(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に共有結合したポリマーコーティングを含む表面を有する基材であって、該ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化２７】
0005859172.tif 000038
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
に由来するポリマーを含み、
ここで、該ポリマーコーティングは、該表面に結合している一連の官能基に共有結合しており、該官能基が、アクリルアミド、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミド、およびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される、基材。
【請求項２】
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）に由来する前記ポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化２８】
0005859172.tif 000039
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、請求項１に記載の基材。
【請求項３】
前記表面にポリマーコート領域と不活性領域の両方が含まれている、請求項１〜２のいずれか１項に記載の基材。
【請求項４】
前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択される、請求項３に記載の基材。
【請求項５】
前記不活性領域がガラスを含む、請求項３または４に記載の基材。
【請求項６】
前記基材の表面に開口ウェルを備える、請求項１〜５のいずれか１項に記載の基材。
【請求項７】
前記基材は、ビーズである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の基材。
【請求項８】
基材の表面に固定化されたポリマーコーティングの調製方法であって、該方法は、ポリマーを基材の表面と接触させることにより該表面上のポリマーコーティングの層を形成することを含み、ここで、該表面は複数の官能基を備えており、該ポリマーコーティングは該表面上の該官能基に共有結合され、
該ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化３２】
0005859172.tif 000040
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含み、
ここで、該ポリマーコーティングが、該表面に結合している一連の官能基に共有結合しており、前記官能基が、アクリルアミド、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミド、およびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される、方法。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化３３】
0005859172.tif 000041
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基材の表面上のナイトレン官能基が光活性化性アジドから生成される、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基材の表面上のナイトレン官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジドから生成される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記フェニルアジドが、前記基材の表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーを前記基材の表面と接触させる前にフェニルアジドを光活性化させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーコーティングが前記官能基に光活性化によって共有結合される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記基材の表面上の官能基がアルキン基を含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーコーティングを前記官能基に銅触媒の存在下で共有結合させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記基材の表面上の官能基がアルケンまたはアクリルアミド基を含む、請求項８〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記アクリルアミド基が、該アミン官能化表面を、活性型アクリル酸エステルまたは塩化アクリルから選択されるアクリロイル基と反応させることにより調製される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミン官能化表面が、前記表面を３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で処理することにより調製される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記活性型アクリル酸エステルがアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数の官能基が前記基材の表面上に、前記ポリマーの層で前記表面をコーティングした後に複数のポリマーコート領域と複数の不活性領域が形成されるように配列される、請求項８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記不活性領域がガラスを含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のポリマーコート領域と前記複数の不活性領域が該表面上に、パターンが形成されるように配列される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記基材がビーズである、請求項８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ビーズのアレイの調製方法であって：
該方法は、
１個または１個より多くのビーズの表面上に複数の官能基を形成すること；および
ポリマーコーティングを該ビーズと接触させ、ポリマーコーティング層を該ビーズの表面上に形成すること
を含み、
ここで、該ポリマーコーティングは該ビーズの表面上の該官能基に共有結合され、
該ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化３５】
0005859172.tif 000042
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含み、
ここで、該ポリマーコーティングが、該ビーズに結合している一連の官能基に共有結合しており、該官能基が、アクリルアミド、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミド、およびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化３６】
0005859172.tif 000043
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ビーズの表面上の官能基がアルケンまたはアクリルアミドを含む、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アルケンまたはアクリルアミド基が、前記ビーズの表面を官能化シランと直接接触させることにより調製される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前処理したビーズを、前記ポリマーコーティングと接触させる前に重合抑制剤を含む溶液に曝露する、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ビーズの表面上のナイトレン官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジド基から生成される、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記フェニルアジドが、前記ビーズの表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリマーコーティングが前記ビーズの表面上の官能基に光活性化によって共有結合される、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリマーコーティングが前記ビーズの表面上の官能基に高温で共有結合される、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ビーズの表面上の官能基がアルキン基を含む、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリマーコーティングを前記官能基に銅触媒の存在下で共有結合させる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、ポリマーコートされたビーズを前記基材の表面に固着させることを含む、請求項２６〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２０１２年６月８日に出願された米国特許出願第６１／６５７，５０８号明細書、２０１３年１月１７日に出願された米国特許出願第６１／７５３，８３３号明細書および２０１３年３月４日に出願された米国特許出願第１３／７８４，３６８号明細書の利益を主張し、これらのすべてが本明細書により参考としてその全体が組み込まれる。
【０００２】
（分野）
一般に、本発明は化学、生物学および材料科学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、核酸およびタンパク質などの分子の検出および／または解析に使用される、基材の表面に共有結合させたポリマーコーティングに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ポリマーコート基材は多くの技術的用途に使用されている。例えば、埋め込み型医療用デバイスは、生物学的に不活性なポリマーでコートされ得る。別の例では、ポリマーコート基材は、生物学的分子の調製および／または解析に使用される。分子解析、例えば特定の核酸の配列決定法は、基材のポリマーコート表面への核酸鎖の結合に依存している。次いで、結合された核酸鎖の配列が、当該技術分野でよく知られた多くの異なる方法によって決定され得る。
【０００４】
特定の合成時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プロセスでは、フローセルの１つまたは１つより多くの表面を、核酸が結合するポリマーでコートする。フローセルをコートするために使用されている現行の手順は、重合性ミックスをフローセル上のチャネル内に移し、一定時間インキュベートすることを伴うものである。この手順は単純であり、ブリッジ増幅および配列決定を含む下流のすべての化学的加工処理工程が一貫して補助され得る信頼性のあるコーティングが得られる。
【０００５】
しかしながら、現在使用されている表面ポリマーコーティングの多くには、いくつかの制限がある。例えば、（ｉ）一部の現行のアプローチでは、空気感受性のポリマーミックスが必要とされるため、表面をコートするために使用できる方法が制限される；（ｉｉ）形成される一部のコーティングは、「湿性」状態、例えば水溶液で保存しなければならない；および（ｉｉｉ）グラフト化条件は、多くの場合、強度勾配を回避するために最適化する必要がある。
【０００６】
また、一定の間隔をあけて規定の特徴を有するパターン形成されたフローセルが創出される必要性も存在している。パターン形成されたフローセルを創出する方法の一例は、ビーズを化学修飾し、次いで、ビーズを、事前にアレイ状にした表面に適用することであり、該表面は、該ビーズを収容できる開口ウェルを含む。ビーズは、ウェル内に負荷する前に、クラスター成長ベース配列決定が補助され得るポリマーでコートされ得る。平坦なアレイ表面に有用なポリマーコーティングは、コーティングによって引き起こされる凝集およびコーティング後、水性バッファー中にビーズを保存するという要件のため、ビーズのコーティングが簡便でない場合があり得る。このため商業的用途において、一部、制限が生じている。したがって、ビーズをコートするために使用される場合の現在のポリマーコーティングの不都合点の１つまたは１つより多くが解消される新たなポリマーコーティングの必要性が存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態は、改善されたポリマーコーティングを含む１つまたは１つより多くの表面を有する基材に関するものである。一部の実施形態では、基材がフローセルであり、ポリマーコーティングが該フローセルの１つまたは１つより多くのレーンの１つまたは１つより多くの表面に適用される。
【０００８】
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態は、表面を含む基材であって、ポリマーコーティングが該表面に共有結合している基材に関するものである。本明細書に記載の組成物の他の実施形態は、官能化表面を含む基材であって、ポリマーコーティングが該表面上の一連の官能基に共有結合しており、該官能基が、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミドおよびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される基材に関する。さらに他の実施形態により、式（Ｉ）および（ＩＩ）の反復単位を含むポリマーコーティングを有する表面を含む基材を提供する。特定の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもある。他の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉｂ）で表されるものでもある。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーを含む。一実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩａ）のポリマーを含む。一実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩｂ）のポリマーを含む。別の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＶ）のポリマーを含む。
【０００９】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態は、基材の表面に固定化されたポリマーコーティングの調製に関するものである。一部の実施形態では、該方法は、ポリマーを基材の表面と接触させ、ここで、該表面は複数の官能基を備えており、それにより該表面上にポリマーコーティングの層を形成することを含む。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが基材の表面上の官能基に共有結合される。一部の実施形態では、該ポリマーは、重合性物質を基材の表面上で重合させることにより、該基材の表面上にインサイチューで形成される。他の一部の実施形態では、基材の表面と接触させる前にポリマーを予備形成させる。特定の実施形態では、該官能基がアルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミド、およびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される。特定の実施形態では、基材の表面上の官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジド基を含む。他の実施形態では、基材の表面上の官能基がアルキン基を含む。さらに他の実施形態では、基材の表面上の官能基がアルケン基を含む。特定の実施形態では、ポリマーコーティングが式（Ｉ）および（ＩＩ）の反復単位を含む。特定の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもある。特定の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉｂ）で表されるものでもある。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーを含む。一実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩａ）のポリマーを含む。一実施形態では、式（ＩＩＩ’）のポリマーが式（ＩＩＩｂ）で表されるものでもある。別の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＶ）のポリマーを含む。一部の実施形態では、該表面の官能基に共有結合させる前に、ポリマーコーティングを水溶液に溶解させる。
【００１０】
本明細書に記載の方法の他の実施形態は、ポリヌクレオチドのアレイの調製に関する。かかる実施形態では、該方法は、複数のオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載のいずれかの組成物のポリマーコーティングまたは本明細書に記載のいずれかの方法によって調製されるポリマーコーティング内に存在する反応性部位と反応させる工程；該ポリマーコーティングに結合された該複数のオリゴヌクレオチドを、増幅対象の鋳型と接触させる工程、該鋳型の各々は、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む；および該鋳型を該オリゴヌクレオチドを用いて増幅させ、それによりポリヌクレオチドのクラスター化アレイを作製する工程を含み得る。一部の実施形態では、２種類のプライマーが使用され得、その一方または両方がポリマーコーティングに結合され得る。例えば、該方法は、複数の第１のオリゴヌクレオチドを本明細書に記載のいずれかの組成物のポリマーコーティングまたは本明細書に記載のいずれかの方法によって調製されるポリマーコーティング内に存在する反応性部位と反応させる工程；該ポリマーコーティングに結合された該複数の第１のオリゴヌクレオチドを、増幅対象の鋳型と接触させる工程、該鋳型の各々は、３’末端に、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列および５’末端に、その相補鎖が第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む；ならびに該鋳型を、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させ、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは任意選択で該ポリマーコーティングに結合されたものであり、それによりポリヌクレオチドのクラスター化アレイを作製する工程を含み得る。かかる方法の一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアジド基と反応するアルキン基を含む。かかる方法の他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティング内に存在する塩化シアヌルと反応するアミン基を含む。かかる方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの活性型アミン基（ヒドラジニルまたはヒドラゾニル基など）と反応するアルデヒド基を含む。かかる方法のまた他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのチオシアネートまたはカルボン酸基と反応するアミン基を含む。かかる方法のさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのグリシジル基と反応するアミン基を含む。かかる方法のなおさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアミン基とジ−アルデヒドリンカーによって反応するアミン基を含む。かかる方法のまた他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティング内に存在する活性型エステルまたはエポキシ基と反応するアミン基を含む。かかる方法のまた他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティング内に存在するオキソ−アミン基と反応するアルデヒド基を含む。かかる方法の一部の実施形態では、複数の第１のオリゴヌクレオチドと複数の第２のオリゴヌクレオチドと反応させる前に、ポリマーコーティングを水または水性バッファーで洗浄する。一実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ）のポリマーを含む。別の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ’）のポリマーを含む。
【００１１】
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態は、本明細書に記載の基材組成物のいずれか１つを備えたフローセルに関する。一部のかかる実施形態は、さらに、基材の表面にポリマーコーティングによって結合されたポリヌクレオチドを備える。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはポリヌクレオチドクラスターで存在している。一部のかかる実施形態では、単一のポリヌクレオチドクラスター内のポリヌクレオチドが同じヌクレオチド配列を有する。クラスター内の個々のポリヌクレオチドは、ポリマーコーティングの一端または両端に結合されたものであり得る。結合（単数または複数）は、ポリヌクレオチド鎖の５’および／または３’末端によるものであり得る。異なるポリヌクレオチドクラスターのポリヌクレオチドは一般的には異なるヌクレオチド配列を有するが、これはすべての実施形態で必要なことではない。
【００１２】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定に関する。一部のかかる実施形態は、（ａ）ポリヌクレオチドポリメラーゼを、本明細書に記載のいずれか１種類の組成物の表面にポリマーコーティングによって結合されたポリヌクレオチドクラスターと接触させる工程；（ｂ）基材の表面にヌクレオチドを、該ヌクレオチドの１個または１個より多くが該ポリヌクレオチドポリメラーゼによって利用されると検出可能なシグナルが発生するように備える工程；（ｃ）１つまたは１つより多くのポリヌクレオチドクラスターにおいてシグナルを検出する工程；ならびに（ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）を反復し、それにより、該１つまたは１つより多くのポリヌクレオチドクラスターに存在するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含む。一部のかかる実施形態では、基材の表面がフローセル内に存在するものである。一部のかかる実施形態では、１回のフロー工程中、単一の型のヌクレオチドのみをフローセル内に存在させる。かかる実施形態では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびその類似体から選択され得る。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法の他の実施形態では、１回のフロー工程中、複数の異なる型のヌクレオチドをフローセル内に存在させる。かかる実施形態では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびその類似体から選択され得る。該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法のさらなる実施形態では、検出可能なシグナルが光学的シグナルを含む。他の実施形態では、検出可能なシグナルが非光学的シグナルを含む。かかる実施形態では、非光学的シグナルはｐＨの変化またはピロホスフェートの濃度の変化であり得る。
【００１３】
本明細書に記載の一部の実施形態は、ビーズのアレイの調製方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、１個または１個より多くのビーズの表面上に複数の官能基を形成すること；本明細書に記載のポリマーコーティングを該ビーズと接触させ、ポリマーコーティング層を該ビーズの表面上に形成することを含み、ここで、該ポリマーコーティングは該ビーズの表面上の該官能基に共有結合される。ポリマーコートされるビーズは、基材の表面上に、コートされる前または後に負荷され得る。一部の実施形態では、該表面は開口ウェルを含み得、各ウェルは、１個または１個より多くのビーズが収容される寸法を有するものであり得る（すなわち、一部の実施形態では、ウェルには１個以下のビーズが収容される場合があり得る）。一部の実施形態では、ビーズの表面上の官能基がアクリルアミド基を含む。一部の実施形態では、ビーズの表面上の官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジド基を含む。一部の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｔｎｔ）では、ビーズの表面上の官能基がアルキン基を含む。特定の実施形態では、ポリマーコーティングが式（Ｉ）および（ＩＩ）の反復単位を含む。特定の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもある。特定の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉｂ）で表されるものでもある。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーを含む。一実施形態では、式（ＩＩＩ）のポリマーが式（ＩＩＩａ）で表されるものでもある。一実施形態では、式（ＩＩＩ’）のポリマーが式（ＩＩＩｂ）で表されるものでもある。別の実施形態では、ポリマーコーティングが式（ＩＶ）のポリマーを含む。特定の実施形態では、ビーズが本明細書に記載のポリマーコーティングで完全にコートされている。他の実施形態では、ビーズが本明細書に記載のポリマーコーティングで一部コートされている。一部の実施形態では、ポリマーコーティングがビーズの表面に高温で共有結合される。他の一部の実施形態では、ポリマーコーティングがビーズの表面に光活性化によって共有結合される。他の一部の実施形態では、ビーズをウェル内で事前にアレイ状にし、次いで、ポリマーコーティングをアレイ状ビーズに共有結合させる。
【００１４】
ビーズは基材の表面（例えば、フローセルまたはウェル）に、化学的、物理吸着的または両方の力によって固着され得る。一部の実施形態では、ポリマーコートビーズは基材の表面に、該基材の表面上の開口ウェル内に負荷することにより固着される。あるいはまたさらに、ポリマーコートビーズは基材の表面に、該基材の表面上の官能基に共有結合させることにより固着される。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、さらに、ポリマーコートビーズを、該ビーズを基材の表面に負荷する前に洗浄して過剰の未結合ポリマーコーティングを除去することを含む。特定の実施形態では、ポリマーコーティングを、前処理したビーズと接触させる前に溶液に溶解させる。一部の実施形態では、ポリマーコーティングを水溶液に溶解させる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、さらに、本明細書に記載のものと同様の方法を用いてアレイ状ポリヌクレオチドを形成するためのさらなる工程を含む。一部の実施形態では、基材の表面をウェル、パッドまたは他の特徴でパターン形成する。
【００１５】
本明細書に記載の一部の好ましい実施形態は、共有結合された状態でポリマーコーティングを含む表面を有する基材であって、ポリマーコーティングが式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーを含む基材に関する。一実施形態では、式（ＩＩＩ）のポリマーが式（ＩＩＩａ）で表されるものでもある。一実施形態では、式（ＩＩＩ’）のポリマーが式（ＩＩＩｂ）で表されるものでもある。一実施形態では、基材がビーズである。
【００１６】
本明細書に記載の一部の好ましい実施形態は、基材の表面上に複数の官能基を形成すること、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーを該基材の表面と接触させ、ポリマーコーティング層を該基材の表面上に形成することを含み、該ポリマーコーティングが基材の表面上の官能基に共有結合される、基材の表面の調製方法に関する。一実施形態では、式（ＩＩＩ）のポリマーが式（ＩＩＩａ）で表されるものでもある。一実施形態では、式（ＩＩＩ’）のポリマーが式（ＩＩＩｂ）で表されるものでもある。一部の実施形態では、基材の表面上の官能基が、アルケン、アルキン、または任意選択的に置換されているフェニルアジドから選択される。一部の実施形態では、ポリマーコーティングがアルケン基に高温で共有結合される。一実施形態では、該アルケン基がアクリルアミド基である。一実施形態では、基材がビーズである。
一実施形態において、たとえば、以下の項目が提供される。
（項目１）  共有結合された状態でポリマーコーティングを含む表面を有する基材であって、該ポリマーコーティングが式（Ｉ）の反復単位と式（ＩＩ）の反復単位：
【化２５】
0005859172.tif 000002
（式中：
Ｒ１およびＲ１’は各々、独立して、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ２およびＲ３は各々、独立して、水素、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミド、アルキルチオ、アリール、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は各々、独立して、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ７およびＲ８は各々、独立してＨまたはアルキルから選択されるか、あるいはＲ７とＲ８が、これらが結合している原子（１個または複数）と一体に連接されて複素環を形成している）
を含む基材。
（項目２）  式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）：
【化２６】
0005859172.tif 000003
（式中、Ｒ１はＨまたはアルキルであり；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは１〜５０の整数である、
ただし、Ｒ１がＨであり、ｏが５であり、ＲＡがハロである場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
で表されるものでもある、項目１に記載の基材。
（項目３）  ＲＡがアジドであり、Ｒ１が水素であり、ｏが５である、項目２に記載の基材。
（項目４）  前記ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化２７】
0005859172.tif 000004
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含む、項目１に記載の基材。
（項目５）  式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化２８】
0005859172.tif 000005
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、項目４に記載の基材。
（項目６）  ポリマーコーティングが、前記表面に結合している一連の官能基に共有結合しており、前記官能基が、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミド、およびオルト位にシュタウディンガーライゲーションのためのホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルからなる群より選択される、項目１〜５のいずれか１項に記載の基材。
（項目７）  前記官能基がアルキンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアジドである、項目６に記載の基材。
（項目８）  前記官能基がナイトレンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアジドである、項目６に記載の基材。
（項目９）  前記官能基が活性型エステルを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアミンである、項目６に記載の基材。
（項目１０）  式（Ｉ）の反復単位が、式（Ｉｂ）：
【化２９】
0005859172.tif 000006
（式中、Ｒ２は、任意選択的に置換されているアリールである）
で表されるものでもある、項目１に記載の基材。
（項目１１）  Ｒ２が、１個または１個より多くのハロゲンで任意選択的に置換されているフェニルアジドである、項目１０に記載の基材。
（項目１２）  前記ポリマーコーティングが、式（ＩＶ）：
【化３０】
0005859172.tif 000007
（式中、ｎは１〜５０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
のポリマーを含む、項目１０に記載の基材。
（項目１３）  式（ＩＶ）のフェニル基が１つまたは１つより多くのフルオロ基で置換されている、項目１２に記載の基材。
（項目１４）  前記表面にポリマーコート領域と不活性領域の両方が含まれている、項目１〜１３のいずれか１項に記載の基材。
（項目１５）  前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択される、項目１４に記載の基材。
（項目１６）  前記不活性領域がガラスを含む、項目１４または１５に記載の基材。
（項目１７）  前記基材の表面に開口ウェルを備える、項目１〜１６のいずれか１項に記載の基材。
（項目１８）  前記基材は、ビーズである、項目１〜１６のいずれか１項に記載の基材。
（項目１９）  基材の表面に固定化されたポリマーコーティングの調製方法であって、該方法は、
ポリマーを基材の表面と接触させ、ここで、該表面は複数の官能基を備えており、それにより該表面上のポリマーコーティングの層を形成することを含み、ここで、該ポリマーコーティングは該表面上の該官能基に共有結合され、
該ポリマーコーティングが式（Ｉ）の反復単位と式（ＩＩ）の反復単位：
【化３１】
0005859172.tif 000008
（式中：
Ｒ１およびＲ１’は各々、独立して、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ２およびＲ３は各々、独立して、水素、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミド、アルキルチオール、アリール、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は各々、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ７およびＲ８は各々、独立してＨまたはアルキルから選択されるか、あるいはＲ７とＲ８が、これらが結合している原子（１個または複数）と一体に連接されて複素環を形成している）
を含む方法。
（項目２０）  前記ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化３２】
0005859172.tif 000009
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化３３】
0005859172.tif 000010
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、項目２０に記載の方法。
（項目２２）  前記基材の表面上の官能基が光活性化性アジドを含む、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）  前記基材の表面上の官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジドを含む、項目１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）  前記フェニルアジドが、前記基材の表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  前記ポリマーを前記基材の表面と接触させる前にフェニルアジドを光活性化させる、項目２３に記載の方法。
（項目２６）  前記ポリマーコーティングが前記官能基に光活性化によって共有結合される、項目２２に記載の方法。
（項目２７）  前記基材の表面上の官能基がアルキン基を含む、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）  重合性物質を前記官能基に銅触媒の存在下で共有結合させる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）  前記基材の表面上の官能基がアルケンまたはアクリルアミド基を含む、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）  前記アクリルアミド基が、該アミン官能化表面を、活性型アクリル酸エステルまたは塩化アクリルから選択されるアクリロイル基と反応させることにより調製される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）  前記アミン官能化表面が、前記表面を３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で処理することにより調製される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  前記活性型アクリル酸エステルがアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである、項目３０に記載の方法。
（項目３３）  前記複数の官能基が前記基材の表面上に、前記重合性物質を重合させた後に複数のポリマーコート領域と複数の不活性領域が形成されるように配列される、項目１９〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）  前記不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）  前記不活性領域がガラスを含む、項目３３または３４に記載の方法。
（項目３６）  前記複数のポリマーコート領域と前記複数の不活性領域が該表面上に、パターンが形成されるように配列される、項目３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）  前記基材がビーズである、項目１９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）  ビーズのアレイの調製方法であって：
１個または１個より多くのビーズの表面上に複数の官能基を形成すること；および
ポリマーコーティングを前記ビーズと接触させ、ポリマーコーティング層を前記ビーズの表面上に形成すること
を含み、
ここで、前記ポリマーコーティングは該ビーズの表面上の該官能基に共有結合され、該ポリマーコーティングが式（Ｉ）の反復単位と式（ＩＩ）の反復単位：
【化３４】
0005859172.tif 000011
（式中：
Ｒ１およびＲ１’は各々、独立して、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ２およびＲ３は各々、独立して、水素、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミド、アルキルチオ、アリール、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は各々、独立して、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ７およびＲ８は各々、独立してＨまたはアルキルから選択されるか、あるいはＲ７とＲ８が、これらが結合している原子（１個または複数）と一体に連接されて複素環を形成している）
を含む方法。
（項目３９）  前記ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化３５】
0005859172.tif 000012
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；
各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；
ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；
Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；
ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；
ｍは、１〜１００，０００の範囲の整数である；
ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）  式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化３６】
0005859172.tif 000013
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  前記ビーズの表面上の官能基がアルケンまたはアクリルアミドを含む、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）  前記アルケンまたはアクリルアミド基が、前記ビーズの表面を官能化シランと直接接触させることにより調製される、項目４１に記載の方法。
（項目４３）  前処理したビーズを、前記ポリマーコーティングと接触させる前に重合抑制剤を含む溶液に曝露する、項目３８〜４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）  前記ビーズの表面上の官能基が任意選択的に置換されているフェニルアジド基を含む、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）  前記フェニルアジドが、前記ビーズの表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  前記ポリマーコーティングが前記ビーズの表面上の官能基に光活性化によって共有結合される、項目３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）  前記ポリマーコーティングが前記ビーズの表面上の官能基に高温で共有結合される、項目３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
（項目４８）  前記ビーズの表面上の官能基がアルキン基を含む、項目３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）  前記重合性物質を前記官能基に銅触媒の存在下で共有結合させる、項目４８に記載の方法。
（項目５０）  さらに、ポリマーコートされたビーズを前記基材の表面に固着させることを含む、項目３８〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【００１８】
【図１Ｂ】図１Ｂは、コンピュータによるＰＡＺＡＭの分子量分布を示す。
【００１９】
【図１Ｃ】図１Ｃは、軽度に架橋させたＰＡＺＡＭの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【００２０】
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてコートした典型的なガラスフローセルのＴｙｐｈｏｏｎスキャン（図２Ｂ）およびＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値（図２Ａ）をフローセルの８つのレーンに沿って示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてコートした典型的なガラスフローセルのＴｙｐｈｏｏｎスキャン（図２Ｂ）およびＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値（図２Ａ）をフローセルの８つのレーンに沿って示す。
【００２１】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてコートしたＨｉＳｅｑガラスフローセルのＴｙｐｈｏｏｎスキャンを示す。図３Ａは、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト化表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。図３Ｂは、インサイチューＰＡＺＡＭのＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてコートしたＨｉＳｅｑガラスフローセルのＴｙｐｈｏｏｎスキャンを示す。図３Ａは、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト化表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。図３Ｂは、インサイチューＰＡＺＡＭのＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。
【００２２】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてスピンコートしたガラス基材のＴｙｐｈｏｏｎスキャンを示す。図４Ａは、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト化表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。図４Ｂは、スピンコートしたＰＡＺＡＭのＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ＰＡＺＡＭを用いてスピンコートしたガラス基材のＴｙｐｈｏｏｎスキャンを示す。図４Ａは、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト化表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。図４Ｂは、スピンコートしたＰＡＺＡＭのＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。
【００２３】
【図５−１】図５Ａ〜Ｃは、フローコートしたＰＡＺＡＭ表面上のクラスターを示す。図５Ａは、チャネルのＵＶ照射領域の拡大版である。図５Ｂおよび図５Ｃは、チャネルのクラスターの数およびクラスターのフィルター処理強度を示す。
【図５−２】図５Ａ〜Ｃは、フローコートしたＰＡＺＡＭ表面上のクラスターを示す。図５Ａは、チャネルのＵＶ照射領域の拡大版である。図５Ｂおよび図５Ｃは、チャネルのクラスターの数およびクラスターのフィルター処理強度を示す。
【００２４】
【図６】図６Ａ〜Ｃは、スピンコートしたＰＡＺＡＭ表面上のクラスターを示す。図６Ａは、Ｈｉｓｅｑフローセル上のスピンコートしたＰＡＺＡＭのｔｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。図６Ｂは、相補的な色素含有オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせたグラフト化表面のＴｙｐｈｏｏｎ蛍光画像を示す。図６Ｃは、レーン３と５のクラスターの拡大画像を示す。
【００２５】
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、典型的なフローセルの画像（図７Ｂ）および強度の中央値（図７Ａ）をフローセルの８つのレーンに沿って示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、典型的なフローセルの画像（図７Ｂ）および強度の中央値（図７Ａ）をフローセルの８つのレーンに沿って示す。
【００２６】
【図８−１】図８Ａ〜Ｉは、フローコートしたＰＡＺＡＭ混合物上のポリヌクレオチドのクラスターおよび配列決定ならびに取得されたデータを示す。
【図８−２】図８Ａ〜Ｉは、フローコートしたＰＡＺＡＭ混合物上のポリヌクレオチドのクラスターおよび配列決定ならびに取得されたデータを示す。
【００２７】
【図９】図９は、相補的な蛍光オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているアルキンオリゴ体で官能化したスピンコート基材を示す。
【００２８】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、択一的な光活性橋かけ剤のスクリーニング結果を示す。図１０Ａは、Ｐｈｏｔｏ  ＸＬに対するＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。図１０Ｂは、異なる架橋剤のＰｈｏｔｏ  ＸＬに対するＵＶ時間の図表を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、択一的な光活性橋かけ剤のスクリーニング結果を示す。図１０Ａは、Ｐｈｏｔｏ  ＸＬに対するＴｙｐｈｏｏｎ強度の中央値の図表を示す。図１０Ｂは、異なる架橋剤のＰｈｏｔｏ  ＸＬに対するＵＶ時間の図表を示す。
【００２９】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、光活性なパターン形成表面およびポリマーロッキングを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、光活性なパターン形成表面およびポリマーロッキングを示す。
【００３０】
【図１２】図１２は、室温で１０％未満の湿度にて６日間保存後の熱的架橋ＰＡＺＡＭ層上の残留表面割合を示す。
【００３１】
【図１３Ａ】図１３Ａは、５種類のＰｈｉＸ鋳型を用いて熱的架橋ＰＡＺＡＭ表面上で成長させたクラスターを示す。
【００３２】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、熱的架橋フローセル上での２×２６サイクル実行後の配列決定メトリックスを示す。
【００３３】
【図１４】図１４は、ＰＡＺＡＭをパターン形成シランパッチに熱的架橋させることにより作製したパターン形成アレイ上で成長させたクラスターを示す。
【００３４】
【図１５】図１５は、ＰＡＺＡＭコートビーズによって調製したパターン形成ＰＡＺＡＭアレイを示す。
【００３５】
【図１６】図１６は、光活性ポリマーを用いた分割／併合アプローチを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（詳細な説明）
本開示は、ポリマーでコートされた表面を含む基材であって該表面に共有結合している基材に関する。かかる基材の好ましい一実施形態は、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（別名ＰＡＺＡＭまたはＤＡＳＦＡ）コーティングを含む。これらのポリマーコーティングは、基材、例えば、フローセルの表面または分子アレイの表面の官能化表面に共有結合される。また、本開示は、かかるポリマーコート表面の調製方法およびかかるポリマーコート表面を含む基材の使用方法に関する。好ましい一実施形態では、ＰＡＺＡＭコート表面を有する基材を用いてポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。
【００３７】
この新しいポリマーコーティングおよびアプローチにより、現在知られているポリマーコーティングの制限の多くが解消される空気中で安定な材料が作製される。
【００３８】
（定義）
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。用語「“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（〜を含む）”」ならびに他の形態、例えば、“ｉｎｃｌｕｄｅ”、“ｉｎｃｌｕｄｅｓ”、および“ｉｎｃｌｕｄｅｄ”の使用は限定的でない。用語“ｈａｖｉｎｇ（〜を有する）”ならびに他の形態、例えば、“ｈａｖｅ”、“ｈａｓ”、および“ｈａｄ”の使用は限定的でない。本明細書で用いる場合、移行句中であれ、請求項の主文中であれ、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）（〜を含む）”および“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は非限定的な意味を有すると解釈されたい。すなわち、上記の用語は、語句“ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ（少なくとも〜を有する）”または“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ（少なくとも〜を含む）”と同義的に解釈されたい。例えば、方法の状況において用いている場合、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は、該方法が少なくとも記載の工程を含むが、さらなる工程を含んでいてもよいことを意味する。化合物、組成物またはデバイスの状況において用いている場合、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”は、該化合物、組成物またはデバイスが少なくとも記載の特徴または成分を含むが、さらなる特徴または成分もまた含んでいてもよいことを意味する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、一般的な有機物質の略号を以下のとおりに規定する。
Ａｃ    アセチル
Ａｃ２Ｏ    無水酢酸
ＡＰＴＳ    アミノプロピルシラン
ＡＰＴＥＳ  （３−アミノプロピル）トリエトキシシラン
ＡＰＴＭＳ  （３−アミノプロピル）トリメトキシシラン
ａｑ．    水性
Ａｚａｐａ    Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド
ＡＰＴＭＳ  ３−アミノプロピルトリメトキシシラン
ＢＨＴ    ブチル化ヒドロキシルトルエン
Ｂｎ    ベンジル
ＢｒａｐａまたはＢＲＡＰＡ  Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド
Ｂｚ    ベンゾイル
ＢＯＣまたはＢｏｃ  ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｕ    ｎ−ブチル
ｃａｔ．    触媒の
Ｃｂｚ    カルボベンジルオキシ
ＣｙＣｌ    塩化シアヌル
℃    セ氏の度数の温度
ｄＡＴＰ    デオキシアデノシン三リン酸
ｄＣＴＰ    デオキシシチジン三リン酸
ｄＧＴＰ    デオキシグアノシン三リン酸
ｄＴＴＰ    デオキシチミジン三リン酸
ＤＢＵ    １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＡ    ジクロロ酢酸
ＤＣＥ    １，２−ジクロロエタン
ＤＣＭ    塩化メチレン
ＤＩＥＡ    ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ    ジメチルアセトアミド
ＤＭＥ    ジメトキシエタン
ＤＭＦ    Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ    ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ    ジフェニルホスホリルアジド
Ｅｔ    エチル
ＥｔＯＡｃ    酢酸エチル
ｇ    グラム（単数または複数）
ＧＰＣ    ゲル浸透クロマトグラフィー
Ｈまたはｈｒ    時間（単数または複数）
ｉＰｒ    イソプロピル
ＫＰｉ    ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸カリウムバッファー
ＫＰＳ    過硫酸カリウム
ＩＰＡ    イソプロピルアルコール
ＩＰＨＡ．ＨＣｌ  Ｎ−イソプロピルヒドロキシルアミン塩酸塩
ＬＣＭＳ    液体クロマトグラフィー−質量分析
ＬＤＡ    リチウムジイソプロピルアミド
ｍまたはｍｉｎ  分（単数または複数）
ｍＣＰＢＡ  メタ−クロロペルオキシ安息香酸
ＭｅＯＨ    メタノール
ＭｅＣＮ    アセトニトリル
ｍＬ    ミリリットル（単数または複数）
ＭＴＢＥ    メチルターシャリー−ブチルエーテル
ＮａＮ３    アジ化ナトリウム
ＮＨＳ    Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＡＺＡＭ  任意のアクリルアミド対Ａｚａｐａ比のポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）
ＰＧ    保護基
Ｐｈ    フェニル
ｐｐｔ    沈殿物
ｒｔ    室温
ＳＦＡ    米国特許出願公開公報第２０１１／００５９８６５号に定義された無シランアクリルアミド
スルホ−ＨＳＡＢまたはＳＨＳＡＢ  Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ａｚｉｄｏｂｅｎｏａｔｅ）
ＴＥＡ    トリエチルアミン
ＴＥＭＰＯ  （２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル
ＴＣＤＩ    １，１’−チオカルボニルジイミダゾール
Ｔｅｒｔ，ｔ    ターシャリー
ＴＦＡ    トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ    テトラヒドロフラン
ＴＥＭＥＤ  テトラメチルエチレンジアミン
μＬ    マイクロリットル（単数または複数）
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「アレイ」は、１つまたは１つより多くの基材に結合させた異なるプローブ分子の集団であって、該異なるプローブ分子が相対位置に従って互いに識別され得るようになっているものをいう。アレイは、各々が基材上の異なるアドレス指定可能な位置に存在している異なるプローブ分子を含み得る。あるいはまたさらに、アレイは、各々が異なるプローブ分子を有する別個の基材を含み得るものであって、該基材が取り付けられた表面上の該基材の位置に従って、あるいは液状物中の基材の位置に従って該異なるプローブ分子が特定され得るものであってもよい。表面上に別個の基材を存在させる例示的なアレイとしては、限定されないが、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、ＵＳ２００２／０１０２５７８およびＰＣＴ出願公開公報番号ＷＯ００／６３４３７に記載のような、ウェル内にビーズを含めたものが挙げられる。例えば、ミクロ流体デバイス（蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）など）を用いて液状アレイ内のビーズを識別するための本発明に使用され得る例示的な形式は、例えば米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明に使用され得るアレイのさらなる例としては、限定されないが、米国特許第５，４２９，８０７号；同第５，４３６，３２７号；同第５，５６１，０７１号；同第５，５８３，２１１号；同第５，６５８，７３４号；同第５，８３７，８５８号；同第５，８７４，２１９号；同第５，９１９，５２３号；同第６，１３６，２６９号；同第６，２８７，７６８号；同第６，２８７，７７６号；同第６，２８８，２２０号；同第６，２９７，００６号；同第６，２９１，１９３号；同第６，３４６，４１３号；同第６，４１６，９４９号；同第６，４８２，５９１号；同第６，５１４，７５１号および同第６，６１０，４８２号；ならびにＷＯ９３／１７１２６；ＷＯ９５／１１９９５；ＷＯ９５／３５５０５；ＥＰ７４２２８７；およびＥＰ７９９８９７に記載されたものが挙げられる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「共有結合された（“ａｔｔａｃｈｅｄ”または“ｂｏｎｄｅｄ”）」とは、原子間での電子対の共有を特徴とする化学結合の形成をいう。例えば、共有結合されたポリマーコーティングとは、基材の官能化表面との結合が他の手段、例えば付着または静電相互作用によるものに対して、該表面と化学結合を形成しているポリマーコーティングをいう。表面に共有結合されたポリマーが共有結合に加え、ある手段によっても結合されていてもよいことは認識される。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「ポリマーロッキング」は、基材の表面上の官能基をポリマーコーティングと、該ポリマーコーティングが該表面に共有結合されるように反応させるプロセスをいう。
【００４３】
本明細書で用いる場合、任意の「Ｒ」基（単数または複数）、例えば限定されないが、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、指示原子に結合され得る置換基を表す。Ｒ基は置換されていても非置換であってもよい。２つの「Ｒ」基が「一体となって」いると記載している場合、該Ｒ基とこれらが結合している原子により、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、または複素環が形成され得る。例えば、限定されないが、Ｒ２とＲ３、またはＲ２、Ｒ３もしくはＲ４とこれらが結合している原子が「一体となって」または「一体に連接されて」いると表示している場合、これらが互いに共有結合して環を形成していることを意味し、その一例を以下に示す。
【化１】
0005859172.tif 000014
【００４４】
ある基が「任意選択的に置換されている」と記載している場合はいつでも、基が非置換であってもよく、表示した置換基のうちの１つまたは１つより多くで置換されていてもよい。同様に、ある基が「非置換または置換型」であると記載している場合、置換されている場合は、置換基が表示した置換基のうちの１つまたは１つより多くから選択され得る。置換基を表示していない場合、これは、表示した「任意選択的に置換されている」または「置換された」基が、個々に独立して、限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、一置換アミノ基、二置換アミノ基、およびその保護誘導体を含む官能部の基から個々に独立して選択される１つまたは１つより多くの基で置換され得ることを意味する。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「アルキル」は、完全飽和（二重結合または三重結合なし）の炭化水素基を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖をいう。一部の実施形態では、アルキル基は１〜２０個の炭素原子を有するものであり得る（例えば「１〜２０」という数値範囲は、本明細書で示している場合はいつでも、示した範囲（両端を含む）内の各整数をいう；例えば、「１〜２０個の炭素原子」とは、アルキル基が１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個を含むまでの炭素原子からなるものであり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲を表示していない場合の用語「アルキル」の存在も包含している）。また、アルキル基は、約７〜約１０個の炭素原子を有する中くらいのサイズのアルキルであってもよい。また、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであってもよい。化合物のアルキル基は「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」または同様の表示で表示され得る。ほんの一例として、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」は、アルキル鎖内に１〜４個の炭素原子が存在すること、すなわち、アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチルおよびｔ−ブチルから選択されることを示す。典型的なアルキル基としては、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられる。アルキル基は置換されていても非置換であってもよい。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「アルケニル」は、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖内に１つまたは１つより多くの二重結合を含むアルキル基をいう。アルケニル基は非置換であっても置換型であってもよい。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「アルキニル」は、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖内に１つまたは１つより多くの三重結合を含むアルキル基をいう。アルキニル基は非置換であっても置換型であってもよい。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「シクロアルキル」は、完全飽和（二重結合または三重結合なし）の単環式または多環式の炭化水素環系をいう。２つまたは２つより多くの環で構成されている場合、該環は、縮合された様式で一体に連接されたものであり得る。シクロアルキル基は環（単数または複数）内に３〜１０個の原子を含み得る。一部の実施形態では、シクロアルキル基は環（単数または複数）内に３〜８個の原子を含み得る。シクロアルキル基は非置換であっても置換型であってもよい。典型的なシクロアルキル基としては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの環内に１つまたは１つより多くの二重結合を含む単環式または多環式の炭化水素環系をいう；が、１つより多く存在する場合、二重結合によりすべての環全体において充分に非局在化したパイ電子系が形成され得ない（あるいは、該基は、本明細書で定義する「アリール」となり得る）。２つまたは２つより多くの環で構成されている場合、該環は、縮合された様式で一体に連結されたものであり得る。シクロアルケニル基は非置換であっても置換型であってもよい。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「シクロアルキニル」は、少なくとも１つの環内に１つまたは１つより多くの三重結合を含む単環式または多環式の炭化水素環系をいう。三重結合が１つより多く存在する場合、三重結合によりすべての環全体において充分に非局在化したパイ電子系が形成され得ない。２つまたは２つより多くの環で構成されている場合、該環は、縮合された様式で一体に連接されたものであり得る。シクロアルキニル基は非置換であっても置換型であってもよい。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「アリール」は、炭素環式（すべて炭素）の単環式または多環式の芳香族環系（例えば、縮合、橋絡またはスピロ環系（２つの炭素環式の環、例えば、１つまたは１つより多くのアリール環と１つまたは１つより多くのアリールまたは非アリール環が化学結合を共有しているもの）など）であって、少なくとも１つの環全体において充分に非局在化したパイ電子系を有するものをいう。アリール基の炭素原子の数は種々であり得る。例えば、一部の実施形態では、アリール基はＣ６〜Ｃ１４アリール基、Ｃ６〜Ｃ１０アリール基、またはＣ６アリール基であり得る。アリール基の例としては、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、およびアズレンが挙げられる。アリール基は置換されていても非置換であってもよい。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「ヘテロシクリル」は、少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ）を含む環系をいう。かかる系は不飽和であってもよく、いくつかの不飽和を含むものであってもよく、いくつかの芳香族部分を含むものであってもよく、すべて芳香族であってもよい。ヘテロシクリル基は非置換であっても置換型であってもよい。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「ヘテロアリール」は、単環式または多環式の芳香族環系（充分に非局在化したパイ電子系を有する少なくとも（ａ  ｌｅａｓｔ）１つの環を有する環系）であって、１個または１個より多くのヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素、例えば限定されないが、窒素、酸素および硫黄と、少なくとも１つの芳香族環とを含むものをいう。ヘテロアリール基の環（単数または複数）内の原子の数は種々であり得る。例えば、一部の実施形態では、ヘテロアリール基は、環（１つもしくは複数）内に４〜１４個の原子、環（１つもしくは複数）内に５〜１０個の原子、または環（１つもしくは複数）内に５〜６個の原子を含み得る。さらに、用語「ヘテロアリール」は、２つの環、例えば、少なくとも１つのアリール環と少なくとも１つのヘテロアリール環、または少なくとも２つのヘテロアリール環が少なくとも１つの化学結合を共有している縮合環系を包含する。ヘテロアリール環の例としては、限定されないが、フラン、フラザン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フタラジン、ピロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、チアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、インドール、インダゾール、ピラゾール、ベンゾピラゾール、イソオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、プリン、プテリジン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリン、およびトリアジンが挙げられる。ヘテロアリール基は置換されていても非置換であってもよい。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「ヘテロ脂環式」または「ヘテロアリシクリル」は、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−、１８員までの単環式、二環式、および三環式の環系であって、炭素原子１〜５個のヘテロ原子と一体になって前記環系を構成しているものをいう。複素環は、任意選択で１つまたは１つより多くの不飽和結合を含むものであってもよいが、すべての環全体において充分に非局在化したパイ電子系が存在しないような様式で存在させる。ヘテロ原子は、酸素、硫黄および窒素から独立して選択される。複素環は、さらに、その定義にオキソ系およびチオ系（ラクタム、ラクトン、環状イミド、環状チオイミド、および環状カルバメートなど）が含まれるように１つまたは１つより多くのカルボニルまたはチオカルボニル官能部を含むものであってもよい。２つまたは２つより多くの環で構成されている場合、該環は、縮合された様式で一体に連接されたものであり得る。さらに、ヘテロ脂環式の窒素（あれば）は第４級化されていてもよい。ヘテロアリシクリルまたはヘテロ脂環式基は非置換であっても置換型であってもよい。かかる「ヘテロ脂環式」または「ヘテロアリシクリル」基の例としては、限定されないが、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１，２−ジオキソラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキソラン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，３−オキサチオラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジン、モルホリン、オキシラン、ピペリジンＮ−オキシド、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン、４−ピペリドン、ピラゾリン、ピラゾリジン、２−オキソピロリジン、テトラヒドロピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロチオピラン、チアモルホリン、チアモルホリンスルホキシド、チアモルホリンスルホン、およびそのベンゾ縮合類縁体（例えば、ベンズイミダゾリジノン、テトラヒドロキノリン、３，４−メチレンジオキシフェニル）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「アラルキル」および「アリール（アルキル）」は、置換基として低級アルキレン基を介して連結されるアリール基をいう。アラルキルの低級アルキレンおよびアリール基は置換されていても非置換であってもよい。例としては、限定されないが、ベンジル、２−フェニルアルキル、３−フェニルアルキル、およびナフチルアルキルが挙げられる。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「ヘテロアラルキル」および「ヘテロアリール（アルキル）」は、置換基として低級アルキレン基を介して連結されるヘテロアリール基をいう。ヘテロアラルキルの低級アルキレンおよびヘテロアリール基は置換されていても非置換であってもよい。例としては、限定されないが、２−チエニルアルキル、３−チエニルアルキル、フリルアルキル、チエニルアルキル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキル、ならびにそのベンゾ縮合類縁体が挙げられる。
【００５７】
「（ヘテロアリシクリル）アルキル」は、置換基として低級アルキレン基を介して連結される複素環式またはヘテロアリシクリル基である。（ヘテロアリシクリル）アルキルの低級アルキレンおよび複素環式またはヘテロシクリルは置換されていても非置換であってもよい。例としては、限定されないが、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）メチル、（ピペリジン−４−イル）エチル、（ピペリジン−４−イル）プロピル、（テトラヒドロ−２Ｈ−チオピラン−４−イル）メチル、および（１，３−チアジナン−４−イル）メチルが挙げられる。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「アルコキシ」は式−ＯＲをいい、式中、Ｒは、上記に定義した（ｉｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｓ  ａｂｏｖｅ）アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはシクロアルキニルである。アルコキシの非限定的な列挙はメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシである。アルコキシは置換されていても非置換であってもよい。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「ヒドロキシアルキル」は、１個または１個より多くの水素原子がヒドロキシ基で置き換えられているアルキル基をいう。例示的なヒドロキシアルキル基としては、限定されないが、２−ヒドロキシエチル、３−ヒドロキシプロピル、２−ヒドロキシプロピル、および２，２−ジヒドロキシエチルが挙げられる。ヒドロキシアルキルは置換されていても非置換であってもよい。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「アルキルアミノ」は、１個または１個より多くの水素原子がアミノ基で置き換えられているアルキル基をいう。例示的なアルキルアミノ基としては、限定されないが、アミノメチル、２−アミノエチル、３−アミノエチルが挙げられる。アルキルアミノは置換されていても非置換であってもよい。
【００６１】
本明細書で用いる場合、「アルキルアミド」は、１個または１個より多くの水素原子がＣ−アミド基またはＮ−アミド基で置き換えられているアルキル基をいう。アルキルアミドは置換されていても非置換であってもよい。
【００６２】
本明細書で用いる場合、「アルキルチオ」はＲＳ−をいい、式中、Ｒはアルキルである。アルキルチオは置換されていても非置換であってもよい。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「Ｃ−アミド」基は「−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲａＲｂ）」基をいい、式中、ＲａおよびＲｂは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであり得る。Ｃ−アミドは置換されていても非置換であってもよい。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「Ｎ−アミド」基は「ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒａ）−」基をいい、式中、ＲおよびＲａは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであり得る。Ｎ−アミドは置換されていても非置換であってもよい。
【００６５】
用語「ハロゲン原子」、「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で用いる場合、元素の周期表の第７列の放射安定性の原子のいずれか１つ、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
【００６６】
用語「アミン」は、本明細書で用いる場合、−ＮＨ２基をいい、ここで、１個または１個より多くの水素がＲ基で任意選択的に置換されていてもよい。Ｒは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであり得る。
【００６７】
用語「アルデヒド」は、本明細書で用いる場合、−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｈ基をいい、式中、Ｒｃは存在していなくてもよく、またはアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアリシクリレン、アラルキレン、または（ヘテロアリシクリル）アルキレンから独立して選択され得る。
【００６８】
用語「活性型エステル」は、本明細書で用いる場合、求核試薬と自発的に反応するエステル、例えば、ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、またはニトロフェニルエステルをいう。
【００６９】
用語「ナイトレン」は、本明細書で用いる場合、カルベンの窒素類縁体であって、該窒素原子が６個の価電子により非荷電になっているものをいう。
【００７０】
用語「アミノ」は、本明細書で用いる場合、−ＮＨ２基をいう。
【００７１】
用語「ヒドロキシ」は、本明細書で用いる場合、−ＯＨ基をいう。
【００７２】
用語「シアノ」基は、本明細書で用いる場合、「−ＣＮ」基をいう。
【００７３】
用語「アジド」は、本明細書で用いる場合、−Ｎ３基をいう。
【００７４】
用語「チオール」は、本明細書で用いる場合、−ＳＨ基をいう。
【００７５】
用語「ヒドラジニル」は、本明細書で用いる場合、−ＮＨＮＨ２基をいう。
【００７６】
用語「ヒドラゾニル」は、本明細書で用いる場合、
【化２】
0005859172.tif 000015
の基をいう。
【００７７】
用語「ホルミル」は、本明細書で用いる場合、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基をいう。
【００７８】
用語「グリシジル」または「グリシジルエーテル」は、本明細書で用いる場合、
【化３】
0005859172.tif 000016
をいう。
【００７９】
用語「エポキシ」は、本明細書で用いる場合、
【化４】
0005859172.tif 000017
をいう。
【００８０】
用語「カルボン酸」は、本明細書で用いる場合、−Ｃ（Ｏ）ＯＨをいう。
【００８１】
用語「チオシアネート」は、本明細書で用いる場合、−Ｓ−Ｃ≡Ｎ基をいう。
【００８２】
用語「オキソ−アミン」は、本明細書で用いる場合、−Ｏ−ＮＨ２基をいい、ここで、−ＮＨ２の１個または１個より多くの水素がＲ基で任意選択的に置換されていてもよい。Ｒは独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであり得る。
【００８３】
本明細書で用いる場合、接頭辞「光」または「光−」は、光または電磁放射線に関することを意味する。この用語には、電磁スペクトルの全部または一部、例えば限定されないが、該スペクトルの電波、マイクロ波、赤外、可視、紫外、Ｘ−線またはγ線部分として一般的に知られている範囲の１つまたは１つより多くが包含され得る。該スペクトルの該部分は、表面の金属領域（本明細書に示した金属など）によって遮断されるものであってもよい。あるいはまたさらに、該スペクトルの該部分は、表面の格子間領域、例えば、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に示した他の材料製の領域を透過するものであってもよい。特定の実施形態では、金属を透過し得る放射線が使用され得る。あるいはまたさらに、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に示した他の材料によってマスクされる放射線が使用され得る。
【００８４】
本明細書で用いる場合、用語「反応性部位」は、本明細書に記載のポリマーコーティング上の、化学反応または分子相互作用による１個または１個より多くの分子との結合に使用され得る部位を意味する。かかる結合は、共有結合によるものであってもよく、他の結合または相互力によるものであってもよい。
【００８５】
本明細書で用いる場合、用語「残留表面割合」は、Ｐ５／Ｐ７表面プライマーを染色するためにＴＥＴ  ｑｃを用いて測定された強度を示すものであり得る。Ｐ５およびＰ７プライマーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．により販売されている市販のフローセルの表面に、ＨｉＳｅｑ、ＭｉＳｅｑおよびＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒの基本型での配列決定のために使用されている。そのプライマー配列は米国特許出願公開公報第２０１１／００５９８６５号Ａ１（これは引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＴＥＴは、Ｐ５／Ｐ７プライマーに対する相補配列を有する色素標識オリゴヌクレオチドである。ＴＥＴは、表面上のＰ５／Ｐ７プライマーにハイブリダイズされ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｅ）得；過剰のＴＥＴは洗い流すことができ、結合された色素の濃度は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）などのスキャン装置を用いて蛍光検出によって測定され得る。
ポリマーコート表面を有する基材組成物
【００８６】
本明細書に記載の組成物の第１の態様は、共有結合された状態でポリマーコーティングを有する表面を含む基材に関する。好ましい一実施形態では、ポリマーがＰＡＺＡＭを含む。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが式（Ｉ）の反復単位と式（ＩＩ）の反復単位：
【化５】
0005859172.tif 000018
（式中：Ｒ１およびＲ１’は各々、独立して、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ２およびＲ３は各々、独立して、水素、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミド、アルキルチオール、アリール、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は各々、独立して、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ７およびＲ８は各々、独立してＨまたはアルキルから選択されるか、あるいはＲ７とＲ８が、これらが結合している原子（１個または複数）と一体に連接されて複素環を形成している）
を含む。
【００８７】
かかる組成物の一部の実施形態では、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が、任意選択的に置換されているアルキルである。
【００８８】
かかる組成物のなおさらなる実施形態では、Ｒ３が、Ｎ−アミド基で置換されているアルキルである。
【００８９】
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）：
【化６】
0005859172.tif 000019
（式中、Ｒ１はＨまたはアルキルであり；ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；ｏは１〜５０の整数である；ただし、Ｒ１がＨであり、ＲＡがハロである場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
で表されるものでもある。
【００９０】
一部のかかる実施形態では、ｏが５であり、ＲＡがアジドである。
【００９１】
さらなる実施形態では、Ｒ１が水素である。
【００９２】
なおさらなる実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８であり、式中のＲ７およびＲ８が各々、独立して、水素、アルキルまたはヒドロキシアルキルから選択される。
【００９３】
かかるポリマー組成物の一部の実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ３または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００９４】
他の実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＯＨまたは−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＯＨである。
【００９５】
さらに他の実施形態では、Ｒ４がＮＲ７Ｒ８であり、式中のＲ７とＲ８が、これらが結合している原子と一体に連接されて、５員の複素環を形成している。
【００９６】
５員の複素環を含む好ましい（ｐｒｏｆｆｅｒｅｄ）実施形態では、該５員の複素環が、任意選択的に置換されているピロリジンである。
【００９７】
また他の実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６であり、式中のＲ６が水素、アルキルまたはヒドロキシアルキルから選択される。
【００９８】
好ましい一実施形態では、Ｒ６が水素である。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、Ｒ６がメチルである。
【０１００】
また別の好ましい実施形態では、Ｒ６がヒドロキシエチルである。
【０１０１】
他の好ましい実施形態では、Ｒ４’が水素である。
【０１０２】
さらに他の好ましい実施形態では、Ｒ４’がアルキルである。
【０１０３】
また他の好ましい実施形態では、Ｒ４’がメチルである。
【０１０４】
一部の好ましい実施形態では、Ｒ５’が水素である。
【０１０５】
好ましいさらなる実施形態では、Ｒ５’がアルキルである。
【０１０６】
さらに好ましい実施形態では、Ｒ５’がメチルである。
【０１０７】
本明細書に記載のポリマーコート表面を含む基材のまた別の実施形態では、ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化７】
0005859172.tif 000020
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、エポキシ、アジリジン、トリアゾリン、およびチオールからなる群より選択され；各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数である；ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
のポリマーを含む。一部の実施形態では、ｏが５である。
【０１０８】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化８】
0005859172.tif 000021
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある。
【０１０９】
一部のかかる実施形態では、ポリマーコーティングが該表面に結合された一連の官能基に共有結合され、該官能基が、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミドまたはオルト位にホスフィン置換基を有するベンゾイルエステルから選択される。
【０１１０】
かかる組成物の好ましい一実施形態では、該官能基がアルキンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアジドである。
【０１１１】
かかる組成物の別の好ましい実施形態では、該官能基がナイトレンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアジドである。
【０１１２】
かかる組成物のまた別の好ましい実施形態では、該官能基が活性型エステルを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアミンである。
【０１１３】
かかる組成物のさらに別の好ましい実施形態では、該官能基がヒドラジンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがホルミルである。
【０１１４】
かかる組成物のまた別の好ましい実施形態では、該官能基がアルデヒド基を含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアミン、オキソ−アミン、またはヒドロジニルである。
【０１１５】
かかる組成物のさらに別の好ましい実施形態では、該官能基がグリシジルエーテルを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアミンである。
【０１１６】
かかる組成物のまた別の好ましい実施形態では、該官能基がアミンを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがアジドである。
【０１１７】
かかる組成物のまた別の好ましい実施形態では、該官能基がマレイミドを含み、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）で表されるものでもあり、式中のＲＡがチオールである。
【０１１８】
本明細書に記載のポリマーコート表面を含む基材のまた別の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が、式（Ｉｂ）：
【化９】
0005859172.tif 000022
（式中、Ｒ２は、任意選択的に置換されているアリールである）
で表されるものでもある。
【０１１９】
一部のかかる実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ２が、１個または１個より多くのハロゲンで任意選択的に置換されているフェニルアジドである。具体的な一実施形態では、Ｒ２がパーフルオロフェニルアジドである。
【０１２０】
一部の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ１が水素である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８である。具体的な一実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
【０１２２】
一部の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ４’が水素である。
【０１２３】
一部の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ５がアルキルである。
【０１２４】
他の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ５が水素である。
【０１２５】
一部の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ５’が水素である。
【０１２６】
本明細書に記載のポリマーコート表面を含む基材の別の実施形態では、ポリマーコーティングが、式（ＩＶ）：
【化１０】
0005859172.tif 000023
（式中、ｎは１〜５０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
のポリマーを含む。具体的な一実施形態では、式（ＩＶ）のフェニル基が、１つまたは１つより多くのフルオロ基で任意選択的に置換されている。
【０１２７】
本明細書に記載のポリマーコーティングは、さまざまな基材に共有結合され得る。反応性基、例えば限定されないが、アルケン、アルキン、ナイトレン、アルデヒド、ヒドラジン、活性型エステル、グリシジルエーテル、アミン、マレイミドで官能化され得る本質的に任意の基材材料が使用され得る。また、アクリルアミド、エノンまたはアクリレートも基材材料として使用され得る。基材は１種類の材料を含んでいてもよく、複数の異なる材料を含んでいてもよい。基材は複合材または積層体であってもよい。一部の実施形態では、基材は、ガラスを含む少なくとも１つの表面を有する。他の実施形態では、基材は、金属を含む少なくとも１つの表面を有する。一部のかかる実施形態では、金属が金である。一部の実施形態では、基材は、金属酸化物を含む少なくとも１つの表面を有する。一実施形態では、該表面は、酸化タンタルを含む。他の基材材料としては、限定されないが、プラスチック、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、溶融シリカ、ヒ化ガリウム、リン化インジウム、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、水晶、樹脂、ポリマーおよびコポリマーが挙げられ得る。基剤は平坦、円形、またはでこぼこ状であり得る。
【０１２８】
本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、基材の表面が、ポリマーコート領域およびポリマーでコートされていない不活性領域の両方を含む。ポリマーコート領域は反応性部位を含み得、したがって、化学結合または他の分子相互作用による分子との結合に使用され得る。一部の実施形態では、ポリマーコート領域と不活性領域が、パターンまたは格子が形成されるように交互であり得る。かかるパターンは、一次元であっても二次元であってもよい。一部の実施形態では、不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択され得る。好ましい一実施形態では、該表面がガラス領域を含む。別の好ましい実施形態では、該表面が金属領域を含む。さらに別の好ましい実施形態では、該表面がマスク領域を含む。また別の好ましい実施形態では、該表面が格子間領域を含む。本明細書に記載の組成物の一部の実施形態では、基材はビーズであってもよい。好ましい一実施形態では、ビーズの表面が官能化される。官能化は、ビーズをウェル内に導入する前に行なっても後に行なってもよい。一実施形態では、ウェルはフローセル表面内に予め画定されている。本開示のポリマーでコートされ得る、または本明細書に示した組成物もしくは方法に別の様式で使用され得る例示的な基材材料は、米国特許出願第１３／４９２，６６１号および同第１３／６６１，５２４号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１２９】
本明細書に記載の組成物の第２の態様は、そこに共有結合されたポリマーコーティングを有する表面を含む１つまたは１つより多くの基材を備えたフローセルに関する。一部の実施形態では、本明細書に記載のフローセルは、上記の基材を１つまたは１つより多く備えたものである。好ましい一実施形態では、ポリマーがＰＡＺＡＭを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、フローセルが、さらに、基材の表面にポリマーコーティングによって結合されたポリヌクレオチドを備える。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドがフローセル内にポリヌクレオチドクラスターで存在しており、該ポリヌクレオチドクラスターのポリヌクレオチドがフローセルの表面にポリマーコーティングによって結合されている。かかる実施形態では、ポリヌクレオチドが結合しているフローセル本体の表面を基材とみなす。他の実施形態では、ポリマーコート表面を有する別個の基材をフローセルの本体に挿入する。好ましい実施形態では、フローセルは、複数のレーンまたは複数のセクターに分かれたフローチャンバであり、該複数のレーンまたは該複数のセクターの１つまたは１つより多くが、共有結合された本明細書に記載のポリマーコーティングでコートされた表面を含んでいる。本明細書に記載のフローセルの一部の実施形態では、単一のポリヌクレオチドクラスター内の結合されたポリヌクレオチドが同じまたは同様のヌクレオチド配列を有する。本明細書に記載のフローセルの一部の実施形態では、異なるポリヌクレオチドクラスターの結合されたポリヌクレオチドが異なるまたは非類似のヌクレオチド配列を有する。本明細書に示した方法または組成物に使用され得る例示的なフローセルおよびフローセルの製造のための基材としては、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているもの、またはＵＳ２０１０／０１１１７６８Ａ１もしくはＵＳ２０１２／０２７０３０５（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられる。
共有結合されたポリマーを有する基材のコーティング方法
【０１３１】
本明細書に開示する本発明の方法の第１の態様は、基材の表面に固定化されたポリマーコーティングの調製方法に関する。一部の実施形態では、該方法は、ポリマーを基材の表面と接触させること、ここで、該表面は複数の官能基を備えており、それにより該表面上にポリマーコーティングの層を形成することを含み、ここで、該ポリマーコーティングは該表面上の該官能基に共有結合される。一部の実施形態では、該ポリマーは、重合性物質を基材の表面上で重合させることにより、該基材の表面上にインサイチューで形成される。他の一部の実施形態では、基材の表面と接触させる前にポリマーを予備形成させる。好ましい一実施形態では、ポリマーがＰＡＺＡＭを含む。
【０１３２】
ポリマーコーティングを基材表面に固定化する方法の一部の実施形態では、ポリマーコーティングが式（Ｉ）の反復単位と式（ＩＩ）の反復単位：
【化１１】
0005859172.tif 000024
（式中：Ｒ１およびＲ１’は各々、独立して、水素、ハロ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ２およびＲ３は各々、独立して、水素、アルキル、アルキルアミノ、アルキルアミド、アルキルチオール、アリール、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は各々、独立して、Ｈ、Ｒ６、ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（Ｏ）Ｒ６、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ７Ｒ８から選択され；
Ｒ６は独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、またはその任意選択的に置換されている変形型から選択され；
Ｒ７およびＲ８は各々、独立してＨまたはアルキルから選択されるか、あるいはＲ７とＲ８が、これらが結合している原子（１個または複数）と一体に連接されて複素環を形成している）
を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、Ｒ２がＨであり、Ｒ３が任意選択的に置換されているアルキルである。一実施形態では、Ｒ３がＮ−アミド基で置換されているアルキルである。
【０１３４】
基材表面をポリマーでコーティングする方法の他の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が式（Ｉａ）：
【化１２】
0005859172.tif 000025
（式中、Ｒ１はＨまたはアルキルであり；ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、アジリジン、トリアゾリン、エポキシ、およびチオールからなる群より選択され；各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；ｏは１〜５０の整数である；ただし、Ｒ１がＨであり、ＲＡがハロである場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）
で表されるものでもある。
【０１３５】
かかる方法の一実施形態では、ｏが５であり、ＲＡがアジドである。
【０１３６】
かかる方法の別の実施形態では、Ｒ１が水素である。
【０１３７】
かかる方法のさらに別の実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８であり、式中のＲ７およびＲ８が各々、独立して、水素、アルキルまたはヒドロキシアルキルから選択される。かかる方法の具体的な一実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
【０１３８】
かかる方法の別の実施形態では、Ｒ４’が水素である。
【０１３９】
かかる方法のさらなる一実施形態では、Ｒ４’とＲ５’の両方が水素である。
【０１４０】
かかる方法のまた別の実施形態では、Ｒ４’とＲ５’の少なくとも一方がアルキル、例えばメチル基である。
【０１４１】
一部の実施形態では、ポリマーコーティングが、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）：
【化１３】
0005859172.tif 000026
（式中、Ｒ１は、Ｈまたはアルキルから選択され；ＲＡは、水素、アミン、任意選択的に置換されているアルケン、任意選択的に置換されているアルキン、オキソ−アミン、アジド、ホルミル、ハロ、ヒドロキシ、ヒドラジニル、ヒドラゾニル、塩化シアヌル、チオシアネート、カルボン酸、グリシジル、活性型エステル、アジリジン、トリアゾリン、エポキシ、およびチオールからなる群より選択され；各−（ＣＨ２）−ｏは任意選択的に置換されていてもよく；ｏは、１〜５０の範囲の整数であり；Ｒ５は、Ｈまたはアルキルから選択され；ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数であり；ｎは、１〜５０，０００の範囲の整数である；ただし、Ｒ１とＲ５がＨであり、ｏが５である場合、ＲＡはブロモ基になり得ないものとする）のポリマーを含む。一部の実施形態では、ｏが５である。
【０１４２】
一実施形態では、式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ’）のポリマーが、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
【化１４】
0005859172.tif 000027
（式中、ｎは１〜２０，０００の範囲の整数であり、ｍは１〜１００，０００の範囲の整数である）
で表されるものでもある。
【０１４３】
かかる方法の一部の実施形態では、基材の表面上の官能基が光活性化性アジドを含む。一部の実施形態では、光活性化性アジドが、任意選択的に置換されているフェニルアジド基である。このような実施形態の一部のものでは、フェニルアジドが、基材の表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される。
【０１４４】
上記の方法の一部の実施形態では、フェニルアジドを、ポリマーを基材の表面と接触させる前に光活性化させる。かかる方法の好ましい一実施形態では、官能基の光活性化によりナイトレンが生じる。かかる方法の別の好ましい実施形態では、ポリマーコーティングがナイトレン基に光活性化によって共有結合される。
【０１４５】
ポリマーコーティングを基材の表面に共有結合させる上記の方法の一部の実施形態では、基材の表面上の官能基がアルキン基を含む。
【０１４６】
ポリマーコーティングを基材の表面に共有結合させる上記の方法の一部の実施形態では、ポリマーコーティングが該官能基に触媒の存在下で共有結合される。具体的な一実施形態では、触媒が銅触媒である。一部の実施形態では、ポリマーコーティングがアルキン基に銅触媒の使用なしで共有結合される。
【０１４７】
ポリマーコーティングを基材の表面に共有結合させる上記の方法の一部の実施形態では、基材の表面上の官能基がアルケン基を含む。一部の実施形態では、アルケン基が、該アミン官能化表面をアクリロイル基と反応させることにより調製される。一部の好ましい実施形態では、該アミン官能化表面が、表面を３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で処理することにより調製される。さらに好ましい一部の実施形態では、アクリロイル基が、活性型アクリル酸エステル、アクリル酸、塩化アクリルまたはＣＯＭＵ（ＣＡＳ番号１０７５１９８−３０−９）から選択され得る。一実施形態では、活性型アクリル酸エステルがアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである。他の一部の実施形態では、アルケン基が、基材の表面を官能化シランと直接接触させることにより調製される。一部のさらなる実施形態では、官能化シランが、３−アクリルアミドトリメトキシシランまたはメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランから選択され得る。
【０１４８】
ポリマーコーティングを基材の表面に共有結合させる上記の方法の一部の実施形態では、ポリマーコーティングが該官能基に高温で共有結合される。好ましい一実施形態では、該高温が６０℃〜９０℃の範囲の任意の温度である。
【０１４９】
ポリマーコーティングを基材表面に固定化する方法の他の実施形態では、式（Ｉ）の反復単位が、式（Ｉｂ）：
【化１５】
0005859172.tif 000028
（式中、Ｒ２は、任意選択的に置換されているアリールである）
で表されるものでもある。
【０１５０】
かかる方法の一実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ２が、１個または１個より多くのハロゲンで任意選択的に置換されているフェニルアジドである。具体的な一実施形態では、Ｒ２がパーフルオロフェニルアジドである。
【０１５１】
基材表面をポリマーでコーティングする方法の別の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ１が水素である。
【０１５２】
かかる方法の一部の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＲ７Ｒ８である。具体的な一実施形態では、Ｒ４が−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である。
【０１５３】
かかる方法の他の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ５が水素である。
【０１５４】
かかる方法のさらに他の実施形態では、式（Ｉｂ）のＲ４’とＲ５’の両方が水素である。
【０１５５】
かかる方法の一部の実施形態では、重合性物質が液状形態で適用される。
【０１５６】
ポリマーコーティングを基材表面に固定化する方法の一部の実施形態では、該複数の官能基が基材の表面上に、高分子材料の重合後に複数のポリマーコート領域と複数の不活性領域が形成されるように配列される。一部の実施形態では、不活性領域が、ガラス領域、金属領域、マスク領域および格子間領域からなる群より選択される。好ましい一実施形態では、不活性領域がガラスを含む。一部の実施形態では、該複数のポリマーコート領域と該複数の不活性領域が該表面上に、パターンまたは格子が形成されるように配列される。かかるパターンまたは格子は基材の表面に対して一次元であっても二次元であってもよい。使用され得る例示的なパターン形成表面は米国特許出願第１３／４９２，６６１号および同第１３／６６１，５２４号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１５７】
基材の表面に固定化されたポリマーコーティングを調製する上記の方法の一部の実施形態では、該表面の官能基に共有結合させる前に、ポリマーコーティングを水溶液に溶解させる。一部の実施形態では、基材がビーズである。
【０１５８】
本明細書に開示する本発明の方法の第２の態様は、ポリヌクレオチドのアレイの調製方法に関する。かかる実施形態では、該方法は、（ａ）複数の第１のオリゴヌクレオチドと複数の第２のオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載の基材のいずれか１つの表面上に存在するポリマーコーティング上の反応性部位、またはポリマーコーティングを基材の表面に固定化する本明細書に記載の方法のいずれか１つによって調製されるポリマーコーティング上の反応性部位と反応させる工程；（ｂ）該ポリマーコーティングに結合された該複数の第１のオリゴヌクレオチドを、増幅対象の鋳型と接触させる工程；および（ｃ）該鋳型を第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させ、それによりポリヌクレオチドのクラスター化アレイを作製する工程を含み得る。一部の実施形態では、各鋳型が、３’末端に、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列、および５’末端に、その相補鎖が第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む。上記の方法において、第２のオリゴヌクレオチドは任意選択的である。したがって、第２のオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では存在させる必要がない。存在させる場合、第２のオリゴヌクレオチドは、ポリマーコーティングに結合させてもよく、増幅工程中（ｓｕｒｉｎｇ）に溶液状で供給してもよい。
【０１５９】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法の一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアジド基と反応するアルキン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６０】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法の他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの塩化シアヌルと反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６１】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの活性型アミン基、例えば、ヒドラジニルまたはヒドラゾニル基と反応するアルデヒド基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６２】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のまた他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのチオシアネートまたはカルボン酸基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６３】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのグリシジル基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６４】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアミン基とジ−アルデヒドリンカーによって反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６５】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの活性型エステルまたはエポキシ基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６６】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのオキソ−アミン基と反応するアルデヒド基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１６７】
ポリヌクレオチドのアレイを調製する上記の方法の好ましい一実施形態では、基材の表面上のポリマーコーティングが式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）のポリマーを含む。
【０１６８】
本明細書に開示する本発明の方法の第３の態様は、１個または１個より多くのビーズの表面上に複数の官能基を形成すること；本明細書に記載のポリマーコーティングを該ビーズと接触させ、ポリマーコーティング層を該ビーズの表面上に形成すること、ここで、該ポリマーコーティングは該ビーズの表面上の該官能基に共有結合される；およびポリマーコートされた該ビーズを基材の表面に固着させることを含む、基材の表面の調製方法に関する。一実施形態では、基材がフローセルである。一実施形態では、ポリマーコーティングがＰＡＺＡＭを含む。ポリマーコーティング層はビーズの全体を被覆しているか一部を被覆しているかのいずれかであり得る。一実施形態では、ビーズの表面上のポリマーコーティング層は約２０ｎｍの厚さを有する。一部の実施形態では、ビーズは約１．２ミクロンまたは約１．２ミクロンより小さい直径を有する。他の一部の実施形態では、ビーズは約０．５ミクロンまたは約０．５ミクロンより小さい直径を有する。好ましい一実施形態では、基材の表面がパターン形成されている。しかしながら、大型のビーズ、例えば限定されないが、約１０ミクロンもしくは約１０ミクロンより小さい、５ミクロンもしくは５ミクロンより小さい、３ミクロンもしくは３ミクロンより小さい、または２ミクロンもしくは２ミクロンより小さい直径を有するものを使用してもよい。
【０１６９】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、ビーズの表面上の官能基がアルケンを含む。一部の実施形態では、アルケン基が、ビーズの該アミン官能化表面をアクリロイル基と反応させることにより調製される。一部の好ましい実施形態では、該アミン官能化表面は、表面を３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）で処理することにより調製される。さらに好ましい一部の実施形態では、アクリロイル基が、活性型アクリル酸エステルまたは塩化アクリルから選択され得る。一実施形態では、活性型アクリル酸エステルがアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルである。他の有用なカップリング剤としては、アクリル酸、ＣＯＭＵ（ＣＡＳ番号１０７５１９８−３０−９）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が挙げられる。他の一部の実施形態では、アルケン基が、基材の表面を官能化シランと直接接触させることにより調製される。一部のさらなる実施形態では、官能化シランが、３−アクリルアミドトリメトキシシランまたはメタクリルオキシプロピルトリメトキシシランから選択され得る。一部の実施形態では、前処理したビーズを、ポリマーコーティングと接触させる前に重合抑制剤を含む溶液に曝露する。一部の実施形態では、重合抑制剤が、ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）、ジエチルヒドロキシルアミン、または（２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル（ＴＥＭＰＯ）から選択される。一部の（ｓｏｍ）好ましい実施では、ポリマーコーティングがビーズの表面上のアルケン基に高温で共有結合される。好ましい一実施形態では、該高温が６０℃〜９０℃の範囲の任意の温度である。
【０１７０】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、ビーズの表面上の官能基が光活性化性アジドを含む。一部の実施形態では、光活性化性アジドが、任意選択的に置換されているフェニルアジド基である。このような実施形態の一部のものでは、フェニルアジドが、基材の表面上のアミン基をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）と反応させることにより調製される。一部の実施形態では、フェニルアジドを、ポリマーを基材の表面と接触させる前に光活性化させる。かかる方法の好ましい一実施形態では、官能基の光活性化によりナイトレンが生じる。かかる方法の別の好ましい実施形態では、ポリマーコーティングが該官能基に光活性化によって共有結合される。
【０１７１】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、ビーズの表面上の官能基がアルキン基を含む。一部の実施形態では、ポリマーコーティングが該官能基に触媒の存在下で共有結合される。具体的な一実施形態では、触媒が銅触媒である。一部の実施形態では、ポリマーコーティングがアルキン基に銅触媒の使用なしで共有結合される。
【０１７２】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、ポリマーコートビーズは基材の表面に、該基材の表面上の開口ウェル内に負荷することにより固着される。ビーズおよびウェルは、各ウェル内に存在するビーズがわずか１個になる寸法を有するものであり得る。あるいはまた、相対寸法は、ウェル１つあたりのビーズが多数になるものであってもよい。一部の好ましい実施形態では、ポリマーコートビーズは基材の表面に、該ポリマーコーティングの官能基を該基材の表面上の官能基と反応させることにより固着される。該表面の官能基は、表面の特定の特徴、例えば、ウェルまたはパッドに存在させてもよい。あるいはまた、基材の官能基が平坦な表面全域に広がるようにしてもよい。本明細書に示した方法および組成物を用いてコートされ得るかかる表面を調製するための例示的な方法は、米国特許出願第１３／４９２，６６１号および同第１３／６６１，５２４号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一実施形態では、ポリマーコーティングの官能基がアミンを含み、基材の表面上の官能基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む。別の実施形態では、ポリマーコーティングの官能基がアジドを含み、基材の表面上の官能基がアルキンを含む。また別の実施形態では、ポリマーコーティングの官能基がチオールを含み、基材の表面上の官能基がマレイミドを含む。
【０１７３】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、該方法は、さらに、ポリマーコートビーズを、該ビーズを基材の表面に負荷する前に洗浄して過剰の未結合ポリマーコーティングを除去することを含む。一部の実施形態では、ビーズと接触させる前にポリマーコーティングを溶液に溶解させる。一実施形態では、該溶液が水溶液である。
【０１７４】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、該方法は、さらに、複数の第１のオリゴヌクレオチドと複数の第２のオリゴヌクレオチドを、ビーズのポリマーコーティング上の反応性部位と反応させること；該ポリマーコーティングに結合された該複数の第１のオリゴヌクレオチドを、増幅対象の鋳型と接触させること、鋳型の各々は、３’末端に、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列、および５’末端に、その相補鎖が第２のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし得る配列を含む；ならびに該鋳型を第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させ、それによりポリヌクレオチドのクラスター化アレイを作製することを含む。
【０１７５】
上記の方法の一部の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアジド基と反応するアルキン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１７６】
上記の方法の他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの塩化シアヌルと反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１７７】
上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの活性型アミン基、例えば、ヒドラジニルまたはヒドラゾニル基と反応するアルデヒド基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１７８】
上記の方法のまた他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのチオシアネートまたはカルボン酸基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１７９】
上記の方法のさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのグリシジル基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８０】
上記の方法のさらなる実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ジ−アルデヒドリンカーによって反応するポリマーコーティングのアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８１】
上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングの活性型エステルまたはエポキシ基と反応するアミン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８２】
上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのチオール基と反応するマレイミド基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８３】
上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのアルケン基とオレフィンのクロスメタセシスによって反応するアルケン基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８４】
上記の方法のさらに他の実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドが、ポリマーコーティングのオキソ−アミン基と反応するアルデヒド基を含む。好ましい一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドの両方がかかる基を含む。
【０１８５】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、該方法は、さらに、ポリマーコートビーズを光学画像形成剤で染色する工程を含む。一部の実施形態では、光学画像形成剤が、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８ホスフィン、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ５５０ホスフィン（ｐｈｏｓｐｉｎｅ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ６５０ホスフィン（どちらもＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、ならびに歪みアルキン色素（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，Ｉｎｃ．製のＤＢＣＯ系色素）例えば：ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ  ５２５、ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ  ５４５、ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ  ５６８、ＤＢＣＯ−Ｆｌｕｏｒ  ５８５、およびＤＢＣＯ−ＳＥＴＡ  ６５０からなる群より選択される。一実施形態では、光学画像形成剤がＤｙＬｉｇｈｔ４８８ホスフィンである。
【０１８６】
本明細書に記載の基材の表面を調製する方法の一部の実施形態では、基材が、シリコン基材、プラスチック基材、または添加剤を含浸させたプラスチック基材から選択され得る。一部のさらなる実施形態では、プラスチック基材にＳｉＯ２、ＴｉＯ２、またはカーボンブラックが含浸され得る。
【０１８７】
本明細書に示す方法には、任意のさまざまな増幅手法が使用され得る。使用され得る例示的な手法としては、限定されないが、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）が挙げられる。特定の実施形態では、増幅に使用されるプライマーの１種類または１種類より多くがポリマーコーティングに結合され得る。ＰＣＲの実施形態では、増幅に使用されるプライマーの一方または両方がポリマーコーティングに結合され得る。２種類の種の結合プライマーを用いる形式は、二本鎖アンプリコンが、コピーされた鋳型配列にフランキングする２種類の結合プライマー間に橋様構造を形成するため、多くの場合、ブリッジ増幅と称される。ブリッジ増幅に使用され得る例示的な試薬および条件は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号；米国特許出願公開公報第２００２／００５５１００号；米国特許第７，１１５，４００号；米国特許出願公開公報第２００４／００９６８５３号；米国特許出願公開公報第２００４／０００２０９０号；米国特許出願公開公報第２００７／０１２８６２４号；および米国特許出願公開公報第２００８／０００９４２０号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、ＰＣＲ増幅を、増幅プライマーの一方をポリマーコーティングに結合させ、第２のプライマーを溶液状にして行なってもよい。一方が結合プライマーと可溶性プライマーの組合せを使用する例示的な形式は、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２（２００３）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許出願公開公報第２００５／０１３０１７３号もしくは同第２００５／００６４４６０号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載のエマルジョンＰＣＲである。エマルジョンＰＣＲは該形式の例示であり、本明細書に示す方法の目的には、エマルジョンの使用は任意選択であることは理解されよう。実際、いくつかの実施形態ではエマルジョンは使用されない。さらに、ｅＰＣＲの参考文献に示されているようにプライマーを直接、固相支持体に結合させる必要はなく、代わりに本明細書に示すポリマーコーティングに結合され得る。
【０１８８】
ＲＣＡ手法は、本開示の方法における使用のために変形され得る。ＲＣＡ反応に使用され得る例示的な成分およびＲＣＡによりアンプリコンが生成される原理は、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）およびＵＳ２００７／００９９２０８Ａ１（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＲＣＡに使用されるプライマーは溶液状であっても、ポリマーコーティングに結合させてもよい。
【０１８９】
ＭＤＡ手法は、本開示の方法における使用のために変形され得る。ＭＤＡの一部の基本原理および有用な条件は、例えば、Ｄｅａｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：５２６１−６６（２００２）；Ｌａｇｅら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：２９４−３０７（２００３）；Ｗａｌｋｅｒら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９５；Ｗａｌｋｅｒら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）；ＵＳ５，４５５，１６６；ＵＳ５，１３０，２３８；およびＵＳ６，２１４，５８７（これらは各々，引用により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＭＤＡに使用されるプライマーは溶液状であっても、ポリマーコーティングに結合させてもよい。
【０１９０】
特定の実施形態では、上記に例示した増幅手法の組合せが使用され得る。例えば、ＲＣＡおよびＭＤＡは、溶液状のコンカテマーアンプリコンを生成させるためにＲＣＡを使用する（例えば、液相プライマーを使用する）組合せで使用され得る。次いで、アンプリコンは、ポリマーコーティングに結合されたプライマーを用いるＭＤＡのための鋳型として使用され得る。この例では、ＲＣＡ工程とＭＤＡ工程の併用後に生成されるアンプリコンがポリマーコーティングに結合される。
【０１９１】
本明細書に開示する本発明の方法の第３の態様は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定方法に関する。かかる実施形態では、該方法は、（ａ）ポリヌクレオチドポリメラーゼを、基材の表面に本明細書に記載のいずれか１種類のポリマーコーティングによって結合されたポリヌクレオチドクラスターと接触させる工程；（ｂ）該基材のポリマーコート表面にヌクレオチドを、ヌクレオチドの１個または１個より多くが該ポリヌクレオチドポリメラーゼによって利用されると検出可能なシグナルが発生するように備える工程；（ｃ）１つまたは１つより多くのポリヌクレオチドクラスターにおいてシグナルを検出する工程；および（ｄ）工程（ｂ）と（ｃ）を反復し、それにより、該１つまたは１つより多くのポリヌクレオチドクラスターに存在するポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含み得る。
【０１９２】
本明細書に記載の方法の一部の実施形態では、フローセル内に存在する基材の表面に結合されたポリヌクレオチドに対してヌクレオチド配列が決定される。一部の実施形態では、ポリマーコート表面がフローセルの一体部分である。他の実施形態では、ポリマーコート表面が、フローセル内に配置された別個の基材である。さらなる実施形態では、該別個の基材がフローセルの表面または他の部分にカップリング、結合または別の様式で固定されたものであり得る。
【０１９３】
核酸の配列決定は、当該技術分野で知られた異なる方法によってポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。好ましい方法の一例では、合成時解読（ＳＢＳ）を使用し、基材の表面に本明細書に記載のいずれか１種類のポリマーコーティングによって結合されたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する。かかる方法では、１個または１個より多くのヌクレオチドを、ポリヌクレオチドポリメラーゼに付随する鋳型ポリヌクレオチドに供給する。ポリヌクレオチドポリメラーゼにより、１個または１個より多くのヌクレオチドが、ポリヌクレオチド鋳型に相補的な新たに合成された核酸鎖内に組み込まれる。合成は、鋳型ポリヌクレオチドの一部分または鋳型ポリヌクレオチドの一端に共有結合させたユニバーサル核酸もしくは非可変核酸の一部分に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーにより開始される。ヌクレオチドが鋳型ポリヌクレオチドに対して組み込まれるにつれて検出可能なシグナルが発生し、これにより該配列決定プロセスの各工程中にどのヌクレオチドが組み込まれたかを調べることが可能になる。このようにして、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な核酸の配列が得られ得、それにより、鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも一部分のヌクレオチド配列の決定が可能になる。フローセルは、本開示の方法によって作製され、また、合成時解読（ＳＢＳ）またはサイクル中に試薬の反復送達を伴う他の検出手法に供されるアレイを収容するための簡便な形式をもたらす。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するため、１個または１個より多くの標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどが、本明細書に示す方法によって作製された核酸アレイを収容したフローセル内／セル中に流され得る。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドの組み込みがもたらされたアレイ内の部位が検出され得る。任意選択で、該ヌクレオチドに、さらに、ヌクレオチドがプライマーに付加したらさらなるプライマー伸長を終止させる可逆的終止特性を含めてもよい。例えば、可逆的ターミネータ部分を有するヌクレオチド類似体がプライマーに、該部分を除去するためのブロック解除剤が送達されるまで、その後に伸長が起こり得ないように付加され得る。したがって、可逆的終止を使用する実施形態では、ブロック解除試薬がフローセルに送達され得る（検出が行なわれる前または後）。この異なる送達工程間の合間に洗浄を行なってもよい。次いで、プライマーがｎ個のヌクレオチド分、伸長されるまでサイクルがｎ回反復され得、それにより配列の長さｎが検出され得る。本開示の方法によって作製されるアレイでの使用に容易に適合され得る例示的なＳＢＳ手順、流体系および検出基本型は、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７；ＵＳ７，０５７，０２６；ＷＯ９１／０６６７８；ＷＯ０７／１２３７４４；ＵＳ７，３２９，４９２；ＵＳ７，２１１，４１４；ＵＳ７，３１５，０１９；ＵＳ７，４０５，２８１、およびＵＳ２００８／０１０８０８２（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９４】
サイクル反応を使用する他の配列決定手順、例えば、ピロシーケンスも使用され得る。ピロシーケンスでは、生成中の核酸鎖に特定のヌクレオチドが組み込まれる際の無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４２（１），８４−９（１９９６）；Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１（１），３−１１（２００１）；Ｒｏｎａｇｈｉら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１（５３７５），３６３（１９９８）；ＵＳ６，２１０，８９１；ＵＳ６，２５８，５６８  およびＵＳ６，２７４，３２０（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる））。ピロシーケンスでは、放出されたＰＰｉが、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換されることにより検出され得、生成したＡＴＰのレベルがルシフェラーゼによる生成光子によって検出され得る。したがって、配列決定反応を発光検出システムによってモニタリングすることができる。蛍光系検出システムに使用される励起放射線源はピロシーケンス手順には必要でない。ピロシーケンスを本開示のアレイに適用するために使用され得る有用な流体系、検出器および手順は、例えば、ＷＯ１２／０５８０９６Ａ１、ＵＳ２００５／０１９１６９８Ａ１、ＵＳ７，５９５，８８３、およびＵＳ７，２４４，５５９（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９５】
また、ライゲーション時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応、例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１７２８−１７３２（２００５）；ＵＳ  ５，５９９，６７５；およびＵＳ  ５，７５０，３４１（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたものなども有用である。一部の実施形態は、例えば、Ｂａｉｎｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３５（３），３０３−７（１９８８）；Ｄｒｍａｎａｃら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，５４−５８（１９９８）；Ｆｏｄｏｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１（４９９５），７６７−７７３（１９９５）；およびＷＯ１９８９／１０９７７（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のハイブリダイゼーション時解読（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）手順を含み得る。ライゲーション時解読およびハイブリダイゼーション時解読のどちらの手順においても、アレイ内の部位に存在する核酸がオリゴヌクレオチドの送達と検出の反復サイクルに供される。本明細書または本明細書に挙げた参考文献に示されたＳＢＳ法のための流体系は、ライゲーション時解読またはハイブリダイゼーション時解読手順のための試薬の送達に容易に適合され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは蛍光標識され、ＳＢＳ手順に関して本明細書または本明細書に挙げた参考文献に記載のものと同様の蛍光検出器を用いて検出され得る。
【０１９６】
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法が使用され得る。例えば、ヌクレオチドの組込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ−ホスフェート−標識ヌクレオチド間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって、またはゼロモード導波管（ＺＭＷ）を用いて検出され得る。ＦＲＥＴ系配列決定のための手法および試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，６８２−６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら  Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６−１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５，１１７６−１１８１（２００８）（その開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９７】
一部のＳＢＳの実施形態は、伸長産物へのヌクレオチドの組込み時に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出プロトンの検出に基づいた配列決定には、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気的検出器および関連手法またはＵＳ２００９／００２６０８２Ａ１；ＵＳ２００９／０１２７５８９Ａ１；ＵＳ２０１０／０１３７１４３Ａ１；もしくはＵＳ２０１０／０２８２６１７Ａ１（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の配列決定法およびシステムが使用され得る。
【０１９８】
例えば本明細書に示す方法によって作製された本開示のアレイのための別の有用な適用は遺伝子発現解析である。遺伝子発現は、ＲＮＡ配列決定手法、例えば、デジタルＲＮＡ配列決定法と称されるものを用いて検出または定量され得る。ＲＮＡ配列決定手法は、上記に示したものなどの当該技術分野で知られた配列決定方法論を用いて行なわれ得る。また、遺伝子発現は、アレイへの直接ハイブリダイゼーションまたはマルチプレックスアッセイ（産物はアレイ上で検出される）の使用によって行なわれるハイブリダイゼーション手法によっても検出または定量され得る。また、例えば本明細書に示す方法によって作製された本開示のアレイは、１例または１例より多くの個体由来のゲノムＤＮＡ試料の遺伝子型を決定するためにも使用され得る。本開示のアレイにおいて行なわれ得るアレイ系発現および遺伝子型判定解析のための例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号；同第６，８９０，７４１号；同第６，９１３，８８４号もしくは同第６，３５５，４３１号または米国特許出願公開公報第２００５／００５３９８０Ａ１号；同第２００９／０１８６３４９Ａ１もしくはＵＳ２００５／０１８１４４０Ａ１（これらは各々、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１９９】
フローセルを使用する上記の方法の一部の実施形態では、１回のフロー工程中、単一の型のヌクレオチドのみをフローセル内に存在させる。かかる実施形態では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびその類似体からなる群より選択され得る。フローセルを使用する上記の方法の他の実施形態では、１回のフロー工程中、複数の異なる型のヌクレオチドをフローセル内に存在させる。かかる方法では、ヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびその類似体から選択され得る。
【０２００】
フローセル内に存在する基材の表面上のポリマーコーティングに結合された１つまたは１つより多くのポリヌクレオチドに対して各フロー工程中に組み込まれたヌクレオチド（１個または複数）の測定は、ポリヌクレオチド鋳型において、または該鋳型付近で生成されるシグナルを検出することにより行なわれる。上記の方法の一部の実施形態では、検出可能なシグナルが光学的シグナルを含む。他の実施形態では、検出可能なシグナルが非光学的シグナルを含む。かかる実施形態では、非光学的シグナルは、１つまたは１つより多くのポリヌクレオチド鋳型における、または該鋳型付近でのｐＨの変化を含む。
【実施例】
【０２０１】
実施例
実施例１
ＰＡＺＡＭの調製
総則
特に記載のない限り、反応はすべて、窒素雰囲気またはアルゴン雰囲気下で行ない、出発物質は市販の供給元（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄｏｗ）から入手し、さらに精製せずに受け取ったままの状態で使用した。記録した反応温度はすべて、反応槽と接している浴／空気の温度を示す。無水溶媒は必要でなかった。
【０２０２】
１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、重水（ＬＣ  ＮＭＲで９９．９ａｔ．％Ｄ）中で、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ４００  ＭＨｚの計器にて記録した。化学シフトは、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）の低磁場側に１００万分の１分率（ｐｐｍ，δ）で表示しており、表示した溶媒を内部標準として参照したものである。
【０２０３】
ＧＰＣ解析は、Ｓｍｉｔｈｅｒｓ  Ｒａｐｒａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄにおいて、以下のクロマトグラフィー条件：
計器：Ｍａｌｖｅｒｎ／Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｒｒａｙ  ＴＤＡ３０１（ポンプおよびオートサンプラーが付属）
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  １×ＰＬａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ  ４０＋１×ＰＬａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ  ６０，３０ｃｍ，１３μｍまたはＡｇｉｌｅｎｔ  ＰＬａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ  Ｇｕａｒｄ＋２×ＰＬａｑｕａｇｅｌ−ＯＨ  Ｍｉｘｅｄ，３０ｃｍ，８μｍ
溶離剤：０．２Ｍ  ＮａＮＯ３；０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ＝７．０に調整）
流速：１．０ｍＬ／分（公称）
温度：３０℃（公称）
検出器：圧力差および直角光散乱を伴う屈折率
を用いて行なわれた。
データは、Ｍａｌｖｅｒｎ／Ｖｉｓｃｏｔｅｋ「ＯｍｉｎＳｅｃ」ソフトウェアを用いて収集し、解析した。
フォトルミネセンス分光法
【０２０４】
蛍光の測定はＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ）で行ない、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬソフトウェアを用いてデータを処理した。
【０２０５】
薄膜を、解析のために適切に調製した清浄Ｓｉまたはガラス基材を、いずれかのスピンコーティングフロー法を用いたコーティングによる分析について調製した。蛍光性の相補オリゴ体とハイブリダイズした乾燥グラフト化膜のフォトルミネセンススペクトルをＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）にて収集した。
合成
【０２０６】
本明細書に記載のポリマーコーティングは異なる様式で調製され得る。式（ＩＩＩａ）のポリマーの合成方法の一例をスキーム１Ａに示す。
【化１６】
0005859172.tif 000029
【０２０７】
Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）（１ｃ）の合成は米国特許出願公開公報第２０１１／００５９８６５号に記載されており、その開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
水溶性アクリルアミドポリマー（ＰＡＺＡＭ）を化学的開始型フリーラジカル重合によって調製した。粗製ポリマーを連続析出によって精製し、３００〜４００ｋＤａの数平均分子量を有するＰＡＺＡＭを得た。より広範囲、例えば３０〜６００ｋＤａの範囲の平均分子量も得られ得る。
【０２０９】
アクリルアミド（５．０ｇ，７０．３ｍｍｏｌ）を脱イオンＨ２Ｏ（４５ｍＬ）に溶解させ、混合物を充分にボルテックスして確実に完全に溶解させた。別のフラスコ内で、ＢＲＡＰＡ（１．０ｇ，３．６１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ、９．４４ｇ）に添加し、得られた混合物を充分にボルテックスし、溶解を補助した。次いで、このＢＲＡＰＡ溶液（９．２５ｇ，または９．８０ｍＬ）、アクリルアミド水溶液（４７．５ｍＬ）および水（１９０ｍＬ）の混合物を合わせ、５分間撹拌した。次いで、この溶液を０．２μｍのＷｈａｔｍａｎフィルターに通して濾過した。
【０２１０】
過硫酸カリウム（１２５ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を水（２．５ｍＬ）に添加し、混合物をボルテックスして溶解させた。アジ化ナトリウム（１１．５ｇ，１７７ｍｍｏｌ）を脱イオン水（８２．９ｍＬ）に添加し、溶液をボルテックスして溶解させた（ＮａＮ３の終濃度（粗製ポリマーミックス中）は０．５３Ｍであり、これは、利用可能なＢＲＡＰＡに対して５０倍過剰のＮａＮ３に相当する）。
【０２１１】
ＢＲＡＰＡ／アクリルアミドプレミックス（約２５０ｍＬ）に、プラスチックピペットを用いてアルゴンを２０分間パージした。このモノマー混合物に、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（無希釈，２７３μＬ）と過硫酸カリウム（５０ｍｇ／ｍＬ；２３７０μＬ）を添加した。混合物を撹拌し、３５℃まで１．５時間加熱し、次いで、室温まで放冷した。撹拌を維持しながら、Ｃｈａｉｎｇｕａｒｄ  Ｉ−１５（１３９０μＬ）を粗製混合物に添加した後、２．０３Ｍアジ化ナトリウム溶液（８２．９ｍＬ）を添加した。重合中に発生した残留ラジカル（あれば）を確実に完全にクエンチするため、混合物中で空気を１０分間、起泡させた。クエンチしたポリマー混合物を６５℃で２時間撹拌した。次いで混合物を室温まで冷却し、この状態（４℃で）長期間保存され得た。
【０２１２】
粗製混合物（約３３５ｍＬ）を、穏やかな撹拌を維持しながら大過剰（約１．５Ｌ）のＩＰＡに滴下した。ポリマーが白色固形物として析出し、これを収集し、ポンプで乾燥させた。部分乾燥ポリマー（約１０ｇ）を、溶解を補助するために混合物を室温で少なくとも１時間撹拌することにより、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）に再溶解させた。次いで、撹拌を維持しながら、ビスコース溶液を１．５ＬのＩＰＡに滴下した。固形物を真空濾過し、次いで高真空を用いて乾燥させ、ＰＡＺＡＭを白色固形物として得た（約５．６ｇ，＞９５％）。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図１Ａに示す。
【０２１３】
ＧＰＣ（０．２Ｍ  ＮａＮＯ３；０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ＝７．０に調整）；１３０，０００のピーク分子量を有する狭いプルラン多糖の分布を用いて較正、固有粘度０．５１１、および０．１Ｍ硝酸ナトリウム中での屈折率の差は０．１４７ｍＬ／ｇ。屈折率の差（ｄｎ／ｄｃ）の値０．１９１ｍＬ／ｇを用いて試料の分子量データをコンピュータ計算）：Ｍｎ＝３．１５×１０５Ｄａ，Ｍｗ＝１．０×１０６Ｄａ，Ｍｗ／Ｍｎ＝３．２（図１Ｂ参照）。ポリマーは多モードのＭＷ分布を有するものであった。ＰＡＺＡＭ試料は、クロマトグラフィー解析を開始する前にフィルター処理するのは困難であり、広範な重量分布に寄与し、不自然な測定結果をもたらし、解析の複雑度を増大させるものであった。次いで、乾燥ＰＡＺＡＭを水に、所望の濃度、典型的には０．０１〜１２％ｗ／ｖまで再溶解させ得る。
線状ＰＡＺＡＭの調製
【０２１４】
択一的に、線状ＰＡＺＡＭ（ＩＩＩｂ）の合成をスキーム１Ｂに示す。
【化１７】
0005859172.tif 000030
【０２１５】
１ｄ／アクリルアミドプレミックスの調製：１ａ（９１５ｍｇ）、アジ化ナトリウム（２３６ｍｇ）およびＤＭＦ（９ｍＬ）を、撹拌バーを備えた２５ｍＬ容丸底フラスコ内で一緒に混合した。フラスコをＤｒｙＳｙｎ浴中に入れ、溶液を窒素雰囲気下で撹拌しながら３５℃（浴温度）で２時間加熱し、１ｄを形成した。アクリルアミド（４．７８ｇ）を脱イオン水に溶解させ、得られた１ｄ溶液をアクリルアミド溶液に添加し、ぐるぐる回して混合した。反応混合物を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０２１６】
１Ｌ容フランジ付フラスコを、撹拌器／加熱板上の１Ｌ容ＤｒｙＳｙｎ浴中にセットアップし、フラスコの蓋を閉じた。フラスコに撹拌器のグランドによっていかり形状の撹拌パドルを備え付け、この撹拌パドルをオーバーヘッドスターラーに連結させた。フラスコの蓋のクイックフィット式ジョイントの１つに空気冷却器を取り付け、窒素マニホールドに連結したチューブアダプタ（この時点ではガス流なし）を空気冷却器上面に取り付けた。濾過した反応混合物溶液をセットアップしたフラスコに移し、窒素マニホールドに取り付けた５ｍＬ容ストリペットを用いて溶液中で窒素を３０分間起泡させ、この間、反応混合物を３５℃（浴温度）まで予備加熱した。
【０２１７】
粗製ＰＡＺＡＭポリマー溶液の調製：アクリルアミド／１ｄプレミックスの脱気を進行させながら、過硫酸カリウム（１１９ｍｇ）を脱イオン水（２．４ｍＬ）にボルテックスしながら溶解させた。空気冷却器上面の窒素流のスイッチをオンにし、脱気した反応混合物の上部に確実に窒素が流れるようにした。脱気プロセス後、２００ｒｐｍで撹拌しながらＴＥＭＥＤ（９９μＬ）を反応混合物に添加した。次いで、この撹拌反応混合物に過硫酸カリウム溶液を添加し、重合を開始させた。撹拌を２００ｒｐｍで、窒素下、３５℃（浴温度）にて１．５時間継続した。
【０２１８】
重合のクエンチ：重合反応を進行させながら、ＩＰＨＡ．ＨＣｌ溶液を、ＩＰＨＡ．ＨＣｌ（３１２ｍｇ）を脱イオン水（２．８０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。重合反応を１．５時間進行させたら、空気冷却器上面から窒素ラインをはずし、反応槽を大気中に開放した。この撹拌反応混合物中に水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）を添加した後、調製したＩＰＨＡ．ＨＣｌ溶液を添加して重合をクエンチした。クエンチした反応混合物を２００ｒｐｍで、３５℃（浴温度）にてさらに３０分間撹拌した。
【０２１９】
ＰＡＺＡＭポリマー精製：粗製混合物をストリペットによって撹拌２−プロパノール（７５０ｍＬ）にゆっくり添加し、撹拌をさらに１時間継続した。溶媒をデカンテーションし、アジ化ナトリウム含有廃棄物として廃棄した。析出したポリマーを押し潰して内包溶媒を絞り出した。このポリマーを脱イオン水（１５０ｍＬ）に再溶解させ、ポリマー溶液をストリペットによって撹拌２−プロパノール（７５０ｍＬ）にゆっくり添加し、撹拌をさらに１時間維持した。溶媒を再度デカンテーションし、アジ化ナトリウム含有廃棄物として廃棄した。析出したポリマーを押し潰して内包溶媒を絞り出した。得られたポリマーを高真空下、デシケータ内で１８時間乾燥させ、次いで、風袋計測したラベル付き容器に移し、暗所で室温にて保存した。
軽度に架橋させたＰＡＺＡＭの調製
【０２２０】
同様にして、軽度に架橋させたＰＡＺＡＭを一般合成スキーム１Ｂに従い、本明細書に記載の変形手順を用いて調製した。
【０２２１】
１ｄ／アクリルアミドプレミックスの調製：１ａ（９１５ｍｇ）、アジ化ナトリウム（１０６ｍｇ）とＤＭＦ（９ｍＬ）を、撹拌バーを備えた２５ｍＬ容丸底フラスコ内で一緒に混合した。フラスコをＤｒｙＳｙｎ浴中に入れ、溶液を窒素雰囲気下で撹拌しながら３５℃（浴温度）で２時間加熱し、１ｄを形成した。アクリルアミド（４．７８ｇ）を脱イオン水に溶解させ、得られた１ｄ溶液をアクリルアミド溶液に添加し、ぐるぐる回して混合した。反応混合物を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０２２２】
１Ｌ容フランジ付フラスコを、撹拌器／加熱板上の１Ｌ容ＤｒｙＳｙｎ浴中にセットアップし、フラスコの蓋を閉じた。フラスコに撹拌器のグランドによっていかり形状の撹拌パドルを備え付け、この撹拌パドルをオーバーヘッドスターラーに連結させた。フラスコの蓋のクイックフィット式ジョイントの１つに空気冷却器を取り付け、窒素マニホールドに連結したチューブアダプタ（この時点ではガス流なし）を空気冷却器上面に取り付けた。濾過した反応混合物溶液をセットアップしたフラスコに移し、窒素マニホールドに取り付けた５ｍＬ容ストリペットを用いて溶液中で窒素を３０分間起泡させ、この間、反応混合物を３５℃（浴温度）まで予備加熱した。
【０２２３】
粗製ＰＡＺＡＭポリマー溶液の調製：アクリルアミド／１ｄプレミックスの脱気を進行させながら、過硫酸カリウム（１１９ｍｇ）を脱イオン水（２．４ｍＬ）にボルテックスしながら溶解させた。空気冷却器上面の窒素流のスイッチをオンにし、脱気した反応混合物の上部に確実に窒素が流れるようにした。脱気プロセス後、２００ｒｐｍで撹拌しながらＴＥＭＥＤ（９９μＬ）を反応混合物に添加した。次いで、この撹拌反応混合物に過硫酸カリウム溶液を添加し、重合を開始させた。撹拌を２００ｒｐｍで、窒素下、３５℃（浴温度）にて１．５時間継続した。
【０２２４】
重合のクエンチおよびアジド溶解（ａｚｉｄｅｌｙｓｉｓ）：重合反応を進行させながら、ＩＰＨＡ．ＨＣｌ溶液を、ＩＰＨＡ．ＨＣｌ（３１２ｍｇ）を脱イオン水（２．８０ｍＬ）に溶解させることにより調製した。また、アジ化ナトリウム溶液を、５７５ｍｇのアジ化ナトリウムを８ｍＬの脱イオン水に溶解させることにより調製した。重合反応を１．５時間進行させたら、空気冷却器上面から窒素ラインをはずし、反応槽を大気中に開放した。蓋からストッパーの１つをはずし、この撹拌反応混合物中に水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ）を添加した後、調製したＩＰＨＡ．ＨＣｌ溶液を添加して重合をクエンチした。次いで、この撹拌反応混合物にアジ化ナトリウム溶液を添加した。クエンチした反応混合物を６５℃（浴温度）まで加熱し、温度を維持しながら、撹拌を２００ｒｐｍでの撹拌で２時間継続した。
【０２２５】
ＰＡＺＡＭポリマー精製：粗製混合物をストリペットによって撹拌２−プロパノール（７５０ｍＬ）にゆっくり添加し、撹拌をさらに１時間継続した。溶媒をデカンテーションし、アジ化ナトリウム含有廃棄物として廃棄した。析出したポリマーを押し潰して内包溶媒を絞り出した。このポリマーを脱イオン水（１５０ｍＬ）に再溶解させ、ポリマー溶液をストリペットによって撹拌２−プロパノール（７５０ｍＬ）にゆっくり添加し、撹拌をさらに１時間維持した。溶媒を再度デカンテーションし、アジ化ナトリウム含有廃棄物として廃棄した。析出したポリマーを押し潰して内包溶媒を絞り出した。得られたポリマーを高真空下、デシケータ内で１８時間乾燥させ、次いで、風袋計測したラベル付き容器に移し、暗所で４℃にて保存した。
【０２２６】
軽度に架橋させたＰＡＺＡＭの１Ｈ  ＮＭＲは、１００μＬのＤ２Ｏと５００μｌのポリマー水溶液（３％）の混合物で取得した（図１Ｃ参照）。
実施例２
ＰＡＺＡＭ誘導体の調製
【０２２７】
ＰＡＺＡＭの誘導体の合成をスキーム２に示す。まず、ＢＲＡＰＡ（１ｃ）をｔ−Ｂｏｃ保護ヒドロキシルアミン（２ａ）と反応させて中間体（２ｂ）を形成し、これをジクロロ酢酸で処理し、ＰＡＺＡＭのオキソ−アミン誘導体（２ｃ）を形成する。続いて、２ｃにアルデヒド官能化オリゴヌクレオチドがグラフト化され、２ｄが形成され得る。
【化１８】
0005859172.tif 000031
実施例３
ポリマーコーティング
ガラス基材／フローセル上のＰＡＺＡＭコーティング
【０２２８】
ＰＡＺＡＭ水溶液をガラス、プラスチックまたはシリコン基材上に成膜した。続いて、このコーティングをグラフト化させ（アルキン官能化オリゴヌクレオチドを使用）、このグラフト化表面に相補的な色素をハイブリダイズさせた。図２Ａおよび２Ｂ参照。典型的な蛍光スキャンを図２Ｂに示す。次いで、異なる濃度のプライマー（アルキンオリゴヌクレオチド）を用いてポリマーをグラフト化させ、ほぼ標準的なオリゴヌクレオチドプライマー密度（約１５０００プライマー／μｍ２）の４つのレーンと高プライマー密度（約５００００プライマー／μｍ２）の４つのレーンを含む表面を得た。プライマー密度は、選択されるグラフト化プライマー濃度にもよるが、２５００〜１×１０６プライマー／μｍ２の範囲であり得る（図２Ａ）。
【０２２９】
ＰＡＺＡＭを用いてコートしたＨｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ガラスフローセルのＴｙｐｈｏｏｎスキャンを図３Ａに示す。ポリマー表面を、この手法を用いて得られ得るプライマー密度（プライマー／μｍ２）の範囲を示す漸増濃度のプライマー（アルキンオリゴヌクレオチド）を用いてグラフト化した（図３Ｂ）。
【０２３０】
図４Ａは、ＰＡＺＡＭを用いてスピンコートしたガラス基材のＴｙｐｈｏｏｎスキャンを示す。次いで、Ｇｅｎｏｍｅ−Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）内に適合するサイズのフローセルをウェハを用いて製作した。図２Ａおよび２Ｂに記載のとおりに、次いで、ポリマー表面を、このアプローチによってスピンコート表面上で得られ得るプライマー密度（プライマー／μｍ２）の範囲を示す漸増濃度のプライマー（アルキンオリゴヌクレオチド）を用いてグラフト化した（図４Ｂ）。
【０２３１】
フローコートしたＰＡＺＡＭ表面により種添加ＤＮＡ鋳型の増幅が補助され得た。図５Ａは、標準ＳＦＡチャネル（レーン１）の鋳型から成長したＤＮＡクラスターが、ＰＡＺＡＭコートチャネル内のものと同一であったことを示す。クラスターは、ｃＢｏｔ．２８サイクルクラスター増幅（ａｐｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（［ＰｈｉＸ］＝１ｐＭ，短鎖鋳型，８０ｂ．ｐ．）を用いて成長させ、次いで、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。結果により、このアプローチにより、ブリッジ増幅が補助され得る頑健な表面が得られることが示された（図５Ｂおよび図５Ｃ）。
【０２３２】
図６Ａおよび６Ｂは、スピンコートＰＡＺＡＭ表面上のＤＮＡクラスターを示す。この図は、スピンコートＰＡＺＡＭ表面により種添加ＤＮＡ鋳型の増幅が補助され、標準ＳＦＡ表面上で観察されたものと同様のクラスターを得ることができたことを示す。クラスターの典型的な画像をＭａｎｔｅｉａ（２０×対物鏡，１ｍＪ露光）を用いて取得し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した（図６Ｃ）。
ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）成膜
材料および設備
【０２３３】
（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（９７％）（ＡＰＴＭＳ）とイソプロパノール（解析等級試薬）（ＩＰＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ、４％ｗ／ｖ溶液）およびアスコルビン酸ナトリウム（ＮａＡｓｃ）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。洗浄液用に５０％ＩＰＡ水溶液を調製した。Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ）はＷｅｂｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。２％ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）ｗ／ｖ水溶液は自社で調製した。希釈は、３５℃にて一晩のハイブリダイゼーションで行なった。リン酸カリウムバッファー（１０ｍＭ水溶液，ｐＨ＝７）（ＫＰｉ）ならびに塩素酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム溶液（ＳＳＣ）は自社で調製した。フローセルの清浄は、Ｅｍｉｔｉｅｃｈ  Ｋ１０５ＯＸ酸素プラズマアッシャー（ｐｌａｓｍａ  ａｓｈｅｒ）を用いて行なった。スルホ−ＨＳＡＢおよびＰＡＺＡＭの溶液の成膜にはＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ）を使用した。スルホ−ＨＳＡＢとＰＡＺＡＭとの光化学反応にはＵＶＰ  ＸＸ−Ｓｅｒｉｅｓ  ＵＶ  Ｂｅｎｃｈ  Ｌａｍｐを使用した。光化学反応によってフローセルに伝達されたＵＶ出力のモニタリングにはＯｐｈｉｒ  ＰＤ３００−ＵＶ光ダイオードセンサー（２０ｐＷ−３００ｍＷ）を使用した。
方法
【０２３４】
そのままのフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）をプラズマアッシャー内に１００Ｗで１０分間入れた。次いで、清浄なガラス基材を蒸着によってシラン処理した。真空デシケータ内で、フローセルのポートを１００μＬの無希釈ＡＰＴＭＳを内包した２本の開口ガラスバイアル上面に配置した。デシケータを真空下に配し、６０℃で一晩インキュベートした。真空デシケータから取り出したら、フローセルをＭＪ上に設置し、ＫＰｉ（１０ｍＭ）で７５μＬ．分−１で２分間プライマー処理した。次いで、２１．１ｍＭのスルホ−ＨＳＡＢ溶液（１０ｍＭ  ＫＰｉ中）を１００μＬ．分−１で２分間流した。静的インキュベーションを暗所にて、室温で１．５時間行なった。次いで、続けて洗浄を脱イオン水、５０％ＩＰＡ溶液および脱イオン水で、それぞれ１００μＬ．分−１で２分間行ない、確実にフローセルのチャネル内への空隙の導入がないようにした。次いで、２％ＰＡＺＡＭ溶液をチャネル内に１００μＬ．分−１で１分間流し入れ、確実にフローセルのチャネル内への空隙の導入がないようにした。ＭＪから取り出したら、フローセルにＵＶランプを用いてＵＶ照射した。ＵＶ源とフローセルの間隔は１ｃｍにした。露光時間を面積１平方センチメートルあたり１５Ｊがフローセルに伝達されるように調整した。次いで、フローセルを、続けて脱イオン水、５０％ＩＰＡ、脱イオン水およびＫＰｉ（１０ｍＭ）で、それぞれ１００μＬ．分−１で２分間洗浄した。次いで、フローセルを、アルキンオリゴヌクレオチド（ＫＰｉ（１０ｍＭ）中）をＰＭＤＥＴＡ、硫酸銅およびＮａＡｓｃ（５００ｍｇ．ｍＬ−１水溶液）と６０℃で３０分間反応させることにより官能化した。表面上のアルキンオリゴヌクレオチドの存在を、アルキンプライマーの５’末端を蛍光色素で官能化した相補配列オリゴヌクレオチドで染色することにより確認した。
結果
【０２３５】
蛍光の検出は、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ蛍光スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行なった。典型的な画像（図７Ｂ）およびチャネルに沿った強度の中央値を示すグラフ（図７Ａ）を示す。
【０２３６】
２×２６サイクルの実行をＨｉＳｅｑ  ２．６ｍｍフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行なった。最初の基本報告では、クラスターがすべてのレーンで検出されることが示された（図８Ａ〜図８Ｃ参照）。２６サイクル後、ＰＡＺＡＭでコートしたチャネル内にクラスターはまだ存在していた。また、結果により、ＰＡＺＡＭクラスターがＩｌｌｕｍｉｎａペアエンドプロトコルで配列決定され得ることも示され、５２サイクル（すなわち、２６サイクルのペア）にデータを返した。図８Ｄ〜図８Ｉ参照。
固相基材上へのＰＡＺＡＭのスピンコーティング
【０２３７】
典型的な実験において、パターン形成ガラス基材をまず、プラズマアッシャー（Ｅｍｉｔｉｅｃｈ  Ｋ１０５ＯＸ）内で１００Ｗにて５分間アッシング（ａｓｈｉｎｇ）することにより清浄にした。清浄後、基材を、真空デシケータ内の０．５ｍＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）を含む開口バイアル内に入れることによりシラン処理した。デシケータを減圧下に配し、６０℃で１時間インキュベートした。シラン処理後、デシケータを開放し、基材を取り出した。次いで、基材を表を下にして、５ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＳＨＳＡＢ）（１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＫＰｉ），ｐＨ７．０中）の溶液を入れたペトリ皿に入れた。室温で１時間後、基材を水ですすぎ洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させた。基材をスピンコーターに設置し、２％ｗ／ｖのＰＡＺＡＭ水溶液を基材上にピペットで載せた。スピンコーティング後、基材に即座に３６５ｎｍのＵＶ放射線（ＵＶＰ，ランプＸＸ１５Ｌ）を３０分間照射した。次いで、表面を水で充分にすすぎ洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。カバースリップで密封後、次いで、アルキンオリゴヌクレオチド（３×１０−９モル）（１０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．０（１．４２９ｍＬ）中）と、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，１３．１４ｕＬ，６．３×１０−５モル）、硫酸銅（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ，４％ｗ／ｖ溶液，７．４９μＬ，１．２×１０−６モル）およびアスコルビン酸ナトリウム（４．７５μＬの５００ｍｇ／ｍＬ水溶液，１．２×１０−５モル）とともに６０℃で３０分間反応させることにより表面を官能化した。表面上のアルキンオリゴヌクレオチドの存在を、５’末端を蛍光テキサスレッド色素で官能化した相補配列オリゴヌクレオチドで染色することにより確認した。図７Ａに示すように、蛍光シグナルは、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ蛍光スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンすることにより検出され得た。
【０２３８】
図９は、相補的な蛍光オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているアルキンオリゴ体で官能化したスピンコート基材を示す。暗色はスピンコートポリマー層上のオリゴヌクレオチドの存在を示す。
実施例４
アルキン官能化表面の調製
【化１９】
0005859172.tif 000032
【０２３９】
本明細書に記載のように、異なる官能基がポリマーロッキングに使用され得る。スキーム３は、アルキン官能化表面の調製のための異なる提案合成経路を示す。
【０２４０】
択一的なアプローチは、光活性カップリング剤Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）の使用を伴うものである。Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢは、光活性アリールアジドと活性型ＮＨＳ単位で構成された市販の二官能性架橋剤である。ＵＶ光（約２５０〜３７４ｎｍ）に露光されると、アリールアジドにより窒素の放出を伴ってナイトレンが生成する。この高度に反応性の種によりさまざまな高速挿入反応が行なわれ得る。
実施例５
光活性表面の調製
【化２０】
0005859172.tif 000033
【０２４１】
スキーム４は、光活性表面を調製するための経路を示す。表面をＡＰＴＳ（メトキシまたはエトキシシラン）で前処理し、焼成し、アミン基の単層（または多層）を形成する。次いで、アミン基をスルホ−ＨＳＡＢと反応させ、アジド誘導体を形成する。１〜３０Ｊ／ｃｍ２のエネルギーを用いた２１℃でのＵＶ活性化により活性ナイトレン種が生成し、これにより、ＰＡＺＡＭを用いたさまざまな挿入反応が容易に行なわれ得る。
【０２４２】
最初の所見では、光活性表面および精製ＰＡＺＡＭ混合物の使用を伴うこのアプローチは、標準的なＧＡフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）をコートするために使用され得、得られるコーティングはクラスターの成長に使用され得ることが示されている。さらに、ポリマーは、調製した光活性ウェハ上に同様の結果を伴って成膜され得る（例えば、スピンコーティング、浸漬（ｄｕｎｋｉｎｇ）、浸漬（ｄｉｐｐｉｎｇ）、噴霧などにより）。コートされたＰＡＺＡＭ混合物（上記のスキーム４に記載のようにして誘導）は配列決定がなされたものであり、実行のまとめを以下に詳述する。
択一的架橋剤
【０２４３】
また、スルホ−ＨＳＡＢに加え、他の３種類の架橋剤の光安定性および効率もスクリーニングし、スルホ−ＨＳＡＢと比較した。
【化２１】
0005859172.tif 000034
【０２４４】
択一的架橋剤を、標準的なフロープロセスを使用し、ＧＡフローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてスクリーニングした。試験対象（ｔｅｔｅｄ）架橋剤には、Ｓｕｌｆｏ−ＨＳＡＢ、ジアジリン、ＢＢＡおよびＡＴＦＢを含める。カップリング反応を約２０ｍＭの濃度のＤＭＦ中で２０℃にて行なった。ＡＰＴＥＳ成膜後、アミノシラン官能化フローセルの交互のレーンを各橋かけ剤の２０ｍＭ水性／ＤＭＦ溶液で処理した。チャネルをスルホ−ＨＳＡＢ対照チャネルと同一時間インキュベートした。連続洗浄、ＰＡＺＡＭコーティングおよび表面へのポリマーロッキングのためのＵＶ露光後、レーンに本発明者らの標準プライマーオリゴヌクレオチドをグラフト化し、相補的な蛍光オリゴヌクレオチド配列で染色した。テキサスレッドハイブリダイゼーション後の結果を図１０Ａおよび１０Ｂにまとめる。
【０２４５】
３種類の択一的橋かけ剤の性能を、ハイブリダイズした相補オリゴヌクレオチドの蛍光シグナルをＴｙｐｈｏｏｎ画像形成装置を用いて測定することにより評価した。結果は、測定された表面プライマー密度がスルホ−ＨＳＡＢで記録されたものの半分より低いことが明らかであった。これらの光活性橋かけ剤（スルホ−ＨＳＡＢを含む）のいずれかで、コートされたポリマーとの共有結合を形成するための挿入機構がおそらく熱的に誘起され得る。
実施例６
不飽和表面の調製およびＰＡＺＡＭの熱架橋
【０２４６】
ポリマーロッキングのための別の択一的なアプローチはＰＡＺＡＭの熱的架橋であり、これは、基材の表面をアルケンなどの不飽和基で官能化することを含む。スキーム５は、アルケン官能化表面を作製するためのいくつかの合成経路を示す。
【化２２】
0005859172.tif 000035
【０２４７】
基材の表面をまず、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）（５ａ）で処理し、アミン官能化表面を形成した。次いで、アミン官能基を塩化アクリロイル（５ｂ）または活性型アクリロイルＮＨＳエステル（５ｃ）と反応させた。続いて、ＰＡＺＡＭを不飽和表面に、フローセル内への１〜２％ＰＡＺＡＭ水溶液のポンプ輸送、または開放ガラススライドの上面へのスピンコーティングのいずれかによって導入した。フローセル内にポンプ輸送される水溶液中に存在させるＰＡＺＡＭの量は、例えば０．１〜１０％であり得る。基材を高温で、典型的には６０℃でインキュベートした。このプロセスで、ＰＡＺＡＭのアジド基を表面上の不飽和アルケン基と反応させた。このプロセスは、Ｋｒｕｌｌｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ（１９９７），８：３０８７−３８２０（これは引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提案されているような異なる機構を伴うものであってもよい。
【０２４８】
水または水性バッファーで洗浄して過剰の未反応ＰＡＺＡＭを除去した後、表面は核酸プライマーにグラフト化され得る。他の下流プロセス、例えばＱＣまたはクラスター成長にはすべて、標準的な手法が使用され得る。該表面は、ＵＶ活性化によるポリマーロッキングと同様の性能特性を有する。例えば、該表面には、異なるプライマー密度を得るために異なる濃度のグラフト化プライマーがグラフト化され得る。また、該表面を脱水、保存し、乾燥および再水和し、活性表面の処理能力を維持してもよい（図１２参照）。
実施例７
クラスター化および配列決定におけるポリマーコーティングの適用
【０２４９】
図８Ａ〜Ｉにおいて、２×２６サイクルの実行をＰＡＺＡＭコートＨｉＳｅｑ  フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて行なった。最初の基本報告では、クラスターがすべてのレーンで検出されることが示された。また、２６サイクル後、ＰＡＺＡＭクラスターはまだ存在していた。ＰＡＺＡＭクラスターはペアエンド読み値で終了し、完全な５２サイクル（すなわち、２６サイクルのペア）にデータを返した。
【０２５０】
また、熱的架橋法によって調製されるポリマーコート表面は、本明細書に記載の標準的な方法を用いたクラスター成長および配列決定に対しても活性である。図１３Ａは、ＰｈｉＸ  Ｖ３を鋳型として有する熱的架橋表面上で成長させたクラスターを示す（Ｈｉ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）での画像）。図１３Ｂは、慣用的な配列決定化学反応を用いたＨｉ−Ｓｅｑでの２×２６サイクル実行により得られた配列決定メトリックスを示す。
実施例８
パターン形成におけるポリマーコーティングの適用
【０２５１】
通常のフローセルのコーティングに加え、光活性層の作製は、パターン形成表面を形成するためにも使用され得る。微細加工手法は、不活性または不動態材料の「海」にアミノ官能部の「島」を作出するために一般的に使用され得る。
【０２５２】
スルホ−ＨＳＡＢなどのアリールアジドは、アミノコア上に存在させてパターン形成光活性層が作出され得る。この表面をＰＡＺＡＭなどのポリマー混合物でコーティングした後、ＵＶ露光し、続いて洗浄すると、ポリマー−パターン形成アレイが得られる。このプロセスを図１１Ａに示す。
【０２５３】
橋かけ剤はパッチ内のみに存在させるため、バックグラウンド領域は光結合したポリマーがないままである。ラジカル挿入反応は表面の単層に限定され、制御不能なラジカルの伝播が最小限になる。また、シランとホスフェート単位で官能化したアリールアジドも市販の出発物質から容易に入手され得、多種多様なパッチ型に固定することが可能である（図１１Ａ参照）。露出ガラス特徴と金格子間領域を有するスライドを用いて、官能化特徴パッチ内で優先的なポリマー成膜が観察された（図１１Ｂ）。右側はＭａｎｔｅｉａ蛍光画像を示し、左側はスライドのＴｙｐｈｏｏｎ画像を示し、暗い領域ほどポリマーコーティングが多いことを示す。
【０２５４】
同様に、熱的架橋法により、下層の官能層がパターン形成されている場合での官能性ポリマーのパターン形成パッチの形成も可能である。例えば、パターン形成アミノシランのパッチは、一般液なリソグラフィー手法を用いて調製され得る。典型的には、これは、基材をレジストでコーティングし、次いで、露光してレジストを現像し、基材上に露出パッチを残すことを伴う。次いで、この露出パッチをシランで官能化した後、レジスト塊を除去すると、後に非官能性基材のバルク格子間を有するアミノ官能化基材の小型パッチが残る。次いで、このパッチは、スキーム５に示すようにして不飽和アルケン基で官能化され、次いでＰＡＺＡＭとともにインキュベートされ得る。得られる表面は予め画定された格子状のＰＡＺＡＭの小型パッチを含み、次いで、これにより画定パターン形成アレイ上でのクラスター成長が補助され得る。図１４において、上記のようにして作製した表面により、パターン形成領域上で選択的にブリッジ増幅補助されることが示される。特徴は直径が４５０ｎｍであり、ピッチは１．４μｍである。クラスターは、１ｐＭのヒトＤＮＡ鋳型を有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｖ３  ＰＥ  ｃＢｏｔキットを用いて成長させた。増幅後、表面をＳｙｂｒ  ｇｒｅｅを用いて画像化した。
【０２５５】
パターン形成表面を作製するための使用され得る他の方法としては、例えば、米国特許出願第１３／４９２，６６１号および同第１３／６６１，５２４号（これらは各々、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられる。
実施例９
ＰＡＺＡＭでのビーズのコーティング
【０２５６】
ビーズへのポリマーコーティングの適用には異なる方法が使用され得る。本明細書に記載のアプローチの一例は、ポリマーロッキングのためにＵＶ活性化性表面の使用を含む。実施例１１に記載の択一的なアプローチは、ポリマーの熱的架橋のためにアルケンまたはアクリルアミド官能化表面の使用を含む。熱系アプローチでは、ビーズは、一般的に、アルケンまたはアクリルアミド基での官能化後、重合抑制剤（例えば、ＢＨＴ、ジエチルヒドロキシルアミン、またはＴＥＭＰＯなど）を含む洗浄溶液に曝露される。これは、該アルケンまたはアクリルアミド基の早期重合によりビーズが凝集するのを抑制するために行なわれ得る。
【０２５７】
ビーズ上でＰＡＺＡＭをコーティングした後、ビーズを洗浄して過剰の未結合ＰＡＺＡＭを除去した。洗浄後、ＰＡＺＡＭ層は約２０ｎｍ厚であった。次いで、ビーズを、ＰＡＺＡＭ上のアジド基と５’アルキン修飾オリゴヌクレオチドとの反応によってプライマー（Ｐ５／Ｐ７のミックス）にグラフト化させた。また、択一的な（Ａｌｔｈｅｒｎａｔｉｖｅ）グラフト化化学反応も使用され得、限定されないが：ポリマー内のアミン基と５’−ＮＨＳ修飾オリゴヌクレオチドとの反応；ポリマー内のオキソ−アミン基と５’−アルデヒド修飾オリゴヌクレオチドとの反応によるオキシムの形成；ポリマー内のチオール基と５’−マレイミド修飾オリゴヌクレオチドとの反応；オレフィンのクロスメタセシス（メタセシス触媒の存在下でのポリマーと５’修飾オリゴヌクレオチドの両方の末端アルケン基の反応）；ポリマー内のアミン基と５’−塩化シアヌル修飾オリゴヌクレオチドとの反応；などが挙げられる。ビーズ上のＰＡＺＡＭにグラフト化されなかった過剰のプライマーは、次いで洗い流され、上面にＰＡＺＡＭ−オリゴ体層を有するビーズが得られ得る。
【０２５８】
基材の表面に適用する前にポリマーコートビーズに関する品質管理を行なうためには、いくつかの方法が使用され得る。方法の一例は、ＰＡＺＡＭを色素（例えば、Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８  Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）で直接染色することである。別の方法は、グラフト化オリゴヌクレオチドを、ＰＡＺＡＭ上のオリゴヌクレオチドの色素標識逆相補鎖で標識することである。標識ビーズは、フローサイトメトリーによって測定され得るか、または表面上に流延し、次いで光学顕微鏡使用（蛍光顕微鏡使用を含む）によって解析され得る。また、ビーズのアリコートを破壊試験に使用し、アッセイにおいてビーズがどのように機能を果たすかを評価してもよい。一例は、アリコートを基材上に負荷し、配列決定を行ない、ビーズ塊が多くのアレイ上への負荷のための使用に充分良好であるかどうかを調べることである。
【０２５９】
異なる型のエッチング可能な基材、例えば、シリコン、プラスチック（Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標））および添加剤（例えば、ＳｉＯ２またはカーボンブラック）含浸プラスチックがビーズの負荷に使用され得る。図１５は、ＰＡＺＡＭ被覆ビーズを透明なＺｅｏｎｏｒスライド上に負荷することにより調製されたパターン形成ＰＡＺＡＭアレイを示す。
【０２６０】
パターン形成アレイの調製にポリマーコートビーズを使用することには、いくつかの利点がある。まず、ビーズアプローチはコスト効率がよく、時間節約的である。ビーズ負荷アプローチにより、フローセルのコーティングおよびグラフト化の慣用的なアプローチと比べて高密度を有するアレイ表面の調製が可能になる。例示的な慣用アプローチでは、異なる試薬をフローセルに送達し、フローセル温度が制御されるデバイスが使用され、これでは、ポンプ輸送されたプライマーのほんの一部しかグラフト化されず、かなりの無駄が生じる。また、本明細書に記載のビーズ負荷手順の方が、慣用的な手順ずっと速く、大規模な商業的応用が可能である。
実施例１０
光活性ポリマー
【０２６１】
本明細書において、ブリッジ増幅およびその後の合成時解読（ＳＢＳ）化学を補助し得る択一的な水溶性ポリマーの使用を開示する。また、該ポリマーは、さまざまな異なる手法を用いて表面に容易に適用され得る。特に、表面への適用前に充分に特性評価され得る線状ポリマーの開発は、表面コーティングの品質の潜在的ばらつきを限定的にするために有益である。また、本明細書に記載のアプローチは、ポリマーの択一的なコーティングストラテジー、例えば、浸漬、噴霧およびスピンコーティングの使用可能性を含む。
【０２６２】
スキーム６は、市販の出発物質を用いて調製され得る線状ポリマーの調製を示す。このポリマーは、制御可能な様式でガラスおよびシリコンウェハをコートするために使用され得、溶液ポリマーおよびフローセルに製作する前のコートウェハの両方について充分な特性評価が可能である。また、この方法では、フローセル表面の一方または両方を適宜官能化することが可能である。
【化２３】
0005859172.tif 000036
【０２６３】
この重合は、従来の液相手法を用いて大規模で行なわれ得る。アクリルアミドと新しいモノマー６ｃ（単純な１工程手順によって合成）は、ＰＡＺＡＭを調製するための現行の手順と同様のフリーラジカル重合を用いて重合され得る。
【０２６４】
変形法の一例は、パーフルオロアリールアジドの使用を伴うものである（Ｋｅａｎａ，Ｊ．Ｆ．Ｗ．；Ｃａｉ，Ｓ．Ｘ．Ｎｅｗ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｔｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ａｚｉｄｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９０，５５，３６４０−３６４７）（その開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの種はナイトレンの生成時に環拡大を受けることが少ない傾向を示す。その結果、ＵＶ誘起反応は、挿入生成物の排他的形成を伴うよりクリーンな状態になる。
【化２４】
0005859172.tif 000037
【０２６５】
アリールアジドを標識剤として使用することは、ずっと以前の１９６９年に報告されていた（Ｆｌｅｅｔ，Ｇ．Ｗ．Ｊ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．；Ｋｎｏｗｌｅｓ，Ｊ．Ｒ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｒｙｌ  Ｎｉｔｒｅｎｅ  ａｓ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ．Ｎａｔｕｒｅ  １９６９，２２４，５１１−５１２）（その開示内容は引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本出願では、この官能基の二重反応性を；ｌ，３−双極子付加環化（オリゴ体のグラフト化のための）におけるパートナーおよび一重項ナイトレン種のＵＶ誘起生成後の光結合剤として利用するものである。ＵＶ活性モノマーを使用する利点は、反応が「クリーン」（挿入生成物のみ）であり、化学選択的であり、莫大な数の挿入可能な結合をもたらすポリマー環境で限局的であることである。
【０２６６】
このアプローチにより、成膜後のなんらかの官能化工程を行なう必要性が排除される。予備グラフト化ポリマーでコートしたら、ウェハはダイスカットされ、カバースリップを取り付け、利用可能な表面プライマーの数を測定／確認するためにＱＣ工程が行なわれ得る。
【０２６７】
精製バッチは、次いで、グラフト化された部分（およそ約８０％）が溶液中で、例えば、銅触媒型ヒュスゲン１，３−付加環化を用いて分割される（図１６：経路２）。グラフト化ポリマーは、次いで未反応物質と再併合され、ペアエンドプライマーとウェハ表面および近隣のポリマー鎖の両方にロッキングされ得る遊離光活性基との両方を含むポリマーミックスが得られ得る（図１６参照）。
【０２６８】
この光結合アプローチにより、クラスター成長と配列決定工程の両方を補助するポリマーの頑健性が改善される。以前の研究では、動的シリコン無含有アクリルアミドミックスはＳＢＳを補助し得るが、クラスター化後にかすかに視認可能な望ましくない「しわ」が示され、配列決定中により顕著になることが示されていた。本明細書に開示した光結合アプローチの使用により、ウェハへのポリマーの固定は改善され得るが、過度な柔軟性は低減され、グラフト化プライマーへのアクセスは維持され得る。
実施例１１
熱的架橋を用いたＰＡＺＡＭでのビーズのコーティング
【０２６９】
シリカビーズを１０ｗｔ％固形分の懸濁液としてＦｉｓｈｅｒｓ，ＩＮのＢａｎｇ’ｓ  Ｌａｂｓから入手した（ＰＮ  ＳＳ０４Ｎ／９３４８，しかしながら、多くの他のビーズ組成およびサイズが同様の様式で使用され得ることに注意されたい）。１ｍｌ（１００ｍｇ）のアリコートを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。このチューブをベンチトップ遠心分離機（５０００ｒｆｕ）で３０秒間遠心分離し、ビーズをスピンダウンさせた。溶液を吸引除去した。次に、１ｍｌのアセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ３４９６７）をこのチューブに添加し、チューブを３０秒間ボルテックスして懸濁液をホモジナイズし、次いで、再度スピンダウンした。このプロセスを５回反復し、溶媒交換した。最後に、最後の溶媒を吸引除去した（遠心分離によるビーズのスピンダウン後）。
【０２７０】
別の１５ｍｌ溶チューブ内に、５ｍｌのアセトニトリルと１００μｌの３−アクリルアミドプロピルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  ＰＮ  ＳＩＡ０１４６．０）を添加した。この溶液を１５秒間ボルテックスし、溶液を混合した。次に、この溶液に、早期重合を抑制するための重合抑制剤を添加した：２μｌのＮ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ４７１５９３）を２ｍｌのシラン溶液に添加して抑制剤濃度を１０００ｐｐｍにした。次に、１ｍｌのシラン溶液を抑制剤溶液とともにビーズに添加した。チューブを３０秒間ボルテックスし、シラン溶液中でビーズ懸濁液をホモジナイズした。次いで、ビーズをシランと室温で３０分間、回転式混合機にて反応させた。次いで、チューブ内のビーズを遠心分離し、ビーズをスピンダウンさせ、溶液を吸引除去した。次いで、ビーズを、１０００ｐｐｍのＮ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン重合抑制剤を含有するアセトニトリルに、上記のものと同様の様式で溶媒交換した。
【０２７１】
シラン処理後、ビーズを、１０００ｐｐｍの重合抑制剤を含有するエタノールに溶媒交換した（５回連続の遠心分離、吸引、および新しい溶媒の添加により）。次に、ビーズを、１０００ｐｐｍの重合抑制剤を含有するアセトンに溶媒交換した。最後に、残留アセトンを吸引除去し（ビーズの遠心分離後）、チューブ内のビーズを、輪ゴムで固定したキムワイプでキャップし、乾燥ビーズが確実にエバキュエーションチャンバ内に逸出しないようにした。次いで、ビーズを、４０℃まで予備昇温させた真空炉内に入れ、真空内収容（およそ２７  Ｔｏｒｒ）に１時間に供した。次いで、ビーズを真空炉から取り出し、１０００ｐｐｍの重合抑制剤を含有する１ｍｌのＨＰＬＣ等級水を添加した。次いで、ビーズ懸濁液を３０秒間ボルテックスすることによってホモジナイズした。
【０２７２】
別の１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ内に、１０ｕｌの先の工程のビーズの水性懸濁液を添加した。次に、ＰＡＺＡＭポリマーの１ｍｌの１．０ｗｔ％溶液（ＨＰＬＣ等級水中）を次いでビーズに添加した。この溶液を、ベンチトップボルテックス装置で２０秒間ボルテックスすることによりホモジナイズし、次いで７０００ｒｆｕで９０秒間遠心分離し、ビーズを得た。次いで、ＰＡＺＡＭポリマー溶液を吸引除去した。次に、１ｍｌの２．０ｗｔ％ＰＡＺＡＭ溶液をビーズに添加し、ベンチトップボルテックス装置で２０秒間ボルテックスすることにより溶液をホモジナイズした。次に、チューブを６０℃で１時間反応させることにより、ＰＡＺＡＭをシランに熱的にグラフト化させた。ビーズへのＰＡＺＡＭの熱的グラフト化後、ビーズを５×１ｍｌのＨＰＬＣ等級水で室温にて（上記の溶媒交換法を使用）、次いで、３×１ｍｌの予備昇温（およそ４０℃）ＨＰＬＣ等級水で洗浄した。ビーズを１００μｌのＨＰＬＣ等級水中で希釈し、１０ｗｔ％固形分の懸濁液にした。
【０２７３】
５’アルキニル官能基を有するＰ％およびＰ７オリゴヌクレオチドを、標準的なオリゴヌクレオチド合成手順を用いて別々に合成した（あるいはまた、オリゴヌクレオチド合成業者から市販品として入手した）。オリゴヌクレオチド溶液は１００μＭ溶液（ＨＰＬＣ水中）として供給した。
【０２７４】
アジド官能化ＰＡＺＡＭに対するアルキニル官能化オリゴヌクレオチドのグラフト化は以下のようにして行なった。１０ｗｔ％固形分のＰＡＺＡＭグラフト化ビーズ溶液の１００μｌのアリコートに、８００μｌの１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）および１００μｌのオリゴヌクレオチド溶液を添加した。この溶液に、穏やかな起泡窒素流速度で窒素ガスを１０分間スパージングした。次に、２μｌの無希釈ＰＭＤＥＴＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  ３６９４９７）を添加した。次に、硫酸銅（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  Ｃ２２８４）の１７μｌの１６０ｍＭ水溶液を次いで添加した。２０秒間ボルテックスすることにより混合すると溶液は紫色に変わった。最後に、アスコルビン酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  Ａ７６３１）２５μｌの４０ｍｇ／ｍｌ溶液（ＨＰＬＣ水中）を添加し、２０秒間ボルテックスすることにより混合すると溶液は青色に変わった。この溶液を６０℃で１時間反応させた。次に、ビーズを遠心分離し、反応溶液を吸引除去した。ビーズを１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中で、先に記載のものと同様の様式で洗浄した（５×１ｍｌのバッファー洗浄液を用いた溶媒交換）。
【０２７５】
次いで、オリゴ官能化ビーズを、空のマイクロアレイスライド（これは、１．２ミクロン孔で官能化）上に負荷した。スライドはＵＳ６，７７０，４４１に記載のとおりにして調製した。ビーズは以下のようにして負荷した。ウェルを内包するスライドを、０．１Ｎ  ＮａＯＨ中に室温で５分間浸漬し、次いで、ＨＰＬＣ等級水流（約１００ｍｌ）で激しく洗浄することにより事前に清浄にし、窒素流下で乾燥させた。次に、１０μｌの２００プルーフのエタノール（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  Ｅ７０２３）を１００μｌのビーズ溶液に添加した。次いで、ビーズ溶液を顕微鏡スライドにピペットによって適用した。次に、スライドを、４０℃まで予備昇温させた真空炉内に入れ、スライドを３０分間エバポレートした。残留ビーズを顕微鏡スライドの表面から、手作業でやさしくエタノール飽和キムワイプを適用することにより除去した。
【０２７６】
この様式で調製したスライドの１つに、１０μＭの５’−色素標識（好ましくは、Ｃｙ５）オリゴヌクレオチド（５×ＳＳＣバッファー（Ａｌｄｒｉｃｈ  ＰＮ  Ｓ６６３９）中）の溶液を、ＰＡＺＡＭグラフト化ビーズに固定化されたオリゴ体に対する逆相補とともに添加した。次いで、スライドをガラスカバースリップで覆った。スライドを室温で３０分間ハイブリダイズさせた。次に、カバースリップをはずし、スライドを多量の５×ＳＳＣバッファー流（約１００ｍｌ）で洗浄した。最後に、このスライドに１００μｌの５×ＳＳＣバッファーを添加し、次いで、カバースリップとスライドをＧＥ  Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００で撮像し、Ｃｙ５色素チャネル設定で５００  ＰＭＴ設定でスキャンした。
【０２７７】
この様式で調製した別のスライドに、ラバーガスケットと別の顕微鏡スライド（これは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ配列決定機器からの液体の導入が可能なようにガラス内の適切な位置に事前に孔をあけておいた）を加えた。次いで、ＤＮＡクラスターをスライド上で成長させ、クラスターを、ＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の製造業者の使用説明書のとおりに配列決定した。このスライドでは、クラスター１つあたり１５０ｂｐまでの試料ＤＮＡが配列決定され得ることが示された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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