(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＳＳＧを検出するための方法であって、以下の工程、
ａ．試料をスルフヒドリルアルキル化剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、
ｂ．前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼと、ＧＳＨ及びグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約２〜５倍高い工程と、
ｃ．シグナルを検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記シグナルが、定量化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＳＨ：ＧＳＳＧの比率を決定するための方法であって、以下の工程、
ａ．任意で試料を溶解剤と接触させる工程と、
ｂ．前記試料の一部を除去する工程と、
ｃ．残りの試料をスルフヒドリルアルキル化剤と接触させる工程と、
ｄ．前記残りの試料に、過剰な還元剤と、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼと、ＧＳＨ及びグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に
変換される基質と、を添加して第１の溶液を形成する工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約２〜５倍高い工程と、
ｅ．前記第１の溶液のシグナルを測定する工程と、
ｆ．前記除去した試料を、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼと、ＧＳＨ及びグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質
と、に接触させて第２の溶液を形成する工程と、
ｇ．前記第２の溶液のシグナルを測定する工程と、
ｈ．前記第２の溶液の前記シグナルを前記第１の溶液の前記シグナルと比較してＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率を決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
試料中の酸化ストレスを決定する方法であって、以下の工程、
ａ．前記試料をスルフヒドリルアルキル化剤、及び任意で、溶解剤と接触させる工程と、ｂ．前記試料を、過剰な還元剤と、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼと、ＧＳＨ及びグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼの存在下でシグナルを生成する化合物に変換される基質と、に接触させる工程であって、前記過剰の還元剤が、前記試料に添加される前記スルフヒドリルアルキル化剤の濃度よりも約２〜５倍高い工程と、
ｃ．前記シグナルを測定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記試料が、細胞、培地、血漿、血清、血液、又は組織抽出物を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記シグナルが、蛍光である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記シグナルが、発光である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記基質が、ＧＳＨ及びグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼの存在下でルシフェリンに変換されるルシフェリン誘導体である、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記基質が、式（ＩＩＩ）、
【化１】
0006041442.tif 000044
で示される化合物であり、
式中、Ｘは、Ｎ又はＯであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒであるか、又はいずれか２つの隣接するＲ1−Ｒ5が縮合環を形成することができるが、但し、Ｒ1、Ｒ3、又はＲ5のうちの少なくとも１つはＮＯ2であって、３つ全てがＮＯ2でなく、
Ｒは、Ｈ又はＣ1-6アルキルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が、下式、
【化２】
0006041442.tif 000045
で示される化合物であり、
式中、ｎが０であって、ＸがＳであるか、又はｎが１であって、ＸがＣＨであり、
Ｙは、Ｏ、ＯＳＯ2、又はＯＰ（Ｏ）ＯＲ（Ｒは任意のアルキル又はアリールエステルである）であり、
Ｒ1は、Ｈ、Ｆ、又はＯＨであり、
Ｒ2は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＨ2Ａｒ、又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨであり、
Ｒ3、Ｒ3’、Ｒ4は、独立して、ＮＯ2、ＣＦ3、又はＨであり、
Ｚは、ＣＨ又はＮである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基質は、下式、
【化３】
0006041442.tif 000046
で示される化合物であり、
式中、ｎが０であって、ＸがＳであるか、又はｎが１であって、ＸがＣＨであり、
Ｒ1は、Ｈ、Ｆ、又はＯＨであり、
Ｒ2は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＨ2Ａｒ、又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨであり、
Ｒ3、Ｒ3’、又はＲ4は、独立して、ＮＯ2、ＣＦ3、又はＨである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記縮合環が、ベンゾ、ナフト、又は複素環である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記基質が、次式、
【化４】
0006041442.tif 000047
の化合物である、請求項１〜５及び７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ルシフェリンが、ルシフェラーゼによって検出される、請求項１〜５及び７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記スルフヒドリルアルキル化剤が、ＮＥＭである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記還元剤が、ＤＴＴである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つのステップが、自動化される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年９月１日に出願された米国特許出願第６１／３７９，２０３号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、細胞中の酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の検出、及びＧＳＨとＧＳＳＧの比率の決定のためのアッセイを提供する。
【発明の概要】
【０００３】
健康な状態を保つために、細胞、特に哺乳類細胞において、しばしばレドックス状態／電位と称される酸化状態と還元状態とのバランスを維持する必要がある。レドックス状態／電位を設定及び保持するために用いられる最も重要な機構のうちの１つは、細胞中の酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンの相対量の維持によって生じる。
【０００４】
グルタチオンは、グルタミン酸、システイン酸、及びグリシンの３つのアミノ酸からなるペプチドである。それは、他のタンパク質及びペプチドよりもはるかに高い濃度で細胞中に存在することが多い。グルタチオンは、複数の形態で細胞中に存在することができる。最も頻繁に細胞のレドックス状態／電位と関連すると考えられる２つの形態は、ＧＳＨ及びＧＳＳＧである。還元型であるＧＳＨは、グルタチオンが他の分子と結合していない場合に生じる。（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ  ８７７：３３３１−３３４６）。酸化型であるＧＳＳＧは、２つのグルタチオン分子間にジスフィルド結合が存在する場合に生じる。ＧＳＨは、しばしば酸化的損傷に対する第１の防衛線であると考えられ、細胞から活性種を除去してＧＳＳＧを形成することができる。血漿中のＧＳＳＧの存在は、しばしばストレス管理の指標となる。ＧＳＨ及びＧＳＳＧは、単純な酸化／還元反応を通して互いに関連しているため、それらは、細胞中にレドックス状態／電位を確立する。更に、典型的には、ＧＳＨ及びＧＳＳＧを合わせると、細胞中で最も多いレドックス対を構成するため、通常、細胞中のＧＳＨ及びＧＳＳＧの量の決定が行われ、ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率が細胞のレドックス電位の目安として報告される。ＧＳＨとＧＳＳＧの比率における変化は、しばしば細胞中の酸化的損傷の尺度として用いられる。
【０００５】
したがって、細胞中のＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率を正確かつ迅速に決定する必要性が存在する。多くの報告により、アセトアミノフェン、タモキシフェン、イソニアジド、及びアモジアキン等の化合物が、ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率を劇的に減少させ、アポトーシス又は壊死による細胞死を引き起こすことが示されている（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １９６：１６５−９４）。ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率における変動が細胞死と関連していることが報告されているため、この比率を正確に決定することができる必要がある（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０００６】
サンプル中のＧＳＨを測定するための複数の方法が存在するが、最も一般的に使用されるのは、グルタチオン還元酵素等の酵素とエルマン試薬の組み合わせ（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９）、及びクロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ法（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）である。これらの方法は、グルタチオン測定のために試料を添加する前に、酸性化、沈殿によるタンパク質除去、中和、内部標準の添加、及びその他を含むいくつかの処理ステップを用いる（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。ＧＳＨは、酸素への曝露等によって容易にＧＳＳＧに変換されるため、多くの処理ステップを必要とする技術を使用して、正確な比率測定のために試料中のＧＳＳＧ及びＧＳＨの初期量を保つことは困難である。したがって、これらの方法は、処理ステップの間に失われる及び酸化される材料の量の推定を可能にする内部標準の添加を必要とすることが多い。
【０００７】
上記方法を使用してサンプル中のＧＳＳＧレベルを測定することは、更により困難である。典型的に、ＧＳＳＧは、試料中のＧＳＨの小さな画分に過ぎないため、試料中のＧＳＳＧの量における比較的小さな変化が、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率に劇的な変化をもたらし得る。例えば、実際のＧＳＨ／ＧＳＳＧのモル比が１００であり（ＧＳＨが１０ｍＭ、ＧＳＳＧが１００μＭの細胞濃度から）、ＧＳＳＧにおける１００μＭの増加に伴ってＧＳＨのレベルが１０ｍＭから９．８ｍＭに低下した（２％の変化）場合［１モルのＧＳＳＧを生成するためには２モルのＧＳＨが必要であるため］、ＧＳＳＧレベルは１００μＭから２００μＭに変化し［１００％の変化］、ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率は１００から４９に変化する［２倍の変化］。よって、ＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を正しく決定するためには、試料中のＧＳＳＧの量の正確な測定が必要不可欠である。
【０００８】
ＧＳＳＧの決定のためのいくつかの方法が報告されている。多くのこれらの方法は、最初にＧＳＨのレベルを測定し、次いで、全てのＧＳＳＧをＧＳＨに還元した後でＧＳＨのレベルを測定することによって、試料中のＧＳＳＧのレベルを算出する（Ｍｏｎｏｓｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。次いで、ＧＳＳＧをＧＳＨに還元した後のＧＳＨのレベルの量から、ＧＳＨの初期測定で見出されたＧＳＨの量を引くことによって、ＧＳＳＧのレベルが推定される。こうして、２つの比較的大きな数字間の差を算出することによってＧＳＳＧのレベルが決定されるが、そのどちらもある程度の可変性を有し、したがって誤差が生じやすい。
【０００９】
ＧＳＳＧを測定するための他の方法では、ＧＳＨ測定反応においてシグナルを発しないように、最初にＧＳＨが試料中で化学修飾されることが要求される。次いで、試料中のＧＳＳＧがＧＳＨに還元され、最終的に、結果として得られたＧＳＳＧから生成されたＧＳＨが測定される。そのような方法は理論においては正確であるかもしれないが、ＧＳＳＧをＧＳＨに還元する前にＧＳＨをマスキングするために使用される材料を除去又は不活性化する必要がある。これを行わないと、形成されたＧＳＨが直ちに修飾されてブロッキング剤によって生成される形態となり、試料中のＧＳＳＧのレベルが実際よりも低く推定される結果となる。そのような場合、ＧＳＨ測定反応においてシグナルを発しない形態にＧＳＨを迅速かつ不可逆的に修飾するためにＮ‐エチルマレイミド（ＮＥＭ）等のアルキル化剤が使用される。残念ながら、これらの方法は、試料中に存在するいずれのスルフヒドリル試薬によってもシグナルを発する化学反応の使用に依存する。よって、通常、アルキル化試薬は、材料を消耗させる過剰なスルフヒドリル試薬の添加によって単純に消耗され得ない。この理由から、これらの方法は、最高９回まで溶液を抽出する必要性をもたらし、試料処理を大幅に複雑化し、ＧＳＨの損失の可能性を増大させる、過剰な試薬（ＮＥＭ）の痕跡を全て除去しなければならない。
【００１０】
したがって、正確かつ迅速な様式でＧＳＨ、ＧＳＳＧの量及び／又はＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率を決定するための方法の必要性が存在し、特に、たとえあったとしてもごく少ない処理ステップを要求する方法が必要とされる。本発明の方法は、試料中のＧＳＨの量の測定のために、処理ステップを必要とせず、かつＧＳＨの損失を防止する、酵素反応を使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】甲虫ルシフェリン（Ｄ‐ルシフェリン）の６員環（「Ａ環」又は「環Ａ」）、５員中心環（「Ｂ環」又は「環Ｂ」）、及び他の５員環（「Ｃ環」又は「環Ｃ」）の環原子の番号付けを示す。
【図２Ａ】グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の基質として有用な例示的なルシフェリン誘導体を示す。
【図２Ｂ】グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の基質として有用な例示的なルシフェリン誘導体を示す。
【図３】ＧＳＴの基質として有用な例示的な蛍光化合物を示す。
【図４Ａ】ルシフェリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図４Ｂ】ルシフェリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図４Ｃ】ルシフェリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図５Ａ】ルシフェリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図５Ｂ】ルシフェリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図６】クマリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図７】クマリン誘導体を使用した蛍光検出を示す。
【図８】ＧＳＨの標準曲線を示す。
【図９】細胞のＧＳＨ及びＧＳＳＧ、培地のＧＳＨ及びＧＳＳＧ、ならびにＧＳＨ及びＧＳＳＧの合計の平均ＲＬＵを示す。
【図１０】細胞及び培地中のＧＳＨ体ＧＳＳＧの比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法は、試料中のＧＳＳＧの量を測定するために酵素反応を使用する。本発明の方法は、試料、例えば、細胞（複数可）を含有する試料を、溶解剤及び修飾剤、例えば、Ｎ‐エチルマレイミド（ＮＥＭ）等のスルフヒドリルアルキル化剤と接触させることを含む。試料、例えば、溶解した細胞（複数可）は、次いで、基質、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及び過剰な還元剤と接触させられ、ＧＳＴと基質の相互作用によって生成されるシグナルが検出される。使用される特定の酵素反応は、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）に特異的であり、試料中に存在する可能性のある他のスルフヒドリルからのシグナルは発しない。酵素反応の特異性のために、はるかに過剰なアルキル化剤中にスルフヒドリル還元剤、例えばＤＴＴを添加してアルキル化試薬を大いに圧倒することによって、活性なアルキル化試薬（例えば、ＮＥＭ）を排除することができる。上記添加は、試料中のいずれのＧＳＳＧもＧＳＨに還元し、過剰なアルキル化剤を不活性化してＧＳＳＧをＧＳＨに還元し、これらの操作の各々のための別個のステップの必要性を排除するという付加的な利点も有する。また、本発明の方法において使用される濃度では、アルキル化剤（例えば、ＮＥＭ）と還元剤との反応は本質的に瞬間的である（また、還元剤は、それ自体では、又は存在する酵素を用いてもしくは用いずに使用されるアルキル化試薬との組み合わせにおいて、シグナルを発しない）ため、還元剤をＧＳＨ検出反応に単純に添加することができ、それによってＧＳＨ検出のための別個のステップを排除する。更に、還元剤は、他の反応構成成分とともに添加されたときに、プレルシフェリンによって発光シグナルを発する種を形成しない。よって、試料中に存在するスルフヒドリル部分の量を超えるようなアルキル化剤（例えば、ＮＥＭ）の量を添加し、いずれの過剰なアルキル化剤も直ちに不活性化され、試料中のいずれのＧＳＳＧもＧＳＨに還元されることを確実にするようにスルフヒドリル還元剤（ＤＴＴ等）の量を添加し、ＧＳＳＧのレベルを検出するためにＧＳＨ検出剤を添加することにより、本発明の方法を試料中のＧＳＳＧのレベルの測定のために使用することができる。
【００１３】
本発明の方法の別の利点は、本方法がＧＳＨに特異的なシグナルのみを生成するということであり、すなわち、本方法は、［エルマン試薬又は化学検出試薬、例えば、ブロモビマン等によってシグナルを発するもののように（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９８８．ｖｏｌ．４４，ｐｐ．８２５−８３２及びＢｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００６．ｖｏｌ３９３，ｐｐ．５７５−５８２）］試料中の全てのＳＨ基からのシグナルを発しないということであり、したがって、例えば、試料の酸性化によるタンパク質変性後に、遠心分離によって沈殿したタンパク質を除去することにより、試料からタンパク質を除去する必要がないということである。
【００１４】
上記特徴を組み合わせることにより、本発明の方法は、タンパク質沈殿又は過度の試料処理の必要なく、細胞抽出物、細胞培地、又は他の生物試料、例えば、血漿、血清、血液等の生理液中の非常に低レベルの酸化型グルタチオンの正確かつ迅速な測定を可能にする。本発明のステップの組み合わせは、非常に予測不可能である一方で、本方法が成功するように必要に応じて行われる多くの要因に依存する。例えば、
１．還元型グルタチオンからのシグナル生成のために使用される試薬は、試料中に存在する他のＳＨ基からの実質的なシグナルを生成してはならない。
２．ＧＳＨ検出反応の特異性も、試料中に存在するタンパク質上に存在するものを含む、反応中に存在する他のＳＨ基の存在からはシグナルを生成しない。
３．アルキル化剤と試料中に存在する全てのＳＨ基との反応は、本質的に即時的であり、非常に短期間のうちに完了しなければならず、よって、試薬がＧＳＨに到達することができるとすぐに、試料中の既存のＧＳＨを完全に排除することができる。
４．細胞からＧＳＨを放出するために使用される物質は、アルキル化試薬を不活性化してはならないが、迅速かつ完全に細胞を溶解させることができなければならず、よって、試薬が添加されるとすぐに、試料からのＧＳＨを完全に排除することができ、それによって試料中のあらゆるＧＳＨのＧＳＳＧへの酸化を防止し、そうすることで試料中のＧＳＳＧのレベルを本質的に「凍結させる」。
５．添加される還元剤の添加は、それが、還元剤が試料中のＧＳＳＧから形成する可能性のあるいずれかのＧＳＨを修飾することができる前にアルキル化剤を最初に不活性化しなければならないか、又はＧＳＨ検出酵素（この場合はＧＳＴ）を不活性化させる。
６．ルシフェラーゼに基づく検出システムの感度は、試料中に存在するＧＳＳＧの量から生成された非常に低レベルのルシフェリンを正確に検出することができなければならない。
したがって、長年の間存在してきた問題を解決するためのこれら全ての要因の組み合わせは、新規であると同時に予期せぬものである。
【００１５】
定義
本明細書で使用される場合、以下の用語及び表現は、指示された意味を有する。本発明の化合物は、非対称に置換された炭素原子を含有し、光学活性形態又はラセミ形態に単離されてもよいことを認識されたい。ラセミ形態の分割による又は光学活性出発材料からの合成による等の光学活性形態の調製の仕方は、当該技術分野において周知である。ある構造の全てのキラル、ジアステレオ異性、ラセミ形態、及び全ての幾何異性体形態が、本発明の一部である。
【００１６】
ラジカル、置換基、及び範囲について以下に列挙する特定の値は、例示のためであるに過ぎず、それらは、他の規定値又はラジカル及び置換基に関する規定範囲内の他の値を除外するものではない。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、「置換された」を使用した表現において指示された基上の１つ以上（例えば、１、２、３、４、又は５個、いくつかの実施形態において１、２、又は３個、他の実施形態において１又は２個）の水素が、指示された基（複数可）から選択される基又は当業者に既知の好適な基で置換されることを意味することを意図するが、但し、指示された原子の通常の原子価を超えず、その置換によって安定な化合物がもたらされるものとする。好適な指示される基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、リン酸塩、硫酸塩、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン、及びシアノを含む。更に、好適な指示される基は、例えば、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ-、−ＮＲ2、−ＮＲ3、＝ＮＲ、−ＣＸ3、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ2、＝Ｎ2、−Ｎ3、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）2ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ  −Ｐ（＝Ｏ）Ｏ2ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲ（式中、各Ｘは、独立してハロゲン（「ハロ」）：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩであり、各Ｒは、独立してＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基、又はプロドラッグ部分である）を含んでもよい。当業者には容易に理解されるように、置換基がオキソ（＝Ｏ）又はチオキソ（＝Ｓ）等である場合、置換された原子上の２つの水素原子が置換される。
【００１８】
本明細書で使用される場合「アルキル」という用語は、例えば、１〜３０個の炭素原子、しばしば１〜１２個、又は１〜約６個の炭素原子を有する分岐鎖、非分岐鎖、又は環状の炭化水素を指す。その例は、限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等を含む。アルキルは、非置換であってもよいか又は置換されていてもよい。また、アルキルは、任意で、部分的に又は完全に不飽和であってもよい。このため、アルキル基の列挙は、アルケニル基及びアルキニル基の両方を含む。アルキルは、上に記載及び例示したような一価の炭化水素ラジカルであってもよいか、又は二価の炭化水素ラジカル（すなわちアルキレン）であってもよい。
【００１９】
「アルケニル」という用語は、モノラジカルの分岐鎖又は非分岐鎖の部分不飽和炭化水素鎖（すなわち、炭素‐炭素、ｓｐ2二重結合）を指す。一実施形態において、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する。その例は、限定されないが、エチレン又はビニル、アリル、シクロペンテニル、５−ヘキセニル等を含む。アルケニルは、非置換であってもよいか又は置換されていてもよい。
【００２０】
「アルキニル」という用語は、完全に不飽和である点（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合）を有するモノラジカルの分枝鎖又は非分枝鎖炭化水素鎖を指す。一実施形態において、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子、又は２〜６個の炭素原子を有することができる。別の実施形態において、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有することができる。この用語は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１−オクチニル等の基によって例示される。アルキニルは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。
【００２１】
「シクロアルキル」という用語は、単環式環又は多縮合環を有する３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。シクロアルキル環は、３〜７個の炭素原子又は５〜６個の炭素原子を有することができる。そのようなシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単環構造、又はアダマンタニル等の多環構造を含む。シクロアルキルは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。シクロアルキル基は、一価又は二価であってもよく、アルキル基について前述したように、任意で置換されてもよい。シクロアルキル基は、任意で１つ以上の不飽和の部位を含むことができ、例えば、シクロアルキル基は、例えば、シクロへキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン等の１つ以上の炭素‐炭素二重結合を含むことができる。
【００２２】
「アルコキシ」という用語は、基アルキル−Ｏ−（アルキルは本明細書に定義されるものである）を指す。一実施形態において、アルコキシ基は、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等を含む。アルコキシは、非置換であってもよいか、又は置換されていてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「アリール」又は「Ａｒ」は、親芳香族環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することに由来する芳香族炭化水素基を指す。ラジカルは、親環系の飽和炭素原子又は不飽和炭素原子に存在してもよい。アリール基は、６〜３０個の炭素原子を有することができる。他の実施形態において、アリール基は、６〜１２個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単環（例えば、フェニル）又は多縮合（縮合）環を有することができ、少なくとも１つの環は芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、又はアントリル）である。典型的なアリール基は、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等に由来するラジカルを含む。アリールは、アルキル基について前述したように、非置換であってもよいか、又は任意で置換されていてもよい。
【００２４】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素を指す。
【００２５】
「ハロアルキル」という用語は、同じか又は異なってもよい、本明細書に定義される１つ以上のハロ基によって置換された本明細書に定義されるアルキルを指す。一実施形態において、ハロアルキルは、１、２、３、４、又は５個のハロ基で置換されてもよい。別の実施形態において、ハロアルキルは、１、２、又は３個のハロ基で置換されてもよい。又はロアルキルという用語は、ペルフルオロ−アルキル基も含む。代表的なハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル、１Η，１Η−ペルフルオロオクチル等を含む。ハロアルキルは、アルキル基について前述したように、任意で置換されていてもよい。
【００２６】
「ヘテロアリール」という用語は、１個、２個、又は３個の芳香環を含有し、芳香環中に少なくとも１つの窒素、酸素、又は硫黄原子を含有し、「置換された」の定義において前述したように、非置換であってもよいか、又は、例えば１つ以上の、特に１〜３個の置換基で置換されていてもよい、単環式、二環式、又は三環式の環系として本明細書において定義される。典型的なヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子に加えて２〜２０個の炭素原子を含有する。他の実施形態において、ヘテロアリール基は、１つ以上のヘテロ原子に加えて３〜１５個の炭素原子を含有してもよいか、又は１つ以上のヘテロ原子に加えて４〜１０個の炭素原子を含有してもよい。特定の実施形態において、ヘテロアリール環は、炭素及びヘテロ原子の両方を含む全部で５〜１２個の環原子、又は５〜１０個の環原子、又は５〜７個の環原子を含有する。ヘテロアリール基の例は、限定されないが、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、及びキサンテニルを含む。
【００２７】
一実施形態において、「ヘテロアリール」という用語は、炭素と、非過酸化物酸素、硫黄、及びＮ（Ｚ）（Ｚは存在しないか、又はＨ、Ｏ、アルキル、アリール、もしくは（Ｃ1−Ｃ6）アルキルアリールである）から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子とを含有する５個あるいは６個の環原子を含有する単環式芳香環を意味する。別の実施形態において、ヘテロアリールは、ヘテロアリールに由来する約８〜１０個の環原子のオルト縮合二環式複素環、特に、ベンゾ誘導体、又はプロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレンジラジカルをそこに縮合させることによって誘導される誘導体を意味する。
【００２８】
「複素環」という用語は、酸素、窒素、及び硫黄の群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、任意で、「置換された」という用語の下に本明細書に定義される１つ以上の基で置換される、飽和又は部分的不飽和環系を指す。複素環は、１つ以上のヘテロ原子を含有する単環式、二環式又は三環式基であってもよい。いくつかの実施形態において、複素環は、全部で３〜２０個の環原子、又は全部で５〜２０個の環原子、又は５〜１２個の環原子を含有する。特定の実施形態において、複素環は、１〜４個のヘテロ原子、又は１個、２個、３個、又は４個のヘテロ原子を含む。また、複素環基は、該環に結合したオキソ基（＝Ｏ）又はチオキソ（＝Ｓ）基を含有することができる。複素環基の非限定的な例は、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、及びチオモルホリンを含む。
【００２９】
「複素環」という用語は、限定ではなく例として、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に、Ｃｈａｐｔｅｒｓ１，３，４，６，７，及び９、Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ''（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特にＶｏｌｕｍｅｓ１３，１４，１６，１９，及び２８、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２，５５６６に記載される複素環のモノラジカルを含むことができる。一実施形態において、「複素環」は、１つ以上（例えば、１、２、３、又は４個）の炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、又はＳ）で置換されている、本明細書において定義される「炭素環」を含む。
【００３０】
限定ではなく例示として、複素環の例はジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサンチニル２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、べンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、イサチノイル、及びビス−テトラヒドロフラニルを含む。
【００３１】
限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５、又は６位、ピリダジンの３、４、５、又は６位、ピリミジンの２、４、５、又は６位、ピラジンの２、３、５、又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール又はテトラヒドロピロールの２、３、４、又は５位、オキサゾール、イミダゾール又はチアゾールの２、４、又は５位、イソオキサゾール、ピラゾール又はイソチアゾールの３、４、又は５位、アジリジンの２又は３位、アゼチジンの２、３、又は４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、又は８、あるいはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、又は８位に結合する。炭素結合複素環は、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル等を含む。
【００３２】
限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドール又はイソインドリンの２位、モルホリンの４位、及びカルバゾール又はβ‐カルボリンの９位に結合されてもよい。一実施形態において、窒素結合複素環は、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、及び１−ピペリジニルを含む。
【００３３】
「炭素環」という用語は、単環として３〜８個の炭素原子、二環として７〜１２個の炭素原子、及び多環として約３０個までの炭素原子を有する飽和環、不飽和環、又は芳香環を指す。単環式炭素環は、典型的には３〜６個の環原子、更により典型的には５又は６個の環原子を有する。二環式炭素環は、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配置された７〜１２個の環原子、又はビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配置された９又は１０個の環原子を有する。炭素環の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロへクス−ｌ−エニル、１−シクロへクス−２−エニル、１−シクロへクス−３−エニル、フェニル、スピリル、及びナフチルを含む。炭素環は、アルキル基について前述したように、任意で置換されていてもよい。
【００３４】
「アルカノイル」又は「アルキルカルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、以前に定義されたアルキル基である）を指す。
【００３５】
「アシルオキシ」又は「アルキルカルボキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、以前に定義されたアルキル基である）を指す。アシルオキシ基の例は、限定されないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、及びペンタノイルオキシを含む。アシルオキシ基を形成するために、上で定義されたいずれのアルキル基を含む。
【００３６】
「アルコキシカルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（又は「ＣＯＯＲ」）（式中、Ｒは、以前に定義されたアルキル基である）を指す。
【００３７】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ2を指す。アミノ基は、「置換された」という用語について本明細書に定義されるように、任意で置換されていてもよい。
【００３８】
「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＲ2（式中、少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキル又は水素である）を指す。「アシルアミノ」という用語は、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（式中、Ｒは、独立して水素、アルキル、又はアリールである）を指す。
【００３９】
「中断された」という用語は、「中断された」という用語を使用した表現において言及される特定の炭素鎖の２つの隣接する炭素原子（及びそれらが付着している水素原子（例えば、メチル（ＣＨ3）、メチレン（ＣＨ2）、又はメチン（ＣＨ））間に別の基が挿入されることを意味するが、但し、指示された原子の各々の通常の原子価を超えず、その中断によって安定な化合物がもたらされるものとする。炭素鎖を中断することができる好適な基は、例えば、１つ以上の、非過酸化物オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ2Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシレート（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）、及びスルホニル（ＳＯ2）を有するものを含む。アルキル基は、前述の好適な基のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、又は約６）によって中断されてもよい。また、中断の部位は、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が結合している炭素原子との間であってもよい。
【００４０】
「ルシフェラーゼ」という用語は、別途指定のない限り、天然に発生するルシフェラーゼ、組換えルシフェラーゼ、又は変異体ルシフェラーゼを指す。天然に発生する場合、ルシフェラーゼは、当業者によって生物から容易に得ることができる。ルシフェラーゼが、天然に発生するルシフェラーゼであるか、又は組換えもしくは変異体ルシフェラーゼである場合、すなわち、ルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において、天然に発生するルシフェラーゼの活性を保持するルシフェラーゼである場合、それは、ルシフェラーゼをコードする核酸を発現するように形質転換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等の培養物から容易に得ることができる。更に、組換え又は変異体ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼをコードする核酸を用いてインビトロの無細胞系から誘導することができる。ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「フルオロフォア」は、ある波長域でエネルギーを吸収することができ、その波長域以外の波長域ではエネルギーを放出することができる分子を含む。好適なフルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン、ローダミン、又は任意の好適なキサンテン色素、レゾルフィン、もしくはクレシルバイオレットを含む。「励起波長」という用語は、フルオロフォアがエネルギーを吸収する波長の範囲を指す。「発光波長」という用語は、フルオロフォアがエネルギーを放出するか、又は蛍光を発する波長の範囲を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「生物発光アッセイ」又は「生物発光反応」又は「発光アッセイ」又は「発光反応」は、非ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体との反応の生成物がルシフェラーゼのための基質である反応、又はルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体を有する非酵素反応の生成物がルシフェラーゼのための基質である反応、又はルシフェラーゼと、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジンの誘導体との反応が生物発光性である、すなわち、測定可能な量の光を生成する反応を含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「生物発光」又は「発光」は、光を発生する酵素と基質との反応の結果として生成される光である。そのような酵素（生物発光酵素）の例は、ホタルルシフェラーゼ、例えば、北米産ホタル又はペンシルバニアホタル、コメツキムシルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミホタルルシフェラーゼ、発光エビルシフェラーゼ、例えば、トゲオキヒオドシエビ、エクオリン発光タンパク質、オベリン発光タンパク質等を含む。
【００４４】
「ルシフェラーゼ反応混合物」は、ルシフェラーゼ酵素と、ルシフェラーゼ酵素に光シグナルを生成する材料とを含有する。発光シグナルを生成するために必要な材料、ならびに該必要な材料の特定の濃度及び／又は量は、使用されるルシフェラーゼ酵素、及び行われるルシフェラーゼに基づくアッセイの種類に応じて異なる。一般に、ホタルルシフェラーゼの場合、これらの材料は、ＡＴＰ、マグネシウム塩（塩化マグネシウム等）、ホタルルシフェラーゼ酵素、及びルシフェリンがホタルルシフェラーゼのための基質として使用された場合に光を発生することができるルシフェリンを含み得る。反応を適切なｐＨで維持するための緩衝液；ルシフェラーゼの活性を維持するのに役立つＰＲＩＯＮＥＸ又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の添加剤；還元剤；界面活性剤等を含む他の材料が溶液に添加されることが多い。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ルシフェリンの誘導体」又は「アミノルシフェリンの誘導体」は、非ルシフェラーゼ酵素（例えば、ＧＳＴ）のための基質であって、ルシフェラーゼのプロ基質である分子か、又は非ルシフェラーゼ酵素（例えば、ＧＳＴ）のための基質であって、ルシフェラーゼのための基質である分子である。本発明の誘導体は、Ｄ−ルシフェリン又はアミノルシフェリン骨格の環のうちの１つ以上に結合する３つの環及び／又は置換基のうちの１つ以上に対する１つ以上の修飾を有する（図１を参照）。
【００４６】
「蛍光アッセイ」又は「蛍光反応」は、非ルシフェラーゼのタンパク非分解性酵素（ＧＳＴ等）とフルオロフォアの誘導体との反応の生成物が蛍光性である反応を含む。
【００４７】
「シグナル生成部分」又は「レポーター部分」は、フルオロフォア、又はルシフェラーゼのための基質、例えば、ルシフェリン、アミノルシフェリン、もしくはセレンテラジン、又は化学発光部分、例えば、アダマンチル１，２−ジオキセタンを含む。
【００４８】
使用方法
一態様において、本発明は、試料中のＧＳＳＧを検出する方法を提供する。別の態様において、本発明は、試料中のＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率を検出する方法を提供する。ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率は、しばしば細胞のレドックス状態をモニタリングするために使用されるため、本発明の方法は、細胞におけるレドックス状態を検出するために使用することができる。
【００４９】
一般的に、本発明の方法は、試料を溶解剤及び修飾剤と接触させることを含む。例えば、試料は、溶解した細胞を含んでもよく、それは、次いで、基質、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、及び過剰な還元剤と接触させられ、ＧＳＴと基質との相互作用によって生成されるシグナルが検出される。特定の実施形態において、シグナルは発光である。他の実施形態において、シグナルは蛍光である。基質が、ルシフェラーゼのための基質、例えば、ルシフェリン又はルシフェリンの誘導体である場合、ルシフェラーゼ反応混合物が添加され、発光が検出される。代替として、基質が、レポーター部分、例えば、フルオロフォアを含む場合、それは当業者に既知の適切な手段を使用して検出される。
【００５０】
試薬は、逐次的に又は同時に添加されてもよい。例えば、溶解剤及びスルフヒドリル修飾剤が、逐次的に又は同時に添加されてもよい。試薬が同時に添加される場合、それらは単一の溶液又は複数の溶液中に存在してもよい。
【００５１】
シグナルは、必要に応じて定量化されてもよい。シグナルは、標準曲線と比較することができる。シグナルの強度は、試料中のＧＳＳＧ又はＧＳＨの存在又は量の関数である。
【００５２】
好適な溶解剤は、標準的な溶解緩衝液を含む。動物細胞の場合、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００もしくはＴｅｒｇｉｔｏｌ等の０．１〜１．０％の非イオン界面活性剤、又はイオン界面活性剤、例えば、ＤＴＡＢ、を含む緩衝液が典型的には適当である。細菌、植物、真菌、又は酵母の細胞は、通常、溶解させるのがより困難である。界面活性剤、凍結解凍サイクル、低張緩衝液、超音波処理、キャビテーション、又はそれらの方法の組み合わせが用いられてもよい。
【００５３】
好適なスルフヒドリル修飾剤は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、４ビニルピリジン（４−ＶＰ）、及びヨードアセトアミド等のアルキル化剤を含む。本発明の方法において典型的に使用されるスルフヒドリル試薬の量は、予想される試料中の還元型グルタチオンのレベルよりも約２〜１０倍高くあるべきである。例えば、９６ウェルプレート中の約１，０００〜２０，０００個の培養哺乳類細胞の処理には、５０〜２５０μΜ  ＮＥＭ溶液の５０μｌの濃縮が必要である。
【００５４】
好適な還元剤は、スルフヒドリル基を含む還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、システイン、及びシステインアミンである。本発明の方法において典型的に使用されるスルフヒドリル試薬の量は、試料に添加されるアルキル化剤の濃度よりも約２〜５倍高くあるべきである。例えば、９６ウェル細胞培養プレート中の哺乳類細胞のウェルを処理するには、５０μｌの１００〜１，２５０μΜ  ＤＴＴ溶液が必要である。
【００５５】
全てのアルキル化剤又は還元剤が水溶液中で高度に安定しているわけではないことに留意されたい。例えば、ＮＥＭは、加水分解して、スルフヒドリル基をアルキル化しない生成物を生成することができる。よって、使用する直前に試薬を作製した場合に最良の結果が達成される。
【００５６】
グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の好適な源は、本質的にグルタチオンを含まない酵素調製物、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）酵素（カタログ番号Ｖ６８７）を含む。本発明の方法を行う場合、本質的にグルタチオンを含まないＧＳＴ酵素調製物を使用することが非常に重要である。好適には、それは、ＧＳＴサブユニット１モル当たり１モル未満のＧＳＨが存在することを意味する。多くのＧＳＴ酵素の源は、酵素を生成するために使用される精製技術の結果として、高レベルのグルタチオンを含有する。そのような調製物は、少数の哺乳類細胞から放出されるグルタチオンのレベルを測定するために使用されたときに、許容できないほど高いバックグラウンド値を得るのに十分なグルタチオンを含有することが多い。本発明の方法において、試料中に存在するグルタチオンから効果的にシグナルを生成するのに十分な量でＧＳＴが添加される必要がある。例えば、１００μｌの反応物の場合、約１〜１０μｇのＧＳＴ酵素、より好ましくは２〜４μｇの酵素の添加が、シグナルを生成するために必要である。
【００５７】
本発明は、任意の細胞、例えば、実験室で培養された細胞、又は動物から得られた細胞中の、ＧＳＳＧの存在又は量を決定するために使用することができる。動物から得られた細胞は、組織、組織抽出物、組織溶解物、又はホモジネート等であってもよい。細胞は、真核細胞、例えば、酵母、鳥類、植物、昆虫、又は限定されないが、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、もしくはブタの細胞を含む哺乳類の細胞、あるいは原核細胞、あるいは２つ以上の異なる生物からの細胞、あるいはそれらの細胞溶解物又は上清であってもよい。細胞は、組換え技術によって遺伝子改変されていてもよい。特定の態様において、細胞は、動物、例えば、トランスジェニック動物中に、又は生理液、例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌等の中に存在してもよい。一実施形態において、本発明の方法は、インビトロで行われてもよい。別の実施形態において、本発明の方法は、インビボで行われてもよい。
【００５８】
更に、本明細書に記載される生物発光アッセイのうちのいずれかのために、限定されないが、ルシフェラーゼの不活性化を阻害もしくは防止するか、又はさもなければ、発光シグナルを延長もしくは増強する試薬を含む他の試薬が反応混合物に添加されてもよい。
【００５９】
基質は、ルシフェラーゼのためのプロ基質であるか、又はレポーター部分に連結された、非ルシフェラーゼ酵素（例えばＧＳＴ）のための基質を含む。レポーター部分は、蛍光部分、例えば、クマリン及びフルオレセイン、化学発光部分、又は視覚的手段によってもしくはその吸光度によって検出され得る色を生成する部分であってもよい。
【００６０】
基質
好適な基質は、限定されないが、下の式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）の化合物を含む。
【化１】
0006041442.tif 000002
式中、ｎが０であって、ＸがＳであるか、又はｎが１であって、ＸがＣＨであり、
Ｙは、Ｏ、ＯＳＯ2、又はＯＰ（Ｏ）ＯＲ（式中、Ｒは任意のアルキル又はアリールエステルである）であり、
Ｒ1は、Ｈ、Ｆ、又はＯＨであり、
Ｒ2は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＨ2Ａｒ、又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨであり、
Ｒ3、Ｒ3’、Ｒ4は、独立して、ＮＯ2、ＣＦ3、又はＨであり、
Ｚは、ＣＨ又はＮである。
【化２】
0006041442.tif 000003
式中、ｎが０であって、ＸがＳであるか、又はｎが１であって、ＸがＣＨであり、
Ｒ1は、Ｈ、Ｆ、又はＯＨであり、
Ｒ2は、Ｈ、アルキル、アリール、ＣＨ2Ａｒ、又はＣＨ2ＣＨ2ＯＨであり、
Ｒ3、Ｒ3’、又はＲ4は、独立して、ＮＯ2、ＣＦ3、又はＨである。
【化３】
0006041442.tif 000004
式中、Ｘは、Ｎ又はＯであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、及びＲ5は、独立して、Ｈ、低級アルキル（Ｃ1−Ｃ6）、ＣＦ3、ハロゲン、ＮＯ2、ＣＯ2Ｒ（式中、Ｒは、ＨもしくはＣ1-6アルキルである）であるか、又は任意の２つの隣接するＲ1−Ｒ5が縮合環（例えば、ベンゾ、ナフト、複素環）を形成することができるが、但し、Ｒ1、Ｒ3、又はＲ5のうちの少なくとも１つはＮＯ2であり、３つ全てがＮＯ2ではないものとする。
【００６１】
更なる基質を図２Ａ〜Ｄ及び３に示す。
【実施例】
【００６２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって更に説明される。
【００６３】
実施例１  ６−（２ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−３）の合成
【化４】
0006041442.tif 000005
【００６４】
２−シアノ−６−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェノキシ）キノリンの合成    ＤＭＳＯ３０ｍｌ中の２−シアノ−６−ヒドロキシキノリン（０．５０ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）、２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゼンクロリド（０．６７ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（０．４１ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃まで３０分加熱した。室温まで冷却してから、３０ｍｌの冷水に混合物を注ぎ入れ、塩化メチレンで３回抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。ヘプタン／塩化メチレン（１：２）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、３５％の収率で生成物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．３６（ｄ，１Ｈ），８．２５（ｄｄ，１Ｈ），７．９４（ｄｄ，１Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．６７（ｄｄ，１Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ），７．３１（ｄ，１Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：３６１．
【化５】
0006041442.tif 000006
【００６５】
ＧＳＴ−３の合成    ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／水中の６−（２−ニトロ−４−（トリフルオロメチル）フェノキシ）−２−シアノ−キノリン（１．０７９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）及びＤ−システイン（０．５３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の均一な溶液に、ｐＨを７．５〜８に調整するのに十分な量のＫ2ＣＯ3を添加した。出発材料が完全に消費されたことがＴＬＣによって示唆されるまで３０分間混合物を撹拌した。次いで、酢酸を用いて溶液のｐＨを４〜５に調整し、ＣＨ2Ｃｌ2,で３回抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で有機層を乾燥した。溶媒を除去した後、塩化メチレン／メタノール（９５：５）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、２０％の収率で化合物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．５５（ｓ，１Ｈ），８．４２（ｄ，１Ｈ），８．１９（ｍ，２Ｈ），８．０６（ｄ，１Ｈ），７．８２（ｓ，１Ｈ），７．７１（ｄ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），５．２２（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．４５−３．７５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：４６４．ＭｅＯＨ中λmax３２８ｎｍ，εmax９，９００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００６６】
実施例２  メチル６−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチル−フェノキシ）キノリニル−ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−４）の合成
【化６】
0006041442.tif 000007
0006041442.tif 000008
【００６７】
エーテル２０ｍｌ中のＫＯＨの混合物（４０％、６ｍｌ）に、Ｎ−メチル−ｎ，ｎ−ニトロソウレア（２．０ｇ、０．０１９４ｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を更に５分間撹拌した。エーテル層を別のフラスコにデカントし、ＫＯＨ上で０℃で乾燥した。ＴＨＦ５ｍＬ中のキノリンルシフェリン（０．２ｇ）の溶液に、該溶液が濃黄色になるまで上記ジアゾメタンエーテル溶液を添加した。混合物を３０分間撹拌し、酢酸（１ｍｌ）を添加することにより反応を停止した。水１０ｍｌを添加し、酢酸エチルで混合物を３回抽出し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥した。ヘプタン／酢酸エチルを溶媒として使用したフラッシュカラムにより化合物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．２３（ｓ，１Ｈ），８．０−８．２（ｍ，３Ｈ），７．７５（ｄ，１Ｈ），７．５０（ｄ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．１５（ｄ，１Ｈ），７．４６（ｄ，１Ｈ），５．４２（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．７４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．５８（ｄ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：４７８．λmax（ｎｍ）／εmax（ｃｍ-1Ｍ-1）：ＭｅＯＨ中３２２／１０，８００；３２８／８，８００．
【００６８】
実施例３  ６−（４−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−５）の合成
【化７】
0006041442.tif 000009
【００６９】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−５を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．３９（ｄ，１Ｈ），８．２８（ｄ，２Ｈ），８．１９（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｄ，１Ｈ），７．２８（ｓ，１Ｈ），５．３７（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５９（ｄ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：３９７．ＭｅＯＨ中λmax３２８ｎｍ，εmax１７，２００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００７０】
実施例４  ６−（２−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−６）の合成
【化８】
0006041442.tif 000010
【００７１】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−６を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．３９（ｄ，１Ｈ），８．１３（ｍ，３Ｈ），７．７８（ｔ，１Ｈ），７．６３（ｄ，１Ｈ），７．５６（ｓ，１Ｈ），７．４８（ｔ，１Ｈ），７．３８（ｄ，１Ｈ），５．３７（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：３９７．λmax（ｎｍ）／εmax（ｃｍ-1Ｍ-1）：ＭｅＯＨ中３２３／１０，４００；３２７／９，５００；３３７／８，３００．
【００７２】
実施例５  ６−（３−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−７）の合成
【化９】
0006041442.tif 000011
【００７３】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−７を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．４７（ｄ，１Ｈ），８．１５−８．３０（ｍ，３Ｈ），７．８５（ｄ，１Ｈ），７．７８（ｄ，１Ｈ），７．７３（ｄｄ，１Ｈ），７．５５（ｄ，１Ｈ），５．４５（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：４６４．ＭｅＯＨ中λmax３２１ｎｍ，εmax１１，０００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００７４】
実施例６  ６−（２−トリフルオロメチル−４−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−８）の合成
【化１０】
0006041442.tif 000012
【００７５】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−８を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．５６（ｄ，１Ｈ），８．４７（ｄ，２Ｈ），８．２０（ｄｄ，２Ｈ），７．９２（ｄ，１Ｈ），７．７２（ｄｄ，１Ｈ），７．３３（ｄ，１Ｈ），５．４４（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：４６４．ＭｅＯＨ中λmax３２８ｎｍ，εmax１０，１００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００７６】
実施例７  ６−（５−トリフルオロメチル−２−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−９）の合成
【化１１】
0006041442.tif 000013
【００７７】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−９を調製した。ＭｅＯＨ中λmax（ｎｍ）／εmax（ｃｍ-1Ｍ-1）：３２１／１０，４００；３２８／８，３００．
【００７８】
実施例８  ６−（４−フルオロ−２−ニトロフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−１０）の合成
【化１２】
0006041442.tif 000014
【００７９】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１０を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．３８（ｄ，１Ｈ），８．０２−８．２（ｍ，３Ｈ），７．６−７．８（ｍ，２Ｈ），７．５−７．６（ｍ，２Ｈ，１Ｈ），５．３４（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：４１５．ＭｅＯＨ中λmax３２１ｎｍ，εmax１０，６００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００８０】
実施例９  ６−（２−ニトロ−４−メチルカルボキシルフェノキシ）キノリニル−ルシフェリン（ＧＳＴ−１１）の合成
【化１３】
0006041442.tif 000015
【００８１】
ＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１１を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．６８（ｄ，１Ｈ），８．１５−８．３０（ｍ，２Ｈ），８．１−８．２（ｍ，２Ｈ），７．６４−７．７４（ｍ，２Ｈ），７．３３（ｄ，１Ｈ），５．４２（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．８１（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：４５５．ＭｅＯＨ中λmax３２１ｎｍ，εmax１６，２００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００８２】
実施例１０  ６−（２−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−１３）の合成
【化１４】
0006041442.tif 000016
【００８３】
２−シアノ−６−（２−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）ベンゾチオゾールの合成    無水塩化メチレン１５ｍｌ中の６−ヒドロキシ−２−シアノベンゾチオゾール（０．５０ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）及び２−ニトロベンゼン−スルホニルクロリド（０．６３ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の溶液にＴＥＡ（０．５８ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を３時間撹拌した。ヘプタン／酢酸エチル／塩化メチレン（７０／３０／１５）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、５５％の収率で生成物を精製した
【化１５】
0006041442.tif 000017
【００８４】
ＧＳＴ−１３の合成    ルシフェリンＧＳＴ−３の合成（実施例１）に使用したものと同様の方法を用いてＧＳＴ−１３を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．１４−８．２６（ｍ，２Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｔｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８５（ｔｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４６６．ＭｅＯＨ中λmax２９２ｎｍ，εmax１９，１００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００８５】
実施例１１  ６−（４−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−１４）の合成
【化１６】
0006041442.tif 000018
【００８６】
ＧＳＴ−１３の合成（実施例１０）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１４を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．４２（ｄ，２Ｈ），８．１７（ｍ，３Ｈ），８．０８（ｄ，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，１Ｈ），５．４４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４６６．ＭｅＯＨ中λmax２９２ｎｍ，εmax１９，４００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００８７】
実施例１２  ６−（２−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）キノリニル−ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−１５）の合成
【化１７】
0006041442.tif 000019
【００８８】
ＧＳＴ−１３の合成（実施例１０）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１５を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：８．５４（ｄ，１Ｈ），７．９−８．３（ｍ，６Ｈ），７．８５（ｔ，１Ｈ），７．５７（ｄｄ，１Ｈ），５．４１（ｔ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４６０．ＭｅＯＨ中λmax２８５ｎｍ，εmax９，０１０ｃｍ-1Ｍ-1．
【００８９】
実施例１３  ６−（４−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）キノリニル−ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−１６）の合成
【化１８】
0006041442.tif 000020
【００９０】
ＧＳＴ−１３の合成（実施例１０）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１６を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：８．２３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），８．１８（ｍ，３Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｊ＝３Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．５−３．７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：４６１．ＭｅＯＨ中λmax２８５ｎｍ，εmax１２，４００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００９１】
実施例１４  ６−（２−ニトロ−４−トリフルオロベンゼンスルホン酸）ルシフェリンエステル（ＧＳＴ−１７）の合成
【化１９】
0006041442.tif 000021
【００９２】
ＧＳＴ−１３の合成（実施例１０）に使用したものと同様の方法を用いて化合物ＧＳＴ−１７を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）：８．８２（ｓ，１Ｈ），８．１５−８．３０（ｍ，４Ｈ），７．４３（ｄ，１Ｈ），５．４３（ｔ，１Ｈ，ＣＨＣＯＯ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ2）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：５３４．ＭｅＯＨ中λmax２９２ｎｍ，εmax１８，６００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００９３】
実施例１５  ７−（５−トリフルオロメチル−２−ニトロフェノキシ）−４−メチル−クマリンの合成
【化２０】
0006041442.tif 000022
【００９４】
ＧＳＴ−３（実施例１）の前駆体の合成に使用したものと同様の方法を用いて化合物を調製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．３７（ｓ，１Ｈ），７．８８（ｄ，２Ｈ），７．７０（ｍ，２Ｈ），７．２８（ｄ，１Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．２５（ｓ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋２）：３６７．ＭｅＯＨ中λmax３２０ｎｍ，εmax１２，７００ｃｍ-1Ｍ-1．
【００９５】
実施例１６  ｂｉｓ（−（５−トリフルオロメチル−２−ニトロフェノキシ）−フルオレセインラクトンの合成
【化２１】
0006041442.tif 000023
【００９６】
ＤＭＳＯ５０ｍｌ中のフルオレセイン（２．０ｇ、６０ｍｍｏｌ）、２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゼンクロリド（３．０ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（２．０ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃まで１時間加熱した。室温まで冷却してから、３０ｍｌの冷水に混合物を注ぎ入れ、塩化メチレンで３回抽出した。合わせた有機相を水で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。ヘプタン／塩化メチレン／酢酸エチル（７／３／０〜７／３／）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、８８％の収率で生成物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．２８（ｓ，ｂｒ，２Ｈ），８．０５（ｄ，１Ｈ），７．８４（ｄ，２Ｈ），７．６６−７．８２（ｍ，２Ｈ），７．２６（ｄ，２Ｈ），７．０３（ｄ，２Ｈ），６．９２（ｄ，２Ｈ），６．８４（ｄｄ，２Ｈ）．
【００９７】
実施例１７  ＰＢＩ４１４６の合成
【化２２】
0006041442.tif 000024
【００９８】
２０ｍｌのＣＨ2Ｃｌ2中のｐ−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（０．６３ｇ、２．８５ｍｍｏｌ）及び７−ヒドロキシル−４−メチルクマリン（０．５ｇ、２．８４ｍｍｏｌ）の溶液にＴＥＡ（０．２９ｇ、０．４ｍｌ）を添加した。得られた混合物を３０分間撹拌した。ヘプタン／ＣＨ2Ｃｌ2、及び酢酸エチルを溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより、８７％の収率で化合物を精製した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）：８．４（ｄ，２Ｈ），８．０８（ｄ，２Ｈ），７．６（ｄ，１Ｈ），６．９−７．１９（ｍ，２Ｈ），６．２７（ｓ，１Ｈ），２．４（ｓ，３Ｈ）．ＭＳ（ｍ＋／ｚ）：３６２．０（Ｍ＋１）．
【００９９】
実施例１８  ＰＢＩ４１５３の合成
【化２３】
0006041442.tif 000025
【０１００】
トリエチルアミン（０．１８ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（１０ｍｌ）に７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（０．１７ｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を溶解した。４−ニトロナフタレン−ｌ−スルホニルクロリド（０．３３ｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を少しずつ添加した。反応混合物を４時間撹拌し、酢酸エチル及び水で抽出した。有機相を回収し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。濾過後、溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／酢酸エチル：１／１）により残渣を精製し、生成物を得た（０．３５ｇ、８７％）。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ2Ｃｌ2，δ）：８．９５（ｍ，１Ｈ），８．４２（ｍ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｍ，３Ｈ），７．５１（ｄ，ＪＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４１２．１（Ｍ＋１）．
【０１０１】
実施例１９  ＧＳＴ−２１の合成
【化２４】
0006041442.tif 000026
【０１０２】
２−メチル−４−ニトロベンゼン−ｌ−スルホニルクロリド    濃縮ＨＣ１（３０ｍｌ）及び酢酸（１０ｍｌ）の混合物に、芳香族アミン（１０．０ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）１部を室温で撹拌しながら添加した。白色の塩酸塩が直ちに形成され、得られた混合物を−１５℃まで冷却した。温度を−５℃〜−１０℃に維持しながら、水１５ｍｌ中の亜硝酸ナトリウムの溶液（５．４４ｇ、７８．９ｍｍｏｌ）を滴下で加え、次いで、得られた混合物をこの温度範囲で４５分間撹拌した。酸性の酸（７０ｍｌ）により０℃で３０分間二酸化硫黄を泡立たせた。溶液に塩化銅（Ｉ）（１．６５ｇ）を添加し、該溶液が淡青色に見えるまで（更に約３０分間）、二酸化硫黄中、０℃で混合物を泡立たせ続けた。上記ジアゾニウム溶液を０℃で二酸化硫黄溶液に添加し、０℃で１０分間撹拌した。次いで、混合物を氷水に注ぎ入れ、エーテルで３回抽出した。合わせた有機相をかん水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を除去した後、ヘプタン／塩化メチレン（７／３〜６／４）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製した（収率２９％）。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：８．１２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）．
【０１０３】
２−シアノベンゾチアゾール−６−イル２−メチル−４−ニトロベンゼンスルホン酸塩    乾燥塩化メチレン１０ｍｌ中のベンゼンスルホニルクロリド誘導体（０．７ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）及び２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール又は２−シアノ−６−ヒドロキシキノリン（２．８４ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．５８ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）を室温で添加し、得られた混合物を３時間撹拌した。ヘプタン／塩化メチレン（１／２）を溶出剤として使用したフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を精製した（収率８５％）。：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：８．３０（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：３７６．
【０１０４】
ルシフェリン２−メチル−４−ニトロベンゼンスルホン酸塩（ＧＳＴ−２１）メタノール（２０ｍｌ）、ＣＨ2ＣＩ2（１０ｍｌ）及びＨ2Ｏ（５ｍｌ）中のニトロベンゼンスルホン酸塩誘導体（１．０７ｍｍｏｌ）及びＤ−システイン（１．２８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（１．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０〜６０分間撹拌し、次いで、酸性の酸で弱酸性に中和した。真空下で有機溶媒を除去した後、濾過により固体を回収し、水で３回洗浄し、塩化メチレン／メタノール（９０／１０）を溶出剤として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。冷エーテル中で生成物を固化し、濾過により白色粉末を回収し、真空下で乾燥した（収率６２％）。1ＨＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）：８．４８（ｓ，１Ｈ），８．１−８．２（ｍ，２Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｄｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４５３（ｔ，Ｊ＝８．７，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．８４（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４８０．ＭｅＯＨ中λmax２９３ｎｍ，εmax１９，７００ｃｍ-1Ｍ-1．
【０１０５】
実施例２０  ＧＳＴ−２２の合成
ＧＳＴ−２１（実施例１９）の合成に使用したものと同様の方法を用いてＧＳＴ−２２を調製した。
【化２５】
0006041442.tif 000027
【０１０６】
２−ニトロ−４−メチルベンゼンスルホニルクロリド（収率５３％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：８．１３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）．
【０１０７】
２−シアノベンゾチアゾール−６−ｙｌ２−ニトロ−４−メチルベンゼンスルホン酸塩（収率６７％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：８．２３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．５−７．６（ｍ，２Ｈ），２．５８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ3）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：３７６．
【０１０８】
ルシフェリン−２−ニトロ−４−メチルベンゼンスルホン酸塩（ＧＳＴ−２２）（収率６２％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）：８．１８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４８（ｓ、ＣＨ3、３Ｈ、ＤＭＳＯと重複）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４８０．ＭｅＯＨ中λmax２９２ｎｍ，εmax２０，５００ｃｍ-1Ｍ-1．
【０１０９】
実施例２１  ＧＳＴ−２３の合成
ＧＳＴ−２１の合成（実施例１９）に使用したものと同様の方法を用いてＧＳＴ−２３を調製した。
【化２６】
0006041442.tif 000028
【０１１０】
２−シアノキノリン−６−ｙｌ２−ニトロ−４−メチルベンゼンスルホン酸塩（収率４０％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：８．３４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：３７０．
【０１１１】
キノリニル−ルシフェリン−２−ニトロ−４−メチルベンゼンスルホン酸塩（ＧＳＴ−２３）（収率５５％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ｄｅ−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）：８．５５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．７，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．５−３．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４８（ｓ、ＣＨ3，３Ｈ、ＤＭＳＯと重複）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４７４．ＭｅＯＨ中λmax２８６ｎｍ，εmax１１，５００ｃｍ-1Ｍ-1．
【０１１２】
実施例２２  ＧＳＴ−２４の合成
ＧＳＴ−２１の合成（実施例１９）に使用したものと同様の方法を用いてＧＳＴ−２４を調製した。
【化２７】
0006041442.tif 000029
【０１１３】
２−ニトロ−５−メチルベンゼンスルホニルクロリド（収率３３％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：８．０５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）．
【０１１４】
２−シアノベンゾチアゾール−６−ｙｌ２−ニトロ−５−メチルベンゼンスルホン酸塩（収率８５％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：８．２１（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），２．４６（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：３７６．
【０１１５】
ルシフェリン２−ニトロ−５−メチルベンゼンスルホン酸塩（ＧＳＴ−２４）（収率４８％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）：８．１８−８．２２（ｍ，２Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０−７．９８（ｍ，２Ｈ），７．３６（ｄｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．６−３．９（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４２（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４８０．ＭｅＯＨ中λmax２９２ｎｍ，εmax１９，７００ｃｍ-1Ｍ-1．
【０１１６】
実施例２３  ＧＳＴ−２５の合成
ＧＳＴ−２１の合成（実施例１９）に使用したものと同様の方法を用いてＧＳＴ−２５を調製した。
【化２８】
0006041442.tif 000030
【０１１７】
２−シアノキノリン−６−ｙｌ２−ニトロ−５−メチルベンゼンスルホン酸塩（収率５６％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ2Ｃｌ2）δ（ｐｐｍ）：８．３４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），７．８０−７．８６（ｍ，３Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｄｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５８（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）ｍ／ｅ（Ｍ＋１）：３７０．
【０１１８】
キノリニル−ルシフェリン２−ニトロ−５−メチルベンゼンスルホン酸塩（ＧＳＴ−２５）（収率４２％）：1Ｈ  ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）δ（ｐｐｍ）：８．５６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１５（ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），５．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．７，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．５−３．８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ2），２．４９（ｓ，ＣＨ3，３Ｈ）．ＭＳ（ＥＳ）：ｍ／ｅ（Ｍ＋１），４７４．ＭｅＯＨ中λmax２８５ｎｍ，εmax１１，６００ｃｍ-1Ｍ-1．
【０１１９】
実施例２４  ルシフェリン誘導体を使用したグルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の測定
ルシフェリン誘導体ＧＳＴ−３をＧＳＴのための基質として調製し、２段階形式でテストした。第１段階において、グルタチオンを含むか又は含まないＧＳＴ酵素を含有する混合物にＧＳＴ−３を添加した。反応開始後の異なる時点で、反応物の一部をルシフェラーゼ反応混合物と混合した。経時的に光の生成が増加した反応は、誘導体ＧＳＴ−３が、ＧＳＴのための基質であり、ＧＳＴ及び／又は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）を検出するためのアッセイにおいて使用できることを示唆する。
【０１２０】
種々のＧＳＴ酵素形態を使用して、ＧＳＴ又はＧＳＨを検出するためのＧＳＴのための基質としてのＧＳＴ−３の使用をテストした。表１に示すように、個々の０．５ｍｌ微量遠心管に反応物を集めた。ＧＳＴ酵素を除く全ての構成成分を添加した。次いで、ＧＳＴ酵素の形態を表１に示す反応物に添加し、反応物を混合した。０．１、５、１０、及び１５分に、１０μｌの各反応物を９０μｌのルシフェリン検出溶液（Ｐ４５０−Ｇｌｏ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合したＬｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ））と混合し、Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ  ２０／２０  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して直ちに発光を検出した。発光値（ＲＬＵ）を表２に示す。
【表１】
0006041442.tif 000031
【表２】
0006041442.tif 000032
【０１２１】
グルタチオンを含まない反応物（１、３、５、及び７番）から得られた発光には、経時的に大きな増加が見られなかった。しかしながら、グルタチオン及びＧＳＴの両方を含有する反応物（２、４、６、及び８番）の発光は、経時的に大幅に増加した。これは、グルタチオンと組み合わせたＧＳＴの作用により、ルシフェリン誘導体ＧＳＴ−３が、ルシフェラーゼに基づく反応において使用することができるルシフェラーゼのための基質に変換されることを実証するものである。したがって、ＧＳＴ−３は、ＧＳＴのための基質であり、ＧＳＴ及び／又はＧＳＨを検出するために使用することができる。
【０１２２】
実施例２５  ルシフェリン誘導体を使用したＧＳＳＧの蛍光検出
以下の実施例は、ＧＳＴのためのルシフェリン誘導体基質を使用してＧＳＳＧの蛍光検出を達成することができることを実証するものである。
【０１２３】
９６ウェル黒壁／透明底プレートに、１０μｌの１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＬＢ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を半分のウェルに添加し、１０μｌのＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ、Ｓｉｇｍａ：１×ＰＬＢ中で２．５ｍｌに希釈されたＤＭＳＯ中の５０ｕｌの５０ｍＭ  ＮＥＭ）を残りの半分のウェルに添加した。
【０１２４】
次いで、ＮＥＭの存在下又は非存在下（１×ＰＬＢのみ）で種々の条件をテストした。
１．滴定（０、５、１０、１５、２０、及び２５ｕＭ）還元型グルタチオン（ＧＳＨ、Ｓｉｇｍａ：１ｍｌの１×ＰＬＢに希釈された１００ｍＭの１ｕｌ）
２．滴定（０、５、１０、１５、２０、及び２５ｕＭ）酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ、Ｓｉｇｍａ：１ｍｌの１×ＰＬＢに希釈された１０ｍＭの２ｕｌ）
３．滴定（０、５、１０、１５、２０、及び２５ｕＭ）酸化型グルタチオン（高濃度（２５ｕＭ）の還元型グルタチオン／ＧＳＨの存在下）
４．グルタチオン対照なし
【０１２５】
適切な混合物を適切なウェルに添加した後、ＤＴＴ及びＧＳＴ−２２の混合物２０μｌ（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に希釈された１００ｍＭの１５０μｌ及び２４０μｌのＧＳＴ−２２（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各試料に添加した。トランスイルミネーターによるＵＶ励起（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してＡｍｂｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で蛍光を画像化し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ８０００ソフトウェア（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して分析した。
【０１２６】
画像化後、２０μｌのＧＳＴ（３ｍｌの１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）に希釈された４５０μｌのＧＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を全ての試料に添加した。いくつかの異なる時点（３、１０、２０、及び３０分）で上記のようにプレートを再び画像化した。
【０１２７】
蛍光読み取り値を確認するために、蛍光画像化後に発光読み取り値を計測した。４０μｌの各反応物を９６ウェル照度計のプレートに移し、４０μｌのＧＳＨ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を全てのウェルに添加した。次いで、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）上で発光を検出した。相対発光量（ＲＬＵ）で表した発光値を図４Ａに示す。２通りのウェルの平均値を求め、図４Ｂ及びＣに列挙する。図４Ｂ及びＣでは、結果の解釈を簡略化するために、ＧＳＳＧを含まない試料の結果を表中のゼロ濃度の位置に配した。
【０１２８】
予想結果
還元型グルタチオンの滴定：
ＥＭに曝露されていない場合、還元型グルタチオンの量の増加により、ＧＳＴの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。しかしながら、酵素を添加する前に還元型グルタチオンをＮＥＭで処理した場合、ＮＥＭが還元型グルタチオンと反応し、プレルシフェリンをルシフェリンに変換するためにＧＳＴによって使用されない新しい化学種を生成するため、シグナルは本質的に失われるはずである。これが正解である場合、時間の増加及びＮＥＭを含有する試料中のグルタチオン濃度の増加に伴って蛍光の増加が見られるはずであり、また、グルタチオン濃度の増加に伴って発光の増加が予想される。その一方で、ＮＥＭを含有するウェルには、「化合物を含まない」試料を超えるごくわずかな蛍光又は発光が見られることが予想される。
【０１２９】
酸化型グルタチオンの滴定：
各試料に還元剤（ＤＴＴ）も添加することにより試料中のＧＳＳＧを減少させ、ＮＥＭを不活性化させるため、酸化型グルタチオンの量の増加によっても、ＧＳＴの作用による経時的なルシフェリン濃度の増加がもたらされることが予想される。ＧＳＳＧはＮＥＭによってアルキル化されないため、最初にＧＳＨに還元されない限り、経時的に及びＧＳＳＧの濃度とともに、ＧＳＳＧの滴定を含む試料において同様の光の増加が予想される。
【０１３０】
高レベルの還元型グルタチオンの存在下における酸化型グルタチオンの滴定：
これらの試料には高レベルの還元型グルタチオンが添加されているため、ＮＥＭも含有しない試料は、非常に高いシグナルを発することが予想され、実際には、ＧＳＳＧからの追加シグナルは還元型グルタチオンからのシグナルに加えられるため、ＧＳＳＧの滴定においてさらなる蛍光又は発光の増加をあまり示さない可能性がある。ＮＥＭ、大量のＧＳＨ、及び様々な量のＧＳＳＧを含有する試料は、ＮＥＭによって排除された還元型グルタチオンからのシグナルを有することが予想され、よって、蛍光及び発光の増加率は、還元型グルタチオンを添加せずにＧＳＳＧを添加した試料の増加率と同様であることが予想される。
【０１３１】
実際の結果
ＮＥＭを添加していない還元型グルタチオンのウェル：
ＮＥＭを添加していない還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光を測定することによって検出することができ、蛍光のレベルが、溶液中に存在する還元型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、発光の増加が見られた（図４Ｂ）。
【０１３２】
ＮＥＭを添加した還元型グルタチオンのウェル：
ＧＳＨの添加によって生成されたシグナルをＮＥＭが中和させることが予想されたため、ＮＥＭが存在する還元型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、ごくわずかな蛍光の増加を示した。また、予想されたように、ＧＳＨを含有しない試料と、最も高いレベルのＧＳＨを含有する試料との間に、ごくわずかな発光の差が見られた（図４ＢとＣを比較）。
【０１３３】
ＮＥＭを添加したか又は添加していない、ＧＳＨを添加していない酸化型グルタチオンのウェル：
ＮＥＭの存在下又は非存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、予想されたように、時間及びグルタチオン依存性の蛍光増加率を示す。このことは、これらのウェルで生成されたルシフェリンは、蛍光的に検出することができ、蛍光のレベルが、存在する酸化型グルタチオンの量に比例することを裏付けるものである。また、予想されたように、添加するグルタチオンの量を増加させると、これらの試料から発光の増加が見られた。また、ＮＥＭの非存在下で測定された値は、ＮＥＭの存在下で測定された値と同様である（図４ＢとＣを比較）。
【０１３４】
ＮＥＭの非存在下ではあるが、大量の還元型グルタチオンの存在下で滴定した酸化型グルタチオンのウェル：
ＮＥＭは用いないが、高濃度の還元型グルタチオンの存在下での酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、還元型グルタチオンの非存在下で酸化型グルタチオンの滴定に見られたものよりもはるかに高かった。これらのウェルにおけるシグナル生成のために存在するグルタチオンの合計レベルが非常に高いため、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料には非常に強い発光が認められた（図４Ｂ）。
【０１３５】
高レベルの還元型グルタチオン及びＮＥＭの存在下で滴定された酸化型グルタチオンのウェル：
高レベルの還元型グルタチオン及びＮＥＭの存在下で酸化型グルタチオンの滴定を含む画像化プレートの試料は、時間依存性の蛍光の増加を示し、蛍光のレベルは、ＧＳＨを添加していない酸化型グルタチオンの滴定を含むウェルに非常に類似していた。還元型グルタチオンのシグナルを生成する電位はＮＥＭによって排除されているはずであり、よって、生成されたいずれのシグナルも、ウェルに添加された酸化型グルタチオンの結果であるはずであるから、このことは予想された。また、予想されたように、これらの試料からの発光は、酸化型グルタチオンを単独で添加したウェルからの発光と非常に類似しており（図４ＢとＣを比較）、２５μＭ  ＧＳＨの存在下及びＮＥＭの非存在下でＧＳＳＧを含有する試料から測定されたものよりもはるかに低い（図４Ｂ）。
【０１３６】
高度に蛍光性の化合物ではないものの、この結果は、ルシフェリン誘導体を使用してＧＳＳＧの蛍光検出を行うことができることを実証するものである。また、試料中のＧＳＳＧからのシグナルは、適切な試料処理を行った場合、高濃度のＧＳＨを含有する試料において測定することができる。更に、本発明の方法を使用することにより、いずれのタンパク質除去ステップも必要とすることなく、そのような測定を迅速かつ容易に行うことができる。
【０１３７】
実施例２６  他のルシフェリン誘導体を用いたＧＳＳＧの測定
固体のＧＳＴルシフェリン誘導体ＧＳＴ３０及びＧＳＴ２８をＤＭＳＯに溶解して４ｍｇ／ｍｌの溶液を作製した。
【０１３８】
３つの異なる９６ウェル照度計のプレート中に、酸化型グルタチオンを水中で１０ｍＭの原液から、０、０．１、０．５、及び２．５ｕＭに段階希釈し、２通りの反応を行った。ＧＳＴ３０原液の試料３０μｌをＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３ｍｌに希釈し、プレートのうちの１つに２５μｌを添加した（「３０」）。ＧＳＴ２８の試料３０μｌをＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで３ｍｌに希釈し、第２のプレートに２５μｌを添加した（「２８」）。ＧＳＴ−２２の試料１１０μＬをＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで３ｍｌに希釈し、第３のプレートに２５μｌを添加した（「ＧＳＴ−２２」又は「ＮＴ」）。次いで、５０μｌのＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒを各プレートの半分の試料に添加した。ＤＴＴを含む２５μｌのＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１５０μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴ対１５ｍｌのＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）を各プレートの残りの半分の試料に添加した。
【０１３９】
ＧＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試料６０μｌをＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒで１ｍｌに希釈し、各プレートの２つのカラムに５０μｌを添加した。室温で３０分のインキュベーション後、１００μｌのＧＳＨ  Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各試料に添加し、照度計を使用して１５分後に発光を読み取った。得られた発光を収集し、２つのカラムの平均値を求めた。３つのＧＳＳＧ濃度からＧＳＳＧの非存在下で測定された発光を引き、得られた値を表３に表す。
【表３】
0006041442.tif 000033
【０１４０】
ＧＳＴ３０又はＧＳＴ２８のいずれかによる反応は、反応物中に存在するＧＳＳＧの量に比例する強い発光を示したのに対し、酵素及びＤＴＴを含まない、又は酵素を含まないがＤＴＴを含む反応物では、発光にごくわずかな変化が見られたのみであった。よって、ＧＳＴ３０及びＧＳＴ２８も、本発明の方法においてＧＳＳＧの測定のために使用することができる。
【０１４１】
実施例２７  クマリン誘導体を使用したグルタチオンの蛍光検出
この実施例では、ＧＳＴ及びグルタチオンの使用により、クマリン誘導体から蛍光シグナルを生成する。
【０１４２】
２００μｌの１０％Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）と９．８ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を混合してＰｒｉｏｎｅｘ（登録商標）溶液を作製し、９６ウェルマイクロタイタープレート（「試料プレート」）の全てのウェルに７５μｌを添加した。ＧＳＴ酵素ＧＳＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．Ｖ６８９Ｂ）、ＧＳＴ  Ａ、ＧＳＴ  Ｂ、及びＧＳＴ  Ｐ（タンパク質１モル当たり１モル未満のＧＳＨを有するように精製した）の原液（２ｍｇ／ｍｌ）を、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）／Ｐｒｉｏｎｅｘ溶液１５０ｕｌに１２ｕｌの酵素を添加することによって希釈した。次いで、これらの希釈した原液をウェルに添加した。７５ｕｌの希釈した原液を列Ａのウェルに添加し、列Ａから７５ｕｌから列Ｈに移すことで１：１の段階希釈した酵素溶液を生成した。
【０１４３】
異なる９６ウェルマイクロタイタープレートに、２５μｌの希釈したＰＢＩ４１５３（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）５ｍｌを含むＰＢＩ４１５３のｌｍｇ／ｍｌ溶液２５μｌ）をプレートのウェルＡ１〜Ｈ１０に添加した（「４１５３」）。別の異なる９６ウェルマイクロタイタープレートに、２５μｌの希釈したＰＢＩ４１４６（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．４）５ｍｌを含むＰＢＩ４１４６の１ｍｇ／ｍｌ溶液２５μｌ）をプレートのウェルＡ１〜Ｈ１０に添加した（「４１４６」）。次いで、２５μｌの希釈した酵素溶液を添加した。
【０１４４】
ルシフェリン誘導体を用いた以前の実験に基づいて、ＧＳＴが存在して反応を触媒しない限り、遊離する還元型グルタチオンがクマリン誘導体と反応して蛍光クマリン種を放出することができるとは予想されなかった。よって、ＧＳＴを含有しない試料において、蛍光の大きな変化は予想されなかった。ＧＳＴ酵素形態のうちの１つ以上が、グルタチオンの存在下でクマリン化合物を触媒することができた場合、ＧＳＴ酵素形態を含有する試料は蛍光の増加を有するであろう。ＧＳＴ酵素形態がクマリン誘導体を良好に利用できるほど、蛍光の増加がより急速となり、経時的に大幅な蛍光の増加をもたらすことができるために必要なＧＳＴ酵素の濃度がより低くなる。
【０１４５】
結果
図６は、ＧＳＴ酵素の添加後１、３、５、及び２０分のプレート「４１５３」の画像を示す。緩衝液のみを有する試料（「対照ウェル」）の蛍光には明らかな増加は見られず、クマリン誘導体を含む還元型グルタチオンの存在のみでは蛍光種が生成されないことを裏付けている。しかしながら、含有するＧＳＴ  Ｍの量を減少させた試料には比較的急速な蛍光の増加が見られ、含有するＧＳＴ  Ａの量を減少させた試料ではより緩やかな増加率、そしてＧＳＴを含有する試料では更により緩やかな増加率であった。これらの結果は、ＧＳＴ  Ｍが、蛍光クマリン誘導体を生成するための基質としてクマリン化合物を迅速に利用することができることを示している。ＧＳＴ  Ａも化合物を利用することができるが、より緩やかな速度である。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｖ６８９Ｂ）からのＧＳＴも化合物を利用したが、ＧＳＴ  Ａよりも更に緩やかな速度であった。ＧＳＴ  Ｐでは、この酵素形態を含有するウェルには蛍光の増加が見られなかったことから、化合物を利用しなかったか、又は極々緩やかな速度で利用したかのいずれかであった。
【０１４６】
図７は、ＧＳＴ添加後１、３、５、及び２０分のプレート「４１４６」の画像を示す。緩衝液のみを有するウェル（「対照ウェル」Ａ１〜Ｆ２）の蛍光には明らかな増加は見られず、クマリン誘導体を含む還元型グルタチオンの存在のみでは蛍光種が生成されないことを裏付けている。ウェルＡ７〜Ｆ８に蛍光の増加が見られ、Ａ３〜Ｆ４ではより緩やかな速度であった。これらの結果は、ＧＳＴ  Ｍが、蛍光クマリン誘導体を生成するためにクマリン化合物を迅速に利用することができることを示している。ＰｒｏｍｅｇａからのＧＳＴも化合物を利用することができるが、ＧＳＴ  Ｍよりも更に緩やかな速度である。ＧＳＴ  Ａ及びＧＳＴ  Ｐでは、これらの酵素形態を含有するウェルには蛍光の増加が見られなかったことから、化合物を利用しなかったか、又は極々緩やかな速度で利用したかのいずれかであった。
【０１４７】
これらの結果は、種々のＧＳＴ形態が、前蛍光性（ｐｒｅ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）のクマリン誘導体を低濃度の還元型グルタチオンと合わせて利用して、蛍光シグナルを生成することができることを示している。予想しなかったわけではなかったが、ＧＳＴ形態のうちのいくつかは、化合物のうちのいくつかを他の形態よりも良好に利用し、よって、還元型グルタチオンを単独で測定するために好ましいか、又は本発明の方法における酸化型グルタチオンから生成される場合に好ましい。
【０１４８】
実施例２８  ＧＳＨ：ＧＳＳＧの比率の決定
本発明の方法は、接着性哺乳類細胞及び懸濁哺乳類細胞中の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）対酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）の比率及び／又はＧＳＳＧのみを測定するように設計される。セクションＢでは、試料中のＧＳＨのモルをＧＳＳＧのモルで除すことにより、どのように比率が算出されるかを説明する。
【０１４９】
Ａ．ＧＳＳＧ及びＧＳＨレベルの決定
ｉ．接着性細胞の播種
アッセイは、ウェル当たり５，０００〜１０，０００細胞のＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞、及び１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルの肝細胞等の、低い細胞密度に最適化されている。ＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞は、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ３９０３  ９６ウェル平底組織培養プレート（白色に処理済み、透明底を有する）上に播種した。肝細胞は、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）４６５０  ９６ウェルＣｏｌｌａｇｅｎ  １  Ｃｅｌｌｗａｒｅ上に播種した。業者の推奨する肝細胞培地を用いて肝細胞を培養した。透明な壁の組織培養プレートを使用する場合は、ルシフェラーゼ検出試薬（ＬＤＲ）の添加後に、反応物を照度計のプレートに入れるための移動ステップが行われなければならない。細胞を播種し、５％ＣＯ2の培養インキュベータにて３７℃で一晩インキュベートする。
【０１５０】
ｉｉ．接着性細胞の処理
メナジオンは、反応性酸素種（ＲＯＳ）誘導物質であり、陽性対照として使用される。クレブス・リンゲル液、クレブス・ヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）緩衝液中で４０μΜメナジオンを調製した。血清、フェノールレッド、及びシステイン等の細胞培養培地の構成成分は、アッセイ化学に干渉する可能性があるため、他の緩衝液がメナジオンを希釈するために使用されてもよい。メナジオンで細胞を処理するのと同時に細胞の培養培地を緩衝液＋ビヒクルと交換することにより、処理対照（ビヒクルのみ）は行わなかった。
【０１５１】
ｉｉｉ．懸濁細胞の播種及び処理
Ｊｕｒｋａｔ又はＨｅｌａ細胞等の懸濁細胞をクレブス・リンゲル液、クレブス・ヘンゼライト液、又はハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）緩衝液中で洗浄し、培地及び血清の痕跡を除去した。次いで、細胞を数え、所望の密度で上記緩衝液のうちの１つに希釈した。Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合、１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルを使用した。次いで、（所望の密度の）細胞懸濁液２０μｌを９６ウェルプレートのウェルに添加した。化合物の処理、ビヒクルのみの処理、及び処理対照なしについてテストするために、十分な細胞をウェルに播種した。次いで、５μｌのテスト化合物、例えば５×濃度のメナジオンを、テスト化合物で処理した細胞に添加し、５μｌのビヒクルのみ、例えばＤＭＳＯを、ビヒクルのみで処理した細胞に添加した。次いで、５％ＣＯ2インキュベータにて、３７℃で６０分間細胞をインキュベートした。
【０１５２】
ｉｖ．ＧＳＳＧの反応のための酸化型グルタチオン試薬
ＧＳＳＧの測定のために以下の試薬を調製した。溶液は、ＧＳＨをブロックするための２５０μΜ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及びプロルシフェリン基質ＧＳＴ−２２を細胞溶解溶液中に含有する。９６ウェルプレートの各ウェルは、５０μｌを必要とする。
【表４】
0006041442.tif 000034
【０１５３】
ｉｖ．ＧＳＨの反応のための総グルタチオン試薬及びＧＳＨ標準曲線
ＧＳＨの測定のために以下の試薬を調製した。ＧＳＨ溶液は、ＮＥＭを含有しない。９６ウェルプレートの各ウェルは、５０μｌを必要とする。
【表５】
0006041442.tif 000035
【０１５４】
ｖ．全ての反応のためのルシフェリン生成試薬
ルシフェリン生成試薬は、ＧＳＨ−Ｇｌｏ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ６９１１）に希釈されたＤＴＴ及びグルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含有する。全てのアッセイウェルに試薬を添加した。９６ウェルプレートの各ウェルは、５０μｌを必要とする。
【表６】
0006041442.tif 000036
【０１５５】
ｖｉ．ルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）
凍結乾燥したルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ８５９Ｂ）をエステラーゼを含有する再構成緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ１４４Ａ）１瓶で再構成することにより、ルシフェリン検出試薬を調製した。９６ウェルアッセイの各ウェルは、１００μｌのＬＤＲを受容する。
【０１５６】
ｖｉｉ．ＧＳＨ標準曲線、０〜１６μΜ
ＧＳＨ標準曲線の包含により、発光（相対発光量又はＲＬＵ）の生成とＧＳＨ及びＧＳＳＧの濃度との相関が可能になる。５ｍＭグルタチオンを水中で３２０μΜに希釈することにより、２０×濃度のグルタチオンを調製した。例えば、３２μｌの５ｍＭ  ＧＳＨを４６８μｌの水に希釈した。２５０μｌの３２０μΜ  ＧＳＨを２５０μｌの水に移すこと等によって段階希釈を行った。５μｌ／ウェルの各ＧＳＨを３回希釈した。例えば、５μｌの３２０μΜ  ＧＳＨは、標準曲線の１６μΜ  ＧＳＨに対応する。ＧＳＨの標準曲線は、接着性細胞アッセイ及び懸濁細胞アッセイの両方で同じであった。
【０１５７】
ｖｉｉｉ．アッセイの手順
接着性細胞から化合物処理を除去し、廃棄した。ＧＳＳＧの測定のために、２５μｌ／ウェル又は５０μｌ／ウェルの酸化型グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。ＧＳＨの測定のために、２５μｌ／ウェル又は５０μｌ／ウェルの総グルタチオン試薬を、それぞれ、懸濁細胞又は接着性細胞に添加した。ＧＳＨの標準曲線の測定のために、５０μｌ／ウェルの総グルタチオン試薬を添加した。プレート振盪機上でプレートを５分間室温で振盪させ、５０μｌ／ウェルのルシフェリン生成試薬を全てのウェルに添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で３０分間インキュベートした後、１００μｌ／ウェルのルシフェリン検出試薬を添加した。再度、プレートを短時間振盪させ、室温で１０分間インキュベートして発光を読み取った。
【０１５８】
Ｂ．ＧＳＳＧ：ＧＳＨの比率の算出
ＧＳＳＧ：ＧＳＨの比率は、試料中のＧＳＨのモルを試料中のＧＳＳＧのモルで除すことによって算出される。ＧＳＳＧの各モルは２モルのＧＳＨを生成するため、また、アッセイは、ＧＳＳＧの還元によって生成される全てのＧＳＨからシグナルを生成するため、ＧＳＨの標準曲線によって定量化されるＧＳＨのモル数には２倍の調整が必要である。
【０１５９】
ｉ．正味のＲＬＵを用いた比率の算出
細胞を含まない対照から生成された発光（ＲＬＵ）又は標準曲線から生成された０μΜのＧＳＨをバックグラウンドに用いた。処理細胞及び未処理細胞について、処理細胞及び未処理細胞から生成されたＲＬＵから、全てのウェルからのバックグラウンドの平均を引いて正味のＲＬＵ値を求めた。次の式を使用して、未処理細胞のＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【化２９】
0006041442.tif 000037
【０１６０】
次の式を使用して、処理細胞のＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【化３０】
0006041442.tif 000038
【０１６１】
ｉｉ．ＧＳＨの標準曲線を使用した比率の算出
発光（ＲＬＵ）対ＧＳＨの濃度（μΜ）をプロットした。第２のプロットは、ＧＳＳＧの濃度を決定するために作製した：Ｘ軸上に、ＧＳＨ値を２で除すことによってＧＳＳＧの濃度を求めた。注）ＧＳＳＧ１モル当たり２モルのＧＳＨなので、ＧＳＨの濃度を２で除すとＧＳＳＧの濃度が得られる。各標準曲線の直線部分によって生成された勾配（ｍ）及び式（Ｙ−Ｂ）／ｍを使用して、処理細胞及び未処理細胞の平均ＲＬＵ（正味のＲＬＵではない）値をＧＳＳＧ及びＧＳＨのμΜに変換した。細胞を含まない対照からのＲＬＵ値、すなわち、０μΜのＧＳＨを、式（Ｙ−Ｂ）／ｍにおいて「Ｂ」として使用した。したがって、未処理細胞のＧＳＨ／ＧＳＳＧの比＝未処理ＧＳＨのμΜ−未処理ＧＳＳのμΜ×２）／未処理ＧＳＳＧのμΜであり、処理細胞のＧＳＨ／ＧＳＳＧの比＝処理ＧＳＨのμΜ−（処理ＧＳＳＧのμΜ×２）／処理ＧＳＳＧのμΜ（図７）である。
【０１６２】
Ｃ．Ａ及びＢに記載した方法を使用した例
ｉ．５，０００細胞／ウェルのＨｅＬａ細胞を、４０ｕＭメナジオン又は０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル）で６０分間処理した。Ａに記載した方法によりＧＳＳＧ及びＧＳＨを検出した。Ｂに記載したようにＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【表７】
0006041442.tif 000039
【０１６３】
ｉｉ：２０，０００細胞／ウェルのラット肝細胞を、ｉのように処理した。Ａに記載した方法によりＧＳＳＧ及びＧＳＨを検出した。Ｂに記載したようにＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【表８】
0006041442.tif 000040
【０１６４】
ｉｉｉ．５，０００細胞／ウェルのＨｅｐＧ２細胞を、ｉのように処理した。Ａに記載した方法によりＧＳＳＧ及びＧＳＨを検出した。Ｂに記載したようにＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【表９】
0006041442.tif 000041
【０１６５】
ｉｖ．１０，０００細胞／ウェル又は２０，０００細胞／ウェルのＪｕｒｋａｔ細胞を、ｉのように処理した。Ａに記載した方法によりＧＳＳＧ及びＧＳＨを検出した。Ｂに記載したようにＧＳＨ／ＧＳＳＧの比率を算出した。
【表１０】
0006041442.tif 000042
【０１６６】
実施例２９  ＧＳＨを含まないＧＳＴ（日本住血吸虫）酵素の精製
試薬
細胞再懸濁緩衝液：ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＰＭＳＦ
カラム洗浄及び平衡化緩衝液：ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ
１０×緩衝液Ａ：２００ｍＭリン酸ナトリウム、一塩基、ｐＨ４．０、５Ｍ  ＮａＣｌ
１×緩衝液Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム、一塩基、ｐＨ４．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ
溶出緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、一塩基、ｐＨ４．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素
ＴＥＤＧ緩衝液：１×ＴＥ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール
保存緩衝液：１×ＰＢＳ、５０％グリセロール
【０１６７】
細胞の再懸濁
１００ｇの細胞ペースト（大腸菌を発現する日本住血吸虫ＧＳＴ酵素）を６００ｍｌの細胞再懸濁緩衝液に再懸濁した（緩衝液６ｍｌ／細胞ペースト１ｇ）。細胞懸濁液が均一になるまで溶液を混合し、次いで、溶液を氷上に置いた。
【０１６８】
細胞の破砕
細胞懸濁液を９０００ｐｓｉでマントンゴーリンに２回通過させることにより再懸濁した細胞を破砕し、氷塩浴中に置いたステンレススチール製バケツに可溶化液を回収した。２回目に通過させた後、１００〜２００ｍｌの細胞再懸濁緩衝液でマントンゴーリンを洗浄し、可溶化液と合わせた。次いで、４℃で６０分間、１６，０００×ｇで可溶化液を遠心分離した。
【０１６９】
カラム精製
還元型グルタチオンを含むＧＳＴ親和性樹脂及びＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂゲル濾過媒体（Ｓｉｇｍａ）を使用して精製カラムを調製した。樹脂２ｍｌ／細胞ペースト１ｇの樹脂対細胞ペーストの比率で１４７ｍｌのＧＳＴ親和性樹脂をカラムに充填した。
【０１７０】
９ｍｌ／分（２７．５ｃｍ／時間）の流速で１０００ｍｌのカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化した。次いで、カラムに１１００ｍｌの可溶化液を負荷し、９ｍｌ／分（２７．５ｃｍ／時間）の速度で流した。次いで、９ｍｌ／分（２７．５ｃｍ／時間）の流速で１５００ｍｌのカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄した。
【０１７１】
溶出緩衝液（高塩緩衝液）に対する１×緩衝液Ａ（低塩緩衝液）の直線勾配溶出を用いて、精製したＧＳＴをカラムから溶出した。最初に、３７５ｍｌの１×緩衝液Ａを０．４７ｍｓ／ｃｍの伝導率になるようにカラムに添加した。次いで、３７５ｍｌの溶出バッファを０．６  ６ｍｓ／ｃｍの伝導率になるように添加した。各溶出の流速は、１５ｍｌ／分（４５．９ｃｍ／時間）であった。フラクションコレクターを１．３分／画分の速度で使用して、５１個の２０ｍｌ勾配画分を収集した。各勾配操作の後に、７５０ｍｌ（５カラム体積）の溶出緩衝液、次いで１５００ｍｌ（１０カラム体積）のカラム洗浄及び平衡化緩衝液を用いて洗浄を行った。
【０１７２】
各画分のＧＳＴ濃度を決定するために、４ｕｌの各画分をＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）１ｍｌと混合し、製造者の指示に従ってタンパク質濃度を決定した。次いで、画分をプールし、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有するＧＳＴ酵素溶液を作製した。
【０１７３】
透析
最初に、プールした各ＧＳＴ酵素溶液を、２０ＬのＴＥＤＧ緩衝液（１０〜２０プール体積）中、４℃で２．５時間、それぞれ２回透析した。１０Ｌの保存緩衝液（１０プール体積）中でそれぞれ２回最終透析を行った：最初に４℃で２５時間行い、２回目に４℃で１５時間行った。次いで、それぞれの透析した画分を、保存緩衝液中で４ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう調整し、使用するまで酵素溶液を４℃で保存した。
【０１７４】
実施例３０  培地の試料抽出による反応性酸素の効果の検出
この実施例では、細胞中の反応性酸素種の生成に影響を与える可能性がある化合物（複数可）又は化学物質（複数可）を用いた処理の後に、細胞の健康をモニタリングするための方法を提供する。種々の研究者によって、哺乳類細胞が、細胞から酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を輸送するトランスポーターを発現することが同定されている（Ｍｉｎｉｃｈ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００６，ｖｏｌ９７，ｐ３７３−３８４）。ＧＳＳＧの輸送は、細胞中に存在するＧＳＳＧのレベルと関連しているはずであり、したがって、化合物（複数可）又は化学物質（複数可）の輸送は、グルタチオン還元酵素等の酵素による細胞中のＧＳＳＧからのＧＳＨの再生と競合する。よって、細胞外ＧＳＳＧの増加を測定することによって、細胞中のＧＳＳＧレベルの増加を検出することが可能であり得る。
【０１７５】
培地及び血清の多くの源は、相当なレベルのグルタチオンを含有するため、そのような測定を行うためには、細胞を処理する際に使用される細胞培地がグルタチオンを含有しないこと、及び血清が添加されていないことが有利である。ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ等の細胞培地が使用される場合、培地中のグルタチオンの出発レベルのために、輸送されるグルタチオンの測定がより困難となる。この理由から、本実施例における培地としてハンクス平衡塩（ＨＢＳＳ）が選択された。
【０１７６】
１０％ウシ胎仔血清を含む１００ｕｌのＤＭＥＭ中の９６ウェル組織培養プレートに、ウェル当たり５，０００細胞の密度でＡ５４９細胞を播種し、１０％ＣＯ2で４８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、培地を除去して廃棄し、４０ｕＭメナジオンを含むか又は含まないＨＢＳＳ緩衝液と交換した。次いで、１０％ＣＯ2で１時間、３７℃でプレートをインキュベートした。
【０１７７】
１時間の処理後、細胞からのＨＢＳＳ緩衝液を新しい９６ウェルプレートに移した。次いで、１００ｕｌの新しいＨＢＳＳ緩衝液と、ＮＥＭを含むか又は含まないＰＬＢの濃縮溶液とを細胞に添加した。これらの操作から次の（３通りの）条件がもたらされた。
１．細胞の可溶化液から細胞のＧＳＨ及びＧＳＳＧを測定したが、溶解する前に、ＨＢＳＳ緩衝液を含むビヒクル又はメナジオン処理を除去した。
２．培地のＧＳＨ及びＧＳＳＧは、細胞から移したＨＢＳＳ緩衝液から測定した。
３．ＧＳＨ合計及びＧＳＳＧ合計は、ＨＢＳＳ緩衝液で処理した細胞の可溶化液から測定したが、ＰＬＢを添加する前にＨＢＳＳ緩衝液を除去しなかった。
【０１７８】
ＧＳＳＧの測定のために、ＧＳＴ−２２、２５ｍＭ  ＮＥＭ、及び１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを含有する混合物を試料に添加した。ＧＳＨの測定のために、ＧＳＴ−２２及び１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを含有する混合物を試料に添加した。室温で５分間試料をインキュベートし、１００ｍＭ  ＤＴＴ及びＧＳＴを含む２５μｌのＬＤＲを添加した。次いで、室温で３０分間試料をインキュベートし、１５０μｌのＬＤＲを添加した。室温でのインキュベーションから１５分後に、発光を検出した。
【０１７９】
３つの条件からの平均ＲＬＵ読み取り値を表１１及び図９に示す。培地及び細胞からのグルタチオン種の合計は、ウェル測定値の合計とほぼ等しくなると予想できることに留意されたい。この計算を表１１の３列目に示す。ＧＳＨ対ＧＳＳＧの比率も決定した（図１０）。
【表１１】
0006041442.tif 000043
【０１８０】
表１１及び図９のデータから、培地のみのＧＳＳＧ測定値でも、メナジオン処理が細胞に与えたある程度の影響が示唆されたことは明らかである。細胞の画分の溶解も培地のＧＳＳＧ値を劇的に上昇させたかもしれないが、この場合、細胞溶解の測定値（ＬＤＨ放出及びＡＴＰレベル）は、いずれかの溶解が起こったことを示唆しなかった（データは示さず）。
【０１８１】
したがって、このデータは、本発明の方法を使用した細胞培地中のＧＳＳＧ及びＧＳＨの測定が、化合物（複数可）が細胞の健康に与える影響を検出するために使用できることを示唆するものである。多くの実験において、細胞培地は典型的に除去及び廃棄されるため、細胞の健康の尺度としての細胞培地の使用は、いずれの細胞又は細胞可溶化液も犠牲にすることなく行うことができ、単一試料からより多くの情報を得ることができるように、細胞に対する他のアッセイ、例えば、細胞生存アッセイ又は酵素アッセイを行うことができる。
【０１８２】
全ての出版物、特許、及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明を、その特定の好ましい実施形態に関連して記載し、例示の目的で多くの詳細を記述してきたが、当業者には、本発明はさらなる実施形態を許容すること、及び本明細書に記載される詳細のうちのいくらかは、本発明の原則から逸脱することなく大幅に変更されてもよいことは明白であろう。
【図１】
0006041442.tif 000048
【図２Ａ】
0006041442.tif 000049
【図２Ｂ】
0006041442.tif 000050
【図３】
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【図４Ａ】
0006041442.tif 000052
【図４Ｂ】
0006041442.tif 000053
【図４Ｃ】
0006041442.tif 000054
【図８】
0006041442.tif 000055
【図５Ａ】
0006041442.tif 000056
【図５Ｂ】
0006041442.tif 000057
【図６】
0006041442.tif 000058
【図７】
0006041442.tif 000059
【図９】
0006041442.tif 000060
【図１０】
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