(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロプレートの複数のウェルのそれぞれに入れられたタンパク質を含む溶液に超音波を照射する超音波照射部と、
前記超音波の照射によって前記タンパク質から形成されたアミロイドとアミロイド特異性蛍光色素との結合によって発せられる蛍光を検出する蛍光検出部と
を備え、
前記超音波照射部は、処理槽と、移動部とを有し、
前記移動部は、
前記超音波照射部が前記溶液に前記超音波を照射している間に、前記処理槽内で前記マイクロプレートを移動させ、
前記超音波の照射後に、前記処理槽内から前記処理槽の外に前記マイクロプレートを移動させることによって、前記マイクロプレートを前記蛍光検出部に移動させる、アミロイドアッセイ装置。
【請求項２】
前記超音波照射部は、前記複数のウェルに不均一に超音波を照射する、請求項１に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項３】
前記超音波照射部は、前記複数のウェルに均一に超音波を照射する、請求項１に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項４】
前記超音波照射部によって前記マイクロプレートの前記複数のウェルのそれぞれに照射された超音波の音圧を測定する音圧測定装置をさらに備える、請求項１から請求項３のうちの一項に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項５】
前記アミロイド特異性蛍光色素はチオフラビンＴを含む、請求項１から請求項４のうちの一項に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項６】
前記超音波照射部は、超音波振動子をさらに有する、請求項１から請求項５のうちの一項に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項７】
前記超音波照射部は、第１所定時間の前記超音波の照射と第２所定時間の中断とを繰り返す、請求項１から請求項６のうちの一項に記載のアミロイドアッセイ装置。
【請求項８】
マイクロプレートの複数のウェルのそれぞれに入れられたタンパク質を含む溶液に超音波を照射する工程と、
前記タンパク質から形成されたアミロイドと前記アミロイド特異性蛍光色素とが結合することによって発せられる蛍光を蛍光検出部で検出する工程と、
前記超音波を照射した後、前記蛍光を検出する前に、処理槽内から前記処理槽の外に前記マイクロプレートを移動部により移動させることによって、前記マイクロプレートを前記蛍光検出部に移動させる工程と
を包含し、
前記超音波を照射する工程は、前記溶液に前記超音波を照射している間に、前記処理槽内で前記マイクロプレートを移動させる、アミロイドアッセイ方法。
【請求項９】
前記超音波を照射する工程において、前記複数のウェルに不均一に超音波を照射する、請求項８に記載のアミロイドアッセイ方法。
【請求項１０】
前記複数のウェルのそれぞれに、タンパク質およびアミロイド特異性蛍光色素を含む溶液の入れられたマイクロプレートを用意する工程を更に含み、
前記マイクロプレートを用意する工程において、前記複数のウェルのそれぞれに同一の溶液を入れる、請求項９に記載のアミロイドアッセイ方法。
【請求項１１】
前記超音波を照射する工程において、前記複数のウェルに均一に超音波を照射する、請求項８に記載のアミロイドアッセイ方法。
【請求項１２】
前記複数のウェルのそれぞれに、タンパク質およびアミロイド特異性蛍光色素を含む溶液の入れられたマイクロプレートを用意する工程を更に含み、
前記マイクロプレートを用意する工程において、前記複数のウェルのそれぞれに異なる溶液を入れる、請求項１１に記載のアミロイドアッセイ方法。
【請求項１３】
前記超音波を照射する工程は、第１所定時間の前記超音波の照射と第２所定時間の中断とを繰り返す、請求項８から請求項１２のうちの一項に記載のアミロイドアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドアッセイ装置およびアミロイドアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミロイドーシスは、高齢化社会の深刻な疾病として知られている。アミロイドーシスは、タンパク質が凝集して幅１０ｎｍで枝分かれのない「アミロイド線維」と呼ばれるタンパク質異常凝集体の沈着する疾病の総称である。アミロイドーシスには、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、プリオン病、透析アミロイドーシス、ＡＬアミロイドーシス、パーキンソン病をはじめ約２０数種類の深刻な疾病が含まれる。アミロイド線維は変性タンパク質が軸方向に規則的に会合したものと考えられるが、その構造や形成機構には不明な点が多い。【０００３】
近年、アミロイドーシスの研究が盛んに行われているが、アミロイドの沈着を未然に予測することは困難である。アミロイドの形成は、物質の結晶形成に似た現象であり、原因物質が危険レベルを超えていても、アミロイド形成のエネルギー障壁が高いため、過飽和状態に保たれている場合が多い。このような状況では、アミロイドやそのオリゴマーは形成されず、アミロイドーシスも発症せず、潜伏状態にある。アミロイドーシスに関する研究の大きな問題点は、アミロイドやオリゴマーなどの関連する異常凝集体の形成を予測することが困難なことである。試験管内での基礎研究においても、原因タンパク質がアミロイドを形成する反応は遅く、一般に、アミロイド形成には、数日から数ヶ月もの長い時間が必要となる。【０００４】
これに対して、本願発明者らは、タンパク質に超音波を照射することにより、アミロイド形成のエネルギー障壁を下げて、アミロイド線維の形成を促進することを発表した（例えば、非特許文献１および２参照）。非特許文献１では、超音波処理を行うことにより、アミロイド線維を効率的に誘導することが記載されている。また、非特許文献２には、超音波処理によってアミロイド線維の形成誘導および破砕を拮抗させることによって微細で均質なアミロイド粒子を形成することが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「ウルトラソニケーション−インデュースド  アミロイド  フィブリル  フォーメーション  オブ  ベータ２−ミクログロブリン（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  β２−ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」．  Ｏｈｈａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｋｉｈａｒａ，  Ｍ．，Ｎａｉｋｉ，  Ｈ．  ＆  Ｇｏｔｏ，  Ｙ．  （２００５）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  ３２８４３−３２８４８．
【非特許文献２】「ウルトラソニケーション−デペンデント  プロダクション  アンド  ブレイクダウン  リード  トゥ  ミニマム−サイズド  アミロイド  フィブリルス（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｍｉｎｉｍｕｍ−ｓｉｚｅｄ  ａｍｌｏｙｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ）」．  Ｃｈａｔａｎｉ，  Ｅ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．−Ｈ．，  Ｙａｇｉ，  Ｈ．，  Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ｙ．，  Ｎａｉｋｉ，  Ｎ．  ＆  Ｇｏｔｏ，Ｙ．  （２００９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０６，  １１１１９−１１１２４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１および２に記載される方法でも、タンパク質を含む複数の溶液のそれぞれについてアミロイドのアッセイを短時間に行うことができなかった。【０００７】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、その目的は、タンパク質を含む複数の溶液のそれぞれについてアミロイドのアッセイを短時間に行うことができるアミロイドアッセイ装置およびアミロイドアッセイ方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明によるアミロイドアッセイ装置は、マイクロプレートの複数のウェルのそれぞれに入れられたタンパク質を含む溶液に超音波を照射する超音波照射部と、前記超音波の照射によって前記タンパク質から形成されたアミロイドとアミロイド特異性蛍光色素との結合によって発せられる蛍光を検出する蛍光検出部とを備える。【０００９】
ある実施形態において、前記超音波照射部は、前記複数のウェルに不均一に超音波を照射する。【００１０】
ある実施形態において、前記超音波照射部は、前記複数のウェルに均一に超音波を照射する。【００１１】
ある実施形態において、前記アミロイドアッセイ装置は、前記超音波照射部によって前記マイクロプレートの前記複数のウェルのそれぞれに照射された超音波の音圧を測定する音圧測定装置をさらに備える。さらにある実施形態において、前記アミロイド特異性蛍光色素はチオフラビンＴを含む。【００１２】
ある実施形態において、前記超音波照射部は、処理槽と、超音波振動子と、前記マイクロプレートを移動させる移動部とを有する。【００１３】
ある実施形態において、前記移動部は、前記マイクロプレートを、前記超音波照射部から前記蛍光検出部に移動させる。【００１４】
ある実施形態において、前記移動部は、前記超音波照射部が前記溶液に前記超音波を照射している間に、前記マイクロプレートを移動させる。【００１５】
本発明によるアミロイドアッセイ方法は、マイクロプレートの複数のウェルのそれぞれに入れられたタンパク質を含む溶液に超音波を照射する工程と、前記タンパク質から形成されたアミロイドと前記アミロイド特異性蛍光色素とが結合することによって発せられる蛍光を検出する工程とを包含する。【００１６】
ある実施形態では、前記超音波を照射する工程において、前記複数のウェルに不均一に超音波を照射する。【００１７】
ある実施形態では、前記複数のウェルのそれぞれに、タンパク質およびアミロイド特異性蛍光色素を含む溶液の入れられたマイクロプレートを用意する工程を更に含み、前記マイクロプレートを用意する工程において、前記複数のウェルのそれぞれに同一の溶液を入れる。【００１８】
ある実施形態では、前記超音波を照射する工程において、前記複数のウェルに均一に超音波を照射する。【００１９】
ある実施形態では、前記複数のウェルのそれぞれに、タンパク質およびアミロイド特異性蛍光色素を含む溶液の入れられたマイクロプレートを用意する工程を更に含み、前記マイクロプレートを用意する工程において、前記複数のウェルのそれぞれに異なる溶液を入れる。【００２０】
ある実施形態において、前記アミロイドアッセイ方法は、前記超音波を照射した後、前記蛍光を検出する前に、前記マイクロプレートを蛍光検出部に移動させる工程をさらに包含する。【００２１】
ある実施形態において、前記超音波を照射する工程は、前記溶液に前記超音波を照射している間に、前記マイクロプレートを移動させる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるアミロイドアッセイ装置およびアミロイドアッセイ方法によれば、タンパク質を含む複数の溶液のそれぞれについてアミロイドのアッセイを短時間に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】（ａ）は本発明によるアミロイドアッセイ装置の実施形態の模式図であり、（ｂ）は（ａ）に示したアミロイドアッセイ装置に用いられるマイクロプレートの模式図である。
【図２】（ａ）は本実施形態のアミロイドアッセイ装置における超音波照射装置の模式図であり、（ｂ）は（ａ）に示した超音波照射装置の模式的な上面図であり、（ｃ）は（ａ）に示した超音波照射装置の模式的な断面図である。
【図３】（ａ）は超音波の照射によるアミロイド線維のサイズの変化を示すグラフであり、（ｂ）は超音波を照射しない場合の原子間力顕微鏡（Ａｔｏｍｉｃ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＡＦＭ）像を示す模式図であり、（ｃ）は（ｂ）のアミロイドに対して超音波を照射した場合のＡＦＭ像を示す模式図である。
【図４】本実施形態のアミロイドアッセイ装置におけるプレートリーダーの模式図である。
【図５】本発明によるアミロイドアッセイ装置の実施形態の模式図である。
【図６】（ａ）は本実施形態のアミロイドアッセイ装置に用いられる音圧測定装置の模式図であり、（ｂ）は（ａ）のセンサ部先端の模式図である。
【図７】本発明によるアミロイドアッセイ方法の実施形態を説明するためのフローチャートである。
【図８】超音波処理後のマイクロプレートの模式図である。
【図９】超音波処理に依存したアミロイド形成度合の時間変化を示すグラフである。
【図１０】（ａ）〜（ｄ）は、それぞれ、超音波の照射時間が、０分、９０分、１２０分、２１０分の場合のアミロイドの量を示す模式図である。
【図１１】（ａ）はタンパク質濃度の違いに応じたアミロイド形成度合の変化を示すグラフであり、（ｂ）は患者体内環境と同様の生理的条件におけるアミロイド形成度合の変化を示すグラフである。
【図１２】（ａ）は各ウェルの超音波の音圧分布を示す模式図であり、（ｂ）はアミロイド形成度合を示す模式図であり、（ｃ）は音圧とアミロイドの量との関係を示すグラフである。
【図１３】（ａ）〜（ｄ）はアミロイドーシスの発症のリスクの判定を説明するための模式図である。
【図１４】本実施形態のアミロイドアッセイ装置の模式図である。
【図１５】（ａ）は本実施形態のアミロイドアッセイ装置における超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図１６】本実施形態のアミロイドアッセイ装置を用いた場合のプレートリーダーにおける各ウェル内の溶液からの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図１７】図１６に示した場合のプレートリーダーにおける各ウェル内の溶液のラグタイムを示す模式図である。
【図１８】（ａ）は本実施形態のアミロイドアッセイ装置における超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図１９】（ａ）は本実施形態のアミロイドアッセイ装置における超音波照射装置の模式的な平面図であり、（ｂ）は（ａ）の模式的な側面図である。
【図２０】本実施形態のアミロイドアッセイ装置の模式図である。
【図２１】図２０に示したアミロイドアッセイ装置におけるプレートリーダーの模式図である。
【図２２】図２１に示したプレートリーダーの一例を示す模式図である。
【図２３】本実施形態のアミロイドアッセイ装置を用いた場合のプレートリーダーにおける各ウェル内の溶液からの蛍光強度の時間変化を示すグラフである。
【図２４】図２３に示した場合のプレートリーダーにおける各ウェル内の溶液のラグタイムを示す模式図である。
【図２５】超音波照射時のマイクロプレートの移動の有無に応じたラグタイムの分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、図面を参照して、本発明によるアミロイドアッセイ装置およびアミロイドアッセイ方法の実施形態を説明する。ただし、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２５】
［アミロイドアッセイ装置］
図面を参照して本発明によるアミロイドアッセイ装置の実施形態を説明する。図１（ａ）に本実施形態のアミロイドアッセイ装置１００の模式図を示し、図１（ｂ）にアミロイドアッセイ装置１００に用いられるマイクロプレートＰの模式図を示す。
【００２６】
アミロイドアッセイ装置１００は、超音波照射装置１０と、プレートリーダー２０とを備えている。超音波照射装置１０には、複数のウェル（穴またはくぼみ）Ｗの設けられたマイクロプレートＰが搭載される。例えば、マイクロプレートＰには９６個のウェルＷが１２行８列に配列されている。マイクロプレートＰの複数のウェルＷのそれぞれにはタンパク質の溶液が入っている。マイクロプレートＰの複数のウェルＷには同一の溶液が入れられていてもよく、あるいは、異なる溶液が入れられていてもよい。本明細書において、同一の溶液とは、溶液成分及び溶液濃度が同一であり、異なる溶液とは、溶液成分及び溶液濃度のうちの少なくとも一方が異なることを意味する。例えば、同一の溶液としては、同一の被験者の体液（血液等）があり、異なる溶液としては、異なる被験者の体液（血液等）がある。
【００２７】
超音波照射装置１０は、各ウェルＷに入れられたタンパク質の溶液に超音波を照射する。アミロイド原因タンパク質の過飽和溶液に対して超音波処理を行うと、アミロイドが生成される。これは、局所的な高温、高圧が発生して溶液がかく乱されて過飽和が乱されるためと考えられる。なお、アミロイド線維に超音波を照射した場合には、アミロイド線維は衝撃によって断片化される。詳細は後述するが、超音波照射装置１０はマイクロプレートＰの複数のウェルＷに入れられたサンプルのそれぞれに均一に超音波を照射させてもよいし、不均一に超音波を照射させてもよい。本明細書において、「複数のサンプルに超音波を不均一に照射する」とは「少なくとも２つのサンプルに超音波を各々異なった強度（音圧）で照射する」ことであり、「超音波を複数のサンプルに均一に照射する」とは「少なくとも２つのサンプルに超音波を各々同じ強度（音圧）で照射する」ことである。このような超音波照射装置１０により、マイクロプレートＰの複数のウェルＷに入れられたそれぞれの溶液においてアミロイドの形成を促進することができる。
【００２８】
タンパク質からアミロイドが誘導される場合、アミロイドはアミロイド特異性蛍光色素と結合することによって蛍光を発する。アミロイドが誘導されたマイクロプレートＰの複数のウェルＷ内にアミロイド特異性蛍光色素が存在することにより、蛍光が発せられ、プレートリーダー２０はこの蛍光を検出することによって溶液内のアミロイドを検出することができる。
【００２９】
［超音波照射装置］
以下、図２を参照して超音波照射装置１０を説明する。図２（ａ）に超音波照射装置１０の模式的な正面図を示し、図２（ｂ）に超音波照射装置１０の模式的な上面図を示し、図２（ｃ）に超音波照射装置１０の模式的な断面図を示す。
【００３０】
超音波照射装置１０にはマイクロプレートＰが搭載される。マイクロプレートＰは超音波効率のよい材料から形成されることが好ましい。例えば、マイクロプレートＰはポリスチレンから形成される。このようなマイクロプレートＰは金型から形成される。また、溶液が感染性物質を含む場合に備えて、マイクロプレートＰにはキャップが装着されてもよい。ここでは、超音波照射装置１０は、「マイクロプレートの複数のウェルのそれぞれに入れられたタンパク質を含む溶液に超音波を照射する超音波照射部」として機能する。
【００３１】
超音波照射装置１０は、処理槽１２および超音波振動子１４を有している。処理槽１２は、中央で内側に４５度曲げられた互いに向かい合う側板１２ａ、１２ｂと、側板１２ａ、１２ｂとそれぞれ連絡する互いに向かい合う側板１２ｃ、１２ｄと、側板１２ａ〜１２ｄと連接する底板１２ｅを有している。処理槽１２には水が入れられる。超音波振動子１４において発生した超音波は水を媒介にして伝達される。側板１２ａ、１２ｂの傾斜面１２ａ２、１２ｂ２に対し、それぞれ、垂直に、超音波振動子１４が取り付けられる。また、ここでは、傾斜面１２ａ２、１２ｂ２の内側には、超音波振動子１４の取り付けられた振動板１４ａが配置されており、超音波同士が直角に交差してエネルギーがより強力になり、アミロイド線維の効果的な破砕作業が行われる。また、処理槽１２の上部には、マイクロプレートＰが載置される。マイクロプレートＰは、各ウェルＷの先端が水に浸漬した状態でホルダー（図示せず）によって固定される。このホルダーは処理槽１２の中央部分の最も超音波を受けやすい位置に配置されている。
【００３２】
超音波振動子１４が振動して超音波を発振すると、超音波は振動板１４ａを通過して強力になって、マイクロプレートＰの各ウェルＷに向かって進行する。このとき、超音波はそれぞれの傾斜板１４ａに対して直交する方向へ進んでいくため、超音波同士は直交して交差することになる。そして、この交差地点をあらかじめ処理槽１２の中央の水面付近に設定しておき、その近傍にマイクロプレートＰの各ウェルＷが配置される。超音波は処理槽１２内の水を通過してマイクロプレートＰの各ウェルＷに到達し、さらにマイクロプレートＰの各ウェルＷ内の溶液に至り、アミロイドの形成誘導および破砕を行う。
【００３３】
なお、超音波照射装置１０には側板１２ａ、１２ｂの２ケ所に超音波振動子１４および傾斜板１４ａが配置されたが、超音波振動子１４および傾斜板１４ａは側板１２ａ、１２ｂだけでなく側板１２ｃ、１２ｄにも取付けてもよい。また、さらに強力な破砕を必要とする場合には超音波振動子１４および傾斜板１４ａは底板１２ｅにも取り付けてもよい。
【００３４】
ここで、図３を参照して、超音波の照射によるアミロイド線維のサイズの違いを説明する。図３（ａ）に、アミロイド線維のサイズおよび自由エネルギーの関係を模式的に示す。また、図３（ｂ）に超音波を照射しない場合のアミロイドのＡＦＭ像を示し、図３（ｃ）に超音波を照射した場合のアミロイドの原子間力顕微鏡像を示す。
【００３５】
過飽和状態のタンパク質を長時間（数日から数カ月）静置した場合、核形成のためのエネルギー障壁が大きいため、低い確率でエネルギー障壁を超える反応が起きて、アミロイド線維が発生する。このためにアミロイド線維の形成には数日から数カ月の長い潜伏期間が存在すると共に、実験の再現性が低い。これに対して、超音波を照射すると、核形成のためのエネルギー障壁を大幅にかつ再現性よく低下させることができる。また、超音波を照射する場合、アミロイド線維が伸長するが、大きなサイズの線維は破砕されやすい。このため、比較的均質なサイズのアミロイド線維を形成することができる。このように、超音波の照射により、アミロイドの形成を促進すると共に再現性を高めることができる。
【００３６】
［プレートリーダー］
図４にプレートリーダー２０の模式図を示す。プレートリーダー２０はマイクロプレートリーダーとも呼ばれる。ここでは、プレートリーダー２０は、「超音波の照射によってタンパク質から形成されたアミロイドとアミロイド特異性蛍光色素との結合によって発せられる蛍光を検出する蛍光検出部」として機能する。
【００３７】
プレートリーダー２０にはマイクロプレートＰが搭載されて固定される。ここでは、マイクロプレートＰは超音波照射装置１０において搭載されたものと同じものであることが好ましい。マイクロプレートＰにキャップが装着される場合、キャップの透明度が高いことが好ましい。ただし、プレートリーダー２０には、超音波照射装置１０において搭載されたものとは異なるマイクロプレートＰが搭載されてもよい。
【００３８】
プレートリーダー２０は、光源２２と、受光部２４とを備えている。例えば、受光部２４は光電子増倍管である。光源２２から出射された光のうちグレーティングによって選択された特定の波長の光が光ファイバーｆｂ１を介してマイクロプレートＰのウェルＷに照射される。ここでは、分光は２回行われる。マイクロプレートＰのそれぞれのウェルＷに対して光の照射および受光が行われる。このために、光ファイバーｆｂ１、ｆｂ２は、その先端が固定されたマイクロプレートＰの主面に対して２次元方向に動作可能なように構成されている。なお、ここでは、マイクロプレートＰを固定したまま光ファイバーｆｂ１、ｆｂ２を移動させて光の照射および蛍光の検出を行うが、マイクロプレートＰに向けて出射される光を移動させることなくマイクロプレートＰを移動させてもよい。
【００３９】
光の照射によってウェルＷ内の溶液から蛍光が発生する。発生した蛍光は光ファイバーｆｂ２を介して受光部２４に伝達され、その強度が測定される。光ファイバーｆｂ１、ｆｂ２はマイクロプレートＰのウェルＷに対応して移動することにより、プレートリーダー２０は、多数のサンプルの評価を行うことができる。なお、アミロイドアッセイ装置１００をアミロイドの基礎研究分野に用いる場合、プレートリーダー２０において、グレーティング素子を利用して波長を任意に選択することが好ましい。
【００４０】
超音波照射装置１０およびプレートリーダー２０に用いられるマイクロプレートＰが同一の場合、観測者がマイクロプレートＰを移動させてもよい。あるいは、超音波照射装置１０およびプレートリーダー２０が一体的に構成されてもよい。
【００４１】
［一体型アミロイドアッセイ装置］
図５に、超音波照射装置１０およびプレートリーダー２０の一体化された一体型アミロイドアッセイ装置１００’を示す。アミロイドアッセイ装置１００’では、マイクロプレートＰは、処理槽１２の上部に光ファイバーｆｂ１、ｆｂ２が設けられている。
【００４２】
［音波測定装置］
なお、アミロイドアッセイ装置１００及び一体型アミロイドアッセイ装置１００’は、超音波照射装置１０によってマイクロプレートＰの複数のウェルＷに照射された超音波の音圧を測定する音圧測定装置をさらに備えてもよい。音圧測定装置は、マイクロプレートＰのそれぞれのウェルＷに照射された超音波の音圧を測定する。
【００４３】
図６（ａ）に音波測定装置３０を示す。音圧測定装置３０は、センサ部３２と、電圧モニタ部３４と、電圧モニタ部３４においてモニタされた値の処理を行う処理部３６とを有している。音圧測定時には、センサ部３２をマイクロプレートＰのウェルＷ内の溶液に浸入させた状態で音圧の測定が行われる。音圧の測定と蛍光の測定とは別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。
【００４４】
センサ部３２は超音波の音圧を電位に変換し、電圧モニタ部３４にはセンサ部３２において変換された電位波形が表示される。処理部３６において、超音波の音圧、周波数および高調波成分を求めることができる。また、処理部３６においてフィルタリングや高速フーリエ変換（Ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ：ＦＦＴ）が行われてもよい。
【００４５】
図６（ｂ）にセンサ部３２の先端の一例を示す。センサ部３２は、ロッド状の本体部３２ａと、本体部３２ａの一方の先端に設けられた圧電素子３２ｂとを有している。本体部３２ａは少なくとも表面において絶縁されている。本体部３２ａは、例えば、直径約４ｍｍ、長さ約１００ｍｍのアルミナのロットである。圧電素子３２ｂは、一対の金属電極３２ｂ１、３２ｂ２と、それらの間の挟まれた圧電体３２ｂ３とを有している。金属電極３２ｂ１、３２ｂ２はそれぞれクロムと金の積層構造を有しており、その厚さは５００ｎｍである。圧電体３２ｂ３は、例えば、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、水晶またはランガサイト（Ｌａ３Ｇａ５ＳｉＯ１４）などから形成される。なお、センサ部３２の先端を含む表面は保護層３２ｃで保護されることが好ましい。保護層３２ｃは例えばエポキシ樹脂から形成される。
【００４６】
［アミロイドアッセイ方法］
以下、図７を参照して本発明によるアミロイドアッセイ方法の実施形態を説明する。
【００４７】
Ｓ２２に示すように、複数のウェルＷのそれぞれにタンパク質の溶液が入れられたマイクロプレートＰを用意する。好適には、この溶液には、アミロイド特異性蛍光色素も含まれている。例えば、アミロイド特異性蛍光色素はチオフラビンＴである。
【００４８】
次に、Ｓ２４に示すように、マイクロプレートＰの複数のウェルＷのそれぞれに入れられた溶液に超音波を照射する。上述したように、複数のウェルＷのそれぞれの溶液に照射される超音波の音圧は均一であってもよいし、不均一であってもよい。
【００４９】
次に、Ｓ２６に示すように、タンパク質から誘導されたアミロイドとアミロイド特異性蛍光色素が結合することによって発せられる蛍光を検出する。蛍光はプレートリーダー２０によって検出される。なお、最終的にタンパク質（アミロイド）および溶液は破棄される。
【００５０】
アミロイドアッセイ装置１００及び一体型アミロイドアッセイ装置１００’はタンパク質の異常凝集の研究に用いることができる。あるいは、アミロイドアッセイ装置１００及び一体型アミロイドアッセイ装置１００’はアミロイドーシス発症のリスクの判定に用いられる。
【００５１】
以上、図１から図７を参照して、本発明のアミロイドアッセイ装置及びアミロイドアッセイ方法の実施形態を説明した。
【００５２】
以下、図８から図１３を参照して、アミロイドアッセイ装置１００、１００’の適用例を説明する。
【００５３】
まず、透析アミロイドーシスの原因となるβ２ミクログロブリンのアミロイドについて、具体的に説明する。現在、国内には２６万人を超える長期血液透析患者がいる。１０年以上の長期血液透析を行う患者の多くで、骨関節の激しい痛みや変形を引き起こす「手根管症候群」が発症するが、この原因は、β２ミクログロブリンの形成するアミロイド沈着である。β２ミクログロブリンは、本来、免疫機能を担う組織適合性抗原の一成分であり、生命機能を担う必須のタンパク質である。透析患者ではβ２ミクログロブリンは分解されず、血液中のタンパク質濃度が上昇する。この状態が長年にわたって続くとアミロイド沈着を引き起こすと考えられるが、詳細な発症機構は不明である。
【００５４】
例えば、β２ミクログロブリンのアミロイド線維の形成は、試験管を静置して行うと、一般に数日から１ヶ月かかる。これに対して、アミロイドアッセイ装置１００では、β２ミクログロブリンの濃度が低くても（例えば、生体内濃度：０．０５ｍｇ／ｍｌであっても）超音波を用いてβ２ミクログロブリンのアミロイドの形成を促進する（２０分程度）だけでなく、そのアミロイドを短時間に（例えば、数百のサンプルを数分以内に）アッセイすることができる。
【００５５】
アミロイドアッセイ装置１００によってβ２ミクログロブリンのアミロイドを形成する場合、マイクロプレートＰの各ウェルＷ内の溶液に提供される音圧は、例えば、０〜０．５ＭＰａであり、さらに音圧の値を調整することができる。ここでは、例えば、マイクロプレートＰの各ウェルＷ内の溶液に提供される音圧（平均値±標準偏差）は３４６００±１７０００Ｐａであり、超音波照射装置１０による超音波振動子の振動数は１７〜２０ｋＨｚであり、超音波振動子の強度は３５０または７００Ｗａｔｔである。なお、各ウェルＷ内の溶液に提供される音圧、超音波照射装置１０による超音波振動子の振動数及び超音波振動子の強度は上述の値に限定されない。「タンパク質を含む溶液への超音波照射によって、タンパク質からアミロイドが形成される」場合には、各ウェルＷ内の溶液に提供される音圧、超音波照射装置１０による超音波振動子の振動数及び超音波振動子の強度の値は任意である。また、アミロイド特異性蛍光色素は、例えば、チオフラビンＴである。この場合、プレートリーダー２０は、励起光として波長４５０ｎｍ近傍の光を照射すると、アミロイドから発せられる波長４９０ｎｍ近傍の蛍光を検出することができる。
【００５６】
図８に超音波処理後のマイクロプレートＰの模式図を示す。ここでは、酸性条件ｐＨ２であり、タンパク質濃度０．３ｍｇ／ｍｌの溶液に１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返し行った。マイクロプレートＰの中央近傍のウェルＷではアミロイドの形成が同様に進行した。
【００５７】
図９に、アミロイド形成度合の時間変化を示す。ここでは、超音波照射の影響を調べるために、１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返したグループＡと、１０分間の超音波照射および５分間の中断を繰り返したグループＢとを比較した。１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返した場合、９０分前後でアミロイドの形成が開始するのに対し、１０分間の超音波照射および５分間の中断の繰り返した場合、２０分前後でアミロイドの形成が開始する。このように、超音波の処理時間を任意に変えることより、より効率的にアミロイドを形成することができる。グループＡおよびＢのそれぞれにおける複数の曲線は、同時に照射した超音波の音圧の近い異なる複数のウェルのデータを示す。１回の測定により、実験の再現性の高いことが理解される。なお、比較のために、超音波の照射を行うことなくマイクロプレートＰを静置したが、この場合、アミロイドは形成されなかった。
【００５８】
図１０（ａ）〜図１０（ｄ）は、それぞれ、超音波の照射時間が、０分、９０分、１２０分、２１０分の場合のアミロイドの量を示す模式図である。照射時間に応じてアミロイドの形成されるウェルが増加するとともに各ウェルにおいてもアミロイドの量が増加することが理解される。
【００５９】
ここで、図１１を参照して、アミロイドアッセイ装置１００又は一体型アミロイドアッセイ装置１００’を用いた場合の最大値を１に規格化したアミロイド形成度合の変化を説明する。図１１（ａ）にタンパク質濃度の違いに応じたアミロイドの形成度合の変化を示す。ここでは、溶液を酸性にしており、１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返している。ここでは、タンパク質濃度は０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌである。いずれの場合でも照射時間がある程度まで増大すると、アミロイドの形成度合が増大する。ただし、タンパク質濃度が高いほどアミロイドの形成度合の増加が開始する時間が短い。また、患者体内タンパク質濃度はおよそ０．０５ｍｇ／ｍｌであるが、アミロイドアッセイ装置１００を用いることにより、このような低濃度であってもアミロイドの形成を検出することができる。
【００６０】
図１１（ｂ）に、患者体内環境と同様の生理的条件におけるアミロイド形成度合の変化を示す。２つのグラフは、マイクロプレートＰの複数のウェルのうち、照射した超音波の音圧の大きさが近い２つのウェルのデータを示したものである。ここでは、タンパク質濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌであり、溶液はほぼ中性である。図１１（ａ）との比較から理解されるように多少時間はかかるものの、この場合でもアミロイドが形成されることが確認された。また、図１１（ｂ）に示すように、マイクロプレートＰの複数のウェルＷを同時に使用することによって、反応の再現性についても観測、評価し得る。
【００６１】
アミロイドアッセイ装置１００及び一体型アミロイドアッセイ装置１００’は、アミロイドーシスの予防および診断にも好適に適用することができる。具体的にはアミロイドアッセイ装置１００又は一体型アミロイドアッセイ装置１００’を用いてアミロイドーシス発症のリスクレベルを判断することができる。上述したように、超音波照射装置１０はウェルＷの溶液に不均一または均一な音圧を提供することができる。例えば、ウェルＷの溶液に照射する音圧を不均一にするか均一にするかは、超音波照射装置１０に設けられた照射状況切り替え手段によって切り替え得る。超音波照射装置１０がウェルＷの溶液に不均一な音圧を提供する場合、マイクロプレートＰの各ウェルＷに同一のサンプル（例えば、同一の被験者の血液等）を入れることが好ましい。あるいは、超音波照射装置１０がウェルＷの溶液に均一な音圧を提供する場合、マイクロプレートＰの各ウェルＷに異なるサンプル（例えば、異なる被験者の血液等）を入れることが好ましい。
【００６２】
まず、超音波照射装置１０がマイクロプレートＰのウェルＷの溶液に不均一な音圧を提供する場合を説明する。音圧は、図６を参照して上述した音圧測定装置３０において測定できる。図１２（ａ）は各ウェルの超音波の音圧分布を示す模式図であり、図１２（ｂ）はアミロイド形成度合を示す模式図である。図１２（ａ）、図１２（ｂ）において、縦軸のＡ〜ＨはマイクロプレートＰの第１列目〜第８列目に対応し、横軸の１〜１２はマイクロプレートＰの第１行目〜第１２行目に対応する。ここでは、マイクロプレートＰの各ウェルＷには同一のサンプル（例えば、同じ被験者の血液等）が入っている。図１２（ａ）および図１２（ｂ）との比較から理解されるように、音圧の高いウェル内のアミロイドほど形成度合が高いことが理解される。図１２（ｃ）に音圧とアミロイドの量との関係を示す。このように、音圧およびアミロイドの量はほぼ比例関係を有している。被験者ごとに、アミロイドーシス発症のリスクは異なるが、所定の照射時間において所定量のアミロイドの形成される音圧を特定することにより、アミロイドーシス発症のリスクレベルを特定することができる。
【００６３】
また、超音波照射装置１０はウェルＷの溶液に均一な音圧を提供する場合、マイクロプレートＰの各ウェルＷには異なるサンプルが入れられることが好ましい。具体的には、マイクロプレートＰの各ウェルＷには異なる被験者の血液等が入れられる。
【００６４】
ここで、図１３を参照して異なる被験者のアミロイドーシス発症のリスクの判定を説明する。図１３（ａ）に、異なる被験者を示す。異なる被験者から血液等を採集し、図１３（ｂ）に示すようにマイクロプレートＰの異なるウェルＷにその溶液を入れる。その後、各ウェルＷに均一な音圧の超音波を照射すると、図１３（ｃ）に示すように、アミロイドーシス発症のリスクの比較的高い被験者の溶液には所定量のアミロイドが形成される一方、アミロイドーシス発症のリスクの比較的低い被験者の溶液には所定量のアミロイドは形成されない。このため、超音波をアミロイドーシス発症のリスクの閾値となるように設定することにより、図１３（ｄ）に示すように、被験者の陽性および陰性を判定することができる。
【００６５】
なお、図５を参照して上述した一体型アミロイドアッセイ装置１００’では、プレートリーダー２０はマイクロプレートＰが処理槽１２内にある状態で溶液から発せられた蛍光を測定している。しかしながら、プレートリーダー２０は、処理槽１２の外部に移動したマイクロプレートＰの溶液から発せられた蛍光を測定してもよい。
【００６６】
図１４に、一体型アミロイドアッセイ装置１００’の模式図を示す。一体型アミロイドアッセイ装置１００’は、超音波照射装置１０と、プレートリーダー２０とを備える。例えば、プレートリーダー２０としてコロナ電気株式会社製のＭＴＰ−８１０またはＳＨ−９０００が用いられる。マイクロプレートＰとして９６個のウェルＷを有するマイクロプレートが用いられる。例えば、マイクロプレートＰは、ハーフエリア黒タイプの９６個のウェルＷを有するものであってもよい。なお、溶液をマイクロプレートＰのウェルＷに入れた後、蒸発等を防ぐために、ウェルＷを封止することが好ましい。また、封止する場合、封止部材として自家蛍光の少ないものを用いることが好ましい。
【００６７】
超音波照射装置１０は、処理槽１２と、超音波振動子１４と、マイクロプレートＰを処理槽１２内で移動させる移動部１６とを有している。処理槽１２には、例えば、水が溜められる。また、ここでも、処理槽１２の内側に振動板１４ａが設けられている。例えば、超音波照射装置１０が超音波を照射した後、移動部１６は、マイクロプレートＰを処理槽１２内から処理槽１２の外に移動させ、その後に、プレートリーダー２０は、マイクロプレートＰのウェルＷ内の溶液において発せられた蛍光を検出する。
【００６８】
以下、図１５を参照して超音波照射装置１０の一例を説明する。移動部１６は、支持部１６ｔと、支持部１６ｔに取り付けられた昇降部１６ｕと、マイクロプレートＰの載せられる固定台１６ｖとを備えている。固定台１６ｖは昇降部１６ｕに取り付けられており、昇降部１６ｕは固定台１６ｖをｚ方向に移動させる。これに伴い、マイクロプレートＰは処理槽１２内から処理槽１２の外に、または、処理槽１２の外部から処理槽１２内に移動する。
【００６９】
昇降部１６ｕにより、マイクロプレートＰは、処理槽１２内から処理槽１２の外のプレートリーダー２０（図１４）まで移動し、その後、プレートリーダー２０は、マイクロプレートＰにおけるウェルＷの溶液内のアミロイドを検出する。上述したように、アミロイド線維が誘導されると、アミロイドはアミロイド特異性蛍光色素と結合して蛍光を発し、この蛍光を測定することにより、アミロイドを検出することができる。なお、ここでは、超音波を照射する際に、マイクロプレートＰは固定したままである。
【００７０】
例えば、タンパク質としてβ２ミクログロブリンが用いられ、アミロイド特異性蛍光色素としてチオフラビンＴが用いられる。ハーフエリア黒タイプの９６個のウェルＷを有するマイクロプレートＰに、０．３ｍｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリン溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５μＭチオフラビンＴを含む、ｐＨ２．５）を２００μＬ入れる。例えば、マイクロプレートＰは温度３７℃に設定される。超音波照射装置１０は、１分間の超音波照射、および、９分間の中断を繰り返す。
【００７１】
図１６に、超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。ここでは、超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間に着目する。超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間が最も短いものは約５０分であり、ほとんどのウェル内の溶液からの蛍光強度は１８０分以内に増加を開始する。なお、本明細書の以下の説明において超音波の照射を開始してから蛍光強度の増加が開始するまでの時間をラグタイムと呼ぶことがある。
【００７２】
図１７に、ラグタイムを表したマイクロプレートＰの模式図を示す。図１７において、第１行〜第１２行のウェルをそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列のウェルをそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図１７から理解されるように、マイクロプレートＰにおいて中央付近のほとんどのウェルＷ内の溶液のラグタイムは１００分程度であり、端部近傍のウェルＷ内の溶液のラグタイムは１２０分程度である。マイクロプレートＰの端部のウェルＷ内の溶液のラグタイムは中央付近のウェルＷ内の溶液のラグタイムよりも長い。
【００７３】
なお、図１５に示した超音波照射装置１０では、処理槽１２内で超音波の照射を行った後、移動部１６は、マイクロプレートＰをプレートリーダー２０に移動させたが、本発明はこれに限定されない。超音波の照射を行っている間に、移動部１６はマイクロプレートＰを移動させてもよい。例えば、移動部１６がマイクロプレートＰを所定の点を中心に回転させ、これにより、マイクロプレートＰは回転移動してもよい。この場合、マイクロプレートＰの回転速度は０．５ｒｐｍ以上１１ｒｐｍ以下の範囲内であることが好ましく、マイクロプレートＰの回転速度は約６ｒｐｍであることがさらに好ましい。あるいは、移動部１６により、マイクロプレートＰは周回移動してもよいし、平行移動してもよい。このように、移動部１６は、処理槽１２内においてマイクロプレートＰを移動させ、これにより、マイクロプレートＰの各ウェルＷの溶液にほぼ均一に超音波を照射させることができる。
【００７４】
以下、図１８を参照して超音波照射装置１０の一例を説明する。移動部１６は、スライド部１６ｓ１と、スライド部１６ｓ１に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ１と、支持部１６ｔ１に固定されたスライド部１６ｓ２と、スライド部１６ｓ２に沿って移動可能に取り付けられた支持部１６ｔ２とを有している。支持部１６ｔ２の先端にマイクロプレートＰが載せられる。本明細書の以下の説明において、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２を第１スライド部１６ｓ１、第２スライド部１６ｓ２と呼び、支持部１６ｔ１、１６ｔ２を第１支持部１６ｔ１、第２支持部１６ｔ２と呼ぶことがある。
【００７５】
スライド部１６ｓ１に沿って支持部１６ｔ１はｙ方向に移動し、これに伴い、マイクロプレートＰも処理槽１２内をｙ方向に移動する。また、スライド部１６ｓ２に沿って支持部１６ｔ２はｘ方向に移動し、これに伴い、マイクロプレートＰも処理槽１２内をｘ方向に移動する。このように、移動部１６により、マイクロプレートＰは処理槽１２内を平面方向に移動させることができる。
【００７６】
なお、図１８を参照して説明した超音波照射装置１０では、移動部１６は、マイクロプレートＰをｘ方向およびｙ方向のそれぞれに沿って移動可能であるが、本発明はこれに限定されない。移動部１６は、マイクロプレートＰをｘ方向およびｙ方向の一方のみに沿って移動可能であってもよい。例えば、図１８を参照して説明した超音波照射装置１０から、第１スライド部１６ｓ１および第１支持部１６ｔ１が省略されてもよい。または、図１８を参照して説明した超音波照射装置１０から、第２スライド部１６ｓ２および第２支持部１６ｔ２が省略されてもよい。
【００７７】
また、図１８を参照して説明した超音波照射装置１０において、移動部１６はマイクロプレートＰを処理槽１２内で平面方向に移動させたが、本発明はこれに限定されない。移動部１６はマイクロプレートＰを垂直方向にも移動させてもよい。
【００７８】
以下、図１９を参照して超音波照射装置１０の一例を説明する。図１９に示した超音波照射装置１０において、移動部１６は、支持部１６ｔ２に取り付けられた昇降部１６ｕと、マイクロプレートＰの載せられる固定台１６ｖとをさらに備える点を除いて、図１８を参照して上述した移動部１６と同様の構成を有しており、冗長を避けるために重複する説明を省略する。
【００７９】
固定台１６ｖは昇降部１６ｕに取り付けられており、昇降部１６ｕは固定台１６ｖをｚ方向に移動させる。これに伴い、マイクロプレートＰは処理槽１２内から処理槽１２の外に、または、処理槽１２の外部から処理槽１２内に移動する。ここでは詳細な説明は省略するが、スライド部１６ｓ１、１６ｓ２および昇降部１６ｕにより、マイクロプレートＰを互いに直交する３つの方向に移動させることができる。図１９に示した超音波照射装置１０では、移動部１６は、超音波を照射する際にマイクロプレートＰを移動させるとともに、超音波の照射後に、マイクロプレートＰをプレートリーダー２０に移動させることができる。
【００８０】
ここで、図２０を参照して一体型アミロイドアッセイ装置の一例を説明する。一体型アミロイドアッセイ装置１００’は、マイクロプレートＰのウェルＷ内の溶液に超音波を照射する超音波照射装置１０と、マイクロプレートＰにおけるウェルＷの溶液内のアミロイドから発せられる蛍光を検出するプレートリーダー２０とを備えている。超音波照射装置１０は、処理槽１２および超音波振動子１４に加えて、処理槽１２内の液体の循環に用いられる循環槽１２ａと、超音波振動子１４を制御する制御部１４ｓと、超音波振動子１４を駆動する駆動部１４ｔとを有している。なお、各ウェルＷ内の溶液への超音波照射の均一性をさらに改善するために、超音波振動子１４の数はできるだけ多いことが好ましい。
【００８１】
水温を測定するために、超音波振動子１４の取り付けられた処理槽１２にセンサを取り付ける場合、センサが音波に起因して破損することがある。このため、水温を測定するセンサを循環槽１２ａに取り付け、循環槽１２ａの温度を測定することが好ましい。
【００８２】
図２１に、本実施形態のアミロイドアッセイ装置１００または一体型アミロイドアッセイ装置１００’におけるプレートリーダー２０の模式図を示す。プレートリーダー２０は、光源２２と、入力光学系Ｏａと、出力光学系Ｏｂと、受光部２４とを備えている。受光部２４として、例えば、光電子増倍管が用いられる。光源２２から出射された光は、入力光学系Ｏａを介してマイクロプレートＰのウェルＷ内の溶液に照射される。溶液から蛍光が発せられる場合、蛍光は出力光学系Ｏｂを介して受光部２４にて検出される。
【００８３】
以下、図２２を参照して、入力光学系Ｏａおよび出力光学系Ｏｂの一例を説明する。図２２に、プレートリーダー２０の模式図を示す。入力光学系Ｏａは、レンズＬ１〜Ｌ４と、スリットＳ１〜Ｓ３と、カラーフィルタＣ１と、グレーティングＧ１、Ｇ２と、ハーフミラーＨ１とを有している。出力光学系Ｏｂは、スリットＳ４〜Ｓ６と、カラーフィルタＣ２と、グレーティングＧ３、Ｇ４と、ハーフミラーＨ２とを有している。
【００８４】
例えば、光源２２から出射された光は、レンズＬ１、Ｌ２、カラーフィルタＣ１およびスリットＳ１を介してグレーティングＧ１において反射される。例えば、レンズＬ１、Ｌ２のｆ値は６０である。また。カラーフィルタＣ１により、特定の波長以外の波長の光が遮断される。反射された光はスリットＳ２を介してグレーティングＧ２において反射される。その後、光は、スリットＳ３、ハーフミラーＨ１、レンズＬ３、Ｌ４を通過し、最後に、ハーフミラーＨ２を介してマイクロプレートＰの各ウェル内の溶液に照射される。なお、ハーフミラーＨ１によって進行方向の変化された光の強度を光検出器ＰＤで検出してもよい。この強度に基づいて、マイクロプレートＰの各ウェル内の溶液に照射される光の強度の調整を簡便に行うことができる。
【００８５】
マイクロプレートＰの各ウェルＷ内の溶液から蛍光が発される場合、蛍光はハーフミラーＨ２を介して進行方向が曲げられ、スリットＳ４を介してグレーティングＧ３において反射される。反射された光はスリットＳ５を介してグレーティングＧ４において反射される。その後、光は、カラーフィルタＣ２およびスリットＳ６を介して、最終的に受光部２４に入射する。
【００８６】
以下、図２３〜図２５を参照して超音波照射時にマイクロプレートＰの移動を行った場合のアミロイド線維の誘導について説明する。超音波照射時にマイクロプレートＰの移動を行うことにより、ラグタイムを短縮するとともに、ラグタイムのバラツキを抑制できる。
【００８７】
ここでも、タンパク質としてβ２ミクログロブリンが用いられ、アミロイド特異性蛍光色素としてチオフラビンＴを用いる。ハーフエリア黒タイプの９６個のウェルＷを有するマイクロプレートＰに、０．３ｍｇ／ｍｌのβ２ミクログロブリン溶液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５μＭチオフラビンＴを含む、ｐＨ２．５）を２００μＬ入れる。例えば、マイクロプレートＰは温度３７℃に設定される。
【００８８】
移動部１６は、超音波を照射する際にマイクロプレートＰを移動させている。ここでは、移動部１６はマイクロプレートＰを回転させる。マイクロプレートＰの回転速度は約６ｒｐｍである。超音波照射装置１０は、１分間の超音波照射および９分間の中断を繰り返す。
【００８９】
図２３に、マイクロプレートＰを移動させながら超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化を示す。ここでもラグタイムに着目すると、ラグタイムの最も短いものは約５０分であり、最も長いものは約１００分である。
【００９０】
図２４に、マイクロプレートを移動させながら超音波を照射する場合のラグタイムを表したマイクロプレートの模式図を示す。図２４において、第１行〜第１２行のウェルをそれぞれ１、２、３・・・１２と示し、第１列〜第８列のウェルをそれぞれＡ、Ｂ・・・Ｈと示している。図２４から理解されるように、ほとんどのウェル内の溶液のラグタイムは７０分〜８０分程度である。
【００９１】
なお、上述した図１６および図１７には、マイクロプレートＰを固定した状態で同様に超音波を照射した場合の蛍光強度の時間変化およびマイプロプレートＰのラグタイムを示している。図１６、図１７と図２３、図２４との比較から理解されるように、マイクロプレートＰを移動させながら超音波を照射することにより、ラグタイムの平均を短縮するとともにラグタイムのバラツキを抑制することができる。
【００９２】
図２５に、ラグタイムの分布を示す。図２５には、マイクロプレートの移動の有無に応じた分布を示している。試料数はいずれも９６である。表１に、移動の有無に応じた平均ラグタイムおよび標準偏差を示す。
【表１】
0005841945.tif 000002
【００９３】
図２５および表１からも、超音波照射時にマイクロプレートを移動させることにより、ラグタイムの平均時間を短縮させるとともにバラツキを抑制できることが理解される。
【００９４】
なお、上述した説明では、タンパク質として、透析アミロイドーシスの原因となるβ２ミクログロブリンについて例示したが、本発明はこれに限定されない。他のタンパク質を用いてもよい。例えば、アルツハイマー病の原因となるアミロイドβペプチド、ＩＩ型糖尿病の原因となるＩＡＰＰ（Ｉｓｌｅｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、ＡＬアミロイドーシスの原因となる抗体Ｌ鎖、および、パーキンソン病の原因となるαシヌクレインなどを用いてもよい。アミロイドアッセイ装置１００及び一体型アミロイドアッセイ装置１００’では、超音波によってタンパク質からアミロイドの形成が促進され、形成されたアミロイドが検出される。
【００９５】
例えば、ＩＡＰＰと呼ばれるペプチドの形成するアミロイド線維はＩＩ型糖尿病の原因とされる。ＩＩ型糖尿病では、インスリンレセプターの数が減少したり、その機能が低下したりする。このような状態が続くと、すい臓でインスリンを合成するランゲルハンス島β細胞も減少、死滅する。β細胞死滅の原因として、「インスリンと共にすい臓で合成されるＩＡＰＰがアミロイド線維を形成してランゲルハンス島β細胞に沈着し、これによってβ細胞を死滅される」という説が有力である。
【００９６】
また、アルツハイマー病は、脳を構成している神経細胞が変性、死滅することによって進行する。もともと、患者の脳に老人斑と呼ばれるアミロイドβペプチドのアミロイド沈着の起きることから、アミロイドの形成が、その直接的な原因であると考えられてきたが、近年、オリゴマーと呼ばれる可溶性で比較的小さい異常凝集体が強い細胞毒性をもつことが明らかとなり、このことが、神経細胞死滅の直接的な原因と考えられている。超音波照射装置１０を用いることにより、このオリゴマーと特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）を行うことにより、オリゴマーのアッセイを行うことができる。
【００９７】
上述した説明では、超音波照射装置１０およびプレートリーダー２０はアミロイドのアッセイに用いられたが、本発明はこれに限定されない。超音波照射装置１０およびプレートリーダー２０による形成およびアッセイの対象は、アミロイドに限定されず、超音波照射装置１０によって発現し、プレートリーダー２０によって読み取り可能な任意のものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、タンパク質を含む複数の溶液のそれぞれについてアミロイドのアッセイを短時間に行うことができる。本発明によるアミロイドのアッセイは、基礎研究だけでなく予防および臨床医学の領域においても広く利用される。
【符号の説明】
【００９９】
１０    超音波照射装置
２０    プレートリーダー
３０    音圧測定装置
１００  アミロイドアッセイ装置
１００’一体型アミロイドアッセイ装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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