(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、腎臓疾患の予防または治療用組成物であって、前記腎臓疾患が、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢性腎臓疾患および腎不全よりなる群から選ばれる少なくとも一つの腎臓疾患である、予防または治療用組成物：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
【請求項２】
下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、腎臓疾患の予防または治療用組成物であって、前記腎臓疾患が、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢性腎臓疾患および腎不全よりなる群から選ばれる少なくとも一つの腎臓疾患である、予防または治療用組成物：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【請求項３】
腎臓疾患の予防または治療用薬学的製剤を製造するための下記に列挙された化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の用途であって、前記腎臓疾患が、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢性腎臓疾患および腎不全よりなる群から選ばれる少なくとも一つの腎臓疾患である、用途：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
【請求項４】
腎臓疾患の予防または治療用薬学的製剤を製造するための下記に列挙された化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の用途であって、前記腎臓疾患が、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢性腎臓疾患および腎不全よりなる群から選ばれる少なくとも一つの腎臓疾患である、用途：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾール誘導体を含む腎臓疾患の予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎疾患（chronic kidney disease：ＣＫＤ）は、心血管疾患の発症率および死亡率が年齢対照群よりも１０倍以上高い深刻な疾患であって、最近、この疾患に苦しむ患者が幾何級数的に増加している(Schieppati A, Remuzzi G: Chronic renal diseases as a public health problem: epidemiology, social, and economic implications. Kidney Int Suppl. 98:S7-S10, 2005(1))。
【０００３】
慢性腎疾患は、上皮から間葉への変化（epithelial-to-mesenchymal transition：ＥＭＴ）と細胞外マトリックス（extracellular matrix：ＥＣＭ）蛋白の蓄積を特徴とし、その代表的な病理学的所見としては、糸球体毛細血管基底膜の肥厚、糸球体メサンギウムの拡張、尿細管間質の線維化、糸球体肥大、腎肥大、およびタンパク尿などがある。腎臓組織の線維化に関連する因子であるトランスフォーミング成長因子（transforming growth factor-β1：ＴＧＦ−β１）は、様々な刺激による細胞外マトリックス蛋白生産の最終的なメディエーターであり、線維化の指標として認識されている(Qian Y, Feldman E, Pennathur S, Kretzler M, Brosius FC 3rd: From fibrosis to sclerosis: mechanisms of glomerulosclerosis in diabetic nephropathy. Diabetes. 57: 1439-45, 2008)。
【０００４】
一方、慢性腎疾患の一つである糖尿病性腎症（diabetic kidney disease：ＤＫＤ）は、末期腎不全（end-stage renal disease：ＥＳＲＤ）誘発の最も一般的な原因である(U.S. Renal Data System, USRDS 2011 Annual Data Report: Atlas of End-Stage Renal Disease in the United States, National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD, 2011)。 
【０００５】
糖尿病性腎症を始めとする慢性腎疾患が末期腎不全に進行するのを抑制するために現在までに知られている治療方法は、徹底した血圧調節や、レニン−アンジオテンシン系（renin-angiotensin system：ＲＡＳ）遮断剤の使用であるが、依然として完璧な腎保護効果を有する治療剤の開発が切実に求められている(Zhang MZ, Wang S, Yang S, Yang H, Fan X, Takahashi T, Harris RC:The Role of Blood Pressure and the Renin-Angiotensin System in Development of Diabetic Nephropathy (DN) in eNOS-/- db/db Mice. Am J Physiol Renal Physiol. Epub ahead of print, 2011)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明者らは、特定のピラゾール誘導体がタンパク尿、糸球体メサンギウムの拡張および腎線維症に対して抑制効果を示すことを見出し、これらが腎臓疾患の予防または治療に使用できることを確認することにより、本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的は、ピラゾール誘導体を含む腎臓疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、本発明のピラゾール誘導体を投与して腎臓疾患を予防または治療する方法、および腎臓疾患の予防または治療のための薬学的製剤を製造するためのピラゾール誘導体の用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、腎臓疾患の予防または治療用組成物を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
【０００９】
本発明は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、腎臓疾患の予防または治療用組成物を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００１０】
本発明において、薬学的に許容される塩は、医薬業界で通常使用される塩を意味し、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、臭素酸、ヨウ素酸、過塩素酸、スズ酸および硫酸などで製造された無機酸塩；酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、コハク酸、シュウ酸、安息香酸、酒石酸、フマル酸、マンデル酸、プロピオン酸、クエン酸、乳酸、グリコール酸、グルコン酸、ガラクツロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルクロン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、カルボン酸、バニリン酸、ヨウ化水素酸などで製造された有機酸塩；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などで製造されたスルホン酸塩などであってもよいが、これらに限定されない。好ましくは、前記薬学的に許容される塩は塩酸塩である。
【００１１】
本発明において、腎臓疾患には、糖尿病性腎症、高血圧性腎症、糸球体腎炎、腎盂腎炎、間質性腎炎、ループス腎炎、多嚢性腎臓疾患または腎不全が含まれ得る。
前記腎臓疾患は、タンパク尿、糸球体硬化、腎間質性線維化などを特徴とし得る。
【００１２】
本発明の組成物は、本発明の効果を損なわない範囲で薬学的に許容される希釈剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、溶解補助剤などの薬学的に許容される添加剤を含むことができる。 
【００１３】
希釈剤としては、糖類、澱粉、微結晶セルロース、乳糖（乳糖水和物）、グルコース、Ｄ−マンニトール、アルギン酸塩、アルカリ土類金属塩、クレイ、ポリエチレングリコール、無水リン酸水素カルシウム、またはこれらの混合物などを使用することができ、結合剤としては、澱粉、微結晶セルロース、高分散性シリカ、マンニトール、Ｄ−マンニトール、ショ糖、乳糖水和物、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ポリビニルピロリドン共重合体（コポビドン）、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、天然ガム、合成ガム、コポビドン、ゼラチン、またはこれらの混合物などを使用することができる。
【００１４】
崩壊剤としては、澱粉グリコール酸ナトリウム、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉または前糊化澱粉などの澱粉または変性澱粉；ベントナイト、モンモリロナイトまたはビーガム(veegum)などのクレイ; 微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースなどのセルロース類；アルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸またはその塩；クロスカルメロース(croscarmellose)ナトリウムなどの架橋セルロース類；グアーガム、キサンタンガムなどのガム類；架橋ポリビニルピロリドン(クロスポビドン(crospovidone))などの架橋重合体; 重炭酸ナトリウム、クエン酸などの発泡剤、またはこれらの混合物を使用することができる。
【００１５】
潤滑剤としては、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水素化植物油、安息香酸ナトリウム、ナトリウムステアリルフマレート、グリセリルベヘネート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルパルミトステアレート、コロイド状二酸化ケイ素、またはこれらの混合物などを使用することができる。
【００１６】
ｐＨ調整剤としては、酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ナトリウムエーテラート、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、クエン酸などの酸性化剤と、沈降炭酸カルシウム、アンモニア水、メグルミン、炭酸ナトリウム、酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウムなどの塩基性化剤などを使用することができる。
【００１７】
酸化防止剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、酢酸トコフェロール、トコフェロール、没食子酸プロピル、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウムなどを使用することができる。本発明の短時間作用型剤において、溶解補助剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベートなどのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ドキュセートナトリウム、ポロキサマー(poloxamer)などを使用することができる。 
【００１８】
また、遅延放出性製剤を調製するために、本発明の組成物は、腸溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、疎水性化合物、および親水性ポリマーを含むことができる。 
【００１９】
前記腸溶性ポリマーとは、ｐＨ５未満の酸性条件下で不溶性であるか或いは安定であって、ｐＨ５以上の特定のｐＨ条件下で溶解または分解されるポリマーをいい、例えば、腸溶性ポリマーとしては、ヒプロメロースアセテートサクシネート、ヒプロメロースフタレート（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、ヒドロキシメチルエチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートサクシネート、セルロースアセテートマレート、セルロースベンゾアートフタレート、セルロースプロピオネートフタレート、メチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロースフタレートおよびメチルヒドロキシエチルセルロースなどの腸溶性セルロース誘導体；スチレン−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチル−アクリル酸共重合体、アクリル酸メチルメタクリル酸共重合体（例えば、アクリル−ＥＺＥ）、アクリル酸ブチル−スチレン−アクリル酸共重合体、およびアクリル酸メチル−メタクリル酸−アクリル酸オクチル共重合体などの腸溶性アクリル酸共重合体；ポリ（メタクリル酸／メタクリル酸メチル）共重合体（例えば、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、エボニック社製、ドイツ）、ポリ（メタクリル酸／アクリル酸エチル）共重合体（例えば、オイドラギットＬ１００−５５）などの腸溶性ポリメタクリレート共重合体；酢酸ビニル−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、スチレン−マレイン酸モノエステル共重合体、ビニルメチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、エチレン−マレイン酸無水物共重合体、ビニルブチルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、アクリロニトリル−アクリル酸メチル−マレイン酸無水物共重合体、およびアクリル酸ブチル−スチレン−マレイン酸無水物共重合体などの腸溶性マレイン酸共重合体；ならびに、ポリビニルアルコールフタレート、ポリビニルアセタールフタレート、ポリビニルブチレートフタレートおよびポリビニルアセトアセタールフタレートなどの腸溶性ポリビニル誘導体が挙げられる。
【００２０】
前記水不溶性ポリマーとは、薬物の放出を制御する水不溶性ポリマーで、薬学的に許容されるものをいう。たとえば、水不溶性ポリマーとしては、ポリビニルアセテート（例えば、コリコートＳＲ３０Ｄ）、水不溶性ポリメタクリレート共重合体［例えば、ポリ（アクリル酸エチル−アクリル酸メチル）共重合体（例えば、オイドラギットＮＥ３０Ｄ）、ポリ（アクリル酸エチル−メタクリル酸メチル−トリメチルアミノエチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＲＳＰＯ）など］、エチルセルロース、セルロースエステル、セルロースエーテル、セルロースアシレート、セルロースジアシレート、セルローストリアシレート、セルロースアセテート、セルロースジアセテート、およびセルローストリアセテートなどがある。
【００２１】
前記疎水性化合物とは、薬物の放出を制御する水不溶性物質で、薬学的に許容されるものをいう。たとえば、疎水性化合物としては、グリセリルパルミトステアレート、グリセリルステアレート、グリセリルベヘネート、セチルパルミテート、グリセリルモノオレエートおよびステアリン酸などの脂肪酸および脂肪酸エステル類；セトステアリルアルコール、セチルアルコールおよびステアリルアルコールなどの脂肪酸アルコール類；カルナウバワックス、蜜蝋およびマイクロクリスタリンワックスなどのワックス類；タルク、沈降炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、カオリン、ベントナイト、モンモリロナイトおよびビーガムなどの無機物質などが挙げられる。
【００２２】
前記親水性ポリマーとは、薬物の放出を制御する水溶性ポリマーで、薬学的に許容されるものをいう。たとえば、親水性ポリマーとしては、デキストリン、ポリデキストリン、デキストラン、ペクチンおよびペクチン誘導体、アルギン酸塩、ポリガラクツロン酸、キシラン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、アミロースならびにアミロペクチンなどの糖類；ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体；グアーガム、ローカストビーンガム、トラガカント、カラギーナン、アカシアガム、アラビアガム、ジェランガムおよびキサンタンガムなどのガム類；ゼラチン、カゼインおよびゼインなどの蛋白質；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびポリビニルアセタールジエチルアミノアセテートなどのポリビニル誘導体；ポリ（ブチルメタクリレート−（２−ジメチルアミノエチル）メタクリレート−メチルメタクリレート）共重合体（例えば、オイドラギットＥ１００、エボニック社製、ドイツ）、ポリ（エチルアクリレート−メチルメタクリレート−トリエチルアミノエチル−メタクリレートクロリド）共重合体（例えば、オイドラギットＲＬ、ＲＳ、エボニック社製、ドイツ）などの親水性ポリメタクリレート共重合体；ポリエチレングリコール、およびポリエチレンオキシドなどのポリエチレン誘導体；カルボマーなどが挙げられる。
【００２３】
この他にも、着色剤および香料から選ばれた様々な添加剤として、薬学的に許容される添加剤を使用して本発明の組成物を製剤化することができる。 
本発明において用い得る添加剤の範囲は上記の添加剤に限定されるものではなく、当業者が前記添加剤を適宜選択し、通常の範囲の用量で用いることにより製剤化することができる。
【００２４】
本発明に係る薬学的組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、およびエアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
【００２５】
また、本発明は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物、またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、本発明の腎臓疾患の予防または治療用組成物を、哺乳類を含む対象に投与し、腎臓疾患を予防または治療する方法を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
【００２６】
本発明において、用語「投与」は、ある適切な方法で患者に本発明の腎臓疾患予防または治療用組成物を導入することを意味し、本発明の腎臓疾患予防または治療用組成物の投与経路は、目的組織に到達することができる限り、いかなる一般的な経路を通じても投与することができる。例えば、経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、内皮投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、腹腔内投与、 硬膜内投与を採用することができるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明に係る腎臓疾患予防または治療用組成物は、１日１回または一定の時間間隔をおいて１日２回以上投与することができる。
【００２８】
本発明において、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じて、その範囲が多様である：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オルの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
例えば、投与量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、これは患者の重症度、年齢、性別などに応じて変化させることができる。
【００２９】
また、本発明は、下記列挙された化合物の中から選ばれた化合物またはこれらの薬学的に許容される塩を含む、本発明の腎臓疾患の予防または治療用組成物を、哺乳類を含む対象に投与し、腎臓疾患を予防または治療する方法を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【００３０】
また、本発明は、腎臓疾患の予防または治療用薬学的製剤を製造するための下記に列挙された化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の用途を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５（４Ｈ）−オン；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール。
【００３１】
また、本発明は、腎臓疾患の予防または治療用薬学的製剤を製造するための下記に列挙された化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の用途を提供する：
１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの塩酸塩（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）；
３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート；
３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；および
３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、タンパク尿、糸球体肥大および腎線維症に対する抑制効果があり、腎臓疾患の予防または治療に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】実施例１の化合物が、糸球体の肥大および糸球体メサンギウムの拡張に及ぼす影響を示す図である。
【図１Ｂ】実施例１の化合物が、糸球体の肥大および糸球体メサンギウムの拡張に及ぼす影響を示す図である。
【図１Ｃ】実施例１の化合物が、糸球体の肥大および糸球体メサンギウムの拡張に及ぼす影響を示す図である。
【図２】実施例１の化合物が、コラーゲン蓄積｛マッソントリクローム(Masson’s trichrome)染色）、ピクロシリウスレッド(picrosirius red)染色｝とマクロファージマーカー（Ｆ４／８０）の生成に及ぼす影響を示す図である。
【図３】実施例１の化合物が、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−β１）、細胞外マトリックスタンパク質（フィブロネクチン、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンＩα１）ならびに炎症性因子（Ｆ４／８０）の生成に及ぼす影響を示す図である。
【図４】実施例１の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図５】実施例２の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図６】実施例３の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図７】実施例４の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図８】実施例５の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図９】実施例６の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図１０】実施例７の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図１１】実施例８の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図１２】実施例９の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【図１３】比較例１の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例および実験例を挙げて本発明をより具体的に説明する。これらの実施例および実験例は、本発明を説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
また、以下に記載された試薬および溶媒は、特別な言及がない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｋｏｒｅａ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、またはＴｏｋｙｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（ＴＣＩ）から購入したものであり、１Ｈ−ＮＭＲデータはＪＥＯＬ社のＥｃｌｉｐｓｅ ＦＴ ３００ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値であり、１３Ｃ−ＮＭＲデータはＪＥＯＬ社のＥｃｌｉｐｓｅ ＦＴ ３００ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値であり、ＭａｓｓデータはＪＥＯＬ社のＭＳｔａｔｉｏｎ ＪＭＳ  ７００ ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで測定した値である。
【実施例】
【００３５】
実施例１：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ[1-(pyridine-2-yl)-3-phenyl-4-propyl-1H-pyrazol-5-o1・HCl]の合成（以下、１８−２７８化合物）
段階１：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[1-(pyridine-2-yl)-3-phenyl-4-propyl-1H-pyrazol-5-o1]の合成
【００３６】
【化１】
0005974180.tif 000002
【００３７】
丸底フラスコに２−プロピル−３−オキソ−３−フェニルプロピオン酸エチルエステル（２．５２ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）とエタノール１０ｍＬを入れ、２−ヒドラジノピリジン（１．２９ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）をエタノール３ｍＬに希釈して０℃でゆっくりと滴下した。３日間１００℃で加熱還流した。減圧蒸留して溶媒を除去し、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥して前記化学式１の化合物を８２％の収率で得た。
1H NMR(300 MHz, CDCl3) δ 12.50 (1H, s), 8.27-8.25 (1H, m), 8.01 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.81 (1H, m), 7.69 (2H, m), 7.48-7.34 (3H, m), 7.14-7.10 (1H, m), 2.54 (2H, d, J = 7.5 Hz), 1.64 (2H, m), 0.93 (3H, t, J = 7.3 Hz); 
EIMS (70 e V) m/z (rel intensity) 279 (M+, 37), 250 (100).
【００３８】
段階２：１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌの合成（２７８）
【００３９】
【化２】
0005974180.tif 000003
【００４０】
丸底フラスコに、段階１で製造した１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール２８０ｍｇをエチルエーテル４ｍＬに溶解した。ここで、２ＭのＨＣｌが溶解したエチルエーテル０．５５ｍＬを０℃でゆっくりと滴下した。前記反応溶液から生成された固体を減圧濾過して溶媒を除去し、ヘキサンと酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥して化学式２の化合物２７０ｍｇを得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.44 (1H, d, J = 4.2 Hz), 8.0 8-8.03 (2H, m), 7.66-7.64 (2H, m), 7.48-7.42 (3H, m), 7.34-7.30 (1H, m), 2.49 (2H, brs), 2.43 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1.48 (2H, m), 0.48 (3H, t, J = 7.3 Hz).
【００４１】
実施例２：３−（３−メトキシフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-(3-methoxyphenyl)-1-(pyridine-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]の合成（１８−００１）
【００４２】
【化３】
0005974180.tif 000004
【００４３】
韓国登録特許１０−０９４２３８２号に開示された合成方法に従って、前記化学式３の化合物を合成した。具体的には、丸底フラスコに３−（３−メトキシフェニル）−３−オキソ−プロピオン酸エチルエステル（１当量）とエタノール４ｍＬを入れ、ここに２−ヒドラジノピリジン（１．１当量）をエタノール３ｍＬに希釈して０℃でゆっくりと滴下した。２０分間加熱還流した。減圧蒸留して溶媒を除去し、生成された固体をヘキサンと酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥して化学式３の化合物を６７％の収率で得た。
【００４４】
【化４】
0005974180.tif 000005
【００４５】
化学式３の化合物と化学式３’の化合物はエノール型とケト型の関係である。したがって、化学式３の化合物は、ケト−エノール互変異性反応によって化学式３’の化合物として存在することもできる。
【００４６】
実施例３：３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-(4-bromophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]の合成（以下、１８−０６６化合物）
【００４７】
【化５】
0005974180.tif 000006
【００４８】
韓国公開特許第１０−２０１１−００２５１４９号に開示された合成方法に従って製造した。具体的には、１００ｍＬの丸底フラスコにエチル４−ブロモベンゾイルアセテート（製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）（１０ｍｍｏｌ、製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）とエタノール（１０ｍＬ）を入れ、２−ヒドラジノピリジン（１０ｍｍｏｌ、製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）をエタノール（１０ｍＬ）に溶かした溶液を前記フラスコに添加した。１００℃で８時間攪拌した後、室温で冷却した。生成した固体を濾過し、エタノールとヘキサンで洗浄した後、固体を真空乾燥して化学式４の化合物を得た。
収率：８１％（２．５ｇ、８．０ｍｍｏｌ）；
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.8 (br, 1H) 8.30-8.28 (m, 1H), 8.03 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.94-7.88 (m, 1H), 7.73 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.54 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 7.21-7.16 (m, 1H), 5.91 (s, 1H); 
EIMS (70eV) m/z (rel intensity) 315 (M+, 25), 317 (M+, 26), 101 (19), 79 (100).
【００４９】
実施例４：３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イルアセテート[3-(4-bromophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-yl acetate]の合成（以下、１８−０６７化合物）
【００５０】
【化６】
0005974180.tif 000007
【００５１】
実施例３で合成した３−（４−ブロモフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール（３ｍｍｏｌ、１当量）を１０ｍＬのＣＨＣｌ３に溶かした後、０℃でトリエチルアミンを１．２当量添加した。その後、塩化アセチルを１当量加え、１０分間還流した。反応が終結した後、溶液にＨ２Ｏ（１０ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出した。有機層を無水のＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過して濃縮した後、カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＥＡ＝５：１（ｖ／ｖ））で分離して、化学式５の化合物を製造した。
【００５２】
実施例５：３−（３−ヨードフェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-(3-iodophenyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]の合成（以下、１８−０８２化合物）
【００５３】
【化７】
0005974180.tif 000008
【００５４】
韓国公開特許第１０−２０１１−００２５１４９号に開示された合成方法に従って製造した。具体的には、１００ｍＬの丸底フラスコにエチル３−ヨードベンゾイルアセテート（１０ｍｍｏｌ、製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）とエタノール（１０ｍＬ）を入れ、２−ヒドラジノピリジン（１０ｍｍｏｌ、製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）をエタノール（１０ｍＬ）に溶かした溶液を、前記フラスコに添加した。
１００℃で８時間攪拌した後、室温で冷却した。生成した固体を濾過し、エタノールとヘキサンで洗浄した後、固体を真空乾燥して化学式６の化合物を得た。
収率：８０．４％  
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.84 (br, 1H) 8.31-8.29 (m, 1H), 8.25-8.24 ( m, 1H), 8.08-8.04 (m, 1H), 7.95-7.89 (m, 1H), 7.81-7.77 (m, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.23-7.13 (m, 2H ), 5.91 (s, 1H).
【００５５】
実施例６：３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-((naphthalen-3-yloxy)methyl)-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]（６ｂ）の合成（以下、１８−０９５化合物）
【００５６】
【化８】
0005974180.tif 000009
【００５７】
韓国公開特許第１０−２０１１−００２５１５１号に開示された合成方法に従って製造した。具体的に下記段階１および２に基づいて合成した。
【００５８】
段階１：エチル４−（ナフタレン−３−イルオキシ）−３−オキソブタノエート[ethyl 4-(naphthalen-3-yloxy)-3-oxobutanoate]の合成
２５ｍＬの丸底フラスコに２−ナフタレンオキシ酢酸(2-naphthalenoxy acetic acid)（４ｂ、４０４．４ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ、製造社：Ｆｌｕｋａ）を入れ、無水ベンゼン２８ｍＬに溶かした後、塩化オキサリル（oxalyl chloride、０．３３８ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ、製造社：Ａｌｄｒｉｃｈ）をゆっくりと加え、触媒としてＤＭＦを少量加えた後、室温で２時間撹拌し、濃縮した後、塩化メチレンで溶かした。
その後、温度を０℃に冷却した後、メルドラム酸(Meldrum’s acid)（３２３ｍｇ、２．２４ｍｍｏｌ）を２ｍＬの塩化メチレンに溶かした溶液をゆっくりと加え、１ｍＬのピリジンをゆっくりと加えた後、室温で１８時間攪拌した。ＴＬＣで反応完結を確認した後、１．５ｍＬの２Ｍ ＨＣｌと氷を添加して反応を終結させ、飽和塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。その後、溶媒をすべて除去するために真空乾燥した後、３０ｍＬのエタノールに溶かし、冷却コンデンサーを差し込み、６０℃で２０時間加熱還流させた。反応混合物を濃縮してエタノールを除去し、酢酸エチルで抽出し、 飽和塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(column chromatography)（ｎ−Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝１０／１（ｖ／ｖ））で精製して、エチル４−（ナフタレン−３−イルオキシ）−３−オキソブタノエートを製造した。
収率６１％
【００５９】
段階２：３−（（ナフタレン−３−イルオキシ）メチル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オールの合成
２５ｍＬの丸底フラスコにエチル４−（ナフタレン−３−イルオキシ）−３−オキソブタノエート（５ａ、１．２ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を入れ、１０ｍＬのエタノールに溶かした後、１００℃で２−ヒドラジノピリジン（０．５５ｇ、５．０ｍｍｏｌ）を５ｍＬのエタノールに溶かした溶液を、３０分間ゆっくりと添加した後、２０時間攪拌した。その後、ＴＬＣで反応終結を確認し、反応溶液を蒸発(evaporation)させて濃縮した後、酢酸エチルで抽出し、飽和塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(column chromatography)（ｎ−Ｈｅｘ／ＥｔＯＡｃ＝９／１（ｖ／ｖ））で精製して、化学式７の化合物を得た。
収率６５．２％；
1 H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 12.76 (br, 1H) 8.29-8.27 (m, 1H), 7.97-7.87 (m, 2H), 7.79-7.7 4 (m, 3H), 7.49-7.41 (m, 1H), 7.37-7.15 (m, 4H), 5.76 (s, 1H), 5.15 (s, 2H); EIMS m/z (rel intensity ) 317 (M+, 100), 174 (99), 106 (7)
【００６０】
実施例７：３−（２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）フェニル）−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-(2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)phenyl)-1-(pyridine-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]の合成（以下、１８−１７７化合物）
【００６１】
【化９】
0005974180.tif 000010
【００６２】
韓国公開特許第１０−２０１１−００２５１４９号に開示された合成方法に従って化学式８の化合物を製造した。
【００６３】
実施例８：３−（ビフェニル−４−イル）−１−（ピリミジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-(biphenyl-4-yl)-1-(pyrimidin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]の合成（以下、１８−１８６化合物）
【００６４】
【化１０】
0005974180.tif 000011
【００６５】
韓国公開特許第１０−２０１１−００２５１４９号に開示された合成方法に従って化学式９の化合物を製造した。
【００６６】
実施例９：３−｛２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール[3-{2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)vinyl}-4-propyl-1-(2-pyridinyl)pyrazol-5-ol]の合成（以下、１８−２７３化合物）
【００６７】
【化１１】
0005974180.tif 000012
【００６８】
（Ｅ）−エチル５−［４−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−メトキシフェニル］−３−オキソ−２−プロピルペンタノエート{(E)-ethyl 5-[4-(tert- butyldimethylsilyloxy)-3-methoxyphenyl]-3-oxo-2-propyl pentanoate}（１．０２ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を酢酸(acetic acid)［５ｍＬ］に溶かした溶液に、２−ヒドラジノピリジン(2-hydrazinopyridine)［２６６ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ］を加えて加熱還流下で２日間攪拌した。反応溶液を減圧蒸留して濃縮した後、酢酸エチル（１５ｍＬ）と水（５ｍＬ）を加えて抽出した（×３回）。有機層は、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、カラムクロマトグラフィー［ヘキサン（Ｈｅｘ）：酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）＝１５：１］で精製して３−｛２−（４−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−３−メトキシフェニル）ビニル｝−４−プロピル−１−（２−ピリジニル）ピラゾール−５−オール[3-{2-(4-tert-butyldimethylsilyloxy-3-methoxyphenyl)vinyl}-4-propyl-1-(2-pyridinyl)pyrazol-5-ol]（６７６ｍｇ、６９％）を得た。
前記化合物（９９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）をメタノール（ＭｅＯＨ）［１ｍＬ］に溶かした後、濃塩酸（０．０２ｍＬ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を１日間攪拌した。減圧して溶媒を除去して固体を得た。得られた固体を真空乾燥して、前記化合物（７４ｍｇ、９８％）を得た。
1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.46 (1H, m), 8.30 (1H, d, J = 9.0 Hz ), 7.95 (1H, m), 7.43-6.81 (6H, m), 3.72 (3H, s), 2.42 (2H, t, J = 7.2 Hz), 1.53 (2H, q, J = 9.0 Hz) , 0.91 (3H, t, J = 9.0 Hz).
【００６９】
比較例：３−フェニル−４−ベンジル−５−ベンジルオキシ−１−（２−ピリジニル）ピラゾール[3-phenyl-4-benzyl-5-benzyloxy-1-(2-pyridinyl)pyrazole]の合成（以下、１８−２３３化合物）
【００７０】
【化１２】
0005974180.tif 000013
【００７１】
１０ｍＬの丸底フラスコに３−フェニル−４−ベンジル−１−（ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−オール[3-phenyl-4-benzyl-1-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-5-ol]（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム(potassium carbonate)［５８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ］、ＤＭＦ（１ｍＬ）を入れて常温で１０分間攪拌した。臭化ベンジル(benzyl bromide)［５５μＬ、０．４６ｍｍｏｌ］を加えて２時間撹拌した。Ｈ２Ｏ（３ｍＬ）を加え、酢酸エチル（３×５ｍＬ）で抽出した。ＭｇＳＯ４で水を除去してろ過した。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ＝２：１）で分離して、前記化学式１１の化合物（６５ｍｇ、５２％）を得た。
1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ 8.61-8.59 (m, 1H), 8.06 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 7.80 (t, 1H, J = 8.4 Hz), 7 .58-7.48 (m, 5H), 7.21-7.07 (m, 7H), 6.96 (d, 2H J = 7.9 Hz), 6.55 (d, 2H, J = 7.1 Hz), 4.91 (s, 2H) , 3.69 (s, 2H); EI-MS (70eV) m/z (rel intensity) 417 (M+, 6), 339 (39), 326 (61), 296 (40), 206 (26), 193 (85), 121 (15), 91 (100)
【００７２】
実施例１０：本発明の化合物による実験動物の状態変化の確認
すべての動物実験は、イファ動物実験倫理委員会の規定に従って進めた。第１型糖尿病モデルにおける本発明の化合物の効果を調べるために、ストレプトゾトシン(streptozotocin)を５０ｍｇ／ｋｇで５日間投与した８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血中糖数値を確認した後(Hwang I, Lee J, Park J, Huh JY, Lee HB, Ho YS, Ha H:Catalase deficiency accelerates diabetic renal injury through peroxisomal dysfunction. Diabetes:728-738, 2012)、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌを、１０ｍｇ／ｋｇ／日（ｄａｙ）で１２週間経口投与した。１２週間後に解剖して分析し、血液を採取して血糖値、ヘモグロビンＡ１ｃ（hemoglobin A1c；ＨｂＡ１ｃ）、血漿クレアチニン(plasma creatinine)を測定し、尿を回収して尿タンパク(urine protein)を測定した。血糖値、ＨｂＡ１ｃ、血漿クレアチニン、尿タンパクは、それぞれジョンソン・エンド・ジョンソン社のＯＮＥＴＯＵＣＨ  Ｕｌｔｒａ、ＳＩＥＭＥＮＳ社のＤＣＡ２０００＋Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｒｂｏｒ Ａｓｓａｙｓ社のＤｅｔｅｃｔ Ｘ Ｓｅｒｕｍ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔおよびＢｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＢｉｏ−Ｒａｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔを用いて測定した。対照群（ＷＴ）、糖尿病群（ＤＭ）および実施例１の化合物処理群（ＤＭ＋実施例１の化合物）は、それぞれ、第１型糖尿病非誘発群、第１型糖尿病誘発群、および第１型糖尿病を誘発した後に実施例１の化合物で処理した群を意味する。
本発明の化合物による実験動物の状態変化は、下記の表１に示す。
【００７３】
【表１】
0005974180.tif 000014
【００７４】
前記表１のデータは、各群につき８〜１２匹のマウスの平均値(mean)±標準誤差（ＳＥ）で表す。各群間の統計的な比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とフィッシャーのＬＳＤ(Fisher’s least significant difference)法で検定した。Ｐ値が０．０５未満である場合に有意であると判定した（＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＷＴ、†Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＤＭ）。
【００７５】
表１に示すように、対照群（ＷＴ）と比較して、糖尿病群（ＤＭ）では体重が減少し、血糖値およびｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ値が増加したことからみて、第１型糖尿病誘発後１２週間高血糖状態が維持されたことが分かった。そして、腎臓重量、および腎臓重量／体重の比も増加したことからみて、腎肥大症(hypertrophy)が出現したことが分かった。血中（血漿）クレアチニンには対照群と比較して有意差は見られなかったが、アルブミン排泄は増加したことが分かった。一方、糖尿病を誘発させ、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌを投与したマウス（実施例１の化合物処理群）では、糖尿病群と比較して、体重、血糖値、ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ値、腎臓重量、腎臓重量／体重の比、血中クレアチニンに有意差は見られなかったが、尿アルブミンは減少することが認められた。
したがって、本発明の化合物（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）は、糖尿病性腎症に伴うタンパク尿（アルブミンの排泄など）を減少させ、腎保護効果を有することが認められた。
【００７６】
実施例１１：糸球体肥大および糸球体メサンギウム細胞の拡張の確認 
糸球体肥大および糸球体メサンギウム細胞の形成を確認するための形態学的分析には、論文(Lee EA, Seo JY, Jiang Z, Yu MR, Kwon MK, Ha H, Lee HB: Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney. Kidney Int.67:1762-71, 2005)に開示された染色技術方法が用いられた。
実施例１０に記載したようにマウスに糖尿病を誘発し、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌで処理し、１２週間後に解剖して０．１Ｍ ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)で心臓灌流(perfusion)を行った後、２％ＰＬＰ(paraformaldehyde-lysine- periodate)で一晩組織を固定した。７０％エタノールで１時間、８０％エタノールで１時間、９０％エタノールで１時間、９５％エタノールで１時間を２回、１００％エタノールで１時間を３回、キシレン(xylene)で３０分を２回、パラフィンで３０分、パラフィンで１時間３０分の順に処理して、パラフィン包埋を実施した。パラフィン組織は、厚さ４μｍの切片にスライスし、ＰＡＳ(periodic acid-Schiff)染色を行って、基底膜とグリコーゲン(glycogen)沈着を検出した。一つの腎臓組織において３０個の糸球体をスキャンし、糸球体の大きさと糸球体メサンギウム細胞の形成程度をＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ４．５ソフトウェア（ＭＥＤＩＡ  ＣＹＢＥＲＮＥＴＩＣＳ社）を用いて測定した。糸球体の大きさは下記の式１によって計算した。
【００７７】
【数１】
0005974180.tif 000015
【００７８】
［式中、Ｂ（＝１．３８）は球体の形状係数であり、ｋ（＝１．１）は粒度分布係数である。］
【００７９】
前記実験結果は図１に示した。図１において、ＡはＰＡＳ(periodic acid-Schiff)で染色した糸球体を示す写真であり、Ｂは糸球体の体積(glomerular volume)を示すグラフであり、Ｃはメサンギウム部分の面積(fractional mesangial area)を示すグラフである。図１において、対照群（ＷＴ）、糖尿病群（ＤＭ）および実施例１の化合物処理群（実施例１の化合物）は、それぞれ、第１型糖尿病非誘発群、第１型糖尿病誘発群、および第１型糖尿病誘発後に実施例１の化合物で処理した群を意味する。図１のデータは、各群について８〜１２匹のマウスの平均値(mean)±標準誤差（ＳＥ）で表す。各群間の統計学的な比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とフィッシャーのＬＳＤ(Fisher’s least significant difference)法で検定した。Ｐ値が０．０５未満の値である場合に有意であると判定した（＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＷＴ、†Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＤＭ）。
【００８０】
表２に示されるように、本発明の実施例１の化合物処理群における糸球体の大きさは、対照群と比較して増加したが、糖尿病群と比較すると有意に小さく、処理群における糸球体メサンギウム細胞の拡張は、糖尿病群と比較して対照群のレベルにまで減少した。
これらの結果から、本発明の化合物が、腎近位尿細管細胞において、細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１のダウンレギュレーションにより、腎メサンギウムおよび尿細管間質内のコラーゲン蓄積を抑制することにより、腎線維症を防止できることが示された。
したがって、本発明の化合物（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）は、糖尿病性腎症が誘発された動物モデルにおいて、糸球体の大きさと糸球体メサンギウム細胞の拡張を減少させることにより、腎保護効果を有することが認められた。
【００８１】
実施例１２：コラーゲン蓄積抑制およびマクロファージの減少の確認
免疫組織化学染色
免疫組織化学染色には、論文(Noh H, Kim JS, Han K-H, Lee GT, Song JS, Chung SH, Jeon JS, Ha H, Lee HB: Oxidative stress during peritoneal dialysis: implications in functional and structural changes in the membrane. Kidney Int. 69: 2022-2028, 2006)に記載された方法を用いた。
簡単に説明すると、実施例１１に記載したようにマウスに糖尿病を誘発し、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌで処理し、１２週間後に解剖して０．１Ｍ ＰＢＳ(phosphate-buffered saline)で心臓灌流(perfusion)を行った後、２％ＰＬＰ(paraformaldehyde-lysine-periodate)で一晩組織を固定した。７０％エタノールで１時間、８０％エタノールで１時間、９０％エタノール１で時間、９５％エタノールで１時間を２回、１００％エタノールで１時間を３回、キシレン(xylene)で３０分を２回、パラフィンで３０分、パラフィンで１時間３０分の順に処理してパラフィン包埋を実施した。パラフィン組織は厚さ４μｍの切片にスライスし、アルコールでパラフィンを除去した。抗体の浸透を高めるために、腎臓組織は、１０ｍＭクエン酸緩衝液（citrate buffer、ｐＨ６．０）に浸漬してマイクロ波で加熱（７００ワットで５分、次いで１００ワットで５分）した後、最終的に室温で３０分インキュベートした。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ）で３０分間処理して、内在性ペルオキシダーゼを除去した。次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ溶液（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｕｓｅ）と１５分間インキュベートした後、１次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社のＦ４／８０）と４℃で一晩インキュベートし、ＡＢＣ ｋｉｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社）を用いて、ＡＢＣ（ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）法で増幅させた。Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）で発色した後、光学顕微鏡で観察した。
【００８２】
マッソントリクローム(Masson's trichrome)およびピクロシリウスレッド(picrosirius red)染色
組織の損傷を調べるため、マッソントリクローム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）およびピクロシリウスレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で、供給者の指示に従って染色を行った。組織損傷の程度は、面積あたりの尿細管間質内コラーゲン蓄積(collagen accumulation)量として表した。
【００８３】
免疫組織化学染色（ＩＨＣ Ｆ４／８０）、マッソントリクローム(Masson’s trichrome)染色およびピクロシリウスレッド(picrosirius red)染色の結果を図２に示した。図２において、対照群（ＷＴ）、糖尿病群（ＤＭ）および実施例１の化合物処理群（実施例１の化合物）は、それぞれ、第１型糖尿病非誘発群、第１型糖尿病誘発群、および第１型糖尿病誘発後に実施例１の化合物で処理した群を意味する。図２において、ＩＨＣ Ｆ４／８０に該当する図面で黒点がＦ４／８０の発現を示し、マッソントリクローム(Masson’s trichrome)とピクロシリウスレッド(picrosirius red)に該当する図面で、それぞれ青色と赤色がコラーゲンの発現を示す。
図２に示されるように、マッソントリクローム染色を行うと、対照群と比較して、糖尿病群では青色に染色された部位が多いことを確認することができた。また、マッソントリクローム染色を行うと、糖尿病群と比較して、実施例１の化合物処理群では青色に染色された部位が減少したことを確認することができた。ピクロシリウスレッド染色を行うと、対照群と比較して、糖尿病群では赤色に染色された部位が多いことを確認することができた。また、ピクロシリウスレッド染色を行うと、 糖尿病群と比較して、実施例１の化合物処理群では赤色に染色された部位が減少したことを確認することができた。免疫組織化学染色（Ｆ４／８０）を行うと、対照群と比較して、糖尿病群では黒色に染色された部位が多いことを確認することができた。また、免疫組織化学染色（Ｆ４／８０）を行うと、 糖尿病群と比較して、実施例１の化合物処理群では黒色に染色された部位が減少したことを確認することができた。
【００８４】
上記の結果より、マッソントリクローム染色とピクロシリウスレッド染色で細胞外マトリックスの蓄積を検討したとき、糖尿病群では対照群に比べて、コラーゲンの蓄積が増加することが示された。また、免疫組織化学染色により、糖尿病群では対照群に比べて、多量のマクロファージ（Ｆ４／８０）が検出された。一方、糖尿病を誘発し、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌを投与したマウス（実施例１の化合物処理群）では、コラーゲン蓄積の増加およびマクロファージ（Ｆ４／８０）の増加が有意に減少することが確認できた。
したがって、本発明の化合物（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）は、糖尿病性腎症が誘発された動物モデルにおいて、コラーゲンの蓄積を抑制し、マクロファージ（Ｆ４／８０）産生を減少させることにより、腎保護効果を示すことが認められた。
【００８５】
実施例１３：腎線維症抑制効果の確認［リアルタイムＰＣＲ(realtime polymerase chain reaction)分析] 
Ｔｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造社の指針に従いトータルＲＮＡを単離した。単離されたトータルＲＮＡを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
簡単に説明すると、実施例１０に記載した方法により糖尿病を誘発し、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌで処理し、１２週間後に解剖した。腎臓組織を摘出し、あらかじめ決められた量（５００μＬ）のＴｒｉｚｏｌ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でホモジナイズした後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、１０分）し、上澄み液を回収した。クロロホルム(Chloroform)２００μＬを加えて１５分間反応させた後、遠心分離した。回収したトータルＲＮＡは、イソプロピルアルコール(Isopropyl alcohol)で沈殿させ、７５％エチルアルコール(Ethyl alcohol)で洗浄し、実験に使用した。２μｇのトータルＲＮＡから、逆転写ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてｃＤＮＡを生成し、ＡＢＩ ７３００ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）にて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｋｉｔを用いて、供給者の指針に従い、選択的なｍＲＮＡ量を定量分析した。各実験は２０μＬで２回(duplicate)実施し、正確な定量と、単一産物から得られた結果であることを確認するため、標準曲線(standard curve)および解離曲線(dissociation curve)が用いられた。ＰＣＲ反応は９５℃で１５秒間、５６℃で１分間を４０サイクル繰り返した。遺伝子の増幅に使用したプライマーは、表２の通りであり、バイオニア社（大田、韓国）にて作成された。リアルタイムＰＣＲの結果を図３に示した。
【００８６】
【表２】
0005974180.tif 000016
【００８７】
図３において、Ａは１８Ｓ ｒＲＮＡに対するＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現量の比、Ｂは１８Ｓ ｒＲＮＡに対するフィブロネクチン(fibronectin)ｍＲＮＡ発現量の比、Ｃは１８Ｓ ｒＲＮＡに対するコラーゲンＩＶｍＲＮＡ発現量の比、Ｄは１８Ｓ ｒＲＮＡに対するコラーゲン(Collagen)Ｉα１ｍＲＮＡ発現量の比、Ｅは１８Ｓ ｒＲＮＡに対するＦ４／８０ｍＲＮＡ発現量の比をそれぞれ示すグラフである。図３において、対照群（ＷＴ）、糖尿病群（ＤＭ）および実施例１の化合物処理群（実施例１の化合物）は、それぞれ、第１型糖尿病非誘発群、第１型糖尿病誘発群、および第１型糖尿病誘発後に実施例１の化合物で処理した群を意味する。図３のデータは、各群につき、８〜１２匹のマウスの平均値(mean)±標準誤差（ＳＥ）で表した。各群間の統計的な比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とフィッシャーのＬＳＤ(Fisher’s least significant difference)法で検定した。Ｐ値が０．０５未満である場合に有意であると判定した（＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＷＴ、†Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＤＭ）。
図３に示されるように、糖尿病を誘発し、本発明の実施例１の化合物である１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌを投与したマウス（実施例１の化合物処理群）では、腎線維症に関連する因子であるＴＧＦ−β１、細胞外マトリックス蛋白としてよく知られているフィブロネクチン(fibronectin)、コラーゲン(collagen)Ｉα１、コラーゲンＩＶ、および炎症性因子であるＦ４／８０の発現量が、糖尿病群と比較して有意に減少した。
したがって、本発明の化合物（１−（ピリジン−２−イル）−３−フェニル−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール−５−オール・ＨＣｌ）は、腎臓線維化を抑制することにより、腎保護効果を有することが認められた。
【００８８】
実施例１４：本発明の化合物による腎近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１発現の抑制効果の確認
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ成体マウスの腎臓を微細に細切して得た近位尿細管の一部から誘導された近位尿細管細胞であるｍＰｒｏｘ２４は、日本国神奈川県の聖マリアンナ医科大学のＳｕｇａｙａ教授から供給を受けた。ｍＰｒｏｘ２４は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および４４ｍＭ ＮａＨＣＯ３が添加されたＤＭＥＭ(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)で、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で培養した。ＲＮＡ発現レベルを測定するために、細胞を６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで培養した。細胞が９０％コンフルエントとなったとき、０．１５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）が添加された新鮮なＤＭＥＭに交換して２４時間培養することにより、細胞の増殖を停止させ、細胞の成長周期を同調させた。実施例１〜９および比較例の各化合物をＤＭＳＯ(dimethylsulfoxide)に５０ｍＭとなるように溶かした後、１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭと段階的に希釈した。実施例１〜９および比較例の各化合物の１０ｍＭ、１ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭ溶液を、０．１５％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）が添加されたＤＭＥＭで１０００倍に希釈して、最終濃度を１０μＭ、１μＭ、０．１μＭ、０．０１μＭとした。さらに、０μＭ（ＤＭＳＯ１μＬ）を用いた。前記希釈液中で細胞を１時間インキュベートした後、組み換えヒトトランスフォーミング成長因子β−１（ｈＴＧＦ−β１、recombinant human transforming growth factor-β1、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）５ｎｇ／ｍＬの存在下に６時間インキュベートした。対照群(Control)には、ｈＴＧＦ−β１を用いなかった。Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｍＰｒｏｘ２４からトータルＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ発現の定量は、ｃＤＮＡ転写物、プライマー対(primer pairs)およびＳ ＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を含む２０μＬの反応液、ならびにＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、リアルタイムＰＣＲ法により行った（リアルタイムＰＣＲ条件：９５℃１０分→９５℃で１５秒の変性(denaturation)、６０℃で１分のプライマーアニーリング(primer annealing)を４０サイクル繰り返し→融解曲線(melting curve)を測定するため、９５℃で１５秒、６０℃で１分、９５℃で１５秒）。定量は１８Ｓ ｒＲＮＡ発現量で標準化した。マウスコラーゲンＩα１プライマー対の配列は、５’−ＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１３）と５’−ＧＴＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＴＴＡ−３’（配列番号１４）であった。また、マウスの１８Ｓ ｒＲＮＡのフォワードプライマー配列は５’−ＣＧＡ ＡＡＧ ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＴ−３’（配列番号１１）、逆方向プライマー配列は５’−ＡＧＴ ＣＧＧ ＣＡＴ ＣＧＴ ＴＴＡ ＴＧＧ ＴＣ−３’（配列番号１２）であった。
【００８９】
前記実験結果を表３〜表１２および図４〜図１３に示した。表３〜表１２および図４〜図１３は、それぞれ実施例１〜９の化合物および比較例１の化合物の近位尿細管細胞におけるコラーゲンＩα１発現に対する抑制効果を示す。
表３〜表１２および図４〜図１３のデータは、各濃度あたり３〜５回繰り返して実験した結果であり、平均値(mean)±標準誤差（ＳＥ）で表す。各群間の統計的な比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）とフィッシャーのＬＳＤ(Fisher’s least significant difference)法で検定し、Ｐ値が０．０５未満で有意であると判定した（＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＷＴ、†Ｐ＜０．０５ ｖｓ ＤＭ）。
表３〜表１２には、各群の１８Ｓ ｒＲＮＡの発現量（１８Ｓ）に対するコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）の発現量の比の平均値(mean)、コラーゲンＩα１発現の抑制率(% of inhibition)およびＩＣ５０値（μＭ）を示す。この際、抑制率は、対照群の抑制率を１００％とし、ｈＴＧＦ−β１で処理し、本発明の実施例に係る化合物または比較例に係る化合物で処理していない群（ＴＧＦ−β１）の抑制率を０％としたときの相対的な抑制率を意味する。
図４〜図１３には各群の１８Ｓ ｒＲＮＡ発現量（１８Ｓ）に対するコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）発現量の比［相対増加(relative increase)］を示す。
【００９０】
【表３】
0005974180.tif 000017
【００９１】
【表４】
0005974180.tif 000018
【００９２】
【表５】
0005974180.tif 000019
【００９３】
【表６】
0005974180.tif 000020
【００９４】
【表７】
0005974180.tif 000021
【００９５】
【表８】
0005974180.tif 000022
【００９６】
【表９】
0005974180.tif 000023
【００９７】
【表１０】
0005974180.tif 000024
【００９８】
【表１１】
0005974180.tif 000025
【００９９】
【表１２】
0005974180.tif 000026
【０１００】
図４〜図１３から確認できるように、本発明の実施例に係る化合物で処理した場合は、近位尿細管細胞における細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）の発現量が減少した。また、近位尿細管細胞における細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）の発現量は、概ね（例えば、実施例９の化合物を除く）本発明の実施例に係る化合物の処理濃度に依存的に抑制された。比較例に係る化合物で処理した場合も、濃度依存的に細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）の発現量が減少した。
しかし、本発明の実施例に係る化合物のＩＣ５０値が比較例に係る化合物のＩＣ５０値より少なくとも３倍低いため、本発明の化合物は、細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１（Ｃｏｌ１α）の発現をより効果的に抑制することを確認することができた。
したがって、本発明の化合物は、近位尿細管細胞における細胞外マトリックスであるコラーゲンＩα１の発現を抑制して、尿細管間質内におけるコラーゲンの蓄積を抑制することにより、腎線維症を抑制できることを確認することができた。
【図１Ａ】
0005974180.tif 000027
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005974180.tif 000034
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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