(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞の分化を誘導し得る、一般式(I)：
【化１】
0005914509.tif 000018
（式中、
- Xは-Hを表し；
- R8は-(C=O)-NH-R1または-(C=O)-O-R1を表し；
- Wは-OHを表し；
- R1は、
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（アリール基で置換されていてもよい）
を表し；
- R2は-Hを表し；
- R3は、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（1以上のアリール基で置換されていてもよい）を表し；
- R4、R5、R6およびR7は-Hを表す）
の化合物(I)を活性物質として含む、骨芽細胞の機能または分化の調節異常および／または骨芽細胞と破骨細胞との間の機能不均衡によって惹き起こされる疾患の治療用医薬組成物。
【請求項２】
上記の疾患が骨粗鬆症；骨減少症；骨形成不全症；高カルシウム血症；副甲状腺機能亢進症；骨軟化症；骨壊死；骨のパジェット病(変形性骨炎)；リウマチ性関節炎；炎症性関節炎；骨髄炎；歯周炎；骨転移から生じる骨格の脆弱性および／または骨の希薄化および／または骨組織の脆化のような障害である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物に含まれる化合物が、一般式(I)において、R3基が3〜8個の炭素原子を有するアルキル基であり；R2基が水素原子であり；R4、R5、R6およびR7基が水素原子である、請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物に含まれる化合物が、
- プロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 1)；
- エチル 4-(1-ベンジル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 2)；
- エチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 3)；
- 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4)；
- ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 5)；
- tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 6)；
- ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7)；
- N-(4-ブチルカルバモイル)フェニル)-1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド (化合物 8)；
- イソプロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 9)
から選択される、請求項1または2に記載の医薬組成物。
【請求項５】
一般式(I)：
【化２】
0005914509.tif 000019
（式中、
- Xは-Hを表し；
- R8は-(C=O)-NH-R1または-(C=O)-O-R1を表し；
- Wは-OHを表し；
- R1は、
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（アリール基で置換されていてもよい）
を表し；
- R2は-Hを表し；
- R3は、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（1以上のアリール基で置換されていてもよい）を表し；
- R4、R5、R6およびR7は-Hを表す）
の化合物を活性成分として含む、間葉細胞の骨芽細胞への分化を誘導することにより怪我および／または外科手術後の骨組織の減少を改善するための、骨芽細胞へ分化させた自己細胞の移植片を製造するための医薬組成物。
【請求項６】
一般式(I)：
【化３】
0005914509.tif 000020
（式中、
- Xは-Hを表し；
- R8は-(C=O)-NH-R1または-(C=O)-O-R1を表し；
- Wは-OHを表し；
- R1は、
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（アリール基で置換されていてもよい）
を表し；
- R2は-Hを表し；
- R3は、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（1以上のアリール基で置換されていてもよい）を表し；
- R4、R5、R6およびR7は-Hを表す）
の化合物の少なくとも1つを溶液状態で含み、成体幹細胞または前駆細胞の発達を可能にする液体栄養培地中で、前記細胞を十分な時間インキュベートする工程を含む、成体幹細胞または前駆細胞から骨芽細胞を製造する方法。
【請求項７】
一般式(Ia)：
【化４】
0005914509.tif 000021
（式中、
- Xは-Hを表し；
- R8は-(C=O)-NH-R1または-(C=O)-O-R1を表し；
- Wは-OHを表し；
- R1は、3〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（アリール基で置換されていてもよい）を表し；
- R3は、3〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素鎖からなるアルキル基（1以上のアリール基で任意に置換されていてもよい）を表し；
- R4、R5、R6およびR7は-Hを表す）
で表される化合物（ただし、ブチル 4-(1-プロピル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエートを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞および前駆細胞の活性の調節、特に分化を含む活性を調節することができるキノリノン誘導体である化合物に関する；これらの化合物は、細胞の分化欠陥に関する障害の治療に役立つ；本発明は、これらのキノリノン誘導体のなかの新規な化合物およびそれを含む医薬組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病もしくは外傷後または年齢で損傷される組織の修復は、種々の細胞型に分化する能力を保持する幹細胞または前駆細胞をますます使用する。これらの細胞は、生物学的機能を回復させるために組織を新しくすることができる貯蔵所を構成する。間葉系幹細胞は、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞または造血支援(hematopoiesis-supporting)間質細胞を生じることができる。
【０００３】
一般的に、これらの細胞を選ばれた表現型に向けることができる技術は、面倒で（発現ベクターを用いる細胞の形質転換およびいくつかの遺伝子を発現させることが必要）、分化を誘導する小さい合成分子の使用のような代替の解決法が、有望な筋道を形成するであろう。
【０００４】
細胞の分化欠陥から生じる疾患のなかに、骨芽細胞分化の機能不全に関連するものがある。
【０００５】
骨は、破骨細胞による吸収と骨芽細胞による形成を含む複合過程によって生きている間絶えず新しくされる。
【０００６】
骨芽細胞前駆体は、間葉系幹細胞としても知られている多能性細胞である。しかしながら、これらの細胞を骨芽細胞系に分化させるメカニズムは、複雑で、骨の発達を理解するうえで非常に重要である。さらに、骨芽細胞分化を誘導し、それらの骨形成活性を刺激するであろう分子の特定は、骨疾患の治療における治療的なアプローチを示すであろう。
【０００７】
実際、多くの疾患が、骨芽細胞機能または分化の異常調節および骨芽細胞と破骨細胞との間の機能不均衡によっても引き起こされる。非常に広く研究された病態は−それが重要な経済的課題であるので−骨粗鬆症である；骨粗鬆症は、骨量の減少と骨微細構造の変化による、骨格の過度の脆弱性により特徴付けられる。骨の剛性は、2つのタイプの骨細胞：骨を硬くする骨芽細胞と骨を砕けやすくする（骨吸収に関与する）破骨細胞の作用の間の平衡から生じる。破骨細胞の優性活性は、成長の最後での不十分な骨ミネラルあるいは加齢の間に過度の骨量の減少のいずれかから生じうる骨粗鬆症をもたらす。骨粗鬆症の予防は、骨粗鬆症の前に、骨の希薄化障害および骨組織の脆化をもたらしうる生理的前駆現象、骨減少症（骨密度の減少）の減少により行うことができる。
【０００８】
その他の病状は、骨量の減少を誘導する機能障害に関連し；それには、
−骨形成不全症：この疾患は「脆弱骨疾患」としても知られており、骨格を形成する結合組織のコラーゲン線維の発達における先天的欠陥による骨の過度の脆弱性により特徴付けられる疾患と一緒のグループである。全てのタイプは、骨の極度の脆弱性によって特徴付けられ、それが次の疾患の最も典型的な兆候である；
【０００９】
− 高カルシウム血症；
− 副甲状腺機能亢進症；
− 骨軟化症；骨格のタンパク質構造の鉱化作用の欠陥（カルシウムおよびリ  ン酸イオンの欠如）によって誘導される骨の脱石灰化に相当する；
− 骨壊死；骨組織の細胞の死によって定義される病気を包含する；
【００１０】
− 骨のパジェット病（変形性骨炎）；1以上の骨に局在し、骨片の進行性肥  大および骨微細構造の相当な異常をもたらす過剰な骨再形成によって特徴付  けられる骨障害；
− リウマチ性関節炎；
− 炎症性関節炎；
− 骨髄炎；
− 歯周炎；
− 骨転移。
【００１１】
骨組織の再生はまた、骨折、形成手術またはインプラントの挿入、特に歯科インプラントのような骨の修復を促進しようとする場合に必要となりうる。
【００１２】
骨芽細胞分化は、例えば、TGB-β(形質転換成長因子 β1)、ヘッジホッグ(Hh)タンパク質、Wnt、FGF(線維芽細胞増殖因子)、IGF1(インスリン様成長因子 1)またはBMP(骨形成タンパク質)の経路を含む多くのシグナル伝達経路によって影響を及ぼされる(Centrella et al. 1994; Yamaguchi et al. 2000; van der Horst et al. 2003; Fromigue et al. 2004; Hu et al. 2005)。
【００１３】
BMPは首尾よく用いられているけれど(Johnson and Urist 2000)、それは高価であり、効率的な細胞分化を行うために必要とされる用量は、許容な生理学的閾値よりはるかに高い。代替手段は、インビボでBMP活性を調節することができる小さい分子の使用であろう(Yu et al. 2008)。
【００１４】
TGF-βもまた、破骨細胞と骨芽細胞との間の活性のバランスを調節する主な関与物として記載されている。 最近、その受容体の薬理学的阻害剤が、骨芽細胞で刺激活性および破骨細胞で阻害活性を示している(Mohammad et al. 2009)。
【００１５】
IGF1の役割は十分に研究されているが、組換えヒトIGF1の使用は、骨代謝に影響を及ぼすにも拘らず、いくつかの不都合を有する。それは、骨格を特異的に標的とせず、骨疾患への使用を制限する副作用を引き起こす。
【００１６】
ヘッジホッグシグナル伝達分子は、骨を含む多くの組織の形態形成および細胞増殖においても基本的な役割を果たし、成体において組織維持および修復に関与するようである(Ingham and McMahon 2001; Wechlser-Reya and Scott 2001; Marti and Bovolenta 2002; Lum and Beachy 2004; Varjosalo and Taipale 2008による総説参照)。
【００１７】
ヘッジホッグ経路の刺激は、種々のモデルで骨形成を誘導することができる。いくつかのアゴニスト分子が研究されている：
− Patchedタンパク質に作用することにより骨芽細胞分化を刺激するヘッジホッグタンパク質および誘導されたポリペプチド(Spinella-Jaegle et al. 2001; Guan et al. 2009)；
− 培養下でヒト骨芽細胞を活性化することができるプルモルファミン(Wu et al. 2004; Beloti et al. 2005)；
【００１８】
− SAGのような小さい有機分子(Chen et al. 2002)；
− Hh Ag1.2 分子(Frank-Kamenetsky et al. 2002)；
− 骨芽細胞分化および骨形成を誘導するオキシステロール誘導体(Corcoran   and Scott 2006; Amantea et al. 2008) (Aghaloo et al. 2007; Dwyer et   al. 2007; Yu et al. 2008)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
しかしながら、細胞分化を調節することができる新規な分子、特に、骨形成活性を有し、良好な活性と限られた費用を結びつけることができる分子を特定することはなお有用である；そのような分子は、骨関連の病態を治療するために特に興味があるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、細胞分化、特に骨芽細胞分化を誘導することができる一般式(I)の化合物を特定した；それゆえ、これらの化合物は、幹細胞または前駆細胞の骨芽細胞またはその他の細胞型への分化を刺激するための新規な薬剤を表す。
【００２１】
「幹細胞」の用語は、細胞分化によって特殊化した細胞を生じることができ、それ自身を実質的に無制限に再生することができる未分化の胚または成体細胞を意味することが意図される。好ましくは、成体幹細胞が用いられる。
前駆細胞は多能性の成体細胞、すなわち、その細胞分化がいくつかの細胞型をもたらすことができる細胞である。
【００２２】
本出願において、細胞がアルカリホスファターゼを産生するとき、細胞が骨芽細胞分化に関与すると見なされ、その結果、それらは、「骨芽細胞表現型を有する細胞」と称される。そのような細胞は、栄養培地中でのそれらの継続的インキュベーションの間および／またはそれらの注入が、該細胞の少なくとも一部が(石灰化した細胞外マトリックスの産生を有する)最終分化のところまで分化することを高めることを可能にするほど骨芽細胞分化に十分に関与する。これらの細胞の特有の性質(すなわち、アルカリホスファターゼの産生)の実証は、慣用的、例えば以下の実験の部で言及される試験を用いて行うことができる。
【００２３】
その結果、本発明の主体は、幹細胞または前駆細胞の細胞分化を誘導するための使用、具体的には、以下の使用が幹細胞または前駆細胞の細胞分化を誘導することを可能にする、骨芽細胞機能または分化の異常調節および／または骨芽細胞と破骨細胞との間の機能不均衡によって引き起こされる疾患を治療するための使用のための、次の一般式(I)の化合物である：
【化１】
0005914509.tif 000002
【００２４】
（式中、
- Xは、オルト、メタまたはパラ位において、-H、-OH、-NH2、ハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し；
【００２５】
- R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、-(C=O)-NH-R1、-(C=O)-O-R1または-NH-(C=O)-R1を表し；
- Wは、-H、-OH、-NH2またはハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素を表し；
【００２６】
- R1、R2およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して；
- 水素原子；または
- 1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基（1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、OおよびSのような1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基、好ましくはピリジン基で任意に置換される）；または
- 3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル（1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基または(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基で任意に置換される）
を表し；
【００２７】
- R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、-H、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、または3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルから選択され；
R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって5-もしくは6-員環を形成するように縮合することができると解釈される）。
【００２８】
本発明のために、「アルキル」の用語は、1〜10個の炭素原子、好ましくは3〜8個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖状の飽和炭化水素ベースの脂肪族基を意味することが意図される。
【００２９】
「分枝」の用語は、1〜6個の炭素原子を有する少なくとも1つのアルキル基、例えばメチルまたはエチルを、直鎖のアルキル鎖が有していることを意味する。
【００３０】
「ハロゲン原子」の用語は、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素原子を意味することが意図され；臭素および塩素の意味が好ましい。
【００３１】
「アリール基」の用語は、少なくとも1つの芳香環から誘導されるいずれかの官能基または置換基を意味することが意図され；フェニル、ベンジルシクロブテン、ペンタレン、ナフタレン、ベンジルフェニルおよびアントラセン基が挙げられうる。
【００３２】
「ヘテロアリール基」の用語は、前で定義された芳香環の少なくとも1つから誘導され、かつP、S、OおよびNから選択されるヘテロ原子を少なくとも1つ含む、いずれかの官能基または置換基を意味することが意図され;ヘテロアリール基の中で、フラン、ピリジン、ピロール、チオフェン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、インドール、イソインドール、ベンゾチオフェン、ベンゾ[c]チオフェン、ベンズイミダゾール、インダゾール、ベンズオキサゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プリンおよびアクリジン基が挙げられうる。
【００３３】
好ましくは、一般式(I)の化合物は、R3基が、3〜8個の炭素原子を有するアルキル基、例えばヘキシル基であり；R2基が、水素原子または1〜3個の炭素原子を有するアルキル基であり；R4、R5、R6およびR7基は、水素原子または1〜3個の炭素原子を有するアルキル基を表すようなものである。
【００３４】
一般式(I)の化合物として、、非限定的に、次の化合物が特に挙げられうる：
- プロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 1):
【化２】
0005914509.tif 000003
【００３５】
- エチル 4-(1-ベンジル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 2):
【化３】
0005914509.tif 000004
【００３６】
- エチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 3):
【化４】
0005914509.tif 000005
【００３７】
- 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4):
【化５】
0005914509.tif 000006
【００３８】
- ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 5):
【化６】
0005914509.tif 000007
【００３９】
- tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 6):
【化７】
0005914509.tif 000008
【００４０】
- ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7):
【化８】
0005914509.tif 000009
【００４１】
- N-(4-ブチルカルバモイル)フェニル)-1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド (化合物 8):
【化９】
0005914509.tif 000010
【００４２】
- イソプロピル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 9):
【化１０】
0005914509.tif 000011
【００４３】
本発明に基づく一般式(I)の化合物は、図1に示される合成スキームに従って製造される。
図1の合成スキームに従って、第1の工程において、アニリンが、キノリノンカルボキシレートを得るためにマイクロウエーブ照射下、トリエチル メタン トリカルボキシレートと縮合され；次に、該キノロンが、カルボキシアミドキノリノンエステルを得るためにマイクロウエーブ照射下、4-tert-ブチルアニリンと縮合され；次の工程は、酸を得るためにこれらの化合物のエステル官能基をけん化することからなり、該酸が、実施例に示される種々の変更のための出発点である。
【００４４】
本発明による一般式(I)の化合物は、間葉細胞の骨芽細胞への分化を誘導する性質を有する。
【００４５】
この点で、これらの化合物は、骨芽細胞への分化が誘導された自己細胞から得られる移植片(implant)の製造で興味がある；これらの移植片は、怪我および／または外科手術後の骨組織の減少を改善するのに役に立つ。
【００４６】
、
それゆえ、一般式(I)の化合物は、骨芽細胞機能または分化の異常調節および／または骨芽細胞と破骨細胞との間の機能不均衡によって引き起こされる疾患の治療で特に興味がある。
【００４７】
具体的には、これらの化合物は、骨粗鬆症；ならびに骨減少症；骨形成不全症；高カルシウム血症；副甲状腺機能亢進症；骨軟化症；骨壊死；骨のパジェット病(変形性骨炎)；リウマチ性関節炎；炎症性関節炎；骨髄炎；歯周炎；骨転移から生じる骨格の脆弱性および／または骨の希薄化および／または骨組織の脆化のような障害の治療に役に立つ。
【００４８】
さらに、より一般的に、前駆細胞分化に作用する分子は、多くの急性、亜急性または慢性、遺伝的または後天的(組織機能不全を含む)病態の内科的または外科的治療(形成手術または再建手術、組織もしくは臓器移植)において、非限定的に、神経系[中枢神経系(脳)および末梢神経系(知覚、運動、交感神経のニューロン)、骨、軟骨、精巣、肝臓、脾臓、腸、膵臓、腎臓、平滑筋および骨格筋、心臓、肺、皮膚および体毛系、粘膜、血液細胞および免疫細胞のような組織の活性の形成、再生、回復および／または増加を誘導するのに役に立つ。これらの病態の非限定の例として、神経障害および関連神経筋疾患、糖尿病、脱毛症、やけど、潰瘍(皮膚および粘膜)ならびに精子形成障害が特に挙げられうる。
【００４９】
本発明は、溶液状態で一般式(I)の化合物の少なくとも1つを含み、幹細胞または間葉細胞のような前駆細胞の発達を可能にする液体栄養培地中で、幹細胞または間葉細胞のような前駆細胞を十分な時間インキュベートする工程を含む、幹細胞または間葉細胞のような前駆細胞から骨芽細胞を製造する方法にも関する。
【００５０】
実際には、前記細胞は、それらの発達、すなわちそれらの生存だけでなく増殖および／または分化を可能にする標準的条件下の培地中でインキュベートされる。ヒト細胞を培養するための標準的条件は知れらており、例えば約37℃の温度；空気-CO 95:5の雰囲気；中性に近いpHである。
【００５１】
用いられる培地は、哺乳動物の細胞の発達に必要な成分を含む、慣用の液体栄養培地である。これらの成分は知られている。それらは、主に無機塩(特に、Na、K、Mg、Caおよび任意にCu、Fe、Zn)、アミノ酸、ビタミンおよび炭素源(例えばグルコース)である。ウシ胎仔血清または好ましくは自己ヒト血清が追加されたイーグル最小必須培地MEMのような栄養培地の使用が特に挙げられうる。
【００５２】
任意にハムF12培地との混合物として、血清を含むか含まない、好ましくは自己血清の存在下での、DME(ダルベッコ改変イーグル培地)タイプのより手の込んだ栄養培地も使用されうる。
【００５３】
これらの培地は、前記以外のBMP因子のような骨誘導因子が追加されうる。これらの因子は、本発明の方法で用いられるヒト細胞の骨芽細胞分化を誘導するために必ずしも必要でない。それゆえ、骨誘導因子を含まない培地を用いることができる。
【００５４】
好ましくは、用いられる培地は、アスコルビン酸およびβ-グリセロホスフェート(例えば、ナトリウムまたはカルシウム β-グリセロホスフェート)のような骨促進(osteopromotive)因子が追加される。
【００５５】
本発明は、ブチル 4-(1-プロピル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート自身および医薬としてその使用のためを除く、一般式(Ia)の新規な化合物にも関する：
【化１１】
0005914509.tif 000012
【００５６】
（式中、
- Xは、オルト、メタまたはパラ位において、-H、-OH、-NH2、ハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキルまたはアリール基を表し；
【００５７】
- R8は、X基を有する炭素以外の炭素上のオルト、メタまたはパラ位において、-(C=O)-NH-R1、-(C=O)-O-R1または-NH-(C=O)-R1を表し；
- Wは、-H、-OH、-NH2またはハロゲン原子、好ましくは塩素もしくは臭素を表し；
【００５８】
- R1およびR3は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、3〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基（1以上の2重もしくは3重結合で任意に不飽和であり、OおよびSのような1以上のヘテロ原子、1以上のハロゲン原子または1以上のアリールもしくはヘテロアリール基、好ましくはピリジン基で任意に置換される）を表し；
【００５９】
- R4、R5、R6およびR7は、同じかまたは異なっていてもよく、かつ互いに独立して、-H、-Cl、-Br、-I、-CN、-NO2、1〜10個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖状の炭素ベース鎖からなるアルキル基、(アルキル基が前で定義されたとおりである、式 -O-アルキルの)アルコキシ基、または3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル、例えばシクロプロピル、シクロペンチルもしくはシクロヘキシルから選択され；
R3およびR4は、それらを有するキノリン環の隣接する窒素および炭素原子と一緒になって6-員環を形成するように縮合することができると解釈される）。
【００６０】
好ましいR5およびR7基は、互いに独立して、-H、-Cl、-Br、-CNおよびアルキル基またはアルコキシ基から選択される。
【００６１】
有用な用量は、治療される病気、投与経路および投与速度により、ならびに治療される対象（ヒトまたは動物）の種および体重によっても変化するであろう。
【００６２】
本発明は、活性成分として本発明による一般式(Ia)の少なくとも1つの化合物および少なくとも1つの医薬的に許容な賦形剤を含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。
【００６３】
本発明に基づく医薬組成物において、好ましくは、一般式(Ia)の化合物は、およそ1 mg〜2 gの間の単位用量で投与することができる量で用いられる。
【００６４】
当業者は、医薬組成物の投与経路により、1以上の医薬的に許容な賦形剤を選択するであろう。もちろんその際に、当業者は、用いられる賦形剤が本発明に基づく組成物に関連する固有特性と両立できることを確認するであろう。
【００６５】
さらに、医薬または薬組成物の形態（例えば、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、カプセル剤、坐剤等）は、選択される投与経路に依存するであろう。
【００６６】
したがって、本発明のために、医薬または医薬組成物は、例えば、経口、肛門、局所、全身、静脈内、筋肉内または粘膜のようないずれかの適した経路あるいはパッチを用いて、代替として、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル等の状態でカプセル化された形態または固定化された形態で投与される。
【００６７】
経口投与に適した賦形剤の非限定的な例として、特に、タルク、乳糖、澱粉およびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ポリエチレングリコール、アクリル酸ポリマー、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、動物性、植物性または合成脂肪、パラフィン誘導体、グリコール、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、湿潤剤、凝固防止剤、分散剤、乳化剤、味覚調節剤、浸透剤、可溶化剤等が挙げられうる。
【００６８】
医薬および医薬組成物の製剤化および投与の技術は、ここでの考慮の技術でよく知られており、特に、当業者は、ハンドブックRemington's Pharmaceutical Sciences(第21版)を参照することができる。
【００６９】
前記の取り決め(arrangement)に加えて、本発明は、以下の記載から現れるであろうその他の取り決めも含み、それは、本発明による一般式(I)の化合物の合成の実施例、使用の実施例に言及し、次における添付の図にも言及する：
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、一般式(I)の化合物の合成スキームを表す。
【図２】図２は、一般式(I)の化合物の作用下、間葉系幹細胞の分化後に誘導されるアルカリホスファターゼの組織化学的検出を示す。細胞は、通常の培地中、6日間、示された化合物1、4、6または8の10 μMの存在下で培養された。次いで、骨形成に対するマーカーであるアルカリホスファターゼの存在を明らかにするために、細胞を組織化学により染色（より暗い点の形態で現れる赤い標識）し、次いで写真に撮った。
【図３】図３は、C3H10T1/2間葉系幹細胞の分化における化合物1の効果の指標であるアルカリホスファターゼ酵素活性における化合物1の効果を示す。化合物1によって誘導される分化は、アルカリホスファターゼ酵素活性（415 nmでのOD）によって測定されている（円）。比較のために、SAGを用いての同じ実験で得られた細胞の分化が示されている（四角）。5つの独立した実験に対しての代表曲線±SDが示されている。  化合物2〜9に対して得られた曲線は図4〜11に示されている。これらの化合物全て、それぞれの化合物に対して特徴的な差を有して分化を刺激することができる。最大の活性は、大半は10 μMで観察される。
【図４】化合物2によるC3H10T1/2細胞の分化。化合物2に対する応答は、化合物1に対して用いられたのと同じ実験条件下で評価された。比較のため、化合物1（10 μM）を用いた同じ実験で得られた細胞の分化を菱形で示している。2-3の独立実験に対する代表曲線。  次の化合物の効果も、化合物1に対して用いられたのと同じ実験条件下で試験された。
【図５】化合物3により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図６】化合物4により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図７】化合物5により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図８】化合物6により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図９】化合物7により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図１０】化合物8により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【図１１】化合物9により誘導されたC3H10T1/2細胞の分化。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７１】
実施例１：式(I)の種々の化合物の合成
エチル 1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシレートの製造
【化１２】
0005914509.tif 000013
【００７２】
コンデンサーを備えた丸底フラスコ中、メタントリカルボン酸トリエチルエステル (1.35 ml, 6.4 mmol)の溶液に、N-ヘキシルアニリン (355 mg, 2 mmol)を加える。得られる反応混合物をCEM Discoveryマイクロウエーブオーブン中に入れ、開放した丸底フラスコ中で照射し、次いで生成されるエタノールを溜去する（パラメータは次のとおりである：出力 = 250 W、温度 = 225℃、実行時間 = 5分、保持時間 = 15分）。
【００７３】
マイクロウエーブ加熱後、粗反応混合物を、4:1で石油エーテル：酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムで精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、本化合物：収量 = 430 mg (69%)を得る。
【００７４】
1H NMR (CDC13): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.64 (m, 1H), 7.27-7.19 (m, 2H), 4.48 (q, J = 8Hz, 2H), 4.18 (t, J=8Hz, 2H), 1.72-0.86 (m, 14H).
【００７５】
I.A. tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物6)
【化１３】
0005914509.tif 000014
【００７６】
エチル 1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシレート (159 mg, 0.5 mmol)およびtert-ブチル 4-アミノベンゾエート (193 mg, 1 mmol)を無水トルエン (4 ml)中に懸濁し、開放の容器を用いてマイクロウエーブ加熱した（パラメータは次のとおりである：出力 = 200 W、温度 = 120℃、実行時間 = 7分、保持時間 = 10分）。
【００７７】
反応の最後で、溶媒の2/3をコンデンサーなしで蒸発させる。粗反応混合物を4:1の石油エーテル：酢酸エチルを用いるクロマトグラフィーカラムにより精製する。得られる結晶の生成物を乾燥し、標記の化合物：収量 = 195 mg (84%)を得る。
【００７８】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.90-7.75 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.25 (bs, 2H), 1.60 (bs, 2H), 1.52 (s, 9H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).
【００７９】
I.B. 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (化合物 4)
【化１４】
0005914509.tif 000015
【００８０】
0℃に冷却したトリフルオロ酢酸(TFA)の溶液に、tert-ブチル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (83 mg, 0.18 mmol)を少しずつ加え、該混合物を3時間反応させる。得られる粗生成物を、白色の結晶固体が生じるまでエチルエーテルで洗浄する。生成物を乾燥し、収量61 mg (83%)を得る。
【００８１】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 7.97-7.65 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 4.27 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.39 (bs, 2H), 1.28 (bs, 5H), 0.84 (bs, 2H).
【００８２】
I.C. ベンジル 4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)ベンゾエート (化合物 7)
【化１５】
0005914509.tif 000016
【００８３】
4-(1-ヘキシル-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1,2-ジヒドロキノリン-3-カルボキシアミド)安息香酸 (41 mg, 0.1 mmol)のTHF溶液を0℃に冷却し、ベンジル アルコール (21 mg, 20 μl, 0.2 mmol)をEDCI (19 mg, 0.1 mmol)およびジメチルアミノピリジン (3 mg, 0.02 mmol)と一緒に加える。反応混合物を終夜撹拌する。有機層を水で洗浄し、減圧下に蒸発させる。粗生成物を4:1 石油エーテル：酢酸エチルを用いるカラムクロマトグラフィーで精製し、収量30 mg (60%)を得る。
【００８４】
1H NMR (DMSO): δ 8.16 (d, J=8Hz, 1H), 8.04 (d, J=8Hz, 2H), 7.83 (d, J=8Hz, 3H), 7.68 (d, J=8Hz, 1H), 7.46-7.25 (m, 6H), 7.38 (m, 1H), 5.30 (s, 2H), 4.28 (bs, 2H), 1.59 (bs, 2H), 1.41-1.15 (m, 6H), 0.84 (bs, 3H).
【００８５】
実施例II - 一般式(I)の化合物の骨形成への効果の立証
本発明に基づく一般式(I)の骨形成の刺激に対する効果を、インビトロで多能性間葉細胞株C3H10T1/2の分化を分析することにより測定した。
【００８６】
II.1) 材料と方法
化合物の溶解、細胞培養
式(I)の試験化合物は、ジメチルスルホキシド中、2.5 mMの濃度に溶解され、次いで、用いられるまで-20℃の温度で保存された。
【００８７】
C3H10T1/2多能性線維芽細胞株(ATCC)は、10%のウシ胎仔血清が追加されたDMEM培地中、37℃の温度で、5% CO2雰囲気下、播種後24時間、ATCCによって推奨される条件下で培養され、該細胞は、前記培地で直接希釈された一般式(I)の化合物の存在下、6日間刺激された。これらの化合物による活性化は、前記細胞株の骨芽細胞系への分化を引き起こし、後者がアルカリホスファターゼを発現できるようする。次いで、該アルカリホスファターゼを組織化学および酵素アッセイにより検出する。
【００８８】
組織化学によるアルカリホスファターゼの検出
この実験のために、細胞はガラス製のカバースリップを含む6ウエルプレート中で培養され、0.05 mg/ml ポリ-D-リシンで1時間処理される。C3H10T1/2細胞をウエル当たり150 000細胞の密度で播種する。化合物を10 μMの濃度で適用し、記載された手順に従ってSigma染色キット(85L-3R)を用いた。簡単に言えば、クエン酸塩／アセトン(2-3)の溶液で30秒間、細胞を固定した後、次いで再蒸留水で洗浄し、暗所で、Fast-Violet/ナフトールの溶液の存在下、30分間染色を行った。次いで、カバースリップを再蒸留水で完全に洗浄し、次いで水性媒体中で標本にした(mounted)後、DMRXA2顕微鏡(Leica Microsystems)で撮影した。アルカリホスファターゼを発現する細胞は赤く染色される。
【００８９】
96ウエルプレート中でのアルカリホスファターゼの酵素アッセイ
C3H10T1/2細胞を、ウエル当たり5×103 細胞の密度で96ウエルプレートに播種した。化合物を10 nM〜10 μMの範囲の増大濃度で適用した。次いでプレートを6日間インキュベートし、次いで、前に記載された方法(Chen et al. 2002; Frank-Kamenetsky et al. 2002)に従って、4反復でアッセイを行った。
【００９０】
細胞を冷たいリン酸緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水)中で洗浄し、次いで、0.9%のNaClおよび0.2%のTriton X-100を含む50 μlの溶液中、4℃での超音波処理により溶解した。次いで、得られた溶解物中のアルカリホスファターゼを、Pepinskyらによって記載された方法(Pepinsky et al. 1998)に従って測定した。100 μlの反応緩衝液 (200 mM Tris-HCL; pH 10.5; 0.4 Mの2-アミノ-2-メチルプロパノールおよび8 mMのMgCl2)と50 μlの基質 (4 mMのジナトリウム p-ニトロフェニル ホスフェート)の溶液を添加後、該溶解物を37℃で60分間インキュベートし、次いで光学密度(OD)を415 nmの波長で読み取った。比較のために、ヘッジホッグ経路に作用することによって骨形成を活性化するSAG化合物の活性を同条件下で試験した。GraphPad Prism 4(登録商標)ソフトウエアを用いて、曲線を描き、有効濃度50 (EC50)を決定した。
【００９１】
II.2) 結果
II.2-1. 式(I)の化合物による、間葉系幹細胞の骨芽細胞系への分化の組織化学的実証
C3H10T1/2多能性細胞での骨形成の刺激を、アルカリホスファターゼ(AP)の誘導を観察することによりアッセイした。10 μMの式(I)の化合物の存在下での分化の6日後、APの発現を組織化学的染色によって検出した。例として、化合物1、4、6および8の存在下、標識された細胞数の増加が、程度の差はあるが強い輝度で観察された(化合物4＞化合物1＞化合物8＞化合物6)。溶媒(DMSO)で処理された細胞は、この方法による検出可能なレベルでAPを発現しない。
【００９２】
II.2-2. 式(I)の化合物による、間葉系幹細胞の分化：アルカリホスファターゼ活性のアッセイ
式(I)の化合物の用量作用曲線を10 nM〜10 μMの間で作図し、C3H10T1/2細胞分化の活性化に対する化合物の親和性(affinities)を測定した。図3は、受容体アゴニストSAGのそれと並行して作成された、化合物1の代表的曲線を示している。それらの親和性は類似しているが、SAGは化合物1より低い最大刺激を与える。
【００９３】
化合物2〜9に対して得られた曲線が図4〜11に示される。これらの化合物全て、それぞれの化合物に対して特徴的な差を有して分化を刺激することができる。最大の活性は、大半は10 μMで観察される。
【００９４】
これらの曲線の搾取(exploitation)の結果が、以下の表Iに示される。化合物の親和性は、1マイクロモルのオーダーである。化合物2は、化合物1の4%の最大活性を有して最も低い活性である。逆に、化合物4は、0.6 μmの親和性と化合物1のそれより20%大きい最大刺激を有して最も良好な活性を示す化合物である。
【００９５】
【表１】
0005914509.tif 000017
【００９６】
分化に対する化合物の有効濃度50(EC50)はμMで表される。最大刺激は、同じ実験において化合物1で得られた最大刺激の百分率として表される。データは2〜5の独立実験の平均に相当する。
【００９７】
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【図１】
0005914509.tif 000022
【図２】
0005914509.tif 000023
【図３】
0005914509.tif 000024
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005914509.tif 000028
【図８】
0005914509.tif 000029
【図９】
0005914509.tif 000030
【図１０】
0005914509.tif 000031
【図１１】
0005914509.tif 000032