(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器の製造方法であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層の一方の側に配置された機能性有機化合物層を備える機能性基体とを少なくとも備え、
機能性基体は、容器本体部材の表面に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層が向くように、基材層と容器本体部材の表面との間に存在する接合層を介して接合されており、
前記接合層は、乾燥状態では粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す材料により構成される層であり、
以下の工程：
乾燥した状態の前記接合層が前記基材層の他方の側に更に配置されている機能性基体において該接合層を溶媒により湿潤させ、前記機能性基体を、前記接合層が湿潤した状態で、容器本体部材の表面に、該接合層と該表面とが接するように接触させる接触工程、並びに
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を含む方法。
【請求項２】
接触工程が、
接合層が乾燥した状態の機能性基体において接合層を溶媒により湿潤させて、接合層が溶媒により湿潤した状態の機能性基体を用意する工程と、
容器本体部材を用意する工程と、
機能性基体を容器本体部材の表面に接触させる工程と
を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
接触工程が、
接合層が乾燥した状態の機能性基体と、表面に溶媒が存在する状態の容器本体部材とをそれぞれ用意する工程と、
機能性基体を容器本体部材の表面に接触させる工程と
を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器の製造方法であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層の一方の側に配置された機能性有機化合物層を備える機能性基体とを少なくとも備え、
機能性基体は、容器本体部材の表面に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層が向くように、基材層と容器本体部材の表面との間に存在する接合層を介して接合されており、
前記接合層は、乾燥状態では粘着性が弱く又は粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す材料により構成される層であり、
以下の工程：
乾燥した状態の前記接合層が表面に配置されている容器本体部材において該接合層を溶媒により湿潤させ、前記接合層が湿潤した状態の容器本体部材に、前記機能性基体を、その基材層と前記接合層とが接するように接触させる接触工程、並びに、
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を含む方法。
【請求項５】
前記機能性基体がフィルム状の機能性基体であり、
予め用意された、前記接合層が乾燥した状態でロール状に巻かれた長尺状の前記機能性基体を繰り出し、繰り出された機能性基体を、前記容器本体部材に接合される形状にカットするカット工程
を更に含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記機能性基体がフィルム状の機能性基体であり、
予め用意された、ロール状に巻かれた長尺状の前記機能性基体を繰り出し、繰り出された機能性基体を、前記容器本体部材に接合される形状にカットするカット工程
を更に含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性有機化合物層を備える機能性基体が固定された細胞培養容器の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度応答性ポリマー等の機能性有機化合物層を表面に被覆した、シャーレ等の細胞培養容器が特許文献１に記載されている。この細胞培養容器を用いることにより、温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊することなく細胞支持体から容易に剥離して回収することができる。しかし、特許文献１に記載のように、シャーレ等の細胞培養容器に、別個にバッチ処理により表面処理を行って機能性化合物層を設けることは、多くの手間を必要とし、作業性の観点からはなお改善する余地がある。
【０００３】
そこで、特許文献２等のように、機能性化合物層を表面に備える、フィルム状、板状等の形状の機能性基体を別途作製し、該機能性基体を、容器の底面上に粘着剤や接着剤等を介して固定して目的の細胞培養容器を形成する技術が提案されている。この技術によれば、細胞培養容器を個別にバッチ処理して機能性有機化合物層を設ける場合と比較して作業性が高まる。
【０００４】
機能性基体を細胞培養容器に接合する手段として、両者を粘着剤により接合する手段がある。このためには、基材層と、基材層の一方の側に配置された機能性化合物層と、基材層の他方の側に配置された粘着剤層とを少なくとも備える機能性基体を、その粘着剤層を介して細胞培養容器に接合することが一般的である。この粘着剤層は、接着剤又は粘着剤を含む層であり、接着剤としてポリアクリル酸エステル系接着剤等、粘着剤としてアクリル系粘着剤等の、それ自体が粘着性を有する物質からなる層であることが通常である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開２０１０−９８９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
常時粘着性を示す粘着剤層を備えた機能性基体を使用する場合、貼付前までは剥離フィルムにより粘着剤層を保護しておき、剥離フィルムを取り除いてから容器に貼付することが通常である。フィルム状の機能性基体（機能性フィルム）はロール・ツー・ロール方式により大量生産可能であることから好ましいが、常時粘着性を示す粘着剤層を有する機能性フィルムを、粘着剤層を剥離フィルムにより保護することなくロール・ツー・ロール方式により製造することは事実上不可能である。
【０００７】
このため、常時粘着性を示す粘着剤層を備えた機能性基体を細胞培養容器に貼付する方法は、剥離フィルムを除去するための工程が必要であること、剥離フィルムが廃棄物として生じること、などの問題がある。
【０００８】
そこで本発明は、剥離フィルムによる保護を必要としない、機能性基体を容器本体に接合して細胞培養容器を製造するための効率的な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、常時粘着性を示す粘着剤層に代えて、乾燥状態では粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す接合層を用いることにより、剥離フィルムによる保護を必要としない、機能性基体を容器本体に接合して細胞培養容器を製造するための効率的な方法を提供する。具体的には以下の発明を包含する。
（１）細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器の製造方法であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層の一方の側に配置された機能性有機化合物層を備える機能性基体と
を少なくとも備え、
機能性基体は、容器本体部材の表面に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層が向くように、基材層と容器本体部材の表面との間に存在する接合層を介して接合されており、
前記接合層は、乾燥状態では粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す層であり、
以下の工程：
前記接合層が前記基材層の他方の側に更に配置されている機能性基体を、該接合層を溶媒により湿潤させた状態で、容器本体部材の表面に、該接合層と該表面とが接するように接触させる接触工程、並びに
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を含む方法。
（２）接触工程が、
接合層が溶媒により湿潤した状態の機能性基体と、容器本体部材とをそれぞれ用意する工程と、
機能性基体を容器本体部材の表面に接触させる工程と
を含む、（１）の方法。
（３）接触工程が、
接合層が乾燥した状態の機能性基体と、表面に溶媒が存在する状態の容器本体部材とをそれぞれ用意する工程と、
機能性基体を容器本体部材の表面に接触させる工程と
を含む、（１）の方法。
（４）細胞及び培地を収容するための容器部を備える細胞培養容器の製造方法であって、
容器部は、
容器本体部材と、
基材層及び該基材層の一方の側に配置された機能性有機化合物層を備える機能性基体と
を少なくとも備え、
機能性基体は、容器本体部材の表面に、細胞及び培地を収容するための空間側に機能性有機化合物層が向くように、基材層と容器本体部材の表面との間に存在する接合層を介して接合されており、
前記接合層は、乾燥状態では粘着性が弱く又は粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す層であり、
以下の工程：
前記接合層が表面に配置されている容器本体部材に、該接合層を溶媒により湿潤させた状態で、前記機能性基体を、その基材層と前記接合層とが接するように接触させる接触工程、並びに、
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を含む方法。
（５）前記機能性基体がフィルム状の機能性基体であり、
予め用意された、前記接合層が乾燥した状態でロール状に巻かれた長尺状の前記機能性基体を繰り出し、繰り出された機能性基体を、前記容器本体部材に接合される形状にカットするカット工程
を更に含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記機能性基体がフィルム状の機能性基体であり、
予め用意された、ロール状に巻かれた長尺状の前記機能性基体を繰り出し、繰り出された機能性基体を、前記容器本体部材に接合される形状にカットするカット工程
を更に含む、（４）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、剥離フィルムによる保護を必要としない、機能性基体を容器本体に接合して細胞培養容器を製造するための効率的な方法が提供される。
【００１１】
また、常時粘着性を示す粘着剤層は、貼付時の粘着性が高いために機能性基体と容器本体部材との貼付面に気泡が残存し易いという問題があるが、本発明のように、溶媒により湿潤させて粘性を発現させた接合層は貼付時の粘着性が比較的低いため、貼付面での気泡の残存が生じにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】本発明により製造される細胞培養容器の一実施形態を示す斜視図である。
【図１Ｂ】図１ＡのＩ−Ｉ’断面図である。
【図１Ｃ】図１ＡのＩＩ−ＩＩ’断面図である。
【図２】図１Ａ〜図１Ｃに示す細胞培養容器の製造過程を説明するための斜視図である。
【図３】本発明により製造される細胞培養容器の別の実施形態の製造過程を説明するための斜視図である。
【図４Ａ】本発明により製造される細胞培養容器のさらに別の実施形態を示す斜視図である。
【図４Ｂ】図４ＡのＩＩＩ−ＩＩＩ’断面図である。
【図５】本発明の方法の第２実施形態に用いられる機能性基体の断面図である。
【図６】本発明の方法の第１実施形態に用いられる機能性基体の断面図である。
【図７】本発明の細胞培養容器の製造方法の第１実施形態の一例を説明するための断面図である。
【図８】本発明の細胞培養容器の製造方法の第１実施形態の別の一例を説明するための断面図である。
【図９Ａ】本発明の細胞培養容器の製造方法の第１実施形態に使用することができるフィルム状の機能性基体を製造するための長尺状の機能性基体の上面模式図である。
【図９Ｂ】図９ＡのＩＶ−ＩＶ’断面図である。
【図１０】本発明の細胞培養容器の製造方法の第２実施形態の一例を説明するための断面図である。
【図１１Ａ】本発明の細胞培養容器の製造方法の第２実施形態に使用することができるフィルム状の機能性基体を製造するための長尺状の機能性基体の上面模式図である。
【図１１Ｂ】図１１ＡのＶ−Ｖ’断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面に基づき本発明の実施形態について詳細に説明する。なお各図は模式的に示した図であり、各部の大きさ、形状は理解を容易にするために適宜誇張して示している。
【００１４】
＜細胞培養容器の形状＞
まず、本発明において製造される細胞培養容器の全体の形状について説明する。
本発明により製造される細胞培養容器は、細胞及び培地を収容するための容器部を少なくとも備え、さらに適宜蓋等を備える。
【００１５】
容器部は、図１Ａ〜図１Ｃに示すように、細胞及び培地を収容するための空間が壁面により閉塞された形状であってもよいし、図４Ａ及び図４Ｂに示すように該空間の一端が開放された形状であってもよい。
【００１６】
細胞培養容器の好ましい一実施形態を図１Ａ〜図１Ｃに示す。図１Ａに示す容器部１００は、底部１０１、及び底部１０１の周縁に立設された側壁部１０２から構成される容器本体部材１０３と、容器本体部材１０３の上端部に接合された、底部１０１に対向配置される天面部材１０４とを少なくとも備える。側壁部１０２の一部に通孔１０５が穿設されており、通孔１０５の周縁から容器部外側に延びる首部１０６を備える、「フラスコ型」と呼ばれる形状の容器部である。容器部１００の首部１０６には蓋１１０を係止するための係止部１０７が形成されており、係止部１０７を介して蓋１１０が着脱可能に装着される。容器部１００と蓋１１０とを組み合わせることによりフラスコ型の細胞培養容器１２０が形成される。
【００１７】
図１Ｂは、容器部１００のＩ−Ｉ’断面図を示し、図１Ｃは、ＩＩ−ＩＩ’断面図を示す。容器部１００の、底部１０１及び側壁部１０２から構成される容器本体部材１０３は、底部１０１及び側壁部１０２によって画定され、かつ上方へ開放された開口部１０８を備える。開口部１０８は、天面部材１０４の接合によって閉塞され、その結果、細胞及び培地を収容するための空間１３０が形成されている。容器本体部材１０３の開口部１０８側の底面（すなわち、空間１３０に面する底部１０１上）には、機能性基体１４０が固定されている。
【００１８】
容器部１００を形成するには、図２に示すように、まず、底部及び側壁部から構成される容器本体部材１０３の内底面に、機能性基体１４０を接合し、次いで、容器本体部材１０３に天面部材１０４を接合する。
【００１９】
図３は、図１Ａ〜図１Ｃと同様のフラスコ型の容器部の別の実施形態の製造過程を示している。この実施形態では、容器本体部材１０９は平板状に形成されており、その平板状の容器本体部材１０９の底面（表面）上に、機能性基体１４０が固定されている。そして、機能性基体１４０が固定された容器本体部材１０９に対し、側壁部材１１１及び天面部材１０４が接合され、図１Ａ〜図１Ｃと同一の外形状を有する容器部が得られる。なお、図３において、容器本体部材１０９及び側壁部材１１１の接合工程と、側壁部材１１１及び天面部材１０４の接合工程とは、いずれが先でもよいことは無論である。
【００２０】
容器部の他の実施形態としては、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、底部２０１、及び底部２０１の周縁に立設した側壁部２０２から構成される容器本体部材２０３を備える皿状の容器部２００が挙げられる。容器本体部材２０３は、底部２０１及び側壁部２０２によって画定され、かつ上方へ開放された開口部２０４を備え、その開口部２０４が、細胞及び培地を収容するための空間２２０として機能する。容器本体部材２０３の開口部２０４側の底面（すなわち、空間２２０に面する底部２０１上）には、機能性基体２１０が固定されている。
【００２１】
本発明において「容器本体部材」とは機能性基体が接合される表面を提供する、容器本体の全体又は一部分に対応する部材である。図２、３に示すように、容器本体部材が容器本体の一部分に対応する部材である実施形態では、容器本体を構成する残部を容器本体部材に適宜接合することができる。
【００２２】
＜細胞培養容器の材料＞
容器本体部材、側壁部材、天面部材、首部及び蓋等の細胞培養容器の部材を形成する材料は特に限定されず、細胞培養において一般的に用いられる材料を用いることができる。例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料、及びガラスや石英等の無機材料であることができるが、好ましくは樹脂材料である。樹脂材料としては、ポリスチレン樹脂又はポリエチレンテレフタレート樹脂であることが好ましい。
【００２３】
容器本体部材は、該部材を通じて容器外から培養細胞を観察することが可能な透明な材料で構成されていることが好ましい。
【００２４】
＜機能性基体＞
本発明における機能性基体１４０、２１０の厚さ方向に沿った断面は、図５に示すように、基材層５０２、及び該基材層５０２上に配置された機能性有機化合物層５０１を少なくとも備える。機能性基体は、典型的には、透明な機能性基体である。ここで「基体」とは、所定の構造を有している限り、フィルムであってもよいし、板状体であってもよい。フィルム状の機能性基体（以下「機能性フィルム」と呼ぶことがある）は、好ましくはロール状に巻き取り可能な可撓性を有するものである。可撓性の機能性フィルムは、ロール・ツー・ロール法による大量生産が容易であるため好ましい。
【００２５】
機能性基体は、基材層５０２に機能性有機化合物層５０１を適当な方法により形成することによって製造することができる。基材層５０２と機能性有機化合物層５０１との間には、必要に応じて１つ以上の他の層（例えば後述するプライマー層）が存在していてもよい。
【００２６】
機能性基体の形状は、固定される部材の領域の形状に応じた任意の形状であることができる。例えば、三角形、四角形（長方形、正方形、平行四辺形、菱形等）、五角形、六角形、七角形、八角形等の多角形や、円形、楕円形等の形状であることができる。
【００２７】
＜基材層＞
基材層５０２は、最終的な機能性基体に応じて適宜選択される。機能性基体が板状であれば板状の基材層が用いられ、機能性基体がフィルム状であればフィルム状の基材層（以下「フィルム基材層」という）が用いられる。
【００２８】
基材層５０２は、一方の表面に上述の機能性有機化合物層５０１を形成することが可能な材料を含むものであればよく、材料の種類は特に限定されない。典型的には、基材層の材料として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ＴＡＣ（トリアセチルセルロース）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、アクリル樹脂等の樹脂材料や、ガラスや石英等の無機材料が挙げられ、樹脂材料が好ましい。
【００２９】
基材層５０２の、機能性有機化合物層５０１が形成される側の表面は、易接着処理された表面であることができる。「易接着処理」とは、例えば、ポリエステル、アクリル酸エステル、ポリウレタン、ポリエチレンイミン、シランカップリング剤、ペルフルオロオクタンスルホン酸（ＰＦＯＳ）等の易接着剤による処理を指す。
【００３０】
基材層５０２の厚さは適宜選択することができる。基材層がフィルム基材層である場合、その厚さ（フィルム基材層が基材の層に加えて易接着層を備える場合は、易接着層を含むフィルム基材層の全体の厚さを指す）は特に制限は無いが、可撓性を付与する厚さであることが好ましく、例えば５〜５００μｍ、より好ましくは２０〜５００μｍ、特に好ましくは５０〜２５０μｍである。
【００３１】
＜機能性有機化合物層＞
機能性有機化合物層５０１を構成する有機化合物としては、所望の機能を有する層であれば特に限定されないが、より好ましくは、所定の刺激によって細胞接着性から細胞非接着性へと変化することが可能な表面を有する刺激応答性ポリマーや、１つ以上のエチレングリコール単位（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）からなるエチレングリコール鎖等の親水性化合物が挙げられる。
【００３２】
機能性有機化合物層５０１の膜厚は、例えば、０．５ｎｍ〜３００ｎｍの範囲内とするよく、特に１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００３３】
以下「刺激応答性ポリマー層」及び「親水性化合物層」の好適な実施形態について説明する。
【００３４】
＜刺激応答性ポリマー層＞
機能性有機化合物層５０１は、刺激応答性ポリマー層であることが特に好ましい。刺激応答性ポリマー層とは、所定の刺激によって表面の細胞の接着度合いが変化するポリマーを含む層である。刺激応答性ポリマーとしては、温度応答性ポリマー、ｐＨ応答性ポリマー、イオン応答性ポリマー、光応答性ポリマー等を挙げることができる。なかでも温度応答性ポリマーが、刺激の付与が容易であることから好ましい。
【００３５】
温度応答性ポリマーとして、例えば、細胞を培養する温度では細胞接着性を示し、作製した細胞シートの剥離する時の温度では細胞非接着性を示すものを用いるとよい。例えば、温度応答性ポリマーは、臨界溶解温度未満の温度では周囲の水に対する親和性が向上し、ポリマーが水を取り込んで膨潤して表面に細胞を接着しにくくする性質（細胞非接着性）を示し、同温度以上の温度ではポリマーから水が脱離することでポリマーが収縮して表面に細胞を接着しやすくする性質（細胞接着性）を示すものを用いるとよい。このような臨界溶解温度は、下限臨界溶解温度と呼ばれる。下限臨界溶解温度Ｔが０℃〜８０℃、さらに好ましくは０℃〜５０℃である温度応答性ポリマーを用いるとよい。Ｔが０℃〜８０℃であると、細胞を安定的に培養できるからである。
【００３６】
好適な温度応答性ポリマーとしてはアクリル系ポリマー又はメタクリル系ポリマーが挙げられる。具体的に好適な温度応答性ポリマーとしては、例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）等が挙げられる。
【００３７】
これらのポリマーを形成するためのモノマーとしては、放射線照射によって重合し得るモノマーを用いることができる。モノマーとしては例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、及びビニルエーテル誘導体等が挙げられ、これらの１種以上を使用してよい。モノマーが一種類単独で使用された場合、基材上に形成されるポリマーはホモポリマーとなり、モノマーが複数種一緒に使用された場合、基材上に形成されるポリマーはヘテロポリマーとなるが、どちらの形態も本発明に包含される。
【００３８】
また、増殖細胞の種類によってＴを調節する必要がある場合や、被覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生じた場合や、細胞支持体の親水・疎水性のバランスを調整する必要がある場合等には、上記以外の他のモノマー類をさらに加えて共重合してよい。さらに本発明に使用する上記ポリマーとその他のポリマーとのグラフト又はブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。
【００３９】
ｐＨ応答性ポリマー及びイオン応答性ポリマーは作製しようとする細胞シートに適したものを適宜選択することができる。
【００４０】
刺激応答性ポリマー層は、重合して目的の刺激応答性ポリマーを形成するモノマーと、該モノマーを溶解しうる有機溶媒と含む塗布用組成物を調製し、これを慣用の塗布方法に従って、基材層の表面に塗布して塗膜を形成し、次に、該塗膜に放射線照射等の適当な手段により塗膜中のモノマーを重合してポリマーを形成するとともに、基材層の表面とポリマーとの間にグラフト化反応を生じさせることにより形成することができる。
【００４１】
＜親水性化合物層＞
機能性有機化合物層の他の実施形態として、１つ以上のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖（複数のエチレングリコール単位からなるエチレングリコール鎖は、「ポリエチレングリコール鎖」ということができる）等の親水性化合物の層が挙げられる。エチレングリコール鎖の末端は水酸基により封鎖された形態であってもよいし、エチレングリコール鎖の末端に生体関連物質等の他の物質が共有結合により連結された形態であってもよい。末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層は、細胞が接着し難い親水性の表面を提供することができる。
【００４２】
エチレングリコール鎖の末端に共有結合されうる生体関連物質としては、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、ホルモン、酵素、サイトカイン、糖鎖、脂質、補酵素、酵素阻害剤、細胞、その他の機能を有するタンパク質が含まれる。さらに、このような生体関連物質と親和性を有する低分子化合物、及び高分子化合物も生体関連物質の範囲に含まれる。
【００４３】
エチレングリコール鎖等の親水性化合物の層を、樹脂製の基材層の表面に固定化するためには、予め、樹脂製の基材層の表面に、該表面に物理的に吸着可能であって、エチレングリコール鎖の末端の水酸基と反応して共有結合を形成可能な官能基を側鎖に含むポリシロキサンを含むプライマー層を設ける。ポリシロキサンの側鎖上の官能基としては、グリシジル基又はエポキシ基が好ましい。プライマー層は、基材層の表面に、所望の側鎖を有するシラノール化合物を適用し、該表面上で縮合重合してポリシロキサンに変換することにより形成することができる。
【００４４】
次いで、プライマー層の官能基と、エチレングリコール又はエチレングリコール単位が２以上繰り返されたポリエチレングリコールの水酸基とを反応させて共有結合を形成し、エチレングリコール鎖を固定化する。このとき、触媒量の濃硫酸を含むエチレングリコール又はポリエチレングリコールをプライマー層に接触させる。末端が水酸基により封鎖されたエチレングリコール鎖を含む層はこのようにして形成される。
【００４５】
さらに、必要に応じて、エチレングリコール鎖の一端に、他の物質との共有結合を形成することが可能な、少なくとも１つの官能基を直接的又は間接的に連結させる。官能基の導入方法は特に限定されない。
【００４６】
＜接合層＞
本発明の特徴の一つは、機能性基体の基材層５０２と、容器本体部材１０３，１０９，２０３の表面とを、接合層５０３を介して接合することである。
【００４７】
本発明の第１実施形態では、接合層５０３は、機能性基体に予め配置される。すなわち本発明の第１実施形態に使用される機能性基体１４０−１，２１０−１は、基材層５０２及び機能性有機化合物層５０１に加えて、基材層５０２の機能性有機化合物層５０１が形成されていない側に接合層５０３を更に備えた状態で予め準備される（図６）。
【００４８】
本発明の第２実施形態では、接合層５０３は、容器本体部材に予め配置される。従って本発明の第２実施形態に使用される機能性基体１４０，２１０は図５に示す２層を備えていればよい。
【００４９】
接合層５０３は、乾燥状態では粘着性を実質的に示さず、溶媒による湿潤状態では粘着性を示す層である。このような接合層は乾燥状態では粘着性を有していないため剥離フィルムにより表面を保護する必要がない。このような接合層を備える機能性基体又は容器本体部材は、取扱いが容易であり、大量生産に適する。特に、当該接合層を備える、フィルム状で長尺状の機能性基体は、剥離フィルムを備えていなくともロール状に巻き取ること、及びロールから繰り出すことができるため、後述するロール・ツー・ロール方式による連続処理が容易であり好ましい。
【００５０】
接合層５０３を構成する材料としては、水、イソプロピルアルコール、プロパノール、エタノール、メタノール等の溶媒、好ましくは水又はイソプロピルアルコールを吸収した湿潤状態において粘着性を示し、乾燥状態では粘着性を実質的に示さない材料が挙げられ、具体的には、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、アクリル酸共重合体等が挙げられる。接合層にはこれらの材料に加えて適宜他の成分、例えば、架橋剤、充填剤等が含まれてもよい。
【００５１】
本発明の第２実施形態において容器本体部材の表面に設けられる接合層５０３は、乾燥状態において粘着性を有さないことまでは求められず、乾燥状態において剥離フィルムによる保護が必要ない程度に粘着性が弱い層であっても同様の効果が得られる。このような接合層５０３としては前記溶媒を吸収した湿潤状態において粘着性を示し、乾燥状態では剥離フィルムによる保護が必要ない程度に粘着性が弱い材料が挙げられ、具体的には、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、アクリル酸共重合体の何れか一つに粘着付与剤を添加したもの等が挙げられる。
【００５２】
接合層５０３の厚さは、機能性基体と容器本体部材とを接合することが可能なように適宜決定することができ、一般的には乾燥状態において１〜２０μｍの厚さであることができる。
【００５３】
接合層５０３を、機能性基体の基材層又は容器本体部材の表面に形成する方法は特に限定されないが、例えば印刷法、スピンコート法を用いることができる。水溶性の高分子材料により接合層５０３を形成する場合に、細胞培養時において細胞培養用培地中に接合層が溶出することを防ぐことを目的として、機能性基体の基材層又は容器本体部材の表面に、高分子材料をグラフト重合により共有結合させて接合層５０３を形成することも可能である。
【００５４】
溶媒により湿潤した接合層５０３’（図７等参照）は、常時粘着性を有する粘着剤層と比較して粘性が低い。常時粘着性を示す粘着剤層は、貼付時の粘着性が高いために貼付面に気泡が残存し易いという問題があるが、本発明のように、貼付時のみ溶媒により湿潤させて粘性を発現させた接合層５０３’を使用することは、気泡の残存を低減するためにも有利である。
【００５５】
＜製造方法＞
以下、本発明の細胞培養容器の製造方法の第１実施形態及び第２実施形態のそれぞれについて説明する。
【００５６】
＜第１実施形態＞
第１実施形態は、図６に示す、基材層５０２、基材層５０２の一方の側に配置された機能性有機化合物層５０１、及び基材層５０２の他方の側に配置された接合層５０３を有する機能性基体１４０−１，２１０−１を用いる実施形態である。
【００５７】
本発明の細胞培養容器の製造方法の第１実施形態は、
前記構造の機能性基体を、接合層５０３を溶媒により湿潤させた状態で、容器本体部材の表面に、該接合層と該表面とが接するように接触させる接触工程、並びに
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を少なくとも含む。
【００５８】
図７及び図８では、第１実施形態に係る方法により、機能性基体１４０−１を容器本体部材１０３に接合し、その後に天面部材１０４を接合して図１Ａ〜図１Ｃに示すフラスコ型細胞培養容器を製造する具体例（図１ＡのＩ−Ｉ’断面視の方向）を説明する。
【００５９】
第１実施形態の典型的な例では、図７に示すように、機能性基体１４０−１の乾燥状態の接合層５０３に、容器本体部材１０３への接合前に所定の溶媒を付与して湿潤させる（図７Ｂ）。湿潤状態の接合層５０３’は上述のように粘着性を示す。次いで別途用意された容器本体部材１０３の所定の表面に湿潤状態の接合層５０３’が接するように、機能性基体１４０−１と容器本体部材１０３とを接触させる（図７Ｃ）。次に、接触状態を維持しつつ、溶媒を揮発させて、接合層５０３を介して基材層５０２を容器本体部材１０３の底部表面に接合させる（図７Ｄ）。次に容器本体部材１０３の上端縁に天板部材１０４を接合してフラスコ型容器部１００を完成させる（図７Ｅ）。溶媒を揮発させる接合工程の条件は、溶媒を揮発させることが可能な条件であれば特に限定されないが、好ましくは低湿度環境下自然乾燥、送風乾燥、乾燥フードの利用等が挙げられる。
【００６０】
典型的には、第１実施形態及び第２実施形態の接合工程において揮発により溶媒が完全に除去されるわけではなく、接合工程後の図７Ｄ、図７Ｅ、図８Ｃ、図８Ｄ、図１０Ｄ、図１０Ｅにおける接合層５０３には適当な量の溶媒が残存する。本発明の第１実施形態及び第２実施形態における溶媒の揮発の程度は、溶媒揮発後の機能性基体と容器本体部材とが十分な強度で接合されるように適宜調節可能である。
【００６１】
第１実施形態の他の例では、図８に示すように、容器本体部材１０３の、機能性基体が設けられる所定の表面に溶媒８１０を塗布や滴下等により配置しておき、ここに別途用意された乾燥状態の接合層５０３を有する機能性基体１４０−１を、接合層５０３が溶媒８１０により湿潤して湿潤状態の接合層５０３’が形成されるように接触させる（図８Ｂ）。次に、接触状態を維持しつつ、溶媒を揮発させて、接合層５０３を介して基材層５０２を容器本体部材１０３の底部表面に接合させる（図８Ｃ）。次に容器本体部材１０３の上端縁に天板部材１０４を接合してフラスコ型容器部１００を完成させる（図８Ｄ）。容器本体部材１０３の表面に配置される溶媒８１０の量は、接合層５０３を湿潤させて粘着性を発現させるために十分な量であれば特に限定されない。溶媒８１０は、上記で例示したような、接合層５０３を湿潤させて粘着性を発現させることが可能な溶媒を、接合層５０３の材料に応じて適宜選択して使用することができる。
【００６２】
図７及び８に示す第１実施形態に用いるための機能性基体１４０−１は、好ましくはフィルム形状である。フィルム状の機能性基体１４０−１は、図９に示すように、機能性有機化合物層５０１、基材層５０２、接合層５０３を備える長尺状のフィルム状機能性基体９００から製造することができる。長尺状のフィルム状機能性基体９００は、接合層５０３が乾燥した状態でロール状に巻くことが可能であり、剥離フィルムによる保護は不要である。ロール状に巻かれた長尺状のフィルム状機能性基体９００を適宜繰り出し、繰り出された機能性基体９００を、容器本体部材１０３に接合される所定形状の枚葉片にカットして、枚葉状の機能性基体１４０−１を得ることができる（カット工程）。機能性基体１４０−１が切り取られたあとの長尺状のフィルム状機能性基体９００の残部を再びロール状に巻き取るロール・ツー・ロール方式による処理も可能である。カット工程は長尺状のフィルム状機能性基体９００から枚葉状の機能性基体１４０−１を裁断により切り出す工程であってもよいし、長尺状のフィルム状機能性基体９００として、機能性基体１４０−１を切り取り可能なようにミシン目、ハーフカット線等の切れ目を予め設けたものを使用し、カット工程はこれらの切れ目に沿って機能性基体１４０−１を取り外す工程であってもよい。図７に示すように、機能性基体１４０−１上の接合層５０３を湿潤させる場合には、カット工程よりも前に、ロールから繰り出された長尺状の機能性基体９００の接合層５０３に溶媒を塗布して湿潤させ、次にカット工程を実行することにより、湿潤状態の接合層５０３’を有する枚葉状の機能性基体１４０−１を製造することができる。或いは、カット工程後に枚葉状の機能性基体１４０−１に溶媒を塗布して湿潤状態の接合層５０３’を形成することも可能である。
【００６３】
＜第２実施形態＞
第２実施形態は、図５に示す、基材層５０２、及び基材層５０２の一方の側に配置された機能性有機化合物層５０１を有する機能性基体と、表面に接合層が設けられた容器本体部材とを用いる実施形態である。
【００６４】
本発明の細胞培養容器の製造方法の第２実施形態は、
接合層５０３が表面に配置されている容器本体部材に、該接合層を溶媒により湿潤させた状態で、機能性基体を、その基材層と前記接合層とが接するように接触させる接触工程、並びに、
接触状態を維持しつつ前記溶媒を揮発させることにより、前記容器本体部材の表面に、前記機能性基体を、前記接合層を介して接合する、接合工程
を少なくとも含む。
【００６５】
具体的には図１０に示すように、接合層５０３が底部の表面に配置されている容器本体部材１０３を用意し、接合層５０３を溶媒により湿潤させて接合層５０３’とする（図１０Ｂ）。湿潤状態の接合層５０３’は上述のように粘着性を示す。別途準備された基材層５０２、及び機能性有機化合物層５０１を有する機能性基体１４０を、その基材層５０２と湿潤状態の接合層５０３’とが接するように、容器本体部材１０３に接触させる（図１０Ｃ）。次に、接触状態を維持しつつ、溶媒を揮発させて、接合層５０３を介して基材層５０２を容器本体部材１０３の底部表面に接合させる（図１０Ｄ）。次に容器本体部材１０３の上端縁に天板部材１０４を接合してフラスコ型容器部１００を完成させる（図１０Ｅ）。
【００６６】
図１０に示す第２実施形態に用いるための機能性基体１４０は、好ましくはフィルム形状である。フィルム状の機能性基体１４０は、図１１に示すように、機能性有機化合物層５０１、及び基材層５０２を備える長尺状のフィルム状機能性基体１１００から製造することができる。長尺状のフィルム状機能性基体１１００はロール状に巻くことが可能であり、剥離フィルムによる保護は不要である。ロール状に巻かれた長尺状のフィルム状機能性基体１１００を適宜繰り出し、繰り出された機能性基体１１００を、容器本体部材１０３に接合される所定形状の枚葉片にカットして、枚葉状の機能性基体１４０を得ることができる（カット工程）。機能性基体１４０が切り取られたあとの長尺状のフィルム状機能性基体１１００の残部を再びロール状に巻き取るロール・ツー・ロール方式による処理も可能である。カット工程は長尺状のフィルム状機能性基体１１００から枚葉状の機能性基体１４０を裁断により切り出す工程であってもよいし、長尺状のフィルム状機能性基体１１００として、機能性基体１４０を切り取り可能なようにミシン目、ハーフカット線等の切れ目を予め設けたものを使用し、カット工程はこれらの切れ目に沿って機能性基体１４０を取り外す工程であってもよい。
【符号の説明】
【００６７】
１００、２００    容器部
１０１、２０１    底部
１０２、２０２    側壁部
１０３、１０９、２０３    容器本体部材
１４０、１４０−１、２１０、２１０−１    機能性基体
５０１    機能性有機化合物層
５０２    基材層
５０３    接合層
８１０    溶媒
９００、１１００    長尺状のフィルム状機能性基体
【図１Ａ】
0005919776.tif 000002
【図１Ｂ】
0005919776.tif 000003
【図１Ｃ】
0005919776.tif 000004
【図２】
0005919776.tif 000005
【図３】
0005919776.tif 000006
【図４Ａ】
0005919776.tif 000007
【図４Ｂ】
0005919776.tif 000008
【図５】
0005919776.tif 000009
【図６】
0005919776.tif 000010
【図７】
0005919776.tif 000011
【図８】
0005919776.tif 000012
【図９Ａ】
0005919776.tif 000013
【図９Ｂ】
0005919776.tif 000014
【図１０】
0005919776.tif 000015
【図１１Ａ】
0005919776.tif 000016
【図１１Ｂ】
0005919776.tif 000017