(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３１７、４０１、４０２および４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、抗原性プロタンパク質転換酵素スブチリシン−ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）ペプチド。
【請求項２】
抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが配列番号：１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、３１７、４０１、４０２および４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなり、免疫原性担体がＣＲＭ１９７およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択される、免疫原性担体に連結した抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原。
【請求項３】
アミノ酸リンカーをさらに含み、ここで：
（ｉ）アミノ酸リンカーが、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドのＣ末端に加わっており、及びＧＧＣ、ＧＣ、およびシステイン（Ｃ）残基からなる群から選択され；
（ｉｉ）抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが、アミノ酸リンカーのシステイン残基を通じて免疫原性担体に連結しており；
（ｉｉｉ）抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが配列番号：１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる；
請求項２に記載の免疫原。
【請求項４】
抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが、配列番号：１８２、１８３、１８４、１８５及び１８６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の免疫原。
【請求項５】
抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが、配列番号：１８７及び１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の免疫原。
【請求項６】
アミノ酸リンカーがシステイン残基である、請求項３に記載の免疫原。
【請求項７】
アミノ酸リンカーがＧＣである、請求項３に記載の免疫原。
【請求項８】
アミノ酸リンカーがＧＧＣである、請求項３に記載の免疫原。
【請求項９】
抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが、配列番号３１７、４０１、４０２及び４０３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２に記載の免疫原。
【請求項１０】
請求項２に記載の免疫原を含む組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アジュバントが、アルム、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、及びＱＳ２１から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項２に記載の免疫原及び薬学的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
アミノ酸リンカーがシステイン残基である、請求項５に記載の免疫原。
【請求項１５】
免疫原性担体がＣＲＭ１９７である、請求項５に記載の免疫原。
【請求項１６】
（ｉ）抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが配列番号：１８８のアミノ酸配列からなり；
（ｉｉ）アミノ酸リンカーがシステイン残基であり；及び
（ｉｉｉ）免疫原性担体がＣＲＭ１９７である
請求項５に記載の免疫原。
【請求項１７】
請求項１６に記載の免疫原を含む組成物。
【請求項１８】
アジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＳＫ９関連性障害を予防、治療、または軽減するための、免疫原性担体に好ましくは連結した抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む新規な免疫原の提供に関するものである。本発明はさらに、これらの薬剤、免疫原性組成物、およびその医薬組成物を生産するための方法、ならびに医薬品におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経アポトーシス調節型転換酵素１（「ＮＡＲＣ−Ｉ」）としても知られているプロタンパク質転換酵素スブチリシン−ケキシン９型（以下、「ＰＣＳＫ９」と呼ぶ）は、哺乳動物ＰＣＳＫファミリーの９番目のメンバーとして同定されたプロテイナーゼＫ様スブチラーゼである。Ｓｅｉｄａｈら、２００３  ＰＮＡＳ  １００：９２８〜９３３を参照されたい。ＰＣＳＫ９の遺伝子は、ヒト染色体１ｐ３３−ｐ３４．３に局在化している。ＰＣＳＫ９は、例えば肝細胞、腎臓間葉細胞、回腸、および結腸の上皮、ならびに胚脳終脳神経を含む、増殖および分化が可能な細胞において発現する。
【０００３】
ＰＣＳＫ９の本来の合成は、約７２ｋＤａの不活性な酵素前駆体、すなわちチモーゲンの形態であり、これは、小胞体（「ＥＲ」）において自己触媒性の分子内プロセシングを受けて、その機能性を活性化させる。ヒトＰＣＳＫ９の遺伝子配列は、６９２個のアミノ酸からなるタンパク質をコードする１２個のエキソンを有する約２２ｋｂの長さのものであるが、例えば、寄託番号ＮＰ＿７７７５９６．２で見ることができる。ヒト、マウス、およびラットのＰＣＳＫ９核酸配列は寄託されており、例えば、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ１２７５３０（またＡＸ２０７６８６）、ＡＸ２０７６８８、およびＡＸ２０７６９０を参照されたい。
【０００４】
ヒトＰＣＳＫ９は、腎臓、肝臓、および腸において主に発現する分泌型タンパク質である。これは、阻害性プロドメイン（アミノ酸１〜１５２、アミノ酸１〜３０のシグナル配列を含む）、触媒性ドメイン（アミノ酸１５３〜４４８）、およびシステイン残基に富んでいる２１０残基長のＣ末端ドメイン（アミノ酸４４９〜６９２）という３つのドメインを有する。ＰＣＳＫ９はチモーゲンとして合成され、これは、小胞体において、プロドメインと触媒性ドメインとの間で自己触媒性の切断を受ける。プロドメインは切断後も成熟タンパク質に結合したままであり、複合体が分泌される。システインに富んだドメインは、活性化されたプロテアーゼのフォールディングおよび調節に必須であると思われる、他のフリン／ケキシン／スブチリシン様セリンプロテアーゼのＰ−（プロセシング）ドメインと類似の役割を有し得る。ＰＣＳＫ９における突然変異は、血漿における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−ｃ）の異常なレベルに関連する（Ｈｏｒｔｏｎら、２００６  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３２（２）：７１〜７７）。
【０００５】
ＰＣＳＫ９は、肝細胞および神経細胞の分化において役割を有しており（上記のＳｅｉｄａｈら）、胎児肝において高度に発現し、かつコレステロールのホメオスタシスに大きく関与している。
【０００６】
心血管疾患の治療において効果的な化合物および／または作用物質の同定が非常に望まれている。ＬＤＬコレステロールレベルの低減は、冠動脈イベントの比率に直接的に関連することが、臨床試験において既に実証されている（Ｌａｗら、２００３  ＢＭＪ  ３２６：１４２３〜１４２７）。さらに、最近、血漿ＬＤＬコレステロールレベルの生涯にわたる適度な低減が、冠動脈イベントの発生の実質的な低減に実質的に相関することが示されている（上記のＣｏｈｅｎら）。これは、脂質に関連しない心血管危険因子の有病率が高い集団においてさえも当てはまることが見出された（上記）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、ＬＤＬコレステロールレベルの制御を可能にする治療用作用物質を同定することが非常に重要である。
【０００８】
したがって、様々な治療条件においてＰＣＳＫ９の活性およびＰＣＳＫ９が有する対応する役割を阻害するかまたはそれに拮抗する薬剤を生産することが非常に重要であろう。
【０００９】
ＰＣＳＫ９の発現または上方調節は、ＬＤＬコレステロールの血漿レベルの増大に関連し、ＰＣＳＫ９の発現の阻害または欠如は、低いＬＤＬコレステロール血漿レベルに関連する。重大なことには、ＰＣＳＫ９の配列の変動に関連する、さらに低いレベルのＬＤＬコレステロールは、冠動脈性心疾患に対する防御をもたらしている（Ｃｏｈｅｎ、２００６  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５４：１２６４〜１２７２）。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと場合により免疫原性担体とを含む免疫原に関するものである。
【００１１】
本発明はまた、免疫原性担体に場合により連結しているこのような抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを生産するための方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、１つまたはいくつかのアジュバント、好ましくは１つまたは２つのアジュバントを場合により含む、免疫原性担体に場合により連結しているこのような抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原性組成物に関する。
【００１３】
本発明の別の態様は、本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む医薬組成物、またはその免疫原性組成物、およびこのような組成物の医学的使用に関する。
【００１４】
特に、本発明は、好ましくはＰＣＳＫ９関連性障害の治療、軽減、または予防において、薬剤として用いるための、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関する。
【００１５】
特に、本発明は、好ましくはコレステロールレベルの上昇に関連する疾患の治療、軽減、または予防において、薬剤として用いるための、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関する。
【００１６】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールの上昇、またはＬＤＬコレステロールの上昇に関連する症状、例えば、脂質障害（例えば、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高脂血症、続発性高トリグリセライド血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏症）を有するか、またはそのリスクがあるヒト患者の治療に特に適している。本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはまた、動脈硬化症状（例えば、アテローム性動脈硬化症）、冠動脈疾患、心血管疾患を有するヒト患者、および、例えば１つまたは複数の危険因子（例えば、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、または高ホモシステイン血症）の存在に起因して、前記障害のリスクがある患者の治療に適している。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するための薬剤の製造における、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【００１８】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物は、別の作用物質と共に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＬＤＬ−Ｒ（３ＢＰＳ）のＥＧＦ−Ａドメインに結合したヒトＰＣＳＫ９のＰＤＢ構造であって、これらの２つのタンパク質の間の相互作用に関与するとして選択されるＰＣＳＫ９における５つのペプチド配列（ペプチド１〜５）を示すＰＤＢ構造を示す図である。
【図２】アルムとＣｐＧとをアジュバントとして用いて、ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドＶＲ＿９．１からＶＲ＿９．９でマウスを免疫化し、完全長の組換えヒトＰＣＳＫ９に対する抗体応答を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清を滴定することによって測定した。結果を、群あたり６頭のマウスのそれぞれについての力価の逆数として示し、力価の逆数は、０．５という最適な密度読み取りをもたらす血清希釈として測定した。
【図３】図２に記載される完全長の組換えマウスＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体応答を示す図である。
【図４】ワクチン接種されたマウスの血清において測定された血漿コレステロールレベルを示す図である（図２および３における抗体アッセイに用いられたものと同一の試料）。
【図５】図２から４において用いられた血漿試料を、異なる希釈で、ＦＲＥＴアッセイによって測定される組換えＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体の細胞外ドメインとの間の相互作用を阻害するそれらの能力について試験した。
【図６】ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の相互作用の用量応答性の阻害を示す、ＦＲＥＴアッセイにおける、ペプチドＶＲ＿９．５およびＶＲ＿９．６でのワクチン接種からの血漿試料の希釈を示す図である。
【図７】ＰＤＢ：３ＢＰＳの、ＰＣＳＫ９（リボン状）とＥＧＦ−Ａ（空間充填）との複合体を示す図である。ＥＧＦ−Ａ以外のＬＤＬＲのドメインと相互作用し得るＰＣＳＫ９の潜在的領域が、楕円によって示されている。
【図８】ペプチドＶＲ＿１３／１４（Ａ）およびＶＲ＿１５／１６（Ｂ）およびＶＲ＿９．５（Ｃ）に対応するアミノ酸が示されている、ＰＣＳＫ９（リボン状）とＥＧＦ−Ａ（空間充填）との複合体を示す図である。
【図９】ペプチドＶＲ＿９．５およびＶＲ＿９．１０からＶＲ＿９．１６でワクチン接種されたマウスの血漿抗体応答を示す図である。マウスＰＣＳＫ９に対する抗体を、完全長のマウスＰＣＳＫ９タンパク質を用いて、血漿の連続希釈物のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。個別の力価曲線を、群あたり８頭のマウスについて示し、コンジュゲートしていないＶＬＰで免疫化されたマウスの血漿のＥＬＩＳＡ応答を対照として示した。
【図１０】ペプチドＶＲ＿９．５およびＶＲ＿９．１０からＶＲ＿９．１６でワクチン接種されたマウスの血漿抗体応答を示す図である。マウスＰＣＳＫ９に対する抗体を、完全長のマウスＰＣＳＫ９タンパク質を用いて、血漿の連続希釈物のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。個別の力価曲線を、群あたり８頭のマウスについて示し、コンジュゲートしていないＶＬＰで免疫化されたマウスの血漿のＥＬＩＳＡ応答を対照として示した。
【図１１】ＶＬＰ（アルム＋／−ＣｐＧをアジュバントとして用いて）またはＣＲＭ１９７（ＴｉｔｅｒＭａｘをアジュバントとして用いて）にコンジュゲートしたペプチドＶＲ＿９．５またはＶＲ＿９．１０でワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘発された、完全長のヒトＰＣＳＫ９タンパク質に対する血清抗体応答を示す図である。ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清を滴定することによって測定した。結果を、群当たり８頭のマウスのそれぞれについて１．０の光学密度で決定された力価のｌｏｇ逆数として示す。
【図１２】図１１で説明されるようにワクチン接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘発された、完全長のマウスＰＣＳＫ９タンパク質に対する血清抗体応答を示す図である。結果を、群当たり８頭のマウスのそれぞれについて０．５の光学密度で決定された力価のｌｏｇ逆数として示す。
【図１３】ＢＡＬＢ／ｃワクチン接種マウスの血清試料（図１１および１２における抗体アッセイに用いたものと同一の試料）において測定された総コレステロールレベルを示す図である。
【図１４】Ｃ５７ＢＬ／６ワクチン接種マウスの血清試料（図１１および１２における抗体アッセイに用いたものと同一の試料）において測定された総コレステロールレベルを示す図である。
【図１５】アルムにＣｐＧを加えたものをアジュバントとして用いて、ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドＶＲ＿９．５またはＶＲ＿９．１７からＶＲ＿９．３５で免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘発された、完全長のヒトＰＣＳＫ９に対する抗体応答を示す図である。ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清を滴定することによって測定した。結果を、群当たり８頭のマウスのそれぞれについて１．０の光学密度で決定された力価のｌｏｇ逆数として示す。
【図１６】図１５で記載されるように免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて誘発された、完全長のマウスＰＣＳＫ９に対する抗体応答を示す図である。マウスＰＣＳＫ９に対する抗体を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清を滴定することによって測定した。結果を、群当たり８頭のマウスのそれぞれについて０．５の光学密度で決定された力価のｌｏｇ逆数として示す。
【図１７】ＢＡＬＢ／ｃワクチン接種マウスの血清試料（図１５および１６における抗体アッセイに用いたものと同一の試料）において測定された総コレステロールレベルを示す図である。
【図１８】楕円によって示される、機能獲得型突然変異もしくは機能喪失型突然変異に連結したアミノ酸配列を含有するＰＣＳＫ９の領域および／またはタンパク質表面に曝露されたエピトープを有する、ＰＣＳＫ９（リボン状）およびＥＧＦ−Ａ（空間充填）との複合体を示す図である。
【図１９】さらなる実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、それ自体が担体にカップリングする多価鋳型に付着し、したがって、抗原の密度を増大させる（以下を参照されたい）。多価鋳型は、（限定はしないが）オリゴグルタメートまたはオリゴキトサンなどの、適切に機能化されたポリマーまたはオリゴマーであり得る（図１９を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチド
本発明は、免疫原性担体に場合により連結している抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原に関するものである。
【００２１】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、４から２０個の間のアミノ酸を含むＰＣＳＫ９の一部であり、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００２２】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との相互作用に関与するＰＣＳＫ９の一部である。
【００２３】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、４から２０個の間のアミノ酸を含む、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との相互作用に関与するＰＣＳＫ９の一部であり、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００２４】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７，３９８、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７および５８８からなる群から選択される。
【００２５】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１から３１２、３３０から３９８、４２１、４２３、４２４、４２６、および４２８から５８８からなる群から選択される。
【００２６】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７および３９８からなる群から選択される。
【００２７】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬ受容体のドメインＥＧＦ−Ａとの相互作用に関与し得るＰＣＳＫ９の一部である。このような部分の例は、図１で表されている。
【００２８】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、４から２０個の間のアミノ酸を含む、ＬＤＬ受容体のドメインＥＧＦ−Ａとの相互作用に関与し得るＰＣＳＫ９の一部であり、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００２９】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００３０】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、および４５からなる群から選択される。
【００３１】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号４６のＰＣＳＫ９断片の５から１５個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００３２】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、および１０１からなる群から選択される。
【００３３】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１０２のＰＣＳＫ９断片の５から１４個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００３４】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、および１４６からなる群から選択される。
【００３５】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１４７のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００３６】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、および１８１からなる群から選択される。
【００３７】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１８２のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００３８】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、および２２６からなる群から選択される。
【００３９】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３３０のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００４０】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、および３５９からなる群から選択される。
【００４１】
好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１９、５６、６３、１０９、１５３、１６５、１８４、１８６、１８７、１８８、３３２、および４２４からなる群から選択される。
【００４２】
好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１９、５６、６３、１０９、１５３、および１８４からなる群から選択される。
【００４３】
好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５６、１８４、１８６、１８７、１８８、および３３２からなる群から選択される。
【００４４】
最も好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５６のペプチドである。
【００４５】
より好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１８４または１８７のペプチドである。
【００４６】
最も好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号１８４のペプチドである。
【００４７】
最も好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３３２のペプチドである。
【００４８】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＥＧＦ−Ａドメイン以外のＬＤＬ受容体の領域との相互作用に関与し得るＰＣＳＫ９の領域において選択される。このような部分の例は、図７および８において表されている。
【００４９】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、４から２０個の間のアミノ酸を含む、ＬＤＬ受容体のドメインＥＧＦ−Ａ以外の領域との相互作用に関与し得るＰＣＳＫ９の一部であり、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００５０】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号２２７のＰＣＳＫ９断片の５から１２個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００５１】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、および２６２からなる群から選択される。
【００５２】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号２６３のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００５３】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、および３０７からなる群から選択される。
【００５４】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３６０のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００５５】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、および３９８からなる群から選択される。
【００５６】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＰＣＳＫ９プロドメイン（配列番号３２９）の領域において選択される。
【００５７】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、４から２０個の間のアミノ酸を含むＰＣＳＫ９プロドメインの一部であり、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００５８】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３０８、３０９、３１０、３１１、および３１２からなる群から選択される。
【００５９】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３０９のＰＣＳＫ９断片の５から１２個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００６０】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３０９、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、および４６３からなる群から選択される。
【００６１】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５０８のＰＣＳＫ９断片の５から１２個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００６２】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、および５４３からなる群から選択される。
【００６３】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１０のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００６４】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１０、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、および５０７からなる群から選択される。
【００６５】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５４４のＰＣＳＫ９断片の５から１３個、好ましくは６から８個の連続するアミノ酸を含むペプチドである。
【００６６】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、および５８８からなる群から選択される。
【００６７】
好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１２、４２１、４２２、４２３、４２６、４２７、４２８、４４５、４８２、５２５、および５６３からなる群から選択される。
【００６８】
より好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号４４５、４８２、５２５、および５６３からなる群から選択される。
【００６９】
最も好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号４４５のペプチドである。
【００７０】
このような抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、好ましくは免疫原性担体にコンジュゲートしている場合、対象における自己抗ＰＣＳＫ９抗体を誘発して、ＰＣＳＫ９関連性障害を治療、予防、または軽減するために、単独でまたは組み合わせて用いることができる。
【００７１】
具体的な構築物が本開示の範囲内にあるかどうかを確認するためにどの技術を用いることができるかは、当業者に明らかであろう。このような技術には、本願の実施例の節において記載される技術が含まれるが、これに制限されるわけではなく、また以下のものにも制限されない。
【００７２】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの、自己抗ＰＣＳＫ９抗体を誘発する能力は、本願の実施例３において開示される試験を用いてマウスにおいて測定することができる。本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドにより誘発される自己抗体の、循環血漿コレステロールのレベルを減少させる能力は、実施例３において開示される試験を用いてマウスにおいて測定することができる。本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドにより誘発される自己抗体の、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の相互作用を阻害する能力は、実施例３において開示される試験（ＦＲＥＴアッセイ）を用いて直接的に測定することができるか、または、（関連文献において良く記載されているように、インビトロで細胞系を用いて、または抗体を発現している動物の肝臓生検におけるＬＤＬ受容体レベルを測定することによって（例えば、ウェスタンブロッティングによって））ＰＣＳＫ９介在性の下方調節をブロックすることによって生じる細胞表面ＬＤＬ受容体の上方調節を測定することによって間接的に測定することができる。
【００７３】
「抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの生物学的活性」という用語は、本明細書において用いられる場合、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの、患者において自己抗ＰＣＳＫ９抗体を誘発する能力を言う。
【００７４】
好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、対象に投与されると、前記対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させ得る。好ましくは、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒトである。好ましくは、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも２％、５％、１０％、２０％、３０％、または５０％低下させ得る。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、それらが、非変性エピトープが見られるＰＣＳＫ９ドメイン全体から選択される領域を模倣するようなサイズのものである。特定の実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、１００アミノ酸未満の長さであり、好ましくは７５アミノ酸より短く、より好ましくは５０アミノ酸未満であり、さらに好ましくは４０アミノ酸未満である。本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、典型的には４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であり、好ましくは４から２０アミノ酸、例えば６から１２、６から８、または９から１２アミノ酸である。
【００７６】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの具体的な例は、配列表において提供され、５から１７アミノ酸長の範囲のペプチドを含む。
【００７７】
本発明の抗原性ペプチドには、哺乳動物ＰＣＳＫ９の一部、好ましくはヒトＰＣＳＫ９（配列番号３９９）またはマウスＰＣＳＫ９（配列番号４００）の一部、より好ましくはヒトＰＣＳＫ９の一部から誘導されるアミノ酸配列が含まれ、ＰＣＳＫ９のこのような誘導された部分は、天然由来のＰＣＳＫ９のアミノ酸配列に対応するか、または変異体ＰＣＳＫ９に対応し、前記変異体ＰＣＳＫ９は、すなわち、少数のアミノ酸が置換されているか、付加されているか、または欠失しているが、同一の免疫学的特性を基本的に保持している、天然由来のＰＣＳＫ９のアミノ酸配列である。さらに、このような誘導されたＰＣＳＫ９タンパク質部分は、さらに、特にＮ末端およびＣ末端で、アミノ酸によって修飾されて、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが立体構造上拘束されるようにし、かつ／または適切な化学が実施された後に抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが免疫原性担体にカップリングするようにし得る。
【００７８】
本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、その免疫原性特性を基本的に損なうことなくアミノ酸が欠失しているか、挿入されているか、または置換されている、ＰＣＳＫ９のアミノ酸配列から誘導される、機能的に活性な変異体ペプチドを包含し、すなわち、このような機能的に活性な変異体ペプチドは、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの実質的な生物学的活性を保持している。典型的には、このような機能的変異体ペプチドは、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に相同な、好ましくは高度に相同なアミノ酸配列を有する。
【００７９】
１つの実施形態において、このような機能的に活性な変異体ペプチドは、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５５８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を示す。
【００８０】
配列同一性とも呼ばれる、ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、様々な置換、欠失、および保存的なアミノ酸置換を含む他の修飾に割り当てられた類似性の評価基準を用いて、類似の配列同士を適合させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含有し、これらは、デフォルトのパラメータと共に用いられて、緊密に関連するポリペプチド間、例えば、異なる種の生物から得られる相同ポリペプチド間、または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１における１つのプログラムである、デフォルトのパラメータまたは推奨パラメータを用いるＦＡＳＴＡを用いて比較され得る。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、アラインメント、および問い合わせ配列と探索配列との間の最良のオーバーラップの領域の配列同一性パーセントを提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５〜２１９（２０００））。本発明の配列を、異なる生物から得られる多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の別のアルゴリズムは、デフォルトパラメータを用いる、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜４０２（１９９７）を参照されたい。
【００８１】
機能的に活性な変異体は、対立遺伝子変異体および種変異体などの天然由来の機能的に活性な変異体、ならびに、例えば突然変異生成技術または直接的な合成によって生産され得る、非天然由来の機能的に活性な変異体を含む。
【００８２】
機能的に活性な変異体は、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８で示されるペプチドのいずれかから、例えば約１、２、３、４、または５アミノ酸残基が異なり、それでも抗原性ＰＣＳＫ９の生物学的活性を保持している。この比較にアラインメントが必要である場合、配列は、最大の相同性についてアラインされる。変異の部位は、生物学的活性が配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８で示されるペプチドに実質的に類似している限り、ペプチドのどこでも生じ得る。
【００８３】
表現型上サイレントなアミノ酸置換を行う方法に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）において提供されており、これは、変化に対するアミノ酸配列の許容性を研究するために２つの主要な戦略があることを教示している。
【００８４】
第１の戦略は、進化の過程の間の自然淘汰によるアミノ酸置換の許容性を利用するものである。異なる種におけるアミノ酸配列を比較することによって、種間で保存されているアミノ酸位置を同定することができる。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能にとって重要である可能性が高い。逆に、自然淘汰によって置換が許容されているアミノ酸位置は、タンパク質の機能にとって重大ではない位置を示す。したがって、アミノ酸置換を許容する位置は、修飾されるペプチドの特異的免疫原性活性を依然として維持しながら、修飾することができる。
【００８５】
第２の戦略は、遺伝子操作を用いて、クローン化遺伝子の特異的位置にアミノ酸変化を導入し、タンパク質の機能にとって重大な領域を同定する。例えば、部位特異的突然変異生成またはアラニンスキャニング突然変異生成を用いることができる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９））。得られた変異体ペプチドは、次に、抗原性ＰＣＳＫ９の特異的な生物学的活性について試験することができる。
【００８６】
Ｂｏｗｉｅらによると、これらの２つの戦略によって、タンパク質がアミノ酸置換に驚くほど許容性であることが明らかにされている。著者はさらに、どのアミノ酸変化がタンパク質内の特定のアミノ酸位置で許容的である可能性が高いかを示している。例えば、（タンパク質の三次構造内で）最も埋もれているかまたは最も内側のアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とし、その一方で、表面または外側の側鎖の特徴は、通常ほとんど保存されない。
【００８７】
タンパク質のアミノ酸に突然変異を導入する方法は、当業者に周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照されたい）。
【００８８】
突然変異はまた、「ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの市販されているキットを用いて導入することができるか、またはペプチド合成によって直接的に導入することができる。抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの機能に有意に影響しないアミノ酸を置き換えることによる、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドに対する機能的に活性な変異体の生成は、当業者が実現することができる。
【００８９】
本発明に従ったペプチドの１つにおいて行うことができるアミノ酸置換のタイプは、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。通常、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的には変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なるケースでは、配列同一性パーセントまたは類似性の程度を上方修正して、置換の保存的性質について補正することができる。この修正を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照されたい。
【００９０】
類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の群には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００９１】
あるいは、保存的な置き換えは、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３〜４５（１９９２）において開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する、あらゆる変化である。「適度に保存的な」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて負ではない値を有するあらゆる変化である。
【００９２】
機能的に活性な変異体ペプチドはまた、ハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。簡潔に述べると、目的のペプチド、例えば配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５５８をコードする核酸配列の全体または一部に対して高い相同性を有するＤＮＡを用いて、機能的に活性なペプチドを調製する。したがって、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはまた、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８のペプチドの１つまたは複数に機能的に同等なペプチドであって、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８のいずれか１つをコードする核酸とハイブリダイズする核酸分子またはその相補体によってコードされるペプチドを含む。当業者であれば、容易に入手できるコドン表を用いて、本発明のペプチドをコードする核酸配列を容易に決定することができる。したがって、これらの核酸配列は、本明細書において提示されていない。
【００９３】
機能的に活性な変異体であるペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする核酸のためのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、１０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（低いストリンジェンシー条件）である。より好ましい条件は、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（中度のストリンジェンシー条件）であり、さらに好ましい条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、１×デンハート溶液、および１×サケ精子ＤＮＡ（高いストリンジェンシー条件）である。しかし、上記のホルムアミド濃度以外のいくつかの因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し、当業者であれば、類似のストリンジェンシーを実現するためにこれらの因子を適切に選択することができる。
【００９４】
機能的に活性な変異体をコードする核酸分子はまた、目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、例えば配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８で示されるペプチドのいずれか１つをコードする核酸分子ＤＮＡの一部をプローブとして用いる、ＰＣＲなどの遺伝子増幅方法によって単離することができる。
【００９５】
本発明の１つの実施形態において、本発明のペプチドは、天然由来源から誘導され、哺乳動物、例えばヒト、霊長類、ネコ、イヌ、ウマ、マウス、またはラットから、好ましくはヒト由来源から単離される。したがって、本発明のペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いて細胞源または組織源から単離することができる。
【００９６】
あるいは、本発明のペプチドは、化学的に合成することができるか、または、組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができる。
【００９７】
例えば、本発明のペプチドは、当技術分野において周知の固相手順によって合成することができる。適切な合成は、「Ｔ−ｂｏｃ」手順または「Ｆ−ｍｏｃ」手順を利用することによって行うことができる。環状ペプチドは、完全に自動化された装置において、周知の「Ｆ−ｍｏｃ」手順およびポリアミド樹脂を用いる固相手順によって合成することができる。あるいは、当業者には、手動でこのプロセスを行うために必要な実験手順が知られよう。固相合成のための技術および手順は、ＩＲＬ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって発行されている、Ｅ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄによる「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ならびにＤ．Ａｎｄｒｅａｕらによる、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｎｇｔｏｎおよびＢ．Ｍ．Ｄｕｎｎ編）、ｃｈａｐｔｅｒ  ７、ｐｐ９１〜１７１において記載されている。
【００９８】
あるいは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において周知の技術を用いて、適切な発現系において発現し得る発現ベクター内に導入することができ、その後、発現した目的のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を単離または精製することができる。様々な細菌発現系、酵母発現系、植物発現系、哺乳動物発現系、および昆虫発現系が当技術分野において利用可能であり、あらゆるこのような発現系を用いることができる。場合により、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを、無細胞翻訳系において翻訳することができる。
【００９９】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはまた、複数の遺伝子の存在、選択的転写事象、選択的ＲＮＡスプライシング事象、ならびに選択的翻訳事象および選択的翻訳後事象の結果生じるものを含み得る。ペプチドは、前記ペプチドが非変性細胞において、または翻訳後修飾の改変もしくは省略をもたらす系において発現する場合に存在する翻訳後修飾と実質的に同一の翻訳後修飾をもたらす系、例えば培養細胞において発現し得、前記翻訳後修飾は、例えば、非変性細胞において発現する場合に存在するグリコシル化または切断である。
【０１００】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、他の非ＰＣＳＫ９アミノ酸配列またはＰＣＳＫ９由来ではないアミノ酸配列、例えば、本明細書において定義されるアミノ酸リンカーまたはシグナル配列または免疫原性担体、ならびにタンパク質の精製において有用なリガンド、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質Ａを含有する、融合タンパク質として生産することができる。本発明の２つ以上の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが融合タンパク質内に存在し得る。異種ポリペプチドを、例えば本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合することができる。本発明のペプチドはまた、相同なアミノ酸配列、すなわち、他のＰＣＳＫ９配列またはＰＣＳＫ９由来の配列を含む融合タンパク質として生産することができる。
【０１０１】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、線状であるか、または立体構造上拘束されているものであり得る。ペプチドに関連して本明細書において用いられる場合、「立体構造上拘束されている」という用語は、三次元構造が経時的に１つの空間配置に実質的に維持されているペプチドを意味する。立体構造上拘束されている分子は、特性が向上している可能性があり、例えば、親和性、代謝安定性、膜透過性、または可溶性が向上している可能性がある。
【０１０２】
さらに、このような立体構造上拘束されたペプチドは、それらの非変性のループ立体構造に類似した立体構造で抗原性ＰＣＳＫ９エピトープを提示し、それによって、無傷の非変性自己ＰＣＳＫ９分子をさらに認識しやすい抗ＰＣＳＫ９抗体、または自己ＰＣＳＫ９分子を認識するための親和性が増大した抗ＰＣＳＫ９抗体を誘発すると予想される。立体構造上の拘束の方法は、当技術分野において周知であり、限定はしないが架橋および環化を含む。
【０１０３】
線状のペプチドに立体構造上の拘束を導入するために、いくつかのアプローチが当技術分野において知られている。例えば、ペプチド内の２つの隣接するアミノ酸の間を架橋すると、局所的な立体構造上の修飾が生じ、その柔軟性は、通常のペプチドの柔軟性と比較して、限られたものである。このような架橋を形成するためのいくつかの可能性には、ラクタムおよびピペラジノンの組み込みが含まれる（概要については、ＧｉａｎｎｉｓおよびＫｏｌｔｅｒ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．編、１９９３、３２：１２４４を参照されたい）。
【０１０４】
ペプチドに関して本明細書において用いられる場合、「環状」という用語は、２つの隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体間の分子内結合を含む構造を言う。環化は、共有結合または非共有結合を介して行うことができる。分子内結合には、限定はしないが、骨格と骨格との結合、側鎖と骨格との結合、側鎖と側鎖との結合、側鎖と末端基との結合、末端と末端との結合が含まれる。環化の方法には、限定はしないが、ペプチドのＮ末端残基とＣ末端残基との間のアミド結合の形成、隣接していないアミノ酸またはアミノ酸類似体の側鎖間のジスルフィド結合の形成、Ｌｙｓ残基およびＡｓｐ／Ｇｌｕ残基の側鎖間のアミド結合の形成、セリン残基とＡｓｐ／Ｇｌｕ残基との間のエステル結合の形成、ラクタム結合の形成、例えば１つのアミノ酸またはその類似体の側鎖基とアミノ末端残基のＮ末端アミンとの間のラクタム結合の形成、ならびにリジノノルロイシン結合およびジチロシン結合の形成が含まれる。炭素型のジスルフィド連結、例えばエテニル連結またはエチル連結（Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃ．２００８、１４、８９８〜９０２）、および適切に多置換された求電子試薬、例えばジハロアルカン、トリハロアルカン、またはテトラハロアルカンを用いるアルキル化反応（ＰＮＡＳ、２００８、１０５（４０）、１５２９３〜１５２９８；ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００５、６、８２１〜８２４）もまた用いることができる。立体構造上の拘束をペプチドに組み込むために、様々な修飾されたプロリン類似体もまた用いることができる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．、１９９６、３９：２７３８〜２７４４；ＰｆｅｉｆｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９９８、１９７７〜１９７８）。本発明のペプチドを環化するために用いることができる化学によって、限定はしないがラクタム結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、チアゾリジン結合、チオエーテル結合、またはスルホニウム結合を含む結合で環化されたペプチドが生じる。
【０１０５】
ＵＳ１０／１１４９１８において記載されている、立体構造上拘束されたペプチドの設計における、さらに別のアプローチは、目的の短いアミノ酸配列を鋳型に付着させて、環状の拘束されたペプチドを生成することである。このような環状ペプチドは、それらの鋳型によって構造的に安定化され、それによって、ウイルスおよび寄生体などの非変性タンパク質上または自己タンパク質（ＰＣＳＫ９などの自己哺乳動物タンパク質）上の立体構造エピトープを模倣し得る三次元立体構造をもたらすだけではなく、血清におけるタンパク質分解に対して、線状ペプチドよりも耐性がある。ＵＳ１０／１１４９１８はさらに、適切に位置したアミノ酸に骨格をカップリングさせるための合成アミノ酸を調製して、ペプチドの超二次構造を安定化させることによる、立体構造上拘束された架橋型ペプチドの合成を開示している。架橋は、オルトゴナルに保護された（２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリン残基の第一アミノ基を、グルタミン酸の適切に位置した側鎖カルボキシル基にアミドカップリングさせることによって、達成することができる。このアプローチは、少なくとも１つのプロリンが２Ｓ，３Ｒ）−３−アミノプロリンによって置き換えられており、かつ側鎖カルボキシル基を導入するためにグルタミン酸がアラニンの置き換えとして組み込まれているＣＳタンパク質の、立体構造上拘束されたテトラペプチド反復の調製において追跡されている。
【０１０６】
架橋戦略にはまた、αらせん立体構造を模倣するように設計された「ステープル」ペプチドを形成するためのＧｒｕｂｂｓ閉環メタセシス反応の適用（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９８、３７：３２８１；ＪＡＣＳ、２０００、１２２、５８９１）、多機能化された糖の使用、トリプタチオニン連結の使用（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｕ．Ｊ．、２００８、２４、３４０４〜３４０９）、側鎖アミノ酸残基として組み込まれ得るかまたはペプチド配列の骨格内に位置し得るアジドおよびアルキンの「クリック」反応の使用（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ、２００３、８（２４）、１１２８〜１１３７）が含まれる。金属イオンが、金属陽イオンに連動する特異的残基、例えばヒスチジンの隔離を介して線状ペプチドの拘束された立体構造を安定化させ得ることも、文献において知られている（Ａｎｇｅｗ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２００３、４２、４２１）。同様に、非天然の酸およびアミンの機能性またはポリアミンおよびポリ酸の機能性を有する線状ペプチド配列の機能化を用いて、活性化およびアミド結合形成の後に環化構造にアクセスさせることができる。
【０１０７】
１つの実施形態に従うと、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの２つの隣接していないアミノ酸、例えば、Ｎ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を、互いに分子内共有結合することにより、立体構造上拘束されている。別の実施形態に従うと、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、足場分子への共有結合によって立体構造上拘束されている。さらなる実施形態に従うと、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、簡単に拘束されており、すなわち、一方の末端（Ｃ末端またはＮ末端）で、またはいずれの末端にも位置していない別のアミノ酸を介して、足場分子にカップリングしている。別の実施形態に従うと、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、二重に拘束されており、すなわち、Ｃ末端およびＮ末端の両方で足場分子にカップリングしている。別の実施形態に従うと、抗原性ペプチドは、対側手のジプロリン単位（Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｒｏ）の鋳型化効果を介する環化によって拘束されている（Ｓｐａｔｈら、１９９８、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ８１、ｐ１７２６〜１７３８）。
【０１０８】
足場（「プラットフォーム」とも呼ばれる）は、共有結合を介して、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドが取り得る立体構造の数を低減させ得る、あらゆる分子であり得る。立体構造を拘束する足場の例には、タンパク質およびペプチド、例えばリポカリン関連分子、例えばβバレルを含有するチオレドキシンおよびチオレドキシン様タンパク質、ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅＡ）、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、エグリンＣ）、抗体またはその構造的に堅固な断片、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光タンパク質、コノトキシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのループ領域、ＣＴＬ−Ａ４、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）が含まれる。
【０１０９】
他の適切なプラットフォーム分子には、セファロースなどの糖質が含まれる。プラットフォームは、線状または環状の分子であり得、例えば、閉じてループを形成している。プラットフォームは、通常、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドに対して異種である。このような、プラットフォームに連結した立体構造上拘束されたペプチドは、線状ペプチドよりもタンパク質分解に対して耐性であると考えられる。
【０１１０】
好ましい実施形態に従うと、足場は、本願において定義される免疫原性担体である。さらなる実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体上に簡単に拘束されている。別のさらなる実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体上に二重に拘束されている。このように、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、細胞内認識分子として特に適切な構造であることが明らかにされている、立体構造上拘束されたループ構造を形成する。
【０１１１】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、プラットフォームへのコンジュゲーションを容易にするために、例えば、一方もしくは両方の末端に末端システインを付加することによって、ならびに／あるいは二重グリシン頭部もしくは尾部および末端システイン、リジン残基で終わるリンカー、またはこのような機能を行うことが当業者に知られているあらゆる他のリンカーなどのリンカー配列を付加することによって、修飾され得る。このようなリンカーの詳細は、以下に開示される。ペプチド配列全体を担体にカップリングさせ、それによりあらゆる位置化学的問題および化学選択性問題を避けるための、生体直交型化学（上記のクリック反応など）もまた、用いることができる。Ｊｏｎｅｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２、４１：４２４１〜４２４４において記載されているような堅固なリンカーは、免疫学的応答の向上を引き起こすことが知られており、同様に用いることができる。
【０１１２】
さらなる実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、それ自体が担体にカップリングする多価鋳型に付着し、したがって、抗原の密度を増大させる（以下を参照されたい）。多価鋳型は、（限定はしないが）オリゴグルタメートまたはオリゴキトサンなどの、適切に機能化されたポリマーまたはオリゴマーであり得る（図１９を参照されたい）。
【０１１３】
本発明の免疫原性担体
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体分子に連結して、ワクチン接種プロトコルのための免疫原を形成し、好ましくは、担体分子は、非変性ＰＣＳＫ９分子に関連しないものである。
【０１１４】
本明細書における「免疫原性担体」という用語には、宿主動物における免疫原性応答を独立して引き起こす能力を有する材料であって、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質内の遊離カルボキシル基、アミノ基、もしくはヒドロキシル基と、免疫原性担体材料上の対応する基との間のペプチド結合もしくはエステル結合の形成を介して直接的に、または従来の二機能性連結基を介する結合によって、または融合タンパク質として、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に共有結合によってカップリングし得る材料が含まれる。
【０１１５】
本発明の免疫原において用いられる担体のタイプは、当業者に容易に知られよう。このような免疫原性担体の例は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；グロブリン；チログロブリン；ヘモグロビン；ヘモシアニン（特に、キーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］）；ポリリジン；ポリグルタミン酸；リジン−グルタミン酸コポリマー；リジンまたはオルニチンを含有するコポリマー；リポソーム担体；ツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）；不活化細菌毒素またはトキソイド、例えば破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）もしくはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（無毒であるが、ジフテリア毒素の、抗原性が同一である変異体）；他のＤＴ点突然変異体、例えば、ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８、３８３８〜３８４４、１９７３）；ＣＲＭ９、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７、ならびにＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｏｘｉｎｓ、Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｍａｅｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ編、１９９２においてＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅによって記載されている他の突然変異；Ｇｌｕ−１４８からＡｓｐ、Ｇｌｎ、もしくはＳｅｒへのおよび／またはＡｌａ１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異、ならびにＵＳ４７０９０１７またはＵＳ４９５０７４０において記載されている他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０、および／またはＬｙｓ５３４の少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異、ならびにＵＳ５９１７０１７またはＵＳ６４５５６７３において記載されている他の突然変異；あるいは、ＵＳ５８４３７１１において開示されている断片、ある様式で解毒されたｐｌｙを含む肺炎球菌溶血素（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ  ６３、２７０６〜１３）、例えばｄＰＬＹ−ＧＭＢＳ（ＷＯ０４０８１５１５、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１０２５８）またはｄＰＬＹ−ｆｏｒｍｏｌ、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、またはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５またはＷＯ００／３９２９９において開示されている）を含むＰｈｔＸ、およびＰｈｔタンパク質の融合体、例えばＰｈｔＤＥ融合体、ＰｈｔＢＥ融合体、Ｐｈｔ  Ａ−Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）、ＯＭＰＣ（通常は髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出される髄膜炎菌外膜タンパク質、ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から）、ＰＤ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、例えばＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、またはそれらの免疫学的に機能的な同等物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、成長因子または成長ホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原から得られる複数のヒトＣ��４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら、（２００１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１、３８１６〜３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ  ｌｍｍｕｎ  ７２、４８８４〜７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取り込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）である。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明の免疫原性担体はＣＲＭ１９７である。
【０１１７】
別の実施形態において、免疫原性担体はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、好ましくは、組換えウイルス様粒子である。
【０１１８】
本明細書において用いられる場合、「ウイルス粒子」という用語は、ウイルス粒子に似ているが病原性ではないことが実証されている構造を言う。通常、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの少なくとも一部を欠いている。また、ウイルス様粒子は、異種発現によって大量に生産され得ることが多く、容易に精製され得る。本発明に従ったウイルス様粒子は、それらのゲノムとは異なる核酸を含有し得る。本発明に従ったウイルス様粒子の典型的なおよび好ましい実施形態は、対応するウイルス、バクテリオファージ、またはＲＮＡファージのウイルスカプシドなどの、ウイルスカプシドである。
【０１１９】
本明細書において用いられる場合、「バクテリオファージのウイルス様粒子」という用語は、複製不可能および非感染性であり、かつバクテリオファージの複製機構をコードする１つまたは複数の遺伝子を少なくとも欠いており、かつ宿主へのウイルスの付着または宿主内への侵入に関与する１つまたは複数のタンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子も典型的に欠いている、バクテリオファージの構造に似たウイルス様粒子を言う。しかし、この定義はまた、前述の１つまたは複数の遺伝子が依然として存在するが不活性であり、したがって同様にバクテリオファージの複製不可能および非感染性のウイルス様粒子をもたらす、バクテリオファージのウイルス様粒子を包含する。
【０１２０】
ＲＮＡファージ被覆タンパク質の１８０個のサブユニットの自己集合体から形成され、宿主ＲＮＡを場合により含有するカプシド構造は、本明細書において、「ＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰ」と呼ばれる。具体的な例は、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質、ＭＳ２被覆タンパク質、ＰＰ７被覆タンパク質、またはＡＰ２０５被覆タンパク質のＶＬＰである。Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質の具体的なケースにおいて、例えば、ＶＬＰは、Ｑｂｅｔａ  ＣＰサブユニット（抑制を介してさらに長いＡ１タンパク質のあらゆる発現を不可能にするＴＡＡ停止コドンを例えば含有するＱｂｅｔａ  ＣＰ遺伝子の発現によって生成する、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６）を参照されたい）からのみ集合し得るか、または、カプシド集合体内にＡ１タンパク質サブユニットをさらに含有し得る。通常、カプシド形成を確実にするためには、カプシド集合体内のＱｂｅｔａ  ＣＰに対するＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質のパーセンテージは限定される。
【０１２１】
本開示の文脈における免疫原性担体として適しているＶＬＰの例には、限定はしないが、Ｑｂｅｔａ、ＭＳ２、ＰＰ７、ＡＰ２０５、および他のバクテリオファージ被覆タンパク質のＶＬＰ、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドタンパク質およびコアタンパク質（Ｕｌｒｉｃｈら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．５０：１４１〜１８２（１９９８））、麻疹ウイルス（Ｗａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅ  １６０：１７３〜１７８（１９９５））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５，０７１，６５１号および米国特許第５，３７４，４２６号）、口蹄疫ウイルス（Ｔｗｏｍｅｙら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：１６０３〜１６１０（１９９５））、ノーウォークウイルス（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１５８０〜１５８３（１９９０）；Ｍａｔｓｕｉ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：１４５６〜１４６１（１９９１））、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／３０５２３）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌ、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（ＷＯ９２／１１２９１）、ヒトパピローマウイルス（ＷＯ９８／１５６３１）、ヒトポリオーマウイルス（Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（３）：３８１〜３８６（１９９９）；Ｓａｓｎａｕｓｋａｓ  Ｋ．ら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ「Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」．Ｂｅｒｌｉｎ、Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２６〜２９（２００１））、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒファージ、ＧＡファージ、ＡＰ２０５ファージ、特にＱｂｅｔａファージ、ササゲクロロティックモトルウイルス、ササゲモザイクウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ウシパピローマウイルス、ブタパルボウイルス、パルボウイルス、例えばＢ１９、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、およびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、カリシウイルス（例えば、ノーウォークウイルス、ウサギ出血病ウイルス［ＲＨＤＶ］）、動物ヘパドナウイルスコア抗原ＶＬＰ、限定はしないがタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）、およびジョンソングラスモザイクウイルス（ＪＧＭＶ）を含む糸状／棒状植物ウイルス、昆虫ウイルス、例えば、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）およびテトラウイルス、ポリオーマウイルス、例えばマウスポリオーマウイルス（ＭＰｙＶ）、マウス肺向性ウイルス（ＭＰｔＶ）、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、およびＪＣウイルス（ＪＣＶ）が含まれる。
【０１２２】
当業者には容易に明らかとなろうが、本発明の免疫原性担体として用いられるＶＬＰは、何らかの具体的な形態に限定されるわけではない。粒子は、化学的に、または天然もしくは非天然であり得る生物学的プロセスを介して合成することができる。例えば、このタイプの実施形態には、ウイルス様粒子またはその組換え形態が含まれる。より具体的な実施形態において、ＶＬＰは、ＶＬＰを形成することが知られているあらゆるウイルスの組換えポリペプチドを含み得るか、あるいはこれらからなり得る。ウイルス様粒子はさらに、このようなポリペプチドの１つまたは複数の断片およびこのようなポリペプチドの変異体を含み得るか、あるいはこれらからなり得る。ポリペプチドの変異体は、例えば、それらの野生型対応物と、アミノ酸レベルで、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を有し得る。本発明における使用に適した変異体ＶＬＰは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、あらゆる生物に由来し得、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１２３】
本発明に従った好ましいＶＬＰには、ＨＢＶのカプシドタンパク質もしくは表面抗原（それぞれＨＢｃＡｇおよびＨＢｓＡｇ）、またはそれらの組換えタンパク質もしくは断片、およびＲＮＡファージの被覆タンパク質またはその組換えタンパク質もしくは断片、より好ましくは、Ｑｂｅｔａの被覆タンパク質またはその組換えタンパク質もしくは断片が含まれる。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇタンパク質である。本発明の文脈において用いられ得るＨＢｃＡｇタンパク質の例は、当業者が容易に決定することができる。例には、限定はしないが、Ｙｕａｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１０１２２〜１０１２８（１９９９））、ならびにＷＯ００／１９８３３３、ＷＯ００／１７７１５８、ＷＯ００／２１４４７８、ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０１／８５２０８、ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、およびＷＯ０３／０２４４８１において記載されているＨＢＶコアタンパク質が含まれる。本発明における使用に適したＨＢｃＡｇは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、あらゆる生物に由来し得、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１２５】
本開示の文脈において用いられ得る、特に目的のＨＢｃＡｇ変異体は、１つまたは複数の天然に存在するシステイン残基が欠失しているかまたは置換されている変異体である。遊離システイン残基が多くの化学的副反応に関与し得ることは、当技術分野において周知であり、前記化学的副反応には、ジスルフィド交換、他の物質との組み合わせ療法において例えば注射もしくは形成される化学物質もしくは代謝産物との反応、またはＵＶ光への曝露の際の直接的な酸化およびヌクレオチドとの反応が含まれる。したがって、ＨＢｃＡｇが核酸を結合する強い傾向を有するという事実を特に考慮すると、毒性付加物が生じ得る。こうして、毒性付加物は多様な種間に分布し、それぞれ独立して低濃度で存在し得るが、総合すると毒性レベルに達する。上記のことを考慮すると、天然に存在するシステイン残基を除去するように修飾されているＨＢｃＡｇをワクチン組成物において用いる１つの利点は、抗原または抗原決定基が付着している場合に毒性種が結合し得る部位が、減数するかまたは完全に除去されることである。
【０１２６】
さらに、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ末端リーダー配列を欠く、ＨＢｃＡｇのプロセシングされた形態もまた、特に、プロセシングが生じない条件下でＨＢｃＡｇが生産される場合（例えば、細菌系における発現）に、本発明の文脈において用いることができる。
【０１２７】
本発明に従った他のＨＢｃＡｇ変異体には、ｉ）既知のコンピュータプログラムを従来のように用いて、野生型ＨＢｃＡｇアミノ酸配列の１つに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を有するポリペプチド配列、またはその小部分、ｉｉ）１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３４個、または３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されている突然変異体を含む、Ｃ末端トランケーション突然変異体、ｉｉ）１個、２個、５個、７個、９個、１０個、１２個、１４個、１５個、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されている突然変異体を含む、Ｎ末端トランケーション突然変異体、ｉｉｉ）１個、２個、５個、７個、９個、１０個、１２個、１４個、１５個、または１７個のアミノ酸がＮ末端から除去されており、１個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３４個、または３５個のアミノ酸がＣ末端から除去されているＨＢｃＡｇを含む、Ｎ末端およびＣ末端の両方でトランケーションされている突然変異体が含まれる。
【０１２８】
本発明の範囲内にあるさらに他のＨＢｃＡｇ変異体タンパク質は、外来エピトープの免疫原の提示を増強させるように修飾された変異体であって、４つのアルギニン反復の１つまたは複数が欠失しているがＣ末端システインは保持されている変異体（例えば、ＷＯ０１／９８３３３を参照されたい）、ならびに、ＷＯ０２／１４４７８、ＷＯ０３／１０２１６５、およびＷＯ０４／０５３０９１において記載されているものなどの、Ｃ末端がトランケーションされたキメラＨＢｃＡｇである。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、ＨＢｓＡｇタンパク質である。本発明の文脈において用いられ得るＨＢｓＡｇタンパク質は、当業者が容易に決定することができる。例には、限定はしないが、ＵＳ５７９２４６３、ＷＯ０２／１０４１６、およびＷＯ０８／０２０３３１において記載されているＨＢＶ表面タンパク質が含まれる。本発明における使用に適したＨＢｓＡｇは、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、あらゆる生物に由来し得、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたは抗原性ＰＣＳＫ９ポリペプチドと組み合わせて用いられる免疫原性担体は、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質である。
【０１３１】
Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されると、カプシドに自己集合することが明らかにされた（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ  ＴＭ．ら、ＧＥＮＥ  １３７：１３３〜１３７（１９９３））。得られたカプシドまたはウイルス様粒子は、２５ｎｍの直径およびＴ＝３の準対称を有する２０面体のファージ様カプシド構造を示した。さらに、ファージＱｓｓの結晶構造が明らかにされている。カプシドは１８０コピーの被覆タンパク質を含有し、前記被覆タンパク質は、ジスルフィド架橋によって共有結合性のペンタマーおよびヘキサマーにおいて連結して（Ｇｏｌｍｏｈａｍｍａｄｉ，Ｒ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：５４３５５５４（１９９６））、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のカプシドの顕著な安定性をもたらす。Ｑｂｅｔａカプシドタンパク質はまた、有機溶媒および変性剤に対する飛び抜けた耐性を示す。Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のカプシドの高い安定性は、本発明に従った哺乳動物およびヒトの免疫化およびワクチン接種におけるその使用にとって、有利な特徴である。
【０１３２】
本発明の文脈において用いられ得るＱｂｅｔａ被覆タンパク質の例は、当業者が容易に決定することができる。例は、ＷＯ０２／０５６９０５、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１（参照することによってその全体が組み込まれる）において幅広く記載されており、限定はしないが、ＰＩＲデータベースにおいて開示されているアミノ酸配列、すなわち、Ｑｂｅｔａ  ＣＰに関しては受託番号ＶＣＢＰＱｂｅｔａ、Ｑｂｅｔａ  ＡＩタンパク質に関しては受託番号ＡＡＡ１６６６３、および、Ｎ末端のメチオニンが切断されている変異体タンパク質を含むそれらの変異体、１００個、１５０個、または１８０個ものアミノ酸がなくなっているＱｂｅｔａ  Ａ１のＣ末端トランケーション形態、欠失もしくは置換によるリジン残基の除去または置換もしくは挿入によるリジン残基の付加によって修飾されている変異体タンパク質（例えば、参照することによってその全体が組み込まれるＷＯ０３／０２４４８１において開示されているＱｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９を参照されたい）、および上記のＱｂｅｔａコアタンパク質のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％の同一性を示す変異体を含む。本発明における使用に適した変異体Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質は、それらの生物が「ウイルス様粒子」を形成し得る限り、あらゆる生物に由来し得、本明細書において定義される「免疫原性担体」として用いられ得る。
【０１３３】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、化学的コンジュゲーションを介して、または遺伝子操作された融合パートナーの発現によって、免疫原性担体にカップリングし得る。カップリングは、必ずしも直接的なものである必要はないが、リンカー配列を介して生じ得る。より一般的には、抗原性ペプチドが免疫原性担体に融合しているか、コンジュゲートしているか、さもなければ付着しているケースにおいて、スペーサー配列またはリンカー配列が、抗原性ペプチドの一方または両方の末端に典型的に付加される。このようなリンカー配列は、通常、プロテアソーム、エンドソームのプロテアーゼ、または細胞の他の小胞状成分によって認識される配列を含む。
【０１３４】
１つの実施形態において、本発明のペプチドは、免疫原性担体との融合タンパク質として発現する。ペプチドの融合は、免疫原性担体の一次配列内への挿入によって、または免疫原性担体のＮ末端もしくはＣ末端への融合によって行うことができる。以降、免疫原性担体へのペプチドの融合タンパク質に言及する場合、サブユニット配列のいずれかの末端への融合または担体配列内へのペプチドの内部挿入が包含される。融合は、以降言及される場合、担体の配列内に抗原性ペプチドを挿入することによって、担体の配列の一部を抗原性ペプチドで置換することによって、または欠失、置換、もしくは挿入の組み合わせによって、実施することができる。
【０１３５】
免疫原性担体がＶＬＰである場合、キメラ抗原性ペプチド−ＶＬＰサブユニットは通常、ＶＬＰに自己集合し得る。ＶＬＰのサブユニットに融合したエピトープを提示するＶＬＰはまた、本明細書において、キメラＶＬＰと呼ばれる。例えば、ＥＰ０４２１６３５Ｂは、ウイルス様粒子内の外来ペプチド配列を提示するための、キメラヘパドナウイルスコア抗原粒子の使用を記載している。
【０１３６】
隣接アミノ酸残基を、抗原性ペプチドの配列のいずれかの末端に付加して、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの末端に融合するか、または、ＶＬＰのサブユニットの配列にこのようなペプチド性配列を内部挿入することができる。グリシン残基およびセリン残基は、融合されるペプチドに付加される隣接配列において用いるために特に好ましいアミノ酸である。グリシン残基はさらなる柔軟性を付与し、この柔軟性は、ＶＬＰサブユニットの配列内への外来配列の融合の潜在的な不安定化効果を弱め得る。
【０１３７】
本発明の具体的な実施形態において、免疫原性担体は、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ末端への抗原性ペプチドの融合タンパク質（Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７１１６３（１９９９））またはいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）内の挿入への抗原性ペプチドの融合タンパク質が記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，ＰおよびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８１１４（２００１）、ＷＯ０１／９８３３３）、本発明の具体的な実施形態である。ＭＩＲにおける欠失を伴うＨＢｃＡｇの天然由来の変異体もまた記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、Ｎ末端またはＣ末端への融合、および野生型ＨＢｃＡｇと比較した欠失部位に対応するＭＩＲの位置での挿入は、本発明のさらなる実施形態である。Ｃ末端への融合もまた記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。当業者であれば、従来の分子生物学的技術を用いて融合タンパク質を構築する方法についてのガイダンスを容易に見出すであろう。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコードし、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用なベクターおよびプラスミドが記載されており（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．および＃３８；Ｇｒｅｎｓ，Ｅ．Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；Ｎｅｙｒｉｎｃｋ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：１１５７〜１１６３（１９９９））、本発明の実施において用いられ得る。自己集合の効率の最適化およびＨＢｃＡｇのＭＩＲ内に挿入されるエピトープの提示の最適化にとって重要な因子は、挿入部位の選択、および挿入の際にＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失されるアミノ酸の数（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）、ＥＰ０４２１６３５、米国特許第６，２３１，８６４号）、または言い換えると、ＨＢｃＡｇのどのアミノ酸が新たなエピトープで置換されるべきかである。例えば、ＨＢｃＡｇのアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５、または８０〜８１の、外来エピトープでの置換が記載されている（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１）；ＥＰ０４２１６３５；ＵＳ６，２３１，８６４；ＷＯ００／２６３８５）。ＨＢｃＡｇは長いアルギニン尾部を含有し（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））、これは、カプシドの集合には不必要であり、核酸を結合し得る（Ｐｕｍｐｅｎｓ，Ｐ．およびＧｒｅｎｓ，Ｅ．、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４（２００１））。このアルギニン尾部を含んでいるかまたは欠いているＨＢｃＡｇは、共に、本開示の実施形態である。
【０１３８】
本開示の別の具体的な実施形態において、免疫原性担体は、ＲＮＡファージのＶＬＰ、好ましくはＱｂｅｔａのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要な被覆タンパク質は、細菌、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現すると、自発的にＶＬＰに集合する。抗原性ペプチドがＱｂｅｔａのトランケーション形態のＡ１タンパク質のＣ末端に融合しているか、またはＡ１タンパク質内に挿入されている、融合タンパク質構築物が記載されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンでの抑制によって生成し、３２９アミノ酸長、またはＮ末端メチオニンの切断を考慮すると、３２８アミノ酸長を有する。アラニン（Ｑｂｅｔａ  ＣＰ遺伝子によってコードされる２番目のアミノ酸）の前のＮ末端メチオニンの切断が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において通常生じ、これは、Ｑｂｅｔａ被覆タンパク質のＮ末端にも当てはまる。Ａ１遺伝子の一部である、ＵＧＡアンバーコドンの３’は、１９５アミノ酸長を有するＣＰ伸長をコードする。ＣＰ伸長の７２位と７３位との間への抗原性ペプチドの挿入は、本発明のさらなる実施形態をもたらす（Ｋｏｚｌｏｖｓｋａ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：９〜１５（１９９６））。Ｃ末端がトランケートされたＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質のＣ末端での抗原性ペプチドの融合は、本発明のさらに好ましい実施形態をもたらす。例えば、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））は、１９位でトランケートされたＱｂｅｔａ  ＣＰ伸長のＣ末端でエピトープが融合されている、Ｑｂｅｔａ  Ａ１タンパク質融合体を記載している。
【０１３９】
Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら（Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６））によって記載されているように、融合エピトープを提示する粒子の集合体は、典型的には、モザイク粒子を形成するために、ＡＩタンパク質−抗原融合体および野生型ＣＰの両方の存在を必要とする。しかし、抗原性ペプチドが融合したＶＬＰサブユニットのみからなるウイルス様粒子、ここでは特に、ＲＮＡファージＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰを含む実施形態もまた、本発明の範囲内である。
【０１４０】
モザイク粒子の生産は、多くの手段で実施することができる。Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）は、３つの方法を記載しており、これらはすべて、本発明の実施において用いることができる。第１のアプローチにおいて、ＶＬＰ上での融合エピトープの効率的な提示は、ＴｒｐへのＵＧＡコドンの翻訳をもたらすクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコードするプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Ｓｍｉｌｅｙ  Ｂ．Ｋ．ら、Ｇｅｎｅ  １３４：３３〜４０（１９９３）））を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株における、ＣＰとＣＰ伸長との間にＵＧＡ停止コドンを有するＱｂｅｔａ  Ａ１タンパク質融合体をコードするプラスミドの発現によって仲介される。別のアプローチにおいて、ＣＰ遺伝子の停止コドンがＵＡＡに修飾され、Ａ１タンパク質−抗原融合体を発現する第２のプラスミドが共形質転換される。第２のプラスミドは、異なる抗生物質耐性をコードし、複製の起点は、第１のプラスミドに適合する。第３のアプローチにおいて、ＣＰおよびＡ１タンパク質−抗原融合体は、バイシストロニックな様式でコードされており、Ｋｏｚｌｏｖｓｋａら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、３９：９〜１５（１９９６）のＦｉｇｕｒｅ  １において記載されているように、Ｔｒｐプロモーターなどのプロモーターに機能可能に連結していてもよい。
【０１４１】
抗原または抗原決定基の融合に適したさらなるＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８１において記載されており、バクテリオファージｆｒ、ＲＮＡファージＭＳ−２、パピローマウイルスのカプシドタンパク質、レトロトランスポゾンＴｙ、酵母、およびまた、レトロウイルス様粒子、ＨＩＶ２  Ｇａｇ、ササゲモザイクウイルス、パルボウイルスＶＰ２  ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇを含む（ＵＳ４，７２２，８４０、ＥＰ００２０４１６Ｂ１）。本発明の実施に適したキメラＶＬＰの例はまた、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：１（１９９６）において記載されているものである。本発明における使用を意図したＶＬＰのさらなる例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ  ＧＡＧ、タバコモザイクウイルス、ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ロタウイルス、およびノーウォークウイルスのウイルス様粒子である。
【０１４２】
免疫原性担体にカップリングしているかまたはしていない、本発明に従った、組換えによって発現したあらゆる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドでは、前記ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸もまた、その核酸を含む発現ベクター、およびその発現ベクター（自律的にまたは染色体に挿入された）を含有する宿主細胞がそうであるように、本発明の一態様を形成する。ペプチドまたはタンパク質を上記の宿主細胞において発現させ、それから免疫原を単離することによる、ペプチドまたはタンパク質を組換えによって生産する方法は、本発明のさらなる態様である。完全長の非変性ＰＣＳＫ９分子またはそれをコードする完全長の非変性ＤＮＡ配列は、本発明によって網羅されていない。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、当技術分野において周知の技術を用いて、免疫原性担体に化学的にカップリングされる。コンジュゲーションは、単一点でのコンジュゲーション（例えば、Ｎ末端点またはＣ末端点）を介してペプチドの自由な動きを可能にするように生じ得るか、またはペプチドの両端が免疫原性担体タンパク質もしくはＶＬＰなどの足場構造にコンジュゲートしているロックダウン構造として生じ得る。コンジュゲーションは、当業者に知られているコンジュゲーション化学を介して、例えば、システイン残基、リジン残基、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸などの、コンジュゲーション点として一般に知られている他のカルボキシ部分を介して、生じ得る。したがって、例えば、共有結合による直接的なカップリングのために、ＣＤＡＰおよびＳＰＤＰなどの一般に市販されているヘテロ二機能性リンカーを利用して（製造者の指示を用いて）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［ｙ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することが可能である。アシルヒドラジンペプチド誘導体を介する、タンパク質担体へのペプチド、特に環化ペプチドのコンジュゲーションの例は、ＷＯ０３／０９２７１４において記載されている。カップリング反応の後、免疫原は、透析方法、ゲル濾過方法、画分化方法などによって、容易に単離および精製することができる。システイン残基で終わっているペプチド（好ましくは、環化領域外のリンカーを有する）は、マレイミド化学を介して、担体タンパク質に共有結合によってコンジュゲートし得る。
【０１４４】
免疫原性担体がＶＬＰである場合、同一のアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有するいくつかの抗原性ペプチドを、単一のＶＬＰ分子にカップリングさせて、ＷＯ００／３２２２７、ＷＯ０３／０２４４８１、ＷＯ０２／０５６９０５、およびＷＯ０４／００７５３８において記載されているように、方向付けされた様式で、いくつかの抗原決定基を提示する、反復性で整列した構造を好ましくはもたらすことができる。
【０１４５】
好ましい実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、化学的架橋、典型的にはおよび好ましくはヘテロ二機能性架橋剤を用いることによる化学的架橋によって、ＶＬＰに結合している。いくつかのヘテロ二機能性架橋剤が、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ヘテロ二機能性架橋剤は、第１の付着部位と、すなわちＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリジン残基の側鎖アミノ基と反応し得る官能基、および、好ましい第２の付着部位と、すなわち、抗原性ペプチドに融合しており、かつまた還元によって反応に利用可能とされていてもよいシステイン残基と反応し得る、さらなる官能基を含有する。典型的には誘導体化と呼ばれる、手順の第１のステップは、ＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化型担体とも呼ばれる活性化されたＶＬＰである。第２のステップにおいて、未反応の架橋剤が、ゲル濾過または透析などの通常の方法を用いて除去される。第３のステップにおいて、抗原性ペプチドが活性化ＶＬＰと反応し、このステップは、典型的にはカップリングステップと呼ばれる。未反応の抗原性ペプチドは、例えば透析によって、第４のステップにおいて除去されてもよい。いくつかのヘテロ二機能性架橋剤が、当技術分野において知られている。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、および、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能で、アミノ基に対して反応性である１つの官能基とシステイン残基に対して反応性である１つの官能基とを有する、他の架橋剤が含まれる。上記の架橋剤は全て、チオエーテル連結の形成をもたらす。
【０１４６】
本発明の実施において適している別のクラスの架橋剤は、カップリングの際に抗原性ペプチドとＶＬＰとの間にジスルフィド連結を導入することによって特徴付けされる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。架橋剤でのＶＬＰの誘導体化の程度は、各反応パートナーの濃度、他方の試薬に対する一方の試薬の過剰度、ｐＨ、温度、およびイオン強度などの実験条件を変化させることによって影響され得る。ワクチンの要求に適合させるために、カップリングの程度、すなわち、ＶＬＰのサブユニット当たりの抗原性ペプチドの量を、上記の実験条件を変化させることによって調節することができる。
【０１４７】
抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させる別の方法は、ＶＬＰの表面上のリジン残基と抗原性ペプチド上のシステイン残基との連結である。いくつかの実施形態において、ＶＬＰへのカップリングのために、第２の付着部位またはその一部としてシステイン残基を含有するアミノ酸リンカーを、抗原性ペプチドに融合することが必要とされ得る。通常、柔軟なアミノ酸リンカーが好ましい。アミノ酸リンカーの例は、（ａ）ＣＧＧ、（ｂ）Ｎ末端γ１リンカー、（ｃ）Ｎ末端γ３リンカー、（ｄ）Ｉｇヒンジ領域、（ｅ）Ｎ末端グリシンリンカー、（ｆ）ｎ＝０〜１２でありｋ＝０〜５である（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｎ、（ｇ）Ｎ末端グリシン−セリンリンカー、（ｈ）ｎ＝０〜３でありｋ＝０〜５でありｍ＝０〜１０でありｉ＝０〜２である（Ｇ）ｋＣ（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｉ（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ｉ）ＧＧＣ、（ｋ）ＧＧＣ−ＮＨ２、（ｌ）Ｃ末端γ１リンカー、（ｍ）Ｃ末端γ３リンカー、（ｎ）Ｃ末端グリシンリンカー、（ｏ）ｎ＝０〜１２でありｋ＝０〜５である（Ｇ）ｎＣ（Ｇ）ｋ、（ｐ）Ｃ末端グリシン−セリンリンカー、（ｑ）ｎ＝０〜３でありｋ＝０〜５でありｍ＝０〜１０であり１＝０〜２でありｏ＝０〜８である（Ｇ）ｍ（Ｓ）ｔ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ）ｏＣ（Ｇ）ｋからなる群から選択される。アミノ酸リンカーのさらなる例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（ＧＧＧＧＳ）ｎ、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎであり、全ては、第２の付着部位としてシステイン残基をさらに含有し、さらにグリシン残基を含有していてもよい。典型的には、前記アミノ酸リンカーの好ましい例は、Ｎ末端γ１：ＣＧＤＫＴＨＴＳＰＰ、Ｃ末端γ１：ＤＫＴＨＴＳＰＰＣＧ、Ｎ末端γ３：ＣＧＧＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰ、Ｃ末端γ３：ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＧＧＡＰＧＧＣＧ、Ｎ末端グリシンリンカー：ＧＣＧＧＧＧ、およびＣ末端グリシンリンカー：ＧＧＧＧＣＧである。
【０１４８】
疎水性抗原性ペプチドがＶＬＰに結合する場合に、本発明の実施において特に適している他のアミノ酸リンカーは、Ｎ末端リンカーではＣＧＫＫＧＧもしくはＣＧＤＥＧＧであり、またはＣ末端リンカーではＧＧＫＫＧＣおよびＧＧＥＤＧＣである。Ｃ末端リンカーでは、末端システインは、Ｃ末端でアミド化されていてもよい。
【０１４９】
本発明のいくつかの実施形態において、ペプチドのＣ末端のＧＧＣＧリンカー、ＧＧＣリンカー、もしくはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカー、またはペプチドのＮ末端のＣＧＧが、アミノ酸リンカーとして好ましい。通常、グリシン残基が、大きなアミノ酸同士の間に挿入され、システインは、カップリング反応におけるさらに大きなアミノ酸の潜在的な立体障害を避けるための、第２の付着部位として用いられる。本発明のさらなる実施形態において、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２は、抗原性ペプチドのＣ末端に融合される。
【０１５０】
抗原性ペプチド上に存在するシステイン残基は、活性化されたＶＬＰ上のヘテロ二機能性架橋剤と反応するために還元状態でなくてはならず、すなわち、遊離システイン、または遊離スルフヒドリル基を有するシステイン残基が利用可能でなくてはならない。結合部位として機能するシステイン残基が酸化形態である場合、例えば、前記システイン残基がジスルフィド架橋を形成している場合、例えばＤＴＴ、ＴＣＥＰ、またはｐ−メルカプトエタノールでのこのジスルフィド架橋の還元が必要である。ＷＯ０２／０５６９０において記載されているように、低濃度の還元剤がカップリングに適合しており、当業者は知っているであろうが、より高い濃度はカップリング反応を阻害し、このケースでは、カップリングの前に、例えば透析、ゲル濾過、または逆相ＨＰＬＣによって、還元剤が除去されるか、またはその濃度が下げられなくてはならない。
【０１５１】
上記の方法に従ってヘテロ二機能性架橋剤を用いることによって抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させると、方向付けされた様式でＶＬＰに抗原性ペプチドがカップリングする。抗原性ペプチドをＶＬＰに結合させる他の方法には、カルボジイミドＥＤＣおよびＮＨＳを用いて抗原性ペプチドをＶＬＰに架橋する方法が含まれる。
【０１５２】
他の方法において、抗原性ペプチドは、グルタルアルデヒド、ＤＳＧＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）、またはＶＬＰのアミン基もしくはカルボキシル基に対して反応性の官能基を有する他の既知のホモ二機能性架橋剤などの、ホモ二機能性架橋剤を用いて、ＶＬＰに付着させられる。
【０１５３】
ＶＬＰを抗原性ペプチドに結合させる他の方法には、例えば、ＷＯ００／２３９５５において記載されているように、ＶＬＰがビオチン化されており、抗原性ペプチドがストレプトアビジン融合タンパク質として発現している方法、または抗原性ペプチドおよびＶＬＰの両方がビオチン化されている方法が含まれる。このケースにおいて、ストレプトアビジンに対する抗原性ペプチドの比率を調節することによって、抗原性ペプチドをストレプトアビジンまたはアビジンにまず結合させ、それによって、遊離結合部位が、次のステップにおいて添加されるＶＬＰの結合に依然として利用可能となるようにすることができる。あるいは、全ての成分を「ワンポット」反応で混合することができる。可溶性形態の受容体および可能性形態のリガンドが利用可能であり、かつＶＬＰまたは抗原性ペプチドに架橋され得る、他のリガンド−受容体対を、抗原性ペプチドをＶＬＰに結合するための結合剤として用いることができる。あるいは、リガンドまたは受容体のいずれかを抗原性ペプチドに融合して、受容体またはリガンドのいずれかにそれぞれ化学的に結合しているかまたは融合しているＶＬＰへの結合を仲介させることができる。融合はまた、挿入または置換によって実施することができる。
【０１５４】
立体的に可能であれば、ＲＮＡファージのＶＬＰの曝露されたリジン残基を好ましくは介して、１つまたはいくつかの抗原分子を、ＲＮＡファージ被覆タンパク質のカプシドまたはＶＬＰの１つのサブユニットに付着させることができる。ＲＮＡファージの被覆タンパク質のＶＬＰの、特にＱＰ被覆タンパク質のＶＬＰの特異的な特徴は、したがって、サブユニット当たりいくつかの抗原がカップリングする可能性である。これによって、密な抗原アレイの生成が可能になる。
【０１５５】
Ｑ被覆タンパク質のＶＬＰまたはカプシドは、それらの表面上に、カプシドの内部を指しＲＮＡと相互作用する３つのリジン残基、およびカプシドの外部に曝露された４つの他のリジン残基との規定されたトポロジーを伴って、規定された数のリジン残基を提示する。これらの規定された特性は、リジン残基がＲＮＡと相互作用する粒子内部への抗原の付着よりも、粒子の外部への抗原の付着に有利である。他のＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰもまた、それらの表面上に、規定された数のリジン残基を有し、これらのリジン残基の規定されたトポロジーを有する。
【０１５６】
本発明のさらなる実施形態において、第１の付着部位はリジン残基であり、かつ／または第２の付着はスルフヒドリル基もしくはシステイン残基を含む。本発明のさらなる実施形態において、第１の付着部位はリジン残基であり、かつ第２の付着はシステイン残基である。本発明のさらなる実施形態において、抗原または抗原決定基は、システイン残基を介して、ＲＮＡファージ被覆タンパク質のＶＬＰのリジン残基に、特にＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰに結合する。
【０１５７】
ＲＮＡファージに由来するＶＬＰの別の利点は、細菌における発現収量が高いことであり、これにより、手頃なコストで大量の材料が生産される。さらに、担体としてＶＬＰを用いることで、可変の抗原密度をそれぞれ有する強固な抗原アレイおよびコンジュゲートが形成される。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、ここでは特にＲＮＡファージＱｂｅｔａ被覆タンパク質のＶＬＰの使用により、非常に高いエピトープ密度が達成される。
【０１５８】
本発明の実施形態に従うと、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原を生成するために、直接的に、または本明細書において開示されるペプチドリンカーの１つを介して、ＣＲＭ１９７に連結しており、好ましくは化学的に架橋されている。１つの実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、本明細書において記載されている化学的架橋剤によって、好ましくは上記に開示されるヘテロ二機能性架橋剤を用いることによって、ＣＲＭ１９７に連結している。
【０１５９】
ＣＲＭ１９７と共に用いるための好ましい二機能性架橋剤は、ＢＡＡＮＳ（ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、および、例えばＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から入手可能な他の架橋剤である。本発明の好ましい実施形態において、ヘテロ二機能性架橋剤は、ＢＡＡＮＳまたはＳＭＰＨである。
【０１６０】
あるいは、抗原性ペプチドとＣＲＭ１９７との間のジスルフィド連結の導入を可能にする適切な架橋剤もまた、本発明の文脈において用いることができる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰおよびＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。
【０１６１】
特定の実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの配列がシステインを含む場合、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、前記システインを介して直接的に、ＣＲＭ１９７に共有結合によって連結することができる。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、免疫原性コンジュゲートの混合物、すなわち、本発明の１つまたは複数の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドにカップリングした免疫原性担体を含み得る。したがって、これらの免疫原性組成物は、アミノ酸配列が異なる免疫原性担体からなり得る。例えば、「野生型」ＶＬＰタンパク質と、１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている（例えば、欠失、挿入、または置換されている）修飾されたＶＬＰタンパク質とを含むワクチン組成物が調製され得る。あるいは、同一の免疫原性担体を用いことができるが、それらは、異なるアミノ酸配列の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドにカップリングされている。
【０１６３】
したがって、本発明はまた、ｉ）本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを提供すること、ｉｉ）本発明に従った免疫原性担体、好ましくはＶＬＰを提供すること、およびｉｉｉ）前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと前記免疫原性担体とを組み合わせることを含む、本発明に従った免疫原を生産するための方法に関する。１つの実施形態において、前記組み合わせステップは、化学的架橋を介して、好ましくはヘテロ二機能性架橋剤を介して行われる。
【０１６４】
本発明の１つの実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体分子に連結している。１つの実施形態において、前記免疫原性担体は、本明細書において記載されるあらゆる免疫原性担体からなる群から選択される。別の実施形態において、前記免疫原性担体は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン、グロブリン、チログロブリン、ヘモグロビン、ヘモシアニン（特に、キーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］）、およびウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７突然変異体、破傷風毒素、キーホールリンペットヘモシアニン、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）である。さらに好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、ＤＴ、ＣＲＭ１９７、または、ＨＢｃＡｇ  ＶＬＰ、ＨＢｓＡｇ  ＶＬＰ、Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰ、ＰＰ７  ＶＬＰ、ＰＰＶ  ＶＬＰ、ノーウォークウイルスＶＬＰ、もしくは本明細書において開示されるあらゆる変異体からなる群から選択されるＶＬＰである。さらに好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、バクテリオファージＶＬＰ、例えば、Ｑｂｅｔａ  ＣＰ、Ｑｂｅｔａ  Ａ１、Ｑｂｅｔａ−２４０、Ｑｂｅｔａ−２４３、Ｑｂｅｔａ−２５０、Ｑｂｅｔａ−２５１、およびＱｂｅｔａ−２５９（ＷＯ０３／０２４４８１において開示されている）からなる群から選択されるＱｂｅｔａ  ＶＬＰ、またはＰＰ７である。
【０１６５】
別の好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、ＣＲＭ１９７である。
【０１６６】
１つの実施形態において、前記免疫原性担体は、直接的に、またはリンカーを介して、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドに共有結合によって連結している。１つの実施形態において、前記免疫原性担体は、本明細書において記載されるように、融合タンパク質の発現によって、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドに連結している。別の実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、本明細書において記載される化学的架橋、好ましくはヘテロ二機能性架橋剤を用いることによる化学的架橋によって、免疫原性担体、好ましくはＶＬＰに連結している。いくつかのヘテロ二機能性架橋剤が、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、ヘテロ二機能性架橋剤は、第１の付着部位と、すなわちＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットのリジン残基の側鎖アミノ基と反応し得る官能基、および、好ましい第２の付着部位と、すなわち、還元によって反応に利用可能とされている抗原性ペプチドに融合しているシステイン残基と反応し得る、官能基を含有する。
【０１６７】
リンカーを含む本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチド
本発明の１つの実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、そのＮ末端またはそのＣ末端またはＮ末端およびＣ末端の両方に、化学的架橋反応において免疫原性担体の付着部位と反応し得るリンカーを含む。１つの実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式（Ｇ）ｎＣ、（Ｇ）ｎＳＣ、または（Ｇ）ｎｋ、好ましくは（Ｇ）ｎＣを有するリンカーをそのＣ末端に含み、前記式において、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは０、１、２、および３からなる群において選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、前記式はシステインを表す）。好ましくは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカーをそのＣ末端に含む。
【０１６８】
本発明の別の実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式Ｃ（Ｇ）ｎ、ＣＳ（Ｇ）ｎ、またはＫ（Ｇ）ｎ、好ましくはＣ（Ｇ）ｎを有するリンカーをそのＮ末端に含み、前記式において、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは０、１、２、および３からなる群において選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、式はシステインを表す）。好ましくは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式ＣＧＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧ、またはＣを有するリンカーをそのＮ末端に含む。
【０１６９】
別の実施形態において、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式（Ｇ）ｎＣ、（Ｇ）ｎＳＣ、または（Ｇ）ｎＫ、好ましくは（Ｇ）ｎＣを有するリンカー（前記式において、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは０、１、２、および３からなる群において選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、前記式はシステインを表す））をそのＣ末端に含み、式Ｃ（Ｇ）ｎ、ＣＳ（Ｇ）ｎ、またはＫ（Ｇ）ｎ、好ましくはＣ（Ｇ）ｎを有するリンカー（前記式において、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは０、１、２、および３からなる群において選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、式はシステインを表す））をそのＮ末端に含む。好ましくは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、式ＣＧＧＧ、ＣＧＧ、ＣＧ、またはＣを有するリンカーをそのＮ末端に含み、式ＧＧＧＣ、ＧＧＣ、ＧＣ、またはＣを有するリンカーをそのＣ末端に含む。好ましくは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、そのＮ末端にシステインを含み、そのＣ末端にシステインを含む。
【０１７０】
このようなリンカーをさらに含む前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの代表は、配列番号３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、および４１９で開示される。
【０１７１】
このようなリンカーをさらに含む前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの代表は、配列番号３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、および３２８で開示される。
【０１７２】
リンカーを含む好ましい抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１７、３２２、３２３、３２４、４０１、４０２、４０３、４１３、４１４、４１５、および４１６で開示される。
【０１７３】
リンカーを含む好ましい抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１７、３２２、３２３、および３２４で開示される。
【０１７４】
リンカーを含む最も好ましい抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、配列番号３１７、３２２、４０２、および４１３で開示される。
【０１７５】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは環化されている。１つの実施形態において、環化された抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体に付着している。１つの実施形態において、前記環化された抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、共有結合によって免疫原性担体に付着している。１つの実施形態において、前記環化された抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、担体へのそのアミノ酸の側鎖の１つの共有結合によって、免疫原性担体に付着している。１つの実施形態において、様々な数のグリシン残基および１つのシステイン残基を含むシステイン、ＧＣ断片、またはＣＣ断片が、環化されたＰＣＳＫ９ペプチドに付加されて、付加されたシステインを介する免疫原性担体への共有結合を可能にする。
【０１７６】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは環化されており、システイン、（Ｇ）ｎＣ断片、またはＣ（Ｇ）ｎ断片を含み、前記式において、ｎは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０からなる群、好ましくは０、１、２、３、４、および５からなる群、より好ましくは０、１、２、および３からなる群において選択される整数であり、最も好ましくは、ｎは０または１である（ｎが０に等しい場合、式はシステインを表す）。
【０１７７】
このような立体構造上拘束された抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの非限定的な例は、配列番号３１８、３１９、３２０、および３２１のペプチドである。好ましい環化されたペプチドは、配列番号３１８のペプチドである。
【０１７８】
全て本発明の範囲内にあり、様々な実施形態を構成するものである、様々なリンカーを用いる、上記の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと担体または足場とのコンジュゲーションの例を、以下に提供する：
ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＣ−足場、ペプチド−ＧＧＧＣ−足場、ペプチド−ＧＧＣ−足場、ペプチド−ＧＣ−足場、ペプチド−Ｃ−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＧＫ−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＫ−足場、ペプチド−ＧＧＧＫ−足場、ペプチド−ＧＧＫ−足場、ペプチド−ＧＫ−足場、ペプチド−Ｋ−足場、ペプチド−ＧＧＧＧＳＣ−足場、ペプチド−ＧＧＧＳＣ−足場、ペプチド−ＧＧＳＣ−足場、ペプチド−ＧＳＣ−足場、ペプチド−ＳＣ−足場、足場−ＣＳＧＧＧＧ−ペプチド、足場−ＣＳＧＧＧ−ペプチド、足場−ＣＳＧＧ−ペプチド、足場−ＣＳＧ−ペプチド、足場−ＣＳ−ペプチド、足場−ＫＧＧＧＧ−ペプチド、足場−ＫＧＧＧ−ペプチド、足場−ＫＧＧ−ペプチド、足場−ＫＧ−ペプチド、足場−Ｋ−ペプチド。
【０１７９】
１つの実施形態において、ペプチドは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドのいずれかからなり、足場は、本明細書において開示される免疫原性担体のいずれか、好ましくはＶＬＰからなる。
【０１８０】
様々なリンカーおよび二重に拘束されたペプチドを用いるコンジュゲーションの典型的な組み合わせを以下に提供し、ここで、担体は、担体の同一のモノマーまたは担体の差次的なモノマーであり得る。（以下の実施例において、ＧＣリンカーは、上記に例示されるＧＫリンカーもしくはＧＳＣリンカーのいずれか、または当業者に既知のあらゆる他のリンカーによって置換され得る）：
担体−ＣＧＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＧＣ−担体、担体−ＣＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＣ−担体、担体−ＣＧＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＧＣ−担体、担体−ＣＧＧＧ−ペプチド−ＧＧＧＣ−担体、担体−ＣＧ−ペプチド−ＧＣ−担体、担体−ＣＧ−ペプチド−Ｃ−担体、担体−Ｃ−ペプチド−Ｃ−担体。
【０１８１】
１つの実施形態において、ペプチドは、本明細書において開示される抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドのいずれかからなり、担体は、本明細書において開示される免疫原性担体のいずれか、好ましくはＶＬＰからなる。
【０１８２】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、またはこれらから本質的になる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原に関するものであり、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、チオエーテル連結を介して免疫原性担体に化学的に架橋しているシステインをそのＣ末端またはそのＮ末端に含む。好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）またはＴＴの断片Ｃ、ＰＤ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ点突然変異体、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７からなる群から選択される。好ましくは、前記免疫原性担体は、ＣＲＭ１９７である。
【０１８３】
１つの実施形態において、本発明は、１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、またはこれらから本質的になる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原に関するものであり、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）またはＢＡＡＮＳ（ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、チオエーテル連結を介して免疫原性担体に化学的に架橋しているシステインをそのＣ末端またはそのＮ末端に含む。好ましい実施形態において、前記免疫原性担体は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）またはＴＴの断片Ｃ、ＰＤ（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ点突然変異体、例えばＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３、およびＣＲＭ１０７からなる群から選択される。好ましくは、前記免疫原性担体は、ＣＲＭ１９７である。
【０１８４】
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１から３１２、３３０から３９８、および４２０から５８８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、またはこれらから本質的になる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原に関するものであり、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはさらに、架橋剤としてＳＭＰＨ（スクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート）またはＢＡＡＮＳ（ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を用いて、チオエーテル連結を介して免疫原性担体に化学的に架橋しているシステインをそのＣ末端に含み、前記連結は、ＣＲＭ１９７のリジン残基と前記抗原性ペプチドのシステイン残基との間にある。
【０１８５】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む組成物
本発明はさらに、免疫原性担体に好ましくは連結した、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドと、場合により少なくとも１つのアジュバントとを含む組成物、特に「対象免疫原性組成物」とも呼ばれる免疫原性組成物に関するものである。このような免疫原性組成物は、特に医薬組成物として製剤される場合、ＰＣＳＫ９関連性障害を予防、治療、または軽減するために有用であると見なされる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、本発明に従った対象免疫原性組成物は抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み、このペプチドは、リンカーを含んでいてもよく、配列番号１から３２８、３３０から３９８、および４０１から５８８から選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの機能的に活性な変異体を含む。いくつかの実施形態において、前記抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、免疫原性担体、好ましくはＤＴ、ＣＲＭ１９７、またはＶＬＰ、より好ましくはＨＢｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ、Ｑｂｅｔａ、ＰＰ７、ＰＰＶ、またはノーウォークウイルスのＶＬＰに連結している。
【０１８７】
好ましい実施形態において、本発明に従った対象免疫原性組成物は抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み、このペプチドは、リンカーを含んでいてもよく、ＶＬＰ、好ましくはＱｂｅｔａ  ＶＬＰに連結した、配列番号１から３２８、３３０から３９８、および４０１から５８８から選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの機能的に活性な変異体を含む。
【０１８８】
好ましい実施形態において、本発明に従った対象免疫原性組成物は抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み、このペプチドは、リンカーを含んでいてもよく、ＣＲＭ１９７に連結した、配列番号１から３２８、３３０から３９８、および４０１から５８８から選択されるアミノ酸配列ならびにそれらの機能的に活性な変異体を含む。
【０１８９】
本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む対象免疫原性組成物は、以下にさらに詳細に記載されるように、多くの手段で製剤することができる。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、対象免疫原性組成物は、単一種の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み、例えば、免疫原性組成物は、そのほぼ全てが同一のアミノ酸配列を有する抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの集団を含む。他の実施形態において、対象免疫原性組成物は、２つ以上の異なる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み、例えば、免疫原性組成物は、その集団のメンバーでアミノ酸配列が異なり得る、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの集団を含む。対象免疫原性組成物は、２から約２０個の異なる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み得、例えば、対象免疫原性組成物は、他の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列をそれぞれが有する、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１〜１５個、または１５から２０個の異なる抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含み得る。
【０１９１】
他の実施形態において、対象免疫原性組成物は、上記のように、マルチマー化されている抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む。本明細書において用いられる場合、「抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む免疫原性組成物」または「本発明の免疫原性組成物」または「対象免疫原性組成物」という用語は、免疫原性担体にカップリングしているかまたはしていない単一種（マルチマー化されているかまたはされていない）または複数種の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチド（複数可）を含む免疫原性組成物を言う。担体にカップリングしている２つ以上のペプチドが用いられる場合、ペプチドは、同一の担体分子にカップリングされ得るか、または、個別に担体分子にカップリングされて、免疫原性組成物を生産するために組み合わされ得る。
【０１９２】
本発明の別の態様は、本発明に従った免疫原を生産するための方法に関し、前記方法は、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを免疫原性担体にカップリングさせることを含む。１つの実施形態において、前記カップリングは化学的なものである。
【０１９３】
アジュバント
いくつかの実施形態において、対象免疫原性組成物は、少なくとも１つのアジュバントを含む。適切なアジュバントには、哺乳動物における、好ましくはヒトにおける使用に適したものが含まれる。ヒトにおいて用いることができる既知の適切なアジュバントの例には、必ずしも限定はしないが、アルム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖのスクアレン、０．５％ｗ／ｖのポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、０．５％ｗ／ｖのソルビタントリオレアート（Ｓｐａｎ  ８５））、ＣｐＧ含有核酸（シトシンがメチル化されていないもの）、ＱＳ２１（サポニンアジュバント）、ＭＰＬ（モノホスホリル脂質Ａ）、３ＤＭＰＬ（３−Ｏ−脱アシル型ＭＰＬ）、Ａｑｕｉｌｌａの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ０６／１３４４２３、およびＷＯ０７／０２６１９０を参照されたい）、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、Ｄ，Ｌ−ラクチドグリコリド共重合体（ＰＬＧ）微小粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＴｉｔｅｒＭａｘクラシック、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ、インターロイキンなどが含まれる。限定はしないが動物実験を含む獣医学的適用では、フロイントアジュバント、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ１１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ１９８３５Ａ）、ならびに、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン内に、細菌から抽出される３つの成分、すなわちモノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有する、ＲＩＢＩを用いることができる。
【０１９４】
組成物の有効性を増強させるためのさらなる典型的なアジュバントには、限定はしないが、（１）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下を参照されたい）または細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫刺激剤を有するかまたは有さない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子内に製剤された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）および０．５％Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミンに共有結合によって連結したムラミルトリペプチド（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有していてもよい）を含有するＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５のＣｈａｐｅｒ  １０）、（ｂ）サブミクロンのエマルジョン内にマイクロ流体化されているかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するようにボルテックスされた、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および１つまたは複数の細菌細胞壁成分、例えば、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））を含有する、ＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、Ａｂｉｓｃｏ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、もしくはＩｓｃｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）などのサポニンアジュバント、またはそれらから生成する粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）（このＩＳＣＯＭは、さらなる洗浄剤を含んでいない可能性がある、例えばＷＯ００／０７６２１）、（３）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、（４）サイトカイン、例えば、インターロキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など、（５）肺炎球菌糖と共に用いる場合には場合により実質的にアルム不存在下の（例えば、ＷＯ００／５６３５８）、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル型ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１およびＥＰ−Ａ−０６８９４５４、（６）３ｄＭＰＬと例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１、（７）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［Ｋｒｉｅ���、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ、Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００１  ３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４；Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、およびＷＯ９８／５２５８１］、すなわち、シトシンがメチル化されていない、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド、（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＷＯ９９／５２５４９、（９）オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、または、オクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）、（１０）サポニンおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）、（１１）免疫刺激物質および金属塩粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５、（１２）サポニンおよび水中油型エマルジョン、例えば、ＷＯ９９／１１２４１、（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（＋ステロールでもよい）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９、（１４）免疫刺激剤として作用して組成物の有効性を増強させる他の物質、例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチルノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチ��ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタルニニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）を含むムラミルペプチド、（１５）ポリＩ：Ｃおよび類似の化合物、例えばＨｉｌｔｏｎｏｌおよびＡｍｐｌｉｇｅｎなどのＴＬＲ３リガンドを含む、天然のまたは合成の、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）のリガンド（例えば、Ｋａｎｚｌｅｒら  ２００７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３、ｐ１５５２〜９において記載されている）が含まれる。
【０１９５】
特定の実施形態において、前記アジュバントは、免疫刺激性オリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである。本明細書において用いられるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）を言い、したがって、これらの用語は、別段の指示がない限り、ほぼ同じ意味で用いられる。免疫刺激性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、特定の好ましい塩基性背景内にあってよい、メチル化されていないシトシン−グアニンジヌクレオチドである１つまたは複数の免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有する。ＣｐＧ免疫刺激性モチーフのメチル化状態は、通常、ジヌクレオチドにおけるシトシン残基について言う。少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、リン酸結合によって３’グアニンに連結している、５’のメチル化されていないシトシンを含有し、かつＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ−９）への結合を介して免疫系を活性化する、オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を介して免疫系を活性化する１つまたは複数のメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含有し得るが、その活性化は、（１つまたは複数の）ＣｐＧモチーフがメチル化されていないようには強力ではない。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のパリンドロームを含み得、このパリンドロームは、ＣｐＧジヌクレオチドを包含し得る。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１９４，３８８号、米国特許第６，２０７，６４６号、米国特許第６，２１４，８０６号、米国特許第６，２１８，３７１号、米国特許第６，２３９，１１６号、および米国特許第６，３３９，０６８号を含む、多くの特許、公開された特許出願、および他の刊行物において記載されている。
【０１９６】
異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドが同定されている。これらは、Ａクラス、Ｂクラス、Ｃクラス、およびＰクラスと呼ばれ、以下にさらに詳細に記載される。本発明の方法は、これらの異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドの使用を含む。
【０１９７】
あらゆるクラスが、その潜在能力を増強させるＥ修飾の支配下にあり得る。Ｅ修飾は、５’末端ヌクレオチドのハロゲン置換であり得、このような置換の例には、限定はしないが、ブロモウリジン置換またはヨードウリジン置換が含まれる。Ｅ修飾にはまた、５’末端ヌクレオチドのエチルウリジン置換が含まれ得る。
【０１９８】
「Ａクラス」のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）から高レベルのインターフェロンα（ＩＦＮ−α）を誘発する能力によって機能的に特徴付けされ、ＮＫ細胞の活性化を誘発するが、Ｂ細胞の活性化に対しては最小の効果しか有さない。構造上、このクラスは、典型的には、５’末端および３’末端に、安定化したポリ−Ｇ配列を有する。これはまた、少なくとも６ヌクレオチドからなる、パリンドローム性のホスホジエステルＣｐＧジヌクレオチドを含有する配列を有し、例えば、これは、Ｙａｍａｍｏｔｏらによって記載されているＧＡＣＧＴＣ、ＡＧＣＧＣＴ、またはＡＡＣＧＴＴというヘキサマーパリンドロームの１つを含有するが、必ずしもそうであるわけではない。Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：４０７２〜６（１９９２）。ＡクラスのＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびこのクラスの典型的な配列は、共に２０００年９月２７日に出願された、米国非仮特許出願第０９／６７２，１２６号および公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／２６５２７（ＷＯ０１／２２９９０）において記載されている。
【０１９９】
１つの実施形態において、本発明の「Ａクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ  ３’という核酸配列を有する。
【０２００】
Ａクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例には、
５’Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｇ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ  ３’が含まれ、ここで、＊はホスホロチオエート結合であり、＿はホスホジエステル結合である。
【０２０１】
本発明のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、上記で広く記載され、かつ公開されたＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１５７０およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１９７９１ならびにＵＳＰ６，１９４，３８８、ＵＳＰ６，２０７，６４６、ＵＳＰ６，２１４，８０６、ＵＳＰ６，２１８，３７１、ＵＳＰ６，２３９，１１６、およびＵＳＰ６，３３９，０６８において開示されているものである。典型的な配列には、限定はしないが、これらの後者の出願および特許において開示されているものが含まれる。
【０２０２】
１つの実施形態において、本発明の「Ｂクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ  ３’（配列番号５８９）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ  ３’（配列番号５９０）または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ  ３’（配列番号５９１）または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ  ３’（配列番号５９２）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡ  ３’（配列番号５９３）
という核酸配列を有する。
【０２０３】
あらゆるこれらの配列において、連結の全ては、全てホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態において、あらゆるこれらの配列において、連結の１つまたは複数は、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間で半軟性のＣｐＧオリゴヌクレオチドを作製する、ホスホジエステルであり得る。あらゆるこれらの配列において、エチルウリジンまたはハロゲンが５’Ｔで置換し得、ハロゲン置換の例には、限定はしないが、ブロモウリジン置換またはヨードウリジン置換が含まれる。
【０２０４】
Ｂクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例には、
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ  ３’または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ  ３’
が含まれ、ここで、＊はホスホロチオエート結合である。
【０２０５】
「Ｃクラス」のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を活性化させＩＦＮ−αを誘発する能力によって、機能的に特徴付けされる。構造上、このクラスは、典型的には、１つまたは複数のＢクラスタイプの免疫刺激性ＣｐＧモチーフを有する領域と、分子による二次構造タイプの構造（例えば、ステムループ）または三次構造タイプの構造（例えば、ダイマー）の形成を可能にする、ＧＣに富んだパリンドローム領域またはニアパリンドローム領域とを含む。これらのオリゴヌクレオチドのいくつかは、従来の「刺激性」ＣｐＧ配列と「ＧＣに富んだ」モチーフまたは「Ｂ細胞中和」モチーフとの両方を有する。これらの組み合わせモチーフのオリゴヌクレオチドは、従来のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドに関連する効果（すなわち、Ｂ細胞の活性化および樹状細胞（ＤＣ）の活性化の強力な誘発）とＡクラスのＣｐＧ  ＯＤＮに関連する効果（すなわち、ＩＦＮ−αおよびＮＫ細胞の活性化の強力な誘発、しかしＢ細胞およびＤＣの活性化の比較的弱い誘発）との間のどこかに当てはまる免疫刺激効果を有する。Ｋｒｉｅｇ  ＡＭら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜９；Ｂａｌｌａｓ  ＺＫら（１９９６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：１８４０〜５；Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｓら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：４０７２〜６。
【０２０６】
Ｃクラスの組み合わせモチーフの免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、完全に安定化されている骨格（例えば、全てがホスホロチオエート）、キメラ骨格（ホスホジエステル中央領域）、または半軟性骨格（例えば、ＣｐＧモチーフ内のホスホジエステル）を有し得る。このクラスは、２００２年８月１９日に出願された米国特許出願ＵＳ１０／２２４，５２３において記載されている。
【０２０７】
ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドの１つの刺激性ドメインまたは刺激性モチーフは、式５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２３’によって定義される。Ｄは、Ｃ以外のヌクレオチドである。Ｃはシトシンである。Ｇはグアニンである。ＨはＧ以外のヌクレオチドである。Ｘ１およびＸ２は、０から１０ヌクレオチド長のあらゆる核酸配列である。Ｘ１にはＣＧが含まれ得、このケースでは、このＣＧの直前にＴが好ましくは存在する。いくつかの実施形態において、ＤＣＧはＴＣＧである。Ｘ１は、好ましくは０から６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、Ｘ２はいずれのポリＧモチーフもポリＡモチーフも含有しない。他の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端にポリＴ配列を有する。本明細書において用いられる場合、「ポリＡ」または「ポリＴ」は、それぞれ、４個以上の連続するＡまたはＴの鎖、例えば５’ＡＡＡＡ  ３’または５’ＴＴＴＴ  ３’を言う。本明細書において用いられる場合、「ポリＧ末端」は、核酸の５’末端または３’末端に生じる４個以上の連続するＧの鎖、例えば５’ＧＧＧＧ  ３’を言う。本明細書において用いられる場合、「ポリＧオリゴヌクレオチド」は、式５’Ｘ１Ｘ２ＧＧＧＸ３Ｘ４  ３’を有するオリゴヌクレオチドを言い、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４はヌクレオチドであり、好ましくはＸ３およびＸ４の少なくとも１つはＧである。この式のもとでのＢ細胞刺激性ドメインについてのいくつかの好ましい設計は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、ＴＣＧＴＣＧＴを含む。
【０２０８】
ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドの第２のモチーフは、ＰまたはＮと呼ばれ、Ｘ１のすぐ５’側またはＸ２のすぐ３’側に位置する。
【０２０９】
Ｎは、ＣＧＧトリヌクレオチドで開始し、かつ少なくとも１０ヌクレオチド長である、Ｂ細胞中和配列である。Ｂ細胞中和モチーフは、ＣＧの前にＣがあるかもしくはＣＧの後にＧがある少なくとも１つのＣｐＧ配列を含む（Ｋｒｉｅｇ  ＡＭら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ  ９５：１２６３１〜１２６３６）か、または、ＣＧのＣがメチル化されているＣＧ含有ＤＮＡ配列である。中和モチーフまたは中和配列は、他の非刺激性モチーフ内に存在する場合には、ある程度の免疫刺激能力を有するが、他の免疫刺激性モチーフの背景において存在する場合には、他のモチーフの免疫刺激性の潜在能力を低減させるように作用する。
【０２１０】
Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチド長の、ＧＣに富んだパリンドローム含有配列である。
【０２１１】
本明細書において用いられる場合、「パリンドローム」および同等に「パリンドローム性配列」は、逆方向反復、すなわち、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’などが、通常のワトソンクリック塩基対を形成し得る塩基である、ＡＢＣＤＥＥ’Ｄ’Ｃ’Ｂ’Ａ’などの配列を言う。
【０２１２】
本明細書において用いられる場合、「ＧＣに富んだパリンドローム」は、少なくとも３分の２がＧおよびＣである塩基組成を有するパリンドロームを言う。いくつかの実施形態において、ＧＣに富んだドメインは、好ましくは、「Ｂ細胞刺激性ドメイン」の３’側である。したがって、１０塩基長のＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームは、少なくとも８個のＧおよびＣを含有する。１２塩基長のＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームはまた、少なくとも８個のＧおよびＣを含有する。１４ｍｅｒのＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームの少なくとも１０個の塩基がＧおよびＣである。いくつかの実施形態において、ＧＣに富んだパリンドロームは、ＧおよびＣのみからなる。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ＧＣに富んだパリンドロームは、少なくとも８１％がＧおよびＣである塩基組成を有する。したがって、このような１０塩基長のＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームはＧおよびＣのみからなる。このような１２塩基長のＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームの少なくとも１０個の塩基（８３％）がＧおよびＣであることが好ましい。いくつかの好ましい実施形態において、１２塩基長のＧＣに富んだパリンドロームは、ＧおよびＣのみからなる。１４ｍｅｒのＧＣに富んだパリンドロームのケースでは、パリンドロームの少なくとも１２個の塩基（８６％）がＧおよびＣである。いくつかの好ましい実施形態において、１４塩基長のＧＣに富んだパリンドロームは、ＧおよびＣのみからなる。ＧＣに富んだパリンドロームのＣは、メチル化されていない可能性があり、またはそれらはメチル化されている可能性がある。
【０２１４】
通常、このドメインは少なくとも３つのＣおよびＧを有し、より好ましくはそれぞれを４個有し、最も好ましくはそれぞれを５個以上有する。このドメインにおけるＣおよびＧの数は、同一である必要はない。ＣおよびＧが、ＣＣＧＣＧＣＧＧのように、それらが自己相補性二本鎖またはパリンドロームを形成し得るように配列していることが好ましい。これは、ＡまたはＴによって中断され得るが、例えばモチーフＣＧＡＣＧＴＴＣＧＴＣＧまたはＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧにおけるように、自己相補性が少なくとも部分的に保存されていることが好ましい。相補性が保存されない場合、非相補性塩基対がＴＧであることが好ましい。好ましい実施形態において、パリンドロームの一部ではないわずか３つ、好ましくはわずか２つ、最も好ましくはわずか１つの連続する塩基が存在する。いくつかの実施形態において、ＧＣに富んだパリンドロームは、少なくとも１つのＣＧＧトリマー、少なくとも１つのＣＣＧトリマー、または少なくとも１つのＣＧＣＧテトラマーを含む。他の実施形態において、ＧＣに富んだパリンドロームは、ＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＧＧＧＧＧまたはＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣではない。
【０２１５】
ＧＣに富んだ領域のＧの少なくとも１つは、イノシン（Ｉ）で置換され得る。いくつかの実施形態において、Ｐは２つ以上のＩを含む。
【０２１６】
特定の実施形態において、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式５’ＮＸ１ＤＣＧＨＸ２  ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｎ  ３’、５’ＰＸ１ＤＣＧＨＸ２  ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２Ｐ  ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３  ３’、５’Ｘ１ＤＣＧＨＰＸ３  ３’、５’ＤＣＧＨＸ２ＰＸ３  ３’、５’ＴＣＧＨＸ２ＰＸ３  ３’、５’ＤＣＧＨＰＸ３  ３’、または５’ＤＣＧＨＰ  ３’の１つを有する。
【０２１７】
本発明は、式５’Ｎ１ＰｙＧＮ２Ｐ  ３’によって定義される他の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを提供する。Ｎ１は１から６ヌクレオチド長のあらゆる配列である。Ｐｙはピリミジンである。Ｇはグアニンである。Ｎ２は０から３０ヌクレオチド長のあらゆる配列である。Ｐは、少なくとも１０ヌクレオチド長の配列を含有するＧＣに富んだパリンドロームである。
【０２１８】
Ｎ１およびＮ２は、５０％超のピリミジン、より好ましくは５０％超のＴを含有し得る。Ｎ１にはＣＧが含まれ得、このケースにおいて、このＣＧの直前にＴが好ましくは存在する。いくつかの実施形態において、Ｎ１ＰｙＧはＴＣＧであり、最も好ましくはＴＣＧＮ２であり、Ｎ２はＧではない。
【０２１９】
Ｎ１ＰｙＧＮ２Ｐは、１つまたは複数のイノシン（Ｉ）ヌクレオチドを含み得る。Ｎ１におけるＣまたはＧのいずれかはイノシンによって置き換えられ得るが、ＩｐＧよりもＣｐＩが好ましい。ＩｐＧなどのイノシン置換では、最適な活性は、「半軟性」骨格またはキメラ骨格を用いて達成され得、ＩＧまたはＣＩとの間の連結はホスホジエステルである。Ｎ１は、少なくとも１つのＣＩモチーフ、ＴＣＩモチーフ、ＩＧモチーフ、またはＴＩＧモチーフを含み得る。
【０２２０】
特定の実施形態において、Ｎ１ＰｙＧＮ２は、ＴＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＴＴＴＣＧ、ＴＣＧＴ、ＴＴＣＧＴ、ＴＴＴＣＧＴ、およびＴＣＧＴＣＧＴからなる群から選択される配列である。
【０２２１】
１つの実施形態において、本発明の「Ｃクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、
５’  ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９４）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９５）、または
５’  ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９６）、または
５’  ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９７）、または
５’  ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９８）、または
５’  ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号５９９）、または
５’  ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６００）、または
５’  ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０１）、または
５’  ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０２）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０３）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０４）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０５）、または
５’  ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴ  ３’（配列番号６０６）
という核酸配列を有する。
【０２２２】
あらゆるこれらの配列において、連結の全ては、全てホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態において、あらゆるこれらの配列において、連結の１つまたは複数は、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間で半軟性のＣｐＧオリゴヌクレオチドを作製する、ホスホジエステルであり得る。
【０２２３】
Ｃクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例には、
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’、または
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ  ３’
が含まれ、ここで、＊はホスホロチオエート結合であり、＿はホスホジエステル結合である。
【０２２４】
あらゆるこれらの配列において、エチルウリジンまたはハロゲンが５’Ｔで置換し得、ハロゲン置換の例には、限定はしないが、ブロモウリジン置換またはヨードウリジン置換が含まれる。
【０２２５】
「Ｐクラス」のＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０９５３１６において記載されており、それらが二本鎖形成領域を含有するという事実によって特徴付けされ、前記領域は例えば、５’末端および３’末端の両方にあるかまたはそれらの付近にある完全なまたは不完全なパリンドロームであり、これは、前記オリゴヌクレオチドに、コンカテマーなどの高度に並んだ構造を形成する潜在能力を与える。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドと呼ばれるこれらのオリゴヌクレオチドは、いくつかの場合において、Ｃクラスよりもはるかに高いレベルのＩＦＮ−α分泌を誘発する能力を有する。Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、インビトロおよび／またはインビボでコンカテマーに自発的に自己集合する能力を有する。これらの分子の作用方法についてのいずれの特定の理論にも縛られないが、１つの潜在的な仮説は、この特性が、特定の免疫細胞内のＴＬＲ９をさらに高度に架橋して、これまでに記載されているクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドと比較して異なるパターンの免疫活性化を誘発する能力を、Ｐクラスのオリゴヌクレオチドにもたらすというものである。
【０２２６】
１つの実施形態において、本発明において用いるためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインと少なくとも２つのパリンドローム性領域とを含有するＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、１つのパリンドローム性領域は、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム性領域であり、直接的に、またはスペーサーを介して、少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム性領域に接続しており、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＹｐＲジヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇではない。１つの実施形態において、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。さらに別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム性領域内にある。別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム性領域のすぐ５’側にある。さらに別の実施形態において、５’パリンドローム性領域は、少なくとも８ヌクレオチド長である。別の実施形態において、３’パリンドローム性領域は、少なくとも１０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域は、少なくとも１０ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、３’パリンドローム性領域は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、３’パリンドローム性領域は、２つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、５’パリンドローム性領域は、２つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも２５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも３０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも３５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも４０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも４５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも５０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも５５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも６０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’パリンドローム性領域および３’パリンドローム性領域は、少なくとも６５の二本鎖安定性値を有する。
【０２２７】
１つの実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、直接的に接続している。別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、３’−３’連結を介して接続している。別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、１つのヌクレオチドがオーバーラップしている。さらに別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、２つのヌクレオチドがオーバーラップしている。別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、オーバーラップしていない。別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、スペーサーによって接続している。１つの実施形態において、スペーサーは、１〜５０ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、スペーサーは、１ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、スペーサーは、非ヌクレオチドスペーサーである。１つの実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｄスペーサーである。別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、リンカーである。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、式５’ＸＰ１ＳＰ２Ｔ  ３’を有し、式中、ＸはＴＬＲ活性化ドメインであり、Ｐ１はパリンドロームであり、Ｓはスペーサーであり、Ｐ２はパリンドロームであり、Ｔは０〜１００ヌクレオチド長の３’尾部である。１つの実施形態において、Ｘは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、またはＴＴＴＣＧである。別の実施形態において、Ｔは、５〜５０ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、Ｔは、５〜１０ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、Ｓは、１〜５０ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、Ｓは、１ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、Ｓは、非ヌクレオチドスペーサーである。１つの実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｄスペーサーである。別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、リンカーである。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムではない。１つの実施形態において、Ｐ１はＡおよびＴに富んでいる。別の実施形態において、Ｐ１は少なくとも４個のＴを含む。別の実施形態において、Ｐ２は完全なパリンドロームである。別の実施形態において、Ｐ２は、Ｇ−Ｃに富んでいる。さらに別の実施形態において、Ｐ２は、ＣＧＧＣＧＣＸ１ＧＣＧＣＣＧであり、式中、Ｘ１はＴであるか、無である。
【０２２８】
１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様連結を含む。別の実施形態において、ホスホジエステル様連結は、ホスホジエステル連結である。別の実施形態において、脂溶性基がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている。１つの実施形態において、脂溶性基は、コレステロールである。
【０２２９】
１つの実施形態において、本発明において用いるためのＴＬＲ−９アゴニストは、５’ＴＬＲ活性化ドメインと少なくとも２つの相補性含有領域、すなわち５’相補性含有領域および３’相補性含有領域とを有する、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであり、各相補性含有領域は、少なくとも８ヌクレオチド長であり、直接的に、またはスペーサーを介して、互いに接続しており、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのピリミジン−プリン（ＹｐＲ）ジヌクレオチドを含み、相補性含有領域の少なくとも１つは、完全なパリンドロームではない。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’相補性含有領域内にある。別の実施形態において、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’相補性含有領域のすぐ５’側にある。別の実施形態において、３’相補性含有領域は、少なくとも１０ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、５’相補性含有領域は、少なくとも１０ヌクレオチド長である。１つの実施形態において、３’相補性含有領域は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、３’相補性含有領域は、２つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態において、５’相補性含有領域は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、５’相補性含有領域は、２つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体を含む。別の実施形態において、相補性含有領域は、分子内二本鎖を形成する。１つの実施形態において、分子内二本鎖は、少なくとも１つの非ワトソンクリック塩基対を含む。別の実施形態において、非ワトソンクリック塩基対は、Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｇ、またはＣ−Ａである。１つの実施形態において、相補性含有領域は、分子間二本鎖を形成する。別の実施形態において、分子間二本鎖の少なくとも１つは、少なくとも１つの非ワトソンクリック塩基対を含む。別の実施形態において、非ワトソンクリック塩基対は、Ｇ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ｇ−Ｇ、またはＣ−Ａである。さらに別の実施形態において、相補性含有領域は、ミスマッチを含有する。さらに別の実施形態において、相補性含有領域は、２つのミスマッチを含有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、介在するヌクレオチドを含有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、２つの介在するヌクレオチドを含有する。
【０２３０】
１つの実施形態において、５’相補性含有領域および３’相補性含有領域は、少なくとも２５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’相補性含有領域および３’相補性含有領域は、少なくとも３０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、５’相補性含有領域および３’相補性含有領域は、少なくとも３５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも４０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも４５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも５０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも５５の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも６０の二本鎖安定性値を有する。別の実施形態において、相補性含有領域は、少なくとも６５の二本鎖安定性値を有する。
【０２３１】
別の実施形態において、２つの相補性含有領域は、直接的に接続している。別の実施形態において、２つのパリンドローム性領域は、３’−３’連結を介して接続している。さらに別の実施形態において、２つの相補性含有領域は、１つのヌクレオチドがオーバーラップしている。別の実施形態において、２つの相補性含有領域は、２つのヌクレオチドがオーバーラップしている。別の実施形態において、２つの相補性含有領域は、オーバーラップしていない。別の実施形態において、２つの相補性含有領域は、スペーサーによって接続している。別の実施形態において、スペーサーは、１〜５０ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、スペーサーは、１ヌクレオチド長を有する核酸である。１つの実施形態において、スペーサーは、非ヌクレオチドスペーサーである。別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｄスペーサーである。さらに別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、リンカーである。
【０２３２】
１つの実施形態において、Ｐクラスのオリゴヌクレオチドは、式５’ＸＮＳＰＴ  ３’を有し、式中、ＸはＴＬＲ活性化ドメインであり、Ｎは不完全なパリンドロームであり、Ｐはパリンドロームであり、Ｓはスペーサーであり、Ｔは０〜１００ヌクレオチド長の３’尾部である。別の実施形態において、Ｘは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、またはＴＴＴＣＧである。別の実施形態において、Ｔは、５〜５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、Ｔは、５〜１０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、Ｓは、１〜５０ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、Ｓは、１ヌクレオチド長を有する核酸である。別の実施形態において、Ｓは、非ヌクレオチドスペーサーである。別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｄスペーサーである。別の実施形態において、非ヌクレオチドスペーサーは、リンカーである。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムではない。別の実施形態において、ＮはＡおよびＴに富んでいる。別の実施形態において、Ｎは少なくとも４個のＴを含む。別の実施形態において、Ｐは完全なパリンドロームである。別の実施形態において、Ｐは、Ｇ−Ｃに富んでいる。別の実施形態において、Ｐは、ＣＧＧＣＧＣＸ１ＧＣＧＣＣＧであり、式中、Ｘ１はＴであるか、無である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート連結を含む。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様連結を含む。別の実施形態において、ホスホジエステル様連結は、ホスホジエステル連結である。別の実施形態において、脂溶性基がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている。１つの実施形態において、脂溶性基は、コレステロールである。
【０２３３】
１つの実施形態において、本発明の「Ｐクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ  ３’（配列番号６０７）という核酸配列を有する。
【０２３４】
前記配列において、連結の全ては、全てホスホロチオエート結合であり得る。別の実施形態において、連結の１つまたは複数は、好ましくはＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間で半軟性のＣｐＧオリゴヌクレオチドを作製する、ホスホジエステルであり得る。あらゆるこれらの配列において、エチルウリジンまたはハロゲンが５’Ｔで置換し得、ハロゲン置換の例には、限定はしないが、ブロモウリジン置換またはヨードウリジン置換が含まれる。
【０２３５】
Ｐクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定的な例には、
５’  Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ  ３’
が含まれ、ここで、＊はホスホロチオエート結合であり、＿はホスホジエステル結合である。
【０２３６】
１つの実施形態において、本明細書において開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間連結は、ホスホジエステル結合（ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０において記載されているような「軟性」のオリゴヌクレオチド）である。別の実施形態において、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、分解に対して耐性にされる（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド」は、（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介する）インビボでの分解に対して比較的耐性なオリゴヌクレオチドを言う。核酸の安定化は、骨格の修飾を介して達成され得る。ホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドは、最大の活性をもたらし、細胞内のエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。
【０２３７】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結およびホスホロチオエート連結の組み合わせを有するキメラ骨格を有し得る。本発明の目的では、キメラ骨格は、少なくとも１つのヌクレオチド間連結がホスホジエステルまたはホスホロジエステル様であり、少なくとも１つの他のヌクレオチド間連結が安定化されたヌクレオチド間連結であり、前記少なくとも１つのホスホジエステル連結またはホスホジエステル様連結と前記少なくとも１つの安定化された連結とが異なる、部分的に安定化された骨格を言う。ホスホジエステル連結がＣｐＧモチーフ内に優先的に位置する場合、このような分子は、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０において記載されているように「半軟性」と呼ばれる。
【０２３８】
他の修飾されたオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、メチルホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、および／またはｐ−エトキシ連結を含む。
【０２３９】
骨格のキメラ性質の目的で、ボラノホスホネート連結はホスホジエステル連結よりも安定化されることが報告されているため、背景に応じて、ボラノホスホネート連結を、ホスホジエステル様連結または安定化された連結のいずれかとして分類することができる。例えば、本発明に従ったキメラ骨格は、いくつかの実施形態において、少なくとも１つのホスホジエステル（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連結および少なくとも１つのボラノホスホネート（安定化された）連結を含み得る。他の実施形態において、本発明に従ったキメラ骨格は、ボラノホスホネート（ホスホジエステルまたはホスホジエステル様）連結およびホスホロチオエート（安定化された）連結を含み得る。「安定化されたヌクレオチド間連結」は、ホスホジエステルヌクレオチド間連結と比較して（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介する）インビボでの分解に対して比較的耐性であるヌクレオチド間連結を意味する。好ましい安定化されたヌクレオチド間連結には、限定はしないが、ホスホロチオエート連結、ホスホロジチオエート連結、メチルホスホネート連結、およびメチルホスホロチオエート連結が含まれる。他の安定化されたヌクレオチド間連結には、限定はしないが、ペプチド連結、アルキル連結、脱ホスホ連結、および上記の他の連結が含まれる。
【０２４０】
ホスホロジチオエートなどの修飾された骨格は、ホスホロアミダイト化学またはＨ−ホスホネート化学を用いる自動技術を用いて合成することができる。例えば米国特許第４，４６９，８６３号において記載されているように、アリールホスホネートおよびアルキルホスホネートを作製することができ、アルキルホスホトリエステル（これにおいて、荷電した酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号において記載されているように、アルキル化されている）は、市販されている試薬を用いる自動固相合成によって調製することができる。ＤＮＡ骨格の他の修飾および置換を作製するための方法は記載されている。Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５。キメラオリゴヌクレオチドを調製するための方法もまた知られている。例えば、Ｕｈｌｍａｎｎらに付与された特許がこのような技術を記載している。
【０２４１】
混合された、骨格が修飾されたＯＤＮは、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／０２６１９０において記載されているように合成することができる。
【０２４２】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、他の修飾を含み得る。これらには、非イオン性ＤＮＡ類似体、例えばアルキルホスフェートおよびアリールホスフェート（これにおいて、荷電したホスホネート酸素は、アルキル基またはアリール基によって置き換えられている）、荷電した酸素部分がアルキル化されているホスホジエステルおよびアルキルホスホトリエステルが含まれる。いずれかのまたは両方の末端にジオール、例えばテトラエチレングリコールまたはヘキサエチレングリコールを含有する核酸はまた、ヌクレアーゼ分解に対して実質的に耐性であることが示されている。
【０２４３】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったヌクレオチド残基の数）はまた、オリゴヌクレオチドの刺激活性に寄与し得る。細胞内への取り込みを容易にするために、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド残基の最小の長さを好ましくは有する。６ヌクレオチドを超えるあらゆるサイズ（さらに大きなｋｂ長）のオリゴヌクレオチドは、十分な免疫刺激性モチーフが存在すれば、免疫応答を誘発し得、それは、より大きなオリゴヌクレオチドが細胞内で分解されるためである。特定の実施形態において、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６から１００ヌクレオチド長であり、好ましくは、８から３０ヌクレオチド長である。重要な実施形態において、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、プラスミドまたは発現ベクターではない。
【０２４４】
１つの実施形態において、本明細書において開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０２６１９０の１３４から１４７段落で記載されている塩基および／または糖におけるような、置換または修飾を含む。
【０２４５】
１つの実施形態において、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されている。化学的修飾の例は、当業者に知られており、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ら（１９９０）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７〜１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊ．ら（１９９５）、Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１〜４１７において記載されている。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾を有し得、各修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡからなる同一の配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋および／または特定のβ−Ｄ−リボース単位および／または特定の天然ヌクレオシド塩基位置に位置する。
【０２４６】
本発明のいくつかの実施形態において、ＣｐＧ含有核酸は、当業者に知られている方法に従って免疫原性担体と簡単に混合することができる（例えば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照されたい）。
【０２４７】
本発明の特定の実施形態において、本明細書において開示されるあらゆるワクチンは、２０μｇから２０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．１ｍｇから１０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．２ｍｇから５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは０．３ｍｇから３ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは０．４から２ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは０．５から１．５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本明細書において開示されるあらゆるワクチンは、およそ０．５から１ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
【０２４８】
本発明において用いるための好ましいアジュバントは、アルム、ＱＳ２１、ＣｐＧ  ＯＤＮ、ＣｐＧ  ＯＤＮと組み合わされたアルム、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、およびＣｐＧ  ＯＤＮと組み合わされたＩｓｃｏｍａｔｒｉｘである。
【０２４９】
本発明の医薬組成物
本発明はまた、１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤を伴い１つまたは複数のアジュバントを（上記のアジュバントとして）含んでいてもよい製剤内の、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物を含む医薬組成物を提供する。「賦形剤」という用語は、本明細書において、免疫原性担体に最終的にカップリングされ１つまたは複数のアジュバントと組み合わされていてもよい活性原料、すなわち本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチド以外の、あらゆる原料を記載するために用いられる。（１つまたは複数の）賦形剤の選択は、特定の投与様式、可溶性および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに投薬形態の性質などの因子に大きく依存する。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容できる賦形剤」には、生理学的に適合する、あらゆるおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、ならびに吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容できる賦形剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝溶液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。多くのケースにおいて、組成物内に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容できる物質のさらなる例は、活性原料の保存期間または有効性を増強させる、湿潤剤、あるいは微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤、または緩衝剤である。
【０２５０】
本発明の医薬組成物およびそれらを調製するための方法は、当業者に容易に明らかとなろう。このような組成物およびそれらを調製するための方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５）において見ることができる。医薬組成物は、好ましくは、ＧＭＰ条件下で製造される。
【０２５１】
本発明の医薬組成物は、１つの単一単位用量または複数の単一単位用量として、大量に調製、包装、または販売され得る。本明細書において用いられる場合、「単位用量」は、事前に決定された量の活性原料を含む、個別の量の医薬組成物である。活性原料の量は、通常、対象に投与される活性原料の投薬量、またはこのような投薬量の都合の良い画分、例えばこのような投薬量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
【０２５２】
当技術分野において認められているペプチドまたはタンパク質を投与するためのあらゆる方法を、本発明のペプチドまたはタンパク質のために適切に用いることができる。
【０２５３】
本発明の医薬組成物は、典型的には、非経口投与に適している。本明細書において用いられる場合、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的破損と組織における破損を介する医薬組成物の投与とによって特徴付けされ、したがって通常、血流内、筋肉内、または内部器官内への直接的な投与をもたらす、あらゆる経路の投与が含まれる。したがって、非経口投与には、限定はしないが、例えば、組成物の注射による、外科的切開を介する組成物の適用による、組織を貫通する非外科的創傷を介する組成物の適用による、医薬組成物の投与が含まれる。特に、非経口投与は、限定はしないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内、静脈内、動脈内、髄腔内、心室内、尿道内、頭蓋内、滑液嚢内の注射または点滴、および腎臓透析点滴技術を含むことが意図されている。好ましい実施形態には、静脈内経路、皮下経路、皮内経路、および筋肉内経路が含まれ、さらに好ましい実施形態は、筋肉内経路または皮下経路である。
【０２５４】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、典型的には、通常、滅菌水または無菌等張生理食塩水などの薬学的に許容できる担体と組み合わされた活性原料を含む。このような製剤は、ボーラス投与または連続投与に適した形態で、調製、包装、または販売され得る。注射可能な製剤は、アンプル、または防腐剤を含有する複数回用量容器などの単位投薬形態で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与のための製剤には、限定はしないが、懸濁液、溶液、油性媒体または水性媒体内のエマルジョン、ペーストなどが含まれる。このような製剤は１つまたは複数のさらなる原料をさらに含み得、前記原料には、限定はしないが、懸濁剤、安定剤、または分散剤が含まれる。非経口投与のための製剤の１つの実施形態において、活性原料は、適切な媒体（例えば、発熱物質を有さない滅菌水）で再構成して、その後、再構成された組成物を非経口投与するために、乾燥（すなわち、粉末または顆粒）形態で提供される。非経口製剤はまた、塩、糖質、および（好ましくは、３から９のｐＨまでの）緩衝剤などの賦形剤を含有し得る水性溶液を含むが、いくつかの適用では、前記非経口製剤は、無菌非水性溶液として、または発熱物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、さらに適切に製剤され得る。典型的な非経口投与形態には、無菌水性溶液内の、例えば水性のプロピレングリコール溶液またはデキストロース溶液内の、溶液または懸濁液が含まれる。このような投薬形態は、必要であれば、適切に緩衝することができる。有用な、他の非経口投与可能な製剤には、微結晶形態、すなわち微粒子状の活性原料を含むもの、またはリポソーム調製物内に活性原料を含むものが含まれる。非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出されるように製剤することができる。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０２５５】
例えば、１つの態様において、無菌の注射可能溶液は、好ましくは免疫原性担体にカップリングされ１つまたは複数のアジュバントと組み合わされていてもよい、所要の量の抗ＰＣＳＫ９ペプチドを、上記に列挙された原料の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒内に組み込み、必要に応じてその後に濾過滅菌することによって、調製することができる。通常、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒質と上記に列挙されたものからの所要の他の原料とを含有する無菌媒体内に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は、真空乾燥およびフリーズドライであり、これにより、活性原料とあらゆるさらなる所望の原料との粉末が、それらの事前に滅菌濾過された溶液から得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって、分散液のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、維持することができる。注射可能な組成物の持効性吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物内に含めることによってもたらされ得る。
【０２５６】
例として、本発明の非限定的な医薬組成物は、約５．０から約６．５の範囲のｐＨを有し、約０．１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの本発明のペプチド、約１ミリモル濃度から約１００ミリモル濃度のヒスチジン緩衝液、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、約１００ミリモル濃度から約４００ミリモル濃度のトレハロース、および約０．０１ミリモル濃度から約１．０ミリモル濃度のＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を含む無菌水性溶液としての製剤である。
【０２５７】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドはまた、鼻腔内で、または吸入によって、典型的には、乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末（単独で、混合物として、または混合成分粒子として、例えば、適切な薬学的に許容できる賦形剤と組み合わされた混合成分粒子として）の形態で、適切な推進剤の使用を伴うかもしくは伴わない加圧溶液、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、細かい霧を生じさせるための電気流体力学を用いるアトマイザー）、もしくは噴霧器からのエアロゾルスプレーとして、または鼻腔滴として投与することができる。
【０２５８】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、または噴霧器は、通常、活性物質を例えば分散させるか、可溶化させるか、または活性物質の放出を延長するための適切な作用物質を含む、本発明の抗体の溶液または懸濁液、溶媒としての（１つまたは複数の）推進剤を含有する。
【０２５９】
乾燥粉末製剤または懸濁液製剤において用いる前に、薬剤生成物は通常、吸入による送達に適したサイズ（典型的には、５ミクロン未満）まで微粉化される。これは、あらゆる適切な粉砕方法、例えばスパイラルジェットミル、流動床ジェットミル、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ、または噴霧乾燥によって達成され得る。
【０２６０】
吸入器または散布器において用いるためのカプセル、ブリスター、およびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、適切な粉末ベース、および性能調節剤を含有するように製剤することができる。
【０２６１】
細かい霧を生じさせるための電気流体力学を用いるアトマイザーにおいて用いるための適切な溶液製剤は、作動当たり適切な用量の本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含有し得、作動容積は、例えば１μＬから１００μＬに変化し得る。
【０２６２】
メントールおよびレボメントールなどの適切な香料、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味料を、吸入／鼻腔内投与を意図した本発明の製剤に添加することができる。
【０２６３】
吸入／鼻腔内投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出されるように製剤することができる。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的放出、およびプログラム放出が含まれる。
【０２６４】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルのケースでは、投薬単位は、規定量を送達するバルブによって決定される。本発明に従った単位は、典型的には、本発明の抗体の規程用量または「一吹き」を投与するように準備されている。１日の総用量は、典型的には、単一用量で投与されるか、またはより一般的には、終日にわたって分割された用量で投与される。
【０２６５】
抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを含む医薬組成物はまた、経口経路投与のために製剤することができる。経口投与は、化合物が胃腸管に入るための嚥下、および／または、化合物が口から直接血流に入るための、口腔投与、舌投与、もしくは舌下投与を伴い得る。
【０２６６】
経口投与に適した製剤には、固体系、半固体系、および液体系、例えば、錠剤；多粒子もしくはナノ粒子、液体、または粉末を含有するソフトカプセルまたはハードカプセル；トローチ（液体充填されたものを含む）；ガム；ゲル；迅速に分散する投薬形態；フィルム；卵形剤；スプレー；および口腔／粘膜接着性パッチが含まれる。
【０２６７】
液体製剤には、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。このような製剤は、ソルトカプセルまたはハードカプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）における充填剤として用いられ得、典型的には、担体、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、ならびに１つまたは複数の乳化剤および／もしくは懸濁剤を含む。液体製剤はまた、例えば小袋からの固体の再構成によって調製することができる。
【０２６８】
本発明の組成物は、免疫療法によって、ＰＣＳＫ９関連性の障害または症候のリスクがあるかまたはこれに罹患している対象における免疫応答を刺激することによって、前記対象におけるこのような障害または症候を治療、軽減、または予防するために用いることができる。免疫療法は、最初の免疫化と、その後に行うさらなる追加免疫、例えば、１回、２回、３回、またはそれ以上の追加免疫とを含み得る。
【０２６９】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその組成物の「免疫学的に効果的な量」は、哺乳動物対象においてＰＣＳＫ９に対する免疫応答を誘発するために効果的な、単一用量の、または一連の用量の一部としての、前記対象に送達される量である。この量は、治療される個体の健康状態および身体状態、治療される個体の分類上の群、個体の免疫系の、抗体を合成する能力、ワクチンの製剤、ならびに他の関連する因子に応じて変化する。量は、通常の試験を通して決定され得る、比較的広範囲のものであると予想される。
【０２７０】
「薬学的に効果的な用量」または「治療上効果的な量」は、対象における１つまたは複数のＰＣＳＫ９関連性の障害または症候を治療または予防または軽減するために必要な用量である。薬学的に効果的な用量は、とりわけ、投与される具体的な化合物、症候の重症度、副作用に対する対象の感受性、疾患のタイプ、用いる組成物、投与経路、治療される哺乳動物のタイプ、具体的な哺乳動物の、健康状態および身体状態などの考慮対象の身体的特徴、併用投薬治療、個体の免疫系の、抗体を合成する能力、所望される防御の程度、ならびに医学分野の当業者が認識する他の因子に依存する。予防目的では、各用量におけるペプチドの量は、典型的なワクチンにおける顕著な副作用を伴わずに免疫防御応答を誘発する量として選択される。最初のワクチン接種の後、対象には、適切に間隔をあけた、１回または複数回の追加免疫化を行うことができる。
【０２７１】
あらゆる特定の患者のための具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康、性別、食習慣、投与時間、投与経路、ならびに排出率、薬剤の組み合わせ、および治療している特定の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存することが理解される。
【０２７２】
例えば、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたは医薬組成物は、約０．１μｇから約５ｍｇの用量で、例えば、約０．１μｇから約５μｇ、約５μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２５μｇ、約２５μｇから約５０μｇ、約５０μｇから約１００μｇ、約１００μｇから約５００μｇ、約５００μｇから約１ｍｇ、約１ｍｇから約２ｍｇの用量で対象に投与することができ、例えば１週間、２週間、３週間、４週間、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、および／または１年後に追加免疫が行われてもよい。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、単一用量の本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたは医薬組成物が投与される。他の実施形態において、複数用量の本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたは医薬組成物が投与される。投与の頻度は、様々な因子のいずれか、例えば、症候の重症度、所望される免疫防御の程度、組成物が予防目的または治癒目的のどちらで用いられるかなどに応じて変化し得る。例えば、いくつかの実施形態において、本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたは医薬組成物は、月に１回、月に２回、月に３回、１週間おき（ｑｏｗ）、週に１回（ｑｗ）、週に２回（ｂｉｗ）、週に３回（ｔｉｗ）、週に４回、週に５回、週に６回、１日おき（ｑｏｄ）、毎日（ｑｄ）、１日２回（ｑｉｄ）、または１日３回（ｔｉｄ）投与される。本発明の組成物を予防目的で用いる場合、組成物は通常、初回免疫用量および追加免疫用量の両方で投与される。追加免疫用量は、適切に間隔があいているか、または好ましくは、毎年、もしくは循環抗体のレベルが所望のレベル未満になるような回数で与えられると予想される。追加免疫用量は、本来の免疫原性担体分子の不存在下での抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドからなり得る。このような追加構築物は、別の免疫原性担体を含み得るか、またはいずれの担体も不存在であり得る。このような追加組成物は、アジュバントを伴ってまたは伴わずに製剤され得る。
【０２７４】
本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの投与の持続時間、例えば、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを投与する期間は、様々な因子のいずれか、例えば患者の応答などに応じて変化し得る。例えば、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、約１日から約１週間、約２週間から約４週間、約１ヶ月から約２ヶ月、約２ヶ月から約４ヶ月、約４ヶ月から約６ヶ月、約６ヶ月から約８ヶ月、約８ヶ月から約１年、約１年から約２年、または約２年から約４年、またはそれ以上にわたる期間にわたり投与することができる。
【０２７５】
本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドを投与することを含む、様々な治療方法もまた、本開示によって意図される。対象の治療方法には、自己ＰＣＳＫ９に対する個体における免疫応答を誘発する方法、および個体におけるＰＣＳＫ９関連性の障害または症候を予防、軽減、または治療する方法が含まれる。
【０２７６】
１つの態様において、本発明は、治療上効果的な量の本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチド、またはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるＰＣＳＫ９関連性の障害または症候を治療、予防、または軽減するための方法を提供する。
【０２７７】
別の態様において、本発明は、治療上効果的な量または免疫学的に効果的な量の、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象における自己ＰＣＳＫ９に対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。
【０２７８】
ＰＣＳＫ９関連性疾患またはＰＣＳＫ９介在性疾患は、例えば、ＰＣＳＫ９活性の阻害またはＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との相互作用の阻害が有利であり得る疾患である。
【０２７９】
「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、生物学的障害および／またはその付随する症候の少なくとも１つを軽減するかまたはなくす方法を言う。本明細書において用いられる場合、疾患、障害、または症状を「軽減する」は、疾患、障害、または症状の症候の重傷度および／または発生頻度を低減させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及には、治癒的、緩和的、および予防的治療への言及が含まれる。前記対象は、好ましくはヒトであり、あらゆる年齢の男性または女性であり得る。
【０２８０】
本発明の他の態様は、好ましくはＰＣＳＫ９関連性の障害の治療、軽減、または予防において、医薬品として用いるための、本発明に従った抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関する。
【０２８１】
さらに別の態様において、本発明は、好ましくはＰＣＳＫ９関連性の障害を治療するための、医薬品の製造における、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８２】
特に、本発明は、好ましくは上昇したレベルのコレステロールに関連する疾患の治療、軽減、または予防において、医薬品として用いるための、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物に関するものである。
【０２８３】
さらに別の態様において、本発明は、好ましくはそれを必要とする対象の血液におけるＬＤＬコレステロールレベルを低下させるための、医薬品の製造における、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８４】
本発明の使用または方法のいくつかの態様において、前記ＰＣＳＫ９関連性障害は、ＬＤＬコレステロールの上昇、ＬＤＬコレステロールの上昇に関連する症状、例えば、脂質障害（例えば、高脂血症、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、またはＶ型高脂血症、続発性高トリグリセライド血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、黄色腫症、コレステロールアセチルトランスフェラーゼ欠乏症）、動脈硬化症状（例えば、アテローム性動脈硬化症）、冠動脈疾患、および心血管疾患からなる群から選択される。
【０２８５】
さらに別の態様において、本発明は、ＬＤＬ受容体の上方調節またはＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の相互作用の阻害が有利である疾患を治療または軽減するための医薬品の製造における、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８６】
さらに別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するための医薬品の製造における、本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物の使用を提供する。
【０２８７】
本発明の使用または方法の他の態様において、前記対象は哺乳動物であり、好ましくはヒト対象である。
【０２８８】
本発明の使用または方法のさらに他の態様において、前記対象は、前記ＰＳＣＫ９関連性障害に罹患している。あるいは、前記対象は、例えば１つまたは複数の危険因子（例えば、高血圧、喫煙、糖尿病、肥満、または高ホモシステイン血症）の存在に起因して、前記ＰＣＳＫ９関連性疾患に罹患するリスクがある。
【０２８９】
本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物は、別のコレステロール低減剤を用いる治療法に対して許容性ではない対象、または別のコレステロール低減剤を用いた治療法が不十分な結果をもたらした対象（例えば、スタチン療法でのＬＤＬ−ｃ低減が不十分であった対象）に有用である。本明細書において記載される本発明の抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドは、ＬＤＬコレステロールが上昇した対象に投与することができる。
【０２９０】
好ましくは、コレステロールが上昇した対象は、総血漿コレステロールレベルが２００ｍｇ／ｄｌ以上であるヒト対象である。好ましくは、コレステロールが上昇した対象は、コレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄｌ以上であるヒト対象である。
【０２９１】
総血漿コレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルは、適切な絶食後に得られた血液試料で標準的な方法を用いて測定される。総血漿コレステロールレベルおよびＬＤＬコレステロールレベルを測定するプロトコルは、当業者に周知である。
【０２９２】
１つの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物は、別の作用物質と共に投与され、この２つは、いずれかの順序で連続的に、または同時に投与され得る。いくつかの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物は、第２の作用物質（例えば、第２のコレステロール低減剤）を用いる治療法も受けている対象に投与される。コレステロール低減剤には、スタチン、胆汁酸隔離剤、ナイアシン、フィブリン酸誘導体、および長鎖α、オメガジカルボン酸が含まれる。スタチンは、コレステロールの生合成において鍵となる酵素であるＨＭＧＣｏＡをブロックすることによってコレステロールの合成を阻害する。スタチンの例は、ロバスタチン、プラバスタチン、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、およびシンバスタチンである。胆汁酸隔離剤は、インテスチンから肝臓への胆汁酸の再利用を中断させる。これらの作用物質の例は、コレスチラミンおよびコレスチポール塩酸塩である。フィブリン酸誘導体の例は、クロフィブラートおよびゲムフィブロジルである。長鎖α、オメガジカルボン酸は、例えば、Ｂｉｓｇａｉｅｒら、１９９８、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．３９：１７〜３０；ＷＯ９８／３０５３０；米国特許第４，６８９，３４４号；ＷＯ９９／００１１６；米国特許第５，７５６，３４４号；米国特許第３，７７３，９４６号；米国特許第４，６８９，３４４号；米国特許第４，６８９，３４４号；米国特許第４，６８９，３４４号；および米国特許第３，９３０，０２４号）によって記載されており、エーテル（例えば、米国特許第４，７１１，８９６号、米国特許第５，７５６，５４４号、米国特許第６，５０６，７９９号を参照されたい）。ドリコールのリン酸塩（米国特許第４，６１３，５９３号）およびアゾリジネジオン誘導体（米国特許第４，２８７，２００号）もまた、コレステロールレベルを低減させるために用いることができる。組み合わせ療法レジメンを加えることができるか、または、これは相乗的な結果（例えば、２つの作用物質の使用を組み合わせた場合に期待されるものよりも優れたコレステロールの低減）をもたらし得る。いくつかの実施形態において、抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドまたはその免疫原性組成物もしくは医薬組成物とスタチンとの組み合わせ療法は、相乗的な結果（例えば、コレステロールの相乗的な低減）をもたらす。いくつかの対象において、これは、所望のコレステロールレベルを達成するためのスタチンの投薬量を低減させることを可能にし得る。
【実施例】
【０２９３】
以下の実施例は、本発明をいかにして行い使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するために提供され、発明者が自らの発明であると考える範囲を限定することを意図したものではなく、本発明者らは、以下の実験が、行われた全てのまたは唯一の実験であることを表すことを意図してもいない。用いられる数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力は行ったが、ある程度の実験的な誤差およびずれがある。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるかまたはそれに近いものである。標準的な省略形が用いられ得、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）であり、ｋｂはキロベース（複数可）であり、ｐｌはピコリットル（複数可）であり、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）であり、ｍｉｎは分（複数可）であり、ｈまたはｈｒは時間（複数可）であり、ａａはアミノ酸（複数可）であり、ｋｂはキロベース（複数可）であり、ｂｐは塩基対（複数可）であり、ｎｔはヌクレオチド（複数可）であり、ｉ．ｍ．は筋肉内であり、ｉ．ｐ．は腹腔内であり、ｓ．ｃ．は皮下である。
【０２９４】
（実施例１）
ＬＤＬ受容体界面のＰＣＳＫ９−ＥＧＦ−Ａドメインでの抗原性ＰＣＳＫ９ペプチドの選択
ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａドメインに結合するヒトＰＣＳＫ９の構造は明らかにされており、公開されている（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ  １０５、１８２０〜１８２５、２００８）。この構造上の情報（ＰＤＢ：３ＢＰＳ）を、遊離ＰＣＳＫ９であるＰＤＢ：２Ｐ４Ｅの構造からの情報（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４、４１３〜４１９、２００７）と共に用いて、ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ受容体相互作用にとって重要な区域に対応する以下のペプチドを設計した（図１を参照されたい）。
ペプチド１．ＡＳＳＤＣＳＴＣＦＶ（配列番号１９）
ペプチド２．ＧＴＲＦＨＲＱＡＳＫ（配列番号６３）
ペプチド３．ＩＱＳＤＨＲＥＩＥＧＲＶ（配列番号１０９）
ペプチド４．ＳＧＲＤＡＧＶＡＫＧＡ（配列番号１５３）
ペプチド５．ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＴＰ（配列番号１８４）
【０２９５】
ペプチド１〜４はＰＣＳＫ９構造内のループに相当するため、それぞれの配列（配列番号１９、６３、１０９、および１５３）は、両端を介してＶＬＰ担体にカップリングして天然ループ構造の立体構造上の模倣をもたらすことを可能にするための、付加されたＣｙｓリンカー、Ｃｙｓ−Ｇｌｙリンカー、またはＬｙｓリンカーを伴って作製された（表１のＶＲ＿９．１からＶＲ＿９．４）。さらに、環化型のペプチド２〜４もまた作製され（表１のＶＲ＿９．６からＶＲ＿９．９）、これは、ＶＬＰへのカップリングのためのＣｙｓ残基を提供した。ペプチド１は、カップリング目的のためのＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ  Ｎ末端リンカーを伴って作製され、その結果、２つのＣｙｓ残基は、非変性ＰＣＳＫ９構造においてそれらがそうであるように、ジスルフィド結合に対して遊離していた。ペプチド５は、成熟したプロセシングされた形態のヒトＰＣＳＫ９のＮ末端に相当し、Ｃ末端に付加されたシステイン残基を介してカップリングして、抗体の認識のためにＮ末端を遊離させた（表１のＶＲ＿９．５）。以下の表（表１）は、ワクチン候補として評価するために生成された９個のペプチドを記載している。
【０２９６】
【表１】
0005859150.tif 000002
【０２９７】
（実施例２）
ワクチン候補として評価するためのペプチド−ＶＬＰコンジュゲートの調製
ＣＬＥＡＲアミド樹脂上で標準的なＦｍｏｃプロトコルを用いて、ペプチドを合成した。アミノ酸のカップリング反応を、ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）の存在下で、１ｅｑのＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）で活性化された、５倍過剰なＦｍｏｃ保護型のアミノ酸を用いて実施した。Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン／ＤＭＦで達成した。次に、樹脂に結合したペプチドを切断し、側鎖の保護基を、Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄ（ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤＴ：８９／３／８）で同時に除去した。ペプチドを、遊離Ｎ末端およびアミド化されたＣ末端を伴って作製した。粗ペプチドを、ＢＥＨ  １３０  Ｃ１８カラムと０．１％ＴＦＡの存在下での水／アセトニトリル勾配とを用いて、ＨＰＬＣによって、均質になるまで精製した。精製されたペプチドを、凍結乾燥器を用いて真空乾燥した。質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いてペプチドを分析し、十分なデータを得た。
【０２９８】
この研究において用いられるＱβ  ＶＬＰは、１４ｋＤのモノマータンパク質ＭＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：Ｍ９９０３９）をコードするｐＥＴ２８プラスミドを組み込むＢＬ２１（ＤＥ３）株における大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）による細菌発酵によって生産された。発酵を、ＩＰＴＧを用いて０．８のＯＤ６００で誘発し、カナマイシンを有するテリフィックブロス（ＴＢ）内で一晩進行させた。次に、宿主細胞において自己集合するＶＬＰを、特許出願ＥＰ１７３６５３８において記載されている方法を用いて発酵細胞ペレットから精製したが、前記方法とは、細胞を崩壊させた後に、澄明化されたホモジネートを５０％飽和の硫酸アンモニウムで処理し、細胞ペレットを遠心分離によって回収したと点で異なっていた。次に、ペレットをＨＥＰＥＳ緩衝液内に再溶解し、ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析し、その後、公表された方法における第１のカラムステップに進めた。イオン交換カラムステップおよびヒドロキシアパタイトカラムステップの後、さらなる陰イオン交換カラムステップを用いて材料を精製し、滅菌濾過して、最終ＶＬＰバルク材料を作製し、これを、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および電子顕微鏡法によって分析し、許容できる結果を得た。
【０２９９】
システイン残基を介するペプチドのコンジュゲーション：
Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）連結試薬またはさらに長いスクシンイミジル−６−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート連結試薬を用いて、Ｑβ  ＶＬＰを活性化した。これらの試薬の両方を利用するための手順は類似しており、すなわち、固体試薬をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内に溶解し、１０≧倍過剰なモル濃度でＶＬＰ溶液に添加した。活性化反応を、≧９０分間にわたり進行させ、次に、ＮＡＰ−２５脱塩カラムを用いて、溶液を５ｍＭのＥＤＴＡを有するダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）または固体ＮａＣｌ（１４．６ｇ／Ｌ）を添加することによって修飾されているダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）内に脱塩した。必要であれば、タンパク質溶液を、次のコンジュゲーション反応の前に、１０ｋＤのスピンマイクロ遠心分離機をわずかに用いて濃縮した。
【０３００】
コンジュゲーション反応の前に、ペプチドを、添加物として５ｍＭのＥＤＴＡを有する、ｐＨ７．４のＤＰＢＳのアリコート内に溶解した。溶液内のペプチドの濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。可溶化されたペプチドを、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳ内で洗浄したＴＣＥＰ固定化型還元剤（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のアリコートに添加した。ペプチドのアリコートを、ＴＣＥＰゲルの存在下で混合しながら、およそ１時間にわたりインキュベートし、その時間の後、アリコートを微量遠心管内で遠沈させ、固体ペレットを捨てた。還元されたペプチドを含有する上清を、事前に調製された、活性化されたＶＬＰに直接添加した。しかし、この手順に代わる１つの手順は、固体ペプチドを、活性化されたＱβ  ＶＬＰの試料に直接添加することである。両方法は、ペプチド−ＶＬＰコンジュゲートの生成に、等しく良好に作用する。
【０３０１】
ＶＬＰと還元されたペプチドとの間の反応を、非常に穏やかに混合しながら、少なくとも３０分間にわたり進行させた。反応時間の最後に、各試料を、ＮＡＰ−１０脱塩カラムまたはＮＡＰ−２５脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）内に脱塩した。脱塩されたコンジュゲートペプチドを、ブラッドフォード（クマシーブリリアントブルー、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）アッセイまたはＢＣＡタンパク質アッセイ（ビシンコニン酸）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を用いて、またＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、タンパク質含有量について分析した。コンジュゲート生成物を、０．２２μｍのフィルターを用いて滅菌濾過し、使用するまで２〜８℃で保管した。凍結または極端な温度への曝露を防ぐために、保管の際、これらの試料に対して細心の注意を払った。
【０３０２】
ＣＲＭ１９７へのＰＣＳＫ９ペプチドのコンジュゲーションを、ＢＡＡＮＳ（ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｓｉｇｍａ  Ｂ８２７１）を用いることによって行った。ＣＲＭ１９７を、冷室で９０分間にわたり、１００のモル濃度比で、０．１ＭのｐＨ８．３の炭酸ナトリウム内のＢＡＡＮＳと反応させることによって、まず活性化した。反応混合物を、Ｚｅｂａ脱塩カラムに通し、流入物を回収した。１０ｍｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９ペプチドを、等容積の固定化されたＴＣＥＰ還元ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、室温で１時間にわたりインキュベートし、遠心分離した後に０．２μｍのフィルターを介して回収した。次に、活性化されたＣＲＭ１９７を、冷室で一晩、処理されたペプチドと混合し、その後、ＰＢＳ緩衝液内で広範囲な透析を行った。コンジュゲートを回収し、濃縮し、０．２２μｍのフィルターを介して滅菌した。クマシーブルーアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質濃度を決定した。
【０３０３】
アミンを介するペプチドのコンジュゲーション
アミン残基を介するＱβへのペプチドのコンジュゲーション、具体的にはペプチドＶＲ＿９．１のために、以下の手順を行った。ＶＬＰモノマーと比較して≧１０倍過剰なモル濃度で固体無水コハク酸を添加することによって、Ｑβをまず誘導体化した。無水コハク酸を溶解させ、誘導体化反応を少なくとも３０分間にわたり進行させた。この時間の後、次に、試料を、ＮＡＰ−２５脱塩カラムを用いて、５ｍＭのＥＤＴＡを有するダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）内に脱塩した。次に、固体ペプチド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、および最後に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドという試薬を、列挙した順序で、ＶＬＰモノマーと比較して≧１０倍過剰なモル濃度で添加した。上記に列挙した順序で試薬を添加した後、試料を室温でインキュベートし、反応を少なくとも３０分間にわたり進行させ、その時間の後、ＶＬＰ−ペプチドコンジュゲートを、ＮＡＰ−２５脱塩カラムを用いて、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）内に脱塩した。
【０３０４】
ＶＬＰ−ペプチド試料についてのコンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定し、分子量の増大が全ての試料で観察され、このことは、ＶＬＰタンパク質モノマーへのペプチドの付加と一致した。さらに、試料を、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーアッセイ（Ｔｏｓｏｈ  ＰＷＸＬ５０００  ＨＰＬＣカラムを用いる）において試験し、コンジュゲートしていないＶＬＰ試料と比較して、集合したＶＬＰを含有することが見出された。ＶＬＰ−ペプチドコンジュゲーションの特徴を表２にまとめる。
【０３０５】
【表２】
0005859150.tif 000003
【０３０６】
（実施例３）
ＰＣＳＫ９ペプチドの免疫原性
この研究は、（上記の実施例２において詳述される）Ｑｂｅｔａ  ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドが、ヒトおよびマウスのＰＣＳＫ９に結合し得る抗体応答の誘発においてどの程度有効であるかを評価することが目的であった。０日目、２１日目、および４２日目に、メスのＢａｌｂ／ｃ（６〜８週齢）に、式５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ  ３’のＣｐＧと共にアルム内に製剤されたＶＬＰ−ペプチドコンジュゲートを、筋肉内経路によって注射した（５０マイクロリットル容量を各前脛骨筋内に注射した）。同一のプロトコルに従って、１つの対照マウス群を、対照（非ＰＣＳＫ９）ペプチドにカップリングしたＶＬＰで免疫化し、第２の対照群は免疫化しないままとした。剖検を４９日目に行った。剖検では、４００〜６００マイクロリットルの血液を、安楽死させたマウスから、抗凝固剤を用いて、心穿刺によって試料採取した。血液を遠心分離して血漿を分離し、血漿を、試験するまで凍結して保管した。
【０３０７】
完全長のヒト組換えＰＣＳＫ９タンパク質に対するＩｇＧ抗体応答を、比色ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。血清試料から連続希釈物を調製し、アッセイにおいて試験した。
【０３０８】
ヒトＰＣＳＫ９  ＥＬＩＳＡ法１：３８４ウェルの高結合アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  カタログ番号３７００）を、２５μＬ／ウェルの、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈したヒトＰＣＳＫ９タンパク質ストックで被覆し、振とう機上で、室温で３時間にわたりインキュベートした。ｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄した後、プレートを、８０μＬ／ウェルの、０．０１ＭのＰＢＳ／１％ＢＳＡを用いてブロックし、室温で１時間にわたりインキュベートし、その後、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回、最終的な洗浄を行った。翌日、１：２５の希釈（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ希釈剤）で開始して、各試料の８．５ｌｏｇの連続希釈物を調製し、２５μＬ／ウェルの連続希釈物を、ヒトＰＣＳＫ９で被覆したプレート内に２重に移し、次に、振とうしながら、室温で１．５時間にわたりインキュベートした。０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルの、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：６０００に希釈した、Ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ検出抗体（ウサギ抗ｍｕ  ＩｇＧ−Ｆｃ、カタログ番号Ａ９０−１３０Ａ  Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、次に、振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、２５μＬ／ウェルの、０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／ｐＨ７．４の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で１：３０００に希釈した、Ｂｉｏ−Ｒａｄキットヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  カタログ番号１７２−１０１９）を添加し、次に、振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、次に０．０１ＭのｐＨ７．４のＰＢＳのみで１回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのマウスＴｙｐｅｒ  ＨＲＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  カタログ番号１７２−１０６４）を添加し、プレートを室温で３０分間にわたりインキュベートした。２５μＬ／ウェルの２％シュウ酸を添加し、次に、吸光度を４０５ｎｍのＡｂｓで読み取った。
【０３０９】
マウスＰＣＳＫ９  ＥＬＩＳＡ法１：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ４ＨＢＸ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μｌの、ＰＢＳ内の１μｇ／ｍｌの組換えマウスＰＣＳＫ９で、４℃で一晩被覆した。洗浄した後、プレートを、３００ｍｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７０３０）で１時間にわたりブロックし、３００μｌのＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、血漿試料の１００μｌの連続希釈物（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ内）を添加した。穏やかに振とうしながら室温で１時間にわたりインキュベートした後、プレートを、３００μｌのＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、１００μｌの、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｐｉｅｒｃｅ  ３１４３０）の１：５０００希釈物を各ウェルに添加した。プレートを、穏やかに振とうしながら室温で４５分間にわたりインキュベートし、次に、３００μｌのＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で７回洗浄した。次に、１００μｌのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−４４４４）を添加し、２Ｎの硫酸を添加することによって４分後に比色反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０３１０】
データ分析：各試験試料について、滴定曲線をプロットした（試料の希釈対吸光度）。その後、試料の力価（後に、力価の逆数に変換された）を、１．０または０．５のカットオフ光学密度（０．Ｄ．）値を達成する血清希釈として得た。
【０３１１】
血漿／血清コレステロールレベルの測定
血漿試料および血清試料におけるコレステロールレベルを、製造者の指示に従って、ＷＡＫＯ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅ  Ａｓｓａｙキット（カタログ番号４３９−１７５０１）を用いて測定した。コレステロール標準または試験血漿／血清試料（４μｌ容量）の希釈物を、９６ウェルプレートのウェルに添加し、１９６μｌの調製されたコレステロール試薬を添加した。プレートを３７℃で５分間にわたりインキュベートし、発色の吸光度を３０分以内に６００ｎｍで読み取った。
【０３１２】
ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体の細胞外ドメインとの間の相互作用の測定
マウス血漿によるＬＤＬＲとＰＣＳＫ９との結合の中断を、フルオロフォアで標識したＬＤＬＲ細胞外ドメイン（ＬＤＬＲ−ＥＣＤ）および完全長の野生型ＰＣＳＫ９タンパク質を用いて、ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ）で決定した。ＬＤＬＲ−ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２１４８−ＬＤ／ＣＦ））を、製造者の指示に従ってユーロピウム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＰＡ９９１４８）で標識した（６：１のＥｕ：ＬＤＬＲモル濃度比）。ＰＣＳＫ９を、８のビオチン：ＰＣＳＫ９モル濃度比で、ビオチン−ＸＸ−ＳＳＥ（Ｐｉｅｒｓｅ、カタログ番号２１２３７）でビオチン化した。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを、３８４ウェルブラックプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６７６）内の２０ｕｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭのｐＨ７．０のＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、および０．０５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）内の、５ｎＭのＬＤＬＲ−Ｅｕ＋３、３０ｎＭのＰＣＳＫ９−ビオチン、および５０ｎＭのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７にコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＳＡ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｓ２１３７４）を用いて行った。マウス血漿の連続希釈物を、湿潤チャンバ内において、ＰＣＳＫ９−ビオチンと共に、室温で３０分間にわたりプレインキュベートし、その後、ＬＤＬＲおよびストレプトアビジン−ＳＡ６４７と混合した。暗所の湿潤雰囲気において室温でさらに６０分間インキュベートした後、プレートを、５０μｓの遅延時間および４００μｓのウィンドウを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーで読み取った。データは、（６６５ｎｍ／６１５ｎＭ）でのシグナルの比率×１０００として報告される。
【０３１３】
結果：図２において示されるように、免疫原として用いられた全てのペプチドは、無傷の完全長ヒトＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体応答を誘発し得、いくつかは、他のものよりも高い応答を誘発した。図３において示されるように、全てのケースにおいて、これらの応答は、マウスＰＣＳＫ９と交差反応した。図４は、ペプチドＶＲ＿９．５での免疫化もまた血漿コレステロールレベルを減少させたことを示し、図５および６は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて、ＶＲ＿９．５およびＶＲ＿９．６が、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間の相互作用を阻害し得る血清抗体応答を誘発したことを示す。
【０３１４】
（実施例４）
ＰＤＢ：３ＢＰＳに存在する受容体ＥＧＦ−Ａドメインと異なる領域に対応するペプチドの設計：
ＬＤＬ受容体は多ドメインタンパク質であり、その細胞外ドメインは、Ｎ末端リガンド結合ドメイン、３つのＥＧＦ様反復（ＥＧＦ−Ａはその１つである）、β−プロペラドメイン、および「Ｏ連結型糖ドメイン」からなる（Ｋｗｏｎら、ＰＮＡＳ  １０５、１８２０〜１８２５、２００８）。ＰＤＢファイル３ＧＣＸは、ＬＤＬ受容体のＥＧＦ−Ａドメインのみの可溶性形態との複合体となっているＰＣＳＫ９の構造を詳述しており、したがって、本発明者らは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ受容体との間に、ＰＤＢ：３ＧＣＸにおいて表されている分子の直接的な分析からは推定され得ない、さらなる自明ではない相互作用が存在し得ると想定した。これらの領域の例は、図７において詳述され、具体的には、ＰＣＳＫ９内の２つの配列が、さらなる推定受容体界面として作用し得ると同定された（ＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬ  およびＩＮＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬ、図８を参照されたい）。
ＳＩＰＷＮＬＥＲＩＩＰ（配列番号３３２）（マウス）
ＮＡＱＤＱＰＶＴＬＧＴＬ（配列番号２２７）
ＩＮＥＡＷＦＰＥＤＱＲＶＬ（配列番号２６３）
ＩＮＭＡＷＦＰＥＤＱＱＶＬ（配列番号３６０）（マウス）
【０３１５】
公共のデータベースにおいて見られるマウスＰＣＳＫ９配列を用いることによって、マウスホモログもまた同定した（表３において表示されるように）。本発明者らはまた、ペプチドＶＲ＿９．５（実施例１において記載される）内に含有されるアミノ酸配列の一部もまた、ＰＤＢ：３ＢＰＳにおいては見えないＬＤＬ受容体の一部と相互作用し得ると想定した（図８）。この概念は、アミノ酸リンカーおよびコンジュゲーションの方向を改変することによって、配列ＶＲ＿９．５を精密化することによって証明された。本発明者らはまた、ＶＲ＿９．５のマウスホモログに対応するペプチドも同定した（ペプチドＶＲ＿９．１０）。上記のアプローチから得られた一連のペプチド配列を、化学的コンジュゲーションを可能にするように、アミノ酸を付加することによって修飾し、ワクチン候補として評価した（表３において詳述されるペプチド）。
【０３１６】
【表３】
0005859150.tif 000004
【０３１７】
（実施例５）
ペプチドＶＲ＿９．１０からＶＲ＿９．１６（および比較のためのＶＲ＿９．５）を、実施例２において記載されているようにＱβ  ＶＬＰにコンジュゲートさせ、実施例３において記載されているように、マウスを免疫化してＰＣＳＫ９に対する抗体応答を評価するために用い、コンジュゲートしていないＶＬＰを対照免疫原として用いた。図９および１０において示されるように、全てのペプチドは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて無傷の完全長マウスＰＣＳＫ９を認識し得る抗体を誘発した。
【０３１８】
（実施例６）
成熟したプロセシングされた形態のヒトＰＣＳＫ９（配列番号１８４）のＮ末端に相当するペプチドＶＲ＿９．５での免疫化によってコレステロールの低下が誘発されるという本発明者らの観察に基づいて、本発明者らは、成熟していないＰＣＳＫ９の切断されたプロドメインが、成熟したＰＣＳＫ９タンパク質を伴ったままであることが知られているため、このプロドメイン（配列番号３２９）の領域もまた、コレステロールレベルを低下させるための候補抗体標的であると仮定した。
ＭＧＴＶＳＳＲＲＳＷＷＰＬＰＬＬＬＬＬＬＬＬＬＧＰＡＧＡＲＡＱＥＤＥＤＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧＬＡＥＡＰＥＨＧＴＴＡＴＦＨＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴＹＶＶＶＬＫＥＥＴＨＬＳＱＳＥＲＴＡＲＲＬＱＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬＨＶＦＨＧＬＬＰＧＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰＨＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱ（配列番号：３２９）
【０３１９】
目的のペプチドの具体的な非制限的な例は、ヒトにおける既知の機能喪失型遺伝子突然変異または機能獲得型遺伝子突然変異を含有する領域を含む、プロドメイン領域のＣ末端配列ならびに表面に曝露された配列およびループ内に見られる。
ＶＤＹＩＥＥＤＳＳＶＦＡＱ（配列番号：３０８）
ＲＣＡＫＤＰＷＲＬＰＧＴ（配列番号：３０９）
ＡＱＡＡＲＲＧＹＬＴＫＩＬ（配列番号：３１０）
ＧＤＹＥＥＬＶＬＡＬＲＳＥＥＤＧ（配列番号：３１１）
ＦＬＶＫＭＳＧＤＬＬＥＬＡＬＫＬＰ（配列番号：３１２）
【０３２０】
上記のペプチドおよびそのトランケーションは、Ｎ末端もしくはＣ末端に付加されたリンカー（例えば、ＣＧＧまたはＧＧＣ）を伴って合成されるか、または、環化された、もしくはそれ以外の方法で立体構造上拘束された分子として合成され、実施例２において記載されているようにＱβ  ＶＬＰにカップリングし、実施例３において記載されているように、マウスを免疫化してＰＣＳＫ９に対する抗体応答を評価するために用いられる。
【０３２１】
（実施例７）
ペプチドＶＲ＿９．５および９．１０を、実施例２において記載されているようにＱβ  ＶＬＰまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ、ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ、アルム、またはアルム−ＣｐＧをアジュバントとして用いてマウス（ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６）を免疫化するために用いた。Ｂ型肝炎ウイルス由来のペプチド（アミノ酸２８〜３９（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ））をＱβ  ＶＬＰまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートさせ、対照免疫原として用いた。
【０３２２】
用いたＥＬＩＳＡ法は、実施例３において開示されたものとはわずかに異なり、このＥＬＩＳＡ法は、以下のように、ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９  ＥＬＩＳＡ（方法２）のために行い、すなわち、３８４ウェルの高結合アッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ７８１０６１）を、２５μＬ／ウェルの、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに希釈したヒトまたはマウスＰＣＳＫ９タンパク質ストックで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを、２５μＬ／ウェルの１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡを用いてブロックし、振とう機上で、室温で１時間にわたりインキュベートした。１：５０または１：５００の希釈（１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０希釈剤）で開始して、各試料の１０．５ｌｏｇの連続希釈物を調製し、２５μＬ／ウェルの連続希釈物を、ヒトまたはマウスＰＣＳＫ９被覆プレート内に２重に移し、次に、振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、２５μＬ／ウェルの、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１：３０００に希釈した、Ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ検出抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（γ）、ＨＲＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍ３０１０７）を添加し、次に、振とうしながら、室温で１時間にわたりインキュベートした。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、２５μＬ／ウェルのＢｉｏ−Ｒａｄ  ＴＭＢ  ペルオキシダーゼＥＩＡ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  カタログ番号１７２−１０６７）を添加し、プレートを１５分間にわたりインキュベートした。１２．５μＬ／ウェルの１Ｎの硫酸を添加し、次に、吸光度を４５０ｎｍのＡｂｓで読み取った。
【０３２３】
結果：Ｑβ  ＶＬＰまたはＣＲＭ１９７にコンジュゲートしたペプチドＶＲ＿９．５および９．１０は、無傷の完全長ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体応答を誘発し得た（図１１および１２を参照されたい）。図１３および１４ならびに表４はまた、異なる担体にコンジュゲートした、かつ異なるアジュバントの存在下での、ペプチドＶＲ＿９．５および９．１０が、血清コレステロールレベルを減少させたことを示す。
【０３２４】
【表４】
0005859150.tif 000005
【０３２５】
（実施例８）
表面への曝露、およびヒトにおいて同定された機能獲得型突然変異または機能喪失型突然変異との関連について、さらなるペプチド（配列番号３１２、４２０、４２１、４２２、４２３、４２５、４２６、４２７、４２８、４４５、４８２、５２５、および５６３）を、ＰＣＳＫ９のプロドメインと触媒ドメインのＣ末端領域との両方から選択した。上記のアプローチから得られた一連のペプチド配列を、化学的コンジュゲーションを可能にするように、アミノ酸を付加することによって修飾し、ワクチン候補として評価した（表５、ペプチド９．２３〜９．３５）。
【０３２６】
【表５】
0005859150.tif 000006
【０３２７】
（実施例９）
ペプチドＶＲ＿９．１７からＶＲ＿９．３５（およびＶＲ＿９．５）を、実施例２において記載されているようにＱβ  ＶＬＰにコンジュゲートさせ、実施例３において記載されているように、マウスを免疫化してＰＣＳＫ９に対する抗体応答を評価するために用いた。Ｂ型肝炎ウイルス由来のペプチド（アミノ酸２８〜３９（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ））をＱβ  ＶＬＰにコンジュゲートさせ、対照免疫原として用いた。ＥＬＩＳＡには方法２を用いた。
【０３２８】
結果：図１５および１６において示されているように、Ｑβ  ＶＬＰにコンジュゲートしたペプチドのほとんどは、無傷の完全長ＰＣＳＫ９に対する抗体応答を誘発し得た。ペプチド９．３１および９．３２では抗体応答は検出されなかった。特定のケース（ペプチド９．２３、９．２４、９．２７、９．２８、９．２９、９．３０、９．３３、および９．３４）において、抗体応答は種特異的であった。ペプチド９．５、９．１８、および９．２９での免疫化はまた、血清コレステロールを減少させ、一方、ペプチド９．１７、９．１９、９．３０、９．３１、および９．３２での免疫化は、コレステロールを低減させる傾向があった（表６、図１７）。
【０３２９】
【表６】
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【０３３０】
配列表：
【０３３１】
【表７−１】
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【０３３２】
【表７−２】
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【０３３３】
【表７−３】
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【０３３４】
【表７−４】
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【０３３５】
【表７−５】
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【０３３６】
【表７−６】
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【０３３７】
【表７−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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