(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム属の一種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）又はトラウストキトリウム属の一種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微細藻類を発酵させて産生されるスクアレンを有機溶剤（エタノールを除く）を用いずに抽出する方法であって、以下の工程：
１）介在性可溶物の濃度を低減し、発酵培地の乾燥総重量分のバイオマスの乾燥重量として表記される３０％〜９９％の純度の、前記微細藻類のバイオマスを調製する工程と、
２）得られた前記バイオマスを中性もしくは塩基性プロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼ酵素を用いて処理する工程であって、エマルジョンの形成を防止しながら前記微細藻類の細胞壁を破砕する工程と、
３）前記得られた反応混合物を遠心分離して、油を水性相から分離する工程と、
４）このようにしてもたらされたスクアレン富化原油を回収する工程と、
を含み、
工程２）の前記酵素処理が、プロペラ攪拌機および阻流板を備えるデバイス中における非せん断性の弱乳化性攪拌で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程１）で調製される前記微細藻類のバイオマスの純度が９５％超であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程２）で用いる前記プロテアーゼ酵素が、アルカラーゼであることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程１）において調製された前記バイオマスが、次いで、６％〜１２％の乾燥物含有量に調節されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程２）の前記酵素処理が、５０℃超の温度、および、７超のｐＨで実施されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程２）の前記酵素処理の終了時に、５％（ｖ／ｖ）超でエタノールが添加されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記エタノール処理が、１０分間超撹拌しながら実施されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程３）の前記遠心分離に先だって、前記反応混合物が７０〜９０℃の温度であり、および、そのｐＨが８〜１２の値とされることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程３）の前記遠心分離が、水性相および細胞片から抽出された軽質上方相（油）の回収を可能とする濃縮器モードの三層出力分離器において実施されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程３）の前記遠心分離が、４０００ｇ超の遠心力で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類からの、有機溶剤を用いないスクアレンの抽出を最適化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の目的上、「トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類」という表現は、シゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）、オーランチオキトリウム属の一種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）およびトラウストキトリウム属の一種（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）に属する微細藻類を意味することが意図されている。
【０００３】
スクアレンは、３０個の炭素原子および５０個の水素原子を含む、式：２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサ−ヘキセンのトリテルペン（イソプレノイド）である。
【０００４】
これは、ヒトを含むすべての高等生物において天然に生じる脂質である（皮脂において見出される）。スクアレンは、実際には、コレステロール、ステロイドホルモンおよびビタミンＤの生合成における重要な中間体である（コレステロール代謝経路の酵素（スクアレンモノオキシゲナーゼ）は、スクアレン分子の一端部を酸化することにより環化を誘引してラノステロールをもたらし、これがコレステロールおよび他のステロイドに変換されることとなる）。
【０００５】
工業的には、スクアレンは、食品分野、化粧品分野および薬学分野において特に用いられる。
【０００６】
栄養補助食品としては、スクアレンは通常カプセルまたは油として配合される。
【０００７】
化粧品分野においては、この分子は、脂肪の跡または脂っぽさを残すことなく直ぐに皮膚に浸透し、他の油およびビタミンと良好に混合される保湿クリームにおいて、抗酸化剤、帯電防止および皮膚軟化剤として用いられることが可能である。
【０００８】
この分野においては、スクアレン（６つの不飽和性）のきわめて高い不安定を考慮すると、スクアレンはスクアレンよりも良好な抗酸化剤である飽和されたスクアラン（水素化によって得られる）を形成し、これは、一般にきわめて高い純度レベル（９９％）で市場において見出されることに留意すべきである。
【０００９】
毒性に関する研究では、化粧品において用いられている濃度では、スクアレンおよびスクアランは全く毒性を示さず、ヒトの皮膚に対する刺激物でも感作物質でもないことが示されている。
【００１０】
薬学分野においては、スクアレンはワクチンの補助剤として用いられる。
【００１１】
これらの補助剤は、免疫系を刺激し、ワクチンに対する応答を高める物質である。
【００１２】
この用途分野において、スクアレンの純度レベルは重要である。
【００１３】
実際に、経口摂取される場合、スクアレンは完全に安全であると考えられるが；しかしながら、注射経路は議論の対象となる。
【００１４】
実際に、医学分野においては、このアジュバントは当然のようにその不純物に対しても強い免疫応答を誘起してしまうことが可能であるために、スクアレンが不純物により汚染されている場合に、ヒトレシピエントに対する有害性リスクが高まってしまう場合がある。
【００１５】
従って、スクアレンは不純物（微量の特に水銀といった金属および他の毒素）を含有しない高品質のものであることが重要である。
【００１６】
一定数のスクアレンの製造および抽出経路が文献において提案されている。
【００１７】
これは、度々、深海鮫などの軟骨魚類の肝臓に蓄えられていることが見出される化合物である（よってこの名とされている）。
【００１８】
従って、これが乱獲される１つの理由であるが、鮫は鰭を採るために既に漁の対象とされている。それ故、鮫の肝臓は、現在、「健康によい」と表現されるゲルカプセルの製造用に販売されている。
【００１９】
しかしながら、それ故、市販されているスクアレンは主に鮫の肝臓から抽出されているが、健康上の問題が存在している。
【００２０】
これは、鮫は、ヒトに有害な物質を産する可能性がある病原菌に感染している可能性があるためである。加えて、生体の解毒および精製器官である鮫の肝臓は、ヒトに有害であるカーチャトキシン（ｃａｒｃｈａｔｏｘｉｎ）などの毒素を含有している可能性がある。
【００２１】
これらの環境問題（鮫の生息数の大幅な減少）および健康上の問題（魚の肝臓もまた健康に関する懸念材料である毒素を有する）により、植物からの抽出が想起された。
【００２２】
それ故、オリーブ油およびヤシ油、ならびに、穀類由来の他の油またはアマランス、種子、米ぬかもしくはコムギ麦芽に由来する他の油から単離することが可能である。
【００２３】
しかしながら、この場合における主な欠点は、スクアレンは、約０．１％〜０．７重量％ときわめて少量でしか抽出されないことである。
【００２４】
鮫の肝臓または植物からのこれらの抽出方法の最初の代替として、微生物：天然酵母または組み換え型酵母、特にサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）タイプからスクアレンを生成するための最初の方法が提案されているが、相当量の濃縮および精製方法が行われるために度々経済的ではなくなってしまう。
【００２５】
そして、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がスクアレンを産出することが可能であることが知られているが、しかしながら、その量は、バイオマスの約０．０４１ｍｇ／ｇときわめて少量である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７、ｐｐ．８１１−８１６）。
【００２６】
従って、遺伝子組み換えによってこれらの産出能を最適化するための研究が行われている。しかしながら、医学分野について国際公開第２０１０／０２３５５１号パンフレットによって提示されているとおり（ワクチンアジュバントとしての９７％を超える純度を有するスクアレンの生産）、この最初の代替は、組み換え型酵母によりスクアレンを過剰産出させる（乾燥細胞の１５重量％超）ことが可能である場合にのみ工業化が可能である。
【００２７】
実際のところ、これらの組み換え型細胞を得るためには、分子生物学的ツールを用い、スクアレン生合成経路の刺激およびスクアレン異化反応経路の阻害をもたらす数多くの面倒で、時間がかかり、複雑な代謝工学工程を実施する必要がある。
【００２８】
鮫の肝臓または植物からの抽出方法の第２の代替として、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）（トラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属およびシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属を含む）、特にシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）またはシゾキトリウムリマシナム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）の微細藻類からスクアレンを生産する有望な方法が提案されている。
【００２９】
これらの微細藻類は、従属栄養的条件下（暗中；炭素源としてのグルコースの供給）でスクアレンを産生し、従って、微生物発酵分野における当業者により容易に操作されることが可能である。
【００３０】
従って、これらの方法は、制御された発酵条件によって、食品、化粧品および医学的な要求を満たすために精製が容易に考えられるスクアレンの品質を提供する。
【００３１】
しかしながら、これらのトラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）の微細藻類において、スクアレンは、ω３族の多価不飽和脂肪酸である、ドコサヘキサエン酸（またはＤＨＡ）などの対象である他の脂質化合物の副産物である。
【００３２】
それ故、スクアレンは、市販のＤＨＡ油の不鹸化性画分の成分の一種として特に記載される（カロチノイドおよびステロールと共に）と考えられる。
【００３３】
比較として、シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１菌株は、０．０１７％のスクアレンに対して、細胞の乾燥重量基準で６．２％の割合でＤＨＡを産生する。
【００３４】
その結果、スクアレンを自然に産生するこれらの微生物は、その量は以下のように少量である。
−  トラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、ｐｐ  ４３９−４４７を参照のこと）については約０．１ｍｇ／バイオマス１ｇ、
−  シゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ１（Ｙｕｅ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００４、５２、ｐｐ  １１９６−１２００を参照のこと）については約０．１６２ｍｇ／バイオマス１ｇ。
【００３５】
これらの産生を増加させるためには、従って、発酵条件を最適化することが重要であることが見受けられる。
【００３６】
しかしながら、成されたすべての試みに関わらず、これらの値は、オリーブ油に係る基準値（約４．２４ｍｇ／ｇ）よりも低いままである。
【００３７】
最善の場合、これらの最適化された産生は、：
−  １ｇのトラウストキトリド（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）ＡＣＥＭ  ６０６３  バイオマス当たり約１ｍｇ〜１．２ｍｇのスクアレン（Ｑｉａｎ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００９、５７、４２６７−４２７２またはＬｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、３、４３９−４４７を参照のこと）；
−  １ｇのシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）バイオマス当たり約０．７２ｍｇのスクアレン（Ｇ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０、２７−４、ｐｐ  ３８２−３８９を参照のこと）；
−  １ｇのオーランチオキトリウムマングローヴァイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）ＦＢ３Ｉバイオマス当たり約０．５３ｍｇのスクアレン（Ｋ．Ｗ．Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０、２６−３、ｐｐ  １３０３−１３０９を参照のこと）；
−  １ｇのシゾキトリウムマングローヴァイ（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）バイオマス当たり約１．１７±０．６ｍｇのスクアレン（Ｃ−Ｊ  ＹｕｅおよびＹ．Ｊｉａｎｇ、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、４４、９２３−９２７を参照のこと）。
の産生をもたらす。
【００３８】
本出願人は、自身によって、本分野における文献においては未だかつて達成されていないレベル、すなわち、１００ｇのバイオマス当たり少なくとも８ｇのスクアレン（本明細書中以下において例示するとおり）でスクアレンの産生を可能とする方法を提供することにより、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類のスクアレンの産生のさらなる向上にも寄与している。
【００３９】
実験規模において、発酵培地からもたらされるバイオマスからスクアレンを抽出するための方法は、従来、有機溶剤を用いる方法である。
−  Ｙｕｅ  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００４、５２、１１９６−１２００には、脂質がメタノール／アセトン（７：３ｖ／ｖ）中に可溶化され、次いで、クロロホルム／メタノール（２：１ｖ／ｖ）中で洗浄する方法が記載されており；
−  Ｃ−Ｊ  ＹｕｅおよびＹ．Ｊｉａｎｇ、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００９、４４、９２３−９２７においては、スクアレンおよびコレステロールの抽出が、凍結乾燥した細胞のエタノールによる事前の鹸化後にヘキサンで実施されており；
−  Ｇ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０、２７−４、ｐｐ  ３８２−３８９においては、スクアレンの抽出が、凍結乾燥した細胞のＫＯＨ（１０％ｗ／ｖ）−エタノール（７５％ｖ／ｖ）による鹸化後にヘキサンで実施されており；
−  Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００１、４３９−４４７においては、先ず、凍結乾燥した細胞から、３級クロロホルム／メタノール／水（１：２：０．８ｖ／ｖ／ｖ）混合物を用いて全脂質が抽出され、次いで、不鹸化脂質を得るために、これらの全脂質の一部がメタノール／水（４：１ｗ／ｖ）中のＫＯＨの５％溶液で処理され、続いて、中性の不鹸化脂質がヘキサン−クロロホルム（４：１ｖ／ｖ）で本抽出される。
【００４０】
大規模では、ヒトおよび環境に有害な溶剤の使用を回避するために、他の解決法が提案されている。
【００４１】
逸話的には、韓国特許ＫＲ２００８／００１７９６０号明細書においては、例えば、シクロデキストリン／スクアレン複合体が得られるよう、スクアレンを含有する培地をシクロデキストリンの溶液に入れ、次いで、前記培地からの分離を促進するためにＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＭｇＣｌ２またはＭｇＳＯ４などの凝析剤を添加することが提案されている。しかしながら、そのまま単離するためにスクアレンを脱複合化する必要性もある。
【００４２】
しかしながら、実際には、２つの技術：
−  超臨界ＣＯ２による抽出方法；
−  有機溶剤の不在下における抽出方法
が主に記載されている。
【００４３】
クロロホルムまたはヘキサンによる抽出方法に対する第１の代替は、従って、超臨界ＣＯ２である。
【００４４】
この技術は、５００ダルトン未満の分子量を有する非極性化合物の抽出にかなり好適である（スクアレンの分子量はわずかに４００Ｄａ未満である）。
【００４５】
スクアレンは、１００〜２５０ｂａｒの圧力で超臨界ＣＯ２に可溶性である。
【００４６】
この技術による抽出に対して沢山の作業が、ボトリオコックスブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、セネデスムスオブリクウウス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）またはトルラスポラデルブリュッキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）で行われてきた。
【００４７】
しかも、超臨界ＣＯ２は、それ故、細胞溶解およびスクアレンの単離の両方に用いられる。
【００４８】
しかしながら、脂質を抽出する前に細胞を凍結乾燥することが推奨され、これは、微生物の種類に対して技術を適合させるために多大な追加的な作業を必要とする。
【００４９】
しかも、これらの条件は、魅力的なコストで工業規模に置き換えることは困難である。
【００５０】
第２の技術的代替は、有機溶剤の不在下における脂質抽出である。
【００５１】
ＢｅｎｅｍａｎｎおよびＯｓｗａｌｄによる数多くの論文および文書から、または、例えば、欧州特許第１  ２５２  ３２４号明細書および欧州特許第１  ３０５  ４４０号明細書からの教示にこのアプローチが記載されているが、いずれのものもスクアレンを抽出するための最適化された条件を特定していない。
【００５２】
「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  Ｐｏｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＯ２  ｔｏ  Ｂｉｏｍａｓｓ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｕｎｄｅｒ  Ｇｒａｎｔ  Ｎｏ．ＤＥ−ＦＧ２２−９３ＰＣ９３２０４」と題された１９９６年の論文において、Ｊ．ＢｅｎｅｍａｎｎおよびＷ．Ｏｓｗａｌｄは、バイオマスを濃縮するためにだけではなく、油相中の藻類から脂質を同時に抽出するために遠心分離を用いることが可能であることを教示する。
【００５３】
この分離は、水、藻類の脂質およびバイオマスの他の構成成分間の比較的大きな密度の差に基づいている。
【００５４】
ＯｓｗａｌｄおよびＢｅｎｎｅｍａｎは、熱油抽出方法によって凝集された藻類バイオマスからβ−カロチンを抽出するための方法の文脈において特に記載している。
【００５５】
それ故、収集および処理工程が、一般的な凝集および遠心分離工程と重畳する。
【００５６】
欧州特許第１  ２５２  ３２４号明細書においては、湿った微生物性バイオマスを破壊して細胞内脂質を放出させ、重質層と軽質層とを含む「相分離混合物」を生成するための方法により細胞ライセートを処理し、重質層を脂質を含有する軽質層から重力により分離し、次いで、脂質を得るために前記軽質相中の水／脂質エマルジョンを破壊することが報告されている。
【００５７】
エマルジョン状態では純粋な脂質の回収が妨げられてしまうことに留意することが重要である。従って、エマルジョンを水、アルコールおよび／またはアセトンであり得る洗浄溶液で、脂質が「実質的に」エマルジョンでなくなるまで洗浄する方法を行う必要性がある。しかしながら、５％を超える非極性有機溶剤を用いることは推奨されない。
【００５８】
エマルジョンの油／水界面は細胞片によって安定化されていることも理解される。これが、細胞−破砕工程の前もしくは最中の発酵培地の加熱、または、細胞破砕工程の最中の発酵培地への塩基の添加がエマルジョン形成の低減に寄与する理由であり、これは、熱（少なくとも５０℃）またはアルカリ処理がタンパク質を変性させて、有機物を可溶化させるためである。
【００５９】
この方法は、すべてのタイプの脂質：リン脂質；遊離脂肪酸；脂肪酸トリグリセリドを含む脂肪酸エステル；ステロール；顔料（例えばカロチノイドおよびオキシ−カロチノイド）および他の脂質、ならびに、フィトステロール、エルゴチオニン、リポ酸などの脂質関連化合物、およびβ−カロチン、トコトリエノールおよびトコフェロールを含む酸化防止剤の抽出を可能とすると言われている。
【００６０】
好ましい脂質および脂質関連化合物は、この場合、コレステロール、フィトステロール、デスモステロール、トコトリエノール、トコフェロール、ユビキノン、カロチノイド、および、β−カロチン、ルテイン、リコペン、アスタキサンチン、ゼアキサンチン、カンタキサンチンなどのキサントフィル、および、共役リノール酸などの脂肪酸、ならびに、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸およびγ−リノレン酸などのω−３およびω−６タイプの多価不飽和脂肪酸である。
【００６１】
スクアレンは、それ自体としても、明記されているいずれかの特定の細胞溶解プロセスまたは遠心分離を実施するための条件としても想定されていない。
【００６２】
欧州特許第１  ３０５  ４４０号明細書に関して、これは、特に、モルチエレラアルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）によって産生されたアラキドン酸の抽出に専用のものである。
【００６３】
従来技術において記載されているものよりも効果的であるスクアレンの抽出方法の開発に関して、本出願人は、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）の微細藻類の発酵培地からのこの化合物の有機溶剤を用いない抽出に対する条件を最適化するための独自のリサーチを展開した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００６４】
従って、本発明は、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ  ｓｐ．）に属する微細藻類を発酵させることにより産生されるスクアレンを有機溶剤を用いずに抽出する方法であって、以下の工程：
１）介在性可溶物の濃度を低減し、これにより、発酵培地の乾燥総重量分のバイオマスの乾燥重量として表記される３０％〜９９％、好ましくは９５％超の純度を達成するために、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）に属する微細藻類のバイオマスを調製する工程と、
２）得られたバイオマスを例えばアルカラーゼといった中性もしくは塩基性プロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼ酵素を用いて処理する工程であって、これにより、前記酵素処理によって生成されるエマルジョンの形成を防止しながら前記微細藻類の細胞壁を破砕する工程と、
３）油を水性相から分離するために、得られる反応混合物を遠心分離する工程と、
４）このようにしてもたらされたスクアレン富化原油を回収する工程と
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６５】
本発明による方法の第１の工程は、介在性可溶物の濃度を低減し、これにより、発酵培地の乾燥総重量分のバイオマスの乾燥重量として表記される３０％〜９９％、好ましくは９５％超の純度を達成するために、トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）に属する微細藻類のバイオマスを調製する工程を含む。
【００６６】
本発明の目的上、「介在性可溶物」という用語は、例えば塩などの水溶性化合物、残存グルコース、タンパク質およびペプチド等といった発酵培地のすべての可溶性の有機汚染物を意味することが意図されている。
【００６７】
トラウストキトリアレス科（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）に属する微細藻類としては、以下の市販されている菌株をテストした。
−  ＡＴＣＣ  ２０８８８と称されるシゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）
−  ＡＴＣＣ  ＰＲＡ  ２７６と称されるオーランチオキトリウム属の一種（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）。
【００６８】
しかも、本出願人はまた、自身の産生菌株である、２０１１年４月１４日に、フランスにおいて、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ］にＮｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−４４６９で寄託し、および、中国においても、武漢大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｕｈａｎ）、Ｗｕｈａｎ  ４３００７２、Ｐ．Ｒ．ＣｈｉｎａのＣＨＩＮＡ  ＣＥＮＴＥＲ  ＦＯＲ  ＴＹＰＥ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮに、Ｎｏ．Ｍ  ２０９１１８で寄託したシゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）を有する。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
培養は、従属栄養的条件下で実施される。一般に、培養工程は、菌株を活性化させるための前培養工程、次いで、培養工程またはそれ自体の発酵工程を含む。後者の工程は、対象の脂質化合物を産生する工程に対応する。
【００７０】
これらの微細藻類を培養するための条件はこの分野において周知である。例えば、Ｇ．Ｃｈｅｎ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１０、２７−４、ｐｐ  ３８２−３８９による論文には、以下の連続的な工程を含む方法が記載されている：
−  グルコース、グルタミン酸ナトリウム、イースト菌抽出物および種々の微量元素を含む寒天栄養培地上で維持した菌株から開始し、
−  活性化されたバイオマスを得るために、オービタルシェーカ上のエルレンマイヤーフラスコ中において、ｐＨ６、２５℃の温度で、前培養物を調製し、
−  前培養において用いられたものと同一の培地を有する他の系列の産生エルレンマイヤーフラスコに、およそ０．５％（ｖ／ｖ）の前段の工程において得られたバイオマスを接種し、温度を２５℃に維持する。
【００７１】
前培養工程は、２４〜７４時間、好ましくはおよそ４８時間継続され得ることが好ましい。培養については、６０〜１５０時間継続され得ることが好ましい。
【００７２】
微細藻類の増殖に要求される炭素源はグルコースであることが好ましい。
【００７３】
窒素源の性質に関して、本出願人は、イースト菌抽出物、尿素、グルタミン酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムからなる群から単独で、または、組み合わせで選択することが可能であることを見出した。同様に、尿素を、グルタミン酸ナトリウムで完全にもしくは部分的に置き換えること、または、グルタミン酸ナトリウムと硫酸アンモニウムとの混合物を用いることが可能である。
【００７４】
従来技術における方法において慣習的に用いられているイースト菌抽出物、５ｍｌ／ｌの割合で用いられるＳｉｇｍａ社により販売されているＢＭＥ反応混液などのビタミン反応混液が加えられた尿素を選択することが可能である。
【００７５】
好ましくは、前培養培地はビタミンＢ１、Ｂ６およびＢ１２を含む。
【００７６】
培地のｐＨに関して、本明細書中以下において例示するとおり、これは、５．５〜６．５、好ましくは６の固定値で維持されることとなる。ｐＨは、例えば２Ｎ硫酸、次いで、８Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによる、当業者に公知であるいずれかの手段により調節されることが可能である。
【００７７】
最後に、溶存酸素含有量は、２０％〜０％の値で調節され、０％で放置される前に、好ましくは、２４〜４８時間、好ましくは３６時間の最初の期間の間５％で維持されることが可能である。酸素移動容量に関して、これは、さらに、４５ｍｍｏｌ／ｌ／時間を超えることがないよう、当業者に公知のいずれかの手段によって調節されることとなる。
【００７８】
本発明の方法によれば、発酵槽から抽出したバイオマスは、発酵培地の乾燥総重量分のバイオマスの乾燥重量として表記される９５％超の純度を達成するために、当業者に公知のいずれかの手段によって処理される。
【００７９】
有利には、本出願人は、本明細書中以下において例示するとおり、バイオマスの一連の濃縮（遠心分離による）／希釈を介して介在性可溶物を洗浄する工程を推奨する。
【００８０】
その介在性可溶物がこのようにして精製されたこのバイオマスは、次いで、脱イオンまたは精製水、好ましくは精製水で、好ましくは６％〜１２％の乾燥物含有量、好ましくは１０％〜１２％の乾燥物含有量に調節される。
【００８１】
本発明による方法の第２の工程は、得られたバイオマスを例えばアルカラーゼといった中性もしくは塩基性プロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼ酵素を用いて処理する工程であって、これにより、前記酵素処理によって生成されるエマルジョンの形成を防止しながら前記微細藻類の細胞壁を破砕する工程を含む。
【００８２】
細胞壁のこの酵素的溶解工程に先だって１２％乾燥物含有量を有するバイオマスが、溶解性酵素の作用を促進する均質な混合が可能でありながら、酵素処理によって生成されることとなる細胞ライセートの乳化が限定されるよう、プロペラ攪拌機（低せん断）および阻流板（発生する効果を乱すため）を備える反応器に入れられる。
【００８３】
温度は５０℃超、好ましくはおよそ６０℃の温度に調節され、および、７超、好ましくはおよそ８のｐＨとされる。本出願において、「およそ」という用語は、前記値の±１０％、好ましくは前記値の±５％で示される値を意味する。当然ながら、正確な値も包含される。例えば、およそ１００とは、９０〜１１０、好ましくは９５〜１０５を意味する。
【００８４】
これらの条件は、乾燥重量基準で０．４％〜１％、好ましくは乾燥重量基準で１％の濃度で用いられるアルカラーゼ酵素（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社によって市販されているもの）の活性にとって最適である。
【００８５】
溶解の期間は２〜８時間、好ましくは４時間である。
【００８６】
溶解の終了時に、本出願人は、５％（ｖ／ｖ）超、好ましくはおよそ１０％（ｖ／ｖ）でエタノールを反応混合物（水中油型エマルジョン形態）に添加し、さらに１５分間攪拌することを推奨する。
【００８７】
エタノールは、エマルジョン脱安定化剤として微量な割合で系に添加される。
【００８８】
本発明による方法の第３の工程は、油を水性相から分離するために、得られる反応混合物を遠心分離する工程を含む。
【００８９】
前段の工程の終了時に得られるエタノール−脱安定化エマルジョンが遠心分離にかけられる。
【００９０】
以下の３つの相が得られる。
−  軽質上方相（油）
−  主体となる水性中間相（水＋水溶性物質）
−  下方相（細胞片ペレット）
【００９１】
これらの３つの相の分離はＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ社によって販売されているＣｌａｒａ  ２０などの濃縮器モードの三層出力分離デバイスで実施され、これにより、水性相および細胞片から抽出された軽質上方相（油）の回収が可能となる。
【００９２】
水性相に関しては、分離器の重質相の排出を介して抽出される。固体相は、自己洗浄を介して抽出される。
【００９３】
本発明による方法の工程２の終了時に得られる細胞ライセートは、７０〜９０℃、特に７０〜８０℃および好ましくは８０℃の温度に加熱されることが可能であり、次いで、容積型ポンプ（ここで、乳化をさらに限定するため）を用いて供給される。好ましくは、そのｐＨは、８〜１２の値、好ましくは１０の値とされることが可能である。
【００９４】
遠心力は、４０００ｇ超、好ましくは６０００〜１００００ｇである。
【００９５】
非乳化軽質相が単パスで得られることが好ましい。
【００９６】
本発明による方法の第４の工程は、最後に、スクアレン富化上方油相を回収する工程を含む。
【００９７】
本発明は、例示であると共に非限定的であることが意図される以下の実施例によってより明白に理解されるであろう。
【実施例】
【００９８】
実施例１
ここでは、実際の培養／産生フェーズに先だつ２回の連続した前培養フェーズで微細藻類の発酵を行った。
【００９９】
この実験に関して、ビタミンは第１の前培地に添加したが、第２の前培地および産生への添加は任意とした。
【０１００】
従って、前培養培地は、以下の表ＩおよびＩＩに記載の組成を有していた。
【０１０１】
【表１】
0005990575.tif 000002
【０１０２】
【表２】
0005990575.tif 000003
【０１０３】
一般に、Ｃｌｅｒｏｌ  ＦＢＡ３１０７消泡剤を１ｍｌ／ｌで用いた。任意により、５０ｍｇ／ｌのペニシリンＧナトリウム塩を用いて汚染細菌の増殖を防止した。ＫＨ２ＰＯ４で、グルコースを残りの培地とは別に滅菌し、これにより、沈殿物（マグネシウム−アンモニウム−リン酸）の形成を防止した。ビタミン混合物および微量元素を滅菌ろ過の後に添加した。培養／産生培地の組成が以下の表ＩＩＩにより記載されている。
【０１０４】
【表３】
0005990575.tif 000004
【０１０５】
ビタミン混合物および微量元素の組成が以下の表ＩＶおよびＶに記載されている：
【０１０６】
【表４】
0005990575.tif 000005
【０１０７】
【表５】
0005990575.tif 000006
【０１０８】
発酵の実施
第１の前培養は、Ｃｏｇｎｉｓ  ＧｍｂＨ  Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ社製のＣｌｅａｒｏｌ  ＦＢＡ  ３１０７消泡剤を滴下した５００ｍｌバッフル付エルレンマイヤーフラスコで実施した。
【０１０９】
その構成成分を完全に溶解させた後に培地をろ過し、任意により、ペニシリンＧナトリウム塩を０．２５ｍｇ／ｌの割合で追加した。
【０１１０】
ペトリ皿中で培養した微細藻類のコロニーを採ることにより接種を行った（１つの１０μｌループの割合で）。
【０１１１】
インキュベーションを、２８℃の温度で、１００ｒｐｍで振盪しながら（オービタルシェーカで）２４〜３６時間行った。
【０１１２】
バイオマスは沈殿する（または、壁に付着する）ため、エルレンマイヤーフラスコをよく振盪した後に３〜５ｍｌのサンプルを採取するよう注意した。
【０１１３】
第２の前培養に対しては、管を取り付けた２リットルのバッフル付エルレンマイヤーフラスコを用いた。
【０１１４】
１滴の消泡剤およびイースト菌抽出物を１００ｍｌの水に添加した。
【０１１５】
培地の構成成分のすべてを３００ｍｌの脱イオン水中に溶解させた後にろ過した。任意により、ペニシリンＧナトリウム塩を添加すること、および、その滅菌に先だって、事前にエルレンマイヤーフラスコに１滴の消泡剤を添加することが可能であった。
【０１１６】
次いで、接種を３〜５ｍｌの第１の前培養物で行った。
【０１１７】
インキュベーションを、２８℃で、さらに２４〜３６時間、１００ｒｐｍで振盪しながら行った。
【０１１８】
実際の培養は、２０ｌ反応器中で以下の方法により行った：
−  反応器中の培地の一部、および、沈殿物の形成が防止されるよう別個に他の部分を滅菌し、
−  第２の前培養の終了時に産生されたバイオマスを、培地の０．５％ｖ／ｖの割合で用いて接種を行い、
−  培養を３０℃で維持し、
−  酸素移動速度を３５〜４０ｍｍｏｌ／ｌ／ｈで固定し、
−  ０．２〜０．３ＶＶＭでエアレーションし、
−  初期ｐＨ＞５．５とし、
−  １５〜７０ｇ／ｌのグルコース濃度が維持されるよう、濃度が＞２０％となったらすぐにグルコースを供給した。
【０１１９】
以下の表ＶＩに、本出願人のシゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）で得られた結果が記載されている。
【０１２０】
【表６】
0005990575.tif 000007
【０１２１】
シゾキトリウム属の一種（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．）バイオマスにおけるスクアレンの定量化方法
バイオマスのビーズによる破壊およびクロロホルム／メタノールでの冷抽出後に、分析を２５℃でプロトンＮＭＲにより実施した。定量化は、以下に記載のとおり内標準により実施した。
【０１２２】
スペクトルを、４００ＭＨｚで操作されるＡｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ４００分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｐｉｎ）で得た。
【０１２３】
バイオマスの破壊：およそ２００ｍｇの新鮮なバイオマスを正確に計量する。およそ１〜１．５ｃｍのガラスビーズおよび０．１ｍｌのメタノールを加える。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより少なくとも５分間撹拌する。
【０１２４】
冷抽出：およそ２ｍｇのトリフェニルリン酸（ＴＰＰ）、０．９ｍｌのメタノールおよび２ｍｌのクロロホルムを添加する。チューブを気密封止し、ボルテックス（Ｖｏｒｔｅｘ）ミキサにより１分間撹拌する。冷蔵庫に入れる。沈殿させた後（最低で１時間）、透明な上方相を注意深く回収し、これをガラスジャーに移し、周囲温度で、窒素流下に乾燥するまで蒸発させる。乾燥した抽出物を０．５ｍｌのＣＤＣｌ３および０．１ｍｌのＣＤ３ＯＤに溶解させ、これをＮＭＲ管に移す。
【０１２５】
スペクトルの記録：機器を適切に設定した後、溶剤抑制を行わず、回転させず、少なくとも１５秒間の緩和時間で取得を行う。スペクトル窓は、７．２５ｐｐｍのクロロホルムピークで較正されたスペクトルで少なくとも−１〜９ｐｐｍの間でなければならない。マニュアルモードにおけるフーリエ変換、位相補正およびベースラインの減算（指数関数的増幅を伴わない、ＬＢ＝ＧＢ＝０）後にスペクトルを用いる。
【０１２６】
シグナルの使用：７．０５〜７．１５ｐｐｍのクロロホルムシグナルを含有しないＴＰＰ未解像ピークを値１００とする（９つのＴＰＰプロトンで計数）。１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積を積分する（６つのプロトンでの一重項の計数）。
【０１２７】
計算および結果の表記：結果は、粗重量割合として表記した。
【数１】
0005990575.tif 000008
ここで、
Ａｓ：１．５５ｐｐｍでのスクアレンシグナルの面積
ＰＴＰＰ：積分したＴＰＰ未解像ピークのプロトンの数：９
ＷＴＰＰ：計量したＴＰＰの重量（グラム）
ＭＴＰＰ：モル質量（グラム／ＴＰＰ１モル）（ＭＴＰＰ＝３２６ｇ／ｍｏｌ）
ＭＳ：モル質量（グラム／スクアレン１モル）（ＭＳ＝４１０ｇ／ｍｏｌ）
ＰＥ：新鮮なバイオマスの重量（グラム）
【０１２８】
実施例２：本発明によるスクアレンの抽出
実施例１の終了時に得られたバイオマスは発酵の終了時に５４ｇ／ｌの濃度であった。
【０１２９】
発酵の終了時に得られたスクアレン滴定量は４．４ｇ／ｌであった。
【０１３０】
発酵槽から抽出したバイオマスを洗浄して、連続する２回の遠心分離による濃縮（５０００ｇで５分間）およびバイオマスの希釈（１／３Ｖペレット／Ｖ水の割合）を介して介在性可溶物を除去する。
【０１３１】
総粗乾燥物含有量分の乾燥細胞濃度は９５％である。
【０１３２】
次いで、乾燥物含有量は蒸留水で１２％に調節される。
【０１３３】
洗浄されたバイオマスを、プロペラ攪拌機および阻流板を備える２ｌ発酵槽タイプのＬａｂｏ反応器（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社によって販売されているものなど）において撹拌する。
【０１３４】
この系によって、溶解性酵素の作用に重要である良好な混合を可能としながら、生成される細胞ライセートの乳化を限定することが可能となる。
【０１３５】
温度は６０℃に調節され、および、ｐＨは水酸化ナトリウムによりおよそ８で調整される。
【０１３６】
これらの条件は、乾燥重量基準で１％の量で添加されるアルカラーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の活性に最適である。
【０１３７】
溶解の期間は４時間に設定される。
【０１３８】
溶解の終了時に、１０％のエタノール（Ｖエタノール／Ｖライセート）が反応混合物（水中油型エマルジョン）に添加され、さらに１５分間攪拌が続けられる。
【０１３９】
温度が再度８０℃に昇温され、その後、３層出力濃縮器モードに構成されたＡｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｃｌａｒａ  ２０遠心分離モジュールで遠心分離が実施される。
【０１４０】
この構成は、固体／液体／液体タイプの三相混合物の分離に特に十分に好適である。
【０１４１】
９６００ｒｐｍでの回転により、およそ１００００ｇに達することが可能となる。
【０１４２】
細胞ライセートは、１００〜４００ｌ／ｈの流速で容積型ポンプを用いて供給される。
【０１４３】
重質相と軽質相との間の界面は、重質相出力背圧を調節することによりシフトされる。
【０１４４】
自己洗浄の頻度は、２〜１５分間の頻度に調節される。
【０１４５】
原油は、このようにして８５％超の収率で回収され、それ故、産生されたスクアレンの実質的にすべてを含有している。
【０１４６】
比較例３：ヘキサンでの従来の方法によるスクアレンの抽出の比較例
実施例２における記載と同様に：
−  実施例１の終了時に得たバイオマスは、発酵の終了時に５４ｇ／ｌの濃度であった。
【０１４７】
−  発酵の終了時に得たスクアレン滴定量は４．４ｇ／ｌであった。
【０１４８】
発酵槽から抽出したバイオマスをまた、遠心分離により１２０ｇ／ｌに濃縮する。
【０１４９】
バイオマスを５０ｌタンクの中で１５０ｒｐｍで攪拌し続け、６０℃に加熱する。
【０１５０】
次いで、ｐＨを４５％水酸化カリウムを用いて１０に調節した。
【０１５１】
アルカリ溶解を完了するために、これらの条件を６時間維持した。
【０１５２】
溶解の質を、光学顕微鏡で、および、サンプルの遠心分離（２分間、１００００ｇ）により監視した。
【０１５３】
溶解の終了時に、１０リットルのエタノール（１体積のエタノール／ライセート体積）を４５℃に維持したタンクに添加し、１０分間撹拌した。
【０１５４】
次いで、１０リットルのヘキサンをタンクに添加して３０分間攪拌し続けた。
【０１５５】
次いで、軽質画分（ヘキサン＋油）を分離するために混合物を遠心分離し、これを１ｍ３タンクに保管した。
【０１５６】
重質（水性）相を再び１０リットルのヘキサンの存在下に入れて、抽出収率を高めるために、既述のものと同一のスキームに従って２回目の抽出とした。
【０１５７】
ロータリーエバポレータにおいてヘキサンの蒸発を行うために２つの有機画分を組み合わせた。
【０１５８】
抽出した油のヘキサン残渣をワイパー付き薄膜式エバポレータにおける蒸発（８０℃；１ｍｂａｒ）により除去した。
【０１５９】
これにより原油を７０％の収率で回収した。
【０１６０】
この「従来の」抽出方法は、従って、本発明による方法よりもかなり効率に劣るものである。