(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種類の温度で被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させ、各温度下でのＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定することを特徴とし、前記少なくとも２種類の温度が、冷感を得ることが望まれない第１の温度および冷感を得ることが望まれる第２の温度であり、前記第１の温度がヒトの正常な皮膚表面温度であり、前記第２の温度が前記皮膚表面温度よりも高い温度である被験試料による冷感制御作用の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料による冷感制御作用の評価方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、使用環境に応じて、ヒトの皮膚に冷感を与える化粧料などの冷感外用剤の開発などに有用な被験試料による冷感制御作用の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚に冷感を付与する化粧料などの冷感外用剤は、例えば、暑い環境下での活動時や、運動後などのように体温が上昇した時などに用いられている。しかしながら、上昇した体温が平温に戻った場合、使用者によっては、冷感外用剤による冷感を不快に感じることがある。
【０００３】
冷感外用剤の評価は、一般にヒトによる官能評価によって行なわれている。しかしながら、ヒトが知覚する冷感は、ヒトの周囲の環境温度によって異なり、しかもヒトによって冷感の感じ方にばらつきがある。したがって、ヒトによる官能評価では微妙な違いを評価することができず、評価の再現性も低いことから、簡便な操作で、厳密にかつ高い再現性で冷感外用剤を評価することができる方法が望まれている。
【０００４】
ところで、一過性受容体電位チャネル（以下、「ＴＲＰチャネル」という）に属するＴＲＰＭ８は、２５〜２８℃の冷刺激、ミントの主成分であるメントールによる化学刺激などによって活性化され、細胞外から細胞内にカルシウムイオンを透過させる受容体として機能することが知られている。また、ＴＲＰＭ８の活性化温度閾値は、メントールによる化学刺激によって上昇することも知られている（例えば、非特許文献１参照）。かかるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象は、例えば、被験試料による清涼感の心地よさを評価する際の指標として用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかしながら、本発明者らは、現時点では、環境温度とＴＲＰＭ８の活性化温度閾値との関連性や前記関連性を利用して、被験試料による冷感制御作用を、簡便な操作で厳密にかつ高い再現性で評価する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−２０５９７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】富永真琴、「生体はいかに温度をセンスするか−ＴＲＰチャネル温度受容体−」、日本生理学雑誌、日本生理学会編、２００３年発行、第６５巻、ｐｐ．１３０−１３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、被験試料による冷感制御作用を簡便な操作で、厳密にかつ高い再現性で評価することができる被験試料による冷感制御作用の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は、少なくとも２種類の温度で被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させ、各温度下でのＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定することを特徴とし、前記少なくとも２種類の温度が、冷感を得ることが望まれない第１の温度および冷感を得ることが望まれる第２の温度であり、前記第１の温度がヒトの正常な皮膚表面温度であり、前記第２の温度が前記皮膚表面温度よりも高い温度である被験試料による冷感制御作用の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の被験試料による冷感制御作用の評価方法は、被験試料による冷感制御作用を簡便な操作で、厳密にかつ高い再現性で評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実験例１において、環境温度と冷刺激閾値との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図２】実施例１において、被験試料と冷刺激閾値との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図３】実施例１において、被験試料とΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の被験試料による冷感制御作用の評価方法は、少なくとも２種類の温度で被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させ、各温度下でのＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定することを特徴とする評価方法（以下、単に「評価方法」という）である。本発明の評価方法によれば、被験試料が冷感制御作用を有しているかどうかの評価および被験試料による冷感制御作用の度合いの評価を行なうことができる。
【００１３】
本発明の評価方法は、ＴＲＰＭ８発現細胞を用い、少なくとも２種類の温度でのＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定する点に１つの大きな特徴を有する。したがって、本発明の評価方法によれば、被験試料による冷感制御作用を、簡便な操作で、厳密にかつ高い再現性で評価することができる。また、ＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値は、ヒトの主観に影響されることなく、同一条件下に同時に何回も並行して精密に測定することができることから、ヒト、実験動物などを用いる場合と比べて、高い処理効率で多種類の被験試料による冷感制御作用を客観的に評価することができる。
【００１４】
本明細書において、「ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値」とは、冷刺激を受けたＴＲＰＭ８が活性化される温度をいう。冷刺激によって活性化されたＴＲＰＭ８は、細胞外から細胞内にカルシウムイオンを透過させる。
【００１５】
また、本明細書において、「冷感制御作用」とは、冷感を知覚する温度を制御する作用をいう。かかる冷感制御作用には、例えば、冷感を得ることが望まれる温度ではヒトに与えられる冷感を増大させるが、冷感が望まれない温度ではヒトに与えられる冷感を減少させるか、あるいはヒトに冷感を与えないように制御することも含まれる。
【００１６】
被験試料としては、例えば、ヒトの皮膚に冷感を与える化粧料などの冷感外用剤に用いられる化合物や植物、動物、微生物などの抽出物、香料成分などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１７】
被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させる温度は、少なくとも２種類の温度である。当該少なくとも２種類の温度は、評価結果の用途などによって異なるため、一概には決定することができないことから、当該評価結果の用途などに応じて適宜決定することが望ましい。当該少なくとも２種類の温度は、通常、好ましくはヒトが皮膚の損傷や疾患を伴うことなく体感可能な温度範囲、より好ましくは１０〜５０℃の温度範囲のなかから適宜選択することができる。また、当該少なくとも２種類の温度は、通常、好ましくは２〜１０種類の温度、より好ましくは２〜５種類の温度、さらに好ましくは２〜３種類の温度、特に好ましくは２種類の温度である。例えば、冷感を得ることが望まれる温度ではヒトに与えられる冷感を増大させるが、冷感が望まれない温度ではヒトに与えられる冷感を減少させる被験試料をスクリーニングすることを目的とする場合には、前記温度として、冷感を得ることが望まれない第１の温度および冷感を得ることが望まれる第２の温度を用いることが好ましい。前記第１の温度としては、例えば、ヒトの正常な皮膚表面温度、好ましくは３０〜３５℃などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記第２の温度としては、ヒトの正常な皮膚表面温度よりも高い温度、好ましくはヒトの正常な皮膚表面温度よりも５〜１０℃高い温度、より好ましくは４０〜４５℃などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、ヒトの正常な皮膚表面温度は、通常、３０〜３５℃、好ましくは３１〜３４℃である。
【００１８】
本発明の評価方法に用いられるＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８の生理学的機能を発現する細胞である。ＴＲＰＭ８の生理学的機能としては、例えば、メントールによる化学刺激、冷刺激（例えば、８〜２８℃程度の刺激）などの刺激による細胞外から細胞内へのナトリウムイオン、カルシウムイオンなどの陽イオンの透過などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１９】
ＴＲＰＭ８発現細胞としては、例えば、内因性ＴＲＰＭ８を発現している野生型の細胞（以下、「内因性ＴＲＰＭ８発現細胞」ともいう）、ＴＲＰＭ８をコードする核酸が発現可能に宿主細胞に導入された細胞（以下、「外因性ＴＲＰＭ８発現細胞」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのＴＲＰＭ８発現細胞のなかでは、かかるＴＲＰＭ８を介して引き起こされる生理学的事象を簡便な操作で測定する観点から、外因性ＴＲＰＭ８発現細胞が好ましい。
【００２０】
内因性ＴＲＰＭ８発現細胞としては、例えば、感覚神経の細胞、前立腺の細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２１】
外因性ＴＲＰＭ８発現細胞は、染色体外要素としてＴＲＰＭ８をコードする核酸が存在している細胞であってもよく、あるいはＴＲＰＭ８をコードする核酸が染色体に組み込まれている細胞であってもよい。外因性ＴＲＰＭ８発現細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸を保持する組換えベクターによって宿主細胞を形質転換させることによって得ることができる。
【００２２】
ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよく、他の動物のＴＲＰＭ８をコードする核酸であってもよい。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸であることが好ましい。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸などが挙げられる。この配列番号：１に示される塩基配列は、アクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４としてＧｅｎＢａｎｋに登録されているヒトＴＲＰＭ８をコードする核酸の塩基配列である。前記ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドが前記生理学的機能を発現するのであれば、ＴＲＰＭ８の構造遺伝子の塩基配列の内部または末端に、１または数個のヌクレオチド残基の置換、欠失または挿入を有する変異型核酸であってもよい。
【００２３】
ＴＲＰＭ８をコードする核酸の変異型核酸としては、例えば、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｇａｐ  １１、Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  １、ｅｘｐｅｃｔ  ｖａｌｕｅ  １０、ｗｏｒｄｓｉｚｅ  １１の条件でアライメントして算出される配列相同性の値が、それぞれの生理学的機能を十分に発揮させる観点から、好ましくは６０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上である塩基配列からなり、かつコードされるポリペプチドが少なくとも前記生理学的機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｂ）配列番号：２において、１個または数個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列をコードし、コードされるポリペプチドが少なくとも陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸、
（Ｃ）ストリンジェントな条件下で、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸とハイブリダイズし、コードされるポリペプチドが、陽イオンを透過させる機能を発現するポリペプチドである核酸
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２４】
なお、本明細書において、「１または数個」とは、１〜３０個をいう。前記「１個または数個」は、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１個または２個をいう。
【００２５】
また、本明細書において、前記ストリンジェントな条件としては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなる核酸に対する相補鎖核酸と前記相補鎖核酸に対応するハイブリダイゼーション対象の核酸とを、ハイブリダイゼーション用溶液〔組成：６×ＳＳＣ（組成：０．９Ｍ塩化ナトリウム、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に調整）、０．５質量％ドデシル硫酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ、５０体積％ホルムアミド〕中で、室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で１０時間インキュベーションし、つぎに、例えば、２×ＳＳＣ、よりストリンジェントな条件として０．１×ＳＳＣのイオン強度条件下で、かつ室温以上の温度、よりストリンジェントな条件として４２℃以上の温度、さらにストリンジェントな条件として６０℃以上の温度で洗浄を行なう条件などが挙げられる。
【００２６】
ＴＲＰＭ８をコードする核酸は、例えば、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて作成されたプローブを用いるハイブリダイゼーション法、配列番号：１に示される塩基配列に基づいて設計され、合成された２種類のオリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマー対を用いる核酸増幅法などによって得られる。
【００２７】
宿主細胞は、ＴＲＰＭ８をコードする核酸を効率よく発現することができ、かつ培養が容易な細胞であればよい。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、ヒトにおけるＴＲＰＭ８の生理学的機能を十分に再現し、ヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、動物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、例えば、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。ヒト細胞としては、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。サル細胞としては、例えば、ＣＯＳ−７細胞などが挙げられる。マウス細胞としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの宿主細胞のなかでは、取扱いが容易である観点から、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞が好ましい。これらのなかでは、ＴＲＰチャネルがほとんど発現しておらず、外因性のＴＲＰＭ８の活性化を容易にかつ選択的に測定することができ、かつヒトに適用する被験試料を的確に評価する観点から、ＨＥＫ２９３細胞が好ましい。
【００２８】
組換えベクターは、ＴＲＰＭ８をコードする核酸と慣用のベクターとを連結させることによって得られるベクターである。ベクターは、その調製が容易であり、効率よく宿主細胞に導入することができ、かつ宿主細胞内でＴＲＰＭ８を効率よく発現させることができるベクターであればよい。ベクターは、形質転換後に、組換えベクターを保持する細胞を容易に選択することができることから、選択マーカー遺伝子を有するベクターであることが好ましい。ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのベクターは、用いられる宿主細胞に応じて適宜選択することができる。なお、前記外因性ＴＲＰＭ８発現細胞を作製するための組換えベクターに用いられるベクターは、発現プロモーターを有していてもよい。
【００２９】
前記組換えベクターを用いた形質転換は、用いられる宿主細胞の種類に応じて、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、トランスフェクション法、パーティクルガン法などの形質転換方法によって行なうことができる。これらの形質転換方法は、例えば、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）〔ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕などの記載に準じて行なうことができる。形質転換後に得られた細胞からの形質転換細胞の選択は、例えば、用いられた組換えベクターが選択マーカー遺伝子を有する場合、選択マーカー遺伝子に応じた選択培地で培養することなどによって行なうことができる。
【００３０】
得られた形質転換細胞が、ＴＲＰＭ８を発現している細胞であることの確認は、例えば、細胞を１ｍＭメントールと接触させ、後述の細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法により、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を測定することによって行なうことができる。細胞がＴＲＰＭ８を発現している場合、接触後の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度は、メントールと接触させていない細胞の細胞内カルシウムイオン濃度よりも高くなる。
【００３１】
少なくとも２種類の温度における被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞との接触は、同じＴＲＰＭ８発現細胞を用いて設定温度毎に行なってもよく、別々のＴＲＰＭ８発現細胞を用いて並行して行なってもよい。
【００３２】
被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞との接触方法としては、例えば、細胞の培養に適した培地中で、被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とをインキュベーションすることなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３３】
培地は、ＴＲＰＭ８発現細胞が生育するのに適した成分〔例えば、グルコース、アミノ酸、ペプトン、ビタミン、細胞増殖促進因子（例えば、細胞成長因子、ホルモン、結合タンパク質、細胞接着因子、脂質など）、血清（例えば、ウシ胎仔血清など）、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなど〕を含む培地であればよい。また、前記培地は、慣用の基本培地に前記成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。基本培地としては、例えば、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる培地は、細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、用いられる細胞がＨＥＫ２９３細胞から得られた細胞である場合、培地として１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地などが用いられる。
【００３４】
被験試料に接触させるＴＲＰＭ８発現細胞の量は、試験データの信頼性の観点から、被験試料１００μＬあたり、好ましくは１×１０1個以上が好ましく、１×１０2個以上がより好ましく、細胞の間隔を確保し、細胞が密になりすぎないようにする観点から、３×１０２個以下が好ましく、２×１０２個以下がより好ましい。
【００３５】
ＴＲＰＭ８発現細胞に接触させる被験試料の量は、被験試料の種類によって異なるため、一概には決定することができないことから、被験試料の種類に応じて適宜設定することができる。
【００３６】
ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値は、一定電位下での電流、細胞内カルシウムイオン濃度などを指標として測定することができる。これらの指標は、本発明の評価方法の用途などによって異なるため、一概には決定することができないことから、本発明の評価方法の用途などに応じて選択することが望ましい。より精密な評価が必要である場合には、一定電位下での電流をＴＲＰＭ８の冷刺激閾値の指標として用いることが好ましい。また、簡便な操作での評価が必要である場合には、細胞内カルシウムイオン濃度をＴＲＰＭ８の冷刺激閾値の指標として用いることが好ましい。
【００３７】
一定電位下での電流の測定方法としては、例えば、パッチクランプ法などが挙げられる。ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値の指標として一定電位下での電流を用いる場合、ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値は、ＴＲＰＭ８発現細胞を所定の温度下に維持した後、ＴＲＰＭ８発現細胞の維持環境の温度を下げながら、降温時のＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８に基づく一定電位下での電流を経時的に測定し、降温前の温度と降温時の電流の変化とに基づいてアレニウスプロットを行なって変曲点を求めることによって算出することができる。
【００３８】
細胞内カルシウムイオン濃度の測定方法としては、例えば、カルシウムキレート化剤に基づく蛍光試薬（以下、「蛍光カルシウム指示薬」ともいう）をＴＲＰＭ８発現細胞に導入し、細胞内のカルシウムイオンに蛍光カルシウム指示薬を結合させ、カルシウムイオンと結合した蛍光カルシウム指示薬の蛍光強度を調べる方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。蛍光カルシウム指示薬は、カルシウムイオンと結合した当該蛍光カルシウム指示薬の量によってその蛍光特性が変化する試薬であればよい。蛍光カルシウム指示薬としては、例えば、ＦＵＲＡ  ２、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、蛍光カルシウム指示薬が２種類の励起波長を有する場合、より精度を高める観点から、各励起波長における蛍光強度から蛍光強度比を算出することが好ましい。ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値の指標として細胞内カルシウムイオン濃度を用いる場合、ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値は、ＴＲＰＭ８発現細胞を所定の温度下に維持した後、ＴＲＰＭ８発現細胞の維持環境の温度を下げながら、降温時のＴＲＰＭ８発現細胞内の細胞内カルシウムイオン濃度を経時的に測定し、細胞内カルシウムイオン濃度が上昇した時点での１秒間の平均温度を求めることによって算出することができる。
【００３９】
ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響は、被験試料と接触させていないＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値と、被験試料と接触させたＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値とを比較することによって調べることができる。
【００４０】
例えば、前記温度として、冷感を得ることが望まれない第１の温度および冷感を得ることが望まれる第２の温度を用いる場合、
（１）被験試料による第１の温度での冷刺激閾値の上昇の度合いが小さいこと、および
（２）被験試料と接触させたときの第２の温度での冷刺激閾値が被験試料と接触させたときの第１の温度での冷刺激閾値よりも大きく、かつこれらの差が大きいこと
の２つの条件を満たす被験試料は、冷感を得ることが望まれる第２の温度ではヒトに与えられる冷感を増大させるが、冷感が望まれない第１の温度ではヒトに与えられる冷感を減少させる被験試料であり、冷感制御作用を有すると評価することができる。
【００４１】
また、前記温度として、冷感を得ることが望まれない第１の温度および冷感を得ることが望まれる第２の温度を用いる場合、被験試料の冷感制御作用の大きさは、例えば、式（Ｉ）：
【００４２】
【数１】
0005859359.tif 000002
【００４３】
で表わされる冷刺激閾値の変化を求め、以下の評価基準に基づいて評価することができる。
［評価基準］
被験試料が冷感制御作用を有しない
・・・・・冷刺激閾値の変化が０以上４未満
被験試料が冷感制御作用を有する
・・・・・冷刺激閾値の変化が４以上６未満
被験試料が強い冷感制御作用を有する
・・・・・冷感制御作用の大きさが６以上
【００４４】
以上説明したように、本発明の評価方法によれば、各温度下でのＴＲＰＭ８発現細胞中のＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定することにより、被験試料による冷感制御作用の有無および被験試料による冷感制御作用の度合いを評価することができる。したがって、本発明の評価方法は、例えば、冷感を得ることが望まれる温度ではヒトに与えられる冷感を増大させるが、冷感が望まれない温度ではヒトに与えられる冷感を減少させる性質を有する冷感外用剤などのように、ヒトのニーズにあった冷感外用剤の開発や、ヒトにおいて、冷感を知覚する温度を制御する冷感制御剤の開発などに利用することができる。
【実施例】
【００４５】
つぎに、実施例によって本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００４６】
（製造例１）
ヒトＴＲＰＭ８をコードするｃＤＮＡ〔配列番号：１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０２４０８０．４）に示される塩基配列の４１位〜３３５５位のポリヌクレオチド〕を、哺乳動物細胞用ベクター〔インビトロジェン社製、商品名：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）〕のクローニングサイトに挿入し、ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを得た。得られたヒトＴＲＰＭ８発現ベクター１μｇと、遺伝子導入用試薬〔インビトロジェン社製、商品名：ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（プラスリージェント）、カタログ番号：１１５１４−０１５〕６μｌとを混合し、混合物Ｉを得た。また、遺伝子導入用カチオン性脂質〔インビトロジェン社製、商品名：リポフェクタミン（登録商標）、カタログ番号：１８３２４−０１２〕４μｌと、血清使用量低減培地〔インビトロジェン社製、商品名：ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：１１０５８０２１）２００μｌとを混合し、混合物ＩＩを得た。
【００４７】
また、５体積％二酸化炭素の雰囲気中、３７℃に維持された直径３５ｍｍのシャーレ上の１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中において、５×１０５細胞のＨＥＫ２９３細胞を７０％のコンフルエンシーになるまで培養した。
【００４８】
得られた細胞培養物に、前記混合物Ｉと混合物ＩＩとを添加することにより、ＨＥＫ２９３細胞に前記ヒトＴＲＰＭ８発現ベクターを導入し、ＴＲＰＭ８発現細胞を得た。
【００４９】
（実験例１）
製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞１個を、温度計を備えた電気式温度制御チャンバー〔ワーナー・インストゥルメント・インク（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ）製、商品名：ＴＣ−３４４Ｂ〕付倒立顕微鏡〔ニコン（株）製、商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｉ〕のチャンバーに入れ、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００５０】
つぎに、洗浄後のＴＲＰＭ８発現細胞が入ったチャンバーに溶媒Ａを入れた。電極およびピペットを備えたマイクロマニピュレーター〔エクスフォ・バーレイ（ＥＸＦＯ  Ｂｕｒｌｅｉｇｈ）社製、商品名：ＰＣＳ−５４００〕と、解析用コンピュータに接続された膜電位固定用増幅器〔モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）社製、商品名：Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ〕を用い、パッチクランプ法に従い、−６０ｍＶの電圧を印加し、かつチャンバー内の温度を４０℃、３７．５℃、３５℃、３２．５℃または３０℃に調節した後、氷冷して２５℃／分の降温速度で約１５℃に降下させたときの電流を経時的に測定した。降温前のチャンバーの温度（環境温度）と、降温時の電流の変化とに基づいてアレニウスプロットを行なって変曲点を求め、冷刺激閾値を算出した。実験例１において、環境温度と冷刺激閾値との関係を調べた結果を図１に示す。
【００５１】
図１に示された結果から、ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値は、従来、環境温度によって変動しないと考えられていたにもかかわらず、環境温度依存的に変化していることがわかる。
【００５２】
（実施例１）
製造例１で得られたＴＲＰＭ８発現細胞を、細胞内カルシウムイオン測定用試薬であるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ（インビトロジェン社製）を最終濃度５μＭで含む１０質量％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地中、室温で６０分間インキュベーションすることにより、前記ＴＲＰＭ８発現細胞にＦＵＲＡ  ２−ＡＭを導入し、ＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞を得た。
【００５３】
得られたＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞を電気式温度制御チャンバー付蛍光測定装置〔浜松ホトニクス（株）製、商品名：ＡＲＧＵＳ−５０〕の各チャンバーに入れた。その後、チャンバー中のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞を、溶媒Ａ〔組成：１４０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、２ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭヘペス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）〕で洗浄した。
【００５４】
つぎに、洗浄後のＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞が入ったチャンバーに、溶媒Ａ、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａ、１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａ、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａまたは１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを入れた。
【００５５】
その後、チャンバー内の温度を４０℃または３０℃に調節した後、２５℃／分の降温速度で約１５℃に降下させたときの励起波長３４０ｎｍにおけるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞内のカルシウムイオンに結合したＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度340nm」という）および励起波長３８０ｎｍにおけるＦＵＲＡ  ２−ＡＭ導入細胞中のＦＵＲＡ  ２−ＡＭに基づく蛍光の強度（以下、「蛍光強度380nm」という）それぞれを経時的に測定した。
【００５６】
測定された蛍光強度340nmおよび蛍光強度380nmから、蛍光強度比340nm/380nm（蛍光強度340nm／蛍光強度380nm）を算出し、蛍光強度比340nm/380nmが上昇した時点での１秒間の平均温度を冷刺激閾値として求めた。
【００５７】
実施例１において、被験試料と冷刺激閾値との関係を調べた結果を図２に示す。図中、レーン１は溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、レーン２は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、レーン３は１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、レーン４は１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、レーン５は１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、レーン６は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値を示す。また、図中、白色バーは降温前のチャンバーの温度（環境温度）が３０℃であるときの冷刺激閾値、黒色バーは降温前のチャンバーの温度（環境温度）が４０℃であるときの冷刺激閾値を示す。
【００５８】
図２に示された結果から、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値（レーン２）、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値（レーン３）および１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値（レーン４）は、溶媒Ａのみを用いたときの冷刺激閾値（レーン１）と比べて上昇していることがわかる。これに対して、１ｍＭリナロールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値（レーン５）は、溶媒Ａのみを用いたときの冷刺激閾値（レーン１）と比べて低下していることがわかる。なお、１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値（レーン６）と、溶媒Ａのみを用いたときの冷刺激閾値（レーン１）との間には、有意な差がなかった。したがって、これらの結果から、シネオール、メントールおよび乳酸メンチルは、ＴＲＰＭ８の冷刺激閾値を上昇させていることから、ヒトが冷感を知覚する温度を上昇させることができることが示唆される。
【００５９】
そこで、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値、１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値および１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いたときの冷刺激閾値と、式（ＩＩ）：
【００６０】
【数２】
0005859359.tif 000003
【００６１】
とを用い、冷刺激閾値の変化〔ΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）〕を算出した。実施例１において、被験試料とΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）との関係を調べた結果を図３に示す。図中、レーン１は１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）、レーン２は１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）、レーン３は１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）、レーン４は１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）を示す。
【００６２】
つぎに、図３に示された冷感制御作用の大きさ〔ΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）〕に基づき、シネオール、メントール、乳酸メンチルおよびカルボンの冷感制御作用の大きさを評価した。評価基準は、下記のとおりである。
【００６３】
［評価基準］
被験試料が冷感制御作用を有しない
・・・・・ΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）が０以上４未満
被験試料が冷感制御作用を有する
・・・・・ΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）が４以上６未満
被験試料が強い冷感制御作用を有する
・・・・・ΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）が６以上
【００６４】
その結果、１ｍＭシネオールを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）（レーン１）および１ｍＭ乳酸メンチルを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）（レーン３）が５以上であるため、シネオールおよび乳酸メンチルが強い冷感制御作用を有することがわかる。これにに対して、１ｍＭメントールを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）（レーン２）および１ｍＭカルボンを含有する溶媒Ａを用いたときのΔＴｈ40℃-30℃／（Ｔｈ30℃−Ｔｈ30℃対照）（レーン４）が４未満であるため、メントールおよびカルボンが冷感制御作用を有しないことがわかる。
【００６５】
したがって、これらの結果から、シネオールおよび乳酸メンチルは、環境温度が通常の皮膚の表面温度（３０℃）よりも高い温度（４０℃）であるときにはヒトに効果的に冷感を感じさせることができるが、環境温度が通常の皮膚の表面温度（３０℃）であるときにはヒトに冷感を感じさせにくいことが示唆される。これに対して、メントールは、環境温度が通常の皮膚の表面温度（３０℃）であっても、通常の表面温度よりも高い温度（４０℃）であっても、ヒトに冷感を感じさせることが示唆される。
【００６６】
以上の結果から、少なくとも２種類の環境温度下に被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させ、各環境温度下でのＴＲＰＭ８の冷刺激閾値を測定することにより、各環境温度下でのＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を調べることができることができることがわかる。したがって、少なくとも２種類の環境温度下に被験試料とＴＲＰＭ８発現細胞とを接触させ、各環境温度下でのＴＲＰＭ８の冷刺激閾値に対する被験試料の影響を測定することにより、被験試料による冷感制御作用を、簡便な操作で、厳密にかつ高い再現性で評価することができることが示唆される。
【図１】
0005859359.tif 000004
【図２】
0005859359.tif 000005
【図３】
0005859359.tif 000006
【配列表】
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