(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
静電紡糸によって食用の複合多糖−ホエータンパク質繊維を調製する方法において、
多糖およびホエータンパク質を含む水溶液を調製する工程、
前記水溶液に１５から２５ｋＶの電圧を印加する工程、
収集板上に前記繊維を収集する工程、および
前記繊維を乾燥させて、乾燥固体繊維を提供する工程、
を有してなる方法。
【請求項２】
前記静電紡糸が無針式である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記多糖が、アルデヒド基を有する、または異性化によりアルデヒド基を形成する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記多糖がデキストランである、請求項１から３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記デキストランの分子量が約１０ｋＤａと約５００ｋＤａの間である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記デキストランが０．１ｇ／ｍＬから約５．０ｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質がホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）である、請求項１から６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液が、５０：１から１：５０の混合比（ｗ／ｗ）で多糖およびタンパク質を含む、請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、３：１から１：１０の混合比（ｗ／ｗ）で多糖およびタンパク質を含む、請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液がデキストランおよびＷＰＩを含む、請求項１から９いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記繊維を２４時間までに亘り少なくとも４５％の相対湿度でインキュベーションし、それによって、複合膜を形成する工程をさらに含む、請求項１から１０いずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記相対湿度が６５％と７５％の間である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記インキュベーションする温度が１０〜７０℃の範囲にある、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
前記繊維の直径が約１００ｎｍから約５００ｎｍである、請求項１から１３いずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記繊維の直径が約１５０ｎｍから約２５０ｎｍである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
静電紡糸によって食用の複合多糖−タンパク質繊維膜を調製する方法において、
３：１と１０：１の間の混合比（ｗ／ｗ）で存在する、１００ｋＤａのデキストランおよびホエータンパク質分離物を含む水溶液を調製する工程、
前記水溶液に１５から２５ｋＶの電圧を印加し、それによって、繊維を形成する工程、
前記繊維を収集板に収集する工程、および
４時間と２４時間の間に亘り少なくとも４５％の相対湿度で前記繊維をインキュベーションし、それによって、複合膜を形成する工程、
を有してなる方法。
【請求項１７】
前記相対湿度が６５％と７５％の間である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記インキュベーションする工程が４時間と８時間の間に亘る、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記インキュベーションする温度が１０〜７０℃の範囲内である、請求項１６から１８いずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記静電紡糸が無針式である、請求項１６から１９いずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記乾燥固体繊維を食品に含める工程をさらに含む、請求項１から１５いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、ここに全てが引用される、２０１２年４月４日に出願された米国仮特許出願第６１／６１９９９６号に優先権を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、静電紡糸による複合タンパク質の形成に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質−多糖複合体を含む複合タンパク質は、多くの加工食品の構造と安定性において重要な役割を果たす。加工食品業界において特に重要な理由の１つは、メイラード反応である。メイラード反応は、アミノ酸と還元性基の縮合を含む非酵素的な化学的相互作用である。この反応により中間体が形成され、この中間体は、後に重合して、メラノイジンとして知られている褐色の窒素含有化合物を形成することがある。
【０００４】
メイラード反応には、３つの主要段階がある。第一段階において、グリコシルアミンが形成され、次いで、アマドリ化合物への転位を経る。第二段階において、アミン基が失われ、カルボニル中間体が形成される。このカルボニル中間体は、脱水または分裂を経て、高反応性カルボニル化合物を形成する。最終段階において、この反応性カルボニル化合物は食品の他の成分と反応して、メラノイジンを形成する。
【０００５】
メイラード反応の生成物は、芳香、風味、および色などのプラスの特性に関連付けられる。しかしながら、この反応により、栄養価の減少、保存期間の短縮、および臭みを生じる望ましくない化合物の形成ももたらし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、メイラード反応の制御は、栄養価の改善された食品を開発する上で重大である。タンパク質複合体を製造する以前の方法は、様々な理由のために効果的ではなかった。例えば、加熱と組み合わされた凍結乾燥プロセスを使用する、ドライインキュベーション(dry incubation)は、進行がゆっくりしており、適正な収量を提供しない。その結果、複合タンパク質の生成を制御するより効果的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここに記載される特徴は、一般に、複合タンパク質を生成するために静電紡糸(electrospinning)を使用する方法に関する。ここに記載される特徴の態様は、デキストランと結合したホエータンパク質を調製する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本開示は、例として図解され、同様の数字が同様の要素を示している添付図面に制限されない。
【図１】図１は、本開示の様々な特徴を実装してよい例示の静電紡糸装置を示す。
【図２】図２は、０．５ｇ／ｍＬ溶媒でのデキストラン（７０ｋＤａ）を有する繊維上のビーズを示している。
【図３】図３は、０．７ｇ／ｍＬ溶媒でのデキストラン（７０ｋＤａ）の溶液から調製された繊維を示している。
【図４】図４は、０．８ｇ／ｍＬ溶媒でのデキストラン（７０ｋＤａ）の溶液から調製された滑らかな繊維を示している。
【図５】図５は、１．０ｇ／ｍＬでのデキストラン（４０ｋＤａ）の水溶液から調製された生の(neat)デキストラン静電紡糸繊維のＬＭ画像を示している。
【図６】図６は、０．６ｇ／ｍＬでのデキストラン（１００ｋＤａ）の水溶液から調製された生のデキストラン静電紡糸繊維のＬＭ画像を示している。
【図７】図７は、最低静電紡糸可能濃度での異なるデキストランにより調製されたデキストラン−ホエータンパク質分離物の混合物の粘度を示している。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、様々なデキストランサイズ：８Ａ：４０ｋＤａ、８Ｂ：７０ｋＤａ、および８Ｃ：１００ｋＤａ：から調製されたデキストラン−ホエータンパク質分離物の静電紡糸繊維の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を示している。
【図８−２】図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃの繊維に関する繊維径が、それぞれ、図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆに示されている。
【図９】図９は、異なる濃度でのデキストラン水溶液の応力・歪み流れ曲線を示している。
【図１０】図１０は、デキストランとホエータンパク質の混合物の流れ挙動への混合比の影響を示している。全固形分は、各混合物について、０．６ｇ／ｍＬであった。
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｄは、異なる濃度（１１Ａ：０．３ｇ／ｍＬ溶媒、１１Ｂ：０．４５ｇ／ｍＬ溶媒、１１Ｃ：０．６ｇ／ｍＬ溶媒、および１１Ｄ：０．７ｇ／ｍＬ溶媒）でのデキストラン溶液から調製された静電紡糸繊維のＳＥＭ画像を示している。静電紡糸条件は、電圧＝２０ｋＶ、静電紡糸距離＝１８ｃｍ、および溶液流量＝１２μＬ／分で一定に維持した。
【図１１−２】図１１Ａ〜Ｄの繊維に関する繊維径が、それぞれ、図１１Ｅ〜Ｈに示されている。
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｅは、異なる混合比（質量）（１２Ａ：１：０、１２Ｂ：０．８：０．２、１２Ｃ：０．７５：０．２５、１３Ｄ：０．６７：０．３３、および１２Ｅ：０．５：０．５）のデキストラン（１００ｋＤａ）およびホエータンパク質分離体を有する混合物から調製された静電紡糸繊維のＳＥＭ画像を示している。全ての混合物の濃度は０．６ｇ／ｍＬ溶媒であり、静電紡糸条件は、電圧＝２０ｋＶ、静電紡糸距離＝１８ｃｍ、および溶液流量＝１２μＬ／分で一定に維持した。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｅの繊維に関する繊維径が、それぞれ、図１２Ｆ〜Ｊに示されている。
【図１３】図１３Ａは、異なる混合比でのデキストラン粉末とホエータンパク質分離物粉末との間の混合物のＩＲスペクトルを示している。図１３Ｂは、１５１８および１００４ｃｍ-1の波数でのピーク吸光度間の比とホエータンパク質分離物含有量との間の関係を示している。
【図１４】図１４は、異なる時間に関する６０℃および７４％ＲＨでアニールされた静電紡糸膜の外観を示している。
【図１５】図１５は、ａ）粉末形態にあるＷＰＩ−デキストラン；ｂ）紡糸したままのＷＰＩ−デキストラン静電紡糸膜；ｃ）からｆ）それぞれ、２、６、２０および４８時間に亘り、６０℃および７４％ＲＨでアニールされた後のＷＰＩ−デキストラン静電紡糸膜：のＩＲスペクトルを示している。
【図１６】図１６は、２−メルカプトエタノールの存在下でのＷＰＩ−デキストラン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルへのアニール時間の影響を示している。レーン１：ＷＰＩ溶液；レーン２〜８：それぞれ、０、２、４、６、８、１６、２４および４８時間に亘り６０℃および７４％ＲＨでアニールされた静電紡糸ＷＰＩ−デキストラン（４０ｋＤａ）膜。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、２−メルカプトエタノールの存在下でのＷＰＩ−デキストラン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示している。図１７Ａはタンパク質染色である。図１７Ｂは糖タンパク質染色である。図１７ＡおよびＢの両方に関するレーンは、レーン１：ＷＰＩ溶液；レーン２〜５：それぞれ、０、８、１６および２４時間加熱された静電紡糸ＷＰＩ−デキストラン（４０ｋＤａ）膜；レーン６〜９：それぞれ、０、８、１６および２４時間加熱された静電紡糸ＷＰＩ−デキストラン（１００ｋＤａ）膜。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＷＰＩ−デキストラン（７０ｋＤａ）複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示している：図１８Ａはタンパク質染色である。図１８Ｂは糖タンパク質染色である。全ての静電紡糸膜におけるデキストランとＷＰＩとの間の質量比は、３：１であった。レーン１：タンパク質ラダー；レーン２〜５：それぞれ、０、８、１６および２４時間、６０℃、７４％ＲＨでアニールされた静電紡糸膜。
【図１９】図１９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに使用したＴＧＸプレキャストゲルの標準曲線を示している。式に示された変数ＭＷおよびｄは、それぞれ、ｋＤａで示された分子量および％で表された移動距離である（Ｒ2＝９９．８６％）。中央の線および２つの外側の線は、それぞれ、予測値および９５％信頼帯を示す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、異なる湿度およびアニール時間で形成されたＷＰＩ−デキストラン（１００ｋＤａ）複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示している。全ての静電紡糸膜におけるデキストランとＷＰＩとの間の質量比は、３：１であった。図２０Ａはタンパク質染色である。図２０Ｂは糖タンパク質染色である。レーン１：紡糸したままの膜；レーン２〜１０：６０℃でアニールしたが、相対湿度が異なる静電紡糸膜：レーン２〜４：０％ＲＨ；レーン５〜７：４４％ＲＨ；レーン８〜１０＝７４％ＲＨ。アニール時間は、８時間：レーン２、５および８；１６時間：レーン３、６および９；および２４時間：レーン４、７および１０。レーン０は標準的なタンパク質ラダーである。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、一定の湿度条件下でのＷＰＩ−デキストラン（１００ｋＤａ）複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示している。静電紡糸膜は、デキストランおよびＷＰＩの間の異なる混合比で調製された：それぞれ、レーン１〜４：  １：２；レーン５〜８：  １：１；レーン９〜１２：  ２：１。図２１Ａはタンパク質染色である。図２１Ｂは糖タンパク質染色である。全ての静電紡糸膜は、６０℃および７４％ＲＨでアニールした。アニール時間は、レーン１、５および９：紡糸したままの膜；レーン２、６および１０：８時間；レーン３、７および１１：１６時間；レーン４、８および１２：２４時間。レーン０は標準的なタンパク質ラダーである。使用した染料は、タンパク質またはマルトデキストリン中には存在しないＮ−グリコシドに特異的である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、異なるアニール時間に亘り、６０℃および７４％ＲＨでアニールされたＷＰＩおよびデキストラン４０ｋＤａの混合物から調製された静電紡糸サンプルのＵＶ吸光度スペクトルを示している。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、静電紡糸サンプルの２８２ｎｍでの吸光度ピークとアニール時間との間の関係を示している（ＷＰＩおよびデキストラン４０ｋＤａサンプル）。
【図２３Ａ】図２３Ａは、異なるアニール時間に亘り、６０℃および７４％ＲＨでアニールされたＷＰＩおよびデキストラン７０ｋＤａの混合物から調製された静電紡糸サンプルのＵＶ吸光度スペクトルを示している。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、静電紡糸サンプルの２８２ｎｍでの吸光度ピークとアニール時間との間の関係を示している（ＷＰＩおよびデキストラン７０ｋＤａサンプル）。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂは、ＷＰＩおよびデキストラン１００ｋＤａの混合物から調製された静電紡糸サンプルのＵＶ吸光度への溶液の濃度の影響を示している。図２４Ａは５ｍｇ／ｍＬであり、図２４Ｂは３ｍｇ／ｍＬである。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、１：１（図２５Ａ）および２：１（図２５Ｂ）の混合比でのＷＰＩおよびデキストラン１００ｋＤａの混合物から調製された静電紡糸サンプルの２８２ｎｍでの吸光度ピークを示している。
【図２６】図２６は、２：１の混合比でのデキストラン１００ｋＤａおよびＷＰＩの混合物から調製された静電紡糸サンプルのＵＶ吸光度スペクトルを示している。
【図２７】図２７は、異なる混合比：Ａ）１：２；Ｂ）１：１；およびＣ）２：１（デキストランとＷＰＩとの間の混合比）でのＷＰＩおよびデキストラン１００ｋＤａから調製された静電紡糸膜を示している。
【図２８】図２８Ａ〜Ｃは、１：２（Ａ）、１：１（Ｂ）、および２：２（Ｃ）の混合比での、比色計を使用して測定した静電紡糸膜の明度（黒丸）および黄色さ（白丸）を示している。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂは、静電紡糸膜ＷＰＩ−デキストラン１００ｋＤａのＮＩＲスペクトルを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示の態様において、静電紡糸手法を使用して複合タンパク質を生成する方法が提供される。いくつかの態様において、その複合体はタンパク質−多糖複合体（すなわち、１つ以上の糖質と共有結合したタンパク質）である。いくつかの態様において、その複合体はタンパク質−多糖複合体（すなわち、１つ以上の多糖と共有結合したタンパク質）である。特別な態様において、その多糖はデキストランであり、そのタンパク質はホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）である。
【００１０】
ａ．ホエータンパク質および糖化
ホエータンパク質は、その優れた機能性（例えば、泡およびエマルションの安定化）および高い栄養素含有量（例えば、高含有量の必須アミノ酸）のために、多種多様の食品に使用される重要な成分である［１］。
【００１１】
ホエータンパク質は、高温、圧力および／または様々な酸の存在などの、本質的に遭遇する環境条件のために、食品加工中に容易に変性される。したがって、ホエータンパク質の安定性の改善は、食品用途におけるその使用を改善するために、食品製造業者にとって重要な関心事である。シッフ塩基中間生成物の形成によるホエータンパク質とデキストランとの間の糖化が、このタンパク質の熱安定性［１］および乳化特性［３，４］を改善する効果的な方法であることが実証された。
【００１２】
タンパク質−多糖複合体の形成により、２２時間に亘る−１８℃および２時間に亘る＋４０℃での凍結融解の３回のサイクル後でさえも、エマルションの凍結融解安定性を改善した［５］。
【００１３】
タンパク質と多糖の非化学的糖化は、４日間までに亘り約６０℃および少なくとも〜４４％の相対湿度で、タンパク質粉末と還元糖を含有する粉末との混合物を乾式加熱することによって行うことができる［６］。乾式加熱において、初期の粉末形態においてＷＰＩおよびデキストランに直接熱を加えるのではなく、液体形態にあるＷＰＩとデキストランの溶液を最初に調製し、その後、凍結乾燥して、混合物の固体形態を得る。これは、その後の糖化反応にとってより適している。
【００１４】
ＷＰＩを糖化する代わりの方法は、４８時間に亘り６０℃およびｐＨ〜６．５で、デキストランおよびホエータンパク質単離物の溶液を加熱すること、いわゆる、湿式加熱である。例えば、米国特許出願公開第２００９／０３１１４０７号明細書を参照のこと。湿式加熱は、乾式加熱よりも実質的に反応時間が短く、色が濃い顔料を生成する改良メイラード反応生成物は、乾式加熱方法におけるほど容易には形成されない。どちらの方法も、関与する出費のために、また両方の方法とも収率が低い（＜５％）ために、普及していない。
【００１５】
静電紡糸
静電紡糸は、電着の一形態であり、高圧電場（例えば、１５から２５ｋＶ）を使用することによって、合成および／または天然高分子から繊維を生成できる多目的技術である。静電紡糸は、針を使用しても、無針式であってもよい。典型的な静電紡糸設備は、紡糸口金を備えた溶液容器、沈着した繊維を収集するために使用されるコレクタ板、および紡糸口金とコレクタ板との間に電場を生成するための高電圧ユニットからなる。図１を参照のこと。溶液容器は、導電性針を備えた注射器であってよく、この針は紡糸口金および電極の両方として使用できる。
【００１６】
その高分子溶液の流量は、注射器ポンプを使用して制御できる。その高分子溶液が一旦、電極を通じて帯電したら、紡糸口金の先端の高分子溶液の液滴の形状が、テイラー円錐形に変化する。電圧が、表面張力を克服するのに十分に高ければ、テイラー円錐先端から細い高分子ジェットが吐出される。吐出された高分子ジェットは、そのジェットの小さい寸法のために、急激に乾燥し、乾燥した固体繊維をコレクタ板から収集できる。静電紡糸繊維の平均径は、典型的に、数百ナノメートル辺りである。
【００１７】
目的の溶液を繊維にうまく静電紡糸するには、高分子鎖の絡み合いが必要である。高分子鎖の絡み合いは、高分子ジェットが、静電紡糸中の電気的伸縮力のために壊れるのを防ぐ。高分子の濃度が低すぎると、溶液中で重なり合う高分子鎖がなくなる。その濃度が臨界濃度ｃ*まで上昇すると、鎖の絡み合いが始まる。鎖の絡み合いの程度（ｎe）solnは、高分子の濃度と分子量の両方に依存し、式２．１［１２］：
【００１８】
【数１】
0006034952.tif 000002
【００１９】
により決定できる。式中、ｃは、溶液中の高分子の濃度であり、Ｍwは、溶液中の高分子の分子量であり、Ｍeは、高分子の絡み合い分子量すなわち絡み合い接合部間の平均分子量である。
【００２０】
式２．１は、高分子の分子量が高いほど、一定の絡み合い数を維持するために、すなわち、溶液の静電紡糸能力を維持するために必要な高分子の濃度が低くなることを立証している。
【００２１】
タンパク質および糖質／多糖
ホエータンパク質は食品における重要な成分である。ホエータンパク質は、泡とエマルションの良好な安定性を提供し、高含有量の必須アミノ酸も有する。ホエータンパク質の調製は当該技術分野で公知である。典型的に、乳クリームを遠心分離して、クリームまたは脂質を除去し、次いで、カゼインを沈殿させて、追加の遠心分離、濾過および／またはイオン交換の各工程によって、ホエータンパク質を分離することができる。典型的なホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）は、β−ラクトグロブリン（〜５５％）、α−ラクトアルブミン（〜２５％）、イムノグロブリン（〜１５％）、ウシ血清アルブミン（〜４％）、およびラクトフェリン（〜２％）を含有するであろう。
【００２２】
ＷＰＩが好ましい糖化標的であるが、静電紡糸に多種多様のタンパク質を選択してもよい。いくつかの態様において、１つのタイプのタンパク質のみが使用される。他の態様において、タンパク質は、１種類以上のタンパク質の混合物であってもよい。
【００２３】
静電紡糸でき、非タンパク質と結合できる(conjugated)（糖と反応できる）どのような可溶性の動物性または植物性タンパク質を使用してもよい。適切なタンパク質としては、植物性タンパク質、動物性タンパク質、および微生物系タンパク質が挙げられる。例えば、適切な植物性タンパク質としては、大豆（濃縮物／分離物）、エンドウ豆（濃縮物／分離物）、小麦（グリアジン、グルテン）、レンズ豆、豆、トウモロコシ（ゼイン）、オート麦、大麦、アマランス、米、ソバ、ファッロ(Farro)、亜麻仁、キノア、ライ麦、ソルガム、テフ、ヒマワリ、および木の実類（ピーナッツ、アーモンド、ペカン）が挙げられる。適切な動物性タンパク質としては、乳製品（ホエーおよびカゼイン）、魚タンパク質、動物タンパク質（牛肉、豚肉、子牛の肉、鶏肉・・・）、および卵タンパク質が挙げられる。適切な微生物系タンパク質としては、藻、真菌、および細菌が挙げられる。
【００２４】
このプロセスに還元性官能基を有する糖質を使用してもよい。特に、適切な糖質は、アルデヒド基を有するか、または異性化により溶液中でアルデヒドを形成する能力を有するかのいずれかである。適切な糖質としては、寒天、アガロース、アルギン酸塩、アルギン酸、アルグロニック酸(alguronic acid)、アルファグルカン、アミロペクチン、アミロース、アラビノガラクタン、アラビノキシラン、ベータ−グルカン、ＢｉｏＣｅｌｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ（登録商標）、カロース、カプシュラン(capsulan)、カラギーナン、セロデキストリン、セルリン、キチン、キチンナノフィブリル、キトサン、クリソラミナリン、カードラン、シクロデキストリン、ＤＥＡＥ−セファロース、デキストラン、デキストリン、エキソ多糖、アルファ−シクロデキストリン、Ｆｉｂｅｒｓｏｌ（登録商標）、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、フルクタン、フコイダン、ガラクトグルコマンナン、ガラクトマンナン、ゲランガム、グルカン、グルコマンナン、グリコカリックス、グリコーゲン、加水分解グアー、グアーガム、アラビアガム、ヘミセルロース、ホモ多糖、ヒプロメロース、イコデキストリン、イヌリン、イヌロース(inulose)、ケフィラン、コンニャク、ラミナリン、レンチナン、レバン、リケニン、ローカストビーンガム、ＭａｔｒｉｘＤＢ、（１，３：１，４）−β−Ｄ−グルカン(mixed-linkage glucan)、加工デンプン、ゴム糊、天然ゴム、酸化セルロース、パラミロン、ペクチン酸、ペクチン、ペンタスターチ、プルーラン(pleuran)、ポリデキストロース、ポリグリコールアルギネート、多糖、多糖ペプチド、ポルフィラン、プルラン、シゾフィラン(schizophyllan)、セファロース、シニストリン(sinistrin)、シゾフィラン(sizofiran)、大豆繊維、スガマデクス、加水分解不可能なグルコースポリマー、ウェランガム、キサンタンガム、キシラン、キシログルカン、ユッカまたはユッカ／キラヤ抽出物、およびザイモサンが挙げられる。
【００２５】
適切な糖質の特別な種類は多糖類である。
【００２６】
多糖などの糖は、糖の重合体である。オリゴ糖は２〜２００の糖の重合体である。多糖は、オリゴ糖よも長い重合体である。適切な多糖は、２０１〜２５００の糖の重合体であろう。
【００２７】
適切な多糖としてはデキストランが挙げられる。デキストランは、様々な長さ（例えば、１０から１５０ｋＤａ）の鎖に接続された多数のグルコース分子を含む分岐した複合多糖である。直鎖は、グルコース分子間のα１→６グリコシド結合からなる。分岐鎖は、α１→４結合、α１→２結合および／またはα１→３結合を含むであろう。
【００２８】
複合体立体構造に適した糖類（糖(sugar)タイプ）は、グルコース、フルクトース、グリセルアルデヒドおよびガラクトースなどの還元単糖を含む。ラクトースおよびマルトースなどの多くの二糖も、それら２つの単位の一方が、アルデヒド基を持つ開鎖形態を有するであろうから、還元形態を有する。グルコースシロップ、マルトデキストリンおよびデキストリンのようなデンプンおよびデンプン誘導体などのグルコースポリマーにおいて、巨大分子は還元糖、遊離アルデヒドから始まる。より加水分解されたデンプンはより多くの還元糖を含有する。これらのデンプン誘導体中に存在する還元糖の割合は、デキストロース当量（ＤＥ）と呼ばれる。
【００２９】
いくつかの実施の形態において、デキストランなどの糖質は、約１０ｋＤａと約５００ｋＤａの間の分子量範囲を有する。他の実施の形態において、デキストランは、約４０ｋＤａと約１００ｋＤａの間、または約７０ｋＤａと約１００ｋＤａの間の分子量範囲を有する。
【００３０】
ここに用いた「約」は、数値の±１０％を意味する。
【００３１】
以下：高出力電源、高分子溶液槽、電極（一方は接地）、および受取り板が提供される限り、任意の適切な静電紡糸方法および装置を使用してもよい。適切な静電紡糸装置としては、以下に限られないが、Ｎｅｅｄｌｅ−ｌｅｓｓおよびＮｅａｒ  Ｆｉｅｌｄが挙げられる。
【００３２】
静電紡糸は、複合タンパク質の以前の方法に勝る実質的な利点を提供する。この静電紡糸方法は、ずっと短いアニール時間で、ずっと多い収率で、糖化を促進した。
【００３３】
静電紡糸ＷＰＩ−デキストラン繊維において、例えば、２つの高分子の物理的状態は、少なくとも３つの理由のために、高い分子対分子の大きい接触数が達成されるようなものである。第一に、静電紡糸が伸縮運動と曲げ運動のために分子の整列を生じるので、それらの高分子はより均一に分布される。第二に、溶媒の急激な蒸発により、相分離が妨げられる。最後に、小さい繊維径のために、ＷＰＩ分子およびデキストラン分子からなる稠密な繊維が得られる。
【００３４】
それゆえ、理論により拘束されるものではないが、静電紡糸プロセスは、分子をうまく整列させ、高分子鎖の絡み合いのために無傷なままにし、特に良好な収率および減少した費用をもたらすと考えられる。
【００３５】
静電紡糸中に繊維の形成を最適化するために、様々なパラメータを変えてよい。繊維の形成に影響を与えるパラメータとしては、デキストラン濃度、混合物の粘度、混合物中のタンパク質対多糖の比率、アニールにかかる時間が挙げられる。
【００３６】
以下の説明は、本発明の１つの態様、すなわち、デキストラン−ホエータンパク質に焦点を当てるものである。そのプロセスは、どの適切なタンパク質および糖質にも拡張できることを理解すべきである。
【００３７】
ｉ．デキストラン濃度および繊維の形成
デキストランは、デキストラン−ホエータンパク質混合物の静電紡糸可能性に関与すると同時に、複合体の形成のための還元糖試薬として働く。
【００３８】
タンパク質と複合体を形成するために、１０〜４４０ｋＤａの幅広いデキストラン分子量が使用されてきた。より低い分子量は、典型的に、より高レベルの複合体を生成する。静電紡糸のためには、低分子量の高分子を使用する場合、高濃度が必要である。残念ながら、高濃度では、粘性が高い溶液が生じ、それでは静電紡糸を行うことができない。
【００３９】
デキストランが繊維を形成する能力は、デキストランの濃度とサイズに関連付けられる。０．４５ｇ／ｍＬまで低い濃度を有する全てのデキストラン（Ｍｗ＝１００ｋＤａ）溶液が、ずり流動化流れ挙動を示した。１００ｋＤａのデキストランについて、滑らかで連続的な繊維には、０．１ｇ／ｍＬ以上または０．６ｇ／ｍＬ以上の濃度が必要であった。このように、１００ｋＤａのデキストランに関するいくつかの態様において、静電紡糸のための混合物は、少なくとも０．６ｇ／ｍＬの、少なくとも０．８ｇ／ｍＬの、または少なくとも１．０ｇ／ｍＬのデキストランを含有する。５ｇ／ｍＬなどの、デキストランの上限は、混合物の粘度により決まるであろうし、高分子のタイプに依存する。
【００４０】
タンパク質および多糖は、静電紡糸のために緩衝液中で混ぜ合わせてもよい。例えば、静電紡糸のための混合物は、リン酸緩衝液中で調製してよい。その緩衝液のｐＨは６．０と７．０の間であり、典型的に、緩衝液のｐＨは６．５０±０．０７である。
【００４１】
ｉｉ．粘度
粘度は、効率的な静電紡糸のための重要なパラメータである。粘度が高すぎると、静電紡糸の効率は悪影響を受ける。例えば、４０ｋＤａのデキストランから調製された溶液の粘度は約１．８Ｐａ・ｓ（ポアズ）であった。このレベルの粘度は、いくつかの理由のために不都合であった。第一に、溶液が「粘つき」始めるので、溶液の調製は難しかった。第二に、混合物中のタンパク質の高い含有量（０．２５ｇ／ｍＬ溶媒）のために、溶液の調製中に、厚い泡の層が形成された。溶媒は、高分子がその中に溶解すればどのような適切な溶媒であってもよい。理想的には、溶媒は、急激に蒸発すべきであり、可燃性であるべきではない。適切な溶媒は水である。したがって、混合物から泡の層を除去するために、長い緩和時間が必要であった。さらに、静電紡糸中に目詰まりが急激に生じ、最低の生産性が観察された。
【００４２】
粘度は、以下に限られないが、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒなどの、どの適切な粘度計およびレオメータを使用したどのような適切な方法によって測定してもよい。一般に、粘度は、所望の流れ曲線に沿うべきであり、どの１つの値にも制限されない。
【００４３】
反対に、試験した最大のデキストランである、１００ｋＤａのデキストランから調製した溶液は、最低の粘度を有した。より低い粘度により、溶液の調製が容易になり、泡の層の形成が減少し、目詰まりの頻度が減少した。
【００４４】
適切な粘度は、４０ｋＤａを超えるデキストランサイズを使用することによって得られるであろう。例えば、そのような混合物は、５０ｋＤａと約１００ｋＤａの間のデキストランを含有するであろう。態様において、所望の粘度レベルを得るために、５０ｋＤａと約１００ｋＤａの間のデキストランサイズの混合物を使用してもよい。特別な態様において、デキストランは、約１００ｋＤａの分子量を有する。
【００４５】
ｉｉｉ．繊維のサイズおよび形成
多糖のタンパク質への結合は、ビーズの形成が減少したかなくなったときに向上すると考えられる。ビーズは、欠陥と考えられ、それゆえ、望ましくない。ビーズのないまたはほとんどない繊維が好ましい。本開示の態様において、繊維は、走査型電子顕微鏡により判定して、ビーズを含有しない。
【００４６】
繊維径は、結合に影響を与えるであろう。より小さい繊維径により、ＷＰＩ分子およびデキストラン分子からなる稠密な繊維が得られる。結合は、ＷＰＩ分子およびデキストラン分子の密集により促進される。いくつかの態様において、繊維径は約１００ｎｍと約５００ｎｍの間である。他の態様において、繊維径は約１００ｎｍと約３００ｎｍの間である。さらに他の態様において、繊維径は約１５０ｎｍと約２５０ｎｍの間である。繊維径は、実施例１に記載されているように測定してよい。
【００４７】
ｉｖ．タンパク質とデキストランの混合比
繊維のタンパク質含有量も、繊維の形成と結合の両方に影響する。混合物のタンパク質含有量が増加すると、繊維径が減少する。例えば、実施例７を参照のこと。タンパク質含有量を３３質量％以上に増加させると、ビーズが形成された。それゆえ、繊維のビーズ形成を減少させるまたはなくすために、混合溶液中のタンパク質含有量は、約２５質量％までであろう。これらの割合を得るために、静電紡糸に使用した水溶液中の多糖のタンパク質に対する混合比（質量／質量）は、表１に示されるようなものであろう。
【００４８】
【表１】
0006034952.tif 000003
【００４９】
膜中のタンパク質含有量に関する追加の詳細が、表９に与えられている。
【００５０】
ゲル電気泳動により測定した、糖タンパク質の形成は、デキストラン：ＷＰＩの比率が増加すると向上する。例えば、
このように、良好な繊維の形成および結合を達成するために、多糖のタンパク質に対する混合比は、２：１より大きい。いくつかの態様において、その比は、約３：１、約４：１、約５：１、約５：１、約５：１、約５：１、約５：１、約５：１、約５：１、約５：１である。したがって、特別な態様において、その比は、約３：１から約１０：１であってよい。他の態様において、この比は約３：１から約４：１であってよい。
【００５１】
ｖ．アニール条件
静電紡糸は分子を互いに近づける。次いで、アニールが、分子間の温度誘発反応を提供する。アニールは、ここに用いたように、それによって、タンパク質と糖との間に共有結合が形成される結合プロセスである。アニールは、長期のインキュベーション期間を使用することによって向上させてもよい。例えば、アニール時間は、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、または２４時間の下限を有してよい。アニール時間は、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２４時間、または２８時間の上限を有してよい。大抵、アニール時間は２時間と４時間の間である。膜の色は、より長いアニール時間が使用された場合、特に膜が２４時間を超えてアニールされた場合、わずかに濃くなる。
【００５２】
ｖｉ．結合へのデキストランサイズの影響
静電紡糸膜を調製するために、１００ｋＤａのデキストランを使用した場合、糖化がより遅かった。しかしながら、ＷＰＩと１００ｋＤａのデキストランとの間に形成された糖タンパク質のサイズは、〜２８０ｋＤａより大きかったのに対し、ＷＰＩと４０および７０ｋＤａのデキストランから形成された糖タンパク質のサイズは、それぞれ、〜７０ｋＤａおよび〜２００ｋＤａより大きかった。
【００５３】
ｖｉｉ．糖化への湿度の影響
糖化を向上させるために、特定の湿度レベルで前記方法を行ってもよい。糖タンパク質染色ゲルに観察されたより強い糖タンパク質バンドにより決定されるように、より高い湿度が糖化を向上させるであろう。サンプルを低い湿度でアニールした場合、糖タンパク質染色ゲルにおける糖化バンドの強度がずっと弱かった。向上した糖化が、０％ＲＨ（図２０ＡおよびＢ；レーン２〜４）および４４％ＲＨ（図２０ＡおよびＢ；レーン５〜７）と比べて、７４％ＲＨ（図２０ＡおよびＢ；レーン８〜１０）で得られた。このように、いくつかの態様において、相対湿度は少なくとも４４％である。他の態様において、相対湿度は４５％と７５％の間、または６５％と７５％の間である；さらに他の態様において、相対湿度は７０％から８０％である。
【００５４】
温度は典型的にほぼ室温である；しかしながら、１０℃と７０℃の間のどの適切な温度も考えられる。
【００５５】
ａ．結合の評価
ＷＰＩ−デキストラン複合体の外観は、どの適切な手法によってモニタしてもよい。例えば、ゲル電気泳動は、アニールした静電紡糸膜中の糖タンパク質の存在を確認するための好ましい方法であろう。ＦＴＩＲは、紡糸されたままの膜からのＩＲスペクトルとアニールされた膜からのＩＲスペクトルとの間の差を明白に示さなかった。したがって、ＦＴＩＲは、それほど有用ではないであろう。
【００５６】
文献
0006034952.tif 000004
【００５７】
0006034952.tif 000005
【００５８】
0006034952.tif 000006
【００５９】
先に挙げられた特許、公開出願、および定期刊行物の論文の開示がここに引用される。
【００６０】
特許請求の範囲にかかわらず、本発明は、以下の条項によっても定義される：
１．  静電紡糸によって糖質−タンパク質の繊維または粒子を調製する方法において、
糖質およびタンパク質を含む水溶液を調製する工程、
その水溶液に１５から２５ｋＶの電圧を印加する工程、および
繊維をコレクタ板に収集する工程、
を有してなる方法。
２．  前記静電紡糸が無針式である、条項１の方法。
３．  前記炭質が、アルデヒド基を有するか、または異性化によってアルデヒド基を形成する、条項１または２の方法。
４．  前記炭質がデキストランである、条項１または２の方法。
５．  前記デキストランの分子量が約１０ｋＤａと約５００ｋＤａの間である、条項４の方法。
６．  前記デキストランが０．１ｇ／ｍＬから約５．０ｇ／ｍＬの濃度で存在する、条項４方法。
７．  前記タンパク質が、微生物、動物、乳製品、および野菜のものから選択される、前記条項のいずれかによる方法。
８．  前記タンパク質がホエータンパク質分離物（ＷＰＩ）である、前記条項のいずれかによる方法。
９．  前記水溶液が、５０：１から１：５０の混合比（ｗ／ｗ）で糖質およびタンパク質を含む、前記条項のいずれかによる方法。
１０．  前記水溶液が、３：１から１：１０の混合比（ｗ／ｗ）で糖質およびタンパク質を含む、前記条項のいずれかによる方法。
１１．  前記水溶液がデキストランおよびＷＰＩを含む、前記条項のいずれかによる方法。
１２．  前記繊維を２４時間までに亘り少なくとも４５％の相対湿度でインキュベーションし、それによって、複合膜を形成する工程をさらに含む、前記条項のいずれかによる方法。
１３．  前記相対湿度が６５％と７５％の間である、条項１２の方法。
１４．  温度が１０〜７０℃の範囲内である、条項１２の方法。
１５．  前記繊維の直径が約１００ｎｍから約５００ｎｍである、前記条項のいずれかによる方法。
１６．  前記繊維の直径が約１５０ｎｍから約２５０ｎｍである、条項１５の方法。
１７．  静電紡糸によって多糖−タンパク質繊維を調製する方法において、
３：１と１０：１の間の混合比（ｗ／ｗ）で存在する、１００ｋＤａのデキストランおよびホエータンパク質分離物を含む水溶液を調製する工程、
その水溶液に１５から２５ｋＶの電圧を印加し、それによって、繊維を形成する工程、
その繊維を収集板に収集する工程、および
４時間と２４時間の間に亘り少なくとも４５％の相対湿度で前記繊維をインキュベーションし、それによって、複合膜を形成する工程、
を有してなる方法。
１８．  前記相対湿度が６５％と７５％の間である、条項１７の方法。
１９．  前記インキュベーションする工程が４時間と８時間の間に亘る、条項１７または１８の方法。
２０．  前記インキュベーションする温度が１０〜７０℃の範囲内である、条項１７から１９のいずれかによる方法。
２１．  静電紡糸が無針式である、条項１７から１９のいずれかによる方法。
【実施例】
【００６１】
実施例１
材料および方法
ａ．デキストラン
リューコノストック属ｓｐｐ．により産生された約４０、７０および１００ｋＤａの平均分子量を有するデキストランをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（独国、シュタインハイム所在）から購入した。ＢＩＰＲＯ（登録商標）ホエータンパク質分離物は、Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．社から供給された。全ての材料は、さらに精製せずに使用した。
【００６２】
様々な混合比（質量で１：０、０．８：０．２、０．７５：０．２５、０．６７：０．３３および０．５：０．５）のデキストラン粉末および／またはホエータンパク質分離物を、３０ｍＭのリン酸緩衝溶液中に溶かした。この溶液を室温（〜２２℃）で一晩マグネチック・スターラーで撹拌して、混合物を確実に完全に溶かした。溶液の粘度、導電率、密度およびｐＨを、それぞれ、流量計（バージニア州、アッシュランド所在のＰｈｙｓｉｃａ社のＭＣＳ３００）、マイクロプロセッサ導電率計（独国、ウェイハイム所在のＷＴＷ社のＬＦ５３７）、密度計（オーストリア国、グラーツ所在のＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社のＤＭＡ  ３５Ｎ）およびｐＨメータ（独国、ウェイハイム所在、ＷＴＷ社のｉｎｏＬａｂ（登録商標））を使用して測定した。全ての溶液の最終ｐＨは６．５０±０．０７であり、これは、ホエータンパク質分離物−デキストラン複合体形成のための適切なｐＨとして以前に報告されたものである［７］。
【００６３】
ｂ．静電紡糸
静電紡糸の設備が図１に示されている。ステンレス鋼製針（内径０．９ｍｍ）を備えた１０ｍＬのガラス製注射筒に目的の溶液を入れた。次いで、この注射筒を、注射器ポンプ（マサチューセッツ州、ホリストン所在のＨａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社の１１Ｐ）に搭載された注射器に装填した。その針先を高圧ＤＣ電源（フロリダ州、オーモンドビーチ所在のＧａｍｍａ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ社のＥＳ３０Ｐ−５Ｗ）に接続した。接地電極をステンレス鋼製コレクタ板に接続した。針先とコレクタ板との間の距離は１８ｃｍに維持した。溶液の流量は１２μＬ／分に一定に維持した。溶液は、約＋２０ｋＶで帯電させた。収集した静電紡糸膜は、さらに調査する前に、−２８℃で凍結させた。
【００６４】
典型的に、静電紡糸中の電圧は１５から２０ｋＶであり、２５ｋＶを超えない。電圧が高すぎると、アーク放電（スパーク）が生じる。繊維が形成されるまで、アンペア数を増加させる。
【００６５】
ｃ．形態分析
集束イオンビームを利用する、ＺＥＩＳＳ  ＯＲＩＧＡクロスビーム電界放射型走査電子顕微鏡（独国、オーバーコッヘン）を使用して、静電紡糸繊維をその形態について調査した。膜を真空乾燥させ、約４分間に亘り金スパッタ被覆した。静電紡糸繊維の平均径は、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（メリーランド州、ベテスダ所在のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ社）により決定した。
【００６６】
ｄ．ＦＴＩＲによる膜の特徴付け
静電紡糸膜は、一般的な減衰全反射付属品を備えたフーリエ変換赤外分光計（ＡＴＲ−ＦＴＩＲ）（英国、ビーコンズフィールド所在のＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＳｐｅｃｔｒｕｍ  １００）を使用して調査した。赤外スペクトルを、透過モードにおいて、４０００〜６５０ｃｍ-1の波長範囲内で、４ｃｍ-1の分解能および１０回の走査で収集した。
【００６７】
ｅ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
ＴＧＸプレキャストゲル（トリス−ＨＣｌゲル、４〜２０％直線勾配、１５ウェル）およびタンパク質染色−脱染溶液（Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステインおよびクマシーデステイン）をＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。標準的なタンパク質ラダー（ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ  ２６６１９、１０〜２５０ｋＤａ）および糖タンパク質染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（独国）から購入した。標準的なタンパク質ラダーは、使用前に−２８℃に保持した。炭酸カリウム（ＫＣＯ3）および塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（独国、シュタインハイム所在）から購入した。
【００６８】
ｆ．熱処理
約５〜１０ｍｇの静電紡糸膜を制御湿度槽内に入れた。この槽を熱風炉（独国、シュワバッハ所在のＭｅｍｍｅｒｔ社のモデル４００）内で前平衡させて、制御体積を６０℃の平衡温度に到達させた。制御体積内の相対湿度は約０％ＲＨ（シリカゲルを使用）、４４％ＲＨ（飽和ＫＣＯ3溶液を使用）または７４％ＲＨ（飽和ＮａＣｌ溶液を使用）であった。
【００６９】
アニールにより、タンパク質と糖が結合し、その後、メイラード反応が続く。
【００７０】
ｇ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより研究したＷＰＩ−デキストラン複合体の相互作用の研究
サンプル緩衝液は、脱イオン蒸留水中に表２に列挙された化合物の全てを１００ｍＬの最終体積に溶解させることによって、調製し、使用前は−２０℃に凍結させた。
【００７１】
【表２】
0006034952.tif 000007
【００７２】
電極緩衝液は、脱イオン蒸留水中に表３に列挙された化合物を５０００ｍＬの最終体積に溶解させることによって調製した。この緩衝液は、使用前は４℃で貯蔵した。
【００７３】
【表３】
0006034952.tif 000008
【００７４】
サンプルは、Zhr等(2008)により以前に記載された方法からの改良手法を使用して、ゲル電気泳動のために調製した。最初に、脱イオン蒸留水中に、熱処理した静電紡糸膜を８０μｇ（タンパク質含有量の）／１５μＬの濃度で溶解させた。この水溶液を２２℃で１５分間に亘り１６０００ｇで遠心分離した。その懸濁液を収集し、サンプル緩衝液で４０μｇ／１５μＬの最終タンパク質濃度にさらに希釈した。次いで、この希釈溶液を少なくとも５分間に亘り水浴中で９５℃で加熱して、ジスルフィド結合を壊し、タンパク質を解離させた（還元性条件）。次いで、この溶液を冷却して維持した。
【００７５】
ｈ．ゲル電気泳動
Laemmli(1970)にしたがって、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  ＣｅｌｌでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＴＧＸプレキャストゲル（トリス−ＨＣｌゲル、４〜２０％直線勾配、１５ウェル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。１０μＬ／ウェルのサンプル溶液を各ウェルに入れた。室温で２００Ｖの定電圧で約４０分間に亘り電気泳動を行った。２つのゲルを同時に泳動させた。電気泳動後、一方のゲルをタンパク質染色し、他方のゲルを糖タンパク質染色して、ＷＰＩ−デキストラン複合体の存在を検出した。
【００７６】
タンパク質染色について、ゲルを、それぞれ、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステインおよびクマシーデステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で、タンパク質染色および脱染した。染色プロセスは、製造業者の使用説明書にしたがって行った。手短に言えば、ゲルを、過剰な量の脱イオン蒸留水で洗浄し、染色容器に移し、そこで、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅクマシーステインを加えて、少なくとも１時間に亘りゲルを完全に被覆した。次いで、ゲルを室温で一晩、クマシーデステイン中で脱染した。
【００７７】
糖タンパク質染色について、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。ゲルを、３０分間に亘り１００ｍＬの５０％メタノール中で固定化し、１０分間に亘り２回、１００ｍＬの３％酢酸で、穏やかに撹拌することによって洗浄した。次いで、ゲルを、１５分間に亘り酸化性溶液中に浸漬し、５分間に亘り（３回）、１００ｍＬの３％酢酸中で洗浄し、１５分間に亘りＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔで染色し、穏やかに撹拌しながら、５分間に亘り還元性溶液に移した。最後に、ゲルを、過剰な量の３％酢酸で洗浄し、その後、脱イオン蒸留水で洗浄した。
【００７８】
ｉ．ＵＶ−可視分光法を使用したアニール中の発色の研究
アニールした静電紡糸膜を脱イオン蒸留水中に５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解させた。この溶液を、約２分間に亘りボルテックスを使用して激しく振盪し、約１２分間に亘り静置し、次いで、ボルテックスを使用して再び激しく振盪して、確実に完全に溶解させた。全ての溶液を、調製直後に使用した。
【００７９】
ｊ．ＵＶ−分光法
ＵＶ測定は、６０ｍｍの内部球体を有するＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（独国所在のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＬａｍｂｄａ  ７５０Ｓ）で行った。１ｍＬのサンプル溶液をセミマイクロキュベット（独国のブランドＰＬＡＳＴＩＢＲＡＮＤ（登録商標））に入れた。サンプルは２５０から３５０ｎｍの波長走査に使用し、２８０ｎｍ辺りで複合体の存在が観察された。
【００８０】
ｋ．紡糸したままの膜とアニールした静電紡糸膜のＮＩＲスペクトル
熱処理の前後に、超微細繊維マットのＮＩＲスペクトルを、６０ｍｍの内部球体を有するＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（独国所在のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＬａｍｂｄａ  ７５０Ｓ）を使用して調査した。スペクトルは、２５０〜２５００ｃｍ-1の波長範囲に亘り、反射モードで、４ｃｍ-1の分解能で収集した。
【００８１】
実施例２
デキストランからの静電紡糸繊維の調製
約４０、７０および１００ｋＤａの平均分子量を有するデキストランを静電紡糸し、得られた繊維の形態を実施例１に記載されたように調査した。
【００８２】
ｉ．７０ｋＤａのデキストラン
デキストラン（７０ｋＤａ）は、濃度に応じて多種多様な形態を与えた。０．５ｇ／ｍＬ（〜３３％ｗ／ｗ）では、短い繊維と共にビーズが主に生成された（図２）。濃度を０．７ｇ／ｍＬ（〜４１％ｗ／ｗ）に上昇させると、ビーズが少なくなり、連続繊維が生成された（図３）。デキストランの濃度を０．８ｇ／ｍＬ（〜４４％ｗ／ｗ）にさらに上昇させると、滑らかな繊維が形成された（図４）。
【００８３】
ｉｉ．４０ｋＤａのデキストラン
４０ｋＤａのデキストランについて、静電紡糸可能な最低濃度は１ｇ／ｍＬ溶媒（〜５０％ｗ／ｗ）まで上昇した。繊維の形態は、滑らかかつ連続的であった（図５）。静電紡糸条件は、電圧＝２０ｋＶ、静電紡糸距離＝１８ｃｍ、および溶液流量＝１２μＬ／分と一定に維持した。
【００８４】
ｉｉｉ．１００ｋＤａのデキストラン
１００ｋＤａのデキストランについて、同じ静電紡糸条件下で滑らかな繊維を生成するために、デキストランの最低濃度は０．６ｇ／ｍＬ（〜３８％ｗ／ｗ）に減少した（図６）。
【００８５】
これらのデータに基づいて、デキストラン溶液の最低の静電紡糸濃度を、表４のように計算した。
【００８６】
【表４】
0006034952.tif 000009
【００８７】
実施例３
ＷＰＩ−デキストラン混合物の粘度分析
一般に、高分子溶液は適切な粘度範囲内（１〜２０ポアズ）でのみ静電紡糸できる［１４］。粘度が高すぎると、静電紡糸中に目詰まりが生じるであろう［１５］。粘度は、高分子の濃度および高分子の分子量に依存する。デキストラン−ホエータンパク質分離物の混合物を調製し、その混合物の粘度を調査した。その混合物の濃度は、デキストランの分子量に依存した。総濃度は、表４に示されたデキストラン溶液の静電紡糸可能な最低濃度と同じであった。
【００８８】
デキストランとホエータンパク質分離物との間の混合比は、３：１（質量）に一定に維持した。混合物の配合が表５に纏められている。
【００８９】
【表５】
0006034952.tif 000010
【００９０】
図７は、これらの混合物の粘度を示している。混合物の番号１の粘度は、約１．８ポアズ（Ｐａ・ｓ）であり、それぞれ、混合物の番号２および３の粘度よりも、約２〜５倍高かった。
【００９１】
４０ｋＤａのデキストランから調製された溶液の高い粘度により、２つの問題が生じた。第一に、この溶液は粘性であるだけでなく、非常に粘ついたので、溶液を、調製するのも、取り扱うのも難しかった。おそらく、溶液中のホエータンパク質の含有量が非常に高いために、混合物の溶解中に、厚い泡の層（全高さの〜６０％）が形成された。一晩撹拌した後、タンパク質と空気の界面から空気を除去するために、真空槽内に溶液を放置する必要があった。第二に、溶液の高粘度のために、静電紡糸中に、目詰まりが急激に生じた。
【００９２】
その結果、最低の分子量のデキストランから調製された混合物の場合で、生産性は最低であった。したがって、最低の粘度（約０．４Ｐａ・ｓ）を有する、１００ｋＤａのデキストランから混合物を調製し、その混合物を静電紡糸することがより都合よかった。
【００９３】
実施例４
静電紡糸繊維の形態分析
表１に記載したように、３：１の混合比（デキストラン−ホエータンパク質分離物）でホエータンパク質分離物をデキストラン溶液に加え、デキストラン−ホエータンパク質分離物の静電紡糸繊維を調製した。図８は、デキストラン−ホエータンパク質分離物の静電紡糸繊維の選択されたＳＥＭ画像を示している。全てのサンプルについて、繊維は滑らかであり、ビーズは観察されなかった。図８Ａ〜Ｃを参照のこと。これらのデータは、各溶液の高分子濃度が適切に選択されたこと、および３：１の混合比でのホエータンパク質分離物のデキストラン溶液に含ませることは、混合物の静電紡糸可能性には悪影響を及ぼさなかったことを示した。
【００９４】
図８Ａ〜Ｃに対応する繊維径の範囲が、図８Ｄ〜Ｆに示されている。４０、７０および１００ｋＤａのデキストランから調製されたデキストラン−ホエータンパク質分離物の繊維径は、それぞれ、４１０±１８０、２４７±８２、１７３±７２ｎｍであった。繊維径の差は、溶液の粘度の差によるものであろう。
【００９５】
４０ｋＤａのデキストランから調製された混合物の粘度は、静電紡糸可能な最低粘度が大きいために、最高であった。４０ｋＤａのデキストランから調製された混合物は、急激な目詰まりおよび非常に大きい繊維径を示した。これは、高い粘度によるものであり得る。反対に、１００ｋＤａのデキストラン／ホエータンパク質分離物の混合物は、調製するのと、取り扱うのが容易であり、目詰まりの頻度が低く、より小さい繊維径を生じた。
【００９６】
したがって、４０ｋＤａと１００ｋＤａの間のデキストランが、繊維の形成に有用であ、約１００ｋＤａのデキストランが好ましい。
【００９７】
実施例５
デキストランおよびＷＰＩを含有する混合物の性質
様々な混合比（質量で１：０、０．８：０．２、０．７５：０．２５、０．６７：０．３３および０．５：０．５）のデキストラン粉末および／またはホエータンパク質分離物を、３０ｍＭのリン酸緩衝溶液中に溶かした。この溶液を室温（〜２２℃）で一晩マグネチック・スターラーで撹拌して、混合物を確実に完全に溶かした。溶液の粘度、導電率、密度およびｐＨを、それぞれ、流量計（バージニア州、アッシュランド所在のＰｈｙｓｉｃａ社のＭＣＳ３００）、マイクロプロセッサ導電率計（独国、ウェイハイム所在のＷＴＷ社のＬＦ５３７）、密度計（オーストリア国、グラーツ所在のＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ社のＤＭＡ  ３５Ｎ）およびｐＨメータ（独国、ウェイハイム所在、ＷＴＷ社のｉｎｏＬａｂ（登録商標））を使用して測定した。全ての溶液の最終ｐＨは６．５０±０．０７であった。
【００９８】
溶液の性質および繊維の形態へのデキストランの濃度およびデキストランとホエータンパク質分離物との間の混合比の影響を調査した。
【００９９】
図９は、デキストラン水溶液の流動性を示している。０．７、０．６、０．４５および０．３ｇ／ｍＬ溶媒の濃度を有する溶液の粘度は、それぞれ、おおよそ１．４、０．７、０．３および０．１Ｐａ・ｓであった。表６は、全ての溶液の稠度係数(consistency coefficient)および流動性指数を示している。最初の３つの溶液（０．７、０．６および０．４５ｇ／ｍＬ溶媒）は、流動性指数ｎ＜１により立証されているように、ずり流動挙動を示した。０．３ｇ／ｍＬ溶媒の濃度では、溶液の流動性は、益々ニュートン挙動になり、これは、高分子鎖の絡み合いの著しい減少を示した。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
ＷＰＩをデキストラン溶液に加えたときに、混合物の粘度が著しく減少した。図１０は、デキストラン−ホエータンパク質分離物の混合物の粘度へのＷＰＩ含有量の影響を示しており、純粋なデキストラン溶液と比べている。より高いＷＰＩ含有量が、より低い混合物粘度に相関した。これは、ホエータンパク質分離物の球状構造により、混合物中のデキストランの鎖の絡み合いの程度が減少し、混合物の粘度が減少したからであろう。混合物の流動性指数は、タンパク質含有量の増加と共に減少した（表７）。０．５：０．５の混合比では、混合物は、０．３ｇ／ｍＬ溶媒の最低の濃度を有するデキストラン溶液と同様の、ニュートン流動性を有するようであった。
【０１０２】
【表７】
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【０１０３】
粘度とは対照的に、混合物の導電率は、タンパク質含有量の増加と共に増加した（表８）。ＷＰＩは、混合物のｐＨが約６．５であり、ホエータンパク質の等電点（ｐＩ）が〜５．２であるので、正味の負電荷を有する。それゆえ、ホエータンパク質分離物の極性構造は、混合物中のイオンの全移動度を増加させ、より高い導電率をもたらした。
【０１０４】
【表８】
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【０１０５】
実施例６
デキストランおよびデキストラン／ＷＰＩ混合物から静電紡糸された繊維の形態
ａ．デキストランのみの繊維
１００ｋＤａのデキストランを異なる濃度で使用して、繊維を調製した。図１１は、デキストラン繊維の形態への１００ｋＤａのデキストランの濃度の影響を示している。最低の濃度（０．３ｇ／ｍＬ溶媒）では、平均直径が８００ｎｍのビーズが主に形成され、短い繊維がわずかに形成された（図１１Ａ）。このことは、剪断応力−歪み挙動または表７に纏められた溶液の流動性指数により表されるように、ニュートン流動挙動により示される不十分な高分子鎖の絡み合いがあったことを示した。高分子の濃度を０．４５ｇ／ｍＬ溶媒に増加させると、ビーズの形成が著しく減少した（図１１Ｂ）。その形態はより繊維状になり、平均直径は約９０ｎｍであった。時々、短い繊維が観察され、高分子鎖の絡み合いがまだ少なすぎて、連続繊維を製造できなかったことを示した。デキストランの濃度が０．６ｇ／ｍＬ溶媒であった場合、滑らかな連続繊維が形成された（図１１Ｃ）。平均繊維径は、約１８０ｎｍであることが分かった。デキストランの濃度を０．７ｇ／ｍＬ溶媒までさらに増加させると、平均繊維径が約３００ｎｍまで大幅に増加した（図１１Ｅ〜Ｈ）。これらのデータは、１００ｋＤａのデキストランについて、０．６ｇ／ｍＬ溶媒の濃度が最適であることを立証した。
【０１０６】
ａ．デキストラン−ＷＰＩ繊維
ホエータンパク質分離物を、異なる混合比で０．６ｇ／ｍＬのデキストラン溶液に混ぜ合わせた（表８参照）。図１２は、静電紡糸繊維の形態へのホエータンパク質含有量の影響を示している。デキストランとホエータンパク質分離物の混合比が１：０から０．８：０．２に変化したときに、平均繊維径が１９２ｎｍ（図１２ＡおよびＦ）から１８６ｎｍ（図１２ＢおよびＧ）にわずかに減少した。混合比を０．７５：０．２５に変化させることによって、ホエータンパク質含有量をさらに増加させると、平均繊維径が約１６１ｎｍ（図１２ＣおよびＨ）に減少した。
【０１０７】
減少した繊維径は、ホエータンパク質分離物の含有量が多いときの、導電率の増加および混合物の粘度の減少によるものであり、このことは、静電紡糸中の高分子ジェットの伸張に有利に働き、より細い繊維をもたらす。
【０１０８】
しかしながら、ホエータンパク質含有量が３３％以上のときに、繊維上にビーズが観察され（図１２Ｄおよび１２Ｉ、並びに１２Ｅおよび１２Ｊ）、混合物の粘度が低すぎたことを示した。したがって、３３％未満のホエータンパク質含有量が最適である。
【０１０９】
実施例７
フーリエ変換赤外分光計（ＦＴＩＲ）による繊維タンパク質含有量の分析
実施例１に記載したように、ＦＴＩＲを行った。異なる量のデキストラン（粉末）およびホエータンパク質分離物（粉末）を有する混合物のＩＲスペクトルを収集した（図１３Ａ）。１５２０ｃｍ-1辺りのアミドバンドＩＩ領域のピーク吸光度が、タンパク質含有量と共に著しく増加し、サンプル中のタンパク質含有量の指標として使用した。１５２０ｃｍ-1および１０００ｃｍ-1辺りの波数でのピーク吸光度の間の比を、各スペクトルから計算し、そのデータを図１３Ｂに再びプロットした。興味深いことに、タンパク質含有量（ω）と、２つのピーク吸光度（ｐr）間の比との間の直線関係が（Ｒ2＝９４．００％）：ｐr＝７９３４．０＝ω（式２．２）であることが分かった。
【０１１０】
その関係は、３０質量％のタンパク質濃度まで直線のままであった。ホエータンパク質含有量が５０％に到達すると、非直線関係が観察された。しかしながら、この研究に使用したタンパク質含有量の目的値は約２５質量％であったので、定量分析にとって、式２．２はまだ有効であった。
【０１１１】
表９は、異なる混合比のデキストラン−ホエータンパク質分離物の混合物から調製された静電紡糸膜におけるタンパク質含有量の値を示している。その計算値は混合比と大して変わりなく、多糖とタンパク質が同時に静電紡糸されたことを示している。このことは、タンパク質と多糖の両方が、その後の複合体の形成に望ましい濃度で、静電紡糸繊維中に同時に存在したことを示した。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
実施例８
ＷＰＩ−デキストラン複合体形成の分析
ＷＰＩタンパク質がデキストラン繊維と関連付けられたが、タンパク質の非タンパク質との結合(conjugation)、すなわち、共有結合の形成が生じたことを確認する必要があった。したがって、デキストランの分子量、アニール中の湿度およびＷＰＩ−デキストラン複合体形成でのＷＰＩとデキストランとの間の混合比を含む、ＷＰＩとデキストランとの間で複合体(conjugate)が形成された条件を調査した。
【０１１４】
ゲル電気泳動を使用して、アニールした静電紡糸膜における糖タンパク質の存在を確認し、ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ分光光度計を使用して、アニール中の発色を調査し、静電紡糸膜のＮＩＲスペクトルを得た。
【０１１５】
実施例９
熱処理膜の外観
図１４は、紡糸したままとアニールした静電紡糸膜の外観を示している。紡糸したままの膜の色は白色であり、低密度であるのに対し、アニールしたサンプルは、密度が増加し、わずかに黄色っぽかった（図１４）。アニール後に匂いは検出されず、低分子量のメイラード反応生成物が形成されなかったことを示している。膜の色は、アニール時間の増加と共に、黄色が濃くなった。
【０１１６】
実施例１０
複合体形成の分析
ＩＲスペクトルを測定することによって、糖化タンパク質を検出する最初の手法はうまくいかなかった。Ｎ＝Ｃ伸縮による１６３０〜１６４０ｃｍ-1辺りのＷＰＩ−デキストランＩＲスペクトルの吸光度の著しい変化を予測した（メイラード反応中のシッフ塩基生成物の形成）［１６、１７］。しかしながら、ＷＰＩ−デキストラン粉末の混合物並びに６０℃および７４％ＲＨ静電紡糸膜から得られたＩＲスペクトルは、そんなに違わなかった。図１５を参照のこと。これは、この技法が、未反応のデキストランとＷＰＩの存在と比べて、アニールした静電紡糸膜中のＷＰＩ−デキストラン複合体の存在を検出するのに十分に敏感でなかったためであろう。
【０１１７】
したがって、実施例１に記載したような、サンプル中の糖タンパク質形成を検出するのにより効果的な、ゲル電気泳動を使用して、タンパク質の非タンパク質との結合を評価した。
【０１１８】
より低分子量のデキストランが、より高分子量のものよりも良好にＷＰＩ−デキストラン複合体の形成を促進するであろうから［１］、４０ｋＤａのデキストランを選択し、表的のデキストラン（１００ｋＤａ）を使用する前に、この方法を実証することができた。図１６は、４８時間までに亘り６０℃でアニールしたＷＰＩ−デキストラン−４０ｋＤａ複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示している。予期せぬことに、ＷＰＩ−デキストラン−４０ｋＤａ複合体が、短ければ２時間ほどアニールしたサンプル（レーン３）中に形成されたように見えた。
【０１１９】
デキストラン−４０ｋＤａおよびＷＰＩの繊維について、糖化が確認された後、ＷＰＩおよびデキストラン−１００ｋＤａのブレンドから膜を静電紡糸した。ＷＰＩ−デキストラン−４０ｋＤａのサンプルにおける条件と同じ条件を使用して、膜をアニールし、サンプル溶液を調製した。次いで、調製したサンプルにゲル電気泳動実験を行った。同じゲルにおいて、先にアニールしたＷＰＩ−デキストラン−４０ｋＤａ静電紡糸膜から調製したサンプルも、それらを、アニールしたＷＰＩ−デキストラン−１００ｋＤａから調製した溶液と比べるために、入れた。ＷＰＩ−デキストラン複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンが図１７に示されている。図１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ、タンパク質染色ゲルおよび糖タンパク質染色ゲルの画像を示している。両方のゲルを同時に泳動させた。
【０１２０】
デキストラン−４０ｋＤａから調製したサンプルについて、その結果は、図１６に示された結果と似ていた。ＷＰＩのバンドは、膜が８時間に亘りアニールされた後（レーン３）、著しく弱まった。アニール時間が長くなるにつれて（レーン４および５：それぞれ、１６および２４時間）、分子量が大きい化合物のバンドは、より強くなった。これは、タンパク質とデキストランの糖化が、より長いアニール時間で増加したことを示した（図１７Ｂ）。
【０１２１】
デキストラン−１００ｋＤａから調製された静電紡糸膜のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターン（レーン６〜９）は、デキストラン−４０ｋＤａから調製したもの（レーン２〜５）と同様の挙動を示したが、強度が弱く、ゲルの位置が高かった。デキストラン−１００ｋＤａの大きいサイズは、分子の移動度を低減させたか、または分子間の接触点の数を減少させた（両方とも、反応を促進させる要因）と疑っている。このように、反応は、明らかに、より小さいデキストラン−４０ｋＤａによるものほど効率的ではなかった。それでも、図１７Ｂから、複合体が形成され、そのサイズは、ＷＰＩ−デキストラン−４０ｋＤａ複合体のものよりずっと大きかったのは明らかである。
【０１２２】
図１８ＡおよびＢは、ＷＰＩ−デキストラン（７０ｋＤａ）複合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示している。これまでのように、糖タンパク質バンドは、アニール時間が長くなるにつれて、より強くなった。そのバンド強度は、デキストラン−４０ｋＤａから調製されたものよりも弱かったが、デキストラン−１００ｋＤａから調製されたものよりも、強かった。公知のタンパク質分子量に対する移動距離をプロットすることにより（図１９）、ミニゲルについての分子量の標準曲線を作成するために、同じゲルに標準的なタンパク質ラダーも装填した。このように、デキストラン−４０ｋＤａ、７０ｋＤａおよび１００ｋＤａから調製された静電紡糸膜に見られた糖タンパク質は、それぞれ、＞７０ｋＤａ、＞２００ｋＤａおよび＞２８０ｋＤａと予測できた。
【０１２３】
図２０ＡおよびＢは、糖化への湿度の影響を示している。サンプルを低湿度（０％ＲＨおよび４４％ＲＨ）でアニールした場合、糖タンパク質染色ゲルにおける糖化バンドの強度はずっと弱かった。７４％ＲＨで向上した糖化が得られた（レーン８〜１０参照のこと）。
【０１２４】
静電紡糸繊維における高分子は十分に絡み合い、それゆえ、分子の移動度が制限されている。湿度を上昇させると、鎖の可撓性が増し、より多くの反応を生じさせ、それゆえ、ＷＰＩ−デキストラン複合体の形成を向上させるであろう。
【０１２５】
この実験に使用したホエータンパク質分離物中の２つの主成分であるβ−ラクトグロブリンおよびα−ラクトアルブミンは、それぞれ、１８および１４ｋＤａ辺りの分子量を有する。このことは、ＷＰＩ中の２つの主成分の単量体と二量体のためであり得る、１４、１８、３０および３６ｋＤａ辺りで見られる４つのバンドと一致している。６０ｋＤａ辺りのバンドは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に割り当てられた［７、１９］。
【０１２６】
全てのタンパク質染色ゲルにおけるこれらの主なバンドの存在は、２４時間に亘るアニール後でさえも、静電紡糸膜に未反応のＷＰＩが残留したことを意味した。このことは、デキストランとＷＰＩの混合比は、前駆体溶液中のデキストランを増加させるまたはＷＰＩを減少させることによって、調節できることを示唆した。このように、異なる混合比のＷＰＩおよびデキストラン１００ｋＤａから静電紡糸膜を調製した。図２１は、これらの静電紡糸膜のＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示している。糖タンパク質染色ゲルが、全てのアニールした静電紡糸膜において（レーン２〜４、６〜８、１０〜１２）糖タンパク質バンドの存在を確認したが、紡糸したままの膜において（レーン１、５および９）では、確認されなかった。糖タンパク質バンドの強度は以下のようであった：レーン１０〜１２＞レーン６〜８＞レーン２〜４。しかしながら、小分子のバンドの強度において、それほど差はなかった（β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンおよびＢＳＡ）。それゆえ、デキストラン−１００ｋＤａおよびＷＰＩの間の最適混合比は、この実行可能な研究において使用した２：１よりも高い可能性があるであろう。
【０１２７】
実施例１１
アニール中の発色
アニールした静電紡糸膜の発色を時間の関数として理解するために、ＵＶ−ＶＩＳ−ＮＩＲ分光光度計を使用して、吸光度スペクトルを測定した。図２２Ａおよび２２Ｂは、様々な時間でアニールしたデキストラン−４０ｋＤａから調製した静電紡糸膜のＵＶ吸光度スペクトルを示している。これらのスペクトルは、２８０ｎｍ辺りにたった１つの明白な吸光度ピークしか示さず、これは、サンプル中に残留するタンパク質を検出するために使用したのと同じ波長であった［２０、２１］。その結果は、吸光度ピークはアニール時間と共に増加したことを示している。
【０１２８】
全ての溶液サンプルにおいて、ＷＰＩ濃度は一定に維持した；したがって、吸光度の上昇は、天然のＷＰＩ分子と比べて大きい糖タンパク質のサイズによるものであろう。このことは、より長いアニール時間により、より多くの糖タンパク質の形成が促進されたことを示した。吸光度ピークとアニール時間との間のプロットは、Ｓ字形曲線と同様に見える。アニールの始めでは、デキストラン分子とＷＰＩ分子は、それらを再配列させるのに緩和時間が必要なようであり、それゆえ、糖タンパク質の形成の増加は少しだけ増加した（０〜４時間）。この初期の緩和時間後、糖化は、４時間から２４時間までより速い速度で進行するようである。２４時間と４８時間の間では、糖化の速度は、恐らく反応部位の減少のために、遅くなった。デキストラン７０ｋＤａから調製された静電紡糸膜にも、同様の傾向が観察された（図２３Ａおよび２３Ｂ）
反対に、１：２の混合比でデキストラン１００ｋＤａ−ＷＰＩから調製された静電紡糸膜は、ＵＶ吸光度の異常な変動を示した（図２４Ａ）。ゲル電気泳動実験の結果から、デキストランのサイズにかかわらず、時間に亘り糖タンパク質の上昇があることが確認された；それゆえ、その変動は測定自体によるものであったのであろう。全ての溶液は、デキストラン４０ｋＤａ−静電紡糸膜およびデキストラン７０ｋＤａ−静電紡糸膜から調製された溶液と同じ濃度で調製されたので、デキストラン分子および／または糖タンパク質の大きいサイズが、吸光度と干渉するであろうと疑っている。
【０１２９】
したがって、５から３ｍｇ／ｍＬの低い濃度で溶液を調製した。吸光度への分子サイズの干渉効果が減少したと思われた。図２４Ｂは、図２２Ｂおよび２３Ｂと同様の傾向を示している。しかしながら、デキストラン−１００ｋＤａとＷＰＩの混合比が１：１に増加した場合、干渉効果が戻った（図２５Ａ）。そして、混合比が２：１に増加すると、より大きい干渉となった（図２５Ｂ）。全ての測定において高レベルのノイズが観察された（図２６）。これらの結果は、着色生成物の形成を示した、ゲル電気泳動の結果、すなわち、単純な目視観察（図２７）と対照的であった。
【０１３０】
実施例１２
比色計分析
ＷＰＩ−デキストラン繊維を含有するアニール済み静電紡糸膜を、先に記載した様に調製し、アニールした。デキストラン１００ｋＤａから調製された、アニールした静電紡糸膜の発色を、比色計を使用して評価した。予測したように、サンプルの明度はアニール時間と共に減少したのに対し、黄色さはアニール時間と共に増加した（図２８Ａ〜Ｃ）。色のなさ、例えば、黄色または茶色のないことが好ましい。膜が無色であることが理想的である。色を避けるために、シッフ反応後に反応を停止すべきである。
【０１３１】
実施例１３
ＮＩＲスペクトル分析
ＷＰＩおよびデキストラン１００ｋＤａから調製され、様々な時間でアニールされた静電紡糸膜のＮＩＲスペクトルを収集した（図２９ＡおよびＢ）。タンパク質分子の二次構造に割り当てられた、２０００から２３００ｎｍの範囲に、新たな吸光度ピークは検出されなかった［２０，２２］。これは、６０℃でのアニール中に、タンパク質の二次構造に実質的な変化がなかったことを示しているであろう。この結果は、紡糸したままとアニールした静電紡糸膜のＦＴＩＲスペクトル（図１５）と一致する。１４００ｎｍ辺りに位置するピークが観察され、これは、高湿度雰囲気内でのアニール中の水の存在によるＯ−Ｈ伸縮およびタンパク質分子のＮ−Ｈ伸縮の最初の倍音を原因とし得る［２０、２３］。全体として、アニールした静電紡糸膜の反射率は、下方にシフトした。これは、アニールした静電紡糸膜が、より長いアニール時間により明度がわずかに低くなり、光の吸収能力を高くしたためであった。アニールした静電紡糸膜の全てのスペクトルは、紡糸したままの膜と比べて、２８０ｎｍ辺りで低い反射率値（または高い吸光度）を示す。一般に、膜が濃いほど、膜が問題となり、ＦＴＩＲ分析を行うのが難しくなる。
【０１３２】
別の例として、上述した例示の実施例の特徴の各々を、単独で、または他の実施例の要素との組合せまたは下位の組合せで利用してもよい。例えば、上述したシステムおよび方法またはその一部のいずれを、上述した他の方法およびシステムまたはその一部と組み合わせてもよい。例えば、説明の図面に示された工程を、列挙された順序以外で行ってもよく、説明された１つ以上の工程が、本開示の態様にしたがって随意的であってもよいと当業者に認識されよう。本開示の真の精神および範囲から逸脱せずに、改変を行ってよいことも認識され、理解されるであろう。それゆえ、この説明は、本開示への制限ではなく、説明であると理解すべきである。
【図１１−１】
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【図２１ＡａｎｄＢ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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