(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル出力と廃棄出力を有するマイクロ流体抵抗ネットワークと組み合わせて使用される測定チップであって、前記マイクロ流体抵抗ネットワークと前記測定チップは別々の基板に形成され、前記測定チップが、
サンプル入口とサンプル出口との間に延在するサンプルチャネルであって、前記サンプル入口は前記マイクロ流体抵抗ネットワークのサンプル出力と連通してサンプルストリームを受け、前記サンプルチャネルが、測定手段を含み、第１の流体抵抗を持つ、サンプルチャネルと、
廃棄入口と廃棄出口との間に延在する廃棄チャネルであって、前記廃棄入口は前記マイクロ流体抵抗ネットワークの廃棄出力と連通して、前記サンプルストリームとは別の廃棄ストリームを受け、前記廃棄チャネルが、第２の流体抵抗を持つ、廃棄チャネルとを有する、測定チップ。
【請求項２】
前記第１の流体抵抗と前記第２の流体抵抗の比が事前に規定される、請求項１に記載の測定チップ。
【請求項３】
前記サンプルチャネル及び前記廃棄チャネルの寸法が同じである、請求項１又は２に記載の測定チップ。
【請求項４】
前記サンプル出口及び前記廃棄出口が同じである、請求項１乃至３のいずれかに記載の測定チップ。
【請求項５】
前記チップが、前記廃棄チャネルを複数有する、請求項１乃至４のいずれかに記載の測定チップ。
【請求項６】
前記複数の廃棄チャネルが、同じ廃棄入口及び／又は同じ廃棄出口を共有する、請求項５に記載の測定チップ。
【請求項７】
前記チップが、ガラスチップである、請求項１乃至６のいずれかに記載の測定チップ。
【請求項８】
前記測定手段が、第１の電極及び第１のカウンタ電極を含む第１の電極ペアと、前記第１の電極ペアの下流に第２の電極ペアとを有し、
前記第２の電極ペアは、第２の電極及び第２のカウンタ電極を有し、
前記第１及び第２の電極が、同じ電流信号に結合されるよう構成され、前記第１及び第２のカウンタ電極は、接地に結合されるよう構成される、請求項１乃至７のいずれかに記載の測定チップ。
【請求項９】
前記電極及び／又は前記カウンタ電極が、プラチナ電極である、請求項８に記載の測定チップ。
【請求項１０】
マイクロ流体サンプル調整ステージ、並びに該調整ステージと流体連通するサンプル出力及び廃棄出力を含むマイクロ流体抵抗ネットワークと、
請求項１乃至９のいずれかに記載の測定チップとを有する、マイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記マイクロ流体抵抗ネットワークが、ポリマー物質から作られる、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
サンプルを受ける第１の入口と、
希釈剤を受ける第２の入口とを更に有し、
前記サンプル調整ステージが、前記希釈剤で前記サンプルを希釈する希釈ステージのチェーンを有し、下流の希釈ステージは、前記チェーンにおける以前の希釈ステージから受ける前記サンプルを更に希釈するよう構成され、
前記希釈ステージの第１のものが、前記第１の入口と流体連通し、
前記希釈ステージの各々は、前記第２の入口と流体連通し、
前記希釈ステージの少なくともいくつかが、前記受けたサンプルの部分を前記廃棄チャネルに供給する別々の出力を有する、請求項１０又は１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記サンプルが、血液サンプルであり、
前記マイクロ流体抵抗ネットワークは更に、
追加的なサンプル調整ステージと、
前記血液サンプルを受ける前記サンプル調整ステージ及び前記追加的なサンプル調整ステージの少なくとも１つと流体連通する第１の追加的な入口と、
前記追加的なサンプル調整ステージに対して溶解剤を提供する前記追加的なサンプル調整ステージと流体連通する第２の追加的な入口と、
前記追加的なサンプル調整ステージに対してクエンチ溶液を提供する前記サンプル調整ステージと流体連通する第３の追加的な入口と、
前記追加的なサンプル調整ステージと流体連通する追加的なサンプル出口とを有する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
前記マイクロ流体抵抗ネットワークが更に、前記サンプル調整ステージ、前記サンプル出口及び前記廃棄出口の間に接合部を有し、
前記接合部は、前記サンプル出口に関するサンプル部分及び前記廃棄出口に関する廃棄部分へと、前記希釈された全体の血液サンプルを分離するよう設計される、請求項１３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１５】
サンプル出力と廃棄出力を有するマイクロ流体抵抗ネットワークと組み合わせて用いる測定チップを製造する方法において、
基板を提供するステップと、
前記基板を通るサンプルチャネルを形成するステップであって、前記サンプルチャネルがサンプル入口とサンプル出口との間に延在し、前記サンプル入口が前記マイクロ流体抵抗ネットワークのサンプル出力と連通してサンプルストリームを受ける、ステップと、
前記基板を通る廃棄チャネルを形成するステップであって、前記廃棄チャネルが廃棄入口と廃棄出口との間に延在し、前記廃棄入口が前記マイクロ流体抵抗ネットワークの廃棄出力と連通して、前記サンプルストリームとは別の廃棄ストリームを受ける、ステップと、
前記サンプルチャネルにおいて測定手段を形成するステップとを有し、
前記マイクロ流体抵抗ネットワークが前記基板とは別の基板に形成される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体サンプル希釈ステージと、サンプル出口と、廃棄物出口とを有するマイクロ流体抵抗ネットワークで使用される測定チップに関する。ここで、サンプル出口と廃棄物出口とは共に、上記希釈ステージと流体連通状態にある。測定チップは、上記サンプル出口からサンプルを受けるサンプルチャネルを有する。このサンプルチャネルは、測定手段を有し、第１の流体抵抗を持つ。
【０００２】
本発明は更に、斯かる測定チップ及びマイクロ流体ネットワークを持つマイクロ流体デバイスに関する。
【０００３】
本発明は更に、斯かる測定チップを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ヘルスケアにおいて、いわゆるポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスの発展に向かう傾向が存在する。このデバイスは、しばしば、例えばカートリッジといった使い捨ての要素を持つ、小さなデバイスである。そして、これは、大きくて高価な解析装置に代わるものとして患者の診断及び治療に用いられることができる。
【０００５】
広く使われている診断テストは完全血球算定（ＦＢＣ）テストである。これは、血液の細胞組成物を測定するのに使用される診断テストである。それは、患者の免疫系の状態、酸素を送信する血液の能力及び／又は効果的に凝固させる血液の能力に関する情報を提供することができる。そのようなものとして、このテストは、しばしば初期の「多目的」診断ツールとして、又はより目標をしぼった監視ソリューションとして使用される基本的なテストである。監視ツールとして完全血球算定を含むケアサイクルの例は、腫瘍学、関節炎及びクローン病を含む。３００万件ものＦＢＣテストが、世界において毎年実行される。
【０００６】
現在では、血液学アナライザとして知られる大規模な商業実験室器具は、ＦＢＣを有するすべての測定を自動的に実行するために用いられる。静脈血に関する必要性に結びつけられるこれらのデバイスの高いコスト及び複雑さは、それらがほとんど大きなスケールで中央化された設備であることを意味する。近患者設定（near patient setting）において、特に疾患の進行及び／又は治療を監視するのに完全血球算定を必要とする用途に対して、ＦＢＣを実行する明らかな臨床必要性が存在する。
【０００７】
以前に、ＦＢＣの個別の要素を測定することができるマイクロ流体ポイントオブケアデバイスが開発された。この領域では、Ｈｂ測定デバイス、白血球差分を実行することができるＷＢＣカウンタ、血小板計数バイス、及び赤血球を光学的に計数し、サイズを決定するデバイスが、利用可能である。細胞計数に関して、現在の血液学アナライザは通常、白血球を計数及び識別し、赤血球及び血小板を計数し、そのサイズを決定するのに、電気コールタカウンティング及び／又は光学散乱法を使用する。
【０００８】
現在のところ、マイクロ流体コールタカウンタ技術に関してはわずか数例しか存在しない。１つの例は、Ｈｂ測定とコールタカウンタとを組み合わせるものである。細胞計数の別の例は、フロースルー・インピーダンス分光学によるものである。これは、特にマイクロ流体フォーマットに適したフロー血球計算解析である。この技術は、溶解血液におけるリンパ球、単球及び好中球の間を区別し、赤血球及び血小板を計数し、これらの大きさを決定することができる。
【０００９】
Ｈｂ測定に関する現在の「ゴールドスタンダート」は、「Standardization of hemoglobinometry II、The hemiglobincyanide method」、Clin Chim Acta、1961 、6、p.38 - 44に開示される光度測定のシアン・メトヘモグロビン（ＨｂＣＮ）法である。この方法は、赤血球の化学溶解、及びこれらの細胞がシアン化物イオンと共に解放するすべてのＨｂの後続のラベリングを含む。ラベルは、５４０ｎｍで最大を持つ規定された吸収プロファイルを生成する。５４０ｎｍでの光学吸収を測定することにより、Ｈｂの濃度が決定されることができる。更に、ＨｂＣＮの高い安定性は、較正標準を供給することが容易であることを意味する。
【００１０】
最も一般的な赤血球溶解／シアン化物変換試薬は、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬として知られる。Ｄｒａｂｋｉｎの試薬は、シアン化カリウムを含む。これは、極めて有毒である。この試薬は、全体の血液における非常に大きな希釈剤に関してのみ作用する（１：２５１）。なぜなら、赤血球溶解は、浸透圧衝撃をもたらす試薬の低いイオン強度に依存するからである。この大きな希釈剤は、この方法において固有の不正確さをもたらす。更に、５４０ｎｍでの光学吸収を測定するため、１ｃｍ以下の非常に長い光学経路長が必要とされる。最終的に、いくつかの病理学的サンプルにおいて、汚濁が、誤って高い吸収読み出しをもたらす可能性がある。これは順に、不正確なＨｂ濃度を引き起こすことになる。
【００１１】
毒性及び汚濁に関連付けられる問題を回避するため、Ｈｂを測定する他の多くの光学手段が開発された。既知のポイントオブケアデバイスは、アジ化物配位Ｈｂ派生物（azidemethemoglobin、ＨｂＮ３）へとＨｂを変換するため、アジ化ナトリウムを用いる。この方法そのものは、短い経路長（０．１ｍｍ）吸収分光学を与える。なぜなら、乾燥試薬は、全体の血液の希釈の必要性を除去するからである。ＨｂＮ３濃度を決定するために、２つの吸収度読み出しが行われる。すなわち、１つは、吸収最大（５６５ｎｍ）で行われ、１つは、汚濁を修正するため８００ｎｍで行われる。
【００１２】
ポイントオブケアＷＢＣ／Ｈｂカウンタに関して、ＷＢＣを保存しつつ、同時にイミダゾールでＨｂ分子をラベリングするＲＢＣ溶解溶液が開発された。上述したのと類似する態様で、イミダゾールでラベリングされたＨｂ種の光学吸収は、２つの波長で測定される。すなわち、１つは、吸収ピークで、１つは、白血球に関する汚濁及び散乱効果を修正するためのものである。同じ溶液は、細胞計数を実行するため、コールタカウンタを通り通過されることもできる。
【００１３】
別の既知の溶解／Ｈｂ変換試薬は、ナトリウムラウリル硫酸塩／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ／ＳＤＳ）に基づかれる。ＳＤＳは、すべての血球を溶解させ、ＳＤＳ配位派生物を得るため、Ｈｂをラベリングする。ＳＤＳが界面活性剤分子であるので、汚濁修正は必要でない。従って、Ｈｂ濃度を決定するため、５３５ｎｍでの単一の吸収読み出しが行われる。この方法は、Ｈｂの高い希釈剤に関して設計されるので、ＨｂＣＮ測定に存在する固有の不正確さは、ＨｂＳＤＳ測定においてもまだ存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記のデバイス及び技術はすべて、指に刺した針で得られる血液から特定の測定を実行することができる。しかしながら、上記のデバイス及び技術のいずれも、単一のＰＯＣ測定においてＦＢＣに必要とされるすべてのパラメータを測定することができない。近年では、単一のＰＯＣ測定においてＦＢＣを実行することができるマイクロ流体デバイスが、ＷＯ２０１０／０８６７８６号において開示された。このマイクロ流体デバイスは、２つのサンプル調整ステージを有する。１つは、白血球数に関する溶解剤及びクエンチ溶液で血液サンプルの部分を希釈し、インピーダンス測定手段に対して希釈された部分を提供するステージであり、２つ目は、ヘモグロビン測定のため希釈剤で血液サンプルの追加的な部分を希釈し、例えばＲＢＣ計数、ＨＢ計数及び血小板計数といった赤血球の特性を決定する測定手段に対してこの希釈された追加的な部分を提供する希釈ステージである。高い希釈率を得るため、希釈剤は複数回血液サンプルに供給される。結果的に、ＲＢＣ計数サンプルのわずかな部分が、実際のＲＢＣ計数に用いられる。ここで、様々な希釈ステージの９０％以上が、廃棄するために供給される。
【００１５】
ＦＢＣの正確な測定結果を実現するため、斯かるマイクロ流体デバイスを通るフローレートがうまく規定されることが最も重要である。斯かるフローレートは、各流体ストリームに関する別々のポンプを用いて制御されることができる。しかし、これはかなり高コストである。代替的に、フローレートは、マイクロ流体ネットワークを形成する流体チャネルの寸法（すなわち流体抵抗）をチューニングすることにより、マイクロ流体デバイスの設計ステージでうまく規定（即ちチューニング）されることができる。マイクロ流体ネットワークの特徴サイズが通常、例えばインピーダンス測定チップの特徴サイズより大きいので、マイクロ流体ネットワーク及び測定チップを別々のプロセスで製造することが簡単で従ってよりコスト効率が良い。
【００１６】
しかしながら、このやり方は、マイクロ流体デバイスのチューニングを難しくする。例えば、希釈された血液サンプルの部分だけが測定チップに供給されるので、上記したように、希釈された血液サンプルの残りは通常、廃棄するために供給される。インピーダンス測定チップと比較してマイクロ流体ネットワークの特徴サイズがより大きいことから、マイクロ流体ネットワークにおける廃棄チャネルは通常、流体抵抗マッチング要素を有する。これは、インピーダンス測定チップを通る廃棄チャネル及び測定チャネルの流体抵抗の比がうまく規定され、及び比較可能であることを確実にするためである。
【００１７】
しかしながら、このマッチング要素が常に満足できるチューニングを実現することができるわけではないことが分かっている。これは、マイクロ流体ネットワークの製造プロセスの公差が、インピーダンス測定チップの製造プロセスの公差から独立しているためである。その結果、マッチング要素の必要な寸法が正確に予測されることができない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、フローレートがより容易に制御されることができるマイクロ流体抵抗ネットワークで用いられる測定チップを提供するものである。
【００１９】
本発明は更に、斯かる測定チップを有するマイクロ流体デバイスを提供するものである。
【００２０】
本発明はまた、斯かる測定チップを製造する方法を提供するものである。
【００２１】
本発明のある側面によれば、マイクロ流体サンプル調整ステージ、並びに上記調整ステージと流体連通するサンプル出口及び廃棄出口を含むマイクロ流体抵抗ネットワークと共に用いる測定チップが提供される。上記測定チップが、上記サンプル出口からサンプルを受けるサンプルチャネルであって、測定手段を含み、第１の流体抵抗を持つ、サンプルチャネルと、上記廃棄出口から廃棄ストリームを受け、第２の流体抵抗を持つ廃棄チャネルとを有する。
【００２２】
本発明は、マイクロ流体抵抗ネットワークから測定チップを通るサンプルのフローレートのバランスをとることが、廃棄ストリームも測定チップを通り供給されるとき、かなり好適に制御されることができるという実感に基づかれる。これは、サンプルチャネル及び廃棄チャネルが特徴サイズにおいて同じ削減を示し、同じプロセスで製造されるためである。その結果、サンプル及び廃棄チャネル寸法における変動が、かなり小さくなり、従って、測定チップを通るフローレートのより予測可能で再生可能なチューニングが生み出される。これは更に、マイクロ流体抵抗ネットワークの廃棄ラインにおいてマッチング要素が省略されることができるという追加的な利点を持つ。これにより、マイクロ流体抵抗ネットワークの製造複雑さ及びコストが減らされる。なぜなら、マッチング要素は通常、必要な流体抵抗を実現するのに非常に大きな又は非常に小さな寸法でなければならないからである。このため、第１の流体抵抗及び第２の流体抵抗の間の比は通常、測定チップのマイクロ流体測定チャネルを通る正確なフローレートを確実にするよう事前に規定される。
【００２３】
好ましい実施形態において、サンプルチャネル及び廃棄チャネルの個別の寸法は、同じである。これは、サンプルチャネル及び廃棄チャネルの製作公差における変動を最小化する。ｄが流体チャネルの水力直径であるとき、流体抵抗は、１／ｄ４でスケール化されるので、できるだけ好適に斯かるチャネルの寸法（における変動）を制御することが重要である。
【００２４】
ある実施形態において、測定チップは更に、サンプル入口及びサンプル出口であって、サンプルチャネルが、このサンプル入口及びサンプル出口の間に延在する、サンプル入口及びサンプル出口と、廃棄入口及び廃棄出口であって、廃棄チャネルがこの廃棄入口及び廃棄出口の間に延在する、廃棄入口及び廃棄出口とを有する。
【００２５】
別の好ましい実施形態において、サンプル出口及び廃棄出口は、同じである。サンプルチャネル及び廃棄チャネルが、これらのチャネルの個別の流体抵抗に影響を及ぼすことなしに、同じ出口を共有することができることが分かっている。これは、測定チップの製造費用が提供される利点を持つ。なぜなら、提供されるべき出口が１つ減らされるからである。
【００２６】
更に別の実施形態において、測定チップは、上記廃棄チャネルを複数有する。好ましくは各廃棄チャネルは、サンプルチャネルと同じ寸法を持つ。これは例えば、廃棄チャネルを通るフローレートが、サンプルチャネルを通るフローレートの整数倍であるようチューニングされるとき、有利である。その結果、制御可能な態様で必要なフローレートを実現するため、測定チップは、この整数個の廃棄チャネルを含むことができる。
【００２７】
上記廃棄チャネルは、同じ入口及び同じ出口の間で延在する。これは、製造コストを減らせるという利点を持つ。
【００２８】
好ましくは、測定チップは、ガラスチップである。ガラスチップは、コスト効率の良い態様で製造されることができ、例えばサンプルチャネル及び１つ又は複数の廃棄チャネルといったガラスを通る流体チャネルの寸法にわたり優れた制御で製造されることができる。
【００２９】
上記測定手段が、第１の電極及び第１のカウンタ電極を含む第１の電極ペアと、上記第１の電極ペアの下流に第２の電極ペアとを有し、上記第２の電極ペアは、追加的な電極及び追加的なカウンタ電極を有し、上記第１の及び追加的な電極が、同じ電流信号に結合されるよう構成され、上記第１の及び追加的なカウンタ電極は、接地に結合されるよう構成される。斯かる電極構成は、例えば白血球数といったインピーダンス測定を実行するのに適している。電極は、好ましくはプラチナ電極である。
【００３０】
本発明の測定チップは、マイクロ流体サンプル調整ステージ、並びに該調整ステージと流体連通するサンプル出力及び廃棄出力を含むマイクロ流体抵抗ネットワークを更に有するマイクロ流体デバイスに一体化されることができる。この場合、上記サンプルチャネルは、上記サンプル出力と流体連通し、上記廃棄チャネルが、上記廃棄出力と流体連通する。
【００３１】
斯かるマイクロ流体デバイスは、デバイスを通るフローレートをチューニングする精度にわたり改良された制御可能性を示す。これにより、マイクロ流体デバイスで得られる測定結果の精度が改善される。
【００３２】
マイクロ流体抵抗ネットワークは好ましくは、ポリマー物質で作られる。なぜなら、これは、マイクロ流体ネットワークの寸法にわたり良好な制御を行いつつ、マイクロ流体抵抗ネットワークのコスト効率の良い製造を可能にするからである。
【００３３】
好ましい実施形態において、マイクロ流体デバイスは、サンプルを受ける第１の入口と、希釈剤を受ける第２の入口とを更に有し、上記サンプル調整ステージが、上記希釈剤で上記サンプルを希釈する希釈ステージのチェーンを有し、下流の希釈ステージは、上記チェーンにおける以前の希釈ステージから受ける上記サンプルを更に希釈するよう構成され、上記希釈ステージの第１のもの（３６）が、上記第１の入口（２２'）と流体連通し、上記希釈ステージの各々は、上記第２の入口（２４）と流体連通し、上記希釈ステージの少なくともいくつかが、上記受けたサンプルの部分を上記廃棄チャネル（１１４）に供給する別々の出力（４３、４４）を有する。
【００３４】
本発明は、単一の入口から複数の希釈ステージまで希釈剤を供給することによりサンプルがかなり希釈されるマイクロ流体抵抗ネットワークに適用可能である。斯かる構成において、サンプルの大部分が通常は廃棄するために供給され、各希釈ステージにおいて、入力サンプルのわずかな割合が希釈剤と結合され、残りの入力サンプルは、捨てられる。
【００３５】
好ましい実施形態において、サンプルは、血液サンプルであり、このマイクロ流体抵抗ネットワークは、追加的なサンプル調整ステージと、血液サンプルを受ける追加的なサンプル調整ステージと流体連通する第１の追加的な入口と、追加的なサンプル調整ステージに対して溶解剤を提供するため、追加的なサンプル調整ステージと流体連通する第２の追加的な入口と、上記追加的なサンプル調整ステージに対してクエンチ溶液を提供するため、上記サンプル調整ステージと流体連通する第３の追加的な入口と、上記追加的なサンプル調整ステージと流体連通する追加的なサンプル出口とを更に有する。
【００３６】
斯かるマイクロ流体デバイスは例えば、ＦＢＣを実行する単一のデバイスとして用いられることができる。ここで、サンプル調整ステージは、ＲＢＣ／血小板解析のため、血液サンプルの部分を調整する希釈ステージのチェーンを有し、追加的なサンプル調整ステージは、ＷＢＣ計数に関する血液サンプルの別の部分を調整する。このため、マイクロ流体デバイスは好ましくは、ヘモグロビン計数を測定する光学測定細胞を更に有する。この光学測定細胞は、サンプル調整ステージ、追加的なサンプル調整ステージを介して第１の入口と流体連通することができるか、又は別々の血液サンプル入口から供給されることができる。
【００３７】
本発明の他の側面によれば、マイクロ流体サンプル調整ステージ、並びに希釈ステージと流体連通するサンプル出力及び廃棄出力を含むマイクロ流体抵抗ネットワークと共に用いる測定チップを製造する方法が提供される。この方法は、ガラス基板を提供するステップと、上記ガラス基板を通るサンプルチャネルを形成するステップと、上記ガラス基板を通る廃棄チャネルを形成するステップと、上記サンプルチャネルにおいて測定手段を形成するステップとを有する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】マイクロ流体デバイスを概略的に示す図である。
【図２】インピーダンス測定チップ及び斯かるチップにおいて生成される信号を概略的に示す図である。
【図３】本発明の測定チップの実施形態を概略的に示す図である。
【図４】本発明の測定チップの別の実施形態を概略的に示す図である。
【図５】本発明の測定チップの更に別の実施形態を概略的に示す図である。
【図６】本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスを概略的に示す図である。
【図７】従来技術のマイクロ流体デバイスにおける測定チップ抵抗の関数として、マイクロ流体ネットワークのキー要素を通るフローレートにおけるシミュレーションされた変動を示す図である。
【図８】本発明の実施形態によるマイクロ流体デバイスにおける測定チップ抵抗の関数として、マイクロ流体ネットワークのキー要素を通るフローレートにおけるシミュレーションされた変動を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の実施形態が、対応する図面を参照して非限定的な例を用いてより詳細に説明される。
【００４０】
図面は、概略的なものにすぎず、大きさ通りに描かれているものではない点を理解されたい。同じ又は類似する部分を示すため図面を通して同一の参照番号が用いられる点も理解されたい。
【００４１】
本発明は、複数の別々の要素、特に使い捨てのカートリッジの形のマイクロ流体抵抗ネットワーク及び測定チップを有するマイクロ流体デバイスに関する。マイクロ流体抵抗ネットワークは、サンプル調整の目的を持ち、測定チップに対して調整されたサンプルを提供する。本発明の文脈において、「マイクロ流体」という用語は、流体の挙動、正確な制御及び操作に関する。この流体は、小さな、通常はサブミリメータスケールのボリュームであり、例えば、μｌ、ｎｌ、ｐｌ、ｆｌボリュームに幾何学的に制約される。
【００４２】
図１は、斯かるマイクロ流体デバイス１０の非限定的な例を概略的に示す。これは、使い捨てのマイクロ流体抵抗ネットワーク２０及び測定チップ５０を含む。マイクロ流体抵抗ネットワーク２０は、サンプル入口２２で例えばＲＢＣサンプルといったサンプルを受けるよう設計される。マイクロ流体抵抗ネットワーク２０は更に、希釈剤を受ける希釈剤入口２４を有する。これは、３つの異なる分岐において分岐される。第１の分岐は、サンプル入口２２でサンプルと混合され、続いて、例えばヘビ状ステージといったサンプルミキシング又は希釈ステージ３４に供給される。一方、第２の分岐は、接合部３６でサンプルを更に希釈するために用いられる。接合部３６は通常、希釈剤とサンプルとの所望の希釈率を得るため、特定の態様で成形される。これは、例えば、ＷＯ２０１０／０８６７８６号において更に詳細に説明される。例えばマイクロ流体ヘビ状ステージといったサンプル希釈ステージ３８は、例えばサンプルの希釈を完了し必要な流体抵抗を提供するのに必要な時間期間といった所定の時間期間において、サンプルが希釈剤と接触するよう設計される。接合部３６において、希釈ステージ３４から受ける希釈されたサンプルの実質的な部分は、廃棄チャネル４３に供給される。一方、希釈されたサンプルの（小さな）部分は、希釈剤入口２４の第２の分岐からの希釈剤と混合され、サンプル希釈ステージ３８に供給される。接合部４０において、サンプル希釈ステージ３８で希釈されるサンプルが、廃棄チャネル４４に供給される部分において再度分割される。ここで、残りの部分は、希釈剤入口２４の第３の分岐から受ける希釈剤により更に希釈され、続いて測定チャネル４２を介して測定チップ５０に供給される。ヘビ状ステージ（図示省略）は、上述した理由に関して、接合部４０と測定チップ５０との間に存在することができる。接合部４０は通常、サンプル希釈ステージ３４から受ける希釈されたサンプルと希釈剤との所望の希釈率を得るため、特定の態様で成形される。希釈剤の適切な実施形態は、例えばＷＯ２０１０／０８６７８６号に開示される。
【００４３】
図１に示されるマイクロ流体デバイス１０は、ＦＢＣサンプルの治療及び後続の解析に特に適している。しかしながら、異なるタイプのサンプル、例えば、尿又は唾液サンプル、及び非医学的な評価のためのサンプル、例えば環境サンプル、食品サンプル等を調整するために、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０の設計が変更されることができる点を当業者であれば理解されたい。
【００４４】
図２は、インピーダンス測定チップ５０をより詳細に示す。斯かるインピーダンス測定構成の詳細な説明は、「Impedance spectroscopy flow cytometry: on-chip label-free cell differentiation」Cheung, K.、S. Gawad及びP. Renaud、Cytometry A、2005、65(2)：p. 124-132において見つけ出されることができる。図２は、チップ５０を通るマイクロ流体チャネル及び励起電極５２、６２と検出電極５４、６４との間を通過するサンプルセル８０の側面表示を示す。励起電極５２及び検出電極５４は、第１の電極ペアを形成し、励起電極６２及び検出電極６４は、第２の電極ペアを形成する。
【００４５】
励起電極５２及び６２は、例えばＡＣ又はＤＣ入力信号源である電流入力信号源５８及び６８にそれぞれ接続される。ＡＣ入力信号源は好まれる。なぜなら、それは、電極での電気分解を防止するからである。ある実施形態において、励起電極５２及び６２は、同じＡＣ入力信号源を共有することができる（即ち５８＝６８となる）。検出電極は通常、差分電位検出回路７０に接続される。これは好ましくは、検出電極を近似接地電位に保つ。第１及び第２の電極ペアの間の流体を通過する電流は増幅され、その差は、任意の適切な態様で、例えば既知のアナログ電子部品を用いて決定される。結果として生じるＡＣ信号の同相及び逆位相部分は、標準的なロックイン技術を用いて測定される。電極を進む粒子がなければ、測定された信号は理想的にゼロである。但し、チップ非対称性及び可能性としての電子部品要素の不正確さから、実際には常にオフセットが存在する。左から来る粒子が最初に第１の電極ペアを通過する場合、正のほぼガウシアン形状信号が生成される。なぜなら、第２の電極ペアが、第１の電極ペアに対する参照電極として作用するからである。続いて粒子が第２の電極ペアを通過するとき、負のガウシアン形状信号が生成される。なぜなら、第１の電極ペアが、第２の電極ペアに対する参照電極として作用するからである。結果として生じる反対称二重ガウシアン信号形状が、図２に示される。細胞信号は、両方の電極ペアの間の電流差を測定するロックイン増幅器の出力とすることができる。こうして、インピーダンス分光学は、例えばＲＢＣ又はＷＢＣといった異なる細胞に関して実行されることができる。
【００４６】
測定チップ５０を通り供給されるサンプルの細胞計数を正確に決定するため、測定チップ５０を通るサンプルのフローレートはうまく規定されなければならない。なぜなら、計数された細胞の数は、うまく規定されたサンプルボリュームに関連付けられなければならないからである。このサンプルボリュームは、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０の接合部４０によりセットされ、測定チップ５０及びマイクロ流体廃棄チャネル４４を通るマイクロ流体経路の個別の流体抵抗により影響される。接合部４０を正しく設計するため、これらの流体抵抗は、設計段階で既知でなければならない。測定チップ５０を通るマイクロ流体チャネルの水力直径は通常、マイクロ流体廃棄チャネル４４の水力直径よりかなり小さいので、マイクロ流体廃棄チャネル４４は通常、測定チップ５０を通るマイクロ流体チャネルの流体抵抗とマイクロ流体廃棄チャネル４４の流体抵抗とを整合させるため、マッチング要素（図示省略）を有する。水力直径は、例えば方形又は矩形チャンネルといった非円形チャネルの挙動を近似するために使用される有効な直径である。
【００４７】
しかしながら、測定チップ５０がマイクロ流体抵抗ネットワーク２０とは異なる製造プロセスにおいて製造されるとき、測定チップ５０の製造プロセスは通常、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０の製造プロセスとは異なる公差に従属する。前述したように、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０の分解能は通常、測定チップ５０の分解能より低くあるよう選ばれる。このため、（使い捨ての）マイクロ流体抵抗ネットワーク２０は、例えばプラスチックといったポリマー物質において安く製造されることができる。一方、測定チップ５０に関してはガラス基板が好まれる。なぜなら、ガラスが必要な分解能を実現するのに適した比較的安価な物質であるからである。
【００４８】
これらの異なる製造プロセスの使用、及びマイクロ流体抵抗ネットワーク２０と測定チップ５０とに関する異なる物質の使用の結果は、これらの処理及び物質における公差が、その意図された性能から容認できないほど大きく離れた接合部４０の性能をもたらす可能性がある。例えば、廃棄ストリームから分離されるサンプルのボリュームが不正確となることである。これは通常、測定チップ５０を通るマイクロ流体廃棄チャネル４４及びマイクロ流体チャネルの寸法における独立した変動によりもたらされる。
【００４９】
図３は、この問題が解決された本発明の実施形態による測定チップ１００を示す。入口１０２及び出口１０６の間に延在するマイクロ流体測定チャネル１０４に加えて、測定チップ１００は更に、マイクロ流体廃棄チャネル４４から残りのサンプルを受ける入口１１２及び出口１１６の間に延在するマイクロ流体廃棄チャネル１１４を有する。マイクロ流体測定チャネル１０４は、任意の適切な測定手段を有することができる。その手段は例えば、図２を参照して以前に説明されたインピーダンス測定第１電極ペア１２０と第２の電極ペア１３０といった電極構成、又は分光光度計、フォトダイオード等の光学検出手段である。
【００５０】
任意の適切な電極物質が選択されることができる。好ましくは、電極はプラチナ電極であるが、例えば酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、窒化チタン及び窒化クロミウムといった代替的な電極物質も可能である。図２に示される電極構成は、非限定的な例を用いて示されており、他の電極構成が同様に可能である点を理解されたい。例えば、電極の単一のペア、又はＷＯ２０１０／０８６７９７Ａ１号に開示される電極ペアの長いシーケンスといった構成が可能である。電極は、例えば前述されたＡＣ信号及びＤＣ信号といった任意の適切な制御信号により制御されることができる。
【００５１】
マイクロ流体廃棄チャネル１１４の水力直径が、マイクロ流体廃棄チャネル４４の水力直径よりかなり小さいので、組み合わされた廃棄ラインの流体抵抗は、マイクロ流体廃棄チャネル１１４の流体抵抗により完全に支配される。その結果、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０の製造プロセスにおける公差はもはや、接合部４０でのサンプル分離比に影響を及ぼさない。このサンプル分離比は、それぞれマイクロ流体測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４の流体抵抗により支配される。マイクロ流体測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４が同じ製造プロセスで形成されるので、マイクロ流体測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４の寸法における公差は、かなり好適に制御されることができる。その結果、接合部４０でマイクロ流体測定チャネル１０４に向けられるサンプルのボリュームは、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０及び測定チップ１００の製作公差に関して不変になる。
【００５２】
この時点において、マイクロ流体廃棄チャネル１１４を持つ測定チップ１００を延在することが、測定チップ１００のコストを増加させるが、マイクロ流体抵抗ネットワーク２０及び測定チップ１００を含むマイクロ流体デバイスの全体のコストは減らされる点を留意されたい。なぜなら、製作公差におけるあまりに大きな変動によりもたらされる誤ってチューニングされるデバイスの数が明らかに減らされるからである。
【００５３】
測定チップ１００のコストは、図４に示されるような測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４の出口の組合せにより減らされることができる。図４において、出口１１６は、測定チップ１００の設計から除去される。単一の出口に複数のマイクロ流体チャネルを組み合わせることは、複数のマイクロ流体チャネルの個別のマイクロ流体抵抗に影響を与えないことが分かっている。
【００５４】
マイクロ流体チャネルの流体抵抗Ｒが、
0005919302.tif 000002
のような大きさであるとき、好ましくは、マイクロ流体測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４は同じ寸法を持つ。ここで、ｄは、マイクロ流体チャネルの水力直径である。異なる寸法、すなわち異なる水力直径を持つマイクロ流体チャネルに関して、これらのチャネルの公差における異なる変動が発生する可能性があることが分かっている。これは、マイクロ流体デバイスをチューニングすること、特に接合部４０を含むマイクロ流体抵抗ネットワーク２０をチューニングすることをより困難にする。
【００５５】
にもかかわらずマイクロ流体測定チャネル１０４がマイクロ流体廃棄チャネル１１４とは異なる流体抵抗を必要とする場合、これは好ましくは、より低い抵抗を必要とするチャネルに関して複数のマイクロ流体チャネルを提供することにより実現される。上記複数におけるマイクロ流体チャネルの各々は好ましくは、すでに上述された理由のため同じ水力直径を持つ。斯かる構成の非限定的な例が、図５に示される。そこでは、第１のマイクロ流体廃棄チャネル１１４に加えて、入口１１２'及び出口１１６'の間に第２のマイクロ流体廃棄チャネル１１４'が提供される。ここで、マイクロ流体廃棄チャネル４４からの廃棄ストリームは、第１のマイクロ流体廃棄チャネル１１４及び第２のマイクロ流体廃棄チャネル１１４'にわたり、等しく分けられる。
【００５６】
図５に示される測定チップ１００に対して多くの変形例が可能である点を理解されたい。図５において、２つのマイクロ流体廃棄チャネル１１４及び１１４'は、非限定的な例として示される。異なる数のマイクロ流体廃棄チャネルが同様に可能である。通常、測定チップ１００は、Ｎ個のマイクロ流体廃棄チャネルを有する。ここで、Ｎは、マイクロ流体測定チャネル１０４のマイクロ流体抵抗とマイクロ流体廃棄チャネルのマイクロ流体抵抗の間の比がＮに等しい場合（Ｒ１０４／Ｒ１１４、１１４'＝Ｎ）、正の整数である。２つのマイクロ流体廃棄チャネル１１４及び１１４'が、分離した入口及び出口を持つことが示されるが、マイクロ流体廃棄チャネル１１４及び１１４'が、それらの入口及び／又は出口を共有することができるか、又はマイクロ流体測定チャネル１０４とそれらの出口を共有することができる点を理解されたい。複数のマイクロ流体廃棄チャネルを持つ代わりに、又はこれに加えて、測定チップ１００において、マイクロ流体測定チャネル１０４は、マイクロ流体測定チャネル１０４の流体抵抗を低くするため、好ましくはマイクロ流体測定チャネル１０４と同じ寸法を持つ１つ又は複数のダミーチャネルを有することもできる点を更に理解されたい。測定チップ１００は例えば、個別の流体抵抗の所望の比がＭ／Ｎである場合、Ｎ個のマイクロ流体廃棄チャネルだけでなく、マイクロ流体測定チャネル１０４及びＭ−１個のダミーチャネル（図示省略）を有することができる。更に、測定チップ１００は、異なるサンプル又は同じサンプルの異なる部分を測定する複数の異なる測定チャネルを有することができる。異なる部分とは例えば、同じサンプルの異なる側面を測定するために異なる試薬で治療される異なる部分であり、異なるチャネルとは例えば、ＲＢＣ及びＷＢＣ計数を実行するための別々のチャネルである。
【００５７】
測定チップ１００は、任意の適切な態様において製造されることができる。例えば、好ましくはガラスプレートである上部プレート及び下部プレートを提供し、エッチング又はレーザ穿設といったドリリングにより上部プレート及び下部プレートの各々において溝のペアを形成し、上部プレートにおける上記溝の１つにおいて及び下部プレートにおける対応する溝において測定手段を形成し、及び下部プレート上に上部プレートを配置することによって製造される。その結果、溝の第１のペアが、測定手段を含むマイクロ流体測定チャネル１０４を形成するよう結合し、溝の第２のペアが、マイクロ流体廃棄チャネル１１４を形成するよう結合する。代替的な製造方法は、当業者に対して明らかである。例えば、好ましくはガラスである基板を提供し、例えばレーザ穿設によってこの基板においてマイクロ流体測定チャネル１０４及びマイクロ流体廃棄チャネル１１４を穿設し、及びマイクロ流体測定チャネル１０４において測定手段を形成することにより製造される。
【００５８】
図６は、本発明のマイクロ流体デバイス２００の実施形態を概略的に示す。マイクロ流体デバイス２００は、単一の血液サンプルに関するＦＢＣを実行するよう設計される。このため、マイクロ流体デバイス２００は、赤血球を溶解させる溶解ステージへの第１の血液サンプル入力部２２を有する。これは、例えばギ酸／サポニン混合物といったＲＢＣ溶解剤を受ける入口２５と、白血球を溶解から保護するため溶解サンプルをクエンチするクエンチング剤を受ける入口２６とを含む。適切なクエンチング剤の非限定的な例は、ＮａＣｌ／ＮａＨＣＯ３溶液である。溶解ステージは、任意の適切な数のヘビ状ステージを有することができる。２つのヘビ状ステージ３５及び３７が、非限定的な例として示される。溶解ステージの出口チャネル４６は、本発明の測定チップ１００へと供給される。サンプル全体が測定チップ１００を通り供給されるので、溶解ステージに関してチップ１００を通る別々の廃棄チャネルは存在しない。
【００５９】
マイクロ流体デバイス２００は更に、第２の血液サンプル入口２２'を有する。これは、赤血球／血小板治療ステージへと供給される。第１の血液サンプル入口２２及び第２の血液サンプル入口２２'は、単一の血液サンプル入口（図示省略）の分離した分岐とすることができるか、又は例えば同じ血液サンプルの別々の部分といった別々の血液サンプルと共に独立して供給されることができる。血球／血小板治療ステージは更に、希釈サンプル入口２４を有する。これは、３つの分岐に分割される。第１の分岐は、血液サンプル入口２２'へ供給される。そこでは、入力血液サンプルが、例えば２０：１といった所定の比で希釈される。第２及び第３の分岐はそれぞれ、接合部３６及び４０に供給される。ここで、希釈剤は、血液サンプルとミックスされる。結果的に、大きな希釈率は、ごく少量の希釈剤で実現されることができる。なぜなら、希釈剤が、マイクロ流体デバイス２００において浪費されないからである。
【００６０】
接合部３６及び４０の各々は、入力サンプルの大部分を基本的に有する廃棄ストリームを生成する第１の出力と、入力希釈剤の全てと入力サンプルの小さな部分との混合物を生成する第２の出力とを持つ。様々な流体チャネルは、例えばステージ３４及び３８といった１つ又は複数のヘビ状ステージを含むことができる。これは、それ自体既知であるように、ミキシング比及び流体チャネルの流体抵抗をチューニングするために含まれることができる。接合部４０のサンプル出力４２は、測定チップ１００のサンプルチャネル、例えば赤血球数を測定する図３に示される測定チャネル１０４に供給される。一方、接合部４０の廃棄出力４４は、以前に説明された理由のため、測定チップ１００の廃棄チャネル、例えば図３に示される廃棄チャネル１１４に供給される。ある実施形態において、個別の希釈ステージ、即ち接合部３６、４０の廃棄ストリームが、測定チップ１００の廃棄チャネル１１４を通りこの廃棄物をフィードする前に結合されることができる。これは、図６において、４３＋４４とラベルがついているマイクロ流体分岐として示される。
【００６１】
マイクロ流体デバイス１０におけるマイクロ流体抵抗ネットワーク２０と比較して、マイクロ流体デバイス２００のマイクロ流体抵抗ネットワーク２０は、（組み合わされた）マイクロ流体廃棄チャネル（４３＋）４４においてマッチング要素を省略することで単純化されることができる。なぜなら、ここでは、この抵抗マッチングは、より高い分解能の（すなわちより小さなサイズの）マイクロ流体廃棄チャネル１１４を通して廃棄物をフィードすることにより実現されるからである。
【００６２】
図６において、第１の接合部３６からの廃棄チャネル４３は、光学測定細胞を含むＨｂサンプルチャンバ２３０の方へ分岐される。このチャンバは、Ｈｂサンプルチャンバ２３０における光学測定細胞において、Ｈｂ吸収測定用の血液サンプルの未使用部分を調整する。Ｈｂサンプルチャンバは、Ｈｂ測定を実行するため、血液サンプルを溶解させ、及びラベリングする乾燥形態のいくつかの試薬を含むことができる。この構成では、血液の小さなサンプルだけが、Ｈｂ吸収測定のためラベリングされる必要がある。これは、有利である。なぜなら、ラベル付け試薬は、例えばシアン化物を有するなどして有毒である可能性があり、必然的にＨｂにバインドしなければならないからである。
【００６３】
図６は、本発明のマイクロ流体デバイス２００の非限定的な例を示す。マイクロ流体デバイス２００は例えば、ＷＯ２０１０／０８６７８６号に詳述されるマイクロ流体デバイスとすることができる。図６において、サンプルの部分は、調整ステージ２３０においてＨｂ測定調整のためＲＢＣ計数調整ステージから分岐される。その代わりにＨｂサンプル調整のためＷＢＣ計数調整ステージからサンプルの部分を分岐することも同様に可能であることを理解されたい。代替的に、マイクロ流体デバイス２００は、血液サンプル入口２２から３つの別々の分岐を生成するよう構成されることができる。すなわち１つは、ＲＢＣ／血小板計数サンプル調整に関する分岐、１つは、ＷＢＣサンプル調整に関する分岐、及び１つは、Ｈｂ測定サンプル調整に関する分岐である。他の変形例が、当業者には明らかである。
【００６４】
本発明は、ＦＢＣ測定に関するマイクロ流体デバイスに限定されるものではない点を更に理解されたい。本発明は、チューニングされたマイクロ流体抵抗ネットワーク２０が測定チップ１００と分離して製造され、チューニングされたマイクロ流体抵抗ネットワーク２０において調整されるサンプルのわずかな部分が、測定チップ１００に対して供給される任意のマイクロ流体デバイスに対して適用されることができる。例えば、唾液及び尿といった身体の流体の解析のためのマイクロ流体デバイス、例えば、環境サンプル、食品サンプル等の解析のためのマイクロ流体デバイスに適用されることができる。
【００６５】
図７は、測定チップ５０のマイクロ流体測定チャネルの流体抵抗の関数として、図１のマイクロ流体デバイス１０において、チューニングされたマイクロ流体抵抗ネットワーク２０のキー要素を通るフローレートのシミュレーションの結果を示す。図７において、薄い実線が、接合部４０から廃棄出口４４へのフローレートであり、厚い実線は、接合部４０へのサンプルのフローレートであり、点線（---）は、接合部４０からサンプル出口４２に向かうフローレートであり、鎖線（−・−・）は、接合部４０への希釈剤のフローレートである。接合部４０からの廃棄ストリームが測定チップを通り供給されないので、これらのフローレートは、測定チップ５０のマイクロ流体測定チャネルの流体抵抗における変化により影響を受ける。重要なことに、フローレートが変化するにつれて、希釈率も同様に変化する。その結果、サンプルのユニット当たりの絶対的な細胞計数は、もはや（正確に）知られることはない。フローレートにおける斯かる変動が許容できないことは、明らかである。
【００６６】
図８は、測定チップ１００のマイクロ流体測定チャネル１０４の流体抵抗の関数として、図６のマイクロ流体デバイス２００において、チューニングされたマイクロ流体抵抗ネットワーク２０を通るこれらのフローレートのシミュレーションの結果を示す。接合部４０からの廃棄ストリームが測定チップ１００のマイクロ流体廃棄チャネル１１４を通り供給されるので、マイクロ流体廃棄チャネル１１４の流体抵抗が同様に変化するという事実によって、これらのフローレートが、測定チップ１００のマイクロ流体測定チャネル１０４の流体抵抗における変化にもはや依存しない。これは、測定チップ１００において廃棄チャネルを提供することが、その要素の製造プロセスにおける変動（公差）に対して全体のマイクロ流体デバイス２００の堅牢性を大幅に向上させることを明らかに証明する。
【００６７】
上述された実施形態は本発明を限定するものではなく、説明するものであり、当業者であれば、添付された請求項の範囲から逸脱することなく、代替的な多くの実施形態をデザインすることができることになることに留意されたい。請求項において、括弧内に配置されるいかなる参照符号も請求項を限定するものとして解釈されるべきではない。「有する」という語は、請求項に記載される以外の要素又はステップの存在を除外するものではない。ある要素に先行する「ａ」又は「ａｎ」という語は、斯かる要素が複数存在することを除外するものではない。本発明は、複数の異なる要素を有するハードウェアを用いて実現されることができる。複数の手段を列挙するデバイスクレームにおいて、複数のこれらの手段がハードウェアの１つの同じアイテムにより実現されることができる。特定の手段が相互に異なる従属項に記載されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを意味するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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