(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を濃縮する段階；および
該濃縮血小板に少なくとも1回の電気パルスを印加することによって、該濃縮血小板を活性化する段階であって、電気パルスが、少なくとも100ピコ秒であり、かつ、1マイクロ秒未満の持続時間と、少なくとも10 kV/cmであり、かつ、350 kV/cm未満の電界強度とを有する、段階
を含む、活性化された血小板を含む血小板ゲルを含む、損傷した心臓組織を処置するための薬剤を形成する方法。
【請求項２】
電気パルスが300 nsの持続時間を有し、かつ電界強度が30 kV/cmである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも2回の電気パルスであり、かつ、10回以下の電気パルスを印加する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記血小板が自己由来である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
心臓損傷が心筋梗塞によるものである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2008年11月13日に提出された米国特許仮出願第61/114,363号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
電界は多様な方法において細胞機能を操作するために用いられうる。電界によって影響を受けうる1つの特定の細胞機構は、細胞内のカルシウム動員である。重要な細胞機能であるカルシウムのシグナル伝達は、多様な細胞応答および作用に関わっている。内部に貯蔵されたカルシウムの放出は、アゴニストに対する応答を促進する、成長および呼吸を活性化する、神経伝達物質の分泌を引き起こす、転写機構を活性化させる、多様なホルモンの放出を引き起こす、筋収縮をもたらす、およびアポトーシス経路における重要な因子の放出を開始することができる（Berridge, M. J., Bootman, M.D., Lipp, P. (1998) Nature. 395, 645-648（非特許文献1））。このカルシウム動員はまた、カルシウムシグナルをさらに伝播させる手段として、および枯渇したカルシウムプールを再度補充する手段として、外部培地から細胞へのカルシウムの流入を誘発する。カルシウムのシグナル伝達を調べるため、カルシウムなどのイオンの動きを操作するために電界を用いることができる。
【０００３】
このカルシウム増加の1つの応用は、血小板を活性化させて、それらをインビトロおよびインビボで凝集させることである。血小板の活性化／凝集は、損傷部位に止血栓を形成することにより外傷時または手術時の失血を予防するために重要である。現在のところ、ヒト血小板において細胞内カルシウムを増加させることが知られているトロンビンによる処置が、損傷部位での出血を遅らせるよう制御するために用いられている。トロンビン処置には、ウシもしくは組換え型トロンビンの局所適用、または自己由来血小板をウシトロンビンによって処置してこれを手術部位に添加する血小板ゲルの使用が含まれる（Brissett and Hom (2003) Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surgery 11, 245-250（非特許文献2）；Man et al, (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237（非特許文献3）；Saltz (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107, 238-239（非特許文献4）；Bhanot and Alex (2002) Facial Plast. Surg. 18, 27-33（非特許文献5））。しかし、動物性産物を用いることは、アレルギー反応を引き起こしうるか、または感染性病原体によって生じる可能性のある多血小板血漿（PRP）の汚染を引き起こしうるであろう。組換え型トロンビンまたはトロンビンの作用を模倣するペプチドの使用は、動物由来トロンビンに対する代替として用いられうるであろう。しかし、このタイプの処置は費用が高く、アレルギー反応もまた生じうるであろう。
【０００４】
カルシウムシグナル伝達は、多くの細胞機能においてそのような重要な役割を果たすことから、このシグナル伝達機構をさらに調べて、治療目的のためにカルシウムシグナル伝達経路を操作する方法を探索する必要性がある。たとえば、創傷治癒などの治療目的のために、ヒト血小板の凝集を含む、カルシウム媒介性細胞機能を活性化させる方法を開発する必要性がある。本発明の1つまたは複数の態様は、これらおよび様々な他の必要性に、少なくとも部分的に取り組む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Berridge, M. J., Bootman, M.D., Lipp, P. (1998) Nature. 395, 645-648
【非特許文献２】Brissett and Hom (2003) Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surgery 11, 245-250
【非特許文献３】Man et al, (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237
【非特許文献４】Saltz (2001) Plast. Reconstr. Surg. 107, 238-239
【非特許文献５】Bhanot and Alex (2002) Facial Plast. Surg. 18, 27-33
【発明の概要】
【０００６】
本発明の1つまたは複数の局面は、細胞におけるカルシウム動員を誘導するための方法を提供する。前記方法は、それによってカルシウムが細胞内で動員される、1つまたは複数の細胞に少なくとも1回の電気パルスを印加する段階を含む。少なくとも1つの態様に従って、電気パルスは、少なくとも1回のナノ秒パルス電界（nsPEF）を含む。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。本発明の1つまたは複数の態様において、前記細胞へのカルシウム流入が起こる。
【０００７】
本発明の1つまたは複数の局面において、前記細胞はヒト血小板であり、それによって血小板の活性化および凝集が誘導される。
【０００８】
本発明はまた、細胞に少なくとも1回のnsPEFを印加し、それによって細胞における細胞内カルシウムが増加する段階を含む、細胞における細胞内カルシウムを増加させるための方法も提供する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。1つまたは複数の態様において、前記細胞はヒト血小板であり、それによって血小板の活性化および凝集が誘導される。
【０００９】
同様に、少なくとも1回のnsPEFを血小板に印加し、それによって血小板が活性化されて凝集体を形成するように誘導される段階を含む、ヒト血小板を活性化および凝集させるための方法が本発明において提供される。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、約10ナノ秒のパルス持続時間と約125 kV/cmの電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、約60ナノ秒のパルス持続時間と約30 kV/cmの電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、300ナノ秒のパルス持続時間と30 kV/cmの電界強度とを有する。血小板は、培地中に懸濁されていてもよく、または、組織中、または生体吸収性のコラーゲン足場もしくはマトリクスなどの、しかしこれらに限定されない天然もしくは合成の組織修復マトリクス中に含まれてもよく、または包帯もしくは創傷閉鎖器具に組み入れられてもよい。他の態様において、活性化血小板を包帯もしくは縫合糸に適用してまたは組み入れて、これを創傷に適用してもよい。
【００１０】
本発明はまた、自己由来血小板に少なくとも1回のnsPEFを印加し、それによって血小板が活性化されて凝集体を形成するように誘導される段階を含む、対象における損傷、外傷、または失血を処置する方法を提供する。活性化されて凝集した血小板は、損傷、外傷、または失血部位に適用される。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。対象における失血は、不活性な血小板または低い血小板数に起因する出血性障害に関連してもよい。失血はまた、先天性の無フィブリノーゲン血症、グランツマン血小板無力症、灰色血小板症候群、およびヘルマンスキー-パドラック症候群などの血小板障害に関連してもよい。
【００１１】
活性化された血小板の凝集体を調製するためのさらなる態様として、本発明の少なくとももう1つの局面は、少なくとも1回のnsPEFを血小板に印加し、それによって血小板が活性化される段階を含む、ヒト血小板を含む血小板ゲルを調製するための方法を提供する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、約10ナノ秒のパルス持続時間と約125 kV/cmの電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、約60ナノ秒のパルス持続時間と約30 kV/cmの電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、300ナノ秒のパルス持続時間と30 kV/cmの電界強度とを有する。血小板は、培地中に懸濁されていてもよく、または、組織中、または生体吸収性のコラーゲン足場もしくはマトリクスなどの、しかしこれらに限定されない天然もしくは合成の組織修復マトリクスに含まれてもよく、または包帯もしくは創傷閉鎖器具に組み入れられてもよい。
【００１２】
本発明の少なくとももう1つの局面は、血小板を損傷、外傷、もしくは失血部位にまたはその近傍に適用し、それによって少なくとも1回のnsPEFの印加を通して、血小板が活性化されてゲルを形成するように誘導される、段階を含む、対象における損傷、外傷、または失血を処置するための方法を提供する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。
【００１３】
本発明の少なくとももう1つの局面は、損傷、外傷、または失血部位に血小板を適用し、それによって少なくとも1回のnsPEFの印加を通して、血小板が活性化されてゲルを形成するように誘導される、段階を含む、対象における損傷、外傷、または失血部位での感染症を処置および／または予防するための方法を提供する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、300ナノ秒のパルス持続時間と30 kV/cmの電界強度とを有する。
【００１４】
本発明の少なくとももう1つの局面は、虚血-再灌流などの虚血事象後の心臓の左心室における収縮期血圧および拡張期血圧の急激な変化を改変するための方法であって、それによって少なくとも1回のnsPEFの印加を通して血小板が活性化されてゲルを形成するように誘導され、心筋組織に注入される、方法を提供する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、300ナノ秒のパルス持続時間と30 kV/cmの電界強度とを有する。
【００１５】
本発明の少なくとももう1つの局面は、それによって少なくとも1回のnsPEFの印加を通して血小板が活性化されてゲルを形成するように誘導される、心臓表面に活性化血小板を適用することを想定する。少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。もう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFは、300ナノ秒のパルス持続時間と30 kV/cmの電界強度とを有する。
【００１６】
本発明の少なくとももう1つの局面は、それによって少なくとも1回のnsPEFの印加を通して血小板が活性化されてゲルを形成するように誘導される、活性化血小板ゲルの貼用物または懸濁物を含有する包帯、または縫合糸などの創傷閉鎖器具を提供する。様々な態様は、包帯への血小板ゲルの適用前および適用後での血小板の活性化を想定しており、少なくとも1回のnsPEFは、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する。
[本発明1001]
少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒未満の持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm未満の電界強度である、少なくとも1回の電気パルスによって活性化された血小板
を含む、血小板ゲル。
[本発明1002]
組織修復マトリクスをさらに含む、本発明1001の血小板ゲル。
[本発明1003]
本発明1001の血小板ゲルを含む包帯。
[本発明1004]
電気パルスが、300 nsの持続時間を有し、かつ電界強度が30 kV/cmである、本発明1001の血小板ゲル。
[本発明1005]
血小板が、少なくとも2回の電気パルス〜10回以下の電気パルスによって活性化される、本発明1001の血小板ゲル。
[本発明1006]
血小板を濃縮する段階；および
該濃縮血小板に少なくとも1回の電気パルスを印加することによって、該濃縮血小板を活性化する段階であって、電気パルスが、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒未満の持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm未満の電界強度とを有する、段階
を含む、血小板ゲルを形成する方法。
[本発明1007]
電気パルスが300 nsの持続時間を有し、かつ電界強度が30 kV/cmである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
少なくとも2回の電気パルス〜10回以下の電気パルスを印加する段階をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
活性化血小板ゲルを創傷に適用する段階をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1010]
活性化血小板ゲルを心臓組織に適用する段階をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1011]
血小板を濃縮する段階；
該濃縮血小板に少なくとも1回の電気パルスを印加することによって該濃縮血小板を活性化する段階であって、電気パルスが、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒未満の持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm未満の電界強度とを有する、段階；および
該活性化血小板を心臓組織に適用する段階
を含む、損傷した心臓組織を処置する方法。
[本発明1012]
心臓損傷が心筋梗塞による、本発明1012の方法。
[本発明1013]
心臓組織に再灌流する段階をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
血小板が自己由来である、本発明1011の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ヒト血小板における細胞内カルシウムに及ぼすnsPEFパルス（10 nsおよび125 kV/cm）の効果を示す。細胞内カルシウムの増加は、印加されたnsPEFパルスの回数に依存することが示され、パルス10回は、カルシウムの2倍増加を引き起こした。
【図２】細胞外カルシウムの非存在下でカルシウムが細胞内ストアから動員された後に、細胞外培地にカルシウムを添加すると容量性カルシウム流入が生じることを示す。Fura-2を負荷した細胞に、細胞外カルシウムの非存在下でパルスを与え、カルシウム濃度を蛍光光度計において測定した。2〜3分後、記録を継続しながらカルシウムを細胞外培地に添加した。
【図３】血小板に125 kV/cmで10 ns間パルスを与えた場合に、血小板凝集のパルス依存的増加が起こることを示す。血小板を凝集検出計に入れて、ベースラインの光線透過率を測定して、15秒後にカルシウムを添加し、次に、血小板を30秒後にパルスキュベットに採取した。血小板に125 kV/cmで各々10 ns間、1、2、5または10回パルスした。次に血小板を凝集検出計に戻して凝集を測定した。パルス10回の処置によって、トロンビン0.02単位/mlについて観察された応答と類似の凝集応答が生じた。
【図４】全虚血の30分後および再灌流期間での、単離されたウサギ心臓の左心室における標準化収縮期血圧を示す。データは平均値±SDとして記載される。*α＝0.1、p＜0.01、生理食塩水対トロンビンおよびnsPEF。
【図５】全虚血の30分後および再灌流期間での、単離されたウサギ心臓の左心室における標準化拡張期血圧を示す。データは平均値±SDとして記載される。*（α＝0.1、p＜0.01、生理食塩水対トロンビンおよびnsPEF）。
【図６】全虚血の30分後および再灌流期間での、単離されたウサギ心臓の左心室における標準化仕事機能（work function）を示す。データは平均値±SDとして記載される。
【図７】全虚血の30分後および再灌流期間での、単離されたウサギ心臓の左心室における標準化脈圧を示す。データは平均値±SDとして記載される。*（α＝0.1、p＜0.05、トロンビンおよびnsPEF対生理食塩水）。
【図８】nsPEFまたはウシトロンビンによって調製された血小板ゲルの存在下または非存在下での、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus Aureus）の増殖の代表的な例を示す。
【図９】nsPEFまたはウシトロンビンによって調製された血小板ゲルの存在下または非存在下での、黄色ブドウ球菌の増殖結果を示す。
【図１０Ａ】nsPEF活性化血小板ゲルまたは生理食塩水で処置した心臓におけるインビボ応答を示す。
【図１０Ｂ】nsPEF活性化血小板ゲルまたは生理食塩水で処置した心臓におけるインビボ応答を示す。
【図１０Ｃ】nsPEF活性化血小板ゲルまたは生理食塩水で処置した心臓におけるインビボ応答を示す。
【図１０Ｄ】nsPEF活性化血小板ゲルまたは生理食塩水で処置した心臓におけるインビボ応答を示す。
【図１０Ｅ】ドブタミンストレスに応答したAMI後14日目の左心室弛緩時間（DREL）を示す。
【図１０Ｆ】ドブタミンストレスに応答したAMI後14日目の左心室弛緩時間（DREL）を示す。
【図１１】図11Aおよび11Bはそれぞれ、nsPEF活性化血小板ゲル処置を行わない、およびnsPEF活性化血小板ゲル処置を行った心臓組織を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明の原理の理解を促進する目的のために、ここで好ましい態様について参照して、その説明のために特定の専門用語を用いる。しかしながら、本発明の範囲のいかなる制限もこれらによって意図されないことが理解されるであろう。むしろ、本発明が関連する技術分野の当業者によって企図されるであろう、本発明のそのような改変およびさらなる修正、ならびに本明細書において例示される本発明の原理のさらなる応用は、本発明の一部であると意図される。
【００１９】
たとえば、ある態様の一部として例示または記述される特色を他の態様について用いて、なおさらなる態様を得ることができる。加えて、特定の特色を、同じまたは類似の機能を果たす、まだ言及されていない類似のデバイスまたは特色と交換してもよい。ゆえに、そのような修正および変更は、本発明の全体に含まれると意図される。
【００２０】
本発明の1つまたは複数の態様は、ナノ秒パルス電界（「nsPEF」）を用いて細胞内でカルシウム動員を誘導する方法に向けられている。本明細書において用いられる「カルシウム動員」とは、細胞内の内部貯蔵されたカルシウムの放出および／または外部培地から細胞内へのカルシウムの流入として定義される。本発明の1つまたは複数の態様において、カルシウム動員によって、細胞の細胞内遊離カルシウムレベルの増加が起こる。
【００２１】
本明細書において用いられるように、「nsPEF」すなわち「ナノ秒パルス電界」とは、約10 kV/cm〜約350 kV/cmの電界強度を有するナノ秒範囲（約100ピコ秒〜約1マイクロ秒）の電気パルスとして定義される。nsPEFを細胞へ送達するために、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約350 kV/cm以下の電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができるパルス発生装置を備えた任意の装置を用いることができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約30 kV/cm以下の電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、少なくとも約100ピコ秒〜約1マイクロ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約125 kV/cm以下の電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、少なくとも約10ナノ秒〜約100ナノ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約30 kV/cm以下の電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、少なくとも約10ナノ秒〜約100ナノ秒以下のパルス持続時間と、少なくとも約10 kV/cm〜約125 kV/cm以下の電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、約10ナノ秒のパルス持続時間と約125 kV/cmの電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。本発明のもう1つの局面において、パルス発生装置は、約60ナノ秒のパルス持続時間と約30 kV/cmの電界強度とを有する短い電気パルスを送達することができる。
【００２２】
特に、nsPEFは、その時間的および電気的特徴、ならびに細胞全体および組織に及ぼすその効果に基づくと、電気穿孔パルスとは異なる。比較目的のために、電気穿孔パルスおよびnsPEFはそれぞれ、異なる電界強度（1〜5 kV/cmに対して10〜350 kV/cm）；異なるパルス持続時間（0.1〜20ミリ秒に対して1〜300ナノ秒）；異なるエネルギー密度（ジュール/ccに対してミリジュール/cc）；および異なる電力（500 Wに対して180 MW）を示す。このように、nsPEFは、電気穿孔パルスよりも5桁から6桁短く、数桁高い電界および電力、および大幅に低いエネルギー密度を有しうる。独自の短い持続時間および迅速な立ち上がり時間に加えて、nsPEFは、それらが非常に低いエネルギーで極めて高い電力であることから、ひときわ優れている。これらの違いに起因して、パルス持続時間が減少するにつれて、nsPEFは形質膜を迂回して、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、核、または任意の細胞内ストアなどの細胞内構造を標的化して、形質膜を無傷のままにする。パルス持続時間が十分に短く電界強度が十分に高い場合、細胞内構造が標的化されることから、これらのパルスは、電気穿孔パルスの効果とは予想外に異なる効果を有する。細胞に及ぼすnsPEFの効果は、細胞型、パルス持続時間および立ち上がり時間、電界強度、ならびに／または他の要因に応じて異なる。
【００２３】
加えて、nsPEFおよび電気穿孔パルスは、細胞に対して異なる効果を有する。たとえば、古典的な電気穿孔パルス（たとえば、100μs）に曝露されたJurkat細胞は、迅速なヨウ化プロピジウム（「PI」）取り込みを示したが、60または300 nsに曝露された場合は、細胞はアポトーシスの誘導と整合するかなり遅い時点でPIを取り込んだ（Deng, J., et al. (2003), Biophys. J. 84, 2709-2714）。さらに、より大きい細胞がより小さい細胞よりも容易に電気穿孔されるという古典的な電気穿孔効果とは対照的に、nsPEFは、より大きい細胞（たとえば、単球）よりもより小さい細胞（たとえば、T細胞）に対して大きな形質膜効果を有する。形質膜電気穿孔に非依存的な条件下で、nsPEFは、細胞の運命を決定するシグナル伝達機構を改変することが示されている。nsPEFを用いて、アポトーシスを誘発することが可能である（Beebe, S.J., et al. (2002), IEEE Trans. Plasma Sci 30:1 Part 2, 286-292；Beebe, S.J., et al. (2003), FASEB J (online, June 17, 2003) 10.1096//fj.02-0859fje；Vernier, P.T., et al. (2003), Biochem. Biophys. Res. Comm. 310, 286-295）。nsPEFは、無傷の形質膜、アネキシン-V-FITC結合、カスパーゼ活性化、細胞収縮、細胞質へのチトクロームc放出、および最終的に、食作用の非存在下でのインビトロにおける形質膜の破裂によって定義される後期の二次的壊死（Beebe et al., 2003）を含む、いくつかの十分に特徴付けされたアポトーシスマーカーを誘導した。
【００２４】
nsPEFを送達するための装置にはまた、高圧電源、およびインビトロまたはインビボでnsPEFを標的細胞に導くための手段が備えられる。nsPEFを導くための適した手段は、好ましくは、たとえば細胞懸濁物または組織内で、高電圧で、ナノ秒範囲の短い持続時間の電気パルスを可能にするであろう。例としては、針または針アレイなどの電極システムが含まれる。本発明の1つまたは複数の態様において、nsPEFは培地中に懸濁された細胞に印加される。他の態様において、nsPEFは自己由来血小板に印加され、それによって血小板を活性化して、凝集体を形成するようにそれらを誘導して、その後、活性化されて凝集した血小板を損傷、外傷、または失血部位に適用する。他の態様において、nsPEFは、出血が起こっている部位に直接印加される。
【００２５】
本発明のnsPEFパルスは、米国特許第6,326,177号およびBeebe et al. FASEB J. 17, 1493-1495 (2003)において以前に記述された発生装置などのパルス発生装置によって細胞に投与されうる。上記のパルス発生装置より前には、表面の荷電時間と同等またはさらにそれを下回る時間規模で大きな細胞内電界を発生させることが難しいために、これらの高周波細胞内作用の適用は限定的であった。しかし、米国特許第6,326,177号およびBeebe et al. (2003)において記述されているように、本発明者らは、細胞懸濁物中または組織内でMV/cmに近い電界を発生させるのに適切な電圧振幅を有するナノ秒範囲の電気パルスを生成することを可能にする、高電圧で短い持続時間の電気パルスを発生させるための技術を開発した（Mankowski, J., Kristiansen, M. (2000) IEEE Trans Plasma Science 28:102-108）。そのナノ秒持続時間のために、これらのパルスによって細胞／組織に移動した平均エネルギーは、理論的に無視できるほどであり、それによって熱影響を伴うことなく電気的効果が得られる。
【００２６】
細胞に印加されるnsPEFパルスの電界強度（または電界の強さ）とは、印加電圧を電極間の距離で割ったものであり、一般に少なくとも約10 kV/cmであるが、細胞が含まれる懸濁物または組織の破壊電界を超えるべきではない。破壊電界は、パルス持続時間が減少するにつれて増加して、実験的に決定されうる。しかし、本発明において一般的に使用される条件下では、破壊電界は一般に500 kV/cmを超えない。本発明の1つまたは複数の局面において、約100ピコ秒〜約1マイクロ秒の持続時間を有する電界パルスは、典型的に約10 kV/cm〜約350 kV/cmの電界強度を有する。
【００２７】
培地のバルク温度に対して起こりうる影響（「熱影響」）を最小限にするために、電界パルスは一般に迅速な立ち上がり時間および短い持続時間を有する。パルス持続時間は、好ましくは、1マイクロ秒未満であるが約100ピコ秒超であるべきである。本発明の1つまたは複数の局面において、パルス持続時間は約1ナノ秒〜約300ナノ秒である。最適なパルス持続時間は、他の要因の中でも細胞型、組織のタイプ、および所望の処置に応じて変動するであろう。
【００２８】
細胞に印加されるnsPEFパルスの回数は、カルシウム動員を誘導するのに十分な回数であり得る。この回数は、意図される効果、nsPEFの投与様式、および処置される細胞を含む多様な要因に基づいて変動しうる。本発明の1つの局面において、カルシウム動員を誘導するために1回のnsPEFが細胞に印加される。本発明のもう1つの局面において、少なくとも1回のnsPEFが細胞に印加される。本発明のもう1つの局面において、少なくとも2回のnsPEFが細胞に印加される。本発明のもう1つの局面において、少なくとも5回のnsPEFが細胞に印加される。本発明のもう1つの局面において、少なくとも10回のnsPEFが細胞に印加される。本発明のなおもう1つの局面において、1〜10回のnsPEFが細胞に印加される。
【００２９】
本発明の1つまたは複数の態様は、nsPEFの使用を通して血小板を活性化および凝集させる方法に向けられている。ヒト血小板中で、nsPEFにより誘導されるカルシウム動員は、血小板の活性化および凝集を誘導して、それによって血液を凝固させるおよび創傷を治癒する機構を提供することが見いだされた。従って、1つの態様において、本発明は、血小板の活性化および／または血小板の凝集を誘導するために細胞にnsPEFパルスを印加する段階を含む、血小板を活性化および凝集させる方法に向けられている。もう1つの態様において、本発明は、手術中にもたらされたまたは失血の原因となる外傷の結果としてのいずれかの、損傷、外傷、または失血部位のいずれかが存在する任意の臨床的状況において用いられてもよい。いくつかの態様において、本発明は、血小板の活性化および血小板の凝集を誘導するために動物の体外で自己由来血小板に電気パルスを与える段階、および活性化血小板の凝集体またはゲルを損傷、外傷、または失血部位に適用する段階を伴う。
【００３０】
さらなる態様において、自己由来血小板は、損傷、外傷、または失血部位に適用される前にnsPEFによって処置されて、活性化血小板ゲルを形成する。血小板ゲルは、たとえばHarvest Technologiesによって記述される方法などの公知の方法によって調製されてもよい。たとえば、血小板ゲルは、ACD-A抗凝固剤（Terumo Cardiovascular System, Ann Arbor, MI）3 mlを含む滅菌シリンジを用いてドナーから血液60 mlを採取することによって調製された。SmartPRep@-2 Platelet Concentrate Systemおよび滅菌した加工用使い捨て容器を用いて、血小板ゲルを調製した。加工用使い捨て容器を遠心器に入れて、14分間遠心して、血液成分を血漿から分離した（Harvest Technology）。1つの態様に従って、Harvest Technology System濃縮器を用いて、全血中で血小板を4〜7倍に濃縮して、たとえば1180×103個/μl〜2065×103個/μlの血小板濃縮物を提供した。乏血小板血漿（「PPP」）を用いて、前記濃縮血小板を最終容積7 mlへと再懸濁した。電気パルス（300 ns）を、懸濁した血小板に電気穿孔キュベット中で印加した（電極間隙0.2 cm、アルミニウム平板電極、面積1 cm2）。1つの態様に従って、血小板ゲルは、10 mMカルシウムの存在下で、持続時間300 nsおよび電界30 kV/cmのnsPEFを用いて活性化されてもよい。
【００３１】
さらなる態様において、本発明に従う活性化血小板ゲルは、対象における損傷、外傷、または失血部位での感染症を処置および／または予防するために、該部位に配置される。そのような態様において、活性化血小板ゲルは、該部位での黄色ブドウ球菌の増殖を阻害するが、他の細菌株の増殖の防止もさらなる態様において想定される。
【００３２】
さらなる態様において、nsPEFによる処置によって産生された活性化血小板ゲルは、損傷した心臓組織を処置するために用いられてもよい。たとえば、1つの態様に従って、nsPEFによる処置によって産生された活性化血小板ゲルは、心筋梗塞に罹患しているまたは罹患したことがある心臓の場合と同様に、虚血-再灌流後の心臓において収縮期血圧および拡張期血圧の急激な変化を処置するために心筋に直接注射されてもよい。この態様において、nsPEFによって産生された活性化血小板ゲルは、生理食塩水によって処置された同様の心臓組織とは対照的に、心室充満を改善して、心拍出量を維持または改善する。
【００３３】
ここで、カルシウム動員の誘導および血小板ゲルの活性化におけるnsPEFの使用を例示する特定の実施例に言及する。実施例は、好ましい態様の応用を例示するために提供されていること、およびそれによって本発明の範囲の制限が意図されるわけではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００３４】
実施例1：ヒト血小板中の細胞内カルシウムの増加におけるnsPEFの効果：nsPEFは、図1に示されるように、ヒト血小板において細胞内カルシウムをパルス依存的に増加させる。細胞外カルシウムの存在下で行われる実験において、nsPEFパルス（10 nsおよび125 kV/cm）をヒト血小板に印加した。カルシウム濃度を、蛍光光度計において定量可能なカルシウム指示薬としてFura 2を用いて測定した。細胞内カルシウムの増加は、パルス回数に依存することが示された（図1）。10回のパルスは、カルシウムの2倍の増加を引き起こした。カルシウム応答はまた、電界条件にも依存することが見いだされた。具体的には、より長いパルスおよびより低い電界（たとえば、60 nsおよび30 kV/cm）は、カルシウムのより強い増加をもたらした。これらの条件下で、10回のパルスは、カルシウムの3倍の増加を引き起こした。nsPEFに応答したカルシウム動員の動態は、トロンビンに対する応答とは異なる。
【００３５】
図2において示されるように、カルシウムは、細胞外カルシウムの非存在下で細胞内ストアから動員され、その後、カルシウムを細胞外培地に添加すると容量性カルシウム流入が起こる。細胞にカルシウム指示薬Fura-2を負荷して、細胞外カルシウムの非存在下でパルスをかけ、カルシウム濃度を蛍光光度計において測定した。2〜3分後、読み取りを継続しながらカルシウムを細胞外培地に添加した。初期のカルシウム動員は、カルシウムの細胞内ストアから生じることが判明した。ヒトHL-60細胞による試験により、このカルシウムが小胞体（ER）から細胞質に放出されることが示されている（White et al., 2004）。カルシウムを細胞外培地に添加すると、形質膜（PM）のストア作動性カルシウムチャンネルを介する容量性カルシウム流入が観察された。これは、ERからカルシウムが放出された後PMのストア作動性チャンネルを介して容量性カルシウム流入が起こることが知られている、トロンビンに対する応答によく似ている。類似の結果は、プリン作動性アゴニストと比較した、nsPEF処置したHL-60細胞について（White et al., 2004）、およびCD-3刺激と比較した、nsPEF処置したJurkat細胞において観察された。これは、カルシウム流入が、PMのストア作動性カルシウムチャンネルを介しては起こらない、nsPEF処置した多形核白血球（PMN）による試験結果とは対照的である（Buescher et al., poster Bioelectromagnetics Society meeting June 2004）。
【００３６】
nsPEFは、トロンビンについて観察された凝集と類似の様式で、血小板を凝集させることができる（図3）。特に、血小板を125 kV/cmで10 ns間パルスすると、血小板凝集がパルス依存的に増加することが観察された。血小板を凝集検出計に入れて、ベースラインの光線透過率を測定し、15秒後にカルシウムを加え、次に30秒後に血小板をパルスキュベットに移した。前記血小板を125 kV/cmで1、2、5または10回、それぞれ10 ns間パルスした。次に、血小板を凝集検出計に戻して凝集を測定した。パルス10回の処置は、トロンビン0.02単位/mlについて観察された応答と類似の凝集応答を生じた。nsPEFの持続時間を増加させた場合、血小板の活性化および凝集を誘導するためにはより低い電界が必要である。逆に、nsPEFの持続時間を減少させた場合は、この効果のためにはより高い電界が必要である。
【００３７】
これらの実験に関しては、新鮮に単離されたヒト血小板を、（たとえば、Dobrydneva and Blackmore (2001)において記述されるように）カルシウムを含有する改変タイロード緩衝液中でインキュベートした。用いた装置は、Chrono Logモデル705血小板凝集検出計であった。データをチャート記録計で記録して、デジタル化も行い、コンピューターハードディスクに保存した。これは、光学シグナルを得ること、およびこれをTektronix（登録商標）5A22N差動増幅器を用いて100倍に増幅することによって達成された。次に、増幅されたシグナルをDATAQ DI- 194RSシリアルポートデータ獲得モジュールを用いてデジタル化した後、ウィンドウズ95で動作するP90ペンティアムコンピューターに送信した。データをWinDaq/Lite波形記録ソフトウェア（DATAQ instruments, Akron OH）を用いて記録した。次に該データを、WinDaq波形ブラウザソフトウェアを用いて分析した。
【００３８】
実施例2：創傷処置についてのnsPEFによって産生された活性化血小板ゲルの調査：ニュージーランドホワイトウサギ21匹を試験のために提供した。ウサギの背部に創傷を作り、血小板ゲルによって処置するか、乏血小板血漿によって処置するか、または無処置のままとした。ウサギ7匹の背側表面の毛を刈って、ベタジンによって処置して、アルコールによって清浄した。動物に1.5％イソフルラン（isofluane）および酸素を吸入させることによって全身麻酔を誘導した。全身吸入麻酔下の動物において、滅菌した#10手術用ブレードを用いて、外科手術用に準備した皮膚領域に切り傷を6ヶ所作った。該創傷は、長さが2 mmの直線状で、真皮および表皮を含めた全層切開であった。1ヶ所の創傷を無処置のままとして、1ヶ所の創傷を乏血小板血漿（「PPP」）によって処置した。これらの創傷を対照とした。2ヶ所の創傷を、nsPEF（パルス1回、30 kV/cmで300 ns）を用いて活性化された血小板ゲルによって処置して、別の2ヶ所の創傷を、ウシトロンビンによって活性化した血小板ゲルによって処置した。
【００３９】
予想されたように、対照を含む全ての処置は、創傷後4日間のあいだに創傷領域の時間依存的減少を示した。創傷治癒の最も大きな差は、創傷後24時間で観察された。PPPを含む全ての処置は、無処置対照と比較して創傷領域の減少を示した。このことは、全ての場合において創傷治癒が増強されたことを示している。しかし、nsPEFによって活性化された血小板ゲルによって処置された創傷は、トロンビンによって活性化された血小板ゲルによって処置された創傷と同じくらい効果的に、およびPPPによって処置された創傷よりも良好に、治癒を増強した。このように、nsPEFによって活性化された血小板ゲルは、トロンビンによって活性化された血小板と少なくとも同じくらい効果的であった。何例かのウサギにおいて、nsPEF活性化血小板ゲルは、トロンビン活性化血小板ゲルよりも優れた治癒能を示し、2群のあいだの差は、24時間の時点で統計学的に有意であった。
【００４０】
創傷治癒を増強するために治療剤として血小板ゲルを用いることは、外科的創傷および軟組織創傷に対して大きな効果を有する。前記結果は、病態生理学的および生理学的事象に関連する不適当な作用の可能性を有するトロンビン活性化ゲルの代わりに、nsPEF活性化ゲルを用いることを実証している。
【００４１】
血小板ゲルは、より生理活性のある創傷部位を作製することから、創傷治癒を増強すると考えられる。創傷に適用された活性化血小板凝集体は、創傷部内の増殖因子シグナル伝達タンパク質および接着分子のレベルを増加させる。1つの有益な結果は、凝塊によって形成された足場への、幹細胞を含む細胞の動員が増加すること、および該足場内で細胞分裂が増加することである。
【００４２】
前記結果は、nsPEFを用いて調製された活性化血小板ゲルが、ウシトロンビンを用いて活性化された血小板ゲルと同じくらい治癒の増強において効果的であることを示唆している。意外にも、nsPEFを用いて活性化された血小板ゲルによって処置された外科的創傷領域は、トロンビン活性化血小板ゲルによって処置された創傷よりも速く減少した。
【００４３】
実施例3：心臓の損傷に及ぼす、nsPEFを用いて調製された血小板ゲルの効果：大動脈カニューレを通る流れを切断することによって心臓に虚血が誘導されるランゲンドルフ組織標本を用いて、ウサギ心臓を分析した。血小板ゲルまたは生理食塩水を、心筋梗塞の急性治療のための手段として左心室心筋に注射した。
【００４４】
キシラジンおよびケタミンの過量を筋肉内に投与することによって、ウサギ14匹を安楽死させた。胸部正中切開を行って、心臓を摘出した。先に記述されているように、該心臓を0〜4℃に冷却した改変タイロード液に入れて、標本を作製した。Hargrave B and Lattanzio F, Cocaine activates the rennin-angiotensin system in pregnant rabbits and alters the response to ischemia, Cardiovasc Toxicol 2002; 2:91-7を参照されたい。標本作製後、圧変換器に取り付けられたバルーンカテーテルを左心室に挿入して、膨張させた。COBE CDX I11変換器およびMicro-Med 100血圧分析器（Louisville, KY）を用いて、ポリビニルカテーテルを介して左心室の収縮期血圧および拡張期血圧を10秒毎に記録した。標本を自発的に拍動させて、15分間平衡化した後、実験プロトコールを開始した。30 kV/cmで300 ns間のnsPEFパルス1回、またはウシトロンビンもしくは同量の0.9％塩化ナトリウム溶液によって処置したPG（0.5 ml）を、左心室の筋層（心筋層）に注射した。心臓を10分間再安定化させた。10分間の再安定化期間の後、大動脈カニューレを通る流れの停止を行って、全虚血をもたらした。心臓を37℃で維持しながら虚血を30分間維持した。30分間の虚血期間終了後、大動脈カニューレを再度開いて、心臓を60分間再灌流させた。
【００４５】
nsPEFおよびトロンビンによって活性化されたPGの急性効果を、左心室収縮期血圧および拡張期血圧、ならびに左心室仕事機能および脈圧について調べた。左心室収縮期血圧（α＝0.1、p＜0.01）および拡張期血圧（a＝0.05、p＜0.03）は、再灌流が始まって30分後では、トロンビンまたはnsPEFによって活性化した血小板ゲルによって処置した心臓よりも、生理食塩水処置した心臓（対照心臓）において高かった（図4および5）。左心室の平均血圧は、再灌流のあいだ任意の時点で、いずれの処置においても統計学的に差はなかった。再灌流が始まって40分後では、左心室仕事機能（α＝0.05、p＜0.03）は、生理食塩水またはトロンビン処置した心臓よりも、nsPEFゲルによって処置した心臓において有意に高かった（図6）。心拍数はいずれの処置においても有意差はなかった。しかし、脈圧は、トロンビンまたはnsPEFによって活性化された血小板ゲルによって処置した心臓よりも、生理食塩水処置した心臓において有意に低かった（図7）。
【００４６】
活性化血小板ゲルは、急性の条件下で、虚血および再灌流の際の左心室の機械的機能を支持する手段として、虚血性障害に対するウサギ心臓左心室の応答を操作するために用いられうるであろう。心臓を全虚血および再灌流に曝露する前に、血小板ゲルをウサギ心臓の心筋に直接注射した。観察された結果は、急性条件下であっても、血小板ゲルによる処置が、虚血-再灌流に対する左心室の収縮期および拡張期血圧応答を変化させたことを示唆している。血小板ゲルによって処置した心臓は、再灌流後30分で、生理食塩水によって処置した心臓（対照）よりも低い収縮期血圧および拡張期血圧を有した。
【００４７】
心筋梗塞などの臨床的状況においては、心機能の変化は、心拍出量の減少を引き起こす心不全と関連する。心拍出量の減少は、収縮機能障害、拡張機能障害、または両者の組み合わせに起因しうる1回拍出量の低下によって生じる。収縮機能障害は心室収縮の障害を指す。収縮機能障害は、収縮の調節を担うシグナル伝達機構の変化、および／または急性心筋梗塞後に起こる生存収縮筋細胞の喪失に起因しうる。拡張機能障害は、心室の伸展性がより低くなる場合に起こり、これによって左心室充満が損なわれる。拡張および／または収縮機能障害の1つの有害な結果は、拡張終期圧（EDP）の上昇である。EDPのこの増加は、フランク-スターリング機構により心拍出量を維持するように設計された代償機構であるという事実にもかかわらず、この圧上昇は、左心房および肺静脈圧の増加を引き起こしえて、肺のうっ血および浮腫を引き起こしうる。加えて、数ヶ月〜数年のあいだに、これらの代償性変化は心機能を悪化させうる。虚血事象の30分後および再灌流の30分後では、拡張期血圧および収縮期血圧は、血小板ゲルによって処置した心臓よりも、生理食塩水（対照）処置した心臓において高かったことから、左心室心筋に注射された活性化血小板ゲル（nsPEF活性化またはトロンビン活性化）は、収縮期および拡張期血圧の増加を鈍らせた。虚血後の血小板ゲル処置した心臓において収縮期血圧および拡張期血圧がより低いことは、左心室充満を増強して、心拍出量を改善または維持する可能性がある。この考えは、1回拍出量の間接的測定値として用いられる脈圧が、nsPEFまたはトロンビン活性化血小板ゲルのいずれかによって処置された心臓よりも、生理食塩水処置した心臓で低かったという事実によって支持された。生理食塩水処置した心臓における上昇した収縮期血圧および拡張期血圧は、1回拍出量および心拍出量の低減を導く、より少ない心室充満を示唆する可能性がある。
【００４８】
血小板ゲルが虚血後および再灌流の際に左心室の急性のポンプ機能を支持する機構は不明である。いかなる特定の作用理論にも拘束されることは望まないが、活性化血小板ゲルが再灌流の際に虚血心臓において活性酸素種（ROS）の産生を調節している可能性がある。ROSは、体の固有の抗酸化剤システムを圧倒する濃度で産生されると、心臓組織に対して有害な作用を及ぼしうる高反応性の化学物質である。不整脈に関与し、虚血後心筋気絶（可逆的な収縮機能障害）の病因に関係する直接の電気生理学的作用を、ROSが有することが示されている。虚血-再灌流後の心筋細胞死は、ROSによって活性化されうる壊死およびアポトーシスに起因する。Kevin LG, Novalija E, Stowe DF, Reactive oxygen species as mediators of cardiac injury and protections: The relevance to anesthesia practice, Anesth Analg 2005 101: 1275-87を参照されたい。ROSは虚血および再灌流の際に生成される。心臓を虚血-再灌流の前に血小板ゲルによって前処置したという事実は、ROSの有害な作用に対する心筋細胞の応答の低減を示唆し得る。
【００４９】
血小板ゲルはまた、心臓にエネルギーを供給するのに重要な遺伝子の発現または発現の増加を誘導する可能性がある。増殖因子用DNAマイクロアレイ Oligo DEArray（登録商標）を用いて、虚血の30分後および再灌流の40分後の左心室心臓組織について分析を行った。このマイクロアレイによって、113個の一般的な増殖因子（血管新生GF、アポトーシス、細胞分化、胚発生、および特定の組織の発生の調節因子）の発現のプロフィールを調べた。乏血小板血漿（「PPP」）を対照として用いた。2個の遺伝子、すなわち骨形成タンパク質10（BMP-10）とシチジンデアミナーゼ遺伝子についてのみ、活性化が観察された。これらの急性の条件下で、シチジンデアミナーゼはアップレギュレートされた。この遺伝子は、ピリミジンサルベージに関係する酵素をコードする。これは、細胞のピリミジンプールの維持を担ういくつかのデアミナーゼの1つである。この遺伝子の早期活性化は、再灌流の際に虚血心臓に対してエネルギー源を供給する可能性がある。血小板から放出される増殖因子である、増加したPDGF-BBの存在下で、左心室組織についてELISAを行った。この場合の予備的なデータは、nsPEFによって活性化された血小板ゲルによって処置された左心室組織における最大の増加を示唆している。
【００５０】
実施例4：抗菌プロトコール−殺菌アッセイ：nsPEFを用いて調製された活性化血小板ゲルとウシトロンビンによって調製された活性化血小板ゲルについての、臨床的に関連する細菌の増殖を阻害する能力を比較するために、黄色ブドウ球菌（ATCC 25923）を、トリプシン分解大豆ブロス（Sigma- Aldrich, St. Louis, MO）4 mlを含む滅菌チューブに入れて、37℃で一晩増殖させた。このプロトコールは一般的に、108 CUF/mlの細菌濃度を提供した。実験の2日目に、細菌試料を10 CFU/mlの濃度まで連続希釈して、PPP 50μl、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、または前述したように調製された、nsPEF（パルス1回、30 kV/cm、300 ns）もしくはウシトロンビンによって活性化された血小板ゲルを用いて処置した。処置した培養物を37℃で一晩インキュベートした。3日目に、細菌培養物25 mlをトリプシン分解大豆寒天プレート上に置いて、37℃で24時間インキュベートした。翌日、形成されたコロニー数を計数した。
【００５１】
血小板ゲルは、いくつかの抗菌活性を示すことが報告されている。本発明の血小板ゲルによる抗菌活性を明らかにするために、黄色ブドウ球菌に対する効果を調べた（図8および9）。30 kV/cmで300 ns間のパルス1回を用いて調製された血小板ゲルは、黄色ブドウ球菌の増殖を有意に阻害した。トロンビン活性化血小板ゲルは、活性を示さず、細菌の増殖を促進する傾向があった。対照的に、nsPEFの1回処置によって活性化された血小板は、ブドウ球菌に対して統計学的に有意な抗菌活性を示した。予想外にも、パルス数を増加させると、より低い抗菌活性が観察された。変化は統計学的に有意ではなかったが、PPPについては細菌増殖を阻害する傾向があった。
【００５２】
実施例5：インビボ実験：nsPEF活性化血小板ゲルは、収縮期血圧および拡張期血圧、ならびに血圧の経時的な正および負の変化（dP/dt）を改変する：この試験において、左冠動脈回旋枝の縁枝を10分間閉塞することによって、左心室の40％梗塞を（左開胸術によって）作り出した。梗塞サイズを、トリフェニルテトラゾール（赤色）およびBlue Heubach-I分散色素によって心臓を染色することによって決定した。閉塞を開放することによって再灌流を行った。再灌流を開始して10分後、nsPEF活性化血小板ゲル（0.2 ml）を、動物EV6の心筋に直接注射した。生理食塩水（0.9％[0.2 ml]）を動物EV2Bの心筋に注射して、この動物を対照とした。麻酔から回復後、動物を各々の収容ユニットに14日間戻した。14日目に、各動物を麻酔して、ドブタミン（陽性変力剤）40μg/kgを静脈内に与えて、心臓にインビボストレスを引き起こさせて、左心室の機械的機能を評価した。ドブタミンを5μg/kgで開始して、用量を10、20、および最後に40μg/kgへと毎分増加させて、3分間静脈内に与えた。図10A〜Dのデータは、対照100％に対して標準化した。
【００５３】
正および負のdP/dt：nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓は、AMIの14日後に、ドブタミン誘発ストレスに応答して左心室の正のdP/dt（左心室が効果的にポンピングする能力の測定）を増加させる傾向を示したが（図10C）、生理食塩水処置した心臓はdP/dtをほとんど一定に維持する傾向であった。同様に重要であるのは、nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓では、ドブタミンストレスに応答して負のdP/dt（左心室がどのくらい良好に弛緩するかを示す測定）が減少する傾向があったが、生理食塩水処置した心臓は応答することができなかった（図10D）。このデータは、インビトロの結果と一貫性があり、AMI後の左心室圧の緩和におけるnsPEF活性化血小板ゲルの潜在的役割を再度示唆している。心拍数（HR）の変化、左心室収縮（DCON）および左心室弛緩（DREL）の時間も同様に分析した。PRP（EV6）処置した動物では、生理食塩水（EV2B）処置した動物よりもHRが低い（HRが10％低い）傾向があった。生理学的に、このことは、生理食塩水によって処置した心臓における心周期の時間が、nsPEF活性化血小板ゲルによって処置した心臓よりも短いことを示唆している。一般的に、心周期が短くなると、拡張（充満）に費やされる時間は減少する。nsPEF活性化血小板ゲル処置した動物におけるHRが、ドブタミンによってストレスが与えられた場合に、生理食塩水処置した動物におけるHRと同程度には増加せず、生理食塩水処置した動物におけるHRよりも速く減少する傾向を示したことは興味深い。加えて、ストレス誘発物質の30分後に、生理食塩水処置した動物よりもnsPEF活性化血小板ゲル処置した動物においてHRがより低い（7％低い）傾向が見られたことは、nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓に関して拡張期がより長いことを示唆している。双方の動物における左心室の収縮時間（DCON）および弛緩時間の分析を行った。AMIの14日後では、DCONは双方の動物において同等であった。しかし、ストレス下では、前記心臓は異なるように挙動した。ストレス誘発物質の30分後では、nsPEF活性化血小板ゲル処置した動物では、生理食塩水処置した動物よりも長いDCON（20％長い、図10E）およびDREL（6％長い、図10F）の傾向が見られ、このことは、心周期の時間がより長く、拡張期がより長く、および心充満がより良好であることを示唆している。nsPEF活性化血小板ゲル処置した動物において、生理食塩水処置した動物よりもLV弛緩時間が長くなる傾向があることを示す図10Eのデータは、これらのデータと一貫性がある。
【００５４】
実施例6：顕微鏡による概念実証−生理食塩水（図11A、n＝1心臓）またはnsPEF活性化血小板ゲル（図11B、n＝1）によって処置した、ウサギからの心臓の顕微鏡検査：左冠動脈回旋枝の縁枝を10分間閉塞することによって、左心室の40％梗塞を（左開胸術を通して）インビボで作り出した。閉塞を開放することによって、再灌流を行った。nsPEF血小板ゲルを、パルス長300 nsおよび電界強度30 kV/cmを有するnsPEF 1回によって活性化した。再灌流を開始して10分後、nsPEF活性化血小板ゲル（0.2 ml）または0.9％生理食塩水（0.2 ml）を心筋に注射した。胸部を閉じて、動物を収容施設に14日間戻した。機械的機能を評価できるように、14日目に、動物に前述したようにドブタミンを与えて、前記梗塞処置した心臓にインビボストレスを引き起こした。次に心臓を摘出して、ヘマトキシリン・エオジン染色によって染色した。生理食塩水によって処置した心臓（図11A）は、肥大型心筋症を連想させるパターンである、筋原線維の虫食い状の外観、壊死、および広範囲の空胞化（空胞形成）を有していた。nsPEF活性化血小板ゲルによって処置した心臓（図11B）はごく軽度の壊死、極小の空胞化、および極小の心筋細胞無秩序を有した。
【００５５】
実施例7：nsPEF活性化血小板ゲルまたは乏血小板血漿（PPP）によって処置した左心室心臓組織のマイクロアレイ分析：CDA遺伝子はピリミジンサルベージ経路に関係する酵素をコードする。これは、心臓のためのエネルギー源として働く細胞のピリミジンプールの維持を担ういくつかのデアミナーゼの1つである。IL-6およびIL-11の双方の遺伝子もまた、nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓において活性化されていた。IL-6ファミリーのサイトカインは炎症促進特性を有するが、シグナル伝達兼転写活性化因子（STAT）タンパク質を活性化することもまた証拠から示唆されている。STAT-3遺伝子を除去すると心不全および毛細管成長障害が起こることから、STAT-3は、心臓の保護および血管形成に関与すると考えられている。IL-11遺伝子もまた活性化されていた。これは、免疫調節物質として機能して、そのエフェクター細胞機能を調節する能力によって抗炎症効果を有し、腸管における再灌流損傷を防止する。IL-11は、nsPEF活性化血小板ゲルによって処置した心臓において増加して（表1）、ゆえに心臓における虚血再灌流損傷を同様に防止するために働いている可能性がある。
【００５６】
（表１）Oligo DEArray（登録商標）DNAマイクロアレイ
0006034564.tif 000002
【００５７】
IL-11は、心筋細胞中で発現されると報告されているが（Ancly 2002）、濃縮／活性化血小板から放出されたIL-11を含有するnsPEF活性化血小板ゲルによる処置は、ランゲンドルフ心臓およびインビボAMIの双方において、左心室の機械的機能がnsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓においてより良好であることを示唆する、本発明者らの予備的な結果を説明するために役立つ可能性がある。従って、nsPEF活性化血小板ゲルは、AMIに関する治療戦略でありうる。IL-6と同様にIL-11は、心筋細胞においてSTAT-3およびERK1/2を活性化して、細胞伸長を引き起こし、過酸化水素によって誘導される細胞死に対する抵抗性を与える。幹細胞因子としても知られるC-Kitリガンド遺伝子は、Nkx2-5転写因子によって活性化されることが示されており、心臓前駆細胞集団を制御する。Tnk1は、多くのポリペプチド増殖因子、サイトカイン、およびホルモンに対して高親和性の細胞表面受容体を有する受容体チロシンキナーゼである。これらの遺伝子は全て、nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓において活性化されたが、対照組織では活性化されず、nsPEF活性化血小板ゲル処置した心臓の機械的性能が生理食塩水処置した心臓の機械的性能よりも良いという傾向がある理由に関する手がかりを提供する可能性がある。
【００５８】
凝集体または血小板ゲルの調製において血小板活性化要素としてnsPEFを用いることに対して、いくつかの利点が存在する。nsPEFを用いることは、創傷部位で「治癒」因子（タンパク質）を放出するための有効かつ安全な手段を提供する。これは不適当な全身作用を誘導する能力を有しない、非化学的アゴニストを用いることを提供する。血小板ゲルに存在することが報告されている増殖因子には、インターロイキン1β、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子α、FGF、EGF、血小板由来増殖因子、およびインスリン様増殖因子が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、その全てが、血小板濃縮物が治癒を媒介しうるという考え方を支持する。
【００５９】
不適当な作用は、トロンビンおよびほとんどの化学的アゴニストに付随しうる。たとえば、ウシトロンビンは、ヒト血液凝固第V因子を阻害する交差反応性の抗ウシ抗体の発生に由来する、重度の術後出血に関連している。さらに、非常に強く感染性の高いタンパク質である、混入したウシ由来プリオンに対する曝露は、ヒトにおける異型クロイツフェルト-ヤコブ病および中枢神経系の疾患の病因に関連している。トロンビンはまた、腫瘍細胞の播種ならびに内皮および細胞外マトリクスへの接着を促進して、従って腫瘍の転移能を増強する。ヒトトロンビンは、ウイルス粒子の伝播の潜在的リスクを有する。このようにnsPEFは、感染物質を伝播させる、または不適当な炎症応答を引き起こす可能性を伴わずに、創傷を治癒するための手段を利用可能にする。
【００６０】
前述の詳細な説明には多くの特定の詳細が含まれる。そのような詳細を含めることは、例示の目的のためであるに過ぎず、本発明を制限すると理解されるべきではない。加えて、1つの態様における特色を、本発明の他の態様の特色と組み合わせてもよい。添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってもよい。加えて、本明細書において引用された全ての非優先権特許および他の参考文献は、当技術分野における技術レベルを示しており、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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