(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)標的細胞のエキソサイトーシス融合機構のタンパク質を切断することができる非細胞毒性プロテアーゼと、
(b)エンドサイトーシスによって前記標的細胞内のエンドソームに取り込まれる前記標的細胞上の結合部位に結合することができるターゲティング部分と、
(c)前記プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を透過して前記標的細胞のサイトゾル内に転位させることができる転位ドメインと、
(d)前記非細胞毒性プロテアーゼと前記転位ドメインとの間に位置し、第1のプロテアーゼによって融合タンパク質を切断することを可能にする第1のプロテアーゼ切断部位と、
(e)前記転位ドメインと前記ターゲティング部分との間に位置し、第2のプロテアーゼによって融合タンパク質を切断することを可能にする第2のプロテアーゼ切断部位と、
(f)前記ターゲティング部分と前記転位ドメインとの間、及び、前記非細胞毒性プロテアーゼと前記ターゲティング部分又は前記転位ドメインとの間の、前記第1及び第2のプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解切断後に元の状態で残っている2つの共有結合と、
を含むことを特徴とする一本鎖ポリペプチド融合タンパク質：
ここで、前記第1及び第2のプロテアーゼ切断部位における切断の後に、前記ターゲティング部分は、前記ターゲティング部分のN末端ドメインと前記結合部位のドメインとの間の相互作用及び前記ターゲティング部分のC末端ドメインと前記結合部位のドメインとの間の相互作用を介して前記標的細胞上の前記結合部位と相互作用することができる。
【請求項２】
前記転位ドメインは、前記非細胞毒性プロテアーゼと前記ターゲティング部分との間に位置する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ターゲティング部分は、前記非細胞毒性プロテアーゼと前記転位ドメインとの間に位置し、前記第1のプロテアーゼ切断部位は、前記非細胞毒性プロテアーゼと前記ターゲティング部分との間に位置する、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記非細胞毒性プロテアーゼは、前記タンパク質のN末端に位置する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記共有結合はジスルフィド結合である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記転位ドメインと前記ターゲティング部分との間には、二次ポリペプチド構造を構成する1〜20個のアミノ酸残基のポリペプチドが位置する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ターゲティング部分は、第1及び第2のドメインを含み、前記第1及び第2のドメインは、10個以下のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ターゲティング部分の前記第1及び第2のドメインは、異なる受容体に対するリガンドに由来する、請求項7に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ターゲティング部分は、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ペプチド、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、BAMペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド、エンケファリンペプチド、サブスタンスPペプチド、コルチコトロピン放出因子(CRF)ペプチド、ガストリン放出ペプチド(GRP)、ノイロメジンBペプチド、ボンベシンペプチド、ガストリンペプチド、CCKペプチド、ソマトスタチン(SST)ペプチド、コルチスタチン(CST)ペプチド、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)ペプチド、PARペプチド、副甲状腺ホルモン(PTH)ペプチド、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、β2-アドレナリン受容体アゴニストペプチド、ガストリン放出ペプチド、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、甲状腺刺激ホルモン(TSH)ペプチド、インスリンペプチド、インスリン様成長因子ペプチド、ゴナドレリンペプチド、コルチコトロフィン放出ホルモン(CRH)ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)ペプチド及び脳下垂体アデニルシクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)からなる群から選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記非細胞毒性プロテアーゼと前記第1のプロテアーゼ切断部位は、10個以下のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記転位ドメインと前記第1のプロテアーゼ切断部位は、10個以下のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記転位ドメインと前記第2のプロテアーゼ切断部位は、10個以下のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項1〜11のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ターゲティング部分と前記第2のプロテアーゼ切断部位は、10個以下のアミノ酸残基によって隔てられている、請求項1〜12のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記第1のプロテアーゼと前記第2のプロテアーゼは同一である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記非細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒L鎖又はそのフラグメントである、請求項1〜14のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記転位ドメインは、クロストリジウム神経毒HNドメイン又はそのフラグメントである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は精製タグを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか1項に記載のポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１９】
プロモーターと、請求項18に記載の核酸と、ターミネーターと、を含み、前記核酸は前記プロモーターの下流に位置し、前記ターミネーターは前記核酸の下流に位置することを特徴とするDNAベクター。
【請求項２０】
請求項18に記載の核酸の相補DNA鎖。
【請求項２１】
請求項1〜17のいずれか1項に記載の一本鎖ポリペプチド融合タンパク質の製造方法であって、宿主細胞内において請求項18に記載の核酸又は請求項19に記載のDNAベクターを発現させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
a. 請求項1〜17のいずれか1項に記載の一本鎖ポリペプチド融合タンパク質を含む溶液を用意し、
b. 第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと、第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第2のプロテアーゼと、を前記溶液に添加し、
c. 前記第1のプロテアーゼ切断部位と前記第2のプロテアーゼ切断部位を切断して三本鎖融合タンパク質を形成することを含むことを特徴とする非細胞毒性薬物の製造方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法によって得られる非細胞毒性ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは三本鎖ポリペプチドであり、
a. 第1の鎖は、標的細胞のエキソサイトーシス融合機構のタンパク質を切断することができる非細胞毒性プロテアーゼを含み、
b. 第2の鎖は、前記非細胞毒性プロテアーゼを、エンドソーム内からエンドソーム膜を透過して前記標的細胞のサイトゾル内に転位させることができる転位ドメインを含み、
c. 第3の鎖は、エンドサイトーシスによって前記標的細胞内のエンドソームに取り込まれる前記標的細胞上の結合部位に結合することができるターゲティング部分を含み、
d. 前記第1及び第2の鎖はジスルフィド結合によって結合しており、前記第2及び第3の鎖は共有結合によって結合していることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２４】
医学的状態を治療、予防又は改善させるための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の一本鎖ポリペプチド融合タンパク質又は請求項23に記載の非細胞毒性ポリペプチドを含む医薬。
【請求項２５】
前記医学的状態は、疼痛、(慢性)神経性炎症、過活動膀胱等の泌尿生殖器の神経学的状態、前立腺癌、肺癌、乳癌又は結腸直腸癌である、請求項24に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な標的分泌阻害剤(TSI)、その活性化方法並びに活性化物に関する。
【背景技術】
【０００２】
非細胞毒性プロテアーゼはよく知られているプロテアーゼであり、細胞機能を不能化することによって標的細胞に作用する。重要なことに、非細胞毒性プロテアーゼはそれらが作用する標的細胞を死滅させることはない。最もよく知られている非細胞毒性プロテアーゼの例としては、クロストリジウム神経毒(例えば、Dysport(商標)、Neurobloc(商標)及びBotox(商標)として市販されているボツリヌス神経毒)及びIgAプロテアーゼが挙げられる。
【０００３】
非細胞毒性プロテアーゼは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、VAMP又はシンタキシン)として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク質分解性に切断することによって作用する(Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. を参照)。SNAREは、可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)の頭字語であり、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)を意味する。SNAREタンパク質は、細胞内小胞形成並びに細胞からの小胞輸送による分子の分泌に不可欠である。従って、非細胞毒性プロテアーゼは、所望の標的細胞に送達されると、標的細胞からの細胞分泌を阻害することができる。
【０００４】
非細胞毒性プロテアーゼは、天然の又は実質的に天然の形態(Dysport(商標)、Neurobloc(商標)及びBotox(商標)等のホロトキシン)で使用することができる。この場合、特定の細胞型に対するプロテアーゼのターゲティングは、(i)プロテアーゼの局所投与及び/又は(ii)天然のプロテアーゼに固有の結合能に依存する。あるいは、ターゲティング部分(targeting moiety (TM))として知られる外因性リガンドを含むように天然のプロテアーゼを改変した再標的形態で非細胞毒性プロテアーゼを使用することもできる。TMは、所望の標的細胞に対する結合特異性が得られるように選択され、再ターゲティング過程の一部として、非細胞毒性プロテアーゼの天然の結合部分を除去する場合がある。
【０００５】
本願出願人は、クロストリジウム神経毒に基づく再ターゲティング技術を最初に開発し、当該再ターゲティング技術によって得られる融合タンパク質は標的分泌阻害剤(targeted secretion inhibitor (TSI))として知られている。
【０００６】
TMによる置換は、当業者に周知の従来の化学的接合手法によって行うことができる。例えば、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press及びWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressを参照されたい。
【０００７】
しかしながら、化学的接合は不正確な場合が多い。例えば、TMは、接合後に1以上の結合部位において接合体の残りの部分に接合する場合がある。また、化学的接合は制御が困難な場合が多い。例えば、TMは、プロテアーゼ成分及び/又は転位成分上の結合部位において改変毒素の残りの部分に接合する場合がある。上述したような状況は、上記成分のいずれか1つのみに対する(好ましくは単一の部位における)結合が治療効果の観点から望ましい場合には問題である。すなわち、化学的接合によって望ましくない改変毒素分子の混合種集団が得られることになる。
【０００８】
化学的接合の代替手段として、遺伝子組換による一本鎖ポリペプチド融合タンパク質の調製によってTMによる置換を行うこともできる。そのような分子の製造はWO98/07864に記載されている。しかしながら、本願発明者らは、WO98/07864に記載されている方法は全てのTMに適するものではないことを見出した。
【０００９】
WO2006/059093には、WO98/07864に記載されている方法の代替となる方法が記載されている。WO2006/059093によれば、非細胞毒性プロテアーゼ成分と転位ドメイン成分との間において、TMを一本鎖融合タンパク質の中央部で結合させる(centrally-presented (CP))。これにより、以下の構造を有する一本鎖ポリペプチドが得られる。
【化１】
0006050330.tif 000002
【００１０】
上記融合タンパク質は、プロテアーゼ成分のC末端に位置する部位を切断するプロテアーゼによる処理によって活性化させる。これにより、融合タンパク質の転位成分に共有結合(ジスルフィド結合)によって結合したプロテアーゼ成分を含む二本鎖タンパク質が得られる。WO2006/059093では、得られる二本鎖タンパク質は、転位ドメイン成分のN末端にC末端を介してペプチド結合されたTMを有する。従って、TMのN-末端部分は所望の受容体と自由に相互作用し、結合することができる。上記構造は、受容体と結合するために遊離N末端又は遊離N末端部分を必要とするTMには重要である。
【００１１】
WO2006/059093では、タンパク質分解活性化により、以下の二本鎖立体構造を有するポリペプチドが得られる。
【化２】
0006050330.tif 000003
【００１２】
上記二本鎖立体構造では、TMと転位成分は一本鎖融合タンパク質を構成しており、TMのC末端は転位成分のN末端にペプチド結合している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第98/07864号
【特許文献２】国際公開第2006/059093号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Gerald K (2002)“Cell and Molecular Biology”(4th edition) John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献２】Hermanson, G.T.(1996), Bioconjugate techniques, Academic Press
【非特許文献３】Wong, S.S.(1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本願発明者らは、WO98/07864及びWO2006/059093に記載された方法は全てのTMに最適なものではなく、所望の標的細胞に対して低い結合能を有する融合タンパク質が産生される可能性があることを見出した。
【００１６】
従って、TSIを製造するための代替又は改善された方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、
(a)標的細胞のエキソサイトーシス融合機構(exocytic fusion apparatus)のタンパク質を切断することができる非細胞毒性プロテアーゼ又はそのフラグメントと、
(b)エンドサイトーシスによって前記標的細胞内のエンドソームに取り込まれる前記標的細胞上の結合部位に結合することができるターゲティング部分と、
(c)前記プロテアーゼ又はフラグメントを、エンドソーム内からエンドソーム膜を透過して前記標的細胞のサイトゾル内に転位させることができる転位ドメイン(translocation domain)と、
(d)前記非細胞毒性プロテアーゼと前記転位ドメインとの間に位置し、第1のプロテアーゼによって融合タンパク質を切断することを可能にする第1のプロテアーゼ切断部位と、
(e)前記転位ドメインと前記ターゲティング部分との間に位置し、第2のプロテアーゼによって融合タンパク質を切断することを可能にする第2のプロテアーゼ切断部位と、
(f)前記ターゲティング部分と前記転位ドメインとの間に位置し、前記第2のプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解切断後に前記ターゲティング部分を前記転位ドメインに結合させる共有結合と、
を含む一本鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供することによって上記課題の1以上を解決する。
【００１８】
WO2006/059093に記載された方法は、標的細胞上の結合部位と相互作用することができるN末端を有するTMを備えたTSIを提供する。しかしながら、本願発明者らは、WO2006/059093に記載された方法は、標的細胞上の結合部位と相互作用するために遊離N末端ドメイン及び遊離C末端ドメインの両方を必要とするTMには適していないことを見出した。
【００１９】
本発明は、WO2006/059093とは異なり、TM成分が遊離N末端ドメイン及び遊離C末端ドメインの両方を有するTSIを提供するものである。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、N末端からC末端に向かって以下に示す構造を有する一本鎖融合タンパク質を提供する。なお、P1及びP2は第1及び第2のプロテアーゼ切断部位を示す。
【化３】
0006050330.tif 000004
【００２１】
第1及び第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、一本鎖融合タンパク質は、TM及び転位成分が共有結合によって結合し、
A)プロテアーゼ成分がTM成分に共有結合によって結合しているか(以下を参照)、
【化４】
0006050330.tif 000005
B)プロテアーゼ成分が転位成分に共有結合によって結合している(以下を参照)、三本鎖構造(tri-chain structure)を有する。
【化５】
0006050330.tif 000006
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、N末端からC末端に向かって以下に示す構造を有する一本鎖融合タンパク質を提供する。なお、P1及びP2は第1及び第2のプロテアーゼ切断部位を示す。
【化６】
0006050330.tif 000007
【００２３】
第1及び第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、一本鎖融合タンパク質は、TM及び転位成分が共有結合によって結合し、
A)プロテアーゼ成分が転位成分に共有結合によって結合しているか(以下を参照)、
【化７】
0006050330.tif 000008
B)プロテアーゼ成分がTM成分に共有結合によって結合している(以下を参照)、三本鎖構造を有する。
【化８】
0006050330.tif 000009
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、N末端からC末端に向かって以下に示す構造を有する一本鎖融合タンパク質を提供する。なお、P1及びP2は第1及び第2のプロテアーゼ切断部位を示す。
【化９】
0006050330.tif 000010
【００２５】
第1及び第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、一本鎖融合タンパク質は、TM及び転位成分が共有結合によって結合し、
A)プロテアーゼ成分が転位成分に共有結合によって結合しているか(以下を参照)、
【化１０】
0006050330.tif 000011
B)プロテアーゼ成分がTM成分に共有結合によって結合している(以下を参照)、三本鎖構造を有する。
【化１１】
0006050330.tif 000012
【００２６】
本発明のTSIポリペプチドは使用時に標的細胞に結合し、結合はTMによって促進される。次に、転位ドメイン成分は、非細胞毒性プロテアーゼ成分を標的細胞のサイトゾルに輸送する。そして、非細胞毒性プロテアーゼ成分は標的細胞のエキソサイトーシス融合過程を阻害する。標的細胞のエキソサイトーシス融合機構を不活性化させることにより、本発明のポリペプチドは標的細胞からの分泌を阻害する。従って、本発明のTSIポリペプチドは、細胞分泌に関連する様々な病態生理学的状態又は症状を抑制又は治療するために使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
非細胞毒性プロテアーゼ
【００２８】
本発明のTSIポリペプチドの生物活性成分は非細胞毒性プロテアーゼである。非細胞毒性プロテアーゼは、標的細胞のサイトゾルに輸送されると、当該所望の標的細胞内でSNARE切断を生じさせる。SNAREタンパク質は哺乳動物の標的細胞内における分泌過程の必須成分であるため、SNAREタンパク質のタンパク質分解不活性化によって標的細胞からの分泌が阻害又は抑制される。
【００２９】
非細胞毒性プロテアーゼは細胞死を引き起こさない分子であり、タンパク質合成以外の細胞過程を阻害することによって作用する。非細胞毒性プロテアーゼは様々な高等生物(例えば、植物及び動物)によって産生され、そのような高等生物の例としてはブラジルに生息するサソリが挙げられる。また、非細胞毒性プロテアーゼは、様々な微生物、特にクロストリジウム属菌及びナイセリア属菌等の細菌によっても産生される。
【００３０】
クロストリジウム神経毒は非細胞毒性毒素分子を代表するものであり、ジスルフィド結合によって結合した2本のポリペプチド鎖を含む。2本のポリペプチド鎖は、約100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)及び約50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。L鎖はプロテアーゼ機能を有し、エキソサイトーシス過程に関与する小胞及び/又は原形質膜関連(SNARE)タンパク質(例えば、シナプトブレビン、シンタキシン、SNAP及び/又はVAMP)に対して高い基質特異性を示す。これらの基質は細胞の分泌機構の重要な成分である。
【００３１】
ナイセリア属菌、特にN.ゴノレエ菌は、機能的に類似した非細胞毒性毒素分子を産生する。そのような非細胞毒性プロテアーゼの例としては、IgAプロテアーゼ(WO99/58571を参照)が挙げられる。同様なIgAプロテアーゼは肺炎レンサ球菌等のレンサ球菌によっても産生される。
【００３２】
一実施形態において、本発明の非細胞毒性プロテアーゼは、クロストリジウム神経毒プロテアーゼ又はIgAプロテアーゼ(例えば、WO 99/032272を参照)であってもよい。非細胞毒性プロテアーゼの別の例としては、ブラジルに生息するサソリであるTityus serrulatusの毒液に存在するサソリ毒プロテアーゼ又はアンタレアーゼ(antarease)(例えば、WO 2011/022357を参照)が挙げられる。
【００３３】
ターゲティング部分(TM)
【００３４】
本発明のTM成分は、本発明のポリペプチドを標的細胞上の結合部位に結合させる。従って、TM成分は、本発明のポリペプチドを選択された標的細胞に結合させるリガンドである。
【００３５】
本発明において、標的細胞は任意の哺乳動物(好ましくはヒト)の細胞であってもよい。TMは、非神経細胞及び/又は神経細胞に結合するものであってもよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドのTM成分は、遊離N末端ドメイン及び遊離C末端ドメインの両方を有する。一実施形態において、TMは、ターゲティング部分のN末端部分と結合部位のドメインとの間の相互作用を介して標的細胞上の結合部位(例えば、受容体)と相互作用することができる。別の実施形態において、TMは、ターゲティング部分のC末端部分と結合部位のドメインとの間の相互作用を生じさせることができる。別の実施形態において、TMは、ターゲティング部分のN末端部分と結合部位のドメインとの間の相互作用と、ターゲティング部分のC末端部分と結合部位のドメインとの間の相互作用とを生じさせることができる。後者の実施形態では、TMのN末端部分及びC末端部分は、結合部位の同一又は異なるドメインに結合及び/又は異なる結合部位のドメインに結合していてもよい。
【００３７】
本発明のポリペプチドに使用するための適当なTMとしては、サイトカイン、成長因子、神経ペプチド、レクチン及び抗体が挙げられる。ここで、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、タンパク質結合足場、Fab、F(ab)’2、Fv、ScFv等の抗体フラグメント及びラクダ科動物等の一本鎖抗体を含む。
【００３８】
一実施形態において、TM成分は、標的細胞上に存在する受容体に結合するペプチドリガンド(例えば、ペプチドホルモン)を含むか、そのようなペプチドリガンドからなる。一実施形態において、ペプチドリガンドは、5〜200個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。例えば、ペプチドリガンドは、5〜150又は5〜100又は5〜50又は5〜40又は5〜30又は5〜25又は5〜20又は7〜12又は約10個の連続するアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるか、そのようなアミノ酸配列を含む。
【００３９】
TM成分は、N末端部分とC末端部分を含む。N末端部分とC末端部分のそれぞれは、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20又は少なくとも25個の連続するアミノ酸残基を通常は含む。
【００４０】
一実施形態において、TMは、MRGPRX1(例えば、ウシ副腎髄質(BAM)ペプチド受容体)、オピオイドペプチド受容体、OPRM1又はOPRD1(例えば、β-エンドルフィンペプチド受容体)、BDKRB1又はBDKRB2(例えば、ブラジキニンペプチド受容体)、OPRM1又はOPRD1(例えば、met又はleu-エンケファリンペプチド受容体)、OPRK1(例えば、ダイノルフィンペプチド受容体)、GALR1、GALR2又はGALR3(例えば、ガラニンペプチド受容体)、OPRL1(例えば、ノシセプチンペプチド受容体)、TACR1、TACR2又はTACR3(例えば、P物質ペプチド受容体)から選択される受容体に結合するペプチドリガンド(又はその類似体)を含むか、そのようなペプチドリガンドからなる。
【００４１】
一実施形態において、TMは、ウシ副腎髄質(BAM)ペプチド、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、met又はleu-エンケファリンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド、ノシセプチンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドリガンドを含むか、そのようなペプチドリガンドからなる。
【００４２】
一実施形態において、TMは、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ペプチドを含むか、GnRHペプチドからなる。GnRHは10個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。GnRHのN末端アミノ酸は受容体活性化における役割を有し、C末端アミノ酸はGnRH受容体との高親和性結合に必要である(Flanagan, Millar & Illing (1997) Reviews of Reproduction, 2, 113-120を参照(上記文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。生体内におけるGnRHの機能は、脳下垂体前葉に位置するGnRH受容体に作用し、黄体形成ホルモン(LH)及び卵胞刺激ホルモン(FSH)等のゴナドトロピンの合成及び放出を促すことである。本願明細書において使用する「GnRHペプチド」という用語は、GnRHペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。例えば、「GnRHペプチド」という用語は、(グリシン及び/又はアラニン等の2つのアキラルアミノ酸残基が隣接する)システインアミノ酸がGnRHペプチドの6位の置換アミノ酸として挿入されたGnRHペプチドを含む。GnRHは、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)とも呼ばれる。その他の例としては、GnRHIペプチド、GnRHIIペプチド、GnRHIIIペプチド、完全長92アミノ酸GnRH前駆体ポリペプチド及びその断片が挙げられる。
【００４３】
一実施形態において、TMは、コルチコトロフィン放出因子(CRF)ペプチドを含むか、CRFペプチドからなる。CRFは、CRF1及びCRF2受容体と相互作用する41個のアミノ酸からなる視床下部ペプチドホルモンである。生体内におけるCRFの主要な機能は、下垂体前葉内における副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞からのACTHの放出を促すことである。本願明細書において使用する「CRFペプチド」という用語は、完全長CRF、ウロコルチン1、ウロコルチン2、それらの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００４４】
一実施形態において、TMは、ガストリン放出ペプチド(GRP)を含むか、GRPからなる。GRPは27個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。GRPは、消化管ホルモンの放出、平滑筋細胞収縮及び上皮細胞増殖等の胃腸系及び中枢神経系の様々な機能を調節し、腫瘍組織の強力な分裂促進因子である。本願明細書において使用する「GRPペプチド」という用語は、GRPペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００４５】
一実施形態において、TMは、ニューロメジンBを含むか、ニューロメジンBからなる。ニューロメジンBは10個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。ニューロメジンBは生体内においてBB1受容体に作用し、正常及び腫瘍性の肺及び胃腸上皮組織の強力な分裂促進因子及び成長因子である。本願明細書において使用する「ニューロメジンBペプチド」という用語は、ニューロメジンBペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。本願明細書において使用する「ニューロメジンBペプチド」という用語は、ヒト相同体ペプチド、ボンベシン、完全長ボンベシン(カエルの皮膚から単離された14個のアミノ酸からなる酸ペプチド)及びそれらの断片及び類似体を含む。
【００４６】
一実施形態において、TMは、ガストリン又はコレシストキニン(CCK)を含むか、ガストリン又はCCKからなる。ガストリンは17個のアミノ酸からなるペプチドホルモンであり、CCKは8個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。ガストリン及びコレシストキニンは、主として胃腸系及び中枢神経系(CNS)内において生体内でCCK1及びCCK2受容体に作用し、膵酵素分泌、胆嚢及び胃の平滑筋収縮、不安、痛覚消失、覚醒及び神経弛緩作用を調節する。本願明細書において使用する「ガストリン及びコレシストキニンペプチド」という用語は、ガストリン及びコレシストキニンペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００４７】
一実施形態において、TMは、ソマトスタチン(SST)ペプチドを含むか、SSTペプチドからなる。SSTペプチドTMの例としては、完全長SST、コルチスタチン(CST)、BIM 23052、BIM 23056及びBIM23268等のそれらの断片及び類似体、オクトレオチドペプチド、ランレオチドペプチド、BIM23027、CYN154806、BIM23027、バプレオチドペプチド、セグリチドペプチド及びSOM230が挙げられる。これらのTMは、sst1、sst2、sst3、sst4及びsst5受容体等のsst受容体に結合する。SST及びCSTは高い構造相同性を有し、あらゆる公知のsst受容体に結合する。本願明細書において使用する「SST及びCSTペプチド」という用語は、SST及びCSTペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００４８】
一実施形態において、TMは、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)ペプチドを含むか、GHRHペプチドからなる。GHRHは、成長ホルモン放出因子(GRF又はGHRF)又はソマトクリニンとも呼ばれる。適当なGHRHペプチドの例としては、完全長GHRH(1-44)ペプチド、GHRH(1-27、1-28、1-29)、GHRH(1-37)及びGHRH(1-40、1-43)-OH等のそれらの断片及び類似体及びBIM 28011及びNC-9-96等のペプチド類似体が挙げられる。本願明細書において使用する「GHRHペプチド」という用語は、GHRHペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００４９】
一実施形態において、TMは、PAR1等のプロテイナーゼ活性化受容体(PAR)ペプチドを含むか、PARペプチドからなる。PARペプチドは、7回膜貫通型受容体Gタンパク質共役受容体のユニークなサブタイプであり、PARペプチドはタンパク質分解性の改変によって新たな細胞外N末端を露出させ、細胞外N末端は係留活性化リガンドとして作用する。同族受容体を活性化するPAR1アゴニスト(TFLLR等)が特定されている。本願明細書において使用する「PARペプチド」という用語は、PARペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００５０】
一実施形態において、TMは、副甲状腺ホルモン(PTH)を含むか、PTHからなる。PTHは、副甲状腺から放出され、PTH1受容体に結合するペプチドである。PTH1受容体は広範に分布しているが、PTH標的組織、主として腎臓及び骨内に特に大量に存在する。本願明細書において使用する「PTHペプチド」という用語は、PTHペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体を含む。
【００５１】
一実施形態において、TMは、粘液分泌細胞又は粘液分泌を制御又は指示する神経細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。例えば、TMは、(a)上皮杯細胞及び粘膜下腺粘液分泌細胞等のムチンを分泌する細胞、(b)クララ細胞及び漿液細胞等の粘液の水性成分を分泌する細胞及び/又は(c)知覚導出C線維又はNANC神経系線維等の粘液分泌を制御又は指示する細胞と結合する。これらのペプチドの例としては、VIP、β2アドレナリン受容体アゴニスト、ガストリン放出ペプチド及びカルシトニン遺伝子関連ペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、粘液過分泌、喘息及び/又は慢性閉塞性肺疾患を治療するために使用することができる。
【００５２】
別の実施形態において、TMは、内分泌細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドの例としては、GHRH、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、インシュリン、インシュリン様成長因子、TSH放出ホルモン(プロチレリン)、FSH/LH放出ホルモン(ゴナドレリン)、コルチコトロフィン放出ホルモン(CRH)及びACTHが挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、MENを含む内分泌腺新生物、甲状腺中毒症及び甲状腺からの過分泌によるその他の疾患、先端巨大症、高プロラクチン血症、クッシング病及び前葉過分泌によるその他の疾患、高アンドロゲン症、慢性無排卵及び多嚢胞性卵巣症候群に関連するその他の疾患を治療するために使用することができる。
【００５３】
別の実施形態において、TMは、炎症細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドTMの例としては、(i) Fc IgEのC4ドメイン等の肥満細胞に対するペプチドTM、(ii) C3a/C4a-R補体受容体に対するリガンド及びCR4補体受容体に対する反応性を有する抗原等の好酸球に対するペプチドTM、(iii)マクロファージ刺激因子等のマクロファージ及び単球に対するペプチドTM、(iv) iC3b補体受容体又はIL8に関連する抗原等の好中球に対するペプチドTMが挙げられる。これらのペプチドTMは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、アレルギー(季節性アレルギー性鼻炎(花粉症)、アレルギー性結膜炎、血管運動神経性鼻炎、食物アレルギー)、好酸球増加症、喘息、関節リウマチ、全身性エリテマトーテス、円盤状紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、痔核、掻痒、糸球体腎炎、肝炎、膵臓炎、胃炎、脈管炎、心筋炎、乾癬、湿疹、慢性放射線誘発線維症、肺瘢痕化及びその他の線維性障害を治療するために使用することができる。
【００５４】
別の実施形態において、TMは、外分泌細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドの例としては、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド(PACAP-38)が挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、消化管、特に結腸に位置する粘液分泌細胞からの粘液過分泌を治療するために使用することができる。
【００５５】
別の実施形態において、TMは、免疫細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドの例としては、エプスタイン・バール・ウイルスフラグメント/表面特徴(surface feature)等のリガンドが挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーテス、円盤状紅斑性狼瘡、臓器移植、組織移植、液性移植、グレーブス病、甲状腺中毒症、自己免疫性糖尿病、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、好中球減少症、慢性自己免疫性肝炎、自己免疫性胃炎、悪性貧血、橋本甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、多発性筋炎、強皮症、全身性硬化症、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、心筋炎、リウマチ性心炎、糸球体腎炎(グッドパスチャー症候群)、ぶどう膜炎、睾丸炎、潰瘍性大腸炎、脈管炎、萎縮性胃炎、悪性貧血及び1型糖尿病を治療するために使用することができる。
【００５６】
別の実施形態において、TMは、心血管細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドの例としては、トロンビン、TRAP(トロンビン受容体アゴニストペプチド)及びGP1b表面抗原認識抗体等の心血管内皮細胞に結合するリガンドが挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、心血管疾患及び/又は高血圧を治療するために使用することができる。
【００５７】
別の実施形態において、TMは、骨細胞に結合するペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。そのようなペプチドの例としては、大理石骨病及び骨粗鬆症から選択される疾患の治療のための骨芽細胞に結合するリガンド(カルシトニン等)及び破骨細胞分化誘導因子(例えば、TRANCE、RANKL又はOPGL)を含む破骨細胞に結合するリガンドが挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。従って、本実施形態のTSIは、骨疾患を治療するために使用することができる。
【００５８】
直鎖及び環状インテグリン結合配列も本発明のペプチドTMとして使用することができる。多くのインテグリンは三重Arg-Gly-Asp(RGD)ペプチド配列を認識する(Ruoslahti, 1996)。RGDモチーフは、フィブロネクチン、テネイシン、フィブリノゲン及びビトロネクチンを含む100種以上のタンパク質において見られる。RGDインテグリン相互作用は、コクスサッキーウイルス(Roivaninen et al., 1991)及びアデノウイルス(Mathias et al., 1994)を含む多くの病原体による細胞侵入の保存機構として利用される。直鎖及び環状ペプチド配列(PLAEIDGIEL及びCPLAEIDGIELC)は、DNAと結合し、α9β1インテグリンを発現する細胞中にDNAを内在化させることが示されている(Schneider et al., 1999)。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。
【００５９】
本発明の他のTMとしては、ファージディスプレー法によって発見されたペプチド、特にヒト気道上皮細胞を標的とし、内在化されるペプチドが挙げられる。そのようなペプチドの例としては、THALWHT (Jost et al., 2001)、LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)及びLEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)(Wu et al., 2003)、CDSAFVTVDWGRSMSLC (Florea et al., 2003)、SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP及びLQHKSMP (Writer et al., 2004)、FSLSKPP、HSMQLST及びSTQAMFQペプチド(Rahim et al., 2003)が挙げられる。これらのペプチドは、これらのペプチドの機能的な結合性フラグメント、変異体及び類似体であってもよい。
【００６０】
一実施形態において、TMは、第1及び第2の部分(例えば、ドメイン)を含むか、第1及び第2の部分からなる。一実施形態において、ターゲティング部分の第1及び第2の部分は同一のリガンド(例えば、上述したTMリガンドのいずれか)に由来するものであってもよい。第1及び第2の部分は、同一の受容体の同一又は異なる部位に結合してもよい。第1及び第2の部分は、異なる受容体の部位に結合してもよい。
【００６１】
ターゲティング部分の第1及び第2の部分は、同一又は異なる受容体に結合する異なるリガンド(例えば、上述したTMリガンドのいずれか)に由来するものであってもよい。従って、TMは2種類のTMのハイブリッドであってもよい。第1及び第2の部分は、同一の受容体の同一又は異なる部位に結合してもよい。第1及び第2の部分は、異なる受容体の部位に結合してもよい。
【００６２】
TMは、別のTM(例えば、上述したTMリガンドのいずれか)に由来する第3及び/又は第4以降の部分を含んでいてもよい。
【００６３】
一実施形態において、第1の部分(例えば、ドメイン)は、遊離N末端部分(例えば、遊離N末端)を介して標的受容体に結合するリガンドを含むか、そのようなリガンドからなる。そのようなリガンドの例としては、オピオイド受容体に結合するリガンド(例えば、オピオイドペプチド等のORL1受容体に結合するリガンド)が挙げられる。オピオイドペプチドの他の例としては、ノシセプチン、ダイノルフィン、β-エンドルフィン及びエンケファリンが挙げられる。非オピオイドペプチドTMリガンドの例としては、BAM、ガラニン、P物質、GnRH、CRF、GRP、ノイロメジンB、ボンベシン、ガストリン、CCK、SST、CST、GHRHペプチド及びそれらの断片、変異体及び類似体が挙げられる。
【００６４】
別の(又は同一の)実施形態において、第2の部分(例えば、ドメイン)は、遊離C末端部分(例えば、遊離C末端)を介して標的受容体に結合するリガンドを含むか、そのようなリガンドからなる。そのようなリガンドの例としては、ブラジキニン受容体(例えば、ブラジキニンペプチド)又はP物質受容体(例えば、P物質ペプチド)に結合するリガンドが挙げられる。その他のペプチドTMリガンドの例としては、BAM、ガラニン、P物質、GnRH、CRF、GRP、ノイロメジンB、ボンベシン、ガストリン、CCK、SST、CST、GHRHペプチド及びそれらの断片、変異体及び類似体が挙げられる。
【００６５】
例えば、ハイブリッドTMは、ノシセプチンペプチドを含むか、ノシセプチンペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、ノシセプチンペプチドを含むか、ノシセプチンペプチドからなり、第2の部分は、BAMペプチド、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、エンケファリンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００６６】
別の例では、ハイブリッドTMは、ダイノルフィンペプチドを含むか、ダイノルフィンペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、ダイノルフィンペプチドを含むか、ダイノルフィンペプチドからなり、第2の部分は、BAMペプチド、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、エンケファリンペプチド、ノシセプチンペプチド、ガラニンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００６７】
別の例では、ハイブリッドTMは、ガラニンペプチドを含むか、ガラニンペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、ガラニンペプチドを含むか、ガラニンペプチドからなり、第2の部分は、BAMペプチド、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、エンケファリンペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００６８】
別の例では、ハイブリッドTMは、BAMペプチドを含むか、BAMペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、BAMペプチドを含むか、BAMペプチドからなり、第2の部分は、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、エンケファリンペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００６９】
別の例では、ハイブリッドTMは、β-エンドルフィンペプチドを含むか、β-エンドルフィンペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、β-エンドルフィンペプチドを含むか、β-エンドルフィンペプチドからなり、第2の部分は、オピオイドペプチド、BAMペプチド、ブラジキニンペプチド、エンケファリンペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００７０】
別の例では、ハイブリッドTMは、エンケファリン(例えば、leu又はmet-エンケファリン)ペプチドを含むか、エンケファリンペプチドからなる第1の部分と、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)を含むか、ブラジキニンペプチド(又はP物質ペプチド)からなる第2の部分と、を含む。あるいは、第1の部分は、エンケファリンペプチドを含むか、エンケファリンペプチドからなり、第2の部分は、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、BAMペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド及びP物質ペプチドから選択されるペプチドを含むか、そのようなペプチドからなる。
【００７１】
一実施形態において、TMは、同一であって(又は類似しており)、標的細胞上の受容体との有効な相互作用を共に生じる第1及び第2の部分(例えば、ドメイン)を含むか、そのような第1及び第2の部分からなる。TMは、さらなる(例えば、第3の)同一の又は類似した部分を含んでいてもよい。従って、本実施形態では、本発明のポリペプチドは、同一の(又は類似した)TMを含む (例えば、TM-TM; TM-TM-TM など) 。
【００７２】
そのような繰り返し構造(例えば、TM-TM又はTM-TM-TM等)は、オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、BAMペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド、エンケファリンペプチド、P物質ペプチド、GnRHペプチド、CRFペプチド、GRPペプチド、ノイロメジンBペプチド、ボンベシンペプチド、ガストリンペプチド、CCKペプチド、SSTペプチド、CSTペプチド及びGHRHペプチドから選択されるTMからなるものであってもよい。
【００７３】
一実施形態において、TMの第1及び第2の(及び/又はその他の)部分はスペーサー配列(例えば、ペプチド配列)によって分離されている。一実施形態において、第1及び第2の(及び/又はその他の)部分は、40個以下又は35個以下又は30個以下又は25個以下又は20個以下又は15個以下又は10個以下又は5個以下のアミノ酸残基の配列によって分離されていてもよい。一実施形態において、第1及び第2の(及び/又はその他の)部分は4、3、2、1又は0個のアミノ酸残基の配列によって分離されていてもよい。
【００７４】
通常、本発明の融合タンパク質は、対応する遊離TM(単離TM)と比較して、標的細胞に対する低い結合親和性(100倍までの領域)を示す。しかしながら、本発明の融合タンパク質は予期せぬ優れた有効性を示す。これは、2つの主要な特徴のためであると考えることができる。第1に、非細胞毒性プロテアーゼ成分は触媒的であり、そのような分子の治療効果は標的細胞内で急速に増幅される。第2に、標的細胞上に存在する受容体は、治療が侵入するためのゲートウェイとして機能すればよく、必ずしもリガンド受容体媒介薬理反応を達成するために必要なレべルに刺激される必要はない。従って、本発明の融合タンパク質は、通常は数μgから数mg(場合によっては数百mg)の量で投与される他の治療分子よりも低い用量で投与することができる。本発明の融合タンパク質は、はるかに低い用量(通常は10倍又は100倍低い用量)で投与することができる。
【００７５】
転位ドメイン
【００７６】
本発明の転位成分は、非細胞毒性プロテアーゼ(又はそのフラグメント)を標的細胞内に転位させ、標的細胞のサイトゾル内におけるプロテアーゼ活性の機能的発現を生じさせることを可能とする。転位成分は、低いpH条件において脂質膜(例えば、エンドソーム膜)にイオン透過孔を形成することができることが好ましい。転位成分は、微生物タンパク質源、例えば、細菌又はウイルスタンパク質源から得ることができる。一実施形態において、転位成分は、細菌毒素等の酵素の転位ドメインを含むか、そのような転位ドメインからなる。別の実施形態において、転位成分は、ウイルスタンパク質の転位ドメインを含むか、そのような転位ドメインからなる。一実施形態において、本発明の転位成分は、クロストリジウム神経毒のHNドメイン(又はその転位フラグメント)等のクロストリジウム神経毒H鎖又はそのフラグメントを含むか、クロストリジウム神経毒H鎖又はそのフラグメントからなる。
【００７７】
第1及び第2のプロテアーゼ切断部位
【００７８】
本発明のポリペプチドは、第1のプロテアーゼ切断部位を含む。第1のプロテアーゼ切断部位は、非細胞毒性プロテアーゼ成分と融合タンパク質の残りの部分との間の位置における融合タンパク質の切断(例えば、制御された切断)を可能とする。上記切断によって一本鎖(非細胞毒性プロテアーゼ-転位ドメイン)構造を活性化し、非細胞毒性プロテアーゼ成分が融合タンパク質の残りの部分に共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって結合した、活性化された二本鎖構造を形成することができる。
【００７９】
また、本発明のポリペプチドは、第2のプロテアーゼ切断部位を含む。第2のプロテアーゼ切断部位は、ターゲティング部分成分と転位ドメイン成分との間の位置における融合タンパク質の切断(例えば、制御された切断)を可能とする。上記切断によって一本鎖(TM-転位ドメイン)構造を分離し、TM成分が融合タンパク質の転位成分に共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって結合した、分離された二本鎖構造を形成することができる。これにより、TM成分の構造的環境が変化し、N末端及びC末端部分(例えば、ドメイン)の両方が融合タンパク質の残りの部分にペプチド結合されておらず、1以上の受容体上の異なる結合ドメインと自由に相互作用(例えば、結合)する立体構造が得られる。
【００８０】
従って、第1又は第2のプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解切断により、一本鎖ポリペプチド融合タンパク質は二本鎖ポリペプチドに変換される。第1のプロテアーゼ切断部位における切断反応の場合には、非細胞毒性プロテアーゼ成分は、共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によって転位ドメイン成分及び/又はTM成分に結合したままである。共有結合は、例えば、非細胞毒性プロテアーゼ成分、TM成分及び/又は転位成分に結合した1以上のスペーサー又はリンカー分子を介した間接的なものであってもよい。同様に、第2のプロテアーゼ切断部位における切断反応の場合には、転位ドメイン成分は、共有結合(例えば、ジスルフィド結合)によってTM成分に結合したままである。共有結合は、例えば、転位成分及び/又はTM成分に結合した1以上のスペーサー又はリンカー分子を介した間接的なものであってもよい。
【００８１】
切断反応が第1及び第2のプロテアーゼ切断部位の両方で生じる場合には、一本鎖ポリペプチド融合タンパク質は三本鎖ポリペプチドに変換される。
【００８２】
第1及び第2のプロテアーゼ切断部位は、部位特異的突然変異誘発等の従来の手段によってDNAレベルで導入(及び/又は固有の切断配列を除去)することができる。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手動で行うか、コンピューターソフトウェア(例えば、DNASTAR社製のMapDrawプログラム)を使用して行うことができる。
【００８３】
任意のプロテアーゼ切断部位を本発明のポリペプチドにおける第1のプロテアーゼ切断部位及び/又は第2のプロテアーゼ切断部位として使用することができるが、以下のプロテアーゼ切断部位が好ましい。
エンテロキナーゼ (DDDDK↓)
第Xa因子 (IEGR↓/IDGR↓)
タバコエッチ病ウイルス(TEV) (ENLYFQ↓G)
トロンビン (LVPR↓GS)
PreScission (LEVLFQ↓GP)
【００８４】
プロテアーゼ切断部位のその他の例としては、例えば、植物パパイン切断部位、昆虫パパイン切断部位、甲殻類パパイン切断部位、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ切断部位、ヒト腸内ウイルス3Cプロテアーゼ切断部位、タバコエッチ病ウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位、タバコベインモットリングウイルス(TVMV)切断部位、ズブチリシン切断部位、ヒドロキシルアミン切断部位及びカスパーゼ3切断部位が挙げられる。
【００８５】
また、「プロテアーゼ切断部位」という用語には、自己切断配列であるインテインも含まれる。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変化させることによって制御することができる。また、「プロテアーゼ切断部位」という用語には、非細胞毒性プロテアーゼ(例えば、クロストリジウム神経毒)が作用する切断配列も含まれる。そのような切断部位の例としては、SNAREタンパク質切断部位配列が挙げられる。様々な非細胞毒性プロテアーゼの固有の切断部位認識配列については後述する。
【００８６】
第1及び第2の切断部位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。第1及び第2の切断部位は、同一のプロテアーゼ(のみ)又は異なるプロテアーゼによって切断されてもよい。
【００８７】
本発明の別の態様として、上述した切断部位/プロテアーゼは、「破壊性」切断部位/プロテアーゼ(後述)として本発明のポリペプチドに組み込むことができる。
【００８８】
一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分と転位ドメイン成分は一本鎖ポリペプチドにおいてジスルフィド結合によって結合している。従って、第1のプロテアーゼ切断部位の切断後、ポリペプチドは、プロテアーゼと転位成分がジスルフィド結合によって結合した二本鎖立体構造を有する。上記切断反応によって向上した(例えば、最適の)プロテアーゼ活性を有する非細胞毒性プロテアーゼ成分が得られるため、上記切断反応は通常は「活性化」工程と呼ばれる。
【００８９】
一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分は、融合タンパク質の転位ドメイン成分と共有結合を形成する。例えば、一実施形態において、共有結合を形成するプロテアーゼ成分のアミノ酸残基は、プロテアーゼ成分の最後の20個、好ましくは最後の10個のC末端アミノ酸残基内に位置する。同様に、一実施形態において、共有結合の第2の部分を形成する転位成分のアミノ酸残基は、転位成分の最初の20個、好ましくは最初の10個のN末端アミノ酸残基内に位置する。
【００９０】
上述した共有結合の構成には、プロテアーゼ及び転位成分が天然の非細胞毒性プロテアーゼ(例えば、天然のクロストリジウム神経毒)と同様に配列されるという利点がある。比較として、天然のクロストリジウム神経毒の一次アミノ酸配列を参照すると、各システインアミノ酸残基は8〜27個のアミノ酸残基によって分離されている(Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Chapter 9, The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer)。
【００９１】
【表１】
0006050330.tif 000013
【００９２】
一実施形態において、本発明の一本鎖融合タンパク質の非細胞毒性プロテアーゼ成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、30、25、20、15又は10個以下のアミノ酸残基によって分離されている。一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において5、4、3、2又1個のアミノ酸残基によって分離されている。別の実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において0個のアミノ酸残基によって分離されている。
【００９３】
従って、一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼと第1のプロテアーゼ切断部位は第1のスペーサー配列によって分離されていてもよく、第1のスペーサー配列は、第1のプロテアーゼ切断部位のN末端と非細胞毒性プロテアーゼ成分のC末端との間に位置する。一実施形態において、第1のスペーサー配列は、第1のプロテアーゼ切断部位の一部又は全てを含むか、非細胞毒性プロテアーゼ成分の一部であってもよい。
【００９４】
一実施形態において、一本鎖融合タンパク質の転位ドメイン(又はTM)成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、30、25、20、15又は10個以下のアミノ酸残基によって分離されている。一実施形態において、転位ドメイン(又はTM)成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において5、4、3、2又1個のアミノ酸残基によって分離されている。別の実施形態において、転位ドメイン(又はTM)成分と第1のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において0個のアミノ酸残基によって分離されている。
【００９５】
従って、一実施形態において、転位ドメイン(又はTM)と第1のプロテアーゼ切断部位は第1のスペーサー配列によって分離されていてもよく、第2のスペーサー配列は、第1のプロテアーゼ切断部位のC末端と転位ドメイン(又はTM)成分のN末端との間に位置する。第2のスペーサー配列は、非細胞毒性プロテアーゼと第1のプロテアーゼ切断部位を分離する第1のスペーサー配列と同一であってもよく、異なっていてもよい。一実施形態において、第2のスペーサー配列は、第2のプロテアーゼ切断部位の一部又は全てを含むか、転位ドメイン成分の一部であってもよい。
【００９６】
一実施形態において、一本鎖融合タンパク質の転位ドメイン成分と第2のプロテアーゼ切断部位成分は、30、25、20、15又は10個以下のアミノ酸残基によって分離されている。一実施形態において、転位ドメイン成分と第2のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において5、4、3、2又1個のアミノ酸残基によって分離されている。別の実施形態において、転位ドメイン成分と第2のプロテアーゼ切断部位成分は、一本鎖融合タンパク質において0個のアミノ酸残基によって分離されている。
【００９７】
従って、一実施形態において、転位ドメインと第2のプロテアーゼ切断部位は第3のスペーサー配列によって分離されていてもよく、第3のスペーサー配列は、転位ドメインのN末端又はC末端に位置する。第3のスペーサー配列は、第1及び第2のスペーサー配列と同一であってもよく、異なっていてもよい。一実施形態において、第3のスペーサー配列は、第2のプロテアーゼ切断部位の一部又は全てを含むか、転位ドメイン成分の一部であってもよい。
【００９８】
一実施形態において、ターゲティング部分と第2のプロテアーゼ切断部位は、30、25、20、15又は10個以下のアミノ酸残基によって分離されている。一実施形態において、ターゲティング部分と第2のプロテアーゼ切断部位は、一本鎖融合タンパク質において5、4、3、2又1個のアミノ酸残基によって分離されている。別の実施形態において、ターゲティング部分と第2のプロテアーゼ切断部位は、一本鎖融合タンパク質において0個のアミノ酸残基によって分離されている。
【００９９】
従って、第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、ポリペプチドは、複合体の残りの部分から実質的に遊離したN末端ドメインとC末端ドメインを有するターゲティング部分を備える。これにより、ターゲティング部分のN末端及びC末側成分と標的細胞上の結合部位との相互作用を促進することができる。
【０１００】
一実施形態において、ターゲティング部分と第2のプロテアーゼ切断部位は第4のスペーサー配列によって分離されていてもよく、第4のスペーサー配列は、ターゲティング部分のN末端又はC末端に位置する。第4のスペーサー配列は、第1、第2及び第3のスペーサー配列の1つ又は2つ又は全てと同一であってもよく、異なっていてもよい。一実施形態において、第4のスペーサー配列は、第2のプロテアーゼ切断部位の一部又は全てを含むか、転位ドメイン成分の一部であってもよい。
【０１０１】
一実施形態において、(第1のプロテアーゼ切断部位を切断する)第1のプロテアーゼは(第2のプロテアーゼ切断部位を切断する)第2のプロテアーゼと同一である。
【０１０２】
従って、一実施形態において、一本鎖ポリペプチド融合タンパク質を1種類のプロテアーゼで処理することにより、第1及び第2のプロテアーゼ切断部位の両方で切断が生じ得る。
【０１０３】
様々な異なるスペーサー分子を本発明の融合タンパク質に使用することができる。そのようなスペーサー分子の例としては、GS5、GS10、GS15、GS20、GS25及びHx27が挙げられる。
【０１０４】
共有結合
【０１０５】
本発明のポリペプチド融合タンパク質は、非細胞毒性プロテアーゼ成分と融合タンパク質の残りの部分との間の共有結合と、ターゲティング部分と転位ドメインとの間の共有結合と、を含む。第1又は第2のプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解切断後、2つの共有結合は元の状態で残っている。一実施形態において、共有結合はペプチド結合ではない(すなわち、共有結合は非ペプチド結合である)。例えば、一実施形態において、共有結合の一方又は両方はジスルフィド結合である。
【０１０６】
第2のプロテアーゼ切断部位におけるタンパク質分解切断後、共有結合は元の状態で残っている。第2のプロテアーゼ切断部位における切断により、ターゲティング部分のN末端(又はC末端)が露出する。従って、第2のプロテアーゼ切断部位における切断により、遊離N末端と遊離C末端を有するターゲティング部分が得られる。
【０１０７】
第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、ターゲティング部分と転位ドメインとの間のペプチド結合は切断されているため、ターゲティング部分成分は転位ドメインと同一のポリペプチド鎖の一部ではない。しかしながら、ターゲティング部分は共有結合によって転位ドメインに結合している。
【０１０８】
共有結合は、ポリペプチド鎖における2個のアミノ酸残基の間に形成することができる任意の共有結合を含むことができる。
【０１０９】
一実施形態において、共有結合はジスルフィド結合である。ジスルフィド結合は、ポリペプチドに存在する任意の2個のチオール(-SH)基の間に形成されてもよい。例えば、ジスルフィド結合は、ポリペプチド鎖における2個のシステイン残基(又はその機能的に等価な変異体)の間に形成されてもよい。
【０１１０】
従って、一実施形態において、転位ドメイン成分内に位置するシステイン残基がターゲティング部分成分内に位置する別のシステイン残基と共有結合を形成する。第2のプロテアーゼ切断部位における切断後、ジスルフィド結合は元の状態で残っている。
【０１１１】
転位ドメイン成分及びターゲティング部分成分内に位置し、共有結合によって結合するアミノ酸残基は、これらの成分内に天然に存在していてもよい。従って、一実施形態において、転位ドメイン成分内に存在するアミノ酸残基がターゲティング部分成分内に存在するアミノ酸残基との間で共有結合を形成する。あるいは、前記アミノ酸残基の一方又は両方が転位ドメイン成分及び/又はターゲティング部分成分に導入されてもよい。アミノ酸残基は置換として導入されてもよい。
【０１１２】
一実施形態において、共有結合は、転位ドメイン成分内に存在するシステイン残基とターゲティング部分成分内に存在するシステイン残基との間で形成されたジスルフィド結合である。別の実施形態において、転位ドメイン成分とターゲティング部分成分との間におけるジスルフィド結合の形成を容易又は可能とするために、システイン残基を転位ドメイン及びターゲティング部分の一方又は両方に導入する。
【０１１３】
一実施形態において、1個以上のシステイン残基をTM及び/又は転位ドメインに導入する。この場合、導入されたシステイン残基は、2個の小さなアキラルアミノ酸残基(グリシン及び/又はアラニン等)と隣接していてもよい。そのようなアミノ酸残基を使用することにより、即時の三次構造を回避し、ジスルフィド結合を容易に形成することができる。小さなアキラルアミノ酸残基は最初から存在していてもよく、TM及び/又は転位ドメインに導入してもよい。
【０１１４】
一実施形態において、共有結合に加えて、転位ドメインとターゲティング部分との間には、二次ポリペプチド構造を構成する短いポリペプチド(例えば、1〜20、1〜10又は5〜10個のアミノ酸残基)が位置する。そのような二次ポリペプチド構造によって転位ドメインとターゲティング部分を位置決めし、(1) TMと転位ドメインとの間の共有結合の形成及び/又は(2) C末端及びN末端が転位成分と反対方向を向くようなTMの位置決めを行うことができる。
【０１１５】
従って、一実施形態において、二次ポリペプチド構造はターゲティング部分の一部を転位ドメインに対して近接させるように作用し、共有結合の形成をエネルギー的により有利にする。
【０１１６】
一実施形態において、二次ポリペプチド構造を形成することができるポリペプチドは、プロリン残基等の少なくとも1個の嵩高なアミノ酸残基を含むポリペプチド配列である。
【０１１７】
従って、一実施形態において、転位ドメインとターゲティング部分との間には、少なくとも1個の嵩高なアミノ酸残基を含むポリペプチドが位置する。嵩高なアミノ酸残基により、ターゲティング部分の一部を転位ドメインに対して近接させるようにポリペプチド鎖に曲げ部を形成することができる。
【０１１８】
転位ドメイン成分とTM成分との間の共有結合と同様に、非細胞毒性プロテアーゼ成分と融合タンパク質の残りの部分(例えば、転位成分及び/又はTM成分)との間の対応する共有結合を形成することができる。上述したように、1個以上の二次構造及び/又は1個以上の嵩高なアミノ酸残基を導入することができる。
【０１１９】
一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分と融合タンパク質の残りの部分との間の共有結合は、非細胞毒性プロテアーゼ成分と転位ドメイン成分との間に位置する。一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼ成分と転位ドメイン成分との間の共有結合は、各成分に位置する天然のシステイン残基(例えば、上述したシステイン残基の1個以上)によるものである。あるいは、1個以上の適当なシステイン残基を各成分に導入してもよい。
【０１２０】
融合タンパク質は、プロテアーゼ成分に対してN末端及び/又は転位成分に対してC末端に位置する1以上の精製タグを含むことができる。
【０１２１】
任意の精製タグを使用することができるが、以下の精製タグが好ましい。
好ましくはC末端及び/又はN末端タグとしてのHisタグ(例えば6×ヒスチジン)
好ましくはN末端タグとしてのマルトース結合タンパク質(MBP)タグ
好ましくはN末端タグとしてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)タグ
好ましくはN末端タグとしてのHis-MBPタグ
好ましくはN末端タグとしてのGST-MBPタグ
好ましくはN末端タグとしてのチオレドキシンタグ
好ましくはN末端タグとしてのキチン結合ドメイン(CBD)タグ
【０１２２】
治療用途
【０１２３】
TM成分は、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の治療分子を所望の標的細胞に移動させる。
【０１２４】
例えば、本願明細書に記載するTM(オピオイドペプチド、β-エンドルフィンペプチド、ブラジキニンペプチド、BAMペプチド、ノシセプチンペプチド、ダイノルフィンペプチド、ガラニンペプチド、エンケファリンペプチド、P物質ペプチド等)は、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の治療分子を疼痛を感じる細胞(例えば、一次感覚求心性神経)に移動させる。融合タンパク質はこのようにして疼痛を抑制するための治療分子を供給する(WO2006/059093、WO2007/138339及びWO96/33273を参照(これらの文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。
【０１２５】
本願明細書に記載するTMは、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子を神経性炎症を促進する細胞に移動させるために使用することができる。従って、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子は、神経性炎症を抑制するための治療分子として機能する(WO2010/138395、WO2010/138392、WO2010/138387、WO2010138382及びWO2010/138379を参照(これらの文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。そのようなTSI分子及び療法における使用のために好ましいTMとしては、ノシセプチン及びダイノルフィン等のオピオイドTMが挙げられる。
【０１２６】
本願明細書に記載するTMは、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子を過活動膀胱等の泌尿生殖器の神経障害を促進する細胞に移動させるために使用することができる。従って、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子は、過活動膀胱等の泌尿生殖器の神経障害を抑制するための治療分子として機能する(WO2010/138393、WO2010/138389、WO2010/138384及びWO2010/138366を参照(これらの文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。そのようなTSI分子及び療法における使用のために好ましいTMとしては、ノシセプチン及びダイノルフィン等のオピオイドTMが挙げられる。
【０１２７】
ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)ペプチド、CRFペプチド、GRPペプチド、ノイロメジンBペプチド、ボンベシンペプチド、ガストリンペプチド、CCKペプチド、SSTペプチド、CSTペプチド及びGHRHペプチド等のTMは、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子を癌を促進する細胞又は癌細胞自体に向かわせるために使用することができる。従って、本発明の標的分泌阻害剤(TSI)の分子は、先端巨大症及びクッシング病等の神経内分泌異常並びに癌、(例えば、肺癌、腎臓癌、脳腫瘍、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、副腎癌、食道癌、リンパ腫、白血病、急性白血病、膀胱癌、骨癌、腸癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、皮膚癌、中咽頭癌、骨髄腫、前立腺癌、胃癌、精巣癌、子宮癌又はカポジ肉腫)を抑制するための治療分子として機能する(WO2009/150489、WO2009/150470及びWO2010/055358を参照(これらの文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。そのようなTSI分子及び療法における使用のために好ましいTMとしては、GHRHペプチド、SSTペプチド及びCSTペプチドが挙げられる。
【０１２８】
破壊性切断部位
【０１２９】
本発明のポリペプチドは、非標的領域への分散に伴う望ましくない副作用を減少又は防止するためにさらに改変することができる。本実施形態によれば、当該ポリペプチドは破壊性切断部位を含む。破壊性切断部位は、活性化部位(二本鎖形成)及び第2のプロテアーゼ切断部位(遊離C末端及びN末端ドメインを有するTMの形成)とは異なる。破壊性切断部位は、第3のプロテアーゼによって切断され、第1又は第2のプロテアーゼによっては切断されない。また、第3のプロテアーゼによって破壊性切断部位において切断されると、本発明のポリペプチドは低い効能(例えば、所望の標的細胞への低い結合能、低い転位作用及び/又は低い非細胞毒性プロテアーゼ活性)を示す。例えば、WO 2010/094905及びWO 02/044199を参照されたい(これらの文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)。
【０１３０】
従って、本実施形態によれば、本発明は、標的場所以外の位置において制御された方法で不活性化及び/又は破壊されるポリペプチドを提供する。
【０１３１】
一実施形態において、破壊性切断部位は、循環性プロテアーゼ(例えば、血清プロテアーゼ又は血液凝固カスケードのプロテアーゼ等の細胞外プロテアーゼ)、組織関連プロテアーゼ(例えば、筋肉のマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)等のMMP)及び細胞内プロテアーゼ(好ましくは、標的細胞に存在しないプロテアーゼ))から選択される第3のプロテアーゼ(破壊性プロテアーゼ)によって認識・切断される。本発明のポリペプチドは、使用時には目的とする標的細胞から離れるように分散及び/又は非標的細胞によって取り込まれるが、破壊性切断部位の(第3のプロテアーゼによる)切断によって不活性化される。
【０１３２】
マトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)は、本発明において好ましい破壊性プロテアーゼである。MMPではADAM17(EC 3.4.24.86(TACEとしても知られる))が好ましく、ADAM17は様々な膜繋留細胞表面タンパク質を切断して細胞外ドメインを「除去」する。MMPとしては、アダマライシン、セラライシン及びアスタシンも好ましい。その他の好ましい破壊性プロテアーゼとしては、トロンビン、血液凝固因子VIIa、血液凝固因子IXa、血液凝固因子Xa、血液凝固因子XIa、血液凝固因子XIIa、カリクレイン、プロテインC及びMBP関連セリンプロテアーゼ等の哺乳動物の血液プロテアーゼが挙げられる。
【０１３３】
本発明の第2の態様は、上述したポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。
【０１３４】
本発明の好適な態様において、DNA配列はDNAベクターの一部として調製し、ベクターはプロモーターとターミネーターを含む。上述したポリペプチド融合タンパク質をコードするDNA配列はプロモーターの下流に位置し、ターミネーターは核酸配列の下流に位置する。
【０１３５】
好適な実施形態では、ベクターは以下から選択されるプロモーターを有する。
【０１３６】
【表２】
0006050330.tif 000014
【０１３７】
本発明のDNA構築物は好ましくはコンピューター内で設計し、従来のDNA合成技術によって合成する。
【０１３８】
上記DNA配列情報は、最終的な宿主細胞(例えば、大腸菌)発現系に応じてコドンバイアスするように任意に変更する。
【０１３９】
DNAバックボーンは、転写・翻訳された場合に、ペプチドコード配列によってコードされる第2のプロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列を生成する、任意の固有の核酸配列についてスクリーニングすることが好ましい。上記スクリーニングは、手動で行うか、コンピューターソフトウェア(例えば、DNASTAR社製のMapDrawプログラム)を使用して行うことができる。
【０１４０】
本発明の別の実施形態は、上述した一本鎖ポリペプチド融合タンパク質の製造方法であって、宿主細胞内において上述した融合タンパク質をコードする核酸配列又は上述したDNAベクターを発現させることを含む方法を提供する。
【０１４１】
本発明の別の実施形態は、
a. 本発明の一本鎖ポリペプチド融合タンパク質を含む溶液を用意し、
b. 第1のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第1のプロテアーゼと、第2のプロテアーゼ切断部位を切断することができる第2のプロテアーゼと、を前記溶液に添加し、
c. 前記第1のプロテアーゼ切断部位と前記第2のプロテアーゼ切断部位を切断して三本鎖融合タンパク質を形成することを含む、非細胞毒性薬物の製造方法を提供する。
【０１４２】
一実施形態において、第1のプロテアーゼと第2のプロテアーゼは順次添加する。別の実施形態において、第1のプロテアーゼを添加する前に第2のプロテアーゼを添加する。別の実施形態において、第1のプロテアーゼと第2のプロテアーゼを同時に添加する。
【０１４３】
本態様は、三本鎖ポリペプチドを提供する。具体的には、得られる三本鎖ポリペプチドは、
a. 第1の鎖は、標的細胞のエキソサイトーシス融合機構のタンパク質を切断することができる非細胞毒性プロテアーゼ又はそのフラグメントを含み、
b. 第2の鎖は、前記プロテアーゼ又はフラグメントを、エンドソーム内からエンドソーム膜を透過して前記標的細胞のサイトゾル内に転位させることができる転位ドメインを含み、
c. 第3の鎖は、エンドサイトーシスによって前記標的細胞内のエンドソームに取り込まれる前記標的細胞上の結合部位に結合することができるターゲティング部分を含み、
d. 第1及び第2の鎖はジスルフィド結合によって結合しており、第2及び第3のドメインは非ペプチド共有結合によって結合している構造を通常は有する。
【０１４４】
ポリペプチドの送達
【０１４５】
本発明の別の態様は、医学的状態を治療、予防又は改善させるための、上述した一本鎖ポリペプチド融合タンパク質又は上述した非細胞毒性ポリペプチドの使用を提供する。
【０１４６】
本発明においては、ポリペプチドと、製薬学的に許容し得る担体、賦形剤、助剤、噴射剤及び/又は塩から選択される少なくとも1種の成分と、を含む医薬組成物を採用する。
【０１４７】
本発明のポリペプチドは、経口、非経口、連続注入、吸入又は局所投与用に製剤化することができる。注入に適した組成物は、溶液、懸濁液、乳液又は使用前に適当な賦形剤に溶解又は懸濁させる乾燥粉末とすることができる。
【０１４８】
局所送達手段としては、エアロゾル又はその他の噴霧(例えば、噴霧器)が挙げられる。ポリペプチドのエアロゾル製剤を使用する場合には、肺及び/又は鼻及び/又は気管支又は気道にポリペプチドを送達することができる。好ましい投与経路は、全身(例えば、点滴)、腹腔鏡下及び/又は局所注入(例えば、腫瘍等の標的細胞への直接的な蝶型骨髄注入)である。
【０１４９】
注入用製剤は、投与部位にポリペプチドを留めたり、投与部位からのポリペプチドの移動を減少させるために薬理活性物質を必要に応じて含むことができる。このような薬理活性物質の例としては、アドレナリン等の血管収縮剤が挙げられる。そのような製剤には、投与後のポリペプチドの滞留時間を増加させ、ポリペプチドの作用を増加及び/又は高めるという利点がある。
【０１５０】
本発明のポリペプチドの投与量は、所望の治療効果を生じる範囲とする。必要とされる投与量の範囲は、ポリペプチド又は組成物の正確な特性、投与経路、製剤の特性、患者の年齢、患者の状態の性質、程度又は重症度、禁忌及び主治医の判断に応じて異なる。投与量は、標準的な経験的最適化方法を使用して調節することができる。
【０１５１】
適当な1日あたりの投与量(患者の体重1kgあたり)は、0.0001〜1mg/kg、好ましくは0.0001〜0.5mg/kg、より好ましくは0.002〜0.5mg/kg、特に好ましくは0.004〜0.5mg/kgの範囲である。単位用量は、1μg未満から30mgの範囲とすることができるが、通常は1回の投与あたり0.01〜1mgであり、毎日又は好ましくはより少ない頻度(毎週又は6カ月毎等)で投与することができる。特に好ましい投与計画では1×用量として2.5ngのポリペプチドを基本とする。この場合、好ましい用量は1×〜100×(2.5〜250ng)の範囲である。
【０１５２】
流体剤形は、通常はポリペプチドと発熱物質を含まない無菌賦形剤を使用して調製する。ポリペプチドは、使用する賦形剤及び濃度に応じて賦形剤に溶解又は懸濁させることができる。溶液を調製する場合には、ポリペプチドを賦形剤に溶解させ、必要に応じて塩化ナトリウムを添加して溶液を等張とし、無菌技法を使用した滅菌フィルタによる濾過によって滅菌した後、適当な滅菌バイアル又はアンプルに充填して密閉する。溶液の安定性が十分な場合には、密閉容器に入れた溶液を高圧蒸気殺菌法によって滅菌してもよい。有利には、緩衝液、可溶化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、懸濁化剤又は乳化剤及び/又は局所麻酔薬等の添加剤を賦形剤に溶解させることができる。
【０１５３】
使用前に適当な賦形剤に溶解又は懸濁させる乾燥粉末は、滅菌領域において無菌技法を使用して予め滅菌した成分を滅菌容器に充填することによって調製することができる。成分は、滅菌領域において無菌技法を使用して適切な容器内に溶解させてもよい。次に、溶液を凍結乾燥させ、容器を無菌的に密閉する。
【０１５４】
筋内、皮下又は皮内注射に適した非経口懸濁液は、滅菌成分を溶解させる代わりに滅菌賦形剤に懸濁させ、滅菌を濾過によって行わないこと以外は実質的に同じ方法で調製する。成分は、滅菌状態で単離するか、単離後にガンマ線照射によって滅菌することができる。
【０１５５】
有利には、ポリビニルピロリドン等の懸濁化剤を組成物に添加して成分を均一に分散させる。
【０１５６】
定義
【０１５７】
ターゲティング部分(TM)とは、結合部位と機能的に相互作用して本発明のポリペプチドと標的細胞の表面との間の物理的会合を生じさせる任意の化学構造を意味する。TMという用語は、標的細胞上の結合部位と結合することができる任意の分子(天然分子又は化学的/物理的に改変されたその変異体)を包含し、結合部位は内在化(例えば、エンドソーム形成)が可能である(受容体媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる)。TMはエンドソーム膜転位機能を有していてもよく、この場合には、本発明の作用薬中に別々のTMと転位ドメイン成分が存在していなくてもよい。具体的なTMについては上述した通りである。上述したTMは単に例示であり、本発明は、例示したTMの基本的な結合(標的)能力を有するあらゆる変異体及び誘導体を包含する。
【０１５８】
上述したように、好ましいTMとしては、抗体(例えば、抗体フラグメント)及び結合性足場、特に標的細胞との結合(例えば、特異的な結合)のために設計された市販の抗体/フラグメント及び足場が挙げられる。
【０１５９】
タンパク質足場は、レパートリーが拡大しつつあるscFv、Fab分子、dAb(単一ドメイン抗体)、ラクダ抗体、ダイアボディ及びミニボディ等の治療用モノクローナル抗体及び誘導体を補完する次世代の普遍的な結合フレームワークであり、いずれも本発明のTMとして使用することができる。足場系は、新規な足場の作製又は既知のタンパク質結合ドメインの改変によってタンパク質認識ドメインを作製又は改変する。そのような足場としては、例えば、以下の足場が挙げられる。
(i)プロテインAに基づく足場-アフィボディ(Nord, K. et al., 1997, “Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain”.Nat Biotechnol 15, 772-777)
(ii)リポカリンに基づく足場-アンチカリン(Skerra, 2008, “Alternative binding proteins: anticalins - harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities”, FEBS J. 275:2677-83)
(iii)フィブロネクチンに基づく足場-アドネクチン(Dineen et al., 2008, “The Adnectin CT-322 is a novel VEGF receptor 2 inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer”, BMC Cancer 8:352)
(iv)アビマー(Silverman et al., 2005, “Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domains”, Nat Biotechnol 23:1556-61)
(v)アンキリンに基づく足場-ダルピン(Zahnd et al., 2006, “Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins”, J Biol Chem. 281:35167-75)
(vi) CDRと類似するループを有するIgドメインとの有意な構造的相同性を有するタンパク質折り畳みに基づくセンチリン足場。Igドメインは、ヒトタンパク質における共通したモジュールであり、代替足場タンパク質として広く用いられている。上記刊行物の記載内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する。
【０１６０】
結合性足場は、特定の細胞表面タンパク質、受容体又は糖基等のその他の細胞表面エピトープとの相互作用によって特定の細胞型を標的とするために使用することができる。そのような改変足場は、本発明のポリペプチドに基づく組換え非細胞毒性プロテアーゼに組み込むことができる。
【０１６１】
本発明のTMは、標的細胞に(好ましくは特異的に)結合する。「特異的に結合する」という用語は、好ましくは、所与のTMが、106 M-1以上、好ましくは107 M-1以上、より好ましくは108 M-1以上、最も好ましくは109 M-1以上の結合親和性(Ka)で標的細胞と結合することを意味する。
【０１６２】
本願明細書における「TM」という用語は、標的細胞と結合する能力を有するそのフラグメント及び変異体を含む。例えば、変異体は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97%又は少なくとも99%の、TMとのアミノ酸配列相同性を有することができる。すなわち、変異体は、アミノ酸(例えば、非天然アミノ酸)の1以上の類似体又は置換結合を含むことができる。また、例えば、TMに関連して使用する場合のフラグメントという用語は、TMのアミノ酸残基の少なくとも10個、好ましくは少なくとも20個、より好ましくは少なくとも30個、最も好ましくは少なくとも40個を有するペプチドを意味する。また、フラグメントという用語は上述した変異体にも関連する。例えば、本発明のフラグメントは、少なくとも10、20、30又は40個のアミノ酸を有するペプチド配列を含むことができ、ペプチド配列は、参照ペプチドの対応するペプチド配列の(連続する)アミノ酸に対して少なくとも80%の配列相同性を有する。
【０１６３】
通常の方法を使用して、TMが、選択された標的細胞と結合することを確認することができる。例えば、標的細胞を代表する組織又は細胞を過剰の未標識TMの存在下において標識(例えば、トリチウム化)TMに曝露する放射活性置換実験を使用することができる。このような実験において、非特異的結合と特異的結合の相対的な割合を評価することにより、TMが標的細胞と結合することを確認できる。必要に応じて、アッセイは1以上の結合アンタゴニストを使用してもよく、TM結合の喪失を観察することをさらに含んでいてもよい。この種の実験の例は、Hulme, E.C.(1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp.303-311, Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Pressに記載されている。
【０１６４】
本発明において使用する「ペプチドTM」という用語は、対応する「参照」TMと同一の受容体に結合するペプチド類似体を含む。類似体は、以下のような合成残基を含むことができる。
β-Nal=β-ナフチルアラニン
β-Pal=β-ピリジルアラニン
hArg(Bu)=N-グアニジノ-(ブチル)-ホモアルギニン
hArg(Et)2=N, N’-グアニジノ-(ジメチル)-ホモアルギニン
hArg(CH2CF3)2=N, N’-グアニジノ-ビス-(2,2,2, -トリフルオロエチル)-ホモアルギニン
hArg(CH3, ヘキシル)=N, N’-グアニジノ-(メチル, ヘキシル)-ホモアルギニン
Lys(Me)=Ne-メチルリジン
Lys(iPr)=Ne-イソプロピルリジン
AmPhe=アミノメチルフェニルアラニン
AChxAla=アミノシクロヘキシルアラニン
Abu=α-アミノ酪酸
Tpo=4-チアプロリン
MeLeu=N-メチルロイシン
Orn=オルニチン
Nle-ノルロイシン
Nva=ノルバリン
Trp(Br)=5-ブロモトリプトファン
Trp(F)=5-フルオロトリプトファン
Trp(NO2)=5-ニトロトリプトファン
Gaba=γ-アミノ酪酸
Bmp=J-メルカプトプロピオニル
Ac=アセチル
Pen=ペンシラミン
【０１６５】
本発明のポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の機能的HC又はHCCドメインが欠失したものであってもよい。その場合、当該ポリペプチドは、結合検定(Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82)において(クロストリジウムHC成分を介して)ラットシナプトゾーム膜と結合することができない。一実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の完全毒素の最後の50個のC末端アミノ酸が欠失している。別の実施形態において、ポリペプチドは、クロストリジウム神経毒の完全毒素の最後の100、150、200、250又は300個のC末端アミノ酸が欠失している。あるいは、HC結合活性は突然変異生成によって無効化又は減少させることができ、例えば、BoNT/Aの場合には、ガングリオシド結合ポケットの1又は2個のアミノ酸残基突然変異(W1266からL、Y1267からF)の改変により、HC領域は受容体結合機能を失う。同様な突然変異を血清型Aでないクロストリジウムペプチド成分に対して生成することもできる(例えば、突然変異を伴うボツリヌスB(W1262からL、Y1263からF)又はボツリヌスE(W1224からL、Y1225からF)に基づく構造物)。活性部位に対するその他の突然変異によってHC受容体結合活性の同じような消失を達成することができる(例えば、ボツリヌスA型におけるY1267S及び他のクロストリジウム神経毒における対応する高度に保存された残基)。上記突然変異及びその他の突然変異の詳細は、Rummel et al. (2004)(Molecular Microbiol. 51:631-634)に記載されている(本文献の記載内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)。
【０１６６】
天然のクロストリジウム神経毒のHCペプチドは、約400〜440個のアミノ酸残基を含み、それぞれ約25kDaの2つの機能的に異なるドメイン、すなわち、N末端領域(通常はHCNペプチド又はドメインと呼ばれる)及びC末端領域(通常はHCCペプチド又はドメインと呼ばれる)からなる。C末端の160〜200個のアミノ酸残基を構成するC末端領域(HCC)は、クロストリジウム神経毒による本来の細胞受容体、すなわち、神経筋接合部における神経終末との結合に関与することが報告されている。従って、クロストリジウム重鎖に機能的重鎖HCペプチド(又はドメイン)が欠失しており、天然のクロストリジウム神経毒が結合する細胞表面受容体にクロストリジウム重鎖が結合することができないということは、クロストリジウム重鎖に機能的HCCペプチドが単純に欠失していることを意味する。すなわち、HCCペプチド領域は、部分的又は全体的に欠失しているか、神経筋接合部における神経終末に対する結合能を不活性化するように(例えば、従来の化学的又はタンパク質分解処理によって)改変されている。
【０１６７】
一実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)の一部が欠失しており、天然のクロストリジウム神経毒のHC結合機能を有していない。例えば、一実施形態において、C末端伸長クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖の40個のC末端アミノ酸残基又は60個のC末端アミノ酸残基又は80個のC末端アミノ酸残基又は100個のC末端アミノ酸残基又は120個のC末端アミノ酸残基又は140個のC末端アミノ酸残基又は150個のC末端アミノ酸残基又は160個のC末端アミノ酸残基が欠失している。一実施形態において、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒のC末端ペプチド部分(HCC)の全体が欠失しており、天然のクロストリジウム神経毒のHC結合機能を有していない。例えば、一実施形態において、クロストリジウムHNペプチドは、クロストリジウム神経毒重鎖の165個のC末端アミノ酸残基又は170個のC末端アミノ酸残基又は175個のC末端アミノ酸残基又は180個のC末端アミノ酸残基又は185個のC末端アミノ酸残基又は190個のC末端アミノ酸残基又は195個のC末端アミノ酸残基が欠失している。例えば、本発明のクロストリジウムHNペプチドは、以下の群から選択されるクロストリジウムHCC参照配列が欠失している。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1111〜L1296)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1098〜E1291)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1112〜E1291)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1099〜E1276)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1086〜K1252)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1106〜E1274)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(Y1106〜E1297)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(Y1128〜D1315)。
【０１６８】
上記参照配列は、亜血清型に応じてわずかな変動が生じ得るために指針とみなすべきである。
【０１６９】
本発明のプロテアーゼは、真核細胞のエキソサイトーシス融合機構の1以上のタンパク質を切断することができる、あらゆる非細胞毒性プロテアーゼを含む。本発明のポリペプチドは、好ましくは細菌プロテアーゼ(又はそのフラグメント)である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム又はナイセリア/ストレプトコッカス属(例えば、クロストリジウムL鎖又はナイセリアIgAプロテアーゼ、好ましくは淋菌又は肺炎球菌)から選択される。
【０１７０】
本発明は、必要なプロテアーゼ活性を示す変異非細胞毒性プロテアーゼ(すなわち、天然に存在するプロテアーゼ分子の変異体)も含む。例えば、変異体は、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%又は少なくとも98%の、参照プロテアーゼ配列とのアミノ酸配列相同性を有することができる。すなわち、変異体という用語は、エンドペプチダーゼ活性が増進(又は減少)した非細胞毒性プロテアーゼを含み、特に、BoNT/A変異体Q161A、E54A及びK165LのKcat/Kmの増加が挙げられる(Ahmed, S.A.(2008), Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8を参照(本文献の記載内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する))。プロテアーゼに関連して使用する場合のフラグメントという用語は、参照プロテアーゼの少なくとも150個、好ましくは少なくとも200個、より好ましくは少なくとも250個、最も好ましくは少なくとも300個のアミノ酸残基を有するペプチドを通常は意味する。上述したTM「フラグメント」成分と同様に、本発明のプロテアーゼフラグメントは、参照配列に基づく変異プロテアーゼのフラグメントを含む。
【０１７１】
本発明のプロテアーゼは、セリン又はメタロプロテアーゼ活性(例えば、エンドペプチダーゼ活性)を示すことが好ましい。プロテアーゼは、好ましくは、SNAREタンパク質(例えば、SNAP-25、シナプトブレビン/VAMP又はシンタキシン)に特異的である。
【０１７２】
特に、神経毒のプロテアーゼドメイン、例えば、細菌神経毒のプロテアーゼドメインが挙げられる。従って、本発明は、天然に存在する神経毒ドメイン及び天然に存在する神経毒の組換えにより調製されたドメインの使用を含む。神経毒の例としては、クロストリジウムにより生成される神経毒が挙げられ、クロストリジウム神経毒という用語は、破傷風菌によって生成される神経毒(TeNT)及び血清型A〜Gボツリヌス菌によって生成される神経毒(BoNT)並びにC. baratii及び酪酸菌によって生成される密接に関連するBoNT様神経毒を含む。上記略語は、本願明細書全体において使用する。例えば、BoNT/Aという名称は、神経毒の供給源がBoNT(血清型A)であることを示す。
【０１７３】
BoNTは、1つのジスルフィド結合によって約50kDaの軽鎖(L鎖)と共有結合した約100kDaの重鎖(H鎖)からなる約150kDaの二本鎖タンパク質としての共通の構造を共有する。H鎖は、それぞれ約50kDaの2つのドメインからなる。C末端ドメイン(HC)は高親和性神経結合に必要であり、N末端ドメイン(HN)は膜転位に関与することが報告されている。L鎖は、基質であるSNAREタンパク質の切断を担う亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。
【０１７４】
「L鎖フラグメント」という用語は、神経毒のL鎖の成分を意味し、L鎖フラグメントはメタロプロテアーゼ活性を示し、細胞性開口分泌に関与する小胞及び/又は細胞膜関連タンパク質をタンパク質分解切断することができる。
【０１７５】
適当なプロテアーゼ(参照)配列の例としては、以下の配列が挙げられる。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜448)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜440)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜441)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜445)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜422)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜439)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(1〜441)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(1〜457)
IgAプロテアーゼ-アミノ酸残基(1〜959)*
*Pohlner, J. et al. (1987).Nature 325, pp.458-462(本文献の記載内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)。
【０１７６】
上記参照配列は、亜血清型に応じてわずかな変動が生じ得るために指針とみなすべきである。例えば、米国特許出願公開第2007/0166332号(上記文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)には、わずかに異なるクロストリジウム配列が記載されている。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜K448)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜K441)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜K449)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜R445)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜R422)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜K439)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(M1〜K446)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(M1〜A457)
【０１７７】
軽鎖を含む様々なクロストリジウム毒素フラグメントは、軽鎖フラグメントが神経伝達物質放出機構のコア成分を特異的に標的とし、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解切断する細胞機構全体に関与することができる場合には、本発明の態様において有用であり得る。クロストリジウム毒素の軽鎖は、約420〜460のアミノ酸長を有し、酵素ドメインを含む。研究によれば、酵素ドメインの酵素活性にはクロストリジウム毒素軽鎖の全長は必要ではないことが示されている。例えば、BoNT/A軽鎖の最初の8個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。また、TeNT軽鎖の最初の8個のアミノ酸は酵素活性に必要ではない。同様に、軽鎖のカルボキシル末端は活性に必要ではない。例えば、BoNT/A軽鎖の最後の32個のアミノ酸(残基417〜448)は酵素活性に必要ではない。また、TeNT軽鎖の最後の31個のアミノ酸(残基427〜457)は酵素活性に必要ではない。従って、本実施形態は、例えば、少なくとも350個、少なくとも375個、少なくとも400個、少なくとも425個又は少なくとも450個のアミノ酸を含む(アミノ酸長を有する)酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含む。また、本実施形態は、例えば、350個以下、375個以下、400個以下、425個以下又は450個以下のアミノ酸を含む(アミノ酸長を有する)酵素ドメインを含むクロストリジウム毒素軽鎖を含む。
【０１７８】
一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼは、SNAP-23タンパク質等の非神経SNAREタンパク質を切断する。一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼは、SNAP-23を切断することができる改変ボツリヌス毒素L鎖である。そのような改変L鎖の例は、Chen and Barbieri, PNAS, Vol.106, No.23, pp.9180-9184, 2009に記載されている。
【０１７９】
一実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼはBoNT/A、BoNT/C又はBoNT/Eプロテアーゼであり、好ましいSNAREモチーフはSNAP(例えば、SNAP25)モチーフである。別の実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼはBoNT/B、BoNT/D、BoNT/F又はBoNT/G又は破傷風神経毒素(TeNT)プロテアーゼであり、好ましいSNAREモチーフはVAMPモチーフである。別の実施形態において、非細胞毒性プロテアーゼはBoNT/C1プロテアーゼであり、好ましいSNAREモチーフはシンタキシンモチーフである。
【０１８０】
本発明のポリペプチド(特にそのプロテアーゼ成分)はPEG化されていてもよく、この場合、プロテアーゼ成分の安定(例えば、作用持続時間)を向上させることができる場合がある。PEG化は、プロテアーゼがBoNT/A、B又はC1プロテアーゼを含む場合に特に好ましい。PEG化は、プロテアーゼ成分のN末端へのPEGの付加を含むことが好ましい。例えば、1以上のアミノ酸(例えば、システイン)残基によってプロテアーゼのN末端を伸長させてもよく、残基は同一又は異なっていてもよい。前記1以上のアミノ酸残基は、アミノ酸残基に結合した(例えば、共有結合)PEG分子を有していてもよい。このような技術の例は、WO2007/104567(上記文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)に記載されている。
【０１８１】
転位ドメインは、プロテアーゼを標的細胞内に転位させ、標的細胞のサイトゾル内におけるプロテアーゼ活性の機能的発現を生じさせることを可能とする。任意の分子(例えば、タンパク質又はペプチド)が本発明において必要とされる転位機能を有するか否かは、従来のアッセイのいずれかによって確認することができる。
【０１８２】
例えば、Shone C. (1987)は、被検分子によって攻撃されたリポソームを使用するインビトロアッセイについて記載している。本発明において必要とされる転位機能の存在は、容易に監視することができるリポソームからのK+及び/又は標識NADの放出によって確認する(Shone C.(1987) Eur.J.Biochem; vol.167(1):pp.175-180を参照)。また、Blaustein R.(1987)は、平面的なリン脂質二重膜を使用する単純なインビトロアッセイについて記載している。被検分子によって膜を攻撃し、必要とされる転位機能は上記膜を介したコンダクタンスの増加によって確認する(Blaustein (1987) FEBS Letts; vol.226, no.1:pp.115-120を参照)。膜融合の評価を可能とし、本発明において使用するために適した転位ドメインの同定を可能とする別の方法は、Methods in Enzymology Vol.220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993に記載されている。
【０１８３】
また、本発明は、必要な転位活性を示す変異転位ドメインも含む。例えば、変異ドメインは、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%又は少なくとも98%の、参照転位ドメインとのアミノ酸配列相同性を有し得る。転位ドメインに関連して使用する場合のフラグメントという用語は、参照転位ドメインの、少なくとも20個、好ましくは少なくとも40個、より好ましくは少なくとも80個、最も好ましくは少なくとも100個のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。クロストリジウム転位ドメインの場合には、フラグメントは、参照転位ドメイン(例えばHNドメイン)の、少なくとも100個、好ましくは少なくとも150個、より好ましくは少なくとも200個、最も好ましくは少なくとも250個のアミノ酸残基を有することが好ましい。上述したTM「フラグメント」成分と同様に、本発明の転位「フラグメント」は、参照配列に基づく変異転位ドメインのフラグメントを含む。
【０１８４】
細菌毒素分子のある種のドメインが前出のような孔を形成できることが報告されている。また、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種の転位ドメインがそのような孔を形成できることも知られている。そのようなドメインを本発明において使用することができる。
【０１８５】
転位ドメインは、HNドメイン(又はその機能的成分)等のクロストリジウム由来の転位ドメインであってもよい。HNは、H鎖のアミノ末端側半分とほぼ等しいクロストリジウム神経毒のH鎖の部分又はフラグメント又は完全なH鎖における当該フラグメントに対応するドメインを意味する。HC細胞結合機能を除去することが望ましい場合には、(DNA合成レベル又はヌクレアーゼ又はプロテアーゼ処理による合成後レベルで)HC又はHCCアミノ酸配列を欠失させることによって行うことができる。あるいは、化学的又は生物学的処理によってHC機能を不活性化させてもよい。
【０１８６】
適当な(参照)転位ドメインの例を以下に記載する。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(449〜871)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(441〜858)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(442〜866)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(446〜862)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(423〜845)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(440〜864)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(442〜863)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(458〜879)
【０１８７】
上記参照配列は、亜血清型に応じてわずかな変動が生じ得るために指針とみなすべきである。例えば、米国特許出願公開第2007/0166332号には、わずかに異なるクロストリジウム配列が記載されている(上記文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(A449〜K871)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(A442〜S858)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(T450〜N866)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(D446〜N862)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(K423〜K845)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(A440〜K864)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(S447〜S863)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(S458〜V879)
【０１８８】
本発明において、転位ドメインを含む様々なクロストリジウム毒素HN領域は、これらの活性フラグメントが細胞内小胞から標的細胞の細胞質への非細胞毒性プロテアーゼ(例えば、クロストリジウムL鎖)の放出を促進し、クロストリジウム毒素が基質をタンパク質分解切断する全体的な細胞機構に関与することができる限りにおいて、本発明の態様において有用である。クロストリジウム毒素の重鎖からのHN領域は約410〜430アミノ酸長を有し、転位ドメインを含む。研究によれば、クロストリジウム毒素重鎖からのHN領域の全長は転位ドメインの転位活性に必要ではないことが示されている。従って、本実施形態は、例えば少なくとも350、少なくとも375、少なくとも400又は少なくとも425のアミノ酸長を有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。本実施形態は、例えば350以下、375以下、400以下又は425以下のアミノ酸長を有する転位ドメインを含むクロストリジウム毒素HN領域を含むことができる。
【０１８９】
ボツリヌス菌及び破傷風菌における毒素生成の遺伝子的基礎についてのさらなる詳細は、Henderson et al (1997)、The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressに記載されている。HNという用語は、改変HN部分が上述した転位機能を示す限りにおいて、天然の神経毒HN部分並びに天然に存在しないアミノ酸配列及び/又は合成アミノ酸残基を有する改変HN部分を含む。
【０１９０】
あるいは、転位ドメインは非クロストリジウム由来のものであってもよい。非クロストリジウム(参照)転位ドメインの由来の例としては、例えば、ジフテリア毒素の転位ドメイン(O’Keefe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206;Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532;London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, pp.25-51)、シュードモナスA型外毒素の転位ドメイン(Prior et al., Biochemistry(1992) 31, 3555-3559)、炭疽毒素の転位ドメイン(Blanke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1996) 93, 8437-8442)、転位機能を有する様々な融合性又は疎水性ペプチド(Plank et al., J.Biol.Chem.(1994) 269, 12918-12924;及びWagner et al.(1992), PNAS, 89, pp.7934-7938)、両親媒性ペプチド(Murata et al.(1992), Biochem., 31, pp.1986-1992)が挙げられる。転位ドメインは、天然に存在するタンパク質中に存在する転位ドメインを反映するものであってもよく、転位ドメインの転位能力を損なわない場合にはアミノ酸変異を含んでいてもよい。
【０１９１】
本発明において使用するために適したウイルス(参照)転位ドメインの特定の例としては、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種の転位ドメインが挙げられる。例えば、Wagner et al. (1992)及びMurata et al. (1992)には、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのN末端領域に由来する複数の融合型及び両親媒型ペプチドの転位(膜融合及び小胞形成)機能について記載されている。所望の転位活性を有することが知られているその他のウイルス発現膜融合タンパク質としては、セムリキ森林ウイルス(SFV)の融合ペプチドの転位ドメイン、水泡性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質の転位ドメイン、SERウイルスFタンパク質の転位ドメイン及び泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質の転位ドメインが挙げられる。ウイルスによりコードされるスパイクタンパク質、例えば、SFVのE1タンパク質及びVSVのGタンパク質は本発明において特定の用途を有する。
【０１９２】
(参照)転位ドメインの使用は、その変異配列の使用を含む。変異は、必要とされる転位機能を有する場合には、1以上の保存的核酸置換及び/又は核酸欠失又は挿入を含むことができる。また、変異は、必要とされる転位機能を有する場合には、1以上のアミノ酸置換及び/又はアミノ酸欠失又は挿入を含むことができる。
【０１９３】
本発明のポリペプチドは、転位促進ドメインを含むことができる。転位促進ドメインは、標的細胞のサイトゾルへの非細胞毒性プロテアーゼの送達を促進するものであり、例えば、WO 08/008803及びWO 08/008805(上記文献の開示内容は、この参照によって本願明細書の開示内容として援用する)に記載されている。
【０１９４】
適当な転位促進ドメインの例としては、エンベロープウイルス融合ペプチドドメインが挙げられる。適当な融合ペプチドドメインの例としては、インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン(例えば23個のアミノ酸からなるA型インフルエンザウイルス融合ペプチドドメイン)、アルファウイルス融合ペプチドドメイン(例えば26個のアミノ酸からなるセムリキ森林ウイルス融合ペプチドドメイン)、ベシクロウイルス融合ペプチドドメイン(例えば21個のアミノ酸からなる水泡性口内炎ウイルス融合ペプチドドメイン)、レスピロウイルス融合ペプチドドメイン(例えば25個のアミノ酸からなるセンダイウイルス融合ペプチドドメイン)、モルビリウイルス融合ペプチドドメイン(例えば25個のアミノ酸からなるイヌジステンパーウイルス融合ペプチドドメイン)、アブラウイルス融合ペプチドドメイン(例えば25個のアミノ酸からなるニューカッスル病ウイルス融合ペプチドドメイン)、ヘニパウイルス融合ペプチドドメイン(例えば25個のアミノ酸からなるヘンドラウイルス融合ペプチドドメイン)、メタニューモウイルス融合ペプチドドメイン(例えば25個のアミノ酸からなるヒトメタニューモウイルス融合ペプチドドメイン)、サル泡沫状ウイルス融合ペプチドドメイン等のスプーマウイルス融合ペプチドドメイン及びそれらのフラグメント又は変異体が挙げられる。
【０１９５】
転位促進ドメインは、クロストリジウム毒素HCNドメイン又はそのフラグメント又は変異体を含んでいてもよい。具体的には、クロストリジウム毒素HCN転位促進ドメインは、少なくとも200、少なくとも225、少なくとも250又は少なくとも275のアミノ酸長を有することができる。クロストリジウム毒素HCN転位促進ドメインは、200以下、225以下、250以下又は275以下のアミノ酸長を有することが好ましい。具体例を以下に記載する。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(872〜1110)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(859〜1097)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(867〜1111)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(863〜1098)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(846〜1085)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(865〜1105)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(864〜1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(880〜1127)
【０１９６】
上記配列位置は、血清型/亜血清型によって多少異なる場合があり、適当な(参照)クロストリジウム毒素HCNドメインのさらなる例を以下に記載する。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(874〜1110)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(861〜1097)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(869〜1111)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(865〜1098)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(848〜1085)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(867〜1105)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(866〜1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(882〜1127)
【０１９７】
上述した促進ドメインは、本発明における使用に適する上述した転位ドメインペプチドのいずれかと組み合わせることができる。例えば、非クロストリジウム促進ドメインは、非クロストリジウム転位ドメインペプチド又はクロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができる。クロストリジウム毒素HCN転位促進ドメインは、非クロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができる。また、クロストリジウム毒素HCN促進ドメインは、以下に示すクロストリジウム転位ドメインペプチドと組み合わせることができる。
A型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(449〜1110)
B型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(442〜1097)
C型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(450〜1111)
D型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(446〜1098)
E型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(423〜1085)
F型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(440〜1105)
G型ボツリヌス神経毒-アミノ酸残基(447〜1105)
破傷風神経毒-アミノ酸残基(458〜1127)
【０１９８】
配列相同性
【０１９９】
例えば、グローバル法、ローカル法及びセグメントアプローチ法等のハイブリッド法等の様々な配列アラインメント法をパーセント同一性を決定するために使用することができる。パーセント同一性を決定するためのプロトコルは、当業者にとって通常の知識の範囲内である。グローバル法は、分子全体の配列を並べ、個別の残基対のスコアを加算し、ギャップペナルティを課すことによって最適なアラインメントを決定する。グローバル法の例としては、CLUSTAL W(例えば、Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994)を参照)及び反復改善法(例えば、Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein. Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838 (1996)を参照)が挙げられる。ローカル法は、入力配列の全てが共有する1以上の保存モチーフを同定することによって配列をアラインメントする。ローカル法の例としては、マッチボックス(例えばEric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509(1992)を参照)、ギブスサンプリング(例えばC.E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131), Science 208-214 (1993)を参照)、Align-M(例えばIvo Van Walle et al., Align-M-A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9), Bioinformatics: 1428-1435 (2004)を参照)が挙げられる。従って、パーセント配列同一性は従来の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603-16, 1986及びHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-19, 1992を参照されたい。簡単に説明すると、10のギャップ開始ペナルティ、1のギャップ伸長ペナルティ及びHenikoffらの「blosum 62」スコア行列を使用してアラインメントスコアを最適化するように2つのアミノ酸配列をアラインメントする。
【０２００】
実質的に相同なポリペプチドは、1以上のアミノ酸置換、欠失又は付加によって特徴付けられる。これらの変異は、保存的アミノ酸置換(以下を参照)及びポリペプチドの折り畳み又は活性に著しい影響を与えないその他の置換;通常は1〜約30個のアミノ酸の小さな欠失;及びアミノ末端メチオニン残基、約20〜25個以下の残基の小さなリンカーペプチド又はアフィニティタグ等の小さなアミノ又はカルボキシル末端伸長であることが好ましい。
【０２０１】
保存的アミノ酸置換
塩基性:アルギニン、リジン、ヒスチジン
酸性:グルタミン酸、アスパラギン酸
極性:グルタミン、アスパラギン
疎水性:ロイシン、イソロイシン、バリン
芳香族:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
小型:グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン
【０２０２】
20個の標準アミノ酸に加えて、非標準アミノ酸(例えば、4-ヒドロキシプロリン、6-N-メチルリジン、2-アミノイソ酪酸、イソバリン及びα-メチルセリン)で本発明のポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸及び非天然アミノ酸によってクロストリジウムポリペプチドアミノ酸残基を置換してもよい。本発明のポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸残基も含むことができる。
【０２０３】
天然に存在しないアミノ酸の例としては、例えば、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノ-プロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、アロ-スレオニン、メチル-スレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法が知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用してナンセンス変異が抑制されたインビトロ系を使用することができる。アミノ酸の合成方法及びtRNAのアミノアシル化方法は公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、大腸菌S30抽出物と市販の酵素及びその他の試薬を含む無細胞系において行われる。タンパク質はクロマトグラフィーによって精製する。例えば、Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991;Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991;Chung et al., Science 259:806-9, 1993;Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993を参照されたい。第2の方法では、翻訳は、ツメガエル卵母細胞において、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAをマイクロインジェクションすることによって行う(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996)。第3の方法では、大腸菌細胞を、置き換えられる天然アミノ酸(例えばフェニルアラニン)が存在せず、所望の天然に存在しないアミノ酸(例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン)が存在する条件下で培養する。天然に存在しないアミノ酸は、対応する天然アミノ酸の代わりにポリペプチドに取り込まれる。Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994を参照されたい。天然に存在するアミノ酸残基は、インビトロ化学修飾によって天然に存在しない種に変換することができる。化学修飾は、置換の範囲を拡大するために部位特異的突然変異誘発と組み合わせることができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
【０２０４】
本発明のポリペプチドのアミノ酸残基は、限られた数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによってコードされないアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸及び非天然アミノ酸で置換することができる。
【０２０５】
本発明のポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発等の公知の手順に従って同定することができる(Cunningham and Wells, Science 244:1081-5, 1989)。生物学的相互作用部位は、推定接触部位アミノ酸の変異と組み合わせた核磁気共鳴、結晶学、電子回折又は光親和性標識等の方法によって決定した構造の物理的解析によって決定することもできる。例えば、de Vos et al., Science 255:306-12, 1992;Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992;Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992を参照されたい。必須アミノ酸は、本発明のポリペプチドの関連する成分(例えば、転位又はプロテアーゼ成分)との相同性の分析から推測することもできる。
【０２０６】
多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6.1989)に開示されているような公知の突然変異誘発及びスクリーニング法を使用して作製し、試験を行うことができる。簡単に説明すると、ポリペプチド中の2以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、突然変異誘発されたポリペプチドの配列を決定し、各位置において許容できる置換の範囲を決定する。ファージディスプレイ(例えばLowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991;Ladner et al.、米国特許第5,223,409号;Huse、WO 92/06204)及び領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986;Ner et al., DNA 7:127, 1988)も使用することができる。
【０２０７】
多重アミノ酸置換は、Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988)又はBowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2152-6.1989)に開示されているような公知の突然変異誘発及びスクリーニング法を使用して作製し、試験を行うことができる。簡単に説明すると、ポリペプチド中の2以上の位置を同時に無作為化し、機能的ポリペプチドを選択し、突然変異誘発されたポリペプチドの配列を決定し、各位置において許容できる置換の範囲を決定する。ファージディスプレイ(例えばLowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991;Ladner et al.、米国特許第5,223,409号;Huse、国際公開第92/06204号)及び領域特異的突然変異誘発(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986;Ner et al., DNA 7:127, 1988)も使用することができる。
【０２０８】
実施例の概要
【０２０９】
実施例1 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
実施例2 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
実施例3 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製(2つの異なるプロテアーゼ認識部位を組み込む場合)
実施例4 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製方法
実施例5 ウェスタンブロッティングによる共有結合リガンドの存在の確認
実施例6 質量分析法による共有結合TMの存在の確認
実施例7 GnRHポリペプチドを組み込むLHDタンパク質の結合能の評価
実施例8 GnRHポリペプチドを組み込むLHDタンパク質のインビトロ機能性の評価
実施例9 ダイノルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
実施例10 β-エンドルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
実施例11 GHRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
実施例12 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製(第2のプロテアーゼ活性化部位から5個のアミノ酸で隔てられている場合)
実施例13 ガストリン放出ペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
実施例14 前立腺癌に罹患した患者の治療方法
実施例15 神経性炎症に罹患した患者の治療方法
実施例16 子宮内膜症に罹患した患者の治療方法
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図1は、還元及び非還元条件における実施例4の活性化試料(80mM+250mMイミダゾール画分に溶出)のSDS-PAGE分析を示す。
【０２１１】
配列番号の概要
【０２１２】
以下に示す配列番号は、最初のメチオニンアミノ酸残基(又は対応するN末端核酸コドン/配列)を除くものである場合がある。
配列番号1 LHD-GnRHのDNA配列
配列番号2 LHD-GnRHのタンパク質配列
配列番号3 LHA-GnRHのDNA配列
配列番号4 LHA-GnRHのタンパク質配列
配列番号5 2つの異なるプロテアーゼ部位を有するLHD-GnRHのDNA配列
配列番号6 2つの異なるプロテアーゼ部位を有するLHD-GnRHのタンパク質配列
配列番号7 ダイノルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質のDNA配列
配列番号8 ダイノルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質のタンパク質配列
配列番号9 β-エンドルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質のDNA配列
配列番号10 β-エンドルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質のタンパク質配列
配列番号11 GHRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDのDNA配列
配列番号12 GHRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDのタンパク質配列
配列番号13 GnRHをHNドメインのC末端に組み込むLHDのDNA配列
配列番号14 GnRHをHNドメインのC末端に組み込むLHDのタンパク質配列
配列番号15 ガストリン放出ペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAのDNA配列
配列番号16 ガストリン放出ペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAのタンパク質配列
【実施例】
【０２１３】
以下、実施例によって本発明の具体的な実施形態について説明する。
【０２１４】
実施例1 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
【０２１５】
BoNT/CのLHNフラグメントと10個のアミノ酸からなるペプチドGnRHの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとTM(GnRH)との間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。
【０２１６】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/DのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/DのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
Glyの代わりに6位にCys残基を組み込むように改変した10個のアミノ酸からなるGnRHペプチド(QHWSYCLRPG)
【０２１７】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号1として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号2として示す。
【０２１８】
実施例2 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
【０２１９】
BoNT/AのLHNフラグメントと10個のアミノ酸からなるペプチドGnRHの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとTM(GnRH)との間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。
【０２２０】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/AのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/AのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
Glyの代わりに6位にCys残基を組み込むように改変した10個のアミノ酸からなるGnRHペプチド
【０２２１】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号3として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号4として示す。
【０２２２】
実施例3 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製(2つの異なるプロテアーゼ認識部位を組み込む場合)
【０２２３】
BoNT/DのLHNフラグメントと10個のアミノ酸からなるペプチドGnRHの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)及びエンテロキナーゼ原型認識部位(DDDDK)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質及びエンテロキナーゼを活性化させ、HNとTM(GnRH)との間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。
【０２２４】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/DのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/DのHN
C末端にDDDDKペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
Glyの代わりに6位にCys残基を組み込むように改変した10個のアミノ酸からなるGnRHペプチド
【０２２５】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号5として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号6として示す。
【０２２６】
実施例4 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製方法
【０２２７】
実施例1において作製したORFを大腸菌発現ベクター(モビリゼーションが欠乏するように改変されたpET (Novagen社製)ベクター)にクローニングし、大腸菌宿主株(BL21)を形質転換した。
【０２２８】
以下のプロトコルを使用してLHD-GnRH融合タンパク質を発現させる。すなわち、250mlのフラスコに入れた0.2%グルコース及び100μg/mlのアンピシリンを含む100mlの改変TBにLHD-GnRH発現株からの単一コロニーを接種する。37℃、225rpmで16時間培養を行う。2×2Lのフラスコに入れた0.2%グルコース及び100μg/mlのアンピシリンを含む1×1Lの改変TBに10mlの一晩培養した培養物を接種する。培養物を37℃で約0.5のOD600nmに達するまで培養した後、温度を16℃に低下させる。1時間後、培養物を1mM IPTGを使用して誘導し、16℃でさらに16時間培養する。培養物を遠心分離して35.2gの細胞ペーストを得た。
【０２２９】
LHD-GnRH融合体の精製はアフィニティクロマトグラフィーによって行う。具体的には、25mlの50mM HEPES (pH7.2)、200mM NaCl及び約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコンチューブを解凍する。細胞ペーストを冷却した状態で超音波処理した(氷上にて30秒間の処理及び30秒間の休止からなるサイクルを10サイクル、パワー:22ミクロン)。溶解した細胞を4℃で30分間遠心処理した(18,000rpm)。50mM HEPES (pH7.2)及び200mM NaClで平衡化したHisTrap HPキレートカラム(5mlのカラムでよい)に上清を載せる。40mMイミダゾールを添加して非特異的結合タンパク質を洗い流した後、80mMイミダゾール、250mMイミダゾール及び500mMイミダゾールによる段階的な勾配によって融合タンパク質を溶出させた。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES (pH7.2)及び200mM NaClに対して4℃で一晩透析し、透析後の融合タンパク質のODを測定する。融合タンパク質1mgあたり10Uの第Xa因子を添加し、25℃で静的に一晩保温する。50mM HEPES (pH7.2)及び200mM NaClで平衡化したHisTrap HPキレートカラム(5mlのカラムでよい)に載せる。50mM HEPES (pH7.2)及び200mM NaClによってカラムをベースラインまで洗浄する。10及び40mMイミダゾールの段階的な勾配によって非特異的結合タンパク質を洗い流し、融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出させる。溶出した融合タンパク質を5Lの25mM Tris及び200mM NaCl (pH8.0)に対して4℃で一晩透析し、融合体を約2mg/mlまで濃縮し、試料を一定量に分け、-20℃にて凍結する。OD、BCA及び純度分析を使用して精製タンパク質の試験を行う。
【０２３０】
還元条件及び非還元条件の両方でSDS-PAGEによって活性化タンパク質の試料を分析する。80mM及び250mMイミダゾール画分に溶出した試料を分析する(図1を参照)。
【０２３１】
実施例5 ウェスタンブロッティングによる共有結合TMの存在の確認
【０２３２】
融合タンパク質中のTMの存在は様々な方法によって評価することができる。方法の1つは、TMに対する特異抗血清を使用し、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティングによって画像化することである。TMに対する抗体は、市販品を購入する(例えば、抗GnRH抗体はAbcam社(AB76560)又はNovus Biologicals社(H00002796-B01)から入手可能)か、商業的サービスプロバイダーによって所与のペプチド配列に対して特異的に製造することができる。
【０２３３】
そのような方法を使用することにより、GnRHは非還元条件において完全長活性化融合タンパク質であることを確認し、還元条件においてはHNドメイン上に存在しないことが確認する。
【０２３４】
実施例6 質量分析法による共有結合TMの存在の確認
【０２３５】
融合タンパク質中のTMの存在は様々な方法によって評価することができる。方法の1つは、質量分析法を使用して還元前後の融合タンパク質の質量を決定することである。
【０２３６】
実施例4において得られたタンパク質を使用し、非還元及び還元タンパク質の試料をSDS-PAGEから抽出し(図1を参照)、質量分析法(Intertek社(マンチェスター))によって分析した。
【０２３７】
非活性化非還元融合タンパク質の予測質量は105,271Daである。観察された試料の質量は105,284Daであり、それらの差(13Da)は機器の誤差の範囲内である。従って、非活性化非還元融合タンパク質における完全なGnRHの存在が確認される。
【０２３８】
【表３】
0006050330.tif 000015
【０２３９】
活性化非還元融合タンパク質の予測質量は105,271Daである。観察された試料の質量は105,321Daであり、それらの差(50Da)は機器の誤差の範囲内である。従って、活性化非還元融合タンパク質における完全なGnRHの存在が確認される。
【０２４０】
【表４】
0006050330.tif 000016
【０２４１】
LC及びHNドメインの還元試料の評価では、HNドメイン(HN+スペーサー+活性化部位を含む)の予測質量は49,419Daであり、観察された質量は49,421Daだった。これは、還元HNドメインはGnRHペプチドを有していないことを示している。ジスルフィド結合のタンパク質分解及び還元によってHNドメインのC末端からGnRH配列が放出されるため、この結果は完全に予測通りである。
【０２４２】
【表５】
0006050330.tif 000017
【０２４３】
これらのデータは、GnRHリガンドは、活性化及び還元前に融合タンパク質に結合し、還元剤の非存在下において活性化後に融合タンパク質に結合し、活性化及び還元後にはHNドメイン上に存在しないことを示している。これにより、融合タンパク質は両方のタンパク質分解部位で正確に活性化され、GnRHリガンドは人工的に作り出したジスルフィド結合を介してHNドメインに結合することが確認される。
【０２４４】
実施例7 GnRHポリペプチドを組み込むLHDタンパク質の結合能の評価
【０２４５】
実施例4において作製したタンパク質のリガンド受容体相互作用の機能性について適当なアッセイの1つを使用して評価する。例えば、Cisbio Bioassays社のゴナドトロピン放出ホルモン受容体(GnRHR)リガンド結合アッセイは、試料における結合活性を定量化する競合アッセイである(http://www.htrf.com/products/gpcr/binding/ligands/inserts/C1TT1GNRH.pdf)。また、文献には利用可能な様々な結合アッセイが報告されている(例えば、Christopher E. Heise, Susan K. Sullivan and Paul D. Crowe, J Biomol Screen 2007 12:235;DOI:10.1177/1087057106297362)。そのようなアッセイを使用することにより、GnRH TMが標的受容体と相互作用することができることを確認することができる。
【０２４６】
データは、GnRH TMが標的受容体と相互作用することができることを示している。
【０２４７】
実施例8 GnRHポリペプチドを組み込むLHDタンパク質のインビトロ機能性の評価
【０２４８】
実施例4において作製したタンパク質が有する、標的細胞内でSNAREタンパク質を切断する能力について評価する。簡単に説明すると、ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)受容体を高いレベルで発現するαT3-1細胞株(不死化性腺刺激ホルモン細胞株)を本発明の化合物と共に培養する。24時間後、細胞材料を採取し、ウェスタンブロッティングによってSNAREタンパク質を分析する。データは、GnRH TMを含む融合タンパク質は標的受容体と相互作用することができ、内在化及び細胞内SNAREタンパク質の切断が可能であることを示している。
【０２４９】
実施例9 ダイノルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
【０２５０】
BoNT/DのLHNフラグメントとダイノルフィン及びブラジキニンの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとダイノルフィンペプチドとの間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。11個のアミノ酸からなるスペーサーをダイノルフィンペプチドとブラジキニンペプチドとの間に構築し、単一のCysを組み込んでHNへのジスルフィド結合を促進する。
【０２５１】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/DのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/DのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
17個のアミノ酸からなるダイノルフィンペプチド
11個のアミノ酸からなるGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
9個のアミノ酸からなるブラジキニンペプチド
【０２５２】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号7として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号8として示す。
【０２５３】
実施例10 β-エンドルフィン及びブラジキニンポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
【０２５４】
BoNT/AのLHNフラグメントとβ-エンドルフィン及びブラジキニンの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとβ-エンドルフィンペプチドとの間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。11個のアミノ酸からなるスペーサーをβ-エンドルフィンペプチドとブラジキニンペプチドとの間に構築し、単一のCysを組み込んでHNへのジスルフィド結合を促進する。
【０２５５】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/AのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/AのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
31個のアミノ酸からなるβ-エンドルフィンペプチド
11個のアミノ酸からなるGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
9個のアミノ酸からなるブラジキニンペプチド
【０２５６】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号9として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号10として示す。
【０２５７】
実施例11 GHRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製
【０２５８】
BoNT/DのLHNフラグメントと2つのGHRHペプチドの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の1次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとGHRHペプチドとの間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。11個のアミノ酸からなるスペーサーを2つのGHRHペプチドの間に構築し、単一のCysを組み込んでHNへのジスルフィド結合を促進する。
【０２５９】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/DのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/DのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
40個のアミノ酸からなるGHRHペプチド
11個のアミノ酸からなるGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser
40個のアミノ酸からなるGHRHペプチド
【０２６０】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号11として示し、発現産物のアミノ酸配列を配列番号12として示す。
【０２６１】
実施例12 GnRHポリペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHDタンパク質の作製(第2のプロテアーゼ活性化部位から5個のアミノ酸で隔てられている場合)
【０２６２】
BoNT/DのLHNフラグメントと10個のアミノ酸からなるペプチドGnRHの遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとTM(GnRH)のN末端へのスペーサーとの間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。
【０２６３】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/DのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/DのHN
IEGRペプチドを組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
Glyの代わりに6位にCys残基を組み込むように改変した10個のアミノ酸からなるGnRHペプチド(QHWSYCLRPG)
【０２６４】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号13として示し、発現生成物のアミノ酸配列を配列番号14として示す。
【０２６５】
実施例13 ガストリン放出ペプチドをHNドメインのC末端に組み込むLHAタンパク質の作製
【０２６６】
BoNT/AのLHNフラグメントと27個のアミノ酸からなるガストリン放出ペプチド(GRP)の遺伝子融合によって構築したキメラタンパク質の一次配列について、第Xa因子原型認識部位(IEGR)と類似性を有するアミノ酸の存在を調べる。そのようなアミノ酸が存在しないので、LC-HN結合部において融合タンパク質を活性化させ、HNとTM(GRP)との間のペプチド結合を切断するプロテアーゼとして、FXaを使用する。
【０２６７】
大腸菌発現用に最適化されたDNAをEntelechon社(ドイツ)から入手し、以下の構造(N末端からC末端への方向)を有する融合タンパク質をコードさせる。
10×His N末端精製タグ
10×アスパラギンアミノ酸スペーサー
BoNT/AのLC
BoNT/Aと類似し、FXaの基質であるテトラペプチドIEGRを組み込むように改変した一次配列を有するドメイン間リンカー
C末端Cysを組み込むように改変したBoNT/AのHN
C末端にIEGRペプチド配列を組み込むGly-Gly-Gly-Gly-Serスペーサー
Argの代わりに17位にCys残基を組み込み、C末端アミド化を不要とするようにC末端にGly残基を組み込むように改変した28個のアミノ酸からなるガストリン放出ペプチド(VPLPAGGGTVLTKMYPCGNHWAVGHLMG)
【０２６８】
大腸菌のコドン使用頻度をGraphical Codon Usage Analyser (Geneart社製)等のソフトウェアプログラムによって評価し、GC含有量(%)及びコドン使用比率をコドン使用頻度表(例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日)を参照して評価してコドン使用頻度が低下しないようにした。DNAを標準的なクローニングベクター(例えば、pCR4)に組み込んだ後、大腸菌ホストを形質転換した。ORF DNAの完全性は配列解析によって確認した。最終ORFを配列番号15として示し、発現生成物のアミノ酸配列を配列番号16として示す。
【０２６９】
実施例14 前立腺癌に罹患した患者の治療方法
【０２７０】
56歳の男性は前立腺癌に罹患しており、アンドロゲン枯渇療法では前立腺癌を抑制するために十分ではなくなっている。男性に対して、本発明のTSI(本具体例ではGnRHペプチドTMに基づくTSI)を含む組成物を前立腺の近傍に局所投与する治療を行う。患者の状態を監視したところ、治療の開始から約2カ月後に本発明の分子を含む組成物の治療効果を示す腫瘍サイズの減少が認められる。
【０２７１】
実施例15 神経性炎症に罹患した患者の治療方法
【０２７２】
関節リウマチと診断された62歳の女性は、関節の硬直及び膨張に苦しんでいる。医師は、関節の硬直及び膨張は慢性の神経性炎症のためであると判断する。女性に対して、本発明のTSI(本具体例ではTSIはオピオイドTMを含む。ノシセプチン又はダイノルフィンTMを含むTSIを使用した並行例も行う。)を含む組成物を患部の近傍に局所投与する治療を行う。患者の状態を監視したところ、治療の開始から約1〜3日後に関節の硬直及び膨張が減少する。1カ月及び3カ月後の検査では、治療した部分で関節の硬直及び膨張の減少が継続している。このような慢性神経性炎症症状の改善は、本発明の分子を含む組成物の治療効果を示すものである。
【０２７３】
実施例16 子宮内膜症に罹患した患者の治療方法
【０２７４】
39歳の女性は、非ステロイド系抗炎症薬(NSAIDS)及び併用型エストロゲン-プロゲスチン避妊薬で適切に治療していない子宮内膜症による骨盤痛を呈している。医師は、本発明のTSI(本具体例ではTSIはオピオイドTMを含む。ノシセプチン又はダイノルフィンTMを含むTSIを使用した並行例も行う。)を含む組成物を投与する。患者の状態を監視したところ、治療の開始から約1〜3日後に疼痛が減少する。1カ月及び3カ月後の検査では、疼痛の減少が継続しており、動作の自由が向上している。このような子宮内膜症に伴う症状の改善は、本発明の分子を含む組成物の治療効果を示すものである。
【０２７５】
実施例17 過活動膀胱に罹患した患者の治療方法
【０２７６】
58歳の男性は、尿意逼迫の増加に苦しんでいる。医師は、患者は異常なニューロン活動を伴う神経学的成分による過活動膀胱に罹患していると診断する。男性には、本発明のTSI(本具体例ではTSIはオピオイドTMを含む。ノシセプチン又はダイノルフィンTMを含むTSIを使用した並行例も行う。)を含む組成物を尿管投与する。異常なニューロン活動の位置に応じて、例えば、排尿筋、外部及び内部尿道括約筋を含む膀胱頚、三角部、膀胱壁の膀胱穹窿部又はその他の部分及び/又は膀胱の周囲の部分(例えば、尿道、輸尿管、尿生殖隔膜、下側骨盤筋、前立腺、尿道球腺、尿道球、脚又は陰茎)に毒素を投与することができる。患者の状態を監視したところ、治療の開始から約1〜3日後に尿意逼迫が減少する。1カ月及び3カ月後の検査では、尿意逼迫の減少が継続している。このような過敏性膀胱症状の改善は、本発明の分子を含む組成物の治療効果を示すものである。
【０２７７】
実施例18 神経性炎症に罹患した患者の治療方法
【０２７８】
関節リウマチと診断された62歳の女性は、関節の硬直及び膨張に苦しんでいる。医師は、関節の硬直及び膨張は慢性の神経性炎症のためであると判断する。女性に対して、本発明のTSI(この具体例ではTSIはオピオイドTMを含む。ノシセプチン又はダイノルフィンTMを含むTSIを使用した並行例も行う。)を含む組成物を患部の近傍に局所投与する治療を行う。患者の状態を監視したところ、治療の開始から約1〜3日後に関節の硬直及び膨張が減少する。1カ月及び3カ月後の検査では、治療した部分で関節の硬直及び膨張の減少が継続している。このような慢性神経性炎症症状の改善は、本発明の分子を含む組成物の治療効果を示すものである。本願明細書に開示するタンパク質の局所投与は、単関節炎、少関節炎又は多発関節炎に関連する慢性神経性炎症、例えば、変形性関節症、若年性特発性関節炎、敗血症性関節炎、脊椎関節症(強直性脊椎炎、反応性関節炎(ライター症候群)、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患に関連する腸疾患に基づく関節炎、ウィップル病又はベーチェット病等)、滑膜炎、痛風、偽性痛風症、若年性関節リウマチ、粘液嚢炎、リウマチ熱又は腱鞘炎に罹患した患者の治療に使用することができる。また、慢性神経性炎症を治療するために、本発明の分子を含む組成物を全身投与することもできる。
【０２７９】
配列番号
【０２８０】
配列番号1
atgcatcaccatcaccatcaccatcaccatcatgggagctCGAACAAtAACAACAATAACAATAACAAtAACggatccatgacgtggccagttaaggatttcaactactcagatcctgtaaatgacaacgatattctgtaccttcgcattccacaaaataaactgatcaccacaccagtcaaagcattcatgattactcaaaacatttgggtcattccagaacgcttttctagtgacacaaatccgagtttatctaaacctccgcgtccgacgtccaaatatcagagctattacgatccctcatatctcagtacggacgaacaaaaagatactttccttaaaggtatcattaaactgtttaagcgtattaatgagcgcgatatcgggaaaaagttgattaattatcttgttgtgggttccccgttcatgggcgatagctctacccccgaagacacttttgattttacccgtcatacgacaaacatcgcggtagagaagtttgagaacggatcgtggaaagtcacaaacatcattacacctagcgtcttaatttttggtccgctgccaaacatcttagattatacagccagcctgactttgcaggggcaacagtcgaatccgagtttcgaaggttttggtaccctgagcattctgaaagttgccccggaatttctgctcactttttcagatgtcaccagcaaccagagctcagcagtattaggaaagtcaattttttgcatggacccggttattgcactgatgcacgaactgacgcactctctgcatcaactgtatgggatcaacatccccagtgacaaacgtattcgtccccaggtgtctgaaggatttttctcacaggatgggccgaacgtccagttcgaagagttgtatactttcggaggcctggacgtagagatcattccccagattgagcgcagtcagctgcgtgagaaggcattgggccattataaggatattgcaaaacgcctgaataacattaacaaaacgattccatcttcgtggatctcgaatattgataaatataagaaaatttttagcgagaaatataattttgataaagataatacaggtaactttgtggttaacattgacaaattcaactccctttacagtgatttgacgaatgtaatgagcgaagttgtgtatagttcccaatacaacgttaagaatcgtacccattacttctctcgtcactacctgccggttttcgcgaacatccttgacgataatatttacactattcgtgacggctttaacttgaccaacaagggcttcaatattgaaaattcaggccagaacattgaacgcaacccggccttgcagaaactgtcgagtgaatccgtggttgacctgtttaccaaagtctgcgtcgacggcatcattacctccaaaactaaatctctgatagaaggtagaaacaaagcgctgaacctgcagtgtattaaagtgaaaaacaatcggctgccttatgtagcagataaagatagcattagtcaggagattttcgaaaataaaattatcactgacgaaaccaatgttcagaattattcagataaattttcactggacgaaagcatcttagatggccaagttccgattaacccggaaattgttgatccgttactgccgaacgtgaatatggaaccgttaaacctccctggcgaagagatcgtattttatgatgacattacgaaatatgtggactaccttaattcttattactatttggaaagccagaaactgtccaataacgtggaaaacattactctgaccacaagcgtggaagaggctttaggctactcaaataagatttataccttcctcccgtcgctggcggaaaaagtaaataaaggtgtgcaggctggtctgttcctcaactgggcgaatgaagttgtcgaagactttaccacgaatattatgaaaaaggataccctggataaaatctccgacgtctcggttattatcccatatattggccctgcgttaaatatcggtaatagtgcgctgcgggggaattttaaccaggcctttgctaccgcgggcgtcgcgttcctcctggagggctttcctgaatttactatcccggcgctcggtgtttttacattttactcttccatccaggagcgtgagaaaattatcaaaaccatcgaaaactgcctggagcagcgggtgaaacgctggaaagattcttatcaatggatggtgtcaaactggttatctcgcatcacgacccaattcaaccatattaattaccagatgtatgatagtctgtcgtaccaagctgacgccattaaagccaaaattgatctggaatataaaaagtactctggtagcgataaggagaacatcaaaagccaggtggagaaccttaagaatagtctggatgtgaaaatctctgaagctatgaataacattaacaaattcattcgtgaatgttcggtgacgtacctgttcaagaatatgctgccaaaagttattgatgaactgaataaatttgatctgcgtaccaaaaccgaacttatcaacctcatcgactcccacaacattatccttgtgggcgaagtggatcgtctgaaggccaaagtaaacgagagctttgaaaatacgatgccgtttaatattttttcatataccaataactccttgctgaaagatatcatcaatgaatatttcaaTCTAGAaTGTggcggtggcggtagcATCGAAGGTCGTcagcactggtcctattgcctgcgccctggttgataa
配列番号2
MHHHHHHHHHHGSSNNNNNNNNNNGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSLIEGRNKALNLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLECGGGGSIEGRQHWSYCLRPG
配列番号3
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配列番号4
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配列番号5
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配列番号6
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配列番号7
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配列番号8
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配列番号9
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配列番号10
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配列番号11
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配列番号12
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配列番号13
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配列番号14
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配列番号15
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配列番号16
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【図１】
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【配列表】
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