(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＲＥＧの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる新生物性疾患治療用薬剤の調製における、ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤の使用であるか、又は
ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる新生物性疾患治療用薬剤の調製における、ＡＲＥＧの阻害剤の使用であって、
前記ＨＢ−ＥＧＦの前記阻害剤が、前記ＨＢ−ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子であり、
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、前記ＡＲＥＧに結合する抗体分子、又は前記ＡＲＥＧの発現を阻害する核酸分子である、使用。
【請求項２】
前記ＨＢ−ＥＧＦの前記阻害剤が第１のｓｉＲＮＡであり、及び／又は前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が第２のｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、抗ＡＲＥＧ抗体分子である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
薬剤を、化学療法剤と同時に、個別に、又は逐次用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
化学療法剤が、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
化学療法剤がＣＰＴ−１１である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
化学療法剤が５−ＦＵである、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
前記新生物性疾患が、結腸直腸癌、乳癌、及び肺癌からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
新生物性疾患が、ｐ５３変異を含む癌である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤と、（ｉｉ）ＡＲＥＧの阻害剤とを含む医薬組成物であって、
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、前記ＡＲＥＧに結合する抗体分子、又は前記ＡＲＥＧの発現を阻害する核酸分子であり、
前記ＨＢ−ＥＧＦの前記阻害剤が、前記ＨＢ−ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子である、医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が抗ＡＲＥＧ抗体分子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＨＢ−ＥＧＦの前記阻害剤が第１のｓｉＲＮＡであり、及び／又は前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が第２のｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
新生物性疾患の治療において同時に、個別に、又は逐次用いる組合せにおいて、
（ｉ）ＨＢ−ＥＧＦの阻害剤であって、前記ＨＢ−ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子である阻害剤と、
（ｉｉ）ＡＲＥＧの阻害剤であって、前記ＡＲＥＧに結合する抗体分子、又は前記ＡＲＥＧの発現を阻害する核酸分子である阻害剤と
を含むキット。
【請求項１６】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が抗ＡＲＥＧ抗体分子である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域と、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域とを含む抗体分子である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記ＨＢ−ＥＧＦの前記阻害剤が第１のｓｉＲＮＡであり、及び／又は前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が第２のｓｉＲＮＡである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の個別、逐次、又は同時の投与のための指示書
をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の少なくとも１つのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体分子である、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
前記抗体分子が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の３つすべてのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の３つすべてのＣＤＲを含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記抗体分子が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体分子が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２１又は２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の少なくとも１つのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体分子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体分子が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の３つすべてのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の３つすべてのＣＤＲを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体分子が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体分子が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＡＲＥＧの前記阻害剤が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の少なくとも１つのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体分子である、請求項１５に記載のキット。
【請求項２９】
前記抗体分子が、配列番号２７として示されるアミノ酸配列を有するＶＨ領域の３つすべてのＣＤＲ、及び／又は配列番号２８として示されるアミノ酸配列を有するＶＬ領域の３つすべてのＣＤＲを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記抗体分子が、配列番号２７のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記抗体分子が、配列番号２８のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項２９又は３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、癌治療に関する。具体的には、本発明は、抗癌剤に対する耐性への感受性を決定する方法、こうした耐性を克服する方法、及び癌治療用の併用療法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
癌は、欧米諸国において、死亡率の主要原因である。癌を治療すべく、極めて多くの化学療法剤が、過去５０年間に開発された。化学療法剤の大半は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び抗腫瘍剤に分類することができる。これらの薬剤すべてが細胞分裂又はＤＮＡの合成に影響し、何らかの形で機能する。
【０００３】
特定の化学療法剤の有効性は、癌の間で、患者の間で、個々の患者における時間経過により異なる。化学療法剤に曝露された癌細胞は、こうした作用薬に対する耐性を生じ、他の複数の抗新生物剤に対しても同様に交差耐性を生じることも多い。さらに、多くの化学療法剤の狭い治療指数が、それらの使用をさらに制約する。したがって、第１選択療法（ｆｉｒｓｔ  ｌｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）又は第２選択療法（ｓｅｃｏｎｄ  ｌｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）が、十分に有効でないか、十分に有効ではなくなった場合は、癌患者の治療を変更することが必要となる場合が多い。多くの場合、特定の治療の組合せが、特に有効であることが分かっている。
【０００４】
例えば、結腸直腸癌は、現在のところ、欧州で最も診断件数の多い癌の１つであり、最も低い５年生存率を有する癌のひとつである。４０年超にわたり、チミジル酸シンターゼ阻害剤、例えば、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）が、この癌の最上の治療法であった。チミジル酸シンターゼ阻害剤は、ＲＮＡ及びＤＮＡへのＦＵＴＰの誤取り込みによってＤＮＡ損傷を引き起こすことにより作用する（Ｌｏｎｇｌｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、第３巻、３３０〜３３８頁、２００３年；Ｂａｃｋｕｓら、Ｏｎｃｏｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年、第１２巻、第５号、２３１〜９頁）。より近年では、新規の化学療法剤、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン：ＣＰＴ−１１）及びＤＮＡ損傷剤（例えば、オキサリプラチン：アルキル化剤）が、臨床に導入されている。
【０００５】
これらの５−Ｆｕを含む化学療法剤は、単独で用いることができるが、臨床レジメンが組合せを組み込むことが通例である。実際、組合せ化学療法は、異なる経路を介して腫瘍に作用することにより、患者における応答速度を改善することによる有望な成果を示している。にもかかわらず、後天的又は先天的な薬剤耐性のために、多くの患者は、いまだこれらのレジメンにより治療することができない。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの研究は、ＴＳ発現の増大が、５−Ｆｕに対する耐性の上昇と相関することを示している（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５２巻、４３０６〜４３１２頁、１９９２年）。５−Ｆｕ化学感受性に対する他の上流の決定因子は、５−Ｆｕ分解酵素であるジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、及び、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼなどの５−Ｆｕ同化酵素を含む（Ｌｏｎｇｌｅｙら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、第３巻、３３０〜３３８頁、２００３年）。
【０００６】
代謝拮抗剤、例えば、トムデックス（ＴＤＸ）、及び、白金含有化合物、例えば、オキサリプラチンの使用も同様に、耐性により制約される。
【０００７】
さらに、化学療法の選択は、癌の種類、及び、例えば、癌が、ｐ５３変異と関連するかどうかにより、さらに複雑化する。例えば、国際公開第２００５／０５３７３９号パンフレットに記載の通り、白金に基づく化学療法と抗Ｆａｓ抗体との組合せが、野生型ｐ５３を伴う腫瘍において相乗的な細胞毒性効果を有することが示されているのに対し、こうした相乗効果は、ｐ５３変異細胞においては見られなかった。
【０００８】
５−Ｆｕ、ＣＰＴ−１１、及びオキサリプラチンは、最前線療法のままであるが、非応答性腫瘍又は化学療法耐性癌の発症が、化学療法の奏効に対する主要な障害のままである。癌の早期治療の重要性により、単独又は組合せの特定の療法が、個々の患者における特定の腫瘍に対して有効であるかどうかについての予測を可能とするツールには、明らかなニーズが存在する。さらに、医師が使用できる治療レパートリーを増加させる新規の治療レジメンに対するニーズが依然として存在する。
【０００９】
［発明の概要］
本発明者らは、異なるクラスの化学療法による治療に応答して上方調節されるタンパク質を探索し、驚くべきことに、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのペプチド増殖因子をコードする各種遺伝子が、異なるクラスの化学療法の異なる生理的に関連のある用量によるｉｎ  ｖｉｖｏでのチャレンジ後に、多数の異なる種類の癌由来の多数の異なる癌の腫瘍細胞株モデルにおいて過剰発現することを示した。
【００１０】
さらに、本発明者らによる探索は、驚くべきことに、異なるＥＧＦ阻害剤の組合せが、単独のＥＧＦ阻害剤を調べた場合の低下と比較して、驚くほど劇的な腫瘍細胞の成長及び増殖の低下をもたらすことを示した。
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様では、対象における新生物性疾患を治療する方法であって、前記対象に対する、有効量の（ｉ）第１のＥＧＦの阻害剤と、（ｉｉ）第２のＥＧＦの阻害剤との、同時、逐次、又は個別の投与を含み、前記第１及び第２のＥＧＦが異なるＥＧＦである方法が提供される。
【００１２】
本発明の第２の態様において、本発明は、（ｉ）第１のＥＧＦの阻害剤と、（ｉｉ）第２のＥＧＦの阻害剤とを含む医薬組成物であって、前記第１及び第２のＥＧＦが異なるＥＧＦである医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の第３の態様は、新生物性疾患の治療において同時に、個別に、又は逐次使用するために組合せる、第１及び第２のＥＧＦが異なるＥＧＦである、
（ｉ）第１のＥＧＦの阻害剤と、
（ｉｉ）第２のＥＧＦの阻害剤と
を含むキットを提供する。
【００１４】
本発明の第１、第２、又は第３の態様では、任意のＥＧＦを用いてよい。したがって、第１及び第２のＥＧＦは、各々独立に、ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、ＮＲＧ１、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、及びＮＲＧ４からなる群から選択される。
【００１５】
一実施形態において、第１のＥＧＦはＨＢ−ＥＧＦであり、前記第２のＥＧＦはＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３からなる群から選択される。
【００１６】
特定の実施形態において、第１のＥＧＦはＨＢ−ＥＧＦであり、前記第２のＥＧＦはＡＲＥＧである。
【００１７】
任意のＥＧＦ阻害剤を用いてよい。本発明で用い得るＥＧＦ阻害剤は、ＥＧＦをコードする遺伝子の発現を低下させる、又はＥＧＦタンパク質にアンタゴナイズする任意の分子を含む。こうした分子は、抗体、抗体フラグメント、免疫抱合体、小分子阻害剤、ペプチド阻害剤、特異的結合メンバー、非ペプチド小有機分子、ＥＧＦの発現を阻害するｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、又はオリゴヌクレオチドデコイなどの核酸分子を含むがこれらに限定されない。
【００１８】
一実施形態において、前記第１及び第２のＥＧＦの阻害剤は異なる。特定の実施形態において、第１のＥＧＦ阻害剤は、第２のＥＧＦ阻害剤ではなく、その逆もあてはまる。
【００１９】
本発明の一実施形態において、各ＥＧＦ阻害剤は、そのＥＧＦの特異的な阻害剤である、即ち、別のＥＧＦの阻害剤ではない。
【００２０】
一実施形態において、前記第１のＥＧＦの前記阻害剤は、前記第１のＥＧＦに結合する抗体、又はＥＧＦの発現を阻害する核酸分子である。
【００２１】
上記の通り、一実施形態において、前記第１のＥＧＦはＨＢ−ＥＧＦである。
【００２２】
こうした一実施形態において、第１のＥＧＦの阻害剤は、それぞれ、配列番号１及び２として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号１：
ＧＡＡＡＡＵＣＧＣＵＵＡＵＡＵＡＣＣＵＵＵ
配列番号２：
ＡＧＧＵＡＵＡＵＡＡＧＣＧＡＵＵＵＵＣＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００２３】
別のこうした実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、それぞれ、配列番号３及び４として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号３：
ＵＧＡＡＧＵＵＧＧＧＣＡＵＧＡＣＵＡＡＵＵ
配列番号４：
ＵＵＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＡＡＣＵＵＣＡＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００２４】
別のこうした実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、それぞれ、配列番号５及び６として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号５：
ＧＧＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＵＵ
配列番号６：
ＵＵＵＣＣＧＡＡＧＡＣＡＵＧＧＧＵＣＣＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００２５】
別のこうした実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、それぞれ、配列番号７及び８として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号７：
ＧＧＡＧＡＡＵＧＣＡＡＡＵＡＵＧＵＡＵＵ
配列番号８：
ＵＣＡＣＡＵＡＵＵＵＧＣＡＵＵＣＵＣＣＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００２６】
一実施形態において、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、上記に示した２つ、３つ、又は４つのｓｉＲＮＡ分子（各分子がセンス分子と相補的なアンチセンス分子とを含む）、即ち、配列番号１／配列番号２、配列番号３／配列番号４、配列番号５／配列番号６、及び配列番号７／配列番号８からなる群から選択される、２つ、３つ、又は４つのセンス／アンチセンス対のプールを含む。
【００２７】
一実施形態において、前記第２のＥＧＦの前記阻害剤は、前記第２のＥＧＦに結合する抗体、又はＥＧＦの発現を阻害する核酸分子である。
【００２８】
一実施形態において、前記第２のＥＧＦはＡＲＥＧである。こうした実施形態において、ＡＲＥＧ阻害剤として用い得る抗体は、抗ＡＲＥＧ抗体６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６である。６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列は、本発明者らにより決定されており、以下に記載される。
【００２９】
本発明の一実施形態において、本発明でＡＲＥＧ阻害剤として用い得るｓｉＲＮＡ分子は、それぞれ、配列番号９及び１０として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号９：
ＵＧＡＵＡＡＣＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ
配列番号１０：
ＵＡＵＵＵＧＵＧＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＡＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００３０】
別のこうした実施形態において、ＡＲＥＧ阻害剤は、それぞれ、配列番号１１及び１２として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号１１：
ＵＧＡＧＵＧＡＡＡＵＧＣＣＵＵＣＵＡＧＵＵ
配列番号１２：
ＣＵＡＧＡＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＣＵＣＡＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００３１】
別のこうした実施形態において、ＡＲＥＧ阻害剤は、それぞれ、配列番号１３及び１４として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号１３：
ＧＵＵＡＵＵＡＣＡＧＵＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵ
配列番号１４：
ＵＡＡＧＣＵＧＧＡＣＵＧＵＡＡＵＡＡＣＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００３２】
別のこうした実施形態において、ＡＲＥＧ阻害剤は、それぞれ、配列番号１５及び１６として示すセンス配列及びアンチセンス配列：
配列番号１５：
ＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵＵＣＧＡＣＡＡＧＡＵＵ
配列番号１６：
ＵＣＵＵＧＵＣＧＡＡＧＵＵＵＣＵＵＵＣＵＵ
を有するｓｉＲＮＡである。
【００３３】
一実施形態において、ＡＲＥＧ阻害剤は、上記に示した２つ、３つ、又は４つのｓｉＲＮＡ分子（各分子がセンス分子と相補的なアンチセンス分子とを含む）、即ち、配列番号９／配列番号１０、配列番号１１／配列番号１２、配列番号１３／配列番号１４、及び配列番号１５／配列番号１６からなる群から選択される、２つ、３つ、又は４つのセンス／アンチセンス対のプールを含む。
【００３４】
実施例に記載の通り、本発明者らは、本発明で用い得る、ＡＲＥＧ特異性を有する抗体を開発した。該抗体は、特に有効であることが分かった。
【００３５】
したがって、本発明の第４の態様では、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６抗体又はそのフラグメントである、ＡＲＥＧに対する結合特異性を有する抗体分子が提供される。
【００３６】
６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列は、本発明者により決定されており、以下の通りである。
６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＨ配列（配列番号２７）：
ＭＥＣＮＷＩＬＰＦＩＬＳＶＴＳＧＶＹＳＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＷＭＱＷＩＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＩＲＹＴＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＡＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＴＴＰＳＳＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦ
６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＬ配列（配列番号２８）：
ＭＭＳＰＡＱＦＬＦＬＬＶＬＷＩＲＥＴＳＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＳＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫ
【００３７】
したがって、本発明の一実施形態において、本発明のＡＲＥＧ及び本発明で用いるＡＲＥＧに対する結合特異性を有する抗体分子は、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＨ領域の少なくとも１つのＣＤＲ及び／又は６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＬ領域の少なくとも１つのＣＤＲを含む抗体分子である。一実施形態において、抗体分子は、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＨ領域の３つすべてのＣＤＲ及び／又は６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＬ領域の３つすべてのＣＤＲを含む。
【００３８】
一実施形態において、特異的結合メンバーは、上記に示したＶＨドメイン配列を有する抗体可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬであり得る）、若しくは、上記に示した抗体ＶＬドメイン配列を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ又はＶＨであり得る）、又はその両方を含む。
【００３９】
抗体分子は、全抗体であり得る。代替的な一実施形態において、抗体分子は、ｓｃＦｖなどの抗体フラグメントであり得る。
【００４０】
本発明の抗体分子の提供は、これもまた腫瘍細胞増殖を阻害し、場合によって、同様又はそれを上回る結合特異性を有する関連抗体の開発を可能とする。
【００４１】
したがって、少なくとも１つのＣＤＲにおいて、５カ所以下、例えば、４カ所、３カ所、２カ所、又は１カ所のアミノ酸置換がなされ、特異的結合メンバーが、腫瘍細胞増殖の阻害能を保持する、上記に示した６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＨ配列を有する抗体可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）を含む抗体分子が、本発明の本態様の範囲内にさらに包含される。また、少なくとも１つのＣＤＲにおいて、５カ所以下、例えば、４カ所、３カ所、２カ所、又は１カ所のアミノ酸置換がなされ、特異的結合メンバーが、腫瘍細胞増殖の阻害能を保持する、上記に示した６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６  ＶＬ配列を有する抗体可変ドメイン（ＶＬ又はＶＨ）を含む抗体分子も、本発明により包含される。
【００４２】
本発明の第１〜第３の態様のいずれか１つの方法は、前記対象に対する、有効量の（ｉｉｉ）化学療法剤の、同時、逐次、又は個別の投与をさらに含み得る。
【００４３】
一実施形態において、化学療法剤は、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、及び植物アルカロイドからなる群から選択される。
【００４４】
本発明者らは、ＥＧＦ阻害剤のトポイソメラーゼ阻害剤との特定の組合せが、単独での各阻害剤の効果から予測され得るよりも高度に、腫瘍細胞増殖を減弱することをさらに示した。
【００４５】
したがって、本発明の第６の態様では、対象における新生物性疾患を治療する方法であって、前記対象に対する、有効量の（ｉ）ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子、又は抗ＥＧＦ抗体であり、前記ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦ又はＡＲＥＧであるＥＧＦ阻害剤と、（ｉｉ）トポイソメラーゼ阻害剤との、同時、逐次、又は個別の投与を含む方法が提供される。
【００４６】
本発明の第７の態様では、癌治療用の医薬組成物であって、有効量の（ｉ）ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子、又は抗ＥＧＦ抗体であり、前記ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦ又はＡＲＥＧであるＥＧＦ阻害剤と、（ｉｉ）トポイソメラーゼ阻害剤とを含む組成物が提供される。
【００４７】
本発明の第８の態様は、新生物性疾患の治療において同時に、個別に、又は逐次使用するために組合せる、有効量の（ｉ）ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子、又は抗ＥＧＦ抗体であり、前記ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦ又はＡＲＥＧであるＥＧＦ阻害剤と、（ｉｉ）トポイソメラーゼ阻害剤とを含むを提供する。
【００４８】
本発明の第６、第７、又は第８の態様のいずれか１つの一実施形態において、ＥＧＦはＨＢ−ＥＧＦである。別の実施形態において、ＥＧＦはＡＲＥＧである。
【００４９】
本発明のこれらの態様では、任意のトポイソメラーゼ阻害剤を用いてよい。特定の実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、ＣＰＴ−１１である。別の実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、ＣＰＴ−１１の活性代謝物、例えば、ＳＮ−３８である。ＥＧＦがＡＲＥＧである一実施形態において、ＥＧＦ阻害剤は、抗ＡＲＥＧ抗体６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６である。
【００５０】
本発明の方法を用いて、任意の新生物性疾患を治療し得る。特定の実施形態において、新生物性疾患は癌である。例えば、本発明の組成物及び方法を用いて治療し得る新生物性疾患は、結腸直腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、リンパ種、白血病、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、腎臓癌、甲状腺癌、黒色腫、癌腫、頭部及び頸部癌、並びに皮膚癌を含むがこれらに限定されない。
【００５１】
具体的な一実施形態において、新生物性疾患は、結腸直腸癌である。
【００５２】
別の一実施形態において、新生物性疾患は、乳癌である。
【００５３】
さらに別の一実施形態において、新生物性疾患は、肺癌である。
【００５４】
実施例に記載の通り、本発明者らは、ｐ５３野生型腫瘍と同様に、ｐ５３変異腫瘍細胞においても、特定のＥＧＦが、化学療法によって上方調節されることを示した。これは、かつて、化学療法に対する耐性が、ｐ５３状態に大きく依存すると示されていたことを踏まえれば、特に驚くべきことである。
【００５５】
特定の実施形態において、新生物性疾患は、ｐ５３変異を含む癌である。
【００５６】
さらに、細胞又は組織においてＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子発現を誘導及び／又は増強する方法であって、前記細胞又は組織に対する、トポイソメラーゼ阻害剤の投与を含み、前記ＥＧＦがＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３からなる群から選択される方法が、本発明の第９の態様により提供される。
【００５７】
ＥＧＦ発現が、様々なトポイソメラーゼ阻害剤による治療に応じて上方調節されることの本発明者らによる実証は、これらの化学療法による治療の療法効果は、患者によっては、ＥＧＦの上方調節により損なわれ得ることを示唆する。
【００５８】
したがって、本発明は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、ＣＰＴ−１１又はその類似体による治療が、特定の患者において有効であるかどうかを決定するアッセイにおいて使用し得る。
【００５９】
したがって、本発明の第１０の態様では、トポイソメラーゼ阻害剤の存在に対する対象由来の腫瘍細胞の応答を評価して、トポイソメラーゼ阻害剤による治療に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の応答を予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
（ａ）対象由来の腫瘍細胞試料を提供すること、
（ｂ）前記腫瘍細胞試料の一部を前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露すること、
（ｃ）前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露された前記腫瘍細胞試料の一部における、ＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３からなる群から選択される、１つ又は複数のＥＧＦをコードする１つ又は複数の遺伝子の発現を、前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露されていない前記試料の対照の一部における前記（１つ又は複数の）遺伝子の発現と比較すること、
を含み、前記トポイソメラーゼ阻害剤に曝露された試料の一部における発現の増強が、前記トポイソメラーゼ阻害剤に対する感受性の低下を示す方法が提供される。
【００６０】
本発明はさらに、腫瘍に苦しむ対象の予後診断及び診断用のツールとなる。予後診断の目的では、化学療法による治療の前後における遺伝子の発現レベルを決定すれば、対象が、併用療法の手法に応答するかどうかが確認されるであろう。診断の目的では、化学療法に対する腫瘍の遺伝子応答の発現プロファイルによれば、どの併用療法が、その腫瘍に対して最も有効であるかが確認されるであろう。
【００６１】
したがって、本発明の第１１の態様は、トポイソメラーゼ阻害剤とＥＧＦ阻害剤とを含む併用療法に対する患者の応答を評価する予後診断の方法であって、
（ａ）前記化学療法による治療前に対象から得た、腫瘍細胞を含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料中において、ＥＧＦをコードする遺伝子の発現を決定すること、
（ｂ）前記化学療法による治療後に対象から得た、腫瘍細胞を含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料中において、ＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３からなる群から選択される前記ＥＧＦをコードする前記遺伝子の発現を決定すること、
（ｃ）（ｂ）における発現を（ａ）における発現と比較すること、
を含み、（ａ）と比較した（ｂ）における発現の増強により、患者が、トポイソメラーゼ阻害剤と前記ＥＧＦ阻害剤とを含む併用療法から利益を受け得ることが示される方法を提供する。
【００６２】
本発明の第１０又は第１１の態様では、１つ又は複数のＥＧＦをコードする（１つ又は複数の）遺伝子発現が決定され得る。例えば、ＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３の少なくとも２つ、例えば、３つ、４つ、又は５つをコードする遺伝子の発現が決定され得る。
【００６３】
本発明の第１０又は第１１の態様の別の実施形態では、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、及びＮＲＧ３の少なくとも２つ、例えば、３つ、又は４つをコードする遺伝子の発現が決定され得る。
【００６４】
ＥＧＦをコードする遺伝子の発現を決定することを含む本発明の態様では、対象において前記ＥＧＦをコードする任意の遺伝子の発現が決定され得る。
【００６５】
例えば、ＥＧＦがＡＲＥＧである実施形態において、遺伝子は、ＮＭ＿００１６５７であり得る。ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦである実施形態において、遺伝子は、ＮＭ＿００１９４５であり得る。
【００６６】
本発明の実施形態において、前記化学療法剤に曝露されていない前記対照試料の一部における１つ又は複数の遺伝子の発現の少なくとも１．５倍、好ましくは、少なくとも２倍、より好ましくは、少なくとも５倍である場合に、前記化学療法剤に曝露された試料中の前記遺伝子の発現は増強されたと考えられる。
【００６７】
文脈による別段の要請がない限り、化学療法剤及びＥＧＦ調節物質を参照する本出願において、化学療法剤とＥＧＦ調節物質とは異なる作用薬である。一般に、化学療法剤は、ＥＧＦ調節物質とは異なる作用モードを有する。一実施形態において、化学療法剤は、ＥＧＦを阻害しない。
【００６８】
本発明のさらなる態様では、新生物性疾患治療用の第２のＥＧＦの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる薬剤の調製における、第１のＥＧＦの阻害剤の使用であって、前記第１と第２のＥＧＦが異なるＥＧＦである使用が提供される。
【００６９】
本発明の別の態様は、新生物性疾患治療用の第１のＥＧＦの阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる薬剤の調製における、第２のＥＧＦの阻害剤の使用であって、前記第１と第２のＥＧＦが異なるＥＧＦである使用を提供する。
【００７０】
提供される別の態様は、新生物性疾患治療におけるトポイソメラーゼ阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる薬剤の調製におけるＥＧＦ阻害剤の使用であって、前記阻害剤がＥＧＦの発現を阻害する核酸分子、又は抗ＥＧＦ抗体であり、前記ＥＧＦがＨＢ−ＥＧＦ又はＡＲＥＧである使用である。
【００７１】
新生物性疾患治療におけるＥＧＦ阻害剤と同時に、個別に、又は逐次用いる薬剤の調製におけるトポイソメラーゼ阻害剤の使用であって、前記ＥＧＦ阻害剤がＥＧＦの発現を阻害する核酸分子、又は抗ＥＧＦ抗体であり、前記ＥＧＦが、ＨＢ−ＥＧＦ又はＡＲＥＧである使用が、さらに提供される。
【００７２】
本発明の各態様の好ましく代替的な特徴は、文脈による別段の要請がない限り、必要な変更を加えて、他の各態様にも関する。
【００７３】
［詳細な説明］
上記及び実施例における記載の通り、本発明は、各種のＥＧＦ遺伝子及びタンパク質の発現が、特定の化学療法の存在下にある腫瘍細胞中で上方調節され、２つ以上のＥＧＦ阻害剤の特定の組合せと同様に、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤の特定の組合せが、腫瘍細胞増殖の減弱において相加的効果を示すことの実証に基づいている。
【００７４】
［アッセイ］
上記の通り、一実施形態において、本発明は、特定の化学療法剤を用いる治療に対する適性を判定するために、腫瘍細胞を含む試料を、ＥＧＦ遺伝子の発現についてスクリーニングする方法に関する。
【００７５】
本発明の方法は、ＥＧＦをコードする任意の遺伝子の発現の決定を伴い得る。ペプチド増殖因子のＥＧＦファミリーは、ＥｒｒＢ受容体（ＥｒｒＢ１又はＥＧＦ受容体、ＥｒｒＢ２又はＨｅｒ２、ＥｒｒＢ３及びＥｒｒＢ４）に選択的に結合する能力を有する１０のメンバーからなる。
【００７６】
本発明の一実施形態において、ＥＧＦは、ＥｒｂＢ−１、例えば、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）、ＴＧＦ、エピレグリン（ＥＲＥＧ）、又はＢＴＣのリガンドである。
【００７７】
別の実施形態において、ＥＧＦは、ＥｒｂＢ−４、例えば、ＮＲＧ３のリガンドである。
【００７８】
これらの遺伝子各々については、以下のアクセッション細目が提供される。
【表１】
0005919593.tif 000002
【００７９】
対象ＥＧＦをコードする任意の遺伝子発現を決定し得る。
【００８０】
例えば、ＥＧＦがＡＲＥＧである場合、Ａｒｅｇ遺伝子は、ＮＭ＿００１６５７であり得る。
【００８１】
本発明の特定の実施形態において、遺伝子は、アクセッション番号ＮＭ＿００１６５７を有するＡｒｅｇである。本発明の別の特定の実施形態において、遺伝子は、アクセッション番号ＮＭ＿００１９４５を有するＨＢ−ＥＧＦである。
【００８２】
各遺伝子の発現は、当技術分野で知られる任意の技法を用いて測定してよい。ｍＲＮＡ又はタンパク質は、遺伝子発現の上方又は下方調節を決定する手段として測定することができる。定量的な技法が好ましい。しかし、半定量的又は定性的な技法もまた、用いることができる。遺伝子産物を測定するのに適する技法は、ＳＡＧＥ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法、免疫細胞化学解析、及びＥＬＩＳＡ法を含むがこれらに限定されない。
【００８３】
本発明の方法では、当技術分野で知られる任意の技法を用いてＲＮＡを検出することができる。試料に由来するＲＮＡ量は極めて少量であり得るので、増幅ステップを用いることが好ましい。適切な技法は、ＲＴ−ＰＣＲ法、コピーｍＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の核酸プローブアレイへのハイブリダイゼーション、及びノーザンブロット法を含み得る。
【００８４】
例えば、ｍＲＮＡ検出を用いる場合、該方法は、標準的な方法により、単離されたｍＲＮＡをｃＤＮＡに転換し；転換されたｃＤＮＡを、核酸プライマーの適切な混合液と共に、容器内で増幅反応試薬（ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応試薬など）により処置し；容器の内容液を反応させて増幅産物を産生し；増幅産物を解析して試料中でＡｒｅｇをコードする１つ又は複数の遺伝子の遺伝子発現産物の存在を検出することにより実施し得る。解析は、ノーザンブロット解析を用いて増幅産物中における遺伝子産物の存在を検出することで達成し得る。ノーザンブロット解析は、当技術分野において知られている。解析ステップは、増幅産物中におけるこうした遺伝子産物の存在を定量的に検出し、検出された産物量を、同様のプライマーを用いて導出された、正常及び悪性組織中における既知の存在又は不在に対する予測値のパネルと比較することによりさらに達成できる。
【００８５】
本発明の方法で用いるプライマーは、当然ながら、その発現が決定される（１つ又は複数の）遺伝子に依存する。本発明の一実施形態では、以下のプライマーセット：
順方向：ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ（配列番号１７）
逆方向：ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＴＧＣＣＴＣＣＣ（配列番号１８）
及びエキソンにまたがる、
順方向：ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴ（配列番号１９）
逆方向：ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧ（配列番号２０）
順方向５’−ＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号２１）
逆方向５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣ−３’（配列番号２２）
の１つ又は複数を用いてよい。
【００８６】
例えば、本発明の方法の実施において遺伝子発現を決定する際に、当技術分野で知られる従来の分子生物学、微生物学及び組換えＤＮＡの技法を用いることができる。こうした技法の詳細は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社，２００５年、及び、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社，２００１年において説明されている。
【００８７】
本発明のアッセイを用いて、例えば、異なる時点における生検試料を用いて、疾患の進行をモニターし得る。こうした実施形態では、ＥＧＦの発現を、前記化学療法剤に曝露されていない対照試料と比較する代わりに、ＥＧＦの発現を、より早期の時点、例えば、数日間、数週間、又は数カ月間早期における同じ組織から得られる試料と比較する。
【００８８】
本発明の方法を用いて、化学療法剤、例えば、ＣＰＴ−１１又はその類似体による任意の適切な癌の治療に対する適性を判定し得る。例えば、本発明の方法を用いて、結腸直腸癌などの消化器癌、頭部及び頸部癌を含むがこれらに限定されない癌の治療に対する感受性又は耐性を判定し得る。
【００８９】
本発明の特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、結腸直腸癌の治療に対する感受性又は耐性を判定し得る。
【００９０】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、肺癌の治療に対する感受性又は耐性を判定し得る。
【００９１】
本発明の別の特定の実施形態では、本発明の方法を用いて、乳癌の治療に対する感受性又は耐性を判定し得る。
【００９２】
腫瘍又は癌の性質は、本発明の方法で用いるべき試料の性質を決定する。試料は、例えば、腫瘍組織生検、骨髄生検、又は例えば血液中を循環する腫瘍細胞由来の試料でよい。或いは、例えば、腫瘍が消化器腫瘍である場合、腫瘍細胞は糞便試料から単離してよい。腫瘍細胞の他の源泉は、血漿、血清、脳脊髄液、尿、間質液、腹水などを含み得る。
【００９３】
例えば、固形腫瘍の試料は、抗生物質を伴う完全組織培養培地において採取される。細胞は、腫瘍標本から手作業ではがしてもよく、必要な場合は、コラゲナーゼ／ＤＮＡアーゼとのインキュベーションにより酵素的に脱凝集させ、例えば、ヒト又は動物血清を含有する適切な培地中に懸濁させてもよい。
【００９４】
他の実施形態では、生検試料を単離し凍結するか、又はホルマリンなどの固定剤中で固定してよい。次いで、後の段階で遺伝子発現レベルについて試料を調べることができる。
【００９５】
治療の判定においては、癌のｐ５３状態を判定することが望ましい。例えば、ｐ５３状態は、特定のＥＧＦタンパク質との組合せで用いるべき化学療法の種類を決定し得るため、有用であり得る。ｐ３状態は、従来の方法を用いて決定することができる。例えば、遺伝子シーケンシング又は他のＤＮＡ解析法も用い得るが、免疫組織化学法を用いて、ホットスポット変異を同定することができる。この解析は、単離された腫瘍組織に対して適切に実施することができる。
【００９６】
［化学療法剤］
本発明のある実施形態では、化学療法剤を用いてよい。例えば、用い得る作用薬は、チミジル酸シンターゼ阻害剤を含む代謝拮抗剤、核酸類似体、白金細胞毒性剤、トポイソメラーゼ阻害剤、又は抗微小管剤を含む。本発明で用い得るチミジル酸シンターゼ阻害剤の例は、５−ＦＵ、ＭＴＡ、及びＴＤＸを含む。用い得る代謝拮抗剤の例は、トムデックス（ＴＤＸ）である。用い得る白金細胞毒性剤の例は、シスプラチン及びオキサリプラチンを含む。
【００９７】
上記に挙げた特定の作用薬に加えて、又はその代りに本発明で用い得る化学療法剤は、アルキル化剤；スルホン酸アルキル；アジリジン；エチレンイミン；メチルアメラミン；ナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス；代謝拮抗剤；葉酸類似体；プリン類似体；ピリミジン類似体；アンドロゲン；抗副腎物質；葉酸補填剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフロミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；イオニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロンを含み得る。
【００９８】
本発明の特定の実施形態において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。本発明では、任意の適切なトポイソメラーゼ阻害剤を用いてよい。特定の実施形態において、トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、例えば、カンプトテシンである。本発明で用い得る適切なトポイソメラーゼＩ阻害剤は、イレノテカン（ＣＰＴ−１１）又はその活性代謝物であるＳＮ−３８である。ＣＰＴ−１１は、開裂又は開裂複合体と称する、可逆的な共有結合反応中間体を安定化させることにより、細胞周期のＳ期において特異的に作用し、Ｇ２〜Ｍ期における細胞周期の停止も誘導し得る。
【００９９】
本発明の特定の実施形態において、化学療法剤は、フルオロピリミジン、例えば、５−ＦＵである。
【０１００】
特定の化学療法剤を参照する場合、特定の作用薬の抗腫瘍活性を保持する、生物学的に活性な誘導体及びその実質的な同等物を含む類似体を用いてよいことを理解されたい。
【０１０１】
［ＥＧＦ阻害剤］
上述の通り、本発明者らは、２つ以上のＥＧＦ阻害剤の組合せを用いて、腫瘍細胞増殖に対する減弱効果の劇的な増強を得ることができることを見出した。本発明の特定の実施形態では、ＥＧＦ遺伝子の発現を低下させるか、又はＥＧＦタンパク質にアンタゴナイズする任意の分子を、ＥＧＦ阻害剤として用いてよい。特定の実施形態において、ＥＧＦは、ＨＢ−ＥＧＦ、ＡＲＥＧ、ＴＧＦ、ＥＲＥＧ、ＢＴＣ、又はＮＲＧ３である。
【０１０２】
一実施形態では、ＨＢ−ＥＧＦ及びＡＲＥＧの阻害剤が用いられる。
【０１０３】
ＥＧＦ阻害剤は、抗体、抗体フラグメント、免疫抱合体、小分子阻害剤、ペプチド阻害剤、特異的結合メンバー、非ペプチド小有機分子、アンチセンス分子、アプタマー、又はオリゴヌクレオチドデコイを含むがこれらに限定されない。
【０１０４】
任意のＥｒｂ１又はＥＧＦ受容体阻害剤は、ＡＲＥＧ活性を間接的に阻害する。適切な阻害剤は、ＰＤ１６９５４０（全ＥｒｂＢ阻害剤）及びＩＲＥＳＳＡ（ＥｒｂＢ１特異的阻害剤）を含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
他の適切な阻害剤は、ＴＧＦ−アルファを間接的に阻害するチルフォスチン（ＣＴｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１４７８（ＥＧＦ−Ｒキナーゼの選択的且つ強力な阻害剤）を含み得る；ＺＭ２５２８６８は、卵巣癌細胞におけるＴＧＦ−アルファ作用を阻害する、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体特異的なチロシンキナーゼ阻害剤である（Ｓｉｍｐｓｏｎら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，第７９巻（第７〜８号），１０９８〜１０３頁，１９９９年）。
【０１０６】
ＨＢ−ＥＧＦの適切な阻害剤は、ＣＲＭ１９７を含み得る。
【０１０７】
一実施形態では、ＥＧＦ受容体の間接的な阻害剤を用いてよい。
【０１０８】
別の実施形態では、ＥＧＦの直接的な阻害剤が用いられる。特定の実施形態において、直接的な阻害剤は、ＥＧＦに結合する抗体分子、又は前記ＥＧＦの発現を阻害する核酸分子である。
【０１０９】
一実施形態において、阻害剤は、抗ＥＧＦ抗体である。
【０１１０】
本発明者らは、本発明で用いる新規の抗体をいくつか開発した。特定の実施形態において、本発明の抗体又は本発明で用いる抗体は、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６抗体又はそのフラグメントである、ＡＲＥＧに対する結合特異性を有する抗体分子である。
【０１１１】
本明細書において、本発明の抗体分子又は本発明で用いる抗体分子は、重及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同である一方で、（１つ又は複数の）鎖の残余が、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか又は相同である、抗体フラグメント及び「キメラ」抗体の他、それが所望の生物活性を示す限りにおける、こうした抗体のフラグメントを含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８１巻，６８５１〜６８５５頁，１９８４年）。本明細書における対象キメラ抗体は、非ヒト霊長動物（例えば、旧世界ザル、類人猿など）及びヒトの定常領域配列に由来する、可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【０１１２】
本発明で用いる抗体分子は、二重特異性抗体又は二重特異性フラグメントであり得る。例えば、抗体分子又はフラグメントは、ＨＢ−ＥＧＦ及びＡＲＥＧに対する特異性を有し得る。例えば、一実施形態において、本発明で用いる二重特異性抗体分子は、抗６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６に由来する第１の重鎖及び第１の軽鎖、並びに、ＨＢ−ＥＧＦに対する結合特異性を有する、追加の抗体重鎖及び軽鎖を含み得る。二重特異性抗体及びフラグメントの産生には、多数の方法が当技術分野で知られている。例えば、こうした方法は、ハイブリドーマの融合、又はＦａｂ’フラグメントの連結（例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第７９巻，３１５〜３２１頁，１９９０年、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第１４８巻，１５４７〜１５５３頁，１９９２年を参照されたい）を含む。別の実施形態において、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」として形成し得る。
【０１１３】
本発明で用いる抗体及び抗体フラグメントなどの抗体分子は、天然又は合成の任意の適切な方法で産生することができる。こうした方法は、例えば、従来のハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５年，Ｎａｔｕｒｅ，第２５６巻，４９５〜４９９頁）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）、又は抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１年，Ｎａｔｕｒｅ，第３５２巻，６２４〜６２８頁、及びＭａｒｋｓら，１９９２年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻，７７９〜７８３頁）を含み得る。他の抗体産生法は、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社，１９９９年に説明されている。
【０１１４】
従来のハイブリドーマ法は、抗原に結合する能力を有するリンパ球の産生を誘発するために、抗原によるマウス又は他の動物の免疫化を伴うことが通例である。リンパ球は、単離され、骨髄腫細胞株と融合されてハイブリドーマ細胞を形成し、次いで、これが、親骨髄腫細胞の増殖は阻害するが、抗体産生細胞の増殖は許容する条件において培養される。ハイブリドーマは、遺伝子変異を受けることがあり、これが、産生される抗体の結合特異性を変化させることもあり、変化させないこともある。合成抗体は、当技術分野で知られる技法（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００年，第２９６巻，５７〜８６頁、及びＫｒｅｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２００１年，第２１５４号，６７〜８４頁を参照されたい）を用いて作製することができる。
【０１１５】
改変は、当技術分野で知られる任意の適切な技法を用いて、結合メンバーのＶＨ、ＶＬ、若しくはＣＤＲ、又は実際にＦＲにおいて行うことができる。例えば、可変ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、ＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を、こうしたＣＤＲを欠くＶＨ又はＶＬドメインに導入することにより産生し得る。Ｍａｒｋｓら、１９９２年，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第１０巻，７７９〜７８３頁は、ＣＤＲ３を欠くＶＨ可変ドメインのレパートリーを産生し、次いで、特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わせて新規のＶＨ領域を産生する、シャフリング技法について説明している。類似の技法を用いて、本発明のＣＤＲに由来する配列を含む新規のＶＨ及びＶＬドメインを産生し得る。
【０１１６】
したがって、本発明で用いる抗体及び抗体フラグメントは、（ａ）置換されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３を含むか、又は核酸がこうしたＣＤＲに対するコード領域を欠く可変ドメインをコードする核酸の出発レパートリーを提供すること、（ｂ）ドナー核酸が、レパートリー内のＣＤＲ領域中に挿入され、可変ドメインをコードする核酸産物レパートリーを提供するよう、レパートリーを、アミノ酸配列をコードするドナー核酸と組み合わせること、（ｃ）産物レパートリーの核酸を発現すること、（ｄ）前記標的に特異的な抗原結合フラグメントを選択すること、及び（ｅ）特異的な抗原結合フラグメント又はそれをコードする核酸を回収することを含む方法により産生し得る。該方法は、前記標的の活性を阻害する能力について、特異的な結合メンバーを調べる任意選択のステップを含み得る。
【０１１７】
本発明で用いる抗体を産生する代替的な技法は、例えば、エラープローンＰＣＲ（Ｇｒａｍら，１９９２年，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，第８９巻，３５７６〜３５８０頁を参照）を用いて、ＶＨ又はＶＬドメインをコードする、（１つ又は複数の）遺伝子のランダムな突然変異誘発を伴い得る。加えて、又は代替的に、ＣＤＲは、例えば、Ｂａｒｂａｓら，１９９１年，ＰＮＡＳ，３８０９〜３８１３頁、及びＳｃｉｅｒ，１９９６年，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，第２６３巻，５５１〜５６７頁、により説明される分子進化の手法を用いて、突然変異の標的とし得る。
【０１１８】
本発明で用いる抗体は、「裸の」抗体（又はそのフラグメント）、即ち、「活性治療薬」と抱合していない抗体（又はそのフラグメント）であり得る。「活性治療薬」とは、抗体部分（抗体フラグメント、ＣＤＲなどを含む）に抱合して抱合体を生成する分子又は原子である。こうした「活性治療薬」の例は、薬剤、毒素、放射性同位元素、免疫調節物質、キレート化剤、ホウ素化合物、染料などを含む。
【０１１９】
本発明で用いるＥＧＦ阻害剤は、「活性治療薬」に抱合した抗体フラグメントを含む、免疫抱合体の形態であり得る。治療薬は、化学療法剤又は別の分子であり得る。
【０１２０】
免疫抱合体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許第５，０５７，３１３号明細書、Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，第４１巻，８３２〜８３９頁，１９８８年；Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，第４６巻，１１０１〜１１０６頁，１９９０年；Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ社，１９９１年）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈら（編），１８７〜２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社，１９９５年）；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），６０〜８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ社，１９９５年）を参照されたい。
【０１２１】
本発明で用いる抗体分子は、さらなる改変を含み得る。例えば、抗体分子は、グリコシル化、ＰＥＧ化、又はアルブミン若しくは非タンパク質性ポリマーに連結することができる。
【０１２２】
［アンチセンス／ｓｉＲＮＡ］
本発明で用いるＥＧＦ阻害剤及びＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、遺伝子発現を調節する能力を有する、例えば、ＥＧＦタンパク質をコードする配列の発現を下方調節する能力を有する核酸分子を含み得る。こうした核酸分子は、アンチセンス分子、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核酸センサー分子、アロザイム、酵素性核酸分子、及び三重鎖オリゴヌクレオチド、並びに、ＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は配列特異的な形での遺伝子サイレンシングを媒介するのに用い得る他の任意の核酸分子を含むが、これらに限定されない（例えば、Ｂａｓｓ，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ，第４１１巻，４２８〜４２９頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，２００１年，Ｎａｔｕｒｅ，第４１１巻，４９４〜４９８頁；国際公開第００／４４８９５号パンフレット；国際公開第０１／３６６４６号パンフレット；国際公開第９９／３２６１９号パンフレット；国際公開第００／０１８４６号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；国際公開第９９／０７４０９号パンフレット；及び国際公開第００／４４９１４号パンフレット；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，１８１８〜１８１９頁；Ｖｏｌｐｅら，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，１８３３〜１８３７頁；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，２２１５〜２２１８頁；Ｈａｌｌら，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，２２３２〜２２３７頁；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，２０５６〜２０６０頁；ＭｃＭａｎｕｓら，２００２年，ＲＮＡ，第８巻，８４２〜８５０頁；Ｒｅｉｎｈａｒｔら，２００２年，Ｇｅｎｅ＆Ｄｅｖ，第１６巻，１６１６〜１６２６頁；並びに、Ｒｅｉｎｈａｒｔ＆Ｂａｒｔｅｌ，２００２年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２９７巻，１８３１頁を参照されたい）。
【０１２３】
「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ間、又はＲＮＡ−ＤＮＡ間、又はＲＮＡ−ＰＮＡ間（タンパク質核酸；Ｅｇｈｏｌｍら，１９９３年，Ｎａｔｕｒｅ，第３６５巻，５６６頁）相互作用により標的ＲＮＡに結合し、該標的ＲＮＡの活性を変化させる非酵素核酸分子（総説としては、Ｓｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ，１９９３年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６１巻，１００４頁、及びＷｏｏｌｆら、米国特許第５，８４９，９０２号明細書を参照されたい）である。アンチセンス分子は、アンチセンス分子の単一の近接配列に沿って標的配列に相補的であってもよく、又、特定の実施形態では、基質に結合し、基質、アンチセンス分子、又はその両者が結合し、アンチセンス分子がループを形成し、アンチセンス分子が２つ以上の非近接基質配列と相補的であり得るか、若しくは、アンチセンス分子の２つ以上の非近接配列部分が標的配列と相補的であり得るか、又はその両方であってもよい。アンチセンス法の詳細は、当技術分野で知られており、例えば、Ｓｃｈｍａｊｕｋら，１９９９年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７４巻，２１７８３〜２１７８９頁、Ｄｅｌｉｈａｓら，１９９７年，Ｎａｔｕｒｅ，第１５巻，７５１〜７５３頁、Ｓｔｅｉｎら，１９９７年，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎ．Ａ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｖ．，第７巻，１５１頁、Ｃｒｏｏｋｅ，２０００年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，第３１３巻，３〜４５頁、Ｃｒｏｏｋｅ，１９９８年，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．，第１５巻，１２１〜１５７頁、Ｃｒｏｏｋｅ，１９９７年，Ａｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，第４０巻，１〜４９頁を参照されたい。
【０１２４】
「三重鎖核酸」又は「三重鎖オリゴヌクレオチド」とは、配列特異的な形で二重鎖ＤＮＡに結合して、三重鎖らせんを形成することのできるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。こうした三重らせん構造の形成は、標的遺伝子の転写を調節することが示されている（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら，１９９２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第８９巻，５０４頁）。
【０１２５】
［アプタマー］
アプタマーとは、特異的な分子標的に固く結合する核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）高分子である。これらは、例えば、ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）法による、小分子、タンパク質、核酸など各種の分子標的への結合を、反復ラウンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択を介して迅速に産生されうる（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ，第３４６巻，第６２８７号，８１８〜８２２頁，１９９０年；Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２４９巻，第４９６８号，５０５〜５１０頁，１９９０年；米国特許第６，８６７，２８９号明細書；米国特許第５，５６７，５８８号明細書；米国特許第６，６９９，８４３号明細書を参照されたい）。
【０１２６】
著明な特異性を示すことに加え、アプタマーは、一般に、極めて高い親和性でその標的に結合し；抗タンパク質アプタマーの大半は、ピコモル（ｐＭ）から低ナノモル（ｎＭ）の範囲における平衡解離定数（Ｋｄｓ）を有する。アプタマーは、化学合成により容易に産生され、所望の保存特性を有し、治療適用においてほとんど又はまったく免疫原性を誘発しない。
【０１２７】
非改変アプタマーは、主に、ヌクレアーゼ分解及び腎クリアランスにより、数分間から数時間の半減期で血流から迅速に除去されるが、これは、アプタマー本来の低分子量の結果である。しかし、当技術分野において知られる通り、ピリミジンの２’−フッ素置換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結などの改変を用いて、必要に応じて分子の半減期を数日間又は数週間に調整することができる。
【０１２８】
ペプチドアプタマーとは、細胞内部の他のタンパク質相互作用に干渉することを目的とするタンパク質である。これらは、両端においてタンパク質骨格に付着する可変ペプチドループからなる。この二重構造的な制約は、ペプチドアプタマーの結合親和性を、抗体と同等のレベル（ナノモル範囲）にまで大きく上昇させる。可変ループ長は、通例では、１０〜２０アミノ酸からなり、骨格は、良好な溶解度特性及び緻密度特性を有する任意のタンパク質であり得る。アプタマーは、任意のデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はリンに結合した非架橋リガンドの１つとしての酸素の代わりに硫黄を有するデオキシチオホスホスフェート（又はホスホロチオエート）など、これらの塩基の改変を含み得る。モノチオホスフェートαＳは、１つの硫黄原子を有し、したがって、リン中心の周囲においてキラルである。ジチオホスフェートは、両方の酸素が置換され、したがって、非キラルである。ホスホロチオエートヌクレオチドは、市販されるか、又は当技術分野で知られる複数の異なる方法により合成することができる。
【０１２９】
［治療］
「治療」又は「療法」とは、ヒト又は非ヒト動物に利益を与えることのできる任意のレジメンを含む。治療は、既存の状態に関することもあり、又は、予防的（予防的処置）でもあり得る。治療は、治癒効果、緩和効果、又は予防効果を含み得る。
【０１３０】
「癌の治療」とは、癌性増殖及び／又は血管新生により引き起こされる状態の治療を含み、新生物性増殖又は腫瘍の治療を含む。本発明を利用して治療することのできる腫瘍の例は、例えば、骨肉腫及び軟部組織肉腫を含む肉腫、癌腫、例えば、乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝癌、子宮癌、前立腺癌、子宮頸癌及び卵巣癌、非小細胞性肺癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、神経芽細胞腫、黒色腫、骨髄腫、ウィルムス腫瘍、並びに、急性リンパ芽球性白血病及び急性骨髄芽球性白血病を含む白血病、星状細胞腫、神経膠腫、及び網膜芽細胞腫を含む。
【０１３１】
本発明は、既存の癌の治療、及び、初回治療又は手術後における癌再発の予防において特に有用であり得る。
【０１３２】
［医薬組成物］
本発明による医薬組成物、及び、本発明に従い用いる医薬組成物は、活性成分、例えば、（ｉ）化学療法剤及び／若しくはＥＧＦ阻害剤、又は（ｉｉ）第１のＥＧＦの阻害剤及び第２のＥＧＦの阻害剤に加え、医薬として許容される賦形剤、担体、緩衝液安定剤、又は当業者によく知られる他の物質（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ社，２００５年を参照されたい）を含み得る。こうした物質は、酢酸、トリス、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；抗酸化剤；防腐剤；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；炭水化物；キレート化剤；等張化剤；及び界面活性剤を含み得る。
【０１３３】
医薬組成物は、必要に応じて、治療される特定の徴候のために選択される、好ましくは本発明の組成物の活性に有害な影響を与えない相補的な活性を有する、１つ又は複数の活性化合物もさらに含有し得る。例えば、癌の治療において、１つ若しくは複数のＥＧＦ阻害剤、及び／又は化学療法剤に加えて、製剤又はキットは、追加の成分、例えば、第２の若しくはさらなるＥＧＦ阻害剤、第２の若しくはさらなる化学療法剤、又は前記阻害剤が結合するＥＧＦ以外の標的に対する抗体、例えば、特定の癌の増殖に影響する増殖因子に対する抗体を含み得る。
【０１３４】
活性成分（例えば、ＥＧＦ阻害剤、例えば、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤、ＡＲＥＧ阻害剤、及び／又は化学療法剤）は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、リポソーム、他の微粒子送達システムを介して投与し得る。例えば、活性成分は、例えば、コアセルベーション法又は界面重合法により調製し得るマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル内に、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中に、又はマクロエマルジョン中に封入し得る。さらなる詳細については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版，Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲら編，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ社，２００５年を参照されたい。
【０１３５】
活性作用薬の送達には、徐放製剤を用いてよい。徐放製剤の適切な例は、成型品の形態、例えば、フィルム、坐薬、又はマイクロカプセルである、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスを含む。徐放マトリックスの例は、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。
【０１３６】
上述の通り、治療法には、核酸もまた用いてよい。本発明で用いる核酸は、当技術分野で知られる任意の適切な技法を用いて、対象の細胞に送達し得る。核酸（場合によって、ベクター内に含有される）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの技法を用いて、患者の細胞に送達し得る。Ｉｎ  ｖｉｖｏ技法の場合、ウイルスベクター（アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルスなど）及び脂質ベースのシステム（遺伝子の脂質を介する導入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）によるトランスフェクションを用い得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５６巻，８０８〜８１３頁，１９９２年を参照されたい。また、国際公開第９３／２５６７３号パンフレットも参照されたい）。
【０１３７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ技法の場合、核酸は、直接に、又は例えば患者に植え込まれる多孔質膜内に封入されて（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号及び第５，２８３，１８７号を参照）患者に投与される改変細胞により、患者の単離された細胞内に導入される。生細胞内に核酸を導入するのに用いられる技法は、レトロウイルスベクター、リポソーム、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含み得る。
【０１３８】
ＥＧＦ阻害剤及び／又は化学療法剤は、腫瘍部位又は他の所望の部位に局所的な形で投与してもよく、又は、それが腫瘍又は他の細胞を標的とする形で送達してもよい。抗体又は細胞特異的リガンドなどの標的化システムの使用による標的化療法を用いて、活性作用薬をより特異的に特定の種類の細胞に送達することができる。標的化は、様々な理由、例えば、作用薬が許容できないほどに毒性である場合、又は別の方法では極めて高用量を要する場合、又は別の方法では標的細胞に侵入できない場合のために望ましいことがある。
【０１３９】
［投与］
ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤を治療に用いる本発明の実施形態において、ＥＧＦ阻害剤は、化学療法剤と同時に、個別に、又は逐次投与してよい。同様に、第１のＥＧＦ阻害剤及び第２のＥＧＦ阻害剤を共に治療に用いる本発明の実施形態において、第１のＥＧＦ阻害剤は、第２のＥＧＦ阻害剤と同時に、個別に、又は逐次投与してよい。個別に又は逐次投与する場合、これらは、例えば、互いに１、２、３、６、１２、２４、４８、又は７２時間以内の任意の適切な時間以内に投与し得る。好ましい実施形態において、これらは、互いに６時間以内、好ましくは、２時間以内、より好ましくは、１時間以内、最も好ましくは、２０分以内に投与される。
【０１４０】
［キット］
本発明は、癌の治療用又は腫瘍細胞の殺滅用の各種のキットまでさらに拡張する。キットは、場合によって、各成分、例えば、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤、又は第１のＥＧＦ阻害剤及び第２のＥＧＦ阻害剤の個別、逐次、又は同時の投与のための指示書を含むことがある。
【０１４１】
［用量］
本発明のＥＧＦ阻害剤及び／又は化学療法剤、及び、本発明に用いるＥＧＦ阻害剤及び／又は化学療法剤は、「治療的な有効量」で個体に投与することに適し、これは、個体に対する利益を示すのに十分である。実際の投与レジメンは、治療される状態、その重症度、治療される患者、用いられる作用薬を含む多数の因子に依存し、医師の裁量下にある。
【０１４２】
ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤が用いられる、本方法、組成物、又はキットの一実施形態において、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤は、効果を高める比率をもたらす用量において投与される。同様に、第１のＥＧＦ阻害剤及び第２のＥＧＦ阻害剤が用いられる、本方法、組成物、又はキットの一実施形態において、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤は、効果を高める比率をもたらす用量において投与される。
【０１４３】
本発明の文脈における「効果を高める比率」という用語は、２つの成分、例えば、ＥＧＦ阻害剤、化学療法剤などが、そのいずれかの成分単独の場合、又は個々の成分の活性に基づく組合せについて予測される付加的活性の場合よりも、組合せの細胞毒性活性が大きくなるような比率で存在することを示す。
【０１４４】
したがって、効果を高める比率において、個々の成分は相乗的に作用する。
【０１４５】
相乗効果は、多数の方法を用いて定義することができる。
【０１４６】
一方法において、相乗効果は、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの方法による組合せ指数（ＣＩ）を計算することにより決定し得る。１、＜１、及び＞１のＣＩ値は、それぞれ、相加効果、相乗効果、及びアンタゴニスト効果を示す。
【０１４７】
本発明の一実施形態において、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤は、０．８５未満など、１未満のＣＩをもたらすのに十分な濃度で存在する。同様に、本発明の別の実施形態において、第１のＥＧＦ阻害剤及び第２のＥＧＦ阻害剤は、０．８５未満など、１未満のＣＩをもたらすのに十分な濃度で存在する。
【０１４８】
相乗効果は、Ｒｏｍａｎｅｌｉ（１９９８年ａ、ｂ）によって改変されたＫｅｒｎの方法を用いて１よりも大きいＲＩとして定義することが好ましい。ＲＩは、推定細胞生存率（Ｓｅｐ、成分Ａ単独により観察される生存率と、成分Ｂ単独により観察される生存率との積として定義される）の、Ａ及びＢの組合せについて観察される細胞生存率（Ｓｏｂｓ）に対する比率（ＲＩ＝Ｓｅ／Ｓｏｂｓ）として計算できる。したがって、相乗効果は、１より大きいＲＩとして定義できる。
【０１４９】
本発明の一実施形態において、ＥＧＦ阻害剤及び化学療法剤（又は第１のＥＧＦ阻害剤及び第２のＥＧＦ阻害剤）は、２．０よりも大きい、例えば２．２５よりも大きいなど、１．５よりも大きいＲＩをもたらすのに十分な濃度で提供される。
【０１５０】
したがって、一実施形態において、組み合わせた薬剤は、腫瘍細胞を治療するのに用いられると、相乗効果をもたらす。
【０１５１】
最適用量は、例えば、年齢、性、体重、治療される状態の重症度、投与される活性成分、及び投与経路を含む多数のパラメータに基づき、医師により決定され得る。
【０１５２】
本発明は、ここで、以下の付随的な図面への参照を伴う、以下の非限定的な実施例において、さらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１Ａは、４８時間のＣＰＴ１１処置又は５−Ｆｕ処置のいずれかを伴う／伴わないＲＫＯ＋／＋における、ＡＲＥＧ及びベータアクチンのＲＮＡ発現の解析を示す。３５サイクルのＰＣＲ後にＲＮＡレベルを解析し、処置及び非処置試料との間の相対的な発現差を決定した。図１Ｂは、４８時間のＣＰＴ１１処置を伴う／伴わないＨＣＴ１１６＋／＋における、ＡＲＥＧ及びベータアクチンのＲＮＡ発現の解析を示す。３５サイクルのＰＣＲ後にＲＮＡレベルを解析し、処置及び非処置試料との間の相対的な発現差を決定した。
【図２】図２は、４８時間のＣＰＴ１１又は５−Ｆｕ処置を伴う／伴わないＨＣＴ１１６＋／＋及びＲＫＯ＋／＋における、ＡＲＥＧ及びガンマチューブリンのタンパク質発現のウェスタンブロット解析を示す。
【図３】図３は、ＣＰＴ−１１処置を伴う又は伴わないＨＣＴ１１６＋／＋における、ＡＲＥＧ及びアクチンタンパク質の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図４】図４は、４８時間のＣＰＴ１１処置後のＨ６３０  ｐ５３変異結腸直腸癌細胞溶解物における、ＡＲＥＧタンパク質発現の解析を示す。ウェスタンブロットは、抗アンフィレグリン抗体を用いてプローブした。化学療法後に、ＡＲＥＧ発現の増強が観察された（Ａ及びＢは、２つの個別の実験を示す）。
【図５】図５は、４８時間のＣＰＴ１１処置又は５−Ｆｕ処置のいずれかを伴う／伴わないＨ４６０肺癌細胞における、ＡＲＥＧ及びベータアクチンのＲＮＡ発現の解析を示す。３５サイクルのＰＣＲ後にＲＮＡレベルを解析し、処置及び非処置試料との間の相対的な発現差を決定した。
【図６】図６は、Ａ）ＨＴ２９、Ｂ）ＨＣＴ１１６、及びＣ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞における化学療法チャレンジ後におけるＡＲＥＧの上方調節を示す。４８時間にわたり、化学療法を伴い／伴わずに細胞を処置した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ヒトＡＲＥＧ遺伝子又はＧＡＰＤＨに特異的なプライマー対を用いて、１μｇの全ＲＮＡについて実施した。ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル電気泳動において分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【図７】図７ａは、ＨＣＴ１１６における、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ特異的サイレンシングを示す。ＡＲＥＧ特異的ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）をＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトした。ＡＲＥＧ及びベータアクチンの遺伝子発現は、トランスフェクションの７２時間後にＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。図７ｂは、ＨＣＴ１１６における、ｓｉＲＮＡによるＨＢ−ＥＧＦ特異的サイレンシングを示す。ＨＢ−ＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）をＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクトした。ＨＢ−ＥＧＦ及びベータアクチンの遺伝子発現は、トランスフェクションの７２時間後にＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【図８】図８は、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ／ＨＢ−ＥＧＦサイレンシング及び／又は化学療法による処置後における、ＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、ＨＢ−ＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、薬剤なし、又は３．５μＭ  ＣＰＴ−１１により処置した。トランスフェクション／化学療法の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図９】図９は、ＨＴ２９結腸直腸癌細胞における、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ特異的サイレンシングを示す。ＡＲＥＧ特異的ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。ＡＲＥＧ及びＧＡＰＤＨの遺伝子発現は、トランスフェクションの７２時間後にＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【図１０】図１０は、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧサイレンシング及び／又は化学療法による処置後における、ＨＴ２９細胞の増殖を示す。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、薬剤なし、又は３．５μＭ  ＣＰＴ−１１により処置した。トランスフェクション／化学療法の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図１１】図１１は、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞における、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ特異的サイレンシングを示す。ＡＲＥＧ特異的ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。ＡＲＥＧ及びＧＡＰＤＨの遺伝子発現は、トランスフェクションの７２時間後にＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【図１２】図１２は、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧサイレンシング及び／又は化学療法による処置後における、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖を示す。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、及び様々な用量の５−ＦＵを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション／化学療法の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図１３】図１３は、ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ／ＨＢ−ＥＧＦサイレンシング後における、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の増殖を示す。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、ＨＢ−ＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション／化学療法の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図１４】図１４は、ｃＤＮＡライブラリーからのアンフィレグリンフラグメントの増幅を示す。アンフィレグリンは、腎臓ｃＤＮＡから増幅し、ＰＣＲ反応は、臭化エチジウムにより染色した１．５％アガロースゲル上で解析した。
【図１５】図１５は、ＡＲＥＧフラグメントのコロニーＰＣＲ法を示す。ＰＣＲ増幅は、コロニーにより実施し、アンフィレグリンフラグメントの発現ベクター内へのクローニングが成功したコロニーを同定した。ＰＣＲ反応は、臭化エチジウムにより染色した１．５％アガロースゲル上で解析した。任意の陽性コロニーを、配列及び発現解析用に選択した。
【図１６】図１６パネルＡ）は、５００ｍｌの培養液量からのＡＲＥＧ組換えタンパク質精製の溶出プロファイルを示す。培養液に由来するペレットは、８Ｍ尿素中に再懸濁させ、次いで、６×ヒスチジンタグの性質により精製した。溶出試料を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により解析した（パネルＢ）。ゲルは、クーマシーブルーにより染色した。
【図１７】図１７は、産生されたＡＲＥＧモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡ法の結果を示す。組換えＡＲＥＧタンパク質、及び、類似の方法により産生された陰性対照に対するＥＬＩＳＡ法により、モノクローナル抗体を調べた。
【図１８】図１８は、モノクローナル試験ブリードのウェスタンブロット解析を示す。モノクローナル試験ブリードは、組換えアンフィレグリンタンパク質及び陰性対照タンパク質に対するウェスタンブロット法により調べた。等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。
【図１９】図１９は、組換えタンパク質に対するＡＲＥＧモノクローナル抗体のウェスタンブロット解析を示す。組換えＡＲＥＧタンパク質及び陰性対照タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。ニトロセルロース膜にゲルを転写し、ＡＲＥＧモノクローナル抗体によりプローブした。
【図２０】図２０は、結腸直腸細胞株であるＨＣＴ１１６及びＨＴ２９に由来する全細胞溶解物に対する、ＡＲＥＧモノクローナル抗体のウェスタンブロット解析を示す。ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞株に由来する全細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した。ブロットは、ＡＲＥＧモノクローナル抗体であるａ）６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８、及びｂ）  ６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６によりプローブした（注：６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８は、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６と同じ抗体であることが後に示されている）。
【図２１】図２１は、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６モノクローナル抗体により染色された、ＨＣＴ１１６＋／＋におけるＡＲＥＧ及びアクチンタンパク質の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図２２】図２２は、６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８モノクローナル抗体により染色された、ＨＣＴ１１６＋／＋におけるＡＲＥＧ及びアクチンタンパク質の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図２３】図２３は、４８時間にわたり２．５μＭイリノテカンを伴うか又は伴わずに処置した、ＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞株におけるＦＡＣＳ解析を示す。
【図２４】図２４は、４８時間にわたり２．５μＭイリノテカンを伴うか又は伴わずに処置した、ＨＣＴ１１６細胞におけるＦＡＣＳ解析を示す。処置後、ＡＲＥＧモノクローナル抗体により細胞を染色し、ＦＡＣＳにより解析した。
【図２５】図２５は、４８時間にわたり２．５μＭイリノテカンを伴うか又は伴わずに処置した、Ｈ４６０肺癌細胞株におけるＦＡＣＳ解析を示す。処置後、ＡＲＥＧモノクローナル抗体により細胞を染色し、ＦＡＣＳにより解析した。
【図２６】図２６は、ＡＲＥＧ抗体による処置後における、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図２７】図２７は、ＡＲＥＧ抗体による処置後における、ＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図２８】図２８は、ＡＲＥＧ抗体による処置後における、ＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図２９】図２９は、ＡＲＥＧ抗体による処置後におけるＭＤＡ  ＭＢ２３１細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図３０】図３０は、ＡＲＥＧ抗体による処置後におけるＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図３１】図３１は、ＡＲＥＧ抗体による処置後におけるＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す。処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【図３２】図３２は、異なる濃度のＡＲＥＧ抗体（６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６）、又はアイソタイプの対照抗体による処置後における、Ｈ４６０肺癌細胞の増殖を示す。細胞は、２５ｎＭ、５０ｎＭ、又は１０ＯｎＭのいずれかの抗体による処置の２４時間前に播種した。細胞生存率は、処置の４８時間後に、ＭＴＴアッセイにより調べた。
【図３３】図３３は、ｓｉＲＮＡによるＨＢ−ＥＧＦサイレンシング及び／又は抗ＡＲＥＧ抗体（６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８＆６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６）による処置後におけるＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す。ＨＢ−ＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）、又は対照ｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を解析した。
【０１５４】
［材料と方法］
［細胞株と培養条件］
ＨＣＴ１１６（ｐ５３野生型）ヒト結腸直腸腺癌細胞株を、マッコイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）中で保持した。ＲＫＯ（ｐ５３野生型）結腸直腸癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト乳癌細胞株、及びＨＴ２９ヒト結腸直腸癌細胞株を、各々、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）中で保持した。
【０１５５】
結腸直腸細胞株は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）中で保持した。ＨＨ６３０（ｐ５３変異）結腸直腸癌細胞株は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）中で保持した。Ｈ４６０（ｐ５３変異）肺癌細胞株は、ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＵＫ）中で保持した。すべての培地に、１０％  ＦＣＳ（標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）又は透析済み（Ａｕｔｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｃｌｅａｒ社製、ＵＫ））、１％ペン／ストレップ（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）、１％  Ｌ−グルタミン（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＵＫ）を補充した。
【０１５６】
［異種移植モデル］
６〜８週齢のＳＣＩＤ雌マウスの各側腹部に、２×１０６個のＨＣＴ１１６＋／＋ヒト結腸直腸腺癌細胞を植え込んだ。対数増殖期にあるＨＣＴ１１６細胞を回収し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＨＢＳＳ中に再懸濁させた。これらに等量のマトリゲルを混合して、５×１０６個／ｍｌの最終濃度とした。植え込みの５日後にマウスを無作為に治療群に分割し、異なる化学療法の用量で治療した。５−Ｆｕ（７０ｍｇｓ／ｋｇ）、ＣＰＴ１１（７０ｍｇｓ／ｋｇ）、又は対照の生理食塩液、そして、異なる時点（注入の２４及び４８時間後）でマウスを安楽死させた。すべての薬剤は、ボーラス注射により投与した。動物は、各時点で安楽死させ、解析用に腫瘍を除去した。
【０１５７】
［マイクロアレイ解析］
約１０μｇのトータルＲＮＡを腫瘍細胞から単離し、プローブ調製用の出発物質として用いた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）を用いて、マイクロアレイ解析を実施した。プローブは、製造元の推奨に従って調製した。
【０１５８】
ＲＮＡの抽出後、試料をｃＤＮＡに逆転写し、次いで、標識化の前に、これをカラム上で精製した。次いで、３’端から高収量のビオチン化標的を産出する、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて、プローブを増幅及び標識化した。ｃＲＮＡをフラグメント化して、最適のアッセイ感受性を得、次いで、品質管理にかけて、フラグメントが、３５〜２００ヌクレオチドの範囲のサイズであることを確認した。分光光度計によりｃＲＮＡを定量し、バイオアナライザーでフラグメント化したｃＲＮＡの品質を点検した。次のステージでは、フラグメント化したｃＲＮＡを、４５℃で１６時間にわたり、アレイにハイブリダイズさせた。この後、アレイを洗浄し、ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎを用いてストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡＰＥ）染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナー３０００を用いてスキャンした。次いで、染色された画像を解析した。
【０１５９】
まず、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧＣＯＳ（Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（登録商標）オペレーティングシステム）ソフトウェアを用いてデータのスケールを定め、測定基準の品質を評価した。次いでデータを対照試料に対して標準化した。標準化の後、ノイズレベルがシグナルを曖昧化し、倍数変化が２倍を超えたすべての遺伝子を除去してデータをフィルターした。最後に、ｔ検定のｐ値を用いて遺伝子をフィルターし、統計学的に頑健なデータリストを導出する信頼性フィルターを用いた。
【０１６０】
処置の種類及び時点ごとにトリプリケートで実施し、各条件に由来する全データセットに統計学的解析及びフィルターを適用した。
【０１６１】
［化学療法による治療］
［ａ−細胞培養］
対数増殖期にある細胞を、〜２０％のコンフルエンスでＴ７５フラスコ内に播種し、一晩インキュベートして、プレートに付着させた。濃度７．５μＭのＣＰＴ−１１（イリノテカン）及び５−Ｆｕ（フルオロウラシル）により、４８時間にわたりウェルを処置した。対照フラスコでは、化学療法を生理食塩液で置換した。化学療法への異なる時間の曝露後、細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、製造元の指示書に従い、ＲＮＡ  ＴＡＴ−６０試薬を用いてトータルＲＮＡを単離した。
【０１６２】
逆転写は、製造元の指示書に従い、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を用いて、２．５μｇのＲＮＡにより実施した。
【０１６３】
［ｂ−臓器］
Ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験用に、マウスの各側腹部に、２×１０６個のＨＣＴ１１６＋／＋ヒト結腸直腸腺癌細胞を接種した。植え込みの５日後にマウスを無作為に治療群に分割し、５Ｆｕ（毎日１５ｍｇ／ｋｇ、又は毎週２回７０ｍｇ／ｋｇ）により治療した、又は治療せずに置いた。すべての薬剤は、ボーラス注射により投与した。動物は、各時点で安楽死させ、臓器及び腫瘍を解析用に除去した。
【０１６４】
［半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法］
ＰＴＣ  ２２５  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。最終容量２５μＬのＰＣＲ混合液は、１２．５μＬの２倍濃度Ｂｉｏｍｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社製、ＵＫ）、２μＬのプライマー（１０μｍｏｌ／Ｌ）、１μＬのｃＤＮＡ、及び９．５μＬのｄＨ２Ｏを含有する。ＰＣＲ法の条件は、９５℃で１０分間の最初の変性ステップの後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、及び７２℃で９０秒間の伸長からなる３５サイクルが続き、最後に７２℃で１０分間にわたり伸長を行った。５μｌの増幅反応産物を、１．５％アガロースゲル（０．００１％臭化エチジウム）に添加し、これを、ＵＶボックスでの解析前に、９０Ｖで３０〜４０分間泳動した。ｃＤＮＡごとにベータアクチン対照のＰＣＲ増幅を実施して、ＰＣＲ混合液に投入されたｃＤＮＡレベルを点検した。
【０１６５】
実施例２では、ＲＮＡ  ＳＴＡＴ−６０の製造元によるプロトコール（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社、ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）に従い、細胞からトータルＲＮＡを単離した。Ｐｒｏｍｅｇａ  ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、サウスハンプトン、ＵＫ）を用いて、１μｇの全細胞ＲＮＡによりＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。ヒトＡＲＥＧ（順方向：５’−ＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＣＩ−３’（配列番号１９）、逆方向：５’−ＴＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＴＡＣＣＴＧＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号２０））、ヒトＨＢ−ＥＧＦ（順方向：５’−ＴＴＴＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号２１）、逆方向：５’−ＣＣＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣ−３’（配列番号２２））、対照としてのヒトＧＡＰＤＨ（順方向：５’−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３’（配列番号２３）、逆方向：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３’（配列番号２４））、及び、対照としてのヒトベータアクチン（順方向：５’−ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ−３’（配列番号２５）、逆方向：５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２６））に特異的なプライマー対を用いて、ＰＣＲ法を実施した。
【０１６６】
ＰＣＲ産物は、１．５％アガロースゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１６７】
［ウェスタンブロット法］
［ａ−細胞溶解］
ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＨＴ２９、及びＨ６３０は、ヒト結腸直腸癌細胞株である。化学療法への異なる時間の曝露の後、細胞を回収し、１倍濃度ＰＢＳで洗浄した。次いで、プロテアーゼ阻害剤を補充した適量の１倍濃度ＲＩＰＡ溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の１０ｍＭトリス、０．１％ＳＤＳ、１．０％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で細胞ペレットを溶解した。細胞溶解物を短時間ボルテックスし、氷上で１０分間インキュベートし、次いで、１２、０００ｒｐｍで遠心分離して細胞破砕物を除去した。遠心分離後、溶解物上清を新しいエッペンドルフチューブに移した。
【０１６８】
［ｂ−全細胞溶解物（ＷＣＬ）の定量］
製造元の指示書に従い、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、タンパク質濃度を調べた。マイクロプレートリーダーを用いて、６２０ｎｍにおける各試料の吸光度を調べた。実験ごとに基準ＢＳＡ曲線をプロットし、各試料のタンパク質濃度を計算した。
【０１６９】
［ｃ−全細胞溶解物（ＷＣＬ）タンパク質試料の調製］
各試料に、等量の５倍濃度のウェスタン用試料緩衝液、及び、最終容量の１０％のβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。試料は９５℃で５分間にわたり変性させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）上に添加する前に、氷上に置いた。ゲルの１つのウェル内に、１０μｌの染色済タンパク質用分子量マーカーを添加した。
【０１７０】
［ｄ−タンパク質のポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜への電気転写］
電気泳動後に、１倍濃度ウェスタン用転写緩衝液中にゲルを浸漬した。３０秒間にわたり、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）片を１００％メタノール中に浸漬し、次いで、脱イオン化Ｈ２Ｏで洗浄し、１倍濃度転写緩衝液中で平衡化した。
【０１７１】
次いで、以下の通りに、上記のものをＴｒａｎｓ−ｂｌｏｔ  ＳＤ  ｓｅｍｉ−ｄｒｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）へアセンブルした。転写緩衝液中に１片のブロット用紙、ＰＶＤＦ膜に続き、ゲルを浸漬し、次いで、１片のブロット用紙を転写緩衝液中に浸漬した。次いで、２０Ｖで９０分間にわたり、タンパク質を膜上に電気泳動した。
【０１７２】
［ｅ−免疫ブロット法（ウェスタンブロット法）］
転写後、１倍濃度ＰＢＳ／５％ミルク中で１時間にわたりブロックする前に、１倍濃度ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで１０分間にわたり３回、ＰＤＶＦ膜を洗浄した。ブロックした膜は、１倍濃度ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ／５％ミルクで適度に希釈した、適切な一次抗体と共に１時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、１倍濃度ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで膜を３回洗浄した後、１倍濃度ＰＢＳ／５％ミルク中で１：５０００に希釈した適切な二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）により、１時間にわたり、プローブした。その後、各回１０分間ずつ３回にわたり、膜を１倍濃度ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、製造元が説明する通りに、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ検出法（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて可視化した。オートラジオグラフへの曝露、その後の現像して、タンパク質バンドを検出した。同じ免疫ブロットから第２のタンパク質の検出を要する場合は、膜をウェスタン用のストリッピング緩衝液中に浸漬し、５０℃のロッキングインキュベーター内で、３０分間にわたりインキュベートした。膜のストリッピング後に、１倍濃度ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで１０分間ずつ５回にわたり洗浄した。前回と同様、適切な抗体により、膜をリプローブした。
【０１７３】
［ＲＮＡ干渉］
ＡＲＥＧ、ＨＢ−ＥＧＦ、及び対照ｓｉＲＮＡ、並びにＤｈａｒｍａｆｅｃｔ  ４トランスフェクション試薬は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社（ラファイエット、コロラド州、米国）から入手した。
【０１７４】
ＨＢ−ＥＧＦの場合、用いたｓｉＲＮＡは、以下の配列：
１  センス配列
ＧＡＡＡＡＵＣＧＣＵＵＡＵＡＵＡＣＣＵＵＵ（配列番号１）
１  アンチセンス配列
ＡＧＧＵＡＵＡＵＡＡＧＣＧＡＵＵＵＵＣＵＵ（配列番号２）
２  センス配列
ＵＧＡＡＧＵＵＧＧＧＣＡＵＧＡＣＵＡＡＵＵ（配列番号３）
２  アンチセンス配列
ＵＵＡＧＵＣＡＵＧＣＣＣＡＡＣＵＵＣＡＵＵ（配列番号４）
３  センス配列
ＧＧＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＵＣＧＧＡＡＡＵＵ（配列番号５）
３  アンチセンス配列
ＵＵＵＣＣＧＡＡＧＡＣＡＵＧＧＧＵＣＣＵＵ（配列番号６）
４  センス配列
ＧＧＡＧＡＡＵＧＣＡＡＡＵＡＵＧＵＡＵＵ（配列番号７）
４  アンチセンス配列
ＵＣＡＣＡＵＡＵＵＵＧＣＡＵＵＣＵＣＣＵＵ（配列番号８）
を有した。
【０１７５】
ＡＲＥＧの場合、用いたｓｉＲＮＡは、以下の配列：
１  センス配列
ＵＧＡＵＡＡＣＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＵＡＵＵ（配列番号９）
１  アンチセンス配列
ＵＡＵＵＵＧＵＧＧＵＵＣＧＵＵＡＵＣＡＵＵ（配列番号１０）
２  センス配列
ＵＧＡＧＵＧＡＡＡＵＧＣＣＵＵＣＵＡＧＵＵ（配列番号１１）
２  アンチセンス配列
ＣＵＡＧＡＡＧＧＣＡＵＵＵＣＡＣＵＣＡＵＵ（配列番号１２）
３  センス配列
ＧＵＵＡＵＵＡＣＡＧＵＣＣＡＧＣＵＵＡＵＵ（配列番号１３）
３  アンチセンス配列
ＵＡＡＧＣＵＧＧＡＣＵＧＵＡＡＵＡＡＣＵＵ（配列番号１４）
４  センス配列
ＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵＵＣＧＡＣＡＡＧＡＵＵ（配列番号１５）
４  アンチセンス配列
ＵＣＵＵＧＵＣＧＡＡＧＵＵＵＣＵＵＵＣＵＵ（配列番号１６）
を有した。
【０１７６】
細胞は、９６ウェルプレートにウェル当たり５０００個、又は６ウェルプレートにウェル当たり５×１０５個で播種した。細胞は、トランスフェクション前に２４時間にわたって培養した。ｓｉＲＮＡは、無血清ＤＭＥＭ培地中で１００ｎＭに調製し、室温で５分間放置した。Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔトランスフェクション試薬もまた、無血清ＤＭＥＭ培地中で調製し、室温で５分間にわたりインキュベートした。トランスフェクション試薬をｓｉＲＮＡに添加し、室温で２０分間にわたりインキュベートした。培地をプレートのウェルから除去し、抗生物質非含有ＤＭＥＭをウェルに添加した。２０分後、ウェルへの滴下によりｓｉＲＮＡを添加した。３７℃で４８時間にわたりプレートをインキュベートした。
【０１７７】
［ＭＴＴアッセイ］
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ社製）アッセイ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ，１９８３年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，第６５巻，５５〜６３頁）により、細胞生存率を評価した。化学療法／ｓｉＲＮＡ間相互作用を評価するため、９６ウェルプレートにウェル当たり５０００個の細胞を播種した。２４時間後、細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、異なる濃度の各種化学療法剤により処置した。４８時間後、各ウェルにＭＴＴ（１．０ｍｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を３７℃で２時間にわたりインキュベートした。培地を除去し、２００μｌ  ＤＭＳＯ中にホルマザン結晶を再吸収させた。マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅ、Ｂｉｏｒａｄ社製、ＵＫ）を用いて、５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度を測定することにより、細胞生存率を決定した。
【０１７８】
［アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）のクローニング］
遺伝子特異的プライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーから、ＰＣＲ法により、アンフィレグリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を増幅した。ＡＲＥＧ遺伝子は、細菌発現ベクターｐＥＴ１００内にクローンされ、これが、組換えタンパク質のＮ末端へのヘキサヒスチジンタグの組み込みを可能とした。次いで、この構築物を用いて、コンピテントのＴＯＰ１０Ｆ’大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を形質転換した。多重クローニング部位に隣接するベクター特異的プライマーを用いるコロニーＰＣＲ法により、陽性形質転換細胞を選択した。
【０１７９】
［組換えＡＲＥＧタンパク質の発現］
５０μＭアンピシリンを補充した５ｍｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中において、３７℃で一晩、陽性クローンを増殖させた。この培養液の３００μｌのアリコートを、二次培養液の接種用に保管し、Ｑｉａｇｅｎ社製のミニプレップキットを用いて試料の残余をミニプレップし、ＤＮＡシーケンシングにより配列を確認した。
【０１８０】
３つの２次培養液を接種して、タンパク質発現の可視化を可能とした。培養液が、それぞれ、０．２、０．５、及び１．０のＯＤ（Ａ５５０）を有する場合は、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）により培養液を発現誘導し、次いで、３７℃で４時間にわたり放置した。次いで、４０００ｒｐｍで１５分間にわたる遠心分離により細胞を回収し、１μｌのリソナーゼを補充した１ｍｌのＰＢＳ／０．１％イゲパル（Ｉｇｅｐａｌ）中にペレットを再懸濁させた。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法及びウェスタンブロット法により試料を解析し、タンパク質の発現を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、クーマシーブルー中で一晩にわたり染色し、翌日脱染色した。
【０１８１】
次いで、二次培養液を接種液として用い、培養液が最適光学濃度に達したらＩＰＴＧで発現誘導して、アンピシリンを補充した５００ｍｌのＬＢ培地中で、組換えＡＲＥＧタンパク質を発現させた。培養液は、５０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離し、タンパク質精製用にペレットを保管した。
【０１８２】
［タンパク質精製］
発現誘導された組換えタンパク質は、５０ｍｌの８Ｍ尿素緩衝液（４８０ｇ尿素、２９ｇ  ＮａＣｌ、３．１２ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４（二水和物）、０．３４ｇイミダゾール）中で一晩にわたり溶解させた。６０００ｒｐｍで１時間にわたり溶液を遠心分離した後、精製前に、０．８μｍジャイロディスクフィルターを用いて上清を濾過した。
【０１８３】
タンパク質は、そのＮ末端ヘキサヒスチジンタグにより精製し、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーによるカラム上でのリフォールディングを用いてリフォールディングさせた。Ａｋｔａｐｒｉｍｅに取り付ける前に、１００ｍＭ硫酸ニッケルを用いてキレート化ハイトラップカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にチャージした。８Ｍ尿素緩衝液を５ｍＭイミダゾール洗浄緩衝液（２９ｇ  ＮａＣｌ、３．１２ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４（二水和物）、０．３４ｇイミダゾール、ｐＨ  ８．０）と交換することによりリフォールディングが生じ、５００ｍＭイミダゾール溶出緩衝液（２９ｇ  ＮａＣｌ、３．１２ｇ  ＮａＨ２ＰＯ４（二水和物）、３４ｇイミダゾール）を用いてタンパク質の溶出が生じる。精製組換えタンパク質の溶出プロファイルは記録され、図１６で見ることができる。
【０１８４】
溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析にかけ、溶出画分中における組換えタンパク質の存在を確認した。クーマシーブルーにより一晩にわたりゲルを染色し、その後、脱染色して、ＡＲＥＧタンパク質を含有する画分を決定した。
【０１８５】
［抗体の産生］
リフォールディングしたタンパク質を免疫原として用いて、モノクローナル抗体を産生した。１５０μｇの精製組換えタンパク質により、３週間間隔で、５匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫化し、３回目と５回目のブースト後に、抗体力価を解析した。各動物から試験血液を採取し、１００ｎｇの抗原に対するウェスタンブロット法により、１：１０００の希釈率で調べた。ブロットは、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて発色させた。
【０１８６】
５回目のブースト後に、マウスから脾臓を取り出し、標準的なプロトコールに従い、抗体を産生するＢ細胞を、ＳＰ２骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ融合の１１日後に、細胞増殖についてプレートを検査した。組換えタンパク質に対して、クローンをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングし、選択された陽性ハイブリドーマを、限界希釈により２回クローニングした。
【０１８７】
［ＥＬＩＳＡ法］
ＥＬＩＳＡ法によりモノクローナル抗体をスクリーニングして、どのクローンを増殖させるかを決定する。スクリーニング抗原を含有する１００μｌのコーティング緩衝液（緩衝液Ａ：０．４２ｇ重炭酸ナトリウム／１００μｌ  Ｈ２０、緩衝液Ｂ：０．５３ｇ炭酸ナトリウム／１００μｌ  Ｈ２０、ｐＨ９．５）を各ウェルに添加（１００ｎｇ／ウェル）することにより、Ｍａｘｉ  Ｓｏｒｂ  ９６ウェルプレートを組換え抗原によりコートした。対照抗原も用いて、非特異的クローンを除去した。３７℃で１時間にわたりプレートをインキュベートして、抗原をウェルに結合させ、次いで、２００μｌ  ＰＢＳ／３％ＢＳＡを各ウェルに添加することにより、室温で１時間にわたりプレートをブロックした。
【０１８８】
プレートからブロッキング溶液を除去し、１００μｌのハイブリドーマ上清を陽性抗原及び対照抗原ウェルに添加した。室温におけるロッカー上で１時間にわたり、スクリーニングプレートを上清と共にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回プレートを洗浄し、その後、１００μｌのヤギ抗マウスＨＲＰ抱合二次抗体（１：３０００）を各ウェルに添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで３回プレートを洗浄し、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加し、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。陽性ウェルは、発色により示され、５０μｌの１Ｍ  ＨＣＬの添加により反応を停止させた。４５０ｎｍにおける分光光度計によりプレートを測定し、対照ウェル（−）中の陰性測定値と共に、スクリーニングウェル（＋）中の陽性測定値を示す試料をさらなる作業用に選択した。元のウェルに由来する細胞を２４ウェルプレートに移し、増殖させた。
【０１８９】
［ウェスタンブロット法］
ウェスタンブロット法によりハイブリドーマ細胞株に由来する上清を解析し、モノクローナル抗体が癌細胞株の範囲において組換えＡＲＥＧ及び内因性の天然ＡＲＥＧタンパク質（癌におけるＡＲＥＧ発現を表す）を共に検出する能力を判定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により、ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９の全細胞溶解物（〜３０μｇ／ｍｌ）、又は組換えＡＲＥＧタンパク質のアリコートを分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ  Ｅｘｔｒａニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）上に転写した。膜は、室温で１時間にわたりＰＢＳ／５％マーベル（ｍａｒｖｅｌ）中でのインキュベーションによりブロックし、その後、ＰＢＳ中で短時間にわたりすすいだ。モノクローナル抗体は、ＰＢＳ中で１：５００又は１：２５０の希釈率で用い、緩やかにロッキングしながら４℃で一晩にわたり膜上でインキュベートした。次いで、ＰＢＳ／１％マーベル（ｍａｒｖｅｌ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０によりブロットを３回すすぎ、次いで、振盪しながら室温で１時間にわたり１：３０００の希釈率におけるヤギ抗マウスＨＲＰ抱合二次抗体でインキュベートした。次いで、ＰＢＳ／１％マーベル（ｍａｒｖｅｌ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液によりブロットを３回すすいだ後、ＰＢＳ中で短時間にわたりすすいだ。ブロットは、室温で５分間にわたりＥＣＬ  ｐｌｕｓ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｃｅｎｃｅｓ社製）と共にインキュベートした後、Ｋｏｄａｋ  ｉｍａｇｅｒ上で解析した。
【０１９０】
［フローサイトメトリー解析］
２．５μＭイリノテカンを伴うか又は伴わずに、４８時間にわたりＨＣＴ１１６又はＨ４６０細胞を処置した。４８時間後、ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、通常ヤギ血清中で２０分間にわたりブロックした。２時間にわたり、ＡＲＥＧ抗体又はアイソタイプ対照と共に５×１０５個の細胞をインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄した。１時間にわたりＦＩＴＣ抱合ヤギ抗マウス抗体と共に細胞をインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄した後で、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ上で解析した。
【０１９１】
［結果］
［実施例１］
処置の２４及び４８時間後における、２つの異なる化学療法薬に対する遺伝子応答を調べる異種移植試験をセットした。各マウスに等量のＨＣＴ１１６細胞を植え込み、各条件をトリプリケートで実施した。３匹ずつのマウスの４群に１００ｕｌ  ＣＰＴ−１１（７０ｍｇ／ｋｇ）、５−ＦＵ（７０ｍｇ／ｋｇ）、又は生理食塩液対照を投与した。次いで、２４時間後（５−ＦＵ）＆４８時間後（ＣＰＴ−１１、５−ＦＵ）に、腫瘍を切除した。腫瘍の平均質量は、対照及び薬剤治療群を通じて変化しなかった。
【０１９２】
１２匹の各マウスにおける腫瘍から単離されたＲＮＡをマイクロアレイ解析にかけ、ｍＲＮＡ発現レベルを測定した。非治療対照に対する薬剤治療マウスの倍数変化値を示す。４８時間後、非治療対照に対する５ＦＵ治療マウスにおけるＡＲＥＧ  ｍＲＮＡ発現の倍数変化値は２．１であり、非治療対照に対するＣＰＴ−１１治療マウスにおけるＡＲＥＧ  ｍＲＮＡ発現の倍数変化値は２．２であった。データは、厳密な統計学的フィルターを通したので、統計学的に頑健であると考えられる。アンフィレグリンＲＮＡは、対照と比較して２倍を超えて有意に上方調節された。
【０１９３】
他の５つのＥｒｂＢ同族のリガンドもまた、本マイクロアレイ解析により上方調節されたことが分かった。５−ＦＵによる治療時には、ＴＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦタンパク質が上方調節を示した。ＣＰＴ−１１及び５−ＦＵの両方による治療の４８時間後には、ＥＲＥＧタンパク質が上方調節を示した。ＢＴＣタンパク質は、３つの条件すべてにおいて上方調節を示した。ＮＲＧ３は、ＣＰＴ−１１及び５−ＦＵの両方による治療の４８時間後に上方調節された。結果は、表１にまとめる。
【０１９４】
アンタゴニストの潜在的な標的として、さらなる試験用に遺伝子を選択した。マイクロアレイ法において観察された発現データを検証するため、これら遺伝子について半定量的ＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。対象範囲の化学療法治療に対する曝露の後、結腸直腸細胞株（ＨＣＴ１１６、ＲＫＯ、ＨＴ２９、＆Ｈ６３０を含む）から抽出したＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ法を実施した。
【０１９５】
Ｑ−ＰＣＲ法を用いて選択した標的についての結果は、マイクロアレイ解析において観察された結果を検証した。ＣＰＴ−１１及び５−ＦＵによる治療の４８時間後におけるＲＫＯ細胞株、並びに、５−ＦＵによる治療の４８時間後におけるＨＣＴ１１６細胞において、ＡＲＥＧの上方調節が検証された（図１）。
【０１９６】
ＡＲＥＧ阻害剤に適する標的を作製するためには、他の生きている臓器と比較して、腫瘍組織中に選好的な上方調節が観察されるべきである。この実験のため、本発明者らは、標的のマウス相同体を用い、遺伝子について、マウス臓器における調節を検討した。解析された標的のいずれもが、検討されたマウス臓器における上方調節を示さなかったことは、化学療法による治療が、安定的な組織よりも癌細胞における発現に対してより強い影響を及ぼすことを示唆する。
【０１９７】
ｍＲＮＡレベルにおいて観察された標的の上方調節が、タンパク質レベルにおいて反映されたことを示すために、ウェスタンブロット解析を実施した。４８時間にわたるＣＰＴ１１又は５ＦＵ処置後に、ＲＫＯ及びＨＣＴ１１６のｐ５３野生型結腸直腸癌細胞溶解物におけるＡＲＥＧタンパク質発現を解析した。抗ＡＲＥＧ抗体を用いて、ウェスタンブロットをプローブした。ＨＣＴ１１６及びＲＫＯの両細胞株に対するＣＰＴ１１処置後に、ＡＲＥＧ発現の増強が観察された（図２）。
【０１９８】
共焦点顕微鏡を用いて、ＨＣＴ１１６細胞に対するＣＰＴ−１１処置（２４時間及び４８時間）のＡＲＥＧ発現レベルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を解析した。本発明者らは、非治療対照と比較した場合の各時点において、発現レベルの上昇を観察した（図３）。
【０１９９】
図４は、ＣＰＴ１１処置の４８時間後における、Ｈ６３０  ｐ５３変異結腸直腸癌細胞溶解物におけるＡＲＥＧタンパク質発現の解析を示す。抗ＡＲＥＧ抗体を用いて、ウェスタンブロットをプローブした。化学療法（Ａ及びＢは、２つの別個の実験を示す）後には、対照と比較してＡＲＥＧ発現の増強が観察された。このデータは、ＥｒｂＢ同族のリガンド（上方調節されることが示される）と組み合わせたＣＰＴ−１１（又は実際にはその類似体若しくは代謝物）を、ｐ５３変異癌の治療に用い得ることを裏付けるものである。
【０２００】
図５は、化学療法（４８時間にわたるＣＰＴ１１又は５−Ｆｕ処置のいずれか）を伴う／伴わないＨ４６０肺癌細胞における、ＡＲＥＧ及びベータアクチンＲＮＡ発現の解析を示す。３５サイクルのＰＣＲ法後にＲＮＡレベルを解析して、処置及び非処置試料との間の発現の相対差を決定した。このデータは、ＣＰＴ−１１及び５−Ｆｕの両チャレンジ後におけるＡＲＥＧ発現の増強を示す。
【０２０１】
【表２】
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【０２０２】
この化学療法に誘導されたＡＲＥＧの上方調節は、ｐ５３野生型及び変異結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴｌｌ６＋／＋；ＲＫＯ＋／＋、及びＨ６３０）を用いる、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方において観察された。ＡＲＥＧは、また、Ｈ４６０肺癌細胞及びＭＤＡ乳癌細胞中のｍＲＮＡレベルにおいても上方調節され、この効果がＡＲＥＧを発現する癌の範囲にわたり観察され得ることを示す。
【０２０３】
分子解析から見られる通り、これらのタンパク質は、異なる癌細胞株における化学療法による治療後に選択的に発現する。これは、癌細胞が、化学療法チャレンジに対する応答として、同じファミリーの６種類の異なる増殖因子を過剰発現することを示す。この応答は、癌細胞が、化学療法による損傷を克服するのに用いる方法であると思われる。これらのタンパク質を選択的に標的とすることにより、癌細胞生存におけるこれらの役割が少なくとも低下し、最良の場合は阻害され、これが、腫瘍増殖の軽減をもたらし得る。さらに、２つ以上の過剰発現リガンドの同時的な標的化（抗体などのアンタゴニスト分子による）は、有用な治療戦略を提供し得る。
【０２０４】
［実施例２］
［結腸直腸及び乳癌細胞株において化学療法により誘導されたＡＲＥＧの上方調節］
複数の癌細胞株において、ＡＲＥＧの上方調節がさらに確認された。ヒトＨＴ２９結腸直腸癌細胞及びヒトＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞において、ＩＣ５０用量のＣＰＴ１１による処置後に、ＡＲＥＧ  ｍＲＮＡの上方調節が観察された（図６Ａ及び６Ｂ）。さらに、ヒトＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞株におけるＩＣ５０用量の５−ＦＵによる処置後に、ＡＲＥＧ  ｍＲＮＡの上方調節が示された（図６Ｃ）。
【０２０５】
［癌細胞におけるＡＲＥＧ及びＨＢ−ＥＧＦのサイレンシング］
ｓｉＲＮＡは、非処置細胞、モックトランスフェクション、及び対照ｓｉＲＮＡと比較して、ＨＣＴ１１６結腸直腸細胞株におけるＡＲＥＧ（図７Ａ）及びＨＢ−ＥＧＦ（図７Ｂ）の発現を強力に下方調節した。図９及び図１１のそれぞれにおいて、ＡＲＥＧのノックダウンは、ＨＴ２９結腸直腸癌細胞及びＭＤＡ−ＭＢ２３１においてもまた示される。
【０２０６】
［結腸直腸癌におけるｓｉＲＮＡ及び化学療法による処置後における細胞増殖の相乗的な減弱］
ｓｉＲＮＡによるＡＲＥＧ及びＨＢ−ＥＧＦのサイレンシングを確認した後、ＭＴＴアッセイを実施して、これらの２つの遺伝子の下方調節が細胞増殖に対して及ぼす効果を検討した。
【０２０７】
ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ単独、ＨＢ−ＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ単独、及びＣＰＴ−１１の単剤療法は、非処置細胞、モックトランスフェクション、及び対照ｓｉＲＮＡと比較して、細胞生存率に対して著明な効果を及ぼさなかった。しかし、ＨＣＴ１１６のＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ及びＣＰＴ−１１による共処置は、細胞生存率の相乗的な低下をもたらした。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡをＨＢ−ＥＧＦ  ｓｉＲＮＡで置換したところ、同じ効果が観察された（図８）。
【０２０８】
別の結腸直腸癌細胞株であるＨＴ２９においても、ＨＣＴ１１６細胞について観察された結果と同様の結果が観察された。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ単独及び対照ｓｉＲＮＡ単独では、細胞増殖に対する著明な効果が生じなかった。ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡとＣＰＴ−１１との組合せは、細胞生存率に対して相乗効果を及ぼし、細胞増殖の低下をもたらした（図１０）。
【０２０９】
まとめると、これらの結果は、化学療法との組合せにおけるＡＲＥＧ／ＨＢ−ＥＧＦ発現の下方調節が、結腸直腸癌における細胞増殖の減弱に対して著明な効果を及ぼしたことを示す。
【０２１０】
ＡＲＥＧのサイレンシングと化学療法による治療との間の相乗効果は、乳癌における細胞増殖の減弱をもたらした。
【０２１１】
対照ｓｉＲＮＡ単独によるトランスフェクション、トランスフェクション試薬単独（モック）によるトランスフェクション、及び化学療法処置の後、細胞増殖の２０％の低下が観察された。細胞をＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ単独でトランスフェクトしたところ、さらに２３％の低下が観察された。各用量の５−ＦＵ（２．５〜６μＭ）による処置は、ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡ単独の結果と同様の結果を示した。しかし、ＡＲＥＧ  ｓｉＲＮＡと組み合わせた７．５μＭ  ５−ＦＵによる処置は、さらに２０％の増殖の低下（非処置の場合と比較して、全体で６０％の低下、図１２）をもたらした。
【０２１２】
ＡＲＥＧとＨＢ−ＥＧＦとの組合せを用いて、ｓｉＲＮＡ実験及びＭＴＴアッセイを実施したところ、本発明者らは、驚くべきことに、細胞増殖の著明な低下を観察した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞株において実験を実施し、ＡＲＥＧ及びＨＢ−ＥＧＦのノックダウンが、乳癌細胞株における細胞生存率に対して何らかの影響を及ぼすかどうかを評価した。
【０２１３】
注目すべきことに、ＡＲＥＧ及びＨＢ−ＥＧＦの共サイレンシングは、対照と比較して、細胞生存率に対して著明な低下をもたらした。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を標的ｓｉＲＮＡにより共処置したところ、対照と比較して〜７５％の細胞増殖の低下が観察された（図１３）。
【０２１４】
［ＡＲＥＧ特異的モノクローナル抗体の開発］
組換えヒトアンフィレグリンに対して、マウスモノクローナル抗体のパネルを作製した（図１４〜１６）。ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法（結腸直腸細胞株ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９に由来する全細胞溶解物）、及び共焦点顕微鏡解析によりこれらを特徴付け、ＡＲＥＧ特異的な認識を裏付けた（図１７〜２２）。
【０２１５】
［結腸直腸癌細胞株及び肺癌細胞株においてＡＲＥＧモノクローナル抗体を用いるＦＡＣＳ解析により示されるＡＲＥＧの上方調節］
ＨＣＴ１１６細胞及びＨ４６０細胞のフローサイトメトリー解析は、抗ＡＲＥＧモノクローナル抗体を用いて評価した場合におけるＡＲＥＧの細胞表面認識を示す（図２３は、ＡＲＥＧクローン４Ｇ５及び６Ｅ１１、並びにアイソタイプ対照により処置したＨＣＴ１１６細胞のＦＡＣＳ解析を示す）。さらに、解析前に４８時間にわたり２．５μＭイリノテカンにより処置した細胞は、ＡＲＥＧの細胞表面発現の最大４０％の上昇を示した。抗ＡＲＥＧクローン６Ｅ１１  １Ｅ９では、イリノテカンによる処置後のＨＣＴ１１６細胞において、２０％のＡＲＥＧ発現上昇を検出した（図２４）。
【０２１６】
ＦＡＣＳ解析は、また、肺癌細胞株Ｈ４６０に対しても実施された。２つのクローン、即ち、３Ｈ５及び３Ｆ８では、２．５μＭイリノテカンによる処置後に表面におけるＡＲＥＧ発現、及び、発現レベルの上方調節を共に検出した（図２５）。
【０２１７】
これらの結果は、本発明者らのＡＲＥＧモノクローナル抗体パネルが、ＨＣＴ１１６細胞の表面上において、ＡＲＥＧタンパク質を認識することを裏付ける。
【０２１８】
［ＡＲＥＧモノクローナル抗体による処置後の癌細胞における細胞増殖の減弱］
癌細胞株であるＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞（図２６＆図２７）及びＨＣＴ１１６結腸直腸癌細胞（図２８）に対して、ＭＴＴアッセイを実施し、細胞増殖に対するＡＲＥＧモノクローナル抗体の効果を確認した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞株における異なるクローンの活性をスクリーニングしたところ、複数のクローンが、非処置細胞と比較して、〜４０％の細胞増殖の低下を示した。ＨＣＴ１１６細胞では、より著明な効果が観察され、クローン４Ｇ５及び６Ｅ１１では、〜６０％の細胞生存率の低下が観察された。図２９は、ＡＲＥＧクローン６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８（６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６と同じクローンであることが示されている）による、ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳癌細胞における細胞増殖に対する同様の効果を示す。図３０及び３１は、ＨＣＴ１１６細胞株におけるＡＲＥＧ抗体の効果を示す。図３０では、細胞生存率の６５％の低下が観察され、図３１は、細胞増殖の５０％の低下を示す。図３２は、肺癌Ｈ４６０細胞株におけるＡＲＥＧ抗体６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６の効果を示し、その効果を、アイソタイプの対照抗体と比較し、抗体が肺癌細胞の細胞生存率を著明に減弱することを示す。まとめると、これらの結果は、ＡＲＥＧモノクローナル抗体が、結腸直腸癌、肺癌、及び乳癌を含むＡＲＥＧ発現癌細胞の細胞生存率に対して著明な効果を及ぼすことを示す。
【０２１９】
［ＨＢＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ及びＡＲＥＧ抗体による処置後の結腸直腸癌細胞に対する増殖の相乗的減弱］
ＭＴＴ細胞生存率アッセイを実施することにより、ＡＲＥＧ抗体と組み合わせたＨＢＥＧＦ  ｓｉＲＮＡの下方調節効果を探索した（図３３）。ＨＢＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ単独による細胞増殖の低下がわずかであったのに対し、ＡＲＥＧ抗体６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８は、細胞増殖を〜５０％低下させた。ＨＢＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ及び６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８を組み合わせて添加したところ、細胞生存率のさらなる低下が観察された。この効果が相乗的であるかどうかを見るため、Ｋｅｒｎ  １９８８により説明され、Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ  １９９８により改変されたＲＩ値を計算した。ＲＩ値は、Ａ及びＢの組合せについて、細胞生存率の観察値（Ｓｏｂｓ）に対する生存率の予測値（薬剤Ａ単独により観察される生存率と、薬剤Ｂ単独により観察される生存率との積として定義されるＳｅｘｐ）の比率（ＲＩ＝Ｓｅｘｐ／Ｓｏｂｓ）として計算される。相乗効果は、ＲＩ＞１として定義される。６Ｅ１１  １Ｅ９  ２Ｄ８のＲＩ値は、約２であった。しかし、６Ｅ１１  １Ｅ９  １Ｃ６のＲＩ値は、５を上回ると計算された。まとめると、これらの結果は、Ｅｒｂリガンド又はＥＧＦと関連する癌（結腸直腸癌、乳癌、肺癌を含む）の治療におけるＨＢＥＧＦ及びＡＲＥＧの両方に対する標的化の組合せが、細胞増殖の相乗的減弱をもたらすことを示す。
【０２２０】
非応答性腫瘍又は化学療法耐性癌の発症は、治療の奏効にとって主要な障害のままである。単独又は組合せのいずれかである特定の療法が、特定の腫瘍に対して有効であるかどうかの予測を可能とするツールには、明らかなニーズが存在する。さらに、用いられる治療レパートリーを増加させる新規の治療レジメンに対するニーズも依然として存在する。
【０２２１】
併用療法は、異なる機構を介して腫瘍に対して作用することにより、患者における奏効率を改善することで有望な結果を示しており、本発明者らのデータは、単独で、又は化学療法と組み合わせて用いられる、ＡＲＥＧ及びＨＢ−ＥＧＦに対して特異的な阻害分子、例えば、アンタゴニスト抗体を用いて、結腸直腸癌、肺癌、乳癌を含む広範な高悪性度の癌を治療し得る可能性があることを示唆する。
【０２２２】
本明細書において参照されるすべての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の説明された実施形態に対する各種の改変及び変更は、本発明の範囲及び精神から逸脱しない限りにおいて、当業者には自明であろう。本発明を、特定の好ましい実施形態との関係で説明してきたが、特許請求に係る発明は、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、本発明を実施する説明された様態の、当業者には明らかな各種の変更は、本発明によって包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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