(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）シュードザイマ属(Pseudozyma sp.) ＳＹ１６（ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ）微生物を、好気条件において、培養液に３０時間〜６０時間培養する一次培養段階と、
（ｂ）前記培養液１００重量部に酸価０．１〜２．０である植物性オイル１００重量部を添加して、７２時間〜１２０時間培養する二次培養段階と、
（ｃ）二次培養を終えた植物性オイル培養液のオイル部分のみを回収する段階、とを含む発酵植物性オイルの製造方法。
【請求項２】
上記発酵植物性オイルは、発酵前よりも必須脂肪酸の含有量が高いことを特徴とする請求項１に記載の発酵植物性オイルの製造方法。
【請求項３】
上記発酵植物性オイルは、発酵前よりも必須脂肪酸の含有量が５倍〜１４０倍高いことを特徴とする請求項２に記載の発酵植物性オイルの製造方法。
【請求項４】
上記発酵植物性オイルは、発酵前よりも遊離脂肪酸の含有量が高いことを特徴とする請求項１に記載の発酵植物性オイルの製造方法。
【請求項５】
上記発酵植物性オイルは、発酵前よりも遊離脂肪酸の含有量が５倍〜１４０倍高いこと
を特徴とする請求項４に記載の発酵植物性オイルの製造方法。
【請求項６】
請求項１の製造方法により発酵植物性オイルを得て、該発酵植物性オイルを有効成分として用いる皮膚外用剤または化粧料組成物の製造方法。
【請求項７】
上記皮膚外用剤または化粧料組成物中の上記発酵植物性オイルの含有量は、２ｗｔ％〜４０ｗｔ％であることを特徴とする請求項６に記載の皮膚外用剤または化粧料組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵植物性オイル及びこれを含む組成物に関するもので、より詳細には、微生物によって発酵することで、補水力による乳化安定性の向上、使用感及び香味の改善、保湿力向上の効果がある発酵植物性オイルを提供する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
オイルの組成に変化を与えることで、機能の変化を誘導し得る多様な技術を開発することは、多様な商品を開発しようとする産業的要求に応えるのに非常に重要である。
【０００３】
一般に、発酵オイルというのは、高麗人参等の漢方剤を発酵し、脂溶性成分を抽出してオイルに添加したり、オイルに高麗人参等の漢方剤を添加したりして熟成したものを意味する。
【０００４】
また、魚類或いはココナッツ等を発酵して脂溶性成分を抽出したオイル、油糧種子（大豆、ヒマワリの種、ブドウの種、ゴマ等）を浸漬・発芽または蒸熟過程を経た後、抽出したオイルを指して発酵オイルともいう。
【０００５】
しかし、大量のオイルに微生物を培養し発酵して、構造及び機能、香味を改善させた技術は、皆無であると言える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、微生物によって発酵することで、補水力による乳化安定性の向上、使用感及び香味の改善、保湿力向上の効果がある発酵植物性オイルを提供することを目的とする。
【０００７】
また、本発明は、簡便な方法で微生物によって発酵した発酵植物性オイルの製造方法を提供することを目的とする。
【０００８】
さらに、本発明は、微生物によって発酵した発酵植物性オイルを有効成分として含むことで、乳化安定性の向上、使用感及び香味の改善、保湿力向上の効果がある皮膚外用剤または化粧料組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するための本発明の発酵植物性オイルは、微生物によって発酵したことを特徴とする。
【００１０】
上記目的を達成するための本発明の発酵植物性オイルの製造方法は、（ａ）微生物を好気条件で培養液にて一次培養する段階と、（ｂ）上記培養液に植物性オイルを添加し、二次培養する段階と、（ｃ）二次培養を終えた植物性オイルを回収する段階とを含むことを目的とする。
【００１１】
上記目的を達成するための本発明の皮膚外用剤または化粧料組成物は、微生物によって発酵した発酵植物性オイルを有効成分として含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明による発酵植物性オイルは、補水力による乳化安定性に優れ、化粧水或いはエッセンスタイプの製品に適用して製品化しやすい。
【００１３】
また、本発明による発酵植物性オイルは、発酵前よりも使用感が軽く、保湿感に優れる。
【００１４】
さらに、本発明による発酵植物性オイルは、似たような効果を有する天然オイル及び熟成オイルと比較したとき、より高い安定性及び使用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】乳化安定度を分析した結果であって、オリーブオイルの乳化活性を測定した結果を示したものである。
【図１ｂ】乳化安定度を分析した結果であって、オリーブオイルの時間による乳化安定度の評価写真を示したものである。
【図１ｃ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オリーブオイルの乳化活性を測定した結果を示したものである。
【図１ｄ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オリーブオイルの時間による乳化安定度の評価写真を示したものである。
【図１ｅ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性を比較した結果を示したものである。
【図１ｆ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｇ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｈ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｉ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｊ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｋ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｌ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図１ｍ】乳化安定度を分析した結果であって、発酵オイルの種類による乳化活性の評価写真を示したものである。
【図２ａ】ガスクロマトグラフで脂肪酸を分析した結果で、脂肪酸分布図である。
【図２ｂ】ガスクロマトグラフで脂肪酸を分析した結果で、オリーブオイルの脂肪酸分析である。
【図２ｃ】ガスクロマトグラフで脂肪酸を分析した結果で、発酵オリーブオイルの脂肪酸分析結果である。
【図３ａ】酸価測定結果であって、オリーブオイルの酸価を測定した結果である。
【図３ｂ】酸価測定結果であって、発酵オリーブオイルの酸価を測定した結果である。
【図４ａ】ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、豆オイルと発酵豆オイルの細胞生存率の結果である。ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、
【図４ｂ】ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、オリーブオイルと発酵オリーブオイルの細胞生存率の結果である。ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、
【図４ｃ】ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、緑茶オイルと発酵緑茶オイルの細胞生存率の結果である。ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、
【図４ｄ】ヒト線維芽細胞で細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を測定した結果であって、アルガンオイルと発酵アルガンオイルの細胞生存率の結果である。
【図５ａ】ＴＬＣ（Thin layer chromatography）を用いて成分を分析した結果であって、オリーブオイルと発酵オリーブオイル、リノール酸とリノレン酸の２Ｄ-ＴＬＣの結果である。
【図５ｂ】ＴＬＣを用いて成分を分析した結果であって、豆オイルと発酵豆オイル、緑茶オイルと発酵緑茶オイル、アルガンオイルと発酵アルガンオイルの２Ｄ-ＴＬＣの結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の利点及び特徴、またそれらを達成する方法は、添付の図面とともに詳しく後述される実施例を参照すればより明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるのではなく、互いに異なる多様な形態で具現され、単に本実施例は本発明の開示を確実にして、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を明確に知らせるために提供されるものである。
【００１７】
以下、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施例による発酵植物性オイル、その製造方法及びそれを含む組成物に関して詳細に説明する。
【００１８】
＜発酵植物性オイル＞
本発明の発酵植物性オイルは、微生物によって発酵したことを特徴とする。
【００１９】
ここで、上記微生物は、シュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６（ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ）であることが好ましいが、上記シュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６（ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ）は、円筒模様であって、極性発芽形式で増殖し、菌糸及び子嚢胞子とは区別される内生胞子を形成する。
【００２０】
また、本発明の発酵植物性オイルは、酸価が０．１００〜２．０００の植物性オイルを含む培地を用いて、上記微生物によって発酵したことを特徴とする。
【００２１】
ここで、培地に使用されて発酵する植物性オイルは、オリーブオイル、豆オイル、緑茶オイル、アルガンオイル等、通常の植物性オイルであれば制限はないが、特に酸価が０．１００〜２．０００の範囲であることが好ましく、特に酸価が低いほど発酵効率が高いので、０．１〜０．５の範囲であることが好ましい。酸価が０．１００未満の植物性オイルはほぼ存在せず、２．０００を超える場合は発酵効率の低下という問題がある。
【００２２】
本発明の発酵植物性オイルは、上記微生物によって発酵することで、発酵する前より必須脂肪酸の含有量が高いことを特徴とする。このとき、発酵後の必須脂肪酸の含有量は発酵前に比べて５．０倍〜１４０．０倍に至る。
【００２３】
ここで、上記必須脂肪酸は特にリノレン酸が好ましい。リノレン酸は表皮脂質の二重膜の重要な構成成分であって、表皮角化層セラミドに含有されている。このようなリノレン酸は、皮膚の保湿、皮膚の恒常性維持、皮膚透過層の形成及び保護に効果的であるため、本発明の発酵植物性オイルに含まれる必須脂肪酸はリノレン酸であることが好ましい。
【００２４】
また、本発明の発酵植物性オイルは、上記微生物によって発酵することで、発酵する前より遊離脂肪酸の含有量が高いことを特徴とする。このとき、発酵後の遊離脂肪酸の含有量は、発酵前に比べて５．９倍〜１４０．０倍に至る。
【００２５】
ここで、上記遊離脂肪酸は、脂肪酸がグリセリドであって結合形態を取らないことを意味する。上記遊離脂肪酸の含有量が高ければ、べたつきが減少して使用感が向上し、使用後のテカリ改善に効果的であるため、本発明の発酵植物性オイルは遊離脂肪酸の含有量が高いことが好ましい。
【００２６】
＜発酵植物性オイルの製造方法＞
本発明の発酵植物性オイルの製造方法は、（ａ）微生物を好気条件で培養液にて一次培養する段階と、（ｂ）上記培養液に植物性オイルを添加し、二次培養する段階と、（ｃ）二次培養を経た植物性オイルを回収する段階とを含む。
【００２７】
まず、（ａ）微生物を好気条件で培養液にて一次培養する。
【００２８】
ここで、上記微生物は、シュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６（ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ）であることが好ましいが、上記シュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６（ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ）は、円筒状であって、極性発芽形式で増殖し、菌糸及び子嚢胞子とは区別される内生胞子を形成する。
【００２９】
ここでの培養液は、植物性オイルがまだ含まれておらず、植物性オイルの発酵がよく起こるように多様な種類の培養物質を配合することが重要である。特に、グルコース、イースト抽出物、麦芽抽出物、ペプトン、大豆粕（soya bean meal）、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＮａＣｌから選択された１種以上を用いることが好ましい。
【００３０】
一次培養時間は２４時間〜７２時間、特に好ましくは３０時間〜６０時間が好ましい。上記範囲内でリパーゼ活性が最も高く表れるからである。
【００３１】
次に、（ｂ）一次培養を終えた培養液に植物性オイルを添加して二次培養する。
【００３２】
培養液で植物性オイルの発酵を最適化するためには、酸価の低い植物性オイルを用いることが重要である。すなわち、最適の培地条件を決めるのは植物性オイルの酸価であって、上記の通り植物性オイルの酸価は、０．１００〜２．０００の範囲であることが好ましく、特に酸価が低いほど発酵効率が高いので、０．１〜０．５の範囲であることが好ましい。酸価が０．１００未満の植物性オイルはほぼ存在せず、２．０００を超える場合は発酵効率の低下という問題があるからである。
【００３３】
ここでの植物性オイルは、植物性オイルがまた入っていない上記培養液１００ｗｔ％に対して１００ｗｔ％以下で投入する。上記植物性オイルの投入量は、目的とする発酵植物性オイルの量に応じて適切に調節できるが、植物性オイルを含む培養液１００ｗｔ％に対して１００ｗｔ％を超えて投入すると、オイルが十分に発酵しない恐れがある。
【００３４】
ここでの二次培養時間は７２時間〜１２０時間であることが好ましい。二次培養による発酵が進むにつれて、遊離脂肪酸が最大限出てくる程の時間が確保されなければならないからである。また、上記時間は、植物性オイルの種類によって異なるため、時間による遊離脂肪酸の増加量を測定して、遊離脂肪酸がこれ以上増加しない時間に到達すれば、二次培養を終えることができる。
【００３５】
最後に、（ｃ）二次培養を終えた植物性オイルを回収する。
【００３６】
回収方法には特に制限がなく、回収された植物性オイルは発酵したものであって、皮膚外用剤または化粧料組成物の有効成分として活用できる。
【００３７】
＜発酵植物性オイルを有効成分として含有する皮膚外用剤または化粧料組成物＞
本発明は、微生物によって発酵した発酵植物性オイルを有効成分として含有し、皮膚外用剤または化粧料の用途として使用される組成物を含む。
【００３８】
本発明による、微生物によって発酵した発酵植物性オイルは、乳化活性及び乳化安定度が高く、必須脂肪酸及び遊離脂肪酸の含有量が一般のオイルに比べて著しく高いので、使用感、保湿力に極めて優れ、皮膚外用剤または化粧料組成物の用途に適する。
【００３９】
このとき、本発明の皮膚外用剤または化粧料組成物に含まれる発酵植物性オイルの含有量は、２ｗｔ％〜４０ｗｔ％であることが好ましい。
【００４０】
発酵植物性オイルの含有量が２ｗｔ％未満の場合は、発酵植物性オイルが十分含まれておらず、製品の効果が微々たるものであるという問題があり、４０ｗｔ％を超える場合は、剤形の製造に困難がある。
【００４１】
本発明の皮膚外用剤または化粧料組成物に含まれる成分は、上記の発酵植物性オイル以外に、皮膚外用剤または化粧料組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、及び担体を含む。
【００４２】
本発明の皮膚外用剤または化粧料組成物は、当業界で通常製造されるいかなる剤形にも製造が可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ジェル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレー等に剤形化できるが、これに制限されるのではない。
【００４３】
本発明の皮膚外用剤または化粧料組成物に含まれる担体は、剤形に応じて当業界で通常用いられる担体が利用できる。
【００４４】
本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリームまたはジェルの場合は、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛等が利用できる。
【００４５】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合は、担体成分として、ラクトス、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドのパウダーが利用可能であり、特にスプレーの場合は、さらに、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含み得る。
【００４６】
本発明の剤形が溶解または乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルがあり、特に、綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚種子油、オリーブオイル、ヒマシ油及びごま油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００４７】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラガンスなどが利用できる。
【００４８】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪族アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
【００４９】
本発明の剤形が石鹸の場合は、担体成分として、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオネート、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖などが利用できる。
【００５０】
さらに、本発明の化粧品組成物は、担体以外に他に補助剤を含み得るが、例えば、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料等を含み得る。
【００５１】
（実施例1）
＜微細物による発酵オイル生産の最適培地組成＞
微生物による発酵オイル生産に適する培地組成を決めるために、下記のような８つの培地組成１Ｌにシュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６［ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ］を接種して、２５℃、３００ｒｐｍの好気条件下で培養した。
【００５２】
【表１】
0005974095.tif 000002
【００５３】
２４時間培養後、培養液を１ｍｌずつ取って分光光度計を用いて微生物の成長度及びリパーゼ活性を測定した。
【００５４】
微生物の成長度は、各条件で培養した後、遠心分離してオイル層を取り除き、２０秒間強く混合して蒸留水で１０倍希釈された各試料の吸光度（６６０ｎｍ）を測定した。
【００５５】
微生物のリパーゼ活性を測定するために、培養液を１２，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して上澄液を補酵素液として使用し、基質と結合したｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）が酵素によって遊離する量を吸光度（４０５ｎｍ）の変化として測定するマイクロプレートの分析方法で測定した。微生物の成長度とリパーゼ活性とを微測定した結果、組成４で最も高い成長度とリパーゼ活性を示し、次の発酵オイルの製造に適用した。リパーゼ活性は補酵素の１００μＬが１分間１μｇのタイロシンを生産する量を１単位（unit）とした。
【００５６】
測定の結果、培地組成４で最も高い微生物の成長度とリパーゼ活性を示したため、以降、微生物による発酵オイル生産の最適培地組成として組成４を決定した。
【００５７】
【表２】
0005974095.tif 000003
【００５８】
＜微生物による発酵オイルの製造＞
１．一次培養
培養液（グルコース１０ｇ／Ｌ、オリーブオイル１００ｇ／Ｌ、yeast extract３ｇ／Ｌ、malt extract３ｇ／Ｌ、peptone３ｇ／Ｌ、soya bean meal３ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ０．１ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ０．１ｇ／Ｌ：上記組成４の培地）１Ｌにシュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６［ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ］を接種して、２５℃、３００ｒｐｍの好気条件下で培養した。
【００５９】
培養後、各々の時間帯別（３ｈ、７ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ、９６ｈ）に培養液を１ｍＬずつ取って分光光度計を用いて６６０ｎｍで微生物の成長度及びリパーゼ活性を測定した。リパーゼ活性を測定した結果、最も高いリパーゼ活性を示した一次培養時間が４８時間であることを確認した。
【００６０】
２．二次培養および発酵オイルの生産
上記のような培養液１００Ｌにシュードザイマ属（Pseudozyma sp.）ＳＹ１６［ＫＣＴＣ  ８９５０Ｐ］を接種して、４８時間の間一次培養を行った後、オリーブオイル１００Ｌを培養液に添加し、２５℃、５００ｒｐｍの好気条件下で二次培養した。二次培養後、各々の時間帯別（３、７、１２、２４、４８、７２、９６、１２０ｈ）に培養液を０．３Ｌ〜０．５Ｌずつ取ってオイル部分のみ回収した。回収されたオイルの遊離脂肪酸を測定して、オイルの発酵程度を確認した。遊離脂肪酸の増加量測定の結果、オイル添加後の培養９６時間で遊離脂肪酸の量が最大であることを確認し、その後は増加しなかった。
【００６１】
＜評価＞
１．乳化活性と乳化安定度
乳化安定度は、乳化物形成後または混合、高温、遠心分離等の条件で乳化物を安定化させる乳化剤の能力（ability）を意味する。
【００６２】
乳化活性を測定するために、オリーブオイルと発酵オリーブオイル１ｍｌをｐHによる各々の緩衝液１０ｍｌに溶解させたのち、２分間完全撹拌して乳化させた。その後１０分間静置させた後、６２０ｎｍで吸光度を測定することで乳化活性を測定し、乳化安定度は初期の吸光度に対する２４時間経過後の吸光度の百分率で求めた。ｐＨ９．０のような場合、発酵したオイルの吸光度測定で最大値を超えたが、機器の予測プログラムによって値を設定したことを記録した。
【００６３】
オリーブオイルと発酵オリーブオイルのｐＨに対する乳化活性は、下記表２に示した。試験の結果、発酵オリーブオイルはｐＨ５．０から乳化活性が急激に増加し、特にｐH９．０ではｐH５．０に比べて５０％以上乳化活性が高いことを確認した。半面、オリーブオイルはｐＨ９．０で乳化活性が増加したが、ｐＨ９．０で発酵オリーブオイルのｐＨ５．０にも及ばない乳化活性を見せた。発酵オリーブオイルとオリーブオイルの乳化活性を比較した結果、発酵オリーブオイルはｐＨ２．０から乳化活性を示し、ｐＨ９．０では発酵オリーブオイルがオリーブオイルに比べて乳化活性が２．５倍以上高いことが確認できた。
【００６４】
【表３】
0005974095.tif 000004
【００６５】
乳化安定度に対する結果は図１に示した。図１ａはオリーブオイルの乳化活性、図１ｃは発酵オリーブオイルの乳化活性を測定した結果である。また、各々の試片に対して１時間後、２４時間後の姿を撮影して乳化安定度を評価し、図１ｂはオリーブオイル、図１ｄは発酵オリーブオイルに対する撮影写真である。
【００６６】
オリーブオイルは、２４時間経過後は乳化活性がほとんど現れなかった半面、発酵オリーブオイルは２４時間経過後もオリーブオイルに比べて４倍以上の乳化活性を示すことで、優れた乳化安定度を見せた。
【００６７】
発酵前後のオイルの種類による乳化活性は下記表４に示した。
【００６８】
【表４】
0005974095.tif 000005
【００６９】
図１ｅは発酵オイル間の乳化活性を測定した結果であり、図１ｆ〜図１ｍは乳化活性に対する撮影写真である。
【００７０】
試験の結果、発酵後のオイルが発酵前に比べて少なくとも２倍以上高い乳化活性を示し、乳化力が良いことを確認した。
【００７１】
２．使用感
肌感（保湿感、べたつき、テカリ等）等の各評価項目別に専門の被験者を１０名ずつ用意して、オリーブオイルと発酵オリーブオイルの使用感を評価した。評価は下記表５の基準点数によって行い、各項目の被験者の点数を合計して下記表６に示した。
【００７２】
【表５】
0005974095.tif 000006
【００７３】
【表６】
0005974095.tif 000007
【００７４】
評価の結果、発酵オリーブオイルがオリーブオイルに比べて保湿感が良く、テカリが少ないと共にべたつきがなかった。したがって、本発明の発酵オイルが保湿感、べたつき、テカリ等の肌の使用感に優れていることが分かった。
【００７５】
３．ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）による脂肪酸組成の分析
発酵過程によるオリーブオイルの脂肪酸組成の変化を確認するために、ガスクロマトグラフィ（gas chromatograph：ＧＣ）で脂肪酸を分析した。
【００７６】
脂肪酸メチルエステルは、脱アシル化後、ヘキサン（hexane）に溶解される脂肪酸を三フッ化ホウ素メタノール混合物に作製して準備し、GC分析器（ＪＭＳ−ＳＫ１０２Ａ，ＪＥＯＬ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で分析した。
【００７７】
オーブンの温度は、７０℃〜１２０℃の区間は分当たり１０℃で上昇させ、１２０℃〜２５０℃の区間は分当たり５℃で上昇させた。結果は図２に示した。図２ａは脂肪酸分布図、図２ｂはオリーブオイルの脂肪酸分析結果、図２ｃは発酵オリーブオイルの脂肪酸分析結果を示したものである。
【００７８】
オリーブオイルと発酵オリーブオイルの脂肪酸組成を比較した結果、オリーブオイルよりも発酵オリーブオイルでリノール酸のような必須脂肪酸の含有量が高くなったことが確認できた。また、緑茶オイルと発酵緑茶オイルの脂肪酸組成を比較した結果、緑茶オイルよりも発酵緑茶オイルでリノール酸のような必須脂肪酸の含有量が高くなったことが確認できた。
【００７９】
以上の結果から、発酵オイルは、必須脂肪酸の含有量が高くなることで皮膚の保水力及び保湿力が向上して、保湿感の改善に効果的であることが確認できた。
【００８０】
４．遊離脂肪酸の測定
酸価は、脂肪酸がグリセリドであって結合形態を取らない遊離脂肪酸の量を測定するものである。一次遊離脂肪酸の変化有無を確認するための酸価の測定は、メトローム社の滴定装置（titrator）を利用した。滴定液（ＫＯＨ ０．０５ｍｏｌ／Ｌ）の予想消費量が１ｍｌ〜１０ｍｌの間にくるようにし、該当量ほどの試料を投入した。試料の性状を均質にして、補助溶液（メタノール：蒸留水＝３：１）を５０ｍｌ投入した。機器のＭＥＴモードを選択し、測定値のうちＵ（電圧）を選択、ＭＥＴ Ｕモードをローディングさせ、電極とビュレットチップとをビーカー内に入れた後、実験を始めた。当量点が認められると、実験を終了した。試料のみを投入していない状態で同じ方法にて実験を実施して空試験の値として定めた。二次で各々のオイルの遊離脂肪酸の含有量比較のための酸価の測定は、食品公典（Korean Food Standards Codex）の酸価試験法を利用した。オイル５〜１０ｇを精密に量って栓付き三角フラスコに入れ、中性のエタノール−エーテル混合液（１：２）１００ｍＬを入れて溶かした後、これを、フェノールフタレイン試液を指示薬として、薄紅色が３０秒間持続するまで０．１Ｎのエタノール性水酸化カリウム溶液で滴定した。
【００８１】
酸価＝５．６１１×ａ×ｆ／Ｓ
Ｓ：検体の採取量（ｇ）
ａ：０．１Ｎのエタノール性水酸化カリウム溶液の消費量（ｍＬ）
ｆ：０．１Ｎのエタノール性水酸化カリウム溶液の力価
一次でオリーブオイルの発酵過程で遊離脂肪酸の変化有無を確認するために酸価を測定し、結果は図３に示した。図３ａはオリーブオイルの酸価、図３ｂは発酵オリーブオイルの酸価の結果である。
【００８２】
オリーブオイルと発酵オリーブオイルの酸価を測定した結果、オリーブオイルは０．１２９４ｍｇＫＯＨ／ｇ、発酵オリーブオイルは８．１０２２ｍｇＫＯＨ／ｇで、発酵オリーブオイルがオリーブオイルに比べて遊離脂肪酸が５０倍以上増加したことを確認した。
【００８３】
二次で各々のオイルの遊離脂肪酸の含有量比較のために酸価を測定し、結果は表７に示した。
【００８４】
【表７】
0005974095.tif 000008
【００８５】
試験の結果、いずれのオイルも発酵前に比べて約５０倍〜１４０倍以上遊離脂肪酸の含有量が 増加した。
【００８６】
以上の結果から、一般のオイルがオイル発酵に最適化な培地で発酵工程を通じて遊離脂肪酸の含有量が高くなることで、べたつきが減少して使用感が向上し、使用後のテカリ改善に効果的であることを確認した。
【００８７】
５．ヒト線維芽細胞（Human Dermal Fibroblast Neonatal）の増殖に及ぼす効果検証試験
培養されたヒト線維芽細胞にオリーブオイルと発酵オリーブオイルを濃度別に処理した後、細胞生存率を比較して発酵工程が細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響を検証した。
【００８８】
ＭＴＴ物質が細胞内に吸収されて、ミトコンドリア内でコハク酸脱水素酵素によってホルマザンを形成するが、該物質の細胞内の蓄積は、ミトコンドリアの活性、広くは細胞の活性を意味するため、細胞の増殖及び毒性の評価を行える。
【００８９】
９６ウェルプレートに培養された細胞に０．５％〜０．００１９％の濃度のオリーブオイルと発酵オリーブオイルを処理し、４８時間５％のＣＯ２、３７℃の培養器で培養した。ＭＴＴ溶液に３〜４時間反応させたのち、ＥＬＩＳＡ測定器により５４０ｎｍでＯ．Ｄ値を測定した。細胞生存率の算出式は次の通りである。
【００９０】
細胞生存率（％）＝（試料添加群の５４０ｎｍでのＯ．Ｄ）／試料無添加群の５４０ｎｍでのＯ．Ｄ）×１００
ＤＭＳＯ処理群を対照群とし、発酵前の豆、オリーブ、緑茶、アルガンオイルと発酵後の豆、オリーブ、緑茶、アルガンオイルを添加して実施した試験結果を図４に示した。
【００９１】
試験の結果、発酵後のオイルの処理群と発酵前のオイルの処理群の細胞生存率を比較したとき、発酵後のオイル処理群の方がより高く生存率が表れた。以上の結果から、オイルが発酵過程を経ても、細胞の増殖及び毒性に及ぼす影響がないことを確認した。
【００９２】
６．ＴＬＣ（Thin layer chromatography）分析
オリーブオイルと発酵オリーブオイルを、ＴＬＣを用いてオイル内に存在する成分を分析し、各々の成分の存在有無及び変化の程度を肉眼で確認する。
【００９３】
サンプルとして使用されるオリーブオイル、発酵オリーブオイルを一定濃度（１／１０，１／５）で希釈して用意する。シリカＴＬＣにサンプルを２、３滴落とした後、分離能の良好な溶媒条件を用いてサンプルを分析し、最適な溶媒条件を決める。サンプルを落としたＴＬＣに分離能の良い溶媒を展開溶媒として使用して、チャンバで展開させる。展開が終わったＴＬＣは取り出してよく乾かす。ＴＬＣを１０％の硫酸に３秒〜４秒間浸し、再び取り出してよく乾かす。よく乾いたＴＬＣを乾燥機またはホットプレートで発色するまで熱を加える。
【００９４】
ＴＬＣを利用してオリーブオイルと発酵オリーブオイルの良好な分離能を示すｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１、クロロホルム：メタノール＝１５：１の条件を確立した。一次溶媒の条件としてｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝５：１を用いて展開し、二次溶媒としてはクロロホルム：メタノール＝１５：１の条件を用いて展開する２Ｄ−ＴＬＣを実施し、その結果を図５ａに示した。
【００９５】
分析の結果、オリーブオイルとは異なり、発酵オリーブオイルで特定のスポットが目立って濃くなることと、新たなスポットが生じることが確認できた。また、発酵オリーブオイルの特定のスポットをリノール酸、リノレン酸の２Ｄ-ＴＬＣと比較した結果、リノール酸、リノレン酸のような部分のスポットが段々濃くなったことが確認できた。以上の結果から、発酵オリーブオイルはオリーブオイルとは異なり非極性オイルの量が大変減少し、リノール酸とリノレン酸の量が、時間が過ぎるにつれて増加することを確認した。
【００９６】
豆オイル、緑茶オイル及びアルガンオイルの発酵前後の２Ｄ−ＴＬＣを実施し、その結果を図５ｂに示した。
【００９７】
分析の結果、豆オイル、緑茶オイル、アルガンオイルもはやり発酵後のオイルで発酵前とは異なり非極性のオイルの量が大変減少し、リノール酸とリノレン酸の量が、時間が過ぎるにつれて増加することを確認した。
【００９８】
７．製剤例
（１）製剤例１：外用クリーム剤
下記表８の組成で外用クリーム剤を製剤化した。まず、精製水に保湿剤を加え７０℃に加熱、調整して水相を製造した。発酵オリーブオイル及び残りの油成分を加熱溶解した後、乳化剤、防腐剤等を加えて７０℃に調整した。これを上記水相に加え、ホモミキサーで乳化粒子を均一化した後、脱気泡、ろ過、冷却した。
【００９９】
【表８】
0005974095.tif 000009
【０１００】
（２）製剤例２：外用ローション剤
下記表９の組成で外用ローション剤を製剤化した。まず、精製水に保湿剤を加え７０℃に加熱、調整して水相を製造した。発酵オリーブオイル及び残りの油成分を加熱溶解した後、乳化剤、防腐剤等を加えて７０℃に調整した。これを上記水相に加え、ホモミキサーで乳化させてからヒアルロン酸１水溶液を添加してホモミキサーで均一に混合した後、脱気泡、ろ過、冷却した。
【０１０１】
【表９】
0005974095.tif 000010
【０１０２】
以上、本発明の実施例を説明したが、本発明は上記実施例に限定されるのではなく、互いに異なる多様な形態に製造でき、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的特徴を変更せずに、他の具体的な形態で実施可能なことは理解できることである。したがって、上述した実施例はあらゆる面で例示的なものであり、限定的でないことは理解すべきである。
【図１ａ】
0005974095.tif 000011
【図１ｂ】
0005974095.tif 000012
【図１ｃ】
0005974095.tif 000013
【図１ｄ】
0005974095.tif 000014
【図１ｅ】
0005974095.tif 000015
【図１ｆ】
0005974095.tif 000016
【図１ｇ】
0005974095.tif 000017
【図１ｈ】
0005974095.tif 000018
【図１ｉ】
0005974095.tif 000019
【図１ｊ】
0005974095.tif 000020
【図１ｋ】
0005974095.tif 000021
【図１ｌ】
0005974095.tif 000022
【図１ｍ】
0005974095.tif 000023
【図２ａ】
0005974095.tif 000024
【図２ｂ】
0005974095.tif 000025
【図２ｃ】
0005974095.tif 000026
【図３ａ】
0005974095.tif 000027
【図３ｂ】
0005974095.tif 000028
【図４ａ】
0005974095.tif 000029
【図４ｂ】
0005974095.tif 000030
【図４ｃ】
0005974095.tif 000031
【図４ｄ】
0005974095.tif 000032
【図５ａ】
0005974095.tif 000033
【図５ｂ】
0005974095.tif 000034