(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を決定することを特徴とする、薬剤性肺障害の発症のリスクを予測する方法。
【請求項２】
前記塩基がアデニンである場合に、薬剤性肺障害の発症のリスクが高いと判断する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤性肺障害の発症のリスクを予測するための、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子と比較して、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型の有無を検出する方法。
【請求項４】
一塩基多型が、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）におけるグアニンからアデニンへの置換である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（ａ）被験者から調製された核酸試料よりＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型がある塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｂ）（ａ）で単離したＤＮＡ試料を、選択的結合条件下で、一塩基多型がある塩基部位を含むＡＢＣＢ１遺伝子断片をヌクレオチドプローブとして固定された基板と接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡ試料と該基板上に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、請求項３又は４に記載の一塩基多型の有無を検出する方法。
（ａ）被検者から調製された核酸試料よりＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を含むＤＮＡを単離する工程
（ｂ）単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程
（ｃ）（ｂ）において決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
【請求項７】
選択的結合条件下で、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型に対して特異的に結合する、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型を検出することにより薬剤性肺障害の発症リスクを予測するためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項８】
ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型を含む核酸配列を増幅する、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型を検出することにより薬剤性肺障害の発症リスクを予測するためのオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
請求項７のオリゴヌクレオチドプローブを含む、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子と比較して、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）の一塩基多型の有無を検出することにより薬剤性肺障害の発症リスクを予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、致死率及び重症率の高い薬剤性肺障害（特には間質性肺炎）の発症のリスクの予測、あるいは、治療方法の改善のための、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無を検出する方法、及び、該方法を実施するキットに関する。さらに、該一塩基多型は、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274である配列番号１における４１６９番目の遺伝子がグアニンからアデニンへの置換である前記の一塩基多型の有無を検出する方法、及び該方法を実施するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））やエルロチニブ（タルセバ（登録商標））といった上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor: EGFR-TKI）は非小細胞肺癌の治療薬であり、感受性因子である活性型ＥＧＦＲ遺伝子変異（非特許文献１、２）の保有頻度が比較的高い日本人の非小細胞肺癌においては、特にその役割が大きいと認識され、適応となる病期・局面も拡大しつつある（非特許文献３−５）。【０００３】
一方、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤投与の際に最も注意が必要となるのが有害事象としての間質性肺炎（interstitial lung disease: ILD）であり（非特許文献６−８）、その発症率は他人種ではほとんど問題にならなかったものの日本人ではやや高く、特異的な急性の発症様式と致死率の高さと併せて一時期社会問題にまでなった。
日本における肺がん患者を対象とした抗がん剤によるＩＬＤのコホート研究では、一般抗がん剤によるＩＬＤの発症頻度が２．１％であったのに対しゲフィチニブによるＩＬＤの発症頻度は４．０％と多く、死亡率はそれぞれ２７．９％、３１．６％と予後不良であった。臨床上の危険因子として、間質性肺炎・肺線維症の既往、喫煙歴、男性、高齢、心疾患の合併などが挙げられ（非特許文献９−１１）、医療現場ではこうした危険因子を多く持つ患者への投与は避けられるが、危険因子を全くもたない患者でもＩＬＤが発症することは間々あり、臨床所見のみをもってその発症を完全に回避することはできていなかった。
上記のことから、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療が考慮される患者において、そのＩＬＤ発症のリスク予測を可能にすることが切望されている。また、致死率の高いこの有害事象の治療方法を改善し、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤を含めた抗がん剤治療の安全性向上が求められている。【０００４】
一方、ＡＢＣＧ２遺伝子の一塩基多型によって、ゲフィチニブ投与によって起こる下痢症との因果関係が高いが、ＡＢＣＢ１遺伝子やＥＧＦＲ遺伝子の一塩基多型では関連性が低いことが示されている（非特許文献１２）。また、皮膚の炎症に関しては、いずれの遺伝子の一塩基多型も関連性が低いことが示されている。しかし、これらの一塩基多型は、薬剤性肺障害の発症の指標となるものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lynch TJ、Bell DW、Sordellaet R、et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med 350: 2129-2139、2004.
【非特許文献２】Paez JG、Janne PA、Lee JC、et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304: 1497-1500、2004.
【非特許文献３】Kim ES、Hirsh V、Mok T、et al. Gefitinib versus docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer (INTEREST): a randomised phase III trial. Lancet 372: 1809-1818、2008.
【非特許文献４】Shepherd FA、Rodrigues PJ、Ciuleanu T、et al. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer. N Engl J Med 353: 123-132、2005.
【非特許文献５】Mok TS、Wu YL、Thongprasert S、et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med 361: 947-957、2009.
【非特許文献６】Inoue A、Saijo Y、Maemondo M、et al. Severe acute interstitial pneumonia and gefitinib. Lancet 361: 137-139、2003
【非特許文献７】Okamoto I、Fujii K、Matsumoto M、et al. Diffuse alveolar damage after ZD1839 therapy in a patient with non-small cell lung cancer. Lung Cancer 40: 339-342、2003
【非特許文献８】Ieki R、Saitoh E、Shibuya M. Acute lung injury as a possible adverse drug reaction related to gefitinib. Eur Respir J 22、179-181
【非特許文献９】Kudoh S、Kato H、Nishiwaki Y、et al. Interstitial lung disease in Japanese patients with lung cancer: a cohort and nested case-control study. Am J Respir Crit Care Med 177:1348-1357、2008
【非特許文献１０】Ando M、Okamoto I、Yamamoto N、et al. Predictive factors for interstitial lung disease、antitumor response、and survival in non-small-cell lung cancer patients treated with gefitinib. J Clin Oncol 24: 2549-2556、2006
【非特許文献１１】Takano T、Ohe Y、Kusumoto M、Tateishi U、et al. Risk factors for interstitial lung disease and predictive factors for tumor response in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with gefitinib. Lung Cancer 45: 93-104、2004
【非特許文献１２】Cusatis G、Gregorc V、Li J、Spreafico A、et al. Pharmacogenetics of ABCG2 and adverse reactions to gefitinib. J Natl Cancer Inst 98(23):1739-1742、2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、前記リスク予測や治療方法の改善には、薬剤性肺障害の発症に係る遺伝子の多型を明らかにし、該一塩基多型の機能解析による薬剤性肺障害の発症機序を解明することが必要だと考えた。
即ち、本発明は、間質性肺炎（ILD）を含む薬剤性肺障害の発症に係る遺伝子の多型を明らかにし、該一塩基多型の機能解析による薬剤性肺障害の発症機序を解明することによって、薬剤性肺障害の発症のリスクの予測、あるいは、治療方法の改善のための、遺伝子の一塩基多型の有無を検出する方法を確立することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究し、薬剤性肺障害の発症に係る遺伝子の一塩基多型を明らかにし、該一塩基多型の機能解析による薬剤性肺障害の発症機序の一端を明らかにした。
後の実施例に詳述するが、各個人が有する一塩基多型の有無によって、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤によって急性肺障害を発症するヒト（疾患群）と発症しないヒト（対照群）がいる。両者において異なる一塩基多型を明らかにしたところ、ＡＢＣＢ１（ATP-binding cassette transporter B1）遺伝子の一塩基多型rs28364274において、疾患群では、１２例中４例（３３％）がＡアレルを保有していたのに対し、対照群ではＡのアレルを持つ症例がいなかった。さらに、日本人以外のいくつかの人種において一塩基多型rs28364274のＡアレルは極めて稀であったことから、上記症例群４例にみられた一塩基多型rs28364274のＡアレルは極めて特異的であると考えられ、ＩＬＤの発症が日本人に多いという事実と矛盾しないことがわかった。
以上の知見に述べたように、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無が、薬剤性肺障害の発症にかかわることを見出し、本発明を完成させた。【０００８】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１１］を提供するものである。
［１］ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を決定することを特徴とする、薬剤性肺障害の発症のリスクを予測する方法。
［２］前記塩基がアデニンである場合に、薬剤性肺障害の発症のリスクが高いと判断する、［１］の方法。
［３］薬剤性肺障害の発症のリスクを予測するための、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子と比較して、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型の有無を検出する方法。
［４］一塩基多型が、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）におけるグアニンからアデニンへの置換である、［３］の方法。
［５］以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、［１］〜［４］のいずれかの方法。
（ａ）被験者から調製された核酸試料よりＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型がある塩基部位を含むＤＮＡを単離する工程
（ｂ）（ａ）で単離したＤＮＡ試料を、選択的結合条件下で、一塩基多型がある塩基部位を含むＡＢＣＢ１遺伝子断片をヌクレオチドプローブとして固定された基板と接触させる工程
（ｃ）該ＤＮＡ試料と該基板上に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出する工程
［６］以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を含む、［３］又は［４］の一塩基多型の有無を検出する方法。
（ａ）被検者から調製された核酸試料よりＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を含むＤＮＡを単離する工程
（ｂ）単離したＤＮＡ試料の塩基配列を決定する工程
（ｃ）（ｂ）において決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する工程
［７］ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を、抗体を用いて該遺伝子の一塩基多型の結果生じるアミノ酸配列の変異として検出する、［３］又は［４］の一塩基多型の有無を検出する方法。
［８］ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基を、抗体を用いてこの塩基における一塩基多型の結果生じるアミノ酸配列の変異として検出する、［１］又は［２］の方法。
［９］選択的結合条件下で、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型に対して特異的に結合する、薬剤性肺障害の発症リスクの予測用オリゴヌクレオチドプローブ。
［１０］ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を含む核酸配列を増幅する、薬剤性肺障害の発症リスクの予測用オリゴヌクレオチドプライマー。
［１１］請求項９のオリゴヌクレオチドプローブを含む、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子と比較して、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型の有無を検出する、薬剤性肺障害の発症リスクの予測用キット。【０００９】
「ＡＢＣＢ１（ATP-binding cassette transporter B1）遺伝子」として、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子の塩基配列（ｍＲＮＡ）が、ＮＣＢＩ番号NM_000927.3（配列表の配列番号１で表される塩基配列。塩基総数＝４８７２個）として登録されている。なお、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳ（開始コドンから終始コドンまでのコード領域）は、配列番号１における４１９〜４２６１番である。
前記「ＡＢＣＢ１遺伝子」でコードされる「ＡＢＣＢ１タンパク質」として、野生型ＡＢＣＢ１タンパク質のアミノ酸配列が、ＮＣＢＩ番号NP_000918.2（配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列。アミノ酸総数＝１２８０個）として登録されている。
本発明で利用する「ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型」は、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）における一塩基多型であり、野生型におけるグアニン（Ｇ）が、アデニン（Ａ）に置換されたものである。この一塩基置換は、ＮＣＢＩ番号rs28364274（配列表の配列番号３で表される塩基配列。配列番号３における２５６番目の塩基Ｒ（すなわち、Ｇ又はＡ）が一塩基多型を示す塩基である）として登録されている。【００１０】
本明細書において「遺伝子型」という用語は、遺伝子の特定の対立形質の形態をいい、これは、特定の部位の核酸配列に存在する特定のヌクレオチドによって定義することができる。【００１１】
「一塩基多型」、「アレル」、「ＳＮＰ」または「対立遺伝子」という用語は、集団における遺伝子の１つの特定の型、遺伝子の配列内の少なくとも１つの、およびより頻繁には複数の変異部位の配列において同じ遺伝子のその他の型とは異なる特定の型をいう。遺伝子の異なる対立遺伝子間で異なるこれらの変異部位の配列は、「遺伝子配列多型」または「多型」または「変異」と呼ばれる。相当する当技術分野において公知のその他の用語は、突然変異および多型を含むが、突然変異は、有害な表現型と関連する対立遺伝子をいうために使用されることが多い。
また、同じ対立遺伝子を持つ場合はホモ、異なる対立遺伝子を持つ場合はヘテロという。
例えば、対立遺伝子を（Ａ：アデニン，Ｇ：グアニン）とすると、遺伝子型は（ＡＡ）、（ＡＧ）、（ＧＧ）の３種類が存在する。【００１２】
「プローブ」という用語は、構造が異なる標的分子間を検出可能に区別することができる分子をいう。検出は、使用するプローブの型および標的分子の型に応じて、種々の異なる方法で達成することができる。したがって、たとえば、検出は、標的分子の活性レベルの識別に基づいてもよいが、好ましくは特異的結合の検出に基づく。このような特異的結合の例は、抗体結合および核酸プローブ・ハイブリダイゼーションを含む。したがって、たとえば、プローブは、酵素基質、抗体、および抗体断片、並びに好ましくは、核酸ハイブリダイゼーションプローブを含むことができる。【００１３】
本明細書に使用される「プライマー」という用語は、ポリヌクレオチドに対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に配置されたときに、相補鎖に沿ってポリヌクレオチド合成の開始位置として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。このような条件は、４つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシド類似体と、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素などの重合のための１つまたは複数の薬剤とが、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を及ぼす置換分を含む。）中に、かつ適切な温度にて存在することを含む。プライマーは、ポリメラーゼのための薬剤の存在下においても伸張産物の合成をプライムするほど十分に長くなければならない。典型的なプライマーは、少なくとも約５ヌクレオチドの長さの、標的配列に対して実質的に相補的な配列を含むが、いくらか長いプライマーが好ましい。通常、プライマーは、約１５〜２６ヌクレオチドを含むが、より長いプライマーを使用してもよい。【００１４】
プライマーは、増幅される特異的配列である標的配列に対して実質的に相補的な配列であって、プライマーがアニールすることができる配列を常に含む。プライマーは、任意に、プロモーター配列を含んでいてもよい。「プロモーター配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される核酸配列の一本鎖を定義し、これは、認識した配列と結合して転写プロセスを開始することにより、ＲＮＡ転写物を産生する。原則として、開始配列を認識することができる、公知の、および利用できるポリメラーゼのために、任意のプロモーター配列を使用してもよい。公知の、および有用なプロモーターは、バクテリオファージＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６などの一定のバクテリオファージ・ポリメラーゼによって認識されるものである。【００１５】
「マイクロアレイ」は、好ましくは別々の領域の直線状または二次元のアレイであり、それぞれ固体基板の表面上に形成された定義された領域を有する。マイクロアレイ上の別々の領域の密度は、単一の固相基板の表面上、好ましくは少なくとも５０／ｃｍ２、より好ましくは、少なくとも約１００／ｃｍ２、さらにより好ましくは少なくとも約５００／ｃｍ２、およびなおより好ましくは少なくとも１，０００／ｃｍ２で検出される標的ポリヌクレオチドの総数によって決定される。本明細書に使用される、ＤＮＡマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを増幅し、またはクローン化するために使用される、チップまたはその他の表面上に配置されたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。アレイにおけるプライマーのそれぞれの特定の群の位置は公知であるので、標的ポリヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイにおける特定の位置に対するこれらの結合に基づいて決定することができる。【００１６】
「標識」という用語は、アッセイ試料中に標的ポリヌクレオチドが存在することを示す検出可能なシグナルを生じることができる組成物をいう。適切な標識は、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、生物発光部分等を含む。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。【００１７】
「基板」という用語は、ビーズ、粒子、計量棒、繊維、フィルター、膜、およびガラススライドなどのシランまたはケイ酸支持体などの従来の支持体をいう。【００１８】
「増幅する」という用語は、広義には、たとえばさらなる標的分子、または標的様分子もしくは標的分子に対して相補的な分子（これらの分子は、試料中に標的分子が存在することによって作製される）を含んでいてもよい増幅産物を作製することを意味するために使用される。標的が核酸である状況では、増幅産物は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素で酵素的に作製することができる。【００１９】
「抗体」という用語は、抗原を結合することができる免疫グロブリンタンパク質であることを意味する。本明細書に使用される抗体は、関心対象の抗原または抗原性断片に結合することができる抗体断片、たとえばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂを含むことが意味される。【００２０】
核酸分子は、当技術分野において周知の任意の多くの手順を使用して、特定の生体試料から単離することができ、選択される特定の単離手順は、特定の生体試料のために適している。たとえば、凍結融解法およびアルカリ法は、固体物質から核酸分子を得るために有用であり得るし；熱およびアルカリ法は、尿から核酸分子を得るために有用であり得るし；およびプロテイナーゼＫ抽出は、血液から核酸を得るために使用することができる（Rolff, A et al. PCR： Clinical Diagnostics and Research, Springer （1994））。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、致死率及び重症率の高い薬剤性肺障害（特には間質性肺炎）の発症のリスクの予測、あるいは、治療方法の改善のための、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無を検出する方法、及び、該方法を実施するキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例１で使用した７６８個のＳＮＰについて、それらの属する各遺伝子群の割合を示すグラフである。
【図２】一塩基多型rs28364274と野生型ＡＢＣＢ１遺伝子（NM_000927.3）の各塩基配列を比較した結果を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子と比較して、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無を検出する方法を提供する。さらに、該一塩基多型が、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）におけるグアニンからアデニンへの置換である前記の一塩基多型の有無を検出する方法を提供する。
【００２４】
加えて、本発明は、癌を発症するリスクがある患者、あるいは、癌に冒されているヒト患者における上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ターゲティング治療において、薬剤性肺障害の発症の可能性を決定するための新規方法を提供する。本方法は、該患者がＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無を含むかどうかを決定することを含む。このような相違の存在は、薬剤性肺障害の発症のリスクが高いことを示す。多型が存在する場合、チロシンキナーゼ阻害剤が患者に投与されないことがある。
【００２５】
上記のように、同定された患者に投与されるチロシンキナーゼ阻害剤は、たとえば、ＥＫＢ−５６９、ＨＫＩ−２７２および／またはＨＫＩ−３５７（Ｗｙｅｔｈ）などのアニリノキナゾリンまたは不可逆的チロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。好ましくは、アニリノキナゾリンは、合成アニリノキナゾリンであり、最も好ましくは、合成アニリノキナゾリンは、ゲフィチニブおよびエルロチニブである。
【００２６】
本発明で対象とする肺障害は、肺の間質（肺胞と肺胞の間の隔壁）を主病変とした肺の炎症性反応から引き起こされる疾患を言う。このような疾患の例としては、間質性肺炎（ILD）が挙げられる。好ましくは、薬剤を投与されたことによって引き起こされる薬剤性肺障害が対象となる。例えば、ゲフィチニブやエルロチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤による薬剤性肺障害は、特徴的な発症様式、画像所見、重篤性など共通する部分が多く、特に重篤性が高いため好ましい。
【００２７】
また、特表２００７−５３１５２５号公報に記載されているように、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ターゲティング治療におけるチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）療法は、肺癌、卵巣癌、乳癌、脳癌、結腸癌、および前立腺癌などの上皮細胞癌で冒されている大多数の患者では有効ではない。そして、ＥＧＦＲのキナーゼドメインに体細胞突然変異が存在すると、ゲフィチニブ、エルロチニブなどのＴＫＩ療法に対するＥＧＦＲの感受性を実質的に増大するため、この突然変異を有する患者は、現在のＴＫＩ療法、たとえばゲフィチニブに応答する可能性が高い。よって、野生型ｅｒｂＢ１遺伝子と比較して、該患者のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの遺伝子変異の有無を検出することにより、少なくとも１つの相違の存在は、ＥＧＦＲターゲティング治療が有効である可能性が高いことが開示されている。
このことから、本発明の該患者がＡＢＣＢ１遺伝子の遺伝子変異の有無を含むかどうかを検出することに加え、野生型ｅｒｂＢ１遺伝子と比較して、該患者のｅｒｂＢ１遺伝子のキナーゼドメインにおける少なくとも１つの遺伝子変異の有無を検出することにより、該患者へのチロシンキナーゼ阻害剤の投与を決定するための指標とすることができる。
【００２８】
本発明において、ＡＢＣＢ１遺伝子は、癌であるか、または癌を発症するリスクがあるヒト由来の生体試料から得られる。好ましくは、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療が考慮される患者由来の生体試料から得られる。
【００２９】
前記生体試料としては、体細胞が含まれていればよく、正常細胞でも腫瘍細胞でも使用することができる。個体から単離された組織または液体の試料を使用することができ、たとえば血液、腫瘍生検、髄液、胸腔内液、乳頭吸引液、リンパ液体、皮膚の外側の切片、口腔内粘膜組織、呼吸器、腸管、および生殖器管、唾液、毛髪、爪、乳、細胞（血液細胞を含むが、これらに限定されるわけではない）、腫瘍、器官、さらにはインビトロ細胞培養成分の試料を含む（しかし、これらに限定されるわけではない）。試料は、パラフィン包埋された、または凍結された組織であってもよい。
好ましくは、非侵襲性の全血由来の抹消血単核球や侵襲性の腫瘍生検による組織が簡便に使用できるので良い。
【００３０】
本発明において、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274における一塩基多型の有無の検出は、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子（NM_000927.3）の４１６９番目のＧ（グアニン）がＡ（アデニン）に置換されていることを指標とする。一塩基多型rs28364274と野生型ＡＢＣＢ１遺伝子（NM_000927.3）の各塩基配列を比較した結果を図２に示す。図２において、配列「ｑｕｅｒｙ」（１〜１２１番）は、一塩基多型rs28364274の塩基配列（配列番号３）の部分配列（配列番号４）であり、配列「ｓｂｊｃｔ」（４１０９〜４２２９番）は、野生型ＡＢＣＢ１遺伝子（NM_000927.3；配列番号１）の部分配列である。また、黒背面白文字は一塩基多型のある箇所である。この置換は、野生型のＡＢＣＢ１タンパク質（NP_000918.2）が１２５１番目のＶ（バリン）がＩ（イソロイシン）と置換されたアミノ酸置換を生じる。
よって、該一塩基多型の有無の検出は、対立遺伝子の核酸の変異を検出すること、あるいは、対立遺伝子のアミノ酸の変異を検出することのいずれか若しくは両方で達成することができる。
【００３１】
本発明のＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型の有無の検出には、多数の公知の解析手順を使用することができる。一般に、一塩基多型の有無の検出は、変異識別技術、所望により増幅反応および所望によりシグナル発生系を必要とする。表１は、変異検出技術を列挙しており、中にはＰＣＲに基づくものもある。これらは、表２に挙げたシグナル発生系と組合わせて使用することもできる。また、表３に、その他の増幅技術を列挙する。一塩基多型の多くの現行検出方法については、Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114-1120 (1997)および標準テキストブック、例えばLaboratory Protocols for Mutation Detection、U.Landegren編、オックスフォード・ユニバーシティー・プレス（１９９６）および PCR、Newton & Grahamによる第２版、ＢＩＯＳ サイエンティフィック・パブリッシャーズ・リミテッド（１９９７）により概説されている。
また、表４に挙げたタンパク質変異検出方法も使用することができる。
【００３２】
【表１】
0005843764.tif 000002
【００３３】
【表２】
0005843764.tif 000003
【００３４】
【表３】
0005843764.tif 000004
【００３５】
【表４】
0005843764.tif 000005
【００３６】
好ましい変異検出技術には、オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）法、ＤＮＡ配列決定法、ＡＲＭＳ（登録商標）、ＡＬＥＸ（登録商標）、ＣＯＰＳ、Ｔａｑｍａｎ、ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法、分子ビーコン、ＲＦＬＰ、および制限部位に基づくＰＣＲおよびＦＲＥＴ技術がある。
【００３７】
オリゴヌクレオチドアレイ（ＤＮＡチップ）法、ＤＮＡ配列決定法、Ｔａｑｍａｎ、ＰＮＡ−ＬＮＡ  ＰＣＲ  ｃｌａｍｐ法が特に好ましい方法である。
【００３８】
以下に、いくつかの検査方法について例示する。
上記検査方法において、ＡＢＣＢ１遺伝子に生じた一塩基多型の検出は、例えば、被検者のＡＢＣＢ１遺伝子の塩基配列を直接決定することにより行うことができる。この方法においてはまず、被検者から得られた生体試料より、ＤＮＡ試料を調製する。これらの試料は、組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。
【００３９】
本方法においては、次いで、ＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型を含むＤＮＡを単離する。該ＤＮＡの単離は、ＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型を含む核酸配列を増幅可能な核酸配列にハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことも可能である。本方法においては、次いで、単離したＤＮＡの塩基配列を決定する。単離したＤＮＡの塩基配列の決定は、当業者に公知の方法で行うことができる。
【００４０】
本方法においては、次いで、決定したＤＮＡの塩基配列を、対照と比較する。本方法における対照とは、正常な（野生型）ＡＢＣＢ１遺伝子の配列を言う。一般には、ＧｅｎＢａｎｋに野生型として登録されているＡＢＣＢ１遺伝子の配列（NM_000927.3）と比較してもよい。
【００４１】
本発明の検査方法は、上記の如く直接被検者由来のＤＮＡの塩基配列を決定する方法以外に、多型の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。例えば、以下のような方法を挙げることができる。まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、調製したＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを、対照と比較する。また、他の一つの態様においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたＤＮＡ断片の大きさを対照と比較する。
【００４２】
このような方法としては、例えば、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism／RFLP）を利用した方法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、制限酵素の認識部位に変異が存在する場合、あるいは制限酵素処理によって生じるＤＮＡ断片内に塩基挿入または欠失がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の大きさが対照と比較して変化する。この変異を含む部分をＰＣＲ法によって増幅し、それぞれの制限酵素で処理することによって、これらの変異を電気泳動後のバンドの移動度の差として検出することができる。あるいは、染色体ＤＮＡをこれらの制限酵素によって処理し、電気泳動した後、本発明のプローブＤＮＡを用いてサザンブロッティングを行うことにより、変異の有無を検出することができる。用いられる制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜選択することができる。この方法では、ゲノムＤＮＡ以外にも被検者から調製したＲＮＡを逆転写酵素でｃＤＮＡに変換し、これをそのまま制限酵素で切断した後、サザンブロッティングを行うことも可能である。また、このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲでＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを増幅し、それを制限酵素で切断した後、移動度の差を調べることも可能である。
【００４３】
さらに別の方法においては、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００４４】
該方法としては、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造多型）法（"Cloning and polymerase chain reaction-single-strand conformationpolymorphism analysis of anonymous Alu repeats on chromosome 11". Genomics. 1992Jan 1; 12(1): 139-146.; "Detection of p53 gene mutations in human brain tumorsby single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reactionproducts." Oncogene. 1991 Aug 1; 6(8): 1313-1318.; "Multiple fluorescence-basedPCR-SSCP analysis with postlabeling."、PCR Methods Appl. 1995 Apr 1; 4(5): 275-282）が挙げられる。この方法は操作が比較的簡便であり、また被検試料の量も少なくて済む等の利点を有するため、特に多数のＤＮＡ試料をスクリーニングするのに好適である。その原理は次の通りである。二本鎖ＤＮＡ断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその塩基配列に依存した独自の高次構造を形成する。この解離したＤＮＡ鎖を、変性剤を含まないポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、それぞれの高次構造の差に応じて、相補的な同じ鎖長の一本鎖ＤＮＡがゲル内の異なる位置に移動する。一塩基の置換・欠失・挿入によってもこの一本鎖ＤＮＡの高次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動において異なる移動度を示す。従って、この移動度の変化を検出することによりＤＮＡ断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等による変異が存在することを検出することができる。
【００４５】
具体的には、まず、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅する。増幅される範囲としては、通常２００〜４００ｂｐ程度の長さが好ましい。ＰＣＲは、当業者においては反応条件等を適宜選択して行うことができる。ＰＣＲの際に、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識したプライマーを用いることにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することができる。あるいはＰＣＲ反応液に３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を加えてＰＣＲを行うことにより、増幅ＤＮＡ産物を標識することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応後にクレノウ酵素等を用いて、３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を、増幅ＤＮＡ断片に付加することによっても標識を行うことができる。こうして得られた標識ＤＮＡ断片を、熱を加えること等により変性させ、尿素などの変性剤を含まないポリアクリルアミドゲルによって電気泳動を行う。この際、ポリアクリルアミドゲルに適量（５〜１０％程度）のグリセロールを添加することにより、ＤＮＡ断片の分離の条件を改善することができる。また、泳動条件は各ＤＮＡ断片の性質により変動するが、通常、室温（２０〜２５℃）で行い、好ましい分離が得られないときには４〜３０℃までの温度で最適の移動度を与える温度の検討を行う。電気泳動後、ＤＮＡ断片の移動度を、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーや、蛍光を検出するスキャナー等で検出し、解析を行う。移動度に差があるバンドが検出された場合、このバンドを直接ゲルから切り出し、ＰＣＲによって再度増幅し、それを直接シークエンシングすることにより、変異の存在を確認することができる。また、標識したＤＮＡを使わない場合においても、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドや銀染色法などによって染色することによって、バンドを検出することができる。
【００４６】
さらに別の方法では、まず、被検者からＤＮＡ試料を調製する。次いで、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを増幅する。さらに、増幅したＤＮＡを、ＤＮＡ変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したＤＮＡのゲル上での移動度を対照と比較する。
【００４７】
このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル（denaturant gradient gel electrophoresis: DGGE法）等を例示することができる。ＤＧＧＥ法は、変性剤の濃度勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で、ＤＮＡ断片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の違いによってＤＮＡ断片を分離する方法である。ミスマッチのある不安定なＤＮＡ断片が、ゲル中のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミスマッチ周辺のＤＮＡ配列はその不安定さのために、部分的に１本鎖へと解離する。この部分的に解離したＤＮＡ断片の移動度は、非常に遅くなり、解離部分のない完全な二本鎖ＤＮＡの移動度と差がつくことから、両者を分離することができる。具体的には、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを本発明のプライマー等を用いたＰＣＲ法等によって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃度が移動するに従って徐々に高くなっているポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対照と比較する。変異が存在するＤＮＡ断片の場合、より低い変性剤濃度位置でＤＮＡ断片が一本鎖になり、極端に移動速度が遅くなるため、この移動度の差を検出することにより変異の有無を検出することができる。
【００４８】
さらに別の方法では、まず、被検者から調製したＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板を用意する。次いで、該ＤＮＡと該基板を接触させる。さらに、基板に固定されたヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたＤＮＡを検出することにより、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を検出する。
【００４９】
このような方法としては、ＤＮＡアレイ法（SNP一塩基多型の戦略、松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135, 2000）が例示できる。被検者からのＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。該ＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、組織または細胞から抽出した染色体ＤＮＡ、あるいはＲＮＡを基に調製することができる。染色体ＤＮＡから本方法のＤＮＡ試料を調製するには、例えばＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いて、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によってＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡを調製することも可能である。調製したＤＮＡ試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出のための標識を施すことができる。
【００５０】
本発明において用いられる「基板」とは、ヌクレオチドを固定することができる板状の材料を意味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に制限はないが、一般にＤＮＡアレイ技術で使用される基板が好適に用いられる。
【００５１】
一般にＤＮＡアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成されている。通常これらのＤＮＡは非透過性（non-pourous）の基板の表層にプリントされる。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性（porous）の膜、例えばニトロセルロースメンブレンを使用することもできる。
【００５２】
本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、Affymetrix社により開発されたオリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示される。オリゴヌクレオチドのアレイにおいて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ（in situ）で合成される。例えば、photolithographicの技術（Affymetrix社）、および化学物質を固定させるためのインクジェット（Rosetta Inpharmatics社）技術等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既に知られており、いずれの技術も本発明の基板の作製に利用することができる。
【００５３】
基板に固定するヌクレオチドプローブは、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。特に好ましくは、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）における一塩基多型、すなわち、グアニンからアデニンへの置換を検出するヌクレオチドプローブが使用される。即ち、該プローブは、例えば、野生型のＡＢＣＢ１遺伝子、あるいは一塩基多型を有するＡＢＣＢ１遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡ、または一塩基置換を有するＡＢＣＢ１遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。
【００５４】
発明において基板に結合させるヌクレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常１０〜１００ベースであり、好ましくは１０〜５０ベースであり、さらに好ましくは１５〜２５ベースである。
【００５５】
本発明においては、次いで、該ｃＤＮＡ試料と該基板を接触させる。本工程により、上記ヌクレオチドプローブに対し、ＤＮＡ試料がハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションの反応液および反応条件は、基板に固定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸要因により変動しうるが、一般的に当業者に周知の方法により行うことができる。
【００５６】
本発明においては、次いで、該ＤＮＡ試料と基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの有無または強度を検出する。この検出は、例えば、蛍光シグナルをスキャナー等によって読み取ることによって行うことができる。尚、ＤＮＡアレイにおいては、一般的にスライドガラスに固定したＤＮＡをプローブといい、一方溶液中のラベルしたＤＮＡをターゲットという。従って、基板に固定された上記ヌクレオチドを、本明細書においてヌクレオチドプローブと記載する。
【００５７】
上記の方法以外にも、特定位置の一塩基置換を含む変異のみを検出する目的にはアレル特異的オリゴヌクレオチド（Allele Specific Oligonucleotide／ASO）ハイブリダイゼーション法が利用できる。変異が存在すると考えられる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを作製し、これと試料ＤＮＡでハイブリダイゼーションを行わせると、一塩基置換を含む変異が存在する場合、ハイブリッド形成の効率が低下する。それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試薬がハイブリッドのギャップにインターカレーションすることにより消光する性質を利用した方法、等により検出することができる。また、リボヌクレアーゼＡミスマッチ切断法による検出も可能である。具体的には、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡをＰＣＲ法等によって増幅し、これをプラスミドベクター等に組み込んだＡＢＣＢ１遺伝子ｃＤＮＡ等から調製した標識ＲＮＡとハイブリダイゼーションを行う。一塩基置換を含む変異が存在する部分においてはハイブリッドが一本鎖構造となるので、この部分をリボヌクレアーゼＡによって切断し、これをオートラジオグラフィー等で検出することによって変異の存在を検出することができる。
【００５８】
また、本発明はＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型を、抗体を用いて該遺伝子の変異の結果生じるアミノ酸配列の変異として検出する方法に関する。ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型によりＡＢＣＢ１タンパク質のアミノ酸配列に変異が生じる場合、このような一塩基多型はアミノ酸配列の変異部分に対する抗体を用いて検出することができる。本発明において利用するＡＢＣＢ１遺伝子の変異はＡＢＣＢ１タンパク質の一アミノ酸の変異を引き起こす多型であることから、当該多型の結果、変異があるタンパク質部分を抗原とする抗体を用いることにより検出することが可能であり、本発明の検出方法はこのような抗体を用いた方法を含む。本方法において使用される抗体としては、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体が挙げられ、さらには抗原結合性を有するそれらの断片を用いることもできる。また、全てのクラスの抗体を利用することができる。さらに、ヒト抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体等、公知の特殊な形態の抗体であってもよい。
【００５９】
ポリクローナル抗体は、ＡＢＣＢ１タンパク質の置換される部分（特に、１２５１番目のアミノ酸部分)を含むペプチドをマウス、ラット等の動物に免疫して周知の方法（Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al. (1987) publish. John Wiley & Sons, Section 11.12〜11.13）により得ることができる。また、モノクローナル抗体は該ペプチドで免疫した動物から抗体産生細胞を単離し、骨髄腫細胞等の細胞と融合させハイブリドーマ細胞を作製し、該ハイブリドーマ細胞から産生させることができる（Current protocolsin Molecular Biology, edit. Ausubel et al. (1987) publish. John Wiley & Sons, Section 11.4〜11.11）。また、ヒト抗体（例えば、"Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice", MendezM.J. et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-156）、ヒト化抗体（Methods in Enzymology 203: 99-121 (1991)）等の特殊な抗体も周知技術に従って製造することができる。
【００６０】
本発明はまた、生体試料中のＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274における遺伝子の一塩基多型の有無を検出するキットを提供する。その一つの態様は、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を含む領域に対応するＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチド（ヌクレオチドプローブとも言う）を含むキットである。
もう一つの態様としては、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を含む領域を増幅することができるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチドプライマーとも言う）を含むキットである。
もう一つの態様としては、上記ヌクレオチドプローブ及び上記ヌクレオチドプライマーを含むキットである。これらは一塩基多型を指標とする検査に使用される。
【００６１】
該オリゴヌクレオチドは、ＡＢＣＢ１遺伝子を含むＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション（選択的結合）条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダーゼーション条件下（例えば、サムブルックら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、検出するＡＢＣＢ１遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【００６２】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明方法におけるヌクレオチドプローブやヌクレオチドプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、一塩基多型（好ましくは一塩基置換）部分を含むＡＢＣＢ１遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００６３】
また、上記オリゴヌクレオチドをヌクレオチドプローブとして使用する場合、該プローブは、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を含む領域に対応するＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖ＤＮＡ断片として作製することもできる。
【００６５】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００６６】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を含む領域に対応するＤＮＡとハイブリダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板からなるＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型の有無を検出するキットである。これは一塩基多型を指標とする検査に使用される。これらは、上述の方法に従って調製することができる。
【００６７】
また、本発明における検査薬の別の態様は、ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）を含む領域に対応するＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを含む、ＡＢＣＢ１遺伝子における一塩基多型の有無を検出するキットである。プライマーの長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、一塩基多型部分を含むＡＢＣＢ１遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００６８】
上記キットにおいては、有効成分であるオリゴヌクレオチド以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。また、上記キットは、適切なパッケージおよび本発明方法における使用説明書を含み得る。上記キットは、さらにポリメラーゼ（複数も可）、例えば熱安定性ポリメラーゼ、例えばｔａｑポリメラーゼを含み得る。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００７０】
《実施例１：ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤によるＩＬＤに関わる一塩基多型の探索》
進行非小細胞肺がんに対してＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤治療（ゲフィチニブまたはエルロニチブの投与）が行われた日本人症例の末梢血単核球由来ＤＮＡを用いて遡及的（retrospective）に疾患−対照関連解析を行った。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤治療を受け急性肺障害を発症した症例（１２例）を患者群とし、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤投与を受けたが急性肺障害を起こさなかった症例（５６例）を対照群とした。【００７１】
まず始めに、急性肺障害に関与する可能性がある遺伝子として、薬剤性肺障害を引き起こす可能性のある機序から推測し、チロシンキナーゼ阻害剤の代謝に関わる遺伝子群（CYP、ABC superfamily）、炎症に関わる遺伝子群（Cytokines & related receptor、Toll-like receptor & related molecules、Tight junction protein）、肺の機能を維持する遺伝子群（Surfactant protein）、肺がん発症因子（ErbB/HER family）、肺で発現が高い遺伝子群（SLC superfamily）を中心に、１１４遺伝子を選択した。続いて、遺伝子名を基に、ＳＮＰ検索プログラム（Illumina社）によって抽出された多数のＳＮＰから、アミノ酸変異を伴うものか、あるいは、遺伝子の発現を調節する領域にあるものから、測定可能な７６８個のＳＮＰを選択した。試験に使用したＳＮＰの総数に対して遺伝子群ごとの割合を図１に示す。
これらの１１４遺伝子における７６８個のＳＮＰの測定は、Illumina Golden Gate Custom Panel（登録商標）（Illumina社）を用いて実施した。なお、スクリーニング条件は、添付の使用説明書に従って行った。【００７２】
その結果、ＡＢＣＢ１（ATP-binding cassette transporter B1）の一塩基多型rs28364274（ＡＢＣＢ１遺伝子のＣＤＳにおける３７５１番目の塩基（配列番号１で表される塩基配列における４１６９番目の塩基）におけるＧ（野生型）又はＡの一塩基多型）について、対照群ではＡ（アデニン）のアレルを持つ症例がいなかったのに対して、ＩＬＤ症例群では１２例中４例（３３％）がＡアレルを保有していた（表５）。Ａアレルの存在をFisher’s exact testで検定したところ、ｐ値が０．０００１６を示し、ＩＬＤ症例群とＡアレルの存在の関連性は、有意であることが示された。【００７３】
【表５】
0005843764.tif 000006
【００７４】
《実施例２：人種間でのrs28364274の遺伝子型における変異頻度の比較》
NCBI Single Nucleotide Polymorphism(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)のReference SNP Cluster Reportによると、アジア人としては韓国人及び中国人のデータが報告されており、日本人以外のいくつかの人種においてrs28364274のＡのアレルは極めて稀であった（表６）。
従って、実施例１の日本人症例群４例にみられたrs28364274のＡアレルの発生頻度から、このＡアレルは日本人に極めて特異的であると考えられ、薬剤性のＩＬＤの発症が日本人に多いという事実と矛盾しないことがわかった。
よって、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274の一塩基多型の有無が、ＩＬＤの発症に関わることが示唆された。【００７５】
【表６】
0005843764.tif 000007
【００７６】
《実施例３：ＡＢＣＢ１遺伝子の配列決定》
実施例１でＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274を測定したプローブ（配列番号４）について、再度、他の遺伝子上に相同配列が存在するか否かを検討したところ、非常に相同性が高い配列がＡＢＣＢ４遺伝子に存在することがわかった。また、その配列には、一塩基多型rs45456698が含まれていた。そこで、実施例１で検出されたＳＮＰが、ＡＢＣＢ１遺伝子の一塩基多型rs28364274であるか検証を行った。
ＡＢＣＢ１遺伝子のゲノム配列（NCBI, NC_000007.13|:c87342564-87132948）及びＡＢＣＢ４遺伝子のゲノム配列（NC_000007.13|:c87105019-87031361）に基づき、下記表７に示すＡＢＣＢ１遺伝子に特異的なＡＢＣＢ１遺伝子の２７番目のエクソン領域を増幅するためのプライマーを設計した。【００７７】
【表７】
0005843764.tif 000008
【００７８】
ＡＢＣＢ１遺伝子の２７番目エクソンのＰＣＲ増幅用プライマーセット（表７、各0.2μmol/L）を用いて、実施例１で検討した急性肺障害を発症した１２人のゲノムＤＮＡ（5ng）について、ＡＢＣＢ１遺伝子の２７番目エクソンを含む領域をEx-Taq（0.625units; Takara Shuzo, Kyoto, Japan）を用いて増幅した。この際の反応液の全量は50μLで、ＰＣＲの条件は、94℃で５分処理後、「94℃で30秒、55℃で1分、72℃で2分」を30サイクル行い、その後72℃で7分処理した。その後、ＰＣＲ増幅産物のうち5μLにExoSAP-IT（USB Co.,Cleveland, OH）を2μL加えて37℃で15分、80℃で15分処理し、その後4℃に冷却した。【００７９】
ＰＣＲにより増幅した産物の両鎖につき表７のプライマーを用いて、ABI BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Life Technologies, Carlsbad, USA）により直接塩基配列を決定した。即ち、計3.0μLのＰＣＲ増幅産物に1μmol/Lのプライマーを3.2μL、BigDye Terminator v1.1を8μL、精製水5.8μLを加え合計20μLとして「96℃で10秒、50℃で5秒、60℃で4分」を25サイクル行い、その後、4℃に冷却した。過剰な色素をCentri-SepTM spin column（Life Technologies）を用いて除去し、溶出液全量20μLを遠心エバポレーターにて乾燥させ，ABI Prism 3100 DNA Analyzer（Life Technologies）を用いて分析した。その際、精製反応物にHi-Di Formamide（Life Technologies）10μLを添加し、94℃で２分間、ヒートショックを行った。
【００８０】
その結果、急性肺障害を発症した１２人のＡＢＣＢ１遺伝子の２７番目エクソンを含む領域を解析し、波形により塩基配列を確認することによって一塩基多型rs28364274のＳＮＰの判定をおこなった。ABI Prism 3100 DNA Analyzerから各個体の波形を出力し、ＡＢＣＢ１遺伝子の３７５１番目の波形のＧを表すシグナルのみが検出されればＳＮＰ判定（ジェノタイプ）はＧＧ、Ｇを表すシグナルとＡを表すシグナルがおよそ１：１で観察されればＳＮＰ判定（ジェノタイプ）はＧＡ、Ａを表すシグナルのみが検出されればＳＮＰ判定（ジェノタイプ）はＡＡであるとした。【００８１】
その結果、１２検体中４検体においてＳＮＰ判定はＧＡとなり、Ａアレルが検出された。Ａアレルが検出された検体は、実施例１で検討したIllumina Golden Gate Custom Panel（登録商標）（Illumina社）によるＳＮＰ解析でＡアレルが検出された検体と一致した（表８）．このことから有意差を持つＳＮＰはＡＢＣＢ１遺伝子の２７番目エクソン上に位置し、ＡＢＣＢ１遺伝子の３７５１番目に位置するrs28364274であると考えられた．本ＳＮＰの塩基置換により野生型ＡＢＣＢ１タンパク質の１２５１番目のバリン（Ｖ）がイソロイシン（Ｉ）に置換され、ＡＢＣＢ１遺伝子産物による薬物代謝に影響を与える可能性があり、薬物の副作用につながる一塩基置換（変異）でありうると考えられた。【００８２】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤投与において、薬剤性肺障害の発症のリスクを予測するのに利用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図２】
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【図１】
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【配列表】
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