(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組織の切片を採取する方法において、
第1のゲル層をニードルに挿入し、
第2のゲル層の上に植物組織を配置し、
第2のゲル層とともに前記植物組織に前記ニードルを貫通させて、ニードルに植物組織
の切片を採取する
工程を含むことを特徴とする植物組織切片の採取方法。
【請求項２】
前記ニードルがシリンジ構造を有するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ニードルの外径が0.26mm以下であり、内径が0.13mm以下である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲル層が多糖ゲルを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記ゲル層が少なくとも1〜4％のアガロースを含むゲルである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲル層が少なくとも1mmの厚みを有する層である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記ニードルに採取された前記植物組織切片を、液滴内に移すことをさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
液滴が1μL以下である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記液滴を凍結することをさらに含む、請求項7又は8に記載の方法。
【請求項１０】
前記ニードルが、4つの頂点を有する四角形の針先を有することを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法により採取された植物組織切片の細胞を破砕し、
核酸を分離する
工程を含むことを特徴とする植物組織からの核酸分離方法。
【請求項１２】
前記細胞の破砕が、チューブ内でのペッスルを用いたホモジナイズにより行われる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
植物組織の切片を採取するシステムにおいて、
採取ニードルと、
前記採取ニードルに第1のゲル層を挿入させる手段と、
植物組織を配置するための第2のゲル層と
前記採取ニードルを、第2のゲル層とともに前記植物組織を貫通させるように移動させる機構を備えることを特徴とする植物組織切片採取システム。
【請求項１４】
植物組織切片を吐出するための液滴を含むチューブと、
液滴凍結手段と
をさらに備える、請求項13に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物組織から切片を採取するための方法及びシステムに関する。また本発明は、植物組織切片の遺伝子解析方法、特に細胞壁や液胞を有する植物組織の遺伝子発現解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物組織の微小部位を、ニードル等を用いて採取し、採取物内に発現している遺伝子やタンパク質などの物質を解析する技術が報告されている（非特許文献１及び３）。この技術では、ミクロトームを用いて薄片化した植物組織を対象として、ニードルや、ピエゾ素子で振動するチップにより、顕微鏡観察下で微小切片を分離回収している。また、同技術では、回収した切片中の遺伝子について、逆転写によりcDNA合成している。【０００３】
また、植物組織中の発現遺伝子のcDNAライブラリ合成技術としては、ビーズ上に固定したpoly(T)プローブを鋳型としたcDNA合成技術が開示されている（非特許文献２）。同技術では、液体窒素温度で粉砕した試料を用い、ビーズ上にcDNAを合成することが開示されている。【０００４】
また、動物細胞を利用する例では、ビーズ上のcDNAを用いた定量PCR解析技術として、細胞から得られた遺伝子を鋳型とするcDNAライブラリを、磁気ビーズ等の微小担体上に合成し、そのcDNAライブラリを利用して、第一の遺伝子に関する定量PCRを実施し、その後、洗浄して上記cDNAライブラリを第二、第三の遺伝子に関する定量解析に、繰り返し利用する遺伝子解析方法が開発されている（特許文献１）。この技術により、細胞1個について、複数種類の遺伝子の定量解析が実現されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2007-319028号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Brandt, S. et al., Plant Molecular Biology Reporter 21:417-427 (2003)
【非特許文献２】Jost, R. et al., Bio Techniques 43:206-211 (2007)
【非特許文献３】Terpitz, U. et al., Bio Techniques 48:68-70 (2010)
【非特許文献４】Taniguchi, K. et al., Nature Methods 6:503-506 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、植物の環境に対する応答を、遺伝子発現の変化として捉える研究を検討した。具体的には、植物に外部刺激を与えた場合、植物個体の部位の違いや空間的位置の違いにより、遺伝子発現がどのように異なるかを検討した。その検討において、以下の課題を検討した。【０００８】
（1）刺激を与えた植物個体から、迅速に、理想的には5分以内に、他の雑多な刺激を極力与えない状態で、複数の部位から、一定の容量の組織切片を、採取する。【０００９】
（2）採取の際には、植物個体に対して大きな物理刺激である「切除」刺激が与えられることから、採取後は迅速に、理想的には1分以内に、遺伝子発現状態を保存（固定）する。【００１０】
（3）採取する切片は、微小であることが好適であり、検討する遺伝子分布の空間分解能の要求から、0.5mm角以下であること。【００１１】
（4）採取する切片が微小となるが、その組織切片内の遺伝子を網羅的に解析できるようにすること。【００１２】
（5）上記のため、複数種類の遺伝子を、網羅的にcDNA合成できること。【００１３】
（6）発現量の小さい遺伝子の解析を可能とするため、組織切片内の遺伝子の回収率（cDNA合成率）を、10％以上とすること。【００１４】
（7）採取は、同一個体から、複数部位の切片を採取すること。【００１５】
しかし、従来技術では、上記の課題を達成できないことが判明した。まず、採取の準備工程が多く、刺激を与えてから5分以内に、同一個体の複数部位から組織切片を回収することが不可能である。また、組織切片の採取において、雑多な刺激が多すぎるため、遺伝子発現の撹乱が発生していると予想される。さらに、切除から遺伝子発現状態の保存までに、具体的な技術の開示がなく、迅速な遺伝子発現状態の保存が達成できていない。そのため、切除刺激の影響で細胞内の液胞が破壊され、液胞内の遺伝子分解酵素の働きから、遺伝子分解が進み、目的とする遺伝子発現状態を解析することができない。また、微小切片を対象とする遺伝子抽出技術は全く開示されていない。具体的には、切片中の細胞について、細胞壁を破壊し、漏れなく細胞質内の遺伝子をcDNA合成するための方法が開示されていない。従来の方法では、微小切片からの遺伝子回収時の損失は大きい。【００１６】
そこで本発明は、植物組織から、好ましくは植物組織の複数部位から微小な切片を迅速に採取し、その微小な切片内の遺伝子発現状態を迅速に保存し、網羅的に解析するための手段及び方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は、上記課題を達成するため鋭意検討を行った結果、下記の手法の一部又は全体により、上記の課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】
（1）植物体の組織の一部を、任意に選択し、迅速に採取するため、採集用ニードルにより植物組織の採集を実施した。具体的には、27G又は31Gの細管を用いた組織採集用ニードルを開発し、同一個体の複数部位から一挙に切片を採取する方法を開発した。また、遺伝子発現状態を迅速に保存するためには、採取切片を迅速に氷点下温度に低下させる。そのための方法としては、純水や、遺伝子分解酵素の阻害剤を含んだ溶液を液滴として準備し、その中に採取切片を移し、液滴を液体窒素温度に冷却した。ここで、微小切片を、ニードルから確実に液滴に移すためには、ニードルにシリンジ構造をもたせ、ニードル内の組織をプランジャで押しだすことが好適である。この際、ニードルの接触により、組織の破損が発生するため、この破損を防ぐ手段として、採取切片を、予め、ゲルやポリマーなどのゲル層で保護することが必要である。後段のような遺伝子固定やcDNA合成（逆転写反応）を行う場合には、このゲルやポリマーなどのゲル層は、そのような反応に対する阻害が起きない物質であることが必要である。それらのゲル層で組織を保護し、液滴内に迅速に切片を移し、液体窒素温度で冷却することで、切除から冷却までを1分以内で実施した。【００１９】
（2）微小切片の組織を含む液滴を、氷点下にすることは、組織内の細胞を完全に破壊するためにも有効であった。氷点下にて凍結した状態で、ペッスルなどにより物理的な力を加えると、全ての細胞組織は完全に破砕され、細胞質は細胞壁外に抽出できた。ただし、ペッスル表面に遺伝子が付着し、遺伝子回収率が低下することを防ぐ目的で、(i) ペッスル等の破砕用具への遺伝子付着を低減するため、予め親水性ポリマーをチューブ表面にコーティングする、(ii) 破砕後の付着物を分離し再回収するため、ペッスルをチューブ内に留まった状態で、ペッスルごと遠心分離できる技術、(iii) 破砕後のcDNA合成処理における反応ボリュームの微少量化、を行った。【００２０】
具体的には、本発明は以下の通りである。【００２１】
［1］植物組織の切片を採取する方法において、
第1のゲル層をニードルに挿入し、
第2のゲル層の上に植物組織を配置し、
第2のゲル層とともに前記植物組織に前記ニードルを貫通させて、ニードルに植物組織の切片を採取する
工程を含むことを特徴とする植物組織切片の採取方法。【００２２】
［2］前記ニードルがシリンジ構造を有するものである、［1］に記載の方法。【００２３】
［2-2］前記ニードルが、4つの頂点を有する四角形の針先を有するものである、［1］又は［2］に記載の方法。【００２４】
［2-3］前記ニードルの外径が0.26mm以下であり、内径が0.13mm以下である、［1］又は［2］に記載の方法。【００２５】
［2-4］前記ニードルが27G又は31Gのゲージのものである、［1］又は［2］に記載の方法。【００２６】
［3］前記ゲル層が多糖ゲルを含む、［1］又は［2］に記載の方法。【００２７】
［4］前記ゲル層が少なくとも1％のアガロースを含むゲルである、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。【００２８】
［5］前記ゲル層が少なくとも1mmの厚みを有する層である、［1］〜［4］のいずれかに記載の方法。【００２９】
［5-2］第1のゲル層の厚みと、第2のゲル層の厚みと、前記植物組織の厚みとの和が所定の厚みになるように調整される、［1］〜［5］のいずれかに記載の方法。【００３０】
［6］前記ニードルに採取された前記植物組織切片を、液滴内に移すことをさらに含む、［1］〜［5］のいずれかに記載の方法。【００３１】
［7］液滴が1μL以下である、［6］に記載の方法。【００３２】
［8］前記液滴を凍結することをさらに含む、［6］又は［7］に記載の方法。【００３３】
［8-2］前記ニードルに採取された植物組織切片を液滴内に移し、凍結するまでの時間が、3分以内、好ましくは1分以内である、［8］に記載の方法。【００３４】
［9］［1］〜［8］のいずれかに記載の方法により採取された植物組織切片の細胞を破砕し、
核酸を分離する
工程を含むことを特徴とする植物組織からの核酸分離方法。【００３５】
［10］前記細胞の破砕が、チューブ内でのペッスルを用いたホモジナイズにより行われる、［9］に記載の方法。【００３６】
［10-2］前記ペッスルが、ホモジナイズ後に、前記チューブと一体化して遠心分離に供することができる形状を有するものである、［10］に記載の方法。【００３７】
［10-3］前記ペッスルの先端が前記チューブの内部に完全に挿入された状態で遠心分離に供することができる形状を有するものである、［10］に記載の方法。【００３８】
［10-4］前記ペッスルの表面が親水化処理されている、［10］に記載の方法。【００３９】
［11］［9］又は［10］に記載の方法により植物組織から分離された核酸又は該核酸と同じ若しくは相補的な配列を有する核酸を固相担体に固定化する工程を含むことを特徴とする、植物組織由来核酸ライブラリの作製方法。【００４０】
［12］［9］又は［10］に記載の方法により植物組織から分離された核酸を分析する工程を含むことを特徴とする、植物組織由来核酸の分析方法。【００４１】
［13］植物組織の切片を採取するシステムにおいて、
採取ニードルと、
前記採取ニードルに第1のゲル層を挿入させる手段と、
植物組織を配置するための第2のゲル層と
前記採取ニードルを、第2のゲル層とともに前記植物組織を貫通させるように移動させる機構
を備えることを特徴とする植物組織切片採取システム。【００４２】
［13-2］採取ニードルがシリンジ構造を有するものである、［13］に記載のシステム。【００４３】
［13-3］シリンジ構造が、中空細管のプランジャを有するものである、［13-2］に記載のシステム。【００４４】
［14］植物組織切片を吐出するための液滴を含むチューブと、
液滴凍結手段と
をさらに備える、［13］に記載のシステム。【００４５】
［15］植物組織切片から核酸を分離するシステムにおいて、
植物組織切片を入れる液滴を含むチューブと、
液滴凍結手段と、
ペッスルと
を備え、前記ペッスルが、前記チューブと一体化して遠心分離に供することができる形状を有することを特徴とする植物組織からの核酸分離システム。【００４６】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2012-37593号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００４７】
本発明により、植物組織から切片を採取するための方法及びシステムが提供される。また本発明により、植物組織から核酸を分離するための方法及びシステムが提供される。本方法及びシステムにより、植物組織の部位特異的な遺伝子発現解析が可能となる。そのため、植物への外部刺激の作用と、その応答の部位依存性や、遺伝子発現の空間分布特性などの研究に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】植物組織切片採取ニードルの一例を説明する図である。
【図２】ニードルのホルダの例を説明する図である。
【図３】ニードル内にゲル層を挿入する手順を説明する図である。
【図４】植物組織切片を採取する状態の説明図である。
【図５】植物組織切片を採取する状態の説明図である。
【図６】植物組織切片が、2つのゲル層に挟まれて回収できた様子の説明図である。
【図７】植物組織切片を、液滴に移す状態の説明図である。
【図８】チューブと一体化して遠心分離可能なペッスルの一例を説明する図である。
【図９】チューブと一体化して遠心分離可能なペッスルをチューブと一体化させた状態の説明図である。
【図１０】チューブと一体化して遠心分離可能なペッスルを遠心分離機に配置した状態の説明図である。
【図１１】27Gニードルを使用して採取した植物組織切片の顕微鏡写真である。
【図１２】植物組織切片の採取システムの一例を説明する図である。
【図１３】植物組織切片の採取から核酸の分離、分析までを説明する図である。
【図１４】31Gニードルを使用して採取した植物組織切片の顕微鏡写真である。
【図１５】液滴に用いる試薬として、核酸分解酵素の阻害成分を有する試薬であるRLTバッファ及びRLCバッファを用い、31Gニードルを使用した場合の、液滴量に対するcDNA合成量を比較した結果を示すグラフである。
【図１６】ニードルでの採取後に一定時間インターバルを入れて、組織切片をチューブ内に排出し、その試料のcDNAライブラリ合成量を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００５０】
本発明は、植物組織の切片を採取し、得られた植物組織切片から核酸を分離するための方法及びシステムを提供する。
【００５１】
本発明において、切片を採取しようとする植物組織の「植物」とは、植物に分類されるあらゆる生物を意味し、具体的には細胞壁を有し、光合成を行う生物である。より具体的には、種子植物、シダ植物、コケ植物、多細胞藻類などが含まれる。植物組織は、このような植物から回収された任意の組織であってよく、例えば根、葉、茎、維管束系、芽、花、種子などの器官から得られる組織とすることができる。得られた植物組織は、そのまま使用してもよいし、あるいは前処理（洗浄、切断など）を行ってもよい。採取しようとする「切片」とは、植物組織の小片を指し、できる限り小さい、例えば一片が0.5mm以下であることが好ましい。
【００５２】
本発明に係る植物組織切片の採取方法は、第1のゲル層をニードルに挿入する工程及び第2のゲル層の上に植物組織を配置する工程を含む。これらの工程は、いずれを先に行ってもよいし、又は同時に行ってもよい。「ゲル層」とは、ある程度の厚みを有するゲルからなる層である。ゲルは、植物組織を保護するのに適した硬さを有し、また植物組織に含まれる成分に対して影響を及ぼさない材料から構成されるものであれば特に限定されるものではない。例えば、多糖ゲル、特に寒天ゲル、アガロースゲル及びセファロースゲル、並びにポリマーゲルなどが挙げられる。後述する核酸ライブラリの作製又は核酸分析を行う場合には、固相担体への捕捉やcDNA合成（逆転写反応）などの反応に対して影響を及ぼさない材料から構成されたゲルであることが好ましい。ゲル層の硬さ及び厚みは、使用するニードルのサイズ、対象の植物組織の種類などに応じて異なり、当業者であれば適宜調整することができる。例えばアガロースゲルを使用する場合、少なくとも1重量％のアガロースを含むことが好ましく、植物組織として葉を選択する場合には少なくとも1.5重量％、好ましくは1.5〜2重量％のアガロース、茎を選択する場合には少なくとも3重量％、好ましくは3〜4重量％のアガロースを含むゲルを使用することが好ましい。また厚みは、少なくとも1mmであり、例えば1mm〜5mm、好ましくは1mm〜2mmである。
【００５３】
第1のゲル層及び第2のゲル層は、同じ種類、硬さ及び厚みであってもよいし、あるいは異なるものであってもよい。第1のゲル層の厚みと、第2のゲル層の厚みと、植物組織の厚みとの和が所定の厚みになるように調整されてもよく、これは、対象の植物組織の種類やニードルのサイズなどに応じて適宜調整することができる。
【００５４】
ニードル（採取ニードル）は、植物組織から切片を採取するのに好適な強度及びサイズを有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、ステンレス製の市販の注射針を、必要であれば加工を行って、使用することができる。好適なサイズは、27G及び31Gのゲージのものであり、小さいサイズであれば微小の切片を採取することができる。例えば、27Gの注射針を使用した場合、外径0.4mm、内径0.2mm、管肉厚0.1mmであり、約26細胞／層の切片を採取することができる。また例えば31Gの注射針を使用した場合には、外径0.26mm、内径0.13mm、管肉厚0.06mmであり、約11細胞／層の切片を採取することができる。
【００５５】
ニードルの針先の形状も特に限定されるものではなく、例えば丸形、楕円形、四角形、菱形などの形状でよいが、4つの頂点を有する四角形の針先を有することが好ましい。これにより、採取する植物組織の量のばらつきを抑えることができる。また、４つの頂点を有する針先のニードルは、植物組織に限らず、動物組織からの切片採取においても、採取組織量のばらつきを抑える効果を有する。特に、凍結やホルマリン固定により作製した病理切片などの一部分の微小領域より、切片を回収する際に活用できる。
【００５６】
ニードルはさらに、シリンジ構造を有することが好ましい。例えば、細管（中空細管）をニードル内に挿入し、プランジャ（押子）として、切片の吐出に利用することによって行うことができる。これにより、ニードル内に採取された植物組織切片を簡便にかつ損傷なく吐出することが可能である。また、ニードルをルアーロックなどの装着具によってプランジャと接続してもよいし、あるいはシャープペンシル状にホルダに保持されてもよい。
【００５７】
ニードルは、使用前に核酸分解酵素の阻害剤（例えばRNAse阻害剤）で処理してもく、これにより植物組織切片内の核酸が分解されるのを防止することができる。また、使用前に親水性ポリマーにより処理してもよく、これによりニードル内にゲル層や植物組織切片が保持されやすくなる。
【００５８】
ニードルに第1のゲル層を挿入するには、例えば、ニードルをゲルシートに1回以上貫通させる方法、ニードルに溶液を入れて溶液をゲル化する方法、などの任意の方法を採用することができる。
【００５９】
第2のゲル層への植物組織の配置も特に限定されるものではなく、ゲルシートに植物組織を置くことによって、又は溶液を含む容器に植物組織を入れ、溶液をゲル化することによって行うことができる。なお、植物組織の上にさらにゲル層が配置されてもよい。その場合は、第1のゲル層が事前にニードルに挿入されていてもよいし、挿入されていなくてもよい。
【００６０】
続いて、第2のゲル層とともに前記植物組織に前記ニードルを貫通させて、ニードルに植物組織の切片を採取する工程を行う。これにより、ニードル内には、第1のゲル層と第2のゲル層に挟まれた状態で植物組織切片が採取される。ニードルの貫通は、植物組織及び第2のゲル層に対してできる限り垂直に行うことが好ましい。
【００６１】
このようにして、植物組織切片を迅速に、好ましくは5分以内に採取することができ、得られた植物組織切片も微小で、組織が保護されることになる。
【００６２】
ニードルに採取された植物組織切片は、できるだけ迅速に液滴内に移し、凍結する。例えば、植物組織切片を液滴内に移し、凍結するまでの時間が、3分以内、好ましくは1分以内となるようにする。それにより、採取時の物理的刺激による影響が少ない遺伝子発現状態を固定することができる。
【００６３】
液滴は、純水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、TEバッファ、並びにそれらの溶媒に核酸分解酵素の阻害剤（例えばRNAse阻害剤）を添加した溶液などで調製する。特に核酸分解酵素の阻害剤添加溶液としては、硫酸アンモニウム成分を基本とする試薬（代表製品名：RNALater（Ambion Inc.））や、グアニジン系の保存液兼抽出試薬（代表製品：RLTバッファやRLCバッファ（QIAGEN））が利用可能である。
【００６４】
液滴の大きさは、採取した切片の大きさに応じて異なるが、好ましくは1μL以下、例えば0.5μLとすることができる。特に、液滴として核酸分解酵素の阻害剤を添加した溶液を用いる場合、その成分がcDNA合成を阻害する可能性があるため、液滴の大きさは必要最小限とするほうが良い。このような液滴を、例えばチューブ内に準備し、そこへ植物組織切片を移す。液滴を準備するチューブは、当技術分野で公知の任意の種類及びサイズのチューブを用いることができる。例えば後述する遺伝子発現分析を行う場合には、PCRチューブを採用することができる。チューブは、液滴や植物組織切片の内容物（核酸など）が保持されやすいような材質であるか又は保持されやすいように処理されていることが好ましい。例えば、チューブを親水性の材質（例えば親水性ポリマーなど）で作製したり、チューブの表面に親水性処理（例えば親水性ポリマーによるコーティング、UVオゾン処理方法など）を行うことができる。
【００６５】
植物組織切片を液滴へ移した後、液滴を凍結する。凍結は、当技術分野で公知の方法により行うことができる。例えば、液体窒素を用いる方法、フリーザーの利用などが一般的に行われている。凍結によって、植物組織切片における遺伝子発現状況を保存することができ、また後述する細胞の破砕も容易となる。
【００６６】
次に、上述のようにして採取された植物組織切片から核酸を分離する方法について説明する。まず、本発明の方法により採取された植物組織切片の細胞を破砕する。植物細胞の破砕は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができ、物理的破砕、例えばペッスル、ガラスビーズ又は超音波処理を用いたホモジナイズなどを利用することができる。
【００６７】
ペッスルを用いて植物細胞の破砕を行う場合、好ましい実施形態では、ペッスルは、チューブ内で植物組織切片の細胞をホモジナイズした後、チューブと一体化して遠心分離に供することができる形状を有する。より好ましくは、ペッスルは、その先端がチューブの内部に完全に挿入された状態で遠心分離に供することができる形状を有する。例えば、ペッスルをチューブに固定化することができるキャップを用いることによって、ペッスルとチューブを一体化することができる。具体例を実施例１及び図８〜１０に示す。あるいは、ペッスルがチューブと一体化し、水平方向にぶれずにチューブの中心に位置するようなストッパーを用いて、ペッスルとチューブを一体化することができる。このような形状のペッスルを用いて遠心分離を行うことによって、ペッスル表面へ植物組織切片の内容物（核酸など）が付着しても内容物を高効率に回収することができると共に、迅速な操作が可能となる。
【００６８】
またペッスルは、植物組織切片の核酸などが付着しないような材質であるか又は核酸などが付着しないように処理されていることが好ましい。例えば、ペッスルを撥水性の材質（例えばポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリ塩化ビニリデンなど）で作製する場合には、ペッスルの表面に親水性処理（例えば親水性ポリマーによるコーティング、UVオゾン処理方法など）を行うことができる。これにより、ペッスル表面への植物組織切片の核酸などの付着を防止することができ、植物組織切片の核酸の回収率をさらに高めることができる。
【００６９】
細胞破砕後、植物組織切片由来の核酸を分離する。分離する核酸の種類としては、ゲノムDNA、メッセンジャーRNA（mRNA）、非コードRNA（ncRNA）、マイクロRNA、並びにそれらの断片などが含まれる。核酸の分離は、分離しようとする核酸の種類に応じて、当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Proteinase Kのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Tween及びSDSといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞に含まれる核酸、すなわちDNA及びRNAを溶出することができる。ゲノムDNAは、物理的切断又は制限酵素切断などにより断片化してもよい。RNA（mRNAなど）を分離する場合には、上記のように溶出された核酸のうち、DNAをDNA分解酵素（DNase）により分解し、核酸としてRNAのみを含む試料が得られる。cDNAを調製する場合には、RNAのみを含む試料から、ポリT配列を含むDNAプローブを用いてmRNAのみを捕捉した後、mRNAから逆転写酵素を用いる逆転写反応を行うことによってcDNAを合成することができる。
【００７０】
本発明の構成によって、植物組織切片に含まれる核酸を、迅速にかつ高効率で分離することができる。これは、植物の遺伝子発現状況を分析するのに有用である。
【００７１】
上述のようにして植物組織から分離された核酸（例えばゲノムDNA、mRNAなど）又は該核酸と同じ若しくは相補的な配列を有する核酸（例えばcDNA）を固相担体に固定化することにより、植物組織由来核酸ライブラリを作製することができる。また、上述のようにして植物組織から分離された核酸（又は固相担体に固定化された核酸）を分析することにより、植物組織由来核酸を分析することができる。このような核酸ライブラリの作製方法や核酸の分析方法は、当技術分野で周知である。例えば特許文献１及び非特許文献４に記載の方法を利用することによって、固相担体としてビーズ上に植物組織由来cDNAのライブラリを作製し、植物組織において発現している核酸（遺伝子）を反復して分析することができる。具体例を図１３に示す。本発明に従って、植物組織から、1以上（好ましくは複数）の箇所から切片を採取し、それぞれの切片から核酸を分離し、それぞれの切片由来の核酸に対応するcDNAライブラリを作製し、該核酸を定量PCRにより分析することによって、植物組織のある箇所（又は複数の箇所）における1種以上の遺伝子発現状況を分析することが可能である。このように、本発明によって、迅速に、かつ高効率に、植物組織由来の核酸を利用することが可能となる。
【００７２】
さらに本発明は、上述したような方法を実施するための植物組織切片の採取システムに関する。具体的には、本発明の植物組織切片採取システムは、
採取ニードルと、
前記採取ニードルに第1のゲル層を挿入させる手段と、
植物組織を配置するための第2のゲル層と
前記採取ニードルを、第2のゲル層とともに前記植物組織を貫通させるように移動させる機構
を備える。
【００７３】
採取ニードルは、上述したとおりであり、シリンジ構造を有することが好ましい。また、採取ニードルに第1のゲル層を挿入させる手段は、採取ニードルをゲルシートを貫通させるように移動する機構とすることができる。あるいは、採取ニードルにゲル化可能な溶液を注入して、その溶液をゲル化することができる手段としてもよい。
【００７４】
第1のゲル層、及び植物組織を配置するための第2のゲル層は上述したとおりである。
【００７５】
採取ニードルを第2のゲル層とともに植物組織を貫通させるように移動させる機構も特に限定されるものではなく、当技術分野で公知の機構を利用することができる。
【００７６】
また、第1のゲル層の厚みと、第2のゲル層の厚みと、植物組織の厚みとの和が所定の厚みになるように調整するための手段を備えるものであってもよい。これは、対象の植物組織の種類や採取ニードルのサイズなどを勘案して、厚みの和が所定の厚みになるように調整する。
【００７７】
本発明の植物組織切片採取システムは、さらに、植物組織切片を吐出するための液滴を含むチューブと、液滴凍結手段とを備えるものであってもよい。これにより、植物組織切片の採取から遺伝子発現状況の保存までを簡便かつ迅速に実施することができる。
【００７８】
また本発明の植物組織切片採取システムは、植物組織上の切片採取場所を決定するための情報入力手段（カメラ、観察ステージ、モニターなど）、採取ニードルの位置決定手段、採取ニードルの移動・位置調整手段、採取ニードルの洗浄手段などを備えていてもよい。
【００７９】
さらに本発明は、植物組織切片から核酸を分離するシステムにも関する。該システムは、
植物組織切片を入れる液滴を含むチューブと、
液滴凍結手段と、
前記チューブと一体化して遠心分離に供することができる形状を有するペッスルと
を備える。
【００８０】
液滴を含むチューブは、上述したとおりである。液滴凍結手段としては、フリーザー、液体窒素などを採用することができる。ペッスルについても上述したとおりである。
【００８１】
本発明の核酸分離システムにより、植物組織切片から、簡便かつ迅速に、高効率に核酸を分離することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、図面を参照して本発明の実施形態の具体例について説明する。ただし、これらの実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。【００８３】
［実施例１］
図１は、本発明において使用する植物組織切片採取ニードルの例である。ニードル101は、27G又は31Gを用いた。上部102は、注射針と同様に、ルアーロックにより、プランジャ等と接続することができる。下部の針先103は、四方から切削することにより、4つの頂点を、ほぼ正方形で有する先端に加工した。図１の（b）は、先端部分の拡大図である。【００８４】
切削の角度を、104で示している。27Gのニードルでは内径（図中の105）が約0.21 mm、31Gのニードルでは内径が約0.13 mmである。このニードル内に、プランジャの機能を有するための、外径0.10mm又は外径0.05mmのステンレス製細管を挿入して、プランジャ（押子）として使用する。切削の角度は、8度〜30度であることが望ましい。特に、12度〜20度である場合、組織への挿入と、切片の切除の効率がよく、さらに耐久性も良い。通常の注射針の場合、8度〜12度が使用されている。この角度においても、本発明の目的は達成できるが、一般に、鋭角の先端は磨耗や変形に弱いため、繰り返しの使用に難点がある。そのため、耐久性を考慮した角度として、12度〜20度が、より好適である。【００８５】
図２（a）は、ニードルを、別途、注射器様に試作した部品に接続した様子である。注射器のプランジャ様のものを上下させることで、ニードル内のステンレス細管を、上下させることができる。また、（b）には、ニードルをシャープペンシルの芯の様に試作し、それをホールドさせた場合の例である。【００８６】
これらのニードルの使用方法を説明する。図３（a）は、ニードルに細管301を挿入した様子を示している。ゲルシート302にニードルを挿入すると、図３（b）に示すように、ニードル内にゲル層（上部ゲル層）303を形成できる。ただし、このゲル層は、予め、他のポリマーなどで形成したものを用いても良い。ただし、後述する遺伝子増幅や逆転写反応を行う場合には、これらの反応を阻害する素材、例えばシリコンゴムなどは使用しない方がよい。【００８７】
次に、植物組織の採取を実施する。図４〜図７は、組織切片を採取する説明図である。まず、採取対象の植物401を、図４に示すようにゲルシート402上に配置する。その状態で、図５に示すようにニードルを植物と下のゲルシートに突き刺す。その結果、ニードル内には、先のゲル層（上部ゲル層）303の下に、植物組織層501と、下部ゲル層502が挿入される。この後、ニードルを静かに引き上げると、ニードル内には、上記のゲル・組織・ゲルのサンドイッチ状の試料601が得られる。これにより、微小な植物組織切片を、迅速に、かつ過度の刺激なく（保護された状態で）採取することができる。【００８８】
次に、図７に示すとおり、あらかじめチューブ701の内壁に形成した液滴702に、試料601を、細管301を押し出すことにより、液滴702内に移すことができる。この場合、ゲル層303が切片を保護するため、切片の破損を生じることなく、液滴内に移すことができる。なお、チューブに試料を移す際、液滴を用いることは重要である。液滴を用いずに、チューブの内壁に付着させる場合、取り扱う試料が微小であり、肉眼では観察できないため、確実な移動が難しい。液滴を用いることにより、細管先端により押し出された組織切片は、確実に液滴内に移動させることが可能である。【００８９】
［実施例２］
実施例１において採取した組織について、細胞壁を破壊し、細胞質を得る工程について、説明する。本実施例のように、植物の微小切片が試料である場合、切片内の全ての細胞について、細胞壁を破壊し、細胞質を取り出すことは、一般的には難しい。その実用的方法として、本実施例では、液体窒素温度への冷却と破砕を利用した。液滴を液体窒素温度に冷却すると、液滴は氷滴となる。その氷滴を、ペッスルで破砕すると、氷滴内の組織も粉砕することが可能である。しかし、確実に粉砕するためには、液滴の大きさを、1μL以下とすることが重要である。それより大きい場合は、氷滴の物体としての強度が大きくなるため、粉砕することが難しくなる。機械的な工夫により、粉砕することは不可能ではないが、マニュアルで簡便な実験を実施するためには、液滴の大きさを、1μL以下とする。【００９０】
好適には、0.5μLのPBSを用いる。【００９１】
また、粉砕するペッスルも特別な工夫が必要である。本実施例では、粉砕後に、ペッスル表面の細胞質も遺失なく回収できる様に、ペッスルとチューブを、同時に遠心器にかけることができるように工夫した。図８は、ペッスルの説明図である。本実施例のペッスルは、ペッスル本体801と、ペッスルキャップ803で構成される。ペッスル本体には、ペッスルキャップを装着する部分802を有している。また、ペッスルキャップの下面から見た様子が804である。キャップには、805の切り込みがあり、ペッスルの802の部分と結合する。806はキャップを装着した状態である。ペッスルは、図９（a）の通り、チューブ901の内壁に、ペッスルの下部分が密着するように設計されており、チューブ内の試料を粉砕することができる。次に、ペッスルキャップを装着する（806）ことにより、図９（b）の様に、チューブと一体になる。この際、チューブ内壁の最下点と、ペッスル先端との距離902は、本実施例では2mmとした。【００９２】
図１０は、遠心分離機1001に、ペッスル及びチューブを装着した様子を示している。この状態（バランス保持のための、他端のチューブは省いた）で、遠心分離をすることにより、ペッスル表面に付着した細胞質を、チューブ内に回収することが可能である。これにより、微小切片から、細胞質を効率的に回収することが可能となった。なお、本実施例では、0.2mL PCRチューブに最適なペッスルを、素材として、UPE：Ultra High Molecular Weight Polyethylene（超高分子量ポリエチレン）、PP：Polypropylene（ポリプロピレン）、POM：Polyoxymethylene（ポリアセタール）、PPS：Polyphenylenesulfide（ポリフェニレンスルファイド）、及び、PEEK：Polyetheretherketone（ポリエーテルエーテルケトン）で試作した。その結果、PEEKを用いたペッスルが、最も回収率が良かった。これは、ペッスル表面に付着する細胞質が、遠心により回収される率を示していると考えている。【００９３】
［実施例３］
次に、試料として、播種後21日経過のシロイヌナズナ（野生型のCol株）の芽生え株について、子葉より組織切片を採取し、遺伝子発現解析を実施した例を、以下に説明する。【００９４】
１．事前準備
まず、本実施例では、組織切片は、アガロースゲルにより挟む状態で採取する例を説明する。事前準備として、以下のことを実施する。 
（1）重量2％濃度アガロースゲルを滅菌状態の超純水で作製し、約2mmの厚さのゲルシートができるようにシャーレに分注して、4℃に冷却する。 
（2）ニードル及びペッスルを、RNAse阻害剤で処理して乾燥する。その後、親水性ポリマーを浸潤させ、乾燥させる。 
（3）0.2mL PCRチューブの内壁も、親水性ポリマーを浸潤させて、乾燥させる。 
（4）上記のチューブの壁面に、約0.5μLのPBS水溶液の液滴を形成し、氷温冷却する。 
（5）液体窒素を準備する。【００９５】
２．組織切片採取
（1）ニードルをホルダに装着し、細管をニードル内に挿入する。その後、アガロースゲルシートにニードルを挿入し、ニードル内にゲル層を形成する。 
（2）採取対象の植物をゲルシート上に配置し、ニードルを採取部位に挿入する。植物と下のゲルシートを同時に貫通させる。この結果、ゲル層、植物組織層、ゲル層のサンドイッチ状のものが、ニードル内に採取できる。 
（3）すぐに、ニードル内のサンドイッチ状態の検体をプランジャで押し出すと共に、それらを0.2mLチューブ内の液滴に移す。検体を移したチューブのフタを閉じ、すぐにチューブを液体窒素に浸し、検体を含む液滴を冷却する。なお、複数部位を同時に採取する場合は、この動作を繰り返す。【００９６】
３．組織破砕
（1）チューブを液体窒素から取り出し、検体を含む氷滴を、ペッスルでつぶす（5秒程度）。0.5μLの氷滴は、内部の検体ごと容易に破砕できる。 
（2）ペッスルキャップを装着して、チューブをペッスルごと遠心する（10秒程度）。 
（3）ペッスルをチューブから外し、フタを閉め、再び液体窒素に浸す。なお、複数部位を同時に採取する場合は、この動作を繰り返す。【００９７】
４．cDNAライブラリ作製
cDNAライブラリ作製は、特許文献１又は非特許文献４に記載の方法を用いる。具体的には、以下の通りである。【００９８】
（1）まず、以下の組成のマスターMixを準備する（量は、1チューブあたり）。 
Resuspension Buffer    1.0 μl
Lysis Enhancer         0.1 μl
10x DNase I Buffer     0.36 μl
DNase I                0.5 μl
PBS pH7.4              1.5 μl 
上記Mixを分注（分注後、3.96μL）し、室温で5〜10分処理する。【００９９】
（2）EDTA（2.5mM）を1.2μL注入し、70℃、5分間処理し、氷冷する。【０１００】
（3）以下の試薬を加える。 
0.1% Tween20, 10mM Tris-HCl(pH8.0)      15.6 μl
10mM dNTP Mix                            1.0 μl
オリゴ(dT)30磁気ビーズ                    1.0 μl
（これは、磁気ビーズにオリゴ(dT)30を、予め固定したものである） 
70℃で5分間反応後、4℃に冷却する。【０１０１】
（4）下記試薬を用いて、逆転写を行う。 
5x RT Buffer           6.0μl
0.1M DTT               1.0μl
RNase OUT              1.0μl
Super Script III RT    1.0μl 
50℃で50分間、攪拌しながら反応させ、85℃で1.5分処理し、氷冷する。【０１０２】
（5）RNase Hを1.0μL加え、37℃で30分間、攪拌しながら反応させ、氷冷する。【０１０３】
以上の工程で、ビーズ上にcDNAライブラリを合成できる。【０１０４】
図１１は、本実施例で採取したシロイヌナズナの切片の一例である。27Gのニードルを使用した例である。この図の示す通り、一辺が約200μm（図中1101）の組織（約4μg）を採取することができる。また、図１４は、31Gのニードルを使用した例である。この場合、約150μmの組織（約2μg）を採取することができる。なお、採取の際の大きさのばらつきは、約10％以下であった。【０１０５】
また、合成したcDNAの回収率を検討するため、シロイヌナズナTUB2（AT5G62690）遺伝子を指標として、表1に示すプライマーを用いて回収率を調べた。TUB2（AT5G62690）は、ハウスキーピング遺伝子として、安定した発現量が期待できるため、指標になり得る。定量PCRは、以下の方法により実施した。まず、定量PCRの濃度キャリブレーションに用いるコントロールを、シロイヌナズナのcDNA溶液を鋳型に、「TUB2 Con FW」及び「TUB2 Con RV」をプライマーとして用いて、PCR合成により得た。このコントロールを用いて、TUB2に関する定量PCR解析を、「TUB2 PCR FW」及び「TUB2 PCR RV」を増幅用プライマーとして、「TUB MGB」をMGBプローブとして用いて、行った。【０１０６】
実験の結果、200μmの切片から、約10,000〜12,000コピーのTUB2遺伝子が回収された。用いた子葉切片は、約4μgであることから、TUB2の回収量は、2.5×106〜3.0×106コピー/mgであることが計算で求められる。【０１０７】
次に、従来方法で、数mgの同条件の子葉を集めて、同様にTUB2遺伝子を回収したところ、遺伝子量は、1mgあたり約107コピーが発現していることが得られた。そのため、本実施例の技術では、発現遺伝子の約25〜30％を回収できていることが、計算により求められる。【０１０８】
また、31Gニードルを用いた実験では、回収された切片は約2μgであり、TUB2回収量は約1.9×106コピー/mgの遺伝子であった。これより、31Gニードルを用いた遺伝子回収における回収率は、約19%であると言える。27Gニードル使用時より、回収率が低下している要因は、回収対象の切片が小さくなったためであると推定される。【０１０９】
ここで、遺伝子回収率を更に向上させるため、液滴に用いる試薬として、PBS以外についても検討を行った。液滴として、核酸分解酵素の阻害成分を有する試薬の例であるRLTバッファ、及びRLCバッファ（共にQIAGEN）を用いることを検討した。実験は、31Gニードルにて実施した。図１５は、液滴量に対するcDNA合成量を比較した結果である。PBSを用いた場合を１に規格化して図示した。これより、以下の結論を得た。RLTおよびRLCを用いた場合、0.5μLの条件ではcDNAライブラリ合成量はそれぞれ約1.7倍および3.4倍に向上した。一方、液滴量が増加すると、cDNAライブラリ合成量が低下した。これは、試薬の核酸分解酵素阻害成分が、cDNA合成の阻害として機能してしまうことが要因である。これより、核酸分解酵素の阻害成分を有する試薬を用いる場合、液滴の量は、必要最小限とすることが重要であることが判った。以上の結果、液滴の最適化により、発現遺伝子の回収及びcDNA合成率は、約60%以上にまで向上できることが解った。【０１１０】
さらに、ニードルでの組織採取において、ニードル内への組織切片の採取から、チューブ内の液滴に移すまでの作業における迅速性の効果を評価した。本実施例では、ニードルでの採取からチューブへの排出までは、約10〜15秒以内に完了できる。そこで、その作業において、採取後に一定時間インターバルを入れて、組織切片をチューブ内に排出し、その試料のcDNAライブラリ合成量を比較したところ、図１６の結果を得た。図は、インターバルなしの作業をゼロ分とし、設けたインターバル(経過時間)によるcDNA合成量を示す。時間ゼロ分を１に規格化して図示した。これより、採取にかかる時間が長くなると、回収できる遺伝子量が減少し、3〜5分では約半分となることがわかる。従来技術では、レーザー等で切片を採取する際、切片が小さくなるほど、回収までの時間がかかるため、遺伝子の回収率が低下していた。本実施例の技術により、遺伝子分解を回避した遺伝子回収が可能である。
【表１】
0005859635.tif 000002
【０１１１】
［実施例４］
本実施例では、図１２を用いて切片採取システムについて説明する。採取システム1200は、顕微鏡観察画像など、対象の植物を観察しながら、採取場所を予め決定するための情報入力手段と、その情報に基づいて、採取ニードルの先端を、ゲルの挿入、組織の採取、チューブ等への排出を実行する採取手段、及び、チューブ等の温度を冷却する冷却手段で構成される。なお、採取手段は、複数独立で制御することができるため、システムでは、複数ポイントにおける採取を、連続して実行することが可能である。【０１１２】
まず、情報入力手段について説明する。情報入力手段は、採取対象物の画像を撮影する顕微鏡カメラ1201と、顕微鏡観察ステージ1202と、画像を表示するモニター1203とで構成される。まず、使用者は、採取対象植物1204を、顕微鏡観察ステージ1202に設置する。その際、植物1204はゲルシート1205上に設置して、固定する。使用者は、顕微鏡像の焦点を調整後、観察画像1206において、採取位置をポインターなどの位置指定入力手段により、画像上で指定する（図中ａ及びｂ）と、システムは、ステージ1202上の対象植物1204における採取指定位置を、高さ、及び水平方向の位置を計算し、記録する。特に、高さ情報については、植物体の位置から、ゲルシート下面までの距離を測定・計算することが重要である。また、複数個の切片を採取する場合は、この位置指定を繰り返す。なお、顕微鏡カメラ1201は、植物切片採取時には、採取の障害にならない位置まで、水平方向1207に移動する。【０１１３】
次に、採取手段について説明する。採取手段は、採取ニードル1208と、ニードルを鉛直方向1209及び水平方向1210に移動させる手段で構成される。まず、事前準備として、採取ニードル1208を接続する。採取ニードルは、注射針状のコネクターにて接続する例、及び、シャープペンシル様にホールドする例がある。両者とも、ニードルの内部にプランジャ用細管を挿入した状態で、採取手段に接続・固定される。ニードル1208接続後、ニードル先端位置（高さ）の測定を実施する。これは、植物切片採取時に、下部のゲルシートを含めて貫通し、かつ、針先をゲルシートの下の容器で破損させない様に、採取手段のニードル先端部の位置を制御するためである。ニードル先端部の測定には、ニードル先端部を水平方向からカメラ1211で観測し、画像認識により測定することが簡便である。システムの使用者が、ステージ1202上の植物1204に対して採取位置を設定した後、動作指令を与えると、採取手段は自動的に採取位置の植物切片を採取する。以下、動作工程を具体的に説明する。使用者が採取動作開始信号を入力すると、採取手段は、はじめに、シート状のゲル1212にニードルを貫通させ、ニードル内にゲル層を形成する。次に、ニードル先端位置を採取位置の鉛直上方まで移動させる。ニードル先端は採取位置の植物から、0.5mm程度上方であればよい。しかし、必要条件として、ニードルと植物との事前接触を防ぐことが必要であるため、位置測定誤差を考慮して、それ以上の距離をとる場合もある。次に、ニードル1208を鉛直方向下向きに押し下げ、植物組織1204を貫通させ、その下のゲルシート1205にニードル1208を達する様にする。その後、ニードル1208を上昇させることで、ニードル内に組織切片を採取できる。次に、ニードル先端を、予め準備したチューブ1213内の液滴の鉛直方向上部まで移動させ、ニードル内部の細管を押し出すことにより、採取した切片をニードル外に押し出す。その後、押し出した切片を液滴に接触させることにより、切片は液滴に移動する。液滴は、約0〜4℃に保たれるように、チューブ1213は冷却手段1214にて保冷されている。組織切片を移動後、チューブ1213をすぐに液体窒素にて冷却できるように、別の冷却手段に移動させる。以上の動作により、採取が完了する。なお、ニードルの洗浄は、ニードル自身を採取手段から離脱し、洗浄することが可能であるが、より簡便な方法として、ニードル内の細管より、洗浄液を通すことにより洗浄することも可能である。【０１１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【０１１５】
101  ニードル
102  ニードル上部
103  針先
104  切削の角度
105  ニードル内径
301  細管
302  ゲルシート
303  上部ゲル層
401  植物
402  ゲルシート
501  植物組織層
502  下部ゲル層
601  試料
701  チューブ
702  液滴
801  ペッスル
802  ペッスルキャップを装着する部分
803  ペッスルキャップ
804  ペッスルキャップ
805  切り込み
806  ペッスルキャップを装着したペッスル
901  チューブ
902  チューブ内壁の最下点とペッスル先端との距離
1001  遠心分離機
1101  採取した組織の一辺
1200  採取システム
1201  顕微鏡カメラ
1202  顕微鏡観察ステージ
1203  モニター
1204  植物
1205  ゲルシート
1206  観察画像
1207  水平方向
1208  採取ニードル
1209  鉛直方向
1210  水平方向
1211  カメラ
1212  ゲル
1213  チューブ
1214  冷却手段
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号1〜5：人工配列（プライマー）
【図１】
0005859635.tif 000003
【図２】
0005859635.tif 000004
【図３】
0005859635.tif 000005
【図４】
0005859635.tif 000006
【図５】
0005859635.tif 000007
【図６】
0005859635.tif 000008
【図７】
0005859635.tif 000009
【図８】
0005859635.tif 000010
【図９】
0005859635.tif 000011
【図１０】
0005859635.tif 000012
【図１１】
0005859635.tif 000013
【図１２】
0005859635.tif 000014
【図１３】
0005859635.tif 000015
【図１４】
0005859635.tif 000016
【図１５】
0005859635.tif 000017
【図１６】
0005859635.tif 000018
【配列表】
0005859635000001.app