(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エイコサペンタエン酸の産生を改良するための組換え油性ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞であって、前記宿主細胞がアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドが、配列番号１１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、
前記アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され；及び、
さらに前記宿主細胞が、Δ９エロンガーゼ変換効率の向上の結果として、
（ｉ）エイコサペンタエン酸の重量百分率の増加した脂質、又は
（ｉｉ）乾燥細胞重量基準の百分率の増加したエイコサペンタエン酸
を有し、ここで、前記（ｉ）又は（ｉｉ）は、前記単離ポリヌクレオチドを含む点においてのみ前記宿主細胞と異なる対照親細胞との比較により決定され、かつ、
前記宿主細胞が、
（ａ）ノックアウトされたｐｅｘ３をコードするポリヌクレオチド、及び
（ｂ）Ｃ16/18エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ、及びマロニルＣｏＡシンテターゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、組換え油性ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組換え油性ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項３】
前記アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが前記宿主細胞に安定的に組み込まれている、請求項１又は２に記載の組換え油性ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞。
【請求項４】
エイコサペンタエン酸を含む油を作製する方法であって、
請求項１から３のいずれか１項に記載の組換え油性ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸を含む油が産生されるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、各々が２００９年６月１６日に出願され、且つ各々が本明細書によって全体として参照により援用される米国仮特許出願第６１／１８７３６６号明細書、同第６１／１８７３６８号明細書及び同第６１／１８７３５９号明細書の利益を主張する。
【０００２】
本発明はバイオテクノロジーの分野である。より具体的には、本発明は、アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］をコードする遺伝子の過剰発現に基づき、長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］を産生する組換え油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率及び／又はΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体膜の主成分であるグリセロリン脂質は、ｓｎ−１位及びｓｎ−２位にＲ基として脂肪酸が結合し、且つｓｎ−３位にリン酸ジエステル結合を介して極性頭部基がつながったグリセロールコアを含む。具体的な極性頭部基（例えば、ホスファチジン酸、クロリン（ｃｈｌｏｌｉｎｅ）、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール、セリン、カルジオリピン）が特定のグリセロリン脂質に与えられる名前を決定し、従ってホスファチジルコリン［「ＰＣ」］、ホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］、ホスファチジルグリセロール［「ＰＧ」］、ホスファチジルイノシトール［「ＰＩ」］、ホスファチジルセリン［「ＰＳ」］及びカルジオリピン［「ＣＬ」］となる。グリセロリン脂質は、様々なホスホリル頭部基に起因するのみならず、その脂肪酸の種々の鎖長及び飽和度の結果でもある著しい多様性を有する。概して、飽和及び一価不飽和脂肪酸はｓｎ−１位でエステル化される一方、多価不飽和脂肪酸はｓｎ−２位でエステル化される。
【０００４】
グリセロリン脂質生合成は複合的である。以下の表１は、Ｋｅｎｎｅｄｙ及びＷｅｉｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２２２：１９３〜２１４頁（１９５６年））によって最初に記載された、デノボ経路におけるステップを要約する。
【０００５】
【表１】
0005931721.tif 000002
【０００６】
これらのデノボ合成の後、グリセロリン脂質は、ｓｎ−２位で脂肪酸アシル組成の急速な代謝回転を受け得る。この「リモデリング」、又は「アシルエディティング」は、膜構造及び機能、ストレス条件に対する生体反応、並びに生物工学的応用における脂肪酸の組成及び量の操作に重要である。具体的には、リモデリングは、グリセロリン脂質の脱アシル化及び得られるリゾリン脂質の続く再アシル化が原因とされている。
【０００７】
Ｌａｎｄｓサイクル（Ｌａｎｄｓ，Ｗ．Ｅ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３１：８８３〜８８８頁（１９５８年））では、リモデリングは、１）ホスファチジルコリンのｓｎ−２位から脂肪酸を遊離させるホスホリパーゼ、例えばホスホリパーゼＡ2と；２）ｓｎ−２位のリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］を再アシル化するアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＬＡＴ」］、例えばリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］との協調的作用によって起こる。他のグリセロリン脂質もまた、リゾホスファチジルエタノールアミンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＥＡＴ」］活性、リゾホスファチジルセリンアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＳＡＴ」］活性、リゾホスファチジルグリセロールアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＧＡＴ」］活性及びリゾホスファチジルイノシトールアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＩＡＴ」］活性を有するＬＰＬＡＴ酵素を含め、そのそれぞれのリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性によりリモデリングに関与し得る。いずれの場合にも、ＬＰＬＡＴは、細胞内アシルＣｏＡプールからのアシルＣｏＡ脂肪酸の除去及びリン脂質プールにおけるｓｎ−２位での様々なリゾリン脂質基質のアシル化に関与する。最後に、ＬＰＬＡＴはまた、ＬＰＡからのＰＡのデノボ生合成に関与するＬＰＡＡＴ酵素も含む。ＬＰＣＡＴ活性には２つの構造的に異なるタンパク質ファミリーが関連し、一方はＬＰＡＡＴタンパク質ファミリーに属し、他方は膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］タンパク質ファミリーに属する。
【０００８】
他の場合、このｓｎ−２位リモデリングは、ＬＰＣＡＴ活性を有する酵素の正反応及び逆反応が原因とされている（Ｓｔｙｍｎｅ  Ｓ．及びＡ．Ｋ．Ｓｔｏｂａｒｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２２３（２）：３０５〜３１４頁（１９８４年））。
【０００９】
Ｓｈｉｎｄｏｕらによるいくつかの最近のレビューに、グリセロリン脂質生合成の概要及びＬＰＬＡＴの役割が提供されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８４（１）：１〜５頁（２００９年）；Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、５０：Ｓ４６〜Ｓ５１頁（２００９年））。様々な保存モチーフに基づき多数のＬＰＬＡＴが一般文献及び特許文献に報告されている。
【００１０】
脂肪酸生合成ではアシルＣｏＡプールとリン脂質プールとの間でアシル基が迅速に交換される必要があるため、ＬＰＬＡＴの多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］産生に対する効果もまた検討されている。具体的には、不飽和化が主にリン脂質のｓｎ−２位で起こる一方、ＣｏＡプールにおいてアシル伸長が起こる。例えば、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットは、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（クローンＴ０６Ｅ８．１）からのＬＰＣＡＴの単離について記載し、それぞれ１８：２脂肪酸又はα−リノレン酸［「ＡＬＡ」；１８：３］脂肪酸を外因的に加えたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の改変株においてＬＰＣＡＴを発現させたときの、それぞれΔ６不飽和化及びΔ６伸長の効率の増加、並びに長鎖ＰＵＦＡエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」；２０：２］及びエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」；２０：４］の生合成の増加を報告している。
【００１１】
さらに、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットの実施例１６は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ様タンパク質（配列番号９３における２８アミノ酸残基のＮ末端伸長部を除いて同じである、それぞれ４１７アミノ酸長又は３８９アミノ酸長を有する配列番号９３及び配列番号９５のタンパク質によりコードされる）の単離について記載している。国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットはまた、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットと同様の方法を用いてこれらのタンパク質の一方を発現させると、ＥＤＡ及びＥＴＡ生合成の同様の改良がもたらされることも報告している。
【００１２】
国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット及び国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットは双方とも、ＥＤＡ及びＥＴＡ生合成の改良が一部のＬＰＡＡＴ様タンパク質における可逆的ＬＰＣＡＴ活性に起因する（但し全てのＬＰＡＡＴ様タンパク質がＬＰＣＡＴ活性を有するわけではない）ことを教示している。これらの文献は、外因的な脂肪酸基質の供給を必要としない株又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）以外の微生物種においてＬＰＣＡＴ発現により改良がもたらされ得ることは教示していない。これらの文献はまた、改変微生物におけるＬＰＣＡＴの発現により、ＥＤＡ及びＥＴＡ以外の高ＬＣ−ＰＵＦＡ、例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡの産生増加がもたらされること、又はＬＰＣＡＴ発現によりΔ６不飽和化以外の代替的不飽和化反応の改良がもたらされ得ることも教示していない。いずれの参考文献も、外因的な脂肪酸供給のないΔ６伸長又はΔ４不飽和化のいずれかに対するＬＰＣＡＴ又はＬＰＡＡＴ様タンパク質の効果について教示していない。
【００１３】
多数の他の参考文献が、概して、トランスジェニック生物の油における所望の脂肪酸の量を増加させたり、全含油量を増加させたり、又は所望の脂肪酸の含量を選択的に増加させたりするためのＬＰＬＡＴのＰＵＦＡ生合成遺伝子との同時発現の利点について記載している（例えば、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレット、国際公開第２００６／０６９９３６号パンフレット、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、国際公開第２００９／００１３１５号パンフレット、国際公開第２００９／０１４１４０号パンフレット）。
【００１４】
上記の研究はなされたものの、これまで、ＥＤＡ及びＥＴＡ以外のＬＣ−ＰＵＦＡ、例えばエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸］及び／又はドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸］を高レベルで産生し、並びに外部的な脂肪酸供給なしにＣ18からＣ20への伸長変換効率が向上し、及び／又はΔ４不飽和化変換効率が向上するように改変した油性生物におけるＬＰＡＡＴ及びＬＰＣＡＴの効果については調査されてこなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、前記宿主細胞が、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なり、及び
さらに宿主細胞が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率の増加
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、宿主細胞に関する。
【００１６】
組換え油性微生物宿主細胞は、酵母、好ましくはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であってよい。
【００１７】
第２の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、長鎖多価不飽和脂肪酸が、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択され得る宿主細胞に関する。
【００１８】
第３の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ；及び、さらに宿主細胞が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；及び、
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも５％のΔ４不飽和化変換効率の増加
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する宿主細胞に関する。
【００１９】
第４の実施形態において、少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生の改良は、
ａ）対照宿主細胞と比較したときのエイコサペンタエン酸産生宿主細胞における少なくとも１３％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｃ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも１８％のΔ４不飽和化変換効率の増加；
ｄ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるエイコサペンタエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加；
ｅ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも２重量パーセントの増加；及び、
ｆ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のドコサヘキサエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加
からなる群から選択され得る。
【００２０】
第５の実施形態において、本発明は、本発明の油性微生物組換え宿主細胞から得られたエイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油に関する。
【００２１】
第６の実施形態において、本発明は、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油を作製する方法であって、
ａ）請求項３に記載の油性微生物宿主細胞を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油が産生されるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の微生物油を回収してもよいステップと、
を含む方法に関する。
【００２２】
第７の実施形態において、本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を増加させる方法であって
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法に関する。
【００２３】
第８の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、
ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときエイコサペンタエン酸産生宿主細胞において少なくとも１３％であり、及び／又はＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときドコサヘキサエン酸産生宿主細胞において少なくとも４％である、
方法に関する。
【００２４】
第９の実施形態において、本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、油性微生物宿主細胞のΔ４不飽和化変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法に関する。
【００２５】
第１０の実施形態において、本発明は、長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法であって、
ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）Δ４不飽和化変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したとき少なくとも１８％である、
方法に関する。
【００２６】
生物寄託
以下の生物学的材料がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０  ２２０９に寄託され、以下の指定番号、受託番号及び寄託日を有する。
【００２７】
【表２】
0005931721.tif 000003
【００２８】
上掲の生物学的材料は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」の条項に基づき寄託された。掲載される寄託物は、指定された国際寄託当局において少なくとも３０年間保管され、それを開示する特許の付与に伴い一般に利用可能となる。寄託物を利用可能であることは、政府の措置によって認められる特許権の特例における本発明の実施権をなすものではない。
図面の簡単な説明及び配列説明
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、この経路の説明を考察するときに合わせて見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を示し、この経路の説明を考察するときに合わせて見るべきである。
【図２】５１．２より高いＥＰＡ  ％  ＴＦＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株の展開を図示する。
【図３】ｐＹ１１６についてのプラスミドマップを提供する。
【図４】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５；及び、（Ｂ）ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ。
【図５】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＺＫＵＭ；及び、（Ｂ）ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ。
【図６】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５；及び、（Ｂ）ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３。
【図７】１８．６ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、２２．８ＤＰＡ  ％  ＴＦＡ及び９．７ＤＨＡ  ％  ＴＦＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ５０３７株の展開を図示する。
【図８】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４１Ｂ；及び、（Ｂ）ｐＺＫＬ３−４ＧＥＲ４４。
【図９】ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４４４についてのプラスミドマップを提供する。
【図１０】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＹ２０１、キメラＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む；及び、（Ｂ）ｐＹ１６８、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１１】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＹ２０８、キメラＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む；及び、（Ｂ）ｐＹ２０７、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【図１２】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＹ１７５、キメラＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む；及び、（Ｂ）ｐＹ１５３、キメラＦＢＡＩＮ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１遺伝子を含む。
【図１３】以下についてのプラスミドマップを提供する：（Ａ）ｐＹ２２２、キメラＹＡＴ１：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む；及び、（Ｂ）ｐＹ１７７、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含む。
【００３０】
本発明は、本願の一部をなす以下の詳細な説明及び添付の配列説明からより十全に理解することができる。
【００３１】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１条〜第１．８２５条（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列表要件（規則第５．２条及び第４９．５条（ａ−ｂｉｓ）、及び実施細則（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）第２０８条及び付属書Ｃ）に則っている。ヌクレオチド及びアミノ酸配列データに用いる記号及びフォーマットは、米国特許法施行規則第１．８２２条に規定される規則に準拠する。
【００３２】
配列番号１〜１０１は、表２に確認されるとおりのプロモーター、遺伝子若しくはタンパク質（若しくはその断片）をコードするＯＲＦ又はプラスミドである。
【００３３】
【表３−１】
0005931721.tif 000004
【表３−２】
0005931721.tif 000005
【表３−３】
0005931721.tif 000006
【表３−４】
0005931721.tif 000007
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書には、ＬＰＬＡＴ活性を有するポリペプチド（例えば、Ａｌｅ１、ＬＰＡＡＴ、及びＬＰＣＡＴ）の発現に基づき、長鎖多価不飽和脂肪酸［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］を産生する組換え油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率及び／又はΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法が記載される。Ｃ18からＣ20への伸長及び／又はΔ４不飽和化の変換効率を増加させることにより、ＬＣ−ＰＵＦＡエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」；シス−５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸］及び／又はドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」；シス−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸］の濃度が、全脂肪酸の重量パーセントとして増加した。組換え宿主細胞もまた特許請求される。
【００３５】
ＥＰＡ及びＤＨＡなどのＰＵＦＡ（又はその誘導体）は、経静脈栄養を受けている患者向けに、又は栄養失調症の予防若しくは治療のため、食事の代用品、又はサプリメント、特に人工栄養乳として使用されている。或いは、精製ＰＵＦＡ（又はその誘導体）は、通常の使用で摂取者が食事補給に望ましい量を取り込み得るように配合されて調理油、油脂又はマーガリン中に加えられることもある。ＰＵＦＡはまた、人工栄養乳、栄養サプリメント又は他の食製品および飲料製品中に加えられることもあり、心血管保護性、抗うつ性、抗炎症性又はコレステロール降下性の作用物質としての使用も見られ得る。その組成物は、ヒト又は獣医学の医薬用途に使用されてもよい。
【００３６】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、全体として参照により援用される。
【００３７】
本開示では、多数の用語及び略称が使用される。以下の定義を提供する。
【００３８】
「オープンリーディングフレーム」は「ＯＲＦ」と略される。
【００３９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は「ＰＣＲ」と略される。
【００４０】
「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」は「ＡＴＣＣ」と略される。
【００４１】
「多価不飽和脂肪酸」は「ＰＵＦＡ」と略される。
【００４２】
「ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ」は「ＤＡＧ  ＡＴ」または「ＤＧＡＴ」と略される。
【００４３】
「トリアシルグリセロール」は「ＴＡＧ」と略される。
【００４４】
「補酵素Ａ」は「ＣｏＡ」と略される。
【００４５】
「全脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略される。
【００４６】
「脂肪酸メチルエステル」は「ＦＡＭＥ」と略される。
【００４７】
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略される。
【００４８】
「長鎖多価不飽和脂肪酸」は「ＬＣ−ＰＵＦＡ」と略される。
【００４９】
「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」又は「リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」は「ＬＰＬＡＴ」と略される。
【００５０】
用語「発明」又は「本発明」は、本明細書で使用されるとき、本発明の任意の一つの特定の実施形態に限定することを意図するものではなく、概して、特許請求の範囲及び本明細書に記載されるとおりの本発明のいかなる実施形態にも適用される。
【００５１】
用語「グリセロリン脂質」は、脂肪酸がｓｎ−１位及びｓｎ−２位にあり、且つ極性頭部基（例えば、リン酸、コリン、エタノールアミン、グリセロール、イノシトール、セリン、カルジオリピン）がリン酸ジエステル結合を介してｓｎ−３位につながったグリセロールコアを有する幅広い分子クラスを指す。従ってグリセロリン脂質には、ホスファチジルコリン［「ＰＣ」］、ホスファチジルエタノールアミン［「ＰＥ」］、ホスファチジルグリセロール［「ＰＧ」］、ホスファチジルイノシトール［「ＰＩ」］、ホスファチジルセリン［「ＰＳ」］及びカルジオリピン［「ＣＬ」］が含まれる。
【００５２】
「リゾリン脂質」は、グリセロリン脂質から、ｓｎ−２位の脂肪酸を脱アシル化することにより誘導される。リゾリン脂質としては、例えば、リゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］、リゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］、リゾホスファチジルエタノールアミン［「ＬＰＥ」］、リゾホスファチジルセリン［「ＬＰＳ」］、リゾホスファチジルグリセロール［「ＬＰＧ」］及びリゾホスファチジルイノシトール［「ＬＰＩ」］が挙げられる。
【００５３】
用語「アシルトランスフェラーゼ」は、アシル基をドナー脂質からアクセプター脂質分子に転移させることに関与する酵素を指す。
【００５４】
用語「アシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」又は「リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ」［「ＬＰＬＡＴ」］は、ｓｎ−２位で様々なリゾリン脂質基質をアシル化する能力を有する幅広いアシルトランスフェラーゼクラスを指す。より具体的には、ＬＰＬＡＴは、ＬＰＡのＰＡへの変換を触媒する能力を有するＬＰＡアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］、ＬＰＣのＰＣへの変換を触媒する能力を有するＬＰＣアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＣＡＴ」］、ＬＰＥのＰＥへの変換を触媒する能力を有するＬＰＥアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＥＡＴ」］、ＬＰＳのＰＳへの変換を触媒する能力を有するＬＰＳアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＳＡＴ」］、ＬＰＧのＰＧへの変換を触媒する能力を有するＬＰＧアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＧＡＴ」］、及びＬＰＩのＰＩへの変換を触媒する能力を有するＬＰＩアシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＩＡＴ」］を含む。ＬＰＬＡＴ命名法の標準化は正式には行われていないため、当該技術分野では他の様々な呼称が用いられる（例えば、ＬＰＡＡＴはまたアシルＣｏＡ：１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸２−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ及び／又は１−アシルグリセロールリン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＡＧＰＡＴ」］とも称されており、及びＬＰＣＡＴは多くの場合にアシルＣｏＡ：１−アシルリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼとも称される）。加えて、一部のＬＰＬＡＴ、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１（ＯＲＦ  ＹＯＲ１７５Ｃ；配列番号９）が幅広い特異性を有し、従って単一の酵素が、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ及びＬＰＥＡＴ反応を含むいくつかのＬＰＬＡＴ反応を触媒する能力を有し得る点に留意することが重要である（Ｔａｍａｋｉ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：３４２８８〜３４２９８頁（２００７年）；Ｓｔａｈｌ，Ｕ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８２：３０５〜３０９頁（２００８年）；Ｃｈｅｎ，Ｑ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、５８１：５５１１〜５５１６頁（２００７年）；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：３０８４５〜３０８５５頁（２００７年）；Ｒｉｅｋｈｏｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８２：２８３４４〜２８３５２頁（２００７年））。
【００５５】
より具体的には、用語「少なくともリゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）［「ＬＰＣＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、反応：アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン  →  ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンの触媒能を有する酵素（ＥＣ  ２．３．１．２３）を指し得る。２個の構造的に異なるタンパク質ファミリー、すなわちＬＰＡＡＴタンパク質ファミリー（Ｈｉｓｈｉｋａｗａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０５：２８３０〜２８３５頁（２００８年）；国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット）及びＡＬＥ１タンパク質ファミリー（Ｔａｍａｋｉ，Ｈ．ら、上記；Ｓｔａｈｌ，Ｕ．ら、上記；Ｃｈｅｎ，Ｑ．ら、上記；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ，Ｍ．ら、上記；Ｒｉｅｋｈｏｆら、上記）におけるＬＰＣＡＴ活性について記載がなされている。
【００５６】
用語「ＬＰＣＡＴ」は、１）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１１（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約４５％のアミノ酸同一性を共有し；及び／又は、２）ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＭ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号３）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号４）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号５）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］タンパク質ファミリーモチーフを有するＡＬＥ１タンパク質ファミリーのタンパク質を指す。ＡＬＥ１ポリペプチドの例としては、ＳｃＡｌｅ１及びＹｌＡｌｅ１が挙げられる。
【００５７】
用語「ＳｃＡｌｅ１」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離された、配列番号８として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ（配列番号９）を指す（ＯＲＦ「ＹＯＲ１７５Ｃ」）。対照的に、用語「ＳｃＡｌｅ１Ｓ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する合成ＬＰＣＡＴ（すなわち、配列番号１２及び１３）を指す。
【００５８】
用語「ＹｌＡｌｅ１」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された、配列番号１０として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ（配列番号１１）を指す。
【００５９】
用語「ＬＰＣＡＴ」はまた、ＬＰＣＡＴ活性を有し（ＥＣ  ２．３．１．２３）、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも約９０％のアミノ酸同一性を共有するタンパク質も指す。
【００６０】
用語「ＣｅＬＰＣＡＴ」は、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）から単離された、配列番号１として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＣＡＴ酵素（配列番号２）を指す。対照的に、用語「ＣｅＬＰＣＡＴＳ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）に由来する合成ＬＰＣＡＴ（すなわち、配列番号６及び７）を指す。
【００６１】
用語「少なくともリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］活性を有するポリペプチド」は、アシルＣｏＡ＋１−アシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸  →  ＣｏＡ＋１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール３−リン酸の反応の触媒能を有する酵素（ＥＣ  ２．３．１．５１）を指し得る。
【００６２】
用語「ＬＰＡＡＴ」は、１）ＬＰＡＡＴ活性を有し、且つＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号１７（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号１８（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも約４３．９％のアミノ酸同一性を共有し；及び／又は、２）ＬＰＡＡＴ活性を有し、且つＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）及びＥＧＴＲ（配列番号２０）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するタンパク質を指す。ＬＰＡＡＴポリペプチドの例としては、ＳｃＬＰＡＡＴ、ＭａＬＰＡＡＴ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１が挙げられる。
【００６３】
用語「ＳｃＬＰＡＡＴ」は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から単離されたＬＰＡＡＴ（配列番号１８）を指す（ＯＲＦ「ＹＤＬ０５２Ｃ」）。
【００６４】
用語「ＭａＬＰＡＡＴ１」は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）から単離された、配列番号１４として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＡＡＴ（配列番号１５）を指す。対照的に、用語「ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現にコドン最適化された、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）に由来する合成ＬＰＡＡＴ（すなわち、配列番号２１及び２２）を指す。
【００６５】
用語「ＹｌＬＰＡＡＴ１」は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離された、配列番号１６として示されるヌクレオチド配列によりコードされるＬＰＡＡＴ（配列番号１７）を指す。
【００６６】
用語「オルソログ」は、系統樹解析の一つのクレードにあることによって明らかなとおり共通の祖先タンパク質から進化した、且つ同じ酵素反応を触媒する異なる種由来の相同タンパク質を指す。
【００６７】
用語「保存ドメイン」又は「モチーフ」は、進化的に関連性を有するタンパク質のアラインメントされた配列に沿った特定の位置に保存されている一組のアミノ酸を意味する。他の位置にあるアミノ酸は相同タンパク質間で異なり得るが、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、又は活性に不可欠なアミノ酸を示す可能性が高い。これらのアミノ酸はタンパク質相同体ファミリーのアラインメントされた配列におけるそれらの高い保存度によって識別されるため、新しく決定された配列を有するタンパク質が既に同定されているタンパク質ファミリーに属するかどうかを判断するための識別子、すなわち「シグネチャ」として用いることができる。
【００６８】
用語「油」は、２５℃で液体であり、且つ通常は多価不飽和の脂質物質を指す。油性生物においては、油が全脂質の大部分を構成する。「油」は、主としてトリアシルグリセロール［「ＴＡＧ」］からなるが、他の中性脂質、リン脂質及び遊離脂肪酸もまた含み得る。油中の脂肪酸組成と全脂質の脂肪酸組成とは概して同様である；従って、全脂質中のＰＵＦＡ濃度の上昇又は低下は油中のＰＵＦＡ濃度の上昇又は低下に対応し、及び逆も同様であり得る。
【００６９】
「中性脂質」は、一般に脂質体の細胞中に蓄積脂肪として見られる脂質を指し、細胞内ｐＨでは脂質は荷電基を含まないため、このように呼ばれる。概して、中性脂質は完全に非極性であり、水に対する親和性を有しない。中性脂質は、概してグリセロールの脂肪酸とのモノエステル、ジエステル、及び／又はトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール又はトリアシルグリセロールとも、又はまとめてアシルグリセロールとも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出させるには加水分解反応が起こらなければならない。
【００７０】
用語「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］は、グリセロール分子とエステル化された３個の脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、ＬＣ−ＰＵＦＡ及び飽和脂肪酸、並びにより短鎖の飽和及び不飽和脂肪酸を含み得る。
【００７１】
本明細書において用語「全脂肪酸」［「ＴＦＡ」］は、例えばバイオマス又は油であってもよい所与の試料において塩基エステル交換法（当該技術分野において公知のとおり）により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化され得る全ての細胞脂肪酸の合計を指す。従って、全脂肪酸には、中性脂質画分（ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール及びＴＡＧを含む）及び極性脂質画分（例えば、ＰＣ及びＰＥ画分を含む）の脂肪酸が含まれ、しかし遊離脂肪酸は含まれない。
【００７２】
細胞の「全脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の百分率としてのＴＦＡの尺度であり、しかしながら全脂質含量は、ＤＣＷの百分率としてのＦＡＭＥの尺度［「ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ」］として近似することができる。従って、全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷ当たりの全脂肪酸のミリグラム数と等価である。
【００７３】
全脂質中の脂肪酸の濃度は、本明細書では、ＴＦＡの重量パーセント［「％  ＴＦＡ」］、例えば１００ミリグラムのＴＦＡ当たりの所与の脂肪酸のミリグラム数として表される。本明細書の開示において特に具体的に指定しない限り、全脂質に対する所与の脂肪酸の百分率を参照するとき、それは％  ＴＦＡとしての脂肪酸の濃度に等しい（例えば、全脂質の％ＥＰＡは、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡに等しい）。
【００７４】
ある場合には、細胞中の所与の１つ又は複数の脂肪酸の含量を、乾燥細胞重量のその重量パーセント［「％  ＤＣＷ」］として表すことが有用である。従って、例えば、ＥＰＡ  ％  ＤＣＷは、以下の式、すなわち（ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）］／１００に従い決定され得る。しかしながら、乾燥細胞重量のその重量パーセント［「％  ＤＣＷ」］としての細胞中の所与の１つ又は複数の脂肪酸の含量は、（ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ）＊（ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ）］／１００として近似することもできる。
【００７５】
用語「脂質プロファイル」と「脂質組成」とは同義であり、特定の脂質画分中、例えば全脂質中又は油中に含まれる個別の脂肪酸の量を指し、ここでその量はＴＦＡの重量パーセントとして表される。混合物中の各個別の脂肪酸の百分率の合計は１００でなければならない。
【００７６】
用語「脂肪酸」は、約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族系酸（アルカン酸）を指し、しかしながらより長い鎖長及びより短い鎖長の双方の酸が公知である。大部分の鎖長はＣ16〜Ｃ22である。脂肪酸の構造は「Ｘ：Ｙ」の単純な表記法により表され、ここではＸが特定の脂肪酸中の炭素［「Ｃ」］原子の総数であり、及びＹが二重結合の数である。「飽和脂肪酸」とそれに対する「不飽和脂肪酸」、「一価不飽和脂肪酸」とそれに対する「多価不飽和脂肪酸」［「ＰＵＦＡ」］、及び「オメガ６脂肪酸」［「ω−６」又は「ｎ−６」］とそれに対する「オメガ３脂肪酸」［「ω−３」又は「ｎ−３」］との違いに関するさらなる詳細は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許第７，２３８，４８２号明細書に提供される。
【００７７】
本明細書においてＰＵＦＡを記載するために使用される命名法を表３に示す。表題「省略表記」の列に、オメガ参照体系を使用して、炭素数、二重結合数、及びその目的上番号１が付されるオメガ炭素から数えてオメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表のその他の部分では、ω−３及びω−６脂肪酸及びそれらの前駆体の一般名、本明細書全体を通じて使用される略称、並びに各化合物の化学名を要約する。
【００７８】
【表４】
0005931721.tif 000008
用語「長鎖多価不飽和脂肪酸」［「ＬＣ−ＰＵＦＡ」］は、Ｃ20又はそれ以上の鎖長を有するＰＵＦＡを指す。従って、用語ＬＣ−ＰＵＦＡは、少なくともＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＤＰＡ及びＤＨＡを含む。
【００７９】
生化学的意味における代謝経路、又は生合成経路は、細胞によって利用若しくは貯蔵される代謝産物の形成、又は別の代謝経路の開始（このときフラックス発生段階と称される）のいずれかを実現するための、酵素の触媒により細胞内で順々に起こる一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑で、所望の正確な化学構造を有する産物に作り上げるには出発物質の段階的な修飾を伴う。
【００８０】
用語「ＰＵＦＡ生合成経路」は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ及びＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸並びにＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程については文献に十分な記載がある（例えば、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照のこと）。要約すれば、この過程には、小胞体膜に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特定の伸長酵素及び不飽和化酵素を介した、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長及び二重結合の付加による分子の不飽和化が関わる。より具体的には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、ＰＵＦＡの生合成に関連する以下の酵素（及び前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す：Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ及び／又はＣ20/22エロンガーゼ。
【００８１】
用語「デサチュラーゼ」は、対象の脂肪酸又は前駆体が産生されるように１つ又は複数の脂肪酸に不飽和化、すなわち二重結合の導入をもたらすことができるポリペプチドを指す。本明細書全体を通じ、オメガ参照体系を使用して特定の脂肪酸を参照するが、デルタ体系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることによりデサチュラーゼの活性を示すことがより好都合である。本明細書において特に関心対象となるのは、Δ８デサチュラーゼ；Δ５デサチュラーゼ；Δ１７デサチュラーゼ；Δ１２デサチュラーゼ；Δ１５デサチュラーゼ；Δ９デサチュラーゼ；Δ６デサチュラーゼ；及びΔ４デサチュラーゼである。Δ１７デサチュラーゼは、及びΔ１５デサチュラーゼもまた、ω−６脂肪酸をそのω−３カウンターパートに変換するそれらの能力に基づき「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、及び／又は「ω−３デサチュラーゼ」と称されることもある。
【００８２】
用語「エロンガーゼ」は、そのエロンガーゼが作用する脂肪酸基質より炭素２個分長い酸が産生されるように脂肪酸炭素鎖を伸長させることのできるポリペプチドを指す。この伸長プロセスは、国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されるとおり、脂肪酸シンターゼと関連した多段階の機序で起こる。エロンガーゼ系により触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへの、ＳＴＡからＥＴＡへの、ＡＲＡからＤＴＡへの、及びＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般に、エロンガーゼの基質選択性はいくらか幅が広く、鎖長と不飽和の程度及び種類との双方により区別される。例えば、Ｃ14/16エロンガーゼはＣ14基質（例えば、ミリスチン酸）を利用し、Ｃ16/18エロンガーゼはＣ16基質（例えば、パルミチン酸）を利用し、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質（例えＧＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ）を利用し、及びＣ20/22エロンガーゼ（Δ５エロンガーゼ又はＣ２０エロンガーゼは同義的に使用し得る）はＣ20基質（例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ）を利用する。本明細書の目的上、２つの異なる種類のＣ18/20エロンガーゼが定義され得る：Δ６エロンガーゼはＧＬＡ及びＳＴＡのそれぞれＤＧＬＡ及びＥＴＡへの変換を触媒し、一方Δ９エロンガーゼはＬＡ及びＡＬＡのそれぞれＥＤＡ及びＥＴｒＡへの変換を触媒することができる。
【００８３】
用語「変換効率」及び「基質変換率」は、デサチュラーゼ、又はエロンガーゼなどの特定の酵素が基質を産物に変換する効率を指す。変換効率は、以下の式：（［産物］／［基質＋産物］）＊１００に従い計測され、式中「産物」は、直接の産物及びそれから誘導された経路中の全ての産物を含む。
【００８４】
用語「Ｃ18からＣ20への伸長変換効率」は、Ｃ18//20エロンガーゼがＣ18基質（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ、ＧＬＡ、ＳＴＡ）をＣ20産物（すなわち、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ）に変換することができる効率を指す。このようなＣ18//20エロンガーゼはΔ９エロンガーゼ又はΔ６エロンガーゼのいずれかであり得る。
【００８５】
用語「Δ９伸長変換効率」及び「Δ９エロンガーゼ変換効率」は、Δ９エロンガーゼがＣ18基質（すなわち、ＬＡ、ＡＬＡ）をＣ20産物（すなわち、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ）に変換することができる効率を指す。
【００８６】
用語「Δ４不飽和化変換効率」及び「Δ４デサチュラーゼ変換効率」は、Δ４デサチュラーゼが基質（すなわち、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−３）を産物（すなわち、ＤＰＡｎ−６、ＤＨＡ）に変換することができる効率を指す。
【００８７】
用語「油性の」は、エネルギー源を油の形態で貯蔵する傾向を有する生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年所収）。概して、油性微生物の細胞含油量はシグモイド曲線に従い、ここでは脂質の濃度が後期対数増殖期又は初期定常増殖期に最高値に達するまで増加し、次に後期定常期及び死滅期の間に徐々に減少する（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ及びＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。油性微生物がその乾燥細胞重量の約２５％を上回って油として蓄積することは稀ではない。油性微生物としては、様々な細菌、藻類、ユーグレナ、コケ、真菌（例えば、モルティエラ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ））、酵母及びストラメノパイル（例えば、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））が挙げられる。
【００８８】
用語「油性酵母」は、油を作ることのできる酵母として分類される微生物を指す。油性酵母の例としては、何ら限定されるものではないが、以下の属：ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。
【００８９】
用語「発酵性炭素源」は、微生物がエネルギーを得るために代謝する炭素源を意味する。典型的な炭素源としては、限定はされないが、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート及び炭素含有アミンが挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用されるとき、用語「バイオマス」は、商業的に有意な量でＰＵＦＡを産生する組換え生産宿主の発酵により消費又は使用された細胞物質を具体的に指し、ここで好ましい産生宿主は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の組換え油性酵母株である。バイオマスは、全細胞、全細胞ライセート、ホモジナイズされた細胞、部分的に加水分解された細胞物質、及び／又は部分的に精製された細胞物質（例えば、微生物により産生された油）の形態であってもよい。
【００９１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」、「核酸断片」及び「単離核酸断片」は、本明細書では同義的に使用される。これらの用語はヌクレオチド配列などを包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってよく、合成の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。ＤＮＡポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１つ又は複数のセグメント、又はそれらの混合物からなり得る。ヌクレオチド（通常、その５’−一リン酸の形態で存在する）は、以下のとおりの一文字表記により示される：アデニレート又はデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡ又はＤＮＡについて）に対する「Ａ」、シチジレート又はデオキシシチジレートに対する「Ｃ」、グアニレート又はデオキシグアニレートに対する「Ｇ」、ウリジレートに対する「Ｕ」、デオキシチミジレートに対する「Ｔ」、プリン（Ａ又はＧ）に対する「Ｒ」、ピリミジン（Ｃ又はＴ）に対する「Ｙ」、Ｇ又はＴに対する「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴに対する「Ｈ」、イノシンに対する「Ｉ」、及び任意のヌクレオチドに対する「Ｎ」。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、核酸断片は、一本鎖形態の核酸断片が適切な温度及び溶液イオン強度条件下で他の核酸断片とアニールされるとき、別の核酸断片、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡ分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、本明細書によって参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）、特に第１１章及び表１１．１に例示される。
【００９３】
アミノ酸又はヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列又は遺伝子のヌクレオチド配列を、当業者による手動での配列評価によるか、又はＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを用いるコンピュータにより自動化された配列比較及び同定によって当該のポリペプチド又は遺伝子を推定上同定するのに十分に含む部分である。概して、ポリペプチド又は核酸配列を既知のタンパク質又は遺伝子と相同であると推定上同定するためには、１０個以上の連続するアミノ酸又は３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、配列依存的な遺伝子同定（例えば、サザンハイブリダイゼーション）及び単離方法、例えば細菌コロニー又はバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーションにおいては、２０〜３０個の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが用いられ得る。加えて、ＰＣＲでは、１２〜１５塩基の短鎖オリゴヌクレオチドが増幅プライマーとして用いられ、そのプライマーを含む特定の核酸断片が得られ得る。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、配列を含む核酸断片を具体的に同定し、及び／又は単離するのに十分な配列を含む。
【００９４】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表して使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、用語「相同性」及び「相同的」は同義的に使用される。これらは、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介する、又は特定の表現型を産生する核酸断片の能力に影響を与えない核酸断片を指す。これらの用語はまた、得られる核酸断片の機能上の特性を当初の未修飾断片と比べて実質的に変質させることのない１つ又は複数のヌクレオチドの欠失又は挿入などの核酸断片の修飾も指す。
【００９６】
さらに、当業者は、相同核酸配列が、中程度にストリンジェントな条件下、例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃で、本明細書に例示される配列、又は本明細書に開示されるヌクレオチド配列及びそれと機能的に等価な配列の任意の一部分とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片、例えば遠縁の生物由来の相同配列から、高度に類似した断片、例えば近縁の生物由来の機能酵素を複製する遺伝子までをスクリーニングするよう調整され得る。ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」、第Ｉ部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；及び「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）に見られる。
【００９７】
本明細書で使用されるとき、用語「同一性パーセント」は、２個以上のポリペプチド配列又は２個以上のポリヌクレオチド配列の間の、配列を比較することにより決定されるとおりの関係を指す。「同一性」はまた、場合によっては、比較される配列間のマッチ率により決定されるとおりのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味することもある。「同一性パーセント」及び「類似性パーセント」は、限定はされないが、１）「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」第Ｉ部（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；及び、５）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）に記載されるものを含め、公知の方法によって容易に計算することができる。
【００９８】
同一性パーセントの好ましい決定方法は、試験する配列間のベストマッチをもたらすように設計される。同一性パーセント及び類似性パーセントの決定方法は、公開されているコンピュータプログラムにコードとして体系化されている。配列アラインメント及び同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを使用して実行されてもよい。配列の多重アラインメントは「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を用いて実行され、この方法は、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法」及び「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法」（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９〜１９１頁（１９９２年）により記載される）を含めた数種類のアルゴリズムを包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）（バージョン８．０．２）プログラムに含まれる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いる多重タンパク質アラインメントのデフォルトパラメータは、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト（ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ、「スロー−アキュレート（ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）」オプションに対応する。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列のアラインメント後、プログラムの「配列距離」テーブルを見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。
【００９９】
当業者には、他の種からのポリペプチドの同定においては多くの配列同一性レベルが有効であることが十分に理解され、ここでかかるポリペプチドは、同じ若しくは類似した機能又は活性を有する。有効な同一性パーセントの例としては、３４％〜１００％の任意の整数百分率、例えば、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が挙げられる。また、この単離ヌクレオチド断片の任意の全長の又は部分的な相補体も対象となる。好適な核酸断片は上記の相同性を有するのみならず、典型的には、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、及び最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１００】
「コドン縮重」は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列が変化することが可能な遺伝子コードにおける性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞が呈する「コドンバイアス」を十分に理解している。従って、宿主細胞における発現を向上させるために遺伝子を合成するときには、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近付くように遺伝子を設計することが望ましい。
【０１０１】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらのオリゴヌクレオチド構成要素はアニールされ、次にライゲートされて遺伝子セグメントを形成し、次にそのセグメントが酵素的に組み立てられて遺伝子全体が構築される。従って遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するヌクレオチド配列の最適化に基づき、最適な遺伝子発現に適応したものとされる。当業者は、コドン使用が宿主に好都合なコドンに偏っている場合に遺伝子発現が成功する可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができ、配列情報が利用可能である。例えば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）についてのコドン使用プロファイルが米国特許第７，１２５，６７２号明細書に提供される。
【０１０２】
「遺伝子」は、特異的タンパク質を発現する核酸断片を指し、これはコード領域のみを指すことも、又はコード配列の前にあり（５’非コード配列）、及びその後ろにある（３’非コード配列）調節配列を含むこともある。「天然遺伝子」は、その独自の調節配列と共に天然に存在するとおりの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではなく、天然では同時に存在することのない調節配列及びコード配列を含む任意の遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列か、又は同じ供給源に由来するが、天然に存在するものとは異なる形で構成された調節配列及びコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中でその天然の位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、又はキメラ遺伝子を含み得る。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノムに導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」は、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度を模倣するよう設計された遺伝子である。
【０１０３】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その範囲内、又はその下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす。調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば、転写開始部位と翻訳開始コドンとの間の）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステム−ループ構造を挙げることができる。
【０１０４】
「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。概して、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、全体として天然遺伝子から得られてもよく、又は天然に存在する異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されてもよく、又はさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。当業者は、異なるプロモーターが異なる組織若しくは細胞型における、又は異なる発生段階での、又は異なる環境若しくは生理学的条件に応じた遺伝子の発現を誘導し得ることを理解する。ほとんどの細胞型においてほとんどの場合に遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合に調節配列の正確な境界は完全には定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることが認識される。
【０１０５】
用語「３’非コード配列」及び「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これはポリアデニル化認識配列と、ｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に作用することが可能な調節シグナルをコードする他の配列とを含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に作用することを特徴とする。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼし得る。
【０１０６】
「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼの触媒により転写される結果として生じる産物を指す。ＲＮＡ転写産物はＤＮＡ配列の完全な相補コピーであるとき、それは一次転写産物と称され、又は一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」すなわち「ｍＲＮＡ」は、イントロンがなく、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的な、且つそれから誘導される二本鎖ＤＮＡを指す。
【０１０７】
用語「作動可能に連結された」は、一方の機能が他方によって影響を受けるように単一の核酸断片上において核酸配列が関連付けられていることを指す。例えば、プロモーターは、それがコード配列の発現に作用することが可能なとき、当該コード配列と作動可能に連結されている。すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、調節配列にセンス方向又はアンチセンス方向に作動可能に連結され得る。
【０１０８】
用語「発現」は、本明細書で使用されるとき、センス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定的な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともある。
【０１０９】
「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への導入を指す。核酸分子は、例えば自己複製するプラスミドであってもよく、又は核酸分子は宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」又は「組換え」又は「形質転換された」又は「形質転換体」生物と称される。
【０１１０】
「安定形質転換」は、遺伝学的に安定した遺伝をもたらす、核ゲノム及びオルガネラゲノムの双方を含めた宿主生物ゲノムへの核酸断片の導入を指す（すなわち、核酸断片は「安定的に組み込まれる」）。対照的に、「一過性形質転換」は、組み込み若しくは安定的な遺伝のない遺伝子発現をもたらす、宿主生物の核、又はＤＮＡを含む細胞小器官への核酸断片の導入を指す。
【０１１１】
用語「プラスミド」及び「ベクター」は、細胞の中央代謝の一部ではない、且つ通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態の遺伝子を有することが多い追加的な染色体エレメントを指す。かかるエレメントは、任意の供給源由来の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡの直鎖状又は環状の自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよく、そこでは複数のヌクレオチド配列がつなぎ合わされ、又は組み換えられて、１つ又は複数の発現カセットを細胞に導入することが可能な固有の構成となっている。
【０１１２】
用語「発現カセット」は、選択された遺伝子のコード配列と、選択された遺伝子産物の発現に必要な、コード配列の前にある（５’非コード配列）及びその後ろにある（３’非コード配列）調節配列とを含むＤＮＡの断片を指す。従って、発現カセットは典型的には、１）プロモーター配列；２）コード配列［「ＯＲＦ」］、及び３）真核生物では通常ポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（すなわち、ターミネーター）から構成される。１つ又は複数の発現カセットは通常ベクター内に含まれ、クローニング及び形質転換が促進される。各宿主に適切な調節配列が使用される限り、種々の発現カセットを、細菌、酵母、植物及び哺乳動物細胞を含めた種々の生物に形質転換することができる。
【０１１３】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピュータアルゴリズム又はソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものであっても、又は独自に開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はされないが、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  バージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））；３）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；及び５）スミス−ウォーターマンアルゴリズムを組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ  １９９２、１１１〜２０頁、編者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を挙げることができる。本願の文脈の範囲内で、配列分析ソフトウェアを使用して分析が行われる場合、特記されない限り、分析の結果は参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づき得ることは理解されるであろう。本明細書で使用されるとき「デフォルト値」は、初回の初期化時に最初にソフトウェアにロードされる任意の一組の値又はパラメータを意味し得る。
【０１１４】
先述のとおり、ＬＰＬＡＴをコードする遺伝子は、グリセロリン脂質のデノボ合成及びリモデリングにおけるその本質的な役割に基づきあらゆる真核細胞に見られ、ここでＬＰＬＡＴは細胞内アシルＣｏＡプールからアシルＣｏＡ脂肪酸を除去し、リン脂質プールにおいてｓｎ−２位で様々なリゾリン脂質基質をアシル化する。公開されているＬＰＬＡＴのコード配列としては、ＳｃＡｌｅ１（配列番号９）、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）及びＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２）が挙げられる。ＳｃＡｌｅ１（配列番号９）及びＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）タンパク質配列を問い合わせ配列として使用して、公開されているＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース（「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ、仏国）からオルソログを同定した（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）もまた参照のこと）。ベストヒットの分析に基づき、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴオルソログが、本明細書ではそれぞれＹｌＡｌｅ１（配列番号１１）及びＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）として同定される（実施例５、下記を参照のこと）。
【０１１５】
好ましい宿主生物内の特定のＬＰＬＡＴ遺伝子又はタンパク質の配列が未知である場合、本明細書で配列番号２、９、１１、１５、１７及び１８として示されるＬＰＬＡＴ配列、又はその一部を使用することにより、同じ又は他の藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイル、酵母又は植物種におけるＬＰＬＡＴ相同体を配列分析ソフトウェアを用いて検索してもよい。概して、かかるコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、及び他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることにより類似配列をマッチさせる。核酸又はタンパク質配列のデータベースに対する任意のＬＰＬＡＴタンパク質の比較、及びそれによる好ましい宿主生物内の既知の類似配列の同定については、低複雑度フィルタ及び以下のパラメータ、すなわち、期待値＝１０、行列＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））でのＢＬＡＳＴＰアラインメント法などのソフトウェアアルゴリズムが周知されている。
【０１１６】
ソフトウェアアルゴリズムを使用した既知の配列データベースの綿密な検索は、配列番号２、９、１１、１５、１７及び１８に示されるものなどの、公開されているＬＰＬＡＴ配列との同一性パーセントが比較的低い相同体の単離に特に好適である。公開されているＬＰＬＡＴ配列との同一性が少なくとも約７０％〜８５％のＬＰＬＡＴ相同体については、単離は比較的容易であろうことが予想される。さらに、少なくとも約８５％〜９０％同一である配列が単離に特に好適であり、及び少なくとも約９０％〜９５％同一である配列が最も容易に単離され得る。
【０１１７】
ＬＰＬＡＴ相同体はまた、ＬＰＬＡＴ酵素に固有のモチーフを用いることによって同定することもできる。これらのモチーフは、ＬＰＬＡＴタンパク質のなかでタンパク質の構造、安定性又は活性に重要な領域を表す可能性が高く、これらのモチーフは、新規ＬＰＬＡＴ遺伝子を迅速に同定するための診断ツールとして有用である。
【０１１８】
様々なＬＰＬＡＴモチーフが提案されており、分析されたアラインメントに含まれる特定の種に基づき僅かな違いがある。例えば、Ｓｈｉｎｄｏｕら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、３８３：３２０〜３２５頁（２００９年））は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来の配列のアラインメントに基づき、以下の膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフがＬＰＬＡＴ活性に重要となることを提案した：ＷＤ、ＷＨＧｘｘｘＧＹｘｘｘＦ（配列番号２３）、ＹｘｘｘｘＦ（配列番号２４）及びＹｘｘｘＹＦｘｘＨ（配列番号２５）。そのうち、ＷＤ、ＷＨＧｘｘｘＧＹｘｘｘＦ及びＹｘｘｘｘＦモチーフはＳｃＡｌｅ及びＹｌＡｌｅ１に存在するが、ＹｘｘｘＹＦｘｘＨモチーフは存在しない。Ａｌｅ１相同体の代替的な非植物モチーフもまた、米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７−Ａ１号明細書に記載されている；具体的にはそれらとしては、Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号２６）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号２７）、ＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号２９）が挙げられる。
【０１１９】
同様に、Ｌｅｗｉｎ，Ｔ．Ｗ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：５７６４〜５７７１頁（１９９９年））及びＹａｍａｓｈｉｔａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１７７１：１２０２〜１２１５頁（２００７年））は、細菌、酵母、線虫及び哺乳動物由来の配列のアラインメントに基づき、以下の１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］ファミリーモチーフがＬＰＬＡＴ活性に重要となることを提案した：ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）、ＧｘｘＦＩ−［Ｄ／Ｒ］−Ｒ（配列番号３０）、ＥＧＴＲ（配列番号２０）及び［Ｖ／Ｉ］−［Ｐ／Ｘ］−［Ｉ／Ｖ／Ｌ］−［Ｉ／Ｖ］−Ｐ−［Ｖ／Ｉ］（配列番号３１）又はＩＶＰＩＶＭ（配列番号３２）のいずれか。ＮＨｘｘｘｘＤ及びＥＧＴＲモチーフはＭａＬＰＡＡＴ１、ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴに存在するが、他のモチーフは存在しない。
【０１２０】
本明細書に記載されるものを含め、公開されているＡｌｅ１、ＬＰＣＡＴ及びＬＰＡＡＴタンパク質配列に基づけば、本発明は、以下のＭＢＯＡＴファミリーモチーフ：Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号３）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号４）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号５）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）に関する。同様に、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフは、ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）及びＥＧＴＲ（配列番号２０）として示されるものである。
【０１２１】
或いは、公開されているＬＰＬＡＴ配列又はそのモチーフは、相同体を同定するためのハイブリダイゼーション試薬であってもよい。ハイブリダイゼーション方法は、上述のとおり当業者には公知である。
【０１２２】
ＬＰＬＡＴ核酸断片のいずれか又は任意の同定された相同体を使用して、同じ又は他の藻類、真菌、卵菌、ユーグレナ、ストラメノパイル、酵母又は植物種由来の相同タンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は当該技術分野において公知である。配列依存プロトコルの例としては、限定はされないが、１）核酸ハイブリダイゼーション方法；２）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの核酸増幅技法の様々な使用により例示されるとおりの、ＤＮＡ及びＲＮＡ増幅方法；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２：１０７４頁（１９８５年））；又は鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年））；及び、３）ライブラリ作成及び相補性によるスクリーニングの方法が挙げられる。
【０１２３】
例えば、公開されているＬＰＬＡＴ遺伝子又はそのモチーフと類似したタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子は、公開されている核酸断片の全て又は一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して任意の所望の生物のライブラリを公知の方法を用いてスクリーニングすることにより、直接単離することができる。公開されている核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを、当該技術分野において公知の方法により設計し、合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）。さらに、配列全体を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション又は末端標識技法、又は利用可能なインビトロ転写系を使用するＲＮＡプローブなど、当業者に公知の方法によりＤＮＡプローブを合成することができる。加えて、特異的プライマーを設計して使用し、公開されている配列又はそのモチーフの一部又は完全長を増幅することができる。得られた増幅産物は増幅反応中に直接標識するか、又は増幅反応後に標識し、適切なストリンジェンシーの条件下でプローブとして使用することにより完全長ＤＮＡ断片を単離することができる。
【０１２４】
典型的には、ＰＣＲタイプの増幅技法では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率性及び正確性の双方を有する複製を提供するように設計しなければならない。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、周知されている（Ｔｈｅｉｎ及びＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」所収、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、（１９８６年）３３〜５０頁、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」所収、Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、（１９９３年）第１５巻、３１〜３９頁、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｈｕｍａｎｉａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１２５】
概して利用可能なＬＰＬＡＴ配列の２つの短いセグメントがＰＣＲプロトコルで使用され、ＤＮＡ又はＲＮＡから相同遺伝子をコードするより長い核酸断片が増幅され得る。ＰＣＲはまた、一つのプライマーの配列が利用可能な核酸断片又はそのモチーフに由来するクローニングされた核酸断片のライブラリで実施されてもよい。他のプライマーの配列は、ｍＲＮＡ前駆体コード遺伝子の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１２６】
或いは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば、当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８頁（１９８８年））に従い、ＰＣＲを用いて転写産物中の単一の点と３’又は５’末端との間の領域のコピーを増幅することによってｃＤＮＡを作成することができる。３’及び５’方向に向くプライマーを、利用可能な配列から設計することができる。市販の３’ＲＡＣＥ又は５’ＲＡＣＥシステム（例えば、ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、特定の３’又は５’ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３頁（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：２１７頁（１９８９年））。
【０１２７】
直前に考察したこれらの公知の方法のいずれかに基づけば、選択される任意の好ましい真核生物においてＬＰＬＡＴ遺伝子相同体を同定及び／又は単離することが可能であり得る。Ｃ18からＣ20への伸長及び／又はΔ４不飽和化は、ＬＰＬＡＴ導入遺伝子が欠損している生物中のものと比べて増加するため（上記）、任意の推定ＬＰＬＡＴ遺伝子の活性は、ＬＣ−ＰＵＦＡ産生宿主生物内で遺伝子を発現させることによって容易に確認することができる。
【０１２８】
これまで、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中のＥＰＡ蓄積においてはＬＰＣＡＴが重要であり得るという仮説が立てられている（米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書）。この文献に記載されるとおり、この仮説は以下の研究に基づいた：１）Ｓｔｙｍｎｅ  Ｓ．及びＡ．Ｋ．Ｓｔｏｂａｒｔ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、２２３（２）：３０５〜３１４頁（１９８４年））、アシルＣｏＡプールとＰＣプールとの間の交換がＬＰＣＡＴの正反応及び逆反応に起因し得るという仮説を立てた；２）Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ら（Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．、２７８：３５１１５頁（２００３年））、ＰＣのｓｎ−２位にＧＬＡが蓄積されたこと、及び酵母ではＡＲＡを効率的に合成することができなかったことが、アシルＣｏＡプール内で起こるＰＵＦＡ生合成に関わる伸長ステップの結果であり、一方、主にＰＣのｓｎ−２位でΔ５及びΔ６不飽和化ステップが起こったことを示唆した；３）Ａｂｂａｄｉ，Ａ．ら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１６：２７３４〜２７４８頁（２００４年））、トランスジェニック油糧種子植物におけるＰＵＦＡ蓄積の制約条件に関する分析に基づき、ＬＰＣＡＴがΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の再構成の成功に重要な役割を果たすことを示唆した；及び、４）国際公開第２００４／０７６６１７  Ａ２号パンフレット（Ｒｅｎｚ，Ａ．ら）、Δ６伸長に好適な脂肪酸基質を外因的に加えたＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に遺伝子導入されたΔ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路の伸長効率を実質的に向上させたカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｔ０６Ｅ８．１）由来のＬＰＣＡＴをコードする遺伝子［「ＣｅＬＰＣＡＴ」］を提供した。Ｒｅｎｚらは、ＬＰＣＡＴにより、デサチュラーゼがＰＣ結合脂肪酸における二重結合の導入を触媒する一方でエロンガーゼが専らＣｏＡエステル化脂肪酸（アシルＣｏＡ）の伸長を触媒するため、新規に合成された脂肪酸のリン脂質とアシルＣｏＡプールとの間での効率的且つ連続的な交換が可能となったものと結論付けた。しかしながら、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットは、脂肪酸が外因的に加えられなかった宿主細胞におけるＣｅＬＰＣＡＴのΔ６伸長変換効率、Δ５伸長変換効率、又はΔ４不飽和化変換効率に対する効果は教示しなかった。
【０１２９】
本明細書では、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＴＡＧ画分中のＥＰＡ及びＤＨＡ蓄積にＬＰＡＡＴ及びＬＰＣＡＴが実に重要であることが実証される。しかしながら、意外にも、ＬＰＬＡＴの過剰発現によりΔ９エロンガーゼ変換効率及び／又はΔ４デサチュラーゼ変換効率の向上がもたらされ得ることが分かった。既に定義したとおり、変換効率は、Δ４デサチュラーゼ又はΔ９エロンガーゼなどの特定の酵素が基質を産物に変換することのできる効率を指す用語である。従って、ＥＰＡを産生するように改変された株では、Δ９エロンガーゼ変換効率の向上によりＥＰＡ  ％  ＴＦＡ又はＥＰＡ  ％  ＤＣＷの増加がもたらされることが示された。同様に、ＤＨＡを産生するように改変された株におけるΔ９エロンガーゼ及び／又はΔ４デサチュラーゼ変換効率の向上によりＤＨＡ  ％  ＴＦＡ又はＤＨＡ  ％  ＤＣＷの増加がもたらされることが示された。
【０１３０】
ＰＵＦＡ不飽和化はリン脂質で起こり、一方、脂肪酸伸長はアシルＣｏＡで起こる。先行研究に基づけば、従ってＬＰＬＡＴ過剰発現によりリン脂質における基質の利用能が向上するため不飽和化の向上がもたらされるであろうことが予想された一方、ＣｏＡプールにおける基質の利用能の向上を必要とする伸長の向上は、ＬＰＬＡＴの発現によってはもたらされないであろうと予想された。
【０１３１】
これらの前提はあったものの、実施例５は、ＬＰＬＡＴ発現がＤＨＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株における全ての不飽和化の変換効率を同程度に向上させるわけではないことを実証した。具体的には、Δ４デサチュラーゼの変換効率は選択的に向上したが、Δ１２、Δ８、Δ５又はΔ１７不飽和化では同様の向上は認められなかった。従ってリン脂質におけるＤＰＡ基質の利用能が限られている結果としてΔ４デサチュラーゼが制約となったという仮設が成り立つ。
【０１３２】
加えて、実施例４及び５は、ＬＰＬＡＴポリペプチドをコードする少なくとも１つの安定的に組み込まれたポリヌクレオチドに基づくＬＰＬＡＴ発現により、それぞれＥＰＡ及びＤＨＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株におけるΔ９エロンガーゼ変換効率が大幅に向上したことを実証している。しかしながら、意外にも、ＬＰＬＡＴはＥＰＡのＣ20/22伸長の効率についても、ＤＨＡ株におけるＤＰＡと同程度の向上をもたらすことはなかった。概して、ＬＰＬＡＴの過剰発現株における、それを過剰発現しない株と比べた全脂質含量に有意な変化はなかった。
【０１３３】
明らかに、ＰＵＦＡを産生する宿主細胞中でのＬＰＬＡＴ過剰発現の効果に関して広く一般化することは困難である。むしろ、ＬＰＬＡＴ活性の効果は、特定の活性を有する一部のデサチュラーゼ及びエロンガーゼ（すなわち、Δ１２デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ９エロンガーゼ、Ｃ14/16エロンガーゼ、Ｃ16/18エロンガーゼ、Ｃ18/20エロンガーゼ［「またΔ６エロンガーゼ」］、Ｃ20/22エロンガーゼ［「またΔ５エロンガーゼ」］）に基づくと考えなければならない。
【０１３４】
上記の考察に基づき、本明細書における一実施形態では、ＬＣ−ＰＵＦＡを産生する組換え油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を向上させる方法が提供され、ここで前記方法は、
ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを前記ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え宿主細胞に導入するステップであって、ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１１（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号３）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号４）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号５）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号１７（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号１８（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）及びＥＧＴＲ（配列番号２０）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率は対照宿主細胞と比べて増加する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加は、ＬＰＬＡＴポリペプチドをコードする少なくとも１つの安定的に組み込まれたポリヌクレオチドに基づき対照宿主細胞と比較したとき、少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを産生する油性微生物宿主細胞において少なくとも４％であり、しかしながら、少なくとも約４〜１０％、より好ましくは少なくとも約１０〜２０％、より好ましくは少なくとも約２０〜４０％、及び最も好ましくは少なくとも約４０〜６０％又はそれ以上の増加を含め、４％より大きいＣ18からＣ20への伸長変換効率の任意の増加が特に好ましい。
【０１３６】
例えば、本明細書において実証される一方法において、Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加は、対照宿主細胞と比較したときＥＰＡ産生宿主細胞において少なくとも１３％であり、Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加は、対照宿主細胞と比較したときＤＨＡ産生宿主細胞において少なくとも４％である。
【０１３７】
同様に、ＬＣ−ＰＵＦＡを産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法もまた本明細書に記載され、ここで前記方法は、
ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを前記ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え宿主細胞に導入するステップであって、ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１１（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号３）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号４）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号５）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号１７（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号１８（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）及びＥＧＴＲ（配列番号２０）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、油性微生物宿主細胞のΔ４不飽和化変換効率は対照宿主細胞と比べて増加する。
【０１３８】
好ましい実施形態において、Δ４不飽和化変換効率の増加は、ＬＰＬＡＴポリペプチドをコードする少なくとも１つの安定的に組み込まれたポリヌクレオチドに基づき対照宿主細胞と比較したとき、少なくとも１つのＬＣ−ＰＵＦＡを産生する油性微生物宿主細胞において少なくとも５％であり、しかしながら、少なくとも約５〜１０％、より好ましくは少なくとも約１０〜２０％、より好ましくは少なくとも約２０〜４０％、及び最も好ましくは少なくとも約４０〜６０％又はそれ以上の増加を含め、５％より大きいΔ４不飽和化変換効率の任意の増加が特に好ましい。
【０１３９】
例えば、本明細書において実証される一方法において、ＤＨＡ産生宿主におけるΔ４不飽和化変換効率の増加は、対照宿主細胞と比較したとき少なくとも１８％であった。
【０１４０】
上記の方法に加え、組換え宿主細胞もまた本明細書に記載される。具体的には、これらの組換え宿主細胞は、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドは、
（ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９（ＳｃＡｌｅ１）及び配列番号１１（ＹｌＡｌｅ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）Ｍ（Ｖ／Ｉ）ＬｘｘＫＬ（配列番号３）、ＲｘＫＹＹｘｘＷ（配列番号４）、ＳＡｘＷＨＧ（配列番号５）及びＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列（ＣｅＬＰＣＡＴ）と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５（ＭａＬＰＡＡＴ１）、配列番号１７（ＹｌＬＰＡＡＴ１）及び配列番号１８（ＳｃＬＰＡＡＴ１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｅ）ＮＨｘｘｘｘＤ（配列番号１９）及びＥＧＴＲ（配列番号２０）からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なり、及び組換え宿主細胞はさらに、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つのＬＣ  ＰＵＦＡを産生する油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つのＬＣ  ＰＵＦＡを産生する油性微生物宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率の増加；
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する。
【０１４１】
好ましい宿主細胞において、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは安定的に組み込まれ；及び、さらに宿主細胞は、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；及び、
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも５％のΔ４不飽和化変換効率の増加；
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する。
【０１４２】
ＬＰＬＡＴポリペプチドをコードする少なくとも１つの安定的に組み込まれたポリヌクレオチドを有するより好ましい宿主細胞において、少なくとも１つの改良は、
ａ）対照宿主細胞と比較したときのＥＰＡ産生宿主細胞における少なくとも１３％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときのＥＰＡ産生宿主細胞中のＴＦＡの少なくとも９％ＥＰＡの増加；
ｃ）対照宿主細胞と比較したときのＤＨＡ産生宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｄ）対照宿主細胞と比較したときのＤＨＡ産生宿主細胞中のＴＦＡの少なくとも２％ＥＰＡの増加；
ｅ）対照宿主細胞と比較したときのＤＨＡ産生宿主細胞における少なくとも１８％のΔ４不飽和化変換効率の増加；及び、
ｆ）対照宿主細胞と比較したときのＤＨＡ産生宿主細胞中のＴＦＡの少なくとも９％ＤＨＡの増加；
からなる群から選択される。
【０１４３】
当然ながら当業者は、上記に記載される改良が本明細書における本発明を限定するものではなく、例示と見なされるべきであることを理解しなければならない。
【０１４４】
上記の改良に基づけば、当業者は、長鎖ＰＵＦＡ、例えば、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを産生する組換え宿主細胞において、それらの脂肪酸の産生を最適化することが望ましい場合にＬＰＬＡＴを発現させることの価値を理解するであろう。
【０１４５】
組換えコンストラクトの作成に有用な標準的文献資料は、特に、１）ＤＮＡ分子、プラスミド等の巨大分子を構築、操作及び単離するための特定の条件及び手順；２）組換えＤＮＡ断片及び組換え発現コンストラクトの生成；及び、３）クローンのスクリーニング及び単離について記載している。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以下「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．及びＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．による「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；及びＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、刊行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）を参照のこと。
【０１４６】
概して、コンストラクトに含める配列の選択は、所望の発現産物、宿主細胞の性質及び形質転換細胞の非形質転換細胞との提案される分離手段に依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含む宿主細胞の形質転換、選択及び増殖を成功させるためにプラスミドベクターに存在しなければならない遺伝要素を認識している。しかしながら、典型的にはベクター又はカセットは、１つ又は複数の関連遺伝子の転写及び翻訳を誘導する配列と、選択可能なマーカーと、自己複製又は染色体組込みを可能にする配列とを含む。好適なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の領域５’、すなわちプロモーターと、遺伝子コード配列と、転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’、すなわちターミネーターとを含む。双方の制御領域が形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、しかしながらそれらは産生宿主にとって天然の遺伝子に由来しなくともよい。
【０１４７】
所望の宿主細胞中での異種遺伝子又はその一部の発現を駆動するのに有用な転写開始領域又はプロモーターは多数あり、周知されている。これらの制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲ及び／又は５’ＵＴＲ領域、及びタンパク質及び／又はＲＮＡ安定化エレメントが含まれ得る。かかるエレメントは、その強度及び特異性が異なり得る。選択された宿主細胞中でのそうした遺伝子の発現を誘導する能力を有する事実上任意のプロモーター、すなわち、天然、合成、又はキメラが好適であるが、宿主種由来の転写及び翻訳領域が特に有用である。宿主細胞中での発現は、誘導的又は構成的な形で起こり得る。誘導的発現は、対象ＬＰＬＡＴ遺伝子に作動可能に連結された調節性プロモーターの活性を誘導することによって起こり、一方、構成的発現は構成的プロモーターの使用により起こる。
【０１４８】
転写終結領域をコードする３’非コード配列が組換えコンストラクト中に提供されてもよく、開始領域が得られた遺伝子の３’領域由来であっても、又は異なる遺伝子由来であってもよい。多数の終結領域が公知であり、様々な宿主において、終結領域が由来したものと同じ及び異なる属及び種のいずれで利用されるときにも満足に機能する。終結領域はまた、好ましい宿主にとって天然の様々な遺伝子に由来してもよい。終結領域は、通常は任意の特定の特性についてではなく、むしろ便宜性から選択される。
【０１４９】
酵母での使用に特に有用な終結領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。γ−インターフェロン及びα−２インターフェロンをコードする哺乳動物遺伝子の３’−領域もまた、酵母で機能することが知られている。当業者は入手可能な情報を利用することにより転写ターミネーターとして機能する３’領域配列を設計及び合成することができるため、３’領域はまた合成のものであってもよい。終結領域はなくてもよいが、極めて好ましい。
【０１５０】
ベクターはまた、上記に記載される調節エレメントに加え、選択可能及び／又はスコア化可能マーカーを含んでもよい。好ましくはマーカー遺伝子は、細胞を抗生物質で処理する結果、形質転換されていない細胞の増殖阻害、又は死滅、及び形質転換細胞の阻害されることのない増殖をもたらす抗生物質耐性遺伝子である。酵母形質転換体の選択には、酵母で機能する任意のマーカーが有用であり、カナマイシン、ハイグロマイシン及びアミノグリコシドＧ４１８に対する耐性、並びにウラシル、リジン、ヒスチン（ｈｉｓｔｉｎｅ）又はロイシン欠損培地での増殖能力が特に有用である。
【０１５１】
単に遺伝子（例えば、ＬＰＬＡＴをコードするもの）をクローニングベクターに挿入するだけは、所望の速度、濃度、量等でのその発現は確実とはならない。高発現率に対する要求に応じて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性及び位置、酸素制限、及び宿主細胞からの分泌を制御する多数の異なる遺伝要素を操作することにより、多くの特殊な発現ベクターが生み出されている。操作された特徴のいくつかとしては、関連する転写プロモーター及びターミネーター配列の性質、クローニングされた遺伝子のコピー数及び遺伝子がプラスミドから産生されるか、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、合成されたタンパク質の最終的な細胞内位置、宿主生物中でのタンパク質の翻訳効率及び正しいフォールディング、宿主細胞内でのクローニングされた遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質の固有の安定性、及びその頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近付くような、クローニングされた遺伝子内でのコドン使用が挙げられる。これらの各々を本明細書に記載される方法及び宿主細胞において使用して、ＬＰＬＡＴ遺伝子の発現をさらに最適化してもよい。
【０１５２】
例えば、ＬＰＬＡＴ発現は、より強力なプロモーター（調節性のものであっても、又は構成的なものであっても）を使用して、ｍＲＮＡ又はコードされたタンパク質のいずれかから不安定な配列を除去する／欠失させることによるか、又は安定的な配列をｍＲＮＡに付加することによって発現の増加を生じさせることにより、転写レベルで増加し得る（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。或いは、遺伝子の追加的なコピーを単一の発現コンストラクト内にクローニングすることにより、又はプラスミドコピー数を増加させるか、若しくはクローニングされた遺伝子をゲノムに複数組み込むことによって追加的なコピーを宿主細胞に導入することにより、ＬＰＬＡＴ遺伝子の追加的なコピーを組換え宿主細胞に導入し、それによりＥＰＡ及び／又はＤＨＡの産生及び蓄積を増加させてもよい。
【０１５３】
プロモーター、ＬＰＬＡＴオープンリーディングフレーム［「ＯＲＦ」］及びターミネーターを含む少なくとも１つのキメラ遺伝子を含む組換えコンストラクトは、作成後、宿主細胞中での自己複製能を有するプラスミドベクター内に置かれるか、又は宿主細胞のゲノムに直接組み込まれる。発現カセットの組込みは、宿主ゲノム中でランダムに行うことができ、又は宿主遺伝子座との標的組換えに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含むコンストラクトを使用することによって標的化することもできる。コンストラクトが内因性遺伝子座に標的化される場合、転写及び翻訳調節領域の全て又は一部を内因性遺伝子座により提供することができる。
【０１５４】
別個の複製ベクターから２個以上の遺伝子を発現させる場合、各ベクターは異なる選択手段を有してもよく、安定した発現を維持し、且つコンストラクト間でのエレメントの混合を防止するため、他の１つ又は複数のコンストラクトと相同性があってはならない。調節領域、選択手段及び導入した１つ又は複数のコンストラクトの増殖方法の妥当な選択は、導入された遺伝子の全てが所望の産物の合成を提供するために必要なレベルで発現するように実験的に決定することができる。
【０１５５】
１つ又は複数の対象遺伝子を含むコンストラクトは、任意の標準的な技術により宿主細胞に導入され得る。それらの技法としては、形質転換、例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年））、遺伝子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、真空ろ過又は対象遺伝子を宿主細胞に導入する任意の他の方法が挙げられる。
【０１５６】
便宜上、例えば発現カセット中に、ＤＮＡ配列を取り込むように任意の方法によって操作された宿主細胞が、本明細書では「形質転換された」又は「組換え」又は「形質転換体」と称される。形質転換宿主は発現コンストラクトのコピーを少なくとも１つを有し、及び遺伝子がゲノムに組み込まれるか、増幅されるか、又は複数のコピー数を有する染色体外エレメントに存在するかに応じて、２つ以上を有してもよい。
【０１５７】
形質転換宿主細胞は、導入されたコンストラクトに含まれるマーカーを選択することにより同定することができる。或いは、多くの形質転換技法が多数のＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するため、別個のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと同時に形質転換してもよい。
【０１５８】
典型的には、形質転換宿主は選択培地でのその成長能力について選択され、選択培地には抗生物質が取り込まれているか、又は栄養若しくは成長因子などの、非形質転換宿主の成長に必要な因子が欠乏していもよい。導入されたマーカー遺伝子は抗生物質耐性を付与し、又は必須成長因子若しくは酵素をコードしてもよく、従って形質転換宿主が発現した場合に選択培地での成長を可能にする。形質転換宿主の選択はまた、発現したマーカータンパク質を、直接的或いは間接的に検出可能な場合にも行なうことができる。さらなる選択技法が米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載される。
【０１５９】
選択された宿主又は発現コンストラクトに関わらず、所望の発現レベル及びパターンを呈する株を得るには、複数の形質転換体をスクリーニングしなければならない。例えば、Ｊｕｒｅｔｚｅｋら（Ｙｅａｓｔ、１８：９７〜１１３頁（２００１年））は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における組み込まれたＤＮＡ断片の安定性が、使用される個々の形質転換体、受容株及び標的化プラットフォームに依存することを指摘している。かかるスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３頁（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５頁（１９９３年））、タンパク質発現のウェスタン解析、ＰＵＦＡ産物の表現型分析又はＧＣ分析によって達成され得る。
【０１６０】
オレイン酸がＬＣ−ＰＵＦＡに変換される代謝過程には、炭素原子の付加による炭素鎖の伸長及び二重結合の付加による分子の不飽和化が関与する。これは、小胞体膜に存在する一連の特別な不飽和化酵素及び伸長酵素を必要とする。しかしながら、図１で分かるとおり、及び以下に記載するとおり、ＬＣ−ＰＵＦＡの産生には複数の代替的な経路が存在する。
【０１６１】
具体的には、図１は以下に記載される経路を示す。全ての経路について、オレイン酸がΔ１２デサチュラーゼによって１番目のω−６脂肪酸であるリノール酸［「ＬＡ」］に最初に変換される必要がある。次に、「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」及び基質としてＬＡを用いて、以下のとおり長鎖ω−６脂肪酸が形成される：１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸［「ＥＤＡ」］に変換される；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸［「ＤＧＬＡ」］に変換される；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸［「ＡＲＡ」］に変換される；４）ＡＲＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサテトラエン酸［「ＤＴＡ」］に変換される；及び、５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡｎ−６」］に変換される。
【０１６２】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」はまた、基質としてα−リノレン酸［「ＡＬＡ」］を用いて、以下のとおり長鎖ω−３脂肪酸を産生することもできる：１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって１番目のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸［「ＥＴｒＡ」］に変換される；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸［「ＥＴＡ」］に変換される；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸［「ＥＰＡ」］に変換される；５）ＥＰＡがＣ20/22エロンガーゼによってドコサペンタエン酸［「ＤＰＡ」］に変換される；及び、６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸［「ＤＨＡ」］に変換される。ω−６脂肪酸はω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えば、ＥＴＡ及びＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡ及びＡＲＡから産生される。本明細書の目的上有利には、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路は、γ−リノレン酸［「ＧＬＡ」］を多量に含まないＥＰＡ油を産生することが可能である。
【０１６３】
ω−３／ω−６脂肪酸の代替的な生合成経路はΔ６デサチュラーゼ及びＣ18/20エロンガーゼを利用し、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」である。より具体的には、ＬＡ及びＡＬＡがΔ６デサチュラーゼによってそれぞれＧＬＡ及びステアリドン酸［「ＳＴＡ」］に変換されてもよく；次に、Ｃ18/20エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡに、及び／又はＳＴＡをＥＴＡに変換する。
【０１６４】
ＬＣ−ＰＵＦＡ産生組換え宿主細胞は、上記に記載される生合成経路の少なくとも１つを、その経路が宿主細胞にとって天然であるか、又は遺伝的に改変されているかに関わらず、有し得る。好ましくは、宿主細胞は、組換え宿主細胞の全脂質中少なくとも約２〜５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約５〜１５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約１５〜３５％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約３５〜５０％のＬＣ−ＰＵＦＡ、より好ましくは全脂質中少なくとも約５０〜６５％のＬＣ−ＰＵＦＡ及び最も好ましくは全脂質中少なくとも約６５〜７５％のＬＣ−ＰＵＦＡを産生する能力を有し得る。ＬＣ−ＰＵＦＡの構造形態は限定的である；従って、例えばＥＰＡ又はＤＨＡは全脂質中に遊離脂肪酸として、又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質若しくは糖脂質などのエステル化形態で存在し得る。
【０１６５】
細菌、酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌、ユーグレナ及び／又は真菌を含めた様々な真核微生物がＬＣ−ＰＵＦＡを産生することができる（又は産生するように改変することができる）。それらは、広範な温度及びｐＨ値にわたり、単純又は複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロ―ル及びアルコール、及び／又は炭化水素を含む様々な供給材料において成長する宿主を含み得る。
【０１６６】
好ましい微生物宿主は油性生物である。これらの油性生物は天然で油を合成及び蓄積する能力を有し、ここで全含油量は、乾燥細胞重量の約２５％超、より好ましくは乾燥細胞重量の約３０％超、及び最も好ましくは乾燥細胞重量の約４０％超を含み得る。様々な細菌、藻類、ユーグレナ、コケ、真菌、酵母及びストラメノパイルが、天然で油性として分類される。この広範な宿主群のなかで特に関心対象となるのは、天然でω−３／ω−６脂肪酸を産生する生物である。例えば、ＡＲＡ、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡは、キクロテラ・エスピー（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、クリプテコディニウム・エスピー（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）、モルティエラ・エスピー（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、ニッチア・エスピー（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｓｐ．）、ピシウム属（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、トラウストキトリウム・エスピー（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）及びシゾキトリウム・エスピー（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）により産生される。従って、例えば、ＡＲＡの産生に商業的に使用されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を誘導性又は調節性プロモーターの存在下で本ＬＰＬＡＴ遺伝子のいずれかにより形質転換すると、より高量のＡＲＡを合成する能力を有する形質転換生物を得ることができる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換方法は、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５頁（２０００年））により記載される。同様に、トラウストキトリアレス目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微生物（例えば、トラウストキトリウム属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換方法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書に開示されている。代替的実施形態では、非油性生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を遺伝子修飾によって油性にしてもよい（米国特許出願公開第２００７／００１５２３７−Ａ１号明細書）。
【０１６７】
より好ましい実施形態において、微生物宿主細胞は油性酵母である。典型的に油性酵母として特定される属としては、限定はされないが、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン属（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）及びリポマイセス属（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。より具体的には、例示的な油合成酵母としては、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スタルケイイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ウチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルチヌス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。最も好ましくは油性酵母ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり；及びさらなる実施形態において最も好ましくは、ＡＴＣＣ番号７６９８２、ＡＴＣＣ番号２０３６２、ＡＴＣＣ番号８８６２、ＡＴＣＣ番号１８９４４及び／又はＬＧＡＭ  Ｓ（７）１として指定されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．、及びＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１６８】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＡＲＡ、ＥＰＡ及びＤＨＡ産生を改変するために利用可能な具体的教示は、それぞれ米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書に提供される。これらの参考文献はまた、直鎖状ＤＮＡ断片を宿主のゲノムに組み込むことによりヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において遺伝子を発現させる好ましい方法、好ましいプロモーター、終結領域、組込み遺伝子座及び破壊、並びにこの特定の宿主種を使用するときの好ましい選択方法についても記載する。
【０１６９】
当業者は、米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書に引用される教示を使用して他の宿主細胞をＰＵＦＡ産生について組換えにより改変することが可能であろう。
【０１７０】
形質転換された組み換え宿主細胞は、キメラ遺伝子（例えば、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、ＬＰＬＡＴ等をコードする）の発現を最適化し、且つ最大の、及び最も経済的なＬＣ−ＰＵＦＡ収率をもたらす条件下で増殖される。概して培地条件は、炭素源の種類及び量、窒素源の種類及び量、炭素対窒素比、種々のミネラルイオンの量、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、バイオマス産生期間の長さ、油蓄積期間の長さ並びに細胞回収の時期及び方法を変更することによって最適化され得る。
【０１７１】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、概して、酵母エキス−ペプトン−デキストロースブロス［「ＹＰＤ」］などの複合培地又は増殖に必要な成分が欠けていることにより所望の発現カセットが強制的に選択される限定最少培地（例えば、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））で増殖される。
【０１７２】
本明細書に記載される方法及び宿主細胞用の発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書及び米国特許出願第１２／６４１，９２９号明細書（２００９年１２月１９日に出願された）に教示されるような好適な炭素源を含まなければならない。利用される炭素源は多種多様な炭素含有供給源を包含し得ることが企図されるが、好ましい炭素源は、糖類、グリセロール及び／又は脂肪酸である。最も好ましくは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコース、スクロース、転化スクロース、フルクトース及び／又は脂肪酸である。例えば、発酵性炭素源は、転化スクロース、グルコース、フルクトース及びそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよく、但しグルコースは転化スクロース及び／又はフルクトースとの組み合わせで使用されるものとする。
【０１７３】
用語「転化スクロース」は、本明細書では「転化糖」とも称され、スクロースの加水分解から生じる等量のフルクトースとグルコースとを含む混合物を指す。転化スクロースは、２５〜５０％のグルコースと２５〜５０％のフルクトースとを含む混合物であってもよい。転化スクロースはまたスクロースを含んでもよく、その量は加水分解度に依存する。
【０１７４】
窒素は、無機源（例えば、（ＮＨ4）2ＳＯ4）又は有機源（例えば、尿素又はグルタミン酸）から供給され得る。適切な炭素源及び窒素源に加え、発酵培地はまた、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、ビタミン及び当業者に公知の、ＥＰＡ及び／又はＤＨＡ高産生宿主細胞の成長並びにＥＰＡ及び／又はＤＨＡを産生する酵素経路の促進に好適な他の成分も含まなければならない。特に、脂質及びＰＵＦＡの合成を促進するＦｅ+2、Ｃｕ+2、Ｍｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2及びＭｇ+2などのいくつかの金属イオンに注意が払われる（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ．、Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ及びＲ．Ｃｏｌｉｎ編、６１〜９７頁（１９９２年））。
【０１７５】
本明細書に記載される方法及び宿主細胞に好ましい増殖培地は、酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）などの一般的な市販品として調製済みの培地である。他の限定又は合成増殖培地もまた使用することができ、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の増殖に適した培地は微生物学又は発酵科学の当業者によって判断され得る。発酵に好適なｐＨ範囲は、典型的には約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０であり、なかでもｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期成長条件の範囲として好ましい。発酵は好気性条件下又は嫌気性条件下で行われてもよく、微好気性条件が好ましい。
【０１７６】
典型的には、油性酵母細胞での高レベルのＰＵＦＡの蓄積には、増殖と脂肪の合成／貯蔵との間で代謝状態が「平衡」しなければならないため、２段階プロセスを要する。従って、最も好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）でのＥＰＡ及び／又はＤＨＡ産生には二段階発酵プロセスが必要である。この手法は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に、様々な好適な発酵プロセス設計（すなわち、バッチ、フェドバッチ及び連続）及び増殖中の考慮事項として記載される。
【０１７７】
本明細書におけるいくつかの態様において、一次産物は油性微生物バイオマスである。そのため、バイオマスからのＬＣ−ＰＵＦＡ含有油の単離及び精製は（すなわち、全細胞バイオマスが産物である場合）、不要のこともある。
【０１７８】
しかしながら、特定の最終用途及び／又は産物形態では、部分的に精製されたバイオマス、精製油、及び／又は精製ＬＣ−ＰＵＦＡをもたらすために、バイオマスからのＬＣ−ＰＵＦＡを含む油の部分的及び／又は完全な単離／精製が必要となり得る。ＰＵＦＡを含む脂肪酸は、宿主微生物中で遊離脂肪酸として、又はアシルグリセロール、リン脂質、硫脂質若しくは糖脂質などのエステル化された形態で存在し得る。これらの脂肪酸は、当該技術分野において公知の様々な手段によって宿主細胞から抽出され得る。酵母脂質についての抽出技法、品質分析及び許容基準の一つのレビューが、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年））のレビューである。下流プロセシングの簡略なレビューもまた、Ａ．Ｓｉｎｇｈ及びＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５：２７１〜３１２頁（１９９７年））により利用可能となっている。
【０１７９】
概して、脂肪酸（ＬＣ−ＰＵＦＡを含む）の精製手段としては、有機溶媒、音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用）、鹸化及び物理的手段、例えばプレス、又はそれらの組み合わせによる抽出（例えば、米国特許第６，７９７，３０３号明細書及び米国特許第５，６４８，５６４号明細書）を挙げることができる。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照のこと。
【０１８０】
多くの食品及び飼料製品が、ω−３及び／又はω−６脂肪酸、特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ及びＤＨＡを組み込む。本明細書に記載される方法及び宿主細胞により作製されるＬＣ−ＰＵＦＡを含む油性酵母バイオマス、ＬＣ−ＰＵＦＡを含む部分的に精製されたバイオマス、ＬＣ−ＰＵＦＡを含む精製油、及び／又は精製ＬＣ−ＰＵＦＡは、その添加によって改良された食品又は飼料を摂取することで健康上の利益を付与することが企図される。これらの油は、いくつか例を挙げれば、食品類似物、飲料、肉製品、穀物製品、ベーカリー食品、スナック食品及び乳製品に添加することができる。米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照のこと。
【０１８１】
これらの組成物は、医療用栄養剤、食事サプリメント、人工栄養乳及び医薬品を含めた医療用食品に添加されることによって健康上の利益を付与し得る。当業者は、食品、飼料、食事サプリメント、ニュートラシューティカルズ、医薬品、及び他の健康上の利益を付与するものとして摂取可能な製品に対する油の添加量を理解するであろう。これらの油の摂取による健康上の利益は当該技術分野で記載がなされており、当業者には公知であって、継続的に調査されている。かかる量は、本明細書では「有効」量と称され、特に、それらの油を含む摂取される製品の性質及びそれらが対処しようとする健康状態に依存する。
【実施例】
【０１８２】
本発明は以下の実施例にさらに説明され、実施例は本発明の実施化を例示するが、しかしその可能な変形例の全てを完全に定義するわけではない。
【０１８３】
一般的方法
実施例において用いられる標準的な組換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は当該技術分野において公知であり、１）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、及びＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；及び、３）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、刊行元Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）により記載がなされている。
【０１８４】
微生物培養物の維持及び成長に好適な材料及び方法は、当該技術分野において公知である。以下の例における使用に好適な技法は、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ及びＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年））において；又はＴｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋにより「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）において示されるとおり見出され得る。微生物細胞の成長及び維持に使用される全ての試薬、制限酵素及び材料は、特記されない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、又はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、基本的にはルリア・ベルターニ［「ＬＢ」］プレートにおいて３７℃で増殖した。
【０１８５】
一般的な分子クローニングは、標準方法により実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）。ＡＢＩ自動シーケンサーでダイターミネーター技法を用いて（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；欧州特許第２７２，００７号明細書）、ベクター及びインサート特異的プライマーの組み合わせを使用してＤＮＡ配列を生成した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒにおいて配列編集を実施した（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）。全ての配列が双方の方向に少なくとも２倍のカバレッジを示す。
【０１８６】
略称の意味は以下のとおりである：「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味し、「ＤＣＷ」は乾燥細胞重量を意味し、及び「ＴＦＡ」は全脂肪酸を意味する。
【０１８７】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」の単純な表記法により表され、ここではＸがプロモーター断片を表し、Ｙが遺伝子断片を表し、及びＺがターミネーター断片を表し、これらは全て、互いに作動可能に連結されている。
【０１８８】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換及び培養
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２を購入した。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるとおり、いくつかの培地中（例えば、ＹＰＤ寒天培地、基本最少培地［「ＭＭ」］、最少培地＋ウラシル［「ＭＭＵ」］、最少培地＋ロイシン＋リジン［「ＭＭＬｅｕＬｙｓ」］、最少培地＋５−フルオロオロチン酸［「ＭＭ＋５−ＦＯＡ」］、高グルコース培地［「ＨＧＭ」］及び発酵培地［「ＦＭ」］）、２８〜３０℃でルーチン的に増殖した。
【０１８９】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書に記載されるとおり実施した。
【０１９０】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸［「ＦＡ」］分析のため、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．及びＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））に記載されるとおり遠心により細胞を回収し、脂質を抽出した。脂質抽出物のナトリウムメトキシドとのエステル交換反応により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．、及びＮｉｓｈｉｄａ  Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、続いて３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）カラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣにより分析した。オーブン温度は、３．５℃／分で１７０℃（２５分間維持）から１８５℃とした。
【０１９１】
直接的な塩基エステル交換反応のため、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞（０．５ｍＬ培養物）を回収し、蒸留水で１回洗浄し、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃにおいて５〜１０分間真空乾燥した。ナトリウムメトキシド（１％の１００μｌ）及び既知量のＣ１５：０トリアシルグリセロール（Ｃ１５：０  ＴＡＧ；カタログ番号Ｔ−１４５、Ｎｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ、Ｅｌｙｓｉａｎ，ＭＮ）を試料に添加し、次に試料をボルテックスにかけ、５０℃で３０分間揺動させた。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌ及び４００μｌヘキサンを添加した後、試料をボルテックスにかけ、回転させた。上層を取り出し、ＧＣにより分析した。
【０１９２】
ＧＣ分析によって記録されたＦＡＭＥピークを、既知の脂肪酸と比較したときのその滞留時間により特定し、ＦＡＭＥピーク面積について既知量の内部標準（Ｃ１５：０  ＴＡＧ）と比較することにより定量化した。従って、任意の脂肪酸ＦＡＭＥの近似量（μｇ）［「μｇ  ＦＡＭＥ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）により計算され、一方、Ｃ１５：０  ＴＡＧの１μｇは０．９５０３μｇの脂肪酸に等しいため、任意の脂肪酸の量（μｇ）［「μｇ  ＦＡ」］は式：（特定の脂肪酸についてのＦＡＭＥピーク面積／標準ＦＡＭＥピーク面積）＊（標準Ｃ１５：０  ＴＡＧのμｇ）＊０．９５０３により計算される。０．９５０３の変換係数は、０．９５〜０．９６の範囲をとる多くの脂肪酸について決定される値の近似であることに留意されたい。
【０１９３】
各個別の脂肪酸の量をＴＦＡの重量パーセントとして要約する脂質プロファイルを、個別のＦＡＭＥピーク面積を全てのＦＡＭＥピーク面積の合計で除して１００を乗じることにより決定した。
【０１９４】
個別の脂肪酸又は全脂肪酸の量を乾燥細胞重量の重量パーセント［「％  ＤＣＷ」］として定量化するため、１０ｍＬの培養物から細胞を遠心により回収し、１０ｍＬの水で一回洗浄し、再び遠心により回収した。細胞を１〜２ｍＬの水に再懸濁し、予め秤量したアルミニウム秤量皿に注入し、同様に同じ秤量皿に加えた１〜２ｍＬの水でリンスした。皿を真空下８０℃で一晩置いた。皿を秤量し、空の皿の重量を減じることによりＤＣＷを計算した。次に％  ＤＣＷとしての脂肪酸の決定は、μｇ  ＤＣＷの分率としてのμｇ  ＦＡＭＥ又はμｇ  ＦＡのいずれかに基づき計算することができる（例えば、ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷは、μｇ  ＦＡＭＥ／μｇ  ＤＣＷ＊１００として計算することができる）。
【０１９５】
実施例１
全脂肪酸の約５１％のＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により全脂質に対して約５１％のＥＰＡを産生する能力を有するＹ８４０６株の構築について記載する。この株は、実施例４においてＥＰＡ産生宿主細胞として使用した。
【０１９６】
Ｙ８４０６株（図２）を生じさせるには、Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、Ｌ１３５株、Ｌ１３５Ｕ９株、Ｙ８００２株、Ｙ８００６Ｕ６株、Ｙ８０６９株、Ｙ８０６９Ｕ株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５４Ｕ株、Ｙ８２６９株及びＹ８２６９Ｕ株の構築が必要であった。
【０１９７】
Ｙ４０３６Ｕ株の生成
要約すれば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２から、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自律的突然変異によるＦＯＡ耐性突然変異体）、Ｙ４００１株（１７％ＥＤＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（１８％ＤＧＬＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）及びＹ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）の構築を介してＹ８４０６株を誘導した。Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株及びＹ４０３６Ｕ株の構築に関するさらなる詳細は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１号明細書の一般的方法に記載されている。
【０１９８】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ４０３６Ｕ株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴであった（ここでＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＭＥ３Ｓはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ８Ｍは合成突然変異Δ８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であって、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するもの［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］である）。
【０１９９】
Ｐｅｘ３の染色体欠失を有するＬ１３５株（Ｕｒａ３＋，Ｌｅｕ−，Δｐｅｘ３）の生成
Ｌ１３５株の構築については、本明細書によって参照により本明細書に援用される国際公開第２００９／０４６２４８号パンフレットの実施例１２に記載されている。要約すれば、コンストラクトｐＹ１５７を使用して、Ｙ４０３６Ｕ株においてペルオキシソーム生合成因子３タンパク質［ペルオキシソーム形成タンパク質ペルオキシン３又は「Ｐｅｘ３ｐ」］をコードする染色体遺伝子をノックアウトし、それによりＬ１３５株（Ｙ４０３６株（Δｐｅｘ３）とも称される）を産生した。Ｌ１３５株における染色体Ｐｅｘ３遺伝子のノックアウトは、Ｙ４０３６株（その天然Ｐｅｘ３ｐがノックアウトされていない）と比較して以下をもたらした：より高い脂質含量（ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ）（約６．０％、対４．７％）、より高いＤＧＬＡ  ％  ＴＦＡ（４６％、対１９％）、より高いＤＧＬＡ  ％  ＤＣＷ（約２．８％、対０．９％）及びＬＡ  ％  ＴＦＡの低下（１２％、対３０％）。加えて、Δ９エロンガーゼ変換効率が、Ｙ４０３６株における約４８％からＬ１３５株における８３％に増加した。
【０２００】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＬ１３５株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ３＋、Ｌｅｕ−、Ｐｅｘ３−、未知１−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴであった。
【０２０１】
Ｌ１３５Ｕ９（Ｌｅｕ−、Ｕｒａ３−）株の生成
Ｌ１３５株中のプラスミドｐＹ１１６（図３；配列番号３３；本明細書によって参照により本明細書に援用される国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載される）においてＣｒｅリコンビナーゼ酵素を一時的に発現させることによりＬ１３５Ｕ株を作成し、Ｌｅｕ−及びＵｒａ−表現型を産生した。プラスミドｐＹ１１６を使用して、新しく増殖したＬ１３５細胞の形質転換を一般的方法に従い行った。形質転換体細胞をＭＭＬｅｕＵｒａに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。３つのコロニーを選び取り、３０℃の３ｍＬの液体ＹＰＤ培地に接種して２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪した。培養物を液体ＭＭＬｅｕＵｒａ培地で１：５０，０００希釈し、１００μＬを新しいＹＰＤ培地に播種して３０℃で２日間維持した。３つのプレートの各々から８つのコロニーを選び取り（合計２４コロニー）、ＭＭＬｅｕ及びＭＭＬｅｕＵｒａ選択プレート上に画線した。ＭＭＬｅｕＵｒａプレートで増殖でき、しかしＭＭＬｅｕプレートでは増殖できなかったコロニーを選択し、ＧＣにより分析してＣ２０：２（ＥＤＡ）の存在について確認した。Ｌｅｕ−及びＵｒａ−表現型を有する１つの株をＬ１３５Ｕ９と命名した。
【０２０２】
ＴＦＡの約３２％のＡＲＡを産生するＹ８００２株の生成
コンストラクトｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５（図４Ａ；配列番号３４）を生成して３つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＬ１３５Ｕ９株のＬｙｓ遺伝子座に組み込み、それによりＡＲＡの産生を可能にした。ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５プラスミドは以下の成分を含んだ。
【０２０３】
【表５】
0005931721.tif 000009
【０２０４】
ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＬ１３５Ｕ９株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭＵｒａＬｙｓプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭＵｒａＬｙｓプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭＵｒａＬｙｓに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２０５】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５の３つのキメラ遺伝子を含む形質転換体にはＡＲＡが存在し、しかし親Ｌ１３５Ｕ９株には存在しないことが示された。ＴＦＡの約３２．２％、３２．９％、３４．４％、３２．１％及び３８．６％のＡＲＡを産生した５個の株（すなわち、＃２８、＃６２、＃７３、＃８４及び＃９５）を、それぞれＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株と命名した。さらなる分析により、ｐＺＫＳＬ−５Ｓ５Ａ５の３つのキメラ遺伝子がＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株のＬｙｓ５部位に組み込まれなかったことが示された。全ての株がＬｙｓ＋表現型を有した。
【０２０６】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８０００株、Ｙ８００１株、Ｙ８００２株、Ｙ８００３株及びＹ８００４株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ−、Ｐｅｘ３−未知１−、未知２−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔであった。
【０２０７】
ＴＦＡの約４１％のＡＲＡを産生するＹ８００６株の生成
コンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４Ｂ；配列番号３９；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表９に記載される）を生成して３つのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子をＹ８００２株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）に組み込んだ。
【０２０８】
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００２株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２０９】
ＧＣ分析により、ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子を含む選択された９６個の形質転換体のほとんどにＴＦＡの２６％〜３１％のＥＰＡが存在し、しかし親Ｙ８００２株には存在しないことが示された。株＃６９はＴＦＡの約３８％のＥＰＡを産生し、Ｙ８００７と命名した。ＥＰＡを産生せず、しかしＴＦＡの約４１％のＡＲＡを産生した株が１つあった（すなわち、株＃９）。この株はＹ８００６と命名した。Ｙ８００６株におけるＥＰＡ産生の欠如に基づき、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するその遺伝子型は、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、Ｕｒａ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔであると推定された。
【０２１０】
対照的に、野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８００７株の最終的な遺伝子型は、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、Ｕｒａ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった（ここでＰａＤ１７は、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり、ＰａＤ１７Ｓは、ピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）由来のコドン最適化Δ１７デサチュラーゼである［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］。
【０２１１】
Ｙ８００６株及びＹ８００７株におけるＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）へのｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子の組込みは確認されなかった。
【０２１２】
Ｙ８００６Ｕ６（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用してＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８００６株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。
【０２１３】
プラスミドｐＺＫＵＭをＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００６株の形質転換に使用した。形質転換後、細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡ選択プレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。
【０２１４】
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長した合計８個の形質転換体を選び取り、ＭＭプレート及びＭＭ＋５−ＦＯＡプレートに別個に再度画線した。８株全てがＵｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上では増殖できたが、ＭＭプレート上では増殖できなかった）。細胞をＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから剥がし取り、一般的方法により脂肪酸分析に供した。
【０２１５】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃２、＃４、＃５、＃６及び＃７に、それぞれ２２．９％、２５．５％、２３．６％、２１．６％、２１．６％及び２５％のＴＦＡのＡＲＡが存在することが示された。これらの６個の株は、それぞれＹ８００６Ｕ１株、Ｙ８００６Ｕ２株、Ｙ８００６Ｕ３株、Ｙ８００６Ｕ４株、Ｙ８００６Ｕ５株及びＹ８００６Ｕ６株（まとめて、Ｙ８００６Ｕ株）と命名した。
【０２１６】
ＴＦＡの約３７．５％のＥＰＡを産生するＹ８０６９株の生成
コンストラクトｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕ（図４Ｂ；配列番号３９；本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表９に記載される）を使用して３つのΔ１７デサチュラーゼ遺伝子をＹ８００６Ｕ６株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）に組み込んだ。
【０２１７】
ｐＺＰ３−Ｐａ７７７ＵプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８００６Ｕ６株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で２〜３日間維持した。次に単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２１８】
ＧＣ分析により、ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子を含む形質転換体にＥＰＡが存在し、しかし親Ｙ８００６Ｕ６株には存在しないことが示された。選択した２４個の株のほとんどが、ＴＦＡの２４〜３７％のＥＰＡを産生した。ＴＦＡの３７．５％、４３．７％、３７．９％及び３７．５％のＥＰＡを産生した４つの株（すなわち、＃１、＃６、＃１１及び＃１４）を、それぞれＹ８０６６、Ｙ８０６７、Ｙ８０６８及びＹ８０６９と命名した。ｐＺＰ３−Ｐａ７７７Ｕの３つのキメラ遺伝子の、Ｙ８０６６株、Ｙ８０６７株、Ｙ８０６８株及びＹ８０６９株のＰｏｘ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ００１３０１）への組込みは確認されなかった。
【０２１９】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８０６６株、Ｙ８０６７株、Ｙ８０６８株及びＹ８０６９株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏであった。
【０２２０】
Ｙ８０６９Ｕ株（Ｕｒａ３−）の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８０６９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計３個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２２１】
ＧＣ分析により、ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で成長したｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１、＃２及び＃３に、それぞれ２２．４％、２１．９％及び２１．５％のＴＦＡのＥＰＡが存在することが示された。これらの３個の株を、それぞれＹ８０６９Ｕ１株、Ｙ８０６９Ｕ２株、及びＹ８０６９Ｕ３株（まとめて、Ｙ８０６９Ｕ株）と命名した。
【０２２２】
ＴＦＡの約４４．８％のＥＰＡを産生するＹ８１５４株の生成
コンストラクトｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃ（図５Ｂ；配列番号４１）を生成して１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子、１つのΔ９エロンガーゼ遺伝子、１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、及び１つのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＰＴ１）をＹ８０６９Ｕ３株のＬｉｐ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０１２６３２）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９Ｃプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２２３】
【表６】
0005931721.tif 000010
【０２２４】
ｐＺＫＬ２−５ｍＢ８９ＣプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８０６９Ｕ３株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２２５】
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどがＴＦＡの約３８〜４４％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４４．７％、４５．２％、４５．４％、４４．８％、４６．１％、４８．６％及び４５．９％のＥＰＡを産出した７個の株（すなわち、＃１、＃３９、＃４９、＃６２、＃７０、＃８５及び＃９２）を、それぞれＹ８１５１株、Ｙ８１５２株、Ｙ８１５３株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５５株、Ｙ８１５６株及びＹ８１５７株と命名した。これらのＥＰＡ株においてＬｉｐ２遺伝子のノックアウトは確認されなかった。
【０２２６】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８１５１株、Ｙ８１５２株、Ｙ８１５３株、Ｙ８１５４株、Ｙ８１５５株、Ｙ８１５６株及びＹ８１５７株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、Ｌｅｕ＋、Ｌｙｓ＋、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏであった。
【０２２７】
Ｙ８１５４Ｕ１（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８１５４株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２２８】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃７においてＴＦＡの２３．１％のＥＰＡがあったことが示された。この株をＹ８１５４Ｕ１株と命名した。
【０２２９】
ＴＦＡの約４５．３％のＥＰＡを産生するＹ８２６９株の生成
コンストラクトｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５（図６Ａ；配列番号４８）を生成して１つのＤＧＬＡシンターゼ、１つのΔ１２デサチュラーゼ遺伝子及び１つのΔ５デサチュラーゼ遺伝子をＹ８１５４Ｕ１株のＬｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ＤＧＬＡシンターゼは、Δ８デサチュラーゼに連結されたΔ９エロンガーゼを含むマルチザイムである（米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書）。
【０２３０】
ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２３１】
【表７】
0005931721.tif 000011
【０２３２】
ｐＺＫＬ１−２ＳＲ９Ｇ８５プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８１５４Ｕ１株の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２３３】
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどが全脂質の４０〜４４．５％のＥＰＡを産生したことが示された。ＴＦＡの約４４．８％、４５．３％、４７％、４４．６％及び４４．７％のＥＰＡを産生した５個の株（すなわち、＃４４、＃４６、＃４７、＃６６及び＃８７）を、それぞれＹ８２６８、Ｙ８２６９、Ｙ８２７０、Ｙ８２７１及びＹ８２７２と命名した。Ｌｉｐ１遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ５００２０）のノックアウトは、これらのＥＰＡ株では確認されなかった。
【０２３４】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８２６８株、Ｙ８２６９株、Ｙ８２７０株、Ｙ８２７１株及びＹ８２７２株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏであった。
【０２３５】
Ｙ８２６９Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号５３；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８２６９株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２３６】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃２、＃３及び＃５において、それぞれＴＦＡの２３．０％、２３．１％及び２４．２％のＥＰＡがあったことが示された。これらの株を、それぞれＹ８２６９Ｕ１株、Ｙ８２６９Ｕ２株及びＹ８２６９Ｕ３株（まとめて、Ｙ８２６９Ｕ株）と命名した。
【０２３７】
ＴＦＡの約５１．２％のＥＰＡ及び５５．８％のＥＰＡを産生するＹ８４０６株及びＹ８４１２株の生成
コンストラクトｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３（図６Ｂ；配列番号５３）を生成して１つのΔ８デサチュラーゼ遺伝子、１つのＣ16/18エロンガーゼ遺伝子及び１つのマロニルＣｏＡシンテターゼ遺伝子をＹ８２６９Ｕ１株のＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）に組み込み、それによりＥＰＡの高レベル産生を可能にした。ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２３８】
【表８】
0005931721.tif 000012
【０２３９】
ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ８２６９Ｕ１株、Ｙ８２６９Ｕ２株及びＹ８２６９Ｕ３株の別個の形質転換に使用した。形質転換体細胞をＭＭプレートに播種し、３０℃で３〜４日間維持した。単一コロニーをＭＭプレートに再度画線し、次に３０℃の液体ＭＭに接種して２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２４０】
各ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３形質転換（すなわち、Ｙ８２６９Ｕ１、Ｙ８２６９Ｕ２及びＹ８２６９Ｕ３）により得られた合計９６個の株をＧＣにより分析した。選択した２８８個の株のほとんどがＴＦＡの４３〜４７％のＥＰＡを産生した。ＴＦＡの約５１．３％、４７．９％、５０．８％、４８％、４７．８％、４７．８％及び４７．８％のＥＰＡを産生した７個のＹ８２６９Ｕ１のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃５９、＃６１、＃６５、＃６７、＃７０、＃８１及び＃９４）を、それぞれＹ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株及びＹ８４１０株と命名した。ＴＦＡの約４８．８％、５０．８％、及び４９．３％のＥＰＡを産生したこれらのＹ８２６９Ｕ２のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃４、＃１３及び＃１７）を、それぞれＹ８４１１、Ｙ８４１２及びＹ８４１３と命名した。さらに、ＴＦＡの約４９．３％及び５３．５％のＥＰＡを産生した２個のＹ８２６９Ｕ３のｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換株（すなわち、＃２、及び＃１６）を、それぞれＹ８４１４及びＹ８４１５と命名した。
【０２４１】
ＳＣＰ２遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３４１０）のノックアウトは、ｐＺＳＣＰ−Ｍａ８３による形質転換によって産生されたこれらのＥＰＡ株のいずれにおいても確認されなかった。
【０２４２】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株、Ｙ８４１０株、Ｙ８４１１株、Ｙ８４１２株、Ｙ８４１３株、Ｙ８４１４株及びＹ８４１５株の最終的な遺伝子型は、Ｕｒａ＋、Ｐｅｘ３−、未知１−、未知２−、未知３−、未知４−、未知５−、未知６−、未知７−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤ：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＥａＤ８Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ／ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ａｃｏ、ＧＰＭ：：ＥｇＤ５ＳＭ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＭＣＳ：：Ｌｉｐ１であった。
【０２４３】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株は２００９年５月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２５を有する。ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４１２株は２００９年５月１４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−１００２６を有する。
【０２４４】
フラスコアッセイによる全脂質含量及び組成の分析
Ｙ８４０４株、Ｙ８４０５株、Ｙ８４０６株、Ｙ８４０７株、Ｙ８４０８株、Ｙ８４０９株、Ｙ８４１０株、Ｙ８４１１株、Ｙ８４１２株、Ｙ８４１３株、Ｙ８４１４株及びＹ８４１５株のＹＰＤプレートからの細胞を増殖し、以下のように一般的方法に従い全脂質含量及び組成について分析した。
【０２４５】
具体的には、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを用いて脂肪酸分析（上記）を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０２４６】
ＤＣＷを決定するため、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、１０ｍＬの培養物を回収した。ペレットを２５ｍＬの水中に再懸濁し、再度上記のとおりに回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中に再懸濁し、予め秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
【０２４７】
フラスコアッセイからのデータは表８のとおり提供される。この表は、細胞の全乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］、細胞の全脂質含量［「ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ＦＡＭＥ  ％  ＤＣＷ」］を提供する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ及びその他として特定され得る。
【０２４８】
【表９】
0005931721.tif 000013
【０２４９】
Ｙ８４０６Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ８４０６株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。いくつかの形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２５０】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃４及び＃５においてＦＡＭＥの２６．１％のＥＰＡがあったことが示された。これらの２つの株を、それぞれＹ８４０６Ｕ１株及びＹ８４０６Ｕ２株（まとめて、Ｙ８４０６Ｕ株）と命名した。
【０２５１】
実施例２
全脂肪酸の約１８．６％のＥＰＡ、２２．８％のＤＰＡ及び９．７％のＤＨＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ５０３７株の生成
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に由来する、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現により全脂質に対して約１８．６％のＥＰＡ、２２．８％のＤＰＡ及び９．７％のＤＨＡを産生する能力を有するＹ５０３７株の構築について記載する。この株は、実施例５においてＤＨＡ産生宿主細胞として使用した。
【０２５２】
要約すれば、図７に図解されるとおり、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２から、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株ＡＴＣＣ番号２０３６２のＵｒａ３遺伝子の自己突然変異によるＦＯＡ耐性突然変異体）、Ｙ４００１株（１７％ＥＤＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（１８％ＤＧＬＡを産生、Ｌｅｕ−表現型）、Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−及びＵｒａ−）、Ｙ４０７０株（１２％ＡＲＡを産生、Ｕｒａ−表現型）、Ｙ４０８６株（１４％ＥＰＡを産生）、Ｙ４０８６Ｕ１株（Ｕｒａ３−）、Ｙ４１２８株（３７％ＥＰＡを産生；２００７年８月２３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、指定番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８６１４を有する）、Ｙ４１２８Ｕ３株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２１７株（４２％ＥＰＡを産生）、Ｙ４２１７Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４２５９株（４６．５％ＥＰＡを産生）、Ｙ４２５９Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４３０５株（５３．２％ＥＰＡを産生）、Ｙ４３０５Ｕ３株（Ｕｒａ−）、Ｙ５００４株（１７％ＥＰＡ、１８．７％ＤＰＡ及び６．４％ＤＨＡを産生）、Ｙ５００４Ｕ１株（Ｕｒａ−）、Ｙ５０１８株（２５．４％ＥＰＡ、１１．４％ＤＰＡ及び９．４％ＤＨＡを産生）、Ｙ５０１８Ｕ１株（Ｕｒａ−）及びＹ５０３７株（全ＴＦＡに対して１８．６％ＥＰＡ、２２．８％ＤＰＡ及び９．７％ＤＨＡを産生）の構築を介してＹ５０３７株を誘導した。Ｙ２２２４株、Ｙ４００１株、Ｙ４００１Ｕ株、Ｙ４０３６株、Ｙ４０３６Ｕ株、Ｙ４０７０株、Ｙ４０８６株、Ｙ４０８６Ｕ１株、Ｙ４１２８株、Ｙ４１２８Ｕ３株、Ｙ４２１７株、Ｙ４２１７Ｕ２株、Ｙ４２５９株、Ｙ４２５９Ｕ２株、Ｙ４３０５株及びＹ４３０５Ｕ３株の構築に関するさらなる詳細は、本明細書によって参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８−０２５４１９１−Ａ１号明細書の一般的方法及び米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の実施例１〜３に記載されている。
【０２５３】
Ｙ４３０５株の完全な脂質プロファイルは以下のとおりであった：１６：０（２．８％）、１６：１（０．７％）、１８：０（１．３％）、１８：１（４．９％）、１８：２（１７．６％）、ＡＬＡ（２．３％）、ＥＤＡ（３．４％）、ＤＧＬＡ（２．０％）、ＡＲＡ（０．６％）、ＥＴＡ（１．７％）、及びＥＰＡ（５３．２％）。細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］は２７．５であった。
【０２５４】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ４３０５株の最終的な遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知１−、未知３−、未知８−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯであった（ここでＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＦｍＤ１２Ｓはフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化Δ１２デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，５０４，２５９号明細書］であり；ＭＥ３Ｓはモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化Ｃ16/18エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，４７０，５３２号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ９ｅＳはユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；Ｅ３８９Ｄ９ｅＳはユートレプティエラ・エスピー（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ３８９に由来するコドン最適化Δ９エロンガーゼ遺伝子［米国特許第７，６４５，６０４号明細書］であり；ＥｇＤ８Ｍは合成突然変異Δ８デサチュラーゼ［米国特許第７，７０９，２３９号明細書］であって、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するもの［米国特許第７，２５６，０３３号明細書］であり；ＥｇＤ５はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＥｇＤ５��はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ遺伝子［米国特許第７，６７８，５６０号明細書］であり；ＲＤ５Ｓはペリジニウム・エスピー（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化Δ５デサチュラーゼ［米国特許第７，６９５，９５０号明細書］であり；ＰａＤ１７はピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；ＰａＤ１７Ｓはピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化Δ１７デサチュラーゼ［米国特許第７，５５６，９４９号明細書］であり；及び、ＹｌＣＰＴ１はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ遺伝子［国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット］である）。
【０２５５】
Ｕｒａ３突然変異遺伝子をＹ４３０５株のＵｒａ３遺伝子に組み込むことにより、Ｙ４３０５Ｕ（Ｕｒａ３−）株を生成した。
【０２５６】
ＴＦＡの約１７．０％のＥＰＡ、１８．７％のＤＰＡ及び６．４％のＤＨＡを産生するＹ５００４株の生成
コンストラクトｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４１Ｂ（図８Ａ；配列番号６０）を構築して２つのＣ20/22エロンガーゼ遺伝子及び２つのΔ４デサチュラーゼ遺伝子をＹ４３０５Ｕ３株のリパーゼ４様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３８２５）に組み込んだ。ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４１Ｂプラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２５７】
【表１０】
0005931721.tif 000014
【０２５８】
ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４１ＢプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ４３０５Ｕ３株（上記）の形質転換に使用した。ＭＭプレート上で形質転換体を選択した。３０℃で５日間増殖した後、ＭＭプレート上で増殖した７２個の形質転換体を選び取り、新鮮ＭＭプレートに再度画線した。増殖後、これらの株を３ｍＬの液体ＭＭに３０℃で個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２５９】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＬ４−２２０ＥＡ４１Ｂを有する形質転換体にはＤＨＡが存在し、しかし親Ｙ４３０５Ｕ株には存在しないことが示された。選択した７２個の株のほとんどが、ＴＦＡの約２２％のＥＰＡ、１８％のＤＰＡ及び５％のＤＨＡを産生した。株＃２は１７％のＥＰＡ、１８．７％のＤＰＡ及び６．４％のＤＨＡを産生した一方、株＃３３は２１．５％のＥＰＡ、２１％のＤＰＡ及び５．５％のＤＨＡを産生した。これらの２つの株を、それぞれＹ５００４及びＹ５００５と命名した。
【０２６０】
Ｙ５００４株又はＹ５００５株のいずれにおいてもリパーゼ４様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ＿５０３８２５）のノックアウトは確認されなかった。
【０２６１】
Ｙ５００４Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例１）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ５００４株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。
【０２６２】
ＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上で増殖した合計８個の形質転換体を選び取り、別個にＭＭプレート及びＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上に再度画線した。８個の株全てがＵｒａ−表現型を有した（すなわち、細胞はＭＭ＋５−ＦＯＡプレート上では増殖することができたが、ＭＭプレート上では増殖できなかった）。ＭＭ＋５−ＦＯＡプレートから細胞を剥がし取り、一般的方法により脂肪酸分析に供した。
【０２６３】
ＧＣ分析により、形質転換体＃５にＴＦＡの１４．８％のＥＰＡ、１７．４％のＤＰＡ及び０．４％のＤＨＡが存在し、及び形質転換体＃８にＴＦＡの１５．３％のＥＰＡ、１７．２％のＤＰＡ及び０．４％のＤＨＡが存在することが示された。これらの２つの株を、それぞれＹ５００４Ｕ１株及びＹ５００４Ｕ２株（まとめて、Ｙ５００４Ｕ株）と命名した。
【０２６４】
ＴＦＡの約２５．４％のＥＰＡ、１１．４％のＤＰＡ及び９．４％のＤＨＡを産生するＹ５０１８株の生成
コンストラクトｐＺＫＬ３−４ＧＥＲ４４（図８Ｂ；配列番号６９）を構築して１つのＣ20/22エロンガーゼ遺伝子及び３つのΔ４デサチュラーゼ遺伝子をＹ５００４Ｕ１株のリパーゼ３様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０６１２１）に組み込んだ。ｐＺＫＬ３−４ＧＥＲ４４プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２６５】
【表１１】
0005931721.tif 000015
【０２６６】
ｐＺＫＬ３−４ＧＥＲ４４プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ５００４Ｕ１株の形質転換に使用した。ＭＭプレート上で形質転換体を選択した。３０℃で５日間増殖した後、ＭＭプレート上で増殖した９６個の形質転換体を選び取り、新鮮ＭＭプレート上に再度画線した。増殖後、これらの株を３ｍＬの液体ＭＭに３０℃で個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２６７】
ＧＣ分析により、選択した９６個の株のほとんどがＴＦＡの約１９％のＥＰＡ、２２％のＤＰＡ及び７％のＤＨＡを産生したことが示された。株＃１は２３．３％のＥＰＡ、１３．７％のＤＰＡ及び８．９％のＤＨＡを産生した一方、株＃４９は２５．２％のＥＰＡ、１１．４％のＤＰＡ及び９．４％のＤＨＡを産生した。これらの２つの株を、それぞれＹ５０１１及びＹ５０１８と命名した。
【０２６８】
Ｙ５０１１株及びＹ５０１８株においてリパーゼ３様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０６１２１）のノックアウトは確認されなかった。
【０２６９】
Ｙ５０１８Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ８００６株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（実施例１）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ５０１８株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計１８個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２７０】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃２にＦＡＭＥの１６．６％のＥＰＡ、１０．４％のＤＰＡ及び０．０％のＤＨＡが存在し、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃４にＦＡＭＥの１７．０％のＥＰＡ、１０．８％のＤＰＡ及び０．０％のＤＨＡが存在することが示された。これらの２つの株を、それぞれＹ５０１８Ｕ１株及びＹ５０１８Ｕ２株（まとめて、Ｙ５０１８Ｕ株）と命名した。
【０２７１】
ＴＦＡの約１８．６％のＥＰＡ、２２．８％のＤＰＡ及び９．７％のＤＨＡを産生するＹ５０３７株の生成
コンストラクトｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４４４（図９；配列番号７４）を構築して１つのＤＨＡシンターゼ及び２つのΔ４デサチュラーゼ遺伝子をＹ５０１８Ｕ１株のリパーゼ７様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５４９５１９）に組み込んだ。ＤＨＡシンターゼは、Δ４デサチュラーゼに連結したＣ２０エロンガーゼを含むマルチザイムである。ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４４４プラスミドは以下の構成要素を含んだ。
【０２７２】
【表１２】
0005931721.tif 000016
【０２７３】
ｐＺＫＬＹ−Ｇ２０４４４プラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般的方法によるＹ５０１８Ｕ１株の形質転換に使用した。ＭＭプレート上で形質転換体を選択した。３０℃で５日間増殖した後、ＭＭプレート上で増殖した９６個の形質転換体を選び取り、新鮮ＭＭプレート上に再度画線した。増殖後、これらの株を３ｍＬの液体ＭＭに３０℃で個別に接種し、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心により回収し、ＨＧＭ中に再懸濁した後、２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。一般的方法に従い細胞を脂肪酸分析に供した。
【０２７４】
ＧＣ分析により、ＴＦＡの選択した９６株のほとんどが約１９％のＥＰＡ、２２％のＤＰＡ及び９％のＤＨＡを産生したことが示された。株＃３は１８．６％のＥＰＡ、２２．８％のＤＰＡ及び９．７％のＤＨＡを産生し；株＃９は１８．４％のＥＰＡ、２１％のＤＰＡ及び９．６％のＤＨＡを産生し；株＃２７は１７．８％のＥＰＡ、２０．６％のＤＰＡ及び１０％のＤＨＡを産生し；及び株＃４０は１８．８％のＥＰＡ、２１．２％のＤＰＡ及び９．６％のＤＨＡを産生した。これらの４個の株を、それぞれＹ５０３７、Ｙ５０３８、Ｙ５０３９及びＹ５０４０と命名した。
【０２７５】
これらのノックアウト株においてリパーゼ７様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ５４９５１９）のノックアウトは確認されなかった。
【０２７６】
野生型ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２に対するＹ５０３７株、Ｙ５０３８株、Ｙ５０３９株及びＹ５０４０株の最終的な遺伝子型は、ＳＣＰ２−（ＹＡＬＩ０Ｅ０１２９８ｇ）、ＹＡＬＩ０Ｃ１８７１１ｇ−、Ｐｅｘ１０−、ＹＡＬＩ０Ｆ２４１６７ｇ−、未知１−、未知３−、未知８−、未知９−、未知１０−、未知１１−、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：ＯＣＴ、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：ＯＣＴ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（３コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＹＡＴ１：：Ｅ３８９Ｄ９ｅＳ：：ＯＣＴ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：ＡＣＯ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：ＯＣＴ、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：ＡＣＯ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥａＣ２０ＥＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＣ２０ＥＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＣ２０ＥＳ：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥａＤ４Ｓ−１：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥａＤ４Ｓ−１：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＥａＤ４Ｓ−１：：Ｌｉｐ１、ＧＰＤＩＮ：：ＥａＤ４ＳＢ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮｍ：：Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ４Ｓ−１：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＥｇＤＨＡｓｙｎ１Ｓ：：Ｌｉｐ１であった。
【０２７７】
Ｙ５０３７Ｕ（Ｕｒａ３−）株の生成
Ｕｒａ３遺伝子を破壊するため、コンストラクトｐＺＫＵＭ（図５Ａ；配列番号４０；米国特許出願公開第２００９−００９３５４３−Ａ１号明細書の表１５に記載される）を使用して、Ｙ５００４株のｐＺＫＵＭ形質転換についての記載（上記）と同様の方法でＵｒａ３突然変異遺伝子をＹ５０３７株のＵｒａ３遺伝子に組み込んだ。合計１２個の形質転換体を増殖させ、Ｕｒａ−表現型を有することを確認した。
【０２７８】
ＧＣ分析により、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃４に１２．１％のＥＰＡ、１０．２％のＤＰＡ及び３．３％のＤＨＡが存在し、ｐＺＫＵＭ形質転換体株＃１１に１２．４％のＥＰＡ、１０．３％のＤＰＡ及び３．５％のＤＨＡが存在することが示された。これらの２つの株を、それぞれＹ５０３７Ｕ１株及びＹ５０３７Ｕ２株（まとめて、Ｙ５０３７Ｕ株）と命名した。
【０２７９】
実施例３
種々のＬＰＬＡＴ  ＯＲＦを含む様々な発現ベクターの構築
本実施例は、各々がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に好適なＬＰＬＡＴ  ＯＲＦを含む一連のベクターの構築について記載する。ＬＰＬＡＴ  ＯＲＦは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴを含んだ。実施例４、５、及び６は、これらのベクターをヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換した後に得られた結果について記載する。
【０２８０】
ＬＰＬＡＴの起源
特許及び公開文献において様々なＬＰＬＡＴが同定されているが、それらの遺伝子の機能についてはこれまで直接比較されたことがない。表１２は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に対して異種遺伝子をコドン最適化した後に（下記）実施例で利用される、公開されているＬＰＬＡＴ（すなわち、ＳｃＡｌｅ１、ＳｃＬＰＡＡＴ、ＭａＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴ）及び本明細書で同定されるＬＰＬＡＴオルソログ（すなわち、ＹｌＡｌｅ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１）を要約する。
【０２８１】
【表１３】
0005931721.tif 000017
【０２８２】
より具体的には、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）及びＳｃＡｌｅ１（配列番号９）タンパク質配列を問い合わせ配列として使用して、ワシントン大学（セントルイス）医学部のＢＬＡＳＴ  ２．０（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ；  ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を利用し「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ、仏国）の公開されているＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースからオルソログを同定した（Ｄｕｊｏｎ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）もまた参照のこと）。ベストヒットの分析に基づき、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴオルソログが、本明細書ではそれぞれＹｌＡｌｅ１（配列番号１１）及びＹｌＬＰＡＡＴ（配列番号１７）として同定される。それぞれＳｃＡｌｅ１及びＳｃＬＰＡＡＴのオルソログとしてのＹｌＡｌｅ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１のアイデンティティについて、レシプロカルＢＬＡＳＴ（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ＢＬＡＳＴ）を行うことによりさらに確認し、すなわち配列番号１１及び１７をサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）公開タンパク質データベースに対する問い合わせ配列として使用して、ベストヒットとしてそれぞれＳｃＡｌｅ１及びＳｃＬＰＡＡＴを求めた。
【０２８３】
ＳｃＡｌｅ１（配列番号９）、ＹｌＡｌｅ１（配列番号１１）、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）、ＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）及びＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２）として上記で同定されたＬＰＬＡＴタンパク質を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（バージョン８．０．２）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（スロー（ｓｌｏｗ）、アキュレート（ａｃｃｕｒａｔｅ）、Ｇｏｎｎｅｔオプション；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜４６８０頁（１９９４年））の方法を用いてアラインメントした。その結果から表１３を作成し、ここでは類似性パーセントが表の上三角部分に示され、一方、分散パーセント（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）が下三角部分に示される。
【０２８４】
【表１４】
0005931721.tif 000018
【０２８５】
この方法により明らかにされる同一性パーセントから、ＬＰＡＡＴポリペプチドの各々の間の最小同一性パーセント及びＡｌｅ１ポリペプチドの各々の間の最小同一性パーセントを決定することが可能となった。ＬＰＡＡＴポリペプチド間の同一性の範囲は３４．０％同一性（ＭａＬＰＡＡＴ１及びＹｌＬＰＡＡＴ１）〜４３．９％同一性（ＳｃＬＰＡＡＴ及びＹｌＬＰＡＡＴ１）であった一方、ＳｃＡｌｅ１及びＹｌＡｌｅ１ポリペプチド間の同一性は４５％であった。
【０２８６】
膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼ［「ＭＢＯＡＴ」］ファミリーモチーフ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ［「ＮＣＢＩ」］ＢＬＡＳＴＰ２．２．２０（タンパク質−タンパク質Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）；及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、ＦＥＢＳ  Ｊ．、２７２：５１０１〜５１０９頁（２００５年））検索を、「ｎｒ」タンパク質データベース（全ての非重複ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ［「ＰＤＢ」］からの三次元構造に由来する配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新の大規模な公開に含まれる配列、ＷＧＳプロジェクトからの環境試料のものを除くＰＩＲ及びＰＲＦを含む）における真菌タンパク質に対する問い合わせ配列としてＳｃＡｌｅ１（配列番号９）を使用し、デフォルトパラメータ（期待値閾値＝１０；ワードサイズ＝３；スコアリングパラメータ行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在＝１１、伸長＝１）を使用して行うことにより、ＳｃＡｌｅ１タンパク質配列（配列番号９）のオルソログを同定した。以下のヒットが得られた。
【０２８７】
【表１５−１】
0005931721.tif 000019
【表１５−２】
0005931721.tif 000020
【０２８８】
表１４の酵母及び真菌タンパク質配列を、ＤＮＡＳＴＡＲを使用してアラインメントした。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いて多重配列アラインメント及び同一性パーセント計算を実施した（上記）。
【０２８９】
より具体的には、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法を用いた多重タンパク質アラインメントのデフォルトパラメータは、以下に対応した：ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト（ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質ウェイト行列＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列＝ＩＵＢ、「スロー−アキュレート（ｓｌｏｗ−ａｃｃｕｒａｔｅ）」オプション付き。得られたアラインメントを分析し、米国特許出願公開第２００８−０１４５８６７−Ａ１号明細書に特定されるとおりの、Ａｌｅ１相同体についての非植物モチーフの存在又は不在を決定した。具体的にそれらとしては、Ｍ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号２６）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号２７）、ＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号２９）（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基をコードする）が挙げられる。配列番号２９のＨｉｓ残基は、タンパク質内における活性部位残基と見られることが報告されている。
【０２９０】
アラインメントを行った３３個の生物全てにおいて完全に保存されていたのは、１つのモチーフ、すなわちＥＸ11ＷＮＸ2−［Ｔ／Ｖ］−Ｘ2Ｗ（配列番号２８）のみであった。他のＭ−［Ｖ／Ｉ］−［Ｌ／Ｉ］−ｘｘＫ−［Ｌ／Ｖ／Ｉ］−ｘｘｘｘｘｘＤＧ（配列番号２６）、ＲｘＫＹＹｘｘＷｘｘｘ−［Ｅ／Ｄ］−［Ａ／Ｇ］ｘｘｘｘＧｘＧ−［Ｆ／Ｙ］−ｘＧ（配列番号２７）及びＳＡｘＷＨＧｘｘＰＧＹｘｘ−［Ｔ／Ｆ］−Ｆ（配列番号２９）モチーフは、部分的にのみ保存されていた。従って、本方法論の目的上、これらのモチーフを適切に切断し、０ミスマッチ（すなわち、ＳＡｘＷＨＧ［配列番号５］）、１ミスマッチ（すなわち、ＲｘＫＹＹｘｘＷ［配列番号４］）、又は２ミスマッチ（すなわち、Ｍ（Ｖ／Ｉ）（Ｌ／Ｉ）ｘｘＫ（ＬＶＩ）［配列番号３］）に適合させた。
【０２９１】
１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ［「ＬＰＡＡＴ」］ファミリーモチーフ：ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）及びＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）を含むタンパク質アラインメントの分析から、１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフＥＧＴＲ（配列番号２０）がＬＰＡＡＴオルソログの各々に存在することが明らかとなった。これに基づき、ＭａＬＰＡＡＴ１をＬＰＡＡＴ候補として同定し、これは国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットに開示されるＭａＬＰＡＡＴ様タンパク質（すなわち、配列番号９３及び９５）とは明確に区別可能なものであった。
【０２９２】
ＥＧＴＲ（配列番号２０）モチーフは、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットではＬＰＣＡＴ配列中にないものの、ＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２）に存在することは注目に値する。他の残基がＬＰＡＡＴ配列及びＬＰＡＡＴ様タンパク質のＬＰＣＡＴ配列を区別しているように思われる。かかる残基の一つは、ＥＧＴＲ（配列番号２０）モチーフの伸長部であり得る。具体的には、ＳｃＬＰＡＡＴ（配列番号１８）、ＭａＬＰＡＡＴ１（配列番号１５）及びＹｌＬＰＡＡＴ１（配列番号１７）のＥＧＴＲモチーフは直後にセリン残基が続くが、ＣｅＬＰＣＡＴのＥＧＴＲモチーフは直後にアスパラギン残基が続く。対照的に、国際公開第２００４／０８７９０２号パンフレットの２つのＬＰＣＡＴは、ＥＧＴＲモチーフにおいてアルギニン残基の代わりにバリンを有し、このモチーフは直後にバリン残基が続く。
【０２９３】
コドン最適化サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１遺伝子を含むｐＹ２０１の構築
「ＳｃＡｌｅ１」（配列番号８）と命名されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＲＦを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＳｃＡｌｅ１Ｓ；配列番号１２）。ＳｃＡｌｅ１Ｓ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号１３］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号９］と同じである）。ＳｃＡｌｅ１ＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＳｃＡｌｅ１Ｓを得た。
【０２９４】
ＳｃＡｌｅ１Ｓを含む１８６３ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＳｃＡｌｅ１Ｓから切り取り、それを使用してｐＹ２０１（配列番号７７；表１５；図１０Ａ）を作成した。キメラＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むことに加え、ｐＹ２０１はまた、必要に応じて、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介組換えにより続いて除去するためのＬｏｘＰ部位が隣接するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３選択マーカーも含む。ＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１キメラ遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子の双方とも、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｐｏｘ３遺伝子の５’領域及び３’領域との相同性を有する断片が隣接し、それにより二重相同組換えによる組込みが促進されるが、しかしながらヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）への組込みは、通常は相同組換えなしに行われることが知られている。従って、これによりコンストラクトｐＹ２０１は以下の構成要素を含んだ。
【０２９５】
【表１６】
0005931721.tif 000021
【０２９６】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１遺伝子を含むｐＹ１６８の構築
「ＹｌＡｌｅ１」と命名されるヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０５６２４；配列番号１０）をヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２  ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲプライマー７９８及び７９９（それぞれ配列番号７９及び８０）を使用してＰＣＲ増幅した。加えて、ＹＡＴプロモーターをｐＹ２０１（配列番号７７）からＰＣＲプライマー８００及び８０１（それぞれ配列番号８１及び８２）により増幅した。互いにいくらかの重複を有する２つのＰＣＲ産物が生じるようにプライマー対を設計したため、次にＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１融合断片を、プライマー７９８及び８０１（それぞれ配列番号７９及び８２）並びに鋳型としての２つのＰＣＲ断片を使用して重複ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ４０  ＰＣＲ機（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、製造者の推奨及びＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００３８０）を用いて実行した。増幅は以下のとおり実行した：９５℃で４分間の初期変性、続いて９５℃で３０秒間の変性を３０サイクル、５５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長。７２℃で１０分間の最終伸長サイクルを実行した後、４℃で反応を終了させた。
【０２９７】
ＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１融合断片を含むＰＣＲ産物をゲル精製し、ＣｌａＩ／ＮｏｔＩで消化した。このＣｌａ１−Ｎｏｔ１断片を、同様に消化した（それによりＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ断片を除去した）ｐＹ２０１にライゲートし、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むｐＹ１６８（配列番号８３）を生じさせた。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ａｌｅ１  ＯＲＦのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐＹ１６８（図１０Ｂ；配列番号８３）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ１６８ではＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＹｌＡｌｅ１は図１０Ｂでは「Ｙｌ  ＬＰＣＡＴ」と表示されることに留意されたい。
【０２９８】
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ２０８の構築
「ＭａＬＰＡＡＴ１」（配列番号１４）と命名されるモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＯＲＦを、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ；配列番号２１）。ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号２２］は野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号１５］と同じである）。ＭａＬＰＡＡＴ１ＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを得た。
【０２９９】
ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを含む９４５ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓから切り取り、それを使用して、ｐＹ２０１（配列番号７７）の２つの断片との３ウェイライゲーションでｐＹ２０８（配列番号８４）を作成した。具体的には、ＭａＬＰＡＡＴ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ２０１断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ２０１断片とライゲートしてｐＹ２０８を得た。ｐＹ２０８（図１１Ａ；配列番号８４）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ２０８ではＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。
【０３００】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ２０７の構築
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の推定ＬＰＡＡＴ１（本明細書では「ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名される；配列番号１７）については、米国特許第７，１８９，５５９号明細書及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿５０４１２７に記載がなされた。このタンパク質は、「ｕｎｉｐｒｏｔ｜Ｐ３３３３３サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＤＬ０５２ｃ  ＳＬＣ１脂肪酸アシルトランスフェラーゼと同様」との注釈が付けられている。
【０３０１】
鋳型としてのヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ番号２０３６２  ｃＤＮＡライブラリ並びにＰＣＲプライマー８５６及び８５７（それぞれ配列番号８５及び８６）を使用して、ＹｌＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦ（配列番号１６）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲは、ｐＹ１６８の合成前のＹＡＴ１：：Ｙｌ  Ａｌｅ１融合断片の増幅についての上記の記載と同じ構成要素及び条件を用いて実行した。
【０３０２】
ＹｌＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦを含むＰＣＲ産物をＰｃｉＩ及びＮｏｔＩで消化し、次にｐＹ１６８からの２つの断片との３ウェイライゲーションに利用した。具体的には、ＹｌＬＰＡＡＴ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ１６８断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ１６８断片とライゲートし、キメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子を含むｐＹ２０７を産生した。ＤＮＡ配列決定によりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１  ＯＲＦを確認した。ｐＹ２０７（図１１Ｂ；配列番号８７）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ２０７ではキメラＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＹｌＬＰＡＡＴ１は図１１Ｂでは「Ｙｌ  ＬＰＡＴ１  ＯＲＦ」と表示されることに留意されたい。
【０３０３】
カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴ遺伝子を含むｐＹ１７５の構築
「ＣｅＬＰＣＡＴ」と命名されるカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＯＲＦ（配列番号１）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によりヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｎｃｏ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＣｅＬＰＣＡＴＳ；配列番号６）。ＣｅＬＰＣＡＴＳ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号７］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号２］と同じである）。
【０３０４】
ＣｅＬＰＣＡＴＳを含むＮｃｏ１−Ｎｏｔ１断片を使用して、ｐＹ１６８（配列番号８３）からの２つの断片との３ウェイライゲーションでｐＹ１７５（配列番号８８）を作成した。具体的には、ＣｅＬＰＣＡＴＳを含むＮｃｏ１−Ｎｏｔ１断片を３５３０ｂｐのＳｐｈ−ＮｏｔＩ  ｐＹ１６８断片及び４２４８ｂｐのＮｃｏＩ−ＳｐｈＩ  ｐＹ１６８断片とライゲートしてｐＹ１７５を得た。ｐＹ１７５（図１２Ａ；配列番号８８）中に存在する構成要素は、ｐＹ２０１においてＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１遺伝子（図１０Ａ）である代わりにｐＹ１７５ではＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１遺伝子であることを除き、ｐＹ２０１中に存在する構成要素と同じである。ＣｅＬＰＣＡＴＳは図１２Ａでは「Ｃｅ．ＬＰＣＡＴｓｙｎ」と表示されることに留意されたい。
【０３０５】
カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴ遺伝子を含むｐＹ１５３の構築
上記のＣｅＬＰＣＡＴＳを含むＮｃｏ１−Ｎｏｔ１断片を使用してｐＹ１５３（配列番号８９；図１２Ｂ）を作成した。キメラＦＢＡＩＮ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：３’Ｙｌ  ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むことに加え、ｐＹ１５３はまたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＵＲＡ３選択マーカーも含む。キメラＦＢＡＩＮ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：３’Ｙｌ  ＬＰＡＡＴ１遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子の双方とも、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子の５’及び３’領域と相同性を有する断片が隣接し、それにより二重相同組換えによる組込みが促進されるが、しかしながらヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）への組込みは、通常は相同組換えなしに行われることが知られている。従って、これによりコンストラクトｐＹ１５３は以下の構成要素を含んだ。
【０３０６】
【表１７】
0005931721.tif 000022
【０３０７】
実施例４
ＥＰＡ産生ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株における種々のＬＰＬＡＴの機能に関する特性決定
ＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴの過剰発現の効果について、それらをヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主染色体に安定的に組み込んだ後、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＬＡＴ、すなわちＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴ１を含むにもかかわらずであった。
【０３０８】
次にヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株（実施例１）を、実施例３に記載される組込みベクターの直鎖状ＳｐｈＩ−ＡｓｃＩ断片により個々に形質転換し、ここで各ＬＰＬＡＴはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＴプロモーターの制御下にあった。具体的には、ベクターｐＹ２０１（ＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ１６８（ＹＡＴ１：：ＹｌＡｌｅ１：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ２０８（ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ２０７（ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１）及びｐＹ１７５（ＹＡＴ１：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：Ｌｉｐ１）を一般的方法に従い形質転換した。
【０３０９】
各形質転換混合物をＭＭ寒天プレートに播種した。いくつかの得られたＵＲＡ＋形質転換体を選び取り、アミノ酸を含まない６．７ｇのＤｉｆｃｏ酵母窒素ベース、５ｇの酵母エキス、６ｇのＫＨ2ＰＯ4、２ｇのＫ2ＨＰＯ4、１．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５ｍｇのチアミンＨＣｌ、及び２０ｇのグルコースをＬ当たりに含有する３ｍＬのＦＭ培地（Ｂｉｏｍｙｘカタログ番号ＣＭ−６６８１、Ｂｉｏｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に接種した。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で２日間増殖した後、培養物を遠心により回収し、ｐＨ７．５に調整された、０．６３％リン酸一カリウム、２．７％リン酸二カリウム、８．０％グルコースを含有する３ｍＬのＨＧＭ培地（カタログ番号２Ｇ２０８０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に再懸濁した。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で５日間増殖した後、培養物の１ｍＬアリコートを遠心により回収し、ＧＣにより分析した。具体的には、培養細胞を１３，０００ｒｐｍで１分間遠心することにより回収し、全脂質を抽出し、エステル交換により脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し、続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した（一般的方法）（一般的方法）。
【０３１０】
３ｍＬ培養物の脂肪酸組成に基づき、選択した形質転換体をフラスコアッセイによりさらに特性決定した。具体的には、発現ベクターｐＹ２０１（ＳｃＡｌｅ１Ｓを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃５及び＃１１を選択し、それぞれ「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５」及び「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１」と命名した；発現ベクターｐＹ１６８（ＹｌＡｌｅ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃１６を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１」と命名した；発現ベクターｐＹ２０８（ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃８を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」と命名した；発現ベクターｐＹ２０７（ＹｌＬＰＡＡＴ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃２１を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名した；及び発現ベクターｐＹ１７５（ＣｅＬＰＣＡＴＳを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃２３を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ」と命名した。加えて、Ｙ８４０６株（Ｙ８４０６Ｕ（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用した。
【０３１１】
各選択した形質転換体及び対照をＭＭ寒天プレートに画線した。次に、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを用いてＧＣ分析（上記）を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０３１２】
ＤＣＷを決定するため、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機のＢｅｃｋｍａｎ  ＧＨ−３．８ロータにおいて４０００ｒｐｍで５分間遠心することにより、１０ｍＬの培養物を回収した。ペレットを２５ｍＬの水中に再懸濁し、再度上記のとおりに回収した。洗浄したペレットを２０ｍＬの水中に再懸濁し、予め秤量したアルミニウム皿に移した。細胞懸濁液を真空オーブンにおいて８０℃で一晩乾燥させた。細胞の重量を決定した。
【０３１３】
脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率
同じ条件下で合計４つの別個の実験を実施した。実験１は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５株と比較した。実験２は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１株と比較した。実験３は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１株、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１株、及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ株と比較した。実験４は対照Ｙ８４０６株をＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ株、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１株及びＹ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ株と比較した。
【０３１４】
各実験において、対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株の１、２又は３個の同型培養物［「レプリケート」］について、ＤＣＷの百分率として脂質含量、脂肪酸組成及びＥＰＡを定量化した。加えて、各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。以下の表１７は、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡとして特定される。
【０３１５】
表１８は、ＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＥＰＡ産生に必要な各デサチュラーゼ及びΔ９エロンガーゼの変換効率を要約する。具体的には、Δ１２デサチュラーゼ変換効率［「Δ１２  ＣＥ」］、Δ８デサチュラーゼ変換効率［「Δ８  ＣＥ」］、Δ５デサチュラーゼ変換効率［「Δ５  ＣＥ」］、Δ１７デサチュラーゼ変換効率［「Δ１７  ＣＥ」］及びΔ９伸長変換効率［「Δ９ｅ  ＣＥ」］が、各対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株について提供される；各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。変換効率は以下の式により計算した：産物／（産物＋基質）＊１００（ここで産物は、産物と産物誘導体との双方を含む）。
【０３１６】
【表１８】
0005931721.tif 000023
【０３１７】
【表１９】
0005931721.tif 000024
【０３１８】
表１７及び表１８の実験１、２及び３に関するデータに基づけば、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１ＳにおけるＬＰＬＡＴの過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の大幅な低下（対照の６７％以下に至る）、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］の増加（対照の少なくとも１２％に上る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも１６％に上る）をもたらす。Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−５及びＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ−１１と比較して、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１はより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より良好なΔ９伸長変換効率、並びに僅かに低いＴＦＡ  ％  ＤＣＷ及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷを有する。Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＡｌｅ１とＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓとは、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの過剰発現がより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷをもたらしたことを除き、同程度である。
【０３１９】
実験４は、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳにおけるＬＰＬＡＴの過剰発現が、ＬＡ  ％  ＴＦＡの大幅な低下（対照の６７％以下に至る）、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡの増加（対照の少なくとも９％に上る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも１３％に上る）をもたらすことを示す。Ｙ８４０６Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳと比較して、Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの双方が、より低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、より高いＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、及び僅かに良好なＴＦＡ  ％  ＤＣＷを有する。Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１とＹ８４０６Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓとは、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓの過剰発現がより低いＬＡ  ％  ＴＦＡ、僅かに低いＥＰＡ  ％  ＴＦＡ及びＥＰＡ  ％  ＤＣＷ、並びに僅かに良好なΔ９エロンガーゼ変換効率をもたらすことを除き、同程度である。
【０３２０】
当該技術分野では、ほとんどの不飽和化がリン脂質のｓｎ−２位で起こり、一方脂肪酸伸長がアシルＣｏＡで起こることが公知である。さらに、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹｌＬＰＡＡＴ１は、アシルＣｏＡプールからアシル基のみをリゾリン脂質、例えばリゾホスファチジン酸［「ＬＰＡ」］及びリゾホスファチジルコリン［「ＬＰＣ」］のｓｎ−２位に組み込むものと予想された。従って、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、及びＹｌＬＰＡＡＴ１の発現により、リン脂質における基質の利用能が向上するため不飽和化の向上がもたらされ、且つＣｏＡプールにおける基質の利用能の向上を必要とする伸長の向上はもたらされないものと予想された。本発明者らのデータ（上記）は、意外にも、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ及びＹｌＬＰＡＡＴ１の発現によって、ＥＰＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株におけるΔ９エロンガーゼ変換効率が大幅に向上し、しかし不飽和化（Δ１２デサチュラーゼ変換効率、Δ８デサチュラーゼ変換効率、Δ５デサチュラーゼ変換効率又はΔ１７デサチュラーゼ変換効率として計測される）は向上しなかったことを示している。
【０３２１】
ＣｅＬＰＣＡＴは、ＬＡ又はＧＬＡを供給されたサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてΔ６伸長変換効率を向上させることが過去に示された（国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレット）。これは、リン脂質からＣｏＡプールに脂肪酸を放出するその可逆的なＬＰＣＡＴ活性に起因した。脂肪酸の供給なしに高レベルＬＣ−ＰＵＦＡを産生するよう改変された油性微生物、例えばヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるΔ９伸長変換効率の向上は、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットでは企図されなかった。
【０３２２】
さらに、ＥＰＡを産生するヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株におけるＰＵＦＡの蓄積レベル又は全脂質含量のいずれかが、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴＳの発現によって大きく変化することはなかった。
【０３２３】
先行研究は、Δ６伸長及びΔ９伸長の双方が、リン脂質とアシルＣｏＡプールとの間でのアシル基の転移の不足により長鎖ＰＵＦＡ生合成における障害となることを示している。上記に実証される、ＬＰＬＡＴの過剰発現によりもたらされるΔ９エロンガーゼ変換効率の向上に基づけば、本明細書に記載されるＬＰＬＡＴ及びそれらのオルソログ、例えばＳｃＬＰＡＡＴもまたΔ６伸長変換効率を向上させるであろうことが予想される。
【０３２４】
実施例５
ＤＨＡ産生Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ５０３７株における種々のＬＰＬＡＴの機能に関する特性決定
ＤＨＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ５０３７Ｕ株を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴの過剰発現の効果について、それらをヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主染色体に安定的に組み込んだ後、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＬＡＴ、すなわちＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴ１を含むにもかかわらずであった。
【０３２５】
形質転換及び増殖
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ５０３７Ｕ株（実施例２）を、実施例３に記載される組込みベクターの直鎖状ＳｐｈＩ−ＡｓｃＩ断片により個々に形質転換し、ここでＳｃＡｌｅ１Ｓ及びＭａＬＰＡＡＴ１Ｓはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＹＡＴプロモーターの制御下にあり、一方ＣｅＬＰＣＡＴＳはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＦＢＡＩＮプロモーターの制御下にあった。具体的には、ベクターｐＹ２０１（ＹＡＴ１：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）、ｐＹ２０８（ＹＡＴ１：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ：：Ｌｉｐ１）及びｐＹ１５３（ＦＢＡＩＮ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１）を一般的方法に従い形質転換した。
【０３２６】
各形質転換混合物をＭＭ寒天プレートに播種した。選択した形質転換体を、以下に詳述するとおりさらに特性決定した。より具体的には、発現ベクターｐＹ１５３（ＣｅＬＰＣＡＴＳを含む）により形質転換したＹ５０３７Ｕ株のクローン＃７を選択し、「Ｙ５０３７Ｕ：：ＦＢＡＩＮ−ＣｅＬＰＣＡＴＳ」と命名した；発現ベクターｐＹ２０１（ＳｃＡｌｅ１Ｓを含む）により形質転換したＹ５０３７Ｕ株のクローン＃１８を選択し、「Ｙ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅ１Ｓ」と命名した；及び発現ベクターｐＹ２０８（ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓを含む）により形質転換したＹ５０３７Ｕ株のクローン＃６を選択し、「Ｙ５０３７Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ」と命名した。加えて、Ｙ５０３７株（Ｙ５０３７（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用した。
【０３２７】
３ｍＬ培養物において、様々な培養条件及び株に基づき合計４つの別個の実験を実施し、脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率に対するＬＰＬＡＴ過剰発現の効果を調べた。実験１は、シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃でＭＭ培地にて２日間増殖し、続いて３ｍＬのＨＧＭ培地にて３日間インキュベートした後、Ｙ５０３７Ｕ：：ＦＢＡＩＮ−ＣｅＬＰＣＡＴＳ株及びＹ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株を対照Ｙ５０３７株と比較した。ＭＭ培地（カタログ番号ＣＭＬ−ＭＭ、Ｂｉｏｍｙｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐＨ６．１は、アミノ酸及びＮＨ4ＳＯ4を含まない１．７ｇの酵母窒素ベース［「ＹＮＢ」］、１ｇのプロリン、０．１ｇのアデニン、０．１ｇのリジン、及び２０ｇのグルコースをＬ当たりに含有する。
【０３２８】
実験２は、シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃でＣＳＭ−Ｕ培地にて２日間増殖し、続いて３ｍＬのＨＧＭ培地にて３日間インキュベートした後、Ｙ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株を対照Ｙ５０３７株と比較した。ＣＳＭ−Ｕ培地（カタログ番号Ｃ８１４０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ，、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）は、０．１３％のウラシル非含有アミノ酸ドロップアウトパウダー、０．１７％の酵母窒素ベース、０．５％の（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び２．０％のグルコースを含む。
【０３２９】
実験３は、シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃でＭＭ培地にて２日間増殖し、続いて３ｍＬのＨＧＭ培地にて５日間インキュベートした後、Ｙ５０３７Ｕ：：ＦＢＡＩＮ−ＣｅＬＰＣＡＴＳ株及びＹ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株を対照Ｙ５０３７株と比較した。
【０３３０】
実験５は、シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃でＦＭ培地にて２日間増殖し、続いて３ｍＬのＨＧＭ培地にて３日間インキュベートした後、Ｙ５０３７Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ株を対照Ｙ５０３７株と比較した。ＦＭ培地の組成は実施例４に記載する。
【０３３１】
ＨＧＭ中で３日間（実験１、２、及び５）又は５日間（実験３）増殖した後、実施例４に記載されるとおり培養物の１ｍＬアリコートを遠心により回収し、ＧＣにより分析した。
【０３３２】
実験４は、上記のとおり２５ｍＬのＦＭ培地にて２日間増殖し、続いてＨＧＭ培地にて５日間インキュベートした後、Ｙ５０３７Ｕ：：ＦＢＡＩＮ−ＣｅＬＰＣＡＴＳ株及びＹ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株を対照Ｙ５０３７株と比較した。具体的には、ＭＭ寒天プレートからの新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＦＭ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＦＭ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、１ｍＬのアリコートを用いてＧＣ分析を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した（上記、実施例４）。
【０３３３】
脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率
各実験において、対照Ｙ５０３７株及び形質転換体Ｙ５０３７Ｕ株の１、２、３又は４個の同型培養物［「レプリケート」］について、脂質含量及び脂肪酸組成を定量化した。加えて、各Ｙ５０３７Ｕ形質転換体のデータをＹ５０３７対照の％として表す。以下の表１９はＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡ及びＥＤＤ（ＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡの合計に対応する）として特定される。加えて、ＤＨＡ  ％  ＴＦＡ／ＤＰＡ  ％  ＴＦＡの比が提供される。
【０３３４】
表２０は、合計ＤＣＷ（ｍｇ／ｍＬ）、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、及びＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＤＨＡ産生に必要な各デサチュラーゼ及びエロンガーゼの変換効率を要約する。具体的には、Δ１２デサチュラーゼ変換効率［「Δ１２  ＣＥ」］、Δ８デサチュラーゼ変換効率［「Δ８  ＣＥ」］、Δ５デサチュラーゼ変換効率［「Δ５  ＣＥ」］、Δ１７デサチュラーゼ変換効率［「Δ１７  ＣＥ」］、Δ４デサチュラーゼ変換効率［「Δ４  ＣＥ」］、Δ９伸長変換効率［「Δ９ｅ  ＣＥ」］及びΔ５伸長変換効率［「Δ５ｅ  ＣＥ」］が、各対照Ｙ５０３７株及び１つ又は複数の形質転換体Ｙ５０３７Ｕ株について提供される；各Ｙ５０３７Ｕ形質転換体のデータはＹ５０３７対照の％として表す。変換効率は以下の式により計算した：産物／（産物＋基質）＊１００（ここで産物は、産物と産物誘導体との双方を含む）。
【０３３５】
【表２０】
0005931721.tif 000025
【０３３６】
【表２１】
0005931721.tif 000026
【０３３７】
表１９及び表２０のデータに基づけば、ＤＨＡ株のＹ５０３７Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ、Ｙ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ及びＹ５０３７Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１ＳにおけるＬＰＬＡＴの過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の低下、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ濃度［「ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ」］の増加、ＴＦＡの重量％としてのＤＨＡ濃度［「ＤＨＡ  ％  ＴＦＡ」］の増加、ＴＦＡの重量％としてのＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ濃度［「ＥＤＤ  ％  ＴＦＡ」］の増加（実験４のＹ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株を除く）、ＤＨＡ  ％  ＴＦＡのＤＰＡ  ％  ＴＦＡに対する比［「ＤＨＡ／ＤＰＡ」］の増加、Δ９エロンガーゼの変換効率の増加及びΔ４デサチュラーゼの変換効率の増加をもたらす。
【０３３８】
より具体的には、培養条件によっては、Ｙ５０３７Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳにおけるＣｅＬＰＣＡＴＳの過剰発現により、対照と比較したときＬＡ  ％  ＴＦＡが４５％に低下し、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡが１７５％に増加し、ＤＨＡ  ％  ＴＦＡが１６９％に増加し、Δ９伸長ＣＥが１２４％に増加し、及びΔ４不飽和化ＣＥが２２６％に増加し得る。同様に、培養条件によっては、Ｙ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳにおけるＳｃＡｌｅ１Ｓの過剰発現により、対照と比較したときＬＡ  ％  ＴＦＡが７２％に低下し、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡが１２５％に増加し、ＤＨＡ  ％  ＴＦＡが２２２％に増加し、Δ９伸長ＣＥが１１３％に増加し、及びΔ４不飽和化ＣＥが１９１％に増加し得る。最後に、Ｙ５０３７Ｕ：：ＭａＬＰＡＡＴ１ＳにおけるＭａＬＰＡＡＴ１の過剰発現により、対照と比較したときＬＡ  ％  ＴＦＡが９４％に低下し、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡが１１５％に増加し、ＤＨＡ  ％  ＴＦＡが１２０％に増加し、Δ９伸長ＣＥが１０４％に増加し、及びΔ４不飽和化ＣＥが１１８％に増加し得る。
【０３３９】
実験４ではＹ５０３７Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳが著しく低い全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］を有したが、全脂質含量はＹ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株において大きく改良された。この脂質含量の増加が、Ｙ５０３７Ｕ：：ＳｃＡｌｅＩＳ株におけるより低いＥＤＤ  ％  ＴＦＡを説明するものである可能性が高い。
【０３４０】
ＥＰＡを介したＤＨＡ生合成には２つのステップ、すなわちＣ20/22エロンガーゼ（また「Ｃ２０」エロンガーゼとしても、又はΔ５エロンガーゼとしても知られる）によるＥＰＡのＤＰＡへの伸長と、Δ４デサチュラーゼによるＤＰＡのＤＨＡへの不飽和化とが関与する。ＥＰＡからのＤＨＡの産生における重要な障害は、ＤＰＡの蓄積によって認められるΔ４不飽和化ステップであるとされているが、この制約についての機構の詳細は未だ不明である。上記の結果は、ＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＹｌＬＰＡＡＴ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、及びＣｅＬＰＣＡＴＳタンパク質の発現によりΔ４不飽和化が著しく改良されたことを示している。従って、Δ４不飽和化は、Δ４デサチュラーゼ活性それ自体が理由で制約となったわけではなかった。むしろΔ４不飽和化は、リン脂質のｓｎ−２位におけるＤＰＡ基質の利用能が限られていたために制約となった。結果からは、意外なことに、（他の不飽和化基質とは異なり）Ａｌｅ１、ＬＰＡＡＴ及びＬＰＣＡＴタンパク質の過剰発現によってリン脂質への限られたＤＰＡ取込みを解消できることが示された。
【０３４１】
これまでに、国際公開第２００４／０７６６１７号パンフレットが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてＣｅＬＰＣＡＴ（配列番号２）を発現させることにより、外因的に提供したＧＬＡのＤＧＬＡへのΔ６伸長が向上することを示した。そこでは、ＣｅＬＰＣＡＴがリン脂質のｓｎ−２位からアシル鎖を除去し、それにより除去されたアシル基がＣｏＡプールでの伸長に利用可能となったという仮説が立てられた。本研究では、それぞれ高レベルのＥＰＡ（実施例４）及びＤＨＡ（実施例５）を産生するよう改変されたヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株において、ＹＡＴ１プロモーターの制御下でコドン最適化ＣｅＬＰＣＡＴＳを発現させることにより、内因的に産生されたＬＡのＥＤＡへのΔ９伸長が向上することが示された。しかしながら、ＤＨＡ産生Ｙ５０３７Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ株におけるＣｅＬＰＣＡＴＳの発現は、意外にも、ＥＰＡのＤＰＡへのΔ５伸長の向上をもたらさなかった。対照的に、ＤＨＡ産生Ｙ５０３７Ｕ：：ＣｅＬＰＣＡＴＳ株におけるＣｅＬＰＣＡＴＳの発現では、ＤＰＡのＤＨＡへのΔ４不飽和化が極めて顕著に向上した（上記）。不飽和化はリン脂質のｓｎ−２位で主に起こり、伸長はＣｏＡプールにおいて起こるため、これは特に予想外のことであった。
【０３４２】
上記に実証されるとおりの、ＬＰＬＡＴの過剰発現によりもたらされるΔ４不飽和化変換効率の向上に基づけば、本明細書に記載されるＬＰＬＡＴ及びそのオルソログ、例えばＳｃＬＰＡＡＴによってもまた、Δ４不飽和化変換効率が向上し得るものと予想される。
【０３４３】
実施例６
ＡＲＡ産生Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８００６Ｕ株における種々のＬＰＬＡＴの機能に関する特性決定
ＡＲＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８００６Ｕ株を使用して、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌｅ１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＬＰＡＡＴ１及びカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）ＬＰＣＡＴの過剰発現の効果について、それらをヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）宿主染色体に安定的に組み込んだ後、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＬＡＴ、すなわちＡｌｅ１及びＬＰＡＡＴ１を含むにもかかわらずであった。
【０３４４】
形質転換及び増殖
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８００６Ｕ株（実施例１）は、実施例４で利用したものと同様の方法で、実施例３に記載される組込みベクターの直鎖状ＳｐｈＩ−ＡｓｃＩ断片により個々に形質転換する。ＵＲＡ＋形質転換体を選択してＦＭ培地で２日間及びＨＧＭ培地で５日間増殖し、次に培養物の１ｍＬアリコートを遠心により回収し、ＧＣにより分析する（実施例４）。３ｍＬ培養物の脂肪酸組成に基づき、Ｙ８００６株（Ｙ８００６Ｕ（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用して、選択した形質転換体をさらに特性決定する。
【０３４５】
各選択した形質転換体及び対照を実施例４に記載されるとおりＦＭ培地及びＨＧＭ培地で再度増殖し、次にＧＣ分析及びＤＣＷ測定に供する。
【０３４６】
対照Ｙ８００６株及び１つ又は複数の形質転換体Ｙ８００６Ｕ株について、ＤＣＷの百分率としての脂質含量、脂肪酸組成及びＡＲＡを定量化する。加えて、各Ｙ８００６Ｕ形質転換体のデータをＹ８００６対照の％として決定する。ＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＡＲＡの産生に必要な各デサチュラーゼ及びΔ９エロンガーゼの変換効率もまた決定し、実施例４及び５と同様の方法で対照と比較する。
【０３４７】
ＡＲＡ株においてＳｃＡｌｅ１Ｓ、ＹｌＡｌｅ１、ＭａＬＰＡＡＴ１Ｓ、ＹｌＬＰＡＡＴ１及びＣｅＬＰＣＡＴＳのＬＰＬＡＴを過剰発現させることにより、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の低下、ＴＦＡの重量％としてのＡＲＡ濃度［「ＡＲＡ  ％  ＴＦＡ」］の増加、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加がもたらされるという仮説が立てられる。
【０３４８】
実施例７
ＬＰＡＡＴ  ＯＲＦ及び自己複製配列を含む発現ベクターの構築
本実施例は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に組み込まないＬＰＡＡＴ遺伝子発現に好適な、自己複製配列［「ＡＲＳ」］とＬＰＡＡＴ  ＯＲＦとを含むベクターの構築について記載する。ＯＲＦは、配列番号１８をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴと、配列番号１７をコードするヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１とを含んだ。実施例８は、これらのベクターをＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に形質転換した後に得られた結果について記載する。
【０３４９】
コドン最適化サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴ遺伝子を含むｐＹ２２２の構築
「ＳｃＬＰＡＡＴ」と命名されるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＲＦ（配列番号１８）を、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によってヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での発現に最適化した。コドン最適化に加え、合成遺伝子には５’Ｐｃｉ１及び３’Ｎｏｔ１クローニング部位を導入した（すなわち、ＳｃＬＰＡＡＴＳ；配列番号９６）。ＳｃＬＰＡＡＴＳ遺伝子のいずれの修飾によっても、コードされるタンパク質のアミノ酸配列は変化しなかった（すなわち、コドン最適化遺伝子によりコードされるタンパク質配列［すなわち、配列番号９７］は、野生型タンパク質配列［すなわち、配列番号１８］と同じである）。ＳｃＬＰＡＡＴＳをｐＪ２０１（ＤＮＡ２．０）にクローニングしてｐＪ２０１：ＳｃＬＰＡＡＴＳを得た。
【０３５０】
ＳｃＬＰＡＡＴＳを含む９２６ｂｐのＰｃｉ１／Ｎｏｔ１断片をｐＪ２０１：ＳｃＬＰＡＡＴＳから切り取り、ＮｃｏＩ−Ｎｏｔ１で切断したｐＹＡＴ−ＤＧ２−１にクローニングしてｐＹ２２２（配列番号１００；表２１；図１３Ａ）を作成した。従って、ｐＹ２２２は以下の構成要素を含んだ。
【０３５１】
【表２２】
0005931721.tif 000027
【０３５２】
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１遺伝子を含むｐＹ１７７の構築
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）セントロメア及び自己複製配列［「ＡＲＳ」］を、プライマー８６９（配列番号９８）及びプライマー８７０（配列番号９９）を使用する標準的なＰＣＲにより、プラスミドｐＹＡＴ−ＤＧ２−１を鋳型として増幅した。ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、ＡｓｃＩ−ＡｖｒＩＩ消化ｐＹ２０７（配列番号８７；実施例３）にクローニングしてｐＹ１７７（配列番号１０１；表２２；図１３Ｂ）を作成した。従って、ｐＹ１７７中に存在する構成要素は、ＡｓｃＩとＡｖｒＩＩとの間の３７３ｂｐのｐＹ２０７配列がＡＲＳを含む１３４１ｂｐの配列に置き換えられたことを除き、ｐＹ２０７（図１１Ｂ）中に存在するものと同じである。より具体的には、ｐＹ１７７は以下の構成要素を含んだ。
【０３５３】
【表２３】
0005931721.tif 000028
【０３５４】
実施例８
ＥＰＡ産生ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株における種々のＬＰＡＡＴの機能に関する特性決定
ＥＰＡを産生するヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株を使用して、自己複製プラスミドに組み込まないサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＰＡＡＴＳ（配列番号９６）及びヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＰＡＡＴ１（配列番号１６）の発現の効果を、機能に関して特性決定した。これは、宿主がその天然ＬＰＡＡＴを含むにもかかわらずであった。
【０３５５】
形質転換及び増殖
ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６Ｕ株（実施例１）を実施例７の切断していないプラスミドにより個々に形質転換した。具体的には、ベクターｐＹ１７７（ＹＡＴ１：：ＹｌＬＰＡＡＴ１：：Ｌｉｐ１）［配列番号１０１］及びｐＹ２２２（ＹＡＴ１：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ：：Ｌｉｐ１）［配列番号１００］を一般的方法に従い形質転換した。
【０３５６】
各形質転換混合物をＭＭ寒天プレートに播種した。いくつかの得られたＵＲＡ＋形質転換体を選び取り、３ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｃ８１４０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に接種した。ここでＣＳＭ−Ｕ培地は、ウラシル非含有０．１３％アミノ酸ドロップアウトパウダー、０．１７％酵母窒素ベース、０．５％（ＮＨ4）2ＳＯ4、及び２．０％グルコースを含むグルコース含有ウラシル非含有ＣＭブロスを指す。シェーカーにおいて２００ｒｐｍ及び３０℃で２日間増殖した後、培養物を遠心により回収し、３ｍＬのＨＧＭ培地（カタログ番号２Ｇ２０８０、Ｔｅｋｎｏｖａ  Ｉｎｃ．）に再懸濁した。シェーカーにおいて５日間増殖した後、培養物の１ｍＬアリコートを回収し、実施例４に記載するとおりＧＣにより分析した。
【０３５７】
３ｍＬ培養物の脂肪酸組成に基づき、選択した形質転換体をフラスコアッセイによりさらに特性決定した。具体的には、発現ベクターｐＹ２２２（ＳｃＬＰＡＡＴＳを含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃５及び＃６を選択し、それぞれ「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−５」及び「Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−６」と命名した；発現ベクターｐＹ１７７（ＹｌＬＰＡＡＴ１を含む）により形質転換したＹ８４０６Ｕ株のクローン＃１を選択し、「Ｙ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１」と命名した。加えて、Ｙ８４０６株（Ｙ８４０６Ｕ（Ｕｒａ−）株に対する親であったＵｒａ＋株）を対照として使用した。
【０３５８】
各選択した形質転換体及び対照をＭＭ寒天プレートに画線した。次に、新しく画線した細胞の１つのループを３ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地に接種し、２５０ｒｐｍ及び３０℃で一晩増殖した。ＯＤ600nmを計測し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＣＳＭ−Ｕ培地に０．３の最終ＯＤ600nmまで細胞のアリコートを添加した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で２日後、遠心により６ｍＬの培養物を回収し、１２５ｍＬフラスコ内の２５ｍＬのＨＧＭ中に再懸濁した。振盪インキュベーターにおいて２５０ｒｐｍ及び３０℃で５日後、実施例４に記載されるとおり１ｍＬのアリコートを用いてＧＣ分析を行い、及び１０ｍＬを乾燥させて乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］を決定した。
【０３５９】
脂質含量、脂肪酸組成及び変換効率
対照Ｙ８４０６株及び形質転換体Ｙ８４０６Ｕ株の２個の同型培養物［「レプリケート」］について、ＤＣＷの百分率として脂質含量、脂肪酸組成及びＥＰＡを定量化した。加えて、各Ｙ８４０６Ｕ形質転換体のデータをＹ８４０６対照の％として表す。以下の表２３は、細胞の全脂質含量［「ＴＦＡ  ％  ＤＣＷ」］、ＴＦＡの重量パーセントとしての各脂肪酸の濃度［「％  ＴＦＡ」］及び乾燥細胞重量の百分率としてのＥＰＡ含量［「ＥＰＡ  ％  ＤＣＷ」］を要約する。より具体的には、脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ及びＥＰＡとして特定される。
【０３６０】
表２４は、実施例４の記載と同じ方法で、ＰＵＦＡ生合成経路で機能し、且つＥＰＡ産生に必要な各デサチュラーゼ及びΔ９エロンガーゼの変換効率を要約する。
【０３６１】
【表２４】
0005931721.tif 000029
【０３６２】
【表２５】
0005931721.tif 000030
【０３６３】
上記の表２３及び表２４におけるデータに基づけば、ＥＰＡ株のＹ８４０６Ｕ：：ＹｌＬＰＡＡＴ１、Ｙ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−５及びＹ８４０６Ｕ：：ＳｃＬＰＡＡＴＳ−６におけるＳｃＬＰＡＡＴＳ及びＹｌＬＰＡＡＴ１の双方の過剰発現は、ＴＦＡの重量％としてのＬＡ（１８：２）濃度［「ＬＡ  ％  ＴＦＡ」］の低下（対照の７６％以下に至る）、及びΔ９エロンガーゼの変換効率の増加（対照の少なくとも７％に上る）をもたらした。ＳｃＬＰＡＡＴＳとＹｌＬＰＡＡＴ１とは脂質プロファイルに対して同様の効果を有する。
【０３６４】
次に上記で得られた結果を実施例４で得られた結果と比較したが、ＬＰＬＡＴの特性決定には異なる手段を利用した。具体的には、実施例４では、ベクターがＡＲＳ配列を含まなかったため、ＬＰＬＡＴを有する直鎖化ＤＮＡを染色体に組み込むことにより形質転換した。その結果、安定的な組み込みがもたらされ、前培養及び２日間の増殖の双方の間に比較的高濃度の非選択的ＦＭ増殖培地で株を増殖し、その後ＨＧＭに移した。
【０３６５】
実施例８では、複製プラスミドに対するＹｌＬＰＡＡＴ１及びＳｃＬＰＡＡＴＳの機能に関する特性決定を行った。従って、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株を、各ＬＰＡＡＴ及びＡＲＳ配列を含む環状ＤＮＡにより形質転換した。これらのプラスミドを維持し、組込みなしに遺伝子発現をアッセイするため、ＨＧＭに移す前に、前培養及び２日間の増殖の双方の間に選択培地（すなわち、ＣＳＭ−Ｕ培地）で形質転換体を増殖させる必要があった。
【０３６６】
上記に記載されるこれらの違いは、実施例４及び８においてＹｌＬＰＡＡＴ１の発現により示されるとおり、脂質プロファイル及び含量の違いに寄与し得る。実施例４でＹｌＬＰＡＡＴを発現させたとき、対照と比べたＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びΔ９エロンガーゼ変換効率の変化は、それぞれ６３％、１１５％、及び１１５％であったが、一方、実施例８でＹｌＬＰＡＡＴを発現させたときの対照と比べたＬＡ  ％  ＴＦＡ、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡ、及びΔ９エロンガーゼ変換効率の変化は、それぞれ７６％、１０１％、及び１０７％であった。従って、実施例８におけるΔ９伸長及びＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の改良は、実施例４で観察されるものと比較したとき最小限となる。これらの違いは、染色体への組込みの「位置効果」及び／又は異なる増殖条件に起因し得る。
【０３６７】
ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の改良（ＬＡ  ％  ＴＦＡの低下、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡの増加及びΔ９エロンガーゼ変換効率の増加として計測される）は、複製プラスミド上のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株に形質転換されたときのＳｃＬＰＡＡＴＳ及びＹｌＬＰＡＡＴの双方について同程度であるため、双方のＬＰＬＡＡＴとも宿主染色体に安定的に組み込まれた場合には同様に機能し得ると予想される。従って、ＳｃＬＰＡＡＴＳは、宿主染色体に安定的に組み込まれた場合、実施例４及び５での観察と同様に脂質プロファイルを改良する可能性が高い。
次に、本発明の態様を示す。
１.  少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、前記宿主細胞が少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドが、
ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
ｅ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なり；及び、
さらに前記宿主細胞が、
（ｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加、
（ｉｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率の増加、
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、組換え宿主細胞。
２.  前記少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸が、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、上記１に記載の組換え宿主細胞。
３.  前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
さらに前記宿主細胞が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；及び、
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも５％のΔ４不飽和化変換効率の増加
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、上記１に記載の組換え宿主細胞。
４.  前記改良が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときのエイコサペンタエン酸産生宿主細胞における少なくとも１３％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｃ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも１８％のΔ４不飽和化変換効率の増加；
ｄ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるエイコサペンタエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加；
ｅ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも２重量パーセントの増加；及び、
ｆ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のドコサヘキサエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加からなる群から選択される、上記３に記載の組換え宿主細胞。
５.  前記微生物が酵母である、上記１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
６.  前記酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記５に記載の組換え宿主細胞。
７.  上記４に記載の油性微生物組換え宿主細胞から得られたエイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油。
８.  エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油を作製する方法であって、
ａ）上記４に記載の油性微生物宿主細胞を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油が産生されるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記微生物油を回収してもよいステップと、
を含む方法。
９.  ステップ（ｂ）の前記回収される油がさらに処理される、上記８に記載の方法。
１０.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記８に記載の方法。
１１.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１０に記載の方法。
１２.  長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
１３.  ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）前記Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときエイコサペンタエン酸産生宿主細胞において少なくとも１３％である、
上記１２に記載の方法。
１４.  ａ）前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときドコサヘキサエン酸産生宿主細胞において少なくとも４％である、
上記１２に記載の方法。
１５.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記１２に記載の方法。
１６.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１５に記載の方法。
１７.  長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のΔ４不飽和化変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
１８.  ａ）前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）前記Δ４不飽和化変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したとき少なくとも１８％である、
上記１７に記載の方法。
１９.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記１７に記載の方法。
２０.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１９に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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