(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列とヒト化軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列の組み合わせを含む、改変Ｆａｂフラグメントであって、
該ヒト化重鎖が、追加のアミノ酸残基を含むｃ末端伸長部をさらに含み、
該ｃ末端伸長部が、抗Ｆａｂ抗体による認識を防止するものであり、および
該ｃ末端伸長部が、配列番号：３６および配列番号：３７から成る群から選択される、
改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項２】
Ｆａｂフラグメントが、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合し、およびＧＰＶＩ枯渇表現型を誘導する、請求項１に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項３】
Ｆａｂフラグメントが、ヒトＧＰＶＩの配座エピトープに結合し、ならびにＳｅｒ４３、Ａｒｇ６７およびＡｓｐ８１を含むヒトＧＰＶＩ残基と接触する、請求項２に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項４】
Ｆａｂフラグメントが、
（ａ）配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０によって定義されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
（ｂ）配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３によって定義されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含む、
請求項２または３に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項５】
Ｆａｂフラグメントが、配列番号６の重鎖および配列番号８の軽鎖を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項６】
Ｆａｂフラグメントが、ヒト化されたものである、請求項２から５のいずれか一項に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項７】
ヒト化Ｆａｂフラグメントが、
（ａ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１０）；
（ｂ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；
（ｃ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１２）；
（ｄ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１３）；
（ｅ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１４）；
（ｆ）ＬＣＶＲ（配列番号１６）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；
（ｇ）ＬＣＶＲ（配列番号１７）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；および
（ｈ）ＬＣＶＲ（配列番号１７）とＨＣＶＲ（配列番号１３）
から成る群から選択される、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項６に記載の改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項において定義したとおりの改変Ｆａｂフラグメントと医薬的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１から７のいずれか一項において定義したとおりの改変Ｆａｂフラグメントの調製方法であって、
ａ．請求項１から７において定義したとおりの改変Ｆａｂフラグメントを発現する細胞系の培養
ｂ．培地において発現された該改変Ｆａｂフラグメントの精製
の工程を含む方法。
【請求項１０】
血栓性疾患および血管疾患の予防または治療に使用するための、請求項１から７のいずれか一項において定義したとおりの改変Ｆａｂフラグメント。
【請求項１１】
重鎖のｃ末端に分子を有する、修飾Ｆａｂフラグメントの調製方法であって、
ａ．Ｆａｂフラグメントの重鎖ｃ末端への、配列番号：３６および配列番号：３７から成る群から選択される分子の付加、
ｂ．適切な系における修飾Ｆａｂフラグメントの生産、
ｃ．修飾Ｆａｂフラグメントの精製、
の工程を含み；
該付加が、既存する抗Ｆａｂ抗体による修飾Ｆａｂフラグメントの認識を防止するか、または抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂを使用するときの、血小板活性を防止する、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト血小板膜タンパク質・糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）に特異的に結合する新規抗体および抗体の一価フラグメントまたは誘導体を開示する。本発明の抗体は、ハイブリドーマクローン３９０からの抗体、およびハイブリドーマクローン３９０からの抗体によって認識される配座エピトープに類似しているエピトープに結合する抗体である。これらの抗体およびＦａｂフラグメントは、コラーゲン結合を遮断することができ、従って、コラーゲンによる血小板活性化を防止することができる。本発明は、開示する抗体およびＦａｂフラグメントの生産のためのハイブリドーマクローンおよび発現プラスミドにも関する。本発明は、さらに、血栓症および他の血管疾患の治療用の研究、診断および免疫療法薬を製造するための一価抗体フラグメントの使用に関する。もう１つの態様において、本発明は、患者特異的抗Ｆａｂ抗体により誘導される受容体クラスター化による受容体活性化を防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板機能は、動脈血栓症および心血管疾患の発生において基本的に重要である。今日では、心血管疾患に罹患している患者を抗血小板薬で治療することは当然のことである。臨床的に成功した様々な抗血小板療法を利用できるにもかかわらず、新たな治療に対する未だ満たされぬ医療ニーズは依然として大きい。この欠陥は、特に薬物の効力と安全性（出血）の相関関係に関して、現在利用できる薬物の効力が限られていることに主として起因する。血小板活性化および粘着の早期事象（現在用いられている薬物により標的にされないメカニズム）への干渉は、効力−安全域の改善のための魅力的なアプローチである。コラーゲン受容体糖タンパク質（ＧＰＶＩ）は、血小板活性化のこれらの早期事象に最も重要であり、従って、このメカニズムへの干渉の主な標的である（Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ  ＳＰ，Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｊｕｌ  １５；１０２（２）：４４９−６１）。ＧＰＶＩの抗血小板および抗血栓症効果は、マウスおよび人間からの血小板を使用して、幾つかのインビトロおよびインビボ系に関して説明されている。ＧＰＶＩが欠損した血小板は、内皮下基質の最も重要な血栓形成性成分の１つであるコラーゲンに対して無反応にされる（Ｌｏｃｋｙｅｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２００６；１１８（３）：３７１−８０）。さらに、ＧＰＶＩ欠損が、特発性出血への罹病性を増すことなく、損傷した血管壁での動脈血栓形成の有効な阻害を生じさせることは、マウス研究によって証明されている。これらのデータすべてが、ＧＰＶＩが動脈血栓症の治療の有効で安全な標的に相当することを示唆している。血栓形成の開始におけるＧＰＶＩの中心的役割は、この受容体の阻害が動脈血栓症の症候群において有益であり得ることを示している。このことから、抗体などの生物療法用タンパク質の使用は、ＧＰＶＩの阻害のための臨床的に意味のある戦略になる。ＧＰＶＩとＧＰＶＩのリガンド・コラーゲンとの相互作用は、膨張したタンパク質表面を必要とすると思われるために尚更、このタンパク質−タンパク質相互作用への干渉は、他の戦略と比較して、阻害性ＧＰＶＩ結合タンパク質を用いるほうが成功する可能性が高い。抗体およびＦａｂフラグメントによるＧＰＶＩ機能の阻害についての概念のインビボでの証拠が、幾つかの動物モデルで示されている。
【０００３】
ＧＰＶＩ活性の臨床的に有効な阻害剤が依然として必要とされている。
【０００４】
ＧＰＶＩは、血小板および巨核球上で排他的に発現される主コラーゲン受容体である。コラーゲンへの結合は、受容体クラスター化およびその後の血小板活性化を誘導する。この誘導は、血栓形成における初期事象である。現行の抗血小板薬は、この過程における後期事象を標的にすることにより血栓形成に干渉する。これらの薬物の重篤な副作用は持続出血であり、この副作用がこれらの薬物の使用を制限する。血栓形成の早期事象（例えばＧＰＶＩ）を標的にすることが、出血しやすさに重大な影響を及ぼすことなく非常に抗血栓性であり得るという幾つかの系統の証拠がある。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を中和することにより、コラーゲンとＧＰＶＩの相互作用をうまく阻害することができる。しかし、ｍＡｂは二価の分子であるので、ＧＰＶＩ−受容体クラスター化、従って血小板活性化を誘導し得る。この誘導を回避するために、Ｆａｂフラグメントなどの一価抗体フラグメントが開発された。
【０００５】
残念なことに、これらの一価抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントの徹底的な安全性プロファイリングにより、患者特異的様式で血小板活性化を依然として誘導する潜在能力が明らかになった。虚血事象の治療のための安全な療法を提供するには、開発されたＦａｂ分子のこの活性化性（ａｃｔｉｖａｔｏｒｙ）潜在能力を完全に無くさなければならなかった。これまでのところ、この問題は解決されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎｉｅｓｗａｎｄｔ  Ｂ  ａｎｄ  Ｗａｔｓｏｎ  ＳＰ，Ｂｌｏｏｄ．２００３  Ｊｕｌ  １５；１０２（２）：４４９−６１
【非特許文献２】Ｌｏｃｋｙｅｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．２００６；１１８（３）：３７１−８０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、ヒトＧＰＶＩにおよび霊長類ＧＰＶＩに特異的に結合する、（クローン３９０からの）新規モノクローナル抗体を提供する。
【０００８】
もう１つの態様において、本発明は、クローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの可変ドメイン配列から誘導される組換えＦａｂフラグメントに関する。これらの抗ＧＰＶＩ抗体およびＦａｂフラグメントは、ヒトＧＰＶＩタンパク質のＤ１およびＤ２ドメイン内の特定の配座エピトープを認識する。
【０００９】
抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂおよびＦａｂフラグメントは、両方とも、ＧＰＶＩへのコラーゲン結合を阻害することができる。抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントは、ヒトＧＰＶＩへのフラグメントの親和性を改善する目的で、ヒト化および改変されている。これらのヒト化変異体の生物物理学的特性を説明する。
【００１０】
コラーゲンの阻害に加えて、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントは、ヒト多血小板血漿においてもヒト全血においてもコラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害することができる。これらのＦａｂフラグメントは、血流下でコラーゲン被覆表面での血栓形成を阻害することもできる。
【００１１】
故に、ヒトにおける抗体によるＧＰＶＩの阻害は、魅力的な抗血栓症戦略であると考えられる。
【００１２】
驚くべきことに、本発明の抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂは、ＧＰＶＩ枯渇表現型を誘導する。従って、ＧＰＶＩ枯渇表現型を誘導することができる抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントは、本発明のもう１つの目的である。
【００１３】
本発明は、既存する抗体によるＦａｂフラグメントの認識の防止方法も提供し、この方法は、ＦａｂのＣ末端先端部を分子の付加によりマスクすることに存する。本発明は、Ｆａｂ  Ｃ末端先端部に対する新たな抗体によるＦａｂフラグメントの認識の防止方法も提供し、この方法は、ＦａｂのＣ末端先端部を分子の付加によりマスクすることに存する。
【００１４】
本発明は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂを使用するときの血小板活性化の防止方法も提供し、この方法では、ＦａｂのＣ末端先端部を分子の付加によりマスクする。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、Ｃ末端先端部に分子を有するＦａｂフラグメントである。
【００１６】
本発明の抗ＧＰＶＩおよびＦａｂフラグメントの発現のためのベクターばかりでなく、ＤＮＡおよびタンパク質配列も提供する。
【００１７】
本発明の抗血栓薬は、血栓性または血管疾患の治療に用いることができる。
【００１８】
本発明は、本発明のＧＰＶＩ特異的モノクローナル抗体フラグメントの医薬としての有効量を適切な賦形剤と共に含む抗血栓症組成物も提供する。
【００１９】
本発明のもう１つの態様では、抗血栓症治療を必要するリスクのある患者の診断に前記抗体を使用することができる。本発明は、抗ＧＰＶＩ抗体または抗体のフラグメントを含む診断用キットも包含する。
【００２０】
本発明は、本発明のＧＰＶＩ抗体、抗体フラグメントおよびマスクされた抗体Ｆａｂフラグメントの調製方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】競合ＥＬＩＳＡによるコラーゲン結合の阻害を示す図である。ｈＧＰＶＩ−Ｆｃに対する用量依存性（ＩＣ５０）を示す。
【図１Ｂ】競合ＥＬＩＳＡによるコラーゲン結合の阻害を示す図である。カニクイザル（Ｍａｃｃａｃａ）ＧＰＶＩ−Ｆｃに対する用量依存性（ＩＣ５０）を示す。
【図２】ＥＬＩＳＡによるヒトおよび霊長類ＧＰＶＩに対する選択ハイブリドーマｍＡｂの交差反応性分析を示す図である。
【図３】ハイブリドーマクローン３９０からのＩｇＧのフィシン切断によって生産されたＦａｂを示す図である。
【図４】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメント（ＶＬ１とＶＨ３）によるコラーゲン誘導血小板凝集の阻害を示す図である。
【図５Ａ】ＦａｂとヒトＧＰＶＩタンパク質の細胞外ドメインとの相互作用を示す結晶学データを示す図である。ＧＰＶＩタンパク質のＤ２ドメインとＦａｂとの相互作用を示す。
【図５Ｂ】ＦａｂとヒトＧＰＶＩタンパク質の細胞外ドメインとの相互作用を示す結晶学データを示す図である。ＧＰＶＩタンパク質のＤ１ドメインとＦａｂとの相互作用を示す。
【図５Ｃ】ＦａｂとヒトＧＰＶＩタンパク質の細胞外ドメインとの相互作用を示す結晶学データを示す図である。ＧＰＶＩタンパク質のＤ１−Ｄ２ドメインとＦａｂとの相互作用をします。
【図６】コラーゲン誘導全血凝集における抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントの阻害活性についてのＩＣ５０曲線の例を示す図である。
【図７Ａ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。未処置の画像を示す。
【図７Ｂ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。Ｆａｂ３９０−ｎＧ（５μｍ／ｍｌ）の画像を示す。
【図７Ｃ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。Ｆａｂ３９０−ｎＧ（１０μｍ／ｍｌ）の画像を示す。
【図７Ｄ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。未処置の画像を示す。
【図７Ｅ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。ＶＬ１／Ｈ３（５μｍ／ｍｌ）の画像を示す。
【図７Ｆ】抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す図である。ＶＬ１／Ｈ３（１０μｍ／ｍｌ）の画像を示す。
【図８】抗ＧＰＶＩ  ＦａｂがＧＰＶＩ表面発現の低減を濃度依存的様式で生じさせることを示す図である。
【図９】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂが有意なＧＰＶＩ枯渇を時間依存的様式で生じさせることを示す図である。
【図１０Ａ】エクスビボ全血血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの効果を示す図である（アゴニスト：１μｇ／ｍＬ）。１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶボーラス投与後を示す。
【図１０Ｂ】エクスビボ全血血小板凝集に対する抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの効果を示す図である（アゴニスト：１μｇ／ｍＬ）。３ｍｇ／ｋｇ  ＩＶボーラス投与後を示す。
【図１１】全血血小板凝集アッセイにおける抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのインビトロ活性を示す図である（アゴニスト：１μｇ／ｍＬ）。
【図１２Ａ】血小板数に対する抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＩＶボーラス投与の効果を示す図である。３ｍＬ／ｋｇでのＰＢＳビヒクル後（対照）を示す。
【図１２Ｂ】血小板数に対する抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＩＶボーラス投与の効果を示す図である。０．０１ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ  ＦＡｂ後を示す。
【図１２Ｃ】血小板数に対する抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＩＶボーラス投与の効果を示す図である。０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ  ＦＡｂ後を示す。
【図１２Ｄ】血小板数に対する抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＩＶボーラス投与の効果を示す図である。１ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ  ＦＡｂ後を示す。
【図１２Ｅ】血小板数に対する抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＩＶボーラス投与の効果を示す図である。３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ  ＦＡｂ後をします。
【図１３Ａ】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与後の血小板上でのＧＰＶＩ受容体発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。垂線が左側のＧＰＶＩ陰性血小板と右側のＧＰＶＩ陽性血小板とを区別する。投薬前を示す。
【図１３Ｂ】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与後の血小板上でのＧＰＶＩ受容体発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。垂線が左側のＧＰＶＩ陰性血小板と右側のＧＰＶＩ陽性血小板とを区別する。投与後２４時間の時点を示す。
【図１３Ｃ】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与後の血小板上でのＧＰＶＩ受容体発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。垂線が左側のＧＰＶＩ陰性血小板と右側のＧＰＶＩ陽性血小板とを区別する。投与後４８時間の時点を示す。
【図１３Ｄ】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与後の血小板上でのＧＰＶＩ受容体発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。垂線が左側のＧＰＶＩ陰性血小板と右側のＧＰＶＩ陽性血小板とを区別する。投与後７２時間の時点を示す。
【図１３Ｅ】抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与後の血小板上でのＧＰＶＩ受容体発現のＦＡＣＳ分析を示す図である。垂線が左側のＧＰＶＩ陰性血小板と右側のＧＰＶＩ陽性血小板とを区別する。投与後１５０時間の時点を示す。
【図１４】血小板活性化に対する抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの効果を示す図である。対照パネルでは、コンブルキシンの添加。パネルＡでは、ＩｇＧ枯渇後のＦａｂの添加。パネルＢでは、修飾Ｆａｂの添加。
【図１５】Ａ−Ｆａｂ対照；Ｂ−Ｆａｂ−Ｈｉｓタグ；Ｃ−ＦａｂＧｌｙ４ＳｅｒおよびＦａｂ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２を示す図である。
【図１６】（配列番号：３２に対応する）２０残基のシグナル配列が除去されたＧＰＶＩを示す図である。太字の残基は、抗体ＣＤＲと接触する配座エピトープを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
第一の態様において、本発明は、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合する新規モノクローナル抗体および抗体のフラグメント、特に、ハイブリドーマクローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂを提供する。本発明の抗体は、ＧＰＶＩの活性に、完全にまたは部分的に拮抗する。
【００２３】
本発明の第二の態様において、本発明者らは、Ｆａｂの重鎖（ＨＣ）のＣ末端先端部でのペプチドの付加が、一部の患者に既存する抗Ｆａｂ抗体によるＦａｂ分子の認識を回避するマスキング効果を有すること、従って血小板活性化および随伴副作用を防止することを立証した。
【００２４】
本明細書において用いる場合、「ハイブリドーマクローン３９０からのモノクローナル抗体」または「クローン３９０からのモノクローナル抗体」は、配列番号６および配列番号８によって定義される抗体ならびに抗体の誘導体（ヒト化抗体、Ｆａｂフラグメントおよびヒト化Ｆａｂフラグメントを含む。）またはとりわけ本出願に記載のこれらの分子の任意の改善バージョンを指す。
【００２５】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で用いており、具体的には任意のアイソタイプのモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む。）、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体ならびに抗原結合フラグメントを包含する。特定の抗原と反応する抗体を、ファージもしくは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリの選択などの組換え法により、または抗原もしくは抗原コード核酸での動物の免疫処置により、産生させることができる。
【００２６】
典型的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって連結されている２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖から成る。各重および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含有し、主としてこれらが抗原のエピトープの結合に責任を負う。通常、これらは、Ｎ末端から逐次的に番号を付けて、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。可変領域のより高度に保存される部分は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００２７】
特別な実施形態において、本発明の抗体およびこれらのフラグメント（抗体Ｆａｂフラグメントを含む。）は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２および配列番号：２３によって定義される６つのＣＤＲを含む。
【００２８】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体およびこれらのフラグメント（抗体Ｆａｂフラグメントを含む。）は、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：３８、配列番号：２１、配列番号：３９および配列番号：２３によって定義される６つのＣＤＲを含む。もう１つの特別な態様において、本発明のＦａｂフラグメントは、
（ａ）配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０（または配列番号：３８）によって定義されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、
（ｂ）配列番号：２１、配列番号：２２（または配列番号：３９）および配列番号：２３によって定義されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）と
を含み、
ＧＰＶＩエピトープ残基との接触を直接分断することなく各ＣＤＲの少なくとも２つのアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に変更することができる。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「ＧＰＶＩエピトープ残基との接触を直接分断すること」は、ＧＰＶＩエピトープ残基と接触しているおよび本明細書の中で与える例の結晶構造で説明される抗体アミノ酸残基を変更することを指す。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「ＶＨ」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含めて、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」への参照は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含めて、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００３１】
「ポリクローナル抗体」は、１つ以上の他の非同一抗体の中でまたは存在下で生産される抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、あるＢリンパ球から、非同一抗体を生産する幾つかの別のＢリンパ球の存在下で生産される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫処置された動物から直接得られる。
【００３２】
「モノクローナル抗体」は、本明細書において用いる場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。即ち、この集団を構成する抗体は、少量で存在することがある自然に発生し得る突然変異を除き、本質的に同一である。これらの抗体は、単一エピトープに対するものであり、従って高特異性である。
【００３３】
本明細書において用いる場合、抗体の「抗原結合部分」という用語、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語、およびこれらに類する用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の自然に存在する、酵素的に得ることができる、合成のまたは遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、完全抗体分子から、任意の適する標準的な技術、例えばタンパク質分解消化または組換え遺伝子改変技術（抗体可変および場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む。）を用いて誘導することができる。抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。他の改変分子、例えば、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディーおよびミニボディーも、本明細書において用いる場合、「抗原結合フラグメント」という表現に包含される。
【００３４】
本明細書において用いる場合、用語「Ｆａｂフラグメント」は、抗体の重鎖（ＨＣ）の一部を加えた軽鎖（ＬＣ）に相当する。Ｆａｂ分子は、タンパク質分解切断によって生産されるか、組換え分子の発現によって作られる。通常、重鎖の定常ドメインの部分（Ｆｃ部分）は除去される。
【００３５】
本明細書において用いる場合、用語「マスクされたＦａｂフラグメント」または「マスクされたＦａｂ」は、抗体の重鎖（ＨＣ）の一部に加えて軽鎖（ＬＣ）を含有するＦａｂフラグメントであって、患者に既存する抗体によるＦａｂの認識をマスクするためにＨＣのＣ末端がペプチドによって伸長されたＦａｂフラグメントに相当する。
【００３６】
本発明の抗体は、細胞外Ｄ１およびＤ２ドメインのみを含有するヒト組換えＧＰＶＩタンパク質を使用するマウス免疫処置技術によるハイブリドーマの産生によって得た。免疫処置に用いたタンパク質の配列は、配列番号３および配列番号４に対応する。
【００３７】
得られたｍＡｂを、ヒトＧＰＶＩタンパク質を認識するこれらの能力について先ず選択したが、ヒトＧＰＶＩタンパク質へのコラーゲンの結合を遮断するおよび高い親和性でＧＰＶＩタンパク質を結合するこれらの性能についても選択した。
【００３８】
抗体は霊長類ＧＰＶＩに対して交差反応性を示す（図２に示すとおりである。）が、マウス、ラット、イヌ、ブタまたはウサギＧＰＶＩに対する交差反応性は存在しない。
【００３９】
選択されたｍＡｂは、ｐＭ親和性でヒトＧＰＶＩタンパク質に結合することができ（表１に示すとおりである。）、および１０μｇ／ｍＬ未満のＩＣ５０値でヒトＧＰＶＩタンパク質へのコラーゲン結合を遮断することができる（図１Ａに示すとおりである。）。この抗体は、非ヒト霊長類ＧＰＶＩへのコラーゲン結合も遮断することができる（図１Ｂに示すとおりである。）。
【００４０】
もう１つの態様において、本発明は、クローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの可変ドメイン配列から誘導される組換えＦａｂフラグメントに関する。Ｆａｂフラグメントを当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、タンパク質分解性Ｆａｂフラグメントをフィチン切断によって得ることができ、または組換えＦａｂフラグメントを必要配列の発現ベクターへのクローニングによって調製することができる（例えば、実施例３Ｂにおいて説明するとおりである。）。抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂと同様に、これらのＦａｂフラグメントは、ＧＰＶＩへのコラーゲン結合を阻害することができる。
【００４１】
ＦａｂフラグメントをＧＰＶＩと共結晶化し、Ｘ線結晶学によって分析して、ＧＰＶＩタンパク質上のＦａｂによって認識されるエピトープを決定した。この分析により、ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメイン内のＤ１ドメインとＤ２ドメインの両方を含む配座エピトープを定義することができた。エピトープにおいて用いた番号付けシステムは、２０残基のシグナル配列を除去したＧＰＶＩに対応し、図１６および配列番号：３２に示すとおりである。
【００４２】
本発明の１つの態様において、ヒトＧＰＶＩの配座エピトープを特異的に結合する、ならびにＳｅｒ４３、Ａｒｇ６７およびＡｓｐ８１を含むヒトＧＰＶＩ残基と接触する、単離された抗体または抗原結合フラグメント。本発明のもう１つの態様において、抗体または抗原結合フラグメントは、Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５およびＡｒｇ１６６から選択される２つ以上のＧＰＶＩ残基とさらに接触する。本発明のもう１つの態様において、前記抗体および抗原結合フラグメントは、Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５およびＡｒｇ１６６から選択される３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上のＧＰＶＩ残基とさらに接触する。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「接触残基」は、ソフトウェアプログラム、例えばＣＣＰ４  ＳｏｆｔｗａｒｅパッケージのＮＣＯＮＴまたは等価のソフトウェアプログラムを使用してＧＰＶＩ抗原残基へのまたはその逆の距離がおよび結晶構造に関して測定する場合にはＧＰＶＩに対する抗体または抗体の抗原結合フラグメントとＧＰＶＩ抗原との間の距離が４．５Ａ未満である残基と定義する。
【００４４】
１つの実施形態において、抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＧＰＶＩの配座エピトープを結合し、ならびにＳｅｒ４３、Ａｒｇ６７およびＡｓｐ８１を含むヒトＧＰＶＩ残基と接触する。
【００４５】
もう１つの実施形態において、抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＧＰＶＩの配座エピトープを結合し、および
Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ａｒｇ６７、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５、Ａｒｇ１６６
を含むヒトＧＰＶＩ残基と接触する。
【００４６】
本発明のｍＡｂは、Ｆａｂフラグメントがクローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの可変ドメイン配列を含有するので、同じ配座エピトープを認識する。
【００４７】
従って、もう１つの態様において、本発明は、ヒトＧＰＶＩタンパク質の細胞外Ｄ１およびＤ２ドメイン内に含まれる配座エピトープを認識する、Ｆａｂフラグメントを含む抗ＧＰＶＩ抗体を提供する。
【００４８】
従って、もう１つの態様において、本発明は、次のアミノ酸：
Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６
を含む配座エピトープを認識するモノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体を提供する。
【００４９】
もう１つの態様において、本発明は、次のアミノ酸：
Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２
を含む配座エピトープを認識する抗ＧＰＶＩ抗体を提供する。
【００５０】
もう１つの実施形態において、抗ＧＰＶＩ抗体は、次のアミノ酸：
Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２
を含む配座エピトープを認識する。
【００５１】
もう１つの実施形態において、抗ＧＰＶＩ抗体は、次のアミノ酸：
Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ａｒｇ６７、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５、Ａｒｇ１６６
を含む配座エピトープを認識する。
【００５２】
もう１つの実施形態において、抗ＧＰＶＩ抗体は、次のアミノ酸：
Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ａｒｇ６７、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５、Ａｒｇ１６６
を含む配座エピトープを認識する。
【００５３】
特別な実施形態において、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、主として、ヒトＧＰＶＩのＤ１ドメインを含む。
【００５４】
本発明の抗体は、（ｉ）配列番号６のＨＣと配列番号８のＬＣとを含む抗体のヒトＧＰＶＩへの結合を競合的に阻害するおよび（ｉｉ）配列番号６のＨＣと配列番号８のＬＣとを含む抗体によって認識される配座エピトープに類似したエピトープまたはこの配座エピトープの一部に、例えば表面プラズモン共鳴（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  Ｒ，Ｌａｒｓｓｏｎ  Ａ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８，３８９−４１５に記載されているＢｉａｃｏｒｅ）のような生物物理学的方法によって判定して少なくとも１０ｎＭの親和性（ＫＤ≦１０−８Ｍ）で結合する、モノクローナル抗ＧＰＶＩ抗体と定義することができる。
【００５５】
本明細書において用いる場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体／抗原相互作用の解離定数を指す。
【００５６】
ヒトＧＰＶＩタンパク質と本発明の抗体およびＦａｂとの相互作用を表すＫＤは、［１０−７；１０−１０］区間に含まれる。ヒトＧＰＶＩに特異的な抗体は、ＫＤ＝１０−７Ｍ、好ましくはＫＤ＝１０−８Ｍ、さらに好ましくはＫＤ＝１０−９Ｍを呈する。最高の親和性を有する抗体は、ＫＤ＝１０−１０Ｍ以下、例えば１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍを有し得る。用語「特異的に結合する」またはこれらに類する用語は、抗体または抗体の抗原結合フラグメントが、生理条件下で比較的安定しているＧＰＶＩ抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、１×１０−６Ｍ以下の解離定数を特徴とし得る。２つの分子が特異的に結合するかどうかを判定するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、平衡透析、実施例２および３におけるような表面プラズモン共鳴、ならびにこれらに類するものを含む。例えば、本発明に関連して用いる場合、ヒトＧＰＶＩを「特異的に結合する」抗体は、例えば表面プラズモン共鳴アッセイで測定される約１０００ｎＭ未満、約５００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満または約０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＧＰＶＩまたはヒトＧＰＶＩの一部分を結合する抗体を含む。
【００５７】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の部位である。抗原が高分子、例えばタンパク質または多糖類である場合、エピトープは連続残基により構成されることもあり、または抗原性高分子の折りたたみによって極めて近接させられた非連続残基により構成されることもある。タンパク質の場合、連続アミノ酸によって構成されるエピトープは、変性溶媒への曝露時に概して保持され、「線形エピトープ」として公知であり、これに対して非連続アミノ酸によって構成されるエピトープは、前記曝露下で概して失われ、「配座エピトープ」として公知である。
【００５８】
本明細書において用いる場合、用語「類似エピトープ」は、クローン３９０から誘導される抗体とヒトＧＰＶＩタンパク質の細胞外ドメインとの相互作用に物理的に関与すると結晶分析によって説明されるアミノ酸のような、同じ領域に位置する１セットのアミノ酸に関する。類似エピトープは、例えば、基準となるエピトープの付近に５以下のアミノ酸の相違のような、幾つかの相違を含む場合がある。類似エピトープは、エピトープを構成すると同定されたアミノ酸、即ちＧＰＶＩタンパク質と相互作用するアミノ酸に１つ以上の修飾を呈する場合もある。基準となるエピトープの一部と同定された１つ以上のアミノ酸が不在であることがあり、１つ以上の追加のアミノ酸残基が存在して類似エピトープを構成することもある。例えば、ハイブリドーマクローン３９０からの抗体と比較して抗体の特性に影響を及ぼさずに５つ以下のアミノ酸を変更することができる。従って、１つの特定の抗体についてのエピトープが位置する領域は、多少の、ことによると追加の相互作用性アミノ酸を含む。この観点で、類似エピトープは、「基準となる抗体と競合的に結合するための領域」と定義することができる。中和抗体がこのような領域に結合すると、受容体の１つ以上の細胞シグナル伝達経路が阻害されて、標的受容体またはより一般的には有効タンパク質の１つ以上の生物学的機能が特異的に損なわれることとなる。
【００５９】
「中和」または「遮断」抗体は、本明細書において用いる場合、ＧＰＶＩへの結合が、（ｉ）ＧＰＶＩとコラーゲンとの相互作用に干渉する、（ｉｉ）および／または（ｉｖ）ＧＰＶＩの少なくとも１つの生物学的機能を阻害する結果となる抗体を指すことを意図したものである。ＧＰＶＩ中和または遮断抗体に起因する阻害は、適切なアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要はない。ＧＰＶＩ阻害を検出するための例示的なアッセイは、本明細書の中で説明する。
【００６０】
特定の生物活性に関連づけられるタンパク質中の局所領域の存在は、例えば特許ＵＳ６，４４８，３８０において例証されている。
【００６１】
クローン３９０から誘導される抗体のような類似エピトープを認識する抗体は、ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質を捕捉抗体として使用する競合的ＥＬＩＳＡアッセイによって選択することができる。ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質で被覆されたプレートをハイブリドーマ上清と共にまたはクローン３９０から誘導された抗体もしくは抗原結合フラグメントと共にインキュベートする。エピトープ遮断ＧＰＶＩへの（任意の標準的技術によって標識された）様々な抗ＧＰＶＩ抗体の結合の欠如は、類似エピトープの認識を示す。等価の選択戦略を競合的Ｂｉａｏｒｅ分析によって遂行することができ、この場合、ＧＰＶＩを固定し、クローン３９０から誘導された抗体（フラグメント）を使用してエピトープを遮断する。他のＧＰＶＩ結合抗体候補を、現在、エピトープ遮断ＧＰＶＩへの結合について分析している。例えば、本発明の抗体によって認識されるエピトープのような類似エピトープを認識する抗体を選択し、Ｘ線分析を用いる共結晶構造の分析によってさらに特性付けることができる。
【００６２】
本発明は、ヒト化および改変抗ＧＰＶＩ抗体および抗体のフラグメントにも関する。
【００６３】
本発明に関連して、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントは、以前にＷＯ２００９／０３２６６１に記載れた方法を用いてヒト化されているが、当該技術分野において公知の任意のヒト化方法を用いることができる。
【００６４】
ＦａｂとＧＰＶＩの結晶学的複合体の分析に基づき、ヒト化のため、およびヒトＧＰＶＩへのＦａｂの親和性を改善する目的、両方で、幾つかの突然変異を導入した。
【００６５】
結果として、ＬＣについて３つの変異体およびＨＣについて５つの変異体を生成した。これらのＦａｂ変異体をＬＣ（ＶＬ）およびＨＣ（ＶＨ）についてそれぞれ表６および表７にまとめる。
【００６６】
すべての可能な組み合わせの中で、本発明は、特に、以下の組み合わせに関する：
配列番号１５および配列番号１０にそれぞれ対応するＶＬ１とＶＨ１
配列番号１５および配列番号１１にそれぞれ対応するＶＬ１とＶＨ２
配列番号１５および配列番号１２にそれぞれ対応するＶＬ１とＶＨ３
配列番号１５および配列番号１３にそれぞれ対応するＶＬ１とＶＨ４
配列番号１５および配列番号１４にそれぞれ対応するＶＬ１とＶＨ５
配列番号１６および配列番号１１にそれぞれ対応するＶＬ２とＶＨ２
配列番号１７および配列番号１１にそれぞれ対応するＶＬ３とＶＨ２
配列番号１７および配列番号１３にそれぞれ対応するＶＬ３とＶＨ４。
【００６７】
好ましい実施形態において、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのヒト化変異体は、配列番号１５と配列番号１２に対応するＶＬ１とＶＨ３の会合である。
【００６８】
本発明の１つの態様では、抗ＧＰＶＩ抗体のＶＨをタグまたはアミノ酸伸長部（ペプチド）の付加によりさらに修飾して、抗体が既存抗体によって認識されないようにマスクすることができる。ヒスチジン残基６以上の配列、特に（Ｈｉｓ）６もしくは（Ｈｉｓ）７もしくは（Ｈｉｓ）８、またはＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒもしくは（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２などのユニットを重鎖のＣ末端に付加させることができる。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「改変Ｆａｂフラグメント」は、重鎖のペプチド伸長部をｃ末端に含有するように遺伝子改変されたＦａｂフラグメントを指す。この伸長部は、以前のｃ末端が覆い隠される原因となり、ならびにＦａｂフラグメントの認識および既存抗Ｆａｂ抗体への結合を防止する。
【００７０】
本発明のもう１つの実施形態では、ヒト化重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列とヒト化軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列とｃ末端伸長部との組み合わせを含む改変Ｆａｂフラグメントを提供する。この改変Ｆａｂフラグメントは、
（ａ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１０）；
（ｂ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；
（ｃ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１２）；
（ｄ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１３）；
（ｅ）ＬＣＶＲ（配列番号１５）とＨＣＶＲ（配列番号１４）；
（ｆ）ＬＣＶＲ（配列番号１６）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；
（ｇ）ＬＣＶＲ（配列番号１７）とＨＣＶＲ（配列番号１１）；および
（ｈ）ＬＣＶＲ（配列番号１７）とＨＣＶＲ（配列番号１３）
から成る群から選択される、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）アミノ酸配列と軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）アミノ酸配列の組み合わせをさらに含み、この場合、ｃ末端伸長部は、配列番号：３５、配列番号：３６および配列番号：３７から成る群から選択される。
【００７１】
特別な実施形態において、本発明は、配列番号６のＨＣおよび配列番号８のＬＣを含むモノクローナル抗体、またはこれらの配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するが前記モノクローナル抗体と同じ活性を保持するモノクローナル抗体に関する。
【００７２】
さらに特別な実施形態において、本発明の抗体Ｆａｂフラグメントは、（ａ）配列番号：６によって定義されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：８によって定義されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００７３】
本発明は、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体およびＦａｂをコードする核酸にも関する。１つの実施形態において、核酸分子は、抗ＧＰＶＩ抗体のＨＣおよび／またはＬＣをコードする。好ましい実施形態では、単一の核酸が抗ＧＰＶＩ抗体のＨＣをコードし、および別の核酸分子が抗ＧＰＶＩ抗体のＬＣをコードする。
【００７４】
特別な実施形態において、ハイブリドーマ３９０からの抗体からのＨＣおよびＬＣのポリペプチドをコードする核酸またはポリヌクレオチドは、配列番号５および配列番号７にそれぞれ対応し、またはこれらの配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するが前記モノクローナル抗体と同じ活性を保持する配列に対応する。
【００７５】
配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に存する群から選択されるポリペプチドをコードするまたはこれらの配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するが前記モノクローナル抗体と同じ活性を保持する配列をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部である。
【００７６】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは、抗ＧＰＶＩ抗体のＨＣをコードするポリヌクレオチドを含有する。もう１つの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、抗ＧＰＶＩ抗体のＬＣをコードする。本発明は、融合タンパク質、修飾抗体、抗体フラグメントおよびこれらのプローブをコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターも提供する。
【００７７】
本発明のベクターは、配列番号５もしくは配列番号７のポリヌクレオチド、または配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に存する群から選択されるポリペプチドをコードするまたはこれらの配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有するが前記モノクローナル抗体と同じ活性を保持する配列をコードする任意のポリヌクレオチドを含有する。
【００７８】
本発明の抗ＧＰＶＩ抗体またはＦａｂのＨＣ、ＨＣのフラグメントおよび／またはＬＣを発現させるために、前記ＨＣおよび／またはＬＣをコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに、遺伝子が転写および翻訳配列に作動可能に連結されるように挿入する。発現ベクターは、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、レトロウイルス、ＥＢＶ由来エピソーム、ならびに前記重鎖および／または軽鎖を確実に発現させるために適便であることが当業者に公知であるすべての他のベクターを含む。ＨＣ／またはＨＣフラグメントおよびＬＣをコードするポリヌクレオチドを異なるベクターにまたは同じベクターでクローニングできることは、当業者にはわかるであろう。好ましい実施形態では、前記ポリヌクレオチドを同じベクターでクローニングする。
【００７９】
本発明のポリヌクレオチド、およびこれらの分子を含むベクターを、適する哺乳動物または微生物宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを細胞宿主に導入するための任意の公知の方法によるものであり得る。このような方法は当業者に周知であり、デキストラン媒介形質転換、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソームへのカプセル化、バイオリスティックインジェクションおよびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションを含む。
【００８０】
本発明のヒト化および改変変異体は、ＧＰＶＩ経路活性に拮抗するように十分に機能できる。特に、これらはＧＰＶＩへのコラーゲンの結合を阻害することができる。これらは、ヒト多血小板血漿およびヒト全血の両方においてコラーゲンにより誘導される血小板凝集を阻害することもできる。さらに、これらは、血流下でコラーゲン被覆表面での血栓形成を阻害することもできる。
【００８１】
本発明の抗ＧＰＶＩ  ＦａｂフラグメントのＧＰＶＩへの結合は、血小板表面でのＧＰＶＩ枯渇表現型の発生を特徴とする。この発生は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントについての新しい予想外の作用メカニズムである。本明細書で説明するＦａｂフラグメントのこのユニークな特性を、これらの分子が標的にする新たなエピトープによって判定することができる。
【００８２】
本明細書において用いる場合、「ＧＰＶＩ枯渇表現型」は、抗体または抗原結合フラグメントが血小板の表面のＧＰＶＩ受容体分子に結合したときに結果として生ずる細胞状態を指し、血小板上のＧＰＶＩ経路の活性化を防止する。このＧＰＶＩ枯渇表現型は、次の２つの異なるメカニズムに依存し得る：（ｉ）ＧＰＶＩ受容体が細胞表面から除去もしくは枯渇される、または（ｉｉ）抗体もしくは抗原結合フラグメントが不可逆的にＧＰＶＩ受容体分子に結合して、受容体の阻害が細胞の寿命にわたって維持される。この表現型は、いずれの状況においても血小板の再生がなければ元に戻らない。
【００８３】
これらの抗ＧＰＶＩ  ＦａｂフラグメントがＧＰＶＩ枯渇表現型を誘導するという事実は、効力に関して２つの利点をもたらす：
ｉ）受容体放出がこのメカニズムの少なくとも一部である場合、この過程は、一般にＧＰＶＩへのＦａｂ結合に依存しない。このことは、Ｆａｂによる細胞表面ＧＰＶＩの小部分（例えば３０％）の占有が放出を誘導する場合、この放出過程が、Ｆａｂによって占有されたＧＰＶＩ受容体の３０％に限定されず、遊離ＧＰＶＩにも及ぶことを意味する。このことは、有意に少ないＦａｂで（枯渇により）ＧＰＶＩ遮断１００％を達成できることを含意する。
【００８４】
ｉｉ）阻害効果が長期効果を有する：Ｆａｂフラグメントがおおよそ１−２時間という非常に短い血漿半減期を有することは公知であり、この短い血漿半減期は、標的の長期持続阻害を必要とする幾つかの適応症には問題であり得る。受容体枯渇または不可逆的占有の本記載メカニズムでは、（薬力学特性に基づく）効果の持続がＦａｂの薬物動態特性から切り離されることとなる。切り離されるのは、枯渇または不可逆的阻害が一旦誘導されると、作用を受けた受容体を血小板が置換できないからである。従って、これらの受容体は、血小板の寿命にわたって不在または利用できないままである。このことは、血小板の寿命に依存して、数日（ヒト血小板については１０日）の作用持続の延長に相当する。
【００８５】
これらの特性すべてが、本発明のＦａｂが血栓性疾患および血管疾患の治療の適する候補であることを明示している。
【００８６】
抗体に基づく生物学の重要な標的クラスは、モノクローナル抗体によって高い特性で遮断され得る膜受容体である。ＩｇＧ形式の完全長抗体は、抗体のＦｖ部分によって抗体の標的を結合し、遮断もする。Ｆｃ部分はこれらの分子にさらに機能性を加え、この結果、抗体由来細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）となる。これらの活性は、とりわけ腫瘍学用途にはｍＡｂ作用機序（ＭｏＡ）の重要な部分であることが多い。しかし、他の利用分野では、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性は、最小にする必要があり、または必要でない。従って、Ｆａｂ分子などのＦｃ部分分を欠く多数の抗体フラグメントが望ましい。
【００８７】
一価抗体フラグメントの開発のもう１つの理由は、標的生物学に由来する。多くの膜受容体は、受容体クラスター化後にシグナル伝達を開始する（例えばＧＰＶＩ）。このような受容体を遮断すべき場合、当然の形式として一価抗体フラグメントが選ばれる。
【００８８】
Ｆａｂフラグメントなどの抗体フラグメントは、多くの臨床用途にとって全抗体よりはるかに適する形式である。この利点は、Ｆａｂフラグメントを全抗体と区別するＦａｂフラグメントの幾つかのユニークな特性、特に、
一価：分子の架橋を回避すべき場合に求められる
Ｆｃドメイン欠如：Ｆｃ機能が必要とされないまたは望ましくない場合に求められる
より低い分子量：薬物動態的および薬力学的挙動ならびに組織分布を決定する
に依存する。患者への投与後に抗体Ｆａｂフラグメントのこれらの望ましい特性を維持するために、Ｆａｂフラグメントと非標的分子との相互作用を回避すべきである。
【００８９】
前に述べたように、Ｆａｂフラグメントは、ＩｇＧ分子の重鎖の定常ドメイン（Ｆｃ部分）の欠失によって得られる。残念なことに、Ｆｃの除去は、新たなＣ末端（またはＣ末端）ペプチド、即ちネオエピトープを露出させる。ＦａｂフラグメントのＣ末端先端部と特異的に相互作用することができるタンパク質の特定のクラスがヒトに関して報告されており、Ｆａｂなどの抗体フラグメントに対して既存抗体として識別されている（Ｋｏｒｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１００（３）；６１２−２１；Ｐｅｒｓｓｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ（１９８５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６；７２３−３０）。これらの既存抗体は、人生の早期に形成されており、患者依存性である。モノクローナル抗体および抗体フラグメントの新規治療薬としての開発に伴い、既存抗Ｆａｂ抗体の存在は、上で述べた理由のため治療用Ｆａｂ分子の利用を制限し、複雑にする。
【００９０】
加えて、ＦａｂのＣ末端先端部は、以前に記載されているように抗体の産生に好ましいエピトープである（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ  １９９４）。しかし、患者がＣ末端に対する既存抗体を有さないまたは少量有する場合でさえ、このエピトープに対する新たな抗体の産生が治療用Ｆａｂの投与後に発生することもあり、従って既存抗体に関して説明した制限と同じ制限を招くことがある。
【００９１】
実際、Ｆａｂ  Ｃ末端エピトープに対する既存抗体または新たな抗体による治療用Ｆａｂ分子の結合は、これらの分子の薬物動態的および薬力学的挙動を変化させる場合があり（例えば、一価分子から二価分子への変化に基づく阻害ではなく受容体活性化）、新たな複合体および機能を生じさせる場合があり（例えば、すべてのこのエフェクター機能を有する抗体Ｆｃ部分の付加）、複合体のサイズを変え、組織分布に影響を及ぼすこともある。従って、この現象は、有意な安全性および効力のリスクを表し、このリスクを回避する必要がある。
【００９２】
このような制限を回避するために、抗Ｆａｂ抗体によって認識されるネオエピトープを、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂ分子について今般説明するようにＦａｂのＣ末端部に分子を付加させることによってマスクすることができる。この原理は、標的生物学が二価分子の使用を妨ぐことができ（例えば、クラスター化による受容体活性化の場合）、従って一価分子の利用を厳密に必要とするすべての治療用抗体フラグメントの開発に不可欠である。
【００９３】
従って、すべての患者にとって最も安全な治療を可能にするために、ならびに患者特異的な薬物動態的および薬力学的変動性を回避するために、Ｆａｂフラグメントに対する既存するまたは新たに産生される抗体により認識され得る、Ｃ末端先端部に作られるＦａｂ特異的ネオエピトープをマスクするように、Ｆａｂ分子を修飾すべきである。
【００９４】
本発明は、分子がＣ末端に付加されたＦａｂフラグメントに関する。この分子は、エピトープをマスクすることができるが標的へのＦａｂの結合に干渉しない、ペプチドまたは任意の他の種類の分子であり得る。
【００９５】
特別な実施形態において、Ｆａｂフラグメントのネオエピトープをマスクすることができる前記分子は、１から１００のアミノ酸、１から５０のアミノ酸、１から２０のアミノ酸、１から１５のアミノ酸または１から１０のアミノ酸を含み得るペプチドである。
【００９６】
例えば、Ｈｉｓタグ、Ｇ４Ｓまたは（Ｇ４Ｓ）２ストレッチペプチドは、適切な分子を構成する。
【００９７】
もう１つの態様において、本発明は、重鎖のＣ末端先端部に分子を有するＦａｂに関する。
【００９８】
特別な実施形態において、Ｃ末端先端部に分子を有するＦａｂフラグメントは、ＧＰＶＩを特異的に認識する。好ましい実施形態において、このＦａｂフラグメントは、前に説明したものの中から選択される。
【００９９】
特別な実施形態において、Ｆａｂ重鎖の配列は、配列番号２９または配列番号３０または配列番号３１を含む配列に対応する。
【０１００】
もう１つの実施形態において、Ｆａｂ重鎖の配列は、配列番号２９または配列番号３０または配列番号３１に存する配列に対応する。
【０１０１】
本発明は、Ｃ末端先端部に対する既存抗体または新たな抗体によるＦａｂフラグメントの認識を防止する方法にも関し、この方法は、分子の付加によりＣ末端部をマスクすることに存する。つまり、この分子によりＦａｂ−抗体複合体の望ましくない生成を防止することができる。
【０１０２】
本発明は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂを使用するときの血小板活性化の防止方法にも関し、この方法は、分子の付加によりＦａｂのＣ末端先端部をマスクすることに存する。
【０１０３】
もう１つの態様において、本発明は、Ｃ末端先端部に分子を有する修飾Ｆａｂの調製方法に関し、この方法は、
ａ．ＦａｂのＣ末端先端部への分子の付加
ｂ．細菌、酵母または哺乳動物細胞系を含めて適切な系における修飾Ｆａｂの生産
ｃ．修飾Ｆａｂの精製
の工程を含む。生産されたＦａｂを適切な溶液中でさらに調合することができる。
【０１０４】
もう１つの態様において、本発明は、例えば急性冠症候群、経皮的冠介入、虚血性脳卒中、頸動脈狭窄または末梢動脈閉塞性疾患のような一定の臨床適応症の治療において血栓性事象を予防するための抗ＧＰＶＩ抗体、特に、本発明において説明するとおりのＦａｂフラグメントの使用に存する。さらに、本抗体を再狭窄およびアテローム性動脈硬化症の予防に使用することもできる。
【０１０５】
本発明は、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体、および特にＦａｂフラグメントと適切な賦形剤を含有する組成物にも関する。この組成物を使用して、血栓性疾患および血管疾患を治療することができる。
【０１０６】
もう１つの態様において、本発明は、本発明による抗体の製造方法に関する。
【０１０７】
本発明のもう１つの態様では、抗体をＧＰＶＩ発現変化の診断に使用することができる。血小板表面でのＧＰＶＩの発現の変化ならびに血漿中の可溶性ＧＰＶＩ（ＧＰＶＩの切断された細胞外ドメイン）の存在および濃度の変化を急性冠症候群、一過性脳虚血発作または一過性虚血性脳卒中などの病態生理学的状態に十分に関連づけることができることは記載されている（Ｂｉｇａｌｋｅ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．，２００９  Ｊｕｌ  ２１；Ｂｉｇａｌｋｅ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２００７  Ｍａｒ；３３（２）：１７９−８４）。
【０１０８】
従って、これらのパラメータの測定値は、抗血栓治療を必要とするおよび抗ＧＰＶＩ治療に対してことによると特に感受性が強い、上述の状態についてのリスクのある患者を特定するために用いることができる。従って、本明細書で説明する抗体および抗体フラグメントは、診断ツールとして使用することができ、ならびに血小板表面のおよび血漿試料中のＧＰＶＩの存在および定量的変化を判定する診断キットの構成要素であり得る。
【０１０９】
抗体および抗体のフラグメントを、抗血栓症治療の恩恵を受け得るリスクのある患者を診断するために、使用することができる。
【０１１０】
患者のＧＰＶＩ変化を診断するためのこのような方法は、（ｉ）前記患者の血小板または血漿試料と本発明の抗体または抗体のフラグメントとを接触させる段階、（ｉｉ）前記試料中に存在する細胞への前記抗体またはＦａｂの結合を測定する段階、および（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）において測定された結合と健常な対照被検者または標準物質のものとを比較する段階を含み得る。本発明は、本発明の抗体または抗体のフラグメントを含む、ヒトＧＰＶＩ発現の変化の検出のための診断キットも包含する。特別な実施形態では、本発明のキットをＥＬＩＳＡアッセイキットとして提供することができる。
【０１１１】
本発明のもう１つの態様では、本発明のマスクしたＦａｂまたは他の抗体のいずれかの投与前に抗Ｆａｂ抗体の存在について患者をスクリーニングする。
【０１１２】
本発明は、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体またはＦａｂフラグメントの調製方法も提供し、この方法は、
ａ．本発明の１つのＨＣまたはＨＣフラグメントおよび１つのＬＣをコードするＤＮＡ配列を含有する細胞系の培養
ｂ．培養基において発現された抗体またはＦａｂの精製
ｃ．適便な形態での抗体の調合
の工程を含む。
【０１１３】
免疫グロブリンを生産することができる任意の発現細胞系を使用して、本発明の抗体を発現させることができる。哺乳動物に由来する発現細胞系を使用することができ、例えば酵母細胞（Ａ．Ｈ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ．１９８８  Ｎｏｖ；８５（２２）：８６７８−８２）または細菌細胞（Ｃｈｉｂａ  Ｙ，Ｊｉｇａｍｉ  Ｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ｄｅｃ；１１（６）：６７０−６）のような任意の他の発現系を使用することもできる。
【０１１４】
抗体の精製は、例については当業者に公知の任意の方法によって、実現することができる。
【０１１５】
抗体の調合は、このような抗体の所期の用途に依存する。用途、例えば医薬用途、獣医学または診断用途に依存して、抗体を凍結乾燥させることがあり、させないことがあり、適切な溶液に可溶化させることがある。
【０１１６】
この一般的な説明および以下の詳細な説明が単に例示的および説明的なものであり、本発明を限定するものではないことに留意されたい。本明細書に含める図面は、本発明の原理を説明することを意図した本発明の幾つかの実施形態を図示するものである。
【実施例】
【０１１７】
［実施例１］
ＧＰＶＩの組換え細胞外Ｄ１およびＤ２ドメインの生成
Ａ  ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ融合発現プラスミド（ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃ）の構築
ヒトｃＤＮＡ含有プラスミドをＰＣＲテンプレートとして使用して、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２３７アミノ酸残基重鎖定常領域をコードするＤＮＡフラグメントを増幅させた。ヒトゲノムＤＮＡをＰＣＲテンプレートして使用して、２０５アミノ酸残基ヒトＧＰＶＩ  Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラグメントを増幅した。このヒトＧＰＶＩ  Ｄ１およびＤ２フラグメントはシグナル配列を含み、および野生型タンパク質（ＮＰ＿０５７４４７／Ｑ９ＨＣＮ６）におけるアミノ酸Ｍ１からＴ２０５に対応する。ヒトＧＰＶＩ  Ｄ１およびＤ２とヒトＦｃ領域とをコードする、得られた増幅され切断され精製されたＰＣＲ産物をライゲーションＰＣＲによって組み合わせ、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔｌ部位を用いるＩｎＦｕｓｉｏｎ法によってバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３にライゲートした。得られたＧＰＶＩ−Ｆｃ  ＯＲＦを配列番号１としておよびこの対応するタンパク質配列を配列番号２として列挙する。
【０１１８】
Ｂ  ＧＰＶＩ−ｔｅｖ−ｈｉｓ発現プラスミド（ＧＰＶＩ−ｔｅｖ−ｈｉｓ）の構築
前に説明したＧＰＶＩ−Ｆｃ含有プラスミドをＰＣＲテンプレートとして使用して、野生型タンパク質（Ｓｗｉｓｓｐｏｒｔ：Ｑ９ＨＣＮ６）におけるアミノ酸Ｍ１からＴ２０５に対応するシグナル配列を含むヒトＧＰＶＩ  Ｄ１およびＤ２細胞外ドメインを増幅した。リバースプライマーは、ｔｅｖ切断認識配列と構築物のＣ末端のＨｉｓタグに相当する７つのヒスチジン残基とをコードするＤＮＡを含有した。得られた増幅ＰＣＲフラグメントを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ＋Ｎｏｔｌで切断し、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３にライゲートした。得られたＯＦＲを配列番号３としておよびこの対応するタンパク質配列を配列番号４として列挙する。
【０１１９】
Ｃ  ｈＧＰＶＩ−ｈＦｃおよびＧＰＶＩ−ｔｅｖ−ｈｉｓタンパク質の発現および精製
ＳＦ９００  ＩＩ無血清浮遊培養（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させたＳＦ９細胞を、発現プラスミドおよびＦｌａｓｈＢａｃバキュロウイルスＤＮＡ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコトランスフェクトした。Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクションを行った。５時間後、トランスフェクトされた培養物に５％全ウシ胎仔血清を添加した。細胞を２８℃で５日間、培養した。組換えウイルスを含有する培養上清を、５％ウシ胎仔血清を含有するＳＦ９００  ＩＩ浮遊培養での大規模ウイルス増幅に使用した。
【０１２０】
タンパク質発現のために、ＥｘＣｅｌｌ  ４０５（ＳＡＦＣ）で増殖するＨｉｇｈＦｉｖｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）細胞を適量のウイルス株で形質導入し、２７℃で７２時間、増殖させた。回収後、細胞培養上清を濾過（０．２２μｍ）により清澄化した。
【０１２１】
精製のために、Ｆｃ−融合ＧＰＶＩタンパク質変異体をプロテインＡマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で捕捉し、ｐＨシフトによって溶離した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＥＣおよび最終限外濾過濃縮工程によりタンパク質を洗練した後、このタンパク質をＥＬＩＳＡおよびさらなるアッセイに使用した。
【０１２２】
精製のために、Ｈｉｓタグ付けＧＰＶＩタンパク質変異体をＩＭＡＣマトリックス（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で上清から直接捕捉し、イミダゾール勾配によって溶離した。Ｓｕｐｒｅｄｅｘ  ７５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＥＣおよび限外濾過によりタンパク質を洗練した後、示す実験においてこのタンパク質を使用した。
【０１２３】
［実施例２］
機能性抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの産生および選択
Ａ  抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの産生
Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら（１９９７．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１３８９）によって記載されたようなＲＩＭＭＳ法を用いて、ＧＰＶＩ特異的抗体を産生させた。
【０１２４】
週齢６−８週メスＢＬＡＢ／ｃマウス（Ｓ０８２３４２；メイン州バーハーバーのＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）それぞれに、３−４日間隔で１クール１４日にわたる精製可溶性ｈｉｓタグ付けＧＰＶＩタンパク質（実施例１において説明したとおり調製したもの）での免疫処置を４ラウンド施した。
【０１２５】
第０日での初回免疫処置については、Ｔｉｔｅｒｍａｘのアジュバント（ＴｉｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ；Ｓｉｇｍａ  ＃Ｔ２６８４）に乳化させた５μｇの抗原を、マウスの背中に沿って流入領域リンパ節の近位の６部位に皮下投与した。ＲＩＢＩのアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｓｉｇｍａ  ＃Ｓ６３２２）に乳化させた別の５μｇの抗原を腹に沿って６近接部位に投与した。第４、７および１１日に追加免疫処置を同じやり方で与えた。
【０１２６】
最後の注射から４日後にマウスを犠牲にした。両側膝窩、浅鼠径、腋窩および鰓リンパ節を無菌で単離し、新しいＲＰＭＩ培地で洗浄した。リンパ球をリンパ節から放出させ、得られた単個細胞浮遊液をＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、ポリエチレングリコールを使用してＰ３×６３−ＡＧ８．６５３骨髄腫細胞と融合させた。融合後、この細胞混合物を３７℃のインキュベーターで１６−２４時間インキュベートした。得られた細胞調製物を選択半固体培地に移し、１００ｍｍペトリプレートに無菌でプレーティングし、３７℃でインキュベートした。
【０１２７】
選択開始から１０日後にプレートをハイブリドーマ増殖について検査し、目に見えるコロニーを採集し、２００μＬの増殖培地が入っている９６ウエルプレートに入れた。これらの９６ウエルプレートを３７℃のインキュベーターの中で２から４日間、保持した。
【０１２８】
Ｂ  ヒトＧＰＶＩタンパク質を認識するｍＡｂのスクリーニング
ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質（実施例１において説明したとおり調製したもの）を捕捉抗原として使用してＥＬＩＳＡにより抗ＧＰＶＩ  ＩｇＧ生産についての最初のスクリーニングを行った。プレートをＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質で被覆し、ハイブリドーマ上清をこのプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；＃Ａ９０４４）を使用することによって検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。
【０１２９】
９６ウエルプレートから選択された３６７のハイブリドーマの中で１２９のハイブリドーマは抗ヒトＧＰＶＩ抗体生産について陽性であり、さらにまた、細胞増幅後に１１１を確認した。
【０１３０】
Ｃ  ヒトＧＰＶＩへのコラーゲンの結合を遮断する抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの能力
競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイで第二のスクリーニングを行って、すべてのヒトＧＰＶＩ特異的ｍＡｂの機能的特性を、ヒトＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質へのコラーゲンの結合を遮断するｍＡｂの能力について特性付けした。特注のコーラゲン被覆９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用した。ヒトＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質とハイブリドーマ上清のプレインキュベートした混合物をこのプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ；＃Ａ０１７０）を使用することによりコラーゲン−ヒトＧＰＶＩ−Ｆｃ複合体を検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。１００のＧＰＶＩ結合ハイブリドーマの中で２２のハイブリドーマがコラーゲンへのＧＰＶＩ−Ｆｃの結合を遮断した（閾値：９０％阻害）。図１Ａに示すように競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトＧＰＶＩに対する予選択ｍＡｂの遮断特性が容量依存性であることを確認した。
【０１３１】
マウスＩｇＧアイソタイプ判別キット（ＳＥＲＯＴＥＣ；＃ＭＭＴ１）の使用により判定して、すべてのアンタゴニストｍＡｂをアイソタイプＩｇＧ１、カッパと判別した（データは示さない。）。
【０１３２】
Ｄ  抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの結合特性
ＧＰＶＩ遮断抗体の結合特性を評価するために表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００）により最後のスクリーニングを行った。この分析において、本発明者らは、ＣＭチップに共有結合で連結させた抗Ｆｃ抗体に固定した抗ヒトＧＰＶＩ  ｍＡｂとヒトＧＰＶＩタンパク質との相互作用を評価した。Ｃａｎｚｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００４．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２５：３０１−３０７により記載されたプロトコルを用いて、個々のｍＡｂの結合動態を実行した。
【０１３３】
すべての遮断ｍＡｂは、ヒトＧＰＶＩに対してナノモル（以下）の範囲の親和性を示した（表１）。標的親和性に基づき、ハイブリドーマクローン３９０からの抗体をさらなる開発のために選択した。
【０１３４】
【表１】
0005843783.tif 000002
【０１３５】
Ｅ  抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂと霊長類ＧＰＶＩタンパク質の交差反応特性
表１に列挙したＧＰＶＩ特異的ｍＡｂを霊長類ＧＰＶＩ−Ｆｃタンパク質に結合するｍＡｂの能力についてＥＬＩＳＡにより評定した。プレートを霊長類ＧＰＶＩ−Ｆｃ融合タンパク質で被覆し、抗ｈＧＰＶＩ  ｍＡｂをプレートに添加し、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートしたウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ；＃Ａ９０４４）で検出した。ＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２緩衝液の添加により抗体結合を可視化し、４５０ｎｍの波長で読み取った。半固体培地中での増殖により、予選択ハイブリドーマをクローニングした。ペトリプレートに１２５細胞／ｍＬで接種し、有意な増殖を示すクローンを、ＧＰＶＩ結合、ＧＰＶＩ遮断活性および霊長類ＧＰＶＩとの交差反応性についてスクリーニングした。図１Ｂおよび図２に示すように、すべてのｍＡｂは霊長類ＧＰＶＩと交差反応性であった。
【０１３６】
霊長類（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓまたはｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ））ＧＰＶＩの細胞外ドメインについて使用した配列を配列番号２７および配列番号２８として記載する。
【０１３７】
Ｆ  抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂの重および軽鎖の配列の決定
モノクローナル抗体の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを次のように得た：ＱｉａｇｅｎからのＯｌｉｇｏｔｅｘキットでハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを抽出した。Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５５℃のトランスクリプターゼＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および表２に記載のプライマー（ＲＡＣＥＭＯＧ１またはＣＫＦＯＲ）を用いて、ＲＡＣＥ法によるＲＴ−ＰＣＲにより、対応するｃＤＮＡを増幅した。５５℃のポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および同じく表２に記載のプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ｃＤＮＡフラグメントを増幅した。
【０１３８】
【表２】
0005843783.tif 000003
【０１３９】
重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の可変領域をコードする増幅フラグメントをＰｒｏｍｅｇａからのｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙプラスミドまたはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｐＣＲ４−Ｔｏｐｏプラスミドにクローニングし、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で増幅した。その後、クローニングされたｃＤＮＡを両方の鎖に関してシークエンシングした。
【０１４０】
タンパク質配列をプラスミドコーディング配列から翻訳し、重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の質量を算出した（表３）。得た値は、対応するハイブリドーマの培養物から精製したｍＡｂの調製物から得た質量分析データと完全に一致した、表３参照。特に、抗ＧＰＶＩ抗体３９０の重鎖の可変領域内のＮ−グリコシル化部位（ＮＳＴ）の占有を確認した。ＨＣおよびＬＣのアミノ酸配列を次のとおり配列表に報告する：配列番号５および配列番号６はクローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂのＨＣに対応し、配列番号７および配列番号８はクローン３９０からの抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂのＬＣに対応する。
【０１４１】
【表３】
0005843783.tif 000004
【０１４２】
Ｇ  抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂのＣＤＲの配列の決定
ＫＡＢＡＴ命名法を用いてタンパク質配列からＣＤＲ領域についての配列を演繹した。
【０１４３】
ＨＣについて、ＣＤＲ１は配列番号１８に対応し、ＣＤＲ２は、配列番号１９に対応し、ＣＤＲ３は配列番号２０に対応する
ＬＣについて、ＣＤＲ１は配列番号２１に対応し、ＣＤＲ２は、配列番号２２に対応し、ＣＤＲ３は配列番号２３に対応する
【０１４４】
［実施例３］
抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂおよびｍＡｂのＦａｂフラグメントの調製および生物物理学的特性
Ａ  抗ＧＰＶＩ  ＩｇＧまたはＩｇＧのタンパク質分解性Ｆａｂフラグメントによる組換えＧＰＶＩへのコラーゲン結合の阻害
コラーゲン被覆３８４ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を３％ＢＳＡで２時間ブロックした。漸増濃度のＩｇＧまたはフィシン切断によって生産されたＩｇＧの対応するＦａｂフラグメント（０．３−２０μｇ／ｍＬ）を組換えＧＰＶＩ（細胞外ＧＰＶＩドメインのＦｃ融合タンパク質；３μｇ／ｍＬ）と共に３０分間インキュベートした。ＧＰＶＩ−ＩｇＧ混合物をコラーゲン被覆プレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。次に、３８４ウエルプレートを５回洗浄し（ＤＥＬＦＩＡ洗浄用緩衝液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｅｕ標識抗ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを再び５回洗浄し、増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加し、１０分間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａリーダーを使用して３６０／６１２ｎｍで蛍光を検出した。図３は、代表的な読取値を示す。表４は、２回の独立した実験のＧＰＶＩへのコラーゲン結合の阻害についての算出ＩＣ５０値（μｇ／ｍＬ）を示す。
【０１４５】
【表４】
0005843783.tif 000005
【０１４６】
Ｂ  組換えＦａｂフラグメントの生産
１．抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの組換え生産のための発現プラスミドの構築
抗ヒトＧＰＶＩ抗体の可変重および軽鎖のアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列に逆翻訳し、Ｙｏｕｎｇ  Ｌ．およびＤｏｎｇ  Ｑ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００４），３２（７），ｅ５９）により記載されたオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＯＥ−ＰＣＲ）の修正プロトコルを用いて、または遺伝子合成（Ｇｅｎｅａｒｔ）によって、それぞれ生成した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯクローニングキットを使用してＰＣＲ産物をｐＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ  ＴＯＰＯベクターにクローニングし、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してシークエンシングした。各可変重鎖をＩＧＨＧ１（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｑ５６９Ｆ４）のＣＨ１ドメインに融合し、可変軽鎖を定常カッパ鎖（ＩＧＫＣ、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｑ５０２Ｗ４）にそれぞれ融合させた。これらのフラグメントをＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、それぞれをエピソーム発現ベクターｐＸＬ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２），Ｅ９によって記載されたｐＴＴベクターの類似物）のＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートして、キメラおよびヒト化抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの一過性哺乳動物発現のためのプラスミドを作った。抗体の重および軽鎖をコードする発現プラスミドをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ  １０−ベータ（ＤＨ１０Ｂ誘導体）において増やした。トランスフェクションに用いたプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ  ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔを使用してＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製した。
【０１４７】
２．組換え抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントの一過性発現および精製
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖しているＨｅｋ  ２９３−ＦＳを、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ）トランスフェクション試薬を使用して、示すＬＣおよびＨＣプラスミドでトランスフェクトした。７日後、細胞を遠心分離によって除去し、１０％  容量／容量  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加し、上清を０．２２μｍフィルタに通して粒子を除去した。ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔマトリックス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＦａｂタンパク質を捕捉し、ｐＨシフトによって溶離した。タンパク質含有画分をプールし、ＰＤ−１０またはＳｅｐｈａｄｅｘカラムを使用して脱塩した。濃縮し、滅菌濾過（０．２２μｍ）したタンパク質溶液を１ｍｇ／ｍＬに調整し、使用するまで４℃で保持した。
【０１４８】
Ｃ  組換えＦａｂの生物学的特性付け
精製抗体フラグメントの詳細な動態特性付けにＢｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴技術を用いた。リガンドとして抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂおよび分析物としてヒトＧＰＶＩで、直接結合アッセイを用いた。典型的には、５００ＲＵの抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂをアミン反応性カップリングにより研究グレードＤＭ５チップ上に固定して、結合したＧＰＶＩ分子について２００ＲＵのＲｍａｘを得た。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中、概して０．８から２０８ｎＭの間の濃度範囲にわたって３０μＬ／分の流量で結合動態を測定した。チップ表面を１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）で再生させた。参照として固定化Ｆａｂのないフローセルを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムパッケージ（バージョン４．１）で動態パラメータを分析および算出した。物質移動を伴う１：１結合モデルを曲線に対するデータのグローバルフィットに利用した。
【０１４９】
グリコシル化クローン３９０（Ｆａｂ  ３９０−Ｇ）から誘導された原配列中に存在する追加のグリコシル化モチーフの機能的帰結を調査するために、保存グリコシル化モチーフをアミノ酸置換によって除去した（Ｆａｂ  ３９０−ｎＧ）。このために、クローン３９０に基づく２つの重鎖フラグメントを構築した：最初のものは修飾を一切有さず、配列番号９に対応し、二番目のものは、配列番号９の位置６０に点突然変異Ｎ→Ｑを有する。
【０１５０】
グリコシル化が非常に不均一であり得ることおよび糖タンパク質不均一性を生じさせ得ることは公知である；このような不均一源はできる限り回避すべきである。
【０１５１】
この場合、追加のグリカンの除去は、表５に示すように、ＧＰＶＩに対する結合親和性に影響を及ぼさない。従って、非グリコシル化Ｆａｂ  ３９０−ｎＧ構築物をさらなる実験に選択した。
【０１５２】
【表５】
0005843783.tif 000006
【０１５３】
Ｄ  抗ＧＰＶＩ  ＦａｂとＧＰＶＩの共結晶化およびＸ線結晶学による抗ＧＰＶＩ  ｍＡｂにより認識されるエピトープの決定
エピトープ特性付けのために共結晶化戦略を利用した。Ｆａｂ  ３９０−ｎＧ（ＨＥＫ２９３細胞において発現されたもの）とヒト糖タンパク質ＶＩ（昆虫細胞Ｈｉｇｈ  ｆｉｖｅにおいて発現された、ヒトＧＰＶＩの細胞外粗メイン（Ｍｅｔ１−Ｔｈｒ２０５））の複合体を、両方のタンパク質の等モル比でのインキュベーションによって形成した。この複合体をトリプシンで消化し、ゲル濾過によって再び精製し、濃縮し、結晶化スクリーニングに付した。１００ｎＬのタンパク質溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、６．５ｍｇ／ｍＬのＦａｂ−抗原複合体）と、０．１Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ（ｐＨ５．５）、２５％ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍ酢酸アンモニウムを含有する１００ｎＬのリザーバー溶液とを混合すること、および密封したシッティングドロップ蒸気拡散結晶化プレートにおいて４℃で２００μＬのリザーバー溶液に対するタンパク質ドロップをインキュベートすることによって、よく回折する結晶を得た。凍結防止のために２５％エチレングリコールを補足したリザーバー溶液を使用して液体窒素で１つの結晶を急速冷凍した。フランス、グルノーブルの欧州シンクロトン放射光施設（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）においてビームラインＩＤ１４−４で結晶学データを収集した。Ｆａｂ  ３９０−ｎＧについてのモデルとしてｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ  １ＦＤＬのＦａｂフラグメントを、およびＧＰＶＩについてのモデルとしてヒト血小板糖タンパク質ＶＩの結晶構造の１つの単量体、ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ  ２ＧＩ７を使用する分子置換によって構造を解明した。この微細構造の分解能および最終Ｒ因子は、１．７２Å、Ｒ因子１７．２％およびＲフリー１９．９％である。ＧＰＶＩ結合エピトープは、抗原ｈＧＰＶＩの下記の残基へのＦａｂ  ３９０−ｎＧの相互作用（距離＜４．５Åと定義する。）を特徴とする配座エピトープである：
Ｐｒｏ４、Ｌｙｓ７、Ｇｌｕ４０、Ｌｙｓ４１、Ｌｅｕ４２、Ｓｅｒ４３、Ｓｅｒ４４、Ｓｅｒ４５、Ａｒｇ４６、Ａｒｇ６５、Ａｒｇ６７、Ｔｒｐ７６、Ｌｅｕ７８、Ｐｒｏ７９、Ｓｅｒ８０、Ａｓｐ８１、Ｇｌｎ８２、Ｓｅｒ１６５、Ａｒｇ１６６。
【０１５４】
これらの残基は、Ｄ１ドメイン（アミノ酸８４まで）に属するか、Ｄ２ドメイン（アミノ酸９４から１７６）を一部を構成し、従って、配座エピトープに相当する。ＧＰＶＩエピトープ残基の番号付けシステムは、図１６および配列番号：３２に示すとおりのシグナル配列が除去されたタンパク質に相当する。クローン３９０からのＦａｂ抗ＧＰＶＩとＧＰＶＩの細胞外Ｄ１−Ｄ２ドメインとの相互作用を図５に図示する。
【０１５５】
ＧＰＶＩペプチドと残基と接触する抗体残基を下の表６から表１１に記載する。
【０１５６】
本明細書において用いる場合、「接触残基」は、ＧＰＶＩ抗原残基へのまたはその逆の距離がおよび結晶構造に関して測定した場合にはＧＰＶＩに対する抗体とＧＰＶＩ抗原との間の距離が４．５Å未満である抗体残基と定義した。ＣＣＰ４  ＳｏｆｔｗａｒｅパッケージのソフトウェアプログラムＮＣＯＮＴを使用してこれらの距離を決定した。
【０１５７】
Ｘ線構造は、ＧＰＶＩへの結合に影響を及ぼすべきでない、突然変異され得るＣＤＲからの残基を強調する。
【０１５８】
以下の説明の中で、ＣＤＲからの残基を、ＧＰＶＩへの結合を分断することなく、示すとおり修飾することがある。ＣＤＲにおける突然変異が、ＣＤＲからの残基の配座および配向に影響を及ぼしてＣＰＶＩへの結合を妨げるべきでないことも理解される。残基の番号付けは逐次的であり、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ（（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，９２７−９４８）において用いられているようなカバット規則に従わない。「Ｘ」は、「任意の残基」を表し、一方、「−」は、この位置で修飾を行うべきでないことを示す。
【０１５９】
配列番号：１８で定義されるようなＣＤＲＨ１配列は、１０残基にわたる。表６に示すように、ＣＤＲＨ１残基の１０のうちの６即ち６０％は、ＧＰＶＩと接触しない。抗体残基と接触しているＧＰＶＩ残基のすべてがセリン残基である。
【０１６０】
【表６】
0005843783.tif 000007
【０１６１】
ＣＤＲＨ２配列は、配列番号：１９で定義され、１６抗体残基にわたる。表７に示すように、ＣＤＲＨ２残基の１６のうちの９即ち５６％は、ＧＰＶＩと接触しない。トリプトファン５２は７つの異なるＧＰＶＩ抗原残基と接触していることが判明した。ＧＰＶＩのアルギニン４６は、５つの異なるＣＤＲＨ２残基と接触していることが判明した。
【０１６２】
【表７】
0005843783.tif 000008
【０１６３】
ＣＤＲＨ３配列は、配列番号：２０で定義され、５抗体残基にわたる。ＣＤＲ配列の定義が、用いるソフトウェアによってわずかに変動し得るという事実に基づき、ＣＤＲＨ３は１つの追加の残基を含むことがあることが判明した。従って、ＣＤＲＨ３は、６抗体残基にわたる配列番号：３８で定義されるとおりである場合がある。表８に示すように、ＣＤＲＨ３残基の６のうちの２即ち３３％は、ＧＰＶＩと接触しない。アルギニン６５は３つの異なるＧＰＶＩ抗原残基と接触していることが判明した。ＧＰＶＩ接触ＣＤＲＨ３残基の３つの異なるアルギニン残基が存在する。
【０１６４】
【表８】
0005843783.tif 000009
【０１６５】
ＣＤＲＬ１配列は、配列番号：２１で定義され、１１抗体残基にわたる。表９に示すように、ＣＤＲＬ１残基の１１のうちの７即ち６４％は、ＧＰＶＩと接触しない。チロシン３２は５つの異なるＧＰＶＩ抗原残基と接触していることが判明した。
【０１６６】
【表９】
0005843783.tif 000010
【０１６７】
ＣＤＲＬ２配列は、配列番号：２２で定義され、７抗体残基にわたる。ＣＤＲ配列の定義が用いるソフトウェアによってわずかに変動し得るという事実に基づき、ＣＤＲＬ２は１つの追加の残基を含むことがあることが判明した。従って、ＣＤＲＬ２は、８抗体残基にわたる配列番号：３９で定義されるとおりである場合がある。表１０に示すように、ＣＤＲＬ２残基の８のうちの６即ち７５％は、ＧＰＶＩと接触しない。このＣＤＲは、ＧＰＶＩのＤ１およびＤ２両方のドメイン内の残基と接触している。チロシン５０は、Ｄ１内のａｓｐ８１およびｇｌｎ８２と接触しており、一方、プロリン５６は、ＧＰＶＩ  Ｄ２ドメインのａｒｇ１６６およびｓｅｒ１６５と接触している。
【０１６８】
【表１０】
0005843783.tif 000011
【０１６９】
ＣＤＲＬ３配列は、配列番号：２３で定義され、８抗体残基にわたる。表１１に示すように、ＣＤＲＬ３残基の８のうちの５即ち６３％は、ＧＰＶＩと接触しない。
【０１７０】
【表１１】
0005843783.tif 000012
【０１７１】
抗体残基と相互作用するＧＰＶＩ残基間の接触の一覧により、ｓｅｒ４３が８つの接点を有し、ｓｅｒ４４が７つの接点を有し、ａｒｇ４６が４つの接点を有し、ａｒｇ６７が４つの接点を有し、ａｒｇ６５が３つの接点を有し、ａｓｐ８１が３つの接点を有し、およびＡｒｇ１６６が２つの接点を有することが明らかになった。殆どのＧＰＶＩ残基には、軽鎖または重鎖のいずれかが好ましいが、Ｒ６７およびＲ１６６は両方と接触する。
【０１７２】
Ｅ  抗ＧＰＶＩ  ＦａｂのＦｖドメインのヒト化
特許出願ＷＯ２００９／０３２６１１に記載されているヒト化プロトコルを用いてＦａｂ  ３９０−ｎＧクローンをヒト化した。加えて、Ｆａｂ  ３９０−ｎＧとヒトＧＰＶＩとの結晶学的複合体の分析は、このヒト化キャンペーンの中でヒトＧＰＶＩに対するＦａｂ  ３９０−ｎＧの親和性を改善するまたは少なくとも保持する目的での幾つかの突然変異につながった。
【０１７３】
Ｆａｂ  ３９０−ｎＧのＶＬおよびＶＨをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）のＡｕｇｕｓｔ  ２００７バージョンに対してブラストした。ＰＤＢ構造１Ｌ７Ｉを使用して、軽鎖の相同モデルを構築した。ＰＤＢ構造１ＹＹ８および１ＺＡ６両方を使用して、重鎖の相同モデルを構築した。１ＺＡ６構造は、特に、ＣＤＲ３サブ領域のモデリングに使用し、一方、１ＹＹ８構造は、この重鎖の残部のために使用した。得られたＶＬおよびＶＨモデルを使用して、可変ドメインの相同モデルを構築し、その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）に実装されている標準的な手順を用いてエネルギーを最小化した。ＭＯＥは、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐによって配給されているコンピュータ援用医薬品設計用ソフトウェアである。その後、このＦａｂ  ３９０−ｎＧの最小化モデルを分子動力学シミュレーションに付して、Ｔ細胞受容体と相互作用する可能性がより高いおよび免疫応答の活性化の原因となる、最もフレキシブルな残基を同定した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより配給されているＡＭＢＥＲソフトウェアでこれらのシミュレーションを実行した。最終的に５７のアミノ酸がＦａｂ  ３９０−ｎＧの中でフレキシブルと同定される。次に、２０ｎｓ（１０×２ｎｓ）中の最大６０のフレキシブルＦａｂ  ３９０−ｎＧ（ＣＤＲ＋５Å領域を除く）の動きを、４９のヒト生殖細胞系相同モデル（これらのそれぞれについて１０×２ｎｓ  ＭＤシミュレーションを実行した。）の対応するフレキシブルアミノ酸の動きと比較した。７つの最も一般的なヒト生殖細胞系軽鎖（ｖｋ１、ｖｋ２、ｖｋ３、ｖｋ４、ｖラムダ１、ｖラムダ２、ｖラムダ３）と７つの最も一般的なヒト生殖細胞系重鎖（ｖｈ１ａ、ｖｈ１ｂ、ｖｈ２、ｖｈ３、ｖｈ４、ｖｈ５、ｖｈ６）を系統的に組み合わせることにより、４９のヒト生殖細胞系モデルを構築した。ｖｋ１−ｖｈ６ヒト生殖細胞系配列は、この配列のフレキシブルアミノ酸について、Ｆａｂ  ３９０−ｎＧのフレキシブルアミノ酸と比較して８４％の４Ｄ類似性を示した；このため、ｖｋ１−ｖｈ６生殖細胞系配列を用いて、フレキシブルアミノ酸に的を絞ってＦａｂ  ３９０−ｎＧ配列をヒト化した。Ｆａｂ  ３９０−ｎＧとｖｋ１−ｖｈ６アミノ酸とのアミノ酸対合については、これら２つの配列を、２つの対応する相同モデルのアルファ炭素の最適な３Ｄ重ね合わせに基づいてアラインした。場合によって、潜在的に問題のある配列の以下のモチーフを考慮した：Ａｓｐ−Ｐｒｏ（酸不安定性結合）、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（グリコシル化、Ｘ＝Ｐｒｏ以外の任意のアミノ酸）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（フレキシブルエリアにおけるスクシンイミド／イソ−ａｓｐ形成）、Ａｓｎ−Ｇｌｙ／Ｈｉｓ／Ｓｅｒ／Ａｌａ／Ｃｙｓ（露出された脱アミド化部位）、Ｍｅｔ（露出されたエリアにおける酸化）。得られた改変配列を、妥当な仮定が設定された信頼度を提供するＵｎｉＰｏｒｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｏｒｔデータベースに対して、配列類似性についてブラストした。加えて、いずれの配列も、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌ��ｓｉｓ  Ｒｅｓｏｒｃｅ（ＩＥＤＢデータベース）に載っている公知ＢおよびＴ細胞エピトープを一切含有しない。
【０１７４】
重鎖については５バージョン（Ｆａｂ  ３９０−ｎＧ  ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５）および軽鎖については３バージョン（ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３）が提案された。すべてのバージョンが抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂ  ３９０−ｎＧ構築物の配列から誘導される。非ヒト化Ｆａｂ  ３９０−ｎＧについての出発配列をＶＨについては配列番号：３３およびＶＬについては配列番号：３４に提供する。Ｌ１バージョンは、４つの突然変異を有する。Ｌ２バージョンは、ヒトＧＰＶＩへの結合を改善する可能性がある追加の突然変異（Ｎ９３Ｈ）を含む。Ｌ３バージョンはＬ１に由来し、およびヒトＧＰＶＩへの結合を改善する可能性がある追加の突然変異（Ｎ９３Ｌ）を含む。
【０１７５】
バージョンＨ１は、前に説明した手順に従って見つけられる最も近いヒト重鎖生殖細胞系配列、ＶＨ６、から誘導される５つのヒト化突然変異を含有する。バージョンＨ２は、４つのヒト化突然変異を含有し、Ｈ１に由来するが、Ｆａｂ  ３９０−ｎＧとヒトＧＰＶＩとの結晶学的複合体において見られるような強力な親和性にとって重要であることが判明した位置７３（Ａｓｎ７３）のアミノ酸を突然変異させない。バージョンＨ３は、ヒト重鎖生殖細胞系配列ＶＨ３から誘導される５つのヒト化突然変異を含有する。ＶＨ３は、前に説明した手順に従ってＦａｂ  ３９０−ｎＧのＶＨ鎖に近いこと、および位置７３にアスパラギン（Ａｓｎ）残基を有することが判明した。Ｈ４バージョンは、Ｈ２に由来し、およびヒトＧＰＶＩへの結合を改善する可能性がある１つの追加の突然変異（Ｇ３１Ｙ）を含む。Ｈ５バージョンは、Ｈ２に由来し、およびＧＰＶＩへの結合を改善する可能性がある１つの追加の突然変異（Ｙ１０３Ｅ）を含む。
【０１７６】
改変抗体の産生のためにＶＬおよびＶＨ変異体の８つの組み合わせを推奨した：Ｖｌ１とＶＨ１、ＶＬ１とＶＨ２、ＶＬ１とＶＨ３、ＶＬ２とＶＨ２、ＶＬ３とＶＨ２、ＶＬ１とＶＨ４、ＶＬ１とＶＨ５およびＶＬ３とＶＨ５。表１２および１３に示すように、本出願の項「発明を実施するための形態」に示す方法論を用いて、Ｆａｂ  ３９０−ｎＧの改変ＶＬおよびＶＨ変異体のアミノ酸を変更した。左の列は、元のアミノ酸およびマウスＦａｂ  ３９０−ｎＧにおけるアミノ酸の位置を示す。
【０１７７】
可変ドメインの改変に加えて、抗体およびこの抗体のフラグメントをタグまたはアミノ酸伸長部の付加によりさらに修飾することができる。例えば、ヒスチジン残基６以上の配列、特に、（Ｈｉｓ）６もしくは（Ｈｉｓ）７もしくは（Ｈｉｓ）８を重鎖のＣ末端に付加させることができ、または配列内の前記末端をアミノ酸、例えばＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒもしくは（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）２ユニットの付加により伸長することができる。同様に、抗体および抗体のフラグメントのフレームワークをＩｇＧ１主鎖からＩｇＧ４のような別のＩｇＧ主鎖に変更することができる。
【０１７８】
【表１２】
0005843783.tif 000013
【０１７９】
【表１３】
0005843783.tif 000014
【０１８０】
Ｆ  ヒト化変異体の生物学的特性付け
精製抗体フラグメントの詳細な動態特性付けのためにＢｉａｃｏａ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴技術を用いた。固定化ヒトＧＰＶＩでのアッセイを用いた。典型的には、ＧＰＶＩの３００ＲＵをアミン反応性カップリングにより研究グレードＣＭ５チップ上に固定して、結合した抗体フラグメントについて２００ＲＵのＲｍａｘを得た。ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）中３．２から１１２ｎＭの間の濃度範囲にわたって３０μＬ／分の流量で結合動態を測定した。チップ表面を１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）で再生させた。参照として固定化ＧＰＶＩのないフローセルを使用して、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムパッケージ（バージョン４．１）で動態パラメータを分析および算出した。物質移動を伴う１：１結合モデルを、Ｆａｂフラグメントの３−５６ｎＭの分析物濃度に対応する曲線に対するデータのグローバルフィットに利用した。
【０１８１】
このヒト化キャンペーンからの抗ＧＰＶＩ抗体フラグメントの結合動態を表１４に示す。この実施例においてデータを測定するために用いたＢｉａｃｏｒｅアッセイが固定化結合パートナーの点で異なること（ＧＰＶＩ対ｍＡｂ／Ｆａｂフラグメント）およびこのことが表５に報告したような異なるＢｉａｃｏｒｅ親和性をもたらすことに留意されたい。
【０１８２】
【表１４】
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【０１８３】
［実施例４］
抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによるコラーゲン結合のおよび血小板凝集の阻害
Ａ．組換え抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによるコラーゲンへの組換えＧＰＶＩの結合の阻害
コラーゲン被覆３８４プレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を３％ＢＳＡで２時間ブロックした。漸増濃度の抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメント（０．３−２０μｇ／ｍＬ）を組換えＧＰＶＩ（ＧＰＶＩの細胞外ドメインとヒトＩｇＧのＦｃ部分の融合タンパク質；３μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。ＧＰＶＩ−Ｆａｂ混合物をコラーゲン被覆プレートに添加し、１時間、室温でインキュベートした。３８４ウエルプレートを５回洗浄し（ＤＥＬＦＩＡ洗浄用緩衝液、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、Ｅｕ標識抗ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加した。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを再び５回洗浄し、増強溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を添加し、１０分間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａリーダーを使用して３６０／６１２ｎｍで蛍光を検出した。ＧＰＶＩコラーゲン結合に対する組換え生産抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントの阻害効果の例を表１５に示す。
【０１８４】
【表１５】
0005843783.tif 000016
【０１８５】
Ｂ．組換え抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによるコラーゲン誘導血小板凝集の阻害（ヒト多血小板血漿）
多血小板血漿（ＰＲＰ）については、１０％の最終濃度までのＡＣＤ−Ａが入っている注射器に血液を採取した。２００×ｇで２０分間、室温で、破壊することなく遠心分離した後、上清（ＰＲＰ）を分離した。１０分間、１５００×ｇでの遠心分離により、残りの血液から少血小板血漿（ＰＰＰ）を分離した。ＰＲＰをＰＰＰでの希釈により３．０×１０８細胞／ｍＬにした。Ｆａｂフラグメントを０．１５−２０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、ＰＲＰと共に５分間、３７℃でインキュベートした。その後、コラーゲンを１−１．５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、９６ウエル・プレート・リーダー（９６ウエルプレート凝集）またはＢｏｒｎ凝集検出計（古典的凝集）のいずれかの使用による光透過の測定により凝集応答をモニターした。凝集応答を２０分間モニターした。表１６に示すように、調査したすべてのＦａｂフラグメントは、濃度依存的様式でコラーゲン誘導血小板凝集を阻害することができた。
【０１８６】
【表１６】
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【０１８７】
Ｃ．抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによるコラーゲン誘導血小板凝集の阻害（ヒト全血）
これらの実験については、血液を２０μｇ／ｍＬヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。測定前に全血をＮａＣｌで１：１希釈した。Ｆａｂフラグメントを０．１５−２０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用し、血液と共に５分間、３７℃でインキュベートした。その後、コラーゲンを１μｇ／ｍＬの濃度で添加し、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）分析装置を使用するインピーダンスの測定により凝集応答をモニターした。反応を６分間モニターした。製造業者により指定されたとおりに凝集曲線下面積（ＡＵＣ）によって凝集応答を定量した。図６に示すように、調査したＦａｂフラグメントは、濃度依存的様式でコラーゲン誘導血小板凝集を阻害することができた。
【０１８８】
Ｄ．抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の防止
これらの実験については、血液を２０μｇ／ｍＬヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。１×０．１ｍｍの内径を有する長方形キャピラリーマイクロスライドガラス（英国、ケンブリッジのＣａｍｌａｂ）を一晩、１００μｇ／ｍＬのＨｏｒｍコラーゲンで被覆し、室温で１時間、熱不活性化０．５％脂肪酸不含ＢＳＡでブロックした。血小板を２μＭのＤｉＯＣ６（３）で蛍光標識し、Ｆａｂフラグメントで５分間、３７℃で処理した。コラーゲン被覆カバーガラス全体の灌流を２分間、２０００秒−１で行った。血液灌流後、タイロード緩衝液１を５分間、同じ剪断速度でマイクロスライド全体に灌流させた。血小板（血栓）表面被覆率の判定により、血栓形成を定量した。このために、キャピラリーの中央の異なるエリアから１０の最終蛍光画像を記録した。加えて、位相差およびＤＩＣ写真を記録した。白黒ＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳｎａｐ  ｃｆ、オットブルンのＲｏｐｅｒｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）に接続したＩｍａｇｅＰｒｏ  ｐｌｕｓ画像処理ソフトウェア（米国、シルバースプリングのＭｅｄｉａｃｙ）を使用して、画像処理、記録および分析を行った。図７Ａ−Ｅは、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントによる血流下での血栓形成の阻害の例を示す。
【０１８９】
Ｅ．動脈血栓症のマウスモデルにおける抗ＧＰＶＩ  ＦａｂＦａｂフラグメントの効果
このインビボ調査には、ＧＰＶＩ受容体がヒト化されたマウスを用いた。頸動脈閉塞を光化学的に誘導して、血管外壁に影響を及ぼすことなく血管内側に血管内皮損傷を生じさせた。この技法により、赤色色素、ローズベンガルを全身投与し、頸動脈の内皮に緑色レーザー光線を照射して、「インサイドアウト」損傷を生じさせた。抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントを１０ｍｇ／ｋｇで頸静脈カテーテルにより静脈内ボーラスとして投与した。１５分のインキュベーション期間の後、レーザー光線源を頸動脈端部からフロープローブのほうに１２ｃｍ離して配置した。９０分の観察期間の間、継続的に血流をモニターした。測定した血栓症パラメータは、血管損傷後に動脈閉塞を完了する時間長（閉塞までの時間、ＴＴＯ）および血流曲線下面積（ＡＵＣ）であった。
【０１９０】
血栓症評価のために、２つの測定パラメータを用いた：ａ）閉塞までの時間（ＴＴＯ）およびｂ）血流曲線下面積。血栓誘発（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）から血管閉塞までの時間（ＴＴＯ）は、対照群についての３３分に対して抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントについては７８分であり、２．４倍増の結果となった（表１７）。血流曲線下面積は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントで治療した群については対照群と比較して２．３倍増加した（表１８）。１０ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントの静脈内ボーラス投与は、ヒト化ＧＰＶＩマウスにおける光化学的誘導動脈血栓症において有意な抗血栓症効果を生じさる結果となった。
【０１９１】
【表１７】
0005843783.tif 000018
【０１９２】
【表１８】
0005843783.tif 000019
【０１９３】
Ｆ．抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂフラグメントにより誘導される血小板表面からのＧＰＶＩの枯渇
これらの実験については、血液を２０μｇ／ｍＬヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。示す濃度で抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントを使用した。血液または多血小板血漿（ＰＲＰ）試料をＦａｂフラグメントと共に５分間、１５分間、１時間および２時間、それぞれインキュベートした。その後、パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、ＧＰＶＩ受容体発現を判定した。血小板表面のＧＰＶＩ密度を、異なる蛍光標識抗ＧＰＶＩ抗体を使用して測定し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）で判定した。対照として、この抗体が調査したＦａｂフラグメントとは無関係に（および調査したＦａｂフラグメント存在下で）ＧＰＶＩに結合できることを予め証明した。
【０１９４】
図８に示すように、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂは、濃度依存的様式でＧＰＶＩ表面発現を低減させる。さらなる実験は、５分の抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂ曝露が、１０μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍで有意なＧＰＶＩ枯渇を既に生じさせたことを証明する（図９）。より低濃度の抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂも、遅い時間経過ではあったが、ＧＰＶＩ表面密度を減少させることができた。
【０１９５】
これらの結果は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂが血小板表面でのＧＰＶＩ枯渇を誘導することを支持する。
【０１９６】
Ｇ．血液学的評定を同時施行したカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるコラーゲン誘導全血凝集に対する抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのインビトロおよびエクスビボ効果
１．動物詳説および投薬レジメン：
動物研究は、地元の動物福祉規制に従っておよび獣医当局による登録を受けたＡＡＡＬＡＣ（実験動物管理公認協会）認証施設において行った。研究において使用した種／株は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）であった。この研究にはメスザルのみを使用した。１用量群につき２匹の動物を研究した。研究した用量は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ビヒクル対照、０．０１、０．１、１および３ｍｇ／ｋｇの抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂを含み、すべて２ｍＬ／ｋｇのＩＶボーラスで投与した。含めたサルの体重は、３．５２ｋｇと７．３４ｋｇの間の範囲であった。１ｍｇ／ｋｇ用量群において使用した動物のうちの１匹（サルＤ）は、投薬前試料で血小板凝集応答を一切示さなかった。この故、継時的な凝集応答（投薬前と比較した％での凝集の阻害）の個体内相対変化の算出は不可能であったのでデータを提供しない。
【０１９７】
２．血液学のための血液試料採取および加工ならびの血漿調製
健常で意識のある一箇所に収容されていたサルの前肘静脈から、薬物またはビヒクル投与前および後に様々な時間間隔（投薬前、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、１４９．５時間）で針を穿刺して、３．１３％クエン酸ナトリウム（ドイツ、Ｂａｄ  Ｎｅｕｅｎａｈｒ−ＡｈｒｗｅｉｌｅｒのＥｉｆｅｌｆａｎｇｏ）が入っている試験管に全血を採集した（血液試料採取後、全試験管容積の１／１０）。ＰＢＳビヒクル治療群からは、試料採取スケジュールがわずかに異なり、次の時点で試料を採取した：投薬前、０．５、１、２、４、６、８、２４、４８、１２６時間。自動血液学分析装置Ｓｃｉｌ  Ｖｅｔ  ａｂｃ（ドイル、ＶｉｅｒｎｈｅｉｍのＳｃｉｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ＧｍｂＨ）を使用することにより、血小板数に特に的を絞って全血球数を判定して、血液学の生理状態をモニターした。全血凝集アッセイ後、残りの血液試料を各時点からの血漿調製のために遠心分離した。血漿調製のために、血液を５０００Ｕ／分で１５分間、遠心分離し上清を別の試験管に回収し、後の時点での抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの血漿レベルについての分析のために−２０℃で冷凍した。
【０１９８】
３．全血血小板凝集の測定
全血血小板凝集アッセイは、ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）血小板機能分析装置（ドイツ、ミュンヒェンのＤｙｎａｂｙｔｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｓｙｓｔｅｍｅ  ＧｍｂＨ）を使用して行った。使用したアゴニストは、１μｇ／ｍＬの最終濃度でのウマＩ型コラーゲン（Ｈｏｒｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、ドイツ、ミュンヒェンのＮｙｃｏｍｅｄ）であった。製造業者の説示に従って分析を行い、投薬前の個々の全血凝集応答それぞれを基準にして全血凝集の阻害率を算出した。簡潔に説明すると、カートリッジに２９７μＬのＣａＣｌ２を前もって負荷し、２９７μＬの全血を添加した。５分の平衡の後、６μＬのアゴニストコラーゲンを１００倍濃度で添加し、測定を開始した。７分間、記録を行い、分での一定期間にわる曲線下面積（ＡＵＣ、任意単位）として結果を表示した。投薬前の値と比較した一定期間のＡＵＣの相対変化を計算して血小板凝集の阻害率を得、グラフにプロットした。
【０１９９】
同じコロニーからの他のサルからの血液試料の別のセットを用いて、インビトロ用量−応答測定を行って、抗ＧＰＶＩ  ＦａｂについてのインビトロＩＣ５０を決定した。このためにエクスビボ測定について上で説明したのと同じように血液試料を処理した。簡潔に述べると、異なる濃度（３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１μｇ／ｍＬ）の抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂをｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ（登録商標）分析装置の試験セル内のＣａＣｌ２／全血混合物に添加し、５分間インキュベートした。１μｇ／ｍＬのアゴニストコラーゲンを添加した後、測定を開始し、７分間、ＡＵＣを記録した。それぞれの用量−応答をプロットすることにより、社内統計ソフトウェアツール（Ｓｐｅｅｄ  ２．０  ＬＴＳ）を使用してＩＣ５０を算出した。
【０２００】
４．ＧＰＶＩ受容体表面発現の測定
健常で意識のある一箇所に収容されていたサルの前肘静脈から薬物またはビヒクル投与前および後に様々な時間間隔で針を穿刺して、３．１３％クエン酸ナトリウムが入っている試験管に全血を採集し（血液試料採取後、全試験管容積の１／１０）、直ちに使用した。５％パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、ＧＰＶＩ受容体発現を判定した。血小板表面の密度を、異なる蛍光標識抗ＧＰＶＩ抗体を使用して測定し、フローサイトメーターで判定した。対照として、この抗体が調査したＦａｂフラグメントとは無関係に（および調査したＦａｂフラグメント存在下で）ＧＰＶＩに結合できることを予め証明した。
【０２０１】
５．全血血小板凝集に関する結果
それぞれの投薬レジメンを比較するために、個々の動物それぞれの投薬前の値を基準にして全血血小板凝集の阻害率を算出した。ＰＢＳビヒクル群は、ＩＶボーラス投与後６時間の時点で６７％までの血小板凝集阻害を見せた（データは示さない。）。しかし、少なくとも２つの連続する時点にわたって少なくとも８０％の血小板凝集阻害が生理学的に適切であると考えられた。試験した抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの２つの低い用量（０．０１および０．１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  ｆａｂ）の両方が全血凝集の適切な阻害を一切示さなかった。１ｍｇ／ｋｇでは、９３％血小板阻害が投与後１時間の時点で既に達成され、（２での効果のわずかな減少（図１０Ａ）を除けば）２４時間まで８０％より上のままであった。その後、血小板機能の阻害は継時的に減少した。３ｍｇ／ｋｇでは、血小板凝集の阻害は観察の最初の２４時間の間８０％より大きい値で安定しており、７２時間まで６９％と７７％の間の値を維持した（図１０Ｂ）。試験したより高い用量群両方において、血小板機能は最後の時点で（１４９．５時間、図１０ＡおよびＢ）完全に回復された。このデータに基づいて、ＥＤ５０をＩＶボーラス投与後０．５時間の時点で概算し、試験した抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂについて０．５ｍｇ／ｋｇと判明した。
【０２０２】
この実験は、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂが、コラーゲン（１μｇ／ｍＬ）を使用してビヒクルと比較したときに用量依存的様式でエクスビボ全血血小板凝集を阻害することを立証する。
【０２０３】
別の実験セットでは、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのインビトロ活性を判定した。算出ＩＣ５０は、０．８１μｇ／ｍＬ［０．５１；１．２８μｇ／ｍＬ］ＣＶ＝２．１６％と判明した（図１１）。
【０２０４】
６．血液学的評定
実験の時間経過を通して血液学の生理状態をモニターするために、血小板数に特に的を絞って全血球数を判定した。平均血小板数は、投薬前の時点でのＰＢＳビヒクル中の４２８×１０３／μＬと０．０１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３６９×１０３／μＬ、０．１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの２３５×１０３／μＬ、１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３５７×１０３／μＬ、および３ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３１２×１０３／μＬの間で様々であった（図１２Ａ−Ｅ）。実験の時間経過を通して、血小板数は実質的に変化せず（即ち、１００×１０３／μＬ未満の値）、ＰＢＳビヒクル群において１２６時間の時点で次の血小板数を判定した：３５８×１０３／μＬ（図１２Ａ）。すべての抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂ治療群において、１４９．５時間の時点で判定した血小板数は、次の値を示した：０．０１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの４１１×１０３／μＬ、０．１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３２９×１０３／μＬ、１ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３２１×１０３／μＬ、および３ｍｇ／ｋｇ  抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂでの３２０×１０３／μＬ（図１２Ｂ−Ｅ）。判定した他のすべての血液学パラメータ、ヘマトクリット、赤血球数およびヘモグロビンは、実験の時間経過を通じて実質的に変わらなかった（データは示さない。）。
【０２０５】
これらのデータは、ＧＰＶＩ  Ｆａｂが血液学の生理状態に影響を及ぼさないことを立証する。
【０２０６】
７．ＧＰＶＩ受容体発現
図１３に示すように、抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂのｉｖ投与前、すべての血小板はＧＰＶＩ発現について陽性であった（投薬前）。薬物投与後に採取した血液では、ＧＰＶＩに対する特異的シグナルを血小板表面で観察することができなかった（２４時間）。薬物投与後４８時間の時点で開始して、新たな血小板集団が発生し、これらはＧＰＶＩ陽性である。薬物投与の１５０時間後、すべての血小板はＧＰＶＩ受容体発現に対して再び陽性であった。
【０２０７】
この実験は、ＧＰＶＩ  Ｆａｂが血小板上のＧＰＶＩ受容体枯渇を誘導することおよびこの効果が可逆的であったことを確証する。
【０２０８】
［実施例５］
自己抗体による認識によるＦａｂフラグメント特性の修飾
Ａ  ドナー血漿における活性化性成分の判定
抗ＧＰＶＩ  Ｆａｂの活性化性効果にとっての血漿中に存在するＩｇＧの重要性を調査するために、５１の異なる血液試料を試験した。活性化性と同定された試料のＩｇＧを、プロテインＡを使用して枯渇させた。
【０２０９】
これらの実験については、血液を２０μｇ／ｍＬヒルジンで抗凝固剤処置し、血漿の調製（１０分間、１６００ｇでの血液試料の遠心分離）に直ちに使用した。その後、プロテインＡを使用して４℃で２時間、血漿のＩｇＧを枯渇させた。プロテインＡを遠心分離によって除去し、血小板を２×１０Ｅ８／ｍＬの最終濃度で添加した。抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントを２０μｇ／ｍＬで使用した。血漿試料をＦａｂフラグメントまたはコンブルキシン（または「ｃｖｘ」、ＧＰＶＩ特異的アゴニスト）と共に１５分間インキュベートし、その後、ＦＩＴＣ標識Ｐａｃ−１抗体（血小板活性化マーカーである、活性化ＧＰＩＩｂＩＩＩａに特異的）で３０分間、染色した。その後、パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）で血小板のＰａｃ−１標識を判定した。
【０２１０】
図１４からわかるように、対照パネルに関して、プロテインＡでの血漿の処置は、ＧＰＶＩ特異的アゴニストコンブルキシン（ｃｖｘ）による血小板活性化に対して影響を及ぼさなかった。しかし、図１４、パネルＡは、ＩｇＧ枯渇後にＦａｂの活性化性効果が大きく低減されたことを示しており、既形成ＩｇＧがこの応答にとって不可欠な成分であることを示唆している。
【０２１１】
Ｂ  修飾抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメント曝露（ｅｘｐｏｓｅｒ）後の血小板活性化マーカーの発現の判定
Ｆａｂによる血小板活性化の活性化に関する血漿ＩｇＧの役割をさらに調査するために、重および軽鎖（ＨＣおよびＬＣ）配列は同一であるが重鎖のＣ末端修飾が異なる種々のＦａｂフラグメントを使用した。
【０２１２】
使用した４つの異なる分子を下で説明し、図１５に図示する。
【０２１３】
Ｆａｂ：ＨＣ上に追加のＣ末端アミノ酸のない対照分子（図１５Ａ）
Ｆａｂ−Ｈｉｓタグ：Ｃ末端Ｈｉｓタグを加えた自然に存在する配列に相当する、ＨＣ上にＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓペプチド配列（配列番号：３５）を有するもの（図１５Ｂ）
Ｆａｂ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒ：Ｃ末端Ｇｌｙ４Ｓｅｒタグを加えた自然に存在する配列に相当する、Ｈｃ上にＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒペプチド配列（配列番号：３６）を有するもの（図１５Ｃ）
Ｆａｂ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２：Ｃ末端（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２タグを加えた自然に存在する配列に相当する、Ｈｃ上にＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒペプチド配列（配列番号：３６）を有するもの（図１５Ｃ）
【０２１４】
図１４、パネルＢに図示するように、修飾Ｆａｂは、ＩｇＧ枯渇がなかったとしても、活性化性のものを一切誘導せず、このことは、修飾Ｆａｂが既形成ＩｇＧによって認識されないことを示唆する。
【０２１５】
これらの実験については、血液を２０μｇ／ｍＬヒルジンで抗凝固剤処置し、直ちに使用した。抗ＧＰＶＩ−Ｆａｂフラグメントを２０μｇ／ｍＬで使用した。血液試料（１−５１）をＦａｂフラグメントと共に１５分間インキュベートし、その後、ＦＩＴＣ標識Ｐａｃ−１抗体（血小板活性化マーカーである、活性化ＧＰＩＩｂＩＩＩａに特異的）で３０分間染色した。その後、パラホルムアルデヒドを使用して試料を固定し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）で血小板のＰａｃ−１標識を判定した。
【０２１６】
４Ｆａｂ形式の活性化性潜在能力を５１の異なる血液試料に関して試験した。オーバーハングを有さないＦａｂは、２３試料（４２％に相当する。）においてＰａｃ−１結合の有意な増加（＞５倍と定義する。）を誘導した。対照的に、下の表１９からわかるように、ＨＣのＣ末端が修飾されたＦａｂのほうがこの試験でははるかに活性が低く、Ｆａｂ−ＨｉｓタグおよびＦａｂ−Ｇｌｙ４Ｓｅｒは、１つの試料でしか活性を示さず、Ｆａｂ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（最長Ｃ末端伸長）は、閾値を超えて活性でなかった。この差別的活性化性パターンは、小さな活性化（基礎値に対して２−５倍）の場合にも反映される。これらの結果は、活性化がＨＣ鎖のＣ末端修飾によって大きく低減されたので、このアッセイにおけるＦａｂフラグメントの活性化性潜在能力が抗原結合ＣＤＲ配列によって決定されるのではなくＨＣ  Ｃ末端に存すると考えられることを示した。従って、これらの結果は、ＦａｂのＣ末端先端部が患者の血液中に既存するＩｇＧによって認識されたこと、この認識によって血小板活性化が誘導されることを示唆している。
【０２１７】
【表１９】
0005843783.tif 000020
0005843783.tif 000021
0005843783.tif 000022
【図１Ａ】
0005843783.tif 000023
【図１Ｂ】
0005843783.tif 000024
【図２】
0005843783.tif 000025
【図３】
0005843783.tif 000026
【図４】
0005843783.tif 000027
【図５Ａ】
0005843783.tif 000028
【図５Ｂ】
0005843783.tif 000029
【図５Ｃ】
0005843783.tif 000030
【図６】
0005843783.tif 000031
【図７Ａ】
0005843783.tif 000032
【図７Ｂ】
0005843783.tif 000033
【図７Ｃ】
0005843783.tif 000034
【図７Ｄ】
0005843783.tif 000035
【図７Ｅ】
0005843783.tif 000036
【図７Ｆ】
0005843783.tif 000037
【図８】
0005843783.tif 000038
【図９】
0005843783.tif 000039
【図１０Ａ】
0005843783.tif 000040
【図１０Ｂ】
0005843783.tif 000041
【図１１】
0005843783.tif 000042
【図１２Ａ】
0005843783.tif 000043
【図１２Ｂ】
0005843783.tif 000044
【図１２Ｃ】
0005843783.tif 000045
【図１２Ｄ】
0005843783.tif 000046
【図１２Ｅ】
0005843783.tif 000047
【図１３Ａ】
0005843783.tif 000048
【図１３Ｂ】
0005843783.tif 000049
【図１３Ｃ】
0005843783.tif 000050
【図１３Ｄ】
0005843783.tif 000051
【図１３Ｅ】
0005843783.tif 000052
【図１４】
0005843783.tif 000053
【図１５】
0005843783.tif 000054
【図１６】
0005843783.tif 000055
【配列表】
0005843783000001.app