(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料であって、
−  ポリマー製のナノファイバー足場；及び場合により、
−  生細胞
を含み、
前記ナノファイバー足場が、３〜１２個の層ペアでコーティングされており、各層ペアは、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなり、前記層は、前記ナノファイバー足場の表面に多層液滴を形成し、前記多層液滴は、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくと１個の層ペアで構成される液滴であり、前記少なくとも１個の層ペアが、治療分子を取り込んでおり、多層液滴の形態であるか、又は多層液滴内に含まれることを特徴とする、生体材料。
【請求項２】
前記ナノファイバー足場が、ポリ（ε−カプロラクトン）製又はコラーゲン製である、請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
前記治療分子が、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、及びそれらをコードする核酸からなる群より選択される成長因子である、請求項１又は２に記載の生体材料。
【請求項４】
前記成長因子が、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）又は骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）である、請求項３に記載の生体材料。
【請求項５】
前記ポリカチオンが、キトサン又はリシンポリマーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項６】
前記ポリアニオンが、治療分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項７】
前記生細胞が、骨芽細胞及び／又は軟骨細胞を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項８】
前記生細胞が、前記ナノファイバー足場上に堆積されたヒドロゲル内に含まれる、請求項１から７のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項９】
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた前記ポリマー製のナノファイバー足場；及び
−  コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞
からなる、請求項７又は８に記載の生体材料。
【請求項１０】
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた前記ポリマー製のナノファイバー足場；
−  コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞；及び
−  アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
からなる、請求項７又は８に記載の生体材料。
【請求項１１】
生細胞を含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項１２】
生体材料を製造するための方法であって、
ａ）生分解性ポリマー製のナノファイバー足場を製造又は入手する工程；及び
ｂ）３〜１２個の層ペアで、前記ナノファイバー足場をコーティングする工程であって、各層ペアは、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなり、前記層は、前記ナノファイバー足場の表面に多層液滴を形成し、前記多層液滴は、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアで構成される液滴であり、前記少なくとも１個の層ペアは、治療分子を取り込んでいる、工程
を含む、方法。
【請求項１３】
３〜１２個の層ペアでナノファイバー足場をコーティングする前記工程が、
ｉ．ポリカチオンを含む溶液中に、ナノファイバー足場を浸漬する工程；
ｉｉ．工程（ｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を洗浄する工程；
ｉｉｉ．ポリアニオンを含む溶液中に、工程（ｉｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を浸漬する工程；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を洗浄する工程；及び場合により、
ｖ．工程（ｉ）〜（ｉｖ）を少なくとも２回反復する工程；及び場合により、
ｖｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終了時に得られたナノファイバー足場を滅菌する工程
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
骨欠損充填材料及び／若しくは軟骨欠損充填材料として使用するための、又は骨再生及び／若しくは軟骨再生に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項１５】
骨欠損及び／又は軟骨欠損の処置に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項１６】
離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎癒合、傷害による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、老化による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、顎顔面再建が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、サイナスリフトが必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、歯槽堤増成が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、又は腫瘍による骨減少及び／若しくは軟骨減少を患っている患者における骨欠損及び／又は軟骨欠損の処置に使用するための、請求項１５に記載の使用のための生体材料。
【請求項１７】
骨欠損の処置に使用するための、請求項９に記載の生体材料。
【請求項１８】
軟骨下骨欠損又は骨軟骨欠損の処置に使用するための、請求項１０に記載の生体材料。
【請求項１９】
小さな骨欠損又は小さな軟骨欠損の処置に使用するための、請求項１１に記載の生体材料。
【請求項２０】
処置されるべき患者から単離された生細胞を含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の使用のための生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体材料であって、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）又はコラーゲン製のナノファイバー足場を含み、前記少なくとも１個の層ペアが、成長因子などの治療分子を取り込んでいる生体材料に関する。生体材料は、場合により、骨芽細胞及び／又は軟骨細胞などの生細胞を含み得る。
【０００２】
高齢化は世界的な現象である。世界の６０歳以上の高齢者人口は、最も急速に増えている年齢群である。これは、健康が向上している良い兆候である。それにもかかわらず、それとともに新たな健康の課題が生じている。この老齢人口の健康を維持するためのナノ医療の機会は無限である。再生医療の成功のためには、新たなナノ構造生体インプラントに基づく組織工学的な戦略が重要になる。加齢に伴う典型的な疾患（関節痛及び関節軟骨変性）として、変形性関節症は、ナノ医療における応用研究の明確かつ大きな焦点である。
【０００３】
骨修復及び／又は軟骨修復の分野では、ナノ構造生体材料を使用することが魅力的であると思われる。ナノテクノロジー応用の魅力は、それらの小さなサイズによって発揮する独自の特徴及び現象にある。このナノスケールの工学材料により、新規な内科的治療、例えば、改善された特異性で細胞にターゲティングし、患者に対する副作用の減少をもたらすナノ粒子に基づく薬物の設計が可能になる。その他にも、低侵襲的な外科的移植に使用するためのナノ構造生体材料が進歩し、回復時間の短縮、及び術後感染又はその他の合併症のリスクの低下につながっている。このようなイノベーションは、生活の質を向上させ、平均余命を伸ばし、健康管理の全体的なコストを低減するであろう。生体材料は、細胞の挙動及び機能を管理する設計可能な生物物理学的及び生化学的環境として、再生医療及び組織工学の現代における戦略に重要な役割を果たす。
【０００４】
組織工学は合成及び天然のポリマーを用いる様々な加工方法を利用して、組織及び臓器再生用の足場の作製を試みている学際的分野である。正常組織及び病理組織の両方における構造−機能の関係についての研究は、生体活性物質及び工学材料の開発と一体になっている。
【０００５】
材料の重点は三次元応用に限定されており、新たなクラスのポリマー生体模倣材料、例えばナノファイバー、自己集合プロセスによって形成される超分子材料、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来する単一又は複数の生化学的シグナルを示すマトリックスに置かれている。生体材料によって提供されるガイダンスは、損傷組織及び機能不全組織の構造並びに機能の回復を促進し得る。このような材料は、細胞と相互作用するための暫定的な三次元支持体を提供してそれらの機能をコントロールし、組織形成及び組織再生の空間的及び時間的に複雑な多細胞プロセスをガイドするはずである（Dvir et al. 2011 Nature Nanotechnology 6:13-22）。
【０００６】
全層軟骨欠損の修復を目的とする現在の方法としては、軟骨下骨穿孔、アブレージョン、関節形成及び微小破壊などの骨髄刺激技術（ＭＳＴ）が挙げられる。例えば、ＭＳＴは、軟骨下骨の穿孔から生じた修復組織で軟骨欠損の充填を刺激しようとするものである。しかしながら、特に、２〜４cm2よりも大きくて大腿顆以外の領域に位置する欠損について、修復組織の耐久性及びそのため臨床結果に対して懸念がある（Kreuz et al. 2006 Osteoarthritis Cartilage 14:1119-1125）。これらの限定的な技術は、一般に、耐久性のある軟骨修復を復元するのに十分ではない。健常な軟骨下層がなければ、骨軟骨単位全体が機能しない可能性があることが明らかになっている。
【０００７】
従って、関節軟骨修復の将来は、骨軟骨単位全体の交換を可能にする先進的なインプラントの開発に依存する。最近、ＥＣＭ類似物に基づく先進的な材料の開発は、再生医療における応用研究の大きな焦点になっている。これまでは、様々な研究の焦点は骨再生又は軟骨再生のいずれかに合わせられており、骨軟骨単位全体の復元には全く焦点が合わせられていなかった。
【０００８】
Li et al. (2005 Biomaterials. 26:599-609)及びSavarino et al. (2007 Biomaterials. 28:3101-9)には、間葉幹細胞又は骨髄間質細胞のいずれかを含む生分解性ポリマー製のナノファイバー足場が記載されている。しかしながら、これらの生体材料は、生細胞の使用だけに基づくものであり、所定の特異的治療分子の持続放出を可能にするものではない。加えて、これらの生体材料は生細胞を必ず含み、このことが、特に小さな骨欠損を処置しようとする場合にそれらを使用することを困難にしている。また、Savarino et al. (2007 Biomaterials. 28:3101-9)に開示されている生体材料は、ＢＭＰ４を発現するように設計されたリコンビナント間葉幹細胞の使用に基づくものである。このような種類の細胞は、診療所では使用できない。
【０００９】
Medtronicは、InductOS（登録商標）という名称のナノファイバー足場を商品化しており、これは、ＢＭＰ２中にコラーゲンマトリックスを浸漬したものである。しかしながら、InductOS（登録商標）は、複合インプラントの重要な要件として認識されているＢＭＰ２の徐放動態を示さない。
【００１０】
従って、当技術分野において、効率的な骨修復及び／又は軟骨修復を可能にする生体材料、特に骨軟骨単位全体の復元を可能にする生体材料の必要性がある。理想的には、これらの生体材料は、骨修復及び／又は軟骨修復において役割を果たしている成長因子の遅延放出及び徐放を可能にするべきである。
【００１１】
発明の詳細な説明
本明細書において、本発明者らは、成長因子の高性能なナノリザーバーを取り込んでいる軟骨下骨再生用のナノ構造ハイブリッド生体活性膜の最初の実例を報告する。有利なことに、本発明の生体材料は、組織が再成長する期間にわたって放出を遅延及びコントロールするための治療分子のナノリザーバーを作る。
【００１２】
より具体的には、本発明者らは、成長因子を取り込んでいる高分子電解質多層でコーティングすることによって、ナノファイバー足場を機能化できることを見出した（例えば、図３、図６及び図７を参照のこと）。加えて、これらのコーティングされたナノファイバー足場上に、生細胞を堆積させてもよい。
【００１３】
さらに、このような機能化されたナノファイバー足場は、骨再生をｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に誘導できることを実証した（例えば、図５を参照のこと）。
【００１４】
本発明の生体材料
本発明は、生体材料であって、
ａ）ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアであって、成長因子などの治療分子を取り込んでいる少なくとも１個の層ペアでコーティングされた生分解性ポリマー製のナノファイバー足場；及び場合により、
ｂ）生細胞
を含む生体材料を提供する。
【００１５】
これらの生体材料は、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアであって、成長因子などの治療分子を取り込んでいる少なくとも１個の層ペアで、ナノファイバー足場がコーティングされていることを特徴とする好ましい実施態様では、前記層ペアは、多層液滴の形態であるか、又は多層液滴内に含まれる。一実施態様によれば、ナノファイバー足場は、多層液滴コーティングされる。
【００１６】
「生体材料」は、哺乳動物、特にヒト患者において、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するのに適切な任意の材料を意味する。より具体的には、本発明の生体材料は、インプラントとして使用するのに適切である。
【００１７】
本発明の生体材料は、ポリマー製のナノファイバー足場を含む。前記ポリマーは、合成のものでもよいし、天然のものでもよい。前記ナノファイバー足場は、好ましくは、多孔質であるか、又は少なくとも１つの多孔質面若しくは多孔質部分を含む。ポリマーは、好ましくは、生分解性である。しかしながら、非生分解性ポリマー製のナノファイバー足場は、例えば、プロステーシスの交換で脊椎固定を行う場合に、又は骨欠損充填材料として有用であるので。このような足場もまた、本明細書において企図される。好ましくは、ナノファイバー足場は、ナノファイバー製、特に合成又は天然のナノファイバー製である。
【００１８】
ナノファイバー足場は、典型的には、約５０〜約１０００nm、好ましくは約５０〜約５００nm又は約１００〜約１０００nmの直径を有するナノファイバーに基づくものであり、高空隙率及び相互接続細孔構造を有する材料を形成する。このような材料は、特にその高比表面積により、足場構造として特に適切である。
【００１９】
本発明のナノファイバー足場は、少なくとも約５０ミクロン、７５、１００、１５０、１７０、２００、２５０、３００、３５０、５００、６００、８００、１０００、１５００ミクロン及び／又は２０mm、１５、１０、９、８、５、４、２、１、０．８、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０９、０．０８mm未満の厚さを有し得る。
【００２０】
本明細書全体を通して使用される「ナノファイバー足場」という用語は、組織再生のための一時的な足場を提供しながら、組織（例えば、骨及び／又は軟骨）の本来の性質を模倣できるマトリックスを指す。すなわち、ナノファイバー足場は、組織の三次元構造を模倣するだけではなく、細胞の接着及び拡散も容易にする。
【００２１】
本発明の枠組みにおいて、ナノファイバー足場は、好ましくは、骨及び／又は軟骨の三次元構造を模倣する。ナノファイバー足場は、ナノファイバーを含む。本発明によれば、ナノファイバー足場は、治療分子（好ましくは、成長因子）、及び場合により生細胞で機能化されることにより、治療分子のためのリザーバーとして、及び生細胞が存在する場合は細胞送達ビヒクルとしても働く。
【００２２】
インプラントとして使用するのに適切なナノファイバー足場は、当業者に周知である。例えば、Swieszkowski et al. (2007 Biomol Eng. 24:489-95)には、骨再生及び／又は軟骨再生の枠組みにおいてインプラントとして使用するのに適切ないくつかのナノファイバー足場が開示されている。これらの生分解性ポリマー製のナノファイバー足場は、例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）、コラーゲン、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）−テレフタラート、ポリ（ブチレンテレフタラート）、又はそれらのコポリマーから作られ得る。ナノファイバー足場はまた、コラーゲン、ヒアルロン酸、ヒドロキシアパタイト、コンドロイチン硫酸、キトサン、及びそれらの混合物などのポリマーから作られ得る。
【００２３】
好ましい実施態様では、ナノファイバー足場は、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）から作られ、及び／又はポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）からなる。本発明の枠組みにおいて、ＰＣＬは、好ましくは、エレクトロスピニングされる。エレクトロスピニングＰＣＬ製のナノファイバー足場は、例えば、実施例１の最初の２段落に記載されているように、又はLi et al. (2005 Biomaterials. 26:599-609)若しくはSavarino et al. (2007 Biomaterials. 28:3101-9)に記載されているように得られ得る。
【００２４】
別の好ましい実施態様では、ナノファイバー足場は、コラーゲンから作られ、及び／又はコラーゲンからなる。コラーゲンは、例えば、ブタから得られ得る天然のポリマーである。コラーゲン製のナノファイバー足場はインプラントとして一般的に使用されており、例えば、Geistlich Pharma AG (Germany)によって商品化されているBio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜が挙げられる。
【００２５】
本発明の枠組みにおいて、ナノファイバー足場が治療分子で機能化されて、本発明の生体材料の移植部位における前記治療分子の持続放出が可能になる。
【００２６】
本明細書全体を通して使用される「治療分子」という用語は、疾患を処置又は予防することを目的とする任意の分子を指す。それは、例えば、（例えば、European Medicines Agency (EMA)又はU.S. Food and Drug Administration (FDA)によって）販売承認が出されている薬物、又は臨床試験若しくは前臨床試験を受けている候補薬物に対応し得る。治療分子は、例えば、ポリペプチド（リコンビナントタンパク質、抗体及びペプチドを含む）、核酸（ＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子を含む）、化学分子（例えば、小分子）、又は糖（例えば、リポ多糖）に対応し得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、治療分子は、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、又はそれらをコードする核酸などの成長因子である。
【００２８】
本発明の生体材料が骨再生及び／又は軟骨再生に使用される場合、前記治療分子は、最も好ましくは、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２、ヒトＢＭＰ２の配列は配列番号１として示される）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）（ヒトＢＭＰ７の配列は配列番号２として示される）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ９）及び線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ１８）からなる群より選択される。
【００２９】
驚くべきことに、本発明者らは、
−  ポリアニオン層；及び
−  ポリカチオン層
からなる少なくとも１個の層ペアであって、治療分子を取り込んでいる少なくとも１個の層ペアで、ナノファイバー足場をコーティングできることを見出した。
【００３０】
いくつかの実施態様によれば、ナノファイバー足場は、多層液滴コーティングされる。ナノファイバー足場は、好ましくは、フィルムコーティングされない
【００３１】
本発明のコーティングは、好ましくは、ナノファイバーの表面全体に不規則に塗布される。
【００３２】
より具体的には、本発明のナノファイバー足場は、負又は正のいずれかに帯電した層で、層ごと（layer-by-layer）にコーティングされる。これらの層の少なくとも１個は、治療分子を取り込んでおり、及び／又は治療分子からなる。例えば、図３は、それぞれがポリアニオン層（すなわち、負に帯電したＢＭＰ２）及びポリカチオン層（すなわち、正に帯電したＤＧＬＧ５）からなる１〜６個の層ペアでコーティングされたナノファイバー足場を示す。図３及び図９に見られ得るように、これらの層は、ナノファイバー足場の表面上に「多層液滴」を形成する。このコーティングにより、治療分子のナノリザーバーを作るように、治療分子でナノファイバー足場を機能化することが可能になる。「多層液滴」という用語は、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される液滴又はパッチを指す。前記液滴は、様々な形状：円形、卵形又は鱗形を示し得る。好ましくは、前記液滴は、１０〜１５０nm、より好ましくは１５〜１００nm、さらにより好ましくは２５〜５０nmのサイズを有する。
【００３３】
本発明によれば、「多層液滴コーティング」という用語は、液滴又はパッチをナノファイバーの表面に堆積させ、逆帯電した分子多層液滴の層堆積（layer-by-layer (LbL) deposition）を得るコーティングを指す。さらに、「多層液滴コーティング」は、ナノファイバーの断続的なコーティング、すなわち、ナノファイバーの表面に沿った連続フィルムの形態ではないコーティングを指す。多層液滴コーティングは、その不規則な形状を特徴とし得るか、及び／又はナノファイバーの表面の少なくとも一部がコーティングされないように、それがナノファイバーの表面全体を覆わないという事実を特徴とし得る。本発明の多層液滴コーティングは、滑らかな表面を有し、ナノファイバーの表面全体を覆うフィルムコーティングと対比され得る（図９を参照のこと）。
【００３４】
コーティングの構築は、逆帯電した分子の交互積層に基づくものである。すなわち、ナノファイバー足場のコーティングは、高分子電解質多層フィルムが作られるのと同じように作られる。従って、本発明の生体材料は、ナノファイバー足場の表面上に多数の多層液滴の形態で、高分子電解質多層を含む（図３を参照のこと）。
【００３５】
ナノファイバーの表面全体を覆うフィルムコーティングとは対照的に（図９Ｃを参照のこと）、本発明の多層液滴コーティングは、好ましくは、ナノファイバーの表面を部分的にのみ覆うものである（図９Ａ及び図９Ｂを参照のこと）。本発明のコーティングは交互に（ＬｂＬ）適用され、過剰量のポリアニオン又はポリカチオンは、各工程において、連続的な吸着工程の間の洗浄工程で除去される。ナノファイバーを構成するポリマーの表面電荷の再配分により、第１のポリアニオン層又はポリカチオン層は、ナノファイバーの表面に沿って吸着した小さな液滴又はパッチを形成する。ポリアニオンポリマー又はポリカチオンポリマーを適用する各工程において、各液滴は、ポリアニオンポリマー又はポリカチオンポリマーの新たな層によって覆われる。フィルムコーティング前に多層液滴コーティングが観察される場合、コーティングプロセスは中止される。多層液滴コーティングは、フィルムコーティングで観察されない有利な特性をナノファイバーに提供する。フィルムコーティングが得られる場合、多層液滴は、コーティングされたナノファイバーの表面に沿ってそれ以上得ることができない。
【００３６】
フィルムコーティング又は非コーティングのナノファイバーと比較した多層液滴コーティングの第１の利点は、その不規則な表面である（図９Ａ及び図９Ｂを参照のこと）。この不規則な形状は、ナノファイバー足場への細胞接着を改善する。本発明者らは、細胞によるマトリックス定着時間の短縮を示す。実際、本発明のマトリックスは、組織再生プロセスを加速させる。また、この不規則な形状は、コーティングと細胞との間の接触表面の増加を提供し、コーティングと細胞との間のやり取りを最適化する。その結果として、低濃度の治療分子が、細胞成長のより良い刺激を観察するのに必要である。
【００３７】
加えて、本発明のコーティングは、フィルムコーティングよりも少ないポリアニオン層及びポリカチオン層を使用する。従って、層数の減少が、多層液滴コーティングを得るのに必要である。
【００３８】
その結果として、より少量の治療分子が、ナノファイバー足場上に適用され得る。実際、本発明の膜を用いて、治療分子は、低レベル（従来技術の膜よりも最大２６００倍低い）で適用され得る。治療分子の過剰投与は、副作用の発生を増加させることが周知である。例として、ＢＭＰ−２の過剰投与は、細胞溶解、及び患者へのＢＭＰ−２に対する免疫付与の原因になることが公知であり、組織再生プロセスの成功を大きく低下させる。本発明者らは、従来技術よりも少ないポリアニオン層及びポリカチオン層並びに治療分子を使用して、組織再生の時間を大幅に改善できることを示した。
【００３９】
「ナノファイバー」は、ナノファイバー足場を構成する天然又はポリマーのフィラメントを意味する。
【００４０】
本明細書においてさらに使用される「高分子電解質多層」という用語は、特に、本発明のナノファイバー足場をコーティングする多層液滴を包含する。
【００４１】
本明細書の枠組みにおいて、「高分子電解質」という用語は、いくつかの電解質基を有する化合物、特にその反復単位が電解質基を持つポリマーを指す。この基は水溶液中で解離して、ポリアニオン又はポリカチオンを生じさせ、場合によりポリマーを帯電させるであろう。
【００４２】
ナノファイバー足場をコーティングする高分子電解質多層は、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアから構成される。それらは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又はそれ以上の層ペアを含み得る。好ましくは、それは、３〜１２個の層ペアを含む。
【００４３】
例えば、国際公開公報第０２／０８５４２３号、国際公開公報第２００６／０７９９２８号、Lynn (2006 Soft Matter 2:269-273)、Decher (1997 Science 277:1232-1237)及びJessel et al. (2003 Advanced Materials 15:692-695)に記載されているように、治療分子は、高分子電解質多層に組み込まれ得る。
【００４４】
高分子電解質多層、特に本明細書において記載される多層液滴は、実施例及び「本発明の生体材料を製造するための方法」という表題の段落に詳細に記載されているように、ポリアニオン溶液及びポリカチオン溶液中に、ナノファイバー足場を交互に浸漬することによって容易に得られ得る。
【００４５】
当業者であれば明らかなように、ポリアニオン及びポリカチオンの選択の唯一の条件は、分子の電荷である（すなわち、ポリアニオンは負に帯電したものであり、ポリカチオンは正に帯電したものである）。本発明のポリアニオン及びポリカチオンは、（場合により化学的に改変された）ポリペプチド又は多糖（シクロデキストリン、キトサンなどを含む）などの任意の種類の分子に対応し得る。
【００４６】
高分子電解質多層を構築する場合にポリカチオンとして一般的に使用される分子としては、例えば、ポリ（リシン）ポリペプチド（ＰＬＬ）、共有結合シクロデキストリン−ポリ（リシン）（ＰＬＬ−ＣＤ）、ポリ（アルギニン）ポリペプチド、ポリ（ヒスチジン）ポリペプチド、ポリ（オルニチン）ポリペプチド、デンドリグラフトポリ−リシン（例えば、デンドリグラフトポリ−Ｌ−リシン）及びキトサンが挙げられる。高分子電解質多層を構築する場合にポリアニオンとして一般的に使用される分子としては、例えば、ポリ（グルタミン酸）ポリペプチド（ＰＧＡ）及びポリ（アスパラギン酸）ポリペプチドが挙げられる。これらのポリアニオン及びポリカチオンは、本発明の枠組みにおいて使用され得る。
【００４７】
ナノファイバー足場をコーティングする高分子電解質多層は、治療分子を必ず取り込んでいる。本発明の生体材料に組み込まれるべき治療分子が帯電している場合、前記治療分子は、高分子電解質多層を構築する場合にポリアニオン又はポリカチオンとして使用され得る。治療分子が帯電していないか、又は十分に帯電していない場合、それは、高分子電解質多層を構築するためにポリアニオン又はポリカチオン（例えば、上記リストに記載されるものの中の１つ）に共有結合され得る。
【００４８】
具体的な実施態様では、高分子電解質多層は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個又はそれ以上の層ペアを含むか、又はそれらからなり、各層ペアは、
−  治療分子（例えば、ポリペプチド、特に成長因子など）を含むか、又はそれからなるポリアニオン層；及び
−  キトサン若しくはリシンポリマー（例えば、ポリ（リシン）ポリペプチド（ＰＬＬ）又はデンドリグラフトポリ−リシン（ＤＧＬ）など）を含むか、又はそれらからなるポリカチオン層
からなる。
【００４９】
本発明の具体的な実施態様では、ポリカチオン層は、デンドリグラフトポリ−リシン（ＤＧＬ）であるリシンポリマーを含むか、又はそれからなる。ＤＧＬを得るための方法は、当業者に公知である。ＤＧＬは、例えば、Colletet et al. (2010 Chem. Eur. J. 16:2309-2316)に記載されているように調製され得る。本発明によれば、ＤＧＬは、任意の世代、例えば第１世代、第２世代、第３世代、第４世代又は第５世代であり得る。
【００５０】
具体的な実施態様では、高分子電解質多層は、実施例に記載されるものの中の１つ、すなわち、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）１、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）２、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）４、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）５又は（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）１；２：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）２、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）３、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）４、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）５、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）６、（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）１、（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）２、（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）３、（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）４、（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）５又は（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）６である。「ＤＧＬＧ５」は、第５世代のデンドリグラフトポリ−Ｌ−リシンを表す。「ＢＭＰ２」は、配列番号：１の骨形成タンパク質２を表す。「ＰＬＬ」は、ポリ（リシン）ポリペプチドを表す。「Ｃｈｉ」は、キトサンを表す。「ｎ」は、層ペアの数を示す。
【００５１】
本発明の文脈において、ナノファイバー足場は、生細胞でさらに機能化され得る。実際、生細胞を埋め込むことは、組織修復又は臓器修復の有望な解決方法である。
【００５２】
骨再生及び／又は軟骨再生の文脈において、前記生細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）、骨髄間質細胞、又はそれらの混合物を含み得るか、又はそれらからなり得る。好ましくは、前記生細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、又はそれらの混合物を含むか、又はそれらからなる。具体的な実施態様では、胚性幹細胞は、本発明の生細胞から除外され得る。
【００５３】
前記生細胞は、好ましくはヒト細胞であり、最も好ましくは自家細胞（すなわち、処置されるべき患者から得られる細胞）である。
【００５４】
前記生細胞は、好ましくは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）技術によって得られる。
【００５５】
具体的な実施態様では、前記生細胞は、前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積しているヒドロゲル（例えば、アルギン酸ヒドロゲル又はコラーゲンヒドロゲル）内に含まれる。換言すれば、本発明の生体材料は、コーティングされたナノファイバー足場に加えて、生細胞を含むヒドロゲルを含み得る。
【００５６】
ヒドロゲルは、当業者に周知である。コラーゲンヒドロゲルは、例えば、コラーゲン（例えば、３mLのラット尾Ｉ型コラーゲン）を１０％ＦＢＳ含有培地（例えば、５．５．mL）及び０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（例えば、０．５．mL）と混合することによって調製され得る。アルギン酸ヒドロゲルは、例えば、アルギン酸塩及びヒアルロン酸の混合物（例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で調製され得るアルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１））であり得る。
【００５７】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；及び
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞
を含むか、又はそれらからなる。
【００５８】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞；及び
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなる。
【００５９】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなる。
【００６０】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、生細胞を含まない。より具体的には、それは、単に、ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場からなり得る。
【００６１】
具体的な実施態様では、本発明の生体材料は、
ａ）それぞれが成長因子（例えば、ＢＭＰ２）層及びリシンポリマー（例えば、ＰＬＬ又はＤＧＬ）層からなる１個、２個、３個、４個、５個又は６個の層ペアでコーティングされたエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）製のナノファイバー足場、並びに場合により（例えば、コラーゲンヒドロゲルなどのヒドロゲル内に含まれる）骨芽細胞、及び／又は（例えば、アルギン酸ヒドロゲルなどのヒドロゲル内に含まれる）軟骨細胞；
ｂ）それぞれが成長因子（例えば、ＢＭＰ２）層及びリシンポリマー（例えば、ＰＬＬ又はＤＧＬ）層からなる１個、２個、３個、４個、５個又は６個の層ペアでコーティングされたコラーゲン製のナノファイバー足場、並びに場合により（例えば、コラーゲンヒドロゲルなどのヒドロゲル内に含まれる）骨芽細胞、及び／又は（例えば、アルギン酸ヒドロゲルなどのヒドロゲル内に含まれる）軟骨細胞；又は
ｃ）リシンポリマーがキトサンで置換されている（ａ）又は（ｂ）のナノファイバー足場
である。
【００６２】
本発明者らは、（ｉ）治療分子を多く含み、コントロールされたサイズ及び厚さを有するナノファイバー足場インプラントを製造できること、（ｉｉ）骨形成及び関節軟骨修復をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導できることを示した。
【００６３】
関節軟骨修復については、インタクトな軟骨下骨層の支えがなければ、軟骨表面の損傷についてのいかなる処置も失敗する可能性があることが明らかになっている。ネイティブな関節面によく似ており、長時間耐久性を維持するより予測可能な修復組織を達成することを目的として、骨軟骨単位全体の生理的特性を回復させることを、大きな軟骨欠損又は大きな骨軟骨欠損の処置目標にするべきである。本明細書において、本発明者らは、合成ナノ構造膜に基づく戦略を使用した軟骨下骨再生の最初の実例を報告する。このエレクトロスピニング膜は、ＦＤＡによって承認されているポリマーを使用して製造され、成長因子（ＢＭＰ２）などの治療分子のナノリザーバーで機能化される。
【００６４】
欧州及び米国の当局は、骨再生の用途にＢＭＰ−２を使用することを既に承認している。例えば、Medtronicは、ＢＭＰ−２に浸漬された塩基性コラーゲンマトリックスであるInductOS（登録商標）を提供している。この種の複合デバイスの有効性は、ＢＭＰの徐放動態に依存する。この基準は、複合インプラントの重要かつ最も難しい要件として認識されている。効率的な骨再生のためには、ターゲット細胞は、新たな骨又は軟骨下骨が誘導されるまで、長期間にわたって確実かつ連続的に成長因子に曝露することを必要とする。この点において、現在利用可能なデバイスは高性能ではない。対照的に、本発明者らが提案する医療デバイスは、細胞との接触に応じてナノリザーバーから送達するものであり、ＢＭＰ−２の持続的なアベイラビリティのために特別に設計されている。この戦略は、現在の単純化したアプローチと比較して、治療効果を大幅に高めることを目的とする。注目すべきことに、治療分子の量の減少はコーティング処理に必要なので、それは経済的にも価値がある。
【００６５】
治療分子の分解は水溶液中で急速に起こることが多いが、これはＢＭＰ−２に当てはまる。成長因子と一緒に浸漬されたコラーゲンマトリックスを使用する現在のシステムでは、この問題は過剰投与によって対処されているが、有害な副作用を引き起こし得る。本発明者らは、治療分子のナノ固定化及び保護に基づく有利なアプローチを提供する。ナノ構造足場は、治療分子を液滴中に、そして足場ナノファイバー上にトラップする特別なコーティングプロセスを使用して製造される。治療分子は、ポリマーによってカプセル化されると保護及び安定化される。細胞がナノリザーバー（多層液滴）に接触すると、細胞の酵素がポリマーコーティングを分解し、治療分子が利用可能になる。細胞は成長し、分裂し、膜の多孔質構造中により深く浸透するので、それらは治療分子の緩徐進行性放出を引き起こし、次いで生理作用を誘導する（例えば、治療分子が成長因子である場合は、さらなる細胞増殖を刺激する）。この高性能な「細胞依存性」ナノリザーバーにより、治療分子の持続放出が可能になる。
【００６６】
この戦略を用いて、大きな欠損において頑丈で耐久性のある軟骨又は骨の修復能力を持つ複合的な細胞治療インプラントを低コストで作製できるはずである。加えて、所望の数の吸着工程にわたって交互（ＬｂＬ）積層を継続する可能性（これが、この方法のロバスト性及び万能性を説明する）は、コーティングを変化させることによってインプラントの生物学的活性又は作用動態を調整することを可能にするであろう。本発明は、再生ナノ医療の分野に大きく貢献するものであると考えられる。本明細書において見られる概念は幅広いクラスの組織に適用可能であり、高性能なインプラントを設計するのに役立ち得る。
【００６７】
本発明の生体材料を製造するための方法
本発明の一態様は、上記段落に記載される本発明の生体材料を製造するための方法であって、
ａ）生分解性ポリマー製のナノファイバー足場を製造又は入手する工程；及び
ｂ）ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアであって、治療分子を取り込んでいる少なくとも１個の層ペアで、前記ナノファイバー足場をコーティングする工程
を含む方法に関する。
【００６８】
少なくとも１個の層ペアでナノファイバー足場をコーティングする前記工程は、例えば、
ｉ．ポリカチオンを含む溶液中に、ナノファイバー足場を（例えば、約５〜６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｉ．工程（ｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を（例えば、約５〜６０分間、好ましくは約１５分間）洗浄する工程；
ｉｉｉ．ポリアニオンを含む溶液中に、工程（ｉｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を（例えば、約５〜６０分間、好ましくは約１５分間）浸漬する工程；
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）の終了時に得られたナノファイバー足場を（例えば、約５〜６０分間、好ましくは約１５分間）洗浄する工程；及び場合により、
ｖ．工程（ｉ）〜（ｉｖ）を少なくとも２回反復する工程；及び場合により、
ｖｉ．工程（ｉｖ）又は（ｖ）の終了時に得られたナノファイバー足場を（例えば、紫外線に曝露することによって）滅菌する工程
を含み得る。
【００６９】
工程（ｉ）及び（ｉｉｉ）において、ポリカチオン又はポリアニオンを含む溶液は、例えば、約２０〜約５００μM、好ましくは約５０〜約２００μMの範囲内でポリカチオン又はポリアニオンの濃縮物を含み得る。前記溶液は、例えば、ポリアニオン又はポリカチオンに加えて、０．０２Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含み得るか、又はそれらからなり得る。溶液のｐＨは、好ましくは、中性（例えば、ｐＨ７．４）である。
【００７０】
工程（ｉｉ）及び（ｉｖ）において、ナノファイバー足場を、例えば、中性のｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）を有する溶液で洗浄し得る。前記溶液は、例えば、０．０２Ｍ  ＭＥＳ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含み得るか、又はそれらからなり得る。
【００７１】
ナノファイバー足場をコーティングするべき層ペアの数に応じて、工程（ｖ）を任意の回数反復し得る。例えば、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６からなるコーティングを構築する場合、工程（ｖ）は、工程（ｉ）〜（ｉｖ）の５回の反復からなる。
【００７２】
工程（ｖｉ）は、例えば、紫外線に曝露することによって行われ得る（例えば、２５４nm、３０Ｗ、照明距離２０cm、約１５分間〜約１時間、好ましくは約３０分間）。
【００７３】
使用前に、（例えば、本発明の生体材料を無血清培地に接触させることによって）本発明の生体材料を平衡化し得る。
【００７４】
ナノファイバー足場をコーティングするのに使用され得る詳細なプロトコールは、実施例１の第４段落に提供される。
【００７５】
当業者であれば直ぐに分かるように、ポリカチオン又はポリアニオンを含む溶液中に、ナノファイバー足場を浸漬する工程は、前記溶液をナノファイバー足場に噴霧する工程で置き換えてもよい。
【００７６】
本発明の生体材料を製造するための上記方法は、
ｃ）生細胞（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された骨芽細胞又は軟骨細胞）を提供又は入手する工程；
ｄ）前記生細胞をヒドロゲル（例えば、コラーゲンヒドロゲル又はアルギン酸ヒドロゲル）と混合する工程；及び
ｅ）工程（ｄ）で得られた混合物を工程（ｂ）で得られた生体材料上に堆積させる工程
をさらに含み得る。
【００７７】
ヒドロゲルを調製するための方法は、当業者に周知である。コラーゲンヒドロゲルは、例えば、コラーゲン（例えば、３mLのラット尾Ｉ型コラーゲン）を１０％ＦＢＳ含有培地（例えば、５．５．mL）及び０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（例えば、０．５．mL）と混合することによって調製され得る。アルギン酸ヒドロゲルは、例えば、アルギン酸塩及びヒアルロン酸の混合物（例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ７．４）中で調製され得るアルギン酸塩：ヒアルロン酸溶液（４：１））であり得る。
【００７８】
具体的な実施態様では、生細胞は骨芽細胞であり、ヒドロゲルはコラーゲンヒドロゲルである。この実施態様の枠組みにおいて、工程（ｄ）は、骨芽細胞懸濁液（例えば、細胞２ｘ１０５個／mL）をコラーゲンヒドロゲルと混合することによって行われ得る（例えば、１mLの骨芽細胞懸濁液を９mLのヒドロゲルと混合する）。工程（ｅ）において、コラーゲン調製物を、工程（ｂ）で得られた生体材料の表面上にかけることができ、次いでポリマー化させるためにインキュベーションし得る（例えば、３７℃で約３０分間）。
【００７９】
別の具体的な実施態様では、生細胞は軟骨細胞であり、ヒドロゲルはアルギン酸ヒドロゲルである。この実施態様の枠組みにおいて、工程（ｄ）は、軟骨細胞懸濁液（例えば、細胞１ｘ１０５個／mL）をアルギン酸ヒドロゲルと混合することによって実施され得る。工程（ｅ）において、この調製物を、工程（ｂ）で得られた生体材料の表面上にかけることができる。
【００８０】
使用前に、（例えば、滅菌生検パンチを使用して）シリンダーを切断し、約３７℃で、例えば５％ＣＯ２の加湿環境中で一晩インキュベーションし得る。
【００８１】
あるいは、生細胞はまた、事前にヒドロゲルと混合せずに、工程（ｂ）又は（ｅ）で得られたコーティングされたナノファイバー足場上に直接堆積され得る。
【００８２】
骨芽細胞及び軟骨細胞の両方を、本発明のコーティングされたナノファイバー足場上に堆積させるべき場合、本発明の生体材料を製造するための上記方法は、工程（ａ）及び（ｂ）の後に、
ｃ）（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された）骨芽細胞を提供又は入手する工程；
ｄ）場合により、前記骨芽細胞をコラーゲンヒドロゲルと混合する工程；
ｅ）工程（ｃ）で得られた骨芽細胞又は工程（ｄ）で得られた混合物を工程（ｂ）で得られた生体材料上に堆積させる工程；
ｆ）（例えば、骨欠損及び／又は軟骨欠損を患っている患者から単離された）軟骨細胞を提供又は入手する工程；
ｇ）前記軟骨細胞をアルギン酸ヒドロゲルと混合する工程；及び
ｈ）工程（ｇ）で得られた混合物を工程（ｅ）で得られた生体材料上に堆積させる工程；
をさらに含み得る。
【００８３】
これらの工程（ｃ）〜（ｈ）は、例えば、上に詳細に記載されるように行われ得る。
【００８４】
本発明は、本明細書において記載される方法によって得られ得る生体材料をさらに提供する。
【００８５】
本発明の生体材料の治療用途
本発明者らは、ＢＭＰ２などの成長因子、並びに場合により骨芽細胞及び／又は軟骨細胞で機能化した本発明の生体材料が、骨再生及び／又は軟骨再生を誘導するのに非常に効率的であることを示した（実施例３〜５を参照のこと）。特に、それらは、インプラントとして使用するのに適切である。
【００８６】
従って、本発明は、骨欠損充填材料及び／若しくは軟骨欠損充填材料として使用するための、又は骨再生及び／若しくは軟骨再生に使用するための、上記段落に記載される生体材料に関する。本発明はまた、骨欠損及び／又は軟骨欠損の処置に使用するための、上記段落に記載される生体材料を提供する。いくつかの実施態様では、生体材料は、少なくとも１つの治療分子を含む。好ましくは、少なくとも１つの治療分子は、前記生体材料の多層液滴コーティングに含まれる。
【００８７】
骨欠損及び／又は軟骨欠損は、骨若しくは軟骨のいずれか、又は両方に影響を与え得る。それは、例えば、軟骨欠損、骨軟骨欠損又は軟骨下骨欠損であり得る。
【００８８】
本発明の具体的な実施態様では、骨欠損及び／又は軟骨欠損は、軟骨下骨欠損である。従って、本発明は、軟骨下骨再生に使用するための、及び／又は軟骨下骨欠損の処置に使用するための、上記段落に記載される生体材料を提供する。
【００８９】
特に、本発明の生体材料は、離断性骨軟骨症、骨壊死、骨軟骨骨折、脊椎癒合、傷害（例えば、スポーツの傷害又は事故による傷害）による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、老化による骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、顎顔面再建が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、サイナスリフトが必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、歯槽堤増成が必要な骨欠損及び／若しくは軟骨欠損、又は腫瘍（良性腫瘍及びガン性腫瘍を含む）による骨減少及び／若しくは軟骨減少を患っている患者における骨欠損及び／又は軟骨欠損の処置用途を見出すものである。
【００９０】
具体的な実施態様では、骨欠損及び／又は軟骨欠損は、例えば、膝及び／又は足首の欠損などの関節欠損である。
【００９１】
骨及び／又は軟骨の修復並びに再生の枠組みにおいて、本発明の生体材料は、生細胞を含んでもよいし、含まなくてもよい。それが生細胞を含む場合、細胞は、好ましくは、自己細胞（すなわち、処置されるべき患者から単離された細胞）である。上に示されるように、これらの生細胞は、ヒドロゲル内に含まれ得る。
【００９２】
生体材料が、（例えば、顎顔面手術又は整形手術の枠組みにおいて）小さな骨欠損及び／又は小さな軟骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、生細胞を欠いてもよい。
【００９３】
一方、骨欠損及び／又は軟骨欠損が大きな及び／又は深い欠損である場合、生体材料が生細胞を含むことが好ましい。例えば、生体材料が、大きな及び／又は深い骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞を含む。生体材料が、大きな及び／又は深い軟骨欠損の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、軟骨細胞を含む。生体材料が、骨及び軟骨に影響を与える大きな及び／又は深い欠損（例えば、骨軟骨欠損又は軟骨下骨欠損）の処置にインプラントとして使用するためのものである場合、生体材料は、好ましくは、骨芽細胞及び軟骨細胞の両方を含む。
【００９４】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；及び
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞
を含むか、又はそれらからなり、骨再生に、及び／又は骨欠損（好ましくは、深い及び／又は大きな骨欠損）の処置に使用するためのものである。実際、このような生体材料は、軟骨ではなく骨のみに影響を与える欠損の処置に特によく適している。
【００９５】
本発明の別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）コラーゲンヒドロゲル内に場合により含まれる骨芽細胞；及び
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなり、軟骨下骨再生に、骨軟骨再生に、及び／又は軟骨下骨欠損若しくは骨軟骨欠損の処置に使用するためのものである。換言すれば、このような生体材料は、骨及び軟骨の両方に影響を与える欠損の処置に特によく適している。
【００９６】
本発明のさらに別の好ましい実施態様では、本発明の生体材料は、
−  ポリアニオン層及びポリカチオン層からなる少なくとも１個の層ペアでコーティングされたポリマー製のナノファイバー足場；及び
−  （前記コーティングされたナノファイバー足場上に堆積した）アルギン酸ヒドロゲル内に含まれる軟骨細胞
を含むか、又はそれらからなり、軟骨再生に、及び／又は軟骨欠損の処置に使用するためのものである。
【００９７】
本発明は、骨欠損及び／又は軟骨欠損を処置するための方法であって、本発明の生体材料をそれを必要とする個体に埋め込む工程を含む方法をさらに提供する。
【００９８】
本発明の枠組みにおいて、処置されるべき個体及び／又は患者は、好ましくは、ヒトの個体及び／又は患者である。しかしながら、本発明の生体材料はまた、動物用医薬品分野における用途を見出すものである。
【００９９】
学術論文若しくは抄録、公開された特許出願、発行された特許、又は任意のその他の参考文献を含む本明細書において引用されるすべての参考文献は、引用される参考文献に示されているすべてのデータ、表、図及び文章を含め、参照により本明細書に全体的に組み込まれる。
【０１００】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は異なる意味を有するものであるが、上記本発明の説明全体を通して互いに置き換えてもよい。
【０１０１】
本説明の枠組みにおいて、すべての分子及び細胞は、場合により、単離及び／又は精製され得る。
【０１０２】
以下の実施例及び図面の点から、本発明をさらに評価する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】（Ａ）以下を使用することによる、ＢＭＰ２を多層に組み込んだものの水晶マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）分析。  −  デンドリグラフトポリ−リシンＤＧＬＧ５。１：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）１；２：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）２；３：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３；４：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）４；５：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）５；６：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６；  −  （ポリ）リシンポリペプチド。１：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）１；２：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）２；３：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）３；４：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）４；５：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）５；６：（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）６；及び  −  キトサン。１：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）１；２：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）２；３：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）３；４：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）４；５：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）５；６：（Ｃｈｉ−ＢＭＰ２）６。
【図１Ｂ】（Ｂ）ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２多層についてのパネルＡに示されるデータから導き出した、連続的なＢＭＰ−２堆積工程の平均湿質量増分。
【図１Ｃ】（Ｃ）（下）ネイティブ及び（上）石灰化（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３膜の通常のラマンスペクトル（ＥＮＭ  ＮＲ３を基準とした）（ＨＡｐ、ヒドロキシアパタイト；ＯＣＰ、リン酸オクタカルシウム）。石灰化は、膜をヒト骨芽細胞と一緒に適切な培地中で２１日間インキュベーションすることによって実施した。明確にするために、スペクトルをオフセットする。
【図２Ａ】（Ａ）多層エレクトロスピニングナノファイバー膜：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３の表面上で成長しているヒト骨芽細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖。「％ＡＢ減少」は、AlamarBlueの減少率を表す。
【図２Ｂ】（Ｂ）（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３機能化エレクトロスピニング膜上で培養したヒト骨芽細胞中の骨芽細胞マーカーをｑＰＣＲによってモニタリングして、非機能化マトリックスと比較した遺伝子発現の差異。
【図２Ｃ】（Ｃ）エレクトロスピニング膜上に堆積させたＩ型コラーゲン格子中で三次元培養した骨芽細胞の増殖。
【図３Ａ】積層、及び多層エレクトロスピニング膜（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎへのＢＭＰ２の組み込み中のエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーをＳＥＭで可視化したもの。（Ａ）エレクトロスピニング膜。
【図３Ｂ】積層、及び多層エレクトロスピニング膜（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎへのＢＭＰ２の組み込み中のエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーをＳＥＭで可視化したもの。（Ｂ）（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）１。
【図３Ｃ】積層、及び多層エレクトロスピニング膜（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎへのＢＭＰ２の組み込み中のエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーをＳＥＭで可視化したもの。（Ｃ）（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３。
【図３Ｄ】積層、及び多層エレクトロスピニング膜（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎへのＢＭＰ２の組み込み中のエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーをＳＥＭで可視化したもの。（Ｄ）（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６。
【図３Ｅ】積層、及び多層エレクトロスピニング膜（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎへのＢＭＰ２の組み込み中のエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーをＳＥＭで可視化したもの。（Ｅ）Ｃ：（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３の詳細図。
【図４】左の写真は、ＢＭＰ２の活性ナノリザーバーによって機能化し、コラーゲン／患者に由来するヒト骨芽細胞と混合したエレクトロスピニングＰＣＬ膜である２型インプラントを示す。このインプラントは、大きな損傷における迅速な骨再生のための安定的かつ取り扱い容易な新規インプラントを生み出す（２型インプラント−生体活性膜）。この複合材料マトリックスは、大きな損傷における迅速な骨再生のための有望なアプローチに相当する。右の写真は、３型インプラントを示す。このインプラントは、２型インプラントをヒト軟骨細胞／アルギン酸塩＋ヒアルロン酸の混合物でコーティングしたものに対応する。得られたナノ構造ハイブリッド活性生体材料は、独自型インプラントに相当し、信頼できる迅速かつ「シームレス」な、そしてそのため非常に耐久性のある骨軟骨損傷再生の可能性を提供する（３型インプラント−ハイブリッド生体活性膜）。
【図５】図５は、マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ骨軟骨再生を示す。結果は、ハイブリッド生体活性インプラント（すなわち、アルギン酸塩／ヒアルロン酸ヒドロゲル中にＢＭＰ２のナノリザーバー、ヒト骨芽細胞及びヒト軟骨細胞を含む膜）を使用して得られた。
【図６】コーティングされていないか、又は（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６、（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）３若しくは（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）６でコーティングされたエレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバー足場をＳＥＭで可視化したもの。
【図７】（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３又は（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）６でコーティングする前後のBio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜（Geistlich Pharma AG, Germany）をＳＥＭで可視化したもの。左列：Bio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜の多孔質面。右列：Bio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜の緻密面。
【図８Ａ】（Ａ）（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）６ＬｂＬナノ構造を金でコーティングした水晶センサーに積層する間の、２回の異なる実験の平均吸着質量及び厚さの変遷をＱＣＭ−Ｄで追跡したもの。均等かつ均一なフィルムを密度１．１g cm-3と仮定して、厚さの値を質量値から導き出した。
【図８Ｂ】（Ｂ）（Ａ）のデータから導き出した、連続的なＢＭＰ−２堆積工程の平均質量増分。エラーバーは、標準誤差を表す。
【図８Ｃ】（Ｃ）（下）非石灰化ネイティブ及び（上）石灰化（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３で処理したＥＮＭ足場から得られた通常のラマンスペクトル（ＨＡｐ：ヒドロキシアパタイト；ＯＣＰ：リン酸オクタカルシウム）。石灰化ネイティブ及び（ＰＬＬ／ＢＭＰ−２）３で処理した足場について、類似のペクトルが得られた。石灰化は、足場をヒト骨芽細胞と一緒に適切な培地中で２１日間インキュベーションすることによって実施した。明確にするために、スペクトルをオフセットする。
【図９Ａ】（Ａ）多層液滴コーティングしたナノファイバーの略図の前面図及び断面図。（Ｂ）多層液滴コーティングしたナノファイバーの略図の前面図及び断面図。（Ｃ）フィルムコーティングしたナノファイバーの略図の前面図及び断面図。
【図９Ｂ】（Ｂ）多層液滴コーティングしたナノファイバーの略図の前面図及び断面図。
【図９Ｃ】（Ｃ）フィルムコーティングしたナノファイバーの略図の前面図及び断面図。
【０１０４】
実施例
実施例１：材料及び方法
化学物質
ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）（分析用）は、Sigma Aldrichから購入した。ジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（ＤＣＭ／ＤＭＦ５０／５０vol/vol）の混合物にＰＣＬを１５% wt/volで溶解させ、使用前に一晩撹拌した。デンドリグラフトポリ−Ｌ−リシン（ＤＧＬ）は、COLCOM (Montpellier, France)から購入した。本研究では、第５世代のＤＧＬＧ５を使用した。ヒトリコンビナントＢＭＰ２は、PeproTechから購入した。アルギン酸ナトリウムmedium viscosityはSigma製であり、ヒアルロン酸（M.W. 132300）はLifecore製である。ラット尾Ｉ型コラーゲンは、Institut de Biotechnologies Jacques Boyから購入した。ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）はSigmaから購入しキトサン（ＣＨＩ）（Protasan up CL 113）はFMC Biopolymer (Norway)から購入した。ヒトリコンビナントＢＭＰ−２は、PeproTechから購入した。
【０１０５】
散逸モニタリング水晶振動子マイクロバランス（Quartz Cristal Microbalance with Dissipation monitoring）（ＱＣＭ−Ｄ）
ＱＣＭ−Ｄは、QAFC302(フローチャンバー）及びQSX301(金でコーティングした水晶振動子センサー）を使用してD300 system (Q-Sense, Sweden)で行った、この技術は、材料堆積時における水晶振動子センサーの共鳴周波数シフトΔｆ及び散逸率変化ΔＤを測定することからなる（M.V. Voinova, et al. Phys. Scr. 59 (1999) 391-396）。フローチャンバーを通して高分子電解質溶液又はタンパク質溶液（５mL）及び洗浄溶液（５mL）を連続注入することによって、交互（ＬｂＬ）積層を実施し、ｉｎ  ｓｉｔｕでモニタリングした。共鳴周波数の変化は、１５−MHzの共鳴周波数に対応する３次オーバートーン（ν＝３）で測定した。Δｆのシフトは、Sauerbreyの関係式（G. Sauerbrey, et al,  Z. Phys. 155 (1959) 206-222）：ｍ＝−ＣｘΔｆ／ν（式中、Ｃは、使用した水晶の定特性である（Ｃ＝１７．７ng cm-2 Hz-1））により、１次近似において水晶に吸着した質量の変動量に関連付けることができる。ＣＨＩ（５００μg mL-1）及びＢＭＰ−２（２００ng mL-1）は、０．０２Ｍ  ＭＥＳ（ｐＨ７．４）及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を使用することによって吸着させた。フィルム密度を１．１ｇ cm-3［３１］と想定して、均等かつ均一なフィルムの平均厚さを質量値から導き出した。
【０１０６】
エレクトロスピニング
自作の標準的なエレクトロスピニング設定を使用して、ＰＣＬ足場を作製した。ＰＣＬ溶液を５mLの注射器に注入し、プログラム可能なポンプ（Harvard Apparatus）によって直径０．５mmの針を通して流速１．２ml／時で噴出させた。高圧電源（SPELLMAN, SL30P10）を使用して、針を１５kVに設定した。針から１７cmの距離にアース接続したアルミホイル（２０ｘ２０cm2）を使用して、エレクトロスピニングＰＣＬ足場を回収した。
【０１０７】
ＳＥＭ観察
形態学的研究のために、ＰＣＬ足場を金でコーティング（Edwards Sputter Coater）し、Thornley-Everhart二次電子検出器を備える通常モード（高真空）のPhilips XL-30 ESEM走査型電子顕微鏡で観察した。
【０１０８】
高分子電解質多層の調製
すべての生物学的活性の実験について、高分子電解質多層は、エレクトロスピニングＰＣＬ膜上で調製した。０．０２Ｍ  ＭＥＳ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）の存在下で５０μM（ＤＧＬＧ５又はＰＬＬ又はＣＨＩ）及び２００nM（ＢＭＰ２）の各濃度の各溶液（３００μl）中に、表面を交互に１５分間浸漬することによって、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎ又は（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）ｎ又は（ＣＨＩ−ＢＭＰ２）ｎで構成される多層を構築した。各堆積工程の後、０．０２Ｍ  ＭＥＳ及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．４）で膜を１５分間洗浄した。紫外（ＵＶ）線（２５４nm、３０Ｗ、照明距離２０cm）に曝露することによって、すべての膜を３０分間滅菌した。使用前に、すべての膜を１mlの無血清培地に接触させて平衡化した（細胞培養を参照のこと）。
【０１０９】
加えて、エレクトロスピニングＰＣＬ膜に代えて、Bio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜（Geistlich Pharma AG, Germany）上にも高分子電解質多層を構築した。
【０１１０】
細胞培養
Cell Applicationsからヒト初代骨芽細胞（ＨＯＢ）を入手し、５０U/mLペニシリン、５０μg/mLストレプトマイシン、２．５μg/mLアンフォテリシンＢ及び１０％ＦＢＳ（Life Technologies, Paisley, UK）を含有するDulbecco改変Eagle培地（D-MEM（登録商標））で培養した。培養液を、５％ＣＯ２の加湿環境中、３７℃でインキュベーションした。細胞がサブコンフルエンスに達したら、それらをトリプシンで回収し、継代培養した。
【０１１１】
共焦点ラマン顕微鏡法
直径５mmのＰＣＬ  ＥＮＭ膜２個を（ＤＧＬ、ＰＬＬ又はＣＨＩ／ＢＭＰ−２）nLｂＬナノ構造でコーティングした。一方の膜を積層培地中で保存し、他方にヒト骨芽細胞を播種し、石灰化培地中で２１日間インキュベーションし、次いで４％ＰＦＡで２時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、最後に水中で保存した。基準として、同じ石灰化処理をネイティブな膜に適用した。これらの膜をガラス基板上に載せ、共焦点ラマン顕微鏡法による分析前に、穏やかなアルゴン気流下で乾燥させた。ラマン測定は、ｘｙｚマッピングステージを備える顕微鏡（Model BX41, Olympus）にラマン分光計（LabRam HR（Jobin-Yvon Horiba）、６００本／mm格子）を光ファイバーを介して連結したものから構成される共焦点ラマンマイクロ分光計を使用することによって空気中で行った(K.C. Schuster, E. et al., J. Microbiol. Meth. 42 (2000) 29-38]。ラマン散乱の励起は、波長６３２．８nmのヘリウム−ネオンレーザーで行った。ｘ５０ＬＷＤ顕微鏡対物レンズを用いて、レーザービームの焦点をサンプルに合わせた。入射スリットの前に配置した直径４００μmの共焦点ピンホールを使用して、非焦点面からのラマン信号を排除した。良好な信号対雑音比のラマンスペクトルを、積分時間６０秒（単一スペクトルの場合）及び１５秒（二次元マッピングの場合）で記録した。
【０１１２】
２型及び３型インプラントの調製
５ｘ１０４個のヒト骨芽細胞を播種し、ゲル調製前に７２時間インキュベーションした。コラーゲン格子を調製するために、３mlのラット尾Ｉ型コラーゲン（Institut de Biotechnologies Jacques Boy）を、５．５mlの１０％ＦＢＳ含有培地、０．５mLの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液及び細胞２ｘ１０５個／mlの細胞懸濁液１mlと混合した。０．５mLの細胞懸濁液：コラーゲン調製物をエレクトロスピニング膜の表面にかけて、それを３７℃で３０分間インキュベーションすることによってポリマー化させた。ポリマー化させた後、０．１５Ｍ  ＮａＣＩ（ｐＨ７．４）中で調製したアルギン酸塩ヒアルロン酸溶液（４：１）に溶解させたヒト軟骨細胞懸濁液（細胞１ｘ１０５個／ml）０．５mlをコラーゲン格子の表面にかけて、３層の構築物を得た。滅菌生検パンチを使用して５mm又は２mmのシリンダーを切断し、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験前に、５％ＣＯ２の加湿環境中、３７℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベーションした。
【０１１３】
細胞の生存率及び増殖
細胞生存率は、トリパンブルー色素排除によって測定した。AlamarBlue（登録商標）（Serotec）を使用して、細胞増殖を評価した。AlamarBlue試験は、非毒性で水溶性の酸化還元比色指示薬であり、細胞代謝に反応して色を変化させる。本研究では、２４ウェルプレート上に配置したＬｂＬコーティング膜（直径１４mm）（ｎ＝３）の表面上に、２ｘ１０４個のヒト骨芽細胞を播種した。２日間培養した後、３７℃及び５％ＣＯ２の加湿環境において、細胞を１０％AlamarBlue／ＤＭＥＭ溶液中でインキュベーションした。４時間後、１００mLのインキュベーション培地を９６ウェルプレートに移し、５９０nm及び６３０nmで測定して、AlamarBlueの減少率を決定した。
【０１１４】
免疫蛍光
細胞を４％ＰＦＡで１時間固定し、０．１％Triton X-100で１時間透過処理し、Ｆ−アクチンをラベルするためにAlexa Fluor 546標識ファロイジン（Molecular Probes）と一緒に２０分間インキュベーションし、核を染色するために２００nM  ＤＡＰＩ（Sigma）と一緒に５分間インキュベーションした。Vectashield (Vector)を使用して細胞を顕微鏡スライド上に載せ、共焦点顕微鏡（Zeiss, LSM 510）によってイメージングした。
【０１１５】
共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）
ＣＬＳＭ観察結果は、ｚ−断面間隔０．４μmでｘ４０／１．４油浸対物レンズを使用してZeiss LSM 510顕微鏡を用いて記録した。カットオフダイクロイックミラー４８８nm及び発光バンドパスフィルタ５０５〜５３０nm（緑色）を用いて４８８nmで励起した後に、ＦＩＴＣの蛍光を検出した。
【０１１６】
統計分析
すべての値は平均±ＳＥＭとして表し、すべての実験は少なくとも３回反復した。統計分析は、Mann Whitney U検定を使用して実施した。０．０５未満の確率ｐ値を有意であるとみなして、帰無仮説を棄却した。
【０１１７】
実施例２：骨再生及び／又は軟骨再生に使用するための足場
これまでは、様々な研究の焦点は骨再生又は軟骨再生のいずれかに合わせられており、骨軟骨単位全体の復元には全く焦点が合わせられていなかった。本発明は、骨軟骨単位を復元するためのＥＣＭ合成材料に基づく新たな戦略を提案する。
【０１１８】
ＥＣＭスケール（直径５０〜５００nmの範囲のタンパク質）で忠実に生体模倣する足場又はＥＣＭ類似物を作るためには、ナノ技術を用いなければならない。ナノ技術の最近の進歩は、人工ＥＣＭ類似物の様々な開発アプローチにつながっている。今までに、３つの加工技術（自己集合、相分離及びエレクトロスピニング）が発展して、ナノファイバー足場の作製が可能になった。様々な組織について忠実に「生体模倣する」か若しくは「理想的」な組織工学的環境又は足場を構築することが長く待ち望まれ非常に期待されていたが、これらの進歩により、今や高度に実現可能である。
【０１１９】
何人かの研究者は、天然ＥＣＭ成分の複雑な線維構造から着想を得て、類似構造の材料を製造している。直径１０ミクロンの繊維上では、細胞は二次元基板のように応答して不自然な平面形状になると思われ、接着レセプターの占有が非生理的かつ非対称的になる；それにもかかわらず、このようなマトリックスは、イヌの膀胱再建（Oberpenning et al. 1999 Nat Biotechnol 17:149-155）、又はマウス脳卒中モデルにおける脳損傷後の再生を促進するための神経幹細胞用の足場（Park et al. 2002 Nat Biotechnol 20:1111-1117）などの組織工学用途で、目覚ましい成功を既に収めている。エレクトロスピニング（Kenawy et al. Biomaterials 2003 24:907-913）などのポリマー加工技術により、繊維形成を１０nmスケールに下げることが可能である。
【０１２０】
本研究では、ＰＣＬポリマー（ポリ（ε−カプロラクトン））を使用して、エレクトロスピニングナノファイバーから構成される膜を足場として作った。ＰＣＬは、生理的条件下（例えば、ヒトの体内）でそのエステル結合の加水分解によって分解されるので、埋め込み型生体材料としての用途について大きな注目を集めている。特に、その分解はポリラクチドの分解よりもさらに遅いので、それは、長期間の埋め込み型デバイスを調製するためにとりわけ興味深いものである。ＰＣＬは、Food and Drug Administration (FDA)によって承認されている材料であり、例えば、薬物送達デバイス、縫合糸（Monocrylのブランド名で又は一般的に販売されている）、又は接着バリアとしてヒトの体内で使用されている。
【０１２１】
組織工学用途では、一般に、不活性ＥＣＭ模倣足場は、耐久性のある修復を生み出すのに十分ではないと認識されている。例えば、持続的に放出され得る成長因子を取り込んでいる高性能な活性材料についての必要性がある。
【０１２２】
近年、機能特性を有する構造マトリックスの設計及び作製のコントロールに相当な努力がなされている（Zhang et al. 2003 Nat Biotechnol 21:1171-1178）。
【０１２３】
機能タンパク質及びその他の生体活性材料を取り込んでいる高分子電解質多層（ＰＥＭ）フィルムは、一例を示す（Lynn. 2006 Soft Matter 2:269-273）。ＰＥＭフィルムは、相互作用する材料の交互（ＬｂＬ）積層によって、典型的には逆帯電した高分子電解質の静電相互作用によって調製される（Decher. 1997 Science 277:1232-1237）。機能化された生体活性コーティングを調製するための新たな機会を提供するＰＥＭフィルムに、ペプチド、タンパク質及び核酸などの治療薬及び生体分子が埋め込まれている（Lynn. 2006 Soft Matter 2:269-273; Decher. 1997 Science 277:1232-1237; 15. Jessel et al. 2003 Advanced Materials 15:692-695）。これらの超分子ナノ構造は、細胞接着、炎症のコントロール（Benkirane-Jessel et al. 2004 Advanced Materials 16:1507; Benkirane-Jessel et al. 2004 Adv Funct Mater 14:174-182）、及び薬物、成長因子又は核酸の局所送達（Jessel al. 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103:8618-8621; Kim et al. 2008 ACS Nano 2, 386-392）などの特定の特性を示すように設計され得る。埋め込まれた生体分子は、高分子電解質に化学結合しているか、又は物理吸着しており、多くの研究においてそれらの生物学的活性を保持することが示されている（Benkirane-Jessel et al. 2004 Advanced Materials 16:1507; Benkirane-Jessel et al. 2004 Adv Funct Mater 14:174-182; Jessel al. 2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103:8618-8621; Kim et al. 2008 ACS Nano 2, 386-392; Benkirane-Jessel et al. 2005 Adv Funct Mater 15:648-654）。生体活性タンパク質は、高分子電解質と共有結合せずに構造中に直接組み込まれ、それらのネイティブな形態に近い二次構造を維持し得る。従って、分解性の層構造は、結合された活性薬剤を徐々に送達するのに非常に有利であると思われる（Dierich et al.  2007 Advanced Materials 19:693-697; Facca et al. 2010 Proc Natl Acad Sci U S A 107:3406-3411; Krogman et al. 2009 Nat Mater 8:512-518; Barnes et al. 2007 Adv Drug Deliv Rev 59:1413-1433; Yoo et al. 2009 Advanced Drug Delivery Reviews 61:1033-1042; Fioretti et al. 2010 ACS Nano 22:3277-3287）。
【０１２４】
本発明者らは、活性マトリックスを細胞化ヒドロゲルと組み合わせて使用して軟骨下骨を作成するための新規な戦略を提供する。
【０１２５】
本研究では、成長因子としてＢＭＰ２を使用して、エレクトロスピニングＰＣＬ（ポリ（ε−カプロラクトン））ナノファイバー（ＥＮＭ）を機能化した。
【０１２６】
実施例３：１型インプラントの構築及び研究
最近、本発明者らは、ＰＬＬ（ポリ−Ｌリシン）又はリシンのデンドリグラフト（ＤＧＬ）を使用して、活性ペプチドを多層フィルムに組み込むことによって、炎症をモデュレーションできるだけではなく、この多層フィルムに接触している細胞の増殖を増大させることもできることを報告した（Fioretti et al. 2010 ACS Nano 22:3277-3287）。
【０１２７】
本研究では、本発明者らは、ＤＧＬ、及び骨誘導を刺激する活性成長因子ＢＭＰ２（ＢＭＰ２は、骨再生について既に臨床的に承認されている）を使用することを選択した。ＢＭＰ２を多層フィルムに組み込んだもの（ＤＧＬ／ＢＭＰ２）を分析するために、積層後に水晶マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ）を行ったところ、各堆積後に厚さの直線的な増加が示された（図１）。
【０１２８】
図３は、膜のＳＥＭ画像（ｘ２０．０００）を示しており、ＢＭＰ−２を取り込んでいるナノリザーバー（ＮＲｎ）の交互積層を示す。非コーティング膜ＮＲ０（図３Ａ）と比較して、１個の層ペアの堆積（ＮＲ１、図３Ｂ）から異なるナノ構造を観察できる。ナノリザーバーは、３個（ＮＲ３、図３Ｃ及び図３Ｅ）又は６個の層ペア（ＮＲ６、図３Ｄ）で明確に識別可能である。
【０１２９】
図３Ｅで観察されるように（図３Ｃの拡大ＳＥＭ画像（ｘ３５．０００）、スケールバー：１μm）、コーティングは、ナノファイバーの表面全体を覆っていない。コーティングは、多層液滴が構成されるまで、ナノファイバーの狭い表面上にポリマーパッチを交互積層することによって構成される（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ）。１個の層ペアの堆積でわずかな液滴が観察され（図３Ｂ）、液滴数は、層ペアの堆積の数とともに増える。本発明によれば、フィルムコーティングを得る前に、堆積を中止する。
【０１３０】
連続的なＢＭＰ−２堆積工程の平均湿質量増分は、図１Ａに示されるデータから導き出した。各ＢＭＰ−２注入工程により、ＮＲ３構造までは約１８０ng cm-2のＢＭＰ−２、そしてそれ以上の工程では約３３０ng cm-2の固定化がもたらされた（図１Ｂ）。下層基板の考えられる影響を克服して安定した層成長型を達成するために、吸着工程は一般にほとんど必要ないことを考慮すると、この差異は予想外である。
【０１３１】
これらの膜が骨石灰化を誘導する能力をより詳細に分析するために、ヒト骨芽細胞による２１日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ石灰化後に共焦点ラマン顕微鏡法によってＥＮＭ  ＮＲ３膜を検査して、リン酸カルシウム（ＣａＰ）の堆積を検出した。基準として、非石灰化ＥＮＭ  ＮＲ３膜を分析した。ラマン信号は、ＣａＰに対する９６０cm-1付近の領域を除いて非常に類似しているが（図１Ｃ）、この領域では、石灰化膜の信号は、非石灰化膜とは反対に、ＣａＰの存在を証明する有意なピークを示している。後者のラマン信号は、ＰＣＬに対する９６３cm-1で弱いピークを示しているが、石灰化膜のＣａＰピークに対するその寄与は無視できるものである。石灰化膜全体のＣａＰピーク強度の二次元マッピングは（データは示さない）、ＥＮＭ  ＮＲ３膜全体にわたってＣａＰが塊状に堆積していることを示している。９６０cm-1及び４３０cm-1におけるピークは（図１Ｃ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）及び／又はリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）の存在を示しているが、１００５cm-1におけるピークは、明らかにＯＣＰに起因するものである。コーティングが純粋なＯＣＰである場合、９６６〜９７０cm-1にはショルダー型が現れるはずである。このような特徴が存在しないのは、必然的にＨＡｐピークの圧倒的な寄与によるものであり、このことが、ＨＡｐ及びＯＣＰが共存することを間接的に裏付けている。ＯＣＰは骨中ではＨＡｐの前駆段階であるので、ＯＣＰの存在は驚くべきものではない。
【０１３２】
これらの多層フィルムがヒト骨芽細胞の存在下で特異的遺伝子発現を誘導する能力も、免疫化学によって分析した。エレクトロスピニングナノファイバー膜（ＥＮＭ）用のコーティングとしてこの多層フィルムを使用することによって、ヒト骨芽細胞の増殖の増大がｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察され（図２Ａ）、（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）３で機能化した膜上でこれらの細胞を７日間培養した場合に、特異的遺伝子発現の増加も観察された；それぞれ、非機能化膜上で成長させた細胞と比較して４３．７（±８．８）倍高いオステオカルシン遺伝子発現、１３５．３（±２７．５）倍高いインテグリン結合シアロタンパク質（ＩＢＳＰ）遺伝子発現（骨マトリックスの主な構造タンパク質）、及び１８６．２（±５０．１）倍高いオステオポンチン遺伝子発現（図２Ｂ）。
【０１３３】
このナノ構造ＢＭＰ２活性ＥＮＭが移植３０日後に骨形成をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する効率をオステオポンチンの発現によって分析した（免疫蛍光から得られたデータは示さない）。
【０１３４】
この工程において、結果は、本発明を使用して、
（ｉ）ＢＭＰ２リザーバーを取り込んでいる（厚さ及びサイズがコントロールされた）ＥＮＭインプラントを設計できること（１型インプラント、以下の表１を参照のこと）；及び
（ｉｉ）骨形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで誘導できること
を明らかに示している。
【０１３５】
この膜は、患者に由来する細胞を追加することを必要とせずに、小さな骨の損傷に使用できる。残念なことに、大きくて深い損傷の場合は、患者に由来する骨芽細胞を追加することが必要になる。今日の診療所では、外科医は、骨形成をゆっくりと誘導し、すべての種類の損傷に使用できないコラーゲン膜（動物起源）を使用している。
【０１３６】
実施例４：２型インプラントの構築及び研究
本研究では、細胞化コラーゲンマトリックス（ヒト骨芽細胞、ＧＭＰ臨床用）を膜（１型インプラント、すなわち、上の実施例３に記載したように得られたインプラント）上に堆積させて、ナノ構造生体活性膜（２型インプラント、以下の表１を参照のこと）を作製した。このようなインプラントは、骨誘導を誘導できることを示した。
【０１３７】
活性膜（ＢＭＰ２のリザーバー）の表面上で成長している幹細胞（胚性幹細胞）を使用することによって、骨再生を誘導できることも示した（免疫蛍光から得られたデータは示さない）。
【０１３８】
図２Ｃにおいて、膜支持体なしでコラーゲンマトリックスを使用するよりも、ＢＭＰ２の活性リザーバーを含むＥＮＭ上に細胞を含むコラーゲンマトリックスを構築したものを使用することによって、ヒト骨芽細胞の増殖の増大が観察された。
【０１３９】
前述のように、インタクトな軟骨下層（骨）がなければ、軟骨表面の損傷についての処置は失敗する傾向がある。本発明者らは、軟骨下骨再生用のナノ構造ハイブリッド生体活性膜の最初の実例を報告する。これらの有望な結果は、現在利用可能なものよりも潜在的にさらにより効率的な外科的アプローチを示している。
【０１４０】
１型、２型及び３型インプラントの構築を以下の表１に要約する。
【０１４１】
【表１】
0005990720.tif 000002
【０１４２】
実施例５：治療分子のナノリザーバーを含む足場を用いたさらなる研究
図３において、本発明者らは、成長因子ＢＭＰ２を活性ナノ構造コーティングとしてエレクトロスピニングナノファイバー上にどのようにして組み込むことができるかを報告する。本明細書において、このコーティングがどのようにして交互に構築され得るのかを理解し、ナノファイバーの周囲のナノ構造組織をナノリザーバーとして認めることができる。
【０１４３】
骨修復の促進について、２型インプラントの効率をマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで研究した。ヌードマウス（雄、１６週齢）への移植２カ月後、回収したインプラントのナノ機械分析により、ＥＮＭ  ＮＲ０膜（１．７４±０．６５ＧＰａ）と比較して、１型インプラントＮａｎｏＭ１デバイスの弾性率（２．１９±０．３９ＧＰａ）が増加したことが示されたが、これは、組み込まれたＢＭＰ−２の効果による可能性がある。有望なことに、弾性率の最高値は、骨芽細胞を多く含む２型インプラント膜で測定された（１４．２６±２．１６ＧＰａ）。
【０１４４】
ネイティブな関節面によく似ており、長時間耐久性を維持するより予測可能な修復組織を達成することを目的として、骨軟骨単位全体の生理的特性を回復させることを、大きな軟骨欠損又は大きな骨軟骨欠損の処置目標にするべきである。本明細書において、本発明者らは、ＦＤＡによって承認されているポリマーを使用して製造し、成長因子（ＢＭＰ−２）のナノリザーバーで機能化した合成ナノ加工エレクトロスピニング膜に基づく戦略を使用した軟骨下骨再生の最初の実例を報告する。
【０１４５】
実際、本発明者らは、このようなインプラントが骨再生を誘導できることを示した（図５）。より具体的には、結果は、骨芽細胞のナノファイバー膜定着が起こること、及び石灰化も起こることを明らかに実証している。
【０１４６】
１型インプラントは、エレクトロスピニングポリ（ε−カプロラクトン）ナノファイバーよりもむしろBio-Gide（登録商標）吸収性コラーゲン膜（Geistlich Pharma AG, Germany）をナノファイバー足場として使用しても構築できることを示した（図７を参照のこと）。
【０１４７】
（ＤＧＬＧ５−ＢＭＰ２）ｎだけではなく（ＰＬＬ−ＢＭＰ２）ｎ及び（キトサン−ＢＭＰ２）ｎも、活性分子のナノリザーバーを得るのに適切であることをさらに示した（図１及び図６を参照のこと）。
【０１４８】
実施例６：キトサン及びＢＭＰ−２でコーティングした、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）ポリマーのエレクトロスピニングナノファイバー膜
金でコーティングした基板上にＣＨＩ／ＢＭＰ−２ＬｂＬ構造を積層する有効性を、ＱＣＭ−Ｄ（最大６回の吸着サイクル）によって実証した。ＣＨＩ／ＢＭＰ−２層ペアをそれぞれ新たに堆積させる際の堆積質量増分を約１．１μg cm-2（均等かつ均一な厚さで１０nmに対応する）とすると、それは線形成長型に従った（図８Ａ）。各ＢＭＰ−２吸着工程（工程＃２〜工程＃６）で固定化した成長因子の平均量は、１２５±７ng cm-2であった（図８Ｂ）。下層基板の考えられる影響を克服して安定した層状成長型を達成するために、吸着工程は一般にほとんど必要ないことを考慮すると（K. Abdelkebir, et al; Soft Matter 7 (2011) 9197-9205）、工程＃１及び工程＃２におけるＢＭＰ−２の吸着量がその後の工程よりもわずかに少ないことは予想外であった。
【０１４９】
エレクトロスピニングナノファイバー膜（ＥＮＭ）基板上に生体活性ＬｂＬ構造をナノスケール規模で堆積する有効性を、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって確認した。ネイティブなナノファイバーの滑らかな形態は、（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３で処理したナノファイバーの周囲に均一に分布したナノ構造堆積物に対して場所を提供した（図９Ｂ）。ＬｂＬ処理によって誘導された化学変化に加えて、ナノファイバーの粗さについての観察された変化もまた、細胞の挙動に影響を与え得る。８．０〜８．５の等電点の場合（M. Geiger, et al Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (2003) 1613-1629; T. Crouzier, et al., Small 5 (2009) 598-608; M.L. Macdonald, et al, Biomaterials 32 (2011) 1446-1453）、ＢＭＰ−２はほとんど中性のタンパク質であるが、生理的条件下（ｐＨ７．４）ではわずかに全体的に正に帯電する（S. Chen, et al, Sci. Technol. Adv. Mater. 12 (2011) 065003）。これは、正に帯電した中心のドメイン及び負に帯電した両端のドメインを有する細長い両性タンパク質である（C. Scheufler, et al, J. Mol. Biol. 287 (1999) 103-115）。ＣＨＩは６．５のｐＫａを有するので、ｐＨ７．４でプロトン化されるアミン部分の量は非常に少なく、ＣＨＩもわずかに正に帯電するようなものである。同じように帯電しているＣＨＩとＢＭＰ−２との間の反発静電相互作用（repulsive elecrostatic interactions）を考慮すると、これらの高分子から構成されるＬｂＬコーティングを積層する有効性は、最初のアプローチではかなり予想外のように思われ得る。
【０１５０】
培養２４時間後において、（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３で処理したＥＮＭ足場へのヒト骨芽細胞（ＨＯＢ細胞）接着は、ネイティブな足場と比較して明らかに促進されており、その結果、より広範にさらにより伸展した細長い細胞が、多数の糸状仮足突起を介してナノファイバーに固定された（データは示さない）。最近公開されたデータ（K. Anselme, et al, Acta Biomater. 6 (2010) 3824-3846; I. Wheeldon, et al, Nanotechnology 22 (2011) 212001）と一致して、ネイティブな足場に接着している細胞と、ＬｂＬ処理したＥＮＭ足場に接着している細胞との間の形態の変化は、ＬｂＬ処理によって表面の化学的性質及びナノトポグラフィーの両方が複合的に改変されたことによる可能性がある。改変ＥＮＭ足場がＨＯＢ細胞による特異的遺伝子発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導する能力を、免疫化学によって検証した（データは示さない）。従って、ＨＯＢのｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖は、処理したＥＮＭ足場では未処理のものと比較して非常に促進された（データは示さない）。本発明者らはまた、不活性タンパク質（アルブミン、ＢＳＡ）を多層コーティングに組み込んだものをネガティブコントロールとして分析したところ、ＨＯＢ細胞によるオステオポンチン発現は示されなかった（データは示さない）。
【０１５１】
これらの足場が骨石灰化を誘導する能力をより詳細に調べるために、ＨＯＢ細胞による２１日間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ石灰化後に、共焦点ラマン顕微鏡法によって、（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３で処理したＥＮＭ足場を分析して、リン酸カルシウム（ＣａＰ）の堆積を検出した。ＢＭＰ−２をＥＮＭファイバーに埋め込むためのＬｂＬ法の万能性を試験するために、ＣＨＩの代わりにポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）を使用して処理した足場も分析した。基準として、ネイティブな非石灰化足場を分析した。ラマン信号は、ＣａＰに対する４３０cm-1及び９６０cm-1付近の領域を除いてすべての足場で非常に類似していたが、これらの領域では、石灰化足場の信号は、非石灰化足場とは反対に、ＣａＰの存在を証明する有意なピークを示した（図８Ｃ）。後者のラマン信号は、ＰＣＬに対する９６３cm-1で弱いピークを示したが、石灰化膜のＣａＰピークに対するその寄与は無視できるものであった（P. Taddei, et al, J. Mol. Struct. 744-747 (2005) 135-143）。４３０cm-1及び９６０cm-1におけるピークは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）及び／又はリン酸オクタカルシウム（ＯＣＰ）の存在を示したが、１００５cm-1におけるピークは、明らかにＯＣＰに起因するものであった（B.O. Fowler, et al, Chem. Mater. 5 (1993) 1417-1423; N.J. Crane, et al, Bone 39 (2006) 434-442）。純粋なＯＣＰコーティングの場合、９６６〜９７０cm-1にはショルダーが現れるはずである（B.O. Fowler, et al, Chem. Mater. 5 (1993) 1417-1423; N.J. Crane, et al, Bone 39 (2006) 434-442）。ショルダーが存在しないのは、必然的にＨＡｐピークの圧倒的な寄与によるものであり、このことが、ＨＡｐ及びＯＣＰが共存することを間接的に裏付けている。ＯＣＰは骨中ではＨＡｐの前駆段階であるので、ＯＣＰの存在は驚くべきものではない（N.J. Crane, et al, Bone 39 (2006) 434-442）。
【０１５２】
石灰化足場全体のＣａＰのラマンピーク強度の二次元マッピングにより、（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３で処理したＥＮＭ足場全体にわたってＣａＰが塊状に堆積しているが、ＬｂＬ処理なしの場合、及びＣＨＩの代わりにＰＬＬを使用した場合の両方で堆積したＣａＰの量は非常に少なく、同程度であることが示された（データは示さない）。これらの結果は、ＣＨＩ／ＢＭＰ−２ＬｂＬ堆積物が生体石灰化に及ぼす有望な促進効果を裏付けている。また、堆積物の中のポリカチオン性成分の選択は、非常に重要である。ＣＨＩに基づく処理の効力が生体石灰化の点で顕著であるのは、表面に固定化されたＢＭＰ−２に細胞がアクセスしやすいためである可能性があり、これは、（ＣＨＩ／ＢＭＰ−２）３堆積物の開放的な板状の形態によって容易になるはずだが、（ＰＬＬ／ＢＭＰ−２）３堆積物のコンパクトな形態は埋め込まれた成長因子に細胞がアクセスするのを制限する可能性がある（図９Ａ；図９Ｂ）。キトサンの低柔軟性／高持続長（６〜１２nm）（H. Coelfen, et al. Polym. 45 (2001) 373-383）はＢＭＰ−２との相互作用を制限するが、ＰＬＬの高柔軟性／低持続長（２nm）（D.A. Brant, et al, J. Am. Chem. Soc. 87 (1965) 2788-2800）はＢＭＰ−２との相互作用の最適化を可能にするということで、異なる形態を説明できる。
【０１５３】
結果は、本発明によれば、（ｉ）ＢＭＰ−２を多く含み、コントロールされたサイズ及び厚さを有するＥＮＭインプラントを設計できること、（ｉｉ）骨形成をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導できることを示している。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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