(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に照射する可干渉性を有する照明光を発振する光源と、前記照明光を試料に照射する投影光学系と、前記試料に照射された照明光により前記試料から発生した光を検出する検出部とを備えた顕微鏡装置において、
可干渉性を有する前記照明光を前記投影光学系を介して多数の焦点として光軸に垂直な平面上に投影するとともに、これら多数の焦点の隣り合う焦点の位相を変化させて前記投影された多数の焦点の領域を干渉により小さくし、
可干渉性を有する前記照明光をピンホールアレイを通過させて複数の発散光を発生させるとともに、前記ピンホールアレイを投影することにより前記多数の焦点を光軸に垂直な平面上に投影し、
前記試料から発生した光を検出する検出部を含む検出光学系は、前記試料による回折光と前記試料の通過の光とを干渉させてコントラストを生成することを特徴とする顕微鏡装置。
【請求項２】
前記ピンホールアレイを構成する各ピンホールは、レンズ効果を有する光学素子と組み合わされていることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
【請求項３】
前記焦点の間隔は、焦点の第一暗点までの距離の０．６倍から２倍の間の値であることを特徴とする請求項１または請求項２記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記試料から発生した光を検出する検出部を含む検出光学系は、検出された画像の高周波成分を抽出する手段を含むことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関し、特に光の回折限界を超えた超解像の観察が行える顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に生物研究の分野で用いられる顕微鏡には、二つのタイプが存在する。一つは試料を蛍光染色する蛍光顕微鏡に分類されるものであり、もう一つは試料を蛍光染色せずに資料からの透過光、回折光、反射光を観察する顕微鏡である。これらの顕微鏡としては、明視野顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡などが知られている。
【０００３】
図１９は、特許文献１（特開平５-３３３２７２号公報）に記載されている一般的な位相差顕微鏡の構成説明図である。図１９において、光源１と、光学系２を構成するコンデンサレンズ２ａおよび結像レンズ２ｂと、開口絞り板３および位相板４とを有している。透明の被観察物５は試料テーブル６に支持され、コンデンサレンズ２ａと結像レンズ２ｂとの間に配設されている。７は結像面である。
【０００４】
開口絞り板３は、光源１からの照明光をたとえばリングスリット状などの所定のパターンの絞り光とできるように構成されている。
【０００５】
位相板４は、透明板４ａに開口絞り板３の開口と同形状となるように位相制御膜４ｂが形成されたものであり、この位相制御膜４ｂは、その透過光の位相に遅れ（または進み）を生じさせるとともに、透過光量を低下させるものである。開口絞り板３は光学系２の前側焦点位置に配設され、位相板４は後側焦点位置に配設されている。
【０００６】
光源１から照射される光は、まず開口絞り板３の光透過部を通過する際にリング状の光に成形され、この光をコンデンサレンズ２ａにより平行光とした後に、被観察物５を透過させる。この透過光は、さらに順次結像レンズ２ｂおよび位相板４を経て、結像面７に結像する。
【０００７】
いま、被観察物５が均質で、しかも表面に凹凸などがなければ、開口絞り板３でリング状に絞られた照明光はこの被観察物５を透過して、位相板４における位相制御膜４ｂを通って、直接光（Ｓ波）としてそのまま結像面７に投影される。
【０００８】
一方、たとえば被観察物５に他の物体５ａが積層されていてこの観察物５に屈折率の差があったり、また表面に凹凸があったりすると、この被観察物５の物体５ａが位置する部位を通過する光は回折し、この回折光（Ｄ波）は位相板４における位相制御膜４ｂの形成領域以外の部位を透過する。しかも、このＤ波はＳ波に対して位相がずれる。
【０００９】
この位相のずれは、被観察物５の物体５ａが存在する部位とそれ以外の部位との屈折率の差およびその厚みにより変化するが、屈折率の差が小さくまた厚みも薄いものであればほぼλ／４となる。ここで、開口絞り板３は前側焦点位置に配置され、位相板４の位相制御膜４ｂは後側焦点位置に配置されていることから、Ｓ波は必ず位相制御膜４ｂを通過する。
【００１０】
したがって、この位相制御膜４ｂを通過する光の波長をＤ波に対してλ／４だけ遅れる方向または進む方向にずらせ、かつその透過光量を回折光の光量とほぼ同じ程度に設定しておくことにより直接光と回折光とが干渉し、結像面７に結ばれる像には明暗の差が生じる。位相板４によって位相を進む方向にずらせれば結像面７にはポジティブコントラストが表示され、また位相を遅らせればネガティブコントラストが表示されることになる。
【００１１】
図２０は、特許文献２（特開平５-１５０１６４号公報）に記載されている一般的な蛍光顕微鏡の構成説明図である。図２０において、たとえば水銀ランプなどの光源１１から投射された光は、コレクターレンズ１２で集光される。
【００１２】
干渉フィルター１３は、コレクターレンズ１２の出力側光軸と垂直方向の軸をもって回転可能に保持された透過波長シフト用フィルターとして機能する。さらに、この干渉フィルター１３の出力側には、開口絞り１４、視野絞り１５、所定の透過率を持った励起フィルター１６および所定の透過率を持ったダイクロイックミラー１７の順序で配置されている。
【００１３】
ダイクロイックミラー１７からの反射光は対物レンズ１８を介して上下動可能なステージ１９に載置された標本２０に照射され、この標本２０から発する２種類の蛍光を再度対物レンズ１８を通ってダイクロイックミラー１７に導くように構成されている。
【００１４】
ダイクロイックミラー１７の出射側には、所定の透過率を有する吸収フィルター２１と必要に応じて光路を観察系または写真撮影系に切り換えるために光路に挿脱可能に配置されたビームスプリッター２２が配置されている。
【００１５】
さらに、ビームスプリッター２２の観察系光路側には接眼光学系２３が配置され、写真撮影系光路側には写真撮影用接眼レンズ２４が配置されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開平５-３３３２７２号公報
【特許文献２】特開平５-１５０１６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ところで、たとえば細胞の内部構造などのより細かいものを見るためには、解像度を大きくする必要がある。解像度は、異なる２点間の識別能すなわち分解能として測ることができ、観察に使う光の波長に比例し、対物レンズの開口数に反比例する。
【００１８】
これらから、波長の短い光を開口数の大きな対物レンズで観察することにより解像度を大きくできるが、観察可能な光の波長はせいぜい２００ｎｍまでであり、光による観察には限界がある。
【００１９】
そこで、光に比べて波長がはるかに短い電子線を光の代わりに使ったのが電子顕微鏡である。ヒトの肉眼での分解能は約０．１ｍｍ、光学顕微鏡は約０．２μｍであるが、電子顕微鏡の分解能は約０．２ｎｍである。
【００２０】
光学顕微鏡の千倍もの解像度を有する電子顕微鏡を使うことにより、細胞の詳細な内部構造まで見ることができるが、電子顕微鏡は電子線を使うため、細胞を生きたまま観察することはできない。
【００２１】
本発明は、これらの問題点を解決したものであり、その目的は、超解像の観察が可能な位相差顕微鏡や蛍光顕微鏡などの光学的な顕微鏡装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
試料に照射する可干渉性を有する照明光を発振する光源と、前記照明光を試料に照射する投影光学系と、前記試料に照射された照明光により前記試料から発生した光を検出する検出部とを備えた顕微鏡装置において、
可干渉性を有する前記照明光を前記投影光学系を介して多数の焦点として光軸に垂直な平面上に投影するとともに、これら多数の焦点の隣り合う焦点の位相を変化させて前記投影された多数の焦点の領域を干渉により小さくし、
可干渉性を有する前記照明光をピンホールアレイを通過させて複数の発散光を発生させるとともに、前記ピンホールアレイを投影することにより前記多数の焦点を光軸に垂直な平面上に投影し、
前記試料から発生した光を検出する検出部を含む検出光学系は、前記試料による回折光と前記試料の通過の光とを干渉させてコントラストを生成することを特徴とする。
【００２３】
請求項２記載の発明は、請求項１に記載の顕微鏡装置において、
前記ピンホールアレイを構成する各ピンホールは、レンズ効果を有する光学素子と組み合わされていることを特徴とする。
【００２４】
請求項３記載の発明は、請求項１または請求項２記載の顕微鏡装置において、
前記焦点の間隔は、焦点の第一暗点までの距離の０．６倍から２倍の間の値であることを特徴とする。
【００２５】
請求項４記載の発明は、請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置において、
前記試料から発生した光を検出する検出部を含む検出光学系は、検出された画像の高周波成分を抽出する手段を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の顕微鏡装置によれば、多数の焦点の領域を干渉により回折限界よりも小さな照明光とすることができ、光の回折限界を超えた超解像の観察が行える。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明に基づく顕微鏡装置３１の具体例を示す構成説明図である。
【図２】制御系３３の具体例を示すブロック図である。
【図３】ピンホールディスク３７の部分拡大図である。
【図４】ピンホールディスク３７の断面図である。
【図５】実施形態の第２の制御のときの位相分布および強度分布の図である。
【図６】焦点面ＦＰの正面から見た状態図である。
【図７】回折光の分布例説明図である。
【図８】情報欠落状態を示す模式図である。
【図９】本発明の他の実施例を示す構成説明図である。
【図１０】制御系５９の具体例を示すブロック図である。
【図１１】本発明の他の実施例を示す構成説明図である。
【図１２】図１１で用いる位相回折格子の説明図である。
【図１３】スリットリング４１と同じ位置に設けられているコンデンサレンズ４２の瞳の説明図である。
【図１４】位相板４６が配置されている位置における対物レンズ４５の瞳の説明図である。
【図１５】位相回折格子７６の説明図である。
【図１６】本発明の他の実施例を示す構成説明図である。
【図１７】本発明の他の実施例を示す構成説明図である。
【図１８】スリットリング４１の他の構成説明図である。
【図１９】一般的な位相差顕微鏡の構成説明図である。
【図２０】一般的な蛍光顕微鏡の他の構成説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。図１は、本発明に基づく顕微鏡装置３１の具体例を示す構成説明図である。この顕微鏡装置３１は、顕微鏡光学系３２と制御系３３とで構成されている。
【００３３】
顕微鏡光学系３２は、レーザ光源３４と光ファイバ３５とコリメータレンズ３６とピンホールディスク３７とで構成されている。さらに、ピンホールディスク３７は、微動ステージ３８に連結されている。レーザ光源３４としては、たとえば波長４０５ｎｍのものが用いられる。
【００３４】
ピンホールディスク３７の前面には投影レンズ３９が配置され、投影レンズ３９の前面には反射ミラー４０が配置されている。反射ミラー４０の先にはコンデンサレンズ４２が配置され、コンデンサレンズ４２の瞳位置にはスリットリング４１が配置されている。観察対象の試料４３は試料台４４に搭載されている。
【００３５】
試料４３を通過した光を観察するために、対物レンズ４５が設けられている。ここで、対物レンズ４５およびコンデンサレンズ４２は、たとえば倍率１００倍でＮＡ（開口数）１．２のものが選択され、共役関係になる位置に配置されている。
【００３６】
対物レンズ４５の瞳位置には位相板４６が配置されている。位相板４６の先には全反射ミラー４７が配置され、その先にはカメラ４９に結像するためのチューブレンズ４８が配置されている。チューブレンズ４８の結像位置にはカメラ４９が配置されている。チューブレンズ４８と投影レンズ３９は、焦点距離が同じものが選択されている。カメラ４９としては、たとえば画素サイズが６μｍのものが用いられる。
【００３７】
図２は、制御系３３の具体例を示すブロック図である。制御系３３は、コントローラ５０とディスプレイ５１により構成されている。コントローラ５０は、入力部５２、画像生成部５３、光源制御部５４、制御部５５、微動ステージコントローラ５６などで構成されている。画像生成部５３はディスプレイ５１に接続されている。
【００３８】
図３は、ピンホールディスク３７の部分拡大図である。直径約１６μｍのピンホールＰＨが縦横２０μｍの間隔でマトリックス状に均一に配置されている。
【００３９】
図４は、ピンホールディスク３７の断面図である。ピンホールディスク３７の出射側には、すべてのピンホールＰＨに対してマイクロレンズＭＬが設けられている。さらに、ピンホールディスク３７の入射側には、ピンホールＰＨの一つおきに１/２波長板ＰＳが設けられている。
【００４０】
次に、動作について説明する。
レーザ光源３４の出力光は光ファイバ３５を介してコリメータレンズ３６に入射されて平行光に変換され、この平行光はピンホールディスク３７に入射される。ここで、平行光はそれぞれのピンホールＰＨによって分けられるとともに、ピンホールＰＨによって拡散されるが、マイクロレンズＭＬの作用によってその発散角は適切に調節される。
【００４１】
ピンホールディスク３７を出て発散されたそれぞれの光は、投影レンズ３９によりそれぞれピンホールＰＨの位置に対応した傾きを有する平行光に変換される。この平行光は反射ミラー４０によって反射された後、コンデンサレンズ４２に投影される。
【００４２】
コンデンサレンズ４２の瞳位置には、スリットリング４１が設けられている。このスリットリング４１の外径は、コンデンサレンズ４２の瞳径とほぼ同じ大きさに設定されている。したがって、このスリットリング４１を通過した光は、コンデンサレンズ４２によって焦点面ＦＰ上に焦点を結ぶが、これらの光はコンデンサレンズ４２の瞳径の外周部を通過しているために、ほぼ回折限界のスポットに絞られる。
【００４３】
これらそれぞれのスポットは、試料４３の内部に位置するように配置された焦点面ＦＰ上でそれぞれ焦点を結ぶ。これらの焦点において、微小な観察対象によって回折される光と、そのまま通過する光に分けられる。
【００４４】
そのまま通過する透過光は対物レンズ４５によって再び平行光に変換されるが、対物レンズ４５の瞳位置には位相板４６が配置されている。この位相板４６には、スリットリング４１に対応する位置に波長を１／４波長進ませるような波長板が組み込まれている。さらに、この波長板には、明るさを調節するためのＮＤフィルタも組み込まれている。
【００４５】
試料４３を通過した光は、この波長板によって波長を１／４波長進ませられた後、反射ミラー４７で反射して結像レンズ１によりカメラ４９上に結像され、カメラ４９によって撮影される。
【００４６】
一方、観察対象で回折された光は、回折により位相が１／４波長遅れるとともに、位相板４６の波長板のない部分を通過した後、結像レンズ４８を介してカメラ４９上の透過光と同じ焦点位置の同じ場所に結像する。
【００４７】
この試料４３を回折した光は、試料４３を通過した光に対して位相が１／２遅れていることからこれらの光は干渉により弱め合って暗くなり、コントラストが付く。
【００４８】
ピンホールディスク３７の動作について説明する。
ピンホールディスクを通過する光は互いに干渉性を有するレーザ光であるが、隣り合う光は１／２波長板によりその光の位相が半波長ずれるようになっていて、これらの光がコンデンサレンズ１３によって焦点を結ぶ。
【００４９】
コンデンサレンズの倍率を前述のように１００倍とすると、ピンホールの間隔２０μｍは０．２μｍとして投影される。ここで、投影される焦点のエアリーディスク径に着目すると、０．６１λ／ＮＡで示されることから約０．２μｍとなり、焦点の間隔と焦点の第一暗点までの距離すなわちエアリーディスクの半径とがほぼ等しくなる。
【００５０】
図５は、それぞれの光の点像分布図である。通常、個々の焦点は点線Ａで示すように焦点を結ぶが、互いに隣り合う焦点の位相が半波長ずれているために、隣り合う光が重なる部分は互いに弱め合う干渉となり、図５の実線Ｂで示すような点像分布となる。この点像分布は、通常の回折限界より細い幅となっている。
【００５１】
図６は、焦点面ＦＰの正面から見た状態図である。隣り合う光のうち、位相が同じものを実線Ａで、位相が半波長ずれているものを点線Ｂで示す。これらは干渉により、図６の直線で示される部分が干渉の弱め合う谷となる。したがって、図６にハッチングで示すエリアＣのみが選択的に照明されるが、これは通常の照明光で絞られる太い実線の円Ｄで示すスポットの領域よりも小さい。
【００５２】
この限られた領域からの回折光は、カメラ４９上で透過光と干渉する。図７はカメラ４９上における回折光の分布例図であり、各照明光の焦点の頂上部に極小さな観察対象が存在して光を回折させた場合の回折光の分布を示す。
【００５３】
図７に示すように、回折光の分布は、結像系の光学系によって急峻であった照明パターンよりはなだらかになるものの、それでも限られたエリアからの情報はカメラ４９に結像される。
【００５４】
チューブレンズ４８と投影レンズ３９は焦点距離が同じものが選択されているため、カメラ４９上の焦点の間隔はピンホール間隔と同じ２０μｍとなる。カメラ４９の画素サイズはたとえば６μｍであり、２０μｍに対して十分小さいものが選択されているので、これらの微細な情報が撮影可能である。
【００５５】
コントローラ５０の制御部５５は、光制御部２４を介してレーザ光源３４の発振を制御する。入力部５２は、ここで撮影される画像を保存する。ここで撮影される画像は、図５に示すように狭いスポットからの限られた画像情報であるため、図６に示される谷の部分の情報は欠落している。
【００５６】
図８はこのような情報欠落状態を示す模式図であり、隣り合う焦点を小さな実線の円で示している。制御部５５は、それぞれ干渉によって情報が欠落している部分を補完するように、微動ステージコントローラ５６を介してピンホールディスク３７をＡ→Ｂ→Ｃ→Ｄのように移動させるとともに、そこで撮影された画像を入力部５２で保存し、それらをもとに画像生成部５３でそれぞれの情報を合わせた画像を構築して、ディスプレイ５１に表示させる。
【００５７】
このような構成によれば、照明光を複数の焦点とするとともに、互いに干渉させて回折限界よりも小さい照明光としていることにより、従来に比べて高分解能で位相差観察が行える。
【００５８】
スリットリング４１をコンデンサレンズ４２の瞳径の外周部に設けていることにより、コンデンサレンズ４２のほぼ回折限界の焦点を投影することができ、高分解能が実現できる。
【００５９】
ピンホールＰＨの全面にマイクロレンズＭＬを配置していることにより、ピンホールＰＨで回折する光の発散角を調節することができ、光の利用効率を高く改善できる。
【００６０】
ピンホールディスク３７を微小に移動させて焦点の領域を微動させることにより、試料４３を隈なく観察できる。
【００６１】
そして、焦点の間隔と焦点の第一暗点までの距離すなわちエアリーディスクの半径とがほぼ等しく設定されているので、照明する領域を効果的に小さくでき、この例が最適である。
【００６２】
このような干渉により点像分布が小さくなる効果は、隣り合う焦点の間隔が第一暗点までの距離の２倍になるまで継続するが、焦点の距離が離れるのにつれて点像分布が小さくなる効果も減少する。
【００６３】
逆に隣り合う焦点の間隔が第一暗点までの距離よりも小さくなると、隣り合う光の外側の光の影響により信号光の強度が小さくなる。しかしながら、干渉により点像分布が小さくなる効果は、隣り合う焦点の間隔が第一暗点までの距離の０．６倍になるまでは継続することが計算により明らかである。
【００６４】
したがって焦点の間隔は、焦点の第一暗点までの距離の０．６倍より大きく、２倍より小さいことが好ましい。
【００６５】
図９は本発明の他の実施例を示す構成説明図であり、蛍光顕微鏡に応用したものであって、図１と共通する部分には同一の符号を付けている。この顕微鏡装置５７は、顕微鏡光学系５８と制御系５９とで構成されている。
【００６６】
顕微鏡光学系５７は、図１と同様に、レーザ光源３４と光ファイバ３５とコリメータレンズ３６とピンホールディスク３７を有する。さらにピンホールディスク３７は微動ステージ３８に連結されている。レーザ光源３４は波長４０５ｎｍのものが用いられている。
【００６７】
ピンホールディスク３７の前面には投影レンズ６０が配置されており、その前面にはダイクロイックミラーミラー６１が配置されている。このダイクロイックミラー６１はレーザ光源３４の波長は反射し、それよりも長い波長の光は透過するものが選択されている。ダイクロイックミラー６１で反射されたレーザ光の先には、対物レンズ６２が配置されている。観察対象である試料６３は、試料台６４に搭載されている。
【００６８】
対物レンズ６２は、たとえば倍率１００倍でＮＡ１．２のものが選択されている。ダイクロイックミラー６１を通過したその先には、カメラ６７に結像するためのチューブレンズ６６が配置されている。ダイクロイックミラー６１とチューブレンズ６６の間には蛍光フィルタ６５が配置されており、所望の蛍光帯域のみを通過させる。チューブレンズ６６の結像位置にはカメラ６７が配置されている。カメラ６７は、たとえば画素サイズが６μｍのものが用いられている。
【００６９】
図１０は、制御系５９の具体例を示すブロック図である。制御系５９は、コントローラ６８とディスプレイ６９により構成されている。コントローラ６８は、高周波成分抽出回路７０、一時保存部７１、画像生成部７２、光源制御部７３、制御部７４、微動ステージコントローラ７５などで構成されている。画像生成部７２にはディスプレイ６９が接続されている。
【００７０】
図９の動作を説明する。
レーザ光源３４の出力光は光ファイバ３５を介してコリメータレンズ３６に入射されて平行光に変換され、この平行光はピンホールディスク３７に入射される。ここで、平行光はそれぞれのピンホールＰＨによって分けられるとともに、ピンホールＰＨによって拡散されるが、マイクロレンズＭＬの作用によってその発散角は適切に調節される。
【００７１】
ピンホールディスク３７を出て発散されたそれぞれの光は、投影レンズ６０によりそれぞれピンホールの位置に対応した傾きを有する平行光に変換される。この平行光は、ダイクロイックミラー６１によって反射された後に対物レンズ６２に投影される。
【００７２】
各光は対物レンズ６２によって焦点面ＦＰ上に焦点を結ぶが、これらの光は対物レンズ６２によりほぼ回折限界のスポットに絞られる。これらのスポットは、試料６４の内部に位置するように配置された焦点面ＦＰ上でそれぞれ焦点を結ぶ。
【００７３】
この焦点位置におけるレーザ光により試料６４が励起され、蛍光を発する。この蛍光は対物レンズ６２により再び平行光に変換されてダイクロイックミラー６１を通過し、蛍光フィルタ６５で所望の波長帯域のみが選択された後に、結像レンズ６６によりカメラ６７上に結像され、カメラ６７によって撮影される。
【００７４】
ピンホールディスク３７の動作について説明する。
図１の実施例と同様に、ピンホールディスクを通過する光は互いに干渉性を有するレーザ光であるが、隣り合う光は１／２波長板によりその光の位相が半波長ずれるようになっていて、これらの光が対物レンズ６２によって焦点を結ぶ。
【００７５】
対物レンズ６２の倍率をたとえば１００倍とすると、ピンホールの間隔２０μｍは０．２μｍとして投影される。ここで、投影される焦点のエアリーディスク径は０．６１λ／ＮＡで示されので約０．２μｍとなり、焦点の間隔と焦点の第一暗点までの距離がほぼ等しくなる。
【００７６】
したがって、そのそれぞれの光は図１の実施例と同様に図５のようになる。通常、個々の焦点は点線Ａで示すように焦点を結ぶが、互いに隣り合う焦点の位相が半波長ずれているために、隣り合う光が重なる部分は互いに弱め合う干渉となるために実線Ｂで示すような点像分布となる。この点像分布は、通常の回折限界より細い幅となっている。
【００７７】
焦点面ＦＰの正面から見た状態図も、図１の実施例と同様に図６のようになる。隣り合う光のうち、実線で示す位相が同じ光と、点線で示す位相が半波長ずれているものとの干渉により、直線で示される部分が干渉の弱め合う谷となる。この結果、図６に示すハッチングエリアのみが選択的に照明されるが、これは通常の照明光で絞られるスポット（円で示される領域）よりも小さい。
【００７８】
この限られた領域からの蛍光は、カメラ６７で撮影される。前述の図７は、各照明光の焦点の頂上部に極小さな観察対象が存在して光を蛍光させた場合のカメラ上の蛍光の分布も示している。
【００７９】
図７に示すように、結像系の光学系によって、急峻であった照明パターンよりもなだらかになるものの、それでも限られたエリアからの情報はカメラ６７に結像される。
【００８０】
チューブレンズ６６と投影レンズ６０は焦点距離が同じものが選択されているため、このカメラ６７上の焦点の間隔はピンホール間隔と同じ２０μｍとなる。カメラ６７の画素サイズは６μｍと、２０μｍに対して十分小さいものが選択されているので、これらの微細な情報が撮影可能である。
【００８１】
コントローラ６８の動作を説明する。
制御部７４は、光源制御部７３を介してレーザ光源３４を制御する。
【００８２】
カメラからの画像は、高周波成分抽出回路７０に入力されて、高周波成分すなわち超解像成分が抽出される。この画像は一時保存部７１に一時保存される。ここで撮影される画像は、図５に示すように狭いスポットからの限られた画像情報であるため、図６に示される谷の部分の情報が欠落したものであり、図８の模式図のようになる。
【００８３】
制御部７４は、図８に示すそれぞれ干渉による情報の欠落部分を補完するように、微動ステージコントローラ７５を介してピンホールディスクを移動させるとともに、そこで撮影された画像を一時保存部７１で保存し、それらをもとに画像生成部７２でそれぞれの情報を合わせた画像を構築してディスプレイ６９に表示させる。
【００８４】
この場合も、照明光を複数の焦点とした上で互いに干渉させて回折限界よりも小さい照明光としたことにより、従来よりも高分解能な蛍光画像観察が行える。
【００８５】
また、ピンホール全面にマイクロレンズを配置したことにより、ピンホールで回折する光の発散角を調節できるので、光の利用効率を高く設定できる。
【００８６】
また、ピンホールアレイを微小移動させて焦点の領域を微動させることができ、試料を隈なく観察することができる。
【００８７】
また、撮影された画像のうちの高周波成分を抽出することにより、焦点近傍の画像情報を抽出することができ、あたかも共焦点顕微鏡のような焦点近傍のスライス像を観察できる。
【００８８】
さらに、焦点の間隔と焦点の第一暗点までの距離をほぼ等しくしたので、照明する領域を効果的に小さくできる。
【００８９】
図１１も本発明の他の実施例を示す構成説明図であり、図１と共通する部分には同一の符号を付けている。図１と図１１の相違点は、図１１では図１のピンホールディスク３７に代えて、図１２に示すような位相回折格子７６を用いていることである。この位相回折格子７６もピンホールディスク３７と同様に微動ステージ３８に連結されている。
【００９０】
図１２において、位相回折格子７６はたとえば９μｍピッチで区切られており、ハッチング部７６ａは白色部７６ｂに対して通過する光の位相をπ/２遅らせる構造になっている。
【００９１】
コンデンサレンズ４２および対物レンズ４５は、たとえば倍率４０倍でＮＡ０．９５のものが選択され、共役関係になる位置に配置されている。
【００９２】
対物レンズ４５の瞳位置には位相板４６が配置されている。位相板４６の先には全反射ミラー４７が配置され、その先にはカメラ４９に結像するためのチューブレンズ４８が配置されている。チューブレンズ４８の結像位置にはカメラ４９が配置されている。チューブレンズ４８と投影レンズ３９は、焦点距離が同じものが選択されている。カメラ４９としては、たとえば画素サイズが２μｍのものが用いられる。
【００９３】
次に、動作について説明する。
レーザ光源３４の出力光は光ファイバ３５を介してコリメータレンズ３６に入射されて平行光に変換され、この平行光は位相回折格子７６に入射される。ここで位相回折格子７６の作用によって０次光と一次回折光に回折される。図１１では一次回折光のみを示している。
【００９４】
この一次回折光は投影レンズ３９の作用によって反射ミラー４０で反射された後、図１３に示すようにコンデンサレンズ４２の瞳位置に集光される。なお、コンデンサレンズ４２の瞳位置にはスリットリング４１が設けられていて、このスリットリング４１の開口の外径は、コンデンサレンズ４２の瞳径とほぼ同じ大きさに設定されている。
【００９５】
このスリットリング４１は、位相回折格子７６を通過した０次光を遮る役割を果たす。一次回折光はコンデンサレンズ４２により二つの平行光となり、試料４３の内部に来るように配置された焦点面ＦＰ上に干渉縞を形成する。
【００９６】
試料４３が位相物体である場合を考える。
試料４３をそのまま通過する透過光は、レンズ４５の瞳位置で焦点を結ぶ。対物レンズ４５の瞳位置には位相板４６が配置されている。この位相板４６のスリットリング４１に対応する位置には波長を１／４波長進ませるような波長板４６ａが組み込まれていて、波長板４６ａの部分には明るさを調節するためのＮＤフィルタも組み込まれている。
【００９７】
試料４３を通過した光は波長板４６ａによって波長を１／４波長進ませられた後、反射ミラー４７で反射し、結像レンズ４８によって２つの平行光に変換され、カメラ４９上で再び干渉縞を形成する。
【００９８】
位相物体である試料４３によって回折された光は、回折によって位相が１／４波長遅らせられた後に対物レンズ４５に入射される。この回折光の大部分は位相板４６の波長板のない部分を通過した後に、結像レンズ４８によってカメラ４９面上に結像する。
【００９９】
試料４３を回折した光は試料４３を通過した光に対して位相が１／２遅れていることから、これらの光が干渉して弱め合うことで暗くコントラストが付くことになり、像を形成する。
【０１００】
図１３は、スリットリング４１とともに同じ位置に設けられているコンデンサレンズ４２の瞳の説明図である。瞳の円周近傍にはリング状の一次回折光Ｆ１の照射部４２ａが形成され、このリング状の照射部４２ａを除く部分は遮光部４２ｂとして形成されている。
【０１０１】
図１４は、位相板４６が配置されている位置における対物レンズ４５の瞳の説明図である。円周近傍にはリング状に重なり合うように位相板４６が位置していて、透過光ＴＬが照射される。
【０１０２】
図１５は、位相回折格子７６の動作説明図である。
位相回折格子７６を通過する光は互いに干渉性を有するレーザ光であるが、位相回折格子７６の格子７６ａと７６ｂで形成される縞の隣り合う光の位相が半波長ずれるようになっている。これによって以下の角度の方向に一次回折光が発生する。
Ｐ・Ｓｉｎθ＝λ/２
ここで、ピッチＰを９μｍとすると、Ｓｉｎθは０．０２３となる。
【０１０３】
また、投影レンズ３９として焦点距離ｆが１８０ｍｍのものを選ぶと、コンデンサレンズ４２の中心から４.１ｍｍの所に焦点を結ぶ。コンデンサレンズ４２のｆ４．５は、ＮＡ０．９５とすると瞳の半径は４．３ｍｍとなり、瞳径の外周付近に焦点を結ぶ。
【０１０４】
位相回折格子７６によって発生した１次回折光と−１次回折光は、図１３に示すように、コンデンサレンズ４２のリング状の照射部４２ａにおける直径の線上の点対称となる位置に二つの焦点Ｆ１、Ｆ２を結ぶ。
【０１０５】
コンデンサレンズ４２のリング状の照射部４２ａに結像された１次回折光と−１次回折光は、図１４に示すように、対物レンズ４５の円周近傍にリング状に設けられている位相板４６に透過光ＴＬとして照射される。
【０１０６】
これら１次回折光と−１次回折光はコンデンサレンズ４２によって二つの平行光に変換され、焦点面上に干渉縞を形成する。
【０１０７】
これら二つの光はＮＡ０．９相当の傾きを有する光となり、干渉縞のピッチＰ１は、
２・Ｐ１・ＮＡ＝λ
となる。ここで、Ｐ１は０．２２５μｍとなり、ほぼ回折限界に近い縞を形成する。
【０１０８】
対物レンズとしてｆ４．５でＮＡ０．９５のものを選び、チューブレンズ４８はｆ１８０ｍｍのものを選ぶとする。
【０１０９】
試料４３を通過した光は、対物レンズ４５によってその瞳位置に焦点を結ぶ。瞳位置には位相板４６が配置されていて、スリットリング４１の開口に対応する位置に、位相を１/４波長進ませる波長板が組み込まれている。この波長板上に光は焦点を結ぶ。
【０１１０】
これらの光は、照明光学系と共役の関係になっている。位相板４５を通過した光はチューブレンズ４８によって二つの平行光に変換され、カメラ４９上で９μｍのピッチを有する干渉縞を形成する。ここでカメラの画素をたとえば２μｍとすると、干渉縞よりも十分細かく、干渉縞を忠実に撮像できる。
【０１１１】
さらに焦点面で回折が発生すると、これらの回折光と通過光が干渉を起こす。
たとえば焦点面にピッチＰ１よりも細かくＰ１の半分よりは大きい周期構造があると仮定する。照明光のピッチがＰ１であるためＰ１のピッチで回折が起こり、カメラ４９の面上ではモアレが発生する。このモアレは照明光のパターンが分かっているため、逆演算によって焦点面の周期構造を求めることができる。モアレは投影したピッチの１／２程度の周期構造によって発生するため、逆演算によって従来よりも分解能が約２倍の情報を得ることができる。
【０１１２】
また、このままの状態では焦点面における干渉縞の明の部分の情報しか得ることができないが、干渉縞をたとえばピッチＰ１がＰ１／３ずつ移動するように位相回折格子７６をステージ３８によって移動させながら画像を撮影し、焦点面のすべての場所の情報を演算によって求めることができる。
【０１１３】
なお、上記の方法で高分解能になるのは縞を有する１方向だけであるが、ステージ３８によって位相回折格子７６をたとえば１２０度ずつ回転させた位置において上記の撮影をそれぞれ行うことにより、複数の方向成分の高解像情報が得られる。最終的にこれらの情報を合成することで高解像画像が作成できる。
【０１１４】
また、位相回折格子７６を回転させると、照明光はスリットリング４１の開口部に焦点を結び、さらに位相板４６上の波長板上で焦点を結ぶことになる。この場合には、スリットリング４１と位相板４６を回転させる必要がなくなるので、装置全体の構成を簡略化できる。
【０１１５】
上記実施例では位相回折格子７６を用いる例を示したが、これに限らず、たとえば空間位相変調素子を用いても構わない。
【０１１６】
このように、試料４３に回折限界に近い縞を生じる照明光を照射してこの照明光の試料４３を透過した光を再びカメラ４９上に投影するとともに、照明光による試料４３の回折光をカメラ４９上に投影させて透過光と回折光を干渉させることにより、撮影される画像から高分解能画像を再構築できる。
【０１１７】
試料４３を透過した光の波長を１／４波長板で操作することにより、試料４３が位相物体であっても回折光と照明光が干渉を起こすことから、コントラストのある画像を得ることができる。
【０１１８】
スリットリング４１をコンデンサレンズ４２の瞳径の外周部に設けることにより、コンデンサレンズ４２のほぼ回折限界の縞を投影することができる。
【０１１９】
スリットをスリットリング４１としてリング状に構成しているので、位相回折格子７６を回転させても、照明光スリットを回転させなくてもよい。
【０１２０】
また、位相板４６もリング状に配置したので、位相回折格子７６を回転させても、位相板４６を回転させる必要はない。
【０１２１】
図１６も本発明の他の実施例を示す構成説明図であり、図１と共通する部分には同一の符号を付けている。図１と図１６の相違点は、図１６では図１のスリットリング４１を用いていないことである。なお、観察対象である試料４３は光吸収体であるとする。
【０１２２】
ここで試料４３をそのまま通過する透過光は、対物レンズ４５の瞳位置で焦点を結ぶ。試料４３を通過した光はその光の一部を吸収された後に、波長板がないのでそのまま反射ミラー４７で反射し、結像レンズ４８によって２つの平行光に変換され、カメラ４９上で再び干渉縞を形成する。
【０１２３】
本実施例の場合、観察対象の光吸収体によって発生する回折光は、対物レンズ４５で回収されて反射ミラー４７で反射され、結像レンズ４８によってカメラ４９の面上に結像される。図１に示した実施例とは異なり、光吸収体を通過した光と回折した光とは等位相であるため、カメラ４９の面上で干渉して像を形成する。
【０１２４】
また、レーザ光源３４として複数の波長を有するものを使用して各波長ごとに像の撮影を行い、各波長ごとの透過光の像を求めることによりカラー情報を得ることができる。試料４３が光吸収体であっても高分解能に観察できる。
【０１２５】
図１７も本発明の他の実施例を示す構成説明図であり、明視野顕微鏡に応用した例であって、図１と共通する部分には同一の符号を付けている。図１と図１７の相違点は、顕微鏡光学系である。
【０１２６】
図１７では、反射ミラー４０の代わりにハーフミラー８１を用い、チューブレンズ４８およびカメラ４９をハーフミラー８１の後方に配置している。
【０１２７】
スリットリング４１としては、たとえば図１８に示すように構成されたものを用いる。図１８において、中心部には０次光を遮るために遮光部４１ａが設けられているが、遮光部４１ａの大きさは必要最小限となっている。遮光部４１ａの外周は開口部４１ｂとして形成されている。位相回折格子７６によって発生した１次回折光と−１次回折光は、図１３と同様に、スリットリング４１の直径の線上の点対称となる位置に入射される。
【０１２８】
そして、コンデンサレンズ４２の代わりに対物レンズ４５を配置している。
【０１２９】
照明系は、図１、図９、図１１に示す他の実施例と同様に動作する。図１７の実施例では、観察する試料４３は表面が平坦な高反射物体とし、たとえばガラスなどの表面状態を詳細に観察するような場合を考える。
【０１３０】
図１７において、一次回折光は、投影レンズ３９の作用によってハーフミラー８１で反射された後に対物レンズ４５の瞳位置に集光される。また、対物レンズ４５の瞳位置にはスリットリング４１が設けられている。
【０１３１】
前述のように、このスリットリング４１の開口の外径はコンデンサレンズ４２の瞳径とほぼ同じ大きさに設けられている。ここでこのスリットリング４１は位相格子を通過した０次光を遮る役割を果たす。１次回折光は対物レンズ４５により二つの平行光となり、試料４３の表面に来るように配置された焦点面ＦＰ上に干渉縞を形成する。
【０１３２】
ここで、試料４３をそのままそのまま反射する光は対物レンズ４５の瞳位置で再び焦点を結ぶ。この光はハーフミラー８１を通過し、結像レンズ４８によって２つの平行光に変換され、カメラ４９上で再び干渉縞を形成する。
【０１３３】
また、試料４３の表面に散乱体がある場合、この散乱体によって散乱された光は対物レンズ４５で回収されてハーフミラー８１を通過し、結像レンズ４８によってカメラ４９面上に結像する。ここで、この試料４３で散乱した光と試料４３で反射した光が干渉し、像を形成する。
【０１３４】
なお、本実施例でも、複数の波長の光源を用いてカラー情報を得てもよい。
【０１３５】
これにより、試料４３が反射物体であっても、高分解能で観察できる。
【０１３６】
以上説明したように、本発明によれば、多数の焦点の領域を干渉により回折限界よりも小さな照明光とすることができ、光の回折限界を超えた超解像の観察が行える顕微鏡装置が実現できる。
【符号の説明】
【０１３７】
３１、５７  顕微鏡装置
３２、５８  顕微鏡光学系
３３、５９  制御系
３４  レーザ光源
３５  光ファイバ
３６  コリメータレンズ
３７  ピンホールディスク
３８  微動ステージ
３９  投影レンズ
４０  反射ミラー
４１  スリットリング
４２  コンデンサレンズ
４３、６３  試料
４４、６４  試料台
４５、６２  対物レンズ
４６  位相板
４７  全反射ミラー
４８、６６  チューブレンズ
４９、６７  カメラ
５０、６８  コントローラ
５１、６９  ディスプレイ
５２  入力部
５３、７２  画像生成部
５４、７３  光源制御部
５５、７４  制御部
５６、７５  微動ステージコントローラ
６０  投影レンズ
６１  ダイクロイックミラー
７０  高周波成分抽出回路
７１  一時保存部
７６  位相回折格子
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
0005915874.tif 000017
【図１７】
0005915874.tif 000018
【図１８】
0005915874.tif 000019
【図１９】
0005915874.tif 000020
【図２０】
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