(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、下記式（Ｉ）：
【化１】
0005841903.tif 000007
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド［（ｎ）−ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅｐｈｔｈａｌｉｄｅ］、またはその製薬上許容できる塩を含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物であり、下記（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方を満たす、肝線維症または肝硬変の治療のための薬剤；
（ａ）前記活性成分は、１日あたり、８０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の治療上有効な量で投与される、
（ｂ）前記（ｎ）−ブチリデンフタリドが唯一の活性成分である。
【請求項２】
前記肝線維症または肝硬変は、化学物質による閉塞（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、微生物による閉塞（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、物理的な閉塞（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、アルコールによる閉塞（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、ウィルスによる閉塞（ｖｉｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、または先天性胆道閉塞（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって引き起こされる、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
活性成分として、下記式（Ｉ）：
【化２】
0005841903.tif 000008
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド［（ｎ）−ｂｕｔｙｌｉｄｅｎｅｐｈｔｈａｌｉｄｅ］、またはその製薬上許容できる塩を含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物であり、下記（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方を満たす、プロトロンビン時間の減少または血清アルブミンレベルの増加を含む、肝機能の向上のための薬剤；
（ａ）前記活性成分は、１日あたり、８０〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の治療上有効な量で投与される、
（ｂ）前記（ｎ）−ブチリデンフタリドが唯一の活性成分である。
【請求項４】
前記活性成分は、植物から抽出、単離されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記植物は、トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
経口で、静脈内に、筋肉内に、皮下にまたは徐放形態で投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝障害の治療または肝機能の向上のための薬剤に関する。詳しくは、本発明は、肝線維症、肝硬変または肝炎等の肝障害を治療する際の、または肝機能が肝障害によって悪影響を受けた後に肝機能を回復および／または改善する際の、ｎ−ブチリデンフタリド（以下、「ｎ−ＢＰ」とも省略する）の新規な使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝線維症またはより重篤な形態である、肝硬変は、様々なウィルスによる、毒によるまたは代謝による損傷(insult)からの外因的な損傷(injury)に対する肝細胞の応答である。肝硬変は、肝機能の進行性変性(progressive degeneration)が肝移植により救済されない場合には、米国では毎年３５，０００人という多数の人が亡くなる原因となっている。組織学的には、肝硬変は、再生性肝細胞結節(regenerative hepatocellular nodule)を取り囲む、過剰な細胞外マトリックスの沈着(即ち、線維症)の特徴を有する。
【０００３】
肝機能の低下に加えて、これらの結節はまた肝細胞癌の形成の温床にもなっている。臨床的には、シリマリン(Silymarin)及びペントキシフィリン(Pentoxifylline)（トレンタール(Trental)）は、アルコール性肝硬変の患者の死亡率を有意に減少できる。しかしながら、肝線維症を軽減し、肝機能を向上することを示す曖昧な有効性があるのみである（非特許文献１）。したがって、肝線維症の進行を軽減し(attenuate)、肝線維症の抑制を誘導できる有効な薬剤、食品、または物質が重要である。
【０００４】
トウキ(Angelica sinensis)（「Dong Quai」としても知られている）は、更年期の症状等の、月経不順の治療に適応される（非特許文献２）。また、トウキ(Angelica sinensis)(Dong Quai)は、胃粘膜の損傷、肝損傷、心筋血流の低下、及び慢性の糸球体腎炎等の症状に対して広く使用されている（非特許文献３〜５）。さらに、トウキ(Angelica sinensis)(Dong Quai)は、米国では幾つかの婦人科疾患の処置に推奨されている（非特許文献６）。
【０００５】
（Ｅ）−リグスチリド(liguistilide)、（Ｚ）−リグスチリド、ｎ−ブチリデンフタリド(butylidenephthalide)、パルミチン酸、ｂ−シトステロール、及びフェルラ酸の、６種の主要な化合物が、トウキ(Angelica sinensis)から単離された。ｎ−ブチリデンフタリド（ｎ−ＢＰ；分子量、＿１８８．２２）及びリグスチリド(liguistilide)（Ｋ２；分子量、＿１９０．２３）は、特に豊富に存在する（非特許文献７）。この際、ｎ−ブチリデンフタリド（ｎ−ＢＰ）は、リグスチリドよりより優れた効能を示す。覚醒ラット(conscious rat)では、ｎ−ＢＰは、血圧または心拍数に影響を与えずに、狭心症症状を和らげる（非特許文献８〜９）。以前に、本発明者らは、トウキ(Angelica sinensis)のアセトン抽出物がインビトロで癌細胞の増殖を阻害することを報告した（非特許文献１０）。また、本発明者らは、次に得られたトウキ(Angelica sinensis)のクロロホルム抽出物がインビトロ及びインビボで脳腫瘍細胞を遮断する(antagonize)ことも報告した（非特許文献１１）。本発明者らはまた、インビトロでの神経芽細胞腫、肺癌、黒色腫、奇形腫、白血病、乳癌、及び肝細胞癌へのｎ−ＢＰの抗腫瘍効果、さらにはインビトロ及びインビボ双方でのＧＢＭ脳腫瘍へのｎ−ＢＰの抗腫瘍効果を示した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Zhang FK, Zhang JY, Jia JD (2005) Treatment of patients with alcoholic liver disease. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 4:12-17
【非特許文献２】Huntley AL, Ernst E (2003) A systematic review of herbal medicinal products for the treatment of menopausal symptoms. Menopause 10:465-476
【非特許文献３】Yim TK, Wu WK, Pak WF, Mak DH, Liang SM, Ko KM (2000) Myocardial protection against ischaemia-reperfusion injury by a Polygonum multiflorum extract supplemented 'Dang-Gui decoction for enriching blood', a compound formulation, ex vivo. Phytother Res 14:195-199
【非特許文献４】Ye YN, Koo MW, Li Y, Matsui H, Cho CH (2001a) Angelica sinensis modulates migration and proliferation of gastric epithelial cells. Life Sci 68:961-968
【非特許文献５】Ye YN, Liu ES, Li Y, So HL, Cho CC, Sheng HP, Lee SS, Cho CH (2001b) Protective effect of polysaccharides-enriched fraction from Angelica sinensis on hepatic injury. Life Sci 69:637-646
【非特許文献６】Abebe W (2002) Herbal medication: potential for adverse interactions with analgesic drugs. J Clin Pharm Ther 27:391-401
【非特許文献７】Wang H, Chen R, Xu H (1998) [Chemical constituents of radix Angelicae Sinensis]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 23:167-168, inside backcover
【非特許文献８】Ko WC, Sheu JR, Tzeng SH, Chen CM (1998) The selective antianginal effect without changing blood pressure of butylidenephthalide in conscious rats. Planta Med 64:229-232
【非特許文献９】Chan SS, Jones RL, Lin G (2009) Synergistic interaction between the Ligusticum chuanxiong constituent butylidenephthalide and the nitric oxide donor sodium nitroprusside in relaxing rat isolated aorta. J Ethnopharmacol 122:308-312
【非特許文献１０】Cheng YL, Chang WL, Lee SC, Liu YG, Chen CJ, Lin SZ, Tsai NM, Yu DS, Yen CY, Harn HJ (2004) Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis. Life Sci 75:1579-1594
【非特許文献１１】Tsai NM, Chen YL, Lee CC, Lin PC, Cheng YL, Chang WL, Lin SZ, Harn HJ (2006) The natural compound n-butylidenephthalide derived from Angelica sinensis inhibits malignant brain tumor growth in vitro and in vivo. J Neurochem 99:1251-1262
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、肝線維症または肝硬変に対するｎ−ＢＰについては今まで何ら研究されていなかった。肝線維症は、慢性的な肝組織の損傷の特徴を有する様々な肝臓の病気の共通の結果である。肝星細胞(hepatic stellate cell)（ＨＳＣ）が慢性的に活性化する結果、これが進行し、これにより、細胞が増殖し、細胞外マトリックス成分の沈着が増加する。
【０００８】
したがって、本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、肝障害の治療または肝機能の向上に有効な薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、ビリルビンレベル及び組織試験(histology examination)（メタヴィアスコア(Metavir score)）に基づいて、ｎ−ＢＰが肝臓の炎症を阻害できることを見出した。加えて、本発明者らは、肉眼的検査(gross examination)、ヘマトキシリン−エオシン染色及び組織化学的染色でのメタヴィアスコアを用いることによって、ｎ−ＢＰが肝臓のコラーゲン繊維を低減し、再生結節(regeneration nodule)を軽減することを見出し、これにより肝線維症の治療への有用性が期待できると考えた。さらに、本発明者らは、肝機能の指標であるプロトロンビン時間及び血清アルブミンレベル（血清アルブミン値）に基づいて、ｎ−ＢＰが肝細胞が損傷を受けた後に肝機能を回復できることをも知得した。上記知見に基づいて、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、上記目的は、活性成分として、下記式（Ｉ）：
【００１１】
【化１】
0005841903.tif 000002
【００１２】
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド[(n)-butylidenephthalide]、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステルを含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である、肝障害の治療のための薬剤によって達成される。
【００１３】
また、上記目的は、上記式（Ｉ）で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド[(n)-butylidenephthalide]、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステルを含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である、肝機能の向上のための薬剤によって達成される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の薬剤は、肝障害の治療または肝機能の向上への適用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】図１ａは、チオアセトアミド（ＴＡＡ）  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肉眼による検査結果を示す写真である。肝障害を誘導するために、正常群以外のすべての実験群で、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇを８週間にわたって３日毎に１回注射した。Ｎｏ．９１、Ｎｏ．９２及びＮｏ．１６２は、ＴＡＡを４週間注射した後に剖検した実験ラットにおける肝臓の写真である。様々な濃度のＢＰまたはオリーブ油（コントロール）を経口投与することによる治療を、５週目に開始し、８週間最後まで行った。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓を示す。Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７８及びＮｏ．７９は、８週間最後の８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓である。治療してから２週間（１０週間）後に、実験ラットを剖検した；Ｎｏ．７３、Ｎｏ．７４及びＮｏ．７７は、８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群のラット肝臓切片のヘマトキシリン−エオシン染色による結果を示すものである。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓切片を示す。Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７８及びＮｏ．７９は、８週間最後の８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片である。治療してから２週間（１０週間）後に、実験ラットを剖検した；Ｎｏ．７３、Ｎｏ．７４及びＮｏ．７７は、８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓切片を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群のラット肝臓切片のマッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)による結果を示すものである。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓切片を示す。Ｎｏ．７２、Ｎｏ．７８及びＮｏ．７９は、８週間最後の８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片である。治療してから２週間（１０週間）後に、実験ラットを剖検した；Ｎｏ．７３、Ｎｏ．７４及びＮｏ．７７は、８０ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓切片を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肉眼による検査結果を示す写真である。Ｎｏ．９１、Ｎｏ．９２及びＮｏ．１６２は、ＴＡＡを４週間注射した後に剖検した実験ラットにおける肝臓の写真である。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓を示す。Ｎｏ．８０、Ｎｏ．８１及びＮｏ．８２は、８週間最後（５００ｍｇ／ｋｇ／日のｎ−ＢＰを４週間摂取させた後）の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓である。Ｎｏ．８３、Ｎｏ．８６及びＮｏ．８７は、治療してから２週間（１０週間）後の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与時のラット肝臓切片のヘマトキシリン−エオシン染色による結果を示すものである。Ｎｏ．９１、Ｎｏ．９２及びＮｏ．１６２は、ＴＡＡを４週間注射した後に剖検した実験ラットにおける肝臓切片の写真である。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓切片を示す。Ｎｏ．８０、Ｎｏ．８１及びＮｏ．８２は、８週間最後（５００ｍｇ／ｋｇ／日のｎ−ＢＰを４週間摂取させた後）の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片である。Ｎｏ．８３、Ｎｏ．８６及びＮｏ．８７は、治療してから２週間（１０週間）後の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓切片を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するコントロール群（オリーブ油の経口投与）および５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与時のラット肝臓切片のマッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)による結果を示すものである。Ｎｏ．９１、Ｎｏ．９２及びＮｏ．１６２は、ＴＡＡを４週間注射した後に剖検した実験ラットにおける肝臓切片の写真である。Ｎｏ．８８は、８週間最後（オリーブ油を４週間摂取させた後）のオリーブ油投与群の肝臓切片を示す。Ｎｏ．８０、Ｎｏ．８１及びＮｏ．８２は、８週間最後（５００ｍｇ／ｋｇ／日のｎ−ＢＰを４週間摂取させた後）の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片である。Ｎｏ．８３、Ｎｏ．８６及びＮｏ．８７は、治療してから２週間（１０週間）後の５００ｍｇ  ｎ−ＢＰ投与群の肝臓切片を示し、Ｎｏ．１３９は、オリーブ油投与群の肝臓切片を示す。
【図３】図３は、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間での肝線維化のスコア(quantity score)（メタヴィアスコアシステムに従った）を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。ｐ＜０．０５の値は有意差あり（＊）と考え、ｐ＜０．０１の値はかなり有意差あり（＊＊）と考え、さらに、ｐ＜０．００１は非常に有意差あり（＊＊＊）と考える。
【図４】図４は、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間でのメタヴィアスコアシステムに従った肝臓活性のスコア(quantity score)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【図５Ａ】図５Ａは、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間での血清中のＧＯＴの血漿生化学値(plasma biochemical value)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【図５Ｂ】図５Ｂは、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間での血清中のＧＰＴの血漿生化学値(plasma biochemical value)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【図６】図６は、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間での総ビリルビンレベルの血漿生化学値(plasma biochemical value)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【図７】図７は、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間での血清中のアルブミンレベルの血漿生化学値(plasma biochemical value)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【図８】図８は、下記各実験群の４週間、６週間、８週間および１０週間でのプロトロンビン時間（ＰＴ）の血漿生化学値(plasma biochemical value)を示す：正常、ＴＡＡ誘導（ＴＡＡ）、オリーブ油（コントロール）、ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）。すべてのデータは、平均値及び標準偏差（ＳＤ）で示す。２群での異なる処置結果を比較するために、データをＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定(Student's t-test)を用いて分析した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、活性成分として、下記式（Ｉ）：
【００１７】
【化２】
0005841903.tif 000003
【００１８】
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド[(n)-butylidenephthalide]、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステルを含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である、肝障害の治療のための薬剤に関する。また、本発明は、上記式（Ｉ）で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド[(n)-butylidenephthalide]、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステルを含み、前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である、肝機能の向上のための薬剤に関する。
【００１９】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２０】
慢性の肝臓病及び肝硬変は、生命を脅かす病気である。にもかからわず、有効な予防または治療に使用できる薬剤は非常に少ないまたはほとんどない。本発明は、上記事情をかんがみたものであり、肝障害、特に肝線維症および肝硬変を阻害および／または治療するためのｎ−ブチリデンフタリド（ｎ−ＢＰ）の新規な使用方法（用途）を提供するものである。
【００２１】
すなわち、本発明の一態様は、活性成分として、治療上有効な量の上記式（Ｉ）：
【００２２】
【化３】
0005841903.tif 000004
【００２３】
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド（本明細書中では、一括して「（ｎ）−ブチリデンフタリド」または「ｎ−ＢＰ」とも称する）、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステル（本明細書中では、一括して「活性成分」とも称する）を含む、患者の肝障害を治療するおよび／または肝機能を向上するための薬剤に関する。なお、前記式（Ｉ）の（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である。
【００２４】
また、本発明は、活性成分として、治療上有効な量の下記式（Ｉ）：
【００２５】
【化４】
0005841903.tif 000005
【００２６】
ただし、Ｒは、＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、
で示される（ｎ）−ブチリデンフタリド、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステル（前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である）を、肝障害を治療する必要のある患者に投与することを有する、肝障害の治療方法を提供する。本発明はまた、活性成分として、治療上有効な量の上記式（Ｉ）の（ｎ）−ブチリデンフタリド、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステル（前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である）を、肝機能を向上する必要のある患者に投与することを有する、肝機能の向上方法をも提供する。
【００２７】
さらに、本発明は、活性成分として、治療上有効な量の上記式（Ｉ）の（ｎ）−ブチリデンフタリド、またはその製薬上許容できる塩若しくはエステル（前記（ｎ）−ブチリデンフタリドは、Ｅ体、Ｚ体またはこれらの混合物である）、および必要であれば製薬上許容できる担体を含む患者の肝障害を治療するおよび／または肝機能を向上するための薬剤組成物をも提供する。ここで、担体は、投与経路によって、異なる形態を有しうる。上記薬剤組成物に使用される担体とは、活性成分（（ｎ）−ブチリデンフタリド）を一緒に投与する希釈剤、賦形剤、またはベヒクルを意味する。このような医薬担体は、水及び油等の、滅菌液体であってもよい。水または水溶液、生理食塩水、ならびに含水デキストロース及びグリセロール溶液が担体として、特に注射溶液に好ましく使用される。
【００２８】
例えば、滅菌注射用組成物は、非毒性の非経口で許容できる希釈剤または溶剤における溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオールにおける溶液であってもよい。使用できる許容できるベヒクルや溶剤の中には、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、固定油が、溶剤または懸濁媒体として従来使用される（例えば、合成モノまたはジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体等の、脂肪酸が、注射剤の調製に使用でき、特にポリオキシエチレン化された型の、オリーブ油またはヒマシ油等の、天然の製薬上許容できる油もまた同様にして使用できる。また、これらの油溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤若しくは分散剤、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤を含んでもよい。ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）もしくはスパン（Ｓｐａｎ）等の、他の一般的に使用される界面活性剤または製薬上許容できる固体、液体、または他の投与形態の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤若しくはバイオアベイラビリティ促進剤もまた、配合目的で使用されうる。
【００２９】
経口投与用の組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョンならびに水性懸濁液、分散液および溶液などの経口投与が許容できる投与形態であってもよい。錠剤の場合には、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチがある。ステアリン酸マグネシウム等の滑剤もまた一般的に添加される。カプセル形態での経口投与では、使用できる希釈剤としては、ラクトースや乾燥コーンスターチがある。水性懸濁液またはエマルジョンを経口投与する場合には、活性成分を乳化剤または懸濁化剤と組み合わせて油相中に懸濁または溶解することができる。必要であれば、特定の甘味剤、風味剤、または着色剤を添加してもよい。
【００３０】
薬剤組成物における担体は、組成物の活性成分と適合し（好ましくは、活性成分を安定化でき）、処置される患者に有害でないという意味で「許容できる」ものでなければならない。１以上の可溶化剤を、本発明の活性のある化合物のデリバリーのための製薬賦形剤として使用してもよい。他の担体の例としては、コロイド酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃  １０が挙げられる。
【００３１】
上記薬剤組成物は、公知の担体ならびに調製方法を用いて調製できる。すべての担体は、溶剤、造粒剤、湿潤剤、及びバインダーと混合しうる。本明細書に使用される、「有効量」または「治療上有効な量」ということばは、肝障害の少なくとも一つの症状またはパラメーターを測定可能な程度に改善する量を意味する。治療上有効な量は、当該分野において既知な方法（例えば、肉眼的所見、メタヴィアスコア）によって測定できる。肝障害を治療するための有効量は、当業者に既知の経験的方法によって容易に決定できる。患者に投与される正確な量は、疾患の状態及び重篤度ならびに患者の体調によって異なるであろう。症状またはパラメーターの測定可能な改善は、当業者によって決定可能であるまたは医者に患者から報告されうる。肝障害の症状またはパラメーターの臨床学的または統計学的に有意な軽減または改善は本発明の範囲に含まれることは理解されるであろう。臨床学的に有意な軽減または改善とは、患者および／または医者に認識できることを意味する。
【００３２】
また、「製薬上許容できる」という表現は、生理学的に許容でき、一般的にヒトに投与される際に望ましくない反応を引き起こさないような組成物の分子的実体や他の成分を意味する。好ましくは、「製薬上許容できる」ということばは、通常認可されるまたは哺乳動物、及び特にヒトに使用される際に薬局方若しくは他の通常認められる薬局方に列挙されることを意味する。製薬上許容できる塩、エステルは、合法的な医学的な判断(sound medical judgment)内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応等を引き起こさずに患者の組織に接触させて使用するのに適し、理にかなった損益比に見合い、使用目的に対して効果的である塩（例えば、カルボン酸塩、アミノ酸付加塩）、エステルを意味する。
【００３３】
本発明の薬剤（または下記の薬剤組成物；以下、同様）の投与方法は、特に制限されない。例えば、本発明の薬剤は、経口で、皮下に、静脈内に、筋肉内に、皮膚塗布を介してまたは徐放形態(form of slow-release)で投与される。本発明の薬剤を、経口で、静脈内に、筋肉内に、皮下にまたは徐放形態で投与することが好ましい。投与間隔は、特に制限されず、病気の重篤度などを考慮して適切に選択される。投与は、１日に１回、数日に１回、１週間に１回、またはそれ以上であってもよいが、頻度は病気または疾患の維持段階中は減らしてもよい。
【００３４】
ここで、肝障害は、一般的な肝障害と同様の定義であるが、肝線維症、肝硬変または肝炎であることが好ましい。また、肝障害は、いずれの原因で生じたものであってもよいが、化学物質による閉塞(chemical obstruction)、微生物による閉塞(microorganism obstruction)、物理的な閉塞(physical obstruction)、アルコールによる閉塞(alcoholic obstruction)、ウィルスによる閉塞(viral obstruction)、または先天性胆道閉塞(congenital biliary obstruction)によって引き起こされることが好ましい。
【００３５】
また、肝機能の向上は、いずれの指標で得られるものであってもよいが、プロトロンビン時間の減少または血清アルブミンレベル（血清アルブミン値）の増加を指標としたものであることが好ましい。すなわち、肝機能の向上は、プロトロンビン時間の減少または血清アルブミンレベルの増加を包含することが好ましい。
【００３６】
本発明において、（ｎ）−ブチリデンフタリドの適切な投与量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；患者の大きさ、体重、表面積、年齢、及び性；他の薬剤を投与しているか；ならびに主治医の判断によって異なる。（ｎ）−ブチリデンフタリドの投与量は、様々な投与経路の異なる有効性などを考慮して、投与量を変化させる必要がある。当該分野ではよく理解されるように、最適化のための標準的な経験的な方法(standard empirical routines)を用いて、変動を調節できる。好ましくは、活性成分としての（ｎ）−ブチリデンフタリドは、１日あたり、約８０〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の治療上有効な量で投与されうる。
【００３７】
なお、本明細書において、「治療(treating, treatment)」ということばは、肝障害または肝障害を引き起こす疾患を患っているまたは発症する危険のある、患者に、上記障害／疾患、上記障害／疾患の症状、上記障害／疾患に続発する病状、または上記障害／疾患になりやすい素因を治療する(cure)、軽減する(alleviate)、和らげる(relieve)、矯正する(remedy)、または改善する(ameliorate)ことを目的として、薬剤または薬剤組成物を投与することを意味する。治療方法は、単独でまたは他の薬剤若しくは治療法と組み合わせて行われうる。
【００３８】
活性成分としての（ｎ）−ブチリデンフタリドは、合成されてもあるいは植物等の天然源から抽出・単離されてもよいが、活性成分は、植物から抽出、単離されることが好ましい。この場合、植物は、（ｎ）−ブチリデンフタリドを含むものであれば特に制限されないが、トウキ(Angelica sinensis)またはセンキュウ(Ligusticum chuanxiong)であることが好ましい。好ましくは、活性成分は、トウキ(Angelica sinensis)またはセンキュウ(Ligusticum chuanxiong)の抽出物中に主成分として含まれる。なお、活性成分としての（ｎ）−ブチリデンフタリドの植物から抽出、単離する方法は特に制限されず、公知の方法が同様にしてあるいは適宜修飾して適用できる。
【００３９】
本発明に係る詳細な技術および好ましい実施形態は、当業者が本発明の特徴をよく理解できるように、本明細書および図面に記載される。
【実施例】
【００４０】
本発明の効果を、以下の実施例を用いて詳細に説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
【００４１】
実施例１
チオアセトアミドで誘導された慢性の肝障害ラットモデルを用いて、本発明の実施可能性を示す。すなわち、５ｍｌ／ｋｇのチオアセトアミド（ＴＡＡ）を、８週間にわたって、３日毎にウィスターラット(Wistar rat)に腹腔内注射して、肝障害を誘導した。チオアセトアミドによる誘導期間中５週目から以下の治療を開始した。８０ｍｇ／ｋｇ／日または５００ｍｇ／ｋｇ／日のｎ−ＢＰをこの実験ラットに４週間経口投与した。なお、コントロール群（治療なし）では、ｎ−ＢＰの代わりにオリーブ油を投与した。
【００４２】
結果を、図１〜８に示す。コントロール群（治療なし）と比較すると、ＧＯＴ（図５Ａ）、ＧＰＴ（図５Ｂ）、アルブミンレベル（図７）、総ビリルビンレベル（図６）及びプロトロンビン時間（図８）等の肝機能の指標の分析から、ｎ−ＢＰ治療群では肝障害が有意に回復していることが示される。また、組織学的試験［肉眼による検査（図１ａ、図２ａ）、ラット肝臓切片の組織染色（図１ｂ、図１ｃ、図２ｂ、図２ｃ）、メタヴィアスコアシステムによるスコア（図３、図４）］から、治療群では、炎症及びコラーゲン繊維の蓄積が有意に減少していることが示される。これらの結果から、ｎ−ＢＰの経口投与は、慢性の肝障害から肝機能を回復させるのを促進し、肝線維症治療のための臨床応用の可能性があることが考察される。
【００４３】
実験１：慢性の肝線維症モデルの確立および肝機能の評価
本研究では、ウィスターラット(Wistar rat)を、LASCO CO., LTD (Taiwan)から得た。すべての方法は、倫理ガイドラインに従い、Institutional Animal Care and Use Committee of Dong-Hwa University, Taiwanで認可された。
【００４４】
ラットで慢性の肝線維症モデルを確立するにあたって、オスの成体ウィスターラット(Wistar rat)（３２０±２０ｇ）を用いて、これに、８週間にわたって３日毎に１回、２００ｍｇ／ｋｇ  ＴＡＡ(Sigma-Aldrich)を腹腔内注射して、肝線維症モデルを作製した（７８ラット）。正常群（２４ラット）では、生理食塩水をＴＡＡの代わりに使用した。４、６、８、及び１０週（即ち、それぞれ、２８、４２、５６、及び７０日）目に、これらのラットを剖検し、心血液サンプルを集めた。これらのサンプルを、生化学分析装置(Integra800; Roche, Holliston, MA, USA)を用いて分析し、肝機能の指標（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、血清アルブミン、総ビリルビン及びプロトロンビン時間）を測定した。
【００４５】
次に、これらの剖検ラットから得られた肝組織サンプルの組織病理を分析した。肝組織サンプルを３．７％ホルムアルデヒド中に固定した後、パラフィンに包埋した。包埋した組織の一連の３μｍの切片を、ヘマトキシリン及びエオシンまたはマッソントリクローム(Masson's Trichrome)で染色した。肝線維症は肝臓中に過剰なコラーゲンの蓄積が認められるため、コラーゲンの蓄積が肝線維症（肝線維化）を評価するための重要な指標となる。マッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)は、線維症肝中のコラーゲン組織の増加を同定するのにしばしば使用される。マッソントリクローム染色では、切片化されたサンプルを、ブアン溶液(Bouin's solution)(Sigma-Aldrich)中に５６℃で１時間おいた後、下記溶液で順次染色した：Mayerのヘマトキシリン溶液(Mayer's hematoxylin solution)(Sigma-Aldrich)に５分間、Biebrich scarlet-acid fuchsin溶液(Sigma-Aldrich)に１５分間、リンモリブデン酸−リンタングステン酸(Sigma-Aldrich)に１５分間、およびアニリンブルー(aniline blue)(Sigma-Aldrich)に５分間。
【００４６】
実験２：肝線維症モデルへのｎ−ＢＰ経口投与
ＴＡＡで誘導された線維症肝を有する７８匹のラットをランダムに４群に分けた。第１群（ＴＡＡ群）では、２４匹のラットに何ら治療を施さなかった。残りの５８匹は下記３群に分けた：コントロール群、ｎ−ＢＰ処置群Ｉ（ＢＰ  ８０ｍｇ／ｋｇ群）及びｎ−ＢＰ処置群ＩＩ（ＢＰ  ５００ｍｇ／ｋｇ群）。これらの３群では、５週間目から開始して８週まで、それぞれ、オリーブ油、ｎ−ＢＰ（８０ｍｇ／ｋｇ）及びｎ−ＢＰ（５００ｍｇ／ｋｇ）を、ラットに１日に１回経口投与した。この際、投与量は、それぞれ、１ｍｌオリーブ油／ｋｇ体重（コントロール群）、１ｍｌの８０ｍｇ／ｍｌ  ｎ−ＢＰオリーブ油溶液／ｋｇ体重（ＢＰ  ８０ｍｇ／ｋｇ群）、および１ｍｌの５００ｍｇ／ｍｌ  ｎ−ＢＰオリーブ油溶液／ｋｇ体重（ＢＰ  ５００ｍｇ／ｋｇ群）であった。ｎ−ＢＰは、Alfa AesarＲ, cat. A10353から購入した。
【００４７】
６、８、及び１０週目に、各群のラットを剖検し、心血液サンプルを集めた。これらのサンプルを、生化学分析装置(Integra800; Roche, Holliston, MA, USA)を用いて分析し、肝機能の指標（グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、血清アルブミン、総ビリルビン及びプロトロンビン時間）を測定した。次に、これらの剖検ラットから得られた肝組織サンプルの組織病理を分析した。肝組織サンプルを３．７％ホルムアルデヒド中に固定した後、パラフィンに包埋した。包埋した組織の一連の３μｍの切片を、上記したのと同様にして、ヘマトキシリン及びエオシンまたはマッソントリクローム(Masson's Trichrome)で染色した。
【００４８】
結果：コントロール群（オリーブ油）と比較した場合の、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するｎ−ＢＰ経口投与の肝線維症（肝線維化）軽減の有効性（肉眼的検査、ヘマトキシリン−エオシン染色及びマッソントリクローム染色による評価）
図１ａ及び図２ａは、コントロール群及び治療群のラットの肝臓の肉眼による検査結果を示す。これから、肝臓の色、容積；滲出、肥厚または癒着が存在するか否か；肝臓の表面が平滑であるかまたは結節性であるかを、観察する。正常な肝臓は、赤茶色であり、表面が平滑である。また、図１ａのＮｏ．７３及びＮｏ．７８（ＢＰ  ８０ｍｇ／ｋｇ群）及び図２ａのＮｏ．８１及びＮｏ．８７（ＢＰ  ５００ｍｇ／ｋｇ群）は、正常な肝臓の形態と同様に良好になっていることがわかる。損傷を受けると、コントロール群（図１ａ、２ａ：Ｎｏ．８８、１３９）のように、肝臓が肥大し、表面がザラザラし、組織が硬い。
【００４９】
損傷を受けたラットの肝臓組織切片のヘマトキシリン−エオシン染色から、組織の空胞形成、壊死、及び細胞核の変性(degeneration)が、コントロール群のチオアセトアミドで誘導された肝線維症ラットの肝臓切片では観察された（図１ｂ、２ｂ：Ｎｏ．８８、１３９）。また、組織病理から、ｎ−ＢＰ投与により、肝障害が軽減し；組織の変性及び空胞形成の回復が８週間及び１０週間後のｎ−ＢＰ処置群で明らかに示されたことが分かる（図１ｂ：Ｎｏ．７２、７８、７９、７３、７４、７７及び図２ｂ：Ｎｏ．８０、８１、８２、８３、８６、８７）。一方、コントロール群（オリーブ油）では、依然として重篤な炎症及び壊死が観察される（図１ｂ、２ｂ：Ｎｏ．８８、１３９）。
【００５０】
マッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)では、肝線維症ラットの肝臓ではコラーゲンがかなり蓄積したことが示される。ｎ−ＢＰ処置群では、コラーゲン分解が８週（図１ｃ：Ｎｏ．７２、７８、７９；図２ｃ：Ｎｏ．８０、８１、８２）及び１０週（図１ｃ：Ｎｏ．７３、７４、７７；図２ｃ：Ｎｏ．８３、８６、８７）で認められた。一方、コントロール群では、依然として、コラーゲンのかなりの蓄積が認められた（図１ｃ、図２ｃ：Ｎｏ．８８、１３９）。
【００５１】
線維化グレード(fibrosis grade)を用いることによって得られる線維化スコア(fibrosis score)（表１）は、ｎ−ＢＰ処置群では、４２、５６及び７０日で、コントロール群のスコアより、低い（図３）。コラーゲンに関するマッソントリクローム染色(Masson's Trichrome staining)から、４２、５６及び７０日では、ｎ−ＢＰ処置群では、ほとんどコラーゲンの蓄積が認められない（線維化グレード  １〜２）（図３）。一方、コントロール群では、依然として、４２、５６及び７０日で、かなりの量のコラーゲンの蓄積が認められる（線維化グレード  ３〜４）（図３）。
【００５２】
炎症活性スコア（表１）を試験した（図４）。これらの知見から、損傷を受けた肝臓の回復の改善がｎ−ＢＰ処置から２週間で得られることが示唆される。
【００５３】
【表１】
0005841903.tif 000006
【００５４】
結果：コントロール群（オリーブ油）と比較した場合の、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するｎ−ＢＰ経口投与の炎症活性軽減の有効性（ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、ビリルビンによる評価）
肝線維症ラット群では、血清ＧＯＴ（ＳＧＯＴ）、血清ＧＰＴ（ＳＧＰＴ）及び総ビリルビンレベルは、正常群に比べて、４週後に（処置前に）鋭く上昇することから、肝臓損傷が示唆される（図５Ａ、図５Ｂおよび図６）。
【００５５】
ｎ−ＢＰ処置群では共に、血清ＧＯＴ及び血清ＧＰＴレベルが１０週後にほぼ正常値にまで減少したが、コントロール群では、依然として、正常群のレベルに比べて有意に高いままである（図５Ａ、及び図５Ｂ）。図６に示されるように、血清中の総ビリルビンレベルは、双方のｎ−ＢＰ処置群で、６週後（処置してから２週）で減少し、１０週まで減少し続けた。一方、コントロール群では、血清中の総ビリルビンレベルは、８週まで減少しない。１０週では、双方のｎ−ＢＰ処置群で、血清中の総ビリルビンレベルがコントロール群に比べて有意に低い。これらのデータから、ｎ−ＢＰの経口摂取により、肝臓の炎症活性を低減できると、考察される。
【００５６】
結果：コントロール群（オリーブ油）と比較した場合の、ＴＡＡ  ２００ｍｇ／ｋｇ注射による肝線維症に対するｎ−ＢＰ経口投与の肝機能回復の有効性（アルブミンレベルおよびプロトロンビン時間による評価）
図７及び８に示されるように、ＴＡＡ注射開始から８週までの間、ＴＡＡで誘導された肝損傷により、ＴＡＡ群の血液中の、アルブミンレベルは減少し（４．０４±０．２７ｇ／ｄｌから３．６２±０．３３ｇ／ｄｌにまで）、プロトロンビン時間は有意に延長する（１０．９±０．３２ｓから１２．６±０．７８ｓまで）。これらの実験の生化学的結果は、従来の報告（Zhao DC, Lei JX, Chen R, Yu WH, Zhang XM, Li SN, Xiang P (2005) Bone marrow-derived mesenchymal stem cells protect against experimental liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol 11:3431-3440；Abdel Aziz MT, Atta HM, Mahfouz S, Fouad HH, Roshdy NK, Ahmed HH, Rashed LA, Sabry D, Hassouna AA, Hasan NM (2007) Therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on experimental liver fibrosis. Clin Biochem 40:893-899；Dai LJ, Li HY, Guan LX, Ritchie G, Zhou JX (2009) The therapeutic potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis. Stem Cell Res 2:16-25；およびLin SZ, Chang YJ, Liu JW, Chang LF, Sun LY, Li YS, Luo GH, Liao CH, Chen PH, Chen TM, Lee RP, Yang KL, Harn HJ, Chiou TW (2010) Transplantation of human Wharton's Jelly-derived stem cells alleviates chemically induced liver fibrosis in rats. Cell Transplant 19:1451-1463）と一致するものである。これから、これらの実験ラットでの肝機能の顕著な低下が示唆される。
【００５７】
図７に示されるように、アルブミンレベルは、ｎ−ＢＰ処置群では、６週から８週（処置してから２週から４週）で上昇する；これに対して、コントロール群では、その反対の結果となる。１０週後には、血清アルブミンレベルが、ｎ−ＢＰ処置群では、コントロール群に比べて、かなり回復した（３．６２±０．３３に対して、４．３５±０．４７）。また、コントロール群および双方のｎ−ＢＰ処置群では、プロトロンビン時間が６週から減少する。図８に示されるように、双方のｎ−ＢＰ処置群での１０週でのプロトロンビン時間は、短くなり、正常群の時間に近づく；これに対して、コントロール群では、依然として、正常群の時間に比べて、プロトロンビン時間が長い。
【００５８】
プロトロンビン時間及び血清アルブミンレベルの回復から、ｎ−ＢＰ処置してから２〜３週間で、肝機能が向上し、機能的な肝臓(functional liver mass)が再生すると、考察される。
【図１ａ】
0005841903.tif 000009
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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