(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNAリガーゼとしてのHSPC117分子のインビトロ（in vitro）での使用。
【請求項２】
第一のRNA末端の第二のRNA末端への転移のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記第一のRNA末端が3'リン酸を含み、そして/または前記第二のRNA末端が5'-OH終端を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記3'リン酸が、2’,3’-環状リン酸である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ストランド間又はストランド内のライゲーションのための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記RNAリガーゼが結合するRNAは二本鎖である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
RNAスプライシングのための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記RNAリガーゼが結合するRNAはmRNA又はtRNAである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記RNAリガーゼが結合するRNAは、長さが2〜3000個のヌクレオチド又は塩基対である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記HSPC117分子が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23のいずれか１つである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも２つのRNA分子を連結する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用を含む、インビトロ（in vitro）での方法。
【請求項１２】
少なくとも２つのRNA分子を前記HSPC117分子と接触させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記HSPC117分子を、複合体で供することをさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記複合体がスプライセオソーム粒子との複合体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体がDEADボックスヘリカーゼDDX1分子、FAM98B分子、CGI-99分子、ASW又はこれらの任意の組合せを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
HSPC117分子、
バッファー成分、及び0.1-20mMの最終濃度範囲での使用のための、Mg2+、Mn2+、Ni2+又はそれらの混合物から選択される１又は２以上の金属イオンを含むRNAリガーゼ反応バッファー、
を含むRNAライゲーションの実施に適した、キット。
【請求項１７】
前記最終濃度範囲が1-10mMである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記最終濃度範囲が2-5mMである、請求項１６又は１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらにRNA分子を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
前記RNA分子は、2’,3’-環状リン酸を有するRNA分子である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記RNA分子は、標識を有するRNA分子である、請求項１９又は２０に記載のキット。
【請求項２２】
細胞中で、RNAリガーゼ活性を減少するための組成物であって、HSPC117分子を細胞中で抑制し、HSPC117 siRNA、HSPC117 shRNA、又は抗HSPC117抗体を含む、前記組成物。
【請求項２３】
前記RNAリガーゼ活性は、RNA>pリガーゼ活性である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抑制が、前記細胞においてHSPC117分子の発現を減少することによることを特徴とする、請求項２２又は２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抑制が、前記細胞において内因性HSPC117分子の発現を減少することによることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細胞においてtRNA産生又はプロセシングを減少するための、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
宿主のポリメラーゼに依存的な腫瘍細胞成長、疾患又は感染を減少するための医薬組成物であって、HSPC117 siRNA、HSPC117 shRNA、及び抗HSPC117抗体から選択されるHSPC117分子阻害剤を含む前記医薬組成物。
【請求項２８】
機能障害性tRNAスプライシングと関係した疾患を対象において治療するための医薬組成物であって、HSPC117分子を含む前記医薬組成物。
【請求項２９】
前記感染は、D型肝炎ウイルス感染である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記機能障害性tRNAスプライシングと関係した疾患は、橋小脳発育不全である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞及び分子生物学ツールの分野、特に、RNAリガーゼ、並びに分析及び治療用のRNAリガーゼを使用及び抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
RNA又はDNAを連結する天然の酵素は通常、5'位のホスホリル基を有する核酸分子を3'位のヒドロキシル基を有する第二の核酸分子に結合する。5'末端上のリン酸は、通常エネルギー移動ステップにおいてATPによって供される。
【０００３】
転移RNA（tRNA）は、伝令RNA（mRNA）のタンパク質への翻訳に必須のアダプター分子である。他のRNA分子と同様に、前駆tRNA転写物（tRNA前駆体）は、生物学的機能を果たし得る前に、広範囲の転写後プロセシングに供される。5’-リーダー及び3’-トレーラー配列の除去、ヌクレオチドの広範囲の塩基及び糖の修飾、並びに鋳型非依存的添加に加えて、一部のtRNAは介在配列の切除を受けなければならない。tRNAイントロンの除去は、mRNAのカノニカル（canonical）スプライソソーム依存性プロセシングとは異なるスプライシングプロセスによって達成される。tRNAスプライシングは、イントロンを切り取る特定化されたエンドヌクレアーゼ及びエクソンのハーフ（halves）を結合するためのリガーゼを必要とする（図1A）。
【０００４】
国際公開第2004/087884号は、tRNAプロセシングに関与する小分子の有機分子のスクリーニング方法を記載する。Pascal等の、Current Opinion in Structural Biology 18（1）（2008）: 96-105は、PNA及びRNAリガーゼにおける相違に関する。Kato等の、Journal of Molecular Biology 239（5）（2003）: 903-911は、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）のRNAリガーゼの結晶構造を記載する。Wang等は、RNA 11（6）（2005）: 966-975に、実施した酵母tRNAリガーゼの構造機能分析を記載する。Okada等は、PROTEINS 63（4）（2006）: 1119-1122において、RNAシクラーゼである、超好熱古細菌（Pyrococcus horikoshii）由来のRtcB相同タンパク質の結晶構造を供した。
【０００５】
tRNA遺伝子中のイントロンの存在は全生物のドメインに共通するようであるが、スプライシング機構の進化はライゲーションステップで分化したようである。異なる生物界に寄与しうる２つの主要なライゲーション経路が記載されている（Abelson et al.、1998）。真菌及び植物クレードは、バクテリオファージT4RNAリガーゼ1と相同である１つの多機能ポリペプチドによって触媒される共通のライゲーション機構を使用する。斯かる経路は、続くライゲーションのためのエクソン終端を調製するために、ホスホジエステラーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼの活性作用を必要とする。結果として、ヌクレオシド三リン酸（NTP）ドナーから生ずる外因性リン酸は、成熟tRNAに取り込まれる（図1A、分岐上部）。一方、動物及び古細菌クレードは、エンドヌクレアーゼ反応後に残る2’,3’-環状リン酸と5’-ヒドロキシル（5’-OH）終端とを直接結合することによってtRNAエクソンを連結することができる（Laski et al.、1983）。斯かるリガーゼ反応（図1A、分岐下部）は、2’,3’-環状リン酸終結RNA（RNA>p）に依存的であり、前駆体由来の2’,3’-環状リン酸の、3’、5’-リン酸ジエステルとしての成熟tRNAのスプライスジャンクションへの取り込みをもたらす（Filipowicz and Shatkin、1983）。斯かるRNA>pリガーゼ反応の重要な生化学的側面は、解明されている。しかしながら、斯かるtRNAスプライシング経路は当初仮定であり、多くの生化学的、バイオインフォマティクス及び遺伝的な取り組みにもかかわらず、適したRNAリガーゼは確認されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、本発明の目的は、少なくとも基質として2’,3’-環状リン酸終結のRNAを使用することもできるRNAリガーゼ（「RNA>pリガーゼ」）を供することである。斯かる目的は、請求項の主題によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特に、本発明は、HSPC117分子の、分子生物学ツールとして及び治療におけるRNAリガーゼとしての使用に関する。HSPC117は、配列決定されており（例えば、Genbank ACC NO: NP_055121又はCAG33456）、染色体22 orf 28（「C22ORF28」）に位置する。HSPC117は、未知の機能の高度に保存された領域（UPF0027）と特有のタンパク質の折り畳み構造とを特徴とする、細菌性/古細菌のRtcB遺伝子ファミリーのヒト相同体である。UPF0027タンパク質は、植物又は真菌モデル生物において検出可能な代替のない、オルソロガス遺伝子（KOG3833）のクラスターを形成する。斯かる系統発生上の違いは、動物及び古細菌においてRNA>pリガーゼ活性の独占的発生が非常に連想される。HSPC117は本明細書中で、HSPC117/C22ORF28又はRtcB/HSPC117とも呼ぶ。本明細書において、用語「HSPC117分子」とは、今日RNAリガーゼ反応を触媒すると同定されている斯かるクラスターにおける任意の相同又はオルソロガス分子を意味する。このような「HSPC117分子」の配列の例を、配列番号1〜配列番号11として図6に供する。HSPC117分子は全て、配列番号1のC122に相当する触媒のシステイン残基を含むことが分かっている。
【０００８】
HSPC117分子及び配列はさらに、例えば、米国特許出願第2007/0204352号（特に、配列番号15、16、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78）に記載されるが、その中で本発明の使用は認識されない。米国特許出願第2007/0204352号は、α-syncleinの集合に潜在的に関与する遺伝子のスクリーニングに関する。米国特許出願第2007/0204352は段落[50]において、HSPC117遺伝子の顕著な進化的保存の背景を供しており、HSPC117分子の新規機能が分かっているので斯かるタンパク質は本発明の方法に使用できる。
【０００９】
本発明のRNAリガーゼは、第一のRNAの第二のRNAへの転移を触媒するために使用できる。双方のRNAの末端は、リガーゼによって結合することができる。斯かる結合は、通常双方のRNA間のホスホジエステル結合の共有結合である。特に、一方のRNAは、特に、2’,3’-環状リン酸の形態で、3'リン酸を含むことができ、他方は5'-OH終端を含むことができる。このような末端間で、特に、5'-OH終端を使用することによって結合を形成する能力は、本発明のHSPC117分子の特有の特徴である。
【００１０】
通常、RNAライゲーションは、ストランド間又はストランド内のライゲーションとすることができる。２つの別々のRNA鎖は、3'及び5'末端上で、それぞれ結合することができる。さらに、ストランド内のライゲーションにおいて、一方のRNA分子の5'及び3'末端が結合される。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、RNAは二本鎖である。特に、本発明のRNAリガーゼによって結合される第一及び/又は第二のRNA分子は、二重鎖部分を含むことができる、又は完全に二重鎖である若しくは一本鎖である。特に好ましくは、RNAリガーゼ反応によって結合される上記の3'末端及び他方のRNA末端の5'終端は、二本鎖とすることができる。RNA、特に、通常tRNA前駆体の一本鎖3'オーバーハングが存在する、RNAスプライシングのさらなる部分は、一本鎖とすることもできる。また、RNAリガーゼ反応によって結合される5'及び/又は3'末端は、tRNA前駆体プロセシングでは通常、一本鎖とすることができる。二本鎖性（Double-strandedness）は、第一及び第二のRNA分子間の塩基対合とすることができ、あるいはさらなるRNA鎖への塩基対合とすることができる。
【００１２】
特に好ましい実施形態において、本発明のHSPC117分子はRNAスプライシングのために使用する。RNAスプライシング反応において、イントロン部分は、本発明のRNAリガーゼによって結合される２つのエクソン間で除去される。典型的なスプライシング反応は、エクソン1-イントロン-エクソン2配列の、エクソン1-エクソン2への反応である。他のスプライシング反応は、複数のイントロンを、任意にはこれらのイントロン部分間でエクソンもまた除去することができる。
【００１３】
RNAリガーゼとしてのHSPC117分子の本発明の使用によって結合されるRNAは、任意の長さとすることができる。RNAの長さは例えば、2〜3000ヌクレオチド又は塩基対である。特定の実施形態において、第一のRNA又は第二のRNAは、長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、45、50、60、70、80、90以上、又は100以上のヌクレオチド又は塩基対とすることができる。あるいは又はさらに、RNAは、第一のRNA若しくは第二のRNA又は双方とも、長さが最大で3000、2000、1500、1200、1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、80、70、60又は50ヌクレオチド又は塩基対とすることができる。
【００１４】
本発明のHSPC117分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11のいずれか１つとすることができる。配列は、ヒト（H.sapiens）、ハツカネズミ（M.musculus）、アフリカツメガエル（X.leavis）、アメリカムラサキウニ（S.purpuratus）、キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）、シー・エレガンス（C.elegans）、コナミドリムシ（C.reinhardtii）、メタン生成古細菌（M.jannaschii）、超好熱古細菌（P.horikoshii）、サーマス・サーモフィラス（T.thermophilus）、又は大腸菌（E.coli）の、各々のHSPC117分子の例を供する。さらにHSPC117配列又は配列変異体を、配列番号12〜23に開示し、これらはヒト（H.sapiens）、シー・エレガンス（C.elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）、ゼブラ・ダニオ（Danio rerio）、ウシ、マウス及びラット由来のさらなる核酸及びアミノ酸配列を供する。本発明のHSPC117分子は、これらの任意の生物から得ることができる。好ましい実施形態において、本発明のHSPC117分子は、動物又は古細菌、特に、哺乳類、例えば、ヒトを含む霊長類等、又はゲッ歯類、特に、マウス又はラット由来である。
【００１５】
本発明のHSPC117分子は、１又は２以上のアミノ酸置換又は欠失によってさらに修飾することができる。さらに、本発明のHSPC117分子は、融合タンパク質の一部として表すことができ、さらなるアミノ酸又はポリペプチド配列を含むことができる。特に好ましくは、本発明のHSPC117分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23のいずれか１つと、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は少なくとも95%の配列同一性を有する。好ましい実施形態において、当該配列同一性は、配列番号1に関する。配列同一性は、通常配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23の全長配列に亘って算出される。当然ながら、このようなHSPC117分子変異体は上記のRNAリガーゼ活性を保持し、本明細書の実施例部分に示すように斯かる活性は標準アッセイによって容易に測定できる。特に、HSPC117分子が触媒的に重要な残基、例えば、配列番号1のシステイン122等を保持することが重要である。本発明のHSPC117分子の変異体は、例えば、米国特許出願第2007/0204352号（特に、その配列番号15、16、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78）に記載され、配列番号12〜23として参照により本明細書に組み込まれ、本発明の目的のために使用できる。
【００１６】
アミノ酸置換の場合、好ましい実施形態において、置換の少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも95%が、保存アミノ酸置換である。保存置換は、アミノ酸基内の突然変異である。アミノ酸は、通常その極性、電荷及び/又はサイズに従ってグループ化される。次のグループは注目に値する: 塩基性アミノ酸: アルギニン、ヒスチジン、リジン; 酸性アミノ酸: アスパラギン酸、グルタミン酸; 極性アミノ酸: アスパラギン、グルタミン; 小分子アミノ酸: アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、グリシン; 芳香族アミノ酸: フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン; 疎水性アミノ酸: ロイシン、イソロイシン、バリン。システインは通常セリン及び任意の他の極性非荷電の側鎖で保存的に置換することができ逆もまた同様であるので、システインは特例である。グリシンは、任意のアミノ酸のための置換基として使用できる。グリシンは、通常小分子側鎖、例えば、アラニン、セリン、トレオニン等によって置換できる。プロリンは、通常グリシンのための置換基として置換、又は使用することができる。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、例えば、上記の少なくとも２つのRNA分子を連結する方法に関し、上記のHSPC117分子を使用することを含む。ここで、表現「RNAリガーゼとしての使用」と「RNA分子を連結する方法」とは、互換的に使用される。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明の使用又は方法は、細胞中で少なくとも２つのRNA分子をHSPC117分子と接触させることを含むことができる。本発明はまた、組換えHSPC117の使用に関する。組換えHSPC117（上記の任意の相同体又はオルソログを含む）は、制御DNA配列（非相同制御配列とすることができる）、宿主細胞における、例えばプロモーター又はエンハンサー等に操作可能に結合される、１又は２以上のHSPC117 DNA配列を含む遺伝子コンストラクトの発現によって容易に得ることができる。宿主細胞の例は、細菌性、古細菌、真菌（酵母を含む）、植物又は動物（昆虫又は哺乳類を含む）細胞である。このようなコンストラクトにおいて、その設計は通常の実験マニュアルに記載され当業者にとってルーチンであり、制御配列は、HSPC117分子をコードするポリヌクレオチド又はRNAリガーゼ活性を有するその活性変異体に操作可能に結合させることができる。
【００１９】
本発明のHSPC117分子は、インビトロ（in vivo）で、例えば細胞中で使用することができ、例えば、その中で人工的に供する又は細胞中で遺伝子組換えで発現させることができる。２つのRNA分子は、本発明の実施形態に従って細胞中で連結させることができる。細胞は、上記の通り任意の細胞とすることができ、好ましくは非ヒト細胞又は単離されたヒト細胞とすることができる。
【００２０】
さらなる実施形態において、RNA分子は、例えば、細胞外又は無細胞溶液中等を含むインビトロ（in vitro）又はインサイツ（in situ）でHSPC117分子と接触させることができる。RNA分子は、分離させ、エクスビボ（ex vivo）で本発明のHSPC117分子と連結することができる。
【００２１】
本発明によれば、HSPC117が天然にもまたインビトロ（in vivo）で複合体に含まれ得る、触媒的に活性のあるタンパク質であることが分かった。よって、本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のHSPC117分子はまた、このような複合体で供される。複合体は、例えば、スプライセオソーム粒子であり、例えば、核HeLa細胞抽出物から分離することができるSF3B粒子等とすることができる。他の複合体メンバーは、特に、他の生物の他のHSPC117分子又はその変異体に関して、各生物の細胞抽出物から分離することができる。
【００２２】
特に好ましい実施形態において、本発明の複合体はDEADボックスヘリカーゼDDX1、FAM98B分子、CGI-99 分子、ASW又はこれらの任意の組合せ、特に好ましくは、DDX1及びFAM98B分子との組み合わせを含むことができる。HSPC117分子の複合体中に含まれ得るさらなる複合体メンバーは、実施例5に示す表1及び2のいずれか１つとすることができる。
【００２３】
本発明によれば、HSPC117分子、それ自体を供することができる。あるいは、HSPC117分子はキットの成分として使用または供することができる。
【００２４】
よって、さらなる態様において、本発明は、HSPC117分子を含むキットに関する。キットはさらに、バッファー成分或いはMg2+、Mn2+、Ni2+又はその混合物から選択される１又は２以上の金属イオンを含む、RNAリガーゼのための反応バッファーを含むことができる。好ましい実施形態において、金属イオンは最終濃度範囲約0.1-20 mM、好ましくは1-10mM、特に好ましくは、2-5mMの使用量で含まれる。
【００２５】
上記の金属イオンに加えて、キットのバッファーは、当技術分野で周知の通常のバッファー成分を含むことができる。このようなバッファーは、例えば、リン酸、ヘペス、トリス-HCl成分を含むことができる。好ましくはバッファーは、生理的pH値の範囲、例えば、pH 6〜pH 9の範囲、好ましくはpH 7〜8の範囲、特に好ましくは約pH 7.4である。バッファーは、約10-200mMの範囲のKCl又はNaClである、浸透圧物質（tonic substance）又は塩を含むことができる。さらに、バッファーは非イオン性の浸透圧物質、例えば、グリセロール等を含むことができる。
【００２６】
試験キットの形態において、キットはさらに、本発明のHSPC117分子の基質であるRNA分子、特に、2’,3’環状リン酸を有するRNA分子を含むことができる。斯かるRNA分子は、例えば、さらに標識、例えば、RNAリガーゼ反応の前後でRNA分子を検出するための放射性標識等を含むことができる。このようなキットは、あらゆる種類の反応及びRNAプロセシング又はハイブリッド形成のモニターに有用である。本発明のHSPC117分子又はキットは、特に、RNAライゲーション又はスプライシング試験に使用することができる。
【００２７】
さらなる態様において本発明は、外因的に発現されたHSPC117分子を含むトランスジェニック細胞に関する。細胞は細胞株とすることができ、あるいは動物モデル、特に、非ヒト動物モデルに含むことができる。細胞株は、HSPC117分子を安定して発現するヒト細胞株とすることもできる。
【００２８】
外因的に発現されたHSPC117分子の安定した発現は、プロモーター、好ましくは誘導プロモーターの制御下での、細胞へのHSPC117 DNAの挿入によって達成される。特定の実施形態において、斯かるDNAは細胞のゲノムに挿入でき、それは従来の方法、例えば、テトラサイクリン誘導系のような市販の系、例えば、t-REx系（invitrogen）等によって達成できる。このような細胞は、2’,3’環状リン酸又は5'-OHと連結できるRNA、特に、2’,3’環状リン酸又は5'-OHを有するRNAと組み合わせて、RNA分子を連結するのに有用である。
【００２９】
本発明はさらに、細胞中で、RNAリガーゼ活性、特に、RNA>pリガーゼ活性を減少する方法に関し、好ましくはノックアウト又はRNAiによって細胞中でHSPC117分子を抑制することを含む。RNA>pリガーゼ活性は、上記の通り、2’,3’-環状リン酸終結RNAを基質として使用するRNAリガーゼ反応に関する。このような方法は、細胞中でtRNA産生又はプロセシングを減少するために使用できる。HSPC117の減少は、細胞においてHSPC117を結合、分離又は通常を不活性化するリガンドをHSPC117へ投与する、又はHSPC117発現を抑制することによって達成できる。このような結合阻害剤は、例えば、市販のHSPC117抗体である。「HSPC117-抗体」は、HSPC117を結合する抗体断片、例えば、Fab、F（ab）2、Fv、又は一本鎖の抗体（scAb）等を含む、任意の機能等価物及びその誘導体を含む。好ましい実施形態において、斯かる抑制は、細胞においてHSPC117分子、好ましくは内因性HSPC117分子の発現を減少させることによって達成される。HSPC117発現を減少するための適した阻害剤は、RNAiを誘発するHSPC siRNA分子である。
【００３０】
HSPC117発現を抑制する好ましい方法は、ノックアウト又はRNAiである。ノックアウトのために、機能性HSPC117分子の発現、転写又は翻訳を示すようにゲノムHSPC117を修飾する。このような修飾は、触媒中心における、例えば、最大200又はそれ以上のヌクレオチドの大きな伸展欠失又は選択的修飾（欠失又は置換）を含むことができる。例えば、配列番号1のヒトHSPC117配列の触媒C122における修飾は、機能分子の発現を防止するのに十分である。もちろん、当業者は別の修飾を容易に選択でき、これは分子細胞生物学者のルーチン能力内である。
【００３１】
さらに好ましい方法は、RNAi（RNA干渉）である。拮抗性細胞HSPC117発現に関して、好ましくはsiRNA分子は発現及び機能を低下するために投与される。RNA干渉は、配列特異的態様で遺伝子発現を抑制するための機構である。RNA干渉は、真核細胞における特異的な遺伝子機能の抑制のための非常に有効な方法である。細胞及び生物に適用する場合、RNAiはベクターをコードする低分子干渉RNA（siRNA）オリゴ又は低分子ヘアピン型RNA（shRNA）のトランスフェクションにおいて、標的mRNAの分解を引き起こす。RNAiの様々な方法が記載されており、例えば、米国特許出願第2002/0162126号及び米国特許出願第2002/0173478号に記載されるように、これ等は植物細胞、ショウジョウバエ及びヒトメラノーマ細胞において遺伝子発現を変化することが一般的に知られている。本発明の方法及び組成物における使用のためのsiRNAは、HSPC117分子を標的とするために選択される。斯かる態様において、それはHSPC117遺伝子に相当する様々なRNA又はその部分を標的にする。当業者によって、本明細書に記載されるsiRNAは、ハイブリッドDNA/RNAコンストラクト又はその任意の等価物である改変siRNA、二重鎖RNA、マイクロRNA（miRNA）、及びsiRNA型、例えば、siRNA複製、ウイルス性及び非ウイルス性ベクター中の低分子ヘアピン型RNA（shRNA）並びに担体中のsiRNA又はshRNAもまた含むことができることと理解されたい。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明はHSPC117ノックアウト細胞又は減少若しくは抑制されたた内因性HSPC117発現を有する細胞に関する。
【００３３】
このような細胞株は、RNAライゲーション又はスプライシング試験において、すなわち、RNAライゲーションの機能を試験するためにさらに使用することができる。内因性HSPC117発現の減少は、2’,3’環状リン酸の5'-OH RNA分子への転換を媒介する、本発明のHSPC117リガーゼのバックグラウンド活性がないという利点も有する。HSPC117が誘導プロモーターの制御下であるトランスジェニック細胞と組み合わせて、これによりRNAリガーゼの特異的なオンオフ試験が可能でありリガーゼ活性を制御するための有用なツールであり、それはスプライシング試験専用又は唯一の細胞生化学工学ツールとなり得る。よって、好ましい実施形態において、本発明は、内因性HSPC117を発現しないが、誘導プロモーターの制御下でさらにHSPC117分子が外因的にトランスフェクトされているHSPC117ノックアウト細胞に関する。好ましい実施形態において、細胞は哺乳類細胞、特に好ましくは霊長類、特に、ヒトの細胞又はゲッ歯類、例えば、マウス細胞である。上記の通りHSPC117発現が増大又は減少された細胞を含むこれらの細胞は、RNAライゲーション又はスプライシング試験に使用できる。
【００３４】
さらなる態様において、本発明は、異常tRNAプロセシングが付随する疾患又は（増大された）tRNAプロセシングに依存的な疾患の治療に関する。特定の実施形態において、本発明はRNAリガーゼとしてのHSPC117分子の使用又はHSPC117分子を抑制する方法（但し、治療によるヒト又は動物の治療方法は除く）、又は医薬としての使用のためのHSPC117分子又はHSPC117阻害剤の使用を供する。HSPC117阻害剤は、上記のHSPC117の活性又は発現を減少する任意の分子であり、好ましくはHSPC117抗体又はHSPC117 siRNAである。
【００３５】
HSPC117分子の抑制は、一部の疾患において治療効果を有することができる。このような疾患は、増殖性疾患、特に、癌を含む。tRNAプロセシングを減少させることにより、増殖性活性を非常に減少させ、減少された細胞成長を生じることができる。よって本発明は、腫瘍細胞成長を減少させる方法を供し、斯かる方法は、HSPC117分子阻害剤を細胞に投与することを含む。腫瘍細胞が異常に高速のポリメラーゼ（Pol）III転写を有することが知られている（Marshall & White、2008）。Pol IIIはtRNAを合成するので、tRNAリガーゼの標的化は、癌細胞における律速の（高）tRNA産生となるであろう。増殖に関するtRNAスプライシング成分の重要性は、例えば国際公開第2004/087884号に開示される（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３６】
さらなる態様において、本発明は宿主ポリメラーゼに依存的な疾患又は感染、例えば、D型肝炎ウイルス感染等の治療を供し、斯かる治療はHSPC117分子阻害剤の細胞への投与を含む。ヒトD型肝炎ウイルスは、宿主ポリメラーゼを使用してRNAゲノムを複製することが知られる唯一の動物ウイルスである。ウイルスの複製に関与する宿主因子は、特定が困難である。複製中のウイルス性ゲノムの環状化においてリガーゼ宿主因子が関係する（Reid & Lazinski、2000）。結合プロテオミクス-RNAiスクリーンにおいて、100異常のタンパク質がＤ型肝炎抗原に関係することが確認された。同定されたタンパク質の一部はRNA代謝において役割を有し、それらの１つはHSPC117である。まとめると、これはHSPC117がD型肝炎ウイルス感染の治療に重要な標的であることを示す。
【００３７】
さらに、本発明は、機能障害性tRNAスプライシングと関係した疾患に罹患する、特に、RNA>pによるtRNAライゲーションが欠如した対象、好ましくは橋小脳発育不全の対象における治療方法に関し、斯かる方法はHSPC117分子の対象への投与を含む。tRNAスプライシング経路と橋小脳発育不全との間の関係性が確立されている。斯かる疾患は、出生前の発症を伴う変性常染色体劣性遺伝疾患、小脳の萎縮又は発育不全及び他の運動障害から成る群に属する。機構的に、これらの疾患は、tRNAスプライシング中のイントロンの異常的除去及びエクソンのライゲーションと関係する。よって、機能性HSPC117分子の投与は、正常のスプライシング及びイントロン除去を回復し、疾患を治療することができ、一方で分子レベルでは理解されていないが、tRNA代謝が脳機能へ特別な影響を有することもまた周知である。
【００３８】
細胞は、血管新生における周知の役割に加えてリボヌクレアーゼ活性を示す因子であるアンジオゲニンを分泌することによって酸化ストレスに応答する。アンジオゲニンは成熟tRNAをアンチコドンループで切断し、それにより、tRNA由来のストレス誘発性RNAのための、tiRNAとして知られるtRNA断片を産生している。tiRNAの蓄積は、タンパク質合成を損ない、よって、細胞の健康及び機能に有害である。ヒトtRNAリガーゼHSPC117を不活性化することは、培養細胞においてtiRNAの増大につながる。増加されたHSPC117は、アンジオゲニンの切断を戻しtiRNAレベルを低下する。HSPC117はよって、アンジオゲニン切断のtRNAの再結合において異なる役割を有することができる。このアンジオゲニン反応は、HSPC117分子の抑制状態では戻すことができない。よって本発明はまた、例えば、細胞中のHSPC117活性の増大又は減少による、細胞におけるtiRNA量の調節方法に関する。
【００３９】
さらなる態様において、本発明は、上記の通り、好ましくは発現ベクター、又はHSPC117分子阻害剤、好ましくは抗体又はsiRNA或いはその変異体の形態の、核酸を発現しているHSPC117分子を含む医薬組成物を供する。このような組成物は、例えば、上記の任意の疾患の治療のための、即使用可能な組成物とすることができる。治療又は予防使用のための医薬組成物又は製剤は、医薬的に許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤及び/又は保存剤を含むことができる。本発明はまた、HSPC117阻害剤又は発現核酸の治療上有効量を含む医薬組成物を供する。用語「治療上有効量」とは、特定の投与条件及び経路に治療効果を供する量を意味する。組成物は液体又は凍結乾燥形態とすることができ、様々なpH値及びイオン強度を有する希釈剤（トリス、酢酸又はリン酸バッファー）、可溶化剤、例えば、ツイーン又はポリソルベート等、担体、例えば、ヒト血清アルブミン又はゼラチン等、保存剤、例えば、チメロサール又はベンジルアルコール等、及び抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は二亜硫酸ナトリウム等を含む。特定の組成物の選択は、治療される条件、投与経路及び目的の薬物動態パラメータを含む因子の数に依存的とすることができる。核酸及びsiRNA製剤は、好ましくはリポソーム製剤で投与される。本発明の組成物は、注射によって、皮下、静脈内又は筋肉内に、或いは経口、経鼻、肺性又は直腸投与によって投与できる。最終的に選択される投与経路は、因子の数次第であり、当業者によって確定することができる。
【００４０】
本発明は、図及び実施例を参照して、それらに限定されることなく、より詳細に説明できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】図１Ａは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（A）は、記載のRNAライゲーション経路における機構の相違を説明しているスキームを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（B）[5’-32P]-pCp-放射標識の5’-OH、3’-P RNAオリゴヌクレオチド（放射標識は灰色のアステリスクマーク位置で示す）を、APの存在下又は不在下でインキュベートし、ATPの存在下においてT4 Pnkの存在下又は不存在下でインキュベートしたRNA鎖とアニーリングした（黒で示す）。得られたRNA二本鎖を、HeLa細胞抽出物中のストランド間ライゲーションの基質として使用した。ライゲーション反応の一定分量を表示の時点で取り出し、変性ゲル電気泳動によって分析した。
【図１Ｃ】図１Ｃは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（C）は、HeLa抽出物からのRNA>pリガーゼの部分精製に関して確立された画分スキームを表す。[5’-32P]-pCp放射標識された5’-OHの精製ストランド間ライゲーションを介して、RNA>pリガーゼ活性をモニターするために3’-P dsRNAを使用した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（D）HSPC117-siRNA-トランスフェクトした細胞及び対照のsiRNA-トランスフェクトした細胞から調製されたタンパク質抽出物の一連の希釈物を、ストランド間ライゲーションに関してアッセイした。レーン上の数字は、抽出物希釈を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（E）同一の抽出物を、[α-32P]-GTP-放射標識されたtRNA前駆体のプロセシングに関して時間経過実験においてアッセイした。
【図１Ｆ】図１Ｆは、RNAライゲーション機構及びRNA>pリガーゼHSPC117の同定を表す。（F）抽出物中のHSPC117の減少レベルを、ウエスタンブロットによって確認した。
【００４２】
【図２Ａ】図２Ａは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（A）WT又はC122A c-myc-HSPC117のIPを、[α-32P]-GTP-放射標識したtRNAエクソンハーフと共にインキュベートした。非発現クローンから調製したIPは、負の対照として使用した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（B）比較IPにおける親和性精製の特異性並びにWT及び変異体c-myc-HSPC117の等量の存在を、ウエスタンブロットによって確認した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（C）tRNAエクソンハーフをClp1又はT4 Pnkと共に、ATPの存在又は不存在下でインキュベートした。RNAを回収し、インキュベーションにおいて免疫精製したc-myc-HSPC117と共に基質として使用した。
【図２Ｄ】図２Ｄは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（D）は、成熟tRNA及び環状イントロン（Np、ヌクレオシド3’-一リン酸; pN、ヌクレオシド5’-一リン酸）における、スプライスジャンクションの隣接分析に関して使用した手順のコースを説明するスキームを表す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（E）T4 Pnk/Rnl1又は親和性精製c-myc-HSPC117によって産生された[α-32P]-UTP-放射標識された成熟tRNAに由来するリボヌクレアーゼT1断片を、変性ゲル電気泳動によって分解した。6-mers、7-mers及び8-mersをゲルから分離し、リボヌクレアーゼT2によって消化しTLCによって溶媒D中で分析した。
【図２Ｆ】図２Ｆは、安定してトランスフェクトしたHeLa細胞株由来のc-myc-HSPC117の親和性精製から、RNA>pリガーゼ複合体が得られることを表す。（F）T4 Pnk/Rnl1又は親和性精製c-myc-HSPC117によって産生された環状、[α-32P]-ATP-放射標識されたイントロンをゲルから分離し、リボヌクレアーゼ P1で消化し溶媒C中でTLCによって分析した。
【００４３】
【図３Ａ】図３Ａは、活性RNA>pリガーゼ複合体のSF3B複合体との同時精製を表す。（A）は、HeLa核抽出物由来のSF3B-複合体の精製に関して確立された親和性プロトコールを表す。トリメチルグアノシン（m32,2,7G）mRNAキャップ構造を認識する固定化モノクローナル抗体H20によるU2の欠乏後に、固定化モノクローナルSF3B155標的抗体13E12によってHSPC117-及びSF3B-複合体は結合された。
【図３Ｂ】図３は、活性RNA>pリガーゼ複合体のSF3B複合体との同時精製を表す。図３Ｂでは、抗SF3B155 13E12カラムからの溶出において、SF3BとRNA>pリガーゼとの複合体をスペロース6上でのサイズ排除によって分離した。SDS-PAGE及びクーマシーブルーで染色されたタンパク質によって画分を分析した。  図３Ｃでは、スペロース6カラムから溶出された画分を、tRNAエクソンハーフを基質として使用してRNA>pリガーゼ活性に関してアッセイした。反応から回収したRNAを、変性ゲル電気泳動によって分析した。
【図３Ｄ】図３Ｄは、活性RNA>pリガーゼ複合体のSF3B複合体との同時精製を表す。（D）RNA>pリガーゼピーク画分をSDS-PAGEによって分析し、タンパク質バンドを、クーマシーブルーで染色することによって可視化した。標識されたバンドを、質量分析によって同定した。
【図３Ｅ】図３Ｅは、活性RNA>pリガーゼ複合体のSF3B複合体との同時精製を表す。（E）は、RNA>pリガーゼ複合体の他の成分ではなく、HSPC117のサイレンシングにおけるストランド間ライゲーション及びtRNA成熟活性の欠失を表す。細胞に、C22ORF28/HSPC117、DDX1、C14ORF166/CGI-99、FAM98B、C2ORF49/ASW及び対照としてのEGFPを標的にするsiRNAを処理した。抽出物をこれらの細胞から調製し、[5’-32P]-pCp-放射標識されたdsRNAのストランド間ライゲーションに関してアッセイした。
【図３Ｆ】図３Ｆは、活性RNA>pリガーゼ複合体のSF3B複合体との同時精製を表す。（F）は、RNA>pリガーゼ複合体の他の成分ではなく、HSPC117のサイレンシングにおけるストランド間ライゲーション及びtRNA成熟活性の欠失を表す。細胞に、C22ORF28/HSPC117、DDX1、C14ORF166/CGI-99、FAM98B、C2ORF49/ASW及び対照としてのEGFPを標的にするsiRNAを処理した。抽出物をこれらの細胞から調製し、[α-32P]-GTP-放射標識されたtRNA前駆体のプロセシングに関してアッセイした。
【図３Ｇ】図３Ｇは、（G）C22ORF28/HSPC117、DDX1、C14ORF166/CGI-99、FAM98B及びC2ORF49/ASW mRNAの効率的欠乏を、定量PCRによって確認した。結果は、トリプリケート（triplicate）PCR反応の平均値及び標準偏差を表す。
【図３Ｈ】図３Ｈは、（H）HSPC117、DDX1、FAM98B及び負荷対照としてのβ-アクチンに関するウエスタンブロットから、個々のRNA>p複合体メンバーの効率的欠乏が確認される。
【００４４】
【図４Ａ】図４Ａは、HSPC117のサイレンシングが生HeLa細胞においてストランド間ライゲーションを消滅し、部分的にインビトロ（in vivo）でtRNAプロセシングを損なうことを示す。（A）[5’-32P]-pCp-放射標識されたdsRNAを、対照遺伝子としてのEGFP、HSPC117又はRTCD1を標的にするsiRNAをプレトランスフェクトしたHeLa細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションを、表示の時点で停止した。RNAを分離し変性ゲル電気泳動によって分析した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、（B）siRNA及びレポーターコンストラクトのトランスフェクション及びタグをつけたtRNAの転写の誘発に使用した処理スキームを表す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、（C）タグをつけたtRNAレポーターコンストラクトに存在する要素の模式図を表す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、（D）Tet-リプレッサー発現HeLa細胞に、対照遺伝子EGFP、HSPC117又はTSEN2を標的とするsiRNA、及びタグをつけたtRNA前駆体Ileを発現しているレポーターコンストラクトpSTet-Ileをコトランスフェクトした。導入後、表示の時点でRNAを分離し、ノーザンブロットによって分析した。
【図４Ｅ】図４Ｅは、（E）複数のノーザンブロット実験の定量化を表す。siRNA及びレポーターコンストラクトのトランスフェクションを、トリプリケートで行った。RNAを細胞から回収し、成熟tRNAをノーザンブロットによって検出し、ImageQuantを使用したリン酸画像化（Phosphorimaging）によって定量化した。エラーバーは標準偏差を表す。
【００４５】
【図５】図５は、インビトロ（in vitro）でのRNAライゲーションの遺伝子レスキューが、RNAiのHSPC117が欠乏した抽出物に欠如していることを表す。（A）安定したマウス-BACトランスジェニックHeLa細胞プール又は野生型HeLa細胞を、ヒトHSPC117の非保存3’-UTRを標的にするsiRNA又は対照siRNAでトランスフェクトした。これらの細胞から調製した抽出物を、[5’-32P]-pCp-放射標識されたdsRNAでストランド間ライゲーションに関してアッセイした。レーン上の数字は、ライゲーション生成物の相対量を示す。レーン1におけるシグナルは、任意に1.0に設定した。（B）RNAを同一の実験から並行して分離し、定量PCRによってマウス及びヒトHSPC117のレベルに関して分析した。HeLa細胞におけるヒトHSPC117並びにマウス-BACトランスジェニックHeLa細胞プール中のヒト及びマウスHSPC117の発現レベルを、任意に100%と設定した。
【００４６】
【図６】図６は、HSPC117/RtcBタンパク質の配列アライメントを表す。HSPC117/RtcBタンパク質は、古細菌、細菌及び動物において広範囲に広がっているが、植物及び菌類においては広がっていない。アステリスクは、ヒト/マウスHSPC117の推定活性部位における特徴的なC122A突然変異の位置を示す。次の配列アイデンティフィアー（identifier）を使用した: ヒト（H.sapiens）: 配列番号1、ハツカネズミ（M.musculus）: 配列番号2、アフリカツメガエル（X.leavis）: 配列番号3、アメリカムラサキウニ（S.purpuratus）: 配列番号4、キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）: 配列番号5、シー・エレガンス（C.elegans）: 配列番号6、コナミドリムシ（C.reinhardtii）: 配列番号7、メタン生成古細菌（M.jannaschii）: 配列番号8、超好熱古細菌（P.horikoshii）: 配列番号9、サーマス・サーモフィラス（T.thermophilus）: 配列番号10、大腸菌（E.coli）: 配列番号11。
【００４７】
【図７Ａ】図７Ａは、スプライスジャンクションリン酸の隣接分析に使用したプロトコールの詳細な説明を表す。（A）示されるtRNA前駆体は、[α-32P]-UTPでbody標識した。理解容易のために、放射標識されたリン酸のみ示す。メタン生成古細菌（Methanocaldococcus jannaschii）（MjTSEN）の組換えスプライシングエンドヌクレアーゼでのこのtRNA前駆体の切断は、放射標識された末端2’,3’-環状リン酸を有する5’-エクソンハーフが得られる。c-myc-HSPC117でのエクソンハーフのライゲーションは、前駆体由来のスプライスジャンクションリン酸を含む成熟tRNA分子の形成に通じる。T4 Pnk及びT4 Rnl1の混合物での同一のエクソンハーフのライゲーション中、スプライスジャンクションリン酸は、ヌクレオシド三リン酸によって供される外因性リン酸と置換される。結果として、放射性スプライスジャンクション標識が失われる。成熟tRNAは両ライゲーション反応から分離され、リボヌクレアーゼT1で消化される。スプライスジャンクションは、調製変性ゲル電気泳動によって分離され得るリボヌクレアーゼT1 7-merに含まれる。リボヌクレアーゼT1 7-mersのリボヌクレアーゼT2での完全な消化は、スプライスジャンクションリン酸をグアノシン3’-一リン酸（Gp）として放出する。よって、放射標識されたGpの検出は、前駆体由来の、放射標識された末端2’,3’-環状リン酸の、3’、5’-リン酸ジエステルとしてのスプライスジャンクションへの取り込みを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、スプライスジャンクションリン酸の隣接分析に使用したプロトコールの詳細な説明を表す。（B）示されるtRNA前駆体は、[α-32P]-ATPでbody標識されている。この前駆体の切断は、放射標識された末端の2’,3’-環状リン酸を有する直線状イントロンを生成する。この直線状イントロンのc-myc-HSPC117でのライゲーションは、放射標識された末端リン酸を含む環状化イントロンが得られる。T4 Pnk及びRnl1での直線状イントロンのライゲーション中、このリン酸は除去され、ヌクレオシド三リン酸によって供される外因性リン酸は直線状イントロンの第一のウリジンヌクレオチドの5’-OHに蓄積される。環状化イントロンは、調製変性ゲル電気泳動によって分離される。c-myc-HSPC117でのライゲーション中、放射標識された2’,3’-環状リン酸は、直線状イントロンの第一のウリジンヌクレオチドの5’-リン酸となる。よって、リボヌクレアーゼP1での環状化イントロンの消化は、ジャンクションのリン酸をウリジン5’-一リン酸（pU）として放出する。よって、放射標識されたpUの検出は、直線状イントロンの放射標識された末端2’,3’-環状リン酸の、環状イントロンへの3’、5’-リン酸ジエステルとしての取り込みを示す。
【００４８】
【図８】図８は、RNAiによりHSPC117が欠乏した抽出物中の、インビトロ（in vitro）でのRNAライゲーション欠如の生化学的レスキューを表す。RNAiによりHSPC117が欠乏した細胞の抽出物を、SF3B粒子と共に共精製したHSPC117-複合体のスペロース6画分によって補完した。画分を、[α-32P]-GTP-放射標識されたtRNA前駆体のプロセシングに関してアッセイした。
【００４９】
【図９Ａ】図９Ａは、十字型DNAでの特異的な抑制によるRNA>pリガーゼの干渉を表す。（A）[5’-32P]-pCp-放射標識されたdsRNAを、dsRNA基質に関して、十字型（ScraPal）又は対照DNA（ScraPalΔ）二本鎖の2000倍のモル過剰の存在下で、HeLa細胞抽出物と共にインキュベートした。反応物の一定分量を、表示される時点に取り出し、変性ゲル電気泳動によって分析した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、十字型DNAでの特異的な抑制によるRNA>pリガーゼの干渉を表す。（B）HeLa抽出物を、RNA基質に関して、十字型又は対照DNA二本鎖の2000倍のモル過剰の存在下で、[α-32P]-GTP-放射標識されたtRNA前駆体のプロセシングのアッセイを行った。反応物の一定分量を表示時点に取り出し、変性ゲル電気泳動によって分析した。
【００５０】
【図１０】図１０は、インビトロ（in vivo）でのtRNAプロセシング実験に関する、タグをつけたtRNA Ileの設計及びRNAi-媒介のHSPC117及びTSEN2の欠乏の確認を表す。エクソン配列でタグをつけたtRNA前駆体IleTATをコードするpSTet挿入のアライメントは、注記のヒトゲノムtRNA Ile座に由来した（Chan and Lowe、2009）。下部の大文字は普遍的に保存される残基を、アステリスクはchr19/trna10-IleTATに関する置換位置を示す。
【実施例】
【００５１】
実施例1: 新規生化学的ストラテジーによる哺乳類RNA>pリガーゼの同定
RNA>pリガーゼを検出するための新規ストラテジーの適用は、潜在的にtRNAリガーゼの同定につながる。3’-リン酸化（3’-P）、5’-OH二本鎖RNA分子（dsRNA）がヒト細胞抽出物とのインキュベーションにおいて共有結合していることを、今回思いがけず発見した。これらの抽出物中、3’-P dsRNAは、ヒトRNA末端シクラーゼRTCD1によって2’,3’-環状リン酸終結dsRNAに変換される。よって、我々は特定し難いtRNAリガーゼに関して、3’-P dsRNAを安定した代替基質として使用することを決定した。ストランド間ライゲーションは、5’-OH相補鎖とアニーリングされた3’-P一本鎖のRNAとを必要とする。ATPの存在下でのアルカリホスファターゼ（AP）とのインキュベーションによる3’-Pの除去、又はバクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼ（T4 Pnk）とのインキュベーションによる5’-OHのリン酸化反応或いは両者の組み合わせは、ストランド間ライゲーションを抑制した（図1B）。この結果は、古典活性ガイドタンパク質クロマトグラフィーによってRNA>pリガーゼを同定することにつながる。ストランド間ライゲーションをモニターしながら、４つの精製ステップを介してRNA>pリガーゼ活性を追従することができた（図1C）。ストランド間ライゲーション活性をさらに分画することはできず、最も濃縮されたMonoQ画分に含まれるタンパク質を、溶液中でトリプシン消化によって、続いてタンデム質量分析（MS）によって同定した。同定した91のポリペプチド（表S1）の中の１つ、HSPC117/C22ORF28は、次の理由のため特に興味深く思われた。第一に、HSPC117が、機能が未知の高度に保存されたドメイン（UPF0027）、及び推定の金属イオン結合部位を含む特有のタンパク質折り畳み構造を特徴とする細菌性/古細菌RtcB遺伝子ファミリーのヒト相同体である。興味深いことに、大腸菌（E. coli）RtcA及びRtcBにおいて、RNA 3’-P末端シクラーゼは、σ54制御オペロン内に存在する（Genschik et al.、1998）。結果、RtcB/HSPC117タンパク質は、RNAプロセシング又は修飾に機能を有することがこれまでに予測されている（Galperin and Koonin、2004）。第二に、UPF0027タンパク質は、植物及び真菌モデル生物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）及び分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）に検出可能な代替のない、オルソロガス遺伝子（KOG3833）のクラスターを形成する。この系統発生上の違いは、動物及び古細菌におけるRNA>pリガーゼ活性の特異的な発生を非常に連想させる（Abelson et al.、1998）。
【００５２】
実施例2: HSPC117は、ストランド間ライゲーション及びtRNA成熟に必要である。
よって、HSPC117が実際にストランド間ライゲーション及びtRNAプロセシングに関与するか否かを試験した。HeLa細胞に、HSPC117又は対照としてのEGFPを標的にする低分子干渉RNA（siRNA）をトランスフェクトした。抽出物をこれらの細胞から調製し、ストランド間ライゲーションに関してアッセイした。著しく、RNA干渉（RNAi）によるHSPC117の欠乏がストランド間ライゲーションに影響した（図1D、レーン2-4とレーン5-7との比較）。3’-P dsRNAは単に代替基質として使用し、RNA>pライゲーションはtRNAのスプライシングに必要であると想定される。次に、サイレンシングHSPC117のtRNA成熟への影響を、インビトロ（in vitro）で試験した。適したtRNA前駆体（pre-tRNA）転写物を、HeLa細胞質抽出物において成熟tRNAのために処理する（Laski et al.、1983）。よって、[α-32P]-GTP-放射標識されたtRNA前駆体転写物が、RNAiによってHSPC117が欠乏した抽出物と共に含まれた（図1E）。HSPC117のレベルの減少は成熟tRNAの形成を減じ、エクソンのハーフの随伴的な蓄積につながり、これはtRNAエクソンのライゲーションにおける生化学的機能と一致する。抽出物中のHSPC117レベルの効率的な減少は、ウエスタンブロット分析によって確認された（図1F）。HSPC117のsiRNA媒介欠乏の特異性を、siRNAの異なるセットで及びRNAi表現型のレスキュー（図5）によって、マウスゲノムDNAに由来するバクテリア人工染色体（BAC）からのHSPC117のRNAi耐性形態の発現で確認した。
【００５３】
実施例3: HSPC117は、哺乳類RNA>pリガーゼの触媒成分である。
次に、HSPC117がRNA>pリガーゼ活性と関係するか否かを検討した。よって、安定してトランスフェクトした、c-myc-タグをつけたマウスHSPC117を発現しているクローンHeLa細胞株を確立した。UPF0027タンパク質（図6）及び超好熱古細菌（Pyrococcus horikoshii）由来のRtcBの公開された結晶構造（Okada et al.、2006）によって導かれる複数の配列アライメントに基づいて、点変異体c-myc-HSPC117 C122Aを発現している安定してトランスフェクトされたクローン細胞株を産生した。RTCD1及びtRNAエンドヌクレアーゼから独立しているtRNAリガーゼ活性を検出するために、適した[α-32P]-GTP放射標識されたハイブリッドtRNA前駆体（Englert、2005）を、メタン生成古細菌（Methanocaldococcus jannaschii）（MjTSEN）由来の組換えスプライシングエンドヌクレアーゼで切断することによって、tRNAエクソンハーフを調製した。c-myc-HSPC117の親和性精製から、tRNAエクソンハーフを連結することが可能である免疫沈降物（IP）を得た。一方、点変異体c-myc-HSPC117 C122Aは、RNAリガーゼとして不活性であった（図2A、レーン6及び7とレーン8との比較）。野生型（WT）及びC122A変異体c-myc-HSPC117の等量の比較を、ウエスタンブロットによって確認した（図2B、レーン2と3の比較）。よって、HSPC117がtRNAリガーゼの触媒成分であることが結論付けられた。
【００５４】
実施例4: HSPC117は、2’,3’-環状リン酸及び5’-OH RNA終端の直接ライゲーションを触媒する。
RNA>pリガーゼは、その基質終端で5’-OHを必要とすることが予測される。3’-エクソンの5’-OHを5’-Pに変換するために、tRNAエクソンハーフをATPの存在下で組換え5’-OH RNAキナーゼCLP1と共にプレインキュベートした場合、一貫して、c-myc-HSPC117 IPsにおいてリガーゼ活性を検出することはできなかった（図2C、レーン2及び3を比較）。その5’-OH RNAキナーゼ活性に加えて、T4 Pnkが2’,3’-ホスホジエステラーゼ及び3’-ホスファターゼ活性を有することは周知である。c-myc-HSPC117 IPとのライゲーションのための基質としてのATPの不存在下（2’,3’-環状リン酸を除去するため）又は存在下（2’,3’-環状リン酸を除去し、さらに5’-OHを5’-Pに変換するため）で、T4 Pnkと共にプレインキュベートしたtRNAエクソンハーフを使用した場合、RNA>pリガーゼに関して予想通り、いずれのリガーゼ活性も検出することができなかった（図2C、レーン4及び5）。よって、記載のRNA>pリガーゼによるライゲーションは、5’-OH（図1Bも参照）及び2’,3’-環状リン酸に有益である。
RNA>pリガーゼによるtRNAエクソンハーフのライゲーションの最も特有の特徴は、カノニカル5’、3’-リン酸ジエステル結合における前駆体由来のスプライスジャンクションリン酸を含む成熟tRNAの生成である（図1A、分岐下部）。c-myc-HSPC117 IPによって触媒されるRNAライゲーションに関してこれが本当かを試験するために、スプライスジャンクションリン酸の隣接分析を実施した（図2D）。5’-エクソンハーフの終端に放射標識された2’,3’-環状リン酸を有するtRNAエクソンハーフを、組換えスプライシングエンドヌクレアーゼで[α-32P]-UTP-放射標識されたtRNA前駆体を切断することによって調製した（図7）。これらのエクソンハーフを、c-myc-HSPC117 IP又は負の対照としてのT4 PnkとバクテリオファージT4 RNAリガーゼ1（T4 Rnl1）の混合物とのインキュベーションによって連結した。これらの反応物から成熟tRNAを分離し、各グアノシンヌクレオチドのRNA 3’を切断し、その基質をグアノシン3’-一リン酸（Gp）によって終結された断片に処理するリボヌクレアーゼT1によって消化した。長さが6-8ヌクレオチドの範囲の断片を分離し、リボヌクレアーゼT2によって消化し、薄層クロマトグラフィーによって分解されたヌクレオチド3’-一リン酸が得られた。斯かる手順に従って、c-myc-HSPC117によって産生される成熟tRNAに由来するRNA 7-mersにおいて、放射標識されたGpが唯一検出され、これは前駆体由来のスプライスジャンクションリン酸の保持を示している（図2E、レーン3）。予想通り、スプライスジャンクションリン酸は、T4 Pnk及びT4 Rnl1を用いて行われた対照ライゲーションにおいて交換された（図2E、レーン4）。放射標識されたNTPはいずれのライゲーション反応にも添加しなかったので、成熟、T4 Rnl1-連結tRNAに由来するリボヌクレアーゼ T1-7-mersのリボヌクレアーゼT2消化物において放射標識されたGpは検出することができなかった（図2E、レーン4）。同様の隣接分析はまた、c-myc-HSPC117 IPによるその環状イントロンへの転換後に、2’,3’-環状リン酸の末端放射標識された直線状イントロンと共に行った。c-myc-HSPC117によって（T4 Pnk/Rnl1によってではない）環状化されたイントロンのP1ヌクレアーゼ消化物における放射標識されたウリジン5’-一リン酸（pU）の検出は、スプライスジャンクションリン酸の保持を裏付けた（図2F、レーン1及び2を比較する）。同定したRNA>pリガーゼが、カノニカル3’、5’-リン酸ジエステル結合において、前駆体由来のスプライスジャンクションリン酸を成熟tRNAに組み込むことによってtRNAエクソンハーフを結合することが結論付けられた。
【００５５】
実施例5: HSPC117は、安定したヘテロマータンパク質複合体中に存在する。
顕著なことに、RNA>pリガーゼを精製する我々の努力に並行して、これまで機能が未知であった安定且つ非常に均質のHSPC117含有複合体が、核HeLa細胞抽出物から調製されたスプライセオソームSF3B粒子と同時精製されることを発見した。よって、SF3B結合且つ高精製HSPC117-複合体がRNA>pリガーゼ活性を示すか試験した。SF3B結合のHSPC117-複合体をSF3B及びU2スプライセオソーム複合体の解離によって、続いてU2の選択的免疫除去によって得た。非結合のSF3B-及びHSPC117-複合体を、通過画分から回収し、抗SF3B155結合樹脂によって捕捉し、抗体エピトープペプチドで特異的に溶出した（図3A）。親和性カラムからの溶出後に、SF3B複合体（図3B、画分12-19）及びHSPC117複合体（図3B、画分23-26）を、スペロース6上でサイズ排除クロマトグラフィーによって分離した。c-myc-HSPC117 IPsで得られた最初のデータに一致して、HSPC117-複合体を含む（SF3Bスプライセオソーム複合体でない）画分はtRNAエクソンハーフと直線状イントロンを成熟tRNA及び環状イントロンに各々変換した（図3C）。さらに、同一の画分は、RNAiによりHSPC117が欠乏した抽出物を欠如したtRNAスプライシングを生化学的にレスキューできた（図8）。このHSPC117含有複合体で同定したタンパク質を、クーマシーブルー染色ゲルから分離した単一バンドのトリプシン消化によって、続いてMS分析によって分析した。同定したタンパク質はC22ORF28/HSPC117に加えて、DEADボックスヘリカーゼDDX1及びFAM98B、さらにニネイン相互作用タンパク質C14ORF166/CGI-99、並びにASW/C2ORF49の準化学量論量を含んだ（図3D）。このタンパク質のセットは、安定細胞クローン由来のc-myc-HSPC117の免疫沈降物（表2）及びMonoQ RNA>pリガーゼ画分において同定したタンパク質（図1C及び表1）のMS分析結果と重複する。
【００５６】
【表１】
0005990171.tif 000002
【００５７】
【表２】
0005990171.tif 000003
【００５８】
言及のHSPC117のインタラクターのサイレンシングは、mRNAレベルの効率的減少（図3G）を除き、ストランド間のライゲーション（図3E）又はtRNA成熟（図3F）に効果を有しなかった。HSPC117、DDX1、CGI-99、FAM98B及びCGI-99のいずれかが欠乏のタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によって、HSPC117、DDX1及びFAM98Bの効率的欠乏が確認された（図3H）。著しいことに、HSPC117の欠乏はまた、他の複合体メンバーDDX1及びFAM98Bのタンパク質レベルの低下につながった。同様に、DDX1及びCGI-99双方の欠乏は、DDX1とFAM98Bとの欠乏を伴った。興味深いことに、HSPC117含有複合体は、十字型DNA構造に親和性を示すことが報告された（Drewett et al.、2001）。我々は、十字型DNA（対照の二本鎖DNAでない）でストランド間ライゲーション（図9A）及びtRNA成熟（図9B）双方を抑制することができた。総合すると、これらのデータは、RNA>pリガーゼ活性を示すHSPC117/C22ORF28、DDX1、CGI-99/C14ORF166及びFAM98Bから構成される安定した複合体の強力な証拠を供する。SF3Bスプライセオソーム粒子及びRNA>pリガーゼの同時精製は、興味深いカノニカルmRNAスプライシングとRNA>pリガーゼとの間の関連を明らかにする。
【００５９】
実施例6: HSPC117は、生細胞においてtRNAライゲーションに関与する。
インビトロ（in vitro）でHSPC117がRNA 2’,3’-環状リン酸及び5’-OH終端を直接的に結合可能な複合体のメンバーであることを示した後、続いてインビトロ（in vivo）でのRNAライゲーションにおけるHSPC117の役割を検討した。我々はまず、RNAiによるRNA末端シクラーゼ（RTCD1）、HSPC117又は対照遺伝子としてのEGFPが欠乏したHeLa細胞への、[5’-32P]-pCp-放射標識されたdsRNAのトランスフェクションによって、ストランド間ライゲーションが生細胞で生じうるか否かを試験した（図4A）。ゲル電気泳動による全RNAの単離及び分析は、放射標識された3’-P dsRNAが細胞に取り込まれ、続いて連結されることを示した。インビトロ（in vivo）において、ストランド間ライゲーションは、HSPC117に依存的であり（図4A、レーン4及び7と、レーン3及び6とを各々比較）、あまり明白でない程度であるがRTCD1に依存的であった（図4A、レーン5及び8と、レーン3及び6とを各々比較）。RNAi-媒介のHSPC117の欠乏の、新規合成のtRNA前駆体のプロセシングへの効果を試験するために、これまでにブルセイトリパノソーマ（Trypanosoma brucei）におけるtRNAのミトコンドリア移入の試験に適用された系（Bouzaidi-Tiali et al.、2007）を使用した。HSPC117、ヒトスプライシングエンドヌクレアーゼサブユニットTSEN2又は対照としてのEGFPを標的とするsiRNAを、テトラサイクリン（Tet）反応性プロモーターの制御下でタグをつけたtRNA前駆体IleTATをコードするレポーターコンストラクトと共に（図4B）（図9）、安定してTet-リプレッサーを発現しているHeLa細胞中にトランスフェクトした。選択され時点での誘発後（図4C）、RNAを抽出しノーザンブロットによって分析した。タグをつけたtRNA IleTATの5’-エクソンに関するブロットのプロービング（プローブI5E、図4B）は、HSPC117及びTSEN2（EGFP対照siRNA処理ではない）のRNAi-媒介の欠乏で、成熟tRNAの形成における明白な遅延を明らかにした（図4D及び図4Eの、レーン1-3をレーン4-6又は7-9と各々比較）。総合すると、これらのデータは、広範の基質特異性及びtRNAプロセシングにおいて機能を有するHSPC117のRNAリガーゼとしての役割を示す。
【００６０】
実施例7: ヒトにおいて発見される第一のRNAリガーゼとしてのHSPC117の潜在的機能
HSPC117は、ヒトRNAリガーゼ複合体の触媒サブユニットである。周知のATPアーゼ及びヘリカーゼの巻き戻し活性は、tRNAスプライシングを支持するためのATP依存的立体構造変化においてDDX1に関する潜在的役割を示す。実際、DDX1は、DEAD-boxヘリカーゼとしての作用にATPを必要とすることが示されている、RNA>pリガーゼ依存的tRNAスプライシング経路と関係する唯一のポリペプチドである。これは、エンドヌクレアーゼ-RNA>pリガーゼ反応カスケードにおけるATPの支持的であるが重要でない役割の説明が可能であり、それは機構的にさらなるエネルギーが少しも必要でない。CGI-99、FAM98B及びASWの潜在的機能についてはほとんど知られていない。RNAi-媒介欠乏に基づく本明細書中のデータは、tRNAハーフのライゲーションに関する非必須の役割を示す（図7B及びC）。
【００６１】
RNA>pリガーゼ及びT4 Pnk/Rnl1様ライゲーション機構はともに、ヒト細胞において検出できる（Filipowicz and Shatkin、1983）。今回、我々はRNA>pリガーゼ経路の要素を同定した。5’-OHキナーゼ及び2’,3’-ホスホジエステラーゼ回復（healing）反応並びに最終ホスホトランスフェラーゼステップ（斯かる経路に必要）を触媒するタンパク質を、ヒトにおいて同定した。さらに今回、インビトロ（in vivo）で、これらのタンパク質が実際にtRNAスプライシング酵素として機能し得ることを酵母におけるヘテロ相補性試験によって示した。以前の研究は、RNA>pリガーゼ経路が哺乳類において一般的tRNAライゲーション経路であることを示す（Filipowicz and Shatkin、1983）。
【００６２】
本明細書に記載のRNA>pリガーゼ複合体は、RNA終端の事前の「回復（healing）」を必要とせず、2’,3’-環状リン酸と、tRNAエンドヌクレアーゼ反応の5’-OH表示生成物の、直接的結合が可能な最初に同定されるRNAリガーゼタンパク質であることを示す。これは、RNA修復経路におけるRNA>pリガーゼのより一般的な役割を意味する。RNA修復系の示唆的な例は、原核生物から周知である。現在、真核生物におけるRNA修復の役割は、注目が高まっている。RNA>pリガーゼは、ヒトRNA修復経路及びHSPC117によって媒介される非カノニカルスプライシング事象に関与する。小胞体ストレス応答（UPR）中のmRNAのストレス誘発性切断及び続くスプライソソーム独立性ライゲーションは、RNAリガーゼを必要とするこのような非カノニカルスプライシング事象を裏付ける。経路は出芽酵母（S. cerevisiae）で広範囲に検討されており、最終ライゲーションステップにおいて酵母tRNAリガーゼTrl1pと関係する。XBP1 mRNAのストレス誘発性の非従来のスプライシングに依存する同様のUPR経路は、ヒト細胞に存在する。しかしながら、関連のリガーゼは、これまで未知であった。以前の研究は、ヒトにおけるT4 Pnk-様RNAライゲーション経路の潜在的成分であるホスホトランスフェラーゼTPT1が、XBP1 mRNAのストレス誘発性スプライシングに重要でないことを示す。HSPC117は、ヒトUPR経路においてRNA>pリガーゼとして機能する。
【００６３】
さらにRNAリガーゼは、ヒトでウイルス複製に関与すると提唱されている。例えば、ヒトにおけるローリングサークル複製中に、宿主コードのリガーゼはD型肝炎ウイルス（HDV）のRNAゲノムを環状化することが以前に想定されている。本明細書に記載のHSPC117含有リガーゼ複合体が宿主媒介のウイルス性ゲノム環状化に関与すると思われる。近年、HSPC117及びDDX1は共に、ヒト細胞においてHDVの複製に必要であることが報告されている。さらに、記載されるRNA>pリガーゼ複合体の全メンバーが、マウス脳抽出物中のキネシン結合RNA輸送顆粒と相互作用することが示されている。興味深いことに、RTCD1はまた、これらのRNA輸送顆粒と関係することが分かり、それによりRNA末端リン酸環化とRNAライゲーションとの間の潜在的機能上の関連が確認された。
【００６４】
ヒトと大腸菌ほど遠縁の生物においてHSPC117/RtcBタンパク質が高度に保存されていることは、斯かるタンパク質ファミリーにおいて普遍的且つ重要な役割を有することを示す。最初の研究によって実際に、HSPC117の哺乳類の発生における必須の機能が確認された。他方、一部の細菌におけるHSPC117/RtcB及びRtcAを含むオペロンに割り当てることができる生物学的機能はこれまでなかった。この点で、HSPC117/RtcBタンパク質の分子機能が今回解明された。
【００６５】
参考文献
Abelson, J., Trotta, C.R., and Li, H. (1998). tRNA splicing. The Journal of biological chemistry 273, 12685-12688.
Bouzaidi-Tiali, N., Aeby, E., Charriere, F., Pusnik, M., and Schneider, A. (2007). Elongation factor 1a mediates the specificity of mitochondrial tRNA import in T. brucei. The EMBO journal 26, 4302-4312.
Chan, P.P., and Lowe, T.M. (2009). GtRNAdb: a database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucleic acids research 37, D93-97.
Drewett, V., Molina, H., Millar, A., Muller, S., von Hesler, F., and Shaw, P.E. (2001). DNA-bound transcription factor complexes analysed by mass-spectrometry: binding of novel proteins to the human c-fos SRE and related sequences. Nucleic acids research 29, 479-487.
Englert, M. (2005). Mechanismus des pre-tRNA Spleiβens: Struktur und Funktion pflanzlicher und animaler RNA Ligasen. In PhD thesis, Faculty of Chemistry and Pharmaceutics (Wurzburg, Bayerische Julius-Maximilians-Universitat), pp. 139.
Filipowicz, W., and Shatkin, A.J. (1983). Origin of splice junction phosphate in tRNAs processed by HeLa cell extract. Cell 32, 547-557.
Galperin, M.Y., and Koonin, E.V. (2004). 'Conserved hypothetical' proteins: prioritization of targets for experimental study. Nucleic acids research 32, 5452-5463.
Genschik, P., Drabikowski, K., and Filipowicz, W. (1998). Characterization of the Escherichia coli RNA 3'-terminal phosphate cyclase and its sigma54-regulated operon. The Journal of biological chemistry 273, 25516-25526.
Laski, F.A., Fire, A.Z., RajBhandary, U.L., and Sharp, P.A. (1983). Characterization of tRNA precursor splicing in mammalian extracts. The Journal of biological chemistry 258, 11974-11980.
Okada, C., Maegawa, Y., Yao, M., and Tanaka, I. (2006). Crystal structure of an RtcB homolog protein (PH1602-extein protein) from Pyrococcus horikoshii reveals a novel fold. Proteins 63, 1119-1122.
Reid CE, Lazinski DW (2000) A host-specific function is required for ligation of a wide variety of ribozyme-processed RNAs. Proc Natl Acad Sci USA 97(1): 424-429
【図１Ａ】
0005990171.tif 000004
【図１Ｂ】
0005990171.tif 000005
【図１Ｃ】
0005990171.tif 000006
【図１Ｄ】
0005990171.tif 000007
【図１Ｅ】
0005990171.tif 000008
【図１Ｆ】
0005990171.tif 000009
【図２Ａ】
0005990171.tif 000010
【図２Ｂ】
0005990171.tif 000011
【図２Ｃ】
0005990171.tif 000012
【図２Ｄ】
0005990171.tif 000013
【図２Ｅ】
0005990171.tif 000014
【図２Ｆ】
0005990171.tif 000015
【図３Ａ】
0005990171.tif 000016
【図３Ｂ】
0005990171.tif 000017
【図３Ｄ】
0005990171.tif 000018
【図３Ｅ】
0005990171.tif 000019
【図３Ｆ】
0005990171.tif 000020
【図３Ｇ】
0005990171.tif 000021
【図３Ｈ】
0005990171.tif 000022
【図４Ａ】
0005990171.tif 000023
【図４Ｂ】
0005990171.tif 000024
【図４Ｃ】
0005990171.tif 000025
【図４Ｄ】
0005990171.tif 000026
【図４Ｅ】
0005990171.tif 000027
【図５】
0005990171.tif 000028
【図６】
0005990171.tif 000029
【図７Ａ】
0005990171.tif 000030
【図７Ｂ】
0005990171.tif 000031
【図８】
0005990171.tif 000032
【図９Ａ】
0005990171.tif 000033
【図９Ｂ】
0005990171.tif 000034
【図１０】
0005990171.tif 000035
【配列表】
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