(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１のアミノ酸配列と対応する可変重鎖領域、および配列番号：２のアミノ酸配列と対応する可変軽鎖領域を含む、プロラクチン受容体媒介シグナリングに拮抗する抗体Ｍａｔ３またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体のＣＤＲを含む請求項１に記載の抗体Ｍａｔ３またはその抗原結合性フラグメントであって、可変重鎖が、配列番号：５、６および７に対応するＣＤＲ配列を含み、可変軽鎖が、配列番号：８、９および１０に対応するＣＤＲ配列を含む、抗体Ｍａｔ３またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
抗体が、ヒト、サルおよびマウス由来のＰＲＬＲの細胞外ドメインの１つ以上の領域に特異的に結合する抗原結合領域からなり、ヒトＰＲＬＲのアミノ酸配列が、配列番号：１２および配列番号：１２のヒト多型変異体の位置１〜２１０のアミノ酸配列、配列番号：１１のサルＰＲＬＲおよび配列番号：１３のマウスＰＲＬＲの位置１〜２１０のアミノ酸配列により示される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト、サルおよびマウス由来のＰＲＬＲの細胞外ドメインに対するアフィニティが、少なくとも１００ｎＭである、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
抗体がヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインの１つ以上の領域に特異的に結合する抗原結合領域からなり、アフィニティが少なくとも１０ｎＭである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖定常ドメインが修飾されたまたは無修飾のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を決定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号：３および４に対応する、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項７または８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１０】
高等真核宿主細胞、下等真核宿主細胞または原核細胞である、請求項９に記載のベクターあるいは請求項７または８に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１１】
抗体または抗原結合性フラグメントを生産するために請求項１０に記載の宿主細胞を使用する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、該抗体を回収することを含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法によって生産された抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１３】
少なくとも９５重量％均一にまで精製された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１４】
医薬としての、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメントと賦形剤および助剤を含む医薬上許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
容器に詰められた抗体Ｍａｔ３の治療有効量を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体を含むキットであって、所望により第二の治療剤を含み、さらに、容器に添付されたまたは容器と共に包装されたラベルを含み、ラベルが、容器の内容物を記載し、子宮内膜症、腺筋症、良性乳房疾患および乳房痛、または類線維腫を処置するための、または抗エストロゲン耐性乳癌を処置および予防するための、容器の内容物の使用に関して示すおよび／または指示する、キット。
【請求項１７】
子宮内膜症および腺筋症（内性子宮内膜症）を処置および／または予防する方法における使用のための請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１８】
良性乳房疾患および乳房痛の処置方法における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項１９】
抗エストロゲン耐性乳癌の処置または予防方法における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性フラグメント。
【請求項２０】
少なくとも１つの他の薬剤と組み合わされた請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰＲＬＲ抗体または抗原結合性フラグメントを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３に関し、プロラクチン受容体に特異的に結合してそれを中和する抗体Ｍａｔ３の組換え抗原結合領域およびそのような抗原結合領域を含有する機能性フラグメント、前記抗体をコードする核酸配列、それを含有するベクター、それらを含有する医薬組成物、およびプロラクチン受容体媒介シグナリング(prolactin receptor mediated signaling)の阻害によって利益を受ける子宮内膜症および他の疾患の処置または予防における、それらの使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プロラクチン（ＰＲＬ）は１９９個のアミノ酸から構成されるポリペプチドホルモンである。ＰＲＬは、成長ホルモン（ＧＨ）・胎盤性ラクトゲン（ＰＬ）ポリペプチドホルモンファミリーに属し、下垂体のラクトトローフ細胞(lactotroph cell)ならびにいくつかの下垂体外組織、例えばリンパ球、乳腺上皮細胞、子宮筋層、および前立腺において合成される。２つの異なるプロモーターが下垂体および下垂体外ＰＲＬ合成を調節する（BioEssays 28:1051-1055, 2006）。
【０００３】
ＰＲＬは、クラス１サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する１回膜貫通受容体であるＰＲＬ受容体（ＰＲＬＲ）に結合する（Endocrine Reviews 19:225-268, 1998）。ＰＲＬＲは３つの異なるアイソフォーム、すなわち短鎖型、長鎖型、および中間型で存在し、これらはその細胞質テールの長さによって識別することができる。リガンドが結合すると、逐次的プロセスがＰＲＬＲの活性化をもたらす。ＰＲＬは一つのＰＲＬＲ分子とその結合部位１を介して相互作用し、次にその結合部位２を介して、もう一つの受容体分子を引きつけることにより、ＰＲＬＲの活性二量体をもたらす。ＰＲＬＲの二量体化は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ（ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達性転写因子）経路の優性活性化(predominant activation)につながる。受容体が二量体化すると、受容体と会合しているＪＡＫ（主にＪＡＫ２）が互いをトランスリン酸化し、活性化する。さらに、ＰＲＬＲもリン酸化され、ＳＴＡＴなどのＳＨ２ドメイン含有タンパク質に結合することができる。受容体に結合したＳＴＡＴは続いてリン酸化され、受容体から解離して核内に移行し、そこで、ターゲット遺伝子の転写を刺激する。さらに、ＰＲＬＲによるＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫ経路の活性化および細胞質ｓｒｃキナーゼの活性化も記述されている（Endocrine Reviews 19:225-268, 1998に総説がある）。
【０００４】
ＰＲＬＲ媒介シグナリングは、乳腺発生、泌乳、生殖、乳房および前立腺腫瘍成長、自己免疫疾患、全般的成長および代謝、ならびに免疫調整など、さまざまなプロセスにおいて役割を果たす（Endocrine Reviews 19:225-268, 1998;Annu. Rev. Physiol. 64:47-67,2002）。
【０００５】
現在、ブロモクリプチンや他のドーパミン受容体２アゴニストの使用による下垂体ＰＲＬ分泌の阻害の他に、ＰＲＬＲ媒介シグナリングの完全な妨害を可能にする利用できる薬物は存在しない（Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism 2(10): 571-581, 2006）。しかしこれらの薬剤は、下垂体ＰＲＬ合成の阻害をうまく補償してほとんど損なわれていないＰＲＬＲ媒介シグナリングをもたらすことができる下垂体外ＰＲＬ合成を抑制しない（Endocrine Reviews 19:225-268,1998）。それゆえに、プロラクチンは乳がんまたは全身性狼蒼もしくは関節リウマチなどの自己免疫疾患と関連づけられているとはいえ、ドーパミン２型受容体アゴニストがこれらの疾患を患っている患者において有益でなかったことは、驚くにはあたらない（Breast Cancer Res. Treat. 14:289-29, 1989;Lupus 7:414-419, 1998）。乳癌または自己免疫疾患においてそれぞれ中枢的な役割を果たす乳がん細胞またはリンパ球における局所的プロラクチン合成は、ドーパミン受容体アゴニストによってはブロックされなかった。
【０００６】
乳癌診断のためのＰＲＬＲへの抗体結合が、初めて、ＷＯ２００３／００４９８９（Millenium Pharmaceuticals）に記載された。該ＷＯ０３／００４９８９において、いくつかの乳房腫瘍組織において過剰発現されるＰＲＬＲを含む多数の遺伝子および対応するタンパク質は、悪性腫瘍の早期検出のための適当なマーカーと見なされた。ＷＯ０３／００８５８３において、ＰＲＬＲを含むリンパ腫および白血病、癌腫関連遺伝子およびタンパク質に対する取り組みが記載されている。
【０００７】
さらに、ＷＯ２００６／１１０５８５（Novartis）において、癌マーカーとしてのＰＲＬＲ過剰発現および乳癌および他の癌型（肺、前立腺および皮膚癌）の診断および処置のためのＰＲＬＲ特異的抗体の使用が記載された。このとき、アンタゴニスト活性を有するモノクローナル抗体が、２つの実験的証拠に基づいて請求された。ａ）乳癌ＭＣＦ７細胞におけるＰＲＬＲ特異的ｓｉＲＮＡによるＰＲＬＲ発現のブロッキングが、これらの細胞の増殖の阻害を誘導した、およびｂ）プロラクチンが、乳癌細胞、例えばＴ４７ＤにおけるＳＴＡＴ５およびＭＡＰＫリン酸化を誘導する。しかしながら、いずれの証拠にも、モノクローナル抗体が実際に乳癌細胞株の増殖を阻害することを提供しておらず、何ら具体的な抗体が記載されてもいなかった。
【０００８】
ＰＲＬＲアンタゴニストが乳癌発生を成功裏に妨げる概念の第１のインビボ証明は、１９８８に公開されている。ＤＭＢＡマウス乳房腫瘍モデルにおいて、モノクローナルＰＲＬＲ抗体が、乳房腫瘍の発生率の減少をもたらした（Am J Pathol 133:589-595,1988）。
【０００９】
乳癌の予防および処置のために請求された第１のＰＲＬＲ抗体は、ＵＳ  ２００７／０２６９４３８（Biogen）に記載された。５つのハイブリドーマ細胞株由来の発現産物（抗体）が、乳癌細胞株Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７にしっかりと結合し、ＰＲＬ媒介シグナリング（ＳＴＡＴ５−、ＭＡＰＫ−、ＡＫＴ−リン酸化）をブロックする能力について記載された。しかしながら、概念のインビボ証明は記載されていない。さらに、最先端の知識を超える証拠は、とりわけ、患者の癌が抗エストロゲン独立となった後、抗ＰＲＬＲ抗体が患者へ投与され得るという言及について提供されていない。
【００１０】
一次配列と共に、モノクローナルＰＲＬＲ特異的抗体の第２のセットが、ＷＯ２００８／０２２２９５（Novartis）に記載された。これらの抗体が乳房、肺および前立腺癌に対する治療剤として請求されたが、リンパ腫モデルが、インビボにおけるこれらの薬剤の抗増殖性効果を示すために使用された。
【００１１】
他方では、プロラクチンに由来し、Ｎ−末端欠失および点突然変異を有するペプチド作動性ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、デルタ１−９Ｇ１２９Ｒプロラクチン）はまた、ＰＲＬＲのアンタゴニストとして機能したが、しかしながら、それらは、プロラクチンと比較したとき、半減期の減少（１５−２０分）および効力の低下を受ける（Pituitary 6:89-95,2003）。したがって、中和ＰＲＬＲ抗体は、とりわけ、乳癌および前立腺癌において役割を果たす自己分泌プロラクチンシグナリングの増強の阻害に関して優れている。
【００１２】
ＰＲＬＲ媒介シグナリングの役割もまた、良性疾患子宮内膜症の関連において調査された。１つの試験において、子宮内膜症患者由来の子宮内膜試料および正所性子宮内膜におけるＰＲＬＲの発現パターンが、月経周期の中期増殖期中に分析された（Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002）。ＰＲＬＲ  ｍＲＮＡが、分析された子宮内膜症患者の７９％において正所性子宮内膜に存在するが、子宮内膜症患者の８６％において子宮内膜病変に非存在であることが証明された。これらのデータは、正常組織と子宮内膜組織間のＰＲＬＲ発現の可能な分別制御を示唆した。しかしながら、とりわけ、ＰＲＬＲが子宮内膜病変において発現されるべきであることが見いだせなかったため、これらの発現データから、ＰＲＬＲの阻害が適当な子宮内膜症治療を示し得ると結論づけることができない（Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002）。
【００１３】
結論として、ＰＲＬＲ媒介シグナリングがさまざまな細胞過程における役割を果たすが、子宮内膜症を含む多数の良性疾患に対するＰＲＬＲアンタゴニスト作用の治療的価値を証明する非常に少ない、部分的に矛盾する結果が、記載されている。
【００１４】
ＰＲＬＲが乳癌における原因としての働きを果たし得ることを示す多くのデータが公開されている。概念的に、強力なＰＲＬＲアンタゴニストは、乳癌に対するＰＲＬＲ阻害の治療的価値を証明する適当な薬剤であり得る。それにもかかわらず、ＰＲＬＲ遮断が実際に腫瘍増殖の阻害（リンパ腫処置および乳癌発症の阻害を除く）をもたらすこと、さらに、アンタゴニスト性ＰＲＬＲ抗体がＰＲＬＲシグナリングの遮断から利益を得る良性疾患の処置のために使用することができることの概念のインビボ証明が、現在までに提供されていない。したがって、現在利用できる抗体は、前臨床概念実証試験を可能にする予測モデルにおいて使用することができない。
【００１５】
ＰＲＬへ競合的に結合することなく、ヒト、サルおよびマウスにおけるＰＲＬＲに対して高アフィニティで結合し、全３つの種におけるＰＲＬＲ媒介シグナリングを中和し、マウスにおいて、ならびに適度な用量でサルにおいても前臨床概念実証試験を行うことを可能にする抗体の必要性が存在する。
【００１６】
したがって、本発明の根本的な問題は、概念試験の前臨床証明を可能にする予測モデルに使用することができ、プロラクチン(prolaction)受容体シグナリングの遮断から利益を得る疾患の処置のために使用することができる新規ＰＲＬＲ抗体の提供にある。
【００１７】
課題は、新規抗体Ｍａｔ３の提供によって解決される。
【発明の概要】
【００１８】
今回、該抗体が、驚くべきことに、非競合的にＰＲＬに結合するＷＯ２００８／０２２２９５に記載されている抗体、例えばＨＥ０６６４２と対照的に、ＰＲＬへ競合的に結合することなく、生化学的ならびに細胞的結合試験においてヒト、サルおよびマウスにおけるＰＲＬＲに特異的であり、これらのＰＲＬＲに対して高アフィニティを有し、全３つの種におけるＰＲＬＲ媒介シグナリングを中和することを見出した。このように、該抗体は、マウスにおいて、ならびに適度な用量でサルにおいても前臨床概念実証試験を行うことを可能にする。さらに、今回、該抗体は、非競合的にＰＲＬに結合するＷＯ２００８／０２２２９５に記載されている抗体、例えばＨＥ０６６４２と比較して、より強力であり、ヒト生殖細胞株配列とより密接に関連している対象へ治療的利益を送達することができ、したがって、改善された副作用プロフィールの機会、すなわち用量の減少およびヒト生殖細胞株配列と類似性の増加による免疫原性の危険性の減少を提供することを見出した。
【００１９】
新規Ｍａｔ３抗体は、好ましくは、アカゲザル(Macacca mulatta)およびカニクイザル(Macacca fascicularis)、マウス(Mus musculus)およびヒト(Homo sapiens)などの他の種由来のＰＲＬＲに交差反応する。ここで、交差反応性は、ヒト、サルおよびマウスＰＲＬＲに対する該抗体のアフィニティ（ＫＤ値）および細胞結合ＥＣ５０値が、１０ｘ１０−９Ｍ以下であり（表１、実施例９、１０、１３および１４参照）、増殖阻害ＩＣ５０値が２０ｘ１０−９Ｍ以下である（実施例１から３参照）ことを意味する。本発明は、対象へ治療的利益を送達することができる新規抗体Ｍａｔ３の発見に基づく（新規抗体の配列は配列番号：１−１０である）。ヒト生殖細胞株配列に対する非常に密接な関連でより好ましくは完全にヒトであり得るか、または完全ヒトバージョンのＣＤＲを有するヒト化またはキメラまたはヒト操作(human engineered)変異体であり得る本発明の抗体は、より完全に本明細書に記載されている多数の文脈において使用することができる。
【００２０】
非競合的にＰＲＬに結合するＷＯ２００８／０２２２９５からの最も深く特徴付けられた既知の抗体を超える本発明の抗体の効力およびヒト−サル−マウス交差反応性における優位性を示すために、インビトロ増殖試験において、該抗体をＷＯ２００８／０２２２９５からのＨＥ０６６４２と比較している（実施例１−３）。ここで、記載されているＨＥ０６６４２またはＨＥ０６．６４２または０６．６４２は、ＷＯ２００８／０２２２９５におけるｈｅ０６．６４２−２の配列と同一である可変ドメイン配列番号：１４および１５を含む。
【００２１】
ＰＲＬＲ媒介シグナリングおよび増殖の不活化を扱う異なるリードアウトパラダイム(readout paradigm)で、その種特異性および力価(potency)ならびに効力(efficacy)を決定した。増殖アッセイは、ヒトＰＲＬＲ（実施例１）、マウスＰＲＬＲ（実施例２）またはアカゲザルＰＲＬＲ（実施例３）のいずれかを安定にトランスフェクトしたＢａ／Ｆ細胞株において行った。抗体Ｍａｔ３は、ヒト、マウスおよびアカゲザルＰＲＬＲを有する細胞の増殖を完全に阻害した（実施例１−３）。抗体ＨＥ０６６４２（ＷＯ２００８／０２２２９５）は、マウスＰＲＬＲを有する細胞で不活性であり、Ｍａｔ３と比較して、アカゲザルＰＲＬＲ細胞で強く減少した活性を示した。抗体Ｍａｔ３はまた、抗体ＨＥ０６．６４２よりもヒトＰＲＬＲでさらに強力であった。また、Ｍａｔ３が、ＨＥ０６４２２よりもより強い力価でラットＮＢ２リンパ腫細胞増殖を阻害することを証明する。細胞増殖アッセイの他にも、ヒトまたはマウスＰＲＬＲ（実施例１２）のいずれかを安定にトランスフェクトし、かつＬＨＲＥ（乳腺刺激ホルモン応答エレメント）の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使って、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。これらの系を使用することにより、ＰＲＬＲ媒介シグナリングに依存するプロモーターが、Ｍａｔ３の存在下でオフになることを確認することができた。抗体ＨＥ０６．６４２はマウスＰＲＬＲ媒介シグナリングを効率よくブロックできないことが、再び明白になった。
【００２２】
結論として、したがって、抗体Ｍａｔ３は、マウスおよびサルモデルにおけるＰＲＬＲ媒介シグナリングの阻害を試験するために適切である。
【００２３】
該抗体は、ＨＥ０６６４２と翻訳されるヒト生殖細胞株Ｖ遺伝子と非常に類似する可変ドメインを含む。図６は、ＶＨおよびＶＬドメインが翻訳されるヒト生殖細胞株重鎖Ｖおよびラムダ軽鎖Ｖ遺伝子とそれぞれ９０％同一であることを示す［VBASE2 database; Retter I, Althaus HH、Munch R, Muller W: VBASE2, an integrative V gene database. Nucleics Res. 2005 Jan 1;33 (Database issue):D671-4］。ＨＥ０６６４２は、ＶＢＡＳＥ２において見られる、最も類似の翻訳されるＶＨ生殖細胞株配列と８９％同一性、最も類似の翻訳される生殖細胞株カッパ軽鎖Ｖ配列とわずか８０％同一性を示す。この見出したことは、Ｍａｔ３で患者を処置するとき、免疫原性の危険性をさらに低くする機会を提供する。
【００２４】
ヒト、サルおよびマウスＰＲＬＲの細胞外ドメインとＭａｔ３およびＨＥ０６６４２の結合試験は、両方の抗体がこれらの精製ドメインと相互作用することを示す（以下の実施例１０および表１参照）。しかしながら、これらのドメインが細胞表面上に発現されるとき、Ｍａｔ３とＨＥ０６６４２間のより大きな違いを観察することができる。最も顕著には、Ｂａ／Ｆ細胞がマウスＰＲＬＲを発現するとき、ＨＥ０６６４２はマウスＰＲＬＲに結合しないが、Ｍａｔ３は結合する（表２および図５および実施例９）。この見出したことは、Ｍａｔ３が、ＨＥ０６６４２と対照的に、マウスＰＲＬＲ媒介シグナリングおよび増殖をブロックするという観察と一致する。精製されるとき、ならびに細胞表面上に発現されるとき、Ｍａｔ３およびＨＥ０６６４２により結合されるヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインにおけるペプチドスキャンは、以前に報告された（ＷＯ２００８／０２２２９５）ＨＥ０６６４２のように、Ｍａｔ３がサブドメインＳ２に結合することを示した（実施例１１）。さらに、該スキャンは、Ｍａｔ３とＨＥ０６６４２間のＳ２ドメインへの結合における違いがあることを示した（図８）。最近、このようなペプチドスキャンにより観察される抗体の結合の違いが抗体の性質の違いを説明することを可能にすることが公開された（Niederfellner et al., Blood. 2011, Mar 28. doi:10.1182/blood-2010-09-305847）。結論として、該ペプチドスキャンは、なぜ抗体Ｍａｔ３がＨＥ０６６４２と比較して異なる種特異性および効力を示すのかを示す。
【００２５】
プロラクチン受容体媒介シグナリングと拮抗する表５（配列番号．１−１０）におけるヒトモノクローナル抗体Ｍａｔ３またはその抗原結合性フラグメントを提供する。該抗体は、ＰＲＬＲ（配列番号１２）または配列番号１２のヒト多型変異体、例えばPNAS 105 (38), 14533, 2008およびJ. Clin. Endocrinol. Metab. 95 (1), 271, 2010に記載されているＩ１４６ＬおよびＩ７６Ｖ変異体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する。さらに、該抗体は、アカゲザルおよびカニクイザルＰＲＬＲ（配列番号：１１）ならびにマウスＰＲＬＲ（配列番号：１３）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合する。
【００２６】
１つの態様において、ヒト抗体Ｍａｔ３、またはそのヒト化、ヒト操作もしくはキメラ抗体もしくは抗原結合性フラグメントを記載しており、該抗体は、配列番号：３の核酸配列および配列番号：１のアミノ酸配列と対応する可変重鎖領域ならびに配列番号：４の核酸配列および配列番号：２のアミノ酸配列と対応する可変軽鎖領域を含み、プロラクチン受容体媒介シグナリングと拮抗する。
【００２７】
ある実施形態では、上述した抗体のＣＤＲを含む抗体または抗原結合性フラグメントであって、可変重鎖が配列番号５、６および７に対応するＣＤＲ配列を含有し、可変軽鎖が配列番号８、９、および１０に対応するＣＤＲ配列を含有するもの。
【００２８】
本発明のもう一つの実施形態においては、抗体Ｍａｔ３は、ヒト、サルおよびマウス由来のＰＲＬＲの細胞外ドメインの１つ以上の領域に特異的に結合する抗原結合領域からなり、ここで、ヒトＰＲＬＲのアミノ酸配列は、配列番号：１２および配列番号：１２のヒト多型変異体の位置１から２１０のアミノ酸配列により、配列番号：１１のサルＰＲＬＲおよび配列番号：１３のマウスＰＲＬＲの位置１から２１０のアミノ酸配列により示される。
【００２９】
本発明のもう一つの実施形態において、Ｍａｔ３は、抗原結合領域からなり、ここで、ヒト、サルおよびマウス由来のＰＲＬＲの細胞外ドメインに対するアフィニティは、少なくとも１００ｎＭ、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約３０ｎＭ未満であり、さらに好ましくは約１０ｎＭ未満である。
【００３０】
もう一つの実施形態において、抗体Ｍａｔ３は、ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインの１つ以上の領域に特異的に結合する抗原結合領域からなり、ここで、アフィニティは、少なくとも１０ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ未満である。
【００３１】
また、重鎖定常ドメインが修飾されたまたは無修飾のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を決定する上述Ｍａｔ３も、本発明の目的である。
【００３２】
表１は、直接固定化した抗体上でのヒトＰＲＬＲ（配列番号：１２）、アカゲザルおよびカニクイザルＰＲＬＲ（配列番号：１１、Ｆｃ−Ｈｉｓ融合物は、タンパク質分解性第Ｘａ因子消化により除去されている）およびマウスＰＲＬＲ（配列番号：１３）の単量体型細胞外ドメイン（アミノ酸１−２１０）による表面プラズモン共鳴（Biacore）で決定された、本発明の抗体Ｍａｔ３の解離定数および解離速度の要約を提供する。
【００３３】
表１：表面プラズモン共鳴により、ヒトＩｇＧ分子としてＭａｔ３に関して決定されたＨＥＫ２９３細胞中で発現したヒト、アカゲザル／カニクイザルおよびマウスＰＲＬＲの細胞外ドメインの一価(monovalent)解離定数および解離速度（実施例１０参照）
【表１】
0005859641.tif 000002
【００３４】
ＷＯ２００８／０２２２９５においてＨＥ０６６４２について記載されているアフィニティは、ヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインに対して２．６ｘ１０−９Ｍ、カニクイザルＰＲＬＲの対応するドメインに対して３８．９ｘ１０−９ＭおよびマウスＰＲＬＲの対応するドメインに対して２．７ｘ１０−９Ｍである。
【００３５】
抗体Ｍａｔ３の細胞ベースのアフィニティは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）とスキャッチャード解析との組合せによって決定された（実施例９）。
【００３６】
表２は、ヒトおよびアカゲザルＰＲＬＲでそれぞれ安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株に対するヒトＩｇＧ２分子としてのＭａｔ３の結合力(binding strength)を表す。
【００３７】
表２：ヒトおよびアカゲザルＰＲＬＲでそれぞれ安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株に対するＦＡＣＳによって決定されたＩｇＧ２フォーマットにおける抗ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３の細胞ベースの結合力価(binding potency)（実施例９参照）
【表２】
0005859641.tif 000003
【００３８】
抗体生成
ヒトおよびマウスＰＲＬＲを機能的にブロックすることができる一群の抗体を単離するために、ｓｃＦｖフラグメントとＦａｂフラグメントをそれぞれ発現する２つのフォーマットの、Ｂｉｏｉｎｖｅｎｔ製のｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）と呼ばれる合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリー（Soederlind et al, 2000, Nature BioTechnology. 18, 852-856）を、並行して調べた。ｓｃＦｖ選択またはＦａｂ選択に使用したターゲットは、ビオチン化変異体（ＮＨＳ−ＬＣビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ）および非ビオチン化変異体として適用したヒトＰＲＬＲの可溶性ＥＣＤ（配列番号１２のアミノ酸位置１〜２１０）およびマウスＰＲＬＲの可溶性ＥＣＤ（配列番号１３のアミノ酸位置１〜２１０）、ならびにＰＲＬＲを発現するヒト乳がん細胞株Ｔ４７Ｄであった。
【００３９】
ファージディスプレイ技術（ＰＤＴ）におけるさまざまなアプローチの組み合わせを使用して、高アフィニティのＰＲＬＲ特異的なヒトモノクローナル抗体を、タンパク質パンニングと全細胞パンニングの組み合せおよび特別なツールの開発によって単離した。これらのパンニングツールおよびスクリーニング方法には、Ｆｃドメインとの融合物として組換え発現させたヒトおよびマウスＰＲＬＲのＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、それぞれカタログ番号１１６７−ＰＲおよび１３０９−ＰＲ；ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ１の位置１００〜３３０にそれぞれ融合された、それぞれ配列番号１２および１３の位置１〜２１６）、６ヒスチジンタグとの融合物として組換え発現させたヒトＰＲＬＲの細胞外ドメイン（配列番号１２）、それぞれヒトおよびマウスＰＲＬＲをそれぞれ安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３およびマウスリンパ腫細胞株Ｂａ／Ｆ、ならびにそれぞれＰＲＬＲを天然に発現する乳がん細胞株Ｔ４７Ｄおよびラットリンパ腫細胞Ｎｂ２が含まれると共に、細胞表面上にディスプレイされたＰＲＬＲに優先的に結合する、マウス由来のＰＲＬＲに対して交差反応性である、中和抗体を同定することが可能なパンニング手法およびスクリーニングアッセイの開発が含まれる。
【００４０】
スクリーニングは、組換え発現させた抗原を用いるＥＬＩＳＡ試験において、まず最初にヒトＰＲＬＲに関して、そして最終的にマウスＰＲＬＲに関して、バインダー(binder)を同定することによって行った。これらの特別な方法の組み合わせにより、他のものから抗体「００５−Ｃ０４」の単離が可能になった。
【００４１】
ヒトＰＲＬＲおよびマウスＰＲＬＲの細胞外ドメインにおける「００５−Ｃ０４」のアフィニティ成熟により、有益な置換は、実施例８に記載されている処理にしたがって同定された。最後に、改善されたアフィニティに対して有益である個々の置換は、抗体の熱安定性に対する影響に関して評価した。とりわけ、（例えば、温度上昇による）成熟抗体の変性中のＦａｂドメインの共同アンフォールディングは、保証されるはずである（共同アンフォールディングに関する文献：Roethlisberger, D. et al., J. Mol. Biol. 2005: 347, 773-789）。抗体Ｍａｔ３は、上記抗体発見および成熟アプローチから生じた。
【００４２】
ペプチド変異体
本発明の抗体は、ここに提供する具体的ペプチド配列に限定されない。むしろ、本発明はこれらのポリペプチドの変異体も包含する。本開示ならびに従来から利用できる技術および参考文献を参照して、当業者は、本明細書に開示する抗体の機能的変異体を製造し、試験し、利用することができ、それと同時に、ＰＲＬＲに結合し、ＰＲＬＲを機能的にブロックする能力を有する変異体が、本発明の範囲に包含されることを理解するであろう。
【００４３】
変異体には、例えば、本明細書に開示するペプチド配列と比較して改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を少なくとも１つは有している抗体が含まれうる。この概念をより良く説明するために、抗体構造を以下に簡単に説明する。
【００４４】
抗体は２本のペプチド鎖で構成され、それぞれが１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインと可変領域（ＶＬ、ＶＨ）を含有し、このうち後者は、いずれも、４つのＦＲ領域（ＶＨ：ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３、ＨＦＲ４；ＶＬ：ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３、ＬＦＲ４）と、その間に配置された３つのＣＤＲ（ＶＬ：ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３；ＶＨ：ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）から構成されている。抗原結合部位は１つ以上のＣＤＲによって形成されるが、ＦＲ領域はＣＤＲに構造的フレームワークを提供しており、それゆえに、抗原結合において重要な役割を果たしている。ＣＤＲまたはＦＲ領域中のアミノ酸残基を１つ以上改変することによって、当業者は、変異したまたは多様化した抗体配列をルーチンに生成させることができ、それらを、例えば新しい性質または改良された性質を求めて、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【００４５】
図４に、可変ドメインＶＬおよびＶＨ中の各アミノ酸位置に番号を付与するためのスキームを示す。表３（ＶＨ）および表４（ＶＬ）では、本発明の抗体Ｍａｔ３についてＣＤＲ領域を詳述し、所与の位置におけるアミノ酸を、対応するコンセンサス配列または「マスター遺伝子(master gene)」配列（ここではＣＤＲ領域が「Ｘ」で記されている）と比較している。表５および表６は、本発明において提供される抗体、抗体フラグメントおよびＰＲＬＲ変異体に配列番号を割り当てるのに役立つ。
【００４６】
表３：ＣＤＲの注釈を含む抗体Ｍａｔ３のＶＨ配列
【表３】
0005859641.tif 000004
【００４７】
表４：ＣＤＲの注釈を含む抗体Ｍａｔ３のＶＬ配列
【表４】
0005859641.tif 000005
【００４８】
表５：抗体の配列
【表５】
0005859641.tif 000006
【００４９】
表６：ヒト、サルおよびマウス由来のＰＲＬＲの細胞外ドメインの配列
【表６】
0005859641.tif 000007
【００５０】
当業者は、表３、４および５のデータを使って、本発明の範囲に包含されるペプチド変異体を設計することができる。変異体は１つ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築することが好ましく、また変異体は、１つ以上の改変されたフレームワーク領域（ＦＲ）も有し得る。例えば、ペプチドＦＲドメインが改変されていてもよく、そこでは、生殖細胞株配列と比較して残基に変動がある。
【００５１】
さらにまた、変異体は、成熟(maturation)によって、すなわち、ある抗体を最適化のための出発点として使用し、その抗体中の１つ以上のアミノ酸残基、好ましくは１つ以上のＣＤＲ中のアミノ酸残基を多様化し、その結果生じた一群の抗体変異体を、改良された性質を有する変異体を求めてスクリーニングすることによって得ることもできる。特に好ましいのは、ＶＬのＬＣＤＲ３、ＶＨのＨＣＤＲ３、ＶＬのＬＣＤＲ１および／またはＶＨのＨＣＤＲ２中の１つ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、トリヌクレオチド変異誘発(trinucleotide mutagenesis)（ＴＲＩＭ）技術を使って一群のＤＮＡ分子を合成することによって行うことができる［Virnekaes, B., Ge, L., Plueckthun, A., Schneider, K.C., Wellnhofer, G., and Moroney S.E. (1994) Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucl. Acids Res. 22, 5600、実施例８も参照］。
【００５２】
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載する抗体ペプチド配列の全体的分子構造を保存しているポリペプチド変異体を作製することができる。個々のアミノ酸の性質を考えれば、いくつかの合理的な置換が、当業者にはわかるだろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。
【００５３】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；（ｃ）陽性荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；（ｄ）陰性荷電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）のグループ内で行うことができる。また、グリシンおよびプロリンは、αヘリックスを破壊するその能力に基づいて、互いに置換することができる。また、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどといった一定のアミノ酸は、αヘリックス中に見いだされることの方が多く、一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、βプリーツシート中に見いだされることの方が多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンはターン中によく見いだされる。いくつかの好ましい置換は、次に挙げるグループ内で行うことができる：（ｉ）ＳおよびＴ；（ｉｉ）ＰおよびＧ；ならびに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬおよびＩ。既知の遺伝暗号、組換え技法および合成ＤＮＡ技法を考慮すれば、当業者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【００５４】
本明細書において、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、それら配列間で同一なアミノ酸の百分率を示す。「配列相同性」は、同一であるか、または保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸の百分率を示す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、以下のアミノ酸配列を含む。
ａ．ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、８個のアミノ酸のうち少なくとも７個において配列番号：５と同一である、
ｂ．ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、１９個のアミノ酸のうち少なくとも１４個、より好ましくは１９個のアミノ酸のうち１９個、より好ましくは１９個のアミノ酸のうち１６個、より好ましくは１９個のアミノ酸のうち１７個、またはさらにより好ましくは１９個のアミノ酸のうち１８個において配列番号：６と同一である、
ｃ．ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、１１個のアミノ酸のうち少なくとも８個、より好ましくは１１個のアミノ酸のうち９個、またはさらにより好ましくは１１個のアミノ酸のうち１０個において配列番号：７と同一である、
ｄ．ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は、１４個のアミノ酸のうち少なくとも１２個、またはより好ましくは１４個のアミノ酸のうち１３個において配列番号：８と同一である、
ｅ．ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は、７個のアミノ酸のうち少なくとも４個、より好ましくは７個のアミノ酸のうち５個、またはさらにより好ましくは７個のアミノ酸のうち６個において配列番号：９と同一である、
ｆ．ＬＣＲ３のアミノ酸配列は、１２個のアミノ酸のうち少なくとも１１個において配列番号：１０と同一である。
【００５５】
本発明のＤＮＡ分子
本発明は本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子にも関係する。これらの配列には、配列番号３および４に示すＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００５６】
本発明のＤＮＡ分子は本明細書に開示する配列に限定されるわけではなく、その変異体も包含する。本発明に包含されるＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるその物理的性質に言及することによって記述することができる。ＤＮＡを使ってその相補体(complement)を同定することができ、ＤＮＡは二重鎖であることから、核酸ハイブリダイゼーション技法を使って、その等価物またはホモログを同定することができることは、当業者にわかるであろう。ハイブリダイゼーションが１００％未満の相補性で起こりうることもわかるであろう。しかし、条件を適当に選択すれば、ＤＮＡ配列を特定のプローブに対するその構造的関連性に基づいて弁別するために、ハイブリダイゼーション技法を使用することができる。そのような条件に関する指針については、Sambrook et al., 1989[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A laboratory manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, USA)]およびAusubel et al., 1995[Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Sedman, J. G., Smith, J. A., & Struhl, K.eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons]を参照されたい。
【００５７】
２つのポリヌクレオチド配列間の構造類似性は、それら２つの配列が互いにハイブリダイズするであろう条件の「ストリンジェンシー」の関数として表現することができる。本明細書において使用する用語「ストリンジェンシー」は、その条件がハイブリダイゼーションを嫌う度合を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌うので、そのような条件下では、構造的に最も近縁の分子だけが互いにハイブリダイズするであろう。逆に、非ストリンジェント条件は、低い構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションにとって有利になる。それゆえに、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接的に相関する。次の関係は、ハイブリダイゼーションと関連性とを相関させるのに役立つ（式中、Ｔｍは核酸二重鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．二重鎖ＤＮＡのＴｍは、ミスマッチ塩基対の数が１％増加するごとに１℃低下する。
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μ１＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。
【００５８】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、総ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在などといった数多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低温、長いプローブサイズ、および水素結合を破壊する薬剤の不在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階と「洗浄」段階の二段階で行われる。
【００５９】
まず最初に、結合段階では、ハイブリダイゼーションに有利な条件下で、プローブをターゲットに結合させる。この段階では、通常、温度を変えることによって、ストリンジェンシーが制御される。高ストリンジェンシーの場合、短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブを使用するのでない限り、温度は通常、６５℃〜７０℃である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡを含む［Ausubel et al., section 2.9, supplement 27 (1994)］。もちろん、異なっているが機能的には等価なバッファー条件も、数多く知られている。関連性の程度が低い場合は、低い温度を選ぶことができる。低ストリンジェンシー結合温度は約２５℃〜４０℃である。中ストリンジェンシーは少なくとも約４０℃〜約６５℃未満である。高ストリンジェンシーは少なくとも約６５℃である。
【００６０】
次に、過剰のプローブを洗浄によって除去する。よりストリンジェントな条件が通常、適用されるのは、この段階である。したがって、ハイブリダイゼーションによって関連性を決定する際に最も重要なのは、この「洗浄」段階である。洗浄溶液は、典型的には、より低い塩濃度を含有する。模範的な中ストリンジェンシー溶液の一つは２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する。高ストリンジェンシー洗浄溶液は、（イオン強度で）約０．２×ＳＳＣ未満の当量(equivalent)を含有し、好ましいストリンジェント溶液は約０．１×ＳＳＣを含有する。さまざまなストリンジェンシーに関連する温度は「結合」に関して上に述べたものと同じである。また、洗浄溶液は、典型的には、洗浄中に何度も交換される。例えば、典型的な高ストリンジェンシー洗浄条件は、５５℃で３０分間、２回洗浄すること、および６０℃で１５分間、３回洗浄することを含む。
【００６１】
したがって、本発明の主題は、本発明の抗体および抗原結合性フラグメントをコードする単離された核酸配列である。
【００６２】
本発明のもう一つの実施形態は、本発明の抗体をコードする上述の単離された核酸配列であって、核酸配列が表５に記載されているものである。
【００６３】
したがって本発明は、高ストリンジェンシー結合および洗浄条件下において表５に示す分子にハイブリダイズする核酸分子を包含し、ここで、そのような核酸分子は、本明細書に記載する性質を有する抗体またはそのフラグメントをコードする。（ｍＲＮＡの観点から見て）好ましい分子は、本明細書に記載するＤＮＡ分子の一つと少なくとも７５％または８０％（好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％）の配列同一性を有するものである。この分子は、プロラクチン受容体媒介シグナリングをブロックする。
【００６４】
機能的に等価な変異体
本発明の範囲に包含されるさらにもう一種類のＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物を基準にして記述することができる。これらの機能的に等価な遺伝子は、遺伝暗号の縮重ゆえに、配列番号１および２に見いだされるものと同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
【００６５】
本明細書に記載するＤＮＡ分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築できることはわかる。例えば、それらは、完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０〜約１５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドを効率よく合成する方法は、種々、利用することができる。Ausubel et al., section 2.11, Supplement 21 (1993)参照。Khorana et al., J. Mol. Biol. 72:209-217 (1971)によって初めて報告された方法で、オーバーラップしたオリゴヌクレオチドを合成し、アセンブルすることができる。Ausubel et al., supra, Section 8.2も参照されたい。好ましくは、適当なベクターへのクローニングが容易になるように、遺伝子の５’端および３’端にて操作(engineer)された好都合な制限部位を持つ合成ＤＮＡが設計される。
【００６６】
ここに示すとおり、変異体を生成させる方法は、本明細書に開示するＤＮＡの一つから出発し、次に部位特異的変異誘発を行うことである。Ausubel et al., supra, chapter 8, Supplement 37 (1997)参照。典型的な一方法では、ターゲットＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ媒体中にクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望のヌクレオチド改変を含有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主中に導入する。その結果生じる子孫の一部は所望の変種(mutant)を含有し、そのことは、ＤＮＡ配列決定を使って確認することができるであろう。また、子孫ファージが所望の変種になる確率を増加させるさまざまな方法を利用することができる。これらの方法は当業者にはよく知られており、そのような変種を生成させるためのキットが市販されている。
【００６７】
組換えＤＮＡコンストラクトおよび発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の１つ以上を含む組換えＤＮＡコンストラクトも提供する。本発明の組換えコンストラクトは、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターなどのベクターと一緒に使用され、そこに本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入される。
【００６８】
コードされた遺伝子はSambrook et al., 1989およびAusubel et al., 1989に記載の技法によって作製することができる。あるいは、例えば合成装置(synthesizer)を使って、ＤＮＡ配列を化学的に合成することもできる。例えば、引用によりそのまま本明細書に組み込まれるＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（1984, Gait, ed., IRL Press, Oxford）に記載の技法を参照されたい。当業者は、可変ドメインをコードするＤＮＡを、変異させたまたは変異させていないさまざまなヒトＩｇＧアイソタイプまたはその誘導体の定常領域をコードする遺伝子フラグメントと、融合することができる。当業者は、組換えＤＮＡ技術を応用して、例えばグリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリンを３回含有する１５アミノ酸長などのリンカーを使って、両方の可変ドメインを単鎖フォーマットに融合することができる。本発明の組換えコンストラクトは、コードされているＤＮＡのＲＮＡ産物および／またはタンパク質産物を発現する能力を有する発現ベクターで構成される。ベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されたプロモーターなどといった調節配列を、さらに含みうる。ベクターはさらに選択可能マーカー配列を含みうる。挿入されたターゲット遺伝子コード配列の効率的な翻訳には、特別な開始シグナルおよび細菌分泌シグナルも要求されうる。
【００６９】
本発明は、本発明のＤＮＡを少なくとも１つは含有する宿主細胞を、さらに提供する。宿主細胞は、それに合う発現ベクターを入手できるのであれば、基本的にどの細胞であってもよい。それは、例えば、哺乳類細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であってもよいし、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。宿主細胞への組換えコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション(DEAE, dextran mediated transfection)、エレクトロポレーションまたはファージ感染によって達成することができる。
【００７０】
細菌発現
細菌での使用に役立つ発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的プロモーターに対して作動可能な読み枠(reading phase)で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持が保証されるように、また所望であれば、宿主内での増幅がもたらされるように、１つ以上の表現型選択可能マーカーと複製起点とを含むであろう。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、およびシュードモナス(Pseudomonas)属、ストレプトミセス(Streptomyces)属、およびスタフィロコッカス(Staphylococcus)属のさまざまな種が含まれる。
【００７１】
細菌ベクターは、例えばバクテリオファージベース、プラスミドベース、またはファージミドベースのベクターであることができる。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターｐＢ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の要素を含有する市販のプラスミドに由来する選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含有することができる。適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適当な細胞密度まで成長させた後、選択したプロモーターを、適当な手段（例えば温度シフトまたは化学的誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞をさらに一定期間培養する。細胞を典型的には遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、その結果得られた粗抽出物を、さらなる精製のためにとっておく。
【００７２】
細菌系では、発現させるタンパク質の使用目的に応じて、いくつかの発現ベクターを、有利に選択することができる。例えば、抗体を生成させるために、またはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、前述のタンパク質を大量に生産しようとする場合は、例えば、精製が容易な融合タンパク質産物を高レベルに発現させるベクターが望ましいであろう。
【００７３】
それゆえに、本発明の目的の一つは、本発明の新規抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
【００７４】
哺乳類発現および精製
哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウイルス調節要素のさらなる説明およびその配列については、例えばStinskiによるＵ．Ｓ．５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵ．Ｓ．４，５１０，２４５、およびSchaffner et alによるＵ．Ｓ．４，９６８，６１５を参照されたい。組換え発現ベクターは複製起点および選択可能マーカーも含むことができる（例えばAxel et al.によるＵ．Ｓ．４，３９９，２１６、４，６３４，６６５およびＵ．Ｓ．５，１７９，０１７を参照されたい）。適切な選択可能マーカーには、そのベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子は、メトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与する。
【００７５】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの標準的技法を使って行うことができる。
【００７６】
ここで提供される抗体、その抗原結合部分または誘導体を発現させるのに適した哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）［例えばR.J.Kaufman and P.A.Sharp (1982) Mol.Biol.159:601-621に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるUrlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む］、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。一部の実施形態では、発現したタンパク質が宿主細胞を成長させる培地中に分泌されるように、発現ベクターが設計される。抗体、その抗原結合部分または誘導体は、標準的なタンパク質精製法を使って培養培地から回収することができる。
【００７７】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、例えば限定するわけではないが、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどといった周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収し精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に使用することができる。例えばColligan「Current Protocols in Immunology」または「Current Protocols in Protein Science」(John Wiley & Sons, NY, N.Y.,)(1997-2001)の例えばＣｈａｐｔｅｒ  １、４、６、８、９、１０を参照されたい（これらは、それぞれ引用により、全て本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントには、天然精製産物(naturally purified product)、化学合成手法の生成物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核宿主から組換え技法によって生産された産物が含まれる。組換え生産手法に使用する宿主に依存して、本発明の抗体はグリコシル化体であることも、非グリコシル化体であることもできる。そのような方法は、多くの標準的な実験マニュアル、例えばSambrook, supra, Sections 17.37-17.42;Ausubel, supra、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １０、１２、１３、１６、１８および２０に記載されている。
【００７９】
それゆえに、ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞も本発明の目的であり、ここで、宿主細胞は、哺乳動物細胞などの高等真核宿主細胞、酵母細胞などの下等真核宿主細胞であることができ、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。
【００８０】
本発明のもう一つの目的は、宿主細胞を使って抗体および抗原結合性フラグメントを生産する方法であって、宿主細胞を適切な条件下で培養し、該抗体を回収することを含む方法である。
【００８１】
それゆえに、本発明のもう一つの目的は、本発明の宿主細胞を使って生産され、少なくとも９５重量％均一にまで精製された、本発明の抗体である。
【００８２】
子宮内膜症および腺筋症（内性子宮内膜症）
子宮内膜症は、子宮内膜組織（腺および間質）が子宮腔外に存在することを特徴とする良性エストロゲン依存性婦人科障害である。子宮内膜症病変は主として骨盤腹膜上、卵巣内および直腸膣中隔内に見いだされる（Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. 24:235-238, 1997）。子宮内膜症はしばしば不妊および月経困難症などの疼痛症状を伴う。また、多くの患者は自己免疫疾患を患っている（Hum. Reprod. 17(19):2715-2724, 2002）。内性子宮内膜症とも呼ばれている子宮腺筋症は、子宮に制限された子宮内膜症の亜型(subform)をいう。子宮腺筋症の場合、子宮内膜腺は子宮筋層および子宮壁に浸潤する。
【００８３】
移植説(transplantation theory)によれば、患者でも健常女性でも、逆行性月経によって、子宮内膜フラグメントが腹膜腔中に流される（Obstet. Gynecol. 64:151-154, 1984）。患者の骨盤腔における子宮内膜症病変の樹立の成功には、４つの主要因が決定的に関与しているようである：
ａ）月経周期の分泌期後期において、健常女性の子宮内膜細胞はアポトーシス性になる。患者では、子宮内膜細胞のアポトーシスの程度が明確に低下している（Fertil. Steril. 69:1042-1047,1998）。それゆえに、患者では、逆行性月経によって腹膜腔中に流れ込んだ子宮内膜フラグメントが死なずにうまく移植性転移(implant)する確率が、健常女性より高い。
ｂ）異所性子宮内膜フラグメントが腹膜内で移植性転移(implantation)に成功して、長期間にわたって生き残るには、新しい血管の形成が必要である（British Journal of Pharmacology, 149:133-135, 2006）。
ｃ）患者は自己免疫疾患を患っており、したがって免疫系が損なわれている（Hum. Reprod. 17(19): 2002, 2715-2724, 2002）。このことから、無傷免疫応答−これは健常女性には存在するので−が、子宮内膜症病変の樹立の防止に役割を果たしているかもしれないという結論が導かれうる。
ｄ）病変は成長する必要があり、したがって分裂促進刺激および成長因子の存在に依存する。
【００８４】
子宮内膜症の処置には、現在、次に挙げるアプローチが存在する：
ａ）性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）類似体：卵巣エストラジオール合成の抑制をもたらし、その成長をエストラジオールの存在に決定的に依存している異所性子宮内膜移植性転移物(implant)の萎縮を誘発する。
ｂ）アロマターゼ阻害剤：子宮内膜移植性転移物によるエストラジオールの局所的産生を阻害し、アポトーシスを誘発し、異所性子宮内膜フラグメントの増殖を阻害する。
ｃ）選択的エストロゲン受容体モジュレーター：正常子宮内膜および異所性移植性転移物においてエストロゲン受容体アンタゴニスト活性を有するので、移植性転移した異所性子宮内膜組織の萎縮をもたらす。
ｄ）プロゲステロン受容体アゴニスト：正常および異所性子宮内膜細胞の増殖を阻害し、分化およびアポトーシスを誘発する。
ｅ）併用経口避妊薬：現状を維持し、疾患の進行を防止し、異所性および正所性子宮内膜の萎縮を誘発する。
ｆ）病変の外科的切除。
【００８５】
ＧｎＲＨ類似体、ＳＥＲＭ、およびアロマターゼ阻害剤は、重篤な副作用を有し、子宮内膜症を患っている若い女性に顔面紅潮および骨量減少をもたらす。プロゲステロン受容体アゴニストによる処置は、排卵抑制、不規則月経とそれに続く無月経、体重増加およびうつ病につながる。静脈血栓塞栓症(venous thrombembolism)のリスクが増加するために、併用経口避妊薬は、３５歳より高齢の女性、喫煙者および過体重を患っている個体には適応がない。病変の外科的切除は再発率が高くなりがちである。
【００８６】
本発明の抗体は、下垂体が産生したプロラクチンおよび局所的に産生されたプロラクチンによって刺激された、または活性化ＰＲＬＲ変異による、ＰＲＬＲ媒介シグナルを妨害し、それゆえに、下垂体プロラクチン分泌だけを妨害するドーパミン２受容体アゴニストよりも効果的である。
【００８７】
したがって、本発明の目的は、医薬としての本発明に記載されている抗体または抗原結合性フラグメントである。
【００８８】
ＰＲＬおよびＰＲＬＲは子宮において発現し、正常な子宮生理機能に役割を果たす。ＰＲＬは強力なマイトジェンとして作用することができ、免疫調整的役割を有している。本発明では、ＰＲＬ／ＰＲＬＲ系の改変がヒト子宮内膜症において役割を果たすことを示す。定量Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲによる健常女性の子宮内膜ならびに患者の子宮内膜および病変におけるＰＲＬおよびＰＲＬＲの発現の分析（実施例４参照）を、図１および２に示す。
【００８９】
図１（ＰＲＬ発現）および図２（ＰＲＬＲ発現）に示されるとおり、ＰＲＬとその受容体はどちらも、子宮内膜症病変においては、強くアップレギュレートされる。これらの発見は驚くべきことであり、ヒト子宮内膜病変においてＰＲＬＲ発現がほぼ完全に存在しないことを記載する以前に公開された試験（Acta Obstet Gynecol Scand 81:5-10, 2002）と対照的である。
【００９０】
本発明の発見は、オートクリン型ＰＲＬシグナリングが子宮内膜症病変の樹立、成長および維持に基本的役割を果たすという実験的証拠を、初めてもたらすものである。
【００９１】
ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３は、マウスでの内性子宮内膜症、すなわち子宮腺筋症の動物モデルにおける試験で、成功を収めた（実施例５参照）。腺筋症は、子宮内膜の子宮筋層における子宮内膜腺の浸潤再成長を特徴とする。これは、子宮に限定される子宮内膜症形態−無月経種(non-menstruating species)が発症しうる子宮内膜症の唯一の形態−に似ている。
【００９２】
子宮内膜症を患っている患者の臨床処置に有効なダナゾールは、子宮腺筋症の処置にも有効である（Life Sciences 51:1119-1125, 1992）。しかし、ダナゾールはアンドロゲン性プロゲスチン(androgenic progestin)であり、若い女性に重篤なアンドロゲン性副作用をもたらすことが、その使用を制限する。
【００９３】
本発明の抗体は、子宮内膜症の新しい処置または予防を提供するための課題を解決し、現在の標準的治療法よりも副作用が少ない。
【００９４】
本発明のもう一つの態様は、子宮内膜症および腺筋症（内性子宮内膜症）を処置または予防するための、本発明に記載する抗体Ｍａｔ３および抗体抗原結合性フラグメントの使用である。
【００９５】
良性乳房疾患および乳房痛
良性乳房疾患は、線維嚢胞性乳房疾患、線維腺腫、乳房痛、および大嚢胞(macrocyst)など、さまざまな症状を包含する。閉経前女性の３０〜５０％は線維嚢胞性乳房疾患を患っている（Epidemiol Rev 19:310-327, 1997）。女性の年齢に依存して、良性乳房疾患は異なる表現型で現れうる（J Mammary Gland Biol Neoplasia 10:325-335, 2005）。すなわち、正常乳房において小葉発達が起こる早期生殖相（１５〜２５歳）中は、良性乳房疾患は線維腺腫をもたらす。単一の巨大線維腺腫ならびに複数の腺腫が観察される。これらの線維腺腫は間質細胞および上皮細胞で構成され、小葉から生じる。成熟生殖相（２５〜４０歳）においては、各月経周期中に乳房が周期的変化を起こす。罹患女性には、周期的乳房痛と、その乳房中にいくつかの小結節を認められる。その後（３５〜５５歳）、正常乳房は退縮するのに対して、罹患乳房では、大嚢胞ならびに異型性を伴うおよび異型性を伴わない上皮過形成を観察することができる。増進した上皮細胞増殖を伴うこれらの形態の良性乳房疾患では、乳癌を発生するリスクが高まっている。このリスクは、増殖細胞画分に細胞異型性が存在する場合には、１１％にまで達しうる（Zentralbl Gynaekol 119:54-58,1997）。６０〜８０歳の女性の２５％も良性乳房疾患を患っており、エストロゲン補充療法(replacement therapy)または脂肪症(adiposity)は、閉経後も良性乳房疾患が持続する理由である（Am J Obstet Gynecol 154:161-179, 1986）。
【００９６】
線維嚢胞性乳房疾患の病態生理は、エストロゲン優位およびプロゲステロン欠乏によって決定され、これは、結合組織の過剰増殖（線維症）をもたらし、これに続いて条件的(facultative)上皮細胞増殖が起こる。上述のように、線維嚢胞性病変内において増進した上皮細胞増殖を呈する患者では、乳がんのリスクが上昇する。臨床的には、線維嚢胞性乳房疾患は乳房疼痛(breast pain)および乳房圧痛(breast tenderness)を呈する。線維嚢胞性乳房疾患を有する患者の７０％は、黄体機能不全または無排卵を患っている（Am J Obstet 154:161-179,1986）。黄体機能不全は、プロゲステロンレベルの低下とエストロゲン優位をもたらす。
【００９７】
乳房痛（乳房疼痛）は、女性の約７０％を、その生殖期間(reproductive lifespan)のどこかの時点で冒す。乳房疼痛は、月経前症候群の他の基準と関連することも関連しないこともある。乳房痛を患う女性は、視床下部下垂体軸の刺激後に、過剰なプロラクチン放出をもって応答することが証明されている（Clin Endocrinol 23:699-704,1985）。
【００９８】
良性乳房疾患および乳房痛の標準的な治療法は次のとおりである。
【００９９】
１）ブロモクリプチン
ドーパミンアゴニストとしてのブロモクリプチンは、下垂体プロラクチン合成だけをブロックし、乳腺上皮細胞におけるプロラクチンの局所的合成はブロックしない。それゆえに、これは、上昇した全身性プロラクチンレベルに依拠する形態の乳房痛および良性乳房疾患にしか有効でない。ブロモクリプチンの主な副作用は、悪心、嘔吐、浮腫、低血圧、めまい、脱毛、頭痛、および幻覚である。
【０１００】
２）ダナゾール
ダナゾールは、その抗性腺刺激活性(antigonadotrophic activity)によって良性乳房疾患に観察されるエストロゲン優位に対抗するアンドロゲン性プロゲスチンである。主な副作用は、月経不順、うつ病、ざ瘡、多毛症、声の低音化(voice deepening)、および顔面紅潮、ならびに体重増加である。
【０１０１】
３）タモキシフェン
タモキシフェンは、乳房では抗エストロゲン活性を、また子宮ではエストロゲン活性を有する、選択的エストロゲン受容体モジュレーターである。主な副作用は、骨量減少および顔面紅潮などの閉経後症状、卵巣嚢胞、および子宮内膜癌である。
【０１０２】
４）プロゲスチン
プロゲスチンは、下垂体性腺軸の抑制、排卵阻害およびエストロゲン枯渇によって良性乳房疾患を阻害する。エストロゲン枯渇は骨量減少および顔面紅潮などの閉経症状につながる。
【０１０３】
５）低用量併用経口避妊薬
この処置は、３５歳より高齢の女性、喫煙者ならびに糖尿病患者および過体重患者には適応がない。
【０１０４】
一般に、プロラクチンレベルは、良性乳房疾患を有する女性の３分の１では増加していることが見いだされている。エストロゲンは下垂体プロラクチン分泌を増進するので、血清プロラクチンレベルの増加は、この疾患におけるエストロゲンの優位性の結果であると考えられている。線維嚢胞性乳房疾患の亜型に似た多発性乳腺腺腫(multiple breast adenoma)を患っている女性には活性化ＰＲＬＲ変異がしばしば存在することが報告されている（Paul Kelly, Breast Congress Turin, 2007およびProc Natl Acad Sci 105: 14533-14538;2008)。
【０１０５】
良性乳房疾患、乳房痛および月経前の胸の張り(breast tension)は、一つの共通する病態生理学的機序、すなわち増進したプロラクチンシグナリングに依拠する。上昇したプロラクチンシグナリングは、
・全身性高プロラクチン血症（下垂体腺腫によるもの）
・局所的高プロラクチン血症（増殖する乳腺上皮細胞におけるプロラクチン合成によるもの）。局所的高プロラクチン血症は、上昇した血中プロラクチンレベルには移行しない；
・正常プロラクチンレベルの存在下で構成的に活性なＰＲＬＲシグナリング（活性化ＰＲＬＲ変異によるもの）
の結果でありうる。
【０１０６】
一定の形態の良性乳房疾患が乳がんを生じさせうることを考えると、この疾患を処置する医学的必要性がある。
【０１０７】
良性乳房疾患の前臨床モデルにおける中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３の効力を証明するために、全身性高プロラクチン血症に基づくマウスモデルを使用した。実施例６で述べるように、成体Ｂａｌｂ／ｃマウスに、下垂体同系移植片を腎被膜下に移植した（Methods in Mammary gland Biology and Breast Cancer Research, 101-107, 2000）。良性乳房疾患に対する本発明のマウスモデルにおいて、発癌物質、例えばＤＭＢＡは使用されていない。マウスは、増強された良性上皮細胞増殖に対するＭａｔ３抗体適用の結果を試験するために、下垂体を移植されたのみであった。以前の試験において、下垂体同種移植動物は発癌物質ＤＭＢＡでの添加において処理され、乳癌発生に対する種々のモノクローナルＰＲＬＲ抗体の効果が分析された（Am J Pathol 133:589-595,1988）。これらの抗体は乳癌の処置において有効であり、しかしながら、良性乳房疾患に対する効果は分析されなかった（Am J Pathol 133:589-595,1988）。
【０１０８】
本発明のモデルにおいて、全身性高プロラクチン血症は、無処置の未交尾対照マウスと比較して、乳腺における上皮細胞増殖の増進を引き起こし、側枝形成(sidebranching)および小葉腺胞発生を刺激した。実施例６で述べるように、中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３を、非特異的抗体と比較して、このＢａｌｂ／ｃマウスモデルにおいて、
・側枝形成および小葉腺胞発生をブロックする能力
・乳腺上皮細胞増殖を阻害する能力
・プロラクチンターゲット遺伝子ｅｌｆ５の発現を阻害する能力
について試験した。
【０１０９】
中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３は、側枝形成（図３Ａ）およびプロラクチンターゲット遺伝子ｅｌｆ５の発現（図３Ｂ）を阻害した。
【０１１０】
本発明のもう一つの態様は、閉経前女性および閉経後女性における良性乳房疾患および乳房痛を処置するための、本発明に記載する抗体Ｍａｔ３および抗原結合性フラグメントの使用である。
【０１１１】
抗体Ｍａｔ３によるＰＲＬＲ媒介シグナリングの遮断を受ける他の適応：
【０１１２】
非ホルモン雌性避妊：
雌性避妊のための現在のアプローチは、次のとおりである：
ａ）エストロゲンおよびプロゲスチンを含有する併用経口避妊薬。
プロゲストーゲン性コンポーネントは、視床下部−下垂体−性腺軸に対する負のフィードバックによって避妊効果を媒介する。エストロゲン性コンポーネントは、良好な出血制御を保証し、ターゲット細胞におけるプロゲステロン受容体の誘導によってゲスターゲン作用を増強する。
ｂ）プロゲスチンだけを含有する子宮内器具(intrauterine device)。
局所的に放出されるプロゲスチンは、子宮内膜を着床抵抗性状態(implantation-resistant state)にする。また、頸管粘膜が精子細胞にとってほとんど不透過性になる。
ｃ）プロゲスチン単独の丸剤およびインプラント。
プロゲスチンは、視床下部−下垂体−性腺軸に対する負のフィードバックによって排卵を阻害する。加えて、精子細胞に対する頸管粘膜の透過性が低下する。
ｄ）エチニルエストラジオールおよびプロゲスチンを含有する腟内リング(vaginal ring)。
併用経口避妊薬の主な副作用は静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）のリスクの上昇である。そのうえ、過体重の女性または喫煙女性は、狼蒼などの自己免疫疾患を患っている女性および３５歳より高齢の女性と共に、経口併用避妊薬を使用することができない。
プロゲスチンのみを含有する子宮内器具およびインプラントは、機能障害性子宮出血をもたらしうる。
プロゲスチン単独の丸剤は、不規則な出血パターン、点状出血(spotting)、無月経を引き起こしうる。異所性妊娠のリスクが増加する。体重増加および骨密度の低下がさらなる副作用である。
腟内リングは、膣炎、白帯下または駆血(expulsion)をもたらしうる。
【０１１３】
ＰＲＬＲ欠損(PRLR-deficient)マウスは数年前に作出されている（Genes Dev 11:167-178, 1997）。興味深いことに、ＰＲＬＲ欠損雌は完全に不妊であるが、雄マウスはそうではない。ＰＲＬＲ−／−雌は受精直後に卵発生の停止を呈した。すなわち、これらの雌は排卵が正常であるが、着床前発生の停止を示した。極めてわずかな卵母細胞だけが胚盤胞段階に到達し、変異雌では着床(implant)することができなかったが、移植後の野生型里親(foster mother)では正常な胚へと発生した。ＰＲＬＲ欠損マウスの不妊表現型は、プロゲステロン補給(supplementation)によって妊娠中期まで救出することができた。ＰＲＬＲ媒介シグナリングが、妊娠を可能にし維持するのに必要なプロゲステロンを産生する黄体の維持および機能に重要な役割を果たすことは、明白である。加えて、ＰＲＬＲ欠損雌は、腹部脂肪量およびレプチンレベルの低下を伴う体重の減少を呈したが、雄はそうではなかった。
【０１１４】
現在までのところ、不活化ヒトＰＲＬＲ変異は知られていないので、ヒト不妊におけるＰＲＬＲ媒介シグナリングの正確な役割は、まだ不明である。しかし、ヒトでも、妊娠の成功を可能にするには、最低限のプロラクチンレベルが必要であることを示す証拠は、増えつつある。高プロラクチン血性黄体機能不全ゆえに原発性不妊症を患っている患者が、ブロモクリプチンで処置された。いくつかの症例では、プロラクチンレベルが過剰に抑制されて、再び、短縮された黄体期が再出現した（Bohnet HG et al.「Lisuride and other dopamine agonists」D.B. Calne et al, Raven Press, New York, 1983）。これらのデータから、高および低プロラクチン血性状態は、雌性不妊と負に干渉すると結論された。これは、ＰＲＬとその受容体との相互作用によって説明することができる。低プロラクチンレベルの場合、十分な受容体活性がないのに対して、高プロラクチン血症の場合は、全ての受容体が１つのプロラクチン分子によってブロックされていて、もはや二量体化することができないので、やはり受容体活性は十分でない。言い換えると、プロラクチンに関する用量応答は、ベル形であり、最適な受容体活性化は、一定の濃度範囲でのみ達成される。患者における子宮内膜プロラクチン発現の欠如が早期着床不全をもたらすことを示す証拠は、もう一つの研究から得られている（Human Reprod. 19:1911-1916, 2004）。さらに、ＰＲＬＲ欠損マウスにおいて立証されているように、エクスビボで、プロラクチンは培養ヒト顆粒膜細胞のアポトーシスを防止することができ、それゆえに早期黄体機能を維持できることも示されている（Human Reprod. 18:2672-2677,2003）。
【０１１５】
上述の標準的アプローチと比較して、中和ＰＲＬＲ抗体による雌性避妊にはいくつかの利点がある：
・この抗体は、喫煙女性、過体重の女性、および高齢女性に使用することができ、紅斑性狼瘡(lupus erythematodes)を患っている女性にも使用することができる（ＰＲＬＲ抗体は狼蒼の処置および腹部脂肪の減少にさえ有益であるかもしれない。すなわちＰＲＬＲ欠損マウスは腹部脂肪が少なかった）；
・このＰＲＬＲ抗体はＶＴＥ（静脈血栓塞栓(venous thrombembolic)リスク）を上昇させない；
・併用経口避妊に使用されるエストロゲンおよびプロゲスチンとは対照的に、ＰＲＬＲ媒介シグナリングの中和は乳房上皮増殖の阻害につながり、妊性制御(fertility control)のためのホルモンアプローチとは対照的に、使用者を乳がんから防御することさえ考えられる。
【０１１６】
本発明のもう一つの目的は、標準的な処置と比較して副作用が少ない、雌性避妊のための抗体Ｍａｔ３の使用である。
【０１１７】
泌乳阻害
プロラクチンは出産後の泌乳に関与する主要ホルモンである。これはＰＲＬＲ欠損マウスの表現型によって立証される。ヘテロ接合マウスでさえ重度の泌乳障害を有し、その仔（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）に授乳することは全くできない（Frontiers in Neuroendocrinology 22:140-145, 2001）。
【０１１８】
女性は、多くの理由で、すなわち、乳児にとって潜在的に危険な薬物の、母体による摂取、重症感染症（乳腺炎、腎炎）、大量の分娩後出血、および糖尿病、癌、衰弱などといった重度の母体疾患、または新生児の疾患により、母乳栄養を停止する必要がある。現在、出産後の泌乳を阻害するには、ブロモクリプチンやリスリドなどのドーパミン受容体アゴニストが使用される。しかしこれらの化合物は、悪心、嘔吐、浮腫、低血圧、めまい、脱毛、頭痛、および幻覚などの重篤な副作用を惹起しうる。加えて、ドーパミン受容体アゴニストは、心疾患および高血圧を患っている女性には適応がない。ブロモクリプチンのさらなる欠点は、半減期が短く、１４日間にわたって毎日４〜６回の服薬が必要になることである。
【０１１９】
したがって、本発明者らは、中和ＰＲＬＲ抗体が泌乳阻害に対して適当であることを予期する。以前の文献において、部分的に精製されたＰＲＬＲに対して産生された抗血清は、泌乳ラットに関与した。一腹総体重における小さい減少があるため、抗血清が泌乳阻害をもたらしたと考えられた（Endocrinology 102:1657-1661,1978）。しかしながら、著者らは、さらに他のメカニズムが一腹総体重におけるわずかな減少を引き起こし得たことを排除することができなかった。加えて、著者らは、抗血清が、処置されたラットにおける黄体の増加を引き起こすことを観察した（Endocrinology 102:1657-1661,1978）。該観察は、排卵が損なわれておらず、黄体の増加が観察されなかったＰＲＬＲ欠損マウス（Genes Dev 11:167-178, 1997）の表現型と明らかに対照的である。おそらく、使用された抗血清は、いくつかのさらなる未知の分子を阻害した。
【０１２０】
本発明のもう一つの目的は、泌乳を阻害するための抗体Ｍａｔ３の使用である。
【０１２１】
良性前立腺過形成
良性前立腺過形成（ＢＰＨ）は、高齢男性において４番目によく見られる要医療状態(healthcare condition)である。前立腺の拡大は、≧５０歳の男性の５０％以上を冒す年齢依存的な進行性の状態である。ＢＰＨは、前立腺間質細胞および上皮細胞の過形成を特徴とし、それが、前立腺の尿道周囲領域における大きな離散的結節の形成をもたらして、尿道を圧迫する。したがって尿流障害はＢＰＨの主要な結果の一つである。
【０１２２】
ＢＰＨの標準的治療法には、次に挙げるものが含まれる：
ａ）α１−アドレナリン作動性受容体アンタゴニスト（例えばタムスロシン、アルフゾシン、テラゾシン、ドキサゾシン）は下部尿路におけるＢＰＨ症状を緩和する。これらは、アルファ受容体が媒介する前立腺平滑筋の刺激をブロックすることによって、膀胱下尿道閉塞を減少させる。主な副作用は、血管拡張性有害事象、めまいおよび射精不全(ejaculation failure)である。
ｂ）５α−レダクターゼ阻害剤（例えばフィナステリド）
５α−レダクターゼ阻害剤は、前立腺におけるテストステロンの活性型であるジヒドロテストステロン（これは前立腺拡大の原因になる）の形成を防止する。主な副作用は勃起障害および性欲減退などの性機能障害である。
ｃ）経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）
この外科的処置は高い手術合併症率(moribidity)を伴う。副作用は出血、失禁、狭窄形成、射精の消失、および膀胱穿孔である。
ｄ）前立腺ステント留置術
適正な尿流量を保証するために、尿道の前立腺部分にステントが挿入される。主な副作用は、痂皮形成(encrustation)、尿路感染、およびステントの移動である。そのうえ、ステントは、何らかの経尿道的操作を行う前には除去する必要がある。
【０１２３】
乳腺に関して述べたように、ＰＲＬおよびＰＲＬＲは前立腺内でオートクリン／パラクリン的に作用する（J. Clin. Invest. 99:618 pp,1997）。
【０１２４】
臨床研究により、高プロラクチン血症（および先端肥大症(agromegaly)）は、前立腺の拡大および炎症細胞の間質蓄積と関連することが示されている。ヒト成長ホルモンは亜鉛の存在下でヒトＰＲＬＲに結合できるが、これが、先端肥大症が良性前立腺過形成につながりうる理由の説明になるかもしれない。ＢＰＨを有する患者ではＰＲＬの血清中レベルがしばしば上昇している。
【０１２５】
ＰＲＬ遺伝子を遍在的に過剰発現するトランスジェニック動物は、重度の間質性前立腺過形成を発生させ、ＰＲＬが前立腺過形成の発生に関して重要な病態生理学的因子であることを示す（Endocrinology 138:4410 pp,1997）。さらにまた、前立腺特異的プロバシンプロモーター下でのトランスジェニックマウスにおけるＰＲＬの局所的過剰発現は、ヒトＢＰＨの基本的特徴である間質拡張、炎症細胞の蓄積および局所性上皮異形成(focal epithelial dysplasia)をもたらす（Endocrinology 144:2269 pp,2003）。
【０１２６】
本発明のもう一つの態様は、良性前立腺過形成を処置するための、本発明に記載する抗体および抗原結合性フラグメントの使用である。
【０１２７】
併用ホルモン療法
まだ子宮を有する閉経後女性における顔面紅潮を処置するために、エストロゲン（エストラジオールまたは結合型ウマエストロゲン＝ＣＥＥ）とプロゲスチン（例えば酢酸メドロキシプロゲステロン（ＭＰＡ）、プロゲステロン、ドロスピレノン、レボノルゲストレル）との組合せが使用された。プロゲスチンは、エストラジオールで活性化された子宮上皮細胞増殖を阻害するために添加する必要がある。しかし、プロゲスチンの添加は乳腺上皮細胞増殖を増加させる。正常乳腺上皮細胞とがん性乳腺上皮細胞はどちらも、併用エストロゲン＋プロゲスチン処置に対して、増殖をもって応答するので、ＣＥＥ＋ＭＰＡ処置後には、乳がんの相対的リスクが増加していることがわかった（JAMA 233:321-333;2002）。
【０１２８】
本発明の抗体は、併用ホルモン療法下において観察される増進した乳腺上皮細胞増殖を処置するための課題を解決する。
【０１２９】
本発明のもう一つの目的は、乳腺上皮細胞増殖を阻害するための、併用ホルモン療法（すなわちエストロゲン＋プロゲスチン療法）におけるＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３または抗原結合性フラグメントの使用である。
【０１３０】
脱毛
脱毛の処置は今なお未充足ニーズである。頭髪は周期的に成長する。すなわち、成長期(anagen phase)は活発な毛髪の成長を特徴とし、退行期(catagen phase)は退縮を示し、その後に休止期(telogen phase)（休眠期(resting)）が続く。脱落期(exogen phase)（死んだ毛髪の遊離）は、休止期の最後と一致する。脱毛は、いずれかの時期における毛髪成長障害の結果でありうる。
【０１３１】
休止期脱毛には多くのトリガー（生理学的ストレスおよび情動ストレス、医学的状態、鉄不足および亜鉛不足）が考えられ、重要なことに、アンドロゲン性脱毛症は、その初期段階において、休止期毛髪脱落を示す（Cleveland clinic journal of medicine 2009;76:361-367）。成長期脱毛は放射線療法または化学療法の結果であることが多い。
【０１３２】
ミノキシジルおよびフィナステリドはアンドロゲン性脱毛の処置に使用されており、一方、グルココルチコイドは円形脱毛症に使用されている。一般に、これらの処置は全て副作用を有し（フィナステリド：男性における性欲減退およびインポテンス、グルココルチコイド：糖尿病、体重増加、骨粗鬆症）、脱毛を処置するという課題は完全には解決されていない。
【０１３３】
齧歯類動物において、成体動物における剃毛実験を使って、剃毛区域における毛髪再成長をリードアウトパラダイムとして使用することにより、脱毛に対する化合物の効果が分析された（British Journal of dermatology 2008;159:300-305）。成体動物の剃毛（大半が休止期の毛髪）は、毛髪の成長を特徴とする成長期を誘発する。
【０１３４】
プロラクチンおよびＰＲＬＲは、毛包において発現されることが見出されている。発現データから、ＰＲＬＲ媒介シグナリングとの干渉が脱毛に対して有用であり得ることが示唆されたが、この仮説を証明する機能的データが示されていなかった（Aktuelle Dermatologie 31:109-116,2005）。
【０１３５】
本発明の抗体は、女性および男性における高および正常プロラクチン血性脱毛の新しい処置を提供するための課題を解決する。
【０１３６】
それゆえに、本発明のさらなる態様は、高および正常プロラクチン血性脱毛の処置または予防のために抗体Ｍａｔ３または抗原結合性フラグメントを使用することである。
【０１３７】
抗エストロゲン耐性乳癌の処置および予防
ＰＲＬＲがヒト乳癌において過剰発現されること（J Clin Endocrinol Metab 83:667-674,1998）、およびＰＲＬ−ＰＲＬＲ相互作用とのネガティブな干渉が乳癌処置に対するポジティブな影響を有し得る（Int. J. Cancer: 55(5): 712-721, 1993）が示唆されている。典型的には、血漿プロラクチンレベルが乳癌の危険性と相関する証拠がある（Cancer Lett 243:160-169,2006）。タモキシフェン耐性乳癌を有する患者において、進行性疾患の発生は、プロラクチン血漿レベルと相関する（Eur J Surg Oncol 20:118-121,1994）。プロラクチンを過剰発現するトランスジェニックマウスは、乳癌を発生しやすい（J Clin Invest 100:2744-2751,1997）。
【０１３８】
本発明のもう一つの局面は、抗エストロゲン耐性乳癌の処置または予防のための、本発明に記載されている抗体Ｍａｔ３または抗原結合性フラグメントの使用である。
【０１３９】
定義
本明細書にいうターゲット抗原ヒト「ＰＲＬＲ」は、配列番号１２のアミノ酸位置１〜２１０と実質的に同じアミノ酸配列を、その細胞外ドメインに有するヒトポリペプチド、ならびにその天然の対立遺伝子(allelic)および／またはスプライス変異体を指す。本明細書にいう「ＰＲＬＲのＥＣＤ」は、上述のアミノ酸によって表されるＰＲＬＲの細胞外部分を指す。加えて、ターゲットヒトＰＲＬＲは、Ｐａｕｌ  Ｋｅｌｌｙが記載した活性化変異Ｉ１４６Ｌなどといった変異型の受容体も包含する（Proc Natl Acad Sci U S A.105(38):14533-14538,2008；および口頭発表(oral communication)、トリノ(Turin)、２００７）。
【０１４０】
本明細書にいうターゲット抗原サル「ＰＲＬＲ」は、配列番号１１のアミノ酸位置１〜２１０と実質的に同じアミノ酸配列を、その細胞外ドメインに有するアカゲザルならびにカニクイザルポリペプチドならびにその天然の対立遺伝子および／またはスプライス変異体を指す。本明細書にいう「ＰＲＬＲのＥＣＤ」は、上述のアミノ酸によって表されるＰＲＬＲの細胞外部分を指す。
【０１４１】
本明細書にいうターゲット抗原ネズミまたはマウス「ＰＲＬＲ」は、配列番号１３のアミノ酸位置１〜２１０と実質的に同じアミノ酸配列を、その細胞外ドメインに有するマウスポリペプチドならびにその天然の対立遺伝子および／またはスプライス変異体を指す。本明細書にいう「ＰＲＬＲのＥＣＤ」は、上述のアミノ酸によって表されるＰＲＬＲの細胞外部分を指す。
【０１４２】
本明細書において使用する表現「治療有効量」は、望ましい処置レジメンに従って投与した場合に、所望の治療的または予防的効果または応答（前述の疾患症状の一部または全部を軽減すること、または疾患への罹りやすさを低下させることを含む）を引き出すのに適当であるだろう治療用または予防用抗体の量を指すものとする。
【０１４３】
結合特異性は絶対的性質ではなく、相対的性質であるから、本明細書にいう「に特異的に結合する」抗体は、前述の抗体が前述の抗原と１つ以上の参照(reference)抗原とを区別するのであれば、抗原（ここではＰＲＬＲ）「に対して特異的」であり、または抗原「を特異的に認識する」。「特異的結合」とは、その最も一般的な形態において（かつ参照物が明示されていない場合には）、例えば下記の方法の一つに従って決定される、目的の抗原と無関係な抗原とを区別する抗体の能力を指している。そのような方法には、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ試験、ＲＩＡ試験、ＥＣＬ試験、ＩＲＭＡ試験およびペプチドスキャン(peptide scan)が含まれるが、これらに限るわけではない。例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコア化は標準的な発色法（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼを伴う二次抗体およびテトラメチルベンジジンと過酸化水素）で行うことができる。一定のウェルにおける反応を、例えば４５０ｎｍにおける光学密度によってスコア化する。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり、また典型的な陽性反応は１ＯＤであることができる。これは陽性／陰性差が１０倍を上回りうることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照抗原ではなく、例えば粉乳(milk powder)、ＢＳＡ、トランスフェリンなど約３〜５個の無関係な抗原のセットを使って行われる。
【０１４４】
しかし「特異的結合」は、ターゲット抗原と、参照点(reference point)として使用される１つ以上の密接に関連する抗原とを区別する抗体の能力をも指しうる。さらにまた、「特異的結合」は、そのターゲット抗原の異なる部分、例えばＰＲＬＲの異なるドメイン、サブドメインまたは領域、例えばＰＲＬＲのＥＣＤのＮ末端領域中またはＣ末端領域中のエピトープ、またはＰＲＬＲのＥＣＤの１つ以上のキー(key)アミノ酸残基またはアミノ酸残基のストレッチを区別する抗体の能力にも関しうる。
【０１４５】
「アフィニティ」または「結合アフィニティ」ＫＤは、多くの場合、平衡会合定数（ｋａ）と平衡解離定数（ｋｄ）を測定し、ｋｄをｋａで割った商（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を計算することによって決定される。「免疫特異的」または「特異的に結合」という用語は、抗体が、１０−６Ｍ（一価アフィニティ）以下のアフィニティＫＤで、ＰＲＬＲまたはそのＥＣＤに結合することを意味する。「高アフィニティ」という用語は、抗体が、１０−７Ｍ（一価アフィニティ）以下のアフィニティ（ＫＤ）で、ＰＲＬＲまたはそのＥＣＤに結合することを意味する。抗体は、ターゲット抗原に対し、他の無関係な分子と比較して実質的に大きなアフィニティを有しうる。抗体は、ターゲット抗原に対し、ホモログと比較して実質的に大きなアフィニティ、例えば少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０−３倍、１０−４倍、１０−５倍、１０−６倍またはそれ以上の、ターゲット抗原に対する相対的アフィニティも有しうる。そのようなアフィニティは、従来の技法を使って、例えば平衡透析によって；ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００計器により、製造者が概説する一般的手法を使って；ラジオイムノアッセイにより、放射標識ターゲット抗原を使って；または当業者に知られる他の方法を使って、容易に決定することができる。アフィニティデータは、例えばScatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)の方法によって解析することができる。
【０１４６】
本明細書において使用する「抗体がプロラクチン媒介シグナリングを拮抗する」という表現は、プロラクチン受容体媒介シグナリングの完全な阻害につながる本発明の抗体によるプロラクチン受容体活性化の阻止（遮断）を指すものとする。
【０１４７】
本明細書において使用する「抗体が結合に関して競合する」という表現は、プロラクチン受容体への結合に関する、１つの抗体と第２のリガンドとの間の競合を指すものとする。
【０１４８】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全にアセンブルされた(assembled)抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、抗原に結合することができる抗体フラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ダイアボディ(diabody)）、ラクダ抗体を包含し、前記のものを含む組換えペプチドも、それらが所望の生物学的活性を呈する限りにおいて包含する。抗体は、その重鎖上に、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプに由来する異なる定常ドメイン（Ｆｃドメイン）を保有しうる（下記参照）。エフェクター機能を修飾するために、変異を導入することができる。補体タンパク質Ｃ１ｑおよびＦｃ受容体との相互作用に支配的(dominant)な役割を果たすＦｃドメイン中のアミノ酸残基が同定され、エフェクター機能に影響を及ぼす変異が記載されている（概観するにはLabrijn et al., Current opinion in Immunology 20:479-485, 2008を参照されたい）。特に、ＩｇＧ１の非グリコシル化(aglycosylation)は、アミノ酸位置２９７においてアスパラギンをアラニンに変異させるか、アスパラギンをグルタミンに変異させることによって達成することができ、これは、抗体依存性細胞性細胞傷害(antibody-derived cell-medidated cytotoxicity)（ＡＤＣＣ）を消滅させると報告されている（Sazinsky et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 105 (51): 20169, 2008;Simmons et al., J. of Immunological Methods 263: 133-147, 2002）。位置３２２のリジンをアラニンで置き換えると、ＡＤＣＣの低下、および補体依存性細胞傷害(complement-derived cytotoxicity)（ＣＤＣ）の除去が起こり、一方、位置２３４および２３５にある２つのロイシンを同時にアラニンで置き換えると、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの回避(avoidance)が起こる［Hezareh et al., J. of Virology, 75 (24):12161-12168, 2001］。アビディティ(avidity)を保ったインビボ二価(bivalent)治療薬としてＩｇＧ４アイソタイプを応用するには、「コアヒンジ領域(core hinge region)」におけるセリン→プロリン交換(serine-to-proline exchange)などの修飾（Schuurman, J. et al. Immunology 97: 693-698, 1999）を導入することができる。ヒトＩｇＧ２分子が不均一な共有結合二量体を形成する傾向は、位置１２７、２３２および２３３にあるシステインの一つをセリンに交換することによって回避することができる（Allen et al., Biochemistry, 2009, 48 (17), pp 3755-3766）。低下したエフェクター機能を伴うもう一つのフォーマットとして、４つのＩｇＧ４特異的アミノ酸残基変化を保有するＩｇＧ２から誘導されるＩｇＧ２ｍ４フォーマットを挙げることができる（An et al., mAbs 1(6), 2009）。抗体フラグメントは、組換えＤＮＡ技法によって生産するか、無傷抗体の酵素的または化学的切断によって生産することができ、抗体フラグメントについては以下に詳述する。限定するわけではないが、モノクローナル抗体の例には、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）免疫グロブリン、免疫グロブリンに由来する配列を有するキメラ融合タンパク質、またはそのムテイン(mutein)もしくは誘導体が含まれ、それぞれについて以下に詳述する。化学的に誘導体化された抗体を含めて、無傷分子および／またはフラグメントの多量体または凝集体(aggregate)も考えられる。
【０１４９】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量に存在しうる天然の変異が考えられることを除けば、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。さらにまた、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。モノクローナル抗体は、その特異性だけでなく、それらが均一な培養物によって合成され、異なる特異性および特徴を有する他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点でも有利である。
【０１５０】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示しており、何らかの特定の方法によって抗体が生産されることを要求していると解釈すべきではない。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 [1975]に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することもできるし、組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することもできる。「モノクローナル抗体」は、例えば、組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）、または抗体フラグメントであることができる。
【０１５１】
「免疫グロブリン」または「ネイティブ(native)抗体」は四量体型糖タンパク質である。天然の免疫グロブリンでは、各四量体が、２つの同一なポリペプチド鎖対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を含む。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識を担うアミノ酸数が約１００〜１１０個またはそれ以上である「可変」領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能を担う定常領域を規定する。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて異なるクラスに割り当てることができる。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、およびイプシロン（ε）と分類することができ、抗体のアイソタイプを、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと規定する。これらのうちいくつかは、さらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割することができる。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する。例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプはＡＤＣＣ活性を有することが多い。ヒト軽鎖はカッパ（Κ）軽鎖およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖内および重鎖内では、可変領域と定常領域とが、アミノ酸数約１２個またはそれ以上の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は、アミノ酸数約１０個またはそれ以上の「Ｄ」領域も含む。総論については、Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989))を参照されたい。
【０１５２】
抗体／免疫グロブリンの「機能的フラグメント」または「抗原結合性抗体フラグメント」は、本明細書においては、抗原結合領域を保持している抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えばＩｇＧの可変領域）と定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つ以上の超可変領域、すなわちＣＤＲ−１、−２、および／または−３領域に見いだされるが、可変「フレームワーク」領域も、ＣＤＲに足場(scaffold)を提供することなどにより、抗原結合に重要な役割を果たすことができる。「抗原結合領域」は、好ましくは少なくとも、可変軽（ＶＬ）鎖のアミノ酸残基４〜１０３と、可変重（ＶＨ）鎖のアミノ酸残基５〜１０９とを含み、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１０７とＶＨのアミノ酸残基４〜１１１とを含み、とりわけ好ましいのは、完全なＶＬ鎖およびＶＨ鎖［ＶＬのアミノ酸位置１〜１０９とＶＨのアミノ酸位置１〜１１３、ここで、アミノ酸位置の番号付与はＫａｂａｔデータベースに準ずる（Johnson and Wu, Nucleic Acids Res., 2000, 28, 214-218）］である。本発明における使用にとって好ましい免疫グロブリンクラスはＩｇＧである。
【０１５３】
用語「超可変」領域は、抗原結合を担う抗体の可変ドメインＶＨおよびＶＬまたは機能的フラグメントのアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」またはＣＤＲ［すなわち、図１２に記載する軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８８〜９７（ＬＣＤＲ３）ならびに重鎖可変ドメインの残基２９〜３６（ＨＣＤＲ１）、４８〜６６（ＨＣＤＲ２）および９３〜１０２（ＨＣＤＲ３）］からのアミノ酸残基および／または超可変ループ［すなわちChothia et al., J. Mol.Biol. 196: 901-917 (1987)に記載の軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１内）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２内）および９１〜９６（ＬＣＤＲ３内）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（ＨＣＤＲ１内）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２内）および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３内）］からの残基を含む。
【０１５４】
限定するわけではないが、抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体フラグメント、ダイアボディ、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)、ミニボディ(minibody)、線状抗体(linear antibody)（Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)）；キレーティング(chelating)組換え抗体、トリボディ(tribody)またはバイボディ(bibody)、イントラボディ(intrabody)、ナノボディ(nanobody)、スモール・モジュラー・イムノファーマシューティカル(small modular immunopharmaceutical)（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化(camelized)抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそのムテインもしくは誘導体、および抗体が所望の生物学的活性を保持している限りにおいて、免疫グロブリンの少なくとも一部であって、ポリペプチドに特異的抗原結合性を付与するのに十分である部分（例えばＣＤＲ配列）を含有するポリペプチド；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体（C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press;R. KontermannおよびS. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag）などがある。「二重特異性」または「二官能性」抗体以外の抗体は、その結合部位のそれぞれが同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメイン間に生じる分子間ジスルフィド相互作用が最小限になるか完全に除去されるように、操作することができる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一な抗原結合性フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメント（この名称は容易に結晶化するその能力を反映している）とを生成する。ペプシン処理は、２つの「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントをもたらす。「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は、固く非共有結合的に会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体とからなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合性部位を規定しているのは、このコンフィギュレーション(configuration)でのことである。全体として、６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与している。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有する。
【０１５５】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここでは、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在する。
【０１５６】
好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成することを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを、さらに含む。ｓＦｖを概観するには、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, RosenburgおよびMoore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【０１５７】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。ＦａｂフラグメントとＦａｂ’フラグメントとの相違点は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数残基が付加されている点である。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書においては、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を保持しているＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々は、Ｆａｂ’フラグメントのペアであって、それらの間にヒンジシステインを有するものとして生産された。
【０１５８】
「フレームワーク」残基、すなわちＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１５９】
「定常領域」という表現は、抗体分子のうち、エフェクター機能を付与する部分を指す。
【０１６０】
用語「ムテイン」または「変異体」は互換的(interchangeably)に使用することができ、可変領域または可変領域と等価な部分に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を指す。ただし、ムテインまたは変異体は、所望の結合アフィニティまたは生物学的活性を保っているものとする。
【０１６１】
ムテインは、親抗体と実質的に相同または実質的に同一でありうる。
【０１６２】
「誘導体」という用語は、ユビキチン化、治療剤または診断剤へのコンジュゲーション(conjugation)、標識(labeling)（例えば放射性核種または種々の酵素によるもの）、共有結合によるポリマーの取り付け(attachment)、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールによる誘導体化）、および非天然アミノ酸の化学合成による挿入または置換などといった技法によって共有結合的に修飾された抗体を指す。
【０１６３】
「ヒト」抗体または機能的ヒト抗体フラグメントは、本明細書においては、キメラ抗体または「ヒト化」ではなく、非ヒト種に（全部または一部が）由来する抗体でもないものと定義される。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントはヒトから得られるか、合成ヒト抗体であることができる。「合成ヒト抗体」とは、本明細書においては、既知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列からインシリコ(in silico)で全部または一部が導き出された配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのインシリコ設計は、例えばヒト抗体配列または抗体フラグメント配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成することができる。ヒト抗体または機能的抗体フラグメントのもう一つの例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである（すなわち前述のライブラリーはヒト天然供給源から採取された抗体に基づく）。ヒト抗体の例には、CarlssonおよびSoederlind, Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001)、Soederlin et al., Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000)および米国特許第６，９８９，２５０号に記載のｎ−ＣｏＤｅＲベースの抗体が含まれる。
【０１６４】
「ヒト化抗体」または機能的ヒト化抗体フラグメントは、本明細書においては、（ｉ）非ヒト供給源（例えば異種免疫系を保持するトランスジェニックマウス）に由来し、ヒト生殖細胞株配列に基づく抗体；または（ｉｉ）ＣＤＲ移植されたものであって、可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源のものであり、一方、可変ドメインの１つ以上のフレームワークはヒト起源のものであり、定常ドメイン（存在する場合）はヒト起源のものであるものと定義される。
【０１６５】
本明細書において使用する「キメラ抗体」という表現は、２つの異なる抗体（典型的には異なる種を起源とするもの）に由来する配列を含有する抗体を指す（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。最も典型的には、キメラ抗体はヒト抗体フラグメントとマウス抗体フラグメントを含み、一般的にはヒト定常領域とマウス可変領域とを含む。
【０１６６】
「Ｈｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ（商標）」抗体は、例えば配列番号１４および１５によって表される抗体および特許出願ＷＯ０８／０２２２９５に記載されている抗体など、米国特許第５，７６６，８８６号に記載されている方法で親配列を改変することによって作製された抗体である。
【０１６７】
本発明の抗体は、組換え抗体遺伝子ライブラリーに由来することができる。組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製し、コードされた抗体フラグメントを線維状バクテリオファージの表面上にディスプレイするための技術の開発により、ヒト抗体を直接作製し、選択するための組換え手段が得られており、これを、ヒト化、キメラ、マウスまたはムテイン抗体に応用することもできる。ファージ技術によって生産される抗体は、細菌内で抗原結合性フラグメント−通常はＦｖまたはＦａｂフラグメント−として生産されるので、エフェクター機能を欠いている。エフェクター機能は、次に挙げる２つの戦略のうちの一つによって導入することができる。すなわち、フラグメントは、哺乳動物細胞において発現させるための完全な抗体、またはエフェクター機能をトリガー(trigger)することができる第２の結合部位を有する二重特異性抗体フラグメントへと、工学的に操作することができる。典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を、ＰＣＲによって別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーにおいてランダムに組み換え、次にそれを、特定の抗原に対する結合に関して選択することができる。Ｆａｂフラグメントはファージ表面上に発現され、すなわち、それらをコードする遺伝子に物理的に連結されている。したがって、抗原結合性によるＦａｂの選択は、そのＦａｂをコードする配列を同時に選択することになり、次にそれを増幅することができる。抗原結合と再増幅とを数ラウンド行うこと（パンニングと呼ばれる手法）により、抗原に特異的なＦａｂが濃縮され、最終的には単離される。
【０１６８】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るために、さまざまな手法が記載されている。そのようなライブラリーは、Carlsson and Soederlind Exp. Rev. Mol. Diagn. 1 (1), 102-108 (2001)、Soederlin et al. Nat. Biotech. 18, 852-856 (2000)および米国特許第６，９８９，２５０号に記載されているように、インビボで形成された（すなわちヒト由来の）多様なＣＤＲを組み込むことが可能な単一のマスターフレームワーク上に構築することができる。あるいは、そのような抗体ライブラリーは、合成的に創製された核酸によってコードされる、インシリコで設計されたアミノ酸配列に基づいてもよい。抗体配列のインシリコ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することなどによって達成することができる。インシリコ創製配列を設計し取得するための方法は、例えばKnappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57;Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67；および米国特許第６，３００，０６４号に記載されている。ファージディスプレイ技法を概観するにはＷＯ０８／０２２２９５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を参照されたい。
【０１６９】
あるいは、本発明の抗体は動物由来であってもよい。そのような抗体はＷＯ０８／０２２２９５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）に要約されているヒト化またはＨｕｍａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ抗体であることができ、そのような抗体はトランスジェニック動物に由来してもよい［同様にＷＯ０８／０２２２９５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）参照］。
【０１７０】
本明細書にいう、異なる「形態」の抗原、例えばＰＲＬＲとは、本明細書においては、異なる翻訳時修飾および翻訳後修飾、例えば限定するわけではないが、一次プロラクチン受容体転写産物のスプライシングの相違、グリコシル化の相違、および翻訳後タンパク質分解的切断(proteolytic cleavage)の相違に起因する異なるタンパク質分子と定義される。
【０１７１】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置(surface grouping)からなり、通常は特異的な三次元構造特徴と、特異的な電荷特徴とを有している。２つの抗体は、当業者に周知の方法のいずれかによって、一方の抗体が競合結合アッセイにおいてもう一つの抗体と競合することが示されるのであれば、そして、エピトープのアミノ酸の全てがそれら２つの抗体によって結合されるのであれば、「同じエピトープに結合する」といわれる。
【０１７２】
用語「成熟抗体」または「成熟抗原結合性フラグメント」、例えば成熟Ｆａｂ変異体には、ＰＲＬＲの細胞外ドメインなど、所与の抗原に対して、より強い結合−すなわち、増加したアフィニティでの結合−を呈する抗体または抗体フラグメントの誘導体が含まれる。成熟は、抗体または抗体フラグメントの６個のＣＤＲ内にあってアフィニティの増加につながる少数の変異を同定するプロセスである。成熟プロセスは、抗体中に変異を導入するための分子生物学的方法と、スクリーニングによって改良されたバインダーを同定するための分子生物学的方法との組み合わせである。
【０１７３】
治療法
治療法は、本発明によって考えられる抗体の治療有効量を、処置を必要とする対象に投与することを伴う。「治療有効」量とは、本明細書においては、単回投与として、または複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤との組み合わせで、対象の処置区域におけるＰＲＬＲ陽性細胞の増殖をブロックするのに十分な量であって、有害な状態の軽減につながるが、毒物学的には認容できるような、抗体の量と定義される。対象は、ヒトまたは非ヒト動物（例えばウサギ、ラット、マウス、サル、または他の下等霊長類）であることができる。
【０１７４】
本発明の抗体は、既知の医薬(medicament)と同時投与することができ、場合によっては、抗体そのものを修飾してもよい。例えば抗体は、潜在的に効力をさらに高めるために、免疫毒素または放射性同位体にコンジュゲートすることができるだろう。
【０１７５】
本発明の抗体は、ＰＲＬＲが望ましくないほど多量に発現しているさまざまな状況において、治療ツールまたは診断ツールとして使用することができる。本発明の抗体による処置にとりわけ適した障害および状態は、子宮内膜症、腺筋症、非ホルモン女性避妊(female fertility contraception)、良性乳房疾患および乳房痛、泌乳阻害、良性前立腺過形成、類線維腫、高および正常プロラクチン血性脱毛、ならびに乳腺上皮細胞増殖を阻害するための併用ホルモン療法における共処置である。
【０１７６】
上述の障害のいずれかを処置するために、本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容できる担体または賦形剤を使って、従来の方法で製剤化することができる。本発明の抗体は、処置される障害のタイプに応じてさまざまであることができる任意の適切な手段によって投与することができる。考えうる投与経路には、非経口（例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下）、肺内および鼻腔内、ならびに局所免疫抑制処置にとって望ましい場合には、病変内投与が含まれる。また、本発明の抗体は、例えば抗体の用量を減らしていく、パルス注入(pulse infusion)によって投与することもできる。好ましくは、投薬は、投与が短期間であるか、長期間であるかに部分的に依存して、注射によって、最も好ましくは静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与すべき量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物を投与するかどうかなど、さまざまな因子に依存するだろう。投与の経路が処置すべき障害または状態に依存して変動することは、当業者にはわかるだろう。
【０１７７】
本発明の新規ポリペプチドの治療有効量の決定は、主として、特定の患者特徴、投与経路、および処置される障害の性質に依存するだろう。一般的指針は、例えば医薬品規制ハーモナイゼーション国際会議(International Conference on Harmonisation)の刊行物およびRemingtons's Pharmaceutical Sciences, chapter 27 and 28, pp. 484-528 (18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.:Mack Pub. Co., 1990)に見いだすことができる。より具体的には、治療有効量の決定は、医薬の毒性および効力などの因子に依存するであろう。毒性は、上述の参考文献に見いだされる当技術分野において周知の方法を使って決定することができる。効力は、同じ指針を、下記実施例で述べる方法と合わせて利用することによって、決定することができる。
【０１７８】
医薬組成物および投与
本発明は、ＰＲＬＲ抗体を含みうる医薬組成物であって、単独で、または安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などといった（ただしこれらに限るわけではない）滅菌生体適合性医薬担体に入れて投与することができる、医薬組成物にも関係する。これらの分子はいずれも、患者に単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、医薬組成物として投与することができ、医薬組成物では、賦形剤または医薬上許容される担体と混合される。本発明のある実施形態では、医薬上許容される担体は医薬的に不活性である。
【０１７９】
本発明は医薬組成物の投与にも関係する。そのような投与は、非経口的に行われる。非経口送達の方法には、局所(topical)、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮下、髄内(intramedullary)、髄腔内(intrathecal)、脳室内(intraventricular)、静脈内、腹腔内、子宮内または鼻腔内投与が含まれる。これらの医薬組成物は、活性成分の他にも、活性化合物を医薬的に使用することができる調製物に加工することを容易にする賦形剤および助剤を含む適切な医薬上許容される担体を含有しうる。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)の最新版に見いだすことができる。
【０１８０】
非経口投与用の医薬製剤には活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液中に、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液(Hank's solution)、リンゲル液、または生理学的緩衝食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有しうる。また、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として製造することもできる。適切な親油性溶剤または媒体には、ゴマ油などの脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。所望により、懸濁液は、高濃度溶液の調製が可能になるように、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を増加させる薬剤も含有してよい。
【０１８１】
局所または鼻投与のためには、浸透すべき特定の障壁に適した浸透剤(penetrant)を、製剤中に使用する。そのような浸透剤は当技術分野では一般的に知られている。
【０１８２】
非経口投与は、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、および脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣、または鼻腔内投与も含む非経口送達の方法も含む。
【０１８３】
キット
本発明はさらに、上述した本発明組成物の成分の１つ以上が充填された１つ以上の容器を含む医薬パック(pharmaceutical pack)およびキットに関する。そのような容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示された形式で、当局によるヒト投与用製品の製造、使用または販売の認可を反映した告知書(notice)を、添付することができる。
【０１８４】
もう一つの実施形態において、キットは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を含有してもよい。これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、宿主細胞へのトランスフェクションと宿主細胞による発現に適したプラスミドに入れて提供される。プラスミドは、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を調節するために、プロモーター（多くの場合、誘導性プロモーター）を含有しうる。プラスミドは、プラスミド中に他のＤＮＡ配列を挿入してさまざまな抗体を生産することが容易になるように、適当な制限部位も含有しうる。プラスミドは、コードされているタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするために、数多くの他の要素も含有しうる。そのような要素は、当業者にはよく知られており、例えば選択可能マーカー、開始コドン、停止コドンなどが含まれる。
【０１８５】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当技術分野においてよく知られている方法で、例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成(dragee-making)、研和(levigating)、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥プロセスなどによって、製造することができる。
【０１８６】
医薬組成物は、使用前にバッファーと混合される、ｐＨ範囲が４．５〜５．５の１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトール中の凍結乾燥粉末として提供することができる。
【０１８７】
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を製造したら、それらを適当な容器に入れ、適応症(indicated condition)の処置に関して医薬品の表示をすることができる。ＰＲＬＲ抗体の投与に関して、そのような医薬品の表示(labeling)には、投与の量、頻度および方法が含まれるだろう。
【０１８８】
治療有効量
本発明における使用に適した医薬組成物には、その活性成分が、意図する目的、すなわちＰＲＬＲ発現を特徴とする特定の疾患状態の処置を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。有効量の決定は、当業者の能力の範囲で十分に可能である。
【０１８９】
任意の化合物について、まず最初は細胞培養アッセイにおいて、例えばリンパ腫細胞において、または動物モデル、通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルにおいて、治療有効量を推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を実現するためにも使用される。次に、そのような情報を、ヒトにおける投与にとって有用な用量および経路を決定するために使用することができる。
【０１９０】
治療有効量は、症状または状態を改善する、タンパク質またはその抗体、アンタゴニスト、または阻害剤の量を指す。そのような化合物の治療効力および毒性は、細胞培養または実験動物において、例えばＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な用量）などといった、標準的な医薬的手法によって決定することができる。治療効果と毒性効果の間の用量比が治療係数(therapeutic index)であり、これは比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療係数を呈する医薬組成物は好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投薬量範囲を処方する際に使用される。そのような化合物の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用する剤形、患者の感度、および投与経路に応じてこの範囲内で変動する。
【０１９１】
厳密な投薬量は、処置すべき患者を考慮して個々の医師が選択する。投薬量および投与は、十分なレベルの活性部分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように、調節される。考慮されるであろうさらなる因子には、疾患状態の重症度、例えば子宮内膜症病変のサイズおよび場所；患者の年齢、体重および性別；食餌(diet)、投与の時間および頻度、併用薬、反応感度、および治療に対する認容性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物を、その特定製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、３〜４日ごと、１週間ごと、または２週間に１回、または１ヶ月以内に１回投与してもよい。
【０１９２】
通常の投薬量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００マイクログラム、合計用量約２ｇまでの範囲で変動しうる。特定の投薬量および送達方法に関する指針は文献に記載されている。ＵＳ４，６５７，７６０；ＵＳ５，２０６，３４４；またはＵＳ５，２２５，２１２を参照されたい。当業者は、ポリヌクレオチド用には、タンパク質用またはそれらの阻害剤用とは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的であるだろう。放射標識抗体の場合、好ましい比放射能は０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇタンパク質の範囲にありうる（Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999;Wong et al., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863, 2000;Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002）。
【０１９３】
以下に実施例を挙げて、本発明を、さらに詳しく説明する。これらの実施例は、具体的な実施形態を参照して本発明を例証するために提供されるにすぎない。これらの実証は、本発明の一定の具体的態様を例示しているが、限定を表すものではなく、ここに開示する発明の範囲を制限するものでもない。
【０１９４】
全ての実施例は、別段の説明が詳細になされている部分を除き、当業者にとっては周知でありルーチンである標準的技法使って行われた。下記実施例のルーチンな分子生物学技法は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989などの標準的実験マニュアルに記載されているとおりに行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】健常女性および子宮内膜症を患っている女性からのヒト子宮内膜および病変（異所性組織）におけるプロラクチン−ｍＲＮＡ（ＰＲＬ−ｍＲＮＡ）の発現（リアルタイムＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析によって分析）。
【０１９６】
【図２】健常女性および子宮内膜症を患っている女性からのヒト子宮内膜および病変（異所性組織）におけるプロラクチン受容体−ｍＲＮＡ（ＰＲＬＲ−ｍＲＮＡ）の発現（リアルタイムＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析によって分析）。
【０１９７】
【図３Ａ】中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３は、良性乳房疾患の高プロラクチン血症代用モデルにおいて使用されているマウスの乳腺における側枝形成を阻害した。非特異的抗体は効果を有さなかった。健常正常プロラクチン血性マウス（下垂体なし）は側枝形成の減少を示したが、下垂体移植（高プロラクチン血症）は側枝形成および小葉腺胞発生の増強を示した。特異的抗体Ｍａｔ３は、高プロラクチン血症の作用を拮抗した。
【０１９８】
【図３Ｂ】中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３は、良性乳房疾患の高プロラクチン血症代用モデルにおけるマウスの乳腺におけるプロラクチンターゲット遺伝子ｅｌｆ５の誘導を阻害した。非特異的抗体は効果を有さなかった。健常正常プロラクチン血性マウス（下垂体なし）は乳腺においてｅｌｆ５発現の減少を示したが、下垂体移植（高プロラクチン血症）はｅｌｆ５遺伝子発現の強い刺激を示した。非特異的対照抗体ではなく、特異的抗体Ｍａｔ３は、高プロラクチン血症の作用を拮抗した。
【０１９９】
【図４】ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ（Nucleic Acids Res. 2000, 28, 214-218）によるフレームワークアミノ酸位置のＫａｂａｔ番号付与。
【０２００】
【図５Ａ】抗ＰＲＬＲ抗体ＨＥ０６６４２でのＦＡＣＳ分析結果。抗体の結合を、抗体の結合を、ヒトおよびマウスＰＲＬＲを発現するＨＥＫ２９３細胞において、ＰＲＬＲを発現しない親細胞株と比較して、固定濃度で決定した。Ｙ軸：＃、ＩｇＧ１分子として０．３７μｇ／ｍｌのＨＥ０６６４２での中央蛍光強度。＊、１＝ヒトＰＲＬＲを有するＨＥＫ２９３；２＝マウスＰＲＬＲを有するＨＥＫ２９３；３＝ＰＲＬＲなしのＨＥＫ２９３。
【０２０１】
【図５Ｂ】抗ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３でのＦＡＣＳ分析結果。抗体の結合を、ヒトＰＲＬＲを発現するＨＥＫ２９３細胞およびアカゲザルＰＲＬＲを発現するＢａ／Ｆ細胞において、ＰＲＬＲを発現しない細胞株（ＨＥＫ２９３）と比較して、一連の異なる濃度で決定した。最も高い抗体濃度での最大シグナル強度は、細胞表面上に発現されるＰＲＬＲの数に依存する、すなわちＨＥＫ２９３およびＢａ／Ｆ細胞は、それらの表面上に同じ数のＰＲＬＲを有さない。Ｙ軸：＃、中央蛍光強度；Ｘ軸：°、ＩｇＧ２分子として抗体Ｍａｔ３のμｇ／ｍｌにおける異なる濃度；＊、１（丸）＝ヒトＰＲＬＲを有するＨＥＫ２９３；２（三角）＝アカゲザルＰＲＬＲを有するＢａ／Ｆ；３（四角）＝ＰＲＬＲなしのＨＥＫ２９３。
【０２０２】
【図６Ａ】Ｍａｔ３−ＶＬドメインの配列領域と、ＶＢＡＳＥ２において同定された最も類似のヒトＶセグメントとのアラインメント（Ｍａｔ３−ＶＬは、生殖細胞株配列ｈｕｍＩＧＬＶ０５６と９０％同一である）。
【０２０３】
【図６Ｂ】Ｍａｔ３−ＶＨドメインの配列領域と、ＶＢＡＳＥ２において同定された最も類似のヒトＶセグメントとのアラインメント（Ｍａｔ３−ＶＨは、生殖細胞株配列ｈｕｍＩＧＨＶ３１３と９０％同一である）。
【０２０４】
【図６Ｃ】ＨＥ０６６４２−ＶＬドメインの配列領域と、ＶＢＡＳＥ２において同定された最も類似のヒトＶセグメントとのアラインメント（ＨＥ０６６４２−ＶＬは、生殖細胞株配列ｈｕｍＩＧＫＶ０８３と８０％同一である）。
【０２０５】
【図６Ｄ】ＨＥ０６６４２−ＶＨドメインの配列領域と、ＶＢＡＳＥ２において同定された最も類似のヒトＶセグメントとのアラインメント（ＨＥ０６６４２−ＶＨは、生殖細胞株配列ｈｕｍＩＧＨＶ３１３と８９％同一である）。
【０２０６】
【図７】成熟Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ−ベースの結合性試験：Ｆａｂ−含有大腸菌上清を、固定化したヒトＰＲＬＲの細胞外ドメインに対する結合性について試験した。図は、Ｆａｂ変異体の結合を棒図表として表す。シグナル強度（吸光度）がｙ軸に示され、Ｆａｂ変異体の名称（＊）がｘ軸に示される。親抗体００５−Ｃ０４の非成熟Ｆａｂと比較して上昇した成熟Ｆａｂ変異体のシグナル強度は、００５−Ｃ０４と比較して、００５−Ｃ０４−２０−２のより良いＰＲＬＲ−結合を実証する。「変異体」ｐＥＴ２８は、Ｆａｂ−発現プラスミドｐＥＴ２８ａ（Novagen, EMD Chemicals Group, Merck, Darmstadt, Germany）を有するがいかなるＦａｂも発現しない大腸菌株の上清を表す。
【０２０７】
【図８】Ｐｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡ結果の棒図表  それぞれのプロットされた値は、Ｓ．Ｅ．Ｍ（平均の標準誤差）と共に、５４個のペプチドについて得られた平均値を示す。黒棒は、抗体ＨＥ０６６４２の相対結合力を示す。白棒は、抗体Ｍａｔ３の相対結合力を示す。データは、全２９１６個のペプチドのデータセットにわたる平均に対して標準化し、バックグラウンドシグナルに対して補正した。
【０２０８】
図８Ａは、Ｘ軸において「１１７」として示されるアミノ酸１０３−ＰＤＰＰＬＥＬＡＶＥＶＫＱＰＥ−１１７から１２７−ＷＳＰＰＴＬＩＤＬＫＴＧＷＦＴ−１４１（「１４１」として示される）の範囲であるペプチドのサブセットに対するＥＬＩＳＡ結果を示す。すなわち、ＥＣＤアミノ酸配列に沿って３つのアミノ酸がシフトされたこれらのペプチドは、ヒトＰＲＬＲのＥＣＤのアミノ酸位置１０３から１４１の領域に及ぶ。このデータセット内で観察される最も強い違いは、４ｘ１０−１２の有意ｐ−値を有するペプチド１０９−ＬＡＶＥＶＫＱＰＥＤＲＫＰＹＬ−１２３（「１２３」として示される）、および７ｘ１０−４０の有意ｐ−値を有するペプチド１２１−ＰＹＬＷＩＫＷＳＰＰＴＬＩＤＬ−１３５（「１３５」として示される）である。
【０２０９】
図８Ｂは、１３９−ＷＦＴＬＬＹＥＩＲＬＫＰＥＫＡ−１５３（Ｘ軸において「１５３」として示される）から１６３−ＱＱＴＥＦＫＩＬＳＬＨＰＧＱＫ−１７７（「１７７」として示される）の範囲であるペプチドのサブセットに対するＥＬＩＳＡ結果を示す。すなわち、ＥＣＤアミノ酸配列に沿って３つのアミノ酸がシフトされたこれらのペプチドは、ヒトＰＲＬＲのＥＣＤのアミノ酸位置１３９から１７７の領域に及ぶ。このデータセット内で観察される最も強い違いは、６ｘ１０−２６の有意ｐ−値を有するペプチド１４８−ＬＫＰＥＫＡＡＥＷＥＩＨＦＡＧ−１６２（「１６２」として示される）、および８ｘ１０−８の有意ｐ−値を有するペプチド１６０−ＦＡＧＱＱＴＥＦＫＩＬＳＬＨＰ−１７４（「１７４」として示される）である。
【０２１０】
これらのデータは、両方の抗体がヒトＰＲＬＲのＥＣＤのＳ２サブドメイン（アミノ酸１０１から２１０）に結合し、したがって、Ｓ１ドメインに主に結合する天然リガンドＰＲＬに対して非競合的であることを証明する。しかしながら、該ペプチドスキャンは、Ｍａｔ３とＨＥ０６６４２間のＳ２ドメインへの結合の違いがあることを示した。この見出したことは、なぜ抗体Ｍａｔ３が、ＨＥ０６６４２と比較して異なる種特異性および効力を示すのかを示す。
【０２１１】
【図９】中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（ヒトプロラクチン受容体で安定にトランスフェクトされたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘導増殖の阻害。以下の抗体について、ＩｇＧ１フォーマットでＩＣ５０値を決定した：Ｍａｔ３（黒丸）、ＩＣ５０＝０．７ｎＭ［１μｇ／ｍｌ（＝６．７ｎＭ）で１００％阻害］；ＨＥ０６．６４２（白四角）、ＩＣ５０＝４．２ｎＭ［１μｇ／ｍｌ（＝６．７ｎＭ）で８１％阻害］；非特異的対照抗体（白三角）：阻害効果なし。
【０２１２】
【図１０】中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（マウスプロラクチン受容体で安定にトランスフェクトされたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘導増殖の阻害。以下の抗体について、ＩｇＧ１フォーマットでＩＣ５０値を決定した：Ｍａｔ３（黒丸）、ＩＣ５０＝３．０ｎＭ［１μｇ／ｍｌ（＝６．７ｎＭ）で９７．４％阻害］；ＨＥ０６．６４２（白四角）、阻害効果なし；非特異的対照抗体（白三角）：阻害効果なし。
【０２１３】
【図１１】図１１ＡおよびＢ：中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（アカゲザルプロラクチン受容体で安定にトランスフェクトされたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘導増殖の阻害。以下の抗体について、ＩｇＧ１フォーマットでＩＣ５０値を決定した：Ｍａｔ３（黒丸）、ＩＣ５０＝４．６ｎＭ［１μｇ／ｍｌ（＝６．７ｎＭ）で９９．１％阻害］（図１１Ａ参照）；ＨＥ０６．６４２（白四角）、ＩＣ５０＝２０６ｎＭ［２４０μｇ／ｍｌ（＝１６００ｎＭ）で９２．４％阻害］（図１１ＡおよびＢ参照）；非特異的対照抗体（白三角）：阻害効果なし（図１１ＡおよびＢ参照）。
【０２１４】
【図１２】中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３でのＳＨＮマウスにおける子宮腺筋症（＝内性子宮内膜症）の処置。結果を実施例５に記載されている疾患スコア（腺筋症スコア）としてｙ軸に図示する。各実験群について中央疾患スコアを平行線として示す。実験群は以下の一つである。群１、下垂体同種移植片なし（正常プロラクチン血性マウスは、ある程度、内性子宮内膜症を発症する、中央疾患スコア＝１）；群２、下垂体同種移植片あり（下垂体同種移植片による高プロラクチン血症が疾患スコアを高める、中央疾患スコア＝３）；群３、非特異的マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体による３０ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回で処置された下垂体同種移植片を有する（中央疾患スコア＝３）；群４、マウスＩｇＧ２ａフォーマットにおける抗体Ｍａｔ３（Ｍａｔ３−ｍＩｇＧ２ａ）による３０ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回で処置された下垂体同種移植片を有する（Ｍａｔ３は、動物を完全に治癒した）。３０ｍｇ／ｋｇのＭａｔ３による週に１回後の疾患スコアは、正常プロラクチン血性マウスの疾患スコア（中央疾患スコア＝１）よりもさらに低かった（中央疾患スコア＝０）。群５、抗体Ｍａｔ３−ｍＩｇＧ２ａによる１０ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回で処置された下垂体同種移植片を有する（中央疾患スコア＝２）；群６、抗体Ｍａｔ３−ｍＩｇＧ２ａによる３ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回で処置された下垂体同種移植片を有する（中央疾患スコア＝２．５）；群７、抗体Ｍａｔ３−ｍＩｇＧ２ａによる１ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回で処置された下垂体同種移植片を有する（中央疾患スコア＝２．５）。抗体Ｍａｔ３での処置は、中央疾患スコアにおける用量依存的増加を示す。それゆえに、Ｍａｔ３は、女性における内性子宮内膜症（＝子宮腺筋症）および外性子宮内膜症を処置するのに適している。
【０２１５】
【図１３】図１３ＡおよびＢ：ヒトおよびマウスＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害。図１３Ａにおいて、ヒトＰＲＬＲ依存性活性を抗体濃度に対してプロットし、図１３Ｂは、マウスＰＲＬＲ依存性活性を示す。ルシフェラーゼ活性は、任意の抗体の添加なしで得られた最大ルシフェラーゼ活性のパーセントとして表される。以下の抗体について、ＩｇＧ１フォーマットでＩＣ５０値を決定した：Ｍａｔ３（黒丸）、ＩＣ５０＝０．５ｎＭ（図１３Ａ、ｈＰＲＬＲ）および１．３ｎＭ（図１３Ｂ、ｍＰＲＬＲ）；ＨＥ０６．６４２（白四角）、ＩＣ５０＝４．６ｎＭ（図１３Ａ、ｈＰＲＬＲ）および＞＞１３３３ｎＭ（＝２０μｇ／ｍｌ）（図１３Ｂ、ｍＰＲＬＲ）；非特異的アイソタイプ対照抗体（白三角）：阻害効果なし（図１３ＡおよびＢ参照）。これらのデータは、ＨＥ０６．６４２と比較してｈＰＲＬＲに対するＭａｔ３の改善された活性を示し、ｍＰＲＬＲに対するＭａｔ３の活性を証明するが、ＨＥ０６．６４２はｍＰＲＬＲ依存性ルシフェラーゼ活性を阻害しない。
【０２１６】
【図１４】フローサイトメトリーを使用するヒト、マウスおよびサル由来のＰＲＬＲを発現する細胞に対する中和ＰＲＬＲ抗体の細胞結合。中央蛍光シグナル強度を抗体濃度に対してプロットする。以下のＩｇＧ１抗体を適用した：Ｍａｔ３（黒丸）、ＨＥ０６．６４２（白四角）、非特異的アイソタイプ対照抗体（白三角）。種々の細胞株を試験した。Ａ）ヒトＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株、Ｂ）マウスＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株、Ｃ）ＰＲＬＲ遺伝子でトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞株（ネガティブコントロール細胞株）、Ｄ）ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄ、Ｅ）アカゲザルＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞株、Ｆ）ヒトＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞株、Ｇ）マウスＰＲＬＲで安定にトランスフェクトされたＢａＦ３細胞株。種々の細胞株に対する抗体の細胞株結合力価は、ＥＣ５０値として、用量応答曲線から導かれている（表８参照）。用量応答プロットは、ＨＥ０６．６４２と比較してＭａｔ３の優れた細胞結合特徴を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２１７】
配列番号：１は、Ｍａｔ３のＶＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号：２は、Ｍａｔ３のＶＬのアミノ酸配列を示す。
配列番号：３は、Ｍａｔ３のＶＨの核酸配列を示す。
配列番号：４は、Ｍａｔ３のＶＬの核酸配列を示す。
配列番号：５は、Ｍａｔ３のＨＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号：６は、Ｍａｔ３のＨＣＤＲ２の核酸配列を示す。
配列番号：７は、Ｍａｔ３のＨＣＤＲ３の核酸配列を示す。
配列番号：８は、Ｍａｔ３のＬＣＤＲ１の核酸配列を示す。
配列番号：９は、Ｍａｔ３のＬＣＤＲ２の核酸配列を示す。
配列番号：１０は、Ｍａｔ３のＬＣＤＲ３の核酸配列を示す。
配列番号：１１は、Ｆｃ−Ｈｉｓに融合したカニクイザルおよびアカゲザルＰＲＬＲの細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１２は、ヒトＥＣＤ＿ＰＲＬＲのアミノ酸位置１−２１０、Ｓ１ドメイン１−１００（Ｓ１ドメイン  コンストラクト１−１０２）、Ｓ２ドメイン１０１−２１０を示す。
配列番号：１３は、マウスＥＣＤ＿ＰＲＬＲ、アミノ酸位置１−２１０を示す。
配列番号：１４は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＷＯ２００８／２２２９５）におけるＨＥ０６６４２のＶＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１５は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＷＯ２００８／２２２９５）におけるＨＥ０６６４２のＶＬのアミノ酸配列を示す。
配列番号：１６は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＷＯ２００８／２２２９５）におけるＨＥ０６６４２のＶＨの核酸配列を示す。
配列番号：１７は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（ＷＯ２００８／２２２９５）におけるＨＥ０６６４２のＶＬの核酸配列を示す。
【実施例】
【０２１８】
実施例１
中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（ヒトプロラクチン受容体を安定にトランスフェクトしたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘発性増殖の阻害
中和ＰＲＬＲ抗体のインビトロ効力を解析するために、ＢａＦ３細胞のプロラクチン活性化細胞増殖の阻害を使用した。細胞にヒトＰＲＬＲを安定にトランスフェクトし、２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ中、１０％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのヒトプロラクチンの存在下で、通常培養した。１％ＦＣＳを含有するプロラクチン非含有培地中で６時間の飢餓処理(starvation)後に、細胞を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２５０００細胞の密度で播種した。細胞を３５ｎｇ／ｍｌのプロラクチンで刺激し、一連の用量(increasing doses)の中和ＰＲＬＲ抗体と共に、２日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って細胞増殖を分析した。プロラクチン刺激細胞成長の阻害に関する用量応答曲線を作成し、ＩＣ５０値を算出した。陰性対照として、非特異的対照抗体による刺激を使用した。抗体Ｍａｔ３を、抗体ＨＥ０６．６４２との比較において試験した（両方ともＩｇＧ１フォーマットであった）（図９）。
【０２１９】
実施例２
中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（マウスプロラクチン受容体を安定にトランスフェクトしたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘発性増殖の阻害
中和ＰＲＬＲ抗体のインビトロ効力を解析するために、Ｂａ／Ｆ３細胞のプロラクチン活性化細胞増殖の阻害を使用した。細胞にマウスＰＲＬＲを安定にトランスフェクトし、２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ中、１０％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのヒトプロラクチンの存在下で、通常培養した。１％ＦＣＳを含有するプロラクチン非含有培地中で６時間の飢餓処理(starvation)後に、細胞を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２００００細胞の密度で播種した。細胞を５０ｎｇ／ｍｌのプロラクチンで刺激し、一連の用量(increasing doses)の中和ＰＲＬＲ抗体と共に、３日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って細胞増殖を分析した。プロラクチン刺激細胞成長の阻害に関する用量応答曲線を作成し、ＩＣ５０値を算出した。陰性対照として、非特異的対照抗体による刺激を使用した。抗体Ｍａｔ３を、抗体ＨＥ０６．６４２との比較において試験した（両方ともＩｇＧ１フォーマットであった）（図１０）。
【０２２０】
実施例３
中和プロラクチン受容体抗体および非特異的対照抗体によるＢａＦ３細胞（アカゲザルプロラクチン受容体を安定にトランスフェクトしたモノクローナル細胞）のプロラクチン誘発性増殖の阻害
中和ＰＲＬＲ抗体のインビトロ効力を解析するために、Ｂａ／Ｆ３細胞のプロラクチン活性化細胞増殖の阻害を使用した。細胞にアカゲザルＰＲＬＲを安定にトランスフェクトし、２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ中、１０％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌのヒトプロラクチンの存在下で、通常培養した。１％ＦＣＳを含有するプロラクチン非含有培地中で６時間の飢餓処理後に、細胞を９６ウェルプレートに、１ウェルあたり２５０００細胞の密度で播種した。細胞を１００ｎｇ／ｍｌのプロラクチンで刺激し、一連の用量の中和ＰＲＬＲ抗体と共に、２日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使って細胞増殖を分析した。プロラクチン刺激細胞成長の阻害に関する用量応答曲線を作成し、ＩＣ５０値を算出した。陰性対照として、非特異的対照抗体による刺激を使用した。抗体Ｍａｔ３を、抗体ＨＥ０６．６４２との比較において試験した（両方ともＩｇＧ１フォーマットであった）（図１１）。
【０２２１】
実施例４
患者および健常対照からの正所性および異所性子宮内膜および子宮内膜症病変におけるリアルタイムＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ分析によるプロラクチンおよびプロラクチン受容体遺伝子発現の定量的分析
リアルタイムＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを製造者の説明書（PE Applied Biosystems）に従って、Endocrinolgy 2008, 149(8): 3952-3959に記述されているとおり、そしてまた当業者に知られているとおりに、使用し行った。ＰＲＬおよびＰＲＬＲの相対的発現レベルをシクロフィリン(cyclophillin)の発現に対して標準化した。本発明者らは、健常女性からの子宮内膜ならびに患者からの子宮内膜および子宮内膜症病変におけるＰＲＬおよびＰＲＬＲの発現を、定量リアルタイムＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析を使って分析した。プロラクチンとその受容体の発現は、健常子宮内膜または患者に由来する子宮内膜と比較して、子宮内膜症病変では明確にアップレギュレートされていた。
【０２２２】
結果を図１および２に示す。
【０２２３】
これらの知見は、オートクリン型プロラクチンシグナリングが子宮内膜症および子宮腺筋症（内性子宮内膜症、子宮に制限された子宮内膜症の一形態）の発生と維持に役割を果たすことを含意している。
【０２２４】
実施例５
中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３によるＳＨＮマウスにおける子宮腺筋症（＝内性子宮内膜症）の処置
子宮内膜症における中和ＰＲＬＲ抗体の効力を調べるために、全身性高プロラクチン血症に依拠する、ＳＨＮマウスにおける子宮腺筋症モデルを使用した（Acta anat. 116:46-54, 1983）。７週齢雌マウスの腎被膜下に下垂体同系移植を行うことにより、ＳＨＮマウスにおける高プロラクチン血症を誘導した（Acta anat. 116:46-54, 1983）。中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３（３０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）または非特異的抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）の皮下投与を、下垂体同系移植の２週間後から開始した。７週間、動物を抗体で週に１回処置した。腺組織による子宮筋層の浸潤を既述のように評価した（Laboratory Animal Science 1998, 48:64-68）。剖検時（下垂体移植後６６日目）に、子宮を緩衝４％ホルマリン中で終夜固定し、パラフィンに包埋した。腺筋症（＝内性子宮内膜症）の度合を次のように評価した：
グレード０＝腺筋症なし
グレード１＝子宮筋層の内層がその同心的配向(concentric orientation)を緩める
グレード２＝子宮内膜腺が子宮筋層の内層に侵入
グレード３＝子宮筋層の内層と外層の間に子宮内膜腺
グレード４＝子宮内膜腺が子宮筋層の外層に侵入
グレード５＝子宮筋層の外層の外側に子宮内膜腺。
【０２２５】
実験は次の実験群から構成された：
１．下垂体移植なしの動物、すなわち正常プロラクチン血性マウス
２．下垂体移植を受けた動物、すなわち高プロラクチン血性マウス
３．３０ｍ／ｋｇの用量で１週間に１回、非特異的対照抗体で処置された、下垂体移植を受けた動物
４．３０ｍ／ｋｇの用量で１週間に１回、マウスＩｇＧ２ａフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３で処置された、下垂体移植を受けた動物
５．１０ｍ／ｋｇの用量で１週間に１回、マウスＩｇＧ２ａフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３で処置された、下垂体移植を受けた動物
６．３ｍ／ｋｇの用量で１週間に１回、マウスＩｇＧ２ａフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３で処置された、下垂体移植を受けた動物
７．１ｍ／ｋｇの用量で１週間に１回、マウスＩｇＧ２ａフォーマットの中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３で処置された、下垂体移植を受けた動物
【０２２６】
中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３は、内性子宮内膜症（＝腺筋症）を阻害した（図１２）。それゆえに、中和ＰＲＬＲ抗体はＭａｔ３、女性における内性子宮内膜症（＝子宮腺筋症）および外性子宮内膜症を処置するのに適している。
【０２２７】
実施例６
中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３は、良性乳房疾患の処置に適している
活性化ＰＲＬＲ突然変異または局所もしくは全身性高プロラクチン血症は良性乳房疾患を惹起しうる。したがって、それゆえに、乳腺における増進した増殖（大半の重症な形態の良性乳房疾患の特徴(hallmark)）を有する高プロラクチン血症マウスモデルを使用した。１２週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、腎被膜下に下垂体同種移植片を移植するか、または無手術のままにしておいた。下垂体同種移植したマウスを無処置のままにしておくか、下垂体移植１５、２２、２９および３６日後に、ＩｇＧ２フォーマットの中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３（＝ＩｇＧ２  Ｍａｔ３）またはＩｇＧ２フォーマットの非特異的対照抗体で週に１回皮下処置した。抗体用量は３０ｍｇ／ｋｇであった。実験群サイズは８匹の動物であった。
実験は、以下の実験群を含んだ：
１．下垂体移植なしの動物、すなわち正常プロラクチン血性マウス
２．下垂体移植ありの動物、すなわち高プロラクチン血症マウス
３．３０ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回、非特異的対照抗体で処置された、下垂体移植ありの動物
４．３０ｍｇ／ｋｇの用量で週に１回、中和プロラクチン受容体抗体Ｍａｔ３で処置された、下垂体移植ありの動物
下垂体移植後３８日目に、マウスを屠殺した。死亡の２時間前に、上皮細胞増殖をモニターするために動物にＢｒｄＵの腹腔内注射を行った。左鼠径部乳腺をＣａｒｎｏｙ溶液で固定し、乳腺全載を調製し、Ｃａｒｍｉｎｅ  ａｌａｕｎｅで染色した。Ｓｉｄｅ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇを乳腺全載において評価した。結果は、図３Ａに記載されている。抗体Ｍａｔ３は乳腺における側枝形成を阻害したが、非特異的対照抗体は効果がなかった（図３Ａ）。
【０２２８】
次に、乳腺全載をパラフィンに包埋し、ＢｒｄＵ免疫染色以前に記載（Endocrinology 149 (8): 3952-3959; 2009）されているとおりにを行った。上皮細胞増殖を、１動物あたり４つの組織学的乳腺スライスにおいて分析した。
【０２２９】
リンパ節なしの右鼠径乳腺側部１／３を液体窒素中で凍結し、ＲＮＡ調製のために処理した。逆転写後、リアルタイムＴａｑｍａｎ  ＰＣＲ分析を、製造業者（PE Applied Biosystems）の指示にしたがって、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して行った。プロラクチンターゲット遺伝子ｅｌｆ５の発現を評価し、サイトケラチン１８発現について標準化した。相対ｍＲＮＡレベルを、比較ΔＣＴ方法により計算した。下垂体同種移植片、すなわち高プロラクチン血症は、プロラクチンターゲット遺伝子ｅｌｆ５の発現を増強した（図３Ｂ）。非特異的対照抗体ではなく、特異的抗体Ｍａｔ３は、プロラクチン受容体の遮断の成功を示すｅｌｆ５遺伝子発現を阻害した（図３Ｂ）。
それゆえに、抗体Ｍａｔ３は良性乳房疾患を処置するのに適している。
【０２３０】
実施例７
ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーからのターゲット特異的抗体の単離
ヒトＰＲＬＲの活性を中和することができる一群の抗体を単離するために、ＦａｂおよびｓｃＦｖフラグメントを発現する３つのヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを並行して調べた。ライブラリーパンニングに使用したターゲットは、配列番号１２および１３のアミノ酸１−２１０によりそれぞれ示されるヒトおよびマウスプロラクチン受容体の可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であった。これに代わるターゲットは、Ｃ末端において、６個のヒスチジンに、またはヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインにアミノ酸配列「イソロイシン−グルタミン酸−グリシン−アルギニン−メチオニン−アスパラギン酸」を有するリンカーを介して連結されたＰＲＬＲのＥＣＤであった。
【０２３１】
ファージディスプレイからのターゲット特異的抗体の選択は、Ｍａｒｋｓらによって記載された方法（Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004）に従って行った。ファージディスプレイライブラリーを５０ｐｍｏｌのビオチン化ＥＣＤと共に室温で１時間インキュベートした後、形成された複合体を１００μｌのストレプトアビジンビーズ懸濁液（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使って捕捉した。ビーズを洗浄バッファー（ＰＢＳ＋５％ミルク（Ｍｉｌｋ））で洗浄することによって、非特異的ファージを除去した。結合しているファージを０．５ｍｌの１００ｎＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）で溶出させ、等体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．４を添加することによって、直ちに中和した。溶出したファージプールを使って、対数増殖期にある成長中のＴＧ１大腸菌細胞を感染させ、記述されているように、ファージミドを回収した（Methods Mol Biol. 248:161-76, 2004）。選択を合計３ラウンド繰り返した。３ラウンド目のパンニングからの溶出ファージに感染させたＴＧ１細胞から得た単一コロニーを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、結合活性についてスクリーニングした。簡単に述べると、溶出したファージで感染させたＴＧ１細胞から得られた単一コロニーを使って、９６ウェルプレート中の培地に接種した。
【０２３２】
微量培養をＯＤ６００＝０．６まで成長させ、その時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって可溶性抗体フラグメントの発現を誘導し、続いて３０℃の振とう培養器中で終夜培養した。細菌を遠沈し、周辺質抽出物を調製し、それを使って、９６ウェルマイクロプレート（９６ウェル平底Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂプレート、Ｎｕｎｃ）上に固定化したＥＣＤへの抗体結合活性を、マイクロプレートの製造者によって提供された標準的なＥＬＩＳＡプロトコールに従って検出した。
【０２３３】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００を使って、組換え細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への結合に関する抗プロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）抗体のアフィニティを推定し、それを抗体のアフィニティランキング(affinity ranking)に使用した。
【０２３４】
実施例８
抗体変異体の成熟：
抗体アフィニティ成熟は、飽和突然変異誘発、およびウェルベースのハイスループット・スクリーニングが、アフィニティ増加をもたらす少数の変異を同定するために組み合わされる２段階プロセスである。BMC Biotechnology 7: 65, 2007によれば、アフィニティ成熟の第１段階において、野生型抗体の位置的多様性が、BMC Biotechnology 7: 65, 2007にしたがって、ＮＮＫ−トリヌクレオチドカセット（ここで、Ｎは、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンヌクレオチドそれぞれ２５％混合物を表し、Ｋは、チミンおよびグアニンヌクレオチドそれぞれ５０％混合物を表す）を用いる部位特異的突然変異誘発によって導入される。このようにして、全ての２０アミノ酸が個々のアミノ酸位置に導入される。この位置的ランダム化は、６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に限定している。アフィニティ成熟の第２段階において、有益な置換が、再結合され、さらなる改良についてスクリーニングされる。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡ試験による成熟「００５−Ｃ０４」Ｆａｂ変異体のスクリーニング：
９６ウェルマイクロタイタープレートを、ヒトＰＲＬＲの１ミリリットルあたり１μｇで被覆した。プレートを一晩４℃でインキュベートした。３％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ緩衝液でブロッキングした後、Ｆａｂ変異体を含有する正規化Ｅ．ｃｏｌｉ由来上清を加えた。形成された複合体の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ｆｌａｇ抗体（Sigma, A8592）の添加を介して生じた。
【０２３６】
西洋ワサビペルオキシダーゼの蛍光発生基質としてのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄを加え、室温で３０分間インキュベートした。５７０ｎｍでの吸収および５８５ｎｍでの消光をＴｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５００  ｒｅａｄｅｒを用いて測定した。スクリーニングヒット「００５−Ｃ０４−２０−２」における得られた結果は、図７に示される。アフィニティ改良のために有益であるスクリーニングヒット「００５−Ｃ０４−２０−２」（図７）における個々の置換は、温度上昇による変性中のＦａｂドメインの共同アンフォールディングを保証するために、抗体の熱安定性に対するこれらの影響に関して評価した。抗体Ｍａｔ３は、「００５−Ｃ０４−２０−２」の誘導体であり、熱不安定置換が親抗体「００５−Ｃ０４」に対して逆転されている。
【０２３７】
実施例９
細胞表面上に発現したマウスおよびヒトＰＲＬＲに対する抗体の交差反応性
ａ）マウスＰＲＬＲを有する細胞に対する抗体ＨＥ０６６４２の欠落した抗増殖活性を理解するために、細胞上に発現したマウスおよびヒトＰＲＬＲに対するＨＥ０６６４２の結合特徴を、ヒトおよびマウスＰＲＬＲをそれぞれ安定に発現するＨＥＫ２９３細胞上で、フローサイトメトリーによって決定した。これらの細胞と、ＰＲＬＲを伴わない親ＨＥＫ２９３細胞株とを収穫し、遠心分離し、２％ＦＢＳおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）に、約５ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。抗体ＨＥ０６６４２をＦＡＣＳバッファーに最終濃度の２倍まで希釈し、適当な試料ウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。二次抗体および自己蛍光対照について、５０μｌのＦＡＣＳバッファーを適当なウェルに加えた。５０μｌの細胞懸濁液を各試料ウェルに加えた。試料を４℃で１時間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１００希釈のＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。図５Ａに示すように、抗体ＨＥ０６．６４２は、ヒトＰＲＬＲのみに結合し、一方、マウスＰＲＬＲに結合しなかった。この観察結果は、マウスＰＲＬＲ依存的増殖およびルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいてＨＥ０６．６４２が効力を欠くことに関する実施例２および１２に記載の知見と合致している。
【０２３８】
ｂ）細胞外ドメインのアミノ酸配列がカニクイザルのものと同一であるヒトおよびアカゲザルＰＲＬＲを有する細胞に対する抗体Ｍａｔ３の細胞結合を証明するために、細胞上に発現したヒトおよびサルＰＲＬＲに対するＭａｔ３の結合特徴を、ヒトおよびサルＰＲＬＲをそれぞれ安定に発現するＨＥＫ２９３細胞上で、フローサイトメトリーによって決定した。これらの細胞を収穫し、遠心分離し、３％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）に、約２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。抗体Ｍａｔ３をＦＡＣＳバッファーに最終濃度の２倍まで希釈し、適当な試料ウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。二次抗体および自己蛍光対照について、５０μｌのＦＡＣＳバッファーを適当なウェルに加えた。５０μｌの細胞懸濁液を各試料ウェルに加えた。試料を４℃で１時間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１００希釈のＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。図５Ｂに示すように、抗体Ｍａｔ３は、ヒトＰＲＬＲならびにサルＰＲＬＲに結合する。最も高い抗体濃度での最大シグナル強度は、細胞表面上に発現されるＰＲＬＲの数に依存する、すなわちＨＥＫ２９３およびＢａ／Ｆ細胞は、それらの表面上に同じ数のＰＲＬＲを有さない。ＥＣ５０値を、細胞に対するＭａｔ３の結合力に関する測定値を導くために、図５Ｂにおいて説明される用量応答曲線に基づいて計算した（表２）。Ｍａｔ３の細胞ベースの結合力価は、ヒトＰＲＬＲでＨＥＫ２９３細胞に対して０．５３ｎＭおよびサルＰＲＬＲでＢａ／Ｆ細胞に対して２．９４ｎＭであった。これらのデータは、Ｍａｔ３が非常に強力なヒト特異的薬剤だけでなく、妥当な用量で低いナノモル範囲におけるサルＰＲＬＲに対して活性でもあるとういうことを見出したことをサポートする。
【０２３９】
実施例１０
表面プラズモン共鳴分析を使用する精製細胞外ＰＲＬＲドメインでの結合試験
抗体Ｍａｔ３の結合アフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（GE Healthcare Biacore, Inc.）において、表面プラズモン共鳴分析により決定した。間接的な捕獲試薬である抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを介して、抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定した。「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ」（BR-1008-39, GE Healthcare Biacore、Inc.）からの試薬を、製造業者により記載されているとおりに使用した。約５０００ＲＵのモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を細胞ごとに固定した。抗体Ｍａｔ３を１０秒間１０μｌ／分で５μｇ／ｍｌの濃度で注射し、約２００から６００ＲＵの捕獲レベルに到達させた。ＨＥＰＥＳ−ＥＰバッファー（GE Healthcare Biacore, Inc.）中のさまざまな濃度（４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭ）のヒト、サルまたはマウスＰＲＬＲのＥＣＤを、３分間６０μｌ／分の流速で固定されたＭａｔ３抗体上に注射し、１０分間、解離させた。ヒトＰＲＬＲ（配列番号：１２）、サルＰＲＬＲ（配列番号：１１、第Ｘａ因子消化を介するＦｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇのタンパク質分解除去後）およびマウスＰＲＬＲ（配列番号：１３）のＥＣＤは、一価の分析物を示した。センサーグラムを、インライン(in-line)参照細胞補正、次にバッファー試料減法後に作製した。解離平衡定数（ＫＤ）は、ソフトウェアを使用して、一次１：１結合モデルでセンサーグラムをフィットすることにより得られる会合（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ＝ｋｄ）定数の比率に基づいて計算した。一価の解離定数（ＫＤ、アフィニティ）および解離速度（ｋｄ＝ｋｏｆｆ）値は、表１に示される。
【０２４０】
実施例１１
ペプチドスキャン
ａ）ペプチド合成：
ヒトＰＲＬＲのＥＣＤである標的分子配列番号１２のアミノ酸位置１から２１０の不連続的なエピトープを再構築するために、構造化したペプチドのライブラリーを合成した。これは、Pepscan専売Chemically Linked Peptides on Scaffolds(CLIPS)技術を使用して行った（Timmerman et al., 2007, J. Mol. Recognit. 20:283-99; Pepscan Therapeutics, Lelystad, Netherlands）。ＣＬＩＰＳ技術は、シングルループ、ダブルループ、トリプルループ、シート様折りたたみ、ヘリックス様折りたたみおよびそれらの組合せに、ペプチドを構築することができる。ＣＬＩＰＳテンプレートはシステイン残基と結合していた。ペプチドにおける多数のシステインの側鎖は、１または２つのＣＬＩＰＳテンプレートと結合していた。例えば、Ｔ２  ＣＬＩＰＳテンプレート  １，３−ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を、重炭酸アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ）に溶解させた。該溶液をペプチドアレイ上に加えた。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチドアレイの固相結合ペプチド中に存在する２つのシステインの側鎖に結合した（３ｕｌのウェルを有する４５５ウェルプレート）。ペプチドアレイを、溶液に完全に浸漬しながら３０から６０分間、溶液中で穏やかに震盪撹拌した。最後に、ペプチドアレイを、過剰のＨ２Ｏで広範囲に洗浄し、７０℃で３０分間、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１パーセントＳＤＳ／０．１パーセントベータ−メルカプトエタノールを含む破壊(disrupt)バッファー中で超音波処理し、次に、さらに４５分間、Ｈ２Ｏ中で超音波処理した。ペプチドを有するＴ３  ＣＬＩＰＳは、３つのシステインを用いて同様の方法で作製された。
【０２４１】
ｂ）Ｐｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡ：
それぞれのペプチドへの抗体Ｍａｔ３および抗体ＨＥ０６６４２の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡにおいて試験した（Slootstra et al., 1996, Molecular Diversity 1: 87-96）。ペプチドアレイを、５％から１００％−結合バッファーでプレインキュベートした（１時間、２０℃）。結合バッファーは、１％  Ｔｗｅｅｎ−８０、４％  ウマ血清、５％  オボアルブミン（ｗ／ｖ）からなり、ＰＢＳで希釈した。洗浄後、ペプチドアレイを、１％  Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳ中の一次抗体溶液（１から５μｇ／ｍｌ）でインキュベートした（一晩４℃）。洗浄後、ペプチドアレイを、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートの１００％結合バッファーにおける１／１０００希釈物で２５℃で１時間インキュベートした（抗ヒト、ｈｕｍｐｏ）。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２マイクロリットル／ミリリットルの３パーセントＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、色の発生(color development)を測定した。色の発生を、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよびイメージ処理システムで定量した。
【０２４２】
ｃ）データ処理：
生のデータは、ＣＣＤカメラにより得られる光学的値であった。該値は、標準９６−ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーと同様に、０から３０００ｍＡＵの範囲であった。該結果を定量し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに蓄積した。結合値を分析のために抽出した。時折、ウェルは偽陽性値における気泡結果を含み、表(card)を手動で検査し、気泡により引き起こされた値を０とスコア化した。
【０２４３】
ｄ）データ分析および表示：
ヒートマップ(heat map)は、実験データからの経験値が二次元マップにおいて構成され、次に色づけされるデータのグラフ表示である（Ｂｒｉｎｔｏｎ，  １９１４，  Ｇｒａｐｈｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍａｇａｚｉｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ；  Ｇｏｗｅｒ  ａｎｄ  Ｄｉｇｂｙ，  １９８１，  ），  “Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ”  ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｄａｔａ，  ｅｄ．  Ｂａｒｎｅｔｔ，  Ｖ．，  Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，  ＵＫ：  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ｐｐ．  ８３−１１８．）。ダブルループのＣＬＩＰＳペプチドについて、かかる二次元マップは、第１のループおよび第２のループの独立した配列から得ることができる。
【０２４４】
標的タンパク質（ヒトＰＲＬＲのＥＣＤ）について、２９１６個のＣＬＩＰＳペプチドは、２つの連続的なＣＬＩＰＳループにおいて組み合わせられた、５４個のユニークなサブ配列からなる有効な順列である配列を有した。したがって、観察されたＰｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡデータを、それぞれのＸ座標が第１のループのアミノ酸配列であり、それぞれのＹ座標が第２のループのアミノ酸配列である５４ｘ５４マトリックスにおいてプロットすることができた。マトリックスにおけるそれぞれのＸＹ座標について、配列Ｘ＋Ｙにてペプチドから生じるＰｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡ値を置いた。視覚化をさらに容易にするために、Ｐｅｐｓｃａｎ  ＥＬＩＳＡ値を、連続的な勾配から色で置き換えた。この場合、極端に低い値は緑色に色づけられ、極端に高い値は赤色に色づけられ、平均値は黒色に色づけられた。このカラーマップが記載されているデータマトリックスに適用されたとき、カラーヒートマップを得た。抗体Ｍａｔ３とＨＥ０６６４２との間のＥＬＩＳＡ結果における非常に著しい差異を示すペプチドを、これらのヒートマップ表示に基づいて選択した。これらのペプチドについて、それぞれのＥＬＩＳＡシグナル値を、バープロットの表示のために処理した（図８Ａおよび８Ｂ）。それぞれのプロットされた値は、Ｓ．Ｅ．Ｍ（平均の標準誤差）と共に、５４個のペプチドの得られた平均値を示す。データは、全２９１６個のペプチドのデータセットにわたる平均に対して標準化し、バックグラウンドシグナルに対して補正した。
【０２４５】
図８Ａは、Ｘ軸において「１１７」として示されるアミノ酸１０３−ＰＤＰＰＬＥＬＡＶＥＶＫＱＰＥ−１１７から１２７−ＷＳＰＰＴＬＩＤＬＫＴＧＷＦＴ−１４１（「１４１」として示される）の範囲であるペプチドのサブセットに対するＥＬＩＳＡ結果を示す。すなわち、ＥＣＤアミノ酸配列に沿って３つのアミノ酸がシフトされたこれらのペプチドは、ヒトＰＲＬＲのＥＣＤのアミノ酸位置１０３から１４１の領域に及ぶ。このデータセット内で観察される最も強い違いは、４ｘ１０−１２の有意ｐ−値を有するペプチド１０９−ＬＡＶＥＶＫＱＰＥＤＲＫＰＹＬ−１２３（「１２３」として示される）、および７ｘ１０−４０の有意ｐ−値を有するペプチド１２１−ＰＹＬＷＩＫＷＳＰＰＴＬＩＤＬ−１３５（「１３５」として示される）である。
【０２４６】
図８Ｂは、１３９−ＷＦＴＬＬＹＥＩＲＬＫＰＥＫＡ−１５３（Ｘ軸において「１５３」として示される）から１６３−ＱＱＴＥＦＫＩＬＳＬＨＰＧＱＫ−１７７（「１７７」として示される）の範囲であるペプチドのサブセットに対するＥＬＩＳＡ結果を示す。すなわち、ＥＣＤアミノ酸配列に沿って３つのアミノ酸がシフトされたこれらのペプチドは、ヒトＰＲＬＲのＥＣＤのアミノ酸位置１３９から１７７の領域に及ぶ。このデータセット内で観察される最も強い違いは、６ｘ１０−２６の有意ｐ−値を有するペプチド１４８−ＬＫＰＥＫＡＡＥＷＥＩＨＦＡＧ−１６２（「１６２」として示される）、および８ｘ１０−８の有意ｐ−値を有するペプチド１６０−ＦＡＧＱＱＴＥＦＫＩＬＳＬＨＰ−１７４（「１７４」として示される）である。
【０２４７】
これらのデータは、両方の抗体がヒトＰＲＬＲのＥＣＤのＳ２サブドメイン（アミノ酸１０１から２１０）に結合し、したがって、Ｓ１ドメインに主に結合する天然リガンドＰＲＬに対して非競合的であることを証明する。しかしながら、該ペプチドスキャンは、Ｍａｔ３とＨＥ０６６４２間のＳ２ドメインへの結合の違いがあることを示した。この見出したことは、なぜ抗体Ｍａｔ３が、ＨＥ０６６４２と比較して異なる種特異性および効力を示すのかを示す。
【０２４８】
実施例１２
ヒトおよびマウスＰＲＬＲを安定にトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の阻害
ヒトおよびマウスＰＲＬＲに対する中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３のインビトロ活性をさらに解析するために、レポーター遺伝子アッセイを使用した。マウスＰＲＬＲを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞に、ＬＨＲＥ（乳腺刺激ホルモン応答エレメント）の制御下にあるルシフェラーゼレポーター遺伝子を、一過性にトランスフェクトした。その後、細胞を、ウェル（８０μｌ）あたり２００００細胞の密度で、４，５ｇ／Ｌ  グルコース、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５％  ＦＣＳ、および１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ  高グルコース培地中に９６ウェルプレートに播種した（０．５％チャコールストリッピング済血清、ＤＭＥＭ）。翌日、２００ｎｇ／ｍｌのヒトプロラクチン（１０μｌ）を、一連の用量の試験抗体（１０μｌ）と共に、および試験抗体を伴わずに、加えた。２４時間後に、ルシフェラーゼ活性を決定した。比較のために、抗体ＨＥ０６６４２およびＣＴＸと称される非特異的抗体ターゲットコレラ毒素も試験した。全ての抗体は、ＩｇＧ１分子として試験した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。
【０２４９】
実施例１３
表面プラズモン共鳴分析を使用する精製細胞外ＰＲＬＲドメインとの結合試験
抗体Ｍａｔ３およびＨＥ０６６４２の結合アフィニティを、並行して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置（GE Healthcare Biacore, Inc.）における表面プラズモン共鳴分析により決定した。間接的な捕獲試薬である抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを介して、抗体をＣＭ５センサーチップ上に固定した。「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ」（BR-1008-39, GE Healthcare Biacore、Inc.）からの試薬を、製造業者により記載されているとおりに使用した。約５０００ＲＵのモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を細胞ごとに固定した。それぞれの試験抗体を１０秒間１０μｌ／分で５μｇ／ｍｌの濃度で注射し、約２００から６００ＲＵの捕獲レベルに到達させた。ＨＥＰＥＳ−ＥＰバッファー（GE Healthcare Biacore, Inc.）中のさまざまな濃度（４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭおよび３．１２ｎＭ）のヒト、サルまたはマウスＰＲＬＲのＥＣＤを、３分間６０μｌ／分の流速で固定された試験抗体上に注射し、１０分間、解離させた。ヒトＰＲＬＲ（配列番号：１２）、サルＰＲＬＲ（配列番号：１１、第Ｘａ因子消化を介するＦｃ−Ｈｉｓ−ｔａｇのタンパク質分解除去後）およびマウスＰＲＬＲ（配列番号：１３）のＥＣＤは、一価の分析物を示した。センサーグラムを、インライン参照細胞補正、次にバッファー試料減法後に作製した。解離平衡定数（ＫＤ）は、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ  ソフトウェアを使用して、一次１：１結合モデルでセンサーグラムをフィットすることにより得られる会合（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ＝ｋｄ）定数の比率に基づいて計算した（表７参照）。
表７：表面プラズモン共鳴によりＭａｔ３およびＨＥ０６．６４２に対して決定された（ＨＥＫ２９３細胞において発現される）ヒト、サルおよびマウスＰＲＬＲの精製細胞外ドメインの一価の解離定数および解離速度
【表７】
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＃ＷＯ２００８／０２２２９５におけるＨＥ０６６４２に対して記載されているアフィニティは、ＫＤ（ヒトＰＲＬＲ）＝２．６ｘ１０−９Ｍ、ＫＤ（サルＰＲＬＲ）＝３８．９ｘ１０−９Ｍ、およびＫＤ（マウスＰＲＬＲ）＝２．７ｘ１０−９Ｍである。
【０２５０】
表７に示されるとおり、Ｍａｔ３は、ＨＥ０６．６４２と比較して、サルおよびマウスＰＲＬＲに対する改善されたアフィニティを示す。ヒトＰＲＬＲに対するＭａｔ３の改善された細胞結合および抗増殖活性は、ＨＥ０６．６４２と比較して、ｈＰＲＬＲに対する改善されたアフィニティにより反映されない。マウスＰＲＬＲの精製ＥＣＤへの結合にもかかわらず、ＨＥ０６．６４２は、マウスＰＲＬＲを発現する細胞に結合しないか、または細胞の増殖を阻害する（図１０および１４、表８）。対照的に、Ｍａｔ３は、全３つの種において、ナノモルからサブナノモルスケールにおいて細胞増殖をブロックする。
【０２５１】
さらに、可溶性ＥＣＤ−ＰＲＬＲ（配列番号：１２）が、固定化された試験抗体Ｍａｔ３およびＨＥ０６６４２を介して表面上に捕捉され、したがって、捕捉抗体のエピトープは、全ての結合したＥＣＤ−ＰＲＬＲ分子に対してブロックした。ヒトＰＲＬは、表面上を即座に通過し、固定化されたＥＣＤ−ＰＲＬＲに結合した。このように、ＰＲＬがＥＣＤ−ＰＲＬＲに結合し、ＥＣＤが試験抗体により捕捉されるかを測定することができる。
【０２５２】
ＰＲＬが、Ｍａｔ３およびＨＥ０６．６４２への結合から独立してＥＣＤ−ＰＲＬＲに結合することを観察することができる。したがって、両方の抗体は、ＥＣＤ−ＰＲＬＲ上の天然リガンドＰＲＬと競合しない。
【０２５３】
実施例１４
ヒト、マウスおよびサルＰＲＬＲを発現するさまざまな細胞株に対する抗体の細胞結合試験
細胞結合試験を、全てＩｇＧ１フォーマットにおいて、抗体Ｍａｔ３およびＨＥ０６６４２ならびにコレラ毒素特異的アイソタイプで行った。試験された細胞株は、ヒトおよびマウスＰＲＬＲそれぞれを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞、ヒト乳癌細胞株Ｔ４７Ｄならびにヒト、マウスおよびアカゲザルＰＲＬＲを発現するＢａ／Ｆ細胞株であった。細胞結合を、上記細胞に対するフローサイトメトリーによって決定した。これらの細胞を収穫し、遠心分離し、３％ＦＢＳおよび０．０５％アジ化ナトリウムを含有する１×ＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）に、約２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。それぞれの試験抗体をＦＡＣＳバッファーに最終濃度の２倍まで希釈し、適当な試料ウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。二次抗体および自己蛍光対照について、５０μｌのＦＡＣＳバッファーを適当なウェルに加えた。５０μｌの細胞懸濁液を各試料ウェルに加えた。試料を４℃で１時間インキュベートし、冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１：１００希釈のＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧを含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファーで２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を含有するＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２５４】
得られたデータを、図１４における用量応答曲線として示す。これらの曲線から、細胞結合力価を示すＥＣ５０値を導いた（表８）。結論として、データは、ＰＲＬＲを発現する種々の細胞株にわたって、ＨＥ０６．６４２と比較して、Ｍａｔ３の優れた細胞結合特徴を示す。
表８：フローサイトメトリーから導かれた、ヒト、マウスおよびサル由来のＰＲＬＲを発現する細胞に対する、ＩｇＧ１フォーマットにおける中和ＰＲＬＲ抗体Ｍａｔ３およびＨｅ０６．６４２の細胞結合力価
【表８】
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＊有意な結合なし；＃図１４における用量応答の図
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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