(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質と、分子量の異なる複数の不純物タンパク質と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、前記目的タンパク質を精製する方法において、
前記複数の不純物タンパク質の等電点の値に対し、前記溶液の水素イオン指数の値を高く調整する調整工程と、
調整された前記溶液を前記アニオン交換膜に通液する通液工程と、
前記目的タンパク質を回収する回収工程と、
を有し、
前記分子量の異なる複数の不純物タンパク質は、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満の成分と、分子量が１００ｋＤａ以上の成分と、を含み、
前記アニオン交換膜が、ポリエチレン多孔質基材と、前記ポリエチレン多孔質基材に結合されたグラフト鎖と、を備え、前記ポリエチレン多孔質基材に設けられた孔の最大孔径が０．１μｍ以上０．８μｍ以下であり、
前記通液工程を経た溶液中の前記１００ｋＤａ未満の成分の体積あたりの質量濃度と、前記１００ｋＤａ以上の成分の体積あたりの質量濃度と、が、通液前の溶液中の５％以下となる、
方法。
【請求項２】
前記アニオン交換膜の透過フラクションの液体積が、前記アニオン交換膜の体積の８０倍未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調整工程において、前記目的タンパク質の等電点に対し、前記溶液の水素イオン指数の値を、前記目的タンパク質の等電点の値と、１と、の和で得られる値以下に調整し、
前記通液工程において、前記アニオン交換膜に、前記溶液を通液して、前記目的タンパク質を透過させ、
前記回収工程において、前記アニオン交換膜を透過した溶液を採取して、前記目的タンパク質を回収する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記調整工程において、前記目的タンパク質の等電点に対し、前記溶液の水素イオン指数の値を高く調整し、
前記通液工程において、前記アニオン交換膜に、前記溶液を通液して、前記目的タンパク質と、前記不純物タンパク質と、の両方を、前記アニオン交換膜に吸着させ、
前記回収工程において、塩濃度、及び／又は、水素イオン濃度を調整した溶出液を前記アニオン交換膜に通液して、前記目的タンパク質を溶出して回収する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記アニオン交換膜が３級アミンのアニオン交換基を有し、
前記多孔膜状のアニオン交換膜の単位体積あたりの塩素イオンの交換容量であるイオン交換容量が０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ以上、１．０ｍｍｏｌ／ｍＬ以下である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン交換膜に吸着される、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満の成分と、分子量が１００ｋＤａ以上の成分と、を含む前記不純物タンパク質の全成分中、最小の等電点を有する不純物タンパク質の等電点と、最大の等電点を有する不純物タンパク質の等電点と、の差が、１以上である、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記通液工程において、前記アニオン交換膜の透過液中の、前記複数の不純物タンパク質の前記分子量１００ｋＤａ未満及び分子量１００ｋＤａ以上の総ての成分の濃度が、通液前の溶液中の５％以下となり、１分間当たり前記アニオン交換膜の体積の５倍以上の体積の溶液を供給する、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、分子量１００ｋＤａ以上の、免疫グロブリン、チログロブリン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、フィブリノゲン、キモトリプシノーゲン及び酵素からなる群から選択される１種である、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が、有機溶媒、界面活性剤、及び脂質からなる群から選択される少なくとも１種の不純物を含み、
前記通液工程において、前記不純物が前記アニオン交換膜を透過する、
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的タンパク質を含む溶液を前記アニオン交換膜に供給する際、及び／又は前記目的タンパク質を前記アニオン交換膜から溶出する際、１分間当たり前記アニオン交換膜の体積の５倍以上の体積の溶液を供給する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質を含む溶液を前記アニオン交換膜に供給し、洗浄後に前記溶出液を前記アニオン交換膜に通液して前記目的タンパク質を溶出回収する際の、前記アニオン交換膜の膜体積あたりの前記目的タンパク質の回収量が１０ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項1乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は精製技術に関し、特にタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品及び医療などの分野において、様々な有用なタンパク質を効率的に精製する方法は重要な技術として認識されている。即ち、タンパク質はその性質によって特定の機能を示すため、目的とするタンパク質を単離し、精製する技術が各分野において求められている。一般に有用タンパク質は、ヒトを含む動物由来のものとして抽出される場合と、目的とするタンパク質の遺伝子を組み込んだプラスミドを導入した大腸菌、あるいは細胞培養により発現させて得られる場合と、に大別される。いずれの場合においても、目的とするタンパク質を単離、精製するためには、複数の工程に渡る複雑なプロセスを用いる必要がある。
【０００３】
動物由来の有用タンパク質として、代表的なものに、動物由来の細胞株を用いる細胞培養によって産生されるモノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などの抗体タンパク質、さらには、ヒトから採血された血液から得られる、フィブリノゲン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、免疫グロブリン、血清アルブミン、トロンビン、アンチトロンビン、及びトランスフェリンなどの、各種の血漿分画製剤がある。これら、動物細胞培養液から得られる抗体タンパク質は、遠心分離、及び精密ろ過膜による除濁の後に、クロマトグラフィー工程によって精製される（例えば、非特許文献１参照。）。ここで、クロマトグラフィー工程は、目的とするタンパク質を、吸着して回収する工程（Ｂｉｎｄ−ａｎｄ−Ｅｌｕｔｅ）と、不純物となるタンパク質などを吸着して、目的タンパク質を透過して回収する工程（Ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）と、に大別される。また、血漿分画製剤は、採血された血漿を集めたプール血漿に、エタノールや酸などを添加して、物理化学的条件を少しずつ変化させ、特定のタンパク質が沈殿しやすい条件を作ることにより、目的とするタンパク質を取り出す、１９４０年代に開発されたコーン分画法を基本として、ろ過やクロマトグラフィーなどの分離手法を組み合わせた方法により精製され、工業的にも当該精製方法が一般に用いられる（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
特に血液凝固因子のような血中濃度の低い有用タンパク質を有効に単離、精製、濃縮するためには、分画法と、クロマトグラフィー技術と、の組み合わせが不可欠となる。例えば、特許文献１には、特定の緩衝液によって平衡化されたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）のアニオン交換基を有するクロマトグラフィーカラムにより、フォンビルブラント因子を精製、濃縮する方法が記載されている。また、非特許文献３にはアフィニティクロマトグラフィー、ウィルス除去膜及びアニオン交換クロマトグラフィーを組み合わせた工程により、血液凝固第ＶＩＩＩ因子を精製する方法が報告されている。さらに、特許文献２では特定のイオン交換クロマトグラフィーろ過タイプのメンブレンを用いて、血液凝固第ＶＩＩＩ因子又はフォンビルブラント因子を精製する方法が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−５８２９８号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３７９６０号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／０００２０８１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“ＰＲＯＣＥＳＳ  ＳＣＡＬＥ  ＢＩＯＳＥＰＡＲＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ”、Ｃｈａｐｔｅｒ  １、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ２００７  ｂｙ  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、ＵＳ．
【非特許文献２】「バイオセパレーションの応用」シーエムシー出版
【非特許文献３】“Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ２０−ｎｍ  ｐｏｒｅ−ｓｉｚｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ”、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ  （２００６）９１、１１９−１２５
【非特許文献４】“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｌａｒｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ”、Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．  ２００２、４１、１５９７−１６０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記に示したように、クロマトグラフィー工程は、細胞培養液などから不純物を除去して目的物を精製する目的に有用であり、また分画法とクロマトグラフィー法とを組み合わせる方法は、血液中での濃度の低い血液凝固因子などを濃縮、精製するために有用である。しかしながら、カラムクロマトグラフィーは吸着するタンパク質の分子量が大きいほど、吸着量が低下することが知られており（例えば、特許文献３参照。）、フロースルー（Ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）によって不純物を除去する場合に、高分子量の不純物タンパク質の除去が困難となる場合がある。さらに、第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、及びフィブリノゲンのような、高分子量タンパク質のＢｉｎｄ−ａｎｄ−Ｅｌｕｔｅによる精製にクロマトグラフィーを用いる場合、動的吸着容量が通常１０ｍｇ／ｍＬにも満たないために、低分子量タンパク質の精製に比べて精製効率が低下するという難点があり、特許文献１及び非特許文献２に開示された方法では、迅速な精製処理が容易ではない。また、特許文献２で開示されたイオン交換クロマトグラフィーろ過タイプのメンブレンにおいても、高分子量タンパク質の吸着量が十分ではないという課題は解決されていない。
【０００８】
上記に記載したように、従来のカラムクロマトグラフィーを用いた方法では、高分子量の不純物タンパク質を含む、広い範囲の分子量分布を有する不純物を除去することが難しく、また、高分子量の有用タンパク質を吸着及び溶出して、効率的かつ迅速に精製することも容易ではない。
【０００９】
かかる状況に鑑み、本発明の解決しようとする課題は、効率的かつ迅速に高分子量の目的タンパク質を精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン交換膜が、高分子量タンパク質に対して、特異的に高い吸着容量を有することを見出し、さらに、目的に応じて水素イオン指数（ｐＨ）が調整されたタンパク質溶液を、このアニオン交換膜に通液することにより、高分子量の不純物タンパク質の除去、及び高分子量の目的タンパク質の精製が有効になされることを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明の態様は、目的タンパク質と、分子量の異なる複数の不純物タンパク質と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、目的タンパク質を精製する方法であって、複数の不純物タンパク質の等電点の値に対し、溶液の水素イオン指数の値を高く調整する調整工程と、調整された溶液をアニオン交換膜に通液する通液工程と、目的タンパク質を回収する回収工程と、を有し、分子量の異なる複数の不純物タンパク質は、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満の成分と、分子量が１００ｋＤａ以上の成分と、を含み、通液工程を経た溶液中の１００ｋＤａ未満の不純物タンパク質の成分の体積あたりの質量濃度と、１００ｋＤａ以上の不純物タンパク質の成分の体積あたりの質量濃度と、が、通液前の溶液中の５％以下となる、方法であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の、アニオン交換膜を用いた精製方法によれば、動物細胞培養液などに含まれる、高分子量成分を含む、広い分子量範囲の不純物タンパク質を有効に除去することができる。さらに、第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、及びフィブリノゲンなどに代表される、高分子量タンパク質の吸着溶出による精製を、効率的かつ迅速に実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１と比較例１に係る、アニオン交換膜の透過液量と、透過液に含まれるタンパク質の種類と濃度と、の関係を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。
【図２】実施例２に係る、アニオン交換膜の透過液量と、透過液に含まれるタンパク質の濃度と、の関係を示すグラフである。
【図３】比較例２に係る、アニオン交換カラムの透過液量と、透過液に含まれるタンパク質の濃度と、の関係を示すグラフである。
【図４】実施例６に係る、２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【図５】比較例３に係る、２次元電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することが可能である。
【００１５】
本実施の形態に係るタンパク質の精製方法は、目的タンパク質と、分子量の異なる複数の不純物タンパク質と、を含有する溶液をアニオン交換膜に通液して、目的タンパク質を精製する方法であって、複数の不純物タンパク質の等電点の値に対し、溶液の水素イオン指数の値を高く調整する調整工程と、調整された溶液をアニオン交換膜に通液する通液工程と、目的タンパク質を回収する回収工程と、を有する。分子量の異なる複数の不純物タンパク質は、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満の成分と、分子量が１００ｋＤａ以上の成分と、を含む。通液工程を経た溶液中の１００ｋＤａ未満の不純物タンパク質の成分の体積あたりの質量濃度と、１００ｋＤａ以上の不純物タンパク質の成分の体積あたりの質量濃度と、は、通液前の溶液中の５％以下となる。
【００１６】
本実施の形態で用いられる多孔膜状のアニオン交換膜は、高分子量タンパク質の吸着量が高く、分子量が１００ｋＤａ以上、好ましくは２００ｋＤａ以上、より好ましくは３００ｋＤａ以上のタンパク質の１０％破過の動的吸着容量が、好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上である。なお、１０％破過とは、透過液中の物質濃度が、供給された物質含有溶液の濃度の１０％を超えた時点のことをいう。また、動的吸着容量Ａは、溶液の濃度をＱ、破過した時までに透過させた溶液の体積をＶB、アニオン交換膜の膜体積をＶMとして、下記式（１）で与えられる。
Ａ＝Ｑ×ＶB／ＶM  ・・・（１）
一般に市販されているアニオン交換膜としては、旭化成メディカル製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ、Ｐａｌｌ製ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ製ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ、Ｎａｔｒｉｘ製ａｄｓｅｐｔＱ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製ＣｈｒｏｍａＳｏｒｂなどが挙げられるが、これらの中でも、ポリエチレン多孔質基材にグラフト鎖を固定した形態を有する、旭化成メディカル製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄが、最も高分子量タンパク質の動的吸着容量が高く、好ましい。
【００１７】
アニオン交換膜の細孔径は、０．１μｍ以上０．８μｍ以下、好ましくは０．２μｍ以上０．８μｍ以下、さらに好ましくは０．２μｍ以上０．６μｍ以下である。細孔径が小さすぎると、溶液を通液する際の圧力が高くなる傾向にある。また細孔径が大きすぎると、高分子量タンパク質の吸着性能が低下する傾向にある。
【００１８】
アニオン交換膜は、アニオン交換基を有する。アニオン交換基は例えば３級アミンである。アニオン交換膜の、体積あたりのリガンド密度に対応する、塩素イオン交換容量の値は、０．３ｍｍｏｌ／ｍＬ以上１．０ｍｍｏｌ／ｍＬ以下が好ましく、より好ましくは、０．４ｍｍｏｌ／ｍＬ以上０．８ｍｍｏｌ／ｍＬ以下である。イオン交換容量が高いほど、リガンド密度が高いため、高分子量タンパク質の吸着に有利であるが、高すぎると高分子量タンパク質の、アニオン交換膜のグラフト鎖への進入が阻害される傾向にある。
【００１９】
アニオン交換膜に溶液を通液する際の通液速度は、精製処理の効率化のためにより速いことが好ましい。通常のビーズカラムにタンパク質を吸着させる場合、通液速度が速くなると、吸着性能が低下することは、タンパク質精製に関する技術分野では公知であり、特に１分間当たりのカラム体積の５倍以上の体積の溶液を供給する速度で通液すると、タンパク質の吸着性能は著しく低下する。これに対し、アニオン交換膜はタンパク質の吸着性能は通液速度に殆ど依存しない。したがって、カラムを用いた場合に比べて明確に処理効率が向上するために、アニオン交換膜に溶液を通液する速度は、１分間当たりアニオン交換膜の体積の５倍以上の体積の溶液を供給することに相当する流速、即ち、５ＭＶ／ｍｉｎ以上が可能であり、より好ましくは１０ＭＶ／ｍｉｎ以上である。流速の上限は、用いる溶液の粘度及び濁度などの性状に依存するが、通液の際の膜間差圧を検知することにより、容易に設定することができる。ここで、溶液とは、タンパク質溶液、並びにアニオン交換膜の平衡化、洗浄及びタンパク質の溶出に用いる塩溶液のことを指す。
【００２０】
アニオン交換膜に通液するタンパク質溶液のｐＨは、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等の不純物タンパク質を膜に吸着させるため、不純物タンパク質の等電点（ｐＩ）より、高い値に調整する。ｐＨを不純物タンパク質のｐＩより高くすることにより、不純物タンパク質はアニオン交換膜に吸着される。タンパク質溶液が塩を含む場合、吸着が有効になされるためには、溶液のｐＨは不純物タンパク質のｐＩより、十分に高い値であることが好ましい。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは吸着される不純物タンパク質のｐＩよりも、１以上高い値であることが好ましい。
【００２１】
また、アニオン交換膜に通液するタンパク質溶液のｐＨは、目的タンパク質を膜に吸着させる場合には、目的タンパク質のｐＩより、高い値に調整する。ｐＨを目的タンパク質のｐＩより高くすることにより、目的タンパク質はアニオン交換膜に吸着される。タンパク質溶液が塩を含む場合、吸着が有効になされるためには、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより、十分に高い値であることが好ましい。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは吸着される目的タンパク質のｐＩよりも、１以上高い値であることが好ましい。
【００２２】
目的タンパク質を含む溶液をアニオン交換膜に通液し、透過液として精製されたタンパク質を回収する場合には、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより低い値であることが好ましいが、溶液が塩を含む場合には、溶液のｐＨは目的タンパク質のｐＩより高い値であることも可能である。具体的には、細胞培養液と同程度の０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを塩として含む溶液の場合には、ｐＨは透過する目的タンパク質のｐＩ（ｐＩｂ）に対して、ｐＩｂ＋１より低く調整されれば、ｐＩの値より高いｐＨであっても、目的タンパク質を透過液として回収することができる。
【００２３】
アニオン交換膜に吸着した目的タンパク質を溶出、回収する場合、塩を含む溶液、又は吸着されたタンパク質のｐＩ値よりもｐＨを低く調整した溶液を、溶出液として用いる。塩濃度は０．１ｍｏｌ／Ｌ以上２．０ｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、より好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下である。塩濃度が低すぎると、十分な溶出が得られない傾向にあり、塩濃度が高すぎると、目的タンパク質溶液の脱塩に負荷がかかる傾向にある。ｐＨを調整した溶液のｐＨは、塩濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の場合に、目的タンパク質のｐＩより低い値に調整することが好ましく、その範囲において具体的な値は目的タンパク質の種類に依存する。
【００２４】
目的タンパク質を溶出、回収する場合の効率を示す、膜体積あたりの回収量は、精製処理が迅速かつ効率的に実施されるために、１０ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、より好ましくは２０ｍｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは３０ｍｇ／ｍＬ以上である。膜体積あたりの回収量は、用いるアニオン交換膜の目的とするタンパク質の動的吸着容量、及び供給量によって異なるが、これらの値が大きいほど大きくなる。したがって、目的とする高分子量タンパク質の動的吸着容量の大きなアニオン交換膜が用いられる。
【００２５】
本発明の目的タンパク質は特には限定しないが、分子量が１００ｋDa以上であると、アニオン交換膜への吸着容量がカラムに比べて優位に高いため、好ましい。高分子量の目的タンパク質は、分子量が１００ｋＤａ以上であれば特に限定されないが、血漿分画製剤として回収される、有用なタンパク質である免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、及びＩｇＤ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブラント因子、フィブリノゲン、大腸菌あるいは細胞培養によって得られる酵素、並びに動物あるいは植物の組織から抽出される有用タンパク質が挙げられ、本実施の形態に係る精製方法は、これらのタンパク質の精製に有効である。
【００２６】
目的タンパク質と、分子量の異なる複数の不純物タンパク質と、を含有する溶液は、不純物タンパク質以外の不純物をさらに含みうる。不純物の種類は特に限定されないが、高分子量タンパク質を目的タンパク質とする場合に一般的な、有機溶剤、界面活性剤、脂質、さらには高ｐＩタンパク質などの、アニオン交換膜に吸着しにくい性質を有する不純物がある。アニオン交換膜に吸着しにくい不純物は、目的タンパク質をアニオン交換膜に吸着させる過程において、非吸着成分として透過するために、目的タンパク質を溶出して回収することにより、除去することができる。
【００２７】
また、アニオン交換膜に吸着する不純物は、溶出条件を制御することによって除去することができる。例えば、目的タンパク質ではない低分子量の不純物タンパク質は、一般に高分子量タンパク質を溶出するための溶液の塩濃度より低い塩濃度の溶液で溶出される傾向にある。そのため、例えば、予め０．１ｍｏｌ／Ｌ以下の低塩濃度の溶出液で低分子量タンパク質を溶出し、次いで０．１ｍｏｌ／Ｌ以上の高塩濃度の溶出液で精製された目的タンパク質を溶出し、回収する。
【００２８】
以下、実施例及び比較例（本明細書中において、単に「実施例等」ともいう。）に基づいて本実施の形態をさらに具体的に説明するが、本実施の形態の範囲は以下の実施例のみに限定されない。
【実施例１】
【００２９】
（目的タンパク質と広い分子量範囲の不純物タンパク質を含む混合液のアニオン交換膜への通液）
２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に、目的タンパク質として、キモトリプシノーゲン（α−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｏｇｅｎ−Ａ、分子量２５ｋＤａ、ｐＩ９．２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）０．２５ｇ／Ｌを含む溶液に、不純物タンパク質として、表１に示すように、チログロブリン（ＴＨＹ）（分子量６６０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）（分子量１８ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、オブアルブミン（ＯＶＡ）（分子量４３ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（分子量６５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）の分子量の異なる４種類のタンパク質をそれぞれの濃度が、０．２５ｇ／Ｌとなるように添加し、溶解した後、ザルトリウス社製の精密ろ過膜ミニザルト（最大細孔径０．２２μｍ）を用いてろ過し、評価に用いる、目的タンパク質と高分子量のタンパク質を含む４種類の不純物タンパク質の混合溶液を調製した。表１に示すように、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満であるＢＳＡの等電点と、分子量が１００ｋＤａ以上のチログロブリンの等電点と、の差は、１以上であった。
【表１】
0005931363.tif 000002
【００３０】
グラフト鎖を有し、アニオン交換基として３級アミンを有する多孔膜状のアニオン交換膜として、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  （ＱＳＤ）  ０．６ｍＬ  （細孔径０．２−０．３μｍ、イオン交換容量０．５５−０．６ｍｍｏｌ／ｍＬ）を用意し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を２０ｍＬ通液して平衡化した後、膜体積の１４０倍の溶液体積（１４０ＭＶ）に相当する８４ｍＬの、タンパク質混合溶液を透過させ、１０ＭＶごとの透過フラクションを採取した。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって流速８ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。この流速は、毎分膜体積の１３．３倍の溶液を供給しており、規格化した流速１３．３ＭＶ／ｍｉｎと記載する。
【００３１】
得られた透過フラクションに含まれるタンパク質を評価するために、１０−２０ＭＶ、４０−５０ＭＶ、７０−８０ＭＶ、１００−１１０ＭＶ及び１３０−１４０ＭＶの透過フラクションについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。分析に用いる透過液１０μＬを同量のサンプル処理液（第一化学薬品株式会社製、トリスＳＤＳ  β  ＭＥサンプル処理液）と混合し、１００℃で５分間熱処理した。得られたサンプルを、マイクロピペットを用いて電気泳動用ゲルプレート（第一化学薬品株式会社製、マルチゲルＩＩミニ８／１６）に１ウェルにつき１０μＬを適用した。次に、泳動用緩衝液（第一化学薬品株式会社製、ＳＤＳ−トリス−グリシン泳動緩衝液を１０倍希釈して使用）を満たした電気泳動槽（和光純薬株式会社製、ＥａｓｙＳｅｐａｒａｔｏｒ（登録商標））に電気泳動用ゲルプレートを挿入し、３０ｍＡの定電流で１時間泳動させ、透過液中のタンパク質を分離した。泳動後、図１に示すように、ゲルプレートを染色試薬（フナコシ株式会社製、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ）で染色した。
【００３２】
図１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２は透過前のタンパク質溶液、レーン３からレーン７は、それぞれ１０−２０ＭＶ、４０−５０ＭＶ、７０−８０ＭＶ、１００−１１０ＭＶ及び１３０−１４０ＭＶの透過フラクションの泳動結果である。この結果から、透過量５０ＭＶまでは全分子量の不純物タンパク質が除去されて、分子量２５ｋＤａの目的タンパク質であるキモトリプシノーゲンのみが透過液中に含まれ、透過量８０ＭＶ以降で不純物タンパク質が徐々に漏れ始めていている事が示された。
【００３３】
［比較例１］
（目的タンパク質と広い分子量範囲の不純物タンパク質を含むタンパク質混合液のアニオン交換カラムへの通液）
実施例１で用いたものと同じ、目的タンパク質と異なる分子量の４種類の不純物タンパク質の混合溶液を、アニオン交換カラムに通液し、透過液中に含まれる各タンパク質の濃度を評価した。透過フラクションはカラム体積の１０倍に相当する体積（１０ＣＶ）ごとに採取した。アニオン交換カラムとして、ＧＥヘルスケア製、ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ＿１ｍｌ（粒子径９０μｍ、イオン交換容量０．１８−０．２６ｍｍｏｌ／ｍＬ）を用い、流速２ｍＬ／ｍｉｎ（２ＣＶ／ｍｉｎ、あるいは３００ｃｍ／ｈｒ）で、実施例１と同様の方法で通液し、その透過フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価した。結果を実施例１と同じく図１に示す。レーン８は透過前のタンパク質溶液、レーン９からレーン１３は、それぞれ１０−２０ＣＶ、４０−５０ＣＶ、７０−８０ＣＶ、１００−１１０ＣＶ及び１３０−１４０ＣＶの透過フラクションの泳動結果である。この結果から、アニオン交換カラムを用いた場合、最初の透過フラクションから、高分子量の不純物タンパク質が含まれ、実施例１に比べて目的タンパク質の十分な精製が実現されない事が示された。
【実施例２】
【００３４】
（タンパク質混合液のアニオン交換膜への通液）
表２に示すように、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に、チログロブリン（ＴＨＹ）（分子量６６０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）（分子量１８ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、オブアルブミン（ＯＶＡ）（分子量４３ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（分子量６５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）の分子量の異なる４種類のタンパク質をそれぞれの濃度が、０．２５ｇ／Ｌとなるように添加し、溶解した後、ザルトリウス社製の精密ろ過膜ミニザルト（最大細孔径０．２２μｍ）を用いてろ過し、評価に用いる、高分子量のタンパク質を含む４種類のタンパク質の混合溶液を調製した。表１に示すように、少なくとも分子量が１００ｋＤａ未満であるＢＳＡの等電点と、分子量が１００ｋＤａ以上のチログロブリンの等電点と、の差は、１以上であった。
【表２】
0005931363.tif 000003
【００３５】
グラフト鎖を有し、アニオン交換基として３級アミンを有する多孔膜状のアニオン交換膜として、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ（登録商標）Ｄ  （ＱＳＤ）  ０．６ｍＬ  （細孔径０．２−０．３μｍ、イオン交換容量０．５５−０．６ｍｍｏｌ／ｍＬ）を用意し、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を２０ｍＬ通液して平衡化した後、破過が開始するまで４種類のタンパク質の混合溶液を透過させた。溶液は評価モジュール内の中空糸多孔膜の内側から外側に向かって流速８ｍＬ／ｍｉｎにて通液した。この流速は、毎分膜体積の１３．３倍の溶液を供給しており、規格化した流速１３．３ＭＶ／ｍｉｎと記載する。
【００３６】
評価はＧＥヘルスケアバイオサイエンス製ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ１００を用いて実施し、同装置に設置されているＵＶ吸光度計により、透過液の２８０ｎｍのＵＶ吸光度をモニターした。膜体積の６０倍の溶液体積（６０ＭＶ）に相当する、３６ｍＬの通液量を超えるまで、透過液のＵＶ吸光度は検出されず、４種類総てのタンパク質がアニオン交換膜に吸着し、４種類総てのタンパク質が除去された透過液が得られた。
【００３７】
また、２０ＭＶずつの透過液中に含まれる、各タンパク質の濃度を、ゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した。島津製作所株式会社製クロマトグラフＬＣ−１０Ａシステムにゲルろ過カラムとして東ソー株式会社製ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬを取り付け、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸及び０．２ｍｏｌ／Ｌのアルギニン（ｐＨ６．８）を含むバッファーを用いて、３０℃において流速０．６ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここに評価サンプルを１０μＬ添加し、ゲルろ過カラムを透過して得られる、リテンションタイム（保持時間）ごとの２８０ｎｍのＵＶ吸光度を、システムに付属のＵＶ吸光度計により計測した。
【００３８】
まず、各タンパク質単独の溶液をゲルろ過クロマトグラフィーによって評価することにより、各タンパク質のリテンションタイムを計測すると共に、ピーク面積とタンパク質濃度との検量線を作成し、この結果をもとに、アニオン交換膜の透過液に含まれる、各タンパク質の濃度を求めた。図２に透過液量と、その透過液に含まれる、各タンパク質の濃度と、をプロットした。ここで、タンパク質濃度は、供給液濃度ｃ０に対する透過液中の濃度ｃの比、ｃ／ｃ０で表している。図２より、ＱＳＤを透過することにより、供給液に含まれる異なる分子量の全タンパク質が、透過液量６０ＭＶまで、透過液中から完全に除去されていることが示された。
【００３９】
［比較例２］
（タンパク質混合液のアニオン交換カラムへの通液）
実施例２で用いたものと同じ、異なる分子量の４種類のタンパク質の混合溶液を、アニオン交換カラムに通液し、透過液中に含まれる各タンパク質の濃度を評価した。アニオン交換カラムとして、ＧＥヘルスケア製、ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ＿１ｍｌ（粒子径９０μｍ、イオン交換容量０．１８−０．２６ｍｍｏｌ／ｍＬ）を用い、流速２ｍＬ／ｍｉｎ（２ＣＶ／ｍｉｎ、あるいは３００ｃｍ／ｈｒ）で、実施例２と同様の方法で通液した。実施例２のアニオン交換膜からの透過液と異なり、アニオン交換カラムでは、最初の透過フラクションからＵＶ吸光度が検出され、透過液にタンパク質が含まれていることが示された。
【００４０】
カラム体積の２０倍に相当する体積（２０ＣＶ）ごとの、透過液に含まれる各タンパク質の濃度を、実施例２と同様にしてゲルろ過クロマトグラフィーにより評価した。図３にアニオン交換カラムの透過液量と、その透過液に含まれる、各タンパク質の濃度をプロットした。図３より、最初の透過フラクションの段階から透過液中にタンパク質が含まれており、特に分子量１００ｋＤａ以上の高分子量のタンパク質が、吸着されずに透過することが確認された。
【実施例３】
【００４１】
（目的タンパク質の回収）
実施例２で調製した、４種類のタンパク質を不純物タンパク質とし、当該４種類のタンパク質を含む混合溶液に、塩濃度０．１ｍｏｌ／ＬとなるようにＮａＣｌを添加し、さらに目的タンパク質として抗体ＩｇＧタンパク質（株式会社ベネシス製、献血ヴェノグロブリン−ＩＨ、分子量約１７０ｋＤａ、ｐＩ約７〜８）を２ｍｇ／ｍＬとなるように添加した後、ｐＨを、抗体ＩｇＧタンパク質のｐIの値と、１と、の和で得られる値以下の８．０に調整した。得られた溶液を実施例１と同様にしてアニオン交換膜ＱＳＤに、６０ＭＶに相当する体積だけ通液し、透過液を回収した。
【００４２】
得られた透過液を、実施例２と同様にして、ゲルろ過クロマトグラフィーにより評価したところ、ＩｇＧであることを示す分子量１７０ｋＤａのみのピークが確認され、不純物である広範囲の分子量に渡る４種類のタンパク質が除去され、目的タンパク質のみが回収されたことが示された。また、ＩｇＧタンパク質溶液の濃度と２８０ｎｍでのＵＶ吸光度から得られる検量線から、透過液中のＩｇＧタンパク質の濃度を評価したところ、１．９ｍｇ／ｍＬであった。これより、目的タンパク質であるＩｇＧの回収率は９５％であった。
【実施例４】
【００４３】
（タンパク質混合溶液からの高分子量タンパク質（ＴＨＹ）の回収）
実施例２と同様にして、ＴＨＹ、β−ラクトグロブリン、オブアルブミン、ＢＳＡをそれぞれ０．２５ｇ／ｍＬ溶解した混合タンパク質溶液を作成した。ただし、実施例４においては、ＴＨＹを高分子量の目的タンパク質とし、β−ラクトグロブリン、オブアルブミン、ＢＳＡを目的としない低分子量のタンパク質とする。この混合溶液をＱＳＤの膜体積の６０倍に相当する３６ｍＬを、ＱＳＤに通液し、緩衝液で洗浄した。次に、目的としない低分子量のタンパク質を溶出するために０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む、前記緩衝液を２０ｍＬ通液し、その後、目的とするＴＨＹを溶出するために０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む緩衝液を同様に１０ｍＬ通液し、この溶出液を回収した。
【００４４】
回収した０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含む緩衝液よりなる溶出液に含まれる、各タンパク質の濃度を実施例１と同様にして、ゲルろ過クロマトグラフィーにより評価したところ、目的タンパク質であるＴＨＹは０．７６ｍｇ／ｍＬ、目的としないタンパク質であるβ−ラクトグロブリン、オブアルブミン、及びＢＳＡはそれぞれ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０１２ｍｇ／ｍＬであった。また、ＴＨＹの回収率は８４％、膜体積あたりの回収量は１２．６ｍｇ／ｍＬ−ａｄであった。この結果から、溶出条件を制御することにより、目的とするタンパク質を濃縮、精製して回収可能なことが示された。
【実施例５】
【００４５】
（目的タンパク質（ＦＶＩＩＩ）からの不純物界面活性剤の除去と濃縮）
血液凝固第ＶＩＩＩ因子（日本赤十字社製、ＣＲＯＳＳ  ＥＩＧＨＴ  Ｍ（登録商標））０．０１ｇ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液９５０ｍＬ、界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、及び東京化成工業より購入）１０ｍＬを混合し、０．１％の界面活性剤を含み、血液凝固第ＶＩＩＩ因子の濃度が０．０１ｇ／Ｌの希薄溶液を作成した。この溶液の全量を、実施例１と同様の方法で、アニオン交換膜モジュール、旭化成メディカル社製ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ（ＱＳＤ）  ０．６ｍＬに通液して血液凝固第ＶＩＩＩ因子を同モジュールに吸着させ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液１５ｍＬを通液して、モジュールを洗浄した後、１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液１０ｍＬを通液して、吸着した血液凝固第ＶＩＩＩ因子を溶出、回収した。
【００４６】
得られた回収液の回収率を実施例２と同様の方法によりゲルろ過クロマトグラフィーの方法で評価したところ、回収液中の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の濃度は、０．９７ｇ／ｍＬであり、回収率は９７％であった。また、回収液に界面活性剤は含まれていなかった。これらの結果より、不純物である界面活性剤が除去され、精製及び濃縮された血液凝固第ＶＩＩＩ因子が得られることが確認された。
【実施例６】
【００４７】
（細胞培養液からの不純物タンパク質の除去）
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ無血清培地を用いて得られた細胞培養液を、ザルトリウス社製の精密ろ過膜ミニザルト（最大細孔径０．２２μｍ）を用いてろ過し、評価に用いる不純物溶液を得た。また、この不純物溶液６０ｍＬをアニオン交換膜であるＱＳＤに通液し、膜体積の１００倍（１００ＭＶ）に相当する体積の、ｐＨ７．５及び電気伝導度１０ｍＳ／ｃｍの不純物溶液の透過液を得た。体積２ｍＬの得られた不純物溶液、及びその透過液に、それぞれ３倍量の体積（６ｍＬ）の、−２０℃に冷却したアセトンを添加し、−２０℃にて７２時間放置後、遠心分離機を用いて沈殿物を回収することにより、それぞれの溶液に含まれていた、塩及び各種夾雑物が除去された不純物タンパク質を得た。
【００４８】
得られたそれぞれの不純物タンパク質の分子量及びｐＩの分布を調べるために、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製ＺＯＯＭ  ＩＰＧ  Ｒｕｎｎｅｒを用いて、２次元電気泳動を実施した。ここで、ＺＯＯＭ  ＩＰＧ  Ｒｕｎｎｅｒとは、評価に必要な泳動槽及び試薬類を含む、装置一式の名称である。それぞれの、得られた不純物タンパク質に、１３０μＬの泳道用サンプル調製液（８．４ｍｏｌ／Ｌ  Ｕｒｅａ，２．４ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｈｉｏｕｒｅａ，  ４．８％ＣＨＡＰＳをソニケーターと撹拌にて溶解し、０．２２ｕｍフィルターにて濾過後、分注し−２０℃にて保管した後、室温に戻したもの）、１．５μＬのＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製  ＺＯＯＭキャリア  アンフォライト（ｐＨ３−１０）、１．５μＬの０．２％ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）水溶液を添加し、さらに精製水を加えて１５５μＬとして溶解し、泳動用サンプルを調製した。得られたサンプル１５５μＬを、１次元目のストリップゲル（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製  ＺＯＯＭストリップゲルｐＨ３−１０（ｎｏｎ−Ｌｉｎｅａｒ））に添加し、パワーサプライ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（現ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）社製  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｐｏｗｅｒ  Ｓｕｐｐｌｙ−ＥＰＳ  ３５００ＸＬ）を使用して、１７５Ｖにて２０分間、次いで１７５Ｖから２０００Ｖまで昇圧しながら  ４５分間、さらに２０００Ｖにて６０分間の電気勾配をかけて泳動を行った。
【００４９】
一次元目の電気泳動終了後のストリップゲルは、室温で緩やかに振とうしながらＳＤＳ処理を１５分間行った。ＳＤＳ処理液として、ストリップゲル１本に対してＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （４ｘ）  １．２５ｍＬを精製水で５ｍＬに希釈したものを用いた。二次元目の電気泳動では、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製  ＮｕＰａｇｅ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＺＯＯＭ  ｇｅｌｓ（１０ｍｍ・ＩＰＧｗｅｌｌ）  にＳＤＳ処理を行ったストリップゲルを添加し、泳動用緩衝液にはＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｘ）を精製水にて１Ｘに希釈したものを使用した。また、分子量サイズマーカーには、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製  Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  を用い、２００Ｖにて５５分間、定電圧で泳動を行った。二次元目の泳動を終了したゲルは、メタノール５０％・酢酸１０％を精製水に溶解した固定液に浸し、室温で一晩静置した。固定したゲルは、コスモ・バイオ株式会社製２Ｄ−銀染色試薬・ＩＩを用いて、銀染色を行い、分子量及びｐＩ分布を示す、２次元電気泳動の結果を得た。
【００５０】
図４に得られた２次元電気泳動の結果を示す。ここで、ａ）は細胞培養液から得られた不純物溶液に含まれていたタンパク質、ｂ）は不純物溶液のアニオン交換膜ＱＳＤの透過液に含まれていたタンパク質の、それぞれの２次元電気泳動パターンである。図４ａ）の結果から、細胞培養液に含まれる不純物タンパク質は、約３００ｋＤａまでの分子量、及び少なくとも３から９．５までの範囲に渡るｐＩの、広い範囲の分布を有していることが示される。これに対し、図４ｂ）の結果から、アニオン交換膜ＱＳＤの透過液に含まれるタンパク質は、ｐＩが４以下の全分子量範囲のタンパク質が除去されたことが確認された。よって、ｐＩの差が１以上の複数の不純物タンパク質を除去可能なことが示された。
【００５１】
［比較例３］
アニオン交換膜ＱＳＤの換わりに、アニオン交換カラムとして、ＧＥヘルスケア製、ＨｉＴｒａｐＱ  ＨＰ＿１ｍｌを用い、流速２ｍＬ／ｍｉｎ（２ＣＶ／ｍｉｎ、あるいは３００ｃｍ／ｈｒ）にて通液する以外は、実施例６と全く同様にして、細胞培養液に含まれる不純物溶液の透過液を回収し、２次元電気泳動法を用いて、透過液中のタンパク質の分子量及びｐＩの分布を評価した。図５に得られた２次元電気泳動の結果を示す。これより、やや不純物タンパク質の除去が認められるものの、広い範囲の分子量分布のタンパク質が除去されるｐＩ領域はなかった。
【図１】
0005931363.tif 000004
【図２】
0005931363.tif 000005
【図３】
0005931363.tif 000006
【図４】
0005931363.tif 000007
【図５】
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