(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ケラチノサイト成長因子（KGF）、または少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有するKGFのドメイン；および
（ii）少なくともビトロネクチン（VN）のインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメイン
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体。
【請求項２】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインがC末端ヘパリン-結合ドメイン（HBD）を含まない、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項３】
成熟VN配列（配列番号2）のアミノ酸1〜346を含む、請求項2に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項４】
インテグリン結合ドメインがαvインテグリン結合ドメインである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項５】
インテグリン結合ドメインがαvβ3インテグリン結合ドメインまたはαvβ5インテグリン結合ドメインである、請求項4に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項６】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインが成熟VN配列（配列番号2）のアミノ酸1〜311を含む、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項７】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインが成熟VN配列（配列番号2）のアミノ酸1〜125を含む、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項８】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインが成熟VN配列（配列番号2）のアミノ酸1〜64を含む、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項９】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインが成熟VN配列（配列番号2）のアミノ酸1〜52を含む、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１０】
少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメインが成熟VNタンパク質（配列番号2）の残基53〜64に対応するポリアニオンアミノ酸配列を含まない、請求項9に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１１】
追加のVNフラグメントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１２】
少なくとも1つのリンカー配列をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１３】
リンカー配列がプロテアーゼ切断部位を含む、請求項12に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１４】
リンカー配列が
（i）Gly4Ser（配列番号4）;
（ii）Gly4Ser3（配列番号5）；
（iii）(Gly4Ser)3（配列番号6）;
（iv）(Gly4Ser)4（配列番号7）;
（v）Leu Ile Lys Met Lys Pro（配列番号8）；および
（vi）Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys（配列番号9）
からなる群より選択される、請求項12に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１５】
該合成キメラタンパク質が、1-459VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His（配列番号10）、1-311VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His（配列番号11）、1-125VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His（配列番号12）、1-64VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His（配列番号13）、または1-64VN:(Gly4Ser)4:343-376VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His（配列番号14）のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体をコードする単離された核酸。
【請求項１７】
ベクター中の1つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された請求項16に記載の単離された核酸を含む遺伝子コンストラクト。
【請求項１８】
単離された核酸がプロモーターに作動的に連結されている発現コンストラクトである、請求項17に記載の遺伝子コンストラクト。
【請求項１９】
請求項17に記載の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
【請求項２０】
請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体と医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項２１】
請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体が含浸されているか、コーティングされているか、または他の形で含まれている、外科用インプラント、スキャフォールドまたはプロテーゼ。
【請求項２２】
請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を含む、創傷または熱傷ドレッシング。
【請求項２３】
創傷の治療のための創傷ドレッシングの製造における請求項1〜15のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体の使用。
【請求項２４】
創傷ドレッシングがヒトへの投与用に処方されている、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質複合体を用いて、細胞によって発現されたケラチノサイト成長因子受容体とインテグリン受容体との両方に結合し、それによって、該細胞の遊走および/または増殖を誘導、増強、または他の形で促進するステップを含み、ここに、該単離されたタンパク質複合体が１つ以上の細胞または組織にインビトロで投与される、細胞の遊走および/または増殖を促進する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ケラチノサイト成長因子（KGF）受容体とビトロネクチン（VN）に対するインテグリン受容体との両方に結合し、その両方を活性化することを可能にするそれぞれのドメインを有する、タンパク質複合体に関する。特定の実施形態において、本発明は、ケラチノサイト成長因子受容体結合ドメインとビトロネクチンのインテグリン受容体結合ドメインとを含むキメラタンパク質に関する。より具体的には、本発明は、細胞遊走を刺激するタンパク質複合体およびキメラタンパク質、ならびに細胞の遊走および/または増殖を促進または誘導する組成物および方法に関する。これらの組成物および方法は、上皮細胞の遊走および/または増殖が要求される創傷治癒、組織工学、皮膚置換および皮膚補充などの美容的および治療的処置、ならびに熱傷の処置に利用される。別の実施形態では、本発明は、特に乳がんとの関連において、がん細胞転移の防止または抑制に関係する本発明が提供する処置を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
ケラチノサイト成長因子は、過形成、DNA合成、分化、細胞周期進行、およびアポトーシスの抑制を含む幅広い細胞プロセスに関与する分裂促進性ペプチド成長因子である（Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144:326-32）。これらの効果は、そのチロシンキナーゼ連結型細胞表面受容体であるKGF受容体への結合によって媒介される。
【０００３】
ビトロネクチンは、血中および細胞外マトリックス（ECM）中にきわめて豊富に存在する糖タンパク質である。主として肝臓において合成されるが、他の多くの細胞タイプでも発現するVNは、閉じたコンフォメーションで血中を循環し、開いたコンフォメーションまたは伸びたコンフォメーションでECMに沈着する（Schvartzら, 1999, Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:531-44）。どちらのコンフォメーションも、IGF-IIに結合すると共に（Uptonら, 1999, Endocrinology 140:2928-31；国際公開WO 02/24219；McMurtyら, 1996, Endocrinology 150:149-60）、コラーゲン（Morrisら, 1994, J. Bio. Chem. 269:23845-52）、グリコサミノグリカン（Francoisら, 1999, J. Bio. Chem. 274:37611-19）、他の多くのECMタンパク質、ならびに多種多様なインテグリン、特にαvインテグリンを含む、他の複数のリガンドにも結合すると考えられている。事実、ビトロネクチンの主な役割は、RGD結合モチーフを介したこれらの細胞表面インテグリン受容体への接着連結をもたらすECM組織化分子としての役割である。VN受容体（αvインテグリン）は、成長と浸潤に要求されるアクチン細胞骨格再編成を調節することが示されているので、VN結合は細胞の接着と運動とを調和させる（DePasquale, 1998, Histochemistry and Cell Biology 110:485-94；Huang, 2000, Oncogene 19:1915-23）。
【０００４】
しかし、細胞の遊走および/または増殖などといった生物学的応答を刺激することに関して、タンパク質複合体中に存在するKGFおよびVNならびに各々のドメインの相対的寄与は、まだ解明されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
［発明の概要］
本発明者らは、KGFとVNとを含むタンパク質複合体が、ケラチノサイト成長因子受容体およびVN結合性インテグリン受容体に結合し、それらを相乗的に同時活性化することによって、細胞の遊走および/または増殖を刺激することを見出した。
【０００６】
したがって本発明は、ケラチノサイト成長因子の受容体結合ドメインとインテグリン受容体に結合する能力を有するビトロネクチンのドメインとを含む単離されたタンパク質複合体を広く対象とし、ここで、単離されたタンパク質複合体は、ケラチノサイト成長因子受容体とインテグリン受容体とを同時活性化し、それによって生物学的応答を引き出すことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第1の態様において、本発明は、
（i）ケラチノサイト成長因子、または少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有するケラチノサイト成長因子のドメイン；および
（ii）少なくともビトロネクチン（VN）のインテグリン結合ドメインを含むVNの1つ以上のドメイン
のアミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質の形態にある、単離されたタンパク質複合体を提供する。
【０００８】
好ましくは、インテグリン受容体は、αvインテグリンである。
【０００９】
より好ましくは、インテグリン受容体は、αvβ3インテグリンまたはαvβ5インテグリンである。
【００１０】
本発明のこの態様は、上記（i）および（ii）に対応するアミノ酸配列のアミノ酸欠失、付加、置換および/または変異も、その範囲に包む。
【００１１】
第2の態様において、本発明は、第1態様の単離されたタンパク質複合体をコードする単離された核酸を提供する。
【００１２】
第3の態様において、本発明は、発現ベクター中で1つ以上の調節配列に作動的に連結されている第2態様の単離された核酸を含む遺伝子コンストラクトを提供する。
【００１３】
好ましくは、遺伝子コンストラクトは、発現コンストラクトである。
【００１４】
第4の態様において、本発明は、第3態様の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
【００１５】
第5の態様において、本発明は、第1態様の単離されたタンパク質複合体と医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明のこの態様では、該合成タンパク質を発現する細胞である第4態様の宿主細胞を含む医薬組成物も考えられる。
【００１７】
第6の態様において、本発明は、第1態様の合成タンパク質に特異的な抗体を提供する。
【００１８】
第7の態様において、本発明は、合成タンパク質を使ってケラチノサイト成長因子受容体とインテグリン受容体との両方に結合するステップを含む、細胞遊走を促進する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは、インテグリン受容体は、αvインテグリンである。
【００２０】
より好ましくは、インテグリン受容体は、αvβ3インテグリンまたはαvβ5インテグリンである。
【００２１】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、創傷治癒を促進するための上皮/ケラチノサイト/フィブロブラストの細胞の遊走および/または増殖の促進または誘導に関する。
【００２２】
好ましくは、該合成タンパク質は、本発明の第1態様によるものである。
【００２３】
第8の態様において、本発明は、ケラチノサイト成長因子とビトロネクチンとを含む複合体によって、ケラチノサイト成長因子受容体とインテグリン受容体との両方の結合を防止、抑制または他の形で減少させるステップを含む、細胞の遊走および/または増殖を防止する方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、インテグリン受容体は、αvインテグリンである。
【００２５】
より好ましくは、インテグリン受容体は、αvβ3インテグリンまたはαvβ5インテグリンである。
【００２６】
好ましい実施形態において、本発明のこの態様は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、転移性がん細胞の遊走および/または増殖の防止または抑制に関する。
【００２７】
本発明のこの態様によって考えられる特定の一例は、乳がん転移の防止または抑制である。
【００２８】
第7態様および第8態様の方法が予防的および治療的処置方法を包含しうることも理解されるであろう。
【００２９】
第9の態様において、本発明は、
（i）ケラチノサイト成長因子とビトロネクチンとを含むタンパク質複合体のアゴニストである分子、または
（ii）ケラチノサイト成長因子とビトロネクチンとを含むタンパク質複合体のアンタゴニストである分子
を作製するための、第1態様の単離されたタンパク質複合体の使用を提供する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明は、
（i）KGF:VNタンパク質複合体のアゴニストである分子、または
（ii）KGF:VNタンパク質複合体のアンタゴニストである分子
を作製するための、第1態様の合成タンパク質の使用を提供する。
【００３１】
本発明のこの態様に従って作製されたアゴニストおよび/またはアンタゴニストは、創傷治癒の促進、組織工学、皮膚再生および/またはがん細胞転移もしくは瘢痕化および乾癬などといった皮膚の過剰増殖障害の防止に特に効力がありうる。
【００３２】
第10の態様において、本発明は、第1態様の単離されたタンパク質複合体を含む生体材料を提供する。
【００３３】
特定の実施形態において、生体材料は、本発明の単離されたタンパク質複合体が適切に含浸されているか、コーティングされているか、または他の形で含まれている、外科用インプラント、プロテーゼ、スキャフォールド、創傷または熱傷ドレッシングなどである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ビトロネクチン内のさまざまなドメイン、ならびに残基修飾部位、リガンド結合部位およびプロテアーゼ認識部位に関する残基への言及を含む、ビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号1）。
【図２】リガンド結合部位を示した完全長VN（75kDa）と（b）卵黄VN（54kDa）の構造的関係。哺乳動物と鳥類の血清VNはどちらも同じドメイン構造を有するが、アミノ酸配列には相違がある。卵黄VN（54kDa）はこれらのタンパク質の切頭型である。使用されている略号は次のとおりである：Som B、ソマトメジンB；接続、接続ドメイン；ヘモペキシン、ヘモペキシン様リピート；HBD、ヘパリン結合ドメイン；PAI-1、プラスミノゲン活性化因子インヒビター1；uPAR、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体；TAT、トロンビン-アンチトロンビンIII複合体；uPA、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子；- - - -、ポリアニオン領域（塩基性領域）；+ + +、ポリカチオン領域（酸性領域）。
【図３】（A）成熟ビトロネクチンタンパク質（配列番号2）、（B）成熟KGF（配列番号3）、（C）好ましいリンカー配列（配列番号4〜9）、ならびに（D）〜（H）KGFおよびVN含有キメラタンパク質の実施形態（配列番号10〜14）のアミノ酸配列。
【図４】（A）VN:KGFキメラタンパク質は初代ケラチノサイトの細胞遊走を刺激する。播種インサートの内側チャンバ内に播種し、そのインサートを取り除いて、VN:KGFキメラおよび対照がコーティングされている培養ウェルに呼応して起こる外向き遊走を可能にした、単離された皮膚ケラチノサイト細胞の遊走。各バーは、24時間インキュベーション後の細胞被覆の平均面積（±SEM）を表し、処理を三つ一組のウェルで分析した少なくとも3つの重複実験から得られたものである。（B）VN:KGFキメラタンパク質は初代フィブロブラストの細胞遊走を刺激する。播種インサートの内側チャンバ内に播種し、そのインサートを取り除いて、VN:KGFキメラおよび対照がコーティングされている培養ウェルに呼応して起こる外向き遊走を可能にした、単離された皮膚フィブロブラスト細胞の遊走。各バーは、24時間インキュベーション後の細胞被覆の平均面積（±SEM）を表し、処理を三つ一組のウェルで分析した少なくとも3つの重複実験から得られたものである。（C）VN:KGFキメラタンパク質は初代ケラチノサイト細胞の増殖を刺激する。VN:KGFキメラおよび対照がコーティングされている培養ウェルに呼応して起こる単離された皮膚ケラチノサイト細胞の増殖。各バーは、72時間インキュベーション後のDNA結合性GR色素の平均吸光度（±SEM）（細胞数を表す）を表し、処理を三つ一組のウェルで分析した少なくとも3つの重複実験から得られたものである。（D）VN:KGFキメラタンパク質は初代フィブロブラスト細胞の増殖を刺激する。VN:KGFキメラおよび対照がコーティングされている培養ウェルに呼応して起こる単離された皮膚フィブロブラスト細胞の増殖。各バーは、24時間インキュベーション後のDNA結合性GR色素の平均吸光度（±SEM）（細胞数を表す）を表し、処理を三つ一組のウェルで分析した少なくとも3つの重複実験から得られたものである。
【図５】VN:KGFキメラタンパク質および対照に対する初代ケラチノサイトおよびフィブロブラストのシグナリング応答。VN:KGFキメラタンパク質は、ERK1/2およびAKTシグナリング経路の相対的活性化を、それぞれの対照と同等レベルに増進する：（A）ケラチノサイトERK1/2；（B）ケラチノサイトAKT；（C）フィブロブラストERK1/2；（D）フィブロブラストAKT。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［発明の詳細な説明］
本発明は、KGFとVNとを含むタンパク質複合体が、応答細胞によって発現されるKGF受容体およびVN結合性インテグリン受容体に結合し、それらを介して、細胞遊走に対するその生物学的効果を発揮するという発見から生じたものである。より具体的には、この二重結合イベントは、細胞の遊走および/または増殖を相乗作用的に刺激する。
【００３６】
いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、KGFと相互作用するまたはKGFに結合するVNのドメインは、成熟VN（配列番号2）のアミノ酸53〜64に対応するVNのポリアニオン領域であると思われる。
【００３７】
この発見により、本発明者らは、少なくともKGF受容体に結合する能力を有するKGFの最小ドメインまたは最小領域を、VNのインテグリン結合ドメインと併せて含む、単離されたタンパク質複合体を提供することになった。より一層具体的には、これらのドメインを含む単一の連続したタンパク質を作製することができる。
【００３８】
単一の合成タンパク質の形態にあるそのようなタンパク質複合体は、KGF受容体とVN結合性インテグリン受容体とに協調的に結合または同時ライゲーション（co-ligate）し、それゆえに、細胞の遊走および/または増殖ならびに創傷治癒を促進するための有用な薬剤である。同様に、KGF受容体およびVN結合性インテグリン受容体の同時ライゲーションの防止は、がん細胞転移を防止するために使用することができる。
【００３９】
本明細書の全体を通して、別段の表示がある場合を除き、「含む」（comprise、comprisesおよびcomprising）は、排他的にではなく非限定的に使用されるので、明示した整数（integer）または整数の群は、明示していない他の1つ以上の整数または整数の群を包含しうる。
【００４０】
特にケラチノサイト成長因子受容体結合ドメインおよびインテグリン結合ドメインとの関連において、そのようなドメインは、そのドメインのアミノ酸配列を、所望に応じて他の追加アミノ酸と共に含みうる。
【００４１】
また、そのようなドメインは、追加のアミノ酸が10個以下、好ましくは5個以下、さらに好ましくは4、3、2または1個以下であって、そのドメインのアミノ酸配列「から本質的になる」（consist essentially of）ものでありうることも、理解されるであろう。
【００４２】
また、そのようなドメインは、追加アミノ酸が何も存在せず、そのドメインのアミノ酸配列「からなる」（consisting of）ものでありうることも、理解されるであろう。
【００４３】
本発明に関して、「単離された」とは、その自然状態から取り出された物、または他の何らかの形で人為操作に付された物を意味する。単離物は、その自然状態ではそれに通常付随している構成要素を実質的にまたは本質的に含まないか、またはその自然状態においてそれに通常付随している構成要素と共に人工的状態に置かれるように操作されているであろう。単離物は天然型、化学合成型または組換え型であることができる。
【００４４】
本明細書にいう「合成」とは、自然には存在しないが、人為的技術介入によって作られたことを意味する。合成タンパク質および合成核酸との関連において、これは、当技術分野ではよく理解されているとおり、組換え、化学合成またはコンビナトリアル技法によって作製された分子を包含する。
【００４５】
「タンパク質」とはアミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、当技術分野ではよく理解されているとおり、天然または非天然アミノ酸、D-またはL-アミノ酸であることができる。「タンパク質」という用語は、当技術分野において一般に使用されているとおり、「糖タンパク質」、「リポタンパク質」などの用語も含み、包含する。
【００４６】
「ペプチド」は、アミノ酸数が50未満のタンパク質である。
【００４７】
「ポリペプチド」は、アミノ酸数が50以上のタンパク質である。
【００４８】
前述のように、本発明は、ある特定態様において、
（i）ケラチノサイト成長因子、または少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有するケラチノサイト成長因子のドメイン；および
（ii）ビトロネクチン、または少なくともビトロネクチンのインテグリン結合ドメイン
のアミノ酸配列を含む、合成キメラタンパク質の形態にある単離されたタンパク質複合体を提供する。
【００４９】
本明細書にいう「キメラタンパク質」は、ビトロネクチンのインテグリン受容体結合ドメインと、ケラチノサイト成長因子、または少なくともケラチノサイト成長因子の受容体結合ドメインとに由来するアミノ酸の連続的配列を含む。
【００５０】
本明細書にいう「ケラチノサイト成長因子」は、インビトロおよび/またはインビボで細胞の成長、分化、生存および/または遊走を調節する能力を有する生物学的に活性なタンパク質である（Marcheseら, 1990, J. Cell Physiol. 144:326-32；UniProtKB/Swiss-Prot：#P21781、成熟タンパク質は完全配列のアミノ酸残基32〜194を含む）。
【００５１】
本発明の合成キメラタンパク質の形態にある単離されたタンパク質複合体は、ケラチノサイト成長因子、または少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有するケラチノサイト成長因子のドメインを含む。
【００５２】
これに関連して「ドメイン」とは、ケラチノサイト成長因子のうち、少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有する部分または領域を意味する。限定するわけではないが、典型的には、ケラチノサイト成長因子受容体は細胞によって発現され、前記少なくともケラチノサイト成長因子のドメインによるケラチノサイト成長因子受容体の結合またはライゲーションは、細胞の成長、分化、生存および/または遊走などの細胞応答を引き出す。
【００５３】
本発明の合成キメラタンパク質の形態にある単離されたタンパク質複合体のもう一つの構成要素が、少なくともビトロネクチンのインテグリン結合ドメインであることも理解されるであろう。
【００５４】
好ましくは、インテグリン受容体は、αvインテグリンである。
【００５５】
より好ましくは、インテグリン受容体は、αvβ3インテグリンまたはαvβ5インテグリンである。
【００５６】
いかなる特定理論にも束縛されることは望まないが、合成キメラタンパク質は、ケラチノサイト成長因子の受容体とVNのインテグリン受容体とを同時ライゲーションかつ同時活性化し、それによって、細胞の増殖、分化、生存および/または細胞遊走を刺激、誘導、増強、または他の形で促進することができるのだと考えられる。
【００５７】
本発明のキメラタンパク質の利点は、それらが化学合成または組換え手段によって容易に作製される点と、それらが、非共有結合的オリゴタンパク質複合体において要求されるタンパク質-タンパク質相互作用の維持には依拠していないので、インビボで、より安定だと予想される点である。
【００５８】
本発明では、VNのC末端ヘパリン結合ドメイン（HBD）および/またはポリアニオン領域を含まない合成キメラタンパク質の実施形態が考えられる。「C末端HBD」とは、成熟VN配列（配列番号2）の残基347〜459を意味する。Xuら（2001, Proteins 44:312-20）は、VNがその中央領域に第2のHBDを含有していると主張している。HBDであると主張されているこの領域を、本発明では考慮しない。
【００５９】
C末端HBDおよび/またはポリアニオン領域を含まないVNタンパク質およびそのアミノ酸配列に関して、これらは、54kDニワトリ卵黄VN（C末端HBDを欠く）などの自然に存在するタンパク質であってもよいし、C末端HBDおよび/またはポリアニオン領域が欠けるか、少なくとも実質上非機能的になるように、VNタンパク質またはアミノ酸配列の欠失、変異または切頭によって、工学的に作製されたものであってもよい。
【００６０】
当技術分野ではよく理解されているとおり、この目的には、タンパク質消化や部位特異的変異導入などの技法を利用することができる。
【００６１】
特定の実施形態では、該少なくともVNのインテグリン結合ドメインが、
（i）VNのアミノ酸残基1〜459；
（ii）VNのアミノ酸残基1〜379；
（iii）VNのアミノ酸残基1〜346；
（iv）VNのアミノ酸残基1〜311；
（v）VNのアミノ酸残基1〜130；
（vi）VNのアミノ酸残基1〜125；
（vii）VNのアミノ酸残基1〜64；および
（viii）VNのアミノ酸残基1〜52（いずれも成熟VN配列（配列番号2）への言及である）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００６２】
含まれていてもよい追加アミノ酸配列は、
（ix）VNのアミノ酸残基65〜459；
（x）VNのアミノ酸残基343〜376；
（xi）VNのアミノ酸残基347〜459；および
（xii）VNのアミノ酸残基347〜379（いずれも成熟VN配列（配列番号2）への言及である）
からなる群より選択される。
【００６３】
上述の配列は、例えばVNのアミノ酸残基1〜130とVNのアミノ酸残基347〜459、またはVNのアミノ酸残基1〜52とVNのアミノ酸残基65〜459などというように、組み合わせて使用することができる。
【００６４】
特に、KGFとVNとを含むキメラタンパク質の非限定的な例を図3に示す。これには、（i）1-459VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His；（ii）1-311VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His；（iii）1-125VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His；（iv）1-64VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6His；および（v）1-64VN:(Gly4Ser)4:343-376VN:(Gly4Ser)4:1-163KGF:Gly4SerGly4:6Hisが含まれる。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、KGFとVNまたは少なくともVNのインテグリン結合ドメインを含むVNのフラグメントとを含む単離されたタンパク質複合体、例えば合成キメラタンパク質の形態にあるものを提供する。
【００６６】
これに関連して「フラグメント」とは、VNのドメイン、部分配列または一部を意味する。フラグメントは、好ましくは、成熟VN配列の500個未満、400個未満、300個未満、より好ましくは約80〜280個の連続するアミノ酸を構成する。
【００６７】
VNのインテグリン結合ドメインはRGD配列（成熟VN配列のアミノ酸45〜47）を適切に含む。したがって、ある特定の実施形態では、合成キメラが、RGD配列を含むVNフラグメントを含む。
【００６８】
好ましくは、前述の合成キメラタンパク質はさらに、ケラチノサイト成長因子配列とVNアミノ酸配列の間に位置してそれらと連続している「リンカー配列」を含む。
【００６９】
ある実施形態では、該リンカー配列が、1つ以上のグリシン残基と1つ以上のセリン残基とを含む。
【００７０】
リンカー配列の特定の例は、Gly4Ser（配列番号4）；Gly4Ser3（配列番号5）；(Gly4Ser)3（配列番号6）；および(Gly4Ser)4（配列番号7）から選択することができるが、これらに限定されるわけではない。
【００７１】
もう一つの実施形態では、リンカー配列が、プラスミン切断認識部位（Sakiyama-Elbertら, 2001, FASEB 15:1300-02）、例えば配列：
Leu Ile Lys Met Lys Pro（配列番号8）
に従うものを含む。
【００７２】
さらにもう一つの実施形態では、リンカー配列が、コラゲナーゼ3切断認識部位（KimおよびHealy, 2003, Biomacromolecules 4:1214-23）、例えば配列：
Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys（配列番号9）
に従うものを含む。
【００７３】
本発明は、本発明の合成キメラタンパク質の生物学的に活性なフラグメントの使用および/または本明細書に例示するケラチノサイト成長因子受容体結合ドメインとインテグリン結合ドメインの生物学的に活性なフラグメントの使用にも及ぶ。
【００７４】
ある実施形態において、該「生物学的に活性なフラグメント」は、それが由来するタンパク質の生物学的活性の10％以上、好ましくは25％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは75％、80％、85％、90％、または95％以上を有する。
【００７５】
もう一つの実施形態において、該「生物学的に活性なフラグメント」は、それが由来するタンパク質の連続するアミノ酸配列の10％以上、好ましくは25％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは75％、80％、85％、90％、または95％以上を有する。
【００７６】
本発明の変異体タンパク質複合体も考えられる。
【００７７】
タンパク質に関していうと、典型的には、「変異体」タンパク質では、1つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されている。タンパク質の活性の性質を変化させずに、いくつかのアミノ酸を、大まかに類似する性質を有する他のアミノ酸に変えることができるということ（保存的置換）は、当技術分野ではよく理解されている。
【００７８】
ケラチノサイト成長因子、ケラチノサイト成長因子の受容体結合ドメイン、VNのインテグリン結合ドメインなどといった基準配列の1つ以上のアミノ酸残基、または合成キメラタンパク質中に存在する1つ以上の対応する残基を、本発明の単離されたタンパク質複合体の生物学的活性を実質的に変化させることなく、修飾または欠失するか、追加配列を付加しうることも、理解されるであろう。
【００７９】
本発明が考える成熟VN（配列番号2）中の具体的変異には、（i）T50A；（ii）T57A；（iii）T50E；（iv）T57E；（v）S378E；（vi）S378A；および（v）S362Eが含まれる。
【００８０】
ある実施形態では、タンパク質変異体が、基準アミノ酸配列との間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、95％、98％、または99％の配列同一性を有している。
【００８１】
好ましくは、配列同一性は、基準配列の少なくとも60％にわたって、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、98％にわたって、または実質的に全長にわたって測定される。
【００８２】
配列同一性パーセントを決定するために、アミノ酸配列および/またはヌクレオチド配列の最適アラインメントを、アルゴリズムのコンピュータへの実装（IntelligeneticsによるGeneworksプログラム；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0（Genetics Computer Group、米国ウィスコンシン州）中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または目視によって行うことができ、最適アラインメント（すなわち比較ウィンドウにおいて最も高い相同性パーセンテージをもたらすもの）は、選択されたさまざまな方法のいずれかによって生成させることができる。例えばAltschulら（1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-402）によって開示されたようなBLASTファミリーのプログラムも挙げることができる。
【００８３】
もう一つの例では、「配列同一性」が、DNASISコンピュータプログラム（ウィンドウズ用バージョン2.5；Hitachi Software engineering Co., Ltd.（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ））によって算出される「マッチ率」を意味すると理解してもよい。
【００８４】
配列分析の詳細な議論はAusubelら編「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」（John Wiley & Sons Inc. NY、1995-1999）のUnit 19.3に見いだすことができる。
【００８５】
本発明では、ケラチノサイト成長因子の受容体結合ドメイン、VNのインテグリン結合ドメイン、またはそれを含む単離されたタンパク質複合体の誘導体も考えられる。
【００８６】
本明細書にいう本発明の「誘導体」タンパク質は、当技術分野ではよく理解されているとおり、例えば他の化学的部分の付加、他の化学的部分とのコンジュゲーションもしくは複合体化によって、または翻訳後修飾技法によって、改変されている。
【００８７】
アミノ酸の「付加」は、ポリペプチドまたはその変異体と他のポリペプチドまたはタンパク質との融合を含みうる。前記他のタンパク質は、例えば、タンパク質の精製を助けるものであることができる。例えばそれらには、ポリヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク質、緑色蛍光タンパク質（GFP）、プロテインAまたはグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）が含まれる。
【００８８】
本発明によって考えられる他の誘導体には、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の組込み、ならびに架橋剤および本発明のポリペプチド、フラグメントおよび変異体にコンフォメーションの拘束を課す他の方法の使用が含まれるが、これらに限定するわけではない。本発明によって考えられる側鎖修飾の例には、無水酢酸によるアシル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；メチルアセトイミデートによるアミジン化；シアネートによるアミノ基のカルバモイル化；ピリドキサール-5-リン酸とそれに続くNaBH4還元によるリジンのピリドキシル化；アルデヒドとの反応とそれに続くNaBH4による還元的アルキル化；および2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化などといった、アミノ基の修飾が含まれる。
【００８９】
カルボキシル基は、O-アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、それに続く、その後の誘導体化、例えば対応するアミドへの誘導体化などによって、修飾することができる。
【００９０】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬との複素環式縮合生成物の形成によって修飾することができる。
【００９１】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化；4-クロロメルクリフェニルスルホン酸、4-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、および他の水銀含有化合物を使った水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；およびアルカリpHにおけるシアネートによるカルバモイル化などといった方法によって修飾することができる。
【００９２】
トリプトファン残基は、例えば、2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドまたはスルホニルハライドによるインドール環のアルキル化によって、あるいはN-ブロモスクシンイミドによる酸化によって、修飾することができる。
【００９３】
チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化で3-ニトロチロシン誘導体を形成させることによって修飾することができる。
【００９４】
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートによるN-カルベトキシ化によって、またはヨード酢酸誘導体によるアルキル化によって、修飾することができる。
【００９５】
ペプチド合成中の非天然アミノ酸および誘導体の組込みの例には、4-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、t-ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2-チエニルアラニン、および／またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００９６】
タンパク質の化学的誘導体化に適した方法の一例は、Coliganら編「CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE」（John Wiley & Sons NY（1995-2001））のChapter 15に掲載されている。
【００９７】
単離されたタンパク質複合体およびその個々のタンパク質構成要素（フラグメント、変異体、誘導体、およびホモログを含む）は、当業者に知られる任意の適切な手法によって調製することができる。
【００９８】
ある実施形態では、本発明のタンパク質が化学合成によって作製される。化学合成技法は当技術分野では周知であるが、当業者は、適切な方法の例に関して、Coliganら編「CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE」（John Wiley & Sons NY（1995-2001））のChapter 18を参照することができる。
【００９９】
もう一つの実施形態では、タンパク質を組換えタンパク質として調製することができる。
【０１００】
組換えタンパク質の生産は当技術分野ではよく知られているが、当業者は、例えばSambrookら「MOLECULAR CLONING A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Press、1989）、特にSection 16および17；Ausubelら編「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）、特にChapter 10および16；ならびにColiganら編「CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE」（John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999）、特にChapter 1、5および6に記載されているような標準的プロトコールを参照することができる。
【０１０１】
ある実施形態では、組換えタンパク質が、
（i）発現ベクター中の1つ以上の調節ヌクレオチド配列に作動的に連結された、該タンパク質をコードする核酸を含む、発現コンストラクトを調製するステップ；
（ii）発現コンストラクトで宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するステップ；および
（iii）該宿主細胞中で組換えタンパク質を発現させるステップ
を含む方法によって作製される。
【０１０２】
「発現ベクター」は、プラスミドなどの自己複製性染色体外ベクターであってもよいし、宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。
【０１０３】
「作動的に連結」または「作動的に接続」とは、該調節ヌクレオチド配列が、本発明の組換え核酸に対して、その核酸の転写またはその核酸によってコードされるタンパク質の翻訳を開始し、調節し、または他の形で制御するような位置にあることを意味する。
【０１０４】
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用する宿主細胞にとって適当なものであるだろう。さまざまな宿主細胞に関して、さまざまなタイプの適当な発現ベクターと適切な調節配列が、当技術分野では知られている。
【０１０５】
典型的には、該1つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、スプライスドナー/アクセプター配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれうるが、これらに限るわけではない。
【０１０６】
構成的プロモーター（例えばCMV、RSV、アデノウイルス、SV40、およびヒト伸長因子プロモーター）および誘導性/抑制性プロモーター（例えばtet抑制性プロモーターおよびIPTG誘導性、メタロチオニン誘導性またはエクジソン誘導性プロモーター）は当技術分野ではよく知られており、本発明でも考えられる。プロモーターが、2つ以上のプロモーターの要素を併せ持つハイブリッドプロモーターでありうることも理解されるであろう。
【０１０７】
本発明の組換えタンパク質が融合パートナーとの融合ポリペプチドとして発現するように、発現コンストラクトが該融合パートナー（典型的には発現ベクターによって提供されるもの）を含んでいてもよい。融合パートナーの主な利点は、それらが該融合タンパク質の同定および/または精製を助けることである。
【０１０８】
融合パートナーの周知の例には、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離にとりわけ有用なグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、ヒトIgGのFc部分、マルトース結合タンパク質（MBP）、およびヘキサヒスチジン（HIS6）などが含まれるが、これらに限るわけではない。アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製という目的にとって、関連するアフィニティークロマトグラフィー用マトリックスは、それぞれグルタチオン-、アミロース-、およびニッケル-またはコバルト-コンジュゲート樹脂である。そのような多くのマトリックスは、(HIS6)融合パートナーに役立つQIAexpress（商標）システム（Qiagen）や、Pharmacia GST精製システムなどといった「キット」の形態で入手することができる。
【０１０９】
場合により、融合パートナーは、関連プロテアーゼで本発明の融合タンパク質を部分消化することによって本発明の組換えポリペプチドをそこから遊離させることを可能にするプロテアーゼ切断部位、例えば第Xa因子またはトロンビンによる切断部位も有する。次に、遊離したタンパク質を、その後のクロマトグラフィー分離によって融合パートナーから単離することができる。
【０１１０】
本発明にいう融合パートナーは、対応する特異的抗体を入手することができる短いペプチド配列である「エピトープタグ」も、その範囲に包む。対応する特異的モノクローナル抗体を容易に入手することができるエピトープタグの周知の例には、c-myc、ヘマグルチニンおよびFLAGタグが含まれる。
【０１１１】
適切な発現用宿主細胞としては、原核細胞または真核細胞、例えば大腸菌（DH5αなど）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系と共に利用されるSf9細胞、CHO細胞、COS、CV-1、NIH 3T3および293細胞を挙げることができるが、これらに限定するわけではない。
【０１１２】
発現コンストラクトは、形質転換された宿主細胞に選択剤に対する耐性を付与する1つ以上の選択マーカーヌクレオチド配列も含みうる。形質転換された細菌の選択という目的に役立つ選択マーカーにはbla、kanRおよびtetRなどがあり、一方、形質転換された真核細胞は、ハイグロマイシン、G418およびピューロマイシンなどのマーカーによって選択することができるが、これらに限るわけではない。
【０１１３】
宿主細胞への遺伝物質の導入に関して、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞への遺伝子物質の導入を記述するために広く使用される。宿主細胞に外来遺伝物質を導入するための周知の方法は数多く、例えばリン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、リポフェクトアミン、リポフェクチンおよび他の親油性剤による送達、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクション、マイクロパーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、およびプロトプラスト融合などがあるが、これらに限るわけではない。
【０１１４】
本発明は、本発明の合成キメラタンパク質（その変異体およびホモログを含む）をコードする単離された核酸を提供する。
【０１１５】
本明細書において使用する「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖mRNA、RNA、cRNA、RNAi、およびDNAを示し、これにはcDNAおよびゲノムDNAならびにDNA-RNAハイブリッドも含まれる。
【０１１６】
「ポリヌクレオチド」は、80個以上の連続ヌクレオチドを有する核酸であり、一方、「オリゴヌクレオチド」は80個未満の連続ヌクレオチドを有する。
【０１１７】
「プローブ」は、例えばノーザンブロット法またはサザンブロット法で相補的配列を検出するという目的のために適切に標識された、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであることができる。
【０１１８】
「プライマー」は、通常は、相補的核酸「テンプレート」にアニーリングし、Taqポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼまたはSequenase（商標）などのDNAポリメラーゼの作用によってテンプレート依存的に伸長されうる一本鎖オリゴヌクレオチド（好ましくは15〜50個の連続するヌクレオチドを有するもの）である。
【０１１９】
本発明の合成核酸は、当業者にはよく知られているとおり、化学合成的アプローチによって、もしくは核酸配列増幅技法を利用する組換え法によって、またはそれらの組合せによって、作製することができる。
【０１２０】
本発明において役立つ化学合成プライマーおよびオリゴヌクレオチド、合成装置ならびに関連技術は、通例、大半の研究室において利用可能であるか、業者から購入することができる。
【０１２１】
適切な核酸増幅技法は当業者にはよく知られており、例えばAusubelら編「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」（John Wiley & Sons Inc NY、1995-1999)のChapter 15に記載されているポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびリガーゼ連鎖反応（LCR）；例えば米国特許第5,422,252号に記載されている鎖置換増幅法（strand displacement amplification；SDA）；例えばLiuら（1996, J. Am. Chem. Soc. 118:1587-94）、国際出願WO 92/01813および国際出願WO 97/19193に記載されているローリングサークル複製法（rolling circle replication；RCR）；例えばSooknananら（1994, Biotechniques 17:1077-80）に記載されている核酸配列に基づく増幅（nucleic acid sequence-based amplification；NASBA）；および例えばTyagiら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5395-400）に記載されているQ-βレプリカーゼ増幅法などが含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１２２】
好ましい核酸配列増幅技法はPCRである。
【０１２３】
本明細書にいう「増幅産物」とは、核酸増幅技法によって生成する核酸産物を指す。
【０１２４】
本発明の核酸を作製し発現させる際には、コドン配列の縮重を利用して、本明細書に例示する核酸に、それがコードするアミノ酸配列を変化させることなく、容易に変更を加えうることも、理解されるであろう。
【０１２５】
特定の実施形態では、当技術分野ではよく知られているとおり、組換え発現に使用する宿主細胞の好ましい「コドン使用頻度」に従って、核酸を最適化することができる。これにより、優先的コドン使用頻度がタンパク質発現に影響を及ぼす特定生物またはその細胞における最適な発現のために、核酸を効果的に「仕立てる」（tailor）ことができる。
【０１２６】
それゆえに本発明は、本明細書に例示する核酸に相同な合成核酸を包含する。
【０１２７】
ある実施形態では、核酸ホモログが、本明細書に記載する合成キメラタンパク質コンストラクトのいずれかをコードする核酸との間に、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する。
【０１２８】
好ましくは、配列同一性は、本発明のコード核酸の少なくとも70％にわたって、より好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、95％にわたって、さらに好適には実質上全長にわたって測定される。
【０１２９】
もう一つの実施形態では、核酸ホモログが、本明細書に記載する合成キメラタンパク質コンストラクトのいずれかをコードする核酸に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【０１３０】
「ハイブリダイズ」および「ハイブリダイゼーション」は、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対合によるDNA-DNA、RNA-RNAまたはDNA-RNA二重鎖の生成を表すために使用される。当技術分野ではよく知られているとおり、ハイブリダイズした配列は、相補的なプリン塩基とピリミジン塩基の間の塩基対合によって生じる。
【０１３１】
これに関連して、修飾プリン塩基（例えばイノシン、メチルイノシンおよびメチルアデノシン）および修飾ピリミジン塩基（チオウリジンおよびメチルシトシン）も塩基対合に関与しうることは、理解されるであろう。
【０１３２】
本明細書にいう「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション中の温度およびイオン強度条件、ならびに一定の有機溶媒および／または洗浄剤の有無を指す。ストリンジェンシーが高いほど、高レベルの相補性が、ハイブリダイズするヌクレオチド配列間に要求される。
【０１３３】
「ストリンジェントな条件」とは、相補的塩基の頻度が高い核酸だけがハイブリダイズするような条件を示す。
【０１３４】
ここでの高ストリンジェンシー条件への言及には、
（i）42℃におけるハイブリダイゼーションについては、少なくとも約31％v/vから少なくとも約50％v/vまでのホルムアミドおよび少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mまでの塩、および42℃における洗浄については、少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩；
（ii）65℃におけるハイブリダイゼーションについては、1％ BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4（pH7.2）、7％SDS、および65℃を超える温度における約1時間の洗浄については、（a）0.1×SSC、0.1％SDS；または（b）0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4（pH7.2）、1％SDS；および
（iii）68℃またはそれ以上における約20分間の洗浄については、0.2×SSC、0.1％SDS
が含まれ、包含される。
【０１３５】
一般に、洗浄は、Tm＝69.3±0.41(G＋C)％−12℃で行われる。一般に、二重鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基の数が1％増えるごとに約1℃ずつ低下する。
【０１３６】
上記とは別に、ストリンジェントな条件は、例えばAusubelら編「CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」（John Wiley & Sons Inc NY、1995-1999）のChapter 2.9および2.10、特に2.9.1〜2.9.20ページにも記載されているとおり、当技術分野ではよく知られている。
【０１３７】
本発明では、本発明の合成キメラタンパク質（キメラタンパク質、またはそのフラグメント、変異体および/もしくは誘導体を含む）に対する抗体も考えられる。本発明の抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体の作製、精製および使用に応用することができる周知のプロトコールは、例えばColiganら「CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY」（John Wiley & Sons NY、1991-1994）のChapter 2ならびにHarlow, E.およびLane, D.「Antibodies: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor、Cold Spring Harbor Laboratory、1988）に見いだすことができる。
【０１３８】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体に結合またはコンジュゲートする。例えば本抗体はポリクローナル抗体を含みうる。そのような抗体は、例えば、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を生産種（これにはマウスまたはウサギを含めることができる）に注射して、ポリクローナル抗血清を得ることによって調製することができる。ポリクローナル抗体を作製する方法は当業者にはよく知られている。使用することができる例示的プロトコールは、例えばColiganら「CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY」（John Wiley & Sons NY、1991-1994）ならびにHarlow, E.およびLane, D.「Antibodeis: A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor、Cold Spring Harbor Laboratory、1988）に記載されている。
【０１３９】
生産種において得られるポリクローナル抗血清の代わりに、例えばKoehlerおよびMilstein（1975, Nature 256:495-97）に記載されているような標準的方法を使って、または例えばColiganら「CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY」（John Wiley & Sons NY、1991-1994）に記載されているような、より最近の、その変法によって、本発明のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体の1つ以上を接種された生産種に由来する脾臓または他の抗体生産細胞を不死化することにより、モノクローナル抗体を作製することもできる。
【０１４０】
本発明は、上に述べたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のFcまたはFabフラグメントを含む抗体も、その範囲に含む。あるいは、抗体は、本発明のタンパク質に対する単鎖Fv抗体（scFv）も含みうる。そのようなscFvは、例えば米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号またはWinterおよびMilsteinによる論文（1991, Nature 349:293-99）にそれぞれ記載されている方法に従って、調製することができる。
【０１４１】
ラベルを抗体または抗体フラグメントに結合させてもよい。
【０１４２】
ラベルは、色素原、触媒、酵素、発蛍光団、化学発光分子、ユーロピウム（Eu34）などのランタノイドイオン、放射性同位体、および直接視認ラベルを含む群から選択することができる。直接視認ラベルの場合は、コロイド金属粒子または非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、シグナル生成物質を含有するリポソームまたは他のベシクルなどを利用することができる。
【０１４３】
米国特許第4,366,241号、米国特許第4,843,000号および米国特許第4,849,338号には、ラベルとして有用な酵素が数多く開示されている。本発明において役立つ酵素ラベルには、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、b-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどがある。酵素ラベルは、単独で使用するか、溶液中の第2の酵素と組み合わせて使用することができる。
【０１４４】
例えば、発蛍光団としてフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、オレゴングリーン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITL）、アロフィコシアニン（APC）およびR-フィコエリトリン（RPE）を挙げることができるが、これらに限るわけではない。
【０１４５】
本発明は、本発明の単離されたタンパク質複合体（その変異体および誘導体を含む）を含む医薬組成物も提供する。
【０１４６】
そのような単離されたタンパク質複合体は、本発明の合成キメラタンパク質を含む（ただしこれに限るわけではない）任意の形態にあることができる。
【０１４７】
本発明の医薬組成物は、細胞遊走、組織再生および創傷治癒を促進し、または他の形で助長するために使用することができる。あるいは、続発部位への腫瘍細胞の遊走を防止または抑制することによって腫瘍転移を防止するために、本医薬組成物を投与することもできる。
【０１４８】
本組成物は、必要に応じて治療的処置または予防的処置に使用することができる。例えば、本医薬組成物は、皮膚修復、創傷治癒、熱傷の治癒および他の皮膚科学的処置のための治療製剤または美容製剤の形態で応用することができる。
【０１４９】
これに関連して、医薬組成物は、その医薬組成物が適切に含浸されているか、コーティングされているか、または他の形で含まれている、生体材料、生体高分子、ヒドロキシアパタイトまたはその誘導体などの無機物、外科用インプラント、プロテーゼ、創傷または熱傷ドレッシング、圧定布、包帯などと一緒に、またはそれらの一構成要素として投与することができる。
【０１５０】
好適には、医薬組成物は、適当な医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【０１５１】
好ましくは、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤は、哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与に適している。
【０１５２】
「医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤」とは、全身投与に安全に使用しうる固形または液状の増量剤、希釈剤または封入物質を意味する。その特定投与経路に応じて、当技術分野においてよく知られるさまざまな担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水および塩類、例えば塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含む鉱酸塩、有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸およびマロン酸、ならびにパイロジェンフリー水を含む群から選択することができる。
【０１５３】
医薬上許容される担体、希釈剤および賦形剤を記載している有用な参考文献は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publishing Co. N.J. USA、1991）である。
【０１５４】
患者に本発明の組成物を与えるには、安全な投与経路を、どれでも使用することができる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、口腔粘膜、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを使用することができる。
【０１５５】
剤形には、錠剤、分散系、懸濁剤、注射剤、溶液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル、経皮パッチなどが含まれる。これらの剤形には、注射用または埋め込み用放出制御デバイスであってこの目的のために特別に設計されたもの、またはそのようにも作用するように改変された他の形態のインプラントも含めることができる。治療剤の放出制御は、それを、例えばアクリル樹脂、ロウ、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの一定のセルロース誘導体などといった疎水性ポリマーでコーティングすることによって、達成することができる。さらに、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはマイクロスフェアを使って放出制御を達成することもできる。
【０１５６】
上記の組成物は、その製剤に適合する方法で、また医薬的に有効であるような量で、投与することができる。本発明との関連で患者に投与される用量は、患者における有益な応答を適当な期間にわたってもたらすのに十分な量とすべきである。投与されるべき薬剤の量は、処置されるべき対象、例えばその年齢、性別、体重および全身の健康状態、医師の判断に依存するであろう因子に依存しうる。
【０１５７】
創傷治癒のための医薬組成物については、特に、米国特許第5,936,064号および国際公開WO 99/62536が挙げられる。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、発現ベクター、例えばワクシニアなどのウイルスベクター、および遺伝子治療に有用なウイルスベクターも含みうる。後者には、Braun-Falcoら（1999, Gene Ther. 6:432-41）に記載されているようなアデノウイルスおよびアデノウイルス随伴ウイルス（AAV）、Buchshacherら（2000, Blood 95:2499-504）に記載されているようなレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクター、ならびに単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来するベクターが含まれる。内分泌遺伝子治療に役立つウイルスベクターは、Stoneら（2000, J. Endocrinol. 164:103-18）に総括されている。
【０１５９】
本発明では、例えば米国特許第5,958,764号に記載されているような、遺伝子発現を上皮細胞にターゲティングする特殊な発現ベクター、または米国特許第5,962,427号に記載されているような、インビボ創傷治癒のための特殊な発現ベクターを利用することもできる。
【０１６０】
本発明は、本発明の合成キメラタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体を使用する処置の方法を提供する。これらの方法は特に、哺乳動物の、特にヒトの、治療的処置および/または予防的処置を目的とする。
【０１６１】
しかし、本発明の治療的使用は、家畜およびコンパニオン動物などの哺乳動物、ウマ、ラクダおよびグレイハウンドなどの使役動物、畜産動物、実験動物、ならびに異種移植用の細胞、器官および組織の供給源として使用される動物にも応用することができる。
【０１６２】
本発明では、皮膚の質または皮膚の外観を改善しまたは高めるために、本発明の合成キメラタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体が投与される、美容的処置の方法も考えられる。
【０１６３】
そのような処置には、異常な皮膚細胞増殖によって生じる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の防止または矯正が含まれうる。
【０１６４】
あるいは、続発部位への腫瘍細胞の遊走を阻止することによって腫瘍転移が防止または抑制される処置の方法も考えられる。また、細胞増殖を阻止することによってがんを処置する方法も考えられる。
【０１６５】
特定の実施形態において、治療的および/または予防的処置では、本発明の合成キメラタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体を、その単離されたタンパク質複合体が適切に含浸されているか、コーティングされているか、または他の形で含まれている、生体材料、生体高分子、フルオロヒドロキシアパタイトなどの無機物、外科用インプラント、プロテーゼ、創傷または熱傷ドレッシング、圧定布、包帯などと一緒に、またはそれらの一構成要素として利用することができる。
【０１６６】
そのような方法には、上に定義した医薬組成物の投与が含まれ、例えば、米国特許第6,090,790号に記載されているような特異的組織部位へのマイクロニードル注射、米国特許第6,054,122号に記載されているような創傷、熱傷または潰瘍に適用される外用クリーム剤、ローション剤または密閉ドレッシング、あるいは国際公開WO 99/47070に記載されているような組成物を放出するインプラントを挙げることができる。
【０１６７】
これに関連して、遺伝治療も、例えば米国特許第5,929,040号および米国特許第5,962,427号に記載されている方法などに従って応用することができる。
【０１６８】
代用皮膚を作り出す目的で、例えば所望の成長因子発現を遺伝子操作することなどによって、皮膚細胞を遺伝子改変する方法も存在する（Suppら, 2000, J. Invest. Dermatol. 114:5-13）。この分野の総説の一例が、Bevanら（1999, Biotechnol. Gent. Eng. Rev. 16:231-56）に掲載されている。
【０１６９】
また、例えば国際公開WO 99/11789に記載されているように、受容者にトランスフェクト細胞または形質転換細胞を「接種する」ことも考えられる。
【０１７０】
これらの方法は、細胞遊走を刺激し、それによって、創傷および熱傷の治癒、潰瘍などの皮膚病変の修復、自己皮膚のインビトロ培養などによる組織置換および組織移植、腎臓および肺などの内臓の再上皮化、損傷した神経組織の修復を助長し、または進捗させるために使用することができる。
【０１７１】
皮膚置換治療は当技術分野では周知の治療になっており、この治療では、例えばKeheら（1999, Arch. Dermatol. Res. 291:600-05）に記述されているような共培養上皮/ケラチノサイト細胞株、または初代（通常は自己）表皮、真皮および/またはケラチノサイト細胞のインビトロ培養の使用を、採用することができる。これらの技法では、工学的に作製された生体材料および合成ポリマー「スキャフォールド」を利用することもできる。
【０１７２】
この分野全般の総説の例は、TerskikhおよびVasiliev（1999, Int. Rev. Cytol. 188:41-72）ならびにEaglesteinおよびFalanga（1998, Cutis 62:1-8）に掲載されている。
【０１７３】
より具体的には、頭蓋顔面外科において有用な置換用口腔粘膜の作製が、Izumiら（2000, J. Dent. Res. 79:798-805）に記載されている。Fauzaら（1998, J. Pediatr. Surg. 33:357-61）に記述されているように、胎児ケラチノサイトおよび真皮フィブロブラストをインビトロで増殖させて、皮膚病変を処置するための移植用の皮膚を作製することができ、一方、ヒアルロン酸由来の生体材料上でインビトロ培養した真皮および表皮皮膚要素からの代用皮膚は、熱傷の処置に潜在的に有用であることが示されている（Zacchiら, 1998, J. Biomed. Mater. Res. 40:187-94）。
【０１７４】
ポリマースキャフォールドは、例えばSheridanら（2000, J. Control Release 64:91-102）およびFauzaら（1998, J. Pediatr. Surg. 33:357-61）に記載されているように、置換用皮膚の工学的操作を容易にするという目的でも考えられ、創傷および熱傷に皮膚細胞を送達するための薬剤としてのマイクロスフェアも同様である（LaFranceおよびArmstrong, 1999, Tissue Eng. 5:153-70）。
【０１７５】
本発明では、ケラチノサイト成長因子とビトロネクチンとを含む複合体のアゴニストまたはアンタゴニストを同定し、スクリーニングし、設計し、または他の形で作製するための、本発明の合成キメラタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体の使用が考えられる。そのような薬剤は「ミメティック」でありうる。「ミメティック」という用語は、本明細書では、タンパク質またはペプチドの特定の機能的領域に似るように設計された分子を指すために使用され、当技術分野ではよく理解されているとおり、「アゴニスト」、「類似体」および「アンタゴニスト」という用語を、その範囲に含む。
【０１７６】
ある実施形態では、KGF:VN複合体によるケラチノサイト成長因子受容体およびVN受容体の結合を模倣するアゴニストが作製される。そのような分子は、創傷治癒、皮膚再生などに要求されるような細胞遊走の刺激因子として役立ちうる。
【０１７７】
もう一つの実施形態では、KGF:VN複合体によるケラチノサイト成長因子受容体およびインテグリン受容体の結合を防止または抑制するアンタゴニストが作製される。そのような分子は、細胞遊走および/または細胞増殖の阻害因子として役立ち、それにより、有用な抗腫瘍剤を構成すると共に、異常な細胞増殖によって生じる乾癬および肥厚性瘢痕形成などの皮膚障害の処置にも役立ちうる。
【０１７８】
前述のミメティック、アゴニスト、アンタゴニストおよび類似体は、所望の生物学的活性および半減期を有するペプチド、ポリペプチドまたは他の有機分子、好ましくは小さな有機分子であることができる。
【０１７９】
コンピュータ支援構造データベース検索は、メティックを同定するための手法として、ますます利用されるようになりつつある。原理的にミメティックの同定に適切でありうるデータベース検索法は、国際公開WO 94/18232（HIV抗原ミメティックの作製に関する）、米国特許第5,752,019号および国際公開WO 97/41526（EPOミメティックの同定に関する）に見いだすことができる。
【０１８０】
他の方法には、分子相互作用を同定するさまざまな生物物理学的技法が含まれる。これらは、例えば候補分子がKGF:VN複合体の形成に影響を及ぼすかどうかによって候補分子をスクリーニングすることを可能にする。競合放射性リガンド結合アッセイ（関連する方法についてはUptonら, 1999, Endocrinology 140:2928-31を参照されたい）、分析用超遠心分離、微小熱量測定、表面プラズモン共鳴、および光学的バイオセンサーに基づく方法などといった、潜在的に有用な技法に応用することができる方法は、Coliganら編「CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE」（John Wiley & Sons、1997）のChapter 20に掲載されている。
【０１８１】
本発明をより容易に理解し、実行に移すことができるように、当業者に以下の非限定的実施例を提示する。
【実施例】
【０１８２】
［実施例1］
KGF:VNキメラは細胞の遊走と増殖を刺激する
単離されたヒトケラチノサイト細胞およびフィブロブラスト細胞（それぞれP1およびP3）を、さまざまな用量のVN:KGFキメラおよび対照で前処理された培養ウェル中の播種リングの内側チャンバに適用した。4時間の付着後に、播種リングを取り除き、ケラチノサイトについては24時間、フィブロブラストについては48時間にわたって、事前に結合させた処理に呼応して起こる外向きの遊走を許した。それぞれが三つ一組の独立した試験を含む少なくとも3つの個別の実験からの細胞アッセイデータをプールし、結果を、SG/SFM（陰性対照）を上回るパーセンテージとして表現して、図4Aおよび4Bに表す。エラーバーはSEMを示す。SG＝ストリッピング処理済みグリーン（Stripped Green）培地、SFM＝無血清培地（どちらも陰性対照）。単離されたヒト皮膚ケラチノサイトを利用する実験については、VN:KGFキメラが、個々の構成要素の等モルの組合せ（VN＋KGF）との機能的等価性を示したことから、適正なタンパク質発現、精製およびプロセシングが示された。単離された皮膚フィブロブラストの応答を調べる実験は、VN:KGFキメラが、個々の構成要素の等モルの組合せ（VN＋KGF）を有意に上回る（p≦0.05）細胞遊走を誘導することを示した。
【０１８３】
VN:KGFキメラの増殖誘導能力を評価するために、単離されたヒトケラチノサイト細胞およびフィブロブラスト細胞（それぞれP1およびP3）を、さまざまな用量のVN:KGFキメラおよび対照で前処理したウェルに、15,000細胞/cm2の密度で播種した。細胞をケラチノサイトおよびフィブロブラストについてそれぞれ72時間および48時間増殖させた後、培養培地を除去し、培養プレートを−80℃で瞬間凍結させた。プレートを融解した後、細胞溶解液とGR色素の混合物（Invitrogen、CYQUANTキット）を各ウェルに加え、室温で5分間インキュベートした。次にプレートを485nmでの励起による蛍光について調べ、吸光度を520nmで読み取った。それぞれが三つ一組の独立した試験を含む少なくとも3つの個別の実験からの細胞アッセイデータをプールし、結果を、SG/SFM（陰性対照）を上回るパーセンテージとして表現して、図4Cおよび4Dに表す。エラーバーはSEMを示す。SG＝ストリッピング処理済みグリーン培地、SFM＝無血清培地（どちらも陰性対照）。単離されたヒト皮膚ケラチノサイトにおける増殖を試験する実験は、VN:KGFキメラが、個々の構成要素の等モルの組合せ（VN＋KGF）と等価に機能することを示した。単離された皮膚フィブロブラストを利用する増殖実験は、VN:KGFキメラ（150nM）が、個々の構成要素の等モルの組合せおよび四量体VN:IGFBP-3:IGF-I:EGF複合体を有意に上回る（p≦0.05）細胞増殖を誘導することを示した。
【０１８４】
［実施例2］
VN:KGFシグナリング
VN：KGFキメラタンパク質がERK1/2およびAKTシグナリング経路に及ぼす影響を評価するために、CELISA（Millipore）キットを使用した。簡単に述べると、20,000個の初代ケラチノサイトまたは10,000個の初代フィブロブラストを96ウェル黒色ボトム蛍光プレートのウェルに播種し、37℃で終夜成長させた。次に、細胞を無血清培地（SFM）で2回洗浄し、SFM中で終夜インキュベートすることにより、細胞を血清飢餓状態にした。約16時間後に、血清飢餓培地を、次に挙げるとおり、100μLのタンパク質処理で置き換えた：VNのみ（15nM、1125ng/mLに相当）、VN（15nM、1125ng/mLに相当）とKGF（50nM、820.4ng/mLに相当）およびVN:KGF（50nM、1318.9ng/mLに相当）。細胞を、10分、30分および60分間、タンパク質処理に曝露した後、細胞を固定するために、処理溶液をTBS中の4％ホルムアルデヒドで置き換えた。次にウェルを、活性化（リン酸化）ERK1/2およびAKTのレベルについて、それぞれ総ERK1/2およびAKTに対する比率として、抗体ベースの方法（ELISA法）を製造者の指示に従って使用することによって調べた。
【０１８５】
キメラ処理は、各対照と比較して、相対的活性化を類似するレベルに増進し、経時的に類似する傾向を示した（図5）。
【０１８６】
［実施例3］
合成キメラビトロネクチン:ケラチノサイト成長因子タンパク質
VN:KGFキメラの形態にある本発明の合成キメラタンパク質の例を、ここに記載する。
【０１８７】
本合成キメラタンパク質は、ケラチノサイト成長因子と融合された任意の完全長または切頭型VNを含み、アミノ酸残基修飾を伴うもの、またはアミノ酸残基修飾を伴わないものがある。また、VNおよびケラチノサイト成長因子は、さまざまなペプチドリンカーを使って融合してもよいし、ペプチドリンカーを使わずに融合してもよい。
【０１８８】
さまざまな長さのVNタンパク質が、完全長成熟KGFタンパク質または少なくともケラチノサイト成長因子受容体に結合する能力を有するKGFタンパク質のドメインに連結される、一連のキメラ発現コンストラクトを設計する。いずれの場合も、VNセグメントは、好ましくは、リンカー、例えばGly4Ser（配列番号4）リンカー、Gly4Ser3（配列番号5）リンカー、(Gly4Ser)3（配列番号6）リンカー、または(Gly4Ser)4（配列番号7）リンカーを介して、KGF配列に連結される。
【０１８９】
例示的合成キメラタンパク質には、
A）1-459VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:1-163KGF:[リンカー；例えばG4SG4]:6H
B）1-311VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:1-163KGF:[リンカー；例えばG4SG4]:6H
C）1-125VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:1-163KGF:[リンカー；例えばG4SG4]:6H
D）1-64VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:1-163KGF:[リンカー；例えばG4SG4]:6H
E）1-64VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:343-376VN:[リンカー；例えば(G4S)4]:1-163KGF:[リンカー；例えばG4SG4]:6H
が含まれるが、これらに限るわけではない。
【０１９０】
本明細書の全体を通して、その目的は、本発明をどの一実施形態にも、または特徴のどの具体的集合体にも限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することにあった。それゆえに、例示した特定の実施形態には、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および改変を加えうることは、この開示に照らして、当業者には理解されるであろう。
【０１９１】
本明細書において言及したコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許および科学文献は全て、引用により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
0005843175.tif 000007
【配列表】
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