(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蚊の幼虫に対して生物学的コントロールにおいて使用するための、バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)種に属する、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１９９番号で寄託されているＭＢＩ５細菌株を含む組成物。
【請求項２】
蚊の幼虫に対して生物学的コントロールにおいて使用するための、バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)種に属する、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０２００番号で寄託されているＭＢＩ６細菌株を含む組成物。
【請求項３】
蚊の幼虫に対して生物学的コントロールにおいて使用するための、バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)種に属する、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０２００１番号で寄託されているＭＢＩ７細菌株を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、蚊の幼虫（家蚊属）に対する生物学的コントロールにおいて使用することができる新規細菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
蚊は、多数の疾患、例えば、蚊媒介性アルボウイルス、マラリア、フィラリア症および日本脳炎の媒介動物である。一般的に、蚊駆除は、世界中で、生物農薬よりも化学農薬で行う。これらの化学農薬は、ジクロロジフェニルトリクロロエタン（ＤＤＴ）、ガンメキサン(gammaxane)、マラチオン、クロルデンおよび有機リン酸化合物(organophosphate)として知られている。これらの全ては、ヒトの健康および環境に対して高い毒性を有する。化学農薬と比較して、微生物殺虫剤は、しばしば種特異的であり、環境を汚染せず、したがって、自然において非標的生物体に安全である。種々の微生物農薬中で、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thrungiensis)およびバチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)が広く使用されている。殺蚊剤用細菌は、水中の蚊を抑制するための化学農薬に代わる環境的に優しい代替物である。
【０００３】
バチルス・チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス(israilensis)（Ｂｔｉ）は、世界中で、非常に広範囲に使用されている蚊殺幼虫細菌である。Ｂｔｉは、胞子形成中、種々の遺伝子、例えば、Ｃｒｙ４Ａ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ１０Ａ、Ｃｒｙ１１ＡおよびＣｒｙ１Ａによりコードされる結晶糖タンパク質（プロトキシン）を生産する。Ｂｔｉ  Ｃｒｙ毒素は、広範囲の蚊および黒い昆虫(blackfly)種ならびに線虫、ダニ類および原生動物のコントロールにおいて広く使用されている。別の可能性のある微生物農薬殺虫剤であるバチルス・スファエリクスは、家蚊属およびハマダラカ属の種に対して有効であることが知られており、バイナリー毒素（Ｂｉｎ）および蚊の毒素（Ｍｔｘ）の生産により汚染された水中でより良い残効性を有する。単一のＢｉｎ（バイナリー）毒素遺伝子を有するバチルス・スファエリクス(B. sphaericus)株のいくつかに対する蚊の耐性は、多数の国において報告されている。
【０００４】
最先端で知られる出願である欧州特許文献第ＥＰ０３４９７６９号は、バチルス・チューリンゲンシス亜種イスラエレンシス（Ｂ．ｔ．ｉ．）細菌から得られ、バチルス・スファエリクス株に導入した毒素を生産する遺伝子で遺伝的に操作されたバチルス・スファエリクス細菌を記載している。生産された遺伝子操作された（ＧＭ）バチルス・スファエリクス株は、有効量においてＢ．ｔ．ｉ．毒素を生産することができ、蚊の幼虫および黒い昆虫(black flies)に対して有効にコントロールすることができる。
【０００５】
最先端で知られる出願である欧州特許文献第ＥＰ０４５４４８５号は、水中に生存する害虫、例えば蚊の幼虫に対してバチルス・チューリンゲンシスまたはバチルス・スファエリクス細菌から得られる昆虫を殺す毒素を使用することを記載している。これらの細菌の胞子は、これらの胞子を摂取したいくつかの昆虫の幼虫を殺す。胞子は、幼虫の腸で消化され、これらの毒素を放出し、幼虫を中和する。該技術における既知の出願は、蚊に対する生物学的コントロールのために幼虫に適用するための細菌の毒素の摂取を記載している。細菌の毒素の取り出し(Taking)は、余分な労働およびコストを必要とする。すなわち、タンパク質単離工程が、これらの出願において行われる。
【０００６】
多数の商業的製品が市場に導入されているけれども、いくつかの既知の生物学的コントロール製品に対する蚊の集団における耐性の発達によって、科学者が、新規な商業的微生物殺虫剤の開発のための新規株の開発のために使用することができる新規な天然の殺蚊剤用細菌株を探索する必要性は常に高く、探索することを強いられる。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明の目的は、生物学的コントロールにおける幼虫駆除剤として使用することができる新規細菌株を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、産物を得る段階における毒素タンパク質単離工程が除去される、生物学的コントロールのための新規細菌株を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、汚染された水および新鮮な水の両方において有効である、生物学的コントロールのための新規細菌株を提供することである。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明の目的を果たすために開発された「蚊の生物学的コントロールのための新規細菌株」は、図面において説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１。プライマーＢ．ｓｐｈ：バチルス・スファエリクス、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７によりＰＣＲ増幅されたＢｉｎ５１およびｂｉｎ４２毒素遺伝子。
【図２】図２。プライマーＢ．ｓｐｈ：バチルス・スファエリクス、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７によりＰＣＲ増幅されたＭｔｘ１およびＭｔｘ２毒素遺伝子。
【図３】図３は、臭化エチジウムを有する１％アガロースゲルにおける電気泳動法後の、ゲルイメージングシステム（ＢＩＯＲＡＤ）におけるＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７細菌株のＰＣＲバンドである（ＮＣ：ネガティブコントロール）。
【図４】図４。近隣結合法：バチルス・スファエリクス様株中の系統発生関係。
【図５】図５はバチルス・スファエリクス細菌細胞の走査型電子顕微鏡像である。
【図６】図６はＭＢＩ５細菌株の走査型電子顕微鏡像である。
【図７】図７はＭＢＩ６細菌株の走査型電子顕微鏡像である。
【図８】図８はＭＢＩ７細菌株の走査型電子顕微鏡像である。
【図９】図９はＭＢＩ５細菌株の１６ｒＤＮＡ配列である。
【図１０】図１０はＭＢＩ６細菌株の１６ｒＤＮＡ配列である。
【図１１】図１１はＭＢＩ７細菌株の１６ｒＤＮＡ配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の蚊の幼虫に対する生物学的コントロールにおいて、バチルス・スファエリクス種の株は、蚊の幼虫に対して適用される。寄託番号は、２００９年１月２８日に、United States Department of Agriculture Research, Education and Economics Agricultural Research Serviceから本発明の株について与えられている。ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ６と名付けられたバチルス・スファエリクス種に属する亜種の寄託番号は、それぞれ、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０１９９、ＮＲＲＬ  Ｂ−５０２００およびＮＲＲＬ  Ｂ−５０２００１として記録されている。
【００１３】
蚊の幼虫（家蚊(イエカ)属）に対して行われた研究室実験において、バチルス・スファエリクスＭＢＩ５、６、７株の幼虫駆除効果およびＢｉｎ遺伝子の存在が、バチルス・スファエリクスの市販の株と同じであることが見出された。さらに、蚊の幼虫に対する実験において、本発明の細菌株が、既知のバチルス・スファエリクス株よりも高い割合でより速い効果を示すことが明らかとされた。以前の技術の出願において、単離物からタンパク質を得るために、余分なプロセスが行われる。本発明の手段により、産物を得る段階においてタンパク質単離工程は除去される。新たに見出された細菌株（ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７）が、タンパク質単離を行うことなしに、幼虫が存在する培地(medium)に直接与えられるときに、有効であることが観察される。同時に、バチルス・スファエリクス株は、汚染された水および新鮮な水の両方において高い幼虫駆除効果を示す。本発明の有効性を試験するために、種々の実験研究が行われた。
【００１４】
実験研究
新たに単離された細菌株ならびにＢｔｉ  ４Ｑ４、Ｂｔｉ  ＡＴＣＣ  ３５６４６およびバチルス・スファエリクスの単一のコロニーを、ＮＹＳＭ（栄養酵母塩培地(Nutrient Yeast Salt Medium)）寒天上に培養し、３０℃で４８時間インキュベートした。それぞれの株の細菌培養物を回収し、１０ｍｌの蒸留水に再懸濁した。吸光度(Absorbance)を水で０．２に調整し、次に、１ｍｌの懸濁液を１００匹の家蚊属の幼虫（３または４齢の段階）を含む２５０ｍｌフラスコ中の１００ｍｌの新鮮な水／汚染された水に加えた。接種フラスコを研究室の椅子上に維持し、室温で４８時間観察した。幼虫の９０％を殺すことができた殺幼虫細菌株を決定するために、参照株および滅菌水のそれぞれで処理されたポジティブおよびネガティブコントロールフラスコを、接種フラスコとして同じ条件を維持した。毒性試験後、バチルス・スファエリクス（ＭＢＩ５、６、７）の３つの株を高い毒性の蚊の細菌として選択し、さらなる試験のために使用した。バイオアッセイ試験結果によると、ＭＢＩ５，６，７は、家蚊属の幼虫に対して毒性である可能性を有する。３つの細菌の殺幼虫特性の研究が、１００匹の幼虫を含む新鮮な水および汚染された水中で行われた（表１参照）。Ｂｔｉ  ＡＴＣＣ  ３５６４６、Ｂｔｉ  ４Ｑ４および市販のバチルス・スファエリクスを、ポジティブコントロールとして使用した。
【００１５】
表１：汚染された水および新鮮な水中での家蚊属幼虫に対するＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７株およびバチルス・スファエリクス、Ｂｔｉ  ＡＴＣＣ３５６４６およびＢｔｉ  ４Ｑ４細菌の有効性
【表１】
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【００１６】
試験結果によると、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７株が、既知のバチルス・スファエリクス、Ｂｔｉ  ＡＴＣＣ  ３５６４６およびＢｔｉ  ４Ｑ４  細菌と比較して、２４時間で汚染された水中でより有効であることを見出した。ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７株の有効性パーセントは、それぞれ、９４％、９３％および９１％と決定された。新鮮な水中で行われた試験において、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７株およびバチルス・スファエリクス細菌が２４時間で全ての生存健常幼虫を１００％殺すことに成功したことが観察された。他方では、Ｂｔｉ  ＡＴＣＣ  ３５６４６およびＢｔｉ  ４Ｑ４細菌が、それぞれ、新鮮な水中で８４％および７６％の比率で幼虫に対して有効であることを見出した（表１）。
【００１７】
診断試験
表現型診断試験
方法の全てを、バチルスの３つの新規株の細胞特性を理解するために提供する。ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７は、好気性グラム陽性細菌であった。ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７およびバチルス・スファエリクスの電子顕微鏡像によると、それらは、桿菌（図６、図７、および図８）であり、バチルス・スファエリクス（図５）と同様である。
【００１８】
それらはまた、２０−３５℃で培養し、最適培養温度は２７−３０℃であった。５０℃および４℃での培養は、栄養寒天上で観察されなかった。ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７の生理学的特性を要約し、選択的特性をバチルス・スファエリクスとの関連モデルと比較した（表２）。
【００１９】
表２：市販のバチルス・スファエリクスと比較した株ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７の表現型特性
【表２】
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（＋、ポジティブ；−、ネガティブ）
【００２０】
脂肪酸プロフィール分析
それぞれのＭＢＩ株を、ＢＩＯＬＯＧ、ＦＡＭＥプロフィールおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列データに関して、唯一(unique)かつ新規として特徴付けた。
【００２１】
ＭＢＩ５、６、７およびバチルス・スファエリクスの細胞脂肪酸プロフィールを、表３に記載した。ＭＢＩ５において主な細胞脂肪酸は、イソ−ペンタデカン酸（Ｃ１５：０  イソ、４５，００％）およびＣ１６：０  イソ、１２，６５％を含んだ。少量のイソ−分枝鎖脂肪酸Ｃ１４：０  イソ（０．６０％）、Ｃ１６：０（１．７２％）、Ｃ１７：１  イソω１０ｃ（１，４３％）を含んだ。ＭＢＩ６において主な細胞脂肪酸は、イソ−ペンタデカン酸（Ｃ１５：０  イソ、４４，９９％）およびＣ１６：０  イソ、１５，２４％を含んだ。少量の脂肪酸Ｃ１６：０（０．７８％）、Ｃ１７：１  イソω１０ｃ（１，４０％）を含んだ。ＭＢＩ７において主な細胞脂肪酸は、イソ−ペンタデカン酸（Ｃ１５：０  イソ、４５，８４％）およびＣ１５：０  アンテイソ、１３，１３％を含んだ。少量のイソ−分枝鎖脂肪酸Ｃ１４：０  イソ（０．６８％）、Ｃ１８：１  イソω９ｃ（１，０３％）を含んだ。結果として、脂肪酸プロフィールにおける有意な類似性は、バチルス・スファエリクスとＭＢＩグループとの間に見られた。グループＭＢＩの全ておよびバチルス・スファエリクスは、ＭＩＤＩでバチルス・スファエリクス−ＧＣ  サブグループＥと同定された。
【００２２】
表３：ＭＢＩ５、６、７およびバチルス・スファエリクスの細胞脂肪酸組成
【表３】
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【００２３】
核酸ベースの１６Ｓ−ｒＤＮＡ  ＰＣＲ増幅での配列分析
細菌株からのＤＮＡ抽出：
いくつかの修飾と共にＪｉｍｅｎｅｚにより記載された方法論にしたがって、全ゲノムＤＮＡを細菌株から抽出した。純粋な株を２７Ｃで１６−２０時間ニュートリエント寒天(Nutrient Agar)（ＮＡ）固形培地で培養し、１つの単一コロニーを、６６０ｎｍで最大１の吸光度まで、２７Ｃで３−４時間１０ｍｌのニュートリエントブロス(Nutrient Broth)（ＮＢ）に汚染した。２０００ｇ遠心分離で１０分後、細菌細胞を培地から回収した。細胞を１ｍｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂａｓｅ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ９．０）で懸濁し、２ｍｌマイクロ遠心チューブに移し、１４０００ｇで２分間遠心し、上清をチューブから捨て、１ｍｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーを加え、適用を３回繰り返した。最後に、３００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーを加え、水浴で９４Ｃで３０分間沸騰した。１４０００ｇで２分間遠心し、２００μｌのＤＮＡを上清から回収し、さらなるＰＣＲ適用のために−２０で貯蔵した。
【００２４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅および精製：
細菌ＤＮＡ単離物（ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７およびコントロールのためのバチルス・スファエリクス血清型Ｈ）の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、精製されたＤＮＡおよびプライマー  ２７ｆおよび１４９２ｒ（Ｌａｎｅ、１９９１）を使用して、ＰＣＲ（ＢＩＯＲＡＤ、Ｉｔａｌｙ）により増幅した。全１６Ｓに対する０．２ｍＭの２７ｆおよび１４９２ｒプライマー、１Ｕのｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＵＳＡ）、０．２ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび５０ｎｇ  鋳型ＤＮＡを含む５０ｕｌの反応混合物の全容量で、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：前増幅  ９４℃５分：変性  ９４℃３０秒：アニーリング  ５５℃４０秒：伸長  ７２℃２分  ３４サイクル繰り返し、次に最後の伸長のための後増幅  ７２℃１０分。
【００２５】
本発明者らは、バシラスファミリーのバチルス・スファエリクス様メンバーに対する特定の２つの新規プライマーを設計した。本発明者らは、精製されたＤＮＡおよにプライマーＦＡＭ１およびＦＡＭ２を使用するＰＣＲ（ＢＩＯＲＡＤ、Ｉｔａｌｙ）により、細菌ＤＮＡ単離物（ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７およびコントロールのためのバチルス・スファエリクス血清型Ｈ）の５５０ｂｐの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子フラグメントを増幅した。５５０ｂｐの１６Ｓに対する０．２ｍＭのＦＡＭ１およびＦＡＭ２プライマー、１Ｕのｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＵＳＡ）、０．２ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび５０ｎｇ  鋳型ＤＮＡを含む５０ｕｌの反応混合物の全容量で、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：前増幅  ９４℃５分：変性  ９４℃３０秒：アニーリング  ５１℃４０秒：伸長  ７２℃４５秒  ３４サイクル繰り返し、次に最後の伸長のための後増幅  ７２℃１０分。
【００２６】
増幅されたＤＮＡ産物を、臭化エチジウムで染色された１％  アガロースゲルにおけるＰＣＲアンプリコンの電気泳動法後に、Ｂｉｏｒａｄ画像分析システム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｉｔａｌｙ）を使用して検出した。
【００２７】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングおよび系統発生分析
純粋な増幅産物を、Prism ABI 3100 Genetic Analyzer 16 caillaries, dideoxy terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems)でシーケンシングした。使用したプロトコールは、製造業者の推奨によった。配列を自動ＤＮＡシーケンサー（model: Prism ABI 3100; Applied Biosystems）で決定した。両方の鎖を、プライマー２７ｆ、１４９２ｒ、ＦＡＭ１およびＦＡＭ２を使用して、シーケンシングした（Lane, 1991; Nakamura, 1996）。ｃｌｕｓｔａｌ  ｗ  ｐｒｏｇｒａｍ（Higginsら, 1992）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣＢＩからのバチルス・スファエリクス様メンバーの配列で生成された１６Ｓ  ＤＮＡ配列をアラインした（Larsenら, 1993）。１６ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の配列を得た（図９、図１０、図１１）。
【００２８】
遺伝学的距離を、Ｋｉｍｕｒａの２パラメーターモデル（Ｋｉｍｕｒａ、１９８０）を使用することにより計算し、近隣結合分析のために使用した。系統樹を、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ＿２＿１＿１により提供される近隣結合および最大節約方法を使用して構築した（両方の方法は、同様のトポロジー(topologies)を有する樹をもたらした）。この試験において生成されたヌクレオチド配列は、受入番号の下にＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【００２９】
別の試験は、１４５０ヌクレオチド配列に基づく近隣結合樹分析であった。ブートストラップ(bootstrap)分析（１００複製）から概算される信頼限界は、節点（ｎｏｄｅ）で見られる。配列データから生成された最大節約樹は、この樹と同様のトポロジーを示した。系統樹において、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７は、高いブートストラップ値により示されるとおり、バチルス・スファエリクスの株に明らかに属した（図４）。
【００３０】
毒素遺伝子の決定
Ｎｉｓｈｉｗａｋｉらにより記載された方法論にしたがって毒素遺伝子を調べた。細菌ＤＮＡ単離物（ＭＢＩ５、ＭＢＩ６、ＭＢＩ７およびコントロールのためのバチルス・スファエリクス血清型Ｈ）の毒素遺伝子のＰＣＲを、殺蚊バイナリー毒素（５１および４２ｋＤａ）であるＭｔｘ１およびＭｔｘ２をコードする遺伝子に対して行った。ＰＣＲは、以下の条件にしたがって構築した：前増幅  ９４℃２分  次に変性  ９４℃１５秒、アニーリング  ５５℃３０秒、および伸長  ７２℃１分３０秒  ３０サイクル繰り返し。マスターミックスは、５０ｕｌの全容量の反応混合物中、１ＵのＴＳＧポリメラーゼ（Ｂｉｏｂａｓｉｃ，Ｃａｎａｄａ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．２ｍＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および５ｐｍｏｌのそれぞれのプライマーからなった。
【００３１】
増幅されたＤＮＡ産物を、臭化エチジウムで染色された１％  アガロースゲルにおけるＰＣＲアンプリコンの電気泳動法後に、Ｂｉｏｒａｄ画像分析システム（ＢＩＯＲＡＤ、Ｉｔａｌｙ）を使用して検出した（図１、図２）。
【００３２】
ＭＢＩ５、６、７および市販のバチルス・スファエリクスのＢｉｎおよびＭｔｘ毒素遺伝子のＰＣＲ増幅を行った。図１は、バチルス・スファエリクス、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７がＢｉｎ５１およびＢｉｎ４２毒素を有することを示す。同時に、ＭＢＩ５、ＭＢＩ６およびＭＢＩ７は、Ｍｔｘ１およびＭｔｘ２毒素を有さない（図２）。加えて、市販のバチルス・スファエリクスは、ＢｉｎおよびＭｔｘ毒素の両方を有する。
【００３３】
参考文献
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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