(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗体であってもよいヒトモノクローナル抗体、又はその免疫反応性断片であって、（ｉ）インフルエンザＡ型のグループ１に由来する少なくとも１つのクレード及びグループ２に由来する少なくとも１つのクレードを含むインフルエンザウイルスクレードに由来するＨＡ０及びＨＡ２の両方のタンパク質ストーク領域に結合し；（ｉｉ）前記少なくとも１つのクレードによる感染を中和し；（ｉｉｉ）インビトロでｐＨを６まで下げてもインフルエンザＨＡ０タンパク質への結合を維持し；かつ、（ｉｖ）０．５μｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０で中和する抗体又は断片。
【請求項２】
インフルエンザＡウイルスクレードＨ１、Ｈ７及びＨ９に由来するＨＡ０タンパク質ストーク領域、又は、インフルエンザＡウイルスクレードＨ１、Ｈ７及びＨ３に結合する、請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項３】
配列番号７５及び７６に記載のアミノ酸配列を有する抗体であるＭＡＢ５３とＨ１クレードのＨＡ０タンパク質への結合についての競合アッセイにおいて競合する、請求項１又は２に記載の抗体又は断片。
【請求項４】
エンドソーム経路による取込み後も前記ウイルスへの結合を維持する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又は断片。
【請求項５】
ＭＤＣＫ細胞における、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ３又はＨ５Ｎ１ウイルスによる感染を中和する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又は断片。
【請求項６】
マウスにおいて、該抗体又は断片の非投与で致死力価のＨ１Ｎ１又はＨ５Ｎ１による感染に対して、１〜１０ｍｇ／ｋｇの単回投与で防御効果を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は断片。
【請求項７】
（ｉ）配列ＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮ（配列番号７７）のＣＤＲ１、配列ＧＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号７８）のＣＤＲ２、及び、配列ＡＲＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹ（配列番号７９）のＣＤＲ３を含む重鎖；並びに、（ｉｉ）配列ＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡ（配列番号８０）のＣＤＲ１、配列ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号８１）のＣＤＲ２、及び、配列ＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴ（配列番号８２）のＣＤＲ３を含む軽鎖を含む抗体又は断片である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又は断片。
【請求項８】
（ｉ）配列ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＲＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＰ（配列番号７５の１〜１２０番目のアミノ酸）を含む重鎖；及び、（ｉｉ）配列ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＦＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号７６の１〜１０９番目のアミノ酸）を含む軽鎖を含む抗体又は断片である、請求項１に記載の抗体又は断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又は断片を含む医薬組成物。
【請求項１０】
対象におけるインフルエンザ感染の治療方法又は予防方法に使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又は断片、あるいは、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１１】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項７又は８のいずれか１項に記載の抗体又は断片の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードしているヌクレオチド配列を含む組換え発現系。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現系を含むように改変された組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の細胞を、前記ヌクレオチド配列が発現する条件下で培養することを含む、インフルエンザウイルスに対して免疫反応性であるモノクローナル抗体又は断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１１年２月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／４４５，４５５号、２０１１年２月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／４４３，１０３号、及び２０１０年６月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／３５５，９７８号からの優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢに提出された配列表の参照
米国特許商標庁ＥＦＳ−ＷＥＢサーバーへ電子提出された以下の配列表の全内容は、ＭＰＥＰ  §１７３０  ＩＩ．Ｂ．２（ａ）（Ｃ）において承認され、定められている通り、あらゆる目的において、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列表は、以下の電子出願テキストファイルとして特定される：
0006050747.tif 000002
【技術分野】
【０００３】
本発明は、インフルエンザに対する受動免疫の分野に関する。より詳しくは、インフルエンザ血球凝集素ＡのＨＡ０成熟切断部位コンセンサス配列の近傍に結合する抗体に関し、ヒト細胞によって分泌される抗体を含む。
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質は、インフルエンザ株間で非常に不均一な球形の頭部ドメイン、及び細胞内への進入に必要な融合部位を含むストーク領域を有する。血球凝集素タンパク質（ＨＡ０）は、活性化されると、ジスルフィド結合によるカップリングは維持したまま、コンホメーションの変化を受けてＨＡ１部分とＨＡ２部分に切断されることによって、融合部位が毒性をもつようになる。この切断部位には、インフルエンザＡ型及びインフルエンザＢ型の両方、並びに種々のインフルエンザＡ型株及びＢ型株が共有しているコンセンサス配列が含まれている。
【０００５】
Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００５）７９：７３８０−７３８８には、髄膜炎菌の外膜タンパク質複合体に結合させると、マウスで抗体を産生させることができる、当該切断部位のコンセンサス配列に基づく「ユニバーサル」インフルエンザＢ型ワクチンが記載されている。また、コンセンサス配列に結合すると思われるモノクローナル抗体も報告されている。また、抗血清の受動伝達をマウスで達成できることが観察されている。国際公開第２００４／０８０４０３号に記載されたインフルエンザのＭ２及び／又はＨＡタンパク質に由来するペプチドを含むこれまでのワクチンでは、ウイルス株全体に亘る有効性が弱いか、又は有効でない抗体が誘導されやすい。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、複数のインフルエンザ株間で共有されるエピトープに結合するモノクローナル抗体、より具体的には、代表であるインフルエンザＡ型のグループ１及びグループ２のいずれか、又はその両方と結合するモノクローナル抗体を提供する。このような抗体は、例えば、これまで同定されていないインフルエンザ株又は現在入手可能な季節性ワクチンによって防御できない株などによって引き起こされる世界的流行において、受動免疫を付与することができる。該抗体は、多くの株にわたって結合することから、必須部位を標的とすることを示している。このような標的部位は、これまでに見出されていない株にも含まれているであろうことから、このようなワクチンは、そのような状況下でも有効であると考えられる。また、当該抗体は、ワクチン接種によって充分な防御的応答が得られなかった対象又は免疫機構が弱いため高リスクである対象（例えば、非常に若年である者、高齢者、移植患者、癌又はＨＩＶの化学療法治療患者）の感染を改善又は予防するためにも有用である。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、タイプ例として、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１３、Ｈ１６を含むグループ１、又はＨ３及びＨ７を含むグループ２のインフルエンザＡ型ウイルスと広く交差反応性であるか、あるいはグループ間交差反応性を示す、モノクローナル抗体又はその免疫反応性断片に関する。前記抗体は、インフルエンザウイルスのＨＡ０タンパク質内に含まれるエピトープに特異的に結合し、ＨＡの天然三量体形態を認識する。当該技術分野で充分理解されているように、非免疫グロブリン系タンパク質が、抗体と同様のエピトープ認識特性を有している場合があり、これによっても好適な実施形態が提供されることもできる。このような非免疫グロブリン系タンパク質には、フィブロネクチン、トランスフェリン、リポカリンを基礎とした結合因子、又は核酸に基づくアプタマーが含まれる。
【０００８】
他の態様において、本発明は、対象のウイルス感染を受動的に抑制するための本発明の抗体及び断片の使用方法に関する。また、本発明は、このような抗体又は断片を製造するための組換え物質及び方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】様々なインフルエンザクレードに由来するＨＡ０タンパク質に対するＭＡＢ５３の結合をＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す。
【図１Ｂ】様々なインフルエンザクレードに由来するＨＡ０タンパク質に対するＭＡＢ８の結合をＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す。
【図１Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞で発現した天然三量体へのＭＡＢ５３の結合を示す。
【図２Ａ】様々なクレードに由来するＨＡ０タンパク質に対するＭＡＢ５３の結合をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）バイオセンサーで試験した結果を示す。
【図２Ｂ】様々なクレードに由来するＨＡ０タンパク質に対するＭＡＢ８の結合をＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）バイオセンサーで試験した結果を示す。
【図３Ａ】完全タンパク質であるＨＡ０及び切断断片ＨＡ１に対するＭＡＢ５３の結合力をＥＬＩＳＡによって試験した結果を示す。
【図３Ｂ】ＣＰと示したＨＡ２由来のペプチドに対するＭＡＢ５３の結合力を示す。
【図４】ＭＡＢ５３がＭＡＢ８と競合するが、ＭＡＢ３０とは競合しないことを示す、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）アッセイの結果を示す。
【図５Ａ】ＭＡＢ５３の重鎖可変領域のＫａｂａｔ番号付けによるＣＤＲマッピングを示す。ＩＧＨＶ１−６９＊０１は配列番号８３である。
【図５Ｂ】ＭＡＢ５３の軽鎖可変領域のＫａｂａｔ番号付けによるＣＤＲマッピングを示す。ＩＧＫＶ３−２０＊０１は配列番号８４である。
【図６】インビトロプラークアッセイによって測定した、様々な量のＭＡＢ５３によるＨ１Ｎ１の中和を示す。
【図７Ａ】Ｈ１Ｎ１（パネルＡ）の抗原を投与したマウスに、様々な量のＭＡＢ５３を投与した際の効果として、マウスの生存期間を示す。
【図７Ｂ】Ｈ５Ｎ１（パネルＢ）の抗原を投与したマウスに、様々な量のＭＡＢ５３を投与した際の効果として、マウスの生存期間を示す。
【図８】ＭＡＢ５３でのＨ５Ｎ１感染後治療の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、有用な抗体を提供するものであり、そのような抗体の後の容易な組換え技術による製造のために関連コード配列を解読し、保存することができるように該抗体を分泌する細胞を特定するための有効な手段を提供することを含む。当該方法には、二値論理に基づいたスクリーニング手順の設計が含まれる。
【００１１】
そのような手順は、ヒト細胞に対して、特に、米国特許第７，４１３，８６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）法を用いて容易に適用することができる。簡単に述べれば、該方法により、ヒト（又は他の）対象から得られた個々の細胞を、粒状標識での標識及び顕微鏡的観察を利用してハイスループットアッセイにおいてスクリーニングすることができる。例示的な一実施形態において、単独の細胞であっても、分泌された抗体について、該分泌された抗体を表面上に吸着又はカップリングさせ、次いで前記表面を、それぞれ識別用粒状標識にカップリングさせた所望の抗原で処理することにより解析することができる。従って、顕微鏡を用いることにより細胞のフットプリントを確認することができる。この手法を使用することで、数百万個もの細胞を所望の抗体の分泌についてスクリーニングすることができ、さらには、希少な抗体、例えば、本明細書における株全体に亘る受動インフルエンザ免疫化に望ましい抗体を回収することができる。ヒト対象には少なくとも一部のインフルエンザ株に対する抗体が既に存在しており、かつ、本発明の方法によって得られる抗体は保存配列に結合するため、このような抗体は、ヒト集団が経験を有する株とともに新しい株にも対処する目的に供される。
【００１２】
本発明は、血球凝集素（ＨＡ０）切断部位コンセンサス配列の近傍の位置に結合するモノクローナル抗体を同定する方法を提供する。該方法は、候補モノクローナル抗体又は断片を：ｉ）前記コンセンサス配列の上流又は下流のアミノ酸配列から本質的になるが、前記コンセンサス配列が欠落したペプチド；ｉｉ）前記コンセンサス配列の上流のアミノ酸配列から本質的になり、前記コンセンサス配列を含むペプチド；及びｉｉｉ）前記コンセンサス配列の下流のアミノ酸配列から本質的になり、前記コンセンサス配列を含むペプチドと接触させることを含み；ここで、ｉｉ）とｉｉｉ）のペプチドに結合するがｉ）のペプチドには結合しないモノクローナル抗体が、ＨＡ０切断部位コンセンサス配列に特異的に結合するペプチドと同定される。また、二値論理に従う限り、当業者には明白であろう他の組合せを使用してもよい。例えば、ｉ）第１の株のコンセンサス配列の上流のアミノ酸から本質的になり、コンセンサス配列が欠落したペプチドを、ｉｉ）第１の株に由来する完全ＨＡ０配列、及びｉｉｉ）第２の株に由来する完全ＨＡ０配列と共に使用してもよい。また、より短い部分を使用してもよい。また、さらなる確認のために、保存領域から単離したペプチドを使用してもよいが、より大きいタンパク質ドメインから得られる情報の方が完全抗原の認識に関する情報がより多く得られると考えられる。
【００１３】
本方法はＣｅｌｌＳｐｏｔ（商標）法の使用に限定されず、ヒト抗体にも限定されない。該方法の二値論理は、任意の択一的なスクリーニング方法において使用することができる。同様に、前記方法は、天然免疫グロブリンに加えて、他の多様なライブラリーにも適用することができる。
【００１４】
本発明の方法は二値論理に依存し、所望のコンセンサス配列及び上流及び／又は下流の追加部分を含むペプチドを試験ペプチドとして使用し、コンセンサス配列に欠ける領域と比較した抗体との複合体形成能を評価する。従って、適切な抗体を分泌している細胞を即座に特定できるパターンが得られる。
【００１５】
例示的な一実施形態では、３種類の抗原を使用し、分泌抗体集団を評価する。第１のペプチドは、ＨＡ０に含まれるコンセンサス配列の上流のアミノ酸配列の全部又は実質的に全部であり、赤色などの粒状標識に結合させる。第２の試験抗原は、このような上流配列を含むが、コンセンサス配列も含み、異なる色、例えば青色の粒子で標識する。第３の試験ペプチドは、コンセンサス配列とＨＡ０タンパク質の下流領域の全部又は実質的に全部を含み、第３の色、例えば緑色の粒状物で標識する（上流部分は、コンセンサス配列からＮ末端の方向を意味し、下流部分は、コンセンサス配列からＣ末端の方向に向けて連続するアミノ酸配列を意味する。「実質的に全部」は、１個だけ、又は数個の非必須アミノ酸の欠落を意味する）。コンセンサス配列に結合する抗体は、緑色及び青色の両方の粒状標識ペプチドに結合するが、コンセンサス配列が欠落した赤色標識された上流配列には結合しない。所望により、例えば黄色の粒状物標識に結合した、コンセンサス配列を有しない下流部分のみに代表される第４のペプチドを加えることにより特異性を確認することができ、ここで、黄色の粒状標識は本発明の抗体に結合しない。もちろん、上流部分又は下流部分を陰性対照として選択してもよい。
【００１６】
様々なインフルエンザＡ型株及びインフルエンザＢ型株の切断部位が知られている。例えば、Ｂｉａｎｃｈｉらによる上述の論文には、表１に、いくつかのそのような株の切断部位周囲の配列が示されている。
【表１】
0006050747.tif 000003
【００１７】
示したように、厳密なコンセンサスは、切断部位の上流のアルギニン残基から始まっており、従って、本発明の試験ペプチドに含まれる好ましいコンセンサス配列は、配列ＲＧＩ／Ｌ／Ｆ  ＦＧＡＩＡＧＦＬＥ（配列番号７）を有する。試験ペプチドにおいて、この配列の一部分のみを使用することもできる。
【００１８】
所望の抗体を分泌する細胞が同定された後、該抗体をコードするヌクレオチド配列を解読し、かつ、所望の抗体を組換え技術により大規模に製造することは容易に行われる。また、これにより、例えば、一本鎖抗体、又はその可変領域のみが産生できるように抗体を操作することも可能となる。
【００１９】
解読した核酸は、後の組換え製造のために物理的に保存、回収してもよく、かつ／又は、該抗体をコードする配列に関する配列情報を解読し、後に適切な核酸を合成するために保存してもよい。既知の組換え製造法に加え、コード配列に含まれる情報が入手可能であり、かつ、迅速な合成及びクローニング技術があることにより、世界的流行又は他の緊急の事象の場合に、必要とされる抗体を迅速に製造することができる。
【００２０】
本出願人らは、複数のクレードのインフルエンザのＨＡ０タンパク質と免疫反応性である複数のモノクローナル抗体を回収した（配列番号９〜２３、２６〜４０、４２〜５６、及び５９〜７３）。他の配列として、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号８）、ヒト軽鎖定常κ領域のアミノ酸配列（配列番号２４）、ヒト軽鎖定常λ領域のアミノ酸配列（配列番号２５）、ヒト重鎖定常領域のヌクレオチド配列（配列番号４１）、ヒト軽鎖定常κ領域のヌクレオチド配列（配列番号５７）、及びヒト軽鎖定常λ領域のヌクレオチド配列（配列番号５８）が含まれる。
【００２１】
これらのｍＡｂのうち２種類のＭＡＢ５３及びＭＡＢ８は、重要な遠縁インフルエンザクレード間において実質的な交差反応性を有する。図１Ａ及びＢに示すように、これらの各々は、３種類の異なるクレードに適度な親和性又は高親和性で結合する。ＭＡＢ５３は、Ｈ１、Ｈ９及びＨ７クレードに由来するＨＡ０に結合し、ＭＡＢ８は、Ｈ１、Ｈ７及びＨ３クレードに由来するＨＡ０タンパク質に結合する。図１に示した結果は、ＨＡ０タンパク質に対するＥＬＩＳＡアッセイにより得たものであり、親和性がナノモル域であることを示す。全てのグループ１クレードに由来するＨＡの天然三量体に対する反応性を、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたＨＡを用いて、フローサイトメトリーにより測定した抗体結合で確認した。
【００２２】
図２Ａ及び２Ｂに示すとおり、これらの結果を、択一的なアッセイ系である、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）バイオセンサーと呼ばれるバイオレベル干渉法に基づく結合アッセイを用いて確認した。本アッセイでより厳密に測定することにより、親和性は以下のとおりであった：
ＭＡＢ５３／Ｈ１＝６０ｐＭ，Ｈ５＝６ｎＭ，Ｈ７＝７０ｐＭ，Ｈ９＝３０ｐＭ
ＭＡＢ８／Ｈ１＝９ｎＭ，Ｈ３＝１６ｎＭ，Ｈ５＝０．２ｎＭ
【００２３】
ＭＡＢ５３及びＭＡＢ８は共に完全ヒト抗体であるが、他の種に特有の同様の抗体も本発明に含まれる。本発明との関連において、「抗体」及びその断片は、結合に関連する分子の一部分が含まれ；従って、断片は可変領域のみを含んでいてもよく、一般的な用語としての「抗体」はこのような断片も包含すると考えてもよい。従って、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、並びに組換えにより作製された一本鎖抗体、及び二重特異性物質を与えるこのような構築物の融合体も包含される。キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体は、全て本発明の範囲に含まれ、フィブロネクチン、トランスフェリン又はリポカリンなどの他のタンパク質骨格を基礎とした抗体模倣物も本発明の範囲に含まれる。同様に、現在、２種類の別々の抗体に由来する抗原特異的ドメインが組み込まれた１種類の抗体様分子（二重特異性抗体）を作製するための複数の技術が存在している。従って、非常に広範な株に反応性を有する１種類の抗体が、それぞれグループ１及びグループ２に対して広範な反応性を有する個々の抗体のＦａｂドメインを用いて構築することができる。好適な技術は、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）及びＭｅｒｒｉｍａｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に記載されている（例えば、Ｏｒｃｕｔｔ  ＫＤ，Ａｃｋｅｒｍａｎ  ＭＥ，Ｃｉｅｓｌｅｗｉｃｚ  Ｍ，Ｑｕｉｒｏｚ  Ｅ，Ｓｌｕｓａｒｃｚｙｋ  ＡＬ，Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ  ＪＶ，Ｗｉｔｔｒｕｐ  ＫＤ．Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｇＧ−ｓｃＦｖ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．（２０１０）２３：２２１−２２８；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｊ，Ｌｕｇｏｖｓｋｏｙ  Ａ．Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．ＭＡｂｓ．（２０１１）１：３（３）；Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＰＡ，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｃ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００９）６９：４９４１−４９４４を参照）。
【００２４】
ＭＡＢ５３が結合するエピトープを同定するため、非切断ＨＡ０タンパク質、ＨＡ１断片及びＨＡ２断片に対してＥＬＩＳＡアッセイを行った。図３Ａ及びＢに示すとおり、ＭＡＢ５３は、高親和性でＨＡ０に結合するがＨＡ１には結合しないことから、相補的なＨＡ２断片に結合することが示唆された。この仮説を確認するため、ＨＡ２に由来するペプチドを、Ｃ末端のビオチンでストレプトアビジンコートプレート上に固定化した。具体的には、試験配列はＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷ（配列番号７４）とした。無関連な隣接部分も使用した。ＭＡＢ５３は、このペプチドに結合できることが確認された。ＭＡＢ５３は、ウェスタンブロットによる試験でＨＡ０に結合しないことから、主要なエピトープは、少なくとも天然の立体構造の一部にあると思われる。
【００２５】
また、ＭＡＢ８及びＭＡＢ５３は、Ｈ１クレードのＨＡ０タンパク質への結合において互いに競合することから、同一又は近くのエピトープに結合することが見出された。これは、２μｇ／ｍｌの抗体及び５０ｎＭのＨ１由来ＨＡ０を用いて、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）アッセイを使用することにより示された。図４Ａに示すとおり、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）表面に結合したＭＡＢ５３から得られたシグナルは、５０ｎＭのＨＡ０溶液を添加すると増大する。しかし、次いでＭＡＢ８を添加すると、さらなるシグナルは発生しない。従って、ＭＡＢ５３はＭＡＢ８が結合するエピトープをブロックする。しかし、図４Ｂに示すとおり、ＨＡ０と免疫反応性である別の抗体ＭＡＢ３０は、結合したＭＡＢ５３−ＨＡ０に添加するとシグナルが強化されるため、明らかに異なるエピトープに結合する。
【００２６】
重要なことに、ＭＡＢ５３及びＭＡＢ８は、ＭＡＢ８がｐＨを６まで下げるとＨＡ０タンパク質から放出されるのに対し、ＭＡＢ５３は放出されないという点で異なる。この違いは、これにより中和能が予測されると思われるため意義深い。ＭＤＣＫ標的細胞でのプラーク減少アッセイにおけるＭＡＢ８のＨ１Ｎ１ウイルス感染中和能の試験では、１〜５μｇ／ｍｌという低用量のＭＡＢ５３が、Ｈ１Ｎ１、Ｈ７Ｎ３、Ｈ５Ｎ１及びＨ９Ｎ２による感染を中和した。しかし、ＭＡＢ８は、これらの株による感染を中和しない。従って、一次スクリーニングの間に結合ＭＡＢ又は断片をｐＨ６で洗浄することにより、中和株を優先的に選択することができる。ＨＡ０から除去されることにより、抗体−ウイルス複合体として維持されていそうにないＭＡＢは、エンドソーム区画を介して細胞内に入り、それによりウイルス中和能が低減されると予測される。
【００２７】
例えば、ＣｅｌｌＳｐｏｔ法では、ＨＡ０を固相支持体（蛍光ビーズ）に結合させ、ＭＡＢ又はＭＡＢ混合物によって捕捉し、次いでｐＨ６で洗浄する。
【００２８】
ＭＡＢ５３は、組換え技術により作製されたものであり、配列決定されている。重鎖と軽鎖の完全長配列は以下のとおりである。
重鎖：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＲＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹＷＧＱＧＳＬＶＴＶＳＰＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＶＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７５）；及び
軽鎖：ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡＷＹＱＨＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＦＧＡＳＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号７６）。
【００２９】
下線の配列は可変ドメインであり、非下線の配列は、重鎖のＩｇＧ１定常鎖及び軽鎖のκ定常鎖を表す。
【００３０】
また、これらの可変領域を、マッチするフレームワーク領域に基づきＫａｂａｔＣＤＲ評価に従って解析した。図５Ａに示すとおり、ＩＧＨＶ１−６９＊０１重鎖（配列番号８３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ＧＧＩＩＲＫＹＡＩＮ（配列番号７７）、ＧＧＩＩＡＩＦＮＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号７８）及びＡＲＧＭＮＹＹＳＤＹＦＤＹ（配列番号７９）である。図５Ｂに示すとおり、ＩＧＫＶ３−２０＊０１軽鎖（配列番号８４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、ＲＡＳＱＳＶＲＳＮＮＬＡ（配列番号８０）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号８１）及びＱＱＹＧＳＳＰＡＬＴ（配列番号８２）である。
【００３１】
図６に示すとおり、ＭＡＢ５３は、インビトロのプラークアッセイにおいてＨ１Ｎ１を中和する。
【００３２】
また、図７に示すとおり、段階的用量のＭＡＢ５３で前処理したマウスは、他の状況では致死的力価のＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１ウイルスによる感染でも生存し、Ｈ１Ｎ１感染に対しては１００％の防御を示した。グループ２の株に対して活性を示さないＣｒｕｃｅｌｌに記載された先行技術の抗体と同等の効力である。Ｔｈｒｏｓｂｙ  Ｍ．ら，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．（２００８）３：ｅ３９４２．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｄｅｃ  １６。これらは、ヒトＩｇＭ＋メモリーＢ細胞から回収されたＨ５Ｎ１及びＨ１Ｎ１に交差防御的なヘテロサブタイプ中和モノクローナル抗体である。
【００３３】
図７Ａに示すとおり、ＭＡＢ５３は、１０ｍｇ／ｋｇで充分な防御を示し；２ｍｇ／ｋｇで９０％が生存し、０．４ｍｇ／ｋｇで５０％が生存した。それに比べ、Ｃｒｕｃｅｌｌの先行技術抗体では、２ｍｇ／ｋｇで充分な防御を示したが、０．７ｍｇ／ｋｇを投与した場合、２０％しか生存しなかった。ウイルス投与量の致死性は図７Ａに示した実験のものより低い；９０％のマウスだけが感染後死亡しているが、図７Ａに示した実験では、全てのマウスが６日目に死亡したにもかかわらずこのような結果となっている。これは、ＭＡＢ５３の能力が高いことを示す。
【００３４】
Ｈ１Ｎ１による感染の代わりにＨ５Ｎ１による感染を行った場合、ＭＡＢ５３については図７Ｂに示すとおり、１０ｍｇ／ｋｇでは８０％が生存し；２ｍｇ／ｋｇでは６０％が生存し、０．４ｍｇ／ｋｇでは５０％が生存した。それに比べ、先行技術抗体では、５ｍｇ／ｋｇで１００％の生存が得られ、１．７ｍｇ／ｋｇでは６０％が生存した。従って、１．７ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇでの生存率は同等であった。この試験においては、ウイルス投与量自体は、ＭＡＢ５３で試験したマウスの方が、若干能力が低かった。
【００３５】
図８に示すとおり、ＭＡＢ５３（１０ｍｇ／ｋｇ）を、感染後治療として＋３日目に、高度に病理的なＨ５Ｎ１株に対して投与した。対照抗体は、アイソタイプはマッチしているがどのインフルエンザ抗原も認識しない抗体とした。感染及び治療プロトコルは図７Ａと同じであるが、−１日目ではなく＋３日目に投与した。
【００３６】
ペプスキャン解析を行い、ＭＡＢ５３及びＣＲ６２６１は、ＨＡの類似する領域に結合するが、異なるエピトープに結合することが確立された（データは非図示）。これは、この２つの抗体の活性が異なることと整合する。
【００３７】
従って、ＭＡＢ５３及び同じ条件下で同じエピトープに結合する抗体は、一時的流行及び世界的流行に対する集団の防御に適し、また、免疫機構が弱体化した患者の季節性インフルエンザに対する予防的又は治療的使用に適した受動ワクチンとして有効である。
【００３８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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