(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ燃料または潤滑剤のための脂質を製造するための方法であって、前記方法が、
ストレプトマイセス属のバクテリア細胞を、有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培地中で培養すること、および
細胞からまたは培養培地から脂質を回収すること
を含み、前記培養培地が滅菌されていない、または、低温殺菌されている方法。
【請求項２】
前記有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物が、培養培地中の炭素および／または栄養の主要源である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記有機性廃棄物または残渣が、産業有機性廃棄物もしくは残渣、農業有機性廃棄物もしくは残渣、一般廃棄物または微生物廃棄物もしくは残渣、またはそれらの任意の混合物を含む請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記培養培地が、追加の炭素源としてグリセロール、製糖業もしくはでんぷん産業からの画分、液糖または水あめまたは精製糖、またはそれらの任意の混合物を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも１ｇ／リットルである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも５ｇ／リットルである請求項１〜４のいずれか１項に５載の方法。
【請求項７】
製造される脂質が主にトリアシルグリセロールを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
製造される脂質がバイオディーゼルを製造するためにエステル交換されるかまたは、再生可能なディーゼルを製造するために水素処理される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地がリパーゼ阻害剤を含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
培養が回分または流加回分発酵として行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ストレプトマイセス種が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  リジカスの群より選択される請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ストレプトマイセス宿主が、脂質合成経路の少なくとも１つの遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ストレプトマイセス宿主が、ＤＧＡＴ（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ストレプトマイセス宿主が、
（ａ）配列番号１に記載のｓｃｏ０９５８遺伝子および／または配列番号２に記載のｓｃｏ５８８８遺伝子、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列であって、かつ、脂肪酸生合成に関与するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよび／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ストレプトマイセス宿主が、抗生物質の産生不全とされる請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
脂質製造のためのストレプトマイセス培養物であって、前記培養物が、
（ａ）ストレプトマイセス属であるバクテリアの個体群、および
（ｂ）有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培養培地であって、滅菌されていない、または、低温殺菌されている培養培地
を含む培養物。
【請求項１７】
前記有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物が、培養培地中の炭素および／または栄養の主要源である請求項１６記載の培養物。
【請求項１８】
使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも１ｇ／リットルである請求項１６または１７記載の培養物。
【請求項１９】
使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも５ｇ／リットルである請求項１６または１７記載の培養物。
【請求項２０】
製造される脂質画分が主にトリアシルグリセロールを含む請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２１】
前記培養培地がリパーゼ阻害剤を含む請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２２】
ストレプトマイセス種が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  リジカスの群より選択される、好ましくはストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンスおよびストレプトマイセス  ミルベマイセニウスの群より選択される請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２３】
ストレプトマイセス宿主が、脂質合成経路の少なくとも一つの遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２４】
ストレプトマイセス宿主が、ＤＧＡＴ（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２５】
ストレプトマイセス宿主が、
（ａ）配列番号１に記載のｓｃｏ０９５８遺伝子および／または配列番号２に記載のｓｃｏ５８８８遺伝子、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列であって、かつ、脂肪酸生合成に関与するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよび／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２６】
ストレプトマイセス宿主が、抗生物質産生不全である請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の培養物。
【請求項２７】
ＤＧＡＴ活性（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子、または、
配列番号３または配列番号４に対し少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であって、かつ、遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じ機能をもたらすヌクレオチド配列
を発現し、かつ抗生物質産生不全であるように遺伝子組み換えされているストレプトマイセス宿主。
【請求項２８】
宿主細胞が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、ストレプトマイセス  リジカスおよびストレプトマイセス  ミルベマイセニウス種の群より選択される、好ましくはストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  アルブス種の群より選択される請求項２７記載の宿主。
【請求項２９】
前記宿主が、
（ａ）配列番号１に記載のｓｃｏ０９５８遺伝子および／または配列番号２に記載のｓｃｏ５８８８遺伝子、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも９０％の同一性を示すアミノ酸配列であって、かつ、脂肪酸生合成に関与するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼおよび／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている請求項２７または２８記載の宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ燃料または潤滑剤適用のための脂質製造のための方法および前記方法において使用可能な微生物菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料の製造のための再生可能な生物材料の使用は、一般的に気候変動への影響を低減すること、燃料の供給を確保することおよび経済的要因によって動機づけられる。しかしながら、増加する人口のため食用の作物をさらに精製して食料とする代わりの、燃料を製造するためのそれらの使用は、倫理的にますます短命なものとなっている。したがって、ヒトやウシに供給するためには使用できず、かつ、環境に優しい方法で製造され得る生物源が興味の対象として高まりつつある。
【０００３】
ＢＣＣリサーチ（BCC Research)（http://www.bccresearch.com/）は液体のバイオ燃料の世界市場が、２００８年において３０３億ドルの価値があったと見積もっている。これは、２０１３年には４２８億ドルに増加するとされ、年平均成長率（ＣＡＧＲ）は７．２％である。市場への別の視点は、その量である。２００８年では、欧州連合の研究報告において考察された２１カ国にわたるバイオ燃料の製造能力は、合計でバイオディーゼル１０９億リットル、およびバイオエタノール６６６億リットルであった。この産出の９９％以上が、糖類およびでんぷんをベースとしたバイオエタノールならびに油糧種子および廃棄物オイルをベースとしたバイオディーゼルの両方を含む、いわゆる第一世代バイオ燃料であると考えられる。バイオディーセルは油糧種子作物、動物性脂肪から、または再生油脂から作られ得る。藻類および一部の微生物が脂質を産生および／または蓄積する能力を有していることが知られているので、バイオディーゼルのためのオイル源としてのそれらの使用もまた提案されてきた。これらの微生物ベースのオイルは、しばしば単細胞油脂（single cell oils）と称される。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ２００８およびＳｔｒｏｂｅｌら２００８は、バイオ燃料を精製するための脂質および脂肪酸の収率を最大とするための種々のタイプのバイオリアクターにおける藻類および菌類の培養条件の最適化について記載している。
【０００４】
脂質の光合成による産生の代替の選択肢は、有機分子（たとえば糖類など）から光を必要とせずに脂質を製造する従属栄養微生物を利用することである。従属栄養微生物を使用する単細胞油脂製造方法は、通気したバイオリアクター中で微生物を培養すること、脂質を蓄積させること、脂質に富んだ細胞を採取すること、および、細胞からオイルを回収することを含む（Ｒａｔｌｅｄｇｅら、２００５、Ｍｅｎｇら、２００９）。
【０００５】
単細胞油脂は、従来、汎用化学製品としてではなく、たとえば健康食品中などの特別な製品として使用されてきた。このような単細胞油脂製造方法においては、生産量は比較的少量であり、そして、製品は高価である。したがって、これら方法の費用構造は、高価な供給原料および単位操作の使用を可能にする。同様の製造方法がまた、バイオディーゼル製造のための脂質の製造について記載されている（ＲａｔｌｅｄｇｅおよびＣｏｈｅｎ，２００８；Ｍｅｎｇら２００９）。しかしながら、製品が安価な汎用化学製品である場合、単位原価は特別な製品の単位原価のレベルにあるべきではない。さらに、従属栄養微生物による脂質の収率は通常非常に低く、供給された糖質の２０重量％未満である（ＲａｔｌｅｄｇｅおよびＣｏｈｅｎ，２００８）。
【０００６】
従属栄養微生物による脂質産生における使用のためのより安価な原料がいくつかの最近の特許文献において提案されてきた。国際公開第２００９／０３４２１７号は、パラフィン、脂肪酸およびアルコールを廃棄物材料および微生物によって製造するための発酵方法を記載している。国際公開第２００９／０４６３７５号は、バイオマス由来の多糖類の単糖類またはオリゴ糖への転換、ならびに、唯一の炭素源として多糖類上で微生物が増殖できるようにする外来遺伝子を含む組み換え微生物を使用することによりそれらをバイオ燃料へと変換することを提案している。米国特許出願公開第２００９／００６４５６７号明細書は、主要な炭素源としてセルロースを含むフィードストックを用いることによってストラメノパイル界の微生物を培養することによる、従属栄養発酵による生物学的オイルの製造を開示している。国際公開第２００９／０１１４８０号は、微細藻類および菌類による脱重合されたセルロース系材料からの生物学的オイルの製造を開示する。米国特許出願公開第２００９／０１４８９１８号明細書は、炭素源としてグリセロール上で微細藻類を培養することによる脂質製造の方法を開示する。また、国際公開第２００９／００９３９１号は、初めにアルコール組成物を製造しそして、脂肪酸エステル産生宿主にそれを提供することによる脂肪酸エステルの製造を開示する。国際公開第２００９／０６３１３８号は、有機材料を水、酸またはアルカリおよび破砕によって処理するための方法を記載している。沈殿物およびろ液が分離され、そして、脂質産生微生物のための培養培地中で脂質製造のために使用される。
【０００７】
バイオ燃料にとって単細胞油脂の製造の経済性は極めて重要なものであるので、バイオ燃料製造のための脂質製造のための、新規な、費用効率の高い方法が依然として関心を集めている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明のある目的は、バイオ燃料のためまたは潤滑剤適用のための脂質を製造するための費用効率の高い方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記方法において使用可能である新規の微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書中に記載される発明は、ある局面において、特にはバイオ燃料のためまたは潤滑剤適用のための、脂質を製造するための方法を提供する。本発明は、ストレプトマイセス属（Streptomyces）菌が、有機性廃棄物および／または残渣を含む培地上で効果的に脂質を産生することができるという発見に基づいている。
【００１１】
前記方法は、ストレプトマイセス属の細菌細胞を有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培地中で培養することを含む。前記方法は、細菌の細胞からまたは培養培地からの脂質の回収を含む。脂質またはその画分はバイオ燃料および／または潤滑剤として、またはバイオ燃料および／または潤滑剤製造のための出発材料として有用である。
【００１２】
本発明の種々の実地態様において、培養培地は、たとえば農業などの産業からの有機性廃棄物または残渣、一般廃棄物、または微生物残渣を含んでいても良い。
【００１３】
さらに、培養培地は、たとえばグリセロールまたは製糖業もしくはでんぷん産業からの画分などの追加の炭素源を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明のある実施態様において、前記方法は滅菌されていない培養培地を使用することができる。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、前記方法は低温殺菌された培養培地を使用してもよい。
【００１６】
本発明のいくつかの実施態様において、培養培地はリパーゼ阻害剤を含んでいてもよい。リパーゼ阻害剤は工程において生成されるアシルグリセロールの加水分解または脂質の分解を遅らせる、または、妨げるために使用され得る。
【００１７】
本発明のある実施態様において、培養は回分発酵として行われる。
【００１８】
本発明の別の実施態様において、培養は流加回分発酵として行われる。
【００１９】
本明細書中に開示されるように、前記方法は、主にＴＡＧｓ（トリアシルグリセロール）を含む脂質を産生する。典型的には使用済み培養培地中のＴＡＧｓの量は少なくとも培地１リットルあたり１ｇである。
【００２０】
種々のストレプトマイセス種が本発明において使用され得る。前記種は、好ましくは以下を含む群より選択され得る、より好ましくは以下の群より選択され得る種を含む；ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）、ストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス  アルブス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス  ピウセチウス（Streptomyces peucetius）、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）、ストレプトマイセス  リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス  セリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）、ストレプトマイセス  エバミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス（Streptomyces milbemycenius）およびストレプトマイセス  リジカス（Streptomyces lydicus）。
【００２１】
ストレプトマイセス株は、好ましくは以下を含む群より選択され得る、より好ましくは以下の種の群より選択され得る株を含む；ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス（Streptomyces albus）  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス（Streptomyces peucetius）  Ｄ２、ＧＡＬ４０８２、ストレプトマイセス  ピウセチウス（Streptomyces peucetius）  Ｐ５５  ＧＡＬ４０８１、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens）  ＧＡＬ１００４、ストレプトマイセス  リビダンス（Streptomyces lividans）  ＧＡＬ１００２、ストレプトマイセス  セリカラー（Streptomyces coelicolor）  ＧＡＬ１００３、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）  ＧＡＬ４０５１、ストレプトマイセス  エバミティリス（Streptomyces avermitilis）  ＧＡＬ１００６、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス（Streptomyces milbemycenius）  ＧＡＬ４２１１およびストレプトマイセス  リジカス（Streptomyces lydicus）  ＧＡＬ１００７。
【００２２】
本発明の方法における有利な点は、生物活性な代謝産物を産生しないかまたは非常に少量しか産生しないストレプトマイセス種または株にある。
【００２３】
本発明のある特定の実施態様においては、ストレプトマイセス種または株は生物活性な代謝産物を産生しないようにされ得る。生物活性な代謝産物の例としてはたとえば、ダプトマイシンもしくはミルベマイシンなどの例えばリポペプチド抗生物質または例えばダウノマイシンなどの化学療法剤といった抗生物質などが挙げられる。
【００２４】
少量の生物活性な化合物しか産生しない菌株または生物活性な化合物を産生しないようにされている菌株としては例えば、好ましくは以下を含む群より選択される菌株、より好ましくは以下の群より選択され得る菌株を含む菌株が挙げられる；ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス（Streptomyces roseosporus）  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス（Streptomyces griseus）  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス（Streptomyces albus）  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス（Streptomyces peucetius）  Ｐ５５  ＧＡＬ４０８１およびストレプトマイセス  ピウセチウス（Streptomyces peucetius）  Ｄ２  ＧＡＬ４０８２、ならびに、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス（Streptomyces milbemycenius）  ＧＡＬ４２１１。
【００２５】
ある局面において、本発明は、
（ａ）ストレプトマイセス属であるバクテリアの個体群、および（ｂ）有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培養培地
を含むストレプトマイセス培養物を提供する。
【００２６】
本発明の別の局面において、本発明は、効果的な脂質産生能力のある、新規の遺伝子組み換えストレプトマイセス宿主を提供する。
【００２７】
本発明の一実施態様において、ストレプトマイセス宿主細胞は、脂質生合成経路の少なくとも１つの遺伝子を発現するように遺伝子組み換えがなされていてもよい。特には、遺伝子はジアシルグリセロール  アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）をコードする遺伝子および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）をコードする遺伝子であってもよい。
【００２８】
本発明の一実施態様において、ストレプトマイセス宿主細胞は、以下を含む、好ましくは以下を含む群より選択される、より好ましくは以下の群より選択され得る一またはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えがなされてもよい；
（ａ）ｓｃｏ０９５８（配列番号１）および／またはｓｃｏ５８８８（配列番号２）、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）ストリンジェントな条件下、前記遺伝子または前記ホモログの少なくとも１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｄ）遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列、および／または
（ｅ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも６０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００２９】
特には、適切な遺伝子組み換え株は、以下を含む、好ましくは以下を含む群より選択される、より好ましくは以下の群より選択される菌株を含む株である；Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１２、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９。
【００３０】
本発明のある特定の実施態様において、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３およびＧ０１７の群より選択される新規のストレプトマイセス菌株が提供される。
【００３１】
さらなる一局面において、本発明は、脂質を産生するストレプトマイセスの任意の宿主細胞、培養物または菌株の使用、および、バイオ燃料および／または潤滑剤として、または、バイオ燃料および／または潤滑剤製造のための出発物質として脂質を使用することを提供する。
【００３２】
加えて、ある局面では、本発明は本開示による方法を使用することにより得られる製品を提供する。
【００３３】
本発明の方法により顕著な優位性が得られる。本明細書に提示される方法および微生物によって、バイオ燃料および／または潤滑剤のための、または、バイオ燃料および／または潤滑剤製造のための出発物質としての脂質を効果的に製造することが可能である。本発明の長所は以下にまとめられ得る。
【００３４】
本発明において、驚いたことに、ストレプトマイセスが有機性廃棄物および／または残渣を含む培地上で培養された場合に、多量の脂質を産生し得ることが発見された。とりわけ、廃棄物および／または残渣は安価であり、そして、使用前の前処理を必要としないかまたはほとんど必要としないため、炭素および／または栄養源としての有機性廃棄物および／または残渣の使用は培養培地のコストを低減する。廃棄物または残渣材料の成分は、それらが培養培地に添加される前に、必ずしも分離、加水分解（脱重合）、精製および／または滅菌される必要がない。
【００３５】
前記方法においてストレプトマイセスによって産生される脂質の収率は、培養培地中においてリパーゼ阻害剤を使用することによりさらに増加させることができる。リパーゼ阻害剤は、工程中に生成した、アシルグリセロールの加水分解または脂質の分解を遅らせる、または、妨げることができる。
【００３６】
本明細書中に記載される方法は、主にＴＡＧｓ（トリアシルグリセロール）を含む脂質を産生する。バイオ燃料製造のための化学処理に適した、好ましい化合物はＴＡＧｓである。
【００３７】
ストレプトマイセス種または株の、脂質産生のための効率は、種または株をたとえば抗生物質などの生物活性な代謝産物を産生しないようにすることによりさらに改良され得る。改変された宿主株は、生物活性な代謝産物を産生しない場合に、脂質を産生する能力をより有する。
【００３８】
脂質産生の効率は、脂質生合成経路の少なくとも１つの遺伝子を発現するように遺伝子組み換えがなされているかもしれない新規の遺伝子組み換えストレプトマイセス宿主を作製することによって、さらに増大され得る。
【００３９】
以下、本発明は詳細な説明を用いることによって、および、いくつかの実施例を参照することによって、より詳細に検討されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】工程スキームを示す図である。
【図２】Ｇ００９株のＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プロファイルを示す図である。
【図３】液体ＴＳＢ培地中でのＧ００９株の５日間の培養における固体および液体画分中の、ＰＭＶ、菌体量および脂質の分散の変化を示す図である。増殖サイクルは約３６時間であり、その後、細胞溶解が起こる。ＴＡＧｓの蓄積は、早い増殖期後直ちに、２４〜４８時間で起こる。
【図４】Ｇ００９による種々の培地中でのＴＡＧｓの蓄積例を示す図である。試料は左から右に、０、２、５および７日後のＥ０５−１４培地、０、２、５および７日間培養後のＥ０５−１５培地、標準ＣＯＤ（コレステロールオクタデカネート（Cholesterol octadecanat））、Ｃ（コレステロール（cholesterol））およびＧＴＭ（グリセリントリミリスタート（Glyceryl trimyristate））、０、２、５および７日後のＥ０５−１６培地、０、２、５および７日間培養後のＥ０５−１７培地である。
【図５】Ｇ０１７、Ｇ０１６、Ｇ０１３およびＧ０１１株による種々の培地中でのＴＡＧｓの蓄積例を示す図である。試料は左から右に、４０、２０、１０および５ｇ／Ｌの濃度のＧＴＭ標準、０、１、２および５日間培養後のＧ０１７の試料、２、３および６日間培養後のＧ０１６の試料、１、２、５および６日間培養後のＧ０１３の試料、２、３および６日間培養後のＧ０１１の試料である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
「バイオ燃料（biofuel）」は、主にバイオマスまたはバイオ廃棄物由来の、固体、液体またはガス状の燃料を意味し、そして、有史以前の微生物、植物および動物の有機的な遺物由来である化石燃料とは異なる。
【００４２】
ＥＵ指令（directive）２００３／３０／ＥＵに従えば、「バイオディーゼル（biodiesel）」は植物油または動物油から製造されるメチルエステルであって、バイオ燃料として使用されるディーゼル品質のものを意味する。より広義には、バイオディーゼルは、ディーゼル品質の、植物油または動物油由来の、たとえばメチル、エチルまたはプロピルエステルなどの、長鎖アルキルエステルを意味する。バイオディーゼルは微生物脂質からもまた製造されることができ、ここで微生物脂質は、バクテリア、菌類（イーストまたは糸状菌）、藻類またはその他の微生物起源であり得る。
【００４３】
「再生可能ディーゼル（renewable diesel）」とは、動物、植物もしくは微生物起源の脂質またはそれらの混合物の水素処理によって製造される燃料を意味し、ここで微生物脂質は、バクテリア、菌類（イーストまたは糸状菌）、藻類またはその他の微生物起源であり得る。再生可能ディーゼルはまた、ガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成によりバイオマスに由来するワックスから製造され得る。任意には、水素処理に加えて、異性化またはその他の処理工程が行われてもよい。再生可能ディーゼル製造方法はまた、ジェット燃料および／またはガソリンの製造に使用され得る。再生可能ディーゼルの製造は、欧州特許第１  ３９６  ５３１号明細書、欧州特許第１  ３９８  ３６４号明細書、欧州特許第１  ７４１  ７６７号明細書および欧州特許第１  ７４１  ７６８号明細書の特許文献に記載されている。
【００４４】
バイオディーゼルまたは再生可能ディーゼルは、鉱物油ベースのディーゼルと混合されてもよい。適切な添加物、たとえば防腐剤および酸化防止剤などが燃料製品に添加されてもよい。
【００４５】
「潤滑剤（lubricant）」とは、たとえばグリース、脂質またはオイルなどの、可動部への表面コーティングとして適用された場合に摩擦を減少させる物質を意味する。潤滑剤の他の２つの主な機能は、熱の除去および不純物を溶解させることである。潤滑剤の適用の例としては例えば、内燃エンジン内におけるエンジンオイルとしての使用、燃料中への添加物、例えばポンプおよび油圧装置などのオイル駆動機器における使用、または、種々のタイプの軸受部における使用などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。典型的には潤滑剤は、７５〜１００％のベースオイルを含み、そして、残りは添加物である。適切な添加物としては例えば、界面活性剤、貯蔵安定剤、酸化防止剤、腐食防止剤、曇り防止剤、抗乳化剤、消泡剤、共溶媒および潤滑性添加物（たとえば米国特許第７，６９１，７９２号明細書などを参照のこと）が挙げられる。潤滑剤のためのベースオイルは鉱物油、植物油、動物油起源、または、バクテリア、菌類（イーストまたは糸状菌）、藻類またはその他の微生物起源であり得る。ベースオイルはまた、バイオマスに由来するワックスからガス化およびフィッシャー−トロプシュ合成により生じ得る。粘度指数がベースオイルを特徴付けるために使用される。典型的には高い粘度指数が好ましい。
【００４６】
用語「脂質（lipid）」とは、脂肪性物質であって、その分子が一般的に、その一部として、脂肪族炭化水素鎖を含み、非極性有機溶媒に溶解するが水には溶解しにくい物質を意味する。脂質は生体細胞における巨大分子の不可欠な一群である。脂質としては例えば、脂肪、オイル、ワックス、ろうエステル、ステロール、テルペノイド、イソプレノイド、カロテノイド、ポリヒドロキシアルカノエート、核酸、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびアシルグリセロールが挙げられる。
【００４７】
用語「アシルグリセロール」とは、グリセロールおよび脂肪酸のエステルを意味する。アシルグリセロールは天然に脂肪および脂肪油として存在する。アシルグリセロールの例としては例えば、トリアシルグリセロール（ＴＡＧｓ、トリグリセリド）、ジアシルグリセロール（ジグリセリド）およびモノアシルグリセロール（モノグリセリド）が挙げられる。
【００４８】
本発明は、炭素および／または栄養源としての有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を含む培養培地を使用した、ストレプトマイセスによる脂質の効率的な製造のための方法に関する。加えて、培養培地は、典型的には前記微生物を培養する際に使用される例えば無機塩などの他の成分を含んでいてもよい。培養は脂質産生に適切な条件下行われる。培養は典型的には、攪拌およびエアレーションを使用することにより発酵槽中で行われる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施態様においては、有機性廃棄物または残渣は、唯一のまたは主な炭素および／または栄養源として使用されてもよく、または、いくつかの実施様態においては、補充物（supplement(s))として使用されてもよい。廃棄物または残渣は、一またはそれ以上の種々の廃棄物または残渣またはそれらの混合物を含んでいてもよい。
【００５０】
廃棄物または残渣が培地中の「主な炭素および／または栄養源（main source of carbon and/or nutrient）」である場合、それは重量に基づいて、廃棄物の量が培地中において、培地中の純粋な成分（すなわち糖類）の量よりも多いことを意味する。
【００５１】
廃棄物または残渣画分が「補充物として（as a eupplement）」使用される場合、それは重量に基づいて、廃棄物または残渣画分の量が培地中において、培地中の純粋な成分（すなわち糖類）の量よりも少ないことを意味する。
【００５２】
本発明により、驚くべきことに、ストレプトマイセス属バクテリアが廃棄物および／または残渣材料上で培養された場合に多量の脂質および特にはトリアシルグリセロール（ＴＡＧｓ）を蓄積することが発見されたのである。
【００５３】
ストレプトマイセス属のバクテリアは、医薬産業においては良く知られている。ストレプトマイセスが低分子、有用な酵素およびその他の様々な代謝物を一次および二次代謝によって産生することが知られている。これらのバクテリアをモデル生物として使用して様々な状況における方法が開発されてきているため、典型的には、好気性発酵工程が様々なストレプトマイセス種に適している。先行技術の製造方法においては、ストレプトマイセスは典型的には、例えば抗生物質などの産業的に有用な代謝物の蓄積を促進するために混合培地中で培養される。これらの発酵工程のコストは材料および精製コストによって大きく影響される。発酵を汚染物質のない状態に維持するために必要とされる滅菌は、非常にエネルギーを消費し、かつ、滅菌のコストは高い。また、大量の抗生物質を製造する際、それらは大きな、かつ簡略な発酵タンク中で製造されるにもかかわらず、培地の滅菌のために必要とされるエネルギーが製造方法における主たる価格区分を形成する。
【００５４】
本発明において、驚くべきことに、ストレプトマイセスが、廃棄物および残渣材料上で培養された場合に多量の脂質を産生することができることが発見された。廃棄物または残渣材料の成分が、それらが培養培地に添加される前に、必ずしも分離、加水分解（脱重合）、精製および／または滅菌される必要がないことは注目に値する。これゆえ、いくつかの実施態様では、廃棄物材料はいかなる分離、加水分解（機械的、化学的または酵素的）、精製または滅菌もなしに培養培地に添加され得る。例えば、リグノセルロース系材料が多糖類の加水分解（脱重合）なしに培養および脂質産生に使用され得る。他の実施態様において、それは粗製の形で、すなわちいくつかの予備的な精製を含むが、成分を分離するために精製はされていない形で添加されてもよい。さらに、廃棄物または残渣はそのままで添加されてもよく、また、材料の構造に依存して、すり砕かれたまたはすりつぶされた形で培養培地に添加されてもよい。廃棄物および／または残渣はまた、部分的にまたは完全に、精製され、分離されおよび加水分解（脱重合）された形で、ストレプトマイセスによる脂質産生のために使用されてもよい。
【００５５】
本開示において、「有機性廃棄物または残渣（organic waste or residue）」とは、特には廃棄物材料であって、その成分が、全くまたは少なくとも完全には、分離され、加水分解（脱重合）されおよび／または精製されていない廃棄物材料を意味する。成分の分離、加水分解（脱重合）および／または精製なしの廃棄物または残渣材料の使用は、本発明の製造方法を純粋な成分の使用と比較してよりコスト効率の良いものとする。しかし、本発明のいくつかの実施様態においては、純粋な成分が、廃棄物材料に加えて炭素源として培養培地中で使用され得る。
【００５６】
「有機性廃棄物または残渣を含む、非滅菌の有機性廃棄物または残渣または培養培地（non-sterile organic waste or residue or cultivation medium comprising organic waste or residue）」とは、特には滅菌されていない廃棄物または残渣材料または培地を意味する。いくつかの実施態様において、廃棄物材料または培地は低温殺菌され得る。
【００５７】
滅菌とは、典型的には廃棄物または残渣材料を含む廃棄物または残渣材料または培養培地が高温で、通常は１２１℃、またはより高い温度で、少なくとも１５分間、または少なくとも２０分間、典型的には１２１℃で少なくとも２０分間処理されることを意味する。
【００５８】
「低温殺菌（pasteurization）」とは、廃棄物または残渣材料を含む廃棄物または残渣材料または培地の６０℃〜７５℃での２〜３０分間の加熱を意味する。本明細書中で記載されるように、２００ｇ／Ｌまでの高い含有量の廃棄物または残渣画分を用いてでさえも、ＴＳＡ（トリプトソイ寒天）で生体細胞または芽胞は検出されなかった。滅菌培地の代わりに低温滅菌された培地が使用された培養において、ストレプトマイセスの増殖に差異は認められなかった。培養培地は有機性廃棄物または残渣またはそれらの組み合わせを純粋な栄養素とともに含み得る。
【００５９】
本発明のいくつかの実施態様において、有機性廃棄物または残渣を含む培養培地は、そのままで使用されてもよく、いくつかの実施態様ではいかなる方法による滅菌もなしで、または低温殺菌なしで使用され得る。「非滅菌（non-sterile）」とは、これらの実施態様において、廃棄物または残渣材料を含む培養培地がいかなる方法でも滅菌されていないことを意味する。
【００６０】
本開示において、廃棄物または残渣材料を含む廃棄物または残渣材料または培地は、滅菌されておらず、特には例えば１２１℃などでの高温で滅菌されていないが、または低温滅菌される。
【００６１】
本開示において、「有機性廃棄物または残渣（organic waste or resideu）」とは特には農業を含む産業からの廃棄物または残渣、一般廃棄物または微生物残渣を意味する。このような廃棄物または残渣は典型的には、（ｉ）ヒトまたは動物のための食料として使用されない、および（ｉｉ）大量に（典型的には、世界的に年率で数千、数百万トンで）生成される。産業からの有機性廃棄物の多くのグループがこれらの基準を満たす。「有機性廃棄物または残渣」とは生物学的に分解性である任意の廃棄物または残渣材料または画分を意味する。
【００６２】
産業廃棄物または残渣は、臓物残渣、例えば製パン業から、例えば麦芽汁（mash）、麦芽エキスなど醸造所から、例えば臓物残渣、肉もしく魚の残屑など畜殺場から、例えば甜菜パルプなど製糖業からなどの食料または飼料製造からの有機性廃棄物または残渣、または、木材由来のセルロース系もしくはリグノセルロース系材料または残渣、または、例えばふすま、もみ殻、わら、茎、サトウキビバガスなどの穀物残渣、もしくは、セルロース系作物、スイッチグラス（switchgrass）、リードカナリーグラス（reed canary grass）、ススキ（Miscanthus）、ファイバーソルガム（fiber sorghum）、ファイバーケイン（fiber cane）などの他の植物といったなどの農業残渣、または、例えばコーンスティープリカー（corn steep liquor）（ＣＳＬ）などの植物残渣、または、例えばバイオディーセル製造からなどのグリセロールを含んでいてもよい。
【００６３】
一般廃棄物は、都市汚泥、古紙、事業用キッチンもしくは家庭からのバイオ廃棄物、菜園の有機性廃棄物または食糧生産の有機廃棄物を含み得る。
【００６４】
微生物廃棄物は、例えば微生物の使用に基づく工業的処理からの微生物細胞または細胞片（例えば乳酸桿菌（lactobacilli）、ストレプトマイセスなど）、または、藻類片（例えばフェオダクチラム（Phaeodactylum）、クロレラ（Chlorella）、ドナリエラ（Dunaliella）、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）など）を含み得る。
【００６５】
好ましい廃棄物または残渣は、農業からのリグノセルロース系廃棄物または残渣およびセルロース系（エネルギー）作物を含むパルプおよび製紙工業の工程からの廃棄物または残渣である。
【００６６】
好ましい廃棄物または残渣はまた、事業用キッチンからまたは食料もしくは飼料工業からのバイオ廃棄物である。
【００６７】
好ましい廃棄物または残渣はまた、微生物廃棄物または残渣であり、特には藻類またはバクテリアの廃棄物または残渣である。有機性廃棄物または残渣材料とは特には、ストレプトマイセスが増殖のためおよび／または脂質産生のために使用できる任意の有機性廃棄物または残渣を意味する。
【００６８】
本発明のいくつかの実施態様において、有機性廃棄物または残渣は、例えばグリセロール、製糖業またはでんぷん産業からの画分、液糖または水あめまたは精製された砂糖またはそれらの任意の混合物などの付加的な炭素源で補充されてもよい。より具体的には、有機性廃棄物または残渣は、例えば液糖、水あめ、グルコース（デキストロース）シロップまたは糖液などの製糖業またはでんぷん産業からの粗生成物で補充されてもよい。さらに、廃棄物は、例えばグルコース、フラクトース、マンノース、キシロースもしくはアラビノースなどの精製されたＣ６またはＣ５糖類、例えばサクロースもしくはラクトースなどの糖類二量体、または、セルロース、でんぷんもしくはキシランなどの糖ポリマーの単一物または混合物で補充されてもよい。製糖業もしくはでんぷん産業からの補充物またはその他の精製糖の使用は、ストレプトマイセスの増殖および／または脂質の蓄積を増加および促進するかもしれない。
【００６９】
有機性廃棄物または残渣なる用語はまた、用語「廃棄物または残渣画分（waste or residue fraction）」を包含する。用語「廃棄物または残渣画分」とは、例えば、副（分岐）生成物として製造される廃棄物または主製品として他の製品を製造する工業的工程からの副（分岐）生成物を意味する。
【００７０】
本発明の範囲において、有機性廃棄物または残渣の使用は単独または任意の組み合わせまたは混合物である。
【００７１】
培養における脂質の蓄積に関し、廃棄物または残渣と水あめまたは液糖とを１０／１から１／２までの比で、好ましくは５／１から１／１までの比で使用することが有利である。例えば、脂質の良好な蓄積が、１０〜５０ｇ／Ｌの廃棄物を１０ｇ／Ｌの液糖とともに含む培養物中で見られた。
【００７２】
さらに、本明細書中で記載されるように、工業的廃棄物または残渣材料を、例えば細胞片などの微生物残渣で補充することは細胞増殖にとって有益である。本明細書中で記載されるように、良好な増殖が、例えば細胞片、特にはバクテリアからのまたは藻類由来の細胞片が、例えばＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機性廃棄物材料および／または培地補充物としてのファルマメディア（Farmamedia）と共に使用された培養物中で見られた。例えば、ストレプトマイセスまたは乳酸桿菌からのバクテリア片および／またはフェオダクチラム、クロレラ、ドナリエラおよびナンノクロロプシスからの藻類片が本発明において使用され得る。本発明による、細胞増殖に有益な別の補充物はソヤである。
【００７３】
でんぷんは脂質の蓄積に有利である。しかしながら、もしでんぷんが、例えばバガス、ふすま、もみ殻またはわらなどの農業残渣によって置換されるならば経済的に有益である。藻類または微生物細胞または例えばバクテリアもしくは藻類片などの残渣、バイオ廃棄物、肉、ＣＳＬ、ＯＶＲ（穀物（大麦）タンパク質飼料）、ミンクフィード（mink feed）および／または臓物が、例えば酵母抽出物、ファルマメディアおよび／またはソヤなどの、ストレプトマイセスの発酵において典型的に有用であるタンパク質ベースの成分を置換することができる。
【００７４】
培養培地において、広範囲の廃棄物または残渣が使用され得る。いくつかの実施態様においては、培養培地中の廃棄物または残渣の量は、１ｇ／Ｌから４００ｇ／Ｌまで、典型的には２ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌまで、いくつかの実施態様では２０から１５０ｇ／Ｌまで、いくつかの他の実施態様では５０から１００ｇ／Ｌまで異なり得る。ストレプトマイセスは増殖に廃棄物画分を効果的に使用することが発見され、そして、脂質の蓄積は純粋な栄養素を使用した培養と比較して同様であることが判明した。
【００７５】
本明細書中で記載されるように、微生物細胞の増殖は、充填菌糸体積（Package Mycelia Volume (ＰＭＶ))、菌体量変化（cell mass changes）、平板培養（plating）、顕微鏡検査および視覚分析を使用して調べられた。
【００７６】
高密度の細胞増殖がいくつかの廃棄物画分で得られた。様々な実施態様において、それは乾燥菌体量として１〜２００ｇ／Ｌまで、典型的には１０〜１３０ｇ／Ｌまでさまざまである。
【００７７】
いくつかの廃棄物画分でのＰＭＶ値は、標準的な培養条件下（２８℃、１５０ｒｐｍ）、１％から８０％まで、典型的には６％から４０％までさまざまである。
【００７８】
しかしながら、より高い細胞密度でさえも発酵条件を適宜調節することにより得られ得ることは明らかである。一方、菌体量は蓄積される脂質の量と直接的に相関するわけではない。
【００７９】
純粋な成分と組み合わせた廃棄物材料の使用もまた、本発明の範囲内である。
【００８０】
加水分解された、または部分的に加水分解された（脱重合された）有機性廃棄物または残渣が、本発明において使用可能である。廃棄物または残渣は、（熱）機械的、化学的または酵素的加水分解によって加水分解され得る。例えば、廃棄物または残渣材料は、粗成分を消化するために適切な酵素によって処理され得る。適切な酵素は例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラーゼおよびペクチナーゼなどである。また、消化酵素機能および脂質を蓄積することのできる能力の両方を有するストレプトマイセスが、本発明において使用され得る。したがって、廃棄物の処理は必ずしも必要ではない。例えば、この目的のために適切な菌株として、Ｓ．ロゼオスポラスおよびＳ．アルブス種が挙げられる。
【００８１】
回分培養、流加回分培養および連続培養が本発明の範囲内である。
【００８２】
原料（炭素および／または栄養源）として固体または半固体の物質を使用する培養において、バイオマスは、培養を始めた最初の数日間は微生物による原料の利用のため減少し、その後数日間で増加していくかもしれない。
【００８３】
本発明のいくつかの実施態様において、ストレプトマイセスは、培養物から得られるクロロホルム抽出物の乾燥重量により見積もって、使用済み培養培地１リットル当たりで少なくとも０．１ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．５ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５ｇ／Ｌ、いくつかの実施態様では少なくとも１０ｇ／Ｌ、典型的には５〜３０ｇ／Ｌ、いくつかの他の実施態様では１０〜２５ｇ／Ｌ、クロロホルム抽出物の乾燥重量として見積もって１５０ｇ／Ｌまでの脂質を産生する。いくつかの実施態様においては、使用済み培養培地１リットル当たり１〜２００ｇ／Ｌの範囲で様々であり、典型的には５〜１００ｇ／Ｌである。
【００８４】
本発明のいくつかの実施態様において、ＴＡＧｓの濃度（力価（titre））は、一般的に、使用済み培養培地に対し少なくとも０．１ｇ／Ｌ（０．１ｋｇ／１０００Ｌ）、好ましくは少なくとも０．５ｇ／Ｌ（０．５ｋｇ／１０００Ｌ）、より好ましくは少なくとも１ｇ／Ｌ（１ｋｇ／１０００Ｌ）、さらにより好ましくは少なくとも５ｇ／Ｌ（５ｋｇ／１０００Ｌ）である。これは、使用済み培養培地に対し０．５〜１５０ｋｇ／１０００Ｌ、いくつかの実施態様では１〜１００ｋｇ／１０００Ｌ、いくつかの他の実施態様では１〜７０ｋｇ／１０００Ｌ、典型的には５〜５０ｋｇ／１０００Ｌ、いくつかの実施態様では１０〜３０ｋｇ／１０００Ｌ、いくつかの他の実施態様では１５〜２５ｋｇ／１０００Ｌとさまざまである。
【００８５】
遺伝子改変された菌株によるＴＡＧ産生の改良は、一般的に、親株と比較して少なくとも１０％、典型的には少なくとも３０％、いくつかの実施態様では少なくとも５０％および１００〜３００％でさえある。
【００８６】
「使用済み培養培地（spent cultivation medium）」とは微生物の培養において使用され、そして、微生物によって蓄積された産生物を含む培地を意味する。使用済み培養培地は、微生物および固体の原料といった例えばバイオマスなどの固相および液相を含む。したがって、使用済み培養培地は微生物細胞の内部に蓄積された産生物および細胞から培地に遊離された産生物を含む。使用済み培養（cultivation）（または培養（culture））培地はまた、使用済み培養ブロース（broth）とも称され得る。「培養培地（cultivation medium）」とは通常、使用前（播種および培養の前）の培養培地を意味する。
【００８７】
さらに、本発明の様々な実施態様において、総脂質量は、乾燥細胞重量に対して少なくとも１０重量％、典型的には乾燥細胞重量の２０〜６０重量％である。
【００８８】
本発明の様々な実施態様において、ストレプトマイセスによって産生される脂質画分は主にＴＡＧｓを含む。これは、脂質画分の少なくとも３０重量％、いくつかの実施態様では少なくとも５０重量％、いくつかの別の実施態様では少なくとも６０重量％、さらにいくつかの別の実施態様では少なくとも７０重量％、さらにいくつかのさらなる実施態様では少なくとも８０重量％、またはさらにいくつかのさらなる実施態様では少なくとも９０重量％がＴＡＧｓであることを意味している。
【００８９】
純粋な糖類上で培養された、遺伝子組み換えしていない（親株）または遺伝子組み換え株に特徴的な脂質プロファイルは、典型的には約７０〜９５％のＴＡＧｓおよび約５〜３０％のオリゴマー、ジアシルグリセロールおよびモノシルグリセロールならびに遊離脂肪酸を含む。遺伝子組み換えしていないまたは遺伝子組み換えストレプトマイセス株の脂肪酸は、典型的には分岐および直鎖の脂肪酸を含む。分岐脂肪酸の画分は２０〜８０重量％、および典型的には４０〜７０重量％のあいだであり得る。メチル分岐を有する脂肪酸の含有量は４５〜５０％のあいだであり得る。測定された脂肪酸の大多数は飽和していた。
【００９０】
さらに、ストレプトマイセス脂質はまた、典型的には２〜５重量％のスクアレンまたはスクアレン誘導体を含み、これはベースオイルまたは潤滑剤適用のためのベースオイルまたは出発原料として使用され得る。
【００９１】
ストレプトマイセスの脂質プロファイルは、ＯｌｕｋｏｓｈｉおよびＰａｃｋｔｅｒ（１９９４）による文献、ＰａｃｋｔｅｒおよびＯｌｕｋｏｓｈｉ（１９９５）による文献に開示されている。
【００９２】
脂質プロファイルの組成は、ストレプトマイセスが純粋な糖類の代わりに廃棄物または残渣を含む培地上で培養される場合に変化する可能性があるが、これは脂質抽出が廃棄物からの脂質（例えば膜リン脂質が抽出される）を含むからかもしれない。
【００９３】
本明細書中において「脂質（lipids）」とは一般的に、培養中にストレプトマイセスにより産生される脂質、および、培養培地の成分中、特には培養培地中の廃棄物または残渣材料中に含まれる脂質を意味する。「脂質画分（a lipid fraction）」とは脂質の画分、例えばＴＡＧｓまたは分岐の脂肪酸またはスクアレンなどを意味する。
【００９４】
本発明のいくつかの実施態様において、細胞片および藻類残渣さえもが、卓越した量の、ＴＡＧｓが大半を占める脂質を与える。好ましい藻類の栄養および／または炭素源は、クロレラおよびドナリエラであり、使用済み培養培地中において最も多量のＴＡＧｓが生成した。
【００９５】
本明細書中に記載されるように、廃棄物画分中（典型的には７日を超える）および純粋な成分ベースの培地中（典型的には５日を超える）でのストレプトマイセス株の長期に渡る回分培養は、ＴＡＧｓおよびいくつかのその他の脂質の消失をもたらし、これは脂質が分解されたことを示唆している。
【００９６】
本発明のいくつかの実施態様において、リパーゼ阻害剤が溶媒培地へ添加されてもよい。適切なリパーゼ阻害剤としては例えば、銀イオン（Ｌｅｅ＆Ｌｅｅ，２００６）またはカチオン性物質（ＣｏｔｅおよびＳｈａｒｅｃｈ，２００８）が挙げられる。リパーゼ阻害剤を使用することにより、脂質の分解を阻害すること、およびＴＡＧｓの蓄積を増大させることが可能である。低濃度の阻害剤でさえ、例えば０．０４〜０．０６ｇ／Ｌの濃度のＡｇＮＯ3でさえも、実施例１２に示されるように有用である。
【００９７】
本発明のいくつかの実施態様において、培養培地の播種はストレプトマイセスの菌糸体または芽胞によって行われる。好ましい実施態様において、播種は芽胞を用いることによって行われる。芽胞の量は１０7〜１０9芽胞／１リットル（例えば５×１０12芽胞／５００リットル）であり得る。
【００９８】
本発明のいくつかの実施態様においては、培養は１〜２１日間、典型的には２〜１４日間、好ましくは２〜６日間で行われ得る。いくつかの実施態様において、リパーゼ阻害剤が培養の途中で（または開始後もしくは終了前に）添加されてもよい。
【００９９】
本発明の様々な実施態様において、培養温度は通常、２０〜３６℃であり、典型的には２６〜３０℃である。
【０１００】
脂質産生のためのストレプトマイセスの培養は典型的には、本発明の様々な実施態様において、液体培養培地中で発行槽中で、好ましくは適切なエアレーションおよび攪拌下、行われる。混合スピードは典型的には０〜８００ｒｐｍ、典型的には１５０〜６００ｒｐｍの間でさまざまである。
【０１０１】
廃棄物または残渣が脂質を含んでいるかもしれないので、バクテリアの菌株によって生成される脂質を測定するために外来脂質の使用を追跡調査することは合理的である。本明細書中で記載されるように、外来脂質の使用は、固体重量の変化および脂質プロファイルの変化によって追跡調査された。バイオマスは培養の開始から３６〜４８時間まで減少し、そして、その後増加し始めることが判明した。サイクル時間は使用中の廃棄物の処理の程度に依存する。それにもかかわらず、培養が８日間まで追跡調査された場合、５日培養後には顕著な差異が見られなかった。脂質は０サンプルの上澄み中で検出可能であり、４〜５日まで固体画分中で増加した。その後、脂質は細胞画分中で減少し、そして、脂質の一部は上澄み中に認められ、そしておそらく蓄積された脂質の一部は代謝に使用された。図３は、８日間の培養における、ＰＭＶ、菌体量ならびに固体および液体画分の脂質の追跡調査を示している。三日後に検出された脂質はバクテリアの代謝に由来するものであったと結論づけられ得る。
【０１０２】
供給された糖類に対して決定される脂質収率（ｇ脂質／ｇグルコース）は、１０〜５５％の範囲で様々であった。収率は供給された純粋な糖類を基準に決定され、そして、廃棄物および残渣に含まれる糖類は考慮されなかった。グルコースからの理論上の最大脂質収率は２０〜２２％である（ＲａｔｌｅｄｇｅおよびＣｏｈｅｎ  ２００８）。したがって、２２％よりも高い脂質収率は脂質が廃棄物および残渣材料から生成された（産生された）ことを示している。
【０１０３】
ストレプトマイセス株
本明細書において、ストレプトマイセス細菌とはストレプトマイセス属に属している任意の種または株を意味する。
【０１０４】
本発明の様々な実施態様における好ましい種は、以下を含む種、好ましくは以下を含む群より選択される、より好ましくは以下の群より選択される；ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、およびストレプトマイセス  リジカス。最も好ましい種は、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  オーレオファシエンスの群より選択される。
【０１０５】
より具体的には、ストレプトマイセス株は、以下を含む、以下を含む群より選択されてもよい、より好ましくは以下の群より選択される；ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｄ２  ＧＡＬ４０８２、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｐ５５  ＧＡＬ４０８１、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス  ＧＡＬ１００４、ストレプトマイセス  リビダンス  ＧＡＬ１００２、ストレプトマイセス  セリカラー  ＧＡＬ１００３、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス  ＧＡＬ４０５１、ストレプトマイセス  エバミティリス  ＧＡＬ１００６、ストレプトマイセス  リジカス  ＧＡＬ１００７。最も好ましくは、菌株は、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  グリセウス  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｄ２  ＧＡＬ４０８２、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス  ＧＡＬ４２１１およびストレプトマイセス  オーレオファシエンス  ＧＡＬ１００４の群より選択される。
【０１０６】
様々なストレプトマイセス種が少量のトリアシルグリセロール（ＴＡＧｓ）を蓄積できることが知られている：Ｓ．アルブス（ＡｌｖａｒｅｚおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，２００２）；Ｓ．リビダンス（Ｐａｃｋｔｅｒ  ＮＤ  Ｏｌｕｋｏｓｈｉ，１９９５、ＡｌｖａｒｅｚおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，２００２）；Ｓ．セリカラー（Ａｒａｂｏｌａｚａら，２００８、ＡｌｖａｒｅｚおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，２００２）；Ｓ．ハイグロスコピカス（Ｇｅｓｈｅｖａら，１９９７）；Ｓ．オーレオファシエンス（ＢｅｈａｌおよびＪｉｌｅｋ，１９６９）；Ｓ．グリセウス（Ｓｕｕｔａｒｉら，１９９２、ＡｌｖａｒｅｚおよびＳｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ，２００２）；Ｓ．エバミティリス（Ｋａｄｄｏｒら，２００９、Ｎｏｖａｋら，１９９２）；およびＳ．リジカス（Ｎａｇａｏら，１９９１）。Ｗａｅｌｔｅｒｍａｎｎら（２００６）による文献は、バクテリアにおける中性脂肪の生合成に関る遺伝子産物を明らかにしている。しかしながら、典型的な先行技術の発酵工程を用いることによる脂質の産生は、比較的エネルギー多消費であり、これゆえ高価である。
【０１０７】
本開示において、ストレプトマイセス菌は特にはストレプトマイセス属に属しているバクテリアの純粋な培養菌を意味する。いくつかの実施態様において、種々のストレプトマイセス種または株が組み合わされて、続いてまたは一緒に培養され得る。さらに、本開示において、ストレプトマイセス菌は、特には天然で脂質を産生する能力のあるストレプトマイセス種および株を意味する。本発明のいくつかの実施態様において、ストレプトマイセス種または株の前記能力は脂質産生に関与する核酸配列をストレプトマイセス株に導入することによって、および、これらの核酸配列を、プロモーターなどのストレプトマイセス宿主によって認識される調節エレメント下で発現させることによって改良され得る。
【０１０８】
脂質産生に使用されるストレプトマイセス種または株を、宿主株を例えばリポペプチド抗生物質といった抗生物質などの内因性の生物活性な生成物を産生不全にすることにより改良することもまた可能である。これは当技術分野において公知の分子生物学的方法によって行われ得る。有益な方法は、例えば生物活性生成物の産生に関与する遺伝子の欠失、または、例えば部位特異的突然変異などの種々の変異誘発方法などである。
【０１０９】
「遺伝子不全とする（making deficient of a gene）」とは、任意の適切な方法による、特定の遺伝子を欠失またはトランケートするようなストレプトマイセス宿主の遺伝子組み換え、または、遺伝子の減少した発現もしくは遺伝子産物の減少した活性をもたらすようなストレプトマイセス宿主の遺伝子組み換えのどちらかを意味する。「不活性化（inactivation）」とは、遺伝子産物の活性の完全な欠損をもたらす遺伝子組み換え（通常は欠失）を意味する。
【０１１０】
ストレプトマイセス株から、例えば抗生物質などの所望の生物活性な生成物を産生しない突然変異体を作製することができる。突然変異体は例えば、ＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）などの化学的変異原を使用してランダム法により作製され得る。抗生物質を産生しないコロニーが、例えば抗菌性アッセイなどの適切なアッセイにより試験され得る。さらに、脂質の蓄積が例えばＨＰＬＣによって分析され得る。ストレプトマイセス株から、例えば抗生物質などの所望の生物活性な生成物を産生しない突然変異体が、特定の遺伝子の標的不活性化、例えば生物活性な生成物の生合成に関与する初めの遺伝子の不活性化によってもまた作製され得る。これは、ストレプトマイセス宿主におけるポリケチド生合成（ＰＫＳ）遺伝子を不活性化することによって例示された。遺伝子産物はバイオマーカーによってトランケートされた。得られたクローンは抗細菌性の発現に関して試験され、ＨＰＬＣによりミルベマイシンの産生が分析された。
【０１１１】
本発明において、驚くべきことに、ストレプトマイセス株がその脂質合成経路の遺伝子操作なしで顕著な量の脂質を産生できることが発見された。しかしながら、上記に記載したように、宿主を、抗生物質などの例えばリポペプチド抗生物質などの生物活性な生成物を産生不全にすることが好都合であるかもしれない。
【０１１２】
本発明において、驚くべきことに、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス種が多量の脂質を産生する能力があることが発見された。多量の脂質産生は、とりわけ抗菌性のミルベマイシン（マクロライドのグループである）を産生不全にしたＳ．ミルベマイセニウス株を用いて実証された。実施例に記載されるように、Ｓ．ミルベマイセニウス株は２０ｇ／Ｌまたはそれ以上の脂質を産生することができた。純粋なグルコースまたはでんぷん由来のグルコースの変換効率は３３％であった。ＴＡＧｓの量は全ての脂質の８０〜９０％の範囲内であった。
【０１１３】
本発明をもたらした研究に照らして、様々なストレプトマイセス種および株からのストレプトマイセス株の脂質産生が調べられた。いくつかのストレプトマイセス種および株において、脂質合成経路が遺伝子操作された。これらの実験後に、廃棄物または残渣材料が炭素および／または栄養源として使用された培地上で菌株が培養される実験が行われた。ストレプトマイセス属の株による脂質の産生が１１個のストレプトマイセス株を使用して実証された。菌株は、脂質画分、本明細書中でＴＡＧｓと称されるトリアシルグリセリドを含む代謝物の蓄積に関して試験された。全ての試験された菌株は検出可能な量のＴＡＧｓを蓄積し、そして、驚くべきことに、試験された１１個のストレプトマイセス株のうち４個が非常に迅速に増殖し、２〜３日で２００ｇ／Ｌを超える細胞湿重量を示した（表１参照）。これらの菌株は、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウスおよびストレプトマイセス  アルブス由来であった。これらの菌株は、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス  ＧＡＬ１００４、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１およびそれ由来の突然変異体  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス  ＧＡＬ１００５ならびにストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１であった。これらの菌株はさらに培養され、そして、ＴＡＧ産生について分析された。また、保管中において、生物活性な代謝物を産生しない性質を保持する菌株の能力が確認された。
【０１１４】
本明細書中に記載されるように、１１個のストレプトマイセス株は増殖およびまた二次代謝物の蓄積を増大させるために典型的な培養条件下、培養された。使用された培地は、ＴＳＢ、２×ＴＹおよびＥ０５であった。シェーカー中の培養条件は、１５０および３００ｒｐｍの攪拌下２８℃、３０℃、および３４℃であった。
【０１１５】
培養培地の内容は以下のとおりである：
ＴＳＢ：１７ｇ／Ｌ  カゼインのパンクレアチン消化物、３ｇ／Ｌ  大豆かすの酵素消化物、２．５ｇ／Ｌ  デキストロース、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌ  リン酸二カリウム；
２×ＴＹ：１６ｇ／Ｌ  トリプトンペプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ；
Ｅ０５：２０ｇ／Ｌ  デキストロース、２０ｇ／Ｌ  でんぷん、５ｇ／Ｌ  ファルマメディア、２．５ｇ／Ｌ  酵母抽出物、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、３ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ3、３ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ。
【０１１６】
表１は菌株の性状およびＴＳＢ培地中で行われた培養の関連する結果を示している。ＴＡＧｓはＴＬＣプレートにより標準物質と比較することにより見積もられた。
0005964291.tif 000002
【０１１７】
細胞湿重量によっておよび／またはＰＭＶ値として測定される、良好に増殖することができ、かつ、短い培養時間で検出可能なレベルの脂質を蓄積することのできる菌株が、脂質蓄積のための菌株の改良に関するさらなる開発のため、および発酵条件の開発のために好ましい菌株である。
【０１１８】
強化されたオイル製造のための遺伝子操作された菌株
効率よく脂質を産生する組み換え宿主（すなわち遺伝子組み換えが行われている菌株  ＧＭＯ）の構築が、本明細書において、脂質の生合成に関与する遺伝子を、天然で脂質を効果的に蓄積する能力を有するいくつかのストレプトマイセス宿主に導入することによって実証された。
【０１１９】
原種および脂質生合成に関与する遺伝子を有するクローンの両方が、バイオ廃棄物を含む多種多様の廃棄物および残渣材料中で培養された。予期せぬことに、菌株は、廃棄物または残渣画分上で、追加の炭素源を用いて、および、追加の炭素源なしでさえも、増殖しそして脂質画分を産生することが可能であった。
【０１２０】
培養は迅速な増殖周期を示した。つまり、２４時間またはそれ以前にもかかわらず定常期に達する一方、脂質の蓄積はその後６日までも継続した。培養物中の乾燥細胞量／細胞湿重量は、親種と比較してクローンによっては顕著には増加しなかった。しかしながら、脂質蓄積における著しい増加、親種と比較して３００％までもの増加が、とくに主な画分であるＴＡＧｓ中で観察された。
【０１２１】
本明細書中で記載されるように、工業的に有益なバイオ燃料発酵工程に適切な特性を有するストレプトマイセス宿主はさらに、自然選択、ランダム突然変異誘発などの任意の公知の菌株改良方法によって、および遺伝子操作によって改良され得る。
【０１２２】
脂質の蓄積を改良するために適切な遺伝子は、脂肪酸生合成に関与する酵素をコードする様々な遺伝子を含む。適切な遺伝子としては、特には、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）（ＥＣ  ２．３．１．２０）をコードする遺伝子および３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ  ２．３．１．４１）をコードする遺伝子である。
【０１２３】
ＤＧＡＴ機能（ＥＣ  ２．３．１．２０）をコードする遺伝子遺伝子は、たとえばｓｃｏ０９５８（配列番号１）であり、そして、３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ  ２．３．１．４１）をコードする遺伝子は、例えばｓｃｏ５８８８（配列番号２）である。遺伝子ｓｃｏ０９５８（ＩＤ１０１０９６３８１）は、ＴＡＧｓの生合成における最終的な段階を触媒し（Ａｒａｂｏｌａｚａら，２００８）、そして、ｓｃｏ５８８８（ＩＤ１０１１０１３３０）（Ｌｉら，２００５）は、脂肪酸の生合成における最初の伸張段階に関与している。遺伝子ｓｃｏ５８８８およびｓｃｏ０９５８はＳ．セリカラー由来である。
【０１２４】
様々なストレプトマイセス種における、前記遺伝子ｓｃｏ５８８８およびｓｃｏ０９５８の最も近いホモログもまた、本発明の範囲内である。
【０１２５】
ストリンジェントな条件下、前記遺伝子または前記ホモログの少なくとも１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
【０１２６】
遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
【０１２７】
配列番号３または配列番号４であるアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％の相同性を示す、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％の相同性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もまた、本発明の範囲内である。
【０１２８】
前記遺伝子ｓｃｏ５８８８（ＩＤ１０１０９６３８１）およびｓｃｏ０９５８（ＩＤ１０１１０１３３０）が有する機能と同じ機能または同等の機能をもたらすヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。このようなヌクレオチド配列は、前記遺伝子のフラグメントまたは誘導体、他のストレプトマイセス種における前記遺伝子の最も近いホモログ、または、前記遺伝子もしくは前記ホモログの少なくとも一つにハイブリダイズするヌクレオチド配列であってもよい。
【０１２９】
ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行われる。ストリンジェントな条件下とは、ベーリンガーマンハイムのマニュアル（Boehringer Mannheim's manual）、フィルターハイブリダイゼーションのためのＤＩＧシステムユーザーズガイドによれば、６５℃、低塩濃度、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および０．０１５  ＮａＣｌにおけるハイブリダイゼーションとして定義され得る。
【０１３０】
遺伝子のヌクレオチド配列における少しの変化が、エンコードされたタンパク質の触媒特性を顕著には変化させないことは明らかである。例えば、ヌクレオチド配列における多くの変化はエンコードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えない。また、アミノ酸配列はタンパク質の機能特性を変化させない、とくには酵素がその触媒機能を遂行することを妨げない変化を有していてもよい。ヌクレオチド配列もしくはＤＮＡ分子におけるまたはアミノ酸配列におけるこのような変化は、それらが例えば特定の反応を触媒するなどの特定の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子の機能を顕著に変化させないかまたは、タンパク質の特定の機能を顕著に変化させないため、「機能的等価物」として公知である。フラグメントもしくは誘導体、または、配列番号１もしくは配列番号２のヌクレオチド配列のまたは配列番号３もしくは配列番号４のアミノ酸配列にそれぞれの最も近いホモログを含む機能的等価物は、本発明の範囲内である。
【０１３１】
脂質生合成に関与する酵素を産生する能力のあるストレプトマイセスが、スクリーニングされ、各種基質に対する活性が測定され、そして酵素が特徴づけられ得る。様々な生物中の脂質生合成に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列が単離され、そして、アミノ酸配列が配列番号３および配列番号４のアミノ酸配列と比較され得る。当業者であればまた、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中の保存領域を同定し、そしてＰＣＲ技術を使用して遺伝子フラグメントをクローニングし得る。フラグメントをシークエンシングした後、たとえばベクター中のｃＤＮＡライブラリーを使用するなどして完全な遺伝子が得られ得る。酵素をコードしているヌクレオチド配列はまた、核酸ハイブリダイゼーションによっても同定され得る。
【０１３２】
標準的な分子生物学的方法が遺伝子をクローニングする際に、すなわち、ＤＮＡの単離および酵素処理において、大腸菌の形質転換、ＰＣＲ反応における増幅による遺伝子を含むフラグメントの単離（Ｃｏｅｎ  ＤＭ，２００１）において、およびコドン変換のための技術において使用され得る。使用される基本的な方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）などの標準的な分子生物学ハンドブックに記載されている、発現ベクター中の強力なプロモーター下へのヌクレオチド配列の挿入、適切な宿主細胞へのベクターのトランスファーおよび前記酵素の産生を誘発する条件での宿主細胞の培養。種々のホストシステムにおける組み換え技術によるタンパク質産生の方法は当該技術分野において公知である（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，２００５）。
【０１３３】
ストレプトマイセス宿主を内因性または外因性の遺伝子を発現するように遺伝子操作することは、たとえば、ストレプトマイセス宿主に他のストレプトマイセス種からの外因性遺伝子または内因性遺伝子の追加のコピーもしくは複数のコピーを導入することによって行われ得る。遺伝子はストレプトマイセス宿主によって認識されるプロモーター下で発現されてもよい、いくつかの実施態様では、遺伝子は遺伝子の増大された発現をもたらす別のプロモーター下で発現されてもよい。代わりに、ストレプトマイセス宿主が、遺伝子がより大量に発現されるようにか、または遺伝子産物の活性が増大されるように遺伝子組み換えされてもよい。
【０１３４】
用語「内因性遺伝子（endogenous gene）」とは本明細書中においてストレプトマイセス宿主にとって天然のものである遺伝子を意味する。
【０１３５】
用語「外因性遺伝子（exogeneous gene）」とは本明細書中においてストレプトマイセス宿主にとって天然のものではない遺伝子を意味する。
【０１３６】
他のストレプトマイセス種における「Ｓ．セリカラー遺伝子の最も近いホモログ（closest homologue of an S. coelicolor gene）」とは本明細書中において、Ｓ．セリカラー遺伝子およびその他の種の遺伝子の配列アラインメントにおいて同一のヌクレオチドの割合が最も高い遺伝子；または、そのタンパク質産物が最も高い割合の、Ｓ．セリカラー遺伝子によってコードされるタンパク質産物に同一なアミノ酸を有していることを意味する。「最も近いホモログ（closest homologue）」とは、特には、特定のＳ．セリカラー遺伝子（配列番号１もしくは配列番号２）または前記遺伝子産物（配列番号３もしくは配列番号４）と比較して、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、よりさらに好ましくは少なくとも９８％のヌクレオチドまたはアミノ酸配列相同性を有する遺伝子またはヌクレオチド配列を意味する。
【０１３７】
「相同性（identity）」とは２つの核酸またはアミノ酸配列のあいだで、それぞれお互いに最初の核酸から最後の核酸まで、または、対応する遺伝子によってコードされる最初のアミノ酸から最後のアミノ酸まで比較された場合の相同性を意味する。全長の配列の相同性は、ＥＭＢＯＳＳプログラムパッケージのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ  ｇｌｏｂａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ；Ｒｉｃｅら，２０００）を使用することによって評価され得る。プログラムのバージョンは２．９．０であり、パラメーターは：ＥＭＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  １０．０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ  ０．５であってもよい。
【０１３８】
ストレプトマイセス宿主の「遺伝子組み換え（genetical modification）」とは本明細書中において任意の遺伝子組み換え方法であって、それによってストレプトマイセス宿主が特定の内因性または外因性遺伝子を発現するように、および／または、特定の遺伝子もしくは複数の遺伝子を不全とするように改変されることを意味する。
【０１３９】
ストレプトマイセス宿主のための遺伝子組み換え方法は当業者にとって広く公知でありかつ利用可能であり、そして、例えばＫｉｅｓｅｒら，２０００などに開示されている。
【０１４０】
本明細書中で記載されるように、ストレプトマイセス宿主中に遺伝子を導入するための適切な方法は、例えば、プロトプラスト形質転換である。
【０１４１】
遺伝子配列、典型的には例えばＰＣＲフラグメントなどを宿主株中に導入するためのベクターは、宿主株中にクローン化されたフラグメントを導入することが可能である任意のベクターから選択され得る。適切な宿主中にフラグメントを導入するための、組み込み型ベクター、中程度のコピー数のベクターならびに高および低コピー数ベクターが成功裏に使用され得る。
【０１４２】
ストレプトマイセス宿主中に核酸フラグメントをトランスファーするための適切なベクターとしては例えば、ｐＩＪＥ４８６（Ｙｌｉｈｏｎｋｏら，１９９６）およびｐＨＪＬ４０１（Ｋｉｅｓｅｒら，２０００）が挙げられる。
【０１４３】
最も好ましい宿主株は、表１に示されるストレプトマイセス株であり、特には、株ＧＡＬ１００１およびＧＡＬ４１１１または前記株由来の任意の突然変異株である。
【０１４４】
しかしながら、バイオ燃料の商業生産のための培養ブロース中において生物活性な化合物を蓄積することができない突然変異株を使用することが有利である。この目的のために最も好ましい株は、ＧＡＬ１００１およびＧ０１１である。
【０１４５】
本明細書中で記載されるように、Ｓ．ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１および内因性の生物活性な生成物産生不全であるその誘導体、Ｓ．ロゼオスポラス  Ｇ０１１、ならびにＧＡＬ１００１が、脂質の生合成に関与する遺伝子を使用することにより遺伝子組み換えされた。
【０１４６】
バクテリアにおいては、脂質代謝に関与する数個の遺伝子が存在する。本発明の開示において、遺伝子ｓｃｏ０９５８およびｓｃｏ５８８８が、別個にまたは組み合わせてのいずれかで、ストレプトマイセスにより蓄積されるＴＡＧｓの量を驚くほどに増加させることが示された。ｓｃｏ０９５８は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）の脂肪酸分子によるエステル化反応である、トリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の生合成における最終反応に関与する（Ａｒａｂｏｌａｚａら，２００８）。ｓｃｏ５８８８は、脂肪酸の生合成の最初の伸張段階をコードする３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質である（Ｌｉら，２００５）。遺伝子は、任意の適切なクローニング方法を使用してクローニングされ得る。本発明のある実施態様によれば、クローニングは、染色体ＤＮＡから相同プライマー（homologous primer）を使用してＰＣＲにより行われる。
【０１４７】
遺伝子はプロトプラスト形質転換により前記株中に導入された。これらの遺伝子を別個にまたは組み合わせて有する株はＴＡＧｓの増加された蓄積を示した。
【０１４８】
選択され、そして、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９として規定されたＧＭＯ株は、数回の継代後においても培養特性および脂質蓄積を維持しているインタクトなプラスミドを保持している。
【０１４９】
ＴＡＧｓに富む脂質画分の蓄積のために最も良好な株はＧＡＬ１００１由来のクローンであり、Ｇ００９、Ｇ０１３およびＧ０１７と規定された。
【０１５０】
本明細書中で記載されるように、ベクターｐＩＪＥ４８６（Ｙｌｉｈｏｎｋｏら，１９９６）およびｐＨＪＬ４０１（Ｋｉｅｓｅｒら，２０００）が遺伝子ｓｃｏ０９５８およびｓｃｏ５８８８をストレプトマイセス宿主ＧＡＬ１００１、ＧＡＬ４１１１およびＧ０１１中に導入するために使用された。実施例２において、表３は、遺伝子組み換えされた株に使用されたコードを示している。全ての株は親株と比較してより多くの脂質を産生した。培養は、２０〜３６℃までの範囲の温度で、０〜８００ｒｐｍまでのさまざまな攪拌で、そしてｐＨ５〜８．５で行われた。
【０１５１】
ＧＭＯ株Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９、および、コントロールとしてのそれらの親株ＧＡＬ１００１、ＧＡＬ４１１１およびＧ０１１が幅広い種類の培養培地中で培養された。脂質収率は、（ｇ脂質／ｇグルコース）×１００として評価された。親株ＧＡＬ１００１およびＧ０１１は、それぞれ、クロロホルム抽出物の乾燥重量により、および培養ブロース１Ｌ当たり０．１〜０．５ｇである標準物質を参照してＴＬＣ分析により評価されるように脂質を産生した。形質転換体の細胞画分のクロロホルム抽出物は、５．９〜２５．２ｇ／Ｌの範囲の重量を与え、一方、ＴＡＧ含有量は３〜２３ｇ／Ｌと見積もられた。最も良好な改良は、Ｇ００９によって得られた。驚くべきことに、ＴＬＣ上での脂質画分は、全ての形質転換体において非常に似通っており、かつ、７０％を超える検出可能な脂質がＴＡＧ画分中に存在した。
【０１５２】
上記の計算において、糖類含有量は、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、ニュートリソイ（Nutrisoy）１０ｇ／Ｌおよびデキストロースシロップ１０ｇ／Ｌを含む試験された培地中で、１０ｇ／Ｌであると計算された。培養がフラスコ内で、５日間、２８℃で、１５０ｒｐｍで行われ、脂質が、細胞および等量のクロロホルム−メタノール（２：１）を用いて１時間攪拌することにより分離された上澄みから抽出された。クロロホルム画分のサンプルがＴＬＣプレートに適用され、そして、クロロホルム画分が重量測定のために蒸発乾固された。
【０１５３】
得られた脂質組成物をバイオ燃料の製造におけるさらなる処理に適切なものとするため、これらの化合物の化学的性質は非常に重要である。種々の形状の脂肪がバイオ燃料製造のための化学的処理のために適切ではあるが、好ましい化合物はＴＡＧｓである。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）分析法に加え、例えばＧＣ（ガスクロマトグラフィー）などの代謝物の特性をさらに明らかにするためのいくつかの公知の方法が存在する。ＧＣ分析は標準的手順（ＩＳＯ１５３０４）にしたがい行われ得る。ＨＰＬＣは株のグリセリド脂質プロファイルを測定するために使用され得る。例えば、親株（ＧＡＬ１００１により例示される）に特徴的なおよび遺伝子組み換え株（本明細書中においてＧ００９により例示される）に特徴的な脂質プロファイルが表２に示されている。
【０１５４】
表２．ＨＰＬＣにより分析された、ＧＡＬ１００１およびＧ００９から生じる、百分率の値としての脂質のグリセリドプロファイル
0005964291.tif 000003
＊Ｎ．Ａ．＝該当データなし
【０１５５】
ストレプトマイセス中の脂質の大半はトリグリセリドからなる。
【０１５６】
表３．Ｓ．ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１およびＳ．アルブス  ＧＡＬ１００１の、ＧＣ−ＭＳによって測定された脂肪酸分布（総脂肪酸からの％）の例。前記株は２日間、細胞廃棄物培地：１０ｇ／ＬのＣＳＬおよび５０ｇ／Ｌの細胞廃棄物（ストレプトマイセスの細胞片）中で、追加の補充物なしで、２８℃、１５０ｒｐｍで培養された。
0005964291.tif 000004
＊Ｎ．Ａ．＝該当データなし
【０１５７】
ストレプトマイセスオイルは飽和しており、そして、測定された脂肪酸の大半（〜７０％）は飽和していた。さらに、ストレプトマイセスオイルは、顕著な量のメチル分岐した脂肪酸を含んでいた（この場合、４５〜５０％）。
【０１５８】
表４．Ｓ．ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１およびＳ．アルブス  ＧＡＬ１００１の、ＧＣ−ＭＳによって測定された脂質組成の例。
0005964291.tif 000005
＊脂肪酸はアシルグリセロールおよび遊離の脂肪酸を含む。
【０１５９】
脂質の大半は脂肪酸で構成されていた（アシルグリセロールおよび遊離の脂肪酸を含む）。脂質はまた、スクアレンを含んでいた（総脂質からの２．５および４．３％）。ＧＡＬ４１１１およびＧＡＬ１００１におけるスクアレンは、スクアレン、テトラヒドロスクアレン、ジヒドロスクアレン（主成分）、ヘキサヒドロスクアレンおよびオクタヒドロスクアレンから構成されていた。
【０１６０】
本発明によれば、脂質の蓄積のために適切なストレプトマイセスを培養するためのいくつかの別の方法が存在する。様々な炭素および／または栄養源を含む種々の条件、および増殖条件が試験された。
【０１６１】
産業的に実行可能な工程とするために、Ｇ００９、Ｇ０１３およびＧ０１７などの天然で脂質を蓄積する株が、好気性発酵に適しているであろうし、かつ、発酵工程はコスト効率のよいものでなければならない。発酵工程のコストは、培地成分、エネルギー消費量、廃棄物コストおよび労働力により大きく影響される。
【０１６２】
純粋な成分由来の培地ならびに例えば、本明細書中で記載されるＴＳＢ、２×ＴＹおよびＥ０５などを使用することも可能であるが、原料として組成の分離、加水分解および／または精製なしに任意の廃棄物画分を選択することがよりコスト効率がよい。必要要件は、使用するバクテリアが、廃棄物を含む粗成分による成長を促進するための消化酵素に富んでいることである。したがって、本発明はさらに、産業廃棄物画分または廃棄物と純粋な成分との組み合わせの使用を考慮している。本明細書中で記載されるように、農業を含む産業からの幅広い種類の有機性廃棄物または残渣、一般廃棄物および微生物残渣を用いて、包括的試験が行われた。廃棄物画分から遊離の糖類および増殖のために利用される栄養源を生産するための、本発明における使用のための適切な方法は、例えば粗成分の消化のために適切な酵素の使用などの公知のものである。しかしながら、これらの消化酵素機能を有しつつ、一方では前記脂質の蓄積のための能力を有しているバクテリアの培養が好ましい。この目的のために適している株は、それゆえ、Ｓ．ロゼオスポラスおよびＳ．アルブスである。好ましい株は、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９とこれらの親株、ＧＡＬ１００１、ＧＡＬ４１１１およびＧ０１１である。
【０１６３】
本開示に含まれる菌株および好ましくは株Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３およびＧ０１７は、有機性廃棄物または残渣上で培養されてもよい。たとえば前述のロットなどから得られる細胞片の使用は、コスト効率的な方法で脂質を産生するための非常に適した栄養源である。これらの培養において、菌体量の変化は、初めの２〜３日においてはより低く検出されるが、続く３〜４日において５〜２０ｇ／Ｌに増加した。これらの培養物から得られたクロロホルム抽出物の乾燥重量は、７〜６５ｇ／Ｌの範囲であり、ＴＬＣ上で分析された３〜２３ｇ／ＬというＴＡＧｓの量を反映している。
【０１６４】
本発明の実施態様において記載されるこれら全ての単位操作および原料は、単独でもまたは組み合わせであってもどちらでも、バイオ燃料のためのオイルの製造に効率的である。特定の好ましい実施態様においては、工程は株Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３またはＧ０１７を使用する。播種は好ましくは芽胞を使用することによって行われる。芽胞の量は、有利には約１０10芽胞／１リットルから５×１０12芽胞／５００リットルである。培養は好ましくは２〜６日間行われる。培養温度は約２８℃である。培養は回分または流加回分発酵として行われる。適切な攪拌が培養のあいだ用いられる。さらに、高エネルギー消費を避けるために滅菌の代わりに培地の低温殺菌を用いることが推奨される。工程は、例えば、いかなる補充物または培養の６日目に低濃度で添加される銀イオンなどのリパーゼ阻害剤を用いることなしに６日間継続されてもよい。培養の最後に、細胞集団が採取される。典型的にはこれは、バッチ５００Ｌ当たり約６５ｋｇである。脂質は細胞バイオマスまたは培養ブロースから適切な方法によって回収される。溶媒ベースの抽出物の収率または物理的散乱（physical scattering）による収率は典型的には、少なくとも使用済み培養培地１０００Ｌ当たり５ｋｇＴＡＧｓ、典型的には１０００Ｌあたり１０〜７０ｋｇＴＡＧｓ、通常１０００Ｌバッチから約３０ｋｇのＴＡＧｓである。
【０１６５】
オイルの回収
本発明の様々な実施態様において、オイル、またはオイルの前駆体は細胞バイオマスまたは培養ブロースから公知のまたは将来開発される方法を用いて回収され得る。例えば、バクテリアは培地からろ過または傾斜法を使用して分離されてもよい。代わりに、大容積容量の工業規模の業務用遠心分離機を用いる遠心分離が所望の生成物を分離するために使用されてもよい。
【０１６６】
本発明のいくつかの実施態様において、バクテリア細胞は、オイルおよび他の成分の分離を容易にするために破砕されてもよい。細胞破砕のために公知の任意の方法、たとえば超音波処理、浸透圧衝撃、機械的せん断力、コールドプレス、熱衝撃、酵素触媒のまたは自発的な自己溶菌などが使用され得る。オイルは有機溶媒を用いた抽出によって、または、公知のまたは将来開発される方法により細胞から回収され得る。
【０１６７】
本明細書中に開示されそしてクレームされる菌株、方法、培養条件、発酵のための成分および工程スキームは、ストレプトマイセスバクテリアの大量かつ経済的な培養を支持する技術に関係する。この技術は種々の関連する製品の工業的製造を指示するために有用である。この技術はストレプトマイセスの大量培養および集菌を経済的に支持するための使用であってもよい。
【０１６８】
バイオ燃料の製造
本明細書中で記載される方法を用いて製造される脂質は、バイオディーゼル、再生可能なディーゼル、ジェット燃料またはガソリンの製造のためのフィードストック（feedstock）として使用され得る。バイオディーゼルは脂肪酸メチルエステルからなり、そして、典型的にはエステル交換によって製造される。エステル交換において、アシルグリセロールは長鎖脂肪酸アルキル（メチル、エチルまたはプロピル）エステルへと変換される。再生可能なディーゼルとは、脂質の水素処理（水素化または水素化処理）によって製造される燃料を意味する。水素処理において、アシルグリセロールは対応するアルカン（パラフィン）へと変換される。アルカン（パラフィン）はさらに異性化によってまたは他の代替の工程によって修飾され得る。再生可能なディーゼルの製造工程はジェット燃料および／またはガソリンを製造するためにもまた使用され得る。加えて、脂質のクラッキングがバイオ燃料を製造するために行われてもよい。さらに、脂質は特定の適用においては直接的にバイオ燃料として使用され得る。
【０１６９】
ストレプトマイセス脂質はバイオ燃料の製造に有益である。ストレプトマイセス脂肪酸は典型的にはメチル分岐鎖を有する脂肪酸を含み、これはバイオ燃料および潤滑剤適用に有益である。分岐の脂肪酸は、より広い流動性範囲を有するので、それらの低温適用に関心が集まっており、かつ、それらの低表面張力は良好な展延性を生じさせる（Ｇｕｎｓｔｏｎｅら，２００７）。脂肪酸の分岐は、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルなどのバイオ燃料の低温特性を改良する。ストレプトマイセスオイルは比較的高い飽和度を有する（多量の飽和脂肪酸を含む）。この特性は、脂肪酸の飽和が水素化において必要とされる水素の量を減少させることから、再生可能なディーゼル製造工程にとって特に有利である。脂質の高い飽和度はまた、オイルの安定性および保存性を改良し、そして、オイル保管における抗酸化剤の必要性を減少させる。さらに、主な脂肪鎖の鎖長は主にＣ１４（１４個の炭素）からＣ１８（１８個の炭素）までであり、これはディーゼル応用における利用にとって有益である。
【０１７０】
前記方法を用いて製造された脂質は、潤滑剤（潤滑油（lubrication oils））のためのベースオイルとして、または、潤滑剤のためのベースオイルの製造のための出発物質として使用され得る。ストレプトマイセスオイルはスクアレンまたはスクアレン誘導体を含む（Ｇｒａｆｅら，１９８５；ＯｌｕｋｏｓｈｉおよびＰａｃｋｔｅｒ  １９９４）。とりわけ、スクアレンおよびスクアレン誘導体は潤滑剤適用における使用に適している。しかしながら、ストレプトマイセスによる他の脂質もまた潤滑剤適用のために使用され得る。
【０１７１】
本発明の開示にしたがって製造される脂質組成物を含むバイオ燃料は、バイオ燃料への使用のための有意な特性を含んでいる。このような特性としては例えば、低温特性を改良する脂肪酸の分岐などが挙げられる。脂肪酸の飽和は、再生可能なディーゼル製造のために特に有利である。
【０１７２】
寄託された微生物
ストレプトマイセスｓｐ．Ｇ０１１株は、ブタペスト条約に基づき、２００９年１２月１５日に、ＤＳＭＺ−ドイチェ  ザンルング  フュア  ミクロオルガニズメン  ウント  ツェルクルツレン  ＧｍｂＨに寄託され、そして、受託番号ＤＳＭ  ２３１８２を与えられた。ＤＳＭＺ−ドイチェ  ザンルング  フュア  ミクロオルガニズメン  ウント  ツェルクルツレン  ＧｍｂＨに受託番号ＤＳＭ  ２３１８２のもとに寄託された生物学的材料は、フィンランド共和国、２０７８１  カーリナ、カイリスクルマンティエ  １０に所在のガリラエウス  オユ（Galilaeus Oy）による。ガリラエウス  オユは出願人に、本発明における前述の生物学的寄託への言及および出願／特許が本出願から優先権を主張することへの権限を与えており、そして、寄託された材料が関係国内法にしたがって公に入手可能となる旨の留保不能かつ取消不能な同意を与えている。
【０１７３】
本明細書中に示されるその他の株は、表５に示されるように、商業用カルチャーコレクションにおいて入手可能な菌株と同一の特徴を示している。表５に記載されている株は、可能な場合にはそれらの二次代謝物、１６ＳｒＤＮＡの部分配列にしたがって、および、コロニー形態の比較によって初めに同定された。約１．４ｋｂであるＤＮＡフラグメント中のＧＡＬ１００１、ＧＡＬ１００２、ＧＡＬ１００３、ＧＡＬ４０５１、ＧＡＬ１００４、ＧＡＬ１００５、ＧＡＬ４１１１、ＧＡＬ１００６、ＧＡＬ１００７、ＧＡＬ４０８１、ＧＡＬ４０８２の配列同一性は、表５に示されている菌株の対応する配列に対し＞９８％であった。比較に用いられた配列はジーンバンクから入手可能である。
【０１７４】
表５は菌株の同定を示すものである。
0005964291.tif 000006
＊アントラサイクリン生合成における二番目および３番目の環化に関する研究。J. Antibiot (Tokyo), 2003 Feb; 56(2): 143-53. 
【０１７５】
菌株は、以下の相同プライマーを用いたＰＣＲによって得られた１６ＳｒＤＮＡ配列を用いて同定された：
0005964291.tif 000007
【０１７６】
本発明の種々の実施態様は番号付けされた以下の項目１〜３６を用いて記載される。
【０１７７】
１．バイオ燃料または潤滑剤のための脂質を製造するための方法であって、前記方法が、
ストレプトマイセス属のバクテリア細胞を、有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培地中で培養すること
細胞からまたは培養培地から脂質を回収すること
を含む方法。
【０１７８】
２．前記有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物が炭素および／または栄養の主要源として使用される項目１記載の方法。
【０１７９】
３．前記培養培地中の前記廃棄物または残渣の量が、１ｇ／Ｌから６００ｇ／Ｌ、典型的には１ｇ／Ｌから４００ｇ／Ｌ、通常２ｇ／Ｌから４００ｇ／Ｌ、典型的には２ｇ／Ｌから２００ｇ／Ｌである項目１または２記載の方法。
【０１８０】
４．前記有機性廃棄物または残渣が、産業有機性廃棄物もしくは残渣、農業有機性廃棄物もしくは残渣、一般廃棄物または微生物廃棄物もしくは残渣、またはそれらの任意の混合物を含む項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８１】
５．前記培養培地が、追加の炭素源としてグリセロール、製糖業もしくはでんぷん産業からの画分、液糖または水あめまたは精製糖、またはそれらの任意の混合物を含む項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１８２】
６．廃棄物または残渣の水あめまたは液糖に対する比が１０／１から１／２、好ましくは５／１から１／１である項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０１８３】
７．使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも１ｇ／リットル、好ましくは少なくとも５ｇ／リットルである項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１８４】
８．製造される脂質が主にトリアシルグリセロールを含む項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０１８５】
９．製造される脂質がバイオディーゼルを製造するためにエステル交換されるかまたは、再生可能なディーゼルを製造するために水素処理される項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０１８６】
１０．前記培養培地が滅菌されていない、または、低温殺菌されている項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１８７】
１１．前記培養培地がリパーゼ阻害剤を含む項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１８８】
１２．培養が回分または流加回分発酵として行われる項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
１３．ストレプトマイセス種が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  リジカスの群より選択される項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
１４．前記ストレプトマイセス株が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｄ２  ＧＡＬ４０８２、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｐ５５  ＧＡＬ４０８１、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス  ＧＡＬ１００４、ストレプトマイセス  リビダンス  ＧＡＬ１００２、ストレプトマイセス  セリカラー  ＧＡＬ１００３、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス  ＧＡＬ４０５１、ストレプトマイセス  エバミティリス  ＧＡＬ１００６、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス  ＧＡＬ４２１１およびストレプトマイセス  リジカス  ＧＡＬ１００７の群より選択される項目１３記載の方法。
【０１９１】
１５．ストレプトマイセス宿主が、ＤＧＡＴ（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１９２】
１６．前記ストレプトマイセス宿主が、
（ａ）ｓｃｏ０９５８（配列番号１）および／またはｓｃｏ５８８８（配列番号２）、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および０．０１５  ＮａＣｌ中、６５℃で、前記遺伝子または前記ホモログの少なくとも１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｄ）遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも６０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０１９３】
１７．前記ストレプトマイセス宿主が、例えば抗生物質などの生物活性な代謝物の産生不全とされる項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【０１９４】
１８．ストレプトマイセス株が、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９の群より選択される項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【０１９５】
１９．脂質製造のためのストレプトマイセス培養物であって、前記培養物が、
（ａ）ストレプトマイセス属であるバクテリアの個体群、および
（ｂ）有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物を炭素および／または栄養源として含む培養培地
を含む培養物。
【０１９６】
２０．前記有機性廃棄物または残渣またはそれらの混合物が炭素および／または栄養の主要源として使用される項目１９記載の培養物。
【０１９７】
２１．使用済み培養培地中のトリアシルグリセロールの量が少なくとも１ｇ／リットル、好ましくは少なくとも５ｇ／リットルである項目２０記載の培養物。
【０１９８】
２２．製造される脂質画分が主にトリアシルグリセロールを含む項目２０または２１記載の培養物。
【０１９９】
２３．前記培養培地がリパーゼ阻害剤を含む項目２０〜２２のいずれか１項に記載の培養物。
【０２００】
２４．前記培養培地が滅菌されていない、または、低温殺菌されている項目２０〜２３のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０１】
２５．ストレプトマイセス種が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  セリカラー、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  リジカスの群より選択される項目２０〜２４のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０２】
２６．前記ストレプトマイセス株が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１、ストレプトマイセス  グリセウス  ＧＡＬ１００５、ストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｄ２  ＧＡＬ４０８２、ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｐ５５  ＧＡＬ４０８１、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス  ＧＡＬ１００４、ストレプトマイセス  リビダンス  ＧＡＬ１００２、ストレプトマイセス  セリカラー  ＧＡＬ１００３、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス  ＧＡＬ４０５１、ストレプトマイセス  エバミティリス  ＧＡＬ１００６、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス  ＧＡＬ４２１１およびストレプトマイセス  リジカス  ＧＡＬ１００７の群より選択される項目２５記載の培養物。
【０２０３】
２７．前記ストレプトマイセス宿主が、脂質合成経路の少なくとも一つの遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目２０〜２６のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０４】
２８．ストレプトマイセス宿主が、ＤＧＡＴ（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目２０〜２７のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０５】
２９．前記ストレプトマイセス宿主が、
（ａ）ｓｃｏ０９５８（配列番号１）および／またはｓｃｏ５８８８（配列番号２）、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および０．０１５  ＮａＣｌ中、６５℃で、前記遺伝子または前記ホモログの少なくとも１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｄ）遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも６０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目２０〜２８のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０６】
３０．前記ストレプトマイセス宿主が、例えば抗生物質などの生物活性な代謝物産生不全である項目２０〜２９のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０７】
３１．ストレプトマイセス株が、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９株からなる群より選択される項目２０〜３０のいずれか１項に記載の培養物。
【０２０８】
３２．ＤＧＡＴ活性（ＥＣ  ２．３．１．２０）および／または３−ケトアシル−アシル輸送蛋白質合成酵素III（ＦａｂＨ）（ＥＣ：２．３．１．４１）をコードする内因性または外因性遺伝子、または、遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列を発現するように遺伝子組み換えされているストレプトマイセス宿主。
【０２０９】
３３．宿主細胞が、ストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  グリセウス、ストレプトマイセス  アルブス、ストレプトマイセス  ピウセチウス、ストレプトマイセス  オーレオファシエンス、ストレプトマイセス  リビダンス、ストレプトマイセス  ハイグロスコピカス、ストレプトマイセス  エバミティリスおよびストレプトマイセス  リジカスの種の群より選択される、好ましくはストレプトマイセス  ロゼオスポラス、ストレプトマイセス  ミルベマイセニウスおよびストレプトマイセス  アルブスを含む種の群より選択される項目３２記載の宿主。
【０２１０】
３４．前記宿主が、
（ａ）ｓｃｏ０９５８（配列番号１）および／またはｓｃｏ５８８８（配列番号２）、
（ｂ）ストレプトマイセス種における、前記遺伝子の最も近いホモログ、
（ｃ）１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および０．０１５  ＮａＣｌ中、６５℃で、前記遺伝子または前記ホモログの少なくとも１つにハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｄ）遺伝子産物ＩＤ  １０１０９６３８１またはＩＤ  １０１１０１３３０が有する機能と同じまたは同等の機能をもたらすヌクレオチド配列、
（ｅ）配列番号３または配列番号４に対し少なくとも６０％の相同性を示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
の群より選択される１つまたはそれ以上の遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされている項目３２または３３記載の宿主。
【０２１１】
３５．菌株が、Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１２、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９株からなる群より選択される項目３２〜３４のいずれか１項に記載の宿主。
【０２１２】
３６．項目１〜１５のいずれか１項により製造される脂質組成物。
【０２１３】
３７．項目１〜１５のいずれか１項により製造される脂質もしくは脂質組成物、または、項目３６により製造される脂質組成物、または脂質もしくは脂質組成物の画分の、バイオ燃料および／または潤滑剤として、または、バイオ燃料および／または潤滑剤製造のための出発物質としての使用。
【０２１４】
３８．項目１〜１５のいずれか１項により製造される脂質もしくは脂質組成物、または、項目３６により製造される脂質組成物の、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルの製造のための使用。
【０２１５】
３９．項目１〜１５のいずれか１項により製造される脂質もしくは脂質組成物、または、項目３６により製造される脂質組成物、または脂質もしくは脂質組成物の画分、および、任意にはバイオ燃料使用に適切である添加物を含むバイオ燃料。
【０２１６】
４０．項目１〜１５のいずれか１項により製造される脂質もしくは脂質組成物、または項目３６に記載の脂質組成物、または脂質もしくは脂質組成物の画分、および、任意には潤滑剤使用に適切である添加物を含む潤滑剤。
【０２１７】
実施例
本明細書中で別段に記載されていない限り、分析のための以下の方法が実施例に関係する実験において使用された。
【０２１８】
方法：
細胞湿重量の検出：細胞湿重量は培養ブロースのサンプル１０ｍＬを秤量されたファルコンチューブに秤取し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより測定された。遠心分離後、上澄みは廃棄され、そしてファルコンチューブが細胞画分の重量を得るために秤量された。細胞重量は培養ブロースの１リットル当たりのグラム数として得られた。
【０２１９】
乾燥細胞重量の検出：湿性の細胞集団が重量が秤量により測定された後、２日間７０℃で乾燥された。細胞重量は培養ブロースの１リットル当たりのグラム数として得られた。
【０２２０】
ＰＭＶの検出：充填菌糸体積は、１０ｍＬの培養ブロースを秤取し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後、細胞相の容積を％値として測定することにより測定された。
【０２２１】
培養物の視覚分析：バクテリア培養物は、寒天プレート上の分離したコロニーによって、液体培養物を調べることによって、および、顕微鏡分析によって視覚的に分析された。
【０２２２】
ＴＬＣ分析：５μ／Ｌの１０倍に濃縮されたクロロホルム抽出物がＴＬＣプレート（シリカゲル６０  Ｆ２５４  Ｍｅｒｃｋ  １．０５７２９）上にピペッティングされ、そして、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（８０：２０：２）中で展開された。脂質は展開後ヨウ素を用いて発色されるかまたは焼いて炭素化された。脂質の焼成はプレートを５０％Ｈ2ＳＯ4に浸し、そしてプレートを１８０℃で１時間加熱することによって行われた。コレステロール（Ｃ）、コレステロールオクタデカネート（ＣＯＤ）、デカン酸、グリセリントリミリスタート（ＧＴＭ）およびＬ−α−ホスファチジルエタノールアミンがＴＬＣ上の標準物質として使用された。脂質はＴＬＣプレート上で黄色（ヨウ素）または黒色（炭素）のスポットとして視覚的に検出された。
【０２２３】
ＴＬＣスポットの分析：脂質はＴＬＣプレート上で黄色（ヨウ素）または黒色（炭素）のスポットとして視覚的に検出された。ヨウ素呈色されたスポットはＵＶライト中でより明確に観察された。サンプルのスポットは、ｇ／Ｌでの量を見積もるために標準物質と比較された。同じ展開試験におけるサンプル間の比較がなされた場合に、値（−、＋／−、＋、＋＋、＋＋＋または０〜３）がスポットの強度を基準として示された。
【０２２４】
また、ＴＡＧｓのｇ／Ｌ値が、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｐｒｏｇｒａｍ（http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html）を用いるイメージ分析により見積もられた。標準曲線が１ｇ／Ｌから４０ｇ／Ｌまでのスケールの濃度を利用して作成され、そして、培養ブロース中の脂質の力価が標準曲線に対して測定された。
【０２２５】
サンプル抽出：培養ブロース全体（凝集段階（solid stage）の培養物）または分離された菌糸体が等量のクロロホルム−メタノール（Ｃｌｆ−ＭｅＯＨ；２：１）を用いて抽出された。チューブをシェーカー中、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。遠心分離後、サンプルが抽出物から採取され、そして、ＴＬＣによりおよび／またはＧＣにより分析された。
【０２２６】
乾燥抽出物重量の検出：乾燥抽出物重量は１〜５ｍＬの抽出物を室温で１日間、通気下で乾燥させ、その後、重量を秤量によって測定することによって決定された。重量は培養ブロース１リットル当たりのグラム数として与えられた。
【０２２７】
抗生物質産生に関するバイオアッセイ
指標細菌はＴＳＢブロース中、＋３０℃で終夜培養された。細胞ストックは、ＴＳＢ軟寒天培地に１：１００（ｖ／ｖ）で希釈された。等量のＴＳＢ軟寒天培地（１０ｍＬ）がＴＳＢ寒天プレートの上に移され、そして軟寒天層は固化するまで静置された。突然変異体およびコントロールの培養物または酢酸エチル抽出物（１：１）の小さなディスクがプレート上部に移された。プレートは＋３７℃で終夜インキュベートされた。突然変異体によって形成された透明のハロ（halo）がコントロール培養物の対応するハロと比較された。
【０２２８】
ＨＰＬＣ方法の概略：
機器：
装置：アジレント（Agilent）  １１００シリーズ  クロマトグラフィーシステム（Ａ３１２−３１９）
検出器：アジレント  ＵＶ−ＶＩＳ検出器（Ｇ１３１５Ａ）
カラム：Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ８、４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ
実行パラメータ：
溶出液：溶出液Ａ  ２０００ｍＬ  ＰＷ
溶出液Ｂ  ２０００ｍＬ  ＭｅＣＮ
カラム温度：６０℃
流速：１．５ｍＬ／分
実行時間：１５ｍｉｎ
注入：５μＬ＋ニードル洗浄液（１：１  ＰＷ＋ＭｅＯＨ）
検出：２４０ｎｍ
【０２２９】
0005964291.tif 000008
【０２３０】
実施例１  脂質蓄積のためのストレプトマイセスのスクリーニング
現地微生物株保存機関からのストレプトマイセス種（表１）が、サイクル時間、菌体量および脂質の蓄積を明らかにするために標準的な培養条件下での増殖に関して試験された。菌株は典型的なブロース、トリプトンソイブロースＴＳＢ（Ｄｉｆｃｏ）中で、２日から３日間シェーカー中（１００〜３３０ｒｐｍ、２６〜３４℃）で培養された。以下の菌株：ＧＡＬ４１１１（ストレプトマイセス  ロゼオスポラス）、ＧＡＬ１００５（ストレプトマイセス  グリセウス）、ＧＡＬ１００１（ストレプトマイセス  アルブス）およびＧＡＬ４０８２（ストレプトマイセス  ピウセチウス  Ｄ２）が高い菌体量および顕著な量での脂質の蓄積を標準的培養条件において与えることが見出された。
【０２３１】
それぞれの菌株の一定量の芽胞懸濁液または菌糸のループが２５０ｍＬ  エルレンマイヤーフラスコ中のＴＳＢ培地５０ｍＬに播種するために使用された。攪拌しながら３日間インキュベーションを継続し、そして、１０ｍＬのサンプルを培養中、毎日、例えば２４時間間隔で採取した。以下の性状が分析された：細胞湿重量および乾燥細胞量の検出、ＰＭＶ、ｐＨの追跡および増殖サイクルを決定するためのサンプリングによる視覚分析、脂質画分のクロロホルム中への抽出およびクロロホルム抽出物のＴＬＣ分析。
【０２３２】
典型的な培養条件：
温度：２２〜３６℃
ｐＨ：５．０〜８．５
攪拌：１００〜３３０ｒｐｍ（３／４〜１インチ衝程）
播種形態：増殖型菌糸、菌糸基質、芽胞
トランスファー割合：０．５〜５０％
使用した標準培地：ＴＳＢ、２×ＴＹ、Ｅ０５
ＴＳＢは、１７ｇ／Ｌ  カゼインのパンクレアチン消化物、３ｇ／Ｌ  大豆かすの酵素消化物、２．５ｇ／Ｌ  デキストロース、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌ  リン酸二カリウムを含む、Ｄｉｆｃｏからのトリプトンソヤブロースである；２×ＴＹは、１６ｇ／Ｌ  トリプトンペプトン、１０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌを含み、そして、Ｅ０５は、以下の成分を含む：２０ｇ／Ｌ  デキストロース、２０ｇ／Ｌ  でんぷん、５ｇ／Ｌ  ファルマメディア、２．５ｇ／Ｌ  酵母抽出物、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、３ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ3、３ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ。
【０２３３】
ストレプトマイセス培養物の性状
指数増殖時間：１２〜６４時間
脂質蓄積までの時間：２４〜６４時間
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：２０〜８０％
ＧＣにより測定された抽出物中のオイル含有量は２５〜８０％、オイル画分中のＴＡＧｓ含有量は５０〜９５％
クロロホルム抽出物の重量：１Ｌ培養ブロース当たり＞１０ｇ
クロロホルム抽出物中のＴＡＧ画分：１０〜８０％
細胞湿重量：＞１００ｇ／Ｌ
乾式細胞重量：＞８ｇ／Ｌ
ＰＭＶの範囲：６〜１６％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：３ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は３日間）
【０２３４】
実施例２  遺伝子組み換え株の構築
同じ方法がＧＡＬ１００５およびＧＡＬ４０８２ならびに他のいくつかのストレプトマイセスに対して有用であるが、２つの菌株、ＧＡＬ４１１１およびＧＡＬ１００１が遺伝子操作の宿主として使用された。加えて、ダプトマイシン産生のＧＡＬ４１１１の遮断突然変異体が培養中の抗生物質の産生を防ぐために作製され、そして、Ｇ０１１と名付けられた。興味深いことに、Ｇ０１１の他の全ての培養物特性は、Ｇ０１１における検出可能な量のリポペプチド抗生物質の蓄積の欠失以外ＧＡＬ４１１１で見出されるものと同じであった。が見られない点で異なっていた。Ｇ０１１は、ＧＡＬ４１１と同じ培養条件において同様の量のＴＡＧｓおよび他の脂質を蓄積する。
【０２３５】
遺伝子組み換えされた菌株の構築における標準的な方法を参照するならば、ストレプトマイセスについては、Ｋｉｅｓｅｒら，２０００によるストレプトマイセスマニュアル（Streptomyces manual）に、および、大腸菌についてはＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１に見出される。
【０２３６】
プラスミド構築：
ｓｃｏ０９５８およびｓｃｏ５８８８と称される脂肪酸生合成に関与する遺伝子は、Ｓ．セリカラーのゲノムＤＮＡからｐＩＪＥ４８６ベクターにクローニングされ、それぞれｐＩＪＥｓｃｏ０９５８およびｐＩＪＥｓｃｏ５８８８が得られた。同一の制限酵素部位を使用して、遺伝子は低コピー数ベクターｐＨＪＬ４０１にクローニングされ、それぞれｐＨＪＬｓｃｏ０９５８およびｐＨＪＬｓｃｏ５８８８が得られた。遺伝子はまた、同じ構築物中に組み込まれてｐＩＪＥｓｃｏ５８８８＋０９５８およびｐＨＪＬｓｃｏ０９５８＋５８８８がそれぞれ得られた。遺伝子ｓｃｏ５８８８およびｓｃｏ０９５８は相同プライマー：
0005964291.tif 000009
および
0005964291.tif 000010
を使用してＰＣＲにより得られた。
【０２３７】
ＰＣＲによって得られたフラグメントは、対応する制限酵素部位を使用してｐＩＪＥ４８６ベクター中にクローニングされた。ＧＡＬ４１１１およびＧＡＬ１００１株中へのＤＮＡの導入のために、プロトプラスト形質転換が使用された。標準的なＰＥＧ補助の形質転換法が使用された。形質転換混合物をＲ２ＹＥプレート上に播種し、３０℃でインキュベートした。終夜のインキュベーションの後、水懸濁液中の２０μｇ／ｍＬのチオストレプトンを、菌株を含むプラスミドの選択のためプレート上に広げた。インキュベーションを３〜５日継続し、その後形質転換体をプレートから採取した。
【０２３８】
上記で記載したフラグメントを連結し、そして、ストレプトマイセス種にトランスファーするための標準的な手順で大腸菌にクローニングした。
【０２３９】
ＰＣＲ産物はシークエンシングによって検証された。形質転換体のプラスミドが単離され、そして、形質転換されたプラスミドを検証するために消化された。
【０２４０】
表６．本発明において使用されたクローンの名称
0005964291.tif 000011
ｐＩＪＥ４８６は、ストレプトマイセス中で複製する高コピー数プラスミドである（Ｙｌｉｈｏｎｋｏら，１９９６）。
ｐＨＪＬ４０１は、ストレプトマイセス中で複製する低コピー数プラスミドである（Ｋｉｅｓｅｒら，２０００）
【０２４１】
実施例３  脂質蓄積のためのＧＭＯ−ストレプトマイセスの小規模培養
菌株Ｇ００９、Ｇ０１０、Ｇ０１２、Ｇ０１３、Ｇ０１４、Ｇ０１５、Ｇ０１６、Ｇ０１７およびＧ０１９が本明細書中で記載される条件で培養された。宿主株Ｇ０１１、ＧＡＬ４１１１およびＧＡＬ１００１が培養におけるコントロールとして使用された。
【０２４２】
典型的な培養条件：
温度：２２〜３６℃
ｐＨ：５．０〜８．５
攪拌：０〜３３０ｒｐｍ
播種形態：増殖型菌糸、菌糸基質、芽胞
トランスファー割合：０．５〜５０％
使用した培地：ＴＳＢ、Ｅ０５は実施例１に開示され、そして、種々の廃棄物または残渣培地が実施例４に記載されている。
【０２４３】
ＴＡＧの蓄積が、ＴＬＣ分析により、野生型であるＧＡＬ１００１およびＧＡＬ４１１１と比較された。図５は、菌株Ｇ０１７、Ｇ０１６、Ｇ０１３およびＧ０１１による種々の培地中におけるＴＡＧｓの蓄積の例を示している。種々のプラスミドベクター中にｓｃｏ０９５８遺伝子を保持しているＧＭＯ株中およびｓｃｏ５８８８を保持しているクローン（株）中で、脂質および特にはＴＡＧｓの蓄積において明らかな増加が見られた。結果は以下に示される：
【０２４４】
表７  使用されたＧＭＯ株の名称
0005964291.tif 000012
【０２４５】
実施例４  培養ブロースの内容：増殖のための廃棄物の使用
経済的、低コストな培養条件での最大増殖およびＴＡＧｓの蓄積を促進するため、いくつかの廃棄物および／または画分が、培養において炭素および／または栄養源として使用された。驚くべきことに、実施例１および実施例２に記載の全ての試験されたストレプトマイセスが、広い範囲の廃棄物中において、増殖し、かつ、脂質を蓄積することが可能であった。廃棄物画分は、単独で、および糖類とともに、ならびに他の栄養素との組み合わせで試験された。表８に記載の以下の廃棄物画分が、細胞増殖およびＴＡＧｓの蓄積によって示されるように、成功裏に使用された。以下のデータは、それぞれ、加水分解（脱重合）されていない廃棄物（５０ｇ／Ｌ）＋デキストロースシロップ（ＤＸ７５）（１０ｇ／Ｌ）中におけるＧ００９の培養物から算出された。
【０２４６】
表８．本発明において炭素および／または栄養源として使用された、廃棄物または残渣を主とする材料の名称、ならびにそれらの増殖およびＴＡＧｓの蓄積に及ぼす影響
0005964291.tif 000013
＊５日間のサンプル−２日間のサンプルから見積もられた。
【０２４７】
実施例５  一定条件における選択された菌株の発酵
ＧＡＬ１００１、ＧＡＬ４１１１、Ｇ００９およびＧ０１０株が以下の範囲の制御された発酵条件において培養された。
【０２４８】
温度：２２〜３６℃
ｐＨ：５．０〜８．５
攪拌：０〜４ｍ／ｓの先端速度
エアレーション：０〜２ｖｖｍ
播種形態：増殖型菌糸、菌糸基質、芽胞
継代：０〜２シード
トランスファー割合：０．５〜５０％
容積：１．５Ｌ作用容積
基本的な培地：ＴＳＢ、２×ＴＹ、Ｅ０５（これらの培地の内容は実施例１に開示されており、いくつかの廃棄物培地は表９に示されるとおり）
【０２４９】
表９．発酵において使用された廃棄物または残渣培地
0005964291.tif 000014
【０２５０】
ストレプトマイセス培養物の性状：
指数増殖時間：１２〜６４時間
脂質蓄積までの時間：２４〜６４時間
ＴＬＣに基づく脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞８ｇ
クロロホルム抽出物の重量：１Ｌ培養ブロース当たり＞１５ｇ
クロロホルム抽出物中のＴＡＧ画分：１０〜８０％
細胞湿重量：＞２００ｇ／Ｌ
乾式細胞重量：＞２０ｇ／Ｌ
ＰＭＶの範囲％：１０〜４０
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：４ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は６日間）
【０２５１】
実施例６ａ  Ｇ００９株の回分発酵
前記株は１．５、２０および５００リットルの発酵体積で培養された。以下の手順により容易に追試可能な発酵工程の詳細な情報が与えられる。
【０２５２】
播種：芽胞または寒天プレート培養物のプラグ
トランスファー割合：４％
播種工程：２
温度：２８℃
エアレーション：０．５ｖｖｍ
攪拌１００〜２８０ｒｐｍ
背圧：０．５ｂａｒ
滅菌前のｐＨ：７
サイクル時間：９６時間
定常状態に達するまで：２４時間（ＤＯは２４時間の培養後０）
培養培地：実施例５に開示されるいくつかの廃棄物および／または残渣培地、Ｅ０５、基本的なＥ０５培地の成分およびそれらに替えて使用され得る材料は本明細書に開示されている（表１０）。
【０２５３】
表１０  基本的なＥ０５培地の材料に替えて使用される成分
0005964291.tif 000015
＊＝家庭内、製パン業、園芸用、植物性、醸造（たとえば麦芽汁）、臓物またはこれらの混合物などの堆肥にできる廃棄物；組成は異なる
＊＊＝フェオダクチラム、クロレラおよびドナリエラ
＊＊＊＝任意の細胞集団、たとえば乳酸桿菌およびストレプトマイセスなど
【０２５４】
菌体量（湿重量）：３４８ｇ／Ｌ
ＰＭＶ：３０％
乾燥されたクロロホルム抽出物：２８ｇ／Ｌ
ＴＬＣに基づく、得られたＴＡＧｓ：２３ｇ／Ｌ
クロロホルム抽出物中のＴＡＧｓ：８２％
供給された糖類をＴＡＧｓへ変換した割合：４０ｇ／Ｌから２３ｇ／Ｌ＝５７．５％（廃棄物からの追加の糖類）（収率は、添加された純粋な糖類（デキストロースおよびでんぷん）のみをベースに算出された）。理論的な最大値は３３％である。理論最大値よりも高い収率は、脂質が廃棄物材料に含まれる糖類から産生されていることを意味している。Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：１０．２ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は６日間）
【０２５５】
実施例６ｂ  ＧＡＬ１００１株の回分発酵
前記株は１．５Ｌ、２０Ｌおよび５００リットルの発酵体積で培養された。実施例６ａで開示され説明された手順により容易に追試可能な発酵工程の詳細な情報が与えられる。
【０２５６】
培養の指標となる数値：
菌体量（湿重量）：２６７ｇ／Ｌ
ＰＭＶ：２５％
乾燥されたクロロホルム抽出物：１０ｇ／Ｌ
得られたＴＡＧｓ：５ｇ／Ｌ
クロロホルム抽出物中のＴＡＧｓ：８２％
供給された糖類をＴＡＧｓへ変換した割合：４０ｇ／Ｌから５ｇ／Ｌ＝１２．５％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：２．１ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は３日間）
【０２５７】
実施例７  Ｇ００９株の流加回分発酵
前記株は１．５、２０および５００リットルの発酵体積で培養された。パラメーターは実施例６ａに記載されるとおり。デキストロースの供給は、初期のグルコースが殆ど消費された培養の１〜２日後に開始され、そして、培養の終わりまで継続された。供給された糖類の量は総量として４０ｇ／Ｌであり、したがって培養ブロースに添加された糖類の総量は６０ｇ／Ｌである。
【０２５８】
４日間の発酵により得られた培養ブロースの１リットル当たりの結果：
菌体量（湿重量）：３５６ｇ／Ｌ
ＰＭＶ：３６％
乾燥されたクロロホルム抽出物：１４ｇ／Ｌ
得られたＴＡＧｓ：６ｇ／Ｌ
供給された糖類をＴＡＧｓへ変換した割合：６０ｇ／Ｌから６ｇ／Ｌ＝１０％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：３．６ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は３日間）
【０２５９】
本実施例は流加回分培養がストレプトマイセスによる脂質産生に使用され得ることを示している。
【０２６０】
実施例８  ブロース中の異なる廃棄物の組み合わせ；藻類およびバイオ廃棄物
Ｇ００９株は異なる種類の廃棄物を組み合わせることにより作られたブロース中で一定条件下および以下のパラメーターで培養された。
【０２６１】
温度：２８℃
ｐＨ：培養の開始時で７
攪拌：３００ｒｐｍ
エアレーション：０、５ｖｖｍ
播種形態：増殖型菌糸、菌糸基質、芽胞
継代：２
トランスファー割合：２％
容積：１．５Ｌ作用容積
【０２６２】
表１１．発酵において使用された廃棄物および／または残渣
0005964291.tif 000016
【０２６３】
Ｇ００９培養物の性状
指数増殖時間：９７時間
脂質蓄積までの時間：１４４時間
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞７０％  図４はＧ００９による種々の培地中でのＴＡＧｓの蓄積を示している。
【０２６４】
クロロホルム抽出物の重量：１Ｌ培養ブロース当たり＞２２ｇ
クロロホルム抽出物中のＴＡＧ画分：６８．９％
Ｉｍａｇｅ  Ｊにより測定されたＴＡＧｓ：１５．３ｇ／Ｌ
ＰＭＶ：３９％
脂質収率（廃棄物なしでの供給された純粋な糖類総量）：５５％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：４、６ｇ／Ｌ
最も多い値までの時間は３日間）
【０２６５】
本実施例は様々な廃棄物および残渣がストレプトマイセスによる脂質産生において混合物として供給され得ることを示している。３３％という理論値を超える脂質収率は、糖類が廃棄物から使用されていることを意味している。
【０２６６】
実施例９  発酵における栄養源としての、脂質抽出されたバクテリア培養物の再利用
Ｇ０１６、Ｇ０１３およびＧ００９株が、１．５Ｌの回分発酵で一定条件により培養された。細胞はろ過によって採取され、そして、等量のクロロホルム（１：１）によって抽出された。その後、残った細胞片を、たとえばデキストロースシロップ１０ｇ／Ｌなどの追加の糖類源とともに、またはなしで発酵培地へと供給するため、クロロホルム残渣を除去するために６０℃で１０分間さらに乾燥された。
【０２６７】
温度：２２〜３６℃
ｐＨ：５．０〜８．５
攪拌：０〜４ｍ／ｓの先端速度
エアレーション：０〜２ｖｖｍ
播種形態：増殖型菌糸、菌糸基質、芽胞
継代：０〜２シード
トランスファー割合：０．５〜５０％
容積：０．０５〜１．５Ｌの作用容積
【０２６８】
Ｇ０１６培養物の性状
指数増殖時間：２０〜１４４時間
ＰＭＶ：３３％
脂質蓄積までの時間：７２時間まで
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞８０％
クロロホルム抽出物の重量：２７．４ｇ／Ｌ
クロロホルム抽出物中の量より算出されたＴＡＧ：１４ｇ／Ｌ
脂質収率（廃棄物なしでの糖類総量から）：５１％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：１．６ｇ／Ｌ
最も多い値までの時間は３日間）
【０２６９】
Ｇ０１３培養物の性状
指数増殖時間：２０〜１４４時間
ＰＭＶ：３３％
脂質蓄積までの時間：１４４時間まで
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞８０％
クロロホルム抽出物の重量：２０．５ｇ／Ｌ
クロロホルム抽出物中の量より算出されたＴＡＧ：１０ｇ／Ｌ
脂質収率（廃棄物なしでの糖類総量から）：４９％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：２．６ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は３日間）
【０２７０】
Ｇ００９培養物の性状
指数増殖時間：６〜５０時間
ＰＭＶ：２０％
脂質蓄積までの時間：４８時間まで
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞９０％
クロロホルム抽出物の重量：１４ｇ／Ｌ
クロロホルム抽出物中の量より算出されたＴＡＧ：７．０ｇ／Ｌ
脂質収率（廃棄物なしでの糖類総量から）：５０％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：３ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は３日間）
【０２７１】
本実施例は、脂質抽出されたストレプトマイセス細胞がストレプトマイセスによる脂質産生における栄養源として再利用され得ることを示している。
【０２７２】
実施例１０  培地の低温殺菌
典型的な発酵スキームと並行して、使用されるブロースの滅菌なしでの培養が行われた。１２１℃での２０分間の滅菌が、シードおよび産生に関するブロース両方の６０℃まで１０〜３０分間および７５℃まで２〜１０分間の加温と置換された。培養物は、毎日顕微鏡によって、および、１００μＬのサンプルを、広範囲の種類の微生物の増殖を可能とするＴＳＡ（トリプトンソヤ寒天）プレート上に播種することによって調べられた。典型的には、もっとも短い加熱時間であった培養物中でさえもコンタミネーションは見られず、かつ、培養物は、滅菌培地中での対応する培養と同様であった。
【０２７３】
播種：芽胞または寒天プレート培養物のプラグ
トランスファー割合：４％
播種工程：２
温度：２８℃
エアレーション：１ｖｖｍ
攪拌：１．３ｍ／ｓの先端速度
背圧：０．５ｂａｒ
滅菌前のｐＨ：７
サイクル時間：９６時間
定常状態に達するまで：１６時間
培養培地：実施例５に開示されるいくつかの廃棄物培地、Ｅ０５、２０ｇ／Ｌ臓物＋２０ｇ／Ｌデキストロースシロップ
【０２７４】
結果：
菌体量（湿重量）：１７８ｇ／Ｌ
ＰＭＶ：１６％
脂質蓄積までの時間：７２時間まで
クロロホルム抽出物の重量：９ｇ／Ｌ
得られたＴＡＧｓ（ＴＬＣにより見積もられた）：５ｇ／Ｌ
脂質蓄積までの時間：９６時間まで
脂質の主な画分：ＴＡＧｓ
ＴＬＣにより見積もられた代謝物画分におけるＴＡＧ含有量：＞９０％
Ｉｍａｇｅ  ＪによるＴＡＧｓの増加（最も多い量−ゼロのサンプル）：１．８ｇ／Ｌ（最も多い値までの時間は６日間）
【０２７５】
結果は、培地の滅菌が、ストレプトマイセスによる脂質産生において培地の低温殺菌によって置換され得ることを示している。
【０２７６】
実施例１１  溶解（lysis）に至る細胞増殖の測定
上記の実施例１〜７に記載された培養条件において、典型的には１０〜４８時間のインキュベーションで定常状態に達した。定常段階は約４８〜７２時間継続し、その後細胞溶解が起こった。ＴＡＧｓは延長された培養で消失した。７日間培養のブロースから得られたサンプルにおいて、少量のＴＡＧｓのみが−たとえあったとしても−ＴＬＣ上で検出可能であった。脂質および特にはＴＡＧｓは、ＴＬＣで検出されるように、培養の４日目において既に徐々に減少していた。細胞溶解は、培養実験において観察されたように、リパーゼの作用を誘発し、ＴＡＧｓの加水分解をもたらすことが考えられる。したがって、発酵は自己消化の前に停止されるか、または、リパーゼの阻害剤が培養ブロースに添加された。
【０２７７】
実施例１２  ＴＡＧ分解の防止
Ｇ００９の芽胞が、ｐＨ７の１Ｌの水道水中、以下の原料を含培地中で培養された：デキストロース  ７５  ２０ｇ、バガス  ２０ｇ、製パン業および菜園からの廃棄物（１：１）  ５または１０ｇ、藻類  ２５〜５０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ  １ｇ、ＫＨ2ＰＯ4  １ｇおよびＣａＣＯ3  ３ｇ。培養条件は、２８℃、３００ｒｐｍで１１日間であった。培養６日後に、０．０５ｇ／ＬのＡｇＮＯ3または０．０５ｇ／ＬのＣａＣＯ3を含む０．４％のトリトンＸ１００溶液。前記補充物なしのフラスコがリパーゼ阻害剤処理試験のためのコントロールと見なされた。同じ条件で培養は５日間以上継続された。
【０２７８】
本発明において使用される一般的なサンプリング手順にしたがい、サンプルが培養の７、８、１１日後に採取され、サンプリングの結果が本明細書中に示されている。並行した培養が、藻類片およびバイオ廃棄物両方の２つの濃度で使用して行われ、そして、それぞれの試験条件の上段は両方の廃棄物画分のより高い濃度での結果を示している。
【０２７９】
表１０．リパーゼ阻害剤試験の結果
0005964291.tif 000017
【０２８０】
リパーゼ阻害剤の効果は、脂質の重量（クロロホルム抽出物）において非常に良好に観察され、少し増加するかまたは安定であった。ＴＡＧｓの量の変化において、コントロールと比較して顕著な差異が検知された。
【０２８１】
実施例１３  化学的突然変異を用いたランダム法による非産生突然変異体の作製
抗生物質産生株よりの遮蔽突然変異体を作製できるいくつかの可能性がある。本実施例では、ミルベマイシンと呼ばれる抗生物質を産生するＳ．ミルベマイセニウス  ＧＡＬ４２１１株がＮＴＧ突然変異のために用いられた。菌株は厚みのあるＩＳＰ４寒天プレート（９ｃｍ）上に播種され、そして３０℃で芽胞が形成されるまでインキュベートされた。芽胞は１０ｍＬの水に懸濁され、そしてスムーズに振とうするために遠心分離管に移された。芽胞の均一な懸濁液が３ｃｍの脱脂綿を通してろ過され、そして３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。採取された芽胞が２０％グリセロール中、−８０℃で保管され、そして芽胞の力価が、コロニー計数のために適切な希釈物を寒天プレート上に播種することによって決定された。
【０２８２】
１０7芽胞／ｍＬの容量の芽胞懸濁液が、１〜３ｍｇ／ｍＬの種々の濃度のＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）によって、７〜９のｐＨ緩衝液中、＋３０℃で０．５〜１時間処理された。ＮＴＧ処理後、細胞は２回洗浄され、そしてＩＳＰ４プレートに播種された。前記条件において観察された殺細胞率は９０〜１００％であった。
【０２８３】
抗菌アッセイおよびＨＰＬＣ（２４０および４３０ｎｍ）分析によって試験されたように、抗生物質を産生することのできなかったコロニーが脂質の蓄積について試験された。
【０２８４】
実施例１４  第一の生合成遺伝子を不活性化することを標的とすることによる非産生突然変異体の作製
ポリケチド生合成（ＰＫＳ）遺伝子が、非相同であるが保存的ＤＮＡフラグメントを用いたＰＣＲによってクローニングされた。フラグメントは単離され、そして大腸菌中で複製するがストレプトマイセス中では複製しないｐＵＣ１９ベクター中にクローニングされた。アプラアイシン抵抗性をコードしている遺伝子であるバイオマーカーが、遺伝子産物のトランケーションを生じさせるようにＰＫＳ遺伝子中に挿入された。得られた組み換えｐＵＣ１９構築物が接合によりＳ．ミルベマイセニウス中に導入された。クローンは抗菌特性の発現について試験され、そしてＨＰＬＣによってミルベマイシンの産生について分析された。特有の抗生物質、ミルベマイシンを非産生であることの確認が液体培地中および固体寒天上での繰り返された培養によって行われた。
【０２８５】
使用されたプライマー
0005964291.tif 000018
【０２８６】
縮重したプライマーの記号：Ｓ＝ＣまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴおよびＮ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ。
【０２８７】
ＰＣＲ条件
0005964291.tif 000019
【０２８８】
接合
接合のため、組み換えｐＵＣ１９構築物は、大腸菌株ＥＴ１２５６７／ｐＵＺ８００２中に形質転換された。コロニーはｋａｎ、ｃａｍおよびａｐｒを含む３ｍＬのＬＢまたは２×ＴＹに播種され、そして、３０℃、３３０ｒｐｍで終夜培養された。終夜の培養物は、抗生物質を含む新しいＬＢまたは２×ＴＹ中に１：３０で希釈され、そして、３０℃で、ＯＤ600が０．４〜０．６まで培養された。細胞は等量の培地で洗浄され、そして、使用された培地の０．１当量に再懸濁された。１０7芽胞／ｍＬ容量のＳ．ミルベマイセニウスの芽胞懸濁液１ｍＬを等量のＴＳＢで２回洗浄し、そして、１ｍＬのＴＳＢに再懸濁した。１００μＬまたは２５０μＬの芽胞懸濁液が４００μＬまたは２５０μＬの大腸菌懸濁液に添加され、そして混合された。１００μＬの懸濁液を４個のＭＳ＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2プレート上に撒き、そして３０℃で１６〜２０時間インキュベートした。接合体は抗生物質（アプラマイシン  ５０ｍｇ／Ｌ）に対する抵抗性によって選択され、そして、ナリジクス酸（１ｍｇ／プレート）が大腸菌を死滅させるために使用された。抗生物質は滅菌した純水に懸濁され、そして、プレート上に重ねられた。
【０２８９】
実施例１５  ストレプトマイセス  ミルベマイセニウス株由来の遮断突然変異体および増大された量の脂質蓄積
突然変異体は培地Ｅ０５中で培養された。菌株は、２８℃、２００ｒｐｍで、フラスコ中で、および、０．５ｖｖｍのエアレーションを用いて、２５０ｒｐｍの攪拌および２８℃で、２００Ｌの作用体積の発酵槽中で培養された。種細胞培養物が２００Ｌ培養のため菌体量を増大させるために播種率１０％で作製された。フラスコまたは発酵槽のどちらかでの８日間の培養後、得られた培養ブロース全体をメタノール：クロロホルム（２：８）を用いて、室温で２時間攪拌により抽出した。脂質画分を含むクロロホルム相を脂質量に関してＴＬＣにより調べたところ、最低でも２０ｇ／Ｌが検出された。純粋なグルコースまたはでんぷん（４０ｇ／Ｌ）由来のグルコース（２０ｇ／Ｌ）の転換効率は３３％である。ＴＡＧｓの量は全ての脂質の８０〜９０％の範囲であった。細胞量は比較的少なく、培養終了時で１０〜２０％という低いＰＭＶ値であった。
【０２９０】
ＧＣ分析により、脂質プロファイルはストレプトマイセス株に特徴的なものであることが明らかとなった。
【０２９１】
実施例１５  ＧＭＯ株の評価
菌株評価はコロニー形態、サイクル時間および代謝物産生に関する試験により行われた。
【０２９２】
ＧＭＯ株を構築するために使用されたＰＣＲ産物はシークエンシングにより確認された。菌株のプラスミドが単離され、そして、形質転換されたプラスミドを検証するために消化された。
【０２９３】
ＩＳＰ４およびＩＳＰ２寒天プレート上、ならびに、ＴＳＢ中および種々の異なる廃棄物を用いたＥ０５中での液中培養における菌株の性状が本明細書中に記載されている。
【０２９４】
Ｇ００９は、ｐＩＪＥｓｃｏ０９５８を保持するストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１株であり、クローン２と名付けられた。これは検出可能な量の生物活性な代謝物を産生せず、そして、ＧＡＬ１００１と同様にランダム突然変異により生物活性な二次代謝物の生合成が遮断されていると考えられる。コロニー形態：ＩＳＰ４寒天上ではＧ００９は寒天プレートの裏面に白色色素を呈する芽胞を形成する；コロニーは茶色であり、薄い明るい部分によって囲まれている。より養分に富む寒天、ＩＳＰ２では、Ｇ００９コロニーは、黄色基質の菌糸体および黄色がかった気菌糸を形成する。白色色素の芽胞が僅かに視認される。液中培養における典型的な形態は、ペレットまたは分散した菌糸体である。菌株は液中培養中においても、例えばＴＳＢ中およびＥ０５中などにおいてもまた芽胞を形成する。本開示に関連する性状は、親株と比較して増大された菌体量およびさまざまな培養条件における３０ｇ／ＬまでのＴＡＧｓの蓄積である。菌株の性状はこれまでに試験された２０回までの継代において安定である。
【０２９５】
Ｇ０１３は、ｐＩＪＥｓｃｏ５８８８を保持するストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１株である。これは検出可能な量の生物活性な代謝物を産生せず、そして、ＧＡＬ１００１と同様にランダム突然変異により生物活性な二次代謝物の生合成が遮断されていると考えられる。固体および液中培養でのコロニー形態は、Ｇ００９で記載されたものと非常に類似しているが、増殖はＧ００９で見られたほど良好ではない。コロニーの大きさは、固体の寒天上のＧ００９培養物で見られたよりもいくらか小さい。本開示に関連する性状は、さまざまな培養条件における１１ｇ／ＬまでのＴＡＧｓの蓄積である。
【０２９６】
Ｇ０１６は、ｐＨＪＬｓｃｏ５８８８を保持するストレプトマイセス  アルブス  ＧＡＬ１００１株である。これは検出可能な量の生物活性な代謝物を産生せず、そして、ＧＡＬ１００１と同様にランダム突然変異により生物活性な二次代謝物の生合成が遮断されていると考えられる。固体および液中培養でのコロニー形態は、Ｇ００９で記載されたものと非常に類似しているが、増殖はＧ００９で見られたほど良好ではないが、Ｇ０１３で見られたものよりはわずかに良い。本開示に関連する性状は、さまざまな培養条件における２４ｇ／ＬまでのＴＡＧｓの蓄積である。
【０２９７】
Ｇ０１１はＧＡＬ４１１１の突然変異体であり、そして、その親株に起因して検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。ＧＡＬ４１１１は、ＤＮＡ配列の同一パターン、コロニーの特徴および少量の、１Ｌ当たり数ミリグラムのダプトマイシン類似体を産生する能力をもとにストレプトマイセス  ロゼオスポラスであると同定された。コロニー形態：ＩＳＰ４寒天上ではＧ０１１は寒天プレートの裏面に白色／赤色色素を呈する芽胞を形成し、基質菌糸体は赤色がかった色から茶色であり、そして、これらの赤色／茶色コロニーの周りの薄い透明な部分が視認でき、これはアミラーゼ活性を示している。より養分に富む寒天、ＩＳＰ２では、Ｇ０１１コロニーは茶色であり、白色／赤色色素を呈する胞子形成が見られる。ＩＳＰ２上の基質菌糸体はわずかに赤色であり、茶色がかった気菌糸をともなう。液中培養中では赤色がかったペレットまたは分散した菌糸体を生成する。菌株は液中培養中においても、例えばＴＳＢ中およびＥ０５中などにおいてもまた芽胞を形成する。本開示に関連する性状は、親株と比較して増大された菌体量および１ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０２９８】
Ｇ０１２は、ｐＩＪＥｓｃｏ０９５８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１株であり、その親株Ｇ０１１と同様に検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。しかしながら、増殖はＧ０１１で見られたほど良好ではない。コロニーの大きさは、固体の寒天上のＧ０１１培養物で見られるよりもいくらか小さいが、それに基づくコロニーの識別はできなかった。本開示に関連する性状は、１２ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０２９９】
Ｇ０１７は、ｐＨＪＬｓｃｏ０９５８＋５８８８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１株であり、その親株Ｇ０１１と同様に検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。増殖はＧ０１１で見られたものと非常に類似している。本開示に関連する性状は、親株と比較して増大された菌体量および２０ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０３００】
Ｇ０１９は、ｐＨＪＬｓｃｏ５８８８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  Ｇ０１１株であり、その親株Ｇ０１１と同じように検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。増殖はＧ０１１で見られたものと非常に類似している。本開示に関連する性状は、コントロール株ＧＡＬ４１１１と比較して増大された菌体量および１７ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０３０１】
Ｇ０１０は、ｐＩＪＥｓｃｏ０９５８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１株であり、その親株ＧＡＬ４１１１とは異なり、検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。しかしながら、増殖はＧ０１１で見られたほど良好ではない。本開示に関連する性状は、１８ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０３０２】
Ｇ０１４は、ｐＩＪＥｓｃｏ５８８８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１株であり、その親株ＧＡＬ４１１１とは異なり、検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。増殖はＧ０１１で見られたものと非常に類似している。本開示に関連する性状は、親株ＧＡＬ４１１１と比較して増大された菌体量およびＧ０１７と同様の２０ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０３０３】
Ｇ０１５は、ｐＩＪＥｓｃｏ５８８８＋０９５８を保持するストレプトマイセス  ロゼオスポラス  ＧＡＬ４１１１株であり、その親株ＧＡＬ４１１１とは異なり、検出可能な量の生物活性な代謝物を産生しない。コロニー形態は、Ｇ０１１で記載されたものと同一である。増殖速度はＧ０１１で見られたものと非常に類似している。本開示に関連する性状は、親株ＧＡＬ４１１１と比較して増大された菌体量および２５ｇ／ＬのＴＡＧｓの蓄積である。
【０３０４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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