(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
配列番号３１に記載されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼが触媒する発光反応における発光強度と比較して、５．５倍以上の発光強度を示す発光反応を触媒する、オオオバボタル（Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）に由来するルシフェラーゼ。
【請求項２】
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有し、且つ５０番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がアスパラギン酸であり、５３０番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がアルギニンであるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、オオオバボタルに由来するルシフェラーゼ。
【請求項３】
ｉ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有し、且つ２９４番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がチロシンであり、３２３番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がロイシンであり、３５４番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がバリンであるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、オオオバボタルに由来するルシフェラーゼ。
【請求項４】
ｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列、および、ｉｉ）配列番号３６に記載のアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有し、且つ３２２番目のアミノ酸またはそれに対応するアミノ酸がトリプトファンであるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、オオオバボタルに由来するルシフェラーゼ。
【請求項５】
配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼが触媒する発光反応における発光強度と比較して、４倍以上の発光強度を示す発光反応を触媒する請求項２に記載のルシフェラーゼ。
【請求項６】
配列番号３０または３１に記載されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼと比較して、タンパク質分解に対する安定性が高い請求項１に記載のルシフェラーゼ。
【請求項７】
請求項１から６の何れか１項に記載のルシフェラーゼであって、
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の１３番目のアラニンに対応するアミノ酸残基がプロリンであること、
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２１１番目のトレオニンに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであること、
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２２７番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸残基がチロシンであること、
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２４９番目のリジンに対応するアミノ酸残基がメチオニンであること、
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の５３０番目のロイシンに対応するアミノ酸残基がイソロイシンまたはアルギニンであること、および
配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の５４２番目のアラニンに対応するアミノ酸残基がバリンであること
の少なくとも１つを満足するアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
【請求項８】
ｐＨ７．０から８．０の任意のｐＨ環境下において、６１１から６１５ｎｍの最大発光波長を有する発光を示す発光反応を触媒する請求項３に記載のルシフェラーゼ。
【請求項９】
ｐＨ６．８から７．０の任意のｐＨ環境下において、５６８から５７２ｎｍの最大発光波長を有する発光を示す発光反応を触媒する請求項４に記載のルシフェラーゼ。
【請求項１０】
配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼと比較して、５５℃以上の環境下において、より高い発光強度を示す発光反応を触媒する請求項８または９に記載のルシフェラーゼ。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載のルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１２】
前記ルシフェラーゼの遺伝子のコドンが哺乳類における発現に最適化された請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
配列番号３、４、５、３２、３５、３７、３８または３９に記載される塩基配列を含む請求項１１または１２に記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オオオバボタル（Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）に由来するルシフェラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達および遺伝子発現といった細胞の活動を解析するために、蛍光色素および蛍光タンパク質といった蛍光プローブ並びにルシフェリン・ルシフェラーゼ反応を利用する発光プローブが用いられている。特に遺伝子の発現調節の解析には、励起光による細胞のダメージが生じず且つ自家発光の問題が生じない、定量性に優れた発光計測が用いられる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子が導入された細胞を観察する場合、ルシフェラーゼ活性に因る細胞からの発光量を測定することで、ルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さ（具体的には発現量）を調べることができる。発光量の測定は、最初に細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後この細胞溶解液にルシフェリンおよびＡＴＰ等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで定量するという手順で行われる。すなわち、発光量の測定は細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点でのルシフェラーゼ遺伝子の発現量は、細胞全体の平均値として測定される。ルシフェラーゼ遺伝子等の発光遺伝子をレポーター遺伝子として導入する方法として、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等を使用でき、各方法は目的および細胞の種類の違いに応じて使い分けられている。細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子の上流または下流に目的のＤＮＡ断片を繋ぎ、ルシフェラーゼの発現量を分析することで、当該ＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることが可能となる。また、細胞に導入するルシフェラーゼ遺伝子と目的の遺伝子とを共発現させることで、当該遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現に及ぼす影響を調べることが可能となる。
【０００３】
時間経過に沿って発光遺伝子の発現量を分析するには、生きた細胞からの発光量を経時的に測定する必要がある。このような測定は、ルミノメーターを備えたインキュベーターにて細胞を培養し、全細胞集団からの発光量を一定時間ごとに定量することで行われる。これにより、一定の周期性をもった発現リズム等を分析することができ、細胞全体における発光遺伝子の発現量の経時的な変化を捉えることができる。
【０００４】
近年、生物学および医学の研究において、生きた試料を対象とした画像による動的変化の経時的観察の必要性が高まってきている。蛍光観察を利用する研究分野では、試料内のタンパク質分子機能を動的に捉えるために、タイムラプスまたは動画撮像が行われている。従来技術では、蛍光試料を用いた経時的観察（例えば、蛍光分子を付したタンパク質１分子の動画観察）が行われている。
【０００５】
一方、経時的観察のために発光試料を用いる場合、発光試料の発光強度は極めて小さいため、イメージ・インテンシファイアを装着したＣＣＤカメラを用いて観察する必要がある。また最近では、発光試料を観察するための光学系を有した顕微鏡も開発されている（特許文献１および２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３０１５９９号公報
【特許文献２】国際公開第０６／０８８１０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、有用な新規のルシフェラーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態に係るルシフェラーゼは、オオオバボタル（Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）に由来する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、有用な新規のルシフェラーゼが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施形態に係るオオオバボタルルシフェラーゼの各ｐＨにおける発光スペクトルである。
【図２】図２は、各ルシフェラーゼのＫｍ値をプロットした図である。
【図３】図３は、実施形態に係る野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび変異型オオオバボタルルシフェラーゼ並びにＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼの発光強度を比較する図である。
【図４】図４は、実施形態に係るオオオバボタルルシフェラーゼおよびオバボタルルシフェラーゼのタンパク質分解に対する安定性を比較する図である。
【図５】図５は、実施形態に係る野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび変異型（Ｍ２４９Ｋ）オオオバボタルルシフェラーゼ並びにオバボタル由来のルシフェラーゼの発光強度を比較する図である。
【図６】図６は、種々のｐＨ環境下にて、実施形態に係る変異型（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）オオオバボタルルシフェラーゼを酵素として使用した発光反応において得られる発光スペクトルである。
【図７】図７は、種々のｐＨ環境下にて、実施形態に係る変異型（Ｅ３２２Ｗ）オオオバボタルルシフェラーゼを酵素として使用した発光反応において得られる発光スペクトルである。
【図８】図８は、５５℃の環境下においた野生型オオオバボタルルシフェラーゼまたは変異型（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）オオオバボタルルシフェラーゼを発現する大腸菌から生じる発光を観察した画像をモノクロにて示した図である。
【図９】図９は、５５℃の環境下においた野生型オオオバボタルルシフェラーゼまたは変異型（Ｅ３２２Ｗ）オオオバボタルルシフェラーゼを発現する大腸菌から生じる発光を観察した画像をモノクロにて示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一実施形態は、オオオバボタル（Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）に由来するルシフェラーゼに関する。
【００１２】
「ルシフェラーゼ」とは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。現在、ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものおよびバクテリアに由来するものが取得されている。実施形態に係るルシフェラーゼも、上述の通り定義されるルシフェラーゼと同義であるが、後述するホタルから初めて取得された新規のルシフェラーゼである。
【００１３】
実施形態に係るルシフェラーゼは、オオオバボタル（学名：Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）に由来する。オオオバボタルとは、節足動物門・昆虫綱・甲虫目・ホタル科・オバボタル属に属すホタルであり、本州、四国および九州の主に山間部に生息することが確認されている。なお、オオオバボタルの近縁種としてオバボタル（学名：Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ｂｉｐｌａｇｉａｔａ）というホタルが存在しており、これは北海道、本州、四国および九州の主に平野部に生息していることが確認されている。これらのホタルは、地域によって両種が混生することも確認されている。オバボタルと比較して体長が大きいことから「オオ」オバボタルとの和名が付されている。なお、ここにいう「由来する」とは、オオオバボタルが有する野生型のルシフェラーゼに加えて、その変異体をも含むことを意味する。
【００１４】
発光強度が小さい発光試料を顕微鏡により撮像する場合、鮮明な画像を撮影するために必要な露出時間は長くなる。このような発光試料は、使用できる研究用途が制限される。例えば、発光強度の小ささのために３０分間の露出時間が必要となる場合、３０分間隔での経時的撮影は可能であっても、より短い間隔での撮影、さらにはリアルタイムでの撮影は不可能である。また、画像の取得に当って、発光する細胞に焦点を合わせるために複数枚の画像を取得し比較する必要があるが、発光強度の小ささのために長い露出時間を必要とする場合、１枚の画像を取得するだけでも手間と時間を要することになる。
【００１５】
実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して高い発光強度を示し得る。この場合、実施形態に係るルシフェラーゼは、タンパク質のイメージングのためのレポーターとしての利用において有利な効果を奏する。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、少量でも高い発光量を提供できるため、発現量が低いタンパク質の良好な検出を可能とする。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、発光強度が高いことにより検出に必要な露出時間を短縮できる。このため、実施形態に係るルシフェラーゼを経時的観察のためのレポーターとして利用すれば、撮影間隔を短くすることが可能となり、よりリアルタイムに近い観察が可能となる。
【００１６】
実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、オバボタルに由来するルシフェラーゼ（配列番号３０または３１）による発光強度の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上、５倍以上または５．５倍以上の発光強度を示し得る。また、実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（主に北米に生息するホタル）に由来するルシフェラーゼ（配列番号３３）９による発光強度の１．１倍以上、１．５倍、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上または４倍以上の発光強度を示し得る。
【００１７】
実施形態に係るルシフェラーゼは、５００ｎｍから７００ｎｍの間の波長において高い発光強度を示す発光スペクトルを有し得る。特に、５５０ｎｍから６５０ｎｍの間において高い発光強度を示し得る。さらに、実施形態に係るルシフェラーゼの最大発光波長は、周囲の環境のｐＨに応じてシフトし得る。例えば、ｐＨ８．０からｐＨ７．５の環境下において５６４ｎｍ付近の最大発光波長を示し、ｐＨ７．０の環境下において６０５ｎｍ付近の最大発光波長を示し、ｐＨ６．５からｐＨ５．５の環境下において６１４ｎｍ付近の最大発光波長を示す。なお、「最大発光波長」とは、ルシフェラーゼが関与する発光反応において、測定波長範囲内において発光強度が最大となる波長を意味する。
【００１８】
実施形態に係るルシフェラーゼは、既知のルシフェラーゼと比較して高い分解安定性を示し得る。「分解安定性」とは、ルシフェラーゼが使用される環境における、当該ルシフェラーゼの分解の生じにくさを意味する。また、「分解安定性」とは、タンパク質分解酵素による分解に対する安定性のみでなく、タンパク質分解酵素が関与しない分解、例えば熱や機械的刺激に起因した分解等に対する安定性をも含む。ルシフェラーゼが使用される環境とは、溶液中、培養液中、細胞外液中、細胞内等を意味する。特に、培養液、細胞外液および細胞中にはタンパク質分解酵素が多数存在する場合があり、実施形態に係るルシフェラーゼはそのような環境下であっても分解に強い。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、そのような環境下であっても分解されず、高い発光強度を維持できる。実施形態に係るルシフェラーゼは、例えば、オバボタルに由来するルシフェラーゼと比較して、タンパク質分解に対する安定性が高い。
【００１９】
実施形態に係るルシフェラーゼの一例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むルシフェラーゼである。このルシフェラーゼはオオオバボタルから取得されたものであり、何ら変異処理を受けていない。本願では、当該ルシフェラーゼを、野生型オオオバボタルルシフェラーゼと称する。
【００２０】
図１に、この野生型オオオバボタルルシフェラーゼの発光スペクトルを示す。この図から示されるとおり、ｐＨに応じて最大発光波長がシフトする。特に、ｐＨ８の環境下で最も高い強度の発光を示し、このとき最大発光波長は５６４ｎｍ付近である。図２に、この野生型オオオバボタルルシフェラーゼのＡＴＰに関するＫｍ値およびＤ−ルシフェリンに関するＫｍ値を示す。図３および５に、既知のホタルルシフェラーゼとの発光強度の比較を示す。図３の左および中央のグラフの比較から、野生型オオオバボタルルシフェラーゼが、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼと比較して約１．１倍以上の発光強度を示すことがわかる。また、図５の左３つのグラフの比較から、野生型オオオバボタルルシフェラーゼが、オバボタル由来ルシフェラーゼと比較して少なくとも約５．５倍以上の発光強度を示すことがわかる。図４に、この野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび既知のホタルルシフェラーゼの分解安定性を比較した結果を示す。この結果は、各々のルシフェラーゼを大腸菌中に発現させて、そのライセートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することで得られたものである。野生型オオオバボタルルシフェラーゼ（中央のレーン）では７０ｋＤａ付近に一本のバンドが現れている。一方、オバボタル由来ルシフェラーゼ（左および右のレーン）では、同じく７０ｋＤａ付近のバンドが最大サイズのバンドとして現れ、さらにそれよりも小さなバンドが複数現れている。このことは、野生型オオオバボタルルシフェラーゼでは、ほとんど分解が進んでいないのに対し、オバボタル由来ルシフェラーゼでは、分解が進んでいることを意味する。
【００２１】
実施形態に係る野生型オオオバボタルルシフェラーゼ（配列番号１）は、既知のホタルルシフェラーゼとは異なる新規の配列を有する。実施形態に係る野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、文献（Oba Y, Furuhashi M, Inouye S. (2010) Identification of a functional luciferase gene in the non-luminous diurnal firefly, Lucidina biplagiata. Molecular Insect Biology 19(6):737-743.）により報告されているオバボタルのアミノ酸配列（配列番号３０）および本発明者らによってクローニングされたオバボタルのアミノ酸配列（配列番号３１）との間で以下の表１に示されるアミノ酸残基の差異を有する。なお、文献により報告されたオバボタルの配列と本発明者らのクローニングにより示されたオバボタルの配列とは、２４９番目のアミノ酸がそれぞれリジンおよびメチオニンである点で異なっている。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
表１に示される配列の差異に関して、次のように表現することができる。すなわち、実施形態に係るルシフェラーゼは、オバボタル由来ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号３０）との間で相同性検索を行った場合に、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の１３番目のアラニンに対応するアミノ酸残基がプロリンであること、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２１１番目のトレオニンに対応するアミノ酸残基がアスパラギンであること、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２２７番目のフェニルアラニンに対応するアミノ酸残基がチロシンであること、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の２４９番目のリジンに対応するアミノ酸残基がメチオニンであること、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の５３０番目のロイシンに対応するアミノ酸残基がイソロイシンであること、および配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の５４２番目のアラニンに対応するアミノ酸残基がバリンであることの少なくとも１つを満足するアミノ酸配列を有する。なお、この実施形態に係るルシフェラーゼでは、配列番号３０に記載されるアミノ酸配列の１３番目、２１１番目、２２７番目、２４９番目、５３０番目および５４２番目に対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸残基については、特に限定されず、配列番号３０に記載のアミノ酸配列との間で対応するアミノ酸残基が異なってもよい。
【００２４】
実施形態に係るルシフェラーゼは、野生型オオオバボタルルシフェラーゼだけでなく、このルシフェラーゼのアミノ酸配列の一部に変異が生じた変異型オオオバボタルルシフェラーゼを含む。以降、野生型オオオバボタルルシフェラーゼを「野生型ルシフェラーゼ」または「野生型」と記載し、変異型オオオバボタルルシフェラーゼを「変異型ルシフェラーゼ」または「変異型」と記載する場合がある。
【００２５】
そのような変異型オオオバボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼの性質に変化を与えない変異であってよい。例えば、発光反応に対する寄与率の高い配列またはドメインにおいては変化がなく、発光反応に対する寄与率の低い配列またはドメインについて変化が生じる変異であってよい。具体的には、例えば、発光反応にあまり関与しない部位を削る変異、そのような部位に特定の配列を挿入する変異、末端に特定の配列を付加する変異等であってよい。
【００２６】
また、変異型オオオバボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、ルシフェラーゼとしての発光活性以外の性質を変化させる変異であってよい。例えば、実験的な操作性を向上させる変異であってよい。具体的には、例えば、野生型ルシフェラーゼが哺乳細胞内において低い可溶性を示す場合にその可溶性を高める変異であってよい。
【００２７】
さらに、変異型オオオバボタルルシフェラーゼを得るための変異とは、発光反応に関する性質を向上させる変異であってよい。例えば、発光強度を高める変異、最適ｐＨを変更する変異、最適温度を変更する変異、分解安定性を向上させる変異等であってよい。
【００２８】
野生型オオオバボタルルシフェラーゼと比較して発光強度が高まる変異を受けたルシフェラーゼの一例は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する変異型オオオバボタルルシフェラーゼである。この変異型オオオバボタルルシフェラーゼは、図３に示されるように、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓに由来するルシフェラーゼによる発光強度の約４倍以上の発光強度を示し、野生型オオオバボタルルシフェラーゼによる発光強度の約３．６倍以上の発光強度を示す。
【００２９】
変異の別の例は、発光スペクトルの最大発光波長がシフトする変異である。このような変異型オオオバボタルルシフェラーゼを発光反応の酵素として用いた場合、野生型を用いた場合と比較して、最大発光波長がシフトした発光スペクトルが得られる。ｐＨ７．０の環境下において野生型オオオバボタルルシフェラーゼを用いた場合、最大発光波長が６０５ｎｍ付近となる発光が生じるが、このような変異によって、最大発光波長が長波長側または短波長側にシフトする。このような変異を有する変異型ルシフェラーゼにおいて、最大発光波長のシフトは、発光反応におけるｐＨ条件を特定のｐＨにした場合にのみ生じてもよい。例えば、ｐＨ６．５未満の範囲およびｐＨ７．０を超える範囲ではシフトが生じないものの、ｐＨ６．５からｐＨ７．０の範囲においてシフトが生じてよい。この変異型ルシフェラーゼを野生型ルシフェラーゼまたはその他の変異型ルシフェラーゼとともに細胞内に発現させた場合、これらのルシフェラーゼを、最大発光波長の差異に基づいて区別することができる。したがって、マーカーとしてこれらのルシフェラーゼを利用する研究において、最大発光波長がシフトした変異型ルシフェラーゼを使用することで、マーカーの選択肢を増やすことができる。
【００３０】
変異のさらに別の例は、発光強度の温度依存性が変化する変異である。すなわち、特定の温度における発光反応に対する触媒活性が野生型と比較して高くなり、その結果、その温度における発光強度が高くなる変異である。この変異は、特定の温度範囲のみにおいて発光強度が高くなる変異であってよい。例えば、ある温度において野生型と同等または野生型よりも低い発光強度を示すものの、別の温度では野生型よりも高い発光強度を示すようになる変異であってよい。このような変異型の例は、一般的に使用される温度では野生型と同等の活性を示すものの、それよりも高い温度または低い温度では、野生型が活性を下げるのとは対照的に、活性を維持するようなルシフェラーゼである。この変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼを使用できない温度域でも使用できるため、オオオバボタルルシフェラーゼの用途を広げることができる。
【００３１】
上記のような発光強度を高める変異、最大発光波長がシフトする変異および発光強度の温度依存性が変化する変異は、任意の組み合わせで同時に導入することができ、または互いに独立して導入することができる。
【００３２】
実施形態に係る変異型オオオバボタルルシフェラーゼの一例は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。配列番号３４に記載のアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼが有する配列番号１に示されるアミノ酸配列において２９４番目のフェニルアラニン（Ｆ）残基をチロシン（Ｙ）残基に置換し（Ｆ２９４Ｙ）、３２３番目のバリン（Ｖ）残基をロイシン（Ｌ）残基に置換し（Ｖ３２３Ｌ）、および３５４番目のグルタミン酸（Ｅ）残基をバリン（Ｖ）残基に置換した（Ｅ３５４Ｖ）ものである。この変異型ルシフェラーゼをコードする核酸は、例えば、配列番号３５または３８に示される塩基配列を有する核酸である。配列番号３８に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号３に対して、対応するアミノ酸配列上で上述の３つの置換が生じるような変異を入れたものである。配列番号３５に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号３に対して、後述のような哺乳細胞における発現に対するコドン最適化を施し、更に、対応するアミノ酸配列上で上述の３つの置換が生じるような変異を入れたものである。
【００３３】
配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、特定のｐＨにおいて最大発光波長のシフトが生じている。具体的には、この変異型ルシフェラーゼは、ｐＨ７．０から８．０の任意のｐＨ環境下において、６１１から６１５ｎｍの最大発光波長を有する発光を示す発光反応を触媒する。これに対し、野生型ルシフェラーゼを用いて得られる最大発光波長は、後述するように、ｐＨ７．０の環境下で６０５ｎｍ付近、ｐＨ７．５の環境下で５６７ｎｍ付近およびｐＨ８．０の環境下で５６４ｎｍ付近である。したがって、この変異型ルシフェラーゼを用いて得られる発光の最大発光波長を野生型と比較すると、少なくともｐＨ７．０から８．０において長波長側にシフトしている。長い波長を有する光は、生体内での透過性がより優れている。そのため、この変異型ルシフェラーゼを用いることにより、組織、胚および個体を測定の対象とする場合のように、ルシフェリンから光の検出手段までの間に遮蔽物が多く介在する場合であっても、発光強度の低下を抑えて発光を検出することができる。
【００３４】
また、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、発光強度の温度依存性が変化している。具体的には、常温より高い温度において、野生型よりも高い触媒活性を示す。例えば、５５℃において、この変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌において発光反応を生じさせると、野生型ルシフェラーゼの場合よりも高い発光を示す。
【００３５】
実施形態に係る変異型オオオバボタルルシフェラーゼの一例は、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。配列番号３６に記載のアミノ酸配列は、野生型ルシフェラーゼが有する配列番号１に示されるアミノ酸配列において３２２番目のグルタミン酸（Ｅ）残基をトリプトファン（Ｗ）残基に置換した（Ｅ３２２Ｗ）ものである。この変異型ルシフェラーゼをコードする核酸は、例えば、配列番号３７または３９に示される塩基配列を有する核酸である。配列番号３９に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号３に対して、対応するアミノ酸配列上で上述の１つの置換が生じるような変異を入れたものである。配列番号３７に示される塩基配列は、野生型ルシフェラーゼをコードする配列番号３に対して、後述のような哺乳細胞における発現に対するコドン最適化を施し、更に、対応するアミノ酸配列上で上述の１つの置換が生じるような変異を入れたものである。
【００３６】
配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、特定のｐＨ環境下において最大発光波長のシフトが生じている。具体的には、この変異型ルシフェラーゼは、ｐＨ６．８から７．０の任意のｐＨ環境下において、５６８から５７２ｎｍの最大発光波長を有する発光を示す発光反応を触媒する。これに対し、野生型ルシフェラーゼを用いて得られる最大発光波長は、後述するように、Ｈ６．５の環境下で６１２ｎｍ付近およびｐＨ７．０の環境下で６０５ｎｍ付近である。したがって、この変異型ルシフェラーゼを用いて得られる発光の最大発光波長を野生型と比較すると、少なくともｐＨ６．８から７．０において短波長側にシフトしている。
【００３７】
また、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する変異型ルシフェラーゼは、野生型ルシフェラーゼと比較して、発光強度の温度依存性が変化する変異している。具体的には、常温より高い温度において、野生型よりも高い触媒活性を示す。例えば、５５℃において、この変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌において発光反応を生じさせると、野生型ルシフェラーゼの場合よりも高い発光を示す。
【００３８】
配列番号２、配列番号３４および配列番号３６に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する３種の変異型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と、野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との間の差異を、以下の表２にまとめる。なお表２には、既知のオバボタルのアミノ酸配列との間の差異についても示す。
【００３９】
【表２】
0005896679.tif 000003
【００４０】
表２に示されるとおり、上記変異型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は、野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列との間で、５０番目および５３０番目のアミノ酸が異なる。
【００４１】
さらに、実施形態に係るルシフェラーゼには、上述したような野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（配列番号１または２）のアミノ酸配列に変異（例えば、アミノ酸の置換、欠失および／または付加等）が生じたルシフェラーゼが含まれる。このような変異を受けたルシフェラーゼとは、例えば、上述の野生型または変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１または２）の１以上のアミノ酸、好ましくは、１から２０のアミノ酸、１から１５のアミノ酸、１から１０のアミノ酸または１から５のアミノ酸に変異を受けたルシフェラーゼである。あるいは、このような変異を受けたルシフェラーゼとは、好ましくは、上述の野生型または変異型ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１または２）との間で７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有するルシフェラーゼである。特に、このような変異を受けたルシフェラーゼが、発光反応に関して、上述したような野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（配列番号１または２）と同様の性質を示すことが好ましい。
【００４２】
本発明の一実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼをコードする塩基配列を含む核酸に関する。すなわち、当該核酸は、オオオバボタルに由来するルシフェラーゼ遺伝子を含む核酸である。核酸とは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。また、ルシフェラーゼの「遺伝子」とは、主として、ｍＲＮＡに転写される領域、すなわち構造遺伝子を意味する。実施形態に係る核酸がコードするルシフェラーゼは、野生型および変異型のルシフェラーゼを含む。
【００４３】
実施形態に係る核酸の一例は、配列番号３に記載される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、オオオバボタルからクローニングされており、野生型オオオバボタルルシフェラーゼをコードする。また、実施形態に係る核酸の別の例は、配列番号３２に記載される塩基配列を含む核酸である。この配列を有する遺伝子は、オオオバボタルからクローニングされた塩基配列に変異を加えたものであり、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（配列番号２）をコードする。
【００４４】
実施形態に係る核酸は、上述のような塩基配列に対してさらに変異を加えたものであってよい。そのような塩基配列に対する変異には、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異が含まれる。この変異を受けた核酸からは、変異導入前と同じアミノ酸配列を有するルシフェラーゼが発現する。そのようなアミノ酸配列に変化が生じない変異の例は、遺伝子中に存在する特定の制限酵素の認識配列を無効にする変異である。この変異によって、遺伝子を含む核酸は当該制限酵素によって切断されなくなるものの、当該遺伝子は変異前と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードできる。このような変異は、制限酵素の認識配列を構成するコドンを、異なる塩基配列の同義コドンに変換することで達成できる。このような変異は、遺伝子組み換えに使用する制限酵素の認識配列が当該遺伝子中に存在する場合に有用である。この場合、予め遺伝子中の認識配列を無効にしておくことで、制限酵素で処理した場合に遺伝子を含む核酸が断片化することを防ぐことができ、結果として組み換えが容易になる。特定の制限酵素の認識配列を無効にした例は、配列番号４に示される塩基配列である。当該配列は、塩基配列１に示されるオオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列においてＥｃｏＲＩの認識配列を無効にする変異を導入したものである。
【００４５】
また、コードされるアミノ酸配列に変化が生じない変異の別の例は、遺伝子のコドンを特定の生物種における発現に最適化させる変異である。ここにいう「最適化」とは、核酸に含まれる遺伝子のコドンを、特定の生物種においてコドン出現頻度が高いコドンに代えることを意味する。最適化を行った場合、特定の生物種における遺伝子の発現は、最適化をしない場合に比べて高まる。実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子はホタルから取得されたものであるため、当該遺伝子を導入しようとする生物種が分類学的にホタルから遠い程、最適化の効果はより高いと考えられる。特定の生物種とは、例えば細菌細胞、酵母細胞および哺乳細胞である。更に哺乳細胞は、例えばマウスの細胞、サルの細胞およびヒトの細胞である。このようなコドンが最適化された核酸の一例は、配列番号５に示される塩基配列を含む核酸である。当該核酸は、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列が無効にされており、且つ哺乳細胞における発現にコドンが最適化されている。
【００４６】
実施形態に係る核酸は、Ｋｏｚａｋ配列が付与されたルシフェラーゼ遺伝子の塩基配列を含む核酸を含む。Ｋｏｚａｋ配列とは、開始コドンとその前後の複数の塩基配列から成る配列であり、Ｋｏｚａｋ配列が存在することで、その遺伝子の発現量が増大することがわかっている。Ｋｏｚａｋ配列は、生物種または生物群ごとに共通配列が見出されている。実施形態に係るＫｏｚａｋ配列を含む核酸は、それを導入する生物種に対応したＫｏｚａｋ配列を有する。例えば哺乳細胞に導入される場合、核酸は、Ｋｏｚａｋ配列としてｇｃｃｒｃｃａｔｇｇ（ｒはグアニンまたはアデニンを意味する）の配列を含む。Ｋｏｚａｋ配列を付与するルシフェラーゼ遺伝子は、野生型遺伝子であってもよいが、上述のようなコドンの最適化を行った変異型遺伝子であってもよい。
【００４７】
本発明の一実施形態は、上述の核酸を含むベクターを含む。当該ベクターには、ルシフェラーゼをコードする核酸以外に、発現を調節するための配列またはマーカー遺伝子の配列を含む核酸等を含んでよい。
【００４８】
本発明の一実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内の機能を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼを細胞内に導入する工程、および前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。例えば、ＤＮＡ中の特定の発現調節領域の下流に実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子を導入し、ルシフェラーゼの発現を、それによる発光の有無によって検出することで、発現調節領域の機能を調べることが可能である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、実施形態に係るルシフェラーゼを利用して細胞内タンパク質を解析する方法に関する。当該方法は、実施形態に係るルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質とから成る融合タンパク質を細胞内に導入する工程；および、前記ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程を含む。
【００５０】
当該方法は、解析の対象とするタンパク質の細胞内の局在の観察、および、その局在の時間変化の観察（タイムラプス）を含む。また、当該方法は、タンパク質の局在だけでなく、そのタンパク質が単に発現したか否かの確認をも含む。使用される細胞に特別な限定はなく、細胞のイメージングの分野において通常使用できる細胞であってよい。また、解析の対象とするタンパク質も特別に限定はなく、研究の目的に応じたタンパク質を選択することができる。当該タンパク質は、使用する細胞内に本来存在するタンパクであってよく、または細胞内に本来存在しない異種性のまたは改変したタンパク質であってよい。
【００５１】
融合タンパク質を細胞内に導入する場合、既知の導入方法を使用することができる。１つの方法は、細胞外で精製した融合タンパク質を細胞内に直接導入する方法である。例えば、マイクロインジェクション法によって融合タンパク質を細胞内に直接注入することができる。または、融合タンパク質を含む培養液にて細胞をインキュベートさせて、エンドサイトーシスによって融合タンパク質を細胞に取り込ませることができる。また別の方法は、まず融合タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を導入し、その後細胞内で融合タンパク質を発現させる方法である。例えば、当該核酸を含む発現ベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法またはエレクトロポレーション法等によって細胞内に導入し、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることができる。ここにおいて、融合タンパク質の遺伝子は、実施形態に係るルシフェラーゼ遺伝子と解析の対象とするタンパク質の遺伝子とを含む遺伝子であり、ここにおいて、ルシフェラーゼ遺伝子とタンパク質遺伝子とは、それぞれ正常に翻訳されるよう連結されている。
【００５２】
ルシフェラーゼの発光をイメージング装置により検出する工程は、既知の検出方法を使用することができる。例えば、ルシフェラーゼを含む融合タンパク質を発現する細胞に、ルシフェリン、ＡＴＰおよびＭｇ２＋イオン等を適宜与えてルシフェラーゼによる発光反応を生じさせ、発生した発光をイメージング装置により検出することができる。イメージング装置とは、例えば発光を捉えるためのフィルターを備えた顕微鏡である。顕微鏡を使用することで、細胞内における発光の位置を特定して、この情報をもとにタンパク質の局在を特定することが可能となる。また、イメージング装置として、経時的に撮像できる機能を備えた顕微鏡を使用することができ、この顕微鏡によって経時的観察も可能となる。
【実施例】
【００５３】
［実施例１：オオオバボタル由来のルシフェラーゼ遺伝子のクローニング］
１．材料
材料として東京都で採集したオオオバボタル（Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ）の幼虫を用いた。
【００５４】
２．トータルＲＮＡの抽出とｃＤＮＡの合成
ホタルの幼虫からハサミを用いて発光器を切り取った。組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含むチューブであるＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に、採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を入れた。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）またはＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１００Ａ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
【００５５】
次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたｍＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。
【００５６】
３．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側の同定
３−１．ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ）法に用いるプライマーの作製
オオオバボタルのルシフェラーゼ遺伝子のクローニングをＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって行った。このＰＣＲに使用するプライマーは、既知の近縁生物由来のルシフェラーゼ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
【００５７】
ホタルルシフェラーゼにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている１０種類のホタルルシフェラーゼのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物は、ラムフィリス・ノクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ  ｎｏｃｔｉｌｕｃａ）（登録番号ＣＡＡ６１６６８）、ルキオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ）（登録番号Ｐ１３１２９）、ルキオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ）（登録番号Ｑ０１１５８）、ルキオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ  ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）（登録番号Ｑ２６３０４）、ホタリア・パルヴラ（Ｈｏｔａｒｉａ  ｐａｒｖｕｌａ）（登録番号ＡＡＣ３７２５３）、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）（登録番号ＢＡＦ４８３９０）、フォトゥリス・ペンシルヴァニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）（登録番号Ｑ２７７５７）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｍｉｙａｋｏ）（登録番号ＡＡＣ３７２５４）、ピロコエリア・ルファ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｒｕｆａ）（登録番号ＡＡＧ４５４３９）およびラハゴフタルムス・オーバイ（Ｒｈａｇｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ  ｏｈｂａｉ）（登録番号ＢＡＦ３４３６０）である。
【００５８】
その結果、ホタルルシフェラーゼのＣ末端側４４０残基付近に位置するＬ−Ｉ−Ｋ−Ｙ−Ｋ−Ｇ−Ｙ−Ｑ−Ｖ（配列番号６）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。この９つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ  ＰＣＲに用いる１２種類のホタルルシフェラーゼ特異的混合プライマーを設計した。このプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹ、ＲおよびＮは混合塩基を示す）：ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号８）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＴＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号９）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１０）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１１）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＡＣＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１２）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１３）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１４）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＴＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１５）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＡ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＡ  ＡＴ−３’：配列番号１６）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＧ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＧ  ＡＴ−３’：配列番号１７）、ｆｌｅｘＬｕｃ５−ＧＣＴ（５’−ＡＣＹ  ＴＧＲ  ＴＡＮ  ＣＣＹ  ＴＴＧ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴ−３’：配列番号１８）。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
【００５９】
３−２．５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーおよび５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’：配列番号１９）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’：配列番号２０）を用いて５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６０】
一度目のＰＣＲとして、上述の通り作製した１２種類の特異的混合プライマーのいずれかとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｐｒｉｍｅｒとから成る１２通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．２μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％トリス酢酸緩衝液（ＴＡＥ）アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。１２の反応溶液の全てにおいてわずかに遺伝子増幅が認められたため、これらのＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を次の通り実施した。
【００６１】
ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、一度目のＰＣＲで使用した１２種類プライマーのうちの４つとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとから成る４通りのプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．００５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度が１．０μＭの１２種類プライマーの内１つおよび最終濃度が０．３μＭのＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、４５℃３０秒および７２℃９０秒を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせ条件を確認した。
【００６２】
３−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００６３】
約１．４ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’：配列番号２１）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’：配列番号２２）とから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００６４】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。
【００６５】
シークエンシングによって得られた遺伝子配列（配列番号２３）を、配列情報解析ソフトウェア  ＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏの「シークエンス連結」機能を用いて解析した。この配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （以下ＮＣＢＩと略す）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側であると決定した。
【００６６】
４．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
４−１．３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ  ＰＣＲの実験で得られたホタルルシフェラーゼ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いるプライマーおよびＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲに用いるプライマーを作成した。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
【００６７】
４−２．ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲ
上述の通り作成したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルルシフェラーゼの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマー（名称：ＪＰ−Ｏｈｏｂａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ１、配列番号２４）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＡＣ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  Ｇ−３’：配列番号２５）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＣ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’：配列番号２６）を用いて３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効率的にルシフェラーゼ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘ−Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６８】
一度目のＰＣＲとして、５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液を０．４μｌ加えた。なお、ホタル完全長ｃＤＮＡライブラリー溶液の濃度は未定量であった。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。わずかに遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を鋳型としてそれぞれｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応を実施した。
【００６９】
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲとして、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマー（名称：ＪＰ−Ｏｈｏｂａ−Ｆｕｌｌ−Ｆ２、配列番号２７）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとから成るプライマー対を用いてルシフェラーゼ遺伝子の増幅を行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマーを含む２０μｌのＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として１度目のＰＣＲ反応溶液を滅菌水で１０倍希釈した溶液を１．０μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。
【００７０】
４−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００７１】
約２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したプライマーの組み合わせでＰＣＲ（最終容量２０μｌ）を実施し、ゲル抽出の手法を用いて目的とする遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＴＯＰ１０株またはＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  ＰｒｉｍｅｒとＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅとから成るプライマー対を用いた。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマー対を含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃１分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃２分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、２μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００７２】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。
【００７３】
シークエンシングによって完全長ホタルルシフェラーゼ遺伝子を獲得した。この塩基配列（配列番号３）またはアミノ酸（配列番号１）へ翻訳した配列について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルルシフェラーゼの塩基配列と高い相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。以下に、この塩基配列およびアミノ酸配列を記載する。  
塩基配列：
ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTTCTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAAGAAGTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGAGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGAATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA（配列番号３）
アミノ酸配列：
MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL*（配列番号１）
【００７４】
以下、この新規のルシフェラーゼをオオオバボタルルシフェラーゼと称する。
【００７５】
［実施例２：新規ルシフェラーゼの酵素学的なパラメータの測定］
１．新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子のタンパク質発現
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従い以下のように実験を実施した。
【００７６】
１−１．新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の制限酵素認識部位の改変
上述の通り決定した塩基配列によれば、新規ルシフェラーゼ遺伝子はＥｃｏＲＩの制限酵素認識配列を含む。ルシフェラーゼのアミノ酸配列を維持しつつ、これらの塩基配列におけるこれらの認識配列を除去する遺伝子改変を実施した。この処理は、後述するルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターへの導入を容易にするために行った。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。変異導入後の配列は、配列番号４に示される塩基配列である。
【００７７】
１−２．新規ホタルルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマーを作成した。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００７８】
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ認識配列を持たないルシフェラーゼ遺伝子の溶液を０．４μｌ加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。遺伝子増幅が認められたため、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理した。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解した。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行った。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出した。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。これらの操作はマニュアルに従って実施した。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに抽出したＤＮＡを導入した。このベクターＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。
【００７９】
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐＲＳＥＴ−Ｂに導入したルシフェラーゼ遺伝子を増幅した。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’：配列番号２８）およびＴ７  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＴＡ  ＧＴＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＴＧＧ−３’：配列番号２９）のプライマー対を用いて行った。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加えた。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察した。
【００８０】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターｐＲＳＥＴ−Ｂに導入されていることを確認した。
【００８１】
２．発光タンパク質の精製
ＪＭ１０９（ＤＥ３）を含む大腸菌溶液５０μｌにルシフェラーゼ発現ベクター０．５μｌを添加し、氷上で１０分、その後４２℃で１分、最後に氷上で２分インキュベートした。その後、大腸菌溶液５０μｌをＳＯＣ培地２００μｌに加えた。その大腸菌／ＳＯＣ培地混合溶液を３７℃で２０分間振とうしながらインキュベートした。インキュベート後のサンプル１００μｌをＬＢ培地プレート（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む）にストリークし、３７℃で一晩インキュベートした。翌日得られたコロニーをピックアップし、５００ｍｌスケールのＬＢ培地で培養した。培養は３７℃で２４時間、１８℃で２４時間行った。合計４８時間の培養の後、遠心分離で菌体を回収し、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ８．０）に再度懸濁して超音波破砕した。菌体破砕液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）し、沈査を除去して上清を回収した。ベッドボリューム２ｍｌのカラムにＮｉ−Ａｇａｒ懸濁液５００μｌと０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２ｍｌを加え、カラムを平衡化した。回収した上清をカラムに添加し、自然落下させた。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。２５ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液２ｍｌでカラムを洗浄した。洗浄後のカラムに５００ｍＭイミダゾール／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ溶液を２ｍｌ加え、ルシフェラーゼを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルをＶｉｖａｓｐｉｎ６（ザルトリウス）で限界ろ過し、濃縮されたサンプルにグリセリンを添加して、５０％グリセリン溶液とした。保存は−２０℃で行った。
【００８２】
３．発光スペクトルの測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用い、０．１Ｍクエン酸／０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５−８．０）に１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、２ｍＭ  ＡＴＰおよび４ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む溶液に、精製酵素を１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、酵素添加後１５秒経過時点で発光スペクトルを測定した。測定結果を図１に示す。
【００８３】
図１より、取得されたルシフェラーゼは、ｐＨ８．０の環境において５６４ｎｍ付近に最大発光波長を示した。また、ｐＨ７．５において５６７ｎｍ付近、ｐＨ７．０において６０５ｎｍ付近、ｐＨ６．５において６１２ｎｍ付近、ｐＨ６．０において６１４ｎｍ付近およびｐＨ５．５において６１６ｎｍ付近にそれぞれ最大発光波長を示した。
【００８４】
４．速度論的解析
４−１．Ｄ−ルシフェリンおよびＡＴＰの濃度の決定
Ｄ−ルシフェリン溶液中のＤ−ルシフェリン濃度およびＡＴＰ溶液中のＡＴＰ濃度を以下の通りに決定した。
【００８５】
ＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて、Ｄ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定し、この測定結果と以下のε値とから濃度を算出した。  
Ｄ−ルシフェリン：λｍａｘ  ３２８ｎｍ、ε１８２００、ｐＨ５．０
ＡＴＰ：λｍａｘ  ２５９ｎｍ、ε１５４００、ｐＨ７．０。
【００８６】
測定はそれぞれ１０回ずつ行い、吸光度の平均値を濃度算出に用いた。このように濃度を決定したＤ−ルシフェリン溶液およびＡＴＰ溶液を用いて、以下のＫｍ値算出を行った。
【００８７】
４−２．Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値の測定
様々なＤ−ルシフェリン濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、Ｄ−ルシフェリンに対するＫｍ値を決定した。
【００８８】
Ｄ−ルシフェリンを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の８種類のＤールシフェリン溶液を作製した。これらの溶液は、Ｄ−ルシフェリンの終濃度がそれぞれ０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０、４０および８０μＭとなるようにＤ−ルシフェリンを含む。これらのＤ−ルシフェリン溶液を９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、４ｍＭ  ＡＴＰおよび８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定にはＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を使用した。測定は各ルシフェリン濃度について３回ずつ行った。
【００８９】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ルシフェリン濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００９０】
４−３．ＡＴＰに対するＫｍ値の測定
様々なＡＴＰ濃度の環境下において、得られたルシフェラーゼによる発光の強度を測定した。測定結果に基づいて、ＡＴＰに対するＫｍ値を決定した。
【００９１】
ＡＴＰを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に添加して、異なる濃度の８種類のＡＴＰ溶液を作製した。これらの溶液は、ＡＴＰの終濃度がそれぞれ１０、２０、４０、８０、１６０、３２０、４８０および６４０μＭとなるようにＡＴＰを含む。これらのＡＴＰ溶液をそれぞれ９６穴マイクロプレートに５０μｌずつ分注した。各種精製ルシフェラーゼ、１ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液をルミノメーターの標準ポンプに接続し、当該溶液をウェルに５０μｌ添加すると同時に測定を行った。測定は各ＡＴＰ濃度について３回ずつ行った。
【００９２】
得られたフォトンカウント値のピーク強度を初速度Ｖとして、ＡＴＰ濃度Ｓに対してプロットした。このプロットにミカエリス・メンテン型のカーブフィッティングを行い、Ｋｍ値を算出した。カーブフィッティングは非線形の最小二乗法で行い、パラメータの探索にはニュートン法を用いた。
【００９３】
上記のようにして決定されたＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値およびＡＴＰに対するＫｍ値を表３に示す。表３には、同様に測定した既知のルシフェラーゼの各Ｋｍ値も示される。ＧＬ３とはＰ．ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼである。また、ＥＬｕｃ、ＣＢＧおよびＣＢＲとは既知のコメツキムシ由来のルシフェラーゼである。これらの既知のルシフェラーゼは市販のものを使用した。
【００９４】
【表３】
0005896679.tif 000004
【００９５】
さらに、これらの結果について、縦軸をＡＴＰに対するＫｍ値とし、横軸をＤ−ルシフェリンに対するＫｍ値としてプロットした図を図２として示す。
【００９６】
［実施例３：Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼとの間の発光強度の比較］
野生型オオオバボタルルシフェラーゼ、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（Ｎ５０Ｄ、Ｉ５３０Ｒ）およびＰ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ（配列番号３３）をそれぞれＨｅＬａ細胞に発現させ、発光強度を測定して比較した。
【００９７】
野生型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターは次の通りに作製した。すなわち、野生型オオオバボタルルシフェラーゼにおいて、哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子を含む核酸（配列番号５）にＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。以下にこの塩基配列を記載する。  
ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA（配列番号５）
【００９８】
変異型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターは次の通りに作製した。まず、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子を作製した。上記の通り作製したコドン最適化後の野生型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子（配列番号５）に対し、変異用のプライマーを用いて２ヶ所の変異を導入した。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。この変異の導入により、その遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において、５０番目のアミノ酸残基がアスパラギンからアスパラギン酸に変更され（Ｎ５０Ｄ）、５３０番目のアミノ酸残基がイソロイシンからアルギニンに変更される（Ｉ５３０Ｒ）。この変異導入後の変異型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子（配列番号３２）にＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。以下にこの塩基配列を記載する。  
ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGGACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGAGAGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA（配列番号３２）
【００９９】
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ遺伝子を含む発現ベクターは次の通りに作製した。すなわち、既知のＰ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ遺伝子を哺乳細胞における発現に最適化させ、さらにＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。
【０１００】
なお、ｐＦ９Ａベクターは、内部コントロールとしてウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子を含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子の発光強度をウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発光強度との比として算出することが可能である。
【０１０１】
このようにして得られた３種のプラスミドを、２４穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。２４穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を野生型オオオバボタルルシフェラーゼ、変異型オオオバボタルルシフェラーゼおよびＰ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、２５℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、５分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光強度とした。野生型オオオバボタルルシフェラーゼ、変異型オオオバボタルルシフェラーゼおよびＰ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除算した値を計算し、算出されたその値を各ルシフェラーゼの発光強度としてグラフ化した。その結果を図３に示す。
【０１０２】
Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ、野生型オオオバボタルルシフェラーゼおよび変異型オオオバボタルルシフェラーゼは、それぞれ６．６、７．３および２６．５の発光強度を示した。すなわち、野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼによる発光強度の１．１倍以上の発光強度を示した。変異型オオオバボタルルシフェラーゼは、Ｐ．ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼによる発光強度の４倍以上の発光強度を示した。変異型オオオバボタルルシフェラーゼは、野生型オオオバボタルルシフェラーゼによる発光強度の３．６倍以上の発光強度を示した。
【０１０３】
［実施例４：安定性の検討］
野生型オオオバボタルルシフェラーゼの分解に対する安定性を、既知であるオバボタルルシフェラーゼとの間で比較した。
【０１０４】
オバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列は文献（Oba Y, Furuhashi M, Inouye S. (2010) Identification of a functional luciferase gene in the non-luminous diurnal firefly, Lucidina biplagiata. Molecular Insect Biology 19(6):737-743.）に報告されている（配列番号３０：以降、この配列を「文献配列」と称する）。一方、本発明者等は、東京都八王子市で採集したオバボタルの成虫からオバボタルルシフェラーゼをクローニングし、そのアミノ酸配列を特定した（配列番号３１：以降、この配列を「クローニング配列」と称する）。これらのアミノ酸配列を比較したところ、２４９番目のアミノ酸が、文献配列ではリジンであったのに対し、クローニング配列ではメチオニンであった。以下にこの塩基配列を記載する。  
MEEDKNILRGPAAFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELTHTSVCVRFSHCRDPVFGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKEVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILVKAKKTKSKL*（配列番号３１）
【０１０５】
これらのオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列と、野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列とを比較したところ、以下の表４に示されるような差異があった。オバボタルルシフェラーゼの文献配列（配列番号３０）と野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１）とを比較すると、６残基のアミノ酸が異なっており、９８．９％の相同性であった。
【０１０６】
【表４】
0005896679.tif 000005
【０１０７】
これら３種の遺伝子を発現ベクターに導入し、大腸菌に発現させた。発現の方法は、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス（ストラタジーン社）を用い、それに適した培養を行った以外は実施例２と同様に行った。
【０１０８】
それぞれの遺伝子が発現した大腸菌からライセートを作製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。そのゲルを染色した結果を図４に示す。３種全てのタンパク質において、最大サイズのバンドとして７０ｋＤa付近に一本のバンドを確認できた。野生型オオオバボタルルシフェラーゼ（中央のレーン）では、それ以外のバンドを確認できなかった。一方、オバボタルルシフェラーゼ（左および右のレーン）では、７０ｋＤaよりも小さなバンドを複数確認できた。特に、文献配列のオバボタルルシフェラーゼ（左レーン）では、７０ｋＤaよりも小さい領域において、ゲルがスメア状に染色された。
【０１０９】
図４の結果は、野生型オオオバボタルルシフェラーゼの分解はほとんど生じていないのに対し、オバボタルルシフェラーゼの分解がかなり進んでいることを意味する。すなわち、野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、オバボタルルシフェラーゼと比較してタンパク質分解に対する安定性が高いことがわかった。
【０１１０】
［実施例５：オバボタルルシフェラーゼとの間の発光強度の比較］
野生型オオオバボタルルシフェラーゼ（配列番号１）の発光強度を、文献配列を有するオバボタルルシフェラーゼ（配列番号３０）およびクローニング配列を有するオバボタルルシフェラーゼ（配列番号３１）との間で比較した。さらに、文献配列とクローニング配列との間の違いに着目し、野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の２４９番目のアミノ酸残基をメチオニンからリジンに変更することで、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（Ｍ２４９Ｋ）を作製し、それを発光強度の測定に用いた。
【０１１１】
４種類のルシフェラーゼにおいて、哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子を含む核酸にＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入した。ｐＦ９Ａベクターは内部コントロールとしてウミシイタケ由来ルシフェラーゼ遺伝子をベクター配列に含んでおり、マルチクローニングサイトに挿入された発光遺伝子の発光強度をウミシイタケ由来ルシフェラーゼの発光強度との比として算出することが可能である。
【０１１２】
このようにして得られた４種類のルシフェラーゼのプラスミドを、４８穴のプレートに播種したＨｅＬａ細胞にそれぞれリポフェクション法で遺伝子導入し、２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄した。４８穴プレートの各ウェルに２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒ（ＡＴＴＯ）を用いて９０分間発光強度を測定した。９０分経過時点の発光強度を各ルシフェラーゼの発光強度とした。各ウェル内の培養液を除去した後、ＰＢＳで各ウェルを３回洗浄した。次に各ウェルに１０μＭセレンテラジン／ＣＯ２  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを５００μｌずつ添加し、３７℃、各ウェルあたり１秒間測定の条件でＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓｏｒを用いて３０分間発光強度を測定した。セレンテラジン添加後、５分経過時点の発光強度を内部コントロールであるウミシイタケルシフェラーゼの発光強度とした。各ルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除算した値を算出し、各ルシフェラーゼの発光強度とした。その結果を以下の表５および図５にまとめる。なお、各ルシフェラーゼにおいて複数の測定を同時に行い、発光強度の値は平均値として算出した。
【０１１３】
【表５】
0005896679.tif 000006
【０１１４】
野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、クローニング配列を有するオバボタルルシフェラーゼの発光強度の５．５倍以上の発光強度を示した。また、野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、文献配列を有するオバボタルルシフェラーゼの発光強度の２９倍以上の発光強度を示した。このことから、野生型オオオバボタルルシフェラーゼは、既知のオオバボタルルシフェラーゼと比較して、非常に高い発光強度を示すことがわかった。
【０１１５】
また、アミノ酸配列の２４９番目のアミノ酸残基の違いに着目すると、野生型オオオバボタルルシフェラーゼ（２４９番目はメチオニン）は、Ｍ２４９Ｋ変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（２４９番目はリジン）の発光強度の３４．８倍以上の発光強度を示した。さらに、クローニング配列を有するオバボタルルシフェラーゼ（２４９番目はメチオニン）は、文献配列を有するオバボタルルシフェラーゼ（２４９番目はリジン）の発光強度の５．２５倍以上の発光強度を示した。このことから、アミノ酸配列において２４９番目のメチオニン残基がルシフェラーゼの発光活性に重要であることが示唆された。
【０１１６】
［実施例６：最大発光波長がシフトした変異型の取得］
野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の２９４番目のフェニルアラニン（Ｆ）残基をチロシン（Ｙ）残基に置換し（Ｆ２９４Ｙ）、３２３番目のバリン（Ｖ）残基をロイシン（Ｌ）残基に置換し（Ｖ３２３Ｌ）、および３５４番目のグルタミン酸（Ｅ）残基をバリン（Ｖ）残基に置換（Ｅ３５４Ｖ）することで、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）を作製した。
【０１１７】
また、野生型オオオバボタルルシフェラーゼのアミノ酸配列の３２２番目のグルタミン酸（Ｅ）残基をトリプトファン（Ｗ）残基に置換（Ｅ３２２Ｗ）することで、変異型オオオバボタルルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）を作製した。
【０１１８】
具体的には、野生型オオオバボタルルシフェラーゼ遺伝子に対し、変異用のプライマーを適宜用いて変異を導入することで、２種の変異型ルシフェラーゼの遺伝子を取得した。遺伝子変異の導入は、多比良和誠編「遺伝子の機能阻害実験法―簡単で確実な遺伝子機能解析から遺伝子治療への応用まで」（羊土社、２００１年発行、ｐ．１７−２５）に示される方法に従った。
【０１１９】
作製した変異型ルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）のアミノ酸配列は、
MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSYFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKELGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPVGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL（配列番号３４）
であり、
作製した変異型ルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）遺伝子の塩基配列は、
ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTACTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAAGAACTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGTGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGGATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA（配列番号：３８）
である。
さらに、哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子を含む変異型ルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）遺伝子を作製した。その塩基配列は、
ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTaCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAGAAcTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGtGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA（配列番号３５）
である。
【０１２０】
また、作製した変異型ルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）のアミノ酸配列は、
MEEDKNILRGPAPFYPLEDGTAGEQLHRAMKRYALIPGTIAFTDAHAGVNITYSEYFEMACRLAESLKRYGLGLQHRIVVCSENSLQFFMPVVGALFIGVGVAPANDIYNERELLNSMTISQPTLVFCSRKGLQKILNVQKKLPVIQKIIILDTKEDYMGFQSMYSFVDSQLPVGFNEYDYVPDSFDRDQATALIMNSSGSTGLPKGVELNHTSVCVRFSHCRDPVYGNQIIPDTAILSVIPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLAKWVGEAVAKRFNLRGIRQGYGLTETTSAVIITPEGDDKPGAVGKVVPFFSAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCLKGPMIMKGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDISYWDEDGHFFIVDRLKSLIKYKGYQVPPAELESILLQHPFIFDAGVAGIPDDEAGELPAAVVVLEEGKTMTEKEIMDYVAGQVTTAKRLRGGVVFVDEVPKGLTGKIDARKIREILVKVKKTKSKL（配列番号３６）
であり、
作製した変異型ルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）遺伝子の塩基配列は、
ATGGAAGAGGATAAAAATATTCTGCGCGGCCCAGCGCCATTCTATCCTTTAGAAGATGGAACTGCAGGCGAACAATTACATAGAGCGATGAAAAGATATGCCTTAATTCCAGGAACCATCGCTTTCACGGACGCTCATGCGGGAGTAAATATCACGTACTCCGAATATTTCGAAATGGCATGCCGATTAGCTGAAAGTTTGAAAAGATACGGACTTGGATTACAGCACAGAATTGTTGTGTGTAGTGAAAATTCTCTACAATTTTTTATGCCCGTCGTGGGTGCCCTATTTATTGGAGTGGGGGTCGCACCAGCAAATGATATTTATAACGAGCGTGAATTACTCAATAGCATGACCATATCGCAGCCCACCTTAGTCTTCTGCTCCAGAAAAGGATTGCAAAAAATTTTGAACGTACAGAAAAAATTACCAGTAATTCAAAAAATTATTATTCTGGATACTAAAGAGGATTATATGGGATTTCAGTCAATGTACTCATTTGTTGACTCGCAATTACCAGTAGGTTTCAACGAATATGATTATGTACCGGACTCCTTCGACCGCGATCAAGCAACGGCACTTATAATGAACTCCTCTGGATCTACTGGGTTGCCGAAAGGGGTGGAGCTTAACCACACGAGTGTTTGTGTCAGATTTTCGCATTGCAGAGATCCTGTTTATGGGAATCAAATTATTCCCGATACTGCAATTTTAAGTGTTATCCCATTCCATCATGGATTTGGGATGTTTACAACGCTAGGATATTTAATATGTGGATTTCGAGTTGTGCTGATGTATAGATTTGAAGAAGAACTATTTTTGCGATCCCTTCAAGATTATAAAATTCAGAGTGCGTTACTAGTACCCACCCTATTTTCGTTCTTTGCGAAAAGCACTCTAATTGACAAGTACGATTTATCCAATTTACATGAAATTGCGTCTGGTGGTGCTCCCCTCGCAAAATGGGTTGGAGAAGCAGTGGCAAAACGCTTTAACCTTCGAGGTATACGGCAAGGGTACGGCTTGACCGAAACTACATCGGCCGTTATTATTACACCTGAGGGAGATGATAAGCCAGGTGCAGTCGGTAAGGTTGTACCCTTCTTTTCGGCAAAAGTTGTTGATCTCGACACCGGGAAAACTTTGGGAGTTAATCAAAGGGGCGAATTGTGTCTGAAAGGCCCCATGATTATGAAAGGTTATGTAAATAACCCTGAAGCTACAAATGCCTTGATCGATAAAGATGGATGGCTACACTCTGGTGATATATCATACTGGGACGAAGACGGTCACTTCTTCATTGTTGATCGCTTGAAATCTTTGATTAAATATAAAGGGTACCAGGTACCGCCCGCTGAATTGGAATCCATTTTGCTGCAACATCCCTTTATCTTCGATGCAGGGGTGGCTGGGATTCCCGACGATGAAGCCGGTGAATTGCCCGCTGCCGTTGTTGTTTTAGAGGAAGGAAAAACTATGACTGAAAAAGAAATCATGGATTATGTGGCAGGTCAGGTAACTACAGCAAAACGGCTACGTGGAGGTGTCGTATTCGTCGATGAAGTGCCGAAGGGTCTCACTGGGAAAATCGATGCACGAAAAATTAGAGAAATACTTGTGAAAGTAAAGAAAACCAAATCAAAATTGTAA（配列番号：３９）
である。
さらに、哺乳細胞での発現に最適化した遺伝子を含む変異型ルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）遺伝子を作製した。その塩基配列は、
ATGGAAGAGGACAAGAACATCCTGAGAGGCCCTGCCCCATTCTACCCCCTGGAAGATGGCACAGCCGGCGAGCAGCTGCACCGGGCCATGAAGAGATACGCCCTGATCCCCGGCACAATCGCCTTCACAGACGCCCACGCCGGAGTGAACATCACCTACAGCGAGTACTTCGAGATGGCCTGTAGACTGGCCGAGAGCCTGAAGAGATATGGCCTGGGACTGCAGCATCGGATCGTGGTCTGCAGCGAGAACAGCCTGCAGTTCTTCATGCCCGTGGTCGGAGCCCTGTTCATCGGAGTGGGCGTGGCCCCTGCCAACGACATCTACAACGAGCGCGAGCTGCTGAACAGCATGACCATCAGCCAGCCCACCCTGGTGTTCTGCAGCCGGAAGGGCCTGCAGAAAATCCTGAACGTGCAGAAAAAGCTGCCCGTGATCCAGAAGATCATCATCCTGGACACCAAAGAGGACTACATGGGCTTCCAGAGCATGTACAGCTTCGTGGACAGCCAGCTGCCTGTGGGCTTCAACGAGTACGACTACGTGCCCGACAGCTTCGACCGGGATCAGGCCACCGCCCTGATCATGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCTGCCCAAGGGCGTGGAACTGAACCACACCAGCGTGTGCGTGCGGTTCAGCCACTGCAGGGACCCCGTGTACGGCAACCAGATCATCCCCGACACCGCCATCCTGAGCGTGATCCCTTTCCACCACGGCTTCGGCATGTTCACCACCCTGGGCTACCTGATCTGCGGCTTCCGGGTGGTGCTGATGTACAGATTCGAGGAAGAACTGTTCCTGCGGAGCCTGCAGGACTACAAGATCCAGAGCGCCCTGCTGGTGCCTACCCTGTTCAGCTTCTTCGCCAAGAGCACACTGATCGATAAGTACGACCTGAGCAACCTGCACGAGATCGCCAGCGGCGGAGCCCCCCTGGCCAAAtggGTGGGAGAGGCCGTCGCCAAGCGGTTCAACCTGCGGGGCATCAGACAGGGCTACGGCCTGACCGAGACAACCAGCGCCGTGATCATCACCCCCGAGGGCGACGATAAGCCTGGCGCCGTGGGCAAGGTGGTGCCATTCTTCAGCGCCAAGGTGGTGGACCTGGACACCGGCAAGACCCTGGGCGTGAACCAGAGGGGCGAGCTGTGCCTGAAGGGCCCCATGATCATGAAGGGCTACGTGAACAACCCCGAGGCCACCAATGCCCTGATCGACAAGGACGGCTGGCTGCACAGCGGCGACATCAGCTACTGGGACGAGGACGGCCACTTCTTCATCGTGGACCGGCTGAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGCCCCCTGCCGAGCTGGAATCCATCCTGCTGCAGCACCCCTTCATCTTCGATGCCGGCGTGGCCGGAATCCCCGATGATGAAGCCGGCGAACTGCCTGCCGCCGTGGTGGTGCTGGAAGAGGGAAAGACCATGACCGAGAAAGAAATCATGGACTACGTGGCCGGACAGGTCACAACCGCCAAGAGACTGAGAGGCGGCGTGGTGTTCGTGGACGAGGTGCCAAAGGGACTGACCGGCAAGATCGACGCCCGGAAGATCCGCGAGATCCTGGTGAAAGTGAAAAAGACCAAGAGCAAGCTGTGA（配列番号３７）
である。
【０１２１】
その後、実施例２に記載の方法と同様に、作製した遺伝子（配列番号３８および３９）をそれぞれｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、変異型ルシフェラーゼを発現させ、大腸菌から変異型ルシフェラーゼを精製した。さらに、実施例２に記載の方法と同様に、種々のｐＨ環境下で、変異型ルシフェラーゼが触媒する発光反応によって生じる発光のスペクトルを測定した。
【０１２２】
図６に、種々のｐＨ環境下において、変異型ルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）を酵素として使用した発光反応によって得られる発光スペクトルを示す。各スペクトルの最大発光波長は、ｐＨの記載に続く括弧の中に記載される。図６から、この変異型ルシフェラーゼでは、ｐＨ７．４の環境下において、最も強度の高い最大発光波長が得られ、その波長は６１５ｎｍ付近であることがわかる。また、ｐＨの違いによる最大発光波長の変化は、図１に示される野生型の場合と比較して小さいことがわかる。さらに、図１に示される野生型の場合と比較すると、特にｐＨ７．０以上のスペクトルにおいて、最大発光波長の長波長側へのシフトが顕著であることがわかる。
【０１２３】
図７に、種々のｐＨ環境下において、変異型ルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）を酵素として使用した発光反応において得られる発光スペクトルを示す。各スペクトルの最大発光波長は、ｐＨの記載に続く括弧の中に記載される。図７から、この変異型ルシフェラーゼでは、ｐＨ８．０の環境下において、最も強度の高い最大発光波長が得られ、その波長は５５７ｎｍ付近であることがわかる。また、ｐＨ６．８、ｐＨ６．６およびｐＨ６．４の環境下にて得られた発光スペクトルは、２つのピークが重なったような形を有していることがわかる。そして、ｐＨが下がるほど、最大発光波長は長波長側にシフトしていることがわかる。さらに、図１に示される野生型の場合と比較すると、特にｐＨ６．８およびｐＨ７．０のスペクトルにおいて、最大発光波長の短波長側へのシフトが顕著であることがわかる。
【０１２４】
［実施例７：発光強度の温度依存性の検討］
実施例６にて取得された２つの変異型ルシフェラーゼについて、発光強度の温度依存性を検討した。
【０１２５】
野生型オオオバボタルルシフェラーゼの遺伝子および実施例６にて取得した２種の変異型の遺伝子をそれぞれｐＲＳＥＴ−Ｂベクターに導入し、大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。得られたコロニーを培養し、ＬＢ寒天培地に塗布し、２４時間かけて再度コロニーを形成させた。そして、５５℃で１時間熱処理し、１時間室温で放置した後に、０．５ｍＭのＤ−ルシフェリンを含む液体を噴霧した後、ＣＣＤカメラ（ＤＰ７０、オリンパス製）で１分間撮影した。
【０１２６】
図８には、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼ（Ｆ２９４Ｙ、Ｖ３２３ＬおよびＥ３５４Ｖ）との比較を示す。但し、この図に含まれる画像は、カラーにて取得された画像をモノクロに変換したものである。図中、「赤色変異型」と記された画像が、この変異型ルシフェラーゼの画像である。図８から、５５℃において、この変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌において生じる発光反応は、野生型ルシフェラーゼの場合よりも高い発光を示すことがわかる。すなわち、この変異型ルシフェラーゼは、５５℃においても触媒活性を保持している。なお、カラーにて取得された画像によると、野生型ルシフェラーゼを発現する大腸菌は橙色がかった黄色に発光しているのに対し、変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌は赤色に発光していることがわかる。
【０１２７】
図９には、野生型ルシフェラーゼと変異型ルシフェラーゼ（Ｅ３２２Ｗ）との比較を示す。但し、この図に含まれる画像は、カラーにて取得された画像をモノクロに変換したものである。図中、「緑色変異型」と記された画像が、この変異型ルシフェラーゼの画像である。図８から、５５℃において、この変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌において生じる発光反応は、野生型ルシフェラーゼの場合よりも高い発光を示すことがわかる。すなわち、この変異型ルシフェラーゼは、５５℃においても触媒活性を保持している。なお、カラーにて取得された画像によると、野生型ルシフェラーゼを発現する大腸菌は橙色がかった黄色に発光しているのに対し、変異型ルシフェラーゼを発現する大腸菌は黄緑色に発光していることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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