(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する方法であって、校正試料が３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液である、測定方法。
【請求項２】
以下の１）〜３）の工程を含む、請求項１記載の測定方法。
１）校正試料と被検液において、メバロン酸を前処理により消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
２）校正試料と被検液において、メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
３）１）と２）の測定値の差からメバロン酸量を求める工程
【請求項３】
前処理がメバロン酸キナーゼにより行われる、請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する方法において、校正試料として用いるための、酸を含む、安定性が向上した３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液。
【請求項５】
酸が塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、および酢酸からなる群から選ばれるもの、またはその組み合わせである、請求項４記載の溶液。
【請求項６】
ｐＨが４以下である、請求項４または５記載の溶液。
【請求項７】
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの濃度が０．１ｍＭ以下である、請求項４〜６のいずれか一項記載の溶液。
【請求項８】
酸の濃度が０．１ｍＭから１００ｍＭである、請求項４〜７のいずれか一項記載の溶液。
【請求項９】
酸が硫酸であり、さらに界面活性剤を含む、請求項４〜８のいずれか一項記載の溶液。
【請求項１０】
校正試料が請求項４〜９のいずれか一項記載の溶液である、請求項１〜３のいずれか一項記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素サイクリング反応による測定方法およびその校正試料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する方法において、被検液中にメバロン酸以外に酵素サイクリング反応の基質となる物質が存在する場合には前処理によりメバロン酸を消去した被検液と前処理をしない被検液で酵素サイクリング反応を行い、そのシグナルの差からメバロン酸量を正確に測定する方法が報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０８２６６５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
被検液中のメバロン酸を測定する方法において、前処理により被検液中のメバロン酸を消去してから酵素サイクリング反応を行う工程を含む場合、該工程の校正試料として、濃度が既知のメバロン酸溶液は前処理によりメバロン酸が消去されるため検量線を作成することができず、実質的に使用することができない。
そこで、本発明が解決しようとする課題は、酵素サイクリング反応による被検液中のメバロン酸の測定方法において、メバロン酸をより正確に測定することのできる方法を提供することにある。
【０００５】
また、特許文献１には、保存安定性など性能向上を目的として、メバロン酸、コエンザイムＡまたは３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの標準物質に添加物を適宜加えてよいと記載されているものの、その添加物の具体的な成分および濃度、安定性向上の程度等詳細は開示されておらず、実現可能性は乏しいものであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、不安定な３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを安定化させる方法を見出したことにより、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いて被検液中のメバロン酸を測定することのできる方法を見出し、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は以下のとおりである。
［１］
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する方法であって、校正試料が３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液である、測定方法。
［２］
以下の１）〜３）の工程を含む、［１］記載の測定方法。
１）校正試料と被検液において、メバロン酸を前処理により消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
２）校正試料と被検液において、メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
３）１）と２）の測定値の差からメバロン酸量を求める工程
［３］
前処理がメバロン酸キナーゼにより行われる、［２］記載の測定方法。
［４］
酸を含む、安定性が向上した３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液。
［５］
酸が塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、および酢酸からなる群から選ばれるもの、またはその組み合わせである、［４］記載の溶液。
［６］
ｐＨが４以下である、［４］または［５］記載の溶液。
［７］
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの濃度が０．１ｍＭ以下である、［４］〜［６］のいずれか記載の溶液。
［８］
酸の濃度が０．１ｍＭから１００ｍＭである、［４］〜［７］のいずれか記載の溶液。
［９］
酸が硫酸であり、さらに界面活性剤を含む、［４］〜［８］のいずれか記載の溶液。
［１０］
校正試料が［４］〜［９］のいずれか記載の溶液である、［１］〜［３］のいずれか記載の測定方法。
［１１］
酸を用いる、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイム溶液の安定化方法。
［１２］
酸が塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、および酢酸からなる群から選ばれるもの、またはその組み合わせである、［１１］記載の安定化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に従うと、酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定が正確になる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態（以下、本実施の形態という。）について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。
【００１０】
本実施の形態の酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定方法は、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する際に、校正試料が３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液である、測定方法である。
本実施の形態において、酸を含むことにより、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液において、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定性が向上したことが見出された。本実施の形態においては、かかる安定性が向上した３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を、校正試料として用いることで、より正確に被検液中のメバロン酸量を測定することのできる方法を提供することができる。
【００１１】
本実施の形態においては、特許文献１に記載されるメバロン酸の測定方法を用いてメバロン酸の測定を行うものであるが、その際に、校正試料として３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を用いることにより、より正確にメバロン酸を測定する方法を提供する。
【００１２】
一般に、測定試薬を用いて被検液中に存在する物質Ａの量を吸光度、発光量、電気量等のシグナル量に変換することで測定する場合には、既知量の物質Ａを含む被検液（校正試料またはキャリブレーターと呼ばれる）を用いて、シグナル量と物質Ａの濃度の関係を表す検量線が必要である。検量線は直線近似で表されることもあるが、多次式近似、指数関数近似、スプライン近似で表されることもある。
したがって、酵素サイクリング反応でメバロン酸濃度を測定しようとする場合は既知濃度のメバロン酸を含む校正試料を用いて検量線を作成する必要がある。
【００１３】
例えば、特許文献１では、メバロン酸濃度を測定しようとする際には、被検液中のメバロン酸を除去したサンプルと除去しないサンプルの２つを準備し、それぞれのサンプルに下記反応式１および反応式２の反応を触媒する酵素を作用させ、それらの測定量の差から被検液中のメバロン酸を算出する方法として記載されている。そして、以下のｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）の工程を含む測定方法としてメバロン酸溶液を校正試料として測定する場合が例示されている。
ｉ）校正試料と測定試料において、前処理によりメバロン酸を消去したのち酵素サイクリング反応を行い吸光度を測定する工程
ｉｉ）校正試料と測定試料において、メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い吸光度を測定する工程
ｉｉｉ）校正試料においてｉ）とｉｉ）の吸光度差とメバロン酸濃度の関係から検量線を作成し、測定試料のｉ）とｉｉ）の吸光度差からメバロン酸濃度に変換する工程
具体的には、特許文献１の実施例２６において、校正試料として、濃度既知（０ｎＭおよび５０ｎＭ）のメバロン酸溶液に対し、０ｎＭの校正試料である場合の工程ｉ）と工程ｉｉ）における吸光度差を求め、５０ｎＭの校正試料である場合の工程ｉ）と工程ｉｉ）における吸光度差を求め、０ｎＭと５０ｎＭにおけるそれぞれの吸光度差を利用して検量線を作成している。
そして、測定試料についても、工程ｉ）と工程ｉｉ）における吸光度差を求め、吸光度差から被検液中のメバロン酸濃度を測定している。
ここで、吸光度差を用いて検量線を作成するのには、５０ｎＭにおける校正試料のメバロン酸溶液に対して、メバロン酸を消去すると、実質的に、５０ｎＭにおける吸光度の測定が０ｎＭにおける吸光度の測定と同様の結果を与えることとなり、０ｎＭ−５０ｎＭの検量線を作成することができないことによる。
かかる方法は、工程ｉｉ）により測定される吸光度から、工程ｉ）により測定される被検液中に存在するメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質による吸光度を控除することにより、被検液中のメバロン酸自体を測定することができる方法である。
しかしこの方法では、より正確にメバロン酸量を測定するという課題に対し、精度上の問題においてｉ）とｉｉ）の異なる工程においても、吸光度とメバロン酸濃度の関係は同じである、つまり同じ検量線を適用できるという前提に立っているが、その検証ができないことがある。また、検量線を作成できるのはｉ）とｉｉ）の吸光度差を計算したのちであり、一般的な自動分析機においてこのような複雑な検量方法による測定はできず、自動分析機で得られた測定データにさらに人による計算処理を加えることが必要となり、簡便性の点でも問題がある。
【００１４】
一方、以下のｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）の工程による校正試料としてメバロン酸以外の試料を用いた測定法においては、より正確にメバロン酸量を測定するという課題に対し、上記２つの問題点は解消される。
ｉｖ）校正試料と測定試料において、前処理によりメバロン酸を消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の濃度と吸光度の関係から検量線を作成し、測定試料のメバロン酸濃度を検量線から測定する工程
ｖ）校正試料と測定試料において、メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の濃度と吸光度の関係から検量線を作成し、測定試料のメバロン酸濃度を検量線から測定する工程
ｖｉ）ｉｖ）とｖ）で測定されたメバロン酸量の差からメバロン酸濃度を測定する工程
ここで、校正試料としてメバロン酸以外の試料を用いた工程ｉｖ）における、「メバロン酸を消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の濃度と吸光度の関係から検量線を作成し、測定試料のメバロン酸濃度を検量線から測定する」とは、被検液中に存在するメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質により、酵素サイクリング反応が起きることで生じるシグナルを相当するメバロン酸量として表すことをいう。
また、校正試料としてメバロン酸以外の試料を用いた工程ｖ）における「メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の濃度と吸光度の関係から検量線を作成し、測定試料のメバロン酸濃度を検量線から測定する」とは、被検液中に存在するメバロン酸とメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質とにより、酵素サイクリング反応が起きることで生じるシグナルを相当するメバロン酸量として表すことをいう。
この方法は、校正試料としてメバロン酸以外の試料を用いていることにより、工程ｖ）により測定される被検液中のメバロン酸量と、工程ｉｖ）により測定される被検液中のメバロン酸量とをそれぞれ測定することができ、そして、工程ｖ）により測定される被検液中のメバロン酸量から、工程ｉｖ）により測定される被検液中のメバロン酸量を控除することにより、被検液中のメバロン酸自体を測定することができる方法である。
特許文献１に記載された方法においては、工程ｉ）と工程ｉｉ）の吸光度差に基づいてメバロン酸濃度を測定しているが、工程ｉｖ）及び工程ｖ）それぞれにおけるメバロン酸濃度を測定した上でメバロン酸自体の量を測定することができるため、より正確な値として測定することができる。
【００１５】
ここで、工程ｉｖ）にはメバロン酸を消去する前処理工程があるため、校正試料としてメバロン酸溶液を用いることができないが、本実施の形態では、工程ｉｖ）の前処理により消去されずに、酵素サイクリング反応の基質になる３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡをメバロン酸測定の校正試料として用いることに着想した。そこで、その実現のための課題であった不安定な３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの溶液中での安定化できる方法を見出したことにより、本発明とすることができたものである。すなわち、工程ｉｖ）及び工程ｖ）の校正試料として、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を用いることで、本発明のメバロン酸の測定方法を提供している。
【００１６】
本実施の形態において、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応とは、特許文献１に示される酵素サイクリング反応を意味し、下記反応式１および反応式２により示されるコエンザイムＡ存在下での酵素サイクリング反応である。
反応式１：
【化１】
0005914019.tif 000002
反応式２：
【化２】
0005914019.tif 000003
具体的には、下記反応式３で示されるように、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下Ｔ−ＮＡＤともいう）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤＨともいう）およびコエンザイムＡの存在下でのハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応である。
反応式３：
【化３】
0005914019.tif 000004
反応式３は、より詳しくは下記反応式４で示される多段階反応である。
反応式４：
【化４】
0005914019.tif 000005
【００１７】
本実施の形態において、被検液とは測定対象であるメバロン酸が溶解している溶液のことであり、水、酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、界面活性剤、キレート剤、その他有機化合物を含む溶液が挙げられる。
食品の被検液としてはビール、ジュース、固形食品からの抽出液等が挙げられ、生体試料の被検液としては、血液、血漿、血清、血球などの細胞内液、尿、唾液、涙、組織抽出液が挙げられる。また、食品や生体試料に酸、塩基、金属イオン、糖類、アルコール類、アミノ酸類、タンパク質、界面活性剤、キレート剤、その他有機化合物などの添加物を適宜加えた溶液を被検液として被検液中のメバロン酸量が測定される。
【００１８】
本実施の形態においては、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いる。
酵素サイクリング反応を行い、被検液中のメバロン酸を測定する場合、得られる吸光度からメバロン酸濃度として測定する。この吸光度からメバロン酸濃度への変換は吸光度と濃度の関係を表す検量線を用いて行うが、この検量線を作成するために校正試料が必要となる。したがって、校正試料とは、本実施の形態においてはメバロン酸の量を決定するために用いる検量線を作成するための試料である。
本実施の形態において用いる校正試料は、測定対象物質であるメバロン酸の代わりに３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液であり、それを用いて酵素サイクリング反応を行うと得られる吸光度と同じ吸光度が得られる濃度のメバロン酸が含まれる校正試料の代用になるものである。よって、前処理によりメバロン酸を消去してから酵素サイクリング反応を行う場合においても、この３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む校正試料を用いるとメバロン酸を含んでなる校正試料ではできなかった検量線を作成することができる。
【００１９】
本実施の形態における酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定方法においては、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いるが、具体的には、以下の１）〜３）の工程からなるメバロン酸の測定方法を提供する。
１）校正試料と被検液において、メバロン酸を前処理により消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
２）校正試料と被検液において、メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する工程
３）１）と２）で測定されたメバロン酸量の差からメバロン酸量を測定する工程
ここで、工程１）および工程２）において、検量線は、校正試料の濃度と吸光度の関係に基づいて測定されることが好ましい。
工程１）における、「メバロン酸を前処理により消去したのち酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する」とは、被検液中に存在するメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質により、酵素サイクリング反応が起きることで生じるシグナルを相当するメバロン酸量として表すことをいう。
また、工程２）における「メバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応を行い、校正試料の検量線を作成し、被検液中のメバロン酸を測定する」とは、被検液中に存在するメバロン酸とメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質とにより、酵素サイクリング反応が起きることで生じるシグナルを相当するメバロン酸量として表すことをいう。
この方法は、工程２）により測定される被検液中のメバロン酸量から、工程１）により測定される被検液中に存在するメバロン酸以外の酵素サイクリング反応の基質によるメバロン酸量を控除することにより、被検液中のメバロン酸自体を測定することができる方法である。すなわち、校正試料として３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを用いていることにより、工程２）により測定される被検液中のメバロン酸量と、工程１）により測定される被検液中のメバロン酸量とをそれぞれ測定することができ、そして、工程２）により測定される被検液中のメバロン酸量から、工程１）により測定される被検液中のメバロン酸量を控除することにより、被検液中のメバロン酸自体を測定することができる方法である。
本実施の形態のメバロン酸の測定方法により、より正確なメバロン酸量を測定することができる。なお、本実施の形態においては、工程３）のメバロン酸量を測定できるように、工程３）の前に工程１）と工程２）における被検液中のメバロン酸が測定されていればよいので、工程１）と工程２）の順番は限定されない。
【００２０】
工程１）において、酵素サイクリング反応に先立ち被検液中のメバロン酸を消去する前処理としては、マスキング剤処理、吸着剤処理、酵素反応処理などが挙げられるが、酵素反応処理が簡便で好ましく、さらに好ましくはメバロン酸キナーゼによりメバロン酸を消去することである。
また、前処理反応は酵素サイクリング反応中に生成するメバロン酸を消去してシグナルを減弱させるので、酵素サイクリング反応中には停止をしておく必要がある。
【００２１】
酵素サイクリング反応に用いられるハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼは反応式１〜４で示される酵素サイクリング反応を触媒するものであれば動物由来、細菌由来のものなど、特に限定はされないが、例えば特許文献１記載の酵素サイクリング反応に用いられるシュードモナス属由来のハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼなどを使用することができる。
【００２２】
前処理に用いられるメバロン酸キナーゼは下記反応式５を触媒する酵素であれば動物由来、細菌由来のものなど、特に限定はされないが、例えば特許文献１記載の酵母由来のメバロン酸キナーゼなどを使用することができる。
反応式５：
【化５】
0005914019.tif 000006
【００２３】
前処理にメバロン酸キナーゼを用いる場合、酵素サイクリング反応中にメバロン酸キナーゼの反応を停止させる方法として、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどのキレート剤添加、ｐＨシフト、熱処理、メバロン酸キナーゼ阻害抗体添加などが挙げられ、続く酵素サイクリング反応に影響が少ない方法を選択すればよく、例えばキレート剤添加が好ましい。
【００２４】
本実施の形態においては、工程１）および工程２）においては校正試料として３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を用いている。一方、工程２）において、メバロン酸を使用することも可能であるが、工程１）では使用することができないため、工程１）と２）で別の校正試料が必要となる。本実施の形態におけるように、工程１）と２）で同じ校正試料を用いたほうが精度がよくなることは一般に推測される。
【００２５】
このように、本実施の形態においては、工程１）および工程２）においては校正試料として３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を用いることが着想されたものであるが、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡは高価であり、また、溶液で不安定であり、測定精度を考えると校正試料としては適さず、通常、これを校正試料にしようとは想到しないものであった。
しかしながら、本発明者らが鋭意検討した結果、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液に酸を加えることで思いがけず安定化することを発見し、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料とすることを可能にした。したがって、本実施の形態においては、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化方法として、酸による安定化方法も提供される。
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む校正試料は、使用時には溶液状態であるが、保存時は凍結乾燥状態、凍結状態であってもよい。
【００２６】
校正試料としての安定性としては、安定であればあるほどよいが、例えば１０℃で８日間保存して残存率が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、または例えば３７℃で２日間保存し残存率が１７％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上である。
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を酵素サイクリング反応によるメバロン酸測定の校正試料として用いる場合には、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの濃度は、メバロン酸測定試薬におけるメバロン酸の測定範囲に合わせて設定されるが、酵素サイクリング反応による高感度な測定試薬の場合には０．１ｍＭ以下、０．０１ｍＭ以下、０．００１ｍＭ以下といった低濃度領域に設定される。低濃度であればあるほど、少しの量の変化でも変動率が大きくなるので、その安定性を維持することは大変重要なものになってくる。また、低濃度であればあるほど、容器、器具等への吸着による影響も大きくなるので、界面活性剤、ペプチド類、タンパク質、核酸類、アルコール類、有機溶媒等を加えて吸着の影響も最小化することが重要である。なお、ここで表記する０．１ｍＭなどの３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の濃度はラセミ体としての濃度であるので、後述する実施例７であるように相当するＲ−メバロン酸の濃度としては表記した濃度の０．２−０．５倍程度になる。
【００２７】
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液には、酸を加えることで安定性が向上した３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液とすることができるが、好ましくはｐＨを５以下、より好ましく４以下、さらに好ましくは３以下にするように酸を添加すればよい。
そのような酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、クエン酸、酢酸からなる群から選ばれる酸が挙げられ、これらの酸を組み合わせて用いてもよい。
安定化させるために３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液に加える酸の濃度としてはｐＨを下げる効果があり、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡが分解または析出しない範囲であれば特に限定はされないが、酵素サイクリング反応の校正試料として用いる場合には酵素サイクリング反応に影響を及ぼさない程度として、好ましくは０．１ｍＭから５００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭから１００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭから２０ｍＭである。
【００２８】
酸を加えて安定化させた３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液に界面活性剤、キレート剤、金属イオン、糖類、アミノ酸類、ペプチド類、タンパク質、核酸類、色素類、アルコール類、有機溶媒、防腐剤、塩基、緩衝液成分その他有機化合物などの添加物を適宜加えてもよく、酸として硫酸を用いた場合には、界面活性剤をさらに含むことが３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの安定化において好適である。
【００２９】
界面活性剤としては陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ＤＯＣなどのステロイド骨格を持つ界面活性剤、ｎ−Ｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅなどの糖骨格を持つ界面活性剤、Ｎ−アシルアミノ酸塩、アルキルエーテルカルボン酸塩などの界面活性剤などを用いることができるが、好ましくは非イオン性界面活性剤であり、より好ましくはＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｔｗｅｅｎ８０である。
安定化させるために３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液に加える界面活性剤の濃度としては特に限定はされないが、酵素サイクリング反応の校正試料として用いる場合には酵素サイクリング反応に影響を及ぼさない程度として、好ましくは１０％以下、より好ましくは１％以下である。
【００３０】
キレート剤としてはＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＩＤＡ、ＮＴＰＯ、ＴＰＥＮなどが挙げられる。金属イオンとしてはナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄、金、銀、銅などの金属イオンが挙げられる。糖類としてはグルコース、フルクトース、キシロース、イノシトール、ソルビトール、シュークロース、トレハロースなどの単糖類、多糖類が挙げられる。アミノ酸類としては、グリシン、アラニン、オルニチン、ノルロイシンなどのＤおよびＬアミノ酸が挙げられる。ペプチド類としては、長さ２〜１０程度のアミノ酸がつながったものとして、ジペプチド類、トリペプチド類、およびタンパク質のプロテアーゼ分解物などが挙げられる。タンパク質類としては、リゾチーム、アルブミン、セリシン、カゼイン、カタラーゼ、パーオキシダーゼなどが挙げられる。核酸類としてはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドが挙げられる。色素類としてはクロロフィル、クロロフィリン、タートラジン、メチレンブルー、メチルレッド、フェノールフタレインなどが挙げられる。アルコール類としてはメタノール、エタノール、オクタノールなどが挙げられる。ポリオール類としてはエチレングリコール、グリセロール、プロピレングリコールなどが挙げられる。有機溶媒としてはジメチルスルオキシド、ジメチルホルムアミド、フェノールなどが挙げられる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、ケーソンＣＧ、プロクリンなどの抗菌物質や静菌物質、カナマイシンなどの抗生物質などが挙げられる。
【００３１】
本実施の形態においては、以下の１）〜３）の工程
１）被検液中のメバロン酸を前処理により消去したのち、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いて酵素サイクリング法で被検液中のメバロン酸を測定する工程
２）被検液中のメバロン酸を消去せずに被検液として、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いて酵素サイクリング法で被検液中のメバロン酸を測定する工程
３）１）と２）の測定値の差からより正確なメバロン酸量を求める工程
によりメバロン酸量をより正確に測定することができるが、前処理が酵素法である、特にメバロン酸キナーゼである場合は、メバロン酸の測定精度がとても高くなりより有用である。工程２）においては、被検液中のメバロン酸を消去せずに酵素サイクリング反応が行われるが、メバロン酸の前処理による消去を行っていないということを意味している。
ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼは、反応式４として前述のように多段階反応を触媒するので基質となる物質が多く、メバロン酸、メバルデハイド、メバジルコエンザイムＡ、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡもが基質となるが、メバロン酸キナーゼによる特異性によって、工程１）においてメバロン酸が前処理により除去されて検出対象が限定されるため、工程２）における測定結果から工程１）における測定値の差分を取ることにより、理論上メバロン酸のみを正確に測定することができるからである。さらにまた、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼにメバロン酸に関係なくＴ−ＮＡＤＨを生成する酵素活性が内在またはハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼとは別に混在する場合でも、メバロン酸キナーゼによる特異性によって検出対象が限定されるため、メバロン酸のみを正確に測定できるようになる。
【００３２】
このように、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料とすることが可能となったことで、以下の１）〜３）の工程のうち、工程１）および工程２）において、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として用いて、
１）被検液中のメバロン酸をメバロン酸キナーゼにより消去したのち、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング法で被検液中のメバロン酸を測定する工程
２）被検液中のメバロン酸を消去せずに被検液としてハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング法で３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡを含む溶液を校正試料として被検液中のメバロン酸を測定する工程
３）１）と２）の測定値の差からより正確なメバロン酸量を求める工程
を含む測定法とすることができ、工程１）および工程２）の異なる工程において同一の校正試料を使って、それぞれの工程における検量線を作成することが可能になり、本実施の形態のメバロン酸の測定方法の精度が向上する。
【００３３】
メバロン酸は生体内のコレステロール生合成系ではＲ−メバロン酸のみが利用され、同じく３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡはＳ−３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡのみが利用されるが、試薬としてはラセミ体で販売されている。本実施の形態においては、特に断らない限り、単にメバロン酸、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡといった場合、試薬としてはラセミ体のことを、生体内に存在するものを指す場合はで利用される異性体のことを意味する。また、表記される濃度も特に断らない限り同様である。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例等によりさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例等に限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
＜酢酸、クエン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化＞
ＤＬ−３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリルコエンザイムＡナトリウム塩（シグマ：Ｈ６１３２）を精製水で溶解し０．０１ｍＭの３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を作製した。次に０．０１ｍＭの溶液０．０５ｍＬに０．９５ｍＬの希釈液を加えて０．０００５ｍＭの溶液を作製した。希釈液として、精製水（ｐＨ７．６）、２ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）、１０ｍＭ酢酸（ｐＨ３．５）、１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）、１０ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）の６種類を用いた。それぞれの希釈液で希釈した６種類の３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を希釈した当日と、３７℃で２日保存後に以下の測定法で測定した。保存後の３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量を保存前の量で除すことにより、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を求めた（表１）。
【００３６】
【表１】
0005914019.tif 000007
【００３７】
表１に示すように、ｐＨが低いほど３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡは安定であることがわかり、精製水に比べ大幅に改善していることがわかる。
【００３８】
＜ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡの測定法＞
３μＬのサンプル溶液に、３７℃で９０μＬの第１測定試薬（０．４６ｍＭ ＮＡＤＨ、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｍＭ ＡＴＰ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．０７２％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ９．９）を加え、９分後に３０μＬの第２測定試薬（０．０２％プロクリン３００、１１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２．４ｍＭコエンザイムＡ、２５ｍＭ Ｔ−ＮＡＤ、２３Ｕ／ｍＬハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ、ｐＨ６．０）を加えてから、３７℃１２分間の波長４１０ｎｍの吸光度変化［ｍＡＢＳ］を測定した。
校正試料は１００ｎＭのＲＳ−メバロン酸を用いて、測定は自動分析機ＢＭ９０２０（日本電子製）を用いて行った。また、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼは、特許文献１に記載されるように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１−ＭＶ  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６３）由来のハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを遺伝子組み換えＥ．ｃｏｌｉで発現、製造したものである。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１−ＭＶ  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６３）は土壌から分離され、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅに近縁なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．と同定され、平成２０年１１月１３日に日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６３が付与されている。
【００３９】
［実施例２］
＜塩酸添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化＞
実施例１と同様に表２記載の６種類の希釈液を用い、３７℃で４日保存後に、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を測定した（表２）。
【００４０】
【表２】
0005914019.tif 000008
【００４１】
表２に示すように、１ｍＭ以上の塩酸添加により、ほぼ同等に安定であることがわかる。
【００４２】
［実施例３］
＜硫酸添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化＞
実施例１と同様に表３および表４記載のそれぞれ６種類の希釈液を用い、３７℃で３日保存後および１０℃で８日保存後に、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を測定した（表３および表４）。０．１ｍＭ塩酸で約ｐＨ４であり、０．１ｍＭ硫酸で約ｐＨ３．７である。
【００４３】
【表３】
0005914019.tif 000009
【００４４】
【表４】
0005914019.tif 000010
【００４５】
表３および表４に示すように、塩酸と同様に１０ｍＭまでは硫酸濃度が高いほど３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡは安定であることがわかる。
【００４６】
［実施例４］
＜硫酸、塩酸、酢酸添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化＞
実施例１と同様に表５記載の１４種類の希釈液を用い、３７℃で２日保存後に、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を測定した（表５）。
【００４７】
【表５】
0005914019.tif 000011
【００４８】
表５に示すように、塩酸と硫酸の安定化効果は同等であり、酢酸は少し劣ること、およびＴｗｅｅｎ８０は単独では安定化効果はないが、硫酸、塩酸とともに用いると弱いながら安定化効果があることがわかる。
【００４９】
［実施例５］
＜硫酸およびＴｗｅｅｎ８０添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化（１）＞
実施例１と同様に表６記載の７種類の希釈液を用い、３７℃で２日保存後に、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を測定した（表６）。
【００５０】
【表６】
0005914019.tif 000012
【００５１】
表６に示すように、Ｔｗｅｅｎ８０は単独では安定化効果はない、または不安定化効果があるが、硫酸とともに用いると安定化効果があることがわかる。また、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５％  ｓｕｃｒｏｓｅは、酸添加に比較して安定化効果がほとんどないことがわかる。
【００５２】
［実施例６］
＜硫酸およびＴｗｅｅｎ８０添加による３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液の安定化（２）＞
実施例１と同様に表７記載の１３種類の希釈液を用い、３７℃で５日保存後に、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ量の残存率を測定した（表７）。
【００５３】
【表７】
0005914019.tif 000013
【００５４】
表７に示すように、硫酸濃度が２ｍＭまでは高いほど安定化効果があり、３７℃５日保存してもほとんど劣化しないようになった。
【００５５】
［実施例７］
＜３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を校正試料として酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定＞
被検液として５１．６ｎＭのメバロン酸水溶液、プール血清、５０．８ｎＭのメバロン酸を添加したプール血清、プール血漿、４７．８ｎＭのメバロン酸を添加したプール血漿を作製した。なお、ここでのメバロン酸濃度はＲ−メバロン酸濃度として表記してある。また、プール血清、プール血漿はコージンバイオからの購入品である。
【００５６】
＜メバロン酸キナーゼによる前処理を含む、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを用いた酵素サイクリング反応によるメバロン酸の測定＞
ＤＬ−３−ヒドロキシー３−メチルグルタリルコエンザイムナトリウム塩（シグマ：Ｈ６１３２）を精製水で溶解後、１０ｍＭ硫酸、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０で希釈して５００ｎＭの溶液を作製した。表８に示すように、この溶液を以下の前処理工程を含まない酵素サイクリング反応において、５０ｎＭのＲ−メバロン酸を含むメバロン酸溶液を校正試料として測定するとＲ−メバロン酸量として１９３．２ｎＭ相当することから、１９３．２ｎＭの校正試料とした。
【００５７】
【表８】
0005914019.tif 000014
【００５８】
（前処理工程を含む酵素サイクリング反応）
５μＬの被検液に、３７℃で１５０μＬの第１測定試薬（０．７ｍＭ  ＮＡＤＨ、３０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、０．４ｍＭ塩化マグネシウム、０．４ｍＭ  ＡＴＰ、０．０５％アジ化ナトリウム、０．０７２％Ｔｗｅｅｎ８０、０．１６Ｕ／ｍｌメバロン酸キナーゼ、１８％シュークロース、ｐＨ１０．０）を加え、１０分後に５０μＬの第２測定試薬（０．０２％プロクリン３００、１１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．４ｍＭ  コエンザイムＡ、２５ｍＭ  Ｔ−ＮＡＤ、１２０Ｕ／ｍｌハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ、１８％シュークロース、ｐＨ５．８）を加えてから、３７℃１２分間の波長４０５ｎｍの吸光度変化［ＡＢＳ］を測定した。測定は自動分析機７１７０Ｓ（日立製）で、表８に示すように上記の３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を校正試料として用いて行った。また、ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．１−ＭＶ  （ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０６３）由来のハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼを遺伝子組み換えＥ．ｃｏｌｉで発現、製造したものであり、メバロン酸キナーゼはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＮＢＲＣ１１３６）由来のメバロン酸キナーゼを遺伝子組み換えＥ．ｃｏｌｉで発現、製造したものである（特許文献１）。
【００５９】
（前処理工程を含まない酵素サイクリング反応）
第１測定試薬にメバロン酸キナーゼを含まないこと以外は上記の前処理工程を含む酵素サイクリング反応と全く同じ測定を行った。
【００６０】
（被検液中の正確なメバロン酸を計算する）
前処理工程を含む酵素サイクリング反応により測定されたメバロン酸量と前処理工程を含まない酵素サイクリング反応により測定されたメバロン酸量の差から被検液中のメバロン酸量を測定した（表９）。
【００６１】
【表９】
0005914019.tif 000015
【００６２】
プール血清およびプール血漿に添加されたメバロン酸量は測定値に精度よく反映されている。また、メバロン酸キナーゼにより消去された後に測定されるメバロン酸相当量、つまり、酵素サイクリング反応の基質にはなるがメバロン酸キナーゼの基質にはならない物質量は、プール血清ではメバロン酸を添加することに関係なく６．２〜６．６ｎＭであり、プール血漿では同様に９．１〜９．２ｎＭであり、本測定法ではこれらの影響が除かれて正確なメバロン酸測定ができていることを示すものである。つまり、３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を校正試料とすることで精度よくメバロン酸が測定できていることがわかる。
【００６３】
比較のため同じ実験結果をもとに、特許文献１に記載されるように、前処理工程を含む酵素サイクリング反応により測定された吸光度と前処理工程を含まない酵素サイクリング反応により測定された吸光度の差から、メバロン酸溶液を校正試料として検量線を作成して被検液中のメバロン酸量を求めた(表１０)。
【００６４】
【表１０】
0005914019.tif 000016
【００６５】
３−ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ溶液を校正試料として用いたことで、メバロン酸溶液を校正試料として用いた場合に比して、より正確にメバロン酸濃度を測定することができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、メバロン酸を正確に測定することのできる方法を提供することができるので、病態診断等に産業上の利用可能性を有する。