(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体からの髄液サンプル中の二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)レベルを測定することを特徴とする、個体のアルツハイマー病のインビトロ検出方法。
【請求項２】
前記個体が、認知症に罹患していない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体が、軽度認知障害(MCI)に罹患している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
PKRとは別のアルツハイマー病の生物学的マーカーであって、βアミロイド(Aβ)、トータルタウ(T-tau)及びリン酸化タウ(ptau)からなる群より選択される少なくとも１つのマーカーの髄液サンプル中におけるレベルが正常である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記サンプル中の二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)のレベルが、サンプル中のリン酸化PKRレベル、サンプル中のトータルPKRレベル、又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKRレベルの比に相当する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中のリン酸化PKRレベル、サンプル中のトータルPKRレベル、又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKRレベルの比を、少なくとも１つの既定値と比較する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患の診断は容易ではない。一例として、アルツハイマー病については、慣用の「NINCDS-ADRDA」基準(McKhannら, (1984) Neurology 34: 939-944)に従って、疑い例(possible)、ほぼ確実例(probable)及び確実例(definite)のアルツハイマー病を区別しており、これを用いれば、患者の死体解剖及び脳の神経病理学的検査(一方では老人斑、他方では神経原線維変性の存在を示す)後の、検死後だけの確実例のアルツハイマー病の診断を確立することが可能である。
【０００３】
疑い例又はほぼ確実例のアルツハイマー病の診断は、一般的にはDSM IV基準(精神障害の診断と統計の手引き第４版, American Psychiatric Association, 1994)に従って、個体が認知症の症状を示しているか否かをまず確定し、次いで認知症の病因を決定することを目的とする臨床的基準及び神経心理学的検査に本質的に基づく。認知症の基準は、社会的な職業上の活動に対する影響を有し、以前の機能と比較して衰えをもたらす記憶障害及びその他認知機能の障害の組合せを本質的に含む。診断は、患者の進行を監視することにより強化され、このことは、特に認知の衰えの他の原因を除外することにより、認知症の原因を特定することを可能とする。この点において、脳のイメージングは、局所的海馬萎縮(また一方で、これは老人に影響するその他の疾患において存在し得る)の評価及び認知障害のその他の原因(例えば脳卒中の後遺症)の除外のために、診断の重要な要素である。
【０００４】
しかしながら、一般的には、ほぼ確実例のアルツハイマー病の症例のおよそ85％だけが検死後に確認されると考えられている。15％の偽陽性は、一般的には、その他の神経変性疾患、例えば、特にレヴィー小体認知症(Delacourte (1998) Annales de Biologie Clinque 56: 133-142)を含む前頭側頭型認知症に起因する。したがって、アルツハイマー病診断の現行の方法論は特異度を欠いている。更に、最初の認知障害の発現により定義される疾患の開始から、疑い例又はほぼ確実例のアルツハイマー病の診断の確立を生じ得る最初の認知症の発症までに10年以上の期間がかかることもあるようである(Amievaら(2008) Ann. Neurol. 64: 479-480)。したがって、アルツハイマー病の診断は、現在のところ決まって遅くに行われ、それまでに疾患は非常に進行した段階にある。しかしながら、アルツハイマー病について想定される現行の治療は、有効であるためには、例えば治療される個体が軽度認知障害(MCI)しか示さない病理プロセスの開始直後に行う必要があり、このことは、疾患を早期に診断することが可能であることを暗示する。
【０００５】
事実、補助的な検査(例えば患者の髄液中の生化学的マーカーのアッセイ)を、アルツハイマー病の診断を改善するために行うことができる。一例として、髄液中のβ-アミロイド1-42ペプチド(Aβ42)レベル及びタウ(チューブリン関連ユニット；Tubulin Associated Unit)ペプチドのトータルレベル(すなわち、リン酸化形態及び非リン酸化形態の両方)を測定することにより、92％の感度及び89％の特異度をもってアルツハイマー病を診断できることが特に示された(Sunderlandら(2003) JAMA 289: 2094-2103)。その後、Aβ42及びトータルタウ(T-tau)に加えて、第３のマーカー、すなわちリン酸化タウ(ptau)、特にスレオニン181をリン酸化されたもの(ptau181)が加えられている。更に、これら３つのマーカーを組み合わせることにより、MCIに罹患する個体において、83％の感度及び72％の特異度をもって初期のアルツハイマー病を検出できることを示すことが可能であった(Mattesonら(2009) JAMA 302: 385-393)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、現時点では、これらのアッセイは、部分的には、アルツハイマー病診断の信頼性及び早期性の観点から、上記アッセイを常に利用することを正当化するには不十分であるために、常には行われない。
【０００７】
二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)は、主な標的が真核細胞の翻訳開始因子2α(eIF2α)であるセリン/スレオニンキナーゼである。PKRは、446位スレオニン及び/又は451位スレオニンのリン酸化により活性化された形態として存在する。特に、アルツハイマー病、ハンチントン病及びクロイツフェルト・ヤコブ病に罹患する患者の脳内の高い活性化PKRレベルを、及びアルツハイマー病に罹患する患者の血液性リンパ球中の高い活性化PKRレベルでさえも示すことが可能となっている(レビューとしてHugonら(2009) Expert Rev. Neurother. 9: 1455-1457を参照)。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、個体の髄液中のPKR、特にそのリン酸化されて活性化された形態のレベルを測定することが、初期又は早期の、任意に無症候性の疾患段階を含む、これら個体のアルツハイマー病を選択的かつ特異的に診断することに有用であるという本発明者らによる立証から得られるものである。
【０００９】
かくして、本発明は、
-       個体からの生物学的サンプル、特に髄液サンプル中の二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)レベルを測定し、
-       それから個体が神経変性疾患に罹患しているか否かを推定する、
個体の神経変性疾患の、特にインビトロにおける診断方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、
-       個体からの生物学的サンプル、特に髄液サンプル中の、トータルPKRレベルに対する活性化PKRレベルの比を測定し、
-       それから個体が神経変性疾患に罹患しているか否かを推定する、
個体の神経変性疾患の、特にインビトロにおける診断方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、
-       個体からの生物学的サンプル、特に髄液サンプル中の二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)レベルを測定し、
-       それから個体が神経変性疾患に罹患しているか否かを推定する、
認知症の症状を示していない個体の神経変性疾患の、特にインビトロにおける診断方法に関する。
【００１２】
また、本発明は、
-       個体の生物学的サンプル、特に髄液サンプル中の二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)レベルを測定し、
-       それから個体が神経変性疾患を発症するリスクに瀕しているか否かを推定する、
神経変性疾患の症状を示していない個体が神経変性疾患に罹患するリスクを測定するための、特にインビトロにおける方法に関する。
【００１３】
ここで意図されるように、表現「神経変性疾患」は、変性疾患、すなわち神経系及び特に脳に影響する進行性の分解(degradation)を伴う疾患を意味する。
好ましくは、本発明による神経変性疾患は、認知症である。認知症は、当業者に周知である。一般的には、認知症は、個体の知的機能の進行性の劣化を特徴とし、そのことにより環境、特に新しい状況に直面したときの適応能力を弱め、自律性の喪失をもたらすと考えられている。好ましくは、本発明による認知症の症状は、特に米国精神医学会の精神障害の診断と統計の手引き第４版(1994) (DSM IV)においてアルツハイマー病型の認知症について定義されるものである。すなわち、
A.     (1)      記憶障害(新たな情報を習得する能力及び以前に習得した情報を思い出                す能力の低下)；
(2)     １(又はそれより多い)下記の認知障害：
(a)     失語(言語機能障害)、
(b)     失行(運動機能が損なわれていないにも拘らず運動活                                動を実行する能力の低下)、
(c)     失認(感覚機能が損なわれていないにも拘らず物体を                                認識又は識別する能力の欠如)、
(d)     遂行機能(すなわち、計画すること、体系化すること                                、分解して順序立てること、抽象的に考えること)の                                障害
を通じて同時に顕在化する複数の認知機能欠損(multiple cognitive deficit)の発症。
【００１４】
B.      それぞれ社会的又は職業的機能の顕著な障害を引き起こし、以前の機能レベルと比較して著しい衰えを示す基準A1及びA2の認知機能欠損。
C.      進行は、進行性の開始(progressive triggering)及び継続的な認知の衰えを特徴とする。
【００１５】
D.      基準A1及びA2の認知機能欠損は、下記のいずれにも起因しない。
(1)     進行性の認知及び記憶機能欠損(例えば、脳血管疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、硬膜下血腫、正常圧水頭症、脳腫瘍)を引き起こすその他の神経系の疾患；
(2)     認知症を引き起こすことが公知の全身の疾患(例えば、甲状腺機能低下症、ビタミンB12又は葉酸欠乏症、ナイアシン欠乏症、高カルシウム血症、神経梅毒、HIV感染);
(3)     物質誘導性の疾患。
【００１６】
E.      機能欠損は、せん妄の間だけに起こるものではない。
F.      (DSM IVの意味する範囲内、すなわち当面の注意を必要とする)別の第一軸の疾患(例えば大うつ病性障害又は統合失調症)に起因する問題からは、より深く理解することができない。
【００１７】
好ましくは、本発明による神経変性疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病及びパーキンソン病からなる群より選択される。
特に好ましくは、本発明による神経変性疾患は、アルツハイマー病である。
好ましくは、本発明による個体は、ヒトである。本発明による個体は、１又はそれより多い認知症の症状を示していてもよいし、認知症に罹患していてもよい。
【００１８】
また、本発明による個体は、認知症に罹患していなくてもよいし、如何なる認知症の症状も示していなくてもよい。認知症を示さないとき、本発明による個体は、当業者に周知の、及び特にPetersenら, (1999) Arch. Neurol. 56: 303-308に定義される認知障害、特に軽度認知障害(MCI)に罹患していてもよい。一般的に、全体的な認知及び知的機能並びに毎日の生活での行動の統合性の貧弱化(sparing)を伴う記憶挙動の客観的に明らかな機能欠損に関連する特定の主観的な愁訴の場合、個体はMCIを有すると定義される。好ましくは、本発明によるMCIを有する個体は、ミニメンタルステート検査(MMSE)試験、特にGroupe de Reflexion sur les Evaulations Cognitives (GRECO) [認知評価研究グループ]の合意版において、同年齢及び同じ社会的文化的レベルの機能の５パーセンタイルに相当するスコアよりも高いスコアを有する。更に、本発明による個体はまた、如何なる認知障害も示していなくてもよい。
【００１９】
本発明による個体が、認知症、特にアルツハイマー病に罹患していないか、又は如何なる認知症、特にアルツハイマー病の症状も示さないとき、とりわけ特に前記個体がMCIを有するとき、本発明による方法は、特に個体が認知症、特に初期又は早期の、或いは無症候性の段階にあるアルツハイマー病を有するか否か、又は個体が認知症、特にアルツハイマー病を発症するリスクに瀕しているか否かを測定することを可能にする。
【００２０】
同様に好ましくは、個体の髄液サンプル中の、少なくとも１つの神経変性疾患の生物学的マーカーのレベルは正常である。ここで意図されるように、神経変性疾患の生物学的マーカーのレベルは、当該マーカーが関連している神経変性疾患を個体が罹患していると診断することについて当業者に一般的に受け入れられる閾値よりもそのレベルが低いとき、正常であるという。神経変性疾患、特にアルツハイマー病の多くの生物学的マーカーは、当業者に公知である。好ましくは、本発明による神経変性疾患の生物学的マーカーは、特にマーカーβ-アミロイド(Aβ)、特にβ-アミロイド1-42 (Aβ42)、トータルタウ(T-tau)及びリン酸化タウ(ptau)、特にスレオニン181をリン酸化されたもの(ptau181)からなる群より選択されるアルツハイマー病の生物学的マーカーである。これらのマーカー及び髄液サンプル中におけるそれらのレベルの測定方法は、当業者に周知であり、Sunderlandら (2003) JAMA 289: 2094-2103、Blennowら (2006) Lancet 368: 387-403及びMattsonら (2009) JAMA 302: 385-393に特に定義されている。
【００２１】
E2AK2としても知られる二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ(PKR)は、当業者に周知であり、Hugonら (2009) Expert Rev. Neurother. 9: 1455-1457又はUniProtKBデータベースのアクセッションリファレンスP19525に特に定義されている。ここで意図されるように、表現「二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ」又は「PKR」は、区別することなく、非リン酸化PKR、446位スレオニン(pPKR446)及び/又は451位スレオニン(pPKR451)をリン酸化されたPKR(pPKR)、又はこれらPKRの全ての形態を指す。また、本発明の生物学的サンプル中のリン酸化及び非リン酸化形態のPKRの総量は、トータルPKRとして公知である。
【００２２】
一例として、本発明の診断又はリスク測定方法の１つの好ましい実施態様においては、サンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベル、サンプル中のトータルPKRレベル又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベルの比に基づいて、個体が神経変性疾患、特にアルツハイマー病に罹患していると推定する。本発明の診断又はリスク測定方法の別の好ましい実施態様においては、
-       サンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベル、サンプル中のトータルPKRレベル又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベルの比と、
-       少なくとも１つの既定値と
の比較に基づいて、特に、サンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベル、サンプル中のトータルPKRレベル又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベルの比が当該既定値よりも大きいとき、個体が神経変性疾患、特にアルツハイマー病に罹患していると推定する。
【００２３】
本発明による既定値は、当業者が容易に決定することができる。それは、特に認知障害に罹患していないコントロールの個体からのCSFサンプル中の、本発明によるPKRレベルの平均値又はこの平均値の１より多い倍数であってもよい。また、それは、下記の実施例で説明するような、特に選択性(selectivity)及び特異度の合計を最大化するために特定の選択性及び特異度の値を定めることによりトータルPKR、リン酸化PKR、特にpPKR446、又はサンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベルの比について確定する受信者動作特性(ROC)曲線から得られる閾値であってもよい。一例として、本発明による実施例では、サンプル中のトータルPKRレベルに対するサンプル中のリン酸化PKR、特にpPKR446レベルの比が0.76又は0.77より大きいとき、個体はアルツハイマー病を有すると診断される。
【００２４】
更に、別の特定の実施態様においては、本発明による診断又はリスク測定方法はまた、少なくとも１つのその他の神経変性疾患、特に上記に定義されるようなアルツハイマー病の生物学的マーカーのレベルの測定を含む。
好ましくは、本発明による生物学的サンプルは、液体の生物学的サンプル、より好ましくは髄液(CSF)である。当業者は、個体からCSFを得る方法、例えば腰椎穿刺を熟知している。
【００２５】
好ましくは、本発明による方法においては、本発明による生物学的サンプル中の本発明によるPKRレベルは、免疫学的方法、すなわち抗体、特にモノクローナル抗体、抗原に特異的に結合する抗体の一部を含む抗体フラグメント、或いは生物学的サンプル、特にCSFサンプルのその他の構成要素に本質的に結合しない、すなわちPKRを特異的に指向するアプタマーを用いる方法によって測定する。当業者に明確となるであろうが、トータルPKRレベルの測定に用いる抗体は、リン酸化により改変されていないPKRの一部を指向する；反対に、pPKR446又はpPKR451レベルの測定に用いられる抗体は、PKRのリン酸化部分に結合する(但し、これと同一の部分は、リン酸化されていないときは結合しない)。このような抗PKR抗体は、当業者に周知である。本発明による免疫学的方法は、当業者に周知であり、特にウェスタンブロッティング又はELISA技術を包含する。
更に、本発明は、下記の図面及び実施例によって、非限定的に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１〜３は、認知障害に罹患していないコントロールの個体(control)のCSFについて測定したものと比較した、アルツハイマー病(AD)に罹患する患者のCSFについて測定したトータルPKRレベル(PKR；単位なし(arbitrary unit)) (図１)、pPKR446レベル(pPKR；単位なし) (図２)及びpPKR446/トータルPKR比(100倍) (pPKR/PKR) (図３)の箱ひげ図を示す。
【図２】図１〜３は、認知障害に罹患していないコントロールの個体(control)のCSFについて測定したものと比較した、アルツハイマー病(AD)に罹患する患者のCSFについて測定したトータルPKRレベル(PKR；単位なし) (図１)、pPKR446レベル(pPKR；単位なし) (図２)及びpPKR446/トータルPKR比(100倍) (pPKR/PKR) (図３)の箱ひげ図を示す。
【図３】図１〜３は、認知障害に罹患していないコントロールの個体(control)のCSFについて測定したものと比較した、アルツハイマー病(AD)に罹患する患者のCSFについて測定したトータルPKRレベル(PKR；単位なし) (図１)、pPKR446レベル(pPKR；単位なし) (図２)及びpPKR446/トータルPKR比(100倍) (pPKR/PKR) (図３)の箱ひげ図を示す。
【図４】図４〜６は、トータルPKRレベル(図４)、pPKR446レベル(図５)及びpPKR446/トータルPKR比(図６)に基づくアルツハイマー病の診断の選択性(y軸)及び１−特異度(1-specificity) (y軸)を示すROC曲線を表す。
【図５】図４〜６は、トータルPKRレベル(図４)、pPKR446レベル(図５)及びpPKR446/トータルPKR比(図６)に基づくアルツハイマー病の診断の選択性(y軸)及び１−特異度(y軸)を示すROC曲線を表す。
【図６】図４〜６は、トータルPKRレベル(図４)、pPKR446レベル(図５)及びpPKR446/トータルPKR比(図６)に基づくアルツハイマー病の診断の選択性(y軸)及び１−特異度(y軸)を示すROC曲線を表す。
【図７】図７は、CSF中の、pPKR446/トータルPKR比(100倍) (pPKR/PKR、y軸、単位なし)と、ptau181レベル(ptau、x軸、pg/ml)との関係及び対応する線形相関曲線を表す。
【図８】図８は、アルツハイマー病に罹患する、特に正常(AD-PLn)又は中間(AD-PLi)レベルのAβ42、T-tau及びptau181マーカーを有する患者(AD)；認知障害を有しないコントロールの個体(HC)；アルツハイマー病に関連しない認知障害を有するコントロール(CC)；アルコール認知症を有する個体(OH)；及び軽度認知障害を有する個体(MCI)のCSF中の、トータルPKRレベルに対するpPKR446レベルの比(y軸、単位なし)を表す。
【図９】図９〜１１は、それぞれ、コントロールの個体(NC)、健忘軽度認知障害に罹患する個体(MCI)及びアルツハイマー病に罹患する個体について、実施例３で測定される、CSF中のトータルPKRレベル及びpPKR446レベル(光学密度ユニット)、並びにpPKR446/トータルPKR比(単位なし)を表す。実線の水平バーは平均値を、破線の水平バーは閾値を表す。
【図１０】図９〜１１は、それぞれ、コントロールの個体(NC)、健忘軽度認知障害に罹患する個体(MCI)及びアルツハイマー病に罹患する個体について、実施例３で測定される、CSF中のトータルPKRレベル及びpPKR446レベル(光学密度ユニット)、並びにpPKR446/トータルPKR比(単位なし)を表す。実線の水平バーは平均値を、破線の水平バーは閾値を表す。
【図１１】図９〜１１は、それぞれ、コントロールの個体(NC)、健忘軽度認知障害に罹患する個体(MCI)及びアルツハイマー病に罹患する個体について、実施例３で測定される、CSF中のトータルPKRレベル及びpPKR446レベル(光学密度ユニット)、並びにpPKR446/トータルPKR比(単位なし)を表す。実線の水平バーは平均値を、破線の水平バーは閾値を表す。
【実施例】
【００２７】
実施例１
１．  患者及び方法
患者
アルツハイマー病(AD)を有すると診断された46人の患者及びアルツハイマー病を有しない39人のコントロールの個体を本研究に含めた。AD患者は、NINCDS-ADRDA基準に基づいて含めた。全ての患者は、Lariboisiere病院のCentre Memoire [記憶センター] (Paris, France)に由来した。コントロールの個体は皆、如何なる認知障害も示さず、アルツハイマー病の基準を満たしていた。神経学的検査、ルーチンの血液検査、神経心理学的検査及び脳のMRIイメージングを組み合わせた慣用の診断手順に従って腰椎穿刺後、髄液(CSF)サンプルを回収した。本研究は、Paris Nord Bichat病院の倫理委員会に承認された。
【００２８】
ウェスタンブロッティングによるCSF分析：トータルPKR及びスレオニン446リン酸化PKR(pPKR446)レベルの測定
アルブミン及びIgGを除去するためにカラム(ProteoExtract(商標), Calbiochem(登録商標))を用いてCSFサンプルを前処理し、次いで標準的な技術に従って、ウェスタンブロッティングのために調製した。タンパク質の濃度は、Micro BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific)を用いて、製造業者の説明書に従って測定した。CSFサンプルをNuPAGE BisTris 4〜12％ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)上で分離し、次いでニトロセルロース膜(GE Healthcare)上に電気的に転写(electrotransfer)させた。PBS中の５％ミルク中でブロッキングされたpPKR446のリン酸化されたスレオニン446を特異的に及び全てのPKRタンパク質(SantaCruz)をそれぞれ認識するウサギ一次抗体と共に膜をインキュベートし、次いで1/5000に希釈した抗ウサギ抗体(Rockland Immunochemical Inc.)に結合したIRダイ(商標) 800蛍光体の存在下でインキュベートした。結合したタンパク質はOdysseyイメージングシステム(LI COR Biosciences)によって可視化し、次いでMultigaugeソフトウェア(Fuji)を用いて濃度測定により定量した。pPKR446/トータルPKR比を各々の患者及び各々のコントロールの個体について測定した。全ての結果を内部コントロール(アルツハイマー病に罹患するヒトの脳)と比較して調節した。定量の統計学的解析は、Prismソフトウェア(GraphPad)のバージョン５によって行った。
【００２９】
ELISAによるCSFの分析：β-アミロイド1-42 (Aβ42)、トータルタウ(T-tau)、スレオニン181リン酸化タウ(ptau181)
製造業者の推奨に従って、トータルPKR及びpPKR446レベルの測定に用いたものと同一のCSFサンプル中のAβ42、T-tau及びptau181レベルを、ELISA(Innotest tests Abeta, Innotests tau, Innotests p181tau, Innogenetics, Ghent, Belgium)によって測定した。
【００３０】
統計学的解析
記述統計は、患者及びコントロールの特性を記述するために用いた。グループは、スチューデントのｔ検定を継続的な測定のために、及びカイ２乗検定を割合のために用いて比較した。２つのグループ(患者及びコントロール)のトータルPKR及びppKR446レベルの分布並びにトータルPKRレベルに対するpPKR446レベルの比(pPKR446/トータルPKR)は、箱ひげ図の手法により表した。ROC(受信者動作特性)曲線解析は、測定したCSFマーカーのレベルについての最良のカットオフ値の測定及び曲線下面積(AUC)の算出に用いた。最良のカットオフ値としては、感度及び特異度の合計の最大値を与えるものと定義した。一方でPKR及びpPKR446間、他方でAβ42、T-tau及びptau間のスピアマン相関係数も測定した。
【００３１】
２．  結果
研究対象の個体の特性を下記の表１に示す。
【表１】
0005914480.tif 000002
【００３２】
表中のデータは、PKR及び活性化PKR (pPKR446)濃度並びにpPKR446/PKR濃度比の平均値が、アルツハイマー病に罹患する患者のCSF中において、コントロールの個体よりも著しく高いことを示す。
【００３３】
これら観察結果は、図１、２及び３に示した箱ひげ図で表されたデータ全体について確認される。特に、コントロールの個体に関して、pPKR446濃度及びpPKR446/トータルPKR比について得られた値の組は、アルツハイマー病に罹患する患者のものよりも著しく低い。
【００３４】
更に、トータルPKR、pPKR446及びpPKR446/トータルPKR比についてROC曲線を確定した。これらの曲線から得られた感度及び特異度のデータを下記の表２に示す。
【表２】
0005914480.tif 000003
【００３５】
トータルPKRレベル及び特に活性化PKR(pPKR446)レベル並びにpPKR446/トータルPKR比の使用により、アルツハイマー病に罹患する患者の検出が可能となる。特に、活性化PKR (pPKR446)及びpPKR446/トータルPKR比のレベルを測定することで、診断マーカーAβ42、T-tau及びptau181により提供されるものよりも高感度のアルツハイマー病検出が可能となることが観察される。
【００３６】
一方でAβ42、T-tau及びptau181マーカー間、他方でトータルPKR、pPKR446及びpPKR446/トータルPKRマーカー間のスピアマン相関係数を下記の表３及び図７に示す。
【表３】
0005914480.tif 000004
【００３７】
一方でAβ42、T-tau及びptau181マーカー間、他方でトータルPKR、pPKR446及びpPKR446/トータルPKRマーカー間のスピアマン相関係数は比較的低い。したがって、これら２つのグループのマーカーは、比較的、互いに独立しているようであり、このことは、本発明のマーカーをAβ42、T-tau及びptau181と組み合わせることで、後者の診断の有効性を改善することへの期待を抱かせる。
【００３８】
実施例２
実施例１の方法論に従うことにより、本発明者らはまた、実施例１に示されるようにして選択されたアルツハイマー病に罹患する患者(AD)のCSF中のトータルPKRレベルに対するpPKR446レベルの比を、認知障害を有しないコントロールの個体(HC)、アルツハイマー病に関連しない認知障害(例えば、うつ病性若しくは別の精神病性の異常、前頭側頭型認知症、血管性認知症又はレヴィー小体の疾患に続発性のもの)を有するコントロール(CC)、アルコール認知症を有する個体(OH)及び軽度認知障害を有する個体(MCI)のCSF中で測定した同一の比と比較した(図８)。
【００３９】
pPKR446/トータルPKR比の平均値が、アルツハイマー病に罹患する患者のCSF中において、(実施例１において既に示されたように)認知障害を有しないコントロールの個体のCSF中及びアルコール認知症を有する個体のCSF中においてよりも高く、更にこの比の平均値は、認知障害を有しないコントロールのものと同一であることが観察される。本事例において、このことは、pPKR446/トータルPKR比の上昇がアルツハイマー病及び可能性として、より一般的な神経変性の認知症に特異的であることを示す。
【００４０】
また、軽度認知障害(MCI)に罹患する個体のCSF中のpPKR446/トータルPKR比の平均値がアルツハイマー病に罹患する患者のもの及び認知障害を有しないコントロールの個体のものと比較して中程度であることが観察される。MCIを有する個体がアルツハイマー病に罹患する個体となる確率(年間)がおよそ15％である限り(一部の個体はアルツハイマー病を続けて発症しない)、MCIに罹患する個体におけるpPKR446/トータルPKR比の上昇は、初期又は早期の段階にあるアルツハイマー病の存在(すなわち認知症の症状の発現前)の指標であるか、又は短期間のうちにアルツハイマー病を発症するリスクに瀕している個体の指標である蓋然性が高い。更に、アルツハイマー病に関連しない認知障害を有するコントロールの個体のCSF中のpPKR446/トータルPKR比の平均値は認知障害を有しないコントロールのものと類似しており、このことは、MCIに罹患する個体におけるpPKR446/トータルPKR比の上昇がアルツハイマー病及び可能性として、より一般的な神経変性性の異常に特異的であることを示す。
【００４１】
最後に、アルツハイマー病に罹患する患者の一部が正常(AD-PLn)又は中程度、すなわち正常範囲及び病気の範囲(AD-PLi)の間のCSF中のAβ42、T-tau及びptau181マーカーレベルを示すにも拘らず、pPKR446/トータルPKR比の値が上昇することが観察され、このことは、この比が、慣用のマーカーを用いて特定することができないアルツハイマー病に罹患する患者を特定するのに用いられ得ることを示す。
【００４２】
実施例３
実施例１のものに補足的な臨床研究を行った。
１．  患者及び方法
患者
認知障害研究のために、髄液(CSF)分析のためLariboisiere病院のCentre Memoire [記憶センター] (Paris, France)を訪れた119人の個体を１年間継続して本研究に含めた。症例数が少ないので、本研究から除外されたのは、前頭側頭型認知症又はレヴィー小体の疾患を有する５人の個体及びHachinksi虚血スケールに関して４以上のスコアを有する脳卒中を経験したか、又は脳内MRIにおいて視認可能という結果を有する心血管疾患(多発性の大血管梗塞、戦略的に配置された(strategically placed)単一の梗塞、多発性の基底核、白質中の裂け目、白質の脳室周囲の広範な損傷)を有する６人の個体であった。診断前に、全ての個体について、病歴並びに身体的及び神経学的検査を含む標準的な臨床的検査に付した。全ての個体について、血清コバラミン及び葉酸レベル測定、化学パネル、甲状腺機能検定、梅毒血清学、反応性プロテインＣレベル測定、全血精密検査及び脳のMRIを含む実験室的検査を行った。診断は、認知障害を専門とする神経学者及び神経心理学者の多専門的チームによって確定した。アルツハイマー病診断はNINCDS-ADRDA基準(McKhannら(1984) Neurology 34: 939-44)に従って確定し、健忘軽度認知障害(MCI)に罹患する個体は通常の基準(Petersenら(2001) Arch. Neurol 58: 1985-92)を満たしていた。この研究は、パリ大学病院センター(CEERB CHU Bichat, Paris, France)の倫理委員会により承認された。全ての個体及び介護者は、CSF分析に関するインフォームドコンセントを書面で提出した。
【００４３】
CSFに関する手順
臨床診断後１カ月以内の食事摂取しない期間後の個体について腰椎穿刺を行った。CSFを12 mlのポリプロピレンチューブ中に回収した。２時間以内に、CSFサンプルを1800 g、10分間４℃で遠心分離した。少量のCSFを、全細胞数計測、細菌学的検査及びトータルグルコース及びタンパク質レベルを含むルーチンの分析に用いた。CSFを500 μlのポリプロピレンチューブに分割し、分析待機中−80℃で保管した。Innotest ELISAサンドイッチ試験を用いて、製造業者(Innogenetics, Ghent, Belgium)の説明書に従って、CSF中のAβ42、T-tau及びptau181レベルを測定した。Lariboisiere病院のCentre Memoire [記憶センター]で用いられるカットオフ閾値に従って、バイオマーカー陽性の基準をAβ42、T-tau及びptau181レベルの異常に応じて定義した(Aβ42 < 500 pg/ml; T-tau > 302 pg/ml; ptau181 > 65 pg/ml)。１組の生物学的分析は、単一の実験室で行った。CSFの分析に関係する生物学者のチームは、臨床診断のことを知らされていなかった。CSF分析の質は、欧州委員会(アルツハイマー病協会のCSFバイオマーカーに関する品質管理プログラム)により評価された。
【００４４】
CSF中のトータルPKR及びpPKR446レベルの測定
アルブミン及びIgGを除去するために、製造業者の説明書に従って、CSFサンプルをカラム(ProteoExtract(商標), Calbiochem(登録商標), Darmstadt, Germany)上で前処理した。簡潔には、800 μlの平衡化バッファーをカラムに加え、それを再水和した。次いで、300 μlの各CSFサンプルを別個の使い捨てカラムに堆積し、重力で溶出した。製造業者により提供された特異的バインディングバッファーを用いる２回の洗浄によるカラムの溶出後、濾過したサンプルを得た。IgG及びアルブミンを除去されているサンプルを分注し、−20℃で保管した。濾過工程の効率は、ヒト血清アルブミン(Santa Cruz, Danvers, MA, United States)を指向する抗体を用いる免疫標識分析によって評価した。Micro BCA タンパク質アッセイキット(Thermo Scientific, Cergy-Pontoise, France)を用いて、製造業者の説明書に従って、タンパク質濃度を測定した。
【００４５】
CSFタンパク質のサンプルをNuPAGE BisTris 4〜12％ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)上で分離し、次いでニトロセルロース膜(GE Healthcare, Chalfont St. Giles, United Kingdom)上に400 mA/ゲルで、25 mM Tris (pH 8.3), 200 mMグリシン及び20％エタノール中で電気的に転写させた。転写後、TBS中の５％(重量/容量)ミルク中でニトロセルロース膜をブロッキングし、次いで一次抗体と共にインキュベートした。
【００４６】
下記の一次抗体を用いた。ウサギ抗PKR446抗体(Santa Cruz)、ウサギ抗PKR抗体(Cell Signaling, Beverly, MA, United States)、マウス抗血清アルブミン抗体(Santa Cruz)。IRダイ(商標) 700DX蛍光体とコンジュゲートした抗マウスIgG及びIRダイ(商標)蛍光体とコンジュゲートした抗ウサギIgG(Rockland Immunochemical Inc., Gilbertsville, PA, United States)を二次抗体として用いた。Odysseyイメージングシステム(LI COR Biosciences, Lincoln, NE, United States)を用いて結合したタンパク質を可視化し、次いでMultigaugeソフトウェア(Fuji film, Tokyo, Japan)を用いて濃度測定により定量した。測定結果は、光学密度ユニット(ODU)で表した。
【００４７】
トータルPKR及びpPKR446レベルの測定の信頼性を評価するために、本発明者らは、25人のランダムに選択された個体のCSFについて試験-再試験研究を行い、トータルPKR及びpPKR446レベルの２つの連続的な測定間の級内相関関数を算出した。
【００４８】
統計解析
臨床診断(神経学的コントロール又はコントロール(NC)、軽度認知障害(MCI)及びアルツハイマー病(AD))に従って個体の特性を表し、カテゴリー変数についてのχ2検定及び連続変数の分散分析を用いて、３つのグループ間で比較する。ROC(受信者動作特性)曲線解析を用いて、NC及びADの個体の差別化に関するトータルPKR、pPKR446及びpPKR446/トータルPKR比の識別能力を測定した。最適なカットオフ閾値は、ヨーデン指数(感度 + 特異度 - 100)によって最大化することにより特定した。様々なバイオマーカー間の相関は、ピアソン相関係数を用いて評価した。全てのｐ値は両側であり、0.05未満又はそれに等しいＰ値は、統計的に有意であると考えた。SASソフトウェアバージョン9.2 (SAS Institute, Cary, North Carolina, Unites States) 及びStataソフトウェアバージョン10.0(Statacorp LP, College Station, Texas, United States)を用いて統計解析を行った。
【００４９】
２．  結果
含まれた108人の個体のうち、６人のAD、10人のコントロール(NC)及び１人のMCIをCSF分析に関する技術的な理由(８人は不十分なCSF量のため及び９人はCSF中のタンパク質濃度が低過ぎたため)から除外した。これら個体は、年齢及び性別の比率に関して、含められた個体との差はなかった。したがって、合計91人の個体(AD, n = 45; 健忘MCI, n = 11; NC, n = 35)を最終的に本研究に含めた。NCの個体は、認知症のためのLariboisiere病院のCentre Memoire [記憶センター]に送られた(大不安-うつ病性障害 14、脳卒中の合併症 5、アルコール認知症 4、睡眠時無呼吸症候群 2、シェーグレン症候群 2、サルコイドーシス 1、多発性硬化症 2、筋委縮性側索硬化症 1、ライム病 1、正常圧水頭症 1、てんかん 1、末梢神経障害 1)。
【００５０】
AD、MCI及びNCの個体の臨床的特徴を下記の表４に示す。
【表４】
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【００５１】
NCの個体における平均年齢は、ADの個体と比較して僅かに低い。AD及びMCIの個体におけるCSFバイオマーカーAβ42、T-tau及びptau181は、NCの個体と比較して、有意に異なる。トータルPKR及びpPKR446レベル並びにpPKR446/トータルPKR比の測定は、３つのグループの個体について、同一のCSFサンプル中で行った。トータルPKRレベル、特にpPKR446レベルは、ADの個体において上昇する。
【００５２】
特に、トータルPKR及びpPKR446レベル並びにpPKR446/トータルPKR比に関する３つのグループ間の統計的な有意差が見られる。例えば、pPKRの平均レベルは、NCの個体において29.0 +/- 13.9であり、MCIの個体において85.0 +/- 40.4であり、ADの個体において92.3 +/- 38.0である(ODU)。このことは、個体の結果及び下記で測定された閾値を表す図９〜１１においても見られる。
【００５３】
下記の表５は、AD及びNCの個体の識別に関する、トータルPKRレベル、pPKR446レベル及びpPKR446/トータルPKR比について確定したROC曲線の結果を示す。
【表５】
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【００５４】
曲線下面積(AUC)は、pPKR446について0.98及びpPKR446/トータルPKRについて0.95である。よって、pPKR446について51.8 ODUの閾値は、ADの個体とNCの個体とを、91.1％の感度及び94.3％の特異度をもって見分けることを可能にする。これら閾値は、同一のCSFサンプル中のAβ42、T-tau及びptau181について測定したものと同一のオーダーである。慣用のCSFマーカーAβ42、T-tau及びptau181を含むマーカーが考慮されたにも拘らず、pPKR446に関連するAUC値は最良であることが特筆される。
【００５５】
測定の信頼性を研究するために、試験-再試験、すなわち１つのサンプル及び同一のサンプル中のマーカーレベルの二重の測定を25個(10 NC、2 MCI及び13 AD)のCSFサンプルについて行った。トータルPKR及びpPKR446の２つの連続測定間の級内相関係数の信頼可能な値を証明することができた(それぞれ0.94及び0.97)。
【００５６】
他方、トータルPKR及びpPKR446レベル並びに年齢又はMMSEスコア間の如何なる相関も確定することは不可能であった。更に、ADの個体において、pPKR446レベルは男性において、女性よりも上昇することが観察される。
【００５７】
また、本発明者らは、AD及びNCの個体におけるトータルPKRレベル、pPKR446レベル、pPKR446/トータルPKR比並びにAβ42、T-tau及びptau181レベル間の相関を研究した(表６)。
【表６】
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【００５８】
ADの個体において、ptau181濃度は、トータルPKR及びpPKR446レベルと相関するが、相関係数は低いことが観察される。他方、ADの個体におけるトータルPKR又はpPKR446レベルとAβ42及びT-tauのものとの間には、如何なる相関も見られない。更に、NCの個体におけるトータルPKRレベル又はpPKR446レベルとAβ、T-tau及びptau181レベルとの間に、如何なる相関も証明することができなかった。
【００５９】
したがって、このことは、トータルPKRレベル、pPKR446レベル又はpPKR446比が慣用のCSFマーカーとは本質的に独立な情報を提供することにより、特にトータルPKRレベル、pPKR446レベル、又はpPKR446比をAβ42、T-tau及びptau181レベルと組み合わせることにより、これらマーカーに基づく現行の検定の有効性を改善することができるであろうと期待を抱くことができることを示す。
【００６０】
更に、本発明者らは、45人のADの個体において、６人がAβ42、T-tau及びptau181レベルについて陽性の基準を満たさないCSFサンプルを示したが、それにも拘わらず、pPKR446レベル及びpPKR446/トータルPKR比の増大を示したことが観察された(表７)。
【表７】
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【００６１】
よって、慣用のバイオマーカーでは示すことができないが、トータルPKR及びpPKR446レベルの評価は異常を証明することができ、このことは、それらの利点を強固にし、本発明のバイオマーカーが、慣用のバイオマーカーとは本質的に独立な情報を提供することを確認する。
【００６２】
最後に、本発明者らは、MCIの個体における様々なバイオマーカーのレベルを比較した(表８)。
【表８】
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【００６３】
pPKR446レベルについての51.8 ODUのカットオフ値に関して、81.8％の健忘MCIの個体は、異常なpPKR446レベルを示すことが観察された。１年続いた本研究中にアルツハイマー病を発症した５人の個体のうち、１人の個体だけが正常なトータルPKR及びpPKR446レベルを示した。比較すると、５人の個体のうち１人だけが異常なAβ42レベルを示し、５人の個体のうち３人だけが異常なT-tau及びptau181レベルを示した。したがって、本発明のバイオマーカーは、MCIの個体のうち、早期の無症候性の段階にあるアルツハイマー病である個体又は短期間のうちにアルツハイマー病を発症するリスクに瀕している個体を特定することについて、Aβ42、T-tau及びptau181よりも高感度であり得るようである。
【００６４】
更に、６人の安定なMCI患者のうち、４人が異常なトータルPKR及びpPKR446レベルを示した。長期間に亘る研究により、これらの個体がアルツハイマー病を実際に発症するか否かを評価することが可能となるであろう。
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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