(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が膵癌を有するかまたは膵癌を有さないかの可能性について試験するための方法であって、該方法は：
個体からの生体サンプルにおいて、
C5及びCTSB、C5a及びCTSB、CTSB及びETHE1、CTSB及びHAMP、CTSB及びTHBS4、KIT及びCTSB、C9及びCTSB、CTSB及びKLK7、CTSB及びC2、C5及びAPOA1、CTSB及びCRP、CCL23及びCTSB、C5-C6及びCTSB、CTSB及びIL11RA、CCL18及びCTSB、APOA1及びCTSB、C5及びCSF1R、GDF11及びCTSB、C5及びC2、C2及びTFPI、C5及びCCL18、C2及びIL11RA、並びにTIMP1及びC5からなる群から選択される少なくとも一つの２バイオマーカーのパネルにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出すること、
を含み、
C5のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5aのアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びETHE1のアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びHAMPのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びTHBS4のダウンレギュレーション；
KITのダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C9のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びKLK7のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びAPOA1のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びCRPのアップレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5-C6のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL18のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
APOA1ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCSF1Rのアップレギュレーション；
GDF11ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びTFPIのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCCL18のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；及び/又は
TIMP1のアップレギュレーション及びC5のアップレギュレーション
は、個体が膵癌を有する増大した可能性を示す、上記方法。
【請求項２】
前記試験が、膵癌と、膵炎または胃腸障害などの良性の状態との鑑別のための試験である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体が、腹部の腫瘤を有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカー値を検出することが、インビトロでの分析を行うことを含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記インビトロでの分析が、前記バイオマーカーそれぞれに対応する少なくとも１種の捕捉試薬を含み、さらに前記少なくとも１種の捕捉試薬が、アプタマーおよび抗体からなる群より選択されることも含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インビトロでの分析が、イムノアッセイ、アプタマーベースの分析、および、組織学的または細胞学的な分析からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記生体サンプルが、全血、血漿、血清および膵液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記生体サンプルが、血漿である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生体サンプルが膵臓組織であり、ここで前記バイオマーカー値が、前記膵臓組織の組織学的または細胞学的な解析から導き出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記個体が、ヒトである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記個体が、喫煙、アルコール摂取または膵癌の家族歴のために膵癌に関して高リスクを有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
膵癌の可能性を示すためのコンピューターによって実施される方法であって、該方法は：
コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること、ここでバイオマーカー情報は、C5及びCTSB、C5a及びCTSB、CTSB及びETHE1、CTSB及びHAMP、CTSB及びTHBS4、KIT及びCTSB、C9及びCTSB、CTSB及びKLK7、CTSB及びC2、C5及びAPOA1、CTSB及びCRP、CCL23及びCTSB、C5-C6及びCTSB、CTSB及びIL11RA、CCL18及びCTSB、APOA1及びCTSB、C5及びCSF1R、GDF11及びCTSB、C5及びC2、C2及びTFPI、C5及びCCL18、C2及びIL11RA、並びにTIMP1及びC5からなる群から選択される少なくとも一つの２バイオマーカーのパネルにそれぞれ対応するバイオマーカー値を含む；
コンピューターにより、前記バイオマーカー値それぞれの分類が自動的に行われること；ここで、
C5のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5aのアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びETHE1のアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びHAMPのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びTHBS4のダウンレギュレーション；
KITのダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C9のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びKLK7のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びAPOA1のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びCRPのアップレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5-C6のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL18のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
APOA1ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCSF1Rのアップレギュレーション；
GDF11ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びTFPIのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCCL18のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；及び/又は
TIMP1のアップレギュレーション及びC5のアップレギュレーション
は、個体が膵癌を有する可能性の増大を示す；および、
前記分類に基づいて前記個体が膵癌を有する可能性が自動的に示されること、
を含む、上記方法。
【請求項１３】
前記個体が膵癌を有する可能性が自動的に示されることが、コンピューターディスプレイに尤度が表示されることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
膵癌に関して無症状の高リスク個体を検出するための方法であって、該方法は：
個体からの生体サンプルにおいて、C5及びCTSB、C5a及びCTSB、CTSB及びETHE1、CTSB及びHAMP、CTSB及びTHBS4、KIT及びCTSB、C9及びCTSB、CTSB及びKLK7、CTSB及びC2、C5及びAPOA1、CTSB及びCRP、CCL23及びCTSB、C5-C6及びCTSB、CTSB及びIL11RA、CCL18及びCTSB、APOA1及びCTSB、C5及びCSF1R、GDF11及びCTSB、C5及びC2、C2及びTFPI、C5及びCCL18、C2及びIL11RA、並びにTIMP1及びC5からなる群から選択される少なくとも一つの２バイオマーカーのパネル中のＮ種のバイオマーカーにそれぞれ対応するバイオマーカー値を検出すること、
を含み、
C5のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5aのアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びETHE1のアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びHAMPのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びTHBS4のダウンレギュレーション；
KITのダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C9のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びKLK7のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びAPOA1のダウンレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びCRPのアップレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5-C6のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
CTSBのアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL18のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
APOA1ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCSF1Rのアップレギュレーション；
GDF11ダウンレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びC2のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びTFPIのアップレギュレーション；
C5のアップレギュレーション及びCCL18のアップレギュレーション；
C2のアップレギュレーション及びIL11RAのダウンレギュレーション；
CCL23のアップレギュレーション及びCTSBのアップレギュレーション；及び/又は
TIMP1のアップレギュレーション及びC5のアップレギュレーション
は、個体が膵癌を有する増大した可能性を示す、上記方法。
【請求項１５】
前記バイオマーカー値を検出することが、インビトロでの分析を行うことを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記インビトロでの分析が、前記バイオマーカーそれぞれに対応する少なくとも１種の捕捉試薬を含み、さらに前記少なくとも１種の捕捉試薬が、アプタマーおよび抗体からなる群より選択されることも含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インビトロでの分析が、イムノアッセイ、アプタマーベースの分析、および、組織学的または細胞学的な分析からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体サンプルが、全血、血漿、血清および膵液からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体サンプルが膵臓組織であり、ここで前記バイオマーカー値が、前記膵臓組織の組織学的または細胞学的な解析から導き出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記個体が、ヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記個体が、喫煙、アルコール摂取または膵癌の家族歴のために膵癌に関して高リスクを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体サンプルが血漿である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記個体が、膵癌を有するまたは膵癌を有さないと分類されるか、または、個体が膵癌を有する可能性が、前記バイオマーカー値および前記個体に対応する追加の生物医学的情報の少なくとも１つの項目に基づいて決定される、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記追加の生物医学的情報の少なくとも１つの項目が、独立して、
（ａ）膵臓の腫瘤またはその他の腹部の腫瘤の存在または非存在に相当する情報、
（ｂ）前記個体の身体的なデータに相当する情報、
（ｃ）前記個体の体重変化に相当する情報、
（ｄ）前記個体の民族性に相当する情報、
（ｅ）前記個体の性別に相当する情報、
（ｆ）前記個体の喫煙歴に相当する情報、
（ｇ）前記個体のアルコール摂取歴に相当する情報、
（ｈ）前記個体の職業歴に相当する情報、
（ｉ）前記個体の膵癌またはその他の癌の家族歴に相当する情報、
（ｊ）前記個体または前記個体の家族において膵癌または癌のより高いリスクと相関する少なくとも１つの遺伝子マーカーが前記個体において存在するかまたは存在しないかに相当する情報、
（ｋ）前記個体の臨床症状に相当する情報、
（ｌ）その他の実験室試験に相当する情報、
（ｍ）前記個体の遺伝子発現値に相当する情報、および、
（ｎ）前記個体の既知の発癌性物質への曝露に相当する情報、
からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]本願は、２０１０年８月１３日付けで出願された米国仮出願第６１／３７３，６８７号、２０１０年１２月１日付けで出願された米国仮出願第６１／４１８，６８９号、２０１１年５月４日付けで出願された米国仮出願第６１／４８２，３４７号、および、２０１１年５月４日付けで出願された米国仮出願第６１／４８２，４８０号に基づき優先権を主張する（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０００２】
発明の分野
[0002]本願は、一般的に、バイオマーカーの検出、および、個体における癌の診断に関し、より具体的には、個体における癌、より具体的には膵癌を診断するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システムおよびキットの１種またはそれより多くに関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]以下の説明は本願に関連する情報の要約を示すものであり、提供された情報または本明細書において参照された出版物のいずれかが本願の従来技術であることを認めたものではない。
【０００４】
[0004]膵癌は、米国における癌関連死の第四の主要因である。膵癌は、５年生存率はわずか５％であるが、早期の外科的介入で増加することが示されており、「治癒的」切除が望ましい被験者の２０％において生存率が１５〜２０％増加する。診断の時点で、半分以上の患者が遠隔転移した病気を有し、残りの２５％にも局部的な拡散がみられる。これはなぜなら、この病気は初期段階における診断が極めて難しいことで知られているためである。［ステージＩＩｂまたはそれ未満の］「手術可能な」病気を有する患者の約２０パーセントが「治癒的」切除を受けており、５年生存率は５％未満から１５〜２０％に増加する。
【０００５】
[0005]膵癌は、膵臓の外分泌部分に起因するものと内分泌部分に起因するものとがある。膵臓の腫瘍のうち９５％が、導管上皮、腺房細胞、結合組織およびリンパ組織などの膵臓の外分泌部分から発生したものである。全ての膵癌のおよそ７５％が膵臓の頭頚部内で発生し、１５〜２０％が膵臓本体で発生し、５〜１０％が尾部で発生する。
【０００６】
[0006]再発は、局所的（初発の部位またはその近傍）の場合もあるし、または遠隔で起こる場合もある（肝臓、肺または骨などの臓器への拡散）。膵外分泌系の癌が再発すると、実質的に転移癌と同じ方法で治療されるが、患者が耐性を有するのであれば化学療法も行う可能性が高い。典型的には、膵癌はまず所属リンパ節に転移し、その次に肝臓に転移し、また、あまり一般的ではないが肺にも転移する。また、例えば十二指腸、胃および結腸などの周囲の内臓にも直接侵入する可能性もあり、または、腹膜内に拡散することにより腹腔の表面のどこかに転移する可能性もある。結果的に腹水が生じることがあり、そのような場合の予後は好ましくない。膵癌は、痛みを伴う結節への転移として皮膚にも拡散することもある。膵癌はまれに骨にも転移する。
【０００７】
[0007]血液ベースの膵癌試験に関する臨床的な応用には、無症状の高リスク群における発症前診断のためと、症状を示す個体群における鑑別診断のための２つがある。以下でこれらの指標双方に関する臨床的有用性を概説する。
【０００８】
[0008]無症状の高リスク群におけるスクリーニング：２０１０年の米国における膵癌新規症例は、４３，１４０件であり、うち死亡は３６，８００件と推測される。遺伝学、家族歴、慢性膵臓炎、喫煙および高いアルコール摂取量は、嚢胞性線維症と同様に膵癌のリスクを高める。リスクの増加は以下のように報告されている：
・喫煙：１日２５本未満ではリスクは２倍であり、１日２５本を越えるとリスクは３倍である。
・アルコール：１日３回より多くの飲酒はリスクを１．６倍高める。
・家族歴：この病気を有する一等親の血縁者がいる場合は、リスクを５倍高める。
・嚢胞性線維症を有する成人：３１倍のリスク。
・ＢＲＣＡ２遺伝子突然変異：１０倍のリスク。
【０００９】
[0009]有効なスクリーニング体系がない場合の無症状であるがリスクのある個体群において、癌は、症状が現れたときにしか検出されない。このような場合、遅すぎることが多い。早期発見試験があれば、治癒的な外科手術が望ましい患者の比率が高くなるであろう。早期発見された被験者の２０％における現在の２０％の治癒率は、全個体群のわずか４％にすぎない。無症状の個体群における早期発見によって治癒的な外科手術を受けることが望ましい患者の割合が現在の２０％から増加すれば、治癒可能な患者の総数も増加すると予想され、１年あたりの生存者の数も同様に増加すると予想される。膵癌は罹患率の低い病気であるため、このような高リスク群においてでさえも、高い特異度が、スクリーニング試験の重要な特性である。不必要な経過観察にかかるコストを減らし患者の不安を減らすために、低い偽陽性率は必須である。
【００１０】
[0010]症状を示す患者における鑑別診断：膵癌は、膵炎または胃腸障害などの良性の状態と区別することが難しい場合がある。原発性の外分泌系膵癌の鑑別診断は、慢性膵炎、膵内分泌腫瘍、自己免疫性膵炎、リンパ腫、および、その他の様々なまれな状態を含む。膵癌に関連する共通の、ただし非特異的な症状としては、以下が挙げられる：
・腹痛（特に背中に放射線照射した場合）、
・閉塞性黄疸、
・突然の原因不明の糖尿病、
・体重の減少、
・食欲低下、疲労、
・吐き気、嘔吐、
・急性または慢性膵炎。
【００１１】
[0011]以下の表に、救急処置室および救急病院に搬送された、これらの関連症状のうち少なくとも２つを有する複数名の患者を示す；第一の症状は列挙された症状のいずれか一つであり、第二の症状は表に列挙された症状のうちの一つである。救急処置室のデータは、（http://hcupnet.ahrq.gov/）から得て、外来のデータは、ＣＤＣ２００８全米自由行動下医療管理調査２００６（CDC 2008 National Ambulatory Medical Care Survey 2006）（第8番）から得た。
【００１２】
【表１】
0005931874.tif 000002
【００１３】
[0012]切除可能な病気の高感度検出は、この指標の臨床的有用性のために必須である。膵癌の迅速な検出によって、治癒可能な病気を診断する機会が増加する。膵癌は通常、膵管または胆管系を遮断することが多い膵臓内の塊を放射線によって発見することにより診断される。しかしながら、イメージングは侵襲的であり高価になる可能性がある。どの患者が経過観察を必要とするかを決定する血液試験（画像診断を含む）は、患者にとって有益であり診断も簡単になると予想される。
【００１４】
[0013]特異的な病状に関するバイオマーカーの選択は、特定の医療を適用するために、まず病気の個体群においてコントロール個体群と比較して測定可能で統計学的に有意な差を有するマーカーを同定することを含む。バイオマーカーは、病気の開発または進行を示し、腫瘍に応答して膵癌組織または周囲の組織や循環する細胞からの血流に容易に放散される分泌または放出分子であり得る。同定されたバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットは通常、臨床的に確認されるか、または、それが選択された本来の目的とする用途にとって信頼できる指標であることが示される。バイオマーカーとしては、低分子物質、ペプチド、タンパク質、および、核酸が挙げられる。バイオマーカーの同定に影響を与える主な問題のいくつかを挙げれば、利用可能なデータの過剰適合とデータ中のバイアスがある。
【００１５】
[0014]バイオマーカーを同定して病気を診断しようとする試みにおいて様々な方法が用いられてきた。タンパク質ベースのマーカーに関しては、例えば、二次元電気泳動、質量分析法、および、イムノアッセイ法などの方法が挙げられる。核酸マーカーに関しては、例えばｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、一連の遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）、および、ラージスケールの遺伝子発現アレイなどの方法が挙げられる。
【００１６】
[0015]二次元電気泳動の有用性は、検出感度の低さ；タンパク質の溶解性、電荷および疎水性に関する問題；ゲルの再現性；および、単一のスポットが複数種のタンパク質を示す可能性のために限定的である。質量分析法に関して、用いられるフォーマットに応じて、サンプルの処理および分離、少量のタンパク質に対する感度、ＳＮ比の考慮、および、検出されたタンパク質を即座に同定できないことについて限界がある。バイオマーカーを発見するためのイムノアッセイ法に関する限界は、多数の分析物を測定するための抗体ベースの多重分析が不可能なことに集中している。単に高品質の抗体のアレイをプリントして、その抗体に結合した分析物をサンドイッチしないで測定することが可能である。（これは、生物または細胞中の全てのＤＮＡまたはＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションによって測定するために核酸配列のゲノム全体を用いた場合と形式的には同等なものと思われる。ハイブリダイゼーションは同一性に関してストリンジェントな試験であり得るために、ハイブリダイゼーション実験は役に立つ。マトリックス中の様々なタンパク質の存在量は極めて異なるために、極めて優れた抗体でも、それらの結合パートナーを選択するにあたり、血液中で作用するほど、または、細胞抽出物中でも作用するほどストリンジェントではない）。従って、バイオマーカー発見のためのイムノアッセイベースの方法を用いた異なるアプローチを使用しなければならず、すなわち、どの分析物が実際にバイオマーカーであるかどうかを決定するために多くの分析物を同時に測定できるような十分なストリンジェンシーを得るために多重化ＥＬＩＳＡ分析（すなわちサンドイッチ）を使用する必要があると思われる。サンドイッチイムノアッセイでは高含量は測定されないため、標準的なアレイフォーマット利用のストリンジェントなサンドイッチイムノアッセイを用いてバイオマーカーを発見することはできない。最後に、抗体試薬は、実質的なロットごとに品質が変動しやすく、不安定な試薬である。本発明のタンパク質バイオマーカー発見のためのプラットフォームは、この問題を克服するものである。
【００１７】
[0016]これらの方法の多くは、解析前のある種のサンプルの分画化に頼るものもあれば、サンプルの分画化が必須のものもある。従って、一連の明確に定められたサンプル群において統計学的に関連を有するバイオマーカーが同定および発見されるように設計された高処理量の研究を行うのに必要なサンプル調製物は、極めて扱いにくく、高価で時間がかかるものである。分画化の際に、様々なサンプルに多様な可変性を導入することができる。例えば、潜在的な（potential）マーカーがプロセスに対して不安定であってもよいし、マーカーの濃度が変化してもよいし、不適切な凝集または解離が起こり故意ではないサンプル汚染が起こる可能性があるため、初期の病気において予想されるわずかな変化をあいまいにすることもできる。
【００１８】
[0017]このような技術を用いたバイオマーカーの発見および検出方法では、診断用バイオマーカーを同定するにはかなり限界があることが広く認められている。このような限界としては、存在量が少ないバイオマーカーを検出できないこと、プロテオームのダイナミックレンジ全体を一貫してカバーできないこと、サンプルの加工および分画化が再現不可能なこと、および、方法の安定性が全体的に再現不可能であり欠如していることが挙げられる。さらにこれらの研究ではデータにバイアスが生じ、個体群内で標的とする病気のバイオマーカーを同定し確認するのに必要な分布およびランダム化に関して適切なコントロールを含むサンプル群の複雑さが適切に処理されていなかった。
【００１９】
[0018]数十年にわたり新規で有効なバイオマーカーの発見を目的とする努力が続けられているが、この努力はほとんど成功していない。様々な病気のためのバイオマーカーは、教育機関の研究所で、ある種の病気の経過に関する基礎的な調査の過程で通常偶発的な発見によって同定されることが一般的である。このような発見とわずかな臨床データに基づいて、新しいバイオマーカーの同定を示唆する論文が公開されている。しかしながら、そこで提唱されたバイオマーカーの多くは、現実的なバイオマーカーまたは有用なバイオマーカーであるかどうかは確認されておらず、これはなぜなら、主として試験されたわずかな量の臨床サンプルでは、実際に有効なバイオマーカーが見出されたことを示す統計学的な証明がほとんど提供できないためである。すなわち、初期の同定は統計の基礎的要素に関して厳密なものではない。１９９４年から２００３年にかけて、科学論文を検索したところ、バイオマーカーを対象にした文献が何千も公開されてきたことがわかっている。しかしながら、それと同じ期間中に、ＦＤＡは、診断剤用途で１年で最大で３種の新しいタンパク質バイオマーカーしか承認しておらず、その後数年にわたり新しいタンパク質バイオマーカーは承認されていない。
【００２０】
[0019]バイオマーカー発見の努力が失敗に終わった歴史に基づき、数学理論が提唱されてきたが、病気に関するバイオマーカーが希少で発見が困難であるという一般的な見解をよりいっそう高める結果となった。二次元ゲルまたは質量分析法に基づくバイオマーカーの調査は、このような概念を裏付けるものである。これらのアプローチによっても有用なバイオマーカーはほとんど同定されなかった。しかしながら、二次元ゲルや質量分析法は、血中濃度がおよそ１ｎＭ以上の濃度で存在するタンパク質しか測定されないこと、および、この一連のタンパク質は、病気によって変化する可能性が最も低いと予想されることが見落とされることが多い。タンパク質の発現レベルをかなり低い濃度で正確に測定することができるプロテオームのバイオマーカー発見のためのプラットフォームは、本発明のバイオマーカー発見のためのプラットフォーム以外に存在しない。
【００２１】
[0020]複雑な人間の生物学に関する生化学的経路について多くのことがわかっている。多くの生化学的経路は、病理学の範囲内で言えば、局所的に作用する分泌タンパク質によって終結または開始しており、例えば増殖因子が分泌されると、病理学的に言えば他の細胞の複製を刺激し、その他の因子が分泌されて免疫系が回避される。これらの分泌タンパク質の多くが傍分泌的に作用するが、そのうちいくつかは、体の遠位で稼働する。生化学的経路の基礎的な理解がある当業者であれは当然理解しているものと思われるが、多くの病気に特異的なタンパク質は、血液中において二次元ゲルおよび質量分析法の検出限界より低い（それよりかなり低い）濃度で存在するはずである。このような比較的数が豊富な病気に関するバイオマーカーの同定より先に行わなければならないことは、二次元ゲルまたは質量分析法で検出可能な濃度未満の濃度でタンパク質を解析することができるプロテオームのプラットフォームを見出すことである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】CDC 2008 National Ambulatory Medical Care Survey 2006 (第8番)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
[0021]従って、（ａ）膵癌と良性の状態との識別；（ｂ）膵癌に関して無症状の高リスク個体のスクリーニング；（ｃ）膵癌バイオマーカーの検出；および、（ｄ）膵癌の診断を可能にするバイオマーカー、方法、装置、試薬、システムおよびキットが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
概要
[0022]本願は、癌、より具体的には膵癌の検出および診断のためのバイオマーカー、方法、試薬、装置、システムおよびキットを含む。本願のバイオマーカーは、実施例１で詳細に説明されている多重化アプタマーベースの分析を用いて同定された。本明細書において説明されるアプタマーベースのバイオマーカー同定方法を用いることによって、本願は、膵癌の検出および診断に有用な驚くほど多数の膵癌バイオマーカー、加えてより一般的に癌の検出および診断に有用な様々な癌バイオマーカーを説明する。これらのバイオマーカーの同定において、何百もの個体サンプルからの８００種を超えるタンパク質を測定したが、そのうちいくつかは低フェムトモルレベルの濃度であった。これは、二次元ゲルおよび／または質量分析法を用いてなされたバイオマーカーの発見試験のときよりも４桁も低いレベルである。
【００２５】
[0023]ここで説明される膵癌バイオマーカーのいくつかは単独でも膵癌の検出および診断において有用であるが、ここではバイオマーカーのパネルとして有用な膵癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法を説明する。個々のバイオマーカーまたはバイオマーカーの部分集合が同定されたら、選択されたバイオマーカーまたは生体サンプル中のバイオマーカーのレベルの差を測定することができるあらゆる分析プラットフォームまたはフォーマットを用いて個体における膵癌の検出または診断を達成することができる。
【００２６】
[0024]しかしながら、本明細書において説明されるアプタマーベースのバイオマーカー同定方法を用いて、８００種を超える別個の潜在的なバイオマーカー値を個々に、これまでに膵癌を有するまたは膵癌を有さないと診断された多数の個体からスクリーニングすることによってのみ、本明細書において開示された膵癌バイオマーカーを同定することができる。この発見アプローチは、人間の病理学に解釈し直す必要がなく、より患者に関連するシステムを審査するものであるため、調整培地または溶解細胞からのバイオマーカー発見法とは全く異なっている。
【００２７】
[0025]従って、本願の一形態において、膵癌を診断するための、または、膵癌と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像などの良性の胃腸（ＧＩ）状態との鑑別診断のための、単独または様々に組み合わせて使用される１種またはそれより多くのバイオマーカーが提供される。代表的な実施態様は、表１の第２列に示されるバイオマーカーを含み、本バイオマーカーは、上述したように、実施例１に概説されており実施例２により具体的に説明されているような多重化アプタマーベースの分析を用いて同定された。表１に示されるマーカーは、無症状の高リスク群において膵癌を診断すること、および、膵癌と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像とを区別することにおいて有用である。
【００２８】
[0026]本明細書において説明される所定の膵癌バイオマーカーは、単独でも膵癌を検出および診断することに関して有用であるが、それぞれ２種またはそれより多くのバイオマーカーのパネルとして有用な膵癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法も、本明細書において説明する。従って、本願の様々な実施態様は、Ｎ種のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮ種のバイオマーカーは、少なくとも２種のバイオマーカーである。その他の実施態様において、Ｎは、２〜６５種のバイオマーカーのいずれかの数になるように選択される。
【００２９】
[0027]さらにその他の実施態様において、Ｎは、２〜７、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、または、２〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、３〜７、３〜１０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、３〜５５、または、３〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、４〜７、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、または、４〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、５〜７、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、または、５〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、６〜５０、６〜５５、または、６〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、７〜５０、７〜５５、または、７〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、８〜５０、８〜５５、または、８〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、９〜５０、９〜５５、または、９〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、または、１０〜６５のいずれかの数字になるように選択される。当然のことながら、Ｎは、類似の、ただしより高次の範囲を包含するように選択することができる。
【００３０】
[0028]その他の形態において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて膵癌を有すると分類される。
【００３１】
[0029]その他の形態において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここでその個体が膵癌を有するかどうかの可能性（likelihood）は、上記バイオマーカー値に基づいて決定される。
【００３２】
[0030]その他の形態において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記バイオマーカー値に基づいて膵癌を有すると分類され、Ｎは２〜１０である。
【００３３】
[0031]その他の形態において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここでその個体が膵癌を有するかどうかの可能性は、上記バイオマーカー値に基づいて決定され、Ｎは２〜１０である。
【００３４】
[0032]その他の形態において、個体が膵癌を有さないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて膵癌を有さないと分類される。
【００３５】
[0033]その他の形態において、個体が膵癌を有さないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記バイオマーカー値に基づいて膵癌を有さないと分類され、Ｎは２〜１０である。
【００３６】
[0034]その他の形態において、膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が膵癌を有することが示され、Ｎは３〜１０である。
【００３７】
[0035]その他の形態において、膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が膵癌を有することが示され、Ｎは３〜１０である。
【００３８】
[0036]その他の形態において、膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表２〜１１に示されるパネルからなる群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が膵癌を有することが示される。
【００３９】
[0037]その他の形態において、膵癌がないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において膵癌がないことが示され、Ｎは３〜１０である。
【００４０】
[0038]その他の形態において、膵癌がないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において膵癌がないことが示され、Ｎは３〜１０である。
【００４１】
[0039]その他の形態において、膵癌がないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表２〜１１に示されるパネルからなる群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において膵癌がないことが示される。
【００４２】
[0040]その他の形態において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、既定の限界値から逸脱する分類スコアに基づいて膵癌を有すると分類され、Ｎは２〜１０である。
【００４３】
[0041]その他の形態において、個体において膵癌がないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１の第２列に記載のバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、既定の限界値から逸脱する分類スコアに基づいて膵癌を有さないと分類され、Ｎは２〜１０である。
【００４４】
[0042]その他の形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は：コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値（ここでＮは上記で定義された通りである）を含む）；コンピューターを用いて、それぞれのバイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が膵癌を有する可能性を、複数の分類に基づいて示すこと、を含む。
【００４５】
[0043]その他の形態において、個体を膵癌を有するまたは膵癌を有さないのいずれかに分類するための、コンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は：コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのいずれか１種に対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、それぞれのバイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が、複数の分類に基づいて膵癌を有するかどうかを示すこと、を含む。
【００４６】
[0044]その他の形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値（ここでＮは上記で定義された通りである）を含む）；および、その個体が膵癌を有する可能性をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコード、を含む。
【００４７】
[0045]その他の形態において、個体の膵癌の状態を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体の膵癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００４８】
[0046]その他の形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は、コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、バイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が膵癌を有する可能性を上記分類に基づいて示すことを含む。
【００４９】
[0047]その他の形態において、個体を膵癌を有するまたは膵癌を有さないのいずれかに分類するための、コンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は、コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、バイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が膵癌を有するかどうかを上記分類に基づいて示すことを含む。
【００５０】
[0048]さらにその他の形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体が膵癌を有する可能性をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００５１】
[0049]さらにその他の形態において、個体の膵癌の状態を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体の膵癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００５２】
[0050]ここで説明される癌バイオマーカーのいくつかは単独でも癌の検出および診断において有用であるが、ここではバイオマーカーのパネルとして有用な癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法を説明する。個々のバイオマーカーまたはバイオマーカーの部分集合が同定されたら、選択されたバイオマーカーまたは生体サンプル中のバイオマーカーのレベルの差を測定することができるあらゆる分析プラットフォームまたはフォーマットを用いて個体における癌の検出または診断を達成することができる。
【００５３】
[0051]しかしながら、本明細書において説明されるアプタマーベースのバイオマーカー同定方法を用いて、８００種を超える別個の潜在的なバイオマーカー値を個々に、これまでに癌を有するまたは癌を有さないと診断された多数の個体からスクリーニングすることによってのみ、本明細書において開示された癌バイオマーカーを同定することができる。この発見アプローチは、人間の病理学に解釈し直す必要がなく、より患者に関連するシステムを審査するものであるため、調整培地または溶解細胞からのバイオマーカー発見法とは全く異なっている。
【００５４】
[0052]従って、本願の一形態において、癌を診断するための、単独または様々に組み合わせて使用される１種またはそれより多くのバイオマーカーが提供される。代表的な実施態様は、表１９に示されるバイオマーカーを含み、本バイオマーカーは、実施例１に概説されており実施例７により具体的に説明されているような多重化アプタマーベースの分析を用いて同定された。表１９に示されるマーカーは、癌を有する個体と癌を有さない個体とを区別することにおいて有用である。
【００５５】
[0053]ここで説明される癌バイオマーカーのいくつかは、単独でも癌を検出および診断することにおいて有用であるが、それぞれ３種またはそれより多くのバイオマーカーのパネルとして有用な癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法も、本明細書において説明する。従って、本願の様々な実施態様は、Ｎ種のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは、少なくとも３種のバイオマーカーである。その他の実施態様において、Ｎは、３〜６５種のバイオマーカーのいずれかの数字になるように選択される。
【００５６】
[0054]さらにその他の実施態様において、Ｎは、３〜７、３〜１０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、３〜５５、３〜６０、または、３〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、４〜７、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、４〜６０、または、４〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、５〜７、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、または、５〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、６〜５０、６〜５５、６〜６０、または、６〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、７〜５０、７〜５５、７〜６０、または、７〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、８〜５０、８〜５５、８〜６０、または、８〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、９〜５０、９〜５５、９〜６０、または、９〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、または、１０〜６５のいずれかの数字になるように選択される。当然のことながら、Ｎは、類似の、ただしより高次の範囲を包含するように選択することができる。
【００５７】
[0055]その他の形態において、個体において癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて癌を有すると分類される。
【００５８】
[0056]その他の形態において、個体において癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで個体が癌を有する可能性は、上記バイオマーカー値に基づいて決定される。
【００５９】
[0057]その他の形態において、個体において癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記バイオマーカー値に基づいて癌を有すると分類され、Ｎは３〜１０である。
【００６０】
[0058]その他の形態において、個体において癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで個体が癌を有する可能性は、上記バイオマーカー値に基づいて決定され、Ｎは３〜１０である。
【００６１】
[0059]その他の形態において、個体が癌を有さないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくとも１つのバイオマーカーに対応する少なくとも１つのバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記少なくとも１つのバイオマーカー値に基づいて癌を有さないと分類される。
【００６２】
[0060]その他の形態において、個体が癌を有さないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、上記バイオマーカー値に基づいて癌を有さないと分類され、Ｎは３〜１０である。
【００６３】
[0061]その他の形態において、癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が癌を有することが示され、Ｎは３〜１０である。
【００６４】
[0062]その他の形態において、癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が癌を有することが示され、Ｎは３〜１０である。
【００６５】
[0063]その他の形態において、癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表２０〜２９に示されるパネルからなる群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体が癌を有することが示される。
【００６６】
[0064]その他の形態において、癌が存在しないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において癌が存在しないことが示され、Ｎは３〜１０である。
【００６７】
[0065]その他の形態において、癌が存在しないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれＮ種のバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカーは、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択され、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において癌が存在しないことが示され、Ｎは３〜１０である。
【００６８】
[0066]その他の形態において、癌が存在しないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表２０〜２９に示されるパネルからなる群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記バイオマーカー値を分類することによりその個体において癌が存在しないことが示される。
【００６９】
[0067]その他の形態において、個体において癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含む、ここで上記個体は、既定の限界値から逸脱する分類スコアに基づいて癌を有すると分類され、Ｎは３〜１０である。
【００７０】
[0068]その他の形態において、個体における癌がないことを診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を検出することを含み、ここで上記個体は、既定の限界値から逸脱する分類スコアに基づいて癌を有さないと分類され、Ｎは３〜１０である。
【００７１】
[0069]その他の形態において、癌の可能性を示すためのコンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は：コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値（ここでＮは上記で定義された通りである）を含む）；コンピューターを用いて、それぞれのバイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が癌を有する可能性を複数の分類に基づいて示すことを含む。
【００７２】
[0070]その他の形態において、個体を癌を有するまたは癌を有さないのいずれかに分類するための、コンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は：コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、それぞれのバイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が癌を有するかどうかを複数の分類に基づいて示すことを含む。
【００７３】
[0071]その他の形態において、癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値（ここでＮは上記で定義された通りである）を含む）；および、その個体が癌を有する可能性をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００７４】
[0072]その他の形態において、個体の癌の状態を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、それぞれ表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体における癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００７５】
[0073]その他の形態において、癌の可能性を示すためのコンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は、コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、バイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が癌を有する可能性を上記分類に基づいて示すことを含む。
【００７６】
[0074]その他の形態において、個体を癌を有するまたは癌を有さないのいずれかに分類するための、コンピューターによって実施される方法が提供される。本方法は、コンピューターで、個体に関するバイオマーカー情報を検索すること（ここで上記バイオマーカー情報は、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；コンピューターを用いて、バイオマーカー値の分類を行うこと；および、その個体が癌を有するかどうかを上記分類に基づいて示すことを含む。
【００７７】
[0075]さらにその他の形態において、癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体が癌を有する可能性をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００７８】
[0076]さらにその他の形態において、個体の癌の状態を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを包含するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、表１９に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体における癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【００７９】
[0077]さらにその他の形態において、膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１に示されるパネルからなる群より選択されるバイオマーカーのパネル上のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値に加えて、腫瘍マーカーＣＡ１９−９を検出することを含み、ここでＣＡ１９−９とバイオマーカー値との組み合わせを分類することによりその個体が膵癌を有することが示される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】[0078]図１Ａは、生体サンプル中の膵癌を検出する典型的な方法を示すフローチャートである。
【図１Ｂ】[0079]図１Ｂは、単純ベイズ分類法を用いて生体サンプル中の膵癌を検出する典型的な方法を示すフローチャートである。
【図２】[0080]図２は、膵癌を検出する試験において、単純ベイズ分類器を用いて単一のバイオマーカーＣＴＳＢに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図３】[0081]図３は、膵癌を検出する試験について、単純ベイズ分類器を用いて２〜１０種のバイオマーカーのバイオマーカーのパネルに関するＲＯＣ曲線を示す。
【図４】[0082]図４は、膵癌パネルについて、単純ベイズ分類を用いてバイオマーカーの数を１から１０に増加させた際の分類スコア（ＡＵＣ）の増加を説明する。
【図５】[0083]図５は、ＧＩおよび正常なコントロールの合計（実線）および膵癌病気グループ（点線）について、累積分布関数（ｃｄｆ）として対数変換されたＲＦＵでＣＴＳＢに関して測定されたバイオマーカーの分布と、単純ベイズ分類器を操作するために用いられた標準ｃｄｆ（点線）に適合させた曲線とを示す。
【図６】[0084]図６は、本明細書において説明される様々なコンピューターによって実施される方法で使用するための典型的なコンピューターシステムを説明する。
【図７】[0085]図７は、一実施態様に従って個体が膵癌を有するかどうかの可能性を示す方法に関するフローチャートである。
【図８】[0086]図８は、一実施態様に従って個体が膵癌を有するかどうかの可能性を示す方法に関するフローチャートである。
【図９】[0087]図９は、生体サンプル中の１種またはそれより多くの膵癌バイオマーカーを検出するのに用いることができる典型的なアプタマー分析を説明する。
【図１０】[0088]図１０は、集められた潜在的なバイオマーカーのセットから、膵癌とＧＩおよび正常なコントロールとを区別するための分類器を構築する際にどのバイオマーカーが用いられるかの頻度を表すヒストグラムを示す。
【図１１Ａ】[0089]図１１Ａは、表１に示されるバイオマーカー（実線）、および、ランダムマーカーのセット（点線）を用いて、あらゆる可能な単一のタンパク質の単純ベイズ分類器のスコア（ＡＵＣ）をまとめた一対のヒストグラムを示す。
【図１１Ｂ】[0090]図１１Ｂは、表１に示されるバイオマーカー（実線）、および、ランダムマーカーのセット（点線）を用いて、あらゆる可能な２種のタンパク質の単純ベイズ分類器のスコア（ＡＵＣ）をまとめた一対のヒストグラムを示す。
【図１１Ｃ】[0091]図１１Ｃは、表１に示されるバイオマーカー（実線）、および、ランダムマーカーのセット（点線）を用いて、あらゆる可能な３種のタンパク質の単純ベイズ分類器のスコア（ＡＵＣ）をまとめた一対のヒストグラムを示す。
【図１２】[0092]図１２は、完全なパネル（ひし形）から選択された２〜１０種のマーカーを用いた単純ベイズ分類器に関するＡＵＣ、および、分類器作製中に最良の５、１０および１５種のマーカーを除外することにより得られたスコアを示す。
【図１３】[0093]図１３は、３種の異なる分類器：ＣＡ１９−９単独、ＳＯＭＡｍｅｒパネル、および、ＳＯＭＡｍｅｒとＣＡ１９−９との組み合わせの性能を示す。
【図１４】[0094]図１４は、ＣＡ１９−９に加えて、１種（ＨＡＭＰ）または２種（ＨＡＭＰおよびＣＴＳＢ）のＳＯＭＡｍｅｒバイオマーカーの性能を示す。
【図１５】[0095]図１５は、１０種のマーカーのランダムフォレスト分類器の性能を示す。
【図１６Ａ】[0096]図１６Ａは、表１４に示された１〜５種のマーカーのパネルに関するデータからモデル化した一連のＲＯＣ曲線を示す。
【図１６Ｂ】[0097]図１６Ｂは、図１２Ａと同様に１〜５種のマーカーのパネルに関する訓練データからコンピューターで計算された一連のＲＯＣ曲線を示す。
【図１７Ａ】[0098]図１７Ａと１７Ｂは、貪欲選択法によって選択された１０種のバイオマーカー（表１９）と、１，０００種のランダムにサンプリングした１０種の「非マーカー」のバイオマーカーセットとの性能の比較を示す。表１９に記載の１０種のバイオマーカーの平均ＡＵＣは、点線の垂直線として示した。図１７Ａにおいて、１０種のバイオマーカーのセットを、貪欲法によって選択されたものではない３つの癌研究全てに存在する１０の分析物全てからランダムに選択した。
【図１７Ｂ】図１７Ｂにおいて、図１７Ａと同じ手法を用いた；しかしながら、サンプリングは、表１に記載の貪欲法によって選択されたものではない残りの５５種のバイオマーカーに限定した。
【図１８】[0099]図１８は、表１９に記載の３つの単純ベイズ分類器に関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。いずれの研究についても、凡例の隣りに濃度曲線下面積（ＡＵＣ）も表示した。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
[0100]以下、本発明の代表的な実施態様について詳細に説明する。ここで本発明は列挙された実施態様と共に説明されるが、当然のことながら、本発明は、これらの実施態様に限定されることは目的としない。それとは逆に、本発明は、請求項で定義される本発明の範囲内に含まれる可能性がある全ての代替物、改変物および等価物を包含するものとする。
【００８２】
[0101]当業者であれば当然のことながら、本明細書において説明されるものと類似のまたはそれらと同等な多くの方法および材料を認識しているものと予想されるが、これらは本発明の実施の範囲で用使用することが可能であり、本発明の実施の範囲内である。本発明は、いかなることがあってもここで説明された方法および材料に限定されることはない。
【００８３】
[0102]特に他の指定がない限り、本明細書において用いられる専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同様の意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書において説明されるものと類似のまたはそれらと同等のあらゆる方法、装置および材料は使用される可能性があるが、好ましい方法、装置および材料は以下で説明される。
【００８４】
[0103]本願において引用された全ての公報、公開された特許文書および特許出願は、本願が関連する技術分野における能力のレベルを示すものである。本明細書において引用された全ての公報、公開された特許文書および特許出願は、参照により本発明に包含させるが、それぞれ個々の公報、公開された特許文書または特許出願が個別かつ具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されたのと同じこととする。
【００８５】
[0104]本願、加えて添付の請求項でも用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、内容が明らかに違うことを意味していない限り複数形の対象物も含み、さらに「少なくとも１つの」および「１またはそれより多くの」も同じ意味で用いられる。従って、「アプタマー」と述べられる場合、アプタマーの混合物も含み、「プローブ」と述べられる場合、プローブの混合物も含む（他も同様）。
【００８６】
[0105]本明細書で用いられる用語「約」は、その数値が関連する事柄の基礎的な機能が変化しないような有意ではない数値の変化または変動を示す。
[0106]本明細書で用いられるように、用語「〜を含む（comprise）」、「〜を含む（comprising）」、「〜を含む（include）」、「〜を含む（including）」、「〜を含む（contain）」、「〜を含む（containing）」およびそれらのあらゆる変化形は、要素または一連の要素を含む（comprise、includeまたはcontain）事柄のプロセス、方法、プロダクト−バイ−プロセスまたは組成物が、そのような要素だけでなく、明記されていないその他の要素やこのような事柄のプロセス、方法、プロダクト−バイ−プロセスまたは組成物に固有のその他の要素も含み得るように、包括的にあらゆるものが包含されることを意味するものとする。
【００８７】
[0107]本願は、膵癌、より一般的には癌の検出および診断のためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システムおよびキットを含む。
[0108]一形態において、膵癌を診断するため、膵癌と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像などの良性のＧＩ状態との鑑別診断を行うため、膵癌の再発をモニターするため、または、その他の臨床的な指標を処理するための、単独または様々に組み合わせて使用される１種またはそれより多くのバイオマーカーが提供される。以下で詳細に説明するように、代表的な実施態様としては、実施例１で概説され、実施例２でより詳細に説明される多重化アプタマーベースの分析を用いて同定された、表１の第２列に示されるバイオマーカーが挙げられる。
【００８８】
[0109]表１の第２列は、数百人の膵癌患者それぞれからの血液サンプルと、それに相応する数百人のＧＩおよび正常なコントロールそれぞれからの血液サンプルとを解析することにより得られた発見を説明する。ＧＩおよび正常なコントロールグループは、無症状の個体と症状を示す個体を含み、膵癌診断テストで最も高い利益を示す可能性がある個体群に匹敵するように設計された。正常なコントロールグループには、膵癌の高リスクを有する無症状の個体も含まれる。膵癌に関する高リスクとしては、膵癌の家族歴、肥満症、喫煙、糖尿病、嚢胞性線維症、慢性または遺伝性膵炎、ＢＲＣＡ突然変異キャリアー、ｐ１６突然変異、および、ポイツ−ジェガース症候群が挙げられる（Brand E et al.Gut 2007:56:1460）。ＧＩコントロールグループは、非特異性の腹部症状、例えば急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像を含む。高リスクの無症状の個体のスクリーニングと、症状を示す個体における鑑別診断との両方に有用なバイオマーカーを発見するために、正常なコントロール由来のサンプルと、ＧＩコントロールとを組み合わせた。病気およびコントロール血液をプールするのではなく、個体のサンプルごとに潜在的なバイオマーカーを測定した；それにより、病気（この場合は膵癌）の存在および非存在に関する表現型における個体間およびグループ間のバリエーションをよりよく理解することが可能になる。８２３種のタンパク質測定を各サンプルごとに行うため、病気およびコントロール個体群それぞれからの数百ものサンプルを個々に測定することにより、極めて大きいデータ群の解析から表１の第２列が得られた。これらの測定結果を、本明細書の「バイオマーカーの分類および疾患スコアの計算」の章で説明されている方法を用いて解析した。表１の第２列に、膵癌を有する個体から得られたサンプルとＧＩおよび正常なコントロールから得られた「コントロール」サンプルとを区別することにおいて有用であることが見出された６５種のバイオマーカーを列挙した。ＧＩコントロールは、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石を有する被験者、または後で良性と判別される異常な画像を示す被験者を含む。
【００８９】
[0110]本明細書において説明される所定の膵癌バイオマーカーは、単独でも膵癌を検出および診断することに関して有用であるが、膵癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法も本明細書において説明され、ここでそれぞれのグループ化または部分集合の選択は、３種またはそれより多くのバイオマーカーのパネルとして有用であり、このパネルは、本明細書において「バイオマーカーのパネル」やパネルと同義的に用いられる。従って、本願の様々な実施態様は、Ｎ種のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは、少なくとも２種のバイオマーカーである。その他の実施態様において、Ｎは、２〜６５種のバイオマーカーから選択される。
【００９０】
[0111]さらにその他の実施態様において、Ｎは、２〜７、２〜１０、２〜１５、２〜２０、２〜２５、２〜３０、２〜３５、２〜４０、２〜４５、２〜５０、２〜５５、または、２〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、３〜７、３〜１０、３〜１５、３〜２０、３〜２５、３〜３０、３〜３５、３〜４０、３〜４５、３〜５０、３〜５５、または、３〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、４〜７、４〜１０、４〜１５、４〜２０、４〜２５、４〜３０、４〜３５、４〜４０、４〜４５、４〜５０、４〜５５、または、４〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、５〜７、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、または、５〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５、６〜３０、６〜３５、６〜４０、６〜４５、６〜５０、６〜５５、または、６〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５、７〜３０、７〜３５、７〜４０、７〜４５、７〜５０、７〜５５、または、７〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、８〜３０、８〜３５、８〜４０、８〜４５、８〜５０、８〜５５、または、８〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、９〜１５、９〜２０、９〜２５、９〜３０、９〜３５、９〜４０、９〜４５、９〜５０、９〜５５、または、９〜６５のいずれかの数字になるように選択される。その他の実施態様において、Ｎは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、または、１０〜６５のいずれかの数字になるように選択される。当然のことながら、Ｎは、類似の、ただしより高次の範囲を包含するように選択することができる。
【００９１】
[0112]一実施態様において、バイオマーカーの部分集合またはパネルに有用なバイオマーカーの数は、バイオマーカー値の特定の組み合わせにおける感度および特異度の値に基づく。本明細書において用語「感度」および「特異度」は、個体の生体サンプル中で検出された１種またはそれより多くのバイオマーカー値に基づいて、その個体が膵癌を有するまたは膵癌を有さないと正確に分類する能力に関して用いられる。「感度」は、膵癌を有する個体を正確に分類することに関するバイオマーカーの性能を示す。「特異度」は、膵癌を有さない個体を正確に分類することに関するバイオマーカーの性能を示す。例えば、一連のコントロールサンプルおよび膵癌サンプルを試験するのに使用されたマーカーのパネルについて、８５％の特異度および９０％の感度という場合、これは、そのパネルによってコントロールサンプルの８５％がコントロールサンプルとして正確に分類されたこと、および、そのパネルによって膵癌サンプルの９０％が膵癌サンプルとして正確に分類されたことを示す。望ましいまたは好ましい最小値は、実施例３で説明されているようにして決定することができる。代表的なパネルは、表４〜１１に示されたものであり、各パネルごとに指定されたレベルの特異度および感度を有する３〜１０種のバイオマーカーの一連の１００種の異なるパネルが示されている。これらのパネルそれぞれにおける各マーカーの出現総数は、各表の下に示される。
【００９２】
[0113]一形態において、膵癌は、個体からの生体サンプルを分析すること、および、それぞれバイオマーカーＣＴＳＢ、Ｃ５ａまたはＣ５のうち少なくとも１種、および、表１の第２列に示されたバイオマーカーのリストから選択された少なくともＮ種の追加のバイオマーカー（ここでＮは、２、３、４、５、６、７、８または９である）に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出または診断される。さらなる形態において、膵癌は、個体からの生体サンプルを分析すること、および、それぞれバイオマーカーＣＴＳＢ、Ｃ５ａまたはＣ５、および、表１の第２列に示されたバイオマーカーのリストから選択された少なくともＮ種の追加のバイオマーカー（ここでＮは、１、２、３、４、５、６または７である）のいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出または診断される。さらなる形態において、膵癌は、個体からの生体サンプルを分析すること、および、それぞれバイオマーカーＣＴＳＢ、および、表１の第２列に示されたバイオマーカーのリストから選択された少なくともＮ種の追加のバイオマーカー（ここでＮは、２、３、４、５、６、７、８または９である）のいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出または診断される。さらなる形態において、膵癌は、個体からの生体サンプルを分析すること、および、それぞれバイオマーカーＣ５ａ、および、表１の第２列に示されたバイオマーカーのリストから選択された少なくともＮ種の追加のバイオマーカー（ここでＮは、２、３、４、５、６、７、８または９である）のいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出または診断される。さらなる形態において、膵癌は、個体からの生体サンプルを分析すること、および、それぞれバイオマーカーＣ５、および、表１の第２列に示されたバイオマーカーのリストから選択された少なくともＮ種の追加のバイオマーカー（ここでＮは、２、３、４、５、６、７、８または９である）のいずれか１種に対応するバイオマーカー値を検出することによって、個体において検出または診断される。
【００９３】
[0114]本明細書において同定された膵癌バイオマーカーは、膵癌を効果的に検出または診断するのに使用することができるバイオマーカーの部分集合またはパネルのために相当多数選択されたものの代表例である。このようなバイオマーカーの望ましい数の選択は、選択されたバイオマーカーの特定の組み合わせによって様々である。膵癌を検出または診断するためのバイオマーカーのパネルは、表１の第２列に記載されていないバイオマーカーを含んでいてもよいこと、および、表１の第２列から選択される特定の部分集合またはパネルに表１の第２列に記載されていない追加のバイオマーカーが含まれることにより、バイオマーカーの数を減らすことが可能になることに留意することが重要である。また、所定の分析にとって許容できる感度および特異度の値を確立するために、バイオマーカー値と共に追加の生物医学的情報が使用される場合も、部分集合またはパネルで使用される表１の第２列に記載のバイオマーカーの数を減らすことが可能になる。
【００９４】
[0115]バイオマーカーの部分集合またはパネルに用いようとするバイオマーカーの数に影響する可能性があるその他の要因は、膵癌に関して診断を受けている個体から生体サンプルを得るために用いられる手法である。慎重に制御されたサンプル調達環境における望ましい感度および特異度の値を達成するのに必要なバイオマーカーの数は、サンプル回収、取り扱いおよび貯蔵の際により変動が起こりやすいような状況に比べて少ないと予想される。表１の第２列に示されるバイオマーカーのリスト開発の際、分類器の訓練のために、複数のサンプル回収場所を利用してデータ回収を行った。それにより、サンプル回収、取り扱いおよび貯蔵の際の変動に対して影響を受けにくいより確実なバイオマーカーが提供されるが、部分集合またはパネルにおけるバイオマーカーの数を、全て極めて類似した条件下で訓練データを得た場合よりも多くすることが必要になる場合もある。
【００９５】
[0116]図１Ａおよび１Ｂを参照しながら本願の一形態を概説する。生体サンプルは、対象の１つの個体または複数の個体から得る。続いて生体サンプルを分析して、１種またはそれより多くの対象の（Ｎ種の）バイオマーカーの存在を検出し、前記Ｎ種のバイオマーカー（図１ＢではマーカーＲＦＵ）それぞれのバイオマーカー値を決定する。バイオマーカーが検出されたら、各マーカーごとに決定されたバイオマーカー値を、本明細書において詳細に説明されるようにスコア付けまたは分類する。続いてマーカーのスコアを合わせて、総合的な診断スコアを出すが、ここで診断スコアとは、サンプルを採った個体が膵癌を有する可能性を示すものである。
【００９６】
[0117]「生体サンプル」、「サンプル」および「試験サンプル」は、本明細書において同じ意味で用いられ、個体から得られた、または、その他の方法で個体から誘導されたあらゆる材料、生体液、組織または細胞を意味する。このようなサンプルとしては、血液（例えば、全血、白血球、末梢血単核細胞、軟層、血漿および血清など）、痰、涙、粘液、鼻の洗浄液、鼻からの吸引物、呼気、尿、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺細胞液（glandular fluid）、膵液、リンパ液、胸膜液、乳頭からの吸引物、気管支からの吸引物、気管支のブラッシングにより得たサンプル、滑液、関節からの吸引物、臓器の分泌物、細胞、細胞抽出物、および、髄液が挙げられる。さらにこのようなサンプルとしては、前記したもの全ての実験的に分離した分画も挙げられる。例えば血液サンプルは、血清、血漿に分離することもできるし、または、特定のタイプの血液細胞、例えば赤血球または白血球（白血球）を含む分画に分離することもできる。必要に応じて、サンプルは、個体からのサンプルの組み合わせであってもよく、例えば組織サンプルと流体サンプルとの組み合わせであってもよい。また用語「生体サンプル」は、例えば便サンプル、組織サンプルまたは組織生検などの固体材料をホモジナイズしたものを含む材料も含む。また用語「生体サンプル」は、組織培養または細胞培養から誘導された材料も含む。生体サンプルを得るためのあらゆる適切な方法を使用することができる；典型的な方法としては、例えば、静脈切開、綿棒（例えば腔内用綿棒）、および、穿刺吸引細胞診による生検法が挙げられる。穿刺吸引細胞診に適した典型的な組織としては、リンパ節、肺、肺洗浄液、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液）、甲状腺、乳房、膵臓および肝臓が挙げられる。またサンプルは、例えば顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）またはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹標本（例えば、ＰＡＰ塗抹標本）、または、乳管洗浄によっても回収することができる。個体から得られたまたは個体から誘導された「生体サンプル」は、個体から採取された後にあらゆる適切な方式で加工されたあらゆるサンプルも含む。
【００９７】
[0118]さらに、当然のことながら、生体サンプルは、多数の個体から生体サンプルを採取し、それらをプールするかまたはそれぞれ個々の生体サンプルのアリコートをプールすることによっても誘導できることも認識すべきである。プールされたサンプルは、単一の個体からのサンプルとして扱うことができ、さらに、プールされたサンプル中に癌の存在が立証された場合、それぞれ個々の生体サンプルを再度試験して、その個体が膵癌を有するかどうかを決定することができる。
【００９８】
[0119]本発明の目的において、成句「個体からの生体サンプルに起因するデータ」は、様々な形態で、個体の生体サンプルから誘導されたデータ、または、個体の生体サンプルを用いて作製されたデータを意味するものとする。このようなデータは、作製後に、例えば一つの測定システムでの単位からその他の測定システムでの単位に変換することによって、ある程度再フォーマットしてもよいし、改訂してもよいし、または、数学的に改変してもよい；ただし、このようなデータは当然ながら、生体サンプルから誘導されたものであるか、または、生体サンプルを用いて作製されたものである。
【００９９】
[0120]「標的」、「標的分子」および「分析物」は、本明細書において同じ意味で用いられ、生体サンプル中に存在し得るあらゆる対象分子を意味する。「対象分子」は、何らかのわずかな変化を含む特定の分子も包含し、例えばタンパク質の場合、例えばアミノ酸配列のわずかな変化、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または、その他のあらゆる操作または改変、例えば標識成分との共役など、分子の性質を実質的に変更することのない変化を含むものも包含される。「標的分子」、「標的」または「分析物」は、１つの分子タイプまたは分子種の一連の複製か、または多分子構造である。「標的分子」、「標的」および「分析物」は、このような一連の分子の１つより多くを意味する。典型的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ（affybody）、抗体ミミック、ウイルス、病原体、有毒物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、および、前述のもののいずれかのあらゆるフラグメントまたは部分が挙げられる。
【０１００】
[0121]本明細書で用いられる「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において同じ意味で用いられ、様々な長さのアミノ酸ポリマーを意味する。このようなポリマーは直鎖状でもよいしまたは分岐状でもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、さらに、アミノ酸以外のものが割り込んでいてもよい。またこれらの用語は、自然に修飾されたアミノ酸ポリマー、または、例えばジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化またはその他のあらゆる操作もしくは改変、例えば標識成分との共役などの介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。またこれらの定義には、例えば、１種またはそれより多くのアミノ酸類似体（例えば、自然には存在しないアミノ酸など）、加えて当業界でよく知られているその他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、一本鎖であってもよいし、または、複数が連携した鎖であってもよい。これらの定義には、プレタンパク質および無傷の成熟タンパク質；成熟タンパク質から誘導されたペプチドまたはポリペプチド；タンパク質フラグメント；スプライス変異体；タンパク質の組換え型；アミノ酸の改変、欠失または置換を含むタンパク質変異体；消化産物；および、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などの翻訳後修飾がなされたものも含まれる。
【０１０１】
[0122]本明細書で用いられる「マーカー」および「バイオマーカー」は、同じ意味で用いられ、個体における正常または異常なプロセス、または、個体における病気またはその他の状態を示す標的分子か、または、そのようなプロセスまたは状態の徴候となる標的分子を意味する。より具体的に言えば、「マーカー」または「バイオマーカー」は、特定の生理学的な状態またはプロセスの存在に付随する、解剖学的、生理学的、生化学的または分子的なパラメーターであって、正常または異常かどうか、異常な場合、慢性または急性かどうかを示す。バイオマーカーは、実験室レベルの分析や医学的なイメージングなど様々な方法で検出および測定が可能である。バイオマーカーがタンパク質の場合、生体サンプル中のある種のタンパク質バイオマーカーの量やそれらの存在もしくは非存在の代替的な尺度として、それに対応する遺伝子の発現を利用したり、または、バイオマーカーまたはバイオマーカーの発現を制御するタンパク質をコードする遺伝子のメチル化の状態を利用したりすることも可能である。
【０１０２】
[0123]本明細書で用いられる「バイオマーカー値」、「値」、「バイオマーカーレベル」および「レベル」は、同じ意味で用いられ、生体サンプル中のバイオマーカーを検出するためのあらゆる分析方法を用いてなされる測定を意味し、さらに、生体サンプル中のバイオマーカーの、生体サンプル中のバイオマーカーに関する、または、生体サンプル中のバイオマーカーに対応する、存在、非存在、絶対量もしくは濃度、相対量もしくは濃度、タイター、レベル、発現レベル、測定されたレベルの比率または同種のものを示す測定を意味する。「値」または「レベル」の正確な意味は、バイオマーカーを検出するのに用いられる具体的な分析方法の特定の設計および構成に応じて決まる。
【０１０３】
[0124]あるバイオマーカーが、個体における異常なプロセスまたは病気またはその他の状態を示すかまたはそれらの徴候である場合、そのバイオマーカーは、一般的に、個体において正常なプロセスまたは病気もしくはその他の状態の非存在を示すか、または、その徴候を示すバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して過剰発現されるかまたは過小発現されると説明される。「アップレギュレーション」、「アップレギュレートされた」、「過剰発現」、「過剰発現された」およびそれらのあらゆる変化形は、同じ意味で用いられ、健康または正常な個体から得られた類似の生体サンプルから一般的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（または、値またはレベルの範囲）よりも高い、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを意味する。この用語はまた、特定の病気の異なるステージで検出される可能性があるバイオマーカーの値またはレベル（または、値またはレベルの範囲）よりも高い、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを意味する場合もある。
【０１０４】
[0125]「ダウンレギュレーション」、「ダウンレギュレートされた」、「過小発現」、「過小発現された」およびそれらのあらゆる変化形は、同じ意味で用いられ、健康または正常な個体から得られた類似の生体サンプルから一般的に検出されるバイオマーカーの値またはレベル（または、値またはレベルの範囲）よりも低い生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを意味する。この用語はまた、特定の病気の異なるステージで検出される可能性があるバイオマーカーの値またはレベル（または、値またはレベルの範囲）よりも低い生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルを意味する場合もある。
【０１０５】
[0126]さらに、過剰発現されたバイオマーカーまたは過小発現されたバイオマーカーはいずれも、個体において正常なプロセスまたは病気もしくはその他の状態の非存在を示すか、または、その徴候を示すバイオマーカーの「正常な」発現レベルまたは値と比較して「示差的に発現される」、または、「示差的なレベル」または「示差的な値」を有することを意味する場合もある。従って、バイオマーカーの「示差的発現」は、そのバイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動を意味する場合もある。
【０１０６】
[0127]用語「示差的遺伝子発現」および「示差的発現」は、同じ意味で用いられ、その発現が、特定の病気に罹った被検者において、正常またはコントロール被験者における発現と比べて高いまたはそれより低いレベルに活性化される遺伝子（またはそれに対応するタンパク質発現産物）を意味する。この用語はまた、その発現が、同じ病気の異なるステージにおいてより高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子（またはそれに対応するタンパク質発現産物）も含む。また当然のことながら、示差的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化されるかまたは阻害される場合もあり、あるいは、オルタナティブスプライシングを受けて異なるポリペプチド産物が生成する場合もある。このような差は、ｍＲＮＡレベル、表面発現、ポリペプチドの分泌またはその他の分節化などの様々な変化によって証明される場合がある。示差的遺伝子発現としては、２種またはそれより多くの遺伝子の発現またはそれらの遺伝子産物の比較；または、２種またはそれより多くの遺伝子の発現またはそれらの遺伝子産物の比率の比較；またさらには、同じ遺伝子の生成物であってそれぞれ異なってプロセシングされた２種の生成物の比較（これらは、正常な被験者と病気に罹った被験者とで異なる）；または、同じ病気の様々なステージにおける生成物の比較が挙げられる。示差的発現は、例えば正常細胞および病的な細胞を比較した、または、異なる病気の現象または病気のステージを経た細胞を比較した、遺伝子またはその発現産物の時間的な発現パターンまたは細胞発現パターンにおける、定量的な差と定性的な差の両方を含む。
【０１０７】
[0128]本明細書で用いられる「個体」は、被験者または患者を意味する。個体は、哺乳動物であってもよいし、または、哺乳動物以外の動物でもよい。様々な実施態様において、個体は、哺乳動物である。哺乳動物の個体は、ヒトでもよいし、または、ヒト以外でもよい。様々な実施態様において、個体は、ヒトである。健康または正常な個体は、従来の診断方法によって対象の病気または状態（例えば、膵臓疾患、膵臓関連の疾患またはその他の膵臓の状態など）が検出されない個体である。
【０１０８】
[0129]「〜と診断する」、「診断すること」、「診断」およびそれらの変化形は、個体に関する徴候、症状、データまたはその他の情報の１種またはそれより多くに基づきその個体の健康の状況または状態を検出、決定または評価することを意味する。個体の健康状態は、健康／正常と診断される場合もあり（すなわち、病気または状態がないという診断）、または、病的／異常と診断される場合もある（すなわち、病気または状態の特徴があるという診断、または、そのような特徴の評価）。用語「〜と診断する」、「診断すること」、「診断」等は、特定の病気または状態に関して、その病気を最初に検出すること；その病気の特徴付けまたは分類；その病気の進行、寛解または再発を検出すること；および、個体に処置または治療を施した後の病気の応答を検出することも含む。膵癌の診断は、癌を有する個体を、癌を有さない個体と区別することを含む。膵癌の診断はさらに、ＧＩおよび正常なコントロールを膵癌と区別することも含む。
【０１０９】
[0130]「〜を予知する」、「予知すること」、「予知」およびそれらの変化形は、病気または状態を有する個体における将来的な病気または状態の経過の予想を意味し（例えば、患者の生存を予想すること）、このような用語は、個体に処置または治療を施した後の病気の応答を評価することも包含する。
【０１１０】
[0131]「〜を評価する」、「評価すること」、「評価」およびそれらの変化形は、「〜を診断すること」および「〜を予知すること」の両方を包含し、さらに、病気を有さない個体における将来的な病気または状態の経過に関する決定または予測、加えて、病気が治癒したように見える個体において病気または状態が再発する可能性に関する決定または予測も包含する。また用語「〜を評価する」は、治療に対する個体の応答を評価すること、も包含し、例えば、個体が、治療剤に良好に応答する可能性が高いか、または、治療剤に応答する可能性が低い（または、例えば毒作用またはその他の望ましくない副作用を経験すると予想される）かどうかを予想すること、個体に投与する治療剤を選択すること、または、個体に施された治療に対する個体の応答をモニターまたは決定することも包含する。従って、膵癌「を評価すること」としては、例えば、以下のいずれか：個体における将来的な膵癌の経過を予知すること；膵癌が外見的に治癒したように見える個体における膵癌の再発を予想すること；または、膵癌治療に対する個体の応答を決定または予想すること、または、個体の生体サンプルから誘導されたバイオマーカー値の決定に基づいて個体に施す膵癌治療を選択すること、が挙げられる。
【０１１１】
[0132]以下の例はどれも、膵癌を「診断すること」または「評価すること」のいずれかと称することができる：まず膵癌の存在または非存在を検出すること；特定のステージ、タイプもしくはサブタイプまたはその他の分類、あるいは膵癌の特徴を決定すること；疑わしい腫瘤が良性病変かまたは悪性の膵臓腫瘍かどうかを決定すること；または、膵癌の進行（例えば、腫瘍増殖または転移性の拡大をモニターすること）、寛解または再発を検出／モニターすること。
【０１１２】
[0133]本明細書で用いられる「追加の生物医学的情報」は、癌のリスク、または、より具体的には膵癌のリスクに関連する本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれかを用いてなされる評価以外の、個体の１つまたはそれより多くの評価を意味する。「追加の生物医学的情報」としては、以下に示すものが挙げられる：三次元再構成を用いたコントラスト増強マルチスライス（多検出器）ヘリカルコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、経皮的超音波または超音波内視鏡（ＵＳまたはＥＵＳ）、内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、磁気共鳴像（ＭＲＩ）、ＭＲ胆道膵管造影（ＭＲＣＰ）、または、腹部超音波のいずれかによって観察された膵臓の腫瘤を含む個体の身体的なデータ；個体の身長および／または体重；体重の変化；個体の民族性；職業歴；膵癌（またはその他の癌）の家族歴；個体または家族におけるより高い膵癌（またはその他の癌）のリスクと相関する遺伝子マーカーの存在；膵臓の腫瘤またはその他の腹部の腫瘤の存在または非存在；腫瘤のサイズ；腫瘤の位置；（例えばイメージングによって観察されるような）腫瘤および関連する腹部領域の形態；腹痛、体重の減少、食欲低下、早期の満腹感、下痢または脂肪便症、黄疸、非定型的な糖尿病の最近の発病、近年の、ただし説明のつかない血栓性静脈炎の病歴、または、以前の膵炎の発作などの臨床症状；遺伝子発現値；放射線イメージングによって観察された身体的なデータなどの個体の身体的なデータ；個体の身長および／または体重；個体の性別；個体の民族性；喫煙歴；アルコール摂取歴；職業歴；既知の発癌性物質への曝露（例えばアスベスト、ラドンガス、化学物質、火災の煙、および、大気汚染、固定または移動汚染源からの排気、例えば工場／工場または自動車／船舶／航空機からの排気等のいずれかへの曝露）；間接的な煙への曝露；および、膵癌の家族歴またはその他の癌。その他の実験室試験（例えばＣＡ１９−９試験、血清ビリルビン濃度、アルカリホスファターゼ活性、貧血の存在）などの追加の生物医学的情報のいずれかの評価と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、バイオマーカーのみを試験すること、または、追加の生物医学的情報いずれか特定の項目のみ（例えば超音波イメージング単独）を評価することと比較して例えば膵癌の検出（またはその他の膵癌に関連する用途）に関する感度、特異度および／またはＡＵＣを改善する可能性がある。追加の生物医学的情報は、当業界でよく知られている日常的な技術を用いて個体から得ることができ、例えば慣例的な患者への質問事項または健康歴の質問事項等を使用することにより個体本人から得てもよいし、または、医療の専門家から得てもよい。追加の生物医学的情報のいずれかの評価と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、バイオマーカーのみを試験すること、または、追加の生物医学的情報いずれか特定の項目のみ（例えばＣＴイメージングのみ）を評価することと比較して、例えば、膵癌の検出（またはその他の膵癌に関連する用途）に関する感度、特異度および／またはＡＵＣを改善する可能性がある。
【０１１３】
[0134]癌関連抗原１９−９（ＣＡ１９−９）は、膵癌に関連するよく知られた血液マーカーである。ＣＡ１９−９の報告されている膵癌に関する感度および特異度は、それぞれ８０〜９０パーセントである。しかしながら、これらの値は腫瘍のサイズに密接に関連する。ＣＡ１９−９の外科的に切除可能な小さい癌を有する患者を確認する精度には限界がある。ＣＡ１９−９は、発現されるルイス式血液型抗原（グリコシルトランスフェラーゼ）の存在を必要とする。なかでもルイス陰性の表現型を有する個体（人口の５〜１０パーセントと推測される）においては、ＣＡ１９−９レベルは、有用な腫瘍マーカーではない。またＣＡ１９−９は特異度にも限界がある。ＣＡ１９−９は、様々な良性の膵胆道系障害を有する患者において高レベルであることが多い。（初期の測定値と術後の測定値の両方における）ＣＡ１９−９上昇の程度は、長期予後に関連する。さらに、切除可能な病気を有するように見える患者において、同様に、ＣＡ１９−９レベルの規模は、放射線による潜在性の転移性疾患の存在を予測する助けにもなる。ＣＡ１９−９レベルを連続的にモニターすることは、治癒する可能性がある外科手術を受けた後の患者の経過を観察するのに有用であり、さらに、進行中の病気のために化学療法を受けている患者のためにも有用である。ＣＡ１９−９レベルの上昇は通常、再発疾患が放射線撮影によって明らかになる前に起こるが、病気の進行の確認は、画像の研究および／または生検の後になると予想される。ＣＡ１９−９と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、例えば、ＣＡ１９−９単独と比較して、膵癌の検出（またはその他の膵癌に関連する用途）に関する感度、特異度および／またはＡＵＣを改善する可能性がある。
【０１１４】
[0135]用語「濃度曲線下面積」または「ＡＵＣ」は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の濃度曲線下面積を意味する用語であり、これらはいずれも当業界公知である。ＡＵＣ測定は、全データ範囲にわたり分類器の精度を比較するのに有用である。分類器のＡＵＣが大きければ大きいほど、未知のものを対象の２つのグループ（例えば膵癌サンプルと正常またはコントロールサンプル）に正確に分類する能力がより高い。ＲＯＣ曲線は、２つの個体群（例えば、膵癌を有する患者と膵癌を有さないコントロール）を区別することにおいて、具体的な特徴（例えば、本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれか、および／または、追加の生物医学的情報のいずれかの項目）の挙動をプロットするのに有用である。典型的には、全個体群（例えば上記患者とコントロール）の特徴のデータを、一つの特徴の値に基づいて昇順にソートする。続いてその特徴に関する各値ごとに、データの真陽性と偽陽性との比率を計算する。真陽性の比率は、その特徴に関する値より高い値を示す患者の数をカウントして、その数を患者の総数で割ることにより決定される。偽陽性の比率は、その特徴に関する値より高い値を示すコントロールの数をカウントして、その数をコントロールの総数で割ることにより決定される。この定義は、特徴がコントロールと比較して高い値を示すという前提で述べられているが、この定義はまた、特徴がコントロールの場合と比較してより低いという前提においても適用される（このような前提において、その特徴に関する値より低い値を示すサンプルがカウントされると思われる）。ＲＯＣ曲線は、一つの特徴に関して作製することができるし、さらにその他のデータと共に作製してもよく、例えば２種またはそれより多くの特徴の組み合わせを数学的に（例えば足し算、引き算、かけ算により）連結して、単一の合計値を提供してもよく、さらにこの単一の合計値をＲＯＣ曲線にプロットしてもよい。加えて、複数の特徴のあらゆる組み合わせから単一のデータ値を引き出して、それらをＲＯＣ曲線にプロットすることもできる。これらの特徴の組み合わせは、試験を含んでもよい。ＲＯＣ曲線は、試験の真陽性の比率（感度）を、その試験の偽陽性の比率（１−特異度）に対してプロットしたものである。
【０１１５】
[0136]本明細書で用いられるように、バイオマーカー値に関して「〜を検出すること」または「〜を決定すること」は、バイオマーカー値に相当するシグナルを観察して記録するのに必要な装置と、そのシグナルを発生させるのに必要な材料の両方を使用することを含む。様々な実施態様において、バイオマーカー値はあらゆる適切な方法を用いて検出され、このような方法としては、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析法、赤外分光分析法、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡法、電気化学的な検出方法、核磁気共鳴、量子ドットなどが挙げられる。
【０１１６】
[0137]「固体支持体」は、本明細書において、分子が共有結合または非共有結合のどちらかを介して直接的または間接的に付着することができる表面を有するあらゆる基材を意味する。「固体支持体」は、様々な物理形態を有していてもよく、このような物理形態としては、例えば、メンブレン；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えばスライドガラス、または、カバースリップ）；カラム；中空、固体、半固体、孔または空隙を含むビーズのような粒子；ゲル；ファイバー、例えば光ファイバー材料；マトリックス；および、サンプル貯蔵容器が挙げられる。典型的なサンプルの貯蔵容器としては、サンプルウェル、チューブ、毛細管、バイアルおよびその他のあらゆる容器、サンプルを保持することができる溝またはへこみが挙げられる。サンプルの貯蔵装置は、例えばマイクロタイタープレート、スライド、マイクロフルイディクス装置などのマルチサンプルプラットフォームに入れることもできる。支持体は、天然材または合成材料で構成されていてもよいし、有機または無機材料で構成されていてもよい。捕捉試薬を付着させた固体支持体の組成は、一般的に付着の方式（例えば共有結合）に依存する。その他の典型的な容器としては、その中で分析および関連の操作が可能な、微小液滴、および、マイクロフルイディック制御されたまたは大型の油／水エマルジョンが挙げられる。適切な固体支持体としては、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカベースの材料、官能化ガラス、変性ケイ素、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、ナイロン、天然繊維（例えば絹、羊毛および綿）、ポリマーなどが挙げられる。このような固体支持体を構成する材料は、例えば捕捉試薬の付着に用いられるカルボキシ、アミノまたはヒドロキシル基などの反応性基を含んでいてもよい。高分子固体支持体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、および、ポリメチルペンテンが挙げられる。使用することができる適切な固体支持体粒子としては、例えばコード化された粒子、例えばルミネックス（Luminex）タイプのコード化された粒子、磁気粒子、および、ガラス粒子が挙げられる。
【０１１７】
バイオマーカーの例示的な用途
[0138]様々な代表的な実施態様において、個体において膵癌を診断する方法が提供され、本方法は、個体の循環系中に存在する、例えば血清または血漿中に存在する１種またはそれより多くのバイオマーカーに対応する１種またはそれより多くのバイオマーカー値を、様々な分析方法（例えば本明細書において説明される分析方法のいずれか）によって検出することによってなされる。このようなバイオマーカーは、例えば、膵癌を有する個体において膵癌を有さない個体と比較して示差的に発現される。個体におけるバイオマーカーの示差的発現の検出は、例えば、膵癌を早期診断するため、良性腫瘤と、悪性腫瘤（例えばコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、ＭＲＩまたは超音波で観察された腫瘤）とを区別するため、膵癌の再発をモニターするため、または、例えば急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像などのその他の臨床症状との鑑別診断のために用いることができる。
【０１１８】
[0139]本明細書において説明されるバイオマーカーはいずれも、以下に示すような膵癌に関する様々な臨床的な指標において用いることができる：（例えば高リスクの個体または個体群における）膵癌の検出；例えば膵癌（膵癌）と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像とを区別すること、および／または、腺癌と、その他のタイプの悪性細胞とを区別すること（または別の方法で組織病理学的観察を補助すること）によって膵癌を特徴付けること（例えば、膵癌のタイプ、サブタイプまたはステージを決定すること）；膵臓の腫瘤が良性なのかまたは悪性の膵臓腫瘍なのかを決定すること；膵癌の予後を決定すること；膵癌の進行または寛解をモニターすること；膵癌の再発をモニターすること；転移をモニターすること；処置の選択；治療剤またはその他の処置に対する応答をモニターすること；超音波内視鏡（ＥＵＳ）によるスクリーニングのための個体の層化（例えば、より高い膵癌リスクを示すために放射線スクリーニングが功を奏する可能性が最も高い個体を同定し、ＥＵＳの陽性適中率を増加させること）；バイオマーカー試験を、喫煙もしくはアルコール摂取歴など、または、ＣＡ１９−９レベル、膵癌に関するより高いリスクを示す遺伝子マーカーの存在等の追加の生物医学的情報や、または、腫瘤のサイズ、形態、腹水の存在などと組み合わせること（例えば、ＣＡ１９−９試験またはその他のバイオマーカー試験、あるいは腫瘤のサイズ、形態学的な観察などと比較して高い診断性能を有する分析を提供するため）；腹部の腫瘤が悪性か良性かの診断を容易にすること；ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴまたはＥＵＳで腹部の腫瘤が、観察されたら、臨床的な判断を容易にすること（例えば、腹部の腫瘤のリスクが低いとみなされた場合、例えばバイオマーカーベースの試験で陰性であった場合、再度の放射線スキャンを命じること（腫瘤サイズの類別は行ってもよいし行わなくてもよい）、または、例えばバイオマーカーベースの試験で陽性であった場合、腫瘤が中程度〜高リスクとみなされた場合、生検を考察すること（腫瘤サイズまたは組織浸潤の程度の類別は行ってもよいし行わなくてもよい））；および、臨床的な経過観察に関する決定（例えば、腹部の腫瘤をイメージングで観察した後に、再度の放射線イメージングスキャン、細針生検または外科手術を実施するかどうかの決定）を容易にすること。バイオマーカー試験は、高リスク個体のＥＵＳスクリーニングを単独で行うよりも陽性適中率（ＰＰＶ）を改善することが可能である。ＥＵＳスクリーニングと併用した場合の有用性に加えて、本明細書において説明されるバイオマーカーは、例えばＣＴ、ＭＲＩまたはＰＥＴスキャンなどの膵癌に関して用いられるその他のあらゆるイメージング様式と併用することもできる。ここで説明されるバイオマーカーはさらに、上記の使用のいずれかを、イメージング様式またはその他の臨床的な相関によって膵癌の指標が検出される前、または症状が現れる前に達成することにおいて有用であり得る。ここで説明されるバイオマーカーの使用はさらに、膵癌と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像とを区別することも含む。
【０１１９】
[0140]本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれかを使用して膵癌を診断する方法の一例として、膵癌を有するかどうかわかっていない個体における、ここで説明されるバイオマーカーの１種またはそれより多くの示差的発現が挙げられるが、これは、その個体が膵癌を有することの指標となり、従って、おそらくその他の手段によって膵癌が検出される前、または、症状が現れる前における、処置が最も有効な初期の疾患ステージにおける膵癌の検出を可能にする。膵癌の経過中における１種またはそれより多くのバイオマーカーの過剰発現は、膵癌の進行を示す可能性があり、例えば膵臓腫瘍が成長および／または転移していること（従って予後不良）を示すが、それに対して、１種またはそれより多くのバイオマーカーが示差的に発現される程度が低い場合（すなわち、それに続くバイオマーカー試験において、その個体の発現レベルが変動したり、または「正常な」発現レベルに近づいたりする場合）は、膵癌の寛解を示す可能性があり、例えば膵臓腫瘍が縮小したことを示す（従って良好な予後またはより優れた予後を示す）。同様に、膵癌治療の経過中に１種またはそれより多くのバイオマーカーが示差的に発現される程度の増加（すなわち、それに続くバイオマーカー試験において、その個体における発現レベルが変動したり、または「正常な」発現レベルからさらに逸脱する場合）は、膵癌が進行していることを示す可能性があり、従って、処置の効果がないことが示されるが、それに対して膵癌治療の経過中における１種またはそれより多くのバイオマーカーの示差的発現の減少は、膵癌の寛解を示す可能性があり、従って、処置が功を奏したことを示す。加えて、個体の膵癌が外見的に治癒した後における１種またはそれより多くのバイオマーカーの示差的発現の増加または減少は、膵癌の再発を示す可能性がある。このような状況において、個体は、後になって膵癌の再発が検出されなかったときではなく、それよりも初期のステージで、例えば治療を再開してもよい（または、治療計画を改変してもよく、例えば個体が治療を続ける場合、投与量および／または頻度を増やしてもよい）。さらに、個体における１種またはそれより多くのバイオマーカーの示差的発現レベルから、特定の治療剤に対する個体の応答を予測することも可能である。膵癌の再発または進行のモニターにおいて、バイオマーカーの発現レベルの変化は、例えば膵癌の活発度を決定するために、または、処置の変更の必要性を決定するために再度のイメージング（例えば再度のＥＵＳ）の必要性の指標になる可能性がある。
【０１２０】
[0141]本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれかの検出は、例えば処置の成功を評価するために、または、処置後に膵癌の寛解、再発および／または進行（転移を含む）をモニターするために、膵癌治療の後、または、それと共に行うことが特に有用な場合がある。膵癌治療としては、例えば、個体への治療剤の投与、外科手術の実施（例えば、膵臓腫瘍の少なくとも一部の外科的切除、または、膵臓と周辺組織の除去）、放射線療法の投与、または、当業界用いられるその他のあらゆるタイプの膵癌治療、ならびにこれらの処置のあらゆる組み合わせが挙げられる。例えば、本バイオマーカーはいずれも、処置後に少なくとも１回検出してもよいし、または、処置後に（例えば定期的な間隔で）複数回検出してもよく、または、処置の前後両方で検出してもよい。個体における本バイオマーカーのいずれかの長期にわたる示差的発現レベルは、膵癌の進行、寛解または再発の指標となる可能性があり、このような指標の例としては、以下に示すものが挙げられる：本バイオマーカーの発現レベルの処置後が、本バイオマーカーの処置前における発現レベルと比較して増加しているかまたは減少していること；処置後の後期のタイムポイントにおける本バイオマーカーの発現レベルが、処置後の初期のタイムポイントにおける本バイオマーカーの発現レベルと比較して増加しているかまたは減少していること；および、本バイオマーカーの正常レベルと比較した、本バイオマーカーの一つのタイムポイントにおける示差的発現レベル。
【０１２１】
[0142]具体的な例として、本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれかに関するバイオマーカーレベルは、術前および術後（例えば術後２〜８週間）の血清または血漿サンプルで決定することができる。術後サンプルにおける本バイオマーカーの発現レベルが術前サンプルと比較して増加している場合、膵癌の進行（例えば外科手術の失敗）を示す可能性があるが、それに対して術後サンプルにおける本バイオマーカーの発現レベルが術前サンプルと比較して減少している場合、膵癌の退縮（例えば、外科手術による膵臓腫瘍除去の成功）を示す可能性がある。それ以外の形態の処置の前後に本バイオマーカーレベルの類似の解析を行ってもよいし、例えば放射線療法、または治療剤もしくは癌ワクチンの投与の前後に行ってもよい。
【０１２２】
[0143]バイオマーカーレベルを独立した診断テストとして試験することに加えて、バイオマーカーレベルの試験は、病気の罹りやすさのリスクが高いことを示すＳＮＰまたはその他の遺伝子の損傷または変異の決定と共に行うこともできる（例えば、Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)を参照）。
【０１２３】
[0144]バイオマーカーレベルを独立した診断テストとして試験することに加えて、バイオマーカーレベルの試験は、放射線スクリーニングと共に行うこともできる。バイオマーカーレベルを独立した診断テストとして試験することに加えて、バイオマーカーレベルの試験は、関連する症状または遺伝学的試験と共に行うこともできる。本明細書において説明されるいずれかのバイオマーカーの検出は、イメージングによって膵臓の腫瘤が観察された後に、膵癌の診断に役立たせること、適切な外科専門医によるケア、または、切除では治療できない患者における待期的療法によるケアなどの個体への適切な臨床的ケアの手順を示すのに有用な場合がある。バイオマーカーレベルを関連する症状または危険因子と共に試験することに加えて、本バイオマーカーに関する情報はさらに、その他のタイプのデータと共に評価することもでき、このようなデータとしては、具体的には、膵癌に関する個体のリスク（例えば、患者の病歴、症状、膵癌の家族歴、喫煙歴またはアルコール摂取歴、糖尿病の突然発症、黄疸、例えば遺伝子マーカーの存在などの危険因子、および／または、その他のバイオマーカーの状態など）を示すデータが挙げられる。これらの様々なデータは、例えばコンピュータープログラム／ソフトウェアなどの自動的な方法で評価することができ、このような方法はコンピューターまたはその他の装置／デバイスで実施することができる。
【０１２４】
[0145]高リスク個体においてバイオマーカーレベルを放射線スクリーニングと共に試験すること（例えば、バイオマーカーレベルを、画像スキャンで観察された膵臓の腫瘤のサイズまたはその他の特徴と共に評価すること）に加えて、本バイオマーカーに関する情報はさらにその他のタイプのデータと共に評価することもでき、このようなデータとしては、具体的には、膵癌に関する個体のリスク（例えば患者の病歴、症状、癌の家族歴、例えば個体が喫煙者や重度のアルコール摂取者であるかどうかといった危険因子、および／または、その他のバイオマーカーの状態など）を示すデータが挙げられる。これらの様々なデータは、例えばコンピュータープログラム／ソフトウェアなどの自動的な方法で評価することができ、このような方法はコンピューターまたはその他の装置／デバイスで実施することができる。
【０１２５】
[0146]ここで説明されるバイオマーカーはいずれも、造影試験で使用することが可能である。例えば、その他の使用のなかでも特に、膵癌診断に役立たせるため、病気の進行／寛解または転移をモニターするため、病気の再発をモニターするため、または、治療に対する応答をモニターするために用いることができる造影剤を、ここで説明されるいずれかのバイオマーカーと組み合わせることができる。
【０１２６】
バイオマーカーおよびバイオマーカー値の検出および決定
[0147]本明細書において説明されるバイオマーカーに関するバイオマーカー値は、よく知られた様々な分析方法のいずれかを用いて検出することができる。一実施態様において、バイオマーカー値は、捕捉試薬を用いて検出される。本明細書で用いられる「捕捉物質」または「捕捉試薬」は、バイオマーカーに特異的に結合することができる分子を意味する。様々な実施態様において、捕捉試薬は、溶液中で本バイオマーカーに曝露させてもよいし、または、捕捉試薬が固体支持体に固定されている間に本バイオマーカーに曝露させてもよい。その他の実施態様において、捕捉試薬は、固体支持体上で二次的な特徴との反応性を有する特徴を含む。これらの実施態様において、捕捉試薬を溶液中で本バイオマーカーに曝露させ、続いて、捕捉試薬上の特徴を、本バイオマーカーを固体支持体上に固定するための固体支持体上の二次的な特徴と共に利用することができる。捕捉試薬は、実施する予定の解析のタイプに基づいて選択される。捕捉試薬としては、これらに限定されないが、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体およびその他のタンパク質の足場、自己抗体、キメラ、低分子物質、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティクス、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および、合成受容体、ならびにこれらを改変したものおよびこれらのフラグメントが挙げられる。
【０１２７】
[0148]いくつかの実施態様において、バイオマーカー値は、バイオマーカー／捕捉試薬複合体を用いて検出される。
[0149]その他の実施態様において、このようなバイオマーカー／捕捉試薬複合体から誘導されたバイオマーカー値は、間接的に検出され、例えばバイオマーカー／捕捉試薬の相互作用の後に起こるが、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の形成に依存する反応の結果として間接的に検出される。
【０１２８】
[0150]いくつかの実施態様において、バイオマーカー値は、生体サンプル中のバイオマーカーから直接的に検出される。
[0151]一実施態様において、本バイオマーカーは、生体サンプル中の２種またはそれより多くのバイオマーカーを同時に検出することができる多重化フォーマットを用いて検出される。多重化フォーマットの一実施態様において、捕捉試薬は、固体支持体上の別々の位置で、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合によって固定される。その他の実施態様において、別々の固体支持体を使用する多重化フォーマットも挙げられ、このような場合、それぞれの固体支持体は、例えば量子ドットのようなその固体支持体に関連する固有の捕捉試薬を有する。その他の実施態様において、生体サンプル中で検出され得る複数のバイオマーカーそれぞれの検出のために個々の装置が用いられる。このような個々の装置は、生体サンプル中の各バイオマーカーが同時に処理されるように設計することができる。例えば、マイクロタイタープレートは、プレート中の各ウェルがぞれぞれ、生体サンプル中で検出され得る複数のバイオマーカーのうちいずれか１種を独自に解析するために用いられるように利用することができる。
【０１２９】
[0152]上述の実施態様の１またはそれより多くにおいて、蛍光タグを用いて、バイオマーカー値の検出が可能になるようにバイオマーカー／捕捉試薬複合体の成分を標識することができる。様々な実施態様において、蛍光標識を、よく知られた技術を用いて本明細書において説明されるバイオマーカーのいずれかに特異的な捕捉試薬に結合させてもよく、続いてこのような蛍光標識を用いて、それに対応するバイオマーカー値を検出することもできる。適切な蛍光標識としては、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３、Ｑｄｏｔ６０５、リサミン、フィコエリトリン、テキサスレッド、およびその他の類似の化合物が挙げられる。
【０１３０】
[0153]一実施態様において、蛍光標識は、蛍光色素分子である。いくつかの実施態様において、蛍光色素分子としては、インドリウム環の３位炭素における置換基に化学的に反応性を有する基または共役物質が含まれる、少なくとも１種の置換インドリウム環系が挙げられる。いくつかの実施態様において、このような色素分子としては、アレクサフルオロ（AlexFluor）分子、例えばアレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ５３２、アレクサフルオロ６４７、アレクサフルオロ６８０、または、アレクサフルオロ７００が挙げられる。その他の実施態様において、このような色素分子としては、第一種および第二種の色素分子が挙げられ、例えば２種の異なるアレクサフルオロ分子である。その他の実施態様において、このような色素分子としては、第一種および第二種の色素分子が挙げられ、このような２種の色素分子は、異なる放出スペクトルを有する。
【０１３１】
[0154]蛍光は、多様な分析フォーマットと適合する様々な機器を用いて測定することができる。例えば、分光蛍光計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、印刷されたアレイ、キュベットなどを解析するように設計されている。J.R. Lakowicz著のPrinciples of Fluorescence Spectroscopy(Springer Science + Business Media, Inc.(2004))を参照。Bioluminescence & Chemiluminescence:Progress & Current Applications;Philip E. StanleyおよびLarry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company(2002年1月)を参照。
【０１３２】
[0155]上述の実施態様の一つまたはそれより多くにおいて、バイオマーカーの値の検出を可能にするために、任意に化学発光タグを使用して、バイオマーカー／捕捉試薬複合体の成分を標識することもできる。適切な化学発光物質としては、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ビピリジン）３２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、ピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニン、ペルオキシオキサレート、シュウ酸アリール、アクリジニウムエステル、ジオキセタン等のあらゆるものが挙げられる。
【０１３３】
[0156]さらにその他の実施態様において、検出方法としては、バイオマーカー値に対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせが挙げられる。一般的に、このような酵素は、分光光度法、蛍光および化学発光などの様々な技術を用いて測定することができる発色性基質の化学的変化を触媒する。適切な酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、および、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。
【０１３４】
[0157]さらにその他の実施態様において、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する蛍光、化学発光、放射性核種の組み合わせ、または、酵素／基質の組み合わせであってもよい。バイオマーカー分析フォーマットにおいて、多モードのシグナル生成が独自で有利な特徴を示す場合がある。
【０１３５】
[0158]より具体的に言えば、本明細書において説明されるバイオマーカーに関するバイオマーカー値は、よく知られた分析方法を用いて検出することができ、このような分析方法としては、シングルプレックスアプタマー分析、多重化アプタマー分析、シングルプレックスまたは多重化イムノアッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分光分析、組織学的／細胞学的な方法などが挙げられる（以下で詳述する）。
【０１３６】
アプタマーベースの分析を用いたバイオマーカー値の決定
[0159]生体サンプルおよびその他のサンプル中の生理学的に重要な分子の検出および定量化を目的とした分析は、科学的な調査や健康管理の分野において重要なツールである。このような分析の種類の一つは、固体支持体に固定された１種またはそれより多くのアプタマーを含むマイクロアレイの使用を含むものである。それぞれのアプタマーは、高度に特異的な方式で、極めて高い親和性で標的分子に結合することができる。例えば発明の名称が「核酸リガンド（Nucleic Acid Ligands）」という米国特許第５，４７５，０９６号を参照；さらに、例えば米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、および、それぞれ発明の名称が「核酸リガンド診断バイオチップ（Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip）」という米国特許第６，５０３，７１５号も参照されたい。マイクロアレイがサンプルと接触すると、アプタマーはサンプル中に存在するそれぞれの標的分子に結合し、それによりバイオマーカーに対応するバイオマーカーの値の決定が可能になる。
【０１３７】
[0160]本明細書で用いられる「アプタマー」は、標的分子に特異的な結合親和性を有する核酸を意味する。親和性相互作用は、程度の問題であるが、本発明に係る状況において、アプタマーのその標的に対する「特異的な結合親和性」は、アプタマーがその標的に結合する際、一般的に試験サンプル中のその他の成分に結合するよりもかなり高い程度の親和性で結合することを意味することとする。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する１種の核酸分子タイプまたは核酸分子種のコピーのセットである。アプタマーは、適切であればどのような数のヌクレオチド（様々な化学的修飾ヌクレオチド等も含む）を含んでいてもよい。「アプタマー」は、このような分子群の１種より多くを意味する。アプタマーごとに、ヌクレオチドの数は同一でもよいしまたは異なっていてもよい。アプタマーは、ＤＮＡ、または、ＲＮＡ、または、化学修飾された核酸であってもよく、さらに、一本鎖、二本鎖であってもよいし、または、二本鎖の領域を含んでいてもよいし、さらにより高次の構造を有していてもよい。またアプタマーは光アプタマーであってもよく、このようなアプタマーには光反応性または化学反応性を有する官能基が含まれており、それに対応する標的と共有結合で連結させることが可能である。本明細書において開示されたアプタマー方法はいずれも、同じ標的分子に特異的に結合する２種またはそれより多くのアプタマーの使用を含んでいてもよい。以下でさらに説明されるように、アプタマーはタグを含んでいてもよい。アプタマーがタグを含む場合、アプタマーのコピー全てが同じタグを有していなくてもよい。さらに、異なるアプタマーそれぞれがタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは同じタグまたは異なるタグのどちらを有していてもよい。
【０１３８】
[0161]アプタマーは、例えばＳＥＬＥＸプロセスなどのよく知られたあらゆる方法を用いて同定することができる。アプタマーが同定されたら、アプタマーは、例えば化学合成法や酵素合成法などのよく知られたあらゆる方法に従って製造または合成することができる。
【０１３９】
[0162]本明細書で用いられる「ＳＯＭＡｍｅｒ」、または、遅い解離速度の改変アプタマー（Slow Off-Rate Modified Aptamer）は、改善された解離速度特性を有するアプタマーを意味する。ＳＯＭＡｍｅｒは、発明の名称が「解離速度が改善されたアプタマーの製造方法（Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates）」という米国公報第２００９／０００４６６７号で説明されている、改善されたＳＥＬＥＸ方法を用いて生成することができる。
【０１４０】
[0163]用語「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸプロセス」は、本明細書において同じ意味で用いられ、一般的に、（１）標的分子と望ましい方式で相互作用する（例えばタンパク質に高親和性で結合する）アプタマーの選択と、（２）このようにして選択された核酸の増幅との組み合わせを意味する。ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、特異的な標的またはバイオマーカーに高親和性を有するアプタマーを同定することができる。
【０１４１】
[0164]ＳＥＬＥＸは、一般的に、核酸の候補混合物を製造すること、候補混合物を望ましい標的分子に結合させて親和性複合体を形成すること、親和性複合体を未結合の候補核酸から分離すること、親和性複合体を分離してそれから核酸を単離すること、核酸を精製すること、および、特異的なアプタマー配列を同定することを含む。選択されたアプタマーの親和性をさらに向上させるために、このプロセスを複数回行ってもよい。このプロセス中に１ヶ所またはそれより多くの時点に、増幅工程が含まれていてもよい。例として、発明の名称が「核酸リガンド」という米国特許第５，４７５，０９６号を参照された。ＳＥＬＥＸプロセスを用いることにより、標的と共有結合するアプタマーだけでなく、標的と非共有結合によって結合するアプタマーも生成される可能性がある。例として、発明の名称が「指数関数的な濃縮による核酸リガンドの系統的進化：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX）」という米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
【０１４２】
[0165]ＳＥＬＥＸプロセスを用いて、アプタマーに例えば改善されたインビボでの安定性または改善された送達特定などの改善された特徴を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性のアプタマーを同定することができる。このような修飾の例としては、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基位置における化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸプロセスによって同定された修飾ヌクレオチド含有アプタマーは、発明の名称が「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド(High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides）」という米国特許第５，６６０，９８５号で説明されており、これは、ピリミジンの５’位および２’位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを説明している。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１種またはそれより多くのヌクレオチドを含む高度に特異的なアプタマーを説明している。さらに、増補された物理特性および化学特性を有する核酸ライブラリー、ならびにそれらのＳＥＬＥＸおよびＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸにおける使用を説明する、発明の名称が「ＳＥＬＥＸおよびＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ（SELEX and PHOTOSELEX）」という米国特許出願公開公報第２００９００９８５４９号も参照されたい。
【０１４３】
[0166]ＳＥＬＥＸは、望ましい解離速度特性を有するアプタマーを同定するのに用いることもできる。標的分子に結合することができるアプタマーを製造するための改善されたＳＥＬＥＸ方法を説明している、発明の名称が「解離速度が改善されたアプタマーの製造方法（Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates）」という米国特許出願公開公報第２００９０００４６６７号を参照されたい。それによれば、それぞれの標的分子からの解離速度が比較的遅いアプタマーおよび光アプタマーの製造方法が説明されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸標的複合体が形成が起こるようにそのままにし、続いて遅い解離速度の濃縮プロセスを行うことを含み、ここで遅い解離速度を有する複合体がその状態を保つ一方で、速い解離速度を有する核酸標的複合体は、解離して再形成されないと予想される。加えて、この方法は、改善された解離速度性能を有するアプタマーを作製するために、候補核酸混合物の製造中に修飾ヌクレオチドを使用することを含む。
【０１４４】
[0167]この分析のバリエーションにおいて、アプタマーとそれらの標的分子との共有結合または「光架橋」を可能にする光反応性官能基を含むアプタマーが用いられる。例えば、発明の名称が「核酸リガンド診断バイオチップ（Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip）」という米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称される。例えば、いずれも発明の名称が「指数関数的な濃縮による核酸リガンドの系統的進化：核酸リガンドおよびＳＥＬＥＸ溶液の光選択（Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX）」という米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および、米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい；さらに例えば、発明の名称が「核酸リガンドの光選択（Photoselection of Nucleic Acid Ligands）」という米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイをサンプルと接触させて、光アプタマーにそれらの標的分子と結合する機会が与えられると、光アプタマーが光活性化されて、固体支持体を洗浄して非特異的に結合したあらゆる分子が除去される。光アプタマー上の光活性化した官能基によって形成された共有結合のために光アプタマーに結合した標的分子は概ね除去されないため、激しい洗浄条件を用いることができる。従ってこのような分析は、試験サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値の検出をこのような方式で可能にしている。
【０１４５】
[0168]これらの分析フォーマットのいずれにおいても、アプタマーは、サンプルと接触させる前に固体支持体に固定される。しかしながら、ある種の環境下では、サンプルと接触させるの前にアプタマーを固定すると、最適な分析が行われない場合がある。例えば、事前のアプタマーの固定は、固体支持体の表面上でアプタマーとその標的分子との非効率的な混合が起こる可能性があり、おそらくそのために反応時間が長くなり、従って、アプタマーの標的分子への効率的な結合をもたらすためにインキュベート期間も延長される恐れがある。さらにこのような分析で光アプタマーが用いられる場合、固体支持体として用いられる材料によっては、固体支持体は、光アプタマーとその標的分子との共有結合の形成を達成するのに必要な光を散乱させたりまたは吸収したりする傾向を有する場合がある。さらに、用いられる方法によっては、固体支持体の表面も使用されたあらゆる標識物質に曝露されたりその影響を受けたりすることから、そのアプタマーに結合した標的分子の検出も不正確になりやすい。最後に言えば、固体支持体上へのアプタマーの固定は通常、アプタマーをサンプルに曝露させる前にアプタマー調製工程（すなわち固定）を含むが、この調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を与える可能性がある。
【０１４６】
[0169]さらに、溶液中でアプタマーがその標的を捕捉することを可能にし、検出前にアプタマー標的混合物の特異的な成分が除去されるように設計された分離工程を利用するアプタマー分析も説明されている（発明の名称が「試験サンプルの多重化解析（Multiplexed Analyses of Test Samples）」という米国特許出願公開公報第２００９００４２２０６号を参照）。ここで説明されるアプタマー分析方法は、核酸（すなわちアプタマー）を検出および定量することによる試験サンプル中の非核酸標的（例えばタンパク質標的）の検出および定量化を可能にする。ここで説明される方法では、非核酸標的を検出および定量するための核酸の代替物（すなわちアプタマー）が作製されるため、増幅などの広範囲の様々な核酸技術を、タンパク質標的などの様々な望ましい標的に適用することができる。
【０１４７】
[0170]アプタマーバイオマーカー複合体（または光アプタマーとバイオマーカーとが共有結合した複合体）から分析要素を容易に分離して、検出および／または定量化のためにアプタマーを単離できるように、アプタマーを構築することができる。一実施態様において、このようなコンストラクトは、アプタマー配列内に切断可能な要素または取り外し可能な要素を含んでいてもよい。その他の実施態様において、アプタマーに、例えば標識された成分または検出可能な成分、スペーサー要素、または、特異的な結合タグ、または固定化要素などの追加の官能基を導入してもよい。例えばアプタマーは、切断可能な部分を介してアプタマーに連結されたタグ、標識、標識と切断可能な部分とを隔てるスペーサー要素を含んでいてもよい。一実施態様において、切断可能な要素は、光切断可能なリンカーである。光切断可能なリンカーは、ビオチン部分とスペーサーセクションとに結合させてもよいし、アミンを誘導体化するためのＮＨＳ基を含んでいてもよいし、さらに、アプタマーにビオチン基を導入して、その後の分析方法においてアプタマーを放出できるようにするために用いてもよい。
【０１４８】
[0171]溶液中の全ての分析要素を用いて行われる均質分析（homogenous assay）は、シグナル検出の前にサンプルと試薬との分離を必要としない。このような方法は、迅速で取り扱いが簡単である。このような方法では、その特異的な標的と反応する分子または結合試薬の捕捉に基づいてシグナルが発生する。膵癌に関して、分子の捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体または同種のものであると予想され、特異的な標的は、表１の第２列に示された膵癌バイオマーカーであると予想される。
【０１４９】
[0172]一実施態様において、シグナル生成方法は、フルオロフォア標識された捕捉試薬とその特異的なバイオマーカー標的との相互作用による異方性のシグナル変化を利用する。標識された捕捉物がその標的と反応すると、分子量の増加により複合体に結合したフルオロフォアの回転運動が起こり、異方性の値の変化がかなり遅くなる。異方性の変化をモニターすることによって、結合現象を利用して溶液中のバイオマーカーを定量的に測定することができる。その他の方法としては、蛍光偏光分析、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー転移などが挙げられる。
【０１５０】
[0173]生体サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するのに用いることができる典型的な溶液ベースのアプタマー分析は：（ａ）第一のタグを含み、バイオマーカーに特異的な親和性を有するアプタマーと、生体サンプルを接触させることにより混合物を製造すること（ここで、上記バイオマーカーがサンプル中に存在する場合、アプタマー親和性複合体が形成される）；（ｂ）この混合物を、第一の捕捉要素を含む第一の固体支持体に晒して、そのまま第一のタグと第一の捕捉要素とを会合させること；（ｃ）第一の固体支持体に会合しなかった混合物中の全ての成分を除去すること；（ｄ）第二のタグを、アプタマー親和性複合体のバイオマーカー成分に結合させること；（ｅ）第一の固体支持体からアプタマー親和性複合体を放出させること；（ｆ）放出されたアプタマー親和性複合体を、第二の捕捉要素を含む第二の固体支持体に晒して、そのまま第二のタグと第二の捕捉要素とを会合させること；（ｇ）複合体化しなかったアプタマーをアプタマー親和性複合体から分けることにより、この混合物から全ての複合体化しなかったアプタマーを除去すること；（ｈ）アプタマーを固体支持体から溶出させること；および、（ｉ）アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによりバイオマーカーを検出すること、を含む。
【０１５１】
[0174]当業界公知のあらゆる手段を用いて、アプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することによりバイオマーカー値を検出することができる。多数の様々な検出方法を用いて、親和性複合体のアプタマー成分を検出することができ、このような方法としては、例えば、ハイブリダイゼーション分析、マススペクトロスコピー、または、ＱＰＣＲが挙げられる。いくつかの実施態様において、核酸配列解析方法を用いてアプタマー親和性複合体のアプタマー成分を検出することができ、それによってバイオマーカー値を検出することができる。簡単に言えば、試験サンプルをあらゆる種類の核酸配列解析方法で処理することにより、試験サンプル中に存在する１種またはそれより多くのアプタマーの配列または複数の配列を同定および定量することができる。いくつかの実施態様において、このような配列としては、アプタマー分子全体でもよいし、または、分子を固有に同定するのに利用することができるアプタマー分子のいずれか一部でもよい。その他の実施態様において、識別に役立つ配列は、アプタマーに付加される特異的な配列である；このような配列はしばしば「タグ」、「バーコード」または「ジップコード」と称される。いくつかの実施態様において、配列解析方法には、アプタマー配列を増幅するため、または、様々な位置に化学修飾を含むＲＮＡおよびＤＮＡなどのあらゆる種類の核酸を、配列解析に適したその他のあらゆる種類の核酸に変換するために、酵素を用いた工程が含まれる。
【０１５２】
[0175]いくつかの実施態様において、配列解析方法には、１またはそれより多くのクローニング工程が含まれる。その他の実施態様において、配列解析方法には、クローニングを行わない直接的な配列解析方法が含まれる。
【０１５３】
[0176]いくつかの実施態様において、配列解析方法には、試験サンプル中の１種またはそれより多くのアプタマーを標的とする特異的なプライマーを用いた指向性アプローチが含まれる。その他の実施態様において、配列解析方法には、試験サンプル中の全てのアプタマーを標的とするショットガンアプローチが含まれる。
【０１５４】
[0177]いくつかの実施態様において、配列解析方法には、配列解析のために標的化された分子を増幅するための酵素を用いた工程が含まれる。その他の実施態様において、配列解析方法において、単一の分子を直接的に配列解析する。生体サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するのに用いることができる典型的な核酸配列解析ベースの方法は：（ａ）酵素を用いた工程を用いて、化学修飾されたヌクレオチドを含むアプタマーの混合物を修飾されていない核酸に変換すること；（ｂ）このようにして得られた修飾されていない核酸を、例えば４５４シークエンシングシステム（Sequencing System）（４５４ライフサイエンシズ／ロシュ（Life Sciences/Roche））、イルミナ・シークエンシングシステム（Illumina Sequencing System）（イルミナ（Illumina））、ＡＢＩソリッド・シークエンシングシステム（ABI SOLiD Sequencing System）（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））、ヘリスコープ・シングルモレキュール・シーケンサー（HeliScope Single Molecule Sequencer）（ヘリコス・バイオサイエンシズ（Helicos Biosciences））、または、パシフィック・バイオサイエンシズ・リアルタイム・シングルモレキュール・シークエンシングシステム（Pacific Biosciences Real Time Single-Molecule Sequencing System）（パシフィック・バイオサイエンシズ（Pacific BioSciences））、または、ポロネーターＧシークエンシングシステム（Polonator G Sequencing System）（ドーバー・システムズ（Dover Systems））などの大規模並列配列解析プラットフォームを用いてショットガン配列解析で解析すること；および、（ｃ）この混合物中に存在するアプタマーを、特異的な配列および配列数によって同定および定量すること、を含む。
【０１５５】
イムノアッセイを用いたバイオマーカー値の決定
[0178]イムノアッセイ法は、それに対応する標的または分析物への抗体の反応に基づいており、特定の分析フォーマットに応じてサンプル中の分析物を検出することができる。分析方法の特異度と感度を免疫反応性に基づいて改善するために、その特異的なエピトープ認識のためにモノクローナル抗体が用いられることが多い。また、ポリクローナル抗体はモノクローナル抗体と比較して標的に対し高い親和性を有するために、ポリクローナル抗体の使用も様々なイムノアッセイで成功を収めてきた。イムノアッセイは、多様な生体サンプルマトリックスと併用するために設計されている。イムノアッセイのフォーマットは、定性的、半定量的および定量的な結果が得られるように設計されている。
【０１５６】
[0179]定量結果は、検出しようとする特定の分析物の既知濃度を用いて作製された標準曲線を使用することによって得られる。標準曲線に未知のサンプルからの応答またはシグナルをプロットして、未知のサンプル中の標的に相当する量または値が定められる。
【０１５７】
[0180]多数のイムノアッセイフォーマットが設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出について定量的な分析を行うことができる。この方法は、標識が分析物または抗体のいずれかに付着することに基づいており、標識成分は直接的または間接的に酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的またはサンドイッチによる検出に適合するようにフォーマットすることができる。その他の方法は、例えば放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に基づくものである。さらなる技術としては、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックス分析、およびその他の技術が挙げられる（ImmunoAssay:A Practical Guide, edited by Brian Law, published by Taylor & Francis, Ltd., 2005年版を参照）。
【０１５８】
[0181]典型的な分析フォーマットとしては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、および、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、または、時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出する手法の例としては、バイオマーカーの免疫沈降、その後に行われるゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面エレクトロクロマトグラフィーなどのサイズおよびペプチドレベルの識別が可能な定量方法が挙げられる。
【０１５９】
[0182]検出可能な標識またはシグナルを生成する材料を検出および／または定量する方法は、標識の性質によって決められる。適切な酵素によって触媒された反応の生成物（ここで検出可能な標識は酵素である；上記参照）は、これらに限定されないが、が挙げられる蛍光性、発光または放射性であってもよく、またはこのような生成物は可視光または紫外光を吸収するものでもよい。このような検出可能な標識の検出に適したを検出器の例としては、これらに限定されないが、Ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、熱量計、蛍光測定器、ルミノメーター、および、濃度計が挙げられる。
【０１６０】
[0183]いずれの検出方法も、反応物のあらゆる適切な調製、処理および解析が可能なあらゆるフォーマットで行うことができる。検出方法は、例えばマルチウェル（例えば９６ウェルまたは３８４ウェル）の分析プレートで行うこともできるし、または、あらゆる適切なアレイまたはマイクロアレイを用いることもできる。様々な物質のストック溶液を手動で作製してもよいし、またはロボット作製してもよく、それに続くピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、サンプル読み出し、データ回収および解析はいずれも、市販の解析ソフトウェア、ロボット工学、および、検出可能な標識を検出することができる検出装置を用いてロボットで行うこともできる。
【０１６１】
遺伝子発現プロファイリングを用いたバイオマーカー値の決定
[0184]生体サンプル中のｍＲＮＡの測定は、それに対応する生体サンプル中のタンパク質レベルを検出する代わりに用いることができる。従って、本明細書において説明されるバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルはいずれも、適切なＲＮＡを検出することによって検出が可能である。
【０１６２】
[0185]ｍＲＮＡの発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、それに続いてｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製することができる。ｑＰＣＲ分析でｃＤＮＡを用いると、ＤＮＡ増幅プロセスが進行につれて蛍光が生じる。標準曲線と比較することにより、ｑＰＣＲにより、例えば細胞あたりのｍＲＮＡコピー数のような絶対的な測定値を得ることができる。サンプル中のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために、ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダー分析およびＲＴ−ＰＣＲと、キャピラリー電気泳動とのあらゆる組み合わせが用いられている。Gene Expression Profiling:Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004を参照されたい。
【０１６３】
[0186]ｍｉＲＮＡ分子は、コーディング配列でなないが遺伝子発現を調節する可能性がある低分子ＲＮＡである。ｍＲＮＡ発現レベルの測定に適した方法はいずれも、それに対応するｍｉＲＮＡに用いることもできる。近年、多くの研究所で病気のバイオマーカーとしてのｍｉＲＮＡの使用が調査されている。多くの病気が広範囲の転写調節を伴っているため、ｍｉＲＮＡのバイオマーカーとしての役割が見出され得ることは驚くことではない。ｍｉＲＮＡ濃度と病気との関連は、タンパク質レベルと病気との関連ほど明確ではないことが多いが、それでもｍｉＲＮＡバイオマーカーの価値はかなりのものである可能性がある。当然ながら、病中に示差的に発現されるあらゆるＲＮＡの場合と同様に、インビトロでの診断製品の開発が直面する問題は、ｍｉＲＮＡが罹患した細胞中で存在し続け、解析のために容易に抽出できるという要件、または、ｍｉＲＮＡが血液またはその他のマトリックスに放出され、そこでそれらが、長期間にわたり測定されるのに十分なだけ存在し続けなければならないという要件を満たすことが挙げられる。タンパク質バイオマーカーにも類似の要件があるが、多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、病中に、傍分泌の様式で、病変部位および機能性部位で意図的に分泌される。多くの潜在的なタンパク質バイオマーカーは、その内部でタンパク質が合成される細胞の外側で機能するように設計される。
【０１６４】
インビボでの分子イメージング技術を用いたバイオマーカーの検出
[0187]ここで説明されるバイオマーカー（表１の第２列を参照）はいずれも、分子イメージング試験で使用することが可能である。例えば、その他の使用のなかでも特に、膵癌診断に役立てるため、病気の進行／寛解または転移をモニターするため、病気の再発に関してモニターするため、または、治療に対する応答をモニターするために用いることができる造影剤を、ここで説明されるいずれかのバイオマーカーと組み合わせることができる。
【０１６５】
[0188]インビボでのイメージング技術によって、個体の体内において特定の病気の状態を決定するための非侵襲的方法が可能になる。例えば、体の一部または全身でさえも三次元画像として観察することができ、それによって体の形態および構造に関する有用な情報を得ることができる。このような技術は、個体の癌の状態、具体的には膵癌の状態に関する情報を得るために、本明細書において説明されるバイオマーカーの検出と組み合わせるすることができる。
【０１６６】
[0189]インビボでの分子イメージング技術の使用は、様々な技術の進歩により拡がっている。これらの進歩としては、体内で強いシグナルを提供することができる新しいコントラスト剤または標識、例えば放射標識および／または蛍光標識の開発；および、これらのシグナルを有用な情報が得られるように十分な感度と精度で体外で検出および解析することができる強力な新しいイメージング技術の開発が挙げられる。コントラスト剤は、適切なイメージングシステムで可視化することができ、それによりコントラスト剤が存在する体の部分または体の複数の部分の画像を提供することができる。コントラスト剤は、捕捉試薬、例えばアプタマーまたは抗体、例えば、および／または、ペプチドまたはタンパク質、または、オリゴヌクレオチド（例えば遺伝子発現の検出の場合）、または、これらのいずれかと１種またはそれより多くの高分子とを含む複合体、および／または、その他の粒状物質と結合または会合することができる。
【０１６７】
[0190]またイメージングにおいて有用な放射性原子を特徴とするコントラスト剤もある。適切な放射性原子としては、シンチグラフィー研究のためのテクネチウム−９９ｍ、または、ヨウ素−１２３が挙げられる。その他の容易に検出可能な部分としては、例えば磁気共鳴像（ＭＲＩ）のためのスピン標識が挙げられ、このようなものとして、例えば、上記同様にヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄が挙げられる。このような標識は当業界でよく知られており、当業者であれば容易に選択することができる。
【０１６８】
[0191]標準的なイメージング技術としては、これらに限定されないが、磁気共鳴像、コンピューター断層撮影スキャン、ポジトロンエミッショントモグラフィー（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などが挙げられる。インビボにおける画像診断について、利用可能な検出装置のタイプは、所定のコントラスト剤（例えば所定の放射性核種）と、それを用いてターゲティングするための特定のバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡなど）とを選択する際の重要な要素である。通常、所定のタイプの装置で検出可能な崩壊のタイプを有する放射性核種が選択される。またインビボでの診断のための放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織による取り込みが最大になる程度の長さである一方で、宿主にとって有害な放射線照射が最小になるような短い時間で検出できるような長さとすべきである。
【０１６９】
[0192]典型的なイメージング技術としては、これらに限定されないが、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴが挙げられ、これらは、個体に放射性核種が合成的または局所的に投与されるイメージング技術である。それに続く放射性トレーサーの取り込みが経時的に測定され、標的化された組織とバイオマーカーに関する情報を得るために用いられる。用いられた特定の同位体からの高エネルギー（ガンマ線）の放出、および、それらを検出するのに用いられる装置の感度や精巧さのために、体外で放射活性の二次元分布を推測してもよい。
【０１７０】
[0193]ＰＥＴにおいて一般的に使用される陽電子放出核種としては、例えば、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、および、フッ素−１８が挙げられる。ＳＰＥＣＴでは、電子捕捉および／またはガンマ線放出によって崩壊する同位体が用いられ、このような同位体としては、例えば、ヨウ素−１２３、および、テクネチウム−９９ｍが挙げられる。アミノ酸をテクネチウム−９９ｍで標識する典型的な方法は、キレート前駆体の存在下で過テクネチウム酸イオンを還元して不安定なテクネチウム−９９ｍ前駆体複合体を形成し、続いてこれを二官能基を有するように改変した走化性ペプチドの金属結合基と反応させてテクネチウム−９９ｍ−走化性ペプチド結合体を形成する方法である。
【０１７１】
[0194]このようなインビボでの画像診断方法において、抗体がよく使用される。インビボでの診断のための抗体の製造と使用は当業界でよく知られている。個体の病気の状態を診断または評価する目的で、表１の第２列に示されるバイオマーカーのいずれかと特異的に結合する標識抗体は、使用された特定のバイオマーカーによって検出可能な所定のタイプの癌（例えば膵癌）を有する疑いのある個体に注入することができる。使用された標識は、これまでに述べらたような使用する予定のイメージング様式に従って選択されると予想される。標識の局在化によって、癌の拡大を判定することができる。また臓器または組織内の標識の量も、その臓器または組織における癌の存在または非存在の判定を可能にする。
【０１７２】
[0195]このようなインビボでの画像診断方法には、アプタマーも同様に用いることができる。例えば、表１の第２列に記載された特定のバイオマーカーを同定するのに使用された（従って、その特定のバイオマーカーに特異的に結合する）アプタマーを適切に標識して、その特定のバイオマーカーに従って検出可能な膵癌を有する疑いのある個体に、その個体の膵癌の状態を診断または評価する目的で注入することができる。使用された標識は、これまでに述べらたような使用する予定のイメージング様式に従って選択されると予想される。標識の局在化によって、癌の拡大を判定することができる。また臓器または組織内の標識の量も、その臓器または組織における癌の存在または非存在の判定を可能にする。アプタマーに向けられた造影剤は、その他の造影剤と比較して、組織浸透、組織分布、速度論、排出、効力および選択性に関して独自で有利な特徴を有する可能性がある。
【０１７３】
[0196]またこのような技術は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたイメージングによる遺伝子発現の検出のために、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて行ってもよい。これらの方法は、例えばインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、標識として蛍光分子または放射性核種と共に用いられる。その他の遺伝子発現の検出方法としては、例えば、レポーター遺伝子活性の検出が挙げられる。
【０１７４】
[0197]その他の一般的なタイプのイメージング技術は、光学造影法であり、これは、被験者の外部にある光学装置によって被験者内の蛍光シグナルを検出する方法である。このようなシグナルは、実際の蛍光に起因するシグナルでもよいし、および／または、生物発光に起因するシグナルでもよい。光学的な検出装置の感度を改善することで、インビボでの診断分析における光学造影法の有用性を高めてきた。
【０１７５】
[0198]例えば臨床試験等について、新しい癌治療に関する試験で臨床効果をより迅速に測定するため、および／または、例えば多発性硬化症のような病気のためのプラセボを用いた長期にわたる処置であって、このような長期にわたる処置が倫理的に問題があるとみなされる恐れがある処置を回避するために、インビボにおける分子レベルのバイオマーカーイメージングの使用が増えている。
【０１７６】
[0199]その他の技術の総論に関しては、N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009を参照されたい。
組織学的／細胞学的方法を用いたバイオマーカー値の決定
[0200]膵癌を評価するために、組織学的または細胞学的方法において様々な組織サンプルを使用することができる。サンプルの選択は、原発腫瘍の位置および転移の部位に応じて決定される。組織学的方法には、例えば内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）または超音波内視鏡（ＥＵＳ）ガイド下ＦＮＡの時点で回収された組織サンプル（鉗子生検、穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）、および／または、ブラシ細胞診）を用いてもよい。細胞学的方法には、腹水または腹腔洗浄液または膵液を用いてもよい。本明細書において、膵臓を有する個体においてアップレギュレートされていることが示された確認されたバイオマーカーのいずれか（表１の第６列を参照）を用いて、病気の指標として組織標本を染色することができる。
【０１７７】
[0201]一実施態様において、膵臓細胞サンプルの細胞学的な評価において、対応するバイオマーカーに特異的な１種またはそれより多くの捕捉試薬が用いられるが、このような評価は、以下に示すもの：細胞サンプルを回収すること、細胞サンプルを固定すること、細胞サンプルを脱水し、洗浄し、顕微鏡スライド上に固定すること、細胞サンプルを透過化すること、分析物の検索のために処理すること、染色すること、脱色すること、洗浄すること、ブロックすること、および、緩衝液中で１種またはそれより多くの捕捉試薬と反応させること、のうち１つまたはそれより多くを含む。その他の実施態様において、細胞サンプルは細胞ブロックから生産される。
【０１７８】
[0202]その他の実施態様において、膵臓の組織サンプルの組織学的な評価において、対応するバイオマーカーに特異的な１種またはそれより多くの捕捉試薬が用いられるが、このような評価は、以下に示すもの：組織試料を回収すること、組織サンプルを固定すること、組織サンプルを脱水し、洗浄し、顕微鏡スライド上に固定すること、組織サンプルを透過化すること、分析物の検索のために処理すること、染色すること、脱色すること、洗浄すること、ブロックすること、水を加えて復元すること、および、緩衝液中で捕捉試薬と反応させること、のうち１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。その他の実施態様において、固定および脱水の代わりに凍結を行ってもよい。
【０１７９】
[0203]その他の実施態様において、対応するバイオマーカーに特異的な１種またはそれより多くのアプタマーを組織学的または細胞学的なサンプルと反応させることにより、核酸増幅法における核酸標的として利用することができる。適切な核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ、ｑ−ベータレプリカーゼ、ローリングサークル増幅、鎖置換、ヘリカーゼ依存性増幅、ループ媒介等温増幅、リガーゼ連鎖反応、ならびに、制限および循環化支援ローリングサークル増幅が挙げられる。
【０１８０】
[0204]一実施態様において、組織学的または細胞学的な評価において使用するために、対応するバイオマーカーに特異的な１種またはそれより多くの捕捉試薬は緩衝液中で混合されるが、このような緩衝液は、以下のもの：ブロッキング材料、競合剤、洗浄剤、安定剤、キャリアー核酸、ポリアニオン系材料等のいずれかを含んでいてもよい。
【０１８１】
[0205]「細胞学的プロトコール」は、一般的に、サンプルの回収、サンプルの固定、サンプルの不動化、および、染色を含む。「細胞の調製」は、サンプル回収後に数種の処理工程を含んでいてもよく、例えば、調製された細胞を染色するための１種またはそれより多くの遅い解離速度のアプタマーの使用を含む。
【０１８２】
[0206]サンプルの回収は、未処理の運搬容器中に直接サンプルを入れること、いくつかのタイプの媒体を含む運搬容器中にサンプルを入れること、または、何の処置または固定を行わないでスライド上に直接サンプルを置くこと（固定）を含み得る。
【０１８３】
[0207]サンプルの固定は、回収された試料の一部をポリリジン、ゼラチンまたはシランで処理したスライドガラスに塗布することによって改善することができる。スライドは、スライド全体に細胞の薄く均一な層を塗りつけることによって調製することができる。一般的に、機械的な変形や乾燥による人為的な結果を最小化するように注意する。液体試料は、細胞ブロック法で処理することができる。あるいはその代わりに、液体試料と固定液とを１：１の比率で室温で約１０分間混合してもよい。
【０１８４】
[0208]細胞ブロックは、残留した滲出液、痰、尿沈渣、胃腸液、細胞擦過物、または、穿刺吸引細胞診から製造することができる。細胞は、遠心分離または膜ろ過によって濃縮または収集される。細胞ブロックを調製するための様々な方法が開発されてきた。代表的な手法としては、堆積物の固定、細菌寒天、または、膜ろ過法が挙げられる。堆積物を固定する方法において、細胞堆積物を、ブアン固定液、ピクリン酸または緩衝ホルマリンのような固定剤と混合し、続いてこの混合物を遠心分離して固定した細胞をペレット化する。上清を捨てて、細胞ペレットを可能な限り完全に乾燥させる。ペレットを回収して、レンズペーパーで包み、組織カセット中に入れる。組織カセットを追加の固定剤を含むジャーの中に入れ、組織サンプルとして加工する。寒天法は非常に類似した方法であるが、ペレットを取り出してペーパータオル上で乾燥させ、続いて半分にカットする。カット面をスライドガラス上で融解させた寒天１滴のなかに入れて、続いてペレットを寒天で覆って寒天中に気泡が形態されないようにする。寒天をそのまま硬化させて、過量の寒天を全て取り除き形を整える。これを組織カセットに入れて、組織処理を完了させる。あるいは、ペレットを６５℃で２％の液体寒天に直接懸濁して、サンプルを遠心分離してもよい。寒天細胞ペレットをそのまま４℃で１時間凝固させる。遠心管から凝固した寒天を取り出して、半分にスライスしてもよい。寒天をろ紙で包み、組織カセットに入れる。この時点から先の処理は上述した通りである。これらの手法のいずれにおいても、遠心分離を膜ろ過で代用してもよい。これらのプロセスのどれを用いても、「細胞ブロックサンプル」を作製することができる。
【０１８５】
[0209]細胞ブロックは、特殊樹脂を用いて調製することができ、このような特殊樹脂としては、ロイクリル（Lowicryl）樹脂、ＬＲホワイト（LR White）、ＬＲゴールド（LR Gold）、ユニクリル（Unicryl）、および、モノステップ（MonoStep）が挙げられる。これらの樹脂は低粘度であり、低温で、紫外線（ＵＶ）を用いて重合が可能である。このような包埋プロセスは、サンプルを脱水中に徐々に冷却すること、サンプルを樹脂に移動させること、および、ブロックを最終的な低温で適切なＵＶ波長で重合することに頼る。
【０１８６】
[0210]細胞ブロックの切片は、細胞形態学的な試験のためにヘマトキシリン−エオシンで染色してもよく、同時に、特異的なマーカーの試験のために追加の切片が用いられる。
[0211]このようなプロセスが細胞学的でも組織学的でも、サンプル分解を防ぐために追加の処理が行われる前に、サンプルを固定してもよい。このプロセスは「固定」と呼ばれており、同じ意味で用いることができる様々な材料および手法を説明する。サンプルの固定手順および試薬は、検出しようとうする標的と解析しようとする特異的な細胞／組織タイプに基づいて経験的に最適なものが選択される。サンプルの固定は、例えばエタノール、ポリエチレングリコール、メタノール、ホルマリン、または、イソプロパノールのような試薬によってなされる。サンプルは、回収してスライドに付着させた後できるだけすぐに固定すべきである。しかしながら、選択された固定剤によって様々な分子標的に構造変化が導入されて、その後の検出をより難しくする可能性がある。固定および不動化プロセスおよびそれらの順序によって細胞の外観が変化する可能性があるため、細胞検査技師はこれらの変化を予想し確認しなければならない。ある種の細胞型において、固定剤により収縮が起こり、細胞質が顆粒状または網状に見えるようになる可能性がある。多くの固定剤は、細胞成分と架橋を形成することによって機能する。それにより、特異的なエピトープに損傷を与えたりまたはそれらを変性させたり、新しいエピトープが生成したり、分子会合を引き起こしたり、および、膜の透過性を低下させたりする可能性がある。ホルマリン固定は、最も一般的な細胞学的／組織学的なアプローチの一つである。ホルマリンは、隣接するタンパク質間で、または、タンパク質内でメチル架橋を形成する。さらに沈殿または凝固も固定に用いられ、この種の固定にはエタノールがよく用いられる。架橋形成と沈殿とを固定に併用してもよい。形態学的な情報を保存するには強い固定プロセスが最良であり、一方で分子標的の保存にはそれより弱い固定プロセスが最良である。
【０１８７】
[0212]代表的な固定剤は、５０％無水エタノール、２ｍＭポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１．８５％ホルムアルデヒドである。この調合のバリエーションとしては、エタノール（５０％〜９５％）、メタノール（２０％〜５０％）、および、ホルマリン単独（ホルムアルデヒド）が挙げられる。その他の一般的な固定剤は、２％ＰＥＧ１５００、５０％エタノール、および、３％メタノールである。スライドを固定剤中に室温で約１０〜１５分入れ、その後取り出しそのまま乾燥させる。スライドが固定されたら、それらをＰＢＳなどの緩衝液ですすいでもよい。
【０１８８】
[0213]細胞、細胞内および組織の特徴または形態学的な構造を示差的に強調表示して相違を示したり、または「染色」したりするのに、様々な色素を用いることができる。ヘマトキシリンは、核を青色または黒色に染色するのに用いられる。オレンジＧ−６およびエオシンアズールはいずれも、細胞の細胞質を染色する。オレンジＧは、ケラチンおよびグリコーゲンを含む細胞を黄色に染色する。エオシンＹは、核小体、繊毛、赤血球、および、表層上皮扁平細胞を染色するのに用いられる。ロマノフスキー染色は、空気乾燥させたスライドに用いられ、多形態性を高めて、細胞外物質を細胞内物質から区別することにおいて有用である。
【０１８９】
[0214]染色プロセスは、細胞の染色剤の透過性を高める処置を含んでいてもよい。界面活性剤を用いた細胞の処理を用いて、透過性を高めることができる。細胞および組織の透過性を高めるために、溶媒、サポニンまたは非イオン性界面活性剤で固定サンプルをさらに処理してもよい。また酵素消化も、組織サンプル中における特異的な標的の接近しやすさを改善する可能性がある。
【０１９０】
[0215]染色後、サンプルをアルコール濃度を徐々に増加させた一連のアルコールですすぐことにより脱水する。最後の洗浄は、スライドに載せられるカバースリップの屈折率に近い屈折率を有する、キシレンまたは柑橘類のテルペンなどのキシレン代替物でなされる。この最終工程はクリーニングと称される。サンプルを脱水してクリーニングしたら、マウントのための媒体を塗布する。マウントのための媒体は、ガラスに近い屈折率を示すように選択され、カバースリップをスライドに一体化させることができる。このような媒体はさらに、細胞サンプルのさらなる乾燥、収縮または退色を防ぐと予想される。
【０１９１】
[0216]使用された染色剤または処理にかかわらず、膵臓の細胞学的試料の最終的な評価は、形態の目視検査およびマーカーの存在または非存在の決定を可能にするいくつかのタイプの顕微鏡によってなされる。典型的な顕微鏡法としては、明視野、位相コントラスト、蛍光および微分干渉コントラストが挙げられる。
【０１９２】
[0217]試験後にサンプルに第二の試験が必要な場合、カバースリップを取り除き、スライドを脱色してもよい。脱色は、最初にスライドを染色するのに使用された元の溶媒系を、色素を添加しないで、さらに染色手順と逆の順番で用いることを含む。また脱色は、細胞が無色になるまでスライドを酸性アルコールに浸すことによって達成してもよい。無色になったら、スライドを水浴中でよくすすぎ、第二の染色手順を適用する。
【０１９３】
[0218]加えて、抗体または核酸プローブまたはアプタマーのような特異的な分子試薬を使用することにより、細胞形態学的な解析と併せて特異的な分子の識別を行ってもよい。それにより、細胞学的診断の精度が改善される。顕微解剖を用いて、さらなる評価のために、具体的には異常染色体、遺伝子発現または突然変異の遺伝学的評価のために細胞の部分集合を単離することができる。
【０１９４】
[0219]組織学的な評価のための組織サンプルの調製は、固定、脱水、浸潤、包埋、および、切出しを含む。組織学において使用される固定試薬は、細胞学において使用されるものと極めてよく似ているかまたは同一のものであるため、個々のタンパク質などの分子の特徴を犠牲にして形態学的な特徴を保存するといった同じ問題を有する。組織サンプルを固定したり脱水したりする代わりに、凍結させて、凍結させたまま切り出せば、時間を節約できる。これは比較的穏やかな処理法であり、より多くの個々のマーカーを保存することができる。しかしながら、氷の結晶が入り込むことにより細胞内の情報が失われるため、凍結は組織サンプルの長期保存には不適切である。また凍結組織サンプル中の氷も、切り出し工程で極めて薄い切片を作製することの妨げになるため、細胞内構造の顕微鏡レベルの解像度と造影がある程度損なわれる恐れがある。ホルマリン固定に加えて、四酸化オスミウムを用いてリン脂質（膜）を固定し染色してもよい。
【０１９５】
[0220]組織の脱水は、アルコール濃度を徐々に増加させて連続的に洗浄することにより達成される。クリーニングは、アルコールと混和性を有する材料と包埋剤を用い、５０：５０のアルコール：クリーニング試薬から開始して１００％クリーニング試薬（キシレンまたはキシレン代替物）になるまでの段階的なプロセスを含む。浸透は、組織を液状の包埋剤（温めたワックス、ニトロセルロース溶液）とインキュベートすることを含み、ここで最初は５０：５０の包埋剤：クリーニング試薬で、最終的に１００％包埋剤でインキュベートする。包埋は、組織を型またはカセットに入れて、例えばワックス、寒天またはゼラチンなどの融解させた包埋剤を充填することによって達成される。そのまま包埋剤を硬化させる。続いて硬化した組織サンプルを、染色およびそれに続く試験用に薄い切片にスライスしてもよい。
【０１９６】
[0221]染色の前に、組織切片から蝋を取り除き、水を加えて復元する。切片から蝋を取り除くのにキシレンが用いられ、キシレンを１回またはそれより多く交換して、濃度を減少させたアルコールで連続的に洗浄することによって組織に水を加えて復元することができる。蝋を取り除く前に、組織切片をスライドガラスに、約８０℃で約２０分、加熱固定してもよい。
【０１９７】
[0222]さらなる解析のために、レーザー捕捉顕微解剖によって組織切片からの細胞の部分集合の単離が可能になる。
[0223]細胞学の場合と同様に、微視的な特徴の可視化を強化するために、組織切片または切片は、様々な染色剤を用いて染色することができる。様々な市販の染色剤を用いて、特異的な特徴を強化したりまたは同定することができる。
【０１９８】
[0224]分子試薬と細胞学的／組織サンプルとの相互作用をさらに高めるために、様々な「分析物検索」技術が開発されてきた。このような技術の一つは、固定サンプルの高温加熱を使用する技術である。この方法はまた、熱誘導エピトープ検索またはＨＩＥＲとも称される。様々な加熱技術が用いられており、このような加熱技術としては、水蒸気加熱、マイクロ波、オートクレーブ処理、水浴、および、圧力釜での過熱、またはこれらの加熱方法の組み合わせが挙げられる。分析物検索溶液としては、例えば、水、クエン酸緩衝液、および、生理食塩水緩衝液が挙げられる。分析物検索の秘訣は高温での時間であるが、より低温でより長時間の使用も成功している。分析物検索のその他の秘訣は、加熱溶液のｐＨである。低いｐＨによって最良の免疫染色が得られることがわかっているが、バックグラウンドも発生するのでネガティブコントロールとして第二の組織切片の使用が必要になることが多い。一般的に、最もバランスの取れた利益（バックグラウンドの増加を起こさずに免疫染色を向上させること）は、緩衝液の組成に関係なく高いｐＨ溶液をもちいた場合に得られる。特定の標的に関する分析物検索プロセスは、プロセス最適化のための変数として熱、時間、ｐＨおよび緩衝液の組成を用いて、その標的にあわせて経験的に最適化される。マイクロ波による分析物検索方法を用いることにより、異なる標的の抗体試薬を用いた連続的な染色が可能になる。しかしながら、染色工程中に抗体と酵素の複合体化を達成するのに要する時間が、細胞膜分析物も劣化させることが示されている。マイクロ波加熱方法は、同様にインサイチュハイブリダイゼーション方法も改善している。
【０１９９】
[0225]分析物検索プロセスを開始させるために、まず切片の蝋を取り除き、水を加えて復元する。続いてスライドを、皿またはジャー中で１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に入れる。代表的な手法では１１００Ｗのマイクロ波が使用され、スライドを出力１００％で２分間マイクロ波照射し、続いてスライドが液体で覆われたままであることを確認した後にスライドを出力２０％で１８分間マイクロ波照射する。続いてスライドを蓋のない容器で中でそのまま冷却させ、続いて蒸留水ですすぐ。標的の免疫化学試薬への反応性を改善するために、ＨＩＥＲと酵素消化とを併用してもよい。
【０２００】
[0226]このような酵素消化プロトコールの一つは、プロテイナーゼＫを使用する。５０ｍＭトリス塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％トリトン（Triton）Ｘ−１００のｐＨ８．０緩衝液で濃度２０ｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを調製する。このプロセスでは、まずキシレンをそれぞれ５分で２回交換して切片の蝋を取り除くことを行う。次に、１００％エタノールをそれぞれ３分で２回交換し、９５％および８０％エタノールをそれぞれ１分で交換してサンプルを水で戻し、続いて蒸留水ですすぐ。切片をプロテイナーゼＫ標準溶液で覆い、加湿したチャンバー中で３７℃で１０〜２０分インキュベートする（最適なインキュベート時間は、組織のタイプと固定の程度に応じて様々であってよい）。切片を室温で１０分間冷却し、続いてＰＢＳトゥイーン（Tween）２０で２×２分間すすぐ。必要に応じて、内因性の化合物や酵素からの起こり得る干渉を取り除くために、切片をブロックしてもよい。続いて切片を、一次抗体希釈緩衝液で適切に希釈した一次抗体と共に、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートする。続いて切片をＰＢＳトゥイーン２０で２×２分間すすぐ。特定の用途において必要があれば、追加のブロッキング、続いてＰＢＳトゥイーン２０で３×２分間の追加のすすぎを行うことにより、最終的に免疫染色プロトコールを完了させてもよい。
【０２０１】
[0227]また室温での１％ＳＤＳを用いた簡単な処理でも、免疫組織化学的染色が改善されることが実証されている。分析物検索方法は、スライドにマウントした切片だけでなく浮遊する切片にも適用されている。その他の処理の選択肢は、スライドをｐＨ６．０でクエン酸および０．１ノニデントＰ４０を含むジャーに入れ、９５℃に加熱する処理である。続いてスライドをＰＢＳのような緩衝液で洗浄する。
【０２０２】
[0228]組織の免疫学的染色について、切片を血清または無脂肪ドライミルクのようなタンパク質溶液に浸すことにより、抗体と組織のタンパク質との非特異的な会合をブロックすることが有用な場合がある。
【０２０３】
[0229]ブロッキング反応は、内因性ビオチンのレベルを低下させる；内因性の電荷の作用を除去する；内因性のヌクレアーゼを不活性化する；および／または、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼのような内因性の酵素を不活性化する必要性を含む。内因性のヌクレアーゼは、プロテイナーゼＫでの分解、熱処理、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレート剤の使用、キャリアーＤＮＡまたはＲＮＡの導入、例えば尿素、チオ尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、過塩素酸リチウムなど、または、ピロ炭酸ジエチルなどのカオトロープでの処理によって不活性化することができる。アルカリホスファターゼは、室温で５分の０．１ＮのＨＣｌでの処理、または、１ｍＭレバミソールでの処理によって不活性化することができる。ペルオキシダーゼ活性は、０．０３％過酸化水素での処理によって消失させることができる。内因性ビオチンは、アビジン（ストレプトアビジン、ニュートラビジンで代用が可能）溶液にスライドまたは切片を室温で少なくとも１５分浸すことによってブロックすることができる。続いてこのようなスライドまたは切片を緩衝液中で少なくとも１０分洗浄する。これは、少なくとも３回繰り返してもよい。次にスライドまたは切片をビオチン溶液に１０分浸す。これは、毎回新しいビオチン溶液を用いて少なくとも３回繰り返してもよい。この緩衝液で洗浄する手順を繰り返す。ブロッキングプロトコールは、細胞もしくは組織構造または対象の標的もしくは複数の標的のどれかがダメージを受けないように最低限にすべきであるが、これらのプロトコールの１種またはそれより多くを組み合わせて、１種またはそれより多くの遅い解離速度のアプタマーとの反応の前にスライドまたは切片を「ブロック」することが可能である。Richard G. Kessel著のBasic Medical Histology:the Biology of Cells, Tissues and Organs（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス(Oxford University Press), 1998）を参照されたい。
【０２０４】
質量分析法を用いたバイオマーカー値の決定
[0230]様々な質量分析計の配置を用いて、バイオマーカー値を検出することができる。数種の質量分析計を利用してもよいし、または、様々な配置で作製してもよい。一般的に、質量分析計は以下の主要な構成要素：サンプル注入口、イオン源、質量分析計、検出器、真空システム、および、機器制御システム、および、データシステムを含む。一般的に、サンプル注入口、イオン源および質量分析計の違いが、機器のタイプおよびその性能を決定する。例えば注入口は、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であってもよいし、または、例えばマトリックス支援レーザー脱離で用いられるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的なイオン源としては、例えば、エレクトロスプレー、例えばナノスプレーおよびマイクロスプレー、または、マトリックス支援レーザー脱離が挙げられる。一般的な質量分析計としては、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析計、および、飛行時間型質量分析計が挙げられる。さらなる質量分析法は当業界でよく知られている（Burlingame et al. Anal. Chem.70:647 R-716R (1998); KinterおよびSherman, ニューヨーク(2000)を参照）。
【０２０５】
[0231]タンパク質バイオマーカーおよびバイオマーカー値は、以下に示すのいずれかによって検出および測定することができる：エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、ウルトラフレックスＩＩＩＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、および、ＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析法、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析法、および、イオントラップ質量分析法。
【０２０６】
[0232]タンパク質バイオマーカーの質量分析法による特徴付けおよびバイオマーカー値決定の前に、複数のサンプル調製戦略を用いてサンプルを標識して濃縮する。標識方法としては、これらに限定されないが、相対定量および絶対定量のための同重核タグ（isobaric tag）（ｉＴＲＡＱ）、および、細胞培養におけるアミノ酸を用いた安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ）が挙げられる。質量分光分析の前に候補バイオマーカータンパク質に関してサンプルを選択的に濃縮するのに用いられる捕捉試薬としては、これらに限定されないが、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子物質、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体足場（例えば二重特異性抗体など）インプリントポリマー、アビマー、ペプチドミメティクス、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、および、合成受容体、ならびにこれらを改変したものおよびこれらのフラグメントが挙げられる。
【０２０７】
近接ライゲーションアッセイを用いたバイオマーカー値の決定
[0233]近接ライゲーションアッセイを用いてバイオマーカー値を決定することができる。簡単に言えば、試験サンプルを一対の親和性プローブと接触させることであるり、この親和性プローブは、一対の抗体または一対のアプタマーであってもよく、これらの対のそれぞれはオリゴヌクレオチドで延長されている。このような一対の親和性プローブの標的は、一方のタンパク質における２種の別個の決定因子（determinate）であってもよいし、または、２種の異なるタンパク質それぞれにおける一方の決定因子であってもよく、これらは、同種または異種多量体の複合体として存在していてもよい。プローブが標的の決定因子に結合すると、オリゴヌクレオチド伸長部分の遊離末端が、ハイブリダイズして一体化できるほど十分に近接する。オリゴヌクレオチド伸長部分のハイブリダイゼーションは、一般的なコネクターオリゴヌクレオチドによって促進され、このようなコネクターオリゴヌクレオチドは、それらが十分に近接して存在する場合、オリゴヌクレオチド伸長部分を架橋して一体化するのに役立つ。プローブのオリゴヌクレオチド伸長部分がハイブリダイズすると、伸長部分の末端が酵素的ＤＮＡライゲーションによって結合して一体化する。
【０２０８】
[0234]オリゴヌクレオチド伸長部分はそれぞれ、ＰＣＲ増幅のためのプライマー部位を含む。オリゴヌクレオチド伸長部分がライゲーションして一体化したら、オリゴヌクレオチドは連続したＤＮＡ配列を形成し、これらから、ＰＣＲ増幅により、標的タンパク質の同一性および量に関する情報、加えて標的の決定因子が２種の異なるタンパク質上にあるようなタンパク質−タンパク質相互作用に関する情報が解明される。近接ライゲーションは、リアルタイムＰＣＲの使用によってリアルタイムのタンパク質濃度および相互作用情報に関する高感度で特異的な分析を提供することができる。対象の決定因子に結合しないプローブは、対応するオリゴヌクレオチド伸長部分を近接させることはなく、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅を続行させることができないため、結果的にシグナル生産が起こらない。
【０２０９】
[0235]前述の分析は、膵癌を診断する方法において有用なバイオマーカー値の検出を可能にするものであり、ここで本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応する少なくともＮ種のバイオマーカー値を検出することを含み、ここで以下で詳細に説明するようにバイオマーカー値を用いた分類は、その個体が膵癌を有するかどうかを示す。本明細書において説明される所定の膵癌バイオマーカーは、単独でも膵癌を検出および診断することに関して有用であるが、それぞれ３種またはそれより多くのバイオマーカーのパネルとして有用な膵癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法も、本明細書において説明する。従って、本願の様々な実施態様は、Ｎ種のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは、少なくとも３種のバイオマーカーである。その他の実施態様において、Ｎは、２〜６５種のバイオマーカーのいずれかの数になるように選択される。当然のことながら、Ｎは、上記で説明した範囲のいずれか、加えて類似の、ただしそれより高いオーダーの範囲からのいずれかの数値になるように選択することができる。本明細書において説明される方法のいずれかによれば、バイオマーカー値は、個々に検出および分類してもよいし、またはそれらは、例えば多重分析フォーマットにおける場合のように集合的に検出および分類してもよい。
【０２１０】
[0236]その他の形態において、膵癌がないことを検出する方法が提供され、本方法は、個体からの生体サンプルにおいて、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応する少なくともＮ種のバイオマーカー値を検出することを含み、ここでバイオマーカー値を分類することにより、以下で詳細に説明するように、その個体において膵癌がないことが示される。本明細書において説明される所定の膵癌バイオマーカーは、単独でも膵癌がないことを検出および診断することにおいて有用であるが、それぞれ３種またはそれより多くのバイオマーカーのパネルとして有用な膵癌バイオマーカーの複数の部分集合をグループ化する方法も、本明細書において説明する。従って、本願の様々な実施態様は、Ｎ種のバイオマーカーを含む組み合わせを提供し、ここでＮは、少なくとも３種のバイオマーカーである。その他の実施態様において、Ｎは、２〜６５種のバイオマーカーのいずれかの数になるように選択される。当然のことながら、Ｎは、上記で説明した範囲のいずれか、加えて類似の、ただしそれより高いオーダーの範囲からのいずれかの数値になるように選択することができる。本明細書において説明される方法のいずれかによれば、バイオマーカー値は、個々に検出および分類してもよいし、またはそれらは、例えば多重分析フォーマットにおける場合のように集合的に検出および分類してもよい。
【０２１１】
バイオマーカーの分類および疾患スコアの計算
[0237]所定の診断テストに関するバイオマーカーの「サイン（signature）」は、マーカーのセットを含み、それぞれのマーカーは、対象の個体群において異なるレベルを示す。このような状況において、異なるレベルは、２またはそれより多くのグループにおける個体についてのマーカーレベルの異なる平均値、または、２またはそれより多くのグループにおける異なる分散、または、これら両方の組み合わせを意味する場合がある。診断テストの最も簡単な形態において、これらのマーカーを用いて、個体からの未知のサンプルを、罹患グループまたは非罹患グループの２つのグループのうちどちらか一方に割り当てることができる。２またはそれより多くのグループのうち１つにサンプルを割り当てることは、分類として知られており、この割り当てを達成するのに用いられる手法は、クラス分類器（classifier）または分類法(classification method)として知られている。また分類法は、スコアリング法と称されることもある。バイオマーカー値のセットからの診断分類器を構築するのに使用することができる多くの分類法がある。一般的に、教師なし(supervised)学習方法によって行う分類法が最も簡単であり、このような場合、データセットは、区別しようとする２つの（または、複数の分類条件が用いられる場合はそれより多くの）別個のグループ内の個体から得られたサンプルを用いて回収される。このような分類法は、各サンプルが属するクラス（グループまたは個体群）が各サンプルごとに予めわかっているため、望ましい分類応答が得られるように訓練することができる。また、教師なし学習方法を使用して診断分類器を作製することも可能性である。
【０２１２】
[0238]診断分類器を開発するための一般的なアプローチとしては、決定木；バギング＋ブースティング＋ランダムフォレスト；推論ルールに基づく学習；パルザン窓；線形モデル；記号論理学；ニューラルネットワーク法；管理なしのクラスター化；Ｋ平均法；階層上昇／下降；半監督された学習；プロトタイプ法；最近傍；カーネル密度推定；サポーティブベクターマシーン；隠れマルコフモデル；ボルツマン学習；が挙げられ、分類器は、単純に組合わせてもよいし、または、特定の目的機能を最小化するような方式で組合わせてもよい。総論に関して、例えば、Pattern Classification, R.O. Duda等編, ジョン・ワイリー＆サンズ(John Wiley & Sons), 第2版, 2001；さらに、The Elements of Statistical Learning-Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie等編, スプリンガー・サイエンス＋ビジネスメディア社（Springer Science+Business Media, LLC）, 第2版, 2009を参照されたい；これらはそれぞれ、その全体が参照により開示に組み入れられる。
【０２１３】
[0239]監督された学習方法を用いて分類器を作製するために、訓練データと呼ばれるサンプルのセットを得る。診断テストに関して、訓練データは、後で未知のサンプルが割り当てられる別個のグループ（クラス）からのサンプルを含む。例えば、未知のサンプル（または、より具体的にはサンプルを得た個体）を病気有りまたは病気無しいずれかに分類できる分類器を開発するために、訓練データは、コントロール個体群における個体、および、特定の病気の個体群における個体から回収されたサンプルで構成されていてもよい。訓練データからの分類器の開発は、分類器の訓練として知られている。分類器の訓練に関する具体的な詳細は、監督された学習方法の性質によって決まる。例証するために、以下に単純ベイズ分類器の訓練の例を説明する（例えば、Pattern Classification, R.O. Duda等編, ジョン・ワイリー＆サンズ(John Wiley & Sons), 第2版, 2001；さらに、The Elements of Statistical Learning-Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie等編, スプリンガー・サイエンス＋ビジネスメディア社(Springer Science+Business Media, LLC), 第2版, 2009を参照されたい）。
【０２１４】
[0240]典型的には、訓練セット中のサンプルよりも多くの潜在的なバイオマーカー値が存在するため、過剰適合を回避するように注意しなければならない。過剰適合は、統計モデルが、前提となる関係の代わりにランダムエラーまたはノイズを記述するような場合に起こる。過剰適合は、様々な方法で回避することができ、このような方法としては、例えば分類器を開発する際に用いられるマーカーの数を制限すること、マーカー応答は互いに独立していると仮定すること、用いられる前提となる統計モデルの複雑さを制限すること、および、前提となる統計モデルがデータと確実に一致するようにすることによる方法が挙げられる。
【０２１５】
[0241]バイオマーカーのセットを用いた診断テストの実証的な例としては、単純ベイズ分類器の適用、バイオマーカーの厳密に独立した処理を伴うベイズ理論に基づく簡単な確率分類器が挙げられる。各バイオマーカーは、各クラスにおいて測定されたＲＦＵ値または対数ＲＦＵ（相対的な蛍光単位）値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）によって記述される。１つのクラスにおけるマーカーセットについての結合（joint）ｐｄｆは、各バイオマーカーについての個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると仮定される。このような状況において単純ベイズ分類器を訓練することは、パラメーターを割り当てて（「パラメータ化」）クラス依存性ｐｄｆを特徴付けることになる。クラス依存性ｐｄｆにとって前提となるあらゆるモデルを使用できるが、このようなモデルは通常、訓練セットで観察されたデータに一致するものと予想される。
【０２１６】
[0242]具体的に言えば、病気クラスにおけるバイオマーカーｉに関する値ｘｉを測定する際のクラス依存性確率は、ｐ（ｘｉ｜ｄ）と記述され、
【０２１７】
【数１−１】
0005931874.tif 000003
【０２１８】
という値を有するｎ個のマーカーを観察する際の全体の単純ベイズ確率は、
【０２１９】
【数１−２】
0005931874.tif 000004
【０２２０】
と記述され、ここで上記式中、個々のｘｉは、ＲＦＵまたは対数ＲＦＵにおいて測定されたバイオマーカーレベルである。未知のものの分類の割り当ては、測定された
【０２２１】
【数２−１】
0005931874.tif 000005
【０２２２】
を示す罹患の確率
【０２２３】
【数２−２】
0005931874.tif 000006
【０２２４】
を、同じ測定値についての、病気なし（コントロール）の確率
【０２２５】
【数２−３】
0005931874.tif 000007
【０２２６】
と比較して計算することにより容易になる。これらの確率の比率は、ベイズ理論、すなわち、
【０２２７】
【数２−４】
0005931874.tif 000008
【０２２８】
（式中、ｐ（ｄ）は、試験に適した個体群における病気の罹患率である）の適用によりクラス依存性ｐｄｆからコンピューターで計算される。この比率の両辺の対数を取り、上記からの単純ベイズクラス依存確率を代入して、
【０２２９】
【数３】
0005931874.tif 000009
【０２３０】
を得る。このような形式は対数尤度比として知られており、これは単に、特定の病気有りに対する特定の病気無しの対数尤度を述べたものであり、主としてＮ個の個々のバイオマーカーそれぞれの対数尤度比の合計で構成される。その最も簡単な形態において、未知のサンプル（または、より具体的にはサンプルを採取した個体）は、上記の比率がゼロよりも大きい場合は病気がないと分類され、上記の比率がゼロ未満である場合病気があると分類される。
【０２３１】
[0243]代表的な実施態様の一つにおいて、クラス依存性バイオマーカーｐｄｆのｐ（ｘｉ｜ｃ）およびｐ（ｘｉ｜ｄ）は、測定されたＲＦＵ値ｘｉにおいて正規分布または対数正規分布と仮定され、すなわち、
【０２３２】
【数４】
0005931874.tif 000010
【０２３３】
（これと類似の表現も含む）であると仮定される。モデルのパラメータ化は、それぞれのクラス依存性ｐｄｆにつき２種のパラメーター、すなわち訓練データからの平均μおよび分散σ２の推定を必要とする。これは、最大尤度推定法、最小二乗法、および、当業者によく知られたその他のあらゆる方法などの様々な方法で達成することが可能である。正規分布を上記で定義された対数尤度比に代入して、以下の式を得る：
[0244]
【０２３４】
【数５】
0005931874.tif 000011
【０２３５】
[0245]訓練データからの各クラスにおいてそれぞれのｐｄｆにつきμおよびσ２のセットが定義され、個体群における病気罹患率が明らかになったら、ベイズ分類器が十分に完全に確率され、測定値
【０２３６】
【数６】
0005931874.tif 000012
【０２３７】
を有する未知のサンプルを分類するのに用いることができる。
[0246]単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築して訓練するのに用いられるバイオマーカーの数および質に依存する。単一のバイオマーカーは、以下の実施例３で定義されるようにそのＫＳ距離（コルモゴロフ−スミルノフ）に従った挙動を示すと予想される。分類器の性能計量を受信者操作特性曲線（ＡＵＣ）下面積と定義すると、完全な分類器は１のスコアを有すると予想され、ランダム分類器は、平均して０．５のスコアを有すると予想される。サイズｎおよびｍの２つのセットＡとＢとのＫＳ距離の定義は、
【０２３８】
【数７】
0005931874.tif 000013
【０２３９】
で示される値であり、これは、２つの実験的な累積分布関数（ｃｄｆ）間の最も大きい差である。ｎ個の観察ＸｉのセットＡについての実験的なｃｄｆは、
【０２４０】
【数８】
0005931874.tif 000014
【０２４１】
と定義され、ここでＩＸｉ≦ｘは指標関数であり、Ｘｉ＜ｘの場合１に等しく、その他の場合は０に等しい。定義によれば、この値は０と１の間で境界され、１のＫＳ距離が経験分布がオーバーラップしないことを示す。
【０２４２】
[0247]それに続く良好なＫＳ距離（例えば＞０．３）を示すマーカーを追加することは、一般的に、その後追加されたマーカーが第一のマーカーから独立している場合、分類性能を改善すると予想される。分類器のスコアとして感度と特異度とを用いれば、貪欲アルゴリズムのバリエーションを用いて多くのハイスコア分類器を簡単に作製することができる。（貪欲アルゴリズムは、大域的最適を見出すために各段階で局所最適選択を作製する問題解決メタヒューリスティクスに従うあらゆるアルゴリズムである）。
【０２４３】
[0248]ここで用いられるアルゴリズム法は、実施例４で詳細に説明される。簡単に言えば、全ての単一分析物分類器を潜在的なバイオマーカーの表から作製し、リストに加える。続いて保存された単一分析物分類器それぞれへの考え得るあらゆる第二の分析物の追加が行われ、新しいリストに、最良スコアの対の既定数（例えば１０００）が保管される。この最良の２マーカーの分類器の新しいリストを用いて、考えられ得るあらゆる３マーカーの分類器が調査され、再びこれらのうち最良の１０００が保管される。このプロセスは、追加のマーカーが追加される際にスコアがプラトーに達するかまたは劣化し始めるまで続けられる。このような収束後に残るハイスコア分類器は、目的とする使用における望ましい性能について評価することができる。例えばある診断用途において、高感度と中程度の特異度を有する分類器が、中程度の感度と高い特異度を有するよりも望ましい場合がある。その他の診断用途において、高い特異度と中程度の感度を有する分類器が、より望ましい場合もある。一般的に、望ましい性能レベルは、それぞれ特定の診断用途で許容され得る偽陽性の数と偽陰性の数との間で行わなければならないトレードオフに基づいて選択される。このようなトレードオフは、一般的に、過誤の医学的結果、偽陽性または偽陰性のいずれかに依存する。
【０２４４】
[0249]その他の様々な技術が当業界でよく知られており、単純ベイズ分類器を用いてバイオマーカーのリストから多くの潜在的な分類器を作製するのに用いることができる。一実施態様において、いわゆる遺伝的アルゴリズムと称されるものを、上記で定義されたように適合性スコアを用いて異なるマーカーと併用することができる。遺伝的アルゴリズムは、潜在的な分類器の多種多様な個体群を探索するのに特に適している。その他の実施態様において、いわゆる蟻コロニー最適化を分類器のセットを作製するのに用いることができる。また当業界でよく知られているその他の方策として、例えば、その他の進化的な方策、加えて焼きなまし法やその他の確率的探索方法も使用できる。また例えばハーモニー探索法のようなメタヒューリスティクス法も用いることができる。
【０２４５】
[0250]代表的な実施態様は、表１の第２列で列挙された多数の膵癌バイオマーカーを様々な組み合わせで使用して、膵癌を検出するための診断テストを作製する（これらのバイオマーカーをどのように同定するかの詳細な説明については実施例２を参照）。一実施態様において、膵癌を診断する方法は、表１の第２列に列挙した多数の膵癌バイオマーカーと共に単純ベイズ分類法を使用する。実証的な例（実施例３）において、ＧＩおよび正常なコントロール群から膵癌を検出する最も簡単な試験は、膵癌で示差的に発現されＫＳ距離が０．５２の単一のバイオマーカー（例えばＣＴＳＢ）を用いて構築することができる。表１６からのＣＴＳＢに関するパラメーター、μｃ，ｉ、σｃ，ｉ、μｄ，ｉ、および、σｄ，ｉ、ならびに上述の対数尤度の方程式を用いて、ＡＵＣが０．７９の診断テストを導くことができる（表１５を参照）。図２にこの試験のＲＯＣ曲線を示す。
【０２４６】
[0251]例えばＫＳ距離が０．４０のバイオマーカーＣ５ａの追加によって、分類器の性能がＡＵＣ０．８５に有意に改善される。ここで留意すべきは、２種のバイオマーカーから構築された分類器のスコアは、ＫＳ距離の単純な合計ではないことであり、ＫＳ距離は、バイオマーカーを組み合わせるときに加法的ではなく、強いマーカーと同じレベルの性能を達成するためには多くのそれより弱いマーカーが必要である。例えば第三のマーカーＣ５を追加することにより、分類器の性能がＡＵＣ０．８８に高められる。例えばＣＣＬ１８、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＬＫ７、ＥＴＨＥ１、Ｃ５−Ｃ６、ＫＬＫ８、および、ＶＥＧＦＡのようなさらなるバイオマーカーを追加することにより、表１５にまとめられた、図３において一連のＲＯＣ曲線として示される一連の膵癌試験が得られる。図４に、分類器の構築で用いられた分析物の数の関数としての分類器のスコアを示した。この典型的な１０マーカーの分類器のＡＵＣは０．９１である。
【０２４７】
[0252]表１の第２列で列挙されたマーカーを様々な方法で組み合わせて、膵癌を診断するための分類器を作製することができる。いくつかの実施態様において、バイオマーカーのパネルは、選択される特定の診断性能の基準に応じて多数の異なる分析物で構成される。例えば、バイオマーカーの所定の組み合わせによって、その他の組み合わせより高感度の（またはより特異的な）試験が得られると予想される。
【０２４８】
[0253]パネルを表１の第２列からの特定のバイオマーカーのセットが含まれるように定義し、分類器を訓練データのセットで構成したら、診断テストの定義は完了である。一実施態様において、図１Ａに未知のサンプルを分類するのに用いられる手法を概説する。その他の実施態様において、図１Ｂに未知のサンプルを分類するのに用いられる手法を概説する。生体サンプルを適切に希釈し、続いて１またはそれより多くの分析で処理して、分類に用いられる関連のある定量的なバイオマーカーレベルを得る。測定されたバイオマーカーレベルは、クラス割り当ての信頼性を反映するサンプルの分類と任意のスコアを出力する分類法のための入力値として用いられる。
【０２４９】
[0254]表１は、膵癌を診断するのに有用な６５種のバイオマーカーを同定する。これは、バイオマーカー発見の試みの際に通常見出される数と比較した場合、期待された数よりも驚くほど多い数であり、これは、場合によっては低フェムトモル濃度範囲の濃度で何百もの個体サンプルで測定された８００種を超えるタンパク質を包含する、説明された研究の規模に起因する可能性がある。おそらく、発見された多数のバイオマーカーは、腫瘍生物学および腫瘍の存在に対する体の応答の両方にに関与する多様な生化学的経路を反映しており、それぞれの経路およびプロセスには多くのタンパク質が関与している。その結果から、このような複雑なプロセスに関して独自に有益なタンパク質小集団の単一のタンパク質はなく、むしろ複数のタンパク質が例えばアポトーシスまたは細胞外マトリックス修復のような関連プロセスに関与することが示される。
【０２５０】
[0255]説明された研究中に多数のバイオマーカーが同定されたと仮定すると、様々な診断方法で使用できる膨大な数の高性能分類器を得ることができると期待される。この観念を検証するために、表１に示されるバイオマーカーを用いて何万もの分類器を評価した。実施例４で説明されているように、表１に示されるバイオマーカーの多くの部分集合を組み合わせて、有用な分類器を作製することができる。一例として、膵癌検出のための１、２および３種のバイオマーカーを含む分類器について説明する。実施例４で説明されているように、表１に示されるバイオマーカーを用いて構築された全ての分類器は、「非マーカー」を用いて構築された分類器よりも明らかに優れた性能を示す。
【０２５１】
[0256]表１に示されるマーカーのうちいくつかをランダムに除外すること（それにより分類器を構築する部分集合がより小さくなった）により得られた分類器の性能も試験した。実施例４の第３部で説明されているように、このような表１に示されるマーカーのランダムな部分集合から構築された分類器は、表１に示されるマーカーの全リストを用いて構築された最適な分類器と同様の性能を示した。
【０２５２】
[0257]また集められた１０種のマーカーから「最良の」個別マーカーを除外することにより得られた１０マーカーの分類器の性能も試験した。実施例４の第３部で説明されているように、表１に示される「最良の」マーカーを用いずに構築された分類器も良好な性能を示した。表１に列挙されたバイオマーカーの多くの部分集合は、表に列挙された上位１５種のマーカーを除外した後でさえも最適に近い性能を示した。このことは、あらゆる特定の分類器の性能特性は、バイオマーカーのいくつかの小さいコア集団に起因しない可能性があること、および、病気の経過は、多数の生化学的経路に影響を与える可能性があり、そのため多くのタンパク質の発現レベルが変化することを示している。
【０２５３】
[0258]実施例４からの結論は、ある程度可能性のある結論を示唆している：第一に、多数のバイオマーカーを同定することにより、それらを、同様に高性能を提供する大量の分類器に集合化することができる。第二に、分類器は、疑いなく前提となる病気の経過の複雑さの元になっている冗長度を反映する方式で、特定のバイオマーカーがその他のバイオマーカーで代用可能なように構築することができる。すなわち、表１に示される特定のバイオマーカーまたはバイオマーカーの小集団が、いずれかの分類器に含まれていなければならないということにならないように、表１で同定された個々のいずれかのバイオマーカーに起因する病気に関する情報は、その他のバイオマーカーに起因する情報とオーバーラップする。
【０２５４】
[0259]代表的な実施態様では、未知のサンプルを分類するために、表１６に示されたデータで構成された単純ベイズ分類器が使用される。図１Ａおよび１Ｂにこの手法を概説した。一実施態様において、生体サンプルを任意に希釈し、多重化アプタマー分析で処理する。この分析からのデータを実施例３で概説したようにして正規化し較正し、得られたバイオマーカーレベルをベイズ分類スキームへの入力値として使用する。測定されたそれぞれのバイオマーカーごとに対数尤度比をコンピューター計算し、合計して、最終的な分類スコアを得る（これは診断スコアとも称される）。得られた割り当て、加えて総体的な分類スコアを報告することができる。任意に、各バイオマーカーレベルごとにコンピューター計算された個々の対数尤度の危険因子も同様に報告してもよい。実施例３に分類スコア計算の詳細を示す。
【０２５５】
キット
[0260]表１の第２列に示されるバイオマーカー（加えて、追加の生物医学的情報）のあらゆる組み合わせは、適切なキットを用いて、例えば本明細書において開示された方法を行う際に使用するための適切なキットを用いて検出することができる。さらに、いずれのキットも、例えば蛍光性の部分などの、本明細書において説明されているような１種またはそれより多くの検出可能な標識を含んでいてもよい。
【０２５６】
[0261]一実施態様において、キットは、（ａ）生体サンプル中の１種またはそれより多くのバイオマーカーを検出するための、１種またはそれより多くの捕捉試薬（例えば少なくとも１種のアプタマーまたは抗体）（ここでバイオマーカーは、表１の第２列に示されるバイオマーカーのいずれかを含む）、および、任意に（ｂ）さらなる本明細書においてさらに説明されるように、生体サンプルを採取した個体を膵癌を有するまたは膵癌を有さないのいずれかに分類するための、または、その個体が膵癌を有する可能性を決定するための、１種またはそれより多くのソフトウェアまたはコンピュータープログラム製品を含む。あるいは、１種またはそれより多くのコンピュータープログラム製品ではなく、上記の工程を人が手作業で行うための説明書を１種またはそれより多く提供してもよい。
【０２５７】
[0262]固体支持体と、それに対応する捕捉試薬およびシグナル生成材料との組み合わせは、本明細書において「検出装置」または「キット」と称される。このようなキットはさらに、装置および試薬の使用、サンプルの取り扱い、および、データの解析に関する説明書を含んでいてもよい。さらに本キットをコンピューターシステムまたはソフトウェアと併用して、生体サンプルの解析結果を解析して報告することができる。
【０２５８】
[0263]本キットはさらに、生体サンプルを処理するための１種またはそれより多くの試薬（例えば、可溶化緩衝液、洗浄剤、洗剤、または、緩衝液）を含んでいてもよい。本明細書において説明されるキットはいずれも、例えば、緩衝液、ブロッキング剤、質量分析法マトリックス材料、抗体捕捉剤、ポジティブコントロールサンプル、ネガティブコントロールサンプル、ソフトウェアおよび情報、例えばプロトコール、ガイダンスおよび参照データを含んでいてもよい。
【０２５９】
[0264]一形態において、本発明は、膵癌の状態を解析するためのキットを提供する。本キットは、表１の第２列から選択される１種またはそれより多くのバイオマーカー用のＰＣＲプライマーを含む。本キットはさらに、バイオマーカーの用途と膵癌との相関についての説明書を含んでいてもよい。本キットはさらに、サンプルＤＮＡを増幅または単離するための、表１の第２列から選択される１種またはそれより多くのバイオマーカーの相補体を含むＤＮＡアレイ、試薬および／または酵素を含んでいてもよい。本キットは、リアルタイムＰＣＲ用の試薬、例えばＴａｑＭａｎプローブ、および／または、プライマー、および、酵素を含んでいてもよい。
【０２６０】
[0265]例えば、キットは、（ａ）少なくとも試験サンプル中の１種またはそれより多くのバイオマーカーを定量するための捕捉試薬を含む試薬（ここで前記バイオマーカーは、表１の第２列に示されるバイオマーカー、または、その他のあらゆる本明細書において説明されるバイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルを含む）、および、任意に（ｂ）試験サンプル中で定量された各バイオマーカーの量を１種またはそれより多くの既定のカットオフと比較する工程、前記比較に基づいて定量された各バイオマーカーにスコアを割り当てる工程、定量された各バイオマーカーに割り当てられたスコアを総合して総スコアを得る工程、総スコアを既定のスコアと比較する工程、および、前記比較を使用して個体が膵癌を有するかどうかを決定する工程を実行する１種またはそれより多くのアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを含んでいてもよい。あるいは、１種またはそれより多くのアルゴリズムまたはコンピュータープログラムではなく、上記の工程を人が手作業で行うための説明書を１種またはそれより多く提供してもよい。
【０２６１】
コンピューターを用いた方法およびソフトウェア
[0266]バイオマーカーまたはバイオマーカーのパネルが選択されたら、個体を診断する方法は、以下：１）生体サンプルを回収するかまたは別の方法で入手すること；２）分析方法を行い、生体サンプル中で、パネル中のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーを検出して測定すること；３）バイオマーカー値を回収するのに用いられる方法に必要なあらゆるデータ正規化または標準化を行うこと；４）マーカーのスコアを計算すること；５）マーカーのスコアを統合して総診断スコアを得ること；および、６）個体の診断スコアを報告すること、を含んでいてもよい。このアプローチにおいて、診断スコアは、全てのマーカー計算値の合計から決定された一つの数であってもよく、これを、病気の存在または非存在の指標である既定の閾値と比較する。または、診断スコアは、それぞれバイオマーカー値を示す一連のバーであってもよく、病気の存在または非存在を決定するために応答パターンを既定のパターンと比較することもできる。
【０２６２】
[0267]本明細書において説明される方法の少なくともいくつかの実施態様は、コンピューターを併用して実施することができる。図６にコンピューターシステム１００の例を示す。図６を参照すると、システム１００は、プロセッサー１０１、入力装置１０２、出力装置１０３、保存装置１０４、コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａ、通信システム１０６、加速処理（例えば、ＤＳＰまたは特殊な用途のためのプロセッサー）１０７およびメモリ１０９を含む、バス１０８を介した電気的に連結されたハードウェア要素で構成されることが示される。コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａはさらにコンピューターで読取り可能な記憶媒体１０５ｂに連結され、このような組み合わせは、広義には一時的および／または比較的永続的にコンピューターで読取り可能な情報を保持するための遠隔、局所、固定および／または取り外し可能な保存装置、加えて記憶媒体、メモリ等に相当するものであり、このようなものとして、例えば保存装置１０４、メモリ１０９、および／または、このようなあらゆるその他のアクセス可能なシステム１００リソースも挙げられる。またシステム１００はさらに、オペレーティングシステム１９２およびその他のコード１９３、例えばプログラム、データなどを含むソフトウェア要素（ここでは作業メモリ１９１内に配置されている例が示される）も含む。
【０２６３】
[0268]図６に関して、システム１００は、かなりのフレキシビリティーおよび設定可能性（configurability）を有する。従って、例えば単一の構成を用いて、目下望ましいプロトコール、プロトコール変更、拡張などに従ってさらに設計が可能な１種またはそれより多くのサーバーを提供することができる。しかしながら、当業者には明白であると思われるが、より具体的な適用要件によっても実施態様を十分に利用できるものと予想される。例えば、システム１００要素内の（例えば通信システム１０６内の）サブ要素として１種またはそれより多くのシステム要素を実行してもよい。またカスタマイズされたハードウェアも利用が可能であり、および／または、ハードウェア、ソフトウェアまたはその両方で特定の要素を実行することも可能である。さらに、例えばネットワーク入力／出力装置（示さず）のようなその他の計算装置への接続も使用できるが、当然のことながら、有線、ワイヤレス、モデムおよび／またはその他のその他の計算装置への接続または複数の接続も利用される。
【０２６４】
[0269]一形態において、このようなシステムは、膵癌に特徴的なバイオマーカーの特徴を含むデータベースを含んでいてもよい。バイオマーカーのデータ（またはバイオマーカー情報）は、コンピューターによって実行される方法の一環として使用するために、コンピューターへの入力値として利用することができる。バイオマーカーのデータは、本明細書において説明されているようなデータを含んでいてもよい。
【０２６５】
[0270]一形態において、このようなシステムはさらに、１つまたはそれより多くのプロセッサーに入力データを提供するための１つまたはそれより多くの装置を含む。
[0271]このようなシステムはさらに、ランク付けされたデータ要素のデータセットを保存するためのメモリを含む。
【０２６６】
[0272]その他の形態において、入力データを提供する装置は、例えば質量分析計または遺伝子チップリーダーのようなデータ要素の特徴を検出するための検出器を含む。
[0273]加えてこのようなシステムは、データベース管理システムを含んでもよいユーザーのリクエストまたはクエリーは、クエリーを処理して訓練セットのデータベースから関連情報を抽出するデータベース管理システムが理解する適切な言語でフォーマットすることができる。
【０２６７】
[0274]このようなシステムは、ネットワークサーバーおよび１種またはそれより多くのクライアントが接続されるネットワークに接続することができる。ネットワークは、当業界でよく知られているようなローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）でもよいし、または、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）でもよい。好ましくは、サーバーは、コンピュータープログラム製品（例えばソフトウェア）を作動させてユーザーのリクエストを処理するためのデータベースデータにアクセスするのに必要なハードウェアを含む。
【０２６８】
[0275]このようなシステムは、データベース管理システムからの命令を実行するオペレーティングシステム（例えばユニックス（UNIX）（登録商標）またはリナックス（Linux）（登録商標））を含んでいてもよい。一形態において、オペレーティングシステムは、インターネットのようなグローバルコミュニケーションネットワーク上で作動することができ、このようなネットワークに連結するのにグローバルコミュニケーションネットワークサーバーを利用してもよい。
【０２６９】
[0276]このようなシステムは、当業界でよく知られているグラフィカルユーザーインターフェイスでよく見られるような、例えばボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールドなどのインターフェース要素を含む画面表示インターフェースを含む１つまたはそれより多くの装置を含んでいてもよい。ユーザーインターフェースに入力されたリクエストを、フォーマットするためにシステム中のアプリケーションプログラムに送信して、１種またはそれより多くのシステムデータベースにおいて関連情報を検索することができる。ユーザーが入力したリクエストまたはクエリーは、あらゆる適切なデータベース言語で構築することができる。
【０２７０】
[0277]グラフィカルユーザーインターフェースは、グラフィカルユーザーインターフェースコードによってオペレーティングシステムの一部として作製してもよく、データを入力したりおよび／または入力されたデータを表示したりするのに用いることができる。処理されたデータの結果は、インターフェースに表示してもよいし、システムと通信して印刷機で印刷してもよいし、メモリデバイス中に保存してもよいし、および／または、ネットワークに送信してもよいし、または、コンピューターで読取り可能な媒体の形態で提供することもできる。
【０２７１】
[0278]このようなシステムは、データ要素に関するデータ（例えば発現値）をシステムに提供するために入力装置と通信状態であってもよい。一形態において、入力装置は、例えば質量分析計、遺伝子チップまたはアレイリーダーなどを含む遺伝子発現プロファイリングシステムを含んでいてもよい。
【０２７２】
[0279]様々な実施態様に従って膵癌バイオマーカー情報を解析する方法および装置は、あらゆる適切な方式で実施することができ、例えばコンピューターシステムで作動するコンピュータープログラムを用いて実施することができる。プロセッサーおよびランダムアクセスメモリ、例えば遠隔アクセス可能なアプリケーションのサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピューターまたはワークステーションを含む従来のコンピューターシステムを用いることができる。追加のコンピューターシステム要素は、メモリデバイスまたは情報保存システム、例えば大容量記憶システム、および、ユーザーインターフェース、例えば従来のモニター、キーボードおよびトラッキング装置を含んでいてもよい。このようなコンピューターシステムは、自立式のシステムであってもよいし、または、サーバーおよび１つまたはそれより多くのデータベースを含むコンピューターのネットワークの一部であってもよい。
【０２７３】
[0280]膵癌バイオマーカー解析システムは、例えばデータ収集、処理、解析、報告および／または診断などのデータ解析を完了させるための機能および操作を提供することができる。例えば、一実施態様において、コンピューターシステムは、膵癌バイオマーカーに関する情報を受ける、保存する、検索する、解析する、および報告することが可能なコンピュータープログラムを実行することができる。このようなコンピュータープログラムは、様々な機能または操作を行う複数のモジュールを含んでもよく、このようなモジュールとしては、例えば、生データを処理して補足データを作製する処理モジュール、および、生データと補足データを解析して膵癌の状態および／または診断を作製するための解析モジュールなどが挙げられる。膵癌の状態の診断は、病気に関連する個体の状態について追加の生物医学的情報などのその他のあらゆる情報を作製または回収すること、さらなる試験が望ましいかどうかを確認すること、または、個体の健康状態を別の方法で評価することを含んでもよい。
【０２７４】
[0281]ここで図７を参照すれば、開示された実施態様の原理に従ってコンピューターを利用する方法の例を見ることができる。図７において、フローチャート３０００が示される。ブロック３００４において、バイオマーカー情報は個体に関して検索することができる。バイオマーカー情報は、例えば個体の生体サンプルの試験を行った後にコンピューターデータベースから検索することができる。バイオマーカー情報は、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を含んでいてもよく、Ｎは２〜６５である。ブロック３００８において、コンピューターを利用して、それぞれのバイオマーカー値を分類することができる。そしてブロック３０１２において、個体が膵癌を有するかどうかの可能性について複数の分類に基づき判断することができる。その指標を、人が見ることができるようにディスプレイまたはその他の表示装置に出力することができる。従って、例えば、コンピューターまたはその他の出力装置のディスプレイのスクリーンにそれらを表示することができる。
【０２７５】
[0282]ここで図８を参照すると、フローチャート３２００によってその他の実施態様に従ってコンピューターを利用する代替方法を説明することができる。ブロック３２０４において、コンピューターを利用して、個体に関するバイオマーカー情報を検索することができる。バイオマーカー情報は、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む。ブロック３２０８において、コンピューターを用いてバイオマーカー値の分類を行うことができる。そしてブロック３２１２において、その個体が膵癌を有する可能性について、分類に基づき指標を作製することができる。この指標は、人が見ることができるようにディスプレイまたはその他の表示装置に出力することができる。従って、例えば、コンピューターまたはその他の出力装置のディスプレイのスクリーンにそれらを表示することができる。
【０２７６】
[0283]本明細書において説明されるいくつかの実施態様は、コンピュータープログラム製品が含まれるように実行することができる。コンピュータープログラム製品は、アプリケーションプログラムをデータベースを含むコンピューターで実行させるための媒体で実施されるコンピューターで読取り可能なプログラムコードを有するコンピューターで読取り可能な媒体を含んでいてもよい。
【０２７７】
[0284]本明細書で用いられる「コンピュータープログラム製品」は、あらゆる性質を有する物理媒体（例えば、書記媒体、電子媒体、磁気媒体、光媒体またはその多の方式の媒体）上に収録され、コンピューターまたはその他の自動データ処理システムと共に用いることができる、自然言語またはプログラミング言語の命令文の形態の組織化された一連の命令を意味する。このようなプログラミング言語の命令文は、コンピューターまたはデータ処理システムによって実行される際に、命令文の具体的な内容に従ってコンピューターまたはデータ処理システムが作動するようにする。コンピュータープログラム製品としては、これらに限定されないが、ソースおよび目的コード中のプログラム、および／または、コンピューターで読取り可能な媒体に組み込まれたテストまたはデータライブラリーが挙げられる。さらに、コンピューターシステムまたはデータ処理装置が予め選択された方式で作動することを可能にするコンピュータープログラム製品は、様々な形態で提供が可能であり、このような形態としては、これらに限定されないが、オリジナルのソースコード、アセンブリコード、目的コード、機械言語、前述のものの暗号化または圧縮されたバージョンおよびありとあらゆる等価体が挙げられる。
【０２７８】
[0285]一形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、それぞれ表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択される少なくともＮ種のバイオマーカーのうちの１種に対応するバイオマーカー値を含み、Ｎは２〜６５である）；および、その個体の膵癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【０２７９】
[0286]さらにその他の形態において、膵癌の可能性を示すためのコンピュータープログラム製品が提供される。本コンピュータープログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサーによって実行可能なプログラムコードを具現化するコンピューターで読取り可能な媒体を含み、ここで上記プログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（ここで上記データは、生体サンプル中の、表１の第２列に示されるバイオマーカーからなる群より選択されるバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を含む）；および、その個体の膵癌の状態をバイオマーカー値の関数として示す分類法を実行するコードを含む。
【０２８０】
[0287]様々な実施態様を方法または装置として説明したが、当然のことながら実施態様は、コンピューターと連結されたコード、例えばコンピューター内に常駐の、またはコンピューターによってアクセス可能なコードによって実施することができる。例えばソフトウェアおよびデータベースを利用して、上記で考察された方法のいずれかを実施することができる。従って、ハードウェアによって達成される実施態様に加えて、これらの実施態様は、そこで実施されるコンピューターで読取り可能なプログラムコードを有するコンピューターが使用できる媒体（それにより、ここでの説明で開示された機能を作動させる）で構成される製品を使用することによって達成できることにも留意する。従って、このような実施態様もそのプログラムコード手段において同様に本特許によって保護されるものとみなされることが望ましい。さらに、このような実施態様は、これらに限定されないが、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光媒体または磁気光学媒体などの実質的にあらゆる種類のコンピューターで読取り可能なメモリ内に保存されたコードとして実施が可能である。より一般的に言えば、このような実施態様は、ソフトウェアまたはハードウェアで、または、これらのあらゆる組み合わせで実施することができ、このようなソフトウェアとしては、これらに限定されないが、汎用プロセッサー、マイクロコード、ＰＬＡまたはＡＳＩＣで作動するソフトウェアなどが挙げられる。
【０２８１】
[0288]また、このような実施態様は、搬送波で実施されるコンピューターシグナル、加えて伝送媒体を介して伝播されたシグナル（例えば電気および光）として達成することができることも想定される。従って、上記で考察された様々な種類の情報は、データ構造のような構造においてフォーマットし、伝送媒体を介して電気信号として伝送するかまたはコンピューターで読取り可能な媒体に保存することができる。
【０２８２】
[0289]また、本明細書において列挙された構造、材料および行為の多くが、ある機能を実行するための手段またはある機能を実行するため工程としても列挙されることにも留意する。それゆえに、当然のことながら、このような言語は、このような本明細書で開示された全ての構造、材料または行為およびそれらの等価体（参照により本明細書に組み込まれる内容を含む）を包含することができる。
【０２８３】
[0290]上記で、本明細書において開示されたバイオマーカーの同定プロセス、該バイオマーカーの利用、および、バイオマーカー値を決定する様々な方法を膵癌に関して詳細に説明した。しかしながら、本方法の適用、同定されたバイオマーカーの使用、および、バイオマーカー値を決定する方法は、その他の特定のタイプの癌、癌全般、その他のあらゆる病気または病状、または、補助的な薬物療法で効果が得られない、またはその可能性がある個体の同定にも十分に適用が可能である。膵癌に関する特定の結果について述べる場合を除いては、文脈から明かなように、本明細書における膵癌についての記述は、その他のタイプの癌、癌全般、または、その他のあらゆる病気もしくは病状も包含するものと理解することができる。
【実施例】
【０２８４】
[0291]以下の実施例は単に説明のために提供されたものであり、添付の請求項で定義されるような本願の範囲を限定することは目的としない。本明細書において説明される全ての実施例は当業者によく知られており慣例的な標準的な技術を用いて行われた。以下の実施例で説明されている慣例的な分子生物学的技術は、例えばSambrook等のMolecular Cloning:A Laboratory Manual, 第3版, コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press), ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(2001)のような標準的な実験マニュアルで説明されているようにして行うことができる。
【０２８５】
実施例１．サンプルの多重化アプタマーの解析
[0292]この実施例において、表１の第２列に示されるバイオマーカーを同定するため（図９を参照）、および、表１９に記載の癌バイオマーカーを同定するための、サンプルおよびコントロールを解析するのに用いられる多重化アプタマー分析を説明する。膵癌、肺癌および中皮腫の研究のために、多重化解析においてそれぞれ特異的な標的に固有な８２３種のアプタマーを利用した。
【０２８６】
[0293]この方法において、溶液添加ごとにピペットチップを交換した。
[0294]また特に他の指定がない限り、ほとんどの溶液の移動およびせ洗浄液の追加には、ベックマン・バイオメックＦｘＰ（Beckman Biomek FxP）の９６ウェルのヘッドを使用した。手動でピペット操作される方法工程には、特に他の指定がない限り１２チャンネルのＰ２００ピペットマン（Pipetteman）（レイニン・インスツルメンツ社（Rainin Instruments, LLC），カリフォルニア州オークランド）を使用した。ｐＨ７．５で４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＳＢ１７と称されるカスタム緩衝液を社内で製造した。ｐＨ７．５で４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＳＢ１８と称されるカスタム緩衝液を社内で製造した。特に他の指定がない限り全ての工程は室温で行われた。
【０２８７】
[0295]１．アプタマーストック溶液の製造
[0296]光切断型ビオチンリンカーを有さないアプタマーのために、１０％、１％および０．０３％血漿用のカスタムストックアプタマー溶液を、適切な光切断型ビオチン化プライマーと共に、１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で８倍濃度で製造したところ、得られたプライマー濃度は関連アプタマー濃度の３倍であった。これらのプライマーは、対応するアプタマーの全部または一部にハイブリダイズした。
【０２８８】
[0297]３種の８倍アプタマー溶液それぞれを別々に１ｘＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で１：４に希釈し（１５００μＬの８倍ストックを４５００μＬの１ｘＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０に希釈）、２倍濃度とした。続いて希釈したアプタマーマスターミックスをそれぞれ１５００μＬに分て、４２ｍＬのねじ蓋付きチューブに入れ、９５℃で５分間処理し、続いて３７℃で１５分間インキュベートした。インキュベートした後に特定のアプタマーマスターミックスに対応する４２ｍＬのチューブをまとめて試薬槽に入れ、（３種全てのミックスにつき）５５μＬの２倍アプタマーミックスを手動でピペット操作して９６ウェルのハイバイド（Hybaid）プレートに入れ、プレートをホイルで密封した。最終的に、３種の９６ウェルのホイルで密封したハイバイドプレートが得られた。個々のアプタマー濃度は０．５ｎＭであった。
【０２８９】
[0298]２．分析サンプルの調製
[0299]−８０℃で保存した１００％血漿の凍結アリコートを２５℃の水浴に１０分間置いた。融解させたサンプルを氷上に置き、穏やかにボルテックス（４に設定）で８秒混合し、続いて氷上に置いた。
【０２９０】
[0300]５０μＬの８チャンネルスパニングピペッターを用いて１６μＬのサンプルを、各ウェルに４℃で６４μＬの適切なサンプル希釈剤（血漿の場合、０．８×ＳＢ１８、０．０５％トゥイーン−２０、２μＭのＺ−ブロック２、０．６ｍＭのＭｇＣｌ２）を含む９６ウェルのハイバイドプレートに移動することにより２０％サンプル溶液を製造した。次のサンプル希釈工程が開始されるまでこのプレートを氷上で保存した。
【０２９１】
[0301]サンプルおよびアプタマーの平衡化を始めるために、２０％サンプルのプレートを短時間で遠心分離し、ベックマンＦＸに入れて、そこで９６ウェルのピペッターを上下にピペッティングすることによりを混合した。続いて１０μＬの２０％サンプルを９０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０に希釈することによって２％のサンプルを製造した。続いて得られた２％のサンプル６μＬを１９４μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０に希釈して０．０６％のサンプルのプレートを作製した。ベックマン・バイオメックＦｘＰで希釈を行った。それぞれ移動させた後、上下にピペッティングすることによって溶液を混合した。続いて５５μＬのサンプルを５５μＬの適切な２倍アプタマーミックスに添加することによって、３種のサンプル希釈プレートをそれらの各アプタマー溶液に移した。サンプルおよびアプタマー溶液をロボットで上下にピペッティングすることによって混合した。
【０２９２】
[0302]３．サンプルの平衡結合
[0303]サンプル／アプタマープレートをホイルで密封し、３７℃のインキュベーターに３．５時間置き、その後キャッチ（Catch）１工程に進んだ。
【０２９３】
[0304]４．キャッチ２ビーズプレートの調製
[0305]マイワン（MyOne）（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.），カリフォルニア州カールスバッド）ストレプトアビジンＣ１ビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）の５．５ｍＬアリコートを等量の２０ｍＭのＮａＯＨで２回洗浄し（それぞれの洗浄につき５分間インキュベートした）、等量の１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で３回洗浄し、５．５ｍＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０に再懸濁した。１２−スパンマルチチャンネルピペッターを用いて、この溶液５０μＬを手動でピペットを用いて９６ウェルのハイバイドプレートの各ウェルに入れた。続いてプレートをホイルで覆い、分析で使用するために４℃で保存した。
【０２９４】
[0306]５．キャッチ１ビーズプレートの調製
[0307]３つの０．４５μｍのミリポア（Millipore）ＨＶプレート（デュラポア（Durapore）メンブレン，カタログ番号ＭＡＨＶＮ４５５０）を１００μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で少なくとも１０分間平衡化した。続いてプレートに平衡緩衝液を通過させてろ過し、各ウェルに１３３．３μＬの７．５％ストレプトアビジン−アガロースビーズスラリー（１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０中）を添加した。ストレプトアビジンアガロースビーズを懸濁した状態で維持しつつそれらをフィルタープレートに移すために、手動でビーズ溶液を２００μＬの１２チャンネルピペッターで１５回混合した。３つのフィルタープレート全体にビーズを分散させた後、真空にしてビーズ上清を取り除いた。最後に、フィルタープレート中でビーズを２００μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で洗浄し、続いて２００μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０に再懸濁した。フィルタープレートの底を吸い取り、分析で使用するためにプレートを保存した。
【０２９５】
[0308]６．サイトマット（Cytomat）の装填
[0309]サイトマットの槽中に全てのチップ、プレート、全ての試薬、３つの調製済みキャッチ１フィルタープレート、および、１つの調製済みマイワンプレートを装填した（ただしＮＨＳビオチン試薬は、プレートに添加する直前に新しいものを調製した）。
【０２９６】
[0310]７．キャッチ１
[0311]３．５時間平衡化した後、インキュベーターからサンプル／アプタマープレートを取り出し、約１分間遠心分離し、ホイルを取り除き、ベックマン・バイオメックＦｘＰのデッキに置いた。ベックマン・バイオメックＦｘＰのプログラムを開始させた。特に他の規定がない限り、その後のキャッチ１の全工程をベックマン・バイオメックＦｘＰロボットによって行った。このプログラム内で、キャッチ１フィルタープレートを真空にして、ビーズ上清を取り除いた。それぞれ１００マイクロリットルの１０％、１％および０．０３％平衡結合反応液をそれらの各キャッチ１ろ過プレートに添加し、デッキ上のオービタルシェーカーを８００ｒｐｍで１０分間用いて各プレートを混合した。
【０２９７】
[0312]真空ろ過によって未結合溶液を除去した。この溶液を分配して即座に真空にすることによって、この溶液をプレートでろ過することにより、キャッチ１ビーズを、１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０中の１９０μＬの１００μＭビオチンで洗浄し、続いて１９０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０で洗浄した。
【０２９８】
[0313]続いてキャッチ１プレートに１９０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０を添加した。デッキ上のブロットステーションを用いてプレートを吸い取り液滴を除去し、続いてオービタルシェーカーを８００ｒｐｍで、２５℃で１０分間で用いてインキュベートした。
【０２９９】
[0314]この洗浄液をロボットを用いて真空ろ過により除去し、デッキ上のブロットステーションを用いてフィルタープレートの底を吸い取り液滴を除去した。
[0315]８．タグ付け
[0316]ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンのアリコートを３７℃で６分間融解させ、続いてタグ付け緩衝液（ＳＢ１７、ｐＨ７．２５、０．０５％トゥイーン−２０）で１：１００に希釈した。ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン試薬を１００ｍＭ濃度で無水ＤＭＳＯに溶解させ、−２０℃で凍結保存した。ロボットを始動させたらすぐに、希釈したＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン試薬を手動でデッキ上の槽に添加し、ロボットプログラムを手動で再始動させて１００μＬのＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを各キャッチ１フィルタープレートの各ウェルに分配した。この溶液をそのまま、オービタルシェーカーで８００ｒｐｍで５分間振盪させながらキャッチ１ビーズと共にインキュベートした。
【０３００】
[0317]９．動的な攻撃と光切断
[0318]ＮＨＳタグを含む間にキャッチ１プレートに１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０中の２０ｍＭグリシン（１５０μＬ）を添加することによってタグ付け反応を止めた。続いてプレートを、オービタルシェーカーで、８００ｒｐｍで１分間インキュベートした。ＮＨＳ−タグ／グリシン溶液を真空ろ過により除去した。続いて各プレートに１９０μＬの２０ｍＭグリシン（１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０）を添加し、オービタルシェーカーで、８００ｒｐｍで１分間インキュベートし、その後真空ろ過により除去した。
【０３０１】
[0319]各プレートに１９０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０を添加し、真空ろ過によって除去した。
[0320]その後キャッチ１プレートのウェルを１９０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０の添加によって３回洗浄し、プレートをオービタルシェーカーに８００ｒｐｍで１分間置き、続いて真空ろ過した。最後の洗浄が終わったら、プレートを１ｍＬの深いウェルのプレートの上面に置き、デッキから取り除いた。キャッチ１プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、溶出前にアガロースビーズからできるだけ多くの余剰量を除去した。
【０３０２】
[0321]プレートをベックマン・バイオメックＦｘＰに戻し、フィルタープレートの各ウェルに１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０中の１０ｍＭのＤｘＳＯ４（８５μＬ）を添加した。
【０３０３】
[0322]デッキからフィルタープレートを取り出し、ブラックレイ（BlackRay）（テッド・ペラ社（Ted Pella, Inc.)，カリフォルニア州レディング）光源下のバリオマグ（Variomag）サーモシェーカー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific, Inc.），マサチューセッツ州ウォルサム）に置き、８００ｒｐｍで振盪しながら１０分間照射した。
【０３０４】
[0323]まず１ｍＬの深いウェルのプレートの上面に１０％キャッチ１フィルタープレートを置き、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離することによって、光切断処理された溶液を各キャッチ１プレートから連続的に共通の深いウェルのプレートに溶出させた。続いて１％および０．０３％キャッチ１プレートを連続的に遠心分離して同じ深いウェルのプレートに入れた。
【０３０５】
[0324]１０．キャッチ２ビーズの捕捉
[0325]キャッチ１の合わせた溶出物を含む１ｍＬの深いウェルのブロックをキャッチ２用にベックマン・バイオメックＦｘＰのデッキに置いた。
【０３０６】
[0326]ロボットによって全ての光切断処理された溶出液を、１ｍＬの深いウェルのプレートから、予め調製されたキャッチ２マイワン磁気ビーズを含むハイバイドプレート上に移した（磁気分離によってマイワン緩衝液を除去した後）。
【０３０７】
[0327]この溶液を、バリオマグサーモシェーカー（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社，マサチューセッツ州ウォルサム）で、２５℃で１３５０ｒｐｍで５分間振盪しながらインキュベートした。
【０３０８】
[0328]ロボットによってプレートをデッキ上の磁気分離ステーションに移した。プレートを磁石上で９０秒間インキュベートし、その後上清を除去して捨てた。
[0329]１１．３７℃での３０％グリセロール洗浄
[0330]キャッチ２プレートをデッキ上のサーマルシェーカーに移し、各ウェルに７５μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０を入れた。プレートを１３５０ｒｐｍおよび３７℃で１分間混合し、ビーズを再懸濁して温めた。キャッチ２プレートの各ウェルに、７５μＬの６０％グリセロールを３７℃で移し、プレートを１３５０ｒｐｍおよび３７℃でさらに１分間混合し続けた。ロボットによってプレートを３７℃の磁気分離装置に移し、そこでプレートを磁石上で２分間インキュベートし、続いてロボットによって上清を取り除き捨てた。このような洗浄をさらに２回繰り返した。
【０３０９】
[0331]キャッチ２ビーズから第三の３０％グリセロール洗浄液を除去した後、各ウェルに１５０μＬの１×ＳＢ１７、０．０５％トゥイーン−２０を添加し、１３５０ｒｐｍで１分間振盪しながら３７℃でインキュベートし、その後３７℃の磁石上で磁気分離により除去した。
【０３１０】
[0332]１５０μＬの１×ＳＢ１９、０．０５％トゥイーン−２０を用いて、１３５０ｒｐｍ、２５℃で振盪しながら１分間インキュベートすることによりキャッチ２ビーズを最後に洗浄し、その後、磁気分離した。
【０３１１】
[0333]１２．キャッチ２ビーズの溶出および中和
[0334]各ウェルに１ＭのＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン−２０を含む１００ｍＭのＣＡＰＳＯ（１０５μＬ）を添加することによってキャッチ２ビーズからアプタマーを溶出させた。ビーズをこの溶液と共に１３５０ｒｐｍで５分間振盪しながらインキュベートした。
【０３１２】
[0335]続いてキャッチ２プレートを磁気分離装置に９０秒間入れ、その後、９０μＬの溶出液を、各ウェルに１０μＬの５００ｍＭのＨＣｌ、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０５％トゥイーン−２０を含む新しい９６ウェルプレートに移した。移動後、この溶液９０μＬを、ロボットで上下に５回ピペッティングすることによって混合した。
【０３１３】
[0336]１３．ハイブリダイゼーション
[0337]ベックマン・バイオメックＦｘＰにより、新しいハイバイドプレートに２０μＬの中和したキャッチ２溶出液を移し、各ウェルに、ハイブリダイゼーションコントロールの１０倍スパイクを含む１０倍アジレント（Agilent）ブロック５μＬを添加した。続いて、中和したサンプルおよびブロッキング緩衝液を含むプレートの各ウェルに、２５μＬの２倍アジレントハイブリダイゼーション緩衝液をピペットを用いて手動で入れ、この溶液２５μＬを手動で上下に１５回、大規模な気泡形成を回避するためにゆっくりピペッティングすることによって混合した。プレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心した。
【０３１４】
[0338]アジレントハイブリダイゼーションチャンバーにガスケットスライドを入れ、各ガスケットに、ハイブリダイゼーション溶液とブロッキング溶液を含むそれぞれのサンプル４０μＬを手動でピペットを用いて入れた。気泡形成が最小化されるように８チャンネルの可変式スパニングピペッターを使用した。続いて、ナンバーバーコードが上に向いた状態のカスタムアジレントマイクロアレイスライド（アジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies, Inc.），カリフォルニア州サンタクララ）をガスケットスライドに向かってゆっくりと降ろした（アジレントの詳細な説明に関するマニュアルを参照）。
【０３１５】
[0339]ハイブリダイゼーションチャンバーのトップをスライド／裏材のサンドイッチ上に置き、締付けブラケットをアセンブリ全体にスライドさせた。これらのアセンブリをネジをしっかりと回すことによりきつくと固定した。
【０３１６】
[0340]各スライド／裏材のスライドサンドイッチの外観を検査して、溶液の気泡がサンプル内で自由に移動できることを確認した。気泡が自由に移動しなかった場合、ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリを穏やかにタッピングしてガスケット付近に溜まった気泡を除いた。
【０３１７】
[0341]組み立てられたハイブリダイゼーションチャンバーを、アジレントハイブリダイゼーションオーブン中で、６０℃で１９時間、２０ｒｐｍで回転させながらインキュベートした。
【０３１８】
[0342]１４．ハイブリダイゼーション後の洗浄
[0343]およそ４００ｍＬのアジレント洗浄緩衝液１を２つの別個のガラス染色皿それぞれに入れた。染色皿のいずれか一方を磁気撹拌プレート上に置き、緩衝液中にスライドラックおよびスターラーバーを入れた。
【０３１９】
[0344]空のガラス染色皿にスターラーバーを置くことにより、アジレント洗浄液２のための染色皿を調製した。
[0345]第四のガラス染色皿を、最終的なアセトニトリルでの洗浄にとっておいた。
【０３２０】
[0346]６つのハイブリダイゼーションチャンバーそれぞれを分解した。スライド／裏材のサンドイッチを一つずつそのハイブリダイゼーションチャンバーから取り出し、洗浄液１を含む染色皿に浸した。マイクロアレイスライドを浸したままで一対のピンセットを用いてスライド／裏材のサンドイッチを引き離した。スライドを、磁気撹拌プレート上の洗浄１染色皿中のスライドラックに迅速に移した。
【０３２１】
[0347]スライドラックを穏やかに５回昇降させた。磁気スターラーを低速設定で回転させ、スライドを５分間インキュベートした。
[0348]洗浄１について残り１分の時点で、第二の調製済み染色皿にインキュベーター中で予め３７℃に温めた洗浄緩衝液２を添加した。スライドラックを迅速に洗浄緩衝液２に移し、染色皿の上でかき集めることによりラック底にある過量の緩衝液すべてを除去した。スライドラックを穏やかに５回昇降させた。磁気スターラーを低速設定で回転させ、スライドを５分間インキュベートした。
【０３２２】
[0349]洗浄２からスライドラックをゆっくり引き出し、およそ１５秒間かけて溶液からスライドを取り出した。
[0350]洗浄２について残り１分で、第四の染色皿にアセトニトリル（ＡＣＮ）を添加した。アセトニトリル染色皿にスライドラックを移した。スライドラックを穏やかに５回昇降させた。磁気スターラーを低速設定で回転させ、スライドを５分間インキュベートした。
【０３２３】
[0351]スライドラックをＡＣＮ染色皿からゆっくり引き出し、吸収タオル上に置いた。スライドの下端を迅速に乾燥させ、スライドを清潔なスライドボックスに入れた。
[0352]１５．マイクロアレイイメージング
[0353]製造元の説明書に従ってマイクロアレイスライドをアジレントスキャナースライドホルダーに入れ、アジレントマイクロアレイスキャナーに装填した。
【０３２４】
[0354]スライドを、Ｃｙ３チャンネルで、解像度５μｍで、１００％ＰＭＴ設定および０．０５で可能なＸＲＤオプションで画像化した。得られたｔｉｆｆ画像をアジレント特徴抽出ソフトウェア（バージョン１０．５）を用いて加工した。
【０３２５】
実施例２．バイオマーカーの同定
[0355]無症状の個体と、急性または慢性膵炎（またはその両方）、膵管閉塞、ＧＥＲＤ、胆石または後で良性と判別される異常な画像を示す症状を示す個体（まとめてＧＩおよび正常なコントロールという）において、膵癌の診断に関して潜在的な膵癌バイオマーカーの同定を行った。この研究の登録基準は、年齢が１８歳またはそれ以上であること、インフォームド・コンセント、および、血漿サンプル、ならびに文書化された膵癌または良性結果の診断を提供できること、である。いずれのケースにおいても、血液サンプルを、処置または外科手術の前、および、膵癌と診断された後に回収した。除外基準は、血液採取から過去５年間以内に癌の診断または治療を受けたことがあること（ただし皮膚の扁平上皮癌は除く）である。２種の異なる部位から血漿サンプルを回収し、１４３個の膵癌サンプル、および、１１５個のコントロールグループサンプルを得た。実施例１で説明されているような多重化アプタマー親和性分析を用いて、これら２５８サンプルそれぞれにおける８２３個の分析物についてＲＦＵ値を測定し報告した。２つの独立した試験および場所から類似のプロトコールでの血漿サンプルを得て、バイオマーカー発見のための解析の前に部位間の差についての試験を行った。
【０３２６】
[0356]８２３個の分析物それぞれについてクラス依存性累積分布関数（ｃｄｆ）を作製することによりそれぞれの患者群およびコントロール群を別々に比較した。２セットのサンプル間の値のＫＳ距離（コルモゴロフ−スミルノフ統計）は、１つのセット（セットＡ）由来の値の経験分布が他のセット（セットＢ）由来の値の分布と異なっている程度を示すノンパラメトリック測定値である。閾値Ｔのどの値についても、セットＡ由来の値のある比率はＴより小さく、および、セットＢ由来の値のある比率はＴより小さいと予想される。ＫＳ距離は、Ｔのいずれかの選択値について、これら２セットからの値の比率間の最大の（符号なしの）差を測定したものである。
【０３２７】
[0357]この潜在的なバイオマーカーのセットを用いて、サンプルをコントロールまたは病気グループのいずれかに割り当てる分類器を構築することができる。実際には、このような分類器の多くをこれらのバイオマーカーのセットから作製し、どのバイオマーカーでも優れたスコア付けされた分類器で使用される頻度を決定した。上位のスコア付けされた分類器のなかでも最も高い頻度で出現するバイオマーカーが、診断テストを構築するのに最も有用であった。この実施例において、分類空間を調査するのにベイズ分類器を用いたが、この目的のためにその他の多くの監督された学習方法が利用できる。いずれか個々の分類器のスコア化の適合性を、病気罹患率０．５と仮定されるベイズ表面における分類器の受信者動作特性曲線下面積（ＲＯＣのＡＵＣ）によって測定した。このスコア化計量はゼロから１に変動し、ここで１はエラーのない分類器である。実施例３において、バイオマーカー群測定からベイズ分類器を構築することの詳細を説明する。
【０３２８】
[0358]表１に記載の６５個の分析物を用いて、合計９７３の１０個の分析物よりなる分類器は、コントロールグループから膵癌を診断することについて０．９０のＡＵＣを示すことがわかった。この分類器のセットから、合計で１１種のバイオマーカーが、ハイスコア分類器の３０％またはそれより多くに存在することがわかった。表１３は、これらの潜在的なバイオマーカーのリストを示し、図１０は、同定されたバイオマーカーについての頻度プロットを示す。
【０３２９】
実施例３．膵癌に関する単純ベイズ分類
[0359]膵癌とコントロールとを識別するのに有用と同定されたバイオマーカーのリストから、１０種のバイオマーカーのパネルを選択し、単純ベイズ分類器を構築した（表１６を参照）。クラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）、ｐ（ｘｉ｜ｃ）、および、ｐ（ｘｉ｜ｄ）（式中ｘｉは、バイオマーカーｉおよびｃについて測定されたＲＦＵ値の対数であり、ｄはコントロールおよび病気の個体群を意味する）を平均μと分散σ２を特徴とする対数−正規分布関数としてモデル化した。表１６に１０種のバイオマーカーのｐｄｆについてのパラメーターを列挙し、図５に生データの例は、正規ｐｄｆへのモデルのフィッティングと共に示した。図５で証明されるように、前提はこのデータと非常によく適合しているようである。
【０３３０】
[0360]このようなモデルのための単純ベイズ分類は、検定に適した以下の方程式：
【０３３１】
【数９−１】
0005931874.tif 000015
【０３３２】
で示され、式中ｐ（ｄ）は個体群における病気罹患率であり、ｎは１０である。このような加法における項のそれぞれは、個別マーカーに関する対数尤度比であり、サンプル
【０３３３】
【数９−２】
0005931874.tif 000016
【０３３４】
において対象の病気（すなわちこのケースでは膵癌）有りに対する対象の病気無しの合計対数尤度比は、単にこれらの個々の項と病気罹患率を構成する項との合計である。簡単にするために、ｐ（ｄ）＝０．５と仮定すると、
【０３３５】
【数１０】
0005931874.tif 000017
【０３３６】
である。
[0361]未知のサンプルの対数（ＲＦＵ）での測定値が、１０種のバイオマーカーそれぞれについて６．３、９．３、８．７、１０．８、７．４、１１．４、１１．７、９．０、８．０、７．３であるとすると、分類の計算は表１６で詳述した通りである。病気とコントロールクラスとの対数尤度比を含む個々の構成要素をまとめ、表１６に記載のパラメーターとｘの値からコンピューターで計算することができる。個々の対数尤度比の合計は−３．０４４であり、または、病気有りに対する病気無しの尤度は２１であった（ここで尤度ｅ３．０４４＝２１である）。第一の３つのバイオマーカー値は、病気グループ（対数尤度＞０）と比較的一致する尤度を有するが、残りの７つのバイオマーカーはいずれも、一貫してコントロールグループに有利であることがわかった。尤度を掛けて一つにすることによっても、上記で示されたのと同じ結果が得られ、未知のサンプルが病気を有さないことを示す尤度は２１であった。実際に、このサンプルは訓練セットにおいてコントロール個体群に由来するものであった。
【０３３７】
実施例４．分類器用のバイオマーカーのパネルを選択するための貪欲アルゴリズム
[0362]この実施例では、本明細書において説明される方法のいずれかにおける分類器として用いることができるパネルを形成するための表１からのバイオマーカーの選択を説明する。表１に示されるバイオマーカーの部分集合を選択して、優れた性能を有する分類器を構築した。この方法はまた、実施例２においてどの潜在的なマーカーがバイオマーカーとして包含されるのかを決定するのにも用いられた。
【０３３８】
[0363]ここで使用された分類器性能の尺度は、ＡＵＣである；０．５の性能は、ランダム（コイントス）分類器の標準の期待値であり、ランダムよりも悪い分類器は０．０〜０．５のスコアを示し、ランダムの性能よりも優れている分類器は０．５〜１．０のスコアを示すと予想される。エラーがない完全な分類器は、１．０の感度および１．０の特異度を有すると予想される。実施例４で説明した方法を、例えばＦ測定値、感度と特異度の合計、または、感度と特異度の積などの性能のその他の一般的な尺度に適用することができる。具体的に言えば、感度をある程度犠牲にしてより高い特異度で機能する分類器が選択されるか、または、特異度をある程度犠牲にしてより高い感度で機能する分類器が選択されるように、感度と特異度とを異なる重みで処理することが望まれる場合がある。本明細書で説明される方法は「性能」の尺度だけに関連するため、単一の性能の尺度が得られるあらゆる重み付けスキームを用いることができる。適用が異なれば、真陽性および真陰性の所見についての利益も異なり、さらに、偽陰性の所見からの偽陽性の所見に関連するコストも異なる。例えば無症状の高リスク個体のスクリーニング、および、膵癌と良性のＧＩ症状との鑑別診断において、一般的には、特異度と感度との最適なトレードオフが同じではないと予想される。２つの試験の異なる要求は、一般的に、性能の尺度に反射される陽性および陰性の誤分類に対して異なる重み付けを設定することを必要とすると予想される。性能の尺度を変化させると、一般的に、所定のデータセットについて表１の第２列から選択されるマーカーの正確な部分集合も変化すると予想される。
【０３３９】
[0364]実施例３で説明されている膵癌サンプルとコントロールサンプルとの識別に対するベイズ法について、病気および良性の訓練サンプルにおけるバイオマーカーの分布によって分類器を完全にパラメータ化し、バイオマーカーのリストを表１から選択した；すなわち、包含（inclusion）のために選択されたマーカーの部分集合から、訓練データのセットが得られる１対１の方式で分類器を決定した。
【０３４０】
[0365]ここで利用される貪欲法は、表１からマーカの最適な部分集合を検索するのに使用された。少数のマーカーまたは比較的少数のマーカーを含む分類器について、可能性のあるマーカーの部分集合全てを列挙し、その特定のマーカーのセットで構築された分類器の性能に関して評価した（実施例４の第２部を参照）。（このアプローチは統計分野において「最良サブセットの選択法」としてよく知られている；例えばHastie et alを参照）。しかしながら、本明細書において説明される分類器について、複数のマーカーの組み合わせの数は極めて大きくなる可能性があり、３０のみの全分析物のリストから作製することができる可能な組み合わせが３０，０４５，０１５通りであることから、可能性のある１０種のマーカーのセット全てを評価することは実行不可能であった。マーカーの部分集合全ての検索が実行不可能であったために、一つの最良の部分集合を見出すことができなかった；しかしながら、このアプローチを用いることによって、多くの優秀な部分集合が見出され、多くの場合において、これらの部分集合のいずれかが代表的な最良の部分集合のとなり得る。
【０３４１】
[0366]可能性のあるマーカーのセット全てを評価する代わりに、「貪欲な」前方段階的アプローチに従ってもよい（例えば、Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10):e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002を参照）。この方法を用いて、（個別マーカーのＫＳ距離に基づいて）最良の単一のマーカーで分類器を開始させ、マーカーリストに記載されているが目下分類器におけるマーカーのセットの構成要素ではない構成要素それぞれを順に試みることによって各工程で成長させる。既存の分類器と組み合わせて最良のスコアを示す１つのマーカーが、分類器に追加される。性能のさらなる改善が達成されなくなるまでこれを繰り返す。残念ながら、このアプローチは、マーカーの有用な組み合わせを逃す可能性がある（このようなマーカーに関して、プロセスが止まる前に個別マーカーのいくつかが全て選択されるわけではない）。
【０３４２】
[0367]ここで使用された貪欲法は、各工程でただ単一の候補分類器（マーカーの部分集合）を維持するのではなく、検索を拡張するために候補分類器のリストを維持した点で、前述した前方段階的アプローチに手を加えたものである。このリストを、単一のマーカー部分集合それぞれに適用した（表中の全てのマーカーをそのまま用いた）。現在のところリスト上にあるものから新しい分類器（マーカーの部分集合）導きだし、それらをリストに追加する工程によって、このリストを拡張した。この時点でリスト上にある各マーカーの部分集合をそれぞれ、表１から、まだその分類器の一部ではなくその部分集合への追加時に既存の部分集合と重複しないと予想されるいずれかのマーカー（これらは、「許容マーカー」と称される）を追加することによって拡張した。全ての現存するマーカーのそれぞれの部分集合を、それぞれの許容マーカーによってリストから拡張した。このようなプロセスによって最終的に全ての可能性のある部分集合がそれぞれ作製され、そのリストはスペースを使い果たすことは明らかである。従って、リストがある既定のサイズ（多くの場合において３つ全てのマーカーの部分集合保持するのに十分な程度）よりも小さい場合にのみ、作製された全ての分類器を維持した。リストが既定サイズの限界に達したら、それがエリートになる；すなわち、所定レベルの性能を示した分類器だけがリストに維持され、その他のものはリストの端から落ちて失われた。これは、分類器の性能順に並べられたリストを維持することにより達成された；少なくともその時点でリスト上で最低の分類器と同等の新しい分類器を挿入すると、その時点で最下層の成績不良なものが強制的に排除される。さらなる実施の詳細事項の一つは、リストを作製工程ごとに完全に置き換えたことである；それゆえに、リスト上の全ての分類器はそれぞれ同じの数のマーカーを含み、各工程で分類器ごとのマーカーの数は１つづつ増えた。
【０３４３】
[0368]この方法ではマーカーの異なる組み合わせを用いて候補分類器のリストを作製したことから、最良の単一の分類器または最良の分類器の少数派グループから生じる可能性があるエラーを回避するために、分類器を組み合わせることができるかどうか尋ねられる可能性がある。このような「アンサンブル」および「専門委員会」法は統計学や機械学習の分野においてよく知られており、例えば、「平均化（Averaging）」、「投票（Voting）」、「スタッキング（Stacking）」、「バギング（Bagging）」および「ブースティング（Boosting）」（例えばHastie et al.を参照）が挙げられる。これらの単純分類器を組み合わせることで、いくつかの異なる分類器を包含させることにより特定のあらゆるマーカーのセットにおけるノイズによる分類における分散を少なくする方法が提供され、それゆえに、分類器間で効果的に平均化されたバイオマーカーの表からより大きいマーカーのセットからの情報も提供される。このアプローチの有用性の例は、単一マーカー中の異常値が単一サンプルの分類に悪影響を与えないようにすることである。より多くのシグナル数を測定するための要件は、従来の「１時点で１マーカー」の抗体分析においては非現実的と思われるが、完全多重化アプタマー分析にとっては否定的な面はない。このような技術により、より大規模なバイオマーカーの表から利益を得て、病気の経過に関する複数の情報源を使用することにより、より確実な分類を提供することができる。
【０３４４】
[0369]表１で選択されたバイオマーカーは、「非マーカー」（すなわち、（実施例２で説明されているような）表１の包含基準を満たさないシグナルを有するタンパク質）で構築された分類器よりも優秀に機能する分類器を形成する。
【０３４５】
[0370]１、２および３つのマーカーのみを含む分類器について、表１に示されるバイオマーカーを用いて得られたあらゆる可能な分類器を列挙し、ランダムに選択された非マーカーシグナルの類似の表から構築された分類器と比較して性能分布について試験した。
【０３４６】
[0371]図１１において、ＡＵＣを性能の尺度として用いた；０．５の性能が、ランダム（コイントス）分類器にとって標準的な期待値である。分類器性能のヒストグラムを、６５種の非マーカーシグナルの「非マーカー」の表から構築された分類器の類似の網羅的列挙からの性能のヒストグラムと比較した；６５種のシグナルをコントロールと病気の個体群とで示差的なシグナル生成が示されなかったアプタマーからランダムに選択した。
【０３４７】
[0372]図１１は、コントロールグループと膵癌とを識別することができるバイオマーカーについて、表１４のバイオマーカーのパラメーターから構築されたあらゆる可能な１、２および３バイオマーカー分類器の性能のヒストグラムを示しており、これらの分類器を、６５個の「非マーカー」アプタマーＲＦＵシグナルを用いて構築されたあらゆる可能な１、２および３マーカー分類器と比較する。図１１Ａは、単一マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、図１１Ｂは、２マーカー分類器の性能のヒストグラムを示し、図１１Ｃは、３マーカー分類器の性能のヒストグラムを示す。
【０３４８】
[0373]図１１において、実線は、表１４のＧＩおよび正常なコントロール、ならびに膵癌に関するバイオマーカーデータを用いた、１、２および３マーカー分類器全ての分類器性能のヒストグラムを示す。点線は、コントロールおよび膵癌に関するデータを用いた、ただしランダムな非マーカーシグナルのセットを用いた、１、２および３マーカー分類器全ての分類器性能のヒストグラムである。
【０３４９】
[0374]表１に列挙したマーカーから構築された分類器は、１マーカー、２マーカーおよび３マーカー全ての比較のために、「非マーカー」からのシグナルで構築された分類器から十分に分離された別個のヒストグラムを形成する。表１に示されるバイオマーカーから構築された分類器の性能およびＡＵＣスコアはまた、マーカーの数と共に非マーカーから構築された分類器よりも速く増加し、分類器あたりのマーカー数が増加するにつれてマーカーと非マーカー分類器との間の隔たりが増加する。表１４に列挙されたバイオマーカーを用いて構築された全ての分類器は、「非マーカー」を用いて構築された分類器よりも明らかに優れた性能を示す。
【０３５０】
[0375]分類器の性能分布は、表１の分析物のセットから導き出すことができる多くの可能性のある多重マーカー分類器が存在することを示す。単一の分析物についての分類器のスコア分布およびＡＵＣから証明されるように、いくつかのバイオマーカーはその他のバイオマーカー単独よりも優れているが、このようなバイオマーカーが高性能分類器を構築するのに必要であるかどうかを決定することが望ましい。この決定を行うために、最良のバイオマーカー数個を除外することにより分類器の性能の挙動を試験した。図１２は、表１のバイオマーカーの完全リストで構築された分類器の性能と、上位のマーカーを排除した表１からのバイオマーカーの部分集合で構築された分類器の性能とを比較する図である。
【０３５１】
[0376]図１２は、最良のマーカーなしで構築された分類器が良好な性能を示すことを実証しており、これは、分類器の性能が、マーカーのいくつかの小さいコアグループによるものではないこと、および、基礎的な病気関連のプロセスにおける変化が、多くのタンパク質活性に反映されることを示唆している。表１に示されるバイオマーカーの多くの部分集合が、表１から６５個のマーカーのうち上位１５種を除外した後でさえも最良に近い性能を示す。表１から上位にランク付けされた（ＫＳ距離でランク付けされた）１５種のマーカーを落した後、分類器の性能は表から選択されたマーカーの数と共に向上し、ＡＵＣはほぼ０．８７に達し、これは、バイオマーカーの完全リストから選択された最良な分類器の性能のスコア０．９１に近い。
【０３５２】
[0377]最後に、図１６は、実施例３に従って表１４に記載されたパラメーターのリストから構成された典型的な分類器のＲＯＣ性能を示す。５つの分析物分類器を、ＣＴＳＢ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ＣＣＬ１８、および、ＣＳＦ１Ｒで構築した。図１６Ａは、実施例３の場合と同様にこれらのマーカーの非依存性を前提としたモデルの性能を示しており、図１６Ｂは、表１４でパラメーターを定義するのに用いられた研究データセットから作製した実験的なＲＯＣ曲線を示す。モデル計算では分類器の性能が過大評価される傾向が示されたが、ＡＵＣによって証明されたように、所定数の選択されたマーカーの性能が定性的に一致していること、および、定量的な一致は通常極めて優れていることがわかる。これは、モデル計算は完全に独立していると推測されるが、病気の経過に関するあらゆる特定のバイオマーカーによる情報は、その他の表１に示されるバイオマーカーによる情報と重複するという観念と一致する。従って図１６は、表１と実施例３で説明されている方法とを併用することにより、膵癌とコントロールグループとの識別に有用な極めて多くの分類器の構築および評価が可能になることを実証する。
【０３５３】
実施例５．ＣＡ１９−９の取り込み
[0378]癌関連抗原１９−９（ＣＡ１９−９）は、膵癌に関連する既知の血清マーカーである。膵癌に関するＣＡ１９−９の報告されている感度および特異度は、それぞれ８０〜９０パーセントである。しかしながら、ＣＡ１９−９の外科的に切除可能な小さい癌を有する患者を同定する精度には限界がある。ＣＡ１９−９の特異度も限界がある；ＣＡ１９−９は、様々な良性の膵胆道系障害を有する患者において高いことが多い。
【０３５４】
[0379]膵癌におけるＣＡ１９−９上昇の程度は、長期予後と関連する。さらに、切除可能な病気を有する可能性があるようにみえる患者において、ＣＡ１９−９レベルの規模は、放射線によって潜在性の転移性疾患の存在を予測することの補助にもなり得る。ＣＡ１９−９レベルを連続的にモニターすることは、治癒する可能性がある外科手術の後に患者を追跡調査するのに有用であり、さらに、進行中の病気のために化学療法を受けている患者にとっても有用である。ＣＡ１９−９レベルが上昇すると、通常、再発疾患の放射線撮影がまず行われるが、病気の進行の確認もイメージングの研究および／または生検と共に続けるべきである。ＣＡ１９−９と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、ＣＡ１９−９単独と比較して、膵癌の検出（またはその他の膵癌に関連する用途）に関する感度、特異度および／またはＡＵＣを改善する可能性がある。
【０３５５】
[0380]高レベルのＣＡ１９−９とは、血清中３５〜４０Ｕ／ｍｌとする。
[0381]我々は、訓練サンプルの部分集合について臨床的なＣＡ１９−９測定を行った。我々は、元の１００人の患者と６９人のコントロールのなかから、９９人の患者および５２人のコントロールについてＣＡ１９−９測定を行った。それゆえに、我々は、表１に記載のＳＯＭＡｍｅｒの部分集合を用いて、このサンプルの部分集合に対してランダムフォレストモデルの新しいセットを訓練した。我々はさらに、我々のＳＯＭＡｍｅｒパネルと共にＣＡ１９−９測定を包含する新しい分類器も訓練した（連結パネル）。
【０３５６】
[0382]図１３に３種の異なるアプローチの分類器（ＳＯＭＡｍｅｒ、ＣＡ１９−９、および、連結パネル）の性能を示す。ＳＯＭＡｍｅｒパネルおよびＣＡ１９−９は同様の性能を示したが、これら２つを組み合わせて単一の分類器にしたところ、性能が劇的に改善された。１００％の特異度について、ＳＯＭＡｍｅｒパネルおよびＣＡ１９−９は５０％をちょうど下回る感度を示したが、連結された分類器は約７５％の感度を示した。
【０３５７】
[0383]さらなる解析から、分類器にＣＡ１９−９が含まれる場合、同じ相対的な性能に必要なＳＯＭＡｍｅｒの数は減少することが明らかになった。図１４は、ＣＡ１９−９と１または２つの追加のＳＯＭＡｍｅｒのいずれかを使用するランダムフォレスト分類器の性能を示す。左のパネルは、ＣＡ１９−９およびＨＡＭＰを用いて訓練したモデルの性能を示し、右のパネルは、ＣＡ１９−９、ＨＡＭＰ、および、ＣＴＳＢの性能を示す。
【０３５８】
実施例６．臨床的なバイオマーカーのパネル
[0384]ランダムフォレスト分類器を、臨床診断テストで使用するのに最適であると予想される、選択されたバイオマーカーのパネルから構築した。単純ベイズ貪欲前向きアルゴリズムによって選択されたモデルとは異なり、ランダムフォレスト分類器は、バイオマーカー測定がランダムに分布しないものと推定される。それゆえにこのモデルは、単純ベイズ分類器において有効ではない表１からのバイオマーカーを利用することができる。
【０３５９】
[0385]ランダムフォレスト分類器によって提供されるジニ（ｇｉｎｉ）の重要性の測定を利用した変数減少法を用いてパネルを選択した。ジニの重要性は、訓練セットでサンプルを正確に分類することにおけるバイオマーカーの有効性の尺度である。このバイオマーカー重要性の尺度は、分類器の性能にそれほど重要ではないマーカーを除去するのに用いることができる。表１に示される６５種全てのを含むランダムフォレスト分類器を構築することによって変数減少法を開始させた。続いて最も重要が低いバイオマーカーを除去し、残りのバイオマーカーを用いて新しいモデルを構築した。一つのバイオマーカーだけが残るまでこの手法を続けた。
【０３６０】
[0386]選択された最終的なパネルは、モデルにおいて最大ＡＵＣと最小数のマーカーとの最良のバランスを示した。これらの基準を満たす１０種のバイオマーカーのパネルは、以下の分析物、ＡＰＯＡ１、ＣＴＳＢ、Ｃ２、ＭＭＰ７、ＨＡＭＰ、ＴＦＰＩ、Ｃ５、ｃ５ａ、ＳＦＲＰ１、および、ＥＴＨＥ１で構成される。図１５にこのバイオマーカーのパネルについてのＲＯＣ曲線のプロットを示す。この図は、矢印によって示される２つの可能性のある決定カットオフ：すなわち、８４％またはそれより高い感度を少なくとも８０％の特異度と共に得ることができる症状有りのカットオフ；および、９７．５％の特異度を少なくとも６０％の感度と共に得ることができる無症状のカットオフを示す。
【０３６１】
実施例７．癌診断のためのバイオマーカー
[0387]全般的な癌診断のための潜在的なバイオマーカーの同定を行った。３種の異なるタイプの癌（膵癌、肺癌および中皮腫）からの患者サンプルとコントロールサンプルの両方を評価した。回収部位全てにわたり、試験対象患者基準は、１８歳以上、署名したインフォームド・コンセントの提出とした。患者とコントロールの両方において試験される癌以外の既知の悪性腫瘍を除外した。
【０３６２】
[0388]膵癌：実施例２で説明されているようにして患者サンプルとコントロールサンプルを得た。
[0389]肺癌：３つの大学癌センターのバイオサンプル保管機関、および、１つの民間のバイオサンプル保管機関から患者サンプルとコントロールサンプルを得て、高リスクの喫煙者および良性肺結節を有する個体のコントロールグループから非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の鑑別診断のための潜在的なマーカーを同定した。この研究は、喫煙者および良性結節を有する患者、加えてＮＳＣＬＣと診断されている３２０個体から回収された９７８個のサンプルで構成される。
【０３６３】
[0390]胸膜中皮腫：大学癌センターのバイオサンプル保管機関から患者サンプルとコントロールサンプルを得て、悪性胸膜中皮腫と、アスベスト曝露歴がある個体または良性の肺疾患（後で良性と判別される放射線医学的に疑わしい所見を含む）を有する個体との鑑別診断のための潜在的なマーカーを同定した。この研究は、アスベストに曝露された個体から回収された３０個のサンプル、および、中皮腫患者から回収された４１個のサンプルで構成される。
【０３６４】
[0391]癌バイオマーカーの最終リストは、３種の異なる癌研究それぞれについて考察されたバイオマーカーセットを組み合わせることにより同定された。サイズを大きくしたバイオマーカーセットを使用したベイズ分類器を貪欲アルゴリズムを用いて連続的に構築した（この実施例の７．２章でより詳細に説明した通り）。癌のタイプのなかでも全般的に癌を診断するのに有用なバイオマーカーのセット（またはパネル）をセット（またはパネル）のサイズの関数として編纂し、それらの性能について解析した。この解析から、表１９に示される１０種の癌バイオマーカーのリストが得られ、これらはそれぞれ、サイズが３〜１０個のマーカーの範囲のこれらの連続したマーカーセットのうち少なくとも１つに存在する。実証的な例として、表３２に示される１０種の癌バイオマーカーで構成される特定のパネルの作製を説明する。
【０３６５】
７．１：癌に関する単純ベイズ分類
[0392]表１のバイオマーカーのリストから、１０種の潜在的な癌バイオマーカーのパネルを、この実施例の７．２章で概説したようにバイオマーカー選択用の貪欲アルゴリズムを用いて選択した。それら３つそれぞれについて個別の単純ベイズ分類器を構築した。クラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）、ｐ（ｘｉ｜ｃ）、および、ｐ（ｘｉ｜ｄ）（式中ｘｉは、バイオマーカーｉについて測定されたＲＦＵ値の対数であり、ｃおよびｄはコントロールおよび病気の個体群を意味する）を平均μおよび分散σ２を特徴とする対数−正規分布関数としてモデル化した。表３１に１０種の潜在的なバイオマーカーで構成される３つのモデルについてのｐｄｆのパラメーターを列挙した。
【０３６６】
[0393]このようなモデルのための単純ベイズ分類は、このような試験に適した以下の方程式：
【０３６７】
【数１１−１】
0005931874.tif 000018
【０３６８】
で示され、式中ｐ（ｄ）は個体群における病気罹患率であり、ｎは１０である。このような加法における項のそれぞれは、個別マーカーに関する対数尤度比であり、サンプル
【０３６９】
【数１１−２】
0005931874.tif 000019
【０３７０】
における対象の病気（すなわちこのケースでは３種の異なるタイプの癌）有りに対する対象の病気無しの合計対数尤度比は、単にこれらの個々の項と病気罹患率を構成する項との合計である。簡単にするために、ｐ（ｄ）＝０．５と仮定すると、
【０３７１】
【数１２】
0005931874.tif 000020
【０３７２】
である。
[0394]未知のサンプルの対数（ＲＦＵ）での測定値が、１０種のバイオマーカーそれぞれについて１０．１、８．９、８．８、８．８、９．１、７．３、８．２、９．５、６．７、７．７であるとすると、分類の計算は表３２で詳述した通りである。病気とコントロールクラスとの対数尤度比を含む個々の構成要素をまとめ、表３１に記載のパラメーターとｘの値からコンピューターで計算することができる。個々の対数尤度比の合計は−４．５６８であり、または、病気を有することに対する病気を有さないことの尤度は９６であった（ここで尤度ｅ４．５６８＝９６である）。これらのバイオマーカー値のうち１つだけが、病気グループ（対数尤度＞０）と比較的一致する尤度を有するが、残りの７つのバイオマーカーはいずれも、一貫してコントロールグループに有利であることがわかった。尤度を掛けて一つにすることによっても、上記で示されたのと同じ結果が得られ、未知のサンプルが病気を有さないことを示す尤度は９６であった。実際に、このサンプルはＮＳＣＬＣ訓練セットにおいてコントロール個体群に由来するものであった。
【０３７３】
７．２：分類器用の癌バイオマーカーのパネルを選択するための貪欲アルゴリズム
第１部
[0395]表１に示されるバイオマーカーの部分集合を選択して、癌を検出するためにどのマーカーが全般的な癌バイオマーカーとして使用することができるのかを決定するのに使用することができる潜在的な分類器を構築した。
【０３７４】
[0396]所定のマーカーのセットを仮定して、３つの癌研究それぞれについて個別のモデルを訓練したところ、多くの様々なタイプの癌を同時に分類することができるバイオマーカーのセットを選択するには性能の汎用尺度が必要であった。ここで使用された分類器の性能の尺度は、全ての単純ベイズ分類器にわたり、ＲＯＣ曲線下面積の平均であった。ＲＯＣ曲線は、偽陽性の比率（１−特異度）に対して単一の分類器の真陽性の比率（感度）をプロットしたものである。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は０〜１．０の範囲であり、ここでＡＵＣ１．０は、完全な分類に相当し、ＡＵＣ０．５は、ランダム（コイントス）分類器に相当する。例えばＦ測定値、または、感度と特異度の合計もしくは積などのその他の一般的な性能の尺度を適用することができる。具体的に言えば、感度をある程度犠牲にしてより高い特異度で機能する分類器が選択されるか、または、特異度を犠牲にしてより高い感度で機能する分類器が選択されるように、感度と特異度とを異なる重みで処理することが望まれる場合がある。我々は、ＡＵＣは、単一の尺度で感度および特異度の全ての組み合わせを包含するため、ＡＵＣを使用することを選択した。適用が異なれば、真陽性および真陰性の所見についての利益も異なり、さらに、偽陰性の所見からの偽陽性の所見に関連するコストも異なると予想される。性能の尺度を変化させると、所定のデータのセットについて選択されたのマーカーの正確な部分集合も変化する可能性がある。
【０３７５】
[0397]この実施例の７．１章で説明されている癌サンプルとコントロールサンプルとの識別に対するベイズ法について、３つの癌研究それぞれにおけるバイオマーカーの分布によって分類器を完全にパラメータ化し、バイオマーカーのリストを表１９から選択した。すなわち、包含のために選択されたマーカーの部分集合から、訓練データのセットが得られる１対１の方式で分類器を決定した。
【０３７６】
[0398]ここで利用される貪欲法は、表１からマーカの最適な部分集合を検索するのに使用された。少数のマーカーまたは比較的少数のマーカーを含む分類器について、可能性のあるマーカーの部分集合全てを列挙し、その特定のマーカーのセットで構築された分類器の性能に関して評価した（実施例４の第２部を参照）。（このアプローチは統計分野において「最良サブセットの選択法」としてよく知られている；例えばHastie et alを参照）。しかしながら、本明細書において説明される分類器について、複数のマーカーの組み合わせの数は極めて大きくなる可能性があり、３０のみの全分析物のリストから作製することができる可能な組み合わせが３０，０４５，０１５通りであることから、可能性のある１０種のマーカーのセット全てを評価することは実行不可能であった。マーカーの部分集合全ての検索が実行不可能であったために、一つの最良の部分集合を見出すことができなかった；しかしながら、このアプローチを用いることによって、多くの優秀な部分集合が見出され、多くの場合において、これらの部分集合のいずれかが代表的な最良の部分集合のとなり得る。
【０３７７】
[0399]可能性のあるマーカーのセット全てを評価する代わりに、「貪欲な」前方段階的アプローチに従ってもよい（例えば、Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10):e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002を参照）。この方法を用いて、（個別マーカーのＫＳ距離に基づいて）最良の単一のマーカーで分類器を開始させ、マーカーリストに記載されているが目下分類器におけるマーカーのセットの構成要素ではない構成要素それぞれを順に試みることによって各工程で成長させる。既存の分類器と組み合わせて最良のスコアを示す１つのマーカーが、分類器に追加される。性能のさらなる改善が達成されなくなるまでこれを繰り返す。残念ながら、このアプローチは、マーカーの有用な組み合わせを逃す可能性がある（このようなマーカーに関して、プロセスが止まる前に所定の個別マーカーが全て選択されるわけではない）。
【０３７８】
[0400]ここで使用された貪欲法は、各工程でただ単一のマーカーの部分集合を維持するのではなく、検索を拡張するために候補マーカーのリストを維持した点で、前述した前方段階的アプローチに手を加えたものである。このリストを、単一のマーカーのリストに適用した。現在のところリスト上にあるものから新しいマーカーの部分集合導きだし、それらをリストに追加する工程によって、このリストを拡張した。この時点でリスト上にある各マーカーの部分集合をそれぞれ、表１から、まだその分類器の一部ではなくその部分集合への追加時に既存の部分集合と重複しないと予想されるいずれかのマーカー（これらは、「許容マーカー」と称される）を追加することによって拡張した。新しいマーカーのセットが定義されるごとに、各癌研究につき１つで構成される分類器のセットをこれらのマーカーを用いて訓練し、３つ全ての研究にわたる平均ＡＵＣによって汎用の性能を測定した。起こり得る過剰適合を回避するために、各癌研究モデルに関するＡＵＣを１０回の相互検証法により計算した。全ての現存するマーカーのそれぞれの部分集合を、それぞれの許容マーカーによってリストから拡張した。このようなプロセスによって最終的に全ての可能性のある部分集合がそれぞれ作製され、そのリストはスペースを使い果たすことは明らかである。従って、リストがある既定のサイズよりも小さい場合にのみ、作製された全てのマーカーのセットを維持した。リストが既定サイズの限界に達したら、それがエリートになる；すなわち、所定レベルの性能を示した分類器のセットだけがリストに維持され、その他のものはリストの端から落ちて失われた。これは、分類器のセットの性能順に並べられたリストを維持することにより達成された；少なくともその時点でリスト上で最低の分類器のセットと同等の新しいマーカーセットを挿入すると、その時点で最下層の成績不良な分類器のセットが強制的に排除される。さらなる実施の詳細事項の一つは、リストを作製工程ごとに完全に置き換えたことである；それゆえに、リスト上の全てのマーカーのセットはそれぞれ同じの数のマーカーを含み、各工程で分類器ごとのマーカーの数は１つづつ増えた。
【０３７９】
[0401]一実施態様において、全般的な癌と癌ではない状態とを診断するための分類器を構築するのに有用なバイオマーカーのセット（またはパネル）は、分類スキームで使用されたバイオマーカーの特定の組み合わせの平均ＡＵＣに基づく。我々は、表１９に示されるマーカーから導き出された、様々な癌サンプルとコントロールとを効果的に分類することができるバイオマーカーの多くの組み合わせを同定した。代表的なパネルは、表２２〜２９に記載のものであり、これらの表においては、３〜１０種のバイオマーカーを含む１００種の異なるパネル一式が記載されており、各パネルごとに示された平均相互検証（ＣＶ）のＡＵＣも示される。これらのパネルそれぞれにおける各マーカーの出現総数は、各表の一番下に示される。
【０３８０】
[0402]表１９で選択されたバイオマーカーから、「非マーカー」で構築された分類器よりも優れた性能を示す分類器が形成された。図１７において、我々は、我々の１０種のバイオマーカー分類器の性能を、その他の可能性のある分類器の性能と比較して表示した。
【０３８１】
[0403]図１７Ａは、表１９に示される１０種のマーカーを除外して、３つの全ての研究に存在する１０種のセット全てからランダムにサンプリングした１０種の「非マーカー」のセットから構築された分類器平均ＡＵＣの分布を示す。これら１０種の潜在的な癌バイオマーカーの性能は、垂直の点線で表示した。このプロットから明らかに、これら１０種の潜在的なバイオマーカーの性能はその他のマーカーの組み合わせの分布を十分に上回っていることが示される。
【０３８２】
[0404]図１７Ｂは図１７Ａと類似の分布を表示するが、ランダムにサンプリングしたセットを、１０種の分析物分類器のためのバイオマーカーの貪欲選択法で選択されなかった表１からの５５個のバイオマーカーに限った。このプロットから、貪欲アルゴリズムによって選択される１０種のマーカーは、残りの５５個のバイオマーカーで構築された分類器よりもかなり優秀な、その他のタイプの癌に一般化された代表的なバイオマーカーの部分集合であることが実証される。
【０３８３】
[0405]最後に、図１８は、３つの癌研究の分類器それぞれについての分類器のＲＯＣ曲線を示す。上述の実施態様および実施例は、単なる例として示されたものである。いずれの具体的な実施態様、実施例、または具体的な実施態様もしくは実施例の要素も、いずれかの請求項の重要な、必要なまたは必須の要素または特徴と解釈されないこととする。さらに、本明細書において説明されるどの要素も、「必須」または「重要」であると明確に説明されていない限り、添付の請求項の実施に必ずしも必要でなない。開示された実施態様に、添付の請求項によって定義される本願の範囲から逸脱することなく様々な変更、改変、置換およびその他のバリエーションを施すことができる。明細書は、図面と実施例も含めて、限定というよりも説明目的とみなされ、このような全ての改変および置換は、本願の範囲内に包含されることとする。従って、本願の範囲は、上記で示された実施例ではなく添付の請求項およびそれらの法的に同等なものによって決定されるべきである。例えば、方法またはプロセスの請求項のいずれかで列挙された工程は、実行可能なあらゆる順番で実施してもよく、実施態様、実施例または請求項のいずれかに示された順番に限定されない。さらに、上述の方法のいずれにおいても、表１または表１９に示される１種またはそれより多くのバイオマーカーは、個々のバイオマーカーとして、または、あらゆるパネルからのバイオマーカーとして具体的に除外することができる。
【０３８４】
【表２】
0005931874.tif 000021
【０３８５】
【表３】
0005931874.tif 000022
【０３８６】
【表４】
0005931874.tif 000023
【０３８７】
【表５】
0005931874.tif 000024
【０３８８】
【表６】
0005931874.tif 000025
【０３８９】
【表７】
0005931874.tif 000026
【０３９０】
【表８】
0005931874.tif 000027
【０３９１】
【表９】
0005931874.tif 000028
【０３９２】
【表１０】
0005931874.tif 000029
【０３９３】
【表１１】
0005931874.tif 000030
【０３９４】
【表１２】
0005931874.tif 000031
【０３９５】
【表１３】
0005931874.tif 000032
【０３９６】
【表１４】
0005931874.tif 000033
【０３９７】
【表１５】
0005931874.tif 000034
【０３９８】
【表１６】
0005931874.tif 000035
【０３９９】
【表１７】
0005931874.tif 000036
【０４００】
【表１８】
0005931874.tif 000037
【０４０１】
【表１９】
0005931874.tif 000038
【０４０２】
【表２０】
0005931874.tif 000039
【０４０３】
【表２１】
0005931874.tif 000040
【０４０４】
【表２２】
0005931874.tif 000041
【０４０５】
【表２３】
0005931874.tif 000042
【０４０６】
【表２４】
0005931874.tif 000043
【０４０７】
【表２５】
0005931874.tif 000044
【０４０８】
【表２６】
0005931874.tif 000045
【０４０９】
【表２７】
0005931874.tif 000046
【０４１０】
【表２８】
0005931874.tif 000047
【０４１１】
【表２９】
0005931874.tif 000048
【０４１２】
【表３０】
0005931874.tif 000049
【０４１３】
【表３１】
0005931874.tif 000050
【０４１４】
【表３２】
0005931874.tif 000051
【０４１５】
【表３３】
0005931874.tif 000052
【０４１６】
【表３４】
0005931874.tif 000053
【０４１７】
【表３５】
0005931874.tif 000054
【０４１８】
【表３６】
0005931874.tif 000055
【０４１９】
【表３７】
0005931874.tif 000056
【０４２０】
【表３８】
0005931874.tif 000057
【０４２１】
【表３９】
0005931874.tif 000058
【０４２２】
【表４０】
0005931874.tif 000059
【０４２３】
【表４１】
0005931874.tif 000060
【０４２４】
【表４２】
0005931874.tif 000061
【０４２５】
【表４３】
0005931874.tif 000062
【０４２６】
【表４４】
0005931874.tif 000063
【０４２７】
【表４５】
0005931874.tif 000064
【０４２８】
【表４６】
0005931874.tif 000065
【０４２９】
【表４７】
0005931874.tif 000066
【０４３０】
【表４８】
0005931874.tif 000067
【０４３１】
【表４９】
0005931874.tif 000068
【０４３２】
【表５０】
0005931874.tif 000069
【０４３３】
【表５１】
0005931874.tif 000070
【０４３４】
【表５２】
0005931874.tif 000071
【０４３５】
【表５３】
0005931874.tif 000072
【０４３６】
【表５４】
0005931874.tif 000073
【０４３７】
【表５５】
0005931874.tif 000074
【０４３８】
【表５６】
0005931874.tif 000075
【０４３９】
【表５７】
0005931874.tif 000076
【０４４０】
【表５８】
0005931874.tif 000077
【０４４１】
【表５９】
0005931874.tif 000078
【０４４２】
【表６０】
0005931874.tif 000079
【０４４３】
【表６１】
0005931874.tif 000080
【０４４４】
【表６２】
0005931874.tif 000081
【０４４５】
【表６３】
0005931874.tif 000082
【０４４６】
【表６４】
0005931874.tif 000083
【０４４７】
【表６５】
0005931874.tif 000084
【０４４８】
【表６６】
0005931874.tif 000085
【０４４９】
【表６７】
0005931874.tif 000086
【０４５０】
【表６８】
0005931874.tif 000087
【０４５１】
【表６９】
0005931874.tif 000088
【０４５２】
【表７０】
0005931874.tif 000089
【０４５３】
【表７１】
0005931874.tif 000090
【０４５４】
【表７２】
0005931874.tif 000091
【０４５５】
【表７３】
0005931874.tif 000092
【０４５６】
【表７４】
0005931874.tif 000093
【０４５７】
【表７５】
0005931874.tif 000094
【０４５８】
【表７６】
0005931874.tif 000095
【０４５９】
【表７７】
0005931874.tif 000096
【０４６０】
【表７８】
0005931874.tif 000097
【０４６１】
【表７９】
0005931874.tif 000098
【０４６２】
【表８０】
0005931874.tif 000099
【０４６３】
【表８１】
0005931874.tif 000100
【０４６４】
【表８２】
0005931874.tif 000101
【０４６５】
【表８３】
0005931874.tif 000102
【０４６６】
【表８４】
0005931874.tif 000103
【０４６７】
【表８５】
0005931874.tif 000104
【０４６８】
【表８６】
0005931874.tif 000105
【０４６９】
【表８７】
0005931874.tif 000106
【０４７０】
【表８８】
0005931874.tif 000107
【０４７１】
【表８９】
0005931874.tif 000108
【０４７２】
【表９０】
0005931874.tif 000109
【０４７３】
【表９１】
0005931874.tif 000110
【０４７４】
【表９２】
0005931874.tif 000111
【０４７５】
【表９３】
0005931874.tif 000112
【符号の説明】
【０４７６】
１００  コンピューターシステム
１０１  プロセッサー
１０２  入力装置
１０３  出力装置
１０４  保存装置
１０５ａ  コンピューターで読取り可能な記憶媒体リーダー
１０５ｂ  コンピューターで読取り可能な記憶媒体
１０６  通信システム
１０７  加速処理
１０９  メモリ
１０８  バス
１９１  作業メモリ
１９２  オペレーティングシステム
１９３  コード
３０００、３２００  フローチャート
３００４、３００８、３０１２、３２０４、３２０８、３２１２  ブロック
【図１Ａ】
0005931874.tif 000113
【図１Ｂ】
0005931874.tif 000114
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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