(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体が膵管腺癌に罹患しているのか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があるのかを診断するのを補助する方法であって、前記被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手順を含み、
（１）前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０９２−２−Ｐ、ＭＩＲ−０９６−Ｐ、ＭＩＲ−１２９−２、ＭＩＲ−１３３ｂ、ＭＩＲ−１３９、ＭＩＲ−１４８ａ、ＭＩＲ−１８８ｂ−Ｐ、ＭＩＲ−２０４、ＭＩＲ−２９９−Ｐ、ＭＩＲ−３３７、ＭＩＲ−３７１、およびＭＩＲ−３８３またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて減少することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示されるか、あるいは、
（２）前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ａ−２−Ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−００１−２、ＭＩＲ−００７−１、ＭＩＲ−０１５ａ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１６−１、ＭＩＲ−０１９ｂ−ｌ−Ｐ、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２３ａ、ＭＩＲ−０２４−１，２、ＭＩＲ−０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ−０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ−０３０ｄ、ＭＩＲ−０３２、ＭＩＲ−０９２−１、ＭｌＲ−０９８、ＭＩＲ−０９９ａ、ＭＩＲ−１００、ＭＩＲ−１０７、ＭＩＲ−１２５ｂ−１、ＭＩＲ−１２６、ＭＩＲ−１２８ａ、ＭＩＲ−１３２、ＭＩＲ−１３６、ＭＩＲ−１４２−Ｐ、ＭＩＲ−１４５−Ｐ、ＭＩＲ−１５２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ−１９６ａ−２、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２１３、ＭＩＲ−２１５、ＭＩＲ−２１８−１，２、ＭＩＲ−２２１、ＭＩＲ−２２２−Ｐ、ＭＩＲ−３０１、ＭＩＲ−３２８、ＭＩＲ−３３１−Ｐ、ＭＩＲ−３４５、ＭＩＲ−３６７、ＭＩＲ−３７６、ＭＩＲ−４２４、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−００９＊、ＭＩＲ−０１０ａ、ＭＩＲ−０１０ｂ、ＭＩＲ−０１６、ＭＩＲ−０１７−３ｐ、ＭＩＲ−０１７−５ｐ、ＭＩＲ−０１８、ＭＩＲ−０２０、ＭＩＲ−０２２、ＭＩＲ−０２３ｂ、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−０２６ａ、ＭＩＲ−０２８、ＭＩＲ−０２９ｂ、ＭＩＲ−０３０ｅ−３ｐ、ＭＩＲ−０３１、ＭＩＲ−０３４ａ、ＭＩＲ−０３４ｃ、ＭＩＲ−０９３、ＭＩＲ−０９９ｂ、ＭＩＲ−１０１、ＭＩＲ−１０３、ＭＩＲ−１０６ｂ、ＭＩＲ−１２５ａ、ＭＩＲ−１２６＊、ＭＩＲ−１２７、ＭＩＲ−１３０ａ、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１４０、ＭＩＲ−１４２−３ｐ、ＭＩＲ−１４２−５ｐ、ＭＩＲ−１４３、ＭＩＲ−１４５、ＭＩＲ−１４６、ＭＩＲ−１４６ｂ、ＭＩＲ−１４８ｂ、ＭＩＲ−１４９、ＭＩＲ−１５０、ＭＩＲ−１８ｌｂ、ＭＩＲ−１８ｌｄ、ＭＩＲ−１８３、ＭＩＲ−１８６、ＭＩＲ−１８９、ＭＩＲ−１９０、ＭＩＲ−１９１、ＭＩＲ−１９３、ＭＩＲ−１９４、ＭＩＲ−１９５、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−１９９ａ＊、ＭＩＲ−１９９ａ、ＭＩＲ−１９９ｂ、ＭＩＲ−２００ａ、ＭＩＲ，２００ｂ、ＭＩＲ−２０３、ＭＩＲ−２１０、ＭｌＲ−２１４、ＭＩＲ−２１８、ＭＩＲ−２２２、ＭＩＲ−２２３、ＭＩＲ−２９６、ＭＩＲ−３２４−３ｐ、ＭＩＲ−３２４−５ｐ、ＭＩＲ−３３０、ＭＩＲ−３３１、ＭＩＲ−３３８、ＭＩＲ−３３９、ＭＩＲ−３４０、ＭＩＲ−３４２、ＭＩＲ−３４６、ＭＩＲ−３６１、ＭＩＲ−３７０、ＭＩＲ−３７２、ＭＩＲ−３７４、ＭＩＲ−３７６ａ、ＭＩＲ−３７９、ＭＩＲ−３８２、およびＭＩＲ−４２５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて増加することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、
方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−０１５ａ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１６−１、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２３ａ、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−０２４−１，２、ＭＩＲ−０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ−０９６−Ｐ、ＭＩＲ−０９８、ＭＩＲ−０９９ａ、ＭＩＲ−１００、ＭＩＲ−１２５ｂ−１、ＭＩＲ−１２６、ＭＩＲ−１３２、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１４２−Ｐ、ＭＩＲ−１４５−Ｐ、ＭＩＲ−１４８ａ、ＭＩＲ−１５２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−１９６ａ−２、ＭＩＲ−２１０、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２１３、ＭＩＲ−２１８−１，２、ＭＩＲ−２２１、ＭＩＲ−２２２−Ｐ、ＭＩＲ−２２３、ＭＩＲ−３０１、ＭＩＲ−３３１−Ｐ、ＭＩＲ−３４５、およびＭＩＲ−３７６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０９２−２−Ｐ、ＭＩＲ−０９６−Ｐ、ＭＩＲ−１２９−２、ＭＩＲ−１３３ｂ、ＭＩＲ−１３９、ＭＩＲ−１４８ａ、ＭＩＲ−１８８ｂ−Ｐ、ＭＩＲ−２０４、ＭＩＲ−２９９−Ｐ、ＭＩＲ−３３７、ＭＩＲ−３７１、およびＭＩＲ−３８３またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて減少することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−１４８ａ、またはＭＩＲ−０９６−Ｐである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ａ−２−Ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−００１−２、ＭＩＲ−００７−１、ＭＩＲ−０１５ａ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１６−１、ＭＩＲ−０１９ｂ−ｌ−Ｐ、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２３ａ、ＭＩＲ−０２４−１，２、ＭＩＲ−０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ−０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ−０３０ｄ、ＭＩＲ−０３２、ＭＩＲ−０９２−１、ＭｌＲ−０９８、ＭＩＲ−０９９ａ、ＭＩＲ−１００、ＭＩＲ−１０７、ＭＩＲ−１２５ｂ−１、ＭＩＲ−１２６、ＭＩＲ−１２８ａ、ＭＩＲ−１３２、ＭＩＲ−１３６、ＭＩＲ−１４２−Ｐ、ＭＩＲ−１４５−Ｐ、ＭＩＲ−１５２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ−１９６ａ−２、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２１３、ＭＩＲ−２１５、ＭＩＲ−２１８−１，２、ＭＩＲ−２２１、ＭＩＲ−２２２−Ｐ、ＭＩＲ−３０１、ＭＩＲ−３２８、ＭＩＲ−３３１−Ｐ、ＭＩＲ−３４５、ＭＩＲ−３６７、ＭＩＲ−３７６、ＭＩＲ−４２４、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−００９＊、ＭＩＲ−０１０ａ、ＭＩＲ−０１０ｂ、ＭＩＲ−０１６、ＭＩＲ−０１７−３ｐ、ＭＩＲ−０１７−５ｐ、ＭＩＲ−０１８、ＭＩＲ−０２０、ＭＩＲ−０２２、ＭＩＲ−０２３ｂ、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−０２６ａ、ＭＩＲ−０２８、ＭＩＲ−０２９ｂ、ＭＩＲ−０３０ｅ−３ｐ、ＭＩＲ−０３１、ＭＩＲ−０３４ａ、ＭＩＲ−０３４ｃ、ＭＩＲ−０９３、ＭＩＲ−０９９ｂ、ＭＩＲ−１０１、ＭＩＲ−１０３、ＭＩＲ−１０６ｂ、ＭＩＲ−１２５ａ、ＭＩＲ−１２６＊、ＭＩＲ−１２７、ＭＩＲ−１３０ａ、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１４０、ＭＩＲ−１４２−３ｐ、ＭＩＲ−１４２−５ｐ、ＭＩＲ−１４３、ＭＩＲ−１４５、ＭＩＲ−１４６、ＭＩＲ−１４６ｂ、ＭＩＲ−１４８ｂ、ＭＩＲ−１４９、ＭＩＲ−１５０、ＭＩＲ−１８ｌｂ、ＭＩＲ−１８ｌｄ、ＭＩＲ−１８３、ＭＩＲ−１８６、ＭＩＲ−１８９、ＭＩＲ−１９０、ＭＩＲ−１９１、ＭＩＲ−１９３、ＭＩＲ−１９４、ＭＩＲ−１９５、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−１９９ａ＊、ＭＩＲ−１９９ａ、ＭＩＲ−１９９ｂ、ＭＩＲ−２００ａ、ＭＩＲ，２００ｂ、ＭＩＲ−２０３、ＭＩＲ−２１０、ＭｌＲ−２１４、ＭＩＲ−２１８、ＭＩＲ−２２２、ＭＩＲ−２２３、ＭＩＲ−２９６、ＭＩＲ−３２４−３ｐ、ＭＩＲ−３２４−５ｐ、ＭＩＲ−３３０、ＭＩＲ−３３１、ＭＩＲ−３３８、ＭＩＲ−３３９、ＭＩＲ−３４０、ＭＩＲ−３４２、ＭＩＲ−３４６、ＭＩＲ−３６１、ＭＩＲ−３７０、ＭＩＲ−３７２、ＭＩＲ−３７４、ＭＩＲ−３７６ａ、ＭＩＲ−３７９、ＭＩＲ−３８２、およびＭＩＲ−４２５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて増加することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ  ７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−ｌ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−００７−１、ＭＩＲ−０１５ａ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１６−１、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２３ａ、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−０２４−１，２、ＭＩＲ−０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ−０３０ｄ、ＭＩＲ−０９８、ＭＩＲ−０９９ａ、ＭＩＲ−１００、ＭＩＲ−１２５ｂ−ｌ、ＭＩＲ−１２６、ＭＩＲ−１３２、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１４２−Ｐ、ＭＩＲ−１４５−Ｐ、ＭＩＲ−１５２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８ｌａ，ｃ、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−１９６ａ−２、ＭＩＲ−２１０、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２１３、ＭＩＲ−２１８−１，２、ＭＩＲ−２２１、ＭＩＲ−２２２−Ｐ、ＭＩＲ−２２３、ＭＩＲ−３０１、ＭＩＲ−３３１−Ｐ、ＭＩＲ−３４５、およびＭＩＲ−３７６、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、１ｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−０１５ａ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１６−１、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２３ａ、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−１００、ＭＩＲ−１２５ｂ、ＭＩＲ−１３２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８ｌａ、ＭＩＲ−１８１ｃ、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２２１、ＭＩＲ−３０１、およびＭＩＲ−３７６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ａ−２−Ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−ｌ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−０１５ｂ、ＭＩＲ−０１９ｂ−１−Ｐ、ＭＩＲ−０９８、ＭＩＲ−１２８ａ、ＭＩＲ−１３６、ＭＩＲ−１５２、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８ｌａ、ＭＩＲ−１９６ａ−２、ＭＩＲ−２１２、ＭＩＲ−２１５、ＭｌＲ−２１８−１、ＭｌＲ−２１８−２、ＭＩＲ−３０１、ＭＩＲ−３２８、ＭＩＲ−３３１−Ｐ、およびＭＩＲ−４２４からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ−ｌ、ｌｅｔ−７ｉ、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１８１ａ、ＭＩＲ−２１２、およびＭＩＲ−３０１からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−２１０、またはＭＩＲ−２２３である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
被験体が膵管腺癌に罹患しているのか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があるのかを診断するのを補助する方法であって、
（ａ）前記被験体由来の試験試料における複数のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを検定して、前記試験試料のｍｉＲ発現プロファイルを得る手順；
（ｂ）前記試験試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルを、対照試料から作成された対応するｍｉＲ発現プロファイルと比較する手順であって、前記試験試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルと前記対照試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルとの差によって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかが示される、手順
を含む、方法であって、
ここで、
（１）前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０９６−ＰおよびＭＩＲ−１４８ａからなる群から選択される１または複数のｍｉＲ遺伝子産物を含み、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて減少することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示されるか、あるいは、
（２）前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−２１０、およびＭＩＲ−２２３からなる群から選択される１または複数のｍｉＲ遺伝子産物を含み、前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて増加することによって、前記被験体が膵管腺癌に羅患していることか、もしくは膵管腺癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、
方法。
【請求項１２】
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ−０２１、ＭＩＲ−０２４、ＭＩＲ−０９６−Ｐ、ＭＩＲ−１３５ｂ、ＭＩＲ−１４８ａ、ＭＩＲ−１５５、ＭＩＲ−１９６ａ、ＭＩＲ−２１０、およびＭＩＲ−２２３からなる群から選択される１または複数のｍｉＲ遺伝子産物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対照試料が、正常膵臓組織から得られるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲＮＡ前駆体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、成熟型ｍｉＲＮＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記レベルが、増幅に基づく検定を用いて測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記レベルが、ハイブリダイゼーションに基づく検定を用いて測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記レベルが、前記試料中の対応するｍｉＲ遺伝子コピーを測定することによって判定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料は、膵組織、膵腫瘍、膵臓細胞または膵液を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
政府の支援に関する声明
本発明は、アメリカ合衆国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによるグラント番号ＣＡ１０７４３５によって少なくとも部分的にサポートされる。Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＴｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのグラントＰ３０  ＣＡ１６０５８によって資金援助される。米国合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本願は、２００６年３月２日に出願された米国仮特許出願第６０／７７８，２７１号に基づく。米国仮特許出願第６０／７７８，２７１号の利益は、本明細書によって特許請求され、そしてその開示は本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
背景
膵臓癌は、米国の癌関連の死亡で４番目の主要原因である。この５年間の年間死亡率は約３万人であり、毎年診断される新症例の数とほとんど同じである。膵臓癌の予後はすべての癌の中で最悪であり、死亡率／発現率の比は０．９９である。米国の膵臓癌の発現率は、１０万人当たり約９人である。これらの思わしくない数字は、発現率と死亡率とが増加傾向にあることを反映しており、検出法および診断法の進歩が見られないことや、治療計画における進展が不十分であることに起因する。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、広範囲にわたる種のゲノムにおいて同定されている短い非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、１９９３年に最初にシノラディス・エレガンスにおいて発見され、その後すべての多細胞生物で発見された。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の負の調節因子であり、タンパク質コードｍＲＮＡの３’非翻訳領域内の配列との塩基対の不完全な相互作用によって主に機能すると考えられる。２００６年までに３２６種のｍｉＲＮＡがヒトにおいて発見された。これらのｍｉＲＮＡのそれぞれの役割は知られていないが、特定のｍｉＲＮＡは、脂肪細胞の分化や、卵母細胞の成熟、多能性細胞状態の維持、インスリン分泌の調節などの多様な細胞過程の調節に関わっていた。
【０００５】
ｍｉＲＮＡの発現の変化と癌との間の関係を示唆する直接的エビデンスおよび間接的エビデンスが増加している。これらには、慢性リンパ性白血病におけるｍｉＲ‐１５ａおよびｍｉＲ‐１６‐１、結腸直腸癌におけるｍｉＲ‐１４３およびｍｉＲ‐１４５、肺癌におけるｌｅｔ‐７、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫におけるｍｉＲ‐１５５が含まれる。発現プロファイリングによって、乳癌や、膠芽細胞腫、甲状腺乳頭癌など、いくつかのｍｉＲＮＡの特異的な発現を伴う他の癌が同定されてきた。５種のｍｉＲＮＡをコードするポリシストロンがヒトＢ細胞リンパ腫で増幅され、ｃ‐ｍｙｃとのポリシストロンの強制的発現は腫瘍形成性であったが、このことはこのｍｉＲＮＡの群が腫瘍遺伝子として機能することを示唆する。
【０００６】
膵臓癌を確実かつ正確に診断する方法、あるいは膵臓癌の素因について個体をスクリーニングする方法が必要とされる。また、膵臓癌の治療方法も非常に望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明は、膵臓腺癌において発現が変化するｍｉＲＮＡの同定に一部基づく。
【０００８】
従って、本発明は、被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法を包含する。本方法は、被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手順を含む。生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される。
【０００９】
特定の実施形態において、発現が変化したｍｉＲ遺伝子産物は、以下の群から選択される：ＭＩＲ‐０３４ｂ、ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３０ａ‐Ｐ、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐１９２、ＭＩＲ‐２００ａ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２１０、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０２ｄ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３７８、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐４２２ｂ、ＭＩＲ‐４２３、ＭＩＲ‐３７５、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭｌＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせ。
【００１０】
一実施形態において、生体試料における遺伝子産物のレベルは、対照試料におけるその対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。このような過小発現の遺伝子産物には、ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐３７５およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００１１】
別の実施形態において、生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料におけるその対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。このような過剰発現のｍｉＲ遺伝子産物には、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせが含まれる。
【００１２】
本発明はまた、被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する別の方法も提供する。本方法は、（ａ）被験体の膵臓由来の試験試料を提供する手順であって、前記試験試料が複数のｍｉＲ遺伝子産物を含む、手順；（ｂ）試験試料におけるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを検定して、試験試料のｍｉＲ発現プロファイルを得る手順；（ｃ）試験試料のｍｉＲ発現プロファイルを、対照試料から作成された対応するｍｉＲ発現プロファイルと比較する手順を含む。試験試料のｍｉＲ発現プロファイルと対照試料のｍｉＲ発現プロファイルとの差によって、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される。
【００１３】
一実施形態において、複数のｍｉＲ遺伝子産物は、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の実質部分に相当する。他の実施形態において、複数のｍｉＲ遺伝子産物は、細胞内のｍｉＲ補体全長な補体の約９５％、９０％、８０％、７０％または６０％に相当する。
【００１４】
別の実施形態において、複数のｍｉＲ遺伝子産物は、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐３７５、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐００７‐１およびＭＩＲ‐０２１からなる群から選択される１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物を含む。
【００１５】
前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当該技術分野で周知の種々の技法を使用して測定することができる。これらの技法には、増幅に基づく検定、ハイブリダイゼーションに基づく検定およびマイクロアレイ分析が含まれる。他の実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、試料中の対応するｍｉＲ遺伝子コピーを測定することによって判定できる。
【００１６】
被験体から得られる生体試料は、膵組織、膵腫瘍または膵臓細胞を含んでよい。また、生体試料は膵液を含むこともできる。
【００１７】
本発明はまた、膵臓癌に羅患しているか、もしくは膵臓癌を発症する危険性がある被験体における膵臓癌を診断するためのキットも企図する。このようなキットは、（ａ）被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手段、および（ｂ）生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する手段を含む。生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルと、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルとの間で検出された差は、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかであることを示す。
【００１８】
本発明はまた、膵臓癌を発症する危険性がある被験体をスクリーニングする方法も提供する。このような方法は、被験体の膵臓から得た生体試料中の膵臓癌に関連した、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルを評価する手順であって、生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルが、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、被験体に膵臓癌を発症する危険性があることが示される、手順を含む。
【００１９】
一実施形態において、生体試料は、正常であるか、もしくは前癌性の疑いがあるかのいずれかの膵組織を含む。
【００２０】
本発明はまた、対照細胞よりも多くのｍｉＲ遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法も提供する。このような方法は、膵臓癌細胞内のｍｉＲ遺伝子産物の量を減少させることができる有効量の阻害剤分子を被験体に投与する手順を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、阻害剤分子は、アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物の転写後のサイレンシングを引き起こすか、もしくはアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物の成熟を阻害する。いくつかの実施形態において、阻害剤分子は、前記アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物についてコードする遺伝子とともに３重らせんを形成することができる分子である。いくつかの実施形態において、阻害剤化合物は、ｍｉＲ遺伝子産物プロモーターのメチル化を引き起こし、それによってｍｉＲ遺伝子の発現が低下する。
【００２２】
一実施形態において、阻害剤分子は、送達剤とともに裸のＲＮＡとして投与される。別の実施形態において、阻害剤分子は、阻害剤分子をコードする核酸として投与される。
【００２３】
本発明はまた、対照細胞よりも少ないｍｉＲ遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法も提供する。このような方法は、ｍｉＲ遺伝子産物に対応する有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を被験体に投与する手順を含む。
【００２４】
一実施形態において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、機能性成熟型ｍｉＲである。他の実施形態において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ヘアピンのループ部を含むｍｉＲ前駆体ヘアピン配列を含むオリゴヌクレオチド、またはヘアピンを有さない２本鎖のｍｉＲ前駆体を含むオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
一実施形態において、単離された遺伝子産物は、送達剤とともに裸のＲＮＡとして投与される。別の実施形態において、単離された遺伝子産物は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸として投与される。
【００２６】
別の方法においては、癌の進行は、ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のプロモーター領域の低メチル化を引き起こす化合物の投与によって抑制される。
【００２７】
本発明はまた、少なくとも１つの過小発現のｍｉＲ遺伝子産物を示す被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物も提供する。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、過小発現のｍｉＲ遺伝子産物に対応する単離されたｍｉＲ遺伝子産物と薬学的に許容される担体とを含む。他の実施形態において、薬学的組成物は、過小発現のｍｉＲ遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸と薬学的に許容される担体とを含む。
【００２８】
本発明はまた、少なくとも１つの過剰発現のｍｉＲ遺伝子産物を示す被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物も提供する。薬学的化合物は、過剰発現のｍｉＲ遺伝子産物に特異的な少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子阻害剤化合物と薬学的に許容される担体とを含む。
【００２９】
本発明はまた、被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法も提供する。このような方法は、（ａ）対照細胞に比べてアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；（ｂ）被験体に治療レジメンを施す手順；（ｄ）ある期間後に被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；および（ｅ）第１および第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順を含む。第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが第１の試験試料よりも低いことによって、その治療レジメンが被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される。
【００３０】
本発明で検討される別の方法においては、被験体における膵臓癌の進行の抑制に対する治療レジメンの有効性は、（ａ）対照細胞に比べてアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；（ｂ）被験体に治療レジメンを施す手順；（ｄ）ある期間後に被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；および（ｅ）第１および第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順によって評価される。第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが第１の試験試料よりも低いことによって、その治療レジメンが被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される。
【００３１】
本発明はまた、膵臓癌用抗癌剤を同定する方法も提供する。本方法は、（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過剰発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；（ｂ）生体試料に試験剤を接触させる手順；（ｃ）生体試料のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルが低下することによって、試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順を含む。
【００３２】
本発明はまた、膵臓癌用抗癌剤を同定する方法も提供する。本方法は、（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過小発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；（ｂ）生体試料に試験剤を接触させる手順；（ｃ）手順（ｂ）の後に生体試料のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルが上昇することによって、試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順を含む。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法であって、前記被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手順であって、前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、手順を含む、方法。
（項目２）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ‐０３４ｂ、ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３０ａ‐Ｐ、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐１９２、ＭＩＲ‐２００ａ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２１０、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０２ｄ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３７８、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐４２２ｂ、ＭＩＲ‐４２３、ＭＩＲ‐３７５、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭｌＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１８‐１，２，、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３７６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、前記対照試料におけるその対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐３７５およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐１３９である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐０９６‐Ｐである、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐３７５である、項目５に記載の方法。
（項目９）
前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、前記対照試料におけるその対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３７６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ；ｌｅｔ‐７ｄ；ｌｅｔ‐７ｆ；ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐０１５ａ；ＭＩＲ‐０１５ｂ；ＭＩＲ‐０１６‐１；ＭＩＲ‐０２１；ＭｌＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４、ＭＩＲ‐１００；ＭＩＲ‐１２５ｂ；ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐１８１ｃ；ＭＩＲ‐２１２；ＭＩＲ‐２２１；ＭＩＲ‐３０１；ＭＩＲ‐３７６ａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１、ＭＩＲ‐２１８‐２、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐３０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐１５５である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐００７‐１である、項目９に記載の方法。
（項目１７）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐０２１である、項目９に記載の方法。
（項目１８）
被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法であって、
（ａ）前記被験体の膵臓由来の試験試料を提供する手順であって、前記試験試料が複数のｍｉＲ遺伝子産物を含む、手順；
（ｂ）前記試験試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを検定して、前記試験試料のｍｉＲ発現プロファイルを得る手順；
（ｃ）前記試験試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルを、対照試料から作成された対応するｍｉＲ発現プロファイルと比較する手順であって、前記試験試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルと前記対照試料の前記ｍｉＲ発現プロファイルとの差によって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかが示される、手順
を含む、方法。
（項目１９）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の実質部分に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の約９５％に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の約９０％に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の約８０％に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２３）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の約７０％に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、細胞内のｍｉＲ遺伝子の補体全長の約６０％に相当する、項目１８に記載の方法。
（項目２５）
前記複数のｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐３７５、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０２１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２６）
前記対照試料が正常膵組織から得られる、項目１〜２５に記載の方法。
（項目２７）
前記試験試料が、癌または前癌性であることが疑われる膵臓の領域から得られる、項目１〜２５に記載の方法。
（項目２８）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がｍｉＲＮＡ前駆体である、項目１〜２５に記載の方法。
（項目２９）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が成熟型ｍｉＲＮＡである、項目１〜２５に記載の方法。
（項目３０）
前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、増幅に基づく検定を使用して測定される、項目１〜２９に記載の方法。
（項目３１）
前記増幅に基づく検定が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＲＴ‐ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲからなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、ハイブリダイゼーションに基づく検定を使用して測定される、項目１〜２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ハイブリダイゼーションに基づく検定が、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ防御検定、ＲＮＡマイクロアレイ分析ならびにＤＮＡまたはｃＤＮＡマイクロアレイ分析からなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、前記試料における前記対応するｍｉＲ遺伝子コピーを測定することによって判定される、項目１〜２９に記載の方法。
（項目３５）
前記生体試料が膵組織、膵腫瘍または膵臓細胞を含む、項目１〜３４に記載の方法。
（項目３６）
前記生体試料が膵液の試料を含む、項目１〜３４に記載の方法。
（項目３７）
膵臓癌に羅患しているか、もしくは膵臓癌を発症する危険性がある被験体における膵臓癌を診断するためのキットであって、
（ａ）前記被験体の膵臓由来の生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手段、および
（ｂ）前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する手段
を含み、
前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物のレベルと、前記対照試料における前記対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルとの間で検出された差によって、前記被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれかであることが示される、
キット。
（項目３８）
膵臓癌を発症する危険性がある被験体をスクリーニングする方法であって、前記被験体の膵臓から得た生体試料中の膵臓癌に関連した、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルを評価する手順であって、前記生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルが、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて変化することによって、前記被験体に膵臓癌を発症する危険性があることが示される、手順を含む、方法。
（項目３９）
前記生体試料が、正常であるか、もしくは前癌性の疑いがある膵組織を含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
対照細胞よりも多くのｍｉＲ遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法であって、前記膵臓癌細胞内の前記ｍｉＲ遺伝子産物の量を減少させることができる有効量の阻害剤分子を前記被験体に投与する手順を含む、方法。
（項目４１）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３７６およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ；ｌｅｔ‐７ｄ；ｌｅｔ‐７ｆ；ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐０１５ａ；ＭＩＲ‐０１５ｂ；ＭＩＲ‐０１６‐１；ＭＩＲ‐０２１；ＭｌＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４、ＭＩＲ‐１００；ＭＩＲ‐１２５ｂ；ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐１８１ｃ；ＭＩＲ‐２１２；ＭＩＲ‐２２１；ＭＩＲ‐３０１；ＭＩＲ‐３７６ａおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１、ＭＩＲ‐２１８‐２、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐４２４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐３０１およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４６）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐１５５である、項目４０に記載の方法。
（項目４７）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐００７‐１である、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐０２１である、項目４０に記載の方法。
（項目４９）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が成熟型ｍｉＲである、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５０）
前記阻害剤分子が前記ｍｉＲ遺伝子産物の転写後のサイレンシングを引き起こす、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５１）
前記阻害剤分子が前記ｍｉＲ遺伝子産物の成熟を阻害する、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５２）
前記阻害剤分子が前記ｍｉＲ遺伝子産物のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５３）
前記阻害剤分子が低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５４）
前記阻害剤分子が、前記ｍｉＲ遺伝子産物についてコードする遺伝子とともに３重らせんを形成することができる分子である、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５５）
前記阻害剤分子がリボザイムである、項目４０〜４８に記載の方法。
（項目５６）
前記阻害剤分子が送達剤とともに裸のＲＮＡとして投与される、項目４０〜５４に記載の方法。
（項目５７）
前記阻害剤分子が、前記阻害剤分子をコードする核酸として投与される、項目４０〜５４に記載の方法。
（項目５８）
対照細胞よりも少ないｍｉＲ遺伝子産物を含む膵臓癌細胞を有する被験体における膵臓癌の進行を抑制する方法であって、前記ｍｉＲ遺伝子産物に対応する有効量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を前記被験体に投与する手順を含む、方法。
（項目５９）
前記ｍｉＲ遺伝子産物が、ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐３７５およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐１３９である、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐０９６‐Ｐである、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記ｍｉＲ遺伝子産物がＭＩＲ‐３７５である、項目５８に記載の方法。
（項目６３）
前記単離されたｍｉＲ遺伝子産物が前記機能性成熟型ｍｉＲである、項目５８〜６２に記載の方法。
（項目６４）
前記単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、ヘアピンのループ部を含むｍｉＲ前駆体ヘアピン配列を含むオリゴヌクレオチドである、項目５８〜６２に記載の方法。
（項目６５）
前記単離されたｍｉＲ遺伝子産物が、前記ヘアピンを有さない２本鎖のｍｉＲ前駆体を含むオリゴヌクレオチドである、項目５８〜６２に記載の方法。
（項目６６）
前記単離された遺伝子産物が送達剤とともに裸のＲＮＡとして投与される、項目５８〜６２に記載の方法。
（項目６７）
前記単離された遺伝子産物が、前記単離されたｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸として投与される、項目５８〜６２に記載の方法。
（項目６８）
前記核酸が組換えプラスミドまたは組換えウイルスベクターである、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
項目４０〜５７に記載の阻害剤分子と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
（項目７０）
項目５８〜６６に記載の単離されたｍｉＲ遺伝子産物と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
（項目７１）
項目６７〜６８に記載の単離されたｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸と薬学的に許容される担体とを含む、被験体における膵臓癌を治療するための薬学的組成物。
（項目７２）
被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法であって、
（ａ）対照細胞に比べてアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む前記被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；
（ｂ）前記被験体に前記治療レジメンを施す手順；
（ｄ）ある期間後に前記被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；ならびに
（ｅ）前記第１および前記第２の試験試料における前記アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順であって、前記第２の試験試料における前記アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが前記第１の試験試料よりも低いことによって、前記治療レジメンが前記被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される、手順
を含む、方法。
（項目７３）
被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法であって、
（ａ）対照細胞に比べてダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む前記被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；
（ｂ）前記被験体に前記治療レジメンを施す手順；
（ｄ）ある期間後に前記被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；および
（ｅ）前記第１および前記第２の試験試料における前記ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順であって、前記第２の試験試料における前記ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが前記第１の試験試料よりも高いことによって、前記治療レジメンが前記被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される、手順
を含む、方法。
（項目７４）
膵臓癌用抗癌剤を同定する方法であって、
（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過剰発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；
（ｂ）前記生体試料に試験剤を接触させる手順；
（ｃ）手順（ｂ）の後に前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および
（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記試験後の発現レベルが低下することによって、前記試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順
を含む、方法。
（項目７５）
膵臓癌用抗癌剤を同定する方法であって、
（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過小発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；
（ｂ）前記生体試料に試験剤を接触させる手順；
（ｃ）手順（ｂ）の後に前記生体試料における前記ｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および
（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記試験後の発現レベルを前記試験前の発現レベルと比較する手順であって、前記ｍｉＲ遺伝子産物の前記試験後の発現レベルが上昇することによって、前記試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ｍｉＲＮＡプロセッシングおよびプライマー設計。ヒトｍｉＲ‐１８などのｍｉＲＮＡは、核酵素のＤｒｏｓｈａによってプロセッシングされる（Ａ）大きな一次前駆体（ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡ）として転写され、（Ｂ）推定で６２ｎｔの前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ）を作製する。ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡとｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡの両方ともヘアピン構造を含む。ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡの下線部分は、リボヌクレアーゼのＤｉｃｅｒによってｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡからプロセッシングされる（Ｃ）２２ｎｔの成熟型ｍｉＲＮＡの配列を表す。単線は前方プライマーを示し、２重線は後方プライマーを示し；破線はｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡだけを増幅するために後方（黒）プライマーとともに使用されるセンスプライマーを示す。
【図２−１】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。前記配列はｍｉＲＮＡ前駆体を表し、前駆体配列内の下線が引かれた配列は成熟型ｍｉＲＮＡを表す。すべての配列は５’側から３’側の方向に示す。
【図２−２】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−３】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−４】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−５】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−６】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−７】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−８】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−９】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−１０】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−１１】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−１２】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−１３】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図２−１４】ヒトｍｉＲ遺伝子産物配列の表。
【図３−１】臨床データおよび腫瘍病理。
【図３−２】臨床データおよび腫瘍病理。
【図４−１】ヒトｍｉＲＮＡ前駆体を増幅するために使用されるＰＣＲプライマー。ｍｉＲＮＡ一次前駆体配列へのｐ，プライマー。その他すべてのプライマーは、ｍｉＲＮＡを一次前駆体と前駆体の両方に存在するヘアピンにハイブリダイズする。
【図４−２】ヒトｍｉＲＮＡ前駆体を増幅するために使用されるＰＣＲプライマー。ｍｉＲＮＡ一次前駆体配列へのｐ，プライマー。その他すべてのプライマーは、ｍｉＲＮＡを一次前駆体と前駆体の両方に存在するヘアピンにハイブリダイズする。
【図４−３】ヒトｍｉＲＮＡ前駆体を増幅するために使用されるＰＣＲプライマー。ｍｉＲＮＡ一次前駆体配列へのｐ，プライマー。その他すべてのプライマーは、ｍｉＲＮＡを一次前駆体と前駆体の両方に存在するヘアピンにハイブリダイズする。
【図４−４】ヒトｍｉＲＮＡ前駆体を増幅するために使用されるＰＣＲプライマー。ｍｉＲＮＡ一次前駆体配列へのｐ，プライマー。その他すべてのプライマーは、ｍｉＲＮＡを一次前駆体と前駆体の両方に存在するヘアピンにハイブリダイズする。
【図５】膵組織内の１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現。１８Ｓ  ｒＲＮＡ内部コントロールの発現は、膵腫瘍、隣接する良性組織、正常な膵臓、慢性膵炎および膵臓癌の細胞株に認められる。本明細書に記載されるリアルタイムＰＣＲを使用して判定される１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現は、２‐ＣＴとして示される。破線は平均値。
【図６】膵臓試料におけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現のヒートマップ。Ａ．２０１のｍｉＲＮＡ前駆体の相対的発現がリアルタイムＰＣＲによって判定され；データは、Δ  ＣＴとして示される。管理されない階層的クラスタリングを、すべてのデータセットのサブセットにおいて実施した；データはフィルタリングされない。１に等しい発現値の中央値は黒色で；発現増加は赤色で；発現低下は緑色で；検知されない発現は灰色で示される。Ｂ．４７の試料におけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現パターンの階層的クラスター分析の結果を表す樹状図。試料は、原発性膵腫瘍（黄色、Ｎ＝２８）、正常膵組織（青、Ｎ＝６）、慢性膵炎（オレンジ、Ｎ＝４）および膵臓癌細胞株（トルコ玉色、Ｎ＝９）を含む。
【図７】膵臓試料におけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現。Ａ．各ｍｉＲＮＡ前駆体の相対的発現がリアルタイムＰＣＲによって判定され；データは、Δ  ＣＴとして示される。ＡＮＯＶＡ多群比較試験によって判定される群（腫瘍、慢性膵炎、細胞株および正常組織）の中で異なって発現する（Ｐ＜０．００１）１０８の遺伝子のサブセットにおいて、管理されない階層的クラスタリングを実施した。１に等しい発現値の中央値は黒色で；発現増加は赤色で；発現低下は緑色で；検知されない発現は灰色で示される。Ｂ．４７の試料におけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現パターンの階層的クラスター分析の結果を表す樹状図。試料は、原発性膵腫瘍（Ｎ＝２８）、隣接する良性組織（Ｎ＝１５）、正常膵組織（Ｎ＝６）、慢性膵炎（Ｎ＝４）および膵臓癌細胞株（Ｎ＝９）を含む。
【図８】立体的な発現地形図が該当なし７に示すフィルタリングされたｍｉＲＮＡ前駆体の発現データから作成された。各山は、個々の試料（腫瘍、隣接する良性、慢性的膵炎、正常な膵臓または膵臓癌細胞株）を表す。個々の山は、互いの類似性または差に基づいて小さな群に分かれる。着色された点は試料のタイプを表し、腫瘍は黄色；隣接する良性組織は青色；正常膵組織は黒色；慢性膵炎はオレンジ色；および膵臓癌細胞株はトルコ玉色である。試料の対をつなぐ線は、平均相関が閾値（＞０．８）を超えるｍｉＲＮＡの発現の非常に類似したパターンを有するそれらの試料を示す。
【図９】トレーニングデータおよび試験データについて推定された確率。６個の正常膵臓試料と膵腫瘍であることが知られている試料の内の１８個とを含むすべてのトレーニングデータが正確に分類される（Ａ）。１５個の隣接する良性試料の内の１１個と膵腫瘍であることが知られている１０個の試料が試験群（Ｂ）に正確に分類される。試料は、真実のクラス（Ａ）と予測されたクラス（Ｂ）とで分けられる。
【図１０−１】上位６９番目までは膵臓腺癌におけるｍｉＲＮＡ前駆体を異常に発現した。
【図１０−２】上位６９番目までは膵臓腺癌におけるｍｉＲＮＡ前駆体を異常に発現した。
【図１０−３】上位６９番目までは膵臓腺癌におけるｍｉＲＮＡ前駆体を異常に発現した。
【図１１】マイクロＲＮＡの発現についての膵臓癌の組織学的解析および分子解析。パネルＡ（４００×）は、膵臓腺癌のヘマトキシリン‐エオジン分析を示す。正常な膵臓腺（小さな矢印）には、癌（大きな矢印）の不十分に形成された腺が侵入している。対応するｃＤＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕ増幅後のｍｉＲ‐２２１の連続切片の分析によって、腫瘍細胞の内の多くが標的配列を含むことが示され；細胞質の局在化が示される（矢印、パネルＢ‐４００×およびそれ以上の倍率、パネルＣ‐１０００×；シグナルは、ファストレッドで対比染色された陰性細胞を有するＮＢＴ／ＢＣＩＰにより青色）。シグナルは、プライマーの除外またはＨＰＶ特異的プライマー（パネルＤ、４００×）による置き換えのいずれかによって消失した。隣接する連続切片もまた、ｃＤＮＡ（Ｅ、Ｆ）のｉｎ  ｓｉｔｕ増幅後に腫瘍細胞の内の多くがｍｉＲ‐３７６ａを発現することを示した。パネルＥ（４００×）は、陽性の腫瘍細胞（大きな矢印）と、線維形成の領域における陰性の間質細胞（小さな矢印）とを示すが、一方でパネルＦ（４００×）は、陰性の良性の膵腺房（小さな矢印）に隣接する陽性の腫瘍細胞（大きな矢印）を示す。
【図１２】ノーザンブロット法によるｍｉＲＮＡ発現。ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐３７５、ｍｉＲ‐１５５およびＵ６ＲＮＡの発現は、膵臓癌（Ｔ）、隣接する良性組織（Ｂ）または正常膵臓（Ｎ）の組織標本において判定された。ブロットはストリップされ、次いで再プローブされた。
【図１３】成熟型および前駆体ｍｉＲＮＡ発現のバリデーション。
【図１４】前駆体および成熟型ｍｉＲＮＡレベルのバリデーション。８つのｍｉＲＮＡの発現が、６つの正常膵臓標本、１０の隣接する良性組織および１６の膵臓腺癌において確認された。ｍｉＲＮＡ前駆体の相対的発現（開いた棒）がｍｉＲＮＡ前駆体に対するリアルタイムＰＣＲ検定を使用して判定され、一方で成熟型ｍｉＲＮＡの相対的発現（閉じた棒）が成熟型ｍｉＲＮＡに対するリアルタイムＰＣＲ検定を使用して判定された。ｍｉＲＮＡ発現における平均差は、膵臓（黒色）と腫瘍（赤色）の間で有意（Ｐ＜０．０１（スチューデントのｔ検定））であった。Ａ、ｌｅｔ７ｉ；Ｂ、ｍｉＲ‐２２１；Ｃ、ｍｉＲ‐１００；Ｄ、ｍｉＲ‐３０１；Ｅ、ｍｉＲ‐２１；Ｆ、ｍｉＲ‐１８１ａ，ｃ（前駆体）およびｍｉＲ‐１８１ａ（成熟型）；Ｇ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１（前駆体）およびｍｉＲ‐１２５ｂ（成熟型）；Ｈ、ｍｉＲ‐２１２。
【図１５】膵臓試料における成熟型ｍｉＲＮＡ発現のヒートマップ。Ａ．９つの膵臓癌の腫瘍と膵疾患のない６人のドナーからの膵臓とのリアルタイムＰＣＲを使用して測定された１８４の成熟型ｍｉＲＮＡの相対的発現。データはΔＣＴとして示される。管理されない階層的クラスタリングを、すべてのデータセットのサブセットにおいて実施した；データはフィルタリングされない。１に等しい発現値の中央値は黒色で；発現増加は赤色で；発現低下は緑色で；検知されない発現は灰色で示される。Ｂ．１５の試料におけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現パターンの階層的クラスター分析の結果を表す樹状図。
【図１６】膵臓腺癌における異常発現した成熟型ｍｉＲＮＡ。
【図１７】ｍｉＲ‐２１の発現増加が腫瘍に局在化されることを示す、正常膵臓の部分（Ａ）および膵臓癌（Ｂ）に適用したｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ‐ＰＣＲ検定。成熟型ｍｉＲ‐２１は、正常膵臓管よりも顕微解剖された腫瘍組織において実質的に増加した（Ｃ）。成熟型ｍｉＲ‐２１の発現は、腫瘍において増加した（Ｄ）。また、成熟型ｍｉＲ‐２１発現は、正常膵臓細胞株よりも、７つの膵臓癌細胞株すべてにおいて増加した（Ｅ）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本発明は、膵臓腺癌（以下、「膵臓癌」）の被験体から得られた生体試料における発現が特定の対照試料に比べて変化した特定のマイクロＲＮＡ遺伝子産物の同定に一部基づく。本発明は、被験体が膵臓癌に罹患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかを診断する方法を包含する。本発明はまた、膵臓癌を発症する危険性があると考えられる被験体をスクリーニングする方法、膵臓癌の進行を抑制することによって膵臓癌を治療する方法、ならびにこのような治療に使用することができる薬学的化合物も提供する。また、膵臓癌を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法、および膵臓癌用抗癌剤を同定する方法も提供される。本発明はまた、上述の方法の実施に適切な各種キットも包含する。
【００３５】
本発明を、より詳細な例を参照して説明する。これらの例は、当業者が本発明を作製および使用することができる方法を例示するものであって、特許請求の範囲に列挙されないいかなる限界も課すことなく、本発明の使用可能性および最良の形態を提供するために本明細書に記載するものである。
【００３６】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、インターネットウェブページおよび他の参考文献は、全体が参考として本明細書で明示的に援用される。援用される参考文献の用語の定義が本教示内容で定められる定義と異なると思われる場合は、本教示内容で定められる定義が優先される。
【００３７】
特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分、反応条件などの量を表すすべての数値は、すべての例で「約」という用語によって修飾されると理解されるものとする。従って、そうでないことが示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の性質によって異なる場合がある近似値である。各数値パラメータは、少なくとも、そして特許請求の範囲に均等論の適用を限定しようとするものとしてではなく、有効桁数および通常の丸め方法を考慮して解釈されなければならない。
【００３８】
本発明の幅広い適用範囲を示す数値範囲およびパラメータは、近似値であるが、具体例に記載される数値は可能な限り正確に報告している。しかし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に認められる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含んでいる。本明細書全体にわたって定められるすべての数値範囲は、このようなより広い数値範囲内に含まれるすべてのより狭い数値範囲を、あたかもこのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書で明示的に記載されているかのように包含する。
【００３９】
以下の紹介は、本明細書で使用される用語の理解に有用である。以下の理論に拘束されることなく該当なし１を参照すると、マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）は、単一のまたはクラスター形成されたｍｉＲＮＡ前駆体に転写されるｍｉＲ遺伝子によってコードされると考えられる。
【００４０】
本明細書で交換可能に使用される「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」は、ｍｉＲ遺伝子からのプロセッシングされていないまたはプロセッシングされたＲＮＡ転写物を指す。プロセッシングされていないｍｉＲ遺伝子転写物はまた、「ｍｉＲＮＡ前駆体」とも称される。図１に示す通り、これらのｍｉＲＮＡ前駆体は、段階的なプロセッシングによってｍｉＲＮＡの成熟形に変わる。このプロセッシングは、まず（Ａ）大きな一次前駆体または「ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡ」を産生し、これが次いで核酵素のＤｒｏｓｈａによってプロセッシングされ、（Ｂ）推定前駆体または「ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ」を産生すると考えられる。ｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡは、通常５０〜９０ヌクレオチド（ｎｔ）を、具体的には６０〜８０ｎｔを有する。本明細書で使用される「ｍｉＲＮＡ前駆体」または「プロセッシングされていない」ｍｉＲＮＡという用語は、ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡおよびｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡの両方を示し該当なし１における分子Ａおよび／またはＢを指す。活性の１９〜２５ｎｔ成熟型ｍｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼのＤｉｃｅｒによってｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡからプロセッシングされる。図１におけるｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ配列の下線部分は、「プロセッシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写物とも称される成熟型ｍｉＲＮＡの配列を表し該当なし１の分子Ｃとして示される。
【００４１】
活性または成熟型のｍｉＲＮＡ分子は、天然のプロセッシング経路を介して（例えば、無傷細胞や細胞溶解液を使用して）または合成プロセッシング経路によって（例えば、単離されたＤｉｃｅｒやＡｒｇｏｎａｕｔ、ＲＮＡアーゼＩＩＩなどの単離されたプロセッシング酵素を使用して）ｍｉＲＮＡ前駆体から得ることができる。但し、活性の１９〜２５個のヌクレオチドＲＮＡ分子はまた、ｍｉＲ前駆体からプロセッシングされることなく、生物学的または化学的な合成によって直接産生できることが理解される。
【００４２】
さらに図１を参照すると、ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡ分子およびｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡ分子はいずれも特徴的な「ヘアピン配列」を有している。この配列は、前半部分が少なくとも部分的にその後半部分に対して相補的であるオリゴヌクレオチド配列であって、それによりその半分の部分をそれ自体の上に折り畳み、「ヘアピン構造」を形成する。ヘアピン構造は該当なし１に示す通り、通常は、相補配列または部分的相補配列からなる「幹」部分、および幹部分の２つの相補鎖の間に位置する領域である「ループ」部分で構成される。
【００４３】
本明細書で使用される「ｍｉＲ遺伝子発現」という用語は、ｍｉＲ遺伝子からｍｉＲ遺伝子産物を産生することを指し、成熟型ｍｉＲＮＡ遺伝子産物にｍｉＲ前駆体をプロセッシングすることを包含する。
【００４４】
標的ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、被験体から得られる生体試料において測定される。例えば、生体試料は、膵臓癌を有することが疑われる被験体から切除することができる。このような生体試料は、前癌性または癌であることが疑われる膵臓の領域から得られる組織または細胞の生検材料を含んでよい。あるいは、生体試料は、膵臓の刺激後に抽出される膵液を含んでよい。別の例では、血液試料を被験体から採取することができる。膵液試料の使用については、例えば、内容が本明細書で援用される、Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３），Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２：７８‐８３；Ｒｏｓｔｙ，Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ
Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．１６：３７‐５２；Ｍａｔｓｕｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：５７３‐５８３；およびＧｒφｎｂｕｒｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３（５），１０４２‐１０５５に記載の通り、当該技術分野で既知である。対応する対照試料は、被験体の影響を受けていない膵組織から、すなわち正常被験体または正常被験体群から得ることができる。次いで、対照試料は、被験体の試料において特定のｍｉＲ遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料由来の対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較できるように、被験体由来の試験試料とともにプロセッシングされる。
【００４５】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、生体試料がｍｉＲ遺伝子産物を含むいずれの動物をも包含する。動物は哺乳類であってよく、イヌやネコなどの愛玩動物；ウシや、ウマ、ヒツジなどの家畜；ラットや、マウス、ウサギなどの実験動物；およびサルやヒトなどの霊長類を包含してよい。一実施形態において、哺乳類はヒトまたはマウスである。
【００４６】
対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べた、被験体から得られる試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（すなわち上昇または低下）によって、被験体において膵臓癌が存在することが示される。いくつかの実施形態において、試験試料における標的ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「アップレギュレート」されるか、またはｍｉＲ遺伝子産物が「過剰発現」する）。本明細書で使用される通り、被験体由来の試験試料のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照試料における同じ遺伝子産物の量よりも多い場合、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は「アップレギュレート」される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物は、以下の１つ以上を含む：ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭＩＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４。
【００４８】
他の実施形態において、試験試料における標的ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「ダウンレギュレート」されるか、またはｍｉＲ遺伝子産物が「過小発現」する）。本明細書で使用される通り、被験体由来の試験試料におけるｍｉＲ遺伝子産物の量が対照試料における同じ遺伝子産物の量よりも少ない場合、ｍｉＲ遺伝子の発現は「ダウンレギュレート」される。対照試料における相対的なｍｉＲ遺伝子の発現は、１つ以上のＲＮＡ発現基準に対して判定することができる。これらの基準は、例えば、正常な対照群についてすでに得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含んでよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物は、以下の１つ以上を含む：ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、ＭＩＲ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＩＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐３７５。
【００５０】
複数のｍｉＲ遺伝子産物が膵臓癌と関連していることから、膵臓癌は、列挙したｍｉＲ遺伝子産物のいずれか１つを評価することによって、または測定の際に膵臓癌の症状を示す列挙したｍｉＲ遺伝子産物のいずれかの組み合わせを評価することによって、診断することができると理解される。いくつかの例においては、膵臓腺癌に固有に関連するｍｉＲ遺伝子産物が評価される。
【００５１】
膵臓癌に関連するｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、被験体の細胞における形質転換されたまたは腫瘍性の表現型の発現の前または発現の初期段階に検出することができる。そのため、本発明はまた、膵臓癌を発症する危険性がある被験体をスクリーニングする方法であって、被験体の膵臓から得た生体試料において膵臓癌に関連する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルを評価する手順を含む、方法も提供する。従って、生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物の組み合わせのレベルが、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに比べて変化することは、被験体に膵臓癌を発症する危険性があることを示す。このようなスクリーニングのために使用される生体試料は、正常であるかまたは前癌性であることが疑われるかのいずれかの膵組織を含んでよい。膵臓癌に関連する１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが変化した被験体は、さらなるモニタリングおよび試験の候補者である。このようなさらなる試験は、組織試料の組織学的検査または当該技術分野の範囲内に含まれる他の技法を含んでよい。
【００５２】
本明細書で使用される「標的ヌクレオチド配列」または「標的ヌクレオチド」という用語は、検出されることが求められるポリヌクレオチド配列を指す。標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、ならびにそれらの誘導体、フラグメントおよび同族体を含むものとして意図される。
【００５３】
試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生体試料におけるＲＮＡ発現レベルを検出するのに適切ないずれかの技法を使用して測定することができる。生体試料におけるＲＮＡ発現レベルを判定するのに適切な技法には、増幅に基づく検定やハイブリダイゼーションに基づく検定が含まれる。
【００５４】
増幅に基づく検定では、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲ）における鋳型として、ｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列またはｍｉＲ遺伝子を使用する。ｍｉＲ遺伝子転写物の相対数はまた、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写の後、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）によって逆転写された転写物の増幅によって判定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルは、内部標準、例えば同じ試料内に存在する「ハウスキーピング」遺伝子由来のｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準として使用するのに適切な「ハウスキーピング」遺伝子には、例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ミオシン、またはグリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的増幅では、増幅産物の量が、元の試料における鋳型の量と比例する。ＴａｑＭａｎプローブを使用するリアルタイム定量的ＰＣＲまたはＲＴ‐ＰＣＲの方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：９８６‐９９４；およびＧｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：９９５‐１００１に記載されている。癌と相関するすべての既知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを判定することができる定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ法は、全体が参考として本明細書で援用される、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３，５３９４‐５４０３；Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  Ｔ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，Ｅ４３；および２００５年２月２４日出願の米国仮出願第６０／６５６，１０９号に記載されている。ｍｉＲＮＡ検出のための増幅に基づく検定の他の例は、当該技術分野で周知であり、例えば、全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００６／００７８９２４号の説明を参照されたい。
【００５５】
ハイブリダイゼーションに基づく検定はまた、試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを検出するために使用することもできる。これらの検定には、例えば、ノーザンブロット解析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、溶液ハイブリダイゼーション、およびＲＮアーゼ保護検定（Ｍａ  ＹＪ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）ＲＮａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０２７３‐８）が含まれ、当業者に周知である。
【００５６】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、２重らせん、３重らせんまたは他の高次構造の形成をもたらす核酸同士の相補的塩基対合相互作用を指し、本明細書において「アニーリング」と交換可能に使用される。通常、一次相互反応は、ワトソン／クリックおよびフーグスティーン型水素結合によって塩基特異的（例えばＡ／ＴおよびＧ／Ｃ）である。また、塩基スタッキングおよび疎水性相互作用はまた、２重らせんの安定性にも寄与する可能性がある。相補的および実質的に相補的な標的配列に対する検出用プローブおよびプライマーをハイブリダイズさせる条件は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８５）などに記載される通り、周知である。一般的に、このようなアニーリングが起こるかどうかは、とりわけ、ポリヌクレオチドおよび相補形の長さ、ｐＨ、温度、１価および２価の陽イオンの存在、ハイブリダイズ領域におけるＧヌクレオチドとＣヌクレオチドの割合、培地の粘度、ならびに変性剤の存在に影響される。このような変数は、ハイブリダイゼーションに必要な時間に影響を及ぼす。従って、好ましいアニーリング条件は特定の用途により異なる。しかし、このような条件は、過度の実験を行うことなく当業者により慣例的に判定することができる。相補性は完全である必要がなく、標的配列と本教示内容の１本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションの最小限の妨げとなる塩基対ミスマッチが少数存在する可能性があることが理解されるであろう。しかし、塩基対ミスマッチの数が、最小限のストリンジェントな条件下でもハイブリダイゼーションが行われないほどに多い場合、配列は一般的に相補的な標的配列でない。従って、本明細書における相補性とは、プローブまたはプライマーが、本教示内容の目的を達成するために選択された反応条件下でハイブリダイズする上で、標的配列に対して十分に相補的であることを意味する。
【００５７】
生体試料における特定の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを判定するのに適切な技法は、ノーザンブロット法である。例えば、トータル細胞ＲＮＡは、核酸抽出緩衝剤の存在下でホモジナイゼーションを行った後、遠心分離することによって細胞から精製することができる。核酸を析出させた後、ＤＮＡをＤＮアーゼによる処理と析出とによって除去する。次いでＲＮＡ分子を、標準的技法に従ってアガロースゲル上のゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移す。次いでＲＮＡを加熱によってフィルター上に固定する。特異的ＲＮＡの検出および定量化は、当該のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを使用して達成される。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７を参照されたい。
【００５８】
特定のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適切なプローブは該当なし２で示される核酸配列、あるいは、例えば、（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｒｆａｒｎ／ｍｉｒｎａ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ）（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ‐Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏ‐ＲＮＡ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２００４．３２（１）：ｐ．Ｄ１０９‐１１）におけるｍｉＲＮＡレジストリにおいて入手可能な既知のｍｉＲＮＡ種の公表された配列から産生することができる。標識ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製方法、ならびに標的ヌクレオチド配列にこれらをハイブリダイズする条件は、当該技術分野で既知であり、例えば、開示内容が参考として本明細書で援用される、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ
ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １０  ａｎｄ  １１に記載されている。
【００５９】
ＲＮＡ転写物のレベルの判定は、ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション法のほかに、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用して達成することができる。この技法は、必要とする細胞がノーザンブロット法よりも少なく、顕微鏡カバーガラスまたはスライド上に細胞全体を置いて、放射性プローブまたは他の標識核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含む溶液で細胞の核酸含有量を調べる手順を伴う。この技法は、被験体由来の組織生検試料の解析に特に適している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の実施については、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許第５，４２７，９１６号に詳述されている。上記の通り、特定のｍｉＲ遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適切なプローブは、図２で示される核酸配列から産生することができる。
【００６０】
試料における複数のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に測定するのに適切な技法は、高処理のマイクロアレイに基づく方法である。このような技法を使用して、例えば、癌と相関するすべての既知のｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを判定する場合がある。このような方法は、１組のｍｉＲ遺伝子に特異的な１組のプローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロチップフォーマット（すなわち、マイクロアレイ）において、オリゴライブラリーを作成する手順を伴う。このようなマイクロアレイを使用して、生体試料における複数のマイクロＲＮＡの発現レベルは、ＲＮＡを逆転写して１組の標的オリゴヌクレオチドを生成し、それらの標的オリゴヌクレオチドをマイクロアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションプロファイルまたは発現プロファイルを作成することにより、判定される。次いで、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、どのマイクロＲＮＡにおいて膵臓癌または前癌性の細胞における発現レベルが変化したのかを判定することができる。一例として、オリゴライブラリーは、ヒトゲノム由来のすべての既知のｍｉＲに対応するプローブを含む。マイクロアレイは、ｍｉＲＮＡが発見されるにつれてさらなるｍｉＲＮＡを含むように拡大される場合がある。このアレイは、各ｍｉＲＮＡに対して２種類異の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含み、１つは成熟型ｍｉＲの活性配列を含むプローブであり、もう１つはｍｉＲ前駆体に特異的なプローブである。このアレイはまた、ハイブリダイゼーションの厳密性条件のために対照を含む場合もある。ｍｉＲＮＡｓを検出するためのマイクロアレイ法の例は、内容が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００５／０２７７１３９号に記載されている。
【００６１】
ｍｉＲ遺伝子産物のレベルはまた、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子のコピー数を検出する検定を使用して判定することもできる。腫瘍において増幅を受けたｍｉＲ遺伝子の存在は、ｍｉＲ遺伝子のコピー数、すなわちｍｉＲ遺伝子産物をコードする細胞内のＤＮＡ配列の数を判定することによって評価される。一般的に、正常２倍体細胞は、特定の常染色体遺伝子のコピーを２つ有する。しかし、コピー数は、例えば癌細胞において、遺伝子増幅または複製によって増加させることもできれば、欠失によって減少させることもできる。特定の遺伝子のコピー数を評価する方法は、当該技術分野で周知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションに基づく検定および増幅に基づく検定を含む。
【００６２】
いくつかのハイブリダイゼーションに基づく検定のいずれを使用しても、生体試料の細胞におけるｍｉＲ遺伝子のコピー数を検出することができる。このような方法の１つがサザンブロット分析であり（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｄ  Ｅｄ．を参照）、この分析において、ゲノムＤＮＡは通常断片化され、電気泳動により分離され、膜に転写された後、ｍｉＲ遺伝子特異的プローブにハイブリダイズされる。標的領域のプローブのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、同じゲノムにおける正常な非増幅、単一コピーゲノムＤＮＡの領域の対照プローブのシグナルとの比較によって、使用する特異的なプローブに対応する相対的ｍｉＲ遺伝子コピー数の推定値が得られる。対照よりもシグナルが増加していれば、増幅の存在が示される。
【００６３】
試料中のｍｉＲ遺伝子のコピー数を判定する方法は、例えば、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである（Ａｎｇｅｒｅｒ，１９８７  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５２：６４９を参照）。一般的に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、以下の主な手順を含む：（１）解析する組織または生体構造の固定；（２）標的ＤＮＡのアクセシビリティの向上および非特異的結合の減少のための生体構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）生体構造内または組織内の核酸への核酸混合物のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーション非結合していない核酸フラグメントを除去するハイブリダイゼーション後洗浄、および（５）ハイブリダイズされた核酸フラグメントの検出。このような用途で使用されるプローブは、通常、例えば、放射性同位体または蛍光レポーターによって標識される。適切なプローブは、例えば約５０、１００または２００ヌクレオチドから約１０００以上のヌクレオチドと十分に長く、ストリンジェントの条件下で標的核酸による特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００６４】
ＤＮＡコピーの数を判定するための別の代替の方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）である。比較ゲノムハイブリダイゼーション法では、核酸の「試験」回収物が第１の標識によって標識され、第２の回収物（例えば、正常細胞または組織由来のもの）は第２の標識によって標識される。核酸のハイブリダイゼーションの比率は、アレイにおける各ファイバーに結合する第１および第２の標識の比率によって判定される。例えば、試験回収物における遺伝子増幅による２つの標識からのシグナルの比率の差が検出され、この比率によって、使用される特異的プローブに対応するｍｉＲ遺伝子コピー数の測定値が得られる。ＤＮＡコピー数の変化の細胞遺伝学的表現はＣＧＨによって作成することができ、これにより、特異的に標識された試験および参照ゲノムＤＮＡに由来する染色体の長さに沿って蛍光比が得られる。
【００６５】
本発明の方法による使用に適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１２２７‐１２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：９１３８‐９１４２；ＥＰＯ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．４３０：４０２；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３：Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）に記載されている。
【００６６】
また、増幅に基づく検定を使用して、ｍｉＲ遺伝子のコピー数を測定することもできる。このような検定において、対応するｍｉＲ核酸配列は、増幅反応（例えば、ＰＣＲ）の鋳型の役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量が元の試料における鋳型の量に比例する。適切な対照に対する比較により、上で考察した原理に従って、使用される特異的プローブに対応するｍｉＲ遺伝子のコピー数の指標が得られる。ＴａｑＭａｎプローブを使用したリアルタイム定量的ＰＣＲの方法は、当該技術分野で周知である。リアルタイム定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、例えば、Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０：９８６‐９９４に示されている。
【００６７】
また、ＴａｑＭａｎに基づく検定を使用して、ｍｉＲポリヌクレオチドを定量化することもできる。ＴａｑＭａｎに基づく検定では、５’蛍光色素および３’消光剤を含む蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブが使用される。このプローブはＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、３’末端における遮断剤によりそれ自体は伸長することができない。次のサイクルでＰＣＲ産物が増幅されると、ポリメラーゼ（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑ）の５’ヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎプローブの開裂をもたらす。この開裂によって、５’蛍光色素と３’消光剤とが分離し、それによって増幅の機能として蛍光が増大する（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｐｅｒｋｉｎ‐ｅｌｍｅｒ．ｃｏｍを参照）。
【００６８】
適切な増幅方法の他の例には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０，１９８９；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７，１９８８；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７，１９９０）、転写増幅（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１１７３，１９８９）、自立配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８７：１８７４，１９９０）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
ＤＮＡコピー数を判定する１つの効果的な方法は、マイクロアレイに基づくプラットフォームを使用する。マイクロアレイ技術は、高分解能が得られるため、使用される場合がある。例えば、伝統的なＣＧＨのマッピング分解能は一般的に２０Ｍｂと限られているのに対して、マイクロアレイに基づくＣＧＨでは、特異的に標識された試験および参照ゲノムＤＮＡの蛍光比によって、遺伝子座ごとのＤＮＡコピー数の変化の指標が得られ、それによりマッピング分解能の向上が達成される。各種のマイクロアレイ方法の詳細については、文献に記載されている。例えば、米国特許第６，２３２，０６８号；Ｐｏｌｌａｃｋ
ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３（１）：４１‐６，（１９９９）などを参照されたい。
【００７０】
本明細書で使用される「プローブオリゴヌクレオチド」とは、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。「標的オリゴヌクレオチド」とは、（例えばハイブリダイゼーションを介して）検出する分子または配列を指す。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」または「ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド」とは、特異的ｍｉＲ遺伝子産物に、または特異的なｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００７１】
特定の試料の「発現プロファイル」または「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的には試料の状態のフィンガープリントであり、２つの状態にはいずれかの特定の遺伝子が同じように発現されている場合があり、いくつかの遺伝子の評価によって、細胞の状態に固有の遺伝子発現プロファイルの作成が同時に可能となる。すなわち、正常組織は、膵臓癌組織、膵炎組織、あるいは癌組織に隣接した被験体の膵臓の非癌性部位から得られる「良性組織」と区別される場合がある。異なる状態の膵組織の発現プロファイルを比較することによって、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるのか（遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの両方を含む）に関する情報が得られる。この情報の使用は、膵臓癌組織または正常膵組織に特異的に発現される配列の同定、ならびに異なる予後の転帰をもたらす特異な発現によって、いくつかの方法で可能となる。例えば、特定の治療レジメンは、（例えば、特定の患者の長期の予後を改善するように化学療法薬が作用するかどうかを判定するために）評価される場合がある。同様に、診断は、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより実施または確認される場合がある。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個体遺伝子）によって、膵臓癌発現プロファイルを抑制するかもしくは予後不良プロファイルを予後良好プロファイルに変える候補薬のスクリーニングが可能となる。
【００７２】
従って、検出するｍｉＲ遺伝子産物の標的ヌクレオチド配列は、（ａ）成熟型ｍｉＲＮＡの一部またはすべての配列；（ｂ）ｍｉＲＮＡ前駆体の一部またはすべてのヘアピン配列；または（ｃ）ｐｒｉ‐ｍｉＲＮＡの一部またはすべての配列；（ｄ）配列（ａ）〜（ｃ）の補体；または（ｆ）配列（ａ）〜（ｄ）に実質的に同一である配列、であってよい。（図１を参照）。実質的に同一の核酸は、標的配列に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超の配列同一性を有する。
【００７３】
本発明の一例において、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ヒト膵組織または膵臓細胞の生検材料におけるｍｉＲＮＡ前駆体を測定することによって検出される。２０１の測定されたｍｉＲ遺伝子産物の配列を、図２に示す。本明細書における核酸配列はすべて、５’側から３’側の方向で得られる。さらに、遺伝子はイタリック体で表し、遺伝子産物は通常体で表す。例えば、ｍｉｒ‐１７は遺伝子であり、ｍｉＲ‐１７は遺伝子産物である。ヒトｍｉＲＮＡ前駆体を増幅するために使用されるプライマーを、図４に示す。
【００７４】
別の例において、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ヒト膵臓癌または良性組織の生検材料における成熟型ｍｉＲＮＡを測定することによって検出される。測定された成熟型ｍｉＲ遺伝子産物の配列を、図１３および図１６に示す。
【００７５】
別の例において、活性の成熟型ｍｉＲＮＡｉの発現は、ノーザンブロット法を使用して評価される。
【００７６】
別の例において、逆転写ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを使用して膵臓腫瘍細胞に対して最も特異的に発現したｍｉＲＮＡの内の３つを局在化させる。
【００７７】
また、膵臓癌に罹患しているか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることが疑われる被験体の膵臓癌を診断するためのキットも検討される。このようなキットは、（ａ）被験体の膵臓に由来する生体試料における少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する手段、および（ｂ）生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する手段を含む。従って、生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物のレベルと、対照試料における対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルとの間で検出された差によって、被験体が膵臓癌に羅患していることか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があることのいずれが示される。
【００７８】
被験体が膵臓癌に羅患しているのか、もしくは膵臓癌を発症する危険性があるのかの診断に加えて、本発明は、膵臓癌特異的ｍｉＲ遺伝子産物の発現が変化した被験体を治療する方法を検討する。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、細胞内の１つ以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、癌の形成を生じる可能性があるこれらのｍｉＲに対する１つ以上の標的の調節解除をもたらす可能性がある。そのため、（例えば、癌細胞においてアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを低下させることにより、および／または癌細胞においてダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを上昇させることにより）癌特異的ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させることによって、膵臓癌の治療を成功させることができる。
【００７９】
従って、本発明は、被験体における膵臓癌を治療する方法であって、少なくとも１つの膵臓癌特異的ｍｉＲ遺伝子産物が、被験体の癌細胞において調節解除（例えば、ダウンレギュレート、アップレギュレート）される、方法を包含する。ｍｉＲ遺伝子産物が膵臓癌細胞においてダウンレギュレートされる場合、本方法は、被験体における癌の進行が抑制されるように有効量のｍｉＲ遺伝子産物を投与する手順を含む。ｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞においてアップレギュレートされる場合、本方法は、被験体における癌の進行が抑制されるように、アップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子の発現を抑制するための有効量の少なくとも１つの化合物（本明細書において、ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物と称される）を被験体に投与する手順を含む。
【００８０】
癌の「進行の抑制」または癌の「治療」という用語は、癌の形成、発現または成長の阻止または緩慢化、ならびに侵襲および／または転移を包含する癌症状の消失または軽減を意味する。このような治療は、癌細胞のさらなる分化をもたらすことを含む。
【００８１】
本明細書で使用される通り、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効量」とは、膵臓癌を患っている被験体における癌の進行を抑制するのに十分な量のことである。当業者は、因子（例えば、被験体のサイズおよび重量；疾患の浸透度；被験体の年齢、健康および性別；投与経路；投与が局所的であるか全身性であるか）を考慮することによって、特定の被験体に投与するｍｉＲ遺伝子産物の有効量を容易に判定することができる。
【００８２】
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、治療する腫瘤の近似の重量に基づいてよい。腫瘤の近似の重量は、腫瘤の近似の体積を算出することによって判定することができるが、ここで１立方センチメートルの体積はおよそ１グラムに相当する。腫瘤の重量に基づく単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、腫瘤１グラム当たり約１０〜５００マイクログラムであってよい。特定の実施形態において、腫瘤は、腫瘤１グラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、腫瘤１グラム当たり少なくとも約６０マイクログラム、または腫瘤１グラム当たり少なくとも約１００マイクログラムであってよい。
【００８３】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量はまた、治療する被験体の近似または推定の体重に基づいてもよい。本明細書に記載の通り、このような有効量は、非経口的または経腸的に投与することができる。
【００８４】
当業者はまた、特定の被験体に単離されたｍｉＲ遺伝子産物を投与するための適切な投与計画を容易に判定することもできる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、被験体に１回投与することができる（例えば、単回注射または沈殿として）。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、数日から数カ月の期間、特に約３日間から約２８日間、とりわけ約７日間から約１０日間、１日１回または１日２回、被験体に投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は、１日１回、７日間投与される。投与計画が反復投与を含む場合、被験体に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、すべての投与計画を通じて投与される遺伝子産物の総量を含んでよいものと理解される。
【００８５】
本明細書で使用される、「単離」されたｍｉＲ遺伝子産物は、合成されたものか、もしくは人の介入によって自然状態から変化または取り出されたものである。例えば、合成のｍｉＲ遺伝子産物、あるいはその自然状態の共存材料から部分的または完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離」されたと判断される。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、実質的に精製された形態で存在することができるか、もしくはｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞内に存在することができる。
【００８６】
単離された遺伝子産物は、機能性成熟型ｍｉＲ遺伝子産物を含むオリゴヌクレオチド、ヘアピンのループ部を含むｍｉＲ前駆体の短いヘアピンを含むオリゴヌクレオチド、ヘアピンを有さない２本鎖のｍｉＲ前駆体、またはこのような分子を発現するベクターであってよい。従って、慎重に細胞内に送達または発現されるｍｉＲ遺伝子産物は、「単離」されたｍｉＲ遺伝子産物と判断される。また、ｍｉＲ前駆体分子から細胞内部で産生されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離」された分子であると判断される。
【００８７】
いくつかの態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、以下の内の１つ以上を含む：ＭＩＲ‐０９２‐２‐Ｐ、ＭＩＲ‐０９６‐Ｐ、ＭＩＲ‐１２９‐２、ＭＩＲ‐１３３ｂ、ＭＩＲ‐１３９、ＭＩＲ‐１８８ｂ‐Ｐ、ＭＩＲ‐２０４、Ｍ１Ｒ‐２９９‐Ｐ、ＭＩＲ‐３３７、ＭＲ‐３７１、ＭＩＲ‐３８３、ＭＩＲ‐３７５。
【００８８】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、多くの標準的技法を使用して得ることができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は、当該技術分野で既知である方法を使用して、化学的に合成することができるか、もしくは組み換えにより産生することができる。一実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザを使用して化学的に合成される。合成のＲＮＡ分子または合成試薬の商品製造業者には、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）や、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部門、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アシュランド）、Ｃｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【００８９】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、裸のＲＮＡとして、送達剤とともに投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は、任意の適切なプロモーターを使用して組換え環状または直鎖状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。プラスミドからＲＮＡを発現するための適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列やサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該技術分野の範囲内に含まれる。また、本発明の組換えプラスミドは、癌細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導性または調節可能なプロモーターを含むこともできる。
【００９０】
組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、標準的技法によって培養細胞発現系から単離することができる。また、組換えプラスミドから発現するｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞に送達することができるか、もしくは癌細胞において直接発現することができる。癌細胞にｍｉＲ遺伝子産物を送達する組換えプラスミドの使用については、以下でさらに詳細に考察する。
【００９１】
ｍｉＲ遺伝子産物は、別々の組換えプラスミドから発現させることができるか、もしくは同じ組換えプラスミドから発現させることができる。一実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現し、前駆体分子は、癌細胞の中に残存するプロセッシング系を包含するがこれに限らない適切なプロセッシング系によって、機能性成熟型ｍｉＲ遺伝子産物にプロセッシングされる。他の適切なプロセッシング系には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏショウジョウバエ細胞可溶化物系（例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００２／００８６３５６号（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．）に記載）や、大腸菌ＲＮＡｓｅＩＩＩ系、（例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００４／００１４１号（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）に記載）が含まれる。
【００９２】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現に適切なプラスミドの選択、遺伝子産物を発現するためのプラスミド内に核酸配列を挿入する方法、および対象の細胞に組換えプラスミドを送達する方法は、当該技術分野の範囲内に含まれる。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７‐１３３３；Ｔｕｓｃｈｌ（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６‐４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０‐５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７‐５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８‐９５８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００‐５０５；およびＰａｕｌ  ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５‐５０８を参照されたい。
【００９３】
一実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中間体初期プロモーターのコントロール下にあるｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で使用される、プロモーターの「コントロール下」とは、プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物コード配列の転写を開始することができるようにｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がプロモーターに機能的に結合することを意味する。
【００９４】
また、ｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物は、２種の別々の組換えウイルスベクターから、あるいは同じウイルスベクターから発現させることができると考えられる。組換えウイルスベクターから発現させるＲＮＡは、標準的技法によって培養細胞発現系から単離すること、あるいは癌細胞において直接発現させることのいずれかが可能である。癌細胞にｍｉＲ遺伝子産物を送達する組換えウイルスベクターの使用については、以下でさらに詳細に考察する。
【００９５】
本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列ならびにＲＮＡ配列を発現するための任意の適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列やサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当該技術分野の範囲内に含まれる。また、本発明の組換えウイルスベクターは、癌細胞におけるｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導性または調節可能なプロモーターを含むこともできる。
【００９６】
ｍｉＲ遺伝子産物のためのコード配列を収容することができるいずれのウイルスベクター（例えば、アデノウイルス（ＡＶ）に由来するベクター；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルスなど）も使用することができる。ウイルスベクターの向性は、エンベロープタンパク質または他のウイルス由来の他の表面抗原でベクターを偽型にすることによって、あるいは必要に応じて種々のウイルスキャプシドタンパク質を置換することによって変化させることができる。
【００９７】
例えば、本発明のベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）や、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルスなどに由来する表面タンパク質によって偽型にされてよい。本発明のＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するためのベクターを設計することによって異なる細胞を標的とすることができる。例えば、血清２型ゲノムにおける血清２型キャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清２型キャプシド遺伝子を血清５型キャプシド遺伝子で置換してＡＡＶ２／５ベクターを作製することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを作製するための技法は、当該技術分野の範囲内に含まれる。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１‐８０１を参照されたい。
【００９８】
本発明の使用に適する組換えウイルスベクターの選択、ベクター内にＲＮＡを発現させるための核酸配列を挿入する方法、対象の細胞にウイルスベクターを送達する方法、および発現したＲＮＡ産物の回収は、当該技術分野の範囲内に含まれる。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１‐３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８‐６１４；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．１：５‐１４；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５‐３０を参照されたい。
【００９９】
適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来するものである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを作製する方法、および標的細胞内にベクターを送達する方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６‐１０１０に記載されている。ｍｉＲ遺伝子産物を発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを作製する方法、および標的細胞にベクターを送達する方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６‐３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０‐５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２‐３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号に記載されている。一実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物は、ＣＭＶ中間体初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現する。
【０１００】
一実施形態において、本発明の組換えＡＡＶウイルス性ベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターのコントロール下でｐｏｌｙＴ終止配列と機能的に結合してｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で使用される「ｐｏｌｙＴ終止配列と機能的に結合して」は、センス鎖またはアンチセンス鎖をコードする核酸配列が５’側の方向のｐｏｌｙＴ終止シグナルに直接隣接していることを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写中に、ｐｏｌｙＴ終止シグナルは、転写を終了させるために作用する。
【０１０１】
膵臓癌のｍｉＲＮＡ発現レベルを変化させる別の方法は、例えばｍｉＲＮＡ遺伝子のプロモーターの高メチル化や低メチル化などの後成的事象によるものである。プロモーターの高メチル化はｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の低下につながり、プロモーターの低メチル化はｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の増大につながる。（Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ，Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ．Ｔｈｅ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：４１５‐２８（２００５））。そのため、癌の進行を抑制する別の方法は、ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のプロモーター領域の低メチル化をもたらす化合物の投与である。
【０１０２】
また、本発明の治療方法の他の実施形態において、ｍｉＲ発現を抑制する有効量の少なくとも１つの化合物を被験体に投与することができる。本明細書で使用される、「ｍｉＲ発現の抑制」とは、投与後のｍｉＲ遺伝子産物の活性の成熟形態の産生が、投与前に産生した量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えば、診断法について上記で考察したｍｉＲ転写物レベルを判定するための技法を使用して、ｍｉＲ発現が癌細胞において抑制されたかどうかを容易に判定することができる。抑制は、遺伝子発現のレベル（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を抑制することによる）またはプロセッシングのレベル（例えば、成熟型の活性ｍｉＲへのｍｉＲ前駆体のプロセッシングを抑制することによる）で生じる可能性がある。
【０１０３】
本明細書で使用される、ｍｉＲ発現を抑制する化合物の「有効量」とは、膵臓癌を患う被験体の癌の進行を抑制するのに十分な量である。当業者は、因子（例えば、被験体のサイズおよび重量；疾患の浸透度；被験体の年齢、健康および性別；投与経路；投与が局所的であるか全身性であるか）を考慮することによって、特定の被験体に投与するｍｉＲ発現抑制化合物の有効量を容易に判定することができる。
【０１０４】
例えば、発現抑制化合物の有効量は、治療する腫瘤の近似の重量に基づくてよい。腫瘤の近似の重量は、腫瘤の近似の体積を算出することによって判定することができるが、ここで１立方センチメートルの体積はおよそ１グラムに相当する。腫瘤の重量に基づく有効量は、腫瘤１グラム当たり約１０〜５００マイクログラムであってよく、腫瘤１グラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、腫瘤１グラム当たり少なくとも約６０マイクログラム、および腫瘤１グラム当たり少なくとも約１００マイクログラムであってよい。
【０１０５】
ｍｉＲ発現を抑制する化合物の有効量はまた、治療する被験体の近似または推定の体重に基づいてもよい。とりわけ、本明細書に記載の通り、このような有効量は非経口的または経腸的に投与することができる。例えば、被験体に投与される発現抑制化合物の有効量は、体重１ｋｇ当たり約５〜３０００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約７００〜１０００マイクログラムであってもよければ、あるいは体重１ｋｇ当たり約１０００マイクログラムを超えてもよい。
【０１０６】
当業者はまた、特定の被験体にｍｉＲ発現を抑制する化合物を投与するための適切な投与計画を容易に判定することもできる。例えば、発現抑制化合物は、被験体に１回投与することができる（例えば、単回注射または沈殿として）。あるいは、発現抑制化合物は、数日から数カ月の期間、特に約３日間から約２８日間、とりわけ約７日間から約１０日間、１日１回または１日２回、被験体に投与することができる。特定の投与計画において、発現抑制化合物は、１日１回、７日間投与される。投与計画が反復投与を含む場合、被験体に投与される発現抑制化合物の有効量は、すべての投与計画を通じて投与される化合物の総量を含んでよいものと理解される。
【０１０７】
いくつかの態様において、レベルが低下する可能性があるｍｉＲ遺伝子産物は、以下の内の１つ以上を含む：ｌｅｔ‐７ａ‐２‐Ｐ、ｌｅｔ‐７ｂ、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７
ｄ、ｌｅｔ‐７ｆ‐１、ｌｅｔ‐７ｉ、ＭＩＲ‐００１‐２、ＭＩＲ‐００７‐１、ＭＩＲ‐０１５ａ、ＭＩＲ‐０１５ｂ、ＭＩＲ‐０１６‐１、ＭＩＲ‐０１９ｂ‐１‐Ｐ、ＭＩＲ‐０２１、ＭＩＲ‐０２３ａ、ＭＩＲ‐０２４‐１，２、ＭＩＲ‐０２７ａ，ｂ、ＭＩＲ‐０２９ａ，ｃ、ＭＩＲ‐０３０ｄ、ＭＩＲ‐０３２、ＭＩＲ‐０９２‐１、ＭＩＲ‐０９８、ＭｌＲ‐０９９ａ、ＭＩＲ‐１００、ＭＩＲ‐１０７、ＭＩＲ‐１２５ｂ‐１、ＭＩＲ‐１２６、ＭＩＲ‐１２８ａ、ＭＩＲ‐１３２、ＭＩＲ‐１３６、ＭＩＲ‐１４２‐Ｐ、ＭＩＲ‐１４５‐Ｐ、ＭＩＲ‐１５２、ＭＩＲ‐１５５、ＭＩＲ‐１８１ａ，ｃ、ＭＩＲ‐１９６ａ‐２、ＭＩＲ‐２１２、ＭＩＲ‐２１３、ＭＩＲ‐２１５、ＭＩＲ‐２１８‐１，２、ＭＩＲ‐２２１、ＭＩＲ‐２２２‐Ｐ、ＭＩＲ‐３０１、ＭＩＲ‐３２８、ＭＩＲ‐３３１‐Ｐ、ＭＩＲ‐３４５、ＭＩＲ‐３６７、ＭＩＲ‐３７６、ＭＩＲ‐４２４。
【０１０８】
ｍｉＲ遺伝子発現を抑制するための適切な化合物には、２本鎖ＲＮＡ（例えば短い干渉ＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、リボザイムなどの酵素ＲＮＡ分子、または３重らせんをｍｉＲ遺伝子により形成することができる分子が含まれる。抑制化合物の別の種類は、ｍｉＲ遺伝子産物プロモーターの高メチル化を引き起こし、それによりｍｉＲ遺伝子の発現を低下させる。これらの化合物のそれぞれは、特定のｍｉＲ遺伝子産物を標的として、ｍｉＲ遺伝子産物を破壊するか、ｍｉＲ遺伝子産物の破壊を誘導するか、さもなければｍｉＲ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【０１０９】
例えば、特定のｍｉＲ遺伝子の発現は、ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列相同性を有する単離された２本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子でｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することによって抑制することができる。特定の一実施形態において、ｄｓＲＮＡ分子は、「短い干渉ＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１１０】
本方法において有用なｓｉＲＮＡは、約１７〜約２９ヌクレオチドの長さ、あるいは約１９〜約２５ヌクレオチドの長さの短い２本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、標準的ワトソン‐クリック塩基対合相互作用（以下「塩基対」）によって共にアニール化されたセンスＲＮＡストランドおよび相補型アンチセンスＲＮＡストランドを含む。センス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物の中に含まれる核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
【０１１１】
本明細書で使用される、標的ｍＲＮＡの範囲内に含まれる標的配列に「実質的に同一」であるｓｉＲＮＡ内の核酸配列は、標的配列と同一である核酸配列であるか、もしくは標的配列とは１個または２個のヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補型１本鎖ＲＮＡ分子を含んでよいか、もしくは２つの相補的部分が塩基対を形成しかつ１本鎖「ヘアピン」領域が共有結合した単一の分子を含んでよい。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡはまた、１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変化によって天然のＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡであってもよい。このような変化には、例えばｓｉＲＮＡの末端やｓｉＲＮＡの１個以上の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加、ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ分解に抵抗性とする修飾、またはデオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡにおける１個以上のヌクレオチドの置換が含まれる場合がある。
【０１１３】
また、ｓｉＲＮＡは、特定の「薬物のような」性質を含むように設計することもできる。このような修飾には、安定のための化学修飾や送達のためのコレステロール抱合が含まれる。このような修飾によってｓｉＲＮＡに対してより良好な薬理学的性質が付与され、このような修飾を使用して、薬理活性ｓｉＲＮＡは、幅広い生体分布を達成することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける大部分の組織内でｍｉＲＮＡの効率的なサイレンシングを達成することができる。
【０１１４】
また、ｓｉＲＮＡの一方または両方のストランドは、３’オーバーハングを含んでよい。本明細書で使用される「３’オーバーハング」とは、２重らせんＲＮＡストランドの３’末端から伸長する少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。従って、特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１〜約６個のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、１〜約５個のヌクレオチドの長さ、１〜約４個のヌクレオチドの長さ、または約２〜約４個のヌクレオチドの長さの少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。一実施形態において、３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両ストランドに存在しており、かつ２個のヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡの各ストランドは、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含んでよい。
【０１１５】
ｓｉＲＮＡは、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上記で記載した通り、化学的または生物学的に産生することができるか、もしくは組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生および試験するための例示的な方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、米国特許出願第２００２／０１７３４７８号（Ｇｅｗｉｒｔｚ）および米国特許出願第２００４／００１８１７６号（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。ｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉＲＮＡを非発現化するために設計される治療上有効なｓｉＲＮＡを合成および確認する方法は、内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ
ｗｉｔｈ’ａｎｔａｇｏｍｉｒｓ，’Ｎａｔｕｒｅ  ４３８（７０６８）：６８５‐９に記載されている。
【０１１６】
また、特定のｍｉＲ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸によって抑制することもできる。本明細書で使用される場合、「アンチセンス核酸」とは、標的ＲＮＡの活性を変えるＲＮＡ‐ＲＮＡまたはＲＮＡ‐ＤＮＡまたはＲＮＡ‐ペプチド核酸相互作用によって標的ＲＮＡに結合する核酸分子を指す。本方法の使用に適したアンチセンス核酸は、一般的にｍｉＲ遺伝子産物内の連続した核酸配列に相補的な核酸配列を含む１本鎖核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ‐ＤＮＡキメラ、ＰＮＡ）である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物内の連続した核酸配列に対して５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的な核酸配列を含んでよい。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸２本鎖を消化するＲＮアーゼＨまたは別の細胞ヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【０１１７】
例えば、真核生物においては、ＲＮＡポリメラーゼは、構造遺伝子の転写を触媒してｍＲＮＡを産生する。ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ転写物が好ましいｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有するＲＮＡポリメラーゼ鋳型を含むように設計することができる。ＲＮＡ転写物は、「アンチセンスＲＮＡ」と称される。アンチセンスＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ発現を抑制することができる（例えば、Ｒｙｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６２（３）：８０１‐８，２００２；Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，９４（１）：６‐１５，２００１）。
【０１１８】
あるいは、第１の核酸分子に対して、相補配列であるかもしくは第１の分子の相補配列またはその一部に相同である配列で作製される第２のＤＮＡ分子または第２のキメラ核酸分子は、第１の分子の「アンチセンスＤＮＡまたはＤＮＡデコイまたはデコイ分子」と称される。「デコイ分子」という用語はまた、ＤＮＡまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）を含み（Ｍｉｓｃｈｉａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，９（６）：６３３‐９，２００２）、かつ調節タンパク質のための結合部位や転写因子のための結合部位などのタンパク質結合部位の配列を含む核分子（１本鎖であっても２本鎖であってもよい）を包含する。アンチセンス核酸分子の応用は、アンチセンスＤＮＡおよびデコイＤＮＡ分子を包含し、当該技術分野で既知である（例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４７：２９４‐３０１，２００１；Ａｎｄｒａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２１：（５）３５４１‐３５５０，２００１）。
【０１１９】
また、アンチセンス核酸は、核酸主鎖あるいは糖および塩基部分（またはそれらの等価物）に修飾を含んで標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達性または分子の有効性に関するその他の性質を向上させることができる。このような修飾は、コレステロール部分、アクリジンなどの２本鎖インターカレータ、または１つ以上のヌクレアーゼ耐性群を含む。
【０１２０】
アンチセンス核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上記で記載した通り、化学的または生物学的に産生することができるか、もしくは組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させることができる。産生および試験するための例示的な方法は、当該技術分野の範囲内に含まれ；例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎｇ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４；および米国特許第５，８４９，９０２号（Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．）を参照されたい。
【０１２１】
特定のｍｉＲ遺伝子の発現はまた、酵素核酸によって抑制することもできる。本明細書で使用される「酵素核酸」とは、ｍｉＲ遺伝子産物の連続した核酸配列に相補性を有し、具体的にはｍｉＲ遺伝子産物を開裂することが可能な基質結合領域を含む核酸を指す。酵素核酸基質結合領域は、ｍｉＲ遺伝子産物における連続した核酸配列に対して、例えば５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的であってよい。酵素核酸はまた、塩基、糖および／またはリン酸基に修飾を含むこともできる。本発明の方法で使用される酵素拡散の例にはリボザイムがある。
【０１２２】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素ＲＮＡ分子である。概要は、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９‐４７１（１９９４）で示される。リボザイムの作用機序は、相補型標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレアーゼによる開裂を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な１つ以上の配列を含む必要があり、かつｍＲＮＡ開裂の原因となる周知の触媒配列を含む必要がある（米国特許第５，０９３，２４６号）。
【０１２３】
いずれの可能性のあるＲＮＡ標的中の特異的なリボザイム開裂部位も、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣという配列を含むリボザイム開裂部位に対する対象の分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、開裂部位を含むｍｉＲ遺伝子の領域に対応する約１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にする可能性がある、例えば二次構造などの予想される構造特性について評価することができる。候補配列の適合性もまた、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの容易さを、リボヌクレアーゼ防御検定を使用して評価することができる。
【０１２４】
酵素核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物について上記で記載した通り、化学的または生物学的に産生することができるか、もしくは組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を産生および試験するための例示的な方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｗｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９５），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０
９２‐９６；Ｈａｍｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．９：２５‐３１；および米国特許第４，９８７，０７１号（Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。
【０１２５】
３重らせん形成分子は、標的ｍｉＲ遺伝子活性のレベルを低下させる際に使用することができる。３本鎖立体配座（３重らせん）において共に会合することができ、それにより標的遺伝子の翻訳を阻害するために使用することができる核酸分子は、デオキシヌクレオチドから構成される１重らせんでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に２本鎖の一方の鎖上のプリンまたはピリミジンのいずれかの相当大きなストレッチを必要とするフーグスティーン型塩基対合則により３重らせんの形成を促進するように設計される必要がある。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づくことができ、それによって、生成する３重らせんの３本の会合した鎖を横切るＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットが生じるのである。ピリミジン富化分子は、２本鎖のうちの１本鎖のプリン富化領域に対し、この鎖と平行方向の塩基相補性を提供する。加えて、プリンに富んだ核酸分子、例えばＧ残基のストレッチを有するものを選択することができる。これらの分子が、ＧＣ対に富んだＤＮＡ２本鎖と３重らせんを形成するのである。この場合、プリン残基の大半は、標的２本鎖の内の１本鎖に位置し、３本鎖中の３本の鎖を横切るＧＧＣトリプレットを生成させる。あるいは、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより、３重らせん形成のために標的とされる可能性のある配列を増加させることができる。スイッチバック分子は、交互に５’‐３’、３’‐５’様式で合成され、その結果、それらは２本鎖の最初の１本の鎖と塩基対合し、次いでもう一方の鎖と塩基対合することになり、２本鎖分子の一方の鎖上のプリンまたはピリミジンのいずれかの相当大きなストレッチの必要性がなくなる。
【０１２６】
膵臓癌のｍｉＲＮＡ発現レベルを変化させる別の方法は、例えばｍｉＲＮＡ遺伝子のプロモーターの高メチル化や低メチル化などの後成的事象によるものである。プロモーターの高メチル化はｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の低下につながり、プロモーターの低メチル化はｍｉＲＮＡ遺伝子の発現の増大につながる。（Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ，Ｂａｙｌｉｎ  ＳＢ．Ｔｈｅ  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．３：４１５‐２８（２００５））。
【０１２７】
少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現を抑制するために少なくとも１つの化合物を投与することで、被験体の膵臓癌の進行が抑制される。ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現を抑制する化合物の投与後に被験体におけるかかる細胞の数が一定のままであるかもしくは減少する場合に、癌細胞増殖の抑制が推定される。このような細胞の絶対数は増加するが、腫瘍成長の速度が減少する場合に、癌細胞の増殖の抑制が推定される。
【０１２８】
被験体の身体内の癌細胞の数は、直接測定するか、もしくは原発性腫瘤または転移性腫瘤のサイズから推定することによって判定することができる。例えば、被験体における癌細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、または癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技法によって測定することができる。
【０１２９】
腫瘤のサイズは、直接的な目視観測によって、あるいはＸ線や、磁気共鳴映像法、超音波検査、シンチグラフィーなどの画像診断法によって確認することができる。当該技術分野で既知であるように、腫瘤のサイズを確認するために使用される画像診断法は、コントラスト剤の有無にかかわらず使用することができる。腫瘤のサイズはまた、物理的手段（例えば、組織塊の触診あるいはキャリパーなどの計器による組織塊の測定）によって確認することもできる。
【０１３０】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、被験体の癌細胞へのこれらの化合物の送達に適切ないずれの手段によっても被験体に投与することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現抑制化合物は、これらの化合物またはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸によって被験体の細胞をトランスフェクションさせるための適切な方法によって投与することができる。一実施形態において、細胞は、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターによってトランスフェクションされる。
【０１３１】
真核細胞のトランスフェクション方法は、当該技術分野で周知であり、細胞の核または前核への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソーム転移または疎水性材料によって仲介される転移；レセプター仲介核酸送達、バイオバリスティックまたは粒子加速；リン酸カルシウム沈殿およびウイルスベクターによって仲介されるトランスフェクションを包含する。
【０１３２】
例えば、細胞は、リポソーム型転移化合物（例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ‐［１‐（２，３‐ジオレオイロキシ）プロピル］‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムメチルスルフェイト、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ‐Ｍａｎｎｈｅｉｍ）または等価物（例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ））によってトランスフェクションすることができる。使用する核酸の量は、本発明の診療に重大な意味を持たず；許容される結果は、細胞１０５個当たり０．１〜１００マイクログラムの核酸で達成される場合がある。例えば、細胞１０５個当たり３マイクログラムのＤＯＴＡＰにおいて約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比を使用することができる。
【０１３３】
一実施形態において、膵臓癌細胞は、被験体から単離され、ダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸によってトランスフェクションされ、被験体に再導入される。
【０１３４】
また、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、任意の適切な経腸または非経口投与経路によって被験体に投与することができる。本方法に適切な経腸投与経路には、例えば、経口送達や、直腸送達、鼻腔内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば、血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射や、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、血管系へのカテーテル滴下注入）；組織周囲および組織内注射（例えば、腫瘍周囲および腫瘍内注射や、網膜内注射、網膜下注射）；皮下注射または沈殿（皮下注入（例えば浸透ポンプによって）など）；例えばカテーテルまたは他の配置装置（例えば、網膜ペレットや、坐剤や、多孔性、非多孔性またはゼラチン状材料を含むインプラント）による対象の組織に対する直接塗布；および吸入が含まれる。適切な投与経路は、腫瘍への注射、注入および直接注入である。
【０１３５】
本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現抑制化合物は、送達試薬とともに裸のＲＮＡ、もしくはｍｉＲ遺伝子産物または発現抑制化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）のいずれかとして被験体に投与することができる。適切な送達試薬には、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ疎水性試薬や；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；ポリ陽イオン（例えばポリリジン）、リポソームが含まれる。
【０１３６】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物を発現する配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびに癌細胞にこのようなプラスミドおよびベクターを送達するための技法は、本明細書において考察される。
【０１３７】
一実施形態において、リポソームを使用して、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）が被験体に送達される。リポソームはまた、遺伝子産物または核酸の血中半減期を延長させることができる。本発明に使用される適切なリポソームは、一般的に中性または負に荷電したリン脂質やステロール（例えばコレステロール）を含む標準的ベシクル形成脂質から形成されることができる。脂質の選択は、一般的に、因子（例えば所望のリポソームのサイズや、血流におけるリポソームの半減期）を考慮して導かれる。例えば、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号および第５，０１９，３６９号に記載の通り、リポソームを調製するための種々の方法が知られている。
【０１３８】
本方法に使用されるリポソームは、リポソームを癌細胞に標的とするリガンド分子を含んでよい。癌細胞に一般的なレセプターと結合するリガンド（例えば、腫瘍細胞抗原と結合するモノクローナル抗体）が適切である。
【０１３９】
本方法に使用されるリポソームはまた、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを回避するように修飾することができる。そのように修飾されたリポソームは、表面上にオプソニン化抑制部分を有するか、もしくはリポソーム構造内に組み込まれる。いくつかの実施形態において、本発明のリポソームは、オプソニン化抑制部分およびリガンドの両方を含んでよい。
【０１４０】
本発明のリポソームの調製に使用されるオプソニン化抑制部分は、通常は、リポソーム膜に結合する大きな親水性ポリマーである。本明細書で使用される場合、オプソニン化抑制部分がリポソーム膜に「結合」するとは、例えば膜自体への脂溶性アンカーの挿入または膜脂質の活性基への直接の結合によって化学的または物理的に膜に結合させる場合のことである。開示内容全体が参考として本明細書で援用される米国特許第４，９２０，０１６号に記載されている通り、これらのオプソニン化抑制親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する。
【０１４１】
リポソームの修飾に適切なオプソニン化抑制部分は、約５００〜約４０，０００ダルトン、または約２，０００〜約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーを含む。このようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体；例えば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧやステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；合成ポリマー（例えばポリアクリルアミドやポリＮ‐ビニルピロリドン）；直鎖状、分岐状またはデンドリマーのポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール（例えば、カルボキシル基またはアミノ基が化学的に結合するポリビニルアルコールやポリキシリトール）ならびにガングリオシド（例えばガングリオシドＧＭ１）が含まれる。また、ＰＥＧ、メトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧのコポリマーまたはそれらの誘導体も適切である。さらに、オプソニン化抑制ポリマーは、ＰＥＧのブロックコポリマーならびにポリアミノ酸、ポリサッカリド、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、ポリヌクレオチドのいずれかであってよい。オプソニン化抑制ポリマーはまた、アミノ酸またはカルボン酸（例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸）、カラギーナンを含む天然のポリサッカリド；アミノ化されたポリサッカリドまたはオリゴサッカリド（直鎖状または分岐状）；あるいはカルボキシ化されたポリサッカリドまたはオリゴサッカリド（例えば、カルボキシル基と結合を生じる炭酸の誘導体と反応したもの）であってもよい。オプソニン化抑制部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧまたはそれらの誘導体であってよい。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されるリポソームは、「ポリエチレングリコール化されたリポソーム」と称される場合がある。
【０１４２】
オプソニン化抑制部分は、数多くの周知の技法の内のいずれか１つによって、リポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーに結合させることができ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３と混合溶媒（例えば、６０℃で３０：１２の比のテトラヒドロフランと水）を使用して還元的アミノ化によってステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１４３】
オプソニン化抑制部分によって修飾されるリポソームは、無修飾リポソームより非常に長く血行の中にとどまる。このために、このようなリポソームは「ステルス」リポソームと称されることがある。ステルスリポソームは、多孔性または「漏出性」微小血管系によって供給された組織内に蓄積することが知られている。従って、このような微小血管系の欠損（例えば固形腫瘍）を特徴とする組織は、これらのリポソームを効率的に蓄積する。Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１８：６９４９‐５３を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取り込みの減少は、肝臓および脾臓におけるリポソームの著しい蓄積を防止することによってステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化抑制部分によって修飾されるリポソームは、腫瘍細胞へのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）の送達に非常に適している。
【０１４４】
ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、当該技術分野で既知の技法に従って、被験体への投与前に、「医薬品」と称されることがある薬学的組成物として調製することができる。従って、本発明は、膵臓癌を治療するための薬学的組成物を包含する。一実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物および薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、ｍｉＲ遺伝子産物は、適切な対照細胞よりも膵臓癌細胞における発現レベルが低下したｍｉＲ遺伝子産物に相当する。
【０１４５】
他の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つのｍｉＲ発現抑制化合物を含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、対照細胞よりも膵臓癌細胞において発現が大きいｍｉＲ遺伝子に特異的である。
【０１４６】
本発明の薬学的組成物は、少なくとも無菌であり、かつ発熱物質がないことを特徴とする。本明細書で使用される場合、薬学的「組成物」または「製剤」は、ヒトおよび獣医学的使用のための製剤を包含する。本発明の薬学的組成物を調製する方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８５）に記載の通り、当該技術分野の範囲内に含まれる。
【０１４７】
本薬学的製剤は、薬学的に許容される担体と混合された少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）（例えば０．１〜９０重量％）またはその生理的に許容される塩を含む。また、本発明の薬学的製剤は、リポソームおよび薬学的に許容される担体によってカプセル化された少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含んでよい。
【０１４８】
特に適切な薬学的に許容される担体は、水、緩衝用水、生理食塩液、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【０１４９】
本発明の薬学的組成物は、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性である少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含んでよい。当業者は、例えば２’位で修飾される１つ以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物内に組み込むことによって、ヌクレアーゼ抵抗性である核酸を容易に合成することができる。適切な２’修飾リボヌクレオチドには、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシおよびＯ‐アリルで２’位が修飾されたものが含まれる。
【０１５０】
本発明の薬学的組成物はまた、従来の薬学的賦形剤および／または添加剤を含んでもよい。適切な薬学的賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、モル浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が含まれる。適切な添加剤には、例えば、生理的に生体適合性の緩衝剤（例えば塩酸トロメタミン）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡやＤＴＰＡ‐ビスアミド）またはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ‐ビスアミド）の添加剤、あるいたは場合により、カルシウムまたはナトリウム塩（例えば、塩酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム）の添加剤が含まれる。本発明の薬学的組成物は、液体形態で使用するためにパッケージすることができるか、もしくは凍結乾燥することができる。
【０１５１】
本発明の固体の薬学的組成物としては、従来の無毒性で固体の薬学的に許容される担体（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレード）を使用することができる。
【０１５２】
例えば、経口投与のための固体の薬学的組成物は、上記に掲載された担体および賦形剤のいずれか、ならびに１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含んでよい。エアゾール（吸入）投与のための薬学的組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくは１％〜１０重量％の、上記の通りのリポソームおよび噴射剤の中にカプセル化した少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（またはそれらをコードする配列を含む少なくとも１つの核酸）を含んでよい。また、例えば鼻腔内送達のためのレシチンなどの担体を所望により含んでよい。
【０１５３】
本発明はまた、被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する方法も提供する。本方法は、（ａ）対照細胞に比べてアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；（ｂ）被験体に治療レジメンを施す手順；（ｄ）ある期間後に被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；および（ｅ）第１および第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順を含む。第２の試験試料におけるアップレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが第１の試験試料よりも低いことによって、その治療レジメンが被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される。
【０１５４】
被験体における膵臓癌の進行を抑制する治療レジメンの有効性を判定する他の方法は、（ａ）対照細胞に比べてダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物を有する癌細胞を含む被験体の膵臓から第１の試験試料を得る手順；（ｂ）被験体に治療レジメンを施す手順；（ｄ）ある期間後に被験体の膵臓から第２の試験試料を得る手順；および（ｅ）第１および第２の試験試料におけるダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較する手順を含む。第２の試験試料におけるダウンレギュレートされたｍｉＲ遺伝子産物レベルが第１の試験試料よりも高いことによって、その治療レジメンが被験体における膵臓癌の進行抑制に効果的であることが示される。
【０１５５】
本発明はまた、膵臓癌用抗癌剤を同定する方法も包含する。本方法は、（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過剰発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；（ｂ）生体試料に試験剤を接触させる手順；（ｃ）手順（ｂ）の後に生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順を含む。過剰発現したｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルが低下することによって、試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される。
【０１５６】
別の実施形態において、膵臓癌用抗癌剤を同定する方法は、（ａ）膵臓癌細胞を含む生体試料において過小発現する少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験前の発現レベルについてのデータを作成する手順；（ｂ）前記生体試料に試験剤を接触させる手順；（ｃ）手順（ｂ）の後に生体試料におけるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定し、これにより試験後の発現レベルについてのデータを作成する手順；および（ｄ）前記ｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルを試験前の発現レベルと比較する手順であって、過小発現したｍｉＲ遺伝子産物の試験後の発現レベルが上昇することによって、試験剤が膵臓癌の抗癌性を有することが示される、手順を含む。
【０１５７】
適切な剤としては薬物（例えば低分子、ペプチド）や生体高分子（例えばタンパク質、核酸）が含まれるが、これらに限定されるものではない。剤は、組み換えにより、合成的に作製することができるか、もしくは天然の原料から単離（すなわち、精製）することができる。このような剤を細胞に与える各種方法（例えばトランスフェクション）は、当該技術分野で周知であり、このような方法のいくつかは上に記載されている。少なくとも１つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出する方法（例えばノーザンブロット法や、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ‐ＰＣＲ、発現プロファイリング）は、当該技術分野で周知である。これらの方法のいくつかもまた、上に記載されている。
【０１５８】
以下では、本発明を以下の非限定的な実施例で例示する。
【実施例】
【０１５９】
（実施例１）  膵臓癌を正常組織または膵炎組織と区別するマイクロＲＮＡ発現サインの同定
リアルタイム定量的ＰＣＲ検定を使用して、ヒト膵臓癌（腺癌）、良性対組織、正常な膵臓、慢性膵炎および膵臓癌細胞株の臨床検査材料における２００超のｍｉＲＮＡ前駆体の発現を測定した。膵臓癌を正常かつ良性の膵臓と区別した固有のｍｉＲＮＡサインを同定した。リアルタイム定量的ＲＴ‐ＰＣＲのために使用される方法は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｊｉａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：５３９４‐５４０３；Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  Ｔ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：Ｅ４３；および２００５年２月２４日出願の米国仮出願第６０／６５６，１０９号に詳述されている。また、実験手順および結果は、開示内容全体が参考として本明細書で援用される、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １２０：１０４６‐１０５４に報告されている。
【０１６０】
材料および方法
組織の入手：この研究において解析された組織試料は、オクラホマ大学ヘルスサイエンスセンターおよびオハイオ州立大学で膵臓の一部の切除のための外科手術を受けた患者に由来するものであった。試料の採集は、施設の施設内倫理委員会の方針および慣行に適合したものであった。外科的な検体の切除と同時に、研究員は直ちにその組織を外科病理検査室に移した。病理部は、検体のグロス分析を実施し、研究のために、癌と思われる膵組織および正常と思われる膵組織を選んだ。各試料をクライオバイアル内に配置し、液体窒素中で急速冷凍し、解析を行うまで‐１５０℃で保存した。次に、外科的な検体を提供する研究所によって次病理学的解析を行い、それにより研究のために採取された試料の組織変化を確認した。ＲＮＡ解析を実施した研究機関によって、隣接する良性組織にセカンドレベルの精度管理を行った。組織のスライドを、ＲＮＡが単離された組織に直接隣接する凍結組織の切片から準備した。これらのスライドを、良性組織が膵臓腫瘍細胞を含むかどうかを判定するために、本発明者等（Ｗ．Ｌ．Ｆ．）の内の１人が検査した。残りの腫瘍を含む良性組織については、この研究に含めなかった。検体に関する臨床データを付録の表１に示す。
【０１６１】
細胞株：以下の膵臓腫瘍細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナッサス）から購入した。Ｐａｎｃ‐１、ＨＳ７６６Ｔ、ＭＩＡ  ＰａＣａ‐２、ＨＰＡＦ‐ＩＩ、ＢｘＰＣ‐３、Ｍｐａｎｃ‐９６、ＰＬ４５、Ｐａｎｃ０３．２７およびＰａｎｃ１０．０５。細胞株を、標準条件を使用して、１０％ＦＢＳまたは他の最適化された完全培地を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。
【０１６２】
ｍｉＲＮＡ前駆体発現プロファイリング：トータルＲＮＡを、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールズバッド）中で細胞株または組織から単離した。まず、凍結組織（約１０ｍｇ）をステンレス鋼乳鉢および乳棒で微粉状にした。正常膵臓由来のトータルＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎ（米国テキサス州オースティン）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国カリフォルニア州マウンテンビュー）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）から購入した。正常組織のすべてのドナーは、膵疾患以外の合併症で死亡した（図３）。ＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ
２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州パロアルト）を使用して評価した。ＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）は、Ｉｍｂｅａｕｄ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３，ｅ５６におけるプロトコルに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００エキスパートソフトウェアのＲＩＮアルゴリズムを使用して判定された。ＲＩＮ≧４のＲＮＡ試料をこの研究に含めた（図３）。しばらくＲＮＡをＲＮアーゼフリーのＤＮＡａｓｅ  Ｉで処理し、２２２のｍｉＲＮＡ前駆体と１８Ｓ  ｒＲＮＡとに対する遺伝子特異的プライマーを使用してｃＤＮＡを１μｇのトータルＲＮＡから合成した。２２２のｍｉＲＮＡ前駆体の発現は、リアルタイム定量的ＰＣＲ検定を使用して測定した。ｃＤＮＡの各試料中の各ｍｉＲＮＡ前駆体遺伝子について重複ＰＣＲを行った。平均ＣＴを重複ＰＣＲから判定した。相対的遺伝子発現を２‐（ＣＴｍｉＲＮＡ‐ＣＴ１８Ｓ  ｒＲＮＡ）として算出した。相対的遺伝子発現には、データの提示を単純化するために、１０６を乗算した。生の相対的ｍｉＲＮＡ前駆体発現データを図４に示す。
【０１６３】
統計：２０１の遺伝子発現値（対照遺伝子発現に比べたもの）についてのΔＣＴデータの平均中心を求め、以下の方法を使用して解析した。フィルタリングされていないデータの発現パターンを、試料の管理されない階層的クラスタリングと、平均連結法およびユークリッド距離に基づく遺伝子の管理されない階層的クラスタリングとを使用して評価した（Ｅｉｓｅｎ  ＭＢ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：１４８６３‐８；Ｓａｅｅｄ  ＡＩ，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３４：３７４‐８）。試料群間に特異に発現する遺伝子を判定するため、そのデータは、ｐ＜０．０１（１０，０００無作為順列）の多群の順列に基づくＡＮＯＶＡ検定（ウェルチの近似法）および多重検定補正（ｍａｘＴのＷｅｓｔｆａｌｌ‐Ｙｏｕｎｇ手順ダウン補正）を使用して差の有意性においてフィルタリングを行った。特異に発現した遺伝子の発現パターンを比較するため、フィルタリングされたデータを、試料の階層的クラスタリングと、平均連結法およびユークリッド距離に基づく遺伝子の階層的クラスタリングとを使用して解析した。
【０１６４】
フィルタリングされたデータのさらなるクラスター分析を、発現地形図を使用して行った（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３：２０８７‐９２）。その地形図は、そのデータにおいて固有の主要なクラスターの３次元の概観を提供する。試料は、各エレメントの配置が、ｍｉＲＮＡ前駆体発現データを使用して算出されたユークリッド距離に基づく多くの最近傍によって影響される、二次元のグリッドに最初にマップされた。第３次元は二次元のグリッド上の点の密度によって判定され、その値は表面として投影されるが、より高いピークは、非常に類似したエレメントのより大きな数を示す。試料の各組間の平均相関もまた算出した。閾値（０．８）超の平均相関を有する試料の各組は、２つの試料を結ぶ線によって発現地形図に示される。これにより、ｍｉＲＮＡ発現の高相関パターンを有する試料のサブセットの視覚化が可能になる。特定のクラスターからの試料を表すピークは、各ピークの上で着色してコードされた球体によって標識された。
【０１６５】
管理された装置の学習アルゴリズムを、フィルタリングされていないｍｉＲＮＡ発現データに基づいて、試料の分類のために適用した。各ｍｉＲＮＡの予測スコアは、訓練、テイクワンアウトクロス確認および試験手順に基づくマイクロアレイアルゴリズムの予測分析（ＰＡＭ）（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：６５６７‐７２）を使用した発現データの２つのクラスの比較（正常対腫瘍）に基づいて算出した。訓練セットと試験セットとへの試料の分割は、データを無作為に訓練セットと試験セットとに分割する（通常、訓練には２／３。試験には１／３）一般的に認められたアプローチを使用して行う。この研究では、腫瘍試料を、訓練のために約７５％に、試験のために２５％に無作為に分割した。正常例の数がわずかだった（Ｎ＝６）ため、正常例は訓練セットのみに含めた。わずかな数の慢性膵炎試料（Ｎ＝４）は、ＰＡＭ分析に含めなかった。２つのレベルの精度管理を行っていかなる腫瘍細胞を含む隣接良性組織も除去しつつ、ＲＮＡを、顕微解剖した組織ではなく組織全体から抽出した。従って、本発明者等は、いくつかの腫瘍細胞が隣接良性組織を汚染したという可能性を完全に除外することができず、腫瘍に隣接した組織から得られるこれらの良性試料において早期の前癌性変化が発現したのかどうかは不明である。そのため、真の正常例および腫瘍例についてのクラシファイアを訓練するために、良性試料を訓練セットから除外した。良性例については、試験セットにおいて使用した。
【０１６６】
結果
内部コントロール遺伝子のバリデーション：膵組織はリボヌクレアーゼが豊富であり、ＲＮＡ単離時には自己分解の可能性を低下させるように注意する必要がある。膵組織から単離されるＲＮＡの完全性を確認するため、約１００ｎｇの各ＲＮＡ試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して検定した。５２の組織において、ＲＩＮ≧４（中央値７．６、範囲４．３〜９．６、（図３））であった。
【０１６７】
試料のそれぞれにおけるｍｉＲＮＡ前駆体の発現を、リアルタイムＰＣＲを使用して判定し、内部コントロール遺伝子に正規化した。対応量のトータルＲＮＡを各ＲＴ反応物に添加し、各種試料（すなわち腫瘍、正常および良性）における平均発現を比較することによって１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部コントロールとして確認した。平均１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現においては、腫瘍試料と正常膵臓の間に統計学的有意差がみられなかった（ｐ＝０．１１６、図５）。ここで判定された腫瘍および正常組織における１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現は、膵組織についてすでに報告されたもの（Ｒｕｂｉｅ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １９：１０１‐９）と一致していた。腫瘍群と正常群と良性群との間に１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現の有意差がなかったことから、１８Ｓ  ｒＲＮＡは、その研究の内部コントロール遺伝子として選ばれた。
【０１６８】
膵組織におけるｍｉＲＮＡ前駆体プロファイリング：２００５年４月に見出された２２２のｍｉＲＮＡを表す２０１のｍｉＲＮＡ前駆体の発現を、２８の腫瘍、１５の隣接良性組織、４つの慢性膵炎検体、６つの正常膵臓組織、および９つの膵臓癌細胞株において測定した。試料の管理されない階層的クラスタリングを、腫瘍、正常膵臓、膵炎および膵臓癌細胞株についてのフィルタリングされていないデータのすべてのセットにおいて実施した。ヒートマップは、２０１のｍｉＲＮＡ前駆体のみのフィルタリングされていない発現データにより試料が正常な膵臓、腫瘍、慢性膵炎および細胞株のクラスターに十分に分類されることを示す（図６）。
【０１６９】
同一の膵臓癌患者に由来する１５の隣接良性組織のｍｉＲＮＡ発現は、正常膵臓、膵炎、膵腫瘍および癌細胞株とともに含まれていた。ｍｉＲＮＡ前駆体発現データを、多群ＡＮＯＶＡを使用してフィルタリングした。遺伝子発現データは本質的にノイズが多いため、データの統計学的フィルタリングは、発現データの前処理の必要な手順であると慣習的に判断される。試料および遺伝子の階層的クラスタリングは、結果として生じた１１２のｍｉＲＮＡについて実施した。フィルタリングされたデータの階層的クラスタリングによって、本発明者等は、結果として生じた４つの試料クラスターにおける異なる発現パターンを有するｍｉＲＮＡの主要な群を同定することができた（図７）。１つのクラスターは、細胞株のみを含んでいた。別のクラスターは、６つのすべての正常膵臓および１５の良性組織の内の９つを含んでいた。３番目のクラスターは、４つの慢性膵炎検体および１つの良性組織を含んでいた。最後に、大きなクラスターは、２８の腫瘍の内の２８および５つの良性組織を含んでいた（図７）。
【０１７０】
また、フィルタリングされたデータを、発現地形図として知られている種々のクラスタリング法を使用して解析した。地形図から、発現データは、試料の５つの主な群に分けられた（図８）。階層的クラスタリングのように、地形図では、正常膵臓、細胞株、膵臓腺癌および慢性膵炎から試料群が分けられる。この分析は、試料のクラスターのそれぞれが発現地形図上の異なる領域を占めることを示しており、従って、試料の４群のそれぞれがｍｉＲＮＡ発現の異なるパターンを有しており、正常試料と腫瘍試料とを識別するマイクロＲＮＡのサブセットを明らかにする可能性を示唆するものであるというさらなる証拠を提供する。大部分の隣接良性組織は正常と腫瘍とに分類されるが、腫瘍によってクラスター形成されたそれらの良性試料もまた、地形図上の腫瘍で分類される（図８）。地形図のさらなる特徴としては、すべてのｍｉＲＮＡ発現値の平均相関を、試料の各組間で算出した。０．８の閾値を越えるそれらの相関は、ｍｉＲＮＡ発現パターンが類似した試料の組を結ぶ線として示される。これにより、ｍｉＲＮＡ発現の高く相関しているパターンを有する試料のサブセットを視覚化することが可能になる。４つの主な群それぞれの中の試料が結ばれるが（すなわち、平均相関＞０．８）、腫瘍試料の一部と相関する２つの膵炎試料を除いて群の間に結線はなかった（図８）。
【０１７１】
異なる膵臓組織の中の遺伝子発現プロファイルの比較を使用して、間質および細胞増殖（例えば細胞株）の寄与を排除し、膵腫瘍において発現する遺伝子を同定した。図７のｍｉＲＮＡ発現データにおけるこのような解析を実施する試みは、癌細胞株における発現が一様に高く、かつ膵炎試料における発現が一様に低かったため、成功しなかった。しかし、多くの腫瘍関連の可能性があるｍｉＲＮＡは、細胞株および／または腫瘍においては増加したが、正常または膵炎においては増加しないことが同定された（図７）。
【０１７２】
マイクロアレイアルゴリズムの予測分析（ＰＡＭ）によるデータ解析：ＰＡＭ分類アルゴリズムを使用して、ｍｉＲＮＡ発現データによってどのクラスに試料が適合するのか（腫瘍または正常）を予測することができ、かつ膵臓腺癌に関連した最も重要で、特異に発現したｍｉＲＮＡを判定することができた。２０１のｐｒｅ‐ｍｉＲＮＡに関するフィルタリングされていないデータを、Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９，６５６７‐７２に記載された方法に従って、ＰＡＭアルゴリズムにより解析した。７５％超の欠測値を有する３つの遺伝子は、補完アルゴリズムの起こり得るアーチファクトを阻止するために分析から除外した。ＰＡＭ訓練およびクロス確認を、６つの正常膵臓および１８の膵腫瘍を使用して実施した。ＰＡＭによって、正常および腫瘍試料の１００％が正確に分類された（図９Ａ）。ＰＡＭ試験を、１０の腫瘍試料および１５の隣接良性試料について実施した。ＰＡＭによって、試験された腫瘍試料の１００％および試験された１５の良性試料の内の１１が正確に分類された（図９Ｂ）。ＰＡＭによって選択された通りの膵臓腺癌において特異に発現した上位６８番目までにランクされたｍｉＲＮＡを図１０に示す。ＰＡＭによって選択された通りの膵臓腺癌において特異に発現した上位２０番目までにランクされたｍｉＲＮＡを表１に示す。
【０１７３】
【表１】
0005841024.tif 000002
【０１７４】
考察
以下では、膵管腺癌において初めての詳細なｍｉＲＮＡ発現プロファイリング研究の結果を報告する。発現プロファイリングによって、膵管腺癌において異常に発現する多数のｍｉＲＮＡが同定された。
【０１７５】
ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域内の保存配列への結合後の遺伝子発現の負の調節因子として主に機能すると考えられる。ｍｉＲＮＡの生物学的役割については、鋭意研究が行われているが、発生のタイミングおよび分化を調節することによって転写因子と類似の方法で細胞内運命を規定かつ維持すると考えられる。発育経路の変化が膵臓癌の発生において重大な役割を果たすことから、ｍｉＲＮＡ発現の変化は、膵臓腺癌の発生にとって重要な要因である場合がある。
【０１７６】
ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングによって、腫瘍として、２８の組織の内の２８が正確に同定された（図９）。全６つの正常膵臓が正しく予測され、１５の隣接良性組織の内の１１が正常組織として分類された（図９）。ここで示されるデータによって、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングが特定の癌についての固有の分子サインを作成することができることが示される。
【０１７７】
腫瘍と正常組織との間に遺伝子発現の差をもたらすと考えられる３つの因子は、正常な腺房、間質および腫瘍細胞である。本発明者等は、ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲによって、スクリーニングにおいて同定された特異に発現したｍｉＲＮＡの内の上位３つが腫瘍細胞に局在していることを確認した（図１１）。良性の組織の一部は、正常な膵臓とクラスターを形成することができなかった（図７）。２つのレベルの精度管理を行って腫瘍細胞を汚染したという可能性を低下させたものの、ＲＮＡが組織全体から単離されたが、顕微解剖組織からは単離されなかったことから、いくつかの腫瘍細胞が良性組織に存在していた可能性がある。別の可能性としては、それらの試料が腫瘍に隣接する組織から得られるので、良性組織の一部に前癌性の変化がすでに発現していたというものである。この考え方を支持するものとしては、大部分の良性試料（および慢性膵炎も）が発現地形図において正常膵臓と腫瘍との間にあるという事実がある（図８）。この観察は、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリングによって、これらの良性組織において起きた前癌性の変化を検出できるということを示す。
【０１７８】
膵臓癌において特異に発現したｍｉＲＮＡの一部は、他の癌において異常に発現した。これらには、ｍｉＲ‐１５５（本研究およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫において増加した）；ｍｉＲ‐２１（本研究ならびに膠芽細胞腫、乳癌および甲状腺乳頭癌において増加した）；ｍｉＲ‐２２１（膵臓癌、膠芽細胞腫および甲状腺癌において増加した）が含まれる。ｍｉＲ‐２２１は、Ｘ染色体上のｍｉＲ‐２２２から約７００ｂｐに位置し；両ｍｉＲ‐２２１およびｍｉＲ‐２２２は、キットに結合してそれを調節すると予測される。ｍｉＲ‐２２２前駆体は、上位２０位までの特異に発現したｍｉＲＮＡの中になかったが、ＰＣＲによる成熟型ｍｉＲ‐２２２の次の分析は、ｍｉＲ‐２２１に類似のレベルで膵臓癌においてｍｉＲ‐２２２が増加したことを示した（データ未掲載）。従って、上述のｍｉＲＮＡの調節解除は、癌全般に固有であってよい。他の癌において特異に発現したｍｉＲＮＡは、膵臓癌と同程度には調節解除されなかった。肺癌において減少するｌｅｔ‐７ファミリーは、ここでは増加した。ｍｉＲ‐１７‐９２ポリシストロン（ｍｉＲ‐１７、‐１８、‐１９ａ、‐１９ｂ‐１および‐９２‐１をコードする）の発現は、リンパ腫および結腸直腸癌において増加したが、膵臓癌においては有意な変化はなかった。本発明者等は、膵臓癌において多くのｍｉＲＮＡ（例えば、本発明者等の知る限りでは他の癌において報告のないｍｉＲ‐３７６ａや、ｍｉＲ‐２１２、ｍｉＲ‐３０１、ｍｉＲ‐１８１ａ）の調節解除を報告する。また、ここで報告された大部分の調節解除されたｍｉＲＮＡは、正常な膵臓よりも腫瘍の発現が増加したことを示すという事実も興味深い。ｍｉＲ‐３７５やｍｉＲ‐１３９などの多少のｍｉＲＮＡは、膵臓癌における発現が低下した（表１、図１２〜１３）。ｍｉＲ‐３７５は、膵臓からクローニングされ、膵島細胞特異的であると考えられる（Ｐｏｙ  ＭＮ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ，４３２：２２６‐３０）。
【０１７９】
（実施例２）  膵臓癌組織における成熟型ｍｉＲＮＡ発現のノーザンブロット法
実施例１において使用されたリアルタイムＰＣＲ検定によって、ｍｉＲＮＡ前駆体が定量化されるが、活性の成熟型ｍｉＲＮＡは定量化されない。リアルタイムＰＣＲ分析において使用したのと同一のＲＮＡについてノーザンブロット法を実施して、成熟型ｍｉＲＮＡが前駆体ｍｉＲＮＡと相関したかを確認した。
【０１８０】
３つの正常膵臓および４組の腫瘍／隣接良性組織に由来する成熟型ｍｉＲ‐１００、ｍｉｒ‐３７５およびｍｉＲ‐１５５の発現レベルは、ＰＣＲによるｍｉＲＮＡ前駆体のレベルに近似していた（図１２）。ｍｉＲ‐１００およびｍｉＲ‐１５５は、上位２０位までの特異に発現するｍｉＲＮＡの中にあった（表１）。ｍｉＲ‐３７５は、膵臓癌における発現が低下した数少ないｍｉＲＮＡの内の１つであったため、ノーザンブロット法によって確認した。ｍｉＲ‐３７５は上位２０位までのｍｉＲＮＡの中になかったが（表１）、前駆体および成熟型ｍｉＲ‐３７５の両方の発現は、リアルタイムＰＣＲにより、膵臓癌において有意に減少した（ｐ＜１×１０‐５）。良性および腫瘍対組織におけるｍｉＲＮＡ発現は、すべての例において一貫して増減したが、このことによって、腫瘍と良性との間のｍｉＲＮＡ発現における差は、個々の患者の組織の差によるものであって、群の平均発現の差によるものではないことを示している。
【０１８１】
ノーザンブロット法：ノーザンブロット法を、Ｌａｕ  ＮＣ，ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：８５８‐６２およびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３２：Ｅ４３に既述したように実施した。成熟型ｍｉＲＮＡに対する逆相補鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドをプローブとして使用した。ブロットを首尾よくストリップし、３回まで再プローブした。
【０１８２】
（実施例３）  膵臓癌組織における成熟型ｍｉＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ
実施例１に記載されたリアルタイムＰＣＲデータを、市販されるリアルタイムＰＣＲ検定を使用して確認し、成熟型ｍｉＲＮＡを増幅および定量化した。成熟型ｍｉＲＮＡ発現は、ＰＡＭから、上位２８位までの異常に発現したｍｉＲＮＡについて確認した。以下の組織に由来するｃＤＮＡを検定した：６つの正常膵臓、１６の膵臓腺癌およびＰＡＭから正常であると予測された１０の隣接良性組織。
【０１８３】
成熟型ｍｉＲＮＡ発現は、ｍｉＲＮＡ前駆体と高度に相関していた（図１３および１４）。本発明者等の知る限り、これは、感受性リアルタイムＰＣＲ検定によって判定される前駆体および成熟型ｍｉＲＮＡの両方の発現の最初の発現である。これらの成熟型ｍｉＲＮＡについての相対発現値が３ｌｏｇ（０．１〜１００）にわたったが、腫瘍と正常組織との間の特異な発現における傾向は存続した（図１４）ことは興味深い。このことにより、ｍｉＲＮＡは異なる発現レベルで腫瘍および正常膵臓において機能するものの、特異な発現が癌と正常組織との間で維持されることが示唆される。
【０１８４】
成熟型ｍｉＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ。成熟型ｍｉＲＮＡを定量化する検定（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ検定、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を、１つの変更を伴ってＣｈｅｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：ｅｌ７９に記載された通りに実施した。２８の異なるアンチセンスループＲＴプライマーを含む５×カクテルを、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにおいて２×原液を濃縮することによって調製した。１００ナノグラムのトータルＲＮＡを８０℃で５分間加熱し、次いで１０μＭの１８Ｓ  ｒＲＮＡアンチセンスプライマーとともに６０℃で５分間インキュベートし、その後室温に冷却した。次いで３マイクロリットルの５×ループプライマー混合物を添加し、ｃＤＮＡを作製した。これにより、２８のｍｉＲＮＡ  ｃＤＮＡと１８Ｓ  ｒＲＮＡ内部コントロールのライブラリーの作成が可能になった。リアルタイムＰＣＲ（１０μＬの全体の反応）を、記載された通りにｃＤＮＡの１μＬの１：５０希釈溶液を使用して行った。ｃＤＮＡの各試料における各成熟型ｍｉＲＮＡ遺伝子について重複ＰＣＲを行った。平均ＣＴを、重複ＰＣＲから判定した。上記の通りに遺伝子発現を１８Ｓ  ｒＲＮＡに比べて算出し、データ提示を単純化するために１０６を乗算した。
【０１８５】
（実施例４）  膵臓腫瘍細胞におけるｍｉＲＮＡ前駆体のＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ
細胞型ｍｉＲＮＡ発現を、ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを使用して検討した。ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３７６ａおよびｍｉＲ‐３０１は、上位で特異に発現したｍｉＲＮＡ（表１）の中のものであり、かつ正常膵臓および膵炎よりも腫瘍および細胞株において発現が増加したことから、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲのために選択した（図７）。本発明者等は特にｍｉＲ‐３７６ａの細胞型発現に関心があったが、それは、Ｐｏｙ  Ｍ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，２２６‐３０において膵細胞からクローニングされたためであった。本発明者等の結果から、ｍｉＲ‐２２１およびｍｉＲ‐３７６ａは、腫瘍細胞に局在したが、良性膵腺房または間質細胞（図１１）または良性の管（図示せず）には局在しなかったことが示された。また、ｍｉＲ‐３０１は、腫瘍に局在した（データ未掲載）。
【０１８６】
ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ：  ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲプロトコルを、Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６，１２７５４‐９に既述したように実施した。概略説明すると、最適プロテアーゼ消化時間は、レポーターヌクレオチドジゴキシゲニンｄＵＴＰの非特異的組み込みを使用して判定した。最適プロテアーゼ消化の後、ＲＮアーゼフリーのＤＮアーゼ（１試料当たり１０Ｕ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、米国インディアナ州インディアナポリス）における一晩のインキュベーションとｒＴｔｈ系およびジゴキシゲニンｄＵＴＰを使用したワンステップＲＴ／ＰＣＲとを行った。色素原は、ニトロブルーテトラゾリウムおよび対比染色としてヌクレアファストレッドを有するブロモクロロインドリルホスフェート（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）であった。ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３０１およびｍｉＲ‐３７６ａの前駆体に対するプライマー配列は、実施例１におけるプロファイリングのために使用されたものと同様であった。陰性対照においては、プライマーの除外および無関係な（ヒトパピローマウイルスに特異的な）プライマーによる置換が行われたが、それはこのウイルスが膵組織に感染しないためであった。ＲＴ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲは、保存状態のホルマリン固定パラフィン包埋試料１０５０００５Ａ２（Ｔ）において行った（図３）。
【０１８７】
（実施例５）  膵臓特異的ｍｉＲＮＡおよび膵臓濃縮ｍｉＲＮＡの同定
正常な膵臓組織に特異的であるか、あるいは正常な膵臓組織において濃縮されるかのいずれかのｍｉＲＮＡを同定するために、１８４の成熟型ｍｉＲＮＡの発現を、２２の正常なヒト組織におけるリアルタイムＰＣＲを使用して測定した。これらの組織には、脂肪、膀胱、脳、子宮頚部、大腸、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、脾臓、小腸、気管、胸腺、甲状腺、精巣、および正常なＢ細胞が含まれる。膵臓特異的ｍｉＲＮＡは、膵臓においては高発現で、他の２１の正常組織においては発現がほとんど検出されないｍｉＲＮＡと定義された。膵臓濃縮ｍｉＲＮＡは、膵臓組織における発現が他の２１の組織の平均よりも１０倍以上のｍｉＲＮＡと定義された。膵臓濃縮ｍｉＲＮＡは、他の組織の一部に存在してもよい。膵臓特異的ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ‐２１６やｍｉＲ‐２１７が含まれる。膵臓濃縮ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ‐７、ｍｉＲ‐１４８ａおよびｍｉＲ‐３７５が含まれる。
【０１８８】
【表２】
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【０１８９】
（実施例６）  膵臓組織における成熟型ｍｉＲＮＡのプロファイリング
膵臓癌において特異に発現するｍｉＲＮＡを同定するために、９つの膵臓癌腫瘍と、膵疾患のない６人のドナーからの膵臓とにおけるリアルタイムＰＣＲを使用して、１８４の成熟型ｍｉＲＮＡの発現を測定した。成熟型ｍｉＲＮＡは、市販されるリアルタイムＰＣＲ検定（ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ検定、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して測定した。この検定は、実施例３で説明した通りに実施された。リアルタイムＰＣＲデータは、ヒートマップとして示され、管理されない階層的クラスタリングを使用して解析された（図１５）。多少のｍｉＲＮＡの発現が１５の試料のすべてにおいて検知されず、これらのｍｉＲＮＡはヒートマップに含めなかった。多くの成熟型ｍｉＲＮＡは、正常膵臓よりも膵臓腫瘍における発現が増加した。ヒートマップはまた、成熟型ｍｉＲＮＡ発現プロファイルによって、膵臓腫瘍と正常とを区別することが、その両者が樹状図の分かれた分枝として出現するために可能になることを示す。正常に比べた腫瘍における成熟型ｍｉＲＮＡ発現の倍率変化およびｐ値を、図１６に示す。
【０１９０】
（実施例７）  膵臓癌細胞においてｍｉＲ‐２１の発現が増加
いくつかの方法を使用して、成熟型ｍｉＲ‐２１の発現は、膵臓腺癌細胞に局在し、膵臓の腺房、間質および他の非癌細胞には局在しなかったことを示した。（図１７）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ‐ＰＣＲは、正常膵臓の切片（Ａ）および膵臓癌（Ｂ）に適用され、ｍｉＲ‐２１の発現増加が腫瘍に局在することを示した。膵管腺癌および正常な（非癌）膵臓管を、レーザー顕微解剖を使用していくつかの検体から単離した。ＲＮＡを顕微解剖組織から単離し、次いで１８Ｓ  ｒＲＮＡ内部コントロールと同様に成熟型ｍｉＲ‐２１をリアルタイムＰＣＲによって定量化した。成熟型ｍｉＲ‐２１は、正常膵臓管（Ｃ）よりも顕微解剖腫瘍組織において実質的に増加した。前に記載された通りに成熟型ｍｉＲＮＡの市販されるリアルタイムＰＣＲ検定を使用して、膵臓腫瘍の９つの検体および６つの正常膵臓検体において、成熟型ｍｉＲ‐２１を検定した。成熟型ｍｉＲ‐２１発現は、腫瘍（Ｄ）において増加した。成熟型ｍｉＲ‐２１発現を、２つの正常膵臓上皮細胞株および転移癌に由来する３つと原発性膵臓癌に由来する４つとを含む７つのヒト膵臓癌細胞株におけるリアルタイムＰＣＲによって定量化した。成熟型ｍｉＲ‐２１発現は、正常膵臓細胞株（Ｅ）よりも７つの膵臓癌細胞株のすべてにおいて増加した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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