制、改善）又は予防するために十分な量のＩＬ−１３抗体又はそのフラグメントを対象に投与する段階を含む。ＩＬ−１３抗体は治療用又は予防用又はその両方に投与することができる。ＩＬ−１３アンタゴニスト（例えば抗ＩＬ−１３抗体）又はそのフラグメントは対象に単独で投与してもよいし、本願に記載する他の治療手段と併用投与してもよい。ある実施形態において、対象は哺乳動物（例えば本願に記載するようなＩＬ−１３関連障害に罹患したヒト）である。
【０１５４】
上記のように、ＩＬ−１３は喘息に関連する病理応答の誘導に中枢的役割を果たすと考えられている。しかし、別の免疫経路の他のメディエーターも喘息病因に関与しているので、ＩＬ−１３に加えてこれらのメディエーターを遮断すると、他の治療効果が得られると思われる。従って、本発明の結合蛋白質は、限定されないが、例えばＩＬ−１３と炎症誘発性サイトカイン（例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα））等の標的対と結合することが可能な二重特異性抗体に配合することができる。ＴＮＦαは喘息において炎症応答を増幅し、疾患の重篤度に関係があるらしい（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１），３１（Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ａｓｔｈｍａ，Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ＣＯＰＤ），２４７−２５０．）。従って、ＩＬ−１３とＴＮＦαを同時に遮断すると、特に重度気道疾患において有益な効果があると思われる。非限定的な１態様において、本発明の二重特異性抗体はＩＬ−１３とＴＮＦαの標的に結合し、喘息を治療するために使用される。
【０１５５】
別の態様において、  本発明の結合蛋白質はＩＬ−１３とＩＬ−１β、ＩＬ−１３とＩＬ−９、ＩＬ−１３とＩＬ−４、ＩＬ−１３とＩＬ−５、ＩＬ−１３とＤＬ−２５、ＩＬ−１３とＴＡＲＣ、ＥＬ−１３とＭＤＣ、ＩＬ−１３とＭＩＦ、ＩＬ−１３とＴＧＦ−β、ＥＬ−１３とＬＨＲアゴニスト、ＤＬ−１３とＣＬ２５、ＩＬ−１３とＳＰＲＲ２ａ、ＥＬ−１３とＳＰＲＲ２ｂ、及びＤＬ−１３とＡＤＡＭ８に結合する二重特異性抗体分子を作製するために使用することができる。本発明は更に、ＣＳＦ１（ＭＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＦＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ヒスタミン及びヒスタミン受容体、ＥＬ１Ａ、ＤＬ１Ｂ、ＢＬ２、ＩＬ３、ＥＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＥＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＥＬ１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＥＬ−２３、ＥＬ−２４、ＥＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＥＬ−２８、ＩＬ−３０、ＥＬ−３１、ＥＬ−３２、ＩＬ−３３、ＫｔＴＬＧ、ＰＤＧＦＢ、ＩＬ２ＲＡ、ＥＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ８ＲＡ、ＤＬ８ＲＢ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＥＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１８Ｒ１、ＴＳＬＰ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２４．ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＸＣＬ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸ３ＣＲ１、ＧＰＲ２、ＸＣＲ１、ＦＯＳ、ＧＡＴＡ３、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ６、ＴＢＸ２１、ＴＧＦＢ１、ＴＮＦＳＦ６、ＹＹ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＬＴＢ４Ｒ、ＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ並びにキチナーゼから構成される群から選択される喘息に関与する１種以上の標的とＩＬ−１３に結合することが可能な二重特異性抗体も提供する。
【実施例】
【０１５６】
１．抗ＩＬ−１３抗体の産生
原薬の産生バッチは産生用リアクターの１サイクルに由来する原薬のシード継代培養、産生、一次回収・捕集、及び精密精製から得られたＡＢＴ−３０８モノクローナル抗体の溶液である。
【０１５７】
１．１  培地調製
ＵＳＰ／ＥＰ／ＪＰ標準に準拠する精製水を使用し、ＧＭＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｓに従って溶液を調製する。調合培地溶液を０．１μｍフィルターで濾過し、予め滅菌した適当な寸法の容器、バッグ又はバイオリアクターに捕集する。使用後に０．１μｎｍフィルターの完全性を試験する。増殖培地と産生培地の組成を表２に示す。
【０１５８】
【表２】
0005914342.tif 000003
【０１５９】
１．２  接種材料増殖
スピナーフラスコとバイオウェーブバッグの操作を利用してＣＨＯ細胞をＭＣＢの凍結バイアル１本から１１０Ｌシードバイオリアクターの接種に望ましいバイオマスまで増殖させる。マスターセルバンクの凍結バイアルを解凍し、増殖培地（ＳＲ−５１２）に加え、遠心する。細胞を増殖培地に再懸濁し、容積を増加させながら使い捨てスピナーフラスコ又はバイオウェーブバッグで３７℃、５％  ＣＯ２にて増殖させる。２０Ｌウェーブバッグ２個を使用し、シードバイオリアクターに接種する前に２０Ｌウェーブバッグ２個を使用して最終細胞塊増殖を最大にする。両方の２０Ｌウェーブバッグからの細胞密度が約１５〜１７日目に生存細胞≧２．０×１０６個／ｍＬに達したら、更に増殖させるために、増殖培地ＳＲ−５２０を充填した１１０シードバイオリアクターに培養液を移す。接種後、目標温度を３７℃とし、ｐＨを７．１の目標値に設定し、ＮａＯＨ添加とＣＯ２スパージングにより制御する。空気と酸素のスパージングによりバイオリアクター内の溶存酸素（ＤＯ）を４０％の目標値に制御する。約２〜４日後に細胞密度が生存細胞≧２．６×１０６個／ｍＬに達したら、培養液を３０００Ｌ産生用バイオリアクターに移す。
【０１６０】
１．３  ショートフィルバイオリアクター
３０００Ｌ産生用バイオリアクターの部分フィルを使用して細胞培養液を更に増殖させる。先ず、リアクターに増殖培地（ＳＲ−５２０）を仕込み、１１０Ｌシードバイオリアクターからのバッチを接種する。
【０１６１】
このショートフィル段階中は、温度、溶存酸素及びｐＨを夫々３７℃、４０％及び７．１に制御する。培養ｐＨはＣＯ２スパージングとＮａＯＨ添加により制御する。典型的には、細胞は必要な密度である生存細胞≧１．６×１０６個／ｍＬに達する前に２〜４日間増殖する。
【０１６２】
１．４  産生用バイオリアクター
産生培地ＳＲ−５２１（１９５０Ｌ）を３０００Ｌバイオリアクター内の細胞培養液に加え、産生段階を開始する。消泡剤Ｃを加えて発泡を抑える。ＣＯ２スパージングとＮａＯＨ添加のオンオフにより培養ｐＨを６．９の目標値に制御する。温度と溶存酸素を夫々３５℃と４０％の目標値に制御する。バイオリアクター内のＤＯは先ず空気スパージングにより所望値に制御した後、必要に応じて純水素を補充する。生存細胞密度が≧３．０×１０６個／ｍＬに達したら、温度を３３℃の目標値まで下げ、ｐＨとＤＯを夫々６．９と４０％の目標値に維持する。必要に応じてグルコース（ＳＲ−３３４）を加える。細胞生存率が≦５０％まで低下したら、培養液を回収する。
【０１６３】
１．５  工程性能
工程性能及びインプロセス試験結果を表３及び表４に示す。
【０１６４】
【表３】
0005914342.tif 000004
【０１６５】
【表４】
0005914342.tif 000005
【０１６６】
２．抗ＩＬ−１３抗体の単離・精製
一次回収・捕集操作は、濾過による回収液の清澄化、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによる抗体の捕集、及び低ｐＨウイルス不活性化と、その後の深層濾過を含む。精密精製操作はアニオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ウイルス濾過、限外濾過／透析濾過、並びに最終濾過、ボトリング及び凍結を含む。
【０１６７】
２．１  溶液の調製
ＵＳＰ精製水（ＵＳＰ−ＰＷ）又は注射用水（ＷＦＩ）を使用し、ＧＭＰ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄｓに従って溶液を調製する。大半の溶液を０．２μｍフィルターで濾過し、放射線照射済みバッグ、オートクレーブ滅菌済み又は現場蒸気処理済み容器に捕集する。
【０１６８】
２．２  一次回収及び清澄化
濾過による一次回収の目的は、産生用バイオリアクター回収液から細胞及び細胞破片を除去することである。未処理回収液をデプスフィルター、デリピッドデプスフィルター及びメンブレンフィルターから構成されるフィルター列に通す。清澄化上清を回収液槽に捕集し、２〜８℃に維持する。清澄化した回収液のインプロセス制御はＰｏｒｏｓ  ＡクロマトグラフィーによるＡＢＴ−３０８濃縮、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１６９】
２．３  プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの目的は、清澄化した回収液からＡＢＴ−３０８を捕集し、工程関連不純物を低減することである。回収液全体を処理するために典型的には３クロマトグラフィーサイクルを実施する。後続処理のために３サイクルからの生成物プールを集める。
【０１７０】
直径４５ｃｍ×長さ２２ｃｍのカラム（３５Ｌ）にＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を充填し、使用できるようにする。ＵＳＰ精製水（ＵＳＰ−ＰＷ）後に０．２Ｍ酢酸を使用し、最後にＵＳＰ  ＰＷでリンスすることにより保存バッファーをカラムから除去する。カラムを２５ｍＭトリス，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で平衡化後、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）プロテインＡ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の場合には蛋白質３２ｇ／Ｌ樹脂、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）樹脂の場合には蛋白質４５ｇ／Ｌ樹脂の最大値まで清澄化した回収液をロードする。カラムを２５ｍＭトリス，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２、次いで２０ｍＭクエン酸ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０で洗浄後、最後に２５ｍＭトリス，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２で再び洗浄する。０．１Ｍ酢酸，ｐＨ３．５でカラムから抗体を溶出させる。各サイクル後、必要に応じて溶出液プールのｐＨを４．１の目標値に調整する。インプロセス制御はＡ２８０による蛋白質濃度の測定、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１７１】
第１サイクル後、カラムを０．２Ｍ酢酸で再生し、ＵＳＰ−ＰＷでリンスする。第２サイクル後、カラムを０．２Ｍ酢酸で再生し、ＵＳＰ−ＰＷでリンスした後、０．１Ｍ酢酸、２０％エタノールで消毒後、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０％エタノール，ｐＨ５で洗浄・短期間保存する。第３サイクル後、カラムを０Ｍ酢酸で再生し、ＵＳＰ−ＰＷでリンスする。その後、０．４Ｍ酢酸，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０で洗浄後、ＵＳＰ−ＰＷで洗浄し、次いで５０ｍＭ  ＮａＯＨ  １．０Ｍ  ＮａＣｌで洗浄後、ＵＳＰ−ＰＷで洗浄する。最後に、０．１Ｍ酢酸，２０％エタノールで消毒後、５０ｍＭ酢酸，２０％エタノール，ｐＨ５．０で洗浄・保存する。
【０１７２】
２．４  低ｐＨインキュベーション及び濾過
低ｐＨインキュベーションは、プロテインＡ溶出液中に存在する可能性のある外来エンベロープウイルスの不活性化によりウイルス安全性を更に確実にする専用ウイルス低減工程である。低ｐＨインキュベーション後の濾過の目的は低ｐＨ処理中に形成される可能性のある沈殿を除去することである。
【０１７３】
集めたプロテインＡクロマトグラフィー溶出液のｐＨを０．５Ｍリン酸で３．５の目標値に調整し、１８〜２５℃に６０〜７０分間維持する。次に、混合物を１Ｍトリス，ｐＨ１０でｐＨ５に調整し、デプスフィルターとメンブレンフィルターの併用により清澄化した後、１０〜１４℃まで冷却する。低ｐＨ処理・濾過工程のインプロセス制御はＡ２８０による蛋白質濃度の測定、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１７４】
２．５  一次回収・捕集工程性能
一次回収・捕集操作の工程性能を表５に示し、インプロセス制御の結果を表６に示す。
【０１７５】
【表５】
0005914342.tif 000006
【０１７６】
【表６】
0005914342.tif 000007
【０１７７】
２．６  強アニオン交換クロマトグラフィー
強アニオン交換クロマトグラフィー工程の目的は、宿主細胞蛋白質、ＤＮＡ及び内毒素等の工程関連不純物を低減することである。この工程は、ウイルス除去工程も兼用できる。ある実施形態では、抗体がカラムを通過し、不純物が樹脂に保持されるフロースルーモードでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ樹脂カラムを操作し、代替態様では、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ樹脂カラムの代わりにＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（登録商標）メンブレン（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）を利用する。操作は１０〜１４℃で実施する。
【０１７８】
直径４５ｃｍ×長さ２２ｃｍのカラム（３５Ｌ）にＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填し、使用できるようにする。カラムを２５ｍＭトリス，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０で平衡化する。中和・濾過した不活性化溶液のｐＨを１Ｍトリス，ｐＨ１０で８．０に調整し、導電率を５．０〜６．５に調整し、溶液をデリピッド及びメンブレンフィルターで濾過する。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ロードを蛋白質８０ｇ／Ｌ樹脂の最大ロードでカラムにポンプ導入する。ロード後、カラムを２５ｍＭトリス，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．０で洗浄し、フロースルーと洗浄液を合わせる。これをＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）フロースルー・洗浄液（ＱＦＴＷ）プールとする。Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）工程のインプロセス制御はＡ２８０による濃度、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１７９】
カラムを２５ｍＭリン酸ナトリウム，１．０Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０で再生した後、ＷＦＩでリンスし、１．０Ｍ  ＮａＯＨで消毒後、ＷＦＩでリンスする。次にカラムを２５ｍＭリン酸ナトリウム，１．０Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０で中和し、２５ｍＭリン酸ナトリウム，２０％イソプロパノール，ｐＨ７．０中で保存する。
【０１８０】
２．７  疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）工程の目的は、ＡＢＴ−３０８凝集物、フラグメント及び工程関連不純物を除去することである。操作は１０〜１４℃で実施する。
【０１８１】
直径６０ｃｍ×長さ１５ｃｍのカラム（４２Ｌ）にＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填し、使用できるようにする。カラムをＷＦＩ、次いで２０ｍＭリン酸ナトリウム，１．１Ｍ硫酸アンモニウム，ｐＨ７．０で平衡化する。
【０１８２】
Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）フロースルー及び洗浄液を４０ｍＭリン酸ナトリウム，２．２Ｍ硫酸アンモニウム，ｐＨ７．０で１：１（ｖ／ｖ）に希釈する。この溶液即ちＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ロードを０．２μｍフィルターで濾過し、蛋白質６４ｇ／Ｌ樹脂の最大ロードでカラムにロードする。カラムを２５ｍＭリン酸ナトリウム，１．４Ｍ硫酸アンモニウム，ｐＨ７．０で洗浄し、ＡＢＴ−３０８を１１ｍＭリン酸ナトリウム，０．６２５Ｍ硫酸アンモニウム，ｐＨ７．０でカラムから溶出させる。Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）工程のインプロセス制御はＡ２８０による濃度、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１８３】
カラムをＷＦＩで再生した後、１Ｍ  ＮａＯＨで消毒し、ＷＦＩでリンスし、２５ｍＭリン酸ナトリウム，２０％イソプロパノール，ｐＨ７中で保存する。
【０１８４】
２．８  ナノ濾過
ナノ濾過は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰカラム溶出液中に存在する可能性のある直径≧２０ｎｍの外来ウイルスの物理的除去によりウイルス安全性を更に確実にする専用ウイルス除去工程である。操作は１０〜１４℃で実施する。
【０１８５】
１５ｍＭヒスチジン，ｐＨ５．６で予め湿潤させた０．１μｍフィルターとＵｌｔｉｐｏｒ  ＤＶ２０  フィルター列にＰｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨＰカラム溶出液を通す。濾過後、フィルター列を１５ｍＭヒスチジン，ｐＨ５．６でフラッシュし、保持されたＡＢＴ−３０８を回収する。使用後、ＤＶ２０フィルターで完全性試験を実施し、フィルターを捨てる。フィルターが完全性試験に合格しない場合には、溶液を上記のように再濾過すればよい。ナノ濾過工程のインプロセス制御はＡ２８０による濃度、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１８６】
２．９  限外濾過／透析濾過によるＡＢＴ−３０８原薬の製剤化
ＵＦ／ＤＦ工程の目的は、原薬を最終製剤化バッファーである１５ｍＭヒスチジン，ｐＨ５．６で透析濾過し、ＡＢＴ−３０８を濃縮することである。これらの操作は１０〜１４℃で実施する。
【０１８７】
３０ｋＤａ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホンメンブレンを使用してナノ濾液を約５０ｇ／Ｌまで濃縮し、製剤化バッファーで透析濾過した後、約１８０ｇ／Ｌまで濃縮する。ＵＦシステムから生成物を取出し、透析濾過バッファーでリンスし、システム内に生成物が残っている場合には回収する。濃縮液と洗浄液を合わせ、約１２０〜１６０ｇ／Ｌの濃度の透析濾過ＡＢＴ−３０８を生成する。濃縮したＡＢＴ−３０８をメンブレンフィルターで濾過する。限外濾過／透析濾過工程のインプロセス制御はＡ２８０による濃度、ＳＥ−ＨＰＬＣ、バイオバーデン及び内毒素試験を含む。
【０１８８】
各回の試験後、限外濾過システムをＷＦＩでフラッシュし、２５０ｐｐｍ次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄後、０．１Ｍ水酸化ナトリウムで消毒・保存する。
【０１８９】
２．１０  最終濾過、ボトリング及び凍結
濾過・ボトリング操作は、クラス１００層流フード下にクラス１００領域で２〜８℃にて実施する。製剤化したＡＢＴ−３０８を０．２μｍフィルターで濾過し、予め滅菌したパイロジェンフリーＰＥＴＧボトルに捕集する。ラベルを付けたボトルを凍結するまで空の−８０℃（公称値）冷凍庫に入れた後、−８０℃（公称値）に維持した保存用冷凍庫に移す。最終濾過・ボトリング工程のインプロセス制御はＡ２８０、バイオバーデン及び内毒素試験（原薬試験結果）を含む。
【０１９０】
２．１１  精密精製工程性能
一次回収・捕集操作の工程性能を表７に示し、インプロセス制御結果を表８に示す。
【０１９１】
【表７】
0005914342.tif 000008
【０１９２】
【表８】
0005914342.tif 000009
【０１９３】
３．抗体組成物中の宿主細胞蛋白質濃度の測定
この工程は、抗体サンプル中の残留宿主細胞蛋白質濃度の測定試験方法に関する。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して宿主細胞蛋白質（抗原）を２層の特異的抗体の間にサンドイッチする。その後、非特異的部位をカゼインでブロックする。次に宿主細胞蛋白質をインキュベートすると、この間に抗原分子は第１の抗体（コーティング抗体）により捕集される。次に抗原（宿主細胞蛋白質）と結合する第２の抗体（ビオチン化抗宿主細胞蛋白質）を加える。ビオチン化抗宿主細胞蛋白質と結合するニュートラアビジンＨＲＰ−コンジュゲートを加える。次にＫ−Ｂｌｕｅ基質を加える。発色基質は結合した酵素共役抗体により加水分解され、青色を発色する。２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で反応を停止すると、黄色に変色する。色強度はウェル内で結合した抗原の量に正比例する。
【０１９４】
５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー），ｐＨ９．４の調製。１ＬビーカーにミリＱ水９００ｍＬ、重炭酸ナトリウム４．２０ｇ±０．０１ｇを加える。完全に溶解するまで撹拌する。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで９．４に調整する。１Ｌメスフラスコに移し、ミリＱ水を補充する。均質になるまで反転により混合する。０．２２μｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。調製日から７日間まで公称値４℃で保存する。
【０１９５】
０．１０４Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．３７Ｍ  ＮａＣｌ，０．０２７Ｍ  ＫＣｌ，０．０１７６Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝６．８〜６．９（１０×ＰＢＳ）の調製。ミリＱ水約４００ｍＬをガラスビーカーに加える。Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  １３．９４ｇ±０．０１ｇを加える。ＮａＣｌ  ４０．０ｇ±０．１ｇを加える。ＫＣｌ  １．００ｇ±０．０１を加える。ＫＨ２ＰＯ４  １．２０ｇ±０．０１ｇを加える。均質になるまで撹拌する。５００ｍＬメスフラスコに移す。ミリＱ水を補充して５００ｍＬにする。反転により混合する。０．２μｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。室温で７日間まで保存する。
【０１９６】
１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００，ｐＨ７．４０（プレート洗浄バッファー）の調製。４Ｌメスシリンダー内で１０×ＰＢＳ（ステップ５．２）４００ｍＬをミリＱ水３５００ｍＬと混合する。ｐＨをチェックし、必要に応じて１Ｎ  ＨＣｌ又は１Ｎ  ＮａＯＨで７．４０±０．０５に調整する。ミリＱ水を補充する。シリンダーをパラフィルムで密閉し、均質になるまで反転により混合する。４Ｌボトルに移す。１×ＰＢＳ  ４ｍＬを取り出し、捨てる。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍの１×ＰＢＳに加える。撹拌プレートにセットし、完全に溶解するまで撹拌する。希釈バッファー調製に必要な量のプレート洗浄バッファーを０．２２μｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。室温で７日間まで保存する。
【０１９７】
コーティング抗体混合物：アフィニティー精製ヤギ抗ＣＨＯ  ５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０１＠１．５３４ｍｇ／ｍＬ）の調製（注：バイアルに入れて−８０℃で保存したストック）。アリコートを調製する。使用時にプレート１枚当たりアリコート１個を取出す。使用直前に、抗体混合物を最終濃度４μｇ／ｍＬとなるように冷温５０ｍＭ重炭酸ナトリウムで次のように希釈する。例えば、コーティング抗体混合物３１μＬを冷温コーティングバッファー１１９６９μＬに加える。反転により穏やかに混合する。
【０１９８】
ビオチン化ヤギ抗宿主細胞蛋白質混合物５９９／６２６／７４８（ロット＃Ｇ１１２０２＠０．８２２ｍｇ／ｍＬ）の調製（注：バイアルに入れて−８０℃で保存したストック）。アリコートを調製する。使用時にプレート１枚当たりアリコート１個を取出す。使用直前に、ビオチン化抗体混合物を最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように３７℃±２℃カゼインで次のように希釈する。例えば、ビオチン化抗体混合物１４．６μＬを３７℃±２℃カゼイン１１９８５μＬに加える。反転により穏やかに混合する。
【０１９９】
ニュートラアビジン−ＨＲＰの調製。新規ロット（２ｍｇ／バイアル）を次のように１ｍｇ／ｍＬまで再構成する。ミリＱ水４００μＬをバイアルに加えた後、１×ＰＢＳ  １６００μＬを加え、合計２ｍＬとする。穏やかにボルテックスして混合する。公称値−２０℃で保存する。プレート１枚当たりアリコート１個を使用するように所望体積のアリコートを調製する。ポリプロピレンチューブ内で調製する。ワーキング濃度を決定するように新規ロットを適格化する。調製日から６カ月間の期日を指定する。例えば、ワーキング濃度が０．２μｇ／ｍＬと決定されたならば、以下のように調製する。使用直前にニュートラアビジン−ＨＲＰのアリコートを室温で解凍する。１ｍｇ／ｍＬニュートラアビジン溶液を３７℃±２℃カゼインで０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）まで希釈する。例えば、１０倍に希釈し、ニュートラアビジン５０μＬをカゼイン４５０μＬに加える。穏やかにボルテックスして混合する。更に１００μｇ／ｍＬ溶液を３７℃±２℃カゼインで０．２μｇ／ｍＬまで希釈する。例えば、５００倍に希釈し、ニュートラアビジン（１００μｇ／ｍＬ）２４μＬをカゼイン１１９７６μＬに加える。穏やかにボルテックスして混合する。
【０２００】
５．７  ２Ｍリン酸（停止溶液）の調製。濃リン酸から２Ｍリン酸溶液を次のように調製する。ラベルに記載されたリン酸％、密度（１．６８５ｇ／ｍＬ）及び製剤重量（９８ｇ／モル）から、２Ｍリン酸５００ｍＬを調製するために必要な濃リン酸の体積を計算する。上記のように計算した体積の濃リン酸をフラスコに加える。ミリＱ水を補充し、均質になるまで反転により混合する。調製日から６カ月間まで周囲温度で保存する。
【０２０１】
希釈バッファー（１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００，ｐＨ７．４で１００倍に希釈したカゼイン）の調製。（上記からの）０．２２μｍで滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００，ｐＨ７．４で３７℃±２℃カゼインを１００倍に希釈する。例えば、０．２２μｍで滅菌濾過した１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００（ｐＨ７．４）９９ｍＬに３７℃±２℃カゼイン１ｍＬを加える。よく混合する。使用毎に新たに調製する。
【０２０２】
標準の調製。宿主細胞蛋白質標準（抗原標準）（ロット＃Ｇ１１２０３＠１．２１８ｍｇ／ｍＬ）（注：７０μＬアリコートとして公称値−８０℃で保存したストック）。アリコートを室温で解凍する。希釈バッファーを使用してポリプロピレンチューブ内で系列希釈を実施する。
【０２０３】
サンプルの調製。ポリプロピレンチューブ内で最終バルクサンプルを希釈バッファーで２４ｍｇ／ｍＬまで希釈する。濃度を記録する。注：下記溶液を使用してスパイクサンプルを調製し、下記１２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製する。ポリプロピレンマイクロチューブ内で更に２４ｍｇ／ｍＬ溶液を希釈バッファーで１２ｍｇ／ｍＬまで希釈する。１２ｍｇ／ｍＬ溶液を各々プレート上の３個のウェルにロードし、合計６個のウェルにロードする。
【０２０４】
スパイクの調製。ポリプロピレンマイクロチューブ内で希釈バッファーで２倍に希釈することにより上記に調製した２０ｎｇ／ｍＬ標準から１０ｎｇ／ｍＬ宿主細胞蛋白質スパイクを調製する。１０ｎｇ／ｍＬスパイク溶液を各々プレート上の３個のウェルにロードする。サンプルをスパイクするためにステップ６．１からの２０ｎｇ／ｍＬ標準溶液を使用する。
【０２０５】
スパイクサンプルの調製。ポリプロピレンマイクロチューブ内で２４ｍｇ／ｍＬ最終バルク溶液各３００μＬを２０ｎｇ／ｍＬスパイク溶液（６．１）３００μＬでスパイクする。スパイクサンプル溶液を各々３個のウェルにロードし、合計６個のウェルにロードする。
【０２０６】
対照の調製。日常的試験で使用する前に全新規対照ストック溶液に対照範囲を設定する必要がある。対照ストック：ＡＢＴ−３０８原薬濃縮液バッチの１５０μＬアリコートを調製し、３年間まで公称値−８０℃で凍結保存する。
【０２０７】
ワーキング対照の調製。対照のアリコートを室温で解凍する。ポリプロピレンチューブ内で対照を希釈バッファーで２４ｍｇ／ｍＬまで希釈する。ポリプロピレンマイクロチューブ内で更に２４ｍｇ／ｍＬ対照溶液を希釈バッファーで１２ｍｇ／ｍＬまで希釈する。単一希釈液を調製し、対照をプレートの３個のウェルにロードする。
【０２０８】
ＥＬＩＳＡ手順。プレート洗浄ボトルにプレート洗浄バッファーを充填する（ステップ５．３参照，１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００）。プレートウォッシャーを起動する。以下のパラメーターをチェックする。パラメーターは以下のように設定すべきである：プレートタイプ：各サイクルで１（合計５サイクル）；体積：４００μＬ；浸漬時間：１０秒；吸引時間：４秒。
【０２０９】
アッセイ手順。冷温５０ｍＭ重炭酸ナトリウム中４μｇ／ｍＬヤギコーティング抗体混合物１００μＬ／ウェルでプレートをコーティングする。コーティング溶液がウェルの底を均等に覆うまでプレートの側面をタッピングし、シーリングテープを貼り付け、プレートシェーカー（又は同等手段）速度３にて１８時間±１時間振盪しながら公称温度４℃でインキュベートする。一晩インキュベーション後、プレートを冷蔵庫から取り出し、室温で平衡化させる。コーティングを振り払う。プレートをペーパータオルで拭う。３７℃±２℃カゼイン３００μＬ／ウェルでブロックし、シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。ブロッキングインキュベーション中に標準、サンプル、対照、スパイク及びスパイクサンプルを調製する。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。８チャネルピペットを使用し、標準、サンプル、スパイク、スパイクサンプル及び対照１００μＬ／ウェルをプレートの３個のウェルに分注する。ブランクとしてプレートの全ての空のウェルに希釈バッファー１００μＬ／ウェルをピペットで分注する。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。テンプレートを作成し、プレートにロードする際のガイドとして使用する。
【０２１０】
プレートリーダー設定。テンプレートを設定し、標準用濃度を入力する。サンプル、対照、スパイク又はスパイクサンプルの希釈係数は入力しない。希釈剤を加えたウェルを全ウェルから差し引くブランクとして割り当てる。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。ビオチン化ヤギ抗体１００μＬ／ウェルを加える。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。ニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液１００μＬ／ウェルを加える。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。プレートを洗浄バッファーで５回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。冷温Ｋ−Ｂｌｕｅ基質１００μＬ／ウェルを加え、シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅタイタープレートシェーカー（又は同等手段）で速度３にて振盪しながら室温で１０分間インキュベートする（基質を最初の行に添加後、すぐにタイマーをスタートする）。２Ｍリン酸１００μＬ／ウェルを加えることにより反応を停止する（ステップ５．７）。プレートをプレートシェーカーにセットし、速度３で３〜５分間振盪する。プレートを４５０ｎｍで読取る。
【０２１１】
データ解析及び計算。注：光学密度が標準曲線の実際の定量限界（２．５ｎｇ／ｍＬ標準）内にあり且つ下記％ＣＶ又は％差条件を満たすサンプル、スパイク、スパイクサンプル及び対照のみが許容される。サンプルＯＤが２．５ｎｇ／ｍＬ標準に達しない場合には、結果を２．５ｎｇ／ｍＬ未満と報告する。その後、この数値を希釈後のサンプル濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割り、数値（ｎｇ／ｍｇ）を報告する。サンプルの宿主細胞濃度が高く、非スパイク及び／又はスパイクサンプルが標準曲線を上回る場合には、数値を＞１００ｎｇ／ｍＬと報告する。その後、この数値を希釈後のサンプル濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）で割り、数値（ｎｇ／ｍｇ）を報告する。サンプルが２．５ｎｇ／ｍＬ標準を下回る場合には、スパイク回収率計算のサンプル値をゼロとみなす。
【０２１２】
標準曲線。標準濃度をプロトコルテンプレートに入力する。二次曲線フィットを使用する。測定係数は０．９９でなければならず、３個のウェル間の％ＣＶは２０％でなければならない。この条件を満たさない場合には、標準を１本（１レベル，ウェル３個）下げることができる。１．２５ｎｇ／ｍＬ下げる場合には、光学密度が２．５ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬ（残りの標準曲線の点）光学密度以内のサンプル及びスパイクサンプルのみが許容可能である。更に、各標準レベルの３個について、１個のウェルが明白に汚染されているか又は結合度が低い場合には、このウェルを下げることができる。１個のウェルを標準レベルから下げる場合には、残りの２個は％差＝２０％でなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示す最低標準の％ＣＶは３０％でなければならない。ウェル１個を下げる場合には、残りの２個の％差は３５％でなければならない。最低標準を下げる場合には、光学密度が残りの標準曲線レベル光学密度以内にあるサンプル及びスパイクサンプルのみが許容可能である。
【０２１３】
サンプル。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。３個のウェル間の％ＣＶを報告する。各サンプル希釈液から１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。注：非スパイクサンプルＯＤが２．５ｎｇ／ｍＬ標準ＯＤを下回る場合には、％差条件は非スパイク結果に適用されない。上記計算参照。
【０２１４】
平均（ｎｇ／ｍＬ）値から実際の宿主細胞濃度（ｎｇ／ｍｇ）を次のように計算する：ＣＨＯ宿主細胞蛋白質（ｎｇ／ｍｇ）＝平均「非スパイクサンプル結果（ｎｇ／ｍＬ）」／希釈後のサンプル濃度（１２ｍｇ／ｍＬ）。
【０２１５】
スパイク。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。％ＣＶを記録する。スパイクから１個のウェルを下げることができる。残りの点は％差＝２０％でなければならない。上記計算参照。宿主細胞濃度（ｎｇ／ｍＬ）を報告する。この結果をスパイク回収率計算で使用する。各スパイクに得られる濃度（ｎｇ／ｍＬ）は理論スパイク濃度の±２０％でなければならない。結果を記録し、合否を判定する。スパイク結果が理論値の２０％以内にない場合には、アッセイを繰返す必要がある。平均スパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００は１００％±２０％  １０ｎｇ／ｍＬでなければならない。
【０２１６】
スパイクサンプル。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。３個のウェル間の％ＣＶを記録する。各スパイクサンプル希釈液から１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。上記計算参照。各希釈液の「スパイクサンプル結果」（ｎｇ／ｍＬ）を報告する。２種類の希釈液間の％差を記録する。希釈液間の％差は２５％でなければならない。これらの結果をスパイク回収率計算で使用する。
【０２１７】
下式を使用して各希釈液セットの％スパイク回収率を計算する：％スパイク回収率＝スパイクサンプル値−非スパイクサンプル値×１００。スパイク値。注：（１）非スパイクサンプル値ＯＤが２．５ｎｇ／ｍＬ標準を下回る場合には、％スパイク回収率計算において数値をゼロとみなす。各サンプルの各希釈液の％スパイク回収率は１００％±５０％（５０％〜１５０％）でなければならない。結果と合否を記録する。
【０２１８】
対照。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。％ＣＶ結果を記録する。対照からの１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。上記計算参照。対照の宿主細胞濃度を報告する（ｎｇ／ｍＬ）。宿主細胞濃度（ｎｇ／ｍｇ）を次のように計算する：宿主細胞蛋白質（ｎｇ／ｍｇ）＝対照宿主細胞蛋白質結果（ｎｇ／ｍＬ）。
【０２１９】
４．抗体組成物中のプロテインＡ濃度の測定
このＥＬＩＳＡでは、プレートをニワトリ抗プロテインＡでコーティングし、インキュベートする。非特異的部位をＰＢＳ中カゼインでブロックする。プレートを１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００で洗浄し、未結合材料を除去する。サンプルとＣｙｓ−プロテインＡ標準を１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ＋１０％カゼインで希釈する。９５℃±２℃に加熱することにより溶液を変性させ、プロテインＡを抗体から分離する。ある実施形態において、例えば（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する場合には、溶液をプレートに加え、インキュベートする。代替態様において、例えば、プロテインＡアフィニティー工程がＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用する場合には、溶液を冷却し、０．８５％  ＮａＣｌ＋１２．５％  １Ｎ酢酸＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を各チューブに加え（１：１）、サンプル蛋白質からプロテインＡを更に分離し易くする。チューブを激しくボルテックスし、インキュベートし、遠心する。上清を取り出し、更に処理する。未結合材料を１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−Ｉ００で洗い流す。ビオチン化ニワトリ抗プロテインＡをマイクロタイタープレートに加え、インキュベートする。プレートを洗浄して未結合材料を除去し、ニュートラアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを加える。
【０２２０】
ニュートラアビジンはウェルと結合したビオチン化ニワトリ抗プロテインＡと結合する。プレートを再び洗浄し、未結合ニュートラアビジンを除去し、Ｋ−Ｂｌｕｅ（テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））基質をプレートに加える。基質は結合したニュートラアビジンにより加水分解され、青色を発色する。リン酸で反応を停止すると、黄色に変色する。ウェル内の黄色の強度はウェル内に存在するプロテインＡの濃度に正比例する。
【０２２１】
試薬及び溶液の調製。カゼインボトルを３７℃±２℃に加温し、２分間超音波処理し、分取する。アリコートを公称値４℃で保存する。アッセイを実施する場合には、必要数のカゼインアリコートを３７℃±２℃にする必要がある。コーティングバッファーと基質は冷温で使用する（使用直前に公称値４℃から取出す）。
【０２２２】
５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（コーティングバッファー），ｐＨ９．４。１ＬビーカーにミリＱ水９００ｍＬ、重炭酸ナトリウム４．２０ｇ±０．０１ｇを加える。完全に溶解するまで撹拌する。ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨで９．４に調整する。１Ｌメスフラスコに移し、ミリＱ水を補充する。均質になるまで反転により混合する。０．２２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。調製日から７日間まで公称値４℃で保存する。
【０２２３】
１０４Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．３７Ｍ  ＮａＣｌ，０．０２７Ｍ  ＫＣｌ，０．０１７６Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ＝６．８〜６．９（１０×ＰＢＳ）の調製。ミリＱ水約４００ｍＬをガラスビーカーに加える。Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ  １３．９４ｇ±０．０１ｇを加える。ＮａＣｌ  ４０．０ｇ±０．１ｇを加える。ＫＣｌ  １．００ｇ±０．０１ｇを加える。ＫＨ２ＰＯ４  １．２０ｇ±０．０１ｇを加える。均質になるまで撹拌する。５００ｍＬメスフラスコに移す。ミリＱ水を補充して５００ｍＬにする。反転により混合する。０．２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。調製日から７日間まで室温で保存する。
【０２２４】
１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００，ｐＨ７．４０（プレート洗浄バッファー）。４Ｌメスシリンダー内で１０×ＰＢＳ（上記参照）４００ｍＬをミリＱ水３５００ｍＬと混合する。ｐＨをチェックし、必要に応じて１Ｎ  ＨＣｌ又は１Ｎ  ＮａＯＨで７．４０±０．０５に調整する。ミリＱ水を補充する。シリンダーをパラフィルムで密閉し、均質になるまで反転により混合する。４Ｌボトルに移す。１×ＰＢＳ  ４ｍＬを取り出し、捨てる。４ｍＬのトリトンＸ−１００を３９９６ｍＬの１×ＰＢＳに加える。撹拌プレートにセットして撹拌し、完全に溶解させる。室温で７日間まで保存する。
【０２２５】
ニワトリ抗プロテインＡコーティング抗体。使用時にプレート１枚当たり抗体アリコート１個を取出す。新規ロットのニワトリ抗プロテインＡを適格化するためには、（同一ロットのコーティングから調製した）ニワトリ抗プロテインＡ−ビオチンコンジュゲートを同時に使用・適格化する必要があると思われる。使用直前に抗体混合物をコーティング適格化中に決定された濃度まで冷温５０ｍＭ重炭酸ナトリウムで希釈する。例えば、適格化中にプレートにロードするコーティング濃度が６μｇ／ｍＬと決定され、ストック濃度が３０００μｇ／ｍＬであるならば、コーティング抗体２４μＬを冷温コーティングバッファー１１９７６μＬに加える。反転により穏やかに混合する。
【０２２６】
ビオチン化ニワトリ抗プロテインＡ。使用時にプレート１枚当たり抗体アリコート１個を取出す。新規ロットのニワトリ抗プロテインＡ−ビオチンコンジュゲートを適格化するためには、コンジュゲートの作製に使用した同一ロットのニワトリ抗プロテインＡと同時に使用・適格化する必要があると思われる。使用直前にビオチン化抗体をビオチン化抗体適格化中に決定された濃度まで３７℃±２℃カゼインで希釈する。例えば、適格化中にプレートにロードするビオチン化抗体濃度が４μｇ／ｍＬと決定され、ストック濃度が１０００μｇ／ｍＬであるならば、ビオチン化抗体４８μＬを３７℃±２℃カゼイン１１９５２μＬに加える。反転により穏やかに混合する。
【０２２７】
ニュートラアビジン−ＨＲＰ。新規ロット（２ｍｇ／バイアル）を次のように１ｍｇ／ｍＬまで再構成する。ミリＱ水４００μＬをバイアルに加えた後、１×ＰＢＳ  １６００μＬを加え、合計２ｍＬとする。穏やかにボルテックスして混合する。公称値−８０℃で保存する。プレート１枚当たりアリコート１個を使用するように所望体積のアリコートを調製する。ポリプロピレンチューブ内で調製する。調製日から６カ月間の期日を指定する。例えば、ワーキング濃度が０．１μｇ／ｍＬと決定されたならば、以下のように調製する。使用直前にニュートラアビジン−ＨＲＰのアリコートを室温で解凍する。１ｍｇ／ｍＬニュートラアビジン溶液を３７℃±２℃カゼインで０．０１ｍｇ／ｍＬ（１０μｇ／ｍＬ）まで希釈する。例えば、１０倍に希釈し、ニュートラアビジン５０μＬをカゼイン４５０μＬに加える。穏やかにボルテックスして混合し、再び１０倍に希釈し、１０倍ニュートラアビジン希釈液１００μＬをカゼイン９００μＬに加える。穏やかにボルテックスして混合する。更に１０μｇ／ｍＬ溶液を３７℃±２℃カゼインで０．１μｇ／ｍＬまで希釈する。例えば、１００倍に希釈し、ニュートラアビジン（１０μｇ／ｍＬ）１２０μＬをカゼイン１１８８０μＬに加える。数回穏やかに反転して混合する。
【０２２８】
停止溶液（購入した１Ｎリン酸を使用する）。入手日から１年間まで周囲温度で保存する。希釈バッファー（１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ１００＋１０％カゼイン，ｐＨ７．４）。（ステップ５．３からの）１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ１００（ｐＨ７．４）８６ｍＬをビーカー又はフラスコに加え、４ｍＬのトリトンＸ−１００を加え、ブロッカーカゼインＰＢＳ溶液１０ｍＬを加え、撹拌し、溶解／混合する。トリトンを溶解させるには２０〜３０分間かかると思われる。これは１×ＰＢＳ＋４．１％トリトンＸ１００＋１０％カゼイン，ｐＨ７．４溶液に等しい。０．２２ＣＡμｍ滅菌フィルターユニットで濾過する。使用毎に新たに調製する。プレート１枚にはこれで十分である。
【０２２９】
プロテインＡ標準（抗原標準）。注：７０μＬアリコートとして公称値−２０℃で保存したストック。アリコートを氷上で解凍する。製造業者のＣＯＡに記載されている濃度で希釈バッファー（上記参照）を使用してポリプロピレンチューブ内で下表の例に従って系列希釈を実施する。例えば、ストック濃度が２．１ｍｇ／ｍＬ（２１０００００ｎｇ／ｍＬ）であるとＣＯＡに記載されている場合には、サンプルを氷上で解凍する。ポリプロピレンマイクロ遠心管内で最終バルクサンプルを希釈バッファー（上記）で２０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。別々に２回希釈を行う。濃度を記録する。下記溶液を使用してスパイクサンプルを調製し、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製する。ポリプロピレンマイクロ遠心管内で、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を更に希釈バッファーで１０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。
【０２３０】
スパイクの調製。ポリプロピレンマイクロ遠心管内で、希釈バッファーで２倍に希釈することにより、上記ステップ６．１で調製した０．５９３ｎｇ／ｍＬ標準から０．２９６ｎｇ／ｍＬプロテインＡスパイクを調製する。希釈を１回行う。０．２９６ｎｇ／ｍＬスパイク溶液をプレートの３個のウェルにロードする。サンプルをスパイクするにはステップ６．１からの０．５９３ｎｇ／ｍＬ標準溶液を使用する。
【０２３１】
スパイクサンプルの調製。ポリプロピレンマイクロ遠心管内で、２０ｍｇ／ｍＬ最終バルク溶液各５００μＬを０．５９３ｎｇ／ｍＬスパイク溶液５００μＬでスパイクする。変性用に保持する。各スパイクサンプル溶液をプレートの３個のウェルにロードし、合計６個のウェルにロードする。
【０２３２】
対照の調製。ＡＢＴ−３０８原薬のロットを入手する。１５０μＬアリコートを分取し、分取日から３年間まで公称値−８０℃で凍結保存する。
【０２３３】
ワーキング対照：対照のアリコートを氷上で解凍する。ポリプロピレンマイクロ遠心管内で対照を最終体積１０００μＬとなるように希釈バッファーで１０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。単一希釈液を調製する。変性用に保持する。プレートの３個のウェルに対照をロードする。
【０２３４】
変性。プレートブランクでは、プレートで試験するブランク数と同数のマイクロ遠心管に希釈バッファー１０００μＬを加える。加熱中にチューブのキャップが開かないようにパラフィルムで密閉するか、又はキャップを閉じた状態に維持するように第２のラックをキャップの上に配置することができる。標準、非スパイクサンプル、スパイクサンプル、スパイク、ブランク及び対照を９５℃±２℃に１５分間加熱する。パラフィルムを使用した場合には冷却中にチューブから剥がす。１５分間冷却し、約１００００ｒｐｍで５分間遠心する。上清７００μＬをマイクロチューブに移し、プレートにロードする。トリトン／蛋白質ペレットに支障のないように注意する。
【０２３５】
プレートウォッシャー指示及び水浴設定。プレート洗浄ボトルにプレート洗浄バッファー（ステップ５．３参照，１×ＰＢＳ＋０．１％トリトンＸ−１００）を充填する。プレートウォッシャーを起動する。以下のパラメーターをチェックする。パラメーターは以下のように設定すべきである：プレートタイプ：各サイクルで１（合計４サイクル）；吸引速度：１０ｍｍ／ｓ；体積：４００μｌ；浸漬時間：５秒；吸引時間６秒。水浴をオンにし、９５℃に設定する。水浴温度を９５℃±２℃に少なくとも３０分間平衡化させる。
【０２３６】
アッセイ手順：ステップを完了するにつれて外していくことによりチェックリストをガイドとして使用することができる。更に、アッセイ中に使用される全機器を記録する。アッセイを実施する日毎に使用する量のカゼインアリコートを３７℃±２℃にする必要がある。コーティングバッファーと基質は冷温で使用する。ブロッキングインキュベーションの前とその間に標準、サンプル、対照、スパイク及びスパイクサンプルを調製する。希釈液を調製し、エッペンドルフチューブに移し、１５分間変性させ、１５分間冷却し、５分間遠心し、マイクロチューブに移すためには、１時間を越えるブロックインキュベーションが必要になる場合がある。プレートをブロックする前に少なくとも４０分間放置する。１２チャネルピペットを使用してサンプル、スパイクサンプル、標準、対照、アッセイスパイク及びブランクを水平方向にプレートのＢ〜Ｇ行にロードする。標準は高濃度から低濃度の順にロードする。プレートコーティング、ビオチン添加、ニュートラアビジン添加、基質添加、及び停止溶液添加はカラム２〜１１に垂直に実施する。
【０２３７】
冷温５０ｍＭ重炭酸ナトリウム中コーティング抗体１００μＬ／ウェルでプレートをコーティングする。コーティング溶液がウェルの底を均等に覆うまでプレートの側面をタッピングし、シーリングテープを貼り付け、プレートシェーカー（又は同等手段）速度３にて振盪しながら公称温度４℃でインキュベートする。
【０２３８】
一晩インキュベーション後、プレートを冷蔵庫から取り出し、室温で平衡化させる。コーティングを振り払う。プレートをペーパータオルで拭う。３７℃±２℃カゼイン３００μＬ／ウェルでブロックし、シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間±１０分間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。
【０２３９】
ブロッキングインキュベーション前とその間に標準、サンプル、対照、スパイク及びスパイクサンプルを調製する。プレートを洗浄バッファーで４回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。８チャネルピペットを使用し、変性した標準、サンプル、スパイク、スパイクサンプル、ブランク及び対照１００μＬ／ウェルをプレートの３個のウェルに分注する。プレートの外側のウェルは使用せず、これらのウェルには非処理希釈バッファーを加える。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて２時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。テンプレートを作成し、プレートにロードする際のガイドとして使用する。
【０２４０】
プレートリーダー設定。プレートを洗浄バッファーで４回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。ビオチン化抗体１００μＬ／ウェルを加える。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて１時間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。
【０２４１】
プレートを洗浄バッファーで４回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。ニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート溶液１００μＬ／ウェルを加える。ニュートラアビジンを最後の行に添加後、すぐにタイマーをスタートする。シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎプレートシェーカー（又は同等手段）で８０ｒｐｍ±５ｒｐｍにて３０分間振盪しながら３７℃±２℃でインキュベートする。プレートを洗浄バッファーで４回洗浄する。プレートをペーパータオルで拭う。冷温Ｋ−Ｂｌｕｅ基質１００μＬ／ウェルを加え、シーリングテープを貼り付け、Ｌａｂ−ｌｉｎｅタイタープレートシェーカー（又は同等手段）で速度３にて振盪しながら室温で１０分間インキュベートする（基質を最初の行に添加後、すぐにタイマーをスタートする）。１Ｎリン酸１００μＬ／ウェルを加えることにより反応を停止する。プレートをプレートシェーカーにセットし、速度３で３分間振盪する。プレートを４５０ｎｍで読取る。
【０２４２】
データ解析及び計算。注：光学密度が標準曲線の実際の定量限界内にあり且つ下記％ＣＶ又は％差条件を満たすサンプル、スパイク、スパイクサンプル及び対照のみが許容される。サンプルＯＤが標準曲線に達しない場合には、結果を０．１８ｎｇ／ｍＬ未満と報告する（アッセイＬＯＱ）。その後、この数値を希釈後のサンプル濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）で割り、数値（ｎｇ／ｍｇ）を報告する。サンプルのプロテインＡ濃度が高く、非スパイク及び／又はスパイクサンプルが標準曲線（２ｎｇ／ｍＬ）を上回る場合には、標準曲線内となるように更に希釈する。その後、この数値を希釈後のサンプル濃度で割り、数値（ｎｇ／ｍｇ）を報告する。スパイク回収率計算では、非スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）が曲線に達しない場合でも、スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）から非スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）を差し引く。数値がマイナスの場合又は「範囲」が得られる場合には、スパイク回収率計算の非スパイクサンプルをゼロとみなす。
【０２４３】
標準曲線。標準濃度をプロトコルテンプレートに入力する。二次曲線フィットを使用する。測定係数は０．９９でなければならず、３個のウェル間の％ＣＶは２０％でなければならない。この条件を満たさない場合には、標準を１本（１レベル，ウェル３個）下げることができる。０．１８ｎｇ／ｍＬ下げる場合には、光学密度が０．２６ｎｇ／ｍＬ及び２ｎｇ／ｍＬ（残りの標準曲線の点）光学密度以内のサンプル及びスパイクサンプルのみが許容可能である。更に、各標準レベルの３個について、１個のウェルが明白に汚染されているか又は結合度が低い場合には、このウェルを下げることができる。１個のウェルを標準レベルから下げる場合には、残りの２個は％差＝２０％でなければならない。プレートのバックグラウンド（ブランク）に近いＯＤ値を示す最低標準の％ＣＶは３０％でなければならない。ウェル１個を下げる場合には、残りの２個の％差は３５％でなければならない。最低標準を下げる場合には、光学密度が残りの標準曲線レベル光学密度以内にあるサンプル及びスパイクサンプルのみが許容可能である。
【０２４４】
％差を次のように計算する：％差＝（絶対値（希釈液１の結果−希釈液２の結果）／平均値）×１００％。標準が上記条件を満たさない場合には、アッセイを繰返す必要がある。％ＣＶ及び／又は％差の数値と標準曲線測定係数結果を報告する。
【０２４５】
サンプル。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。３個のウェル間の％ＣＶを報告する。各サンプル希釈液から１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。注：非スパイクサンプルＯＤが最低標準ＯＤを下回る場合には、％差条件は非スパイク結果に適用されない。上記計算参照。
【０２４６】
各希釈液の「非スパイクサンプル結果」（ｎｇ／ｍＬ）を報告する。これらの数値をスパイク回収率計算で使用する。平均「非スパイクサンプル結果（ｎｇ／ｍＬ）」と希釈液間の％差を計算する。結果を報告する。希釈液間の％差は２５％でなければならない。平均（ｎｇ／ｍＬ）値から実際のプロテインＡ濃度ｎｇ／ｍｇを次のように計算する：プロテインＡ（ｎｇ／ｍｇ）＝平均「非スパイクサンプル結果（ｎｇ／ｍＬ）」／希釈後のサンプル濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）。結果を記録する。
【０２４７】
スパイク。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。％ＣＶを記録する。スパイクから１個のウェルを下げることができる。残りの点は％差＝２０％でなければならない。上記計算参照。プロテインＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を報告する。この結果をスパイク回収率計算で使用する。各スパイクに得られる濃度（ｎｇ／ｍＬ）は理論スパイク濃度の±２０％でなければならない。結果を記録し、合否を判定する。スパイク結果が理論値の２０％以内にない場合には、アッセイを繰返す必要がある。平均スパイク濃度（ｎｇ／ｍＬ）×１００は１００％±２０％  ０．２９６ｎｇ／ｍＬでなければならない。
【０２４８】
スパイクサンプル。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。３個のウェル間の％ＣＶを記録する。各スパイクサンプル希釈液から１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。上記計算参照。各希釈液の「スパイクサンプル結果」（ｎｇ／ｍＬ）を報告する。２種類の希釈液間の％差を記録する。希釈液間の％差は２５％でなければならない。これらの結果をスパイク回収率計算で使用する。下式を使用して各希釈液セットの％スパイク回収率を計算する：％スパイク回収率＝スパイクサンプル値−非スパイクサンプル値×１００。スパイク値。注：スパイク回収率計算では、非スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）が曲線を下回る場合でも、スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）から非スパイクサンプル値（ｎｇ／ｍＬ）を差し引く。数値がマイナスの場合又は「範囲」が得られる場合には、スパイク回収率計算では非スパイクサンプルをゼロとみなす。各サンプルの各希釈液の％スパイク回収率は１００％±５０％（５０％〜１５０％）でなければならない。結果と合否を記録する。
【０２４９】
対照。％ＣＶは３個のウェル間で２０％でなければならない。％ＣＶ結果を記録する。対照から１個のウェルを下げることができる。残りの２個は％差＝２０％でなければならない。
【０２５０】
【表９】
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【０２５１】
【表１０】
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【０２５２】
本願では種々の刊行物を引用するが、その開示内容全体を本願に援用する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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