(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症の治療において使用するための医薬組成物であって、
ブメタニドまたはその類似体と、薬学的に許容される担体とを含み、
前記類似体は、ブメタニドアルデヒド、ブメタニドジベンジルアミド、ブメタニドジエチルアミド、ブメタニドモルホリノエチルエステル、ブメタニド３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ブメタニドＮ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ブメタニドジメチルグリコールアミドエステル、ブメタニドピバキセチルエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−ｉ−エチルエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩またはブメタニドセチルトリメチルアンモニウム塩から選択される、
医薬組成物。
【請求項２】
ブメタニドを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自閉症の治療に使用される、神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害する化合物または神経細胞からの塩素イオンの流出を改善する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
小児自閉症候群障害（ＡＳＤ：Autistic
Syndrome Disorder）としては、情動的関係の構築能力の先天的欠如、互恵的社会交流での行動異常、言語および非言語コミュニケーション、常同的行動や繰り返しの遊びに付随する周囲環境での制限された関心などの広範囲にわたる異常が挙げられる（Ｋａｎｎｅｒ、１９４３年；ＬｅｖｙおよびＨｙｍａｎ、１９９３年；ＬｅｖｙおよびＨｙｍａｎ、２００５年；Ａｄｒｉｅｎら、２００１年；Ｂｌａｎｃら、２００５年；Ｂｏｕｒｒｅａｕら、２００９年）。これまでの調査から、遺伝的素因がこの疾患に関与していると考えられているが、環境汚染物質や恐らく妊娠中の母親の曝露などの１つ以上の環境要因が整った場合に症状が発生するのでないかということが分かっている（ＰｅｒｓｉｃｏおよびＢｏｕｒｇｅｒｏｎ、２００６年；Ｂｏｕｒｇｅｒｏｎ、２００９年；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、２００２年）。遺伝的および環境的危険因子が発達プログラムを変え、それにより、皮質および／または皮質下の奇形が引き起こされ、誤って配置／接続された神経細胞集合が形成されるということが示唆されている。第１の症状は、最も可能性が高い早期の起点である３歳前に発症する。現在のところ、ＡＳＤに有効な生物学的／医薬的治療が存在しない。
【０００３】
脳の成熟は、電位開口型受容体シナプス作動チャネルの発達上の一連の発現および脳のパターンに関連している（Ｓｐｉｔｚｅｒら、１９９４年；Ben Ariら、２００７年）。抑制性伝達物質ＧＡＢＡの作用の発達的変化は、これらの変化の単に一例である。未発達の神経細胞は、成人よりも高い（Ｃｌ−）Ｉを有し、それにより、ＧＡＢＡの奇異的興奮作用が生じる（Ben Ari、２００２年；Ben Ariら、２００７年）。これは、塩素イオンを流入させる共輸送体ＮＫＣＣ１の早期での発現と、神経細胞から塩素イオンを流出させるＫＣＣ２の後期での働きに起因する（ＫａｈｌｅおよびＳｔａｌｅｙ、２００８年；Ｒｉｖｅｒａら、１９９９年；Ｄｚｈａｌａら、２００５年；Ｄｅｌｐｉｒｅら、１９９９年；Ｄｅｌｐｉｒｅ、２０００年；Ｌｉら、２００２年）。さらに、（Ｃｌ−）Ｉの調節は動的であり、活性亢進の短時間の発症によってさえも変化し（ＢａｌｅｎａおよびＷｏｏｄｉｎ、２００８年；Ｆｉｕｍｅｌｌｉら、２００５年；ＦｉｕｍｅｌｌｉおよびＷｏｏｄｉｎ、２００７年；Ｗｏｏｄｉｎら、２００３年）、様々な発作、病変、てんかん発作および神経障害によってより持続的になる（Ｋｈａｌｉｌｏｖら、２００３年；Ｋｈａｌｉｌｏｖら、２００５年；Ｃｏｈｅｎら、２００２年；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄら、２００６年；Ｈｕｂｅｒｆｅｌｄら、２００７年）。従って、（Ｃｌ−）Ｉを減少させる利尿薬は、新規抗てんかん薬および神経保護薬を構成する（Ｄｚｈａｌａら、２００５年；Ｎａｒｄｏｕら、２００９年；Ｋａｈｌｅら、２００８年；Ｐａｙｎｅら、２００３年）。これに沿って、現在、小児てんかんにおけるその目的に向かって臨床試験が行われている。
【０００４】
ブメタニド（Ｂｕｍ）（Ｃｏｈｅｎ、１９８１年；Ｆｅｉｔ、１９８１年）は、共輸送体ＮＫＣＣ１に選択的に拮抗し、それにより（Ｃｌ−）Ｉを減少させる古典的な利尿剤である（Ｄｅｌｐｉｒｅら、１９９９年；ＤｅｌｐｉｒｅおよびＭｏｕｎｔ、２００２年）。Ｂｕｍは、１９７５年以降成人に、そして１９８６年以降小児に広く利用されており、成人および小児におけるその薬物動態学とその副作用は、よく知られている（Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｍｂｌａｓら、１９９７年；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９６年；Ｗｉｔｔｅら、１９８６年；Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９９８年）。Ｂｕｍは、急性疾患（頭部外傷後の浮腫）や、気管支肺異形成、腎炎症候群または心臓鬱血などの長期疾患に使用されており（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら、２００４年；Ｍａｃｋｉｅら、１９８６年；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９６年）、最近では、症例報告（Ｋａｈｌｅら、２００９年）に、てんかん発作の重症度の減少が報告されている。特に小児において、連続的な臨床的および生物学的監視を伴う限り、Ｂｕｍの使用は安全である。
【０００５】
本発明者らは、現在５人の自閉症児において、臨床的および生物学的監視を行いながら、Ｂｕｍの効果を調査している。様々な症例を得るために、施設または自宅にいるＡＳＤ小児の大集団からアプリオリなしにこれらの自閉症児を選択した。本利尿剤を投与し（１ｍｇ／２４時間、０．５ｍｇを１日に２回）、治療を３ヶ月間継続した。この期間は、ＩＡＳに対する効果の評価にとって十分だとみなされた最短持続期間であった。本発明者らは、５人の小児におけるＩＡＳ兆候の有意な改善を報告する。これらの観察は、ＩＡＳ（より一般的には自閉症）におけるＢｕｍの使用の広範囲なスクリーニングを必要とする。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害し、それにより細胞内濃度を減少させるＮＫＣＣ共輸送体拮抗薬が自閉症の治療に有用になり得るという仮説を立てた。
【０００７】
従って、本発明は、自閉症の治療に使用される、神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害する化合物および神経細胞からの塩素イオンの流出を改善する化合物に関する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、本発明に係る化合物と医薬的に許容される担体とを含む自閉症の治療に使用される医薬組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（定義）
本明細書の全体にわたって、いくつかの用語が用いられており、これらの用語を以下の段落に定義する。
【００１０】
本明細書に使用されている「自閉症」という用語は、社会的交流およびコミュニケーション障害と、他の欠陥を伴う制限された繰り返し行動を特徴とする神経発達障害ファミリーを意味する。小児が３歳になる前に、これらの全ての徴候が始まる。自閉症は、神経細胞およびそれらのシナプシスの接続および組織化方法が変化することによって脳内の情報処理に影響を与えるが、この発生機序は十分に理解されていない。２つの他の自閉症スペクトル障害（ＡＳＤ）は、認知的発達および言語の遅延がないアスペルガー症候群と、他の２つの障害の完全な基準が満たされない場合に診断される非定型自閉症と、広汎性発達障害が特定されない場合の特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）である。
【００１１】
本明細書に使用されている「Ｎａ−Ｋ−Ｃｌ共輸送体」を表すＮＫＣＣとは、細胞内外へのナトリウム、カリウムおよび塩素イオンの能動輸送を支援するタンパク質を意味する。この膜輸送タンパク質のいくつかの変種またはイソ型、特にＮＫＣＣ１およびＮＫＣＣ２が存在する。ＮＫＣＣ１は、体全体に分布しているが、脳内、特に発達中の動物およびヒトの脳内にも広く分布している。ＮＫＣＣ１は、神経細胞内に細胞内塩素イオンを増加させ、それによりＧＡＢＡをより興奮性にするように作用する。広範囲な調査から、ＮＫＣＣ１の遮断により細胞内塩素イオンが減少し、それによりＧＡＢＡの阻害作用が増加することが分かっている。現在では、生体内および生体外調査から、ＮＫＣＣ１の遺伝的および／または薬理学的遮断により、初期のネットワーク活動が減少することが分かっている。
【００１２】
本明細書に使用されている「カリウム塩素共輸送体」を表すＫＣＣという用語は、塩素イオンの共輸送体を意味する。いくつかの変種またはイソ型、特にＫＣＣ２が存在する。ＫＣＣ２は、多くの臓器、特に脳内に存在し、細胞内塩素イオンを除去し、それによりＧＡＢＡの阻害作用を増強するように作用する。ＫＣＣ２遮断薬は、ＧＡＢＡを興奮性にし、かつ容易にてんかん発作を発生させるように形質転換させ、ＫＣＣ２の遺伝子欠損は、マウスでは致死的である。また、ＫＣＣ２は、興奮性から抑制性へのＧＡＢＡの作用の変化に対応して、発達の比較的後期に発現する。また、広範囲にわたる発作およびてんかん発作により機能的なＫＣＣ２が除去され、それにより、ＧＡＢＡの持続的な興奮作用およびさらなるてんかん発作が引き起こされる。
【００１３】
本明細書に使用されている「利尿薬」という用語は、利尿率を上昇させ、そのようにして強制利尿手段を提供する任意の薬物を意味する。いくつかの種類の利尿薬が存在する。すべての利尿薬は体からの水の排出を増加させるが、各種類は異なった方法でこの増加を行う。
【００１４】
本明細書に使用されている「ループ利尿薬」という用語は、腎臓のヘンレ係蹄上行脚に作用する利尿薬を意味する。
【００１５】
本明細書に使用されている「治療すること」または「治療」という用語は、そのような用語が適用される障害または疾患の進行の後退、軽減もしくは阻害または予防、あるいはそのような用語が適用される障害または疾患の１つ以上の症状の進行の後退、軽減もしくは阻害または予防を意味する。
【００１６】
（拮抗薬およびその使用）
本発明の第１の目的は、自閉症の治療に使用される、神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害する化合物または神経細胞からの塩素イオンの流出を改善する化合物に関する。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明に係る化合物は、ＮＫＣＣ共輸送体を阻害するかＫＣＣ共輸送体を活性化する。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る化合物は、ＮＫＣＣ共輸送体拮抗薬またはＫＣＣ共輸送体作動薬である。
【００１９】
一実施形態では、前記ＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬は、低分子量拮抗薬、例えば小有機分子（天然または非天然）であってもよい。
【００２０】
「小有機分子」という用語は、医薬品に一般に使用されるそれらの有機分子に相当する大きさの分子（天然または非天然）を指す。上記用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい小有機分子は、最大約５０００Ｄａ、より好ましくは最大２０００Ｄａ、最も好ましくは最大約１０００Ｄａのサイズ範囲を有する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明のＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬は、ＮＫＣＣを阻害するかＫＣＣを活性化する抗体またはＮＫＣＣを阻害するかＫＣＣを活性化する抗体断片であってもよい。
【００２２】
ＮＫＣＣまたはＫＣＣに対する抗体は、例えば、特に、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に適当な抗原またはエピトープを投与することによって、公知の方法に従って産生することができる。抗体産生を高めるために、当該技術分野で知られている各種アジュバントを使用することができる。本発明の実施で有用な抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。ＮＫＣＣまたはＫＣＣに対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株によって抗体分子の産生を得る任意の技術を用いて調製および単離することができる。産生および単離技術としては、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）、the human B-cell hybridoma technique（Ｃｏｔｅら、１９８３年）およびthe EBV-hybridoma technique （Ｃｏｌｅら、１９８５年）に記載されたハイブリドーマ技術が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、単鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号を参照）の産生について記載されている技術を、抗ＮＫＣＣまたは抗ＫＣＣ単鎖抗体を産生するように構成することができる。本発明を実施するのに有用なＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬としては、限定されるものではないが、無傷の抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることによって生成することができるＦａｂ断片などの抗ＮＫＣＣ抗体断片または抗ＫＣＣ抗体断片が挙げられる。あるいは、ＮＫＣＣまたはＫＣＣに対して所望の特異性を有する断片の迅速な同定を可能にするように、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリを構築することができる。
【００２３】
ヒト化抗ＮＫＣＣ抗体または抗ＫＣＣ抗体およびそこからの抗体断片は、公知の技術に従って調製することもできる。「ヒト化抗体」は、ヒト以外の免疫グロブリン由来の最小配列を含む、ヒト以外（例えば齧歯類）のキメラ抗体型である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたはヒト以外の霊長類などのヒト以外の生物種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中に存在しない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために行う。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変領域の実質的に全てを含み、可変領域では、超可変ループの全てまたは実質的に全ては、ヒト以外の免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンＦｃ）の少なくとも一部も含む。ヒト化抗体の作製方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ（米国特許第５，２２５，５３９号）およびＢｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ社、米国特許第４，８１６，３９７号）に記載されている。
【００２４】
さらに別の実施形態では、ＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬を、アプタマーから選択してもよい。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替物となる分子種である。アプタマーは、高親和性および特異性により、実質的にあらゆる種類の標的分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C.およびGold L.（１９９０年）に記載されているように、ランダム配列ライブラリの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離してもよい。ランダム配列ライブラリは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリの各メンバーは、非反復配列の最終的に化学修飾される直鎖状オリゴマーである。この種の分子の考えられる修飾、用途および利点は、Jayasena S.D.（１９９９年）に概説されている。ペプチドアプタマーは、２種類のハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリから選択される大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によって示される立体構造的に制限された抗体可変領域からなる（Ｃｏｌａｓら、１９９６年）。
【００２５】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明で使用されるＮＫＣＣ共輸送体遺伝子発現阻害剤として機能することができる。ＮＫＣＣ共輸送体遺伝子発現は、ＮＫＣＣ共輸送体遺伝子発現が特異的に阻害されるように（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）、対象または細胞を、小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小さな二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物に接触させることによって減少させることができる。適当なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコードベクターの選択方法は、配列が知られている遺伝子については当該技術分野でよく知られている（例えば、Tuschl, T.ら（１９９９年）、Elbashir, S. M.ら（２００１年）、Hannon, GJ.（２００２年）、McManus, MT.ら（２００２年）、Brummelkamp, TR.ら（２００２年）、米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号ならびに国際特許公開第０１／３６６４６号、第９９／３２６１９号および第０１／６８８３６号を参照）。
【００２６】
リボザイムも、本発明で使用されるＮＫＣＣ共輸送体遺伝子発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序は、相補的な標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリッド形成と、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を伴う。そのため、ＮＫＣＣ共輸送体ｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子工学的ヘアピン型またはハンマー型リボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。最初に、典型的にはＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣ配列などのリボザイム切断部位の標的分子を走査することによって、任意のＲＮＡ標的候補内の特異的リボザイム切断部位を同定する。一旦同定したら、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにし得る二次構造などの予測される構造特徴について、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５〜２０個のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列を評価することができる。候補となる標的の適合性についても、例えば、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成への利用可能性を試験することによって評価することができる。
【００２７】
ＮＫＣＣ共輸送体遺伝子発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは、公知の方法によって調製することができる。これらの方法としては、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成などの化学合成技術が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列の生体外もしくは生体内転写によってアンチセンスＲＮＡ分子を生成することができる。そのようなＤＮＡ配列を、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが組み込まれる多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対する様々な修飾を、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な修飾としては、分子の５’および／または３’末端に対するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加または、オリゴヌクレオチド骨格中のホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、単独でまたはベクターに結合させて、生体内送達してもよい。「ベクター」は、その最も広い意味では、細胞、好ましくはＮＫＣＣ共輸送体を発現している細胞までアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸を容易に運搬することができる任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターが消失する分解の程度よりも低い分解で核酸を細胞まで運搬する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡもしくはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されたウイルス源もしくは細菌源由来の他の媒体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタインバーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスからの核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。列挙されていないが当該技術分野で知られている他のベクターも容易に用いることができる。
【００２９】
好ましい実施態様では、ＮＫＣＣ共輸送体を阻害する化合物は利尿薬である。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、利尿薬はループ利尿薬である。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明に係る化合物はＮＫＣＣ１拮抗薬である。
【００３２】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る化合物はブメタニドである。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明に係る化合物は、フロセミド、エタクリン酸、トルセミド、アゾセミド、ムゾリミン、ピレタニド、トリパミドなど、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メトラゾンおよびキネタゾンなどのチアジドおよびチアジド様利尿薬ならびにそのような化合物の類似体および機能的な誘導体から選択される。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、国際特許公開第２００６１１０１８７号に記載されている式を有していてもよい。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、ブメタニドアルデヒド、ブメタニドジベンジルアミド、ブメタニドジエチルアミド、ブメタニドモルホリノエチルエステル、ブメタニド３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ブメタニドＮ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ブメタニドジメチルグリコールアミドエステル、ブメタニドピバキセチルエステル、ブメタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−ｉ−エチルエステル、ブメタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩およびブメタニドセチルトリメチルアンモニウム塩であってもよい。
【００３６】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、フロセミドアルデヒド、フロセミドエチルエステル、フロセミドシアノメチルエステル、フロセミドベンジルエステル、フロセミドモルホリノエチルエステル、フロセミド３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、フロセミドＮ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、フロセミドジベンジルアミド、フロセミドベンジルトリメチルアンモニウム塩、フロセミドセチルトリメチルアンモニウム塩、フロセミドＮ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドエステル、フロセミドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−ｉ−エチルエステル、フロセミドピバキセチルエステルおよびフロセミドプロパキセチルエステルであってもよい。
【００３７】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、ピレタニドアルデヒド、ピレタニドメチルエステル、ピレタニドシアノメチルエステル、ピレタニドベンジルエステル、ピレタニドモルホリノエチルエステル、ピレタニド３−（ジメチルアミノプロピル）エステル、ピレタニドＮ，Ｎ−ジエチルグリコールアミドエステル、ピレタニドジエチルアミド、ピレタニドジベンジルアミド、ピレタニドベンジルトリメチルアンモニウム塩、ピレタニドセチルトリメチルアンモニウム塩、ピレタニドＮ，Ｎ−ジメチルグリコールアミドエステル、ピレタニドメトキシ（ポリエチレンオキシ）ｎ−ｉ−エチルエステル、ピレタニドピバキセチルエステルおよび／またはピレタニドプロパキセチルエステルであってもよい。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、テトラゾリル置換アゾセミド（例えば、メトキシメチルテトラゾリル置換アゾセミド、メチルチオメチルテトラゾリル置換アゾセミドおよびＮ−ｍＰＥＧ３５０−テトラゾリル置換アゾセミド）、アゾセミドベンジルトリメチルアンモニウム塩および／またはアゾセミドセチルトリメチルアンモニウム塩であってもよい。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、本発明に係る類似体は、ピリジン置換トルセミド第四級アンモニウム塩または対応する内塩（双性イオン）であってもよい。例としては、メトキシメチルピリジニウムトルセミド塩、メチルチオメチルピリジニウムトルセミド塩およびＮ−ｍＰＥＧ３５０−ピリジニウムトルセミド塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明に係る化合物はＫＣＣ２作動薬である。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明に係る化合物は、細胞表面のＮＫＣＣタンパク質濃度を抑制するか細胞表面のＫＣＣタンパク質濃度を高める化合物である。
【００４２】
別の好ましい実施形態では、当該細胞は神経細胞である。
【００４３】
本発明の別の目的は、それを必要としている対象に神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害する化合物または神経細胞からの塩素イオンの流出を改善する化合物を投与することを含む、自閉症の治療方法に関する。
【００４４】
一態様では、本発明は、それを必要としている対象に上記ＮＫＣＣ拮抗薬を投与することを含む、自閉症の治療方法に関する。
【００４５】
本発明の化合物を、以下に定義されている医薬組成物の形態で投与してもよい。
【００４６】
好ましくは、神経細胞内への塩素イオンの流入を阻害するか神経細胞からの塩素イオンの流出を改善する前記化合物、好ましくは前記ＮＫＣＣ拮抗薬または前記ＫＣＣ作動薬を、治療的有効量で投与する。
【００４７】
「治療的有効量」とは、先に記載した疾患を治療および／または予防するのに十分な化合物の量を意味する。
【００４８】
当然のことながら、本発明の化合物および組成物の１日の総使用量は、適切な医学的判断の範囲内で主治医によって決定される。任意の特定の患者のための具体的な治療的有効投与量は、治療中の障害および障害の重症度、用いられる具体的な化合物の活性、用いられる具体的な組成物、患者の年齢、体重、健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および用いられる具体的な化合物の排出率、治療の持続時間、用いられる具体的なポリペプチドと併用または同時使用される薬物、ならびに医療業界でよく知られている同様の要因などの様々な要因によって決まる。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされる投与量よりも低量で本化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増加させることは当該技術分野の技術の範囲に十分に含まれている。但し、本製品の１日投与量は、成人１人当たり１日０．０１〜１，０００ｍｇの広範囲にわたって異なってもよい。好ましくは、本組成物は、治療される患者に対する投与量の対症調整(symptomatic adjustment)のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０および５００ｍｇの有効成分を含有する。本薬剤は典型的に、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの有効成分、好ましくは１ｍｇ〜約１００ｍｇの有効成分を含有する。薬物の有効量は、通常１日当たり体重の０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの投与量、特に１日当たり体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇで投与される。
【００４９】
本発明に係る化合物は、自閉症の治療で使用される医薬組成物の調製のために使用してもよい。
【００５０】
従って、本発明は、有効投与量のＮＫＣＣ共輸送体を阻害する化合物、好ましくはＮＫＣＣ拮抗薬または本発明に係るＫＣＣ共輸送体を活性化させる化合物を含む医薬組成物も提供する。
【００５１】
本発明の任意の治療薬を薬学的に許容される賦形剤および任意に生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。
【００５２】
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、適当であれば哺乳類（特にヒト）に投与された場合に、有害なアレルギ−または他の不都合な反応を引き起こさない分子的実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤とは、非毒性の固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈液、封入材または任意の種類の製剤補助剤を指す。
【００５３】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量および投与計画は、当然のことながら、治療される疾患、疾患の重症度、患者の年齢、体重および性別などによって異なる。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、局所、口腔、鼻腔内、非経口、眼内、静脈内、筋肉内または皮下投与などのために製剤化することができる。
【００５５】
好ましくは、本医薬組成物は、注射可能な製剤用の薬学的に許容される媒体を含有する。このような媒体は、特に等張かつ無菌の食塩水（リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムなどとそのような塩の混合物）、または、場合に応じて滅菌水または生理食塩水を添加するとすぐに注射溶液の構成が可能となる乾燥した、特に冷凍乾燥した組成物であってもよい。
【００５６】
投与に使用される投与量は、各種パラメータの関数として、特に使用される投与様式、関連する病態の関数として、または代わりとして所望の治療持続時間の関数として構成することができる。
【００５７】
さらに、他の薬学的に許容される形態としては、例えば経口投与のための錠剤または他の固体、徐放性カプセルおよび現在使用することができる任意の他の形態が挙げられる。
【００５８】
また、本発明に係る医薬組成物は、生物学的に活性または不活性の他の化合物を含有していてもよい。例えば、治療薬の組み合わせにおいて、本発明の１種以上の治療薬を、別の薬剤と組み合わせ、本発明の治療投与計画に従って投与してもよい。そのような組み合わせ薬剤は、別々の組成物として投与しても、相補的な送達システムでの送達のために組み合わせてもよく、あるいは、組み合わせた組成物、例えば混合物または融合化合物として製剤化してもよい。さらに、上記治療薬の組み合わせは、ＢＢＢ浸透促進剤および／または高浸透圧剤を含んでいてもよい。
【００５９】
あるいは、ＮＫＣＣ共輸送体を阻害するかＫＣＣ共輸送体を活性化する本発明の化合物を、後述するスクリーニング法によってさらに同定することができる。
【００６０】
（スクリーニング法）
本発明の別の目的は、ＮＫＣＣ共輸送体を阻害するかＫＣＣ共輸送体を活性化する化合物のスクリーニング法に関する。
【００６１】
特に、本発明は、自閉症の治療のためのＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬のスクリーニング法を提供する。
【００６２】
例えば、スクリーニング法は、候補化合物に直接または間接的に関連づけられた標識によって、ＮＫＣＣもしくはＫＣＣに対する、ＮＫＣＣもしくはＫＣＣを担持している細胞もしくは膜に対する、あるいはそれらの融合タンパク質に対する候補化合物の結合を測定してもよい。あるいは、スクリーニング法では、標識した競合物質（例えば、拮抗薬）との受容体に対する候補化合物の結合の競合を測定しても、定性的もしくは定量的に検出してもよい。
【００６３】
さらに、スクリーニング法では、受容体を担持している細胞にとって適当な検出システムを用いて、本候補化合物により、ＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬によって生成される信号を生じるか否かを試験してもよい。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明のスクリーニング法は、
ａ）その表面にＮＫＣＣまたはＫＣＣを発現している神経細胞を用意する工程、
ｂ）前記細胞を候補化合物と共にインキュベートする工程、
ｃ）前記候補化合物がＮＫＣＣに結合して阻害するか否かまたはＫＣＣに結合して活性化するか否かを決定する工程、および
ｄ）ＮＫＣＣに結合して阻害するかＫＣＣに結合して活性化する候補化合物を選択する工程、
とからなる工程を含む。
【００６５】
一実施形態では、スクリーニング法で使用されるＮＫＣＣ共輸送体またはＫＣＣ共輸送体は、本発明に定義されているその相同分子種および誘導体であってもよい。
【００６６】
一般に、そのようなスクリーニング法は、その表面に、ＮＫＣＣもしくはＫＣＣまたはそれらの相同分子種および誘導体を発現する適当な細胞を用意する工程を伴う。特に、ＮＫＣＣまたはＫＣＣをコードする核酸を用いて細胞を形質移入し、それにより本発明の受容体を発現させてもよい。そのような形質移入は、当該技術分野でよく知られている方法によって達成してもよい。
【００６７】
特定の実施形態では、細胞は、グリア細胞、ノイロン細胞、神経細胞、調査用に形質移入された細胞系、または任意の生物種（マウス、ヒト…）の腎細胞からなる群から選択される。
【００６８】
そのような細胞をスクリーニングされる化合物に接触させ、そのような化合物が共輸送体を阻害または活性化するか否かを決定することによって拮抗薬または作動薬を決定するために本発明のスクリーニング法を用いてもよい。
【００６９】
細胞生存率を決定することによってＮＫＣＣの阻害を評価することができる。細胞救援活性の例として以下に記載されている方法のいずれか１つで陰性である場合、化合物は細胞生存率を減少させるとみなされる。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、本候補化合物は、以前に合成された化合物のライブラリ、データベース上に構造が決定されている化合物のライブラリ、あるいは新しく合成された化合物または天然化合物のライブラリから選択してもよい。
【００７１】
本候補化合物を、（ａ）タンパク質またはペプチド、（ｂ）核酸および（ｃ）有機もしくは化学化合物（天然または非天然）の群から選択してもよい。例示として、米国特許第５，４７５，０９６号および第５，２７０，１６３号に記載されているＳＥＬＥＸ法を行うことによって、事前に選択した候補核酸のライブラリを得てもよい。さらなる例示として、本候補化合物を、ＮＫＣＣまたはＫＣＣに対する抗体の群から選択してもよい。
【００７２】
そのような方法を使用して、本発明に係るＮＫＣＣ拮抗薬またはＫＣＣ作動薬をスクリーニングしてもよい。
【００７３】
以下の表および実施例によって本発明をさらに例示する。但し、これらの実施例および図は決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【００７４】
【表１】
0005914357.tif 000002
【００７５】
【表２】
0005914357.tif 000003
【実施例】
【００７６】
（材料および方法）
本発明者らは、５人の自閉症児において、臨床的および生物学的監視を行いながら、Ｂｕｍの効果を調査した。様々な症例を得るために、施設または自宅にいるＩＡＳ小児の大集団からアプリオリなしに、これらの自閉症児を選択した。本利尿剤を投与し（１ｍｇ／２４時間、０．５ｍｇを１日に２回）、治療を３ヶ月間継続した。この期間は、ＩＡＳに対する効果の評価にとって十分だとみなされた最短持続期間であった。本発明者らは、５人の小児におけるＩＡＳ兆候の有意な改善を報告する。これらの観察は、ＩＡＳにおけるＢｕｍの使用の広範囲なスクリーニングを必要とする。
【００７７】
自閉性障害の厳しいＩＣＤ−１０（ＯＭＳ１９９３）基準を用いて、経験豊富な臨床精神科医によって小児を診断した。これらの小児は、神経系疾患の病歴を有していなかった（正常なＥＥＧ）。体系的に行った遺伝子検査は、識別可能な突然変異（核型および脆弱Ｘ）を示さず、陰性であった。すべての参加者のＡＤＩ−Ｒ(Le Couteurら、１９８９年；Ｌｏｒｄら、１９９４年）を回収して、診断を確認した。臨床的および生物学的検査から、小児の中にＢｕｍに対して反対の兆候（特に、血液イオノグラム、アミノ基転移酵素、アルカリホスファターゼ、尿毒症、クレアチン血症、クレアチニンクリアランス、γＧＴ、血糖症など）を示すものはいないことが分かった。低カリウム血症によって突発性不整脈が誘発される可能性があるため、ＥＣＧを行って、不整脈を引き起こす傾向がより高い当該患者の中にＱＴ延長を有しているものは誰もいないことを確認した。治療開始から１週間後および２ヶ月後の血中ナトリウムおよびカリウムを含む臨床的監視を、治療の開始後１、２および３ヵ月間にわたって毎週行った。小児の中に関連する神経障害に罹患したものは誰もおらず、少なくとも３ヶ月以降に他の治療を受けたものは誰もいなかった。
【００７８】
可能な治療指数（有効性）を決定するために、本発明者らは、以下を含むＩＡＳ重症度の５つの古典的な行動決定法を利用した：
ｉ）小児自閉症評定尺度（ＣＡＲＳ）は、スクリーニング手法として、経時的な自閉症症状の変化を評価するために使用されている１５項目の評定尺度である。これらの項目は、自閉症の広範囲な症状を含み、１〜４の尺度で評定し、１は正常な行動を示し、４は、重度に異常かつ／または不適当な行動を意味する。総評点は、１５項目を加算することによって決定する。３以上の尺度を有する項目数は、症候群の重症度の強い指標であり、治療後の総評点および／または３以上の尺度を有する項目数の減少は、自閉的特徴の重症度の改善を示す（Ｒｏｇｅｒｓら、１９９３年）。この手法は診断プロセスを補助するために開発されたが、自閉的症状の発達変化にも影響されるため（Ｓｃｈｏｐｌｅｒら、１９８０年；Ｍｅｓｉｂｏｖら、１９８９年）、治療によって引き起こされる変化を測定するために使用することができる(Di LallaおよびＲｏｇｅｒｓ、１９９４年；B. Roge、１９８９年のフランス語版も参照)。小児にゲームをさせるセッションおよび先週の小児の行動に関する両親との活発な議論の間に記録を取った。
ｉｉ）ＡＢＣ（異常行動チェックリスト）は、両親との議論の間に治療医師によって記入される質問表である（Ａｍａｎら、１９８５年；ＲｏｊａｈｎおよびＨｅｌｓｅｌ、１９９１年）。これは、行動に対する分子の影響を評価するために治験で広く使用されている。ＡＢＣは、０（全く生じない）から３（深刻）までの４つの尺度で項目を評価することができる行動チェックリストを用いた、５８項目の標準化された問題点である。チェックリストの質問は、５つの下位尺度：被刺激性（ＡＢＣ１）、社会的ひきこもり（ＡＢＣ２）、常同症（ＡＢＣ３）、活動亢進（ＡＢＣ４）および過剰な発話（ＡＢＣ５）を含む。ＡＢＣは米国では大規模に有効であり、小児集団の調査に適している。フランス語版を本調査で使用した（Ｂｏｕｖａｒｄ、２０００年）。
ｉｉｉ）臨床全般印象尺度（ＣＧＩ）は、疾患の重症度を調査するために、大部分の治験で広く使用されている。これは、０〜７で評価され、１は正常値であり、患者の全般的な状況の良好な評価とみなされる。臨床医は、当該患者の調査に参加している他の患者との経験の関数として疾患の評価を提供することが求められる。第２の印象尺度によって、治験の開始と比較して、患者および回復の全般的な改善の評価が得られる。７つのレベルがあり、ゼロは進展がないことを示す。第３の印象尺度は、治療指数に関するものであり、治療効果と副作用の両方を示す単一の評価を必要とするため、最も有用である。これは、ほとんど副作用のない新世代精神病薬の研究に利用されている（Ｇｕｙ、１９７６年）。
ｉｖ）調節不全評価グリッド（ＲＤＥＧ）は、調節不全のレベルおよび小児の反応の遅さを検出することができるフランスの活動尺度（９６）である（Ａｄｒｉｅｎ、１９９６年；Ａｄｒｉｅｎら、２００１年；Ｂｌａｎｃら、２００５年）。質問表は両親によって記入され、先週の小児の行動に関するものである。
ｖ）反復制限行動（ＲＲＢ）尺度（Ｂｏｕｒｒｅａｕら、２００９年）は、０（その行動がその人によって全く発現されない）から、４（その行動が深刻に発現され、その人の特徴である）までの５つの尺度で項目評価することができる３５項目からなる標準化されたチェックリストである。要因解析によって、４つの臨床的に有意義な要因、すなわち、感覚運動の常同（Ｆ１）、変化に対する反応（Ｆ２）、制限された行動（Ｆ３）および調節不全（Ｆ４）が分かる。
【００７９】
（結果）
患者の要約を表１に示す。３人の男児は機能的言語を使用したが、残りの男児および女児は機能的言語を使用しなかった。ＡＤＩ−Ｒの評点は、臨床診断を確認する閾値を上回っている。小児１、３、５は、補助人の同行で伝統的な学校に通っている。その年の間、小児１に対して週に１回、小児２に対して週に３回、心理学者がＡＢＡ手法を用いて小児１および小児２を追跡調査する。小児２に対しては、絵カード交換式コミュニケーションシステム（ＰＥＣＳ）を利用した週２回の発声正常のセッションも行う。小児３に対しては発声正常の治療を毎週行い、小児５に対しては全く治療を行わない。小児４を精神的発達の遅い小児専門の医療施設で治療する。行動治療法および学校が中断される夏休みの間に、Ｂｕｍの試験を行った。
【００８０】
表２は、使用した異なる尺度の評点と３ヶ月の治療の前後で得られた評点を示す。治療前の４人の小児（１、２、３、４）のＣＡＲＳ評点は、深刻なＩＡＳを示す３６超であった。小児５は、中程度の自閉症を示した。結果は、治療から３か月後に全小児のＣＡＲＳ、ＡＢＣ、ＲＤＥＧおよびＲＲＢの総評点の改善を示している。ＣＧＩ１は有意に変化しなかったが、この試験は、この段階で有意な変化を示さない疾患の重症度に関するものである。本発明者らは、５人の小児について、ＣＧＩ２の僅かな全般的な回復も観察した。患者１、２および５は、ＣＧＩ３で３の指数を有し、これは、副作用のない適度な作用を示していた。患者３および４は、２の指数を有し、これは副作用のない最小の作用を示していた。５人の小児において、ＣＡＲＳに関する３以上の尺度を有する項目数が治療によって減少した。ＡＢＣ５の下位評点は、治療によって変化しなかった。５人の小児において、ＡＢＣ２、ＡＢＣ３、ＡＢＣ４、ＲＤＥＧ（調節不全）、ＲＤＥＧ（遅さ）、RRB F4およびRRB F1は、可変的な程度まで改善した。対照的に、ＡＢＣ１、RRB F2、RRB F3の結果は不均一である。
【００８１】
治療から１週間後に開始し、毎月１回、脱水、起立性低血圧症、過敏症、痙攣、無力症、下痢、筋肉痛、関節痛、嘔気、眩暈の調査を含む臨床的監視を行った。ナトリウムおよびカリウムのレベルは安定なままだった（試験は、治療の開始から１週間後および２ヶ月後に行った）。副作用は全く認められなかった。
【００８２】
（考察）
本結果は、ブメタニドがＩＡＳの行動的側面を改善することを示唆し、本利尿薬が全般的な作用を有することを示唆している。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、これは、自閉症における塩素イオンの変化の可能性を高める最初の報告である。
【００８３】
これらの観察から導き出される結果は、限定された数の症例によるランダム化二重盲検法およびプラセボ調査の欠如などのいくつかの制限によって妨げられている。プラセボ効果は、成人よりも小児においてよく見られ（Ｒｈｅｉｍｓら、２００８年）、これは自閉症にも当てはまる（Ｓａｎｄｌｅｒ、２００５年）。明らかに、観察を確認または否定するためには広範囲の調査が必要である。本発明者らは、これらの制限のために、ブメタニドの好ましい効果の実証およびＩＡＳに対するその作用の関与には限界があることを認識している。それにも関わらず、本発明者らの観察から、ブメタニドは、利尿薬に対する一般的な耐性に伴う副作用がないことが分かる。また、本発明者らは、その結果に示唆されている劇的な行動回復および自分の子供がより存在感がある(present)という両親の主張ならびにＢｕｍの有意な作用を支持して治療を続行したいという両親の願望によって、これらの観察を提供すように促された。この主観的な概念を伝えることの難しさにも関わらず、存在感(presence)という同じ用語がすべての両親によって使用されたことを強調することは興味深い。
【００８４】
現時点では、ブメタニドが総体的症状の一側面に対して選択的な作用を与えるか否かについて決定することはできない。発話については３ヶ月で改善が生じる可能性が低いため、ＡＢＣ５に対するブメタニドの効果の欠如（文脈から外れた不適切に過剰な発話）が予想される。対照的に、ほとんど全ての評点が可変的な程度まで改善され、これはブメタニドの一般作用を強調している。認知および情動行動の変化は、ＩＡＳの基本的な特徴であり（Ｋａｎｎｅｒ、１９４３年；ＨｉｌｌおよびＦｒｉｔｈ、２００３年；Ｈｉｌｌ、２００４年；ＢｉｅｂｅｒｉｃｈおよびＭｏｒｇａｎ、２００４年）、ブメタニドにより、より良好な認知制御が可能となるという事実は、おそらく、両親によって報告されている存在感の改善(improved presence)と相関しているはずである。ＡＢＣの下位尺度の結果は、警戒の状態および社会交流、常同的行動、および認知制御の概念にも一致する活動亢進の改善を示唆している。ブメタニドの薬力学については、ヒトの新生児で調査されており（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９６年；Ｌｏｐｅｚ−Ｓａｍｂｌａｓら、１９９７年）、最近の報告では、ブメタニドによっててんかんの小児におけるてんかん発作の重症度が減少することが示唆されている（Ｋａｈｌｅら、２００９年）。広範囲にわたる実験的な調査では、ブメタニドにより、てんかん発作の重症度が減少することが示唆されている（ＫａｈｌｅおよびＳｔａｌｅｙ、２００８年；Ｋａｈｌｅら、２００８年；Ｎａｒｄｏｕら、２００９年）。ブメタニドは、新生児のてんかん発作の新規治療薬として、現在調査されている（Eu FP7 NEMOプロジェクト）。
【００８５】
本観察は、細胞内塩素イオンを減少させ、ＧＡＢＡの阻害作用を強化することによってブメタニドにより神経細胞の総合的プロセスの有効性が高められるという作業仮説に矛盾していない。これらの調査の基本的な概念フレームは、発達プログラムを順守することに失敗した神経細胞が、おそらく高い（Ｃｌ−）Ｉおよび他の電気的および構築上の特性を含む未発達の特徴を維持するということである（Ｂｅｎ−Ａｒｉ、２００８年）。他の観察は、ＧＡＢＡ作動性シグナルと自閉症との関連性を示唆している（Ｍｉｎｓｈｅｗ、１９９７年；Ｈｕｓｓｍａｎ、２００１年；Ｓｃｈｍｉｔｚら、２００５年）。また、いくつかの脳画像化観察により、自閉症では、特に、海馬、小脳および各種辺縁系構造におけるＧＡＢＡ／ベンゾジアゼピン受容体の有意な喪失が分かる（Ｇａｒｒｅａｕら、１９９３年；Ｏｂｌａｋら、２００９年；Ｇｕｐｔｉｌｌら、２００７年；Ｂｌａｔｔ、２００５年）。
【００８６】
結論として、新興の一連の調査は、各種発達奇形に関連して塩素イオンが脳成熟の間に蓄積することを示唆している。本観察は、この蓄積を減少させ、かつＧＡＢＡの阻害作用を復活させるように作用する従来の利尿薬が自閉症において有益な作用を与え得、ＧＡＢＡ／（Ｃｌ−）ＩとＩＡＳとの関連性に関するより詳細な実験的かつ臨床的調査を必要としていることを示唆している。
【００８７】
（参考文献）
本出願の全体にわたって、各種参考文献は、本発明が属する最先端技術について記載している。これらの参考文献の開示内容は、参照により本開示に組み込まれる。
【００８８】
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