(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法であって、該方法が：
ａ）（ｉ）少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、および（ｉｉ）タグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれ、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を細胞内に導入すること、ならびに、
ｂ）標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、タグ無しの内因性タンパク質と機能的に同等であるタグ付き内因性タンパク質が生成されるように、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、ここで、該内因性タンパク質は、アクチン、チューブリン、ラミン、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、および高移動度グループＡタンパク質（ＨＭＧＡ）から選択されるものである、
を含む方法。
【請求項２】
標的エンドヌクレアーゼが一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、ヒトＵ２ＯＳ細胞、ヒトＭＣＦ１０Ａ細胞、ヒトＳＫＯＶ３細胞、またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
内因性タンパク質がＣ末端で、またはＮ末端でタグ付けされる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号１および２、配列番号１３および１４、配列番号１８および１９、配列番号２２および２３、または配列番号２５および２６と、少なくとも８０％の配列同一性を有する一対の配列に結合する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
配列同一性が８５％、９０％、９５％、９９％または１００％である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、タグ無しの内因性タンパク質と機能的に同等である少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む、ほ乳類細胞であって、該内因性タンパク質は、アクチン、チューブリン、ラミン、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、および高移動度グループＡタンパク質（ＨＭＧＡ）から選択されるものである、ほ乳類細胞。
【請求項８】
細胞が、ヒトＵ２ＯＳ細胞、ヒトＭＣＦ１０Ａ細胞、ヒトＳＫＯＶ３細胞、またはヒトｉＰＳ細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
内因性タンパク質がＣ末端で、またはＮ末端でタグ付けされる、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が一つ以上の蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する、請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞が：
ａ）（ｉ）少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、および（ｉｉ）タグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれ、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を親細胞内に導入すること、ならびに、
ｂ）標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、
によって生成される、請求項７に記載の細胞。
【請求項１２】
標的エンドヌクレアーゼが一対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼが、配列番号１および２、配列番号１３および１４、配列番号１８および１９、配列番号２２および２３、または配列番号２５および２６と、少なくとも８０％の配列同一性を有する一対の配列に結合する、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
配列同一性が８５％、９０％、９５％、９９％または１００％である、請求項１３に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７０２号、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，７１９号、２０１０年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／３２３，６９８号、２０１０年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／３６７，０１７号、２０１０年１０月７日に出願された米国仮特許出願第６１／３９０，６６８号、２０１０年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／４０８，８５６号、および２０１１年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／４３１，９５７号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は内因性タンパク質にタグを付けるための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質のタグ付けは、細胞内の対象のタンパク質での視覚的な読み出し情報を提供するため広範囲に使用されている。他の用途間では、タグ付きタンパク質を使用して、タンパク質の分布および局在、転写および翻訳調節、翻訳後修飾、タンパク質間相互作用、選択的スプライシング、ＲＮＡｉによるＲＮＡおよびタンパク質のノックダウン、および転写因子結合部位が研究されている。しかしながら、細胞内でタグ付きタンパク質を発現する現在の方法は、内因性タンパク質の発現パターンを反映しない、歪んだ発現を引き起こす。これは、タグ付きタンパク質の発現が、発現のために異種プロモーターに依存することが多いからである。加えて、いくつかのタグ付きタンパク質は、エピジェネティックなベクターまたは細胞ゲノム内にランダムにインテグレートされたベクターから異所性に発現され、それゆえ内因性調節経路によって制御されない。そのため、内因性調節経路によって制御されるタグ付きタンパク質を生成するため、細胞の染色体内へ特異的なインテグレーションを行うことができる方法について、強い要望がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様では、本開示は、少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法を提供する。該方法は、ａ）（ｉ）少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼあるいは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸、該標的エンドヌクレアーゼは標的部位に結合し、かつ内因性タンパク質をコードする染色体配列内の切断部位を切断することができるものである、および（ｉｉ）タグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチド、該タグ配列は上流配列および下流配列に挟まれ（ｆｌａｎｋｅｄ）、該上流配列および下流配列は染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである、を細胞内に導入すること；ならびに、（ｂ）標的エンドヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされ、ここにタグ付き内因性タンパク質が生成されるものであるように、相同性指向過程により修復されるような条件下で、細胞を維持すること、を含む。
【０００５】
別の態様では、本開示は、細胞が少なくとも一つのタグ付きタンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。
【０００６】
さらに別の態様では、本開示は、内因性タンパク質の局在を観察するためのキットを提供する。該キットは、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含む。
【０００７】
本開示の他の態様および繰り返し（ｉｔｅｒａｔｉｏｎ）は、以下に、より詳細に記載される。
【０００８】
カラー図面の参照
本願は、カラーで制作された少なくとも一つの写真を含む。カラー写真付きの本特許出願公報の写しは、請求および必要手数料の支払いにより、特許庁から提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）でのタグ配列インテグレーションの設計を表す。（Ａ）は、タグ配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位（囲まれたヌクレオチド）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（緑色の矢印）での染色体配列（配列番号２９）を示す概略図である。（Ｂ）は、コード領域（赤）、非翻訳領域（青）、およびＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）を示す、ＴＵＢＡ１Ｂゲノム標的領域を表す概略図である。（Ｃ）は、インテグレーション前のＴＵＢＡ１Ｂゲノム領域のＤＮＡ断片の概略図である。（Ｄ）は、ＴＵＢＡ１Ｂコード配列とインフレームでインテグレートされたＧＦＰ配列を備えるＴＵＢＡ１Ｂゲノム領域のＤＮＡ断片の概略図である。（Ｅ）は、タグ配列のインテグレーション成功後に構築される、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合された内因性α−チューブリンタンパク質の概略図である。
【００１０】
【図２】図２は、ゲノムチューブリン配列に挟まれたＧＦＰタグを含むドナープラスミドのマップを表す。
【００１１】
【図３】図３は、ＧＦＰ２コード配列がチューブリンコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＴＵＢＡ１Ｂゲノム領域のＤＮＡ配列（配列番号４）を表す。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＧＦＰ２のコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのためのＭｅｔコドンを示す。
【００１２】
【図４】図４は、ＲＦＰコード配列がチューブリンコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＴＵＢＡ１Ｂゲノム領域のＤＮＡ配列（配列番号５）を表す。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＲＦＰのコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのためのＭｅｔコドンを示す。
【００１３】
【図５】図５は、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＧＦＰの標的化インテグレーション（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に対して特異的なプライマーを用いる、１４種の細胞クローンのジャンクションＰＣＲのアガロースゲル電気泳動解析を示す。分子サイズマーカーおよびＧＦＰ対照もまた示される。
【００１４】
【図６】図６は、ＧＦＰでタグ付けされた内因性α−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質を発現する、個々の単離された細胞クローンの微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像の多数の例を示す。（Ａ）Ｕ２ＯＳ細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｂ）Ｕ２ＯＳ細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｃ）Ｕ２ＯＳ細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｄ）Ａ５４９細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｅ）Ａ５４９細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｆ）Ｋ５６２細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、（Ｇ）ＨＥＫ２９３細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質、および（Ｈ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質。
【００１５】
【図７】図７は、ゲノムチューブリン配列に挟まれたＲＦＰタグを含むドナープラスミドのマップを表す。
【００１６】
【図８】図８は、ＭＣＦ１０ａ細胞株におけるＴＵＢＡ１Ｂ領域内へのＲＦＰインテグレーションの検証（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を表す。インテグレーションは、チューブリンプライマーを用いてゲノムＰＣＲおよびジャンクションＰＣＲにより検証した。（Ａ）１９４５ｂｐのＲＦＰ／チューブリン融合バンドの存在を示すサザンブロッティング、および（Ｂ）数クローンにおけるＴＵＢＡ１Ｂ内へのＲＦＰタグ配列の陽性インテグレーション（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を示すゲノムＰＣＲ（Ｔ．Ｉ．＝標的化インテグレーション）。野生型（Ｗｔ）ＭＣＦ１０ａ細胞およびＲＦＰインテグレーションを備えるＵ２ＯＳ細胞株を対照群として用いた。
【００１７】
【図９】図９は、ＲＦＰ配列のインテグレーションを示すＭＣＦ１０ａ細胞におけるＴＵＢＡ１Ｂ領域の確認された配列を表す（配列番号８）。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＧＦＰ２のコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのためのＭｅｔコドンを示す。
【００１８】
【図１０】図１０は、ＭＣＦ１０ａ細胞のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＲＦＰインテグレーション、ならびに、Ｕ２ＯＳ細胞の同じ遺伝子座内へのＲＦＰおよびＧＦＰインテグレーションのＰＣＲ検証を表す。野生型バンドは４５２ｂｐであり、標的化インテグレート（Ｔ．Ｉ．）されたバンドは１１９０ｂｐであった。
【００１９】
【図１１】図１１は、ＭＣＦ１０ａクローン５におけるＲＦＰの挿入の部位でのジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が予測されるサイズであったことを示す。左ジャンクションの予測されるサイズは４５３ｂｐであり、右ジャンクションの予測されるサイズは４０８９ｂｐであった。
【００２０】
【図１２】図１２は、ＲＦＰタグ付きチューブリンを備えるＭＣＦ１０ａクローン５におけるＲＦＰおよびチューブリン発現を検出するウェスタンブロッティングを表す。
【００２１】
【図１３】図１３は、野生型ＭＣＦ１０ａ細胞の＞９９％は赤色蛍光を欠く一方、ＲＦＰタグ付きチューブリンを含むＭＣＦ１０ａクローン５細胞の＞９９％は赤色蛍光を有したことを表す。
【００２２】
【図１４】図１４は、ＲＦＰタグ付きチューブリンを含むトランスフェクトされたＭＣＦ１０ａ細胞の表現型安定性を表す。（Ａ）Ｐ２での発現、および（Ｂ）Ｐ１８。ＤＩＣ画像が左、蛍光画像が右である。
【００２３】
【図１５】図１５は、ゲノムＳＴＡＴ３配列に挟まれたＧＦＰタグを含むドナープラスミドのマップを表す。
【００２４】
【図１６】図１６は、タグ配列のインテグレーションのためのＳＴＡＴ３領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位（黄色の配列）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（緑色の矢印）での染色体配列（配列番号２７）を示す概略図である。「Ｍ」はアミノ酸開始コドンメチオニンを表す。
【００２５】
【図１７】図１７は、意図される部位でのＳＴＡＴ３染色体配列の切断におけるＺＦＮの有効性を確認するＣｅｌ−１アッセイを表す（第三レーン）。ドナーポリヌクレオチド対照単独に対するＣｅｌ−１の結果、およびドナーポリヌクレオチド対照を備えるＺＦＮに対するＣｅｌ−１の結果も示される。
【００２６】
【図１８】図１８は、ＳＴＡＴ３遺伝子座に対して特異的なＺＦＮをコードする合成ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動解析を示す。
【００２７】
【図１９】図１９は、ＳＴＡＴ３遺伝子座内へのＧＦＰのインテグレーションのために、ＺＦＮおよびドナーポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞に対するセルソーターデータを表す（Ａ）。陰性対照細胞に対するセルソーターデータも示される（Ｂ）。
【００２８】
【図２０】図２０は、ゲノムにおける２つの異なる標的とされる領域のジャンクションＰＣＲのアガロースゲル電気泳動解析を示す：β−アクチンをコードするＡＣＴＢ領域はＧＦＰまたはＲＦＰのいずれかをコードするタグ配列で標的とされ、一方でＳＴＡＴ３はＧＦＰをコードするタグ配列で標的とされた。ＳＴＡＴ３は２つの異なるジャンクションプライマーセット（「プライマー１」および「プライマー２」）を用いて解析された。ＰＣＲでアクチン遺伝子座内のインテグレーションは確認されたが、ＳＴＡＴ３遺伝子座内は確認されなかった。分子サイズマーカーおよびＧＦＰ対照も示される。
【００２９】
【図２１】図２１は、ＧＦＰタグ配列を挟むゲノムＭＡＰＲＥ３配列を含むドナープラスミドのマップを表す。
【００３０】
【図２２】図２２は、Ｎ末端インテグレーション部位でのＭＡＰＲＥ３染色体配列の切断における多数のＺＦＮペアの有効性を確認するＣｅｌ−１アッセイを表す。レーン１はＤＮＡサイズマーカー、レーン２および１１はＧＦＰ対照、ならびにレーン３から１０は各レーンの上部に示される様々なＺＦＮペアを用いるＣｅｌ−１アッセイを表す。
【００３１】
【図２３】図２３は、Ｃ末端インテグレーション部位でのＭＡＰＲＥ３標的化染色体配列の切断における多数のＺＦＮペアの有効性（レーン４−７）、および、ＬＭＮＢ１標的化染色体配列の切断におけるＺＦＮペアのＣｅｌ−１アッセイ結果（レーン１０−１３）を示すＣｅｌ−１アッセイを表す。レーン１および２はＤＮＡサイズマーカー、レーン３および８はＧＦＰ−ＭＡＰＲＥ３対照、ならびにレーン９および１４はＧＦＰ−ラミン（Ｌａｍｉｎ）対照である。
【００３２】
【図２４】図２４は、ＭＡＰＲＥ３標的部位でのジャンクションＰＣＲのアガロースゲル電気泳動解析を示す。丸はタグ配列の予想されるインテグレーションを強調する。
【００３３】
【図２５】ＭＡＰＲＥ３遺伝子座内へＧＦＰタグ配列をインテグレートするために、ＺＦＮおよびドナーポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞のセルソーター解析を表す。（Ａ）ドナーポリヌクレオチド単独でトランスフェクトされた対照細胞、および（Ｂ）ＺＦＮ＋ドナーポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞。
【００３４】
【図２６】図２６は、ＡＣＴＢ遺伝子座でのタグ配列インテグレーションの設計を表す。（Ａ）は、タグ配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位（黄色の配列）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（緑色、ならびに緑黄色の矢印）での染色体配列（配列番号２４）を示す概略図である。（Ｂ）は、コード領域（赤）、非翻訳領域（青）、およびＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）を示す、ＡＣＴＢゲノム標的領域を表す概略図である。（Ｃ）は、ＡＣＴＢコード配列とインフレームでインテグレートされたＧＦＰ配列を備えるＡＣＴＢゲノム領域の概略図である。（Ｄ）は、タグ配列のインテグレーション成功後に構築される、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合された内因性β−アクチンタンパク質の概略図である。
【００３５】
【図２７】図２７は、Ｋ５６２細胞におけるＡＣＴＢ遺伝子座を標的とするＺＦＮに対するＣｅｌ−１アッセイスクリーンを示す。レーン１はマーカー、レーン上部の数字はＺＦＮペアを示す。
【００３６】
【図２８】図２８は、インテグレーション部位が図２６Ａで「ｖ．２」として表される、ゲノムＡＣＴＢ配列に挟まれたＧＦＰタグを含む、ドナープラスミドのマップを表す。
【００３７】
【図２９】図２９は、ＧＦＰでタグ付けされた内因性β−アクチンタンパク質を発現する個々の単離された細胞クローンの蛍光顕微鏡画像を示す。ウェル位置は各画像上部に表示される。
【００３８】
【図３０】図３０は、ＧＦＰ２コード配列がアクチンコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＡＣＴＢ１ゲノム領域のＤＮＡ配列（配列番号１６）を表す。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＧＦＰ２のコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのためのＭｅｔコドンを示す。
【００３９】
【図３１】図３１は、ＲＦＰコード配列がアクチンコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＡＣＴＢ１ゲノム領域のＤＮＡ配列（配列番号１７）を表す。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＲＦＰのコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのためのＭｅｔコドンを示す。
【００４０】
【図３２】図３２は、インテグレーション部位が図２６Ａで「ｖ．１」として表される、ＧＦＰタグ配列をインテグレートし、かつ、代替コドン使用（ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ）をコードする核酸配列と、β−アクチンタンパク質の最初の１５アミノ酸をコードするゲノム配列を交換するための、ドナープラスミドのマップを表す。
【００４１】
【図３３】図３３は、代替コドン使用をコードする核酸配列と、β−アクチンタンパク質の最初の１５アミノ酸をコードするゲノム配列を置き換えるために使用されるドナーポリヌクレオチドにおける、ＡＴＣＢゲノム領域の図３２において示されるＤＮＡ断片の概略図である。
【００４２】
【図３４】図３４は、ＬＭＮＢ１遺伝子座でのタグ配列インテグレーションの設計を表す。（Ａ）は、タグ配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位（黄色の配列）、ＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）、およびタグ配列インテグレーション部位（緑色の矢印）での染色体配列（配列番号２０）を示す概略図である。（Ｂ）は、コード領域（赤）、非翻訳領域（青）、およびＺＦＮ切断部位（黄色の矢印）を示す、ＬＭＮＢ１ゲノム標的領域を表す概略図である。（Ｃ）は、ＬＭＮＢ１ゲノム領域におけるインテグレーションの標的化部位の概略図である。（Ｄ）は、ＬＭＮＢ１コード配列内にインテグレートされたＧＦＰ配列を備えるＬＭＮＢ１ゲノム領域の概略図である。（Ｅ）は、タグ配列のインテグレーション成功後に構築される、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合された内因性ラミン（Ｌａｍｉｎ）Ｂ１タンパク質の概略図である。
【００４３】
【図３５】図３５は、ＧＦＰでタグ付けされた内因性ラミンＢ１タンパク質を発現する細胞の微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡画像および蛍光顕微鏡画像を示す。
【００４４】
【図３６】図３６は、ＲＦＰコード配列がラミンコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＬＡＭＮＢ１ゲノム領域のＤＮＡ配列を表す（配列番号２１）。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＧＦＰ２のコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのための開始コドンを示す。
【００４５】
【図３７】図３７は、ＲＦＰタグ付きラミンを含むｉＰＳ細胞の画像を示す。（Ａ）細胞の視野のＤＩＣ画像。（Ｂ）ＲＦＰでタグ付けされたラミンの発現を示す赤色蛍光画像。（Ｃ）ＤＡＰＩで染色された細胞の核。
【００４６】
【図３８】図３８は、ＥＲＢＢ２遺伝子座でのタグ配列（配列番号１５）インテグレーションの設計を表す。概略図は、タグ配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位、ＺＦＮ切断部位、およびタグ配列インテグレーション部位での染色体配列を示す。
【００４７】
【図３９】図３９は、ＧＦＰタグ配列をインテグレートするための、ドナープラスミドのマップを表す。ＧＦＰコード配列はＥＲＢＢ２ゲノム配列に挟まれている。
【００４８】
【図４０】図４０は、ＳＫＯＶ３細胞におけるＥＲＢＢ２遺伝子座内へのＧＦＰ２のインテグレーションを確認するための、左ジャンクションのジャンクションＰＣＲを表す。
【００４９】
【図４１】図４１は、ＳＫＯＶ３細胞内のＧＦＰタグ付きＨＥＲ２の発現を示す。上画像：ＤＩＣ、下画像  蛍光顕微鏡。
【００５０】
【図４２】図４２は、ＨＭＧＡ遺伝子座でのタグ配列インテグレーションの設計を表す。概略図は、タグ配列のインテグレーションのための標的領域、染色体標的領域上のＺＦＮ結合部位、ＺＦＮ切断部位、およびタグ配列インテグレーション部位での染色体配列（配列番号３）、ならびに、コード領域の関連する部位、非翻訳領域、およびＨＭＧＡ遺伝子座におけるＧＦＰの挿入部位を示す。
【００５１】
【図４３】図４３は、ＧＦＰタグ配列をインテグレートするためのドナープラスミドのマップを表す。ＧＦＰコード配列はＨＭＧ１染色体配列により挟まれている。
【００５２】
【図４４】図４４は、選択されたクローンにおけるＨＭＧＡ１遺伝子座内へのＧＦＰタグのインテグレーションの（Ａ）ゲノムＰＣＲおよび（Ｂ）サザンブロッティング（ＧＦＰプローブを用いる）検証を表す。
【００５３】
【図４５】図４５は、ＧＦＰ２コード配列がＨＭＧＡコード領域内にインテグレートされたことを示す、Ｕ２ＯＳ細胞内のＨＭＧＡ１ゲノム領域のＤＮＡ配列を表す（配列番号１７）。下線が引かれた文字は配列解析された領域を示し、太字の文字はＧＦＰ２のコード配列を示し、斜字は制限部位またはリンカーを示し、太字かつ大文字の文字はスプライスジャンクションのための開始コドンを示す。
【００５４】
【図４６】図４６は、ＧＦＰタグ付きＨＭＧＡ１タンパク質を発現するＵ２ＯＳ細胞の画像を示す。左；ＤＩＣ画像；右：蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
本開示は、細胞内の内因性タンパク質にタグを付けるための方法を包含する。該方法は、標的エンドヌクレアーゼおよびタグ配列を含むドナーポリヌクレオチドと細胞を接触させることを含む。標的エンドヌクレアーゼは、内因性タンパク質をコードする染色体配列内の特定の部位で二本鎖切断を導入する。二本鎖切断は、鋳型としてドナーポリヌクレオチドを用いる、相同組換えおよび二本鎖切断の修復を引き起こす、細胞ＤＮＡ修復過程を誘導する。結果として、ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列は、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされる。タグ配列が内因性コード配列とインフレームでインテグレートされるため、内因性タンパク質は、生成される際、タグ配列を含む。
【００５６】
有利なことに、実施例で説明されるように、本方法は、内因性タンパク質の発現パターンを反映する内因性調節経路の制御下で、タグ付きタンパク質を発現するために利用することができる。
【００５７】
本開示はまた、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。また本明細書において、少なくとも一つの内因性タンパク質の局在を観察するためのキット、ここに該キットは、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含むものである、も提供される。
【００５８】
Ｉ．タグ付き内因性タンパク質を含む細胞
本開示の一態様は、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を含む細胞を提供する。適したタグの例があるように、適した内因性タンパク質の例が以下に詳述される。
【００５９】
（ａ）内因性タンパク質
本明細書における用語「内因性タンパク質」は、細胞の遺伝物質によりコードされるタンパク質をさす。一般的に、任意の対象の内因性タンパク質は、様々なタグ配列でタグ付けされるであろう。
【００６０】
一つの実施形態では、内因性タンパク質はチューブリンタンパク質であってもよい。様々な実施形態では、チューブリンタンパク質は、ＴＵＢＡ１Ａ、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＴＵＢＡ３Ｃ、ＴＵＢＡ３Ｄ、ＴＵＢＡ３Ｅ、ＴＵＢＡ４ＡおよびＴＵＢＡ８遺伝子によってコードされるα−チューブリンタンパク質；ＴＵＢＢ、ＴＵＢＢ１、ＴＵＢＢ２Ａ、ＴＵＢＢ２Ｂ、ＴＵＢＢ２Ｃ、ＴＵＢＢ３、ＴＵＢＢ４、ＴＵＢＢ４ＱおよびＴＵＢＢ６遺伝子によってコードされるβ−チューブリンタンパク質；ＴＵＢＧ１、ＴＵＢＧ２、ＴＵＢＧＣＰ２、ＴＵＢＧＣＰ３、ＴＵＢＧＣＰ４、ＴＵＢＧＣＰ５およびＴＵＢＧＣＰ６遺伝子によってコードされるγ−チューブリンタンパク質；ＴＵＢＤ１遺伝子によってコードされるδ−チューブリンタンパク質、またはＴＵＢＥ１遺伝子によってコードされるε−チューブリンタンパク質などの、ヒトチューブリンタンパク質であってもよい。例示的な実施形態では、内因性チューブリンは、ヒト１２番染色体上のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子（登録番号  ＮＭ＿００６０８２）によってコードされるヒトα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質であってもよい。
【００６１】
別の実施形態では、内因性タンパク質はアクチンタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、アクチンタンパク質は、ＡＣＴＡ１遺伝子によってコードされるα−アクチンタンパク質、ＡＣＴＢ遺伝子によってコードされるβ−アクチンタンパク質、またはＡＣＴＧ１遺伝子によってコードされるγ−アクチンタンパク質などの、ヒトアクチンタンパク質であってもよい。例示的な実施形態では、ヒト７番染色体上のＡＣＴＢ遺伝子（登録番号  ＮＭ＿００１１０１）によってコードされるヒトβ−アクチンタンパク質であってもよい。
【００６２】
また別の実施形態では、内因性タンパク質はラミン（ｌａｍｉｎ）タンパク質であってもよい。特定の実施形態では、ＬＭＮＢ１遺伝子およびＬＭＮＢ２遺伝子によって発現されるＢ１ラミンおよびＢ２ラミンなどのヒトラミンタンパク質、または、ラミンＡおよびＣタンパク質、ＬＭＮＡ遺伝子のスプライスバリアント（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）であってもよい。例示的な実施形態では、ヒト５番染色体上のＬＭＮＢ１遺伝子（登録番号  ＮＭ＿００５５７３）によってコードされるヒトラミンＢ１タンパク質であってもよい。
【００６３】
さらに別の実施形態では、内因性タンパク質はＥＲＢＢ２遺伝子によってコードされるヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２タンパク質）であってもよい。ＨＥＲ２は、細胞膜表面結合受容体チロシンキナーゼであり、細胞成長および分化を導くシグナル伝達経路に関わる。ＥＲＢＢ２遺伝子の増幅またはそのタンパク質生成物の過剰発現は、乳癌、卵巣癌、および胃癌に関連する。内因性ＨＥＲ２タンパク質はヒトＨＥＲ２タンパク質であってもよい（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  登録番号：Ｐ０４６２６）。
【００６４】
代替的な実施形態では、内因性タンパク質はＨＭＧＡである。ＨＭＧＡは、ＡＴリッチ領域に結合することにより、ＤＮＡ構造を変化させることによって、遺伝子発現を制御する高移動度グループの染色体タンパク質をさす。それらは、最も大きくかつ最も特徴づけられた非ヒストン性核タンパク質グループの一つである。ＨＭＧＡ１遺伝子は、細胞成長、増殖、分化および死滅を含む多種多様の正常な生物学的過程を調節する。この遺伝子に対して、２種の異なるアイソフォームをコードする少なくとも７種の転写バリアントが発見されている。いくつかの実施形態では、内因性タンパク質はヒトＨＭＧＡタンパク質であってもよい。本発明において使用することができるヒトＨＭＧＡタンパク質の非限定的な例には、ＨＭＧＡ１遺伝子（登録番号  ＮＭ＿１４５８９９）によって発現される、ＨＭＧＡアイソフォームａおよびアイソフォームｂが挙げられる。
【００６５】
さらなる実施形態では、内因性タンパク質は表Ａに記載されるタンパク質とすることができる。
【表１−１】
0005841997.tif 000002
【表１−２】
0005841997.tif 000003
【表１−３】
0005841997.tif 000004
【表１−４】
0005841997.tif 000005
【表１−５】
0005841997.tif 000006
【００６６】
（ｂ）タグ配列
本明細書においてタグは、タグ付き内因性タンパク質を構築するために内因性タンパク質に融合されるタンパク質をさす。タグ配列は、融合タンパク質が生成されるように、内因性タンパク質コード配列にインフレームで融合される。インフレームは、タンパク質をコードする染色体配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が、タグ配列の挿入後、維持されることを意味する。インフレーム挿入は、挿入されたヌクレオチドの数が３によって割り切れる際に起こり、可能な場合には、タグタンパク質コード配列に、任意の数のヌクレオチドのリンカーを付加することによって達成することができる。内因性タンパク質は、該内因性タンパク質の機能に影響しないことを条件に、タンパク質ポリペプチド配列内であればどこでも、タグ付けされてもよい。一般的にタグ付けは、タンパク質のＮ末端またはＣ末端である。内因性タンパク質は、例えば、タンパク質のＮ末端でタグ付けされてもよい。あるいは、内因性タンパク質は、タンパク質のＣ末端でタグ付けされてもよい。
【００６７】
タグ配列は、核酸配列によってコードされる任意のペプチド配列であってもよい。タグ配列は、エピトープタグ、アフィニティータグ、レポーター、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない、様々なタグをコードすることができる。
【００６８】
タグ配列は、例えば、エピトープタグであってもよい。エピトープタグは、無作為のアミノ酸配列または公知のアミノ酸配列を含んでもよい。公知のアミノ酸配列は、例えば、それに対して生成された抗体を有してもよく、または、その配列に対して生成された公知の抗体が存在しなくてもよい。エピトープタグは、それに対する市販の抗体が入手できる抗体エピトープタグであってもよい。適した抗体エピトープタグの非限定的な例は、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、マルトース結合タンパク質、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、ＢＣＣＰおよびカルモジュリンである。
【００６９】
例示的なタグはレポーターであってもよい。適したレポーターは当分野において知られている。レポーターの非限定的な例には、アフィニティータグ、視覚的レポーター、または選択的マーカーレポーターが挙げられる。アフィニティータグの非限定的な例には、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。視覚的レポーターは典型的に、細胞における色彩変化、または細胞の蛍光もしくは発光などの、視覚的シグナルをもたらす。例えば、βーガラクトシダーゼをコードする、レポーターＬａｃＺは、Ｘ−ｇａｌなどの適した基質が存在する中で、細胞を青色に変化させるであろう。視覚的レポーターの他の非限定的な例には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、アルカリフォスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびそれらの変種が挙げられる。さらに、ルシフェラーゼが使用されてもよい。選択的マーカーレポーターは、典型的に薬物耐性（例えば、抗生物質耐性）などの選択可能な特徴を細胞へ与える。
【００７０】
例示的なタグは蛍光タンパク質視覚的レポーターである。蛍光タンパク質視覚的レポーターの非限定的な例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ（ｔａｇＧＦＰ）、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、エメラルド（Ｅｍｅｒａｌｄ）、アザミグリーン（Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ）、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン（Ｃｉｔｒｉｎｅ）、ビーナス（Ｖｅｎｕｓ）、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト（Ａｚｕｒｉｔｅ）、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア（Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、Ｔ−サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン（Ｃｅｒｕｌｅａｎ）、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシ（Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ）−シアン）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−エクスプレス、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、ＨｃＲｅｄ−タンデム、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、クサビラ−オレンジ（Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ）、単量体クサビラ−オレンジ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または任意の他の適した蛍光タンパク質が挙げられる。例示的なタグは、緑色蛍光タンパク質、または赤色蛍光タンパク質である。
【００７１】
非限定的な例にはまた、アミノ部分およびカルボキシル部分が入れ替えられ、かつ本来の末端を結合する短いスペーサーと再結合され、同時にまだ蛍光性である、緑色蛍光タンパク質の環状変異体（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）も挙げられる。蛍光タンパク質のこれらの環状変異体は、ｐＫａ値および発色団の配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）が変化した。さらに、いくつかの蛍光タンパク質内の特定の位置は、タンパク質全体の挿入を許容し、挿入における構造変化は色彩増強または色彩変化などの、蛍光に重大な影響を及ぼす。例えば、ＧＦＰの黄色変異体（ＥＹＦＰ、高感度黄色蛍光タンパク質）のＴｙｒ−１４５の位置におけるカルモジュリンまたはジンクフィンガードメインの挿入は、金属結合するとすぐにその蛍光を数倍増強させることができる、指標タンパク質（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をもたらす。高感度黄色蛍光タンパク質へのカルモジュリングラフト（ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｇｒａｆｔ）は、単一のほ乳類細胞における細胞質Ｃａ２＋を観察することができる。
【００７２】
内因性タンパク質は、例えば、ペプチドリンカーを介してタグに融合されてもよい。リンカーペプチドの配列は、適切なフォールディングを可能にし、タグ付けされるタンパク質およびタグポリペプチドの立体障害を妨げるために、ペプチド断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）の公知の構造的寄与および立体配座的寄与（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）に基づき選択されている。リンカーペプチドは通常、当分野で使用され、かつ知られており、約３から約４０アミノ酸長であってもよい。
【００７３】
内因性タンパク質は二以上のタグでタグ付けされてもよい。例えば、内因性タンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のタグでタグ付けされてもよい。二以上のタグは、対象の内因性タンパク質に融合された単一のポリペプチドとして、発現されてもよい。内因性タンパク質に融合された二以上のタグは、翻訳後に個々のタグポリペプチドへと切断される単一のポリペプチドとして、発現されてもよい。非限定的な例として、タグポリペプチド間、またはタグポリペプチドと内因性タンパク質の間に挿入されたピコルナウイルスの２Ａポリペプチドが、タグの共翻訳「切断」をもたらし、等モルレベルでの多数のタンパク質の発現を引き起こすことができる。
【００７４】
一つの例示的な実施形態では、細胞は蛍光タンパク質でタグ付けされる一つの内因性タンパク質を発現する。別の例示的な実施形態では、細胞は２つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する。また別の例示的な実施形態では、細胞は３つの蛍光タグ付けされた内因性タンパク質を発現する。さらなる実施形態では、細胞は４つ以上のタグ付き内因性タンパク質を発現する。
【００７５】
（ｃ）細胞型
一般的に、細胞は真核細胞であろう。適した細胞には、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）もしくはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの、真菌または酵母；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９細胞もしくはドロソフィア・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）由来のＳ２細胞などの、昆虫細胞；植物細胞；マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、非ヒト霊長類細胞、もしくはヒト細胞などの、動物細胞が挙げられる。例示的な細胞はほ乳類である。ほ乳類細胞は、初代細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ）であってもよい。一般的に、二本鎖切断に感受性である任意の初代細胞を用いることができる。細胞は、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴもしくはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞など、様々な細胞型であってもよい。
【００７６】
ほ乳類細胞はほ乳類細胞株細胞であってもよい。細胞株は任意の樹立された細胞株または初代細胞株であってもよい。細胞株は接着性もしくは非接着性であってもよく、あるいは、細胞株は、当業者に知られた標準的な技術を使用して、接着性、非接着性もしくは器官型の生育を促す条件下で成長させることができる。適したほ乳類細胞株の非限定的な例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ７）；ヒト胎児腎臓株２９３；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ）；ラット肝臓癌細胞（ＨＴＣ）；ＨＩＨ／３Ｔ３細胞、ヒトＵ２−ＯＳ骨肉腫細胞株、ヒトＡ５４９細胞株、ヒトＫ５６２細胞株、ヒトＨＥＫ２９３細胞株、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株、およびＴＲＩ細胞が挙げられる。ほ乳類細胞株の広範なリストに関して、当業者は、アメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ（ＡＴＣＣ登録商標、Ｍａｍａｓｓａｓ、ＶＡ）を参照することができる。一般的に、細胞は、例えば、線維芽細胞、筋芽細胞、ＴもしくはＢ細胞、マクロファージ、上皮細胞など、様々な種類の細胞であってもよい。本開示による、例示的な細胞株は、ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞株である。代替的な例示的なヒト細胞株は、Ａ５４９細胞株、Ｋ５６２細胞株細胞株、ＨＥＫ２９３細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株細胞株である。別の例示的なヒト細胞株は、ＭＣＦ１０ａ、乳腺上皮癌細胞株、である。まだ別の例示的なヒト細胞株は、ＳＫＯＶ３、上皮細胞株、である。代替的な例示的なヒト細胞株には、線維芽細胞または他の細胞型から生成された、誘導性多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞が挙げられる。
【００７７】
さらに他の実施形態では、細胞は幹細胞であってもよい。適した幹細胞には、胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、誘導性多能性幹細胞、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
さらなる実施形態では、細胞は一細胞胚（ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｅｍｂｒｙｏ）であってもよい。胚は、脊椎動物または無脊椎動物であってもよい。適した脊椎動物には、ほ乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられる。適したほ乳類の例には、齧歯類、コンパニオンアニマル、家畜、および非霊長類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。齧歯類の非限定的な例には、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、およびモルモットが挙げられる。適したコンパニオンアニマルには、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミおよびフェレットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。家畜の非限定的な例には、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラマおよびアルパカが挙げられる。適した非霊長類には、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカク、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザルおよびオナガザルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。鳥類の非限定的な例には、鶏、七面鳥、アヒルおよびガチョウが挙げられる。あるいは、動物は、昆虫、線虫等などの無脊椎動物であってもよい。昆虫の非限定的な例には、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および蚊が挙げられる。
【００７９】
ＩＩ．タグ付き内因性タンパク質のための方法
本開示の別の態様は、細胞内で少なくとも一つの内因性タンパク質にタグを付けるための方法を包含する。本方法は、インフレームでの内因性コード配列とタグ配列のインテグレーションを介在するために、標的エンドヌクレアーゼを使用することを含む。より具体的には、本方法は、少なくとも一つのジンクフィンガーヌクレアーゼまたはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸、および少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することを含む。ドナーポリヌクレオチドは、内因性染色体配列内にインフレームでインテグレートされるタグ配列、タグ配列を挟む上流配列および下流配列を含み、ここに該上流配列および下流配列は、タンパク質をコードする内因性染色体配列における切断部位の両側と実質的な配列同一性を共有するものである。細胞は次いで、該ジンクフィンガーヌクレアーゼにより切断部位で導入された二本鎖切断が、該ドナーポリヌクレオチド内のタグ配列が、内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされるような、相同性指向過程により修復されるような条件下で、維持される。少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現する、本方法によって生成された細胞は、上記（Ｉ）節に詳述される。本方法の構成要素は、以下に詳しく記載される。
【００８０】
（ａ）標的エンドヌクレアーゼ
本方法は、一つには、少なくとも一つの標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞内に導入することを含む。標的エンドヌクレアーゼは、天然に存在するタンパク質または人工タンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼとすることができる。他の実施形態では、標的エンドヌクレアーゼは、転写活性化物質様エフェクター（ＴＡＬＥ）−ヌクレアーゼであってもよい。好ましい実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼとすることができる。典型的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、以下に記載される、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含む。
【００８１】
（ｉ）ジンクフィンガー結合ドメイン
ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の最適な核酸配列を認識し、結合するように操作されてもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５（４３）：３３８５０−３３８６０；Ｄｏｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：７０２−７０８；およびＳａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０５：５８０９−５８１４を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質に比べて、新規の結合特異性を有してもよい。操作方法は、合理的設計および様々な型の選択が挙げられるが、これらに限定されるものではない。合理的設計には、例えば、二重鎖、三重鎖、および／または四重鎖ヌクレオチド配列ならびに個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含み、ここに各二重鎖、三重鎖、および／または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの一以上のアミノ酸配列と会合されるものである、データベースを使用することが挙げられる。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。例として、米国特許第６，４５３，２４２号において記載されるアルゴリズムを使用して、事前に選択された配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる。また、非縮重認識コード表を使用する合理的設計などの代替方法を使用して、特定の配列を標的とするためのジンクフィンガー結合ドメインを設計することができる（Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−７０８１）。ＤＮＡ配列における標的部位候補を同定し、ジンクフィンガー結合ドメインを設計するための、公的に利用可能なウェブをベースとするツールが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｔｏｏｌｓ．ｏｒｇおよびｈｔｔｐ：／／ｂｉｎｄｒ．ｇｄｃｂ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ＺｉＦｉＴ／  にそれぞれ見つかり得る（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３４：Ｗ５１６−Ｗ５２３；Ｓａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３５：Ｗ５９９−Ｗ６０５）。
【００８２】
ジンクフィンガー結合ドメインは、約３ヌクレオチドから約２１ヌクレオチド長、または約８から約１９ヌクレオチド長の範囲であるＤＮＡ配列を認識し、結合するように設計することができる。一般的に、本明細書に開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガー結合ドメインは、少なくとも３つのジンクフィンガー認識領域（すなわち、ジンクフィンガー）を含む。一つの実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは４つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは５つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。また別の実施形態では、ジンクフィンガー結合ドメインは６つのジンクフィンガー認識領域を含んでもよい。ジンクフィンガー結合ドメインは、任意の適した標的ＤＮＡ配列に結合するように設計されてもよい。例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６０７，８８２号、同第６，５３４，２６１号および同第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【００８３】
ジンクフィンガー認識領域を選択するための例示的な方法には、ファージディスプレイおよびツーハイブリッドシステムが挙げられ、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびに、国際公開第９８／３７１８６号；国際公開第９８／５３０５７号；国際公開第００／２７８７８号；国際公開第０１／８８１９７号、および英国特許第２，３３８，２３７号に開示される。さらに、ジンクフィンガー認識領域に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号に記載される。
【００８４】
ジンクフィンガー結合ドメイン、ならびに融合タンパク質（および同一物をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は当業者に知られており、全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および同第２００６０１８８９８７号に詳しく記載される。ジンクフィンガー認識領域および／またはマルチ−フィンガー型ジンクフィンガータンパク質は、例えば５以上のアミノ酸長のリンカーを含む、適したリンカー配列を使用して、共に結合することができる。６以上のアミノ酸長のリンカー配列の非限定的な例に関して、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載されるジンクフィンガー結合ドメインは、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に適したリンカーの組み合わせを含むことができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼはさらに核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）を含んでもよい。ＮＬＳは、染色体における標的配列で二本鎖切断を導入するために、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を核内に標的化させることを促進する、アミノ酸配列である。核局在化シグナルは当分野において知られている。例えば、Ｍａｋｋｅｒｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１０２５−１０２７を参照されたい。
【００８６】
例示的なジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１、２、１３、１４、１８、１９、２２、２３、２５および２６から選択される配列と、少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を認識し、結合する。他の実施形態では、配列同一性は、約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってもよい。
【００８７】
（ｉｉ）切断ドメイン
ジンクフィンガーヌクレアーゼは切断ドメインも含有する。本明細書で開示されるジンクフィンガーヌクレアーゼの切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、２００２−２００３  Ｃａｔａｌｏｇ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．；およびＢｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８またはｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍを参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マング・ビーン・ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカス・ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３も参照されたい。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）の一以上を、切断ドメインの供給源として使用してもよい。
【００８８】
切断ドメインはまた、上述のような、切断活性のために二両体化を必要とする、酵素またはその部分であってもよい。２つのジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体の単量体を含む各ヌクレアーゼとして、切断のために必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼが、活性酵素二量体を構築するための両方の単量体を含むことができる。本明細書で用いる場合、「活性酵素二量体」とは核酸分子を切断することができる酵素二量体である。２つの切断単量体が同一のエンドヌクレアーゼ（あるいはその機能的な断片）に由来してもよく、または、各単量体が異なるエンドヌクレアーゼ（あるいはその機能的な断片）に由来してもよい。
【００８９】
２つの切断単量体を使用して活性酵素二量体を形成する場合、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼのための認識部位は、それら各々の認識部位との２つのジンクフィンガーヌクレアーゼの結合が、例えば二量体化によって、切断単量体に活性酵素二両体を形成させる、互いに対する空間的配向で切断単量体を設置するように、配置されるのが好ましい。結果として、認識部位の近端は、約５から約１８ヌクレオチドにより分離され得る。例えば、近端は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドにより分離され得る。しかしながら、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの認識部位の間に介入し得ることが認識される（例えば、約２から約５０ヌクレオチド対以上）。例えば、本明細書で詳細に記載されるものなど、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識部位の近端は、６ヌクレオチドにより分離され得る。一般的に、切断部位は認識部位の間に位置する。
【００９０】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多数の種に存在し、かつ、ＤＮＡに配列特異的に（認識部位で）結合し、結合部位またはその付近で、ＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は、認識部位から移動した部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９ヌクレオチド、他方のその認識部位から１３ヌクレオチドのところで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，  ９７８−３１，  ９８２を参照されたい。それゆえ、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、操作されてもされなくてもよいが、少なくとも一つのタイプＩＩＳ制限酵素由来の切断ドメインおよび一以上のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができる。例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、国際公開第０７／０１４，２７５号に記載される。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合ドメインおよび切断ドメインを含有し、これらもまた本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【００９１】
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である（Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  １０，  ５７０−１０，  ５７５）。したがって、本開示の目的のため、ジンクフィンガーヌクレアーゼにおいて使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体であるとみなされる。それゆえ、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的化二本鎖切断のために、各々がＦｏｋＩ切断単量体を含む、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素二量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含有する単一のポリペプチド分子が用いられてもよい。
【００９２】
特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、その開示の全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号、同第２００６０１８８９８７号および同第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化するまたは防ぐ、一以上の操作された切断単量体を含むことができる。非限定的な例として、ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインの二量体化に影響を与えるための標的である。強制的なヘテロ二量体を形成する、例示的なＦｏｋＩの操作された切断単量体には、第一の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位での変異を含み、第二の切断単量体がアミノ酸残基４８６位および４９９位での変異を含むものである、ペアが挙げられる。
【００９３】
それゆえ、一つの実施形態では、アミノ酸４９０位での変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；アミノ酸５３８位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換し；アミノ酸４８６位での変異はＧｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置換し；かつ、アミノ酸４９９位での変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置換する。特に、操作された切断単量体は、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」で示される操作された切断単量体を生成するために、一つの切断単量体において、４９０位をＥからＫへ、５３８位をＩからＫへ変異させること、および、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」で示される操作された切断単量体を生成するために、別の切断単量体において、４８６位をＱからＥへ、４９９位をＩからＬへ変異させることにより、調製され得る。上述の操作された切断単量体は、異常な切断が最小化または撤廃された、強制されたヘテロ二量体変異体である。操作された切断単量体は、例えば、米国特許出願公開第２００５００６４４７４号に記載されるような、野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異導入（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、適した方法を用いて調製されてもよい（実施例５を参照されたい）。
【００９４】
上述のジンクフィンガーヌクレアーゼは、インテグレーションの標的化部位で二本鎖切断を導入するように操作されてもよい。二本鎖切断はインテグレーションの標的化部位であってもよく、インテグレーションの部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、または１０００ヌクレオチド離れてもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、または２０ヌクレオチド離れてもよい。他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド離れてもよい。さらに他の実施形態では、二本鎖切断はインテグレーションの部位から最大５０、１００、または１０００ヌクレオチド離れてもよい。
【００９５】
（ｉｖ）標的化切断のためのさらなる方法
染色体配列における標的部位を有する任意のヌクレアーゼが、本明細書に開示される方法において用いられてもよい。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは非常に長い認識配列を有し、そのうちのいくつかは、統計的に、ヒトサイズのゲノムにおいて一度ぐらい、存在する可能性がある。細胞内ゲノムにおいて固有の標的部位を有する任意のこのようなヌクレアーゼを、細胞染色体の標的化切断のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、または、加えて、使用してもよい。
【００９６】
ホーミングエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−Ｓｃｅｌｌ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩｌおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。これらの酵素の認識配列は当分野において知られている。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。
【００９７】
ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性は、それらの認識部位に対して絶対的ではないが、その部位は、ほ乳類サイズのゲノムあたり単一の切断事象が、単コピーのその認識部位を含有する細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現することにより得られる、十分な長さである。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性を、非天然標的部位に結合するよう操作してもよいということもまた、報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６を参照されたい。
【００９８】
（ｖ）ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸として細胞内に導入されてもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。一つの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡとすることができる。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼコード配列を含むプラスミドＤＮＡが、細胞内に導入されてもよい。別の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡである場合、該ｍＲＮＡ分子は５’キャップされてもよい。同様に、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする核酸がｍＲＮＡである場合、該ｍＲＮＡ分子はポリアデニル化されてもよい。それゆえ、本方法による核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする、キャップされ、ポリアデニル化されたｍＲＮＡとすることができる。ｍＲＮＡをキャップする方法およびポリアデニル化する方法は当分野において知られている。
【００９９】
（ｂ）ドナーポリヌクレオチド
標的とされる染色体配列内にインフレームでタグ配列をインテグレートするための方法は、タグ配列を含む少なくとも一つのドナーポリヌクレオチドを細胞内に導入することをさらに含む。ドナーポリヌクレオチドは、上記（Ｉ）（ｂ）節に詳述されるようにタグ配列を含むだけでなく、上流配列および下流配列も含む。該上流および下流配列は、ドナーポリヌクレオチドにおいてタグ配列を挟む。さらに、該上流および下流配列は、内因性染色体配列におけるインテグレーション部位の両側と実質的な配列同一性を共有する。
【０１００】
ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列およびドナーポリヌクレオチドの間の組換えを促進するように選択される。上流配列とは、本明細書で用いられる場合、インテグレーションの標的化部位の上流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。同様に、下流配列とは、インテグレーションの標的化部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列をいう。ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％配列同一性を有してもよい。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％配列同一性を有してもよい。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチドにおける上流および下流配列は、標的とされる染色体配列と約９９％または１００％配列同一性を有してもよい。
【０１０１】
上流または下流配列は、約２０ｂｐから約２５００ｂｐを含んでもよい。一つの実施形態では、上流または下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、または２５００ｂｐを含んでもよい。例示的な上流または下流配列は、約２００ｂｐから約２０００ｂｐ、約６００ｂｐから約１０００ｂｐ、またはより具体的には約７００ｂｐから約１０００ｂｐを含んでもよい。
【０１０２】
典型的には、ドナーポリヌクレオチドはＤＮＡであるだろう。ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状断片（ｌｉｎｅａｒ  ｐｉｅｃｅ）ＤＮＡ、ＰＣＲ断片、ネイキッドな（ｎａｋｅｄ）核酸、またはリポソームあるいはポロキサマー（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）などの送達媒体（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）と複合体化された核酸であってもよい。一つの実施形態では、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡプラスミドとすることができる。別の実施形態では、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドは、ＢＡＣとすることができる。
【０１０３】
当業者は、周知の標準的な組換え技術を使用して、本明細書に記載されるようなドナーポリヌクレオチドを構築できるであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６を参照されたい）。
【０１０４】
（ｃ）細胞への送達
本方法は、標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸およびドナーポリヌクレオチドを、細胞内に導入することを含む。適した細胞は上記（Ｉ）（ｃ）節に詳述される。
【０１０５】
適した送達方法には、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、陽イオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、オプティカルトランスフェクション（ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、専売薬剤（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ  ａｇｅｎｔ）で促進された核酸の取り込み、およびリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、あるいは人工ビリオンを介する送達、が挙げられる。一つの実施形態では、分子はヌクレオフェクションにより細胞内に導入することができる。別の実施形態では、分子はマイクロインジェクションにより細胞内に導入することができる。分子は、細胞の核内あるいは細胞質内にマイクロインジェクションすることができる。
【０１０６】
標的エンドヌクレアーゼまたは標的エンドヌクレアーゼをコードする核酸に対する、タグ配列を含むドナーポリヌクレオチドの割合は、変化でき、変化するであろう。好ましい実施形態では、標的エンドヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼとすることができる。一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約１：１０から約１０：１の範囲であってもよい。様々な実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ分子に対するドナーポリヌクレオチドの割合は、約１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１であってもよい。一つの実施形態では、割合は約１：１であってもよい。
【０１０７】
二以上の標的エンドヌクレアーゼ分子および二以上のドナーポリヌクレオチドが細胞内に導入される実施形態では、分子は同時にあるいは順に導入されてもよい。例えば、各々異なる認識配列に特異的である標的エンドヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを、同時に導入してもよい。あるいは、各標的エンドヌクレアーゼ分子、ならびに、対応するドナーポリヌクレオチドを順に導入してもよい。
【０１０８】
（ｄ）細胞培養
本方法はさらに、標的エンドヌクレアーゼ介在インテグレーションが起こり得るような、適切な条件下で細胞を維持することを含む。必要であれば、細胞は、標的エンドヌクレアーゼの発現を可能とする標準手順を使用して、培養することができる。標準的な細胞培養技術は、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  ＰＮＡＳ  １０５：５８０９−５８１４；Ｍｏｅｈｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  ＰＮＡＳ  １０４：３０５５−３０６０；Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−６５１；およびＬｏｍｂａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：１２９８−１３０６に記載される。当業者は、細胞を培養するための方法が当分野において知られ、かつ、細胞型によって変化でき、変化するであろうことを十分理解している。いかなる場合でも、特定の細胞型のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。
【０１０９】
細胞が一細胞胚である実施形態では、胚をインビトロで培養することができる（例えば、細胞培養）。典型的には、胚は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを可能とする、必須のＯ２／ＣＯ２比を備える、適切な温度かつ適切な培地で培養される。培地の適した非限定的な例には、Ｍ２、Ｍ１６、ＫＳＯＭ、ＢＭＯＣ、およびＨＴＦ培地が挙げられる。当業者は、培養条件が、胚の種類によって変化でき、変化するであろうことを十分理解しているであろう。いかなる場合でも、特定の胚の種類のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。場合によっては、胚は、メス宿主の子宮内に胚を移植する（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ことにより、インビボで培養することができる。一般的に言えば、メス宿主は、胚と同種または類似種に由来する。好ましくは、メス宿主は偽妊娠である。偽妊娠メス宿主の調製方法は当分野において知られている。さらに、胚をメス宿主に移植する方法も知られている。インビボで胚を培養することは胚の発生（ｄｅｖｅｌｏｐ）をもたらし、その胚に由来する動物の生児出生（ｌｉｖｅ  ｂｉｒｔｈ）を引き起こす。
【０１１０】
過程のこの段階の間、（場合によっては、導入された核酸から発現した）標的エンドヌクレアーゼは、染色体内の標的配列を認識し、結合し、切断する。標的エンドヌクレアーゼにより導入された二本鎖切断は、ドナーポリヌクレオチドのタグ配列が染色体位置内にインフレームでインテグレートされるように、ドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを介して、修復される。ドナーポリヌクレオチドは物理的に（ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ）インテグレートされてもよく、またあるいは、染色体内へのドナーポリヌクレオチドのタグ配列ならびに上流および下流配列の全部または一部のインテグレーションを引き起こす、切断の修復のための鋳型として、ドナーポリヌクレオチドを使用してもよい。当業者は、細胞の培養のための方法が当分野において知られ、かつ、細胞型によって変化でき、変化するであろうことを十分理解している。いかなる場合でも、特定の細胞型のための最良の技術を決定するために、所定の最適化を用いることができる。
【０１１１】
（ｅ）多重インテグレーション
上記発明のさらなる実施形態は、二以上の内因性タンパク質がタグ付けされるように、二以上の標的化インテグレーションと共に細胞を発生（ｄｅｖｅｌｏｐ）させるよう、本発明の方法を連続的に実行することを含む。例えば、第一の標的化インテグレーションを備える細胞を、第二の標的化インテグレーションを構築するために、次いで、本発明の方法において使用することができる。同じ過程を繰り返して、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１以上の標的化インテグレーションを備える細胞を構築することができる。
【０１１２】
あるいは、多重インテグレーションを備える細胞は、各々異なるインテグレーション部位に特異的である、二以上の標的エンドヌクレアーゼを導入すること、および、対応する数のドナーポリヌクレオチドを導入することによって、発生（ｄｅｖｅｌｏｐ）させることができる。各ドナーポリヌクレオチドは、上記に詳述されるような、インテグレートされる核酸配列ならびにインテグレーションの染色体部位と相同である上流および下流配列を含むであろう。細胞内に注入される、標的エンドヌクレアーゼおよび対応するドナーポリヌクレオチドの数は、２、３、４、５、または６以上であってもよい。
【０１１３】
ＩＩＩ．内因性タンパク質にタグを付けるためのキット。
本開示はまた、細胞内の少なくとも一つの内因性タンパク質の局在を観察するためのキットを包含する。該キットは、細胞が少なくとも一つのタグ付き内因性タンパク質を発現するように、該内因性タンパク質をコードする染色体配列内にインフレームでインテグレートされた、少なくとも一つのタグ配列を有する細胞を含む。該細胞はほ乳類細胞であってもよい。好ましくは、該細胞はヒト細胞である。ヒト細胞は、ヒトＵ２ＯＳ細胞、ヒトＭＣＦ１０Ａ細胞、ヒトＳＫＯＶ３、またはヒトｉＰＳ細胞から選ばれる細胞株細胞であってもよい。タグ付き内因性タンパク質は、チューブリン、アクチン、ラミン、ＨＥＲ２、およびＨＭＧＡから選ぶことができる。あるいは該キットは、表Ａに記載されるものから選ばれる少なくとも一つのタグ付きタンパク質を発現することができる。好ましい実施形態では、内因性タンパク質のタグは、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、オレンジ色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質から選ばれる蛍光タンパク質とすることができる。例示的なタグは、緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質である。
【０１１４】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語および科学用語は、この発明の属する分野における当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、この発明で用いられる用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，  １９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書で用いられる場合、特に指定がない限り、以下の用語はそれらに与えられた意味を有する。
【０１１５】
本開示またはその好ましい実施形態の要素を導入する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」は、一以上の要素が存在するということを意味することを目的としている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、記載された要素以外のさらなる要素が存在してもよいということを意味することを目的としている。
【０１１６】
本明細書で用いられる「遺伝子」は、遺伝子産物をコードする（エキソンおよびイントロンを含む）ＤＮＡ領域、ならびに、そのような調節配列が、コード配列および／または転写配列に隣接しているか否かを問わず、遺伝子産物の生成を調節する、全てのＤＮＡ領域をさす。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメント（ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、複製起点、マトリックス付着部位（ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｓｉｔｅ）、および遺伝子座制御領域が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【０１１７】
「異種タンパク質」とは、対象の細胞または生命体に対して天然でない（例えば、外来性の）タンパク質である。
【０１１８】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、線状または環状構造で、かつ、一本鎖または二本鎖形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーをさす。本開示のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関する制限と解釈されることはない。該用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに、塩基、糖、および／またはリン酸部分において修飾された（例えば、ホスホロチオエート骨格）ヌクレオチドを包含し得る。一般的に、特定のヌクレオチドのアナログは、同一の塩基対合特異性を有する；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対合するであろう。
【０１１９】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをさすために区別しないで用いられる。
【０１２０】
用語「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間での、遺伝情報の交換過程をさす。本開示のため、「相同組換え」は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復の間で起こる、そのような交換の特殊な形態をさす。この過程は、２つのポリヌクレオチド間の配列相同性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復に対し「ドナー」または「交換」分子を使用し、かつ、「非クロスオーバー（ｎｏｎ−ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）遺伝子変換」または「ショートトラクト（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として、さまざまに知られている、というのも、ドナーから標的への遺伝情報の移動を導くからである。特定の理論に拘束されるつもりはないが、このような移動は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または、標的の一部分となる遺伝情報の再合成のためにドナーが使用される「合成依存鎖アニーリング（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒａｎｄ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」、および／または関連過程を伴うことができる。そのような特殊な相同組換えは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子配列の変更をもたらす。
【０１２１】
用語「配列同一性」とは、２つのヌクレオチド配列が変化していない度合い、すなわち、２つの配列が同一の位置に同一のヌクレオチドを有する度合いをさす。配列同一性は一般的にパーセントとして表される。配列および長さにおいて同一である２つのヌクレオチド配列は、１００％の配列同一性を有する。
【０１２２】
本明細書で用いられる場合、用語「標的部位」または「標的配列」は、改変（ｅｄｉｔ）される染色体配列の部分を定義する核酸配列であって、結合のために十分な条件が存在するという条件で、ジンクフィンガーヌクレアーゼが認識かつ結合するために操作されるものをさす。
【０１２３】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための技術は当分野において知られている。典型的にそのような技術には、ある遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／または、それによりコードされるアミノ酸配列を決定すること、ならびにこれらの配列を第二のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較すること、が含まれる。ゲノム配列もまたこのような方法で決定され、比較され得る。一般的に同一性とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の対応をさす。二以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）を、それらの同一性パーセントを決定することにより比較することができる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかを問わず、２つの整列された配列間の正確な合致数をより短い方の配列の長さで割り、１００をかけたものである。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｍ．Ｏ．  Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，  ５  ｓｕｐｐｌ．  ３：３５３−３５８，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  ＵＳＡ，より開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により規格化されたスコアリング行列を用いて、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施態様は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションによって提供されている。配列間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の適したプログラムは、当分野において広く知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ用いて使用することができる：遺伝コード（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）；フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし（ｎｏｎｅ）；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方（ｂｏｔｈ）；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６０；期待数（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；分類方法（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝高スコア（ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はＧｅｎＢａｎｋウェブサイト上に見出すことができる。本明細書に記載する配列に関��て、望ましい配列同一性の度合の範囲は約８０％から１００％およびその間の任意の整数値である。典型的に、配列間の同一性パーセントは、少なくとも７０−７５％、好ましくは８０−８２％、より好ましくは８５−９０％、さらに好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
【０１２４】
あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の度合いは、配列類似性の度合いを共有する領域間で安定な二重鎖を形成させるような条件下での、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続く一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、ならびに消化された断片のサイズ決定により、決定することができる。２つの核酸配列、または２つのポリペプチド配列は、配列が、上記の方法を用いて決定して、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約７０％−７５％、好ましくは８０％−８２％、より好ましくは８５％−９０％、さらに好ましくは９２％、より一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示す場合に、実質的に互いに相同である。本明細書で用いる場合、実質的に相同というのはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をさす。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系に対して規定されるようなストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験により同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当分野の技術の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  （１９８５）  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【０１２５】
２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、次のように決定することができる。２つの核酸分子間の配列同一性の度合いは、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強さに影響する。部分的に同一な核酸配列は、少なくとも部分的に、標的分子への完全に同一な配列のハイブリダイゼーションを阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野においてよく知られたハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる（例えば、サザン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９８９），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。そのようなアッセイは、さまざまな度合いの選択性を使用して、例えば低から高ストリンジェンシーへと変化する条件を使用して実施することができる。低ストリンジェンシー条件を使用する場合、非特異的結合が存在しないことは、部分的な度合いの配列同一性さえ失った第２プローブ（例えば標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価することができ、そのため、非特異的結合事象が存在しないと、第２プローブは標的にハイブリダイズしない。
【０１２６】
ハイブリダイゼーションに基づく検出システムを利用する場合は、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に適当な条件を選択することにより、プローブと参照配列とが互いに選択的にハイブリダイズし、または結合し、二本鎖分子を形成する。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの長さを有する標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約９０−９５％を上回る配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチドの長さの標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションに役立つハイブリダイゼーション条件は、プローブおよび参照配列が特定の配列同一性の度合いを有する場合、当分野で公知であるように決定することができる（例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  ＳＪ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ  （１９８５）  Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。ハイブリダイゼーションのための条件は当業者には周知である。
【０１２７】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成を嫌う度合いをさし、より高いストリンジェンシーはミスマッチしたハイブリッドに対する許容度がより低いことと相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者によく知られており、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒、例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの濃度が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度およびより低い溶媒濃度により増大する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、さまざまな配列の塩基組成、塩類および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーション反応温度および時間パラメータを変化させると共に、洗浄条件を変化させることにより、数多くの等価な条件を使用して、ある特定のストリンジェンシーを確立することができることが、当分野においてよく知られている。特定のハイブリダイゼーション条件の組の選択は、当分野の標準的方法に従って選択することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。
【実施例】
【０１２８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を行うために含まれる。
【実施例１】
【０１２９】
内因性α−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質のタグ付け。
内因性α−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質を、ＺＦＮ誘導相同組換えを使用して、ＧＦＰでタグ付けした。要するに、ＺＦＮを使用して、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座によりコードされる、α−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのＧＦＰコード領域のインテグレーションを引き起こす、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたタンパク質を生成するために、α−チューブリンアイソフォーム１Ｂコード配列とインフレームでＧＦＰタグを融合した。ＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質を、内因性チューブリンプロモーターの制御下で発現させた。
【０１３０】
一対のＺＦＮが、ＴＵＢＡ１Ｂ標的部位内へのタグの標的化インテグレーションのために設計された。さらなる情報は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２５：４３３を参照されたい。細胞のＺＦＮ処理プールにおける、標的化ＺＦＮペア二本鎖切断発生の頻度を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。このアッセイは、ＺＦＮ誘導ＤＮＡ二本鎖切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性の不完全な修復の結果として、野生型から逸脱する、標的遺伝子座のアレル（ａｌｌｅｌｅ）を検出する。ＺＦＮ処理細胞のプールからの標的化領域のＰＣＲ増幅は、ＷＴおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の融解および再アニーリングは、ＷＴおよび変異アレルのヘテロ二重鎖間で生じるミスマッチを引き起こす。ミスマッチの部位で形成されたＤＮＡ「バブル」は、サーベイヤーヌクレアーゼ（ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｃｅｌ−１により切断され、切断産物がゲル電気泳動により確認できる。親バンドと比較した切断産物の相対強度が、ヘテロ二重鎖のＣｅｌ−１切断のレベルの測定量である。これは、同様に、その後にＮＨＥＪによって不完全な修復を受けた内因性標的遺伝子座のＺＦＮ介在切断の頻度を反映する。α−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質にタグを付けるために使用されるＺＦＮペアのため、一方のＺＦＮは５’  ＣＴＴＣＧＣＣＴＣＣＴＡＡＴＣ  ３’（配列番号１）配列に結合するように設計され、他方のＺＦＮは５’  ＣＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＧＴＡＡ  ３’（配列番号２）配列に結合するように設計された（図１Ａ）。次いで、ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のＣＣＴＡＧＣ染色体配列内に二本鎖切断を導入する（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１３１】
Ｕ２ＯＳヒト細胞株のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＧＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド（図２）が構築された。該プラスミドは、１Ｋｂおよび７００塩基対の、ＺＦＮペアにより導入される切断部位の上流および下流のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含んだ（図１ＣおよびＤ）。該プラスミドにおけるタグ配列は、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座が発現された場合、図１Ｅで詳述されるように、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合されたα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座に融合された。ＧＦＰ−チューブリン融合はまた、ＧＦＰコード配列が導入された、ＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座の第一エキソンのスプライスシグナル（ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｇｎａｌ）が、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のままであるように、設計された。
【０１３２】
Ｕ２ＯＳ細胞におけるチューブリンのタグ付け。
ドナープラスミドおよびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを、Ｕ２ＯＳ、Ａ５４９、Ｋ５６２、ＨＥＫ２９３、ＭＣＦ１０ａ、またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。３７℃および３０℃で実行されるジャンクションＰＣＲを用いて、ドナーＤＮＡがチューブリンＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座にインテグレートされたことを確認した。図３に示されるように、ＧＦＰ２配列がＵ２ＯＳ細胞においてＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へインテグレートされたことを、配列解析で確認した（配列番号４）。Ｕ２ＯＳ細胞でＴＵＢＡ１Ｂ領域において確認されたＲＦＰ配列のインテグレーションは、図４に示される（配列番号５）。
【０１３３】
右ジャンクションを挟むプライマーを使用するＰＣＲ解析でインテグレーションを確認した。このために、１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを、２５μｌ反応混合液内で増幅した（２６サイクルの９５℃、５分；９５℃、３０秒；５１℃、３０秒；７０℃、１．１分；７０°Ｃ、７分；４°Ｃ、ホールド）。図５は、１４細胞クローンがＧＦＰインテグレーションを示すＰＣＲ断片サイズを含んでいたことを示す。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きα−チューブリンアイソフォーム１Ｂタンパク質を視覚化した、Ｕ２ＯＳ細胞（図６Ａ−Ｃ）、Ａ５４９細胞（図６Ｄ−Ｅ）、Ｋ５６２細胞（図６Ｆ）およびＨＥＫ２９３細胞（図６Ｇ−Ｈ）。
【０１３４】
ＭＣＦ１０ａ細胞株におけるチューブリンのタグ付け。
ＭＣＦ１０ａヒト細胞株のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＲＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド（図７）が構築された。ＭＣＦ１０ａ細胞株のＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのＲＦＰタグインテグレーションは、チューブリンプライマー５’  ＣＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＴ  ３’（配列番号６；ｔｕｂ８０Ｕ）および５’  ＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＡＧＴ  ３’（配列番号７；ｔｕｂ５１１Ｌ）を使用する、ゲノムＰＣＲおよびジャンクションＰＣＲにより検証した。ゲノムＰＣＲおよびサザンブロッティングは、数個のクローンにおけるＴＵＢＡ１Ｂ内へのＲＦＰタグのインテグレーションを示した（図８）。ＭＣＦ１０ａ細胞株におけるＴＵＢＡ１Ｂ遺伝子座内へのタグ配列のインテグレーションを確認する配列解析が、図９（配列番号８）に示される。トランスフェクトされたＭＣＦ１０ａのクローン５が、さらなる検証のために選択された（図１０）。ＲＦＰインテグレーションのジャンプスタート（Ｊｕｍｐｓｔａｒｔ）ＰＣＲ検証において：９５ｎｇのゲノムＤＮＡ（ＭＣＦ１０ａ細胞の野生型およびクローン５、ならびにＵ２ＯＳ細胞の野生型およびクローン９、５）が増幅された（ｔｕｂ８０Ｕプライマーおよびｔｕｂ５２２Ｌプライマーを用いて、３５Ｘ、６９℃でアニーリングかつ７２℃で伸長）。トランスフェクトされたＭＣＦ１０ａクローン５はインテグレートされた配列を有することが確認された（図１０を参照されたい）。ＭＣＦ１０ａクローン５の左ジャンクションおよび右ジャンクションのサイズは、ＲＦＰ特異的プライマーおよびチューブリン特異的プライマーを用いて確認され、それぞれ、４５２塩基対および４０８塩基対の予測されたサイズであることがわかった（図１１）。ＲＦＰ−チューブリンタンパク質の発現はウェスタンブロッティングを通して検証された（図１２）。ブロットは、抗−ＲＦＰ抗体または抗−チューブリン抗体のいずれかを用いて調べられた。ＲＦＰ発現もまた蛍光顕微鏡で観察され、内因性ＴＵＢＡ１Ｂ発現と共存することが観察された（図１３）。トランスフェクトされたＭＣＦ１０ａ細胞の成長特性を親細胞株と比較した。トランスフェクトされたＭＣＦ１０ａ細胞の倍化時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）は、親細胞株のものの＋／−２０％であった。トランスフェクトされたＭＣＦ１０ａ細胞の表現型安定性を評価した。８週かつ１６分割後、９９％の細胞がＲＦＰシグナルを維持したことが観察された（表１）。蛍光顕微鏡でＭＣＦ１０ａクローン５細胞におけるＲＦＰタグ付きチューブリンの発現を確認した（図１４）。
【表２】
0005841997.tif 000007
【実施例２】
【０１３５】
ＳＴＡＴ３によりコードされるシグナル伝達性転写活性化因子３タンパク質へのタグ付けの試み。
ＧＦＰまたはＲＦＰタグ付きのＳＴＡＴ３によりコードされるシグナル伝達性転写活性化因子３タンパク質の生成への試みは成功しなかった。シグナル伝達性タンパク質のＮ末端に融合されたＧＦＰまたはＲＦＰをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流ＳＴＡＴ３遺伝子座配列を含むドナープラスミドが生成された（図１５）。ＺＦＮは上記の実施例に記載されるように設計された。一方のＺＦＮは５’  ＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＴＴＧ  ３’（配列番号９）配列に結合するように設計され、もう一方のＺＦＮは、ＳＴＡＴ３遺伝子座を含み、５’  ＣＧＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧ  ３’（配列番号１０）配列に結合するように設計された（図１６）。上述のＣｅｌ−１アッセイを用いて、ＺＦＮペアが適切な部位でＳＴＡＴ３遺伝子座を効率よく切断することを確認した（図１７）。
【０１３６】
ドナープラスミドおよびＺＦＮをコードするＲＮＡのペア（図１８）を、細胞にトランスフェクトした。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析では、蛍光シグナルは全く検出されず、それゆえ、標的化インテグレーションは成功しなかった（図１９）。これらの結果は、β−アクチンタンパク質をコードするＡＣＴＢ遺伝子座での、ＧＦＰおよびＲＦＰをコードするタグ配列の標的化インテグレーションを検出すると同時に、ＳＴＡＴ３遺伝子座内でのＧＦＰのいかなる標的化インテグレーションも検出できなかった、ジャンクションＰＣＲにより確認された（図２０）。
【０１３７】
それゆえ、たとえ設計されたＺＦＮペアが正しい染色体位置へ二本鎖切断を導入することができても、ＧＦＰタグのインテグレーションは達成されなかった。
【実施例３】
【０１３８】
ＭＡＰＲＥ３によりコードされる微小管結合タンパク質ＲＰ／ＥＢファミリーメンバー３へのタグ付けの試み。
ＧＦＰタグ付きのＭＡＰＲＥ３によりコードされる微小管結合タンパク質ＲＰ／ＥＢファミリーメンバー３の生成への試みは成功しなかった。
【０１３９】
第一に、Ｎ末端での微小管結合タンパク質のタグ付けが試みられた。上記実施例１に記載されるように、多重ＺＦＮを設計して、微小管結合タンパク質のＮ末端でタグ配列をインテグレートした。ＭＡＰＲＥ３のＮ末端付近で染色体ＤＮＡの切断に成功したＺＦＮが見出された（ペア６／８および１６／１７；図２２および表２）。しかしながら、所望のタグ付き融合タンパク質を生成するために適した位置で染色体を切断したＺＦＮペアはなかった。
【表３】
0005841997.tif 000008
【０１４０】
Ｎ末端での微小管結合タンパク質のタグ付けが成功しなかったので、Ｃ末端での該タンパク質のタグ付けが試みられた。多重ＺＦＮを設計して、微小管結合タンパク質のＣ末端でタグ配列をインテグレートした。対照として、ＺＦＮペアを設計して、ラミンタンパク質のＮ末端でタグ配列をインテグレートした（図２３および表４）。一つのＺＦＮペアが、ＭＡＰＲＥ３のＣ末端またはその付近で染色体ＤＮＡの切断に成功したことが見出された（ペア３１／３２；図２３および表３）。このペアにおいて、一方のＺＦＮは５’  ＴＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＣＣＡＣ  ３’（配列番号１１）配列に結合するように設計され、もう一方のＺＦＮは、ＭＡＰＲＥ３遺伝子座を含み、５’  ＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣ  ３’（配列番号１２）配列に結合するように設計された。
【表４】
0005841997.tif 000009
【表５】
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【０１４１】
ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流ＭＡＰＲＥ３遺伝子座配列を含むプラスミドが生成された（図２１）。ドナープラスミドおよびＺＦＮをコードするＲＮＡの３１／３２ペアを細胞内にトランスフェクションし、ジャンクションＰＣＲによりＭＡＰＲＥ３遺伝子座内のＧＦＰタグの予想される挿入が示された（図２４）。しかしながら、ＦＡＣＳ解析では蛍光シグナルは全く検出されず、それゆえ標的化インテグレーションは成功しなかった（図２５）。
【実施例４】
【０１４２】
内因性β−アクチンタンパク質のタグ付け。
内因性β−アクチンタンパク質を、ＺＦＮ誘導相同組換えを使用してタグ付けした。要するに、ＺＦＮを使用して、ＡＣＴＢ遺伝子座によりコードされる、β−アクチンをコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのＧＦＰコード領域のインテグレーションを引き起こす、ＡＣＴＢ遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチド（図２８）を構築して、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたタンパク質（図２６Ｄ）を生成するために、β−アクチンコード配列（図２６、「ｖ．２」）とインフレームでＧＦＰタグをインテグレートした。ＧＦＰタグ付きβ−アクチンタンパク質を、内因性アクチンプロモーターの制御下で発現させた。
【０１４３】
一対のＺＦＮが、上記に詳述されるように、ＡＣＴＢ標的部位内へのタグの標的化インテグレーションのために設計された。β−アクチンタンパク質にタグを付けるために使用されるＺＦＮペアのため、一方のＺＦＮは５’  ＧＴＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＧＧＣＴＣＣ  ３’（配列番号１３）配列に結合するように設計され、他方のＺＦＮは５’  ＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＣＧＧ  ３’（配列番号１４）配列に結合するように設計された（図２６Ａ）。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のＧＧＣＡＴＧ染色体配列内に二本鎖切断を導入する（図２６Ａおよび２６Ｂ）。次いで、ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。
【０１４４】
細胞のＺＦＮ処理プールにおける、標的化ＺＦＮペア二本鎖切断発生の頻度を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した（図２７）。このアッセイは、ＺＦＮ誘導ＤＮＡ二本鎖切断の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）介在性の不完全な修復の結果として、野生型から逸脱する、標的遺伝子座のアレルを検出する。ＺＦＮ処理細胞のプールからの標的化領域のＰＣＲ増幅は、ＷＴおよび変異アンプリコンの混合物を生成する。この混合物の融解および再アニーリングは、ＷＴおよび変異アレルのヘテロ二重鎖間で生じるミスマッチを引き起こす。ミスマッチの部位で形成されたＤＮＡ「バブル」は、サーベイヤーヌクレアーゼＣｅｌ−１により切断され、切断産物がゲル電気泳動により確認できる。親バンドと比較した切断産物の相対強度が、ヘテロ二重鎖のＣｅｌ−１切断のレベルの測定量である。これは、同様に、その後にＮＨＥＪによって不完全な修復を受けた内因性標的遺伝子座のＺＦＮ介在切断の頻度を反映する。
【０１４５】
ヒト細胞株のＡＣＴＢ遺伝子座内へのＧＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミド（図２８）が構築された。該プラスミドは、８６１および５９３ヌクレオチドの、ＺＦＮペアにより導入される切断部位の上流および下流のＡＣＴＢ遺伝子座配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含んだ（図２６Ｃ）。該プラスミドにおけるタグ配列は、ＡＣＴＢ遺伝子座が発現された場合、図２６Ｄで詳述されるように、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合されたβ−アクチンタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のＡＣＴＢ遺伝子座に融合された。ＧＦＰ−アクチン融合はまた、ＧＦＰコード配列が導入された、ＡＣＴＢ遺伝子座の第一エキソンのスプライスシグナル（ｓｐｌｉｃｅ  ｓｉｇｎａｌ）が、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のままであるように、設計された。
【０１４６】
ドナープラスミドおよびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを、細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きβ−アクチンタンパク質を視覚化した（図２９）。Ｕ２ＯＳ細胞内のＧＦＰ２インテグレーションを備えるＡＣＴＢ遺伝子座の確認された配列は、図３０に示される（配列番号１６）。Ｕ２ＯＳ細胞内のＲＦＰインテグレーションを備えるＡＣＴＢ遺伝子座の確認された配列は、図３１に示される（配列番号１７）。
【実施例５】
【０１４７】
２Ａペプチドを利用するＧＦＰタグ付きβ−アクチン。
β−アクチンはまた、β−アクチンの最初の１５アミノ酸をコードする核酸配列を、代替のコドン使用を有する核酸配列で同時に置換しながら、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされる。
【０１４８】
ＧＦＰと翻訳的に融合された全長β−アクチンをもたらすであろう、タグ配列をＺＦＮ切断部位（図２６、「Ｖ．１」）付近でインテグレートするために、β−アクチンの最初の１５アミノ酸が変更された、新たなドナープラスミドが構築された（図３２）。該ドナープラスミドは、順に、３アラニンアミノ酸リンカーを介して、代替コドンによりコードされるβ−アクチンの最初の１５アミノ酸に融合される、ＧＦＰに融合した２ａペプチドをコードするポリヌクレオチドを挟む、上流および下流ＡＣＴＢ遺伝子座配列を含んだ（図３３）。２ａペプチドの共翻訳切断（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ）は、新しいコドンによりコードされるβ−アクチンの最初の１５アミノ酸を除き、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたβ−アクチンを生成する（図２６Ｄ）。
【０１４９】
ＺＦＮは実施例４に記載されるとおりであった。ドナープラスミド、およびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きβ−アクチンタンパク質の発現を確認した（図２９）。
【実施例６】
【０１５０】
内因性ラミンＢ１タンパク質のタグ付け。
内因性ラミンＢ１タンパク質を、ＺＦＮ誘導相同組換えを使用して、ＧＦＰでタグ付けした。要するに、ＺＦＮを使用して、ＬＭＮＢ１遺伝子座によりコードされる、ラミンＢ１をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのＧＦＰコード領域のインテグレーションを引き起こす、ＬＭＮＢ１遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたタンパク質を生成するために、ラミンＢ１コード配列とインフレームでＧＦＰタグを融合した。ＧＦＰタグ付きラミンＢ１タンパク質を、内因性ラミンプロモーターの制御下で発現させた。
【０１５１】
一対のＺＦＮが上述のように設計された。細胞のＺＦＮ処理プールにおける、標的化ＺＦＮペア二本鎖切断発生の頻度を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。ラミンＢ１タンパク質にタグを付けるために使用されるＺＦＮペアのため、一方のＺＦＮは５’  ＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴ  ３’（配列番号１８）配列に結合するように設計され、他方のＺＦＮは５’  ＧＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧ  ３’（配列番号１９）配列に結合するように設計された（図３４Ａ）。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のＧＴＣＴＣＣ染色体配列内に二本鎖切断を導入する（図３４Ａおよび３４Ｂ）。次いで、ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。
【０１５２】
Ｕ２ＯＳヒト細胞株のＬＭＮＢ１遺伝子座内へのＧＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された。該プラスミドは、６３３塩基対および６２９塩基対の、ＺＦＮペアによって導入される切断部位の上流および下流のＬＭＮＢ１遺伝子座配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含んだ（図３４Ｃおよび３４Ｄ）。該プラスミドにおけるタグ配列は、ＬＭＮＢ１遺伝子座が発現された場合、図３４Ｅで詳述されるように、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合されたラミンＢ１タンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のＬＭＮＢ１遺伝子座に融合された。
【０１５３】
ドナープラスミド、およびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。３７℃および３０℃で実行されるジャンクションＰＣＲを用いて、ドナーＤＮＡがＬＭＮＢ１遺伝子座にインテグレートされたことを確認した。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きラミンＢ１タンパク質を視覚化した（図３５）。Ｕ２ＯＳ細胞内のラミンコード領域におけるＧＦＰ２のインテグレーション部位で確認された配列は、図３６に示される（配列番号２１）。
【０１５４】
ＲＦＰコード配列を含みラミン配列を挟むドナープラスミド、およびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアを、線維芽細胞または他の細胞型から生成された人工多能性幹細胞である、ｉＰＳ細胞にもトランスフェクトした。ＲＦＰタグ付きラミンを含むｉＰＳ細胞の画像は図３７に示される。
【実施例７】
【０１５５】
内因性ＨＥＲ２タンパク質のタグ付け。
内因性ＨＥＲ２タンパク質を、ＺＦＮ誘導相同組換えを使用して、ＧＦＰでタグ付けした。要するに、ＺＦＮを使用して、ＥＲＢＢ２遺伝子座によりコードされる、ＨＥＲ２をコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのＧＦＰコード領域のインテグレーションを引き起こす、ＥＲＢＢ２遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたタンパク質を生成するために、ＨＥＲ２コード配列とインフレームでＧＦＰタグを融合した。ＧＦＰタグ付きＨＥＲ２タンパク質を、内因性ＥＲＢＢ２プロモーターの制御下で発現させた。
【０１５６】
一対のＺＦＮが上述のように設計された。細胞のＺＦＮ処理プールにおける、標的化ＺＦＮペア二本鎖切断発生の頻度を、Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼアッセイを使用することにより決定した。ＨＥＲ２タンパク質にタグを付けるために使用されるＺＦＮペアのため、一方のＺＦＮは５’  ＴＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＣ  ３’（配列番号２２）配列に結合するように設計され、他方のＺＦＮは５’  ＡＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＣ  ３’（配列番号２３）配列に結合するように設計された。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のＧＴＧＣＣ染色体配列内に二本鎖切断を導入する（図３８）。次いで、ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。
【０１５７】
ＥＲＢＢ２遺伝子座内へのＧＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された（図３９）。該プラスミドにおけるタグ配列は、ＥＲＢＢ２遺伝子座が発現された場合、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合されたＨＥＲ２タンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のＥＲＢＢ２遺伝子座に融合された。
【０１５８】
ドナープラスミド、およびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアをＳＫＯＶ３細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。３７℃および３０℃で実行されるジャンクションＰＣＲを用いて、ドナーＤＮＡがトランスフェクトされたＳＫＯＶ３細胞内のＥＲＢＢ２遺伝子座にインテグレートされたことを確認した（図４０）。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きＨＥＲ２タンパク質を視覚化した（図４１）。
【実施例８】
【０１５９】
内因性ＨＭＧＡタンパク質のタグ付け。
ＨＭＧＡタンパク質を、ＺＦＮ誘導相同組換えを使用して、ＧＦＰでタグ付けした。要するに、ＺＦＮを使用して、ＨＭＧＡ１遺伝子座によりコードされる、ＨＭＧＡをコードする染色体領域内に、二本鎖切断を導入した。二本鎖切断は、染色体内へのＧＦＰコード領域のインテグレーションを引き起こす、ＨＭＧＡ１遺伝子座染色体領域と相同である核酸配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含むドナーポリヌクレオチドとの相同組換えを誘導する。ドナーポリヌクレオチドを構築して、Ｎ末端においてＧＦＰでタグ付けされたタンパク質を生成するために、ＨＭＧＡ１コード配列とインフレームでＧＦＰタグを融合した。ＧＦＰタグ付きＨＭＧＡ１タンパク質を、内因性ＨＭＧＡ１プロモーターの制御下で発現させた。
【０１６０】
内因性ＨＭＧ１タンパク質にタグを付けるため、一対のＺＦＮが上述のように設計された。一方のＺＦＮは５’  ＣＡＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡ  ３’（配列番号２５）配列に結合するように設計され、他方のＺＦＮは５’  ＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡ  ３’（配列番号２６）配列に結合するように設計された（図４２）。結合するとすぐに、ＺＦＮペアは、相同組換えを誘導するために、認識部位間のＣＣＴＣＡＣＡ染色体配列内に二本鎖切断を導入する（図４４）。次いで、ＺＦＮペアをコードする、キャップされポリアデニル化されたｍＲＮＡを公知の分子生物学的手法を用いて生成した。
【０１６１】
ＨＭＧＡ１遺伝子座内へのＧＦＰタグの標的化インテグレーションのため、ポリヌクレオチドドナーとしてプラスミドが構築された（図４３）。該プラスミドは、８０６塩基対および７４７塩基対の、ＺＦＮペアによって導入される切断部位の上流および下流のＨＭＧＡ１遺伝子座配列に挟まれたＧＦＰコード配列を含めた（図４３）。該プラスミドにおけるタグ配列は、ＨＭＧＡ１遺伝子座が発現された場合、Ｎ末端でＧＦＰタグに融合されたＨＭＧＡタンパク質が生成されるような方法で、上流および下流のＨＭＧＡ１遺伝子座に融合された。
【０１６２】
ドナープラスミド、およびＺＦＮをコードするＲＮＡのペアをＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。該核酸混合物は、一部のＺＦＮ  ＲＮＡに対し、一部のドナーＤＮＡを含んだ。トランスフェクトされた細胞は、次いで培養され、個々の細胞クローンが解析された。ゲノムＰＣＲおよびサザンブロッティングは、選択されたクローンにおけるＨＭＧＡ１遺伝子座内へのタグ配列のインテグレーションを示した（図４４Ａおよび図４４Ｂ）。配列解析で標的とされる染色体領域内へのインテグレーションを確認した（図４５）（配列番号２８）。次いで、蛍光顕微鏡を用いて、ＧＦＰタグ付きＨＭＧＡ１タンパク質を視覚化した（図４６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0005841997.tif 000014
【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0005841997.tif 000017
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
0005841997.tif 000021
【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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