(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水中で５００μｇ／０．１ｍｌから１５００μｇ／０．１ｍｌの濃度のメチルコバラミンと、補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物とを、浸透促進剤、および場合により防腐剤、粘膜付着剤、キレート剤、湿潤剤、抗酸化剤またはそれらの組合せとともに含み、
ｐＨが６から６．５であり、粘度が１から２００Ｃｐｓであり、
前記浸透促進剤が、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、テトラデシルマルトシド、ドデシルマルトシドまたはそれらの組合せであることを特徴とする、安定な鼻腔内水性組成物。
【請求項２】
水中で補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物の存在下または不在下で、５００μｇ／０．１ｍｌから１５００μｇ／０．１ｍｌの濃度のシアノコバラミンと、少なくとも１種の浸透促進剤と、場合により防腐剤、粘膜付着剤、キレート剤、湿潤剤、抗酸化剤またはそれらの組合せとを含み、
ｐＨが４から６であり、粘度が１から２００Ｃｐｓであり、
前記浸透促進剤が、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、テトラデシルマルトシド、ドデシルマルトシドまたはそれらの組合せであることを特徴とする、安定な鼻腔内水性組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記補助溶媒／可溶化剤が、グリコフロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、またはそれらの混合物から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記補助溶媒／可溶化剤が１から３５％ｗ／ｖの範囲内にあることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記浸透促進剤またはそれらの組合せの量が組成物の２．５％ｗ／ｖ以下であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記粘膜付着剤が、セルロース誘導体；カルボポールを含むポリ（アクリル酸）ポリマ；ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（ビニルアルコール）ポリマを含む合成ポリマ、またはトラガカント、アルギン酸ナトリウム、カラヤガム、グアーガム、キサンタンガム、レクチン、可溶デンプン、ゼラチン、ペクチンおよびキトサンを含む天然ポリマまたは任意のそれらの組合せから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記粘膜付着剤が組成物の５重量％以下であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記防腐剤が、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシルアニソール、ブチル化ヒドロキシルトルエン、クロロクレゾール、またはイソプロピルアルコールまたはそれらの組合せから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記防腐剤が組成物の４重量％以下であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記湿潤剤が、グリセリン、乳酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール、ブチレングリコールから選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の安定な鼻腔内水性組成物であって、前記湿潤剤が組成物の５重量％であることを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチルコバラミン、シアノコバラミンおよびヒドロキソコバラミンなどのビタミンＢ１２誘導体クラスの鼻腔内用組成物およびそれを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＢ１２不足は、人々の間で非常に一般的である。米国および英国における大規模な調査により、６０歳以上の人たちの約６％がビタミンＢ１２不足であることが明らかになった。そのうえ、インドのような開発途上国においては、この不足はさらに一般的で、人生の初期から始まって一生を通じて続く。Ｐｕｎｅ（インド）における４４１名の中年男性についての調査では、６７％の男性のビタミンＢ１２濃度が低い（＜１５０ｐｍｏｌ／Ｌ）ことが明らかになった。都市部の中流階級のうち、８１％が低ビタミンＢ１２濃度であり、菜食主義者では、ビタミンＢ１２濃度が低いリスクが４．４倍も高かった。
【０００３】
Ｂ１２不足の主要な原因としては、内因子の不足の他に、腸管因子の不足（例えば吸収不良）、稀な遺伝的障害、および不適切な摂取が挙げられる。それ故、非経口的、経口などの種々の経路を通るシアノコバラミン、ヒドロキソコバラミンまたはメチルコバラミンにより補完することによってＢ１２の不足を克服することが必要である。
【０００４】
経口療法は、全ての患者に適するとは限らず、例えば、内因子が不足した患者、胃萎縮と関連する状態、魚の条虫の寄生その他には適しない。そのような患者にとっては、鼻内投与がより適当であろう。鼻腔内経路による薬物送達も、全身的循環への有効な薬物送達を提供し、その結果、よりよい治療有効性が得られる。鼻腔内経路を通る薬物の全身送達を改善するためには、薬物を可溶化することが必須であることも知られている。一般的に高溶解性の薬物が、そのような療法のための良い候補と考えられている。
【０００５】
メチルコバラミンは、コリン環をベースとし、分子式Ｃ６３Ｈ９１ＣｏＮ１３Ｏ１４Ｐを有する。ビタミンＢ１２変形体のクラスに属する化合物にはシアノコバラミンおよびヒドロキシコバラミンも含まれる。メチルコバラミンは、シアノコバラミンまたはヒドロキシコバラミンと比較して水に対する溶解度がはるかに低い。水に対しては、ヒドロキシコバラミンが最高の溶解度を有するのに対して、メチルコバラミンは最低の溶解度を示す。
【０００６】
メチルコバラミンは、非常に分解しやすく、それ故、ビタミンＢ１２の全ての誘導体中で最も不安定であることも知られている。メチルコバラミンの急速な分解を考慮して、貯蔵中の分解に基づく損失を補うために、メチルコバラミンの液剤中（例えば注射液）では５０％から１００％の範囲で余分に加えるのが通常の慣行である。そのような高濃度の過剰は、分解生成物の寿命が長くなるにつれて非常に多量の分解生成物を生ずるので望ましくない。
【０００７】
シアノコバラミンを、週に少なくとも５００μｇ／０．１ｍｌの用量で、鼻腔内投与により使用することが知られている。ビタミンＢ１２不足およびＡＤＨＤのような疾患の治療ためにメチルコバラミンを使用することも知られている。しかしながら、それは他のコバラミン誘導体より好ましくなく、低溶解度および高不安定性というその本質的問題のために市販の鼻腔内製剤では使用されない。
【０００８】
米国特許第４，７２４，２３１号には、５００μｇ／０．１ｍｌの濃度で存在する水中に溶解したシアノコバラミンの鼻腔内製剤が記載されている。さらに、前記特許で開示された組成物は、ゲル剤、クリーム剤、軟膏の形態であり、２，５００〜１０，０００ＣＰＳの範囲内の高粘度を有する。本発明者らは、組成物の鼻粘膜での滞留時間を増すために高い粘度範囲を選択した。そのような高粘稠性ゲルは、正確な投薬によって投与することが難しく、治療期間を通じて患者に不快感を生じさせる。
【０００９】
米国特許出願第２００９００１２０３９号には、注意欠陥障害の治療のために鼻腔内メチルコバラミン製剤を使用する方法が開示されている。前記特許出願には、メチルコバラミン（フォリック酸添加または無添加）および任意選択の薬学的添加剤、例えば、水、食塩水、デキストロース水溶液、グリセリン、エタノールなどを溶解、分散、混合または混入して、溶液または懸濁液を形成することにより調製することができる鼻内投与用組成物が開示されている。鼻内投与されるべき組成物は、必要であれば、少量の無毒性の補助物質、例えば、加湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、ソルビン酸カリウム、グリセリン、レシチン、その他を含んでいてもよいと言及されている。
【００１０】
米国特許第７，２２９，６３６号には、４から６の範囲内のｐＨを有する鼻腔内送達用のシアノコバラミンの低粘度の水性製剤が開示されており、ｐＨは４．５から５．５が最も好ましい例示範囲である。該特許は、市販の鼻腔内ゲル製剤（ＮＡＳＣＯＢＡＬ）の不快な粘稠度の問題と取り組み、許容される低粘度のシアノコバラミンの鼻腔内スプレ製剤を提供する。シアノコバラミンは、そのより高い安定性および製剤開発の容易さが理由でメチルコバラミンより好ましいとされている。
【００１１】
先行技術は、シアノコバラミン鼻腔内製剤およびメチルコバラミンの使用への若干の取り組みを開示しているが、メチルコバラミンの低溶解度、不安定性に関する問題、およびそれ故、最適化された治療有効性のためのバイオアベイラビリティに対するそれらの効果は未だ検討されていない。さらに、有効な鼻腔内送達のための製剤の粘度およびｐＨの最適化は、依然として課題であり、したがって、メチルコバラミンの治療的に有効な市販製剤は、市場で入手可能ではない。さらに、ビタミンＢ１２誘導体ファミリーの製剤のバイオアベイラビリティを増強して改良された治療効果を達成する製剤を提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第４，７２４，２３１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００９／００１２０３９号明細書
【特許文献３】米国特許第７，２２９，６３６号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の主要な目的は、メチルコバラミン、シアノコバラミンおよびヒドロキソコバラミンなどのビタミンＢ１２誘導体のクラスの鼻腔内組成物およびそれらの調製方法を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、目標を定めた浸透促進剤の使用により、メチルコバラミンのバイオアベイラビリティが増大して、改善された治療効果を達成する鼻腔内適用のための安定な高濃度製剤を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、先行技術における製剤より有意に高いバイオアベイラビリティを有する、ビタミンＢ１２の他の誘導体、例えばシアノコバラミンの高濃度製剤を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、鼻腔内投与における薬物のバイオアベイラビリティを最大化するために、浸透促進剤を添加するかまたは添加せずに、適当な補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物を使用することにより、安定で高濃度の明澄透明のメチルコバラミンの水溶液を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、浸透促進剤を添加するかまたは添加せずに、適当な補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物を使用することによりメチルコバラミンの安定で高濃度の明澄透明の水溶液を提供することであって、補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物の量は、鼻腔内製剤の粘度を大きく上昇させずに製剤の溶解度性が増大するような様式で選択される。
【００１８】
本発明の他の目的は、前記の安定で高濃度の明澄透明のメチルコバラミン溶液を、約５００μｇ／０．１ｍｌから約１５００μｇ／０．１ｍｌのメチルコバラミン濃度で提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、メチルコバラミンの鼻腔内薬物を全身に送達するのに適した約５．０から約７．０の間の範囲内のｐＨを有する、前記の安定な高濃度の明澄透明のメチルコバラミン水溶液を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、鼻腔内薬物を全身に送達するのに適した約１から２００ＣＰＳの範囲内の粘度を有する前記の安定な高濃度の明澄透明のビタミンＢ１２誘導体の水溶液を提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、場合により適量の粘膜付着剤またはそれらの混合物を有する、全身に鼻腔内薬物を送達するのに適した、前記の安定な高濃度の明澄透明のメチルコバラミン水溶液を提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、鼻腔内薬物を全身に送達するのに適した、胆汁酸塩、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アルキルマルトシドまたはそれらの混合物などの浸透促進剤を添加したかまたは添加しない、前記の安定な高濃度の明澄透明のメチルコバラミン水溶液を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、適量のＥＤＴＡ二ナトリウムなどのキレート剤と組み合わせた、鼻腔内薬物を全身に送達するのに適した、前記の安定な高濃度の明澄透明のメチルコバラミン水溶液を提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、適当な防腐剤および抗酸化剤を組み合わせた、前記の安定な高濃度の明澄透明のメチルコバラミン水溶液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、溶解した形態で薬物濃度および製剤の粘度が最適化され、治療有効性のための所望のバイオアベイラビリティを達成する、メチルコバラミンの新規で安定な鼻腔内製剤を提供する。本発明は、バイオアベイラビリティが先行技術の製剤より有意に高いビタミンＢ１２の他の誘導体、すなわちシアノコバラミンの新規製剤も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】用量１５００μｇについてのメコバラミン平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）対時間を示す図である。
【図２】５００μｇに調節した用量についてのメコバラミンの平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）対時間を示す図である。
【図３】メチルコバラミンを測定したメコバラミン鼻スプレの平均グラフである。
【図４】合計Ｂ１２を測定したメコバラミン鼻スプレの平均グラフである。
【図５】合計Ｂ１２を測定したメコバラミン鼻スプレの平均グラフである。
【図６】合計ビタミンＢ１２を測定したメコバラミン鼻スプレの平均グラフである。
【図７】メチルコバラミンを測定したメコバラミン鼻スプレの平均グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、胆汁酸塩などの適当な浸透促進剤または粘膜付着剤または抗酸化剤またはキレート剤、例えばエデト酸ナトリウムなど、または湿潤剤または抗酸化剤または防腐剤またはそれらの組合せを場合により添加した、適当な補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物および緩衝系を用いることにより水に溶解したメチルコバラミンなどのビタミンＢ１２誘導体を含む鼻腔内送達のための製剤を提供する。本発明は、ここで開示した製剤を調製する方法および投与する方法も提供する。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明は、適当な補助溶媒／可溶化剤またはそれらの混合物およびバイオアベイラビリティを増大させるための適当な浸透促進剤を含む緩衝系を用いることによりまたは用いずに水に溶解したシアノコバラミンおよびヒドロキソコバラミンを含む、鼻腔内送達のための組成物を提供する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、約５００μｇ／０．１ｍｌから１５００μｇ／０．１ｍｌの濃度で有効量のビタミンＢ１２誘導体を含む組成物を提供する。
【００３０】
他の実施形態において、本発明は、適当な補助溶媒／可溶化剤を用いることにより水に溶解したメチルコバラミンを、１種以上の追加の薬学的に許容し得る添加剤、例えば、緩衝系もしくは防腐剤もしくは浸透促進剤またはそれらの組合せとともに含む新規薬物送達組成物を提供する。
【００３１】
さらに他の実施形態において、本発明は、適当な補助溶媒／可溶化剤を用いることにより水に溶解したメチルコバラミンを、１種以上の他の薬学的に許容し得る添加剤、例えば、緩衝系もしくは防腐剤もしくは胆汁酸塩などの浸透促進剤または任意のそれらの組合せ、あるいは粘膜付着剤もしくはエデト酸ナトリウムもしくは抗酸化剤もしくは湿潤剤または任意のそれらの組合せとともに含む新規薬物送達組成物を提供する。
【００３２】
メチルコバラミンは、シアノコバラミンまたはヒドロオキソコバラミンと比較して水に対する溶解度がはるかに低い。最適な治療の恩恵を鼻内経路により提供するために、溶液が０．１ｍｌ当たり約５００μｇから約１５００μｇの範囲内の濃度を有するようにメチルコバラミンを可溶化することが必要である。本発明者らは、驚くべきことに、補助溶媒／可溶化剤すなわちグリコフロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物を個々にまたは水と組み合わせて使用する溶媒系を上手に調合することによって（補助溶媒／可溶化剤の量は１から３５％ｗ／ｖである）、粘度が制御された溶液を生成する所望の濃度範囲で可溶化が達成され得ることを見出した。そのうえ、製剤は、それらの粘度およびｐＨに関して最適化され、薬物の鼻腔内吸収の最大化が確実になり、有効な治療効果およびバイオアベイラビリティが、患者コンプライアンスの改善とともに達成された。
【００３３】
溶媒系に加えて、製剤は、グリセリンなどの湿潤剤、および／または防腐剤および／または抗酸化剤／または浸透促進剤および／または粘膜付着剤を含む添加剤の群から選択される薬学的に許容し得る他の添加剤を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
本発明の防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ベンジルアルコール、ブロノポール、ブチル化ヒドロキシルアニソール、ブチル化ヒドロキシルトルエン、クロロクレゾール、またはイソプロピルアルコールまたはそれらの組合せから選択される。
【００３５】
本発明の浸透促進剤は、胆汁酸塩、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アルキルマルトシド、ＨＬＢ値８〜１４を有する非イオン性、アニオン性または両性の界面活性剤またはそれらの組合せから選択することができる。そのような浸透促進剤の例は、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、ドデシルマルトシド、トリデシルマルトシドまたはテトラデシルマルトシド、または任意のそれらの組合せであるが、これらに限定されない。浸透促進剤は、組成物の２．５重量％以下で使用される。
【００３６】
粘膜付着剤は、セルロース誘導体（メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシ−エチルセルロース、ヒドロキシルプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース）；ポリ（アクリル酸）ポリマ（カルボマーまたはカルボポール、ポリカルボフィル）、例えば、カルボポール９３４；ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（ビニルアルコール）などの合成ポリマから選択される。粘膜付着剤は、さらに、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カラヤガム、グアーガム、キサンタンガム、レクチン、可溶デンプン、ゼラチン、ペクチンおよびキトサンなどの天然ポリマから選択されて、組成物の５重量％以下で使用される。
【００３７】
湿潤剤は、グリセリン、乳酸ナトリウム、ソルビトール、キシリトール、ブチレングリコールから選択される。
【００３８】
本発明者らは、驚くべきことに、成分、特に溶媒系、の賢明な組合せにより約１から２００ＣＰＳの所望の粘度を達成し、さらにメチルコバラミンの大きく増強された経鼻吸収を提供することが可能であることを見出した。製剤は、所定の容量を送達する多回用量容器中の溶剤、滴剤またはスプレ剤パックの形態で提供される。本発明の製剤のより低い粘度にも拘わらず、薬物の経鼻吸収が弱まっていないことに注目することが大切である。先行技術は、製剤が鼻粘膜上における所望の滞留時間を確保するために高粘度を有しなければならないと教示している（米国特許第４７２４２３１号では２５００から１００００ＣＰＳの粘度が推奨されている）。本発明は、先行技術の教示からの明確な逸脱であり、さらに、粘度、スプレ性、吸収および増強されたバイオアベイラビリティ間の完全なバランスを達成する。
【００３９】
本発明の製剤は、製剤の安定性をさらに向上させるために使用される追加の薬学的に許容し得る添加剤を場合により含む。そのような添加剤の例は、鼻粘膜を刺激しないＥＤＴＡナトリウムなどのキレート剤および／または抗酸化剤であるが、これらに限定されない。そのような抗酸化剤の例はアスコルビン酸であるが、これに限定されない。
【００４０】
本明細書において開示するメチルコバラミン鼻内溶液の製剤は望ましい安定性を示し、それにより従来より低い過剰が可能になる。
【００４１】
単に可溶化を達成するだけでは、メチルコバラミンなどの薬物の最大吸収を確保するために十分な条件ではない。製品寿命に関系する製剤の粘度、薬物の安定性などのパラメータも、治療有効性のために必要な経鼻吸収およびバイオアベイラビリティを確保するために最適化される必要がある。
【実施例】
【００４２】
約３．７５から７の範囲内のｐＨを有する種々の溶液を調製した。クエン酸緩衝液などの適当な緩衝系を、所望のｐＨを達成するために使用することができる。次にメチルコバラミンの鼻腔内吸収に対するｐＨの影響を決定することが必要であった。
【００４３】
メチルコバラミンの鼻腔内吸収に対するｐＨの影響を評価するために、メチルコバラミン溶液を調製して、バイオアベイラビリティの検討をｐＨ３．７５、５、および６．２５を示す製剤について実施した。本発明者らは、驚くべきことに、メチルコバラミンの所望の鼻腔内吸収を達成するために、６を超えるｐＨが最も適当であることを見出した。結果は、下の表１および２に示す。
【００４４】
【表１】
0005843873.tif 000002
【００４５】
結果：ベースラインで補正した、１５００μｇの用量および５００μｇに調節した用量を用いたメコバラミンに対するＡＵＣ０−ｔ（ｐｇ．時間／ｍｌ）を下に示す。
【００４６】
【表２】
0005843873.tif 000003
【００４７】
＜組成物の調製方法＞
調製は全てナトリウム蒸気ランプの下で窒素を流しながら実施した。溶解した酸素濃度を可能な限り低く、好ましくはおよそ１から１．５ｐｐｍに保った。この方法は、
ｉ）１バッチについてグリコフロールを水の８０％ｖ／ｖまで加えるステップと、
ｉｉ）塩化ベンザルコニウムおよびグリセリンを撹拌しながら溶解するステップと、
ｉｉｉ）クエン酸緩衝液を使用して溶液を緩衝するステップと、
ｉｖ）メチルコバラミンを溶解するまで撹拌して加えるステップと、
ｖ）ｐＨを酸／アルカリの添加により必要な値に調節するステップと、
ｖｉ）鼻スプレ溶液０．１ｍｌ当たり５００μｇの所望濃度を得るように溶液の容量を調整するステップと、
を含む。
【００４８】
本発明の組成物は、典型的には、
薬物５００μｇ／０．１ｍｌから１５００μｇ／０．１ｍｌ、
溶媒（合計）１〜３５％、
保湿剤０〜５％、
粘膜付着剤５％以下、
浸透促進剤２．５％以下、
防腐剤４％以下
を含む。明細書でさらに説明するように、組成物は、使用される薬物に応じてｐＨを必要な値に調節するために緩衝成分をさらに含有する。
【００４９】
［製剤のバイオアベイラビリティに関する検討］
上記のようにして調製された５００μｇ／０．１ｍＬのメチルコバラミンを含有する鼻スプレのバイオアベイラビリティの検討を、絶食状態の健常なヒト被験者で実施した。試験計画は、６名の健常ヒト成人被験者における絶食状態で、非盲検、無作為化、３時期、３治療、３シーケンス、単回投与、３元クロスオーバー比較のバイオアベイラビリティ検討であった。
【００５０】
方法：試験は、無作為化した試験における６名の健常ヒト成人被験者の絶食状態で実施して、薬物動態学的パラメータ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆ．を評価することにより、３種のテスト製品の比較バイオアベイラビリティを決定した。全ての被験者が登録に先立って試験に参加する書面によるインフォームドコンセントを提出し、試験中いつでも離脱することが自由であった。試験は当施設の倫理委員会により承認され、適正臨床基準およびヘルシンキ宣言に従って実施した。
【００５１】
試験製品：（表１に開示した処方）
テスト製品（Ａ）：５００μｇ／０．１ｍｌのメコバラミン鼻スプレ
テスト製品（Ｂ）：５００μｇ／０．１ｍｌのメコバラミン鼻スプレ
テスト製品（Ｃ）：５００μｇ／０．１ｍｌのメコバラミン鼻スプレ
【００５２】
予備試験評価：被験者は、薬物分析のために、人口統計データ、病歴、身体検査、１２誘導心電図、血液像、生化学検査、血液学検査、尿検査および尿スクリーニング検査についてスクリーニングした。
【００５３】
（薬物投与）
被験者は、製剤無作為化スケジュールに従って、各期間の間少なくとも７日の休薬期間を設けて、クロスオーバー方式で各治療（メコバラミン鼻スプレ）を受けた。
【００５４】
夜間１０時間絶食後、被験者は、予定された用量のテスト製剤（Ａ）またはテスト製剤（Ｂ）またはテスト製剤（Ｃ）を投与され、それらは鼻内経路で、医療関係者の監督下で投与された。
【００５５】
（鼻スプレのプライミング（活性化））
初回用量を投与する前に、ポンプをプライミングした。ポンプをプラミングするために、ボトルの底に親指を当ててノズルを第一指と第二指の間に置いた。スプレの最初の出現までユニットをしっかり且つ速やかにポンピングした。ポンプをさらに２回プライミングして、鼻スプレはいつでも使える状態にした。
【００５６】
（投与手順）
被験者に、鼻スプレを投与しやすいように頭を少し後ろに傾けるように頼んだ。次に、外鼻孔中に深く３回噴霧した。用量が漏れ出さないように、被験者に同じ姿勢で２分間座っているように頼んだ。
【００５７】
被験者の試験中のモニタリング：身体検査、生命徴候モニタリングおよび健康状態を、０．００時間（投薬前）、２．００、５．００、１２．００、２４．００および３６．００時間（投薬後）±３０分と、必要な時にモニタした。
【００５８】
試験後アセスメント：１２誘導心電図、血液像、生化学検査および尿検査を第ＩＩＩ期間の最後の血液試料採取後または被験者の試験中止／離脱時に行った。
【００５９】
収容：薬物投与の約１２時間前から薬物投与の３６時間後まで。
【００６０】
食事：被験者には、標準食を、各試験期間中投薬後４．００、８．００、１２．００、２５、２９および３３時間に提供した。
【００６１】
（試料収集）
血液試料の総数：１期間当たり２０。
【００６２】
試料採取時間：−１０．００、−０６．００、０．００時間（ベースラインとして適用前試料）、０．５０、０．７５、１．００、１．２５、１．５０、１．７５、２．００、２．５０、３．００、４．００、５．００、６．００、８．００、１２．００、１８．００、２４．００および３６．００時間（適用後）。血液試料は、琥珀色／アルミニウム箔被覆バキュテーナー中に収集した。
【００６３】
総血液損失：５．０ｍＬの血液試料を収集して０．１ｍＬを各試料収集前に廃棄し、それは３０６ｍｌに相当する。合計約３２６ｍＬ（試験臨床的実験室テスト前および後の２０ｍＬを含む）の血液を全期間中に各被験者から引き出した。
【００６４】
試料処理：血液試料を室温で１時間凝血するに任せてから４０００±３００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。血清を分離して、速やかに適当なサイズの、琥珀色のポリプロピレンスクリュ栓（試験コードおよび試料コードを予めラベルした）バイアルに２連で移した。全ての試料を−２０°Ｃ±５°Ｃに維持された深冷冷凍庫中で貯蔵した。
【００６５】
（薬物動態学的パラメータ）
初期パラメータ：Ｃｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆ
二次パラメータ：ｔ１／２、ｋｅ、Ｔｍａｘ
【００６６】
（分析方法）
メコバラミンの血清濃度は、予め検証した分析方法により測定した。
【００６７】
（統計的評価）
未変換および対数変換薬物動態学的パラメータＣｍａｘ、ＡＵＣ０−ｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆについて比較および比分析のためのＡＮＯＶＡ、２つの片側検定を実施した。全てのパラメータが同様な結論を示していたので、治療の恩恵に最も関連のあるパラメータであるＡＵＣ０−ｔ（ｐｇ．時間／ｍｌ）が、実例とされた製剤についての結果で提供される。
【００６８】
この試験は、１５００μｇのメチルコバラミン用量について実施した。統計分析は、１５００μｇの用量について行い、同様に５００μｇの調節された用量についても行った。１５００μｇの用量についての平均血漿濃度−時間プロファイルを図１に示し、５００μｇの単回投与の補正データについての平均血漿濃度−時間プロファイルを図２に示す。１５００μｇおよび５００μｇの用量のテスト製剤についての平均曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）を表２に挙げる。
【００６９】
結果：ベースライン補正したメコバラミン１５００μｇの用量および５００μｇの調節された用量についてのＡＵＣ０−ｔ（ｐｇ．時間／ｍｌ）を下に示す。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
３種の製剤の全てのバイオアベイラビリティ試験結果は、テストＡがメチルコバラミンの最大経鼻送達を提供することが見出されたことを示す。ｐＨを３．７５から６．２５に上げることによりメチルコバラミンのバイオアベイラビリティが劇的に増大することは注目に値する。１５００μｇの用量についてのグラフ、および５００μｇに調節した用量についてのグラフを図１および図２に示す。
【００７２】
驚くべきことに、メチルコバラミンの吸収に有利なｐＨ範囲は、５〜７であり、最も好ましいｐＨは５．５から７であり、ｐＨ６．２５が最高の吸収に最も適当であることが見出された。高いｐＨは鼻腔における病原性細菌の成長に有利なので、７を超えるｐＨ値は好ましくないことがわかる。
【００７３】
さらに驚くべきこととして、製剤が鼻内に送達されたときに、浸透促進剤の添加、例えば、胆汁酸塩、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ（ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート）、またはドデシルマルトシド、トリデシルマルトシドもしくはテトラデシルマルトシドなどのアルキルマルトシドまたは任意のそれらの組合せなどの添加が、メチルコバラミンの吸収およびバイオアベイラビリティに大きく影響することが見出された。
【００７４】
したがって、浸透促進剤なしのメチルコバラミンの製剤（テストＤ）を、２％浸透促進剤を添加したメチルコバラミンの製剤（テストＥ）と比較して、メチルコバラミンの鼻腔内吸収に対する浸透促進剤の効果を評価した。これらの製剤のｐＨは、６．２５＋０．２５に調節した。これらのテスト製剤の組成を下表に開示する。図３および図４も参照されたい。
【００７５】
【表４】
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【００７６】
【表５】
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【００７７】
結果は、驚くべきことに、メチルコバラミンの経鼻浸透が少量の浸透促進剤の存在で顕著に増大することを示す。このことは、合計ビタミンＢ１２の血漿濃度を測定した試験の結果によりさらに確認された。グリココール酸ナトリウムの高めの濃度が鼻への刺激を生じることが見出されたので、グリココール酸ナトリウムの濃度が、好ましくは、製剤の２．５ｗ／ｖ％以下であるように調節した。
【００７８】
グリココール酸ナトリウムの変化させた濃度で、すなわち２％ｗ／ｖ、１．５％ｗ／ｖ、および１％ｗ／ｖでテストＥと同様な製剤を調製して、３元生体内利用率等価性試験によりメチルコバラミンの経鼻吸収について評価した。合計ビタミンＢ１２濃度を示す試験結果を下に示す。
【００７９】
【表６】
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【００８０】
上の試験結果は、図５にも示すように、１％ｗ／ｖグリココール酸ナトリウムの組込みは、結果として、メチルコバラミン吸収が２％ｗ／ｖグリココール酸ナトリウムに比較して高いことを明確に示す。換言すれば、浸透促進剤の量が２％ｗ／ｖから１％ｗ／ｖに減少したときに、吸収は増加する。したがって、浸透促進剤の量を減少させると吸収が高くなる結果となる。
【００８１】
他の一組の実験を実施して、シアノコバラミンまたはヒドロキソコバラミンを含有する製剤中のグリココール酸ナトリウムなどの浸透促進剤の役割を厳密に評価した。
【００８２】
シアノコバラミンの鼻腔内吸収に対するグリココール酸ナトリウムの効果を評価するために、およびそれぞれの製剤により生ずるメチルコバラミン濃度を比較するために、３元生体内利用率等価性試験を実施した。生体内利用率等価性試験に供した製剤は、本発明に従ってグリココール酸ナトリウムを組込んで調製したシアノコバラミン製剤（テストＧ）、シアノコバラミンスプレの市販の鼻腔内製剤（Ｎａｓｃｏｂａｌ−ＵＳＡ）および本発明のメチルコバラミン製剤（テストＦ）を含んだ。テストＦおよびテストＧの処方を下表に開示する。
【００８３】
【表７】
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【００８４】
鼻腔内製剤についてメチルコバラミンおよび合計ビタミンＢ１２の血漿濃度を測定し、シアノコバラミンに優るメチルコバラミンの投与効果を厳密に評価した。Ｎａｓｃｏｂａｌ（登録商標）鼻スプレは、鼻粘膜に送達するためのスプレの形態にあるシアノコバラミンの溶液である。Ｎａｓｃｏｂａｌ鼻スプレの各ボトルは、純水中にクエン酸ナトリウム、クエン酸、グリセリンおよび塩化ベンザルコニウムを加えたシアノコバラミンの５００μｇ／０．１ｍｌ溶液２．３ｍｌを含んでいた。シアノコバラミンの市販の製剤（Ｎａｓｃｏｂａｌ）を測定して、次に、テストＦおよびＧの製剤を本発明に従って調製し、等量のメチルコバラミンおよびシアノコバラミンをそれぞれ組込み、２種の製剤のバイオアベイラビリティを正確に比較した。ＮａｓｃｏｂａｌのｐＨは５であることが見出され、それ故、本発明のシアノコバラミン製剤（テストＧ）のｐＨは約４．９６に調節した。生体内利用率等価性試験の結果を下に、および図６および図７にも示す。メチルコバラミン製剤のｐＨは６．２５±０．２５に調節した。
【００８５】
【表８】
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【００８６】
本発明により調節されたグリココール酸ナトリウムを含有するシアノコバラミン製剤が市販のシアノコバラミンスプレ（Ｎａｓｃｏｂａｌ）と比較して２倍を超える合計ビタミンＢ１２のバイオアベイラビリティを生じたことは最も驚くべきことである。そのうえ、本発明のメチルコバラミン製剤（テストＦ）の合計ビタミンＢ１２濃度は、Ｎａｓｃｏｂａｌと比較して著しく高かった。
【００８７】
本発明のメチルコバラミン製剤（テストＦ）が、他の２種のシアノコバラミン製剤と比較してメチルコバラミンの著しく高い濃度を生ずることも見出された。本発明によるメチルコバラミンの製剤のみがビタミンＢ１２の活性な補酵素であるメチルコバラミンの高い濃度を生じたことに注目することは当を得ている。
【００８８】
この結果は、少なくとも１種の浸透促進剤、場合により防腐剤、キレート剤、湿潤剤またはそれらの組合せとともにシアノコバラミンを含み、ｐＨが約４から約６および粘度が約１〜２００ＣＰＳの鼻腔内製剤が、提供する薬物の全身送達を大きく増大させて、その結果患者コンプライアンスまたは製剤の安定性を損なわずに治療の有効性を増強することを立証することは明白である。
【００８９】
本発明を以下の限定するものではない実施例により例証する。
【００９０】
【表９】
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【００９１】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は１．２８ＣＰＳであることが見出された。
【００９２】
【表１０】
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【００９３】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は２．３ＣＰＳであることが見出された。
【００９４】
【表１１】
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【００９５】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は１．５７ＣＰＳであることが見出された。
【００９６】
【表１２】
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【００９７】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は２．０ＣＰＳであることが見出された。
【００９８】
【表１３】
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【００９９】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は１．４３ＣＰＳであることが見出された。
【０１００】
【表１４】
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【０１０１】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は８ＣＰＳであることが見出された。
【０１０２】
【表１５】
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【０１０３】
製剤のｐＨは市販のシアノコバラミン製剤に従って４．５±０．５に調節した。製剤の粘度は１．６ＣＰＳであることが観察された。
【０１０４】
【表１６】
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【０１０５】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は１０ＣＰＳであることが観察された。
【０１０６】
【表１７】
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【０１０７】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は本発明による範囲内であることが観察された。
【０１０８】
【表１８】
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【０１０９】
製剤のｐＨは、６．２５±０．５に調節し、製剤の粘度は本発明による範囲内であることが観察された。
【０１１０】
カルボポール、ポリエチレングリコールの濃度を上げたときに、従来より実質的に高い粘度の組成物を調製することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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