(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、哺乳動物の組織または器官のマトリックスを再細胞化するエクスビボの方法：
a）生理学的緩衝液で灌流された、灌流脱細胞化された哺乳動物の組織または器官のマトリックスを提供する工程；および
b）内皮細胞または内皮前駆細胞の集団を含む生理学的組成物で前記組織または器官のマトリックスの脱細胞化された血管系を順行方向および逆行方向に灌流することにより、前記脱細胞化された哺乳動物の組織または器官のマトリックスを再内皮化する工程。
【請求項２】
前記内皮細胞が、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、肝臓類洞内皮細胞、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、高増殖ECFC（HPP-ECFC）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記内皮細胞または内皮前駆細胞が、胚性幹細胞（ESC）または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する内皮細胞または内皮前駆細胞である、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記組織または器官のマトリックスが、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、筋肉、皮膚、乳房、食道、気管、または網からなる群より選択される器官に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記組織または器官のマトリックスが、灌流脱細胞化された器官のマトリックスである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記組織または器官のマトリックスと前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが異種由来である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記組織または器官のマトリックスと前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが同種由来である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
工程b）の前に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を、前記組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
工程b）の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を、前記組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
再内皮化された組織または器官が血栓形成および免疫原性を低下させる、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、参照により本明細書に組み入れられる、2010年9月1日に出願された米国仮出願第61/379,073号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
政府によって支援された研究または開発
本発明は、National Institutes of Healthにより授与されたグラント番号HL063346およびHL100407-01の下で政府の援助を受けて作成された。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本開示は、一般に、脱細胞化された組織または器官を再細胞化する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
血管が損傷されるか、または細胞外マトリックスが露出すると、血小板およびフィブリンが、損傷からの失血を防止するため、血餅を形成する。血栓症は、血栓と呼ばれる血餅が血管内に形成されることである。血管は、静脈、動脈、または毛細血管であり得る。血栓は、典型的には、様々な程度に、循環系内の血流を妨害する。インビボで凝固応答を低下させるためには、抗血栓剤および／または抗凝固剤が使用されるが、これらは、脱細胞化された器官、組織、またはスキャフォールドの移植の際に観察される血栓症の低下または排除においては有用でないことが判明している。
【発明の概要】
【０００５】
概要
一つの局面において、組織または器官のマトリックスを再細胞化する方法が提供される。そのような方法は、典型的には、組織または器官のマトリックス、例えば、灌流脱細胞化された組織または器官のマトリックスを、圧力下で生理学的緩衝液で灌流する工程；および組織または器官のマトリックスを、内皮細胞または内皮前駆細胞の集団を含む生理学的組成物で灌流することにより、組織または器官のマトリックスを再内皮化する工程を含む。分化した内皮細胞または平滑筋細胞の例示的な集団は、例えば、内皮細胞または平滑筋細胞の細胞特徴または表現型特性を区別するため、細胞タンパク質を検出する抗体を使用する二重標識免疫蛍光法および免疫ペルオキシダーゼ法を含む、当技術分野において公知の免疫細胞化学的技術を使用して検出され得る。内皮細胞についての細胞マーカーには、例えば、VEカドヘリン、CD144、CD141、CD106、またはCD142が含まれ、平滑筋細胞についての細胞マーカーには、Flkが含まれる。免疫細胞化学は、CD31およびe-NOSのような内皮細胞遺伝子の発現を検出することにより、内皮細胞を同定するためにも使用され得る。成熟内皮細胞集団には、CD45+集団のような造血細胞が比較的欠如しているはずである。内皮遺伝子mRNAに特異的なcDNAプローブまたはRNAプローブを使用したインサイチューハイブリダイゼーション組織化学も、実施され得る。これらの技術は、特定の表現型の同定を増強するため、免疫細胞化学的方法と組み合わせられ得る。上述の抗体および分子プローブは、細胞同定を補助するため、それぞれウエスタンブロット手法およびノーザンブロット手法に適用され得る。一つの態様において、実質的に純粋な集団は、少なくとも50％、60％、70％、またはそれ以上、例えば、80％、85％、90％、95％、99％、または100％、内皮細胞または内皮前駆細胞である。灌流脱細胞化とは、血管の管路を維持しながら、脱細胞化を促進するため、器官、器官の一部、または血管化組織へ脱細胞化溶液を灌流させる、哺乳動物の器官、器官の一部（一部分）、または血管化組織を脱細胞化するエクスビボの方法である。得られた脱細胞化された器官、マトリックス、組織スキャフォールド、またはグラフトは、液体または細胞が、1個または複数個の流入点、例えば、1つまたは複数の血管を介して導入され、異なる経路を通って、器官、マトリックス、組織、またはグラフトから流出することができるよう、動脈供給、毛細血管床が存在する間質空間、および静脈出力を含む血管系を保持している。主要な動脈入力を有する器官全体は、液体の完全な静脈還流を有するであろう。器官または組織の単離された一部分は、静脈還流と、組織または器官の一部分が切除されている露出した間質マトリックスを介した液体流出との組み合わせを有するであろう。器官の被膜は、存在する場合、完全なままであり、例えば、被膜を横切る水性液体の移動を促進せず、このことは、浸漬脱細胞化に供された器官とは対照的である。
【０００６】
代表的な内皮細胞には、非限定的に、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、肝臓類洞内皮細胞、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、高増殖ECFC（HPP-ECFC）、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、内皮細胞または内皮前駆細胞は、胚性幹細胞（ESC）、成体幹細胞、前駆細胞、または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する。
【０００７】
ある種の態様において、組織または器官のマトリックスは、生物学的な組織または器官のマトリックスである。ある種の態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスは、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、筋肉、皮膚、乳房、食道、気管、または網からなる群より選択される器官に由来する。ある種の態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスは、灌流脱細胞化された組織または器官のマトリックスである。
【０００８】
ある種の事例において、生物学的な組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞とは異種由来である。ある種の事例において、生物学的な組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞とは同種由来である。
【０００９】
いくつかの態様において、そのような方法は、再内皮化工程の前に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、そのような方法は、再内皮化工程の後に、内皮細胞、内皮由来細胞、未熟内皮細胞、または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む。
【００１０】
もう一つの局面において、レシピエントへの移植後の再細胞化された組織または器官における血栓形成および免疫原性を低下させる方法が提供される。そのような方法は、典型的には、組織または器官のマトリックスを圧力下で生理学的緩衝液で灌流する工程；組織もしくは器官のマトリックスを、内皮細胞または内皮前駆細胞の集団を含む生理学的組成物により灌流することにより、組織または器官のマトリックスを再内皮化する工程；および再内皮化された組織または器官のマトリックスをレシピエントへ移植する工程を含む。再内皮化された組織または器官における血栓形成性は、血小板活性化、酸化バースト、溶血、線維素溶解、フィブリン形成、トロンビンの生成、接触活性化、トロンボモジュリンアッセイ、および／または補体活性化を含むが、これらに限定されない、標準的な血液適合性の試験およびアッセイを介して査定され得る。一つの態様において、再内皮化された組織または器官のマトリックスは、移植のために適当であって、移植時に開存性を維持している。
【００１１】
代表的な内皮細胞には、非限定的に、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、肝臓類洞内皮細胞、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、高増殖ECFC（HPP-ECFC）、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、内皮細胞または内皮前駆細胞は、胚性幹細胞（ESC）、成体幹細胞、前駆細胞、または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する。
【００１２】
ある種の態様において、組織または器官のマトリックスは、生物学的な組織または器官のマトリックスである。ある種の態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスは、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、筋肉、皮膚、乳房、食道、気管、または網からなる群より選択される器官に由来する。ある種の態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスは、灌流脱細胞化された組織または器官のマトリックスである。
【００１３】
いくつかの態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞とは異種由来である。いくつかの態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞とは同種由来である。いくつかの態様において、生物学的な組織または器官のマトリックスはレシピエントに対して異種であり、かつ内皮細胞または内皮前駆細胞はレシピエントに対して同種である。
【００１４】
いくつかの態様において、そのような方法は、再内皮化工程の前に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む。いくつかの態様において、そのような方法は、再内皮化工程の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む。ある種の態様において、そのような方法は、移植工程の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む。内皮細胞、内皮由来細胞または未熟内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を含む生理学的組成物は、例えば、灌流、直接注射、局所適用、またはそれらの組み合わせを介して、組織または器官のマトリックスへ導入され得る。
【００１５】
[本発明1001]
以下の工程を含む、組織または器官のマトリックスを再細胞化するエクスビボの方法：
a）圧力下で生理学的緩衝液で灌流された組織または器官のマトリックスを提供する工程；および
b）内皮細胞または内皮前駆細胞の実質的に純粋な集団を含む生理学的組成物で前記組織または器官のマトリックスを灌流することにより、前記組織または器官のマトリックスを再内皮化する工程。
[本発明1002]
前記内皮細胞が、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、肝臓類洞内皮細胞、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、高増殖ECFC（HPP-ECFC）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記内皮細胞または内皮前駆細胞が、胚性幹細胞（ESC）または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する内皮細胞または内皮前駆細胞である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記組織または器官のマトリックスが、生物学的な組織または器官のマトリックスである、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスが、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、筋肉、皮膚、乳房、食道、気管、または網からなる群より選択される器官に由来する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスが、灌流脱細胞化された組織または器官のマトリックスである、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスと前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが異種由来である、本発明1004の方法。
[本発明1008]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスと前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが同種由来である、本発明1004の方法。
[本発明1009]
工程b）の前に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を、前記組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
工程b）の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を、前記組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
以下の工程を含む、レシピエントへの移植後の再細胞化された組織または器官における血栓形成および免疫原性を低下させる方法：
a）圧力下で生理学的緩衝液で灌流された組織または器官のマトリックスを提供する工程；
b）内皮細胞または内皮前駆細胞の実質的に純粋な集団を含む生理学的組成物で、前記組織または器官のマトリックスを灌流することにより、前記組織または器官のマトリックスを再内皮化する工程；および
c）再内皮化された組織または器官のマトリックスをレシピエントへ移植する工程。
[本発明1012]
前記内皮細胞が、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、肝臓類洞内皮細胞、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、高増殖ECFC（HPP-ECFC）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記内皮細胞または内皮前駆細胞が、胚性幹細胞（ESC）または誘導多能性幹細胞（iPSC）に由来する内皮細胞または内皮前駆細胞である、本発明1011または1012の方法。
[本発明1014]
前記組織または器官のマトリックスが、生物学的な組織または器官のマトリックスである、本発明1011〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスが、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、腸、筋肉、皮膚、乳房、食道、気管、または網からなる群より選択される器官に由来する、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスが、灌流脱細胞化された組織または器官のマトリックスである、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスと、前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが異種由来である、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスと、前記内皮細胞または内皮前駆細胞とが同種由来である、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記生物学的な組織または器官のマトリックスが前記レシピエントに対して異種であり、かつ前記内皮細胞または内皮前駆細胞が前記レシピエントに対して同種である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
工程b）の前に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、本発明1011〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
工程b）の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、本発明1011〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
工程c）の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入する工程をさらに含む、本発明1011〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を含む生理学的組成物が、灌流、直接注射、局所適用、またはそれらの組み合わせを介して、前記組織または器官のマトリックスへ導入される、本発明1020、1021、または1022の方法。
[本発明1024]
提供された組織または器官のマトリックスが、灌流脱細胞化されている、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、全て、本発明の方法および組成物が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である方法および材料が、本発明の方法および組成物の実施または試験において使用され得るが、適当な方法および材料が以下に記載される。さらに、材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定的なものではない。本明細書中に言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によりその全体が組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】パネルAは、基部から頂部へと分布する4箇所の異なる短軸位置においてDAPI陽性核を定量化することにより推定された、再細胞化された心臓構築物の全域における細胞の存在を示すグラフである（各方法につきN＝3心臓）。ラット大動脈内皮細胞（RAEC）が、単回または2回、送達された。送達された細胞の総数が、各方法について括弧内に示される。細胞の単回送達は、第3枝遠位側大動脈へのRAECの灌流（大動脈）または腕頭動脈を介した灌流（BA）のいずれかを含んでいた。2回送達においては、半分の細胞がIVCを通して送達され、続いて、半分がBAを通して送達された（BA＋IVC）。完全心臓マトリックスの全域におけるRAECの分布は、送達前に細胞をDiI（赤）およびDiO（緑）により標識することにより可視化された。パネルBおよびCにおいては、4000万個のDiI標識RAECがBAを介して送達され、パネルDおよびEにおいては、2000万個のDiO標識細胞がIVCを介して送達され、続いて、さらに2000万個のDiI標識細胞がBAを介して送達された。エラーバーは平均値の標準誤差であり、スケールバーは5mmである。*はp＞0.05を示す。
【図２】2000万個のDiO（緑）標識RAECがIVCを介して送達され、2000万個のDiI（赤）RAECがBAを介して送達され、脱細胞化されたスキャフォールドへの播種の7日後に可視化された写真である（パネルA〜E）。標識されたRAECは、心室壁（パネルA〜C）および心内膜表面（パネルD〜E）において異なる分布で見られた。DAPI陽性核は青色（パネルA〜E）である。パネルA〜Eにおけるスケールバーは50ミクロンである。
【図３】パネルA〜Dは、BA（4000万細胞、パネルA〜B）またはBAおよびIVC（各注射2000万、パネルC〜D）を介してRAECを再播種された、脱細胞化されたラット心臓ECMの組織学的査定を示す写真である。パネルAおよびCは、ヘマトキシリン・エオシン染色された切片であり、パネルBおよびDは、ヴァーヘフ-ヴァン・ギーソン（Verhoeff-van Gieson）染色されたものである。LV壁およびRV壁について血管径が定量化され、サイズによって分類された。そのデータがパネルEに示される（各データセットN＝3）。スケールバーは250ミクロンである。エラーバーは平均値からの1標準偏差である。*は所定の血管径についての送達法間の統計的有意差（p＜.001）を示す。
【図４】0日目に、BAへの注入を介して4000万個のRAECを播種された（パネルA）、またはIVCへの注入を介して3000万個のRAECを播種された（パネルBおよびC）、脱細胞化されたラット心臓構築物の写真である。7日目に、生細胞を蛍光標識（緑）するため、大動脈を介して生体色素CMFDAにより心臓構築物を灌流した。CMFDA陽性RAECは、送達経路に関係なく、心室壁（パネルAおよびB）ならびに心臓構築物の心内膜表面（パネルC）に見られた。アポトーシスによる細胞死がTUNEL染色により調査された（パネルD〜I）。パネルD〜Fは、BAによって細胞を送達された構築物についての代表的な左心室、中隔、および右心室の短軸像である。パネルG〜Iは、BAおよびIVCによって細胞を播種された構築物についての左心室、中隔、および右心室のTUNEL像である。細胞核はDAPI（青）により染色され、TUNEL陽性染色は赤色である。経時的な細胞生存能の変化をさらに定量化するため、培地を毎日採取し、G6PDH活性を定量化した（パネルJ）（N＝6）。エラーバーは、平均値からの1標準偏差を表す。パネルA〜Cにおいて、スケールバーは100ミクロンを表し、パネルD〜Iにおいて、スケールバーは250ミクロンを表す。＃はTUNEL陽性染色を意味する。パネルJはデータのグラフ表示である。
【図５】細胞が、依然として生存可能であり、増殖性であり（パネルA、緑はCMFDAであり、赤はPCNAである）、機能的に活性なECのマーカーを発現している（パネルB、赤はeNOSであり、緑はCMFDAであり、青はDAPIである；パネルC、赤はvWFであり、緑はCMFDAであり、青はDAPIである）ことを示す、脱細胞化された心臓スキャフォールドにおける7日後のRAECの組織化学的染色の写真である。再内皮化されたマトリックスは、依然として、トロンボモジュリンシグナル伝達を介してスキャフォールドの血栓形成性を低下させることができた（パネルD、無細胞対照についてはN＝6、BAおよびBA＋IVCについてはN＝8）。各方法について送達されたRAECの総数が括弧内に示される。*は無細胞対照と比較してp＜.05であることを示す。エラーバーは平均値の標準誤差である。スケールバーは100ミクロンを表す。
【図６】異所移植の7日後の、無細胞スキャフォールドの外植片（パネルA〜D）と再内皮化構築物の外植片（パネルE〜H）との間の比較を示す写真である。無細胞スキャフォールド（それぞれパネルAおよびB）および再内皮化された構築物（それぞれパネルEおよびF）の大動脈および左心室の肉眼調査は、血栓形成の減少を明らかにした。無細胞スキャフォールド（パネルC〜D）および再内皮化構築物（パネルG〜H）のヘマトキシリン・エオシン染色は、無細胞スキャフォールドにおける血液がより疎性であったこと、ならびに無細胞スキャフォールド外植片および再内皮化スキャフォールド外植片の両方における動員された細胞の量が比較可能であったことを明らかにした。*は構築物内の開存性の血管を示す。スケールバーは、パネルA、B、E、およびFにおいては1mm、パネルCおよびGにおいては250ミクロン、パネルDにおいては50ミクロン、パネルHにおいては100ミクロンを示す。
【図７】移植の7日後の、無細胞スキャフォールド（パネルA）および再内皮化構築物（パネルB）のVEGF-R2（赤）染色の写真である。移植の7日後の、無細胞スキャフォールド（パネルC）または再内皮化構築物（パネルD）のPECAM（赤）染色。DAPI陽性核は青色である。スケールバーは100ミクロンを表す。*は血液自己蛍光を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
再細胞化された組織または器官のマトリックスの血栓症は、血液を含む組織または器官の移植および再灌流の後に起こることが報告されている現象である。さらに、移植された組織または器官は、しばしば、免疫原性であり、レシピエントは、しばしば、移植された組織または器官に対する炎症応答を開始する。組織または器官のマトリックスが後に宿主へ移植され、血液により再灌流された時の血栓形成性の低下をもたらす、組織または器官のマトリックスを再細胞化する方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載された再細胞化の方法は、移植され血液により再灌流された時、限定された炎症を示す組織および器官ももたらす。
【００１８】
本明細書に記載される組織または器官のマトリックスを再細胞化する方法は、生物学的な組織または器官のマトリックスを利用することができる。代表的な生物学的な組織および器官のマトリックスには、例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、脾臓、子宮、膀胱、食道、気管、脊髄、関節（例えば、膝、肩、または腰）、皮膚、乳房、筋肉、腸、網、および脂肪組織が含まれる。生物学的なマトリックスには、例えば、細胞により分泌またはリモデリングされたコラーゲンマトリックスも含まれ得る。本明細書に記載される生物学的なマトリックスの再細胞化は、典型的には、マトリックスが、生存可能細胞を欠いているかまたは少なくとも実質的に欠いていることを必要とする。
【００１９】
生物学的な組織および器官は、多数の公知の方法を使用して脱細胞化され得る。例えば、生物学的な組織および器官は、灌流法を使用して脱細胞化され得る。灌流に基づく脱細胞化法の説明に関しては、例えば、WO2007/025233およびOttら（2008,Nat.Med.,14:213-21）を参照のこと。灌流脱細胞化法は、再細胞化のための極めて優れたマトリックスを作製することが示されている。例えば、WO2007/025233；Ottら（2008,Nat.Med.,14:213-21）；Uygun et al.,2010,Nat.Med.,16(7):814-20；Petersen et al.,2010,Science,e-pub June；およびOtt et al.,2010,Nat.Med.,e-pub Julyを参照のこと。
【００２０】
灌流に基づく脱細胞化の代わりに、生物学的な組織または器官は、細胞を除去する脱細胞化溶液への浸漬によって脱細胞化されてもよい。例えば、米国特許第6,376,244号および第6,753,181号を参照のこと。さらに、生物学的な組織および器官のマトリックスを利用する代わりに、本明細書に記載された再細胞化の方法は、合成の組織または器官のマトリックスを利用することができる。ただし、そのような合成マトリックスは血管床型構造を保有していなければならない。代表的な合成の組織および器官のマトリックスには、例えば、ハイドロゲル、ポリマー（例えば、生分解性のPLGA、PLA、またはポリウレタンのような耐久性ポリマー）、コラーゲンスキャフォールド、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、およびそれらの組み合わせを含むECMマトリックススキャフォールドが含まれる。
【００２１】
本明細書に記載される組織または器官のマトリックスを再細胞化する方法は、組織または器官のマトリックスを圧力下で生理学的緩衝液で灌流する工程を含む。組織または器官のマトリックスのこの圧力下での灌流は、マトリックスへ細胞を導入する前に実施され、WO2007/025233に記載された脱細胞化過程において使用される灌流と同様に、器官または組織のマトリックスの血管系またはその他の管腔構造もしくは導管構造（例えば、肺の気管、肝臓の胆管、腎臓の尿道等）を介してなされ、一般に、器官または組織のマトリックスの血管系（例えば、動脈、静脈、細動脈、小静脈、および毛細血管）ならびに／またはその他の管腔および／もしくは導管（以後、「血管系型」構造と呼ぶ）のカニューレ挿入により開始する（約1〜約300Hg）。このように、カニューレ挿入には、液体、物質、または老廃物を導入するかまたは除去するための、気管、膀胱、または血管のような身体の導管、腔、または脈管へのカニューレの挿入が含まれる。本明細書において使用されるように、器官または組織のマトリックスの圧力下での灌流とは、組織または器官のマトリックスの中の血管系および血管系型構造が開き拡大したままであるために十分であるが、組織または器官のマトリックスの血管系または血管系型構造の傷害または膨脹を引き起こすほどには高くない圧力の下で、液体組成物（例えば、生理学的緩衝液）を送達することをさす。組織または器官のマトリックスの圧力下での細胞前灌流（pre-cellular perfusion）のために適当な生理学的緩衝液は、組織または器官のマトリックスと適合性の任意の緩衝液であり得る。例えば、生理学的緩衝液は、糖および炭水化物のような栄養素を含んでいてよく、例えば、血管新生を誘導する化合物（例えば、VEGF、FGF-1、および／またはbFGF）のような、内皮促進因子（例えば、内皮細胞または内皮に対して正の効果を有する化合物）も含んでいてよい。生理学的緩衝液は、一般に、生理学的pHである。
【００２２】
一つの態様において、細胞前灌流または細胞灌流のために適当な生理学的緩衝液には、移植を含む器官の灌流および／または保存のために利用され得る、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、またはEGM-2、EGM-2MV、DMEM、PromoCell Endothelial Cell Medium、Medium 200、DMEMF/12を含むが、これらに限定されない、内皮細胞培養に適した培養培地溶液、栄養補助剤、例えば、グルコースを含む緩衝液が含まれるが、これらに限定されない。それらには、例えば、心組織の場合、以下の組成：118mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、25mM NaHCO3、11mMグルコース、1.75mM CaCl2、および2.0mMピルビン酸、および5U/Lインスリンの改変クレブス-ヘンゼライト（Krebs-Henseleit）緩衝液、または95％O2、5％CO2ガスで処理された118mM NaCl、4.7mM KCl、25mM NaHCO3、1.2mM MgSO4,1.2mM KH2PO4、2mM CaCl2を含有しているクレブス緩衝液；またはグルコース（例えば、11mM）または1mMもしくは1.2mMパルミチン酸と組み合わせられたグルコースが含まれる。腎組織のための例示的な培地は、KPS-1腎臓灌流溶液である。肝組織のための例示的な培地は、2％BSAが補足された118mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM MgSO4、1.2mM KH2PO4、26mM NaHCO3、8mMグルコース、および1.25mM CaCl2を含有しているクレブス-ヘンゼライト緩衝液である。
【００２３】
特定の機序に拘束はされないが、この圧力下での細胞前灌流は、マトリックス、具体的には、組織または器官のマトリックスの血管床を開き、洗い流し、それにより、再内皮化の際により多くのマトリックスを細胞に曝し、組織または器官のマトリックスの血管系の全域における生存可能内皮の確立を可能にすると考えられる。（例えば、異なる起源、例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓等に由来する）異なる組織および器官のマトリックスは、異なる量の圧力に耐え得ることが、当業者により理解されるであろう。特定の組織または器官のマトリックスが耐え得る圧力の量は、その特定の組織または器官のマトリックスの血管床に、少なくとも一部分、関係している。
【００２４】
本明細書に記載される組織または器官のマトリックスを再細胞化する方法は、内皮細胞、内皮由来細胞、未熟内皮細胞、または内皮前駆細胞による、組織または器官のマトリックスの再内皮化も含む。内皮細胞の起源には、自己採集、例えば、生検から入手されたものが含まれる。自己内皮細胞は、動脈、静脈、または特定の組織の生検を介して患者から採集され、集団の正常な増幅のため細胞培養物中に置かれる。内皮細胞の選択は、VEGFもしくはbFGFが平滑筋細胞を含む夾雑細胞集団を抑制する培養条件を通して、または直接FACS分取、もしくは磁性ビーズ、マイクロフルイディクス、ラブオンチップ（lab-on-a-chip）、アフィニティカラム、もしくはCD31、VEGFR-1、VEGFR-2、CD105、CD144、TEM7、CD146、および／もしくはD2-40を含むが、これらに限定されない、一般に認められている内皮細胞表面マーカーのいずれかに基づき純粋な内皮細胞集団を選択するための関連装置のような、その他の利用可能なエクスビボ選択法を通して達成される。
【００２５】
内皮前駆細胞（EPC）は、増殖し、遊走し、および内皮細胞へ分化する能力を有するが、成熟内皮細胞の特徴を未だ獲得していない未熟内皮細胞である。EPCは、例えば、組織損傷のようなある種の生理学的刺激に応答して、骨髄から末梢血へ動員される場合がある（循環EPC）。循環EPCは、成人ヒト血液において同定され（Asahara et al.(1997)Science 275:964-967）、その後の研究は、内皮の完全性および機能の維持、ならびに出生後の新血管新生におけるEPCの役割を示唆した。EPCは、血液、骨髄、または臍帯血から単離され得、成人ヒト末梢単核細胞の中のCD34+細胞画分に同定される。これらは、直接FACS分取、または磁性ビーズ、マイクロフルイディクス、ラブオンチップ、アフィニティカラム、もしくは関連装置のようなその他の利用可能なエクスビボ選択法を介して、単独で、または末梢血中のEPCリッチ細胞画分としてのKDR+と組み合わせて、CD34+細胞またはCD133+細胞を使用して、単離され得る。次いで、EPCを、直接マトリックスへ灌流させ、増殖および分化を支援する適切な条件の下で培養することもできるし、または全細胞数を増加させるため、EPC維持培養培地においてインビトロ培養することもできる。例えば、初期増大期に無血清StemSpan（登録商標）培地（StemCell Technologies,Vancouver,Canada）において7日間培養し、1％ペニシリン-ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich,St.Louis,USA）および組換えヒト（rh）Flt-3リガンド（100ng/mL）、rh幹細胞因子（100ng/mL）、rh IL-3（20ng/mL）、rh IL-6（20ng/mL）を補足する。次いで、これらの細胞を、EPCとしてマトリックスへ灌流させてもよいし、またはECへ予め分化させ、マトリックスへ灌流させてもよい。EPCの分化は、FBS（2％）、ヒドロコルチゾン、hFGF、VEGF、R3-IGF-1、アスコルビン酸、hEGF、ゲンタマイシン、アンフォテリシンB、およびヘパリン（Lonza,Basel,Switzerland）を含有している内皮細胞成長培地-2（EGM-2）における約3×105〜約1×106/1.5mL/9.6cm2の培養のような方法を通して、達成され得る。3日間の培養の後、細胞を収集し、約1×106細胞/1.5mL/9.6cm2の密度で、フィブロネクチン（10μg/ml）（Sigma-Aldrich,St.Louis,USA）によりコーティングされたプレートに移し、新鮮EGM-2培地においてさらに3日間培養することができる。
【００２６】
同種の内皮細胞または内皮前駆細胞の集団が使用されてもよく、レシピエントのものと同種である組織から調製され、レシピエントの組織適合性型と精密にマッチさせるため、組織適合試験の周知の方法により使用について試験される。これらには、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）、免疫原性を低下させるため遺伝的に改変された内皮細胞、HLA適合内皮細胞、臍帯血由来内皮細胞、EPC由来EC、前駆細胞、iPS、または胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。大部分の同種アプローチは、移植後に免疫抑制剤の使用を必要とするであろう。最近の研究は、移植後に免疫抑制が必要とされない、EPC由来ECの免疫特権性を証明した（Cardiovasc Res.2010 Oct 1;88(1):121-9.Epub 2010 Apr 13）。EPC分化法の例には、Pancoll rat（PAN-Biotech）による密度勾配遠心による血液からのEPCの単離、およびCD45モノクローナル抗体を使用したCD45枯渇の実施が含まれる。20mg/mLフィブロネクチンによりコーティングされたディッシュにおいて、内皮分化培地［5％FCS、50mg/mLゲンタマイシン、10ng/mLラットVEGF、1ng/mLウシbFGF、10ng/mLマウスIGF-1（いずれもR&D Systems）、10ng/mLマウスEGF、および1mg/mLヒドロコルチゾンが補足されたEBM］中で、CD45(-)画分を培養する。4日毎に培地交換により非付着細胞を除去する。増幅中の細胞クラスターが、約15〜約22日間の培養の後に出現し、それを、トリプシン処理によりクローニングリング内に採取する。PECAM-1抗体およびIgG1 MicroBeadsを使用したMACS分離により、PECAM-1(+)細胞を選択する。PECAM-1(+)画分を、最長25代目までさらに培養することができ、複数のマトリックスに灌流させることができる。
【００２７】
さらに、免疫抑制技術を利用する代わりに、Smithies et al.,317 Nature 230-234(1985)により教示され、細胞株における遺伝子交換またはノックアウトに拡張された（Zheng et al.,88 Proc.Natl.Acad.Sci.8067-8071(1991)）、幹細胞における相同組換えを使用した遺伝子交換またはノックアウトの方法を、主要組織適合性複合体（MHC）遺伝子のアブレーションのため、内皮細胞および内皮由来細胞に適用することができる。MHC発現を欠く細胞は、レシピエントを免疫抑制する必要なしに、同種間の、おそらくは異種間ですら、組織適合性の障壁を越えて、濃縮された内皮細胞集団のグラフティングを可能にする。ドナー細胞の抗原性を低下させるための組換え法の使用に関する一般的な概説および引用は、Gruber,54 Transplantation 1-11(1992)によっても開示されている。表面修飾による移植片の免疫原性の低下のための例示的なアプローチは、PCT国際特許出願WO92/04033およびPCT/US99/24630により開示されている。あるいは、MHC抗原が改変されているかまたは欠失しているトランスジェニック動物から細胞を調製することにより、グラフトの免疫原性を低下させることもできる。
【００２８】
内皮細胞前駆細胞には、内皮細胞コロニー形成単位（CFU-EC）、循環血管新生細胞（CAC）、循環内皮前駆細胞（CEP）、内皮コロニー形成細胞（ECFC）、低増殖能ECFC（LPP-ECFC）、および高増殖ECFC（HPP-ECFC）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
一つの態様において、内皮細胞および内皮前駆細胞は、幹細胞を内皮系統へ向けるための適切な条件の下で、胚性幹細胞（ESC）または誘導多能性幹細胞（iPSC）を培養することにより入手される。内皮前駆細胞は、内皮細胞へ分化し始めたが（例えば、系統を制限された；例えば、内皮細胞になるよう運命付けられた細胞）、完全分化内皮細胞とは見なされない細胞である。例えば、内皮前駆細胞は、CD133のような前駆細胞マーカーを発現している場合があり、血小板内皮細胞接着分子-1（PECAM1；別名CD31）、VEGFR-1（別名Flt-1）、VEGFR-2（別名Flk-1）、グアニル酸結合タンパク質-1（GBP-1）、トロンボモジュリン（別名CD141）、VEカドヘリン（別名CD144）、フォンビルブラント因子（vWF）、および細胞間接着分子2（ICAM-2）のような（これらに限定されない）、内皮細胞マーカーも発現している場合がある。一般に、内皮前駆細胞は、アセチル化LDLを取り込むこともでき、さらに、VEGFに向かって遊走し、かつ／またはマトリゲル上でチューブを形成することができる。
【００３０】
ヒトESCおよびヒトiPSCのようなESCまたはiPSCは、完全分化内皮細胞をもたらす条件、例えば、VEGFおよびbFGFの下で、さらに培養され得る。付加的にまたは代替的に、内皮細胞は、骨髄、血液、皮膚、肝臓、心臓、肺、網膜、および内皮細胞を保持するその他の組織または器官のような多数の起源から入手されてもよい。例えば、代表的な内皮細胞には、非限定的に、血液内皮細胞、骨髄内皮細胞、循環内皮細胞、ヒト大動脈内皮細胞、ヒト脳微小血管内皮細胞、ヒト皮膚微小血管内皮細胞、ヒト腸微小血管内皮細胞、ヒト肺微小血管内皮細胞、ヒト微小血管内皮細胞、肝類洞内皮細胞、ヒト伏在静脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞、リンパ管内皮細胞、微小脈管内皮細胞、微小血管内皮細胞、肺動脈内皮細胞、網膜毛細血管内皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、血管内皮細胞、臍帯血内皮細胞、およびそれらの組み合わせが含まれる。当業者が理解するように、これは内皮細胞の網羅的なリストではない。
【００３１】
EPCは、密度勾配遠心により末梢血単核細胞（PBMC）を単離することにより、末梢血から入手され得る。細胞懸濁物を、細胞を維持することができる容器、具体的には、培養フラスコ、培養プレート、またはローラーボトル、より具体的には、25cm2培養フラスコのような小さな培養フラスコに播種する。懸濁培養される細胞は、およそ5×104〜約2×105細胞/mL（例えば、約1×105細胞/mL）で再懸濁させられ得る。固定基質上に播種される細胞は、およそ2〜約3×103細胞/cm2で蒔かれ得る。任意で、培養プレートは、コラーゲンのようなマトリックスタンパク質によりコーティングされる。細胞は、グルタミンおよびその他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル、およびトランスフェリンのようなタンパク質等のような細胞代謝のために必要とされる補助剤を含有している、HEM、DMEM、RPMI、F-12等を含む、細胞成長を支持することができる公知の培養培地に置かれ得る。培養培地は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等のような、酵母、細菌、および真菌による夾雑を防止するための抗生物質も含有していてよい。培養培地は、ウシ、ウマ、ニワトリ等に由来する血清を含有していてもよい。培養条件は、一般に、生理学的条件に近似しているべきである。培養培地のpHは、生理学的pHに近似しているべきである（例えば、pH6〜8、約pH7〜7.8、またはpH7.4）。生理学的温度は、約30℃〜40℃の範囲である。EPCは、約32℃〜約38℃（例えば、約35℃〜約37℃）の温度で培養され得る。
【００３２】
任意で、培養培地は、少なくとも1種の増殖誘導性（「分裂促進性」）成長因子を補足される。「成長因子」とは、EPCに対する成長増殖誘導効果、分化誘導効果、または栄養効果を有する、タンパク質、ペプチド、またはその他の分子である。「増殖誘導性成長因子」とは、EPCが増殖することを可能にする栄養因子であり、細胞の表面上の受容体に結合して、細胞に対して栄養効果または成長誘導効果を発揮する任意の分子を含む。増殖誘導性成長因子には、EGF、アンフィレギュリン、酸性繊維芽細胞成長因子（aFGFまたはFGF-1）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bFGFまたはFGF-2）、トランスフォーミング成長因子α（TGFα）、VEGF、およびそれらの組み合わせが含まれる。成長因子は、通常、約1fg/mL〜1mg/mLの範囲の濃度で培養培地に添加される。約1〜100ng/mLの濃度が、通常、十分である。単純な滴定アッセイが、特定の成長因子の最適濃度を決定するため、容易に実施され得る。成長因子および栄養因子の生物学的効果は、一般に、細胞表面受容体との結合を通して媒介される。多数のこれらの因子について受容体が同定されており、特定の受容体のための抗体および分子プローブが利用可能である。EPCは、分化の全ての段階で、成長因子受容体の存在について分析され得る。多くの場合に、特定の受容体の同定により、外因性の成長因子または栄養因子の添加による、特定の発生経路に沿った細胞のさらなる分化において使用するための戦略についての案内が提供される。
【００３３】
一般に、インビトロで約3〜10日後、培地を吸引し、新鮮な培地を培養フラスコに添加することにより、EPCの培養培地を補充する。任意で、吸引された培地を、収集し、ろ過し、後にEPCを継代するための条件培地として使用する。例えば、10％、20％、30％、40％、またはそれ以上の条件培地が使用される。EPC細胞培養物は、増殖を再開させるために容易に継代され得る。例えば、インビトロで約3〜約7日後、培養フラスコをよく振とうし、次いで、EPCを50mL遠心管に移し、低速で遠心分離する。培地を吸引し、EPCを少量の培養培地に再懸濁させ、次いで、増殖を再開させるため、細胞を計数し、所望の密度で再び蒔く。この手法を、各代において、生存可能細胞の数の指数関数的な増加をもたらすため、毎週、繰り返すことができる。所望の数のEPCが入手されるまで、その手法を継続する。
【００３４】
EPCおよびEPC子孫は、必要とされるまで、当技術分野において公知の任意の方法によって凍結保存され得る（例えば、米国特許第5,071,741号、PCT国際特許出願WO93/14191、WO95/07611、WO96/27287、WO96/29862、およびWO98/14058、Karlsson et al.,65 Biophysical J.2524-2536(1993)を参照のこと）。EPCは、特定の凍結保存剤を含有している、等張溶液、好ましくは、細胞培養培地に懸濁させられ得る。そのような凍結保存剤には、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール等が含まれる。これらの凍結保存剤は、5〜15％（例えば、8〜10％）の濃度で使用され得る。細胞は、-10℃〜-150℃（例えば、-20℃〜-100℃または-70℃〜-80℃）の温度に徐々に凍結させられる。
【００３５】
培養条件に依って、EPCは、内皮細胞または平滑筋細胞へ分化することができる。EPCは、分化誘導性成長因子を含む培養培地において、固定基質上で、内皮細胞または平滑筋細胞EPCへ分化することができる。EPCの分化は、イノシトール三リン酸および細胞内Ca2+の遊離、ジアシルグリセロールの遊離、ならびにプロテインキナーゼCおよびその他の細胞キナーゼの活性化等を含む、成長をもたらす生物学的イベントのカスケードを活性化する、当技術分野において公知の任意の方法によっても誘導され得る。ホルボールエステル、分化誘導性成長因子、およびその他の化学的シグナルによる処理が、分化を誘導することができる。EPCの増殖のための増殖誘導性成長因子（上記参照）の代わりに、分化誘導性成長因子を、EPCの分化に影響を及ぼすために培養培地に添加することができる。その他の分化誘導性成長因子には、血小板由来成長因子（PDGF）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）、トランスフォーミング成長因子β（TGFβ）、インスリン様成長因子（IGF-1）等が含まれる。
【００３６】
分化した内皮細胞または平滑筋細胞は、当技術分野において公知の免疫細胞化学的技術を使用して検出され得る。免疫組織化学（例えば、二重標識免疫蛍光および免疫ペルオキシダーゼ法）は、内皮細胞または平滑筋細胞の細胞特徴または表現型特性を区別するため、細胞タンパク質を検出する抗体を使用する。内皮細胞についての細胞マーカーには、例えば、VEカドヘリン、CD144、CD141、CD106、またはCD142が含まれ、平滑筋細胞についての細胞マーカーには、Flkが含まれる。免疫組織化学は、CD31およびe-NOSのような内皮細胞遺伝子の発現を検出することにより、内皮細胞を同定するためにも使用され得る。
【００３７】
内皮遺伝子mRNAに特異的なcDNAプローブまたはRNAプローブを使用したインサイチューハイブリダイゼーション組織化学も、実施され得る。これらの技術は、特定の表現型の同定を増強するため、免疫細胞化学的方法と組み合わせられ得る。必要であれば、上述の抗体および分子プローブは、細胞同定を補助するため、それぞれウエスタンブロット手法およびノーザンブロット手法に適用され得る。
【００３８】
内皮細胞は、例えば、世界中の多くの生物学的材料寄託機関のうちの一つから入手され得る。例えば、American Type Culture Collection（ワールドワイドウェブ上のATCC.org）またはInternational Depositary Authority of Canada（IDAC；ワールドワイドウェブ上のnml-lnm.gc.ca）を参照のこと。内皮細胞または内皮前駆細胞は、移植される組織または器官のマトリックスのレシピエントになるであろう個体から入手されてもよい。これらの細胞は、そのレシピエントにとって自己であると見なされるであろう。さらに、ある種の環境の下で、組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞との間の関係は、同種（即ち、同一種からの異なる個体）であってもよく；その他の場合において、組織または器官のマトリックスと内皮細胞または内皮前駆細胞との間の関係は、異種（即ち、異なる種からの個体）であってもよい。ある種の事例において、組織または器官のマトリックスはレシピエントと異種であり、かつ内皮細胞または内皮前駆細胞はレシピエントと同種である。
【００３９】
内皮細胞または内皮前駆細胞を含む組成物は、典型的には、生理学的条件（例えば、37℃）の下で、細胞と適合性の溶液で（例えば、生理学的組成物で）組織または器官のマトリックスへ送達される。生理学的組成物には、本明細書において言及されるように、非限定的に、緩衝液、栄養素（例えば、糖、炭水化物）、酵素、増大および／もしくは分化のための培地、サイトカイン、抗体、リプレッサー、成長因子、塩溶液、または血清由来タンパク質が含まれ得る。本明細書において使用されるように、内皮細胞または内皮前駆細胞「から本質的になる」組成物とは、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞を実質的に含んでいないが、生理学的組成物に見出され得る成分のいずれか（例えば、緩衝液、栄養素等）を含んでいてもよい組成物である。
【００４０】
再内皮化を最適化するため、内皮細胞または内皮前駆細胞は、一般に、灌流により器官または組織のマトリックスへ導入される。細胞前灌流と同様に、そしてWO2007/025233に記載されるように、灌流は、器官または組織のマトリックスの血管系または血管系型構造（例えば、その他の管腔または導管）を介して起こる。器官または組織のマトリックスを再内皮化するための灌流は、血管系および血管系型構造に細胞の生理学的組成物を循環させるために十分な流速でなされければならない；しかしながら、組織または器官のマトリックスを再内皮化するための灌流は、典型的には、圧力をほとんどから全くかけずに（例えば、血管床を拡大させ洗い流すための細胞前灌流工程において使用されるより低い圧力の下で）実施される。内皮細胞または内皮前駆細胞による灌流は、再内皮化をさらに最適化するため、多方向性（例えば、順行性および逆行性）であってもよい。
【００４１】
再内皮化のため組織または器官のマトリックスへ導入される内皮細胞または内皮前駆細胞の数は、器官または組織（例えば、どの器官もしくは組織であるか、器官もしくは組織のサイズおよび重量、器官もしくは組織の発生段階、ならびに／または器官もしくは組織の血管新生の程度）、ならびに内皮細胞、内皮由来細胞、未熟内皮細胞、または内皮前駆細胞の型および発生段階の両方に依存する。さらに、複数の型の内皮細胞または内皮前駆細胞（例えば、内皮細胞または内皮前駆細胞のカクテル）を、器官または組織のマトリックスへ灌流させることができる。異なる型の内皮細胞または内皮前駆細胞は、それらの細胞が到達するであろう集団密度に関して異なる傾向を有する可能性があり、同様に、異なる器官または組織のマトリックスは、異なる密度で再内皮化される可能性がある。単なる例として、少なくとも約100（例えば、少なくとも約103、104、105、106、107、109、または1010）個の内皮細胞または内皮前駆細胞を、器官または組織のマトリックスへ導入することができる。
【００４２】
植え込み前に、マトリックスまたはグラフトは、内皮細胞についての細胞マーカーの発現により定義されるような成熟内皮細胞を過半数で含有しているべきである。内皮細胞についての細胞マーカーには、例えば、VEカドヘリン、CD144、CD141、CD106、またはCD142が含まれる。CD31およびe-NOSのような内皮細胞遺伝子の発現を検出することにより、内皮細胞を同定するためにも、免疫細胞化学が使用され得る。非破壊的な内皮単離の方法は、内皮細胞の小画分＜0.01％を除去することを可能にするための、トリプシン（0.25％以下）の短時間灌流またはその他の細胞剥離法であろう。次いで、それらの内皮細胞を、CD105、CD31を含むが、これらに限定されない内皮細胞マーカーの発現およびe-NOSの機能的な発現についてアッセイすることができる。さらに、マトリゲルアッセイにおける内皮チューブ形成を通して、内皮細胞の機能を査定することもできる。簡単に説明すると、96穴プレートのウェルを、50μLの氷冷Matrigel（商標）によりコーティングした後、37℃で1時間インキュベートする。その後、約25,000〜約50,000個の内皮細胞を含有しているEGM-2培地100μLをMatrigel（商標）に添加する。5％CO2を含む37℃の加湿雰囲気において16時間、インキュベーションを実施する。チューブ形成を倒立顕微鏡により査定し、各単一ウェルのディジタル顕微鏡写真を4倍の倍率で撮り、チューブの総数、分岐点、チューブの長さ、およびチューブの長さの合計を、各ウェルについて計算することができる。内皮チューブの存在が、機能的な内皮細胞を定義する。さらに、再内皮化の測定は、血小板活性化、酸化バースト、溶血、線維素溶解、フィブリン形成、トロンビンの生成、接触活性化、および補体活性化を含むが、これらに限定されない、標準的な血液適合性の試験およびアッセイの使用を通して完了され得る。非破壊的な方法には、ネイティブ組織の既知の値へ外挿され得る、マトリックス内に存在する内皮細胞の密度を決定するための、CellTiter Blueまたはその他の代謝アッセイのような増殖アッセイの使用が含まれる。目標は、ネイティブ組織の＞50％の内皮細胞密度を有することである。
【００４３】
再内皮化の測定は、血小板活性化、酸化バースト、溶血、線維素溶解、フィブリン形成、トロンビンの生成、接触活性化、および補体活性化を含むが、これらに限定されない、標準的な血液適合性の試験およびアッセイの使用を通して実施され得る。非破壊的な方法には、ネイティブ組織の既知の値へ外挿され得る、マトリックス内に存在する内皮細胞の密度を決定するための、CellTiter Blueまたはその他の代謝アッセイのような増殖アッセイの使用が含まれる。目標は、ネイティブ組織の＞50％の内皮細胞密度を有することである。
【００４４】
血管系は、＞300mmHgの圧力に耐え得るため、内皮細胞の導入のための灌流圧は、一般に、そのマトリックスまたはスキャフォールドが由来した組織または器官のネイティブ灌流圧に+/-300％の範囲内で相当する。
【００４５】
本明細書に記載される再内皮化された組織または器官のマトリックスは、レシピエントへ移植され得る。そのような再内皮化された組織または器官のマトリックスは、血栓形成をほとんど示さず、免疫原性をほとんど示さない。そのような再内皮化された組織または器官のマトリックスは、移植後、インビボでさらに再細胞化され得る。移植後、そのような再内皮化された組織または器官のマトリックスは、インビボで（即ち、レシピエント由来のネイティブ細胞により）再細胞化され得る。インビボの再細胞化には、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞（例えば、肝細胞、胆管上皮細胞、幹細胞、前駆細胞、iPS細胞、骨髄単核細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、心臓繊維芽細胞、繊維芽細胞、クフナー（kuffner）細胞、スキャフォールド筋細胞、随伴細胞、腎糸球体壁細胞、腎糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄細部（thin segment）細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、I型肺胞上皮細胞（肺細胞の気腔を裏打ちしている）、膵管細胞（房心細胞）、β細胞、島細胞、細胞、間在細胞、（微絨毛を有する）腸刷子縁細胞、外分泌腺線条導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣上体主細胞、間質腎細胞、および／または精巣上体基底細胞のような、組織または器官に特異的な細胞）によるさらなる再内皮化および／または再細胞化が含まれ得る。
【００４６】
任意で、組織もしくは器官のマトリックスが再内皮化される前に、または組織もしくは器官のマトリックスが再内皮化された後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞により、組織または器官のマトリックスをインビトロで再細胞化することができる。本明細書において使用されるように、「内皮細胞、内皮由来細胞、または内皮前駆細胞以外の」細胞とは、特定の組織または器官に存在する全ての他の型の細胞をさす。本明細書に記載された方法において、幹細胞もしくは前駆細胞（例えば、胚性幹細胞（ESC）、成体幹細胞、もしくは誘導多能性幹（iPS））が、組織もしくは器官の実質を再細胞化するために使用されてもよいし、または組織もしくは器官に特異的な細胞（即ち、分化細胞もしくは部分分化細胞）が、組織もしくは器官の実質を再細胞化するために使用されてもよい。組織または器官に特異的な細胞の場合、送達される細胞の特定の型は、典型的には、最終的に作製される組織または器官の型に依る。例えば、心臓を再細胞化する時には、心筋細胞、平滑筋細胞、心繊維芽細胞、および／または心幹細胞を、組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入することができ；肝臓を再細胞化する時には、肝細胞、胆管細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、および／または肝細胞前駆細胞を、組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入することができ；腎臓を再細胞化する時には、有足細胞、糸球体細胞、および／または上皮細胞を、組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入することができ；肺を再細胞化する時には、上皮細胞、クララ細胞、杯細胞、I型肺胞上皮細胞、および／またはII型肺胞上皮細胞を、組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入することができ；膵臓を再細胞化する時には、β細胞および／または島細胞を、組織または器官のマトリックス内または該マトリックス上へ導入することができる。
【００４７】
内皮細胞または内皮前駆細胞と同様に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞は、（例えば、緩衝液、栄養素、酵素、成長または分化のための培地を含む）生理学的組成物で、組織または器官のマトリックスへ送達され得、任意の多数の経路（例えば、注射（例えば、複数の位置における注射）、灌流、注入、および／または局所適用）を使用して送達または導入され得る。
【００４８】
組織または器官のマトリックスの再内皮化の後に、内皮細胞または内皮前駆細胞以外の細胞が導入される態様においては、他の細胞が送達される前に、内皮細胞または内皮前駆細胞に、組織または器官のマトリックスの血管系内に付着し、確立するための時間を与えることが有益であり得る。内皮細胞または内皮前駆細胞が組織または器官のマトリックスに付着するために十分な時間は、例えば、30〜180分である。しかしながら、例えば、28〜30日（例えば、約1ヶ月）もの間、内皮細胞または内皮前駆細胞を、組織または器官のマトリックスに付着させ、確立させることもできる。
【００４９】
一つの態様において、脱細胞化された肝臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肝臓グラフトを作出するため、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、および／または肝類洞内皮細胞により再内皮化される。肝臓グラフトは、隣接肝臓からの細胞の移動を通して天然にインビボで再細胞化される。
【００５０】
もう一つの態様において、脱細胞化された肝臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肝臓グラフトを作出するため、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、および／または肝類洞内皮細胞により再内皮化される。移植後、肝細胞（自己、同種、幹細胞由来、またはiPS由来）のような他の細胞が、患者の血管系を介して灌流させられるか、または肝臓グラフトの間質へ注射される。
【００５１】
もう一つの態様において、脱細胞化された肝臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肝臓グラフトを作出するため、先に再内皮化され、次に肝細胞を注射される。
【００５２】
もう一つの態様において、脱細胞化された心臓のグラフトまたはパッチは、ネイティブ心臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な心臓グラフトを作出するため、再内皮化される。グラフトは、心臓の虚血領域に吻合され配置される。
【００５３】
もう一つの態様において、脱細胞化された心臓のグラフトまたはパッチは、ネイティブ心臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な心臓グラフトを作出するため、再内皮化される。移植後、心筋細胞（自己、同種、幹細胞由来、またはiPS由来）のような他の細胞が、患者の血管系を介して灌流させられるか、または心臓グラフトの間質へ注射される。
【００５４】
もう一つの態様において、脱細胞化された心臓のグラフトまたはパッチは、ネイティブ心臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な心臓グラフトを作出するため、再内皮化される。心臓の虚血組織が除去され、再内皮化されたグラフトが吻合され、外科的に植え込まれる。
【００５５】
もう一つの態様において、脱細胞化された心臓のグラフトまたはパッチは、ネイティブ心臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な心臓グラフトを作出するため、まず再内皮化され、その後、心筋細胞を注射される。心臓の虚血組織が除去され、収縮性のグラフトが吻合され、外科的に植え込まれる。
【００５６】
一つの態様において、脱細胞化された肺のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肺グラフトを作出するため、内皮細胞により再内皮化される。肺グラフトは、隣接肺組織からの細胞の移動を通して天然にインビボで再細胞化される。
【００５７】
もう一つの態様において、脱細胞化された肺のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肺グラフトを作出するため、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、および／または肝類洞内皮細胞により再内皮化される。移植後、肺上皮細胞（自己、同種、幹細胞由来、またはiPS由来）のような他の細胞が、患者の血管系を介して灌流させられるか、または肺グラフトの間質へ注射される。
【００５８】
一つの態様において、脱細胞化された腎臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な腎臓グラフトを作出するため、内皮細胞により再内皮化される。肺グラフトは、隣接腎臓からの細胞の移動を通して天然にインビボで再細胞化される。
【００５９】
もう一つの態様において、脱細胞化された腎臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ腎臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肝臓グラフトを作出するため、内皮細胞により再内皮化される。移植後、腎尿細管細胞（自己、同種、幹細胞由来、またはiPS由来）のような他の細胞が、患者の血管系を介して灌流させられるか、または腎臓グラフトの間質へ注射される。
【００６０】
一つの態様において、脱細胞化された膵臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ肝臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な膵臓グラフトを作出するため、内皮細胞により再内皮化される。肺グラフトは、隣接膵臓からの細胞の移動を通して天然にインビボで再細胞化される。
【００６１】
もう一つの態様において、脱細胞化された膵臓のグラフトまたは葉は、ネイティブ膵臓血液供給へ移植され吻合されることができる移植可能な肝臓グラフトを作出するため、内皮細胞により再内皮化される。移植後、β細胞（自己、同種、幹細胞由来、またはiPS由来）のような他の細胞が、患者の血管系を介して灌流させられるか、または膵臓グラフトの間質へ注射される。
【００６２】
一つの態様において、出発材料は、灌流脱細胞化された肝葉である。もう一つの態様において、出発材料は、灌流脱細胞化された肝葉の一部である。もう一つの態様において、出発材料は、左心室から単離され灌流脱細胞化された心臓グラフトである。もう一つの態様において、出発材料は、右心室から単離され灌流脱細胞化された心臓グラフトである。もう一つの態様において、出発材料は、肺葉から単離され灌流脱細胞化された肺グラフトである。もう一つの態様において、出発材料は、灌流脱細胞化された肺葉である。もう一つの態様において、出発材料は、灌流脱細胞化された腎臓である。もう一つの態様において、出発材料は、腎臓の一部分から単離され灌流脱細胞化された腎臓グラフトである。もう一つの態様において、出発材料は、灌流脱細胞化された膵臓である。もう一つの態様において、出発材料は、膵臓の一部分から単離され灌流脱細胞化された膵臓グラフトである。
【００６３】
本明細書に示されるように、組織または器官のマトリックスの広範囲の再内皮化をもたらす本明細書に記載された再細胞化法は、レシピエントへ移植された時に、血栓形成性をほとんど示さない組織または器官のマトリックスを作製する。そのような再内皮化された組織または器官のマトリックスは、移植された組織もしくは器官において観察される炎症および／または移植後にレシピエントが開始する炎症応答の量に基づき、免疫原性もほとんど示さない。
【００６４】
本開示に従い、当技術分野の技術の範囲内にある従来の分子生物学、微生物学、生化学的技術、および組換えDNA技術が利用され得る。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の方法および組成物の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例
実施例1−動物
全ての実験が、US Animal Welfare Actに従って実施され、University of MinnesotaのInstitutional Animal Care and Use Committeeにより認可された。心臓マトリックスは、スプラーグドーリーラット（250〜319g）またはフィッシャー344ラット（196〜296g）に由来した。移植研究においてはフィッシャー344マトリックスが使用された。心臓スキャフォールドの生成において使用された全てのラットが、体重1kg当たり100mgのケタミン（Phoenix Pharmaceutical）および体重1kg当たり10mgのキシラジン（Phoenix Pharmaceutical）により麻酔をかけられた後、全身ヘパリン処理された。
【００６６】
実施例2−死体ラット心臓の脱細胞化
死体ラット心臓を、以前に公開された方法（Ott et al.,2008;Nature Med.,14(2):213-21）に従って脱細胞化した。簡単に説明すると、ラットに麻酔をかけた。次に、胸骨正中切開を実施した後、縦隔血管を露出させるため、心膜の解剖および胸骨後脂肪体の除去を行った。上行性胸大動脈から分かれた最初の3本の分枝および両上大静脈を結紮し、横切した。下大静脈（IVC）ならびに肺血管（静脈および動脈）を横切した。次いで、単離された心臓を、胸腔から取り出し、PBSを含有しているペトリ皿に置き、カテーテルを挿入し、PBSにより濯いだ。次いで、心臓を、1％SDSにより重力灌流した後、脱イオン水、1％Triton-X100（Sigma）、および抗生物質含有PBS（100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン；Gibco）により洗浄した。
【００６７】
実施例3−ラット心臓スキャフォールドの再細胞化
ラット大動脈内皮細胞（RAEC）を、Vec Technologies（Rensselaer,NY）から購入した。14〜20代目のRAECを、全ての実験において使用した。RAECを、完全MCDB-131（Vec Technologies）中で、ゼラチンによりコーティングされたT185フラスコにおいて培養し、TrypLE Express（Invitrogen）を使用して継代した。大動脈を介した再細胞化については、脱細胞化されたスキャフォールドへの細胞懸濁物の逆行性大動脈灌流が実施され；腕頭動脈（BA）を介した再細胞化については、連続的な逆行性大動脈培地灌流下の構築物が、BAに細胞を注入された。IVCを介して再細胞化された構築物は、IVCにカテーテルを置かれた後、RAECにより灌流された。全ての構築物について、細胞は、1mL当たり1000万細胞で注入された。特記しない限り、組織培養インキュベーターにおいて、7日間、大動脈を介して培地（完全MCDB-131）を連続的に灌流させながら、構築物を培養した。培地レザバーには、実験の期間中、カルボゲン（5％CO2および95％O2）を連続的に注射した。
【００６８】
実施例4−細胞標識
研究のサブセットにおいて、再細胞化の日に、RAECをDiIまたはDiOにより標識した。簡単に説明すると、RAECのコンフルエントなプレートから培地を除去し、5μM SP-DiIC18またはSP-DiOC18（Invitrogen）を含有しているDPBSと交換した。37℃での5分間のインキュベーションの後、プレートを冷却装置に移し、4℃で15分間インキュベートした。次いで、プレートを、PBSにより1回洗浄し、培養培地中で37℃で2時間回復させた後、単離し構築物へ播種した。実験の最後に、構築物をバイオリアクターから取り出し、Stereo Discovery V20 Macro Stereo（Carl Zeiss Inc.）上で画像化し、解剖し、Slowfade（Invitrogen）に置き、510 Meta Confocal顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）上で画像化した。
【００６９】
別の研究においては、培養の最終日（7日目）に、完全培養培地を除去し、37℃で45分間、無血清CMFDA含有DMEM（Cellgro）を循環させることにより、RAECを播種された構築物を、Cell Tracker Green CMFDA（Invitrogen）により標識した。次いで、CMFDA含有培地を完全MCDB-131と交換し、構築物を45分間インキュベートした。次いで、CMFDAにより標識された構築物を、バイオリアクターから取り出し、解剖し、Slowfade（Invitrogen）に置き、510 Meta Confocal顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）上で画像化した。
【００７０】
実施例5−組織学および細胞核／血管定量化
培養の最終日に、構築物をバイオリアクターから取り出し、基部から頂部に無作為に分布する4個の短軸面へと切片化し、次いで、パラフィン包埋した。パラフィン包埋、切片化、および再水和の後、それらを、標準的なプロトコルに従い、ヘマトキシリン・エオシンまたはヴァーヘフ・ヴァン・ギーソンにより染色した。スライドをNikon Eclipse TE200倒立顕微鏡（Fryer Co.Inc.）を使用して画像化した。核定量化のため、未染色スライドを、DAPIを含有しているVectashield（Vectorlabs）でマウントし、1切片当たり5個のランダム強拡大像を撮った。次いで、DAPI陽性核を定量化し、組織面積に対してノーマライズした。血管径定量化のため、ヴァーヘフ-ヴァン・ギーソン染色切片の5個のランダムに分布した強拡大像を撮り、以前に記載されたようにして加工した。直径は、ImageJソフトウェア（NIH）により細胞含有血管の短軸直径を測定することにより推定された。全ての画像化が、Nikon Eclipse TE200倒立顕微鏡（Fryer Co.Inc.）を使用して実施された。
【００７１】
実施例6−免疫蛍光染色
キシレンおよび段階的なアルコールの交換を通して、パラフィン切片を再水和した。スライドを、0.05％ツイーン20を含む10mMクエン酸緩衝液（pH6.0）において20分間煮沸した。PBS中の3％BSAにより、1時間、ブロッキングを実施した。PCNA、PECAM-1（ウサギポリクローナル、Santa Cruz）、vWF、eNOS、カルレチニン、ビメンチン（ウサギポリクローナル、Abcam）、vWF（ヤギポリクローナル、Santa Cruz）、FLK-1（マウスモノクローナル、BD Bioscience）、CD34、CD45、CD11b（マウスモノクローナル、Santa Cruz）、α平滑筋アクチン（マウスモノクローナル、Sigma）、およびCD8（ウサギモノクローナル、Abcam）に対する一次抗体を、PBSで10μg/mlに希釈し、4℃で一夜インキュベートした。工程間には、0.05％ツイーン20を含むPBSの3回の交換により、スライドを洗浄した。FITCまたはTexas Red（Jackson Immunoresearch）のいずれかに共役した適切な二次抗体を1:250希釈し、1時間インキュベートした。スライドを、DAPI含有封入剤によりマウントし、Nikon Eclipse TE200蛍光顕微鏡上で可視化した。
【００７２】
実施例7−G6PDHアッセイ
培地を、バイオリアクターから毎日採集し、-20℃で保管した。アッセイの日に、試料を解凍し、製造業者の説明に従って、Vybrant Cytotoxicity Assay Kit（Invitrogen）を使用して、G6PDH活性を定量化した。
【００７３】
実施例8−TUNEL
7日間の培養の後、再内皮化された構築物を、ホルマリン固定し、基部から頂部への4個の代表的な短軸面へと切断し、パラフィン包埋し、次いで、切片化した。DeadEnd Colorimetric TUNEL系（Promega）を、ニックの入ったDNAについて染色するために使用した。以下のように修飾して、パラフィン包埋試料のための製造業者の指示に従った：試料を脱パラフィン処理し、エタノール系列を通して再水和した後、10mMクエン酸緩衝溶液（trater et al.,1995,Histochem.Cell Biol.,103(2):157-60）において2分間マイクロ波処理し；ストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシダーゼを使用する代わりに、試料をDyLight594共役ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）により処理した。スライドを、DAPIを含有しているVectashield（Vectorlabs）によりマウントし、Nikon Eclipse TE200倒立顕微鏡（Fryer Co.Inc.,Huntley,IL）を使用して画像化した。
【００７４】
実施例9−インビトロトロンボモジュリンアッセイ
トロンボモジュリンアッセイは、以前に公開された研究（Calnek & Grinnell,1998,Experimen.Cell Res.,238(1):294-8；Ibrahim & Ramamurthi,2008,J.Tissue Eng.Regen.Med.,2(1):22-32）から改作された。培養の最終日（7日目）に、計45分間、1mL/分の流速で、フェノールレッド不含DMEM/F12（Invitrogen）により3回、構築物を洗浄した。次いで、ヒトαトロンビン（0.1 NIH U/mL；Haematologic Technologies）およびヒトプロテインC（12μg/mL、Haematologic Technologies）を含有しているフェノールレッド不含DMEM/F12 4ミリリットルを、1mL/分で、45分間、大動脈を介して心臓構築物に連続的に循環させた。トリプリケートで、培地100μLを96穴プレートに移し、ヒルジンストック（12ATU/mL；American Diagnostica）50μLと混合し、37℃で5分間インキュベートした。各試料含有ウェルに、基質S-2366（最終濃度0.75mM；Chromogenix）50μLを添加し、室温で5分間インキュベートした。410nmおよび490nmにおける吸光度を、Sprectra MAX 340（Molecular Devices）を使用して測定した。410nmにおける吸光度から490nmにおける吸光度を差し引くことにより、最終的な相対吸光度を計算し、次いで、無細胞スキャフォールド対照によりノーマライズした。
【００７５】
実施例10−異所移植
レシピエントラットであるRNUヌードラット（213〜388g）またはフィッシャー344ラット（278〜351g）に、ペントバルビタールナトリウムにより麻酔をかけた（60mg/Kg体重、腹腔内注射）。下行大動脈および下大静脈を露出させるため、腹壁の正中切開を使用した。Ono & Lindsey（Ono,1969,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.,57(2):225-9）に従い、ドナー心臓の上行大動脈および左肺動脈の、レシピエントラットの腹部大動脈および大静脈への端側吻合を、9-0縫合糸により実施した。ラットは、移植前にあらかじめヘパリン処理され、裸のマトリックスのみの移植は、継続的な抗凝固治療（移植の日に2回、体重1Kg当たり100i.u.のヘパリンナトリウム、次の2日間は、体重1Kg当たり200i.u.皮下）および飲料水中のクマジン（0.25mg/Kg体重/日）を受容した。
【００７６】
実施例11−ラット大動脈内皮細胞の灌流および分布
内皮細胞送達のための最適の技術を決定するため、3種の再細胞化法を調査した：（a）大動脈を介したRAECの直接灌流、（b）大動脈へ培地を流動させながらのBAを通した細胞灌流、または（c）細胞の組み合わせ送達：IVCを介した第1の灌流の後、記載されたようなBAを介した第2の注入。送達後、培地の逆行性大動脈灌流の下で、1週間、構築物を培養した後、分析した。7日間の培養の後、細胞の局在を確認し、細胞充実性を定量化するため、構築物を固定し、基部から頂部へと分布する4個の短軸面へと切片化し、パラフィン包埋し、染色し、DAPI陽性核を定量化した（図1A）。各送達法において、細胞は構築物内に保持され、血管の内腔を裏打ちしていた。2000万個の細胞を、大動脈またはBAを介して送達した時、マトリックス内の内皮細胞の数に統計的有意差は見られなかった（図1A）。しかしながら、大動脈を介して送達された細胞は、心臓の全域における均一な分布を達成せず、頂部に局在し、心臓の基部は無細胞のままであった。細胞播種数を2倍にした時、定量化された細胞充実性の統計的に有意な増加が観察された。最も大きな細胞充実性は、IVCおよびBAにより播種された構築物で観察され、それは、同一細胞数の単回BA注入と比較しても統計的に有意であった。
【００７７】
再細胞化前のDiIおよびDiOによるRAECの標識は、BA（図1B〜C）またはIVC＋BA（図1D〜E）を介して送達された細胞を播種された構築物について、心臓マトリックスの全域における細胞の均一な分布を確認した。同様に、IVC RAEC灌流の後、頂部から基部まで心臓の全域に（DiO陽性）細胞を観察することができた。DiO標識細胞およびDiI標識細胞の両方を播種された構築物の調査は、単一の経路を介して送達された細胞（図2AおよびB）（即ち、BAまたはIVCのいずれかにより送達された細胞）により表面再生された血管、または両経路を介して送達された細胞（図2C）を含有している血管が、心室壁に見出されることを明らかにした。左心室の心内膜表面は、BAへ送達された細胞により主に再細胞化され、右心室の心内膜表面は、IVCを介して送達されたRAECにより再裏打ちされた（図2DおよびE）。
【００７８】
7日間培養された構築物の組織学（ヘマトキシリン・エオシン染色およびヴァーヘフ-ヴァン・ギーソン染色）は、様々な直径の血管が再裏打ちされ（図3A〜D）、エラスチン陽性動脈血管およびエラスチン陰性血管の両方が再裏打ちされた（図3BおよびD）ことを示す。これらの結果は、RAECが、再細胞化およびその後のインビトロ培養において、観察可能な血管の優先を示さないことを示した。中央心室壁内の血管径の定量化は、IVCおよびBAを介した細胞の組み合わせ送達が、単独BA RAEC送達より、小血管（直径11〜25ミクロン）の数の統計的に有意な増加をもたらすことを明らかにした（図3E）。頂部切片を調査した時、血管径分布におけるこの送達依存性は観察されなかった。
【００７９】
実施例12−培養中のラット大動脈内皮細胞生存率
RAEC表現型を維持し、かつ再細胞化された構築物における細胞死を防止するために、逆行性灌流が十分であるか否かを確認するため、3種の異なるアッセイを利用した：（a）インビトロ培養の最後のCMFDA細胞標識、（b）TUNEL染色、および（c）7日間にわたる構築物灌流液中のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PDH）活性の定量化。構築物を、単独のBAまたはIVCのいずれかを介して再細胞化し、記載されたようにして7日間培養し、次いで、CMFDA標識した。CMFDAは、生存可能細胞のみを標識することができ、生存可能細胞によってのみ切断され得るため、使用された。BAにより送達された細胞およびIVCにより送達された細胞は、いずれも、7日目にCMFDAを切断することができた（図4A〜C）。右心室を裏打ちする心内膜細胞を標識したところ（図4C）、未発達の冠動脈が示された。TUNEL分析は、細胞の位置（LV、RV、または中隔）に関わらず、7日目に、アポトーシスのRAECは、たとえ存在したとしても、ほとんど存在しなかったことを示した（図4D〜I）。進行中の細胞死の指標として、G6PDH活性を定量化した。細胞送達法に関わらず、実験期間中、G6PDHの増加は観察されなかった（図4J）。これらの結果は、いかにして送達されるかに関わらず、再細胞化された心臓構築物の全域にRAECを維持するために、大動脈灌流が十分であることを示す。
【００８０】
実施例13−再内皮化された構築物のインビトロ表現型分析
再細胞化後7日目に、構築物内の細胞の免疫蛍光染色により、RAECの表現型および機能を調査した。構築物の全域に、PCNA+細胞が見出され、そのことから、増殖が継続中であったことが示唆された（図5A）。同様に、血管樹の全域にeNOS+細胞が見出され、そのことから、細胞が機能性を維持していることが暗示された（図5B）。最後に、RAECはフォンビルブラント因子を発現しており（図5C）、そのことから、凝固の調節の可能性が示された。再内皮化された構築物が凝固経路を阻害することができるか否かを決定するため、構築物内を循環する灌流液に対してインビトロトロンボモジュリンアッセイを実施した。それを行うため、7日目に、トロンビンおよびプロテインCを含有している溶液を、再細胞化された構築物または無細胞スキャフォールドに循環させた。トロンボモジュリンおよびトロンビンにより媒介されるプロテインC活性の統計的に有意な6〜8倍の増加が見られた（図5D）。プロテインCは凝固カスケードの負の調節因子であり；従って、これらの結果は、再細胞化された構築物は、プロテインCを活性化する能力を保持しているため、凝固カスケードを阻害する可能性を有することを示す。BAにより再細胞化された構築物およびBA＋IVCにより再細胞化された構築物は、同等の性能であったが、BA＋IVCにより細胞を送達された構築物の方が高性能である傾向が存在した。
【００８１】
実施例14−異所外植片の特徴決定
無細胞スキャフォールドおよびBA RAEC再内皮化構築物の両方を、レシピエントラットの腹部へ異所移植した。移植前に、RAECの付着および成長を可能にするため、再内皮化構築物を、7日間培養した。移植後7日目、構築物を外植し調査した（図6）。大動脈において血餅が形成されたが、再細胞化構築物においては低下した（図6AおよびE）。LV壁および心室の調査は無細胞スキャフォールド移植片における血栓形成が、再内皮化構築物と比較して、より大きいことを示した（図6BおよびF）。無細胞スキャフォールドの実質には、より疎性の血液が観察されたが（図6CおよびG）、再内皮化構築物においては、血液が充満した開存性の血管が観察された（図6DおよびI）。免疫蛍光染色による動員された細胞の特徴決定（表1）は、マクロファージマーカー（CD11b）またはリンパ球マーカー（CD8）について陽性であるのは、極わずか（4％未満）であることを示した。さらに、平滑筋マーカー（SMA）、中皮マーカー（カルレチニン）、内皮前駆マーカー（CD34）、内皮マーカー（vWF）、および繊維芽細胞マーカー（ビメンチン）は、動員された細胞の小さなサブセットによってのみ発現されていた（表1）。構築物が再細胞化されていたか否かに関わらず、動員された細胞の過半数が、細胞マーカーPECAM+およびVEGFR2+を発現していた（図7）。しかしながら、前駆細胞マーカーCD34および造血幹細胞マーカー（CD45）は、動員された細胞の小さなサブセットによってのみ発現されていた（表1）。
【００８２】
【表１】
0005931878.tif 000002
【００８３】
本発明の方法および組成物を、多数の異なる局面と共に本明細書において説明したが、様々な局面の上記の説明は、本発明の方法および組成物を例示するためのものであって、その範囲を制限するものではないことが理解されるべきである。その他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【００８４】
開示された方法および組成物のために使用され得るか、開示された方法および組成物と共に使用され得るか、開示された方法および組成物の調製において使用され得るか、または開示された方法および組成物の産物である方法および組成物が開示される。これらおよびその他の材料が本明細書に開示されており、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されていることが理解される。即ち、これらの組成物および方法の様々な個々の組み合わせおよび順列ならびに集合的な組み合わせおよび順列の各々についての具体的な言及は、明示的には開示されていないかもしれないが、各々が具体的に企図され、本明細書に記載されている。例えば、本発明の特定の組成物または特定の方法が開示され論じられ、多数の組成物または方法が論じられる場合、具体的に否定されない限り、組成物および方法の組み合わせおよび順列が、各々、全て、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に企図され開示されている。
【００８５】
全ての刊行物、特許、および特許出願が、参照により本明細書に組み入れられる。上記の明細書において、本発明がそのある種の好ましい態様に関して説明され、多くの詳細が例示の目的のために示されたが、本発明が付加的な態様を受け入れること、そして本明細書に記載された詳細のいくらかが、本発明の基本原理から逸脱することなく相当に変動し得ることは、当業者に明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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