(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも３０００の連続するヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも２０００の連続するヌクレオチドからなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも１５００の連続するヌクレオチドからなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して９９％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを二分子以上含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ベクター。
【請求項９】
下記（ｉ）及び（ii）に記載のポリヌクレオチドを含むことからなる、外来遺伝子発現ベクター。
（ｉ）請求項１乃至６の少なくともいずれか一つに記載のポリヌクレオチド
（ｉｉ）(a)乃至(d) の少なくともいずれか一つに記載のポリヌクレオチド
(a)配列番号１のポリヌクレオチド配列あるいは該ポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列、又はそれらの部分断片からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド
(b)配列番号３のポリヌクレオチド配列あるいは該ポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列、又はそれらの部分断片からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド
(c)配列番号４のポリヌクレオチド配列あるいは該ポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列、又はそれらの部分断片からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド
(d)配列番号５のポリヌクレオチド配列あるいは該ポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列、又はそれらの部分断片からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
外来遺伝子にコードされる蛋白質が多量体蛋白質である、請求項８又は９に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項１１】
外来遺伝子にコードされる蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、請求項１０に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項１２】
外来遺伝子にコードされる蛋白質が抗体又はその機能性断片である、請求項１１に記載の外来遺伝子発現ベクター。
【請求項１３】
請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１４】
細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、請求項１３に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ−１細胞、２９３細胞、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択されるいずれか一つの細胞である、請求項１４に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
外来遺伝子にコードされる蛋白質が多量体蛋白質である、請求項１３乃至１５のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
外来遺伝子にコードされる蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
外来遺伝子にコードされる蛋白質が抗体又はその機能性断片である、請求項１７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
請求項１３乃至１８のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から外来遺伝子にコードされた蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、又は請求項８乃至１２のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ベクターを使用することを特徴とする、外来遺伝子又は外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞における外来遺伝子の発現を亢進させる方法。
【請求項２１】
形質転換細胞において外来遺伝子の発現を亢進させることを目的とする、請求項１乃至７のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡエレメントを有する外来遺伝子発現ベクターを用いることにより、外来蛋白質分泌能が増強された哺乳動物形質転換宿主細胞、及びこれを用いた該外来蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発展によって、治療用蛋白質や抗体医薬といった蛋白質性医薬品が急速にその市場を拡大している。中でも、抗体医薬は人体に投与しても有害な免疫反応を引き起こさず、その特異性の高さから開発が盛んに進められている。
【０００３】
抗体医薬に代表される蛋白質性医薬を生産させる宿主細胞としては、微生物や酵母、昆虫、動植物細胞、トランスジェニック動植物等を挙げることができる。蛋白質性医薬の生理活性や抗原性には、フォールディングや糖鎖修飾といった翻訳後修飾が必須であるため、複雑な翻訳後修飾を行うことができない微生物や糖鎖構造の異なる植物はバイオリアクターとして不適である。ヒトと類似した糖鎖構造を有し、翻訳後修飾が可能、さらには安全性の面を考慮し、ヒトと近縁生物であるＣＨＯ細胞等の哺乳動物培養細胞が現在の主流となっている。
【０００４】
哺乳動物培養細胞を宿主とする場合、微生物等と比較して、増殖速度の低さ、生産性の低さ、高価なコスト等の問題を抱えている（非特許文献１参照）。また、蛋白質性医薬品を臨床で利用するためには大量の投与が必要となるため、世界的にもその生産能力の不足が問題となっている。そこで、哺乳動物培養細胞における外来遺伝子の生産性を向上させるため、これまでに、プロモーターやエンハンサー、薬剤選択マーカー、遺伝子増幅、培養工学的手法等多くのアプローチが試行錯誤されてきたが、一律に発現を上げる系は未だ存在していないのが現状である。外来蛋白質の低生産性の原因の１つとして、位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）が挙げられる（非特許文献２参照）。外来遺伝子は宿主細胞へ導入された後、ランダムに宿主染色体ゲノムへ組込まれ、その転写には組込まれた周辺のＤＮＡが大きく影響を及ぼす。位置効果は、外来遺伝子の挿入部位、コピー数、構成等の要因に影響されるが、染色体の挿入位置を制御することは非常に困難である。
【０００５】
それを解決するため、近年、遺伝子座調節領域（ＬＣＲ：ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎ）、核マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ：ｓｃａｆｆｏｌｄ／ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）、インシュレーター、クロマチンオープンエレメント（ＵＣＯＥ：ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、ａｎｔｉ―ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ（ＳＴＡＲ  ｅｌｅｍｅｎｔ）等の調節ポリヌクレオチド配列が同定されてきた（非特許文献３乃至６参照）。ＬＣＲは、内在性の遺伝子座においてはクロマチン構造を弛緩することは求められないが、外来遺伝子の発現ユニットと用いることにより、外来遺伝子が組込まれたＤＮＡ周辺のクロマチン構造を弛緩し、広範囲のクロマチン再構築能を有する転写調節エレメントであり、ＡＴリッチ領域を必要とするといわれている（非特許文献７参照）。
【０００６】
ＬＣＲに代表される上記ＤＮＡエレメントはプロモーターと共に用いられることが多く、ＤＮＡエレメントを用いた場合、プロモーターのみの場合よりも外来遺伝子の発現量が亢進することが知られている。しかしながら、これまでに報告されたＤＮＡエレメントの種類は非常に少なく、外来遺伝子の発現亢進に寄与するメカニズムはそれぞれ異なっている。さらに、これらを用いた場合においても、必要量の治療用蛋白質の生産性の確保が充分ではないことから、外来蛋白質の生産性亢進を可能にするＤＮＡエレメントについて充分な知見が得られているとは言い難い。
【０００７】
従って、本発明の課題は、哺乳動物培養細胞等の宿主細胞において、高い外来遺伝子発現亢進活性を有するＤＮＡエレメントを用いて、蛋白質性医薬品となる外来蛋白質の産生を亢進させる手段を提供することにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｍ．Ｗｕｒｍ．  （２００４）  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２（１１）：１３９３−１３９８
【０００９】
【非特許文献２】Ｔｅｄ  Ｈ．Ｊ．Ｋｗａｋｓ  ａｎｄ  Ａｒｉｅ  Ｐ．Ｏｔｔｅ．  （２００６）  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｔｏ  ａｕｇｍｅｎｔ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２４（３）：１３７−１４２
【００１０】
【非特許文献３】Ｐｉｒｒｅ−Ａｌａｉｎ  Ｇｉｒｏｄ，  Ｄｕｃ−Ｑｕａｎｇ  Ｎｇｕｙｅｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ４（９）：７４７−７５３
【００１１】
【非特許文献４】Ａｄａｍ  Ｃ．Ｂｅｌｌ，  Ａｄａｍ  Ｇ．Ｗｅｓｔ，  Ｇａｒｙ  Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ．  （２００１）  Ｉｎｓｕｌａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ：  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２９１：４４７−４５０
【００１２】
【非特許文献５】Ｓｔｅｖｅｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｔｒａｃｅｙ  Ｍｕｓｔｏｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＣｐＧ−ｉｓｌａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５（１７）：１−９
【００１３】
【非特許文献６】Ａｒｉｅ  Ｐ．Ｏｔｔｅ，  Ｔｅｄ  Ｈ．Ｊ．Ｋｗａｋｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  ＤＮＡ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｆｒｏｍ  ＳＴＡＲ−Ｓｅｌｅｃｔ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｉｇｈ  Ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  ２３：８０１−８０７
【００１４】
【非特許文献７】Ｑｉｌｉａｎｇ  Ｌｉ，  Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ  Ｆａｎｇ，  ａｎｄ  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｓｔａｍａｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ．  （２００２）  Ｌｏｃｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  １００（９）：３０７７−３０８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記に挙げたように、調節ポリヌクレオチド配列であるＤＮＡエレメントの種類はいまだ少なく、さらにその中でも外来遺伝子の高い発現亢進効果を有するＤＮＡエレメントは極めて少ない。本発明の目的は、外来遺伝子発現ユニットが導入された遺伝子座周辺のクロマチン構造変化を伴う等により転写活性化を促進するＤＮＡエレメントを用いることで、哺乳動物細胞が安定的に高発現を達成する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、哺乳動物培養細胞において特定の１種又は２種以上のＤＮＡエレメントを用いて、発現対象となる外来蛋白質の分泌生産性を向上させることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）  配列表の配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（２）  配列表の配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（３）  配列表の配列番号３に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（４）  配列表の配列番号４に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（５）  配列表の配列番号５に記載のポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（６）  配列表の配列番号１乃至５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも３０００の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（７）  配列表の配列番号１乃至５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも２０００の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（８）  配列表の配列番号１乃至５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列のうち少なくとも１５００の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
（９）  （１）乃至（８）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して９５％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１０）  （１）乃至（８）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列に対して９９％以上相同性を有するポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１１）  （１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を二分子以上含むポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
（１２）  （１）乃至（１０）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を二種以上含むことからなる、ポリヌクレオチド。
（１３）  （１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を含むことからなる、外来遺伝子発現ベクター。
（１４）  外来遺伝子にコードされる蛋白質が多量体蛋白質である、（１３）に記載の外来遺伝子発現ベクター。
（１５）  外来遺伝子にコードされる蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、（１４）に記載の外来遺伝子発現ベクター。
（１６）  外来遺伝子にコードされる蛋白質が抗体又はその機能性断片である、（１５）に記載の外来遺伝子発現ベクター。
（１７）  （１３）乃至（１６）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ベクターが導入された形質転換細胞。
（１８）  細胞が哺乳動物由来の培養細胞である、（１７）に記載の形質転換細胞。
（１９）  哺乳動物由来の培養細胞が、ＣＯＳ−１細胞、２９３細胞、及びＣＨＯ細胞からなる群から選択されるいずれか一つの細胞である、（１８）に記載の形質転換細胞。
（２０）  外来遺伝子にコードされる蛋白質が多量体蛋白質である、（１７）乃至（１９）のいずれか一つに記載の形質転換細胞。
（２１）  外来遺伝子にコードされる蛋白質がヘテロ多量体蛋白質である、（２０）に記載の形質転換細胞。
（２２）  外来遺伝子にコードされる蛋白質が抗体又はその機能性断片である、（２１）に記載の形質転換細胞。
（２３）  （１７）乃至（２２）のいずれか一つに記載の形質転換細胞を培養し、培養物から該外来遺伝子にコードされた蛋白質を取得することを特徴とする、該蛋白質の製造方法。
（２４）  （１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド、又は（１３）乃至（１６）のいずれか一つに記載の外来遺伝子発現ベクターを使用することを特徴とする、該外来遺伝子又は該ベクターが導入された形質転換細胞における該外来遺伝子の発現を亢進させる方法。
（２５）  形質転換細胞において外来遺伝子の発現を亢進させることを目的とする、（１）乃至（１２）のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列の使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ＤＮＡエレメントを用いた外来遺伝子発現ベクターを哺乳動物宿主細胞へ導入することによって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の発現が著しく亢進することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＣｈＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐを行ったサンプルが、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体特異的にＣｈＩＰされたことを、ＧＡＰＤＨ領域の増幅により確認した図。
【図２】ＤＮＡエレメントが挿入されたＳＥＡＰ発現ベクターの概略図。
【図３】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４の発現亢進効果について、ＣＭＶプロモーターにより発現されたＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図４】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７の発現亢進効果について、ＥＦ−１α又はＳＶ４０プロモーターにより発現されたＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図５】ＤＮＡエレメントが挿入された抗体発現（抗体遺伝子Ｘ  重鎖、軽鎖共発現）ベクターの概略図。
【図６】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ７の発現亢進効果について、ＣＭＶ又はＥＦ−１αプロモーターにより発現された抗体生産量を指標にＥＬＩＳＡ法により確認した図。
【図７】ＤＮＡエレメントＡ２及び関連配列の配列長。
【図８】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ２及び関連配列の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図９】ＤＮＡエレメントＡ７及び関連配列の配列長。
【図１０】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ７及び関連配列の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図１１】ＤＮＡエレメントＡ１８及び関連配列の配列長。
【図１２】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ１８及び関連配列の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図１３】ＤＮＡエレメントＢ５及び関連配列の配列長。
【図１４】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＢ５及び関連配列の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図１５】ＤＮＡエレメントＣ１４及び関連配列の配列長。
【図１６】ＣＨＯ安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＣ１４及び関連配列の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図１７】ＨＥＫ２９３安定発現株を用いて、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４の発現亢進効果について、ＳＥＡＰ活性を指標に確認した図。
【図１８】ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、又はＡ１８の全長配列を基準として始点と終点となるヌクレオチドを示した図。
【図１９】ＤＮＡエレメントＢ５、又はＣ１４の全長配列を基準として始点と終点となるヌクレオチドを示した図。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明で実施例で用いるプラスミド、制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することが出来る。また、ＤＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換宿主細胞の培養、得られえる培養液からの抗体の取得、精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることが出来るものである。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びそのＲＮＡも含まれるものとする。
【００２１】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
【００２２】
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
【００２３】
本明細書中において、「遺伝子発現」という語は、ある遺伝子からｍＲＮＡが転写される現象、及び／又は該ｍＲＮＡから蛋白質が翻訳される現象を意味している。
【００２４】
本明細書中において、「外来遺伝子」という語は、人工的に宿主細胞に導入される遺伝子を意味している。
【００２５】
本明細書中において、「外来蛋白質」という語は、外来遺伝子にコードされる蛋白質を意味している。
【００２６】
本明細書中においては、「遺伝子発現ユニット」という語は、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、外来遺伝子、転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するポリヌクレオチドを意味している。
【００２７】
本明細書中において「外来遺伝子発現亢進活性」とは、外来遺伝子を含む遺伝子発現ユニット周辺ＤＮＡに転写、翻訳に有利な環境を作り出し、転写、翻訳効率を大きく向上させることにより、外来蛋白質の宿主細胞における生産を亢進させる活性をいう。
【００２８】
本明細書中において「ＤＮＡエレメント」という語は、遺伝子発現ユニットの近傍又は、遺伝子発現ユニットの含まれる外来遺伝子発現ベクター上に配置された場合に、外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００２９】
本明細書中においては、「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２等を含むが、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。
【００３０】
１．外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメント
本発明におけるＤＮＡエレメントは、実施例１に示されるように、アセチル化ヒストンＨ３との相互作用を指標として取得することが可能である。一般にヒストン（Ｈ３、Ｈ４）のアセチル化は転写の活性化に関与しているといわれており、主に２つの説が考えられている。ヒストンテールがアセチル化することで電荷的に中和され、ＤＮＡとヒストンとの結合が緩くなるというヌクレオソームの立体構造変化が関係している説（Ｍｅｌｌｏｒ  Ｊ．  （２００６）  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ２２（６）：３２０−３２９）と、様々な転写因子のリクルートに関与するという説（Ｎａｋａｔａｎｉ  Ｙ．  （２００１）  Ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｓｅｓ−ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｌａｙｅｒｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．  ６（２）：７９−８６）である。いずれの説においても、ヒストンのアセチル化が転写活性化に関与している可能性は高く、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体を用いたクロマチン免疫沈降（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ＣｈＩＰ）によって、アセチル化ヒストンＨ３と相互作用するＤＮＡエレメントを濃縮することが可能である。
【００３１】
本発明において、外来遺伝子の発現亢進に使用されるＤＮＡエレメントの１つとして、Ａ２を挙げることができる。Ａ２はヒト１５番染色体８０９６６４２９〜８０９７４８７８に位置しており、ＡＴ含量６２．２％、８４５０ｂｐのポリヌクレオチド配列である。Ａ２のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１に記載されている。
【００３２】
同様のＤＮＡエレメントとして、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４を挙げることができる。Ａ７はヒト１１番染色体８８９９２１２３〜８９０００５４２に位置しており、ＡＴ含量６４．５２％、８４２０ｂｐの配列である。Ａ７のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２に記載されている。
【００３３】
Ａ１８は、ヒト４番染色体１１１２７５９７６〜１１１２８４４５０に位置しており、ＡＴ含量６２．５４％、８４７５ｂｐの配列である。Ａ１８のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３に記載されている。
【００３４】
Ｂ５は、ヒト１番染色体１４３０３４６８４〜１４３０４３０８４に位置しており、ＡＴ含量６６．３７％、８４０１ｂｐの配列である。Ｂ５のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号４に記載されている。
【００３５】
最後に、Ｃ１４は、ヒト１１番染色体４６０８９０５６〜４６０９７４８２に位置しており、ＡＴ含量６３．８１％、８４２７ｂｐの配列である。Ｃ１４のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５に記載されている。
【００３６】
本発明において、ＤＮＡエレメントの有する外来遺伝子発現亢進活性は、ＳＥＡＰ等のレポーター遺伝子にコードされる蛋白質の活性を指標として検定することが可能である。該ＤＮＡエレメントが存在しない場合と比較して、レポーター蛋白質の活性が好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは５倍以上に上昇した場合、該ＤＮＡエレメントが外来遺伝子発現亢進活性を有すると判断することができる。２倍程度以上の亢進によっても、細胞の培養スケールの削減、及び培養時間の短縮が期待され、結果として収量の向上と培養コストの削減が可能となる。収量が向上すれば、医薬としての外来蛋白質を安定して供給することが可能となる。又、培養コストが削減されれば、医薬としての外来蛋白質の原価が軽減され、外来蛋白質を投与される患者の金銭的負担も軽減される。
【００３７】
本発明においては、上記ＤＮＡエレメントのいずれか１種を単独で使用しても良く、ＤＮＡエレメントの１種を２コピー以上使用しても良い。あるいは２種以上ＤＮＡエレメントを組み合わせて使用しても良い。
【００３８】
本発明において使用されるＤＮＡエレメントの好ましい例として、Ａ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４が挙げることができる。
【００３９】
本発明において使用されるＤＮＡエレメントは、配列番号１乃至５に示すポリヌクレオチド配列に対して８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列からなり、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するポリヌクレオチド配列であっても良い、上記８０％以上の相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性をいう。ポリヌクレオチド配列のホモロジー検索は、例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋ  ｏｆ  ＪＡＰＡＮ）等を対象に、ＦＡＳＴＡやＢＬＡＳＴ等のプログラムを用いて行うことができる。
【００４０】
本発明に使用されるＤＮＡエレメントは、配列番号１乃至５に記載のポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来遺伝子発現亢進活性を有するＤＮＡエレメントであってもよい。
【００４１】
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いポリヌクレオチド配列、すなわち配列番号１乃至５に記載されているポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるいずれか一つのポリヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましく９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件を挙げることができる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
【００４２】
当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ  （１９８９））等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記のポリヌクレオチド配列の相同性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
【００４３】
上記ポリヌクレオチド配列の変異（欠失、置換、及び／又は付加）の導入は、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の当該技術分野で公知の手法、又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社製）若しくはＭｕｔａｎｔ−Ｇ（タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキット等が利用できる。このような変異ポリヌクレオチドも本発明のＤＮＡエレメントとして使用することができる。
【００４４】
本発明のＤＮＡエレメントとしては、配列表の配列番号１乃至５のいずれか一つに記載のポリヌクレオチド配列のうち、少なくとも３０００、あるいは、少なくとも２０００の連続するヌクレオチドからなる部分断片を使用することができる。このような部分断片の例としては、Ａ２の部分断片であるＡ２−１乃至Ａ２−１７、Ａ７の部分断片であるＡ７−１乃至Ａ７−１８、Ａ１８の部分断片であるＡ１８−１乃至Ａ１８−４、Ｂ５の部分断片であるＢ５−１乃至Ｂ５−６、又はＣ１４の部分断片であるＣ１４−１乃至Ｃ１４−１４を挙げることができるが、外来遺伝子発現亢進活性を有している限りこれらの部分断片に限定されない。
【００４５】
本発明においては、上記部分断片のいずれか１種を単独で使用しても良く、部分断片の１種を２コピー以上使用しても良い。あるいは２種以上部分断片を組み合わせて使用しても良い。また、各ＤＮＡエレメントの全長配列と部分断片を組み合わせて使用しても良い。該組み合わせにおいて、部分断片は、組合せを構成する全長配列のＤＮＡエレメント由来であっても、異なる全長配列のＤＮＡエレメント由来であっても良い。
【００４６】
Ａ２の各断片のポリヌクレオチド配列においては、Ａ２−１は配列表の配列番号１の１乃至３０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−２は配列表の配列番号１の２８０１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−３は配列表の配列番号１の５４０１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−４は配列表の配列番号１の７０１乃至２７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−５は配列表の配列番号１の７０１乃至２２００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−６は配列表の配列番号１の７０１乃至３７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−７は配列表の配列番号１の２００１乃至５０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−８は配列表の配列番号１の４００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−９は配列表の配列番号１の１乃至３７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１０は配列表の配列番号１の２００１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１１は配列表の配列番号１の２８０１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１２は配列表の配列番号１の７０１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１３は配列表の配列番号１の２００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１４は配列表の配列番号１の２８０１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１５は配列表の配列番号１の１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１６は配列表の配列番号１の７０１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ２−１７は配列表の配列番号１の２００１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００４７】
Ａ７の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ａ７−１は配列表の配列番号２の６０１乃至３６００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−２は配列表の配列番号２の３６０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−３は配列表の配列番号２の５４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−４は配列表の配列番号２の３４０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−５は配列表の配列番号２の１５０１乃至４５００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−６は配列表の配列番号２の４４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−７は配列表の配列番号２の２４０１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−８は配列表の配列番号２の１乃至３６００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−９は配列表の配列番号２の１５０１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１０は配列表の配列番号２の２４０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１１は配列表の配列番号２の３４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１２は配列表の配列番号２の４４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１３は配列表の配列番号２の１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１４は配列表の配列番号２の１５０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１５は配列表の配列番号２の２４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１６は配列表の配列番号２の３４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１７は配列表の配列番号２の１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ７−１８は配列表の配列番号２の１５０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００４８】
Ａ１８の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ａ１８−１は配列表の配列番号３の１乃至５０４０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ１８−２は配列表の配列番号３の１００１乃至６００２番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ１８−３は配列表の配列番号３の２００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ１８−４は配列表の配列番号３の３０００乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００４９】
Ｂ５の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ｂ５−１は配列表の配列番号４の１乃至４００１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−２は配列表の配列番号４の１乃至３２００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−３は配列表の配列番号４の２４９１乃至５６０１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−４は配列表の配列番号４の５３７３乃至８４０１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−５は配列表の配列番号４の９０１乃至４００１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＢ５−６は配列表の配列番号４の４００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００５０】
Ｃ１４の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ｃ１４−１は配列表の配列番号５の９６０乃至４０１５番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−２は配列表の配列番号５の１９８７乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−３は配列表の配列番号５の４０２０乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−４は配列表の配列番号５の９６０乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−５は配列表の配列番号５の９６０乃至６０１１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−６は配列表の配列番号５の４９３９乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−７は配列表の配列番号５の９６０乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−８は配列表の配列番号５の２９９４乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−９は配列表の配列番号５の４０２０乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１０は配列表の配列番号５の１乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１１は配列表の配列番号５の１９８７乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１２は配列表の配列番号５の２９９４乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１３は配列表の配列番号５の９６０乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＣ１４−１４は配列表の配列番号５の１９８７乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【００５１】
２．ポリヌクレオチドの取得
本発明において、後記の産生亢進の対象となる外来蛋白質をコードする外来遺伝子を含むポリヌクレオチドは、以下に示す一般的な方法により取得することができる。例えば、外来遺伝子が発現している細胞や組織に由来するｃＤＮＡライブラリーを、当該遺伝子断片をもとにして合成したＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることにより単離することができる。ｍＲＮＡの調製は、当該技術分野において通常用いられる手法により行うことができる。例えば、上記細胞又は組織を、グアニジニン試薬、フェノール試薬等で処理して全ＲＮＡを得、その後、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムやセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得る。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ＋）ＲＮＡをさらに分画してもよい。次いで、得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成し、該一本鎖ｃＤＮＡからＤＮＡ合成酵素Ｉ、ＤＮＡリガーゼ及びＲＮａｓｅＨ等を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡ合成酵素によって平滑化後、アダプター（例えば、ＥｃｏＲＩアダプター）の連結、リン酸化等を経て、λｇｔ１１等のλファージに組み込んでｉｎ  ｖｉｖｏパッケージングすることによってｃＤＮＡライブラリーを作製する。また、λファージ以外にもプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することもできる。その後、ｃＤＮＡライブラリーから目的のＤＮＡを有する株（ポジティブクローン）を選択すればよい。
【００５２】
また、蛋白質の産生亢進に用いる上記ＤＮＡエレメント、又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡから単離する場合、あるいは、プロモーター、ターミネーター領域を含むポリヌクレオチドの単離は、一般的手法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４（１９９１））に従い、採取源となる生物の細胞株よりゲノムＤＮＡを抽出し、ポリヌクレオチドを選別することにより行う。ゲノムＤＮＡの抽出は、例えば、Ｃｒｙｅｒ  らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １２，  ３９−４４（１９７５））及びＰ．  Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，  １６９−１８２（１９９１））に従って行うことができる。
【００５３】
目的とするＤＮＡエレメント、又は外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、例えばＰＣＲ法（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｈｅｎｒｙ  Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ａｔｏｃｋｔｏｎ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって行うこともできる。ＰＣＲ法を用いたポリヌクレオチドの増幅には、プライマーとして２０〜３０ｍｅｒの合成１本鎖ＤＮＡを、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる。増幅された遺伝子はポリヌクレオチド配列を確認した後、用いる。ＰＣＲの鋳型としては、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）等のゲノムＤＮＡライブラリーを使用することが可能である。
【００５４】
一方、配列未知の外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの取得は、（ａ）常法により遺伝子ライブラリーを作製し、（ｂ）作製された遺伝子ライブラリーから所望のポリヌクレオチドを選択し、当該ポリヌクレオチドを増幅する、ことによって行うことができる。遺伝子ライブラリーは、採取源となる生物の細胞株から常法により得た染色体ＤＮＡを適当な制限酵素によって部分消化して断片化し、得られた断片を適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによって調製することができる。また、細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ここからｃＤＮＡを合成後、適当なベクターに連結し、該ベクターを適当な宿主に導入することによっても調製することができる。この際用いられるベクターとしては、通常公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られるプラスミドを用いることができ、ファージベクター又はコスミド等も広く用いることができる。形質転換又は形質導入を行う宿主は、上記ベクターの種類に応じたものを用いればよい。外来遺伝子を含むポリヌクレオチドの選択は、上記遺伝子ライブラリーから、外来遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法等によって行う。
【００５５】
また外来遺伝子を含むポリヌクレオチドを化学的に全合成することもできる。例えば相補的な２対のオリゴヌクレオチドを作製しこれらをアニールさせる方法や、数本のアニールされたＤＮＡをＤＮＡリガーゼにより連結する方法、又は一部相補的な数本のオリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲによりギャップを埋める方法等により、遺伝子を合成することができる。
【００５６】
ポリヌクレオチド配列の決定は、通常の方法、例えばジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ７４，  ５４６３−５４６７（１９７７））等により行うことができる。更に上記ポリヌクレオチド配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いることによっても容易に行い得る。
【００５７】
３．外来遺伝子発現ベクター、エレメントベクター
本発明の外来遺伝子発現ベクターとしては、上記ＤＮＡエレメントの１種、上記のＤＮＡエレメントの１種を２個以上のコピー数、又は上記のＤＮＡエレメントの２種以上の組み合わせを含み、さらに外来遺伝子発現ユニットを含むベクターが提供される。上記の外来遺伝子発現ベクターによって外来遺伝子を宿主細胞内で発現させる際には、ＤＮＡエレメントを遺伝子発現ユニットの直前又は直後に配置してもよく、又は遺伝子発現ユニットから離れた位置に配置しても良い。また、複数のＤＮＡエレメントを含む１つの外来遺伝子発現ベクターを用いてもよい。なお、ＤＮＡエレメントの向きは、遺伝子発現ユニットに対して順方向又は逆方向のいずれであっても良い。
【００５８】
また、本発明で使用されるベクターとしては、上記ＤＮＡエレメントの１種、上記のＤＮＡエレメントの１種を２個以上のコピー数、又は上記のＤＮＡエレメントの２種以上の組み合わせを含み、かつ遺伝子発現ユニットを含まないベクター（以下、「エレメントベクター」という。）も含まれる。このようなエレメントベクターは、上記のＤＮＡエレメントを含む外来遺伝子発現ベクター、又は外来遺伝子発現ユニットのみを含みＤＮＡエレメントは含まない外来遺伝子発現ベクターと組み合わせて使用することが可能である。エレメントベクターを並存させることによって、外来遺伝子発現ベクターを単独で使用する場合に比べて外来遺伝子の発現が亢進されるため、上記のベクターの組み合わせも本発明の外来遺伝子発現ベクターに含まれる。
【００５９】
外来蛋白質をコードする遺伝子としては、特に限定はされないが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、α−ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、医薬上有用な生理活性蛋白質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、ＩＬ１、ＩＬ２等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子、又は抗体遺伝子等を挙げることができる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
【００６０】
本発明は特に疎水性の高い蛋白質、複合体を形成するような分泌生産が困難な蛋白質に対して有効であり、よって、上記の外来蛋白質には、多量体蛋白質、例えば、抗体又はその機能的断片であるヘテロ多量体が含まれる。「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の機能性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
【００６１】
遺伝子発現ユニットは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、外来遺伝子、転写ターミネーター領域（ポリＡ付加シグナル）を有するものである。ここで使用し得るプロモーターとしては、構成発現プロモーターであっても、誘導発現プロモーターであってもよい。構成発現プロモーターとしては、例えば、種々の天然のプロモーターであるＳＶ４０  ｅａｒｌｙ  プロモーター、アデノウイルスＥ１Ａプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＥＦ−１α（ヒト延長因子−１α）プロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、ＭＴプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター、アクチンプロモーター、人工（融合）プロモーターであるＳＲαプロモーター、ＣＡＧプロモーター等を挙げることができる。また、ポリＡ付加配列は、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じ又は異なる遺伝子のものであってもよい。
【００６２】
外来蛋白質を生産亢進させるためには強力なプロモーターを用いることが必要であるが、高活性なプロモーターを用いてフォールディングされにくい蛋白質や、分泌されにくい蛋白質の生産を試みた場合、かえって分泌不全が起こることがある。これは、蛋白質の生産が、翻訳が行われるリボソーム、フォールディング・分泌が行われる小胞体のキャパシティを越えることにより、過剰に生産されたタンパクが細胞内で変性し、蓄積、ユビキチン化され、プロテオソームにて分解するような状況になるためである。従って、生成する蛋白質が変性しアグリゲーションを起こさない、又は生産された蛋白質が分泌能のキャパシティを越えない程度の発現量を達成できるプロモーターを適宜採択するか、あるいは活性を弱める等の調整を行って使用することが好ましい。多量体蛋白質の中でも、ヘテロ多量体を形成する分子は上記の影響を受けやすく、特に抗体のような分子は重鎖、軽鎖が２分子ずつ会合したヘテロ４量体であるため、適切に会合させるためには発現度は重要な因子である。
【００６３】
また、本発明の外来遺伝子発現ベクター及びエレメントベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、ネオマイシン等の薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカー等を使用することで、形質転換体の選抜を行うことが可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
【００６４】
本発明の外来遺伝子発現ベクター及びエレメントベクターは、染色体ＤＮＡに組込まれないベクターであってもよい。一般的に、外来遺伝子発現ベクターは宿主細胞に遺伝子導入された後、ランダムに染色体に組込まれるが、ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）やｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＢＰＶ、ＨＰＶ）、ＥＢＶ等の哺乳動物ウイルス由来の構成成分を用いることにより、導入された宿主細胞中で自己複製が可能なｅｐｉｓｏｍａｌ  ｖｅｃｔｏｒとして使用することができる。例えば、ＳＶ４０由来の複製起点（ｏｒｉＰ）及びｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒであるＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原をコードした配列を有するベクターやＥＢＶ由来のｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ−１をコードした配列を有するベクター等が広く用いられている。ＤＮＡエレメントの効果はベクターの種類、あるいは染色体への組込み有無を問わず、外来遺伝子発現亢進活性を示すことが可能である。
【００６５】
４．形質転換細胞
本発明の形質転換細胞は、前記「１．」のＤＮＡエレメントを含む前記「３．」の外来遺伝子発現ベクターを用いて導入した形質転換細胞である。外来遺伝子発現ベクターとして、（Ａ）ＤＮＡエレメントを含む外来遺伝子発現ベクターのみを導入しても良く、（Ｂ）ＤＮＡエレメントを含む外来遺伝子発現ベクターと「３．」に記載のエレメントベクターを組み合わせて導入しても良い。あるいは、（Ｃ）ＤＮＡエレメントを含まない外来遺伝子発現ベクターとエレメントベクターを組み合わせて導入しても良い。
【００６６】
上記（Ｂ）又は（Ｃ）の組み合わせによる外来遺伝子の宿主細胞内での発現は、例えば、Ｇｉｒｏｄ  らの方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｉｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９１，２−１１（２００５））及びＯｔｔｅらの方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．，  ２００７，２３，８０１−８０７（２００７））に従って行うことができる。
【００６７】
形質転換させる宿主細胞としては、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくはヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、又はウシ由来の細胞である。哺乳動物細胞としては、ＣＯＳ−１細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−、ＣＨＯ−Ｓ）等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明において、宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，３４１）、エレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｄ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９４，１８２−１８７）、スフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５，３３７６（１９８５））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，  Ｈ．  （１９８３）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５３，  １６３−１６８）、リポフェクション法等を挙げることができる。
【００６９】
５．外来蛋白質の製造方法
本発明における外来蛋白質の製造は、外来蛋白質をコードする遺伝子を、前記「３．」の項目に記載のベクターを用いて導入した、上記「４．」の項目に記載の形質転換細胞を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。なお、「４．」の項目に記載の形質転換細胞を用いて産生することのできる外来蛋白質としては、単量体蛋白質のみならず多量体蛋白質を選択することも可能である。異なる複数のサブユニットから構成されるヘテロ多量体蛋白質の生産を行う場合、これらのサブユニットをコードしている複数の遺伝子を、それぞれ「４．」の項目に記載の宿主細胞に導入する必要がある。
【００７０】
形質転換細胞を培養する方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００７１】
形質転換細胞が哺乳動物細胞の場合は、例えば３７℃、５％又は８％ＣＯ２条件下で培養し、培養時間は２４〜１０００時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養や流加培養又は連続培養等により実施することができる。
【００７２】
上記の培養物（培養液）から外来蛋白質遺伝子の発現産物の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタン解析、ＥＬＩＳＡ等により行うことができる。生産された蛋白質を単離精製するためには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。培養後、目的蛋白質が細胞内に生産される場合には、細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより、目的蛋白質を採取する。また、目的蛋白質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により目的蛋白質を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー等）、分子篩を用いたゲルろ過法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いて単離精製すればよい。
【００７３】
上記の培養法、精製法は一例であって、これらに限定されるものではない。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
【００７４】
６．抗体蛋白質の製造方法
前記「５．」の項目に記載の製造方法を用いて製造されるヘテロ多量体蛋白質としては抗体蛋白質を挙げることができる。抗体蛋白質は、２分子の重鎖ポリペプチド及び２分子の軽鎖ポリペプチドからなる４量体蛋白質である。従って、抗原結合能を維持した形態で抗体蛋白質を取得するためには、前記「４．」の項目に記載の形質転換細胞において、重鎖及び軽鎖の遺伝子の双方が導入されている必要がある。この場合に、重鎖及び軽鎖の遺伝子発現ユニットは、同じ発現ベクター上に存在しても良く、あるいは異なる発現ベクター上に存在していても良い。
【００７５】
本発明において製造される抗体としては、ウサギ、マウス、ラット等実験動物を所望の抗原で免疫して作製された抗体を挙げることができる。また、前記の抗体を原料とするキメラ抗体、及びヒト化抗体も本発明において製造される抗体として挙げることができる。さらに、遺伝子改変動物又はファージディスプレイ法によって取得されるヒト抗体についても、本発明において製造される抗体である。
【００７６】
抗体製造に用いる抗体遺伝子としては、該抗体遺伝子より転写・翻訳される重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの組合せが、任意の抗原蛋白質と結合する活性を保持している限り、特定のポリヌクレオチド配列を持つ抗体遺伝子に限定されない。
【００７７】
また、抗体遺伝子としては、必ずしも抗体の全長分子をコードしている必要はなく、抗体の機能性断片をコードしている遺伝子を用いることができる。これらの機能性断片をコードする遺伝子は、抗体蛋白質の全長分子をコードする遺伝子を遺伝子工学的に改変することによって取得することができる。
【００７８】
７．その他の外来蛋白質の製造方法
本発明の製造方法の対象となる外来蛋白質としては、前述の抗体に加え、ヒト又は非ヒト動物由来の各種蛋白質、その機能性断片、その改変体等を挙げることができる。そのような蛋白質等としては、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、バソプレッシン、ソマトスタチン、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、オキシトシン、グレリン、レプチン、アディポネクチン、レニン、カルシトニン、オステオプロテジェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）等のペプチドホルモン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα／βほかＴＮＦスーパーファミリー等）、神経成長因子（ＮＧＦ）、細胞増殖因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ等）、造血因子（ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン等）、アディポカイン等のサイトカイン、ТＮＦ受容体等の受容体、リゾチーム、プロテアーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ等の酵素、その機能性断片（元の蛋白質の生物活性を一部又は全部保持している断片）、それらの蛋白質を含むことからなる融合蛋白質等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド、制限酵素、ＤＮＡ修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、ＤＮＡのクローニング、ポリヌクレオチド配列の決定、宿主細胞の形質転換、形質転換細胞の培養、得られる培養物からの蛋白質の採取、精製等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。
【実施例１】
【００８０】
ＤＮＡエレメントの抽出
（１−１）  抗アセチル化ヒストンＨ３抗体を用いたクロマチン免疫沈降
抗アセチル化ヒストン抗体を用いたＣｈＩＰは、下記手順によりＥＺ  ＣｈＩＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ）を用いて行った。尚、特記がない限り、下記手順の中で使用した抗体、ｂｕｆｆｅｒ等はＵｐｓｔａｔｅ社製品を使用した。
【００８１】
まず、２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＧＩＢＣＯ（登録商標）  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃、８％ＣＯ２条件下で培養を行い、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分、室温）により増殖期にある細胞を回収した。２×１０＾７個の細胞を１％ホルムアルデヒド入り培地で１０分間攪拌した後、１０×グリシンを加えて５分間室温で攪拌を行った。遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）により上清を除き、ＰＢＳを加えて細胞縣濁後に再度、遠心分離によりＰＢＳを除去し、ＳＤＳ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて細胞の縣濁・溶解を行った。溶解したサンプルを氷水で冷却しながら超音波ホモジナイザー（ＢＲＡＮＳＯＮ）を用いてＤＮＡの断片化を行い、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ入りｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ固定化アガロースを加え、４℃で１時間攪拌し、遠心分離後に上清の回収を行った。次に、１０μｇのｎｏｒｍａｌ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ、又はα―ａｃｅｔｙｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３抗体を加え、４℃で一晩攪拌を行った。その溶液にｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ固定化アガロースを加えて、４℃で１時間攪拌後、遠心分離によりペレットの回収を行った。そのペレットをＬｏｗ  Ｓａｌｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回、Ｈｉｇｈ  Ｓａｌｔ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回、ＬｉＣｌ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで２回、最後にＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄し、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（２０μｌの１Ｍ炭酸水素ナトリウム、１０μｌのＳＤＳ、１７０μｌの滅菌水）を加えて３０分後に遠心分離を行い、上清の回収を行った。
【００８２】
次に、その上清に５Ｍ塩化ナトリウムを加えて６５℃で一晩加熱し、更に、ＲＮａｓｅ  Ａを加えて３７℃で３０分間インキュベートした。０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｐｔｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを加えて４５℃で２時間静置した。
最後に、Ｐｔｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで処理した溶液の５倍量のＲｅａｇｅｎｔＡ、Ｂ、Ｃを加え、Ｓｐｉｎ  ｆｉｌｔｅｒによる遠心分離（１００００ｒｐｍ、３０秒、室温）によりクロマチン免疫沈降されたＤＮＡの精製を行った。
【００８３】
（１−２）  マイクロアレイ解析
ＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、（１−１）の各ＣｈＩＰサンプルの増幅を行った。手順はＫｉｔ付属のＳｉｇｍａ社のプロトコールに従って行った。
【００８４】
ＣｈＩＰの確認を行うため、ＷＧＡにより増幅した各ＤＮＡ３２０ｎｇを鋳型として、下記プライマー及びＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＴＭ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、ＰＣＲ法（９５℃  ５秒、６０℃  ２０秒×４５ｃｙｃｌｅ）によりグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｌａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）遺伝子内部の増幅を行った。なお、ＧＡＰＤＨは、ＣｈＩＰによりＤＮＡエレメントが濃縮されたことを確認するための陽性コントロールとなるハウスキーピング遺伝子であり、ＥＺ  ＣｈＩＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ）に付属のプライマーを用いてＰＣＲ法を実施した。
５’−ＴＡＣＴＡＧＣＧＧＴＴＴＴＡＣＧＧＧＣＧ−３’
５’−ＴＣＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＧＣＧＡ−３’
その結果、抗アセチル化ヒストンＨ３抗体で免疫沈降を行ったサンプル特異的にＧＡＰＤＨの増幅が確認された。ＷＧＡによって増幅した各ＤＮＡサンプルをマイクロアレイ解析（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）にかけることにより、Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ（ＣｈＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐ）を行った。ＣｈＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐは、（１−１）で濃縮されたＤＮＡをマイクロアレイ解析に供することによって、各ＤＮＡエレメントの同定を行う手法である。
【００８５】
（１−３）  ＤＮＡエレメントの抽出
（１−２）から得られたＣｈＩＰ  ｏｎ  ｃｈｉｐ解析結果を基に、６２％以上のＡＴ含量を有する５つの配列の抽出を行った。
Ａ２；１５番染色体（８０９６６４２９〜８０９７４８７８）
Ａ７；１１番染色体（８８９９２１２３〜８９０００５４２）
Ａ１８；４番染色体（１１１２７５９７６〜１１１２８４４５０）
Ｂ５；１番染色体（１４３０３４６８４〜１４３０４３０８４）
Ｃ１４；１１番染色体（４６０８９０５６〜４６０９７４８２）
【実施例２】
【００８６】
分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を指標とした、ＤＮＡエレメントの効果
（２−１）  ＳＥＡＰ発現ベクターの構築
ｐＳＥＡＰ２−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（９４℃  ３０秒、６８℃  ２分×４０ｃｙｃｌｅ）により、ＳＥＡＰ遺伝子の増幅を行った。
５’−ＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣ−３’
５’−ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣ−３’
次に、アガロースゲル電気泳動により増幅されたＳＥＡＰ断片を分離後、ゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、このＤＮＡ断片をインサートとした。インサートを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ベクターｐＩＲＥＳ  ｈｙｇ３（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限酵素ＮｈｅＩ，ＢａｍＨＩで処理後、アガロース電気泳動によりそれぞれの目的断片を分離後、ゲルから切り出し、精製後に、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを行った。Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応は、ＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行った。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎは、まず、凍結しているコンピテントセルＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ）を融解し、その溶液にｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液１０μｌを加え、氷上で３０分静置した。その後、ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ（４２℃、４５秒）を行い、５分氷冷した。この菌体懸濁液に１ｍｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間振とうし、０．１ｍｇ／ｍｌアンピシリン入りのＬＢプレートに播き、３７℃で１４〜１６時間培養した。その後、アルカリ法によりＬＢプレート上で培養したコロニーから目的プラスミドの回収を行った。最後に、アルカリ法にて得られたプラスミド中のＳＥＡＰのポリヌクレオチド配列を決定することで、ｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｈｙｇｒｏを構築した。
【００８７】
（２−２）  ＤＮＡエレメントのクローニング
次に、実施例１で抽出したＤＮＡエレメントを、それぞれのポリヌクレオチド配列を有するバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）からＢＡＣ  ＳＵＢＣＬＯＮＩＮＧ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）を用いて（２−１）のＳＥＡＰ発現ベクターへクローニングを行った。
【００８８】
まず、（２−１）のｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｈｙｇｒｏを制限酵素ＳｐｅＩで数時間処理し、エタノール沈殿を行い、滅菌水で溶解した。ＳｐｅＩ処理した上記ベクターを鋳型に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）を用いたＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １０分×３０ｃｙｃｌｅ）を行った。
【００８９】
Ａ２Ｄ；
５’−ＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２Ｒ；
５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【００９０】
Ａ７Ｄ；
５’−ＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７Ｒ；
５’−ＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡＡＧＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【００９１】
Ａ１８Ｄ；
５’−ＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ１８Ｒ；
５’−ＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＴＧＡＧＡＣＣＴＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＡＧＴＴＡＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【００９２】
Ｂ５Ｄ；
５’−ＡＣＣＧＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＴＴＴＡＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｂ５Ｒ；
５’−ＧＡＴＣＴＴＡＧＧＧＧＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＴＧＴＡＧＴＣＴＴＡＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【００９３】
Ｃ１４Ｄ；
５’−ＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４Ｒ；
５’−ＣＡＡＡＡＣＣＴＣＡＴＣＴＣＴＡＣＴＧＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【００９４】
反応溶液の一部を用いてアガロースゲル電気泳動により増幅の確認を行った後、残りの溶液はエタノール沈殿を行い、滅菌水で溶解し、形質転換用ＤＮＡとした。
【００９５】
次に、形質転換用大腸菌の調製を行った。
【００９６】
実施例１で抽出された５配列と対応するＢＡＣクローンは以下の通り。
0005859988.tif 000002
融解した上記ＢＡＣ（株式会社ジェノテックス）  １０μｌを培地１ｍｌ（最終濃度ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  １５μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養を行った。その培養液３０μｌを１．４ｍｌの培地（最終濃度ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  １５μｇ／ｍｌ含む）に移し、３７℃で２時間培養を行い、遠心及び滅菌水による洗浄を２回繰り返し、２０μｌの滅菌水で懸濁した。冷却したキュベット（０．１ｃｍ）にｐＲＥＤ／ＥＴ（Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ）  １μｌ及び大腸菌を添加し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（１３５０Ｖ、１０μＦ）を行った後、ＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３０℃で７０分間の培養を行い、培養液１００μｌをＬＢプレート（最終濃度ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ  ３μｇ／ｍｌ、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  １５μｇ／ｍｌ含む）に播種し、３０℃で一晩インキュベートした。次の日に得られたコロニーを培地１ｍｌ（最終濃度ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ  ３μｇ／ｍｌ、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  １５μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３０℃で一晩培養を行った。培養液３０μｌを１．４ｍｌ培地（最終濃度ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ  ３μｇ／ｍｌ、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  １５μｇ／ｍｌ含む）に移し、３０℃で２時間培養を行い、５０μｌの１０％Ｌ―ａｒａｂｉｎｏｓｅを添加し、更に３７℃で１時間の培養を行った。その後、滅菌水による洗浄を２回繰り返し、３０μｌの滅菌水で懸濁した大腸菌及び、形質転換用ＤＮＡ  １μｌを、冷やしたキュベット（０．１ｃｍ）に添加し、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（１３５０Ｖ、１０μＦ）を行った。ＳＯＣ培地１ｍｌを加え、３７℃で９０分培養を行い、培養液全量をＬＢプレート（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含む）への播種、プレート培養、アルカリ法による目的プラスミドの取得を行った。最後に、取得されたプラスミドの配列確認及び制限酵素確認の実施により、目的プラスミドの構築を行った。
【００９７】
（２−３）  ＳＥＡＰ発現を指標とした評価
宿主細胞ＣＨＯ―Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、（２−２）で構築された各プラスミドの評価を実施した。
【００９８】
遺伝子導入２日後からｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  ８００μｇ／ｍｌによる薬剤選択を約２週間行い、ポリクローナル安定発現株の構築を行った。樹立された細胞株は、測定前日に培地交換を行い、一定細胞数を２４穴プレート（ＩＷＡＫＩ）に播種した。播種２４時間後に培養上清の回収を行い、ＳＥＡＰ活性の測定を行った。培養上清中のＳＥＡＰ活性は、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅＴＭ  ｐＮＰＰ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を用いて、測定した。
【００９９】
測定結果を図３に示す。Ｎｏ  ｅｌｅｍｅｎｔであるコントロールのＳＥＡＰ活性を１としたとき、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４を有するＣＨＯ安定発現株の培養上清中のＳＥＡＰ活性は５倍以上の数値を示した。このことにより、ＤＮＡエレメント５種類全てはＳＥＡＰ発現を劇的に亢進することが確認された。なお、上記の５種類のポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号の１乃至５に記載されている。
【実施例３】
【０１００】
併用プロモーターの一般性
実施例２においてＤＮＡエレメントの評価に用いたベクターのプロモーターはＣＭＶプロモーターであったが、他の一般的なプロモーターとの併用について検討を行った。
【０１０１】
（３−１）  ＥＦ−１α及びＳＶ４０プロモーターを用いたＳＥＡＰ発現ベクターの構築
ｐＳＥＡＰ２−ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型に、（２−１）に記載のプライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いたＰＣＲ法（９４℃  ３０秒、６８℃  ２分×４０ｃｙｃｌｅ）により、ＳＥＡＰ遺伝子の増幅を行った。増幅されたＳＥＡＰは、（２−１）と同様の方法によりインサートとして調製した。インサートを制限酵素ＮｈｅＩ、ＢｇｌＩＩ、ベクターｐＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ３（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩで処理し、（２−１）と同様の方法でｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏを構築した。
【０１０２】
次に、ｐＥＦ１／Ｖ５−Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  ２分×３０ｃｙｃｌｅ）により、ＥＦ−１αプロモーターの増幅を行った。
５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＣ−３’
５’−ＡＡＡＧＡＴＡＴＣＣＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣ−３’
上記で構築したｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏをベクターとして、それぞれを制限酵素ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＶで処理し、（２−１）に記載の方法に準じてｐＥＦ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏの構築を行った。
【０１０３】
同様に、ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、６０℃  ３０秒、６８℃  １分×３０ｃｙｃｌｅ）により、ＳＶ４０プロモーターの増幅を行った。
５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧＧＧＴＧ−３’
５’−ＡＡＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＣ−３’
上記で構築したｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏをベクターとして、それぞれを制限酵素ＳｐｅＩ、ＥｃｏＲＶで処理し、（２−１）に記載の方法に準じてｐＳＶ４０／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏの構築を行った。
【０１０４】
（３−２）  ＤＮＡエレメントＡ２又はＡ７のクローニング
（３−１）で構築したｐＥＦ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏ及びｐＳＶ４０／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏを基本骨格として、ＤＮＡエレメントＡ２又はＡ７のクローニングを行った。
【０１０５】
まず、ｐＥＦ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏ及びｐＳＶ４０／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｐｕｒｏを制限酵素ＳｐｅＩで数時間処理し、エタノール沈殿を行い、滅菌水で溶解した。ＳｐｅＩ処理したそれぞれのベクターを鋳型に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １０分×３０ｃｙｃｌｅ）により、形質転換用ＤＮＡの調製を行った。
Ａ２（ＥＦ／Ｄ）；
５’−ＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’
Ａ２（ＳＶ４０／Ｄ）；
５’−ＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧ−３’
Ａ２（共通／Ｒ）；
５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡ−３’
【０１０６】
Ａ７（ＥＦ／Ｄ）；
５’−ＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧＣ−３’
Ａ７（ＳＶ４０／Ｄ）；
５’−ＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＡＧＴＣＴＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＧＴＴＡＧ−３’
Ａ７（共通／Ｒ）；
５’−ＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡＡＧＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡ−３’
調製した形質転換用ＤＮＡ及びｐＲｅｄ／ＥＴを形質転換したＢＡＣを用いて、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７を（３−１）に記載のベクターへクローニングを行った。尚、操作は（２−２）に記載の方法に準じて行った。
【０１０７】
（３−３）  ＳＥＡＰ発現を指標とした評価
宿主細胞ＣＨＯ―Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、（３−２）で構築された各プラスミドの評価を実施した。
【０１０８】
遺伝子導入２日後からｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ８μｇ／ｍｌによる薬剤選択を約２週間行い、ポリクローナル安定発現株の構築を行った。樹立された細胞株は、測定前日に培地交換後に一定細胞数を２４穴プレートに播種した。播種２４時間後に培養上清の回収を行い、ＳＥＡＰ活性の測定を行った。培養上清中のＳＥＡＰ活性は、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅＴＭ  ｐＮＰＰ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を用いて、測定した。
【０１０９】
測定結果を図４に示す。Ｎｏ  ｅｌｅｍｅｎｔであるコントロールのＳＥＡＰ活性を１としたとき、ＤＮＡエレメントＡ２又はＡ７は、ＥＦ−１αプロモーターと併用することで２倍以上、ＳＶ４０プロモーターと併用することで４倍以上の発現亢進効果を示した。このことから、これらのＤＮＡエレメントは、一般的なプロモーターとの併用により外来遺伝子の発現亢進効果を示すことが確認された。
【実施例４】
【０１１０】
抗体発現を指標とした評価
（４−１）  ヒト軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬの構築
プラスミドｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法を行うことにより、ＢＧＨｐＡの直後（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２１７４）から、ＳｍａＩ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ２９５８）までのＤＮＡ断片（ｆ１  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ及びＳＶ４０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｏｒｉｇｉｎを含むＤＮＡフラグメント、以下、「フラグメントＡ」とする。なお、フラクメントＡのポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６に記載されている。）を取得した。
５’−ＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣ−３’  
５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧ−３’
【０１１１】
得られたフラグメントＡと、ヒトκ鎖分泌シグナル、ヒトκ鎖定常領域及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナルをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメント（以下、「フラグメントＢ」とする）をオーバーラップＰＣＲにより結合した。得られたフラグメントＡとフラグメントＢとが結合したＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化し、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したプラスミドｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＢ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションし、ＥＦ−１αプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトκ鎖定常領域、及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナル配列をもつ、ヒト軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬを構築した。
【０１１２】
上記の方法で得られたｐＥＦ６ＫＣＬから制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したｐＥＦ１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とｌｉｇａｔｉｏｎし、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認によりプラスミドｐＥＦ１ＫＣＬを構築した。
【０１１３】
（４−２）  ヒト重鎖発現ベクターｐＥＦ１ＦＣＣＵの構築
ヒトＩｇＧ１シグナル配列及び定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（このＤＮＡ断片の有するポリヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７に記載されている）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩで消化したプラスミドｐＥＦ１ＫＣＬと結合し、ＥＦ−１αプロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒト重鎖定常領域、及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナル配列をもつヒト重鎖発現ベクターｐＥＦ１ＦＣＣＵを構築した。
【０１１４】
（４−３）  ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃）の構築
（４−１）、（４−２）で構築したＬ鎖又はＨ鎖発現ベクターを結合させることにより、ヒト化抗体発現シングルベクター（ｐＥＦ＿ＬＨＮ（可変領域なし））の構築を行った。
【０１１５】
ｐＥＦ１ＫＣＬのプロモーター上流及びｐｏｌｙＡの下流までの遺伝子発現ユニットの両端にＰＣＲ法により制限酵素ＳａｌＩサイトの付加を行い、アガロースゲル電気泳動、切り出し、ＤＮＡ断片の精製を行い、インサートとした。（４−２）で構築されたｐＥＦ１ＦＣＣＵを制限酵素ＳａｌＩで処理することで、遺伝子発現ユニットより上流に存在するＳａｌＩサイトでベクターをリニアーにし、上記インサートとｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行い、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認によりヒト化抗体発現シングルベクター（ｐＥＦ＿ＬＨＮ（可変領域なし）の構築を行った。
【０１１６】
次に、ｐＥＦ＿ＬＨＮ（可変領域なし）のＡａｔＩＩサイトへ下記オリゴの導入を行った。
５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＴ−３’
５’−ＣＡＣＴＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＴ−３’
それぞれのオリゴを５ｐｍｏｌに希釈し、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、３７℃で１時間反応後、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＡＫＡＲＡ）を添加し、９６℃  １分、室温３０分の反応によりアニーリングを行った。このオリゴと、制限酵素ＡａｔＩＩ処理したベクターｐＥＦ＿ＬＨＮとをｌｉｇａｔｉｏｎし、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認により、ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃（可変領域なし）を構築した。
【０１１７】
上記で構築した汎用ベクター（ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃（可変領域なし））にヒト化抗体遺伝子Ｘの可変領域の組込みを行うことで、ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃）の構築を完成させた。
まず、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １分×３０ｃｙｃｌｅ）により、ヒト化抗体遺伝子ＸのＬ鎖可変領域の増幅を行った。
【０１１８】
Ｌ鎖可変領域；
５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣ−３’
５’−ＡＡＡＣＧＴＡＣＧＣＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＧＧ−３’
増幅したＬ鎖可変領域断片及び汎用ベクター（ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃（可変領域なし））を制限酵素ＮｄｅＩ、ＢｓｉＷＩ処理し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の切り出し、精製、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認によりＬ鎖可変領域の組込みを行った。同様に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １分×３０ｃｙｃｌｅ）により、ヒト化抗体遺伝子ＸのＨ鎖可変領域の増幅を行った。
【０１１９】
Ｈ鎖可変領域；
５’−ＡＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’
５’−ＡＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣ−３’
増幅したＨ鎖可変領域断片及びＬ鎖可変領域が挿入されたベクターを制限酵素ＢｌｐＩで処理し、アガロースゲル電気泳動による目的断片の切り出し、精製、ｌｉｇａｔｉｏｎ反応、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認によりＨ鎖可変領域の組込みを行い、ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃）を構築した。
【０１２０】
（４−４）  ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃）の構築
（４−３）で構築したヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃）をベクター基本骨格として、下記手順によってプロモーターの交換を行い、ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃）の構築を行った。
ｐＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ３を鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  ３０秒、６８℃  ３分×４０ｃｙｃｌｅ）によりＣＭＶプロモーター断片の増幅を行った。
【０１２１】
Ｈ鎖上流；
５’−ＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣ−３’
５’−ＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡ−３’
【０１２２】
Ｌ鎖上流；
５’−ＴＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＧＴＴＡＣＡＴＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＡＡＡＴＧＧＣＣ−３’
５’−ＣＴＧＧＡＴＧＴＣＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＣＣＧＧＡＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡ−３’
ＰＣＲ反応溶液に制限酵素ＤｐｎＩを加えて３７℃、１時間反応させ、ｍｉｎｉＥｌｕｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により精製を行い、Ｉｎ―Ｆｕｓｉｏｎ用のサンプルとした。一方、ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＮｄｅＩ、ＦｓｅＩで処理し、アガロースゲル電気泳動を行うことで、断片の中で大きな断片２本の分離を行った。ゲルからそれぞれを切り出し、ゲルからＤＮＡの抽出を行い、Ｉｎ―Ｆｕｓｉｏｎ用のサンプルとした。全てのＩＮ―Ｆｕｓｉｏｎ用サンプルを集め、Ｉｎ―ＦｕｓｉｏｎＴＭ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（ＴＡＫＡＲＡ）、ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ、アルカリ法、配列確認により、ヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃）を構築した。
【０１２３】
（４−５）  ＤＮＡエレメントＡ７のクローニング
ＳＥＡＰの発現亢進効果が認められた５種類のＤＮＡエレメントの中からＡ７を選択し、抗体発現ベクターへのクローニングを行った。
（２−２）と同様の方法で、制限酵素ＮｏｔＩ処理したヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクター（ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃、ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃）それぞれを鋳型として、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いてＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １１分×３０ｃｙｃｌｅ）により、形質転換用ＤＮＡの調製を行った。
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃  Ｄ；
５’−ＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡＡＧＡＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴ−３’
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃  Ｒ；
５’−ＣＴＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡＡＧＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧ−３’
【０１２４】
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃  Ｄ；
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃  Ｄを使用。
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＣＭＶ＿ＬＨＮ＃  Ｒ；
ヒト化抗体遺伝子Ｘ／ｐＥＦ＿ＬＨＮ＃  Ｒを使用。
【０１２５】
調製した形質転換用ＤＮＡ及びｐＲｅｄ／ＥＴを形質転換したＢＡＣを用いて、ＤＮＡエレメントＡ７を（４−３）、（４−４）記載のヒト化抗体遺伝子Ｘ発現シングルベクターへクローニングを行った。尚、操作は（２−２）に記載の方法に準じて行った。
【０１２６】
（４−６）  抗体発現を指標とした評価
宿主細胞ＣＨＯ―Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、（４−５）で構築された各プラスミドの評価を実施した。
遺伝子導入２日後からＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）  ８００μｇ／ｍｌによる薬剤選択を約２週間行い、ポリクローナル安定発現株の構築を行った。樹立された細胞株は、測定前日に培地交換後、一定細胞数を２４穴プレートに播種し、播種２４時間後に培養上清の回収を行い、ＥＬＩＳＡ法により培養上清中の抗体発現量の測定を行った。尚、ＥＬＩＳＡは以下の方法で行った。Ａｎｔｉ−ｋａｐｐａ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎを５０ｎｇ／ｗｅｌｌでコーティングした９６穴プレートに、除細胞した培養上清１００μｌを添加し、３７℃で１時間静置した。次に、サンプル（培養上清）を除き、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）２００μｌで各ｗｅｌｌを洗った後、ＨＲＰ標識されたａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆｃ）１００μｌをｗｅｌｌに添加し、さらに３７℃で１時間静置した。その後、ＨＲＰ標識されたａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆｃ）を除き、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で各ｗｅｌｌを洗った後、ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キット（ｎａｃａｌａｉ）を用いて発色させ、測定波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。ａｎｔｉ−ｋａｐｐａ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆｃ）及びサンプルの希釈にはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）を用いた。段階希釈（１２ｎｇ、６ｎｇ、３ｎｇ、１．５ｎｇ、０．７５ｎｇ、０．３７５ｎｇ、０．１８７５ｎｇ）したｈｕｍａｎ  ＩｇＧをスタンダードに、サンプル濃度を算出した。
結果を図６に示す。ＥＦ−１αプロモーター又はＣＭＶプロモーターを有する抗体発現ベクターにおいて、ＤＮＡエレメントＡ７を持つサンプルは、ｎｏ  ｅｌｅｍｅｎｔであるコントロールよりも大きな抗体生産亢進効果を示すことが確認された。
【実施例５】
【０１２７】
外来遺伝子発現亢進活性を示す配列長
（５−１）  配列長の異なるＤＮＡエレメントのクローニング
実施例２で用いた配列長を基に、各ＤＮＡエレメントの異なる配列長を有するベクターの構築を行った。
【０１２８】
ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４のｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈを基に設計した異なる配列長を有するエレメントの詳細を図７、９、１１、１３、１５に示す。（２−１）のｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｈｙｇｒｏを制限酵素ＳｐｅＩで数時間処理し、エタノール沈殿を行い、滅菌水で溶解した。ＳｐｅＩ処理した上記ベクターを鋳型に、下記プライマー及びＫＯＤ−ｐｌｕｓ−を用いたＰＣＲ法（９４℃  １５秒、５５℃  ３０秒、６８℃  １０分×３０ｃｙｃｌｅ）を行い、形質転換用ＤＮＡの調製を行った。調製した形質転換用ＤＮＡ及びｐＲｅｄ／ＥＴを形質転換したそれぞれのＢＡＣを用いて、配列長の異なる各ＤＮＡエレメントを（２−１）のｐＣＭＶ／ＳＥＡＰ  ｉｒｅｓ  Ｈｙｇｒｏへクローニングを行った。尚、操作は（２−２）に記載の方法に準じて行った。
【０１２９】
Ａ２−１Ｄ；
５’−ＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＡＴＴＴＡＧＴＡＣＴＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−１Ｒ；
５’−ＣＴＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＡＴＧＣＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＡＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３０】
Ａ２−２Ｄ；
５’−ＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＡＣＡＧＧＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−２Ｒ；
５’−ＡＣＴＧＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＧＴＧＧＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３１】
Ａ２−３Ｄ；
５’−ＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＧＴＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−３Ｒ；
５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３２】
Ａ２−４Ｄ；
５’−ＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＣＴＣＡＣＴＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＡＴＡＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−４Ｒ；
５’−ＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＣＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３３】
Ａ２−５Ｄ；
５’−ＣＧＣＡＴＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−５Ｒ；
Ａ２−４Ｒを使用。
【０１３４】
Ａ２−６Ｄ；
５’−ＧＧＧＡＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＴＣＴＡＡＣＣＡＣＴＡＡＡＡＧＧＣＡＴＧＡＣＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−６Ｒ；
Ａ２−４Ｒを使用。
【０１３５】
Ａ２−７Ｄ；
５’−ＴＣＴＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＴＣＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−７Ｒ；
５’−ＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＣＧＴＴＡＡＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３６】
Ａ２−８Ｄ；
５’−ＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＴＡＡＧＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ２−８Ｒ；
５’−ＡＴＧＡＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＧＴＴＡＧＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１３７】
Ａ２−９Ｄ；
Ａ２−６Ｄを使用。
Ａ２−９Ｒ；
Ａ２Ｒを使用。
【０１３８】
Ａ２−１０Ｄ；
Ａ２−２Ｄを使用。
Ａ２−１０Ｒ；
Ａ２−７Ｒを使用。
【０１３９】
Ａ２−１１Ｄ；
Ａ２−８Ｄを使用。
Ａ２−１１Ｒ；
Ａ２−２Ｒを使用。
【０１４０】
Ａ２−１２Ｄ；
Ａ２−２Ｄを使用。
Ａ２−１２Ｒ；
Ａ２−４Ｒを使用。
【０１４１】
Ａ２−１３Ｄ；
Ａ２−８Ｄを使用。
Ａ２−１３Ｒ；
Ａ２−７Ｒを使用。
【０１４２】
Ａ２−１４Ｄ；
Ａ２Ｄを使用。
Ａ２−１４Ｒ；
Ａ２−２Ｒを使用。
【０１４３】
Ａ２−１５Ｄ；
Ａ２−２Ｄを使用。
Ａ２−１５Ｒ；
Ａ２Ｒを使用。
【０１４４】
Ａ２−１６Ｄ；
Ａ２−８Ｄを使用。
Ａ２−１６Ｒ；
Ａ２−４Ｒを使用。
【０１４５】
Ａ２−１７Ｄ；
Ａ２Ｄを使用。
Ａ２−１７Ｒ；
Ａ２−７Ｒを使用。
【０１４６】
Ａ７−１Ｄ；
５’−ＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＧＧＣＡＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−１Ｒ；
５’−ＡＴＡＣＡＡＴＧＴＴＣＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１４７】
Ａ７−２Ｄ；
５’−ＧＡＴＣＴＴＡＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＴＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−２Ｒ；
５’−ＴＧＴＴＧＴＴＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＣＴＡＧＧＡＡＡＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１４８】
Ａ７−３Ｄ；
Ａ７−２Ｄを使用。
Ａ７−３Ｒ；
５’−ＡＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１４９】
Ａ７−４Ｄ；
５’−ＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＡＴＡＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−４Ｒ；
５’−ＧＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＴＧＣＴＡＴＧＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＴＡＣＣＴＧＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１５０】
Ａ７−５Ｄ；
５’−ＣＡＣＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＴＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＴＴＡＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−５Ｒ；
５’−ＣＡＡＴＴＡＣＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＴＣＴＧＣＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴＧＣＡＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１５１】
Ａ７−６Ｄ；
５’−ＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−６Ｒ；
５’−ＡＡＧＣＡＧＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＣＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＣＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＧＧＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１５２】
Ａ７−７Ｄ；
５’−ＡＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＴＧＴＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＴＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ７−７Ｒ；
５’−ＴＴＧＧＧＡＧＧＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＡＧＧＣＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＴ−３’
【０１５３】
Ａ７−８Ｄ；
Ａ７−１Ｄを使用。
Ａ７−８Ｒ；
Ａ７Ｒを使用。
【０１５４】
Ａ７−９Ｄ；
Ａ７−７Ｄを使用。
Ａ７−９Ｒ；
Ａ７−５Ｒを使用。
【０１５５】
Ａ７−１０Ｄ；
Ａ７−４Ｄを使用。
Ａ７−１０Ｒ；
Ａ７−７Ｒを使用。
【０１５６】
Ａ７−１１Ｄ；
Ａ７−６Ｄを使用。
Ａ７−１１Ｒ；
Ａ７−４Ｒを使用。
【０１５７】
Ａ７−１２Ｄ；
Ａ７−２Ｄを使用。
Ａ７−１２Ｒ；
Ａ７−６Ｒを使用。
【０１５８】
Ａ７−１３Ｄ；
Ａ７−７Ｄを使用。
Ａ７−１３Ｒ；
Ａ７Ｒを使用。
【０１５９】
Ａ７−１４Ｄ；
Ａ７−４Ｄを使用。
Ａ７−１４Ｒ；
Ａ７−５Ｒを使用。
【０１６０】
Ａ７−１５Ｄ；
Ａ７−６Ｄを使用。
Ａ７−１５Ｒ；
Ａ７−７Ｒを使用。
【０１６１】
Ａ７−１６Ｄ；
Ａ７−２Ｄを使用。
Ａ７−１６Ｒ；
Ａ７−４Ｒを使用。
【０１６２】
Ａ７−１７Ｄ；
Ａ７−４Ｄを使用。
Ａ７−１７Ｒ；
Ａ７Ｒを使用。
【０１６３】
Ａ７−１８Ｄ；
Ａ７−６Ｄを使用。
Ａ７−１８Ｒ
Ａ７−５Ｒを使用。
【０１６４】
Ａ１８−１；
５’−ＡＴＣＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＴＴＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＡＧＴＴＣＴＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ１８−１Ｒ；
Ａ１８Ｒを使用。
【０１６５】
Ａ１８−２Ｄ；
５’−ＣＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＣＡＴＴＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ１８−２Ｒ；
５’−ＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＣＡＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＧＴＴＣＡＡＴＡＴＡＧＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１６６】
Ａ１８−３Ｄ；
５’−ＣＡＧＧＣＡＴＡＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＣＧＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ａ１８−３Ｒ；
５’−ＣＴＧＡＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＡＧＴＣＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１６７】
Ａ１８−４Ｄ；
Ａ１８−３Ｄを使用。
Ａ１８−４Ｒ；
５’−ＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＧＡＧＧＣＴＣＡＴＴＴＧＴＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＡＧＴＡＣＴＧＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１６８】
Ｂ５−１Ｄ；
５’−ＡＣＡＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｂ５−１Ｒ；
Ｂ５Ｒを使用。
【０１６９】
Ｂ５−２Ｄ；
５’−ＧＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＡＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｂ５−２Ｒ；
Ｂ５Ｒを使用。
【０１７０】
Ｂ５−３Ｄ；
５’−ＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｂ５−３Ｒ；
５’−ＴＡＴＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７１】
Ｂ５−４Ｄ；
Ｂ５Ｄを使用。
Ｂ５−４Ｒ；
５’−ＧＡＡＡＧＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７２】
Ｂ５−５Ｄ；
Ｂ５−１Ｄを使用。
Ｂ５−５Ｒ；
５’−ＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＧＡＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧＴＴＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＴＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７３】
Ｂ５−６Ｄ；
５’−ＣＡＧＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＡＧＴＴＡＡＧＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｂ５−６Ｒ；
５’−ＧＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＧＴＧＧＴＴＡＧＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７４】
Ｃ１４−１Ｄ；
５’−ＣＴＴＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＴＧＴＴＴＡＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＡＧＧＣＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＧＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４−１Ｒ；
５’−ＡＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＡＧＣＡＴＧＴＡＣＣＡＡＴＣＴＡＴＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７５】
Ｃ１４−２Ｄ；
５’−ＣＴＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４−２Ｒ；
５’−ＣＣＴＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＴＡＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＧＣＴＡＣＴＡＴＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７６】
Ｃ１４−３Ｄ；
５’−ＣＡＡＧＡＣＣＣＴＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４−３Ｒ；
５’−ＧＧＡＧＧＧＧＡＴＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＴＡＡＣＡＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＡＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１７７】
Ｃ１４−４Ｄ；
５’−ＣＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＡＴＴＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＡＡＧＴＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４−４Ｒ；
Ｃ１４−１Ｒを使用。
【０１７８】
Ｃ１４−５Ｄ；
５’−ＣＧＣＴＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＣＧ−３’
Ｃ１４−５Ｒ；
Ｃ１４−１Ｒを使用。
【０１７９】
Ｃ１４−６Ｄ；
Ｃ１４−４Ｄを使用。
Ｃ１４−６Ｒ；
５’−ＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＡＧＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＴＡＣＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１８０】
Ｃ１４−７Ｄ；
Ｃ１４−２Ｄを使用。
Ｃ１４−７Ｒ；
Ｃ１４−１Ｒを使用。
【０１８１】
Ｃ１４−８Ｄ；
Ｃ１４−３Ｄを使用。
Ｃ１４−８Ｒ；
５’−ＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＡＧＴＣＡＡＴＡＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧ−３’
【０１８２】
Ｃ１４−９Ｄ；
Ｃ１４−４Ｄを使用。
Ｃ１４−９Ｒ；
Ｃ１４−３Ｒを使用。
【０１８３】
Ｃ１４−１０Ｄ；
Ｃ１４−２Ｄを使用。
Ｃ１４−１０Ｒ；
Ｃ１４Ｒを使用。
【０１８４】
Ｃ１４−１１Ｄ；
Ｃ１４−３Ｄを使用。
Ｃ１４−１１Ｒ；
Ｃ１４−２Ｒを使用。
【０１８５】
Ｃ１４−１２Ｄ；
Ｃ１４−４Ｄを使用。
Ｃ１４−１２Ｒ；
Ｃ１４−８Ｒを使用。
【０１８６】
Ｃ１４−１３Ｄ；
Ｃ１４−３Ｄを使用。
Ｃ１４−１３Ｒ；
Ｃ１４−１Ｒを使用。
【０１８７】
Ｃ１４−１４Ｄ；
Ｃ１４−４Ｄを使用。
Ｃ１４−１４Ｒ；
Ｃ１４−２Ｒを使用。
【０１８８】
Ａ２の各断片のポリヌクレオチド配列においては、Ａ２−１は配列表の配列番号１の１乃至３０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−２は配列表の配列番号１の２８０１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−３は配列表の配列番号１の５４０１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−４は配列表の配列番号１の７０１乃至２７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−５は配列表の配列番号１の７０１乃至２２００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−６は配列表の配列番号１の７０１乃至３７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−７は配列表の配列番号１の２００１乃至５０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−８は配列表の配列番号１の４００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−９は配列表の配列番号１の１乃至３７００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１０は配列表の配列番号１の２００１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１１は配列表の配列番号１の２８０１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１２は配列表の配列番号１の７０１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１３は配列表の配列番号１の２００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１４は配列表の配列番号１の２８０１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１５は配列表の配列番号１の１乃至５８００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ２−１６は配列表の配列番号１の７０１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ２−１７は配列表の配列番号１の２００１乃至８４５０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【０１８９】
Ａ７の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ａ７−１は配列表の配列番号２の６０１乃至３６００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−２は配列表の配列番号２の３６０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−３は配列表の配列番号２の５４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−４は配列表の配列番号２の３４０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−５は配列表の配列番号２の１５０１乃至４５００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−６は配列表の配列番号２の４４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−７は配列表の配列番号２の２４０１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−８は配列表の配列番号２の１乃至３６００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−９は配列表の配列番号２の１５０１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１０は配列表の配列番号２の２４０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１１は配列表の配列番号２の３４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１２は配列表の配列番号２の４４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１３は配列表の配列番号２の１乃至５４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１４は配列表の配列番号２の１５０１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１５は配列表の配列番号２の２４０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１６は配列表の配列番号２の３４０１乃至８４２０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ７−１７は配列表の配列番号２の１乃至６４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ７−１８は配列表の配列番号２の１５０１乃至７４００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【０１９０】
Ａ１８の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ａ１８−１は配列表の配列番号３の１乃至５０４０番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ１８−２は配列表の配列番号３の１００１乃至６００２番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ａ１８−３は配列表の配列番号３の２００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＡ１８−４は配列表の配列番号３の３０００乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【０１９１】
Ｂ５の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ｂ５−１は配列表の配列番号４の１乃至４００１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−２は配列表の配列番号４の１乃至３２００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−３は配列表の配列番号４の２４９１乃至５６０１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−４は配列表の配列番号４の５３７３乃至８４０１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｂ５−５は配列表の配列番号４の９０１乃至４００１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＢ５−６は配列表の配列番号４の４００１乃至７０００番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【０１９２】
Ｃ１４の各断片のポリヌクレオチド配列おいては、Ｃ１４−１は配列表の配列番号５の９６０乃至４０１５番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−２は配列表の配列番号５の１９８７乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−３は配列表の配列番号５の４０２０乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−４は配列表の配列番号５の９６０乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−５は配列表の配列番号５の９６０乃至６０１１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−６は配列表の配列番号５の４９３９乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−７は配列表の配列番号５の９６０乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−８は配列表の配列番号５の２９９４乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−９は配列表の配列番号５の４０２０乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１０は配列表の配列番号５の１乃至５０１４番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１１は配列表の配列番号５の１９８７乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１２は配列表の配列番号５の２９９４乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、Ｃ１４−１３は配列表の配列番号５の９６０乃至７１１９番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当し、そしてＣ１４−１４は配列表の配列番号５の１９８７乃至８１４１番目のヌクレオチドからなるポリヌクレオチド配列に相当する。
【０１９３】
各断片の全長配列上の始点と終点は、図１８及び図１９でも示されている。
【０１９４】
（５−２）  配列長の異なるＤＮＡエレメントの評価
宿主細胞ＣＨＯ―Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、（５−１）で構築された各プラスミドの評価を実施した。
【０１９５】
（２−３）の方法と同様に、遺伝子導入後からｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を行い、ポリクローナル安定発現株の樹立を行った。樹立された細胞株は、測定前日に培地交換後、一定細胞数を２４穴プレートに播種し、播種２４時間後に培養上清の回収を行い、ＳＥＡＰ活性の測定を行った。
【０１９６】
測定結果を図８、１０、１２、１４、１６に示す。ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈのＤＮＡエレメントだけでなく、ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈより短い配列長を有するクローンにおいても発現亢進効果が確認された。このことより、ＤＮＡエレメントＡ２、Ａ７、Ａ１８、Ｂ５、Ｃ１４はｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈに比べて短い配列長を持つ場合においても外来遺伝子発現亢進活性を示すが、配列長がｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈの場合に最も大きな効果を発揮することが確認された。
【実施例６】
【０１９７】
ＣＨＯ細胞以外での効果
実施例２〜５における評価細胞にはＣＨＯ細胞が用いられてきたが、ＣＨＯ細胞以外の細胞株としてＨＥＫ２９３細胞を選択した。ＨＥＫ２９３細胞は１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃、５％ＣＯ２存在下で静置培養を行い、遺伝子導入前日に一定細胞数を６穴プレートに播種した。（３−２）で構築された各ＤＮＡエレメントを有するＳＥＡＰ発現ベクターの評価を行うため、各プラスミド及び遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入を行い、遺伝子導入２日後からｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎによる薬剤選択を約２週間行い、ポリクローナル安定発現株の樹立を行った。樹立された細胞株は、測定前日に培地交換後に一定細胞数を２４穴ｐｌａｔｅに播種し、播種２４時間後に培養上清の回収を行い、ＳＥＡＰ活性の測定を行った。培養上清中のＳＥＡＰ活性は、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅＴＭ  ｐＮＰＰ  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ（ＡＮＡＳＰＥＣ）を用いて、測定した。
測定結果を図１７に示す。実施例３における結果と同様、各ＤＮＡエレメントはＨＥＫ２９３細胞においても外来遺伝子（ＳＥＡＰ）の高い発現亢進効果を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
本発明のＤＮＡエレメントを用いた外来遺伝子発現ベクターを哺乳動物宿主細胞へ導入することによって、治療用蛋白質や抗体等の外来遺伝子の生産性を向上させることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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