(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
その工程が、
［ａ］栄養培地中にＡＴＣＣ  １８５００に対応するアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＩＴＣＣ  ６４３６の菌胞子を植菌し、培養して、バイオマスを得ることと、
［ｂ］工程［ａ］で得られるバイオマスを回収し、次いで、前記バイオマスを無菌条件下にて滅菌蒸留水で洗浄することと、
［ｃ］工程［ｂ］で得られる洗浄されたバイオマスをＨＡｕＣｌ４溶液に懸濁し、２〜３日間培養し、次いで、前記バイオマスを無菌条件下にて滅菌蒸留水で洗浄することと、
［ｄ］工程［ｃ］で得られる洗浄されたバイオマスを不活性条件下にて管状炉中において６００℃で６〜８時間熱処理して、熱処理された炭素金ＨＴＣ−６００  Ａｕを得ることと、
［ｅ］工程［ｄ］で得られたＨＴＣ−６００  Ａｕをエタノールで洗浄することと、
［ｆ］エタノール洗浄した、滅菌ＨＴＣ−６００  ＡｕをＴｒｉｓ．Ｃｌ、ＮａＣlベースの緩衝液に懸濁したＤＮＡと混合することと、
［ｇ］工程［ｆ］で得られるような混合物をスペルミジン（spermidine）およびＰＥＧで順次平衡化し、次いで、２．５ＭのＣａＣｌ２中で超音波処理することと、
［ｈ］工程［ｇ］で得られた超音波処理した混合物を１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを無水アルコールを用いて２回洗浄し、最終的に所要の容量のエタノールに再懸濁して、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子を得ることと
を含む、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子の調製のためのプロセス。
【請求項２】
ＨＡｕＣｌ４溶液の濃度が、１０−３モルであることを特徴とする、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
その工程が、
（ｉ）ＡＴＣＣ  １８５００に対応するアスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＩＴＣＣ  ６４３６の真菌胞子を、マルトース−グルコース−酵母抽出物とペプトンブロスとを含有する培地に植菌することと、
（ｉｉ）バイオマスを得るために、前記胞子を発芽させ、菌糸を３７℃で３日間生成させて、バイオマスを回収し、次いで、前記バイオマスを滅菌条件下にて、オートクレーブしたＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄することと、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られる洗浄されたバイオマスをＨＡｕＣｌ４溶液に再懸濁し、次いで、３７℃で２日間培養し、次いで、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）（ＲＴＭ）水で洗浄することと、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得られる洗浄されたバイオマスを、窒素流下にて、管状炉中６００℃で６時間熱処理して、生成物のＨＴＣ−６００  Ａｕを得ることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）で得られるようなＨＴＣ−６００  Ａｕをエタノールで洗浄し、Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ＮａＣｌベース緩衝液に懸濁されたＤＮＡと混合することと、
（ｖｉ）工程（ｖ）で得られた混合物をスペルミジンおよびＰＥＧで順次平衡化し、次いで、２．５ＭのＣａＣｌ２中で超音波処理することと、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得られるような超音波処理した混合物を１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを無水アルコールを用いて２回洗浄し、最終的に所要の容量のエタノールに再懸濁して、炭素質支持体表面に支持されたＤＮＡ担持金ナノ粒子を得ることと
を含む、炭素質支持体表面での、請求項１に記載されたＤＮＡ担持支持金ナノ粒子の調製のためのプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子、その調製のためのプロセスおよびその使用に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子送達に有用な鋭利な先端を有する炭素に包埋されたナノ金粒子に関する。本発明はさらに、鋭利な先端を有する該炭素に包埋されたナノ金粒子の調製のためのプロセスおよびそれを用いた植物の形質転換の方法に関する。炭素支持体が不活性およびより優れた穿孔能力のような特性を有すると考えられる一方、包埋された金ナノ粒子は、ＤＮＡに対する最も良好な支持を提供する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的要素に所望の形質を提示させる遺伝子操作は多くの新たな道を開いた。ウイルスベクターは、良好な遺伝子送達媒体として同定されている。それらには、急性毒性、細胞免疫応答、挿入突然変異による発癌性、限られたカーゴ能力、感染の繰返しに対する抵抗性ならびに生産および品質管理の他の選択肢のような限界があるので、脂質、ポリマー化合物、糖質デンドリマーおよびポリペプチドに基づくシステムのような非ウイルスベクターが、より優れた代替法であることが示されている。ナノ粒子、特に、炭素ナノ構造体は、遺伝子送達用途について研究途上である。しかしながら、研究の大半は、動物システムまたは細胞株に限定されている。他方、植物システム用の非ウイルスベクターは、Ｓａｎｆｏｒｄらによって開発された、Ｎａｔｕｒｅ，１９８７  ３２７，７０−７３に報告されているような、ＤＮＡを無傷の植物細胞に送達する加速されたＤＮＡコーティングマイクロ金発射体を利用するパーティクルガン（particle gun）を用いる新規の方法を除いて、比較的開発が遅れている。マイクロ金構造体の改良として、Ｗａｎｇおよび共同研究者らは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，２００７，２，２９５−３００に発表されているような、ナノ金が担持された多重遺伝子送達用のメソ多孔質シリカを合成した。金で被覆された低密度メソ多孔質シリカは、軟らかいトウモロコシ胚を透過することが示されていたが、木質樹種の１つのような硬い胚の透過を示す明らかなデータはなかった。
【０００３】
最近、"Ｓｍａｌｌ"２００６，２，６２１−６２５というジャーナル中のＬｅｎｇ  Ｎｉｅらによる、"Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｔｅｔｒａｐｏｄｌｉｋｅ  ＺｎＯ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ"というタイトルの論文で、プラスミドを運ぶ４本脚の鋭利な頂端が細胞に侵入した場合に、４本脚の鋭利な構造体が、ウイルスベクターカプシドを模倣して、ＤＮＡをヒト細胞株に送達し、必要なトランスフェクション（transfection）を誘発することが報告された。同様に、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３，１０８９３−１０８９６では、Ｖａｋａｒｅｌｓｋｉらにより、形質膜を透過するためにより低い力（０．１〜０．２ｎＮ）を必要とする（直径３０〜４０ｎｍの）カーボンナノチューブと比較して、（直径２００〜３００ｎｍの）シリコンナノ針は０．７〜２．０ｎＮの力を必要としたことも報告されており、これもまた、遺伝子送達タイプの用途のための鋭利な物体の有用性を強調した。
【０００４】
ここで、細胞内と細胞外の両方における、微生物による金属ナノ粒子の合成に関する十分な文献が入手可能であることに触れるのは価値のあることである（Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｋ．Ｂ．およびＳａｋｔｈｉｖｅｌ，Ｎ．２０１０．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１５６［１−２］：１−１３を参照されたい）。しかしながら、軟らかい組織だけでなく、硬い組織へのＤＮＡ導入も容易にすることができる、鋭利な先端の支持体に担持されたナノ粒子による遺伝子送達に関する報告で、入手可能なものはない。
【０００５】
このように、先行技術調査によって、鋭利な先端を有する遺伝子材料の担体の必要性が明らかにされている。さらに、担体は、遺伝子材料を運ぶ十分な能力および損傷をより少なくして硬い材料を透過する鋭利さも有するべきである。該担体の調製のプロセスは、簡単で、容易に実行でき、またさらに、先行技術と当技術分野における必要性とのギャップを埋めるものであるべきである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】"Ｓｍａｌｌ"２００６，２，６２１−６２５  "Ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｔｅｔｒａｐｏｄｌｉｋｅ  ＺｎＯ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ"
【非特許文献２】Ｎ．２０１０．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１５６［１−２］：１−１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それゆえ、本発明の主な目的は、鋭利な先端の遺伝子担体組成物を提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は、鋭利な先端の支持体に包埋された遺伝子送達用の金ナノ粒子を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、材料の損傷をごくわずかにして硬い材料を透過する能力を有する遺伝子材料の担体を提供することである。
【００１０】
本発明のまた別の目的は、プラスミドおよび金を少量しか必要としない遺伝子送達用の合成担体を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、鋭利な先端を有するＤＮＡ担持支持金ナノ粒子の調製のためのプロセスおよびそれを用いた植物の形質転換の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
鋭利な先端を有する担体とナノ金の組合せは、遺伝子銃に基づく形質転換における重要なブレークスルーとなり得ると予想して、本明細書において、本発明者らは、生化学的／物理的／化学的形質転換の組合せを用いる炭素支持金ナノ粒子の調製を記載している。粒子は、ＡＴＣＣ  １８５００に対応する真菌アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）ＩＴＣＣ  ６４３６によって生体内原位置（in situ）で合成される細胞内金ナノ粒子の不活性加熱によって調製される。簡潔にするため、６００℃で熱処理された細胞内金ナノ粒子は、本テキストでさらにＨＴＣ−６００  Ａｕと表される。このマトリックスは、金ナノ粒子を支持し、ＤＮＡが結合して担体に最小密度を提供し、植物システムの硬い細胞壁を穿孔するために遺伝子銃で閾値速度を得るためのプラットフォームを与える。炭素マトリックスに包埋された金ナノ粒子は、ＤＮＡが結合することができるプラットフォームを提供する。炭素支持体は、金ナノ粒子を固定し、ＤＮＡコーティング手順で必要とされる工程である超音波処理の間にそれらが浸出するのを防いだ。他方、純粋な炭素材料では、金が存在しないのでＤＮＡを結合させることができなかった。
【００１３】
したがって、本発明は、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子が、図２Ａの曲線２に示すような鋭利な先端を有することを特徴とする、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子の調製のためにプロセスを提供するものであり、ここで、その工程は、
［ａ］栄養培地中で細胞内金ナノ粒子を合成することができる微生物培養物を植菌し、培養して、バイオマスを得ることと、
［ｂ］工程［ａ］で得られるバイオマスを回収し、次いで、バイオマスを無菌条件下にて滅菌蒸留水で洗浄することと、
［ｃ］工程［ｂ］で得られる洗浄されたバイオマスをＨＡｕＣｌ４溶液に懸濁し、２〜３日間培養（incubating）し、次いで、バイオマスを無菌条件下にて滅菌蒸留水で洗浄することと、
［ｄ］工程［ｃ］で得られる洗浄されたバイオマスを不活性条件下にて管状炉中で６〜８時間熱処理して、熱処理された炭素金ＨＴＣ−６００  Ａｕを得ることと、
［ｅ］工程［ｄ］で得られるようなＨＴＣ−６００  Ａｕをエタノールで洗浄することと、
［ｆ］エタノール洗浄した、滅菌ＨＴＣ−Ａｕ−６００をＸＨＯ緩衝液（Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ＮａＣベースの緩衝液）に懸濁したＤＮＡと混合することと、
［ｇ］工程［ｆ］で得られるような混合物をスペルミジンおよびＰＥＧで順次平衡化し、次いで、２．５ＭのＣａＣｌ２中で超音波処理することと、
［ｈ］工程［ｇ］で得られるような超音波処理した混合物を１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを無水アルコールを用いて２回洗浄し、最終的に所要の容量のエタノールに再懸濁して、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子を得ることと
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａ：金イオンと培養（incubation）する前のバイオマス。Ｂ：金イオンと培養（incubation）した後のバイオマス。Ｃ：ＳＥＭ下の真菌の極細微小菌糸。Ｄ：ＳＥＭ下の焼成バイオマス。
【図２】Ａ：ＸＲＤスペクトル。曲線１：１×１０−３ＭのＨＡｕＣｌ４と培養（incubated）した未焼成バイオマス。曲線２：６００℃で熱処理した炭素金（ＨＴＣ  ６００−Ａｕ）。Ｂ：バイオマス（サンプル１）のラマンスペクトル。Ｃ：６００℃で熱処理した炭素金（ＨＴＣ  ６００−Ａｕ）のラマンスペクトル。
【図３】（Ａ）６００℃で熱処理した炭素金（ＨＴＣ  ６００−Ａｕ）のＳＥＭ画像。（Ｂ、ＣおよびＤ）：６００℃で熱処理した炭素金（ＨＴＣ  ６００−Ａｕ）のＴＥＭ画像。ＣおよびＤのＴＥＭ画像によって明らかにされているような炭素マトリックスに包埋された小さい金粒子平面の存在に注目すべきである。（Ｄの中の挿入写真）金の１１１相に対応する「ｄ」スペーシングを示す金ナノ粒子のＨＲＴＥＭ画像。
【図４】得られるようなＧＵＳフォーカスの数を市販のマイクロ金の仕様と一致させるための、１ｍｇの６００℃で熱処理した炭素金（ＨＴＣ  ６００−Ａｕ）表面の様々な濃度のプラスミドＤＮＡの標準化。
【図５】微粒子銃で打ち込まれたレウカエナ（Ｌｅｕｃａｅｎａ）胚のＳＥＭ画像。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ：１００、３０、１０および３μｍ規模の胚。ＥおよびＦ：１０および３μｍ規模のＨＴＣ  ６００−Ａｕが打ち込まれた胚。ＧおよびＨ：１０および３μｍ規模のマイクロ金粒子が打ち込まれた胚。ＩおよびＪ：１μｍおよび３００ｎｍ規模の打ち込まれていない胚。
【図６】微粒子銃で打ち込まれたイネカルスのＳＥＭ画像。（ＡおよびＢ）ＨＴＣ  ６００−Ａｕが打ち込まれたカルス。（ＣおよびＤ）マイクロ金粒子が打ち込まれたカルス。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の目的のために、「ナノ金が担持された鋭利な先端の炭素弾」、「鋭利な炭素質シート表面に支持された金ナノ粒子」および「ＨＴＣ  ６００−Ａｕ」という表現は、本明細書の全体を通じて互換的に用いられ、それらは、当業者によって、そのようなものとして理解されうる。
【００１７】
本明細書で使用されるように、「ＨＴＣ  ６００−Ａｕ」という用語は、本発明のプロセスによって調製される、「６００℃で熱処理した炭素金」を指す。
【００１８】
本発明では、鋭利な炭素質シート表面に支持された金ナノ粒子を含む合成材料が、Ｓａｎｆｏｒｄおよび共同研究者らにより開発された遺伝子銃を用いる遺伝子送達用の代替材料として記載されている。炭素支持体が、不活性、より優れた穿孔能力などの所要の特性を有すると考えられる一方、包埋された金ナノ粒子は、ＤＮＡに対する最も良好な支持を提供する。
【００１９】
上記の合成材料の調製を目的とした第１の工程は、細胞内で金ナノ粒子を合成することができる微生物バイオマスを金イオンと培養（incubation）して、細胞内マトリックス内部での金イオンの金ナノ粒子への還元を示す真紅色の発色をバイオマスに対して生じさせることを含む。バイオマトリックスに対する金前駆体の濃度は、最大量の金ナノ粒子がバイオマトリックスに担持されるように最適化された。さらに、焼成後に得られた金の濃度は、試験されたロットの違いを越えて一貫していることが分かった。
【００２０】
合成材料のＨＴＣ−６００  Ａｕが効率的なＤＮＡ送達剤として機能することができることを確かめるために、マイクロメートル大の金粒子［Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ］について規定されている通常の日常的な手順を用いて、上記の合成ＨＴＣ−６００  ＡｕにＤＮＡをコーティングした。最後に、ＤＮＡがコーティングされたＨＴＣ−６００  Ａｕを無水エタノールに懸濁し、使用する前に、−２０℃で保存した。ＤＮＡがコーティングされた上記のＨＴＣ−６００  ＡｕのアリコートをＢｉｏｌｉｓｔｉｃ−ＰＤＳ  １００／Ｈｅシステムとともに用いて、形質転換実験を実施した。
【００２１】
双子葉植物樹種のギンゴウカン（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）へのプラスミドＤＮＡ送達を標準化することにより、市販の非生物ミクロン金担体表面に担持された６００ｎｇのプラスミドＤＮＡで得られた結果と一致させるのに、ＨＴＣ  ６００−Ａｕ（６００℃で熱処理した炭素金）表面に担持されたわずか２００ｎｇのプラスミドＤＮＡで十分であることが分かった（図３Ｂ）。それゆえ、さらなる研究は全て、ＨＴＣ  ６００−Ａｕ表面に担持された２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いて実施された。さらに、粒径分布（図２Ｃ；差し込み図）および使用された金の重量を用いて、この２００ｎｇのプラスミドＤＮＡが、１個の金粒子表面に担持される約０．２３個のプラスミドに相当することが明らかにされた。それに比べて、ミクロン大の金表面に担持される６００ｎｇのプラスミドは、各粒子表面に担持される約２１００個のプラスミドに相当する。したがって、プラスミドＤＮＡは、表面積がより大きいために、ＨＴＣ  ６００−Ａｕ表面により均一に広がり、かつそれらは、所望の位置に効率的に送達されることが明白である。
【００２２】
したがって、本発明は、鋭利な炭素質シート表面に支持された金ナノ粒子を含む合成材料を開示する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、任意で金属、金属イオンまたは酸化金属ナノ粒子の支持担体組成物を提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明の金属ナノ粒子の支持担体組成物は、限定するものではないが、ＤＮＡ送達、金属イオン除去、燃料電池、抗菌剤および触媒反応のための使用などの多くの分野で用途を見出す。
【００２５】
さらに別の実施形態では、支持体は、炭素質物質、窒素性物質、硫黄物質、リン物質、細胞物質、生物などから選択される。
【００２６】
別の実施形態では、微生物は、好ましくは、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＡＧ  ２５９  ＡＴＣＣ  １７５８８、シワネラ・アルゲ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｌｇａｅ）、プレクトネマ・ボリアヌム（Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｂｏｒｙａｎｕｍ）ＵＴＥＸ４８５、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ロドバクター・カプスラーツス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、コルネバクテリウム属種（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  sｐ．）ＳＨ０９、バシルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ラクトバシルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、バーティシリウム属種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（ＡＡＴ−ＴＳ−４）（ＡＴＣＣ．１６３１２）、トリコデルマ属種（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｓｐ．）、Ｖ．ルテオアルブム（Ｖ．ｌｕｔｅｏａｌｂｕｍ）、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）およびアスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）から選択される。
【００２７】
さらに別の実施形態では、本発明は、好ましくは炭素質支持体表面での、ＤＮＡ担持支持金ナノ粒子の調製のためのプロセスを提供するものであり、ここで、その工程は、
ａ）真菌胞子を、マルトース−グルコース−酵母抽出物とペプトンブロスとを含有する培地に植菌することと、
ｂ）胞子を発芽させ、菌糸を３７℃で３日間生成させて、回収されたバイオマスを得、次いで、バイオマスを滅菌条件下にて、オートクレーブしたＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄することと、
ｃ）工程（ｂ）で得られるバイオマスをＨＡｕＣｌ４溶液に再懸濁し、次いで、３７℃で２日間培養（incubation）し、次いで、ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で洗浄することと、
ｄ）工程（ｃ）で得られるバイオマスを、窒素流下にて、管状炉中６００℃で６時間熱処理して、生成物のＨＴＣ  ６００−Ａｕを得ることと、
ｅ）工程（ｄ）で得られるようなＨＴＣ−６００  Ａｕをエタノールで洗浄し、ＸＨＯ緩衝液（Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、ＮａＣベースの緩衝液）に懸濁されたＤＮＡと混合することと、
ｆ）工程（ｅ）で得られるような混合物をスペルミジンおよびＰＥＧで順次平衡化し、次いで、２．５ＭのＣａＣｌ２中で超音波処理することと、
ｇ）工程（ｆ）で得られるような超音波処理した混合物を１２０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを無水アルコールを用いて２回洗浄し、最終的に所要の容量のエタノールに再懸濁して、炭素質支持体表面に支持されたＤＮＡ担持金ナノ粒子を得ることと
を含む。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、胞子は、好ましくは、ＡＴＣＣ  １８５００に対応するアスペルギルス・オクラセウスＩＴＣＣ  ６４３６のものである。ＨＡｕＣｌ４溶液の濃度は、好ましくは１０−３モルである。
【００２９】
また別の実施形態では、湿重量ベースで６０ｇの洗浄されたバイオマスを２００ｍＬの１０−３ＭのＨＡｕＣｌ４に懸濁した。生成物を熱処理して、４００ｍｇのＨＴＣ−６００  Ａｕを得た。
【００３０】
さらに別の実施形態では、本発明の担体組成物は、実施例１で例示するように、ＡＴＣＣ  １８５００に対応する真菌アスペルギルス・オクラセウスＩＴＣＣ  ６４３６によって生体内原位置（in situ）で合成された細胞内金ナノ粒子の不活性加熱によって調製される。このマトリックスは、金ナノ粒子を支持し、ＤＮＡが結合して担体に最小密度を提供し、また植物システムの細胞壁を穿孔するために遺伝子銃で閾値速度を得るためのプラットフォームを与える。
【００３１】
本発明のまた別の実施形態では、打ち込み１回につき１〜１０ｍｇの担体組成物と少なくとも２ｎｇのＤＮＡの組合せにより、様々な種での様々なレベルの形質転換が示される。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明の担体組成物を遺伝子改変細胞について調べるために、ナス科、イネ科およびマメ科の植物に対して研究を実施した。しかしながら、本発明のプロセスの遺伝子改変細胞は、限定するものではないが、植物種、細菌、真菌、酵母および動物細胞から選択される。
【００３３】
さらなる実施形態では、それぞれ、ＨＴＣ  ６００−Ａｕおよびマイクロ金について、タバコから得られた３つの複製の平均の再生効率は４１．７３および３８．９３％であり、形質転換効果は１４．８０および１２．４０％であった。イネの場合、それぞれ、ＨＴＣ  ６００−Ａｕおよびマイクロ金について、再生効率は２６．４２および２３．２５％であり、形質転換効果は９．３３および８．４２％であった。レウカエナの場合、必要とされる再生時間はより長い（６〜７カ月）ので、推定トランスジェニック植物はまだ選択の過程にあり、したがって、再生および形質転換効率は算出されなかった。
【００３４】
別の実施形態では、炭素マトリックスが担体の９５％を形成するので、１回の形質転換で使用される金およびＤＮＡの量は、本発明によって低下する。さらに、ＳＥＭ研究で証明されたように、モデル植物のタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｂａｃｃｕｍ）、単子葉植物のイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）および双子葉植物樹種のギンゴウカン（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）における、調製された材料を用いて観察されたより高い一過性のまたは安定なＧＵＳ発現および形質転換効率は、標準的な１．０μｍの非生物担体と比較して、このより小さくかつ鋭利な先端の担体によって生じたより少ない損傷が原因であった。ＨＴＣ  ６００−Ａｕ積載量に対するＧＵＳフォーカスの比率がより高いことによって、遺伝子銃アプローチにおける重大な懸念であるキメラ率を低下させる可能性がもたらされる。
【００３５】
また別の実施形態では、金粒子はナノ規模であり、より多くの遺伝子カーゴを処理するためのより大きい金表面積を提供する。また、鋭利な先端を有するグラファイト様炭素は、硬い植物細胞壁および核膜を穿孔し、遺伝子をクロマチン糸に位置させることができる。ＳＥＭ画像により、遺伝子銃を用いた形質転換の後に、創傷が極めて迅速に治癒したこと（これは、効率的な形質転換に必要とされる）が示されている。
【実施例１】
【００３６】
好ましい実施形態を含む以下の実施例は、本発明の実施を例証するのに役立ち、示された詳細は、一例であり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な考察を目的とするものであって、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではないことが理解される。
【００３７】
実施例１
一般的な反応において、単離された真菌胞子を、２００ｍＬのマルトース−グルコース−酵母抽出物およびペプトンブロスを含有する５００ｍＬのエルレンマイヤーフラスコに植菌した。ＡＴＣＣ  １８５００に対応するアスペルギルス・オクラセウスＩＴＣＣ  ６４３６の胞子をシェーカー（２００ｒｐｍ）にて３７℃で３日間発芽させ、菌糸を生成させておいた。この胞子は、湿重量ベースで６０ｇのバイオマスを生成させた。これを回収し、滅菌条件下にて、オートクレーブしたＭｉｌｌｉＱ（登録商標）水で３回洗浄した（１０００ｒｐｍ、１５分間）。次に、バイオマスを２００ｍＬの１０−３ＭのＨＡｕＣｌ４に再懸濁し、次いで、シェーカー（２００ｒｐｍ）にて３７℃で２日間培養（incubation）した。生成物のバイオマスをＭｉｌｌｉＱ（登録商標）で洗浄し、窒素流下にて管状炉中で熱処理（６００℃、６時間）した。これによって４００ｍｇの生成物が得られた。この生成物を微粉砕して、特徴付けた。このサンプル中の金濃度をＡＡＳを用いて分析し、約５ｗｔ％であることが分かった。このサンプルをＨＴＣ  ６００−Ａｕと命名した。バイオマス中で真紅色の発色を生じさせる真菌バイオマスと金イオンとの培養（incubation）により、細胞マトリックス内部での金イオンのＡｕナノ粒子への還元が示された（図１ＡおよびＢ）。
【００３８】
実施例２
室温で乾燥させて、粉粒化したバイオマス（図２Ａ、曲線１）；および不活性雰囲気下にて６００℃で焼成したバイオマス（図２Ａ、曲線２）のＸＲＤシグナルを記録した。調製されたままの状態のサンプル（曲線１）のＸＲＤパターンは、面心立方金に特徴的な、約２．３６、２．０４、１．４５および１．２３Åｄ値におけるいくつかのブラッグ反射を示した。これにより、これらのナノ粒子が金イオンとバイオマスとの処理のみによって形成されることが明確に示された。ＨＴＣ  ６００−Ａｕ（曲線２）におけるピークは、加熱なしで調製されたサンプルにおけるピークよりも鋭く、加熱による結晶化度の改善を示した。
【００３９】
実施例３
炭素支持ＨＴＣ  ６００−ＡｕのＴＥＭサンプルは、非晶質炭素をコーティングした銅グリッドをその水分散液の滴で覆い、溶媒を風乾させておくことによって調製した。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像は、３００ｋＶの加速電圧で操作されるＴｅｃｈｎａｉ  Ｇ２  Ｆ−３０モデルと２００ｋＶで操作されるＪＥＭ  ２１００装置とを用いて記録した。図３ＡのＳＥＭ画像は、多くのフラットシート様材料でできた鋭利な粒子を示す。この図は、そのような材料が有する可能性のある鋭利な頂端／先端を強調するために選択した。より低倍率のＴＥＭ画像（図３Ｂ）は、鋭利な先端を有する炭素マトリックスに包埋された５０ｎｍのＡｕ粒子の存在を示した。図３Ｃでは、少数の５０ｎｍ粒子とは別に、炭素シート全体に広がった多数の５ｎｍ粒子が観察される。図３Ｄの炭素をさらによく見ると、波形の先端を示しており、１つのシートが突き出して、鋭利な先端を形成しているシート配列の束を示している。単離された粒子のうちの１つのＨＲＴＥＭ画像（図３Ｄの差し込み図）は、金（１１１）面の格子スペーシング２．３６Åと一致する２．４Åの「ｄ」スペーシングを示している。
【００４０】
実施例４
６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザー励起を用いて、後方散乱配置でラマンスペクトルを測定した。散乱光を電荷結合アレイ検出器とホログラフィックノッチフィルターとを備えたＪｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ  ＨＲ８００質量分析計で分析した。レーザーによるサンプルの損傷を回避するために、低いレーザー出力（２Ｗ／ｃｍ２）で実験を実施した。ＨＴＣ  ６００−Ａｕのラマンシグナルは図２Ｃにプロットされている。曲線は、不規則炭素に特有の特徴を示し、それぞれ、ＧおよびＤピークとして示されている約１５９０ｃｍ−１および−１３５０ｃｍ−１でのピークを有する。データをデコンボリュートして、２つのガウスピークに当てはめた。１３６５および１５９０ｃｍ−１でのピークの強度から、グラファイト面内ドメインサイズ（Ｌａ）値は、金ナノ粒子を含まない純粋な炭素サンプルでの０．９０ｎｍと比較して、ＨＴＣ  ６００−Ａｕでは１．３５ｎｍであると決定された。ＨＴＣ  ６００−Ａｕでの１．３５ｎｍという面内サイズは、非晶質炭素マトリックスの存在をさらに示唆した。
【００４１】
実施例５
金中空陰極ランプを備えたＣｈｅｍｉｔｏの原子吸光分析計（ＡＡＳ）２０１を用いて金濃度を測定した。Ｌｅｉｃａ  Ｓｔｅｒｅｏｓｃａｎ  ４４０モデルにより、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を記録した。
【００４２】
実施例６
タバコ（タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｃｕｍ）変種アナンド（Ａｎａｎｄ）１１９）植物を、植物成長調節因子の非存在下、基本ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（ＭＳ培地１９６２）にて試験管内（in vitro）で成長させた。２カ月齢の植物由来の新鮮な葉を外植片として用いて、約５ｍｍ２の小片に切断し、２％のショ糖、０．８％の６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）およびα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）が補充された、１．４％寒天を含むＭＳ基本培地（ｐＨ５．８）中に接種し、成長インキュベーター中、暗所下、２５±２℃でカルスを誘導した。９０ｍｍ直径のペトリプレートの中央に配置した後、２５インチのＨｇ真空を含む９００ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）仕様の破裂板を用いて、葉外植片に由来する選択された胚形成カルスにＨＴＣ−６００  Ａｕを４時間間隔で２回打ち込んだ。暗所下で２日間培養（incubation）した後、打ち込まれたカルスを、基本ＭＳ培地、Ｂ５ビタミン類、１ｍｇ／ＬのＢＡＰ、０．１ｍｇ／ＬのＮＡＡ、３０ｇ／Ｌのショ糖、４ｇ／Ｌのｐｈｙｔａｇｅｌを含有する分化培地に１週間移し、その後、植物選択マーカーのカナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ濃度）を含有する同じ培地に移した。３回の選択を切り抜けて生き残った推定トランスジェニック植物を解析した。
【００４３】
手作業で脱穀したコメ（現地の優良インディカ品種ＩＲ６４）の種籾の表面を７０％エタノールで３分間、次いで、１．５％（ｖ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウムで１０〜１５分間滅菌し、滅菌蒸留水で５〜７回洗浄した。次に、滅菌した種籾を２．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地（カルス誘導培地）上に置き、暗所にて２５±２℃で３週間培養した。５０個の脆い胚形成カルスを計数し、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅバイオリスティック粒子送達システムを用いて１回目の打ち込みを行なう４時間前に、オスモティカ（ｏｓｍｏｔｉｃａ）を含有するカルス誘導培地（３６．４ｇ／Ｌのマンニトールおよび３６．４ｇ／Ｌのソルビトールが補充されたカルス誘導培地）が入った９０ｍｍ直径のペトリプレートの中央に置いた。先に実施したように、破裂板を用いて外植片に２回打ち込んだ。２回目の打ち込みの４８時間後、５０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含有するＭＳカルス誘導培地上にカルスを直接移し、２５±２℃で１５〜１８日間培養した。活発に増殖するカルスを新鮮な選択培地上に１５〜１８日間隔で３回継代培養した。ハイグロマイシンＢで３回選択した後の増殖する胚形成カルスをＭＳ再生培地（それぞれ、３ｍｇ／Ｌおよび０．５ｍｇ／ＬでＢＡＰおよびＮＡＡ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）が補充されたＭＳ培地）上に移した。これらのカルスを、シュートが定着するまで、明所（１１０〜１３０ｍＭ／ｍ２／ｓ）にて１６時間および暗所にて８時間、２５℃で培養した。出現したシュートを、３０ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢを含有するＭＳ発根培地（半分の濃度のＭＳ基本塩類、ＭＳビタミン類および１５ｇ／Ｌのショ糖）に移した。
【００４４】
実施例７
多年生のマメ科の樹種であるギンゴウカン（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）（鉛樹、ギンネム（ｗｈｉｔｅ  ｐｏｐｉｎａｃ）、ギンネム（ｓｕｂａｂｕｌ））の、鞘から取り出された種子の表面を１．５％（ｖ／ｖ）の次亜塩素酸ナトリウム溶液で１０〜１５分間滅菌し、次いで、滅菌水で４回洗浄した。
【００４５】
未成熟胚を１本の鋭利な滅菌ピンセットを用いて無菌的に単離し、その生長点を上に向けて、再生培地（１／２のＭＳ＋Ｔｈｉａ  Ｄｉａ  Ｚｕｒｏｎ）（０．５ｍｇ／Ｌ）を含有する９０ｍｍ直径のペトリプレートの中央に置いた。これらの胚に先に実施したように打ち込み、暗所に２日間保持した。１週間選択なしで上記の再生培地上で胚を成長させた後、カナマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有する同じ再生培地にて１５日間隔で３回の選択を胚に施した。カナマイシン（２００ｍｇ／Ｌ）での３回の選択を切り抜けて生き残った植物を、サイトカイニンの２ｉｐ（２−イソペンテニルアデニン）を０．５ｍｇ／Ｌで含む１／２のＭＳに移して、形質転換シュートの伸長を増強した。
【００４６】
上記の全ての実験において、植物形質転換は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて確認した。損傷および透過効率を可視化するために、打ち込まれた組織をＳＥＭで調べた。図４から、植物形質転換で用いられる６００ｎｇの標準的な非生物ミクロン金担体の結果と一致させるのに、わずか２００ｎｇのプラスミドで十分であることが明らかである。また、ＨＴＣ  ６００−Ａｕの１ユニット当たりのＤＮＡ濃度を増大させると、さらにより高いレベルのＧＵＳ発現フォーカスを得ることができることも分かった。これを最適化して、他の植物形質転換系にうまく用いることができる。
【００４７】
したがって、細胞内生体ナノ粒子を単に熱処理して生成される鋭利な先端の支持Ａｕナノ粒子は、市販のマイクロメートル大の金粒子よりも優れた植物形質転換非生物担体であることが証明されたと推論することができる。これによって、ナノ粒子がマトリックスから分離されない限り、他の方法では用途のない細胞内で合成されたナノ粒子の独特の用途が明らかにされている。
【００４８】
本発明の利点
本発明が提供する合成物の利点は、以下の通りである：
・金粒子がナノ規模であるので、より大きい金表面積が得られ、したがって、より多くの遺伝子カーゴを処理することができる。
・金は高いＤＮＡ充填密度を支持することが知られているので、より良い形質転換効率と低いヌクレアーゼ分解とを提供する可能性がある。
・包埋された金も、合成物の密度を向上させるので、必要な閾値速度を獲得することができる。
・さらに、鋭利な先端を有するグラファイト様炭素は、硬い植物細胞壁および核膜を穿孔し、遺伝子を染色体部位に位置させることができる。ＳＥＭ画像により、形質転換の後に、細胞壁／核膜表面の創傷が極めて迅速に治癒することが示されている。これは、効率的な形質転換に必要とされる。
【図１】
0005896901.tif 000002
【図２】
0005896901.tif 000003
【図３】
0005896901.tif 000004
【図４】
0005896901.tif 000005
【図５】
0005896901.tif 000006
【図６】
0005896901.tif 000007