(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウトウ又はその抽出物を有効成分とするエストロゲン受容体β活性化剤。
【請求項２】
ホウトウ又はその抽出物を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
【請求項３】
ホウトウ又はその抽出物を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
【請求項４】
ホウトウ又はその抽出物を有効成分とするニキビ改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体βに対して選択性の高い、エストロゲンβ受容体活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
女性は閉経を迎えると血液中のエストロゲン濃度が著しく減少し、皮膚全体の機能に変化が生じることが知られている。特に、真皮においてはコラーゲン線維が著しく減少し、その結果しわやたるみといった皮膚老化現象が目立つようになる（非特許文献１、２）。
閉経後の女性に対して女性ホルモン補充療法（ＨＲＴ）を行うとしわ、血行が改善すること、エストロゲンを塗布するとしわ、弾力性、水分量が改善することが報告されている（非特許文献３、４）。また、エストロゲンを塗布すると皮脂腺からの皮脂の分泌が抑制されることが報告されている（非特許文献５）。
【０００３】
エストロゲンは２種類のエストロゲン受容体（ＥＲα、ＥＲβ）に結合し、これらが協調して働くことでその作用を発揮することが知られている。エストロゲンは初めに、ＥＲα、ＥＲβのｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＬＢＤ）に結合して立体構造を変化させ、それに続いて二量体（ＥＲα／α、ＥＲβ／β、ＥＲα／βの三種類の組み合わせ）を形成する（非特許文献６、７）。二量体を形成したＥＲは核内へ移行し、ゲノム上に存在するエストロゲン応答配列に結合し、そこで様々な共役因子をリクルートした後に、標的遺伝子の転写活性を制御する（非特許文献８、９）。
ＥＲαとＥＲβの標的遺伝子は、大部分が同一であることが報告されている（非特許文献１０）。ところが最近になって、いくつかの相違する標的遺伝子の組み合わせに起因して、ＥＲαとＥＲβがそれぞれ異なる生理機能を有していることが示唆されている（非特許文献１１）。例えば、ＥＲαは、乳癌細胞の増殖を活性化する一方で、ＥＲβは、その増殖を抑制するといった正反対の役割を果たしていることが報告されている（非特許文献１２）。また、ＥＲβは、皮膚の光老化を防御する機能を有することが報告されている（非特許文献１３）。
このようなことから、ＥＲβは安全にエストロゲンの作用を発揮できる理想的な分子であり、ＥＲβを選択的に活性化できれば、エストロゲン減少に起因する皮膚老化症状の予防・改善等に有用であると考えられる。
【０００４】
一方、ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）はゴマノハグサ科の高木で、鼻炎、結膜炎、やけど等の治療に、カチラン（Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ  Ｇｒａｈ．）はマメ科の草木で、咳止めや耳鳴り等の治療に、キョウヨウヨウ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｄｅｎｐｏｄａ  Ｍａｘｉｍ．）はヤナギ科の植物で、虫歯や打撲等の治療に、キンセンソウ（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｔｙｒａｃｉｆｏｌｉｕｍ（Ｏｓｂ．）Ｗｅｒｒ）はマメ科の植物で、尿路感染や結石、胆石、腎炎浮腫、でき物、黄疸等の治療に、ロウバイ（Ｃｈｉｍｏｎａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｃｏｘ（Ｌ．）Ｌｉｎｋ）はロウバイ科の低木で、解熱、鎮咳、鎮痛、麻疹、百日咳等の治療に、ミゾコウジュ（Ｓａｌｖｉａ  ｐｌｅｂｅｉａ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ）はシソ科の草で、吐血、痔等の治療に、ウケツ（Ｓｔｅｎｏｌｏｍａ  ｃｈｕｓａｎｕｍ（Ｌ．）Ｃｈｉｎｇ）はイノモトソウ科の植物で、肝炎、急性気管支炎、やけど等の治療に、シナフジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｓｗｅｅｔ）はマメ科のつる性の木本で、下剤等に、テンオウゴン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ａｍｏｅｎａ  Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）はシソ科の植物で、消炎、解熱、気管支炎、風邪等の治療に、それぞれ有用なことが知られている。
しかしながら、これらの植物とエストロゲン受容体活性化との関係については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｉｃｈｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４：３７１−３７８
【非特許文献２】Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ５３：５５５−６８
【非特許文献３】Ｓａｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ３９：４３−５５
【非特許文献４】ＰｉＣｒａｒｄ−Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）  Ｍａｔｕｒｉｔａｓ  ２２：１５１−１５４
【非特許文献５】Ｐｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７４）Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ６２：１９１−２０１
【非特許文献６】Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２７：１４３９−１４６８
【非特許文献７】Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：１９０１２−１９０１７
【非特許文献８】Ｋｕｌａｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ２９：１３７−１５２
【非特許文献９】Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００６）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００６  ２０  ：  １４０５−１４２８
【非特許文献１０】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０５：２６０４−２６０９
【非特許文献１１】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５：２６０４−２６０９
【非特許文献１２】Ｈｅｌｇｕｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４  ：  ６６０５−６６１６
【非特許文献１３】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７７：７４４−７５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、エストロゲン受容体βに対して選択性の高い、エストロゲン受容体β活性化剤を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、ＥＲβの分子構造内にあるｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＬＢＤ）を利用した評価系及びＤＮＡ上に存在するエストロゲン応答配列を利用した転写活性化能評価系を構築し、エストロゲン受容体のうちＥＲβの活性を選択的に高める物質について鋭意研究したところ、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴンに優れたエストロゲン受容体β活性化作用があることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（５）に係るものである。
（１）ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴン及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするエストロゲン受容体β活性化剤。
（２）ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を含有する皮膚外用剤。
（３）ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ウケツ、シナフジ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
（４）ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
（５）ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビ改善剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のエストロゲン受容体β活性化剤等は、エストロゲン受容体βを選択的に活性化し、また、乳癌発症・悪化の危険性がなく安全であることから、皮膚の老化症状の予防又は改善や皮脂腺からの皮脂分泌抑制効果等を発揮し得る医薬品、医薬部外品、化粧品として、或いはこれらへ配合するための素材又は製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ハムスター耳介部組織のオイルレッド染色を示す図である。
【図２】エストラジオール、ＰＰＴ又はＤＰＮ塗布による皮脂腺サイズの変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為、すなわち治療による人体への処理行為を含まない概念である。
【００１２】
本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転、疾患、症状又は状態の悪化の防止又は遅延、あるいは疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
【００１３】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患若しくは症状の発症の防止又は遅延、あるいは個体の疾患若しくは症状の発症の危険性を低下させることをいう。
【００１４】
本明細書において、ホウトウとは、ゴマノハグサ科キリ属のＰａｕｌｏｗｎｉａ  ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．（和名ココノエギリ、キリ）を指し、カチランとは、マメ科タヌキマメ属のＣｒｏｔａｌａｒｉａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ  Ｇｒａｈ．（和名ナンバンタヌキマメ、キョウレイソウ）を指し、キョウヨウヨウとは、ヤナギ科ポプラ属のＰｏｐｕｌｕｓ  ａｄｅｎｐｏｄａ  Ｍａｘｉｍ．を指し、キンセンソウとは、マメ科ヌスビトハギ属のＤｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｔｙｒａｃｉｆｏｌｉｕｍ（Ｏｓｂ．）Ｗｅｒｒを指し、ロウバイとは、ロウバイ科ロウバイ属のＣｈｉｍｏｎａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｃｏｘ（Ｌ．）Ｌｉｎｋ（和名ロウバイ）を指し、ミゾコウジュとは、シソ科サルビア（アキギリ）属のＳａｌｖｉａ  ｐｌｅｂｅｉａ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ（和名ミゾコウジュ）を指し、ウケツとは、イノモトソウ科ステノロマ属のＳｔｅｎｏｌｏｍａ  ｃｈｕｓａｎｕｍ（Ｌ．）Ｃｈｉｎｇ（和名ダイヨウキンカソウ）を指し、シナフジとは、マメ科フジ属のＷｉｓｔｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｓｗｅｅｔ（和名シナフジ、シトウ）を指し、テンオウゴンとは、シソ科タツナミソウ属のＳｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ａｍｏｅｎａ  Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ（和名オウゴン）を指す。
【００１５】
斯かる植物は、いずれの任意の部位、例えば全草、葉、茎、芽、花、蕾、木質部、樹皮、地衣体、根、根茎、仮球茎、球茎、塊茎、種子、果実、菌核若しくは樹脂等、又はそれらの組み合わせを使用することができるが、ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）は花、カチラン（Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ  Ｇｒａｈ．）は全草、キョウヨウヨウ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｄｅｎｐｏｄａ  Ｍａｘｉｍ．）は根皮、樹皮或いは葉、キンセンソウ（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｔｙｒａｃｉｆｏｌｉｕｍ（Ｏｓｂ．）Ｗｅｒｒ）は枝葉、ロウバイ（Ｃｈｉｍｏｎａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｃｏｘ（Ｌ．）Ｌｉｎｋ）は花蕾、ミゾコウジュ（Ｓａｌｖｉａ  ｐｌｅｂｅｉａ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ）は全草、ウケツ（Ｓｔｅｎｏｌｏｍａ  ｃｈｕｓａｎｕｍ（Ｌ．）Ｃｈｉｎｇ）は全草或いは根状茎、シナフジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｓｗｅｅｔ）は茎葉、テンオウゴン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ａｍｏｅｎａ  Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）は根、をそれぞれ用いるのが好ましい。
斯かる植物は、そのまま又は乾燥・粉砕等して用いることができる。また、上記部位は、そのまま抽出工程に付されてもよく、又は粉砕、切断若しくは乾燥された後に抽出工程に付されてもよい。該抽出物は天然成分由来であり安全性も高い。
【００１６】
抽出物を得る抽出手段は、具体的には、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の手段を用いることができる。抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出が望ましい。この固液抽出の好適な条件の一例としては、１００〜４００ｒ／ｍｉｎで１〜３０分間の攪拌が挙げられる。
抽出物の酸化を防止するため、煮沸脱気や窒素ガス等の不活性ガスを通気して溶存酸素を除去しつつ、いわゆる非酸化的雰囲気下で抽出する手段を併用してもよい。
【００１７】
抽出のための溶剤には、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。溶剤の具体例としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；及び超臨界二酸化炭素；ピリジン類；油脂、ワックス等その他オイル類等の有機溶剤；ならびにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類、アルコール−水混合液、炭化水素類が挙げられ、アルコール−水混合液、炭化水素類がより好ましい。アルコール類としては炭素数１〜５のアルコール類が好ましく、エタノールがより好ましい。炭化水素類としてはヘキサンが好ましい。
【００１８】
抽出のための溶剤としてアルコール−水混合液を使用する場合には、アルコール類と水との配合割合（容量比）としては、０．００１〜１００：９９．９９９〜０が好ましく、５〜９５：９５〜５がより好ましく、２０〜８０：８０〜２０がさらに好ましく、３０〜７０：７０〜３０がさらにより好ましく、４０〜６０：６０〜４０がなお好ましい。エタノール水溶液の場合、エタノール濃度が４０〜６０容量％であることが好ましい。
【００１９】
溶剤の使用量としては、それぞれの植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬ、更に８〜５０ｍＬが好ましく、抽出時間としては、１分間〜１００日間が好ましく、１分間〜３日間がより好ましい。このときの抽出温度は、０℃〜溶媒沸点、より好ましくは２０〜１００℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。
【００２０】
斯くして得られる植物抽出物は、抽出液や画分をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、或いは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、水・エタノール混液、水・プロピレングリコール混液、水・ブチレングリコール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
また、植物の抽出物は市販品を使用することもできる。
【００２１】
本発明の植物の抽出物は、食品上・医薬品上許容し得る規格に適合し本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよく、さらに得られた粗精製物を公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。
【００２２】
後記実施例で示すとおり、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＥＲβの分子構造内にあるｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＬＢＤ）を利用したｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系において優れたエストロゲン受容体β活性化作用を示した。
当該評価系は、ＥＲαとＥＲβのｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（ＬＢＤ）の配列の違い（Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １６３：３７９−３８３（１９９９））を利用した系であって、リガンドのＬＢＤへの結合、ＥＲの活性化を判別することによりＥＲβの選択的な活性化評価を可能にしたものである。
また、本発明の植物又はそれらの抽出物は、エストロゲン応答配列（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ：ＥＲＥ、ＡＧＧＴＣＡｎｎｎＴＧＡＣＣＴ）を利用したＥＲβを介する転写活性化能評価系において標的遺伝子の転写を活性化させる作用を示した。
そして、本発明の植物又はそれらの抽出物は、ＥＲβを活性化することが有用と考えられる各種疾病や症状の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。例えば、ＥＲβが皮膚の光老化を防御する機能を有することが報告されていることから（非特許文献１３）、本発明の植物又はそれらの抽出物は、皮膚のシワ、タルミ（弛緩）、弾力性やハリの低下等の皮膚の老化症状の予防、改善又は治療に有効であると考えられる。
また、後記参考例に示すように、ＥＲβの活性化によりハムスター耳介部の皮脂腺の大きさが減少するため、本発明の植物又はそれらの抽出物は皮脂の分泌抑制やニキビの改善に有効であると考えられる。
【００２３】
従って、本発明の植物又はその抽出物は、ＥＲβの選択的な活性化のために或いは皮膚の老化症状の予防、改善又は治療や、皮脂の分泌抑制のために使用することができる。当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。
【００２４】
また、本発明の植物又はそれらの抽出物は、エストロゲン受容体β活性剤、皮膚外用剤、皮膚老化予防又は改善剤、皮脂分泌抑制剤、ニキビ改善剤（以下、エストロゲン受容体β活性剤等）として使用することができ、さらにこれらの剤を製造するために使用することができる。このとき、当該エストロゲン受容体β活性化剤等には、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を単独で、又はこれ以外に、必要に応じて適宜選択した担体等の、配合すべき後述の対象物において許容されるものを使用してもよい。なお、当該製剤は配合すべき対象物に応じて常法により製造することができる。
【００２５】
当該エストロゲン受容体β活性剤等は、それ自体、ＥＲβの選択的活性化、皮膚の老化症状の予防、改善又は治療、皮脂の分泌抑制効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧料、食品又は飼料であってもよく、又は当該医薬品等に配合して使用される素材又は製剤であってもよい。ここで、食品には、エストロゲンβ受容体の活性化或いは皮膚の老化症状の予防、改善又は治療や、皮脂の分泌抑制、ニキビ改善等の生理機能をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した飲食品、機能性飲食品、病者用飲食品、特定保健用食品等が包含される。
【００２６】
上記医薬品（医薬部外品も含む）の剤形は、例えば注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、各種外用剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の何れでもよく、また投与形態も、経口投与（内用）、非経口投与（外用、注射）の何れであってもよい。
このような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、本発明のエストロゲン受容体β活性剤等を単独で、又は他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、担体、希釈剤等を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２７】
これらの投与形態のうち、好ましい形態は経口投与でありエストロゲン受容体β活性剤等を含む製剤中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、そして１０質量％以下、好ましくは１質量％以下が挙げられる。例えば０．００００１〜１０質量％とするのが好ましく、０．０００１〜１質量％とするのがより好ましい。
【００２８】
上記食品の形態は、固形、半固形又は液状であり得、例えば、パン類、ケーキ類、麺類、菓子類、ゼリー類、冷凍食品、アイスクリーム類、乳製品、飲料等の各種食品の他、上述した経口投与製剤と同様の形態（錠剤、カプセル剤、シロップ等）が挙げられる。
種々の形態の食品を調製するには、本発明のエストロゲン受容体β活性剤等を単独で、又は他の食品材料や、溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、安定剤、着色剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤等を適宜組み合わせて用いることができる。当該食品中の本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量（抽出物の乾燥物換算）は、一般的に０．０１質量％以上、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、そして１００質量％以下、９５質量％以下が挙げられる。例えば０．０１〜１００質量％とするのが好ましく、０．１〜１００質量％とするのがより好ましく、更に好ましくは１〜１００質量％とするのが好ましい。
【００２９】
また、上記飼料としては、例えば牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、マグロ、ウナギ、タイ、ハマチ等に用いる魚介類用飼料、犬、猫、小鳥、リス等に用いるペットフード等が挙げられる。
尚、飼料を製造する場合には、本発明のエストロゲン受容体β活性剤等の他に、牛、豚、羊等の肉類、蛋白質、穀物類、ぬか類、粕類、糖類、野菜、ビタミン類、ミネラル類等一般に用いられる飼料原料、更に一般的に飼料に使用されるゲル化剤、保型剤、ｐＨ調整剤、調味料、防腐剤、栄養補強剤等を組み合わせて用いることができる。
また、飼料中の、本発明の植物又はそれらの抽出物の含有量は、その使用形態により異なるが、乾燥物換算で、通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下が挙げられる。例えば０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
【００３０】
本発明のエストロゲン受容体β活性剤等の投与量又は摂取量は、対象者の状態、体重、性別、年齢又はその他の要因に従って変動し得るが、経口投与又は摂取の場合成人１人当たり、植物抽出物（乾燥物換算）として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇとすることが好ましく、特に０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇとするのが好ましい。
【００３１】
上記化粧料（医薬部外品も含む）のは、皮膚外用剤、洗浄剤、メイクアップ化粧料等の形態とすることができ、使用方法に応じて、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏剤、粉末、顆粒等の種々の剤型で提供することができる。このような種々の剤型の化粧料は、本発明の植物及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種と、皮膚化粧料に配合され得る、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤（例えば、抗炎症剤、殺菌剤、酸化防止剤、ビタミン類、脂肪代謝促進作用又は脱共役蛋白質発現促進作用が知られている薬物或いは天然物）、香料、樹脂、防菌防黴剤、植物抽出物、アルコール類等を適宜組み合わせることにより調製することができる。
【００３２】
当該化粧料の全量中の、本発明の植物又はそれらの抽出物は、抽出物の乾燥物換算で、通常０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、そして２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５質量％以下が挙げられる。例えば０．０００１〜２０質量％であり、０．００１〜１０質量％が好ましく、０．０１〜５質量％がより好ましい。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴン及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするエストロゲン受容体β活性化剤。
＜２＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を含有する皮膚外用剤。
＜３＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ウケツ、シナフジ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚老化予防又は改善剤。
＜４＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮脂分泌抑制剤。
＜５＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするニキビ改善剤。
【００３４】
＜６＞  エストロゲン受容体β活性化剤を製造するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴン及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜７＞  皮膚外用剤を製造するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜８＞  皮膚老化予防又は改善剤を製造するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ウケツ、シナフジ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜９＞  皮脂分泌抑制剤を製造するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１０＞  ニキビ改善剤を製造するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
＜１１＞  エストロゲン受容体β活性化に使用するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴン及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１２＞  皮膚に外用するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１３＞  皮膚老化予防又は改善に使用するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ウケツ、シナフジ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１４＞  皮脂分泌抑に使用するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１５＞  ニキビ改善に使用するための、ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種。
＜１６＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ、ウケツ、シナフジ、テンオウゴン及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に投与又は摂取するエストロゲン受容体β活性化方法。
＜１７＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ウケツ、シナフジ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に投与又は摂取する皮膚老化予防又は改善方法。
＜１８＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に投与又は摂取する皮脂分泌抑制方法。
＜１９＞  ホウトウ、カチラン、キョウヨウヨウ、キンセンソウ、ロウバイ、ミゾコウジュ及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種を、それらを必要とする対象に投与又は摂取するニキビ改善方法。
【実施例】
【００３５】
参考例１  皮脂の分泌抑制
＜ハムスター耳介部への化合物の塗布＞
６週齢のＳｙｒｉａｎ  ｈａｍｓｔｅｒ雄（日本ＳＬＣ製）を使用し、１０％グリセリン含有エタノール溶媒のみを塗布するコントロール群を５匹、１００ｎＭのエストラジオール（和光純薬社製、以下同じ）を塗布するＥｓｔｒａｄｉｏｌ（Ｅ２）群を５匹、１６０ｎＭの１，３，５−トリス（４−ヒドロキシフェニル）−４−プロピル−１Ｈ−ピラゾール（ＰＰＴ、ＥＲα選択的アゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ社製、以下同じ）を塗布するＰＰＴ群を５匹、７００ｎＭの２，３−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニトリル（ＤＰＮ、ＥＲβ選択的アゴニスト、Ｔｏｃｒｉｓ社製、以下同じ）を塗布するＤＰＮ群５匹を用意し、それぞれの溶液１００μｌを１日１回、２週間連続して耳介部に塗布した（ＰＰＴ、ＤＰＮの塗布濃度はエストラジオールのＥＣ５０の値に基づいて設定した）。その後、J Invest Dermatol 124:1127−1133, 2005に記載の方法に準じて耳介部を回収し、凍結組織包埋剤（ＯＣＴコンパウンド、 サクラファインテックジャパン）に包埋後、使用するまで−８０℃にて保存した。
【００３６】
＜オイルレッド染色（中性脂質の染色法）＞
ＯＣＴコンパウンドに包埋した凍結耳介部組織より、クリオスタットを用いて６μｍの厚さで凍結切片を作成し、スライドガラス上に貼り付けた（１匹に対して１スライド作成）。組織の固定を行うために、１０％  中性緩衝ホルマリンに１分間浸漬し、その後ＯＣＴコンパウンドを除去するためにｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ（Ｄ．Ｗ．）に浸漬した。次に６０％イソプロパノールに浸漬し、余分なイソプロパノールを除去した後、オイルレッド染色溶液を１００μＬマウントし５分間染色を行った。染色終了後、６０％  イソプロパノール、Ｄ．Ｗ．の順番で洗浄し、水溶性封入剤を用いて封入を行った。
【００３７】
＜オイルレッド染色陽性領域の抽出＞
皮脂腺においてオイルレッド染色陽性領域を抽出するために、顕微鏡下で組織像を取り込み、画像解析ソフトであるＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を用いて画像解析を行った。取り込んだ画像からダクト部分を含む皮脂腺をランダムに５つ選択し、皮脂腺１つにおけるオイルレッド染色陽性領域（赤色）のピクセル数を算出した。
【００３８】
＜オイルレッド染色後の組織像＞
オイルレッド染色後の組織像を図１に示した。基底細胞（最外層の細胞）付近の染色強度は弱く、成熟細胞の分化過程の進行（皮脂腺の中心に向かって分化は進行する）に伴い、染色強度が増強する傾向が認められた。コントロール群と比較しエストラジオール群、ＰＰＴ群、ＤＰＮ群で皮脂腺サイズの減少が視覚的にも確認された。
【００３９】
＜皮脂腺サイズの測定＞
各群の皮脂腺サイズをＩｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓを用いて解析した結果を図２に示した。統計学的有意差検定はＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて解析した。その結果、コントロール群と比較してエストラジオール群、ＰＰＴ群、ＤＰＮ群のいずれも有意に皮脂腺サイズを縮小していた（ｐ＜０．０１：コントロールｖｓエストラジオール、コントロールｖｓＰＰＴ、ｐ＜０．０５：コントロールｖｓＤＰＮ）。また、有意差は認められなかったもののＰＰＴ群は、ＤＰＮ群よりも若干強く皮脂腺サイズを抑制していた。
このことから、ＥＲβの活性化は皮脂の分泌抑制に有効であることが示唆された。
【００４０】
参考例２  評価系の構築
ｐＢＩＮＤ−ＥＲα及びｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］はＰｒｏｍｅｇａ社より購入した。ｐＢＩＮＤ−ＥＲβは、ｐＢＩＮＤ  ｖｅｃｔｏｒにＥＲβのＬＢＤ（アミノ酸配列：２２２−５３１）をクローニングしプラスミドを構築した。
この評価系では、ＥＲのＬＢＤに被験物質が反応した場合にのみ、ｐＧＬ４．３５にコードされたホタルルシフェラーゼの転写活性が上昇する（詳細はＰｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２７：１４３９−１４６８（２０１０）参照）。
【００４１】
ＨＥＫ２９３細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに４．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％  チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ）を交換し、ｐＢＩＮＤ−ＥＲα又はｐＢＩＮＤ−ＥＲβをｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール、陽性対照であるエストラジオール、ＰＰＴ又はＤＰＮをそれぞれ表１記載の終濃度となるように添加し、さらに２４時間培養を行った。
ホタルルシフェラーゼ（ＥＲ活性の指標）、及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄの導入効率の指標）の活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTM  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。それぞれの結合活性の値は陽性対照であるエストラジオールを終濃度１０ｎＭで添加した際のＲＬＵを１とした場合の相対値として示した。
結果を表１に示す。対ＥＲα、対ＥＲβの欄の数値は、それぞれｐＢＩＮＤ−ＥＲαを導入した細胞、ｐＢＩＮＤ−ＥＲβを導入した細胞に、各化合物を添加した際の結合活性を示している。結合活性増強作用の評価は陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を添加した際の結合活性値と比較して行った。
【００４２】
【表１】
0005990058.tif 000002
【００４３】
その結果、ｐＢＩＮＤ−ＥＲαを導入した細胞では陽性対照であるエストラジオール及びＥＲα選択的アゴニストであるＰＰＴによるＥＲαとの結合活性増強作用が認められた。他方、ｐＢＩＮＤ−ＥＲβを導入した細胞ではエストラジオール及びＥＲβ選択的アゴニストであるＤＰＮによるＥＲβとの結合活性増強作用が認められ、ＰＰＴによるＥＲβとの結合活性増強作用は認められなかった。このことから、当該評価系によりＥＲβとの結合活性を選択的に増強する物質の探索が可能であることが確認された。
【００４４】
実施例１  各抽出物におけるＥＲβ結合活性の選択的増強作用
＜植物抽出物の調製＞
（製造例１）ホウトウ（Ｐａｕｌｏｗｎｉａ  ｆｏｒｔｕｎｅｉ（Ｓｅｅｍ．）Ｈｅｍｓｌ．）抽出物の調製
ホウトウの花２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、８５℃、３時間で抽出し、不溶物をろ別後、抽出液を得、減圧濃縮し、ホウトウの抽出乾固物を得た。
この抽出固形分を５０（ｖ／ｖ）％エタノールに溶解し、ホウトウの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００４５】
（製造例２）カチラン（Ｃｒｏｔａｌａｒｉａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ  Ｇｒａｈ．）抽出物の調製
カチランの全草１００ｇに、２０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてカチランの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００４６】
（製造例３）キョウヨウヨウ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｄｅｎｐｏｄａ  Ｍａｘｉｍ．）抽出物の調製
キョウヨウヨウの根皮、樹皮、葉計１００ｇに、２０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてキョウヨウヨウの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００４７】
（製造例４）キンセンソウ（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｔｙｒａｃｉｆｏｌｉｕｍ（Ｏｓｂ．）Ｗｅｒｒ）抽出物の調製
キンセンソウの枝葉２００ｇに、１０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてキンセンソウの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００４８】
（製造例５）ロウバイ（Ｃｈｉｍｏｎａｎｔｈｕｓ  ｐｒａｅｃｏｘ（Ｌ．）Ｌｉｎｋ）抽出物の調製
ロウバイの花蕾１８０ｇに、約１１倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてロウバイの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００４９】
（製造例６）ミゾコウジュ（Ｓａｌｖｉａ  ｐｌｅｂｅｉａ  Ｒ．Ｂｒｏｗｎ）抽出物の調製
ミゾコウジュの全草１００ｇに、１５倍量（１．５Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてミゾコウジュの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００５０】
（製造例７）ウケツ（Ｓｔｅｎｏｌｏｍａ  ｃｈｕｓａｎｕｍ（Ｌ．）Ｃｈｉｎｇ）抽出物の調製
ウケツの全草、根状茎計２００ｇに、１１倍量（２．２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてウケツの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００５１】
（製造例８）シナフジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｓｗｅｅｔ）抽出物の調製
シナフジの茎葉２００ｇに、１０倍量（２Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてシナフジの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００５２】
（製造例９）テンオウゴン（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ  ａｍｏｅｎａ  Ｃ．Ｈ．Ｗｒｉｇｈｔ）抽出物の調製
テンオウゴンの根２００ｇに、１５倍量（３Ｌ）の５０（ｖ／ｖ）％エタノール−水混合溶液を加え、上記（１）と同様にしてテンオウゴンの５０（ｖ／ｖ）％エタノール抽出物を調製した。
【００５３】
＜評価方法＞
ＨＥＫ２９３細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに４．０×１０4  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％  チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ）を交換し、ｐＢＩＮＤ−ＥＲα、もしくはｐＢＩＮＤ−ＥＲβをｐＧＬ４．３５［ｌｕｃ２Ｐ／９ＸＧＡＬ４ＵＡＳ／Ｈｙｇｒｏ］とともに、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液、陽性対照であるエストラジオール（終濃度１０ｎＭ）、又は上記製造例１〜９で調製した植物抽出物を表２記載の終濃度となるように添加し、さらに２４時間培養を行った。
ルシフェラーゼ活性を上記と同様にして測定し、ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。それぞれの活性値は陽性対照におけるＲＬＵを１とした場合の相対値として示した。結合活性増強作用の評価は陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を添加した際の結合活性値と比較して行った。
結果を表２に示す。
【００５４】
【表２】
0005990058.tif 000003
【００５５】
＜結果＞
表２より、本発明の植物抽出物はＥＲαと比較してＥＲβとの結合活性増強作用が顕著に高いことが認められた。
このことから、上記植物抽出物は、ＥＲβと選択性高く結合し、活性化する作用を有していることが確認された。
【００５６】
参考例３  ＥＲβを介する転写活性化能評価系の構築
ＥＲβは、ゲノム上に存在するＥＲＥ（J Steroid Biochem Mol Biol. 120, 172-9, (2010).）に結合し、標的遺伝子の転写を制御することが知られている。そこで、ＥＲＥを利用し、ＥＲβを介した転写活性化能の有無を評価できる系の構築を行った。
ｐＥＲＥ（ホタルルシフェラーゼ）はＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より購入した。ｐＲＬ−ＣＭＶ（ウミシイタケルシフェラーゼ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ社より購入した。
【００５７】
ＨＥＫ２９３細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに４．０×１０4  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％  チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ）を交換し、ｐＥＲＥ、ｐＲＬ−ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３−ＥＲβをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、陰性対照として５０（ｖ／ｖ）％エタノール、陽性対照としてエストラジオール、ＰＰＴ又はＤＰＮをそれぞれ表３記載の終濃度となるように添加し、さらに２４時間培養を行った。ホタルルシフェラーゼ（転写活性化能の指標）、及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐｌａｓｍｉｄの導入効率の指標）の活性測定には、Ｄｕａｌ−ＧｌｏTM  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、添付のプロトコールに従い実施した。ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。ＥＲβを介した転写活性化能は、陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を添加した際のＲＬＵと比較して評価した。
【００５８】
【表３】
0005990058.tif 000004
【００５９】
その結果、ＰＰＴ又はＤＰＮを添加したところ、ＰＰＴよりもＤＰＮの方が、ＥＲβを介した転写活性化能が高かった。このことから、当該評価系はＥＲβを介した転写活性化能を評価するのに有用であることが確認された。
【００６０】
実施例２  各抽出物におけるＥＲβを介した転写活性化能の評価
＜評価方法＞
ＨＥＫ２９３細胞を９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに４．０×１０4 ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、その１２時間後に培養液（５％  チャコール処理血清を含むＤＭＥＭ）を交換し、ｐＥＲＥ、ｐＲＬ−ＣＭＶ及びｐｃＤＮＡ３−ＥＲβをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）を用い、製品添付のプロトコールに従い細胞に導入した。導入２４時間後に、陰性対照として５０（ｖ／ｖ）％エタノール、陽性対照としてエストラジオール、又は上記製造例１〜９で調製した各植物抽出物を表４記載の終濃度となるように添加し、さらに２４時間培養を行った。ルシフェラーゼ活性を上記と同様にして測定し、ホタルルシフェラーゼの発光強度をウミシイタケルシフェラーゼの発光強度で除したものを、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ（ＲＬＵ）として算出した。ＥＲβを介した転写活性化能は、陰性対照である５０（ｖ／ｖ）％エタノール水溶液を添加した際のＲＬＵと比較して評価した。
【００６１】
【表４】
0005990058.tif 000005
【００６２】
＜結果＞
表４より、本発明の植物抽出物にＥＲβを介した転写活性化能が認められた。以上より、本発明の植物抽出物はＥＲβと選択性高く結合し、標的遺伝子の転写を活性化する作用を有していることが確認された。
【００６３】
実施例２  植物抽出物の皮脂分泌抑制作用
＜評価方法＞
ハムスター初代培養皮脂腺細胞（クラボウ社）を２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３日間Ｈｕｍｅｄｉａ−ＢＧ（クラボウ社）で培養した後、陰性対照であるＤｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（コントロール）、皮脂蓄積を抑制することが知られているａｌｌ  ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ａｔＲＡ）、アダパレン（ａｄａｐａｌｅｎｅ）、および上記製造例１で調製したホウトウ抽出物をそれぞれ１.０（ｖ／ｖ）％となるように添加したＨｕｍｅｄｉａ−ＢＤ（クラボウ社）中で更に３日間培養した。培養後、それぞれのｗｅｌｌをＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍｌ  Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ染色液を滴下し３０分３７℃、ＣＯ2  ５％の条件下で染色した。染色終了後にＰＢＳで２回洗浄し、４８５ｎｍの励起波長を当て、５６５ｎｍの波長の蛍光強度を測定した。
【００６４】
＜結果＞
ホウトウ抽出物は、ハムスター皮脂腺細胞における皮脂の産生を抑制した（表１）。
【００６５】
【表５】
0005990058.tif 000006
【図２】
0005990058.tif 000007
【図１】
0005990058.tif 000008