(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、
アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、
前記組成物から前記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、
ポリプロピレンバイアルまたはポリプロピレンバイアルインサートを含むサンプル容器中に前記抽出液を配置し、ウシ血清アルブミンを前記抽出液に添加して、前記サンプル容器への前記抽出液中の前記アレルゲンの吸着を最小化するステップ、ならびに
前記サンプル容器中に含まれる前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および／または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび／または空気アレルゲンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記空気アレルゲンが花粉または胞子である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
トウモロコシ穀粒における脂質輸送タンパク質アレルゲンの量を測定する方法であって、
挽いたトウモロコシ穀粒から９ｋＤａの分子量を有するトウモロコシ由来脂質輸送タンパク質（LTP）アレルゲンを抽出して抽出液を形成するステップ、
ポリプロピレンバイアルまたはポリプロピレンバイアルインサートを含むサンプル容器中に前記抽出液を配置し、ウシ血清アルブミンを前記抽出液に添加して、前記サンプル容器への前記抽出液中の前記トウモロコシ由来のLTPアレルゲンの吸着を最小化するステップ、ならびに
前記抽出液中の前記トウモロコシ由来ＬＴＰアレルゲンの量を、紫外線検出および／または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップ
を含む方法。
【請求項８】
前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、
アレルゲンの複数のアイソフォームまたは変異体を含む組成物を提供するステップ、
前記組成物から前記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、
ポリプロピレンバイアルまたはポリプロピレンバイアルインサートを含むサンプル容器中に前記抽出液を配置し、ウシ血清アルブミンを前記抽出液に添加して、前記サンプル容器への前記抽出液中の前記アレルゲンの吸着を最小化するステップ、ならびに
前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含み、
前記アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、方法。
【請求項１０】
前記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップが、前記アレルゲンの１つまたはそれ以上の変異体またはアイソフォームの量を、紫外線検出および質量分析検出により測定するステップを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１０年１０月１日出願の米国特許仮出願第６１／３８８，７４８号の「QUANTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF ALLERGENS」の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
脂質輸送タンパク質（ＬＴＰ）は、以前にインビトロで膜の間の脂質輸送において重要な生理学的役割を果たすと思われていた、低分子量タンパク質である。このタンパク質は、多数の植物種において特徴付けられており、さまざまな組織および発育段階に見出される１。それらは多重遺伝子ファミリーを形成し、植物ＬＴＰの５０を超えるアミノ酸配列がゲノムデータバンクに登録されている。異なる分子量の２種の主要なファミリーが単離されている。一方は、約９ｋＤの分子量を有するタンパク質により構成され、他方は、７ｋＤａの分子量を有するタンパク質から構成され、それぞれＬＴＰ１およびＬＴＰ２と称される。ＬＴＰ１タンパク質は、塩基性の、９と１０との間の等電点（ｐＩ）を示すタンパク質である。ＬＴＰ１の公知の配列の中で、すべてが９０〜９５アミノ酸残基を有することにより特徴付けられ、このうち８つは、一次構造の同様の位置にシステインが保存されている。これらのシステイン残基は、ＬＴＰ１の中に厳密に保存されている分子内ジスルフィド結合に関与する１。さらに、ＬＴＰは、芳香族化合物のトリプトファンまたはフェニルアラニン残基を含有しない。２つのよく保存されたチロシン残基は、ポリペプチド骨格のＮ末端およびＣ末端に向かって位置する。両方のファミリー中のタンパク質は、前駆体タンパク質として合成され、シグナルペプチド切断後に分泌経路に進入する。さまざまな植物種由来のＬＴＰ１は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）２、トウモロコシ（Zea mays）３、トウゴマ（Ricinus communis）４およびササゲ（Vigna unguiculata）５、６の種子の細胞壁に位置する。
【０００３】
植物におけるＬＴＰの機能的役割は、広範囲に得わたって討論されてきた。トウゴマ（R.communis）の穀粒において、ＬＴＰのアイソフォームはオルガネラの内部に見出されており、これはグリオキシゾーム（glyoxosome）として特徴付けられた。このＬＴＰは、インビトロ試験において、アセチルＣｏＡオキシダーゼ酵素の活性を増加させることが示されており、おそらく脂質貯蔵の異化の制御における、β酸化への関与を示唆している６。ブロッコリー（Brassica oleracea var.italica）において、ＬＴＰは、ろう様の葉の表面に付随して見出された。この発現パターンは、クチンのモノマーの輸送におけるＬＴＰの役割を示唆する４。さらに、非生物的ストレス因子、例えば、干ばつ、低温および塩が、いくつかの植物種においてＬＴＰファミリーのメンバーを上方制御することが記載されている１、７−９。膜の安定化、クチクラの蓄積および／または細胞壁の組織の変化は、これらのストレス因子に対する応答におけるそれらの推定の役割として主張されている７、９、１０。さらに、ＬＴＰは、胚形成１、発芽１１および花粉−めしべ相互作用１２を含む、植物の成長および発育において潜在的な役割を有する。ＬＴＰの役割は未だ不明瞭なままであるが、植物病原体、例えば細菌、真菌およびウイルスに対する植物の防御機序における役割は、十分確立されていると思われる１、１３、１４。これは、発病関連（ＰＲ）タンパク質としてのＬＴＰの分類につながり、ＰＲ−１４ファミリーに含まれる１４。
【０００４】
さらに、ＬＴＰは、植物性食物アレルゲンとして近年同定されている。ＬＴＰは、それらが、特異的ＩｇＥを感作、すなわち誘導でき、重篤な症状を誘発するという点で、完全な食物アレルゲンとして同定されている。ＬＴＰは、タンパク質分解攻撃および食品加工に対して抵抗性である、強力な食物アレルゲンであると思われる。安定性により、アレルゲンは免疫原性構造およびアレルギー性構造で胃腸の免疫系に達することができ、全身症状を感作および誘導できる。ＬＴＰは、バラ科１５、１６、１７およびブドウ科１８の果実ならびに他の植物種、例えばアスパラガス（Aspargus officinalis）およびキャベツ（B.oleracea var.capitata）１９、２０中に報告されている。近年、トウモロコシのアレルゲンについての包括的研究が、Ｐａｓｔｏｒｅｌｌｏのグループにより実施された２１。トウモロコシ摂取後全身症状を有した２２人の患者から血清をスクリーニングし、患者のうち１９人（８６％）がＬＴＰ９ｋＤａタンパク質を認識したことにより、ＬＴＰが主要なトウモロコシのアレルゲンであることが確認された。追跡研究において、ＬＴＰが、きわめて安定なタンパク質であり、１００℃において調理後でさえＩｇＥ結合活性を保持していることが見出された２２。さらに、トウモロコシＬＴＰは、胃腸内消化に対して抵抗性であるとも思われる２３。まとめると、これらの特性が、タンパク質のＬＴＰクラスのメンバーを、重篤な反応を起こし得る強力な食物アレルゲンにしている可能性がある。興味深いことに、トウモロコシＬＴＰは、南ヨーロッパおよびＵＳ出身の患者の小集団においてだけ関連アレルゲンであることが見出されており、ＬＴＰへの感作は比較的まれであることを示唆している２４。ピーナッツ、木の実、コムギ、牛乳、卵、甲殻類、ダイズおよび魚を含む８つの食物が９０％を超える食物アレルギーを占めることが広く公知である。
【０００５】
タンパク質の正確な絶対的定量が困難なため、多くの場合、ＬＴＰの役割は未だ不明瞭である。先行する研究の多くは、大規模な試料調製または不適切な、非感受性および非特異的なインビトロバイオアッセイにより取り組んでいる。この目的のために一般に用いられた分析方法は、免疫学的取り組みに基づく。免疫化学的方法は一般に感受性が高く、ハイスループットに適合するが、それらは特異性の制限に苦しんだ。さらに、標的タンパク質に対する抗体の発生は、時間のかかるやり方である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は以下を提供する。
［１］組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、上記組成物から上記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに上記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および／または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含む方法。
［２］上記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、上記［１］に記載の方法。
［３］上記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび／または空気アレルゲンである、上記［１］に記載の方法。
［４］上記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、上記［３］に記載の方法。
［５］上記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、上記［４］に記載の方法。
［６］上記空気アレルゲンが花粉または胞子である、上記［３］に記載の方法。
［７］組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、上記組成物から上記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、上記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および／または質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップ、精製アレルゲンの供給源を提供するステップ、および精製アレルゲンの上記供給源を用いて、紫外線検出および／または質量分析検出を備えた上記液体クロマトグラフィーを実施するために使用する上記機器を較正するステップを含む方法。
［８］上記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、上記［７］に記載の方法。
［９］上記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび／または空気アレルゲンである、上記［７］に記載の方法。
［１０］上記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、上記［９］に記載の方法。
［１１］上記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］上記空気アレルゲンが花粉または胞子である、上記［９］に記載の方法。
［１３］組成物のアレルゲン含有量を測定する方法であって、アレルゲンの複数のアイソフォームまたは変異体を含む組成物を提供するステップ、上記組成物から上記アレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに上記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含む方法。
［１４］上記抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップが、上記アレルゲンの１つまたはそれ以上の変異体またはアイソフォームの量を、紫外線検出および質量分析検出により測定するステップを含む、上記［１３］に記載の方法。
［１５］上記液体クロマトグラフィーが二次元液体クロマトグラフィーである、上記［１３］に記載の方法。
［１６］上記アレルゲンが、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび／または空気アレルゲンである、上記［１３］に記載の方法。
［１７］上記食物アレルゲンが、食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンである、上記［１６］に記載の方法。
［１８］上記食品穀物アレルゲンが、トウモロコシ脂質輸送タンパク質である、上記［１７］に記載の方法。
［１９］上記空気アレルゲンが花粉または胞子である、上記［１６］に記載の方法。
本発明の実施形態は、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法を含む。本発明の実施形態は、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、組成物から少なくとも部分的にアレルゲンを精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、精製後のトウモロコシ種子由来内因性ＬＴＰのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を表す図である。Ｍ、分子量マーカー；レーン１トウモロコシ種子抽出液；レーン２、ＬＣ−ＵＶ分析の間にトウモロコシ種子から単離されたＬＴＰ分画；レーン３、ＬＴＰの最終参照。矢印は検出されたＬＴＰバンドを示す。
【図２】図２は、ＬＴＰ参照標準の無処理（intact）のＭＷのＬＣ−ＵＶ／ＭＳ（２１５ｎｍ）のクロマトグラムを表す図である。
【図３】図３は、ＬＴＰ参照のデコンボリューションされた質量スペクトルを表す図である（差し込み図：複数電荷エンベローブの質量スペクトル）。
【図４】図４は、トウモロコシ脂質輸送タンパク質の推定アミノ酸配列を表す図である。ペプチドマスフィンガープリンティングを使用して観察されたトリプシンペプチドおよびＬｙｓ−Ｃペプチドに、それぞれ下線を引き、網掛けしてある。
【図５Ａ−Ｂ】図５（Ａ）は、全ＬＴＰ濃度１１３．６μｇ／ｍＬの参照ＬＴＰをスパイクしたトウモロコシの穀粒抽出液の分析から得られたＬＣ−ＵＶ／ＭＳ（２１５ｎｍ）クロマトグラムを表す図である。図５（Ｂ）は、全ＬＴＰ濃度４．０８μｇ／ｍＬの参照ＬＴＰをスパイクしたトウモロコシの穀粒抽出液の分析から得られたＬＣ−ＵＶ／ＭＳ（２１５ｎｍ）クロマトグラムを表す図である。
【図５Ｃ】図５（Ｃ）は、４．１〜１４７μｇ／ｍＬに及ぶＬＴＰ測定のための典型的な標準曲線を表す図である。
【図６】図６（Ａ）は、系統＃１３由来のトウモロコシ穀粒抽出液のＵＶ（２１５ｎｍ）クロマトグラムを表す図である。図６（Ｂ）は、保持時間１２．３４分の成分のデコンボリューションされた質量スペクトルを表す図である。図６（Ｃ）は、系統＃５由来のトウモロコシ穀粒抽出液のＵＶ（２１５ｎｍ）クロマトグラムを表す図である。Ｙ軸を、トウモロコシ穀粒系統＃１３に対して正規化してある。図６（Ｄ）は、保持時間１２．７４分の成分のデコンボリューションされた質量スペクトルを表す図である。図６（Ｅ）は、系統＃５由来のトウモロコシ穀粒抽出液のＵＶ（２１５ｎｍ）クロマトグラムを表す図である。Ｙ軸を、トウモロコシ穀粒系統＃４に対して正規化してある。図６（Ｆ）は、保持時間１３．１４分の成分のデコンボリューションされた質量スペクトルを表す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の実施形態は、組成物中のアレルゲン含有量を測定する方法を含む。本発明の実施形態は、アレルゲンを含む組成物を提供するステップ、組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成するステップ、ならびに抽出液中のアレルゲンの量を、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを使用して測定するステップを含むことができる。
【０００９】
本明細書において使用する場合、「アレルゲン」はアレルギー反応または過敏反応を誘導する任意の物質である。実施形態において、アレルゲンは、公知のアレルゲン、例えば特定の対象においてアレルギー反応または過敏反応を発生させることが公知である物質であってよい。実施形態において、アレルゲンは、公知のアレルゲンであるという理由で、本発明の方法による分析のために選択されてよい。
【００１０】
本明細書において使用する場合、「アレルギー反応」または「アレルギー」は、後に曝露したときにアレルゲンに対する反応性が著しく増加するような特定のアレルゲンへの曝露により引き起こされる過敏反応または過敏性である。
【００１１】
本発明の実施形態において、液体クロマトグラフィーは、一次元または二次元のいずれであってもよい。
【００１２】
本明細書において使用する場合、「組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成する」は、アレルゲンを含む固体組成物の場合、アレルゲンの少なくとも一部を、それを含む固体組成物から液体組成物中に取り出し、紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーに適切な抽出液を形成することを意味する。実施形態において、アレルゲンの少なくとも一部を、それを含む固体組成物から液体組成物中に取り出すことは、当業者に利用可能な任意の様式で実施されてよい。タンパク質または他のアレルゲンの固体組成物からの抽出は、当分野において周知であり、単一ステップまたは複数ステップの方法で実施できる。タンパク質または他のアレルゲンの固体組成物からの抽出に使用できる技術の例は、浸出法、液化、溶解、超音波処理、凍結／解凍サイクル、均一化、ろ過、電気泳動、透過化、沈殿、変性、遠心分離、クロマトグラフィー、差次的可溶化およびろ過を含むが、これに限定されない。
【００１３】
アレルゲンを含む液体組成物の場合、「組成物からアレルゲンを少なくとも部分的に精製し、抽出液を形成する」は、液体クロマトグラフィーステップにより実施できると考えられ、これにより、アレルゲンが液体中の１つまたはそれ以上の他の成分から分離される。
【００１４】
特定の実施形態において、アレルゲンは、食物アレルゲン、ラテックスアレルゲンおよび／または空気アレルゲンであり得る。食物アレルゲンの例は、食品穀物、ピーナッツ、豆類、エンドウ、果実、セロリ、ゴマ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモのアレルゲンを含むが、これに限定されない。食品穀物アレルゲンの例は、ダイズ、トウモロコシおよびコムギのアレルゲンを含むが、これに限定されない。実施形態において、アレルゲンは、トウモロコシ脂質輸送タンパク質であってよい。
【００１５】
本明細書において使用する場合、「空気アレルゲン」は、アレルギー反応を引き起こし得る任意の空気中物質である。空気アレルゲンの例は、花粉および胞子を含むが、これに限定されない。
【００１６】
本発明に従った方法の実施形態は、精製アレルゲンの供給源を提供または単離するステップ、および精製アレルゲンを使用して紫外線検出および質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィーを実施するために使用する機器を較正するステップもまた含むことができる。
【００１７】
他の実施形態において、アレルゲンを含む組成物は、アレルゲンの複数のアイソフォームまたは変異体を含むことができる。さらなる実施形態において、本発明に従った方法は、試料中のアレルゲンの複数の異なるアイソフォームまたは変異体の量を測定するために使用され得る。実施形態において、アレルゲンの異なるアイソフォームまたは変異体の量の測定は、紫外線検出ステップおよび／または質量分析検出ステップを備えた単一の液体クロマトグラフィーステップを用いて測定され得る。
【００１８】
ＬＣ−ＭＳ法は、近年、複合マトリックスにおける特異性、感受性および正確性の高さによって、さまざまなバイオマーカーを定量および同定するために首尾よく開発されてきた２５、２６。ＬＣ−ＭＳによるタンパク質の定量は、ペプチドレベル（タンパク質分解後の署名ペプチド）またはタンパク質レベル（無処理のタンパク質の分析）のいずれにおいても実施され得る。同位体で標識された合成類似体を内部標準として使用して、トリプシン署名ペプチドを分析することによるタンパク質定量の方法論が、詳細に記載されている２７。しかし、署名ペプチドの取り組みは、（ａ）配列が対象となるタンパク質だけに特異的である適切なペプチドが見出されなければならないこと２７、（ｂ）内部標準の挙動が、消化前の無処理のタンパク質の挙動と比較して、有意に異なり得ること、および（ｃ）タンパク質のトリプシン消化が完全であることに依存することを含む、いくつかの課題を提起する２８。ＬＣ−ＵＶ／ＭＳによる無処理のタンパク質の定量は、時間のかかる、潜在的に問題のある消化ステップを回避する。さらに、署名ペプチドの取り組みにより取り逃されるさまざまなアイソフォームまたは変異体が、分離され、定量され得る。
【００１９】
本明細書において記載する場合、ＬＴＰおよびＬＴＰ類似体は、トウモロコシ穀粒から精製され、特徴付けられた。ＬＴＰの検出のための高い特異性および感受性を得るために、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ法が、迅速な同定および定量用に開発された。この方法は、１４のトウモロコシ系統の比較において、アッセイの特異性、感受性および定量の正確性を実証するために開発された。ＬＣ−ＵＶ／ＭＳの使用は、試料操作の最小化、分析時間の短縮をもたらすことができ、アレルゲンレベルの評価に関する組成物試料の定量を正確にする。
【実施例】
【００２０】
本発明を、以下の実施例においてさらに記載するが、これらは例示目的で提示するものであり、いかなる方法においても本発明を限定する意図では決してない。
実施例に使用する方法および材料：
材料：
【００２１】
アンモニウムビカーボネートおよびＭＥＳバッファは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＨＰＬＣグレードのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、微量金属グレード水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、ＬＣ／ＭＳグレードのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩化水素、ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）およびβ−メルカプトエタノールは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。ＨＰＬＣ−グレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）およびメタノールは、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）から購入した。０．２２μｍのメンブレンフィルタを有するＳｔｅｒｉｆｌｉｐ使い捨て真空ろ過システムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）から購入した。ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ陽イオン交換カラムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。ポリプロピレン・オート・サンプラー・バイアル・インサートは、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から購入した。基準の４〜２０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。Ｌｙｓ−Ｃおよびトリプシンは、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から入手した。すべての分析に、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）脱イオン水を使用した。
参照ＬＴＰの調製：非トランスジェニックトウモロコシ種子からのＬＴＰの精製。
【００２２】
トウモロコシ由来ＬＴＰタンパク質の抽出および単離を、以下のように実施した。既存のトウモロコシ穀粒を、Ｒｏｂｏｔ  Ｃｏｕｐｅグラインダー（Ｍｏｄｅｌ＃：ＲＳＩ  ２Ｙ−１、Ｒｏｂｏｔ  Ｃｏｕｐｅ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を用いて、等量のドライアイスを含有する微粉に粉砕した。ドライアイスを、−２０℃において一晩抜き、翌日、５０グラムの粉末化穀粒を、３５０ｍＬの１２５ｍＭ アンモニウムビカーボネートバッファに再懸濁した。混合物のｐＨをＮａＯＨで８．０に調整し、試料を、連続混合しながら、７２℃で２時間加熱した。不溶性粒子を、試料を３７０００ｇで５分間、２０℃において遠心分離にかけることによって除去した。得られた上清を、Ｐ８グレードのろ紙を通してろ過し、試料を、５ｍｇのトリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  ＃  Ｔ７１６８）で一晩、４０℃において消化した。タンパク質分解後、試料のｐＨを、ＨＣｌで５．２に下げ、試料を、３００００ｇで１５分間、２０℃において遠心分離にかけることによってさらに清澄化した。得られた上清を、０．４５μｍのフィルタを通してろ過し、試料を、５０ｍＭのＭＥＳバッファ、ｐＨ５．５（バッファＡ）であらかじめ平衡化したＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに添加した（５ｍＬ／分、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水と５０／５０で混合）。試料の添加後、カラムを、Ａ２８０がベースラインまで下がるまでバッファＡで広範囲に洗浄した。結合したタンパク質を、バッファＡからバッファＢ（バッファＡ＋０．５Ｍ ＮａＣｌ）のリニアグラジエントにより溶出させ、回収した分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査した。約９ｋＤａのＬＴＰタンパク質を含有する分画を混ぜ合わせ、タンパク質濃度を、定量的アミノ酸分析により測定した。プールした分画をバイアルにアリコートし、−８０℃において保存した。
試料の調製：トウモロコシ穀粒からの、ＬＴＰおよびＬＴＰ変異体の単離。
【００２３】
粉砕トウモロコシ穀粒からのＬＴＰの抽出は、先の報告にいくらかの変更を加えて実施した。２１簡潔に言うと、−２０℃に保存した粉砕トウモロコシ穀粒を、Ｄｒｙ−Ｒｉｔｅ（商標）を含有するドライボックスにおいて室温で解凍した。およそ１００ｍｇの粉砕トウモロコシ穀粒を秤量し、７００μＬの０．１２５Ｍのアンモニウムビカーボネートバッファ、ｐＨ８．３を加え、１，１００ｒｐｍで２時間、２２℃においてＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（商標）を使用して混合した。試料を、１６１００ｇで３０分間、遠心分離により清澄化し、得られた上清を、１．５ｍＬのマイクロチューブに移した。アリコートをオートサンプラーバイアルに移す前に、抽出液を２分間、１６１００ｇで再度遠心分離にかけた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびタンパク質消化。
【００２４】
ＬＴＰの同定および特徴付けを容易にするために、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、４〜２０％ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて実施した。簡潔には、試料を、５％のβ−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉバッファで希釈した。得られた試料を３７１ｇで４５秒間遠心分離にかけ、その後、９５℃において１．５分間加熱した。分離されたタンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いて検出した。分離および染色後、対象となるタンパク質バンドを切り取り、トリプシンまたはＬｙｓ−Ｃとともに、３７℃において一晩インキュベートした。ペプチドを、２５ｍＭのアンモニウムビカーボネートバッファ中５０％ ＡＣＮおよび０．５％ ＴＦＡを用いてゲルから抽出した。ゲルに残留するペプチドを、その後、２５ｍＭ アンモニウムビカーボネートバッファ中７０％ ＡＣＮおよび５％ ギ酸を用いて抽出した。抽出液をプールし、ｖａｃｕｆｕｇｅにおいて乾燥させた。乾燥ペプチドを、１８μＬに再構成した。得られたタンパク質分解ペプチドを、質量分析により直接分析した。
ＬＴＰおよび変異体の特徴付けのための、質量分析条件。
【００２５】
すべての質量スペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５２０  Ｑ−ＴＯＦ質量分析計およびＡｇｉｌｅｎｔ  １２００ＳＬ液体クロマトグラフィー系において得た。クロマトグラフィーをグラジエント溶出によりＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ１３０  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から５０℃において実施し、カラム寸法は１００×２．１  ｍｍであり、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ＳＬ  ｓｙｓｔｅｍ  Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の粒径は１．７μｍであった。カラムを、９５％の移動相Ａ（水中０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡ；ＭＰＡ）および５％の移動相Ｂ（アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ＦＡ；ＭＰＢ）を使用して、流速２００μＬ／分で平衡化した。注入体積は、５および２０μＬの間で変動した。リニアグラジエントを、５％ ＭＰＢから４０％ ＭＰＢは１７．２分にわたって、４０％ ＭＰＢから４５％ ＭＰＢは１．７分にわたって用いた。カラムをその後、初期条件まで６分間再平衡化した。
【００２６】
ＵＶ（２１０〜６００ｎｍ）およびＭＳ（２００〜１８００ａｍｕ、１Ｈｚ）の両方を得た。ＵＶデータを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００ＳＬ  Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して得た。陽イオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を、６５２０  ＱＴＯＦ質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびデュアルＥＳＩイオン源において実施した。質量スペクトル獲得のための機器パラメータは、下記の通りである：ＶＣａｐは３５００Ｖ、フラグメンターは１４５Ｖ、スキマー１は６５Ｖ、ガス温度は３５０oＣ、ガス流速は８Ｌ／分、ネブライザーは３１０ｋＰａに設定した。タンデムＭＳ実験の間、静的排除範囲を用いた標的化ＭＳ／ＭＳを用いた。ピークをタンデムＭＳのために単離し、９ａｍｕ幅および３．６Ｖ／１００Ｄａ＋２Ｖの衝突エネルギー勾配を適用した。得られたすべてのデータ（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）を手作業で処理した。
特徴付けおよび定量のためのクロマトグラフィーおよび質量分析の条件。
【００２７】
クロマトグラフィーを、グラジエント溶出によりＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ３００  Ｃ４カラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から７０℃において実施し、カラム寸法は１００×２．１ｍｍであり、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）の粒径は１．７μｍであった。カラムを、９３％移動相Ａ（水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；ＭＰＡ）および７％移動相Ｂ（ＩＰＡ中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；ＭＰＢ）を、流速３００μＬ／分で使用して平衡化した。試料を、パーシャル・ループ・フィル・注入モードおよび５μＬの注入体積を使用して注入した。リニアグラジエントを、７％ ＭＰＢから１４．５％ ＭＰＢは１５分にわたって用い、その後ＭＰＢを、５０．５％まで７分間線形に傾斜させた。その後、カラムを初期条件まで５分間再平衡化した。試料の注入前、オートサンプラーニードルを、ＩＰＡ（強力洗浄）および水（弱い洗浄）で洗浄し、試料のキャリーオーバーを最小化した。
【００２８】
ＵＶ（２１５ｎｍ、１０Ｈｚ）およびＭＳ（７００〜２３００ａｍｕ、１Ｈｚ）両方のデータを得た。ＵＶデータを、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＴＵＶ検出器  Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して得た。ＵＶ獲得のための機器パラメータは以下の通りであった：波長２１５ｎｍ、サンプリング速度１０ポイント／秒および時定数０．２秒。陽イオンエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を、ロック−スプレーインターフェイスを用いたＱ−ＴｏＦｍｉｃｒｏ（商標）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）にて実施した。ＭＳ注入の前に、７％ グリセロール／６８％ 水／２５％ アセトニトリルの溶液をＴｅｅにより導入し、トリフルオロ酢酸の存在下のイオン化効率を改善した。質量分析スペクトル獲得のための機器パラメータは、以下の通りであった：キャピラリー２８５０Ｖ、試料コーン３５Ｖ、抽出コーン１．５Ｖ、脱溶媒和温度４１０oＣ、供給源温度１００oＣ、低および高質量分解能５、脱溶媒和ガス６００Ｌ／時、コーンガス５０Ｌ／時、ＭＣＰ検出器２３５０Ｖ、スキャン時間０．９秒、インタースキャンデレイ０．１秒および衝突エネルギー１０。
方法の開発
【００２９】
ＥＬＩＳＡによるＬＴＰの定量は選択法である。２９トウモロコシ由来のＬＴＰの場合、特異的抗体の不足のために、ＬＴＰを定量するための別の取り組みが考えられた。このことにより、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析によるトウモロコシ抽出液の可溶性分画中のトウモロコシＬＴＰの定量的測定に関する方法を開発することになった。トウモロコシＬＴＰ中のトリプトファン残基の不在のため、波長２１５ｎｍを使用するに至った。２１５ｎｍという波長は、移動相（ＩＰＡおよびＴＦＡ）の吸光度を最小化し、被検物質の感受性を最大化し、溶媒のグラジエントを通して一定のベースラインを維持するために慎重に選択した。逆相タンパク質分離のためのＩＰＡおよび高温の使用が、優れた回収および分解能を得るために重要であることがすでに示されている３０。特異性の問題に対処するために、ＭＳの反応もまたモニターした。ＴＦＡの存在下の質量分析計の反応を改善するために、水／アセトニトリル混合物中グリセロール溶液をＭＳの前に加えた。シグナル対ノイズ比の増大およびより高い荷電状態への推移を観察した。グリセロール／水／アセトニトリル混合物の存在下で観察された全イオン電流は、移動相の添加剤であるギ酸の存在下で観察されたシグナルと同等であった。グリセロールの添加により、エレクトロスプレーイオン化の間にタンパク質およびタンパク質複合体のイオン化が劇的に増加することが以前に示されている。３１
【００３０】
方法の開発の間に、参照ＬＴＰとガラスバイアルとの結合が観察された。吸着によるこのＬＴＰの損失は、精製された参照ＬＴＰの分析時に観察された。オートサンプラーバイアルへの吸着による損失を最小にするために、ポリプロピレン・バイアル・インサートを、すべての分析に使用した。さらに、参照ＬＴＰのＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析の間、濃度０．３ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンもまた含まれた。ウシ血清アルブミンの添加およびポリプロピレンバイアルの使用の両方は、低濃度における線形性の維持に必須であった。
実施例１：ＬＴＰ  ＭＳによる特徴付け。
【００３１】
脂質輸送タンパク質はトウモロコシの主要なアレルゲンであるが、それらの定量化方法は十分確立されていない。ＬＴＰの多数の分子形態および異性体が多数の異なる組織において観察されており、結果として、これらのタンパク質のアイソフォームの低濃度および構造類似性のため、分析には高い感受性および選択性が求められる。これは、ＬＴＰの精製および特徴付けにつながった。トウモロコシ穀粒中の内因性ＬＴＰを、精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図１に示すように、ＬＴＰの単量体型を表す、およそ９ｋＤａのタンパク質バンドが観察された。図２および３は、それぞれ精製タンパク質の全イオンクロマトグラムおよび対応する質量スペクトルを表す。質量スペクトルにより、［Ｍ＋Ｈ］＋イオンをｍ／ｚ  ９０４７．１において発生する主要成分の存在が明らかにされた。この測定された質量は、ｍ／ｚ  ９０４６における理論的前駆体質量［Ｍ＋Ｈ］＋イオンの０．０１％内であった。
【００３２】
およそ９ｋＤａのタンパク質バンドの同定を、トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃプロテアーゼを使用するゲル内消化後、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）によりさらに確認した。ＬＴＰの完全適用範囲のトウモロコシＬＴＰのアミノ酸配列に基づき、トリプシンペプチドおよびＬｙｓ−Ｃペプチドとの比較を達成した（配列番号１）（図４）。Ｎ末端トリプシンペプチド、ＡＩＳＣＧＱＶＡＳＡＩＡＰＣＩＳＹＡＲ（配列番号２）およびＬｙｓ−Ｃ切断Ｃ末端ペプチド、ＣＧＶＳＩＰＹＴＩＳＴＳＴＤＣＳＲＶＮ（配列番号３）を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用するＭＳ／ＭＳによる確認のためにさらにシーケンシングした。フルスキャンＭＳの手作業の解釈および観察されたすべての前駆体電荷状態のＭＳ／ＭＳスペクトルにより配列が明らかになった。各アミノ酸残基を、フラグメントイオンにより生成されるｙイオン系列またはｂイオン系列のいずれかにより、最小限確認した。
実施例２：検証実験
【００３３】
ＬＴＰを測定するアッセイの正確性を、（４．１から１４７μｇ／ｍＬの範囲内の）１１の濃度レベルの参照ＬＴＰをスパイクしたトウモロコシ穀粒抽出液の二連の注入を分析することにより評価した。ひとまとめにした一点較正を、参照ＬＴＰ（８４．７μｇ／ｍＬ）を使用して実施した。非スパイク抽出液中のＬＴＰ濃度を測定するために、非スパイク抽出液の５つの注入を実施した。アッセイの正確性（相対誤差のパーセント、％ＲＥ）を計算し、表１に示す（＊ＬＴＰ濃度は溶液中の濃度および種子中の対応する濃度の両方の面から報告する）。方法の線形性もまた、同じデータを使用して測定した。線形性曲線が、ＬＴＰのピーク面積対濃度をプロットすることによって得られた。線形回帰を使用して、４．１〜１４７μｇ／ｍＬの範囲にわたる線形方程式を得た。線形性曲線の計算に関して、この方程式は原点を通りらなかった。
【表１】
0005931883.tif 000002
【００３４】
ＬＴＰを測定するアッセイの精度を、４日ごとに、挽いた穀粒の３連の調製品（各調製品を２連に注入）を、３つの濃度レベル（低濃度、中濃度および高濃度）において分析することによって評価した。日ごとに用意された試料を、一点参照ＬＴＰ較正標準に（８５μｇ／ｍＬ）ひとまとめにした。アッセイの１日のうちの正確性および日ごとの正確性（パーセント変動係数、％ＣＶ）を計算し、表２に示す。
【表２】
0005931883.tif 000003
【００３５】
すべてのトウモロコシ種子試料中の内因性ＬＴＰの存在により、アッセイの選択性は、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳにより無処理の分子の質量測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＬＣ（ＬＴＰ）分画の分析により測定した。さらに、被検物質のキャリーオーバーを、もっとも高い標準試料の直後に溶媒ブランクを分析することにより評価した。方法のロバスト性を決定するために、以下のパラメータを調査した：抽出効率、カラム温度、ＴＦＡ濃度ならびに参照ＬＴＰ溶液およびトウモロコシ穀粒抽出液の安定性。
【００３６】
トウモロコシ穀粒からのＬＴＰの抽出効率を測定した。参照系統３および１３からの粉砕トウモロコシ穀粒を、上記の詳細なプロトコルにより、１時間、２時間、５時間または１７時間抽出した。これらのさまざまな時点における抽出ＬＴＰ濃度を、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析により測定した。さらに、２時間抽出した試料を、４００μＬの上清を取り除いた後、５００μＬのアンモニウムビカーボネートバッファをさらに加えて、もう２時間の２回目の抽出にさらに供した。抽出後、ＬＴＰ濃度をＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析により測定し、補正を適用し、１回目の抽出からのＬＴＰの残りを考慮に入れた。
【００３７】
クロマトグラフィー分解能およびＬＴＰ定量についてのカラム濃度（６５℃、７０℃および７５℃）およびＴＦＡ濃度（０．０９％、０．１％および０．１１％）の効果を、粉砕トウモロコシ穀粒抽出液を使用して評価した。濃度の測定に関して、参照ＬＴＰを、同じ実験条件下でさらに分析した。
【００３８】
参照ＬＴＰおよびトウモロコシ穀粒抽出液の、室温および４℃における安定性を、４８時間にわたって評価した。トウモロコシ穀粒抽出液および参照ＬＴＰのアリコートを、４℃および室温において４８時間保存した。参照ＬＴＰおよびトウモロコシ穀粒抽出液の両方の反応を、試料調製直後に測定した。保存後、安定性試料をＬＣ−ＵＶ／ＭＳにより分析した。安定性を、保存試料と、新しく調製された参照ＬＴＰとを比較することによって評価した。
【００３９】
保持時間１２．７分および１３．１分のＬＴＰ変異体を特徴付けるために、２０ｍＬのトウモロコシ穀粒抽出液（参照系統＃５）を、複数回注入し、分画を手作業で回収した。回収した分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ機で濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質バンドを切り取り、Ｌｙｓ−Ｃ消化またはトリプシン消化に供し、ペプチドをゲルの外に抽出した。抽出したペプチドを、その後ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【００４０】
トウモロコシの特定の系統の穀粒由来の水性抽出液は、同様の質量のタンパク質変異体を含有し、逆相カラムにおいて特徴的な同様の保持時間を有する。ＬＴＰと、同様の逆相保持特徴を有する他のタンパク質とを分離する方法の特異性は、図５から推測できる。図６の保持時間１２．３分のピークはトウモロコシＬＴＰに対応するが、１２．７分および１３．１分のピークは、それぞれＬＴＰ変異体ＡおよびＢに対応する。ベースライン分解能は、１．６の測定された分解能を有する、これら２つのタンパク質の分離に関して得られる。ＬＴＰピークの純度を、図１（レーン２）に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥにさらに例示する。ＬＴＰ変異体ＡおよびＢのさらなる特徴付けは、ＬＣ分画を回収し、それらをトリプシンまたはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによる溶液中タンパク質分解に供し、その後ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりペプチドを分析することによって実施した。ペプチドマスフィンガープリンティングおよびタンデムＭＳデータにより、ＬＴＰ変異体Ａが、３４位に単一アミノ酸多型（アルギニンからリジン）を有したことが明らかになった。これは、無処理の分子量測定によりＬＴＰおよびＬＴＰ変異体Ａの間に観察される、２８ａｍｕの差によりさらに裏付けられた（図６ＢおよびＤ）。部分的ペプチドマスフィンガープリンティングおよび無処理の分子量分析に基づいたＬＴＰ変異体Ｂに関する改変（＋３３ａｍｕ）の正確な部位（複数可）は確認できなかった。これらの結果は、開発されたＬＣ−ＵＶ／ＭＳ法の特異性をさらに例示する。カラム温度は、これらの２つの成分の分解能を得る重要な要因であった。温度６０℃および９０℃において、これらの２対の成分の間の分解能は不適切であった。
【００４１】
トウモロコシ穀粒中の内因性ＬＴＰの存在により、アッセイの全検証用ＬＴＰ参照標準試料の調製が複雑となった。結果として、検証研究の開発のために、非スパイクトウモロコシ穀粒抽出液中のＬＴＰ濃度を、ＬＴＰ参照標準を使用することによってまず測定した。線形性および正確な研究のために使用するトウモロコシ穀粒系統中に存在する内因性ＬＴＰレベルは、５８μｇ／ｇであった。アッセイの線形性および正確性を、１１の濃度において、トウモロコシ穀粒抽出液を使用して参照ＬＴＰをスパイクすること、またはアンモニウムビカーボネートバッファで希釈することによって測定した。アッセイが、４．１〜１４７μｇ／ｍＬの範囲にわたって、トウモロコシ穀粒抽出液中のＬＴＰに関して線形であることが観察され（図５）、Ｒ２値は０．９９９であった。この濃度範囲は、トウモロコシ穀粒中のＬＴＰの２８．６から１０３０μｇ／ｇに対応する。アッセイの正確性範囲（％ＲＥ）は０〜５．１％であり、９４．９〜１０３％の範囲の回収であった（表１）。２１５のノイズ応答に対するシグナルが、ＬＴＰの最低測定濃度である４．１μｇ／ｍＬにおいて観察された。
【００４２】
方法の線形性を測定するために、ウシ血清アルブミン中参照ＬＴＰの段階希釈を実施した。Ｒ２値が０．９９９の線形応答が得られたが、応答因子（面積／濃度）の急速な減少が、ＬＴＰ濃度４４．２μｇ／ｍＬ未満において観察された。この減少は、トウモロコシ穀粒抽出液中の内因性ＬＴＰがバッファでＬＴＰ濃度１０．４μｇ／ｍＬにまで段階的に希釈された場合には観察されなかった。これらの観察は、マトリックス成分の不在下での吸着による、ＬＴＰの損失を示唆している可能性がある。
【００４３】
その日のうちおよび日ごとの精度に関する検証結果を表２に提示する。精度を、低濃度、中濃度および高濃度のＬＴＰを有することがこれまでに明らかとなっている３つの異なるトウモロコシ穀粒系統を使用して測定した。中間の精度を、２人の分析者、２つのカラムロットおよび２つの異なるＬＣ系を使用してさらに評価した。精度範囲（％ＣＶ）は９．１〜１４．４％であり、この４日間中すべての試料にわたってプールされた相対標準偏差は１１．６％であった。高濃度ＬＴＰトウモロコシ穀粒系統の後のブランク試料中に存在する絶対キャリーオーバーは、およそ０．６％であることが見出された。これは、トウモロコシ穀粒中６μｇ／ｇのＬＴＰ濃度に置き換えられる。任意のキャリーオーバー効果をさらに軽減するために、溶媒ブランクを、分析対象となる試料を分離するためのセット全体に配置した。
【００４４】
抽出効率を測定するために、抽出ＬＴＰ濃度を、第１および第２の抽出ステップ後に測定した。補正係数を、第２の抽出ステップ後に抽出されたＬＴＰに適用した。この補正後、第１および第２の抽出ステップにおいて抽出されたＬＴＰの濃度は、それぞれ、参照系統３由来で３２．１および１．６１μｇ／ｍＬであり、参照系統１３由来で８８．２および８．７５μｇ／ｍＬであった。第１ステップにおける抽出効率は、９１〜９５％の間である。抽出効率の時間効果もまた、参照系統３および１３に関して、１時間、２時間、５時間および１７時間において測定した。参照系統３に関して、ＬＴＰ濃度は、それぞれ２０４、２２５、２４１および２２０μｇ／ｇであった。参照系統１３に関して、ＬＴＰ濃度は、それぞれ５２６、６１９、６５８および６４８μｇ／ｇであった。まとめると、両方の参照系統に関して、２時間における抽出効率は、５時間において観察される効率の９４％である。
【００４５】
カラム温度の変動およびＬＴＰ濃度測定に対するその効果を評価した。カラム温度６５℃、７０℃および７５℃において、ＬＴＰの濃度は、それぞれ４４．７、４８．１および４７．２μｇ／ｍＬであると測定された。移動相ＡおよびＢにおけるＴＦＡ濃度の０．０９％、０．１％および０．１１％の変動に対して、測定されたＬＴＰ濃度は、それぞれ４６．１、４３．８および４７．１μｇ／ｍＬであった。カラム温度およびＴＦＡ濃度における変動による、ここで観察された偏差は、方法の％ＲＳＤ内である。
【００４６】
溶液中の参照ＬＴＰおよび穀粒抽出液中のＬＴＰの被験物質安定性を、４℃および室温において評価した。溶液中の参照ＬＴＰに関して、１．９１％および４．７５％の損失が、４８時間後に、それぞれ４℃および室温において観察された。穀粒抽出液中のＬＴＰに関して、８．３％および１１．５％の損失が、４８時間後に、それぞれ４℃および室温において観察された。これらの損失を考慮に入れて、損失はアッセイの精度の範囲内であるが、参照標準ＬＴＰを、各試料セットのはじめ、中間および終わりに分析した。
実施例３：トウモロコシ系統中のＬＴＰの分析
【００４７】
１４の異なるトウモロコシ種子系統を、記載のように３連に調製した。各調製品の２連の注入を、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析に供した。分析を、一点ＬＴＰ参照標準を検量体として、ひとまとめにした。検量体もまた、参照系統の分析の間に散在させた。参照ＬＴＰ由来の応答因子を使用して、ＬＴＰおよびそれぞれ保持時間が１２．７および１３．１分の２つの変異体（ａおよびｂ）の濃度を測定した。結果を表３に示す。
【表３】
0005931883.tif 000004
【００４８】
対象となる１４のトウモロコシ穀粒系統中に存在するＬＴＰおよびその変異体の濃度を、開発されたアッセイを使用して測定した。１４の系統中のＬＴＰおよび変異体ＡおよびＢの濃度は、それぞれ、５８〜６７８μｇ／ｇ、３１〜５２８μｇ／ｇおよび２１〜５２μｇ／ｇの間で変動した（表３）。ＬＴＰの発現量は、分析される組織および組織の発育段階に依存することが、以前に示されている３。この研究は、トウモロコシ穀粒中のＬＴＰのさまざまな濃度が、個別のトウモロコシ系統の遺伝的バックグラウンドまたは成長条件に依存し得ることを示す。１４のトウモロコシ系統の分析に関して得られた精度（％ＣＶ）は、検証研究の間に測定されたアッセイの精度と一致する。これらの結果は、ＬＴＰ濃度がこのアッセイ方法を使用して再現可能に測定できることを示す。
実施例４：アレルゲン含有組成物の分析
【００４９】
食品穀物、ピーナッツ、木の実、牛乳、卵、甲殻類、魚またはジャガイモ由来のアレルゲンの抽出液ならびに個々のアレルゲンに対する参照標準を得た。各抽出液の２連の注入を、ＬＣ−ＵＶ／ＭＳ分析に供した。分析を、一点参照標準を検量体として、ひとまとめにした。検量体もまた、参照系統の分析の間に散在させた。参照標準由来の応答因子を使用してアレルゲンおよびこれらの変異体の濃度を測定した。異なる抽出液の分析に関して得られた精度（％ＣＶ）は、検証研究の間に測定されたアッセイの精度と一致する。これらの結果は、アレルゲン濃度がこのアッセイ方法を使用して再現可能に測定できることを示す。
【００５０】
本発明は特定の実施形態において記載されたが、本発明は、この開示の趣旨および範囲内でさらに改良できる。したがって、本出願は、その一般原理を使用する本発明の任意の変形、使用または適合を含むことを意図する。さらに、本出願は、この発明に付随し、添付の特許請求の範囲内に納まる、当分野において公知または習慣的な実践に入るような本開示からの逸脱を含むことを意図する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【配列表】
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