(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドルパニンを有効成分として含有することを特徴とするレチノイドＸ受容体アゴニスト剤。
【請求項２】
ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を有することを特徴とする請求項１に記載のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤。
【請求項３】
アディポネクチンの発現誘導剤として用いられることを特徴とする請求項２に記載のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイドＸ受容体アゴニスト剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞増殖、代謝、恒常性維持などに関与する因子として、レチノイドＸ受容体、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体、レチノイン酸受容体、肝臓Ｘ受容体、ビタミンＤ受容体、胆汁酸受容体といった核内受容体が知られている。これら核内受容体は、それぞれ対応するリガンドと結合することで細胞核内に移行し、それぞれ特定のＤＮＡ配列に作用してＤＮＡの転写を調節する。
【０００３】
上記核内受容体は二量体の状態で機能することが知られている。例えば、レチノイドＸ受容体はホモ二量体の状態で機能する。また、レチノイドＸ受容体は、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体、レチノイン酸受容体、肝臓Ｘ受容体、ビタミンＤ受容体、胆汁酸受容体といった他の核内受容体とのヘテロ二量体の状態でも機能する。
【０００４】
このようにレチノイドＸ受容体は、ホモ二量体の状態で機能するだけではなく、他の様々な核内受容体のパートナーとなり得る。したがって、レチノイドＸ受容体は、細胞増殖、代謝及び恒常性維持に広く関与していると推測され、レチノイドＸ受容体に対する薬剤は、例えば糖尿病、動脈硬化、自己免疫疾患及び腫瘍などに対する治療薬としての適用が期待される。そして、レチノイドＸ受容体に対して結合するアゴニスト物質として、特許文献１に記載されているように、下記一般式（１）で示されるベキサロテンやそのアナログが報告されている。
【０００５】
【化１】
0005919241.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１３−５２０４３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ベキサロテンは、レチノイドＸ受容体に対して比較的に強いアゴニスト活性を有しており、皮膚Ｔ細胞リンパ腫に対する治療薬として欧米２０カ国以上で適用されている。しかし、高脂血症、高コレステロール血症、甲状腺機能低下、白血球減少といった副作用が報告されており、適用が限られているという事情がある。
【０００８】
また、上述したとおり、レチノイドＸ受容体は、糖尿病、動脈硬化、自己免疫疾患といった疾患にも関与していると考えられるが、ベキサロテンはこれら疾患に対しての適用はない。また、ベキサロテン以外にも、レチノイドＸ受容体を標的とし、糖尿病、動脈硬化、自己免疫疾患といった疾患を適用疾患とする薬剤も報告されていない。
【０００９】
本発明は、ドルパニンが新たにレチノイドＸ受容体アゴニストとしての作用を有することを見出したことに基づくものであり、本発明の目的は、新規のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するため、請求項１に記載のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、ドルパニンを有効成分として含有することを特徴とする。
前記レチノイドＸ受容体アゴニスト剤において、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を有することが好ましい。また、前記レチノイドＸ受容体アゴニスト剤において、アディポネクチンの発現誘導剤として用いられることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、優れたレチノイドＸ受容体アゴニスト剤としての作用を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ベキサロテン及びブラジル産プロポリスエタノール抽出物のレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の試験結果を示すグラフ。
【図２】プロポリスエタノール抽出物からのレチノイドＸ受容体アゴニスト活性成分の単離方法を示す図。
【図３】ドルパニンのレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の試験結果を示すグラフ。
【図４】ドルパニンのペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の試験結果を示すグラフ。
【図５】ドルパニンのペルオキシソーム増殖剤感受性受容体に対する結合活性の試験結果を示すグラフ。
【図６】上段は、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γ標的遺伝子の発現量を測定する方法の手順を示す概略図、下段はペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γ標的遺伝子の発現量を示すグラフ。
【図７】ドルパニンの細胞毒性試験結果を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤を具体化した実施形態を説明する。
本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、有効成分としてドルパニンを含有する。ドルパニンは、下記一般式（２）に示される構造を有する。
【００１４】
【化２】
0005919241.tif 000003
ドルパニンの配合形態としては、特に限定されず、例えば天然素材からの精製品を適用してもよいし、生化学的、有機化学的に合成したものを適用してもよい。
【００１５】
天然素材からの精製品を適用する場合、その天然素材原料としてはプロポリスを挙げることができる。ドルパニンが含まれているのであればプロポリスの産地は限定されないが、ブラジル、アルゼンチン、ウルグアイ等の南米諸国を産地とするプロポリスが好ましい。これらの中でも、特にブラジルを産地とするプロポリスには、比較的に多くのドルパニンが含まれている。プロポリス原塊は、そのままの形態で抽出原料として使用できる。
【００１６】
ドルパニンは、これらの抽出原料からの公知の方法、例えば、溶媒抽出法やクロマトグラフィーを用いて精製することができる。溶媒抽出法に用いられる溶媒は、例えば、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶液が使用できる。なお、本実施形態における親水性有機溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロパノール等の低級アルコールが好ましい。
【００１７】
クロマトグラフィーとしては、例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び薄層クロマトグラフィー等が挙げられる。クロマトグラフィーに用いられる担体としては、例えば、シリカ系樹脂や合成吸着剤が挙げられる。また、シリカ系樹脂としては、例えば、オクタデシルシリル化シリカゲル、フェニルシリル化シリカゲル、及びオクチルシリル化シリカゲル等が挙げられる。合成吸着剤としては、例えば芳香族系合成吸着剤及び脂肪族エステル系合成吸着剤が挙げられる。抽出原料に含まれるドルパニン以外の不純物の種類や量などに応じて、上記精製方法を適宜組合せて行うことにより、ドルパニンを含む抽出物を得ることができる。
【００１８】
上記方法により得られたドルパニンは、比較的に高いレチノイドＸ受容体アゴニスト活性を有する。具体的には、ドルパニンによるレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値は、ベキサロテンによるレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値のおよそ５０％である。また、レチノイドＸ受容体は、細胞増殖、代謝及び恒常性維持に関与している。したがって、ドルパニンを有効成分として含むレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、細胞増殖、代謝及び恒常性維持に関する疾患に対する治療剤や症状の緩和剤としての適用が期待できる。
【００１９】
また、ドルパニンは、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性だけではなく、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対するアゴニスト活性を有するデュアルアゴニストである。また、レチノイドＸ受容体とペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γとのヘテロ二量体は、アディポネクチンの発現を誘導する。したがって、ドルパニンを有効成分として含むレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、他のペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト物質を含有していなくとも、アディポネクチン発現誘導剤として利用できる。
【００２０】
なお、アディポネクチンは、インスリン受容体を介さない糖の取り込み作用、脂肪酸の燃焼作用、細胞内の脂肪酸を減少してインスリン受容体の感受性を上げる作用などを有している。したがって、ドルパニンを有効成分として含むレチノイドＸ受容体アゴニスト剤（アディポネクチン発現誘導剤）は、様々な疾患の中でも、特に糖尿病や肥満症に対する治療剤としての適用が期待できる。
【００２１】
本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤においては、ドルパニンのレチノイドＸ受容体アゴニストとしての作用が確保されるのであれば、ドルパニン以外の物質が含まれていてもよい。このような添加剤としては、賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定化剤等が挙げられる。なお、ドルパニンのレチノイドＸ受容体アゴニスト活性を阻害するものとしては、既知のレチノイドＸ受容体アンタゴニスト剤が挙げられる。
【００２２】
また、レチノイドＸ受容体アゴニスト剤に、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を阻害する物質が含まれていないことが好ましい。この場合、レチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、ドルパニンの作用であるペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性も有する。
【００２３】
本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤を、医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）、血管内投与、経皮投与、腹腔内投与の他、患部への塗布（外用）などあらゆる投与方法が採用できる。剤形としては、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。
【００２４】
本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤を飲食品やサプリメントとして使用する場合は、ドルパニンを含む抽出物を各種原素材に添加することによって使用できる。飲食できるものであれば飲食品としての形態は問わず、例えば、パン、コメ、食肉、水産品、野菜、これらの加工品、菓子（キャンディやガムなど）、清涼飲料水などが挙げられる。サプリメントとしての形態は、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤などが挙げられる。
【００２５】
次に、上記レチノイドＸ受容体アゴニスト剤の作用を説明する。
ドルパニンによるレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値は、ベキサロテンによるレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値のおよそ５０％である。この活性であれば、相応量のドルパニンを含む医薬品、食品、サプリメント等は、レチノイドＸ受容体アゴニスト剤として機能できる。また、ドルパニンは、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性だけでなく、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性をも有する。このドルパニンのデュアルアゴニストとしての特性は、既知のレチノイドＸ受容体アゴニスト物質であるベキサロテンでは発揮できない特性である。
【００２６】
レチノイドＸ受容体に対するドルパニン及びベキサロテンドッキングポーズを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．１（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社）を使用して解析した。この解析では、プロテインデータバンクより入手したＰＤＢ  ＩＤ：３ＤＺＹのリガンド結合部位を利用し、予めＣＨＡＲＭｍプログラムを使い構造最適化を行ったドッキングポーズについて検討した。この解析の結果、ドルパニンのレチノイドＸ受容体に対するドッキングポーズは、ベキサロテンのレチノイドＸ受容体に対するドッキングポーズとは異なっていることが確認された。特に、レチノイドＸ受容体のアミノ酸残基に対する水素結合の態様が異なっていることが確認された。また、ドルパニンのレチノイドＸ受容体に対するＣＤｏｃｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅが−４７．０であるのに対して、ベキサロテンのレチノイドＸ受容体に対するＣＤｏｃｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅが−５２．２であることが確認された。なお、ＣＤｏｃｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅは、分子間エネルギーとリガンド分子内部エネルギーとの和で表現される値であり、低い値であるほど親和性が高いことを示すものである。
【００２７】
一般式（１）及び（２）で示されるように、ドルパニンとベキサロテンとでは、基本骨格が異なっている。また、ドルパニンとベキサロテンとでは、ドッキングポーズやＣＤｏｃｋｅｒ  Ｓｃｏｒｅに差異がある。これらの相違により、ドルパニンは、ベキサロテンとは異なる特性を発揮すると考えられる。
【００２８】
本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤によれば、以下のような効果を得ることができる。
（１）本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、有効成分としてドルパニンを含有する。そして、ドルパニンは、既知のレチノイドＸ受容体アゴニストであるベキサロテンとは基本骨格が異なっており、その特性も異なっている。したがって、本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、ベキサロテンとは異なった症状への適用が期待できる。
【００２９】
（２）本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤に含まれるドルパニンは、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性だけでなく、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を有するデュアルアゴニストである。したがって、他のペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト物質を添加することなく、ドルパニン単独でペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を得られる。
【００３０】
（３）レチノイドＸ受容体とペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γとはヘテロ二量体を形成して、アディポネクチンの発現を誘導する。したがって、ドルパニンを有効成分として含有する本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、アディポネクチンの発現誘導剤として用いることができる。なお、アディポネクチンは、糖尿病や肥満症に関わるタンパク質であるため、アディポネクチンの発現誘導剤は、これらの疾患の治療や症状低減剤としての適用が期待できる。
【００３１】
（４）本実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤に含まれるドルパニンは、プロポリスという天然素材から単離されたものである。また、プロポリスは、古くから人類に利用されてきた素材であり、ある程度の安全性が確保されているといえる。したがって、ドルパニンに関しても、極端に強い副作用が生じる可能性は低いといえる。
【００３２】
なお、上記実施形態は、以下のように変更しても良い。
・  上記実施形態のレチノイドＸ受容体アゴニスト剤は、ヒトが摂取する医薬品、飲食品及びサプリメントとして実施することができるのみならず、家畜等の人以外の動物に投与する飼料や薬剤として実施してもよい。
【００３３】
・  さらに、個体を対象とするものでなく、例えば、培養組織や培養細胞に投与するための試験用の薬剤として実施してもよい。この場合、例えば、ドルパニンを含む培養液として実施したり、培養液に添加するための試薬として実施したりすることが考えられる。
【実施例】
【００３４】
以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。
（ルシフェラーゼレポーターアッセイ法）
各受容体に対するアゴニスト活性を測定するにあたっては、公知のルシフェラーゼレポーターアッセイ法を利用した。以下に、簡単にその内容を説明する。
【００３５】
ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株）に対し、リン酸カルシウム共沈法により、受容体の発現ベクター（例えば、レチノイドＸ受容体発現ベクター）、その受容体に対応するルシフェラーゼレポータープラスミド、及びβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを形質導入した。その後、細胞を培地で洗浄し、アゴニスト活性を測定したいサンプルの存在下で２４時間培養した。培養した細胞の溶解液について、ルミネッセンスリーダーでルシフェラーゼ活性を測定するとともに、分光光度計でβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はβ−ガラクトシダーゼ活性と比較することにより標準化した。
【００３６】
添加したサンプルが受容体に対するアゴニスト活性を有していれば、その受容体がルシフェラーゼの発現を誘導する。その一方で、β―ガラクトシダーゼの発現量は変化しない。したがって、細胞溶解液のβ−ガラクトシダーゼ活性に比してルシフェラーゼ活性が高いほど、添加したサンプルは受容体に対するアゴニスト活性が高いといえる。
【００３７】
（プロポリスエタノール抽出物のレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の測定）
ブラジル産プロポリスに対してエタノールを溶媒とする溶媒抽出法を行うことにより、プロポリスのエタノール抽出物を得た。このようにして得られたエタノール抽出物をサンプルとし、レチノイドＸ受容体を対象受容体として、上で説明したルシフェラーゼレポーターアッセイ法によりアゴニスト活性を測定した。加えて、レチノイドＸ受容体アンタゴニストとして知られているＰＡ４５２（１０μＭ）の存在下においても、同様にアゴニスト活性を測定した。また、レチノイドＸ受容体アゴニスト物質として既に知られているベキサロテンについても、ＰＡ４５２非存在下、存在下の両条件で、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性を測定した。
【００３８】
図１に示すように、レチノイドＸ受容体アンタゴニストであるＰＡ４５２の存在下においてはレチノイドＸ受容体アゴニスト活性が検出されず、ＰＡ４５２の非存在下においてレチノイドＸ受容体アゴニスト活性が検出された。このことから、ブラジル産プロポリスのエタノール抽出物には、レチノイドＸ受容体アゴニスト物質が含まれていることが確認された。また、そのレチノイドＸ受容体アゴニスト物質のアゴニスト活性の最大値は、ベキサロテンのアゴニスト活性の最大値のおよそ５０％であり、相応に高いアゴニスト活性を有していることが確認された。なお、プロポリスの抽出物がレチノイドＸ受容体アゴニスト活性を有するという知見は、本研究により初めて明らかにされた知見である。
【００３９】
（レチノイドＸ受容体アゴニスト物質の単離）
図２に示すように、ブラジル産プロポリスのエタノール抽出物を、シリカ系ゲルを担体とし、ヘキサン／アセトン混合液を溶媒としたカラムクロマトグラフィーに供し、フラクション１〜２８を得た。これら複数のフラクションのうち最もレチノイドＸ受容体アゴニスト活性が高いフラクション１３についてエバポレーターで溶媒を蒸発させ、その残渣をエタノールに溶解した。そのエタノール溶解液にろ過を行って不純物を除去した。不純物を除去したろ液を、シリカ系ゲルを担体とし、アセトニトリル／水混合液を溶媒とした逆相のオープンカラムクロマトグラフィーに供した。これにより得られたフラクション１〜３９のうち最もレチノイドＸ受容体アゴニスト活性が高いフラクション７に含まれる化学物質を同定したところドルパニンであった。
【００４０】
ドルパニン及びベキサロテンに対し、上述したルシフェラーゼレポーターアッセイ法により、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性を測定した。また、ブラジル産プロポリスに含まれる生理活性物質であり、細胞増殖抑制作用を示す物質として知られているアルテピリンＣについても、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性を測定した。なお、アルテピリンＣは下記一般式（３）で示される。
【００４１】
【化３】
0005919241.tif 000004
図３に示すように、ドルパニンはレチノイドＸ受容体アゴニスト活性を有しており、ブラジル産プロポリスのエタノール抽出物中に含まれるレチノイドＸ受容体アゴニスト物質がドルパニンであることが確認された。また、ドルパニンのレチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値の５０％を発揮できる濃度が約３．３６μＭであることが確認された。
【００４２】
なお、アルテピリンＣは、ドルパニンと同様にブラジル産プロポリスに含まれている物質であり、かつ化学構造としても類似しているが、有意なレチノイドＸ受容体アゴニスト活性は認められなかった。
【００４３】
（ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の測定）
ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γを対象受容体として、上で説明したルシフェラーゼレポーターアッセイ法により、ドルパニンのペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を測定した。また、同様にして、アルテピリンＣ、及び既にペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト物質としてしられているロシグリタゾンについても、ルシフェラーゼレポーターアッセイ法により、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を測定した。
【００４４】
図４に示すように、ドルパニンは、終濃度が数μＭ以上でペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を有することが確認された。また、ドルパニンのペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の最大値の５０％を発揮できる濃度が約１０．３μＭであることが確認された。アルテピリンＣも、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性を有していることが確認された。しかし、アルテピリンＣのペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性は、終濃度１μＭ〜１００μＭの範囲内において濃度依存性が確認されず、また、その活性も低いものであった。
【００４５】
なお、ドルパニンに関して、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対するアゴニスト活性の他に、レチノイン酸受容体及び肝臓Ｘ受容体に対するアゴニスト活性の有無を、上述したルシフェラーゼレポーターアッセイ法により測定した。その結果、ドルパニンは、これらの受容体に対するアゴニスト活性をほとんど有していないか、活性を有していたとしても既知のアゴニスト剤と比較して非常に低いことが確認された。
【００４６】
（ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体の結合活性の測定）
ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体α、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体δ、及びペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対するドルパニンの結合活性を、ＥｎＢｉｏ  ＲＣＡＳキット（藤倉化成社）を用いて測定した。このキットによる試験では、添加したサンプルが受容体に結合しない場合には発色が減衰せず、添加したサンプルが受容体に結合する場合には発色が減衰する。
【００４７】
ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体αを対象とする試験の場合には、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体αアゴニスト剤として知られているＧＷ７６４７、及びドルパニンをサンプルとして添加した。ＧＷ７６４７を添加した場合において、最も発色の減衰が大きかったときの減衰量を「Ｂｍａｘ」とし、その減衰量に対する発色の減衰量の比率「Ｂ／Ｂｍａｘ」として、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体αに対するドルパニンの結合活性を測定した。
【００４８】
同様に、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体δを対象とする試験の場合には、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体δアゴニスト剤として知られているＧＷ５０１５１６、及びドルパニンをサンプルとして添加した。また、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γを対象とする試験の場合には、ロシグリタゾン及びドルパニンをサンプルとして添加した。そして、アゴニスト剤を添加した場合おいて、最も発色の減衰が大きかったときの減衰量を「Ｂｍａｘ」とし、その減衰量に対する発色の減衰量の比率「Ｂ／Ｂｍａｘ」として、各受容体に対するドルパニンの結合活性を測定した。
【００４９】
図５に示すように、終濃度１００μＭ以下の範囲内において、ドルパニンは、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体α及びペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対する有意な結合活性を示さなかった。一方、ドルパニンは、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対する結合活性を有することが確認された。これらのことから、ドルパニンは、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体の各サブタイプのうち、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに対して特異的に結合することが確認された。
【００５０】
上述したペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の測定においては、細胞内因性の受容体に起因する活性がルシフェラーゼレポーターアッセイ法により検出された可能性が完全には否定できない。これに対して、ＥｎＢｉｏ  ＲＣＡＳキットによる結合活性の測定は無細胞系における試験であるため、ドルパニンがペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γに結合することが直接的に確認されたといえる。
【００５１】
（ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γ標的遺伝子発現への影響）
ドルパニンを培養細胞に投与した場合におけるペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γ標的遺伝子の発現量を評価するため、以下の試験を行った。
【００５２】
図６の上段に図示されているとおり、３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス繊維芽細胞株）をプレーティングし、４日間培養した。次いで、デキサメタゾン（ＤＥＸ：終濃度１μＭ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ：終濃度５００μＭ）、インスリン（終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）を投与し、脂肪細胞への分化誘導を開始した。分化誘導を開始してから、２日後及び４日後に、それぞれインスリンを終濃度で５０ｎｇ／ｍｌ含む培地で培地交換を行った。さらに２日後（分化誘導から６日後）にサンプルを投与し、その１日後（分化誘導から７日後）に、細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、公知の定量ＲＴ−ＰＣＲに供して、アディポネクチン、ａＰ２（脂肪酸結合タンパク質の一種）、ＣＤ３６（リポタンパク質受容体の一種）それぞれのｍＲＮＡの量を測定した。また、同様にβ−アクチンのｍＲＮＡ量を測定した。なお、β−アクチンは、常にほぼ一定量のｍＲＮＡが発現しているタンパク質として知られているものである。
【００５３】
上記ｍＲＮＡ量の測定は、何も投与しないコントロール群、ドルパニン投与群（終濃度２５μＭ）、ベキサロテン投与群（終濃度１μＭ）について行った。また、同様に、ｍＲＮＡの測定は、上記３つの群それぞれに対して、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト剤であるロシグリタゾン（終濃度１００ｎＭ）を投与した３つの群についても行った。なお、図６では、ロシグリタゾン非投与のコントロール群におけるβ−アクチンとアディポネクチンのｍＲＮＡ量の比を「１」とし、これに対する相対量として各群におけるアディポネクチンのｍＲＮＡ量を標準化している。この点、ａＰ２及びＣＤ３６投与群についても同様である。
【００５４】
図６に示すように、ドルパニンを投与した群では、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト剤であるロシグリタゾンを投与していなくとも、単独でアディポネクチンのｍＲＮＡの発現を誘導することが確認された。これは、ドルパニンが、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性及びペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の両方を有しているからであると推測できる。一方、ベキサロテンは、単独ではアディポネクチンのｍＲＮＡの発現を誘導できず、ロシグリタゾンとの共投与によってアディポネクチンのｍＲＮＡの発現を誘導できることが確認された。
【００５５】
図６に示すように、ドルパニンを投与した群では、ロシグリタゾンを投与していなくとも、単独でａＰ２及びＣＤ３６のｍＲＮＡの発現を誘導することが確認された。同様に、ベキサロテンを投与した群でも、ロシグリタゾンを投与していなくとも、単独でａＰ２及びＣＤ３６のｍＲＮＡの発現を誘導することが確認された。ただし、単独投与の場合は、ドルパニンの方がｍＲＮＡの発現誘導効果が高い傾向があった。
【００５６】
（ドルパニンの細胞毒性試験）
接着細胞であるＨｅＬａ細胞（子宮頸がん由来細胞株）、Ａ５４９細胞（肺がん由来細胞株）、ＭＣＦ７細胞（乳がん由来細胞）に対してそれぞれ所定濃度のドルパニンを添加し、その４８時間後にＭＴＴアッセイによって細胞の生存率を測定した。なお、ＭＴＴアッセイとは、テトラゾリウム塩が生細胞の代謝活性によってフォルマザンに還元されて発色することを利用した方法であり、発色の程度（吸光度）が生細胞数に比例するものである。
【００５７】
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒト急性Ｔ細胞性白血病細胞由来細胞株）に対して所定濃度のドルパニンを投与した。その４８時間後に細胞をトリパンブルー染色し、血球計数板を用いて生細胞数の計数を行い、投与前の生細胞数と比較することにより細胞の生存率を測定した。
【００５８】
図７に示すように、ＨｅＬａ細胞及びＡ５４９細胞に対しては、ドルパニンの終濃度２００μＭまでの範囲において生存率に有意な変化がなく、細胞毒性が認められなかった。また、ＭＣＦ７細胞に対しては、ドルパニンの終濃度１００μＭまでの範囲において生存率に有意な変化がなく、細胞毒性が認められなかった。さらに、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対しては、ドルパニンの終濃度２５μＭまでの範囲において生存率に有意な変化がなく、細胞毒性が認められなかった。
【００５９】
上述したとおり、ドルパニンは、レチノイドＸ受容体アゴニスト活性の最大値の５０％を発揮できる濃度が約３．３６μＭであり、ペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト活性の最大値の５０％を発揮できる濃度が約１０．３μＭである。この濃度は、上記各種細胞に対して細胞毒性が認められる濃度に対して十分に低い。したがって、ドルパニンは、レチノイドＸ受容体アゴニスト剤として利用される範囲においては細胞毒性が低く、副作用の小さい薬剤としての利用が期待できる。
【００６０】
上記実施形態、変更例及び試験結果から把握できる技術思想について以下に追記する。
・  ドルパニンはプロポリス由来であることを特徴とする前記レチノイドＸ受容体アゴニスト剤。
・  ドルパニン以外のペルオキシソーム増殖剤感受性受容体γアゴニスト物質を含有しないことを特徴とする前記レチノイドＸ受容体アゴニスト剤。
【図１】
0005919241.tif 000005
【図２】
0005919241.tif 000006
【図３】
0005919241.tif 000007
【図４】
0005919241.tif 000008
【図５】
0005919241.tif 000009
【図６】
0005919241.tif 000010
【図７】
0005919241.tif 000011