(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ:
a)少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する、少なくとも一つの抗生物質を含む、酵素を含まない液状抗生物質組成物による、哺乳動物に由来する組織の灌流、
b)単一細胞懸濁液を獲得するための、組織の、抗生物質を含まない酵素処理の実施、及び
c)滅菌された調製品の獲得
を含み、ステップb)に基づく酵素処理がステップa)に続いて行われる、哺乳動物の組織に由来する滅菌された調製品の製造法。
【請求項２】
組織が肝組織である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
酵素処理がコラゲナーゼ処理及び/又はプロテイナーゼ処理である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
ステップa)での灌流時間が30〜120分であり、灌流の間に温度が高められる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
液状抗生物質組成物が、少なくとも二つの灌流用緩衝液中、詳しくは少なくとも一つのEGTA又はEDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液、及び少なくとも一つのリン酸-HEPES-緩衝液中に存在する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップa)に先立ち、液状抗生物質組成物により組織の表面が洗浄される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップb)に続いて少なくとも一回の、抗生物質を含まない洗浄用緩衝液による洗浄ステップが実施される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、滅菌された単一細胞調製品の製造法、及びそのように製造された調製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝移植は、急性、又は慢性の肝不全において最も重要な人命救助措置である。ドナー臓器によってのみでは満たすことができない移植材料への需要に対処するために、過去数年の間に、完全臓器移植への対案法、例えば、部分肝移植、又は肝細胞調製品の移植が開発された。
【０００３】
単一細胞調製品が特に興味をそそるのは、臓器移植に適さないドナー臓器から獲得できるからである。肝組織から肝細胞を獲得するためには、コラゲナーゼ含有及びEDTA含有緩衝液を使用する二段階灌流法が公知である(BerryとFriend、1969年、The Journal of Cell Biology、第43巻、506〜520頁)。その際、コラゲナーゼ含有緩衝液で肝組織を灌流することによって、個々の細胞が酵素により組織塊から解放される。
【０００４】
獲得された単一細胞調製品は、医薬品であるため、いかなる場合にも微生物的無菌性(mikrobielle Sterilitaet)が保証されている必要がある。しかしながら、調製品のおよそ70〜80%ではこのことが当てはまらず、それというのも、たいていの場合、臓器の輸送培地中にすでに、通常はドナーの臓器材料ないし組織材料に由来する汚染が存在するためである。しかしながら、ヒトのドナー臓器のように非常に貴重な材料においては、微生物で汚染されていない移植可能な組織調製品又は細胞調製品を高収率で得ることが望まれる。加熱、オートクレーブ、又は照射のような従来の除染法は、細胞の生存能力の維持の妨げとなるため、組織を滅菌するためには使用することができない。
【０００５】
抗生物質を用いて組織を除染する方法もすでに公知である。この除染法は、例えば、角膜移植片の保管(米国特許第4,695,536号)又は心臓弁移植片の除染のために開発された(国際特許92/12632号及び欧州特許第0889690号)。ここで使用される抗生物質組成物の作用時間は、24時間から、数週間にわたる保管にまで達する。しかしながら、24時間という作用時間でさえも、肝臓のようにきわめて繊細な組織には適さない。その上、この方法では除染は表面的にしか行われない。組織及び細胞を対象とした、抗生物質に基づく除染法に課されるさらなる要求事項は、その方法並びにそこで使用される薬剤が、肝細胞の獲得にもその細胞品質及び生存能力にも不利な影響を及ぼしてはならない上に、品質管理に使用される無菌性証明系と適合性がなくてはならないということにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第4,695,536号
【特許文献２】国際特許92/12632号
【特許文献３】欧州特許第0889690号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】BerryとFriend、1969年、The Journal of Cell Biology、第43巻、506〜520頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
つまり、本発明の技術的課題は、前記の不利点を克服する、やさしくかつ効果的な組織の除染法、つまり滅菌法を提供することにあり、特に、これらの組織又はその中に含有される細胞がきわめて繊細である、つまり例えば肝臓に由来する場合でも、より効果的かつより迅速な組織の滅菌を、特に穏やかな条件下において、特に組織の生存能力を同時に維持しながら保証するような方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の技術的課題は、独立特許請求項に記載の教示によって解決される。それに応じて、特に好ましい実施形態では、本発明は、以下のステップ:a)液状抗生物質組成物による、哺乳動物に由来する組織の灌流、b)特に、単一細胞懸濁液を獲得するための、組織の酵素処理の実施、及びc)滅菌された調製品、特に単一細胞調製品、つまりその中で細胞がもはや組織複合体(Gewebeverbund)中に存在するのではなく相互に単離して個々の細胞又は場合によっては細胞集合体又はより小さな細胞凝集体として存在する調製品の獲得を含む、哺乳動物、特にヒトの組織に由来する滅菌された調製品、特に単一細胞調製品の製造法に関する。それに応じて、本発明は、有利なことには、哺乳動物、特にヒトの組織、つまり例えば細胞塊又は臓器から、in vitro法において、滅菌された調製品、特に単一細胞調製品、好ましくは単一細胞懸濁液を製造することができる方法を提供する。有利なことには、本発明によると、決定的な無菌検査に特に適した細胞調製品を得ることができる。したがって、本発明による方法は、得られた調製品の無菌性に関する高い確実性を提供する無菌検査を可能にする。
本発明はまた、以下に関する。
[１]
以下のステップ:
a)液状抗生物質組成物による、哺乳動物に由来する組織の灌流、
b)単一細胞懸濁液を獲得するための、組織の酵素処理の実施、及び
c)滅菌された調製品の獲得
を含む、哺乳動物の組織に由来する滅菌された調製品の製造法。
[２]
組織が肝組織である、[１]に記載の方法。
[３]
ステップb)に基づく酵素処理がステップa)と同時に行われる、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]
ステップb)に基づく酵素処理がステップa)に続いて行われる、[１]又は[２]に記載の方法。
[５]
酵素処理がコラゲナーゼ処理及び/又はプロテイナーゼ処理である、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]
ステップa)での灌流時間が30〜120分であり、灌流の間に温度が高められる、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７]
液状抗生物質組成物が少なくとも一つのコラゲナーゼ及び/又は少なくとも一つのプロテイナーゼを含有する、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８]
液状抗生物質組成物が、少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在し、少なくとも一つの抗生物質を含む、[１]〜[７]のいずれかに記載の方法。
[９]
液状抗生物質組成物が、少なくとも二つの灌流用緩衝液中、詳しくは少なくとも一つのEGTA又はEDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液、及び少なくとも一つのリン酸-HEPES-緩衝液中に存在する、[１]〜[８]のいずれかに記載の方法。
[１０]
ステップa)に先立ち、液状抗生物質組成物により組織の表面が洗浄される、[１]〜[９]のいずれかに記載の方法。
[１１]
ステップb)に続いて少なくとも一回の、抗生物質を含まない洗浄用緩衝液による洗浄ステップが実施される、[１]〜[１０]のいずれかに記載の方法。
[１２]
[１]〜[１１]のいずれかに記載の方法で製造された、滅菌された哺乳動物細胞調製品。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、哺乳動物に由来する提供された組織を起点とし、この組織は、例えば、生きている哺乳動物、又は死んだ哺乳動物、特に死んだばかりの哺乳動物に由来してもよい。特に好ましい実施形態では、哺乳動物とは、ヒトあるいは動物、例えば有用動物又は実験動物、特にブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、サル、霊長類、トリ、若しくはげっ歯類と理解される。
【００１１】
ドナー哺乳動物から採取され、そのように本発明のために提供された組織、特に細胞塊、又は臓器が、原料として本発明において使用される。本発明によると、そのように提供された組織を抗生物質組成物と接触させ、好ましくは組織固有、特に臓器固有の脈管系を利用しながら灌流させる。さらに、本発明によると、抗生物質組成物で組織を灌流する間に、又はその後のいずれか一方において、組織を酵素処理し、その酵素処理の過程で組織塊が解離し、単一細胞懸濁液が得られる。このような方法により、抗生物質組成物中において単一細胞が存在することが達成され、この単一細胞は、そのため、特に効果的に抗生物質により処理され、その結果、滅菌され得る。
【００１２】
本発明との関連では、単一細胞調製品又は単一細胞懸濁液とは、特に、その中で細胞が個別に、かつ相互に持続的に物理的接触することなく存在する調製品又は懸濁液と理解される。さらなる一実施形態では、単一細胞調製品又は単一細胞懸濁液とは、存在する細胞の大多数、特に細胞の50%超、60%超、70%超、80%超、90%超、又は95%超が、相互に解離し、かつ相互に持続的に物理的接触することなく存在しており、100%に加算される細胞の残りは、細胞集合体、小さめ又は大きめの細胞凝集体、及び完全には解離していない、組織塊の残りの形状で存在するとも理解される。
【００１３】
本発明との関連では、灌流とは、特に組織灌流、つまり中空臓器を、ないし組織に含有される脈管、特に血管を、液体、つまり特に本抗生物質組成物で貫流させることと理解される。本発明との関連では、灌流は、インキュベーションの特に好ましい実施である。
【００１４】
本発明との関連では、組織とは、細胞の、特に機能及び/又は形態が同一の、まとまりのある塊と理解され、特に臓器、例えば肝臓、特に肝臓からの臓器部分、組織塊、又は切片材料(Sektionsmaterial)、特に肝臓切片材料とも理解される。本発明によると、使用される組織は、肝組織、例えば、完全な肝臓、又はその一部、例えば肝臓切片材料である。本発明により製造された単一細胞懸濁液は、好ましくは肝細胞懸濁液である。
【００１５】
特に好ましい一実施形態では、ステップa)をステップb)と共に、つまり同時に又は時間的に重なって実施する、つまり、好ましくは少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する抗生物質組成物による灌流を実施し、ただしそれと同時に、少なくとも一つの灌流用緩衝液中に、少なくとも一つの、単一細胞懸濁液の獲得を目的として組織を酵素処理するための酵素が存在する。もっとも、好ましくは少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する、酵素を含まない抗生物質組成物での灌流をまず実施してから、ステップb)に基づく、抗生物質を含まない酵素処理を行うことも好ましく、この酵素処理の枠内で組織塊が解離し、ステップa)で使用した組織の単一細胞が得られるため、ステップc)では、完全に滅菌された単一細胞が得られる。
【００１６】
本発明によると、任意選択的なステップにおいて、使用される組織を、本発明による灌流に先立ち抗生物質組成物、好ましくは本発明により使用される抗生物質組成物で表面的に洗浄する、特に、灌流することなしに、つまり一次的な表面滅菌を実施することも可能である。その際、インキュベーション時間は、好ましくは5〜60分のみ、好ましくは5〜45分、特に好ましくは5〜30分である。場合によっては、そのように短いインキュベーション時間の場合には、灌流の際よりも高い抗生物質濃度を使用することも可能である。本発明の一実施形態では、表面洗浄を、ステップa)及び/又はb)の間に実施することもできる。
【００１７】
本発明により予定される、単一細胞懸濁液を獲得するための、組織の酵素処理は、好ましくは少なくとも一つ、又は好ましくは少なくとも二つの酵素を使用し、この酵素は、好ましくは水性溶液、特に緩衝溶液中、特に好ましい実施においては液状抗生物質組成物中に存在する。酵素処理に使用される酵素は、組織塊を解離すること、特に細胞間接着、及び細胞と細胞外マトリクスとの接着を溶解して、この細胞塊から、細胞を損傷又は破壊することなく単一細胞懸濁液を製造することができる。本発明の好ましい実施形態では、特に適した酵素は、コラゲナーゼ、プロテイナーゼ、及びこれらの混合物である。本発明との関連では、プロテイナーゼとはプロテアーゼとも理解される。
【００１８】
好ましくは、コラゲナーゼ及びプロテアーゼ、特に中性プロテアーゼからなる混合物が、コラゲナーゼ1ユニット対プロテアーゼ40〜60、好ましくは50ユニットの酵素活性比にある。
【００１９】
したがって、1回の灌流につき、好ましくはおよそ2000〜4000ヴュンシュ(Wuensch)ユニットのコラゲナーゼが、100000カゼインユニットと組み合わせて、又は400〜2500ユニットのクロストリジオペプチダーゼIと組み合わせて使用される。
【００２０】
つまり、本発明による方法の特に好ましい一実施形態では、好ましくは少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する、少なくとも一つの、組織を単一細胞に解離するための酵素、特にa)少なくとも一つのコラゲナーゼ、又はb)少なくとも一つのコラゲナーゼ及び少なくとも一つのプロテイナーゼ、特に中性プロテイナーゼを含有する抗生物質組成物により、組織がin vitroで灌流される。このことは、滅菌及び組織塊からの個々の細胞の解離、それゆえ滅菌された単一細胞調製品の獲得をもたらす。対案として、別の好ましい一実施形態では、コラゲナーゼ、又はコラゲナーゼ及びプロテイナーゼが、少なくとも一つの抗生物質活性物質、好ましくは複数の抗生物質活性物質とは別々に、少なくとも一つの灌流用緩衝液、好ましくはリン酸-HEPES-緩衝液中、固有の溶媒、例えば緩衝液中に存在しており、抗生物質による灌流ステップとは別々に、つまりそれに続いて使用される。
【００２１】
本発明によると、本発明により使用される抗生物質組成物は、液状で存在し、例えば溶液又は懸濁液として、好ましくは水性溶液又は水性懸濁液として、特に好ましくは少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する。
【００２２】
特に好ましい実施形態では、液状抗生物質組成物が、少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ、特に少なくとも三つ、好ましくは少なくとも四つ、さらにはより多数の異なる抗生物質を有する。これらの抗生物質は、βラクタム系抗生物質の非ペニシリン、アミノグリコシド、グリコペプチド系抗生物質、及びポリペプチド系抗生物質からなる群から選択されていてもよい。
【００２３】
本発明により使用される抗生物質組成物は、好ましい実施形態では、使用される酵素処理、特にコラゲナーゼ処理又はプロテイナーゼ処理に対して、不利な効果又は阻害効果を示さない。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態では、抗生物質組成物がコラゲナーゼ及びプロテイナーゼを含まなくてもよい。
【００２５】
本発明により好ましく使用される抗生物質組成物、特に抗生物質組合せは、有利には、単離された細胞の生命力及び形態に対して不利な影響を及ぼさないことを特徴とする。
【００２６】
少なくとも一つの抗生物質、特に複数の抗生物質が、本発明による組成物中において、好ましくはドナー臓器の輸送培地中に存在するような細菌といった微生物の成長、増殖及び/又は生存能力を本質的に減退させる又は阻害する一方で組織又は細胞の生存能力は本質的に維持されたままである量で存在する。
【００２７】
本発明との関連では、抗生物質組成物とは、抗生物質効果を発揮する、物質的な組成物と理解される。本発明との関連では、抗生物質効果とは、有害効果、特に、殺滅、繁殖阻害、繁殖減退、成長阻害、又は成長減退のような抗菌性有害効果、特に、微生物、特に細菌、詳細にはグラム陽性同様にグラム陰性の好気性及び嫌気性の細菌、真菌類、原生動物、又はそれらの、芽胞若しくは原基(Keime)のような繁殖体(Fortpflanzungsprodukte)を殺滅する効果と理解される。特に好ましくは、抗生物質組成物は、哺乳動物ドナー組織若しくは哺乳動物ドナー臓器内又は表面に、あるいはそれらの輸送培地中に存在する微生物に対して特に効果的である。
【００２８】
したがって、本発明との関連では、抗生物質効果とは、好ましくは微生物が殺滅されること、つまり抗生物質組成物が、殺微生物性、好ましくは殺細菌性に作用することと理解される。本発明によると、本発明の一実施形態では、抗生物質効果は、必ずしも殺微生物効果を伴う必要はなく、微生物が単にその生命機能、例えば成長、代謝、又は繁殖の点で制限されている、つまり静微生物性、特に静細菌性の効果が現れるということを意味してもよい。
【００２９】
本発明との関連では、抗生物質効果という概念は、好ましくは滅菌効果とも理解され、つまり特に好ましい方法で、抗生物質組成物が滅菌性に作用する、つまり使用される材料、例えば組織及び/又は細胞から、生きている微生物を、好ましくは完全に又はほぼ完全に除去する、ないしこれらを殺滅する。その際、滅菌は、原基、つまり微生物の早期発生段階の除去又は殺滅のみならず、微生物の耐久体(Dauerform)を含めた別のすべての発生段階及び状態段階、又は微生物の感染性部分の除去又は殺滅もまた含む。滅菌とは、増殖能力のある微生物の数の著しい低下とも理解され、特に、増殖能力のある微生物の残存量が、滅菌処理物の一単位量において最大限10-6コロニー形成単位であると理解される。本発明との関連では、滅菌とは除染とも理解される。
【００３０】
特に好ましい実施形態では、液状抗生物質組成物が、少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する。
【００３１】
本発明は、つまり、好ましくはβラクタム系抗生物質の非ペニシリン、アミノグリコシド、グリコペプチド系抗生物質、及び/又はポリペプチド系抗生物質からなる、好ましくは少なくとも一つの灌流用緩衝液中の抗生物質組成物が使用される方法に関する。本発明により使用される抗生物質組成物は、哺乳動物組織及び哺乳動物細胞、好ましくはヒトの組織、臓器、又は臓器部分、及びヒトの細胞、特に肝組織及び肝細胞のin vitro滅菌に適しており、特に適しておりかつ決定されている。単離された組織の滅菌は、本発明により使用される抗生物質組成物での灌流により達成され、ただし、生来の脈管系が利用される。これにより、組織全体の、さらには内部の到達しにくい組織の微生物的な滅菌も、組織の表面のみならず達成される。このことは、中でも、肝臓の場合は特に重要であるが、それというのも瀕死の患者においては、様々な規模で細菌が腸壁を移動するため、場合によっては、採取されるべき臓器の門脈系を介して灌流によって流し込まれるかもしれないからである。同様に、生理的には腸内細菌叢と自由に接触している胆管系を介して逆流汚染が起こりかねない。したがって、最適な作業技術にもかかわらず、そのような汚染は、決して完全には阻止され得ず、本発明により使用される抗生物質組成物を用いた、やさしくかつ効果的な除染を特に欠かせないものとする。その上、そのような「内部」汚染は、場合によっては、輸送培地中の病原体がまずは検出不可能であって、組織材料を酵素解離する過程ではじめて放出されるということをもたらすかもしれない。したがって、本発明による抗生物質組成物を用いた灌流による、単離された組織の滅菌は、有利なことには、そのような「内部」汚染の早期の除去をもたらす。したがって、抗生物質の添加なしには、肝臓から製造された肝細胞調製品のほぼ100%は、汚染された輸送培地により同様に汚染されている。しかしながら、本発明による除染によって、65%を超える滅菌された肝細胞調製品を製造することができた。
【００３２】
好ましくは、少なくとも一回の灌流ステップ、好ましくは二回、三回、四回、又は多数回の灌流ステップ、例えば三回のステップにおいて組織を灌流する。好ましい実施形態では、一灌流ステップにつき、それぞれ3〜5リットルの、抗生物質含有及び/又はコラゲナーゼ/プロテイナーゼ含有灌流用緩衝液、好ましくはリン酸-HEPES-緩衝液を使用することができる。特に好ましくは、三回の灌流ステップにおいて、すべての三つの灌流用緩衝液、好ましくはまず一つのEGTA又はEDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液、続いて二回のリン酸-HEPES-緩衝液、が抗生物質を含み、ただし、コラゲナーゼ/プロテイナーゼは、好ましくは最後の灌流ステップにおいてのみ使用される。特に好ましいのは、三回の灌流ステップにおいて、最初の二つの灌流用緩衝液のみが抗生物質を含み、コラゲナーゼ/プロテイナーゼが、最後の灌流ステップにおいて、抗生物質を含まない緩衝液中で使用されることでもある。
【００３３】
特に好ましい一実施形態では、抗生物質組成物が、少なくとも二つの灌流用緩衝液中、特に二つの灌流用緩衝液中、特に、あるいは詳しくは少なくとも一つのEGTA若しくはEDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液及び少なくとも一つのリン酸-HEPES-緩衝液、又は別の適した緩衝溶液中に存在する。
【００３４】
好ましくは、組織材料の灌流、つまり貫流に使用される灌流用緩衝液は、リン酸-HEPES(2-(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル)-エタンスルホン酸)-緩衝液であるが、EGTA(エチレングリコール-ビス-(アミノエチルエーテル)-N,N'-テトラ酢酸)又はEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)含有リン酸-HEPES-緩衝液も好ましい。使用される灌流用緩衝液は、好ましくは生理的pH値7〜8、特に好ましくは7.3〜7.8、特に7.5を有する。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、灌流時間も酵素処理時間も、それぞれ10〜360分、好ましくは20〜240分、特に30〜120分である。特に好ましい一実施形態では、組織の灌流及び酵素処理が、好ましくは共に、特に10〜360分、好ましくは20〜240分、特に30〜120分の間、行われる。
【００３６】
さらなる特に好ましい一実施形態では、灌流に関しても酵素処理に関しても、温度は、9〜39℃、好ましくは10〜37℃、特に25〜37℃である。灌流及び場合によっては酵素処理の間、好ましい一実施形態では、灌流用抗生物質組成物及び灌流される臓器の温度を、特に好ましくは、10℃未満、例えば4℃〜10℃の範囲の初期温度から、30℃〜39℃の範囲の最終温度まで、例えば37℃に高める。
【００３７】
本発明の特に好ましい一実施形態では、使用される抗生物質組成物が、a)少なくとも一つのコラゲナーゼ、又はb)少なくとも一つのコラゲナーゼ及び少なくとも一つのプロテイナーゼ、特に中性プロテイナーゼを含有する。コラゲナーゼ、ないしコラゲナーゼ及びプロテイナーゼの存在により、インキュベーション、特に灌流の間に、組織材料の解離が達成され、その結果、単一細胞懸濁液を得ることができる。
【００３８】
本発明は、好ましい実施において、in vitroでの、組織の滅菌法、又は哺乳動物に由来する滅菌された細胞調製品の製造法も提供し、ただし、a)哺乳動物に由来する組織を、適した条件下、特に適した時間、適した温度において、本発明による抗生物質組成物を用いて灌流し、b)時間的に重なって、つまり少なくともある一定時間は同時に、又は引き続いて、組織から単一細胞懸濁液を製造するための酵素処理を実施し、c)滅菌された細胞調製品を得る。
【００３９】
本発明の特に好ましい一実施形態では、本発明による方法を利用して得られた、滅菌された細胞調製品は、続いて少なくとも一回、例えば、一回、二回、三回、若しくは多数回の洗浄ステップ、一回の単離ステップ、又は両方ともを経るが、この、ないしこれらのステップは、使用された抗生物質、酵素、又は両方ともの濃度を低下させる、ないし得られた調製品からこれらを完全に又はほぼ完全に除去する。特に好ましくは、ステップb)に続いて、例えば、ステップc)の前又は後に、好ましくは抗生物質を含まない洗浄用緩衝液を用いて一回又は複数回の洗浄ステップを実施する。これにより、有利なことには、本発明による方法において使用される抗生物質及び酵素が、完全に又はほぼ完全に除去され、得られた単一細胞調製品は、続く無菌検査に適している。
【００４０】
好ましい実施においては、獲得された、滅菌された細胞調製品が、保管のために凍結保存されてもよい。このためには、凍結保存に適した媒体中で、適した低温において調製品を保存する。
【００４１】
有利なことには、本発明による方法を介して著しく迅速に、より高い細胞収率(獲得された総細胞数)、より高い比細胞収率(使用した肝組織グラムごとの細胞数)、並びに単離され滅菌された肝細胞のより高い生命力(懸濁液中の生細胞の比率)が達成可能であることを、本発明により示すことができた。
【００４２】
本発明により使用される抗生物質組成物の使用は、有利なことには、例えば、移植用に提供はされるもののそれに適さないドナー臓器から、特に迅速、やさしく、かつ効果的に、これまでは獲得不可能であった、滅菌された単一細胞調製品、特に好ましくは細胞懸濁液を、特に肝細胞から、例えば培養培地中において獲得可能とさせる。
【００４３】
本発明による方法は、実施される抗生物質処理が、同時か又はそれに続いてのいずれか一方で実施される酵素処理、特にコラゲナーゼ処理及び/又はプロテイナーゼ処理を損なうことなく、その上、続いて実施される無菌性検査にも不利な影響を及ぼさないという利点を有する。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明により使用される抗生物質組成物は、つまり組織塊又は臓器塊中に存在する単一細胞の培地中での製造ではなく、組織に由来する滅菌された細胞懸濁液の製造に適している。単離された哺乳動物組織又は単離された臓器を貫流させるために、好ましくは、組織ないし臓器のサイズに適合させた体積の、本発明により使用される、少なくとも一つの灌流用緩衝液中に存在する抗生物質組成物が使用される。この体積は、当業者には公知のように、経験的に算出することができる。
【００４４】
本発明は、滅菌された細胞調製品、つまり、本発明の方法のいずれか一つにより製造された、哺乳動物に由来する細胞、細胞懸濁液、又は単一細胞懸濁液にも関する。
【００４５】
本発明のさらなる有利な形態は、従属請求項から明らかになる。
【００４６】
本発明を、以下の実施例において詳細に説明する。これらの実施例は、限定的に理解されるべきではなく、むしろ本発明の利点が詳細に説明され、具体的な実施例を手がかりに説明されるものである。
【００４７】
（実施例）
【実施例１】
【００４８】
抗生物質処理及び酵素処理を同時に行う、滅菌された肝細胞懸濁液の製造
A.実施
肝臓に由来する滅菌された肝細胞懸濁液を製造するために、以下の抗生物質組成物を製造した:
抗生物質は、記載されるすべての灌流用緩衝液に以下の濃度で加えた:
【表１】
0005859532.tif 000002
【００４９】
全臓器移植には適さない、複数ドナーの肝臓をまず表面的に抗生物質含有リン酸-HEPES-緩衝液5Lを用いて、室温におき30分洗浄し、続いて三ステップにおき以下の体積の抗生物質含有緩衝液、pH7.25〜7.45で灌流した:
1.EDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液5L;灌流10分;20〜40℃;
2.リン酸-HEPES-緩衝液5L;灌流10分;25〜40℃;
3.コラゲナーゼ/プロテアーゼ含有リン酸-HEPES-緩衝液3L;灌流24分;25〜40℃
コラゲナーゼ/プロテアーゼ濃度:2000ヴュンシュユニットのコラゲナーゼI及び400〜2500ユニットのプロテアーゼ(クロストリジオペプチダーゼI)からなる組合せ。
【００５０】
酵素含有及び抗生物質含有緩衝液での灌流時間は、全体として44分であった。灌流には、使用された肝臓の生来の血管系を利用した。
【００５１】
灌流の間、灌流される臓器及び周辺の温度を、ゆっくりと<10℃から37℃に高めた(緩衝液温度は室温と40℃との間)。
【００５２】
細胞を組織から単離した後に複数回、抗生物質濃度が、使用された抗生物質濃度の1/1000未満の濃度になるまで、抗生物質を含まない緩衝液で洗浄した。
【００５３】
その中で臓器が供給された輸送培地からも、凍結保存後の、滅菌された細胞懸濁液からも、無菌検査用のサンプルを採取した。
【００５４】
B.結果
輸送培地中には、以下の微生物が検出された:エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、ただし、微生物的な成長が認められるまでの、自動インキュベーションの時間、いわゆる「陽性となるまでの時間(Time to positivity)」は、1.67時間であった。
【００５５】
本発明により滅菌された細胞懸濁液中には、凍結保存後に、14日間インキュベーションした後にも菌を検出することはできなかった。
【００５６】
抗生物質を含まない緩衝液での洗浄ステップを十分な回数行った後に、製造された細胞懸濁液を用いて無菌検査を実施することができる。
【実施例２】
【００５７】
抗生物質処理及び酵素処理を逐次的に行う、滅菌された肝細胞懸濁液の製造
A.実施
全臓器移植には適さない複数ドナー肝臓をまず表面的に、抗生物質濃度が2倍のリン酸-HEPES-緩衝液5Lを用いて、室温におき8分洗浄し、続いて二ステップにおき抗生物質含有緩衝液を用いて、さらなる一ステップにおきコラゲナーゼを含み抗生物質を含まない緩衝液を用いて以下の体積、pH7.25〜7.45で灌流した:
1.EDTA含有リン酸-HEPES-緩衝液10L;灌流68分;20〜40℃;
2.リン酸-HEPES-緩衝液5L;灌流10分;25〜40℃;
3.コラゲナーゼ/プロテアーゼを含み抗生物質を含まないリン酸-HEPES-緩衝液3L;灌流24分;25〜40℃
コラゲナーゼ/プロテアーゼ濃度:2000ヴュンシュユニットのコラゲナーゼI及び400〜2500ユニットのプロテアーゼ(クロストリジオペプチダーゼI)からなる組合せ。
【００５８】
酵素含有及び抗生物質含有緩衝液での灌流時間は、全体として102分であった。灌流には、使用された肝臓の生来の血管系を利用した。
【００５９】
灌流の間、灌流される臓器及び周辺の温度を、ゆっくりと<10℃から37℃に高めた(緩衝液温度は室温と40℃との間)。
【００６０】
細胞を組織から単離した後に複数回、抗生物質濃度が、使用された抗生物質濃度の1/1000未満の濃度になるまで、抗生物質を含まない緩衝液で洗浄した。
【００６１】
その中で臓器が供給された輸送培地からも、凍結保存後の、滅菌された細胞懸濁液からも、無菌検査用のサンプルを採取した。
【００６２】
B.結果
輸送培地中には、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus Aureus)を検出することができた。微生物的な成長が認められるまでの、自動インキュベーションの時間、いわゆる「陽性となるまでの時間(Time to positivity)」は、3.85時間であった。
【００６３】
本発明により滅菌された細胞懸濁液中には、凍結保存後に、14日間インキュベーションした後にも菌を検出することはできなかった。
【００６４】
抗生物質を含まない緩衝液での洗浄ステップを十分な回数行った後に、製造された細胞懸濁液を用いて無菌検査を実施することができる。