(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを製造する方法であって、
非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなる膜を有するとともに、前記膜によって包囲された空隙部を有する、予め調製された空ベシクルを、前記物質とともに水性媒体中で混合する工程、
を含んでなり、
ここで、非荷電親水性セグメントがポリアルキレングリコールであり、第１及び第２の荷電性セグメントのうちカチオン性セグメントがポリアミンであり、アニオン性セグメントがポリカルボン酸、ポリスルホン酸、及びポリリン酸から選択される、方法。
【請求項２】
前記混合が、撹拌、振盪、衝撃からなる群より選択される手法で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記空ベシクルの前記膜が、外層、中間層及び内層からなる三層構造を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が、生体分子、有機化合物及び無機物質からなる群より選択される、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１の重合体が、非荷電性親水性セグメントとアニオン性セグメントとを含むブロックコポリマーであり、第２の重合体が、非荷電性親水性セグメントとカチオン性セグメントとを含むブロックコポリマー、及び／又は、カチオン性セグメントを含むが、非荷電性親水性セグメントを含まないポリマーである、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
第１の重合体が、非荷電性親水性セグメントとカチオン性セグメントとを含むブロックコポリマーであり、第２の重合体が、非荷電性親水性セグメントとアニオン性セグメントとを含むブロックコポリマー、及び／又は、アニオン性セグメントを含むが、非荷電性親水性セグメントを含まないポリマーである、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アニオン性セグメントが核酸である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなる膜と、前記膜によって包囲された空隙部と、前記空隙部内に内包された荷電性物質とを含んでなり、
ここで、非荷電親水性セグメントがポリアルキレングリコールであり、第１及び第２の荷電性セグメントのうちカチオン性セグメントがポリアミンであり、アニオン性セグメントがポリカルボン酸、ポリスルホン酸、及びポリリン酸から選択される、ベシクル。
【請求項９】
前記膜が外層、中間層及び内層からなる三層構造を有する、請求項８に記載のベシクル。
【請求項１０】
前記物質が、生体分子、有機化合物及び無機物質からなる群より選択される、請求項８又は９に記載のベシクル。
【請求項１１】
第１の重合体が、非荷電性親水性セグメントとアニオン性セグメントとを含むブロックコポリマーであり、第２の重合体が、非荷電性親水性セグメントとカチオン性セグメントとを含むブロックコポリマー、及び／又は、カチオン性セグメントを含むが、非荷電性親水性セグメントを含まないポリマーである、請求項８〜１０の何れか一項に記載のベシクル。
【請求項１２】
第１の重合体が、非荷電性親水性セグメントとカチオン性セグメントとを含むブロックコポリマーであり、第２の重合体が、非荷電性親水性セグメントとアニオン性セグメントとを含むブロックコポリマー、及び／又は、アニオン性セグメントを含むが、非荷電性親水性セグメントを含まないポリマーである、請求項８〜１０の何れか一項に記載のベシクル。
【請求項１３】
前記アニオン性セグメントが核酸である、請求項１１又は１２に記載のベシクル。
【請求項１４】
非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体と、核酸とを含んでなる膜を有すると共に、前記膜によって包囲された空隙部を有し、ここで、非荷電親水性セグメントがポリアルキレングリコールであり、カチオン性セグメントがポリアミンである、ベシクル。
【請求項１５】
前記膜が、外層、中間層及び内層からなる三層構造を有する、請求項１４に記載のベシクル。
【請求項１６】
前記カチオン性セグメントのカチオン基の、前記核酸のリン酸基に対するモル比であるＮ+／Ｐ比が、１．０超、３．０未満である、請求項１４又は１５に記載のベシクル。
【請求項１７】
前記膜が架橋剤を更に含んでなる、請求項１４〜１６の何れか一項に記載のベシクル。
【請求項１８】
前記カチオン性セグメントのカチオン基に対する前記架橋剤のモル比であるＣＬ／Ｎ比が、０．１以上である、請求項１７に記載のベシクル。
【請求項１９】
前記架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項１７又は１８に記載のベシクル。
【請求項２０】
薬物送達システムとして用いられる、請求項８〜１９の何れか一項に記載のベシクル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空隙部に物質を内包するベシクル及びその製造方法に関する。
具体的には、高分子の自己組織化により得られる空ベシクルの空隙部に物質を包含・担持させたベシクル（物質内包ベシクル）を簡便且つ効率的に製造する方法と、斯かる方法により得られる新規な物質内包ベシクルとに関する。
【背景技術】
【０００２】
一次構造が精密に制御された高分子を自己組織化させることにより、ベシクルを形成し得ることが知られている。斯かるベシクルは多様な分子設計が可能であるとともに、高分子が本来有する性質に加えて新たな機能を呈する可能性があることから、薬物送達システム（Drug Delivery System：ＤＤＳ）の担体や、バイオマテリアル・機能性材料等としての利用が検討されている。【０００３】
特許文献１（特開平８−１８８５４１号公報）には、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体を自己組織化させてなる静電結合型高分子ミセル薬物担体が、本発明者らの一部によって開示されている。【０００４】
非特許文献１（Schlaad H. et al., Macromolecules, 2003, 36 (5), 1417-1420）には、ポリ（１，２−ブタジエン）ブロック及びポリ（セシウムメタクリレート）ブロックからなるブロック共重合体と、ポリスチレンブロック及びポリ（１−メチル−４−ビニルピリジウムアイオダイド）ブロックからなるブロック共重合体とを自己組織化させてなる、ポリマーソームと称されるベシクルが開示されている。【０００５】
特許文献２（国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット）には、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有する第１のブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリカチオン等）と、非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有する第２のブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリアニオン等）とを自己組織化させてなるベシクルが、本発明者等の一部によって開示されている。【０００６】
非特許文献２（Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), 1631-1636）には、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体（例えばＰＥＧ−ポリカチオン等）と、前記荷電性セグメントとは逆の電荷に荷電した共重合体（例えばポリアニオン等）とを自己組織化させてなるベシクルが、本発明者等の一部によって開示されている。【０００７】
高分子の自己組織化により得られる前記の各種ベシクルは、その空隙部に各種の物質を包含・担持させて利用することが考えられる（概説につき非特許文献３（H. Nyin et al. Soft Matter, 2006, 2, 940-949）及び非特許文献４（「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成等監修、エヌ・ティー・エス、2005年）参照）。【０００８】
空隙部に物質が内包されたベシクル（以降「物質内包ベシクル」と表示する場合がある）を製造する方法としては、内包させるべき物質（以降「被内包物質」と表示する場合がある）を、膜の構成要素となる高分子、或いは予め形成された高分子膜とともに混合し、自己組織化によるベシクルの形成と空隙部への物質の封入とを同時に行う方法が代表的である（以降「同時混合法」と表示する場合がある）。具体例としては、エマルション法（非特許文献５（F. Szoka, Jr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 75 (9) 4194-4198）参照）や、脂質有機溶液滴下法（非特許文献６（Batzri, S. et al., Biochim. Biophys Acta 1973, 298, 1015-1019）参照）等が挙げられる。【０００９】
しかし、同時混合法では、被内包物質の存在が自己組織化によるベシクルの形成に影響を与え、ベシクルの形成が阻害される場合や、ベシクルが形成されても物質が空隙部へ内包されない場合がある。また、成膜に有害な有機溶剤を用いる場合が多く、プロセスが煩雑になるとともに、有機溶剤により被内包物質が損傷を受け易いという課題もある。更に、均一な粒径・構造を持つベシクルの形成が困難であり、斯かる均一な粒径・構造を確保するためには別の工程を追加せざるを得ず、プロセスが煩雑になり易いという課題もある。よって本方法は汎用性に乏しく、種々の物質内包ベシクルを製造する手法としては実用的ではない。【００１０】
一方、主に中空粒子への物質封入に用いられる手法として、既存中空粒子の空隙部に後から被内包物質を導入し、包含・担持させる方法（以降「後担持法」と表示する場合がある）があり（例えば非特許文献７（W. Tong et al. J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165）等参照）、斯かる手法をベシクルに応用することも考えられる。【００１１】
しかし、後担持法をベシクルに応用する場合、空ベシクルの膜を越えて被内包物質を空隙部に導入するための工夫が必要となる。例えば、空ベシクルを膨潤させて膜を弛緩させ、生じた膜の間隙から被内包物質を浸透させて空隙部に導入した後、膜を収縮させて被内包物質の脱落を防止する手法や、空ベシクルの膜に孔を形成し、当該孔を通じて被内包物質を空隙部に導入した後、当該孔を封鎖して被内包物質の脱落を防止する手法等が考えられるが、何れも極めて煩雑であり、実用化には大きな不利益となる。また、被内包物質の封入・担持時に、既存の空ベシクルの粒径・構造が乱されてしまう可能性が高く、とても実用的ではないと考えられてきた。【００１２】
また、リポソーム等の脂質二重膜ベシクルについては、脂質二重膜にチャネルタンパク質を埋め込む等の手法（非特許文献８（Ranquin A, Versees W, Miere W, Steyaert J, Gelder PV. Therapeutic Nanoreactors: Combining Chemistry and Biology in a Novel Triblock Copolymer Drug Delivery System. Nano Lett. 2005;5:2220-4）参照）も報告されているが、やはりプロセスが極めて煩雑である上に、汎用性が極めて低く、やはり実用的ではない。
従って、高分子の自己組織化により得られるベシクルの空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを、簡便且つ効率的に製造する方法が求められていた。【００１３】
また、空隙部分に有効成分を包含・担持させるための空ベシクルについても、有効成分の担持の安定性には改善の余地があり、また、複数の有効成分を担持させることも困難であった。
従って、有効成分の担持安定性や複数成分の担持制御性が改善された、新たなベシクルの開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開平８−１８８５４１号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Schlaad H. et al., Macromolecules, 2003, 36 (5), 1417-1420
【非特許文献２】Anraku Y. et al., J. Am. Chem. Soc., 2010, 132 (5), 1631-1636
【非特許文献３】H. Nyin et al. Soft Matter, 2006, 2, 940-949
【非特許文献４】「リポソーム応用の新展開」、秋吉一成・辻井薫監修、エヌ・ティー・エス、2005年
【非特許文献５】F. Szoka, Jr. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978 75 (9) 4194-4198
【非特許文献６】Batzri, S. et al., Biochim. Biophys Acta 1973, 298, 1015-1019
【非特許文献７】W. Tong et al., J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 13159-13165
【非特許文献８】Ranquin A et al., Nano Lett. 2005;5:2220-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の課題は、高分子の自己組織化により得られるベシクルの空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを、簡便且つ効率的に製造する方法を提供することに存する。
また、本発明の別の課題は、有効成分の担持安定性や複数成分の担持制御性が改善された、新たなベシクルを提供することに存する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題に鑑み、本発明者等は鋭意検討した結果、所定の構造の空ベシクルを用意し、これを被内包物質とともに、水性媒体中で混合することにより、ベシクルの空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルが得られることを見出した。本方法は簡便であるにもかかわらず、後担持法によっても被内包物質を効率的に空ベシクル内に導入することができるとともに、ベシクルの構造も殆ど損なわれることがない。これは極めて驚くべき知見である。
また、本発明者等は、上記方法の開発過程において、核酸を膜内に含有する新規なベシクルを見出した。【００１８】
すなわち、本発明の主旨は、空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを製造する方法であって、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなる膜を有するとともに、前記膜によって包囲された空隙部を有する空ベシクルを用意する工程、及び、前記空ベシクル及び前記物質を水性媒体中で混合する工程を含んでなる方法に存する。
また、本発明の別の主旨は、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とを含んでなる膜と、前記膜によって包囲された空隙部と、前記空隙部内に内包された物質とを含んでなるベシクルに存する。
また、本発明の別の主旨は、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体と、核酸とを含んでなる膜を有するとともに、前記膜によって包囲された空隙部を有するベシクルに存する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、高分子の自己組織化により得られるベシクルの空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを、簡便且つ効率的に製造することが可能となる。また、この方法により、有用性を有する新規な物質内包ベシクルが提供される。
また、本発明によれば、所定のブロック共重合体と核酸とを含む膜によって空隙部が包囲された、新規な構造を有するベシクルも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１（ａ）及び（ｂ）は、本発明の方法を説明するための図である。
【図２】図２は、空ベシクルの構造を説明するための図である。
【図３】図３（ａ）及び（ｂ）は、空ベシクルの膜構造の一態様を説明するための図である。
【図４】図４（ａ）及び（ｂ）は、空ベシクルの膜構造の別の態様を説明するための図である。
【図５】図５（ａ）〜（ｃ）は、膜内核酸含有ベシクルの膜構造の一態様を説明するための図である。
【図６】図６（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、膜内核酸含有ベシクル形成時におけるＮ+／Ｐ比と平均粒径及び多分散指数との関係を表すグラフである。
【図７】図７（ａ）は膜内核酸含有ベシクルが形成された試料（Ｎ+／Ｐ比＝１．２）の透過型電子顕微鏡写真であり、図７（ｂ）は膜内核酸含有ベシクルが形成されなかった試料（Ｎ+／Ｐ比＝２．０）の透過型電子顕微鏡写真である。
【図８】図８（ａ）〜（ｄ）は何れも、架橋された膜内核酸含有ベシクルの位相差クライオ透過型電子顕微鏡写真である。
【図９】図９（ａ）及び（ｂ）は何れも、膜内核酸含有ベシクルの粒径及び形状の経時変化を示すグラフである。
【図１０】図１０は、膜内核酸含有ベシクルのＲＮＡｉ活性を示すグラフである。
【図１１】図１１（ａ）及び（ｂ）は何れも、膜内核酸含有ベシクルによるｓｉＲＮＡの細胞内取り込みを示す図である。
【図１２】図１２は、膜内核酸含有ベシクルへの物質内包を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例Ｖ−１の物質内包ベシクルの粒度分布のグラフである。
【図１４】図１４は、実施例Ｖ−１の物質内包ベシクルのＦＣＳ測定による減衰曲線のグラフである。
【図１５】図１５は、比較例Ｖ−１の物質内包ベシクルの粒度分布のグラフである。
【図１６】図１６（ａ）〜（ｃ）はいずれも、実施例VI−１の物質内包ベシクルによるin vivo活性の評価結果を示す蛍光写真である。
【図１７】図１７は、実施例VI−１の物質内包ベシクルの粒度分布のグラフである。
【図１８】図１８は、実施例VI−１の物質内包ベシクルのＦＣＳ測定による減衰曲線のグラフである。
【図１９】図１９は、比較例VI−１の物質内包ベシクルの粒度分布のグラフである。
【図２０】図２０は、実施例VIIの物質内包ベシクルのＦＣＳ測定による減衰曲線のグラフである。
【図２１】図２１（ａ）（ｂ）は何れも、実施例VIIの物質内包ベシクルの位相差クライオ透過型電子顕微鏡写真である。
【図２２】図２２は、実施例VIIIの物質内包ベシクルによるin vitro活性の評価結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、混合による空ベシクルの構造変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［Ｉ：定義］
本明細書において「ベシクル」とは、単ラメラ構造の膜と、前記膜により包囲された空隙部（内水相）とを有する基本構造体を意味する。
【００２２】
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アルキル」とは、一価の脂肪族飽和炭化水素基を表す。特に断らない限り、アルキルは鎖状でも環状でもよく、鎖状と環状とが結合したものでもよい。鎖状アルキルは直鎖状でも分枝鎖状でもよい。環状アルキルは単環式でも複環式でもよく、複環式の場合は連結環でも縮合環でもスピロ環でもよい。
【００２３】
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アルコキシ」とは、二価の酸素原子の一方の結合手に前記のアルキルが結合してなる基を表す。
【００２４】
本明細書において、基の名称又はその一部としての「アリール」とは、一価の芳香族炭化水素基を表す。特に断らない限り、アリールは単環式でも複環式でもよく、複環式の場合は連結環でも縮合環でもスピロ環でもよい。
【００２５】
本明細書において、基の炭素数は、例えば「Ｃ1-12アルキル」のように表す。ここで「Ｃ1-12」とは、当該アルキルの炭素数が１〜１２個であることを意味する。
【００２６】
本明細書において「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
【００２７】
本明細書において、ある基が「置換されていてもよい」とは、当該基が有する１又は２以上の水素原子が１又は２以上の置換基（２以上の場合は同一でも異なっていてもよい）により置換され得ることを意味する。置換基の最大数は、当該基が有する構造及び置換可能な水素原子数に応じて、当業者であれば容易に決定し得る。
【００２８】
本明細書において「置換基」とは、特に断らない限り、ハロゲン原子、アリール基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミル基、ジメチルアセタール化ホルミル基、ジエチルアセタール化ホルミル基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、シロキシ基、トリ（Ｃ1-6アルキル）シロキシ基（ここでＣ1-6アルキルは同一でも異なっていてもよい）及びシリルアミノ基からなる群から選択される。
【００２９】
本明細書において「剪断応力」とは、力の作用面の法線の向きと力の作用方向とが一致しない応力成分を意味する。また、「剪断応力下で混合する」とは、混合対象となる物体に剪断応力が作用するように混合することをいう。物体（例えばベシクル）を含む流体（例えば水性媒体）に外力を加えた場合、その流体内に存在する物体には、通常「剪断応力」が作用することになる。よって、例えば後述の混合対象液（ベシクル及び被内包物質を水性媒体中に含有する液）に外力を加えて混合した場合、その中に含まれるベシクルには「剪断応力」が作用するため、斯かる混合は「剪断応力下で混合する」ことに該当する。
【００３０】
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ干渉（RNA interference）を意味する。
本明細書において「ｓｉＲＮＡ」（small interfering RNA）とは、ＲＮＡｉに関与する低分子（通常１９〜２７塩基対、好ましくは２１〜２３塩基対）二本鎖ＲＮＡを意味する。
【００３１】
以下、本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の実施の形態はあくまでも例であり、本発明は任意の形態で実施することができる。
【００３２】
［II：物質内包ベシクルの製造方法］
（II−１：概要）
前述のように、物質内包ベシクルの代表的な製造方法である同時混合法は、内包の成否が不確実である上に、被内包物質の安定性やベシクルの粒径・構造の均一性の確保が困難であり、更にはプロセスの煩雑性もあって、種々の物質内包ベシクルを製造する手法として汎用するには課題が多かった。一方、主に中空粒子に用いられる後担持法を応用することも考えられるが、既存の空ベシクルの膜を超えて空隙部に物質を導入するために、空ベシクルの膨潤による膜の弛緩、空ベシクルの膜への孔形成、脂質二重膜へのチャネルタンパク質の埋め込み等の煩雑な手法が必要となり、プロセスが極めて煩雑となる上に、ベシクルの粒径・構造の制御が困難であり、とても実用的ではないと考えられてきた。
【００３３】
それに対して、本発明の物質内包ベシクルの製造方法（以降「本発明の製造方法」と略称する場合がある。）は、所定の構造の空ベシクルを用意し、これを被内包物質とともに、水性媒体中で混合することにより、ベシクルの空隙部に物質が内包された物質内包ベシクルを作製するものである。斯かる簡便な手法であるにもかかわらず、後担持法によっても被内包物質を効率的に空ベシクル内に導入することができるとともに、ベシクルの構造も殆ど損なわれることがない。これは極めて驚くべき知見である。
【００３４】
本発明の製造方法の概要について、以下、図１を用いて説明する。なお、図１は模式図であり、本発明は図１に限定されるものではない。
図１（ａ）に示すように、膜１ａで包囲された空隙部１ｂを有する所定の構造の空ベシクル１を用意し、これを被内包物質９とともに、水性媒体中で混合する。これにより、図１（ｂ）に示すように、被内包物質９が空ベシクル１の膜１ａを越えて空隙部１ｂに導入され、被内包物質９が空隙部１ｂに内包された物質内包ベシクル１’が得られる。
構造の高度な制御が必要な高分子自己組織化ベシクル１に対して、斯かる簡便な手法で物質９を膜１ａ内の空隙部１ｂに導入し、内包させることが可能であるとは、極めて驚くべき知見である。本発明の製造方法は、斯かる知見に基づくものである。
以下、本発明の製造方法について詳述するが、空ベシクル及び被内包物質の詳細については章を改めて後述し、ここではその他の条件及び手順について説明する。
【００３５】
（II−２：空ベシクル及び被内包物質の混合）
本発明の製造方法は、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中で混合する工程を含む（なお、ここで混合の対象となる、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中に含有する液を、以降「混合対象液」という場合がある。）。
混合を行う手法は特に制限されないが、水性媒体に外力を加える手法で行う。すなわち、空ベシクル及び被内包物質を水性媒体に加えて静置し、自然に拡散させて混合する手法（以降「静置・拡散混合」という場合がある。）は除外される。水性媒体に外力を加える混合法の例としては、撹拌、振盪、衝撃等が挙げられる。
撹拌による手法の例としては、混合対象液を含む容器をボルテックスミキサー等により旋回させて撹拌する手法や、溶液を撹拌翼等により直接攪拌する手法等が挙げられる。
振盪による手法の例としては、混合対象液を含む容器を振盪機等により振盪する手法が挙げられる。
衝撃による手法の例としては、混合対象液に対して超音波照射等により振動や他の各種の衝撃を与える手法等が挙げられる。
【００３６】
斯かる混合によって、ベシクル空隙部に物質が内包され、物質内包ベシクルが製造される。
混合により物質内包ベシクルが形成される理由は定かではないが、水性媒体に外力を加えることによって、空ベシクルに剪断応力が作用する（よって、水性媒体に外力を加える混合を、剪断応力下での混合と言い換えることができる。）。斯かる剪断応力によって、空ベシクルの構造が撹乱されて概ね均一な小会合体に分解し、それが再度自己組織化してベシクルが均一に再生するとともに、水性媒体中に存在する被内包物質がベシクル再生時にベシクル内に封入されるものと考えられる（斯かるメカニズムは、後述する参考実験において、混合によるベシクルの小会合体への分解が確認されたことからも推測される。）。これは通常の状態のベシクルでは起こり難い現象であり、斯かる現象を利用した本発明の製造方法は、極めて斬新なものであるといえる。
【００３７】
混合の条件は制限されないが、上述のメカニズムを考慮すると、水性媒体中の空ベシクルの構造が十分に撹乱されるとともに、撹乱後にベシクルの構造が再生し得る程度の条件を選択することが好ましい。通常は混合対象液全体に力が作用する程度に混合すればよいが、好ましくは混合対象液全体が概ね均一になる程度に混合することが好ましい。
具体的な混合の条件は混合法によって異なるが、例えば攪拌の場合、通常５００ｒｐｍ以上、好ましくは１０００ｒｐｍ以上、また、通常１００００ｒｐｍ以下、好ましくは５０００ｒｐｍ以下の回転数で行うことが望ましい。回転数が低過ぎると、均質な物質内包ベシクルが形成され難くなる場合がある。回転数が高過ぎると、ベシクルが損傷・破壊されてしまう場合がある。
また、ボルテックスミキサーによる撹拌時間は、回転数によっても異なるが、通常６０秒以上、好ましくは１２０秒以上、また、通常１０分以内、好ましくは５分以内である。攪拌時間が短過ぎると、均質な物質内包ベシクルが形成され難くなる場合がある。攪拌時間が長過ぎると、ベシクルが損傷・破壊されてしまう場合がある。
その他の混合法（撹拌翼による撹拌、振盪機による振盪、超音波照射による衝撃等）を用いる場合の具体的な条件としては、ボルテックスミキサーによる撹拌を上述した回転数及び攪拌時間のもとで行って得られるのと同程度の力が混合対象液に作用するように、適宜条件を調整すればよい。
【００３８】
また、やはり上述のメカニズムを考慮すると、混合対象液の混合後、ある程度の時間に亘って混合対象液を静置し、ベシクルが均一に再生する時間を確保することが好ましい。斯かる静置時間は限定されるものではないが、例えば１分以上、好ましくは３分以上とする。
【００３９】
なお、ベシクルの空隙部に物質が内包されたことは、蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）による拡散係数（diffusion coefficient）変化の検出、サイズ排除クロマトグラフィーによる分離、透過型電子顕微鏡による直接観察等の手法により確認することができる。蛍光相関分光法による拡散係数の測定の場合、被内包物質として蛍光材料を用い、蛍光材料の拡散係数の変化を測定することにより、被内包物質がベシクル内に偏在すること（即ち物質内包ベシクルが得られたこと）を確認できる。
【００４０】
（II−３：混合に関する他の条件）
通常は、水性媒体中に空ベシクル及び被内包物質を含有する液（混合対象液）を調製し、前述の混合に供する。
水性溶媒の種類は限定されない。好ましくは水であるが、空ベシクルの構造に好ましからぬ影響を及ぼしたり、被内包物質の内部への導入を妨げたりしない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒（例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等）も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００４１】
被混合液の調製手順も任意であるが、後述のように通常、空ベシクルは水性媒体中に調製されるので、調製された空ベシクル含有液に対して被内包物質を加え、混合に供するのが好適である。被内包物質はそのまま空ベシクル含有液に加えてもよいが、水性媒体中の溶液や懸濁液等の形態で加えてもよい。
【００４２】
被混合液中の空ベシクル及び被内包物質の各濃度も特に制限されず、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、空ベシクルに対する被内包物質の所望の内包比率等の条件を勘案して決定すればよい。
但し、空ベシクルへの被内包物質の内包効率を高める観点からは、水性媒体に対する空ベシクルの濃度を、通常０．１ｍｇ／ｍＬ以上、中でも１ｍｇ／ｍＬ以上、また、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、中でも１０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。特に空ベシクルの濃度が低過ぎると、物質内包ベシクルが形成されない場合がある。なお、得られる物質内包ベシクルの粒経は空ベシクルの濃度に依存すると考えられるため、空ベシクルの濃度は所望の物質内包ベシクルの粒経に応じて決定すべきである。
また、水性媒体に対する被内包物質の濃度は、被内包物質の性質によっても異なるが、通常０．１ｍｇ／ｍＬ以上、中でも１ｍｇ／ｍＬ以上、また、通常１００ｍｇ／ｍＬ以下、中でも５０ｍｇ／ｍＬ以下とすることが好ましい。特に被内包物質の濃度が低過ぎると、物質内包ベシクルが形成されない場合がある。
【００４３】
被混合液のｐＨも特に制限されず、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、被混合液中の空ベシクル及び被内包物質の各濃度等の条件を勘案して適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。被混合液のｐＨを調整して用いることは、空ベシクルの構造を保持し、効率的に被内包物質を空ベシクルに内包させる上で有利である。
【００４４】
被混合液のイオン強度は、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
被混合液の混合時の温度は、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲であれば限定されないが、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
【００４５】
混合後、形成された物質内包ベシクルをすぐに所望の用途に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、物質内包ベシクルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは５０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。但し、後述のように架橋剤を用いない場合、形成された物質内包ベシクルの径が経時的に増大する傾向があるので、ベシクルの均一再生に要する時間以上の静置時間を設けないことが好ましい場合もある。
【００４６】
架橋剤を用いる場合、形成された物質内包ベシクルを含有する被混合液に、架橋剤を加えて混合すればよい。架橋剤はそのまま加えてもよいが、架橋剤を含有する水性溶液を調製し、これを加えてもよい。架橋剤の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、被混合液について前述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【００４７】
［III：空ベシクル］
（III−１：空ベシクルの構造）
本発明の製造方法では、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とから形成される膜を有するとともに、前記膜によって包囲された空隙部を有するベシクルを、空ベシクルとして用いる。
【００４８】
空ベシクルの構造の例について、図２〜４を参照しながら説明する。なお、図２〜４は何れも模式図であり、本発明はこれらの図に限定されるものではない。
図２は、ベシクル１の部分破断図である。図２に示すように、ベシクル１は膜１ａと、膜１ａにより包囲される空隙部１ｂとを有する。
【００４９】
図３（ａ）は、本発明の一態様に係るベシクル１の膜１ａの部分断面拡大図である。図３（ａ）に示す膜１ａは、外層１ａo、中間層１ａm及び内層１ａiからなる三層構造を有し、主に第１の重合体２と、第２の重合体３とから形成される。
図３（ｂ）は、図３（ａ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３の拡大図である。図３（ｂ）に示すように、第１の重合体２は、非荷電親水性セグメント２ａと第１の荷電性セグメント２ｂとを有するブロック共重合体であり、第２の重合体３は、第１の荷電性セグメント２ｂとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメント３からなる重合体である。そして好ましくは、図３（ａ）に示すように、非荷電親水性セグメント２ａが膜１ａの外層１ａoを形成し、第１の荷電性セグメント２ｂと第２の荷電性セグメント３とが静電結合して中間層１ａmを形成する。そして好ましくは、主に非荷電親水性セグメント２ａが膜１ａの内層１ａiを形成する。
【００５０】
図４（ａ）は、本発明の別の態様に係るベシクル１の膜１ａの部分断面拡大図である。図４（ａ）に示す膜１ａも、外層１ａo、中間層１ａm及び内層１ａiからなる三層構造を有し、主第１の重合体２と、第２の重合体３’とから形成される。
図４（ｂ）は、図４（ａ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３’の拡大図である。図４（ｂ）に示すように、第１の重合体２は、非荷電親水性セグメント２ａと第１の荷電性セグメント２ｂとを有するブロック共重合体であり、第２の重合体３’は、非荷電親水性セグメント３ａと、第１の荷電性セグメント２ｂとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメント３ｂからなる重合体である。そして好ましくは、図４（ａ）に示すように、非荷電親水性セグメント２ａ、３ａの一方又は両方が膜１ａの外層１ａoを形成し、第１の荷電性セグメント２ｂと第２の荷電性セグメント３ｂとが静電結合して中間層１ａmを形成する。そして好ましくは、主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａの一方又は両方が、膜１ａの内層１ａiを形成する。
【００５１】
理論に束縛されるものではないが、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’からベシクル１が形成される機構は、以下のように考えられる。すなわち、図３（ｂ）、図４（ｂ）に示す第１の重合体２及び第２の重合体３、３’が、電荷の相互作用が生じ得る系（例えば水性媒体中）に置かれると、自己集合し、図３（ａ）、図４（ａ）に示すように、互いに反対に帯電する第１の荷電性セグメント２ｂ及び第２の荷電性セグメント３、３ｂとが静電結合して中間層１ａmを形成するとともに、その外側に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａが配置されて外層１ａoを形成する。また、好ましくは、中間層１ａmの内側にも、主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａが配置されて内層１ａiを形成する。こうして図３（ａ）、図４（ａ）に示す三層構造の膜１ａが形成され、結果として、図２に示すベシクル１が形成されるものと考えられる。
【００５２】
なお、ベシクル１の膜１ａは、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’のみからなっていてもよいが、以上の構造が概略保持される限りにおいて、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分は限定されないが、例としては架橋剤、荷電性ポリマー、荷電性分子等が挙げられる。架橋剤については後に詳述する。
【００５３】
また、後述するようにベシクル１は通常は水性媒質中で調製され、また、膜１ａの内層１ａiは主に非荷電親水性セグメント２ａ、３ａから構成されるため、ベシクル１の空隙部１ｂには通常は水性媒体が存在する（よって本明細書では空隙部１ｂを「内水相」と表示する場合がある）。但し、空隙部１ｂに別の物質が存在していてもよい。
【００５４】
ベシクル１の形状は、限定されないが、通常は球状又は略球状である。
ベシクル１の粒径は、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’の種類及び量比、架橋剤の有無、ベシクル１の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、更に好ましくは２００ｎｍ以下である。
ベシクル１の膜１ａの膜厚は、第１の重合体２及び第２の重合体３、３’の種類及び量比、架橋剤の有無、ベシクル１の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上、また、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。
【００５５】
（III−２：第１及び第２の重合体）
本発明の製造方法に用いられる空ベシクルは、第１の重合体及び第２の重合体から構成される膜を有する。
第１の重合体は、非荷電親水性セグメントと第１の荷電性セグメントとを有するブロック共重合体である。第１の重合体は１種類のみでもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率を併用してもよい。
第２の重合体は、第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する重合体である。第２の荷電性セグメントのみからなる重合体でもよいが、第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有するブロック共重合体であってもよい。第２の重合体は１種類のみでもよく、２種類以上を任意の組み合わせ及び比率を併用してもよい。２種類以上の場合には、第２の荷電性セグメントのみからなる第２の重合体と、第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有する第２の重合体とを併用してもよい。
第１の重合体及び第２の重合体は、それぞれ前述したセグメントに加えて、更に別のセグメントを有していてもよい。
【００５６】
（III−２ａ：非荷電親水性セグメント）
第１の重合体は、非荷電親水性セグメントを有する。また、第２の重合体も、非荷電親水性セグメントを有していてもよい。
非荷電親水性セグメントは、非荷電且つ親水性の性質を有するポリマーセグメントである。ここで「非荷電」とは、セグメントが全体として中性であることをいう。例としてはセグメントが正・負の電荷を有さない場合が挙げられる。また、セグメントが正・負の荷電を分子内に有する場合であっても、局所的な実効電荷密度が高くなく、自己組織化によるベシクルの形成を妨げない程度にセグメント全体の荷電が中和されていれば、やはり「非荷電」に該当する。また、「親水性」とは水性媒体に対して溶解性を示すことをいう。
【００５７】
非荷電親水性セグメントの種類は限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。非荷電親水性セグメントの具体例としては、ポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ（２−メタクロイルオキシエチルホスホリルコリン）、等電点が７付近のペプチド、タンパク質及びそれらの誘導体等が挙げられる。中でもポリアルキレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）等が好ましく、ポリアルキレングリコールが特に好ましい。ポリアルキレングリコールとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられるが、ポリエチレングリコールが好ましい。
【００５８】
非荷電親水性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。具体的な分子量の範囲は、非荷電親水性セグメントの種類や荷電性セグメントとの組み合わせ等によっても異なるが、非荷電親水性セグメントとしてポリエチレングリコールを用いる場合、その分子量（Ｍｗ）は、好ましくは５００以上、より好ましくは１０００以上、また、好ましくは１５０００以下、より好ましくは５０００以下の範囲である。非荷電親水性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常は非荷電親水性セグメントの分子量が前記の分子量範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。
前記条件を満たす非荷電親水性セグメントを用いることにより、第１の重合体及び第２の重合体の水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
【００５９】
（III−２ｂ：荷電性セグメント）
第１の重合体が有する第１の荷電性セグメントと、第２の重合体が有する第２の荷電性セグメントとは、互いに反対の電荷に帯電した荷電性セグメントである。即ち、第１の荷電性セグメントがカチオン性セグメントであれば、第２の荷電性セグメントはアニオン性セグメントとなり、第１の荷電性セグメントがアニオン性セグメントであれば、第２の荷電性セグメントはカチオン性セグメントとなる。
【００６０】
（III−２ｂ−１：カチオン性セグメント）
カチオン性セグメントは、カチオン基を有し、カチオン性（陽イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、カチオン性セグメントは、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクルの形成を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。
カチオン性セグメントの種類も限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。カチオン性セグメントとしては、ポリアミン等が好ましく、側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体が特に好ましい。側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパルタミド誘導体及びポリグルタミド誘導体が好ましい。
【００６１】
カチオン性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。カチオン性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常はカチオン性セグメントの分子量が所定の範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。具体的には、カチオン性セグメントとしてポリアスパラギン酸誘導体を用いる場合、その繰り返し単位数は好ましくは１０以上、より好ましくは５０以上、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下の範囲である。
前記条件を満たすカチオン性セグメントを用いることにより、第１の重合体と第２の重合体との水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
【００６２】
（III−２ｂ−２：アニオン性セグメント）
アニオン性セグメントは、アニオン基を有し、アニオン性（陰イオン性）を示すポリマーセグメントである。但し、アニオン性セグメントは、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクルの形成を妨げない範囲で、多少のカチオン基を有していてもよい。
アニオン性セグメントの種類も限定されない。単一の繰り返し単位からなるセグメントでもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有するセグメントでもよい。アニオン性セグメントとしては、ポリカルボン酸、ポリスルホン酸、ポリリン酸（核酸等）等が好ましく、側鎖にカルボキシル基を有するポリアミノ酸又はその誘導体、核酸が特に好ましい。
【００６３】
側鎖にカルボキシル基を有するポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、前述のポリカチオンで側鎖にアミノ基を有するポリアミノ酸又はその誘導体のアミノ基にアコニチン酸無水物やシトラコン酸無水物を適当量作用させて得られるポリカルボン酸、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸が好ましい。
【００６４】
核酸としては、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。核酸は、ベシクルの用途に応じた機能性核酸であってもよい。機能性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ酵素等が挙げられる。これらはベシクルの用途に応じて選択される。例えば、ベシクルをＲＮＡｉ用のＤＤＳに用いる場合、核酸としてはｓｉＲＮＡが用いられる。また、核酸は修飾されたものでもよい。修飾された核酸の例としては、ベシクル安定化等の用途に向けて、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸が挙げられる。
【００６５】
アニオン性セグメントの分子量は、限定されるものではないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、所定の範囲内の分子量を有することが好ましい。アニオン性セグメントの繰り返し単位数も制限されないが、通常はアニオン性セグメントの分子量が所定の範囲を満たすように、その繰り返し単位の種類に応じて決定される。具体的には、アニオン性セグメントとしてポリカルボン酸、ポリスルホン酸、又は核酸を用いる場合、その繰り返し単位数は好ましくは１０以上、より好ましくは５０以上、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下の範囲である。
前記条件を満たすアニオン性セグメントを用いることにより、第１の重合体と第２の重合体との水性溶液中での会合・沈殿を防止して安定化し、ベシクルを効率的に構築することが可能となる。
【００６６】
（III−２ｃ：非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの組み合わせ）
第１の重合体が有する非荷電親水性セグメントと第１の荷電性セグメントとの組み合わせ、また、第２の重合体が第２の荷電性セグメントに加えて非荷電親水性セグメントを有する場合における、非荷電親水性セグメントと第２の荷電性セグメントとの組み合わせはいずれも制限されず、任意の非荷電親水性セグメントと任意の荷電性セグメントとを組み合わせることが可能である（なお、以降の記載では、第１の荷電性セグメント及び第２の荷電性セグメントを纏めて「荷電性セグメント」と表示する場合がある）。
【００６７】
非荷電親水性セグメント及び荷電性セグメントの個数も任意であり、各々１つでも２つ以上でもよく、２つ以上の場合には互いに同一でも異なっていてもよい。
非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの結合形態も制限されず、直接結合していてもよいが、連結基を介して結合していてもよい。
【００６８】
連結基の例としては、非荷電親水性セグメント及び荷電性セグメントの総個数に対応する価数を有する炭化水素基が挙げられる。連結基としての炭化水素基は脂肪族でも芳香族でもそれらが連結したものでもよく、脂肪族の場合には飽和でも不飽和でもよく、また、直鎖でも分岐でも環状でもよい。連結基としての炭化水素基の分子量は、制限されるものではないが、通常５０００以下、好ましくは１０００以下である。連結基としての炭化水素基の例としては、没食子酸誘導体、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体、グリセリン誘導体、シクロヘキサン誘導体、Ｌ−リシン等が挙げられるが、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が好ましい。
【００６９】
連結基の別の例としては、ジスルフィド基が挙げられる。ジスルフィド基は、非荷電親水性セグメント１つと荷電性セグメント１つを連結するのに用いられる。ジスルフィド基を介して非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとを連結することにより、ベシクルの置かれた環境や外部からの作用によってジスルフィド基を開裂させ、ベシクルの形態や性質を変化させることが可能になる。これを利用すれば、例えばベシクルに薬物を内包させ、得られた物質内包ベシクルを薬物送達用のＤＤＳに用いる場合、生体内でジスルフィド基を開裂させることによって、ベシクル内に内包された物質の放出を促すことも可能になると考えられる。
【００７０】
また、第１の荷電性セグメントと第２の荷電性セグメントとの比率（カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率）、及び、非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの比率も任意であるが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、以下の基準で選択することが好ましい。
【００７１】
まず、カチオン性セグメントとアニオン性セグメントとの比率については、下記式（ｉ）に規定するＣ／Ａ比が、通常０．３、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．６以上、また、通常３．０未満、好ましくは２．０以下、より好ましくは１．７以下となるように調整することが望ましい。
【００７２】
【数１】
0005843763.tif 000002
ここで、第１及び第２の重合体中におけるカチオン基及びアニオン基のモル数は、カチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの構造に依存する値であるが、一般的な電位差（酸・塩基）滴定により求めることが可能である。
【００７３】
また、第１及び第２の重合体中における非荷電親水性セグメントと荷電性セグメントとの比率は、前記Ｃ／Ａ比の範囲を満たすカチオン性セグメント及びアニオン性セグメントの比率を勘案して決定することが好ましい。具体的には、以下の式（ii）で規定される非荷電親水性セグメントの分子量比率Ｘを、通常０．０１以上、好ましくは０．０５以上、また、通常０．３５以下、好ましくは０．１以下の範囲に収めることが望ましい。
【００７４】
カチオン性セグメント（モノマー１つ当たり１つの正電荷を有するとする）及びアニオン性セグメント（モノマー１つ当たり１つの負電荷を有するとする）を各々一種類ずつ用い、少なくとも一方に非荷電親水性セグメントを導入して用いた場合（即ち、第１の重合体がカチオン性若しくはアニオン性セグメントと非荷電親水性セグメントとからなるブロック共重合体であり、第２の重合体がアニオン性若しくはカチオン性セグメントの単独重合体、又はそれと非荷電親水性セグメントとからなるブロック共重合体である場合）、そのＸは次式で規定される。
【数２】
0005843763.tif 000003
【００７５】
（III−２ｄ：第１及び第２の重合体の具体例）
第１及び第２の重合体の具体例としては、以下の［例１］、［例２］が挙げられる。
【００７６】
［例１］
第１の重合体として下記（Ａ１）を用い、第２の重合体として下記（Ｂ１）を用いる。
（Ａ１）非荷電性親水性のセグメントとアニオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
（Ｂ１）下記(i)のブロックコポリマー及び／又は下記(ii)のポリマー。
(i) 非荷電性親水性のセグメントとカチオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
(ii) カチオン性のセグメントを含むポリマー（但し非荷電性親水性のセグメントを含まない）。
【００７７】
［例２］
第１の重合体として下記（Ａ２）を用い、第２の重合体として下記（Ｂ２）を用いる。
（Ａ２）非荷電性親水性のセグメントとカチオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
（Ｂ２）下記(iii)のブロックコポリマー及び／又は下記(iv)のポリマー。
(iii) 非荷電性親水性のセグメントとアニオン性のセグメントとを含むブロックコポリマー。
(iv) アニオン性のセグメントを含むポリマー（但し非荷電性親水性のセグメントを含まない）。
【００７８】
なお、本発明においては、前記（Ｂ１）(ii)及び（Ｂ２）(iｖ)のポリマーのように、非荷電性親水性のセグメントを含まないポリマーを、便宜上、ホモポリマーということがある。
前記（Ｂ１）(i)、(ii)及び（Ａ２）の各ポリマーにおけるカチオン性のセグメントとしては、限定はされないが、例えば、側鎖にカチオン性基を有するポリペプチドに由来するものが好ましく挙げられる。
同様に、前記（Ａ１）及び（Ｂ２）(iii)、(iv)の各ポリマーにおいて、アニオン性のセグメントとしては、限定はされないが、例えば、側鎖にアニオン性基を有するポリペプチドや核酸に由来するものが好ましく挙げられる。
【００７９】
より具体的には、前記（Ａ１）及び（Ｂ２）(iii)の各ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式(I)及び／又は(II)で示されるものが好ましく挙げられる。
【化１】
0005843763.tif 000004
ここで、一般式(I)及び(II)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（以降「ＰＥＧセグメント」と表示する場合がある）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ」の部分と「ｙ」の部分とを合わせたセグメントがポリアニオン由来のアニオン性セグメント（以降「ポリアニオンセグメント」と表示する場合がある）である。
【００８０】
一般式(I)及び(II)中、Ｒ1a及びＲ1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して、他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。
【００８１】
一般式(I)及び(II)中、Ｌ1及びＬ2は、連結基を表す。具体的には、Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−（ここで、ｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−（ここで、ｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ2a、Ｒ2b、Ｒ2c及びＲ2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ2a及びＲ2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ2c及びＲ2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ2a及びＲ2b（Ｒ2b及びＲ2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ2c及びＲ2d（Ｒ2d及びＲ2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
【００８２】
一般式(I)及び(II)中、Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ3は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン又は四級アンモニウム塩の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ4が−ＮＨ−Ｒ9（ここで、Ｒ9は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。
一般式(I)及び(II)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｎ及びｙは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。但し、ｙはｎより大きくないものとする。
【００８３】
一般式(I)及び(II)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリアニオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、３，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは５，０００〜２０，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリアニオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜２０，０００である。
【００８４】
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をアニオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、アニオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
【００８５】
一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したアニオン性基を有する側鎖となるように置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。
【００８６】
本発明において、一般式(I)及び(II)で示されるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（以降「Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）とからなる下記式のアニオン性ブロックコポリマー（以降「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる（なお、以降の式では対カチオンの例としてＮａ+を示す場合があるが、対カチオンはこれに限定されるものではない）。
【００８７】
【化２】
0005843763.tif 000005
上記式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表す整数である。
ｎはＰ（Ａｓｐ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）としては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）：２，０００、ポリアニオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は７５であるものが特に好ましい。
【００８８】
前記（Ａ２）及び（Ｂ１）(i)の各ブロックコポリマーとしては、例えば、下記一般式(III)及び／又は(IV)で示されるものが好ましく挙げられる。
【化３】
0005843763.tif 000006
【００８９】
ここで、一般式(III)及び(IV)の構造式中、繰り返し単位数（重合度）が「ｍ」のセグメントがＰＥＧ由来の非荷電性親水性セグメント（ＰＥＧセグメント）であり、繰り返し単位数が「ｎ−ｙ−ｚ」の部分と「ｙ」の部分と「ｚ」の部分とを合わせたセグメントがポリカチオン由来のカチオン性セグメント（以下、ポリカチオンセグメント）である。
【００９０】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ1a及びＲ1bは、それぞれ独立して水素原子又は未置換もしくは置換された直鎖もしくは分枝のＣ1-12アルキル基を表す。直鎖もしくは分枝のＣ1-12としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、iso−プロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル等を挙げることができる。また置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ1-6アルコキシカルボニル基、Ｃ2-7アシルアミド基、同一もしくは異なるトリ−Ｃ1-6アルキルシロキシ基、シロキシ基又はシリルアミノ基を挙げることができる。ここで、アセタール化とは、ホルミルのカルボニルと、例えば、炭素数１〜６個のアルカノールの２分子又は炭素原子数２〜６個の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によるアセタール部の形成を意味し、当該カルボニル基の保護方法でもある。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基であるときは、酸性の温和な条件下で加水分解して他の置換基であるホルミル基（−ＣＨＯ）（又はアルデヒド基）に転化できる。
【００９１】
一般式(III)及び(IV)中、Ｌ1及びＬ2は、連結基を表す。具体的には、Ｌ1は−（ＣＨ2）b−ＮＨ−（ここで、ｂは１〜５の整数である）であることが好ましく、Ｌ2は−（ＣＨ2）c−ＣＯ−（ここで、ｃは１〜５の整数である）であることが好ましい。
【００９２】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ2a、Ｒ2b、Ｒ2c及びＲ2dは、それぞれ独立してメチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ2a及びＲ2bのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当し、また、Ｒ2c及びＲ2dのいずれもがメチレン基の場合はポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式中、Ｒ2a及びＲ2b（Ｒ2b及びＲ2a）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、及びＲ2c及びＲ2d（Ｒ2d及びＲ2c）がメチレン基及びエチレン基の両者を表す場合、アスパラギン酸誘導体およびグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、あるいはランダムに存在できる。
【００９３】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ3は、水素原子、保護基、疎水性基又は重合性基を表す。具体的には、Ｒ3は、アセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基であることが好ましい。
【００９４】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ4は水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基又は開始剤残基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。さらには場合により、Ｒ4が−ＮＨ−Ｒ9（ここで、Ｒ9は未置換又は置換された直鎖又は分枝のＣ1-20アルキル基を表す）であることが好ましい。
【００９５】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dは、それぞれ独立して水酸基、オキシベンジル基、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基を表す。ここで、ａは１〜５の整数であり、Ｘは、一級、二級、三級アミン、四級アンモニウム塩又はグアニジノ基の内の１種類又は２種類以上を含むアミン化合物残基、又は、アミンでない化合物残基であることが好ましい。
【００９６】
Ｒ5aとＲ5bとの総数及びＲ5cとＲ5dとの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2（但しｅは０〜５の整数）である）であるものが、少なくとも２つ以上存在することが好ましく、上記総数の５０％以上存在することがより好ましく、上記総数の８５％以上存在することがさらに好ましい。
また、Ｒ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dのすべて又は一部が、−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基（ここで、ａは２であり、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ2）2）e−ＮＨ2（但しｅは１）である）ことが好ましい。
【００９７】
さらに、Ｒ4並びにＲ5a、Ｒ5b、Ｒ5c及びＲ5dの例示として上記した−ＮＨ−（ＣＨ2）a−Ｘ基において、Ｘが下記の各式で表される基から選ばれるものである場合が特に好ましい。
【化４】
0005843763.tif 000007
【００９８】
ここで、上記の各式中、Ｘ2は、水素原子又はＣ1-6アルキル基もしくはアミノＣ1-6アルキル基を表し、Ｒ7a、Ｒ7b及びＲ7cは、それぞれ独立して水素原子又はメチル基を表し、ｄ１、ｄ２及びｄ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２及びｅ３は、それぞれ独立して１〜５の整数を表し、ｆは、０〜１５の整数を表し、ｇは０〜１５の整数を表し、Ｒ8a及びＲ8bは、それぞれ独立して水素原子又は保護基を表す。ここで、当該保護基は、通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。
【００９９】
一般式(III)及び(IV)中、Ｒ6a及びＲ6bは、それぞれ独立して水素原子、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2、又は保護基であり、ここで保護基は通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる基であることが好ましい。また、一般式(III)及び(IV)中、ｔは２〜６の整数であることが好ましく、より好ましくは３又は４である。
【０１００】
一般式(III)及び(IV)中、ｍは５〜２，０００の整数であり、５〜２７０の整数であることが好ましく、より好ましくは１０〜１００の整数である。また、ｎは２〜５，０００の整数であり、ｙは０〜５，０００の整数であり、ｚは０〜５，０００の整数である。ｎは、５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。ｙ及びｚは、０又は５〜３００の整数であることが好ましく、より好ましくは０又は１０〜１００の整数である。但し、ｙとｚとの合計（ｙ＋ｚ）は、ｎより大きくないものとする。
【０１０１】
一般式(III)及び(IV)における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムな順で存在することができる。特に、ポリカチオンセグメント中における各繰り返し単位についてのみ、上記の通りランダムな順で存在し得ることが好ましい。
【０１０２】
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの分子量（Ｍｗ）は、限定はされないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のセグメントについては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）は、５００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜５，０００であり、ポリカチオンセグメントの分子量（Ｍｗ）は、全体で５００〜５０，０００であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜３０，０００である。
【０１０３】
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−とＰＥＧ鎖のブロック部分とを含むセグメント（ＰＥＧセグメント）を予め合成しておき、このＰＥＧセグメントの片末端（Ｒ1aＯ−又はＲ1bＯ−と反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖をカチオン性基を含むように置換又は変換する方法、あるいは、上記ＰＥＧセグメントと、カチオン性基を含む側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。上記ＰＥＧセグメントは、例えば、ＷＯ９６／３２４３４号公報、ＷＯ９６／３３２３３号公報及びＷＯ９７／０６２０２号公報等に記載のブロック共重合体のＰＥＧセグメント部分の製法を用いて調製することができる。
【０１０４】
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの、より具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するＰＥＧセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート（ＢＬＡ）及びＮε−Ｚ−Ｌ−リシン等の保護アミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各セグメントの側鎖が前述したカチオン性基を有する側鎖となるように、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）等で置換又は変換する方法が好ましく挙げられる。
【０１０５】
一般式(III)及び(IV)で示されるブロックコポリマーの具体例としては、例えば、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）と、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（以降「Ｐ(Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）からなる下記式のカチオン性ブロックコポリマー（以降「ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる（なお、以降の式では対アニオンの例として、Ｃｌ-を示す場合があるが、対アニオンはこれに限定されるものではない）。
【化５】
0005843763.tif 000008
上記式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表す整数である。
ｎはＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）としては、ＰＥＧセグメントの分子量（Ｍｗ）：２，０００，ポリカチオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は７５であるものが特に好ましい。
【０１０６】
前記（Ｂ２）(iv)のポリマーとしては、例えば、下記一般式(V)及び／又は(VI)で示されるものが好ましく挙げられる。なお、一般式(V)及び(VI)に関する説明については、前述した一般式(I)及び(II)に関する説明（但しＰＥＧセグメントに関する説明は除く）が、適宜同様に適用できる。
【化６】
0005843763.tif 000009
【０１０７】
本発明において、一般式(V)及び(VI)で示されるポリマーの具体例としては、例えば、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ））からなる下記式のアニオン性ホモポリマー（以降「Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる。
【化７】
0005843763.tif 000010
上記式中、
ｎはＰ（Ａｓｐ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ）としては、ポリアニオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は８２であるものが特に好ましい。
【０１０８】
前記（Ｂ１）(ii)のポリマーとしては、例えば、下記一般式(VII)及び／又は(VIII)で示されるものが好ましく挙げられる。なお、一般式(VII)及び(VIII)に関する説明については、前述した一般式(III)及び(IV)に関する説明が、適宜同様に適用できる。
【化８】
0005843763.tif 000011
【０１０９】
本発明において、一般式(VII)及び(VIII)で示されるポリマーの具体例としては、例えば、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（Ｐ(Ａｓｐ−ＡＰ））からなる下記式のカチオン性ホモポリマー（以降「Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）」と表示する場合がある）等が好ましく挙げられる。
【化９】
0005843763.tif 000012
上記式中、
ｎはＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）の重合度を表す整数である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。
Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）としては、ポリカチオンセグメントを示すＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）のユニット数（上記式中ｎ）：７０又は８２であるものが特に好ましい。
【０１１０】
（III−３：その他の膜成分）
空ベシクルの形成時には、第１の重合体及び第２の重合体に加えて、ベシクルの形成を妨げない、或いは安定性を下げない範囲で、その他の膜成分を添加することができる。その他の膜成分に特に制限はないが、具体例としては荷電性重合体、荷電性ナノ粒子等が挙げられる。
荷電性重合体としては、前述した荷電性セグメント（カチオン性セグメント又はアニオン性セグメント）を１又は２以上有する重合体であって、前記の第１の重合体及び第２の重合体に該当しない任意の荷電性重合体が挙げられる。
荷電性ナノ粒子としては、表面に荷電を有する金属系ナノ粒子等が挙げられる。
【０１１１】
前記その他の膜成分は、一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
前記その他の膜成分の使用量も制限されないが、第１の重合体と第２の重合体との自己組織化によるベシクル形成を妨げない程度に抑えることが好ましい。具体的には、ベシクルの総重量に対して通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
【０１１２】
（III−４：空ベシクルの製造方法）
本発明の製造方法で使用される空ベシクルは、第１の重合体と第２の重合体との静電相互作用を利用して形成されることから、第１の重合体と第２の重合体とを水性溶液中で混合することにより簡便に製造される。斯かる製造方法によれば、有機溶媒を用いなくともベシクルを製造し得るから、ＤＤＳやバイオマテリアル等の分野において有利である。
【０１１３】
具体的には、第１の重合体を含んでなる第１の水性溶液と、第２の重合体を含んでなる第２の水性溶液とを用意する。第１及び第２の水性溶液は、所望により濾過して精製してもよい。
第１の水性溶液における第１の重合体の濃度、及び、第２の水性溶液における第２の重合体の濃度は限定されず、第１の重合体と第２の重合体との総電荷数の比率、第１の重合体及び第２の重合体の水性溶液への溶解度、ベシクルの形成効率等の条件を勘案して、適宜決定される。
【０１１４】
第１及び第２の水性溶液の溶媒は、水性溶媒であれば、その種類は限定されない。好ましくは水であるが、ベシクルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
第１及び第２の水性溶液のｐＨは、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。第１及び第２の水性溶液のｐＨを調整して用いることは、第１の重合体及び第２の重合体の荷電状態を保持し、効率的にベシクルを形成する上で有利である。
【０１１５】
第１及び第２の水性溶液の温度は、第１の重合体及び第２の重合体の溶媒に対する溶解度に応じて適宜決定されるが、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
第１及び第２の水性溶液のイオン強度は、ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは０ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは２００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１１６】
以上の第１及び第２の水性溶液を混合することにより、ベシクルを作成する。混合方法は限定されず、第１の水性溶液に第２の水性溶液を加えてもよく、第２の水性溶液に第１の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第１及び第２の水性溶液を同時に入れて混合してもよい。得られた第１及び第２の水性溶液の混合液を、適宜攪拌してもよい。
第１及び第２の水性溶液の混合時の温度は、ベシクルの形成を妨げない範囲であれば限定されないが、第１の重合体及び第２の重合体の温度に応じた溶解度を勘案して設定することが好ましい。具体的には、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
【０１１７】
混合後、形成された空ベシクルをすぐに本発明の製造方法に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。但し、形成されたベシクルの径は経時的に増大する傾向があるので、通常は静置時間を設けないで、形成された空ベシクルをすぐに本発明の製造方法に供することが好ましい。
【０１１８】
その他の膜成分を用いる場合、上記の第１及び第２の水性溶液と、当該膜成分とを混合すればよい。このとき、混合前の第１又は第２の水性溶液に当該膜成分を加えて混合してもよいが、当該膜成分と第１又は第２の水性溶液との間にベシクル形成を妨げる会合や相互作用がないことが望ましい。また、第１及び第２の水性溶液の混合時に当該膜成分を一緒に加えて混合してもよく、第１及び第２の水性溶液の混合後に当該膜成分を加えて更に混合してもよい。また、他の膜成分をそのまま混合に用いてもよいが、当該膜成分を含有する水性溶液を調製し、これを混合に用いてもよい。膜成分の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【０１１９】
［IV：被内包物質］
本発明の製造方法で用いる被内包物質は制限されず、物質内包ベシクルの用途や性質等に応じて適宜、任意に選択することができる。
特に、従来の製造方法の一つである同時混合法によれば、被内包物質として荷電性の物質を用いた場合、膜構成成分である重合体の自己組織化によるベシクルの形成が被内包物質の荷電によって阻害され、適切な物質内包ベシクルが得られないという問題があった。しかし、本発明の製造方法によれば、被内包物質の電気的性質に斯かる制限はなく、被内包物質として荷電性の物質を用いた場合でも非荷電性の物質を用いた場合でも、物質内包ベシクルを効率的に形成することが可能である。
【０１２０】
具体的に、被内包物質の種類としては、生体分子、有機化合物、無機物質等が挙げられる。
生体分子としては、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、脂質（脂肪酸、グリセリド、ステロイド等）、炭水化物（単糖類、多糖類）、及びこれらの誘導体、並びにこれらの二種以上が結合したもの（糖タンパク質、糖脂質等）等が挙げられる。中でもタンパク質、炭水化物等が好ましい。
有機化合物としては、発光（蛍光、燐光等）分子、水溶性薬剤、水溶性高分子、平均粒径１００ｎｍ以下の水溶性分子集合体（ミセル、ベシクル、ナノゲルなど）、平均粒径１００ｎｍ以下のエマルション等が挙げられる。中でも平均粒径５０ｎｍ以下の高分子ミセル、分子量１０万以下の水溶性高分子が好ましい。
無機物質としては、水に分散可能な金属ナノ粒子、酸化物ナノ粒子（シリカナノ粒子、チタニアナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子等）、半導体ナノ粒子（量子ドット等）、水溶性炭素クラスター、ホウ素クラスター、金属錯体等が挙げられる。中でも平均粒径２０ｎｍ以下の量子ドットが好ましい。
【０１２１】
また、用途別に分類すると、被内包物質としては、抗がん剤（例えば、ドキソルビシンやパクリタキセル等の疎水性抗がん剤、シスプラチン等の金属錯体抗がん剤等及びそれらの高分子ミセル化体）、ＭＲＩ等の診断に用いられるガドリニウムや鉄化合物、有機発光（蛍光、燐光等）色素や量子ドット等が挙げられる。
【０１２２】
被内包物質の分子量及び粒径も制限されないが、空ベシクル内に被内包物質を効率的に導入する観点からは、被内包物質の分子量は通常２０万以下、中でも１０万以下とすることが好ましく、被内包物質の粒径は通常１００ｎｍ以下、中でも５０ｎｍ以下とすることが好ましい。
空ベシクルに対する被内包物質の使用比率も、空ベシクルの構造を破壊したり、被内包物質の空ベシクルへの内包を阻害したりしない範囲で、所望の被内包物質の内包量に応じて調整すればよい。
被内包物質は１種を単独で使用しても、２種以上を任意の比率及び組み合わせで使用してもよい。
【０１２３】
［Ｖ：その他の工程］
本発明の製造方法は、少なくとも、所定の構造を有する空ベシクルを用意する工程と、前記空ベシクル及び被内包物質を水性媒体中で混合する工程とを有していればよいが、更にその他の工程を有していてもよい。例としては、架橋剤処理、ろ過操作、透析操作、凍結乾燥操作等が挙げられる。
中でも、物質内包ベシクルを生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下で使用する場合（例えばＤＤＳとして使用する場合等）には、粒径の経時的な増大を防止する観点から、形成された物質内包ベシクルに対して、後処理として架橋剤処理を施すことが好ましい。すなわち、生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下では、架橋剤を含有しないベシクルの粒径は経時的に増大する傾向があるが、架橋剤処理を施すことにより粒径の増大を防止することができる。
【０１２４】
架橋剤の種類は制限されず、ベシクルの用途や第１の重合体及び第２の重合体の種類、他の膜成分の種類等に応じて適宜選択することができるが、効率的に架橋を行うとともに、物質内包ベシクルの安定性を高める観点からは、第１の重合体及び第２の重合体の荷電性セグメントが有する荷電性基（例えばアミノ基等のカチオン基やカルボキシル基等のアニオン基）と反応し、被内包物質とは反応しない架橋剤が好ましい。架橋剤の具体例としては、アミノ基を架橋する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スベリンイミド酸ジメチルニ塩酸塩（dimethyl suberimidate dihydrochloride：ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate：ＤＴＢＰ））、アミノ基とカルボキシル基を縮合することで架橋する架橋剤（例えば、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide：ＥＤＣ）等）、リン酸基を架橋する架橋剤（例えばカルシウムイオン等の金属イオン）等が挙げられるが、グルタルアルデヒド、ＥＤＣ等が好ましく、ＥＤＣが特に好ましい。また、１種の架橋剤を単独で使用してもよいが、２種以上の架橋剤を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
【０１２５】
架橋剤の使用量も制限されず、架橋剤の種類及び架橋点の数、架橋対象成分の量等を考慮して適宜決定すればよいが、例えば、アミノ基とカルボキシル基とを架橋する架橋剤の場合、下記式（iii）に規定するＣＬ比が次に説明する条件を満たすように使用量を選択することが望ましい。
【数３】
0005843763.tif 000013
【０１２６】
効率的に架橋を行うとともに、物質内包ベシクルの安定性を高める観点からは、ＣＬ比が通常０．１以上、好ましくは０．５以上となるように、架橋剤と第１及び第２の重合体との量比を調整することが望ましい。一方、物質内包ベシクルをＤＤＳとして薬物の送達に用いる場合（例えば用いる場合）、薬物を標的部位において効率よく放出させる観点からは、架橋剤の使用量はあまり多過ぎないことが好ましく、具体的には、ＣＬ比が通常１０以下、好ましくは５以下となるように、架橋剤と第１及び第２の重合体との量比を調整することが望ましい。但し、上記記載のＣＬ比の範囲はあくまでも目安であり、実際にはベシクルの用途や第１の重合体及び第２の重合体の種類、他の膜成分の種類等に応じて、ＣＬ比を適宜調整することが好ましい。
【０１２７】
［VI：物質内包ベシクル］
本発明の製造方法により、前述の空ベシクルの空隙部内に前述の被内包物質が内包された、物質内包ベシクルが得られる。
本発明の製造方法により製造される物質内包ベシクル（以下、本発明の物質内包ベシクルと表示する場合がある。）は、非荷電親水性セグメント及び第１の荷電性セグメントを有するブロック共重合体である第１の重合体と、前記第１の荷電性セグメントとは反対の電荷に帯電した第２の荷電性セグメントを有する第２の重合体とから形成される膜と、前記膜によって包囲された空隙部と、前記空隙部内に内包された物質とを含んでなる。
本発明の物質内包ベシクルの膜の構造は、上述した空ベシクルの膜の構造と基本的に同等である。即ち、本発明の物質内包ベシクルは、図２〜４を用いて説明した空ベシクルの構造膜と同様の三層構造膜を有することが好ましく、その形状は通常は球状又は略球状である。
【０１２８】
本発明の物質内包ベシクルの粒径は、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、ベシクルの周辺環境（水性媒体の種類）、混合の条件等に応じて異なるが、通常は空ベシクルの粒径とほぼ同等である。具体的に、本発明の物質内包ベシクルの粒径は、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは１０００ｎｍ以下、より好ましくは４００ｎｍ以下、より好ましくは２００ｎｍ以下である。
本発明の物質内包ベシクルの膜厚も、空ベシクルの構造、被内包物質の種類、ベシクルの周辺環境（水性媒体の種類）、混合の条件等に応じて異なるが、通常は空ベシクルの粒径及び膜厚とほぼ同等である。具体的に、本発明の物質内包ベシクルの膜厚は、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上、また、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。
【０１２９】
従来の手法では、静電相互作用型ベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅ）に物質を内包させることは一部可能であるものの、適用範囲に制限があった。また、空のベシクルに後から物質を内包させることは困難、又は不可能であった。本発明の製造方法によれば、静電相互作用型ベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅ）に広汎な物質を内包させた物質内包静電相互作用型ベシクル（物質内包ＰＩＣｓｏｍｅ）の製造が可能となる。
【０１３０】
本発明の物質内包ベシクルは、高分子の自己組織化により形成されたベシクルの空隙部内に、各種の物質が安定に保持されているため、薬物を送達するＤＤＳや、有効成分を担持する機能性材料等の各種用途に有効に用いることができる。例えば、被内包物質やベシクル膜の構成成分としてｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）を用いることにより、得られる物質内包ベシクルをＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）用のＤＤＳ等に用いることができる。また、複数の薬剤を被内包物質として内包させたり、被内包物質及び膜材料として併用したりすることにより、薬剤の併用療法にも使用可能である。
本発明の物質内包ベシクルは新規であり、且つ、優れた血中滞留性・腫瘍集積性を示す平均粒径が１００〜２００ｎｍのＰＩＣｓｏｍｅの応用範囲を拡大する点で、極めて有用性が高い。
【０１３１】
［VII：膜内核酸含有ベシクル］
なお、上述の本発明の製造方法に用いた空ベシクルにおいて、第１の重合体が非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体である（すなわち、第１の荷電性セグメントがカチオン性セグメントである）とともに、第２の重合体がアニオン性セグメントとして核酸を有する重合体である（即ち、第２の荷電性セグメントがアニオン性セグメントとして核酸を有する）ベシクルは、所定のブロック共重合体と核酸とを含む膜によって空隙部が包囲された、新規な構造を有するベシクルである。斯かるベシクル（以降「膜内核酸含有ベシクル」と略称する）は、それ自体が核酸を送達するＤＤＳや、核酸を有効成分とするバイオマテリアル・機能性材料として有用である。また、斯かる膜内核酸含有ベシクルを、上述の本発明の製造方法の空ベシクルとして用いることにより、膜内に核酸を含有すると共に、空隙部に別の薬物を内包させた物質内包ベシクルとすることができ、核酸と別の薬物とを組み合わせて送達するＤＤＳとしても有用である。
以下、斯かる膜内核酸含有ベシクルについて説明する。
【０１３２】
〔VII−１：膜内核酸含有ベシクルの構造〕
膜内核酸含有ベシクル１０の構造の例について、図５（ａ）〜（ｃ）を参照しながら説明する。なお、図５（ａ）〜（ｃ）は何れも模式図であり、本発明はこれらの図に限定されるものではない。
【０１３３】
図５（ａ）は、膜内核酸含有ベシクル１０の部分破断図である。図５（ａ）に示すように、膜内核酸含有ベシクル１０は、膜１０ａと、膜１０ａにより包囲される空隙部１０ｂとを有する。
図５（ｂ）は、膜内核酸含有ベシクル１０の膜１０ａの部分断面拡大図である。図５（ｂ）に示すように、膜１０ａは、外層１０ａo、中間層１０ａm及び内層１０ａiからなる三層構造を有し、主にブロック共重合体２０と、核酸３０とから形成される。
図５（ｃ）は、ブロック共重合体２０及び核酸３０の拡大図である。図５（ｃ）に示すように、ブロック共重合体２０は、非荷電親水性セグメント２０ａとカチオン性セグメント２０ｂとを有する。
【０１３４】
理論に束縛されるものではないが、ブロック共重合体２０及び核酸３０から膜内核酸含有ベシクル１０が形成される機構は、以下のように考えられる。すなわち、図５（ｃ）に示すブロック共重合体２０及び核酸３０が、電荷の相互作用が生じ得る系（例えば水性媒体中）に置かれると、自己集合し、図５（ｂ）に示すように、正に帯電するカチオン性セグメント２０ｂと負に帯電する核酸３０とが静電結合して中間層１０ａmを形成するとともに、その外側に非荷電親水性セグメント２０ａが配置されて外層１０ａoを形成する。更に好ましくは、中間層１０ａmの内側にも非荷電親水性セグメント２０ａが配置されて、内層１０ａiを形成する。こうして図５（ｂ）に示す三層構造の膜１０ａが形成され、結果として、図５（ａ）に示す膜内核酸含有ベシクル１０が形成されるものと考えられる。
【０１３５】
従って、好ましい態様によれば、図５（ｂ）に示すように、非荷電親水性セグメント２０ａが膜１０ａの外層１０ａoを形成し、カチオン性セグメント２０ｂと核酸３０とが静電結合して中間層１０ａmを形成する。更に好ましくは、主に非荷電親水性セグメント２０ａが膜１０ａの内層１０ａiを形成する。
なお、膜内核酸含有ベシクル１０の膜１０ａは、ブロック共重合体２０及び核酸３０のみからなっていてもよいが、以上の構造が概略保持される限りにおいて、ブロック共重合体２０及び核酸３０に加え、その他の成分を含有していてもよい。その他の成分は限定されないが、例としては架橋剤、荷電性ポリマー、荷電性分子等が挙げられる。架橋剤については後に詳述する。
【０１３６】
また、後述するように、膜内核酸含有ベシクル１０は通常は水性媒質中で調製され、また、膜１０ａの内層１０ａiは好ましくは主に非荷電親水性セグメント２０ａから構成されるため、膜内核酸含有ベシクル１０の空隙部１０ｂには通常は水性媒体が存在する（よって本明細書では空隙部１０ｂを「内水相」と表示する場合がある）。但し、空隙部１０ｂに別の物質が存在していてもよい。特に、膜内核酸含有ベシクル１０をＤＤＳ等に用いる場合には、空隙部１０ｂに薬物を含有させてもよい。薬物を内包させる態様については後に詳述する。
【０１３７】
膜内核酸含有ベシクル１０の形状は、限定されないが、通常は球状又は略球状である。
膜内核酸含有ベシクル１０の粒径は、ブロック共重合体２０及び核酸３０の種類及び量比、架橋剤の有無、膜内核酸含有ベシクル１０の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、また、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下である。なお、実施例において例証するように、生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下では、架橋剤を含有しない膜内核酸含有ベシクル１０の粒径は経時的に増大する傾向があるが、架橋剤を導入することにより粒径の増大を防止することが出来る。
【０１３８】
膜内核酸含有ベシクル１０の膜１０ａの膜厚は、ブロック共重合体２０及び核酸３０の種類及び量比、架橋剤の有無、膜内核酸含有ベシクル１０の周辺環境（水性媒体の種類）等に応じて異なるが、好ましくは５ｎｍ以上、より好ましくは１０ｎｍ以上、また、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは２０ｎｍ以下である。
【０１３９】
〔VII−２：ブロック共重合体〕
膜内核酸含有ベシクルに使用されるブロック共重合体は、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有する。
【０１４０】
（VII−２ａ：非荷電親水性セグメント）
膜内核酸含有ベシクルに使用される非荷電親水性セグメントの詳細は、上記（III−２ａ：非荷電親水性セグメント）の欄において説明した、空ベシクルに使用される非荷電親水性セグメントの詳細と同一である。
【０１４１】
（VII−２ｂ：カチオン性セグメント）
膜内核酸含有ベシクルに使用されるカチオン性セグメントの詳細は、上記（III−２ｂ−１：カチオン性セグメント）の欄において説明した、空ベシクルに使用されるカチオン性セグメントの詳細と同一である。
【０１４２】
（VII−２ｃ：非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとの組み合わせ）
膜内核酸含有ベシクルに使用される非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとの組み合わせは制限されず、任意の非荷電親水性セグメントと任意のカチオン性セグメントとを組み合わせることが可能である。
非荷電親水性セグメント及びカチオン性セグメントの個数も任意であり、各々１つでも２つ以上でもよく、２つ以上の場合には互いに同一でも異なっていてもよい。通常は、非荷電親水性セグメント１つに対して、カチオン性セグメントが１つ結合することが好ましい。しかし、ベシクル内に多量の核酸を保持する観点からは、非荷電親水性セグメントが１つに対して、カチオン性セグメントが２つ以上結合する形態も好適である。
【０１４３】
非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとの結合形態も制限されず、直接結合していてもよいが、連結基を介して結合していてもよい。
連結基の例としては、非荷電親水性セグメント及びカチオン性セグメントの総個数に対応する価数を有する炭化水素基が挙げられる。連結基としての炭化水素基は脂肪族でも芳香族でもそれらが連結したものでもよく、脂肪族の場合には飽和でも不飽和でもよく、また、直鎖でも分岐でも環状でもよい。連結基としての炭化水素基の分子量は、制限されるものではないが、通常５０００以下、好ましくは１０００以下である。連結基としての炭化水素基の例としては、没食子酸誘導体、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体、グリセリン誘導体、シクロヘキサン誘導体、Ｌ−リシン等が挙げられるが、３，５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体等が好ましい。
【０１４４】
連結基の別の例としては、ジスルフィド基が挙げられる。ジスルフィド基は、非荷電親水性セグメント１つとカチオン性セグメント１つを連結するのに用いられる。ジスルフィド基を介して非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを連結することにより、ベシクルの置かれた環境や外部からの作用によってジスルフィド基を開裂させ、ベシクルの形態や性質を変化させることが可能になる。これを利用すれば、例えばベシクルを核酸送達用のＤＤＳに用いる場合、生体内でジスルフィド基を開裂させることによって、ベシクルの膜を構成する核酸や、ベシクル内に内包された薬物（この態様については後述する）の放出を促すことも可能になると考えられる。
また、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとの比率も任意であるが、ブロック共重合体と核酸との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、ベシクル中に含まれる非荷電親水性セグメントの分子量比率を所定の範囲内とすることが好ましい。具体的な比率については、核酸の量も考慮して決定することが好ましいため、（VII−３：核酸）の欄で後述する。
【０１４５】
（VII−２ｄ：ブロック共重合体の具体例）
膜内核酸含有ベシクルに使用されるブロック共重合体の好ましい具体例としては、下記式（IX）に示すものが挙げられる。
【化１０】
0005843763.tif 000014
式（IX）中、
Ｒ10は、−（ＣＨ2）3ＮＨ2、−（ＣＨ2）2ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2、又は−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）s−Ｘであり
（ここで、
ｓは、０〜２０の整数であり、
Ｘは、−ＮＨ2、ピリジル基、モルホリル基、ピペラジニル基、１−イミダゾリル基、４−（Ｃ1-6アルキル）−ピペラジニル基、４−（アミノＣ1-6アルキル）−ピペラジニル基、ピロリジン−１−イル基、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、−（ＣＨ2）tＮＨＲ60、又は−（ＮＲ50（ＣＨ2）o）pＮＨＲ60からなる群から選択される
（ここで、
Ｒ50は、水素原子又はメチル基を表し、
Ｒ60は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基又はtert−ブトキシカルボニル基、グアニジノ基を表し、
ｏは、１〜５の整数であり、
ｐは、１〜５の整数であり、
ｔは、０〜１５の整数である））、
Ｒ20は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基、コレステロール誘導体基、含有炭素数が３〜１３のアシル基、又はグアニジノ基（−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）であり、
Ｒ30は、水素原子、又は、置換されていてもよいＣ1-12アルキル基を表し、
Ｒ40は、−（ＣＨ2）gＲ70ＮＨ−を表し（ここでｇは、０〜１２の整数である）、ここでＲ70は、直鎖又は分岐のＣ1-12アルキルを表し、
ａは、０〜５，０００の整数であり、
ｂは、０〜５，０００の整数であり、但しａ＋ｂが２〜５，０００であり、
ｃは、０〜２０の整数であり、
ｄは、０或いはｃ−１を満たす整数であり、
ｅは、５〜２，５００の整数である。
【０１４６】
式（IX）において、Ｒ10が−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）s−Ｘを表す場合、Ｘは、ブロック共重合体の繰り返し単位ごとに同一の官能基であってもよく、異なる官能基であってもよい。
中でも、本発明のブロック共重合体としては、式（IX）において、Ｒ10が−ＣＯＮＨ（ＣＨ2）S−ＮＨ2基であり、ｓが２〜５の整数であり、Ｒ20が水素原子であり、Ｒ30がメチル基であり、ａが０〜２００の整数であり、ｂが０〜２００の整数であり、但しａ＋ｂが１０〜２００であり、ｅが１０〜３００の整数であるものが特に好ましい。
【０１４７】
（VII−３：核酸）
膜内核酸含有ベシクルに使用される核酸は制限されず、膜内核酸含有ベシクルの用途や性質等に応じて適宜選択することができる。
即ち、核酸は一本鎖でも二本鎖でもよく、また、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、タンパク質のコード化の有無やその他の機能の有無も制限されない。但し、ベシクルの用途を考慮すると、機能性核酸であることが好ましい。機能性核酸としては、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ酵素等が挙げられる。これらはベシクルの用途に応じて選択される。例えば、ベシクルをＲＮＡｉ用のＤＤＳに用いる場合、核酸としてはｓｉＲＮＡが用いられる。
また、核酸は修飾されたものであってもよい。修飾された核酸の例としては、ベシクル安定化等の用途に向けて、コレステロールやビタミンＥ等の疎水性官能基が結合された核酸が挙げられる。
【０１４８】
核酸の塩基数も特に制限されないが、通常９以上、好ましくは１２以上、より好ましくは１９以上、また、通常１００以下、好ましくは４０以下、より好ましくは２７以下の範囲が好適である。特に、核酸としてｓｉＲＮＡを用いる場合、その塩基数は前述のとおり、通常は１９〜２７であるが、好ましくは２１〜２３である。
核酸は、１種を単独で使用してもよいが、２種以上を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
【０１４９】
核酸の使用量も制限されないが、ブロック共重合体と核酸との自己組織化を促し、均質なベシクルを効率的に製造する観点からは、下記式（iv）に規定するＮ+／Ｐ比が、次に説明する条件を満たすように使用量を選択することが望ましい。
【数４】
0005843763.tif 000015
ここで、ブロック共重合体におけるプロトン化した状態のアミノ基のモル数は、ブロック共重合体のカチオン性セグメントの構造に依存する値であるが、一般的な電位差（酸・塩基）滴定により求めることが可能である。
【０１５０】
Ｎ+／Ｐ比の値は、通常１．０超、好ましくは１．０５以上、より好ましくは１．１以上、また、通常３．０未満、好ましくは２．８以下、より好ましくは２．５以下の範囲が望ましい。よって、Ｎ+／Ｐ比の値が前記範囲を満たすように、核酸とブロック共重合体との量比を調整することが望ましい。
但し、Ｎ+／Ｐ比の好適値は、種々の条件に応じて異なる。例えば、核酸として無修飾の核酸を用いる場合、Ｎ+／Ｐ比の値としては、通常１．０超、好ましくは１．０５以上、より好ましくは１．１以上、また、通常１．５未満、好ましくは１．４以下の範囲が好ましい。一方、核酸として修飾核酸（例えばコレステロール修飾核酸等）を用いる場合、Ｎ+／Ｐ比の好適値は比較的高い範囲となる。従って、それらの条件を考慮して、核酸とブロック共重合体との量比を調整することが望ましい。
【０１５１】
なお、非荷電親水性セグメントの分子量は、前記Ｎ+／Ｐ比の範囲を満たすカチオン性セグメント及び核酸の分子量を勘案して決定することが好ましい。具体的には、以下の式（ｖ）で規定される非荷電親水性セグメントの分子量比率Ｘを、通常０．０１以上、好ましくは０．０５以上、また、通常０．３５以下、好ましくは０．１以下の範囲に収めることが望ましい。
【数５】
0005843763.tif 000016
【０１５２】
（VII−４：架橋剤）
膜内核酸含有ベシクルに架橋剤は必須ではないが、膜内核酸含有ベシクルを生理環境下や生理食塩水中等の塩存在条件下で使用する場合（例えばＤＤＳとして使用する場合等）には、粒径の経時的な増大を防止する観点から、膜成分として架橋剤を使用することが好ましい。
【０１５３】
架橋剤の種類は制限されず、膜内核酸含有ベシクルの用途やブロック共重合体及び核酸の種類等に応じて適宜選択することができるが、効率的に架橋を行うとともに、得られる膜内核酸含有ベシクルの安定性を高める観点からは、ブロック共重合体のカチオン性セグメントが有するカチオン基（例えばアミノ基等）と反応し、核酸と反応しない架橋剤が好ましい。架橋剤の具体例としては、アミノ基を架橋する架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド、スベリンイミド酸ジメチルニ塩酸塩（dimethyl suberimidate dihydrochloride：ＤＭＳ）、３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate：ＤＴＢＰ）、１−エチル３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropy)carbodiimide：ＥＤＣ）等）、リン酸基を架橋する架橋剤（例えばカルシウムイオン等の金属イオン）等が挙げられるが、グルタルアルデヒド、ＤＭＳ、ＤＴＢＰ等が好ましく、グルタルアルデヒドが特に好ましい。また、１種の架橋剤を単独で使用してもよいが、２種以上の架橋剤を任意の組み合わせ及び比率で使用してもよい。
【０１５４】
架橋剤の使用量も制限されず、架橋剤の種類及び架橋点の数、架橋対象成分の量等を考慮して適宜決定すればよいが、例えば、アミノ基を架橋する架橋剤の場合、下記式（vi）に規定するＣＬ／Ｎ比が次に説明する条件を満たすように使用量を選択することが望ましい。
【数６】
0005843763.tif 000017
効率的に架橋を行うとともに、得られる膜内核酸含有ベシクルの安定性を高める観点からは、ＣＬ／Ｎ比が通常０．０１以上、好ましくは０．１以上となるように、架橋剤とブロック共重合体との量比を調整することが望ましい。一方、膜内核酸含有ベシクルを核酸の送達に用いる場合（例えばＲＮＡｉ用ＤＤＳとして用いる場合）、核酸を標的部位において効率よく放出させる観点からは、架橋剤の使用量はあまり多過ぎないことが好ましく、具体的には、ＣＬ／Ｎ比が通常１０以下、好ましくは７以下、より好ましくは５以下となるように、架橋剤とブロック共重合体との量比を調整することが望ましい。
【０１５５】
（VII−５：その他の膜成分）
膜内核酸含有ベシクルを製造する際に、ブロック共重合体及び核酸とは異なる他の成分の膜への添加は必須ではないが、膜内核酸含有ベシクルの形成を妨げない、或いは安定性を下げない範囲で、その他の膜成分を添加することができる。その他の膜成分に特に制限はないが、具体例としては、荷電性重合体、荷電性ナノ粒子等が挙げられる。
【０１５６】
荷電性重合体としては、荷電性ポリアミノ酸又はその誘導体等が好ましく、カチオン性ポリアミノ酸又はその誘導体が特に好ましい。カチオン性ポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられるが、特にポリアスパルタミド誘導体及びポリグルタミド誘導体が好ましい。カチオン性ポリアミノ酸又はその誘導体のアミノ酸残基数も制限されないが、好ましくは５以上、より好ましくは３０以上、また、好ましくは２００以下、より好ましくは１００以下の範囲とする。
荷電性ナノ粒子としては、表面に架電を有する金属系ナノ粒子等が挙げられる。
【０１５７】
前記その他の膜成分は、一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
前記その他の膜成分の使用量も制限されないが、ブロック共重合体と核酸との自己組織化によるベシクル形成を妨げない程度に抑えることが好ましい。具体的には、ベシクルの総重量に対して通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
【０１５８】
（VII−６：膜内核酸含有ベシクルの製法）
膜内核酸含有ベシクルは、ブロック共重合体と核酸との静電相互作用を利用して形成されることから、ブロック共重合体と核酸とを水性溶液中で混合することにより、簡便に製造することができる。斯かる製造方法によれば、有機溶媒を用いなくとも膜内核酸含有ベシクルを製造し得ることから、ＤＤＳやバイオマテリアル等の分野において有利である。
【０１５９】
具体的には、ブロック共重合体を含んでなる第１の水性溶液と、核酸を含んでなる第２の水性溶液とを用意する。第１及び第２の水性溶液は、所望により濾過等の手法で精製してもよい。
第１の水性溶液におけるブロック共重合体の濃度、及び、第２の水性溶液における核酸の濃度は限定されず、ブロック共重合体と核酸との総電荷数の比率、ブロック共重合体及び核酸の水性溶液への溶解度、膜内核酸含有ベシクルの形成効率等の条件を勘案して、適宜決定される。
第１及び第２の水性溶液の溶媒は、水性溶媒であれば、その種類は限定されない。好ましくは水であるが、膜内核酸含有ベシクルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【０１６０】
第１及び第２の水性溶液のｐＨは、膜内核酸含有ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくはｐＨ５以上、より好ましくはｐＨ６．５以上であり、また、好ましくはｐＨ９以下、より好ましくはｐＨ７．５以下である。ｐＨの調整は、溶媒として緩衝液を用いることにより、容易に行うことができる。第１及び第２の水性溶液のｐＨを調整して用いることは、ブロック共重合体及び核酸の荷電状態を保持し、効率的にベシクルを形成する上で有利である。
第１及び第２の水性溶液の温度は、ブロック共重合体及び核酸の溶媒に対する溶解度に応じて適宜決定されるが、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、また、好ましくは８０℃以下、より好ましくは６０℃以下である。
第１及び第２の水性溶液のイオン強度は、膜内核酸含有ベシクルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは５ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下である。
【０１６１】
以上の第１及び第２の水性溶液を混合することにより、膜内核酸含有ベシクルを作成する。混合方法は限定されず、第１の水性溶液に第２の水性溶液を加えてもよく、第２の水性溶液に第１の水性溶液を加えてもよい。また、容器に第１及び第２の水性溶液を同時に入れて混合してもよい。得られた第１及び第２の水性溶液の混合液を、適宜攪拌してもよい。
第１及び第２の水性溶液の混合時の温度は、膜内核酸含有ベシクルの形成を妨げない範囲であれば限定されないが、ブロック共重合体及び核酸の温度に応じた溶解度を勘案して設定することが好ましい。具体的には、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上、また、好ましくは６０℃以下、より好ましくは５０℃以下である。
【０１６２】
混合後、形成された膜内核酸含有ベシクルをすぐに所望の用途に供してもよいが、系を平衡化させるために、混合液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、膜内核酸含有ベシクルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは５０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。但し、前述のように架橋剤を用いない場合、形成された膜内核酸含有ベシクルの径が経時的に増大する傾向があるので、静置時間を設けないことが好ましい場合もある。
架橋剤を用いる場合、上記の第１及び第２の水性溶液の混合溶液に、当該架橋剤を加えて混合すればよい。架橋剤はそのまま混合に用いてもよいが、架橋剤を含有する水性溶液を調製し、これを混合してもよい。架橋剤の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
【０１６３】
架橋剤以外のその他の膜成分を用いる場合、上記の第１及び第２の水性溶液と、当該膜成分とを混合すればよい。このとき、混合前の第１又は第２の水性溶液に当該膜成分を加えて混合してもよいが、当該膜成分と第１又は第２の水性溶液との間に膜内核酸含有ベシクル形成を妨げる会合や相互作用がないことが望ましい。また、第１及び第２の水性溶液の混合時に当該膜成分を一緒に加えて混合してもよく、第１及び第２の水性溶液の混合後に当該膜成分を加えて更に混合してもよい。また、他の膜成分をそのまま混合に用いてもよいが、当該膜成分を含有する水性溶液を調製し、これを混合に用いてもよい。膜成分の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【０１６４】
（VII−７：膜内核酸含有ベシクルの用途）
膜内核酸含有ベシクルは、核酸が膜内に安定に保持されているため、核酸を送達するＤＤＳや、核酸を有効成分とする機能性材料として、そのままの状態で有効に用いることができる。例えば、核酸としてｓｉＲＮＡを用いることにより、得られる膜内核酸含有ベシクルをＲＮＡｉ用のＤＤＳに用いることができる。
また、核酸以外の別の物質、例えば薬物を、膜内核酸含有ベシクルの空隙部（内水相）に内包させてもよい。これにより、例えば核酸と当該薬物とを組み合わせて送達するＤＤＳとして、ベシクルを有効に用いることができる。別の薬物は限定されず、ベシクルの用途及びその性質に応じて適宜選択することができるが、例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸及びその誘導体、脂肪、単糖、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、その他の薬剤等が挙げられる。また、用途別では、抗がん剤（例えば、ドキソルビシンやパクリタキセル等の疎水性抗がん剤、シスプラチン等の金属錯体抗がん剤等）、ＭＲＩ等の診断に用いられるガドリニウムや鉄化合物、有機発光（蛍光、燐光等）色素や量子ドット等が挙げられる。
【０１６５】
膜内核酸含有ベシクルの空隙部（内水相）に別の薬物を内包させる場合、その手法としては、以下が挙げられる。
（ｉ）膜内核酸含有ベシクル形成前に第１又は第２の水性溶液に当該薬物を加えて混合する手法。
（ii）膜内核酸含有ベシクル形成時に第１及び第２の水性溶液と共に当該薬物を加えて混合する手法。
（iii）第１及び第２の水性溶液の混合後、形成された膜内核酸含有ベシクルを含有する水性溶液に対して当該薬物を加えて混合する手法。
【０１６６】
（ｉ）及び（ii）の手法は、薬物が非荷電（中性）の物質の場合には有効である。しかし、荷電性（カチオン性又はアニオン性）の薬物に（ｉ）及び（ii）の手法を用いると、荷電性薬物によって膜内核酸含有ベシクルの形成が阻害されてしまい、所望の薬物内包ベシクルが得られない場合がある。
一方、（iii）の手法は、上述の本発明の物質内包ベシクルの製造方法において、空ベシクルとして膜内核酸含有ベシクルを用いる場合に該当する。本方法によれば、上述のように、薬物が非荷電（中性）の物質か、荷電性（カチオン性又はアニオン性）の物質かによらず、用いることができる。その理由は定かではないが、得られた膜内核酸含有ベシクルがいったん解離した後に再集合していると考えられる。
（iii）の手法の場合、その条件は、上記［II：物質内包ベシクルの製造方法］、［IV：被内包物質］及び［Ｖ：その他の工程］等の欄において詳述したとおりである。
【０１６７】
上記（ｉ）〜（iii）の何れの手法でも、内包させる薬物は、そのまま混合に用いてもよいが、当該薬物を含有する水性溶液を調製し、これを混合に用いてもよい。薬物の水性溶液の調製における水性溶媒、ｐＨ、温度、イオン強度等の調製条件は、第１及び第２の水性溶液について上述した条件と同様である。
架橋剤等の他の膜成分を併用する場合、当該薬物と当該膜成分との混合順も任意である。但し、架橋剤を用いる場合には、薬物をベシクルの空隙部に効率的に内包させる観点から、薬物をベシクルに内包させてから、架橋剤を加えて混合することが好ましい。
また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
【０１６８】
（VII−８：その他）
以上、膜内核酸含有ベシクルについて、具体的な実施の形態に即して説明したが、当業者であれば本明細書の記載を元に、上述の実施の形態に適宜変更を加えて実施することが可能である。
例えば、実施の形態で説明した膜内核酸含有ベシクルは、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有するブロック共重合体と、核酸とから形成されるが、これに代えて、非荷電親水性セグメントと核酸とを結合させた共重合体とカチオン性セグメントからなる重合体とを用いても、同様の膜内核酸含有ベシクルを形成することが可能である。
この場合も、通常は、カチオン性セグメントと核酸とが静電結合して中間層を形成し、非荷電親水性セグメントが外層及び内層を形成することにより、三層構造の膜とそれに包囲された空隙部を有する構造の膜内核酸含有ベシクルが形成される。
斯かる態様において、膜内核酸含有ベシクルの各成分の詳細、膜内核酸含有ベシクルの製造方法の詳細は、何れも前記記載の内容と基本的に同様である。当業者であれば本明細書の記載に基づいて、適宜必要な変更を加えることにより、斯かる態様を実施することが可能である。よって、かかる構造を有する膜内核酸含有ベシクル及びその製造方法も、本発明の範囲に含まれる。
【実施例】
【０１６９】
次に、実施例を参照しながら、本発明をより具体的に説明する。なお、以下の実施例は、あくまでも例示を目的とするものであり、本発明を何ら限定するものではない。
なお、以下の記載において「溶液」とは、特に別途記載しない限り、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を溶媒とする溶液を指すものとする。
また、以下の記載において「ボルテックスミキサー」としては、別途記載しない限り、Scientific Industries Inc.製Vortex-Genie 2を用いた。
また、以下の記載における平均粒径、多分散指数（polydispersity index：ＰＤＩ）及びゼータ電位は、別途記載しない限り、Malvern社製Zetasizer Nano-ZSにより測定した。【０１７０】
［実施例群Ｉ：膜内核酸含有ベシクルの製造及び評価］
（Ｉ−ａ）ブロック共重合体の調製：
非荷電親水性セグメントとしてポリエチレングリコール（分子量約２０００）（以降「ＰＥＧ」と表示する場合がある）を有し、カチオン性セグメントとしてポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（重合度約７０）（以降「ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）」と表示する場合がある）を有する、下記式で表されるブロック共重合体（以降「ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）」と表示する場合がある）を合成した。【０１７１】
【化１１】
0005843763.tif 000018
式中、
ｍはＰＥＧの重合度を表し、約４４である。
ｎはＰＡｓｐ（ＤＡＰ）の重合度を表し、約７０である。
ａ、ｂは何れも０より大きく、１未満の数である。但しａ＋ｂ＝１である。【０１７２】
（Ｉ−ｂ）膜内核酸含有ベシクルの調製：
ｓｉＲＮＡとしてＧＬ３（センス鎖：５’−ＣＵＵ ＡＣＧ ＣＵＧ ＡＧＵ ＡＣＵ ＵＣＧ ＡｄＴｄＴ−３’（配列番号１）、アンチセンス鎖：５’−ＵＣＧ ＡＡＧ ＵＡＣ ＵＣＡ ＧＣＧ ＵＡＡ ＧｄＴｄＴ−３’（配列番号２）：塩基数２１）を用いた。ｓｉＲＮＡの１ｍｇ／ｍＬ溶液５０μＬに対して、前記（Ｉ−ａ）で得られたＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）の１ｍｇ／ｍＬ水溶液を、Ｎ+／Ｐ比が以下の表１に規定する値となるような体積で加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌・混合することにより、実施例Ｉ−１〜Ｉ−４及び比較例Ｉ−１〜Ｉ−４の混合液を調製した。
【表１】
0005843763.tif 000019
【０１７３】
（Ｉ−ｃ）膜内核酸含有ベシクルの評価：
（Ｉ−ｃ１）動的光散乱法による測定：
前記（Ｉ−ｂ）で得られた実施例Ｉ−１〜Ｉ−４及び比較例Ｉ−１〜Ｉ−４の混合液中に存在する粒子の物性を調べるため、動的光散乱（dynamic light scattering）法による測定を行い、平均粒径及び多分散指数（polydispersity index：ＰＤＩ）を求めた。
平均粒径及び多分散指数の測定結果を、それぞれ図６（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。図６（ａ）によれば、Ｎ+／Ｐ比が１．０超、１．５未満の範囲内（実施例Ｉ−１〜Ｉ−４）では平均粒径が約１００ｎｍで安定しているのに対し、Ｎ+／Ｐ比が１．０以下（比較例Ｉ−１、Ｉ−２）では平均粒径が大幅に小さくなり、Ｎ+／Ｐ比が１．５以上（比較例Ｉ−３、Ｉ−４）では逆に平均粒径が大幅に大きくなることが判る。また、図６（ｂ）によれば、Ｎ+／Ｐ比が１．０超、１．５未満の範囲内（実施例Ｉ−１〜Ｉ−４）では多分散指数が小さくなり、均一な球状の粒子が存在していることが判る。これらの結果を総合すると、Ｎ+／Ｐ比が１．０超、１．５未満の範囲内（実施例Ｉ−１〜Ｉ−４）では、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）及びｓｉＲＮＡが自己組織化することにより、平均粒径約１００ｎｍの均一な球状粒子が、混合液中に形成されていることが判る。【０１７４】
（Ｉ−ｃ２）透過型電子顕微鏡による観察：
前記（Ｉ−ｂ）で得られた実施例Ｉ−１〜Ｉ−４及び比較例Ｉ−１〜Ｉ−４の混合液中の粒子を、以下の手順により透過型電子顕微鏡で観察した。
コロジオン支持膜を付着した後にカーボンコーティングしたＣｕグリッド（日新ＥＭ社）上に、前記（Ｉ−ｂ）の混合液を滴下し、更に酢酸ウランを微量滴下した後、余分な水分を濾紙で除去し、乾燥させることにより、前記（Ｉ−ｂ）の混合液中の粒子が固定された標本グリッドを作製した。得られた標本グリッドを透過型電子顕微鏡で観察した。【０１７５】
実施例Ｉ−３（Ｎ+／Ｐ比＝１．２）及び比較例Ｉ−４（Ｎ+／Ｐ比＝２．０）について得られた電子顕微鏡写真の例を、それぞれ図７（ａ）及び（ｂ）として示す。実施例Ｉ−２の電子顕微鏡写真（図７（ａ）参照）では、粒径約１００ｎｍの同心円状の粒子が多数観察されたことから、空隙部を有する平均粒径約１００ｎｍの均一な球状のベシクルが形成されていることが判る。一方、比較例Ｉ−４の電子顕微鏡写真（図７（ｂ）参照）では、かかる同心円状の均一粒子は観察されず、不均一形状の大型の粒子しか存在しなかった。
その他のＮ+／Ｐ比の電子顕微鏡写真についても、Ｎ+／Ｐ比が１．０超、１．５未満の範囲内では、図７（ａ）と同様に粒径約１００ｎｍの同心円状の粒子が多数観察されたのに対して、Ｎ+／Ｐ比が１．０以下又は１．５以上では、かかる粒子は観察されなかった。
これらの結果を前記の動的光散乱法の測定結果と考え合わせると、Ｎ+／Ｐ比が１．０超、１．５未満の範囲内（実施例Ｉ−１〜Ｉ−４）では、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）及びｓｉＲＮＡによって形成された膜を有する、新規なベシクル（膜内核酸含有ベシクル）が形成されることが判る。【０１７６】
［実施例群II：架橋された膜内核酸含有ベシクルの製造及び評価］
（II−ａ）架橋された膜内核酸含有ベシクルの調製：
実施例群Ｉの「（Ｉ−ｂ）膜内核酸含有ベシクルの調製」記載の手順において、Ｎ+／Ｐ比を１．４に固定した他は、同様の手順で操作を行い、ベシクルを調製した。調製から２時間後、得られたベシクル溶液３０μＬに対して、架橋剤として以下の表２に規定する濃度の１０μＬのグルタルアルデヒド溶液を加え、ボルテックスミキサーで２分間攪拌・混合することにより、参考例II及び実施例II−１〜II−６のベシクル含有混合液を調製した。なお、各グルタルアルデヒド溶液は、７０重量％グルタルアルデヒド（和光純薬社製）を緩衝液（HEPESバッファー）で希釈して作製した。最終的に得られるベシクル含有混合液のＣＬ／Ｎ比を、以下の表２に併せて示す。
【表２】
0005843763.tif 000020
【０１７７】
（II−ｂ）架橋された膜内核酸含有ベシクルの評価：
前記（II−ａ）で得られた実施例II−１のベシクル含有混合液について、位相差クライオ透過型電子顕微鏡による観察を行った。具体的には、マイクログリッド上に試料溶液を展開し、不要水分を濾紙で除去した後、EM CPC cryo-station (Leica Microsystems, Vienna, Austria)を用いて液化エタンにより急速凍結させ、観察標本を作製した。撮像は、−１７０℃下、Zernike位相板を装備した透過型電子顕微鏡JEM 2011（日本電子株式会社製）を用いて行った。位相差クライオ透過型電子顕微鏡写真を図８（ａ）〜（ｄ）に示す。得られた空ベシクル（架橋された膜内核酸含有ベシクル）は、どれも類似の構造を示しており、それぞれ厚さ約１０ｎｍの一枚の隔壁からなる球状ベシクルで、粒径も約１００ｎｍであった。
また、前記（II−ａ）で得られた参考例II及び実施例II−１〜II−６の膜内核酸含有ベシクルを含有する混合液に、生理食塩水（１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液）と同等の濃度となるよう塩化ナトリウム、或いは塩化ナトリウム含有緩衝液を加えて混合した後、所定時間経過後に動的光散乱法による測定を行うことにより、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）の経時変化を調べた。【０１７８】
平均粒径とＣＬ／Ｎ比及び経過時間との関係を図９（ａ）のグラフに、多分散指数（ＰＤＩ）とＣＬ／Ｎ比及び経過時間との関係を図９（ｂ）のグラフにそれぞれ示す。図９（ａ）及び（ｂ）によれば、参考例II（ＣＬ／Ｎ比＝０、すなわち架橋剤なし）の空ベシクル（架橋されていない膜内核酸含有ベシクル）は、生理条件下で粒径が経時的に増大したのに対して、実施例II−１〜II−６（ＣＬ／Ｎ比≧１、すなわち架橋剤あり）の空ベシクル（架橋された膜内核酸含有ベシクル）は何れも、生理条件下でも粒径の経時変化が殆ど無く、均一且つ球状の粒子のままであったことが判る。【０１７９】
［実施例群III：膜内核酸含有ベシクルによる細胞へのｓｉＲＮＡ導入効率の評価］
（III−ａ）ＲＮＡｉ活性の評価：
（III−ａ１）膜内核酸含有ベシクルの調製：
実施例群IIの「（II−ａ）膜内核酸含有ベシクルの調製」記載の手順において、架橋剤として以下の表３に規定する濃度のグルタルアルデヒド溶液を用い、最終的に得られるベシクル含有混合液のＣＬ／Ｎ比を以下の表３に規定する値となるように調整した他は、同様の手順で操作を行うことにより、実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２のベシクル含有混合液を調製した。
【表３】
0005843763.tif 000021
また、上記手順において、対照用ｓｉＲＮＡとしてスクランブル（センス鎖：５’−ＵＵＣ ＵＣＣ ＧＡＡ ＣＧＵ ＧＵＣ ＡＣＧ ＵｄＴｄＴ−３’（配列番号３）、アンチセンス鎖：５’−ＡＣＧ ＵＧＡ ＣＡＣ ＧＵＵ ＣＧＧ ＡＧＡ ＡｄＴｄＴ−３’（配列番号４）：塩基数２１）を用いた他は、同様の手順で操作を行うことにより、実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２に対応する対照用混合液も調製した。【０１８０】
（III−ａ２）ＲＮＡｉ活性の測定：
前記（III−ａ１）で得られた実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２の膜内核酸含有ベシクルを含有する混合液を用いて、以下の手順でマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃを処理し、ｓｉＲＮＡの導入効率を調べた。
即ち、４００μＬの１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中のマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃに、実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２の各混合液（ｓｉＲＮＡとしてＧＬ３を含有）を、ｓｉＲＮＡ換算濃度５００ｎＭとなるように加え、４８時間インキュベーターで培養した後に培地を取り除き、細胞溶解液を添加し、その上澄み２０μＬに１００μＬのルシフェラゼーアッセイ溶液（プロメガ社製）を添加し、ルミノメーターで発光量を測定することにより、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を求めた。
また、実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２に対応する対照用混合液（ｓｉＲＮＡとしてスクランブルを含有）を用いて同様の操作を行うことにより、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量を求めた。
さらに、ｓｉＲＮＡ等を添加していない細胞群に対して同様の操作を行うことにより、ルシフェラーゼ遺伝子の基準発現量を求めた。【０１８１】
実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２の各々について、上記手順で求めた発現量ａ及び基準発現量ｂから、相対発現量ｃを以下の式（vii）で求めた。
【数７】
0005843763.tif 000022
実施例III−１〜III−３及び参考例III−１、III−２の各々における、ルシフェラーゼ遺伝子の相対発現量の測定結果を図１０に示す。図１０に示すように、実施例III−１〜III−３（ＣＬ／Ｎ比が０〜２）の膜内核酸含有ベシクルによって、ルシフェラーゼ遺伝子の発現は有意に抑制され、ＲＮＡｉ活性が認められた。よって、実施例III−１〜III−３（ＣＬ／Ｎ比が０〜２）の膜内核酸含有ベシクルにより、細胞内にｓｉＲＮＡが効率的に導入されたことが判る。【０１８２】
（III−ｂ）共焦点顕微鏡による細胞取込の評価：
（III−ｂ１）膜内核酸含有ベシクルの調製：
前記（III−ａ１）の手順において、ｓｉＲＮＡとして上述のＧＬ３のアンチセンス鎖及びセンス鎖の５’末端にＣｙ５を付したＣｙ５標識ＧＬ３を用いるとともに、架橋剤として以下の表４に規定する濃度のグルタルアルデヒド溶液を用い、最終的に得られるベシクル含有混合液のＣＬ／Ｎ比が以下の表４に規定する値となるように調整した他は、同様の手順で操作を行うことにより、実施例III’−１〜III’−３及び参考例III’−１〜III’−４のベシクル含有混合液を調製した。【０１８３】
【表４】
0005843763.tif 000023
【０１８４】
（III−ｂ２）共焦点顕微鏡による観察：
得られた膜内核酸含有ベシクルを用いた細胞処理後におけるｓｉＲＮＡの細胞取込を、以下の手順により共焦点顕微鏡で観察した。
即ち、１ｍＬの１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中のマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃに、実施例III’−１〜III’−３及び参考例III’−１〜III’−４の各混合液（ｓｉＲＮＡ換算濃度５００ｎＭ）を加え、２４時間後に共焦点顕微鏡（Carl Zeiss社製LSM 510 META NLO）による観察を行った。
実施例III’−２（ＣＬ／Ｎ比＝１．０）の共焦点顕微鏡写真を図１１（ａ）に示す。図１１（ａ）中、白色の領域はｓｉＲＮＡを表す。図１１（ａ）から、細胞内にｓｉＲＮＡが顕著に取り込まれていることが判る。
同様に、実施例III’−１（ＣＬ／Ｎ比＝０）及び実施例III’−３（ＣＬ／Ｎ比＝２．０）においても、細胞核内へのｓｉＲＮＡの顕著な取り込みが観察された。
また、実施例III’−１〜III’−３及び参考例III’−１〜III’−４について得られた共焦点顕微鏡写真について、画像解析を行った。具体的には、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡに由来する白色のピクセル数をカウントすることにより、細胞内に取り込まれたｓｉＲＮＡ量を見積もった。【０１８５】
得られた結果を図１１（ｂ）のグラフに示す。図１１（ｂ）から、ＣＬ／Ｎ比が０〜２の膜内核酸含有ベシクル、特に１．０の膜内核酸含有ベシクルにおいて、ｓｉＲＮＡの細胞内取り込み量が有意に高いことが分かる。
以上の結果から、実施例III’−１〜III’−３（ＣＬ／Ｎ比が０〜２）の膜内核酸含有ベシクルにより、細胞内にｓｉＲＮＡが効率的に導入されたことが判る。【０１８６】
［実施例群IV：非荷電物質内包膜内核酸含有ベシクルの製造及び評価］
（IV−ａ）非荷電物質内包膜内核酸含有ベシクルの製造：
実施例群IIIの「（III−ｂ１）ベシクルの調製」記載の手順において、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液４７．８μｌ及びｓｉＲＮＡ（またはＣｙ３標識ｓｉＲＮＡ）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液５０μｌ（Ｎ+／Ｐ比１．４）に加えて、被内包物質として非荷電物質である蛍光デキストラン（アルドリッチ社製、分子量１００００）の１０ｍｇ／ｍＬ水溶液１０μｌを用い、下記表の「攪拌・混合Ａ」→「攪拌・混合Ｂ」の順にボルテックスミキサーを用いて攪拌・混合し、ベシクルの調製を行った。調製から２時間後、架橋剤として０．８７５重量％のグルタルアルデヒド水溶液を加えて更に混合し（ＣＬ／Ｎ比１００）、分画分子量（ＭＷＣＯ）約３０万の限外濾過膜を用いて精製することにより、実施例IV−１〜IV−３のベシクル含有混合液を調製した。また、蛍光デキストランを使用せずに同様の操作を行い、参照例VIのベシクル含有混合液を調製した。なお、攪拌・混合Ａ及びＢの各々は、ボルテックスミキサーで約３３００ｒｐｍ、２分間攪拌することにより行った。また、攪拌・混合Ａと攪拌・混合Ｂとの間、及び攪拌・混合Ｂの後には、それぞれ３分以上の放置時間を設けた。
【表５】
0005843763.tif 000024
【０１８７】
（IV−ｂ）非荷電物質内包膜内核酸含有ベシクルの評価：
前記（IV−ａ）で得られた実施例IV−１〜IV−３及び参照例IVのベシクル含有混合液について、蛍光相関分光（Fluorescence Correlation Spectroscopy：ＦＣＳ）法により測定を行い、微小体積中での蛍光粒子の運動速度、すなわち並進拡散係数（diffusion coefficient）を算出した。得られた蛍光デキストランの並進拡散係数の変化から、蛍光デキストランがベシクル内に封入されたかどうかの判定が可能となる。
具体的には、各ベシクル溶液を分画分子量３０万の限外濾過膜を用いて、２０００Ｇ、８分の条件で限外濾過を５回行い、遊離蛍光デキストランを除去した。限外濾過操作の後、各ベシクル溶液を１００μｇ／ｍＬ ｓｉＲＮＡとなるように濃度を調整し、室温下にてカールツァイス社製の共焦点蛍光顕微鏡（ＬＳＭ５１０）によりＦＣＳ測定を行った。蛍光デキストランの励起はアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、対物レンズは４０倍の水浸レンズを用い、解析はConfocor 3ソフトウェアにより行った。
また、対照例として、蛍光デキストランの０．５μｇ／ｍＬの溶液についても、同様の測定を行い、拡散係数を算出した。【０１８８】
得られた拡散係数の結果を図１２のグラフに示す。図１２に示すように、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）とｓｉＲＮＡと蛍光デキストランとを混合して得られた実施例IV−１〜IV−３のベシクルの拡散係数は、対照例である蛍光デキストランのみの場合の拡散係数と比べて遥かに小さく、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）及び蛍光ｓｉＲＮＡから形成された参照例IVのベシクルの拡散係数と同程度であった。【０１８９】
以上の結果から、実施例IV−１〜IV−３では、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）とｓｉＲＮＡと蛍光デキストランとの混合順によらず、参照例VIと同様にＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）及びｓｉＲＮＡからなる膜内核酸含有ベシクル（空ベシクル）が形成され、その空隙部（内水相）に蛍光デキストラン（被内包物質）が封入された物質内包膜内核酸含有ベシクルが得られたことが判る。【０１９０】
特に、実施例IV−３では、先にＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）及びｓｉＲＮＡからなる膜内核酸含有ベシクル（空ベシクル）を形成し、その後に蛍光デキストラン（被内包物質）を加えてボルテックスミキサーで攪拌・混合するという手順により、膜内核酸含有ベシクル（空ベシクル）を崩壊させることなく、その空隙部（内水相）に蛍光デキストラン（被内包物質）が封入された物質内包膜内核酸含有ベシクルが得られたことが判る。これは極めて驚くべき知見である。
なお、実施例IV−１（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）と蛍光デキストランとを攪拌・混合後、ｓｉＲＮＡを加えて更に混合）及び実施例IV−２（ｓｉＲＮＡと蛍光デキストランとを攪拌・混合後、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＡＰ）を加えて更に混合）でも、同様の物質内包膜内核酸含有ベシクルが得られているが、これは被内包物質として非荷電物質である蛍光デキストランを用いたためであることが、以下の実施例群Ｖとの対比から明らかである。【０１９１】
［実施例群Ｖ：負荷電物質内包ベシクルの製造及び評価］
（実施例Ｖ−１：ＱＤ（負荷電物質）内包ベシクルの製造）
第１の重合体として、非荷電親水性セグメントであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（分子量約２０００）と、アニオン性セグメントであるポリアスパラギン酸（Ｐ（Ａｓｐ））（重合度約７５）とからなるアニオン性ブロックコポリマーＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）（ゼータ電位−３０．６ｍＶ）を用いた。
第２の重合体として、カチオン性セグメントであるポリ（ジアミノペンタン構造含有アスパラギン誘導体）（Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ））（重合度約８２）からなるカチオン性ホモポリマーＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）（ゼータ電位＋１６．３ｍＶ）を用いた。
被内包物質として、ＣｄＴｅ量子ドット（以下「ＱＤ」と表記する場合がある）（平均粒径４．２ｎｍ；ゼータ電位−６４．１ｍＶ；参考文献 A. Zintchenko, et al. Molecular Therapy (2009) 17, 11, 1849-1856）を用いた。【０１９２】
第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液及び第２の重合体の溶液を、電荷比が等しくなる（即ちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れて混合し、ボルテックスミキサーで約３３００ｒｐｍ、２分間攪拌することにより、第１及び第２の重合体の自己組織化により形成されたベシクル（空ベシクル）を含有する溶液を得た。
上記で得られた空ベシクル含有溶液について、動的光散乱法（dynamic light scattering）による測定を行い、粒度分布、平均粒径、多分散指数（ＰＤＩ）、ゼータ電位を求めた。平均粒径１０４ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０４５、ゼータ電位は−９．８ｍＶであった。【０１９３】
上記で得られた空ベシクル含有溶液に、被内包物質の溶液を加え、総ポリマー濃度１．０ｍｇ／ｍＬ、被内包物質濃度２．３×１０15個／ｍＬの溶液（混合対象液）を調製した。この混合対象液を、ボルテックスミキサーで約３３００ｒｐｍ、２分間攪拌・混合し、その後３分以上放置した。得られた混合後の溶液は透明であった。【０１９４】
混合後の溶液を、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣ（株式会社ペプチド研究所より購入）を含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）に加え、１２時間室温で静置し、重合体の架橋を行った。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するＱＤを遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万を使用；３００ｒｐｍ、４℃）により除去・精製を行った後、動的光散乱（dynamic light scattering）法による測定を行い、粒度分布、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。粒度分布のグラフを図１３に示す。平均粒径１１４ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。ＰＤＩは０．０６５であった。【０１９５】
続いて、室温下にてカールツァイス社製の共焦点蛍光顕微鏡（ＬＳＭ５１０）により蛍光相関分光（ＦＣＳ）測定を行った。蛍光デキストランの励起はアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）、対物レンズは４０倍の水浸レンズを用い、解析はConfocor 3ソフトウェアにより自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。また、被内包物質であるＱＤの溶液（２．３×１０15個／ｍｌ）についてもＦＣＳによる測定を行い、自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。得られた自己相関関数Ｇ（τ）の経時的な減衰曲線を図１４に示す。
なお、自己相関関数Ｇ（τ）は時間τ後の蛍光強度のゆらぎを評価する関数であり、経時的に減衰して十分な時間の経過後に集束する。集束までの経過時間が長い（減衰が遅い）ほど、ゆらぎが緩やかであること、即ち測定対照の蛍光物体の動きが鈍いことを示す。よって、自己相関関数Ｇ（τ）の減衰曲線が右側にシフトしているほど、測定対照の蛍光物体のサイズが大きくなったことを示す。【０１９６】
図１４に示すとおり、実施例Ｖ−１の混合後溶液の減衰曲線（グラフ中「実施例１の物質内包ベシクル」）は、被内包物質ＱＤ溶液の減衰曲線（グラフ中「被内包物質（ＱＤ）」）と比べて右側にシフトしており、減衰が遅くなっている。また、非特許文献２に記載のＦＣＳデータと比較すると、実施例Ｖ−１の混合後溶液の減衰曲線は、粒径１００ｎｍ程度のベシクルと類似した減衰を示していることが判る。
以上の結果から、実施例Ｖ−１の混合後溶液では、空ベシクルにＱＤが内包された物質内包ベシクルが形成されていることが判る。【０１９７】
（比較例Ｖ-１：重合体及びＱＤの同時混合）
実施例Ｖ−１と同様の第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液に、被内包物質として実施例Ｖ−１と同様のＱＤを、濃度が２．３×１０15個／ｍＬとなるように加えた後、第２の重合体の溶液を、電荷比が等しくなる（即ちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れ、更に、ボルテックスミキサーで３３００ｒｐｍ、２分間攪拌・混合し、その後３分以上放置した。得られた溶液（混合後溶液）は、実施例Ｖ−１の混合後溶液のように無色透明ではなく、白濁していた。【０１９８】
混合後の溶液について、動的光散乱法による測定を行い、粒度分布を求めた。粒度分布のグラフを図１５に示す。図１５から明らかなように、単一の粒径ピークではなく、２つの粒径ピークが認められた。
以上の結果から、比較例Ｖ−１で得られた混合後溶液（第１及び第２の重合体をＱＤとともに同時に混合して得られた溶液）では、重合体が実施例Ｖ−１のような均一なベシクルを形成しておらず、ＱＤ内包ベシクルも均一な生成物として得られていないことが判る。【０１９９】
（実施例Ｖ−２：ＱＤ内包ベシクルのin vivo評価）
Balb/cヌードマウスの後肢にColon26（１．０×１０6／５０μＬ）を皮下移植した腫瘍モデルマウスを、移植後１３日目に使用した。実施例Ｖ−１と同様の手順で得られたＱＤ内包ベシクル溶液３１．４μＬを、ＰＢＳで全量２００μＬ（ＱＤ濃度３６μｇ／μＬ）となるように希釈し、腫瘍モデルマウスに静脈注射した。投与から１、１２、２４及び９６時間後に、ＩＶＩＳ（登録商標）蛍光イメージングシステム（Caliper社製）を用いて蛍光画像を撮像した。
また、比較のために、ベシクルに担持させていないＱＤ単独のＰＢＳ中溶液（ＱＤ濃度３６μｇ／μＬ、全量２００μＬ）を、上記と同様の腫瘍モデルマウスに静脈注射し、上記と同様に蛍光画像を撮像した。また、ＱＤを投与しない腫瘍モデルマウスについても、同様に蛍光画像を撮像した。【０２００】
図１６（ａ）は、ＱＤを投与しない腫瘍モデルマウスの蛍光画像、図１６（ｂ）は、ＱＤを単独で投与した腫瘍モデルマウスの蛍光画像（上から順に投与から１、１２、２４及び９６時間後）、図１６（ｃ）は、ＱＤ内包ベシクルを投与した腫瘍モデルマウスの蛍光画像（上から順に投与から１、１２、２４及び９６時間後）である。ＱＤを単独で投与した腫瘍モデルマウス（図１６（ｂ）参照）では、投与後１２時間で既にＱＤの血中量が減少し、投与後２４時間では殆ど排出されてしまっているのに対し、ＱＤ内包ベシクルを投与した腫瘍モデルマウス（図１６（ｃ）参照）では、投与後９６時間経ってもＱＤが全身に滞留し、特に腫瘍付近に高濃度に集積している。ここから、実施例Ｖ−１で得られたＱＤ内包ベシクルが、血中滞留性及び腫瘍集積性に極めて優れていることが分かる。本実験から、本発明の物質内包ベシクルが、医薬のＤＤＳ等として極めて有効に利用できることが明らかである。【０２０１】
［実施例群VI：正荷電物質内包ベシクルの製造及び評価］
（実施例VI−１：リゾチーム（正荷電物質）内包ベシクルの製造）
実施例Ｖ−１において、被内包物質としてＱＤの代わりにリゾチーム（Sigma社製Lysozyme from Chicken Egg White、平均粒径３ｎｍ、分子量１４，０００、等電点（ｐＩ）＝〜１１）を用い、混合対象液中の被内包物質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた他は、実施例Ｖ−１と同様の手順で操作を行った。得られた混合後の溶液は透明であった。【０２０２】
混合後溶液を、ベシクル中のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）に加え、１２時間室温で静置し、重合体の架橋を行った。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するリゾチームを遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万を使用；３００ｒｐｍ、４℃）により除去・精製した後、動的光散乱法による測定を行い、粒度分布、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。粒度分布のグラフを図１７に示す。平均粒径１１０ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。また、ＰＤＩは０．０８７であった。【０２０３】
また、精製後の溶液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による測定を行い、自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。また、被内包物質であるリゾチームの溶液（１ｍｇ／ｍｌ）についてもＦＣＳによる測定を行い、自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。得られた自己相関関数Ｇ（τ）の経時的な減衰曲線を図１８に示す。図１８に示すとおり、実施例２の混合後溶液の減衰曲線（グラフ中「実施例VI−１の物質内包ベシクル」）は、被内包物質であるリゾチーム溶液の減衰曲線（グラフ中「被内包物質（リゾチーム）」）と比べて右側にシフトしており、減衰が遅くなっている。また、非特許文献２に記載のＦＣＳデータと比較すると、実施例VI−１の混合後溶液の減衰曲線は、粒径１００ｎｍ程度のベシクルと類似した減衰を示していることが判る。
以上の結果から、実施例VI−１の混合後溶液では、空ベシクルにリゾチームが内包された物質内包ベシクルが形成されていることが判る。【０２０４】
（比較例VI−１：重合体及びリゾチームの同時混合）
実施例VI−１と同様の第１及び第２の重合体を各々、ポリマー濃度が２．０ｍｇ／ｍＬとなるように１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（水性媒体）に溶解させた。得られた第１の重合体の溶液に、被内包物質として実施例VI−１と同様のリゾチームを、濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、第２の重合体の溶液を、電荷比が等しくなる（即ちＣ／Ａ比＝１．０となる）ようにエッペンドルフチューブに入れ、更に、ボルテックスミキサーで３３００ｒｐｍ、２分間攪拌・混合し、その後３分以上放置した。得られた溶液（混合後溶液）は、実施例VI−１の混合後溶液のように無色透明ではなく、白濁していた。【０２０５】
混合後の溶液について、動的光散乱法による測定を行い、粒度分布を求めた。粒度分布のグラフを図１９に示す。図１９に示すとおり、単一の粒径ピークではなく、２つの粒径ピークが認められた。
以上の結果から、比較例VI−１で得られた混合後溶液（第１及び第２の重合体をリゾチームとともに同時に混合して得られた溶液）では、重合体が実施例VI−１のような均一なベシクルを形成しておらず、リゾチーム内包ベシクルも均一な生成物として得られていないことが判る。【０２０６】
［実施例VII：巨大粒子（Ｃｙ３標識ＰＩＣミセル）内包ベシクルの製造］
実施例Ｖ−１において、被内包物質としてＱＤの代わりに架橋蛍光標識ミセル（Ｃｙ３標識ＰＩＣミセル、Ｃｙ３標識ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）とＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）（いずれもＰＥＧの分子量２，０００、イオン連鎖の重合度７５）を荷電が釣り合うように混合して調製した後に、１０等量のＥＤＣにて架橋し分画分子量１０万にて同様の精製を行ったもの、平均粒径３８．０ｎｍ、ＰＤＩ０．０３２）を用い、混合対象液中の被内包物質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた他は、実施例Ｖ−１と同様の手順で操作を行った。得られた混合後の溶液は透明であった。【０２０７】
混合後溶液を、ベシクル中のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）に加え、１２時間室温で静置した。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存する架橋ミセルを遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万を使用；３００ｒｐｍ、４℃）により除去・精製した後、動的光散乱法による測定を行い、粒度分布、平均粒径及び多分散指数（ＰＤＩ）を求めた。平均粒径１１３ｎｍで単分散な粒子の形成が認められた。また、ＰＤＩは０．０６３であった。【０２０８】
また、精製後の溶液について、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）による測定を行い、自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。また、被内包物質である蛍光標識ミセルの溶液（１ｍｇ／ｍｌ）についてもＦＣＳによる測定を行い、自己相関関数Ｇ（τ）を求めた。得られた自己相関関数Ｇ（τ）の経時的な減衰曲線を図２０に示す。図２０に示すとおり、実施例VIIの混合後溶液の減衰曲線（グラフ中「実施例２の物質内包ベシクル」）は、被内包物質である蛍光標識ミセル溶液の減衰曲線（グラフ中「被内包物質（Ｃｙ３標識ＰＩＣミセル）」）と比べて右側にシフトしており、減衰が遅くなっている。また、非特許文献２に記載のＦＣＳデータと比較すると、実施例VIIの混合後溶液の減衰曲線は、粒径１００ｎｍ程度のベシクルと類似した減衰を示していることが判る。【０２０９】
また、混合後の溶液について、位相差クライオ透過型電子顕微鏡観察を行った。マイクログリッド上に試料溶液を展開し、不要水分を濾紙で除去した後、EM CPC cryo-station（ライカ・マイクロシステムズ社製）を用いて液化エタンにより急速凍結させ、観察標本を作製した。撮像は、−１７０℃下、Zernike位相板を装備した透過型電子顕微鏡JEM 2011（日本電子株式会社製）を用いて行った。得られた電子顕微鏡写真を図２１（ａ）（ｂ）に示す。図２１（ａ）（ｂ）から明らかなように、膜厚約１０ｎｍで球状のベシクル粒子が観察され、空ベシクルと同様の構造を有していることを確認した。
以上の結果から、実施例VIIの混合後溶液では、空ベシクルに蛍光標識ミセルが内包された物質内包ベシクルが形成されていることが判る。【０２１０】
［実施例VIII：酵素（β−グルコシダーゼ）内包ベシクルの製造及び評価］
実施例Ｖ−１において、被内包物質としてＱＤの代わりにβ−グルコシダーゼ（アーモンド由来、Sigma社製、分子量約１万、等電点（ｐＩ）＝〜４．３）を用い、混合対象液中の被内包物質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた他は、実施例Ｖ−１と同様の手順で操作を行った。得られた混合後の溶液は透明であった。
混合後溶液を、ベシクル中のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）に加え、１２時間室温で静置し、重合体の架橋を行った。ベシクルに内包されず溶液中に遊離状態で残存するβ−グルコシダーゼを遠心限外濾過（VIVASPIN 20、sartorius stedium biotech社製、分画分子量３０万を使用；３００ｒｐｍ、４℃）により除去・精製するとともにＰＢＳに置換し、β−グルコシダーゼ内包ベシクル溶液を得た。【０２１１】
得られたβ−グルコシダーゼ内包ベシクル溶液１００μＬを３７℃で１５分間インキュベートし、続いてこの溶液に、Ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドＰＢＳ溶液（略称ＯＮＰＧｌｃ、分子量３０１）３０．１ｍｇ／ｍＬを１００μＬ加え、更に３７℃で１５分間インキュベートした。その後、濃度２２．１ｍｇ／ｍＬのＮａ2ＣＯ3溶液５０μＬを加え、４２０ｎｍ付近の吸光度を測定した。
分子量３０１のＯＮＰＧｌｃは、ＥＤＣで架橋されたベシクルを透過して内部に浸入し得る。また、ＯＮＰＧｌｃはβ−グルコシダーゼの基質であり、β−グルコシダーゼによって加水分解されるとＯ−ニトロフェノールを生じる。Ｏ−ニトロフェノールは４２０ｎｍ付近にＯＮＰＧｌｃにはないＵＶ吸光ピークを有するため、このピークを観察することにより、β−グルコシダーゼの酵素活性を測定することができる。【０２１２】
得られた吸光度の経時変化を図２２のグラフに示す。図２２のとおり、ベシクルがＥＤＣで架橋されていたにもかかわらず、ベシクル内のβ−グルコシダーゼは、失活することなく酵素活性を発揮したことが分かる。本実験から、本発明の物質内包ベシクルが酵素担体としても極めて有効に利用できることが明らかである。【０２１３】
［参考実験：混合による空ベシクルの構造の撹乱］
実施例Ｖ−１と同様の手順で得られた空ベシクル含有溶液について、ベシクル中のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）に加え、１２時間室温で静置し、重合体の架橋を行った。架橋後、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分子量分布の測定を行った。ＧＰＣは、溶離液として１０ｍＭ ＰＢ（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を用い、カラムとしてSuperose 6TM 10/300 GL（GEヘルスケア社製）を用い、流速０．５ｍｌ／分でカラムに流通させ、ＵＶ検出器（２２０ｎｍ）及び蛍光検出器（Ｅｘ／Ｅｍ＝５２０／５５０ｎｍ）で検出して行った。
また、実施例Ｖ−１と同様の手順で得られた空ベシクル含有溶液について、ボルテックスミキサーで約２０００ｒｐｍ、攪拌・混合しながら、ベシクル中のＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ）に含まれるカルボキシル基に対して１０等量のＥＤＣを含む溶液（ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸緩衝液（０ｍＭＮａＣｌ）中）を加え架橋を行った。架橋後、やはりＧＰＣによる分子量分布の測定を行った。
混合前架橋溶液及び混合後架橋溶液について得られたＧＰＣプロファイルをそれぞれ図２３（ａ）及び（ｂ）に示す。混合前架橋溶液のＧＰＣプロファイル（図２３（ａ）参照）において、１２〜３分前後に出現するピークは、大分子量のベシクルを表し、３０分前後に出現するピークは、分子量がより小さな非会合体（ベシクルを形成しない重合体の集合）を表す。一方、混合後架橋溶液のＧＰＣプロファイル（図２３（ａ）参照）では、ベシクルのピークが消失し、非会合体のピークが増大している。この結果は、混合によって空ベシクルの構造が撹乱され、小会合体に分解したことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０２１４】
本発明によれば、水中で高分子の自己組織化により得られる空ベシクルの空隙部に物質を包含・担持させたベシクル（物質内包ベシクル）を、ベシクルの再生能力を用いて簡便且つ効率的に製造することができるので、薬物を送達するためのＤＤＳや、バイオマテリアル・機能性材料等の分野において、その有用性は極めて高い。特に、静電相互作用型ベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅ）へ直接の封入が難しい物質の封入法を開発し、封入物質の適用範囲を拡大した意義は大きい。実際、優れた血中滞留性・腫瘍集積性を示す平均粒径が１００〜２００ｎｍのＰＩＣｓｏｍｅの応用範囲を拡大できた点で、著しく有用性が高い。【０２１５】
また、本発明によれば、核酸が膜内に保持されたベシクルも提供されるが、膜内核酸含有ベシクルは、斯かる核酸を送達するＤＤＳや、核酸を有効成分とするバイオマテリアル・機能性材料として有用である。また、空隙部に別の薬物を内包させることができるので、核酸と別の薬物とを組み合わせて送達するＤＤＳとしても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１６】
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【図２１】
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【配列表】
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