(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての、培養培地を含まない、アルガン細胞のバイオマスまたは粉砕バイオマス、および
美容上または皮膚科学的に許容される賦形剤、
を含んでなる美容組成物または皮膚科学的組成物であって、前記アルガン細胞が、防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞である、美容組成物または皮膚科学的組成物。
【請求項２】
前記バイオマスまたは粉砕バイオマスの量が、組成物の総重量の０．１〜１０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
皮膚老化または皮膚炎症の処置において使用するための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の美容組成物または皮膚科学的組成物を製造するための方法であって、以下の工程：
ａ）アルガン細胞を含むアルガン植物材料を滅菌することにより、滅菌されたアルガン細胞を得る工程、
ｂ）滅菌されたアルガン細胞を脱分化することにより、脱分化したアルガン細胞を得る工程、
ｃ）脱分化したアルガン細胞を、エリシターを含まない培養培地中に懸濁させる工程、
ｄ）エリシターを含まない培養培地中で脱分化したアルガン細胞を増殖させることにより、防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞の集団を得る工程、
ｅ）エリシターを含まない培養培地から防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞の集団を収穫し、これにより、防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞のバイオマスまたは粉砕バイオマスを取得する工程、ならびに
ｆ）防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞のバイオマスまたは粉砕バイオマスに、美容上または皮膚科学的に許容される賦形剤を添加する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の目的は、脱分化した防御反応誘発されていないアルガン細胞のインビトロ培養物に由来する調製物、前記調製物を含む美容組成物または皮膚科学的組成物、ならびに皮膚老化、炎症および瘢痕の処置のためのその使用である。
【背景技術】
【０００２】
アルガンは、植物のアカテツ科に属する樹木であり、その学名は、Argania spinosa (L.) Scellesである。
【０００３】
その習性は、オリーブと似ており；短いねじれた幹を有する。その木は、非常に硬く、高密度である。枝は、とげが非常に多く、かたまりとして集まっていることが多い小さい皮針形の短く（約２ｃｍ長）細い互生の葉を有する。その葉は、常緑であるが、深刻な干ばつがあるときは必ず枯れて落葉する。その花は、両性花であり、五数性である。それらは、団散花序で密集し、５月および６月に開花する。それらは、緑がかった黄色である。
【０００４】
アルガンの木は、樹齢５年から結実することができる。その果実は、約４〜５ｃｍ長の黄色い卵形の無柄の液果である。それは、共に固着した２〜３個の平らな種子（その各々が、油が豊富なアーモンド形のものを封入している）を含む堅果を取り囲む果肉から構成される。
【０００５】
アルガンは、モロッコに固有であり、主に、ＥｓｓａｏｕｉｒａとＡｇａｄｉｒとの間のモロッコの南西部に生育している。アルガンの森林は、約８３００００ｈａに及ぶ。
【０００６】
モロッコの人々は、まず第一に、アルガンをその著しく堅い樹木を燃料供給物として活用した。他の主要な従来の用途はオイルであり、このオイルは、当初は手作業で抽出されたが現在は圧搾機を用いて抽出されている。このオイルの第１の用途は、食用であり；現在の別の重要な用途は、化粧品用である。果肉およびこのオイル生成から得られる残渣ケーキは、通常、動物用飼料のために使用される。
【０００７】
多くの化粧品が、アルガンから開発されている。その種子に由来するオイル、例えば、溶剤によって得られるオイル（仏国特許第２５５３７８８号）、不鹸化物が豊富なアルガンオイル（仏国特許第２７２４６６３号）についての特許発明がいくつか存在する。
【０００８】
オイル以外の物質、例えば、オイルの抽出後に得られる種子ケーキに由来するペプチド；皮膚老化に関する問題を処置するためのオイルとケーキ由来のペプチドとの組み合わせにもまた特許権が与えられている（仏国特許第２７５６１８３号）。アルガンの葉、ケーキ由来のタンパク質およびサポニン＝葉の抽出物（欧州特許第１２１３０２５号）、ケーキタンパク質（欧州特許第１２１３０２４号）、ケーキサポニン（欧州特許第１４３０９００号）についての特許発明も存在する。より最近では、アルガン果実の果肉の抽出物のアンチエイジング化粧品における使用を開示している欧州特許出願第１９６８５３６号が出願された。
【０００９】
ゆえに、アルガンの木全体の組成物は、皮膚科学的および／または美容上の使用について興味深い。
【００１０】
アルガンは、「生態系」植物であるので、第一に経済的に重要な資源植物である。アルガンは、干ばつの地域に完全に適応しており、水食および風食から土壌を保護するので、モロッコにおける砂漠の拡大を防ぐ。しかし、複数の用途を有する樹木であるという理由でも、経済的である。
【００１１】
アルガンは、モロッコの主要な作物である。ゆえに、国家がアルガンの森林に対して上位の権利を有するが、地元住民が用益権を有する（果実、枯れ枝、アルガンの木の下の作物）ことを述べている、１９２５年に発行された勅命（ｄａｈｉｒ）（法令）によって、アルガンの森林は保護された。ＵＮＥＳＣＯは、近年、アルガンの森林を生物圏保護区に分類した。
【００１２】
このことは、その樹木または葉の美容上の使用が、この保護されている植物に対して深刻な結果をもたらし得る理由である。
【００１３】
植物から目的の分子を得る別の手段は、脱分化した全能性の細胞培養物を調製することである。また、脱分化した植物細胞を使用することによって、化粧品の開発中に遭遇するいくつかの工業化の問題を回避することができる。細胞培養のおかげで、異なる植物バッチ間または異なる植物採取物間における目的の物質の濃度の相違がなくなる。それはまた、樹立するのに比較的容易かつ安価な非破壊の手法でもある。最後に、その細胞が培養液中に存在し、活性な化合物が培養液中または細胞内の液体中に存在するので、それは抽出の必要性を排除する。ゆえに、簡単な粉砕によって、これらの化合物が利用可能になる。
【００１４】
特許出願ＷＯ０３０７７８８１には、インビトロ培養物中の脱分化し、防御反応誘発された植物細胞（少なくとも１種のフィトアレキシンを合成する）の少なくとも１つのホモジネートを含む局所適用のための組成物が開示されている。その植物材料は、好ましくは、ブドウに由来する。
【００１５】
このように、この文書は、脱分化され、防御反応誘発され得る植物細胞の美容上の適用を開示しており、ここで、その防御反応誘発は、局所的使用において生物学的活性を可能にする十分量の二次代謝産物をもたらす。
【００１６】
驚いたことに、また予想外にも、本発明者らは、脱分化しているが防御反応誘発されていないアルガン細胞のインビトロ培養物に由来する調製物が、アンチエイジング、炎症および瘢痕形成の分野における優れた美容上のおよび／または皮膚科学的な活性を有することを証明した。
【００１７】
得られた結果は、アルガンの特定の場合において、アルガン細胞培養物（この場合、防御反応誘発されていない細胞）の別の応用法が、上記で述べられた状況において可能であることを示す。
【００１８】
さらに、本発明において開示されるような調製物を得ることによって、工業的に困難かつ高価な工程である防御反応誘発工程の必要性を無くすことができる；防御反応誘発は、細胞増殖の低下が原因で、かなり低いバイオマス収量をもたらす。
【００１９】
出願ＷＯ０３０７７８８１には、この防御反応誘発を行う様々な方法、例えば、３日間にわたるＵＶ照射；２４時間から２日間にわたる二酸化炭素；５日間にわたるＵＶ照射および二酸化炭素が述べられている。
【００２０】
アルガン由来の植物材料の細胞の脱分化、次いで、懸濁液中での細胞の培養からなる本発明の枠内において行われるプロセスは、この植物の純度の高い、大量、均一かつ無菌のバイオマスを迅速に生じることができる。細胞培養によって、細胞規模におけるこの植物の生合成についての経路を直接応用することが可能になる。
【００２１】
ゆえに、本発明は、脱分化した防御反応誘発されていないアルガン細胞のインビトロ培養物に由来する調製物、前記調製物を含む美容組成物または皮膚科学的組成物、ならびに化粧品学および／または皮膚科学における（優先的には、皮膚老化、炎症および瘢痕の処置のための）その使用を目的としている。
【００２２】
より一般的に言うと、懸濁液中の植物組織のインビトロ培養物は、細胞の一次代謝または二次代謝から直接得られる活性な有機化合物を生成する手段を提供する。
【００２３】
懸濁液中の植物細胞は、動物細胞培養についての幹細胞の状態と類似の脱分化状態にある。ゆえに、これらの植物細胞は、植物体全体において観察されるすべての代謝産物を生成することが理論上可能である。脱分化は、生合成経路の遺伝的または後成的な撹乱を引き起こし、その結果、植物体全体と得られる細胞株との間で化学的なプロファイルが定量的および定性的に異なる。したがって理論上は、植物体全体で観察されない反応性の中間体が、細胞懸濁液中に出現し得る。これは、「眠っている」化学物質生物多様性に到達することができるような新しい機会を提供する。
【００２４】
当該分野の現在の状況において、概して、細胞培養物の防御反応誘発（化学的、物理的、生物学的）は、より多くの二次代謝産物を刺激、生成することができる。本発明による本発明者らの方法では、本発明者らは、ほとんどの場合とは異なり、驚いたことに、防御反応誘発は必要なく、防御反応誘発がバイオマスの増殖および求められる生物学的活性に有害であることを示す。
【発明の開示】
【００２５】
本発明の目的の１つは、脱分化した防御反応誘発されていないアルガン細胞のインビトロ培養物に由来する調製物に関する。
【００２６】
「脱分化した植物細胞」とは、任意の特定の特殊化性質を有しない、換言すれば、その植物の自然状態における分裂組織と類似の生理学的状態にある、任意の植物細胞のことを指す。これらの細胞は、それ自体だけで生存することができ、他の細胞に依存しない。
【００２７】
脱分化したＡｒｇａｎｉａ  ｓｐｉｎｏｓａ細胞は、葉、葉柄、茎、樹皮、根、果実、種子、花および花成器官または芽からなる樹木または若いシュートから採集された生存している植物材料（特に葉）から得られる。
【００２８】
脱分化した細胞の培養物を得るための方法は、当業者に公知の任意の方法によってインビトロにおいて得られる（例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．，Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．１９６２．Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９６．／Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ，Ｖｏｌ−１  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｅ．Ｆ．Ｇｅｏｒｇｅ，Ｄ．Ｊ．Ｍ．Ｐｕｔｔｏｃｋ，ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｇｅｏｒｇｅ（１９８７）Ｅｘｅｇｅｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．Ｅｄｉｎｇｔｏｎ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓ，ＢＡ１３４ＱＧ  Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと）。
【００２９】
本発明による調製物は、以下の工程を順次行うことによって得ることができる：
ａ）植物材料の滅菌、
ｂ）細胞の脱分化、
ｃ）エリシターを含まない培養培地での細胞懸濁液の調製
ｄ）エリシターを含まない培養培地でのバイオマスの増殖および生産培養、
ならびに調製物の取得。
【００３０】
その調製物は、エルレンマイヤーフラスコ内で（その目的が少量のバイオマスを生成することである場合）、またはバイオリアクター内で（より大量の場合）生成され得る。例えば、５００ｍｌの細胞懸濁液を含むエルレンマイヤーにおいて回収される平均量は、１００ｇの乾燥バイオマス（すなわち、２００ｇバイオマス／Ｌ細胞懸濁液）であり、１０Ｌバイオリアクターにおいて回収される平均乾燥質量は、３０００ｇである（３００ｇ／Ｌのバイオマス）。
【００３１】
バイオリアクター内における植物細胞培養については、３つの主要な様式が存在する：
１．非連続培養またはバッチ培養、
２．再投入／回収または流加培養、および
３．連続培養。
【００３２】
ａ．植物材料の滅菌工程：
Ａｒｇａｎｉａ  ｓｐｉｎｏｓａの外植片、より詳細には葉外植片を採取し、次亜塩素酸ナトリウムもしくは次亜塩素酸カルシウムの溶液または塩化水銀の溶液を用いて、外界温度において数分間除染する。その組織を、滅菌蒸留水ですすぎ、次いで、除染の終わりに滅菌蒸留水で少なくとも１回洗浄する。
【００３３】
ｂ．細胞脱分化工程
除染された外植片を、層流フード下において、スクロースおよび成長因子（またはホルモン）が添加されたＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ寒天栄養培地と接触させて置く。これらの成長ホルモンは、細胞分裂を引き起こすため、および細胞クラスターまたは脱分化したカルス（カルス形成）を引き起こすために外植片の細胞機構を調節する。得られたカルスは、３〜４週間ごとに新しい脱分化栄養培地に移される。この培地のいくつかの寒天が豊富な成分は、カルスによって代謝されることがあるか、または空気の作用によって分解されることがある。
【００３４】
概して、オーキシン（２−４ジクロロ−フェノキシ酢酸）およびサイトカイニン（カイネチン）に基づくホルモン組成物は、もろいカルスの形態の組織の迅速かつ完全な脱分化をもたらし（カルス形成）、液体培地への移動を容易にすると首尾良く試験された。０．５ｍｇ／Ｌのカイネチンおよび０．７５ｍｇ／Ｌの２−４ジクロロ−フェノキシ酢酸（２４Ｄ）添加物とともに３０ｇ／Ｌのスクロース、８ｇ／Ｌの寒天を含み、ｐＨ６に調整された後、１２１℃（１ｂａｒ）における２０分間のオートクレーブが行われたＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．，Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．１９６２．Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９６）から構成される寒天培地と滅菌された葉外植片の向軸面とを接触させて置く。外植片を含むペトリ皿を暗黒下、２８℃に放置してインキュベートする。最初のカルスは、２週間後に出現する。得られたカルスを２〜３ｃｍのサイズに維持するようにメスで分割することによって、そのカルスを３〜４週間ごとに新しい培地に移す。これらの移動を、もろいカルスが得られるまで２〜６ヶ月間続ける。
【００３５】
ｃ．エリシターを含まない培養培地中で細胞懸濁液を調製する工程
寒天培地上のカルスをその後移動させるための細胞の脱分化によって、もろいカルスが形成する。この細胞間の接着の低下は、植物に応じて２〜６ヶ月間に起き得る、脱分化の結果である。この状態は、誘導される機械的ストレスを最小にしつつ、細胞懸濁液中でのカルスの崩壊を保証するものであるので、液体培地に移すのに好ましい。したがって、もろいカルスの一群が、脱分化寒天培地と同じであるがゲル化剤を含まない処方を用いて調製された液体栄養培地中に導入される（１０〜２０体積％）。
【００３６】
したがって、もろいカルスが、２〜３日間にわたる振盪台の作用によって液体培地中で崩壊し、得られた細胞懸濁液は、崩壊されていないカルスの部分のすべてを含まないので、均一な細胞懸濁液が形成される。この懸濁液は、十分に高密度な細胞集団が得られるように培養して維持される。この段階において、その懸濁液は、（継代培養されるか）または新しい栄養培地に希釈され、その培養は、同じ方法で開始される。
【００３７】
最初の細胞懸濁液は、約２０〜４０ｇのもろいカルスを、２００ｍｌの培地を含む５００ｍｌエルレンマイヤーに入れることによって開始され得る。そして、そのもろいカルスは、暗黒下、２９℃での２〜３日間にわたる１１５ｒｐｍの振盪台の作用によって液体培地中で崩壊する。次いで、ピペットを用いて細胞浮遊物が回収され、崩壊していない残留カルスクラスターが残される。このようにして細胞浮遊物が、均一な細胞懸濁液を形成する。この懸濁液は、「十分に」高密度な細胞集団が得られるように培養して維持される。得られた細胞懸濁液は、１５日間培養され、次いで、新しい培地への１：５希釈によって同じ期間にわたって増殖される。バイオマスの生産率を最大にするために、培養培地の組成（栄養分、成長因子など）の調整が行われた。結果は、液体細胞懸濁液について最適化されたＡＲＧＭＳバイオマス増殖培地である（表１を参照のこと）。この培地は、カルス形成用のＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地の改変バージョンである。この培地は、ＫＯＨを加えることによりｐＨ６に調整された後、１２１℃での２０分間のオートクレーブ（ｐ＝１ｂａｒ）または０．２μｍでの濾過滅菌が行われる。
【００３８】
【表１】
0005964288.tif 000002
【００３９】
ｄ．エリシターを含まない培養培地によるバイオマスの増殖および生産培養
いくつかのそのような継代培養物を取り出した後、その期間にわたって得られた細胞密度が一定になると、その細胞懸濁液は安定化される。次いで、バイオマスの生産率を最大にするために、培養培地の組成（栄養分、成長因子など）の調整が可能である。本発明の１つの特定の実施形態において、バイオマス生成手段として使用される最適化された培地は、表１に記載された培地である。
【００４０】
細胞懸濁液は、濾過されることにより、余分な細胞培地または培養浮遊物から分離され、回収されたバイオマスは、蒸留水中の懸濁液に戻され、０℃で粉砕される。得られたホモジネートは、凍結乾燥されるか、または凍結乾燥前に精製するために遠心分離される。
【００４１】
このように生成された「最適な」条件下での細胞培養物は、安定化され、１５日ごとに細胞懸濁液の１：５希釈にてエルレンマイヤー内で維持される（増殖培養）。これは、約６０ｇ／Ｌの新鮮バイオマスが接種された細胞培養物（１５日間培養した後に約３００ｇ／Ｌの細胞懸濁液をもたらす）または必要に応じてバイオリアクターにおいて接種される新鮮バイオマスの細胞培養物と等しい。
【００４２】
エルレンマイヤーまたはバイオリアクターにおいて得られた調製物は：
−細胞懸濁液（本発明の場合、「細胞懸濁液」とは、その培養培地中の細胞（すなわちバイオマス）のことを指す）；
−バイオマス（本発明の場合、「バイオマス」とは、培養培地から分離された細胞クラスター、すなわち、濾過後の細胞懸濁液のことを意味する）；
−蒸留水中の懸濁液に戻された後（または戻されない）の粉砕バイオマス；
−粉砕バイオマスの遠心分離または濾過によって精製された液または浮遊物；
−培養浮遊物（本発明の場合、「培養浮遊物」は、培養中の細胞が残存したままの培養培地または細胞外の培地である）
からなり得る。
【００４３】
細胞懸濁液、バイオマスまたは粉砕バイオマスの浮遊物が関係するか否かを問わず、それらは、凍結された形態で、または保存物質（例えば、フェノキシ−２−エタノール、ベンジルアルコール、または“Ｌｉｓｔ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｂｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ”という表題の化粧品に対するＥＵの指示における付録ＶＩに見られる他の任意の保存製品）を加えることによって、変化せずに維持され得る。それらはまた、化粧品学的に許容される媒質（例えば、グリコール（プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコールなど））に１０〜６０％で変動する比率で希釈され得る。その細胞懸濁液またはバイオマスはまた、粉砕され得、次いで、そのように凍結された状態で、または上に記載されたような保存物質もしくは媒質を加えることによって、保存され得る。
【００４４】
粉砕されているかされていないかに関係なく、細胞懸濁液、バイオマスまたはバイオマス浮遊物はまた、凍結乾燥もしくは微粒子化によって乾燥され得、そのように維持され得るか、またはマルトデキストリン、ラクトースもしくはシリカタイプの媒体または他の任意の化粧品学的に許容される媒体上で乾燥され得る。
【００４５】
最後に、細胞懸濁液は、アフィニティークロマトグラフィ：樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ（登録商標）−２１ａタイプのポリスチレン共重合体など）への吸収およびエタノールなどの適切な溶媒での溶出によって、有用な化合物について濃縮され得る。
【００４６】
本発明による方法を用いて得られた新鮮バイオマスは、最適な回収日（すなわち平均して約１５日）において、懸濁液１リットルあたり約１００〜５００ｇ、より好ましくは、懸濁液１リットルあたり２００〜３５０ｇである。
【００４７】
下記の表は、得られた収率（得られた生成物の収量（単位はグラム）／細胞懸濁液１Ｌ）を表している：
【表２】
0005964288.tif 000003
【００４８】
本発明は、上に記載されたように活性成分として防御反応誘発されていない脱分化したアルガン細胞の培養物に由来する調製物を含む美容組成物または皮膚科学的組成物にも関する。
【００４９】
好ましくは、前記調製物の量は、その組成物の総重量の０．１〜１０％である。なおもより優先的には、前記抽出物の量は、０．２％〜５％である。
【００５０】
本発明による美容組成物は、好都合なことに、局所適用または経口適用、優先的には局所適用のための化粧品において通常使用される任意のガレヌス製剤の形態であり得る。局所経路による投与の場合、ガレヌス製剤の形態は、クリーム、ゲル、軟膏または噴霧であり得る。経口製剤は、錠剤、カプセル、および飲用可能な懸濁液用の粉末を含む群から選択される。
【００５１】
本発明による美容組成物は、通常の美容上適合する賦形剤も含む。
【００５２】
美容組成物に適合する通常の賦形剤は、上に記載されたような形態で局所適用するための美容組成物が得られるような、当業者に公知であるもののうちの任意の賦形剤であり得る。
【００５３】
本発明による美容組成物および／または皮膚科学的組成物は、特に、添加物および製剤化助剤（例えば、乳化剤、洗浄剤、起泡性界面活性物質など）、錯化剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤（抗菌剤および酸化防止剤を含む）、コンディショナー、酸化剤、アルカリ化剤、軟化剤、溶媒、着色剤および芳香剤を含み得る。
【００５４】
本発明者らは、脱分化した防御反応誘発されていないアルガン細胞に由来する調製物が、以下の活性：
−内因性および外因性の加齢に関する酸化プロセスならびに炎症性プロセスを制限する抗酸化抗ラジカル活性
−コラーゲンを分解するメタロプロテアーゼの阻害によって、成熟した皮膚の力学的特性（堅さ、弾性、張度）を改善する、細胞外マトリックスに対する活性
を有し得ることも示した。
【００５５】
最後に、本発明は、皮膚老化、炎症および瘢痕の処置のための本明細書中に開示される組成物に関する。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例は、非限定的な例として与えられる。
【００５７】
本発明による調製物を生成するための実施例
実施例１：新鮮バイオマス／エルレンマイヤー内で行われるプロセス
好ましくは３〜４月齢のアルガン葉を、いくつかの槽によって順に滅菌する：１分間の７０％アルコール、３分間の２％次亜塩素酸ナトリウム、次いで２つの連続する脱塩水槽で８分間および１０分間にわたってすすぐ。
【００５８】
０．５ｍｇ／Ｌのカイネチンおよび０．７５ｍｇ／Ｌの２−４ジクロロ−フェノキシ酢酸（２．４−Ｄ）が補充され、ｐＨ６に調整された後、１２１℃（１ｂａｒ）での２０分間オートクレーブされた３０ｇ／Ｌのスクロース、８ｇ／Ｌの寒天を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，Ｔ．，Ｓｋｏｏｇ，Ｆ．１９６２．Ａ  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｂｉｏ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  １５：４７３−４９６）から構成される寒天培地と滅菌された葉外植片の向軸面とを接触させて置く。外植片を含むペトリ皿を暗黒下、２８℃で放置してインキュベートし、もろい安定化されたカルスが得られるまで、増殖させる。
【００５９】
２００ｍｌのオートクレーブされた培地（その組成は上で述べた表１に記載されている）を含む５００ｍｌのエルレンマイヤーに約４０ｇのもろいカルスを入れることによって、最初の細胞懸濁液を生成する。
【００６０】
その培養物を、２９℃の暗黒下、１１５ＲＰＭの振盪台上で１週間放置する。次いで、カルスのかたまりを残しつつ、ピペットを用いて細胞浮遊物を回収する。得られた細胞懸濁液を、１５日間培養し、次いで、新しい培地への１：５希釈によって同じ期間にわたって増殖させる。
【００６１】
次いで、その懸濁液を真空下で濾過し、バイオマスを回収する。得られた新鮮なバイオマスの収率は、１６８ｇ／Ｌである。
【００６２】
そのバイオマスを−２０℃で維持する。
【００６３】
実施例２：乾燥バイオマス
実施例２ａ：乾燥バイオマス／バッチ培養におけるバイオリアクター内で行われるプロセス
実施例１に記載されたように得られた４つの５００ｍｌ細胞懸濁液エルレンマイヤーを、接種デバイス内でひとまとめにし、それらは、１０Ｌのバイオリアクターに無菌的に注ぎ込まれる２Ｌの接種材料を形成する。このバイオリアクターは、３０ｍｇ／Ｌの予め滅菌された消泡剤によって補完された８Ｌの最適培地（表１を参照のこと）で満たされ、次いで、冷却され、バイオリアクターケーシング内の閉鎖経路におけるサーモスタット制御型水循環によって２９．５℃で維持される。
【００６４】
酸素プローブは、飽和状態によって較正され、コンピュータ化されたｐＯ２制御デバイスにデータをリアルタイムで入力する。このデバイスは、通気システムに無菌の純酸素を注入することによってｐＯ２を８０％で維持する。このバイオリアクターは、排出ガス（ヘッドスペース）にオンラインのＣＯ２測定デバイスも備え、それは同時に、コンピュータ化されたｐＣＯ２制御デバイスにデータを入力することにより、ｐＣＯ２を６％に維持する。これは、酸素と混合される通気デバイスに無菌の空気を注入することによって行われる。そのバイオリアクターは、細胞懸濁液を撹拌し、それが沈降するのを防ぐ、７５ＲＰＭで回転するプロペラ式の撹拌システムも備える。自動のデバイスが、そのバイオリアクターのアウトプット側に設置されることにより、バイオマスの無菌的なサンプリングおよびモニタリングが可能になる。
【００６５】
バッチ培養物は、１５〜１７日間にわたってこれらの一定温度、溶解ガス条件下で維持されることにより、２８０〜３２０ｇ／Ｌという新鮮バイオマスの細胞密度に達する。このバッチ培養が完了した後、そのバイオリアクターは空にされ、そのバイオマスは、ブフナー漏斗を用いて濾紙による濾過により回収される。
【００６６】
同体積の蒸留水に溶解された回収された新鮮バイオマスは、「超音波洗浄器」を用いて冷却粉砕され、次いで、凍結乾燥される。
【００６７】
実施例２ｂ：乾燥バイオマス／流加培養１０．０．０．１におけるバイオリアクター内で行われるプロセス
４つの５００ｍｌ細胞懸濁液エルレンマイヤーを、実施例２ａに記載されたような接種材料として使用した。バイオリアクターは、実施例２ａに示されたように調製される。溶解ガス、温度および撹拌制御システムは、実施例２ａに示されたように調製される。
【００６８】
最初の培養物は、２８０〜３２０ｇ／Ｌという新鮮バイオマスの細胞密度が達成されるまで、１５〜１７日間にわたってこれらの一定温度および溶解ガス条件下で維持される。この最初の培養が完了した後に、１０Ｌバイオリアクターの含有量の８０％が、取り出される。次いで、８Ｌの細胞懸濁液が回収される。この懸濁液中のバイオマスは、ブフナー漏斗を用いて濾紙による濾過により回収される。２２４０ｇ〜２５６０ｇの新鮮バイオマスが回収される。同体積の蒸留水に溶解された回収された新鮮バイオマスは、冷却されたら、超音波洗浄器を用いて粉砕され、次いで、凍結乾燥される。１００〜１３０ｇの凍結乾燥バイオマスが得られる。
【００６９】
８０％の部分的な回収が行われるのと同時に、８Ｌの予めオートクレーブされ冷却されたＡＲＧＭＳ培地を、そのバイオリアクターに注ぎ込み、次いで、培養体積を１０Ｌに戻すために２Ｌの細胞懸濁液を含める。その流加培養物は、２８０〜３２０ｇ／Ｌという新鮮バイオマスの細胞密度が達成されるまで、５〜７日間にわたってこれらの一定温度および溶解ガス条件下で維持される。そのバイオマスが、持続性の生理学的細胞分裂状態にあり、新しい栄養培地の注入が、２４時間未満の潜時期およびそのバイオマスの速やかな増大によって特徴付けられるので、この培養は、最初の培養よりも速い（より生産率が高い）。この流加培養の終わりに、１０Ｌのバイオリアクターの８０％を取り出す。次いで、８Ｌの細胞懸濁液を回収する。この懸濁液のバイオマスは、ブフナー漏斗を用いて濾紙による濾過により回収される。次いで、培養が前述同様に再開される。
【００７０】
実施例２ｃ：乾燥バイオマス／連続培養バイオリアクターにおいて行われるプロセス
４つの５００ｍｌ細胞懸濁液エルレンマイヤーを、実施例２ａに記載されたような接種材料として使用する。バイオリアクターは、実施例２ａに示されたように調製される。溶解ガス、温度および撹拌制御デバイスは、実施例２ａに示されたように調製される。
【００７１】
最初の培養物は、１５０ｇ／Ｌという細胞密度および０．２ｄ−１という即時的な新鮮バイオマス増殖速度が達成されるまで、１０日間にわたってこれらの一定温度および溶解ガス条件下で維持される。この段階において、１０Ｌのバイオリアクターの含有量の１．２％が、１時間２０分ごとに取り出される。同体積の新しいＡＲＧＭＳ培地をそのバイオリアクターに注ぎ込むことによって、これらのサンプルは、自動的に埋め合わされる。この方法は、それらの細胞を一定の生理学的条件および細胞密度で維持する。
【００７２】
次いで、１００〜１２０ｍｌの細胞懸濁液が回収される。この懸濁液中のバイオマスは、ブフナー漏斗を用いて濾紙による濾過により回収される。各サンプルについて１５ｇ〜１８ｇの新鮮バイオマスが回収される。同体積の蒸留水に溶解された回収された新鮮バイオマスは、超音波洗浄器を用いて冷却粉砕され、次いで、凍結乾燥される。得られる結果は、各回収物について０．７１〜０．８５ｇの凍結乾燥バイオマスである。したがって、その培養物は、少なくとも６０日間維持される。それを無期限に維持することが理論上可能である。
【００７３】
以前の様式に対する連続培養の利点は、洗浄および滅菌を必要とするバイオリアクターを再度調製する必要がないという点、ならびに細胞の潜時期がないという点である。細胞懸濁液の１〜１．５％を自動的に取り出した後、バイオリアクターにおいて新しい培地で埋め合わせることにより、そのバイオリアクター内の進行中の培養液の組成のばらつきが最小になる。したがって、この細胞集団では、他の培養様式で見られるバイオマス体積の生産性の喪失に関与する潜時期について一切、代謝的な再調整が行われない。
【００７４】
実施例３：新鮮バイオマス浮遊物（前記バイオマスは実施例２ａに記載されたように得られる）
実施例２ａに記載されたように得られる２０ｇの新鮮粉砕バイオマスを、１５分間にわたって１００００ｇで遠心分離し、浮遊物を回収する。次いで、それを凍結乾燥する。
【００７５】
平均収量は、新鮮バイオマス１ｇあたり３０ｍｇの凍結乾燥浮遊物である。
【００７６】
美容組成物の実施例：
実施例４：Ｈ／Ｅ処方
【表３】
0005964288.tif 000004
【００７７】
実施例５：Ｅ／Ｈ処方
【表４】
0005964288.tif 000005
【００７８】
実施例６：抗酸化活性の評価
化学発光
この方法は、光化学的シグナルによってフリーラジカル（スーパーオキシドラジカルＯ２Ｏ−）を発生する。酸化の強度は、通常の条件下で得られる強度よりも１０００倍高い。検出は、化学発光によって行われ、それを用いることにより、脂溶性または水溶性の抗酸化抽出物または抗酸化分子が評価される。結果は、等量のビタミンＣまたはトロロクス（６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸）として表される。感度は、１ナノモルの程度である。
【００７９】
結果の解析は、２つの基準、すなわち、曲線の形状（積分）、およびソフトウェアによって与えられるナノモル単位の数値（Ｉｇｏｒ  Ｐｏｐｏｖ  ａｎｄ  Ｇｕｄｒｕｎ  Ｌｅｗｉｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ［４４］  ｖｏｌ  ３００．４３７−４５６；  Ｍａｉｂａｃｈ  Ｉ  Ｈｏｗａｒｄ  ａｎｄ  ｃｏｌｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ７（２）９６−１００（２００８））に依存する。
【００８０】
結果は、１μｇの標準物質（＝トロロクス）（ＡＣＬ  Ｋｉｔ）に対して検出される活性と等しい活性を得るのに必要なサンプルのμｇとして表される。
【００８１】
結果：
本研究における抗酸化活性は、化学発光によってスーパーオキシドアニオンを特異的に捕捉する能力に相当する。
【００８２】
【表５】
0005964288.tif 000006
【００８３】
実施例２ａに従って調製された凍結乾燥バイオマスおよび実施例３に従って調製された粉砕凍結乾燥バイオマスの浮遊物は、全体的に等しい抗ラジカル捕捉活性を有する。
【００８４】
２７８μｇの凍結乾燥バイオマスが、１μｇのトロロクスについて検出された活性と等しい活性：参照抗酸化分子であるコエンザイムＱ１０と等しい活性を得るために必要である。
【００８５】
１７１μｇの粉砕凍結乾燥バイオマス浮遊物が、１μｇのトロロクスについて検出された活性と等しい活性を得るために必要である。
【００８６】
外部からの攻撃（冷気、汚染、タバコ、ＵＶ）の結果としてその生成が増加するフリーラジカルは、皮膚細胞のＤＮＡだけでなく細胞膜およびミトコンドリア膜ＤＮＡへの損傷に関与する。これらのフリーラジカルは、炎症プロセスにおいても非常に重要な役割を果たす。これらの非常に反応性の代謝産物は、細胞酸化ストレスのシグナル伝達のセカンドメッセンジャーであり、ゆえに炎症の初期のメディエーターである（Ａ．Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ａｎｄ  ｃｏｌｌ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ８５：９５−１１６  １９９２）。
【００８７】
実施例２ａおよび３に記載される調製物の抗ラジカル活性は、内因性および外因性の皮膚老化および炎症に対する抵抗を助ける。
【００８８】
実施例７：細胞外マトリックスを形成するコラーゲンに対するメタロプロテアーゼ活性の阻害の評価
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、組織に対して構造的な役割および制御する役割を有する動的構造である。細胞外マトリックスは、皮膚に張りおよび力学的特性を与える。表皮では、細胞外マトリックスは、細胞間隙を占め、表皮構造に対して支持を提供する。細胞外マトリックスはまた、表皮細胞間の交換を調節し、細胞活性に関与する。細胞外マトリックスは、繊維（特にコラーゲン）および基本的な物質（水、塩類、糖タンパク質、グリコサミノグリカン）から構成される。コラーゲンは、共有結合性の水素結合によって接続される３つのポリペプチド鎖（同一であっても異なっていてもよい）から形成される繊維状タンパク質である。コラーゲンは、繊維状のネットワークの必須の構成要素を形成し、皮膚に抵抗性および弾性を提供する力学的役割を果たす。
【００８９】
細胞が老化しているとき、ＥＣＭのほとんどの成分が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）と呼ばれる亜鉛リッチなエンドペプチダーゼ型酵素によって分解されている（Ｈｉｄｅａｋｉ  Ｎａｇａｓｅ  §  ａｎｄ  Ｊ．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｗｏｅｓｓｎｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．２７４，Ｉｓｓｕｅ  ３１，２１４９１−２１４９４，Ｊｕｌｙ  ３０，１９９９）。それらは、膜型または分泌型である。すべてのＭＭＰが、強い配列相同性および構造相同性を有するが、基質特異性は異なる。ＭＭＰ１または「間質コラゲナーゼ」は、主にＩ型コラーゲン（正常な皮膚の真皮において８０％の含有量）を分解し、ＩＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＸ型コラーゲンも分解する。
【００９０】
特異的なペプチド基質Ｍｃａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＤＰＡ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２を用いるヒト組換え酵素のモデルにおいて、本発明者らは、蛍光定量的定量（Ｄａｖｉｄ  Ｌｅｐｐｅｒｔｄ  ａｎｄ  ｃｏｌｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２８（２００４）１６６−１７）によって、直接的な酵素活性について抽出物の作用を解析した。
【００９１】
その活性化された酵素を、種々の調製物とともにプレインキュベートし、次いで、その基質の存在下に置く。その酵素は、ペプチドを切断して、クエンチャーＤｐａ（Ｎ−３−（２，４−ジニトロフェニル）−Ｌ−２，３ジアミノプロピオニル）からＭｃａフルオロフォア（７メトキシクマリン−４−イル）アセチル）を分離する。次いで、そのペプチドは、３２０ｎｍで励起されると、４０５ｎｍの波長の蛍光を発する。このように、ＭＭＰ−１の酵素活性が測定され、その活性は、放出される蛍光に比例する。
【００９２】
このｉｎ  ｔｕｂｏ試験を用いるとき、本発明者らは、コラーゲンの分解の惹起において重要な役割を有する酵素であるＭＭＰ１の活性の潜在的な阻害剤を検出することができる。本発明者らは、ＭＭＰ１活性阻害のパーセンテージを測定する。
【００９３】
その阻害剤または生成物に関する酵素阻害のパーセンテージの算出は、以下のとおりである：
％阻害＝１００×（（最大正味酵素活性−阻害剤の存在下における正味酵素活性）／最大正味酵素活性）
【００９４】
結果：
実施例３に従って調製された浮遊物は、６０〜５００μｇ／ｍｌにおいて用量依存的にＭＭＰ１活性を有意に阻害する。
【００９５】
【表６】
0005964288.tif 000007
【００９６】
実施例２ａに従って調製された凍結乾燥バイオマスを、６０〜１０００μｇ／ｍｌにおいて試験した。概してそのバイオマスの物理化学的な干渉に起因して、本発明者らは、阻害活性を測定することができなかった。しかしながら、非常に類似の抽出物を試験したところ、それは、６０μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌにおいて有意な阻害を示した。
【００９７】
実施例３に従って調製された抽出物は、老化が生じているとき、ＭＭＰの高い活性に抵抗することができ、コラーゲンの力学的役割の維持に寄与することができるので、皮膚に対して抵抗性および弾性を提供する。
【００９８】
実施例８：ＨａＣａＴケラチノサイトにおけるＴＧＦ−β１の合成の測定
ＴＧＦ−β１（トランスフォーミング成長因子−ベータ１）は、種々の細胞型によって分泌され、細胞の成長の調節ならびに複数の細胞反応および生物学的プロセスの制御において重要な役割を果たす、ＴＧＦ−βのスーパーファミリーに属する。このスーパーファミリーのサイトカインの主な活性は、それらが、ほとんどの細胞の増殖を調節すること、線維芽細胞の増殖を刺激すること、および細胞外マトリックスの形成を増加させることである（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，１９９６）。ＴＧＦ−β１は、特に、細胞骨格（アクチン）の再編成を誘導すること、および上皮細胞の移動を促進すること（Ｂｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）によって、瘢痕形成プロセスである損傷の修復にも関わる（Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。皮膚組織を最も代表する細胞集団は、ケラチノサイト集団である。それは、皮膚細胞すなわち線維芽細胞の挙動を調節し得、それに影響し得る成長因子の重要な供給源を形成する（Ｇｈａｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００９９】
装置および方法
実施例２ａに係る防御反応誘発されていないバイオマスの生成
防御反応誘発されたバイオマスの調製物
成長因子（カイネチンおよび２４Ｄ）を含まないＭｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地を調製する。ＫＯＨを加えることによってこの培地をｐＨ６に調整した後、１２１℃（ｐ＝１ｂａｒ）で２０分間オートクレーブする。次いで、この培地を、増殖培養物に由来する細胞懸濁液を用いて１：５の体積で接種する。その直後に、カイネチンＤＭＳＯに６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰまたは（Ｎ−（フェニルメチル）−７Ｈ−プリン−６−アミン）およびエリシター剤（アセチルサリチル酸およびジャスモン酸メチル）の濃縮溶液を無菌的に加えることによって、防御反応誘発条件をもたらす。結果は、ＥＭＳ防御反応誘発培地である（表４を参照のこと）。次いで、その防御反応誘発された培養物を、１１５ＲＰＭおよび２９℃、暗黒下の振盪台上で１５日間維持する。次いで、新鮮バイオマスを回収し、ブフナー漏斗上で乾燥した後、粉砕および遠心分離を行い、浮遊物を凍結乾燥することによって安定化する。
【０１００】
【表７】
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【０１０１】
５時間にわたってＨａＣａＴケラチノサイトを種々の抽出物で処理し、次いで、それらの細胞を３７℃のＤＭＥＭ中で２４時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡキットを用いて培養浮遊物中のＴＧＦ−β１を投与する。
【０１０２】
ヒトＨａＣａＴケラチノサイトにおけるＴＧＦ−β１の合成に対する、実施例２ａに従って調製された防御反応誘発されていないアルガンバイオマスおよび防御反応誘発後に得られたアルガンバイオマスの作用を、添付の図１に示す。それらは、ＨａＣａＴケラチノサイトにおいて、実施例２ａに従って調製された防御反応誘発されていないアルガンバイオマス（５０μｇ／ｍＬ）が、ＴＧＦ−β１の合成を４８％刺激するが、防御反応誘発されたアルガンバイオマスは、ＴＧＦ−β１の合成を２６％阻害することを示している。
【０１０３】
実施例９：ヒトケラチノサイトの増殖および細胞移動の測定
実施例９．ａ：ヒトケラチノサイトの細胞増殖の測定
損傷の瘢痕形成は、組織の正常な修復における多くの局所的および全身性の因子の相互作用を含む複雑かつダイナミックな生物学的プロセスである。瘢痕形成の進行は、４つの相互依存的な段階：止血、炎症、増殖およびリモデリングを含む。増殖は、３つの明らかに観察可能なプロセス、すなわち、肉芽化、収縮および再上皮化を包含する。
【０１０４】
肉芽化では、修復プロセスの残りの部分に関わり得る細胞の増殖が、損傷床へのこれらの細胞の移動とともに、観察される。これらの細胞には、マクロファージ、線維芽細胞および内皮細胞が含まれる。マクロファージは、恒常的に走化性因子および成長因子を放出している。線維芽細胞は、損傷の底部の細胞の増殖に必要な新しい細胞マトリックスを構築する。この足場材料は、細胞移動を容易にする。
【０１０５】
損傷の収縮は、損傷のサイズを減少させるための機構であり、線維芽細胞が、この収縮において主導的役割を果たす。
【０１０６】
再上皮化は、有色素であり得る、損傷を覆う表皮を再生して外部環境に対する有効な障壁を再形成すること、ならびにその知覚機能および免疫機能を回復することからなる。ゆえに、再上皮化は、ケラチノサイトの細胞移動プロセスおよび増殖プロセスだけでなく、新しい上皮の分化および真皮と表皮とを再び接続する基底膜の修復も包含する。損傷の中心にむかって基底細胞が移動することにより、その損傷の２つの面が結合できると、細胞の有糸分裂が相次いで生じることにより、その移動によって残された空間が埋まり、３次元の再生において上皮組織に対して細胞が供給される。
【０１０７】
ケラチノサイト細胞、線維芽細胞および内皮細胞の増殖工程は、活性成分の瘢痕形成活性を確かにする機能的な現象の１つであると考えられ得る。線維芽細胞または内皮細胞の増殖の増加は、真皮の瘢痕形成に関与し得る一方、ケラチノサイトの増殖の増加は、再上皮化に関与し得る。
【０１０８】
装置および方法：細胞増殖
用いられる手法は、Ｓ期の細胞のＤＮＡへのヌクレオチドチミジンのアナログである５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みを測定する。
【０１０９】
手術後に廃棄される皮膚から単離されたケラチノサイトを、完全ＫＳＦＭ（ＢＰＥ２５μｇ／ｍｌ；ＥＧＦ１．５ｍｇ／ｍｌ）中で培養する。その細胞を、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気において４８時間にわたって、分子の存在下においてインキュベートすることにより評価する。細胞増殖速度に比例するＢｒｄＵの取り込みは、ペルオキシダーゼに結合された抗ＢｒｄＵ抗体の系によって評価される。ペルオキシダーゼの基質を加えることにより、有色の反応が起きる（Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｌｉｓａ  Ｓｙｓｔｅｍ）。対応する吸光度（ＤＯ）を４５０ｎｍにおいて測定する。ゆえに、このデータは、細胞増殖速度に比例する。
【０１１０】
次いで、増殖パーセントを、以下の式を用いて算出する：
％増殖＝（ＤＯ（処置）−ＤＯ（ｔコントロールｍｉｎ））／（ＤＯ（ｔコントロールｍａｘ）−ＤＯ（ｔコントロールｍｉｎ））×１００
〔ここで：
コントロールｍｉｎ＝最少培地とともにインキュベートされた細胞
コントロールｍａｘ＝完全培地とともにインキュベートされた細胞
したがって、コントロールｍｉｎは、０％増殖に対応し、コントロールｍａｘは、１００％増殖に対応する。〕
【０１１１】
実施例２ａに従って調製されたアルガンバイオマスの、ヒトケラチノサイトの増殖に対する作用を図示している図２に、細胞増殖に対する結果を示す。
【０１１２】
それらは、実施例２ａに従って調製された０．１μｇ／ｍＬのアルガンバイオマスが、ヒトケラチノサイトの増殖を２５％刺激することを示している。そのバイオマスが０．０１μｇ／ｍＬで試験されたときは、作用は測定されない。
【０１１３】
実施例９．ｂ：ヒトケラチノサイトの細胞移動の測定
装置および方法：ＨａＣａＴケラチノサイトの細胞移動
細胞移動を調べるために使用されるプロトコルは、９６ウェルキットの使用に基づく。この試験の原理は、ウェル（９６ウェルプレート）の中心への細胞の移動を調べることからなる。これを行うために、直径２ｍｍの検出ゾーンが得られるように、各ウェルの中心に妨害物を置く。次いで、ＨａＣａＴ細胞をこの妨害物の周りに播種する。細胞がその妨害物の周りの表面に十分に結合したら、その妨害物を取り除き、それにより、細胞は検出ゾーンに移動できる。妨害物なし活性成分ありの状態でプレートを、ＤＭＥＭ０％ＳＶＦ中において３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、細胞の移動を評価するために、妨害物が位置していたゾーンに存在する細胞の量を解析する。その細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で標識し、カバーを用いてこのゾーンに存在する細胞だけを観察し、計数する。各条件について、８ウェルを平均する。結果は、
−蛍光強度（ＩＦ、移動した細胞の量に比例する）
−コントロール０％ＳＶＦに対する活性パーセント：
（（ＩＦ処理−ＩＦ０％移動）／（ＩＦｔコントロール０％ＳＶＦ−ＩＦ０％移動））×１００
として表され、
ここで：
ＩＦ（０％移動）は、妨害物を含むウェルのＩＦ（蛍光強度）、ゆえにバックグラウンドノイズに対応する。
【０１１４】
図３は、細胞移動の結果を示しており、実施例２ａに従って調製されたアルガンバイオマスの、ＨａＣａＴケラチノサイトの移動に対する作用を図示している。
【０１１５】
それらは、実施例２ａに従って調製された０．０１または０．０３μｇ／ｍＬのアルガンバイオマスが、ＨａＣａＴケラチノサイトの移動をそれぞれ７９％および７３％刺激することを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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