(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えポリペプチド足場であって、
I. 以下のアミノ酸配列を有するA、B、C、D、E、FおよびGと命名された7個のβ鎖ドメイン:
a) Aβ鎖について配列番号239のアミノ酸配列、Bβ鎖について配列番号229のアミノ酸配列、Cβ鎖について配列番号230のアミノ酸配列、Dβ鎖について配列番号236のアミノ酸配列、Eβ鎖について配列番号232のアミノ酸配列、Fβ鎖について配列番号245のアミノ酸配列およびGβ鎖について配列番号246のアミノ酸配列、または
b) Aβ鎖について配列番号239のアミノ酸配列、Bβ鎖について配列番号229のアミノ酸配列、Cβ鎖について配列番号247のアミノ酸配列、Dβ鎖について配列番号236のアミノ酸配列、Eβ鎖について配列番号232のアミノ酸配列、Fβ鎖について配列番号248のアミノ酸配列、およびGβ鎖について配列番号234のアミノ酸配列；
II.それぞれのβ鎖ドメインをループ領域が接続するように前記7個のβ鎖ドメインに連結された6個のループ領域であって、該ループ領域は、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと命名され、かつ配列番号１の同族ループ領域に対応しており、その配列番号１の同族ループ領域は以下の残基：
a) ABループ中の残基11から17まで；
b) BCループ中の残基23から31まで；
c) CDループ中の残基39から45まで；
d) DEループ中の残基51から56まで；
e) EFループ中の残基60から67まで；
f) FGループ中の残基75から84まで；
からなり、
BC、DE、およびFGループ領域が配列番号１の同族ループ領域から少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化しているか、または、AB、CD、およびEFループ領域が配列番号１の同族ループ領域から少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化している、前記ループ領域；および
III. Fβ鎖ドメインとGβ鎖ドメインを連結するかまたはCβ鎖ドメインとFβ鎖ドメインを連結するジスルフィド結合；
を含み、前記足場は標的に結合する、組換えポリペプチド足場。
【請求項２】
BC、DE、およびFGループ領域が配列番号１の同族ループ領域から少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化している、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
前記BCループが、S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、aはプロリンまたはアラニンであり、bはアラニンまたはグリシンである)の配列を有する9個のアミノ酸からなる、請求項２に記載の足場。
【請求項４】
前記BCループが、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(配列番号258)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、cはプロリン、セリンまたはグリシンである)の配列を有する11個のアミノ酸からなる、請求項２に記載の足場。
【請求項５】
前記BCループが、A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(配列番号257)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、dはプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、eはアスパラギンまたはグリシンであり、fはセリンまたはグリシンである)の配列を有する12個のアミノ酸からなる、請求項２に記載の足場。
【請求項６】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、aはアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する9個のアミノ酸からなる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の足場。
【請求項７】
前記FGループが、X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、aはアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、bはセリンまたはグリシンである)の配列を有する10個のアミノ酸からなる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の足場。
【請求項８】
前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(配列番号259)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、aはアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)の配列を有する11個のアミノ酸からなる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の足場。
【請求項９】
前記DEループが、X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)の配列を有する6個のアミノ酸からなる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の足場。
【請求項１０】
AB、CD、およびEFループ領域が配列番号１の同族ループ領域から少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化している、請求項１に記載の足場。
【請求項１１】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、aはセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する7個の残基からなる、請求項１０に記載の足場。
【請求項１２】
前記ABループが、配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、aはセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する9個の残基からなる、請求項１０に記載の足場。
【請求項１３】
前記CDループが、7、8または9個の残基からなり、ここで前記CDループ中のそれぞれの残基が無作為化され、それぞれの残基がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンでありうる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の足場。
【請求項１４】
前記EFループが、配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、bはアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、cはイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を有する8個の残基からなる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の足場。
【請求項１５】
前記β鎖ドメインが、Aβ鎖について配列番号239のアミノ酸配列、Bβ鎖について配列番号229のアミノ酸配列、Cβ鎖について配列番号230のアミノ酸配列、Dβ鎖について配列番号236のアミノ酸配列、Eβ鎖について配列番号232のアミノ酸配列、Fβ鎖について配列番号245のアミノ酸配列およびGβ鎖について配列番号246のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の足場。
【請求項１６】
前記β鎖ドメインが、Aβ鎖について配列番号239のアミノ酸配列、Bβ鎖について配列番号229のアミノ酸配列、Cβ鎖について配列番号247のアミノ酸配列、Dβ鎖について配列番号236のアミノ酸配列、Eβ鎖について配列番号232のアミノ酸配列、Fβ鎖について配列番号248のアミノ酸配列、およびGβ鎖について配列番号234のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の足場。
【請求項１７】
前記足場が異種薬剤にコンジュゲートされ、該薬剤が別の足場、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体のFc領域、IgG分子、結合ペプチド、細胞傷害剤、放射性標識、画像化剤、His-Tag、ビオチン、Flag-タグ、核酸、またはサイトカインからなる群より選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 関連出願に対する相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする、2007年10月31日に出願された米国特許仮出願第60/984,209号の利益を請求するものである。
【０００２】
2. 技術分野
本発明は、標的に特異的に結合するタンパク質足場(スカフォールド：scaffold)ならびにそのような足場を作製、スクリーニングおよび使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
3. 背景技術
本発明は、例えば、新規結合特性を有する生成物の作製にとって有用なタンパク質足場に関する。
【０００４】
一般的にはタンパク質足場と呼ばれる、比較的明確な三次元構造を有するタンパク質を、遺伝子工学的に操作された生成物の設計のための試薬として用いることができる。典型的には、これらの足場は特異的もしくは無作為の配列変化の影響を受けやすい1個以上の領域を含み、そのような配列無作為化は、所望の生成物を選択することができるタンパク質のライブラリーを製造するために行われることが多い。そのような足場が有用である1つの特定の領域は、抗体模倣設計の分野である。
【０００５】
市場ではいくつかの成功例と共に治療用抗体が公知であるが(HERCEPTIN(登録商標)、AVASTIN(登録商標)、SYNAGIS(登録商標))、治療用タンパク質としての抗体フラグメントの作製において関心が高まっている。その利点は、所望の結合特性を得るための分子生物学的技術による操作の容易性、微生物系においてそのようなフラグメントを発現する能力、ならびに抗体フラグメントが完全長抗体よりも良好な組織浸透性を有するであろうという期待である。その一例はREOPRO(登録商標)である。
【０００６】
さらに、適切な再折畳みを要するドメイン内ジスルフィド結合に関する要件、ならびに抗体フラグメントが凝集し、完全長IgGよりも安定性が低くなる傾向などの、いくつかの欠点を回避しながら、標的の高親和性結合ならびに低い免疫原性および毒性などの、抗体および抗体フラグメントの利点を十分に利用するために、小さい、非抗体治療剤、すなわち、抗体模倣物質を開発する努力が為されてきた。その一例は、モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインから3個のβ鎖を欠失させることにより設計された、免疫グロブリン折畳みに関連する「ミニボディ」足場である(Tramontanoら、J. Mol. Recognit. 7:9, 1994)。このタンパク質は、61個の残基を含み、抗体中の相補性決定領域(CDR)に酷似した2個の超可変ループを提供するのに用いることができる。これらの2個のループは無作為化されており、生成物は抗原結合のために選択されているが、今までのところ、フレームワークは溶解性の問題に起因してその利用性がいくらか制限されているようである。ループを展示するのに用いられる別のフレームワークは、2個のジスルフィド結合により一緒に保持された74個の残基の6個の鎖のβシートサンドイッチを含み、3個のCDR様ループを形成する、α-アミラーゼの小分子タンパク質阻害剤であるテンダミスタットであった(McConnellおよびHoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995)。
【０００７】
他のタンパク質がフレームワークとして試験されており、αへリックス表面(Nordら、Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nordら、Protein Eng. 8:601, 1995)、αへリックス束中のαへリックス間のループ(KuおよびSchultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995)、小分子プロテアーゼ阻害剤のものなどの、ジスルフィド架橋により拘束されるループ(Marklandら、Biochemistry 35:8045, 1996; Marklandら、Biochemistry 35:8058, 1996; RottgenおよびCollins, Gene 164:243, 1995; Wangら、J. Biol. Chem. 270:12250, 1995)上に無作為化された残基をディスプレイ(展示)するのに用いられている。
【０００８】
かくして、様々な治療および診断用途のために、小さく、安定な人工抗体様分子を開発する必要がある。
【０００９】
本明細書に記載の参考文献の引用または考察は、そのようなものが本発明に対する先行技術であるという許諾として解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１０】
4. 発明の概要
本発明は、任意の目的の化合物に結合することができる組換え非天然タンパク質足場のファミリーを提供する。特に、本明細書に記載のタンパク質を用いて、抗体可変領域の相補性決定領域(「CDR」)と類似する規定のループを展示することができる。これらのループを無作為化または制限進化にかけて、多数の標的化合物に結合するのに必要な多様性を生成させることができる。前記タンパク質を、異なる標的に結合することができる多特異的足場に集合させることができる。
【００１１】
本発明は、天然のタンパク質配列から誘導された複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメインを含み、1個以上の該ループ領域配列が、天然のタンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸による欠失、置換もしくは付加により変化し、ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが、天然のタンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、組換え非天然ポリペプチド足場(本明細書では以後「本発明の足場」と呼ぶ)を提供する。いくつかの実施形態においては、前記天然配列は、ヒトテナシンCに対応するタンパク質配列である。特に、これらの足場は、テナシンCの第3のFnIIIドメイン(「Tn3」ドメインとしても知られる)を含む。特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号1、5〜32、64〜67、および210からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態においては、本発明の足場を、配列番号33〜59からなる群より選択される配列を含む核酸によりコードさせることができる。
【００１２】
他の実施形態においては、前記天然配列は、例えば、限定されるものではないが、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、スタフィロサームス・マリナス(Staphylothermus marinus)、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)、スルフォロブス・ソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)、およびスルフォロブス・トコダイ(Sulfolobus tokodaii)などの好熱性生物に由来するものなどの、予測されたTn3構造モチーフに対応する。
【００１３】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号2〜4、68〜88、および210からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態においては、本発明の足場を、配列番号89〜98からなる群より選択される配列を含む核酸によりコードさせることができる。
【００１４】
本発明の別の態様においては、本発明の足場はまた、ジスルフィドにより安定化された足場を含む。ジスルフィド安定化足場は、熱耐性、カオトロピック変性に対する耐性およびプロテアーゼ処理により測定されるように増強された安定性を示す。
【００１５】
本発明の足場を遺伝子操作して、本明細書に記載のように、目的の標的に結合させることができる。そのような結合は、例えば、少なくとも100μMの親和性を示し得る。
【００１６】
本発明はまた、少なくとも2個の本発明の足場を含む多量体足場(本明細書では以後、「本発明の多量体足場」と呼ぶ)を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の多量体足場は、例えば、限定されるものではないが、二量体ドメイン、アミノ酸リンカー、ジスルフィド結合、化学的架橋、およびIgG分子もしくはその断片、またはFc領域などに連結された少なくとも2個の足場を含む。
【００１７】
本発明はまた、複数の本発明の足場を含むポリペプチドディスプレイ(展示)ライブラリー(本明細書では以後、「本発明のライブラリー」と呼ぶ)も提供する。本発明のライブラリーは、多量体足場を構築するために標的結合足場を捕捉し、同定するのに有用である。
【００１８】
別の態様においては、本発明は、本発明の足場およびライブラリーをコードする単離された核酸分子も提供する。
【００１９】
本発明はまた、本発明の足場およびライブラリーを作製、使用、スクリーニング、最適化、および遺伝子操作する方法も提供する。
【００２０】
さらに別の態様においては、本発明は、本発明の足場を含む医薬組成物も提供する。
【００２１】
本発明はまた、治療上有効量の本発明の足場および／または本発明の足場を含む医薬組成物を投与することにより、患者における本明細書に記載の疾患またはその症候を治療、予防、改善、検出、診断、またはモニターする方法も提供する。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明は、限定されるものではないが、癌などの疾患を予防、改善、検出、診断、またはモニターするのに有用であるTRAIL-R2特異的結合剤を提供する。他の特定の実施形態においては、本発明のTRAIL-R2特異的結合足場は、癌細胞がTRAIL-R2を発現する癌の治療にとって有用である。いくつかの実施形態においては、癌としては、限定されるものではないが、肺癌、非ホジキンリンパ腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、およびメラノーマが挙げられる。
【００２３】
5. 図面の簡単な説明
本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施形態を図面に描く。しかしながら、本発明は、図面に描かれた実施形態の正確な配置および手段に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】足場の組換え総細胞発現を示す。タンパク質足場を発現する大腸菌培養物に由来する様々な組換え溶解物のクマシー染色されたPAGEゲルを提供する。高度に発現される足場をアスタリスク(*)で示す。
【図２】Tn3に基づく足場の発現および精製を示す。組換え発現および精製後のTn3に基づく足場を記録するクマシー染色されたPAGEゲルを提供する。Tn3足場は均質になるまで容易に精製された。
【図３Ａ】Tn3に基づく足場に関する融点決定を示す。このグラフは、示差走査熱量測定法により測定されたTn3に基づく足場の温度融解曲線決定を例示する。TmはpH 7.0で約45℃であると決定された。
【図３Ｂ】Tn3に基づく足場の尿素変性プロフィールを示す。このグラフは、pH 7.5の様々な濃度の尿素中でのTn3に基づく足場の変性プロフィールを表す。この分子の固有の蛍光の変化を、該分子のアンフォールディング(unfolding)の尺度として用いた。Tn3足場については、アンフォールディングは蛍光強度の増加およびより高い波長へのシフトをもたらす。図面に示されるように、この分子は低濃度の尿素(1M以下)で折り畳まれ、より高濃度の尿素で変性されるようになった。50％の分子がアンフォールディングされるモル濃度は、約2Mであると算出された。
【図３Ｃ】Tn3足場が単量体状態で存在することを示す。このグラフは、夾雑断片および／またはより高い次数の構造の相対比率を決定するための精製されたTn3足場のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果を表す。グラフ上で％により表されるように、97％を超える足場が単量体形態で溶出したが(オンライン光散乱検出器により約11 kDaであると決定された)、ほんの少量(約3％)のみが、おそらく二量体として、約21 kDaのピークで溶出した。
【図４−１】足場のBCループはループ長の多様性を示す。グラフは、様々なTn3関連タンパク質足場のBCループの長さ多様性を表す。(A)は、PDBデータベースに由来するTn3関連足場のサブセットから誘導された配列により示されるループ長の多様性を表す(51個の配列)。(B)は、Swiss-プロットデータベースから誘導された配列により示されるループ長の多様性を表す(397個の配列)。提供されるように、様々なTn3関連足場のBCループは、7〜26アミノ酸残基の長さを示す。本明細書で用いられるスキームに従えば、Tn3中のBCループの長さは9残基である。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５】足場のFGループはループ長の多様性を示す。グラフは、様々なTn3関連タンパク質足場のFGループの長さ多様性を表す。この図面は、PDBデータベースに由来するTn3関連足場のサブセットから誘導された配列により示されるFGループ長の多様性を描く。提供されるように、Tn3足場のFGループは、6〜18アミノ酸残基の長さを示す。本明細書で用いられるスキームに従えば、Tn3中のFGループの長さは10残基である。
【図６】足場のDEループはループ長の多様性を示す。グラフは、様々なTn3関連タンパク質足場のDEループの長さ多様性を表す。この図面は、PDBデータベースに由来するTn3関連足場のサブセットから誘導された配列により示されるDEループ長の多様性を描く。提供されるように、Tn3関連足場のDEループは、約4〜約17アミノ酸残基の長さを示す。本明細書で用いられるスキームに従えば、Tn3中のDEループの長さは6残基である。
【図７Ａ】足場のBCループの9個のアミノ酸残基は配列多様性を示す。このグラフはSwiss-Protデータベースに由来する9個のアミノ酸残基のBCループにより示される配列多様性を表す(73個の配列)。アラインメントツールWeblogoを用いて、9アミノ酸長のBCループ中の特定の位置に生じるアミノ酸の相対出現率を、特定の位置の上の一文字コードのサイズにより表す。例えば、9アミノ酸残基の分析されたBCループの位置3で、最も多いアミノ酸はプロリン(P)、次いで、アラニン(A)、次いでバリン(V)である。
【図７Ｂ】足場のBCループの12個のアミノ酸残基は配列多様性を示す。このグラフはSwiss-Protデータセットに由来する12個のアミノ酸残基のBCループにより示される配列多様性を表す(99個の配列)。アラインメントツールWeblogoを用いて、12アミノ酸長のBCループ中の特定の位置に生じるアミノ酸の相対出現率を、特定の位置の上の一文字コードのサイズにより表す。例えば、12アミノ酸残基の分析されたBCループの位置3で、最も多いアミノ酸はプロリン(P)、次いで、グリシン(G)、次いでグルタミン(Q)である。
【図８】足場のFGループは配列多様性を示す。このグラフは、Swiss-Protデータセットに由来する全ての長さのFGループにより示される配列多様性を表す(393個の配列)。アラインメントツールWeblogoを用いて、FGループ中の特定の位置に生じるアミノ酸の相対出現率を、特定の位置の上の一文字コードのサイズにより表す。例えば、分析されたFGループの位置2で、最も多いアミノ酸はアスパラギン(N)、次いで、トレオニン(T)、次いでリジン(K)である。
【図９Ａ】SYNAGIS(登録商標)特異的Tn3足場の発現および精製を示す。組換え発現および精製後のSYNAGIS(登録商標)特異的Tn3足場(SynBP01)を記録するクマシー染色されたPAGEゲルを提供する。SynBP01足場は均質になるまで容易に精製された。
【図９Ｂ】SYNAGIS(登録商標)特異的結合足場のKD決定を示す。トレース図は、BIACORE(登録商標)アッセイによるSYNAGIS(登録商標)に関するSynBP01足場の特異的結合親和性を特性評価する実験を表す。様々な濃度での固定されたSYNAGIS(登録商標)および移動相SynBP01を用いて、結合親和性(KD)が約16μMであると決定された。
【図９Ｃ】SYNAGIS(登録商標)特異的結合足場は、ベース足場と同様の安定性を示す。SYNAGIS(登録商標)特異的結合足場を、実施例3で調製される足場のライブラリーから同定した。固有の蛍光がタンパク質のアンフォールディングを測定する尿素変性実験に由来する結果を提供する。この実験においては、Tn3足場(WT)およびSYNAGIS(登録商標)特異的足場SynBP01(A1)は、尿素濃度の増加と共に非常に類似する変性プロフィールを示した。
【図９Ｄ】結合足場は標的抗体SYNAGIS(登録商標)を二価的に関与させる。トレース図は、BIAcoreアッセイ形式での固定された分子上での2個の足場の関与を特性評価する実験を表す。この実験においては、固定されたSYNAGIS(登録商標)の上に、1μMのSYNAGIS(登録商標)特異的タンパク質足場の溶液(青色のトレース)または1μMのSYNAGIS(登録商標)特異的タンパク質足場＋0.19μMの架橋mAbの溶液(赤色のトレース)を重ねる。このグラフは、単量体足場または架橋された足場により示される示差的結合特性を描く。
【図１０Ａ−１】天然のジスルフィドを含有するTn3構造モチーフの配列アラインメントを示す。提供される配列アラインメントは、安定性操作のための候補位置を決定する努力における、21個の天然のジスルフィドを含有するTn3関連構造モチーフ中のシステイン残基の位置を概略したものである。個々のTn3配列内の同色のCys残基は、ジスルフィド結合により連結されている。Tn3の配列(Iten.pro)をアラインメント中に含有させて、ジスルフィドを含有する足場中のシステイン残基に対応するTn3中の残基および位置の同定を容易にする。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−１の続きである。
【図１０Ａ−３】図１０Ａ−２の続きである。
【図１０Ｂ】足場安定性を増加させるための標的ジスルフィドの操作を示す。この図は、足場配列中で操作される潜在的なジスルフィド位置を描く。安定性を増加させる努力において、4個の描かれたジスルフィド位置を、個々に足場中で操作した。得られた組換え足場を、それぞれTn3SS1、Tn3SS2、Tn3SS3、およびTn3SS4と呼んだ。
【図１０Ｃ】選択され精製されたジスルフィド操作された足場のRP-HPLC追跡を示す。この図は、精製後、還元後、およびジスルフィド結合を形成する再折畳み後の、(i)Tn3SS3および(ii)Tn3SS4の逆相HPLCクロマトグラムを描く。このクロマトグラムは、足場内に含まれるシステインがタンパク質精製後に部分的にのみ酸化され(上側のトレース)、DTTを用いる処理により完全に還元され(中央のトレース)、ならびに再折畳み後にジスルフィドに完全に酸化される(下側のトレース)ことを示す。
【図１０Ｄ】ジスルフィド操作された足場の発現および特性評価を示す。この図面は、図10Bに提供された4つのジスルフィド操作された足場のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析の結果を描く。精製され、再折畳みされた構築物Tn3 (WT)、Tn3SS1(1)、Tn3SS2 (2)、Tn3SS3 (3)、Tn3SS4 (4)のサンプルを、還元的および非還元的条件下で分析して、ジスルフィド結合の予測される形成を評価した。記載のように、Tn3SS2はジスルフィド結合された二量体を形成する。他の構築物(Tn3、Tn3SS1、Tn3SS3、およびTn3SS4)は、精製され、再折畳みされたジスルフィド含有足場が還元的および非還元的条件下で同様に移動するので、組込まれたシステイン残基に応答して二量体を形成しない。
【図１０Ｅ】単一ジスルフィド操作された足場の尿素変性プロフィールを示す。このグラフは、パネルA Tn3SS1(SS1)、Tn3SS3(SS3)、およびTn3SS4(SS4)ならびにTn3 (WT)足場に概略された、選択されたジスルフィド含有足場の尿素変性試験の結果を示す。この実験においては、様々な精製され、再折畳みされた足場を、増加するレベルの尿素に曝露する。アンフォールディングの尺度として、相対蛍光をモニターする。タンパク質がアンフォールディングされるか、またはその安定性が低くなるにつれて、相対蛍光は増加する。パネルに提供されるように、Tn3SS1含有足場は、Tn3足場と比較して尿素に対するより高い感受性を示し、従って安定性が低い。また、足場Tn3SS3およびTn3SS4は、Tn3と比較して尿素を介する変性に対してより高い耐性を示し、従って、より安定である。足場Tn3SS4はこの実験において試験された足場の尿素を介する変性に対する最も高い耐性を示した。
【図１０Ｆ】Tn3SS4ジスルフィド操作された足場は、Tn3足場と比較して高い安定性を示す。このグラフは、Tn3足場(丸)の安定性とジスルフィド含有足場Tn3SS4(四角)とを比較する塩酸グアニジン変性アッセイに由来する結果を示す。グラフに提供されるように、Tn3SS4足場は、Tn3足場と比較して、グアニジンを介する変性に対するより高い耐性を示し、従って、より安定であった。
【図１０Ｇ】Tn3SS4足場は、Tn3足場と比較して高レベルのプロテアーゼ耐性を示す。このパネルは、Tn3足場の安定性と、Tn3SS4含有足場とを比較するプロテアーゼ感受性アッセイに由来する結果を描く。この実験においては、相対プロテアーゼ耐性はタンパク質安定性と相関する。Tn3足場については、サーモリシンと共にわずかに10分インキュベートしただけで分解が引き起こされる。サーモリシン中で1時間インキュベートした後、Tn3足場は完全に分解される。Tn3SS4含有足場は、16時間の全経過に渡ってサーモリシン耐性を示したが、これはTn3足場よりも高い安定性を示唆している。
【図１０Ｈ】Tn3SS4ジスルフィド操作された足場は、高い融点(Tm)を示す。このグラフは、Tn3足場(点線)と、ジスルフィド含有Tn3SS4足場(実線)とを比較する温度安定性試験に由来する結果を描く。融解曲線に提供されるように、Tn3SS4足場は、Tn3足場(約45℃、図3Aも参照)よりも高い融点(約71℃)を示した。
【図１０Ｉ】Tn3SS4ジスルフィド操作された足場は、単量体状態で存在する。この図面は、Tn3SS4足場のサイズ排除クロマトグラフィー／多角光散乱(SEC-MALS)分析に由来する追跡を描く。このデータは、精製されたTn3SS4足場が単量体状態で存在することを示し、オンライン光散乱検出器により約11 kDaであると決定された。
【図１０Ｊ】精製されたTn3SS3+4ジスルフィド操作された足場のRP-HPLCクロマトグラムを示す。グラフは、精製後、還元後、およびジスルフィド結合を形成する再折畳み後のTn3SS3+4の逆相HPLCクロマトグラムを描く。このトレース図は、足場内に含まれるシステインがタンパク質精製後に部分的にのみ酸化され(上側のトレース)、DTTを用いる処理により完全に還元され(中央のトレース)、ならびに再折畳み後にジスルフィドに完全に酸化される(下側のトレース)ことを示していた。
【図１０Ｋ】二重ジスルフィド含有足場Tn3SS3+4は高レベルの安定性を示す。このグラフは、Tn3(WT)足場(丸)の安定性と、単一ジスルフィド含有足場、Tn3SS4(四角)および二重ジスルフィド含有足場、Tn3SS3+4(三角)とを比較する塩酸グアニジン変性アッセイに由来する結果を描く。グラフに提供されるように、再折畳みされた二重ジスルフィド足場Tn3SS3+4は、単一の再折畳みされたジスルフィド含有足場、Tn3SS4ならびにTn3足場と比較して、グアニジンを介する変性に対するより高い耐性を示し、および従ってより安定であった。
【図１１Ａ】超好熱性生物に由来する足場の発現および精製を示す。様々な超好熱性細菌に由来する予測される足場(Tn3構造モチーフ)の発現および精製を記録するクマシー染色されたPAGEゲルを提供する。予測された足場は全部、均質になるまで発現および精製された。図面において、Tは全細胞溶解物を表し、Sは可溶性溶解物画分を表し、Pは精製されたタンパク質を表す。
【図１１Ｂ】スタフィロサームス・マリナスに由来する足場は、高レベルの熱安定性を示す。このグラフは、スタフィロサームス・マリナスに由来する足場の熱安定性を描く。推定される足場を組換え発現させ、精製し、熱安定性試験にかけた。グラフに提供されるように、スタフィロサームス・マリナスに由来する足場は、高い融点(pH 7.0で約83℃)を示す。
【図１１Ｃ】スルフォロブス・トコダイに由来する足場は、高レベルの安定性を示す。このパネルは、スルフォロブス・トコダイに由来する足場の熱安定性を描く。推定される足場を組換え発現させ、精製し、示差走査熱量測定計における熱安定性試験にかけた。グラフに提供されるように、スルフォロブス・トコダイに由来する足場は、pH 3.0で高い融点(約98℃)を示す。この足場はまた、pH 7.0で高いレベルの安定性を示すが、75℃を超える温度でそれは凝集し、溶液から抽出される。
【図１１Ｄ】スタフィロサームス・マリナスに由来する足場は、高レベルの安定性を示す。このグラフは、スタフィロサームス・マリナスに由来する足場の高いタンパク質安定性を証明する塩酸グアニジン変性アッセイに由来する結果を描く。グラフに提供されるように、足場をアンフォールディングする(50％の分子が5.0Mのグアニジン濃度でアンフォールディングされる)には高濃度の塩酸グアニジンが必要であり、高い安定性を例示した。
【図１１Ｅ】スルフォロブス・トコダイに由来する足場は、高レベルの安定性を示す。このパネルは、スルフォロブス・トコダイに由来する足場の高いタンパク質安定性を証明する塩酸グアニジン変性アッセイに由来する結果を描く。タンパク質の変性は、分子の相対蛍光の増加と相関する。グラフに提供されるように、pH 7.0(丸)またはpH 3.0(四角)で足場をアンフォールディングするには、高濃度のグアニジン-HClが必要であり、高い安定性を例示した。
【図１１Ｆ】スタフィロサームス・マリナスに由来する足場は、高レベルのプロテアーゼ耐性を示す。このグラフは、スタフィロサームス・マリナスに由来する足場の安定性を測定するプロテアーゼ感受性アッセイに由来する結果を描く。この実験においては、相対プロテアーゼ耐性は、タンパク質安定性と相関する。この足場については、サーモリシンと共に10分間インキュベートすることにより、長時間に渡って安定なままである小さいレベルの分解が得られる。スタフィロサームス・マリナス足場は、16時間の全経過に渡ってサーモリシン耐性を示した。
【図１１Ｇ】スルフォロブス・トコダイに由来する足場は、高レベルのプロテアーゼ耐性を示す。このパネルは、スルフォロブス・トコダイに由来する足場の安定性を測定するプロテアーゼ感受性アッセイに由来する結果を描く。この実験においては、相対プロテアーゼ耐性は、タンパク質安定性と相関する。スルフォロブス・トコダイ足場は、16時間の全経過に渡ってサーモリシン耐性を示した。
【図１１Ｈ】スタフィロサームス・マリナスに由来する足場を宿主細胞から精製する。このパネルは、スタフィロサームス・マリナス足場の精製における1工程を描く。この足場により示される高レベルの安定性に起因して、組換え足場を含有する未精製の大腸菌溶解物を加熱して、足場を保持しながら宿主細胞タンパク質の塊を除去することができる。レーン1は、加熱処理の前の未精製の溶解物を表す。未精製の溶解物を含むPAGEゲルのクマシー染色は、候補足場が存在したことを示す。70℃で15分間の未精製の溶解物の加熱処理により、宿主細胞タンパク質の多くの喪失をもたらしたが、足場は無傷のままであった(レーン2)。
【図１１Ｉ】スタフィロサームス・マリナスに由来する足場を宿主細胞から精製する。このパネルは、スタフィロサームス・マリナス足場の精製における1工程を描く。この足場により示される高レベルの安定性に起因して、組換え足場を含む未精製の大腸菌溶解物をサーモリシンで処理して、足場を保持しながら宿主細胞タンパク質の塊を分解することができる。レーン1は、プロテアーゼ処理の前の未精製の溶解物を表す。未精製の溶解物を含むPAGEゲルのクマシー染色は、候補足場が存在することを示す。55℃で45分間の未精製の溶解物のプロテアーゼ処理により、宿主細胞タンパク質の多くの喪失をもたらしたが、足場は無傷のままであった(レーン2)。
【図１１Ｊ】スルフォロブス・トコダイに由来する足場を宿主細胞から精製する。このパネルは、スルフォロブス・トコダイ足場の精製を描く。この足場により示される高レベルの安定性に起因して、組換え足場を含む未精製の溶解物をpH 3.0でインキュベートし、温度を15分間70℃に上昇させて、可溶性足場を保持しながら、宿主細胞タンパク質の大部分を除去することができる。レーン1は、酸性化または加熱処理の前の未精製の大腸菌溶解物を表す。レーン2は、未精製の溶解物のpHを3.0に低下させた後にも残存する可溶性タンパク質を表す。レーン3は、pHを3.0に低下させ、70℃で15分間インキュベートした後の可溶性タンパク質を表す。この足場は、耐性であり、これらの処理を通して溶液中に残留した。
【図１２】2個のループがSynBP01のSYNAGIS(登録商標)への結合にとって必要である。このパネルは、プレートに結合したSYNAGIS(登録商標)へのSynBP01およびその変異体の結合を描く。この実験においては、SynBP01のBCおよびFGループを、野生型足場に導入して、SynBP01の単一ループ変異体を作製した。これらの変異体(BCのみおよびFGのみと呼ばれる)を、それらがプレートに結合したSYNAGIS(登録商標)への結合を示さないELISAに基づくアッセイにかけた。対照として、ELISAアッセイ形式におけるSynBP01結合を提供する。さらに、SS4ジスルフィド突然変異をSynBP01の上に重ねた。SynBP01 SS4と呼ばれるこの変異体は、ELISA形式においてプレートに結合したSYNAGIS(登録商標)への結合を示さなかった。
【図１３】BIAcoreにより測定される、TRAIL-R2特異的クローン5E5の結合親和性決定を示す。このパネルは、チップに結合したTRAIL-R2に関するクローン5E5の親和性決定を描く。Kdは、約700 nMであると見積もられた。
【図１４】複数のTRAIL-R2特異的クローンにより示される競合的結合を示す。このパネルは、様々なTRAIL-R2特異的足場の競合的結合実験に由来する結果を描く。2個のTRAIL-R2特異的クローン、5E5および7G11を、ファージ上にディスプレイされた他のTRAIL-R2特異的クローンに対する競合的結合について試験した。5E5はそれ自身ならびに2H6および7G11以外の他の全てのクローンと競合する。7G11のみ、それ自身および2H6と競合する。このデータは、TRAIL-R2上の2個の異なるエピトープを認識するクローンの2個の群が存在することを示している。
【図１５−１】様々なTRAIL-R2特異的クローンの競合を示す。このパネルは、様々なTRAIL-R2特異的足場の競合的結合実験に由来する結果を描く。5個のTRAIL-R2特異的クローン、1E3、1G11、2B4、1C12および2D3を、ファージ上にディスプレイされた他のTRAIL-R2特異的クローンに対する競合的結合について試験した。1E3、1C12および2D3は、8B3および7G11について以外のファージディスプレイクローンの多くと競合した。可溶性1G11はファージディスプレイクローンのいずれとも競合せず、2B4は多くの事例において少しから中程度の阻害を示した。このデータは、1E3、1C12および2D3はTRAIL-R2上の同じエピトープを認識することを示唆する。
【図１５−２】図１５−１の続きである。
【図１５−３】図１５−２の続きである。
【図１６】TRAIL-R2結合剤が細胞の生存能力を阻害することを示す。このパネルは、2:1:0.5のモル比で抗HISタグ抗体および抗マウスIgGと複合体化させた場合、5E5、7G11、1C12、2D3および1E3の処理に対するColo-205細胞系の感受性を描く。生細胞の割合(％)を、TRAIL-R2に結合しない対照Tn3で処理された細胞について得られたシグナルの割合としてTRAIL-R2結合クローンを用いる処理に関するアッセイシグナルを表すことにより得た。
【図１７Ａ】多価Tn3-融合タンパク質の例を表す図表を示す。二価構築物は、抗体Fc領域に融合したTn3であるが、四価構築物はTn3を重鎖定常領域および／または軽鎖Cκ領域に融合させたものである。
【図１７Ｂ】多価Tn3-融合タンパク質中のタンパク質モジュールの連結を示す図表を示す。i)Fc融合構築物においては、N末端のTn3モジュールを、ペプチドリンカーおよびIgG1のヒンジ領域を介してIgG1のFc領域に連結する。リンカー配列の長さおよび組成は変化してもよいが、実施例16においては-GA-モチーフであった。ii)Cκ融合構築物においては、N末端のTn3モジュールを、ペプチドリンカーを介して抗体κ軽鎖の定常領域に連結する。このリンカー配列の長さおよび組成は変化してもよいが、実施例16においては-GGGTPT-モチーフであった。iii)IGHG1融合構築物においては、N末端Tn3モジュールを、ペプチドリンカーを介してIgG1重鎖の定常領域に連結する。このリンカー配列の長さおよび組成は変化してもよいが、実施例16においては-GGGTPT-モチーフであった。
【図１８】多価Tn3構築物の発現を示す。図面に表されるのは、タンパク質A(プロテインA)精製後の二価Tn3構築物(サンプル1〜3)、および四価Tn3構築物(サンプル4〜7)の相対サイズを示す還元的SDS-PAGEである。サンプル番号は、表10に示されるものに対応する。発現された全ての構築物は、この分析により予測されたサイズを示す。
【図１９】Tn3単量体および多量体の結合親和性を示す。このパネルは、一価、二価および四価1C12およびD1 Tn3構築物を用いるBiosensor結合実験に由来するセンサーグラムを描く。TRAIL-R2-Fc融合タンパク質をセンサーチップ上に固定したが、サンプルタンパク質をチップ上に注入した。「テトラ」とは四価Cκ/IGHG1融合構築物を指す。1C12構築物は、価数の関数としてTRAIL-R2への改善された結合を示すが、対照D1構築物は結合を示さない。
【図２０】TRAIL-R2を標的化する二価Tn3構築物の効果を示す。このパネルは、(A)二価形態のTRAIL-R2特異的Tn3結合剤1C12または(B)架橋抗体(抗ヒトFc)を添加した、もしくは添加しない二価形態の非特異的Tn3結合剤で処理したH2122細胞の増殖阻害曲線を描く。対照非結合剤と比較して、TRAIL-R2特異的結合剤は、このアッセイにおいて軽度の活性を示したが、二次抗体の存在下では低下した。
【図２１】TRAIL-R2を標的化する四価Tn3構築物の効果を示す。このパネルは、(A)一特異的四価形態のTRAIL-R2特異的Tn3結合剤1C12または(B)架橋抗体(抗ヒトFc)を添加した、もしくは添加しない一特異的四価形態の非特異的Tn3結合剤で処理したH2122細胞の増殖阻害曲線を描く。対照非結合剤と比較して、TRAIL-R2特異的結合剤は、このアッセイにおいて活性を示したが、二次抗体の存在下ではわずかに低下した。
【図２２】TRAIL-R2を標的化する多特異的四価Tn3構築物の効果を示す。このパネルは、(A)二特異的四価形態のTRAIL-R2特異的Tn3結合剤1C12および2D3 (IgG1重鎖の定常領域に融合させた1C12、Cκドメインに融合させた2D3)または(B)架橋抗体(抗ヒトFc)を添加した、もしくは添加しない二特異的四価形態のTRAIL-R2特異的結合剤2D3および1C12 (IgG1重鎖の定常領域に融合させた2D3、Cκドメインに融合させた1C12)で処理したH2122細胞の増殖阻害曲線を描く。対照非結合剤と比較して(図21に示されたもの)、TRAIL-R2特異的結合剤は、このアッセイにおいて活性を示したが、二次抗体の存在下では増加した。
【図２３】pSec構築物の設計を示す。(A)は、pSec-oppA-Tn3中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を表す。oppAシグナルペプチド(下線)(配列番号227)は、ペリプラズム空間への分泌後に切断される。oppAシグナル内の最後から2番目の残基(イタリック体)を、pSec-oppA(L25M)-Tn3誘導体中でメチオニンに突然変異させて、NcoIクローニング部位を導入した。(B)は、前記構築物内のプロモーター、シグナルペプチド、Tn3およびHisタグモジュールのレイアウトを示すpSec-oppA(L25M)-Tn3構築物を示す。
【図２４−１】分泌されたTn3構築物の調製を示す。(A)は、Tn3を分泌する大腸菌に由来する未精製の培地およびペリプラズム画分のSDS-PAGE分析を表す。(B)は、大腸菌培地から精製されたTn3足場のSDS-PAGE分析を表す。(C)は、大腸菌培地から精製されたTn3のHPLC分析を表す。DTTによる還元後の滞留時間のシフトは、ジスルフィド結合の存在と一致している。
【図２４−２】図２４−１の続きである。
【図２５】SYNAGIS(登録商標)-Fc二価結合剤のSDS-PAGEを示す。このパネルは、Fc領域に融合させたSynBP01足場の還元的(レーン1)および非還元的(レーン2)SDS-PAGE分析を提供する。これらの結果は、この融合物が正確なサイズであり、二量体化を示していることを示している。
【図２６】SYNAGIS(登録商標)-Fc二価結合剤とSynBP01との競合的結合分析を示す。SynBP01とSynBP01-Fcの競合的BIAcore分析を示す。簡単に述べると、SYNAGIS(登録商標)を、アミンカップリングを介してCM5センサーチップの表面上に固定した。SynBP01またはSynBP01-Fcを、1μMの濃度で、75μL/分の流速で注入した。二価SynBP01-Fc構築物は、単一ドメイン結合剤よりも高い親和性を示す。
【図２７】Tn3足場をPEGに結合させることができる。(A)STn3(CTC)の固定金属親和性カラム精製(レーン1〜4)、およびマレイミド誘導体化PEGで処理した後(陽イオン交換クロマトグラフィーの前)の精製されたSTn3(CTC)(レーン5)のSDS-PAGE分析。レーン1：STn3(CTC)発現細胞に由来する全細胞溶解物；レーン2：IMACカラムからの流出物；レーン3：IMACカラムからの洗浄画分；レーン4：STn3(CTC)、非PEG化；レーン5：PEG化されたSTn3(CTC)。(B)SP XL陽イオン交換カラムから精製された、PEG化されたSTn3(CTC)のSDS-PAGE分析。ピーク勾配画分をレーン1〜5に示す。
【図２８】AB、CD、およびEFループはループ長多様性を示す。AB、CDおよびEFループの長さを、103 Fn3配列の各々について抽出し、このデータを用いて、示されたループ長頻度分布を作製した。任意の所与のループについて、全ての長さに関する頻度の合計は、分析された配列数である103に等しい。
【図２９】異なるpHおよびイオン強度でのTn3の融点決定を示す。このグラフは、pH 7.0(20 mMリン酸ナトリウムバッファー中)(A)、pH 5.0(20 mM酢酸ナトリウムバッファー中)(B)およびpH 7.0の高塩バッファー中(1.0 M塩を含む20 mMリン酸ナトリウムバッファー)(C)でのTn3足場に関する、示差走査熱量測定法により測定された、温度融解曲線決定を示す。Tmは、高いイオン強度の存在下、pH 7.0のTn3については約45℃、pH 5.0では52℃、およびpH 7.0では55℃であると決定された。pH 7.0のサンプルに関する反復走査(黄色)は、熱アンフォールディングがこれらの条件下で可逆的であることを示している。Tn3の熱アンフォールディングはpH 5.0では不可逆的である。
【図３０Ａ】Tn3の電荷変異体の設計を示す。Tn3の三次元構造の漫画表示を示す(pdbコード：1ten)。配列番号1の残基8〜90を示し、全てのAspおよびGlu残基の側鎖を黄色および白色で示す。黄色で示されるAspおよびGlu残基をAsnまたはGlnと置換した8個の突然変異体のパネルを設計した。残基番号は配列番号1に従う。
【図３０Ｂ】Tn3の精製された組換え電荷変異体のSDS-PAGE分析を示す。精製タンパク質のそれぞれのアリコートを、SDS-PAGEゲル上で泳動した。比較のために、野生型タンパク質を同じゲルの別々のレーン中で泳動したところ、種々の電荷変異体と同様の移動速度を示す。
【図３１Ａ】Tn3突然変異を安定化させる加算性を示す。個々のAspまたはGlu残基をAsnまたはGlnと置換させた一連のTn3点突然変異体を作製した。固有の蛍光がタンパク質の変性を測定する尿素変性実験に由来する結果を提供する。この実験においては、Tn3足場の8個の電荷変異体のうちの5個(E33Q、D49N、E52Q、D53N、E86Q)は、野生型Tn3足場と比較して、アンフォールディングを行うためにより高濃度の尿素を必要とする。
【図３１Ｂ】電荷突然変異の組合せはTn3安定性におけるさらなる改善をもたらす。野生型Tn3の安定性を増強したAspまたはGlu残基の点突然変異を、Tn3の二重または三重変異中で組合わせた。組合わせたTn3突然変異体の各々(E33Q/D49N、D49N/E86QおよびE33Q/D49N/E86Q)は、対応する点突然変異体または野生型Tn3のいずれよりも高い安定性を示した。
【図３２】野生型および電荷操作されたTn3足場に関する融点決定を示す。このグラフは、示差走査熱量測定法により測定された、pH 7.0のTn3足場変異体の温度融解曲線決定を例示する。Tmは、野生型Tn3(A)については約45℃、E33Q/D49N Tn3(B)については50℃、D49N/E86Q Tn3(C)については52℃およびE33Q/D49N/E86Q Tn3(D)については52℃であると決定された。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
6. 発明の詳細な説明
本明細書に記載のタンパク質足場は、抗体由来フラグメントおよび非抗体フレームワークの両方よりも優れるように設計されている。抗体フラグメントに対する本発明の足場の主な利点は、構造的なものである。これらの足場は、ヒト体液タンパク質中に認められる全部、安定的、かつ可溶性の構造モジュールならびに他の天然起源(例えば、限定されるものではないが、好熱性細菌)に由来するものである。結果として、それらは抗体フラグメントよりも良好な折畳みおよび熱安定特性を示し、その作製は、無傷の抗体において、可変ドメインと定常ドメインとの境界などの疎水性環境中に埋めることができるアミノ酸残基を露出していることが多い、抗体の天然の折畳みの部分の除去を含む。そのような疎水性残基の溶媒への曝露により、凝集の可能性が増加する。
【００２６】
さらに、本発明の足場は、抗体分子の機能的利点を提供する。特に、前記足場が免疫グロブリンではないという事実にも拘わらず、その全体の折畳みは、IgG重鎖の可変領域のものと近く、相対的な方向で抗体CDRと類似する様式でその3個のループを展示させることができる。この構造のため、本発明の足場は、天然で類似する抗原結合特性および抗体のものに対する親和性を有する。結果として、in vivoでの抗体の親和性成熟のプロセスと類似するループ無作為化およびシャッフリング戦略を、in vitroで用いることができる。
【００２７】
6.1 FnIII構造モチーフ
本発明の足場は、哺乳動物の血液および構造タンパク質中に認められるドメインである、III型のフィブロネクチンモジュール(FnIII)の構造に基づく。このドメインは、フィブロネクチン、テナシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体および原核生物酵素などの現在までに配列決定されたタンパク質中に生じることが多い(BorkおよびDoolittle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8990, 1992; Borkら、Nature Biotech. 15:553, 1997; Meinkeら、J. Bacteriol. 175:1910, 1993; Watanabeら、J. Biol. Chem. 265:15659, 1990)。前記ドメインは天然で何度も出現するが、そのアミノ酸配列は全く異なる。特に、これらの足場としては、テナシンCの第3のFnIIIドメイン(「Tn3」ドメインとしても知られる)が挙げられる。このドメインの全体の折畳みは、ラクダおよびラマのIgG中の抗原認識ユニット全体を含む、重鎖の可変領域である最も小さい機能的抗体フラグメントのものと密接に関連する。
【００２８】
さらに、Tn3ドメインは、無作為化に耐える露出したループ配列を有し、高い親和性で特異的標的に結合することができるタンパク質足場の多様なプールの生成を容易にする。
【００２９】
これらのタンパク質足場を、実質的に任意の目的の化合物(例えば、任意のタンパク質)に結合することができるタンパク質を設計する目的で用いることができる。特に、本明細書に記載のTn3構造モチーフに基づく分子を、抗体可変領域の相補性決定領域(CDR)と類似する1個以上のループを無作為化するように設計された指向性進化にかけられる足場として用いることができる。そのような指向性進化手法は、目的の抗原に対する高い親和性を有する抗体様分子の産生をもたらす。さらに、本明細書に記載の足場を用いて、規定の露出したループ(例えば、以前に無作為化され、抗原結合に基づいて選択されたループ)を展示して、そのような導入されたループに結合する分子の進化を指令することができる。この型の選択を実行して、任意の個々のCDR様ループまたはあるいは、非線状エピトープ結合部分中で組み合わされた2個もしくは3個全部のCDR様ループの認識のための認識分子を同定することができる。
【００３０】
IgG重鎖の抗原結合ループに対応するTn3の3個のループのセットは、アミノ酸残基23-31(BC)、50-56(DE)、および75-84(FG)の間に及ぶ。BC、DE、およびFGループの長さは、それぞれ9、6、および10残基であり、抗体重鎖に認められる対応する抗原認識ループの狭い範囲内にある、すなわち、それぞれ7-10、4-8、および4-28残基の長さである。あるいは、別の実施形態においては、BC、DE、およびFGループは、それぞれアミノ酸残基23-31、51-56、および75-84の間に及ぶ。従って、一度、高い抗原親和性について無作為化され、選択されたら、これらのループは、抗原との接触を抗体中の対応するループの接触と等価にすることができる。Tn3ドメインのAB、CD、およびEFループはまた、この特性を共有し、従って、抗原に対する高い親和性のための無作為化および選択のために利用する。このプロセスを、BC、DE、およびFGループの無作為化と平行して、または連続的に達成することができる。
【００３１】
特定の実施形態においては、ヒトテナシンCのTn3ドメインに基づく足場の1個以上のループ領域は、アミノ酸残基：
I. ABループ中に含まれる12〜17；
II. BCループ中に含まれる23〜31；
III. CDループ中に含まれる39〜45；
IV. DEループ中に含まれる50〜56；
V. EFループ中に含まれる60〜66；および
VI. FGループ中に含まれる75〜84、
を含む。
【００３２】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、ループが配列番号201、202、203、204、205または206のアミノ酸配列を含む、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループを含む。一実施形態においては、本発明の足場は、配列番号201のアミノ酸配列を有するABループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号202のアミノ酸配列を有するBCループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号203のアミノ酸配列を有するCDループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号204のアミノ酸配列を有するDEループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号205のアミノ酸配列を有するEFループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号206のアミノ酸配列を有するFGループを含む。特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号201のアミノ酸配列を有するABループ、配列番号202のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号203のアミノ酸配列を有するCDループ、配列番号204のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号205のアミノ酸配列を有するEFループ、および配列番号206のアミノ酸配列を有するFGループを含む。
【００３３】
別の特定の実施形態においては、ヒトテナシンCのTn3ドメインに基づく足場の1個以上のループ領域は、アミノ酸残基：
I. ABループ中に含まれる11〜17；
II. BCループ中に含まれる23〜31；
III. CDループ中に含まれる39〜45；
IV. DEループ中に含まれる51〜56；
V. EFループ中に含まれる60〜67；および
VI. FGループ中に含まれる75〜84、
を含む。
【００３４】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、ループが配列番号207、202、203、208、209、または206のアミノ酸配列を含む、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループを含む。一実施形態においては、本発明の足場は、配列番号207のアミノ酸配列を有するABループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号202のアミノ酸配列を有するBCループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号203のアミノ酸配列を有するCDループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号208のアミノ酸配列を有するDEループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号209のアミノ酸配列を有するEFループを含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号206のアミノ酸配列を有するFGループを含む。特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号207のアミノ酸配列を有するABループ、配列番号202のアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号203のアミノ酸配列を有するCDループ、配列番号208のアミノ酸配列を有するDEループ、配列番号209のアミノ酸配列を有するEFループ、および配列番号206のアミノ酸配列を有するFGループを含む。
【００３５】
他の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号1〜32または68〜88のいずれかにおける同族ループ領域の変異体であるループ領域を含む。
【００３６】
本発明は、天然のタンパク質配列から誘導された複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメインを含み、該ループ領域配列の1個以上が、天然のタンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸による欠失、置換もしくは付加により変化し、ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが、天然のタンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、組換えの非天然ポリペプチド足場を提供する。例えば、そのようなアミノ酸配列は、限定されるものではないが、配列番号1〜32、60〜88、および210のいずれかであってよい。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、ヒトテナシンCのTn3ドメインの配列を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、ヒトテナシンCのTn3ドメインに対して少なくとも50％の相同性を有する配列を含む。さらなる実施形態においては、Tn3ドメインに対する前記相同性は、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％以上である。他の実施形態においては、天然の配列は、ヒトテナシンCに由来するさらなるTn3構造モチーフに対応するタンパク質配列である。他の実施形態においては、天然の配列は、別のテナシンタンパク質に由来するTn3構造モチーフに対応するタンパク質配列、またはあるいは、別の生物に由来するテナシンタンパク質(限定されるものではないが、マウス、ブタ、ウシ、もしくはウマテナシンなど)である。
【００３７】
Tn3は抗体模倣物質の生成のための足場であるが、他の分子を本明細書に記載の分子中でTn3に置換してもよい。これらのものとしては、限定されるものではないが、動物および原核生物に由来する関連Tn3構造モチーフが挙げられる。さらに、他のタンパク質に由来するTn3構造モチーフを用いることもできる。様々な生物および親タンパク質に由来するモジュールは、様々な用途にとって最も好適であってよい；例えば、低いpHで安定な足場の設計においては、低いpHで最適に増殖する生物(限定されるものではないが、スルフォロブス・トコダイなど)からそのタンパク質を生成させるのが最も望ましい。別の実施形態においては、関連するTn3構造モチーフを、限定されるものではないが、それぞれ、70℃より高い温度で最適な増殖を示す、アーケオグロブス・フルギダスおよびスタフィロサームス・マリナスなどの超好熱性細菌から同定し、用いることができる。他の実施形態においては、天然の配列は、例えば、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリナス、スルフォロブス・アシドカルダリウス、スルフォロブス・ソルファタリクス、およびスルフォロブス・トコダイなどの好熱性生物に由来する予測されたTn3構造モチーフに対応する。さらに別の実施形態においては、本発明の足場は、Tn3構造モチーフまたは上記の好熱性生物に由来する予測されたTn3構造モチーフに対応する配列に由来する任意の配列に対して少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％の相同性を有するタンパク質配列を有する。いくつかの実施形態においては、好熱性生物に由来するTn3構造モチーフを、配列番号2-4、および68-88のアミノ酸配列から選択することができる。
【００３８】
本発明はまた、8個以上の複数のβ鎖を有する本発明の足場も提供する。一実施形態においては、本発明の足場は、複数の、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個以上のβ鎖を含む。
【００３９】
本発明はまた、7個以上の複数のループ領域を有する本発明の足場も提供する。一実施形態においては、本発明の足場は、複数の、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個以上のループ領域を含む。
【００４０】
一実施形態においては、本発明の足場は、該β鎖がN末端からC末端に向かって、A、B、C、D、E、F、およびG鎖と呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、ループ領域がN末端からC末端に向かって、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループと呼ばれる、それぞれループ領域により分離された鎖である、少なくとも7個のβ鎖を含む。代替的な実施形態においては、本発明の足場は、それぞれの鎖がループ領域により分離された、7個未満のβ鎖を含む。代替的な実施形態においては、本発明の足場は、それぞれの鎖がループ領域により分離された、7個未満のβ鎖を含む。
【００４１】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個のβ鎖を含み、該β鎖は配列番号228〜234から選択されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該A鎖は配列番号228の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該B鎖は配列番号229の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該C鎖は配列番号230の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該D鎖は配列番号231の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該E鎖は配列番号232の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該F鎖は配列番号233の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該G鎖は配列番号234の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号228の配列を有するA鎖、配列番号229の配列を有するB鎖、配列番号230の配列を有するC鎖、配列番号231の配列を有するD鎖、配列番号232の配列を有するE鎖、配列番号233の配列を有するF鎖および配列番号234の配列を有するG鎖を含む。
【００４２】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個のβ鎖を含み、該β鎖は配列番号235、229、230、236、232、237、および234から選択されるアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該A鎖は配列番号235の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該B鎖は配列番号229の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該C鎖は配列番号230の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該D鎖は配列番号236の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該E鎖は配列番号232の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該F鎖は配列番号237の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、N末端からC末端に向かって、A-Gと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖を含み、該G鎖は配列番号234の配列を含む。別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号235の配列を有するA鎖、配列番号229の配列を有するB鎖、配列番号230の配列を有するC鎖、配列番号236の配列を有するD鎖、配列番号232の配列を有するE鎖、配列番号237の配列を有するF鎖および配列番号234の配列を有するG鎖を含む。
【００４３】
別の実施形態においては、本発明の足場は、配列番号1〜32または68〜99のいずれかの同族β鎖に対して少なくとも50％の相同性を有するβ鎖配列を含む。さらなる実施形態においては、前記相同性は、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％以上である。
【００４４】
タンパク質足場の様々な鎖を接続するループを、長さおよび／または配列多様性について無作為化することができる。一実施形態においては、少なくとも1個のループを有する本発明の足場を、長さおよび／または配列多様性について無作為化する。別の実施形態においては、少なくとも1個のループを有する本発明の足場を一定に保持するが、少なくとも1個のさらなるループを長さおよび／または配列多様性について無作為化する。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、ループAB、CDおよびEFの少なくとも1個を一定に保持するが、ループBC、DEおよびFGの少なくとも1個を長さまたは配列多様性について無作為化した足場を有する。
【００４５】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)を用いて無作為化されたBCループを含む。
【００４６】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(配列番号257)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)を用いて無作為化されたBCループを含む。
【００４７】
別の実施形態においては、本発明の足場は、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(配列番号258)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンもしくはグリシンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含むBCループを有する。
【００４８】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)を用いて無作為化されたFGループを含む。
【００４９】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)を用いて無作為化されたFGループを含む。
【００５０】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(配列番号259)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)を用いて無作為化されたFGループを含む。
【００５１】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)を用いて無作為化された、6個の残基を含む、DEループを有する足場を含む。
【００５２】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニンまたはグリシンである)を用いて無作為化された、7個の残基を含む、ABループを含む。
【００５３】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニンまたはグリシンである)を用いて無作為化された、9個の残基を含む、ABループを含む。
【００５４】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、CDループ中のそれぞれの残基が無作為化され、Xがアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンである、7、8または9個の残基を含むCDループを含む。
【００５５】
特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を用いて無作為化された、8個の残基を含むEFループを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、約75〜約500、約75〜約200、約75〜約100、約75〜約250、または約75〜約150個のアミノ酸を含んでもよい。
【００５７】
6.2 ジスルフィド操作された足場に基づくタンパク質
本発明の足場の安定性を増加させる努力において、バイオインフォマティックス手法を用いて、ジスルフィド結合の操作にとって好適な候補位置を同定した。しかしながら、近い位置にある候補残基対を同定するためのタンパク質構造の手動検査によるジスルフィド設計は、その型の結合により要求される厳密な幾何学的制約に起因して、非生産的であることが多い(Dombkowski, Bioinformatics Vol.19 No.14, 2003, 1852-1853を参照)。かくして、本発明は、熱耐性、カオトロピック変性およびプロテアーゼ処理に対する耐性により測定されるように増強された安定性を示す位置で操作されたジスルフィド結合を有する足場を提供する。
【００５８】
一実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、または少なくとも5個の非天然ジスルフィド結合を含む。一実施形態においては、本発明の足場は、該足場を安定化する、少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、2個のβ鎖間に位置する少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。例えば、前記少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合は、A鎖とB鎖の間、またはD鎖とE鎖の間、またはF鎖とG鎖の間、またはC鎖とF鎖の間の結合を形成してもよい。別の実施形態においては、少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合は、F鎖とG鎖の間の第1の結合、およびC鎖とF鎖の間の第2の結合を形成する。別の実施形態においては、本発明の足場は、2個のループ領域間に位置する少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、ループ領域とβ鎖の間に位置する少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、同じβ鎖内に位置する少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、同じループ領域内に位置する少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、2個の異なる足場間に位置する、少なくとも1個の非天然ジスルフィド結合を含む。
【００５９】
別の実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個以上の足場の多量体足場(用語「多量体」は、結合した少なくとも2個以上の足場と定義される)を形成するジスルフィド結合を含む。
【００６０】
ジスルフィド結合の操作により寄与される安定性の増加を、熱(Tm)変性およびカオトロピック変性(尿素、もしくはグアニジンなど)、プロテアーゼ処理(サーモリシンなど)または別の当業界で許容される安定性パラメーターなどの、当業界でよく知られた技術により容易に測定することができる。タンパク質安定性を測定するのに用いられる技術の包括的概説を、例えば、John WileyおよびSons, 2007による「Current Protocols in Molecular Biology」および「Current Protocols in Protein Science」に見出すことができる。
【００６１】
一実施形態においては、本発明のジスルフィド含有足場は、熱耐性、カオトロピック変性に対する耐性、プロテアーゼ処理または当業界で知られる別の安定性パラメーターにより測定されるように、ジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上の安定性の増加を示す。
【００６２】
タンパク質の安定性を、変化する条件下で該タンパク質により示される蛍光のレベルにより測定することができる。タンパク質の相対的変性性と、該タンパク質がストレス下で示す内部蛍光の変化との間には正の相関がある。温度特性を測定するための好適なタンパク質安定性アッセイとしては、示差走査熱量測定法(DSC)および円偏光二色性分析(CD)が挙げられる。タンパク質がDSCまたはCDにより測定されたパラメーターのかなりのシフトを示す場合、それは変性された構造と相関し、このシフトが為される温度を融点または(Tm)と呼ぶ。一実施形態においては、本発明のジスルフィド操作された足場は、同じ実験条件下での操作前の同じ足場により示される融点(Tm)よりも、少なくとも45℃高い、少なくとも50℃高い、少なくとも55℃高い、少なくとも60℃高い、少なくとも65℃高い、少なくとも70℃高い、少なくとも71℃高い、少なくとも72℃高い、少なくとも73℃高い、少なくとも74℃高い、少なくとも75℃高い、少なくとも76℃高い、少なくとも77℃高い、少なくとも78℃高い、少なくとも79℃高い、少なくとも80℃高い、少なくとも81℃高い、少なくとも82℃高い、少なくとも83℃高い、少なくとも84℃高い、少なくとも85℃高い、少なくとも86℃高い、少なくとも87℃高い、少なくとも88℃高い、少なくとも89℃高い、少なくとも90℃高い、少なくとも91℃高い、少なくとも92℃高い、少なくとも93℃高い、少なくとも94℃高い、少なくとも95℃高い、少なくとも96℃高い、少なくとも97℃高い、または少なくとも98℃高い、または少なくとも100℃高い、または少なくとも105℃高い、または少なくとも110℃高い、または少なくとも120℃高い増加した融点(Tm)を示す。
【００６３】
別の実施形態においては、本発明のジスルフィド操作された足場は、同じ実験条件下でのジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上の増加した融点(Tm)を示す。
【００６４】
タンパク質安定性のための別のアッセイは、該タンパク質内での相互作用を不安定化するように作用する、尿素またはグアニジン(例えば、グアニジン-HClもしくはグアニジンイソチオシアネート)などのカオトロピック剤にタンパク質を曝露することを含む。タンパク質を高レベルの尿素またはグアニジンに曝露する際に、相対的内部蛍光を測定して、タンパク質の50％が変性される値を評価する。この値をCm値と呼び、これがタンパク質安定性に関する基準値である。Cm値が高くなるほど、タンパク質はより安定になる。一実施形態においては、本発明のジスルフィド操作された足場は、同様の条件下での尿素変性実験において測定されたジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上増加したCmを示す。
【００６５】
別の実施形態においては、本発明のジスルフィド操作された足場は、同様の条件下でのグアニジン変性実験において測定されたジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上増加したCmを示す。
【００６６】
タンパク質安定性をアッセイするのに用いられる別のアッセイは、プロテアーゼ耐性アッセイである。このアッセイにおいては、タンパク質安定性の相対レベルは、長時間に渡ってプロテアーゼ分解に対する耐性と相関する。プロテアーゼ処理に対する耐性が高くなるほど、タンパク質は安定になる。一実施形態においては、本発明のジスルフィド操作された足場は、同様の条件下でのプロテアーゼ耐性実験において測定されたジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上増加した安定性を示す。
【００６７】
いくつかの例においては、低下した安定性を有する本発明の足場、例えば、限定されるものではないが、細胞毒素に結合された足場、または放射性核種を用いることが有利である。そのような足場は、非特異的毒性に関連するより速い消失速度を必要とするかもしれない。一実施形態においては、本発明の足場は、操作前の足場と比較して、足場を不安定化するジスルフィド結合を含む。一実施形態においては、本発明のジスルフィド含有足場は、同様の実験条件下で熱耐性、カオトロピック変性に対する耐性、プロテアーゼ処理または当業界でよく知られた別の安定性パラメーターにより測定された、ジスルフィド操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％以上の安定性の低下を示す。
【００６８】
6.3 足場反応速度論
本発明は、標的(例えば、タンパク質)に特異的に結合する足場を提供する。いくつかの実施形態においては、標的は、例えば、限定されるものではないが、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定抗原、免疫サイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原であってよい。
【００６９】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、特定の反応速度で標的に特異的に結合する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、BIAcore(登録商標)アッセイまたは当業界で公知の他のアッセイにより決定されるような、少なくとも105 M-1s-1、少なくとも1.5x105 M-1s-1、少なくとも2x105 M-1s-1、少なくとも2.5x105 M-1s-1、少なくとも5x105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5x106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5x107 M-1s-1、もしくは少なくとも108 M-1s-1の結合速度定数もしくはkon速度(足場(Sc) + 抗原(Ag)(kon→Sc-Ag)、または約105〜約108 M-1s-1のkon速度、約1.5x105 M-1s-1〜約1x107 M-1s-1のkon速度、約2x105〜約1x106 M-1s-1のkon速度もしくは約4.5x105〜約5x 107 M-1s-1のkon速度を有してもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、BIAcore(登録商標)アッセイまたは当業界で公知の他のアッセイにより決定されるような、10-3 s-1未満、5x10-3 s-1未満、10-4 s-1未満、2x10-4 s-1未満、5x10-4 s-1未満、10-5 s-1未満、5x10-5 s-1未満、10-6 s-1未満、5x10-6 s-1未満、10-7 s-1未満、5x10-7 s-1未満、10-8 s-1未満、5x10-8 s-1未満、10-9 s-1未満、または5x10-9 s-1未満、10-10 s-1未満、または10-3-10-10 s-1、10-4-10-8 s-1、または10-5-10-8 s-1のkoff速度(足場(Sc)+抗原(Ag koff←→Sc-Ag))を有してもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも102 M-1、少なくとも5x102 M-1、少なくとも103 M-1、少なくとも5x103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5x104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5x105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5x106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5x107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5x108 M-1、少なくとも109 M-1、少なくとも5x109 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5x1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5x1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5x1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5x1013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5x1014 M-1、少なくとも1015 M-1、または少なくとも5x1015 M-1、または102-5x105 M-1、104-1x1010 M-1、または105-1x108 M-1の親和性定数またはKa(kon/koff)を有してもよい。本発明の足場は、BIAcore(登録商標)アッセイまたは当業界で公知の他のアッセイにより決定されるような、多くても1011 M-1、多くても5x1011 M-1、多くても1012 M-1、多くても5x1012 M-1、多くても1013 M-1、多くても5x1013 M-1、多くても1014 M-1、または多くても5x1014 M-1のKaを有してもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、BIAcore(登録商標)アッセイまたは当業界で公知の他のアッセイにより決定されるような、10-5 M未満、5x10-5 M未満、10-6 M未満、5x10-6 M未満、10-7 M未満、5x10-7未満、10-8 M未満、5x10-8 M未満、10-9 M未満、5x10-9 M未満、10-10 M未満、5x10-10 M未満、10-11 M未満、5x10-11 M未満、10-12 M未満、5x10-12 M未満、10-13 M未満、5x10-13 M未満、10-14 M未満、5x10-14 M未満、10-15 M未満、または5x10-15 M未満の解離定数またはKd(koff/kon)を有してもよい。
【００７３】
6.4 足場に基づく結合タンパク質の指向性進化
本明細書に記載の足場を、新規または改良された標的結合タンパク質を考案するための任意の技術において用いることができる。1つの特定の例においては、この標的をカラム樹脂またはマイクロタイタープレートのウェルなどの固相支持体上に固定し、標的を候補足場に基づく結合タンパク質のライブラリーと接触させる。そのようなライブラリーは、CDR様ループの配列および／または長さの無作為化を介して、Tn3モチーフに基づく足場から構築されたクローンからなってもよい。一実施形態においては、前記ライブラリーは、ファージ、ファージミド、ウイルス、細菌もしくは酵母ディスプレイ(展示)またはリボソーム展示ライブラリーであってよい。必要に応じて、このライブラリーは、例えば、Szostakら、米国特許第6,258,558 B1号、同第6,261,804 B1号; 同第5,643,768号および同第5,658,754号に記載の技術により作製されたRNA-タンパク質融合ライブラリーであってよい。あるいは、それはDNA-タンパク質ライブラリー(例えば、Lohse, DNA-Protein Fusions and Uses Thereof、1998年12月2日に提出された米国特許出願第60/110,549号、現在放棄中、および1999年12月2日に提出された米国特許出願第09/453,190号に記載のもの)であってもよい。
【００７４】
この点で、バクテリオファージ(ファージ)展示は、標的に特異的に結合することができるライブラリーのメンバーを同定するために大きいオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる1つのよく知られた技術である。ファージ展示は、ポリペプチド変異体を、バクテリオファージ粒子の表面上に外被タンパク質との融合タンパク質として展示する技術である(Scott, J. K.およびSmith, G. P. (1990) Science 249: 386)。ファージ展示の有用性は、選択的に無作為化されたタンパク質変異体(または無作為にクローニングされたcDNA)の大きいライブラリーを、高い親和性で標的分子に結合するこれらの配列のために迅速かつ効率的に選別することができるという事実にある。ファージ上へのペプチド(Cwirla, S. E.ら(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378)またはタンパク質(Lowman, H. B.ら(1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T.ら(1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D.ら(1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A. S.ら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363)ライブラリーの展示は、特異的結合特性を有するものについて、数百万個のポリペプチドまたはオリゴペプチドをスクリーニングするために用いられてきた(Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。無作為突然変異体のファージライブラリーの選別には、多数の変異体を構築し、増殖するための戦略、標的受容体を用いる親和性精製のための手順、および結合濃縮物の結果を評価する手段が必要である(例えば、米国特許第5,223,409号、第5,403,484号、第5,571,689号、および第5,663,143号を参照)。
【００７５】
多くのファージ展示方法は繊維性ファージを用いてきたが、λファージ展示系(WO 95/34683; 米国特許第5,627,024号)、T4ファージ展示系(Renら、Gene, 215: 439 (1998); Zhuら、Cancer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiangら、Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Renら、Gene, 195(2):303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimovら、Virus Genes, 10: 173 (1995))およびT7ファージ展示系(SmithおよびScott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); 米国特許第5,766,905号)も公知である。
【００７６】
基本的なファージ展示概念の多くの他の改良およびバリエーションが、現在開発されている。これらの改良は、選択された標的分子への結合についてペプチドライブラリーをスクリーニングし、所望の特性についてこれらのタンパク質をスクリーニングする能力を有する機能的タンパク質を展示する展示系の能力を増強する。ファージ展示反応のための組合せ反応装置が開発されており(WO 98/14277)、生体分子相互作用(WO 98/20169; WO 98/20159)および制約されたへリックスペプチドの特性(WO 98/20036)を分析し、制御するためにファージ展示ライブラリーが用いられてきた。WO 97/35196は、ファージ展示ライブラリーを、リガンドが標的分子に結合する第1の溶液および親和性リガンドが標的分子に結合しない第2の溶液と接触させる親和性リガンドを単離して、結合リガンドを選択的に単離する方法を記載する。WO 97/46251は、親和性精製された抗体を用いて無作為ファージ展示ライブラリーをバイオパンニングした後、結合ファージを単離した後、マイクロプレートウェルを用いるマイクロパンニングプロセスを行って、高親和性結合ファージを単離する方法を記載する。親和性タグとしてのスタフィロコッカス・オーレウスタンパク質Aの使用も報告されている(Liら、(1998) Mol Biotech, 9:187)。WO 97/47314は、ファージ展示ライブラリーであってよい組合せライブラリーを用いて酵素特異性を識別するための基質サブトラクションの使用を記載している。ファージ展示を用いる洗剤における使用にとって好適な酵素を選択する方法が、WO 97/09446に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法が、米国特許第5,498,538号、第5,432,018号およびWO 98/15833に記載されている。
【００７７】
ペプチドライブラリーを作製し、これらのライブラリーをスクリーニングするための方法も、米国特許第5,723,286号、第5,432,018号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,498,530号、第5,770,434号、第5,734,018号、第5,698,426号、第5,763,192号、および第5,723,323号に開示されている。
【００７８】
本発明のライブラリーのために、バイオインフォマティックス手法を用いて、天然のTn3構造モチーフのループ長および多様性の優先傾向を決定した(実施例2を参照)。この分析の間に、ループ長および配列多様性の優先傾向を用いて、「制限無作為化」手法を開発した。この制限無作為化においては、相対的なループ長および配列優先傾向を、ライブラリー戦略の開発に組み入れた。例えば、BCループに関する1つのループ長優先傾向は9残基であると決定された。BCループを含む9残基のさらなる分析の際に、その位置に特定のアミノ酸、もしくはアミノ酸群に関する優先傾向が存在するかどうか、またはその位置が完全に無作為であるかどうかを決定した。ライブラリー開発へのループ長および配列多様性分析の組込みは、制限無作為化をもたらした(すなわち、アミノ酸がその位置に存在することができる無作為化されたループ内の特定の位置が限られていた)。制限無作為化手法の例は、実施例に記載されている(実施例2を参照)。
【００７９】
本発明はまた、本明細書に記載の足場を含むライブラリー(以後「本発明のライブラリー」と呼ぶ)も含む。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、天然のタンパク質配列から誘導された複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメインを含む非天然のポリペプチド足場であって、1個以上のループ領域配列が、天然のタンパク質配列中の対応するループ配列から、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加により変化し、ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが、天然のタンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、前記足場を含む。いくつかの実施形態においては、天然の配列は、ヒトテナシンTn3に対応するタンパク質配列である。他の実施形態においては、天然の配列は、ヒトテナシンCに由来するさらなるTn3構造モチーフに対応するタンパク質配列である。他の実施形態においては、天然の配列は、別のテナシンタンパク質、またはあるいは、別の生物(限定されるものではないが、マウス、ブタ、ウシ、もしくはウマテナシンなど)に由来するテナシンタンパク質に由来するTn3構造モチーフに対応するタンパク質配列である。さらに別の実施形態においては、天然の配列は、任意の生物に由来するTn3構造モチーフに対応するタンパク質配列である。他の実施形態においては、天然の配列は、好熱性生物、例えば、限定されるものではないが、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリナス、スルフォロブス・アシドカルダリウス、スルフォロブス・ソルファタリクス、およびスルフォロブス・トコダイに由来する予測されるTn3構造モチーフに対応する。さらに別の実施形態においては、本発明の足場は、Tn3構造モチーフまたは上記の予測されたTn3構造モチーフに対応する任意の配列に対して、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも99％の相同性を有するタンパク質配列を有する。
【００８０】
前記ライブラリーを、固定された標的と共にインキュベートし、支持体を洗浄して非特異的結合剤を除去し、最も強固な結合剤を非常にストリンジェントな条件下で溶出させ、PCRにかけて、配列情報を回収するか、または配列のさらなる突然変異誘発を用いて、もしくは用いずに、選択プロセスを繰り返すために用いることができる新規ライブラリーを作製する。抗原に対する十分な親和性の結合が得られるまで、選択のラウンド数を実施してもよい。
【００８１】
別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、本明細書に記載の足場を含む。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、N末端からC末端に向かって、A、B、C、D、E、F、およびG鎖と呼ばれる、少なくとも7個のβ鎖をさらに含む足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、それぞれの鎖が、N末端からC末端に向かって、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと呼ばれるループ領域により分離された、少なくとも7個のβ鎖をさらに含む足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、それぞれの鎖が、N末端からC末端に向かって、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGと呼ばれるループ領域により接続された、N末端からC末端に向かって、A、B、C、D、E、FおよびGと呼ばれる少なくとも7個のβ鎖をさらに含む足場を含む。
【００８２】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、アミノ酸残基：
I. ABループ中に含まれる12〜17；
II. BCループ中に含まれる23〜31；
III. CDループ中に含まれる39〜45；
IV. DEループ中に含まれる50〜56；
V. EFループ中に含まれる60〜66；および
VI. FGループ中に含まれる75〜84、
を含むヒトテナシンCのTn3ドメインに基づく足場の1個以上のループ領域をさらに含む足場を含む。
【００８３】
別の特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、アミノ酸残基：
I. ABループ中に含まれる11〜17；
II. BCループ中に含まれる23〜31；
III. CDループ中に含まれる39〜45；
IV. DEループ中に含まれる51〜56；
V. EFループ中に含まれる60〜67；および
VI. FGループ中に含まれる75〜84、
を含むヒトテナシンCのTn3ドメインに基づく足場の1個以上のループ領域をさらに含む足場を含む。
【００８４】
本発明はまた、ループ配列多様性を含む足場を含むライブラリーも提供する。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、無作為化された少なくとも1個の位置を含む少なくとも1個のループを有する足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、無作為化された少なくとも1個の位置を含むが、一定のまま保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを有する足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含むループを有する足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含み、一定に保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを有する足場を含む。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含み、無作為化された少なくとも1個の位置および一定に保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを有する足場を含む。
【００８５】
タンパク質足場の様々な鎖を接続するループを、長さおよび／または配列多様性について無作為化することができる。一実施形態においては、本発明のライブラリーは、長さおよび／または配列多様性について無作為化された少なくとも1個のループを有する足場を有する。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、少なくとも1個のループが一定に保持されるが、少なくとも1個のさらなるループが長さおよび／または配列多様性について無作為化される足場を有する。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、ループAB、CD、およびEFの少なくとも1個、少なくとも2個、もしくは3個全部が一定に保持されるが、ループBC、DE、およびFGの少なくとも1個、少なくとも2個、もしくは3個全部が長さもしくは配列多様性について無作為化された足場を有する。別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、ループAB、CDおよびEFの少なくとも1個、少なくとも2個、もしくは3個全部が無作為化されるが、ループBC、DEおよびFGの少なくとも1個、少なくとも2個、もしくは3個全部が長さもしくは配列多様性について無作為化された足場を有する。
【００８６】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)で無作為化されたBCループを有する足場を含む。
【００８７】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場は、以下のコンセンサス配列：A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(配列番号257)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)で無作為化されたBCループを含む。
【００８８】
別の実施形態においては、本発明のライブラリーは、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(配列番号258)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含むBCループを有する。
【００８９】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)で無作為化されたFGループを有する足場を含む。
【００９０】
別の特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)で無作為化されたFGループを有する足場を含む。
【００９１】
別の特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(配列番号259)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)で無作為化されたFGループを有する足場を含む。
【００９２】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)で無作為化された、7個の残基を含むABループを有する足場を含む。
【００９３】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)で無作為化された、9個の残基を含むABループを有する足場を含む。
【００９４】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、CDループ中の各残基が無作為化され、Xがアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリンまたはセリンである、7、8または9個の残基を含むCDループを有する足場を含む。
【００９５】
特定の実施形態においては、本発明のライブラリーは、以下のコンセンサス配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリンまたはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニンまたはグリシンである)で無作為化された、8個の残基を含むEFループを有する足場を含む。
【００９６】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の足場および上記の足場を含むライブラリーをコードする単離された核酸分子の集団である。
【００９７】
これらのTn3ライブラリーの設計におけるさらなる実用的な考慮は、典型的には、任意のアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチド中で用いられる「NNK」(N＝A、G、T、C；K＝G、T)混合コドンスキームの代替物を同定することであった。「NNK」混合物は20種全部のアミノ酸をコードする32個の異なるコドンを与えるが、それらは等しくコードされない(表11)。例えば、「NNK」スキーム中の3/32個のコドンは、Leu (CTG、CTT、TTG)をコードするが、1/32個のみがAsp (GAT)をコードする。さらに、「NNK」混合物は1個の停止コドン(TAG)およびCysコドン(TGT)をコードし、天然のライブラリーを作製する場合にはいずれも望ましくない。代替的なスキームを考える際に、本発明者らは、小さいサブセットのアミノ酸から構成されるCDR配列をコードする合成抗体ライブラリーが記載されているという事実に留意した。ちょうど4個のアミノ酸(Tyr、Ala、Asp、Ser)、またはさらに2対(Tyr、Ser)から構成されるCDRを有する抗体ライブラリーは、タンパク質抗原に対する特異的な高親和性のmAbをもたらすことが示されている(Fellouseら、Proc Natl Acad Sci, 2004, 101:12467-72, Fellouseら、J. Mol. Biol., 2005, 348:1153-62)。同様に、TyrおよびSerだけを含む無作為化されたループ配列を有する10Fn3足場タンパク質のライブラリーも、タンパク質標的に対する特異的結合剤をもたらした(Koideら、Proc Natl Acad, Sci, 2007, 104:66-32-7)。高度に制限されたセットのアミノ酸を含むライブラリーは特異的結合タンパク質を産生することができるが、ライブラリーから得られた結合剤の多様性が制限される可能性が高い。従って、本発明者らは、Tn3ライブラリー(H＝A、T、C)中に多様性を導入するための代替的な「NHT」混合コドンスキームを設計した。「NHT」混合物は20個のアミノ酸の合理的なサブセットをコードするが、「NNK」混合コドンについて記載された欠点を回避する(表12)。このスキームは、12/20個のアミノ酸をコードする12個のコドンを生成する、すなわち、各コドンは唯一のアミノ酸をコードする。さらに、停止コドンもCysコドンも存在しない。従って、いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、NNK混合コドンスキームによりコードされるコドンを含む。
【００９８】
他の実施形態においては、本発明の足場を、親和性成熟にかけることができる。この当業界で許容されるプロセスにおいては、特異的結合タンパク質を、特異的標的に対する増加した親和性について選択するスキームにかける(Wuら、Proc Natl Aca Sci USA. May 1998 26;95(11):6037-42を参照されたい)。本発明の得られた足場は、親和性成熟の前の足場と比較して少なくとも高い結合特性を示し得る。
【００９９】
他の実施形態においては、本発明の足場を、抗体に関するCDR移植と類似する「ループ移植」にかけることができる。この当業界で許容されるプロセスにおいては、抗体に由来する1個以上のCDRを、受容体抗体(またはこの例においては、本発明の足場)上に「移植」する(Ewertら、Methods:2004 Oct;34(2):184-99を参照)。別の実施形態においては、別の足場に由来する少なくとも1個のループを、本発明の足場上に移植することができる。
【０１００】
本発明はまた、足場：標的複合体を形成するような標的に結合することができるタンパク質足場のアミノ酸配列を同定する方法も提供する。一実施形態においては、前記方法は、a)本発明のポリペプチド展示ライブラリーを提供する工程；b)(a)のポリペプチド展示ライブラリーと、固定された標的もしくは分離可能な標的とを接触させる工程；c)遊離足場から足場：標的複合体を分離する工程；d)低下した多様性を有することにより、および標的に結合することができる展示された足場中で富化することにより、(a)中のものから区別された新規ポリペプチド展示ライブラリーをもたらすように、(c)の分離された足場の複製を引き起こす工程；e)必要に応じて、(d)の新規ライブラリーを用いて工程(b)、(c)および(d)を反復する工程；ならびにf)(d)に由来する標本の展示された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、従って、標的に結合することができるペプチド配列を推定する工程を含む。
【０１０１】
別の実施形態においては、本発明の足場を、ライブラリースクリーンからの同定後にさらに無作為化することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載の方法を用いて、ライブラリーから同定された足場の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループをさらに無作為化することを含む。別の実施形態においては、さらに無作為化された足場を、標的に結合することができる足場を同定するその後の方法であって、(a)さらに無作為化された足場と、固定された、もしくは分離可能な標的とを接触させること、(b)遊離足場からさらに無作為化された足場：標的複合体を分離すること、(c)(b)の分離された足場の複製を引き起こすこと、必要に応じて、工程(a)〜(c)を繰り返すこと、ならびに(d)さらに無作為化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、従って、標的に結合することができるペプチド配列を推定することを含む、前記方法にかける。さらなる実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の無作為化されたループを含む。さらに別の実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化されなかった少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の無作為化されたループを含む。
【０１０２】
別の実施形態においては、本発明の足場を、ライブラリースクリーンからの同定後にさらに無作為化することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載の方法を用いて、ライブラリーから同定された足場の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個または少なくとも7個の鎖をさらに無作為化することを含む。別の実施形態においては、さらに無作為化された足場を、標的に結合することができる足場を同定するその後の方法であって、(a)さらに無作為化された足場と、固定された、もしくは分離可能な標的とを接触させること、(b)遊離足場から、さらに無作為化された足場：標的複合体を分離すること、(c)(b)の分離された足場の複製を引き起こすこと、必要に応じて、工程(a)〜(c)を繰り返すこと、ならびに(d)さらに無作為化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、従って、標的に結合することができるペプチド配列を推定することを含む、前記方法にかける。さらなる実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個または少なくとも7個の無作為化された鎖を含む。さらに別の実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化されなかった少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個または少なくとも7個の無作為化された鎖を含む。
【０１０３】
別の実施形態においては、本発明の足場を、ライブラリースクリーンからの同定後にさらに無作為化することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、本明細書に記載の方法を用いて、ライブラリーから同定された足場の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個および少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の鎖をさらに無作為化することを含む。別の実施形態においては、さらに無作為化された足場を、標的に結合することができる足場を同定するその後の方法であって、(a)さらに無作為化された足場と、固定された、もしくは分離可能な標的とを接触させること、(b)遊離足場から、さらに無作為化された足場：標的複合体を分離すること、(c)(b)の分離された足場の複製を引き起こすこと、必要に応じて、工程(a)〜(c)を繰り返すこと、ならびに(d)さらに無作為化された足場をコードする領域の核酸配列を決定し、従って、標的に結合することができるペプチド配列を推定することを含む、前記方法にかける。さらなる実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化された、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の無作為化されたループおよび少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の鎖を含む。さらに別の実施形態においては、さらに無作為化された足場は、第1のライブラリー中で以前に無作為化されなかった、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の無作為化されたループおよび少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の鎖を含む。
【０１０４】
別の実施形態においては、本発明の足場を取得する1つの方法は、BC、DEおよびFGループからなる群より選択される第1の無作為化されたループと、AB、CDおよびEFループからなる群より選択された前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループとを含む。さらに別の実施形態においては、本発明の足場を取得する別の方法は、AB、CD、EFループからなる群より選択される第1の無作為化されたループと、BC、DEおよびFGループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループとを含む。
【０１０５】
本発明はまた、少なくとも1個以上の標的に結合する少なくとも2個の足場を取得する方法も提供する。この方法により、協調的に作用して特定の応答を引き出す薬剤のスクリーニングが可能になる。2個以上の足場の協調を要するアゴニスト活性が必要とされる場合(例えば、限定されるものではないが、受容体チロシンキナーゼのアゴニズム)、そのようなスクリーンを使用することが有利であり得る。この方法により、多量体複合体を形成させるためにライブラリーを再フォーマットすることなく、協調剤のスクリーニングが可能になる。一実施形態においては、本発明の方法は、足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと本発明のライブラリーとを接触させること、前記足場を、足場の架橋が検出可能な応答を引き出す架橋剤(少なくとも2個の同一もしくは異なる足場を近い位置に持って行く薬剤と定義される)と結合させること、ならびに複合体から、標的に結合する足場を取得することを含む。さらなる実施形態においては、架橋剤は、足場特異的抗体、またはその断片、その断片のエピトープタグ特異的抗体、Fc領域などの二量体ドメイン、ロイシンジッパーモチーフ、化学架橋剤、または当業界で公知の別の二量体ドメインである。
【０１０６】
本発明はまた、本発明の足場を用いて化合物を検出する方法も提供する。ライブラリースクリーニングにより得られる足場の結合特異性に基づいて、診断方法などの、サンプル中の特異的標的を検出するためのアッセイにおいてそのような足場を使用することができる。一実施形態においては、化合物を検出する方法は、化合物：足場複合体を形成させる条件下で、サンプル中の該化合物と、本発明の足場とを接触させること、ならびに該足場を検出することによって、サンプル中の該化合物を検出することを含む。さらなる実施形態においては、前記足場を標識(すなわち、放射標識、蛍光、酵素結合もしくは発色標識)して、前記化合物の検出を容易にする。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の足場を用いて化合物を捕捉する方法も提供する。ライブラリースクリーニングにより得られる足場の結合特異性に基づいて、精製方法などの、サンプル中の特異的標的を捕捉するためのアッセイにおいてそのような足場を用いることができる。一実施形態においては、サンプル中の化合物を捕捉する方法は、化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプル中の化合物と、本発明の足場とを接触させること、ならびに該サンプルから該複合体を除去し、それによって、該サンプル中の該化合物を捕捉することを含む。さらなる実施形態においては、前記足場を固定して、化合物：足場複合体の除去を容易にする。
【０１０８】
いくつかの実施形態においては、本発明のライブラリーから単離された足場は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個以上の無作為化されたループ領域を含む。いくつかの実施形態においては、単離された足場ループ配列を、ドナー足場から、レシーバー足場中の任意のループに交換することができる(例えば、ドナー足場に由来するABループ配列を、レシーバー足場中の任意のループ領域に移動させることができる)。特定の実施形態においては、単離されたループ配列を、受け入れる足場中の同族ループに移動させることができる(例えば、ドナー足場に由来するABループ配列を、ABループ位置中のレシーバー足場に移動させることができる)。いくつかの実施形態においては、単離されたループ配列を、様々なレシーバー足場と無作為に「混合および一致」させることができる。
【０１０９】
他の実施形態においては、単離された足場配列を、ループ配列により同定することができる。例えば、ライブラリーを用いて、特定の標的に対してパンし、特異的結合剤の回収物を単離する。無作為化されたループ配列を、足場バックグラウンド(すなわち、足場が配列番号xのABループ配列を含む、標的Xに結合する足場)とは無関係な特異的配列として特性評価することができる。代替的な実施形態においては、足場が標的Xに結合する2個のループ配列を示す場合、ループ配列を、足場配列の非存在下で標的Xに結合するものとして特性評価することができる。換言すれば、特定の標的に結合するライブラリーから単離された足場を、足場骨格とは無関係な標的に結合する可変ループ配列として発現させることができると意図される。このプロセスは、抗体の可変領域中のCDRの概念と類似するであろう。
【０１１０】
いくつかの実施形態においては、本発明は、SYNAGIS(登録商標)に特異的に結合する配列を含む足場を提供する。そのような実施形態においては、SYNAGIS(登録商標)に特異的に結合する本発明の足場は、配列番号100、102、105、107および109から選択されるBCループ配列を含んでもよい。他の実施形態においては、SYNAGIS(登録商標)に特異的に結合する本発明の足場は、配列番号101、103、104、106、108、または110から選択されるFGループ配列を含んでもよい。さらなる実施形態においては、SYNAGIS(登録商標)に特異的に結合する本発明の足場は、配列番号100、102、105、107および109から選択される少なくとも1個のBCループ配列を含んでもよく；配列番号101、103、104、106、108、または110から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含んでもよい。他の実施形態においては、本発明はまた、SYNAGIS(登録商標)結合剤が、配列番号100、102、105、107および109から選択される1個のBCループ配列；ならびに配列番号101、103、104、106、108または110から選択されるFGループ配列を含む、SYNAGIS(登録商標)に特異的に結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよい。競合アッセイを、実施例11および／もしくは14に提供されるように、または当業界で公知の他のアッセイにより実施することができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態においては、本発明は、リゾチームに特異的に結合する配列を含む足場を提供する。そのような実施形態においては、リゾチームに特異的に結合する本発明の足場は、配列番号111、114、102、120、および124から選択される少なくとも1個のBCループ配列を含んでもよい。他の実施形態においては、リゾチームに特異的に結合する本発明の足場は、配列番号112、113、115、116、117、118、119、121、122、または125から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含んでもよい。さらなる実施形態においては、リゾチームに特異的に結合する本発明の足場は、配列番号111、114、102、120および124から選択される少なくとも1個のBCループ；ならびに配列番号112、113、115、116、117、118、119、121、122、または125から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含んでもよい。他の実施形態においては、本発明はまた、リゾチーム結合剤が、配列番号111、114、102、120、または124から選択される少なくとも1個のBCループ；ならびに配列番号112、113、115、116、117、118、119、121、122、または125から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含む、リゾチームに結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよい。競合アッセイを、実施例11および／もしくは14に提供されるように、または当業界で公知の他のアッセイにより実施することができる。
【０１１２】
6.5 多量体足場
足場単量体に加えて、本明細書に記載の任意の足場構築物を、抗原結合の価数およびかくしてアビディティーを増加させるための手段として、足場の二量体または多量体として作製することができる。また、本明細書に記載の任意の足場構築物を、抗原結合の特異性を増加させるための手段として、足場の二量体または多量体を作製することができる(例えば、異なる抗原に結合する足場を作製することができる)。そのような多量体(多量体足場または本明細書では多価足場としても知られる)を、例えば、アミノ酸リンカーの含有により、個々の足場モジュール間の共有結合を介して作製することができる。他の方法においては、多量体足場を、当業界で公知の二量体ドメインの使用を介して集合させることができる。特定の例においては、単量体足場をコードする融合遺伝子を構築することにより、またはあるいは、システイン残基のコドンを単量体配列中に遺伝子操作し、発現産物間でジスルフィド結合形成を起こさせることにより、共有結合した足場を作製することができる。
【０１１３】
非共有的に結合した多量体足場を、様々な技術により作製することもできる。これらのものは、単量体配列中への、正および／または負に荷電した残基に対応するコドンの導入ならびに発現産物中でのこれらの残基間(および従って、単量体間)の相互作用を起こさせることを含む。この手法を、単量体サブユニット中に天然に存在する荷電した残基を利用することにより単純化することができる。非共有的に結合した足場を作製するための別の手段は、単量体足場遺伝子(例えば、アミノもしくはカルボキシ末端の)に、相互作用することが知られるタンパク質またはタンパク質ドメインのコード配列を導入することである。そのようなタンパク質またはタンパク質ドメインは、コイル-コイルモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、および二量体もしくはより高い次数の多量体の形成を指令することが知られる任意のいくつかのタンパク質サブユニット(またはその断片)を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態においては、本発明の多量体足場は、抗体の任意のドメイン(またはフラグメント)に融合された少なくとも1個の足場を含む。いくつかの実施形態においては、少なくとも1個の足場を、抗体可変ドメイン、CH1ドメイン、Cκドメイン、Cλドメイン、CH2、またはCH3ドメインに融合させる。他の実施形態においては、少なくとも1個の足場を、抗体FcのCH2ドメインに融合させる。そのような実施形態においては、発現させた場合に得られるタンパク質は、抗体FcフラグメントのCH2およびCH3領域の二量体化を介して特定の標的にとって二価であろう。さらなる実施形態においては、本発明の足場は、Fcフラグメントに接続された抗体可変領域を置換する。代替的な実施形態においては、本発明の足場は、CH1-Fcフラグメント、CκまたはCλドメインに接続された抗体可変領域を置換しない。
【０１１５】
さらなる実施形態においては、多量体足場を、抗体のCH1およびCκもしくはCλ領域に足場を融合させることにより構築する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、抗体のCH1およびCκもしくはCλ領域に融合された抗体可変領域を置換する。さらなる実施形態においては、本発明の足場を、抗体の軽鎖または重鎖のC末端に融合させることができる。他の実施形態においては、本発明の足場を、抗体の軽鎖または重鎖のN末端に融合させることができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態においては、本発明の多量体足場は、同じエピトープに特異的である足場を含む。他の実施形態においては、本発明の多量体足場は、さもなければエピトープ結合ドメインとして知られる異なるエピトープに特異的である足場を含む。本発明の多量体足場を、2008年7月30日に提出された米国特許出願第12/182,975号(あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)「Multispecific epitope binding proteins and uses thereof」に示されたように集合させ、使用することができる。そのようなエピトープ結合ドメインを、抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、scFv、Fab、Fv、または結合ペプチドから選択することができる。
【０１１７】
他の実施形態においては、エピトープ結合ドメインは、本発明の足場と同じ標的に特異的であろう。
【０１１８】
別の実施形態においては、エピトープ結合ドメインは、本発明の足場と異なる標的に特異的であろう。
【０１１９】
2個以上の足場を接続する特定の事例のための好適なリンカーの選択は、例えば、単量体ドメインの性質、ならびに／またはタンパク質分解および酸化に対するペプチドリンカーの安定性などの様々なパラメーターに依存してもよい。
【０１２０】
リンカーポリペプチドは、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を主に含んでもよい。例えば、ペプチドリンカーは、Gly、Ser、AlaおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基の少なくとも80％、例えば、少なくとも85％または少なくとも90％などの少なくとも75％(ペプチドリンカー中に存在する残基の総数に基づいて算出される)を含んでもよい。ペプチドリンカーはまた、Gly、Ser、Alaおよび／またはThr残基のみからなってもよい。リンカーポリペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに関連する正確な配置を取るような方法で、本発明の2個以上の単量体ドメインまたは本発明の2個以上の多量体足場を連結するのに十分な長さを有するべきである。
【０１２１】
この目的にとって好適な長さは、2〜25アミノ酸残基、5〜20アミノ酸残基、5〜15アミノ酸残基、8〜12アミノ酸残基または11残基などの、少なくとも1個および典型的には約50アミノ酸残基未満の長さである。同様に、リンカーをコードするポリペプチドは、例えば、約2〜約15アミノ酸、約3〜約15、約4〜約12、約10、約8、または約6アミノ酸のサイズであってよい。DNA、RNA、またはその両方の組合せなどの核酸を含む方法および組成物においては、リンカー配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、約6ヌクレオチド〜約45ヌクレオチド、約9ヌクレオチド〜約45ヌクレオチド、約12ヌクレオチド〜約36ヌクレオチド、約30ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、または約18ヌクレオチドであってよい。同様に、リンカーポリペプチド中への含有のために選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチド多量体の活性または機能を有意に妨害しない特性を示すべきである。かくして、ペプチドリンカーは、全体として、ポリペプチド多量体の活性もしくは機能と一致しないか、または内部の折畳みを妨害するか、または特異的標的へのポリペプチド多量体の結合を著しく妨害する1個以上の単量体ドメイン中のアミノ酸残基との結合もしくは他の相互作用を形成する電荷を示さないべきである。
【０１２２】
また、ペプチドリンカーを、ペプチドリンカー中のアミノ酸残基が特定のポリペプチド多量体中の特定のセットの単量体ドメインについて無作為化されたライブラリーから選択することもできる。可撓性リンカーを用いて、好適な組合せの単量体ドメインを発見した後、可変リンカーのこの無作為なライブラリーを用いて最適化して、最適な長さおよび形状を有するリンカーを取得することができる。最適なリンカーは、標的への結合に関与し、特異的標的に結合しなかった場合、ポリペプチド多量体中で互いに関して単量体ドメインの移動を制限する最小数の右型のアミノ酸残基を含んでもよい。
【０１２３】
ポリペプチドを、新規に連結された融合ポリペプチド中に接続するための天然ならびに人工ペプチドリンカーの使用は、文献中でよく知られている(Hallewellら(1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthanら(1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekarら(1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Faresら(1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshawら(1999), Protein Eng. 12, 623-630; 米国特許第5,856,456号)。
【０１２４】
上記のように、ペプチドリンカーは少なくともいくらかの可撓性を有するのが一般的には好ましい。従って、いくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、1〜25個のグリシン残基、5〜20個のグリシン残基、5〜15個のグリシン残基または8〜12個のグリシン残基を含む。ペプチドリンカーは典型的には、少なくとも75％のグリシン残基などの、少なくとも50％のグリシン残基を含むであろう。本発明のいくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーは、グリシン残基のみを含む。特定の実施形態においては、リンカー配列は、(G-G-G-G-S)x(配列番号260)(式中、xは正の整数である)の配列を含んでもよい。別の特定の実施形態においては、リンカー配列は、(G-A)x(式中、xは正の整数である)の配列を含んでもよい。別の特定の実施形態においては、リンカー配列は、(G-G-G-T-P-T)x(配列番号261)(式中、xは正の整数である)の配列を含んでもよい。
【０１２５】
いくつかの場合、ペプチドリンカー中にいくらかの剛性を提供することが望ましいか、または必要である。ペプチドリンカーのアミノ酸配列中にプロリン残基を含有させることにより、これを達成することができる。かくして、本発明の別の実施形態においては、ペプチドリンカーは、ペプチドリンカーのアミノ酸配列中に少なくとも1個のプロリン残基を含んでもよい。例えば、ペプチドリンカーは、少なくとも50％、例えば、少なくとも75％などの少なくとも25％のアミノ酸残基がプロリン残基であるアミノ酸配列を有する。本発明の1つの特定の実施形態においては、ペプチドリンカーは、プロリン残基のみを含む。
【０１２６】
本発明のいくつかの実施形態においては、ペプチドリンカーを、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基が導入されるような方法で改変する。そのようなアミノ酸残基の例は、システイン残基(次いで、非ポリペプチド部分を結合させる)であってよく、またはアミノ酸配列はin vivoでのN-グリコシル化部位(それにより、ペプチドリンカーに(in vivoで)糖部分を結合させる)を含んでもよい。さらなるオプションは、単量体ドメインまたはリンカー中に、進化したtRNAおよびtRNA合成酵素(例えば、米国特許出願公開第2003/0082575号を参照)を用いて非天然アミノ酸を遺伝的に組込むことである。例えば、ケト-チロシンの挿入は、発現された単量体ドメインまたは多量体への部位特異的カップリングを可能にする。
【０１２７】
時には、ポリペプチド多量体中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は同一であろう。あるいは、ポリペプチド多量体中に存在する全てのペプチドリンカーのアミノ酸配列は異なっていてもよい。
【０１２８】
6.6 融合物
本明細書に記載の足場を、他のタンパク質ドメインに融合させることができる。例えば、これらの足場を、NまたはC末端を介して、IgG(Fc)の定常領域を足場と融合させることにより、ヒト免疫応答と統合することができる。Fc融合分子は、免疫応答の補体成分を活性化し、タンパク質足場の治療値を増加させる。同様に、足場と、C1qなどの補体タンパク質との融合物を用いて、細胞を標的化し、足場と毒素との融合物を用いて、特定の抗原を担持する細胞を特異的に破壊することができる。
【０１２９】
さらに、様々な刊行物が、FcRn結合ポリペプチドを生理学的に活性な分子に導入することにより(WO 97/43316; 米国特許第5,869,046号; 同第5,747,035号; WO 96/32478; WO 91/14438)、または該分子を、FcRn結合親和性が保存されるが、他のFc受容体に関する親和性が大きく低下した抗体と融合させること(WO 99/43713)、もしくは抗体のFcRn結合ドメインと融合させることにより(WO 00/09560；米国特許第4,703,039号)、半減期が改変された前記分子を取得するための方法を記載している。生理学的に活性な分子の半減期を増加させる特定の技術および方法を、「Antibodies with Increased Half-lives」の表題の2006年8月1日に付与された米国特許第7,083,784号(あらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられるものとする)に見出すこともできる。具体的には、本発明の足場を、IgGに由来するFc領域(Fc領域はアミノ酸残基突然変異(KabatのEU指数により番号付けられる)：M252Y/S254T/T256EまたはH433K/N434F/Y436Hを含む)に融合させることができる。
【０１３０】
さらに、本発明の足場を、in vivoでの、または血清中での半減期を増加させるか、または延長する分子と融合させることができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、ヒト血清アルブミン(HSA)などのアルブミン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリサッカリド、免疫グロブリン分子(IgG)、補体、ヘモグロビン、結合ペプチド、リポタンパク質ならびに血流中でのその半減期および／またはその組織浸透を増加させるための他の因子と会合する。任意のこれらの融合物を、標準的な技術により、例えば、公共的に利用可能な遺伝子配列を用いて構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現により作製することができる。
【０１３１】
また、本発明の足場は、in vivoでの、または血清中での半減期を増加させるか、または延長する分子に結合するか、またはそれと会合することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、アルブミン、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリサッカリド、免疫グロブリン分子または血清半減期を増加させるFc突然変異を有する免疫グロブリン分子、補体、ヘモグロビン、リポタンパク質および血清半減期を増加させる他の因子と会合する。任意のこれらの融合物を、標準的な技術により、例えば、公共的に利用可能な遺伝子配列を用いて構築された組換え融合遺伝子からの融合タンパク質の発現により作製することができる。
【０１３２】
用語「ポリエチレングリコール」または「PEG」は、カップリング剤、カップリング部分もしくは活性化部分を含むか、または含まない(例えば、チオール、トリフラート、トレシラート、アジルジン、オキシラン、N-ヒドロキシスクシンイミドもしくはマレイミド部分を含む)、ポリエチレングリコール化合物またはその誘導体を意味する。用語「PEG」は、例えば、末端のOH基がメトキシ基により置換された(mPEGと呼ぶ)類似体を含む、500〜150,000 Daの分子量のポリエチレングリコールを示唆すると意図される。
【０１３３】
一実施形態においては、前記足場をポリエチレングリコール(PEG)で誘導体化する。PEGは、2個の末端ヒドロキシル基を含むエチレンオキシド反復単位の線状の水溶性ポリマーである。PEGは、その分子量により分類され、典型的には約500ダルトン〜約40,000ダルトンの範囲である。現在好ましい実施形態においては、用いられるPEGは5,000ダルトン〜約20,000ダルトンの範囲の分子量を有する。本発明の足場にカップリングされたPEGは、分枝状または非分枝状であってよい(例えば、Monfardini, C.ら、1995 Bioconjugate Chem 6:62-69を参照されたい)。PEGはNektar Inc., Sigma Chemical Co.および他の会社から市販されている。そのようなPEGとしては、限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコール(MePEG-OH)、モノメトキシポリエチレングリコール-コハク酸(MePEG-S)、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルコハク酸(MePEG-S--NHS)、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン(MePEG-NH2)、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシラート(MePEG-TRES)、およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾリル-カルボニル(MePEG-IM)が挙げられる。
【０１３４】
簡単に述べると、一実施形態においては、用いられる親水性ポリマー、例えば、PEGに、メトキシまたはエトキシ基などの非反応性の基により一方の末端でキャップを付ける。その後、前記ポリマーを、ハロゲン化シアヌル(例えば、塩化、臭化もしくはフッ化シアヌル)、ジイマドズル、無水試薬(例えば、無水ジブロモコハク酸などの無水ジハロコハク酸)、アシルアジド、p-ジアゾイウムベンジルエーテル、3-(p-ジアゾニウムフェノキシ)-2-ヒドロキシプロピルエーテル)などの好適な活性化剤との反応により、他方の末端で活性化する。次いで、活性化ポリマーを、本明細書に記載のポリペプチドと反応させて、ポリマーで誘導体化されたポリペプチドを産生させる。あるいは、本発明の足場中の官能基を、ポリマーとの反応のために活性化させるか、または2個の基を公知のカップリング方法を用いて協調カップリング反応において連結することができる。本発明のポリペプチドを、当業者には公知であり、当業者により用いられる多くの他の反応を用いて、PEGを用いて誘導体化することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場を遺伝子操作して、結合のための反応基を提供する。そのような足場においては、また、N末端および／またはC末端は、結合のための反応基を提供するのに役立ち得る。他の実施形態においては、N末端を一方の部分(限定されるものではないが、PEGなど)に結合させるが、C末端を他方の部分(限定されるものではないが、ビオチンなど)に結合させることができ、またはその逆も可能である。
【０１３６】
用語「in vivoでの半減期」は、その通常の意味で用いられる、すなわち、ポリペプチドの生物活性の50％が、体内／標的器官に依然として存在する時間、またはポリペプチドの活性がその初期値の50％である時間である。機能的なin vivoでの半減期の決定に対する代替として、「血清半減期」、すなわち、ポリペプチド分子の50％が、消失する前に血漿または血流中に循環する時間を決定することができる。血清半減期の決定は、機能的半減期の決定よりも単純であることが多く、血清半減期の規模は通常、機能的なin vivoでの半減期の規模を良好に示唆する。血清半減期に対する代替的な用語としては、血漿半減期、循環半減期、循環半減期、血清クリアランス、血漿クリアランス、およびクリアランス半減期が挙げられる。通常、保持しようとする官能基を、凝血促進活性、タンパク質溶解活性、コファクター結合、受容体結合活性、または特定のタンパク質に関連する他の型の生物活性から選択する。
【０１３７】
機能的なin vivoでの半減期または血漿半減期に関連する用語「増加した」は、ポリペプチドの関連する半減期が、比較可能な条件下で決定されるように、参照分子(例えば、非改変ポリペプチド)のものと比較して統計的に有意に増加したことを示すように用いられる。例えば、関連する半減期を、非改変参照分子と比較して、少なくとも約50％などの少なくとも約25％、例えば、少なくとも約100％、少なくとも約150％、少なくとも約200％、少なくとも約250％、または少なくとも約500％増加させることができる。他の実施形態においては、半減期を、非改変参照分子と比較して、少なくとも約1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも20、または少なくとも50倍増加させることができる。
【０１３８】
6.7 無作為化実施形態
一態様においては、本発明は、無作為化された足場を提供する。別の実施形態においては、本発明はまた、多量体無作為化足場を提供する。別の実施形態においては、本発明はまた、ジスルフィド操作された無作為化足場を提供する。さらに別の実施形態においては、本発明は、無作為化足場を含むライブラリーを提供する。この節においては集合的に「本発明」と呼ぶ、本発明の足場の無作為化スキームおよび該足場を含む展示ライブラリーを以下に提供する。
【０１３９】
一実施形態においては、本発明の足場は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、または少なくともBC、または少なくともCD、または少なくともDE、または少なくともEF、または少なくともFGループが無作為化された、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１４０】
一実施形態においては、本発明は、1個の無作為化ループを含む。例えば、本発明は、無作為化されたABループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBCループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたFGループを含む。
【０１４１】
一実施形態においては、本発明は、2個の無作為化ループを含む。例えば、本発明は、無作為化されたABおよびBCループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたABおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたABおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたABおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBCおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBCおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBCおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBCおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたCDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたCDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたCDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたDEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたDEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたEFおよびFGループを含む。
【０１４２】
別の実施形態においては、本発明は、3個の無作為化ループを含む。例えば、一実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BCおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、BCおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、BCおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、BCおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、CDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、CDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、CDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、AB、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、CDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、CDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、CDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、BC、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、DE、EFおよびFGループを含む。
【０１４３】
別の実施形態においては、本発明は、4個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBC、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBC、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBC、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたCD、DE、EFおよびFGループを含む。
【０１４４】
別の実施形態においては、本発明は、5個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CD、DE、およびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CD、DE、およびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、CD、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたBC、CD、DE、EFおよびFGループを含む。
【０１４５】
別の実施形態においては、本発明は6個の無作為化ループを含む。一実施形態においては、本発明は、無作為化されたAB、BC、CD、DE、DF、およびFGループを含む。
【０１４６】
特定の実施形態においては、本発明は、BC、DE、およびFGループが全て無作為化された3個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明のタンパク質は、少なくともAB、少なくともCD、少なくともEFループが無作為化された、少なくとも1個の無作為化ループを含む。特定の実施形態においては、本発明は、AB、CDおよびEFループが全て無作為化された3個の無作為化ループを含む。別の特定の実施形態においては、本発明は、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループが全て無作為化された無作為化ループを含む。
【０１４７】
別の実施形態においては、本発明は、少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個のループが無作為化されていない、無作為化ループを含む。
【０１４８】
一実施形態においては、本発明は、1個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。一実施形態においては、本発明は、ABループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、BCループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、CDループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、DEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、EFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、FGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１４９】
別の実施形態においては、本発明は、2個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。一実施形態においては、本発明は、少なくともABおよびBCループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともABおよびCDループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともABおよびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともABおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともABおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBCおよびCDループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBCおよびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBCおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBCおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCDおよびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCDおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCDおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともDEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともDEおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともEFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１５０】
別の実施形態においては、本発明は、3個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、およびCDループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、およびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、およびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、およびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、およびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、およびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、およびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、DE、およびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、EF、およびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CDおよびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CDおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CDおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、DEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCD、DEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCD、DEおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCD、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともDE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１５１】
別の実施形態においては、本発明は、4個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CDおよびDEループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CDおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CDおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、DEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、DEおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CD、DEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CD、DEおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともCD、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１５２】
別の実施形態においては、本発明は、5個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CD、DEおよびEFループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CD、DEおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、CD、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CD、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともBC、CD、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１５３】
別の実施形態においては、本発明は、6個のループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。別の実施形態においては、本発明は、少なくともAB、BC、CD、DE、EFおよびFGループが無作為化されていない、少なくとも1個の無作為化ループを含む。
【０１５４】
本発明はまた、β鎖領域が無作為化された足場であって、β鎖が無作為化された足場が、同様の条件下で測定されたβ鎖無作為化前の同じ足場と少なくとも同程度の安定性および特異的標的親和性を示す前記足場も提供する。一実施形態においては、本発明は、無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも5個のβ鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化された少なくともA鎖、または少なくともB鎖、または少なくともC鎖、または少なくともD鎖、または少なくともE鎖、または少なくともF鎖を含む。
【０１５５】
別の実施形態においては、本発明は、無作為化された2個のβ鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびB鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびC鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA鎖およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB鎖およびC鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB鎖およびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB鎖およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB鎖およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB鎖およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC鎖およびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC鎖およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC鎖およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC鎖およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD鎖およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD鎖およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD鎖およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたE鎖およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたE鎖およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたF鎖およびG鎖を含む。
【０１５６】
別の実施形態においては、本発明は、無作為化された3個のβ鎖を含む。一実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、およびC鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、BおよびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、BおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、BおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、BおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、CおよびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、CおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、CおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、CおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、DおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、DおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、DおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、CおよびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、CおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、CおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、CおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、DおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、DおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、DおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、DおよびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、DおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、DおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、EおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、EおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、FおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD、EおよびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD、FおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたE、FおよびG鎖を含む。
【０１５７】
一実施形態においては、本発明は、無作為化された4個のβ鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、およびD鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、E、F、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、C、D、およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、C、D、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、C、D、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、E、F、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたC、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたD、E、F、およびG鎖を含む。
【０１５８】
一実施形態においては、本発明は、無作為化された5個のβ鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、およびE鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、C、D、E、およびF鎖を含む。本発明は、無作為化されたB、C、D、E、およびG鎖を含む。本発明は、無作為化されたB、D、E、FおよびG鎖を含む。本発明は、無作為化されたB、C、E、FおよびG鎖を含む。本発明は、無作為化されたB、C、D、F、およびG鎖を含む。本発明は、無作為化されたC、D、E、FおよびG鎖を含む。
【０１５９】
一実施形態においては、本発明は、無作為化された6個のβ鎖を含む。一実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、E、およびF鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、C、D、E、FおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、D、E、FおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、E、FおよびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、F、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、E、およびG鎖を含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化されたB、C、D、E、FおよびG鎖を含む。
【０１６０】
一実施形態においては、本発明は、無作為化された7個のβ鎖を含む。一実施形態においては、本発明は、無作為化されたA、B、C、D、E、FおよびG鎖を含む。
【０１６１】
本発明はまた、ループ長多様性を有するタンパク質足場も提供する。一実施形態においては、本発明は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のループを含む。別の実施形態においては、本発明のタンパク質は、1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30個のアミノ酸残基を含む少なくとも1個のループを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は、同じ長さの少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループを含んでもよい。別の実施形態においては、本発明は、異なる長さの少なくとも2個のループ、少なくとも3個のループ、少なくとも4個のループ、少なくとも5個のループまたは少なくとも6個のループを含んでもよい。
【０１６２】
別の実施形態においては、本発明は、天然のタンパク質配列中の対応するループ配列に由来する少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により天然のタンパク質配列から変化する。一実施形態においては、本発明は、対応する天然のタンパク質配列に由来する少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列中の少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。一実施形態においては、本発明は、対応する天然のタンパク質配列に由来する少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列中の少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、対応する天然のタンパク質配列に由来する少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列中の少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個〜少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６３】
一実施形態においては、本発明は、ループAB中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループAB中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループAB中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６４】
一実施形態においては、本発明は、BCループ中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループBC中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループBC中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも約8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６５】
一実施形態においては、本発明は、CDループ中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループCD中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループCD中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも約8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６６】
一実施形態においては、本発明は、DEループ中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループDE中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループDE中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも約8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６７】
一実施形態においては、本発明は、EFループ中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループEF中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループEF中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも約8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６８】
一実施形態においては、本発明は、FGループ中に少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループFG中に少なくとも1個、または少なくとも2個、または少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または少なくとも8個、または少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。別の実施形態においては、本発明は、ループFG中に少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4〜少なくとも約8個、少なくとも9個、または少なくとも10個、または少なくとも11個、または少なくとも12個、または少なくとも13個、または少なくとも14個、または少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも21個、または少なくとも22個、または少なくとも23個、または少なくとも24個、または少なくとも25個、または少なくとも26個、または少なくとも27個、または少なくとも28個、または少なくとも29個、または少なくとも30個のアミノ酸の欠失、置換または付加を含む。
【０１６９】
本発明はまた、ループ配列多様性を含む足場も提供する。一実施形態においては、本発明は、無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、一定に保持された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置をさらに含みながら、無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、���なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループ含み、一定に保持された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループをさらに含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループ含み、無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループならびに一定に保持された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも25個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、または少なくとも30個の位置を含む少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも6個のループをさらに含む。
【０１７０】
本発明はまた、ループ配列多様性を含む足場も提供する。一実施形態においては、本発明は、無作為化された少なくとも1個の位置を含む少なくとも1個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、無作為化された少なくとも1個の位置を含みながら、一定に保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含むループを含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含み、一定に保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを含む。別の実施形態においては、本発明は、制限無作為化にかけられた少なくとも1個の位置を含み、無作為化された少なくとも1個の位置および一定に保持された少なくとも1個の位置をさらに含む少なくとも1個のループを含む。
【０１７１】
一実施形態においては、本発明は、長さおよび多様性について無作為化された少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループを含む。一実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBCループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたFGループを含む。
【０１７２】
別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABおよびBCループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたABおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBCおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBCおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBCおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBCおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたDEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたDEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたEFおよびFGループを含む。
【０１７３】
別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BCおよびCDループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BCおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BCおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BCおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CDおよびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CDおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CDおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたDE、EFおよびFGループを含む。
【０１７４】
別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、およびDEループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、およびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、およびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、DE、EF、およびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたCD、DE、EFおよびFGループを含む。
【０１７５】
別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、DEおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、CD、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、DE、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、EFおよびFGループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたAB、BC、CD、DEおよびEFループを含む。別の実施形態においては、本発明は、配列の長さおよび多様性について無作為化されたBC、CD、DE、EFおよびFGループを含む。
【０１７６】
6.8 足場コンジュゲート
本発明は、限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣物質、合成薬剤、無機分子、および有機分子などの1個以上の部分にコンジュゲートまたは融合された足場の使用を包含する。本発明は、融合タンパク質を作製するために異種タンパク質またはポリペプチド(もしくはその断片、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも60個、少なくとも70個、少なくとも80個、少なくとも90個もしくは少なくとも100個のアミノ酸のポリペプチド)に組換え的に融合された、または化学的にコンジュゲートされた(共有および非共有コンジュゲーションの両方を含む)足場の使用を包含する。融合は必ずしも直接的なものである必要はないが、本明細書に記載のリンカー配列を介して生じるものであってもよい。例えば、足場を用いて、in vitroまたはin vivoで、該足場を特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合またはコンジュゲートさせることにより、異種ポリペプチドを特定の細胞型に対して標的化することができる。異種ポリペプチドに融合またはコンジュゲートされた足場を、当業界で公知の方法を用いるin vitroでの免疫アッセイおよび精製方法において用いることもできる。例えば、国際特許出願公開WO 93/21232; 欧州特許第EP 439,095号; Naramuraら、1994, Immunol. Lett. 39:91-99; 米国特許第5,474,981号; Gilliesら、1992, PNAS 89:1428-1432; およびFellら、1991, J. Immunol. 146:2446-2452(参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０１７７】
本発明の足場を含むさらなる融合タンパク質を、遺伝子シャッフリング、モチーフ-シャッフリング、エクソン-シャッフリング、および／またはコドン-シャッフリング(集合的に、「DNAシャッフリング」と呼ぶ)の技術を介して作製することができる。DNAシャッフリングを用いて、本発明の足場の活性を変化させることができる(例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する足場)。一般的には、米国特許第5,605,793号; 同第5,811,238号; 同第5,830,721号; 同第5,834,252号; および同第5,837,458号、ならびにPattenら、1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hanssonら、1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313(これらの特許および刊行物の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。足場、またはコードされる足場を、変異性PCR、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による無作為突然変異誘発にかけた後、組換えることにより変化させることができる。特異的標的に結合する足場をコードするポリヌクレオチドの1個以上の部分を、1個以上の異種分子の1個以上の成分、モチーフ、区分、部分、ドメイン、断片などと組換えることができる。
【０１７８】
さらに、本発明の足場を、精製を容易にするためのペプチドなどのマーカー配列に融合させることができる。いくつかの実施形態においては、マーカーアミノ酸配列は、特に、多くが市販されている、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)中に提供されるタグなどのヘキサ-ヒスチジンペプチド(his-タグ)である。Gentzら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824に記載のように、例えば、ヘキサ-ヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製にとって有用な他のペプチドタグとしては、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質(Wilsonら、1984, Cell 37:767)から誘導されるエピトープに対応する、ヘマグルチニン「HA」タグおよび「flag」タグが挙げられる。
【０１７９】
他の実施形態においては、本発明の足場、その類似体または誘導体を、診断剤または検出剤にコンジュゲートさせることができる。そのような足場は、特定の療法の効率の決定などの、臨床試験手順の一部として、疾患の発達または進行をモニターまたは予測するのに有用であり得る。そのような診断および検出を、限定されるものではないが、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルもしくはフィコエリトリンなどの蛍光物質；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；限定されるものではないが、ヨウ素(131I, 125I, 123I, 121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム (3H)、インジウム (115In, 113In, 112In, 111In,)、およびテクネチウム (99Tc)、タリウム (201Ti)、ガリウム (68Ga, 67Ga)、パラジウム (103Pd)、モリブデン (99Mo)、キセノン (133Xe)、フッ素 (18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tnなどの放射性物質；様々な陽電子放出断層撮影、非放射性常磁性金属イオン、および放射標識されるか、もしくは特定の放射性アイソトープにコンジュゲートされた分子を用いる陽電子放出金属などの検出可能な物質に前記足場をカップリングさせることにより達成することができる。
【０１８０】
本発明はさらに、治療部分にコンジュゲートされた足場の使用を包含する。足場を、細胞毒素、例えば、静菌剤もしくは殺菌剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、α-放射体などの治療部分にコンジュゲートさせることができる。治療部分としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、オーリスタチン分子(例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン1、およびソラスタチン10；Woykeら、Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woykeら、Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammadら、Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wallら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammadら、Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)(全て参照により本明細書に組み入れられるものとする))、ホルモン(例えば、糖質コルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、およびエストロゲン)、DNA-修復酵素阻害剤(例えば、エトポシドもしくはトポテカン)、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571、イマチニブメシラート(Kantarjianら、Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002))、細胞傷害剤(例えば、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体もしくは相同体)ならびに米国特許第6,245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,911,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示された化合物、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS-214662ならびに例えば、米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,211,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号、および第6,040,305号により開示されたもの)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン；イリノテカン；SN-38；トポテカン；9-アミノカンプトテシン；GG-211 (GI 147211)；DX-8951f；IST-622；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；XR-5000；サイントピン；UCE6；UCE1022; TAN-1518A; TAN-1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506;およびレベッカマイシン)；ブルガレイン；Hoescht染料33342およびHoechst染料33258などのDNA副溝結合剤；ニチジン；ファガロニン；エピベルベリン；コラリン；β-ラパコン；BC-4-1；ビスホスホナート(例えば、アレンドロナート、シマドロンテ、クロドロナート、チルドロナート、エチドロナート、イバンドロナート、ネリドロナート、オルパンドロナート、リセドロナート、ピリドロナート、パミドロナート、ゾレンドロナート)、HMG-CoA還元酵素阻害剤(例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、ルピトール、ロスバスタチンおよびアトルバスタチン)ならびに製薬上許容し得るその塩、溶媒和物、クラスレート、およびプロドラッグ(例えば、Rothenberg, M. L., Annals of Oncology 8:837-855(1997); およびMoreau, P.ら、J. Med. Chem. 41:1631-1640(1998)を参照)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号、および第5,618,709号に開示されたもの)、免疫調節剤(例えば、抗体およびサイトカイン)、抗体、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、リン酸フルダラビンおよび2-クロロデオキシアデノシン)が挙げられる。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。治療剤としては、限定されるものではないが、代謝拮抗物質(例えば、メトトレキサート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、デカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンCおよびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(以前はダウノルビシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン(AMC))、オーリスタチン分子(例えば、オーリスタチンPHE、ブリオスタチン1、ソラスタチン10 (Woykeら、Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woykeら、Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammadら、Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wallら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammadら、Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)を参照(全て参照により本明細書に組み入れられるものとする))、抗有糸分裂剤(��えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)、ホルモン(例えば、糖質コルチコイド、プロゲスタチン、アンドロゲン、およびエストロゲン)、DNA-修復酵素阻害剤(例えば、エトポシドもしくはトポテカン)、キナーゼ阻害剤(例えば、化合物ST1571、イマチニブメシラート(Kantarjianら、Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002))、ならびに米国特許第6,245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,911,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示された化合物、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えば、R115777、BMS-214662、ならびに例えば、米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,211,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号および第6,040,305号により開示されたもの)、トポイソメラーゼ阻害剤(例えば、カンプトテシン；イリノテカン；SN-38；トポテカン；9-アミノカンプトテシン；GG-211 (GI 147211)；DX-8951f; IST-622; ルビテカン；ピラゾロアクリジン; XR-5000; サイントピン; UCE6; UCE1022; TAN-1518A; TAN-1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506;およびレベッカマイシン；ブルガレイン；Hoescht染料33342およびHoescht染料33258などのDNA副溝結合剤；ニチジン；ファガロニン；エピベルベリン；コラリン；β-ラパコン；BC-4-1；ならびに製薬上許容し得るその塩、溶媒和物、クラスレート、およびプロドラッグ(例えば、Rothenberg, M. L., Annals of Oncology 8:837-855(1997); およびMoreau, P.ら、J. Med. Chem. 41:1631-1640(1998)を参照)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号および第5,618,709号に開示されたもの)、免疫調節剤(例えば、抗体およびサイトカイン)、抗体(例えば、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))、カリケアマイシン(Mylotarg(登録商標)、イブリツモマブ、チウキセタン(Zevalin(登録商標)、およびトシツモマブ(Bexxar(登録商標))、ならびにアデノシンデアミナーゼ阻害剤(例えば、リン酸フルダラビンおよび2-クロロデオキシアデノシン)が挙げられる。
【０１８１】
さらに、足場を、所与の生物学的応答を改変する治療部分または薬剤部分にコンジュゲートさせることができる。治療部分または薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってよい。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM I(国際特許出願公開WO 97/33899を参照)、AIM II(国際特許出願公開WO 97/34911を参照)、Fasリガンド(Takahashiら、1994, J. Immunol., 6:1567-1574)、およびVEGI (国際特許出願公開WO 99/23105を参照)、血栓剤もしくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチンもしくは凝血経路の成分(例えば、組織因子)；または、例えば、リンホカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、および顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」))、増殖因子(例えば、増殖ホルモン(「GH」))、もしくは凝固剤(例えば、カルシウム、ビタミンK、組織因子、例えば、限定されるものではないが、Hageman因子(第XII因子)、高分子量キニノゲン(HMWK)、プレカリクレイン(PK)、凝固タンパク質因子II(プロトロンビン)、第V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X因子、リン脂質、フィブリノゲンのαおよびβ鎖に由来するフィブリノペプチドAおよびB、フィブリンモノマー)などのタンパク質が挙げられる。
【０１８２】
さらに、足場を、限定されるものではないが、131In、131LU、131Y、131Ho、131Smなどの放射性金属イオンをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用な213Biまたは大環状キレーターなどのα-放射体などの放射性金属イオンなどの治療部分にコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態においては、大環状キレーターは、リンカー分子を介して足場に結合させることができる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は当業界で一般的に用いられており、Denardoら、1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Petersonら、1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; およびZimmermanら、1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50(それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１８３】
抗体に治療部分をコンジュゲートさせるための技術はよく知られており、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), pp. 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery (第2版), Robinsonら(編), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編)、pp. 475-506 (1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpeら、1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。同様の手法を、本発明の足場と共に使用するために適合させることができる。
【０１８４】
本発明の足場にコンジュゲートさせた治療部分または薬剤を選択して、被験者における特定の障害のための所望の予防または治療効果を達成するべきである。医師または他の医療関係者は、足場にコンジュゲートさせる治療部分もしくは薬剤を決定する場合に、以下のこと：疾患の性質、疾患の重篤度、および被験者の症状を考慮すべきである。
【０１８５】
本発明の足場を、標的抗原の免疫アッセイまたは精製にとって特に有用である固相支持体に結合させることもできる。そのような固相支持体としては、限定されるものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０１８６】
6.9 製造
本発明の足場の組換え発現には、足場をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。足場をコードするポリヌクレオチドが得られたら、足場の産生のためのベクターを、当業界でよく知られた技術を用いる組換えDNA技術により製造することができる。かくして、足場をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによりタンパク質を調製するための方法を本明細書に記載する。当業者にはよく知られた方法を用いて、足場ポリペプチドをコードする配列ならびに好適な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。かくして、本発明は、プロモーターに機能し得る形で連結された、本発明の足場をコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。
【０１８７】
発現ベクターを、従来の技術により宿主細胞に導入した後、トランスフェクト細胞を従来の技術により培養して、本発明の足場を産生させる。かくして、本発明は、異種プロモーターに機能し得る形で連結された、本発明の足場をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。好適な宿主細胞としては、限定されるものではないが、細菌(例えば、大腸菌およびバチルス・サブチリス(B. subtilis))などの微生物が挙げられる。
【０１８８】
様々な宿主-発現ベクター系を用いて、本発明の足場を発現させることができる。そのような宿主-発現系は、目的のコード配列を産生し、続いて精製することができるビヒクルであるが、好適なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換またはトランスフェクトした場合、本発明の足場をin situで発現することができる細胞でもある。これらのものとしては、限定されるものではないが、足場コード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、大腸菌およびバチルス・サブチリス)などの微生物；足場コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス、ピチア)；足場コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系；足場コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMv；タバコモザイクウイルス、TMV)に感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞(例えば、メタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)から誘導されたプロモーターを含む組換え発現構築物を担持する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞)が挙げられる。
【０１８９】
本発明の足場をコードする遺伝子の挿入物を含む発現ベクターを、3つの一般的な手法：(a)核酸ハイブリダイゼーション、(b)「マーカー」遺伝子機能の存在もしくは非存在、および(c)挿入された配列の発現により同定することができる。第1の手法においては、発現ベクター中のペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする遺伝子の存在を、それぞれ、該ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質をコードする挿入遺伝子と相同である配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションにより検出することができる。第2の手法においては、組換えベクター／宿主系を、ベクター中への抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルス中での封入体形成など)の存在または非存在に基づいて同定および選択することができる。例えば、足場をコードするヌクレオチド配列を、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、足場挿入物をコードする遺伝子を含む組換え体を、マーカー遺伝子機能の非存在により同定することができる。第3の手法においては、組換え発現ベクターを、組換え体により発現される遺伝子産物(例えば、足場またはその多量体)をアッセイすることにより同定することができる。そのようなアッセイは、例えば、in vitroアッセイ系におけるタンパク質の物理的または機能的特性、例えば、足場の結合、アゴニストまたはアンタゴニスト特性に基づくものであってよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態においては、本発明の足場を、少なくとも部分的に化学合成することができる。他の実施形態においては、本発明の足場を、半合成的に製造することができる。
【０１９１】
6.10 足場の精製
本発明の足場を組換え発現により製造したら、それをタンパク質の精製に関する当業界で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換、親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的溶解性、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により精製することができる。
【０１９２】
本発明の足場の高度に安定な性質は、精製スキームに関する変動を可能にする。例えば、本発明の足場により示される温度安定性により、足場を含む粗溶解物を加熱して、変性によって宿主細胞タンパク質の塊を除去することができる。別の実施形態においては、本発明の足場により示される高いプロテアーゼ耐性により、任意の精製工程前に粗溶解物中の宿主細胞タンパク質を迅速に分解することができる。また、本発明の足場により示されるpH寛容性により、任意の精製工程前にpHを低下させるか、または上昇させることにより粗溶解物中の宿主細胞タンパク質を選択的に沈降させることができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場の精製を、粗溶解物から宿主細胞タンパク質塊を除去するために、高い温度シフト、プロテアーゼ処理、pHシフトアップもしくはダウン、または上記のいずれかの組合せにより容易にする。いくつかの実施形態においては、熱変性、プロテアーゼ処理、pHシフト後に残存するタンパク質は、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、または少なくとも95％特異的な足場タンパク質である。
【０１９３】
いくつかの実施形態においては、足場を精製する方法は、宿主細胞タンパク質を沈降させるために、約6.5、または約6.0、または約5.5、または約5.0、または約4.5、または約4.0、または約3.5、または約3.0、または約2.5、または約2.0に、足場を含む粗溶解物のpHを低下させることを含む。他の実施形態においては、精製方法は、約8.0、または約8.5、または約9.0、または約9.5、または約10.0、または約10.5、または約11.0、または約11.5、または約12.0、または約12.5に、足場を含む粗溶解物のpHを上昇させることを含む。
【０１９４】
6.11 足場の測定可能な製造
大量に取得するために、本発明の足場を、測定可能なプロセス(以後、「本発明の測定可能なプロセス」と呼ぶ)により製造することができる。いくつかの実施形態においては、足場を、研究実験室において本発明の測定可能なプロセスにより製造し、スケールアップして、分析規模の生物反応器(例えば、限定されるものではないが、5L、10L、15L、30L、または50Lの生物反応器)中で本発明の足場を製造することができる。他の実施形態においては、足場を研究実験室において本発明の測定可能なプロセスにより製造し、スケールアップして、製造規模の生物反応器(例えば、限定されるものではないが、75L、100L、150L、300L、または500L)中で本発明の足場を製造することができる。いくつかの実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、研究実験室中で行われる製造プロセスと比較して、製造効率のわずかな低下をもたらすか、または低下をもたらさない。
【０１９５】
いくつかの実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、約1 g/L、約2 g/L、約3 g/L、約5 g/L、約7.5 g/L、約10 g/L、約12.5 g/L、約15.0 g/L、約17.5 g/L、約20 g/L、約25 g/L、約30 g/L以上の製造効率で足場を製造する。
【０１９６】
他の実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、少なくとも約1 g/L、少なくとも約2 g/L、少なくとも約3 g/L、少なくとも約5 g/L、少なくとも約7.5 g/L、少なくとも約10 g/L、少なくとも約12.5 g/L、少なくとも約15 g/L、少なくとも約17.5 g/L、少なくとも約20 g/L、少なくとも約25 g/L、少なくとも約30 g/L以上の製造効率で足場を製造する。
【０１９７】
他の実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、約10 g/L〜約300 g/L、約10 g/L〜約250 g/L、約10 g/L〜約200 g/L、約10 g/L〜約175 g/L、約10 g/L〜約150 g/L、約10 g/L〜約100 g/L、約20 g/L〜約300 g/L、約20 g/L〜約250 g/L、約20 g/L〜約200 g/L、約20 g/L〜約175 g/L、約20 g/L〜約150 g/L、約20 g/L〜約125 g/L、約20 g/L〜約100 g/L、約30 g/L〜約300 g/L、約30 g/L〜約250 g/L、約30 g/L〜約200 g/L、約30 g/L〜約175 g/L、約30 g/L〜約150 g/L、約30 g/L〜約125 g/L、約30 g/L〜約100 g/L、約50 g/L〜約300 g/L、約50 g/L〜約250 g/L、約50 g/L〜約200 g/L、約50 g/L〜約175 g/L、約50 g/L〜約150 g/L、約50 g/L〜約125 g/L、または約50 g/L〜約100 g/Lの製造効率で足場を製造する。
【０１９８】
いくつかの実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、約10 mg/L、約20 mg/L、約30 mg/L、約50 mg/L、約75 mg/L、約100 mg/L、約125 mg/L、約150 mg/L、約175 mg/L、約200 mg/L、約250 mg/L、約300 mg/L以上の製造効率で多量体足場を製造する。
【０１９９】
他の実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、少なくとも約10 mg/L、少なくとも約20 mg/L、少なくとも約30 mg/L、少なくとも約50 mg/L、少なくとも約75 mg/L、少なくとも約100 mg/L、少なくとも約125 mg/L、少なくとも約150 mg/L、少なくとも約175 mg/L、少なくとも約200 mg/L、少なくとも約250 mg/L、少なくとも約300 mg/L以上の製造効率で多量体足場を製造する。
【０２００】
他の実施形態においては、本発明の測定可能なプロセスは、約10 mg/L〜約300 mg/L、約10 mg/L〜約250 mg/L、約10 mg/L〜約200 mg/L、約10 mg/L〜約175 mg/L、約10 mg/L〜約150 mg/L、約10 mg/L〜約100 mg/L、約20 mg/L〜約300 mg/L、約20 mg/L〜約250 mg/L、約20 mg/L〜約200 mg/L、約20 mg/L〜約175 mg/L、約20 mg/L〜約150 mg/L、約20 mg/L〜約125 mg/L、約20 mg/L〜約100 mg/L、約30 mg/L〜約300 mg/L、約30 mg/L〜約250 mg/L、約30 mg/L〜約200 mg/L、約30 mg/L〜約175 mg/L、約30 mg/L〜約150 mg/L、約30 mg/L〜約125 mg/L、約30 mg/L〜約100 mg/L、約50 mg/L〜約300 mg/L、約50 mg/L〜約250 mg/L、約50 mg/L〜約200 mg/L、約50 mg/L〜約175 mg/L、約50 mg/L〜約150 mg/L、約50 mg/L〜約125 mg/L、または約50 mg/L〜約100 mg/Lの製造効率で多量体足場を製造する。
【０２０１】
6.12 分泌される足場の製造
本発明はまた、細胞内での、または分泌形態としての足場の製造のための方法を提供する。いくつかの実施形態においては、分泌される足場を、本明細書に記載のレベルで製造する。他の実施形態においては、分泌される足場は、適切に折畳まれ、完全に機能的である。他の実施形態においては、分泌される足場の製造は、Ptacプロモーターの使用を含む。他の実施形態においては、分泌される足場の製造は、oppAシグナルの使用を含む。さらに他の実施形態においては、分泌される足場を、原核宿主細胞中で発現させる。さらなる実施形態においては、足場を原核宿主細胞のペリプラズム空間中に分泌させる。さらに他の実施形態においては、足場を培地中に直接分泌させる。さらに他の実施形態においては、足場を、粗細胞培養培地またはペリプラズム抽出物からスクリーニングすることができる。
【０２０２】
本発明はまた、タンパク質足場を用いてタンデムタンパク質または融合物の分泌のための方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、細胞培養培地または原核細胞のペリプラズム空間へのペプチドおよび／またはタンパク質の分泌のための担体分子として作用し得る。
【０２０３】
別の実施形態においては、本発明の足場を精製する方法は、該足場を含む粗溶解物を15分間、70℃に加熱した後、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む。他の実施形態においては、本発明の足場を精製する方法は、該足場を含む粗溶解物を約50℃、約55℃、約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、または約90℃に加熱した後、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む。他の実施形態においては、本発明の足場を精製する方法は、少なくとも約1分間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、約11分間、約12分間、約13分間、約14分間、約15分間、約20分間、または約30分間、粗溶解物を加熱した後、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む。
【０２０４】
別の特定の実施形態においては、本発明の足場を精製する方法は、粗溶解物のpHを3.0にシフトさせ、足場を含む粗溶解物を15分間、70℃に加熱した後、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む。
【０２０５】
6.13 足場のアッセイ
本発明の足場を、当業界で公知の任意の方法により標的への特異的結合についてアッセイすることができる。用いることができる代表的なアッセイとしては、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイなどの技術を用いる競合的および非競合的アッセイ系が挙げられる。そのようなアッセイは日常的なものであり、当業界で公知である(例えば、Ausubelら(編)、1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい)。
【０２０６】
ELISAは、抗原(例えば、足場)を調製し、96穴マイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素基質(例えば、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ)などの検出可能な化合物にコンジュゲートさせた目的のエピトープ結合タンパク質(例えば、足場特異的抗体)をウェルに添加し、一定時間インキュベートし、抗原の存在を検出することを含む。ELISAにおいては、目的のエピトープ結合タンパク質を、検出可能な化合物にコンジュゲートさせる必要はない；代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートさせた第2抗体(目的のタンパク質を認識する)をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、目的のタンパク質をウェルにコーティングすることができる。この場合、コーティングされたウェルに目的の抗原を添加した後に、検出可能な化合物にコンジュゲートさせた第2抗体を添加することができる。当業者であれば、検出されるシグナルを増加させるように改変することができるパラメーターならびに当業界で公知の他の様々なELISAに精通しているであろう。ELISAに関するさらなる考察については、例えば、Ausubelら(編)、1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1を参照されたい。
【０２０７】
抗原に対する足場の結合親和性および他の結合特性を、例えば、平衡方法(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA；もしくはラジオイムノアッセイ(RIA))、または動力学分析(例えば、BIACORE(登録商標)分析)、および間接結合アッセイなどの他の方法、競合的結合アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過)などの、当業界で公知の様々なin vitroアッセイ方法により決定することができる。これらの方法および他の方法は、試験される1種以上の成分上の標識を使用し、および／または限定されるものではないが、発色標識、蛍光標識、発光標識、または放射性標識などの様々な検出方法を用いることができる。結合親和性および動力学に関する詳細な説明を、Paul, W.E.(編)、Fundamental Immunology、第4版、Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)に見出すことができる。
【０２０８】
本発明の足場の安定性を、多くの異なる手法により増加させることができる。一実施形態においては、本発明の足場は、本明細書に記載の、非天然ジスルフィド結合を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、Nおよび／またはC末端領域の伸長を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、足場の表面電荷を調整するための少なくとも1個のアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。別の実施形態においては、本発明の足場は、本明細書に記載の血清半減期を増加させるための変化を含む。さらに別の実施形態においては、本発明の足場は、足場の疎水性コアを安定化するための少なくとも1個のアミノ酸残基の付加、欠失または置換を含む。
【０２０９】
本発明の足場の安定性を、多くの異なる技術により評価することができる。当業界で公知の技術の選択としては、融点温度、示差走査熱量測定法(DSC)、円偏光二色性分析(CD)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、プロテアーゼ耐性、等温滴定熱量測定(ITC)、核磁気共鳴(NMR)、内部蛍光、および生物活性が挙げられる。一実施形態においては、本発明の操作された足場は、遺伝子操作前の同じ足場と比較して、増加した安定性を示す。
【０２１０】
6.14 医薬組成物
別の態様においては、本発明は、製薬上許容し得る担体と一緒に製剤化された、本発明の足場もしくは標的結合タンパク質の1つまたは組合せを含む、組成物、例えば、限定されるものではないが、医薬組成物を提供する。そのような組成物は、例えば、限定されるものではないが、2種以上の異なる本発明の足場の1つまたは組合せを含んでもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補的活性を有する足場の組合せを含んでもよい。
【０２１１】
本発明の医薬組成物を、他の薬剤との組合せなどの組合せ療法において投与することもできる。例えば、組合せ療法は、免疫療法、化学療法、放射線治療、または薬物療法であってよい、少なくとも1つの他の療法と組合わせた本発明の足場を含んでもよい。
【０２１２】
本発明の医薬化合物は、1種以上の製薬上許容し得る塩を含んでもよい。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸から誘導されるもの、ならびに脂肪族モノ-およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導されるものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から誘導されるもの、ならびにN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンから誘導されるものが挙げられる。
【０２１３】
本発明の医薬組成物はまた、製薬上許容し得る酸化防止剤を含んでもよい。製薬上許容し得る酸化防止剤の例としては、(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性酸化防止剤；(2)パルミチン酸アスコルビル、酪酸ヒドロキシアニソール(BHA)、酪酸ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、プロピルガラート、α-トコフェロールなどの油溶性酸化防止剤；ならびに(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤が挙げられる。
【０２１４】
本発明の医薬組成物中で用いることができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、およびその好適な混合物、オリーブ油などの野菜油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散物の場合、必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０２１５】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の存在の防止を、滅菌手順ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有の両方により確保することができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物中に含有させることが望ましい。さらに、注射可能な医薬製剤の吸収の延長を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の含有によりもたらすことができる。
【０２１６】
医薬組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で滅菌されており、安定でなければならない。この組成物を、溶液、微小乳濁液、リポソーム、または高い薬剤濃度にとって好適な他の高次構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにその好適な混合物を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性を、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散物の場合、必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、前記組成物中に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含有させるのが好適であろう。注射可能な組成物の吸収の延長を、該組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。
【０２１７】
滅菌注射可能溶液を、好適な溶媒中の必要な量の活性化合物を、上記に列挙された成分の1つまたは組合せと混合した後、必要に応じて、滅菌微小濾過することにより調製することができる。一般的には、分散物を、基本的な分散媒体および上記に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を包含させることにより調製する。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分の粉末と、任意のさらなる所望の成分とをもたらす減圧乾燥および凍結-乾燥(凍結乾燥)である。
【０２１８】
一実施形態においては、本発明の組成物(例えば、液体製剤)は、内毒素および／または関連する発熱物質を実質的に含まない無発熱製剤である。内毒素としては、微生物内に限定され、微生物が破壊されるか、または死んだ場合に放出される毒素が挙げられる。発熱物質としては、細菌および他の微生物の外膜に由来する熱誘導性温度安定性物質(糖タンパク質)も挙げられる。これらの物質は両方とも、ヒトに投与した場合、発熱、低血圧およびショックを引き起こすことがある。潜在的に有害な効果に起因して、静脈内投与された薬剤溶液から、少量の内毒素でも除去するのが有利である。食品医薬品局(「FDA」)は、静脈内薬剤適用のために、1時間に体重1キログラムあたり、用量あたり5内毒素単位(EU)の上限を設定している(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000))。治療タンパク質を、体重1キログラムあたり、数百〜数千ミリグラムの量で投与する場合、微量の内毒素でも除去するのが有利である。一実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、10 EU/mg未満、または5 EU/mg未満、または1 EU/mg未満、または0.1 EU/mg未満、または0.01 EU/mg未満、または0.001 EU/mg未満である。別の実施形態においては、前記組成物中の内毒素および発熱物質レベルは、約10 EU/mg未満、または約5 EU/mg未満、または約1 EU/mg未満、または約0.1 EU/mg未満、または約0.01 EU/mg未満、または約0.001 EU/mg未満である。
【０２１９】
6.15 用量／投与
本発明の足場を含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、足場を、製薬上許容し得る担体または賦形剤と混合する。治療剤および診断剤の製剤を、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水性溶液、ローション、または懸濁液の形態の生理学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより調製することができる(例えば、Hardmanら(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams,およびWilkins, New York, N.Y.; Avisら(編)、(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Liebermanら(編)、(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Liebermanら(編)、 (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; WeinerおよびKotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照されたい)。
【０２２０】
治療剤のための投与計画の選択は、実体の血清もしくは組織回転率、症候のレベル、実体の免疫原性、生物マトリックス中の標的細胞の接近性などのいくつかの因子に依存する。特定の実施形態においては、投与計画は、許容し得るレベルの副作用と一致する患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される生物製剤の量は、部分的には、特定の実体および治療される症状の重篤度に依存する。抗体、サイトカイン、および小分子の好適な用量を選択する際の指針が利用可能である(例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (編) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (編) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baertら(2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgromら(1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamonら(2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitzら(2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghoshら(2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskyら(2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602を参照されたい)。
【０２２１】
好適な用量の決定を、例えば、治療に影響するか、または治療に影響すると予測される、当業界で公知であるか、または疑われるパラメーターまたは因子を用いて、医師により行う。一般的には、用量は最適用量をいくらか下回る量で始まり、その後、任意の負の副作用と比較して所望の、または最適な効果が達成されるまで、用量を少しずつ増加させる。重要な診断尺度としては、例えば、炎症または産生される炎症性サイトカインのレベルの症候のものが挙げられる。
【０２２２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルを、患者に対して毒性を示すことなく、特定の患者、組成物、および投与様式に対する所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を取得するために変化させることができる。選択される用量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と共に用いられる他の薬剤、化合物および／もしくは材料、治療される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的な健康および以前の病歴、ならびに医学界でよく知られた同様の因子などの様々な薬物動態因子に依存するであろう。
【０２２３】
本発明の足場を、連続輸液により、または例えば、1日、1週間、もしくは週に1〜7回の間隔の用量により提供することができる。用量を、静脈内、皮下、局所、経口、鼻内、直腸内、筋肉内、脳内的に、または吸入により提供することができる。特異的用量プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または用量頻度を含むものである。合計週用量は、少なくとも0.05μg/kg体重、少なくとも0.2μg/kg体重、少なくとも0.5μg/kg体重、少なくとも1μg/kg体重、少なくとも10μg/kg体重、少なくとも100μg/kg体重、少なくとも0.2 mg/kg体重、少なくとも1.0 mg/kg体重、少なくとも2.0 mg/kg体重、少なくとも10 mg/kg体重、少なくとも25 mg/kg体重、または少なくとも50 mg/kg体重であってよい(例えば、Yangら(2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Heroldら(2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liuら(1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portieljiら(20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照)。小分子治療剤、例えば、ペプチド模倣物質、タンパク質足場、天然生成物、または有機化合物の望ましい用量は、モル／kg体重ベースで、抗体またはポリペプチドとほぼ同じである。小分子または足場治療剤の望ましい血漿濃度は、モル／kg体重ベースで、抗体とほぼ同じである。この用量は、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgであってよい。被験者に投与される用量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12以上の数であってよい。
【０２２４】
本発明の足場については、患者に投与される用量は、患者の体重1 kgあたり0.0001 mg〜100 mgであってよい。用量は、患者の体重1 kgあたり、0.0001 mg〜20 mg、0.0001 mg〜10 mg、0.0001 mg〜5 mg、0.0001〜2 mg、0.0001〜1 mg、0.0001 mg〜0.75 mg、0.0001 mg〜0.5 mg/kg、0.0001 mg〜0.25 mg、0.0001〜0.15 mg、0.0001〜0.10 mg、0.001〜0.5 mg、0.01〜0.25 mg、または0.01〜0.10 mgであってよい。
【０２２５】
本発明の足場の用量を、キログラム(kg)で表した患者の体重に、mg/kgで表した投与される用量をかけたものを用いて算出することができる。本発明の足場の用量は、患者の体重1 kgあたり、150μg以下、125μg以下、100μg以下、95μg以下、90μg以下、85μg以下、80μg以下、75μg以下、70μg以下、65μg以下、60μg以下、55μg以下、50μg以下、45μg以下、40μg以下、35μg以下、30μg以下、25μg以下、20μg以下、15μg以下、10μg以下、5μg以下、2.5μg以下、2μg以下、1.5μg以下、1μg以下、0.5μg以下、または0.5μg以下であってよい。
【０２２６】
本発明の足場の単位用量は、0.1 mg〜20 mg、0.1 mg〜15 mg、0.1 mg〜12 mg、0.1 mg〜10 mg、0.1 mg〜8 mg、0.1 mg〜7 mg、0.1 mg〜5 mg、0.1〜2.5 mg、0.25 mg〜20 mg、0.25〜15 mg、0.25〜12 mg、0.25〜10 mg、0.25〜8 mg、0.25 mg〜7 mg、0.25 mg〜5 mg、0.5 mg〜2.5 mg、1 mg〜20 mg、1 mg〜15 mg、1 mg〜12 mg、1 mg〜10 mg、1 mg〜8 mg、1 mg〜7 mg、1 mg〜5 mg、または1 mg〜2.5 mgであってよい。
【０２２７】
本発明の足場の用量は、被験者中で少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。あるいは、本発明の足場の用量は、被験者中で少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも1μg/ml、少なくとも2μg/ml、少なくとも5μg/ml、少なくとも6μg/ml、少なくとも10μg/ml、少なくとも15μg/ml、少なくとも20μg/ml、少なくとも25μg/ml、少なくとも50μg/ml、少なくとも100μg/ml、少なくとも125μg/ml、少なくとも150μg/ml、少なくとも175μg/ml、少なくとも200μg/ml、少なくとも225μg/ml、少なくとも250μg/ml、少なくとも275μg/ml、少なくとも300μg/ml、少なくとも325μg/ml、少なくとも350μg/ml、少なくとも375μg/ml、または少なくとも400μg/mlの血清力価を達成することができる。
【０２２８】
本発明の足場の用量を反復し、投与を少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2ヶ月、75日、3ヶ月、または少なくとも6ヶ月分離することができる。
【０２２９】
特定の患者のための有効量は、治療する症状、患者の全体の健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重篤度などの因子に応じて変化してもよい(例えば、Maynardら(1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照されたい)。
【０２３０】
投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病巣内による注射もしくは輸液、または持続放出系もしくは埋込み物によるものであってよい(例えば、Sidmanら(1983) Biopolymers 22:547-556; Langerら(1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epsteinら(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwangら(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; 米国特許第6,350466号および第6,316,024号を参照されたい)。必要に応じて、前記組成物はまた、可溶化剤および注射部位の疼痛を緩和するためのリドカインなどの局所麻酔剤を含んでもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を含む製剤の使用による、肺投与を用いてもよい。例えば、米国特許第6,019,968号、第5,985, 320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号、および第4,880,078号; ならびにPCT公開WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、およびWO 99/66903(それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。一実施形態においては、本発明の抗体、組合せ療法、または組成物を、Alkermes AIR(商標)肺薬剤送達技術 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)を用いて投与する。
【０２３１】
本発明の組成物を、当業界で公知の1つ以上の様々な方法を用いて、1つ以上の投与経路を介して投与することもできる。当業者には明らかであろうが、投与経路および／または投与様式は、望ましい結果に応じて変化するであろう。本発明の足場のために選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄内または例えば、注射もしくは輸液による他の非経口投与経路が挙げられる。非経口投与は、通常、注射による腸内投与および局所投与以外の投与様式であってよく、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および輸液が挙げられる。あるいは、本発明の組成物を、局所、表皮もしくは粘膜投与経路などの非経口経路を介して、例えば、鼻内、経口、膣内、直腸内、舌下もしくは局所的に投与することができる。
【０２３２】
本発明の足場を制御放出系または持続放出系で投与する場合、ポンプを用いて制御放出または持続放出を達成することができる(Langer、上掲; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldら、1980, Surgery 88:507; Saudekら、1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい)。ポリマー材料を用いて、本発明の治療剤の制御放出または持続放出を達成することができる(例えば、Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい; また、Levyら、1985, Science 228:190; Duringら、1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら、1989, J. Neurosurg. 7 1:105も参照されたい); 米国特許第5,679,377号; 米国特許第5,916,597号; 米国特許第5,912,015号; 米国特許第5,989,463号; 米国特許第5,128,326号; PCT公開WO 99/15154; およびPCT公開WO 99/20253も参照されたい。持続放出製剤中で用いられるポリマーの例としては、限定されるものではないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニル酢酸)、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態においては、持続放出製剤中で用いられるポリマーは、不活性であり、濾過可能な不純物を含まず、保存の際に安定であり、無菌性であり、生分解性である。制御放出系または持続放出系を、予防または治療標的の近くに置いて、かくして、ほんの少量の全身用量が必要となるようにすることができる(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release、上掲、vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい)。
【０２３３】
制御放出系は、Langer (1990, Science 249:1527-1533)による概説に考察されている。当業者には公知の任意の技術を用いて、本発明の1種以上の足場を含む持続放出製剤を製造することができる。例えば、米国特許第4,526,938号、PCT公開WO 91/05548、PCT公開WO 96/20698、Ningら、1996、「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」、Radiotherapy & Oncology 39:179-189、Songら、1995、「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397、Cleekら、1997、「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854、ならびにLamら、1997、「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760(それぞれ、参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【０２３４】
本発明の足場を局所投与する場合、それを軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、乳濁液の形態、または当業者にはよく知られた他の形態で製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms、第19版、Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。噴霧不可能な局所剤形については、典型的には、局所適用と適合可能な担体もしくは1種以上の賦形剤を含み、いくつかの例においては、水より高い力学的粘性を有する、粘性から半固体もしくは固体の形態を用いる。好適な製剤としては、限定されるものではないが、必要に応じて、滅菌されたか、または例えば、浸透圧などの様々な特性に影響させるための補助剤(例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファー、もしくは塩)と混合した溶液、懸濁液、乳濁液、クリーム、軟膏、粉末、塗布剤、軟膏などが挙げられる。他の好適な局所剤形としては、活性成分を、いくつかの例においては、固体または液体の不活性担体と共に、加圧された揮発性物質(例えば、フロンなどの気体推進剤)との混合物中、またはスクイーズボトル中に充填した噴霧可能なエアロゾル調製物が挙げられる。必要に応じて、湿潤剤または保湿剤を、医薬組成物および剤形に添加することもできる。そのような追加成分の例は、当業界でよく知られている。
【０２３５】
本発明の足場を鼻内投与する場合、それをエアロゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態で製剤化することができる。特に、本発明に従う使用のための予防剤または治療剤を、好適な推進剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体)の使用と共に、加圧包装またはネブライザーからエアロゾルスプレー提供物の形態で都合良く送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位を、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。化合物の粉末混合物とラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤とを含む吸入器または通気器における使用のためのカプセルおよびカートリッジ(例えば、ゼラチンから構成される)を製剤化することができる。
【０２３６】
第2の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射性物質との同時投与または治療のための方法は、当業界でよく知られている(例えば、Hardmanら(編)、(2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.、第3版、McGraw-Hill, New York, N.Y.; PooleおよびPeterson (編) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; ChabnerおよびLongo (編) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい)。有効量の治療剤は、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、または少なくとも50％、症候を減少させることができる。
【０２３７】
本発明の足場と共に投与することができるさらなる療法(例えば、予防剤または治療剤)を、本発明の足場から5分未満、30分未満、1時間、約1時間、約1〜2時間、約2〜3時間、約3〜4時間、約4〜5時間、約5〜6時間、約6〜7時間、約7〜8時間、約8〜9時間、約9〜10時間、約10〜11時間、約11〜12時間、約12〜18時間、18〜24時間、24〜36時間、36〜48時間、48〜52時間、52〜60時間、60〜72時間、72〜84時間、84〜96時間、または96〜120時間空けて投与することができる。2種以上の療法を、1回の同じ患者訪問内で投与することができる。
【０２３８】
本発明の足場および他の療法を、周期的に投与することができる。周期的療法は、一定の期間、第1の療法(例えば、第1の予防剤もしくは治療剤)を投与した後、一定の期間、第2の療法(例えば、第2の予防剤もしくは治療剤)を投与し、必要に応じて、一定の期間、第3の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)などを投与し、この連続投与、すなわち、サイクルを繰り返して、療法の1つに対する耐性の発生を低下させ、療法の1つの副作用を回避するか、もしくは低下させ、および／または療法の効力を改善することを含む。
【０２３９】
特定の実施形態においては、本発明の足場を製剤化して、in vivoでの適切な分布を確保することができる。例えば、血液脳関門(BBB)は多くの親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療用化合物がBBBを通過する(必要に応じて)ことを確保するために、それらを例えば、リポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許第4,522,811号; 第5,374,548号; および第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される1個以上の部分を含み、かくして、標的化された薬剤送達を増強することができる(例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。標的化部分の例としては、葉酸もしくはビオチン(例えば、Lowらの米国特許第5,416,016号を参照されたい)；マンノシド(Umezawaら、(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 抗体 (P.G. Bloemanら(1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owaisら(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 界面活性剤Aタンパク質受容体(Briscoeら(1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreierら(1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられる; また、K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
【０２４０】
本発明は、本発明の足場を単独で、または他の療法と共に含む医薬組成物の、それを必要とする被験者への投与のためのプロトコルを提供する。本発明の組合せ療法の療法(例えば、予防剤または治療剤)を、被験者に同時に、または連続的に投与することができる。本発明の組合せ療法の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)を、周期的に投与することもできる。周期的療法は、一定の期間、第1の療法(例えば、第1の予防剤もしくは治療剤)を投与した後、一定の期間、第2の療法(例えば、第2の予防剤もしくは治療剤)を投与し、必要に応じて、一定の期間、第3の療法(例えば、予防剤もしくは治療剤)などを投与し、この連続投与、すなわち、サイクルを繰り返して、療法(例えば、薬剤)の1つに対する耐性の発生を低下させ、療法(例えば、薬剤)の1つの副作用を回避するか、もしくは低下させ、および／または療法の効力を改善することを含む。
【０２４１】
本発明の組合せ療法の療法(例えば、予防剤または治療剤)を、被験者に同時に投与することができる。用語「同時に」は、正確に同時的な療法(例えば、予防剤または治療剤)の投与に限定されないが、むしろ本発明の足場を含む医薬組成物を、連続的に、および本発明の足場が他の療法と一緒に作用して、それらを別の方法で投与した場合よりも増加した利益を提供することができるような間隔内で被験者に投与することを意味する。例えば、それぞれの療法を、同時に、または異なる時点で任意の順序で連続的に被験者に投与することができる；しかしながら、同時に投与しない場合、それらを十分に近い間隔で投与して、所望の治療効果または予防効果を提供するべきである。それぞれの療法を、任意の好適な形態で、および任意の好適な経路により、別々に被験者に投与することができる。様々な実施形態においては、療法(例えば、予防剤または治療剤)を、15分未満、30分未満、1時間未満、約1時間、約1〜2時間、約2〜3時間、約3〜4時間、約4〜5時間、約5〜6時間、約6〜7時間、約7〜8時間、約8〜9時間、約9〜10時間、約10〜11時間、約11〜12時間、24時間、48時間、72時間、または1週間空けて被験者に投与する。他の実施形態においては、2種以上の療法(例えば、予防剤または治療剤)を同じ患者訪問内で投与する。
【０２４２】
組合せ療法の予防剤または治療剤を、同じ医薬組成物中で被験者に投与することができる。あるいは、組合せ療法の予防剤または治療剤を、別々の医薬組成物中で被験者に同時に投与することができる。予防剤または治療剤を、同じか、または異なる投与経路により被験者に投与することができる。
【０２４３】
6.16 足場の使用方法
本発明の足場は、in vitroまたはin vivoでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、培養物中の細胞に、例えば、in vitroもしくはex vivoで、または被験者中に、例えば、in vivoで投与して、様々な障害を治療、予防または診断することができる。
【０２４４】
本発明はまた、本発明の足場を用いる方法も提供する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染症などの疾患、疾患の障害または障害に関連する1つ以上の症候の予防、診断、管理、治療または改善のための本発明の足場の使用を包含する。本発明はまた、単独で、または他の療法と組合わせた、限定されるものではないが、癌、炎症性疾患および自己免疫疾患、感染症などの疾患、障害または感染に関連する1つ以上の症候の予防、管理、治療または改善のための本発明の足場の使用も包含する。
【０２４５】
また、多くの細胞表面受容体は、サブユニットの架橋の結果として活性化または不活性化する。本発明のタンパク質を用いて、細胞表面受容体の架橋により標的細胞中での応答を刺激または阻害することができる。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を遮断することができる。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、複数の細胞表面受容体と抗原との相互作用を強化することができる。別の実施形態においては、同じ抗原に対する特異性を有するか、または2個の異なる抗原に結合する結合ドメインを含む本発明の足場を用いて、細胞表面受容体のホモまたはヘテロ二量体を架橋することができる。別の実施形態においては、本発明のタンパク質を用いて、特定の細胞表面受容体にリガンド、またはリガンド類似体を送達することができる。
【０２４６】
本発明はまた、伝統的な抗体では容易に達成されないエピトープを標的化する方法も提供する。例えば、一実施形態においては、本発明の足場を用いて、第1に隣接する抗原を標的化することができ、結合の間に、別の結合ドメインが隠蔽抗原に関与し得る。
【０２４７】
本発明はまた、異なる細胞型と一緒に足場を使用する方法も提供する。一実施形態においては、本発明のタンパク質は、1個の結合ドメインを有する標的細胞に結合し、別の結合ドメインを介して別の細胞を動員することができる。別の実施形態においては、第1の細胞は癌細胞であり、第2の細胞はNK細胞などの免疫エフェクター細胞である。別の実施形態においては、本発明の足場を用いて、おそらく免疫応答を促進する、抗原提示細胞とT細胞などの2種の異なる細胞間の相互作用を強化することができる。
【０２４８】
本発明はまた、癌またはその症候を改善、治療、または予防するために足場タンパク質を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳腺、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳、または中枢神経系の癌の治療において有用である。
【０２４９】
本発明はまた、細胞集団を枯渇させるために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、以下の細胞型：好酸球、好塩基球、好中球、T細胞、B細胞、肥満細胞、単球および腫瘍細胞の枯渇において有用である。
【０２５０】
6.17 TRAIL-R2特異的足場
TRAIL-R2タンパク質は、TNF-受容体スーパーファミリー遺伝子のメンバーによりコードされ、細胞内死ドメインを含む。いくつかの例においては、それはTNFRSF10B; CD262、DR5、KILLER< KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB、またはZTNFR9としても知られる。この受容体を、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TNFSF10/TRAIL/APO-2L)により活性化し、アポトーシスシグナルに変換することができる。さらに、TRAIL-R2誘導性アポトーシスは、キャスパーゼおよび細胞内アダプター分子FADD/MORT1 (Walczakら、EMBOJ, (1997), 16, 5386-97)を含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態においては、本発明は、TRAIL-R2に特異的に結合する足場も提供する。特定の実施形態においては、本発明の足場は、ヒトTRAIL-R2に特異的に結合する。他の特定の実施形態においては、本発明の足場は、マウス、ニワトリ、アカゲザル、カニクイザル、ラット、またはウサギに由来するTRAIL-R2相同体に結合する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場は、TRAIL-R2の露出したエピトープに結合する。そのような実施形態は、細胞および／または受容体を異所的に発現するようにトランスフェクトされた細胞上に内因的に発現されたTRAIL-R2を含む。他の実施形態においては、本発明の足場は、単量体TRAIL-R2上に展示されたエピトープを認識する。他の実施形態においては、本発明の足場は、TRAIL-R2のホモ二量体形態上に展示されたエピトープを認識する。さらに他の実施形態においては、本発明の足場は、単量体TRAIL-R2に結合し、2個以上のTRAIL-R2分子の二量体化またはオリゴマー化(例えば、限定されるものではないが、多量体足場)を容易にする。さらに他の実施形態においては、本発明の足場は、TRAILリガンドとのTRAIL-R2の相互作用を低下させるか、または阻害する。他の実施形態においては、本発明の足場は、TRAIL-R2とのTRAILリガンドの相互作用を模倣する。さらなる実施形態においては、本発明の足場は、TRAIL-R2による細胞シグナリングを作動する。
【０２５２】
本発明は、本明細書に記載の足場を用いてTRAIL-R2活性を調節する方法も提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、TRAIL-R2を発現する細胞を、TRAIL-R2特異的足場と接触させ、TRAILリガンドとの相互作用を遮断することを含む。他の実施形態においては、本発明の方法は、TRAIL-R2を発現する細胞を、TRAIL-R2特異的足場と接触させ、TRAILリガンドとTRAIL-R2との相互作用を模倣することを含む。他の実施形態においては、本発明の方法は、TRAIL-R2特異的足場と接触させることにより、TRAIL-R2を作動させることを含む。他の実施形態においては、本発明の方法は、細胞上に発現されたTRAIL-R2の単量体を、TRAIL-R2特異的足場と接触させ、二量体化またはオリゴマー化を容易にすることにより、TRAIL-R2を二量体化またはオリゴマー化することを含む。さらなる実施形態においては、TRAIL-R2の二量体化を、例えば、限定されるものではないが、多量体足場、TRAIL-R2単量体を模倣する足場、TRAIL-R2二量体形成を安定化する足場、TRAIL-R2単量体を脱安定化する足場または細胞上に展示されたTRAIL-R2二量体のみを認識する足場の使用を介して達成することができる。
【０２５３】
他の実施形態においては、TRAIL-R2の二量体化またはオリゴマー化を、足場二量体化またはオリゴマー化剤とカップリングさせた単量体足場の使用を介して達成することができる。そのような足場二量体化剤またはオリゴマー化剤としては、例えば、限定されるものではないが、抗足場抗体、抗体とカップリングさせたエピトープタグを有する足場の使用、または本明細書に記載され、当業界で公知の様々なタンパク質二量体化もしくはオリゴマー化モチーフの組込みが挙げられる。さらなる実施形態においては、TRAIL-R2二量体またはオリゴマーを、単量体足場の投与、次いで、足場二量体化剤またはオリゴマー化剤の投与により誘導することができる。
【０２５４】
いくつかの実施形態においては、本発明の方法は、当業界で公知の日常的なアッセイにより測定されるように、細胞の生存能力を低下させるTRAIL-R2特異的足場の投与を含む。さらなる実施形態においては、細胞生存能力の低下は、当業界で公知のアッセイにより測定されるように、アポトーシスの活性化である。他の実施形態においては、細胞生存能力の低下は、当業界で許容される方法により測定されるように、細胞分裂の阻害である。いくつかの実施形態においては、細胞生存能力を、治療の非存在下での細胞生存能力と比較して、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％以上低下する。いくつかの実施形態においては、細胞生存能力を、本明細書に記載の実施例15および／もしくは17に概略される手順または他の当業界で公知の方法を用いて測定する。
【０２５５】
いくつかの実施形態においては、本発明のTRAIL-R2結合足場は、TRAIL(Apo-2リガンド)として知られる、TRAIL-R2のためのリガンドと同様の活性でTRAIL-R2を作動する(アゴナイズする；agonize)。他の実施形態においては、本発明のTRAIL-R2結合足場は、TRAIL-R2を十分に活性化して、キャスパーゼ3、キャスパーゼ8、キャスパーゼ10、またはFADDの活性化などの1種以上の細胞内シグナリング経路の活性化をもたらすことができる。他の実施形態においては、本発明のTRAIL-R2結合足場は、少なくとも1種の癌細胞型におけるアポトーシスを活性化する。さらなる実施形態においては、本発明のTRAIL-R2結合足場は、TRAILと比較して、少なくとも1種の細胞型におけるアポトーシスの活性化の増強を示す。他の実施形態においては、本発明のTRAIL-R2結合足場は、TRAIL(リガンド)と同じTRAIL-R2上のエピトープに結合するか、またはそれに対する結合について競合し得る。そのような実施形態においては、TRAIL-R2結合足場は、TRAIL-R2とTRAILとの相互作用の阻害を、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％以上遮断することができ、これを可溶性TRAILリガンド(TRAILリガンドの114ー281断片など)、結晶学的研究、または他の公知のin vivoもしくはin vitro研究を用いるin vitro競合アッセイにおいて決定することができる。
【０２５６】
6.17.1 療法においてTRAIL-R2結合剤を使用する方法
TRAIL-R2は、アポトーシスシグナリングを媒介することが知られている。いくつかの型の正常細胞がTRAIL-R2を発現するが、この受容体を介するアポトーシスシグナリングは、主に腫瘍細胞に限定されているようであり、MycまたはRasなどの癌遺伝子によるその形質転換の状況において死受容体媒介性アポトーシスの影響をより受けやすくなる(Wangら、Cancer Cell 5:501-12 (2004); Nesterovら、Cancer Res. 64:3922-7 (2004))。TRAIL-R2は、ヒト癌細胞系ならびに原発性腫瘍により発現されることが多い。
【０２５７】
本発明のTRAIL-R2特異的足場は、癌の予防、治療、維持または改善において有用であってよい。いくつかの実施形態においては、癌は、TRAIL-R2を発現する癌細胞を含んでもよい。他の実施形態においては、癌細胞は、非癌細胞と比較してTRAIL-R2を過剰発現する。いくつかの実施形態においては、癌は、例えば、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、または白血病である。他の実施形態においては、癌としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、または本明細書に記載の他の癌が挙げられる。
【０２５８】
いくつかの実施形態においては、本発明のTRAIL-R2特異的足場を、治療を必要とする被験者(すなわち、癌を有する患者)に投与する。そのような実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場を含む滅菌で発熱物質非含有組成物を、それを必要とする被験者に投与する。治療の効率を、限定されるものではないが、アポトーシス活性、Annexin V結合のキャスパーゼ活性化の使用、ならびに腫瘍組織量もしくは体積の減少などの、当業界でよく知られた様々なin vitroおよびin vivoアッセイを用いて測定することができる。
【０２５９】
他の実施形態においては、本発明のTRAIL-R2特異的足場は、癌または他のTRAIL-R2関連疾患の診断および検出にとって有用である。そのような実施形態においては、本発明のTRAIL-R2特異的足場を、限定されるものではないが、放射性アイソトープ、蛍光または化学発光標識などの検出剤に連結する。そのような連結された結合剤は、被験者、または該被験者から取得されたサンプル中の癌またはTRAIL-R2関連疾患を検出または診断する方法において有用である。さらに、TRAIL-R2特異的足場は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける免疫関連疾患などの他のTRAIL-R2関連病理症状の診断および治療において有用である。
【０２６０】
6.17.2 特異的TRAIL-R2結合配列
TRAIL-R2特異的足場を同定するために、2ループライブラリーおよび3ループライブラリーをスクリーニングした。いくつかのクローンが、TRAIL-R2に特異的に結合すると同定された。
【０２６１】
いくつかの実施形態においては、本発明のTRAIL-R2特異的足場は、TRAIL-R2に結合する少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列を含む。いくつかの実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、2F4、5B10、10D9、6F11、8B3、5E5、2H6、7G11、または6C7から選択されたTRAIL-R2結合足場クローンの少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号126〜143から選択された少なくとも1個のループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、または142から選択される少なくとも1個のBCループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、または143から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、または142から選択されるBCループ配列；および配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、または143から選択されるFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号126のBCループ配列および配列番号127のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号128のBCループ配列および配列番号129のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号130のBCループ配列および配列番号131のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号132のBCループ配列および配列番号133のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号134のBCループ配列および配列番号135のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号136のBCループ配列および配列番号137のFGループ配列を含む。別の特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号140のBCループ配列および配列番号141のFCループ配列を含む。さらに別の特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号138のBCループ配列および配列番号139のFCループ配列を含む。
【０２６２】
他の実施形態においては、本発明はまた、TRAIL-R2に特異的に結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよく、該TRAIL-R2結合剤は、2F4、5B10、10D9、6F11、8B3、5E5、2Hb、7G11、または6C7からなる群より選択される。他の実施形態においては、本発明はまた、TRAIL-R2に特異的に結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよく、該TRAIL-R2結合剤は、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、または142から選択される1個のBCループ配列；および配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、または143から選択される1個のFGループ配列を含む。競合アッセイを、本明細書の実施例11および／もしくは14に提供されるように、または当業界で公知の他のアッセイにより実施することができる。
【０２６３】
他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、1E03、2B04、1C12、1A03、1C10、1B12、2G03、2D3、1C06、2F08、1B04、3B11、1D8、2A12、1E05、2F02、1H05、2A11、または1G11から選択されるTRAIL-R2結合足場クローンの少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、または少なくとも6個のループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号144〜200に由来する少なくとも1個のループを含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、または198から選択される少なくとも1個のBCループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、194、187、190、193、196、または199から選択される少なくとも1個のDEループ配列を含む。他の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、179、182、185、188、191、194、197、または200から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含む。さらなる実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、または198から選択される少なくとも1個のBCループ配列; 配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、194、187、190、193、196、または199から選択される少なくとも1個のDEループ配列; および配列番号146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、179、182、185、188、191、194、197、または200から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含む。
【０２６４】
特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号144のBCループ配列、配列番号145のDEループ配列、および配列番号146のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号147のBCループ配列、配列番号148のDEループ配列、および配列番号149のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号150のBCループ配列、配列番号151のDEループ配列、および配列番号152のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号153のBCループ配列、配列番号154のDEループ配列、および配列番号155のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号165のBCループ配列、配列番号166のDEループ配列、および配列番号167のFGループ配列を含む。特定の実施形態においては、TRAIL-R2特異的足場は、配列番号198のBCループ配列、配列番号199のDEループ配列、および配列番号200のFGループ配列を含む。
【０２６５】
他の実施形態においては、本発明はまた、TRAIL-R2に特異的に結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよく、該TRAIL-R2結合剤は、1E03、2B04、1C12、1A03、1C10、1B12、2G03、2D3、1C06、2F08、1B04、3B11、1D8、2A12、1E05、2F02、1H05、2A11、または1G11からなる群より選択される。他の実施形態においては、本発明はまた、TRAIL-R2に特異的に結合する足場と、結合について競合する足場を含んでもよく、該TRAIL-R2結合剤は、配列番号144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、または198から選択される1個のBCループ配列;配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、194、187、190、193、196、または199から選択される少なくとも1個のDEループ配列;および配列番号146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、179、182、185、188、191、194、197、または200から選択される少なくとも1個のFGループ配列を含む。競合アッセイを、本明細書の実施例11および／もしくは14に提供されるように、または当業界で公知の他のアッセイにより実施することができる。
【０２６６】
6.18 足場の使用方法
本発明はまた、サイトカインを不活性化し、阻害するか、または枯渇させるために足場を用いる方法も提供する。一実施形態においては、本発明の方法は、少なくとも1種の以下のサイトカイン：TNF-α、TGF-β、C5a、fMLP、インターフェロンα(サブタイプ1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17および21など)、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、インターロイキンIL-1-33、CCL1-28、CXCL 1-17、およびCX3CL1の不活性化、阻害、または枯渇において有用である。
【０２６７】
本発明はまた、ウイルス、菌類、真核微生物、および細菌などの様々な感染性因子を不活性化するために足場を用いる方法も提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を用いて、RSV、hMPV、PIV、またはインフルエンザウイルスを不活性化することができる。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ナグレリア(Naegleria)、アスペルギルス(Aspergillus)、ブラストミセス(Blastomyces)、ヒストプラズマ(Histoplasma)、カンジダ(Candida)またはチネア(Tinea)属のメンバーなどの菌類病原体を不活性化することができる。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、ジアルジア(Giardia)、トキソプラズマ(Toxoplasma)、プラスモジウム(Plasmodium)、トリパノソーマ(Trypanosoma)、およびエントアメーバ(Entamoeba)属のメンバーなどの真核微生物を不活性化することができる。他の実施形態においては、本発明の足場を用いて、限定されるものではないが、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、シュードモナス(Pseudomonas)、クロストリジウム(Clostridium)、ボレリア(Borrelia)、ビブロ(Vibro)およびナイセリア(Neiserria)属のメンバーなどの細菌病原体を不活性化することができる。
【０２６８】
本発明はまた、診断試薬として足場タンパク質を用いる方法も提供する。本発明のタンパク質は、異なる抗原を同時に効率的に捕捉する必要があるキットまたは試薬において有用であり得る。
【０２６９】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的にとって、例えば、限定されるものではないが、癌などの様々な慢性および急性疾患および障害に対する治療剤として有用である。本発明の方法に従って予防、管理、治療または改善することができる癌の例としては、限定されるものではないが、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳腺、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、および脳の癌が挙げられる。さらなる癌としては、限定されるものではないが、以下のもの：限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病および骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病、限定されるものではないが、慢性骨髄性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病；真性赤血球増加症；限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖疾患；骨の癌ならびに限定されるものではないが、骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、真珠腫誘導性骨肉腫、骨のパジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨の線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫などの結合組織肉腫；限定されるものではないが、神経膠腫、星状細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、および原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；限定されるものではないが、腺癌、小葉(小細胞)癌、腺管内癌、髄様性乳癌、粘液乳癌、管状乳癌、乳頭癌、パジェット病(若年性パジェット病を含む)および炎症性乳癌などの乳癌；限定されるものではないが、褐色細胞腫および副腎皮質癌などの副腎癌；限定されるものではないが、甲状腺乳頭癌もしくは濾胞性甲状腺癌、甲状腺髄様癌および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；限定されるものではないが、インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドもしくは島細胞腫瘍などの膵臓癌；限定されるものではないが、クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、および尿崩症などの下垂体癌；限定されるものではないが、虹彩黒色腫、脈絡膜メラノーマ、および毛様体メラノーマ、および網膜芽細胞腫などの眼メラノーマなどの眼の癌；扁平上皮細胞癌、腺癌、およびメラノーマなどの膣癌；扁平上皮細胞癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、および腺癌などの頸部癌；限定されるものではないが、子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、および間質性腫瘍などの卵巣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘膜表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、いぼ状癌、および燕麦細胞(小細胞)癌などの食道癌；限定されるものではないが、腺癌、菌状肉芽腫(ポリープ)性、潰瘍性、表在拡大型、びまん性、悪性のリンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；直腸癌；限定されるものではないが、肝細胞癌および肝芽腫などの肝臓癌、腺癌などの胆嚢癌；限定されるものではないが、乳頭状、結節性、および広範性などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌(類表皮癌)、腺癌、巨細胞癌および小細胞肺癌などの肺癌；限定されるものではないが、胚腫瘍、精上皮腫、未分化、古典的(典型的)、精母細胞性、非精上皮腫、胎生期癌、奇形腫、絨毛癌(卵黄嚢腫瘍)などの精巣癌；限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫などの前立腺癌；陰茎癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌などの口腔癌；基底細胞癌；限定されるものではないが、腺癌、粘膜表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；限定されるものではないが、扁平上皮細胞癌、およびいぼ状癌などの咽頭癌；限定されるものではないが、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌およびメラノーマ、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫、悪性黒子黒色腫、末端性黒子性黒色腫などの皮膚癌；限定されるものではないが、腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌(腎盂および／もしくは尿管)などの腎臓癌；ウィルムス腫瘍；限定されるものではないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌が挙げられる。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌および乳頭腺癌が挙げられる(そのような障害に関する概説については、Fishmanら、1985, Medicine、第2版、J. B. Lippincott Co.、PhiladelphiaおよびMurphyら、1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., inc., United States of Americaを参照されたい)。また、アポトーシスの異常により引き起こされる癌を本発明の方法および組成物により治療することもできることが意図される。そのような癌としては、限定されるものではないが、濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌、乳腺、前立腺および卵巣のホルモン依存的腫瘍、ならびに家族性大腸腺腫症などの前癌病変、ならびに骨髄異形成症候群が挙げられる。
【０２７０】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的にとって、例えば、限定されるものではないが、自己免疫疾患および／または炎症性疾患などの、様々な慢性および急性疾患および障害に対する治療剤として有用である。本明細書に記載の本発明の組成物および方法は、自己免疫障害および／または炎症性障害の予防または治療にとって有用である。自己免疫障害および／または炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後部線維増殖症、加齢性黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、甲状腺過形成(グレーブス病など)、角膜および他の組織の移植、ならびに慢性炎症、敗血症、慢性関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再かん流傷害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎(例えば、乾癬性関節炎)、アナフィラキシーショック、器官虚血、再かん流傷害、脊髄損傷および同種移植片拒絶、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、IgAニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、紅斑性狼瘡、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、1型もしくは免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、Raynauld現象、Reiter症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、紅斑性狼瘡、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎、白斑、およびヴェーゲナー肉芽腫などの血管炎が挙げられる。炎症性障害の例としては、限定されるものではないが、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルスもしくは細菌感染の結果生じる慢性炎症が挙げられる。本発明の組成物および方法を、上記疾患を予防、管理または治療するのに用いられる1種以上の従来の療法と共に用いることができる。
【０２７１】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多くの目的にとって、例えば、限定されるものではないが、ウイルス、細菌および菌類疾患を含む感染症などの、様々な慢性および急性疾患および障害に対する治療剤として有用である。ウイルス病原体の例としては、限定されるものではないが、アデノウイルス科(例えば、マストアデノウイルスおよびアビアデノウイルス)、ヘルペスウイルス科(例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5、および単純ヘルペスウイルス6)、レビウイルス科(例えば、レビウイルス、腸内細菌相MS2、アロレウイルス)、ポックスウイルス科(例えば、コルドポックスウイルス科、パラポックスウイルス、アビポックスウイルス、カプリポックスウイルス、レポリポックスウイルス、スイポックスウイルス、モラシポックスウイルスおよびエントモポックスウイルス科)、パポバウイルス科(例えば、ポリオーマウイルスおよびパピローマウイルス)、パラミクソウイルス科(例えば、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス1、モビリウイルス(例えば、麻疹ウイルス)、ルブラウイルス(例えば、ムンプスウイルス)、肺炎ウイルス科(例えば、肺炎ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス)、およびメタニューモウイルス(例えば、トリ肺炎ウイルスおよびヒトメタニューモウイルス)、ピコルナウイルス科(例えば、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス(例えば、ヒトA型肝炎ウイルス)、カルジオウイルスおよびアプトウイルス)、レオウイルス科(例えば、オルトレオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、ファイトレオウイルスおよびオリザウイルス)、レトロウイルス科(例えば、哺乳動物B型レトロウイルス、哺乳動物C型レトロウイルス、トリC型レトロウイルス、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス)、レンチウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルス1型およびヒト免疫不全ウイルス2型)、スプマウイルス、フラビウイルス科(例えば、C型肝炎ウイルス)、ヘパドナウイルス科(例えば、B型肝炎ウイルス)、トガウイルス科(例えば、アルファウイルス(例えば、シンドビスウイルス)およびルビウイルス(例えば、風疹ウイルス))、ラブドウイルス科(例えば、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エファメロウイルス、サイトラブドウイルスおよびネクレオラブドウイルス)、アレナウイルス科(例えば、アレナウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピイウイルスおよびラッサ熱ウイルス)、ならびにコロナウイルス科(例えば、コロナウイルスおよびトロウイルス)が挙げられる。細菌病原体の例としては、限定されるものではないが、アクアスピリルム科(Aquaspirillum)、アゾルピリルム科(Azospirillum)、アゾトバクテリア科(Azotobacteraceae)、バクテロイデス科(Bacteroidaceae)、バルトネラ種(Bartonella)、ブデロビブリオ科(Bdellovibrio)、カンピロバクター種(Campylobacter)、クラミジア種(Chlamydia)(例えば、クラミジア・ニューモニア(Chlamydia pneumoniae))、クロストリジウム(clostridium)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)(例えば、シトロバクター種(Citrobacter)、エドワードシエラ(Edwardsiella)、エンテロバクター・エロジェネス(Enterobacter aerogenes)、エルウィニア種(Erwinia)、大腸菌(Escherichia coli)、ハフニア種(Hafnia species)、クレブシエラ種(Klebsiella)��モルガネラ種(Morganella)、プロテウス・バルガリス(Proteus vulgaris)、プロビデンシア(Providencia)、サルモネラ種(Salmonella)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、およびシゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri))、ガルジネラ科(Gardinella)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ハロバクテリウム科(Halobacteriaceae)、ヘリコバクター科(Helicobacter)、レジオネラ科(Legionallaceae)、リステリア種(Listeria)、メチロコッカス科(Methylococcaceae)、マイコバクテリア(mycobacteria) (例えば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobacterium tuberculosis))、ナイセリア科(Neisseriaceae)、オセアノスピリルム科(Oceanospirillum)、パスツレラ科(Pasteurellaceae)、ニューモコッカス種(Pneumococcus)、シュードモナス種(Pseudomonas)、リゾビウム科(Rhizobiaceae)、スピリルム科(Spirillum)、スピロソマセア科(Spirosomaceae)、ブドウ球菌(Staphylococcuss) (例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus)およびパイロゲネスブドウ球菌(Staphylococcus pyrogenes))、連鎖球菌(Streptococcus)(例えば、腸炎連鎖球菌(Streptococcus enteritidis)、ファシエ連鎖球菌(Streptococcus fasciae)および肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae))、バンピロビブルヘリコバクター科(Vampirovibr Helicobacter)、ならびにバンピロビブリオ科(Vampirovibrio)が挙げられる。菌類病原体の例としては、限定されるものではないが、アブシディア種(例えば、アブシディア・コリンビフェラ(Absidia corymbifera)およびアブシディア・ラモサ(Absidia ramosa))、アスペルギルス種(例えば、アスペルギルス・フラブス(Aspergillus flavus)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・ニドゥランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)およびアスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus))、バシディオボールス・ラナルム(Basidiobolus ranarum)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、カンジダ種(例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・ケル(Candida kerr)、カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)、カンジダ・パラプシローシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、カンジダ・クイレルモンディ(Candida quillermondii)、カンジダ・ルゴーサ(Candida rugosa)、カンジダ・ステラトイデア(Candida stellatoidea)およびカンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis))、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、コニジオボルス(Conidiobolus)種、クリプトコッカス・ネオフォルムス(Cryptococcus neoforms)、カニンガメラ(Cunninghamella)種、皮膚糸状菌(dermatophyte)、ヒストプラズマ・カプスラツム (Histoplasma capsulatum)、石膏状小胞子菌(Microsporum gypseum)、ムコール・プシルス(Mucor pusillus)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリア・ボイディ(Pseudallescheria boydii)、ライノスポリジウム・セーベリ(Rhinosporidium seeberi)、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、クモノスカビ種(例えば、リゾプス・アリズス(Rhizopus arrhizus)、リゾプス・オリザ(Rhizopus oryzae)およびリゾプス・ミクロスポルス(Rhizopus microsporus))、サッカロミセス(Saccharomyces)種、スポロトリクス・シェンキ(Sporothrix schenckii)、接合菌(zygomycetes)、ならびに接合菌(Zygornycetes)、子嚢菌(Ascomycetes)、担子菌 (Basidiomycetes)、不完全菌(Deuteromycetes)、および卵菌(Oomycetes)などのクラ��が挙げられる。
【０２７２】
別の実施形態においては、本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染症またはその1つ以上の症候を予防、管理、治療または改善する方法であって、それを必要とする被験者に、予防上または治療上有効用量の本発明の1種以上の足場を、外科手術と組合わせて、単独で、または標準的もしくは実験的化学療法、ホルモン療法、生物療法／免疫療法および／もしくは放射線療法の投与とさらに組合わせて投与することを含む前記方法を提供する。これらの実施形態に従えば、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染症またはその1つ以上の症候を予防、管理、治療または改善するのに用いられる本発明の足場を、部分(例えば、治療剤もしくは薬剤)にコンジュゲートさせるか、または融合させてもよい。
【０２７３】
本発明は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患もしくは感染症またはその1つ以上の症候を予防、管理、治療または改善する方法であって、それを必要とする被験者に、本発明の1つ以上の足場を、癌治療剤ではない1種以上の治療剤(非癌治療剤とも言う)と組合わせて投与することを含む前記方法を提供する。そのような薬剤の例としては、限定されるものではないが、制吐剤、抗真菌剤、抗細菌剤、例えば、抗生物質、抗炎症剤、および抗ウイルス剤が挙げられる。制吐剤の非限定例としては、メトピマジンおよびメトクロプラミドが挙げられる。抗真菌剤の非限定例としては、アゾール剤、イミダゾール、トリアゾール、ポリエン、アンホテリシンおよびリリミジンが挙げられる。抗細菌剤の非限定例としては、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、セファロスポリン、イミペネム、アクストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、レファンピン、ポリミキシン、アンホテリシンB、ナイスタチン、ケトカナゾール、イソニアジド、メトロニダゾールおよびペンタミジンが挙げられる。抗ウイルス剤の非限定例としては、ヌクレオシド類似体(例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロビル、ビダラビン、イドクスリジン、トリフルリジンおよびリバビリン)、フォスカレット、アマンタジン、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナビル、インターフェロン(「IFN」)-α、βまたはγおよびAZTが挙げられる。抗炎症剤の非限定例としては、非ステロイド系抗炎症剤(「NSAID」)、ステロイド系抗炎症剤、β-アゴニスト、抗コリン剤およびメチルキサンチンが挙げられる。
【０２７４】
別の実施形態においては、本発明は、癌細胞表現型を阻害することができる組成物を含む。一実施形態においては、癌細胞表現型は、細胞増殖、細胞接着、細胞接着の喪失、受容体発現の減少(例えば、限定されるものではないが、Eph受容体など)、受容体発現の増加(例えば、限定されるものではないが、Eph受容体)、転移能力、細胞周期阻害、受容体チロシンキナーゼ活性化／阻害などである。
【０２７５】
一実施形態においては、本発明は、慢性炎症を治療することができる組成物を含む。一実施形態においては、前記組成物は、破壊または脱活性化のための免疫細胞の標的化において有用である。一実施形態においては、前記組成物は、活性化T細胞、休止T細胞、B細胞、好中球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞、または樹状細胞の標的化において有用である。別の実施形態においては、本発明は、免疫細胞機能を低下させることができる組成物を含む。別の実施形態においては、前記組成物は、免疫細胞機能を除去することができる。
【０２７６】
別の実施形態においては、本発明は、血管形成を阻害するか、または低下させることができる組成物を含む。別の実施形態においては、血管形成は、腫瘍増殖、慢性関節リウマチ、SLE、シェーグレン症候群などに関連する。
【０２７７】
別の実施形態においては、本発明は、胃腸管の疾患の治療にとって有用な組成物を含む。本発明の足場は、低いpH条件下で高レベルの安定性を示す。低いpHでの安定性は、前記組成物が、過敏性腸症候群、難治性悪心、消化性潰瘍、虫垂炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、胃炎、ヘリコピロリ疾患、クローン病、ウイップル病、セリアック病、憩室炎、憩室症、嚥下障害、裂孔ヘルニア、感染性食道障害、しゃっくり、反芻などの様々な胃腸障害のための経口投与にとって好適であることを示唆する。
【０２７８】
本発明はさらに、組合せ組成物および疾患またはその症候の予防、治療、軽減、または改善におけるそのような組成物の使用方法を提供する。本発明の足場を、疾患またはその症候の予防、治療、軽減または改善にとって好適な従来の療法と組合わせることができる。例示的な従来の療法を、Physician's Desk Reference (第56版、2002および第57版、2003)に見出すことができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を、化学療法、放射線療法、外科手術、生物剤(抗体もしくはペプチド)を用いる免疫療法、小分子、または当業界で公知の別の療法と組合わせることができる。他の実施形態においては、組合せ療法を別々に投与する。
【０２７９】
本発明はまた、疾患を診断する方法も提供する。疾患と関連する特定の標的に結合する本発明の足場を、前記疾患を診断するために用いられる方法に組み入れることができる。一実施形態においては、本発明の足場を、被験者における疾患を診断するための方法であって、該被験者からサンプルを取得し、標的：足場相互作用を形成させる条件下で該サンプル中で標的と足場とを接触させ、標的：足場複合体を同定し、それによってサンプル中の標的を検出することを含む前記方法において用いる。いくつかの実施形態においては、標的は疾患と関連する抗原である。別の実施形態においては、標的はサイトカイン、炎症メディエーター、および細胞内抗原、自己抗原、非自己抗原、核内抗原、細胞表面抗原、細菌抗原、ウイルス抗原または菌類抗原である。他の実施形態においては、診断しようとする疾患は、本明細書に記載のものである。
【０２８０】
本発明はまた、特定の標的を画像化する方法も提供する。一実施形態においては、緑色蛍光タンパク質、他の蛍光タグ(Cy3、Cy5、ローダミンなど)、ビオチン、または放射性核種などの画像化剤にコンジュゲートされた本発明の足場を、特定の標的の存在、位置、または進行を画像化するための方法において用いることができる。いくつかの実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、in vitroで実施する。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、in vivoで実施する。他の実施形態においては、本発明の足場を含む標的を画像化する方法を、MRI、PET走査、X線、蛍光検出により、または当業界で公知の他の検出方法により実施する。
【０２８１】
本発明はまた、本発明の足場を用いて疾患の進行、再発、治療、または改善をモニターする方法も提供する。一実施形態においては、疾患の進行、再発、治療、または改善をモニターする方法を、本明細書に提供されるように、画像化、診断する方法、または化合物／標的と本発明の足場とを接触させることにより達成する。
【０２８２】
6.19 キット
また、本発明の組成物(例えば、足場)と使用のための説明書を含むキットも、本発明の範囲内に含まれる。このキットはさらに、少なくとも1種の追加試薬、または1種以上の追加の本発明の足場を含んでもよい。キットは、典型的には、キットの内容物の意図される使用を指示する標識を含む。用語「標識」は、キット上で、もしくはキットと共に供給されるか、またはさもなければキットに付随する、任意の文書、もしくは記録された材料を含む。
【０２８３】
6.20 等価物
当業者であれば、日常的なものと同程度の実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されると意図される。
【０２８４】
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると指示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとする。さらに、2007年10月31日に提出された米国特許仮出願第60/984,209号は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０２８５】
6.21 例示的実施形態
1. 組換え非天然ポリペプチド足場であって、
I. 天然タンパク質配列から誘導された複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメイン
を含み、
II. 1個以上の前記ループ領域配列が天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの、少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加により変化し、および
III. ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが配列番号1の天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の相同性を有する、
前記足場。
【０２８６】
2. 複数のβ鎖が少なくとも7個の鎖である、実施形態1に記載の足場。
【０２８７】
3. 複数のループ領域が少なくとも6個の領域である、実施形態1に記載の足場。
【０２８８】
4. 前記足場が、それぞれA、B、C、D、E、FおよびGと呼ばれる7個のβ鎖を含み、ループ領域がそれぞれのβ鎖を接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと呼ばれる6個のループ領域を含む、実施形態1に記載の足場。
【０２８９】
5. 前記足場が、配列番号201のABループ配列、配列番号202のBCループ配列、配列番号203のCDループ配列、配列番号204のDEループ配列、配列番号205のEFループ配列および配列番号206のFGループ配列を含む、実施形態4に記載の足場。
【０２９０】
6. 前記足場が、配列番号207のABループ配列、配列番号202のBCループ配列、配列番号203のCDループ配列、配列番号208のDEループ配列、配列番号209のEFループ配列および配列番号206のFGループ配列を含む、実施形態4に記載の足場。
【０２９１】
7. 前記β鎖ドメインが配列番号1によりコードされるポリペプチド配列を含む、実施形態1に記載の足場。
【０２９２】
8. 前記ループ領域配列が、BCおよびFGループを含む、実施形態5または6に記載の足場。
【０２９３】
9. 前記BCループが、S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する9個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９４】
10. 前記BCループが、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(配列番号258)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９５】
11. 前記BCループが、A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(配列番号257)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する12個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９６】
12. 前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)のコンセンサス配列を有する9個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９７】
13. 前記FGループが、X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する10個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９８】
14. 前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(配列番号259)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含む、実施形態8に記載の足場。
【０２９９】
15. 前記ループ領域配列がDEループをさらに含む、実施形態4〜14のいずれか1つに記載の足場。
【０３００】
16. 前記DEループが、X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)のコンセンサス配列を有する6個のアミノ酸を含む、実施形態15に記載の足場。
【０３０１】
17．前記ループ領域配列が、ABループをさらに含む、実施形態4〜14のいずれか1つに記載の足場。
【０３０２】
18. 前記ABループが、コンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する7個の残基を含む、実施形態7に記載の足場。
【０３０３】
19. 前記ABループが、コンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する9個の残基を含む、実施形態18に記載の足場。
【０３０４】
20. 前記ループ領域配列が、CDループをさらに含む、実施形態4〜14のいずれか1つに記載の足場。
【０３０５】
21. 前記CDループが、CDループ中のそれぞれの残基が無作為化され、それぞれの残基がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってよい7、8または9個の残基を含む、実施形態20に記載の足場。
【０３０６】
22. 前記ループ領域配列が、EFループをさらに含む、実施形態4〜14のいずれか1つに記載の足場。
【０３０７】
23. 前記EFループが、コンセンサス配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を有する8個の残基を含む、実施形態22に記載の足場。
【０３０８】
24. 前記足場が、少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、実施形態1〜14のいずれか1つに記載の足場。
【０３０９】
25. 前記ジスルフィド結合が、A鎖とB鎖との間の連結を形成する、実施形態24に記載の足場。
【０３１０】
26. 前記ジスルフィド結合が、D鎖とE鎖との間の連結を形成する、実施形態24に記載の足場。
【０３１１】
27. 前記ジスルフィド結合が、F鎖とG鎖との間の連結を形成する、実施形態24に記載の足場。
【０３１２】
28. 前記ジスルフィド結合が、C鎖とF鎖との間の連結を形成する、実施形態24に記載の足場。
【０３１３】
29. 前記足場が少なくとも2個のジスルフィド結合をさらに含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載の足場。
【０３１４】
30. 前記ジスルフィド結合が、F鎖とG鎖との間の第1の連結、およびC鎖とF鎖との間の第2の連結を形成する、実施形態29に記載の足場。
【０３１５】
31. 前記少なくとも1個のジスルフィド結合がβ鎖ドメイン中にある、実施形態24または29に記載の足場。
【０３１６】
32. 前記少なくとも1個のジスルフィド結合がループ領域中にある、実施形態24または29に記載の足場。
【０３１７】
33. 前記足場が、Tn3SS1(配列番号64)、Tn3SS2(配列番号210)、Tn3SS3(配列番号65)、またはTn3SS4(配列番号66)に対応する配列を含む、実施形態15に記載の足場。
【０３１８】
34. 前記足場が、Tn3SS3+4 (配列番号67)に対応する配列を含む、実施形態17に記載の足場。
【０３１９】
35. 前記足場が標的に結合する、実施形態1〜34のいずれか1つに記載の足場。
【０３２０】
36. 前記足場が少なくとも100μMの親和性(KD)で前記標的に結合する、実施形態35に記載の足場。
【０３２１】
37. 前記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫サイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である、実施形態36に記載の足場。
【０３２２】
38. 前記足場が、20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0中での示差走査熱量測定法(DSC)により測定されるように、少なくとも40℃の融点(Tm)を示す、実施形態36に記載の足場。
【０３２３】
39. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作前の同じ足場と比較して、尿素変性実験において測定されるように、少なくとも10％のCmの増加を示す、実施形態36に記載の足場。
【０３２４】
40. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作前の同じ足場と比較して、グアニジン変性実験において測定されるように、少なくとも10％のCmの増加を示す、実施形態36に記載の足場。
【０３２５】
41. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作前の同じ足場と比較して、少なくとも10％のプロテアーゼ分解に対する耐性の増加を示す、実施形態36に記載の足場。
【０３２６】
42. 前記足場を異種薬剤にコンジュゲートさせ、該薬剤を別の足場、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体のFc領域、IgG分子、結合ペプチド、細胞傷害剤、放射性標識、画像化剤、His-Tag、ビオチン、Flag-タグ、核酸、またはサイトカインからなる群より選択する、実施形態36に記載の足場。
【０３２７】
43. 実施形態36に記載の少なくとも2個の足場を含む多量体足場。
【０３２８】
44. 前記多量体足場がエピトープ結合ドメインをさらに含み、該エピトープ結合ドメインが抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、scFv、Fab、Fv、結合ペプチドからなる群より選択される、実施形態43に記載の多量体足場。
【０３２９】
45. 前記エピトープ結合ドメインが、前記足場とは異なる標的に特異的である、実施形態43に記載の多量体足場。
【０３３０】
46. 前記エピトープ結合ドメインが、前記足場と同じ標的に特異的である、実施形態43に記載の多量体足場。
【０３３１】
47. 前記足場が、別の足場、IgG分子もしくはその断片、Fc領域、二量体化ドメイン、化学的架橋、ジスルフィド結合、またはアミノ酸リンカーにより連結される、実施形態43〜46のいずれか1つに記載の多量体足場。
【０３３２】
48. 実施形態1〜47のいずれか1つの多量体足場をコードする単離された核酸分子。
【０３３３】
49. 実施形態48に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【０３３４】
50. 実施形態49に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０３３５】
51. 各足場が、天然タンパク質配列から誘導される複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメインを含み、該ループ領域配列の1個以上が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが、配列番号1の天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、実施形態36に記載の足場を含むポリペプチド展示ライブラリー。
【０３３６】
52. 前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも2個のループ領域配列を含む、実施形態51に記載のライブラリー。
【０３３７】
53．前記2個のループ領域配列が、BC/DE、BC/FG、DE/FG、AB/CD、AB/EF、およびCD/EDループからなる群より選択される、実施形態52に記載のライブラリー。
【０３３８】
54. 前記ループ領域配列が、BCおよびFGループを含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３３９】
55. 前記BCループが、S-X-a-X-b-X-X-X-G(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はプロリンまたはアラニンであり、(b)はアラニンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する9個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４０】
56. 前記BCループが、S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G(配列番号258)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(c)はプロリン、セリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４１】
57. 前記BCループが、A-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G(配列番号257)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(d)はプロリン、グルタミン酸またはリジンであり、(e)はアスパラギンまたはグリシンであり、(f)はセリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する12個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４２】
58. 前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-X-S(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)のコンセンサス配列を有する9個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４３】
59. 前記FGループが、X-a-X-X-X-X-b-N-P-A(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンであり、(b)はセリンまたはグリシンである)のコンセンサス配列を有する10個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４４】
60. 前記FGループが、X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A(配列番号259)(式中、Xは任意のアミノ酸であり、(a)はアスパラギン、トレオニンまたはリジンである)のコンセンサス配列を有する11個のアミノ酸を含む、実施形態53に記載のライブラリー。
【０３４５】
61. 前記ループ領域配列がDEループをさらに含む、実施形態52に記載のライブラリー。
【０３４６】
62. 前記DEループが、X-X-X-X-X-X(式中、Xは任意のアミノ酸である)のコンセンサス配列を有する6個のアミノ酸を含む、実施形態61に記載のライブラリー。
【０３４７】
63. 前記ループ領域配列がABループをさらに含む、実施形態52に記載のライブラリー。
【０３４８】
64. 前記ABループが、コンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する7個の残基を含む、実施形態63に記載のライブラリー。
【０３４９】
65. 前記ABループが、コンセンサス配列：K-X-X-X-X-X-X-X-a(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(a)はセリン、トレオニン、アラニン、またはグリシンである)を有する9個の残基を含む、実施形態63に記載のライブラリー。
【０３５０】
66. 前記ループ領域配列がCDループをさらに含む、実施形態52に記載のライブラリー。
【０３５１】
67. 前記CDループが、CDループ中の各残基が無作為化され、各残基がアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであってよい7、8または9個の残基を含む、実施形態66に記載のライブラリー。
【０３５２】
68. 前記ループ領域配列がEFループをさらに含む、実施形態52に記載のライブラリー。
【０３５３】
69. 前記EFループが、コンセンサス配列：X-b-L-X-P-X-c-X(式中、Xはアスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、イソロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、トレオニン、アラニン、プロリン、またはセリンであり、(b)はアスパラギン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグリシンであり、(c)はイソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、アラニン、またはグリシンである)を有する8個の残基を含む、実施形態68に記載のライブラリー。
【０３５４】
70. 前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化する少なくとも3個のループ領域配列を含む、実施形態51に記載のライブラリー。
【０３５５】
71. 前記ループ領域配列がBC、DE、およびFGループを含む、実施形態70に記載のライブラリー。
【０３５６】
72. 前記ループ領域配列がAB、CD、およびEFループを含む、実施形態70に記載のライブラリー。
【０３５７】
73. 前記ループ領域配列が、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループからなる群より選択される任意の3個のループを含む、実施形態70に記載のライブラリー。
【０３５８】
74. 前記ポリペプチドが、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、または酵母の表面上に展示される、実施形態38に記載のポリペプチド展示ライブラリー。
【０３５９】
75. 実施形態51〜74のいずれか1つに記載のライブラリーをコードする単離された核酸分子の回収。
【０３６０】
76. 実施形態75に記載の核酸分子に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【０３６１】
77. (a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと実施形態38に記載のライブラリーとを接触させること、および(b)該複合体から、標的リガンドに結合する足場を取得することを含む、標的に結合するポリペプチド足場を取得する方法。
【０３６２】
78. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態77に記載の方法。
【０３６３】
79. 前記方法が少なくとも2個のループを含む、実施形態78に記載の方法。
【０３６４】
80. 前記方法が少なくとも3個のループを含む、実施形態78に記載の方法。
【０３６５】
81. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、実施形態78に記載の方法。
【０３６６】
82. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態78に記載の方法。
【０３６７】
83. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の前記反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的を接触させることをさらに含む、実施形態78に記載の方法。
【０３６８】
84. 前記方法が、BC、DE、およびFGループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにAB、CD、およびEFループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、実施形態77〜83のいずれか1つに記載の方法。
【０３６９】
85. 前記方法が、AB、CD、EFループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにBC、DE、およびFGループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、実施形態77〜83のいずれか1つに記載の方法。
【０３７０】
86. 前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態77〜83のいずれか1つに記載の方法。
【０３７１】
87. 前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個または7個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態86に記載の方法。
【０３７２】
88. (a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと実施形態38に記載のライブラリーとを接触させること、(b)該足場を、該足場の架橋が検出可能な応答を引き出す架橋剤と接触させること、ならびに(c)該複合体から、標的に結合する足場を取得することを含む、標的に結合する少なくとも2個の足場を取得する方法。
【０３７３】
89. 前記足場が同じエピトープを認識する、実施形態88に記載の方法。
【０３７４】
90. 前記足場が異なるエピトープを認識する、実施形態88に記載の方法。
【０３７５】
91. 前記架橋剤を、抗体、抗体フラグメント、二量体化モチーフ、化学的架橋剤、結合ペプチド、またはエピトープタグからなる群より選択する、実施形態88に記載の方法。
【０３７６】
92. 化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと実施形態1〜47のいずれか1つに記載の足場とを接触させること、該複合体を検出すること、それによって、サンプル中の化合物を検出することを含む、サンプル中の化合物を検出する方法。
【０３７７】
93. 化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと実施形態1〜47のいずれか1つに記載の固定された足場とを接触させること、および固定された足場を除去すること、それによって、サンプル中の化合物を捕捉することを含む、サンプル中の化合物を捕捉する方法。
【０３７８】
94. 実施形態1〜47のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【０３７９】
95. 実施形態1〜47のいずれか1つに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【０３８０】
96. 実施形態95に記載の組成物を用いて患者における疾患を予防、治療、管理または改善する方法。
【０３８１】
97. 実施形態95または96に記載の組成物を用いて、患者における疾患を診断または画像化する方法。
【０３８２】
98. 前記方法が、免疫療法、生物療法、化学療法、放射線療法、または小分子薬剤療法である追加療法をさらに含む、実施形態96に記載の方法。
【０３８３】
99. 前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、感染症、呼吸器疾患、胃腸疾患、糖尿病、狼瘡、または肥満である、実施形態96〜98のいずれか1つに記載の方法。
【０３８４】
100. 組換え非天然ポリペプチド足場であって、
I. 天然タンパク質配列から誘導される複数の予測されたループ領域配列に連結された複数の予測されたβ鎖ドメイン
を含み、
II. 1個以上の前記ループ領域配列が天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、ならびに
III. ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが配列番号2の天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の相同性を有する、
前記足場。
【０３８５】
101. 前記β鎖ドメインが、配列番号2によりコードされるポリペプチド配列を含む、実施形態100に記載の足場。
【０３８６】
102. 組換え非天然ポリペプチド足場であって、
I. 天然タンパク質配列から誘導される複数の予測されたループ領域配列に連結された複数の予測されたβ鎖ドメイン
を含み、
II. 1個以上の前記ループ領域配列が天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、ならびに
III. ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが配列番号3もしくは4の天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％の相同性を有する、
前記足場。
【０３８７】
103. 前記β鎖ドメインが、配列番号3または4のタンパク質配列を含む、実施形態102に記載の足場。
【０３８８】
104. 組換え非天然ポリペプチド足場であって、
I. 天然タンパク質配列から誘導される複数の予測されたループ領域配列に連結された複数の予測されたβ鎖ドメイン
を含み、
II. 1個以上の前記ループ領域配列が天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸の欠失、置換または付加により変化し、ならびに
III. ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが配列番号5〜32、68〜88から選択される天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、
前記足場。
【０３８９】
105. 複数のβ鎖が、少なくとも7個の鎖である、実施形態100〜104のいずれか1つに記載の足場。
【０３９０】
106. 複数のループ領域が少なくとも6個の領域である、実施形態100〜104のいずれか1つに記載の足場。
【０３９１】
107. 前記足場が、それぞれA、B、C、D、E、およびFと呼ばれる7個のβ鎖、ならびにループ領域がそれぞれのβ鎖を接続し、AB、BC、CD、DE、EF、およびFGループと呼ばれる6個のループ領域を含む、実施形態100〜104に記載の足場。
【０３９２】
108. 前記足場が少なくとも1個のジスルフィド結合をさらに含む、実施形態100〜107のいずれか1つに記載の足場。
【０３９３】
109. 前記足場が少なくとも2、3、4個以上のジスルフィド結合をさらに含む、実施形態100〜107のいずれか1つに記載の足場。
【０３９４】
110. 少なくとも1個のジスルフィド結合がβ鎖ドメイン中にある、実施形態108または109に記載の足場。
【０３９５】
111. 少なくとも1個のジスルフィド結合がループ領域中にある、実施形態108または109に記載の足場。
【０３９６】
112. 前記足場が標的に結合する、実施形態100〜111のいずれか1つに記載の足場。
【０３９７】
113. 前記標的が、細胞表面抗原、可溶性抗原、固定化抗原、免疫サイレント抗原、細胞内抗原、核内抗原、自己抗原、非自己抗原、癌抗原、細菌抗原、またはウイルス抗原である、実施形態112に記載の足場。
【０３９８】
114. 前記足場が、少なくとも100μMのKdの親和性で結合する、実施形態112に記載の足場。
【０３９９】
115. 前記足場が、20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0中での示差走査熱量測定法(DSC)により測定されるように、少なくとも40℃の融点(Tm)を示す、実施形態112に記載の足場。
【０４００】
116. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作の前の同じ足場と比較して、尿素変性実験において測定されるように、少なくとも10％のCmの増加を示す、実施形態112に記載の足場。
【０４０１】
117. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作の前の同じ足場と比較して、グアニジン変性実験において測定されるように、少なくとも10％のCmの増加を示す、実施形態112に記載の足場。
【０４０２】
118. 前記足場が、同様の実験条件下で、遺伝子操作の前の同じ足場と比較して、少なくとも10％のプロテアーゼ分解に対する耐性の増加を示す、実施形態112に記載の足場。
【０４０３】
119. 前記足場を異種薬剤にコンジュゲートさせ、該薬剤を別の足場、ポリエチレングリコール(PEG)、ヒト血清アルブミン(HSA)、抗体のFc領域、IgG分子、二量体化ドメイン、結合ペプチド、細胞傷害剤、放射性標識、画像化剤、His-Tag、ビオチン、Flag-タグ、核酸、またはサイトカインからなる群より選択する、実施形態112に記載の足場。
【０４０４】
120. 実施形態100〜119のいずれか1つに記載の少なくとも2個の足場を含む多量体足場。
【０４０５】
121. 前記多量体足場が、エピトープ結合ドメインをさらに含み、該エピトープ結合ドメインを、抗体、抗体フラグメント、ダイアボディ、scFv、Fab、Fv、または結合ペプチドからなる群より選択する、実施形態120に記載の多量体足場。
【０４０６】
122. 前記エピトープ結合ドメインが、前記足場とは異なる標的に特異的である、実施形態121に記載の多量体足場。
【０４０７】
123. 前記エピトープ結合ドメインが、前記足場と同じ標的に特異的である、実施形態121に記載の多量体足場。
【０４０８】
124. 前記足場を、別の足場、IgG分子もしくはその断片、Fc領域、二量体化ドメイン、化学的架橋、ジスルフィド結合、またはアミノ酸リンカーにより連結する、実施形態120〜123のいずれか1つに記載の多量体足場。
【０４０９】
125. 実施形態100〜124のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【０４１０】
126. 実施形態125に記載の核酸に機能し得る形で連結された発現ベクター。
【０４１１】
127. 実施形態126に記載のベクターを含む宿主細胞。
【０４１２】
128. 各足場が、天然タンパク質配列から誘導された複数のループ領域配列に連結された複数のβ鎖ドメインを含み、1個以上のループ領域配列が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列から、少なくとも1個のアミノ酸による欠失、置換または付加により変化し、ポリペプチド足場のβ鎖ドメインが天然タンパク質配列の対応するドメイン配列に対して少なくとも50％の相同性を有する、実施形態100〜119に記載のいずれか1つに記載の足場を含むポリペプチド展示ライブラリー。
【０４１３】
129. 前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸による欠失、置換または付加により変化する少なくとも2個のループ領域配列を含む、実施形態128に記載のライブラリー。
【０４１４】
130. 2個のループ領域配列が、BC/DE、BC/FG、DE/FG、AB/CD、AB/EF、およびCD/EDループから選択される群に由来するループ配列を含む、実施形態128に記載のライブラリー。
【０４１５】
131. 前記足場が、天然タンパク質配列中の対応するループ配列からの少なくとも1個のアミノ酸による欠失、置換または付加により変化する少なくとも3個のループ領域配列を含む、実施形態128に記載のライブラリー。
【０４１６】
132. 前記ループ領域配列が、BC、DE、およびFGループを含む、実施形態131に記載のライブラリー。
【０４１７】
133. 前記ループ領域配列が、AB、CD、およびEFループを含む、実施形態131に記載のライブラリー。
【０４１８】
134. 前記ポリペプチドを、リボソーム、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、または酵母の表面上に展示させる、実施形態128に記載のライブラリー。
【０４１９】
135. 前記ライブラリーが少なくとも106の配列多様性を有する、実施形態134に記載のライブラリー。
【０４２０】
136. (a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと、実施形態128に記載のライブラリーとを接触させること、および(b)該複合体から、リガンドに結合する足場を取得することを含む、標的に結合する足場を取得する方法。
【０４２１】
137. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態136に記載の方法。
【０４２２】
138. 前記方法が、少なくとも2個のループを無作為化することを含む、実施形態137に記載の方法。
【０４２３】
139. 前記方法が、少なくとも3個のループを無作為化することを含む、実施形態137に記載の方法。
【０４２４】
140. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的と接触させることをさらに含む、実施形態137に記載の方法。
【０４２５】
141. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態137に記載の方法。
【０４２６】
142. 工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のループであって、前記ライブラリー中で無作為化されなかった前記ループを無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含み、工程(a)および(b)の反復が、工程(a)および(b)の第1の操作の標的とは異なる標的と接触させることをさらに含む、実施形態137に記載の方法。
【０４２７】
143. 前記方法が、BC、DE、およびFGループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにAB、CD、およびEFループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、実施形態136〜142のいずれか1つに記載の方法。
【０４２８】
144. 前記方法が、AB、CD、EFループからなる群より選択される第1の無作為化されたループならびにBC、DE、およびFGループからなる群より選択される前記ライブラリー中で無作為化されなかった第2のループを含む、実施形態140〜142のいずれか1つに記載の方法。
【０４２９】
145. 前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも1個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態128〜144のいずれか1つに記載の方法。
【０４３０】
146. 前記方法が、工程(b)で得られたタンパク質の足場の少なくとも2、3、4、5、6または7個のβ鎖を無作為化して、さらに無作為化された足場を作製すること、ならびにさらに無作為化された足場を用いて、工程(a)および(b)を反復することをさらに含む、実施形態145に記載の方法。
【０４３１】
147. (a)足場：標的リガンド複合体を形成させる条件下で、標的リガンドと実施形態38に記載のライブラリーとを接触させること、(b)該足場を、該足場の架橋が検出可能な応答を引き出す架橋剤と接触させること、ならびに(c)該複合体から、標的に結合する足場を取得することを含む、標的に結合する少なくとも2個の足場を取得する方法。
【０４３２】
148. 前記足場が、同じエピトープを認識する、実施形態147に記載の方法。
【０４３３】
149. 前記足場が、異なるエピトープを認識する、実施形態147に記載の方法。
【０４３４】
150. 前記架橋剤を、抗体、抗体フラグメント、二量体化モチーフ、化学的架橋剤、結合ペプチド、またはエピトープタグからなる群より選択する、実施形態147に記載の方法。
【０４３５】
151. 化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下で、サンプルと実施形態112に記載の足場とを接触させ、該複合体を検出すること、それによって、サンプル中の化合物を検出することを含む、サンプル中の化合物を検出する方法。
【０４３６】
152. 化合物：足場複合体の形成を可能にする条件下でサンプルと実施形態112に記載の固定された足場とを接触させ、固定された足場を除去することによって、サンプル中の化合物を捕捉することを含む、サンプル中の化合物を捕捉する方法。
【０４３７】
153. 前記足場を含む組成物を、少なくとも15分間、70℃に加熱し、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む、サンプル中の化合物を捕捉する方法。
【０４３８】
154. 前記足場を含む組成物を、pH 3.0もしくはpH 3.5もしくはpH 4.0もしくはpH 4.5もしくはpH 5.0に調整すること；得られる組成物を、50℃、もしくは55℃、もしくは60℃、もしくは65℃、もしくは70℃で1〜30分間加熱すること；ならびに続いて、遠心分離により凝集した化合物を除去することを含む、実施形態101または102に記載の足場を精製する方法。
【０４３９】
155. 実施形態100〜124のいずれか1つに記載の足場を含む滅菌された、発熱物質を含まない組成物。
【０４４０】
156. 実施形態100〜124のいずれか1つに記載の足場を含む医薬組成物。
【０４４１】
157. 実施形態156に記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、患者における疾患を予防、治療、または改善する方法。
【０４４２】
158. 実施形態156に記載の組成物を、モニタリングを必要とする患者に投与すること；該患者において該組成物を画像化すること；および該患者を評価することを含む、患者における疾患の進行をモニターする方法。
【０４４３】
159. 前記疾患が、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、感染症、呼吸器疾患、胃腸疾患、糖尿病、狼瘡、または肥満である、実施形態157または158に記載の方法。
【０４４４】
160. 実施形態1〜47または100〜124のいずれか1つに由来する足場の少なくとも1 g/Lの効率での産生をもたらす、本発明の測定可能な方法。
【０４４５】
161. 前記方法において用いられる培養培地から精製された足場を含む、実施形態160に記載の方法。
【０４４６】
162. 前記足場が培養培地中で産生および分泌される、実施形態1〜47または100〜124のいずれか1つに由来する足場を製造する方法。
【０４４７】
163. 前記方法が、oppAシグナルペプチド(配列番号227)を含む発現ベクターを用いることを含む、実施形態162に記載の方法。
【０４４８】
164. 実施形態162に記載の方法から得られた無細胞材料を用いて、標的への足場の結合をアッセイまたは検出する方法。
【０４４９】
165. 実施形態162に記載の方法により産生される足場を精製する方法。
【０４５０】
166. 前記足場がTRAIL-R2に特異的に結合する、実施形態1に記載の足場。
【０４５１】
167. 前記TRAIL-R2がヒトである、実施形態166に記載の足場。
【０４５２】
168. 前記足場が、2F4、5B10、10D9、6F11、8B3、5E5、2H6、7G11、6C7、1E03、2B04、1C12、1A03、1C10、1B12、2G03、2D3、1C06、2F08、1B04、3B11、1D8、2A12、1E05、2F02、1H05、2A11、または1G11から選択されるTRAIL-R2結合足場から誘導される配列を含む、実施形態166に記載の足場。
【０４５３】
169. 前記足場が多量体足場である、実施形態166に記載の足場。
【０４５４】
170. 前記多量体足場が少なくとも2個の足場ドメインを含む、実施形態168に記載の足場。
【０４５５】
171. 前記少なくとも2個の足場ドメインが、同じエピトープに結合する、実施形態170に記載の足場。
【０４５６】
172. 前記少なくとも2個の足場ドメインが、同じエピトープに結合する、実施形態170に記載の足場。
【０４５７】
173. 少なくとも1個の足場ドメインを、IgG分子から誘導されるFc領域に連結する、実施形態170に記載の足場。
【０４５８】
174. 少なくとも1個の足場ドメインを、IgG分子から誘導されるCH1領域に連結する、実施形態170に記載の足場。
【０４５９】
175. 少なくとも1個の足場ドメインを、IgG分子から誘導されるCH2領域に連結する、実施形態170に記載の足場。
【０４６０】
176. 少なくとも1個の足場ドメインを、IgG分子から誘導されるヒンジ領域に連結する、実施形態170に記載の足場。
【０４６１】
177. 少なくとも1個の足場ドメインを、IgG分子から誘導されるCκまたはCλ領域に連結する、実施形態170に記載の足場。
【０４６２】
178. 少なくとも1個の足場ドメインが、2D3または1C12である、実施形態170に記載の足場。
【０４６３】
179. 前記足場が、IgG分子から誘導されるヒンジ領域に連結された1C12を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６４】
180. 前記足場が、IgG分子から誘導されるヒンジ領域に連結された2D3を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６５】
181. 前記足場が、IgG分子から誘導されるCH1領域に連結された1C12を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６６】
182. 前記足場が、IgG分子から誘導されるCH1領域に連結された2D3を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６７】
183. 前記足場が、IgG分子から誘導されるCκ領域に連結された1C12を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６８】
184. 前記足場が、IgG分子から誘導されるCκ領域に連結された2D3を含む、実施形態170に記載の足場。
【０４６９】
185. 前記足場が、配列番号126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、および198からなる群より選択されるBCループ配列を含む、実施形態166〜184のいずれか1つに記載の足場。
【０４７０】
186. 前記足場が、配列番号145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、および199からなる群より選択されるDEループ配列を含む、実施形態166〜184のいずれか1つに記載の足場。
【０４７１】
187. 前記足場が、配列番号127、129、131、133、135、137、139、141、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、および200からなる群より選択されるFGループ配列を含む、実施形態166〜184のいずれか1つに記載の足場。
【０４７２】
188. 前記足場が、結合の際にTRAIL-R2受容体を作動させる、実施形態166〜184のいずれか1つに記載の足場。
【０４７３】
189. 前記足場が、結合の際にTRAILのTRAIL-R2受容体への結合を模倣する、実施形態166〜189のいずれか1つに記載の足場。
【０４７４】
190. 前記足場が、結合の際にTRAIL-R2受容体を二量体化するように作用する、実施形態166〜190のいずれか1つに記載の足場。
【０４７５】
191. TRAIL-R2受容体と、実施形態166〜190のいずれか1つに記載の足場とを接触させることを含む、TRAIL-R2受容体を作動させる方法。
【０４７６】
192. 前記足場が、TRAILのTRAIL-R2への結合を模倣する、実施形態191に記載の方法。
【０４７７】
193. 前記足場が、TRAIL-R2受容体を二量体化するように作用する、実施形態192に記載の方法。
【０４７８】
194. 細胞上のTRAIL-R2受容体と、実施形態166〜190のいずれか1つに記載の足場とを接触させることを含む、細胞の生存能力を低下させるか、または阻害する方法。
【０４７９】
195. 細胞上のTRAIL-R2受容体と、実施形態166〜190のいずれか1つに記載の足場とを接触させることを含む、細胞中のアポトーシスを活性化または促進する方法。
【０４８０】
196. 実施形態166〜190のいずれか1つに記載の足場またはその組成物を投与することにより、それを必要とする患者における癌を予防、治療、改善、または管理する方法。
【０４８１】
197. 前記癌が、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、非ホジキンリンパ腫、芽細胞腫、胃腸癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、頭部および頸部癌、肺癌、腺癌、腎細胞癌、または肝細胞癌から選択される、実施形態196に記載の方法。
【０４８２】
198. 組換えポリペプチド足場であって、
I. A、B、C、D、E、FおよびGと呼ばれる7個のβ鎖ドメイン；
II. 前記7個のβ鎖ドメインが6個のループ領域に連結され、該ループ領域がそれぞれのβ鎖を接続し、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループと呼ばれる前記6個のループ領域
を含み、
III. 少なくとも1個のループ領域が配列番号1〜32または68〜88のいずれか1つに記載の同族ループ領域の非天然変異体であり、ならびに
IV. 少なくとも1個のβ鎖ドメインが配列番号1〜32または68〜88のいずれか1つに記載の同族β鎖ドメインに対して少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、または少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％の相同性を有する、
前記足場。
【０４８３】
199. 前記β鎖ドメインが、配列番号1〜32または68〜88のいずれか1つによりコードされるポリペプチド配列を含む、実施形態198に記載の足場。
【０４８４】
200. 前記β鎖ドメインが、
a. Aβ鎖(配列番号228)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号231)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号233)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列；または
b. Aβ鎖(配列番号235)、Bβ鎖(配列番号229)、Cβ鎖(配列番号230)、Dβ鎖(配列番号236)、Eβ鎖(配列番号232)、Fβ鎖(配列番号237)およびGβ鎖(配列番号234)のアミノ酸配列、
を含む、実施形態199に記載の足場。
【０４８５】
7. 配列
Tn3野生型ループ(第1の実施形態)：
AB (配列番号201) = DVTDTT
BC (配列番号202) = FKPLAEIDG
CD (配列番号203) = KDVPGDR
DE (配列番号204) = LTEDENQ
EF (配列番号205) = GNLKPD
FG (配列番号206) =RRGDMSSNPA。
【０４８６】
Tn3野生型β鎖(第1の実施形態)：
A (配列番号228) = RLDAPSQIEVK
B (配列番号229) = ALITW
C (配列番号230) = IELTYGI
D (配列番号231) = TTID
E (配列番号232) = YSI
F (配列番号233) = TEYEVSLIS
G (配列番号234) = KETFTT。
【０４８７】
Tn3野生型ループ(第2の実施形態)：
AB (配列番号207) = KDVTDTT
BC (配列番号202) = FKPLAEIDG
CD (配列番号203) = KDVPGDR
DE (配列番号208) = TEDENQ
EF (配列番号209) = GNLKPDTE
FG (配列番号206) =RRGDMSSNPA。
【０４８８】
Tn3野生型β鎖(第2の実施形態)：
A (配列番号235) =RLDAPSQIEV
B (配列番号229) = ALITW
C (配列番号230) = IELTYGI
D (配列番号236) = TTIDL
E (配列番号232) = YSI
F (配列番号237) = YEVSLIS
G (配列番号234) = KETFTT。
【０４８９】
タンパク質配列
大文字はTn3構造モチーフに対応するが、小文字は合成cDNAおよび発現ベクターに由来するフランキング配列付属物である。
【０４９０】
0006034846.tif 000002
0006034846.tif 000003
0006034846.tif 000004
【０４９１】
DNA配列
大文字はTn3構造モチーフに対応するが、小文字はフランキング配列付属物である。
【０４９２】
0006034846.tif 000005
0006034846.tif 000006
0006034846.tif 000007
0006034846.tif 000008
0006034846.tif 000009
0006034846.tif 000010
【０４９３】
野生型Tn3ドメイン(配列番号1)
0006034846.tif 000011
【０４９４】
テナシンTn3足場タンパク質配列
0006034846.tif 000012
【０４９５】
Synagis結合Tn3変異体SynBP01
タンパク質配列
0006034846.tif 000013
【０４９６】
ジスルフィド安定化Tn3s(SS1-4)：
0006034846.tif 000014
0006034846.tif 000015
【０４９７】
Archeaから同定された足場
アーケオグロブス・フルギダスDSM 4304
NCBIアクセッション：NC_000917
タンパク質配列：
0006034846.tif 000016
【０４９８】
スタフィロサームス・マリナスF1
NCBIアクセッション：NC_009033
タンパク質配列：
0006034846.tif 000017
【０４９９】
スルフォロブス・アシドカルダリウスDSM 639
NCBIアクセッション：NC_007181
タンパク質配列：
0006034846.tif 000018
【０５００】
スルフォロブス・ソルファタリクスP2
NCBIアクセッション：NC_002754
タンパク質配列：
0006034846.tif 000019
【０５０１】
スルフォロブス・トコダイstr.7
NCBIアクセッション：NC_003106
タンパク質配列：
0006034846.tif 000020
【０５０２】
実施例5に由来するタンパク質配列
大文字はTn3構造モチーフに対応するが、小文字は合成cDNAおよび発現ベクターに由来するフランキング配列付属物である。
【０５０３】
0006034846.tif 000021
0006034846.tif 000022
【０５０４】
cDNA配列
0006034846.tif 000023
0006034846.tif 000024
0006034846.tif 000025
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0006034846.tif 000027
【０５０５】
0006034846.tif 000028
0006034846.tif 000029
【０５０６】
(実施例)
8. 実施例
ここで、本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は、例示のためだけに提供されるものであり、本発明はいかなる意味でもこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではないが、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意かつ全ての変更を包含すると解釈されるべきである。
【０５０７】
8.1 実施例1：候補足場の組換え発現
本実施例は、ポリアクリルアミドゲル上で染色されたクマシー上で宿主タンパク質のバックグラウンドに対して可視的であるのに十分な量で、候補足場を大腸菌中で組換え発現させることができることを示す(図1)。図1に示されるのは、候補足場を発現する粗大腸菌溶解物のPAGE分析である。いくつかの候補足場は、より高い発現レベル(レーン3、4、5および10により例示される)を示し、これをさらなる開発のために選択した。具体的には、レーン3は、フィブロネクチンIIIの第6のドメインを表し、レーン4はβ-共通受容体に由来する足場を表し、レーン5は増殖ホルモン受容体に由来する候補足場を表し、レーン10はTn3構造モチーフを表す。
【０５０８】
組換え発現
ヒト由来Tn3構造モチーフ配列の一団を、大腸菌中での異種発現のために選択した(表1)。これらのタンパク質の各々をコードし、大腸菌におけるコドン使用のために最適化された合成cDNAは、示された配列のようにGenScript Corporationにより供給されたものである。それぞれのcDNAはフランキングするNco IおよびKpn I制限部位を含み、これらの酵素を用いる消化後、挿入物を、対応するNco I/Kpn I部位を含む改変されたpET22bベクター(Novagen)中にクローニングした。
【０５０９】
他の実施形態においては、ベクターは、本発明の足場の遺伝子操作を容易にするための任意の数の制限部位を含んでもよい。いくつかの実施形態においては、本発明のベクターは、少なくとも1個の制限部位を含む。他の実施形態においては、本発明のベクターは、少なくとも1個のループ配列にフランキングする少なくとも1個の制限部位を含む。他の実施形態においては、本発明のベクターは、NcoI、BglII、BstEII、AscI、およびKpnIからなる群より選択される少なくとも1個の制限部位を含む。さらなる実施形態においては、前記ベクターはリーダー配列を含む。他の実施形態においては、リンカー配列を含む。特定の実施形態においては、本発明のベクターは、配列番号99により定義されるポリヌクレオチド配列を含む。
【０５１０】
Tn3構造モチーフ発現プラスミドを担持するBL21 DE3大腸菌の形質転換体を、50μg/mLのカルベニシルムを含むLuria Broth中、37℃で一晩増殖させた。一晩培養物を、50μg/mLカルベニシルムおよび2％w/vグルコースを含むSuper Broth中、1/20に希釈し、600 nmでの光密度が0.6になるまで振とうしながら37℃でインキュベートした。この時点で、タンパク質発現を、200μMのIPTGの添加により誘導し、培養物を振とうしながら30℃のインキュベーターに移した。30℃で5時間後、少量の培養物をSDS-PAGE分析のために取り出し、残りの細胞を遠心分離によりペレット化し、-20℃で一晩凍結した。全細胞溶解物のSDS-PAGE分析は、Tn3構造モチーフ3、4、5、10が、約10 kDaのゲルバンドにより決定されるように、大腸菌中で高度に過剰発現されることを示唆していた(図1)。別の実験において、Tn3構造モチーフ12が過剰発現されることも決定された。
【０５１１】
精製
凍結細胞ペレットを、1 mg/mLのリゾチーム(Sigma)および200ユニット/mLのDNase (Invitrogen)を含む溶解バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、10 mMイミダゾール、pH 8.0)中に再懸濁した。溶解を超音波処理により行って、清澄化された溶解物を、遠心分離、次いで0.8μmフィルターを通した濾過により、細胞破片から分離した。溶解物を、Ni2+で帯電させたHiTrapキレート化カラム上にロードし、15倍カラム容量の洗浄バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、20 mMイミダゾール、pH 8.0)で洗浄し、4倍カラム容量の溶出バッファー(50 mM NaH2PO4、300 mM NaCl、250 mMイミダゾール、pH 8.0)で溶出させた。精製タンパク質の濃度を、Gillおよびvon Hippel (Anal. Biochem. 182: 319, 1989)に従う280 nmでのUV吸収により決定した。様々なTn3タンパク質の精製後の収率を、表1に報告する。ヒトテナシンC(Tn3)から誘導されたTn3構造モチーフは最も高い収率を与えたが、これは400 mL培養物から得られた110 mgの精製Tn3と一致していた。精製されたTn3サンプルのSDS-PAGE分析を図2に示す。
【表１】
0006034846.tif 000030
【０５１２】
特性評価
大腸菌中で産生された可溶性Tn3の高い収率を考慮すれば、このタンパク質をその安定性および溶液特性について分析した。
【０５１３】
安定性
Tn3の熱アンフォールディング(unfolding)を、示差走査熱量測定法(DSC)により評価した。20 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0中の1 mg/mLのTn3サンプルは、45℃の融点(Tm)を示し(図3A)、さらに、熱アンフォールディングは同じサンプルを冷却し、再加熱した場合、重ね合わせられるサーモグラムにより証明されたように可逆的であった。Tn3は、より低いpHまたは高い塩濃度で熱アンフォールディングに対してより安定であった。20 mM酢酸ナトリウムpH 5.0中でのTmは56℃であり、1 M NaClを含む20 mMリン酸ナトリウムpH 7.0中でのそれは55℃であった。
【０５１４】
カオトロピック剤によるTn3のアンフォールディングを、内在蛍光によりモニターした。様々な濃度の尿素または塩酸グアニジンを含む0.1 mg/mLのTn3のサンプルを、20 mMリン酸ナトリウムpH 7.0または20 mM Tris pH 7.5中で調製した。蛍光放出スペクトルを、280 nmの励起波長でPhoton Technology QuantaMaster蛍光光度計上で獲得した。カオトロープの非存在下では、Tn3の折畳まれたサンプルは、319 nmで最大の放出を示した。尿素またはGuHClによるTn3のアンフォールディングは、蛍光強度の増加に加えて、最大348 nmの赤色シフトをもたらした。pH 7.0または7.5でのアンフォールディングの中点は、約2Mの尿素(図3B)または0.8MのGuHClで生じた。
【０５１５】
タンパク質溶解的分解に対するTn3の安定性を、サーモリシンとのインキュベーションにより試験した。消化バッファー(10 mM CaCl2を含む20 mM Tris pH 7.5)中のTn3(45μM)を、サーモリシン(0.45μM)と共に室温でインキュベートした。消化物のアリコートを異なる時点で取り出し、過剰のEDTAを加えることにより反応をクエンチした。次いで、サンプルをSDS-PAGEにより分析した(図10G中のWTレーンを参照)。図10Gにより示されるように、野生型Tn3ドメインは、サーモリシンと共にインキュベートした場合、急速に分解される。
【０５１６】
多角光散乱(SEC-MALS)と共にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、Tn3が溶液中で単量体であるかどうかを決定した。サイズ排除分離を、0.75 mL/分の流速でBio-Rad Bio-Sil SEC 125-5カラム(7.8 x 300 mm)を用いて実行した。移動相はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH 7.2であった。Wyatt Technologies Optilab rEX示差屈折率検出器およびAgilent 1100 Series可変波長UV検出器と組合わせたWyatt Technologies DAWN EOS多角光散乱検出器を用いて、3重の検出を達成した。SEC-MALS分析により、4℃で2ヶ月間保存した4.5 mg/mL Tn3の単量体含量が97％であることが示された(図3C)。実験由来の単量体質量は10.6 kDaであり、10.8 kDaの計算質量とほぼ一致する。Tn3足場は長期間の保存を経た場合でも単量体として残存する。
【０５１７】
8.2 実施例2：ループ長および配列多様性の同定
理想的な足場は、高度に可溶性であり、かつ安定であるものである。それは構造分析にとっては十分に小さいものであるが、標的の結合を容易にするための多くの変化を調整するには十分に大きいものであるべきである。非抗体タンパク質足場の同定および遺伝子操作ならびに足場の組合せライブラリーの設計を容易にするために、足場配列のバイオインフォマティックス分析を行った。
【０５１８】
Tn3構造モチーフは小さく、単量体であり、可溶性であり、かつ安定である。さらに、Tn3構造モチーフは多くの異なるヒトタンパク質中に存在し、新規結合機能を導入するために活用することができる、安定性および折畳みならびに多様性の領域にとって重要であることが多い保存された残基に関する重要な情報を提供する。配列分析から、大きい変化がBCおよびFGループにおいて認められ、これは、これらのループが安定性にとって重要ではないことを示唆している。この特性を用いて、候補タンパク質足場を同定し、ループ長および配列多様性を分析して、これらの2つのパラメーター中で生じる変化の自然の程度を特性評価するための戦略を開発した。
【０５１９】
利用可能なタンパク質データベースの検索により、Tn3構造モチーフに基づくいくつかのタンパク質足場が同定された。候補足場は、Tn3構造モチーフと類似する予測構造、すなわち、ループ領域によりそれぞれ分割された7個のβ鎖を含んでいた。β鎖およびループ領域の位置の分析により、構造が利用可能ではない候補足場にループ長および配列組成の予測を援助することができる多様性のパターンが示された。長さ多様性分析を、アクセス可能なタンパク質データベースにおいて候補足場のBC、DEおよびFGループについて実施した。
【０５２０】
同定された足場配列の編集は、図4、5および6に提供されたループ長多様性グラフの開発をもたらした。タンパク質データバンク(PDB)に由来する51個の配列の分析から得られたBCループ長多様性を図4Aに提供する。この配列の集団におけるBCループ長が約8アミノ酸残基〜約26アミノ酸残基の範囲であり、9アミノ酸残基のループが最も優勢であることがグラフから明らかである。Swiss-protデータベースから同定された397個の配列の分析から得られたループ長多様性を図4Bに提供する。この配列の集団におけるBCループ長が約7アミノ酸残基〜約19アミノ酸残基の範囲であり、12アミノ酸残基のループが最も優勢であることがグラフから明らかである。PDBデータベースから同定された51個の配列の分析から得られたFGループ長多様性を図5に提供する。この配列の集団におけるFGループ長が約6アミノ酸残基〜約18アミノ酸残基の範囲であり、10アミノ酸残基のループが最も優勢であることがグラフから明らかである。本明細書に記載のものと同様の分析を、DEループ配列のために実施した。DEループの長さが約4アミノ酸残基〜約17アミノ酸残基の範囲であり、6残基のループが最も優勢な長さであることを示す、DEループ長多様性を図6に提供する。
【０５２１】
長さ多様性に加えて、より豊富なループ長について、コンセンサス配列の確立を導く試みにおいて、配列多様性分析を実施した。9アミノ酸残基のBCループの配列多様性グラフを図7Aに提供する。各位置での特定のアミノ酸の普及を、各位置に渡ってその残基を含むボックスの相対サイズにより表す。例えば、9アミノ酸残基のループの位置3には、プロリンまたはアラニンが優先して存在する。また、位置5にはグリシンおよびアラニンが優先して存在する。位置7にはアミノ酸バリン、イソロイシン、およびフェニルアラニンが優先して存在する。ループ中の他の位置はより大きい配列多様性を示し、これらの位置がTn3足場のライブラリーの構築物中での完全な無作為化にとって好適であることを示唆している。12アミノ酸残基のBCループの配列多様性グラフを図7Bに提供する。この分析においては、例えば、位置3にはプロリン残基が好ましい。また、位置1、4、5および12は、アミノ酸残基に関する選択性を示さないため、完全な無作為化にとって好適であるようである。全ての長さのFGループに関する配列多様性グラフを図8に提供する。この分析から、位置2はアスパラギンであることが多く、位置5はグリシンを好み、位置7はグリシンまたはセリンであることが多い。また、位置1、3、4、6、8、9、11、12および13は、アミノ酸残基に関する選択性を示さないため、ライブラリー構築物中での完全な無作為化のための候補位置である。この分析に由来するデータは、ライブラリー中の高い方の比率の分子がWT様安定性、発現および可溶性を維持することができるような配列保存を示す位置でのループ多様性を限定する潜在的な利益を示唆する。
【０５２２】
8.3 実施例3：ファージ展示Tn3ライブラリーの構築および特異的結合剤の選択
上記で確立されたループおよび配列多様性を考慮して、ライブラリーの開発に対する指向性手法を実施した。より具体的には、ループBCおよびFGを、制限された様式で無作為化した。BCおよびFGループについて、以下の戦略を用いた。
【０５２３】
ライブラリーの設計および構築
配列番号10D(配列については第6節を参照)のNcoI-KpnI断片に対応する、Tn3をコードする合成cDNAを、遺伝子IIIコートタンパク質の断片との融合物としてM13バクテリオファージの表面上でのTn3タンパク質の展示を可能にするファージ展示ベクター中にクローニングした。この構築物は、Tn3のC末端とM13遺伝子IIIのコドン251〜406の間の20アミノ酸のThr/Proに富むリンカー配列をコードしていた。
【０５２４】
無作為に突然変異させたTn3のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチドを用いて、Kunkel突然変異誘発(Kunkel TAら、Methods Enzym. 204, 125, 1991)により調製した。3個の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、BCループのコード配列を無作為化し、FGループについては3個を用いた(表2)。この戦略は、特性評価された配列およびループ長多様性のTn3ライブラリーへの導入をもたらし、天然のTn3ドメインについて記載された多様性のパターンと一致していた。
【表２】
0006034846.tif 000031
【０５２５】
無作為に突然変異させたファージミド構築物を用いるエレクトロコンピテントな大腸菌の形質転換後、M13KO7ヘルパーファージを添加し、培養物をカルベニシルムを含む500 mLの2YT培地中、37℃で一晩増殖させた。次いで、ファージを、サリンポリエチレングリコール溶液を用いる沈降により培養上清から単離し、少量のPBS中に再懸濁した。
【０５２６】
特異的SYNAGIS(登録商標)結合足場のためのライブラリーのパンニング
SYNAGIS(登録商標)をマイクロタイタープレートのウェル上に受動的に吸着させ、遊離部位を、10 mg/mLのBSAまたはカゼインを含むPBSで遮断した。ファージ保存液を、2 mg/mLのBSAまたはカゼインおよび0.1％ v/vのTween-20を含むPBSで希釈した。希釈したファージサンプル(100μL；約1012個のファージ)をSYNAGIS(登録商標)でコーティングされたウェルに添加し、穏やかに振とうさせながら、室温で2時間インキュベートした。次いで、プレートを、0.1％ v/vのTween 20を含むPBSで10〜15回洗浄し、結合したファージを100μL/ウェルの0.1M HClで溶出し、1.0M Tris-HCl、pH 8.0の添加により中和した。溶出したファージをXL-1 Blue大腸菌の感染により再増殖させ、50μg/mLカルベニシルムを含む50 mLの2YT培地中のM13KO7ヘルパーファージと同時感染させた一晩培養物から収穫した。1回目および3回目の周回ではブロッキングおよび希釈バッファー中のBSAを用いて、ならびに2周目および4周目ではカゼインを用いて、合計4回の周回についてこの様式でSYNAGIS(登録商標)に対してライブラリーをパンした。
【０５２７】
SYNAGIS(登録商標)結合クローンのスクリーニング
パンニングの最終回の後、溶出したファージを連続希釈し、これを用いてXL-1 Blue大腸菌を感染させ、1時間後に50μg/mLカルベニシルムを含むLB寒天上に一晩塗布した。個々のコロニーを拾い、2YT/カルベニシルム中、37℃で一晩増殖させた。次いで、培養物を2YT/カルベニシルム中で1:100に希釈し、0.4の光密度(600 nm)まで増殖させ、M13KO7ヘルパーファージを添加した後、振とうしながら37℃で一晩インキュベートした。遠心分離後、50μLの培養上清を、0.1％ v/v Tween 20および2％ w/vスキムミルク粉末を含有する等量のPBSで希釈し、ELISAによる分析のために用いた。次いで、BSA/カゼイン被覆ELISAプレートではなく、SYNAGIS(登録商標)への結合について最も高い応答を与えたクローンを、配列決定のために選択した。選択されたクローンにより展示されたTn3変異体の配列を決定するために、1μLの培養上清をPCRにおいて用いて、コードされたTn3配列を包含する断片を増幅した。次いで、このPCR産物をExoSAPit (USB Corp., Cleveland, OH)で処理して、消費されなかったデオキシヌクレオチドおよびプライマーを分解し、直接配列決定した。
【０５２８】
SYNAGIS(登録商標)結合Tn3変異体SynBP01の同定
SYNAGIS(登録商標)結合Tn3変異体のDNA配列決定により、3個のユニークなクローンを同定した。SYNAGIS(登録商標)結合ELISAにおいて最も高いシグナルを有するクローン、SynBP01は、表3に示されるように新規なBCおよびFGループ配列を含んでいた。可溶性SynBP01を発現させるために、NcoI-KpnI cDNA断片をファージ展示ベクターから切り出し、以前に記載された大腸菌発現ベクターの対応する部位にクローニングした。次いで、組換えSynBP01を大腸菌中で発現させ、野生型Tn3について以前に記載されたように精製した。精製されたSynBP01の収率は、400 mLの大腸菌培養物から18 mgであり、SDS-PAGE分析により判定されるように95％以上純粋であった(図9A)。この回収率は用いた1 mLのニッケルキレートアフィニティカラムの能力に近いものであるため、この収率はSynBP01の実際の発現レベルより低い可能性が高い。
【０５２９】
SynBP01により示されるSYNAGIS(登録商標)結合親和性の決定
SYNAGIS(登録商標)へのSynBP01の結合に関する平衡解離定数(KD)を、BIAcore 3000装置上での表面プラズモン共鳴により測定した。SYNAGIS(登録商標)を、一次アミノ基を介してバイオセンサーチップ上に共有的に固定した。SynBP01の平衡結合を、10μL/分の流速でチップ上にHBS-EPバッファー(10 mM HEPES、150 mM NaCl、3 mM EDTA、pH 7.5、0.005％ v/v Tween 20)中のSynBP01のサンプルを注入することにより測定した(図9B)。各平衡結合測定後に、HBS-EPバッファーをチップ上で少なくとも25分間泳動させた後、次のSynBP01サンプルを注入することにより、SynBP01を完全に解離させた。結合プロフィールを、BIAevaluationソフトウェア(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いることにより分析したところ、SYNAGIS(登録商標)へのSynBP01の結合に関するKDは16μMと算出された。
【０５３０】
SynBP01の安定性の試験
pH 7.0の尿素によるアンフォールディングに対するSynBP01の安定性を、Tn3に関して以前に記載されたように測定した(実施例1を参照)。Tn3とSynBP01のカオトロープ誘導アンフォールディングの比較を容易にするために、360 nmでの相対蛍光放出強度を、各タンパク質についてカオトロープ濃度の関数としてプロットした。
【０５３１】
pH 7.0でのTn3とSynBP01の尿素誘導アンフォールディングの比較(図9C)により、50％の変性を達成するのに必要な尿素の濃度が両タンパク質について同様であることが示された。これは、SynBP01の安定性が野生型Tn3のものと類似することを示している。
【０５３２】
他のライブラリースクリーンにおいて、さらなるSYNAGIS(登録商標)およびリゾチーム特異的結合足場を同定した。特異的BCおよびFGループ配列は以下の通りである。
【表３】
0006034846.tif 000032
【０５３３】
足場対のmAb捕捉
2個の同一の足場または2個の異なる足場を含む、二価または二特異的足場は、2個の標的タンパク質に同時に結合するその能力に基づいて、有用な治療用分子であり得る。タンデムまたは融合足場を再初期化および発現させる必要なく、所望の二価または二特異的活性について足場対を直接スクリーニングする方法は、有用な足場対を同定するプロセスを大いに単純化するであろう。次いで、スクリーン中で同定されたそれらの対だけが、二価または二特異的足場(例えば、多量体足場)の調製にとって好適な形態への再初期化を要するであろう。
【０５３４】
完全長IgG抗体分子は、2個の抗原結合部位を含み、従って、2個の標的抗原を同時に結合し得る。かくして、足場の非共有モノクローナル抗体捕捉は、抗体のそれぞれの抗原結合アーム上での2個の足場の提示をもたらすであろう。この方法で捕捉された足場が、BC、DEおよびFGループにより形成された結合表面が他のタンパク質への結合に利用可能であるような向きにあった場合、これにより足場対をスクリーニングするための基礎を形成することができる。この理由から、足場のC末端、またはAB、CD、EFループのいずれか／全部を含むエピトープを認識する抗体による捕捉が最も好適である。2個の同一の足場の抗体捕捉は、二価の足場の活性を模倣することができるホモ二量体mAb-足場複合体の形成をもたらすであろう。2個の異なる足場の捕捉は、ホモ-およびヘテロ二量体mAb-足場複合体の混合物をもたらし、ヘテロ二量体複合体は二特異的足場の活性を模倣することができた。
【０５３５】
このアッセイ戦略の実現可能性を証明するために、様々な濃度のPentaHis、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体(Qiagen)を、HBS-EPバッファー中の1μM SynBP01と共に2時間インキュベートした。C末端ヘキサヒスチジンタグがBC、DEおよびFGループにより形成される結合表面に対して分子の反対側にあるべきであることを考慮すれば、SynBP01のPentaHis捕捉は、SYNAGIS(登録商標)に結合するその能力と干渉しないと予想された(図9D)。次いで、PentaHis-SynBP01サンプルを、以前に記載されたようにSYNAGIS(登録商標)を固定したBIAcore(登録商標)チップ上に注入した。SynBP01の非存在下でのPentaHisの注入に関する対応するセンサーグラムを差し引くことにより、センサーグラムをバックグラウンドについて補正した後、PentaHisの非存在下での1μMのSynBP01の注入について得られたセンサーグラムと比較した。
【０５３６】
SYNAGIS(登録商標)へのPentaHis-SynBP01複合体の結合は、0.19μM PentaHisと1μMのSynBP01との複合体に対応するセンサーグラムにより例示されるように、遊離SynBP01の結合よりも有意に強かった(図9D)。特に、PentaHis複合体化SynBP01は、遊離SynBP01よりも、二価結合を示す、SYNAGIS(登録商標)表面からの非常により遅い解離速度を有していた。対照実験は、PentaHisが単独で注入した場合、SynBP01への検出可能な結合を示さず、SynBP01/無関係のマウスmAb混合物(PentaHisとアイソタイプが一致)の注入もSynBP01単独と比較して結合の増強の証拠を示さないことを検証した。
【０５３７】
8.4 実施例4：ジスルフィド安定化Tn3変異体の設計、発現および特性評価
ジスルフィド含有Tn3変異体の設計
天然のTn3構造モチーフの多くはジスルフィド結合を欠くが、他のものは1個以上のジスルフィド結合を含む。かくして、アミノ酸側鎖間の距離および角度を測定することによるTn3中のジスルフィド結合のde novo設計の試みよりもむしろ、本発明者らは天然のジスルフィドを含むTn3構造ドメインと類似する位置で、Tn3足場中にシステイン残基を導入した。
【０５３８】
ジスルフィド結合を天然に含む21個のTn3構造モチーフの三次元構造を重ね合わせた。これらの構造に関するPDBコードおよび配列を、図10Aに示す。これらの21個の構造内では、足場内の様々な位置にジスルフィド結合が生じるが、これらのうちのいくつかは、ジスルフィド結合が重ね合わせた構造のファミリー内に重ねられる点で類似していた。21個の構造に渡って3回以上現れたジスルフィド結合のうち、3つの例が見出された。これらの3つのうちの2つが、サイトカイン受容体内で共通に保存された以前に記載のジスルフィド結合と一致していた(Bazanら、PNAS, 87, 6934, 1990)。合計8および12例のこれらの2個のジスルフィドを21個の構造中に注記した。第3のジスルフィドは頻度が低く(21個の構造中5事例)、F鎖とG鎖との架橋をもたらした。
【０５３９】
3個のシステイン含有Tn3突然変異体を設計して、これらの3個の天然ジスルフィドに対応する位置にジスルフィド結合を導入した。第4のシステイン含有突然変異体も設計して、マウスG-CSF受容体に由来するTn3構造モチーフ(PDBコードlpgr)の1つに天然に生じるジスルフィドを導入した。21個の構造中にはこのジスルフィドの例は1つだけ存在したが、タンパク質コア内に埋まり、BCおよびFGループの近くに生じるC鎖とF鎖とのジスルフィド架橋をもたらした。それぞれのTn3突然変異体(Tn3SS1-4と呼ぶ)について、2個のシステインを、Tn3と、ジスルフィド含有Tn3タンパク質のものとの構造に基づく配列アラインメントから決定された位置に導入した(図10A)。ジスルフィド2は、Tn3よりも長いDEループを有することが多いTn3構造モチーフ中のDEループの底部に渡って生じるため、2個のグリシン残基もTn3SS2に対応する突然変異体に挿入した。ジスルフィド操作戦略を、図10Bに図式的に示す。
【０５４０】
ジスルフィド突然変異体の作製および組換え発現
Tn3SS1-4のための発現構築物を、実施例1に記載の野生型発現構築物の部位特異的突然変異誘発により作製した。組換えタンパク質を大腸菌中で発現させ、実施例1に記載のように固定化ニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。全てのTn3突然変異体は、50 mg/Lの過剰のレベルで発現した。
【０５４１】
Tn3SS1-4の再折畳み
大腸菌中でのタンパク質の細胞質発現は、一般的には、還元状態でのシステイン含有タンパク質の単離、またはある程度の不適当なジスルフィド形成をもたらす。組換えTn3SS1-4タンパク質が酸化されたか(すなわち、ジスルフィド含有)、または還元されたか(すなわち、ジスルフィド結合を欠く)を決定するために、精製された材料を逆相HPLCにより分析し、塩酸グアニジンの存在下で強力な還元剤DTTと共に最初に予備インキュベートした材料と比較した。全ての事例において、DTT処理された材料は単一のピークとしてクロマトグラフしたが、未処理のサンプルはジスルフィド含有形態への部分的酸化を示唆する第2の小さいピークの存在を示した(TnSS3およびTnSS4の代表的なHPLC分析を図10Cに示す)。
【０５４２】
対応するジスルフィド含有タンパク質への還元されたTn3SS1-4の完全な変換を行うために、10 mM DTTを含む6Mの塩酸グアニジンを用いてサンプルを1 mg/mLに希釈し、pH 8で緩衝化した。室温で10分間インキュベートした後、サンプルを、20 mM Tris-HClでpH 8.5に緩衝化された0.5M塩酸グアニジンに対して一晩透析した。この方法で再折畳みされた材料のHPLC-分析は、典型的にはジスルフィド含有種への30〜70％の変換を示した(図10C)。90〜100％へのジスルフィド含有種のさらなる変換を、37℃で一晩インキュベートするか、またはサンプルを4℃で2週間以上保存することにより行った。あるいは、ジスルフィド含有産物へのほぼ定量的な再折畳みを、還元され、変性されたタンパク質の、0.5M塩酸グアニジン、4 mM還元グルタチオン、0.8 mM酸化グルタチオンを含有し、20 mM Tris-HClでpH 8.5に緩衝化されたバッファー中で一晩透析することにより行うことができる。
【０５４３】
特性評価
純度および再折畳みされたTn3SS1-4サンプル内のジスルフィド結合が分子間であるか、分子内であるかを決定するために、還元および非還元条件下でサンプルをSDS-PAGEにより分析した(図10D)。還元剤の存在下では、全ての再折畳みされたTn3SS1-4サンプルはTn3と同様の位置に移動した。還元剤の非存在下では、Tn3SS1、Tn3SS3およびTn3SS4はTn3と同様に移動し、従って、設計されたように分子内ジスルフィドを含むと予想された。対照的に、Tn3SS2は主に二量体として移動し、少量のタンパク質が単量体として移動した。従って、Tn3SS2は分子間ジスルフィドにより連結された二量体を形成するようであり、従って、さらに試験しなかった。
【０５４４】
安定性
カオトロピック剤によるTn3SS1,3,4のアンフォールディングを、野生型Tn3について以前に記載された内在蛍光によりモニターした。野生型およびジスルフィド含有Tn3のカオトロープ誘導アンフォールディングの比較を容易にするために、360 nmでの相対蛍光放出強度を、各タンパク質についてカオトロープ濃度の関数としてプロットした。
【０５４５】
pH 7.0でのTn3およびTn3SS1,3,4の尿素誘導アンフォールディングの比較(図10E)により、Tn3SS1が野生型タンパク質よりも不安定であるが、Tn3SS3およびTn3SS4はかなりより安定であることが示された。pH 7.0で、野生型Tn3の50％のアンフォールディングを達成するのに必要とされる尿素の濃度(Cm)は2Mであった。対照的に、Tn3SS3のアンフォールディングのためのCmは4M尿素であったが、Tn3SS4に関するCmは少なくとも6Mであり、このタンパク質はこれらの実験において用いられた最も高い濃度の尿素(8M)でも完全にアンフォールディングしなかったため、正確に決定することができなかった。
【０５４６】
また、pH 5.0での塩酸グアニジン(GuHCl)によるTn3SS4のアンフォールディングを蛍光により決定し、野生型Tn3の変性と比較した。GuHClが尿素よりも強力な変性剤であることを考慮すれば、0〜5.5Mの範囲のGuHClの濃度でタンパク質サンプルの蛍光を分析することにより、完全なアンフォールディング推移が得られた(図10F)。pH 5.0での野生型Tn3のアンフォールディングに関するCmは1M GuHClであり、Tn3SS4については約3.2Mであった。
【０５４７】
タンパク質溶解的分解に対するTn3SS4の安定性を、野生型タンパク質について実施例1に以前に記載されたようにサーモリシンと共にインキュベートすることにより試験した。野生型タンパク質とは対照的に、Tn3SS4は、室温で一晩インキュベートした後でも、タンパク質溶解に抵抗した(図10G)。
【０５４８】
Tn3SS4の熱アンフォールディングを、以前に記載のような示差走査熱量測定法(DSC)により評価した。pH 7.0の20 mMリン酸ナトリウム中の1 mg/mLのTn3SS4サンプルは、71℃の融点(Tm)を示し、これは同じ条件下での野生型タンパク質のTmよりも26℃高い(図10H)。Tmは20 mM酢酸ナトリウムpH 5.0中のTn3SS4についてはわずかに上昇した。このpHでは、Tn3SS4のTmは74℃であり、これは野生型タンパク質よりも18℃高い。野生型タンパク質に関してと同様、Tn3SS4の熱アンフォールディングはpH 7.0では完全に可逆的であるようであったが、pH 5.0では沈降をもたらした。
【０５４９】
多角光散乱(SEC-MALS)と共にサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、野生型タンパク質について以前に記載されたのと同じ条件を用いて、Tn3SS4は溶液中で単量体であるかどうかを決定した。2.0 mg/mLのTn3SS4サンプルのSEC-MALS分析により、前記タンパク質が完全に単量体状態にあることが示された(図10I)。実験的に誘導された単量体質量は10.7 kDaであり、10.8 kDaの算出された質量と密接に一致している。
【０５５０】
二重ジスルフィド含有Tn3変異体の調製
野生型タンパク質と比較したTn3SS3とTn3SS4変異体の両方の増強された安定性を考慮して、新しいTn3変異体を調製して、それぞれのジスルフィド結合の安定化効果が組合せ突然変異体の状況において付加的であるかどうかを決定した。
【０５５１】
Tn3SS3+4と命名された、このテトラ-システイン変異体の組換え発現のための構築物を、以前に記載の方法により調製したところ、ジスルフィド3および4に対応する位置に4個のシステイン残基を含んでいた(図10Bを参照)。タンパク質を実施例1に以前に記載のように発現させ、精製した。この変異体について得られた精製タンパク質の収率は、200 mLの大腸菌培養物から22 mgであった。これは精製に用いたカラムの最大の結合容量であるため、実際の発現レベルは少なくとも110 mg/Lである。
【０５５２】
Tn3SS3+4の再折畳み
精製されたTn3SS3+4を、逆相HPLCにより分析し、塩酸グアニジンの存在下で強力な還元剤DTTと共に最初に予備インキュベートされた材料と比較した。DTT処理された材料は単一ピークとしてクロマトグラフしたが、未処理のTn3SS3+4は、いずれか、または両方の潜在的なジスルフィド結合の部分的形成に起因する可能性が最も高い、3個のさらなるより早期の溶出ピークの存在を示した(図10J)。
【０５５３】
正確な二重ジスルフィド含有タンパク質にTn3SS3+4を再折畳みさせるために、サンプルを、10 mM DTTを含む6M塩酸グアニジンで1 mg/mLに希釈し、pH 8に緩衝化させた。室温で10分間インキュベートした後、サンプルを、20 mM Tris.HClでpH 8.5に緩衝化させ、4 mM還元グルタチオンを含有する0.5M塩酸グアニジンに対して一晩透析した。再折畳みされた材料のHPLC分析は、アンフォールディングされた調製物中での最も早い溶出ピークに対応する単一ピークへの還元タンパク質の95％を超える変換を示した。その溶出時間プロフィールの理由から、この生成物は2個の正確に形成されたジスルフィド結合を含むと推測された(図10J)。
【０５５４】
Tn3SS3+4の特性評価
pH 5.0の塩酸グアニジン(GuHCl)によるTn3SS3+4のアンフォールディングを、蛍光により決定し、Tn3およびTn3SS4に関する以前のデータと比較した。pH 5.0でのTn3SS3+4のアンフォールディングのためのCmは、5.0〜5.5M GuHClであった(図10K)。これは野生型またはTn3SS4に関するCmよりもかなり高い。GuHClにより誘導される変性に対する安定性の有意な増強は、ジスルフィド3および4の安定化効果が、両セットの突然変異を1個の足場中で組合わせる場合、付加的であることを示唆している。
【０５５５】
8.5 実施例5：超好熱性生物に由来するTn3構造モチーフの同定、発現および特性評価
Tn3構造モチーフの同定
BLAST検索を実施して、NCBIデータベース内の48個の古細菌ゲノム中にコードされる推定Tn3構造モチーフ配列を同定した。この検索を、本発明者らが本明細書で70℃以上の温度で最適に増殖する生物と定義する超好熱性生物のゲノムにさらに限定した。Tn3をクエリー配列として使用したところ、これはアーケオグロブス・フルギダス生物に由来する仮説タンパク質内のTn3構造モチーフの同定をもたらした。次いで、このTn3構造モチーフをクエリー配列として使用して、さらなるTn3構造モチーフを同定し、次いで、これらをクエリー配列として用いた。合計14個の潜在的なTn3コード配列が、5種の超好熱性生物に由来する仮説タンパク質内で同定された。得られた配列を本明細書の第6節に示す。
【０５５６】
超好熱性生物Tn3の発現および精製
5種の予測される超好熱性生物由来Tn3タンパク質を、大腸菌中での発現のために選択した。これらのタンパク質のそれぞれをコードし、大腸菌におけるコドン使用のために最適化された合成cDNAは、示される配列のようにGenScript Corporationにより供給されたものであった。それぞれのcDNAは、隣接するNco IおよびKpn I制限部位を含み、これらの酵素を用いる消化後に、挿入物を、対応するNco I/Kpn I部位を含有する改変されたpET22bベクター(Novagen)中にクローニングした。コードされるC末端ヘキサヒスチジンタグ付タンパク質の組換え発現および大腸菌溶解物からの精製を、ヒト由来Tn3構造モチーフについて以前に記載された手順に従って実施した。スタフィロサームス・マリナスに由来するTn3構造モチーフ、スルフォロブス・トコダイに由来する両方のTn3構造モチーフは良好に発現したが、スルフォロブス・ソルファタリクスおよびアーケオグロブス・フルギダスに由来するTn3構造モチーフは低レベルで発現した(図11A)。
【０５５７】
特性評価
スルフォロブス・ソルファタリクスに由来するTn3を除く、それぞれのTn3構造モチーフの安定性を、以前に記載されたDSC、蛍光、およびサーモリシン処理により分析した(実施例1を参照)。
【０５５８】
pH 7.0でのスルフォロブス・トコダイに由来するTn3構造モチーフに関するサーモグラフは、熱アンフォールディングに対応する規定のピークを示さなかった。むしろ、データは、スルフォロブス・トコダイの1Tn3は70℃を超える温度で沈降するが、スルフォロブス・トコダイの1Tn3は50℃を超える温度で沈降することを示した(図11C)。アーケオグロブス・フルギダスに由来するTn3構造モチーフに関するサーモグラフは、77℃のアンフォールディングのためのTmに関する特徴的なピークを示したが、同様に、スタフィロサームス・マリナスに由来するTn3構造モチーフは83℃のTmを有していた(図11B)。熱アンフォールディングはこれらの2種のタンパク質のいずれかにとって可逆的ではなく、Tmを超える温度で沈降した。
【０５５９】
塩酸グアニジン(GuHCl)によるpH 7.0でのTn3構造モチーフのアンフォールディングを、蛍光により分析した。全てのTn3構造モチーフは、変性を行うのに高濃度のGuHClを要したが、アンフォールディングの中点は、スタフィロサームス・マリナスに由来するTn3について例示されるように、4.5M〜6MのGuHClであった(図11D)。
【０５６０】
サーモリシンによるタンパク質分解に対する安定性を、45μMのTn3のサンプルを0.45μMのサーモリシンと共にインキュベートする、以前に記載のものと同じ条件(実施例1を参照)を用いて分析した。全てのTn3構造モチーフはタンパク質分解に対して耐性であったが、小さい1〜2 kDaの断片の急速な切断が、本発明者らがコアTn3構造モチーフの一部を形成しないNおよび／またはC末端断片であると仮定する、アーケオグロブス・フルギダス、スタフィロサームス・マリナスおよびスルフォロブス・トコダイの2Tn3に由来するTn3タンパク質について観察された。有意な割合の全部で4つのコアTn3構造モチーフが、スタフィロサームス・マリナスおよびスルフォロブス・トコダイ(2Tn3)に由来するTn3について例示されたように、16時間のサーモリシン処理後にも未消化のままであった(図11F+G)。
【０５６１】
また、スルフォロブス・トコダイに由来するTn3構造モチーフの安定性を、この生物が超好熱性であるに加えて、好酸性であることを考慮して、20 mMのクエン酸ナトリウムバッファー中、pH 3.0で評価した。スルフォロブス・トコダイの1Tn3および2Tn3は共に、pH 7.0の場合と比較して、pH 3.0でGuHClにより誘導されるアンフォールディングに対してより安定であるが、1Tn3は2Tn3よりも安定であった。20 mMクエン酸ナトリウム中、pH 3.0でのスルフォロブス・トコダイの1Tn3の熱アンフォールディングもDSCにより評価した。pH 7.0での熱アンフォールディングとは対照的に、pH 3.0でのサーモグラムは、98℃のTmを示す特徴的なピークを示し、さらに、このpHでのアンフォールディングが部分的に可逆的であることを示した。スルフォロブス・トコダイの1Tn3に関する熱アンフォールディングおよびGuHClにより媒介されるアンフォールディングの比較を、図11Cおよび11Eに示す。
【０５６２】
Tn3構造モチーフの精製のための安定性の活用
極端な温度、pHおよびタンパク質分解に対する超好熱性生物由来Tn3構造モチーフの安定性を活用して、粗大腸菌溶解物からこれらのタンパク質を精製した。スタフィロサームス・マリナスおよびスルフォロブス・トコダイ(1Tn3)に由来するTn3タンパク質を大腸菌中で発現させ、可溶性溶解物を以前に記載のように調製した。スタフィロサームス・マリナスのTn3を含む溶解物を70℃で15分間加熱し、沈降したタンパク質を遠心分離により除去した後、上清をSDS-PAGEにより分析し、加熱しなかった溶解物と比較した(図11H)。ゲル上に認められるように、多くの大腸菌夾雑物が熱処理により除去され、Tn3タンパク質の有意な精製をもたらした。同様に、55℃で45分間のサーモリシンによる可溶性大腸菌溶解物の処理は、大腸菌由来タンパク質の有意な除去およびスタフィロサームス・マリナスのTn3の同時精製をももたらした(図11I)。
【０５６３】
スルフォロブス・トコダイの1Tn3タンパク質のpHおよび高い温度安定性を利用して、粗溶解物から大腸菌タンパク質を除去した。4倍量の200 mMクエン酸ナトリウムpH 3.0を用いてpH 7で緩衝化させた溶解物の希釈は、大腸菌由来タンパク質の有意な沈降をもたらした。遠心分離により沈降物を除去した後、上清を70℃で15分間加熱し、新しく沈降したタンパク質を遠心分離により再度除去した。未処理、pH 3で処理、およびpH 3/熱で処理されたサンプルのSDS-PAGE分析は、これらの2工程によるバックグラウンド大腸菌タンパク質の劇的な除去を示す(図11J)。
【０５６４】
8.6 実施例6：SynBP01のループ交換分析
概要
SynBP01の3種の異なる変異体を構築して、1個のループまたはBCおよびFGループの両方がTn3の結合接点に寄与しているかどうかを試験した(図12)。さらに、Tn3SS4突然変異を付加して、SYNAGIS(登録商標)への結合に対するその影響を試験した。これらの変異体は、以下のようにSynBP01に由来するアミノ酸配列において異なっていた：
「SynBP01-BCのみ」- RRGDMSSNPAで置換されたFGループ、
「SynBP01-FGのみ」- FKPLAEIDGで置換されたBCループ配列、
「SynBP-1 SS4」- 図10B中の4行目に示された、CysによるIleおよびSerの置換。
【０５６５】
実験手順
SynBP01とその3種の変異体との遺伝子3断片融合物をコードするファージ展示ベクターを大腸菌中で形質転換した後、これらの細菌を用いて、実施例3に記載のようにこれらのTn3タンパク質のそれぞれを展示するファージを調製した。プレートを、PBS pH 7.2中、10μg/mlのSYNAGIS(登録商標)で、4℃で一晩コーティングした。プレートを、0.1％v/v Tween-20と4％w/vスキムミルクパウダー(PBST 4％ミルク)を含むPBSで遮断した。希釈したファージ保存液をカラム1に添加し、希釈剤としてPBST 1％ミルクを用いて、3倍連続希釈をプレートに渡って実施した。プレートを、緩やかに振とうしながら、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、結合したファージを、抗M13 HRP結合抗体(GE Healthcare, Piscataway, NJ)で標識し、TMB基質(KPL Laboratories, Gaithersburg, MD)の添加により比色的に検出した。2.5Mリン酸の添加により発色をクエンチした後、450 nmで吸光度を読み取った。
【０５６６】
結果：図12に提供されるデータは、BCおよびFGループの両方が、SYNAGIS(登録商標)へのTn3足場の結合にとって必要であることを示している。いずれかのループの野生型Tn3配列による置換を含むSynBP01変異体は、プレートに結合したSYNAGIS(登録商標)への結合を示さなかった。これらの結果は、Tn3足場の少なくとも2個のループが協働的に作用して機能的な結合表面を提供することを示している。
【０５６７】
さらに、SynBP01足場中へのSS4ジスルフィド結合の導入は、SYNAGIS(登録商標)への結合を除去する(図12)。SynBP01のSS4を含有する変異体に対する活性の喪失はおそらく、このジスルフィドがTn3足場タンパク質の構造における大きな変化をもたらさないと予想されることを考慮して、わずかなコンフォメーション効果に起因する。これはさらに、SYNAGIS(登録商標)の結合がSynBP01の三次元構造に非常に依存することを示唆している。
【０５６８】
8.7 実施例7：Tn3SS4足場上での2個のループライブラリーの構築
図10Bに示されるTn3SS4足場に基づいて新しいライブラリーを構築した。BCループ多様性をPCRを用いて導入し、FGループ多様性をKunkel突然変異誘発を用いて導入した(表5)。約1.12 x 1010個のメンバーのライブラリーを構築した。
【表５】
0006034846.tif 000033
【０５６９】
実験手順
表5中のBC9、11または12プライマーを用いることにより、BCループ多様性を作製した。これらのプライマーはその3'末端上でTn3 DNAにアニーリングし、縮重性はPCRの完了の際にライブラリーを形成した。これらのPCR産物を、フランキングプライマーを用いて増幅して、完全なTn3遺伝子を作製した後、NcoIおよびKpnIで消化し、ファージ展示ベクター中に連結した。DNAをエレクトロポレーションにより大腸菌中に形質転換した。BCライブラリーの最終的な多様性は、約3.4 x 109個のメンバーであると見積もられた。
【０５７０】
エレクトロポレーション後、BCライブラリーを振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。M13K07ヘルパーファージを添加し、1時間後、細胞をより大きい容量に希釈し、振とうしながら一晩増殖させた。次の日、ファージを除去し、PEG 8000を用いる沈降により上清から濃縮した。
【０５７１】
BCライブラリーファージを用いて、CJ236大腸菌を感染させた。1時間の感染後、細胞を、100μg/mLのカルベニシルムを含む2xYT中に希釈し、37℃で振とうしながら一晩増殖させた。次の日、ファージを除去し、PEG 8000を用いる沈降により上清から濃縮した。一本鎖DNAを、Qiagen(Valencia, CA)QIAprepスピンM13キットを用いることにより回収した。このDNAは、表5中のFGプライマーを用いるKunkel突然変異誘発のための鋳型として役立った。
【０５７２】
8.8 実施例8：SYNAGIS(登録商標)特異的足場のための2ループTn3SS4ライブラリーのパンニング
SYNAGIS(登録商標)を15モル等量のEZ Linkスルホ-NHS-SS-ビオチン(Pierce, Rockford, IL)を用いてビオチン化した。室温で1時間インキュベートした後、サンプルをPBS中で一晩透析して、結合しなかったビオチンを除去した。次の日、M280ストレプトアビジンビーズ(Dynal, Carlsbad, CA)および2個のループのライブラリーを、10 mg/mlのBSAを含むPBS中で1時間ブロックした。10μgのビオチン化されたSYNAGIS(登録商標)をブロックされたファージに添加し、転倒回転混合機上、室温で2時間インキュベートした。SYNAGIS(登録商標)を、回転混合機上、室温で30分間、ブロックされたストレプトアビジンビーズを捕捉した。PBSTで3回洗浄して、未結合のファージを除去した後、結合したファージを75 mM DTTで溶出した。XL-1 Blue大腸菌を、溶出したファージを用いて感染させ、M13KO7ヘルパーファージと同時感染させ、実施例3に記載のように一晩再増殖させた。次の日、ファージを、実施例3に記載のように一晩培養培地から収穫した。
【０５７３】
2回目の周回のパンニングは、ブロッキング試薬として10 mg/mlで用いたカゼインを用いる1回目のものと同じであった。2回目の周回に用いたビーズは、Spherotech (Lake Forest, IL)アビジン被覆磁気粒子であった。3回目の周回のために、カゼインをブロッキング試薬として使用し、M280ストレプトアビジンビーズを用いてSYNAGIS(登録商標)を捕捉した。4回目の周回のために、BSAをブロッキング試薬として使用し、Spherotechアビジン磁気粒子を用いてSYNAGIS(登録商標)を捕捉した。4回のパンニングの後、大腸菌を溶出したファージに感染させ、塗布した。個々のコロニーを96穴形式で培養し、M13KO7に感染させ、培養上清をファージELISA中で使用してSYNAGIS(登録商標)結合コロニーを同定した。3個の新しいSS4安定化コロニーを同定し、その配列を表6に示す。
【表６】
0006034846.tif 000034
【０５７４】
8.9 実施例9：TRAIL-R2特異的足場のための2ループTn3SS4ライブラリーのパンニング
M280ストレプトアビジンビーズをPBSTで洗浄し、ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG Fc断片特異的抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を添加した。4℃で一晩インキュベートした後、対照IgG1抗体またはTRAIL-R2/Fc融合タンパク質(R & D Systems, Minneapolis, MN)を添加し、4℃で一晩、再度インキュベートした。ビーズをPBSTで洗浄し、使用前にPBST 2％ミルク中でブロックした。
【０５７５】
2ループTn3SS4ファージライブラリーを、対照IgG1抗体被覆ビーズと共に4℃で一晩インキュベートして、ビーズまたはヒトIgG1 Fcへの結合剤をライブラリーから枯渇させた。次いで、枯渇させたライブラリーをTRAIL-R2被覆ビーズに添加し、振動プラットフォーム上、室温で2時間インキュベートした。ビーズをPBSTで洗浄し、XL-1 Blue大腸菌に添加して、実施例8に記載のように結合したファージを増殖させた。バックグラウンド枯渇のための対照抗体ビーズとのインキュベーションを一晩よりむしろ1時間実施した以外は、このパンニング手順をさらに4回反復した。TRAIL-R2結合変異体を同定するための4回目および5回目のパンニングの後、個々のクローンをファージELISAにより分析した。
【０５７６】
TRAIL-R2ファージELISAに由来する陽性クローンを配列決定した後、9個のユニークな結合クローンを同定した(表7)。小文字のqは、TAG停止コドンがその位置にあったことを示す。XL-1 Blueなどのサプレッサー株は、この位置にグルタミンを挿入することにより、TAG停止コドンを含む遺伝子の発現を可能にする。
【表７】
0006034846.tif 000035
【０５７７】
8.10 実施例10：TRAIL-R2特異的足場のための結合親和性決定
ヤギ抗ヒトFc IgGを、標準的なアミノカップリングプロトコル(BIAcore, Inc.)を用いて、CM5 Biacoreセンサーチップ表面のフローセル上に約7700 RUの密度で固定した。別途、ブランクの表面も同一のカップリングプロトコル-タンパク質を用いて同じチップ上で調製した。このブランク表面を、実験を通して参照細胞として使用し、非特異的結合および特定のハウスキーピング人工物の両方のために補正するのに役立った。
【０５７８】
TRAIL-R2/Fcタンパク質を、HBS-EPバッファー(BIAcore, Inc., 10 mM HEPESバッファー、pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、および0.005％P2Oからなる)中、器具バッファー中で100 nMで調製した後、Fc-捕捉および対照表面の両方に対して75μL/分の流速で注入した。リガンドの捕捉レベルは約800 RUであった。
【０５７９】
基線安定化の後、Tn3クローン5E5の溶液(表7)を、捕捉リガンドおよび対照表面の両方に対して注入した。注入の間に、Fc-捕捉表面を、10 mM Gly, pH2の1分間の注入を2回用いて再生した。
【０５８０】
また、数回のバッファーおよび対照タンパク質注入を、一連の注入を通して散布した。後に、これらのバッファー注入物を、参照セルデータと共に用いて、「二重参照」(Myszka, D.G. (1999) J. Mol. Recognit. 12, pp. 279-284)と一般的に呼ばれる技術を介して、注入人工物および／または非特異的「結合」のための生データセットを補正した。完全に補正されたデータのセンサーグラムオーバーレイを、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(BIAcore, Inc, Uppsala, Sweden)を用いて作製した。TRAIL-R2への結合のための5E5の親和性を、図13に示されるセンサーグラムのためのBIAevaluationソフトウェア中でkonおよびkoff値を測定することにより算出した。この分析により、TRAIL-R2への5E5の結合に関する700 nMの見積もられたKdが得られた。
【０５８１】
8.11 実施例11：クローン5E5および7G11に関するTRAIL-R2への結合のための競合
可溶性5E5および7G11(実施例9で単離されたTRAIL-R2特異的クローン)を発現させ、競合ファージELISAアッセイにおいて用いて、それらがTRAIL-R2に特異的に結合するかどうかを評価した。TRAIL-R2被覆プレートを、可溶性Tn3クローン7G11または5E5の存在下または非存在下でファージを展示するTRAIL-2特異的Tn3'sinと共にインキュベートした。図14に示されるように、可溶性5E5は、ファージ展示された5E5ならびに2H6および7G11以外の他の全てのファージ展示クローンと競合する。可溶性7G11のみ、ファージ展示された7G11および2H6と競合する。この実験は、全てのクローンがTRAIL-R2にとって特異的であり、Tn3タンパク質のこの一団により認識されるTRAIL-R2上の2個の異なるエピトープが存在することを示す。
【０５８２】
8.12 実施例12：3ループTn3SS4ライブラリーの構築
Tn3SS4足場に基づくファージ展示された3ループライブラリーを、表8に示されるプライマーを用いて、BC、DE、およびFGループの配列を無作為化することにより作製した。簡単に述べると、Tn3SS4を含む2ループTn3 BCループライブラリー(実施例7に由来する)に由来する一本鎖DNAを、表8中のDE revプライマーを用いるPCRのための鋳型として用いた。このPCRは、BCおよびDE無作為化を含むTn3遺伝子の一部を含む生成物を生成した。2回目のPCRは、表8に列挙されるFGプライマーを用いる増幅のための鋳型として、このBC、DEループ無作為化PCR産物を用いた。得られるPCR産物をフランキングプライマーを用いて増幅させて、完全なTn3遺伝子を作製した後、NcoI〜KpnIで切断し、ファージ展示ベクター中に連結した。DNAをエレクトロポレーションにより大腸菌中に形質転換した。
【０５８３】
エレクトロポレーション後、ライブラリーを振とうしながら37℃で1時間インキュベートした。M13KO7ヘルパーファージを添加し、1時間後、細胞をより大きい容量に希釈し、振とうしながら一晩、37℃で増殖させた。次の日、ファージを生理食塩水PEG 8000溶液を用いる沈降により培養上清から精製した。ライブラリーサイズは、大腸菌形質転換体のメンバーに基づいて、約1.5 x 109個のメンバーを含むと見積もられた。
【表８】
0006034846.tif 000036
【０５８４】
8.13 実施例13：TRAIL-R2特異的足場のための3ループTn3SS4ライブラリーのパンニング
実施例12で構築された3ループTn3SS4ライブラリーを、TRAIL-R2に対してパンニングし、特異的クローンを実施例9に記載のようにファージELISAにより同定した。TRAIL-R2に結合した、合計で19個の新しいTn3が同定された(表9)。
【表９】
0006034846.tif 000037
【０５８５】
クローン2D3および1G11のヌクレオチド配列中のアンバー停止コドンを、部位特異的突然変異誘発によりグルタミンコドンと置換した。これらのTn3クローンを、1E3、1C12、および2B4と共に、大腸菌発現ベクター(実施例1に記載)中にクローニングし、BL21 DE3細胞中に形質転換した。IPTGで誘導した後、形質転換された細菌を30℃で5時間増殖させた。細胞をペレット化し、超音波により溶解し、可溶性画分をHiTrapキレート化HPカラム(GE Healthcare, Piscataway, NJ)上で精製した。Tn3クローン2B4および1C12は良好な収率で得られたが、残りの3個のクローンの貧弱な回収は、封入体へのタンパク質の蓄積を誘導する過剰発現の結果であった。この場合、緩衝化された6Mの塩酸グアニジン(GuHCl)中で封入体を可溶化した後、変性条件下でHiTrapキレート化カラム上で精製することにより、Tn3の高い収率が続いて得られた。次いで、全てのTn3を、システイン／シスチンレドックス対の存在下で天然のバッファー中への還元および変性されたサンプルの透析により再折畳みさせた。
【０５８６】
8.14 実施例14：エピトープ多様性の決定
表9からのファージ展示クローンの選択を試験して、可溶性形態のTn3 1E3、1G11、2B4、1C12および2D3がファージELISAにおいてTRAIL-R2への結合について競合するかどうかを見た。このアッセイを、実施例11における結合についての競合と同様の様式で実施し、その結果を図15A、BおよびCに示す。可溶性Tn3クローン1E3、1C12、および2D3は、クローン8B3および7G11を除いて、TRAIL-R2への多くのファージ結合Tn3の結合を有意に阻害した。可溶性1G11は、ファージ結合クローンのいずれとも有意に競合しなかった。可溶性2B4は、多くの場合、少し〜中程度の阻害を示した。1E3、1C12、および2D3が同じセットのファージ結合Tn3と競合したという事実は、これらの3種の可溶性Tn3とファージ結合Tn3がTRAIL-R2上の同じエピトープに結合する可能性が高いことを示している。
【０５８７】
8.15 実施例15：抗Hisモノクローナル抗体に連結されたTn3単量体を用いる細胞生存能力アッセイ
Colo 205は、TRAILにより誘導される殺傷に対して高度に感受性である細胞系である。TRAIL-R2に結合するTn3を、マウス抗Hisタグ抗体および抗マウスIgGの複合体への結合を介して多量体化された場合、Colo205細胞の殺傷を誘導するその能力について試験した。10％FBSを含む100μlのRPMI1640培地中のColo205細胞を、平底96穴培養プレートの各ウェル中に塗布し、37℃で一晩インキュベートした。Tn3タンパク質7G11および5E5(表7)、1C12、2D3および1E3(表9)ならびにTn3SS4(実施例4)を、2:1:0.5のモル比でマウス抗Hisタグ抗体(Penta-His; Qiagen Inc)およびウサギ抗マウスIgGと共にインキュベートした。それぞれのTn3複合体の連続希釈液を、Tn3含量に基づいて、5μM、1.66μM、0.55μM、0.185μMおよび0μMの最終濃度で10％FBSを含有するRPMI1640培地中で作製した。一晩培養した細胞から培地を除去した後、100μlのTn3-抗体複合体を添加した。各アッセイ点を3回実施した。
【０５８８】
Tn3複合体の添加後、細胞を37℃で3日間インキュベートした後、細胞生存能力を製造業者の説明書に従ってCellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存能力アッセイ(Promega Corp., Madison, WI)中で測定した。TRAIL-R2に結合するTn3で処理された細胞の生存率を、CellTiter-Glo(登録商標)アッセイで得られた発光シグナルを、同じ濃度の非TRAIL-R2結合対照Tnで処理された細胞について得られた対応するシグナルにより除算することにより算出した。
【０５８９】
細胞生存能力アッセイ(図16)は、Tn3クローン5E5、1C12および2D3が、抗体複合体化を介して多量体化された場合、非TRAIL-R2に結合するTn3による細胞の処理と比較して、用量依存的様式でColo205の生存能力を阻害することができることを示した。細胞生存能力の阻害はおそらく、TRAIL-R2連結により誘発された細胞アポトーシスに起因するものであったが、これを確認するには経路特異的アッセイが必要であろう。クローン7G11および1E3は、アッセイにおいて用いられた濃度で検出可能な活性を示さなかった。さらなる細胞アッセイは、活性Tn3タンパク質はいずれも、抗Hisタグ捕捉抗体を用いずにアッセイした場合、細胞生存能力に影響しないことを示していた。これは、活性が多量体化されたTRAIL-R2結合部分の提示に依存することを示している。クローン5E5はまた、抗IgG抗体が存在しない場合、活性を欠いていたが、クローン1C12および2D3は抗IgGの非存在下では活性であったが、これは抗Hisタグ抗体捕捉を介する二量体化提示が、TRAIL-R2シグナリングを誘発するのに十分であることを示唆している。
【０５９０】
8.16 実施例16：多価抗TRAIL R2 Tn3抗体融合物の構築
TRAIL-R2依存的細胞殺傷を行うオリゴマーTn3複合体の提示のための要件を考慮して、Tn3融合構築物を、二価および四価Tn3含有タンパク質の産生のために消化した(図17)。二価Tn3構築物を、Tn3とヒトIgG1のFc領域との融合により設計したが、2鎖四価Tn3構築物を、Tn3-IGHG1を含むTn3-Cκ融合物、すなわち、ヒトCκ領域に融合されたTn3、およびヒトIgG1の重鎖定常領域へのTn3の融合物の同時発現に基づいて設計した。後者の構築物は、軽鎖および重鎖可変領域をTn3部分と置換した以外は、天然で抗体と類似する。
【０５９１】
図17AおよびBに示される構築物を、それぞれのタンパク質をコードする組織内pOE発現ベクターで一過的にトランスフェクトされた293F細胞中で発現させた。10日間培養した後、培地(250 mL)を収穫し、タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。多価Tn3構築物の選択物の発現レベルを表10に提供する。1C12およびD1と命名された対照SYNAGIS(登録商標)結合Tn3(実施例8の配列番号105および配列番号106に由来する)は、Fc融合物、または2鎖Tn3-Cκ/Tn3-IGHG1融合物のいずれかとして良好に発現した。2D3 Fc融合物と共に1C12および2D3(IGHG1に連結された1C12、Cκに連結された2D3およびその逆)のハイブリッド四価融合物はより少量の材料をもたらしたが、2鎖2D3-Cκ/2D3-IGHG1融合物は発現しなかった。プロテインA精製されたタンパク質のSDS-PAGE分析を図18に示す。
【表１０】
0006034846.tif 000038
【０５９２】
1C12、1C12 Fc、および1C12四価のバイオセンサーアッセイ
単量体1C12、1C12-Fcおよび1C12-Cκ/1C12-IGHG1タンパク質による結合の定性比較を、これらのタンパク質のそれぞれのサンプルをAttanaバイオセンサー装置上のTRAIL-R2チップ上に注入することにより実施した。図19に示されるように、TRAIL-R2とオリゴマー形態の1C12との複合体は、単量体1C12と比較して、親和性における実質的な改善を示す。結合の特異性を、固定されたTRAIL-R2と相互作用しなかったD1-FcおよびD1-Cκ/D1-IGHG1タンパク質の注入により証明した。異なる1C12構築物の解離速度は1C12 > 1C12-Fc > 1C12-Cκ/1C12-IGHG1の順番であり、TrailR2とのその相互作用においてアビディティを示す二価および四価構築物と一致していた。
【０５９３】
8.17 実施例17：多価抗TRAIL-R2 Tn3融合タンパク質を用いる細胞生存能力アッセイ
H2122細胞を、50μlの完全培地(10％FBSを補給したRPMI 1640培地)中、10000細胞／ウェルの密度で96穴プレート中に塗布した。細胞を37℃で一晩インキュベートした。次の日、多価Tn3融合タンパク質(Fc融合物または2鎖四価構築物)を単独で、またはヤギ抗ヒトFcと組合わせて、完全培地中で連続希釈した。用量曲線を達成するために、3倍希釈スキームを用いた(最も高い最終濃度は3.6μMであった)。ヤギ抗ヒトFcを1:2のモル比(すなわち、Tn3含有分子の濃度の半分)で添加した。Tn3および抗ヒトFcを単独で、または組合わせて、2X濃度で調製した(ウェルあたり50μlの各処理を添加した)。全ての処理を3個のウェル中で行った。市販のTRAILリガンド(Chemiconカタログ番号GF092)を、Trailにより誘導される細胞死の陽性対照として用いた。Trailの最終濃度は、1、0.1および0.01 nMであった。48時間後、Promega社製CellTiter-Gloキットを用いて、細胞生存能力を決定した。簡単に述べると、細胞を約10分間、室温まで平衡化させる。CellTiter-Gloバッファーと基質を混合して、製造業者により指示されるようにCellTiter-Glo試薬を調製した。それぞれのウェルは100μlのCellTiter-Glo試薬を受容し、プレートを室温で10分間インキュベートした後、Wallacプレートリーダー中で発光を読み取った。結果を図20〜22に示す。多価構築物を含む1C12および2D3の各々は、おそらくTRAIL-R2依存的アポトーシスを活性化することにより、H2122細胞の生存能力を阻害することができ、さらにこの活性は抗Fc抗体との協働を介するより高い次数の架橋に依存しなかった。四量体形態の1C12は、その二量体形態よりも細胞アッセイにおいてより強力であったが(図20と21を比較)、殺傷活性は価数の関数であることに一致していた。Fc架橋は殺傷の効力を増加させず、一特異的1C12構築物の活性を低下させるようであった。TRAIL-R2に結合しない、D1-FcもD1-Cκ/D1-IGHG1対照タンパク質も細胞生存能力に影響しなかった。二特異的四価構築物(図22)はH2122細胞生存能力の阻害において最も高い効力を有しており、これは抗Fc抗体と同時インキュベートした場合、わずかに増加した。一特異的1C12-Cκ/1C12-IGHG1と比較した2D3/1C12二特異的構築物に関する活性の改善は、2D3対1C12 Tn3単位に関する優れた効力に起因するか、または2D3および1C12がTRAIL-R2上の異なるエピトープを認識し、より高い次数の細胞表面TRAIL-R2の凝集をもたらし得るからであるかもしれない。
【０５９４】
8.18 実施例18：Tn3足場の細菌分泌
細菌発現ベクターを設計して、大腸菌中で正確に折畳まれたTn3足場を分泌させた。この系は、Tn3内での正確なジスルフィド結合形成および、従って、実施例4に記載されたように細胞内発現された材料にとって必要である再折畳みプロセスを回避することができるであろう。分泌ベクターを作製するために、実施例4に記載のものと類似するが、T7の代わりにPtacプロモーターを含む、細胞内Tn3発現ベクターを、大腸菌オリゴペプチド結合タンパク質(oppA)に由来するシグナルペプチド配列の挿入により改変した。oppAは高度に発現される大腸菌タンパク質であるため、Tn3のすぐ上流にクローニングされたこのシグナル配列を選択した。伸長された8xHisタグをTn3の下流にコードさせて、精製を容易にした。このプラスミドと他のプラスミドとの間のTn3カセットの導入を単純にするために、oppAシグナル配列の3'末端にNco I部位を導入することにより、改変された形態のこのベクターも作製した。この改変は、oppAシグナル配列内の最後から2番目の位置での1個のアミノ酸置換(L25M)をもたらす(図23)。これらのベクターをpSec-oppA-Tn3およびpSec-oppA(L25M)-Tn3と呼んだ。
【０５９５】
カルベニシルムを含むスーパーブロス培地(100μg/mL、1％グルコース)に、pSec-oppA-Tn3またはpSec-oppA(L25M)-Tn3で形質転換された大腸菌BL21 DE3の培養物を接種した。培養物を0.5〜0.8のODまで37℃で増殖させた後、0.2 mMのIPTGで誘導した。37℃で5時間振とうした後、細胞を遠心分離により培地から分離した。ペリプラズム抽出物を、細胞ペレットを1/10容量の氷冷抽出バッファー(10 mM Tris, pH 8および1 mM EDTA)中に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートした後、遠心分離して細胞を除去することにより調製した。ペリプラズム抽出物のサンプルおよび培地をSDS-PAGEにより分析した。Tn3を培地およびペリプラズム画分の両方において検出することができ、発現レベルは野生型またはL25M oppAシグナルペプチドを含む構築物について類似していた(図24A)。pSec-oppA(L25M)-Tn3は、便利な5' Tn3クローニング部位を含み、この構築物は展示ライブラリーから誘導されるTn3クローンの発現にとって好ましい。
【０５９６】
培地からのTn3の精製を、以前に記載のように65％w/v硫酸アンモニウムを用いて分泌されたタンパク質を沈降させ、ペレットを50 mM Tris pH 8バッファー中に再懸濁した後、Ni2+を充填したHiTrapキレート化カラム上で精製することにより行った。精製されたサンプルのSDS-PAGE分析を、図24Bに示す。精製されたTn3を、DTT予備処理を用いて、または用いずに逆相HPLC(本明細書に記載)により分析して、ジスルフィド結合を還元した。Tn3は単一ピークとして溶出し、溶出時間はDTTによる還元後にシフトしたが、これは精製されたサンプルが予想通りのジスルフィド結合を含んでいたことを示している(図23C)。この材料の非還元的SDS-PAGEおよびサイズ排除クロマトグラフィーは、単一の単量体種と一致し、質量測定分析により10,896 Daの分子量が得られ、これは図28Aに示される成熟ジスルフィド含有配列に関して予測された分子量の3 Da以内である。
【０５９７】
最後に、培地中に分泌されたTn3の発現レベルを、バイオセンサーアッセイにおいて決定した。抗Hisタグ抗体(Penta-His, Qiagen Inc.)を、標準的なアミンカップリングを介してAttana A100カルボキシルセンサーチップ上に固定した。大腸菌BL21 DE3をpSec-oppA(L25M)-Tn3で形質転換し、上記のようにタンパク質発現を誘導した。清澄化された培地の希釈液をチップ上に注入し、Tn3を含有する結合したHis-タグのレベルを、精製されたTn3標準物の注入物から精製されたものと比較した。この技術により、粗培地中で検出されたTn3のレベルは250 mg/Lであった。
【０５９８】
8.19 実施例19：SynBP01-Fc融合物の作製
概要：SYNAGIS(登録商標)結合Tn3とIgG1のFc領域とのキメラ融合物を作製した。
【０５９９】
方法：SynBP01-Fcの発現
上記のように、SynBP01は、SYNAGIS(登録商標)に対してパンニングされたBCループおよびFGループが無作為化されたTn3変異体のライブラリーから同定されたTn3変異体である。フランキングするNheIおよびKasI部位を、サイレント突然変異誘発により導入し、これを用いてこの構築物をpOE-Fcベクター中にサブクローニングした。pOE-Fcベクターは、KasI制限部位に対して3'側にある、IgG1 FcのCH2およびCH3ドメインを含む。pOE-Fc中にSynBP01をサブクローニングすることにより作製されたベクターを、pOE-SynBP01と命名した。
【０６００】
293EBNA細胞(120 mLの培養容量)を、標準的な方法を用いて、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)を介してpOE-SynBP01でトランスフェクトした。上清をトランスフェクションの10日後に収穫し、SynBP01-Fcを、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、pH 3.08で溶出し、Tris-HClバッファーpH 8で中和する、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー(GE Healthcare)を介して精製した。次いで、精製されたサンプルをpH 7.2で緩衝化されたPBSに対して透析した。精製されたSynBP01-Fcの収量は4 mgであったが、これは33 mg/Lの発現レベルを示している。
【０６０１】
SynBP01-FcのBIAcore分析
この分子のBIAcore分析を、実施例3に記載のように、BIAcore 3000 (GE Healthcare)上で行った。この実験を、SynBP01-FcがSYNAGISに結合することができるかどうかを決定するため、および元のSynBP01結合剤とFc融合物との見かけの親和性の差異を定性的に検出するために設計した。
【０６０２】
結果：等量の1μM濃度で注入した場合、SynBP01-FcはSynBP01と比較して、全応答単位の約6倍の増加をもたらした(図26)。さらに、SynBP01-Fcは、主に二価Fc融合物のアビディティの増加に起因して、SynBP01と比較して実質的に低下した解離速度を有していた。SynBP01-Fc/SYNAGIS(登録商標)相互作用の解離定数(KD)はこの実験では決定しなかったが、結合表面を動的分析のために調製しなかったため、KDは実施例3においてSynBP01/SYNAGIS(登録商標)相互作用について認められた16μMのKDから改善されることが明らかである。
【０６０３】
8.20 実施例20：STn3足場の部位特異的PEG化
PEG化によるタンパク質の改変は、腎臓クリアランスを回避するための小タンパク質の有効サイズを増加させることにより、免疫原性の低下、薬物動態および生物利用能の改善などのその治療特性を改善するために用いられることが多い。タンパク質中の1個以上の特異的残基での結合である、PEGを用いる部位特異的改変は、さもなければタンパク質内の機能的部位で、またはその近くでのPEGの結合の結果生じ得る標的タンパク質活性の不活化を回避することができる。Tn3-様足場タンパク質の部位特異的PEG化を証明するために、STn3(実施例5に由来するスルフォロブス・トコダイ1のTn3)のC末端のシステイン残基を操作した。STn3の野生型配列はシステインを含まないため、Cys-特異的PEG化反応を用いる操作された足場の処理は、PEGの部位特異的結合をもたらし得る。STn3を、pET-22bベクター(Novagen)の変異体において、C末端6xHisタグとの融合物として予め発現させた。このベクターは、前記タンパク質とHisタグとの間にリンカー配列GGGLEを含む。QuikChange (Stratagene)突然変異誘発法に対する変法を用いて、リンカー中のロイシン残基をシステインに突然変異させ、これをマレイミド試薬により改変することができる。このタンパク質をSTn3(CTC)と呼び、実施例1に記載のようにIMACカラムを用いて、BL21(DE3)細胞から発現させ、精製した。
【０６０４】
PEG化試薬Sunbright ME-200MA(NOF)を、4:1モル過剰(PEG試薬：タンパク質)でSTn3(CTC)に添加し、室温で72時間インキュベートさせた。タンパク質PEG化を、SDS-PAGEによりモニターしたところ(図27A、レーン5)、大部分のタンパク質が単一のPEG部分によりPEG化されたことを示していた。典型的には、PEG化はタンパク質の表面電荷を隠す効果を有するため、陽イオン交換クロマトグラフィーのためのpHを6.0(野生型精製のため)から4.5まで低下させて、タンパク質がカラムに効率的に結合することを確保した。タンパク質を、50 mM酢酸、pH 4.5を用いて1 mL SP XLカラム(GE Healthcare)上で精製した。塩化ナトリウム勾配を用いてタンパク質を溶出させたところ、タンパク質ピークは約120 mMのNaClで生じた。PEG化された生成物からの残留非PEG化STn3(CTC)の除去の成功を、陽イオン交換から得られた画分のSDS-PAGE分析により証明し、精製画分を図27B、レーン1〜5に示す。
【０６０５】
8.21 実施例21：AB、CDおよびEFループの分析ならびに無作為化ライブラリーの設計
AB、CDおよびEFループ中で無作為化されたTn3ライブラリーを設計するために、バイオインフォマティックス分析を実施して、天然のFn3ドメイン中でのこれらのループの長さおよび配列多様性に関する情報を誘導した。配列情報のみに基づいてAB、CDおよびEFループ領域を予測することは困難であるため、pdbデータベースに由来する103個の異なるFn3ドメインの三次元構造を重ね合わせ、これを用いて、対応するアミノ酸配列を整列させた(データは示さない)。ループ領域の位置を用いて、それぞれのループに関する長さおよび配列多様性情報を抽出した。AB、CDおよびEFループの各々に関する長さの変化を、図28に図示する。
【０６０６】
Tn3分子の反対側のループに関して、AB、CDおよびEFループは、異なるFn3ドメインについて長さおよび配列組成において変化する。ABおよびCDループは通常5〜9アミノ酸長であるが、これより長いか、または短いABおよび／またはCDループを有するいくつかのFn3ドメインについては例外もある。このデータセット内の最も一般的な長さは、CDループについては6残基(配列の31％)、ABループについては7残基(配列の61％)であった。長さの変動は、EFループについてはあまり生じず、8残基のループが最も一般的に観察される(配列の80％)。ABおよびCDループは共に、有意な配列多様性を示し、特定の位置における特定のアミノ酸に関する明らかな優先を示さない。例外は、SerまたはThrであることが多いABループ中の最後の位置である(58/103配列)。EFループの配列は特定の位置で強く好ましいアミノ酸を示すが、これは8残基長であるものに限られる。これらのループ内の位置3でのLeuは強く保存され(76/82配列)、この残基の側鎖がそれぞれの構造中に埋まっていることを考慮すれば、足場の構造的完全性にとってそれが重要である可能性が高い。Pro残基も位置5で一般的に観察されるが(44/82配列)、Gly、Asn、AspおよびSerは位置2において多く(71/82配列)、位置7においてはThr(40/82)が多い。
【０６０７】
これらのTn3ライブラリーの設計におけるさらなる実用的な考慮は、典型的には、任意のアミノ酸をコードする縮重オリゴヌクレオチド中で用いられる「NNK」(N＝A、G、T、C；K＝G、T)混合コドンスキームに対する代替を同定することであった。「NNK」混合物は20種のアミノ酸をコードする32個の異なるコドンを与えるが、それらは同等にコードされるわけではない(表11)。例えば、「NNK」スキーム中の3/32個のコドンはLeu(CTG、CTT、TTG)をコードするが、1/32個だけがAsp(GAT)をコードする。さらに、「NNK」混合物は1個の停止コドン(TAG)およびCysコドン(TGT)をコードするが、そのいずれもナイーブなライブラリーを作製する場合に望ましくない。代替スキームを考慮する際に、本発明者らは小さいサブセットのアミノ酸から構成されるCDR配列をコードする合成抗体ライブラリーが記載されているという事実に留意した。ちょうど4個のアミノ酸(Tyr、Ala、Asp、Ser)、またはさらにバイナリー対(Tyr、Ser)から構成されるCDRを含む抗体ライブラリーが、タンパク質抗原に対する特異的な高親和性のmAbをもたらすことが示されている(Fellouseら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004, 101: 12467-72; J. Mol. Biol. 2005, 348: 1153-62)。同様に、TyrおよびSerのみを含む無作為化ループ配列を含む足場タンパク質のライブラリーも、タンパク質標的に対する特異的結合剤をもたらした(Koideら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007, 104: 6632-7)。高度に制限されたセットのアミノ酸を含むライブラリーは特異的結合タンパク質を産生することができるが、そのようなライブラリーから得られる結合剤の多様性が限られる可能性が高い。本発明者らは、従って、Tn3ライブラリー中に多様性を導入するための代替「NHT」混合コドンスキーム(H＝A、T、C)を設計した。「NHT」ミックスは20種のアミノ酸の合理的なサブセットをコードするが、「NNK」混合コドンについて記載された欠点を回避する(表12)。このスキームは、12/20個のアミノ酸をコードする12個のコドンを生成する、すなわち、それぞれのコドンはユニークなアミノ酸をコードする。さらに、停止コドンもCysコドンも存在しない。
【表１１】
0006034846.tif 000039
【０６０８】
【表１２】
0006034846.tif 000040
【０６０９】
無作為化されたAB、CDおよびEFループを含むTn3ライブラリーのための最終的な設計を以下に示す。この設計は天然のFn3配列中で観察される多様性を含み、ABおよびCDループについて2つの異なる長さであり、「NHT」コドンミックスを使用する。
【０６１０】
ABループ(7および9残基)：
Tn3野生型アミノ酸配列： KDVTDTT
ライブラリーアミノ酸配列(7アミノ酸)：Kxxxxxa
DNA配列：AAA-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-RST(配列番号262)
ライブラリーアミノ酸配列(9アミノ酸)：Kxxxxxxxa
DNA配列：AAA-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-RST(配列番号263)。
【０６１１】
CDループ(7および9残基)：
Tn3野生型アミノ酸配列： KDVPGDR
ライブラリーアミノ酸配列(7アミノ酸)：xxxxxxx
DNA配列：NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT(配列番号264)
ライブラリーアミノ酸配列(9アミノ酸)：xxxxxxxxx
DNA配列：NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT-NHT(配列番号265)。
【０６１２】
EFループ(8残基)：
Tn3野生型アミノ酸配列： GNLKPDTE
ライブラリーアミノ酸配列：xbLxPxcx
DNA配列：NHT-RRB-CTG-NHT-CCG-NHT-RBT-NHT(配列番号266)
アミノ酸コード：x = N/D/H/Y/I/V/L/F/T/A/P/S; a = S/T/A/G; b = N/K/S/R/D/E/G; c = I/T/S/V/A/G
ヌクレオチドコード：N = G/A/T/C; H = A/T/C; R = A/G; S = G/C; B = T/C/G。
【０６１３】
8.22 増強された安定性を有する電荷操作されたTn3変異体の設計、発現および特性評価
電荷操作されたTn3変異体の設計
熱アンフォールディングに対するTn3の安定性は、pH 7と比較して、pH 5でより高く、塩を含まない同じバッファーよりも、1Mの塩を含むpH 7のバッファー中でより高い(図29)。高い塩濃度は表面タンパク質電荷を隠すが、バッファーの酸性化は負に荷電したAspおよびGlu側鎖の中和をもたらすことができ、これらの観察はTn3上の表面マイナス電荷が脱安定化効果を有することを示唆している。
【０６１４】
表面電荷の操作を介してTn3の安定性を増強するための能力を調査するために、AspおよびGlu側鎖の位置をTn3の三次元構造上にマッピングした。Tn3(配列番号1)中に含まれる合計18個のAspおよびGlu残基から、個々のAspまたはGlu残基が中性の等電性残基AsnまたはGlnで置換された8個の突然変異体の一団を設計した(図30A)。類似する電荷の近似が静電反発力を介して脱安定化に寄与し得ることを考慮すれば、8個の置換部位の選択を、別のAspまたはGluに近い位置にあるAspおよびGlu残基に向かって偏向させた。
【０６１５】
電荷変異体の作製および組換え発現
Tn3突然変異体のための発現構築物を、以前に記載のように野生型発現構築物の部位特異的突然変異誘発により作製した。組換えタンパク質を大腸菌中で発現させ、以前に記載のように固定されたニッケルキレートアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。全てのTn3突然変異体は高レベルで発現し、容易に精製されたが、E54Q突然変異体の調製物はSDS-PAGE分析により証明されるようにいくらかの不純物を含んでいた(図30B)。
【０６１６】
安定性の特性評価
尿素による電荷変異体のアンフォールディングを、野生型Tn3について以前に記載されたように内在蛍光によりモニターした。Tn3の野生型および電荷変異体の尿素誘導性アンフォールディングプロフィールの比較を容易にするために、360 nmでの相対蛍光放出強度を、それぞれのタンパク質について尿素濃度の関数としてプロットした。
【０６１７】
野生型Tn3と種々の電荷変異体に関するpH 7.0での尿素誘導性アンフォールディングの比較(図31A)により、突然変異体のうちの3個(D40N、E54QおよびE67Q)が、野生型タンパク質よりも同じか、またはわずかに低い安定性を有することが示された。突然変異体のうちの5個(E33Q、D49N、E52Q、D53N、E86Q)により、尿素誘導性アンフォールディングの中点における小さいが明確に定義される増加が示されたが、これはタンパク質安定性の増加を示唆する。50％のアンフォールディングを誘導するのに必要な尿素の濃度は、野生型Tn3よりも最良の3個の突然変異体(E33Q、D49NおよびE86Q)について約0.5M高かった。
【０６１８】
複数の電荷突然変異を含むTn3変異体の調製および分析
いくつかのTn3電荷変異体の増強された安定性を考慮すれば、組合わされた電荷変異体を含む新しいTn3変異体を調製して、安定性のさらなる改善を得ることができるかどうかを調査した。この目的のために、突然変異対(D49N/E86QおよびE33Q/D49N)または三重突然変異(E33Q/D49N/E86Q)を含む3個の新しい変異体を調製した。これらの突然変異体を組換え発現させ、精製し、その尿素変性プロフィールを蛍光により特性評価した。
【０６１９】
Tn3の単一の電荷変異体と比較した場合、それぞれの組合せ変異体は、変性に必要な尿素濃度の増加により決定されるように安定性のさらなる増強を示した(図31B)。個々の電荷変異体E33Q、D49NおよびE86Qの尿素誘導性変性の中点は約2.5Mの尿素で生じたが、D49N/E86Q、E33Q/D49NおよびE33Q/D49N/E86Q変異体のそれぞれに関する変性の中点は約3.0Mの尿素に対応していた。これは、複数の脱安定化AspまたはGlu残基の組合わせた置換は、Tn3安定性のさらなる改善を誘導し得るが、本明細書で試験された実施例においては、三重変異体は二重変異体よりも安定ではなかった。
【０６２０】
野生型Tn3と比較して、組合せ電荷変異体の安定性をさらに特性評価するために、これらのタンパク質を以前に記載のようにpH 7でDSCにより分析した。この分析はさらに、電荷突然変異がTn3足場の安定性の改善を誘導することを確認した。野生型タンパク質は45℃の熱アンフォールディングの中点(Tm)を有していたが、E33Q/D49N Tn3突然変異体は50℃のTmを有するが、D49N/E86QおよびE33Q/D49N/E86Q突然変異体は52℃のTmを有していた(図32)。
【０６２１】
前記発明を明確性および理解のためにいくらか詳細に説明してきたが、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における様々な変更を行うことができることが本開示の読解から当業者には明らかになるであろう。例えば、上記の全ての技術および装置を様々な組合せにおいて用いることができる。本出願で引用された全ての刊行物、特許、特許出願、または他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文書があらゆる目的で参照により組み入れられると個別に指示されたのと同じ程度まで、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
0006034846.tif 000041
【図２】
0006034846.tif 000042
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４−１】
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【図４−２】
0006034846.tif 000047
【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【配列表】
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